Хроматография в тонких словах - Шталь Э.

Автор: Шталь Э.

Теги: хроматография

Год: 1965

Похожие

Основы тонкослойной хроматографии (планарная хроматография). Том I

Тонкослойная хроматография

Газовая хроматография

Аффинная хроматография. Методы

Текст

DUNNSGHIGHT-GHROMATOGRAPHIE
EIN LABORATORIUMSHANDBUGH
Bearbeitet von
H. R. Bolliger • M. Brenner • H. Ganshirt
H. K. Mangold • H. Seiler • E. Stahl • D. Waldi
Herausgegeben von
EGON STAHL
SPRINGER - VERLAG
BSRLIN • GOTTINGEN • HEIDELBERG
1962
ХРОМАТОГРАФИЯ
В ТОНКИХ СЛОЯХ
)
ПОД РЕДАКЦИЕЙ Э. ШТАЛЯ
Перевод с немецкого
канд. техн, наук М. И. Яновского
Под редакцией
чл.-корр. АН СССР К. В. Ч м у то в а
ИЗДАТЕЛЬСТВО «МИР» • Москва 1965
Книга посвящена теории и применению нового
метода разделения и анализа, широко использу-
емого в химии природных соединений, фармаколо-
гии, клинической диагностике и многих других
областях.
В книге излагаются принципы хроматографии
в тонких слоях и описывается аппаратура. Специ-
альная часть содержит конкретные примеры исполь-
зования метода: анализ эфирных масел, смол, ви-
таминов, аминокислот, нуклеиновых кислот, саха-
ров, инсектицидов. Две большие главы посвяще-
ны применению метода для анализа лекарствен-
ных препаратов в клинической диагностике и фар-
макологии.
Книга предназначена для широкого круга хими-
ков-аналитиков, биохимиков, физикохимиков, ме-
диков.
Редакция литературы по химии
ПРЕДИСЛОВИЕ
Распределительная хроматография — жидкостная в случае 'разделения
смесей растворенных веществ и газо-жидкостная при разделении газовых
смесей — получила в настоящее время чрезвычайно широкое распростране-
ние. Наряду с колоночными вариантами этого вида хроматографии возник
новый вид аналитического метода — хроматография на бумаге. Следует,
сказать, что по чувствительности и возможностям идентификации разделяе-
мых компонентов метод хроматографии на бумаге превосходит все известные
приемы аналитической химии. Своеобразие гидродинамических условий —
капиллярное передвижение жидкости в промежутках между структурными
элементами адсорбирующего слоя, т. е. волокнами бумаги — создает наряду
с перечисленными выше преимуществами и некоторые неудобства. К ним
относится' прежде всего зависимость процесса разделения от структуры
и свойств бумажного листа (эти качества довольно трудно воспроизводимы),
кроме того, разделение требует много времени.
Метод хроматографии в тонких слоях, предложенный советскими учеными
Н. А. Измайловым и М. С. Шрайбер, устраняет многие из этих затруднений.
Применение самых разнообразных материалов делает метод поистине уни-
версальным. Вместо волокон целлюлозы в распоряжение исследователя
поступают порошки различных сорбентов: окиси алюминия, силикагеля,
ионообменных смол и т. д. Течение жидкости в таких слоях подобно переме-
щению ее в слое зерненого сорбента в колоночной хроматографии; в резуль-
тате получаются более резкие фронты, что приводит к более четкому разделе-
нию. Сама аппаратура поэтому сильно уменьшается в габаритах, сокращает-
ся время разделения и обработки хроматограмм. Идентификация может про-
изводиться не только колориметрически или радиометрически, но и простой
десорбцией с участка слоя, содержащего пятно с последующим химическим
анализом.
Книга Э. Шталя посвящена детальному описанию метода хроматографии
в тонких слоях. В общей части излагаются приемы, аппаратура, сорбенты
и некоторые общие методы идентификации. Подробно освещены вопросы тео-
рии хроматографии в тонких слоях. Специальный раздел посвящен изотоп-
ным методам. Специальная часть состоит из ряда глав, в которых приводятся
примеры анализов отдельных классов соединений, например алифатических
липидов, эфирных масел, бальзамов, смол, витаминов, стероидов, аминокис-
лот, сахаров и т. д.
Предисловие
Как и хроматография на бумаге, хроматография в тонких слоях получила
наибольшее развитие в области биохимических исследований, что придает
книге Шталя определенную окраску. Однако автор находит место и для
описания приемов разделения смесей неорганических веществ.
Следует надеяться, что предлагаемая вниманию читателя книга будет
способствовать еще большему внедрению этого чувствительного и универ-
сального метода анализа в практику наших научно-исследовательских лабо-
раторий.
К. Чмутов
ПРЕДИСЛОВИЕ К НЕМЕЦКОМУ ИЗДАНИЮ
За несколько последних лет хроматография в тонких слоях завоевала
такую популярность, что возникла необходимость в обобщении всего появив-
шегося до настоящего времени разрозненного опытного материала в виде
отдельной монографии и ознакомлении с ним широких кругов исследователей.
Этим методом можно анализировать органические и неорганические вещества
в количествах от 10~9 до 1О’В г. Одному человеку трудно приобрести сведения
и опыт лабораторной работы для составления руководства к практическим
исследованиям, которое бы оказало существенную помощь как начинающему,
так и специалисту. Поэтому для данной цели объединилась группа ученых
различных стран, попытавшихся решить задачу наилучшцм образом. При
нынешнем состоянии хроматографии в тонких слоях казалось весьма важ-
ным, чтобы авторский коллектив использовал свои еще не опубликованные
оригинальные работы.
Поскольку метод находит многочисленное применение в различных обла-
стях естествознания и медицины, мы отказались от краткого изложения спо-
собов получения веществ, понятных только узким специалистам. Краткие
вводные замечания о химии и номенклатуре разделяемых групп веществ
и соответствующие литературные ссылки облегчают освоение материала.
Учитывая конечный результат, пришлось подробнее остановиться на про-
цессах обогащения, в которых часто бывает необходимость. Иногда возника-
ла необходимость по-новому расположить материал — обычно расположение
должно быть в соответствии с излагаемым методом анализа. Так, например,
специальная часть начинается с анализа липоидов и кончается гидрофиль-
ными соединениями. Объем отдельных глав^определяется современным уров-
нем знаний в данной области.
В общей части, в особенности в случае приборов, когда методика работы
и обращение с ними известны, не приводится подробных обзоров, часто услож-
няющих изложение. В виде рабочих инструкций приводятся только испы-
танные, и оправдавшие себя методы, которые могут быть без труда освоены
начинающим. Изложению теоретических основ хроматографических про-
цессов посвящена специальная глава, позволяющая перейти от чисто эмпи-
рического и интуитивного подхода к математическому описанию процесса
и обработке результатов.
К пожеланию о том, чтобы данное руководство оказало столь же полезную
помощь в лаборатории, как это уже можно утверждать в отношении метода,
я присоединяю мою искреннюю благодарность всем помогавшим мне в ра-
боте.
Саарбрюкея, лето 1962 г.
Эгон Шталь
ОБЩАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА 1
ИСТОРИЯ РАЗВИТИЯ ХРОМАТОГРАФИИ
в тонких слоях
Э. Шталъ
С первого взгляда кажется удивительным, что принцип хроматографии
и тонких слоях, описанный впервые около 25 лет назад, стал широко извест-
ным лишь 3 года назад, а сейчас признан уя№ незаменимым. Краткий обзор
истории развития метода представляет поэтому не только простой интерес,
но и позволяет также понять основные закономерности, лежащие в основе
метода. Первые публикации относятся к периоду большого успеха колоноч-
ной хроматографии Цвета. В это время начинают работать над созданием
«микрохроматографии», пытаясь уменьшить диаметр колонки до 1 мм.'
Затруднения того времени Цехмейстер характеризовал в 1938 г. следующими
словами [74]: «Основная задача микрохроматографии заключается не в созда-
нии аппаратуры (имеется в виду колоночная хроматография), а в безупречной
идентификации адсорбированных веществ». Решение этой задачи привело
к переходу от «закрытых» к «открытым» колонкам, т. е. к тонким раздели-
тельным слрим. Это положение, сформулированное несколько лет назад,
уже позволяет понять простоту метода и широкие возможности его примене-
ния [56].
В статье «Капельно-хроматографический метод анализа и его применение
в фармацевтике» Измайлов и Шрайбер [20] в 1938 г. описали основы метода
и использовали его для разделения экстрактов лекарственных растений
(тинктуры русской фармакологии VII).
Они замешивали сорбент (главным образом окись алюминий) на воде
в виде пасты, которую намазывали слоем толщиной в 2 мм на предметные
стекла. В случае более толстых слоев наблюдалось обраэ(№ание трещин,
а получение более тонких слоев, по их мнению, создает технические затрудне-
ния. На середину высушенного слоя наносят каплю исследуемой спиртовой
вытяжки растения. Часто уже при кольцеобразном расширении появляют-
ся красивые зоны; при их отсутствии для проявления добавляют по каплям
немного спирта, пока, зоны не перестанут расплываться. Авторы сравнили
затем полученные ими кольцевые хроматограммы с соответствующими коло-
ночными хроматограммами (рис. 1, ср. с рис. 20) и указали на преимущество
их нового метода.
