Текст
                    БИОЛОГИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ БИОИНДИКАЦИЯ И БИОТЕСТИРОВАНИЕ
ACADEMA

Издательский центр «Академия»
www.academia-moscow.ru
ф s z fU tt о co fU Q. 10
О
Ф О z J) q ro z о s и и Ф e о о. с
ф ф 3 и Z со
БИОЛОГИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ
БИОИНДИКАЦИЯ
И БИОТЕСТИРОВАНИЕ
ACADEMIA
УДК 57(075.8) ББК 28.0:28.080я73 Б633
Авторы:
О.П.Мелехова, Е.И.Егорова, Т.Н.Евсеева, В.М.Глазер, С.А.Гераськин, Ю. К.Доронин, А.А.Киташова, А. В.Киташов, Ю.П. Козлов, И.А.Кондратьева, Г. В. Коссова, С.В.Котелевцев, Д.Н.Маторин, С.А. Остроумов, С. И. Погосян, А. В. Смуров, Г. Н. Соловых, А.Л. Степанов, Н. А. Тушмалова, Л. В. Цаценко
Рецензенты:
декан экологического ф-та Российского университета дружбы народов д-р биол.наук, проф. Н.А. Черных-,
зав. кафедрой аквакультуры Астраханского технического университета (Дмитровский филиал) д-р биол. наук, проф. Н.А. Головина-, декан ф-та «Инженерная экология» Московского государственного университета инженерной экологии проф. Н. Е. Николайкина-, проф. кафедры зоологии беспозвоночных биологического ф-та Московского государственного университета им. М. В. Ломоносова, д-р биол. наук Н. Н. Марфенин
Биологический контроль окружающей среды: биоиндика-Б633 ция и биотестирование : учеб, пособие для студ. высш. учеб, заведений / О. П. Мелехова, Е. И. Егорова, Т. И. Евсеева и др.; под ред. О. П. Мелеховой и Е. И. Егоровой. — М.: Издательский центр «Академия», 2007. — 288 с.
ISBN 978-5-7695-3560-4
В учебном пособии изложены теоретические основы и методология биологической диагностики окружающей среды. Входящие в пособие лабораторные работы (более 40) содержат современные методы биоиндикации и биотестирования. Книга по структуре и содержанию представляет собой основу практикума к таким дисциплинам, как «Экология» и «Биологический мониторинг», входящим в учебные планы многих специальностей биолого-экологической направленности.
Для студёНтой высших учебных заведений.
УДК 57(075.8) ' ' , ББК 28.0:28.080я73
Оригинал-макет данного издания является собственностью Издательского центра «Академия», и его воспроизведение любым способом без согласия правообладателя запрещается
© Коллектив авторов, 2007
© Образовательно-издательский центр «Академия», 2007
ISBN 978-5-7695-3560-4 © Оформление. Издательский центр «Академия», 2007
ПРЕДИСЛОВИЕ
Учебное пособие подготовлено коллективом авторов — известных специалистов в области биологического контроля состояния окружающей среды, имеющих большой опыт преподавания соответствующих дисциплин. В нем впервые представлен столь полный набор разнообразных методов биоиндикации и биотестирования, часть которых разработана авторами пособия.
Книга включает фундаментальные теоретические основы и методологию биологического контроля окружающей среды (гл. 1 — 3). Теоретические главы завершаются списком литературы, куда вошли монографии, учебники, учебные пособия, статьи известных ученых и специалистов в области биоэкологии и охраны окружающей среды.
Практическая часть пособия содержит более 40 лабораторных работ по основным методам биоиндикации и биотестирования (гл. 4). Работы приведены в форме, доступной для воспроизведения их студентами на практических занятиях продолжительностью 2—4 академических часа. Большинство лабораторных работ сопровождается рисунками, справочным материалом и рабочими таблицами, пронумерованными соответственно номерам работ; к каждой работе дается список литературы по изучаемому в ней методу биологического контроля окружающей среды. В гл. 5 пособия приведены общие принципы применения компьютерных технологий в биологическом мониторинге.
Считаем необходимым поблагодарить всех авторов, поддержавших идею создания учебного пособия по биологическому мониторингу для студентов вузов, а также пред ложивших свои методики и собственный взгляд на проблему оценки качества окружающей среды.
Хотим выразить искреннюю признательность и благодарность профессорам О. Ф. Филенке и Б. И. Сынзынысу за профессиональную критику и многочисленные предложения по совершенствованию пособия.
О. П. Мелехова, Е. И. Егорова
ВВЕДЕНИЕ
Биологический контроль окружающей среды включает две основные группы методов: биоиндикацию и биотестирование. В предлагаемом учебном пособии подробно рассматриваются возможности использования в биоиндикационных исследованиях живых организмов — индикаторных видов, которые в силу своих генетических, физиологических, анатомических и поведенческих особенностей способны существовать в узком интервале определенного фактора, указывая своим присутствием на наличие этого фактора в среде. Применение в качестве биоиндикаторов растений, животных и даже микроорганизмов позволяет проводить биомониторинг воздуха, воды и почвы. Благодаря специальным индексам и коэффициентам результаты биоиндикации оказываются достоверными и сопоставимыми^
В пособии приводятся основные задачи и приемы биотестирования окружающей среды, требования к подбору тест-объектов, которыми могут быть как целые организмы, так и молекулы, клетки, органы и ткани, из которых они состоят.
Чтобы в дальнейшем различать очень близкие по целям применения и смысловому использованию понятия, поясним значения терминов «биоиндикация» и «биотестирование».
< Биоиндикация (bioindication) — обнаружение и определение экологически значимых природных и антропогенных нагрузок на основе реакций на них живых организмов непосредственно в среде их обитания. Биологические индикаторы обладают признаками, свойственными системе или процессу, на основании которых производится качественная или количественная оценка тенденций изменений, определение или оценочная классификация состояния экологических систем, процессов и явлений. В настоящее время можно считать общепринятым, что основным индикатором устойчивого развития в конечном итоге является качество среды обитания.
Биотестирование (bioassay) — процедура установления токсичности среды с помощью тест-объектов, сигнализирующих об опасности независимо от того, какие вещества и в каком сочетании вызывают изменения жизненно важных функций у тест-объектов. Для оценки параметров среды используются стандартизованные реакции живых организмов (отдельных органов, тканей, клеток или молекул). В организме, пребывающем контрольное время в условиях загрязнения, происходят изменения физиологических,
4
биохимических, генетических, морфологических или иммунных систем. Объект извлекается из среды обитания, и в лабораторных условиях проводится необходимый анализ. Живой организм может тестироваться также в специальных камерах или на стендах, где создаются условия изучаемого загрязнения (что очень важно для выявления реакций организма на то или иное доминирующее загрязнение или целый комплекс известных загрязняющих веществ на данной территории обитания).
Хотя подходы очень близки по конечной цели исследований, надо помнить, что биотестирование осуществляется на уровне молекулы, клетки или организма и характеризует возможные последствия загрязнения окружающей среды для биоты, а биоиндикация — на уровне организма, популяции и сообщества и характеризует, как правило, результат загрязнения. Живые объекты — открытые системы, через которые идет поток энергии и круговорот веществ. Все они в той или иной мере пригодны для целей биомониторинга.
Контроль качества окружающей среды с использованием биологических объектов в последние десятилетия оформился как актуальное научно-прикладное направление. При этом необходимо отметить дефицит учебной литературы по этим вопросам и большую потребность в ней.
ГЛАВА 1
ПРИНЦИПЫ ОРГАНИЗАЦИИ БИОЛОГИЧЕСКОГО МОНИТОРИНГА
Под экологическим качеством среды обитания человека понимают интегральную характеристику природной среды, обеспечивающую сохранение здоровья и комфортное проживание человека.
Природная среда, в которой мы живем, формировалась в течение многих сотен миллионов лет. Современный лик Земли и состав основных сред обитания живых организмов — почвы, воздуха, воды — созданы и поддерживаются благодаря жизнедеятельности и взаимодействию мириадов живых существ. Искусственно создать полноценную среду обитания для человека не удается. Только биота (совокупность разнообразных живых организмов) поддерживает и регулирует качество среды — параметры, необходимые для жизни (температуру, влажность, солевой состав, соотношение газов в атмосфере, климат). Сейчас науке известны не менее 7 млн биологических видов, и ученые считают, что эта цифра составляет только часть от реально существующего разнообразия обитателей Земли.
Поскольку человек адаптирован* и может комфортно существовать только в современном биологическом окружении, в природных экосистемах, понятие «экологическое качество среды» подразумевает сохранение экологического равновесия в природе (относительной устойчивости видового состава экосистем и состава сред жизни); которое и обеспечивает здоровье человека.
Необходимо различать цели и способы нормирования и оценки качества среды обитания человека по основным физико-химическим параметрам, с одной стороны, и экологического прогноза будущего изменения состояния экосистемы и здоровья людей в условиях антропогенного пресса — с другой.
Для обшей оценки состояния окружающей среды и определения доли участия отдельных источников в ее загрязнении приме-
‘Адаптация — совокупность морфофизиологических, поведенческих, популяционных и других особенностей данного биологического вида, обеспечивающая возможность специфического образа жизни в определенных условиях внешней среды.
6
няют санитарно-гигиенические и токсикологические нормативы (предельно допустимые концентрации — ПДК — поллютантов, предельно допустимые уровни воздействия — ПДУ). Однако для прогноза результатов влияния антропогенных факторов как на экосистемы, так и на здоровье людей необходимо учитывать также и многие показатели, характеризующие реакцию отдельных организмов и экосистемы в целом на техногенное воздействие.
Реакции живых систем на разнообразные химические и физические факторы и их сочетание характеризуются такими особенностями, как интегральность и кумулятивность множества воздействий, парадоксальные эффекты слабых доз на организмы животных и растений, наличие цепных процессов и отдаленных последствий локальных влияний на различные «этажи» сложно организованных экосистем. Стохастической, трудно предсказуемой, является и реакция организмов людей, живущих в условиях техногенных искусственных экосистем.
В настоящее время общепринято, что одним из непременных условий «устойчивого» социально-экономического развития являются сохранение природной среды обитания человека и ее восстановление после разрушительных воздействий.
Необходимо отметить, что живым системам (организмам, их сообществам и целым экосистемам) свойственна способность к саморегуляции, самоочищению, адаптации. Этим, в частности, определяется и экологический прогноз. Устойчивость экосистем, например, зависит от многообразия видов, входящих в них, от соотношений численности видов, представляющих различные трофические уровни, от репродуктивных свойств организмов и регуляции численности каждой популяции межвидовыми отношениями в сообществе и абиотическими факторами.
Экологическую опасность, или риск, следует оценивать с учетом не только характера и силы антропогенного воздействия, но и биологических свойств реагирующей системы. Соответственно этому имеется две группы методов экологического мониторинга (слежения за состоянием экосистем): физико-химические и биологические (биомониторинг). Каждый из видов мониторинга имеет свои ограничения. Для качественной оценки и прогноза состояния природной среды необходимо их сочетание. Таким образом, физико-химический и биологический мониторинг не исключают, а дополняют друг друга.
Антропогенные загрязнения действуют на живые организмы, и в том числе на человека, в самых различных сочетаниях, комплексно. Их интегральное влияние можно оценить только по реакции живых организмов или целых сообществ. Прогноз действия на человека загрязненной воды, химических добавок в пище или загрязненного воздуха правомочен, если в оценку токсичности входят не только аналитические методы, но и биологическая диагно
7
стика действия среды на животных. Кроме того, многие ксенобиотики (чуждые для биосферы вещества) накапливаются в организме, и в результате длительное воздействие даже малых концентраций этих веществ вызывает патологические изменения в организме. Наконец, известен парадоксальный эффект малых доз многих биологически активных соединений, когда сверхслабые дозы (ниже ПДК) оказывают на организм более сильное действие, чем их средние дозы и концентрации.
Универсальным показателем изменения гомеостаза* тест-орга-низма является состояние стресса при попадании из «чистой» среды в «загрязненную».
Понятие «стресс» весьма различно используется во многих областях науки. Впервые в качестве научного термина оно было введено в медицину Г.Селье в 1936 г. и вскоре проникло в обиходный язык как обозначение неспецифического психического напряжения. Г.Селье (1979) определяет стресс как реакцию на повышенную нагрузку, которая проявляется в синдроме, слагающемся из всех неспецифически вызванных изменений внутри биологической системы.
В биологии под стрессом понимается реакция биологической системы на экстремальные факторы среды (стрессоры), которые мотуг в зависимости от силы, интенсивности, момента и продолжительности воздействия более или менее сильно влиять на систему.
Стресс можно разделить на два различно действующих типа. Эустресс характеризуется физиологическими адаптивными реакциями, которые вызываются в организме биоэнергетическими процессами, когда в критических ситуациях живому существу необходимо приспособиться к изменившимся условиям среды. Дистресс означает патогенные процессы, возникающие, как правило, при постоянных нагрузках или усилиях, которые организм не в состоянии регулировать короткое или длительное время. В какой мере тот или иной стрессор обусловливает эустресс или дистресс, зависит от многочисленных факторов, например от сочетания экзогенных раздражителей и внутреннего состояния организма.
Реакционная способность (норма реакции) организма по отношению к воздействующим стрессорам зависит прежде всего от его генетической конституции. При возникновении стресса большую роль играет также фактор времени, связанный как с развитием чувствительности к стрессу, так и с продолжительностью воздействия какого-либо эффективного стрессора на протяжении различных периодов жизни.
♦Гомеостаз — постоянство внутренней среды организма; гомеостатические механизмы обеспечивают приспособление (адаптацию) к среде и сохранение жизнеспособности организма.
8
Опасность антропогенных стрессоров состоит в том, что биологические системы — будь то организмы, популяции или биоценозы — недостаточно адаптированы к ним. Антропогенные стрессоры создаются с такой скоростью, что в живых системах часто не успевают активизироваться соответствующие адаптационные процессы. Многие антропогенные факторы среды потому и становятся опасными стрессорами, что они отличны по величине, интенсивности, продолжительности и моменту воздействия от той обычно существующей в природе “нормы”, к которой адаптированы биологические системы. В результате они часто влияют на диапазон толерантности*, что нередко приводит к превышению допустимой нагрузки на организмы и распаду биологической системы.
Следует также обратить внимание на то, что в природе на организм воздействует не один стрессор, а целый комплекс нарушающих факторов (комплексное стрессовое воздействие среды). При этом, разумеется, какой-либо отдельный фактор может временно или постоянно доминировать. В связи с этим понятно, что реакции организмов на стрессоры в лабораторном эксперименте не всегда совпадают с наблюдающимися в естественных условиях. Поэтому исследования комбинированного воздействия средовых нагрузок, т.е. комплексного стрессового воздействия среды, становятся в последнее время принципиально важными для установления допустимой нагрузки и стабильности биологических систем в нарушенной среде со многими антропогенными стрессорами.
Стрессовое воздействие среды приводит к отклонению основных параметров организма от оптимального уровня.
В настоящее время оценка степени экологической опасности традиционно осуществляется путем определения в окружающей среде отдельных потенциально вредных веществ или воздействий и сравнения полученных результатов с законодательно установленными для них предельно допустимыми величинами. В то же время такой способ контроля имеет ряд существенных недостатков. Аналитические методы, как правило, трудоемки, не всегда экспрессны, требуют дорогостоящего, иногда дефицитного оборудования и реактивов, а также высококвалифицированного обслуживающего персонала. Но главный их недостаток в том, что эти методы не могут гарантировать достоверной оценки экологической опасности, сколь бы широким не был спектр анализируемых веществ. Ведь важны не сами уровни загрязнений и воздействий, а те биологические эффекты, которые они MOiyr вызвать и о которых не может дать информацию даже самый точный химический или физический анализ.
* Толерантность — терпимость, устойчивость. Способность организма переносить неблагоприятное влияние того или иного фактора среды.
9
Заметим, что используемые в практике экологического и санитарно-гигиенического нормирования показатели (предельно допустимые концентрации — ПДК, предельно допустимые дозы — ПДЦ, предельно допустимые уровни — ПДУ), всегда базирующиеся на токсикологических исследованиях с тестированием отдельных биообъектов, не могут учитывать изменений токсичности загрязнителей за счет эффектов синергизма или антагонизма при сочетанном действии антропогенных факторов. Эти нормативы не отражают зависимости токсического действия загрязнения от физических факторов среды, не учитывают процессы естественных трансформаций веществ в окружающей среде или исчезновения их в ходе детоксикации среды от конкретных загрязнителей. Поэтому наряду с физико-химическими методами необходимо использовать методы биологического контроля и диагностики — биоиндикацию и биотестирование, дающие объективные интегральные оценки качества среды и основания для прогноза состояния экосистем.
Биологические методы контроля качества среды не требуют предварительной идентификации конкретных химических соединений или физических воздействий, они достаточно просты в исполнении, многие экспрессны, дешевы и позволяют вести контроль качества среды в непрерывном режиме. Вместе с тем после выявления общей токсичности образцов почвы или воды для определения ее причин следует применить аналитические методы. Традиционные физико-химические методы позволяют также оценить вклад отдельных предприятий или иных источников загрязнения в интегрированное техногенное воздействие на природу.
Проведение интегральной оценки качества среды предлагается для определения состояния биоресурсов, разработки стратегии рационального использования региона, определения предельно допустимых нагрузок для экосистем региона, решения судьбы районов интенсивного промышленного и сельскохозяйственного использования, загрязненных радионуклидами, и т.п.; выявления зон экологических бедствий; решения вопроса о строительстве, пуске или остановке определенного предприятия; оценки эффективности природоохранных мероприятий, введения очистных сооружений, модернизации производства и др.; применения новых химикатов и оборудования; создания рекреационных и заповедных территорий.
Технический пресс как следствие НТР выдвигает в качестве одной из важнейших природоохранных задач проблему «уравновешивания» результатов антропогенного воздействия на окружающую среду. Соблюдение этого условия — единственный способ выживания для человечества.
Реализация основных принципов устойчивого развития цивилизации в современных условиях возможна лишь при наличии соответствующей информации о состоянии среды обитания в от
10
вет на антропогенное воздействие, собранной в ходе проведения биологического мониторинга. Оценка качества среды является ключевой задачей любых мероприятий в области экологии и рационального природопользования. Сам термин «мониторинг» (от англ, monitoring — контроль) подразумевает проведение мероприятий по непрерывному наблюдению, измерению и оценке состояния окружающей среды. Комплексный подход в проведении биологического мониторинга (сочетание методов биоиндикации и биотестирования, использование объектов разных уровней организации) при систематическом наблюдении позволяет судить о перспективах изменения структуры сообществ, продуктивности популяций и устойчивости экосистем по отношению к антропогенным факторам.
Объектами мониторинга являются биологические системы и факторы, воздействующие на них. При этом желательна одновременная регйстрация антропогенного воздействия на экосистему и биологического отклика на воздействие по всей совокупности показателей живых систем. Необходимо проведение многофакторного анализа с учетом наиболее типичных антропогенных воздействий (например, химических веществ), а также изменений природных факторов среды, уровень которых меняется вследствие антропогенного влияния. В первую очередь учитывается изменение численности видов и видового состава ценозов. Важно фиксировать также возможные изменения в природных популяциях, например нарушения эмбрионального развития (уродств) и симметрии взрослых особей в пределах популяции. Необходимо выявлять быстрый «отклик» организмов или популяций и результаты стойких последствий, так как часть изменений может быть отрегулирована биосистемами.
Примеры применения методов биоиндикации и биотестирования в практике экологической экспертизы природных водоемов и питьевых водоисточников демонстрируют, что пороговые концентрации химических поллютантов, нарушающие жизнедеятельность организмов-биотестов, находятся ниже принятых значений ПДК. Постоянное присутствие поллютантов даже в низких концентрациях приводит к снижению видового разнообразия гидробионтов за счет исчезновения наиболее чувствительных к качеству воды видов. Такие изменения в биоценозах устанавливаются методами биоиндикации — определением индексов и показателей сапроб-ности.
Параллельное исследование показателей здоровья больших групп населения, проживающих на загрязненных территориях и использующих загрязненную воду и сельскохозяйственные продукты, достоверно свидетельствует о снижении (по сравнению со средним по региону) уровня продолжительности жизни, повышении общей и младенческой смертности, а также уровня забо
11
леваемости людей, поражения иммунной системы, печени и других органов.
Основополагающим принципом биологического мониторинга является установление оптимального — контрольного — уровня, любые отклонения от которого свидетельствуют о стрессовом воздействии. Обычно при оценке оптимума по какому-либо одному параметру возникает вопрос о том, будут ли данные условия оптимальными также для других характеристик организма. Однако если исследуемые параметры характеризуют основные свойства организма в целом, то их оптимальный уровень оказывается сходным. Например, столь разные и, казалось бы, совершенно независимые параметры, как асимметрия морфологических признаков, показатели крови, интенсивность потребления кислорода, ритмика роста и частота хромосомных аберраций, могут изменяться синхронно, когда при определенном стрессовом воздействии в действительности изменяется наиболее общая базовая характеристика организма — гомеостаз развития.
ГЛАВА 2
БИОИНДИКАЦИЯ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ
2.1.	Общие принципы использования биоиндикаторов
Состояние биологической системы (организм, популяция, биоценоз) в той или иной степени характеризует воздействие на нее природных или антропогенных факторов и условий среды и может применяться для их оценки.
Биоиндикаторы (от био и лат. indico — указываю, определяю) — организмы, присутствие, количество или особенности развития которых служат показателями естественных процессов, условий или антропогенных изменений среды обитания. Их индикаторная значимость определяется экологической толерантностью биологической системы. В пределах зоны толерантности организм способен поддерживать свой гомеостаз. Любой фактор, если он выходит за пределы «зоны комфорта» для данного организма, является стрессовым. В этом случае организм реагирует ответной реакцией различной интенсивности и длительности, проявление которой зависит от вида и является показателем его индикаторной ценности. Именно ответную реакцию определяют методы биоиндикации. Биологическая система реагирует на воздействие среды в целом, а не только на отдельные факторы, причем амплитуда колебаний физиологической толерантности модифицируется внутренним состоянием системы — условиями питания, возрастом, генетически контролируемой устойчивостью.
Многолетний опыт ученых разных стран По контролю состояния окружающей среды показал преимущества, которыми обладают живые индикаторы:
•	в условиях хронических антропогенных нагрузок могут реагировать даже на относительно слабые воздействия вследствие кумулятивного эффекта; реакции проявляются при накоплении некоторых критических значений суммарных дозовых нагрузок;
•	суммируют влияние всех без исключения биологически важных воздействий и отражают состояние окружающей среды в целом, включая ее загрязнение и другие антропогенные изменения;
•	исключают необходимость регистрации химических и физических параметров, характеризующих состояние окружающей среды;
13
•	фиксируют скорость происходящих изменений;
•	вскрывают тенденции развития природной среды;
•	указывают пути и места скоплений в экологических системах различного рода загрязнений и ядов, возможные пути их попадания в пищу человека;
•	позволяют судить о степени вредности любых синтезируемых человеком веществ для живой природы и для него самого, причем дают возможность контролировать их действие.
Выделяют две формы отклика живых организмов, используемых в целях биоиндикации, — специфическую и неспецифическую. В первом случае происходящие изменения связаны с действием одного какого-либо фактора. При неспецифической биоиндикации различные антропогенные факторы вызывают одинаковые реакции.
В зависимости от типа ответной реакции биоиндикаторы подразделяют на чувствительные и кумулятивные. Чувствительные биоиндикаторы реагируют на стресс значительным отклонением от жизненных норм, а кумулятивные накапливают антропогенное воздействие, значительно превышающее нормальный уровень в природе, без видимых изменений.
\ В качестве биоиндикаторов могут быть использованы представители всех «царств» живой природы. Для биоиндикации не пригодны организмы, поврежденные болезнями, вредителями и паразитами. Идеальный биологический индикатор должен удовлетворять ряду требований:
•	быть типичным для данных условий;
•	иметь высокую численность в исследуемом экотопе;
•	обитать в данном месте в течение ряда лет, что дает возможность проследить динамику загрязнения;
•	находиться в условиях, удобных для отбора проб;
•	давать возможность проводить прямые анализы без предварительного концентрирования проб;
•	характеризоваться положительной корреляцией между концентрацией загрязняющих веществ в организме-индикаторе и объекте исследования;
•	использоваться в естественных условиях его существования;
•	иметь короткий период онтогенеза, чтобы была возможность отслеживания влияния фактора на последующие поколения.
Ответная реакция биоиндикатора на определенное физическое или химическое воздействие должна быть четко выражена, т.е. специфична, легко регистрироваться визуально или с помощью приборов..
При выборе индикатора необходимо принимать во внимание соображения экономии и учитывать характер использования тех или иных организмов. Например, широко распространенные на исследуемой территории и не занесенные в «Красную книгу».
14
На уровне популяции биоиндикация проводится в том случае, если процесс распространения негативных изменений охватывает такое количество особей, при котором заметно сокращается численность популяции, изменяется ее половозрастная структура, сокращается продолжительность жизни, происходит сдвиг фенологических фаз и др.
Экосистемный подход к оценке среды дает возможность ранней диагностики ее изменений. Сигналом тревоги служит разбалансировка продукционно-деструкционных процессов. Диагностическими признаками таких сдвигов являются, например, накопление органического вещества, заиление, зарастание водоемов, усиленное развитие микроорганизмов.
В качестве объектов для биоиндикации применяются разнообразные организмы — бактерии, водоросли, высшие растения, беспозвоночные животные, млекопитающие. Для гарантированного выявления присутствия в природных средах токсического агента неизвестного химического состава, как правило, используется набор объектов, представляющих различные группы сообщества. С введением каждого дополнительного объекта эффективность схемы испытаний повышается, однако нет смысла бесконечно расширять ассортимент обязательных объектов для использования в такой оценке.
Для биоиндикации необходимо выбирать наиболее чувствительные сообщества, характеризующиеся максимальными скоростью отклика и выраженностью параметров. Например, в водных экосистемах наиболее чувствительными являются планктонные сообщества, которые быстро реагируют на изменение среды благодаря короткому жизненному циклу и высокой скорости воспроизводства. Бентосные сообщества, где организмы имеют достаточно длинный жизненный цикл, более консервативны: перестройки происходят в них при длительном хроническом загрязнении, приводящем к необратимости процессов.
К методам биоиндикации, которые можно применять при исследовании экосистемы, относится выявление в изучаемой зоне редких и исчезающих видов. Список таких организмов, по сути, является набором индикаторных видов, наиболее чувствительных к антропогенному воздействию.
2.2.	Особенности использования растений в качестве биоиндикаторов
С помощью растений можно проводить биоиндикацию всех природных сред. Индикаторные растения используются при оценке механического и кислотного состава почв, их плодородия, увлажнения и засоления, степени минерализации грунтовых вод и степени загрязнения атмосферного воздуха газообразными соеди
15
нениями, а также при выявлении трофических свойств водоемов и степени их загрязнения поллютантами. Например, на содержание в почве свинца указывают виды овсяницы (Festuca ovina и др.), полевицы (Agrostis tenuis и др.); цинка — виды фиалки (Viola tricolor и др.), ярутки (Tlaspi alpestre и др.); меди и кобальта — смолевки (Silene vulgaris и др.), многие злаки и мхи.
Чувствительные фитоиндикаторы указывают на присутствие загрязняющего вещества в воздухе или почве ранними морфологическими реакциями — изменением окраски листьев (появление хлорозов; желтая, бурая или бронзовая окраска), различной формы некрозами, преждевременным увяданием и опаданием листвы. У многолетних растений загрязняющие вещества вызывают изменение размеров, формы, количества органов, направления роста побегов или изменение плодовитости. Подобные реакции обычно неспецифичны.
Некоторые естественные факторы могут вызывать симптомы, сходные с антропогенными нарушениями. Так, например, хлороз листьев может быть вызван недостатком железа в почве или ранним заморозком. Поэтому при определении морфологических изменений у растений необходимо учитывать возможность действия других повреждающих факторов.
Индикаторы другого типа представляют собой растения-аккумуляторы. Они накапливают в своих тканях загрязняющее вещество или вредные продукты метаболизма, образуемые под действием загрязняющих веществ, без видимых изменений. При превышении порога токсичности ядовитого вещества для данного вида проявляются различные ответные реакции, выражающиеся в изменении скорости роста и длительности фенологических фаз, биометрических показателей и, в конечном счете, снижении продуктивности.
Получить точные количественные данные о динамике и величине стрессовых воздействий на основе морфологических изменений невозможно, но можно довольно точно определить величину потерь продукции и, имея график зависимости «доза — эффект», рассчитать величину стрессового воздействия.
Б. В. Виноградов классифицировал индикаторные признаки растений как флористические, физиологические, морфологические и фитоценотические. Флористическими признаками являются различия состава растительности изучаемых участков, сформировавшиеся вследствие определенных экологических условий. Индикаторное значение имеет как присутствие, так и отсутствие вида. К физиологическим признакам относятся особенности обмена веществ растений, к анатомо-морфологическим признакам — особенности внутреннего и внешнего строения, различного рода аномалии развития и новообразования, к фитоценотическим признакам — особенности структуры растительного покрова: обилие
16
и рассеянность видов растений, ярусность, мозаичность, степень сомкнутости.
Очень часто в целях биоиндикации используются различные аномалии роста и развития растения — отклонения от общих закономерностей. Ученые систематизировали их в три основные группы, связанные: (1) с торможением или стимулированием нормального роста (карликовость и гигантизм); (2) с деформациями стеблей, листьев, корней, плодов, цветков и соцветий; (3) с возникновением новообразований (к этой группе аномалий роста относятся также опухоли).
Гигантизм и карликовость многие исследователи считают уродствами. Например, избыток в почве меди вдвое уменьшает размеры калифорнийского мака, а избыток свинца приводит к карликовости смолевки.
В целях биоиндикации представляют интерес следующие де-формации'растений:
•	фасциация — лентовидное уплощение и сращение стеблей, корней и цветоносов;
•	махровость цветков, в которых тычинки превращаются в лепестки;
•	пролификация — прорастание цветков и соцветий;
•	асцидия — воронковидные, чашевидные и трубчатые листья у растений с пластинчатыми листьями;
•	редукция — обратное развитие органов растений, вырождение;
•	нитевидностъ — нитчатая форма листовой пластинки;
•	филлодий тычинок — превращение их в плоское листовидное образование.
Биомониторинг может осуществляться путем наблюдений за отдельными растениями-индикаторами, популяцией определенного вида и состоянием фитоценоза в целом. На уровне вида обычно производят специфическую индикацию какого-то одного загрязнителя, а на уровне популяции или фитоценоза — общего состояния природной среды.
2.3.	Особенности использования животных в качестве биоиндикаторов
Позвоночные животные также служат хорошими индикаторами состояния среды благодаря следующим особенностям:
•	являясь консументами, они находятся на разных трофических уровнях экосистем и аккумулируют через пищевые цепи загрязняющие вещества;
•	обладают активным обменом веществ, что способствует быстрому проявлению воздействия негативных факторов среды на организм;
.	, санитарною
ВопГУ 1
f	Л	—г.	*
•	имеют хорошо дифференцированные ткани и органы, которые обладают разной способностью к накоплению токсических веществ и неоднозначностью физиологического отклика, что позволяет исследователю иметь широкий набор тестов на уровне тканей, органов и функций;
•	сложные приспособления животных к условиям среды и четкие поведенческие реакции наиболее чувствительны к антропогенным изменениям, что дает возможность непосредственно наблюдать и анализировать быстрые отклики на оказываемое воздействие;
•	животных с коротким циклом развития и многочисленным потомством можно использовать для проведения ряда длительных наблюдений и прослеживать воздействие фактора на последующие поколения; для долгоживущих животных можно выбрать особо чувствительные тесты в соответствии с особо уязвимыми этапами онтогенеза.
Основное преимущество использования позвоночных животных в качестве биоиндикаторов заключается в их физиологической близости к человеку. Основные недостатки связаны со сложностью их обнаружения в природе, поимки, определения вида, а также с длительностью морфо-анатомических наблюдений. Кроме того, эксперименты с животными зачастую дороги, требуют многократной повторяемости для получения статистически достоверных выводов.
Оценка и прогнозирование состояния природной среды с привлечением позвоночных животных проводятся на всех уровнях их организации. На организменном уровне с помощью сравнительного анализа оцениваются морфо-анатомические, поведенческие и физиолого-биохимические показатели.
Морфо-анатомические показатели описывают особенности внешнего и внутреннего строений животных и их изменение под воздействием определенных факторов (депигментация, изменение покровов, структуры тканей и расположения органов, возникновение уродств, опухолей и других патологических проявлений).
Поведенческие и физиолого-биохимические параметры особенно чувствительны к изменению внешней среды. Токсиканты, проникая в кости или кровь позвоночных животных, сразу же воздействуют на функции, обеспечивающие жизнедеятельность. Даже при узкоспецифичном влиянии токсиканта на определенную функцию ее сдвиги отражаются на состоянии всего организма вследствие взаимосвязанности процессов жизнедеятельности. Достаточно отчетливо присутствие токсикантов проявляется в нарушении ритма дыхания, сердечных сокращений, скорости пищеварения, ритмике выделений, продолжительности циклов размножения.
18 •
Для того чтобы иметь возможность сравнивать материал, собранный разными исследователями в различных районах, набор видов-индикаторов должен быть един и невелик. Вот некоторые критерии пригодности различных видов млекопитающих для био-индикационных исследований:
•	принадлежность к разным звеньям трофической цепи — растительноядным, насекомоядным, хищным млекопитающим;
•	оседлость или отсутствие больших миграций;
•	широкий ареал распространения (сравнительно высокая эв-ритопность), т.е. этот критерий исключает использование в качестве тест-индикаторов эндемиков;
•	принадлежность к естественным сообществам: критерий исключает синантропные виды, питающиеся вблизи жилиша человека и неадекватно характеризующие микроэлементный состав загрязнения данного региона;
•	численность вида должна обеспечивать достаточный материал для анализа;
•	простота и доступность методов добывания видов.
Анализируя по данным критериям представителей всех отрядов млекопитающих, встречающихся на территории стран СНГ, можно остановиться на семи видах: обыкновенная бурозубка (Sores areneus), европейский крот (Talpa еигораеа), алтайский крот (Talpa altaica), бурый медведь (Ursus arctos), лось (Alces alces), рыжая полевка (Clethrionomysglareolus), красная полевка (Clethrionomys rubilus).
2.4.	Особенности использования микроорганизмов в качестве биоиндикаторов
Микроорганизмы — наиболее быстро реагирующие на изменение окружающей среды биоиндикаторы. Их развитие и активность находятся в прямой связи с составом органических и неорганических веществ в среде, так как микроорганизмы способны разрушать соединения естественного и антропогенного происхождений. На этом основаны принципы биоиндикации с использовав нием микроорганизмов. Необходимо иметь сведения о составе, количестве и функциональной активности последних.
При прямом микроскопировании, например воды, количество обнаруживаемых микроорганизмов оказывается небольшим, поэтому для изучения морфологического разнообразия и оценок их общего числа в единице объема проводят концентрирование пробы. Для фильтрации воды используют фильтры Зейтца или иной конструкции с размером пор 0,35; 0,5; 0,23; 0,3; 0,4 мкм. Объем фильтруемой воды может быть от 10 до 20 мл в зависимости от типа водоема. Для подсчета численности микроорганизмов фильтр прокрашивают, переносят на предметное стекло в каплю иммер
19
сионного масла и микроскопируют с перемещением сетчатого микрометра. Просчитывается 20 полей зрения; в каждом поле зрения должно быть не менее 50 микробов.
Число колониеобразующих клеток бактерий в 1 мл воды (N) рассчитывают по формуле
где К= S/S\ (S — площадь фильтра, мкм2; 5, — площадь, на которой просчитываются клетки, мкм2); п — среднее число бактерий в одном поле зрения; V — объем профильтрованной воды, мл. Для определения биомассы бактерий необходимо определить размер клеток с помощью микрометра.
Выявление микроорганизмов и их учет можно произвести путем высева проб в жидкие и агаризованные питательные среды. Для учета сапрофитов используют мясопептонный агар, олиготрофных бактерий выращивают на агаризованной воде из исследуемого водоема.
Чаще всего для оценки качества вод используют показатель микробного числа — это число клеток аэробных сапрофитных организмов в 1 мл воды. В водопроводной воде согласно ГОСТ микробное число не должно превышать 100. В чистых водоемах число сапрофитов может исчисляться десятками и сотнями, а в загрязненных и грязных водоемах этот показатель достигает сотен тысяч и миллионов.
Помимо микробного числа используются данные по видовому составу микроорганизмов. В полисапробной зоне наблюдается массовое развитие нитчатых бактерий. В загрязненной фекалиями воде высок коли-индекс, характеризующий наличие в среде энтеробактерий Escherichia coli — условных патогенов и постоянных обитателей кишечника человека и животного. Определение коли-ин-декса ведется в среде Эндо (фуксин-сульфатный агар) подсчетом колоний E.coli. Иногда делают пересчет, определяя коли-титр — наименьший объем воды (в мл), содержащий одну кишечную палочку. Коли-титр - 1000/коли-индекс.
2.5.	Симбиологические методы в биоиндикации
Симбиоз широко распространен в природе, а симбиотические ассоциации часто играют ключевую роль в поддержании нормального функционирования наземных, пресноводных и морских экосистем. Симбиоз грибов и азотфиксирующих бактерий с высшими растениями и водорослей с грибами обеспечил процветание этих ассоциаций в наземной среде. Лишайники, симбиотическая ассоциация водорослей и грибов, очень чувствительны к качеству среды
20
и уже давно используются как традиционные биомаркеры состояния атмосферного воздуха (см. гл. 4). Мадрепоровые кораллы (скле-рактинии) — симбиоз одноклеточных водорослей зооксантелл с кишечнополостными животными, определяющий важную ландшафтообразующую роль этой ассоциации в тропических морях. Все более значительной признается роль симбиотических микроорганизмов в трофике практически всех видов организмов. Прямо или косвенно регулируя численность своих хозяев, симбионты оказывают существенное влияние на их динамику численности и структуру популяции. Биоразнообразие симбионтов (паразитов, комменсалов, мутуалистов), как правило, значительно превышает разнообразие их хозяев. Так, на Большом Барьерном рифе (коралловая постройка) водится около 2 000 видов рыб, а их парази-тофауна представлена более чем 20000 видов; три вида австралийских промысловых креветок в качестве симбионтов имеют 38 видов организмов из разных систематических групп.
Помимо уточнения оценки биоразнообразия по числу видов учет симбионтов позволяет получать достоверную информацию о качестве среды, так как степень интенсивности инвазии (относительное количество хозяев, имеющих симбионтов) и экстенсивность инвазии (среднее количество симбионтов на хозяине) напрямую зависят от условий, в которых находится популяция хозяев. Многие симбионты чувствительны к изменениям внешней среды, в частности симбионты водных организмов — к загрязнению и опреснению, а симбионты наземных организмов — к радионуклидам. При оценке разнообразия фауны симбионтов широко используют статистические методы. Учет симбиотических, в том числе и паразитических, организмов, а также исследование состояния симбиотических ассоциаций позволяют более точно оценить биоразнообразие и характер динамических процессов в экосистемах и могут быть рекомендованы в качестве важных элементов экодиагностических исследований.
2.6.	Области применения биоиндикаторов „
2.6.1.	Оценка качества воздуха
Как известно, воздух представляет собой смесь определенных газов, повсюду на Земле представленных приблизительно в равных объемных долях. Загрязнение воздуха имеет место в том случае, если в смеси имеются вещества в таких количествах и так долго, что создают опасность для человека, животных, растений или имущества. От загрязнения воздуха страдают все живые организмы, но особенно растения. По этой причине растения, в том числе низшие, наиболее пригодны для обнаружения начального
21
изменения состава воздуха. Соответствующие индексы дают количественное представление о токсичном эффекте загрязняющих воздух веществ.
Лишайники являются симбиотическими организмами. Многими исследователями показана их пригодность для целей биоиндикации. Они обладают весьма специфическими свойствами, так как реагируют на изменение состава атмосферы, обладают отличной от других организмов биохимией, широко распространены по разным типам субстратов, начиная со скал и кончая корой и листьями деревьев, удобны для экспозиции в загрязненных районах.
Выделяют четыре основные экологические группы лишайников: эпифитные — растущие на коре деревьев и кустарников; эпи-ксильные — растущие на обнаженной древесине; эпигейные — на почве; эпилитные — на камнях. Из них наиболее чувствительны к загрязнению воздуха эпифитные виды. С помощью лишайников можно получать вполне достоверные данные об уровне загрязнения воздуха. При этом можно выделить группу химических соединений и элементов, к действию которых лишайники обладают сверхповышенной чувствительностью: оксиды серы и азота, фторо- и хлороводород, а также тяжелые металлы. Многие лишайники погибают при невысоких уровнях загрязнения атмосферы этими веществами. Процедура определения качества воздуха с помощью лишайников носит название лихеноиндикации (см. гл. 4).
Оценку чистоты воздуха можно проводить с помощью высших растений. Например, голосеменные — отличные индикаторы чистоты атмосферы. Возможно также изучение мутаций в волосках тычиночных нитей традесканции. Французские ученые подметили, что при увеличении в воздухе окиси углерода и окислов азота, выбрасываемых двигателями внутреннего сгорания, окраска ее тычиночных нитей меняется от синей к розовой (см. гл. 4). Последствия нарушений в индивидуальном развитии растений могут быть выявлены также по частоте встречаемости морфологических отклонений (фенодевиантов), величине показателей флуктуирующей асимметрии (отклонение от совершенной билатеральной и радиальной симметрии), методом анализа сложноорганизованных комплексных структур (фрактал-анализ). Уровни любых отклонений от нормы оказываются минимальными лишь при оптимальных условиях и возрастают при любых стрессирующих воздействиях.
2.6.2.	Оценка качества воды
Прежде всего надо помнить, что биологическое исследование изучает не воду, а водоем в целом как единую экосистему. Н. С. Строганов определил водную токсикологию как науку о ток
22
сичности среды обитания гидробионтов на всех уровнях организации живого, которая изучает все реакции гидробионтов на загрязнение любого происхождения.
Для того чтобы оценить уровень токсического загрязнения водного объекта промышленными или иными стоками, нужно ответить на вопросы: токсична ли исходная вода, поступающая в водоем со сточными водами; какова степень ее токсичности; на ка-
ком расстоянии от источника загрязнения токсичность снижается до минимального значения. В качестве эквивалента было использовано разведение сточной жидкости, при котором еще наблюдается повреждающий эффект по примененному биотесту. Ориентируясь как на основной показатель токсичности химических веществ для гидробионтов на величину медиальной летальной концентрации (LC50), принятую в общей (медицинской) токсикологии для теплокровных животных, Н. С. Строганов предложил количественное определение токсичности как величины, обратной медиальной летальной концентрации, устанавливаемой в 48-ча-
совом опыте:
1
LC48 '
Т =
Развивая этот подход, Л. П. Брагинский предложил определение токсичности природных вод как величины обратной разведению исследуемой воды, при котором проявляется однозначный токсический ответ по избранному (желательно, стандартизован-
ному) биотесту: Тп - —, где Тп — токсичность, d — коэффициент d
разведения. Например, если </=1:1; 1:2; 1:5; 1:10; 1:25; 1:50; 1:100; 1:500 и т.д., то токсичность соответственно выражается величинами 1; 2; 5; 10; 25; 50; 100; 500 и т.д, т.е. целыми числами,
удобными для сравнения. Величину, обратную разведению, назвали баллом интегральной токсичности — БИТ.
Для биологической индикации качества вод могут быть исполь-
зованы практически все группы организмов, населяющие водоемы: планктонные и бентосные беспозвоночные, простейшие, водоросли, макрофиты, бактерии и рыбы. Каждая из них, выступая в роли биологического индикатора, имеет свои преимущества и недостатки, которые определяют границы ее использования при решении задач биоиндикации, так как все эти группы играют ведущую роль в общем круговороте веществ в водоеме. Организмы, которые обычно используют в качестве биоиндикаторов, ответственны за самоочищение водоема, участвуют в создании первичной продукции, осуществляют трансформацию веществ и энергии в водных экосистемах. Всякое заключение по результатам биологического исследования строится на основании совокупности всех полученных данных, а не на основании единичных находок индикаторных организмов. Как при выполнении исследова
23
ния, так и при оценке полученных результатов необходимо иметь в виду возможность случайных, местных загрязнений в точке наблюдения. Например, разлагающиеся растительные остатки, труп лягушки или рыбы могут вызывать местные изменения в характере населения водоема. ...
Наиболее разработанной оценкой степени загрязненности вод по индикаторным организмам является система сапробности.
Метод учитывает относительную частоту встречаемости гидробионтов h (от 1 до 9 или от единичных экземпляров, например инфузорий, в поле зрения микроскопа и до очень частой встречаемости, когда их много в каждом поле зрения) и их индикационную значимость 5. Для статистической достоверности результатов необходимо, чтобы в пробе содержалось не менее 12 видов инди-12
каторных организмов одной зоны сапробности с ]Г/г; >30. Ин-»=1
дикаторные значимости 5 д ля соответствующих зон сапробности табулированы для многих организмов. По рассчитанной величине 5 можно судить о состоянии водоема. Заключение о степени загрязненности воды дают обычно по системе баллов от одного до шести. Методика приведена в гл. 4, расчет индекса сапробности — в подразделе 2.7.
Качество воды можно оценить с помощью биотического индекса по системе Ф.Вудивиса. Техника отбора проб и методика проведения анализа приведены в гл. 4, расчет биотического индекса в разделе 2.7.
Высшие водные растения среди вышеуказанных групп организмов-индикаторов являются наименее изученным звеном, хотя имеют ряд преимуществ. Они представляют собой видимый невооруженным глазом и поэтому весьма удобный для наблюдения объект, а также дают возможность при рекогносцировочном гидробиологическом осмотре водоемов в первом приближении визуально оценить их экологическое состояние. Макрофиты позволяют определить трофические свойства воды, а иногда и специфику ее химизма, что имеет существенное значение при биоиндикации чистых вод (см. гл. 4).
2.6.3.	Диагностика почв
В основе принципа биологической диагностики почв лежит представление о том, что почва как среда обитания составляет единую систему с населяющими ее популяциями разных организмов.
Лучше других разработаны ботанические методы фитоиндикации и диагностики почв. Например, путем анализа состава и структуры растительных сообществ, распространения растений-инди
24
каторов или определенных индикационных признаков у отдельных видов растений можно установить тип почвы, степень ее гидроморфизма, развитие процессов заболачивания, соленакопления и т.д. Среди растений обнаружены индикаторы на тот или иной механический и химический состав почв, степень обогащенности питательными элементами, на кислотность или щелочность, глубину протаивания мерзлотных почв или уровень грунтовых вод (см. гл. 4).
Теоретической предпосылкой применения почвенно-зоологического метода для целей диагностики почв является сформулированное М. С. Гиляровым в 1949 г. представление об «экологическом стандарте» вида — потребности вида в определенном комплексе условий среды. Каждый вид в пределах своего ареала встречается только в тех местообитаниях, которые обеспечивают полный комплекс необходимых для проявления жизнедеятельности условий. Амплитуда варьирования отдельных факторов среды характеризует экологическую пластичность вида. Эврибионты мало пригодны для индикационных целей, тогда как стенобионты служат хорошими индикаторами определенных условий среды и свойств субстрата. Это положение представляет собой общий теоретический принцип в биологической диагностике. Однако использование для индикации одного вида не дает полной уверенности в правильности выводов (здесь имеет место «правило смены местообитаний» и как следствие смена экологических характеристик вида). Лучше исследовать весь комплекс организмов, из которых одни могут быть индикаторами на влажность, другие — на температуру, третьи — на химический или механический состав. Чем больше общих видов почвенных животных встречается на сравниваемых участках, тем с большей долей вероятности можно судить о сходстве их режимов, а следовательно, о единстве почвообразовательного процесса. Менее других полезны микроскопические формы — простейшие и микроартроподы (клещи, ногохвостки). Их представители отличаются космополитизмом в силу того, что почва для них не выступает как единая среда обитания: они живут в системе пор, капилляров, полостей, которые можно найти в любой почве. Из микроартропод наиболее хорошо изучены индикаторные свойства панцирных клещей. Состав их комплексов сообществ зависит не только от почвенных условий, но и от характера и флористического состава растительности, поэтому данный объект перспективно использовать для индикации повреждающих воздействий на почву.
Особенно ценны и удобны для индикационных работ сообщества крупных беспозвоночных (дождевые черви, многоножки, личинки насекомых). Так, стафилиниды рода Bledius и чернотелки рода Belopus показательны для солончаково-солонцовых почв, многоножки-кивсяки, некоторые мокрецы и легочные
25
моллюски служат индикаторами содержания в почве извести. Дождевые черви Octolasium lacteum и некоторые виды проволочников являются показателями высокого содержания кальция в грунтовых водах.
Интерес представляет почвенно-альгологическая диагностика, в основе которой лежит положение о том, что зональности почв и растительности соответствует зональность водорослевых группировок. Она проявляется в общем видовом составе и комплексе доминантных видов водорослей, наличии специфических видов, характере распространения по почвенному профилю, преобладании определенных жизненных форм.
Микробиологическая и биохимическая характеристика почв — наиболее сложные разделы почвенной биодиагностики. Микроорганизмы — очень чуткие индикаторы, резко реагирующие на различные изменения в среде. Отсюда необычайная динамичность микробиологических показателей. Почва характеризуется не только составом и численностью разных групп биоты, но и их суммарной активностью, а также активностью биохимических процессов, обусловленных наличием определенного пула ферментов, выделенных в результате жизнедеятельности растений, животных и микроорганизмов, а также аккумулированных почвой после разрушения клеток. Показателями биологической активности почв, применяемых в биоиндикации, могут служить количественные характеристики численности и биомассы разных групп почвенной биоты, их общая продуктивность, некоторые энергетические данные, активность основных процессов, связанных с круговоротом элементов, ферментативная активность почв, а также количество и скорость накопления некоторых продуктов жизнедеятельности почвообитающих организмов.
Для определения размеров микробной биомассы и продуктивности используют не только прямые подсчеты числа клеток, но и косвенные методы — биохимические и физиологические. Например, биомассу водорослей предложено определять по количеству хлорофилла (см. гл. 4), бактерий — по специфической для прокариот мурамовой кислоте, грибов — по хитину, который входит в состав их клеточной стенки. Микробную активность в почве определяют также по уровню АТФ и полифосфатов, содержанию ДНК, РНК и аминокислот.
Наиболее общими являются методы, позволяющие оценить суммарные биологические процессы по исходным или конечным продуктам: методы определения дыхания почвы по поглощению О2 или выделению СО2; учет активности азотфиксации по восстановлению ацетилена; микрокалориметрические измерения для установления уровня термостойкости; аппликационные методы с применением специальных материалов (целлюлозы, хроматографической бумаги, целлофана) для оценки скорости и степени их
26
разложения и накопления продуктов метаболизма, например аминокислот. Особую группу составляют методы определения потенциальной активности отдельных ферментов в почвах (именно активности, а не количественного содержания) (см. гл. 4).
2.7.	Биологические индексы и коэффициенты, используемые при индикационных исследованиях
Для практических целей следует знать, насколько надежен и эффективен тот или иной индикатор, поэтому было предложено характеризовать индикаторы по двум показателям — достоверности и значимости.
Достоверность — это степень сопряженности индикатора с объектом индикации. Абсолютно достоверным считается индикатор, которому объект индикации соответствует в 100 % случаев. Для расчета показателя достоверности берут определенное число эталонных участков (или площадок), где обязательно имеется индикатор. Среди них есть такие, где индикатор встречается вместе с объектом индикации. Процентное соотношение этих участков и участков с индикатором, но без объекта индикации служит количественным показателем достоверности индикатора. Например, если из 100 обследованных участков с произрастанием растения-индикатора неглубокого залегания грунтовых вод (1,5—5 м) вода была обнаружена только на 95 участках, а на пяти нет, то достоверность индикатора составляет 95/5 =19. Это довольно большой показатель. Если сопряженность превышает 90 %, а показатель достоверности больше 9, то индикатор считается надежным. Удовлетворительным индикатор будет в том случае, если сопряженность равна 75—90 %, а показатель достоверности находится в пределах 3—9. Сомнительным индикатор считается, когда сопряженность составляет 60—75 %, а показатель достоверности равен 1,5—3. Когда сопряженность менее 60 %, а показатель достоверности менее 1,5, индикация невозможна.
Показатель достоверности еще не дает полного представления о практической значимости того или иного индикатора. Так, если растение является абсолютным индикатором, но редко встречается в природе (например, вид занесен в Красную книгу), то его практическое значение ограничено. Вот почему для индикаторов введен показатель значимости, который дает представление о том, насколько часто индикатор встречается вместе с объектом индикации. За 100 % принимается количество эталонных участков с объектом индикации. Значимость выражается отношением (в %) количества эталонных участков, где объект индикации присут
27
ствует вместе с индикатором, к общему количеству эталонных участков с объектом индикации. Например, объект индикации обнаружен на 60 эталонных участках, причем на 42 участках он присутствует вместе с индикатором; следовательно, значимость 42
данного индикатора составляет —100% = 70%.
60
Коэффициенты достоверности и значимости являются важными характеристиками индикаторных свойств растения. Если они достаточно высокие, можно начинать фитоиндикацию. Практическое применение см. в гл. 4.
При оценке уровня загрязнения биогеоценозов обычно используют различные критерии, самыми распространенными из которых являются характеристики видового состава, обилия видов и жизненное состояние особей, входящих в сообщество. Первые два критерия тесно связаны между собой, поскольку сравнение сообществ только по составу имеющихся видов без указания на их обилие представляет приблизительную, рекогносцировочную оценку. Для объективного сравнения двух исследуемых площадок в одном биотопе используются различные индексы.
При биоиндикации загрязнения атмосферного воздуха или почвенного покрова применяют коэффициент Жаккара, определяемый как число видов, общих для двух площадок, выраженное в процентах от общего числа видов:
Kj=--------100%,
а + о-с
где а — число видов на первой площадке; b — число видов на второй площадке; с — число общих видов для этих двух площадок (см. применение данного индекса в гл. 4).
Обобщением коэффициента Жаккара является индекс биотической дисперсии Коха, служащий для оценки общей степени сходства некоторого числа видовых списков. Если п списков включают соответственно S2,..., S„ видов и общее число отличных видов равно S, то индекс Коха
7*=Т~^100%’
(т-5)
где т = 5] + S2 + ... + S„. При л = 2 индекс Коха совпадает с коэффициентом Жаккара.
Другой широко используемый коэффициент общности, коэффициент Серенсена Ks, равен числу видов, общих для двух участков с, выраженному в процентах от среднего числа видов на участках а и Ь:
. 28
2с ks =—100%. a + b
Этот индекс можно применять для регистрации изменений в биогеоценозе за определенный промежуток времени. При этом требуется знать число видов в момент (день, год) начала наблюдений и в момент (день, год), взятый для сравнения. Методика приведена в гл. 4.
Если оценка изменения степени проективного покрытия важнее, чем оценка изменения числа видов, применяют несколько иной коэффициент общности. При этом изменения степени проективного покрытия учитываются с помощью процентного сходства (ПС):
nc = 2£min(x, х)|00Я|
XU-и)
где min (х,  уд — наименьшая степень покрытия вида, общего для описаний х и у.
Важным требованием при проведении сравнительных оценок биоценозов является использование статистических критериев, поэтому вопрос о числе повторностей сравниваемых площадок или о величине площадей должен быть решен с помощью статистических критериев.
При лихеноиндикации атмосферного воздуха используются индексы, в которых учитывается степень проективного покрытия лишайниками и либо общее число видов на площадке, либо среднее число видов, находящихся на всех сравниваемых площадках. Индекс полеотолерантности вида (ИП) соответствует определенной концентрации газообразных соединений, загрязняющих атмосферу, и по нему можно составить карту среднегодовых концентраций загрязняющих веществ на определенной территории:
ип =	,
<=1 сп	’
где с„ —общее проективное покрытие; а, — класс полеотолерантности /-го вида, определяемый по справочной таблице в соответствии с видом лишайника; с, — проективное покрытие /-го вида. Практическое применение индекса приведено в гл. 4.
Более простым для использования является индекс чистоты атмосферы (ИЧА), не требующий специальных таблиц и сложных расчетов:
ИЧА = £ Qtf, r=l
29
где Qj — коэффициент токсикотолерантности вида, равный среднему числу видов, сопровождающих данный вид i по всем пунктам; f — степень проективного покрытия.
Недостаток этих индексов в том, что при их использовании необходимо учитывать площадь исследования, поскольку индекс в значительной степени (хотя и косвенно) зависит от ее величины.
Для оценки уровней загрязнения биогеоценозов могут быть использованы различные индексы видового разнообразия. Максимальным индекс будет в случае, когда каждая особь принадлежит к отдельному виду, а минимальным — когда все особи относятся к одному виду. Преимущество имеют те индексы разнообразия, которые не зависят от размеров пробы, показывают относительное значение видов в сообществе и являются безразмерными. Наиболее широко в биомониторинге используют индекс Шеннона-Винера — индекс Н. Разнообразие И по Шеннону—Винеру математически характеризует два параметра ценоза — число имеющихся видов и равномерность распределения их популяций (численность особей или их количественную долю):
s
i=l
,	1	1
где hj = р/in —.
Pi
В выборке истинное значение р/ неизвестно, поэтому в каче-
5 стве оценки берется n^N, отсюда // =	л,,
/=1
где S — число видов; л,- — количество (численность или масса особей) i-го вида; N — общее количество видов; р, — относительная частота встречаемости /-го вида; й, — частичная мера информации i-го вида или структура доминирования /-го вида.
Величина индекса разнообразия Шеннона—Винера обычно укладывается в интервале от 1,5 до 3,5 и очень редко превышает 4,5. Применение этого индекса для экологического анализа водоема показало, что его величина резко падает в месте сброса сточных вод независимо от того, оценивается ли он на уровне видов, родов, отрядов или классов гидробионтов на разных трофических уровнях. Это значительно расширяет возможности применения данного индекса, причем не только для оценки разнообразия гидробионтов, но и для оценки степени загрязнения, например, городских экосистем.
Индекс видового разнообразия Маргалефа d был предложен для оценки загрязнения водоемов, которые обычно характеризуются уменьшением биоразнообразия: d = (S -1) In Л",
30
где 5 — количество видов; In N — натуральный логарифм количества особей.
Коэффициент принимает максимальное значение, если все особи принадлежат к разным видам (5 — Л), и равен нулю, когда все особи принадлежат к одному виду.
Проточные водоемы могут быть оценены с помощью биотического индекса, разработанного в Англии и впервые опробованного на реке Трент. Определение биотического индекса ведется по рабочей шкале, в которой использована наиболее часто встречаемая последовательность исчезновения бентосных беспозвоночных по мере увеличения загрязнения. Метод Вудивиса имеет многочисленных сторонников, которые, однако, признают ряд его недостатков: довольно общий и часто упрощенный с плохой репрезентативностью отбор проб; часто не принимающиеся во внимание трудности идентификации; недостатки стандартной таблицы для расчета" индекса, а именно — различная чувствительность к загрязнению в некоторых группах выделенных видов, недостаточное таксономическое разнообразие.
Обобщенный индекс биологического качества имеет ряд преимуществ: дифференцированный отбор проб с идентификацией разных зон, стандартная таблица благодаря коррекциям и уточнениям, внесенным в списки таксонов и в классификацию, более удобна в пользовании. Вместе с тем рабочая нагрузка, обусловленная большим разнообразием проб, недостаток классов таксономического разнообразия в стандартной таблице делают использование этого индекса сомнительным. Параллельно с обобщенным индексом биологического качества был предложен индекс потенциального биологического качества, удобный для исследования больших глубин. Более совершенным является биологический индекс общего качества, отличающийся тем, что усовершенствованный отбор проб дает мозаичную картину населения зоны; в списке из 135 таксонов 38 являются индикаторами.
Общий уровень загрязнения часто оценивают по индексу сап-робности Пантле и Букка:
Ё(ЗД)
S=-i=l----,
где S — индекс значимости вида; h — частота встречаемости организмов.
Загрязнение приводит не только к снижению видового разнообразия, но и к увеличению доминирования определенных видов. При этом обилие свойственно небольшому числу видов, которые можно оценить индексом неоднородности Симпсона-.
31
D = Y-—±-^----L
где л, — число особей z-го вида; N— общее число особей. По мере увеличения D разнообразие уменьшается, поэтому используют его обратную величину X/D. Величина индекса в сильной степени зависит от присутствия в пробе самых обильных видов, но в слабой — от видового разнообразия.
При оценке водоемов, загрязненных органическими соединениями, может использоваться олигохетный индекс, или индекс Гуднайта и Уитлея. В собранной пробе подсчитывается общее количество ОрГаНИЗМОВ И ОТДеЛЬНО ЧИСЛО ОЛИГОХеТ: (Аолигохет/^обшая) ' ЮО, где N — численность (экз./м2).
Значение коэффициента увеличивается по мере ухудшения качества воды. Так, высокую концентрацию загрязнения характеризует олигохетный индекс > 80 %; сомнительным загрязнение считается при индексе 60—80%; состояние водной среды хорошее, когда индекс < 60 %.
Помимо олигохет в бентосе континентальных водоемов широко представлены личинки комаров-звонцов, принадлежащие к трем подсемействам: Chironominae, Orphocladinae и Tanypodinae. Орфокладины обитают в основном в чистых водах, таниподины — в загрязненных, хирономиды выдерживают относительно невысокие степени загрязнения. Таким образом, по соотношению численности представителей этих подсемейств можно судить о качестве воды. Е. В. Балушкина предложила индекс К, который может служить для этой цели:
К _ dr + 0,5а
^Ог
где dT = NT + 10, dCh = NCh + 10, dOr = NOr + 10; Nr; NCfl; NOr — выраженные в процентах отношения численности личинок одного из подсемейств к общей численности личинок этого семейства. Величина 10 — верхний предел значений индекса. Нижний предел его равен нулю.
ГЛАВА 3
БИОТЕСТИРОВАНИЕ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ
3.1.	Задачи и приемы биотестирования качества среды
В выявлении антропогенного загрязнения среды наряду с химико-аналитическими методами находят применение приемы, основанные на оценке состояния отдельных особей, подвергающихся воздействию загрязненной среды, а также их органов, тканей и клеток. Их применение вызвано технической усложненностью и ограниченностью информации, которую могут предоставить химические методы. Кроме того, гидрохимические и химико-аналитические методы могут оказаться неэффективными из-за недостаточно высокой их чувствительности. Живые организмы способны воспринимать более низкие концентрации веществ, чем любой аналитический датчик, в связи с чем биота может быть подвержена токсическим воздействиям, не регистрируемым техническими средствами.
Как было показано в гл. 2, биоиндикация предусматривает выявление уже состоявшегося или накапливающегося загрязнения по индикаторным видам живых организмов и экологическим характеристикам сообществ организмов. Пристальное внимание в настоящее время уделяется приемам биотестирования, т.е. использования в контролируемых условиях биологических объектов в качестве средства выявления суммарной токсичности среды. Биотестирование представляет собой методический прием, основанный на оценке действия фактора среды, в том числе и токсического, на организм, его отдельную функцию или систему органов и тканей.
Кроме выбора биотеста существенную роль играет выбор тест-реакции — того параметра организма, который измеряется при тестировании.
Наиболее информативны интегральные параметры, характеризующие общее состояние живой системы соответствующего уровня. Для отдельных организмов к интегральным параметрам обычно относят характеристики выживаемости, роста, плодовитости, тогда как физиологические, биохимические, гистологические и прочие параметры относят к частным. Для популяций интегральными параметрами являются численность и биомасса,
Мелехова
33
а для экосистем — характеристики видового состава, активности продукции и деструкции органического вещества.
С увеличением интегральности тест-реакции повышается «экологический реализм» теста, но обычно снижаются его оперативность и чувствительность. Функциональные параметры оказываются более лабильными, чем структурные, а параметры клеточного и молекулярного уровней проигрывают в отношении экологической информативности, но выигрывают в отношении чувствительности, оперативности и воспроизводимости.
3.2.	Суть методологии биотестирования
Предлагаемая система биомониторинга представляет собой комплекс различных подходов для оценки состояния разных организмов, находящихся под воздействием комплекса как естественных, так и антропогенных факторов. Фундаментальным показателем их состояния является эффективность физиологических процессов, обеспечивающих нормальное развитие организма. В оптимальных условиях организм реагирует на воздействие среды посредством сложной физиологической системы буферных гомеостатических механизмов. Эти механизмы поддерживают оптамальное протекание процессов развития. Под воздействием неблагоприятных условий механизмы поддержания гомеостаза могут быть нарушены, что приводит к состоянию стресса. Такие нарушения могут происходить до появления изменений обычно используемых параметров жизнеспособности. Таким образом, методология биотестирования, основанная на исследовании эффективности гомеостатических механизмов, позволяет уловить присутствие стрессирующего воздействия раньше, чем многие обычно используемые методы.
3.3.	Требования к методам биотестирования
Для того чтобы быть пригодными для решения комплекса современных задач, методы биотестирования, используемые для оценки среды, должны соответствовать следующим требованиям: быть применимыми для оценки любых экологических изменений среды обитания живых организмов; характеризовать наиболее общие и важные параметры жизнедеятельности биоты; быть достаточно чувствительными для выявления даже начальных обратимых экологических изменений; быть адекватными для любого вида живых существ и любого типа воздействия; быть удобными не только для лабораторного моделирования, но также и для исследований в природе; быть достаточно простыми и не слишком дорогостоящими для широкого использования.
34
Одним из наиболее важных требований при оценке состояния среды является чувствительность применяемых методов. Потребность в таких методах особенно возрастает в настоящее время, когда в силу повышенного внимания к проблемам охраны природы и в связи с развитием природоохранных мероприятий становится необходимым оценивать не только и не столько существенные, как правило, уже необратимые изменения в среде, но первоначальные незначительные отклонения, когда еще возможно вернуть систему в прежнее нормальное состояние.
Другое важное требование — универсальность как в отношении физического, химического или биологического оцениваемого воздействия, так и типа экосистем и вида живых существ, по отношению к которым такая оценка проводится. Причем, это необходимо как в отношении отдельных агентов, так и кумулятивного воздействия любого их сочетания (включая весь комплекс как антропогенных, так и естественных факторов).
Система должна быть относительно простой и доступной, пригодной для широкого использования. В настоящее время существует ряд современных молекулярно-биологических тестов качества среды, но в силу высокой технологической сложности и стоимости их применение оказывается ограниченным. При этом возникает вопрос: нужно ли прибегать к таким сложным методам при решении общей задачи мониторинга состояния среды и нельзя ли получить сходную информацию более доступным способом.
3.4.	Основные подходы биотестирования
«Подходами» можно условно назвать группы методов (см. гл. 4), характеризующих сходные процессы, происходящие с тест-объектами под влиянием антропогенных факторов (Биотест, 1993).
3.4.1.	Биохимический подход
Стрессовое воздействие среды можно оценивать по эффективности биохимических реакций, уровню ферментативной активности и накоплению определенных продуктов обмена. Изменения содержания в организме определенных биохимических соединений (например, терпеноидов), показателей базовых биохимических процессов (например, концентрации хлорофилла у фотосинтезирующих растений) и структуры ДНК в результате биохимических реакций (например, при оксидантном стрессе) могут обеспечить необходимую информацию о реакции организма в ответ на стрессовое воздействие.
35
Измерение адаптационного стресса. Каждый физиологический процесс требует определенных затрат энергии, поэтому любое изменение физиологического состояния немедленно сказывается на энергетическом обмене. Биоэнергетические показатели живых систем позволяют выявлять последствия стрессового воздействия среды до наступления необратимых изменений в организме.
Количество энергии, необходимое организму в единицу времени для обеспечения всех физиологических процессов, характеризует интенсивность энергетического обмена. На реализацию одного и того же физиологического процесса в неблагоприятных условиях организму требуется больше энергии, чем в оптимальных, из-за необходимости компенсации неблагоприятных воздействий среды.
В процессе жизнедеятельности всех аэробных организмов в ходе нормальных реакций кислородного метаболизма образуются свободные радикалы (СР) супероксид и другие формы активного кислорода. В норме уровень СР регулируется системой антиоксидантной защиты клетки, так как эти радикалы и продукты их превращения представляют серьезную угрозу: подавляют активность ферментов, разрушают нуклеиновые кислоты, вызывают деградацию биополимеров, изменяют проницаемость мембран. Высокий уровень образования супероксидных радикалов токсичен и может вызвать гибель организма. Уровень их образования, слегка превышающий базовый, может стимулировать рост клеток и играет важную роль в процессе канцерогенеза. Одним из универсальных механизмов стресса является развитие окислительных СР-реакций. Под действием окислительного стресса может происходить повреждение ДНК. Один из механизмов такого повреждения включает прямое окисление нуклеиновых кислот, другой — переваривание ДНК. Образование супероксидных радикалов увеличивается при разных видах облучений, изменении парциального давления кислорода под влиянием ксенобиотиков и при других воздействиях.
Метаболические свободные радикалы — это обширная группа высокоактивных интермедиатов, играющих важную роль в окислительно-восстановительных биохимических реакциях. В клетках животных общепризнано участие CP-реакций при действии окислительных ферментов в системах цитохромов и других гемопроте-идов, НАД, фловопротеидов, убихинона, осуществляемых с помощью коферментов-переносчиков электронов. Свободнорадикальные состояния возникают также в процессах аутоокисления биологически важных соединений, в особенности липидов. В последнем случае чаще всего имеет место образование липидных гидроперекисей, распад которых также приводит к образованию активных радикалов. Особенно подвержены такому аутоокислению ненасыщенные жирные кислоты — компоненты липидов биологи
36
ческих мембран. Появление CP-состояний в липидах клеточной мембраны приводит к модификации ее физико-химического состояния и активности мембранно-связанных ферментов. При повреждающих воздействиях на клетки процессы перекисного окисления липидов развиваются тем более активно, чем выше степень повреждения клетки. При этом перекисные радикалы могут взаимодействовать с молекулами белков или нуклеиновых кислот, связанными с мембраной, изменяя биологические свойства этих молекул и клетки в целом.
Стрессовая реакция биотестов может быть измерена по изменению в них уровня свободных радикалов по сравнению с контролем. Известно, что быстрые изменения интенсивности СР-ре-акций в живых объектах типичны для начальных стадий разных патологических состояний, в том числе для первичных процессов лучевого поражения. В значительной мере это зависит от развития перекисного окисления липидов мембран и определяет неспецифический окислительный стресс клетки. При этом нарушается гомеостатическое равновесие, клетки выходят в неустойчивое состояние, повышается их реактивность.
Исследование ферментативной активности почвенного микроценоза. Различные виды антропогенного воздействия на почву могут изменять условия существования почвенных микроорганизмов, нарушать нормальное протекание в почвах процессов микробной трансформации и, следовательно, отражаются на процессах трансформации веществ в биосфере. Почвенные микроорганизмы участвуют в циклах жизненно-важных элементов, таких как N, Р, S, Fe, Мп и др. Им принадлежит уникальная роль в очистке биосферы от загрязнений, так как именно микроорганизмы обладают высокой способностью к адаптации и могут быстро трансформировать загрязняющие вещества, как естественные для биосферы, так и чужеродные.
Изучение сукцессий и особенностей функционирования микробных комплексов в техногенных экосистемах представляет большой научный и практический интерес. Такие экосистемы могут служить моделью для исследования скорости и направления Микробиологических и биохимических процессов.
Методы энзимологии широко применяются при решении экологических задач. Они позволяют оценить биохимическую активность почвенного микроценоза. Ферменты, выделяемые микроорганизмами в результате их жизнедеятельности, способны иммобилизоваться и накапливаться в почве в активном состоянии и в соответствующих условиях проявлять специфические биокатали-тические функции.
К настоящему времени разработаны методы определения активности большого количества ферментов, участвующих в разнообразных почвенных биохимических процессах.