Работа русских исследователей заканчивается следующим выводом:
«Разработан метод хроматографического адсорбционного анализа, осно-
ванный на разделении веществ в тонком слое адсорбента на эоны, при при-
менении одной капли вещества.
Результаты, полученные предложенным методом, качественно совпадают
с результатами, полученными обычным методом адсорбционной хроматогра-
фии. Метод позволяет получить удовлетворительные результаты при затрате
одной капли исследуемого вещества, очень небольших количеств адсорбента
и за минимальное время.
Метод можно использовать для анализа фармацевтических препаратов
и их идентификации, а также для предварительной оценки сорбента и раст-
ворителя. Новым методом было изучено 16 фармацевтических препаратов».
12
Общая часть
Ссылаясь на реферат этой статьи, Кроуве [9] в 1941 г. сообщил, что в своей
лаборатории он уже в течение некоторого времени использует сорбент
в тонких слоях в чашках Петри и на таких незакрепленных слоях получил
аналогичное разделение. Здесь, разумеется, мы имеем дело только с опы-
тами, предшествовавшими колоночной хроматографии.
Мы можем уже теперь различать два метода: по одному из них работают
с прочно закрепленными разделительными слоями, а по другому — со сво-
бодно насыпанными слоями, со всеми вытекающими отсюда недостатками *.
В усовершенствованном виде метод описан в 1947 г. Вилльямсом [70]. Он
защищает свободный слой, накладывая стеклянную покровную пластинку
с отверстием в центре, через которое вводится капля анализируемой смеси
и растворитель.
Светло-
Р и с. 1. Сравнение окраски флуоресценции колоночной хроматограммы на окиси
алюминия (Z) настойки белладонны с окраской капельной хроматограммы (II)) перед
проявлением (а) и после проявлении (б) спиртом (по Измайлову и Шрайбер [20]).
При решении задачи разделения аминокислот и их производных Мартин
и Синдж [32] ряд лет шли другим путем. Используя распределительную
аппаратуру, они разработали распределительную хроматографию. Для этого
они закрепляли одну из фаз (неподвижную фазу) на носителе, например
порошкообразном силикагеле, и затем заполняли им колонку. В качестве-
«растворителя», называемого в данном случае подвижной фазой, использо-
вали, например, хлороформ.
Чтобы иметь возможность осуществить свою распределительную хрома-
тографию в микромасштабе, они перешли к фильтровальной бумаге, т. е.
к открытой колонке (Консден, Гордон, Мартин [8], 1944 г.). Их результаты
в области разделения аминокислот получили всеобщее признание, и метод,
был широко подхвачен другими исследователями. Начал развиваться метод
хроматографии на бумаге. К 1956 г. было опубликовано свыше 10 тысяч работ,
в которых описывалось применение этого «универсальйого метода» [15].
Понятно, что под впечатлением этих успехов, все время пытались обойти
трудности, изменяя пропитку, используя новые комбинации растворителей,
применяя обращение фаз и химически обрабатывая целлюлозное волокно.
Пытаясь исключить все адсорбционные эффекты, большие надежды возлага-
ли на бумагу со стеклянным волокном.
Аналогично приемам адсорбционной хроматографии пытались наносить
на фильтровальную бумагу, а позже на бумагу со стеклянной тканью дву-
* В последние годы эти опыты были развиты Моттье [40, 41] и другими иссле-
дователями [10, 11, 39, 46].
Гл. 1. История развития хроматографии в тонких слоях
13
окись кремния и окись алюминия. Кирхнер (1950 г.) [25] одним из первых
пошел по этому пути. Не ясно, почему он вместе с Миллером обратился к ра-
боте 1948 г. Майнхарда и Холла [34], в которой метод Измайлова — Шрай-
бер фигурирует под названием «поверхностная хроматография» (Surface
Chromatography). По-видимому, уже тогда их не удовлетворили результаты,
полученные с бумагой, на которую был нанесен силикагель. Безусловно,
Кирхнер и Миллер первые более подробно занялись" рассматриваемым мето-
дом, в частности разделением производных терпенов на тонких слоях сорбен-
тов, и опубликовали свои результаты в многочисленных работах [26, 36—
38]. Они дали толчок к применению мето-
да под названием «метод хроматографиче-
ских полос» (Chromatostrip-technique) для
разделения производных терпенов, после
чего в этой области появилось большое
число публикаций. Один из авторов (Рай-
цема, 1954 г. [50, 51]) применял вместо
узких стеклянных полос более широкие
пластинки (12,5 X 17,8 см) и сумел благо-
даря этому, как и в случае хроматографии
на бумаге, разделить параллельно несколь-
ко смесей веществ. Удивительно, что пра-
ктически все авторы вновь забывали этот
метод. Это, по-видимому, связано с тем, что
как раз при разделении эфирных масел
результаты наименее удовлетворительны,
что обусловлено незнанием основных фак-
торов, вызывающих сильный разброс ве-
личин Rf *. Возможно, это объясняется
также тем, что к этому времени в США
для этой цели стали уже использовать
газовую хроматографию. Как будет видно,
Р и с, 2. Число появляющихся еже-
1 годно с 1903 по 1938 г. публика-
ций, в которых приводятся данные
по колоночной хроматографии.
возможность широкого применения, универсальность и другие многочислен-
ные преимущества остались незамеченными, что отчетливо следует из сводки
ежегодно публикуемых работ, посвященных этому вопросу.
Аналогичную картину развития мы наблюдаем, и в случае колоночной
хроматографии Цвета (рис. 2); прошло свыше 20 лет, пока работами Рихарда
Куна не было доказано значение этого метода. Еще более длинный «инку-
бационный период» имела хроматография на бумаге. Уже в 1906 г. появи-
лась книга Гоппельсредера [14] «К изучению капиллярного анализа, осно-
ванного на адсорбционных и капиллярных явлениях». Лишь полвека спустя
Консден, Гордон, Мартин и Синдж создали из этого полезный метод.
Я уже свыше 10 лет интересовался проблемой разделения содержимого
растительной клетки и занимался поисками метода, пригодного для этого.
Содержимое исследуемых растительных железистых волосков в соответствии
с их объемом составляет менее 0,1 цг, и поэтому я сразу мог констатировать,
что ни один из тогдашних хроматографических методов не позволяет добить-
ся желательного результата. Микрофотография показала, что железистый
волосок меньше отдельного зернышка разделительного слоя или волокна
целлюлозы бумаги. Чтобы продвинуться вперед, я перешел к открытым
колонкам из тонкоизмельченного материала и стал использовать известные
палочки и желобки из окиси магния. Полученные результаты оказались
достаточно хорошими, но адсорбционная активность была слишком мала.
* Отношение расстояния центра пятна от точки старта к расстоянию фронта раст-
ворителя от старта.— Прим. ред.
14 Общая часть
В то время в моей лаборатории Генсхирт начал работать над методом «хрома-
тографических полос» и использовал его., для разделения эфирных масел.
Это не облегчило решения стоявшей тогда передо мной задачи. Дальнейшие-
опыты с прессованными слоями силикагеля, волокнистым или сплавленным
стеклом, пластинками из глины, алюминиевой фольгой, подвергнутой анодно-
му окислению, привели лишь к частичному успеху. Лучше других оказа-
лись тонкие слои, полученные из тонкоиэмельченного геля кремневой кисло-
ты. Так я сумел постепенно установить факторы, влияющие на эффектив-
ность метода и определить возможности его применения, что было мной изло-
жено в 1956 г. в небольшом сообщении [55]. И эта работа, как и работы моих
предшественников, осталась незамеченной. Тогдашнее состояние вопроса
лучше всего характеризует мнение, что этот метод представляет собой «обыч-
ное хроматографическое баловство».
Убежденный в противоположном, я искал убедительных доводов, соглас-
но которым этот метод можно было бы противопоставить обычно используе-
мым. В соответствии с этим мне казались существенными следующие моменты:
1) стандартизация метода (толщина слоя, размеры, методика приготовле-
ния, разделительные камеры);
2) изготовление соответствующей вспомогательной аппаратуры, обеспе-
чивающей рациональное проведение работы;
3) ' создание разнообразных сорбентов в виде веществ постоянного-
состава;
4) определение области применения метода.
В результате этих усилий на Выставке химической аппаратуры (АСНЕМА)
1958 г. было представлено основное оборудование для хроматографии в тон-
ких слоях [56]. Интерес со стороны промышленных лабораторий был велик.
Особенное впечатление производила быстрота анализа и прекрасное разделе-
ние на тонких слоях силикагеля Г*. Лишь с этого времени хроматография
в тонких слоях получила всеобщее признание и распространение. В 1961—
1962 гг. появились первые более полные обзоры, в которых были рассмотре-
ны прежние результаты анализа [2, 12, 21, 42, 45, 54, 59, 61, 67, 69, 73].
♦ Система силикагель—гипс.—Ярил», ред.
ГЛАВА %
АППАРАТУРА ДЛЯ ХРОМАТОГРАФИИ
В ТОНКИХ СЛОЯХ И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ
Э. Шталъ
I НАНЕСЕНИЕ ТОНКИХ РАЗДЕЛИТЕЛЬНЫХ СЛОЕВ НА ПЛАСТИНКИ
’• Для нанесения на пластинки тонких порошков твердых веществ или
Их суспензий в виде тонких слоев существует ряд возможностей. Такие
методы существуют давно, например в промышленности лаков и пленок;
различные методы можно подразделить в зависимости от способа нанесейия
слоя.
А. Намазывание: 1. С помощью подвижного устройства для нане-
сения на неподвижную пластинку. 2. С помощью неподвижного устройства
для нанесения путем перемещения пластинки.
Б. Поливка суспензией или насыпка твердых веществ на пластинку
с применением вспомогательной разравнивающей пластинки.
В. Погружение пластинки в суспензию.
Г. Опрыскивание разбавленной суспензией (метод пульвери-
зации).
Вначале работы велись по методу Б [20]. Поскольку в этом методе не ну-
жен прибор, метод иногда применяют и в настоящее время, однако он не
обеспечивает получения тонких и равномерных Слоев. Это же относится
к методам В и Г. Миллер и Кирхнер [38] описали в 1954 г. неподвижное
устройство для протягивания узких стеклянных полос, напоминающее по
форме воронку (метод А. 2). Наносимая масса вытекает из выходной щели
регулируемой ширины на протягиваемую полосу. В конце работы приво-
дится метод изготовления, эскизы и фотографии. В несколько видоизменен-
ном виде это приспособление было использовано в 1961 г. для получения
«хроматографических полос» [1].
Недавно Уолиш [73] описал работающее по такому же принципу (А.2)
приспособление, предложенноеМуттером и Хофштеттером и выпускаемое фир-
мой «Camag». Приспособление пригодно для пластинок шириной 9,5 и 10 см.
На пластинки наиболее распространенного в настоящее время размера 20 х
X 20 см этим приспособлением слои наносить нельзя. Изготовителем
подчеркивается возможность регулирования йысоты выходной щели. Нет
смысла подробно останавливаться на этом приспособлении, поскольку до
настоящего времени оно использовалось редко. Неубедительным является
довод, что можно применять пластинки различной толщины. Это возможно
и с автоматом для намазывания тонких слоев, кратко описанным в 1958 г.
[56] (рис. 3). Согласно этой конструкции, пластинки осторожно протаскива-
ют под прибором для нанесения слоя и перемещают с помощью небольшого
конвейера. Прибор приводится в действие электромотором и позволяет за
1 час равномерно покрыть более тысячи пластинок. Опыт показал, однако, что,
как правило, достаточно уложить в ряд пластинки одинаковой толщины и за
один ход намазать их с помощью приспособления для нанесения тонких сло-
ев. Правда, ойисанное впервые в 1956 г. устройство (метод А.1.) было при-
годно только для слоев шириной 5 см. Дальнейшее усовершенствование
этого принципа привело к прибору, позволяющему намазывать тонкие слои
16
Общая часть
Р и с. 3. Автомат для нанесения слоев
[56].
Слева магазин со стеклянными пластинками,
ниже транспортер с приводом. В правой
части шаблон для нанесения с приспособле-
нием для точного регулирования толщины
слоя. Масса для нанесения подается в во-
ронку; мешалка уменьшает седиментацию.
ра для микропрепаративного разделения
750 ц на пластинках шириной 20 см и длиной 40 см.
наносили в виде полосы.
шириной 20 см *. В первые годы отка-
зывались от возможности регулирова-
ния ширины выходной щели, посколь-
ку полагали, что при этом потребители
будут работать с различной толщиной
слоя. При разработке метода оказалось
необходимым начать с проверенной
стандартной толщины слоя.
Согласно многочисленным опытам
по аналитическому применению, наи-
более целесообразной оказалась толщи-
на слоя в 150—250 ц, соответствующая
толщине бумаг, обычно используемых
в методе хроматографии на бумаге. Од-
нако иногда необходимы более толстые
слои, например для микропрепаратив-
ного разделения с последующим выде-
лением отдельных компонентов. Поэто-
му устройство для нанесения слоев фир-
мы «Desaga» с 1962 г. снабжено выход-
ной щелью с максимальной шириной
2 мм. Толщину слоя на этом приборе
можно легко регулировать (см. рис. 5).
В случае сильно разбавленных су-
спензий для нанесения нельзя получить
слои толще 1 мм. В лаборатории автб-
использовали слои толщиной 500 и
Вещество (до 500 мг)
ПРИБОР ДЛЯ НАНЕСЕНИЯ ТОНКИХ СЛОЕВ
Всеобщее распространение получило устройство для нанесения тонких
сорбционных слоев, разработанное Шталем, и поэтому его следует описать
подробнее. Прибор состоит из двух
частей: рабочего шаблона, на кото-
ром укладывают в ряд пластинки, и
собственно устройства для нанесе-
ния, содержащего жидкую массу, рав-
номерно наносимую в виде тонкого
слоя. Принцип работы ясен из рис. 4.
Устройство для нанесения тонких
слоев весом почти 2 кг состоит из
Рис. 4.
« — принцип работы прибора для нанесения
тонких слоев; б — рабочий шаблон со стеклян-
ными пластинками, частично намазанными (точ-
ками показана сорбционная масса).
латунного блока, покрытого слоем твердого хрома, в котором укреплена
имеющая с одной стороны щель втулка, содержащая наносимую массу.
♦ Изготовителем элементов основного оборудования для хроматографии в тонких
слоях является фирма «Desaga» (Гейдельберг).
Гл. 2. Аппаратура дляхроматографиив тонких слоях и ее применение 17
Рукояткой втулку можно повернуть на 180°. Этот механизм со втулкой
позволяет перемешивать сорбент с водой и предотвращает преждевременное
вытекание готовой массы. Емкость сосуда составляет 150 мл, что достаточно
для намазывания не менее 10 пластинок (20 X 20 см при толщине слоя
250-р).
Методика работы
а. Рабочий шаблон. Изготовленный из цветной пластмассы рабочий шаблон длиной
112 см и шириной 22 см помещают на прочный стол так, чтобы длинная упорная кромка
находилась ближе к работающему. Короткая кромка находится справа. Полосы пори-
стой резины, приклеенные к нижней пойерхности шаблона, предотвращают скольжение.
После этого помещают 5 квадратных одинаковой толщины., стеклянных пластинок 20 X
X 20 см, или 10 пластинок 10 X 20 см, или 2 большие пластинки 40 X 20 см. Тщательно
очищенные, обезжиренные стеклянные пластинки должны быть плотно прижаты друг
Рис. 5. Прибор для нанесения тонких слоев регулируемой толщины 0 — 2 мм
(фирма «Desaga», Гейдельберг).
к другу и к упорной кромке. В правом и левом концах уложенных в ряд пластинок поме-
щают по пластинке размером 5 X 20 см (начальная и конечная пластинки).
б. Установка прибора для нанесения слоя. Пустой прибор вначале устанавливают
на начальную пластинку. Выгравированная красная стрелка указывает направо, в направ-
лении перемещения прибора. Своей йаправляющей прибор плотно прилегает к рабо-
чему шаблону. Вначале делают несколько равномерных не слишком медленных и не
слишком быстрых движений прибора. При этом лучше находиться у середины шаблона,
держа прибор обеими руками н перемещая его без нажима от начальной пластинки до
конечной. Собственно процесс нанесения слоя для ряда пластинок длиной в 1 ж должен
составлять 5—6 сек. Таким способом проверяют, состоит ли весь ряд из пластинок оди-
наковой толщины (при перемещении прибора не должно происходить толчков).
в. Установка толщины слоя. В новой модели прибора для нанесения тонких слоев
фирмы «Desaga» (рис. 5) очень просто и остроумно решена задача регулирования тол-
щины слоя. Ослабляют два установочных винта на передней стороне прибора и, пере-
мещая переднюю пластинку вправо или влево, подымают ее или опускают. Неподвижная
маркировочная линия указывает на подвижной шкале установленную толщину слоя.
Максимальная ширина выходной щели составляет 2 мм, позволяя; таким образом, равно-
мерно насыпать на пластинки свободные слои из обычно применяемых в колоночной
хроматографии крупнозернистых сорбентов.