37
По типу катализируемых реакций все известные ферменты разделены на шесть классов: оксидоредуктазы, катализирующие окислительно-восстановительные реакции; гидролазы, катализирующие реакции гидролитического расщепления внутримолекулярных связей в различных соединениях; трансферазы, катализирующие реакции межмолекулярного или внутримолекулярного переноса химической группы и остатков с одновременным переносом энергии, заключенной в химических связях; лигазы (синтетазы), катализирующие реакции соединения двух молекул, сопряженные с расщеплением пирофосфатных связей АТФ или другого аналогичного трифосфата; лиазы, катализирующие реакции негидролитического отщепления или присоединения различных химических групп органических соединений по двойным связям; изомеразы, катализирующие реакции превращения органических соединений в их изомеры.
В почве широко распространены и довольно подробно изучены оксидоредуктазы и гидролазы, имеющие очень большое значение в почвенной биодинамике. В гл. 4 приводятся методики определения биологической активности четырех ферментных систем почвенных микроценозов, используемых в практике биологического мониторинга.
3.4.2.	Генетический подход
Наличие и степень проявления генетических изменений характеризует мутагенную активность среды, а возможность сохранения генетических изменений в популяциях отражает эффективность функционирования иммунной системы организмов.
В норме большинство генетических нарушений распознаются и элиминируются клеткой, например путем апоптоза за счет внутриклеточных систем или посредством иммунной системы. Достоверное превышение спонтанного уровня таких нарушений является индикатором стресса. Генетические изменения могут выявляться на генном, хромосомном и геномном уровнях. Принято выделять следующие типы мутаций. Генные, или точковые, — их делят на две группы: замены оснований в ДНК и вставки или выпадения нуклеотидов, приводящие к сдвщу рамки считывания генетического кода. Генные мутации делят также на прямые и обратные (реверсии). Мутации типа сдвига рамки считывания значительно менее склонны к спонтанным реверсиям, чем мутации типа замен оснований. Хромосомные перестройки (аберрации) заключаются в различных нарушениях структуры хромосом. Геномные мутации — изменение количества хромосом в ядре.
Относительно просты, хорошо воспроизводимы и высокочувствительны генетические тесты, основанные на оценке измене
38
ния хромосом в соматических клетках (изменения кариотипа, хромосомные аберрации, сестринские хроматидные обмены, микроядра и др.).
Для выявления канцерогенов и мутагенов применяются краткосрочные генетические тесты.
Уже давно известно, что некоторые химические вещества способны вызывать рак у человека. Относительно недавно пришло и постоянно ширится понимание того, что химические вещества способны вызывать мутации в половых клетках человека, которые повышают частоту генетических или наследственных заболеваний. Многие тысячи химических веществ, включая фармакологические препараты, бытовые химические вещества и пищевые добавки, пестициды и нефтепродукты, уже присутствуют в окружающей среде, и каждый год в нее поступают все новые и новые химические соединения. Помимо этого существуют и природные химические вещества, относительно которых известно, что они обладают мутагенной и/или канцерогенной активностью (например, микотоксины, содержащиеся в пищевых продуктах). Поэтому важно, чтобы химические вещества, воздействию которых люди подвергаются преднамеренно (например, во время терапевтических процедур), в повседневной жизни (это, в частности, относится к бытовым химическим веществам, косметическим средствам и т. п.), по недосмотру или небрежности (как в случае с пестицидами), испытывались на способность вызывать рак и генетические нарушения (мутации).
Относительно немногие химические вещества идентифицированы в качестве канцерогенов благодаря установленной связи этих веществ с возникновением рака у человека. Однако канцерогенная активность обычно определяется на основании способности какого-либо вещества вызывать опухоль у лабораторных животных в результате воздействия на протяжении жизни. Исследования такого рода могут длиться в течение двух или трех лет и требуют дефицитных реактивов и высококвалифицированных специалистов. Это обстоятельство привело к поиску альтернативных путей выявления химических веществ, обладающих канцерогенными свойствами, в результате чего был разработан ряд сравнительно недорогих тестов, во многих из которых вместо цельного организма млекопитающих используются другие биологические системы. Поскольку на проведение тестов уходит значительно меньше времени, чем на классические долгосрочные исследования на грызунах, их стали называть краткосрочными тестами.
Известно, что генетические дефекты являются причиной значительной доли заболеваний у человека, однако до сих пор не ясно, в какой мере присутствующие в окружающей среде химические вещества обусловливают генетические болезни. Это неудивительно, поскольку вероятность такой опасности для здоровья
39
определяется на протяжении жизни по меньшей мере одного поколения.
Информация, определяющая признаки клетки или организма, содержится в генетическом материале клетки, состоящем из дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК). ДНК состоит из субъединиц — нуклеотидов, которые в свою очередь состоят из пятиуглеродного сахара (2-дезоксирибозы), остатка фосфорной кислоты и пуринового или пиримидинового азотистого основания. Эти субъединицы образуют в пространстве спиралевидную двунитчатую структуру. Каждая из двух нитей представляет собой последовательность молекул дезоксирибозы, связанных в цепь молекулами фосфорной кислоты. Обе нити связаны друг с другом водородными связями, располагающимися между комплементарными парами пуриновых и пиримидиновых оснований. Комплементарными парами оснований являются гуанин (пурин), который связан с цитозином (пиримидином), и аденин (пурин), связанный с тимином (пиримидином). Уникальная последовательность оснований, объединенных в тройки, или триплеты, образует генетический код: каждый триплет кодирует определенную аминокислоту. Последовательность триплетов и обеспечивает уникальность информации, необходимой для синтеза функционального белка или фермента. Такую функциональную последовательность оснований называют геномом. Генетическая информация передается от одного поколения клеток к другому путем точного удвоения нитей и равного разделения ДНК перед клеточным делением (митозом в соматических клетках или мейозом в половых), благодаря чему обеспечивается надежное наследование всех признаков каждым последующим поколением. Данный фундаментальный генетический процесс является общим для всех организмов — от простой клетки до сложного организма млекопитающего или растения. У эукариотических организмов длинные нити ДНК связаны с белками (гистонами) и организованы в отдельные сложные структуры, называемые хромосомами, которые располагаются в клеточном ядре.
Изменения информации, содержащейся в ДНК, возникают в результате изменений в структуре молекулы ДНК, отчего последовательность оснований, передающаяся следующему поколению, оказывается нарушенной; это в свою очередь может приводить к появлению потомков, отличающихся по своим признакам от родителей. Такие изменения называются мутациями, и, хотя многие мутации вредны, некоторые из них совместимы с нормальным, здоровым состоянием и обусловливают лишь мелкие различия между особями одного вида. Мутации такого вида являются движущей силой эволюции.
Мутагенные химические вещества взаимодействуют с ДНК, вызывая изменения в ее структуре. Эти процессы могут приводить
40
к потере, увеличению или замене оснований, изменяя тем самым их расположение в ДНК и влияя на точность передаваемой генетической информации.
Почти все краткосрочные методы, позволяющие получить результаты в течение максимум нескольких недель, основаны на демонстрации хромосомных повреждений, генных мутаций или повреждения ДНК, при этом многие из них являются тестами in vitro (т. е. проводятся на экспериментальных биологических системах без использования целостных живых организмов). В этих тестах применяется очень широкий спектр организмов — от бактерий и дрожжей до насекомых, растений и культивируемых клеток млекопитающих. Существуют также краткосрочные тесты, в которых лабораторные животные подвергаются воздействию изучаемого химического вещества на протяжении периодов от нескольких часов до недель.
Хотя в литературе описано более сотни тест-систем для исследования генотоксичности, охватывающих различные организации живого — от бактериофага до млекопитающих, регулярно применяются менее 20 из них, а некоторые доступны лишь в специализированных лабораториях.
Чаще всего для выявления мутагенных химических веществ применяются тесты с использованием бактерий; эта группа тестов в целом и наиболее апробирована. В отличие от эукариотических организмов, у которых ДНК организована в сложные хромосомные структуры, у бактерий присутствует лишь одна кольцевая молекула ДНК, которая легкодоступна для химических веществ, проникающих сквозь клеточную стенку. Бактериальные тесты имеют также то преимущество, что в одном опыте может быть получена популяция, состоящая из многих миллионов клеток с относительно коротким периодом размножения. В классическом варианте используются штаммы бактерии, уже имеющие мутации по определенным генам. Мутации, индуцированные тестируемым веществом, так называемые обратные мутации, выявляются в результате роста таких «ревертантных» бактерий с образованием колоний в соответствующей селективной среде. Бактериальные тесты могут быть использованы для выявления мутагенных метаболитов в биологических жидкостях (например, в моче, цельной крови, плазме) животных или людей, подвергшихся воздействию химических факторов.
Наиболее часто употребляемым в оценке степени мутагенности среды тестом является тест Эймса. Для создания тест-системы Б. Н. Эймсом и его сотрудниками были сконструированы специальные штаммы бактерий. Все штаммы происходят от лабораторного штамма Salmonella typhimurium LT2, у которого были выделены ауксотрофные по гистидину (незаменимая аминокислота) мутанты his G-46 (мутация замены оснований в his G-гене гисти
41
динового оперона) и his D-3052 (мутации типа сдвига рамки считывания в гене D).
На основе штаммов сальмонеллы были созданы полуколиче-ственные и количественные тесты для оценки мутагенной активности. Количественные тесты целесообразно использовать в целях определения частоты мутаций, а также в тех случаях, когда исследуемые вещества являются высокотоксичными и вызывают гибель большей части клеток тест-объекта. Поэтому наиболее широкое распространение получил ставший классическим полуколи-чественный тест Эймса с метаболической активацией in vitro (или, как его иногда еще называют, тест Эймса сальмонелла/микросо-мы).
Непрямым доказательством повреждения ДНК в клетках млекопитающих может служить проявление репарационной активности ДНК. Репарация ДНК может быть выявлена с помощью простого теста на культивируемых клетках млекопитающих, основанного на измерении «репарационного», или «внепланового», синтеза ДНК. В его основе лежит следующее явление: тимидин включается в ДНК в процессе как нормального, так и репарационного синтеза. Клетки, подвергшиеся воздействию предполагаемого химического мутагена, обрабатывают тимидином, меченным радиоактивным изотопом (тритием), на такой стадии клеточного цикла, когда нормального синтеза ДНК не происходит или он подавлен. Количество меченого тимидина, обнаруженного в ДНК, является показателем репарационного синтеза и, следовательно, отражает степень первичного повреждения ДНК.
Химические вещества можно оценить в отношении их способности индуцировать хромосомные повреждения у растений, насекомых и млекопитающих. Для млекопитающих обычной тест-системой является культура клеток, можно использовать какую-либо перевиваемую клеточную линию или культуру лимфоцитов человека. Для изучения повреждения хромосом in vivo хорошо разработан метод анализа метафазных хромосом в клетках костного мозга крыс, мышей или хомячков. Кроме того, хромосомные фрагменты в некоторых клетках костного мозга и других тканей можно идентифицировать в виде микроядер: так называемый микроядер-ный тест зарекомендовал себя как сравнительно простой метод выявления химических веществ, способных индуцировать хромосомные повреждения.
Благодаря огромным успехам, достигнутым в области применения в генетической токсикологии тестов с использованием микроорганизмов и клеток млекопитающих, растительные объекты стали применяться в таких исследованииях значительно реже, чем раньше. Однако некоторые растения, например конские бобы (Vida faba), лук {Allium сера), традесканция (Tradescantia paludosa), ку
42
куруза (Zea mays), ячмень (Hordeum vulgare), соя (Glycine max), могут обладать существенными преимуществами по сравнению с другими тест-системами, в частности при скрининге химических веществ на мутагенность (их роль до конца пока не выяснена). Исследование генетических изменений как на генном, так и на хромосомном уровне можно проводить на растениях без использования сложного лабораторного оборудования, необходимого для постановки других тестов, что при некоторых обстоятельствах может оказаться большим преимуществом. Возможным недостатком этих тестов является существенное различие метаболизма растений и млекопитающих. Следовательно, в настоящее время еще рано ставить вопрос о возможности достоверной экстраполяции на человека результатов, полученных в экспериментах на растениях.
3.4.3.	Морфологический подход
В условиях техногенного воздействия на природные экосистемы снижение численности популяций происходит в значительной мере за счет эмбриональной и личиночной смертности. Эмбрионы и личинки — наиболее чувствительные к повреждающим факторам фазы жизненного цикла гидробионтов. Воздействие на организм стрессирующих факторов приводит к отклонениям от нормального строения различных морфологических признаков. В московских и подмосковных водоемах за последние 20 лет катастрофически возрос процент уродливых личинок лягушек и жаб. Отмечено появление рыб с нарушениями эмбрионального морфогенеза, т. е. с различными аномалиями (асимметрия тела и т. д.). В пригородных водоемах и малых реках, по данным гидробиологического мониторинга, исчезли многие виды гидробионтов. Процессы воспроизведения организмов — это сложная цепь взаимообусловленных событий, любое из звеньев которой может быть нарушено воздействием токсичной среды.
Для диагностики воздействия загрязнений на морфологические характеристики применяются методы оценки флуктуирующей асимметрии.
Симметрия как вид согласованности отдельных частей живых организмов имеет общебиологическое значение. При работе с биологическими объектами в настоящее время используется классификация асимметрий (нарушения симметрии) по Л. Ван Валену (Van Valen, 1962), согласно которой они подразделяются на три типа: 1) направленная асимметрия, когда какая-то структура развита на одной стороне больше, чем на другой (сердце млекопитающих); 2) антиасимметрия — большее развитие структуры на одной из сторон (правша и левша в популяции человека); 3) флук
43
туирующая асимметрия — незначительные ненаправленные отклонения от строгой билатеральной симметрии.
Флуктуирующая асимметрия является результатом неспособности организмов развиваться по точно определенному плану. Различия между сторонами не являются генетически детерминированными и не имеют адаптивного значения. Выступая в качестве меры стабильности развития, флуктуирующая асимметрия характеризует состояние морфогенетического гомеостаза — способности организма к формированию генетически детерминированного фенотипа при минимальном уровне онтогенетических нарушений. Таким образом, флуктуирующая асимметрия может быть охарактеризована как одно из наиболее обычных и доступных для анализа проявлений случайной изменчивости развития.
Возможность использования асимметрии в биоиндикации показана многими авторами, которые убедительно доказали на примере различных видов растений и животных (см. гл. 4), что величина асимметрии реагирует на различные стрессоры антропогенного характера и может являться мерой нарушения развития организма. Флуктуирующая асимметрия — это один из общих онтогенетических показателей, характеризующий стабильность индивидуального развития, дающий оценку состояния природных популяций и зависящий от состояния среды. Величина флуктуирующей асимметрии и ее зависимость от определенных факторов может быть определена лишь на популяционном уровне. Кроме того, В. М. Захаровым показано, что флуктуирующая асимметрия является практически единственной формой фенотипической изменчивости с известной причиной обусловленности.
3.4.4.	Физиологический подход
Одна из наиболее важных характеристик, высокочувствительная к стрессовому воздействию среды, — энергетика физиологических процессов. Наиболее экономичный энергетический обмен имеет место лишь при строго определенных условиях среды, которые могут быть охарактеризованы как оптимальные. Интенсивность энергетического обмена аэробного организма может быть определена посредством измерения скорости потребления кислорода. При оптимальных условиях организм находится на самом низком энергетическом уровне, при любых негативных изменениях среды обитания потребность в кислороде будет увеличиваться.
Для характеристики энергетического обмена две величины являются фундаментальными: основной обмен и максимальный обмен. Основной обмен отражает минимальный уровень потребления энергии, необходимый для обеспечения нормального функ
.44
ционирования организма при отсутствии каких-либо внешних воздействий. Максимальный обмен соответствует предельному количеству энергии, которое организм способен выработать в случае необходимости. Разность между этими величинами представляет энергетический ресурс адаптации конкретного вида животных, поскольку основной и максимальный уровни обмена являются видоспецифическими величинами.
Другая базовая характеристика, перспективная для оценки стрессовых воздействий, — темп и ритмика ростовых процессов (см. гл. 4).
Важной характеристикой физиологических процессов является поведенческая активность живых организмов (см. гл. 4).
В качестве тест-функций применяются физиологические параметры пресноводных беспозвоночных гидробионтов разных уровней филогенеза.
Свойства внешней среды, и в частности гидросферы, проявляются в интенсивности воздействия на организм или популяцию отдельных факторов или их комбинаций. Вещества, поступающие в водоем антропогенным путем, могут оказывать регулирующее, трофическое, токсическое и информативное воздействие на гидробионты. При незначительных концентрациях в водоеме эти вещества можно выявить, оценивая физиологический статус гомеостатических показателей организма, которые могут изменяться при сдвигах в окружающей среде.
Вопрос о роли поведения в иерархии индикационных показателей состояния окружающей среды поднимали в своих работах такие ученые, как Н. С. Строганов, А.Д.Слоним, Б. А. Флёров, Л. П. Брагинский, Н.А.Тушмалова. Степень отклонения от стандартных поведенческих реакций животных служит одним из первичных, регистрируемых на визуальном уровне сигналов изменений в окружающей среде и, несомненно, может быть отнесена к реакциям «первого ранга».
Наибольший интерес представляют типы поведения, относящиеся к эволюционно-универсальным реакциям, свойственным всем эукариотам, включая человека. К таким феноменам относятся спонтанная двигательная активность как врожденная форма поведения и память — приобретенная форма поведения.
В опытах на инфузориях показателями исходного функционального состояния служили объективно регистрируемые реакции: спонтанная двигательная активность, уровень спонтанных сокращений, уровень пищевой возбудимости, состояние ядерного аппарата. Была продемонстрирована применимость основных физиологических показателей, используемых в опытах на позвоночных животных, для определения функционального состояния организмов, лишенных нервной системы. Исследования поведенческих реакций в ответ на внешнее воздействие проводились на пресно
45
водной гидре Hydra attenuate, имеющей примитивную нервную систему. Оценивались реакции привыкания к раздражителю, при этом критерием выработки привыкания служило сокращение щупалец гидры. В экспериментах на плоских червях планариях Poly cells nigra, Euplanaria gonocephala, Dugesia tigrina (примитивный мозг — зачатки цефализации) были изучены основные реакции гидробионтов на экологически значимые раздражители. В дальнейшем для оценки качества водной среды стал успешно применяться метод выработки условных рефлексов у планарий.
Целостное поведение животных рассматривается как лабильное взаимодействие врожденных и приобретенных элементарных реакций, необходимое для быстрой и эффективной адаптации к условиям среды. Изучение поведения сложно и требует тщательных наблюдений в природе, подкрепленных лабораторными экспериментами. Возникшие на заре эволюции закономерности поведения у простейших сохраняются и у более развитых животных.
Таким образом, поведение является эволюционно обусловленным показателем физиологического состояния животного. На основании изменений в поведенческих феноменах одного вида животных можно прогнозировать нарушения поведения и других видов. Выбор форм поведения для биотестирования определяется их чувствительностью к изменениям, происходящим в окружающей среде.
3.4.5.	Биофизический подход
Биофизические методы контроля качества среды всегда основаны на инструментальном определении нарушений биохимических и биофизических процессов тест-организмов. Одни из них регистрируют изменения функций мембранных структур клеток, другие оценивают показатели электропроводности тканей, третьи — способность генерировать электрические потенциалы и т.д.
Для контроля состояния важнейших функциональных систем организмов наибольшее распространение получили люминесцентные и флуориметрические методы. Они обладают высокой чувствительностью, позволяют проводить количественные измерения в режиме реального времени, а в ряде случаев и автоматизировать процесс измерения. Люминесцентные и флуориметрические методы в ряде случаев дают возможность не только экспрессно тестировать качество среды, но и проводить, например, детальный анализ состояния фитопланктонного сообщества, а также прогнозировать его развитие. Высокая скорость измерения позволяет анализировать получаемую информацию непосредственно по ходу экспедиционных работ и вносить коррективы в планы исследова
.46
ния. Представленная методология и комплексное использование люменометрической и флуорометрической аппаратуры могут дать информацию о пространственно-временной изменчивости биофизических и физиологических процессов, определяющих нормальное функционирование биосистем, а также могут служить составной частью системы экологического мониторинга. Особо следует отметить перспективы использования данных флуорометрического анализа фитоценоза локальных территорий (как опорных точек) в сочетании со спутниковой информацией о цветности и аэрокосмического контроля среды.
Приборы для оценки фотосинтетической активности фототрофов в лабораторных и полевых условиях. Приведем краткое описание приборных комплексов, разработанных коллективом сотрудников кафедры биофизики биологического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова. Компактный погружной импульсный флуориметр позволяет проводить зондирование параметров флуоресценции с одновременной регистрацией температуры и подводной освещенности на всех глубинах фотического слоя, где освещенность достаточна для протекания реакций фотосинтеза (от О до 200 м). Прибор состоит из погружаемого зонда (9 кг, 25 см диаметром), бортового блока питания, соединенного с зондом, и с IBM-совместимым компьютером, который управляет процессом измерений по алгоритму, задаваемому пользователем. Прибор питается от сети 220 В или от аккумулятора 12 В. Регистрирующая часть зонда состоит из термометра, датчика подводной освещенности, фотоприемника (фотоумножителя), усилителя сигналов, аналого-цифрового преобразователя, интерфейса связи с компьютером и двух независимых импульсных источников света с длительностью вспышек 0,01 мс (спектральная область 400-480 нм).
Использование в зонде датчика подводной освещенности позволяет по измерению переменной флуоресценции FJFm и освещенности оценивать фотосинтетическую продукцию. Измерение всех параметров производится автоматически, а результаты выводятся на экран компьютера в реальном масштабе времени в виде графиков, отражающих вертикальный профиль температуры, подводной освещенности, концентрации и активности водорослей при погружении флуориметра.
Глубина погружения зонда определяется глубиной фотического слоя (обычно несколько десятков метров). Скорость погружения, как правило, составляет 30—50 см-с-1. Математическая обработка данных ведется в автоматическом режиме с использованием стандартных процедур в программе Statistica.
Подобные зонды могут быть рекомендованы для изучения динамики токсичности водоемов, а также для быстрой оценки реакций природных популяций фитопланктона на различные антро
47
погенные и природные воздействия в акваториях со сложным гидрологическим режимом.
Приборы для оценки биолюминесценции. Существует несколько фирм (в основном зарубежных), выпускающих люминометры, программное обеспечение к ним и биосенсоры. В России наибольшее распространение получила тест-система «Эколюм», разработанная в лаборатории антибиотиков кафедры микробиологии биологического факультета МГУ под руководством доктора биологических наук В. С. Данилова. Мониторинг окружающей среды с применением биосенсора «Эколюм» и соответствующей аппаратуры ориентирован на использование реактивов и сервисных приспособлений отечественного производства. Основным преимуществом метода являются быстродействие (время анализа одной пробы 1— 5 мин) и хорошая воспроизводимость результатов (погрешность метода не более 5 %). Тест-система «Эколюм» — это комплект специальных реагентов (биосенсоров), изготавливаемых на основе культивируемых в лабораторных условиях морских гетеротрофных люминесцентных бактерий в комплексе со специально разработанными для этой системы люменометрами. Люменометр скомму-тирован с компьютером и обеспечен специальной программой, позволяющей вести статистическую обработку измерений в непрерывном режиме, выводить получаемые результаты на дисплей компьютера или на печать и сохранять их.
Принцип работы люменометра «Биотоке» основан на регистрации слабых световых потоков биосенсора «Эколюм» с помощью фотоэлектронного фотоумножителя, работающего в режиме счета анодных импульсов. Биосенсор «Эколюм» представляет собой лиофилизированные культуры люминесцентных бактерий, содержащиеся в среде инертных газов в специальных стеклянных флаконах.
Портативный прибор «Биотоке-10» может в автоматическом режиме осуществлять определение интенсивности биолюминесценции тест-объекта, индекса токсичности пробы, усредненной величины индекса токсичности, вычисление стандартного отклонения показателя токсичности, исследование динамики процесса взаимодействия токсикантов с тест-обьектом, компьютерную обработку данных, а наличие звукового сигнала говорит о превышении пробой допустимого уровня токсичности.
Тест-система «Эколюм» может с успехом применяться при экспрессном контроле за отходами и сбросами промышленных предприятий; контроле технологических процессов в режиме реального времени; постоянном мониторинге питьевой воды, водоемов, почв и воздуха на содержание токсических веществ; определении уровня токсичности новой продукции; контроле за токсическим эффектом фармацевтических материалов и лекарственных веществ; контроле качества и безопасности продуктов питания; оценке
48.
профвредности рабочих мест на предприятиях. «Эколюм» обладает хорошей чувствительностью к разнообразным химическим соединениям, характерным для промышленных сбросов, загрязнений почвы, воды, воздуха (тяжелые металлы, фенолы, формальдегид, пестициды).
3.4.6.	Иммунологический подход
В дополнение к цитогенетическому подходу, характеризующему эффективность иммунной системы организма в отношении элиминации клеток с генетическими нарушениями, возможны развернутая оценка изменений иммунореактивности животного, исследование параметров иммунитета, таких как состав крови и гемолимфы, определение наличия антител в жидкостях организма, концентрации белков плазмы, перивисцеральной жидкости и гемолимфы, оценка динамики клеточного состава.
Основная функция иммунной системы состоит в поддержании постоянства внутренней среды организма. Иммунная система одна из самых лабильных, поэтому любые серьезные изменения в среде обитания влияют на функциональную активность иммунокомпетентных клеток. Значительные по величине и продолжительности неблагоприятные воздействия приводят к перенапряжению, истощению и рассогласованию в функционировании отдельных звеньев иммунитета и, как следствие, к развитию иммунодефицита. Все иммунологические тесты по оценке иммунного статуса млекопитающих дают информацию о трех основных клеточных популяциях иммунной системы. К ним относятся: 1) фагоцитирующие клетки, обеспечивающие захват и переваривание чужеродных или измененнных собственных клеточных структур; 2) Т-лимфоциты, регулирующие взаимодействие клеток внутри системы с помощью цитокинов; они осуществляют распознавание и уничтожение генетически чужеродных и измененных клеток организма, дают сигнал В-лимфоцитам к продукции антител; 3) В-лим-фоциты, продуцирующие антитела иммуноглобулиновой природы, которые нейтрализуют действие чужеродных агентов и облегчают фагоцитоз.
Иммунологический подход при оценке состояния окружающей среды заключается в изучении изменений врожденного и приобретенного иммунитета у беспозвоночных и позвоночных животных.
Предлагается использовать параметры иммунитета животных как критерий состояния организмов, их популяций и сообществ экосистем в норме и при техногенном воздействии. Кроме того, разрабатываются технологии производства новых антимикробных и иммунотерапевтических препаратов на основе иммуномодули
49
рующих веществ, выделенных из клеток и биологических жидкостей гидробионтов.
Широко изучаются реакции врожденного иммунитета рыб, иглокожих, ракообразных, моллюсков, насекомых, червей. Показано, что врожденный иммунитет низших позвоночных и беспозвоночных животных во многом подобен таковому у млекопитающих и представляет собой совокупность реакций неспецифической антимикробной защиты, которая действует практически без латентного периода, с высокой эффективностью и избирательностью распознавания «своего» и «чужого». Антимикробные белки фагоцитов, гемоцитов и жидких сред организмов являются физиологически активными веществами, участвующими в реализации и обеспечении взаимодействия защитных реакций при фагоцитозе, воспалении и стрессе. К фагоцитам позвоночных животных относят нейтрофилы, эозинофилы, моноциты и макрофаги; у беспозвоночных животных — это гемоциты и амёбоциты. Перечисленные клетки объединены в общий функциональный тип вследствие наличия у них ряда общих структурно-метаболических свойств и стереотипности поведения в фагоцитарном процессе. Биохимическая специализация фагоцитов заключается в присутствии у них развитого лизосомального (гранулярного) аппарата, где депонируются физиологически активные вещества антибиотического действия.
Ведущую роль в уничтожении микроорганизмов играет группа катионных белков, таких как миелопероксидаза, лактоферрин, эластаза, катепсин G, лизоцим, дефенсины. Катионные полипептиды, которые осуществляют первичную защиту от инфекций и ухудшения условий среды обитания, представлены в природе от простейших животных до человека. При ухудшении условий среды обитания или при атаке чужеродных агентов в целомической жидкости беспозвоночных и в сыворотке крови позвоночных животных происходит резкое нарастание фагоцитирующих клеток и, как следствие, антимикробных белков и катионных полипептидов, которые осуществляют нейтрализацию стресса или гибель внедрившихся чужеродных агентов. Изучение динамики реакций врожденного иммунитета у водных животных, например определение концентрации гемоцитов и лизоцима, обнаружение новых белков в сыворотке и целомической жидкости, определение наличия специфических антител и сравнение этих параметров с нормой позволяет сделать выводы об изменении условий среды обитания или появлении заболеваний у животных.
Исследование параметров иммунологического статуса водных животных (рыб, моллюсков, морских звезд) в зависимости от изменений условий среды обитания, развития заболеваний или антигенного воздействия показало увеличение количества макрофагоподобных клеток, концентрации лизоцима и, как следствие,
50
появление в жидкостях организмов новых цитотоксических белков и антимикробных пептидов. В гл. 4 приведены некоторые методы анализа подобных изменений в иммунном статусе гидробионтов в ответ на стрессовое воздействие.
Предложенная методология биотестирования пригодна для оценки любой наземной и водной экосистемы по тест-функциям растений и животных. Тестирование позволяет определять состояние живых организмов по комплексу морфологических, генетических, физиологических, биохимических, биофизических и иммунологических параметров. Используемый набор методов исследования и тестов охватывает разные стороны индивидуального развития организма, обеспечивая интегральную оценку состояния биоты и Качества среды в целом.
Методы биотестирования просты, относительно недороги, пригодны для широкого применения и дают возможность оценивать качества природной среды при всем многообразии экологических изменений.
3.5.	Практическое применение методологии биотестирования
Среди возможностей применения подходов биотестирования следует отметить их пригодность в мониторинге районов с интенсивным развитием промышленности и сельского хозяйства. Кроме того, биотестирование позволяет провести беглое сканирование больших пространств в целях ранней диагностики экологических нарушений. В данном случае достаточно ограничиться наиболее простыми, но эффективными методами, основанными, например, на морфологических или физиологических показателях.
Обобщить результаты, полученные методами биотестирования, допустимо по всем методам в пределах каждого подхода; по всем подходам для каждого вида или группы видов живых организмов; для экосистемы в целом, что дает надежную суммарную оценку состояния среды и исключает ошибочное заключение, вполне возможное при использовании единичных показателей в отношении отдельных видов. Итоговое заключение должно содержать характеристику качества среды в исследуемом районе (оценку степени отклонения от нормы и фонового состояния; оконтуривание зоны ощутимых последствий воздействия) и оценку благоприятности среды для человека.
Комплексная оценка качества среды обитания помимо использования разных подходов и тест-объектов биотестирования под
51
разумевает организацию наблюдений за всеми природными средами, в первую очередь за воздушной, водной и почвенной компонентами биосферы.
Организация наблюдений за загрязнением атмосферы. Такие наблюдения проводятся на стационарных, маршрутных и передвижных (подфакельных) постах. Стационарные и маршрутные посты служат для проведения систематических наблюдений, передвижные — для разовых наблюдений в зонах непосредственного влияния промышленных предприятий. Наблюдения под факелами дымовых труб предприятий проводятся с целью получения материалов по распределению вредных веществ от отдельных источников выбросов в зависимости от метеоусловий и для получения оценки их влияния на загрязнение атмосферы.
Согласно международным стандартам ИСО 14000 «Системы управления охраны окружающей среды», отбор проб воздуха проводится по направлению ветра на расстояниях от источника выбросов 0,2—0,5; 1; 2; 3; 4; 6; 8; 10; 15 и 20 км, на высоте 1,5 м от поверхности земли в течение 20—30 мин по специальным методикам.
Организация наблюдений за загрязнением поверхностных вод. Для правильной оценки качества воды в водоеме, характеристики его химико-биологического состояния, степени загрязнения необходимо провести отбор репрезентативных проб воды из исследуемого водоема. Под этим понимается их соответствие поставленной задаче по количеству, объему, выбранным точкам, времени отбора, а также по технике отбора, предварительной обработке, условиям хранения и транспортировки.
Различают простые и смешанные (усредненные) пробы. Простые пробы, т.е. отобранные в полном объеме в определенный момент времени, характеризуют качество воды в данном пункте водоема во время отбора. Смешанные пробы представляют собой объединенную по тому или иному принципу серию простых проб. Смешанные пробы характеризуют среднее содержание определенных компонентов или свойств за некоторый промежуток времени или среднее значение для некоторого участка водоема.
В зависимости от цели исследования отбор проб может быть разовым или регулярным. Место отбора выбирают в соответствии с целями анализа и на основании исследования местности.
Согласно ИСО 14000 «Системы управления охраны окружающей среды», пробы отбирают с глубины 20 — 30 см от поверхности. Объем проб может варьировать от 1—2 до 15—20 л и более. Для отбора проб используют специальные устройства — батометры.
Пробы воды для биологического анализа хранят не более суток в холодильнике при t +4 °C в полиэтиленовой или стеклянной посуде.
• 52
Организация наблюдений за загрязнением почв. В связи с тем что в твердых средах (грунтах) токсиканты редко распределены равномерно, существуют определенные методики отбора проб, позволяющие нивелировать последствия мозаичности. Для определения загрязнений промышленного происхождения отбор проб почвы производится один раз в год в летний период. Как правило, для контроля выбираются почвы, занятые культурными растениями.
Для определения точек отбора применяется азимутальный метод. Каждый год пробы отбираются вокруг промышленных центров по четырем румбам на расстоянии 1; 2; 3; 5 и 10 км. Один раз в пять лет обследование почвы проводят более подробно по всем 16 румбам и на расстояниях 0; 0,2; 0,5; 1; 1,5; 2; 3; 4; 5; 8; 10; 20; 30; 50 км. Положение точек пробоотбора отмечается на карте.
Методика отбора почвенных образцов определяется поставленными перед исследователем задачами. Во всех случаях образцы должны наиболее полно характеризовать исследуемую площадь. Анализируются индивидуальные и смешанные образцы. Для характеристики биологической активности почв на каждой стометровой делянке берут пять смешанных образцов конвертным способом. Каждый образец составляют из 5—7 индивидуальных проб. Если делянка меньше 100 м2, достаточно брать три смешанных образца по диагонали, составленных из 3—5 индивидуальных проб. Все образцы анализируются отдельно.
Делают записи в дневнике с указанием района исследований, описанием выбранного места закладки разреза, участка или опытного поля (рельеф, растительность, предшествующие культуры, агротехника, внесение удобрений) и подробной характеристикой почвы. Обязательно записывают время взятия образца.
Пробы грунта для биохимического анализа берут специальными пробоотборниками. Обычно они представляют собой круглые трубки из прочного нейтрального материала — «нержавейка», пластмасса — диаметром 5 см с крышками. В открытом состоянии пробоотборник аккуратно вгоняют в грунт на максимально возможную глубину. После этого трубка плотно закрывается сверху крышкой и сразу (если позволяет грунт) снизу закрывается второй крышкой. Если плотность грунта велика, то для закрытия взятого керна* трубку необходимо очень аккуратно наклонить, стараясь не нарушить его внутри трубки, и затем закрыть нижнюю крышку. При отборе проб почвы буром смешанный образец составляется из 20 кернов (уколов), отобранных через равные промежутки по диагонали пробной площадки, примерно через 7— 10 м. Все отобранные керны смешиваются в отдельной емкости (ведре или банке). Отсюда берется анализируемый впоследствии
* Керн — почвенная колонка с ненарушенной структурой и порядком почвенных горизонтов, полученная пробоотборником путем бурения.
53
образец и помещается в химически не активную емкость (чистая стеклянная банка, пластиковая емкость). Каждый образец снабжается этикеткой с указанием района взятия пробы, шифра и номера керна, даты, фамилии исследователя.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ К ГЛАВАМ 1—3
Антропогенное влияние на водные экосистемы (по материалам конференции, посвященной 100-летию со дня рождения профессора Н. С. Строганова) / под ред. О. Ф. Филенко. — М.: Т-во научных изданий КМК, 2005.
Актуальные проблемы водной токсикологии / под ред. проф. Б.А.Флё-рова. — Борок : Ин-т биологии внутренних вод РАН, 2004.
Артамонов В. И. Зеленые оракулы. — М.: Мысль, 1989.
Биоиндикация загрязнений наземных экосистем / под ред. Р. Шуберта. — М.: Мир, 1988.
Биологические ресурсы пресных вод: беспозвоночные / Сб. научн. работ, посвященный 95-летию со дня рождения Ф.Д. Мордухой-Болтов-ского. — Рыбинск: Рыбинский дом печати, 2005.
Биотест: интегральная оценка здоровья экосистем и отдельных видов / под ред. В. М. Захарова, Д. М. Кларк. — М.: Моск. отд. Международного фонда «Биотест», 1993.
Брагинский Л. П. Некоторые особенности поведения водных беспозвоночных в токсической среде и их значение для этологии / Л. П. Брагинский [и др.] // Поведение водных беспозвоночных. — Борок : Ин-т биологии внутренних вод, 1972.
Брагинский Л. П. Интегральная токсичность водной среды и ее оценка с помощью методов биотестирования // Гидробиол. журн., 1993. — Т. 29. — № 6.
Брагинский Л. П. Визуально фиксируемые реакции пресноводных гидробионтов как экспресс-индикаторы токсичности водной среды / Л. П. Брагинский, А. А. Игнатюк // Гидробиол. журн., 2005. — Т. 41. — № 4.
Бритаев Т.А. Симбиотические полихеты: морфология, поведение, экология / Автореф. дис.... докт. биол. наук. — М.: ИПЭиЭ РАН, 1999.
Бугмырин С. В. Паразиты как интегрированный показатель биоразнообразия экосистемы // Сохранение биоразнообразия и рациональное использование биологических ресурсов. — М.: СМИ МГУ, 2000.
Егорова Е. И. Биотестирование и биоиндикация окружающей среды: учеб, пособие по курсу «Биотестирование» / Е. И. Егорова, В. И. Белолипецкая. — Обнинск: ИАТЭ, 2000.
Егорова Е. И. Биотестирование объектов окружающей среды. Лабораторный практикум по курсу «Биологический мониторинг» / Е. И. Егорова, Б. И.Сынзыныс. — Обнинск: ИАТЭ, 2003.
Гиляров М. С. Особенности почвы как среды обитания и ее значение в эволюции насекомых. — М., Л.: АН СССР, 1949.
Данильченко О.П. Экспресс-метод определения токсичности водной среды по функциональному состоянию инфузорий спиростом / О.П.Данильченко, Н.А.Тушмалова // Теоретические вопросы биотестирования. — Волгоград, 1983.
•54
Захаров В. М. Асимметрия морфологических структур животных как показатель незначительных изменений состояния среды // Проблемы экологического мониторинга и моделирования экосистем. — Л.: Гидрометео-издат, 1981. — Т.4.
Захаров В.М. Асимметрия животных. — М.: Наука, 1987.
Звягинцев Д. Г. Биология почв / Д. Г. Звягинцев [и др.]. — М.: Изд-во МГУ, 2005.
ИСО 14000 «Системы управления охраны окружающей среды» / под ред. А.В. Гунова. — М.: ВНИИ Междунар. стандар., 1997.
Козлов А. Т. Структура и механизмы поведения беспозвоночных / А. Т. Козлов, Н.А.Тушмалова. — Воронеж: Квадрат, 1995.
Коробейникова Л. А. Методы изучения состояния окружающей среды. Практикум по экологии: в 2 ч. — Вологда: Русь, 1995, 1996.
Котелевцев С. В. Эколого-токсикологический анализ на основе биологических мембран / С. В. Котелевцев [и др.]. — М.: Изд-во МГУ, 1986.
Криволуцкий Д. А. Биоиндикация и экологическое нормирование / Д. А. Криволуцкий (и др.] // Влияние промышленных предприятий на окружающую среду / под ред. Д. А. Криволуцкого. — М.: Наука, 1987.
Кэннеди К. Экологическая паразитология. — М.: Мир, 1978.
Лыскин С. А. Симбиотические организмы в оценке биоразнообразия на примере симбионтов голотурий залива Нячанг Южного Вьетнама / С.АЛыскин [и др.] // Сохранение биоразнообразия и рациональное использование биологических ресурсов. — М.: СМИ МГУ, 2000.
Мелехова О.П. Экспресс-метод биотестирования качества воды по метаболическому критерию / О.П.Мелехова [и др.]. — М.: РГОТУПС, 2000.
Мелехова О.П. Свободнорадикальные процессы в пространственно-временной регуляции развития низших позвоночных / Автореф. дисс. докт. биол. наук. — М.: Изд-во МГУ, 2005.
Мелехова О. П. Свободнорадикальные процессы в эмбриогенезе Anura // Онтогенез, 1976. — Т. 7.
Мелехова О. П. Некоторые физико-химические аспекты дифференцировки глазного зачатка у Anura // Журн. общ. биол., 1977. — № 2.
Методические указания. МВИ интегрального уровня загрязнения почвы техногенных районов методом биотестирования. РД 52.18.344-98. — М.: Федеральная служба России по гидрометеорологии и мониторингу окружающей среды, 1993.
Методы биотестирования качества водной среды / под ред. О. Ф. Фи-ленко. — М.: Изд-во МГУ, 1989.
Микроорганизмы и охрана почв / под ред. Д. Г. Звягинцева. — М.: Изд-во МГУ, 1991.
Маторин Д. Н. Использование двухвспышечного импульсного погружного флуориметра для определения фотосинтетической активности природного фитопланктона / Д. Н. Маторин [и др.] // Докл. РАН, 1996. — Т. 350. - № 2.
Погосян С. И. Использование комплекса флуорометрических методов для оценки состояния фитопланктонного сообщества моря / С. И. Погосян [и др.] // Комплексные исследования северо-восточной части Черного моря / под ред. А. Г. Зацепина, М. В. Флинта. — М.: Наука. 2001.
55
Пельгунов А. Н. Изменение зараженности гельминтами мышевидных грызунов в местах радиоактивного загрязнения в Брянской области / А.Н.Пелыунов, Т.Т. Ларченко // Биоиндикация радиоактивных загрязнений /отв. ред. Д. А. Криволуцкий. — М.: Наука, 1999.
Плохинский Н.А. Математические методы в биологии. — М.: Изд-во МГУ, 1978.
Покаржевский А.Д. Роль микроорганизмов, растений и животных в биологическом круговороте наземных экосистем / А. Д. Покаржевский [и др.] Ц Докл. АН СССР, 1992. - Т.322. - № 4.
Последствия Чернобыльской катастрофы: здоровье среды / под ред. В. М. Захарова, Е. Ю. Крысанова. — М.: Моск. отд. Международного фонда «Биотест», 1996.
Практикум по иммунологии: Учеб, пособие / под ред. И. А. Кондратьевой, А.А.Ярилина. — М.: Издательский центр «Академия», 2004.
Руководство по краткосрочным тестам для выявления мутагенных и канцерогенных химических веществ. — Женева: Всемирная организация здравоохранения, 1989.
Руководство по методам гидробиологического анализа поверхностных вод и донных отложений / под ред. В. А. Абакумова. — Л.: Гидрометео-издат, 1983.
Селье Г. Стресс без дистресса / пер. с англ. — М.: Мир, 1979.
Слоним А.Д. Энергетика поведения и спонтанная деятельность. — Л.: Наука, 1971.
Смуров А. В. Экологическая диагностика: биологический и информационный аспекты. — М.: Ойкос, 2003.
Современные проблемы водной токсикологии / Межд. конфер. памяти проф. Б. А. Флерова. — Борок : Ин-т биологии внутренних вод РАН, 2005.
Сорокин Ю. И. Экосистемы коралловых рифов. — М. Наука, 1990.
Софронов Е.А. Медико-биологические основы оценки опасности экотоксикантов / Е.А.Софронов [и др.]. — СПб.: ВмедА, 1999.
Степанов А. М. Млекопитающие — индикаторы промышленного загрязнения / А. М. Степанов [и др.] // Влияние промышленных предприятий на окружающую среду / под ред. Д.А. Криволуцкого. — М.: Наука, 1987.
Степанов А. Л. Методы газовой хроматографии в почвенной микробиологии: Учеб.- метод, пособие / А. Л. Степанов, Л.В.Лысак. — М.: МАКС Пресс, 2002.
Стрельцов А. Б. Региональная система биологического мониторинга. — Калуга: Изд-во Калужского ЦНТИ, 2003.
Строганов Н. С. Биологический критерий токсичности в водной токсикологии // Критерии токсичности и принципы методик по водной токсикологии. — М.: Изд-во МГУ, 1971.
Тушмалова Н.А. Поведение донервных организмов-индикаторов эффекта сверхмалых доз / Н.А.Тушмалова [и др.] // Вестник МГУ, 1998. — № 4.
Тушмалова Н.А. Использование поведенческих реакций гидробионтов в системе оценки качества окружающей среды / Н.А.Тушмалова, Е. И. Егорова. — Обнинск: ИАТЭ, 2003.
•56
Тушмалова Н.А. Функциональные механизмы приобретенного поведения у низших беспозвоночных. — М: Изд-во МГУ, 1986.
Экологический мониторинг. Методы биомониторинга / под ред. Д. Б. Гелашвили: в 2 ч. — Н.Новгород: ННГУ, 1995.
Федоров В.Д. О методах изучения фитопланктона и его активности. — М.: Изд-во МГУ, 1979.
Федоров В.Д. Изменения в природных биологических системах / под. ред. В. Н. Максимова. — М.: РАГС, 2004.
Филенке О. Ф. Водная токсикология. — М.: Изд-во МГУ, 1988.
Флеров Б. А. Эколого-физиологические аспекты токсикологии пресноводных животных. — Л.: Наука, 1989.
Флинт В. Е. Млекопитающие СССР / В. Е. Флинт [и др.]. — М.: Мысль, 1970.
Фонштейн Л. М. Тест-системы для оценки мутагенной активности загрязнителей в окружающей среде / Л. М. Фонштейн [и др.]. — М.: Наука, 1977.
Van Valen L. A study of fluctuation asymmetry // Evolution, 1962. — Vol. 16. — N 2.
ГЛАВА 4
ЛАБОРАТОРНЫЕ РАБОТЫ ПО ОСНОВНЫМ МЕТОДАМ БИОИНДИКАЦИИ И БИОТЕСТИРОВАНИЯ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ
Современной биологией накоплен значительный арсенал методов, позволяющих достаточно объективно оценивать качество среды, но в настоящем пособии рассмотрены, конечно, далеко не все. Ввиду ограниченности объема книги авторы старались включать в пособие хорошо апробированные или наиболее перспективные, с их точки зрения, биологические методы. При выборе авторы руководствовались и тем соображением, что механизмы поддержания гомеостаза на высоких уровнях организации биосистем (популяция, сообщество и особенно экосистема) изучены в меньшей степени. Это связано с многообразием сообществ и экосистем, а главное, с пролонгированностью процессов, поддерживающих гомеостатические состояния отдельных сообществ, экосистем и биосферы в целом. К тому же у экологов часто отсутствует единое мнение по поводу норм реакций на уровне экосистем. Процессы, обеспечивающие экосистемный гомеостаз, растянуты на десятки, сотни и даже тысячи лет. Имеющиеся в распоряжении ученых сведения о последствиях тех или иных негативных воздействий на экосистемы отрывочны и часто противоречивы. Последствия воздействий на экосистемы приходится оценивать на фоне или слишком короткого промежутка времени, недостаточного для реализации механизмов поддержания экосистемных гомеостазов, или слишком продолжительного периода. При этом трудно учесть вклад в наблюдаемые изменения естественных процессов, произошедших в природе за длительное время (глобальные естественные колебания температуры — оледенения и потепления, естественные эволюционные процессы и т.д.). По большей части прогнозы, касающиеся развития процессов в экосистемах, непроверяемы, имеют определенный оттенок научной фантастики и их практическая ценность невелика. По этой причине и, как уже отмечалось выше, по причине ограниченности объема широкий спектр перспективных биоценотических и других методов не был включен в пособие.
Выполнение лабораторных работ, предложенных в учебном пособии, основано на знании курсов «Общая биология», «Бота
58
ника», «Зоология», «Физиология растений», «Физиология человека и животных», «Микробиология», «Цитология», «Гистология», «Биохимия и биофизика клетки», «Молекулярная биология», «Генетика», «Иммунология», «Биология индивидуального развития», «Экология», читаемых студентам вузов по направлению 020200 «Биология» подготовки бакалавров, магистров и специалистов.
4.1. Оценка качества среды методами биоиндикации
4.1.1. Оценка качества воздуха
Лаборатцрная работа №1. БИОИНДИКАЦИЯ ЗАГРЯЗНЕНИЯ АТМОСФЕРНОГО ВОЗДУХА С ПОМОЩЬЮ ЛИШАЙНИКОВ
(Лабораторная работа подготовлена Е. И. Егоровой)
Лишайники — своеобразные симбиотические организмы, слоевище которых образовано грибом (микобионтом) и водорослью (фитобионтом) с преобладанием в большинстве случаев первого. Поскольку слоевише и плодовые тела лишайников грибные по своей природе, современная систематика рассматривает эту группу в общей системе царства грибов в качестве лихенизированных грибов. Подавляющее большинство лишайниковых грибов относятся к классу Ascomycetes — сумчатых грибов, образующих в результате полового процесса споры (аскоспоры), развивающиеся в гимениальном слое плодовых тел. Фотосинтезирующие компоненты лишайников относятся преимущественно к отделам зеленых (Chlorophyta) или синезеленых (Cyanophyta) водорослей. Водоросль снабжает гриб созданными ею в процессе фотосинтеза органическими веществами, а получает от него воду с растворенными минеральными солями. Кроме того, гриб защищает водоросль от высыхания.
Комплексная природа лишайников позволяет им получать питание не только из почвы, но также из воздуха, атмосферных осадков, влаги росы и туманов, частиц пыли, оседающей на слоевище. Лишайники относительно неприхотливы к субстрату, однако большинство видов обладает избирательной способностью и поселяется на определенном субстрате (на известняках, кварцах, коре деревьев или гниющей древесине, на неподвижно лежащих предметах из стекла, кожи, железа и пр.). Лишайники требовательны к свету, могут переносить засуху, но нуждаются хотя бы в периодическом увлажнении, так как процесс фотосинтеза и дыхания идет лишь во влажных слоевищах.
59
По типу слоевища лишайники делят на накипные (корковые), листоватые, кустистые. Накипные — имеют слоевище в виде тонкой (гладкой или зернистой, бугорчатой) корочки и очень плотно срастаются с субстратом (корой, камнем, почвой), отделить их без повреждений субстрата нельзя. Листоватые — имеют вид мелких чешуек или пластинок, прикрепляются пучками грибных гиф (ризоидами) и легко отделяются от субстрата. Кустистые — имеют вид тонких нитей или более толстых ветвящихся кустиков, прикрепляющихся к субстрату своими основаниями.
Наиболее устойчивыми к загрязнителям являются накипные лишайники, среднеустойчивы листоватые, а слабоустойчивы кустистые лишайники.
Эпифитные лишайники предпочитают старые деревья, причем для них имеет значение поверхность коры. На крупнобугристой коре старых деревьев обычно селятся кустистые виды, реже встречаются листоватые и накипные. На слабоморщинистой коре молодых деревьев растут листоватые и накипные виды, а на гладкой коре поселяются в основном накипные лишайники.
В ряде работ показано, что с помощью лишайников можно получать вполне достоверные данные об уровне загрязнения воздуха. При этом можно выделить группу химических соединений и элементов, к действию которых лишайники обладают сверхповышенной чувствительностью: оксиды серы и азота, фторо-и хлороводород, а также тяжелые металлы. Многие лишайники погибают при малейшем загрязнении атмосферы этими веществами.
Процедура определения качества воздуха с помощью лишайников носит название лихеноиндикации.
Принцип первого метода, предложенного в лабораторной работе, основан на использовании соотношения проективного покрытия стола дерева лишайниками, суммарного количества видов лишайников и лишайников доминантного вида. Эти данные приведены в рабочих таблицах 1.1 — 1.2 (см. лабораторную работу № 1).
Принцип второго метода основан на использовании рабочей шкалы, в которой приведена наиболее часто встречаемая последовательность исчезновения индикаторных лишайников по мере увеличения загрязнения (см. табл. 1.3).
Для проведения исследования в полевых условиях потребуются увеличительные стекла (или лупы), каталоги-определители лишайников, карандаш, блокнот, компас, коробка с пакетами для сбора лишайников. Для оценки степени покрытия деревьев лишайниками необходимо изготовить специальное приспособление — палетку из толстого полиэтилена или целлофана в виде квадрата размером 20x20 см, разделив каждую сторону на 10 частей. В результате получается прозрачная сетка, которой покрывают ствол
60
дерева, и оценивают степень покрытия его поверхности лишайником.
Для определения площади проективного покрытия лишайниками ствола дерева необходимо сделать следующее.
1.	Выбрать место обследования (парк, освещенный участок леса, двор в городе). Очертить эту область на карте.
2.	Выбрать площадку для исследования, включающую 10 деревьев одного вида на расстоянии 5—10 м друг от друга. Деревья должны быть примерно одного возраста и размера, не иметь повреждений.
3.	Приложить прозрачную сетку плотно к стволу дерева на высоте 0,3—1,3 м. Подсчитать количество квадратов с лишайниками.
4.	Подсчитать количество всех видов лишайников под прозрачной сеткой.
5.	Подсчитать количество лишайников доминирующего вида.
Степень покрытия лишайниками стволов деревьев выражается в процентах. Заполнить табл. 1.1. С помощью табл. 1.2 оценить качество воздуха, используя средние значения (по 10 деревьям) числа видов лишайников, степени покрытия и общего количества лишайников на каждом исследуемом дереве.
Переместиться на следующую площадку (100 х 100 м) и по аналогичной схеме исследовать еще 10 деревьев на наличие лишайников и степень покрытия ствола.
Внимание! 1. В городе можно оценивать степень покрытия лишайниками заборов, столбов и т. п. Наш опыт применения данного метода показал некоторые его ограничения и недостатки для оценки качества воздуха. Так, предложенная в табл. 1.2 шкала не пригодна для использования в случае доминирования накипного лишайника, покрывающего ствол дерева на значительной площади. В таком случае удобнее пользоваться методом расчета степени загрязнения воздуха по сумме индикаторных видов лишайников, приведенных в справочном материале к лабораторной работе № 1. Для оценки степени загрязнения воздуха данным методом надо выполнить пп.1, 2, изложенные выше, и занести в блокнот названия всех обнаруженных индикаторных видов лишайников. Используя рабочую шкалу, приведенную в табл. 1.3, определить биотический индекс. Затем классифицировать качество воздуха в соответствии с табл. 1.4.
2. Если вам нужно взять несколько видов лишайников для коллекции или более точного определения, пользуйтесь рекомендациями по сбору, приведенными в справочном материале к лабораторной работе № 1.
Оборудование и материалы:
атлас-определитель лишайников, лупа, стенды (или коллекции лишайников), индивидуальное задание на карточке.
61
ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ ЛАБОРАТОРНОЙ РАБОТЫ
1.	Получить у преподавателя задание на карточке.
2.	Пользуясь табл. 1.1 и 1.2, оценить качество воздуха по степени проективного покрытия лишайниками стволов деревьев.
Таблица 1.1
Журнал оценки качества воздуха по проективному покрытию ствола дерева
Порядковый номер дерева на схеме	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
Степень покрытия лишайниками, %										
Количество видов лишайников										
Количество лишайников доминирующего вида										
Таблица 1.2
Шкала качества воздуха по проективному покрытию лишайниками стволов деревьев
-Степень покрытия	Число видов	Число лишайников доминантного вида	Степень загрязнения
Более 50 %	Более 5	Более 5	6-я зона Очень чистый воздух
	3-5	Более 5	5-я зона Чистый воздух
	2-5	Менее 5	4-я зона
20-50%	Более 5	Более 5	Относительно чистый воздух
	Более 2	Менее 5	3-я зона Умеренное загрязнение
<20%	3-5	Менее 5	2-я зона Сильное загрязнение
	0-2	Менее 5	1 -я зона Очень сильное загрязнение
62
3.	Пользуясь каталогами-определителями лишайников, дать точное родовое и видовое название каждого лишайника, обозначенного номером в карточке. Пользуясь табл. 1.3 и 1.4, дать характеристику качества атмосферного воздуха.
Таблица 1.3
Рабочая шкала для определения биотического индекса
Организмы	Видовое разнообразие	Общее число присутствующих лишайников				
Уснея(^/уиед sp.), алекго-рия (Alectoria/Bryoria sp.)	> 1 вида 1 вид	0-1	2-4	5-7	8-10	> 11
			♦	7 6	8 7	9 8	10 9
Эверния (Evemia sp.), анаптихия (Anapthychia ciliaris), рамалина (Ramalina farinacea)	> 1 вида 1 вид	—	6	7	8	9
		—	5	6	7	8
Пармелия (Parmelia sp.), гипогимния (Hypogymnia physodes)	> 1 вида 1 ВИД	-3	5	6	7	8
			4	5	6	7
Ксантория (Xanthoria parietina), фисция (Physcia pulverulenta)	> 1 вида 1 вид	3	4	5	6	7
		2	3	4	5	6
Леканора (Lecanora sp.), графис (Graphis scripta), другие накипные лишайники	Все виды	1	2	3	—	—
* Ситуация не встречается в природе.
Таблица 1.4
Классификация качества воздуха по биотическому индексу
Класс качества	Степень загрязнения	Биотический индекс
6	6-я зона: очень чистый воздух CSOz = < 0,005 мг/м3	1о
5	5-я зона: чистый воздух CSO2= 0,005—0,009 мг/м3	7-9
4	4-я зона: относительно чистый воздух Cso2 = 0,01—0,05 мг/м3	5-6
3	3-я зона: умеренное загрязнение Cso2 =0,05—0,1 мг/м3	4
2	2-я зона: сильное загрязнение Cso2 = 0,1 —0,3 мг/м3	2-3
1	1-я зона: очень сильное загрязнение Cso, = 0,3 — 0,5 мг/м3	0-1
63
4.	В отчете привести родовое и видовое названия лишайников, указанных в задании номером; сделать выводы о качестве воздуха (привести расчеты и таблицы).
Т абл и ца 1.5
Классы полеотолерантности (А) и типы местообитаний эпифитных лишайников (по Х.Х. Трассу, 1985)
Классы полеотолерантности	Типы местообитаний лишайников и их встречаемость	Виды
I	Естественные, без ощутимого антропогенного воздействия	Lecanora abietina, Parme-liella, самые чувствительные виды рода Usnea
II	Естественные (часто) и слабо антропогенно измененные (редко)	Evemia divaricata, Lecanora coilocarpa, Parmeliopsis aleurites, Ramalina calicaris
III	Естественные (часто) и слабо антропогенно измененные (часто)	Bryoria fuscescens, Hypo-gymnia tubulosa, Pertusaria pertusa, Usnea subfloridana
IV	Естественные (часто) и слабо (часто) и умеренно антропогенно измененные (редко)	Cetraria pinastri, Graphis scripta, Armeliopsis ambigua, Usnea filipendula
V	Естественные и слабо и умеренно антропогенно измененные с равной встречаемостью	Caloplaca pyracea, Lecanora subfuscata, Parmelia oliva-cea, Physcia aipolia
VI	Естественные (сравнительно редко) и умеренно антропогенно измененные (часто)	Evemia prunastri, Hypogym-nia physodes, Lecanora allo-phana, Usnea nitra, Hypo-cenomyce scalaris, Pertusaria discoidea
VII	Умеренно (часто) и сильно (редко) антропогенно измененные	Lecanora varia, Parmelia sulcata, Pertusaria amara, Physcia ascendens
VIII	Умеренно и сильно антропогенно измененные (с равной встречаемостью)	Caloplaca cerina, Physconia grisea, Ramalina pollinaria
IX	Сильно антропогенно измененные (часто)	Phacophyscia orbicularis. Xanthoria parietina
X	Очень сильно антропогенно измененные (встречаемость и жизненность видов низкие)	Lecanora conizaeoides, Scoliciosporum chlorococcum
64
Таблица 1.6
Индекс полеотолерантности (ИП) и среднегодовые значения SO2 (по Х.Х. Трассу, 1985)
ИП	Концентрация SO2 в атмосфере, мг/м3	Зона
1-2	—	Очень чистая
2-5	0,01 -0,03	Чистая
5-7	0,03-0,08	Относительно чистая
7-10	0,08-0,10	Умеренно загрязненная
10	0,10-0,30	Сильно загрязненная
0	Более 0,3	Очень сильно загрязненная (лишайниковая пустыня)
5.	Подсчитать индекс полеотолерантности вида (ИП) по табл. 1.6, который соответствует определенной концентрации газообразных соединений, загрязняющих атмосферу, по формуле:
ИП = У
(=1 сп
где с„ — общее проективное покрытие; а,- — класс полеотолерантности /-го вида, определяемый по табл. 1.5 в соответствии с видом лишайника; с,- — проективное покрытие i-ro вида.
СПРАВОЧНЫЙ МАТЕРИАЛ
Рекомендации по сбору и определению лишайников
•	Собирать лишайники следует в заранее приготовленные конверты. Наиболее удобны для этого конверты из проклеенной бумаги: лист бумаги складывается вдвое так, чтобы нижняя часть была на 1,5—2 см длиннее верхней. Свободный конец нижней части листа загибается на верхнюю сторону будущего конверта. После этого боковые стороны загибаются на верхнюю сторону так, чтобы одна из них вошла в другую на 2—3 см.
•	Перед тем как закладывать образец в конверт, следует написать дату сбора, принадлежность к тому или иному роду или виду, анатомические и физиологические признаки разных видов или их номера в атласе-определителе.
•	Лишайники не следует собирать в сухом виде, так как при этом они легко ломаются. Сухие экземпляры нужно немного смочить водой.
•	Собирать лишайники лучше всего с субстратом — куском коры, древесины, горной породы и т.п., на котором они растут.
3 Мелехова
65
•	Нередко в одной дерновинке можно встретить два и более видов (иногда даже одного рода) лишайников, которые при осмотре могут быть неразличимы. Для определения надо брать индикаторный вид.
•	Выбранные экземпляры нужно отделить пинцетом или ножом от дерновинки и размочить в воде, так как зачастую только при этом условии лишайник приобретает естественные форму и цвет. Для предотвращения плесневения и порчи в период хранения лишайники предварительно тщательно высушивают. Они быстро и хорошо высыхают непосредственно на воздухе, полностью сохраняя свой естественный облик и окраску. Хранить лишайники лучше в небольших картонных коробочках.
•	Качественное изучение собранного материала проводится в лаборатории по соответствующим определителям.
Перечень некоторых лишайников-индикаторов загрязнения воздуха сернистым газом
1.	Гипогимния (Hypogymnia sp.). Гипогимния вздутая (Hypogymnia physodes) — один из обыкновеннейших лишайников, которые растут на коре и ветвях лиственных (чаще березе) и хвойных пород (например, ели), ветви которых часто сплошь покрыты этим видом. Слоевище имеет вид округлых (на коре) или сильно вытянутых в одном направлении (на ветвях) листовидных пепельно-серых розеток, местами плотно сросшихся с субстратом. Нижняя сторона голая, морщинистая, черная или коричневато-черная, к краям светлеющая. Концы лопастей обыкновенно приподнимаются над талломом и слегка заворачиваются на верхнюю сторону.
2.	Ксантория (Xanthoria sp.). Ксантория настенная (Xanthoria parietina) распространена на коре лиственных пород (осин, тополей). Часто встречается на обработанной древесине (заборы, крыши, стены). Слоевища имеют вид почти правильных желто-оранжевых розеток диаметром больше 3 см. Яркость окраски зависит от освещенности. На солнце слоевище оранжевое, при затенении становится серовато-зеленым.
3.	Уснея (Usnea sp.). Виды уснеи свешиваются с ветвей деревьев как длинные сероватые, серовато-зеленые или коричневатые пряди, состоящие из тонких ветвящихся нитей и напоминающие бороду.
4.	Эверния (Evernia sp.). Эверния сливовая (Evernia prunastri) — «дубовый мох». Один из обыкновеннейших и широко распространенных лишайников, растущих на коре и ветвях различных лиственных деревьев. В отличие от уснеи и других кустистых лишайников слоевищные полости эвернии не округлые, а имеют вид дихотомически разветвленных лент, мягких на ощупь. Сверху они беловато- или серовато-зеленые, снизу более светлые, с розова
•66
тым оттенком. Края лопастей обычно заворачиваются на нижнюю поверхность.
5.	Леканора (Lecanora sp.). Слоевище однородное, накипное, гладкое, иногда зернистое или бородавчатое, часто мало заметное, плотно срастается с субстратом (корой дерева, камнями и т. п.). Плодовые тела (апотеции) сидячие, дисковидные. Видовая принадлежность определяется трудно.
6.	Пармелия (Parmelia sp.). — пармелия бороздчатая (Parmelia sulcata)', п.оливковая (Р. olivacea), п.козлиная (Р. caperata). Слоевища листоватые, разрезанно-лопастные, в виде крупных розеток; прикреплены к субстрату ризоидами, реже свободны. Лопасти разнообразные: узкие или широкие, сильно- или маловетвистые, плоские или выпуклые, тесно сомкнутые или раздельные. Окраска верхней стороны — от беловато-сероватой и желтоватой (Р. caperata) до коричневатой и черной, матовая или блестящая (Р. olivacea)', нижней стороны — от белой или светло-коричневой до черной. Обитает на коре деревьев, реже на замшелых почвах и скалах, на обнаженной древесине.
7.	Алектория (Alectoria/Bryoria sp.). Таллом кустистый, прямостоячий или повисающий; с волосовидными или иногда сплюснутыми главными веточками. Прикрепляется к субстрату центральным гифом, который с возрастом отмирает, и тогда таллом становится свободным. Обитает в основном на стволах деревьев, реже на мшистой почве и замшелых скалах.
8.	Рамалина (Ramalina sp.). Рамалина мучнистая (Ramalina farinacea). Таллом в виде прямостоячих кустиков, серовато- или коричнево-зеленый, 5 —6 см длиной, мягкий. Лопасти плоские, к концам немного утончаются, по краям покрыты крупными головчатыми беловатыми соралями. Поселяются на коре и обработанной древесине.
9.	Калоплака (Caloplaca sp.). Таллом накипной, всегда однородный по краю. Окраска оранжевая, желтовато-оранжевая, реже темно-коричневая. Кора таллома развита плохо, края не бывают листоватыми. Слоевище всегда в виде зернисто-бугорчатой корочки. Обитает на древесине, коре, камнях (особенно содержащих "известь), реже на почве.
10.	Фисция (Physcia sp.). Фисция припудренная (Physcia pulverulenta) часто встречается на коре осин, имеет вид изящных, округлых, правильной формы розеток оливкового или темно-коричневого цвета диаметром до 15 см. Плотно прилегает к субстрату, состоит из плоских, довольно широких или узких разветвленных лопастей и сверху покрыта обильным сизоватым налетом, отчего и кажется пепельно-серой. На верхней стороне слоевища образуются довольно крупные плодовые тела с черновато-коричневым диском. Нижняя сторона слоевища темная, почти черная, с густыми темно-серыми или черными ризоидами.
67
11.	Анаптихия (Anapthychia sp.). Анаптихия реснитчатая (Anapthychia ciliaris) наиболее распространена в парках, в светлых лиственных лесах, на придорожных деревьях. Реже ее можно встретить на скалах и древесине. Пепельно-серое или коричневато-серое слоевище имеет вид лежащих на субстрате или слегка приподнимающихся кустиков.
12.	Графис (Graphis sp.). Графис письменный (Graphis scripta) часто встречается на гладкой коре лиственных пород (ольхи, лип, особенно рябины и черемухи). Слоевище лишайника погружено в субстрат (кору), тонкокорковидное, серовато-беловатое, иногда слабо заметное и так плотно врастающее в субстрат, что о его существовании можно судить только по некоторому изменению окраски субстрата — белесым пятнам на коре, да по плодовым телам — апотециям. Апотеции в виде неправильно ветвящихся извилистых черных штрихов образуют на коре красивый узор, напоминающий восточные письмена.
Перечень терминов и анатомо-морфологических особенностей лишайников
Апотеции (ед. ч. апотеций) — один из основных типов плодового тела лишайников, характеризующихся открытым расположением гимениального слоя. Часто имеет вид маленького блюдца с диском в центре, окруженным выступающим краем.
Гимениальный слой— слой, в котором образуются сумки со спорами.
Изидии (ед. ч. изидия) — маленькие выросты слоевища.
Пикнидии — органы бесполого размножения лишайников, в которых образуются пикноконидии.
Подеции (ед. ч. подеций) — вертикальные полые выросты слоевища различной формы: кубковидные (сцифы), шиловичные, в виде разветвленных кустиков, пальцевидные.
Резины — нитевидные, корневищные выросты, развивающиеся на нижней стороне слоевища для прикрепления его к субстрату.
Слоевище (= таллом) — вегетативное тело лишайника.
Сорали — компактное скопление соредий.
Соредии — маленькие частички лишайника, с помощью которых он размножается вегетативным путем.
Пример составления карточки для выполнения лабораторной работы
Все биоиндикационные методы предполагают выполнение исследований непосредственно на природе, поэтому можно лишь смоделировать всевозможные варианты сочетаний индикаторных видов лишайников на макетах. Такие стенды-макеты легко изготовить совместно со студентами во время летних практик. Для данной лабораторной работы необходим один макет «дерева», где
. 68
собраны до 5—6 видов лишайников. На занятии студент с помощью палетки оценивает степень проективного покрытия «ствола дерева» лишайниками. Для выполнения работы по второму методу (оценка с помощью биотического индекса) необходимо изготовить карточки-стенды с 10 индикаторными видами лишайников. Студенты с помощью определителей идентифицируют лишайники. По табл. 1.3 находят биотический индекс и класс качества воздуха.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Артамонов В. И. Зеленые оракулы. — М.: Мысль, 1989.
Гарибова Л. В. Водоросли, лишайники и мохообразные СССР / Л. В. Гарибова [и др.]. — М.: Мысль, 1978.
Жизнь растений. Т. 3. Водоросли, лишайники. — М.: Просвещение, 1977.
Мэнниг У.Д. Биомониторинг загрязнения атмосферы с помощью растений / У.Д.Мэнниг, У.А.Федер. — Л.: Гидрометеоиздат, 1985.
Общая ботаника с основами геоботаники. — М.: Высшая школа, 1994. Солдатенкова Ю. П. Малый практикум по ботанике. Лишайники. — М.: Изд-во МГУ, 1977.
Сынзыныс Б. И. Экологическая диагностика качества атмосферного воздуха с помощью лишайников / Б. И. Сынзыныс, Е. И. Егорова. — М.: Русполиграф, 1997.
Трасс X. X. Классы полеотолерантности лишайников и экологический мониторинг // Проблемы экологического мониторинга и моделирования экосистем. — Л.: Гидрометеоиздат, 1985. — Т.7.
Dobson F.S. Lichens. — Richmond Publishing Co, 1992.
Лабораторная работа №2. СОСНА В КАЧЕСТВЕ ТЕСТ-ОБЪЕКТА В РАДИО- И ОБЩЕЭКОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ
{Лабораторная работа подготовлена Е. И. Егоровой)
Индикаторные растения (см. 2.2) могут использоваться как для выявления отдельных загрязнений воздуха, так и для оценки общего состояния воздушной среды.
Факт исключительно высокой радиочувствительности хвойных древесных пород был отмечен во многих исследованиях зарубежных и российских ученых (табл. 2.1). Так, на территории Восточно-Уральского радиоактивного следа (ВУРС) сосна погибла на участке с плотностью радиоактивного загрязнения более 6,7 • 10 14 Бк*/км2 (поглощенные дозы 30—40 Гр* **). Сосна по радиочувствительности
♦Беккерель (Бк) — единица активности нуклида в радиоактивном источнике в СИ.
**Грей (Гр) — единица поглощенной дозы в СИ. Это количество энергии ионизирующего излучения, поглощенной единицей массы физического тела.
69
Таблица 2.1
Радиационные эффекты в растительном сообществе (Д. А. Криволуцкий, 1988)
Характер поражения	Доза облучения, Гр		
	весной	осенью	хроническое облучение
Г ибель голосеменных	10	15	50
Частичное угнетение травянистых растений	25	50	100
Поражение лиственных деревьев	—	50	100
Гибель лиственных деревьев	—	125	200
Частичная гибель травянистых растений	200	325	530
Полная гибель растительности (нелитературным данным)	3 000	6 000	—
близка к человеку (LD50 = 20 Гр), поэтому она является одним из основных природных тест-систем в радио- и общеэкологических исследованиях.
Радиационные эффекты оцениваются по следующим критериям: гибель и восстановление деревьев; сроки восстановления; морфологические изменения хвои и побегов; количественные характеристики (радиальный и вертикальный прирост, масса и размер хвои и побегов). Репродуктивная способность оценивается по изменчивости семян.
Большинство выявленных морфологических изменений (мор-фозов) сосны, которая произрастала в радиоактивно загрязненных районах, связаны с изменениями в меристемных тканях — это группа клеток в стадии активного деления и роста. Такая ткань представляет собой два типа клеток: одна с высокой репродуктивной способностью, другая с различной степенью дифференциации. Известно, что чувствительность клеток прямо пропорциональна степени их дифференциации. Именно поэтому при высоких дозах облучения наблюдаются гибель верхушечных побегов и появление побегов из боковых почек, находящихся на ранних стадиях дифференциации. Более глубокие причины различий радиочувствительности меристемных тканей следует связать с биохимическими нарушениями в метаболизме клеток. При радиоактивном облучении наблюдаются: гибель почек, хвои, побегов; торможение роста побегов и хвои; двойной прирост в течение одного года вегетации; неравномерный рост хвои на побегах; уко-роченность побегов при интенсивном росте хвои («метлообразные» побеги); многопочечность (появление на побегах верхних
70
мутовок до 30 почек вместо 5—6 в норме); нарушение ориентации хвои и побегов в пространстве (появление «мятой» хвои); искривление побегов; изменение формы хвои; появление гигантизма и карликовости побегов и хвои. Известно, что репродуктивные органы сосны обыкновенной более чувствительны к облучению, чем вегетативные. Особенно высокой радиочувствительностью обладают мужские генеративные органы. Подтверждение этому специалисты наблюдали в зоне сильного и среднего радиоактивного загрязнения после аварии на Чернобыльской АЭС: мужские цветки отсутствовали в течение первых двух лет после аварии, женские цветки также были частично или полностью поражены.
Хвойные породы, помимо их высокой радиочувствительности, особенно сильно страдают от сернистого газа. Чувствительность к нему убывает в последовательности: ель — пихта — сосна вейму-това и обыкновенная — лиственница. Продолжительность жизни хвои сосны в нормальных условиях составляет 3—4 года. За это время она накапливает такое количество сернистого газа, которое существенно превышает пороговое значение. Под влиянием токсиканта хвоя сосны в зонах сильного загрязнения становится темно-красной, окраска распространяется от основания иглы к ее острию, и, просуществовав всего один год, хвоя отмирает и опадает. Лиственница, ежегодно сбрасывающая хвою, значительно устойчивее к сернистому газу. Поэтому по продолжительности жизни хвои сосны и характеру некрозов можно определить степень поражения сосновых насаждений сернистым газом.
По наблюдению ученых толщина воскового слоя на хвое сосны тем больше, чем выше концентрация или продолжительность воздействия на нее сернистого газа. Это послужило основанием для разработки количественного метода индикации данного соединения в атмосфере. Суть метода «помутнения по Гертелю» заключается в том, что степень помутнения экстракта хвои прямо пропорциональна количеству воска, покрывающего хвою. Чем выше мутность, устанавливаемая фотоколориметрически, тем больше концентрация сернистого газа в воздухе. Однако современные исследования показали, что помутнение водного экстракта из’ хвои вызвано не только воском, но и целым рядом других веществ, присутствующих в растительных тканях. В связи с этим возникли сомнения относительно достоверности результатов теста по Гертелю. Между тем накопление эпикутикулярного воска под влиянием сернистого газа обнаружено и у других растений, например у райграса. По этой причине, возможно, следует определять не интенсивность помутнения экстракта, а непосредственно содержание воска в растительном материале.
Вместе с тем двуокись серы вызывает у сосны обыкновенной характерные изменения в содержании фенольных соединений, ко
71
торые наблюдаются задолго до появления видимых симптомов повреждения.
Принцип предложенного в лабораторной работе метода основан на выявленной зависимости степени повреждения хвои (некрозов и усыхания) от загрязнения воздуха в районе произрастания сосны обыкновенной.
Цель работы — экспресс-оценка качества воздуха по состоянию хвои Pinus sylvestris.
Для выбора подходящих деревьев (тест-объектов для определения степени усыхания и повреждения хвои в полевых условиях) потребуются увеличительные стекла (или лупы), карандаш, блокнот, компас. Порядок работы следующий:
1.	Выбрать сосенки высотой 1—1,5 м на открытой местности с 8—15 боковыми побегами. Выборку хвои необходимо делать с нескольких близко растущих деревьев на площади 10 х 10 м2. В блокнот вносятся сведения о месте сбора и наличии вблизи возможного интенсивного движения транспорта; указывается также время осмотра хвои. Очень важен при выборе деревьев показатель вы-топтанности участка произрастания сосны. Степень вытоптанно-сти участка оценивается баллами 1—4:1 — вытаптывания нет; 2 — вытоптаны тропы; 3 — нет ни травы, ни кустарников; 4 — осталось немного травы вокруг деревьев. При вытоптанности территории, оцениваемой баллами 3 и 4, экспресс-оценка воздушного загрязнения невозможна.
2.	Осмотреть у каждого дерева хвоинки предыдущего года (вторые сверху мутовки). Если деревья очень большие, то обследование проводить на боковом побеге в четвертой сверху мутовке (рис. 2.1). Всего собирают или осматривают не менее 30 хвоинок. Ши-пик хвоинки всегда светлее. Он не оценивается. По степени повреждения и усыхания хвои выделяют несколько классов (табл. 2.2).
Рис. 2.1. Участок побега, на котором проводят обследование хвои для экспресс-анализа качества воздуха
 72
Таблица 2.2
большим числом мелких пятен; 3 — хвоинки с большим числом черных и желтых пятен. Классы усыхания: 1 — на хвоинках нет сухих участков; 2 — на хвоинках усох кончик 2— 5 мм; 3 — усохла 1/3 хвоинки; 4 — вся или большая часть хвоинки сухая.
3.	Определить продолжительность жизни хвои. Обследовать верхушечную часть ствола за последние годы: каждая мутовка, считая сверху, — это год жизни (см. рис. 2.1).
4.	Провести оценку степени загрязнения воздуха по оценочной шкале, включающей возрастные характеристики хвои, а также классы повреждения хвои на побегах второго года жизни с помощью табл. 2.3.
Оборудование и материалы:
лупа, стенды с хвоей разной степени поврежденности, индивидуальное задание на карточке.
ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ ЛАБОРАТОРНОЙ РАБОТЫ
1.	Получить у преподавателя задание на карточке.
2.	Оценить, пользуясь табл. 2.2, класс повреждения (некроз) и усыхания хвоинок сосны. Занести данные по всем хвоинкам в тетрадь. Провести статистическую обработку данных.
3.	Определить продолжительность жизни хвои, используя рис. 2.1.
4.	Провести экспресс-оценку загрязнения воздуха по классу повреждения хвои на побегах второго года жизни с учетом возраста хвои с помощью табл. 2.3.
73
Таблица 2.3
Экспресс-оценка загрязнения воздуха (I—VI) с использованием сосны обыкновенной (Pinus sylvestris)
Максимальный возраст хвои	Класс повреждения хвои на побегах второго года жизни		
4	I	I—II	III
3	I	II	III —IV
2	II	III	IV
2	—	IV	IV-V
1	—	IV	V-VI
1	—	—	VI
Примечание. 1 — воздух идеально чистый; II — чистый; III — относительно чистый («норма»); IV — загрязненный («тревога»); V — грязный («опасно»); VI — очень грязный («вредно»);----невозможные сочетания.
5.	Привести в отчете все типы повреждений хвои, указанных в задании; выводы о качестве воздуха (привести расчеты и таблицы). Можно строить трансекты по удаленности от воздействующего фактора.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Артамонов В. И. Зеленые оракулы. — М.: Мысль, 1989.
Криволуцкий Д. А. Экологическое нормирование на примере радиоактивного загрязнения экосистем //Д. А. Криволуцкий [и др.] // Методы биоиндикации окружающей среды в районах АЭС. — М.: Наука, 1988.
Последствия Чернобыльской катастрофы: Здоровье среды / под ред. В. М. Захарова, Е. Ю. Крысанова. — М.: ЦЭПР, 1996.
Тихомиров Ф.А. Действие ионизирующих излучений на экологические системы. — М.: Атомиздат, 1972.
Лабораторная работа №3. ФЛУКТУИРУЮЩАЯ АСИММЕТРИЯ ДРЕВЕСНЫХ И ТРАВЯНИСТЫХ ФОРМ РАСТЕНИЙ КАК ТЕСТ-СИСТЕМА ОЦЕНКИ КАЧЕСТВА СРЕДЫ {Лабораторная работа подготовлена Е. И. Егоровой на основе методических рекомендаций В. М. Захарова)
Для целей биомониторинга могут использоваться только те виды живых организмов, которые отвечают требованиям, применяемым к биоиндикаторам. Для оценки качества водной среды опти
74
мальными являются водные и околоводные крупные высшие сосудистые растения, многие из которых могут являться биоиндикаторами. Листья у них формируются каждый год, что позволяет проводить ежегодный мониторинг; многие виды имеют массовое распространение и четко выраженные признаки, по которым возможно проводить исследование. Оценка воздушной среды, или интегральная оценка качества среды обитания живых организмов, проводится по состоянию высших древесных и травянистых форм растений.
Наиболее удобными для целей биоиндикации являются следующие виды растений: травянистые — сныть обыкновенная {Aegopo-dium podagraridy, мать-и-мачеха обыкновенная {Tussilago farfardy, древесные: тополь бальзамический {Populus balsamiferdy, клен остролистный {Acer platanoides) и ясенелистный {A. negundo); береза бородавчатая {Betula pendula)', водные — рдест пронзеннолистный {Potamogeton perfoliatus)', рдест блестящий {Р. lusens)', рдест плавающий {Р. natans).
Все перечисленные растения имеют четко выраженную двустороннюю симметрию, что является главным требованием метода. Кроме указанных растений часто для биомониторинга стабильности развития используют: подорожник большой {Plantago major) как наиболее пластичный вид травянистых растений; манжетку обыкновенную {Alchemilla vulgaris) и клевер гибридный {Trifolium hybridum) и ползучий {Т. repens) как луговые виды; ячмень {Hordeum sp.), овес {Avenna sp.) и пшеницу {Triticum sp.) как сельскохозяйственные культуры для оценки состояния агроценозов.
Береза бородавчатая (повислая) Betula pendula и близкий к ней вид береза пушистая B.alba способны скрещиваться между собой, образуя межвидовые гибриды, которые обладают признаками обоих видов. Во избежание ошибок следует выбирать деревья с четко выраженными признаками одного вида.
Принцип метода основан на выявлении нарушений симметрии развития листовой пластины древесных и травянистых форм растений под действием антропогенных факторов.
Цель работы — интегральная экспресс-оценка качества среды обитания живых организмов по флуктуирующей асимметрии листовой пластины березы повислой {Betula pendula).
Сбор материала. Для сбора материала в полевых условиях необходимы карандаш, блокнот, компас, курвиметр или линейка, атласы-определители высших растений; пакеты для сбора листьев.
Начинать сбор материала необходимо после завершения интенсивного роста листьев. В средней полосе России это соответствует концу мая — началу июня. Выборку листьев древесных растений необходимо делать с нескольких близко растущих деревьев на площади 10 х 10 м или на аллее длиной 30—40 м, в исклю-
75
читальных случаях с 2—3 растений. Выборка листьев травянистых растений делается с нескольких экземпляров на площади 1 м2. Используются только средневозрастные растения, исключая молодые и старые. Всего надо собрать не менее 25 листьев среднего размера с одного вида растения. Листья собирать из нижней части кроны, на уровне поднятой руки, с максимального количества доступных веток, направленных условно на север, запад, восток и юг. У березы использовать листья только с укороченных побегов. На каждой площадке исследуют максимальное количество видов (но не менее одного древесного и одного травянистого), однако конкретный объем выборки должен определяться на основе статистических методов.
Обработка материала. Обработку материала удобно проводить в лаборатории. Весь собранный материал должен быть снабжен точной информацией о месте сбора, наличии вблизи возможного загрязнения интенсивности движения транспорта, времени сбора и исполнителе. Хранить собранный материал можно не более недели на нижней полке холодильника.
Рис. 3.1. Измерение длин жилок на листьях травянистых и древесных пород (объяснение см. в тексте)
76
Обработка заключается в измерении длин жилок на листьях справа и слева. На рис. 3.1 цифрами обозначены листья следующих деревьев: 1 — березы, измеряется первая жилка от основания листа; 2 — тополя, первая жилка от основания листа; 3 — остролистного клена, средняя жилка боковых пластин справа и слева; 4 — мать-и-мачехи, вторая жилка от основания черешка; 5 — клена американского, первая жилка от основания черешка; 6 — сныти, первая жилка от основания черешка; 7 — клевера ползучего, первая жилка от основания черешка. Жилки измеряются курвиметром или линейкой с точностью до 1 мм. Интерес представляют не размеры жилок, а разница их длины справа и слева.
Существуют более детальные расчеты флуктуирующей асимметрии. С одного листа снимают показатели по пяти параметрам (рис. 3.2). Отдельно фиксируют «загнутость» макушки листа (рис. 3.3). Данные измерений заносят в табл. 3.1. Величину флуктуирующей асимметрии оценивают с помощью интегрального показателя — величины среднего относительного различия по признакам (среднее арифметическое отношение разности к сумме промеров листа справа и слева, отнесенное к числу признаков).
Рис. 3.2. Параметры промеров листьев для детального расчета:
1 — ширина половинки листа (лист складывают пополам, потом разгибают и по образовавшейся складке проводят измерений); 2 — длина второй жилки от основания листа; 3 — расстояние между основаниями первой и второй жилок; 4 — расстояние между концами этих жилок; 5 — угол между главной и второй от основания жилками
77
Рис. 3.3. Примеры «загнутости» макушки листа:
1 — не загнута; 2 — загнута влево; 3 — загнута вправо; 4 — «ласточкин хвост»
12	3	4
Коэффициент флуктуирующей асимметрии определяют по формуле, предложенной В. М. Захаровым:
ХИ., 5'—— ^1-г
где Md = —— — среднее различие между сторонами; п
л Wx-dr)
ai-r —j —д— — различие значений признаков между левой (7) и правой (г) сторонами; п — число выборок.
Качественные признаки считают по проценту суммы асимметричных листьев:
где па — число асимметричных особей; пс — число симметричных листьев.
Показатель асимметрии указывает на наличие в среде обитания живых организмов негативного фактора. Это может быть химическое загрязнение, изменение температуры, обитание биологического объекта на краю ареала и др. Показатель откликается повышением на изменение фактора и стабилен при адаптации к имеющимся условиям. Таким образом, на основании периодического вычисления показателя можно проследить изменения условий обитания объекта.
При балльной оценке используют таблицу соответствия баллов качества среды значениям коэффициентов асимметрии (см. табл. 3.2).
Оборудование и материалы:
курвиметр (линейка); гербарий листьев березы повислой, индивидуальное задание на карточке.
ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ ЛАБОРАТОРНОЙ РАБОТЫ
1.	Получить у преподавателя задание на карточке.
2.	В соответствии с рис. 3.1 измерить жилки листовой пластины березы. Занести данные по всем листьям в табл. 3.1. Провести статистическую обработку данных.
78
Таблица 3.1
Результаты замеров листьев травянистых и древесных пород
Дата				Исполнитель							
Место сбора											
№	Ширина половинок		Длина 2-й жилки		Расстояние между основаниями 1- и 2-й жилок		Расстояние между концами 1- и 2-й жилок		Угол между центральной и 2-й жилками		Форма макушки
	л	пр	л	пр	л	пр	л	пр	л	пр	
1											
2											
Примечание, л — левая сторона; пр — правая сторона.
Таблица 3.2
Балльная система качества среды обитания живых организмов по показателям флуктуирующей асимметрии высших растений (по А. Б. Стрельцову, 2003)
Виды	Балл				
	1	2	3	4	5
Береза бородавчатая	< 0,055	0,056—0,060	0,061-0,065	0,065 - 0,070	> 0,070
Все виды растений	<0,0018	0,0019-0,0089	0,0090- 0,022	0,022-0,04	>0,04
3.	В соответствии с рис. 3.2 измерить жилки листовой пластины березы по пяти параметрам. Занести данные по всем листьям в табл. 3.1. Провести статистическую обработку данных.
4.	Провести экспресс-оценку загрязнения окружающей среды по результатам всех измерений. Сделать вывод о качестве среды обитания живых организмов в соответствии с табл. 3.2.
Баллы соответствуют следующим характеристикам среды обитания живых организмов: 1 — чисто; 2 — относительно чисто («норма»); 3 — загрязнено («тревога»); 4 — грязно («опасно»); 5 — очень грязно («вредно»).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Последствия Чернобыльской катастрофы: Здоровье среды / под ред. В. М. Захарова, Е. Ю. Крысанова. — М.: Моск. отд. Международного фонда «Биотест», 1996.
79
Стрельцов А. Б. Региональная система биологического мониторинга. — Калуга: Изд-во Калужского ЦНТИ, 2003.
Лабораторная работа №4. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ФЛУКТУИРУЮЩЕЙ АСИММЕТРИИ ЖИВОТНЫХ
ДЛЯ ОЦЕНКИ КАЧЕСТВА СРЕДЫ
{Лабораторная работа подготовлена Е. И. Егоровой на основе методических рекомендаций В. М. Захарова)
Оценка стабильности развития рыб проводится по флуктуирующей асимметрии и частоте фенодивиантов пяти меристических признаков карася золотого {Carassius carassius) и карася серебряного {Carassius auratus). На рис. 4.1 представлены показатели, которые обычно используются в ихтиологических исследованиях.
Рис. 4.1 Схема морфогенетических показателей, используемых для оценки стабильности развития рыб: золотого карася и серебряного карася (по рисунку Д. Шепоткина):
1—5 — меристические признаки; в скобках указана условная «норма» — обычное значение или диапазон значений признака (*— золотого карася; ** — серебряного карася): 1 — число лучей в грудных плавниках (* — 15— 16,** — 18—19); 2 — число лучей в брюшных плавниках (* — 9, ** — 9); 3 — число жаберных тычинок (♦ — 26— 29, ** — 46— 49); 4 — число глоточных зубов (* — 4, ** — 4);
5 — число чешуи в боковой линии (* — 29—31, ** — 28—29)
§0
Оценка стабильности развития земноводных проводится по флуктуирующей асимметрии 13 признаков бесхвостых амфибий — зеленых лягушек гибридного комплекса Rana esculenta (R. lessonae и R. esculenta). На рис. 4.2 представлен комплекс показателей морфогенетического гомеостаза лягушек.
Оценка стабильности развития млекопитающих проводится по флуктуирующей асимметрии 10 краниологических признаков рыжей полевки {Clethrionomys glareolus) и обыкновенной бурозубки {Sorex araneus). На рис. 4.3 приводится такая оценка на примере рыжей полевки.
Принцип предложенного в лабораторной работе метода основан на нарушении симметрии развития показателей морфогенетического гомеостаза животных под действием антропогенных факторов.
Цель работы — интегральная экспресс-оценка качества среды обитания лживых организмов по флуктуирующей асимметрии некоторых признаков позвоночных и беспозвоночных животных.
Сбор материала. В полевых условиях для отлова и подготовки материала к анализу понадобятся карандаш, блокнот, атласы-определители позвоночных и беспозвоночных животных, 70%-й и 96%-й спирт, 3%-й формалин, удочки с крючком № 4, мышеловки, приманки, мешочки для сбора материала.
Рис. 4.2. Схема морфогенетических показателей {1—13), используемых для оценки стабильности развития зеленых лягушек гибридного комплекса Rana esculenta (по рисунку Д. Шепоткина);
1— 7 — признаки окраски: число полос (/) и пятен (2) на бедре; число полос (3) и пятен (4) на голени; число полос (5) и пятен (<5) на стопе; число пятен на спине (7); 8—11 — признаки кожных покровов: число пятен на вентральной стороне второго (8), третьего (9) и четвертого (10) пальцев; число пор на вентральной стороне третьего пальца (11); 12—13 — остеологические признаки: число зубов на межчелюстной кости (12) и сошнике (13)
81
Рис. 4.3. Схема морфогенетических показателей, использованных д ля оценки стабильности развития млекопитающих на примере рыжей полевки (Clethrionomys glareolis) (по рисунку Д. Шепоткина):
1— 10 — краниологические признаки (число отверстий для выхода мелких кровеносных сосудов и нервов); 1 — (1); 2 — (1 — 2); 3 — 0; 4 — (3—4); 5 — (1); 6 — (1); 7 — (1 — 2); 8 — (1); 9— (1); 10 — (1). В скобках указана условная «норма» — обычное значение или диапазон значений признака
Отлов рыб производится с помощью удочки или водяного сачка. Оптимально использовать свежепойманную рыбу. Если это невозможно, то собранный материал помещают в морозильную камеру. При фиксации использовать 70%-й спирт или 3%-й формалин.
Зеленых лягушек отлавливают удочкой с крючком № 4. На крючок насаживается приманка (кузнечик, муха или имитатор в виде темной бумаги, резины). Подойти к лягушке на расстояние удочки и поднести приманку к ее рту, слегка покачивая. Отлов бурых лягушек производят вручную или с использованием почвенных ловушек Барбера. Если нет возможности обработать или зафиксировать материал сразу, лягушек можно хранить несколько дней в
82
тряпичных мешочках, куда предварительно кладут пучок травы во избежание «вспенивания» животных. Ежедневно необходимо увлажнять мешочек и просматривать лягушек. Для более длительного хранения лягушек фиксируют в 96%-м спирте или 3%-м формалине.
Рыжих полевок отлавливают с помощью стандартных мышеловок в типичных местах обитания вида в количестве не менее 20 особей с одной точки. В качестве приманки хорошо использовать смоченный подсолнечным маслом белый хлеб. Мышеловки ставят возле нор, коряг, пней, поваленных деревьев на расстоянии 2— 3 м друг от друга. Тела животных фиксируют в 96%-м спирте.
Оборудование и материалы:
бинокуляр; чашки Петри; энтомологические булавки; резиновые перчатки; фиксированный материал рыб и лягушек, выдержанный предварительно в воде; черепа рыжей полевки.
Перед работой с черепами рыжей полевки головы отделяют от тушек и вываривают в воде 30—40 мин после закипания. Далее вычищают череп, используя глазной пинцет, препаравальные иглы, зубную щетку с жесткой щетиной, глазной скальпель. Очищенные черепа высушивают и хранят каждый в отдельной таре с этикеткой.
ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ ЛАБОРАТОРНОЙ РАБОТЫ
1.	С каждого препарата рыб снять 5 признаков в соответствии с рис. 4.1.
2.	С каждого препарата лягушек снять до 11 признаков в соответствии с рис. 4.2 (как правило, не учитывая признаки зубов).
3.	С каждого черепа рыжей полевки снять до 10 параметров в соответствии с рис. 4.3.
4.	Данные измерений занести в таблицу:
Феногенетические признаки исследуемых животных
Дата			Исполнитель					Вид						
Место сбора														
№ препа-рата	№ признака													
	1		2		3		4		5		...		к	
	Л	пр	Л	пр	Л	пр	Л	пр	Л	пр	л	пр	Л	пр
1														
2														
														
20														
Примечание, л — левая сторона; пр — правая сторона.
83
Таблица 4.1
Оценка качества окружающей среды в баллах по интегральному показателю стабильности развития животных
(по В. М. Захарову, 1996)
Класс	Коэффициент асимметрии согласно балльной оценке				
	1 (чисто)	2 (относительно чисто)	3 (загрязнено)	4 (грязно)	5(очень грязно)
Рыбы	<0,35	0,35-0,40	0,40-0,45	0,45—0,50	>0,50
Земноводные	<0,50	0,50-0,55	0,55-0,60	0,60-0,65	>0,65
Млекопитающие	<0,35	0,35-0,40	0,40-0,45	0,45-0,50	>0,50
5.	Провести оценку величины флуктуирующей асимметрии по дисперсии относительного различия между сторонами (л — левая, пр — правая), основанной на оценке величины дисперсии различий между сторонами не от нуля (строгой симметрии), а от некоторого среднего различия между ними, имеющего место в рассматриваемой выборке особей (см. лаб. работу № 3).
6.	Для анализа асимметрии качественных признаков рассчитать среднее число асимметричных признаков (ЧАП) на особь:
к
ЧАП = £*—,
ПК
где А, — число асимметричных проявлений признака i (число особей, асимметричных по признаку 0; п — численность выборки; к — число признаков.
7.	Провести балльную оценку качества среды обитания в соответствии с табл. 4.1, в которой приведены коэффициенты асимметрии.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Захаров В.М. Асимметрия животных. — М.: Наука, 1987.
Последствия Чернобыльской катастрофы: Здоровье среды / под ред. Захарова В. М., Крысанова Е. Ю. — М.: Моск. отд. Международного фонда «Биотест», 1996.
Стрельцов А. Б. Региональная система биологического мониторинга. — Калуга: Изд-во Калужского ЦНТИ, 2003.
84
4.1.2. Оценка качества воды
Лабораторная работа № 5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОБЩЕГО МИКРОБНОГО ЧИСЛА В ВОДОЕМЕ
{Лабораторная работа подготовлена Е. И. Егоровой)
В связи с тем что определение патогенных бактерий при биологическом анализе воды представляет собой непростую и трудоемкую задачу, в качестве критерия бактериологической загрязненности используют подсчет общего числа образующих колонии бактерий {Colony Forming Units — CFU) в 1 мл воды. Полученное значение называют общим микробным числом.
Пробы воды для микробиологического исследования отбирают с соблюдением правил стерильности в стерильную стеклянную посуду с притертыми или ватно-марлевыми пробками. В стоячих водоемах пробы отбирают с помощью батометров, погруженных на уровень 10 —15 см от дна, в проточных водоемах — около берега и в центре течения. При плановом санитарном контроле отбирают не менее 500 мл воды. Микробиологическое исследование выполняют не позднее 2 ч с момента взятия пробы (либо при условии хранения при температурах 1 — 5 "С не более 6 ч).
Выявление микроорганизмов и их учет можно произвести путем высева проб в простые жидкие и агаризованные питательные среды. Для учета некоторых гетеротрофных* сапротрофных** бактерий используют мясопептонный агар (МПА). Обычно число сапротрофных микроорганизмов, выращенных на МПА, соответствует степени загрязненности воды органическими веществами и косвенно характеризует ее санитарное состояние. Для выделения бактерий и подсчета общего микробного числа в основном используют метод фильтрации через мембрану (рис. 5.1) или глубинным посевом.
Принцип предложного в лабораторной работе метода заключается в том, что пробы воды (объем зависит от типа водоема и степени его эвтрофикации) фильтруют через мембранные фильтры. Затем фильтры стерильно раскладывают на поверхность аГй-ризованной среды для проращивания осевших на них микроорга-
* Гетеротрофные организмы (от гетеро... и ... троф) — организмы, использующие в качестве источника углерода экзогенные органические соединения. Участвуют в минерализации органических соединений в биосфере. К ним относятся животные, большинство бактерий, актиномицеты, грибы, а также некоторые безхлорофильные высшие растения, в том числе паразитирующие цветковые и некоторые водоросли.
** Сапротрофы (от греч. dapros — гнилой и ...троф) — гетеротрофные организмы, использующие для питания органические соединения мертвых тел или выделения (экскременты) животных.
85
низмов. После инкубации подсчитывают количество колоний, выросших на поверхности мембранных фильтров.
Цель работы — определение общего микробного числа в водоеме, расположенном в рекреационной зоне города.
Оборудование, материалы и реактивы:
стерильные чашки Петри, стерильные мембранные фильтры (г/ = 0,45мкм); фильтровальный прибор Зейтца; водоструйный насос; мясопептонный агар (МПА); стерильный пинцет; 70 %-й спирт; спиртовка; термостат; стерильные колбы.
ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ ЛАБОРАТОРНОЙ РАБОТЫ
Фильтры стерилизуют кипячением в дистиллированной воде по 1 — 5 мин. Фильтры с дефектами отбрасывают.
1.	Сделать серию последовательных разведений (102—106) воды из водоема (в зависимости от предполагаемой степени загрязнения). По 10 мл воды из каждого разведения пропустить через мембранные фильтры, наложенные на предварительно профламби-рованную поверхность фильтровального прибора Зейтца, используя водоструйный насос. В результате на поверхности мембраны остаются все находящиеся в воде бактерии. Каждую пробу анализировать в 3 — 5-кратной повторности.
2.	Разлить по 20 мл МПА в чашки Петри.
3.	Мембранные фильтры с бактериями стерильным пинцетом поместить фильтратом на поверхность питательной среды в чашки Петри на 24 ч. Чашки перевернуть и инкубировать при температуре 30—37 °C в термостате.
Проба воды
Рис. 5.1. Схема учета микроорганизмов методом мембранных фильтров
Мембрана, помещенная в питательный раствор
Инкубация
86
4.	По истечении времени инкубации подсчитать количество колоний микроорганизмов на поверхности питательного агара, которые можно наблюдать на чашках Петри (рис. 5.2). Подсчет следует провести на всех параллельных чашках и найти среднее значение.
Внимание! Такой метод анализа воды предполагает определение только общего числа колоний, образованных бактериями разных типов, поэтому по его результатам нельзя однозначно судить о присутствии в воде патогенных микроорганизмов. Однако высокое микробное число свидетельствует об общей бактериологической загрязненности воды и высокой вероятности наличия патогенных организмов (табл. 5.1).
5.	Численность клеток гетеротрофных микроорганизмов в I мл воды рассчитать по формуле А = NR/w, где N — число колоний на чашке, кл; Ji — разведение, из которого произведен посев; 10 — пересчет на 1 мл.
Внимание! Посев можно провести глубинным методом. Для этого по 1 мл исследуемой воды из разведений 102—106 внести в чашки Петри, залить сверху расплавленным и охлажденным до 45—50 °C МПА, круговыми движениями по столу размешать посев. Дать застыть, перевернуть чашку и инкубировать в термостате 24 ч при 30—37 °C. Подсчет общего микробного числа сделать с учетом раз-ведений.
6.	После подсчета всех колоний на чашке их можно сгруппировать по культуральным признакам, сделать мазки, прокрасить по Граму для оценки морфологических характеристик и определить микроорганизмы до рода (или до вида).
Рис. 5.2. Рост гетеротрофных микроорганизмов на чашках Петри
87
Таблица 5.1
Классы качества воды природных водоемов по бактериальным показателям
Показатель	Классы качества воды				
	предельно чистая	чистая	удовлетворительно чистая	загрязненная	грязная
Численность бактерий планктона, млн кл/мл	<0,3	0,3-1,5	1,6-5,0	5,1-11,0	>11,0
Численность гетеротрофных бактерий, тыс. кл/мл	<0,1	0,1-1,0	1,1-5,0	5,1-10,0	> 10,0
Численность бактерий группы кишечной палочки, тыс. кл/мл	<0,003	0,003 - 2,0	2,1-10,0	11,0-100	>100
7.	По табл. 5.1 определить, к какому классу качества относится вода из тестируемого водоема, находящегося в рекреационной зоне города.
СПРАВОЧНЫЙ МАТЕРИАЛ
Стерилизация посуды и сред
В микробиологии стерилизация, или обеспложивание (от лат. sterilis — бесплодный), означает полное уничтожение вегетативных клеток, спор и цист микроорганизмов. Существует несколько способов стерилизации.
1.	Прокаливание, или фламбирование в пламени горелки (иглы, петли, горлышки колб, пробирок).
2.	Сухим жаром стеклянную посуду в суховоздушных стерилизаторах в течение 2 ч при 170 °C. Перед стерилизацией стеклянные пробирки и колбы закрывают ватными пробками, отверстия оборачивают бумагой.
3.	Насыщенным паром под давлением питательные среды в автоклаве при температуре 120 °C, давлении 1 атм в течение 20 мин.
Приготовление питательных сред
Наиболее удобны в работе готовые сухие питательные среды, разведение которых указано на этикетке. Однако мясопептонный
. 88
агар (МПА) легко приготовить в лабораторных условиях. Для этого бульонные говяжьи кубики развести в дистиллированной воде. Внести в среду 1 % пептона и 2 % агар-агара. Смесь настоять I ч, затем нагреть на водяной бане до полного растворения агара. МПА стерилизовать автоклавированием в колбах или пробирках.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Гигиенические требования к охране поверхностных вод. — СанПиН 2.1.5.980-00.
Руководство по методам гидробиологического анализа поверхностных вод и донных отложений / под ред. В. А. Абакумова. — М.: Госком-гидромед, 1983.
Санитарно-микробиологический анализ питьевой воды. Методические указания. — J4.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2001.
Те	ппер Е. 3. Практикум по микробиологии / Е.З. Теппер [и др.]. — М.: Колос, 1993.
Лабораторная работа №6. БИОЛОГИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ ВОДОЕМА МЕТОДОМ САПРОБНОСТИ
{Лабораторная работа подготовлена Е. И. Егоровой)
Под сапробностью принято понимать степень распада органических веществ в загрязненных водоемах. Сапробионты, или сапробные организмы могут служить индикаторами загрязнения или различных степеней разложения органических веществ в водоеме. Распад органики в водоеме приводит к дефициту кислорода и накоплению ядовитых продуктов (углекислоты, сероводорода, органических кислот и др.). Способность организмов обитать в условиях разной степени сапробности объясняется потребностью в органическом питании, устойчивостью к дефициту кислорода и выносливостью к вредным веществам, образующимся в процессе разложения органического вещества (табл. 6.1).
Принцип метода сапробных индикаторов основан на взаимосвязи организмов со средой обитания. Понятие сапробности, с одной стороны, приближается к значению эвтрофикации, так как включает трофическую характеристику, а с другой стороны, сап-робность близка к токсичности или загрязненности, поскольку характеризует действие в среде отрицательных факторов (дефицит или отсутствие кислорода, продукты разложения органики и т.д.). Таким образом, понятие сапробности приобретает значение характеристики качества воды.
Организмы водоема относятся к планктону и бентосу, ряд из них составляет перифитон (обрастания). В планктон включают те
89
Таблица 6.1
Основные характеристики зон сапробности
Показатель	Полисапробные	Альфа-мезосапробные
Кислородные условия	Анаэробные	Полуанаэробные
Азотистые соединения	Белковые вещества	Аммиак, аминокислоты
Сероводород	Много	Достаточно много
Загниваемость	Загнивает	Загнивает
Бактерий в 1 мл воды	109	106
Преобладание отдельных видов	Оченьсильное	Небольшое
Разнообразие видов	Очень малое	Небольшое
Смена сообществ	Катастрофическая	Часто катастрофическая
Потребность организмов в кислороде	Ничтожная	Слабая
Окончание табл. 6.1
Показатель	Бета-мезосапробные	Олигосапробные
Кислородные условия	Аэробные	Аэробные
Азотистые соединения	Аммонийные соли, нитраты, нитриты	Нитраты
Сероводород	Мало	Нет
Загниваемость	Не загнивает	Не загнивает
Бактерий в 1 мл воды	105	10-102
Преобладание отдельных видов	Значительное	Очень большое
Разнообразие видов	Значительное	Очень большое
Смена сообществ	Довольно медленная	Медленная
Потребность организмов в кислороде	Большая	Очень большая
формы животных и растений, которые проводят всю жизнь во взвешенном состоянии в толще водоема. К фитопланктону принадлежат микроводоросли, к зоопланктону — простейшие животные.
. 90
Наиболее показательны для оценки загрязнения водоема бентос и перифитон. В состав биоценозов бентоса входят все формы растений и животных, которые своей жизнью тесно связаны с дном водоема. Организмы обрастания прикрепляются к камням, днищам судов, железным и бетонным арматурам мостов.
В полевых условиях для оценки сапробности проводят предварительное обследование водоема. Следует указать, что водоем реагирует на загрязнение целым комплексом взаимосвязей биотической и абиотической среды. Поэтому при биологическом исследовании изучают водоем в целом — воду, дно, берега, а не только организмы, населяющие водоемы. Прежде чем приступить к обследованию, необходимо иметь сведения о гидрологическом режиме водоема: расходах воды, характере водосборной площади, расположении, количестве и качестве выпусков сточных вод, наличии загрязненных территорий вдоль берега водоема. В момент осмотра водоема в полевом журнале отмечают температуру воды, ее прозрачность (по белому диску Секке), наличие или отсутствие пленок на поверхности, запах и особенности цвета воды, наличие водной растительности, загрязнение берегов, заиленность дна и характер ила, пленки нефтепродуктов на дне и поверхности водоема.
При окончательном обследовании водоема производят отбор и обработку проб. Пробы отбирают ниже источника загрязнения, по возможности, на всем протяжении загрязненности водоема, а также для сравнения — в чистом пункте выше сброса. Для полной биологической диагностики водоема должны быть учтены все сообщества: перифитон, бентос, планктон, плейстон, нектон, макрофиты. Но практически при единичном обследовании можно ограничиться рассмотрением наиболее типичных сообществ: например, в малых водостоках исследуют перифитон, в реках — планктон, бентос и перифитон, в прудах — заросли макрофитов и т.д.
Перифитон собирают скребком, переносят в лабораторию в термосе, чтобы сохранить пробу для микроскопирования в живом виде. Впоследствии фиксируют формальдегидом, доведя его концентрацию в пробе до 2—4 %, и затем окончательно определяют виды. Учитывают сапробность и частоту встречаемости организмов.
Зоны сапробности выделяют по различной степени разложения органического вещества. От чистого водоема к загрязненному увеличивается индекс сапробности водоема: ксеносапробные — 0—0,05 -> олигосапробные — 0,51 —1,50 -> бета-мезосапробные — 1,51—2,50 -> альфа-мезосапробные — 2,51—3,50 -> полисапроб-ные — 3,51 — 4,0. Индексы обозначаются греческими буквами к-> 0 -> р -> а -> р.
91
Таблица 6.2
Организмы-индикаторы сапробности
Организмы	Зона сапробности (S)	Организмы	Зона сапробности (S)
Нитчатые бактерии		инфузории	
Beggiatoa sp.	P	Colpidium campylum	P
Thoithrix sp.	P	Colpidium colpoda	P
Грибы		Euplotes charon Opercularia coaretata	ex а
Leptomitus lacteus	a	Paramecium caudatum	a
Mucor racemosus	a	Spirostomus ambiguum	a
Fusarium aquaeductum	P	Stentor coeruleus	a
Водоросли: синезеленые		Vorticella convallaria Vorticella microstoma	a P
Anabaena flos aquae	P	Podophrya fixa	a
Aphanizomenon flos aquae	P	коловратки	
Oscillatoria tenuis	a	Keratella cochlearis	P
диатомовые		Keratella quadrata	P
CymbeUa cesati	0	Rotaria rotatoria (syn.Rotifer vulgaris)	a
Melosira granulata	P	олигохеты	
Navicula apiculata	a	Tubifex tubifex	P
евгленовые		Stylaria lacustris	P
Euglena viridis	P	ракообразные	
Euglena deses	a	Daphnia magna	a
зеленые и протококковые		Leptodora Kindtii	0
Votvox globator	0-0	Astacus fluviatilts	0
Ulothrix zonata	0	насекомые	
Животные: амебы		Caenis macrura	0
Pelomyxa palustris	P	Heptagenia coerulana	P
		Chironomus Plumosus	P
92
Перечень видов-индикаторов с указанием принадлежности их к зонам сапробности имеется в методическом руководстве «Унифицированные методы исследования качества воды»_(см. Список лйтёратуры). Некотбрыейз них приводятся в табл. 6.2.
Для количественного учета просматривают 50 полей зрения не менее чем на трех препаратах — стеклах обрастания. Число организмов оценивают по шкале частот после пересчета на 100 полей зрения соответственно категории крупности (табл. 6.3):
1-я категория — организмы размером до 50 мкм;
Таблица 6.3
Шкала для пересчета организмов-сапробионтов в 100 полях зрения микроскопа на частоту встречаемости
Частота встречаемости в баллах	Сапробионты
1-я категория крупности	
1	Не более 1 в каждом 2-м поле зрения
2	Не более 2 в поле зрения
3	Не более 10 в поле зрения
5	Не более 30 в поле зрения
7	Не более 60 в поле зрения
9	Более 60 в поле зрения
2-я категория крупности	
1	Не более 1 в каждом 20-м поле зрения
2	Не более 1 в каждом 5-м поле зрения
3	Не более 1 в поле зрения
5	Не более 3 в поле зрения
7	Не более 6 в поле зрения
9	Более 6 в поле зрения
3-я категория крупности	
1	1 в 100 полях зрения
2	1 в 50 полях зрения
3	Не более 1 в 10 полях зрения
5	Не более 1 в 4 в полях зрения
7	Не более 1 в 2 в полях зрения
9	Приблизительно 1 в поле зрения
93
2-я категория — 50—200 мкм;
3-я категория — 200— 1 000 мкм.
Частоту встречаемости учитывают по общепринятой в биоин-дикационных исследованиях девятибалльной шестиступенчатой шкале со следующими обозначениями: 1 — очень редко, 2 — редко, 3 — нередко, 5 — часто, 7 — очень часто, 9 — масса.
Таблица 6.4
Шкала оценки качества воды по системе сапробности
Класс качества водоема	Характеристика воды	Индекс сапробности по Пантле и Буку
1	Оченьчистая	<1,00
2	Чистая	1,00-1,50
3	Умеренно (слабо) загрязненная	1,51-2,50
4	Загрязненная	2,51-3,50
5	Грязная	3,51-4,00
6	Очень грязная	>4,00
Для единообразия количественного учета и выражения данных в шкале сапробности можно результаты по просчету планктона и микробентоса выразить в значениях частоты встречаемости (см. табл. 6.4).
Наиболее распространен способ определения сапробности водоема по методу Пантле и Бука. Данный метод позволяет сравнить состояние водоема в разных пунктах, например по продольному профилю реки, и представить результаты в цифровом и графическом виде.
Зонам сапробности 5 придается цифровое значение от 0 до 4 в порядке возрастания загрязнения. Определяется частота встречаемости А организмов в сообществе. Обе величины входят в формулу для определения индекса сапробности: Ind 5 = У, (Sh)/X А.
Пример вычисления сапробности
Проба: река, забор воды ниже города. Дата Сообщество: перифитон
Организмы	S	h	Sh
Euglena viridis	4	3	12
Scenedesmus acuminatus	2	1	2
Spirogyra sygmoidae	2	3	6
Closterium acerosum	3	2	6
94
Окончание табл.
Организмы	S	h	Sh
Closterium moniliferum	2	1	
Cyclotella menengiana	3	3	9
Cymbella vesiculosa	2	2	4
Diatoma vulgare	2	3	6
Melosira varians	2	5	1O
Navicula viridua	3	2	6
Navicula cryptocephala	3	2	6
Nitzschia acicu laris	2	3	6
Nitzschia palea	2	2	6
Surirella ovata	2	2	4
Chilidonella cuculata	3	2	6
Colpoda cuculus	3	2	6 		
Yh = 41	Х(5А) = ЮЗ
ZAP=3;ZAa=15;ZA₽=23.
Ind 5 = Z (WXA = 103/41 = 2,51.
Цель работы — определение сапробности водоема.
Оборудование и материалы:
микроскоп, аквариумы, предметные и покровные стекла, пинцет.
ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ ЛАБОРАТОРНОЙ РАБОТЫ
1.	Получить у преподавателя «стекла обрастания» с разным временем экспозиции в аквариуме (от недели до полутора-двух месяцев).
2.	Рассмотреть под микроскопом препараты с объективом х40.
3.	Используя ключ для определения главных групп водных беспозвоночных животных и определители водорослей, составить таблицу видового многообразия. Оценить сапробность обнаруженных организмов по табл. 6.2.
4.	Произвести учет организмов по частоте встречаемости по табл. 6.3.
5.	Определить сапробность водоема по методу Пантле и Бука (см. пример в тексте). Определить класс качества воды с помощью табл. 6.4.
6.	В отчете привести все сведения из п.п. 3 — 5, в том числе рисунки обнаруженных видов.
95
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Константинов А. С. Общая гидробиология. — М.: Высшая школа, 1972.
Методы изучения состояния окружающей среды. — Вологда: Русь, 1996.
Определители индикаторных видов-сапробионтов.
Унифицированные методы исследования качества воды. — М.: СЭВ, 1975.
Лабораторная работа №7. БИОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ АКТИВНОГО ИЛА
{Лабораторная работа подготовлена Е. И. Егоровой)
Биологический анализ активного ила* имеет большое значение для оперативного контроля состояния процесса биологической очистки сточных вод. Простейшие индикаторные организмы хорошо реагируют на изменения условий существования: нагрузку на ил, обеспеченность кислородом, наличие токсичности, степень регенерации активного ила и т.п. Общее количество простейших и разнообразие видов меняются, кроме того, по сезонам года. В зимний период (температура воды 12—13 °C) наблюдается наибольшее количество простейших при сравнительно небольшом их разнообразии (9—11 видов). Летом (температура воды 23—25 °C) разнообразие видов наибольшее (свыше 15) при незначительном общем количестве простейших.
В связи со своеобразной экологической обстановкой в аэротенке** все организмы активного ила можно рассматривать как показатели условий среды обитания, т.е. состава сточных вод и технологического режима их очистки. Следует отметить, что сигнал о «неблагополучии» на очистных сооружениях индикаторные организмы подают значительно раньше, чем изменяются данные гидрохимических анализов. Так, вспышка Gromia neglecta предупреждает о токсичности поступающих сточных вод за 10—15 дней до ухудшения состава очищенных вод.
Причины многочисленных отклонений от оптимального режима биологической очистки можно разделить на две большие группы. Первая группа — поступающие сточные воды неблагоприятны для биологической очистки: могут быть токсичными, несбалансированными по элементам питания (перегрузки или недогрузки, как по взвешенным веществам, так и по расходу сточных вод), неравномерно попадают на аэрационные сооружения. Вторая группа —
* Активный ил — частицы органических веществ, населенных различными группами аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов.
** Аэротенк — прямоугольные железобетонные резервуары, через которые медленно протекают подвергающиеся аэрации сточные воды, смешанные с активным илом.
. 96
нарушения эксплуатации очистных сооружений. К ним относятся: несвоевременная выгрузка осевшего ила в аэротенк, недостаточная аэрация активного ила в аэрационных сооружениях. Отклонения в режиме эксплуатации городских очистных сооружений или в составе поступающих сточных вод отражаются на численности биологических индикаторов активного ила (табл. 7.1). При ухудшении циркуляции ила сумма всех свободноживущих реснитчатых инфузорий превалирует над суммой прикрепленных ресничных инфузорий, найденных в активном иле. На напряженность в процессах циркуляции ила указывает равенство между суммой прикрепленных и свободноплавающих инфузорий. Увеличение численности мелких жгутиконосцев и мелких голых амеб свидетельствует об ухудшении режима аэрации. Сумма всех видов коловраток — показатель интенсивности процесса нитрификации; при отсутствии нитрификации коловратки в активном иле не обнаруживаются.'
Принцип предложенного в лабораторной работе метода — учет количества и состояния организмов-индикаторов по результатам микроскопирования активного ила. На основании этих характеристик делают заключение о состоянии активного ила и его способ-
Таблица 7.1
Использование индикаторных организмов активного ила для технологического контроля работы городских очистных сооружений
Изменение в технологическом режиме	Индикаторные организмы и признаки
Токсичные стоки	Actinophrye Gromia neglecta (численность превышает 2 млн на 1 г сухого ила) Zooglea ramigera Цисты простейших Нитчатые водоросли, грибы
Нарушение циркуляции ила в системе	Положительный признак: (+) наличие прикрепленных инфузорий Отрицательный признак: (-) наличие свободноплавающих инфузорий
Нарушение аэрации	Мелкие жгутиконосцы Мелкие амебы
Изменение мелких нагрузок на ил	Изменение суммы бентосных раковинных амеб
Продуктивность процессов нитрификации	Изменение суммы коловраток
4 Мелехова
97
ности к переработке загрязнений. Биологический анализ дополняет технологический контроль качества очистки и работы комплекса сооружений биологической очистки.
Пробы для анализа берут отдельно из каждого сооружения: аэротенка, регенератора*, вторичного отстойника**, биофильтра***. Жидкую пробу, отобранную ковшом, переливают в широ-когорлую банку, заполняют ее на половину объема и закрывают пробкой. Немедленно переносят в лабораторию и приступают к анализу не позднее чем через 20—30 мин с момента взятия пробы (в течение 1 — 2 ч пробу, не закрытую пробкой, можно хранить в холодильнике). Для отбора проб со дна сооружения из вторичного отстойника или из резервуара может быть применен батометр. Если его нет, используют склянку с пробкой, открывая ее на заданной глубине при помощи тросика, прикрепленного к пробке. Пробы с биофильтров отбирают скребком на разных глубинах загрузки. В лаборатории берут соскобы пленки с твердого субстрата и рассматривают под микроскопом. Тотчас после доставки проб из аэрационных сооружений в лабораторию отливают из каждой пробы 100 мл в цилиндр для определения объема ила через 30 мин отстаивания и дозы ила.
Обычно для фиксации препаратов применяют 40%-й формалин. Можно использовать более сложные фиксаторы, например осмиевую кислоту, 1%-й водный раствор. Пары осмиевой кислоты очень ядовиты, поэтому для приготовления раствора вскрытую ампулу сразу бросают в склянку и доливают отмеренное количество дистиллированной воды. Хранят в темной склянке с хорошо притертой пробкой и притертым колпачком.
По возможности для фиксации применяют жидкость Утерме-ле: в 20 мл дистиллированной воды с 5 г дважды сублимированного йода растворяют 10 г KI, добавляют 50 мл дистиллированной воды и 5 г уксусно-кислого натрия. Раствор хранят не более 1 мес в склянке из темного стекла с притертой крышкой.
Для микроскопирования жгутиковых пригоден йод, 0,3 %-й водный раствор; для наркоза коловраток — сульфат никеля,! %-й водный раствор. Нейтральрот, водный раствор (1:800), применяют для микроскопирования простейших; глицерин — для микроскопирования червей и изготовления временных препаратов. Спирт
’Регенератор — резервуар, отдельно стоящий или занимающий один—три отсека аэротенка, в котором идет интенсивное окисление органики за счет высокой дозы активного ила и большей подачи воздуха, чем в аэротенк.
♦’Вторичный отстойник — резервуар, в котором отработанный (циркуляционный) активный ил отстаивается, насыщается кислородом, чтобы через регенератор вновь поступить в аэротенк.
♦♦♦Биофильтры — очистные сооружения прямоугольной или круглой формы, заполненные слоем из крупнозернистого материала (камня, шлака, щебня), заселенного аэробными микроорганизмами.
 98
этиловый 96 %-й является универсальным средством для фиксации организмов.
Основным методом анализа организмов активного ила (простейших, коловраток и др.) является микроскопирование в живом состоянии. В очищенной воде для сгущения пробы применяют центрифугирование, отстаивание или фильтрование через мембранный фильтр № 6 (размер пор 2—5 мкм). Каплю свежего ила наносят на стекло, покрывают покровным стеклом и просматривают под микроскопом. Рекомендуется просматривать до 10—15 капель. Кроме определения видов организмов отмечают физиологическое состояние организмов, структуру ила, наличие зоогле-ей, включение минеральных или органических частиц, мусора и т.д. При определении видов организмов надо детально рассмотреть их внутреннее строение, поэтому их делают неподвижными, применяя фиксацию или наркоз. Обычные фиксаторы (этиловый спирт, формалину сильно деформируют простейших, поэтому применяют быстродействующий фиксатор — пары осмиевой кислоты. Чтобы зафиксировать препарат, на предметное стекло наносят маленькую каплю жидкости с простейшими, стекло быстро переворачивают каплей внутрь склянки с раствором осмиевой кислоты и выдерживают в течение нескольких секунд плотно прижатыми к горлышку склянки. Затем рассматривают препарат под покровным стеклом при большом увеличении. Жгутики флагеллят хорошо видны в жидкости Утермеле или в растворе йода. К покровному стеклу на границе с предметным прикладывают полоску фильтровальной бумаги, смоченной реактивом. Чтобы остановить или замедлить движение коловраток, употребляют растворы наркотических веществ, например сульфата никеля. Наиболее простым способом остановить движение коловраток является следующий. К капле воды с живыми коловратками на предметном стекле добавляют каплю глицерина, осторожно тщательно перемешивают концом препаровальной иглы и покрывают покровным стеклом. Остановить движение крупных инфузорий можно также подсушивая каплю, покрытую покровным стеклом, при температуре 40 - 45°.
При качественном просмотре проб организмы можно учитывать по пятибалльной шкале. Наиболее принята шкала шестиступенчатая девятибалльная (1, 2, 3, 5, 7, 9). Однако качественная оценка субъективна, а также недостаточно точна, поэтому количественный учет применяют в счетных камерах. Если невозможно подсчитать каждый вид организмов в отдельности, то количественный учет организмов проводят по следующим счетным группам: нитчатые бактерии, губки, зооглеи, жгутиковые, амебы, свободноплавающие и сидячие инфузории, коловратки, черви, личинки насекомых, рачки и т. п. При взятии пробы пипеткой следует тщательно перемешивать жидкость.
99
При наличии активного ила с крупными организмами, что характерно для лабораторных установок, применяют стереоскопический микроскоп МБС с окулярами 10—12,5, тогда подсчет ведут в чашках Петри. В активном иле производственных сооружений обычно преобладают мелкие организмы, их просчитывают в камерах Кольтвица, Нажотта, Горяева и т.п. В активном иле на сооружениях с низкой нагрузкой или при стабилизации ила нужно применять увеличения микроскопа от 60 до 400 раз. В каждом случае после основного просчета дополнительно просматривают пробу как при большом, так и при меньшем увеличении, чтобы не пропустить очень редкие или очень мелкие организмы.
Количество организмов выражают в экземплярах или объемных единицах биомассы на 1 мл иловой смеси активного ила, а также на 1 г сухого вещества активного ила. При сравнении активного ила из разных сооружений — аэротенка и регенератора или двух аэротенков с разными дозами ила — лучше выражать содержание организмов на 1 г сухого вещества ила. Для этого одновременно с микроскопированием из той же пробы определяют дозу ила и затем делят число организмов на дозу ила в граммах. Поскольку организмы сильно отличаются между собой по размерам, правильнее выражать содержание организмов не в числе, а в их биомассе. Для этого вычисляют объем организмов, исходя из измерений их размеров с помощью окуляра-микрометра и приравнивая форму каждого организма к простейшему геометрическому телу. Плотность организмов принимают равной единице, получают биомассу в граммах. Например, биомасса отдельных видов инфузорий составляет для Tetrahymena 0,01— 0,05 • 10-3 мг; для Paramecium caudatum — 0,5 —0,6 10"3 мг; для Spirostomum — 12,7- 10"3мг.
Результаты микроскопирования проб и количественного учета организмов активного ила записывают в рабочем журнале, который приведен в справочном материале к лабораторной работе. Дают характеристику ила.
Цель работы — ознакомление с биологическим методом анализа активного ила.
Оборудование, материалы, реактивы:
микроскоп; предметные и покровные стекла; пипетка на 1 мл; активный ил (или настой сена 5-, 15-, 20-, 25-, 30-, 35-дневной выдержки в стаканах на 250 м); формалин 40%-й, вата; спирт.
ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ ЛАБОРАТОРНОЙ РАБОТЫ
1.	Получить у преподавателя образцы активного ила или его «макет». Удобным макетом является сенной настой разного срока выдержки с развивающимися в нем индикаторными видами. Тех
100
нику приготовления сенного настоя см. в справочном материале к лабораторной работе.
2.	Использовать микроскоп с малым увеличением. На предметное стекло нанести пипеткой каплю предварительно хорошо перемешанной иловой смеси и накрыть покровным стеклом. Немедленно приступить к микроскопированию. Зарисовывать обнаруженные во всех полях зрения виды в рабочую тетрадь.
3.	На следующем этапе на предметное стекло нанести произвольное количество осевшего ила и зажать между двумя предметными стеклами. Здесь следует сосредоточить внимание на состоянии организмов, величине, форме и плотности хлопьев ила, наличии посторонних примесей.
4.	Дать возможную характеристику активного ила по наличию индикаторных видов.
5.	При статистической обработке полученные данные необходимо сравнить с отклонением от принятых норм, приведенных в табл. 7.2. Согласно приведенной в таблице классификации, средние значения даны для выборки по пробам с хорошим качеством очищенной воды, для которых прозрачность превышает 30 см. Если полученная характеристика не превышает т + 35, то возникшие патологические изменения в процессах биологической очистки нормализуются без дополнительного вмешательства оператора за
Таблица 7.2
Критерии нормы и патологии индикаторных видов активного ила
Биоиндикаторы	т	6	ти + 35	т + 7 5
Zooglea ramigera	428	349	1475	2 871
Нитевидные бактерии	561	2 000	6561	14 561
Грибы	351	375	1476	2 976
Водоросли	76	89	343	699
Мелкие Flagellata	504	431	1797	3 521
Amoebina	1598	1063	4 787	.9039
Jromia neglecta	431	550	2 087	4 281
Цисты	1312	1000	4312	8312
Actinopoda	52	59	229	465
Сумма:				
бентосных раковинных амеб	505	1000	4505	7505
свободноплавающих инфузорий	861	—	—	—-
прикрепленных инфузорий	1087	—	—	—
коловраток	139	—	—	—
101
счет самопроизвольного возврашения к режиму биологической очистки. Если характеристика превышает т + 75, то для восстановления нормальной работы необходимо вмешательство оператора.
6.	В отчете представить рисунки имеющихся групп организмов-индикаторов, сведения об их количественном учете, оценку степени очистки ила.
СПРАВОЧНЫЙ МАТЕРИАЛ
Перечень индикаторных организмов активного ила
Нитчатые бактерии кладотрикс и сферотилюс часто встречаются в активном иле, особенно в углеводистых стоках (крахмально-паточных, гидролизных, текстильных и др.). Кладотрикс усваивает азот из любых соединений, включая минеральные (нитраты), а сферотилюс растет только на органическом азоте. По морфологическим признакам кладотрикс отличается ложнодихотомическим ветвлением. Нитчатые бактерии образуют длинные нити при замедленном течении жидкости и, наоборот, мельчают при сильном механическом перемешивании в сооружениях. Массовые скопления нитчатых в аэротенке вызывают вспухание ила.
Нитчатые серобактерии (Beggiatoa, Thiothrix) встречаются в сточных водах, содержащих сероводород. Сначала сероводород окисляется до серы, которая откладывается капельками в клетках нитчатых. При недостатке кислорода окисление останавливается на этой фазе. При избытке кислорода сера окисляется до сульфатов, которые сильно подкисляют среду. Нити не имеют капель серы при недостатке сероводорода или избытке кислорода. Серобактерии встречаются также в виде отдельных клеток или их скоплений.
Плесневые грибы образуют ветвящиеся нити, разделенные на клетки, или отдельные клетки. Развиваются в широком диапазоне температур и при различной реакции среды, но чаще в кислой среде, в промышленных сточных водах, где отсутствуют другие организмы.
Зооглеи представляют собой желеобразную массу различной формы и консистенции, в которую вкраплены бактериальные клетки шаровидной и палочковидной форм. Размеры бактериальной клетки — от десятых долей микрометра до нескольких микрометров. Зооглеи встречаются в виде комковатых шаровидных скоплений, узких плотных тяжей или древовидного разветвления лопастей.
Корненожки (или амебы) (Arcella vulgaris) в хорошо работающем нормальном активном иле встречаются в значительных количествах, как и в нитрифицирующем иле, но отмечалось их присут
102
ствие и в плохом иле. Amoeba radiosa присутствует при хорошей работе сооружений.
Жгутиковые бесцветные (Bodo, Proteus) в больших количествах встречаются в перегруженных илах; единственные экземпляры — в нормально работающем иле. Жгутиковые имеют размеры около 10 мкм, поэтому хорошо видны в микроскоп только при большом увеличении.
Инфузории (Infusoria) почти всегда присутствуют в созревшем иле. Характерным является состояние ресничной зоны организма: в хорошем иле ресничная зона раскрыта, движения ресничек активные; при неблагоприятных условиях ресничная зона замкнута. При увеличении нагрузки оперкулярия сжимается и инцистиру-ется.
Vorticella microstoma развивается в перегруженном иле с недостаточным содержанием растворенного кислорода.
Epistylis, Carchesium развиваются в заметном количестве в нитрифицирующем иле.
Vorticella convallaria — характерный представитель хорошего ила, при регенерации встречаются скоплениями; чувствительны к токсичным условиям. При недостатке растворенного кислорода вортицеллы отрываются от стебелька и образуют особую, свободно плавающую форму с венчиком ресничек на заднем конце.
Aspidisca — распространенная, почти всегда присутствующая в иле брюхоресничная инфузория. Чаще всего является положительным признаком для оценки качества ила. Вынослива к изменениям условий среды.
Paramecium caudatum — одна из форм, наиболее выносливых к недостатку кислорода; характерна для плохого ила. Как и другие крупные свободно плавающие инфузории встречается при большом количестве бактерий, находящихся во взвешенном состоянии при разложении ила.
Сосущие инфузории (Podophrya, Tokophrya) находятся в условиях недогрузки сооружений. Представлены формами, паразитирующими на других инфузориях.
Круглые черви (Nematoda) часто находятся на биофильтрах, а на аэротенках встречаются в заметных количествах в недостаточно аэрируемом иле, с зонами залежей. Единичные экземпляры могут быть в нормальном иле аэротенков.
Малощетинковые черви (Oligochaeta) в заметных количествах могут развиваться в илах с устойчивой нитрификацией, на биофильтрах.
Коловратки (Philodina, Monostyla, Notommata и др.) находятся в активном состоянии при достаточном обеспечении растворенным кислородом в нитрифицирующем иле, но оказываются в сжатом состоянии при неблагоприятных условиях.
103
Водные клещи {Hydracarina) встречаются на биофильтрах, а в аэротенках — в голодающем иле при низкой температуре.
Личинки насекомых (Psichoda) обычно находятся на биофильтрах.
Рачки (Crustacea) отсутствуют в обычном иле, развиваются в заметных количествах только в голодающем иле при низкой нагрузке.
Техника приготовления сенного настоя
В термостойкий стакан помещают небольшое количество сена, заливают водопроводной водой и кипятят 15 — 20 мин. Выдерживают на свету двое суток. Затем капают 4 — 5 капель (можно больше) воды из лужи или аквариума. После трех дней экспозиции можно готовить и просматривать препараты из сенного настоя. Как показывает наш опыт, 5-суточный сенной настой соответствует голодающему илу, 15-суточный — удовлетворительно работающему, 20-суточный — нитрифицирующему, 25-суточный — перегруженному, 30-суточный — неадаптированному, 35-суточный — илу при недостатке кислорода.
Характеристика ила по индикаторным видам
Удовлетворительно работающий (хороший) ил. Большое разнообразие простейших по видовому составу при небольшом количественном преобладании какого-либо из видов. Постоянное наличие Aspidisca, Zoogloea. Все виды достаточно активны. Ил оседает в виде крупных тяжелых хлопьев. Вода над илом прозрачная.
Ил из регенератора:
а)	при хорошей регенерации — количественное преобладание прикрепленных инфузорий Vorticella convallaria, Epistyllis над свободно плавающими инфузориями; увеличение количества прикрепленных инфузорий и зооглей по сравнению с илом в аэротенке; организмы подвижные; хлопок ила крупный, хорошо осаждается, вода над илом прозрачная; исчезает сера в клетках нитчатых серобактерий;
б)	при глубокой регенерации — преобладание крупных свободноплавающих инфузорий, увеличение размеров Vorticella и Opercularia', распад хлопка ила на более мелкие хлопья, вода над илом имеет мелкую неоседающую муть.
Голодающий ил. Мелкие размеры простейших, организмы становятся прозрачными, пищеварительные вакуоли исчезают, частично инфузории превращаются в цисты. Коловратки образуют цисты позже, чем инфузории. Зооглеи и хлопья ила прозрачные. Вода над илом мутная.
•104
Нитрифицирующий ил. Постоянно присутствуют в заметных количествах коловратки: Philodina, Callidina и другие виды. Количественно преобладают прикрепленные инфузории: Vorticella conval-laria, Carchesium, крупные амебы Arcella. Возможно присутствие в больших количествах малощетинковых червей Aeolosoma. Ил рыхлый, всплывает после осаждения.
Перегруженный ил. Малое количественное разнообразие видов, преобладают два-три. Большое количество бесцветных жгутиковых, мелких амеб, Litonotus и других мелких инфузорий. Присутствуют в заметных количествах Podophrya, Chilodon, Vorticella microstoma, Opercularia, иногда нитчатые бактерии. Ил загрязнен многочисленными включениями: органикой, мышечными волокнами, мусором и т. д. Хлопья ила темные, плотные. Вода над илом с опалесценцией.
Ил при сбросе промышленных стоков, неадаптированный. Уменьшение разнообразия видов, преобладают один-два. Измельчение организмов, особенно, V. convallaria и Opercularia при увеличении их общего количества или при резком уменьшении общего количества в зависимости от степени токсичности стока. Неподвижное состояние ресничных инфузорий, гибель Flagellata, преобладание коловраток и червей.
Ил мелкий, загрязнен включениями промышленных стоков, осаждается плохо, может иметь цветные частицы. Вода над илом мутная.
Ил при недостатке кислорода. Vorticella раздувается в виде шара, некоторые представители рода лопаются и исчезают. Opercularia с замкнутым ресничным диском, неподвижные. Коловратки неподвижные, застывшие в вытянутом состоянии, отмирающие. Большое количество разнообразных жгутиковых. Из инфузорий почти исключительное господство Paramecium caudatum как очень выносливой формы к недостатку кислорода, способной оживленно плавать в гниющем иле. Хлопья ила распадаются. Вода над илом мутная.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Голубовская Э.К. Биологические основы очистки воды. — М.: Высшая школа, 1978.
Небел Б. Наука об окружающей среде. — Т. 1. — М.: Мир, 1995.
Рекомендации по проведению гидробиологического контроля на сооружениях биологической очистки с аэротенками. — М.: ЦБНТИ Мин-водхоза СССР, 1987.
Соловых Г. Н. Биотехнологическое направление в решении экологических проблем / Г. Н. Соловых [и др.]. — Екатеринбург: Ур. отд. РАН, 2003.
Химия воды и микробиология. — М.: Высшая школа, 1995.
105
Лабораторная работа №8. ОЦЕНКА ТРОФИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ВОДОЕМА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ
{Лабораторная работа подготовлена Е. И. Егоровой)
(Высшие водные растения являются наименее изученным звеном среди организмов-индикаторов, хотя имеют ряд преимуществ. Они представляют собой видимый невооруженным глазом и поэтому весьма удобный для наблюдения объект, а также дают возможность при рекогносцировочном гидробиологическом осмотре водоемов в первом приближении визуально оценить их экологическое состояние. Макрофиты позволяют определить трофические свойства воды, а иногда и специфику ее химизма, что имеет существенное значение при биоиндикации чистых вод.
Принцип метода основан на учете видового разнообразия представителей водной макрофлоры и их индикаторной значимости. В прибрежно-водной растительности выявляется исключительно легко поддающаяся учету доминантная флора. При этом подтипу водной растительности, представленной гидромезофитными, гид-рофитными и гигрофитными видами, отводится принципиальная роль в оценке загрязнения водной среды. Подтипу прибрежной растительности, представленной гигрофитными, мезофитными и ксеромезофитными видами, определяющее значение придается при оценке загрязнения донных отложений малорастворимыми токсическими веществами.
При ботанической индикации стоячих водоемов целесообразно учитывать следующие показатели при визуальном осмотре водного объекта: степень покрытия его макрофитами, флористическое разнообразие растений, отклонения в развитии и росте. При последующих лабораторных исследованиях, в случае необходимости, определяется ряд количественных характеристик: величины фитомассы и продукции, высота и масса стебля, химический состав растений. ’•
Большую роль при индикации вод играет наличие определенных видов-индикаторов. Но выявление таких растений встречает ряд трудностей вследствие того, что многие из них обладают широкими экологическими и географическими ареалами. Более того, в различных физико-географических условиях данные растения-индикаторы могут встречаться в водоемах неодинакового трофического статуса и иметь соответственно различное индикаторное значение. Лимитирующим фактором при выявлении индикаторных видов является также ограниченность сведений об экологии и физиологии большинства видов макрофитов.
(По общепринятой классификации стоячие водоемы (озера, естественные пруды и т. п.) делятся на ацидотрофные, дистрофные, олиготрофные, мезотрофные и эвтрофные. Кроме того, имеется ряд переходных стадий (табл. 8.1). Для расчета общей трофности каж-
106
Таблица 8.1			ацидотрофный	Небольшая,	неглубокая |	Торфянистые			Бурый			Менее 1,5 м			Меньше 5	о			ьше 1,5		
													Низкое	меньше		Низкая	меньше				
																					
			дистрофный	Десятки, сотни га,	глубина до 2—4 м	Илистые			Буровато-желтый			До 1,5 м	Низкое,	меньше 4	5-6	Пониженная,	51-99		Мягкая, ме>		
го типа водоема	Тип водоема		эвтрофный ‘	Различных	размеров	Заиленные		пески, ил	Зеленовато-	желтый,	1 желтый	До 2 — 3 м	Пониженное,	5-7	4-9	Умеренная, 100-99			I Умерено	жесткая,	1,5-3,0
ление экологическо			мезотрофный	Сотни, тысячи га		Песчано-			каменистые	Зеленый, желто-	зеленый		До 4 — 6 м	Среднее, 7—8		6-7	Средняя,	пониженная,	|	51-99	меньше 1,5		
ч & О			олиготрофный	Обширная,	глубокая	Песчано-		каменистые |	Голубой			До 10 ми более	Высокое,	больше 8	г-	Низкая,	меньше 50		I	Мягкая, 1		
		। с	с с О £ X	Котловина		и t	2 X D 3 э СХ 3 S сх —<		Цвет воды			Прозрачность воды	Содержание кислорода,	|мг/л	|	Кислотность, pH	Минерализация, мг/л			I Жесткость воды, моль	,4 сч ЬО S + * еч Св О	
107
Таблица 8.2
Соотношение значений относительного обилия и частоты встречаемости организмов (Л)
Частота встречаемости	Количество экземпляров одного вида, %	h
Оченьредко	< 1	1
Редко	2-10	2
Нередко	10-40	3
Часто	40-60	5
Очень часто	60-80	7
Масса	80-100	9
дому типу водоема присуждается номер: ацидотрофные — 0, дистрофине — 1, олиготрофные — 2, мезотрофные — 3 и эвтрофные — 4. Частоту встречаемости учитывают по девятибалльной шестиступенчатой шкале частот со следующими обозначениями:
1 — очень редко, 2 — редко, 3 — нередко, 5 — часто, 7 — очень часто, 9 — масса (табл. 8.2). В рабочий журнал вносятся названия всех индикаторных видов водных растений (табл. 8. 3).
Пример расчета суммарной трофности водоема
Место отбора проб. Дата. Водоем — естественный пруд.
Вид	Тип водоема (1)	Частота встречаемости (2)	(1)х(2) =(3)
Nuphar lutea	1	1	1
Myriophyllum altemiflorum	2	2	4
Potamogeton lucens	2	5	10
P. compressus	3	5	15
Lemna trisulca	3	7	21
Elodea canadensis	3	9	27
Carex vesicaria	3	3	9
Х(2)=31	Х(3)=87
Общая суммарная трофность водоема Х(3) : Х(2) = 2,8, что соответствует переходному типу водоема между олиго- и мезотроф-ным.