г. Заполнение прибора и намазывание пластинок. При заполнении рукоятка рычага
должна быть установлена в направлении красной стрелки, выгравированной на верхней
стороне прибора. После этого загружают воду и сорбент, поворотом рычага на 90°-
закрывают и перемешивают содержимое, встряхивая весь прибор. Формовочную Массу
можно также перемешивать в фарфоровой ступке Для размельчения отдельных кусочков
массы и удаления пузырьков воздуха, после чего загрузить в прибор. Затем помещают ,
прибор на начальную пластинку шаблона и поворачивают правой рукой рычаг на 180°;
левой рукой прижимают прибор к пластинке и ожидают, пока масса не появится из
выходной щели. В это время можно смочить поверхность стекла справа от прибора влаж-
ным пальцем, чем достигается лучшее скольжение прибора, который затем перемещают
2 Заказ № 734
18
Общая часть
описанным методом над пластинками, расположенными в ряд, до конечной пластинки
и возвращают рукоятку рычага в исходное положение. При необходимости обработать
за один рабочий ход 10 пластинок (20 X 20 см) применяют второй рабочий шаблон. При-
бор заполняют удвоенным количеством массы и намазывают первый ряд до конечной
пластинки, после чего подымают конечную пластинку с находящимся на ней прибором,
помещают ее как Начальную на второй шаблон и обрабатывают следующие пластинки.
Процесс от перемешивания массы до окончания обработки пластинок должен длиться
не более 5 мин.
д. Очистка и хранение прибора для нанесения тонких слоев. Сразу после нанесения
слоя прибор промывают сильной струей воды для удаления оставшейся массы. Осла-
бив навинтную крышку втулки, вытаскивают последнюю из металлического блока.
Рис. 6. Простое и аккуратное нанесение слоя на пять пластинок на лабораторном месте.
Слева — разделительная камера с хроматограммой, за ней подставка из легкого металла
для сушки.
Таким образом можно провести тщательную очистку специальной щеточкой. Особенно
следует обратить внимание на хорошее состояние граней выходной щели: они должны
быть зеркально гладкими и не должны иметь бороздок. Поэтому чисткой и хранением
прибора должен заниматься тот же персонал, который на нем работает.
В нашей лаборатории эти приборы используются уже годами без признаков износа;
е их помощью приготовлено свыше 15 000 пластин для хроматографии в тонких слоях.
Для полноты следует отметить, что в некоторых работах были описаны
«устройства для нанесения тонких слоев», в основе которых лежит анало-
Гл. 2. Аппаратура для хроматографии в тонких слоях и ее применение 19
гичный принцип [3, 10, 11, 29, 46, 53]. Их создавали для облегчения процесса
нанесения слоя, однако они давали менее равномерные слои по сравнению
с оригинальным прибором. С помощью этих вспомогательных средств были
проведены предварительные опыты, приведшие к созданию современного
прибора для нанесения тонких слоев.
II. СУШКА, ХРАНЕНИЕ И ПЕРЕНОСКА ПЛАСТИНОК С ТОНКИМИ СЛОЯМИ
В большинстве случаев сорбент наносят на пластинки в виде водных
суспензий, после чего воду следует удалить (6—8 мл с пластинки размером
Р и с. ‘ 7. Процесс сушки свежеприготовленных слоев силикагеля Г при различных
условиях [63].
-----без вентилятора, 22°;------вентилятор, 22°;------сушильный шкаф, 110°. Стрелки
указывают стадию сушки, при которой слой перестает быть прозрачным и становится белым.
20 X 20 см). Этот процесс носит название сушки. Можно установить следую-
щие стадии удаления воды:
1) вначале поверхность слоя обладает водным блеском;
2) через несколько минут блеск исчезает и слой становится матовым;
3) после упарки примерно 50% воды слой перестает быть прозрачным
и становится совершенно белым.
На рис. 7 приведены кинетические кривые сушки слоя силикагеля Г.
Видно, что сушка занимает немало времени. Вначале основную часть воды
удаляют в токе воздуха (предварительная сушка), после чего пластинки
окончательно сушат при повышенной температуре. При предварительной
сушке свеженамазанные пластинки оставляют на шаблоне. Для создания
холодных или теплых потоков воздуха со ступенчатой регулировкой темпера-
туры применяют калориферный вентилятор «Астрон 2000», широко исполь-
зуемый в лаборатории (рис. 8) *.
Сушку завершают при повышенной температуре. Как правило, пластинки
с тонкими слоями достаточно нагревать в вертикальном положении в течение
30 мин при 110°. Для этого лучше всего воспользоваться прямоугольным
воздушным сушильным шкафом шириной не менее 42 с:м с вентилятором. Для
получения очень активных слоев пластинки с силикагелем и окисью алюми-
ния нагревают 3—4 час при 150°.
Интенсивная сушка целесообразна лишь в случае нанесения проб веществ в соот-
ветствующим образом осушенной атмосфере при работе с абсолютно сухими разделяю-
щими жидкостями. Это обычно необходимо только в случае анализа методом хромато-
графии в тонких слоях смесей углеводородов. На очень активных адсорбентах велика
опасность разложения веществ.
* Изготовитель — фирма «А. Sprenger К. G.» (Андреасберг, Гарц). .
2*
20
О&щая часть
Соображения об оптимальном периоде сушки и оптимальной температуре
«ушки связаны друг с другом. В случае хроматографического анализа поляр*’
ных веществ, например аминокислот, совершенно отказываются от предва-
рительной и горячей воздушной сушки и пластинки просто оставляют на ,
12 час при комнатной температуре. Такие пластинки обнаруживают хорошее
прилипание слоя и обеспечивают более воспроизводимые результаты анали-
Р и с. 8. Калориферный вентилятор
«Астрой 2000» для быстрой предва-
рительной сушки слоев (вид сзади).
за по сравнению с активированными пла-
стинками (см. разд. 19. II. 1).
Поскольку за один рабочий ход в боль-
шинстве случаев намазывают 5 или 10 пла-
стинок (20 X 20 см), были изготовлены
удобные и компактные подставки для суш-
ки из легкого металла (см. рис. 30), в ко-
торых пластинки располагаются горизон-
тально. Если подставку перевернуть, то
пластинки устанавливаются вертикально,
что важно для беспрепятственного удале-
ния влажного воздуха. '
Методика работы
После нанесения слоя пластинки оставляют
на шаблоне, на который направляют с помощью
вентилятора (рис. 8) поток холодного или тепло-
го воздуха. Примерно через 5 мин пластинки
перемещают в направлении, в котором произво-
дили нанесение, слоем наверх до упора в на-
правляющих пазах подставки для сушки. В та-
ком положении их еще на несколько минут ста-
вят у вентилятора, после чего подставку перево-
рачивают, чтобы пластинки стали вертикально.
Подставку для сушки с пластинками поме-
щают в сушильный шкаф, предварительно нагретый до 110°. Желательно в первые 10 мин
сушки несколько раз открывать дверцу сушильного шкафа для удаления влажного воз-
духа. Еще лучше применять сушильный шкаф с циркуляцией* И подводом свежего воз-
духа. Горячую подставку вынимают из шкафа и после-предварительного охлаждения
(2—3 мин) переворачивают в исходное положение и помещают в вакуум-эксикатор с пяти-
окисью фосфора или силикагелем. Для выравнивания давления кран эксикатора следует
открыть; полезно надеть на него короткую осушительную трубку.
Во всех случаях разделительные слои следует защищать от паров лабо-
раторной атмосферы. Для хранения 10 пластинок достаточен эксикатор.
Для хранения большего числа сухих пластинок пригодны герметичные пере-
носные ящики (емкостью 22 пластинки 20 X 20 см) или соответствующие
шкафы.
Ш. ПОДГОТОВКА ДЛЯ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО АНАЛИЗА
ПЛАСТИНОК С ТОНКИМИ СЛОЯМИ
а. Проверка высушенных слоев. При осмотре на просвет слои должны
быть равномерными, без полос и неровностей. При освещении поверхность
слоя должна выглядеть ровной и не должна содержать крупных частиц.
При испытании на прочность Сцепления проводят пальцем по слою, который
при этом не должен отрываться от пластинки. Пластинки с тонкими слоями,
имеющие изъяны на рабочей поверхности, следует использовать для предва-
рительных опытов.
б. Окаймление тонких слоев. Край, образуемый опорной поверхностью
прибора для нанесения слоя (примерно 2—5 мм), несколько тоньше. Жела-
тельно его удалить. Его аккуратно снимают, например, большим пальцем
правой руки, используя в качестве направляющего ноготь указательного
Гл. 2. Аппаратура для хроматографии в тонких слоях и ее применение 21
пальца. Это можно легко осуществить также с помощью простого приспособ-
ления, показанного на рис. 9.
в. Маркировка и надпись на слое. Для этого используют острый твердый
карандаш или иглу для препарирования. Слой слегка удаляется и делается
надпись; чтобы избежать повреждения
остальной части слоя, используют пло-
ский шаблон для надписей из прозрач-
ного плексигласа. На верхнем крае шаб-
лона выгравирован масштаб, позволяю-
щий удобнее производить отметку точек
старта на равном расстоянии. Далее на
расстоянии 15 мм выгравирована попе-
речная линия А, а на расстоянии еще
100 мм — втора!я линия Б.