•108
Индикаторные вцды макрофитов водоемов различной трофпости
со
со
сЗ
Д'
S
<=:
ю сЗ
			Повойничек (водяной перец) (Elatine hydropiper)				Шелковник шенхелевидный (В. foeniculaceum)									
	•	S Е & Э и			вник неукореняю-	3 ✓ з										
					Шел ко щийся eradica.											
Я S V О	•	S Е & Э & э 9 U S	Рдест сплюснутый	(Potamogeton compressus)	Ряска трехдольная (Lemna trisulca)		Уруть мутовчатая (Myriophyllum verticullatum)	Кувшинка белая (Nymphaea alba)	Ряска малая (L.minor)		Стрелолист плавающий	(Sagittaria natans)	Осока пузырчатая (Carex	vesicaria)	|	Кувшинка четырехгранная	(N. tetragona)
Тип вс	олиготрофный		Лобелия Дортмана (Lobelia	dortmanna)	Уруть очередноцветковая (Myriophyllum altemiflorum)		Лютик простертый (Ranunculus reptens)	Полушник колючеплодный (Isoetes echinospora)	Полушник озерный (Isoetes	lacustris)	Рдест блестящий	(Potamogeton lucens)				
	дистрофный		Сфагновые мхи (Sphagnum)		Вахта трехлистная (Menyanthes trifoliata)		Белокрыльник болотный (Calla palustris)	Сабельник болотный (Coma rum pa lustre)	Ежеголовник родственный	(Sparganium affine)	Кубышка желтая (Nuphar	lutea)				
109
Окончание табл. 8.3
Тип водоема	эвтрофный					
	мезотрофный	Частуха подорожниковая (Alisma plantagoaquatica)	Рдест маленький (Р.Candida)	Водокрас лягушачий (Hydrocharis morsusranae)	Рогоз узколистный (Typha angustifolia)	Элодея канадская (Elodea canadensis)
	олиготрофный					
	дистрофный					
•ПО
Оборудование и материалы для лабораторной работы:
гербарий растений, произрастающих в водоемах средней полосы России; определители, каталоги высших растений.
ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ ЛАБОРАТОРНОЙ РАБОТЫ
1.	Получить у преподавателя задание на карточке.
2.	Дать название каждому растению, указанному в задании номером, используя гербарий, а также каталоги-определители.
3.	Выделить индикаторные виды водоемов разной трофности. Дать характеристику водоема в шкале трофности по растениям-индикаторам (см. пример в тексте).
4.	Привести в отчете названия всех растений, указать индикаторные виды водоемов по шкале трофности, охарактеризовать трофические свойства водоема.
СПРАВОЧНЫЙ МАТЕРИАЛ
Классификация стоячих водоемов по трофности
Ацидотрофные водоемы довольно своеобразны по своей природе. По классификации Тинеманна—Науманна к ним относятся водоемы с кислой реакцией воды (pH < 5,5). Они могут иметь как бесцветную, так и окрашенную в бурый цвет воду. В первом случае имеет место комбинация ацидотрофии с олиготрофией, во втором — ацидотрофии с дистрофией. Густые заросли тростника и камыша, процветающие в щелочных водах, в более кислых уменьшаются, встречаются более ограниченно, а в очень кислых водах исчезают совсем, на их месте начинают развиваться осока, хвощ и манник.
Ацидотрофно-олиготрофные водоемы можно установить по наличию показателей олиготрофии — лобелии Дортмана {Lobelia dortmanna), урути очередноцветковой {Myriophyllum altemiflorum), по слабому развитию растительного покрова, значительной разреженности зарослей и угнетенному состоянию растений с низким значением фитомассы.
Ацидотрофно-дистрофные водоемы можно выделить по преобладанию водно-болотных растений — видов рода Carex, вахты трехлистной {Menyanthes trifoliata), кизляка кистецветного {Naum-burgia thysiflora), сабельника болотного {Comarumpalustre}. Зарегистрированы в них также водная сосенка {Hippuris vulgaris}, пузырчатка обыкновенная {Utricularia vulgaris}. Ограниченно представлены уруть очередноцветковая и лобелия Дортмана. Степень покрытия этих водоемов макрофитами невелика, заросли в значительной мере разрежены, растения угнетены, величины фитомассы низки. Кислая реакция среды и низкая прозрачность воды отрицательно влияют на произрастание растений.
111
Дистрофные водоемы расположены в основном в заболоченной местности, берега их низкие, болотистые, с редкой растительностью, часто сложены из сфагнума. Реакция среды кислая, вода сильно окрашена, прозрачность ее очень низкая. Значительно разреживаются прибрежные заросли тростника и хвоща. Исчезают рдесты и частично заменяются на заросли ежеголовника. Для дистрофных водоемов характерны вдоль уреза воды различные виды осок и водно-болотной растительности, на дне — сфагновый мох. Часто встречаются тростник обыкновенный {Phragmites australis), хвощ топяной {Equisetum fluviatile), кубышка желтая {Nuphar lutea), ежеголовник родственный {Sparganium affine).
Для озер олиготрофного типа характерно присутствие лобелии Дортмана, урути очередноцветковой. Степень их зарастания незначительна, растительные сообщества распространены весьма ограниченно. Фитоценозы в основном разрежены. Развитие растений удовлетворительное, величина фитомассы невелика.
Для водоемов мезотрофного и эвтрофного типов характерны нейтральная или щелочная среда и малая прозрачность. Показательно наличие рогоза узколистного {Typha angustifolia), стрелолиста плавающего {Sagittaria natans), элодеи канадской {Elodea canadensis).
Пример составления задания на карточках для выполнения лабораторной работы
В ходе летних практик готовятся гербарии, в которых макрофиты указаны под номерами. Делается опись всего материала. В карточке для лабораторной работы «моделируется» водоем определенной трофности. Студентам выдаются гербарии 8—10 видов водных растений, которые они сами идентифицируют с помощью определителей. В карточке для каждого гербарного материала указывается предполагаемая в данном «водоеме» частота встречаемости этого растения. Причем в гербариях могут быть представлены как индикаторы трофности водоема, так и водные растения, не являющиеся таковыми.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Абакумов В. А. Методы распознавания образов в гидробиологическом анализе поверхностных вод / Проблемы экологического мониторинга и моделирования экосистем / В. А. Абакумов [и др.]. — Т. 8. — Л.: Гидрометеоиздат, 1985.
Семин В. А., Фрейндлинг А. В. Макрофиты как индикаторы закисления и изменения трофности водоемов // Биол. науки, 1983. — № 7.
112
Лабораторная работа №9. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КАЧЕСТВА ВОДЫ В ПРЕСНОВОДНОМ ВОДОЕМЕ ПО ВИДОВОМУ
РАЗНООБРАЗИЮ МАКРОФИТОВ
{Лабораторная работа подготовлена Е. И. Егоровой)
Токсические вещества (металлы и продукты органического синтеза) накапливаются в донных отложениях и распределяются в различных средах: в толще воды, в органической компоненте — абиотической и биотической.
В табл. 9.1 отражены свойства различных групп водной растительности и показаны преимущества и недостатки использования их в качестве индикаторов загрязнения непроточных поверхностных вод. Надо отметить, что использование водной растительности ограниченно из-за сезонности развития этих организмов.
Высшие цветковые водные растения и некоторые виды водорослей в той или иной мере отвечают требованиям интегральной оценки степени загрязнения водной среды поллютантами.
Таблица 9.1
Свойства различных групп водной растительности, используемых в качестве биоиндикаторов загрязнения водоемов
Группы организмов	Преимущества	Недостатки
Фитопланктон	Играет важную роль в трофических цепях	Миграция в водоеме, сезонное развитие
Перифитон	Очень высокий фактор накопления загрязняющих веществ; встречаются обычно и повсеместно	Высокочувствителен к токсичности; сложный отбор количественных проб; не минерализуется; сезонное развитие
Макрофиты (Potamogelon, Elodea, Nuphar, Phragmites)	Легко идентифицировать, встречаются в определенных частях водоема в течение ряда лет	Присутствуют в слабо загрязненных средах; большая разница в поглощении загрязняющих веществ у разных видов
Макроскопические водоросли (Cladophora, Lemanea, Enteromorpha)	Легко идентифицировать; встречаются повсеместно и обильно; высокая толерантность к загрязняющим веществам; отражают количественное содержание в воде загрязняющих веществ	Сезонное развитие; очень чувствительны к изменениям гидрологических условий (паводки)
113
Разработан специальный ключ к определению степени загрязненности поверхностных вод.
Принцип метода заключается в обнаружении в водной среде индикаторных видов растений, адаптированных к определенной степени загрязнения (от крайне слабого до очень сильного). Частоту их встречаемости учитывают по девятибалльной шестиступенчатой шкале частот со следующими обозначениями: 1 — очень редко, 2 — редко, 3 — нередко, 5 — часто, 7 — очень часто, 9 — масса.
По степени загрязненности водоемы делят на пять классов: крайне слабо, слабо, умеренно, сильно и очень сильно загрязненные, соответственно обозначая классы цифрами от 1 до 5 (табл. 9.2).
Часто в водоеме присутствует несколько индикаторных видов, произрастающих в среде разной степени загрязненности. Следовательно, необходимо определить общую суммарную степень загрязнения. С этой целью подсчитывают сумму всех частот встречаемости растений-индикаторов. Находят произведение степени загрязнения, на которое указывают присутствие растения-индикатора и частоты его встречаемости, и суммируют эти произведения для всех индикаторных видов, обнаруженных в данном водоеме. Полученную сумму произведений делят на сумму частот: этот коэффициент покажет общую суммарную степень загрязнения.
Пример вычисления общей суммарной степени загрязнения
Проба: верхний пруд. Дата Сообщество: растительное
Вид	Степень загрязнения (1)	Частота встречаемости (2)	(1)х(2) = (3)
Utricularia minor	1	1	2
U. australis	2	1	3
Myriophyllum spicatum	2	3	6
M. verticillatum	3	2	6
Potamogeton perfoliatus	3	2	6
Elodea canadensis	4	7	28
P. crispus	4	7	28
P. pectinatus	4	3	12
Ranunculus circinatus	4	3	12
P. nodosus	5	2	10
		Z(2) =31	Х(3) = из
’ 114
гч о\
сЗ Д S «=: ю 03
Н
Оченьсильно загрязненная (5)	Менее 0,5 м	Отсутствуют	Сильное цветение водорослей	Нитчатые водоросли Cladophora. sp.
Сильно загрязненная (4)	Менее 2 м		Распространены нитевые водоросли	
Умеренно загрязненная (3)	2 —4м	Растут только в приповерхностном слое	Местами нитевые водоросли	Нителлопсис двудомный (Nitellopsis obtusa)
Слабо загрязненная (2)	4—6 м	Большие заросли, достигают в длину 8—10 м		Хара ломкая (Chara fragilis)
Крайне слабо загрязненная (1)	Часто более 6 м	Дно водоема поросло харовыми водорослями (до глубины более 10 м)		Хара тернистая (Chara aspera)
Степень загрязненности воды	Глубина прямой видимости при солнечном свете	Харовые водоросли	Другие водоросли	
115
Окончание табл. 9.2
Оченьсильно загрязненная (5)	Часто заросли одного вида	Роголистник погруженный (Сега-tophyllum demer-sum)	Стрелолист обыкновенный (Sagit-taria sagittifolia)	Ряска/ Многоко-ренник(Lemna/ Spirodella)
Сильно загрязненная (4)		Элодея канадская (Elodea canadensis)	Рдест курчавый (Potamogeton crispus)	Рдест гребенчатый (Potamogeton pertinatus)
Умеренно загрязненная (3)	Большое разнообразие видов	Рдест блестящий (Potamogeton lucens)	Рдест пронзенно-листный (Potamogeton perfoliatus)	Уруть мутовчатая (Myriophyllum verticillatum)
Слабо загрязненная (2)		Уруть колосовая (Myriophyllum spica turn)	Пузырчатка австралийская (Urticularia australis)	
Крайне слабо загрязненная (1)	Редко	Пузырчатка охристая (Utricularia ochroleuca)		
Степень загрязненности воды	Цветковые растения			
Н6
Общая суммарная степень загрязнения 2(3): 2(2) = 3,6, что соответствует промежуточной степени загрязнения водоема между умеренной и сильной.
Вычисляют погрешность. Интервал точности для статистической надежности 95 %. Обычно общая суммарная степень загрязнения вычисляется с точностью до 0,1.
Оборудование и материалы:
гербарий растений, произрастающих в водоемах средней полосы России; определители, каталоги высших растений.
Таблица 9.3
Ключ к определению степени загрязненности поверхностных вод по индикаторным видам растений
Вид	Степень загрязнения (1)	Частота встречаемости (2)	(1)х(2) = (3)
Хара тернистая (Chara aspera)	1		
Пузырчатка малая ( Utricularia minor)	1		
Хара ломкая ( Chara fragilis)	2		
Урутьколосовая (Myriophyllum spicatum)	2		
Урутьмутовчатая (Myriophyllum verticillatum)	3		
Рдест блестящий (Potamogeton lucens)	3		
Рдест пронзеннолистный (Potamogeton perfoliatus)	3		
Элодея канадская (Elodea Canadensis)	4		
Рдест курчавый (Potamogeton crispus)	. 4		
Рдест гребенчатый (Potamogeton pectinatus)	4		
Роголистник погруженный (CeratophyUum demersum)	5		
Ряска малая (Lemna minor)	5		
Стрелолист обыкновенный (Sagittaria sagittifolia)	5		
Многокоренник обыкновенный (Spirodela polyrhisa)	5		
Общая суммарная степень загрязнения: X (3):2 (2) =		2(2) =	2(3) =
117
ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ ЛАБОРАТОРНОЙ РАБОТЫ
1.	Получить у преподавателя задание на карточке.
2.	Дать название каждому растению, указанному в задании номером, используя гербарий, а также каталоги-определители.
3.	Выделить растения-индикаторы разной степени загрязненности водоемов по табл. 9.2.
4.	Рассчитать общую суммарную степень загрязнения водоема (см. пример в тексте).
5.	Привести в отчете названия всех растений, указать индикаторные виды водоемов разной степени загрязненности, привести расчет общей суммарной степени загрязнения.
СПРАВОЧНЫЙ МАТЕРИАЛ
Пример составления задания на карточках
Для работы можно использовать гербарный материал водных растений, который готовили для лабораторной работы № 8. В карточках моделируются «водоемы» разной степени загрязненности. Для этого студентам предлагается от 8 до 10 видов водных растений, большая часть из которых является индикаторами загрязнения и представлена в табл. 9.2. В карточке указывается частота встречаемости всех растений.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Научные основы биомониторинга пресноводных экосистем. — Л.: Гидрометеоиздат, 1988.
Строганов Н. С. Водоросли и макрофиты как объекты для биотестирования / Н. С. Строганов [и др.] Ц Теоретические вопросы биотестирования. — Волгоград, 1983.
Humberg В. Ключ к определению степени загрязненности стоячих (непроточных) поверхностных вод / В. Humberg [et al.]: — ISBN 3-925342-15-1, DIN 4.
Лабораторная работа №10. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КАЧЕСТВА ВОДЫ В ПРЕСНОВОДНОМ ВОДОЕМЕ ПО ВИДОВОМУ РАЗНООБРАЗИЮ ЗООБЕНТОСА
{Лабораторная работа подготовлена Е. И. Егоровой)
Наиболее перспективным, а одновременно простым и широко используемым для анализа качества воды является метод Ф. Ву-дивиса, который разработан в Англии для анализа бентосных проб из прибрежных зон рек и озер по составу фауны. В этом
118
методе учитываются индикаторное значение отдельных видов (таксонов) и изменения разнообразия фауны в условиях загрязнения.
Принцип предложенного в данной работе метода состоит в том, что определение биотического индекса по системе Ф. Вудивиса ведется по рабочей шкале, в которой использована наиболее часто встречаемая последовательность исчезновения индикаторных организмов зообентоса по мере увеличения загрязнения. Для всех живых организмов, представляющих макрозообентос и необходимых для получения результатов в данной работе, предлагается определять так называемую «группу» животных: под понятием «группа» для одних животных подразумеваются отдельные виды, а для других, которых трудно идентифицировать даже с определителем, — более крупные таксоны, например отряд или класс. Таким образом, это достаточный предел определения животных бентоса по данной методике.
Отбор проб для анализа требует соблюдения следующих правил.
1.	Отлов животных для анализа проводится специальным сачком-скребком в зоне погруженных в воду растений. Для этого совершается несколько плавных движений сачком-скребком с захватыванием ила со дна. Общее время сбора одной пробы — 1 мин. Содержимое сачка-скребка тщательно промывается от ила в воде того же пруда. Отмытое содержимое можно индентифицировать на берегу водоема или, что более удобно для дальнейшего анализа, пробы доставляют в лабораторию.
2.	Необходимо либо непосредственно на берегу водоема, либо в лаборатории осмотреть несколько экземпляров мягкой растительности, чтобы выявить прикрепленные формы зообентоса или зашедшие вглубь растения, а также обитателей корневой системы. Однако специально количественный анализ фитофильной макрофауны при контроле качества вод не производится.
3.	Отбор проб (см.п. 1 и 2) производят в нескольких точках, сходных по экотопу.
Дальнейшие процедуры определения качества воды проводятся в лаборатории. Стандартную разборку бентосных организмов проводят согласно табл. 10.1, пользуясь определителями. Устанавливают общее число присутствующих групп для той или иной «точки» в водоеме. Зная эту величину, по табл. 10.2 спускаются вниз от личинок веснянок до олигохет и находят величину биотического индекса данной точки водоема. Далее классифицируют водоем по классам качества воды в соответствии с табл. 10.3.
Оборудование и материалы:
музейные экспонаты зообентоса; определители; каталоги макрозообентоса.
119
ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ ЛАБОРАТОРНОЙ РАБОТЫ
1.	Получить у преподавателя задание на карточках.
2.	Определить представителей зообентоса, указанных цифрами, по «музейным» экспонатам до соответствующего ранга по табл. 10.1.
3.	Определить общее число присутствующих групп согласно табл. 10.1 и биотический индекс водоема по табл. 10.2.
4.	Сделать вывод о качестве воды в водоеме по табл. 10.3.
Таблица 10.1
Список выделяемых в зообентосе «групп» для расчета индекса Вудивиса
Таксон	Достаточный предел определения	Количество групп
Тип плоские черви (Plathelminthes)	До класса	
Тип кольчатые черви (малощетинковые, или олигохеты; многощетинковые, или полихеты)(АппеПс!а)	До класса	
Пиявки (класс Hirudinea)	До вида	
Тип моллюски (Mollusca) Тип членистоногие (Arthoropoda): класс ракообразные (Crustacea) класс паукообразные (Arachnida): клещи (отряд Hydracarina)	До вида До вида До вида До отряда	
Класс насекомые (Insecta): личинки стрекоз (отряд Odonata) личинки поденок (отряд Ephemeroptera) личинки веснянок (отряд Plecoptera)	До вида До вида До вида	
Отряд жесткокрылые (жуки) (Coleoptera)	До вида	
Отряд сетчатокрылые (Neuroptera): личинки ручейников (отряд Trichoptera)	До вида До семейства	
Отряд двукрылые (Diptera): личинки комаров-звонцов (семейство Chironomidae) личинки других двукрылых (семейство Simulidae)	До семейства До вида	
 120
Таблица 10.2
Рабочая шкала для определения биотического индекса
Организмы	Видовое разнообразие	Общее количество присутствующих групп бентосных организмов					
		0-1	2-5	6-10	11-15	16-20	20...
Личинки веснянок	Более 1	—	7	8	9	10	11
(Plecoptera)	1 вид	—	6	7	8	9	10
Личинки поденок	Более 1	—	6	7	8	9	10
(Ephemeroptera)	1 вид	—	5	6	7	8	9
Личинки ручей-	Более 1	—	5	6	7	8	9
ников (Trichoptera)	1 вид	4	4	5	6	7	8
Бокоплавы (Gammarus)		3	4	5	6	7	8
Водяной ослик (Asellus aquaticus)		2	3	4	5	6	7
Олигохеты (Tubificidae) или личинки звонцов (Chironomidae)		1	2	3	4	5	6
Отсутствуют все приведенные выше группы		0	1	2	—	—	—
Таблица 10.3
Классификация качества воды по биологическим показателям
Класс качества воды	Степень загрязнения	Биотический индекс
1	Очень чистая	10
2	Чистая	8-9
3	Умеренно грязная	6-7
4	Загрязненная	5
5	Грязная	3-4
6	Оченьгрязная	0-2 ’
СПРАВОЧНЫЙ МАТЕРИАЛ
Оборудование для сбора макрозообентосных проб
Сачок-скребок с сеткой из мельничного газа № 10. Банки или полиэтиленовые пакеты для сбора бентоса. Пипетки лабораторные и пипетки глазные для отбора обитателей бентоса, пинцеты. Лабораторные эксикаторы или поддоны — для сортировки организмов бентоса, предварительно следует положить под них белую
121
бумагу для контрастирования очень мелких животных. Полевой дневник или рабочий журнал.
Пример составления задания на карточке для выполнения лабораторной работы
В ходе летней практики составляется «музей» основных представителей животных макрозообентоса в соответствии с табл. 10.1. Животных обычно помещают в пронумированные пенициллиновые флаконы или в другую удобную посуду с 40 %-м формалином. Делается опись «музейных» экспонатов. В задании на карточке моделируется «водоем» с набором видов зообентоса. В карточке указываются номера (до 20—30) флаконов с макрозообентосны-ми индикаторными видами. Студенты должны научиться идентифицировать их с помощью определителей, подсчитывать количество «обнаруженных» групп. Используя табл. 10.2, уметь находить биотический индекс и оценивать класс качества воды.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Руководство по методам гидробиологического анализа поверхностных вод и донных отложений / под ред. В. А. Абакумова — Л.: Гидрометео-издат, 1983.
Унифицированные методы исследования качества вод // Методы биологического анализа вод. — Ч. 1 — М.: СЭВ, 1976.
Козлов М.А. Школьный атлас-определитель беспозвоночных / М. А. Козлов, И.М. Олигер. — М.: Просвещение, 1991.
Липин В. Ф. Жизнь водоема. — М.: Учпедиздат, 1955.
Озера, болота, пруды, лужи и их обитатели: Практическое руководство. — М.: Муравей, 1996.
Плавильщиков Н.Н. Определитель насекомых. — М.: Топикал, 1994.
Римский-Корсаков М. Н. Зоологические экскурсии / М. Н. Римский-Корсаков, Б. Е. Райков. — М.: Топикал, 1994.
Растения и животные: Руководство для натуралиста. — М.: Мир, 1991-
4.1.3. Диагностика почв
Лабораторная работа №11. ХАРАКТЕРИСТИКА КАЧЕСТВА ПОЧВЫ С ПОМОЩЬЮ РАСТЕНИЙ-ИНДИКАТОРОВ
(Лабораторная работа подготовлена Е. И. Егоровой)
Издревле растения, биологические потребности которых адаптированы к определенным местообитаниям или свойствам почв, привлекали внимание людей. В начале XX в. благодаря трудам выдающихся отечественных ученых — В. И. Вернадского, В. Н. Сукачева, В. В. Докучаева, А. П. Виноградова и других — интерес к ра
122
стениям-индикаторам вновь усилился. Большое значение для разработки методов фитоиндикации имело учение В. Н. Сукачева о биогеоценозе, о структуре, динамике, связях и классификации фитоценозов. В. В. Докучаев создал учение о всеобщей взаимосвязи явлений и процессов на земной поверхности. Он впервые сформулировал понятие о почве как об особом естественно-историческом теле, которое образуется при взаимодействии факторов почвообразования: материнской породы, климата, растительного и животного мира, рельефа и геологического возраста страны. Все эти ученые сходились во мнении о сложной и динамичной взаимосвязи между объектами живой и неживой природы, что легло в основу фитоиндикации.
Фитоиндикация представляется весьма перспективной и развивается весьма стремительно, находят все новые и новые сферы приложения. При этом она берет на вооружение самые последние достижения науки и техники, в частности современные способы аэрофотосъемки земной поверхности. Однако, к сожалению, некоторые аспекты фитоиндикации остаются неразработанными. Не исследован и не систематизирован опыт использования растений-индикаторов для практических целей. Недостаточно изучены физиолого-биохимические основы фитоиндикации. В результате растения-индикаторы выявляются эмпирически, путем наблюдений, что не исключает элемента случайности. Между тем, разработка физиолого-биохимических основ позволила бы целенаправленно отбирать растения-индикаторы, повысила бы эффективность их использования в практике. До сих пор не вполне выяснены механизмы биологических часов, причины избирательного поглощения определенными растениями химических элементов, роль магнитотропизма в пространственной ориентации растений.
Принцип метода основан на учете видового разнообразия макрофитов и их индикаторной значимости. Фитоиндикаторами называют растения, растительные сообщества или их особенности, указывающие на какие-то конкретные свойства среды. Так, с помощью растений можно выявить отдельные признаки почв: их механический состав, влажность, кислотность, засоленность, обеспеченность питательными веществами.
Различают прямые и косвенные индикаторы. Первые непосредственно связаны с объектом индикации, т. е. с каким-то конкретным условием среды, и зависят от него. Косвенные индикаторы не имеют непосредственной связи с объектом индикации, они показывают предметы или явления, которые, в свою очередь, могут быть связаны с индикатором, интересующим человека. Например, на урановых месторождениях очень часто можно встретить различные виды астрагалов (Astragalus pattersonii, A. bisulcutus, A. racetnosus в штате Колорадо, США). Эти растения, накапливая до 1,5% селена, являются прямыми его индикаторами, но, по
123
скольку селен встречается на урановых месторождениях, то по отношению к урану астрагалы будут косвенными индикаторами.
Растения могут быть индикаторами как на всем протяжении своего ареала, так и в какой-то его части. В зависимости от этого выделяют универсальные (панареальные) и локальные индикаторы. Если связь между индикатором и объектом индикации наблюдается по всему ареалу, индикатор называется универсальным. Гораздо чаще приходится иметь дело с локальными индикаторами, связанными с объектом индикации только в какой-то части своего ареала.
Для практических целей следует знать, насколько надежен и эффективен тот или иной индикатор, поэтому индикаторы характеризуют по достоверности и значимости. Достоверность — это степень сопряженности индикатора с объектом индикации. Абсолютно достоверным считается индикатор, которому в 100 % случаев соответствует объект индикации. Для расчета показателя достоверности берут определенное число эталонных участков или площадок (обычно 100), где обязательно имеется индикатор. Среди них есть и такие, где индикатор встречается вместе с объектом индикации. Процентное соотношение этих участков и участков с индикатором, но без объекта индикации служит количественным показателем достоверности индикатора. Эталонные участки обычно выбираются в одном экотопе с помощью квадратной рамки размером 100 х 100 см.
Коэффициенты достоверности и значимости являются важными характеристиками индикаторных свойств растения. Если они достаточно высокие, можно начинать фитоиндикацию. Для этого в таблицу вносят названия всех индикаторных видов, обнаруженных на площади 10м2. Растениям, характеризующим свойства почвы, присуждаются номера:
• оценка влажности:
1	— гигрофиты;
2	— ксерофиты;
• механический состав:
1	— пелитофиты;
2	— алевритофиты;
3	— псаммофиты;
• оценка кислотности:
1	— крайние ацидофилы;
2	— умеренные ацидофилы;
3	— слабые ацидофилы;
4	— ацвдофилнейтральные;
5	— околонейтральные;
6	— нейтрально-азофильные;
• достаток питательных веществ в почве:
1	— эвтрофы;
• 124
2	— мезотрофы;
3	— олиготрофы.
Частоту встречаемости учитывают по девятибалльной шестиступенчатой шкале со следующими обозначениями: 1 — очень редко, 2 — редко, 3 — нередко, 5 — часто, 7 — очень часто, 9 — масса.
Пример расчета суммарной оценки кислотности почвы
Вид	Кислотность почв (1)	Частота встречаемости (2)	(1)х(2) = (3)
Melampyrum pratense	1	1	1
Trintalis europaea	2	1	2
Pulmonaria obscura	3	3	9
Urtica urens	4	5	20
Festuca pratensis	4	9	28
Filipendula vulgaris	5	3	15
Tussilago farfara	6	2	12
Pyrola chlorantha	6	5	30
Medicago falcata	6	3	18
L(2)=32	L(3)=135
По шкале индикаторных видов растений, характеризующих кислотность почв Х(3): Х(2) = 4,2, pH почвы исследуемого участка соответствует 6,0.
Вычисляют погрешность. Оценку проводят на 5%-м уровне значимости с точностью до 0,1.
Материалы:
гербарий растений, произрастающих в средней полосе России; определители, каталоги растений.
ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ ЛАБОРАТОРНОЙ РАБОТЫ
1.	Получить у преподавателя задание на карточке.
2.	С помощью определителей и каталогов, используя гербарный материал, дать названия растениям по номерам, используя табл. 11.1-11.4.
3.	Выяснить, индикатором каких свойств почв являются данные растения: влажности, кислотности, наличия питательных веществ, механического состава (см. табл. 11.1 — 11.4).
4.	Рассчитать коэффициенты достоверности и значимости растений-индикаторов (см. примеры в тексте).
125
Таблица 11.1
Некоторые наиболее часто встречаемые в средней полосе России растения — индикаторы наличия питательных веществ в почве
Вид	Индикаторная значимость
Эвтрофы — индикаторы большого количества питательных веществ	
Гераньлесная (Geranium sylvaticum)	1
Горец перечный (водяной перец) (Polygonum hydropiper)	1
Грушанка круглолистная (Pyrola rotundifolia)	1
Дурман обыкновенный (Datura stramonium)	1
Звездчатка дубравная (Stellaria nemorum)	1
Иван-чай узколистный (Chamerion angustifolium)	1
Крапива (Urtica sp.)	1
Купена многоцветковая (Polygonatum multiflorum)	1
Ландыш майский (Convallaria majalis)	1
Мятлик обыкновенный (Роа trivialis)	1
Осока лисья (Carex vulpina)	1
Папоротник страусник (Struthiopteris filicastrum)	1
Подбел обыкновенный (Andromeda polifolia)	1
Пролесник многолетний (Mercurialis perennis)	1
Таволга обыкновенная (Filipendula vulgaris)	1
Фиалка удивительная (Viola mirabilis)	1
Мезотрофы — индикаторы среднего достатка питательных веществ	
Бересклет бородавчатый (Euonymus verrucosa)	2
Ветреница лютичная (Anemone ranunculoides)	2
Грушанка круглолистая (Pyrola rotundifolia)	2
Земляника (Fragaria sp.)	2
Калужница болотная (Caltha palustris)	2
Клевер средний (Trifolium medium)	2
Купальница европейская (Trollius europaeus)	2
Лапчатка прямостоячая (калган) (Potentilla erecta)	2
Папоротник щитовник мужской (Dryopterisfilix mas)	2
Подмаренник настоящий (Galium mollugo)	2
126
Окончание табл. 11.1
Вид	Индикаторная значимость
Мезотрофы — индикаторы среднего достатка питательных веществ	
Смолевка поникшая (Silene acaulis)	2
Сфагнум береговой (Sphagnum)	2
Щавель кислый (Rumex acetosa)	2
Олиготрофы — индикаторы низкого достатка питательных веществ	
Брусника (Vacdnium vitis-idaea)	3
Клевер пашенный (Trifollium arvense)	3
Клюква болотная (Oxycoccus palustris)	3
Лишайник кладония (Cladonia sp.)	3
Осока топяная (Carex limosa)	3
Плаун булавовидный (Lycopodium clavatum)	3
Черника (Vacdnium myrtillus)	3
Щавель малый (Rumex asetosella)	3
Ястребинка волосистая (Hieracium pilosella)	3
Эвритрофы — растения, развивающиеся на почвах различного достатка	
Клевер ползучий (Trifolium repens)	4
Душистый колосок обыкновенный (Anthoxantum odoratum)	4
Лапчатка серебристая (Potentilla argentea)	4
Лютик едкий (Ranunculus acris)	4
Лютик ползучий (R. repens)	4
Овсяница луговая (Festuca pratensis)	4
Пастушья сумка (Capsella bursa-pastoris)	4
Тысячелистник обыкновенный (Achillea millefolium)	4
5.	Дать характеристику свойств почв, на которые указывают найденные вами растения-индикаторы (см. пример в тексте).
6.	В отчете привести все названия растений, среди них указать растения-индикаторы и характеризуемые ими свойства почв; привести расчеты коэффициентов достоверности и значимости индикаторов. В выводе должен прозвучать ответ на п. 5.
127
Таблица 11.2
Некоторые представители растений — индикаторов кислотности почв
Вид	Индикаторная значимость
Крайние ацидофилы (pH 3,0—4,0)	
Марьянник луговой (Melampyrum pratense)	1
Осока волосистоплодная (Carex lasiocarpa)	1
Плаун булавовидный (Lycopodium clavatum)	1
Росянка круглолистная (Drosera rotundifolia)	1
Черника (Vaccinium myrtillus)	1
Умеренные ацидофилы (pH 4,5 —6,0)	
Багульник болотный (Ledum palustre)	2
Вейник незамеченный (Calamagrostis neglecta)	2
Грушанка малая (Pyrola minor)	2
Калужница болотная (Caliha palustris)	2
Лютик едкий (Ranunculus acris)	2
Осока двурядная (Carex disticha)	2
Осока ложносытевидная (Carex pseudocyperus)	2
Подмаренник трехнадрезанный (Galium trifidum)	2
Седмичник европейский (Trintalis еигораеа)	2
Слабые ацидофилы (pH 5,0—6,7)	
Белокрыльник болотный (Calla palustris)	3
Ветреница лютичная (Anemone ranunculoides)	3
Горец змеиный (раковые шейки) (Polygonum bistorta)	3
Звездчатка дубравная (Stellaria nemorum)	3
Кипрей мелкоцветковый (Epilobium parviflorum)	3
Медуница неясная (Pulmonaria obscura)	3
Осока желтая (Carexflavella)	3
Сабельник болотный (Comarum palustre)	3
Ситник скученный (Juncus conglomerates)	3
Скерда болотная (Crepis paludosa)	3
128
Продолжение табл. 11.2
Вид	Индикаторная значимость
Лцидофилнейтральные (pH 4,5—7,0)	
Вейник наземный (Calamagrostis epigeios)	4
Иван-чай узколистный (Chamaenerion angustifolium)	4
Крапива жгучая (Urtica urens)	4
Ландыш майский (Convallaria majalis)	4
Марь красная (Chenopodium rubrum)	4
Мятлик расставленный (Роа remota)	4
Овсяница луговая (Festuca pratensis)	4
Хмель вьющийся (humulus lupulus)	4
Ястребинка луговая (Hieracium pratense)	4
Околонейтральные (pH 6,0 —7,3)	
Василисник малый (Thalictrum minus)	5
Клевер горный (Trifolium montanum)	5
Мыльнянка лекарственная (Saponaria officinalis)	5
Очиток едкий (Sedum acre)	5
Полынь шелковистая (Artemisia sericea)	5
Полынь широколистная (A. latifolia)	5
Смолевка поникшая (Silene acaulis)	5
Таволга обыкновенная (Filipendula vulgaris)	5
Чертополох поникший (Carduus nutans)	5
Нейтрально-базофильные (pH 6,7—7,8)	
Василек русский (Centaurea ruthenica)	6
Грушанка зеленоцветковая (Pyrola chlorantha)	6
Кизильник среднерусский (Cotoneaster alaunicus)	6
Люцерна серповидная (Medicago falcata)	6
Мать-и-мачеха (Tussilago fatfara)	6
Молочай тонкий (Euphorbia subtilis)	6
Фиалка скальная (Viola rupestris)	6
Ястребинка зонтиковидная (Hieracium cymosum)	6
5 Мелехова
129
Окончание табл. 11.2
Вид	Индикаторная значимость
Базофильные (pH 6,7—8,5)	
Астра солончаковая (Aster tripolium)	7
Болотница пятицветковая (Eleocharis quinqueflora)	7
Лапчатка белая (Potentilla alba)	7
Лен многолетний (Linum регеппе)	7
Меч-трава обыкновенная (Cladium mariscus)	7
Многоножка обыкновенная (Polypodium vulgaris)	7
Плевел трансильванский (Lotium transsilvanica)	7
Пузырник ломкий (Cystopteris fragilis)	7
Таблица 11.3
Некоторые растения—индикаторы влажности почвы
Вид	Индикаторная значимость
Гигрофиты	
Бодяк болотный (Cirsium palustre)	1
Болотница болотная (Eleocharispalustris)	1
Вахта трехлистная (Menyanthes trifoliata)	1
Вейник незамеченный (Calamagrostis neglecta)	1
Герань болотная (Geranium palustre)	1
Горец земноводный (Polygonum amphibium)	1
Горец змеиный (раковая шейка) (Р. bistorta)	1
Горец перечный (водяной перец) (Р. hydropiper)	1
Дербенник иволистный (плакун-трава) (Lythrum salicaria)	1
Звездчатка длиннолистная (раскидистая) (Stellaria longifolia)	1
Звездчатка толстолистная (St. crassifolia)	1
Калужница болотная (Caltha palustris)	1
Камыш лесной (Scirpus sylvaticus)	1
Камыш озерный (S. lacustris)	1
130 .
Окончание табл. 11.3
Вид	Индикаторная значимость
Кипрей мелкоцветковый (Epilobium parviflorum)	1
Лисохвост коленчатый (Alopecurus geniculatus)	1
Лютик жгучий (Ranunculus flammula)	1
Лютик ядовитый (R. sceleratus)	1
Мятлик обыкновенный (Роа trivialis)	1
Незабудка болотная (Myosotispalustris)	1
Незабудка дернистая (М. caespitosa)	1
Осока вздутая (Carex rostrata)	1
Осока лисья (С. vulpina)	1
Осока пузырчатая (С. vesicaria)	1
Осока топяная (С. lirnosa)	1
Осока удлиненная (С. elongata)	1
Подмаренник болотный (Galium palustre)	1
Пушица широколистная (Eriophorum latifolium)	1
Рогоз узколистный (Typha angustifolia)	1
Росянка круглолистная (Drosera rotundifolia)	1
Сабельник болотный (Comarum palustre)	1
Ситник жабий (Juncus bufonius)	1
Ситник скученный (Juncus conglomerates)	1
Сусак зонтичный (Butomus umbellatus)	1
Сушеница топяная (Gnaphalium uliginosum)	1
Таволга вязолистная (Filipendula ulmaria)	1
Тростник обыкновенный (Phragmites australis)	1
Частуха подорожниковая (Alisma plantago-aquatica)	1
Череда поникшая (Bidens сетиа)	1
Ксерофиты	
Молочай тонкий (Euphorbia subtilis)	2
Мятлик луковичный (Роа bulbosa)	2
Мятлик сплюснутый (Р. compressa)	2
Очиток едкий (Sedum acre)	2
131
Таблица 11.4
Наиболее часто встречаемые растения—индикаторы механического состава почв
Вид	Индикаторная значимость
Не литофиты — на тяжелых суглинках и глинах	
Звездчатка средняя (мокрица) (Stellaria media)	1
Копытень европейский (Asarum еигораеит)	1
Лебеда серая (Atriplex incana)	1
Осока просяная (Carexpanicea)	1
Пузырник ломкий (Cystopteris fragilis)	1
Алевритофиты — на легких почвах	
Астрагал датский (Astragalus danicus)	2
Клевер пашенный (Trifolium arvense)	2
Коровяк обыкновенный (медвежье ухо) (Verbascum thapsus)	2
Купена лекарственная (Polygonatum officinale)	2
Лапчатка серебристая (Potentilla argentea)	2
Льнянка обыкновенная (Linaria vulgaris)	2
Очиток едкий (Sedum acre)	2
Смолевка лежачая (Silene procumbens)	2
Ястребинка зонтиковидная (Hieracium cymosum)	2
Псаммофиты — обитатели песков	
Белокопытник ложный (Petasites spurius)	3
Грушанка зеленоцветковая (Pyrola chlorantha)	3
Житняк сибирский (Agropyron sibiricum)	3
Лапчатка песчаная (Potentilla arenaria)	3
Пырей ситниковидный (Agropyron junceum)	3
Фиалка песчаная (Viola arenaria)	3
Цмин песчаный (бессмертник) (Helichrysum arenarium)	3
Примечание. Авторы благодарят за помощь в составлении таблиц растений-индикаторов преподавателя Обнинского ИАТЭ Горшкову Т.А.
.132
СПРАВОЧНЫЙ МАТЕРИАЛ
Пример составления карточек для выполнения лабораторной работы
На летних практиках готовятся гербарии с описью основных видов растений, произрастающих на почвах с разными характеристиками механического состава, влажности, кислотности, степени обогащенности питательными веществами. В задании моделируется некоторый «участок леса или луга». Студентам выдаются гербарии примерно 10—15 видов растений, которые могут быть индкаторами всех указанных выше характеристик почв. Задается частота их встречаемости в экотопе. Указывается количество эталонных участков, на которых объект индикации (например, суглинистая почва) присутствует вместе с индикатором (например, копытнем .европейским). Далее в карточке указывается количество эталонных участков, на которых есть только объект индикации (например, суглинистая почва), а сам индикатор отсутствует. Студенты должны назвать индикаторые виды по всем характеристикам почв (в гербарии могут присутствовать и не индикаторные виды растений). Рассчитать достоверность и значимость всех индикаторов. Карточку можно составить таким образом, чтобы каждую почвенную характеристику представляли не более двух индикаторных видов или не более двух видов были достоверны и значимы как индикаторы. И только на какую-то одну характеристику почвы (например, по влажности) будут представлены более трех индикаторных видов с показателем значимости более 50 % и достоверности не ниже 1,5. В этом случае студент дальше работает только с этими индикаторными видами и характеризует только, например, влажность почвы.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Артамонов В. И. Зеленые оракулы. — М.: Мысль, 1989.
Методы изучения состояния окружающей среды. — Вологда: Русь, 1996.
Новиков В. С. Школьный атлас-определитель высших растений / В.С.Новиков, И.А.Губанов. — М.: Просвещение, 1991.
Лабораторная работа №12. ЛИХЕНОИНДИКАЦИЯ
РЕКРЕАЦИОННОЙ НАГРУЗКИ НА ПРИГОРОДНЫЕ БИОЦЕНОЗЫ
{Лабораторная работа подготовлена Е. И. Егоровой)
Помимо индикаторной реакции на загрязнение атмосферного воздуха поллютантами химической природы, лишайники извест
133
ны как организмы, высокочувствительные к рекреационной нагрузке на почву. Это их свойство используется при оценке качества почвы в местах активного отдыха, сбора ягод, грибов, выпаса скота и т. п. Как правило, некоторые виды эпигейных лишайников, являющиеся индикаторными на рекреационную нагрузку среды их обитания, исчезают из наземного покрова лесных фитоценозов раньше, чем многие мхи и цветковые растения.
Принцип метода лихеноиндикации рекреационной нагрузки на почву основан на том, что лишайниковый ярус наряду с моховым является наиболее чувствительным компонентом лесного фитоценоза к рекреационной нагрузке и подразделяется по индикаторной значимости лишайников на три группы; по наличию их представителей проводят оценку. При вытаптывании лишайники ломаются, крошатся, а затем совсем исчезают. Многие виды лишайников способны возобновляться вегетативно (с помощью слоевища). Однако многократное прохождение людей по одному и тому же месту приводит к разрушению лишайниковых группировок (синузий) и появлению на их месте луговых и сорных растений, несвойственных данному местообитанию.
Лихеноиндикация рекреационной нагрузки наиболее подходит для сосновых и еловых лесов с развитым лишайниковым покровом. Для анализа берутся наземные (эпигейные) виды лишайников. Условно по степени устойчивости к рекреационной нагрузке эти лишайники можно разделить на три группы: слабо-, средне-и сильноустойчивые (табл. 12.1). Показателями антропогенной рек-
Таблица 12.1
Группы устойчивости индикаторных лишайников к рекреационной нагрузке
Группа	Степень устойчивости	Виды лишайников*
1	Слабоустойчивые	Cladina stellaria, С. arbuscula, С. rangiferina, С. sp.
2	Среднеустойчивые	Cladonia unsialis, C. glasilis, C. crispate, C. sp.
3	Сильноустойчивые	Cetraria islandica, C. sp., Peltigera canina, P. sp.
* В качестве индикаторных видов могут быть представители указанного рода лишайников в каждой группе устойчивости.
.134
реационной нагрузки на лишайниковый ярус могут служить: общее проективное покрытие, выраженное в процентах; видовое разнообразие; видовой состав доминантов в синузиях и процент проективного покрытия доминантов; биомасса; высота кустиков слоевищ лишайников родов Cladonia, Cladina, Cetraria.
Внимание! При проведении оценки степени рекреационной нагрузки с помощью лишайников следует учитывать особенности лишайникового покрова в разных типах леса. В светлых сосновых лесах проективное покрытие несколько выше, чем в еловых, что связано с естественными особенностями этих биотопов.
Ниже приводится способ определения рекреационной нагрузки на почву с помощью лишайников в природных условиях.
1.	На исследуемых участках леса, а также на контрольном участке (вдали от возможного вытаптывания) с одинаковым типом растительности (и биотопом) заложить серию пробных площадок размером 4 м2; количество пробных площадок 20—50. Пробные площадки должны покрывать равномерной сетью всю площадь, на которой проводится оценка степени антропогенного воздействия. Площадки закладывать как вблизи троп, так и на некотором расстоянии от них.
2.	Изготовить рабочую карту или схему обследуемой местности. На схему нанести пробные площадки и дорожную (тропиночную) сеть. Определить площадь дорожно-тропиночной сети в процентах от общей площади обследуемого лесного массива.
3.	На пробных площадках с помощью определителя провести учет видов лишайников, рассчитать проективное покрытие (см. лабораторную работу № 1), выявить доминантные виды и их долю в проективном покрытии (в %). Для расчета суммарной антропогенной нагрузки по индикаторным видам лишайников оценивают частоту встречаемости каждого вида (в %) на всех исследуемых площадках и условно обозначают цифрами: 1 — очень редко, 2 — редко, 3 — нередко, 5 — часто, 7 — очень часто, 9 — масса.
4.	Сравнить видовой состав пробных площадок с помощью коэффициентов сходства и различия. Оценить видовую насыщенность (или богатство), которая определяется как количество видов лишайников на площади 1 м2 с учетом среднеквадратичного отклонения.
Рассчитать коэффициент общности {сходства) по Жаккару Kj по формуле
К.=----С---100%,	(1)
а + Ь-с
где а — число видов лишайников на первой площадке; b — число видов лишайников на второй площадке; с — число видов лишайников, общих для обоих площадок,
135
или коэффициент общности (сходства) по Сенерсену Ks по формуле
2с
Ks =-=Ь-100%.	(2)
а + Ь
Рассчитать коэффициент дифференциальности (различия) Kd, показывающий степень различия видового состава, по формуле
Ka = a+b~2cioo%,	(3)
а + Ь-с
где а — число видов, встречающихся только на 1-й площадке; b — число видов, встречающихся только на 2-й площадке; с — число видов лишайников, общее для двух сравниваемых площадок.
5.	На карте условными значками или цветом выделить зоны с разной степенью рекреационной нагрузки на почву, используя пример.
Пример расчета суммарной антропогенной рекреационной нагрузки на пригородные биоценозы
Место исследования. Дата. Сообщество: ельник—лишайник.
Вид-индикатор, обнаруженный на площадке	Степень устойчивости (1)	Частота встречаемости на площадке (2)	(1)х(2) = (3)
Cladina stellaria,	1	3	3
С. albuscula	1	5	5
Cladonid. unsialis	2	5	10
C. crispata	2	1	2
Cetraria islandica,	3	1	3
Peltigera canina,	3	1	3
P. aphtposa	3	1	3
Z(2)=18	£(3) =29
Суммарная рекреационная нагрузка исследуемой территории 1(3): £(2) = 1,6, что соответствует промежуточной степени рекреационной нагрузки на почву между слабой и средней.
Вычисляют погрешность. Интервал точности для статистической надежности 95 %. Обычно общая суммарная степень антропогенной рекреационной нагрузки вычисляется с точностью до 0,1.
136.
Материалы:
определители-каталоги лишайников; коллекция лишайн>вков, произрастающих в средней полосе России.
ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ ЛАБОРАТОРНОЙ РАБОТЫ
1.	Получить у преподавателя задание на карточке.
2.	С помощью определителя дать родовое и видовое название всех лишайников, указанных в карточке номерами.
3.	Выявить индикаторные виды, характеризующие раз лую степень рекреационной нагрузки (см. табл. 12.1 и рис. 12.1).
4.	Сравнить видовой состав двух пробных площадок, указанных в карточке, с помощью коэффициентов сходс тва (формулы 1 или 2) и различия (по формуле 3).
5.	Полученные результаты представить в виде коэфф*«циентов сходства и различия площадок, а также сумм арной степени рекреационной нагрузки на почву, используя пр имер в тексзте.
6.	В отчете привести родовые и видовые названия инди катеров, указанных в карточке цифрами. Определить их: индикаторную значимость. Привести оценку сходства и различия пробных: площадок по видовому разнообразию присутствующих на них лишайни-
Рис. 12.1. Некоторые индикаторные виды лишайников:
1 — пелтигера собачья (Peltigera canina); 2 — пелтигера горизонтальная (Peltigera horizontalis); 3 — кладония пальчатая (Cladonia digitata)-, 4 — клапоииз) бесформенная (Cladonia deformis); 5 — цетрария можжевельниковая (Cetraria J-uniperina)', б — цетрария смешанная (Cetraria connmecta)
137
ков. Оценить суммарную рекреационную нагрузку на исследуемую территорию.
СПРАВОЧНЫЙ МАТЕРИАЛ
Пример составления карточки для выполнения лабораторной работы
Для изготовления «макетов» лишайниковых сообществ можно привлекать студентов, которые уже прошли лекционный и лабораторный курс по биотестированию и биоиндикации и во время летней практики отрабатывают методики. Собранные ими эпи-гёйные лишайники следует пронумировать и сделать опись.
В задании на карточке к лабораторной работе предложить «макеты» двух разных участков с 5 —7 видами напочвенных лишайников на каждой. Указать частоту их встречаемости в сообществе.
Перечень лишайников-индикаторов рекреационного воздействия на почву
1.	Кладония (Cladonia sp.). Лишайники этого рода широко распространены и растут на земле, пнях, у основания стволов, среди мхов, иногда на скалах. Первичное слоевище у большинства выражено в виде мелких листоватых чешуек или корочек. На первичном слоевище возникает вторичное слоевище в виде вертикально стоящих выростов самой разнообразной формы.
2.	Цетрария (Cetraria sp.). Cetraria islandica (исландский мох) — лишайник с характерным листоватым талломом с глубоко вырезанными лопастями, напоминающими оленьи рога. Растет на почве. Отдельные веточки достигают в ширину 1 — 1,5 см; в зависимости от освещенности — зеленоватого или темно-коричневого цвета с верхней стороны и с серебристо-белым налетом на' нижней. Встречается преимущественно на солнечных сухих участках леса — от равнин до высокогорий.
3.	Пелтигера (Peltigera sp.). Среди представителей данного рода наиболее распространены два вида — Peltigera canina и Р. aphtrosa. Тело листовидное с широкими лопастями. Растут на почве, по обочинам дорог, на стволах деревьев.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Артамонов В. И. Зеленые оракулы. — М.: Мысль, 1989.
Биологический энциклопедический словарь. — М.: Большая российская энциклопедия, 1995.
Гарибова Л. В. Водоросли, лишайники и мохообразные СССР / Л. В. Гарибова [и др.]. — М.: Мысль, 1978.
138
Жизнь растений. Т.З. Водоросли, лишайники. — М.: Просвещение, 1977.
Лемеза Н.А. Малый практикум по низшим растениям / Н.А.Лемеза, А.С. Шуканов. — Минск, 1994.
Методы изучения состояния окружающей среды. — Вологда: Русь, 1996.
4.2. Оценка качества среды методами биотестирования
4.2.1. Биохимический подход
Лабораторная работа № 13. ЛИЗОЦИМНЫЙ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД ОЦЕНКИ СОСТОЯНИЯ
ВОДНЫХ БИОЦЕНОЗОВ
(Методика разработана Г. Н. Соловых)
Микроценозы — структурная единица экосистемы и информативная диагностическая компонента биоты, которая в силу высокой адаптации быстро реагирует на смену экологических условий, меняя свою функциональную активность по количественным и качественным параметрам, что важно для оценки состояния водных биоценозов.
В водной среде регистрируется широкий спектр организмов, обладающих лизоцимной* активностью и играющих значительную роль в самоочищении водоема.
Однако при поступлении промышленно-бытовых стоков в воду происходит селективный отбор штаммов, обладающих антилизо-цимным признаком, обеспечивающим им преимущество в заполнении экологических ниш в водоеме. Микроорганизмы, формирующие водные биоценозы, образуют функциональную систему «лизоцим — антилизоцим».
В биоиндикации антропогенного загрязнения водоема широкое распространение получили микробиологические методы, основанные на учете числа сапрофитных бактерий, выращенных на МПА, а также с помощью весьма распространенного метода оценки на основании коли-титра и коли-индекса. Наиболее надежно качество воды и состояние водного биоценоза характеризуется оценкой их с гидробиологических позиций, т. е. оценкой «откликов» на антропогенные воздействия всех компонентов биоты:
’Лизоцим — мурамидаза, фермент класса гидролаз. Катализирует гидролиз гликозидных связей между остатками аминосахаров N-антиглюкозамина и N-ацетилмурамовой кислоты в полисахаридных цепях муреинов (гетерополисаха-ридных стенок бактериальных клеток), что ведет к разрушению оболочки бактериальной клетки. Обнаружен у фагов, бактерий, растений, животных. В организме лизоцим выполняет функцию неспецифического антибактериального барьера.
139
фито-, зоопланктона и бентоса. Однако все предлагаемые методы не лишены целого ряда недостатков. Это в первую очередь длительность и трудоемкость обработки взятых проб, а значит, низкая оперативность в регистрации антропогенного воздействия, а также регистрация уже состоявшегося изменения в биоценозе, а не предсказание его начала.
В основу принципа метода, предлагаемого в лабораторной работе, положена система «лизоцим — антилизоцим» микроорганизмов, которая образует функциональную систему «лизоцим (ЛА) — антилизоцим (АЛА)» в биоценозе: ЛА бактерии -<-----► АЛА
бактерии.
Исследования показали, что такая система чутко реагирует на антропогенные воздействия и может быть использована для биоиндикации ранних изменений в водоеме. Исходя из сказанного, в основу метода взято определение микробиологического индекса «Л», основанное на изучении количественных и качественных различий микроорганизмов, обладающих лизоцимным (ЛА) и антилизоцимным (АЛА) признаками. Полученный показатель позволяет выявлять ранние нарушения в состоянии водных биоценозов. При условии Л > 1, прогнозируется хорошее состояние биоценозов, при Л < 1 оно ухудшается.
Правила отбора проб для анализа следующие.
1. Пробы отбирают в любой точке обследуемого водоема. Однако для полной биологической оценки водоема рекомендуется отбирать пробы в каждой точке батометром Молчанова с трех горизонтов: поверхность, середина и дно. Пробы сливают по 50 мл в одну стерильную колбу, тщательно перемешивают, в результате чего получается интегрированная проба воды, которую используют для анализа.
2. При мониторинге рек отбор проб производят в трех точках одного створа (поперечного сечения реки): на правом берегу, левом и в середине реки.
Оборудование, материалы и реактивы:
стерильные чашки Петри; пробирки, пипетки на 1 мл, 5 мл, 10 мл; спиртовка; микробиологическая петля; этиловый 96%-й спирт; 1,5-и 0,7%-й МПА; суточная культура Micrococcus lysodecticus, штамм № 2665 (ГНСК им Л. А. Тарасевича); сухой яичный лизоцим; стерильная дистиллированная вода; хлороформ; исследуемая вода водоема.
ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ ЛАБОРАТОРНОЙ РАБОТЫ
1.	Приготовить взвесь микрококка (одномиллиардную взвесь по стандарту мутности).
2.	Приготовить раствор лизоцима в концентрации 5 мкг/мл.
140
3.	Произвести разведение посевного материала (воды исследуемого водоема) до 10~2 и этот материал использовать для посева.
4.	Провести посев микрофлоры из воды с целью выявления лизоцимактивных бактерий. Для этого расплавить 1,5%-й МПА. В чашки Петри добавить 0,2 мл посевного материала и 0,2 мл одномиллиардной взвеси суточной культуры Micrococcus lysodecticus. Затем добавить примерно 10—20 мл расплавленного и охлажденного до 45—50 °C 1,5%-го питательного агара. Содержимое чашки тщательно перемешать на горизонтальной поверхности стола по часовой и против часовой стрелки, не отрывая чашку от поверхности. Дать агару застыть. Чашки перевернуть.
5.	Инкубировать 24 ч в термостате при 37 °C. Затем учитывать те колонии микроорганизмов, которые образовали вокруг себя зоны лизиса микрококка. Полученное число колоний дает нам величину Mj — число лизоцимактивных колоний (ЛА).
6.	Провести посев из воды с целью определения антилизоцим-ных микроорганизмов. Для этого расплавить 1,5%-й МПА. В стерильную чашку Петри влить 1 мл раствора лизоцима (5 мкг/мл) и 0,2 мл посевного материала (воды водоемов в разведении 10-2). Залить примерно 10 мл 1,5%-го питательного агара, тщательно перемешать круговыми движениями на поверхности стола. Дать среде застыть. Чашки перевернуть.
7.	Инкубировать 24 ч при 37 °C. Через сутки выросшие колонии убить хлороформом. Для этого фильтровальную бумагу положить на крышку чашки Петри и налить сверху несколько капель хлороформа. Накрыть крышку чашкой с посевом на 20 мин. По истечении этого времени крышку с хлороформом снять и залить посев сверху 5 —10 мл расплавленного и охлажденного до 45 —50 °C 0,7%-го МПА, добавить 0,2 мл микрококка в концентрации 109, тщательно перемешать, закрыть стерильно крышкой, дать среде подсохнуть. Перевернуть чашки и инкубировать 24 ч при 37 °C.
8.	Произвести после инкубации учет тех колоний микроорганизмов, вокруг которых и над которыми отмечаются зоны роста микрококка. Это и будет число антилизоцимактивных форм бактерий — М2 (количество АЛА форм.).
9.	Использовать полученные данные для подсчета показателя экологического состояния биоценозов — Л.
Оценку и прогнозирование состояния биоценоза делают по
п М,(ЛА)
соотношению: Л = ———— ,
М2(АЛА)
где М[ — число лизоцимактивных микроорганизмов; М2 — число антилизоцимактивных микроорганизмов в исследуемой пробе воды.
141
10.	Дать характеристику экологического состояния биоценоза по соотношению
1 < Л < 1
Благополучное состояние биоценоза
Неблагополучное состояние биоценоза
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Бурдин К. С. Основы биологического мониторинга. — М.: Изд-во МГУ, 1985.
Бухарин О. В. Антилизоцимный признак бактерий и перспективы его практического использования // Персесгенция микроорганизмов. — Куйбышев: КМИ, 1987.
Бухарин О. В. Метод определения антилизоцимной активности микроорганизмов / О. В. Бухарин [и др.] // Микробиология, эпидемиология и иммунология, 1984. — № 2.
Соловых Г. Н. Метод выделения и учета антилизоцимактивных бактерий из воды природных водоемов / Г. Н. Соловых [и др.] // Актуальные вопросы теоретической и клинической медицины, 1992. — Т. XXIX.
Соловых Г. Н., Бухарин О. В., Немцева Н. В. Патент РФ № 2052815, 1996.
Теппер Е. 3. Практикум по микробиологии / Е. 3.Теппер [и др.]. — М.: Колос, 1993.
Лабораторная работа №14. МЕТОД ПРИВИТОЙ СОПОЛИМЕРИЗАЦИИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ
В КАЧЕСТВЕ ТЕСТ-ОБЪЕКТА ДАФНИИ МАГНА
{Методика разработана О. П. Мелеховой и Г. В. Кассовой)
В данной лабораторной работе предлагается освоить метод прогностической оценки экологического качества воды по изменению уровня окислительного метаболизма у дафний, живущих и размножающихся в условиях антропогенного загрязнения.
В качестве теста используется реакция привитой сополимеризации (ПС) меченного по углероду индикатора акриламида 14С.
Принцип метода состоит в том, что при введении в живой организм индикатора-мономера в клетках происходит полимеризация этого ненасыщенного соединения, инициируемая метаболическими свободными радикалами, при этом образуются сополимеры, у которых цепи меченого полимера соединяются с биополимерами (белками, фосфолипопротеидами). Небольшие молекулы водорастворимого мономера легко проникают в живую клетку и достаточно быстро вымываются из нее, тогда как сополимеры, по-видимому, выключаются из нормального метаболизма и при длительной инкубации накапливаются в клетках объекта. Это обусловливает высокую чувствительность метода. Меченые сополиме
142
ры, концентрация которых в клетках биологического объекта пропорциональна количеству образующихся во время инкубации свободных радикалов, могут быть затем обнаружены методом радиометрии. Общая чувствительность метода существенно повышается при использовании современных жидкостных сцинтилляционных счетчиков.
Концентрация свободных радикалов в клетках и тканях характеризует уровень окислительно-восстановительных реакций, так как свободные радикалы (СР) являются промежуточными продуктами этих реакций. В клеточном метаболизме у животных наиболее распространены CP-реакции в ферментативных цепях окисления митохондрий и микросом, возможно, в процессе генерации АТФ, а также при неферментативном окислении (значительная часть СР в живой клетке образуется при перекисном окислении мембранных липидов). В ряде работ показано, что концентрация СР в тканях коррелирует с их функциональной активностью и является весьма чувствительным показателем различного рода повреждений клеток и тканей.
Тест-объектом для оценки степени загрязнения пресных водоемов методом ПС может быть представитель пресноводных биоценозов рачок Daphnia magna, широко распространенный в прибрежной зоне стоячих или медленно текучих водоемов. Вся процедура определения занимает не более двух суток (поэтому способ может считаться экспрессным) и проводится в 2 этапа. Первый этап — отбор проб — проводится в полевых условиях с использованием обычной лабораторной посуды и шприца для введения индикатора — раствора меченого акриламида. Концентрация и активность меченого вещества столь мала (0,1 % в воде при активности рабочего раствора 37 кБк/мл), что нет необходимости в создании особых условий безопасности для работы. Нельзя лишь допускать попадания раствора в рот или на поверхность слизистых глаза, а также следует тщательно собирать в контейнер остатки раствора и отходы опыта и своевременно доставлять их для уничтожения в лабораторию. Пробы отбираются в специальные флаконы для сцинтилляционного счета. На втором этапе работы требуется жидкостный сцинтилляционный счетчик, т.е. исследование должно завершаться в лаборатории.
Цель работы — освоение метода экспресс-оценки качества среды обитания живых организмов по изменению интенсивности СР-реакций у дафний, типичных для ранних стадий патологических процессов.
Оборудование, материалы и реактивы:
тест-объектами могут служить различные гидробионты (дафнии, эмбрионы амфибий и рыб, морские беспозвоночные и т. п.). Чашки Петри, микродозатор, мерные цилиндры (на 10 мл и более),
143
пипетки, контейнеры (с притертой пробкой) для хранения раствора индикатора и сбора отходов, кювета, ножницы, пинцеты, весы аналитические, флаконы для сцинтилляционного счета, термостат, сцинтилляционный счетчик для измерения радиоактивности; 70 %-й спирт; 0,1 %-й раствор индикатора акриламида 14С (с активностью 37кБк/мл)*; концентрированная НСЮ4> трис, сцинтилляционный раствор Брея; СиС12.
ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ ЛАБОРАТОРНОЙ РАБОТЫ
1.	Приготовить исследуемые растворы. В качестве исследуемых растворов в данной задаче используются растворы СиС12 различной концентрации относительно предельно допустимых значений — от 0,1 до 100 ПДК (табл. 14.1).
2.	По 10 дафний поместить в сосуды с 20 мл инкубационной среды — тестируемых проб и чистой воды (контроль).
3.	В каждый стакан добавить индикатор.
4.	По истечении 1,5 ч отмыть рачков тремя порциями чистой воды и, обсушив на фильтрованной бумаге, поместить по 5—6 шт. во флаконы для сцинтилляционного счета.
5.	К каждой пробе добавить по 0,4 мл концентрированной НСЮ4 и поставить в термостат до полного растворения пробы (на 10— 15 ч) при 56 °C.
6.	Затем к каждой пробе добавить по 1 мл 1,5М триса и по 10 мл сцинтилляционного раствора Брея.
7.	Радиоактивность проб определить методом жидкостной сцинтилляции, учитывая, что включение метки пропорциональна уровню радикальной полимеризации.
8.	Для оценки токсичности исследуемых растворов сравнить уровень радикальной полимеризации в опытных и контрольных пробах. Это достигается сопоставлением их радиоактивности (в пересчете на 1 дафнию).
9.	Эксперимент ставится в трех повторностях. Достоверность различия опытных и контрольных выборок оценить стандартными статистическими методами.
Внимание! Индивидуальные различия в интенсивности СР-ре-акций у интактных особей не превышают 20 %, а сдвиг среднего значения уровня CP-реакций в опытной выборке на 30—40% по отношению к контролю соответствует началу патологического процесса.
Форму таблицы для представления результатов см. в лабораторной работе № 15.
* Радиоактивный индикатор (патент № 2073868, 1997) должен применяться в низких концентрациях, которые не нарушают физиологического состояния объекта (что выясняется в предварительных опытах).
144
Таблица 14.1
Предельно допустимые концентрации загрязняющих веществ для рыбохозяйственного назначения
Загрязняющее вещество	Предельно допустимая концентрация, мг/л
Аммоний солевой (NH4+)	0,5
Нитрат-ион (NO3_)	40
Нитрат-ион (NO2~)	0,08
Нефть и нефтепродукты	0,05
Фенолы	0,001
СПАВ анионактивные	0,1
Железо (Fe3+)	0,5
Медь (Си2+)	0,001
Цинк (Zn2+)	0,01
Хром (Сг2+)	0,5
Хром (Сг6*)	0,001
Никель (Ni2+)	0,01
Кобальт (Со2+)	0,01
Свинец (РЬ2+)	0,03
Мышьяк (As3+)	0,055
Ртуть (Hg2+)	0,0005
Кадмий (Cd2+)	0,005
Марганец (Мп2+)	0,01
Фтор (F-)	1,5
Цианиды (CN-)	0,05
Родианиды (CNS~)	0,1
Метилмеркаптаны	0,002
Бензол	0,5
Метанол	0,1
Формальдегид	0,01
Калий (катион) (К+)	50,0
Кальций (катион) (Са2+)	180,0
Магний (катион) (Mg2+)	40,0
Натрий (катион) (Na+)	120,0
Сульфаты (анион) (SO42-)	100,0
Хлориды (анион) (С1~)	300,0
145
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Козлов Ю. П. Привитая сополимеризация как метод исследования свободных радикалов в биологических системах. — М.: Изд-во МГУ, 1970.
Мелехова О. П. Биоиндикация стоков промышленного производства целлюлозы методом радикальной полимеризации / О. П. Мелехова [и др.] // НДВШ, Биологические науки, 1990. — № 5.
Мелехова О.П. Экспресс-метод биотестирования качества воды по метаболическому критерию / О.П.Мелехова [и др.]. — М.: РГОТУПС, 2000.
Мелехова О. П., Бузинова Н. С., Колосова Л. В., Коссова Г. В. — Авт. свид. «Способ биоиндикации загрязнений водной среды» № 1546904, 1988.
Мелехова О. П., Коссова Г.В. — Патент № 2073868, 1997.
НонхибелД. Радикалы / Д. Нонхибел [и др.]. — М.: Мир, 1982.
Лабораторная работа №15. ИССЛЕДОВАНИЕ НАРУШЕНИЙ РАЗВИТИЯ ЭМБРИОНОВ ВОДНЫХ ЖИВОТНЫХ С ПРИМЕНЕНИЕМ МЕТАБОЛИЧЕСКОГО КРИТЕРИЯ
{Методика разработана О. П. Мелеховой и Г. В. Кассовой}
В данной работе предлагается освоить оригинальный метод оценки эмбриотоксичности воды, основанный на определении физиологического состояния зародышей по метаболическому критерию — уровеню свободнорадикальных реакций. Применение эмбриональных моделей в экспериментах по выявлению действия повреждающих факторов позволяет сделать предположения о механизмах повреждения, используя в качестве биотестов эмбрионы низших позвоночных на разных стадиях развития. В серии многолетних исследований автором метода был открыт универсальный метаболический параметр, характеризующий эмбриональные клетки в период детерминации, т.е. вступления в многоступенчатый процесс цитодифференцировки. Таким параметром оказалось активное развитие свободнорадикальных процессов. Удалось показать их участие в первичных стрессовых реакциях эмбриональных клеток при действии химических и радиационных повреждающих факторов. Предложенный в лабораторной работе радиоин-дикаторный метод выявления свободных радикалов лежит в основе нового метода биотестирования. Существенными преимуществами этого метода являются высокая чувствительность, возможность получения результатов в кратчайшие сроки (экспресс-метод), удобство для применения в полевых условиях. Важно отметить также, что результаты измерений метаболической стрессовой реакции при длительных наблюдениях коррелируют с последующими патологическими изменениями тест-объекта (см. лабораторную работу № 24).
146
Измерения уровня свободнорадикальных реакций осуществляются методом привитой сополимеризации с помощью радиоактивного индикатора.
Принцип метода подробно описан в лабораторной работе № 14.
Цель работы — экспресс-оценка эмбриотоксичности испытуемой водной среды по уровню свободных радикалов у эмбрионов и зародышей лягушек.
Оборудование, материалы и реактивы:
чашки Петри, микродозатор, мерные цилиндры (на 10 мл и более), пипетки, контейнер (с притертой пробкой) для раствора индикатора и для отходов, кювета, ножницы, пинцеты, весы аналитические, флаконы для сцинтилляционного счета, термостат, сцинтилляционный счетчик для измерения радиоактивности; 70%-й спирт; 0,1 %-й раствор индикатора (с активностью 37 кБк/мл), концентрированная НС1О4, трис, сцинтилляционный раствор Брея.
Объекты исследования: зародыши (стадия гаструлы или нейру-лы) травяной (Rana temporaria L.) или шпорцевой (Xenopus laevis D.) лягушек, стандартизированные по возрасту. Стадии развития объектов определяли по таблицам Н. В. Дабагян и Л. А. Слепцовой для Rana temporaria L. (приведены в книге «Объекты биологии развития» — см. Список литературы) и П.Ньюкупа и Дж.Фабера для Xenopus laevis D. (приведены там же).
ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ ЛАБОРАТОРНОЙ РАБОТЫ
Для испытания чувствительности зародышей можно использовать следующие химические соединения: янтарную кислоту (биостимулятор); соли меди и лития; пестициды ДДТ и атразин; соляровое масло. Все эти вещества встречаются в сточных водах техногенных зон. Уровень их токсичности, как и механизмы действия, различны.
1.	Проинкубировать по 25 зародышей, помещенных в чашки Петри с отстоянной водой, в присутствии токсикантов различной природы в концентрациях, близких к предельно допустимым хозяйственным, и без токсиканта. Длительность нахождения зародыша в токсиканте может составить от 1 до 30 ч.
2.	В табл. 15.1 занести данные о возрасте эмбриона (стадии развития), размере, характере аномалий, выживаемости.
3.	В среду для инкубации добавить радиоактивный индикатор (активность рабочего раствора — 3,7кБк/мл). Инкубировать 90 мин в комнатных условиях.
4.	После трехкратного отмывания чистой отстоянной водой, не содержащей источников радиоактивности, перенести зародыши во флаконы для сцинтилляционного счета.