Шаблон накладывают на пластинку
и затем передвигают так, чтобы линия
А на нем совпадала с нижним краем
стеклянной пластинки. По масштабу
тонким уколом отмечают места после-
дующего нанесёния смеси веществ (точ-
ки старта). Расстояние точек от края
пластинки должно составлять 15 мм
и между собой 10—20 мм. После этого перемещают шаблон до второй нанесен-
ной поперечной линии. Не следует проводить поперечную линию как «фрон-
тальную». Лучше, как и внизу, сделать на равном расстоянии отметки «точек,
ограничивакицих фронт». Вверху, в случае необходимости, указывают раз-
Рис. 9. Простейший самодельный кро-
мочный скребок из упругого материала,
например из лезвия безопасной бритвы
(ширина кромки 7 мм).
деляемую смесь или делают соот-
ветствующую пометку. Целесооб-
разно также на каждой пластинке
указать растворитель и реактив для
опрыскивания, для чего преиму-
щественно используют свободную
треть слоя.
г. Приборы для точечного нане-
сения веществ. Даже при неколи-
чественном анализе рекомендуется
использовать градуированные ми-
кропипетки. Для точечного нане-
сения особенно хороши специаль-
ные пипетки емкостью 10 ад3
с делениями через 1 мм3. Точность
калибровки у различных фирм-
изготовителей довольно сильно
отличается, и поэтому при коли-
чественном анализе рекомендуется
Повторная калибровка. За один
прием наносят максимум 5 жл3
Вещества. При большем количе-
стве пробы проводят нанесение
в одну и ту же точку несколько
Рис. 10. Количественное нанесение пробы
на тонкослойную пластинку при создании
инертной атмосферы и защите от УФ-излу-
чения.
Слева камера для нанесения пробы фирмы «Desaga»
(по Халпаапу [16]), справа микрошприц «Agla»
в держателе.
раз. При работе с водными растворами между отдельными впусками произво-
дят сушку слоя холодным или теплым поярком воздуха.
Очистку пипетки легче всего провести следующим образом: соединяют пипетку
со шлангом водоструйного наноса и короткое время просасывают соответствующий рас-
творитель, например воду, метанол, ацетон и затем воздух. Если пипетка набита, то
загрязнение высасывают через ее кончик.
22
Общая часть
Более точное нанесение очень небольших количеств жидкости можно
осуществить микрометрическим шприцем. Наиболее известной моделью
является английский микрошприц «Agla»*.B США для нанесения исполь-
зуют микро шприцы фирмы «Hamilton» **. Микрометрическое дозирующее
устройство № 550 *** работает по этому же принципу. При этом рекомендует-
ся использовать специальный штатив (рис. 10).
Примечание. Необходимо следить, чтобы наносились только прозрачные
растворы, а не суспензии кристаллов. Кристаллы растворяются в раствори-
теле очень медленно, что может привести к образованию длинных хвостов.
Такую же опасность при нанесении пробы может представить кристал-
лизация веществ в точке старта.
д. Нанесение в виде полосы больших количеств вещества для микропре-
паративной хроматографии в тонких слоях. Для получения «штриховой
Рис. 11. Сравнение эффективности разделения при различных способах нанесения
пробы для случая «штриховой хроматограммы».
а — напрыскано; б — точечное нанесение.
СцАан зеленый
б1/дан ира'-
V1?; ! :L!
хроматограммы» растворенную смесь веществ до настоящего времени наноси-
ли на линию старта в виде близко расположенных точек. Эта методика требу-
ет много времени и определенной сноровки. Часто при этом слой повреждает-
ся и, кроме того, эти начальные полосы слишком широки. После проведения
хроматографического анализа получают соответственно широкие, часто нерав-
номерные, полосы. Это затрудняет, а иногда делает невозможным соска-
бливание цеобходимого соединения.
Указанные затруднения легко преодолеть при нанесении разделяемого
раствора в виде полосы с помощью специального прибора [52]. В нашей
лаборатории для этого используют так называемый пистолет-микрошприц ***
с отверстиями 0,1—0,25 мм. Для работы пистолета-шприца вместо сжатого
воздуха выгодно использовать инертный газ, например углекислый газ или
азот. Необходимо предварительно точно отрегулировать давление, чтобы
его как раз хватило для распыления жидкости. При слишком высоком давле-
нии выдувается слой сорбента.
Пластинку на линии старта покрывают двумя толстыми стеклянными
пластинами так, чтобы образовалась щель шириной 2 мм; с расстояния 1 см
над этой щелью производят опрыскивание из пистолета. После удаления
покровных пластин проводят хроматографический анализ [63].
* Фирма «Burroughs Wellcome & Со» (Лондон).
** Фирма «Hamilton» (Калифорния).
*** Фирма «Desaga» (Гейдельберг).
Гл. 2. Аппаратура для хроматографии в тонких слоях и ее применение
23
Этим методом можно также дезактивировать стартовую полосу предвари-
тельным опрыскиванием водой, для уменьшения превращений на активных
сорбентах.
струкции камеры на вели-
чину Rf трехцветной эта-
лонной смеси.
а — без камеры; б — лотковая
камера без полного насыще-
ния; в — лотковая камера
с насыщением; г — С-камера.
О масляный желтый; 0 Судан
красный Сг; финдофенол.
IV. РАЗДЕЛИТЕЛЬНЫЕ КАМЕРЫ И НАСЫЩЕНИЕ АТМОСФЕРЫ В НИХ
Переход от колоночной хроматографии Цвета к открытым разделитель-
ным слоям привел к созданию различных систем камер. Поскольку результат
разделения, а также значение Rf, являющееся относительной величиной,
зависят от конструкции и величины камеры, этот
вопрос, которому обычно уделяют мало внимания,
требует подробного рассмотрения.
Применяемые до сих пор устройства в основ-
ном близки по конструкции к камерам, исполь-
зуемым в хроматографии на бумаге, и отличаются
от них только размером. Для более удобного обо-
зрения их можно в зависимости от методов ана-
лиза, используемых в настоящее время, подраз-
делить на:
1) камеры для восходящего разделения;
2) камеры для нисходящего разделения;
3) камеры для горизонтального разделения;
4) камеры для электрофореза в тонких слоях
(ионофореза в тонких слоях).
Для методов 1—3 в качестве конструкционного
материала камер предпочитают стекло или иногда
сталь марки V2A или, лучше, марки V4A. Ка-
меры из пластмасс могут быть использованы лишь
в некоторых случаях (метод 4) из-за неустойчи-
вости по отношению к органическим растворите-
лям. При применяемых в настоящее время разде-
лительных камерах особое внимание следует уде- ,
лить насыщенйю атмосферы камеры [60]. Суще-
ствующие здесь зависимости можно наблюдать,
проведя следующие 4 опыта.
На 4 пластинки, полученные стандартным методом из силцкагеля Г
(10 X 20 см), наносят на расстоянии 1 см от края эталонную смесь из трех
красителей (см. стр. 36).
а) первую пластинку ставят в плоскую чашку, в которую налит метилен-
хлорид слоем 0,5 см;
б) со следующими двумя пластинками повторяют опыт в лотковой камере
фирмы «Desaga» (21 X 21 X 9 см), причем один раз без специального насы-
щения камеры, только с закрытой крьйпкой, а второй раз
в) в камере, выстланной фильтровальной бумагой и предварительно опо-
лоснутой метиленхлоридом;
г) с последней пластинкой проводят опыт в разделительной С-камере.
Йа рис. 1,2 представлены результаты этих опытов.
Легко видеть, что в описанных опытах путь, пройденный веществом,
зависит от количества протекшего растворителя. В опыте а) испаряетс>я так
много вещества, что фронт метиленхлорида подымается на расстояние, равное
лишь 1 см. Поскольку метиленхлорид непрерывно подается, все три красите-
ля через короткое время находятся в области фронта. В опыте б) эффект
испарения уменьшен и растворитель проходит через 60 мин путь, равный
10 см. В С-камере [опыт г)] эффект испарения еще в большей степени подав-
24
Общая часть
лен благодаря уменьшению объема камеры; время опыта составляет только
21 мин, и количество протекшего растворителя меньше, и поэтому окрашен-
ные вещества находятся соответственно ниже. Для обычных камер отношение
площади испарения (см2) к объему камеры (см3) составляет характерную
величину, например 1 : 10, 1 : 50 и т. д.
1. НАСЫЩЕНИЕ КАМЕРЫ И КРАЕВЫЕ ЭФФЕКТЫ
При переходе от разделительных слоев шириной в 1—2 см к стандартному
формату (10 X 20 и 20 X 20 см) наблюдается, что одни и те же вещества,
находящиеся у края пластинки для ХТС, движутся быстрее находящихся
посередине (рис. 13). Эти нежелательные краевые явления наблюдаются
' * * • е • « « е • «
# t в *
Рис. 13. «Краевые эффекты» при тонкослойной хроматографии в лотковой камере
без полного насыщения.
Растворитель хлороформ + 5% метанола [60].