147
Таблица 15.1
Эмбриотоксичность различных химических соединений по метаболическому критерию (объект — гаструлы или нейрулы шпорцевой лягушки)
Испытываемое вещество	Концентрация		Удельная радиоактивность			Заклю-чение по экспрессному биотестированию	Гибель/урод-ство, %	
	мг/л	ДОЛИ от пдк	DPM имп/мин штук		о-к* к , %		через 1 ч (сутки)	суммарно за 2 суток
			опыт	контроль				
Вода Медный купорос Янтарная кислота Соляровое масло Хлористый литий ДДТ Атразин	0,04 0.004 0,0004 о,1 0.01 0.01 0,001 1,5 0,15 0,015 следы 0,1 (ЕЖ 0,0005	10 пдк пдк 0,1 пдк юпдк пдк пдк 0,1 пдк юпдк пдк 0,1 пдк (К,)** К, пдк 0,1 пдк						
. О-К	опыт - контроль п „ ,,
* ——------удельная радиоактивность: -------------—, %, * Kj — концен-
К	контроль
трация условная.
5.	Приготовить и проанализировать пробы по стандартной методике (см. лабораторную работу № 14, пп. 5—8).
6.	Для установления корреляции изменений уровня СР-реак-ций при адаптационной стрессовой реакции зародышей амфибий в присутствии токсикантов с более поздними нарушениями их жизнеспособности часть подопытных зародышей оставить в растворе токсиканта в течение 2 суток. За этот срок дважды подсчитать процент аномальных и погибших зародышей в каждом опыте. Результаты занести в табл. 15.1.
148
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Мелехова О. П., Коссова Г. В. Способ определения эмбриогоксичности химических соединений и их комплексов. — Патент № 2073868 от 20.02.1997.
Дабагян Н.В. Объекты биологии развития / Н. В.Дабагян, Л. А. Слепцова. — М., Наука, 1975.
Лабораторная работа №16. БИОДИАГНОСТИКА ПОЧВ ПО ФЕРМЕНТАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ
(Лабораторная работа подготовлена Е. И. Егоровой по методическим разработкам Л. В.Лысак)
Почвенно-энзимологические методы позволяют определять не количественное содержание ферментов в почве, а активность ферментов, находящихся преимущественно в адсорбированном (иммобилизованном) состоянии на поверхности почвенных коллоидов и частично в почвенном растворе.
Принцип метода определения активности почвенных ферментов основан на учете количества переработанного в процессе реакции субстрата или образующегося продукта реакции в оптимальных условиях температуры, pH среды и концентрации субстратов.
Сущность метода определения активности почвенных ферментов почвы заключается в следующем: навеску почвы насыщают антисептиком (толуолом), добавляют буферный раствор со значением pH, оптимальным для данного фермента, и определенное количество субстрата. Реакционную смесь выдерживают в термостате в течение определенного времени, и после этого проводят количественный учет продуктов реакции. Активность фермента выражают в количествах переработанного субстрата или образующегося продукта реакции в течение определенного промежутка времени и рассчитывают на единицу веса почвы или гумуса.
Для корректировки результатов ставят следующие контроли:
1) почва, стерилизованная сухим жаром при 180 °C в течение 3 ч; 2) нестерильная почва без субстрата (Н2О); 3) субстрат без почвы со всеми реактивами.
В соответствии с рекомендацией Международного биохимического союза по ферментам за единицу измерения принята стандартная ферментная единица (Е): 1Е соответствует такому количеству фермента, которое при заданных условиях катализирует превращение 1 мкМ субстрата в 1 мин. При определении почвенных ферментов это количество рассчитывают на единицу веса (например, на 1 г) почвы.
149
Методика отбора почвенных образцов определяется поставленными перед исследователем задачами. Во всех случаях образцы почв должны наиболее полно характеризовать исследуемую площадь (см. гл. 3).
Образцы высушивают непосредственно после взятия в полевых условиях до воздушно-сухого состояния, обязательно в тени. Перед анализами почву тщательно очищают от корней растений и других растительных остатков и камней. Высушенные пробы растирают и просеивают через сито с диаметром отверстий 1 мм. Хранить почву перед анализом в холодильнике.
Ферменты, относящиеся к классу оксидоредуктаз, катализируют окислительно-восстановительные реакции, играющие ведущую роль в биохимических процессах в клетках живых организмов, а также в почве. Наиболее распространены в почвах такие оксидоредуктазы, как каталаза и дегидрогеназы, активность которых является важным показателем генезиса почв.
Каталаза разлагает на воду и молекулярный кислород ядовитую для клетки перекись водорода, образующуюся в процессе дыхания живых организмов в результате различных биохимических реакций окисления органических веществ.
Активность каталазы определяется газометрическим методом по объему выделившегося кислорода, основанным на измерении скорости разложения перекиси водорода при ее взаимодействии с почвой.
Дегидрогеназы — ферменты, которые участвуют в процессе дыхания, отщепляя водород от окисляемых субстратов. Одни дегидрогеназы переносят водород непосредственно на молекулярный кислород, другие — на какие-либо акцепторы, например на хиноны, метиленовую синь.
Для определения активности дегидрогеназы в качестве акцептора водорода применяют бесцветные соли тетразолия (2,3,5-трифенилтетразол ий хлористый (ТТХ), которые восстанавливаются в красные соединения формазана (трифенилформазан (ТФФ).
Гидролазы осуществляют реакции гидролиза разнообразных сложных органических соединений, действуя на различные связи: сложноэфирные, глюкозидные амидные, пептидные и др. К этому классу относятся ферменты инвертаза, уреаза и др., активность которых является важным показателем биологической активности почв и широко используется для оценки антропогенного воздействия.
Инвертаза действует на p-фруктофуранозидную связь в сахарозе, рафинозе, стахиозе и производит расщепление сахарозы на эквимолярные количества глюкозы и фруктозы.
Фотоколориметрическое определение активности инвертазы основано на учете восстанавливающих сахаров, образующихся при расщеплении сахарозы.
150
Разложение органических азотистых соединений осуществляется при непосредственном участии внеклеточных ферментов. Образующийся при уреазной активности аммиак служит источником питания растений.
Уреаза катализирует гидролиз мочевины. Конечными продуктами гидролиза являются аммиак и углекислый газ. Мочевина попадает в почву в составе растительных остатков, навоза и как азотное удобрение; она образуется также в самой почве в качестве промежуточного продукта в процессе превращения азотистых органических соединений — белков и нуклеиновых кислот.
Описываемые методы определения ферментов даны по Ф. X. Хазиеву.
Цель работы — определение биологической активности почв на разном удалении от дороги по четырем ферментным системам: дегидрогеназам, каталазе, инвертазе, уреазе.
ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ ЛАБОРАТОРНОЙ РАБОТЫ
Определение каталазной активности
Оборудование и реактивы:
система для газометрии (рис. 16.1); 10 %-й раствор Н2О2; СаСО3.
1.	Навеску просеянной почвы 1 г внести в колбу на 100 мл, добавить 0,5 г СаСО3.
2.	На дно осторожно поставить с помощью пинцета маленький стаканчик с 1,7 мл 10 %-го раствора перекиси водорода.
3.	Навеску почвы смочить 4 мл дистиллированной воды.
4.	Колбу плотно закрыть каучуковой пробкой с трубкой, соединенной с бюреткой толстостенным каучуком через тройник, снабженный зажимом. Бюретка сообщается с грушей. Бюретка и груша заполнены водой. Уровень воды в них уравновешивают и грушу закрепляют на определенной высоте.
5.	Начало опыта отметить по секундомеру в момент, когда сосудик с перекисью водорода опрокинут, и вслед за этим встряхнуть содержимое колбы. Взбалтывание смеси следует продолжать во все время опыта, не касаясь непосредственно дна колбы руками. Выделяющийся кислород вытесняет из бюретки воду, уровень которой отмечают.
6.	Количество выделившегося молекулярного кислорода учитывают в течение 1 мин при температуре 18— 20 °C.
7.	Активность каталазы выражают в объеме (см3) кислорода, выделившегося на 1 г почвы в минуту. Ошибка определения до 5%.
8.	Аналогичные процедуры проделать со всеми образцами почв.
9.	По табл. 16.1 оценить степень насыщения исследуемых почв каталазой.
151
Рис. 16.1. Установка для газометрического определения каталазной активности в почвенных образцах:
1 — колба, 2 — бюретка, 3 — переходник, 4 — груша с водой
Таблица 16.1
Шкала для оценки степени обогащеииости почв ферментами
Степень обогащенное™ почв	Каталаза, О2 см3/г за 1 мин	Дегидрогеназы, мг ТФФна 10 г за 24 ч	Инвертаза, мг глюкозы на 1 г за 24 ч	Уреаза, мг nh4, на 10 г за 24 ч	Фосфотаза, мг Р2Оз на 10 г за 1 ч
Очень бедная	< 1	<1	<5	<3	<0,5
Бедная	1-3	1-3	5-15	3-10	0,5-1,5
Средняя	3-10	3-10	15-50	10-30	1,5-5,0
Богатая	10-30	10-30	50-150	30-100	5-15
Очень богатая	>30	>30	> 150	> 100	>15

Определение дегидрогеназной активности
Оборудование, материалы и реактивы:
фотоколориметр; миллиметровая бумага; 0,1М раствор глюкозы; 1 %-й раствор 2,3,5-трифенилтетразолия хлористого (11Х); СаСО3; этиловый спирт; трифенилформазан (ТФФ).
1.	Навески воздушно-сухой почвы по 1 г из каждого образца поместить в пробирки, добавить по 10 мг (на кончике шпателя) СаСО3, по 1 мл 0,1М раствора глюкозы и по 1 мл 1%-го раствора ТТХ; содержимое каждой пробирки тщательно смешать.
2.	Пробирки поместить в анаэростат и откачать воздух насосом при разрежении 10—12 мм рт. ст. в течение 2—3 мин. Затем инкубировать при 30 °C в течение 24 ч.
3.	По истечении времени инкубации содержимое пробирок экстрагировать в 3 — 4 приема 25 мл этилового спирта. Для этого небольшой, объем спирта внести в пробирку и встряхивать в течение 5 мин до появления красной окраски. Дать отстояться и надпочвенную жидкость профильтровать через бумажный фильтр. Добавить в пробирку следующую порцию спирта.
4.	Полученный окрашенный раствор формазана колориметрировать на ФЭКе с синим светофильтром (500—600 нм).
5.	Количество формазана в миллиграммах рассчитать по стандартной кривой. Для этого приготовить стандартный раствор формазана в этиловом спирте в концентрации 0,1 мг в 1 мл. Рабочие растворы для составления кривой приготовить путем разведений стандартного раствора (примерно 5 точек). Стандартную кривую построить на миллиметровой бумаге в системе: оптическая плотность при длине волны 500— 600 нм — концентрация формазана в спирте.
6.	Активность дегидрогеназы (А) выражают в миллиграммах ТФФ на 10 г почвы за сутки по формуле
„ _ ЛГ -10
А —-------,
v
где V — общий объем фильтрата, 25 мл; 10 — пересчетный коэффициент веса почвы, г; v — произведение объемов субстрата и реагента, 1 мл; А — количество ТФФ, полученное по калибровочной кривой, мг/мл. Ошибка определения — до 8 %.
7.	По табл. 16.1 оценить степень насыщения исследуемых почв дегидрогеназой.
Определение инвертазной активности
Оборудование и реактивы:
фотоколориметр; 5%-й раствор сахарозы; ацетатный буфер (pH 4,7); толуол; раствор Феллинга: а — 40 г CuSO4- 5Н2О растворяют в воде и доводят до 1 л, фильтруют через бумажный фильтр, б — 200 г сегнетовой соли (C4H4O6KNa-4Н2О) растворяют в дистиллированной воде, прибавляют 150 г КОН и доводят до 1 л.
153
1.	В колбы вместимостью 50 мл поместить по 5 г каждого образца почвы, добавить по 10 мл 5%-го раствора сахарозы, 10 мл ацетатного буфера (pH 4,7) и 5 — 6 капель толуола.
2.	Колбы закрыть пробками, встряхнуть, поместить в термостат при температуре 30 °C на 24 ч и периодически встряхивать их.
3.	После инкубации содержимое колб отфильтровать в мерные колбы на 25 мл. Довести до метки.
4.	Из фильтратов взять по 6 мл в большие пробирки, добавить по 3 мл раствора сегнетовой соли и 3 мл раствора сернокислой меди, хорошо перемешать и кипятить на водяной бане 10 мин. Получается красный осадок.
5.	Пробирки с раствором охладить в воде, содержимое отфильтровать в большие пробирки. Прозрачный фильтрат колориметрировать на ФЭК, используя светофильтр с длиной волны 630 нм, ширина кюветы 1 см.
6.	Для получения калибровочной кривой приготовить стандартный раствор: 6 мг глюкозы в 1 мл. Разведением приготовить серию растворов. Фотоколориметрировать и построить кривую: оптическая плотность — концентрация глюкозы в 1 мл.
7.	Активность инвертазы (А) выражают в миллиграммах глюкозы
A2V
на 1 г почвы за 24 ч по формуле X =--,
mv
где А — количество глюкозы, полученное по калибровочной кривой из оптической плотности, мг/мл; т — навеска почвы, 5 г; V — общий объем фильтрата, 25 мл; v — объем фильтрата, взятого для анализа, 6 мл. Ошибка определения — до 5 %.
8.	По табл. 16.1 оценить степень насыщения исследуемых почв инвертазой.
Определение уреазной активности почв
Оборудование и реактивы:
фотоколориметр; 2%-й раствор мочевины в фосфатном буфере (pH 6,7); 50%-й раствор сегнетовой соли; 50%-й раствор СС13СООН (трихлоруксусная кислота); 1%-й раствор КС1; реактив Несслера; стандартный раствор NH4C1.
1.	По 5 г воздушно-сухой почвы поместить в колбы емкостью 100 мл, прилить по 20 мл 2%-го раствора мочевины в фосфатном буфере (pH 6,7) и по 200 мкл толуола.
2.	Колбы плотно закрыть и поместить в термостат при температуре 37 °C на 4 ч.
3.	После экспозиции прилить по 1 мл 50%-го раствора трихлоруксусной кислоты.
4.	Для вытеснения из почвы поглощенного аммиака добавить по 50 мл 1 н. раствора хлористого калия.
. 154
5.	Содержимое колб отфильтровать.
6.	По 2 мл фильтрата поместить в мерные колбы объемом 50 мл, развести водой до 30 мл, затем прилить по 2 мл 50%-го раствора сегнетовой соли и по 2 мл реактива Несслера. Колбы долить водой до метки, перемешать и окрашенный раствор колориметрировать при длине волны 400 нм.
7.	Содержание аммиака в фильтрате рассчитать по стандартной кривой. Для этого приготовить стандартный раствор NH4C1 в концентрации 0,005 мг N—NH4 в 1 мл. Сделать серию разведений. Построить калибровочную кривую.
8.	Активность уреазы (X) выражают в миллиграммах N—NH4
AV
на 1 г почвы за 4 ч по формуле: X =-,
т
где А — содержание аммиака в фильтрате, полученное по калибровочной .кривой, мг/мл; V — общий объем фильтрата, 50 мл; т — навеска почвы, 5 г.
9.	По табл. 16.1 оценить степень насыщения исследуемых почв уреазой.
СПРАВОЧНЫЙ МАТЕРИАЛ
Приготовление ацетатных буферных смесей
Для области pH 3,6—5,6 (0,01 М).
Основные растворы: А — 0,2 М уксусная кислота (11,55 мл уксусной кислоты в 1л воды); Б — 0,2 М раствор ацетата натрия (16,4 г C6H3O2Na или 27,2 г C6H3O2Na • ЗН2О в 100 мл воды):
х мл раствора А + у мл раствора Б и разбавить водой до 1 л.
X	У	pH	X	У	pH	X	У	pH
46,3	3,7	3,6	30,5	19,5	4,4	10,5	39,5	5,2
44,0	6,0	3,8	25,5	24,5	4,6	8,8	41,2	5,4
41,0	9,0	4,0	20,0	30,0	4,8	4,8	45,2	* 5,6
36,8	13,2	4,2	14,8	35,2	5,0			
Приготовление фосфатной буферной смеси
Для области pH 5,7—8,0 (0,1 М).
Основные растворы: А — 0,2 М раствор однозамещенного фосфата натрия (27,8 г NaH2PO4 в 1л); Б — 0,2 М раствор двузамещенного фосфата натрия (53,65 г Na2HPO4-7H2O или 71,7 г Na2HPO4- 14Н2О в 1 л):
155
х мл раствора А + у мл раствора Б и разбавить до 200 мл:
X	У	pH	X	У	pH	X	У	pH
93,5	6,5	5,7	68,5	31,5	6,5	23,0	77,0	7,3
92,0	8,0	5,8	62,5	37,5	6,6	19,0	81,0	7,4
90,0	10,0	5,9	56,5	43,5	6,7	16,0	84,0	7,5
87,7	12,3	6,0	51,0	49,0	6,8	13,0	87,0	7,6
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Звягинцев Д. Г. Биология почв / В. Г. Звягинцев [и др.]. — М.: Изд-во МГУ, 2005.
Микроорганизмы и охрана почв / под ред. Д. Г. Звягинцева. — М.: Изд-во МГУ, 1991.
Методы почвенной микробиологии и биохимии / под ред. Д. Г. Звягинцева. — М.: Изд-во МГУ, 1991.
Практикум по агрохимии / под ред. В. Г. Минеева. — М.: Изд-во МГУ, 2001.
Хазиев Ф.Х. Методы почвенной энзимологии. — М.: Наука, 1991.
Лабораторная работа № 17. БИОТЕСТИРОВАНИЕ ВОДОЕМОВ ПО УРОВНЮ БЕЛКОВ-МЕТАЛЛОТИОНЕИНОВ В МЯГКИХ ТКАНЯХ ДВУСТВОРЧАТЫХ МОЛЛЮСКОВ
{Лабораторная работа подготовлена Е. И. Егоровой на основе методических разработок Б. И. Сынзыныса)
Металлотионеины (МТ) — низкомолекулярные белки с молекулярной массой 6—7 до 15 кДа, способные связывать ионы тяжелых металлов Zn, Cd, Pb, Hg, Си и другие и содержащие до 30 % цистеина. Каждый белок способен одновременно связывать шесть двухвалентных и одиннадцать одновалентных металлов. МТ обнаружены во всех исследованных эукариотических и прокариотических организмах в концентрациях до 2 — 3 мкг/г клеток или ткани.
Показано участие этих белков в снижении токсичности ионов металлов и регуляции гомеостаза Zn и Cd в клетках. Синтез МТ в клетках и тканях индуцируется воздействиями токсической и генотоксической природы. В опытах in vitro и in vivo продемонстрирована роль МТ в снижении токсичности и детоксикации тяжелых металлов: связанные с МТ они менее токсичны.
Принцип предложенного в лабораторной работе метода основан на замещении ионов металлов, хелатированных в МТ, на радиоактивный I09Cd в мягких тканях двустворчатых моллюсков.
156
Объектами биотестирования воды по МТ используют моллюсков — перловицу (Unio pictorum) и беззубку (Anodonta sp.) (рис. 17.1) из семейства Unionidae размером 3—12 см. Внутреннее строение у них одинаково. Знание анатомии и умение препарировать позволяют определить содержание МТ в любом органе моллюска.
Можно провести моделирование загрязнения водоема кадмием в лабораторных условиях. Для этого беззубок культивируют в аквариумах с водопроводной водой, содержащей CdCl2 в концентрации 0,2 мг/л в течение 8 сут, 16 сут и 1 мес. Перенос моллюсков из реки в водопроводную воду является стрессирующим фактором, который может оказывать влияние на синтез МТ и на их жизнеспособность. Однако достоверных отличий в содержании МТ не обнаруживается, поэтому специальной адаптации при переносе не требуется. Препарирование можно осуществлять согласно анатомическому атласу внутреннего строения моллюсков (Е. Н. Ци-хон-ЛуканиНа). Извлеченные органы (жабры, печень, почки и мантия) очищают от посторонних включений и взвешивают. Исследования показали, что удельное содержание МТ в почках беззубок в 5 —7 раз выше, чем в печени, мантии и жабрах, и практически не зависит от возраста моллюсков. До начала анализа органы хранят при -40 °C.
Определение содержания МТ методом радиоактивных индикаторов проводят по методике D.L. Eaton и M.G. Cherian с модифи-
Рис. 17.1. Внутреннее строение беззубки Апоdonta sp. (вид слева):
1 — пищевод; 2 — передний аддуктор; 3 — ротовое отверстие; 4 — нога; 5 — кишка; б — правая мантийная складка; 7 — предсердие; 8 — правая жабра; 9 — правая почка; 10 — задний аддуктор; 11 — вводящий сифон; 12 — анальное отверстие; 13 — выводящий сифон; 14 — клоакальная камера; 15 — прямая кишка; 16 — спинной мантийный канал; 17 — задний ретрактор ноги; 18— спинное мантийное отверстие; 19 — задняя аорта; 20 — артиовентрикулярный клапан; 21 — желудочек; 22 — полость перикардия; 23 — передняя аорта; 24 — печеночный проток; 25 — пилорическое отверстие желудка; 26 — желудок; 27 — отверстие печеночного протока; 28 — печень
157
кацией Б. И. Сынзыныса. Количество (Л/) МТ (мкг/г) определяют по формуле
17,8Г-(—-'l
М =--------1 С	(О
т
где V — кратность разбавления образца; 17,8 — коэффициент; т — масса навески органа или ткани, г; А, К, С— количество распадов в пробе, контроле и стандарте соответственно.
Если содержание МТ в тканях равно 2— 3 мкг/r ткани моллюска, это свидетельствует о чистой воде на данном участке водоема. Более высокое удельное содержание говорит о постоянном наличии в воде тяжелых металлов.
Внимание! Концентрация и активность меченого вещества столь мала (0,1 % индикаторного реагента в воде при активности рабочего раствора 40 кБк/мл), что не требует создания особых условий безопасности для работы. Нельзя допускать попадания раствора в рот или на поверхность слизистых глаза; также следует тщательно собирать остатки раствора и отходы от опыта (неиспользованные части тел моллюсков) в контейнер и сдавать их на утилизацию.
Цель работы — определение удельного содержания МТ в мягких тканях двухстворчатых моллюсков, культивируемых в воде с солями тяжелых металлов.
Оборудование, материалы и реактивы:
аквариумы с отстоянной водопроводной водой, не содержащей и содержащей CdCl2 в концентрации 0,2 мг/л; беззубки или перловицы размером примерно 5 —10 см; индикаторный реагент: 109CdC12 в 0,01М трис-HCl буфере, pH 7,4—8,2 (суммарная концентрация Cd2+ в смеси — 2,0 мкг/мл, радиоактивность — 40,0 кБк/мл); 2 %-й гемоглобин кролика; водяная баня; холодильник; центрифуга; гамма-счетчик.
ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ ЛАБОРАТОРНОЙ РАБОТЫ
1.	Получить у преподавателя моллюсков, культивируемых в контрольной воде и загрязненной солями Cd в течение разного времени.
2.	Извлечь жабры, печень, почки, мантию.
3.	Гомогенизировать органы в стеклянном гомогенизаторе Поттера в 0,01 М трис-HCl буфере.
4.	Гомогенат прогреть на кипящей водяной бане в течение 3 мин и быстро охладить во льду до 4 °C. Затем сразу центрифугировать при 10000 g в течение 20 мин.
1-58
5.	К 0,1 мл 0,01 М трис-HCl буфера, добавить 0,1 мл индикаторного реагента 109CdCl2. Затем добавить 0,2 мл пробы, перемешать и инкубировать 10 мин при комнатной температуре.
6.	Внести 0,1 мл 2 %-го гемоглобина кролика, перемешать, прогреть на кипящей бане 3 мин, охладить во льду. Эту операцию провести еще дважды.
7.	Далее центрифугировать 8 мин при 7 000 об/миН на высокоскоростной центрифуге.
8.	0,2 мл супернатанта после центрифугирования перенести в пробирки для счета и измерить радиоактивность на гамма-счетчике {«Beckman PU5500», США).
9.	Для каждой серии измерений провести анализ «контрольной» пробы (вместо исследуемой на МТ пробы вносят буфер) и общей активности (вместо исследуемой пробы и гемоглобина вносят буфер).
10.	Рассчитать количество МТ в каждой пробе по формуле (1).
11.	Сделать вывод о влиянии солей Cd в концентрации 0,2 мг/л на количество МТ в мягких тканях моллюсков по сравнению с контрольным уровнем.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Данилин И. А. Экспериментальное обоснование нового метода биотестирования пресноводных водоемов по содержанию белков металлоти-онеинов в органах и тканях двустворчатых моллюсков / И. А. Данилин [и др.] // Экология, 2002. — № 5.
Цихон-Луканина Е.Н. Трофология водных моллюсков. — М.: Наука, 1987.
Филенко О. Ф. Водная токсикология. — М.: Изд-во МГУ, 1988.
Roesijadi G. Metallotionein indication as a measure of response to metal exposure in aquatic animals // Enviton. Health. Perspect., 1994. — V.73.
Eaton D.L., Cherian M.G. Determination of metallotionein in tissues by cadmium-hemoglobin affinity assay // Methods.Enzymol., 1991- — V.205.
4.2.2. Генетический подход
Лабораторная работа № 18. ТЕСТ-СИСТЕМА ЭЙМСА ДЛЯ АНАЛИЗА МУТАГЕННОЙ И КАНЦЕРОГЕННОЙ АКТИВНОСТИ ХИМИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ В ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЕ
{Лабораторная работа подготовлена В. М. Глазером и С. В. Котелевцевым)
Химические и радиоактивные элементы могут индуцировать мутации всех типов (см. гл. 3). Универсальный метод одновременного выявления всех типов мутаций отсутствует, поэтому на прак-
159
тике используют набор тестов для обнаружения способности исследуемого соединения вызывать разные типы мутаций. На первом этапе осуществляют скрининг большого количества соединений на мутагенную активность с помощью простой, быстрой, дешевой и в то же время высокочувствительной тест-системы Эймса — Salmonella/микросомы на генные мутации. Основная задача теста Эймса — выявление генетической активности у тестируемых агентов. Соединения, проявившие мутагенную активность, подвергают детальному изучению с применением более сложных тестов, способных выявлять и оценивать другие генетические аномалии, такие, как хромосомные перестройки в клетках млекопитающих in vivo и in vitro, доминантные летали у мыши, рецессивные летали у дрозофилы, повреждения ДНК и др.
У бактерий отсутствует система микросомного окисления, которая имеется у животных, но этот недостаток удается преодолеть путем введения в тест-систему препарата, содержащего микросомы и кофакторы микросомного окисления (микросомная активирующая смесь — МАС). Добавление этой смеси обеспечивает микросомальную активность (МА) ксенобиотиков in vitro. Пробы без МА позволяют выявить прямую мутагенную активность, пробы с МА — промутагенную. При использовании тест-системы Эймса обнаруживается высокая (порядка 90 %) корреляция между мутагенной и канцерогенной активностью ксенобиотиков.
Быстрое выполнение теста в значительной мере обусловлено тем, что он является полуколичественным: частота мутаций определяется относительно общего количества клеток в обработанной суспензии без учета их выживаемости, а не количества выживших после обработки клеток, как это делается в количественном тесте.
В основе тест-системы лежит специально созданный Б.Н. Эймсом и его сотрудниками набор индикаторных штаммов Salmonella typhimurium. Здесь будут описаны только штаммы, имеющие непосредственное отношение к данной лабораторной работе. Все штаммы происходят от лабораторного штамма LT-2, у которого были выделены ауксотрофные по гистидину мутанты hisG46 (мутация замены оснований) и hisD3052 (мутация типа сдвига рамки считывания) и др. Мутагенную активность оценивают по частоте возникновения обратных мутаций (реверсий) к прототрофности по гистидину (his*). Мутация hisG46 ревертирует под действием мутагенов, вызывающих замены оснований, hisD3052 — под действием агентов, индуцирующих сдвиг рамки считывания.
Принцип метода Эймса заключается в регистрации способности испытуемого соединения и (или) его метаболитов индуцировать генные мутации у индикаторных микроорганизмов в системе метаболической активности in vitro. Индикаторные бактерии вместе с исследуемым препаратом, гомогенатом печени крысы и ко
160
факторами (НАДФ, глюкозо-6-фосфат) вносят в слой верхнего полужидкого агара на чашки Петри с твердой средой А (см. справочный материал к лабораторной работе № 18), обеспечивающей отбор клонов ревертантов His*. Под влиянием ферментов, содержащихся в гомогенате печени млекопитающего, в результате функционирования системы микросомного окисления препарат может претерпевать ряд метаболических превращений. Как исходное вещество, так и его метаболиты, если они обладают мутагенной активностью, индуцируют мутации у микроорганизмов. Через 2 суток инкубации при 37 °C проводят подсчет колоний ревертантов на чашках.
Все пробы ставят в трех повторностях. Для получения более достоверной информации о свойствах исследуемого вещества используют несколько его доз. В табл. 18.1 и 18.2 представлены схемы постановки эксперимента в качестве образцов. Использованы известные мутагены и промутагены. Цифры в таблицах обозначают номера проб в порядке их использования в эксперименте.
Оборудование, материалы и реактивы:
минимальная среда А (4-кратный солевой раствор); стерильный водный агар (12 г в 750 мл дистиллированной воды); стерильный 10%-й раствор MgSO4 - 7Н2О; стерильный 40%-й раствор глюкозы; МПБ (см. справочный материал к лабораторной работе № 5); стерильный полужидкий агар (0,6 г агара и 0,6 г NaCl в 1 л дистиллированной воды); раствор L-гистидина (0,96 мг/мл); раствор биотина (0,7 мг/мл); физиологический раствор (0,6—0,7%-й NaCl); микросомная фракция S9 (см. справочный материал к лабораторной работе № 18); 0,1 М КС1; 9,85%-й КС1; 6,5%-й MgCl2; НАДФ; глюкозо-6-фосфат; 0,2 М фосфатный буфер pH 7,4; ампициллин или карбенициллин; автоклав; центрифуга; стеклянные колбы на 1 л на 250 мл (4 шт.); пробирки; пипетки на 1, 2 и 10 мл; чашки Петри; культуры штаммов Salmonella typhimurium ТА100 и 5. ty-phimurium TA98; стандартные мутагены и испытуемые химические соединения (табл. 18.1 и 18.2); термостатированная водяная баня на 44 —46 °C; термостат на 37 °C.
Перед постановкой теста Эймса необходимо провести предварительную работу, включающую следующие этапы.
• В колбу с расплавленным агаром (750 мл) внести 250 мл 4-кратного солевого раствора, 0,5 — 1 мл 10%-го раствора MgSO4 и 8 мл 40%-й глюкозы, перемешать и после охлаждения до 50 — 60 °C разлить по 25 мл в стерильные чашки Петри, расставленные на горизонтальной поверхности. После затвердения агара на дне чашек проставить номера проб согласно табл. 18.1 и 18.2 (каждый в трех повторностях). Затем расположить чашки в стопки по 9— 12 шт. таким образом, чтобы в ходе эксперимента было удобно брать их в порядке нумерации.
6 Мелехова
161
Таблица 18.1
Испытание химических соединений на мутагенную активность в полуколичественном тесте Эймса Salmonella/микросомы. Индикаторный штамм Salmonella typhimurium ТА98. Фракция S9 из печени крыс, индуцированных раствором Aroclor 1254
Вещества	Доза препа-рата на чашку	Метаболическая активация									
		прямая мутагенная активность (чашки без МА)					промутагенная активность (чашки с МА)				
Контрольные вещества: Н2О 2-нитрофлуорен 2-аминоантрацен	0,1 мл 10 мкг 0,5 мкг	№ чашки	повторности			среднее	№ чашки	повторности			среднее
			1	2	3			1	2	3	
		1 3 5					2 4 6				
Испытуемые вещества: бромистый этидий фурациллин л-нитрозомор-фолин	50 мкг 10 мкг 1 мкг 0,1 мкг 50 мкг 20 мкг 5 мкг 1 мкг 1 мг 0,1 мг	7 9 11 13 15 17 19 21 23 25					8 10 12 14 16 18 20 22 24 26				
Таблица 18.2
Испытание химических соединений на мутагенную активность в полуколичественном тесте Эймса Salmonella/микросомы. Индикаторный штамм Salmonella typhimurium ТА100.
Фракция S9 из печени крыс, индуцированных раствором Aroclor 1254
Вещества	Доза препа-рата на чашку	Метаболическая активация									
		прямая мутагенная активность (чашки без МА)					промутагенная активность (чашки с МА)				
Контрольные вещества: Н2О азид Na 2-аминоантрацен	0,1 мл 10 мкг 0,5 мкг	№ чашки	повторности			среднее	№ чашки	повторности			среднее
			1	2	3			1	2	3	
		1 3 5					2 4 6				
Испытуемые вещества: фурациллин бромистый этидий л-нитрозомор-фолин	50 мкг 20 мкг 5 мкг 1 мкг 50 мкг 5 мкг 0,5 мкг 1 мг 0,5 мг 0,1 мг 0,01 мг	7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27					8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28				
•	До начала работы колбу с полужидким агаром выдержать в кипящей водяной бане до полного расплавления агара. Затем добавить по 10 мл растворов L-гистидина и биотина. Смесь перемешать и разлить по 2,5 мл в пробирки. Пробирки закрыть ватномарлевыми пробками и стерилизовать в автоклаве. Биотин необходимо добавлять в среду, так как индикаторные штаммы ауксо-трофны по нему. Гистидин вносят с таким расчетом, чтобы дать возможность бактериальным клеткам пройти 1 — 2 цикла деления, что необходимо для фиксации мутаций. Перед опытом агар в пробирках расплавляют в кипящей водяной бане и помещают в термостатированную водяную баню при 44 —46 °C.
•	Перед постановкой эксперимента клетки индикаторных штаммов выращивают в мясопептонном бульоне (МПБ) в течение ночи при 37 °C при интенсивном перемешивании. Желательно добавить в среду ампициллин или карбенициллин в конечной концентрации 25 мкг/мл. Полученные культуры содержат клетки в концентрации (2—5) 109 клеток/мл. Культуру штамма Salmonella typhimurium TAI 00 развести непосредственно перед экспериментом в 20 раз физиологическим раствором. Клетки штамма Salmonella typhimurium ТА98 осадить центрифугированием и ресуспендировать в таком объеме физиологического раствора, чтобы повысить концентрацию клеток в 2—3 раза. Различия в концентрациях суспензий обусловлены отличиями частот спонтанных реверсий между штаммами.
•	Приготовить растворы мутагенов и испытуемых химических соединений. Концентрация вещества должна быть в 10 раз выше его дозы, так как в пробу вносят 0,1 мл раствора. Например, если доза 2-аминоантроцена в пробе должна составлять 0,5 мкг, готовят его раствор в диметилсульфоксиде (ДМСО) с концентрацией 5 мкг/мл. Растворы, приготовленные на ДМСО или других органических растворителях, не стерилизуют, водные растворы стерилизуют пропусканием через бактериальный фильтр с диаметром пор 0,2—0,45 мк. Растворы лабильных соединений готовят непосредственно перед опытом.
•	Микросомную активирующую смесь (МАС) готовят непосредственно перед опытом в ледяной бане и выдерживают в ней в течение всего эксперимента. Растворы НАДФ и глюкозо-6-фосфа-та приготовить путем растворения навески вещества в стерильной воде в стерильной пробирке без дополнительной стерилизации. Для приготовления проб без МА из смеси МАС исключают фракцию S9 (заменить на равный объем 0,1 М КС1), растворы НАДФ и глюкозо-6-фосфата (заменить на равные объемы дистиллированной воды).
•	Все операции, кроме посева бактерий в МПБ, можно проводить в помещении, предварительно обработанном ультрафиолетовыми лучами, без использования горелок.
164
• Удобно ставить опыт в порядке нумерации проб одновременно в 6—12 пробирках.
ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ ЛАБОРАТОРНОЙ РАБОТЫ
Обработку клеток индикаторных бактерий проводят в полужидком агаре. Необходимо поставить две контрольные пробы. Первая должна содержать растворитель вместо химического соединения (показывает спонтанный уровень реверсий). Вторая проба ставится на активность МАС (в этом качестве удобен промутаген 2-аминоантрацен (0,5 мкг на пробу), который не повышает частоту реверсий в пробах без МА, но в результате МА продуцирует широкий спектр мутагенов, резко повышающих частоту реверсий у обоих индикаторных штаммов. Если МА активна, продукты метаболизма 2-аминоантрацена повышают частоту реверсий у штамма ТА100 в 5 —10 раз, у штамма ТА98 — в сотни и более раз.
1.	Снять пробки с пробирок с расплавленным на водяной бане полужидким агаром и, не вынимая пробирки из водяной бани, в каждую добавить 0,1 мл растворителя (Н2О или ДМСО) для контрольных проб или 0,1 мл раствора исследуемого соединения; 0,1 мл суспензии индикаторных бактерий; 0,5 мл МАС (для проб с МА) или 0,5 мл смеси без фракции S9, НАДФ и глюкозо-6-фосфата (для проб без МА).
Внимание! Ввиду лабильности МАС в момент ее добавления пробирку вынуть из водяной бани (для проб без МА эта предосторожность не нужна).
2.	Содержимое пробирок быстро перемешать 3—4 резкими круговыми движениями пробирки между зажатыми ладонями и вылить на поверхность минимальной среды в чашке Петри. Осторожными, но быстрыми покачиваниями чашки верхний слой полужидкого агара равномерно распределить по поверхности и чашку поставить на горизонтальную поверхность. Верхний слой не должен застыть до его распределения по поверхности агара. Через 20 мин чашки перевернуть вверх дном и поместить в термостат на 37 °C на 40—48 ч.
Таблица 18.3
Оценка мутагенной активности химических веществ по тесту Эймса
Кратность превышения среднего числа колоний ревертантов в данной опытной пробе над контролем	< 1,7	1,7-10	10-100	>100
Мутагенная активность	Не выявлена	Слабая	Средняя	Сильная
165
3.	После инкубации подсчитать колонии ревертантов His+. Результаты внести в рабочие таблицы (табл. 18.1 и 18.2).
4.	Вычислить средние количества колоний ревертантов для каждой пробы по трем повторностям. Оценку результатов произвести, исходя из критериев, предложенных в табл. 18.3.
8. Если индукция мутаций проявляется в пробах без МА, сделать заключение о прямой мутагенной активности исследуемых химических препаратов, если только в пробах с МА — о промута-генной активности.
СПРАВОЧНЫЙ МАТЕРИАЛ
Приготовление минимальной среды А
Готовят 4-кратный солевой раствор: натрий лимонно-кислый трехзамещенный • 5,5Н2О — 2,24 г; К2НРО4- ЗН2О — 55 г; К2НРО4 — 18 г; (NH4)2SO4 — 4 г; дистиллированная Н2О — 1 л; pH раствора доводят КОН до 7,2—7,3. Раствор разливают порциями по 250 мл и стерилизуют в автоклаве.
Приготовление микросомной активирующей смеси (МАС)
Для получения 50 мл МАС требуются (все растворы стерильные): 0,2 М фосфатный буфер pH 7,4 — 25 мл (см. прилож. 16.1); раствор НАДФ (32 мг/мл) — 5 мл; глюкозо-6-фосфат (15 мг/мл) — 5 мл; 9,85%-й КС1 — 1,25 мл; 6,5% MgCl2 — 1,25 мл; фракция S9 — 15 мл.
Приготовление фракции S9
Индукцию синтеза микросомных ферментов печени самцов белых беспородных крыс производят внутрибрюшинной инъекцией 0,5 мл раствора Aroclor 1254 (или Совола) в оливковом масле из расчета 100 мг на 1 кг веса животного. Через 48 ч крыс, получавших все это время только воду, забивают после предварительного наркоза декапитированием согласно принятым правилам работы с лабораторными животными. Все остальные операции проводят в стерильных условиях.
Печень извлекают, взвешивают, промывают раствором 0,1 М КС1, измельчают ножницами и растирают в гомогенизаторе Поттера с тефлоновым пестиком. Перед гомогенизацией печень заливают 5 объемами 0,1 М КС1, содержащего 1 мкМ ионола (для предотвращения перекисного окисления липидов) и 1 мг БСА (бычий сывороточный альбумин, фракция IV для связывания свободных жирных кислот). Все операции проводят на холоде. Растворы и инструменты должны быть стерильными.
Гомогенат центрифугируют при 9000 g в течение 30 мин при +2 °C, и надосадочную жидкость (фракция S9) разливают на хо
. 166
лоде (в емкости со льдом) порциями по стерильным пробиркам, после чего сразу используют в опыте или быстро замораживают. Полученная таким образом фракция S9 содержит широкий набор цитозольных и микросомных ферментов, в том числе ферменты НАДФ  Н-генерирующей системы, обеспечивающие протекание реакций микросомного окисления. В 1 мл приготовленной таким образом фракции с концентрацией белка около 40 мг/мл содержатся микросомы из 250 мг печени. Образцы фракции следует проверять на бактериальное загрязнение. В случае загрязнения следует выделить новую фракцию. Фракцию можно хранить в замороженном состоянии при -20 °C и ниже в течение нескольких месяцев. Не допускается повторное замораживание неиспользованной фракции после оттаивания.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Фонштейн Л. М. Тест-система оценки мутагенной активности загрязнителей среды на Salmonella'. Методическое указание / Л. М. Фонштейн [и др]. — М.: Наука, 1977.
Фонштейн Л. М. Методы первичного выявления генетической активности загрязнителей среды с помощью бактериальных тест-систем: Методические указания / Л. М. Фонштейн [и др.]. — М., ВИНИТИ, 1985.
McCann J. Detection of carcinogens and mutagens in the Salmonella / microsome test: Assay 300 chemicals I J. McCann [et al.] I I Prac. Nat. Acad. Sci. — USA, 1975. — V. 72.
Лабораторная работа № 19. АБЕРРАЦИИ ХРОМОСОМ В КЛЕТКАХ КОРНЕВОЙ МЕРИСТЕМЫ РАСТЕНИЙ
ПОД ДЕЙСТВИЕМ МУТАГЕНОВ*
(Лабораторная работа подготовлена Е. И. Егоровой)
Детально хромосомы обычно изучают на стадии метафазы в митозе, когда происходит их максимальная спирализация, а сами хромосомы имеют вид плотных образований. Каждая хромосома состоит из двух хроматид. Форма хромосом определяется положением первичной (кинетической) перетяжки, в области котррой находится центромера, или кинетохор (рис. 19.1). По обе стороны от центромеры расположены плечи хромосомы. Концевые участки хромосом называют теломерами.
Хромосомы каждого кариотипа обладают постоянством числа, формы и внутренней структуры, но несмотря на это, они способны изменяться спонтанно или под влиянием различных агентов: ионизирующих излучений (рентгеновского, нейтронного, альфа-, бета-, гамма-излучений) и химических веществ.
* Авторы учебного пособия благодарят преподавателя Обнинского ИАТЭ Н. В. Амосову за участие в подготовке материала для лабораторной работы.
167
Ня - - Хроматиды
Центромера
I U \
Рис. 19.1. Схема метафазной хромосомы

Изменения в хромосомах, передающиеся потомству, Г. де Фриз в 1900 г. назвал мутациями. По характеру преобразования генотипа различают генные, или точковые, мутации. Они представляют собой изменения отдельных участков хромосом на молекулярном уровне, которые не видны в световой микроскоп. Другую группу составляют перестройки хромосом (структурные мутации), которые можно изучать под микроскопом. Их возникновение связано с фрагментацией и перекомбинацией хромосом. В третью группу входят геномные мутации. Они связаны с изменением числа геномов {полиплоидия) или хромосом (анеуплоидия).
Под термином перестройки, или аберрации,
хромосом обычно понимают изменения их структуры, вызванные перекомбинацией различных участков одной или разных хромосом под влиянием мутагенов. В отличие от точковых мутаций перестройки хромосом относят к структурным мутациям. Перестройки могут быть спонтанными и индуцированными. Поскольку такие мутации затрагивают значительные участки хромосом, они изменяют их морфологию, что удается обнаружить под микроскопом. При анализе перестроек исходят из того, что хромосома на протяжении клеточного цикла может быть дихроматидной (период G2, профаза, метафаза) и монохроматидной (Gb анафаза, телофаза). В зависимости от состояния хромосомы возникают различные типы перестроек: хроматидные, когда хромосома удвоена, или хромосомные, когда она не удвоена.
Делеции, или потери участка хромосомы, могут быть хромосомные и хроматидные. Инверсия возникает в результате повреждений в хромосоме или хроматиде, когда внутренний участок переворачивается на 180°. Транслокации относятся к межхромосомным обменам. При этом происходит перемещение участка одной хромосомы в другую. В справочном материале к лабораторной работе № 19 приведены некоторые перестройки хромосом, наблюдаемые в метафазе митоза.
Для цитологических исследований очень важно понять, какие органы и ткани растения (или любого удобного для подобного рода анализа организма) необходимы для работы. Например, митоз можно наблюдать в меристемах молодых быстрорастущих корней растений, в главных корнях проросших семян, в конусах нарастания стебля. Обычно для изучения митоза и подсчета числа хромосом в соматических тканях растения предпочитают работать с молодыми корнями, так как в них непосредственно под чехли-ком находится зона активного деления клеток (конус нарастания корня) и фигуры деления здесь удобно ориентированы.
• 168
У злаков корни трудно раздавливаются, а цитоплазма клеток нередко сильно окрашивается красителями, поэтому изучение митозов и хромосом у них можно проводить на стеблевой меристеме.
При метафазном методе изучения хромосомных нарушений под действием, например, ионизирующих излучений, корни перед фиксацией необходимо обработать водным раствором колхицина. Облучать можно как сухие, так и проросшие семена. Ниже приводится последовательность обработки проросших семян.
1.	Замочить семена в воде в течение 1 — 1,5 сут при температуре 25 °C.
2.	Проростки с корнями длиной 1,5—2,5 мм облучить в дозе 2 • 10-4 Кл/кг на влажной бумаге и оставить расти в чашках Петри.
3.	За 2 ч до фиксации проростки поместить в 0,01%-й раствор колхицина.
В микроскопической технике широко применяют временные давленные препараты. Наиболее часто для их изготовления используют фиксаторы Карнуа (6:3:1), Ньюкомера (6: 3:1:1 :1), Бата-лья (5 : 5:1:1), уксусный алкоголь (3:1).
Фиксированные препараты хранят в холодильнике в фиксаторе или промывают в 96%-м растворе этилового спирта и хранят в 70%-м растворе до окрашивания.
При изготовлении давленных препаратов исключительное значение имеют способы мацерации (от лат. maceratio — размягчение; в данном случае обработка объекта, чтобы вызвать распад ткани на отдельные клетки) тканей до окрашивания. Обычно для этого используют 45%-й раствор уксусной кислоты (для твердых объектов его подогревают). Окрашивают препараты ацетокармином, ацетоорсеином и др.
Для получения интегральной характеристики цитогенетического состояния живых организмов (помимо человека) В. М. Захаровым предложена балльная шкала:
1	балл — условно нормальное состояние, частота аберрантных клеток до 5 % (в лимфоцитах человека 1 — 2 %);
2	балла — низкая степень изменения, частота аберрантных клеток в пределах 6 —10 %;
3	балла — средняя степень изменения, частота аберрантных клеток в пределах 11 —15 %;
4	балла — высокая степень изменения, частота аберрантных клеток в пределах 16—20 %;
5	баллов — критическое состояние, частота аберрантных клеток выше 20 %.
Условно нормальный уровень находится в пределах колебаний спонтанной частоты аберрантных клеток. Этот показатель изменяется в зависимости от вида, возраста, физиологического состояния, генетических особенностей организма. Однако многолетни
169
ми исследованиями показано, что он не превышает 5 % (по некоторым источникам — для человека не выше 2 %).
Принцип метода, предложенного в лабораторной работе, основан на учете хромосомных аберраций, возникших в клетках корневой меристемы растений после обработки семян мутагенами.
Цель работы — балльная оценка качества проросших семян, подвергнутых у-облучению в разных дозах.
Оборудование, материалы и реактивы:
микроскоп; спиртовка; пинцет; держатель для предметного стекла; предметные и покровные стекла; чашка Петри или кювета для прокрашивания; фильтровальная бумага; препаровальные наборы; красители — ацетотоорсеин или ацетокармин, дистиллированная вода; этанол; 45 %-й раствор уксусной кислоты; корешки (2—3 мм) пророщенных в течение 3 сут после у-облучения и фиксированных в уксусном алкоголе семян ячменя (14 хромосом), ржи (14 хромосом), гороха (14 хромосом) и лука (16 хромосом).
ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ ЛАБОРАТОРНОЙ РАБОТЫ
1.	Получить у преподавателя фиксированные корешки растений, подвергнутые у-облучению в разных дозах.
2.	Приготовить «давленные» препараты из апикальной меристемы и окрасить ацетоорсеином (ацетокармином). Для этого корешки поместить на предметное стекло в каплю красителя и подогреть над пламенем спиртовки, доводя до легкого кипения несколько раз, особенно в том случае, если не была проведена мацерация в НС1.
Внимание! Корешки злаков труднее окрашиваются и мацерируются, поэтому приходится увеличивать время их окрашивания. Например, корни ячменя, пшеницы, ржи иногда выдерживают в ацетоорсеине от одних до полутора суток при комнатной температуре.
3.	На предметное стекло, где расположен объект, нанести каплю 45%-го раствора уксусной кислоты, отделить конус нарастания, удалить лишние ткани, накрыть покровным стеклом и фильтровальной бумагой и постукивать сверху, например тупой стороной карандаша, чтобы уложить клетки конуса нарастания в виде монослоя.
4.	В каждом препарате анализировать все метафазы, учитывая долю клеток с аберрациями хромосом. Анализ спектра аберраций провести по известной классификации с выделением хроматидных (одиночных) и хромосомных (двойных) фрагментов.
5.	В отчете представить рисунки аберраций.
6.	Сделать вывод о влиянии у-облучения на цитогенетические характеристики клеток корневой меристемы растений.
170
-7 .£
<-//
Б
IV
Рис. 19.2. Кариотипы:
А — ячменя; Б — ржи; В — гороха; Г — лука
7.	Рассчитать частоту хромосомных аберраций (Ч, %), учитывая общее число клеток и клетки с хромосомными аберрациями, по формуле
ч = А 10°
в ’
где А — число клеток с нарушениями; В — общее число просмотренных клеток.
Внимание! Если в одной клетке обнаружено несколько типов нарушений, число клеток с нарушениями будет меньше общего
171
числа аберраций. Число аберраций на клетку (или 100 клеток) устанавливают, разделив общее число аберраций (С) на число просмотренных клеток (В).
8.	Рассчитать спектр аберраций (К) по формуле
v ДЮО к = -в“’
где Д — число аберраций определенного типа; В — число просмотренных клеток.
9.	Определить долю аберраций каждого типа от общего числа всех аберраций, разделив число аберраций одного типа (Д) на общее число аберраций (С). Поврежденность клетки определить как отношение общего числа аберраций (С) к числу аберрантных клеток (А) и выразить в процентах.
10.	Оценить в баллах влияние мутагена на проростки злаков (см. в тексте).
СПРАВОЧНЫЙ МАТЕРИАЛ
Фиксаторы
Фиксация материала, т. е. быстрое умерщвление клеток в специально подобранных растворах ядовитых реактивов, которые называются фиксаторами, прерывает тот или иной процесс в клетке, вызывая необратимые изменения. При этом коллоиды протопласта переходят в нерастворимое состояние.
Известно много фиксаторов, но каждый из них имеет определенное назначение. Очень важно выбрать такой фиксатор, который, убивая клетку, несильно искажает ее прижизненную структуру и отвечает целям исследования.
Обычно фиксатор представляет собой смесь нескольких реактивов, каждый из которых редко используется для фиксации вследствие одностороннего действия. В состав этих смесей могут входить: ледяная уксусная кислота, хромовая кислота, формалин, хлороформ, осмиевая кислота, спирт и др.
Уксусная кислота (СН3СООН) — бесцветная жидкость с резким запахом. Хорошо смешивается с водой, спиртом, эфиром, хлороформом. Кислота хорошо сохраняет форму хромосом, но разрушает митохондрии и комплекс Гольджи. В последние годы ее нередко заменяют при фиксации пропионовой кислотой, которая способствует лучшей фиксации и окрашиванию объектов.
Хромовая кислота проникает в объекты не очень быстро, коагулирует белки, сохраняет детали строения ядра, цитоплазмы, а также митохондрии и комплекс Гольджи. После фиксации хромовой кислотой объект необходимо тщательно промыть водой, иначе образуется осадок, мешающий окрашиванию тканей.
172
Классификация перестроек хромосом (по 3. П. Паушевой)
Нормальные хромосомы
Аберрации хромосомного типа
Аберрации хроматидного типа
Ацснтриче- Центричс- Инверсия скис кольца ское кольцо
Парный фрагмент
Фрагмент Варианты
(делеция)	изоделеций
а
Симметричный обмен
Ассиммстричный обмен (дицентрик)
Симметричный Ассимметрич-обмен ный обмен
Осмиевая кислота представляет собой раствор сильного окислителя — тетраоксида осмия. Эта кислота медленно проникает в объект и вызывает наименьшие изменения в структуре цитоплазмы и ядра. Позволяет фиксировать митохондрии.
В цитологических и эмбриологических исследованиях широко применяют, особенно для изготовления давленных препаратов, «уксусный алкоголь», или фиксатор Кларка (3:1). Материал выдерживают в фиксаторе от 2 до 12 ч, а иногда и хранят в нем при 0-3 °C.
Состав уксусного алкоголя: абсолютный этиловый спирт или его 96 %-й раствор — 3 части, ледяная уксусная кислота —1 часть.
Красители
Ацетокармин. Растворить 1 г (лучше 2—4 г) кармина — красящего вещества, состоящего из кармиловой кислоты, — в 45 мл ледяной уксусной кислоты и 55 мл дистиллированной воды. Растворение проводить в колбе с обратным холодильником на водяной бане с подогревом около 3 ч. При отсутствии обратного холодильника в колбу вставить воронку. После остывания темно-красный раствор кармина отфильтровать и поместить в посуду с притертой крышкой. Остатки кармина на фильтре можно использовать повторно.
Ацетоорсеин. Готовят из орсеина — красителя, полученного из лишайника. Растворить 1 г орсеина в 45 мл горячей уксусной кислоты и добавить 55 мл дистиллированной воды. Кипятить на водяной бане 3 ч, остудить и отфильтровать.
173
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Дубинин Л. Г. Структурные мутации в опытах с Crepis capillaries. — М.: Наука, 1978.
Паушева 3. П. Практикум по цитологии растений. — М.: Агропромиз-дат, 1988.
Последствия Чернобыльской катастрофы: Здоровье среды / под ред. В. М. Захарова, Е. Ю. Крысанова. — М.: Моск. отд. междунар. фонда «Биотест», 1996.
Экологический мониторинг. Методы биомониторинга: в 2 ч. / под ред. Д. Б. Гелашвили. — Н. Новгород: ННГУ, 1995.
Лабораторная работа №20. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ТРАДЕСКАНЦИИ (КЛОН 02) ДЛЯ ОЦЕНКИ МУТАГЕННОГО И ТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ФАКТОРОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ
(Лабораторная работа подготовлена Т. И. Евсеевой и С.А. Гераськиным)
Традесканция принадлежит к семейству коммелиновые (Сотте-Ипасеае). Растение названо по имени английского ботаника и естествоиспытателя начала XIX в. Джона Традесканта — садовника герцога Букингемского и основателя одного из первых ботанических садов, а также Музея естественной истории в Лондоне. Многие виды рода Tradescantia произрастают в природных условиях Северной Америки. Большое число этих видов или их межвидовых гибридов были выведены и собраны в Национальной лаборатории в Брукхейвене (США). Клон 02 (2п = 12), гетерозиготный по окраске цветков, впервые обнаружен в 1958 г. W.V. Brown среди коллекции традесканции, произрастающей на открытом воздухе в Университете штата Техас в Остине.
Данный клон является гибридом между Tradescantia occidentalis и Т. ohiensis. Листья ланцетные, собраны в розетку. Высота цветоноса взрослых растений достигает 40—45 см. Двухстороннее соцветие состоит из нескольких бутонов на разных стадиях развития. При оптимальном режиме выращивания ежедневно в каждом соцветии распускается один цветок, состоящий из трех лепестков и трех чашелистиков, шести тычинок и одного пестика (рис. 20.1).
Дикий тип окраски цветков и клеток волосков тычинок — голубой — является доминантным, розовый — рецессивным (рис. 20.2). Голубая окраска цветков у клона 02 обусловлена пигментом — антоцианом. Окрашивание цветков in vivo начинается за 5—6 дней до начала цветения после завершения деления терминальных клеток каждого волоска. Окончание деления, таким образом, является сигналом к началу окрашивания клеток волосков. Первыми окрашиваются терминальная или субтерминальная клетки и в последнюю очередь — у основания волоска. За три дня до начала
174
цветения окрашивание завершается, поэтому бутоны, прошедшие эту стадию к моменту начала воздействия, не должны учитываться в эксперименте.
На каждой тычинке формируется в среднем 45 волосков. Волосок представляет собой меристематические, последовательно расположенные клетки, развивающиеся из одной эпидермальной посредством деления терминальных и субтерминальных клеток. Количество волосков зависит от возраста соцветия и условий окружающей среды. Тычинки последних цветков в старых соцветиях имеют 30 — 32 волоска.
В условиях умеренного климата на открытом воздухе традесканция может произрастать только летом, поэтому ее разводят в теплицах.
Традесканция относится к растениям длительного светового дня, и в условиях высоких широт без специального освещения невозможно круглый год поддерживать ее цветение. Хорошие результаты дает комбинированная подсветка в течение 16—18 ч лампами Reflux 70W и Phillips TLD 36W/840, создающими интенсивность света 12—25 тыс. лк. При указанном режиме растения цветут непрерывно и дают много побегов. Рекомендуемая влажность воздуха — 80 %. Если такие условия создать сложно, учащают полив.
Традесканция размножается преимущественно вегетативно, поэтому ее генетическая изменчивость минимальна. Взрослые растения хорошо развиваются в грунте, состоящем из почвы, песка
Рис. 20.1. Цветок традесканции (клон 02)
Рис. 20.2. Морфологически измененный волосок (разветвление) с розовой (на черно-белом снимке — светлой) клеткой
175
и перегноя (1:1:1). Для быстрого размножения можно укоренять черенки и затем высаживать их в приготовленную указанным способом почвенную смесь с добавлением вермикулита. В грунт нельзя вносить навоз или другие свежие органические удобрения, поскольку при этом значительно повышается частота соматических мутаций. Предполагается, что мутагенами в этом случае являются радикалы пестицидов или продукты жизнедеятельности грибов, такие, как нитрозамины. Подкормки производят, заменяя воду при поливе на минеральные питательные среды (например, Кноппа) или растворы солей гуминовых кислот (например, гумат натрия).
Поскольку спонтанная частота мутаций клеток волосков тычинок традесканции изменяется при колебаниях температуры воздуха, следует контролировать и поддерживать на одном уровне температурный режим в помещении. По нашим данным, при температуре 21 °C частота соматических мутаций в клетках волосков тычинок традесканции (клон 02) составляет (0,09 ±0,04) %, а при 24 °C-(0,12 ±0,04) %.
Традесканция (клон 02) является удобным объектом для изучения действия низких, встречаемых в условиях окружающей среды доз физических факторов, а также концентраций химических мутагенов и токсикантов. В этом отношении к ее достоинствам как тест-объекта можно отнести высокую чувствительность к внешним воздействиям при низких спонтанном уровне мутаций и индивидуальной изменчивости, точность и простоту регистрации маркеров, характеризующих внешнее воздействие.
При оценке мутагенного воздействия факторов применяют методику учета соматических мутаций в клетках волосков тычинок традесканции. Изменение голубой окраски клеток волосков тычиночных нитей на розовую рассматривается как фенотипическое проявление мутации в гетерозиготных по окраске клетках волосков тычинок. В результате деления мутантных клеток в зрелом волоске формируется сектор, включающий одну и более клеток с розовой окраской (см. рис. 20.2). Вероятными механизмами образования розовых мутантных событий считают соматический кроссинговер, предшествующий точковой мутации, замену пар оснований, сдвиг рамки считывания, делеции сегментов хромосом, несущих доминантный ген.
По данным разных авторов, спонтанная частота мутаций для клона 02 изменяется в зависимости от температуры и освещенности в пределах от 0,048 до 0,15 %.
Физические и химические факторы кроме мутагенного оказывают токсическое воздействие, которое оценивают по потере репродуктивной способности клеток. Для определения волосков, остановившихся в росте, необходимо установить число клеток в волоске. Остановка деления клеток может происходить в любом во
176
лоске по всей длине тычинки. У ее основания волоски состоят из 23 — 25, в средней части — 22—23 и около верхушки — 12—16 клеток, причем 95 % волосков в верхней части тычинки сформировано 12 (или немногим более) клетками. В связи с этим такие волоски считают нормально развивающимися, а с меньшим количеством клеток (рис. 20.3) — называют низкорослыми (stunted) и учитывают как потерявшие репродуктивную способность.
В настоящее время большой популярностью при оценке состояния окружающей среды пользуется тест на микроядра в материнских клетках пыльцы традесканции, являющийся показателем генотоксичности. Методика детально изложена в работе (Т.Н.Ма, 1982).
С использованием указанных тестов оценивают мутагенность и токсичность веществ, находящихся в газообразном, твердом и жидком состояниях. Для этого применяют не только почвенные культуры растений, но и гидропонные, которые незаменимы при биотестировании растворов химических соединений, природных и сточных вод, почвенных вытяжек. Используют как укоренившиеся, так и свежесрезанные черенки с соцветиями. Первые более жизнеспособны и дают большее количество цветков, что удобно в случае долгосрочных экспериментов. Однако при проведении исследований с традесканцией очень важно, чтобы цветки от разных соцветий находились на одинаковой стадии развития в момент обработки, поскольку возраст соцветия влияет на частоту мутаций в клетках волосков тычинок. Указанное требование сложно выполнить, если прибегнуть к технике укорененных черенков, так как корне-образование начинается в разные сроки (от 7-го до 10-го дня и позже). Кроме того, корневая система является своеобразным селективным барьером при поглощении растениями элементов из
Рис. 20.3. Остановившиеся в росте волоски тычинки (на фотографии можно подсчитать число клеток в волоске)
177
раствора, а следовательно, заранее дискриминирует поступление одного иона по отношению к другому. Это особенно важно учитывать в случае тестирования модельных растворов различных соединений.
В лабораторной работе предлагается освоить методику учета соматических мутаций и потери репродуктивной способности клеток волосков тычинок традесканции (клон 02), применив для биотестирования свежесрезанные черенки с соцветиями.
Цель работы — оценка мутагенности и токсичности проб природных вод (или почв) из районов с разным по характеру и уровню техногенным загрязнением.
Примечание. Учет нарушений в волосках тычинок традесканции проводят ежедневно в течение 15—17 дней, поэтому целесообразнее обучить студентов данной методике во время прохождения практики на биостанциях.
Оборудование и материалы:
цветущие растения традесканции (не менее 3 черенков на каждый вариант опыта); пробы воды (объемом не менее 500 мл); пробирки (объем 50 мл); штатив; предметные стекла; пинцет; препаровальная игла; лезвие; вазелиновое масло; бинокулярная лупа МБС-10; компрессоры с отводящей системой (при наличии).
ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ ЛАБОРАТОРНОЙ РАБОТЫ
Подготовка проб и растений к эксперименту
1.	Отфильтрованную через фильтровальную бумагу пробу воды разлить в три установленные в штативе пробирки. Объем воды во всех пробирках должен быть одинаковым (желательно не менее 25 мл). Пробы воды можно отобрать вблизи дорог или промышленных предприятий из поверхностных водоемов — ручьев, рек и т. п. При возможности лучше протестировать пробы не менее чем в трех повторностях.
2.	В следующие три пробирки разлить дистиллированную воду (контроль) в том же объеме (по 25 мл на пробирку).
3.	Еще три пробирки заполнить раствором стандартного мутагена (положительный контроль), например 1 мМ раствором малеинового гидразида.
4.	Срезать девять черенков традесканции с соцветиями, в которых распустился первый цветок. Длина черенка — 20 см от соцветия. Распределить по одному черенку на каждую пробирку.
5.	Зафиксировать время начала эксперимента. Через 24 ч (время воздействия регулируется в зависимости от степени токсичности образца и целей эксперимента) все растения перенести в чистые пробирки со свежей дистиллированной водой.
178
6.	На четвертый день от начала эксперимента начать анализ соматических мутаций и потери репродуктивной способности клеток волосков тычинок.
Подготовка препаратов для микроскопических исследований
Распустившийся цветок, время жизни которого ограничено несколькими часами, срезают утром. Аккуратно отворачивают лепестки и, зажав их указательным и большим пальцами левой руки, срезают тычинки, держа лезвие в правой руке. Тычинки необходимо срезать по одной у самого основания, не повреждая клетки волосков. Затем тычинки кладут на заранее приготовленное предметное стекло в вазелиновое масло (рис. 20.4). Следует использовать небольшое количество вазелинового масла, чтобы препарат не «плавал» в нем, иначе волоски сложно равномерно распределить по обеим сторонам тычинки.
Настроить бинокулярную лупу обычным способом. Используя увеличение не более 10x4 и матовый фильтр, начать анализ препаратов. Левая рука при этом находится на винте настройки изображения, а в правой экспериментатор держит препаровальную иглу и с ее помошью при необходимости поправляет волоски тычинок.
Клетки волосков имеют голубую окраску, поэтому трудностей с распознаванием розовых мутантных клеток (секторов) не возникает. Одна розовая клетка или сектор (несколько идущих подряд розовых клеток, не разделенных голубыми) регистрируются как одно мутантное событие.
В каждой тычинке внимательно просматривают волоски и те из них, которые образованы менее чем 12 клетками, учитывают как укороченные (stunted). Когда все указанные нарушения учтены, подсчитывают количество волосков в одной из тычинок. Результаты заносят в табл. 20.1. После чего приступают к анализу следующего цветка.
Рис. 20.4. Тычинки, помещенные в вазелиновое масло на предметное стекло
179
Обработка результатов
Частота соматических мутаций и потеря репродуктивной способности клеток могут быть рассчитаны либо по дням для каждого варианта опыта, либо для каждого растения за весь период наблюдений. При этом используют следующие формулы для расчетов:
где А — частота соматических мутаций; В — число всех зарегистрированных для данного опыта розовых мутантных секторов; С — сумма проанализированных волосков тычинок.
Таблица 20.1
Данные оценки мутагенного и токсического действия образцов природных вод (по Т. И. Евсеевой, 2001)
Код препарата	Порядковый номер цветка	Количество волосков на тычинку	Количество волосков в цветке	Розовые мутантные события	Количество волосков, остановившихся в росте
Контроль 1	1	42	42 • 6 = 252	1	2
Контроль2	1	44	264	0	0
Проба 1/1	1	50	300	0	1
Проба 1/1	2	53	318	2	3
Таблица 20.2
Частота соматических мутаций и потеря репродуктивной способности клеток волосков тычинок традесканции (клон 02) при действии Z32Th (по Т. И. Евсеевой, 2001)
Концентрация 232Th, мг/л	Количество просмотренных волосков тычинок, шт.	Соматические мутации, %		Потеря репродуктивной способности клеток, %	
			инкремент	Х±5Я	инкремент
0,088	12657	0,198 ±0,045	0,081	0,055 ±0,045	-0,017
0,177	20506	0,117* ±0,004	0,061	0,102 ±0,028	0,047
0,360	13424	0,238** ± 0,030	0,170	0,342 ±0,040	0,290
Примечание, х — среднее значение; — стандатная ошибка; * — отличие от контроля достоверно при р < 0,05; ** — отличие от контроля достоверно при р < 0,001.
180
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0 4 5 6 7 8 9 10 11 12 14 15 16 17 18 192123 24 25 26 27 30
Рис. 20.5. Динамика частот соматических мутаций (столбцы серого цвета) и потери репродуктивной способности клеток (белые столбцы) волосков тычинок традесканции (клон 02) в контроле (дистиллированная вода; температура 24 °C; освещенность 25 тыс. лк).
По оси абсцисс — дни цветения растений; по оси ординат — частоты нарушений в волосках тычинок традесканции, %
л = 100£(%)>
где D — потеря репродуктивной способности клеток; Е — число всех зарегистрированных укороченных волосков для данного опыта; С — сумма проанализированных волосков тычинок.
Пример. Рассчитаем по табл. 20.1 частоты нарушений по дням:
1) частота соматических мутаций в контроле (повторность 1) А = 100 • 1/252 (%);
2) потеря репродуктивной способности клеток
(для пробы 1) D= (1 + 3) 100/(300 + 318) (%).
По общепринятой методике Г. Крамера проводят расчет средних значений и стандартных отклонений частот нарушений в волосках тычинок. Статистическая обработка данных может включать также анализ распределений и проверку выборок на наличие выбросов. Оценивают достоверность отличия частот повреждений, регистрируемых в опытных образцах и контроле.
7. Полученные результаты представить в виде таблиц и диаграмм (см. табл. 20.2 и рис. 20.5).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Евсеева Т. И. Сочетанное действие факторов радиационной и нерадиационной природы на традесканцию / Т. И. Евсеева, С.А.Гераськин. — Екатеринбург: УрО РАН, 2001.
Крамер Г. Математические методы статистики. — М.: Мир, 1975.
Сперроу А. X. Возникновение соматических мутаций в Tradescantia под действием химических мутагенов ЭМС (этилметансульфонат) и ДБЭ (1,2-дибромэтан) и специфических загрязнителей атмосферы О3, SO2, NO2 / А. X. Сперроу [и др.] // Генетические последствия загрязнения окружающей среды. — М.: Наука, 1977.
181
Ma T. H. Tradescantia cytogenetic tests (root timitosis, pollen mitosis, pollen mother meiosis). A report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program // Mutat. Res., 1982. — Vol. 99.
Лабораторная работа №21. ЧАСТОТА ХРОМОСОМНЫХ АБЕРРАЦИЙ В ЛИМФОЦИТАХ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ
ЧЕЛОВЕКА
(Лабораторная работа подготовлена Е. И. Егоровой)
Цитогенетические тесты in vitro направлены на то, чтобы продемонстрировать индукцию хромосомных нарушений (аберраций) в культивируемых клетках. Обычно в этих тестах клетки изучаются на стадии метафазы.
В норме хромосомы по форме можно разделить на три группы (рис. 21.1): акроцентрические (галочковидные, у которых одно плечо очень маленькое) — на рисунке хромосомные пары 13, 14, 15 — средние, 21, 22 — мелкие; субметацентрические (неравноплечие) — хромосомные пары 2 — самые крупные, 4, 5 — крупные, 6—12 — средние, 16 — 18 — мелкие; метацентрические (равноплечие) — хромосомные пары 1 — самые крупные, 3 — крупные, 19, 20 — мелкие.
КХ Их хх к и
1 2 3	4 5
to XX М Mi
6	7	8	9
fth М Об
13	14	15
хх хх
19	20
ДА АА
21	22
М ПК ЛИ
10	11	12
XX АХ
16	17	18
X Y
Рис. 21.1. Кариотип человека в норме
182
Хромосомные аберрации являются крупным повреждением хромосом и, следовательно, ДНК, поэтому кластогенные факторы (физический или химический фактор классифицируется как кластоген, если он вызывает увеличение числа разрывов хромосом по сравнению с контрольным образцом) должны рассматриваться как потенциально опасные. Клетки с видимыми хромосомными аберрациями, по всей вероятности, не способны к выживанию, но в клетках, которые кажутся неповрежденными, может происходить репарация ДНК и, если этот процесс протекает с ошибками, возможно возникновение мутаций. Отдельные виды хромосомных нарушений, такие как некоторые делении и перестройки (транслокации, инверсии), могут и не вызывать летального эффекта. Сравнительно высокий уровень хромосомных нарушений у людей свидетельствует о возможной роли изменений хромосом в популяциях человека.
Хромосомные аберрации анализируются в метафазах митотического деления клеток пролиферирующих тканей, например костного мозга лабораторных животных. Данный тест имеет широкое применение, и многие регламентирующие органы, принимающие решения в области охраны окружающей среды, придают ему особое значение. Поскольку он проводится на целом организме животных, то лишен очевидных недостатков, связанных с применением искусственных систем метаболической активации in vitro.