в нормальных камерах в случае адсорбционной ХТС, в особенности при
использовании растворителей, составленных из сильно отличающихся по
полярности веществ. Как показал Шталь, этот эффект объясняется недоста-
точным насыщением камер, а также тем, что стеклянные пластинки образуют
перегородки в разделительных камерах; поэтому растворитель с края испа-
ряется сильнее. Это происходит также, вероятно, потому, что в случае смесей,
состоящих, например, из гексана и этилацетата или из хлороформа и мета-
нола, в результате эффекта испарения с края происходит изменение кон-
центраций в сторону увеличения концентрации более полярного растворите-
ля. В первой смеси менее полярный гексан адсорбируется слабее и поэтому
испаряется быстрее, чем более полярный этилацетат. Кроме того, следует
учесть различную упругость паров компонентов растворителя.
Далее, следует отметить, что различные величины Rf на одних и тех же
пластинках для ХТС могут быть вызваны также различиями в толщине
разделительных слоев. Влияние толщины слоя на величины Rf уже отме-
чалось с 1956 г. и наблюдалось в случае толщин слоя менее 150 ц. Браннер
с сотрудниками подробно исследовал факторы, влияющие на величину Rf
[7].
Для устранения краевых эффектов необходимо равномерное насыщение
камеры парами растворителя перед хроматографическим разделением. В слу-
чае обычных камер (1 : 10—1 : 50) такое насыщение камер может быть дости-
гнуто следующим образом.
Гладкую обезжиренную фильтровальную бумагу размером 15 X 40 см,
сложенную в виде буквы U, помещают в стеклянный лоток и смачйвают пред-
варительно залитым растворителем. Пропитанную таким образом бумагу
прижимают к стенке камеры. В большинстве случаев она прилипает плотно.
Гл. 2. Аппаратура для хроматографии в тонких слоях и ее применение 25
Для лучшей фиксации можно поместить в камеру упругое кольцо из тонкой
стальной проволоки, которое прижимает бумагу. Перед тем как вставить
пластинку, фильтровальную бумагу еще раз смачивают растворителем, накло-
няя камеру.
Описанная операция носит название насыщения камеры. Насыщение
камеры, во всяком случае, не соответствует «климатизации», как ее обычно
называют в методе хроматографии на бумаге. Только при распределительной
Рис. 14. Сравнение величин Rf эталонной смеси при применении лотковой камеры
с насыщением (K.S) и без насыщения (NS) в зависимости от высоты подъема фронта
растворителя.
Слой силикагеля Г, бензол.
ХТС и при распределительной ХТС с обращенными фазами насыщение каме-
ры соответствует в значительной степени «климатизации» в том смысле, как
это понимается в хроматографии на бумаге.
Описанные вначале опыты («б» и «в») показывают, что при работе с насы-
щением камеры время работы значительно сокращается. Если исследовать
зависимость величины Rf от пройденного расстояния, то можно обнаружить,
что при нормальном насыщении существует сильная зависимость величины
Rf от высоты подъема (рис. 14). Только при работе с насыщением камеры
или при применении специально разработанных для ХТС разделительных
камер (С- и БН-камеры) можно говорить о истинных значениях величин
Rf. Тем не менее по возможности следует подбирать одинаковые пройденные
пути и приводить отклонения для длины разделительного слоя, равной 10 см
(стр. 49). Приведенные выше соображения показывают, насколько важно
строго следить за состоянием насыщения в камере для получения хорошего
разделения и сравнимых результатов. х
2. ИЗГОТОВЛЕНИЕ КАМЕР
(Температура, освещение, защита от окисления)
Как правило, работают при комнатной температуре (18—23°). Результат
разделения в случае адсорбционной хроматографии (в отличие от распреде-
лительной хроматографии) мало зависит от температуры. Следует обратить
- внимание на то, чтобы не происходило одностороннего нагревания раздели-
26
Общая часть
тельной камеры. Уже незначительная разница температур внутри камеры
(в результате освещения или из-за сквозняка) может вызвать нежелательное
«искривление» фронта растворителе.
Чаще всего работают при рассеянном дневном освещении, всегда избегая
солнечного света. Удобнее всего оклеить окно комнаты прозрачной пленкой,
не пропускающей ультрафиолетового света*. В случае светочувствительных
веществ камеру покрывают черным картонным колпаком или оклеивают ее
черной фольгой из пластмассы (например, декофиксом). Чтобы иметь возмож-
ность наблюдать фронт растворителя, оставляют на расстоянии 12 см от дна
небольшое окошечко. В случае особо светочувствительных веществ пробу
наносят в темном помещении при красном или зеленом свете.
В случае соединений, чувствительных к действию кислорода, во время
нанесения может произойти разложение, если вещества находятся на актив-
ном слое без растворителя. В этом случае необходимо поступить следующим
образом. Пластинки для ХТС помещают в соответствующей величины раздели-
тельную камеру и накрывают ее стеклянной пластинкой с отверстием, в кото-
рое вставляют шланг и пропускают углекислый газ или азот. При нанесении
пробы покровную пластинку отодвигают так, чтобы пипеткой можно было
достать предварительно маркированные точки старта. Известной защиты от
автоокисления можно достигнуть предварительным увлажнением или опры-
скиванием водой зоны старта (стр. 23).
Халпаап [16] разработал сосуд из плексигласа для нанесения пробы,
в котором предусмотрена защита от ультрафиолетового облучения, а также
имеется приспособление для создания защитной атмосферы (рис. 10). Осу-
ществить защиту от окисления в процессе снятия хроматограммы проще
всего, заполнив камеру углекислым газом. Если имеют дело с основными
веществами (окись алюминия, основные растворители), то камеру предвари-
тельно продувают азотом и открывают крышку только на короткое время
установки пластинки для ХТС..
3. КАМЕРЫ ДЛЯ ВОСХОДЯЩЕГО ХРОМАТОГРАФИРОВАНИЯ
а) Прямоугольные камеры
Современные стандартные прямоугольные стеклянные сосуды в большин-
стве случаев имеют недостаточно отшлифованные края и поэтому их невоз-
можно герметично закрыть. Этот и другие недостатки устранены в специ-
ально изготавливаемой для этой цели фирмой «Desaga» камере (21 X 21 X
х9сж)с широкими утолщенными краями и плоско пришлифованной стеклян-
ной крышкой. Объем этой камеры составляет около 4 л.
Методика работы
В предварительно тщательно очищенную и высушенную камеру наливают 80—
100 мл применяемого растворителя. Затем камеру устилают фильтровальной бумагой, как
описано на стр. 24. Для экономии растворителя можно положить на дно камеры две
стеклянные пластинки (толщиной 0,5—0,8 см, длиной 20 см и шириной 2,5 см)
(рис. 15, б). Следует обратить внимание на то, чтобы пластинки для ХТС при помещении
их в камеру были равномерно погружены в растворитель. Две пластинки (20X 20 см)
можно поместить в виде буквы V; с помощью стойки из стали марки V2A можно поме-
стить в камеру до 5 пластинок. При этом расстояние между пластинками должно состав-
лять не менее 0,5 см. Важно, чтобы на непокрытую сорбентом заднюю сторону пластинки
был помещен кусок фильтровальной бумаги, смоченной растворителем (насыщение
камеры). Ее следует погрузить в растворитель. Для бокового крепления пяти пластинок
Бреннер и Нидервизер [6] предлагают простой держатель, который легко можно
изготовить самостоятельно из стеклянной палочки, придав ей волнообразную форму.
* Изготовитель «Fabriek van Chemische Producten Vondelingenplaat» (Голландия).
Гл. 2. Аппаратура для хроматографии в тонких слоях и ее применение 27
Рис. 15. Разделительные камеры и насыщение.
а — лотковая камера с нормальным насыщением (NS). <Исходящие из сорбционного слоя
стрелки должны символизировать испарение растворители, а точки изображают плотность
пара.); б — лотковая камера, насыщенная путем пропитки обклеивающей фильтровальной
бумаги (KS); в — уменьшение объема в С-камере.
В случае пластинок для ХТС шириной 5 и 10 см можно также использовать цилиндри-
ческие стеклянные стаканы с пришлифованными пробками или достаточно большие стек-
лянные банки.
б) С-камера [63]
При стандартных опытах, в особенности для количественных определений,
микропрепаративных работ, а также для определения величины Rf 20—35
веществ наиболее удобными оказались пластинки шириной 40 см (высота
Рис. 16. С-камера с тонкослойной хроматограммой [63].
20 см). Однако разделительных камер для пластинок такой величины нет
в продаже.
Необходимого уменьшения объема камер проще всего достигнуть, исполь-
зуя пластинку для ХТС в качестве задней стенки камеры. Покровное стекло
такого же размера (пластина на раме) с боковыми приклеенными стеклянны-
ми полосами (шириной 0,5 см и толщиной 0,3 см) служит в этом случае в каче-
стве передней стенки (рис. 15, в и 16). Обе пластины прижимаются друг
к ДРУгу двумя боковыми зажимами. Эта разделительная С-камера уста-
навливается затем в лотке, заполненном растворителем. Лоток камеры состо-
ит из двух вставленных одна в другую гильз, изготовленных из стали марки
' 28 _________________________ Общая .часть
U4A. Внешняя гильза снабжена щелями разных размеров и обеспечивает
таким образом установку Пластинок различной ширины. Лоток длиной 20 см
пригоден для установки пластинок шириной 10 и 20 см, а лоток длиной
40 см пригоден для пластинок шириной 20 и 40 см.