Хромосомные аберрации возникают в результате нарушений в ДНК, приводящих к разрыву двойной спирали. При изучении процессов репарации ДНК установлено много видов первичных нарушений: одно- и двунитевые разрывы, повреждения оснований, сшивки ДНК-ДНК и ДНК-белок, алкилирование оснований или фосфатных групп, тиминовые димеры, сайты, лишенные пуринов и пиримидинов. Эти нарушения могут либо исправляться, либо трансформироваться, при этом либо восстанавливается оригинальная последовательность оснований, либо образуются хромосомные аберрации и/или генные мутации.
Часто для исследования хромосомных аберраций используются лимфоциты периферической крови человека (мононуклеарные лейкоциты). Лимфоциты не способны к делению в культуре, но этот процесс можно стимулировать путем обработки каким-либо митогеном, например фитогемагглютиннином (ФГА). Культуру получают из образца свежеполученной крови и проводят культивирование на протяжении нескольких циклов делений. Первой метафазы после внесения митогена клетки достигают не ранее чем через 36—40 ч, после чего они делятся приблизительно каждые 18 ч.
После введения в культуру клеток тестируемого вещества клетки выращивают в течение одного или двух клеточных циклов с тем, чтобы большинство клеток достигло первой метафазы после
183
обработки, а затем проводят фиксацию. Перед фиксацией добавляют вещество, блокирующее образование веретена деления, например колхицин, для того чтобы остановить деление клеток на стадии метафазы. Клетки обрабатывают гипотоническим раствором, например 0,56 % = М (075М) хлористым калием, после чего фиксируют свежеприготовленной смесью этилового спирта и ледяной уксусной кислоты (в соотношении 3:1). Затем клетки окрашивают по Гимзе, орсеином или другим красителем для хромосом и изучают под микроскопом.
Принцип метода основан на образовании хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови человека под влиянием мутагенов и канцерогенов.
Цель работы — обнаружение в готовых препаратах лимфоцитов крови человека хромосомных аберраций различного типа, образованных под действием различных мутагенов и канцерогенов.
Оборудование и материалы:
микроскопы световые; готовые препараты лимфоцитов периферической крови человека с хромосомными аберрациями разного типа; иммерсионное масло; вата, спирт для протирки оптики.
ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ ЛАБОРАТОРНОЙ РАБОТЫ
1.	Получить у преподавателя препараты лимфоцитов крови человека с хромосомными аберрациями различных типов.
2.	Обнаружить и зарисовать в рабочую тетрадь все типы хромосомных аберраций.
3.	Если известны дозы или концентрации мутагенов и канцерогенов, то построить кривую «доза—эффект». Проанализировать дозовую (концентрационную) зависимость.
СПРАВОЧНЫЙ МАТЕРИАЛ
Культивирование лимфоцитов
Реактивы. 71%-й МЕМ (6,16 мл на 1 флакон Карреля); 20%-й ТС (1,6 мл на 1 флакон Карреля); 1%-е I-глютамин, пенициллин + + стрептоцид (по 0,08 мл на 1 флакон Карреля); 1%-й ФГА (0,15 мл на 1 флакон Карреля). [МЕМ — minimum essential medium — минимальная питательная среда; ТС — телячья сыворотка; ФГА — фитогемаглютинин.] На 1 мл цельной крови добавить 0,1 мл раствора гепарина (1 мл гепарина + 19 мл стерильного физиологического раствора). Инактивация сыворотки проводится на водяной бане при 56 °C в течение 30 мин.
1.	Культивирование. Процесс длится 48 ч при 37 °C. За 2,5 ч до его окончания добавить колцемид 0,2 мг/мл: на 1 флакон с кол-цемидом добавить 10 мл дистиллированной воды — это рабочий
.184
раствор. На 1 флакон Карреля с культурой добавить 0,17 мл рабочего раствора колцемида.
После инкубации пробирки с культурой центрифугировать при 1 000 об/мин в течение 12—15 мин. Снять надосадочную жидкость, оставляя слой 2—3 мм над осадком. Осадок перемешать, в несколько приемов небольшими порциями добавить гипотонический раствор КО — 0,075М (550 мг КО + ПО мл дистиллированной воды). Довести объем до 10 мл, на 13 — 15 мин поместить в термостат или водяную баню. Отцентрифугировать при 1 000 об/мин в течение 12—15 мин, снять надосадочную жидкость.
2.	Фиксация. Осадок перемешать, добавить фиксатор маленькими порциями, постоянно помешивая. Состав фиксатора: 3 ч метанола + 1 ч ледяной уксусной кислоты. Довести объем до 7— 8 мл, отцентрифугировать при 1 000 об/мин в течение 10—12 мин. Фиксацию повторить еще 2 раза. Оставить осадок примерно 0,4 мл.
3.	Приготовление препарата. Фильтровальной салфеткой, сложенной в 6 —8 слоев (ее ширина равна ширине стекла), смоченной дистиллированной водой, провести по предметному стеклу, увлажнив поверхность. Микропипеткой (объем 10 — 20 мкл) набрать суспензию клеток и нанести на стекло, прикасаясь к нему пипеткой. Сверху на суспензию нанести 2—3 капли чистого фиксатора. По краям стекла немедленно убрать остатки фиксатора салфеткой.
4.	Окраска. Краситель Гимза, 2 —4%-й раствор. На 1 кювету берется 158 мл дистиллированной воды, 17,5 мл красителя, 2 мл 5%-го раствора соды. Свежеприготовленной краской красить 10 мин.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Руководство по краткосрочным тестам для выявления мутагенных и канцерогенных химических веществ. — Женева: Всемирная организация здравоохранения, 1989.
Па	ушева 3. П. Практикум по цитологии растений. — М.: Агропромиз-дат, 1988.
Биологическая дозиметрия по хромосомным аберрациям в культуре лимфоцитов человека. Методические рекомендации. — Обнинск: ИМР РАМН, 1979.
Лабораторная работа №22. ЧАСТОТА БИНУКЛЕАРНЫХ КЛЕТОК С МИКРОЯДРАМИ В КУЛЬТУРЕ ЛИМФОЦИТОВ
ЧЕЛОВЕКА ПОСЛЕ у-ОБЛУЧЕНИЯ
(Лабораторная работа подготовлена Е. И. Егоровой}
Микроядерный метод заключается в количественной регистрации микроядер в лимфоцитах периферической крови человека.
185
Известно, что именно лимфоциты периферической крови сохраняют полученные повреждения в течение длительного времени. Микроядра обнаруживаются в лимфоцитах сразу после первого митоза. Поскольку в обычных условиях лимфоциты представляют собой неделящуюся популяцию, их подвергают ФГА-стимуляции в культуре. Для построения дозовой зависимости кровь облучают in vitro и спустя 72 ч от начала ФГА-стимуляции анализируют.
Подсчитывают обычно 500 бинуклеарных клеток, используя метод цитокинетического блока. Он основан на введении в культуру лимфоцитов цитохолазина-Б, который блокирует разделение цитоплазмы. Блокирование цитокинеза ведет к накоплению в культуре бинуклеарных клеток, которые удобно анализировать на возможность присутствия в них микроядер.
Для правильного анализа клеток с микроядрами следует учитывать ряд правил.
•	Микроядра имеют обычно округлую или овальную форму и обладают типичной ядерной окраской.
•	В цитоплазме одной бинуклеарной клетки может присутствовать одно микроядро и более.
•	Большинство микроядер по размеру значительно меньше основного ядра (меньше половины).
•	Регистрировать следует те микроядра, между которыми и основным ядром четко выявляется ядерная мембрана.
В научных исследованиях некоторых лабораторий показано, что при дозах облучения от 1 до 4—5 Гр количество микроядер в клетках увеличивается линейно для всех видов излучений. При дозах от 0,05 до 2 Гр выход микроядер может быть описан линейно-квадратичной зависимостью, хотя в диапазоне доз 0,05 — 0,1 Гр имеется плато (дозонезависимый участок).
С помощью микроядерного теста можно реконструировать дозу, полученную человеком ранее. Для этого предлагается пользоваться калибровочными таблицами, полученными в лаборатории при использовании венозной крови клинически здоровых доноров в возрасте 20—35 лет. Лимфоциты облучают в дозах от 0,05 до 2 Гр. Данные калибровочной кривой представлены в табл. 22.1.
Дозовая зависимость, полученная при образовании бинуклеарных клеток, аппроксимируется линейно-квадратичной функцией
Y= 0,029 + 0,111- D + 0,01 I D2,	(1)
где Y — количество микроядер на одну двуядерную клетку; D — доза облучения.
Построив калибровочную кривую и подсчитав количество микроядер в клетках лимфоцитов исследуемой крови, можно рассчитать дозу, полученную человеком.
186
Таблица 22.1
Частота бинуклеарных (БН) клеток с микроядрами (МЯ) после у-облучения (по М.А.Анкиной, 1991)
Доза, Гр	Частота МЯ в БН клетках, %	Частота БН клеток с МЯ на 100 клеток
0	0,9 + 0,1	0,9 ±0,1
0,05	1,3 + 0,1	1,2+ 0,1
0,1	1,4 ±0,1	1,3 ±0,1
0,2	1,8 ±0,1	1,8 ±0,1
0,3	3,0 ± 0,2	2,8 ± 0,2
0,4	3,7 ±0,2	3,3 ±0,2
0,5.	4,8 ±0,1	4,4 ± 0,2
1	10,2 ±0,6	9,2 ± 0,5
2	26,7 ± 1,2	22,7 ± 1,0
Если в лаборатории нет условий для построения калибровочной кривой, можно пользоваться кривыми, полученными в других лабораториях.
Принцип метода заключается в образовании микроядер вследствие нарушения распределения генетического материала между дочерними клетками (5 %) или формирующихся из обломков хромосом (до 95 %).
Цель работы — реконструкция дозы облучения, полученной донором, по количеству клеток с микроядрами.
Оборудование и материалы:
микроскоп; препараты лимфоцитов периферической крови с микроядрами после разных доз у-облучения.
ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ ЛАБОРАТОРНОЙ РАБОТЫ
1.	Получить у преподавателя препараты лимфоцитов с микроядрами, образованными при у-облучении разными дозами.
2.	По табл. 22.1 построить калибровочную кривую на миллиметровой бумаге.
3.	Найти число бинуклеарных клеток с микроядрами на 500 бинуклеарных клеток.
4.	Для расчета дозы, полученной донором, воспользоваться формулой 1.
5.	Найти дозу, полученную донором, с помощью калибровочной кривой.
187
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Анкина М.А. Изучение зависимости доза-эффект для частоты бину-клеарных клеток с микроядрами в культуре лимфоцитов человека после у-облучения / М.А.Анкина, Г.Ф. Михайлова // Радиобиология, 1991. — Т. 31. — Вып.1.
Использование микроядерного теста для индикации прострадиаци-онных эффектов у человека: Метод, рекомендации. — Л.: ЦНИРРИ, 1991.
Almassy Z. The Present stats and Perspectives of micronucleus assay in radiation protection / Z.Almassy [et al.] // A review. Appl. Radiat. Isoe, 1987 - V. 38. - N 4.
4.2.3.Морфологический подход
Лабораторная работа № 23. БИОТЕСТИРОВАНИЕ ЗАГРЯЗНЕНИЯ ВОДЫ С ПОМОЩЬЮ РЯСКИ МАЛОЙ
(LEMNA MINOR L.)
(Методика разработана Л. В. Цаценко)
Представители семейства рясковых являются самыми маленькими цветковыми растениями в мире. В результате гидрофильной эволюции они достигли крайней степени редукции всех органов, поэтому по простоте строения занимают первое место среди цветковых растений. Это — водные, свободно плавающие, многолетние травянистые растения.
Вегетативное тело рясковых называется листецом. Листецы одиночные или собраны в небольшие группы с помощью гиалиновой нити — тонкого выроста мембраны. Листецы состоят из паренхимных клеток хлоренхимы, разделенных большими межклеточными полостями, заполненными воздухом. Проводящая система неразвита. Корни развиты слабо и не достают грунта, по строению простые, одинарные (у многокоренника их число составляет от 3 до 10), отходят от брюшной поверхности листеца, зеленые, поскольку содержат хлорофилл. Рясковые — растения космополиты, распространены по всему свету. Вегетативное тело по виду напоминает крошечный плавающий лист или слоевище низших растений, поэтому длительное время их считали водорослями.
Листецы рясковых либо одиночные, либо соединены в небольшие группы. Форма листецов может быть почковидной или шаровидной. Цветение у рясок наблюдается крайне редко. Плоды хорошо видны невооруженным глазом, они чуть больше макового зернышка.
Ряску называют «экологической дрозофилой». Особенности морфологического строения, высокая скорость размножения, чувствительность к среде обитания — все это сделало ряску удобным
18В
объектом для биологического тестирования. Семейство рясковых содержит более 40 видов, из них в России обитает только 5 видов (Lemna minor L., L. trisulca L., L. gibba L., Spirodela polyrrhiza L., Wolffia arrhiza L.).
Ряска малая (Lemna minor L.) — растение, плавающее на воде. Размер листецов (см. справочный материал к лабораторной работе № 23) 2 — 4 мм. Число жилок 3 (рис. 23.1). Листецы плоские, образуют группы из 3 — 6 растений. Встречается в стоячих водах. Корни длинные, но не достигают грунта, а выполняют главным образом функцию якоря, предотвращая переворачивание растений в воде. Встречается чаше всего в стоячих водах.
Рясковые размножаются преимущественно вегетативно, отдельный лист может пройти 10 делений за период 7—10 сут. Рясковые могут удваивать свою массу за время от 10 ч до 2 сут при оптимальных температуре, освещении и питании.
Принцип предложенного в данной лабораторной работе метода основан на определении гибели и изменений в темпах роста ряски малой, учете морфологических изменений (хлороз, некроз поверхности листеца, расслоение листецов) при воздействии токсических веществ в исследуемой среде по сравнению с контролем.
Острое токсическое действие исследуемой воды на ряску определяется по гибели ее за определенный период времени. Критерием острой токсичности служит гибель 50 % и более растений за 96 ч в исследуемой воде при условии, что в контроле погибло не менее 10 % растений.
Рис. 23.1. Строение ряски малой (Lemna minor L.):
А — общий вид; Б — группа листецов (один материнский и два дочерних); В — растение ряски в начале эксперимента; Г — растения ряски в конце эксперимента
189
В экспериментах по определению острого токсического действия устанавливают: среднюю летальную концентрацию отдельных веществ (кратность разбавления вод, содержащих смеси веществ), вызывающую гибель 50 % и более тест-организмов; безвредную (не вызывающую эффекта острой токсичности) концентрацию отдельных веществ (кратность разбавления вод, содержащих смеси веществ), вызывающую гибель не более 10 % тест-орга-низмов.
Хроническое токсическое действие исследуемой воды на ряску малую оценивают по смертности и скорости роста за период до 24 сут в исследуемой воде по сравнению с контролем. Критерием хронической токсичности служит гибель 20 % и более тест-организмов и (или) достоверное отклонение в скорости роста из числа выживших растений по сравнению с контролем.
Биотестирование проводится в лабораторных условиях. Помещение не должно содержать токсичных паров и газов. Температура окружающего воздуха в лаборатории от + 18 до + 25 °C. Атмосферное давление 84—106 кПа (630—800 мм рт.ст.). Освещение помещения естественное или искусственное, не ограничено особыми требованиями. Освещенность для ряски 2 500 — 3 500 лк. Интенсивность света должна быть более чем на 15 % больше по сравнению с дневным светом.
Предварительная подготовка к отбору проб и выполнению биотестирования включает подготовку посуды, пробоотборников, мест хранения отобранных проб, а также подготовку рабочего места для обработки доставленных в лабораторию проб и исследования их на токсичность. Все процедуры предварительной подготовки должны исключить попадание токсичных, органических и каких-либо других веществ в исследуемую воду.
Посуда для отбора проб и биотестирования должна быть химически чистой. Она промывается смесью бихромата калия и серной кислоты (хромовой смесью). Стенки посуды осторожно смачиваются хромовой смесью и через 2—3 ч посуда тщательно промывается водопроводной водой, нейтрализуется раствором пищевой соды и промывается 3—4 раза дистиллированной водой. Для мытья посуды не разрешается пользоваться синтетическими поверхностно-активными веществами и органическими растворителями. Посуду для отбора проб сушат на воздухе, а используемую для биотестирования, за исключением мерной, — в сушильном шкафу при 160 °C в течение 1 ч.
Химически чистая посуда для биотестирования должна храниться с закрытыми стеклянными притертыми пробками или завинчивающимися крышками в защищенных от пыли ящиках лабораторного стола или на закрытых полках, стеллажах и т. п. Вся грязная посуда после проведения анализов должна подвергаться стерилизации кипячением в течение 1 ч.
190
Культивационная вода используется для разведения маточной культуры, в качестве контрольной с добавлением питательного раствора для биотестирования, для разбавления исследуемых вод. Для подготовки культивационной воды питьевую воду отстаивают в течение 3 — 7 сут (до полного дехлорирования) в бутыли из бесцветного стекла. При отсутствии питьевой воды удовлетворительного качества допускается использование поверхностной пресной или грунтовой воды, отобранной вне зоны влияния источников загрязнения и профильтрованной через фильтр с размером пор 3,5 мкм.
В культивационной воде должны отсутствовать органические загрязняющие вещества, хлор, токсические вещества и антагонистические для ряски организмы (синезеленые водоросли, простейшие, многоклеточные); pH быть в пределах 4,5 —7,0, температура (20 ±5) °C.
Прежде "чем приступить к биотестированию на представителях семейства рясковых, ознакомьтесь с терминами и понятиями, применяемыми в данной лабораторной работе, которые приведены в справочном материале.
Оборудование, материалы и растворы:
флуоресцентный свет или свет дневной лампы для роста ряски (полное освещение в течение 16 ч); стерильная культура растений ряски; 21 чистый пластиковый контейнер; среда для культивирования — ростовой раствор (табл. 23.1); пипетка для добавления ростового раствора; пинцет для отлова ряски; чистая пластиковая пленка или пластиковая пластинка; 100 мл тестируемого раствора в концентрации 4 ПДК (табл. 23.2); дистиллированная вода для контрольного варианта.
ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ ЛАБОРАТОРНОЙ РАБОТЫ
В тестировании использовали 5-дневный цикл развития растений.
1.	Подготовить посуду для контроля и с указанными концентрациями испытуемого вещества.
2.	Налить 30 мл раствора в каждый контейнер. В контрольный вариант влить родниковую или отстоянную водопроводную воду и добавить одну каплю раствора для культивирования.
3.	Используя пинцет, перенести в каждый контейнер по 5 растений рясок. Выбирать только зеленые, здоровые растения с 2 дочерними листецами и приблизительно одинаковых размеров.
4.	Закрыть контейнеры пленкой и поместить на 24 ч под лампу дневного света. Размещения контейнеров под прямыми солнечными лучами у окна следует избегать, чтобы предотвратить перегрев и усыхание листецов (они сжимаются, теряют тургор).
191
Таблица 23.1
Состав среды для культивирования ряски
Макроэлементы, мг/л	
KNO3	350,00
Ca(NO3)2 • 4Н2О	295,00
КН2РО4	90,00
К2НРО4	12,60
MgSO4-7H2O	100,00
Микроэлементы, мкг/л	
Н3ВО3	120,00
ZnSO4- 7Н2О	180,00
Na2MoO4  2Н2О	44,00
МпС12-4Н2О	180,00
FeCl3-6H2O	760,00
Трилон Б*	1500,00
5.	Контейнер с листецами оставить еще на 5 дней. Его следует прикрыть только пластиковой пластиной, чтобы не допустить попадания воды в течение всего периода тестирования.
6.	В конце пятого дня подсчитать количество листецов в каждом контейнере. Сложность подсчета может быть связана с малыми размерами листецов ряски малой, однако в этом случае можно воспользоваться лупой.
7.	Записать данные учета роста тест-объекта в табл. 23.2 и сделать пометки, какие растения изменили цвет, зафиксировать наличие или отсутствие корней и описать общий вид растений.
8.	Провести стандартную статистическую обработку и анализ полученных результатов. Первый шаг — проверка контрольного варианта с целью выявления фонового роста ряски в незагрязненных условиях. Если растения ряски в контрольном варианте не выросли или выглядят не совсем здоровыми, то результаты эксперимента аннулируются. Возможно, питательный раствор был слишком сильный или растения были не здоровы в самом начале эксперимента; также возможны проблемы с окружающей средой во время тестирования.
9.	Для оценки воздействия загрязнителя существует показатель мгновенного отклика популяции — коэффициент роста (г), изменение которого отражает сопротивление среды, т. е. характеризует сумму всех лимитирующих факторов среды, препятствующих реализации репродуктивного потенциала (rmax), который рассчиты-
• 192
Варианты растворов солей тяжелых металлов, применяемых в лабораторной работе
сч rS сч
гЗ
S к; ю гЗ
Н
Металл	I i	о J J □ J												+	+	+	+	+
	СиС12 (Си2*)								+	+	+	+	+					
	£ с N С с N								+	+	+	+	+					
	о Z								+	+	+	+	+					
	РЬС12 (РЬ2+)			+	+	+	+	+										
Концентрация, мг/л				0,120 (0,25 ПДК)	0,060 (0,5 ПДК)	0,030 (1 ПДК)	0,0075 (2 ПДК)	0,0150 (4 ПДК)	0,5 (0,25 ПДК)	0,25 (0,5 ПДК)	1,0 (ПДК)	2,0 (2 ПДК) 		4,0 (4 ПДК)		1 х 10-3 (0,25 ПДК)	2 х 10"3 (0,5 ПДК)	S' d Е X vy сч	4х 10-3 (2 ПДК)	S Г=1 Е ’4- ч о X V,
7 Мелехова
193
вается по контролю. По истечении времени экспозиции в контроле и в каждой концентрации просчитывается общее количество листецов, включая материнские особи и листецы, отделившиеся
от них.
В контроле и в каждой концентрации на основании полученных результатов рассчитывается коэффициент роста популяции
(г): г = t , где No — начальная численность листецов; N, —
конечная численность листецов; t — время экспозиции (сутки). Данные записываются в таблицу учета роста тест-объекта.
Внимание! Значение описания всевозможных изменений, происходящих с тест-обьектом, очень важно. Также полезно смотреть на отдельные растения, чтобы понять особенности реакции те
стируемого организма. Важно отметить, как растения реагируют в
начале эксперимента, что с ними происходит потом, идет ли реакция по отдельным растениям либо реагирует вся группа. Все эти особенности внести в табл. 23.2. В табл. 23.3 представлены некоторые формы реакции ряски малой на присутствие в воде солей тяжелых металлов.
10.	Провести оценку токсичности среды по следующим критериям:
LC50 — летальная концентрация, которая убивает 50% тест-организмов;
ТС — treshold concentration — минимальная, или пороговая, концентрация, обеспечивающая рост не более 50 % организмов.
В биотестировании по рясковому тесту растения продолжают расти, в связи с чем чаще всего используется показатель ТС50.
СПРАВОЧНЫЙ МАТЕРИАЛ
Перечень основных терминов и понятий
Колония — сообщество материнских и дочерних листецов, соединенных друг с другом.
Листец — одиночное растение в колонии рясок. Это маленькая пластинка, которая соединила в себе лист и стебель, способная к размножению.
Маточная культура — растения одного вида рясок.
Питательный раствор — раствор, содержащий питательные вещества и микроэлементы для роста ряски.
Посевная культура — число листецов, добавленных в тестируемую среду в начале биотестирования.
Предшествующая культура — культура рясок, используемая для акклиматизации тестируемых растений в условиях эксперимента.
Прирост — увеличение биомассы за определенный промежуток времени; оценивается подсчетом численности листецов.
194
Реакция ряски малой (Lemna minor L.) на соли тяжелых металлов
Коэффициент роста (г)		3,55	2,17	0,33	О	2,84	1,55	0,60	5,84	0,17	4,!7	О	0,83	8 О—<
Тестовые реакции	реакция листецов	Нет	Сильное усыхание	Сильное усыхание	Сильное увядание	Сильное усыхание, корни отпали	Сильное усыхание	Сильное усыхание	Сильное усыхание	Отмирание корней	Корни отпали, усыхание	Усыхание	Усыхание	Сильное усыхание
	рассоединение листецов	Нет	Есть	Есть	Есть	Есть	Есть	Есть	Нет	Есть	Нет	Нет	Нет	Нет
	окраска листецов	Интенсивно зеленая	Коричневая	Светло-бурая	Светло-зеленая, коричневая	Светло-зеленая	Светло-зеленая	Темно-коричневая	Белая	Белая	Желто-белая	Светло-зеленая	Коричневая	Светло-зеленая, бурая
Концентрация (мг/мл)		О	0,25	То же	А	А	А	А	А	А	А	А	I» А	А
Металл		Контроль	Cd	РЬ	Zn	р	Со	Ni	О S	Си	Сг	Ва	>	Мп
195
Продолжение табл. 23.3
Металл	Концентрация (мг/мл)	Тестовые реакции			Коэффициент роста (г)
		окраска листецов	рассоединение листецов	реакция листецов	
Cd	0,1	Коричневая	Есть	Сильное усыхание	2,17
Pb	To же	Желтовато-зеленая	Есть	Подсыхание зоны роста	0,50
Zn	»	Темно-бурая	Есть	Усыхание	0,17
Ti	»	Зеленая	Есть	Увядание малозаметное	4,17
Со	»	Светло-зеленая	Есть	Сильное усыхание	1,55
Ni	»	Темно-коричневая	Есть	Сильное усыхание	0,60
Mo	»	Белая	Нет	Сильное усыхание	5,84
Си	»	Белая	Есть	Отмирание корней	0,17
Cr	»	Желто-белая	Нет	Корни отпали, усыхание	4,17
Ba	»	Светло-зеленая	Нет	Усыхание	0,17
V	»	Коричневая	Нет	Усыхание	0,83
Мп	»	Зеленая	Нет	Усыхание краев	1,67
Cd	0,025	Светло-зеленая	Есть	Подсыхание	3,33
Pb	To же	Темно-зеленая	Есть	Подсыхание	1,33
Zn	»	Светло-зеленая, крапчатая	Нет	Усыхание	0,17
Ti	»	Сизо-бурая	Нет	Подсыхание краев	4,00
Со	»	Бурая	Есть	Усыхание	2,34
Ni	»	Ярко-зеленая	Есть	Подвядание	1,17
Mo	»	Сизо-белая	Нет	Усыхание	2,52
Си	»	Белая	Есть	Отмирание корней	0,17
Сг	»	Ярко-зеленая	Нет	Подсыхание корней	6,25
Ва	»	Светло-желтая	Нет	Увядание	0,66
V	»	Коричневая	Нет	Усыхание	0,83
Мп	»	Светло-зеленая	Нет	Увядание	2,00
Cd	0,001	Белая, крапчатая	Есть	Увядание	2,67
Pb	To же	Коричневая	Нет	Увядание	2,83
Zn	»	Светло-коричневая	Нет	Увядание	1,17
Ti	»	Зеленая, светло-коричневые края	Нет	Увядание, корни отпали	3,83
Co	»	Зеленая	Есть	Увядание	1,54
Ni	»	Светло-зеленая	Нет	Подвядание, корни отпали	3,00
Mo	» ♦	Желто-зеленая	Нет	Подсыхание краев	6,03
Си	»	Белая с сизоватым оттенком	Есть	Сильное усыхание	0,73
Окончание табл. 23.3
Коэффициент роста (г)		6,25	0,66	2,00	оо		2,00	1Д7	2,83	2,53	1,67	5,84	0,73	4,83	1,84	1,33	1,87
Тестовые реакции	реакция листецов	Подсыхание корней	Увядание	Увядание	Увядание незначительное	Подсыхание середины	Увядание	Листецы сморщены	Легкое подвядание	Подвядание	Усыхание краев	Легкое подвядание	Сильное усыхание	Увядание	Увядание	Увядание	Увядание незначительное
	рассоединение листецов	Нет	Нет	Нет	Нет	Нет	Нет	Нет	Нет	Нет	Нет	Есть	Есть	Нет	Нет	Нет	Нет
	окраска листецов	Ярко-зеленая	Светло-желтая	Зеленовато-бурая	Желто-зеленая	Бледно-зеленая	Зеленые, крапчатые	Коричнево-зеленая	Ярко-зеленые	Светло-зеленая	Желто-зеленая	Зеленая	Белая с сизоватым оттенком	Зеленая	Зеленая	Светло-зеленая	Желто-зеленая i	
Концентрация (мг/мл)		0,001	То же	А	А	0,0001	То же	А	А	А	А	А	А	А	А	А	*
Металл		б	гЗ	>	Мп	ТЗ О	Ом	С N	н	о О	X	о	3 О	Ьм О	гЗ СО	>	Мп
198
Среда для культивирования — раствор питательных веществ в отстоянной водопроводной воде для обеспечения роста ряски, а также для разбавления исследуемых вод.
Тестируемый образец — получают из анализируемой природной воды, сточных вод и растворов загрязняющих веществ посредством различных приготовлений, таких как разбавление, фильтрация, нейтрализация.
Тестируемый раствор — это комбинация из тестируемого образца, дистиллированной воды и питательного раствора.
Хлороз листеца — пожелтение или полное обесцвечивание ли-стеца в результате потери пигмента.
Чистая культура — культура растений ряски, свободная от других организмов (других видов рясок, водорослей или водных животных).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Евгеньев М. И. Тест-методы и экология // Соросовский образовательный журнал, 1999. — №11.
Методика определения токсичности воды и водных вытяжек из почвы, осадков сточных вод, отходов по смертности и изменению плодовитости дафнии. — Федеральный реестр ФР. 1. 39.2001.00283. — Жмур Н. С. — М.: Акварос, 2001.
Цаценко Л. В. Рясковые — биоиндикаторы агроценоза / Л. В. Цаценко, Н. Г. Малюга. — Краснодар: КубГАУ, 2000.
Цаценко Л. В. Методика биотестирования почвы на основе ряскового теста в агроэкологическом мониторинге / Л. В. Цаценко, Н. Г. Малюга. — Краснодар: КубГАУ, 2003.
AFNOR 1996 Determination of the inhibitory effect on the growth of Lenina minor XP T 90-337.
Environment Canada 1998 Biological test method: test for measuring the inhibition of growth using the freshwater macrophyte Lemna minor Report EPS l/RM/37.
EPA 1996 Ecological effects test Guidelines OPPTS 850.4400 Aquatic plant toxicity test using Lemna ssp., Tiers I and II, ЕРА 712-C-96—156.
OECD 1998 Draft OECD test guideline — Lemna growth inhibition test.
SIS 1995 Swedish Institute of Standards, Water quality — determination of growth inhibition(7-d) Lemna minor, duckweeds SS 02 82 13.
Лабораторная работа №24. НАРУШЕНИЕ
ЭМБРИОНАЛЬНОГО МОРФОГЕНЕЗА АМФИБИЙ В УСЛОВИЯХ ТЕХНОГЕННОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ СРЕДЫ
{Методика разработана О. П. Мелеховой)
В раннем эмбриогенезе имеются особо чувствительные к повреждающим воздействиям фазы («критические периоды» по
199
П. Г. Светлову), которые коррелируют с инициацией экспрессии генов, определяющих цитодифференцировку, а также связанные с межклеточными взаимодействиями при морфогенезе. Эмбрионы амфибий в критических фазах развития могут служить в качестве биотестов для оценки токсичности, вызванной химическими, электромагнитными или радиоактивными загрязнениями водной среды. Оценка эмбриотоксичности водной среды позволяет заключить, что концентрации поллютантов, считающиеся допустимыми для взрослых животных, являются критическими (вызывающими аномалии развития и смертность) для эмбрионов. Таким образом, методы биомониторинга, основанные на изучении параметров гомеостаза лишь взрослых гидробионтов, недостаточно информативны для прогноза воспроизведения популяций. Возможно, нарушения именно гомеостаза развития являются причиной быстрого исчезновения некоторых внешне благополучных поселений водных животных.
Принцип предложенного в лабораторной работе оригинального метода оценки эмбриотоксичности воды основан на определении физиологического состояния зародышей амфибий по морфологическим аномалиям и смертности (рис. 24.1). Применение эмбриональных моделей в экспериментах по выявлению действия повреждающих факторов позволяет сделать предположения о механизмах повреждения, используя в качестве биотестов эмбрионы на разных стадиях развития. Предлагаемый способ оценки каче-
А
Рис. 24.1. Типичные аномалии развития амфибий, вызванные токсичной средой.
Показаны асимметрии тела эмбрионов лягушки, связанные с нарушением развития осевого зачатка: А — пунктиром представлен нормальный контур, сплошной линией — аномалии, приводящие к гибели эмбриона; Б — стадии гибели
200
ства воды с помощью амфибий может быть использован в водной токсикологии, при испытаниях побочного действия фармакологических препаратов, пищевых концентратов, кормовых добавок, при испытаниях экологической чистоты технологий, связанных со сбросом сточных вод, при составлении прогноза изменений в популяциях различных водных животных в трансформированных сбросом сточных вод экосистемах.
Эмбрионы и молодь водных животных являются уникальной природной моделью для исследования механизмов повреждений, вызванных токсическими агентами. Нарушения субклеточных процессов, возникающие в момент воздействия, в результате развития эмбриона быстро визуализируются и могут быть зарегистрированы морфометрически (появление уродств, изменение скорости или остановка развития). Сочетание обнаружения первичных процессов поражения на субклеточном уровне с морфометрической регистрацией изменений хода развития позволяет получить сведения о механизмах повреждений.
Цель работы — выявление действия малых доз гамма-излучения на нарушение развития низших позвоночных на примере амфибий.
В качестве тест-объекта используются эмбрионы лягушки на стадии закладки нервной системы (нейруляции). Эта фаза развития характеризуется резким повышением уровня окислительного метаболизма и инициацией экспрессии генов, связанных с начальными процессами дифференцировки. Нарушение этих процессов повреждающими воздействиями через двое суток определяется визуально по морфологическим аномалиям осевого зачатка.
Оборудование и материалы:
лабораторные препараты “Со (или промышленная установка с источником ионизирующего излучения); чашки Петри; зародыши (нейрулы) травяной (Rana temporaria L.) и шпорцевой (Xenopus laevis D.) лягушек — для каждого опыта берется по 25 зародышей, стандартизированных по возрасту; стадии развития объектов определяются по таблицам Н.В.Дабагяна и Л.А. Слепцовой для R. temporaria и по таблице П. Ньюкупа и Дж. Фабера для X. Laevis.
ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ ЛАБОРАТОРНОЙ РАБОТЫ
• Препараты для лабораторной работы студентов готовятся заранее — за двое-трое суток до начала.
Проинкубировать по 25 зародышей, помещенных в чашки Петри с отстоянной водой в присутствии слабого источника излучения и без него. Длительность у-облучения может составить до 30 ч при мощности дозы 10-6 Гр/ч.
201
1.	Получить у преподавателя зародыши лягушек. В таблицу занести данные о возрасте эмбриона (стадии развития), размере, характере аномалий в соответствии с рис. 24.1, проценте смертности:
Источник излучения	Доза •/-облучения	Стадия развития		Харак-тер аномалий	Заклю-чение по биотестированию	Гибель/уродство, %	
		В начале опыта	В конце опыта			Через 1 ч (сутки)	Суммарно двое суток
							
							
2.	Действующую дозу у-облучения определить по наличию морфологических аномалий развития (например, асимметрия осевого зачатка, недоразвитие или гипертрофия отделов тела), а также по изменениям в скорости роста и процента смертности зародышей, контактировавших с источником излучения, по сравнению с контролем. Эксперимент ставится в трех повторностях.
3.	Сделать вывод об эмбриотоксичности определенных доз облучения на основании сравнения характера распределения регистрируемого признака в опытной и контрольной группе зародышей. Использовать методы непараметрической статистики (например, критерий Пирсона).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Дабагян Н.В. Объекты биологии развития / Н. В.Дабагян, Л. А. Слепцова. — М.: Наука, 1975.
Мелехова О. П. Модификации эмбрионального развития при воздействии радионуклидов / О. П. Мелехова [и др.] // Физические проблемы экологии. — М.: Изд-во МГУ, 2001.
Мелехова О. П. Исследование нарушений развития гидробионтов как средство оценки загрязнений водной среды // Современные проблемы биоиндикации и биотестирования. — Сыктывкар: Ин-т биологии Уральского отд. РАН, 2001.
4.2.4. Физиологический подход
Лабораторная работа №25. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КАЧЕСТВА ВОДЫ ПО ИЗМЕНЕНИЮ БИОМАССЫ ХЛОРЕЛЛЫ (Лабораторная работа подготовлена Е. И. Егоровой)
Одноклеточные водоросли — одни из наиболее распространенных организмов водной среды. К ним относятся представители
202
самых различных систематических групп: диатомовые, перидини-евые — в морских водоемах, желто-зеленые, зеленые и протококковые, обитающие в пресных водах. В силу своих физиологических особенностей одноклеточные водоросли обладают наибольшей чувствительностью к изменениям внешней среды. Короткий цикл их развития позволяет проследить на нескольких поколениях действие токсических веществ. Одноклеточные водоросли используются для биотестирования широкого класса веществ (тяжелые металлы, хлор и фосфорорганические соединения, ПАВ, детергенты), сточных вод различных отраслей народного хозяйства, загрязненных природных вод и грунтов.
Метод биотестирования по выживаемости Chlorella vulgaris в загрязненном водоеме включен в Международные стандарты ИСО 14000.
Chlorella vulgaris — одноклеточная зеленая водоросль, постоянно присутствующая в природных биоценозах. Размер клеток 0,05 мм, поверхность гладкая, содержит пигменты хлорофилл и каротин, размножается автоспорами. Ch.vulgaris — активный продуцент биомассы, период генерации 19,5 ч, легко культивируется в лабораторных условиях, устойчива к микробному загрязнению, чувствительна к действию различных токсикантов. Кроме того, характеризуется устойчивостью морфологических признаков, что облегчает учет дегенерированных форм, возникающих под влиянием токсикантов.
В лабораторных условиях хлорелла растет на жидких и агаризо-ванных средах. Жидкую питательную среду после стерилизации охлаждают и в стерильных условиях разливают по колбам. Культивирование водорослей осуществляют в колбах объемом 250—300 мл либо в специальных культиваторах. Инокулят вносят в среду из расчета 106 клеток на 1 мл среды. После инокуляции колбы закрывают стерильными ватно-марлевыми пробками и сверху прикрывают стерильными бумажными колпачками. Выращивание водорослей проводят при постоянной аэрации в люминостатах или на специально оборудованных стеллажах, оснащенных лампами дневного света (интенсивность 2 000—2500 лк), установленных над верхней полкой и под каждой нижеследующей.
Для хранения водорослей в лабораторных условиях используют агаризованную среду Тамия, скошенную в пробирках или разлитую по чашкам Петри. При культивировании водорослей на поверхности агаризованной среды применяют стандартные микробиологические методы: посев штрихом с помощью бактериологической петли или равномерное распределение шпателем суспензии по поверхности агара. Состав среды Тамия (г/л): KNO3 — 5,0; MgSO4 - 2,5; КН2РО4 - 1,25; FeSO4 - 0,003.
Для биотестирования водной среды с использованием Ch. vulgaris предложены тест-реакции, основанные на изменении по
203
казателей выживаемости, численности, содержания хлорофилла в клетках при культивировании на питательных средах в течение 24 ч (табл. 25.1).
В основу метода определения качества воды, предложенного в лабораторной работе, положены следующие тест-реакции одноклеточных водорослей: изменение численности клеток и их морфологических признаков, учет живых и мертвых клеток, содержание фотосинтезирующих пигментов. Эти параметры могут служить надежной основой для количественной оценки угнетения или стимулирующего влияния сточных вод. Идентификацию живых и мертвых клеток производят по характерным морфологическим изменениям, возникающим под влиянием загрязняющих веществ. К числу признаков мертвой клетки относятся: альбинизация, лизис, появление уродливых форм и т.д. Подсчет клеток проводят в камере Горяева (рис. 25.1) под микроскопом с увеличением 320 (объективом х 40).
Внимание! Камера имеет нужный объем, если покровное стекло правильно притерто, т. е. видны радужные кольца! Камера должна быть очень чистой, а главное обезжиренной, чтобы стекло удалось притереть (можно протереть ее спиртом, чтобы удалить жир).
Принцип действия камеры Горяева
В камере горизонтальные и вертикальные линейки образуют 15 рядов и 15 столбцов, т.е. 225 клеток. Чтобы дважды не сосчитать число особей в одной и той же клетке, передвигают камеру в поле
Таблица 25.1
Тест-реакции Chi. vulgaris при комплексной оценки токсичности водной среды
№ п/п	Тест-реакция	Показатель токсичности	Время отклика, ч
1	Выживаемость клеток	Статистически достоверное увеличение единичных нежизнеспособных клеток, которые не делятся и не образуют микроколоний на агаризованных средах	24
2	Изменение численности	Статистически достоверное изменение численности клеток	24
3	Определение живых и мертвых клеток	Наличие клеток с характерными морфологическими изменениями	24
4	Содержание фотосинтезирующих пигментов	Содержание в водорослях хлорофилла а	24
204
3
1
2
Столбцы
1__ __________ ____________
2		____________________
3	 
Ряды
Рис. 25.1. Схема камеры Горяева
зрения микроскопа так, как показано на схеме (рис. 25.2), и просчитывают клетки ряд за рядом. Если концентрация клеток большая, то не надо просматривать всю камеру. Достаточно просчитать 2—3 ряда или насчитать 200—300 клеток. Содержание клеток в среде определить по формуле:
•	.. а-4000 б
N =----------,
в
где п — количество клеток в 1 мкл среды; а — количество клеток, подсчитанных в объеме камеры; б — количество больших квадратов камеры, где подсчитывались клетки; в — разведение.
В результате роста и развития организмов в водоемах непрерывно нарастает биомасса. Этот процесс называется биологическим продуцированием, а вновь создаваемая биомасса — биологической продукцией. Биологическое продуцирование происходит в форме образования первичной и вторичной продукции, под которой понимается соответственно прирост биомассы автотрофов и гетеротрофов. Само явление биологического продуцирования можно рассматривать в двух аспектах: как свойство популяций и водоемов, соответственно чему различают биологическую продуктивность популяций и водоемов. Биологическая продуктивность популяций определяется их видовыми особенностями и условиями существования. Под биологической продуктивностью водоемов понимается их свойство обеспечивать тот или иной темп воспроизводства организмов. Так, в сельском хозяйстве говорят о плодородии почв, их способности давать тот
Рис. 25.2. Схема просчета Chlorella vulgaris клеток в камере ГоряеЕа
205
или иной урожай, хотя он в значительной степени зависит не только от качества почвы. Таким образом, биологическая продуктивность популяций и водоемов — это разные аспекты одного явления.
Первичная биологическая продукция образуется в водоеме за счет процессов фотосинтеза, осуществляемого организмами, содержащими светопоглощающие пигменты, и в первую очередь хлорофилл а.
Цель работы — оценить прирост биомассы и численность водоросли Chlorella, культивируемой в загрязненной нефтепродуктами воде.
Оборудование, материалы и реактивы:
колбы конические на 250 мл; колба Бунзена; фильтры 0,25 мкм; фарфоровая ступка с пестиком; центрифуга с центрифужными пробирками на 10 мл; концентрационный фотоколориметр, или фотометр КФК; кюветы 1 см; водоструйный насос; пинцет; мерные цилиндры на 10 и 50 мл; камера Горяева; MgCO3; 90 %-й водный раствор ацетона; среда Тамия для культивирования водорослей; нефтепродукты (бензин, нафтеновые кислоты); культура водорослей Chlorella vulgaris.
ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ ЛАБОРАТОРНОЙ РАБОТЫ
1.	Приготовить среду Тамия с концентрацией нефтепродуктов 0,5; 0,05 и 0,005 мг/л (см. табл. 14.1).
2.	Сконцентрировать культуру водорослей Chlorella на центрифуге до 106 клеток/мл.
3.	Приготовить серию последовательных разведений нефтепродуктов в среде Тамия и разлить среду по 100 мл в конические колбы. В контрольную колбу налить 100 мл среды Тамия без нефтепродуктов в двух повторностях.
4.	В каждую колбу добавить по 1 мл концентрированной суспензии водорослей.
5.	Колбу Бунзена подсоединить к водоструйному насосу. В воронку поместить фильтр с диаметром пор 0,25 мкм.
Внимание! Перед фильтрованием для предотвращения разрушения пигментов из-за повышения кислотности в экстрактах фильтр покрывают слоем MgCO3 из расчета 10 мг на каждый 1 см2 фильтрующей поверхности. Чтобы уменьшить возможные потери от частичного разрушения нежных форм фитопланктона, фильтрацию следует проводить при небольшом разрежении, не превышающем 2/3 атм.
6.	Контрольную пробу первой повторности использовать как нулевую точку. Все остальные пробы поставить в люминостат на 24 ч.
206
7.	В контрольной пробе провести подсчет численности клеток водоросли, зафиксировав количество живых и мертвых. Данные занести в табл. 25.2.
8.	Затем содержимое контрольной колбы первой повторности профильтровать через мембранный фильтр диаметром 25 мм с размером пор 0,25 мкм.
9.	После окончания фильтрации сразу же провести экстрагирование фильтра без его подсушивания, чтобы свести к минимуму потери от разрушения пигмента. В качестве растворителя использовать 90 %-ный водный раствор ацетона (можно метанола). Экстракция пигментов ацетоном для некоторых водорослей менее эффективна, чем экстракция метанолом, однако спектральные характеристики пигментов в ацетоне изучены несравненно лучше, чем в метаноле.
Примечание. Хранение подсушенных фильтров допускается в течение нескольких дней или недель (до 2 мес) в присутствии силикагеля, в темноте при t = 1 °C. Потери пигмента при этом могут достигать 10 —15 %.
10.	Для экстракции фильтр осторожно взять пинцетом, поместить в фарфоровую ступку, залить 2 — 3 мл 90%-го ацетона и растирать в течение 1 мин.
11.	Полученную смесь перенести в центрифужную пробирку, добавить 90%-го ацетона до объема 10 мл и выдержать в темноте при комнатной температуре в течение 10 мин.
Внимание! Во все пустые центрифужные пробирки налить по 10 мл дистиллированной воды, предварительно подписав анализируемые.
12.	Центрифугирование экстракта провести в течение 10 мин при 2 000 об/мин.
13.	Прозрачный супернатант из анализируемой пробирки перенести в кювету фотоколориметра толщиной 1 см. Определение концентрации хлорофилла проводят по регистрации оптической плотности, полученной в области красного максимума поглощения (663—665 нм). Провести три измерения на фотоколори-
Таблица 25.2
Тест-реакции Chlorella vulgaris (Chle) в контроле и тестируемой среде
№ опыта	Численность, кл.	Содержание Chi а, мкг/мл	Биомасса, мг/л	Содержание мертвых клеток (% от контроля)	Время отклика, ч
Контроль					0
Среда					24
207
метре, используя среднее значение для расчета концентрации хлорофилла.
14.	Для расчета содержания хлорофилла а используют следующие простые соотношения между его концентрацией в мкг/мл растворителя и оптической плотностью 0665, измеренной при 665 нм в кювете толщиной 1 см:
СЫа = 11,9 Z>665,	(1)
где Chlo — концентрация хлорофилла а, соответствующая длине волны 665 нм, мкг/мл; 11,9 — пересчетный коэффициент; 0665 — оптическая плотность.
15.	Данные по оптической плотности и концентрации хлорофилла занести в табл. 25.2.
16.	Фотоколориметрирование экстракта следует также провести при 750 нм для учета неспецифического поглощения, вызванного наличием в экстрактах посторонних частичек. Величину неспецифического поглощения следует вычесть из изменений спектра до того, как результат измерений оптической плотности при 665 нм будет использован в уравнении для оценки содержания хлорофилла.
17.	Рассчитать концентрацию хлорофилла а по формуле
0^=11,9(2)665-0750),	(2)
где Chlo — концентрация хлорофилла а, мкг/мл; 11,9 — пересчетный коэффициент; D665, Д750 — оптическая плотность.
Данные занести в табл. 25.1 (п.9).
18.	По данным концентрации хлорофилла а рассчитать ориентировочную величину биомассы фитопланктона.
Известно, что концентрация хлорофилла а соответствует примерно 2,5 % от сухой биомассы, или 6,75 % от содержания органического углерода, т.е. при переходе от концентрации хлорофилла а к биомассе, выраженной в единицах углерода (мкг С/л), допустимо использовать пересчетный коэффициент 15, тогда
Дс=15СЫ0,	(3)
где Вс — биомасса фитопланктона, мг/л; 15 — пересчетный коэффициент; Chlc — концентрация хлорофилла а.
19.	Данные по биомассе занести в табл. 25.2.
20.	Через 24 ч культивирования в люминостате провести определение численности и прироста биомассы Chlorella во всех пробах воды, содержащих и не содержащих нефтепродукты, в соответствии с пп. 7 —19.
21.	Провести сравнительный анализ полученных результатов, учтя численность и биомассу в нулевой контрольной пробе.
208
Таблица 25.3
Оценка степени загрязнения природного водоема по биомассе фитопланктона
Показатель	Классы качества воды				
	предельно чистая	чистая	удовлетворительной чистоты	загрязненная	грязная
Биомасса фитопланктона, мг/л	<0,1	0,1-1,0	1,5-5,0	5,1-50,0	>50
Приведенный в лабораторной работе метод оценки биомассы планктонных водорослей хлорелла по концентрации хлорофилла в клетках можно применять для оценки степени загрязнения природных водоемов, используя табл. 25.3.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Методы биотестирования вод / под ред. А. Н. Крайнюковой. — Черноголовка: Ин-т химической физики АН, 1988.
Пашков Е.В. Международные стандарты ИСО 14 000. Основы экологического управления / Е.В.Пашков [и др.]. — М.: ИПК Стандарты, 1997.
Федоров В.Д. О методах изучения фитопланктона и его активности. — М.: Изд-во МГУ, 1979.
Федоров В.Д. Изменения в природных биологических системах / под ред. В. Н. Максимова. — М.: РАГС, 2004.
Лабораторная работа №26. ВЛИЯНИЕ ТОКСИКАНТОВ НА КИСЛОРОДНУЮ ПРОДУКТИВНОСТЬ ВОДОРОСЛЕЙ
{Лабораторная работа подготовлена Е. И. Егоровой)
Изменение кислородной продуктивности является важным функциональным тестом при оценке физиологического состояния фотосинтезирующих организмов. Кислород образуется в водоеме в результате реакций, связанных с фотосинтезом. Большой вклад в кислородную продуктивность вносят водоросли.
Хлоропласты содержатся в эукариотических (ядерных) клетках зеленых растений. В клетках фотосинтезирующих прокариот фотосинтезирующие системы расположены в пластинчатых структурах — хроматофорах, которые содержат почти те же элементы фотосинтетического аппарата, что и хлоропласты.
Хлоропласты имеют шаровидную или дисковидную форму, размеры их не превышают 10 мкм. Число их в клетках разных ви
209
дов водорослей и высших растений варьирует от 1 до 40 на клетку. Хлоропласты окружены наружной мембраной, а внутренняя мембрана образует плоские пузырьки — тилакоиды, уложенные стопками, называемые гранами. В гранах тилакоидов находятся все фотосинтезирующие структуры. Ферменты, восстанавливающие углекислый газ до глюкозы, находятся в основном в строме, окружающей тилакоиды.
Многие физические (тепло, ионизирующее и УФ-излучения) и химические (детергенты, хлорорганические пестициды, тяжелые металлы и др.) факторы могут воздействовать на фотосинтезирующий аппарат и снижать кислородную продуктивность растений. Стандартным методом, используемым в гидробиологии и гидрохимии для измерения растворенного в воде кислорода, является метод Винклера. При этом в растворе происходят три последовательные реакции:
1)	связывание кислорода, растворенного в воде (фиксация):
МпС12 + 2NaOH = Мп(ОН)2Х + 2NaCl;
Осадок белого цвета
2 Мп(ОН)2 + О2 = 2МпО(ОН)2>1;
Осадок
красно-коричневого цвета
2)	освобождение свободного йода в эквивалентном зафиксированному кислороду количестве:
MnO(OH)2 + 2KI + 2H2SO4 = K2SO4 + MnSO4 + ЗН2О + I2;
Мп4 + О(ОН)2 + 4Н+ + 2е- -> Мп2+ + ЗН2О;
2Г + 2е~ -> 12;
3)	титрование свободного йода раствором тиосульфата натрия известной концентрацией:
I2 + 2Na2S2O3 = Na2S4O6 + 2NaI.
Очевидно, что количество тиосульфата, пошедшего на титрование йода, пропорционально количеству растворенного кислорода.
Методом Винклера удобно оценивать кислородную продуктивность микроводоросли рода Chlorella и ее изменения под действием токсикантов (медь, кадмий, свинец и т. п.). Для количественного учета микроводорослей используются световой микроскоп с разрешающей способностью 100—400 и счетная камера Горяева.
210
Количество кислорода (X, мг/мл) рассчитывается по формуле
у_0,08и
л ~	>	I1/
И -V
где п — объем тиосульфата, пошедшего на титрование, мл; V— объем пробы суспензии водорослей, мл; v — объем прибавленных реактивов Винклера, мл; 0,08 — пересчетный коэффициент.
Можно рассчитать количество кислорода, приходящееся на одну клетку водоросли по формуле Хо = Х/N, где N — количество клеток Chlorella в 1 мл суспензии, подсчитанных в камере Горяева (см. лабораторную работу № 25); X — количество кислорода в миллиграммах в мл клеточной суспензии.
Принцип метода, предложенного в лабораторной работе, основан на обратном окислительно-восстановительном титровании (йодометрии).
Цель работы — определение кислородной продуктивности водорослей, культивируемых в среде с токсикантами, методом Винклера.
Оборудование, материалы и реактивы:
микроскоп; камера Горяева; пипетка на 0,2 и 1,0 мл; покровные стекла; 9 колб на 50 мл со шлифом и притертыми пробками; колбы на 100 мл; бюретка на 25 мл; штатив; люминостат; культура водорослей Chlorella в среде Тамия (см. лабораторная работа № 25); раствор CdCl3 в концентрации 0,5 мг/л (см. табл. 14.1).
Реактивы Винклера: 30%-й МпС12; 30%-й NaOH + 10%-й КС1 — хранить в темном месте; конц. H2SO4 (1:1) или конц. Н3РО4; 0,2%-й раствор крахмала (свежеприготовленный); Na2S2O3 - 5Н2О (тиосульфат натрия) — 0,01н. раствор.
ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ ЛАБОРАТОРНОЙ РАБОТЫ
1.	В 9 колб объемом 50 мл налить суспензию водорослей с помощью мерной пипетки. Колбы 1, 2 и 3 закрыть притертыми пробками. Пробы налить в колбы таким образом, чтобы при их закрывании притертыми пробками не оставалось пузырьков воздуха. Наливать следует осторожно с помощью пипетки, опустив ее на дно колбы. Колбы 4, 5 и 6 использовать в качестве контроля в конце опыта. В колбы 7, 8 и 9 добавить 1 мл раствора CdCl3 в концентрации 0,5 мг/л. В трех первых колбах начать определение кислорода, а остальные поставить на интенсивное освещение в люминостат на 24 ч, прикрыв их ватными тампонами.
2.	В колбах 1, 2 и 3 рассчитать количество водорослей в суспензии, используемой для первичного определения кислорода. Подсчет произвести микроскопированием в камере Горяева (х40) (как
211
пользоваться камерой Горяева, подробно описано в лабораторной работе № 25). Подсчитанное количество водорослей занести в табл. 26.1 для дальнейшего определения кислородной продуктивности водорослей в исходной суспензии.
3.	Затем в эти же колбы (1, 2, 3) прибавить по 1 мл щелочного раствора йодида калия и раствора хлорида марганца. Пипетку с реактивами опустить в суспензию на */3 колбы и осторожно приливать соответствующие растворы. Закрыть колбы пробками так, чтобы под ними не оставалось пузырьков воздуха, и осторожно перемешать содержимое, переворачивая колбу вверх дном и обратно. Образуется осадок буровато-коричневого цвета. Количество осадка пропорционально количеству зафиксированного кислорода. Колбы поставить в темное место на 10 мин, чтобы образовавшийся осадок осел на дно.
4.	По истечении этого времени колбы, не взбалтывая, осторожно открыть и прибавить по 1 мл серной кислоты (1:1). Пипетку с раствором кислоты опустить в колбу приблизительно на ’/4 ее верхней части и прилить кислоту осторожно по каплям, не допуская взбалтывания осадка. Поднимать пипетку по мере вытеснения из нее раствора.
Внимание! Не допускать потери осадка за счет его выливания вместе с избытком раствора из колбы.
5.	Колбы закрыть пробками и перемешать, переворачивая вверх дном и обратно. Осадок постепенно растворяется.
6.	После полного растворения осадка приступить к титрованию. Содержимое каждой колбы осторожно перелить в конические колбы объемом 250 мл и титровать тиосульфатом натрия из бюретки до получения слабо-желтой окраски. Затем прибавить 0,5 мл 0,2 %-го раствора свежеприготовленного крахмала (образуется синее окрашивание) и вновь титровать до полного обесцвечивания. Отметить количество тиосульфата, пошедшего на титрование.
7.	Рассчитать количество кислорода (мг/мл) в трех первых колбах по формуле (1). Провести стандартную статистическую обработку результатов. Данные занести в табл. 26.1.
Таблица 26.1
Результаты оценки количества кислородной продуктивности и численности водорослей Chlorella в контроле и тестируемой воде
№ пробы	Количество		
	водорослей, Кл/мл	кислорода, мг/мл	кислорода, мг/ на 1 клетку
			
212
8.	Аналогичные процедуры (пп. 2 — 7) провести через 24 ч инкубации на свету с колбами № 4 —9, в которых под действием света происходит активный фотосинтез. Рассчитать количество кислорода по формуле (1). Данные занести в табл. 26.1.
9.	Сделать пересчет кислородной продуктивности на 1 клетку в контрольных и опытных пробах.
10.	Сделать выводы о влиянии токсикантов на кислородную продуктивность хлореллы.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Унифицированные методы исследования качества вод. — М.: СЭВ, 1990.
Пашков Е.В. Международные стандарты ИСО 14 000. Основы экологического управления / Е. В. Пашков [и др.]. — М.: Изд. стандартов, 1997.
Лабораторная работа №27. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЗАГРЯЗНЕНИЯ СРЕДЫ ТЯЖЕЛЫМИ МЕТАЛЛАМИ ПО РОСТОВЫМ СВОЙСТВАМ ОТРЕЗКОВ КОЛЕОПТИЛЕЙ
(Лабораторная работа подготовлена Е. И. Егоровой на основе методических рекомендаций Н. Ф. Лапиной)
Отрезки колеоптилей* злаковых получают из трехсуточных этиолированных проростков, отсекая на расстоянии 3 — 5 мм ниже верхушки проростка с помощью специального ножа (или лезвия) одинаковые по длине отрезки 4 мм. Отрезки помещают в испытываемую среду. В водной среде в течение нескольких часов происходит рост отрезков колеоптиля благодаря растяжению — продольному смещению целлюлозных микрофибрилл под действием давления в вакуолях клеток. Во время взаимного продольного давления микрофибрилл происходит разрыв поперечных полисахаридных сшивок между ними. Микрофибриллы помещены в связующее пектиновое вещество в клетке, Которое создает высокую вязкость, препятствующую свободному перемещению микрофибрилл относительно друг друга. Способность их к разрыву проявляется в начальный период (несколько часов) пребывания отрезков колеоптилей в испытуемой среде. Затем происходит перестройка полисахаридных связей за счет синтеза целлюлозы и новых полисахаридов.
Предполагается, что скорость роста отрезков колеоптилей пропорциональна величине тургорного давления Fu относительному времени нахождения полисахаридных сшивок в разомкнутом со
*Колеоптиль (от греч. koleos — ножны, футляр; ptilon- перо) — влагалищный лист, первый (бесцветный, зеленый или красноватый) лист злаков.
213
стоянии. Уравнение, описываюшее процесс удлинения отрезков колеоптилей в растворе, можно записать в виде
где / — размер отрезка колеоптиля в конце опыта, мм; — эффективная константа скорости 0,13 ±0,01, для раствора
£эф ------In Ofc,
' b
где а, р — эмпирические параметры, определяющие влияние тур-горного давления и относительного времени нахождения пектинового вещества в размягченном состоянии на прирост отрезков колеоптилей; R — универсальная газовая постоянная; Т — температура, К; Vb — парциальный молярный объем воды в клетке; аь — активность воды в клетке.
После решения уравнение (1) принимает вид
/=/пр(/—е*')>	(2)
где /пр — предельный рост отрезков колеоптилей.
Известно, что предельный рост отрезков колеоптилей зависит от относительной скорости разрушения и образования полисахаридных сшивок. С увеличением токсиканта в среде /пр уменьшается.
Если признать справедливой гипотезу, что при поступлении из внешнего раствора в цитоплазму тот или иной токсикант отрицательно влияет на метаболические процессы в клетке растения, то предельный размер отрезка колеоптиля в среде с токсикантом выражается в виде
4р=/°иРе-8^,	(3)
где /пр — предельный размер колеоптиля в среде с токсикантом; /пР — предельный размер колеоптиля в контроле (воде); 8/ — коэффициент пропорциональности, зависящий от /-го токсиканта; f — коэффициент активности /-го токсиканта; с,- — концентрация /-го токсиканта, сорбированного цитоплазмой из раствора.
В ряде конкретных случаев можно использовать аналогичное уравнение:
/пр = А1°пре~к™с‘,	(4)
где Луг,, — коэффициент условной токсичности /-го токсиканта; с, — концентрация внешнего раствора /-го токсиканта; А — коэффициент пропорциональности < 1.
Закономерности, описываемые уравнением (4), соблюдаются для ростовых свойств отрезков колеоптилей в средах, содержащих
214
соли одновалентных катионов. Для раствора солей двухвалентных катионов зависимость /пр от концентрации электролита описывается суммой двух экспонент:
/ПР = /SP	+ А2е~к^).	(5)
На существование такой зависимости указывают экспериментальные данные, которые предполагают участие двухвалентных катионов в образовании пектинового содержимого растительной клетки, что приводит к повышению вязкости вещества. В основном это проявляется при низких концентрациях солей. При более высоких концентрациях солей двухвалентных металлов действует тот же механизм, что и с участием солей одновалентных катионов. Тип одновалентных анионов не влияет на ростовые свойства отрезков колеоптилей. Замена одновалентного аниона на двухвалентный приводит к возрастанию токсичности. Токсичность сульфатов возрастает в ряду K2SO4 — CoSO4 — CuSO4 — NiSO4 — CdSO4 в соотношении 1:11:53:54:55. Для свинца и цинка сравнение должно проводиться относительно нитрата калия.
Принцип предложенного в лабораторной работе метода основан на изменении скорости роста отрезков колеоптилей растяжением за счет нарушения относительного времени нахождения полисахаридных сшивок в разомкнутом состоянии при их помещении в среду с тяжелым металлом.
Цель работы — определение степени загрязнения среды тяжелыми металлами по приросту отрезков колеоптилей пшеницы.
Оборудование, материалы и реактивы:
окулярный микрометр, термостат, пинцет, чашка Петри, пробирки, фильтровальная бумага, лезвие или специальные приспособления для нарезания колеоптилей, весы, бюксы, мерные колбы; 3-суточные этиолированные проростки ячменя или пшеницы, соли двух- и трехвалентных тяжелых металлов, дистиллированная вода, почва.
ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ ЛАБОРАТОРНОЙ РАБОТЫ
1.	Рассчитать навески, соответствующие 1, 50 и 100 ПДК тяжелых металлов (ТМ) для воды (см. табл. 14.1).
2.	Приготовить растворы солей тяжелых металлов соответствующих концентраций.
3.	В чашках Петри приготовить почвенные пластинки, насыщенные солями тяжелых металлов.
4.	В чашки Петри поместить по 10 отрезков колеоптилей злаковых.
215
5.	Поместить по 10 колеоптилей в пробирки с 5 — 8 мл растворов солей тяжелых металлов.
6.	Поставить чашки и пробирки в термостат на 24 ч при температуре 25 °C.
7.	Через сутки измерить длину каждого отрезка с помощью окулярного микрометра с точностью до 0,1 мм.
8.	Сделать вывод о влиянии ионов металлов на прирост отрезков колеоптилей пшеницы.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Авторское свидетельство 145530 (СССР) № 4096089/30-13. Способ определения степени загрязнения почв тяжелыми металлами. Н.Ф. Лапина и др., 1989.
Либберт Э. Физиология растений / пер. с нем. Д. П. Викторова и Н. С. Гельмана. — М.: Мир, 1976.
Методические указания. МВИ интегрального уровня загрязнения почвы техногенных районов методом биотестирования. РД 52.18.344-98. — М.: Федеральная служба России по гидрометеорологии и мониторингу окружающей среды. 1993.
Нобел П. Физиология растительной клетки / пер. с англ. И. И. Рапано-вича. — М.: Мир, 1973.
Тулупов П.Е. Отрезки колеоптилей — новый интегральный биотест для оценки степени загрязнения природных сред / П.Е.Тулупов [и др.] // Труды ИЭМ. Загрязнение атмосферы и почвы. — М.: Гидрометеоиздат, 1991.
Лабораторная работа Ns 28. ИЗМЕНЕНИЕ СПОНТАННОЙ ДВИГАТЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ИНФУЗОРИИ СПИРОСТОМЫ
ПОД ВЛИЯНИЕМ АНТРОПОГЕННЫХ ФАКТОРОВ
{Методика разработана Н.А. Тушмалоеой)
Водные представители простейших {Protozoa) привлекают в последнее время внимание исследователей, занимающихся поиском критериев оценки качества водной среды. Инфузория спиро-стома {Spirostomum ambiguum Ehrbg.) имеет достаточно большие размеры и видна невооруженным глазом. В ответ на неблагоприятные воздействия окружающей среды инфузория изменяет свою двигательную активность и ряд других физиологических показателей. К ним относятся изменения: сроков выживаемости после воздействия; двигательной активности в ответ на стрессовое воздействие; формы тела под влиянием неблагоприятных факторов; возбудимости в ответ на раздражение. Использование большего числа параметров функционального состояния инфузории позволяет адекватно характеризовать величину нарушений под влиянием антропогенных воздействий.
 216
Спиростома, инфузория длиной 1 — 3 мм, имеет в норме характерную червеобразную форму (Рис- 28.1). Тело покрыто ресничками, более длинными у ротового отверстия, они служат для захвата пищевых частиц. Пищеварительные вакуоли диффузно расположены в плазме. По их числу можно судить о степени насыщения животных. Инфузории свойственна сократимость. Перисто-мальная впадина образует левозаКРУчеинУ10 спираль и тянется от переднего конца до '/3 длины тела. Сократительная вакуоль помещается в конце тела. Ядерный аппарат представлен чечетковидным макронуклеусом и множеством микронуклеусов. При длительном нахождении спиростом в лаборатории четко видим, что ядро принимало округлую бобовИДнУю форму. Такое изменение структуры ядерного аппарата (если оно не связано с делением) служит показателем физиологической реорганизации клетки, а также может, по-видимому, наступать в ответ на изменение состояния бреды. Плазма ограничена от внешней среды двойной мембраной. Поверхность инфузории, на которой расположены реснички, исчерчена гребнями и бороздами. В эктодерме между ресничками перпендикулярно к поверхности тела расположены трихоцисты. Реснички имеют типичное для инфузорий строение — две центральные фибриллы и девять пар периферических фибрилл. В свою очередь фибриллы характеризуются сложным слоистым строением. На границе между экто- и эндоплазмой находится тонкий сетчатый слой, который можно рассматривать как сократительную фибриллярную систему- Вместе с тем не исключена его роль как координационной или опорной системы. В эктоплазме имеются различные волокнистые образования. В периферических слоях цитоплазмы концентрируются крупные митохондрии. Наиболее активными в функциональном отношении следует считать поверхностные слои клетки, характеризуемые сложностью строения и высокой концентрацией митохондрий. Электронно-микроскопическое исследование спиростомы свидетельствует о сложной морфологической организации клетки простейшего, отражающей ее полифункциональность.
Поведение рассматривается как один из факторов, регулирующих состояние биоценоза и косвенно характеризующих его свой-
Рис. 28.1. Внешний вид Spirostomum ambiguum EArftg (увеличение х 1800). Я — ядро; Р — реснички; ПВ - пищеварительная вакуоль; СВ — сократительная вакуоль
217
ства. Среди различных «ответных» реакций животных на внешние воздействия поведение относится к наиболее чувствительным феноменам. Известно, что поведение донервных организмов характеризуется достаточной сложностью и в значительной степени модифицируется под влиянием различных факторов внешней среды. Примером такого поведения служит спонтанная двигательная активность (СДА), свойственная животным всех уровней филогенеза, включая простейших. Вероятно, наличие поведенческих реакций, отражающих реакции гидробионтов на изменения в биоценозе, может явиться критерием «гомеостатического» состояния последнего.
Спиростомы содержатся в водопроводной воде, отстоянной не менее трех суток и отфильтрованной дважды через обеззоленный фильтр. Пересадка спиростом осуществляется раз в неделю. Из маточной культуры, которая может храниться в холодильнике до 2— 3 мес, переливают половину содержимого в чистую пробирку и доливают водой, оставляя от верхнего края 2—2,5 см. Добавляют 5 мг сухих пивных дрожжей (на шпателе). Содержимое пробирки не перемешивают и пробирку закрывают неплотно ваткой.
В ответ на различные раздражители (химические, электрические, тактильные) инфузории изменяют скорость движения. Величина изменения скорости движения служит интегрированным критерием функционального состояния инфузорий, меняющегося в зависимости от глубины влияния воздействия на клетку факторов окружающей среды. Оценку изменения функционального состояния инфузорий спиростом проводят с помощью индекса двигательной активности (СДА) — количества пересечений инфузорией визира окуляра бинокулярной лупы за 1 мин.
Для просчета СДА культуру инфузорий наливают на часовое стекло, помещают под бинокулярную лупу и капилляром переносят по одной спиростоме в специальную ячейку (камеру) для просчета. Камера представляет собой пластиковую пластинку толщиной 5 мм с углублениями 1 — 2 мм диаметром 5 мм (рис. 28.2). Спиростому оставляют в камере на 5 мин для привыкания, затем считают количество пересечений визира окуляра (рис. 28.3) в течение 5 мин.
Принцип метода заключается в изменении спонтанной двигательной активности (СДА) спиростомы в среде с токсикантом, которое оценивается по количеству пересечений животным визи-
Рис. 28.2. Камера для подсчета спонтанной двигательной активности спиростомы
218
Рис. 28.3. Подсчет спонтанной двигательной активности спиростомы с помощью бинокулярной лупы
ра окуляра бинокулярной лупы по сравнению с СДА в чистой воде (контроль).
Оборудование, материалы и реактивы:
лупа бинокулярная МБС-10; камера для просчета спонтанной двигательной, активности (пластиковая пластинка толщиной 5 мм с 1 — 2-миллиметровыми углублениями диаметром 5 мм; капилляр; секундомер или песочные часы; культура спиростомы, выдержанная в течение часа в растворах загрязняющего вещества — FeCl3, в концентрации Fe: 0,5 мг/л, 50 мг/л и 5 мг/л (см. табл. 14.1).
ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ ЛАБОРАТОРНОЙ РАБОТЫ
1.	Получить у преподавателя культуру спиростомы в пробирках с водой для культивирования.
2.	Перелить на часовое стекло в объеме 5 —10 мл (для контроля).
3.	На другое часовое стекло налить раствор FeCl3 (4 мл) с одной из исследуемых концентраций ионов Fe3+ 0,5 мг/л (50 мг/л, 5 мг/л) и добавить на это же часовое стекло культуру спиростомы из пробирки в объеме 4 мл так, чтобы концентрация исследуемого вещества соответствовала 1 ПДК, оставить на 1 ч.
4.	В это время капилляром под бинокулярной лупой из контрольной среды перенести по одной спиростоме в ячейки для просчета спонтанной двигательной активности (СДА).
5.	Выдержать 5 мин для привыкания спиростомы.
6.	Просчитать количество пересечений спиростомой визира окуляра в течение 5 мин.
7.	Для статистики просчитать СДА 20 — 30 спиростом.
8.	Через час инкубации в тестируемом растворе на часовом стекле перенести по одной спиростоме в ячейки для просчета спонтанной двигательной активности (СДА); перенос осуществляют капилляром под бинокулярной лупой.
9.	Повторить пп. 5—7.
10.	Рассчитать среднее количество пересечений и отклонение от среднего в опытном и контрольном образцах. Сделать выводы о влиянии ионов железа на СДА спиростомы.
219
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Егорова Е.И. Исследование природных вод и почв методами биотестирования. — Обнинск: ИАТЭ, 2004.
Санитарные правила и нормы охраны поверхностных вод от загрязнений. ГОСТ 17.0.0.04—90. Экологический паспорт промышленного предприятия.
Тушмалова Н.А. Поведение донервных организмов — индикатор эффекта сверхмалых доз / Н.А. Тушмалова [и др.] // Вестник МГУ, 1998. — №4.
Тушмалова Н.А. Использование поведенческих реакций гидробионтов в системе оценки качества окружающей среды / Н.А. Тушмалова, Е. И. Егорова. — Обнинск: ИАТЭ, 2003. — 52с.
Лабораторная работа №29. ПРОВЕДЕНИЕ
ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ НА ДАФНИЯХ
(Лабораторная работа подготовлена О. П. Мелеховой и Е. И. Егоровой на основе методических рекомендаций
О. Ф. Филенко)
Метод биотестирования с использованием дафний широко применяется у нас в стране и за рубежом. Дафнии как обязательный тест-объект включены в схему установления ПДК веществ-загрязнителей и сточных вод в России. Метод может быть применен для определения токсичности химических соединений, сточных вод, а также состояния природных вод.
Род Daphnia (класс Crustacea, отряд Cladocera) включает 50 видов и имеет повсеместное распространение. В пресноводных водоемах России широко распространены следующие виды дафний: Daphnia magna straus, Daphnia pulex De Oeer, Daphnia longispina O.F. Muller.
Рачки вида Daphnia magna имеют более крупные размеры и их применение в токсикологических экспериментах предпочтительнее (рис. 29.1).
Являются типичными бета-мезосапробами, переносят осоло-нение до 6 %.
Короткий биологический цикл развития позволяет проследить рост и развитие дафний на всех жизненных стадиях.
Новорожденная молодь имеет размеры 0,7—0,9 мм в длину, к моменту половозрелости самки достигают 2,2—2,4 мм (максимальная длина тела до 6,0 мм), а самцы 2,0—2,1 мм.
При благоприятных условиях в лаборатории дафнии большую часть года размножаются без оплодотворения, т.е. партеногенети-чески, производя потомство, состоящее из самок.
Период созревания рачков при температуре 20 ± 2 °C и хорошем питании — 5—8 дней. Длительность эмбрионального разви-
.220
Рис. 29.1. Строение Daphnia magna straus (самка):
1 — антенна; 2 — сложный глаз; 3 — антеннула; 4 — грудные ножки; 5 — яичник; 6 — створки панциря; 7 — каудальные когти; 8 — постабдомен; 9 — хвостовые щетинки; 10 — выводковая камера; 11 — сердце; 12 — кишечник; 13 — печеночные выросты
тия обычно 3—4 дня, а при повышении температуры до 25 °C — 46 ч. По истечении этого времени происходит вымет молоди. Партеногенетические поколения следуют одно за другим каждые 3—4 дня. Вначале число яиц в кладке 10—15, затем — до 30—40 и более. Формирование яиц прекращается за 2 — 3 дня до смерти. В природе дафнии живут в среднем 20—25 дней, а в лаборатории при оптимальном режиме — 3—4 мес и более. При температурах свыше 25 °C продолжительность жизни дафний может сократиться до 25 дней.
Концентрация водорослей 0,7—1 млн кл/л в качестве пищи является оптимальной для развития дафний.
Дафния устойчива к изменению кислородного режима (до 2 мг О2 в литре), что связано со способностью синтезировать гемоглобин. В условиях пониженной концентрации растворенного кислорода дафнии приобретают красноватый цвет, а при благоприятных условиях — розовато-желтый цвет.
Работу с дафниями необходимо проводить в помещении, где не используются химические летучие вещества. Недопустима даже обработка помещения хлор- и фосфорорганическими пестицидами для борьбы с насекомыми.
Устойчивые условия культивирования можно обеспечить в застекленном шкафу-термолюминостате с раздвижными передними стеклами и рядом полок для сосудов. В шкафу монтируются лампы дневного света, обеспечивающие освещенность около 400— 600 лк в течение 10—12 ч в сутки. В шкаф может быть встроен
221
обогреватель с контактным термометром, обеспечивающим температуру (20 ± 2) “С.
Для культивирования дафний используют отстоянную водопроводную воду. Основные гидрохимические показатели воды, используемой для культивирования дафний, должны находиться в следующих пределах: pH 7,0—8,2; содержание кислорода 6 — 8 мг О2/л; окисляемость по Кубелю 4,2 —5,8 О2 мг/л; общая жесткость 3,0—6,5 мгхэкв/л (200 ± 50 мг СаСО3/л); соотношение Ca/Mg 4:1; NH4NO2 — следы (тысячные доли миллиграмм N/л). В качестве корма могут служить зеленые протококковые водоросли, выращиваемые на среде тамия.
Исходная концентрация водорослей должна быть около 2 млн кл./л. Через 7 — 10 дней роста в оптимальных условиях культура достигает максимальной плотности. Для кормления дафний водоросли следует отделить от питательной среды центрифугированием или 2 — 3-суточным отстаиванием в холодильнике. Осадок разбавить в 2 раза дистиллированной водой. Суспензия может храниться в холодильнике не более 14 дней. Старые клетки выделяют хлореллин, который угнетает развитие дафний. Кормление дафний проводится 1 раз в день из расчета 1 мл суспензии (плотность 600 — 1 000 млн кл./мл) на 1 л воды. Один или два раза в неделю дафний можно подкармливать пекарскими или кормовыми дрожжами из расчета 3 мл 1 %-й суспензии на 1 л культуральной среды.
Дафний культивируют в стеклянных кристаллизаторах объемом 2 —5 л при плотности посадки не более 25 особей на 1 л воды. Переносить дафний удобно автоматической пипеткой со срезанной узкой частью наконечника. Вода в кристаллизаторах обновляется наполовину 1 раз в 7 —10 дней. Накопившийся осадок удаляется сифоном. Аэрация среды в кристаллизаторе не проводится.
Для токсикологических исследований используют дафний, начиная со второго поколения. Опыты проводят на синхронизированной культуре, на дафниях одного возраста, что снижает вариабельность исследований.
Для получения синхронизированной культуры 3 — 5 половозрелых самок рассаживают по одной в химические стаканы (100 мл воды). После появления первого помета у наиболее плодовитой самки молодь отбирается и помешается в 1 — 2-литровый кристаллизатор для дальнейшего культивирования. Молодь второго поколения из одного помета в возрасте 1 — 2 сут используют в опыте.
Хронический опыт с дафниями, длящийся до 30 сут, служит для глубокого, подробного исследования свойств природных, сточных вод и отдельных веществ.
Условия проведения хронических опытов аналогичны описанным выше острым опытам: постоянный температурный, свето
222
вой режим, ежедневное внесение корма — водоросли хлорелла (600—700 тыс. кл./мл). Смена растворов производится 2—3 раза в неделю с сохранением соотношения 50 мл раствора на одну дафнию. Значение биологических характеристик дафний в токсикологических опытах сравнивается с контрольными.
При проведении опытов на поколениях придерживаются следующей схемы: молодь из первого помета, появившуюся у исходных особей в опытных и контрольных растворах, отсаживают по 10 шт. в стаканы емкостью 500 мл с соответствующими разведениями сточных вод или концентрациями исследуемых веществ. При наблюдении за размножением рачков учитывают время наступления половозрелости в днях, регистрируемое по моменту откладки яиц в выводковую камеру, время рождения первого помета с учетом выхода молоди из выводковой камеры, число пометов за срок наблюдения, общее количество родившейся молоди, абортивных яиц, мертворожденной и уродливой молоди.
Молодь просчитывают и удаляют. Продолжительность опытов с каждым поколением — 30 сут. Исследуется не менее трех поколений. Результаты записываются в табл. 29.1.
Таблица 29.1
Изменение биологических показателей у дафний
Дата	Длитель-ность, сут	Контроль					
		исходные, поколение 1, 2 и т.д.					
		кол-во дафний	карапаксы	молодь	абортивные яйца	мертвые	Эфиопии
	1						
	30						
Итого							
Продолжение табл.'29.1
Дата	Длительность, сут	В исследуемых образцах природных вод или с солями меди					
		исходные, поколение 1, 2 и т.д.					
		КОЛ-ВО дафний	карапаксы	молодь	абортивные яйца	мертвые	эфип-пии
	1						
	30						
Итого							
223
Общее количество народившейся жизнеспособной молоди от одной самки за 30 сут отражает величину реальной (фактической) плодовитости дафний. Эта величина в конечном итоге определяет сохранность вида и имеет решающую роль при оценке токсичности воды.
Для наглядности строят графики выживаемости, плодовитости (по оси абсцисс откладывают время или поколения, а по оси ординат — величину показателя для контрольных и опытных растворов).
Принцип предложенного в лабораторной работе метода основан на изменении выживаемости и физиологического состояния дафний в среде с токсикантами.
Цель работы — экспресс-оценка качества воды, загрязненной солями меди с использованием в качестве тест-объектов дафний.
Оборудование, материалы и реактивы:
микроскоп МБС-10; колба с культурой водорослей; микрокомпрессор (для продувания воздуха в колбе с культурой водорослей);
12 стаканов химических на 0,2 л; кристаллизатор на 2—5,0 л для культивирования дафний; пипетка автоматическая на 1, 10 мл; раствор СиС12.
ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ ЛАБОРАТОРНОЙ РАБОТЫ
1.	Приготовить раствор СиС12в концентрации 10, 1, 01 ПДК (см. табл. 14.1). В 9 стаканов налить по 200 мл раствора в исследуемых концентрациях (каждая в трех повторностях) и посадить по 10 дафний. В оставшиеся 3 стакана поместить по 10 дафний в 200 мл водопроводной воды (контроль).
2.	В кратковременных опытах основным показателем токсичности среды является выживаемость рачков. Наблюдения за выживаемостью дафний проводят непрерывно в течение первого часа действия раствора, через каждые 15 мин в продолжение второго часа, затем через 24, 48 и 96 ч.
3.	Время гибели рачков отмечают по наступлению неподвижности (иммобилизации): дафнии лежат на дне стакана, плавательные движения отсутствуют и не возобновляются при покачи-
Таблица 29.2
Выживаемость дафний в образцах воды из природных источников (шт.)
Продолжи-тельность экспозиции	Контроль	Образцы воды из природного водоема		
	повторности	повторности		повторности
				
224
Табл и ца 29.3
Индикаторные реакции дафний на загрязнение
Животное	Индикаторные реакции
Дафнии	Усиление или угнетение двигательной активности; выбросы эмбрионов; интенсивные выделения, которые коагулируют, и рачки вместе с эмбрионами и молодью путаются в нитках выделений. Помутнение, изменение окраски, обесцвечивание; разложение жировых капель; неравномерное заполнение или пустой кишечник; забивание фильтрационного аппарата; гибель яиц в выводковой камере. Судорожные конвульсии, замедление движения антенн, гибель. Потеря у мертвых дафний пигмента. Хроническая реакция: измельчание, отрождение мертвой молоди, снижение выживаемости
вании стакана. Данные выживаемости рачков во времени записывают в табл. 29.2.
4.	В качестве дополнительных показателей у дафний в остром опыте можно учитывать физиологические показатели, приведенные в табл. 29.3.
Внимание! Оценка этих показателей у дафний, тестируемых в воде из природных источников, проводится по балльной системе (табл. 29.4). По табл. 29.5 можно приблизительно определить концентрацию Си в воде в миллиграммах на литр.
Таблица 29.4
Определение степени загрязнения водоема по состоянию дафний
Зона загрязнения	Индикационные изменения у дафний
1-я — сильное загрязнение (приближенная к источнику загрязнения)	Частичная гибель особей, особи держатся в природном слое, часть теряет активность, наблюдаются случаи «вертячки». Отмечается осадок на антеннах, забитые фильтрационные аппараты. Гибнущие особи имеют розовую диффузную окраску
2-я — среднее загрязнение	Повышение активности сменяется угнетением, дафнии периодически залегают на дно, особи имеют пустой кишечник, мутно-желтую окраску, сердцебиения ослаблены, отсутствуют жировые капли
3-я — слабое загрязнение (удаленная от источника)	Наличие повышенной активности у отдельных особей, у остальных — периоды активности сменяются нормальным состоянием; кишечник слабо наполнен
8 Мелехова
225
Таблица 29.5
Реакции биотестов на присутствие токсикантов
Концентрация Си, мг/л воды	Индикаторные изменения у гидробионтов
До 0,2	Личинки ручейников не строят домиков или их структура отличается от таковых у контрольных особей. У взрослых вылетающих насекомых отмечается недоразвитие крыльев, кровоизлияние в основании крыльев
0,25	Наблюдается обесцвечивание тела у молоди второго поколения дафний при их культивировании в этой воде
0,5	Обесцвечивание тела дафний, жировые капли отсутствуют
0,8	У личинок хирономид разрушается гемоглобин, и они приобретают зеленую окраску. Нарушается пищеварение и выпадает дистальная часть кишечника
Выше 0,8	Личинки комаров впадают в оцепенение, близкое к параличу. У дафний резко повышается активность и нарушается координация движений
Изменения перечисленных физиологических показателей нередко предшествуют гибели животных, что позволяет использовать их для ранней диагностики.
Внимание! Если гибель контрольных дафний в период испытаний превысит 10%, опыт повторяют заново.
5.	По результатам опытов определить среднюю (медианную) летальную концентрацию вещества (ЛКт), вызывающую гибель 50% подопытных животных за 96 ч (ЛК50), концентрацию вещества, при которой гибнут все животные (ЛК100), пороговую концентрацию (минимально действующую), при которой организмы не гибнут {JIKq), и среднее (медианное) время выживания 50% особей (ЛВ^.
6.	При обработке результатов эксперимента провести сравнение показателей подопытных и контрольных дафний. Определение достоверности отклонения от контроля осуществить стандартными методами вариационной статистики.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Брагинский Л. П. Визуально фиксируемые реакции пресноводных гидробионтов как экспресс-индикаторы токсичности водной среды / Л. П. Брагинский, А. А. Игнатюк // Гидробиол. журн., 2005. — Т. 41. — № 4.
226
Исакова Е. Ф. Методы биотестирования с использованием дафнии / Е.Ф. Исакова, Л. В. Колосова // Методы биотестирования вод. — Черноголовка: Ин-т химической физики АН, 1988.
Мелехова О. П. Экспресс-метод биотестирования качества воды по метаболическому критерию / О. П. Мелехова [и др.]. — М.: РГОТУПС, 2000.
Методы биотестирования качества водной среды / под ред. О.Ф.Фи-ленко. — М.: Изд-во МГУ, 1989.
Методы изучения состояния окружающей среды: Практикум по экологии. — Вологда: Русь, 1996.
Методика определения токсичности воды по смертности и изменению плодовитости дафний. Федеральный реестр ФР.1.39.2001.00285. — М.: Акварос, 2001.
Пашков Е. В. Международные стандарты ИСО 14 000. Основы экологического управления / Е.В. Пашков [и др.]. — М.: Изд. стандартов, 1997.
Филенко О. Ф. Водная токсикология. — М.: Изд-во МГУ, 1988. — 154 с.
Флёров Б. А. Биотестирование с использованием цериодафний: Методическое руководство по биотестированию воды РД 118-02-90 / Б. А Флёров, Н.С.Жмур. - М., 1991.
Лабораторная работа №30. БИОТЕСТИРОВАНИЕ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ РЫБ
{Лабораторная работа подготовлена Е. И. Егоровой)
Принцип метода основан на сравнении выживаемости рыб в воде, содержащей токсические вещества, и в водопроводной воде.
Кратковременное биотестирование (до 96 ч) позволяет определить острое токсическое действие воды на рыб по их выживаемости. Показателем выживаемости служит среднее количество тест-объектов, выживших в тестируемой воде или контроле за определенное время. Критерием токсичности является гибель 50 % и более рыб за период до 96 ч в тестируемой воде по сравнению с контролем.
Длительное биотестирование (до 30 сут) позволяет определить хроническое токсическое действие воды на рыб по их выживаемости.
В качестве тест-объектов используют рыб, широко применяемых в международных и национальных стандартах по биотестированию воды, — гуппи {Poecilia reticulata) или данио {Brachydanio rerio).
Систематическое положение гуппи как тест-объекта: тип Chordata, класс Piscea, отряд Cyprinodotiformes, семейство Poecili-dae, род Poecilia, вид Poecilia reticulate Peters.
Гуппи — один из самых распространенных видов аквариумных рыб. В природе они обитают в тропических водоемах, где играют важную экологическую роль, уничтожая личинок москитов и комаров. Гуппи — мелкие рыбы, с ярко выраженным половым диморфизмом. Самцы (3 — 4 см) обычно мельче самок и окрашены в более яркие цвета. В их окраске преобладают серовато-коричневые
227
тона с очень яркими красными, голубыми, зелеными и черными вкраплениями и точками. Самки достигают 6 см в длину, обычно желтовато-зеленые.
Систематическое положение данио как тест-объекта: тип Chordata, класс Pisces, отряд Cypriniformes, семейство Cyprinidae, род Brachydanio, вид Brachydanio rerio (Hamilton-Buchanan).
Данио — широко распространенная аквариумная рыбка. В природе она обитает в медленно текущих водоемах Юго-Восточной Азии. Длина тела взрослых рыб около 4,5 см. Тело имеет цилиндрическую форму, серебристое, с 7—9 темно-синими горизонтальными полосками. Эти полосы идут к хвостовому и анальному плавникам. Спина оливково-зеленая.
Для успешного проведения анализа следует выполнять ряд требований по содержанию тест-объектов и условиям биотестирования.
•	Использовать термостатируемые аквариумы, обеспечивающие плотность посадки рыб из расчета 1 — 2 л воды на 1 экз., производителей — 4 л на 1 экз. (для гуппи) и не более одного на 3,5 л (для данио).
•	Размещать аквариумы в помещениях, не содержащих токсичных паров или газов; заполнять водопроводной водой (Г= 24— 27 °C), отстоянной трое суток. Поддерживать первоначальный объем воды. Менять '/5 воды еженедельно.
•	Содержать в аквариуме мелколиственные и плавающие растения. Аквариум освещать дневным светом не менее 8 ч в сутки для гуппи, для данио достаточно естественной смены дня и ночи.
•	Кормить тест-объекты 1 — 2 раза в сутки, производителей — 3 — 5 раз сухим (дафнии, циклопы) или живым (мотыль, трубочник, дафнии, циклопы) кормом. Необходим дополнительно растительный корм (водоросли, листья аквариумных растений, салат и т.д.).
•	Используют для биотестирования гуппи в возрасте 1 — 3 нед и половозрелых данио.
•	Биотестирование проводить при естественной смене дня и ночи, концентрация кислорода в воде должна быть не менее 4 мг/л.
•	В аквариумы налить по 10 л тестируемой и контрольной воды. Повторность двукратная. Проводить аэрацию компрессором, воду менять через двое суток. Рыб переносить при помощи сачка. Ежесуточно подсчитывать выживших и удалять умерших рыб. При кратковременном биотестировании рыб не кормить.
Цель работы — оценка токсического действия воды, содержащей хлорорганические пестициды.
Оборудование, материалы и реактивы:
аквариумы объемом 200, 50 и 10 л, микрокомпрессоры; рыбы — гуппи и данио; сачки, корм для рыб; 50 мл исходного раствора
228
пестицида (например, гексохлоран, симазин, 2,4D) в концентрации 10-3—10^* (0,001 - 0,0001 %) в 2%-й сахарозе.
ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ ЛАБОРАТОРНОЙ РАБОТЫ
1.	Приготовить растворы пестицида в концентрациях 0,1; 1 и 10 ПДК (см. табл. 14.1).
2.	В аквариумы налить по 10 л контрольной и тестируемой воды, содержащей пестициды, и поместить по 10 рыб. Воду аэрировать с помощью микрокомпрессора.
Внимание! Так как исследуемое вещество плохо растворимо в воде, разрешается использование растворителей (спирта, ацетона и др.) с целью получения раствора или устойчивой эмульсии. В случае использования этанола его концентрация должна быть не более 10,0 мг/л для острых опытов и 1,0 мг/л для хронических. При использовании растворителя следует ставить второй контроль с растворителем.
3.	Основным показателем токсичности среды является выживаемость рыб. Наблюдения за выживаемостью проводить раз в сутки в течение 96 ч, подсчитывая выживших и удаляя погибших.
4.	Время гибели рыб отмечать по наступлению неподвижности (иммобилизации): рыбы не подают признаков жизни в течение 5 мин после прикосновения к ним стеклянной палочкой. Данные выживаемости рыб во времени при разных концентрациях пестицидов записать в таблицу.
Форма записи результатов биотестирования при определении токсического действия на гуппи (данио)
Время от начала опыта, ч	Контрольная вода				Тестируемая вода с разными концентрациями пестицидов					Оценка тестируемой воды
	Количество выживших рыб, шт.				Количество выживших рыб, шт.				Процент погиб-ших рыб по срав. с контролем	
	повторность			среднее арифметическое	повторность			среднее арифме-тиче- ское		
	1	2	3		1	2	3			
Если в любой учитываемый период времени гибнет 50 % и более рыб, то биотестирование прекращается. При кратковременном биотестировании рыб не кормить.
5.	При обработке результатов эксперимента провести сравнение показателей подопытных и контрольных рыб. Определение достоверности отклонения от контроля осуществить стандартными методами вариационной статистики.
6.	Можно сделать вывод о наличии хронического токсического действия воды на основании достоверности различия выживае
229
мости рыб в контроле и тестируемой воде через 30 сут. Результаты биотестирования занести в таблицу.
7.	При гибели более 50 % рыб, как в остором, так и в хроническом экспериментах вода считается токсичной.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Пашков Е.В. Международные стандарты ИСО 14 000. Основы экологического управления / Е.В. Пашков [и др.]. — М.: Изд. стандартов, 1997.
Лабораторная работа №31. СПЕРМАТОЗОИДЫ КОСТИСТЫХ
РЫБ КАК ТЕСТ-ОБЪЕКТ В ЭКОЛОГО-ЭМБРИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ
{Методика разработана Ю. К. Дорониным)
Сперматозоиды позвоночных, в частности сперматозоиды костистых рыб, отличаются чрезвычайно важной особенностью: они транскрипционно пассивны. Иными словами, реакция на внешнее воздействие не может опосредоваться активацией или блоком транскрипции тех или иных генов, но обеспечена непосредственными изменениями структуры и функциональных проявлений органелл. Структура сперматозоидов «вырождена»: протоплазматическая мембрана ограничивает чрезвычайно малый объем, большую часть которого занимает гиперконденсированный хроматин ядра («головка» сперматозоида), протяженную, типичную для эука-риотных клеток, двигательную систему («хвост») и систему митохондрий, расположенную в основании хвоста. Помимо этих структур в составе сперматозоидов многих вадов позвоночных (но не у костистых рыб) присутствует акросома — модифицированный аппарат Гольджи, деятельность которого обеспечивает проникновение ядра сперматозоида в яйцо.
В лабораторной работе приведены основные экспериментальные приемы объективной регистрации состояния перечисленных органелл и двигательной активности целых сперматозоидов широко используемой в качестве объекта исследований костистой рыбы — вьюна, Misgurnus fossilis L.
Принцип оценки жизнеспособности сперматозоидов по двигательной активности состоит в активации сперматозоидов в гипотонической среде и регистрации их подвижности с помощью цифровой камеры или на фотопленке.
Принцип метода определения состояния мембран сперматозоидов состоит в том, что интактная плазмалемма эукариотных клеток и сперматозоидов, в частности, непроницаема для люминесцентного красителя йодистого пропадия. При изменении проницаемости мембраны под влиянием токсичных факторов среды обитания гидробионтов йодистый пропидий входит в клетку и специ
230
фически связывается с ДНК. В результате при воздействии возбуждающего освещения ядра клеток приобретают характерное красное свечение.
Принцип определения деятельности митохондрий основан на характерном свечении при действии возбуждающего света, связывающегося с митохондриями родамина 123, что свидетельствует об их нормальном функционировании.
Цель работы — оценить изменение подвижности сперматозоидов, состояние их мембран и митохондрий в среде с токсикантами.
Острый цитотоксический эффект определяется по изменениям функциональных показателей сперматозоидов после их активации раствором токсиканта на дистиллированной воде. Хронический цитотоксический эффект также определяется по изменениям функциональных показателей клеток, инкубировавшихся в растворе Рингера, приготовленном на растворе тестируемого токсиканта.
Внимание! Во избежание преждевременной активации движения сперматозоидов инкубационная среда должна быть изото-нична.
Биотестирование возможно также проводить на уровне целого организма. Кратковременное биотестирование (до 96 ч) позволит определить острое токсическое действие воды на выбранные показатели физиологического состояния мужской репродуктивной системы рыб. Длительное биотестирование (до 30 сут) позволит определить хроническое токсическое действие воды.
Оборудование, материалы и реактивы:
холодильный шкаф; термостат; камера Горяева; пластиковые пробирки на 1мл; фильтровальная бумага; автоматические микропипетки (дозаторы) с минимальным объемом 5 мкл; микроскопы световой и люминесцентный; цифровая фотокамера; обезжиренные предметные и покровные стекла; 2 аквариума по 10 л для содержания вьюнов (около 30 рыб при температуре 6 — 8 °C); стеклянные сосуды (около 1,5 — 2 л) для экспонирования рыб/2—3 особи) в растворе токсиканта; изотонический раствор Рингера для холоднокровных организмов (NaCl — 0,65 %, КС1 — 0,025 %, NaHCO3 — 0,20 %, СаС12 — 0,03 %); красители йодистый пропи-дий и родамин 123 в концентрации 10 мкг/мл, приготовленные на растворе Рингера; токсикант.
ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ ЛАБОРАТОРНОЙ РАБОТЫ
1.	В один из аквариумов с тест-объектами внести токсикант в исследуемой концентрации (см. табл. 14.1). Другой аквариум с рыбами использовать для содержания контрольных рыб.
231
2.	По истечении времени инкубации для приготовления суспензии сперматозоидов рыб декапитировать.
3.	Парные семенники выглядят как светлые полоски, прилегающие к дорсальной поверхности брюшной полости. От ближайшей к выводному протоку части семенника отделить небольшой участок и измельчить его в 10 мл раствора Рингера.
4.	Плотность полученной суспензии определить с помощью камеры Горяева (см. лабораторную работу №25) и развести раствором Рингера до окончательной концентрации: обычно это 107 клеток в 1 мл.
Внимание! Образцы сперматозоидов одного организма можно получать неоднократно. Для этого тушку рыбы, завернутую в фильтровальную бумагу, сохраняют в холодильнике при температуре 5 °C. Образцы суспензий сперматозоидов (1 — 0,5 мл) сохраняют в пластиковых пробирках в холодильнике при 5 °C либо термостати-руют при температуре в пределах от 10 до 25 °C.
5.	Сперматозоиды вьюна представляют собой мелкие клетки с размером головки 2 мкм и тонким и коротким хвостом длиной 30—40 мкм. В растворе Рингера неподвижны. В гипотонической среде, т.е. при разбавлении раствора Рингера в 2—3 раза, движение сперматозоидов активируется.
Для активизации сперматозоидов 5 мкл суспензии, полученной от одной из рыб, поместить на предметное стекло между двумя покровными стеклами. К капле суспензии добавить 5 мкл дистиллированной воды и быстро накрыть третьим покровным стеклом, опирающимся на первые два, между которыми располагается капля.
6.	Препарат немедленно поместить на столик микроскопа и фотографировать с помощью цифровой камеры в темном поле с экспозицией в несколько секунд (например, 4 с) через определенные промежутки времени (например, каждые 15 с) на протяжении всего времени движения сперматозоидов (1 — 2,5 мин).
На полученных изображениях неподвижные сперматозоиды выглядят как яркие точки, в то время как движущиеся клетки оставляют отчетливый светлый след — трек движения (рис. 31.1).
7.	На фотографии определить долю движущихся и неподвижных сперматозоидов и измерить длины треков сперматозоидов с помощью многочисленных программ анализа изображений, например «Scionimage», «ImageJ», «Plana».
8.	Проделать аналогичные пп.5 —7 операции со всеми тестируемыми и контрольными рыбами.
9.	Результат тестирования двигательной активности сперматозоидов можно представить так, как изображено на рис. 31.2. По оси X отложены градации скоростей движения сперматозоидов, по оси Y— время получения фотографии, т.е. время, прошедшее с момента активации, а по оси Z — относительная численность движущихся (т. е. активировавшихся) сперматозоидов.
232
50 мкм
Рис. 31.1. Пример регистрации двигательной активности сперматозоидов вьюна в суспензии.
Негатив фотографии изображения в темном поле, полученной с помощью цифровой камеры CoolPix 4500 (Nikon, Япония), снабженной специальной универсальной микроскопической насадкой (разработка фирмы «ЛабМетод», Россия). Темные частицы — неподвижные сперматозоиды. Движущиеся сперматозоиды образуют характерные треки (объектив х6,3; фотоокуляр х4)
Внимание! Гистограммы, на которых представлены изменения скоростей движения сперматозоидов в последовательные моменты после активации, большей частью представляют собой многовершинные распределения с выраженным эксцессом и асимметрией (см. рис. 31.2). В связи с этим сравнение распределений, характеризующих двигательную активность сперматозоидов и их параметров в подопытной и контрольной группах, а также отражающих изменение центральных тенденций и широту варьирования признака, следует производить с помощью методов непараметрической статистики. В первом случае применяются критерии Пирсона (х2) или Колмогорова—Смирнова, во втором — критерий Вилкоксона или Ансари — Бредли. Средние величины не могут быть параметрами этих распределений, но пригодны для характеристики общей тенденции изменений движения сперматозоидов в результате воздействия тех или иных веществ.
10.	Для определения состояния мембраны сперматозоидов к 5 мкл суспензии, помещенной на предметное стекло между двумя покровными стеклами, добавить 5 мкл раствора йодистого про-пидия, приготовленного на растворе Рингера (10 мкг/мл), и накрыть третьим покровным стеклом.
11.	Препарат немедленно поместить под объектив люминесцентного микроскопа и фотографировать 5 неперекрывающихся областей в видимом свете и свете, возбуждающем специфическое свечение (максимум возбуждения — 535 нм, максимум эмиссии — 617 нм).
233
	0—7	7-14	14-21	21-28	28—35	35-42	42-49	49-56	56-63	63-70
150 с	0,00	0,39	0,39	0,00	0,00	0,39	0,00	0,00	0,00	0,00
120 с	0,09	0,55	0,55	0,64	0,18	0,09	0,09	0,00	0,00	0,00
100 с	0,06	0,29	0,23	0,00	0,12	0,06	0,12	0,00	0,00	0,00
80 с	0,79	0,53	3,16	3,16	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
65 с	0,08	0,73	0,90	0,98	0,65	0,49	0,33	0,24	0,00	0,00
50 с	0,00	2,00	1,64	3,64	1,82	1,27	0,18	0,00	0,00	0,00
40 с	0,00	2,13	3,19	3,37	3,02	1,60	1,24	0,18	0,18	0,18
25 с	0,14	2,81	2,67	3,09	2,39	1,54	1,12	0,28	0,00	0,28
Б
Рис. 31.2. Графическая (А) и табличная (Б) формы данных, полученных в результате обработки цифровых микрофотографий с изображениями треков движущихся сперматозоидов, инкубировавшихся при 18 °C.
Ось X — градации скорости движения сперматозоидов, мкм/с; ось Y — моменты последовательных фотографий активированных сперматозоидов (с); за 0 принят момент активации. Ось Z — число движущихся сперматозоидов, %
234
12.	На компьютере совместить два изображения одной и той же области и подсчитать долю элементов (целых сперматозоидов и отдельных ядер), меченных йодистым пропидием.
13.	Произвести операции, аналогичные описанным в пп. 10 — 12, с суспензиями сперматозоидов, полученных от подвергнутых действию токсиканта рыб или с неактивированными сперматозоидами, инкубировавшимися в растворе токсиканта.
Для определения острого цитотоксического эффекта к 5 мкл суспензии сперматозоидов добавить 5 мкл раствора токсиканта и далее 10 мкл раствора йодистого пропидия.
Рис. 31.3. Динамика убыли доли неметящихся йодистым пропидием ядер сперматозоидов в трех образцах суспензии (7—3), инкубировавшихся в разных температурах:
А — 25 °C; Б — 18 °C; В — 10 °C. Ось абсцисс — время инкубирования образцов сперматозоидов, ч; ось ординат — доля неметящихся ядер
235
В качестве примера на рис. 31.3 представлена динамика метки йодистым пропидием в трех образцах суспензии сперматозоидов вьюна, инкубировавшихся при различных температурах.
14.	Для определения состояния митохондрий сперматозоидов к 5 мкл контрольной, инкубировавшейся с токсикантом суспензии либо суспензии, полученной от контрольных или тестируемых рыб, добавить 5 мкл раствора родамина 123.
Для определения острого цитотоксического эффекта к 5 мкл суспензии интактных сперматозоидов добавить 5 мкл раствора токсиканта и далее — 10 мкл раствора родамина 123.
15.	Пять полей зрения фотографировать в видимом и возбуждающем специфическую люминесценцию свете (максимум возбуждения — 507 нм, максимум эмиссии — 529 нм).
1,2
0,6 -
0,41_____l
0	5
1,2 '
у = 0,0018x4-0,9503
Ю 15	20	25 30
А
0,6 -
0,4 _ 0
у = 0,0003х+0,9671 j_____।____।_____।_____।____।_____।
5	10	15	20	25	30 35
1 - ♦ ♦ •
0,8 - 7 ———
0,6 -	*	*
0,4 I______1______I______1_
0	5	10	15
у = 0,0003x4- 0,8853
20	25	30	35	40	45	50	55 60
Рис. 31.4. Изменение доли метящихся родамином 123 клеток по мере инкубирования суспензии сперматозоидов вьюна при температуре 25 °C (А), 18 °C (Б) и 10 °C (В).
Разброс значений аппроксимирован линейной зависимостью, уравнение которой указано в поле каждого графика. Ось ординат — доля метящихся родамином 123 клеток; ось абсцисс — время в часах. На графиках приведены уравнения линейной зависимости, наилучшим образом аппроксимирующими разброс
.236
16.	Изображения одной области совместить на компьютере и определить долю метящихся родамином структур.
Как следует из рис. 31.4, численность метящихся родамином 123 сперматозоидов остается неизменной на протяжении довольно длительного периода существования суспензий in vitro.
17.	Сделать выводы об изменении скорости сперматозоидов рыб, находящихся в среде с токсикантом относительно контрольного уровня.
18.	Сравнить состояние мембран и митохондрий сперматозоидов рыб, находящихся в контрольной и тестируемой средах.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Еськов А. П. Метод определения активности суспензий клеток, обусловленный их собственной подвижностью / А. П. Еськов [и др.] // Бюлл. эксп. библ, и мед. — 1984. — Т. 97. — № 6.
Каюмов Р. И. Токсикологическая оценка индивидуальных химических соединений и смесей сложного состава с использованием подвижного клеточного тест-обьекта / Р. И. Каюмов [и др.] // Бюлл. эксп. биол. и мед. — 1988.-Т. 104.— № 1.
Турдаков А. Ф. Воспроизводительная система самцов рыб. — Фрунзе: Илим, 1972.
Tannenbaum L. V. Rodent sperm analysis in field-based ecological risk assessment: pilot study at Ravenna army ammunition plant / L.V. Tannenbaum [et al.] // Environ Pollut, 2003. — V. 123.
Лабораторная работа №32. ГАЗОХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ПОЧВ
{Методика разработана А. Л. Степановым)
В лабораторных условиях принято определять потенциальную активность азотфиксации, денитрификации, метаногенности и эмиссии СО2. Наиболее удобным и простым является ацетиленовый метод. Нитрогеназа — азотфиксирующий ферментный комплекс диазотрофных бактерий — способна разрушать тройную связь не только молекулярного азота, но и других соединений, в частности ацетилена. Константа Михаэлиса для реакции восстановления ацетилена примерно в 10 раз ниже, чем для редукции азота, а растворимость ацетилена почти в 60 раз выше, чем для азота (при 20 и 1 атм в 1л воды растворяется около 1000 мл ацетилена и только 15 мл азота). Вследствие этого при наличии в газовой фазе уже 5 % ацетилена восстановление молекулярного азота полностью тормозится и протекает только образование этилена. Фиксации одной молекулы азота соответствует образование трех молекул этилена, и, следовательно, коэффициент пересчета от аце-тиленредукции к азотфиксации равен трем.
237
Этилен анализируется на газовом хроматографе; при этом чувствительность обнаружения нитрогеназы составляет 10~9 М, что на несколько порядков выше по сравнению с методом Кьельдаля и даже изотопного (I5N) метода анализа.
Самым распространенным для оценки денитрифицирующей активности почвенных микроорганизмов является метод, основанный на использовании ацетилена в качестве ингибитора редуктазы закиси азота, что позволяет судить об активности процесса по накоплению закиси азота (N2O) в газовой фазе.
Цель работы — определение биологической активности почв на разном удалении от источника загрязнения по азотфиксирую-щей (1) и денитрифицирующей (2) активности почвенного мик-робоценоза, а также по эмиссии СО2 (3).
ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ ЛАБОРАТОРНОЙ РАБОТЫ
Оборудование, материалы и реактивы:
ацетилен технический в баллонах; этилен и пропан хроматографически чистые для эталонирования прибора; карбид кальция СаС2; газовый хроматограф с пламенно-ионизационным детектором (колонка 3,2 м, внутренний диаметр 2 мм, наполнитель Spherosil-200), расход газов, мл/мин: Аг — 25, Н2 — 30, воздуха — 40); аргон, водород в баллонах или генератор водорода типа СГС-2; сжатый воздух из компрессора или из баллона; шприцы медицинские туберкулиновые или инсулиновые на 0,5—1,0 мл, а также объемом 15 — 20 мл; флаконы пенициллиновые с пробками и зажимами к ним.
1. Определение потенциальной активности азотфиксации
1.	Анализ проводят в свежеотобранных образцах почвы, в трехкратной повторности. Для этого по 5 г освобожденной от инородных включений почвы поместить в пенициллиновый флакон, внести в каждый 2%-й раствор глюкозы (от массы абсолютно сухой почвы).
2.	Флаконы закрыть резиновыми пробками и ввести внутрь шприцем по 1 мл ацетилена, и вновь поместить в термостат на 1 — 2 ч.
3.	По истечении этого срока шприцем отобрать газовую пробу 0,5 мл из флакона и ввести ее в газовый хроматограф. Измерить длину пика выхода этилена на ленте самописца.
4.	Измерить содержание этилена в двух других флаконах данного почвенного образца. Кроме того, в дополнительной навеске провести контрольное определение неспецифического выделения этилена, для чего флакон с почвой инкубировать без введения ацетилена. Определить содержание этилена в ацетилене. Величину неспецифического образования этилена и содержание его в ацетилене учесть при окончательных расчетах. Среднее значение ак
238
тивности азотфиксации для трех параллельных проб характеризует потенциальную активность азотфиксации в изучаемой почве.
5.	Об активности азотфиксации судят по скорости эмиссии этилена. Объем вводимой пробы — 0,5 мл. Активность азотфиксации выражается в миллиграммах азота в форме № 2 в 1 части почвы через 1 ч (N2/I г почвы • ч). Расчет активности азотфиксации (А, мг N— А2/г-ч) провести по формуле
X S КСг^ 2 V
Л — —	—     ,
mt
где X — показание прибора, см; 5 — чувствительность прибора; *с2н4 = 1,069  10-11 моль QHVcM = 3,21  Ю^моль N/cm = 8,98 • Ю'10 г N/cm; 2 — коэффициент пересчета вносимой пробы, мл; V — объем газовой фазы над почвой во флаконе, 10 мл; т — масса почвы в пробе, г; t — время инкубации, ч.
2. Определение потенциальной активности денитрификации
Оборудование, материалы и реактивы:
газовый хроматограф с детектором по теплопроводности или с электронным захватом; гелий в баллонах; шприцы для газовой хроматографии; флаконы объемом 250 и 15 мл; закись азота в баллоне для эталонирования прибора; глюкоза, нитрат калия.
1.	Навески почвы по 5 г, предварительно освобожденные от инородных включений, поместить во флаконы объемом 15 мл.
2.	Каждый образец почвы увлажнить 6 мл водного раствора глюкозы и нитрата калия из расчета 2,5 мг и 0,4 мг на 1 г почвы соответственно.
3.	Флаконы закрыть резиновыми пробками, зафиксировать стальными зажимами и вытеснить воздух путем пропускания аргона при давлении 1 атм в течение 30 с через входную и выходную иглы, вставленные в резиновую пробку.
4.	В каждый флакон ввести 1 мл ацетилена, предварительно отобрав из флакона адекватный объем газа.
5.	Флаконы встряхивать в течение 30—60 с, переворачивая* пробкой вниз, и инкубировать при 28 °C в течение 24 ч.
6.	По истечении этого времени провести анализ газовой пробы на газовом хроматографе. Перед началом анализа флаконы тщательно встряхнуть. Объем вводимой пробы — 0,5 мл.
7.	Об активности денитрификации (А, мкг N—М2О/гч) судить по скорости эмиссии закиси азота по формуле
X  An2o 2 - V
mt
где X — показание прибора; = 1, 66 • 10-12 моль = 7,31 • 10"11 г N—N2O; 2 — коэффициент пересчета вносимой пробы, мл; V —
239
объем газовой фазы над почвой во флаконе, 10 мл; т — масса почвы в пробе, г; t — время инкубации, ч.
3. Определение потенциальной эмиссии СО2
Оборудование, материалы и реактивы:
газовый хроматограф с детектором по теплопроводности: колонка 3,2 м, диаметр 1мм; наполнитель полисорб—1, расход газов: Не — 20 мл/мин; раствор глюкозы.
1.	Навеску свежеотобранной почвы по 5 г от каждого образца, освобожденной от инородных включений, поместить во флаконы объемом 15 мл.
2.	В пробы добавить по 1 мл раствора глюкозы из расчета 2,5 мг/г почвы.
3.	В течение часа инкубировать с резиновой пробкой в термостате при 28 °C, закрыв флаконы резиновыми пробками.
4.	Эмиссию СО2 оценить на газовом хроматографе. Объем вводимой пробы — 0,5 мл. Активность оценить по эмиссии СО2 (А), выражая в мкг С—СО2/1 г - ч по формуле
.	Х^со2-2-И
А =------£-----,
т  t
где X — показание прибора; КсО2 = 1, 07- 10-11 моль 1,29-1011 г С—СО2; 2 — коэффициент пересчета вносимой пробы, мл; V — объем газовой фазы над почвой во флаконе, 10 мл; т — масса почвы в пробе, г; t — время инкубации, ч.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Звягинцев Д. Г. Биология почв / Д. Г. Звягинцев [и др.]. — М.: Изд-во МГУ, 2005.
Методы почвенной микробиологии и биохимии / под ред. Д. Г. Звягинцева. — М.: Изд-во МГУ, 1991.
Степанов А. Л. Методы газовой хроматографии в почвенной микробиологии / А.Л.Степанов, Л.В.Лысак. — М.: МАКС-Пресс, 2002.
4.2.5. Биофизический подход
Лабораторная работа №33. ОЦЕНКА ПОТЕНЦИАЛЬНОЙ ОПАСНОСТИ ХИМИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ ПО ИХ СПОСОБНОСТИ СНИЖАТЬ ФИЛЬТРАЦИОННУЮ АКТИВНОСТЬ ГИДРОБИОНТОВ
{Методика разработана С. А. Остроумовым)
В формировании качества воды, ее очищении в водных экосистемах участвуют многие физические, химические и биологиче
240
ские процессы. Среди примеров как ниболее важные можно привести процессы окисления органического вещества и фильтрацию воды гидробионтами.
Анализ фильтрационной активности некоторых ipynn гидробионтов (асцидий, усоногих раков, мшанок, иглокожих, двустворчатых моллюсков, полихет, губок) показывает, что скорость фильтрации обычно составляет от 1 до 8,8 л в час в расчете на 1 г обеззоленной сухой массы тела. Более детальный анализ зависимости скорости фильтрации от массы гидробионта показал, что она имеет вид степенной функции. Суммарная фильтрация воды популяциями макробеспозвоночных (моллюсков, асцидий, полихет) оценивается величинами 1 —10 м3 на 1 м2 дна водной экосистемы за сутки.
Данная работа содержит изложение новой методики биотестирования на гидробионтах-фильтраторах — двустворчатых моллюсках.
Принцип метода заключается в том, что моллюски в процессе фильтрации извлекают из воды одноклеточные организмы, что ведет к снижению оптической плотности (OD) воды в сосуде с моллюсками. Регистрация изменений оптической плотности позволяет характеризовать скорость фильтрационной активности и возможное торможение ее при воздействии изучаемого вещества, которое добавляют в воду.
Оборудование и материал:
моллюски; спектрофотометр (счетчик Култера); весы; термометр для воды; шесть сосудов на 500 мл; сосуды для отстаивания воды; суспензия клеток одноклеточных организмов (одноклеточные водоросли, цианобактерии, дрожжи); исследуемое вещество (см. табл. 14.1).
ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ ЛАБОРАТОРНОЙ РАБОТЫ
1.	В сосуды 1 — 5 внести одинаковое количество моллюсков. Первый сосуд использовать в качестве контроля 1.
Внимание! Предварительно с помощью взвешивания подобрать моллюсков так, чтобы биомасса (сырой вес) во всех сосудах была приблизительно равна 20 — 200 г сырого веса вместе с раковинами.
2.	В сосуд 6 внести только суспензию одноклеточных организмов и использовать в качестве контроля 2.
3.	Во все сосуды добавить по 500 мл воды (пресной для пресноводных моллюсков, морской — для морских).
4.	Провести предварительную инкубацию в течение 1 ч для стабилизации условий при температуре 16—26 °C.
5.	В сосуды 2—5 добавить исследуемое вещество в концентрациях 0,1; 1; 10 и 100 ПДК (см. табл. 14.1). Затем одновременно во все сосуды добавить концентрированную суспензию одноклеточных организмов (при использовании дрожжей рекомендуется начальная концентрация в сосудах 20—120 мг/л по сухому весу; при использовании водорослей 1 — 6 млн клеток в 1 мл).
241
6.	С периодичностью в несколько минут измерять оптическую плотность во всех сосудах при одной и той же длине волны. Для дрожжей длина волны 500 или 550 нм; для водорослей и цианобактерий длина волны должна соответствовать длинноволновому максимуму поглощения хлорофилла (665 нм). Период проведения измерений обычно составляет 30—60 мин. Данные оптической плотности занести в таблицу.
7.	Для каждого момента времени и каждой концентрации исследуемого вещества рассчитать эффективность ингибирования изъятия клеток из воды (ВЭИ) по формуле
ВЭИ = А. юо%, AJ
где Aj — оптическая плотность в сосудах с исследуемым веществом в определенной концентрации; Aj — оптическая плотность в сосуде с моллюсками без исследуемого вещества.
Поскольку обычно исследуется вещество, способное ингибировать фильтрацию, в сосудах с исследуемым веществом оптическая плотность выше и ВЭИ больше 100 %. Результаты занести в таблицу.
Оценка потенциальной опасности химического вещества по его способности снижать фильтрационную активность гидробионтов
Тестируемый образец	Оптическая плотность при исследуемых концентрациях токсичного вещества (вПДК)				ВЭИ, % при исследуемых концентрациях токсичного вещества (вПДК)			
	0,1	1	10	100	0,1	1	10	100
Контроль (вода из природного источника)								
Исследуемое токсичное вещество								
Токсичность вещества								
8.	Сделать выводы о токсичности исследуемого вещества.
Внимание! При отсутствии спектрофотометра можно использовать ФЭК или счетчик Култера. Вместо регистрации оптической плотности прибором можно визуально фиксировать момент времени, когда наблюдается четко различимая разница в мутности или окраске воды над моллюсками в сосудах 1 и 2. Вместо суспензии клеток одноклеточных организмов можно использовать взвесь неорганических частиц.
 242
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Алимов А. Ф. Функциональная экология пресноводных двустворчатых моллюсков. — Л.: Наука, 1981.
Остроумов С. А. Биологические эффекты поверхностно-активных веществ в связи с антропогенными воздействиями на биосферу. — М.: МАКС-Пресс, 2000.
Остроумов С. А. Биологические эффекты при воздействии поверхностно-активных веществ на организмы. — М.: МАКС-Пресс, 2001.
Остроумов С. А. О самоочищении водных экосистем // Антропогенные влияния на водные экосистемы (по материалам конференции, посвященной 100-летию со дня рождения профессора Н. С. Строганова) / под ред. О.Ф.Филенко. — М.: Т-во научных изданий КМК, 2005.
Rand G. (Ed.) Fundamentals of Aquatic Toxicology. — 2nd edition. — Taylor & Francis. London, 1995.
Лабораторная работа № 34. ОЦЕНКА КАЧЕСТВА СРЕДЫ ИНСТРУМЕНТАЛЬНЫМИ МЕТОДАМИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ
ФОТОТРОФНЫХ ОРГАНИЗМОВ
(Методика разработана Д. А. Моториным, А. В. Смуровым и С. И. Погосяном)
Интенсивность и характер фотосинтетической активности является важнейшим показателем физиологического состояния растений. Один из способов оценки интенсивности процессов фотосинтеза — компьютеризованная флуориметрия, основанная на измерении интенсивности флуоресценции хлорофилла. Флуоресценция (слабое свечение) возникает при электронном возбуждении молекул, поглощающих ультрафиолетовый свет и испускающих затем квант света (через 10-8—10-9с). Организмы, содержащие хлорофилл, излучают преимущественно в полосе 690 нм. При флуориметрии фактически оценивается интенсивность электронного транспорта через мембраны. Эта оценка адекватна показателям общего состояния фотосинтетической системы растений. Фотосинтетическую активность оценивают по изменению интенсивности флуоресценции хлорофилла при переходе фотосинтетического аппарата из активного состояния в неактивное. Флуоресцентный метод контроля широко используют для оценки качества среды. Так, при анализе сточных вод, без предварительной подготовки пробы и без выделения индивидуальных органических соединений, он позволяет определить суммарное количество органических веществ в воде по величине интегральной флуоресценции в области 390—560 нм.
В практике оценки качества среды применяют лабораторные и погружные флуориметры. Лабораторными флуориметрами обычно производят биотестирование образцов воды, грунта и других объектов с привлечением тестовых лабораторных культур микроводо
243
рослей. Погружные флуориметры (зонды) позволяют в реальном масштабе времени получать глубинные профили водоемов по температуре, подводной освещенности, концентрации микроводорослей, фотосинтетической активности и продуктивности фитопланктона. Поскольку характер распределения концентрации фитопланктона и его фотосинтетическая активность непосредственно зависят от распределения и качества водных масс, погружные флуориметры позволяют оперативно выявлять загрязненные акватории.
Принцип действия флуориметров достаточно прост и основан на отклике природного фитопланктона или тест-культур водорослей на освещение с заданной энергией светового потока. Первая генерируемая флуориметром слабая зондирующая вспышка света с энергией 0,01 Дж обеспечивает измерение фоновой флуоресценции (/о). На основании этого показателя можно оценить количество хлорофилла у тестируемых фототрофов. Вторая мощная вспышка с насыщающей для фотосинтеза энергией (1 Дж) дает возможность оценивать фотосинтетическую активность фототрофов. Мощное освещение приводит к восстановлению первичных акцепторов фотосистемы II и увеличению интенсивности флуоресценции до максимального уровня (F„). Флуориметр регистрирует степень индуцированного мощной вспышкой усиления интенсивности флуоресценции (Fv= Fm - Fo), что позволяет рассчитать эффективность использования света фототрофами. Измерение всех параметров производится автоматически, а результаты выводятся на экран компьютера.
Для проведения биотеста предлагается инструментальная система, близкая по основным характеристикам к зарубежному аналогу РАМ-2000 (Walz, Германия), но значительно дешевле и способна к измерению сильно разбавленных суспензий фототроф-ных тест-объектов за счет применения более чувствительной системы регистрации флуоресценции на фотоэлектронном умножителе.
Цель работы — степень токсичности природных вод из загрязненных районов по флуоресцирующей активности фототрофных бактерий Chlorella sp.
Оборудование и материалы:
флуориметр, суспензия культуры Chlorella', тестируемая вода из природного источника; донные отложения или почва; фарфоровая ступка с пестиком; дистиллированная вода; колбы на 100 мл; сушильный шкаф; кюветы объемом 10 мл; автоматические пипетки (дозаторы) на 10 и 2 мл или мерные цилиндры объемом 10 мл; технические весы.
ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ ЛАБОРАТОРНОЙ РАБОТЫ
1.	Для приготовления суспензий донных отложений и почв отобранную пробу высушить в сушильном шкафу при температуре
244
50 °C, доводя до постоянного веса. Измельчить массу в фарфоровой ступке. Сделать навеску по 5 г в трех повторностях и внести ее в колбы с 50 мл дистиллированной воды, все тщательно размешать.
2.	В экспериментальные сосуды (кюветы объемом 10 мл) внести по 8 мл культуры хлореллы и 2 мл суспензии донных отложений и тоже тщательно перемешать. Таким образом концентрация суспензии тестируемого образца в эксперименте составит 20 мг/мл.
3.	При тестировании воды к 9 мл культуры микроводорослей в кюветы на 10 мл добавить по 1 мл тестируемого образца в трех повторностях.
4.	Контролем служат кюветы объемом 10 мл с культурой микроводорослей без внесения суспензии тестируемого образца донных отложений или воды.
5.	При проведении измерений на флуориметре возбуждение флуоресценции хлорофилла достигается с помощью тестирующих световых импульсов от 44 синих светодиодов Tl-3/4 Round (фирмы Ledtronics Inc.) с длиной волны излучения 450 нм мощностью 120 мВт.
6.	Для измерения Fm — максимальной величины флуоресценции — кювету с суспензией микроводорослей облучить в приборе, насыщающем фотосистему светом от галогеновой лампы мощностью 70 Вт через светофильтр СЗС-22. Средняя плотность мощности возбуждающего света при измерении Fo — минимальная величина флуоресценции, и Fm 0,4 и 3000 Вт • м~2 соответственно. Интенсивность флуоресценции хлорофилла, возбуждаемую тестирующими импульсами света, в приборе регистрирует фотоэлектронный умножитель ФЭУ-79 через светофильтр КС-18. Управление процессами измерения и обработки получаемой информации ведется ском-мутированным с прибором компьютером при помощи специально разработанного для этого прибора программного обеспечения.
7.	Провести измерение токсичности анализируемых образцов по схеме «контроль — опыт». Результаты занести в таблицу:
Оценка индекса токсичности донных отложений, почв или природной воды по интенсивности флуоресценции Clorella vulgaris
Тестируемый образец	Л				Fm				F * vcp
	Повторности			Среднее значение	Повторности			Среднее значение	
	1	2	3		1	2	3		
Контроль									
Суспензия донных отложений или почв									
Природная вода									
245
«Опыт» — кювета с тест-культурой Chlorella, куда добавили тестируемую воду либо водную вытяжку тестируемого образца донных отложений или почвы.
Суспензии грунтов, как правило, дают более объективные результаты, так как токсический эффект могут проявлять не только водорастворимые компоненты образцов. Однако следует иметь в виду, что взвесь частиц влияет на оценку флуоресцентных параметров водорослей. Величины параметров Fo и пропорционально снижаются из-за поглощения возбуждающего света взвешенными частицами. Поэтому для оценки токсичности используют относительную величину {Fm — F0)/Fm — переменную флуоресценции, рассчитанную для опыта и контроля.
8.	Рассчитать интенсивность флуоресценции хлорофилла в исследуемых образцах донных отложений (почв) или воды. Рассчитать их индексы токсичности по формуле Fv = F„ — Fo.
Выделяют три пороговых уровня индекса токсичности: 1) допустимая степень — индекс токсичности меньше 20; 2) образец токсичен — индекс равен или больше 20 и меньше 50; 3) образец сильно токсичен — индекс равен или больше 50.
Сделать вывод о токсичности исследуемых донных отложений, почв или воды из природного источника.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
МаторинД. Н. Люминесценция хлорофилла в культурах микроводорослей и природных популяциях фитопланктона / Д. Н. Маторин, П. С. Венедиктов // Итоги науки и техн. ВИНИТИ, 1990. — Сер. Биофизика. — Т. 40.
Экологическая диагностика: Энциклопедия (серия «Безопасность России») / под ред. В. В. Клюева. — М.: МГФ «Знание», «Машиностроение», 2000.
Лабораторная работа №35. ИЗМЕРЕНИЕ БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНОЙ АКТИВНОСТИ ИССЛЕДУЕМЫХ ОБРАЗЦОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БИОСЕНСОРОВ
{Методика разработана А. В. Смуровым и С. И. Погосяном)
Биолюминесценция широко распространена в природе и известна у бактерий, грибов, представителей разных типов животных — от простейших до хордовых. Это видимое свечение живых организмов связано с процессами их жизнедеятельности. У многоклеточных организмов (ракообразных, насекомых, рыб) свечение часто обусловлено симбиотическими бактериями. Свечение может исходить от всей поверхности тела или его испускают специальные органы. Продолжительность свечения варьирует от длительного, продолжающегося часы до коротких вспышек, измеряемых у некоторых организмов долями секунды. Свет при биолю
246
минесценции самых разных тонов — от голубого до красного. Биолюминесценция представляет собой один из типов хемилюминесценции: в ходе химической реакции выделяется энергия, которая не теряется в виде тепла и не сопряжена с какими-либо реакциями синтеза, а превращается в энергию электронного возбуждения молекул, способных выделять ее в виде фотонов.
Механизм биолюминесценции связан с окислением люциферина при участии фермента люциферазы.
Для целей биотестирования можно использовать различные светящиеся организмы, например морские люминесцентные бактерии. Они легко культивируются и оптимальным образом сочетают в себе различные типы чувствительных структур, ответственных за поддержание гомеостаза (клеточная мембрана, цепи метаболического обмена, генетический аппарат) с быстрым, объективным и количественным характером отклика целостной системы на интегральное воздействие ксенобиотиков.
Чаще для целей биотестирования используют специальные люминесцентные реагенты (биосенсоры), приготовленные на основе живых культур светящихся организмов или выделенных (иногда из растительных объектов) люциферин-люциферазных комплексов. Интенсивность свечения измеряется специальными приборами — люминометрами. Введение в реакционную смесь пробы с токсическим соединением вызывает спад свечения (рис. 35.1).
Уровень тушения биолюминесценции пропорционален концентрации токсических веществ. На люминометре измеряется интенсивность свечения реагента до и после введения токсиканта в образце почвы или воды небольшого объема (0,2—0,5 мл). Время анализа, который можно проводить в полевых условиях на переносных люминометрах, обычно не превышает нескольких минут.
Биосенсор интегрирует эффекты смесей токсикантов, обеспечивая определение общего индекса токсичности образца. Методы биолюминесценции предпочтительны в качестве первичных тестов и способны быстро ответить на вопрос: присутствуют или нет в среде токсические агенты в концентрации, опасной для че-
Рис. 35.1. Схема динамики интенсивности свечения биосенсора при добавлении токсичного образца
247
ловека и других живых организмов? Биолюминесцентные методы обладают хорошей чувствительностью к разнообразным химическим соединениям, характерным для промышленных сбросов, загрязнений почвы, воды, воздуха (тяжелые металлы, фенолы, формальдегид, пестициды).
Для определения индекса токсичности необходимо проводить параллельное измерение контрольных (не содержащих токсических веществ) и опытных проб. Для большей достоверности число повторностей должно составлять не менее трех измерений.
Цель работы — оценка степени токсичности почв или воды из загрязненных районов.
Оборудование и материалы:
портативный прибор Биотоке-10; биосенсор — система «Эколюм» (см. гл. 3); исследуемая почва или вода из загрязненных районов; дистиллированная вода; холодильник; колбы на 50 мл; технические весы; автоматические пипетки (дозаторы) переменного объема 200— 1 000 мл; 9 пробирок объемом 10 мл.
ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ ЛАБОРАТОРНОЙ РАБОТЫ
1.	Перед началом измерений в пенициллиновый флакон с биосенсором добавить 20 мл дистиллированной (охлажденной до 3 — 5 °C) воды и тщательно встряхнуть для получения живой суспензии бактерий.
2.	Суспензию выдержать не менее 30 мин в холодильнике при температуре 0—5 °C, затем довести до комнатной температуры (20-24 °C).
3.	При исследовании почв, грунтов и донных отложений приготовить суспензии образцов или водные вытяжки.
Для этого взять навеску исследуемого грунта по 5 г в трех повторностях и размешать их в колбах с 25 мл дистиллированной воды (разведение 1:5). При заведомо высокой токсичности образцов разведение может быть 1:10.
При исследовании морского грунта разведение делают приготовленной в лабораторных условиях на основе дистиллята (с учетом солености водоема, откуда отбирались пробы) морской водой. При исследовании воды специальной подготовки проб не требуется.
4.	В три пробирки (по числу повторностей эксперимента) разлить с помощью дозатора по 0,9 мл исследуемых образцов воды или в три другие — суспензию почв (донных отложений).
5.	В три контрольные пробирки прилить по 0,9 мл дистиллированной воды. В каждую пробирку добавить по 0,1 мл суспензии бактерий.
. 248
6.	Измерения максимальной (/max) и минимальной (/min) интенсивности люминесценции провести сразу после приготовления серии опытных и контрольных образцов. Для более объективной оценки степени токсичности опытных образцов можно исследовать динамику изменения токсичности, проводя попарные измерения опытных и контрольных пробирок через каждые 12 ч до окончательного прекращения биолюминесцентной активности в опытных образцах (если образцы токсичны, то не более 48 ч). Результаты занести в таблицу:
Оценка индекса токсичности донных отложений, почв или природной воды по интенсивности люминесценции биосенсора «Эколюм»
Тестируемый образец	Алах				Лтйл				F rtcp
	Повторности			Среднее значение	Повторности			Среднее значение	
	1	2	3		1	2	3		
Контроль									
Суспензия донных отложений или почв									
Природная вода									
Оценить индекс токсичности исследуемых почвы или воды из загрязненных районов по формуле /, = (7^ - Zmin)/4iax> гае /, — интенсивность люминесценции через время t; 1тах — максимальная интенсивность люминесценции; /min — минимальная интенсивность люминесценции.
Выделяют три пороговых уровня индекса токсичности (см. лабораторную работу № 34).
Внимание! Отклик биосенсора на токсические вещества хорошо коррелирует с таковым у других организмов, а концентрации токсических веществ, вызывающих 50 %-е тушение свечения биосенсора (ЕС50), — практически полностью соответствует 50 %-й летальной дозе (LD50) для человека.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Данилов В. С. Бактериальная биолюминесценция / В. С. Данилов, Н. С. Егоров. - М.: Изд-во МГУ, 1985.
Методические рекомендации. Определение токсичности воды и водных экстрактов из объектов окружающей среды по интенсивности биолюминесценции бактерий. — М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 1996.
Методические рекомендации. Определение общей токсичности почв по интенсивности биолюминесценции бактерий. — М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2000.
249
Лабораторная работа №36. ЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ МОНИТОРИНГ ДРЕВЕСНЫХ ПОРОД В УСЛОВИЯХ
АНТРОПОГЕННОГО СТРЕССА
(Лабораторная работа подготовлена Ю. П. Козловым)
Среди компонентов живого вещества биосферы наиболее существенным компонентом является растительность, и особенно древесно-кустарниковые насаждения и естественные лесные массивы. Изучение особенностей ответных реакций растений на действие загрязнения воздушной среды дает ценную информацию для выработки прогностических оценок состояния растительных сообществ вблизи автомагистралей. При малых уровнях загрязнения воздушной среды видимых морфологических изменений в растениях может не быть и в течение длительного времени создается обманчивое впечатление здоровых деревьев. Удобным и перспективным методом для этих целей является метод регистрации флуоресценции хлорофилла, так как состояние фотосинтетического аппарата в значительной степени соответствует общему состоянию растения. Исследования показали, что у чувствительных к загрязнению видов (липа, клен) содержание хлорофилла снижается еще до появления видимых изменений.
Принцип метода измерения уровня фотосинтеза растительных форм, предложенный в лабораторной работе, основан на регистрации спектров флуоресценции хлорофилла листовых пластин деревьев разных видов с помощью флуориметров типа Spectrofluorometer (в частности, применяется модель 430 — 003 производства компании Turner Associates, USA) по безразмерным параметрам W = /720/4») и X = 7б8оД535,47О, ЯВЛЯЮЩИМСЯ ИНТвГраЛЬНЫМИ показателями физиологического состояния и фотосинтетической активности растений.
Цель работы — исследование параметров люминесценции листьев деревьев, произрастающих в чистой воздушной среде и в условиях ее загрязнения автомобильным транспортом, включая измерение флуоресценции хлорофилл-белкового комплекса и флавопротеидов митохондрий.
Оборудование и материалы:
флуориметр типа Spectrofluorometer; цельные листовые пластины липы мелколистной (Tilia cordata), клена американского (Acer negundo), тополя бальзамического (Populus balsamifera) по 25 шт. из районов с чистым воздухом и растущих вдоль автомобильных магистралей.
ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ ЛАБОРАТОРНОЙ РАБОТЫ
1.	Получить у преподавателя свежие цельные листовые пластины индикаторных видов растений.
250
Внимание! Важной особенностью работы является возможность оценивать флуоресценцию хлорофилла цельных листьев без предварительной экстракции.
2.	Измерить на флуориметре безразмерный параметр w, равный отношению интенсивности флуоресценции длинноволновой полосы энергозапасающего хлорофилл-белкового комплекса в области 720 нм к его коротковолновой полосе в области 680 нм (w = 772о/ /б8о)-
3.	Измерить безразмерный параметр х, представляющий собой соотношение интенсивностей флуоресценции хлорофилла в области 680 нм к окисленным флавопротеидам в области 535 нм и восстановленным пиридиннуклеотидам в области 470 нм митохондрий (х = /б8о//535,/47о)-
4.	Соотношение измеренной в опытах интенсивности длинноволновой полосы флуоресценции хлорофилла к его коротковолновой полосе (параметр w) у листьев древесных пород разного состояния внести в табл. 36.1.
5.	Соотношение измеряемой в опытах интенсивности флуоресценции хлорофилла к окисленным флавопротеидам митохондрий и восстановленным пиридиннуклеотидам (параметр х) у листьев древесных пород разного состояния внести в табл. 36.2.
6.	Провести анализ результатов. Как правило, с ухудшением состояния растений в условиях города величина измеряемого (w)
Таблица 36.1
Оценка состояния деревьев разных пород по интенсивности отношения длинноволновой полосы флуоресценции хлорофилла листовых пластин к его коротковолновой полосе (н>)
Порода дерева	Состояние*	w - ino/Itta
Липа мелколистная (Tilia cordata Mill)	1 2 3 4	
Клен американский (Acer negundo L.)	1 2 3 4	
Тополь бальзамический (Populus balsamifera L.)	1 2 3 4	
* Градации состояния деревьев: 1 — здоровые, 2 — ослабленные, 3 — сильно ослабленные, 4 — отмирающие.
251
Таблица 36.2
Оценка состояния деревьев разных пород по интенсивности отношения флуоресценции хлорофилла листовых пластин к флуоресценции окисленных флавопротецдов митохондрий и восстановленных пиридиннуклеотидов (х)
Порода дерева	Состояние	x- Ibw/his/hio
Липа мелколистная (Tilia cordata Mill)	1 2 3 4	
Клен американский (Acer negundo L.)	1 2 3 4	
Тополь бальзамический (Populus balsamifera L.)	1 2 3 4	
параметра возрастает. Характерно, что увеличение параметра w при изменении условий вызвано уменьшением коротковолнового максимума (680 нм) и ростом длинноволновой компоненты флуоресцентного сигнала (720 нм): между пигментами второй и первой фотосистем осуществляется миграция энергии возбуждения. В результате фотоиндуцированного образования гасящего состояния в реакционном центре второй фотосистемы происходит гашение полосы 680 нм. Последнее объясняется наличием характерных переносчиков электронов в фотосинтетической цепи. Так, окисленная форма переносчиков электронов коэнзима Q замедляет флуоресценцию хлорофилла фотосистемы II в хлоропласте, происходящую при воздействии разных загрязняющих веществ — блокаторов электронного транспорта на его различных участках. С другой стороны, ингибирование электронного транспорта ведет к исчезновению индуцированных светом обратимых окислительно-восстановительных превращений переносчиков, в результате чего замедляется процесс фотосинтеза. При этом хлоропласты начинают более медленно синтезировать органическое вещество и выделять кислород. Рост длинноволновой компоненты флуоресцентного сигнала хлоро-филл-белкового комплекса (720 нм) связан с тем, что фотосистема I не содержит коэнзима Q, способного в окисленной форме тушить свечение.
В оптимальных или близких к оптимальным условиях в фотосинтезирующих клетках зеленого листа основная энергопродук
. 252
ция осуществляется, как правило, хлорофилл-белковым комплексом хлоропластов. Однако могут существовать и такие обстоятельства, когда основная энергопродукция клеток листа осуществляется митохондриями, основными характеристическими пигментами которых являются флавопротеиды и пиридиннуклеотиды, обладающие характерными полосами люминесценции с максимумами при длинах волн 535 и 470 нм.
Как правило, у растений природных парков, на которые практически не действуют постоянные источники городского загрязнения, интенсивности спектров флуоресценции флавопро-теидов (535 нм) и пиридиннуклеотидов (470 нм) незначительны.
По мере увеличения степени загрязнения воздушной среды (например, в городских условиях) при общем морфофизиологическом ухудшении состояния растительности в спектрах флуоресценций уменьшается полоса излучения хлорофилла (680 нм) и увеличиваются полосы излучения 535 и 470 нм, принадлежащие окисленным флавопротеидам и восстановленным пиридин-нуклеотидам.
При изменениях условий обитания растений, сопровождающихся ухудшением их состояния, величина параметра w увеличивается, а х — уменьшается.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Журкова Н. В. Биомониторинг состояния древесных пород в условиях большого города: Автореф. дисс. на звание канд. биол. наук. — М.: Изд-во РУДН, 2002.
Карнаухов В. Н. Спектральный анализ в клеточном мониторинге состояния окружающей среды. — М.: Наука, 2001.
Лабораторная работа №37. ОЦЕНКА ТОКСИЧНОСТИ ВОДЫ ПО ФИЛЬТРАЦИОННОЙ АКТИВНОСТИ ДАФНИЙ,
РЕГИСТРИРУЕМОЙ С ПОМОЩЬЮ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ ' ХЛОРОФИЛЛА МИКРОВОДОРОСЛЕЙ
{Методика разработана Д. Н. Моториным)
Дафниевый тест, основанный на оценке выживаемости, плодовитости и качества потомства в исследуемых пробах воды, относится к числу основных при нормировании качества природных и сточных вод во многих странах мира. Одной из первичных реакций дафний на действие токсикантов является уменьшение активности их питания, происходящее задолго до возможной гибели рачков. Высокочувствительным является метод слежения за
253
изменением флуоресценции хлорофилла микроводорослей, которыми питаются дафнии. Это позволяет по выходу постоянной флуоресценции (Fo) в течение 1 — 2 мин определить концентрацию водорослей в пробе в диапазоне от 1 тыс. кл./мл до 5 млн кл./мл по калибровочной кривой.
В настоящее время для этих целей используют флуориметры, разработанные в России (в частности, на кафедре биофизики биологического факультета МГУ), а также зарубежными фирмами (в частности, ТоксиРАМ фирмы Walz GmbH, Германия).