В случае С-камер, а также БН-камер не требуемся специальное насыщение
камеры. Кроме того, экономия растворителя весьма велика: для С-камеры
длиной 20 см требуется 15 мл, для камеры длиною 40 см —30 мл. В заклю-
чение следует отметить, что при использовании таких камер процесс разделе-
ния можно снимать на кинопленку.
Методика работы
Перед нанесением пробы с пластинок для ХТС с обеих сторон скребком (рис. 9)
удаляют слой шириной 7—10 мм. Необходимо* чтобы на краях пластинки не осталось
никаких частичек, так как в противном случае невозможно хорошее уплотнение. После
нанесения пробы накладывают покровные стекла, снабженные справа и слева двумя
широкими зажимами. Полученную таким образом «камеру» вставляют в кольцеобразный
лоток, заполненный растворителем, Для вертикальной установки стеклянной камеры
в конец кольцеобразного лотка вставляют вилкообразный держатель. После этого осто-
рожным вращением и вытягиванием внешней гильзы щель лотка сужают так, чтобы
стеклянная камера была плотно закреплена в нем.
Для очистки лотковых С-камер внешнюю гильзу снимают. После этого раство-
ритель легко вылить.
4. УСТРОЙСТВА ДЛЯ НИСХОДЯЩЕГО ХРОМАТОГРАФИРОВАНИЯ
Следует предупредить, что этот метод не имеет никаких преимуществ
в отношении эффективности разделения и времени анализа по сравнению
с восходящим методом. Кроме того, возни-
Рис. 17. Большая пробир-
ка с боковым отводом для
нисходящего хроматогра-
фирования на узких тонко-
слойных пластинках (по
Стенли и Ваниру). '
кают определенные затруднения при созда-
нии рациональной конструкции прибора.
Приспособление для узких пластинок
(«Chromatostrips») было описано Стенли
Рис. 18. Стойка для промывки тон-
кослойных пластинок по Стенли cjco-
трудниками.
Растворитель находится в ванне (наверху)
и подводится к тонкослойным пластинкам
с помощью фильтровальной бумаги. Скоба
прижимает бумагу к пластинкам.
и Ваниром [66]. Детали видны из рис. 17. В случае наиболее распро-
страненных в настоящее время широких Пластинок для ХТС удачным реше-
нием проблемы является помещаемый над пластинкой лоток с полосой филь-
Гл. 2. Аппаратура для хроматографии в тонких слоях и ее применение
29
тровальной бумаги. Для этого можно использовать описанное Стенли, Вани-
ром и Джентили [65] приспособление для предварительного промывания
сорбционных слоев (рис. 18). Находящийся в лотке растворитель движется
через полоску фильтровальной бумаги и попадает на сорбционный слой.
Скорость подачи растворителя можно регулировать толщиной и сортом
фильтровальной бумаги. Для уменьшения испарения растворителя описанное
устройство необходимо поместить в герметичный сосуд. В период издания
настоящей книги были описаны и другие устройства для нисходящего хро-
матографирования [4].
5. УСТРОЙСТВА ДЛЯ ГОРИЗОНТАЛЬНОГО ХРОМАТОГРАФИРОВАНИЯ
В то время как в случае адсорбционных слоев, прочно пристающих к пла-
стинкам, можно работать, используя описанный метод, в случае свободно
насыпанных на пластинку разделительных слоев требуется горизонтальное
или близкое к горизонтальному положение пластинки. В зависимости от спо-
соба подачи растворителя и способа нанесения пробы, следует различать
следующие методы:
Название метода Подача растворителя Зоны после разделения
а Круговой метод (круговая хроматография) Точечная (в центре) Кольцевые
б Горизонтальный метод (за- крытые или открытые каме- ры) В виде полосы В виде пятен или полос в зависимости от способа нане- сения пробы
в Проточный метод В виде полосы В виде пятен или полос в зависимости от способа нанесения пробы
а) Круговой метод
В простейшей форме круговая хроматография была использована Измай-
ловым и Шрайбер еще в 1938 г. Они наносили на слой каплю исследуемой
жидкости и затем добавляли в центр по каплям раствори-
тель. Так были получены первые круговые хроматограммы "ТГй
(см. рис. 1). Точно так же без камеры работали по этому pl
методу Майнхард и Холл *. Весьма удобна сконструирован- ?•<
ная ими пипетка для растворителя (рис. 19). Эту пипетку I
устанавливают в центре, куда предварительно была нанесена L
в виде капли исследуемая проба. Как ’ показал в 1958 г. ч.
Шталь, микрокруговой метод пригоден для быстрого подбора
необходимого растворителя (рис. 20). Вследствие быстрого
испарения получают, однако, круговую хроматограмму раз- "" j
мером только в 1—2 см. При использовании кругового | \\
Р и с. 19. Самостоятельно устанавливаемая пипетка для получения I
круговых хроматограмм (по Майнхарду и Холлу [34]). '
метода следует работать в замкнутых камерах, насыщенных парами раствори-
теля. Для сорбентов, прочно пристающих к пластинке, пригодны две просто
* Круговой метод на свободных слоях использовали Лагони и Бортман [27, 28].
30
Общая часть
изготавливаемые камеры (рис. 21). Оба приспособления (а и б) обеспечивают
хорошее насыщение камеры и являются, таким образом, типичными пред-
шественниками С- и БН-камер.
Метод а можно описать следующим образом. Накладывают пришлифованную стек-
лянную пластинку 1 со слоем 2, обращенным внутрь, на чашку Петри соответствующего
диаметра, содержащую растворитель (7).Контакт
Г0Ш№
между растворителем и слоем осуществляется там-
поном ваты, свернутым в виде фитиля (5). Разде-
ляемую смесь наносят на расстоянии 1 см от этого
отверстия (4). Для сравнения можно также на-
носить ряд веществ па один и тот же слой.
Четырех-
хлористый
углерод
Метилен-
хлорид
Р и с. 21. Схематическое изображение двух уст-
ройств для хроматографии в тонких слоях при
Рис. 20. Хроматограммы двух
различных смесей красителей, но-
лученные микрокруговым мето-
дом [56].
Для разделения больших коли-
честв используют метод б с предва-
рительной «колонкой». Здесь разде-
лительный слой расположен сверху,
использовании кругового метода.
а — для большого числа смесей веществ (до 8); б—для
одной смеси, с небольшой колонкой для предваритель-
ного разделения. 1 — пластинка 20 X 20 см; 2 — сорб-
ционный слой; .3—отверстие диаметром 2 *н; 4—место
нанесения пробы; 5 — ватный фитиль; 6 — чашка
Петри; 7—растворитель; 8 — ватный тампон, 9 — при-
клеенная полоска стекла [57].
а растворитель (7) подается с помощью
ватного тампона (S) через форколонку (3) в слой (2). Вещество предварительно на-
носится па непокрытую слоем сторону форколопкп (4). Для уменьшения чрезмерного
испарения кругообразного расширяющегося пятна растворителя необходимо закрыть
слой. Для этого используют вторую пластинку размером 20 X 20 см без отверстия; по
краям пластинки приклеены стеклянные полосы шириной 5 мм и толщиной 3 мм, обра-
зующие нечто вроде рамы (9).
б) Метод горизонтальных закрытых камер
Только что описанный круговой метод редко используется при ХТС.
Эта методика проста и дает тонкое разделение, однако визуальное определе-
Опор
Старт
Пластинка
для ХТС
(слоем вниз)
Р и с. 22. Простейшая камера
для горизонтального
хроматографирования.
пие (сравнение величины зон) в случае точечной или штриховой хроматограм-
мы является более удобным.
Простейший метод горизонтальных камер с подводом растворителя в виде
полосы показан на рис. 22. В стеклянной камере находится тонкий слой
Гл. 2. Аппаратура для хроматографии в тонких слоях и ее применение
31
растворителя. Полоса толстого стекла или стеклянный стержень, обмотанный
несколько раз фильтровальной бумагой, используется для подачи растворите-
ля к слою. Стеклянная палочка или трубочка образует вторую опору. Такое
или сходное устройство обеспечивает хорошее насыщение камеры. Для сво-
бодно насыпанных слоев подобная конструкция описана Мистряковым
[391.
в) Проточный метод (QH-камера)
Если при обычной длине пути в 10—18 см пятна веществ лежат слишком
близко друг к другу, то требуемая степень разделения может быть достигну-
та при удлинении «разделительной дорожки». Простейшее решение этой
Рис. 23. БН-камера (по Бреннеру и Нидервизеру).