Предлагаемая методика основана на использовании скорости фильтрации пищи (микроводорослей) дафниями, рассчитываемой по уменьшению флуоресценции водорослей в пробе в процессе выедания их рачками; методика удобна для быстрой предварительной оценки токсичности воды.
Оборудование, материалы, объекты:
флуориметр, стеклянные стаканчики объемом 50 мл, используемые в качестве садков для дафний; автоматическая пипетка на 1 мл с расширенным носиком для отлова дафний, вода из природного источника; лабораторные культуры ветвистоусых рачков-фильтраторов Daphnia magna, выращиваемых по методике, приведенной в лабораторной работе № 29. Кормом для дафний служит отмытая от среды и сконцентрированная культура зеленой водоросли Chlorella vulgaris, выращиваемая по методике, приведенной в лабораторной работе № 29.
ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ ЛАБОРАТОРНОЙ РАБОТЫ
1.	В стеклянные стаканчики-садки налить по 50 мл исследуемой пробы воды из природного источника, а также воду, используемую для культивирования рачков (контрольная проба). Все в трех повторностях.
2.	В каждый стаканчик отсадить по 5 дафний 6—8-дневного возраста (длиной примерно 3—4 мм), осторожно отобранных автоматической пипеткой (либо стеклянной пипеткой) из культуры.
Примечание. При хорошем навыке в пробу попадает не более 1 —1,5 мл среды культивирования дафний.
3.	Оставить дафний в садках на сутки. Корма не добавлять. Суточное голодание приводит, с одной стороны, к увеличению скорости фильтрации, с другой — к уменьшению разброса получаемых результатов.
4.	После суточного выдерживания из садка осторожно отлить воду (объем воды в садках должен составить 25 мл).
5.	Отобрать пробу воды (3 мл) в кварцевую кювету и измерить фоновую флуоресценцию (/ф) на флуориметре. Результаты занести в таблицу.
254
Оценка токсичности природной воды по фильтрационной активности Daphnia magna
Тестируемый образец	4			4				I,				F
	Повторности			Среднее значение			Среднее значение	Повторности			Среднее значение	
	1	2	3	1	2	3		1	2	3		
Контроля: отстоянная водопроводная вода с дафниями												
исследуемая вода без дафний ’												
Суспензия донных отложений или почв												
Вода из природного источника												
6.	Добавить в садок суспензию водорослей до плотности около 100 тыс. кл./мл, осторожно взболтать садок для равномерного распределения водорослей по объему.
7.	Отобрать из садка пробу (3 мл) и измерить флуоресценцию в начальный момент времени (/0). Отобранную пробу вновь вернуть в садок.
8.	Аналогичные операции провести с остальными садками, содержащими дафний.
9.	Кроме контроля с дафниями следует поставить контрольный стаканчик с исследуемой жидкостью, но без дафний — для оценки собственных изменений флуоресценции водорослей и внесения при расчетах соответствующих поправок.
Примечание. Для сведения этих изменений до минимума садки во время эксперимента должны быть помещены в затемненное место.
10.	Через 30 мин после внесения корма садки можно повторно взболтать.
11.	Через 1 ч садки следует осторожно взболтать, отобрать пробу воды из каждого садка (по 3 мл) и измерить флуоресценцию в конечный момент времени(/,). Результаты занести в таблицу-
Она должна быть меньше начального значения в результате выедания водорослей рачками.
255
12.	Рассчитать скорость фильтрации (F) пищи дафниями по формуле
nt
где V — общий объем пробы (25 мл); п — количество дафний в пробе (5 экз.); t — время опыта (1 ч);	— коэффициент, соот-
ветствующий интенсивности флуоресценции в конечный (/,) и начальный(/0) момент опыта. Величина F (мл/даф. ч) обозначает объем воды, профильтрованный дафнией в единицу времени. У 6-8 суточных дафний значение F в среднем составляет 3 — 4 мл/даф.ч; более низкие значения свидетельствуют о неблагоприятных для дафний условиях инкубирования (интоксикация).
Максимальные концентрации веществ, обнаруживаемые данным методом в суточных опытах, близки к ПДК этих веществ, установленным для рыбохозяйственных водоемов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Руководство по определению методом биотестирования токсичности вод, донных отложений, загрязняющих веществ и буровых растворов // Министерство природных ресурсов РФ РЭФИА, НИА — М.: Природа, 2002.
Маторин Д. Н. О возможности использования флуоресцентных методов для изучения питания ракообразных / Д. Н. Маторин [и др.] // Биол. науки, 1990 - № 1. - С. 147-152.
4.2.6. Иммунологический подход
Лабораторная работа № 38. ИССЛЕДОВАНИЕ ПАРАМЕТРОВ
ВРОЖДЕННОГО ИММУНИТЕТА БЕСПОЗВОНОЧНЫХ животных В ОТВЕТ НА НЕБЛАГОПРИЯТНОЕ ВОЗДЕЙСТВИЕ. РЕАКЦИЯ
ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ
{Методика предложена И. А. Кондратьевой и А. В. Киташовым)
Принцип реакции гемагглютинации (РГА) основан на том, что при взаимодействии эритроцитов и гемагглютининов в исследуемой жидкости происходит склеивание эритроцитов, в этом случае возможна полуколичественная оценка концентрации агглютининов. По результатам РГА судят о присутствии в исследуемой жидкости антител против поверхностных антигенов эритроцитов и говорят о титре антител — это последнее разведение исследуемой жидкости, при котором эритроциты склеиваются. Реакция высокочувствительна и позволяет определить наличие антител в концентрации 0,001 мкг/мл. Часто применяют модификации РГА,
256
например пассивную РГА, когда эритроциты обрабатывают таниновой кислотой и нагружают антигеном, против которого следует выявить антитела, т. е. эритроциты используют в качестве индикатора.
В лабораторной работе представлен микрометод РГА для исследования гемолимфы и перивисцеральной жидкости беспозвоночных животных, однако и при исследовании сыворотки крови позвоночных животных, например рыб, ход работы точно такой же. У беспозвоночных гемагглютинирующая активность перивисцеральной жидкости, так же как и при исследовании сыворотки крови позвоночных, служит косвенным показателем иммунного статуса организма.
В качестве объектов используются представители массовых видов беспозвоночных животных (моллюски и морские звезды) и низших позвоночных животных (морские и пресноводные рыбы), относящиеся к разным систематическим группам и различающиеся образом*жизни. Их отлов производят в соответствии с правилами, изложенными в справочном материале к этой лабораторной работе. У беспозвоночных в отличие от позвоночных животных в основном выражены реакции врожденного иммунитета, важнейшую роль в котором играют амебоциты или гемоциты. У рыб впервые в эволюции обнаруживаются антитела — гуморальные факторы приобретенного иммунитета, синтезируемые клетками лимфоидной линии дифференцировки.
Обыкновенная съедобная мидия (Mytilus edulis L.) — один из наиболее распространенных видов двустворчатых моллюсков, в котором выделяются экологические и физиологические расы. Мидии являются донными биофильтраторами, через которые проходит очень большие объемы воды. При температуре около 20 'С одна мидия длиной 5 —6 см может профильтровать около 3 л воды в час. В полость тела при фильтрации воды могут попасть не только пищевые объекты, но и патогенные организмы — простейшие и бактерии.
Морские звезды ведут хищный образ жизни. Характерный представитель этой группы животных — морская звезда Asterias rubens L.
Материал и оборудование:
взвесь эритроцитов человека (ЭЧ) или эритроцитов барана (ЭБ); гемолимфа мидий или перивисцеральная жидкость морских звезд; физиологический раствор; морская вода; стандартные пипетки или микротитратор Такачи; камера Горяева; стеклянная пробирка; водяная баня; центрифуга; планшет круглодонный 96-луноч-ный.
ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ ЛАБОРАТОРНОЙ РАБОТЫ
1.	Гемолимфу или перивисцеральную жидкость центрифугировать при 5 000 g в течение 10 мин для осаждения клеток.
9 Мелехова
257
2.	Супернатант осторожно, чтобы не разрушить осадок, перелить в пробирку.
3.	Жидкость нагреть на водяной бане при 56 °C в течение 30 мин для разрушения лизинов.
4.	Обработанную таким образом гемолимфу или перивисцераль-ную жидкость титровать методом бинарных разведений в круглодонном 96-луночном планшете, используя микротитратор Така-чи. Для этого, начиная со второй лунки, в горизонтальные ряды планшета внести по 50 мкл физиологического раствора (рис. 38.1).
Затем по 50 мкл исследуемой жидкости добавить в первые две лунки. Жидкость 2-й лунки хорошо перемешать и 50 мкл перенести в 3-ю лунку, затем жидкость в 3-й лунке хорошо перемешать и 50 мкл перенести в 4-ю лунку и т. д. В последнюю, 12-ю лунку не добавлять жидкости из предыдущей лунки — это контроль. В результате вышеописанных манипуляций каждая лунка планшета должна содержать 50 мкл жидкости, причем первая лунка каждого ряда — соответствующий неразведенный образец, вторая — образец, разведенный вдвое, третья — вчетверо и так далее, до предпоследней лунки. Последняя лунка каждой строки, используемая в качестве контрольной, должна содержать физиологический раствор.
5.	Для постановки РГА получить эритроциты у преподавателя, отмыть физиологическим раствором, центрифугируя при 5 000 g в течение 5 мин, супернатант слить. Если эритроциты хорошо отмыты, супернатант после их осаждения практически бесцветен.
Внимание! ЭЧ следует хранить в консерванте (в соотношении 1 часть консерванта на 5 частей эритроцитов) под ватной пробкой при 4 °C. Концентрация осадка около 10 млрд клеток в 1 мл.
6.	Полученный осадок развести физиологическим раствором с таким расчетом, чтобы получить 3 —5%-ю взвесь эритроцитов. Обычно на планшет достаточно 5 —6 мл 5%-й взвеси эритроцитов.
7.	В каждую лунку планшета добавить по стандартной капле (25 мкл) 5%-й взвеси эритроцитов.
Внимание! Суспензию эритроцитов необходимо постоянно перемешивать, не допуская оседания клеток.
8.	Содержимое лунок перемешать легкими круговыми движениями планшета в горизонтальной плоскости, после чего план-
1	1:2	1:4	1:8	1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512 1:1024 Контроль
Рис. 38.1. Титрование гемолимфы
258
и оставить при комнат-шет накрыть листком бумаги или фольп
ной температуре на 6—8 ч.	.цты оседают на дно лун-
В течение периода инкубации эритрси ^огут собраться на дне ки. Агглютинировавшие эритроциты н^ результатов реакции, лунки, на чем основан визуальный уче! ^стряхивать планшет во
Внимание!Категорически запрещаете^ азИТЬ результаты реак-время инкубации, так как это может ги
ции-	результатов по системе
9.	После инкубации приступить к уче^^ровочная шкала оцен-«четыре креста». Ниже представлена орие-ки результатов.
« точки на дне лунки -
Эритроциты сгруппированы в виде четк^^ размытыми + Эритроциты сгруппированы в виде точк>
краями на дне лунки	на ДНе лунки ++
Эритроциты образуют небольшой кружоГ^уя сетку	+++
Эритроциты распределены по лунке, обр дунке, образуя ++++
Эритроциты равномерно распределены «зонтик»
реакции следует восполь-Для более точной оценки результатов г
зоваться бинокулярным микроскопом. ^ачинать с контроля. Если 10. Анализ полученных данных следует на дно лунки, а жид-эритроциты совсем или частично не ос^ц цвет, то речь пойдет о кость в ней окрасилась в буровато-розоН^оВ (гемолиз). Гемолиз, а полном или частичном лизисе эритроцй\вных лунках свидетель-также явления гемагглютинации в контр^дохом качестве суспен-ствуют об экспериментальной ошибке, сдучае следует повторить зии эритроцитов или реактивов. В этом с
эксперимент.	явные контроли, то мож-
11. Если получены «чистые» отрицателен в остальных лунках, но приступать к анализу результатов реа* сопоставляя их с контрольными. сТи исследуемого образ-
Мерой гемагглютинирующей активн^едцее разведение, в ко-ца биологической жидкости служит по<? учитывать, что реакция тором выявляется агглютинация. Следуй вСрная оценка ее резуль-гемагглютинации полуколичественная И В
татов требует навыка.	и можно в полевых ус-
Использовать реакцию гемагглютина'* в естественных неза-ловиях, сравнивая животных, обитаюцХ а\ ц местах, подвержен-грязненных районах (контрольная групЛ.рИЯМ (опытная группа), ных каким-либо антропогенным воздей^ сыворотку или целоми-После антигенной стимуляции, исследу^*нОв, можно с уверенно-ческую жидкость на наличие агглютинИ^ецности иммунитета у стью констатировать увеличение напр^ группы демонстрируют опытных групп, тогда как контрольны^ норму реакции.
259
СПРАВОЧНЫЙ МАТЕРИАЛ
Отлов и содержание животных
Исследование иммунозащитных реакций животных не рекомендуется проводить в период нереста. Отлов животных (мидий, морских звезд, морских рыб, пресноводных двустворчатых моллюсков) следует производить в день обследования в экологически чистых (контроль) и подверженных загрязнению (опыт) местах обитания. Пойманных животных нужно перевозить в емкостях с морской (или речной) водой. В каждую экспериментальную группу включают равное число полноценных здоровых особей примерно равного веса и размера. До постановки экспериментов животных содержат в условиях, максимально приближенных к естественным условиям обитания: каждую группу животных поместить в отдельный садок с диаметром ячейки 0,5 см, тщательно завязывают и опускают в водоем на глубину 2 —5 м, привязав веревкой к плавучему причалу. Длину веревки выбирают с учетом возможного наибольшего подъема воды во время прилива, так чтобы садок не отрывался от дна (для морских звезд) или свободно висел (для мидий и рыб). Животных не рекомендуется размещать в местах, подверженных антропогенному загрязнению. Необходимо вести протокол наблюдений, в котором указывается, где отловлены животные, как долго и в каких климатических условиях они содержались до обработки (температура и соленость воды, расписание приливов и отливов, температура воздуха, атмосферное давление и т.п.), состояние экспериментальных животных. Пресноводных рыб (радужную форель) содержат в открытых долевых садках небольшими группами. При этом необходимо строго соблюдать температурный режим.
В течение непродолжительного времени допускается содержание животных в лабораторных условиях. Однако следует учитывать, что водные животные очень чувствительны к ухудшению условий среды обитания, и поэтому при проведении экспериментальных работ необходимо придерживаться ряда требований: менять воду в аквариуме не реже 1 раза в сутки, обогащать воду кислородом, температура в помещении не должна превышать 10 °C, не допускается помещать в один аквариум животных из разных экспериментальных групп, нельзя содержать морских звезд и рыб на воздухе дольше 10—15 мин. Работать следует только в резиновых перчатках, чтобы избежать стрессового воздействия на хладнокровных животных.
Отбор проб
Для взятия гемолимфы у мидий (или пресноводных двустворчатых моллюсков) животное сначала обтирают сухой салфеткой.
260.
Аккуратно приоткрыв створки раковины скальпелем, сливают воду из мантийной полости в стакан. Делают разрез вдоль всей створки раковины, разрезав мышцы-замыкатели. Собирают вытекающую гемолимфу в лунку 6-луночного планшета. Измеряют объем полученной гемолимфы. Он может сильно варьировать у мидий одинакового размера. Например, при использовании в опытах мидий длиной 5 —7 см объем гемолимфы может быть 1,5—4,5 мл. Подсчитывают гемоциты в камере Горяева и определяют их концентрацию в миллилитре объема.
Морских звезд перед взятием перивисцеральной жидкости слегка обтирают сухой салфеткой. Забор жидкости осуществляют шприцем. Иглу вводят в направлении от центра на расстоянии 5—10 мм в дистальный конец луча с аборальной стороны под углом SOSO' к поверхности тела. От одного животного получают не более 1 —1,5 мл перивисцеральной жидкости. Гемолимфа представляет собой прозрачную и бесцветную, слегка опалесцирующую жидкость, не содержащую крупных примесей и темной взвеси. Для каждого животного берут чистую иглу.
Внимание! При взятии перивисцеральной жидкости необходимо следить за тем, чтобы конец введенной иглы не касался внутренней поверхности целома и печеночных выступов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Галактионов В. Г. Иммунология. — М.: Издательский центр «Академия», 2003.
Кондратьева И. А. Современные представления об иммунитете рыб / И. А. Кондратьева [и др.] // Вестник Моск, ун-та. Сер.биол., 2001. — № 4.
Иммунологические методы / под ред. Х.Фремеля. — М.: Мир, 1979.
Практикум по иммунологии / под ред. И. А. Кондратьевой, А.А.Яри-лина. — М.: Издательский центр «Академия», 2004.
Хаитов Р. М. Экологическая иммунология / Р. М. Хаитов [и др.]. — М.: ВНИРО, 1995.
ЯрилинА.А. Основы иммунологии. — М.: Медицина, 1999.
Лабораторная работа №39. ИССЛЕДОВАНИЕ
ГУМОРАЛЬНЫХ ФАКТОРОВ ВРОЖДЕННОГО ИММУНИТЕТА БЕСПОЗВОНОЧНЫХ И ПОЗВОНОЧНЫХ ГИДРОБИОНТОВ МЕТОДОМ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА
{Методика предложена А. А. Киташовой, А. В. Киташовым и И. А. Кондратьевой)
Исследование гемолимфы мидий, перивисцеральной жидкости морских звезд и сыворотки крови рыб методом электрофореза позволяет выявить фракции белка, присутствующие в одних группах животных и отсутствующие в других группах.
261
Принцип электрофореза состоит в следующем. Вначале проводят электрофоретическое разделение смеси белков в забуференном агаровом геле. После разделения в канавку, которая идет в направлении миграции белков, вносят преципитирующую иммунную сыворотку. Антиген и антисыворотка диффундируют в геле навстречу друг другу, и в месте их взаимодействия возникают дуги (линии) преципитации. Число, положение и форма этих линий дает представление о составе исходной смеси антигенов (рис. 39.1) Если в электрофореграмме исследуемых образцов появляются новые полосы по сравнению с электрофореграммами образцов интактных животных, то их исследуют с помощью иммунохимического и биохимического анализа (определяют молекулярную массу по стандарту молекулярных масс в электрофорезе; выделяют белок из сыворотки, определяют его аминокислотную последовательность).
При исследовании целомической жидкости водных беспозвоночных животных и сыворотки крови рыб электрофорез в полиакриламидном геле в восстанавливающих условиях проводят при концентрации разделяющего геля 15 %, благодаря чему становится возможным обнаружить низкомолекулярные (до 10 кДа) белковые фракции. Гемолимфу мидий и перивисцеральную жидкость морских звезд берут в наибольшей возможной концентрации в связи с низким содержанием белков; сыворотку крови рыб разводят в 10 — 20 раз. На рис. 39.2 представлен пример электрофореграммы сывороток крови рыб, стрелками указаны новые белковые фракции, отсутствующие у контрольных экземпляров.
В качестве объектов используются представители массовых видов беспозвоночных и низших позвоночных животных. Правила работы с беспозвоночными животными приведены в этой лабораторной работе.
В качестве представителей группы рыб выбраны северная навага Eleginus navaga Pallas и беломорская треска Gadus morhua maris-
Рис. 39.1. Принцип иммуноэлект-рофореза.
Первый этап: электрофорез в агаровом геле материала, состоящего из смеси антигенов, а-б-в. Забуференный гель — белое поле; лунка с антигенами — черный цвет; разделенные фракции заштрихованы. Второй этап: двойная диффузия с использованием подходящей иммунной сыворотки, А-Б-В. Получены дуги преципитации: антигена а с антителами А, антигена б с антителами Б, антигена в с антителами В
262
Рис. 39.2. Электрофореграмма сыворотки крови рыб:
А — контрольная группа (здоровая радужная форель); Б — экспериментальная группа (радужная форель, заболевшая энтеритом)
А
Б
albi D., распространенные в Белом море, а также пресноводная радужная форель Salmo gairdneri R., широко используемая при промышленном разведении. Радужная форель является хорошей моделью для изучения иммунных реакций при бактериальной инфекции, так как обычно разводимые в прудовых хозяйствах рыбы характеризуются низкой зараженностью паразитами, но у них часты бактериальные инфекции из-за высокой плотности посадки рыб, нарушений температурных и иных условий содержания и воздействия таких стрессовых факторов, как перевозки. Моделью для изучения иммунореактивности при паразитарной инвазии выбраны морские рыбы в естественных условиях обитания — навага и треска Белого моря. Для естественных условий обитания менее свойственны инфекционные болезни, однако паразиты являются характерными симбионтами морских рыб.
Оборудование и материалы:
2%-й агаровый золь; сыворотка крови рыб; антисыворотки'против иммуноглобулинов рыб; агар на барбиталовом буфере с pH 8,6, 2%-й; барбиталовый буфер pH 8,6; красители: бромфеноловый синий и кумасси ярко-голубой; прибор для электрофореза; влажная камера; предметные стекла; нивелирный столик; штампы для пресечения лунок и бороздок; пипетки.
ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ ЛАБОРАТОРНОЙ РАБОТЫ
1.	Тщательно очищенные и обезжиренные предметные стекла поместить на нивелирный столик. Агар на барбиталовом буфере
263
расплавить на водяной бане и с помощью предварительно нагретой пипетки вылить на предметное стекло 4 мл горячего агарового золя.
2.	После затвердения геля с помощью штампа вырезать лунку диаметром 4 мм для антигенов и на расстоянии 3—4 мм от нее канавку для антисыворотки (40x2 мм, боковые стенки не прорезают). Столбик геля удалить из лунки с помощью водоструйного насоса, а гель в канавке оставить, чтобы не нарушить тока во время фореза.
3.	В лунку внести 20 мкл смеси антигенов с помощью пипетки. Добавить также 2 мкл бромфенолового синего в качестве маркера.
4.	Стекла поместить в электрофоретическую камеру, электродные отсеки заполнить барбиталовым буфером с pH 8,6 и соединить гель с буфером с помощью полосок фильтровальной бумаги. Хорошее разделение белков сыворотки обычно происходит за 1,5 ч при напряженности поля 7В/см (около 60 В на стекло).
5.	После электрофоретического разделения белков из продольной канавки удалить агар и внести в нее 50—80 мкл антисыворотки. Иммунодиффузию проводят в течение 12—24 ч во влажной камере.
6.	Сразу начать элюцию белков, которые не участвовали в преципитации. Гель высушить и окрасить кумасси.
7.	Проанализировать результаты нижеизложенными способами.
Использование чистых антигенов
Применяя одно лишь окрашивание, часто не удается идентифицировать неизвестный антиген. В этом случае может помочь сравнение исследуемой смеси антигенов с известными чистыми антигенами. Реагенты располагают, как показано на рис. 39.3.
Применение моноспецифических иммунных сывороток
Индивидуальные линии преципитации могут быть идентифицированы с помощью применения подходящих моноспецифиче-
Рис. 39.3. Идентификация исследуемого антигена путем сравнения с известным чистым антигеном по электрофоретической подвижности
гмяхяяхяяяяхяляляяяляя А+Б+В
Рис. 39.4. Идентификация исследуемого антигена с помощью моноспецифических антисывороток
264
ских антисывороток, находящихся на том же стекле, но в других параллельных канавках (рис. 39.4). Линия преципитации, образованная на одной стороне иммуноэлектрофореграммы полиспеци-фической сывороткой, может слиться с другой линией, которую на противоположной стороне образует моноспецифическая сыворотка. Такое слияние говорит об идентичности данного компонента антигенной смеси тому антигену, к которому была получена моноспецифическая антисыворотка.
СПРАВОЧНЫЙ МАТЕРИАЛ
Отбор проб
Техника отбора гемолимфы мидий и перивисцеральной жидкости морских звезд приведена в справочном материале к лабораторной работе № 38.
Для взятия крови у рыб и получения сыворотки животное обтирают сухой салфеткой. Взятие крови проводят либо прижизненно из хвостовой артерии (с помощью шприца, промытого гепарином, или надрезают хвост), либо для получения больших объемов крови рыбу усыпляют, делают разрез в районе сердца с брюшной стороны, сердце иссекают ножницами, затем пастеркой с грушей или автоматической пипеткой собирают кровь и сгустки.
Методика взятия крови для сыворотки различна для рыб и млекопитающих. Взятую кровь следует сразу поместить в холодильник (4 °C). Сгусток образуется через сутки. Всю отделившуюся жидкость собирают пастеркой и центрифугируют при 6 000 g в течение 5 мин. Надосадок (сыворотку) разливают по аликвотам и замораживают при -70 °C. В зависимости от условий эксперимента допускается хранение сыворотки при -20 °C в течение краткого периода времени.
Внимание! Размораживать сыворотку нельзя, так как при этом снижается активность ферментов, и для определения лизоцима и других белков такая сыворотка не годится.
Приготовление гелей
Гель готовят так же, как и для обычной иммунодиффузии, за исключением того, что вместо NaCl добавляют подходящий буферный раствор. Используют высококачественные марки агаров или агарозы. В отдельных случаях вместо агара рекомендуют добавлять агарозу, если необходимо на стадии электрофореза избежать явления электроэндосмоса. Обычно используют 1 — 2%-ю концентрацию гелирующего агента. Рекомендуют применять барбиталовый или боратный буфер с pH от 6 до 9. Так, для анализа сыворотки используют барбиталовый буфер (pH 8,2, ионная сила 0,025) с добавлением мертиолята в соотношении 1:10000. Концентрацию буфера подбирают таким образом, чтобы, с одной стороны,
265
избежать колебаний pH, возникающих при низких его концентрациях, а с другой — перегрева геля во время электрофореза в случае его высоких концентраций.
Готовить агар желательно только для одного эксперимента, поскольку многократное разогревание перед каждым опытом приводит к испарению жидкости и изменению концентрации физико-химических свойств агара.
Приготовление барбиталового буфера, pH 8,6
В состав буфера входят: 5,5-диэтилбарбитуровая кислота (барбитал) — 30 г; 5,5-диэтилнатрийбарбитурат (барбитал натрия) — 155 г; азид натрия — 10 г; лактат кальция — 3 г; дистиллированная вода — 10 л.
Приготовление растворов для окрашивания белков
Бромфеноловый синий (0,1 %-й): 10 мг бромфенолового синего растворить в 10 мл барбиталового буфера.
Кумасси ярко-голубой: кумасси ярко-голубого R-250—1,25 г растворить в 50 мл ледяной уксусной кислоты и добавить 185 мл дистиллированной воды.
Растворы хранить не больше нескольких недель в закрытой колбе. После многократного применения они могут быть вновь использованы после пропускания через фильтр.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Воробьева Н. В. Руководство по иммунодиффузии и иммуноэлектрофорезу. — М.: МГУП, 2000.
Иммунологические методы / под ред. Х.Фремеля. — М.: Мир, 1979.
Коротяев А. И. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология / А. И. Коротяев, С.А. Бабичев. — СПб.: Спец, литература, 1998.
Остерман Л. А. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами. — М.: Наука, 1983.
Практикум по иммунологии / под ред. И. А. Кондратьевой, А.А.Яри-лина. — М.: Издательский центр «Академия», 2004.
Руководство по количественному иммуноэлекгрофорезу. Методы и применение / под ред. Н.Аксельсен, И.Крелль, Б. Веке. — М.: Мир, 1977.
Лабораторная работа №40. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ БЕЛКА В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ ГИДРОБИОНТОВ В ОТВЕТ НА ИЗМЕНЕНИЕ СРЕДЫ ОБИТАНИЯ
{Методика предложена А. В. Киташовым и А. А. Киташовой)
Общую концентрацию белка в гемолимфе, перивисцеральной жидкости и сыворотки крови беспозвоночных и позвоночных
266
животных принято определять с помощью стандартных методов (метод Лоури, метод Брэдфорд, спектрофотометрическое определение концентрации белка).
Принцип метода заключается в увеличении синтеза общего белка в плазме и перивисцеральной жидкости животных при стрессе, заболеваниях, нарушающих поддержание постоянства внутренней среды организма.
Для моделирования неблагоприятных условий окружающей среды гидробионтов (морских звезд, пресноводных моллюсков) содержат в лабораториях в аквариумах, где экспериментально ухудшают условия содержания с целью стимуляции у них иммуно-защитных реакций. В лабораторной работе предложен метод оценки динамики общей концентрации белка в перивисцеральной жидкости морских звезд в ответ на ухудшение условий содержания и введение антигенов. Аналогичные эксперименты возможны и на пресноводных животных. Техника забора перивисцеральной жидкости представлена в лабораторной работе № 38.
Для активации иммунозащитных реакций беспозвоночным животным вводят различные антигены, растворенные в стерильной профильтрованной морской воде. Контрольным группам вводят равный объем морской воды или оставляют животных интактными. Активация иммунного ответа у рыб происходит естественным образом — патогенными микроорганизмами при бактериальной инфекции у радужной форели и продуктами метаболизма паразитов при инвазии у морских рыб (наваги и трески). Для определения наличия патогенных микроорганизмов и паразитов у рыб проводят дополнительные исследования: бактериологические и паразитологические.
У морских звезд (пресноводных моллюсков), содержавшихся в условиях, приближенных к естественным, при введении различных антигенов в перивисцеральной жидкости общая концентрация белка не изменяется (рис. 40.1, белые столбики). Ухудшение условий содержания приводит к возрастанию концентрации общего белка в перивисцеральной жидкости гидробионтов. Наибольшее влияние на них оказывает пониженная аэрация (черные’стол-бики на рис. 40.1): у опытных животных увеличивается количество белка независимо от природы вводимого антигена.
Оборудование, материалы и растворы:
исследуемая гемолимфа, целомическая жидкость или сыворотка крови (см. справочный материал к лабораторным работам № 38 и 39); физиологический раствор; дистиллированная вода; стеклянные пробирки; автоматические пипетки на 100—1000 мкл; бумажные фильтры; фарфоровая ступка с пестиком; спектрофотометр или фотометр (КФК); антигены (бычий сывороточный альбумин (БСА), липополисахарид (ЛПС),эритроциты человека (ЭЧ)
267
Рис. 40.1. Общая концентрация белка в перивисцеральной жидкости морских звезд в зависимости от условий содержания и от введенного антигена
или барана (ЭЧ)); культура клеток Saccharomyces cerevisiae, черная тушь, профильтрованная через нитроцеллюлозный фильтр с диаметром пор 45 мкм морская вода; аквариумы (100 л); бензин; компрессор для аквариумов; термометр для воды; лабораторные животные — морские звезды (10 шт. на аквариум).
ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ ЛАБОРАТОРНОЙ РАБОТЫ
1.	Для определения концентрации белка спектрометрическим методом пробы исследуемых жидкостей развести профильтрованной через нитроцеллюлозный фильтр с диаметром пор 45 мкм морской водой до концентрации, попадающей в интервал чувствительности спектрофотометра или КФК. Определить оптическую плотность пробы при длинах волн 280 и 260 нм.
2.	Рассчитать концентрацию белка в пробе по формуле: С= 1 ,45£>280 ~ 0,74£>260, где С — концентрация белка в пробе (мг/мл), />28о и £>260 — оптическая плотность пробы при длине волны 280 и 260 нм соответственно; 1,45 и 0,74 — коэффициенты молярной экстинкции белков и нуклеиновых кислот при соответствующих длинах волн.
3.	Морских звезд разделить на 4 группы и поместить в отдельные аквариумы.
4.	В аквариум, где содержатся животные группы 1, добавить в качестве загрязняющего агента бензин (0,003 %); в аквариуме, где содержатся животные группы 2, повысить температуру воды до 15 °C; в аквариуме, где содержатся животные группы 3, уменьшить аэрирование воды; группа 4 — контроль.
268
5.	Для стимуляции иммунных реакций животным каждой группы вводят любые антигены (БСА, ЛПС, ЭЧ или ЭБ, суспензию клеток 5. cerevisial, черную тушь) или профильтрованную морскую воду.
6.	Через 24 ч отобрать пробы пери висцеральной жидкости (см. справочный материал к лабораторной работе № 38) и провести сравнительный анализ концентрации общего белка у контрольных и экспериментальных животных.
7.	В ответ на ухудшение условий обитания у морских звезд обнаруживается увеличение концентрации общего белка в перивисце-ральной жидкости. Этого не происходит при введении антигенов различной природы, что свидетельствует об активизации имму-нозащитных врожденных реакций организма.
СПРАВОЧНЫЙ МАТЕРИАЛ
Приготовление и введение антигенов мидиям и морским звездам
В качестве антигенов служат: бычий сывороточный альбумин (БСА), эритроциты человека (ЭЧ) или эритроциты барана (ЭБ), липополисахарид (ЛПС) из клеточных стенок грамотрицатель-ных бактерий Salmonella typhimurium, клетки Saccharomyces cerevisiae, черная (китайская) тушь.
Растворы и суспензии антигенов готовят на физиологическом растворе или морской воде, которые стерилизуют фильтрованием через нитроцеллюлозный фильтр с порами диаметром 45 мкм.
Существует два принципиально различающихся способа введения антигена в организм мидии: с помощью шприца в полость тела (в области перикарда делают надпил) или в фильтруемый раствор. Во втором случае антиген определенной концентрации добавляют в воду аквариума (объем известен), где содержится определенное количество моллюсков, чтобы можно было рассчитать, сколько антигена приходится на одно животное.
В	экспериментах используют следующие дозы антигенов:
Антиген	Концентрация	Доза раствора на животное	
		мидия	Морская звезда
БСА	Раствор, 8 мкг/мл Раствор, 80 мкг/мл	0,2 мл 0,2 мл	1,2 мл 1,2 мл
ЭЧ или ЭБ	Суспензия, 200— 500 млн кл./мл	0,2 мл	1 мл
ЛПС	Раствор, 100 мкг/мл	0,2 мл	1,2 мл
Клетки Saccharomyces cerevisiae	Суспензия, 120—130 млн кл./мл	0,2 мл	1,2 мл
Черная (китайская) тушь	0,1 %-й раствор туши на аквариум	0,1%	—
269
Перед введением раствора морскую звезду необходимо слегка обтереть сухой салфеткой. Следует помнить, что при сильном сдавливании луча звезды, особенно у основания, может произойти его автоампутация, что сделает животное непригодным для дальнейших экспериментов.
Раствор или суспензию антигена вводят в целом животного при помощи шприца в объеме, не превышающем 1 — 1,5 мл. Иглу вводят с аборальной стороны от второй трети луча на 5—10 мм в направлении центра под углом 30 — 50° к поверхности тела. Ход иглы должен быть плавным, чтобы не повредить внутренние органы животного. После извлечения иглы нужно несколько минут подержать звезду вверх тем лучом, в который производилась инъекция, чтобы уменьшить вытекание жидкости.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Беккер Г Практикум по органической химии. Т.1. — М.: Мир, 1979.
Иммунологические методы / под ред. Х.Фремеля. — М.: Мир, 1979.
Кондратьева И. А. Функционирование и регуляция иммунной системы рыб / И. А. Кондратьева, А. А. Киташова // Иммунология, 2002. — № 2.
Практикум по иммунологии / под ред. И.А. Кондратьевой, А.А.Яри-лина. — М.: Издательский центр «Академия», 2004.
Скоупс Р. Методы очистки белков — М.: Мир, 1985.
Лабораторная работа №41. ОПРЕДЕЛЕНИЕ
КОНЦЕНТРАЦИИ ЛИЗОЦИМА В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ ГИДРОБИОНТОВ В ОТВЕТ НА ИЗМЕНЕНИЕ СРЕДЫ ОБИТАНИЯ
(Методика предложена И. А. Кондратьевой и А. А. Киташовой)
Лизоцим — вещество, относящееся к группе ферментов (мурамидаза) и обладающее бактерицидным действием. Обнаруживается в различных тканях организма, особенно вовлеченных в воспалительный процесс. Лизоцим находится в больших количествах в яйцах птиц, в слюне, в нейтрофилах и макрофагах. При их повреждении лизоцим поступает в окружающие ткани и плазму крови из неповрежденных макрофагов и лейкоцитов. Угнетает реакции отторжения трансплантации у кроликов и мышей. Он является неспецифическим фактором естественной резистентности организма.
Метод определения концентрации лизоцима часто используют для регистрации происходящего в организме воспаления, стресса или ухудшения условий среды обитания, так как при этих явлениях наблюдается нарастание его концентрации в сыворотке крови позвоночных или гемолимфе и целомической жидкости беспозвоночных животных по сравнению с нормой.
270
Рис. 41.1. Концентрация лизоцима в перивисцеральной жидкости морских звезд в зависимости от условий содержания и от введения различных антигенов
Принцип метода, лежащий в основе лабораторной работы, аналогичен предложенному в лабораторной работе № 40.
Для моделирования неблагоприятных условий окружающей среды гидробионтов (морских звезд, пресноводных моллюсков и др.) содержат в лабораторных аквариумах, где экспериментально ухудшают условия содержания с целью стимуляции у животных иммунозащитных реакций (см. лабораторную работу № 40).
У морских звезд (пресноводных моллюсков), содержавшихся в условиях, приближенных к естественным, при введении различных антигенов в перивисцеральной жидкости увеличивается содержание лизоцима (рис. 41.1, белые столбики). При ухудшении условий содержания концентрация лизоцима в перивисцеральной жидкости гидробионтов возрастает. Наибольшее влияние на них оказывает пониженная аэрация (черные столбики): у опытных животных количество лизоцима увеличивается независимо от природы вводимого антигена.
Оборудование, материал и реактивы:
гемолимфа; целомическая жидкость или сыворотка крови; ацетоновый бактериальный порошок Micrococcus lysodeicticus (см. Справочный материал к лабораторной работе); эфир; натрийфосфатный буфер; лизоцим; жидкая питательная среда МП Б (см. Справочный материал к лабораторной работе № 8); физиологический раствор; дистиллированная вода; стеклянная лабораторная посуда; бумажный фильтр; фарфоровая ступка с пестиком; спектрофотометр или КФК; антигены (БСА, ЛПС, ЭЧ); профильтрованная через нитроцеллюлозный фильтр с порами диаметром
271
45 мкм морская вода; аквариумы; бензин; компрессор для аквариумов; термометр для воды; лабораторные животные — морские звезды.
ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ ЛАБОРАТОРНОЙ РАБОТЫ
1.	Получить у преподавателя ацетоновый порошок Micrococcus lysodeicticus для построения калибровочной кривой.
2.	В 5-миллиметровую кювету внести 1,5 мл полученной взвеси, 0,5 мл физиологического раствора и 1 мл стандартного разведения лизоцима. Смесь быстро размешать и измерить оптическую плотность раствора при длине волны 540 нм через 15 и 180 с на спектрофотометре или КФК.
3.	Построить калибровочную кривую зависимости оптической плотности раствора от концентрации в нем лизоцима при стандартных разведениях.
4.	Смешать исследуемую гемолимфу, целомическую жидкость или сыворотку крови с бактериальным ацетоновым порошком в натрий-фосфатном буфере.
5.	Провести измерение оптической плотности и определить концентрацию лизоцима в исследуемом образце по калибровочной кривой, построенной по стандартным разведениям лизоцима.
6.	Морских звезд разделить на 4 группы и поместить в отдельные аквариумы.
7.	В аквариум, где содержатся животные группы 1, добавить в воду бензин в качестве загрязняющего агента (0,003 %); в аквариуме, где содержатся животные группы 2, повысить температуру воды до 15 °C; в аквариуме, где содержатся животные группы 3, уменьшить аэрирование воды; группа 4 — контроль.
8.	Для стимуляции иммунных реакций животным каждой группы ввести антигены (БСА, Л ПС, ЭЧ) или профильтрованную морскую (речную) воду.
9.	Через 24 ч отобрать пробы перивисцеральной жидкости и провести сравнительный анализ концентрации лизоцима у контрольных и экспериментальных животных.
10.	Концентрация лизоцима в перивисцеральной жидкости морских звезд увеличивается в ответ на ухудшение условий среды обитания.
СПРАВОЧНЫЙ МАТЕРИАЛ	4
5
Приготовление ацетонового порошка М. lysodeicticus	?
и построение калибровочной кривой	|
Бактериальную массу М. lysodeicticus, выросшую на жидкой питательной среде МПБ, дважды отмыть физиологическим ра
272 .
створом и один раз дистиллированной водой. ЦентриФ^ д^стил-при 3000 g в течение 20 мин. Осадок ресуспендировать ацетоНа. лированной воде и перенести в десятикратный объеМ_ затем Взвесь поставить в холодильник (температура 4 °C) на смо-ее профильтровать через двухслойный бумажный фи^ тОцом и ченный водой. Осадок промыть два раза холодным а*\1п0Ть ПРИ один раз эфиром. Полученную бактериальную массу ъысУ'' £акте-комнатной температуре на воздухе и измельчить в стУг1*,ец1аТЬ со риальный ацетоновый порошок в количестве 50 мг с?4 100 мл натрий-фосфатного буфера.
Приготовление натрий-фосфатного буфера рстил-0,2 г Na2HPO4 и 0,2 г NaH2PO4 растворяют в 800 М^^,2 ра-лированной воды. При необходимости доводят pH т объем створом одной из солей той же концентрации. Довог до 1 л.
Стандартные разведения лизоцима цй"Ф°с-
Лизоцим в количестве 3 мг растворяют в 10 мл на^сдеДоБа” фатного буфера (концентрация 500 мкг/мл). Делают тельные разведения лизоцима (12,5; 6,25; 3,13; 1,56 мК^'
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
aS r»benS
Кондратьева И. А. Параметры врожденного иммунитета Aste^ (И ЛР-) Ч Mytilus edulis L. после различных воздействий / И. А. Кондратье^ ^|ГУ. — Труды Беломорской биологической станции им. Н.А.Перце”
М.: Русский университет, 2002. — Т. VIII.	_ д. А.Яри-
Практикум по иммунологии / под ред. И. А. Кондратьевой’
лина. — М.: Издательский центр «Академия», 2004.	p J. — №-
Хаитов Р.М. Экологическая иммунология / Р.М. Хаитов [И
ВНИРО, 1995.
Ярилин А. А. Основы иммунологии. — М.: Медицина, 1999'
ГЛАВА 5
КОМПЬЮТЕРНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ В БИОЛОГИЧЕСКОМ МОНИТОРИНГЕ
{Глава написана А. В. Китпашовым)
Использование компьютерных технологий позволяет сократить рутинные операции по получению, обработке и представлению данных, повысить точность и существенно повысить скорость обработки данных, сделать анализ и представление данных более эффективными.
Постановку любой задачи в рамках биотестирования и биомониторинга, как и вообще любой научной задачи, можно представить как передачу информации между исследователем и исследуемым объектом, с одной стороны, и сообществом исследователей (обществом) — с другой.
Применение вычислительной техники позволяет оптимизировать обмен информацией на всех уровнях этого процесса. Поскольку описание математических алгоритмов и способов программной реализации тех или иных подходов выходит далеко за рамки настоящего издания, приведем лишь принципиальное описание существующих возможностей*
5.1.	Общие принципы применения компьютерной техники
В экспериментальной работе исследователь стоит перед необходимостью оценить состояние исследуемого объекта. Для этого он выбирает ряд параметров, например концентрацию вещества, окрашивание и свечение объекта и его частей и т.п. Компьютер способен обрабатывать только данные, представленные в виде чисел. Поэтому первой задачей, которую должен решить экспериментатор, желающий применить в своей работе компьютерную технику, станет выбор способа представления измеряемого параметра в численной форме. К счастью, большая часть таких спосо
* Вопросы оформления результатов не имеют непосредственного отношения к теме настоящего издания и достаточно освещены в соответствующих изданиях.
274
бов уже реализована, и доступны периферийные устройства для перевода данных в численную форму.
Особенность распространенных на сегодняшний день компьютеров такова, что требуется заранее определить, какой диапазон значений может принимать та или иная величина. Следовательно, нам необходимо решать, например, сколько оттенков требуется различать при изучении окрашивания клеток флуоресцентными красителями или какова требуемая точность определения концентрации интересующего нас вещества. Таким образом, любой перевод данных в компьютерную форму неизбежно сопряжен с потерей части информации, и на исследователя возложена ответственность решения, какой частью информации можно пожертвовать. Понятно, что когда изучаемый эффект характеризуется возрастанием концентрации вещества от 10 мкМ до 100 мМ, нет смысла учитывать пикомолярные колебания концентрации. С другой стороны, вряд ли стоит стремиться к точности, превосходящей точность собственно экспериментального метода.
5.2.	Примеры преобразования данных
Представление текста в цифровой форме наиболее очевидно и распространено. Текст естественно рассматривать как последовательность символов, причем общее количество допустимых символов ограничено. В текстах, посвященных вопросам биотестирования, вероятность встретить шумерскую клинопись невелика, поэтому разумно исключить шумерские иероглифы из определяемого диапазона значений. Преобразование текста в численную форму, таким образом, заключается в замене последовательности символов последовательностью чисел, однозначно им соответствующих. Следует иметь в виду, что последовательность символов «12,568» будет при таком преобразовании рассмотрена именно как последовательность символов, а не как число. Для обнаружения в этой символьной последовательности заложенного математического смысла требуются некоторые дальнейшие манипуляции, без которых математическая обработка данных не имеет ожидаемого смысла.
Представление физических параметров, таких как изменение оптической плотности, может быть осуществлено различными способами. Наименее точным и эффективным, но, к сожалению, наиболее распространенным является способ визуальной регистрации. Исследователь сам читает показания прибора и вручную вводит их в ту или иную компьютерную программу. В некоторых случаях применение этого способа неизбежно, например, при проведении единичных измерений, когда затраты на разработку и внедрение компьютеризованной системы неоправданны.
275
Однако во всех других случаях, особенно при проведении серийных измерений, можно рекомендовать применение аналоговоцифрового преобразователя (АЦП). Аналоговым сигналом называют любой непрерывный сигнал: например, колебания стрелки спектрофотометра происходят без скачков, непрерывно. В противоположность аналоговому сигналу цифровой сигнал отражает изменения величины не непрерывно. АЦП представляет собой устройство, преобразующее аналоговый сигнал в цифровой. Многие модели современного научного оборудования снабжены встроенным АЦП, который позволяет отображать данные на цифровых дисплеях или выводить данные на печать.
Точность оцифровки данных АЦП обычно выражают в его битовой разрядности. Так, 8-битные АЦП позволяют представить весь диапазон возможных значений на входе как диапазон целых чисел от 0 до 255 (28 = 256), а 12-битные — от 0 до 4 095 (212 = 4096). Таким образом, если на входе 12-битного АЦП напряжение сигнала может колебаться в пределах 0—1 В, то чувствительность установки составит -0,24 мВ (1/4096 В). Стоимость АЦП обычно тем выше, чем выше его разрядность.
Во многих случаях существует возможность вывода оцифрованных данных на внешний принтер или передачу их в персональный компьютер, для чего чаще всего используется стандартный коммуникационный кабель RS-232. При реализации такого способа подключения измерительный прибор обычно пересылает данные в виде текстовых строк. Это удобно при использовании принтера и позволяет в простейшем случае обходиться обычными программами эмуляции терминала. В более сложном случае, например для автоматической передачи данных в электронные таблицы, приходится предусматривать программную возможность анализа текстовых строк.
К сожалению, не все производители предусматривают возможность подключения внешних устройств (например, персонального компьютера) к встроенному АЦП. Кроме того, точность встроенного АЦП может быть ниже физической точности самого прибора. Однако многие приборы снабжены аналоговым выходом, предназначенным главным образом для подключения самописца. Сигнал с этого выхода можно подать на дополнительный внутренний или внешний АЦП, подключенный к персональному компьютеру. Часто АЦП рассчитаны на одновременное обслуживание нескольких каналов, так что возможно подключение нескольких приборов к одному персональному компьютеру.
Основным подходом к преобразованию изображений в цифровую форму является растеризация. Изображение при этом разбивают на участки (пиксели, точки), образующие прямоугольную матрицу (растр). Любой информацией о неравномерности изображения в пределах одного пикселя пренебрегают. Все изображе
276-
ние, таким образом, представляет собой последовательность чисел, которые характеризуют цвет точек. Оцифровку изображений обычно осуществляют с помощью камеры или сканера.
Существуют различные подходы для численного описания цвета. С одной стороны, можно определить, что число цветов в изображении ограничено и полутонами можно пренебречь. В таком случае можно каждому из цветов присвоить некоторое числовое значение из диапазона. Например, при представлении черно-белых фотографий всему диапазону цветов — от черного до белого — чаще всего присваивают числа от 0 (черный) до 255 (белый). Чем меньше диапазон возможных значений, тем меньше места может занять информация об изображении в памяти компьютера и тем быстрее может происходить его обработка. При сохранении информации о рисунке тушью достаточно ограничить диапазон двумя цветами — черным (0) и белым (1). Если рисунок выполнен красной тушью, то парой цветов будет красный (0) и белый (1), а при использовании красной и черной туши палитра будет состоять из трех цветов: белого (2), черного (0) и красного (1). Во всех этих случаях сопоставление тех или иных чисел с цветом условно, однако при дальнейшей математической обработке изображения выбранные числа каким-то образом должны характеризовать цвета. Так, в случае палитры из трех названных цветов, белый цвет наиболее ярок, черный наименее ярок, а красный занимает промежуточное положение, поэтому черному цвету соответствует наименьшее, а белому — наибольшее число.
Описанный подход может применяться во многих случаях. Например, при обработке изображений электрофоретических гелей в иммунологических исследованиях мы успешно используем палитру синих тонов (от черного как самого темного до белого как самого светлого). Однако при обработке других изображений даже большой палитры бывает недостаточно. В таком случае сложный цвет представляют суммой простых цветов. Например, если в качестве простых цветов выбрать красный, зеленый и синий и возможные значения каждого из них описывать диапазоном 0 — 255*, то желтый цвет будет соответствовать сумме
желтый = (красный х 255) + (зеленый х 255) + (сиииихО).
Очевидно, что белому и черному цветам будут соответствовать суммы
белый = (красныйх255) + (зеленыйх255) + (синийх255);
черный = (красный хО) + (зеленыйхО) + (синий хО).
* Число 256 представляется не круглым с точки зрения десятичной системы исчисления, но в основе работы компьютеров лежит двоичная система исчисления: 256 = 28.
ТП
Система представления любого цвета как суммы трех простых цветов используется наиболее широко, однако не позволяет описать все множество возможных цветов. Предложены и другие алгоритмы, например разложение сложного цвета на сумму четырех или описание цвета, исходя из его физических характеристик.
Очевидно, что при переводе изображения в цифровую форму происходит потеря части информации (точности). С одной стороны, теряются детали изображения при растеризации, с другой — даже при использовании совершенных алгоритмов цветопередачи бесконечное множество цветов будет описано конечным набором возможных значений. Таким образом, подбор параметров оцифровки изображения требует ответственного к себе отношения.
При хранении изображений в цифровой форме часто прибегают к специальным способам сжатия. Сжатые данные занимают существенно меньше места в памяти компьютера. Одни алгоритмы позволяют достигать хорошего сжатия изображений без потери информации за счет поиска и удаления повторов, другие дают возможность существенно уменьшать размер хранимого изображения за счет исключения из него несущественной информации.
Сжатие данных, используемое в стандарте GIF, предназначено только для изображений с палитрой до 256 цветов и обеспечивает полностью обратимое сжатие данных. Развитием стандарта GIF является постепенно завоевывающий все большую популярность стандарт PNG, обеспечивающий сжатие без потери качеств изображений как с палитрой, так и в других форматах. Такие стандарты сжатия рационально применять для изображений, в которых важны мелкие детали. Для работы с изображениями природных объектов рационально применять стандарт JPEG, который позволяет добиваться хорошего сжатия за счет удаления из изображения малозначительных деталей и шума.
В самом сжатии данных нет ничего сверхъестественного. В большинстве изображений можно отыскать повторяющиеся мотивы (последовательности пикселей) или сходные фрагменты. Применение того или иного алгоритма сжатия позволяет при записи сжатых данных обойтись без сохранения избыточной информации, например записать определенный мотив один раз, а в последующем ограничиться ссылкой на него.
Описанные способы преобразования данных позволяют представить некоторые данные в форме, доступной для обработки компьютером. Не следует, однако, забывать, что в основе преобразования любых данных лежит условность. Так, изображение текстовой страницы, переведенное в цифровую форму при помощи сканера, является не текстом, а изображением, и чтобы подойти к его обработке как к обработке текста, требуется предпринять дополнительные действия (произвести распознавание при помощи специальных программных средств).
 278
5.3.	Пример обработки результатов
Приведем пример компьютерной обработки данных, которые можно получить в рамках выполнения задач биотестирования. При постановке, например, электрофореза в иммунологических исследованиях изображение дорожек можно оцифровать при помощи сканера. Полученное изображение будет представлено матрицей N х М точек (направление движения образцов от 0 к М). Информация о цвете каждой точки представлена числом в диапазоне О (наибольшее окрашивание) — 255 (наименьшее окрашивание, т. е. наибольшему окрашиванию соответствует наименьшая яркость точки). Можно усреднить значения всех точек п = 0... Nдля каждого /и и построить усредненный профиль*. Работа с таким профилем во многих случаях более удобна и наглядна, и его построение без применения компьютера затруднительно.
В случае с простыми образцами, содержащими небольшое число хорошо отличающихся фракций, такого профиля вполне достаточно. Однако для более сложных образцов, когда может происходить наложение пиков, даже по профилю не всегда удается провести исчерпывающий анализ полученных результатов. В этих случаях требуется дополнительная работа с привлечением тех или иных математических приемов. Общая стратегия включает:
1)	получение аналитического вида профиля, т.е. построение такой функции, которая с известной долей достоверности описывала бы полученные эмпирические данные**;
2)	вычисление первой и (при необходимости) второй производной этой функции, исследование которых позволит обнаружить экстремумы (точки максимальной концентрации) и точки перегиба (те участки, где меньший пик сливается с большим).
5.4.	Работа с большими массивами данных
Использование компьютерной техники делает возможной работу с большими массивами экспериментальных и статистических данных, обработка которых вручную была бы практически неосуществима.
Наиболее распространенным способом обработки данных на сегодняшний день является объединение их в базы данных. Уни-
* В случае если изображение сильно зашумлено (повреждено), может потребоваться предварительное применение специальных способов его очистки. Одним из подходов к улучшению качества изображений с низким отношением сигнал/шум может служить последовательное получение и последующее усреднение ряда кадров. Нами успешно применен этот метод при обработке изображений объектов, окрашенных иммунофлуоресцентными метками.
** Например, применив преобразование Фурье.
279
нереальный тип баз данных — реляционные базы данных, в которых данные организованы как система взаимосвязанных ортогональных таблиц. В такой форме можно представить практически любые экспериментальные данные.
Для оптимизации работы с базами данных их можно размещать на выделенных серверах, а пользователям предоставлять те или иные средства для обращения к ним. Фактическим стандартом стал особый язык запросов к базам данных — SQL (Structured Query Language), позволяющий осуществлять любые манипуляции с данными в таблицах, изменять, удалять, добавлять их, запрашивать по тем или иным условиям или комбинировать.
Трудно сегодня представить себе лабораторию, в которой не применялась бы компьютерная техника. Однако чаще всего компьютеры используют для набора и простого оформления текстов и научной коммуникации. В лучшем случае применяют пакеты статистических программ и электронные таблицы для обработки данных или поиска информации. Хотелось бы, чтобы этот краткий обзор позволил исследователям взглянуть на уже, казалось бы, знакомый предмет с новой стороны.
ТЕРМИНЫ, ПОНЯТИЯ И ВОПРОСЫ ПО БИОИНДИКАЦИИ И БИОТЕСТИРОВАНИЮ
{Подготовлен Е. И. Егоровой по материалам из Internet)
Диапазон толерантности — пределы колебаний концентраций токсических веществ, при которых не нарушаются функции организма.
Интегральное токсическое воздействие (integral toxicity) — токсическое действие сложных смесей, сточных вод, многокомпонентных факторов для водных организмов. Количественно определяется как величина, обратная максимальному разведению (1:2, 1:5, 1; Ю, 1:50, 1:100 и т.д.), при котором не наблюдается каких-либо нарушений жизненно важных функций тест-организмов при 24—48-часовом биотестировании. Выражается целыми числами (2, 5, 10, 50, 100 и т.д.) соответственно величинам разведения.
Острое токсическое действие вызывает гибель отравленного организма за короткий промежуток времени — от нескольких секунд до 48 ч. Наблюдается в том случае, если интенсивность воздействия агента велика настолько, что компенсаторная и адаптационная реакции организма не успевают проявиться, он гибнет.
Хроническое токсическое действие вызывает отдаленные Патологические изменения. Проявляется длительное время в виде нарушений различных жизненных функций и возникновения патологических состояний (токсикозов) за период времени от нескольких суток или По достоверной разнице рождаемости в контроле и опыте. У водных организмов хроническое действие токсичных веществ приводит к нарушению плодовитости и возникновению уродств в потомстве, так как токсины оказывают гонадотропное и эмбриотропное действие.
При определении хронического токсического действия по показателю плодовитости находят разницу между физиологической и экологической рождаемостью, что является показателем возможности выживаемости популяции в данных условиях. Хроническое токсическое действие менее интенсивно, но более продолжительно. При нем нарушается равновесие между распадом и синтезом веществ в организме, разрушается геном и прекращается воспроизводство.
Тест-объект (test organism) — организм, используемый При оценке токсичности веществ, природных и сточных вод, степени загрязнения почв, донных отложений, кормов. Это «датчики» сигнальной информации о загрязнении среды и заменители сложных химических анализов, позволяющие оперативно констатировать факт токсичности Среды независимо от того, обусловлена она наличием одного точно определяемого аналитиками вещества или целого комплекса аналитически неопределяемых веществ.
Тест-функция (test function) — жизненная функция, используемая в биотестировании для характеристики отклика тест-объекта на повреждающее действие среды. Например, для инфузорий, ракообразных, моллюсков, рыб, насекомых — выживаемость (смертность) тест-Организ-
281
ма, плодовитость; для культур одноклеточных водорослей и инфузорий — коэффициент деления, средняя скорость роста, суточный прирост культуры; для растений — энергия прорастания семян, длина первичного корня и др.
Токсикометрия {toxicometry) — совокупность приемов оценки токсичности веществ. Основными приемами токсикометрии являются установление минимально переносимой концентрации (МПК), медианной летальной концентрации (ЛК50) или дозы (ЛД50) и зоны токсического действия (ЗТД) — диапазона токсических концентраций — от МПК до абсолютно летальной (ЛК1Оо).
Токсикорезистентность {toxic resistance) — сопротивляемость живых организмов к воздействию токсических веществ.
Токсический эффект {toxic effect) — изменение любого показателя жизнедеятельности или функций организма под воздействием токсиканта. Зависит от особенностей яда, специфики метаболизма организма, факторов внешней среды (содержание кислорода, pH, температуры).
Токсичность {toxicity) — свойство химических веществ проявлять повреждающее или летальное действие на живые организмы. Вещество, оказывающее токсическое действие, называется токсикантом, а процесс воздействия токсиканта на организм — токсикацией (на экосистему — токсификацией). Количественно токсичность вещества для отдельного организма определяется как величина, обратная медианной летальной концентрации: Т = 1/LC5().
Токсичность водной среды {toxicity of water environment) — токсичность воды и донных отложений для гидробионтов, возникающая вследствие появления в ней токсических веществ природного или антропогенного происхождения (ксенобиотиков), загрязнения сточными водами, токсическими атмосферными осадками и пр.
Токсобность {toxobity) — способность водных организмов существовать в токсической среде, сорбируя или используя определенное количество токсического вещества.
Толерантность {tolerance) — выносливость (устойчивость) организма к повреждающим воздействиям.
Толерантный лимит {tolerance limit, TLm) — количественное выражение концентрации токсиканта, при которой гибнет или выживает 50 % тест-организмов за 48 ч опыта.
В какой сезон года лучше всего проводить биомониторинг качества воды? В разные времена года в связи с изменением физико-химических условий, господствующих в водоеме, наблюдается совершенно разная биологическая картина.
В текучем водоеме весенний паводок обычно смывает все население, которое было в нем к концу зимы, поэтому весь весенний период для практических исследований совершенно непригоден. Более успешными могут оказаться весенние исследования в стоячих водоемах.
Летний и осенний периоды дают картину максимального развития гидробионтов, что приводит к получению наиболее ценных материалов для биомониторинга качества воды. Однако осенью повышается вероятность загрязнения водоема органикой за счет отмирания водной расти
• 282
тельности, обильно развивающейся за лето и продуцирующей значительные массы органического вещества, которое, подвергаясь распаду, вызывает загрязнение водоема.
Зимний период (как ни странно) может дать весьма ценные результаты биологических исследований. Он важен в трех отношениях: 1) зимние месяцы отличаются обычно наибольшей устойчивостью водного режима; 2) низкие температуры, замедляя процесс минерализации, дают характеристику минимальной скорости процесса самоочищения; 3) в зимние месяцы особенно пышно развиваются многие важные индикаторы — грибная флора, некоторые инфузории.
В чем принцип использования биомаркеров в биотестировании? Принцип заключается в анализе физиологического и биохимического ответов организма на воздействие загрязнителя. К биомаркерам относятся, например, металлотионеины.
Изучению какой группы индикаторных организмов водоема следует уделять большее внимание при оценке его способности к самоочищению? Очень ценные указания дает изучение планктона — организмов, которые обитают в толще воды. В водоеме малого размера вследствие очень выгодного отношения площади дна к объему воды в процессах минерализации на первый план выступает бентос. В более крупных водоемах превалирующее значение в процессе самоочищения принадлежит, несомненно, планктону. Однако изучение планктона аналогично химическому и бактериологическому исследованию воды в том отношении, что оно дает характеристику качества воды в объеме, который взят для анализа в данный момент. В текучем водоеме — это характеристика воды в районе, лежащем по течению выше точки наблюдения. Все это заставляет признать, что исследование планктона в целях оценки загрязнения водоема менее значимо, чем исследование бентоса и особенно перифитона, индикаторы которого регистрируют среднее значение водоема.
Какие сведения о качестве воды в водоеме дает изучение нектона? Нектон, представляющий в водоеме группу сильно и активно плавающих организмов, часто дает очень ценные сведения о степени загрязнения воды, иногда очень отчетливо характеризуя кислородный режим водоема или отмечая поступление в водоем ядовитых веществ. По мере возможности при всяком биологическом исследовании водоема следует собирать сведения о видовом разнообразии рыб, особенно об их заморах.
Каковы задачи глобального мониторинга? Слежение за общемировыми процессами и явлениями в биосфере Земли, включая все ее экологические компоненты и прогнозирование экстремальных ситуаций.
Что включает импактный мониторинг? Мониторинг региональных и локальных антропогенных воздействий, таких, как эмиссия (выделение) веществ, энергии и излучений в природные среды, а также изъятие природных ресурсов, нарушение естественной структуры и их составляющих в особо опасных зонах и местах.
Какова особенность использования перифитона как тест-объекта для оценки качества воды? Перифитон — организмы обрастания, развивающиеся на поверхности водных предметов, — по своему составу и развитию отвечает средним условиям питания омывающей их воды за все время своего развития, предшествующее исследованию. Перифитонные орга
283
низмы не могут характеризовать загрязнение в момент исследования, зато позволяют судить о среднем загрязнении водоема за достаточно значительный промежуток времени. И даже если в момент исследования в данном месте будет совершенно чистая вода, то это не помешает оценить загрязнение, если таковое имелось раньше.
Правда ли, что исследование населения дна водоема обычно дает картину несколько большего загрязнения, чем то, которое действительно свойственно водоему? Бентос — организмы, населяющие дно водоема и живущие как непосредственно в грунте, так и на его поверхности. Изучение только лишь бентоса не позволяет сделать правильное заключение о свойствах воды, потому что в донном грунте нередко скапливаются разлагающиеся органические вещества. Таким образом, бентос прекрасно характеризует степень загрязнения органическими веществами самих донных отложений, что также очень важно для точного установления общей картины загрязнения водоема. Загрязнение донных отложений сказывается как на качественном составе их населения, так и на количественном соотношении его отдельных представителей.
ОГЛАВЛЕНИЕ
Предисловие..................................................3
Введение.....................................................4
Глава 1. Принципы организации биологического мониторинга.....6
Глава 2. Биоиндикация окружающей среды......................13
2.1.	Общие принципы использования биоиндикаторов............13
2.2.	Особенности использования растений в качестве биоиндикаторов..............................................15
2.3.	Особенности использования животных в качестве биоиндикаторов..............................................17
2.4.	Особенности использования микроорганизмов в качестве биоиндикаторов..............................................19
2.5.	Симбиологические методы в биоиндикации.................20
2.6.	Области применения биоиндикаторов......................21
2.6.1.	Оценка качества воздуха..........................21
2.6.2.	Оценка качества воды.............................22
2.6.3.	Диагностика почв.................................24
2.7.	Биологические индексы и коэффициенты, используемые при индикационных исследованиях..............................27
Глава 3. Биотестирование окружающей среды....................33
3.1.	Задачи и приемы биотестирования качества среды.........33
3.2.	Суть методологии биотестирования.......................34
3.3.	Требования к методам биотестирования...................34
3.4.	Основные подходы биотестирования.......................35
3.4.1.	Биохимический подход.............................35
3.4.2.	Генетический подход..............................38
3.4.3.	Морфологический подход...........................43
3.4.4.	Физиологический подход...........................44
3.4.5.	Биофизический подход.............................46
3.4.6.	Иммунологический подход..........................49
3.5.	Практическое применение методологии биотестирования....51
Глава 4. Лабораторные работы по основным методам биоиндикации и биотестирования окружающей среды..........................58
4.1.	Оценка качества среды методами биоиндикации............59
4.1.1.	Оценка качества воздуха...........................59
Лабораторная работа № 1. Биоивдикация загрязнения атмосферного воздуха с помощью лишайников.............59
Лабораторная работа № 2. Сосна в качестве тест-объекта в радио- и общеэкологических исследованиях............69
Лабораторная работа № 3. Флуктуирующая асимметрия древесных и травянистых форм растений как тест-система оценки качества среды.................................74
Лабораторная работа № 4. Использование флуктуирующей асимметрии животных для оценки качества среды.........80
285
4.1.2.	Оценка качества воды..............................85
Лабораторная работа № 5. Определение общего микробного числа в водоеме........................................85
Лабораторная работа № 6. Биологический контроль водоема методом сапробности....................................89
Лабораторная работа № 7. Биологический анализ активного ила....................................................96
Лабораторная работа № 8. Оценка трофических свойств водоема с использованием высших растений..............106
Лабораторная работа № 9. Определение качества воды в пресноводном водоеме по видовому разнообразию макрофитов............................................113
Лабораторная работа № 10. Определение качества воды в пресноводном водоеме по видовому разнообразию зообентоса..118
4.1.3.	Диагностика почв.................................122
Лабораторная работа № 11. Характеристика качества почвы с помощью растений-индикаторов........................122
Лабораторная работа № 12. Лихеноиндикация рекреационной нагрузки на пригородные биоценозы.....................133
4.2.	Оценка качества среды методами биотестирования........139
4.2.1.	Биохимический подход.............................139
Лабораторная работа № 13. Лизоцимный микробиологический метод оценки состояния водных биоценозов..............139
Лабораторная работа № 14. Метод привитой сополимеризации с использованием в качестве тест-объекта дафнии магна.142
Лабораторная работа № 15. Исследование нарушений развития эмбрионов водных животных с применением метаболического критерия..............................146
Лабораторная работа № 16. Биодиагностика почв по ферментативной активности..........................149
Лабораторная работа № 17. Биотестирование водоемов по уровню белков-металлотионеинов в мягких тканях двустворчатых моллюсков...............................156
4.2.2.	Генетический подход..............................159
Лабораторная работа № 18. Тест-система Эймса для анализа мутагенной и канцерогенной активности химических соединений в окружающей среде..............159
Лабораторная работа № 19. Аберрации хромосом в клетках корневой меристемы растений под действием мутагенов...167
Лабораторная работа № 20. Использование традесканции (клон 02) для оценки мутагенного и токсического действия факторов окружающей среды.............................174
Лабораторная работа № 21. Частота хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови человека............182
Лабораторная работа № 22. Частота бинуклеарных клеток с микроядрами в культуре лимфоцитов человека после у-облучения...........................................185
286
4.2.3.	Морфологический подход.........................188
Лабораторная работа № 23. Биотестирование загрязнения воды с помощью ряски малой (Lemna minor L.).........188
Лабораторная работа № 24. Нарушение эмбрионального морфогенеза амфибий в условиях техногенного загрязнения среды...............................................199
4.2.4.	Физиологический подход..........................202
Лабораторная работа № 25. Определение качества воды по изменению биомассы хлореллы......................202
Лабораторная работа № 26. Влияние токсикантов на кислородную продуктивность водорослей............209
Лабораторная работа № 27. Определение загрязнения среды тяжелыми металлами по ростовым свойствам отрезков колеоптилей.........................................213
Лабораторная работа № 28. Изменение спонтанной двигательной активности инфузории спиростомы под влиянием антропогенных факторов.................216
Лабораторная работа № 29. Проведение токсикологических исследований на дафниях.............................220
Лабораторная работа № 30. Биотестирование с использованием рыб..........................................227
Лабораторная работа № 31. Сперматозоиды костистых рыб как тест-объект в эколого-эмбриологических исследованиях ...............................................230
Лабораторная работа № 32. Газохроматографический анализ биологической активности почв.......................237
4.2.5.	Биофизический подход...........................240
Лабораторная работа № 33. Оценка потенциальной опасности химических веществ по их способности снижать фильтрационную активность гидробионтов..............240
Лабораторная работа № 34. Оценка качества среды инструментальными методами с использованием фототрофных организмов..........................................243
Лабораторная работа № 35. Измерение биолюминесцентной активности исследуемых образцов с использованием биосенсоров........................................ 246
Лабораторная работа № 36. Люминесцентный мониторинг древесных пород в условиях антропогенного стресса...250
Лабораторная работа № 37. Оценка токсичности воды по фильтрационной активности дафний, регистрируемой с помощью флуоресценции хлорофилла микроводорослей..253
4.2.6	Иммунологический подход.........................256
Лабораторная работа № 38. Исследование параметров врожденного иммунитета беспозвоночных животных в ответ на неблагоприятное воздействие. Реакция гемагглютинации.....................................256
287
Лабораторная работа № 39. Исследование гуморальных факторов врожденного иммунитета беспозвоночных и позвоночных гидробионтов методом электрофореза.......261
Лабораторная работа № 40. Определение концентрации белка в биологических жидкостях гидробионтов в ответ на изменение среды обитания...................................266
Лабораторная работа № 41. Определение концентрации лизоцима в биологических жидкостях гидробионтов в ответ на изменение среды обитания............................270
Глава 5. Компьютерные технологии в биологическом мониторинге.274
5.1.	Общие принципы применения компьютерной техники.......................................274
5.2.	Примеры преобразования данных..........................275
5.3.	Пример обработки результатов...........................279
5.4.	Работа с большими массивами данных.....................279
Термины, понятия и вопросы по биоиндикации и биотестированию...........................................281
Учебное издание
Мелехова Ольга Петровна, Егорова Елена Игоревна, Евсеева Татьяна Ивановна и др.
Биологический контроль окружающей среды: биоиндикация и биотестирование
Учебное пособие
Редактор Г.Г.Есакова Технический редактор Е. Ф. Коржуева Компьютерная верстка: Л. М. Беляева Корректоры: И. С. Потемкина, Г. Н. Петрова, В. А. Жилкина
Изд. № 1011 12597. Подписано в печать 24.05.2007. Формат 60x90/16.
Гарнитура «Таймс». Печать офсетная. Бумага офсетная № 1. Усл. печ. л. 18,0.
Тираж 2000 экз. Заказ № 19191.
Издательский центр «Академия», www.academia-moscow.ru Санитарно-эпидемиологическое заключение № 77.99.02.953Д.004796.07.04 от 20.07.2004 117342, Москва, ул. Бутлерова, 17-Б, к. 360. Тел./факс: (495) 330-1092, 334-8337.
Отпечатано в ОАО «Саратовский полиграфкомбинат».
410004, г. Саратов, ул. Чернышевского, 59.
Интернет/Home page — www.sarpk.ru.