1 — пластинка со слоем; 2 — покровная пластинка; з — полоса фильтровальной бумаги; 4J— лоток
с растворителем; 5 — зажим (схематично); в — пробковое кольцо в качестве основания камеры.
задачи обеспечивает описанный Бреннером и Нидервизером [6] проточный
метод. Количество протекшего раствора при этом удается увеличить благо-
даря тому, что после прохождения определенного пути в закрытой камере
(1': 0,1) переходят к открытой камере
(1 : со). В незакрытой области раст-
воритель испаряется и таким обра-
зом осуществляется непрерывный
подвод (рис. 23). -
Устройство БН-камеры напоми-
нает устройство С-камеры, применяе-
мой при восходящем методе. Здесь
также необходимо покровное стекло
с двумя боковыми приклеенными сте-
клянными полосками, причем края
пластинки для ХТС шириной 6 мм не (
должны содержать слоя сорбента.
Скрепление осуществляется прочны-
ми зажимами. Небольшой лоток, из-
готовленный из нержавеющей сталд,
имеет плоско отшлифованные края
и служит для хранения растворителя.
Последний поступает через полосу
фильтровальной бумаги на раздели-
тельный слой, проходит его до конца
пластинки и там испаряется. В ре-
зультате непрерывно подается под-
вижная фаза и образуется проточная
хроматограмма. При сильных изме-
нениях комнатной температуры иног-
да можно наблюдать конденсацию
растворителя на покровной пластинке.
В этом случае ее нагревают ладонью
руки.
Рис. 24. БН-камера (по Бреннеру
и Нидервизеру).
а — размеры полосы фильтровальной бумаги и
линии сгиба; б.— полоса фильтровальной бума-
ги, монтированная на покровной пластинке;
в — готовое устройство, обозначения 1—в те
же, что на рис. 23; 7 — боковой зажим (схемати-
чески); 8 — наклеенные с боков стеклянные
полоски; 9 — трубочки для выравнивания да-
вления в лотке.
32
Общая часть
Методика работы
Подготовка пластинок для ХТС (20 X 20 см) осуществляется так же, как в случае
С-камер. Затем нарезают обезжиренную фильтровальную бумагу (например, ватман № 1)
по размеру, показанному на рис. 24, а, складывают один раз по линии cd и кладут поверх-
ностью abed на переднюю часть покровного стекла (рис. 24,6). Полоса бумаги не должна
касаться боковых краев покровной пластинки, и расстояние ab от переднего края плас-
тинки должно составлять только 1—3 мм (точка старта 15 мм от края). Предварительно
фиксируют это положение. Затем пластинку для ХТС (с нанесенной пробой) приклады-
вают к покровной пластинке. Тонкослойная и покровная пластинки прижимаются друг
к другу сильными зажимами. После этого удаляют зажим, служивший для фиксации
бумажной полосы, и сгибают бумажную полосу по линии ef (рис. 24, б). Все устройство,
согласно рис. 24, в, прочно соединяют с лотком двумя другими зажимами. Через поли-
этиленовую трубочку лоток заполняют растворителем (15 ± 5 мл). Легким покачива-
нием достигают равномерного смачивания полосы бумаги. Затем БН-камеру помещают
на пробковое кольцо (рис. 24, 6).
В случае проточной хроматографии иногда целесообразно добавить в рас-
творитель окрашенную или флуоресцирующую эталонную смесь для контро-
ля хода процесса.
6. КАМЕРЫ ДЛЯ ЭЛЕКТРО- ИЛИ ИОНОФОРЕЗА
В ТОНКИХ СОРБЦИОННЫХ СЛОЯХ
С 1946 г. Консден, Гордон и Мартин использовали силикагель в качестве
носителя для электрофоретического разделения аминокислот и пептидов.
После того как получение тонких слоев мелкозернистых сорбционных мате-
риалов перестало быть трудной задачей, этот метод был подхвачен. Хонегге-
ром (тонкослойный ионофорез [19]), с одной стороны, и Пастуска и Тринк-
сом (тонкослойный электрофорез [43, 44])— с другой. Оказалось, что тон-
кие чисто органические мелкозернистые сорбционные слои превосходят при-
менявшиеся до сих пор слои из целлюлозной бумаги (разд. 19 VI). На рис.
25 показано не совсем удовлетворительное, однако просто изготавливаемое
устройство для тонкослойного электрофореза с градиентом напряжения
20 в/см. Более высоким требованиям удовлетворяет устройство, описанное
Рис. 25. Устройство для тонкослойного электрофореза (по Пастуска и Тринксу).
1 — пластинка со слоем; 2 ~ покровная пластинка; 3 — полоски фильтровальной бумаги;
4 — электроды; 5 — миллиамперметр.
S
Хонеггером. Готовят слой из обычного сорбента с размером зерен 250 р. При
изготовлении наносимой массы можно сразу вместо воды применять буфер-
ный раствор. Перед употреблением слои должны быть равномерно увлажне-
ны. Для этого слои опрыскивают буферным раствором, пока они не станут
прозрачными (влажный блеск поверхности). На влажном слое отмечают точку
старта на расстоянии 5—10 см от анодного края и наносят смесь веществ
(13—17). На рис. 26 схематически изображено устройство, описанное Хонег-
гером.
Подставкой (I) служит отполированный металлический блок (40 X 40 см),
охлаждаемый проточной водой, проходящей через каналы внутри блока.
Гл. 2. Аппаратура для Хроматографии в тонких слоях и ее Применение 33
Блок для изоляции покрыт полиэтиленовой пленкой толщиной 0,2 мм. На
середину блока помещают увлажненную пластинку для ХТС (2). Слева
и справа помещают стеклянные пластинки одинаковой толщины (5 X 20 см)
(3) и на каждую из них накладывают полосы фильтровальной бумаги разме-
ром 8X19 см, смоченные буферным раствором (4). Бумажные полосы должны
быть строго одинаковыми по размеру, с помощью ручного валика их прочно
прижимают к пластинкам (3). С каждой стороны (анодная и катодная сторона)
они должны покрывать пластинки для ХТС на расстоянии 0,5—1 см. Их
другие концы лежат на полиэтиленовой пленке. Прохождение тока между
Рис. 26. Устройство для тонкослойного ионофореза (по Хонеггеру).
Подробности в тексте.
электродным сосудом (5) и проводящими полосками (4) обеспечивается
целлофановым рукавом, содержащим марлю, увлажненную буферным раство-
ром (б). Над пластинками (4, 2, 4) помещают раму из плексигласа (иногда
с наклеенной крышкой) с поперечными планками (7 шириной 10 мм и 8 шири-
ной 7 мм). Эти поперечные планки прижимают места стыков и обеспечивают
таким образом хороший контакт. Все устройство покрывают стеклянной
пластинкой размером примерно 35 X 25 см.
При разделении аминов и аминокислот Хонеггер работал с напряжением
440 или 460 в (19,6 или 12,6 ма) и в случае необходимости пропускал ток
в течение часа. После сушки пластинок можно осуществить распределительно-
или адсорбционнохроматографическое разделение (разд. 19, VI). После
этого вещества на хроматограмме можно обнаружить обычными индикато-
рами.
V. ПРИСПОСОБЛЕНИЕ ДЛЯ ОПРЫСКИВАНИЯ И ВЕНТИЛЯЦИИ
Особым преимуществом неорганических разделительных слоев является
возможность обнаружения веществ путем опрыскивания агрессивными реак-
тивами. Небольшие размеры хроматограммы требуют тонкого диспергирова-
ния наносимого реактива. С помощью оцрыскивателей, которые используют
в хроматографии на бумаге, этого обычно нельзя достичь. Поэтому целесооб-
разно применять пульверизаторы высокого давления с тонкими соплами.
Из многочисленных опрыскивателей лучше всего зарекомендовало себя
устройство из двух деталей * с сосудом для жидкости емкостью 10 мл (рис.
27). При этом можно контролировать количество реактива для опрыскивания.
* Изготовитель— фирма «Desaga» (Гейдельберг).
3 Заказ № 734
34
Общая часть
Если отсутствует компрессор, то применяют баллон с сжатым воздухом
с вентилем тонкой регулировки. Сжатый воздух, освобожденный от масла,
легче всего получить, применяя высокопроизводительный мембранный насос
(рис. 28). Другие возможности описаны в гл. 23.
Рис. 27. Прибор для опрыски-
вания из двух частей, исполь-
зующий сжатый воздух (фирма
«Desaga»).
Рис. 28. Мембранный насос для со-
здания давления воздуха, очищенного
от масла (насаживается на универ-
сальный мотор «Мультификс»),
Очистка опрыскивателя. При применении реактивов для опрыскивания,
содержащих хлориды сурьмы, опрыскиватель промывают хлороформом или
четыреххлористым углеродом, после чего на несколько часов помещают
Рис. 29. Кабина для опрыскивания из тровидура, смонтированная в вытяжном шкафу.
а — вид спереди (заштрихована стойка для установки хроматограммы); б — вид сбоку
(разрез). Дополнительно показано приспособление для опрыскивания под давлением
воздуха.
в царскую водку (широкогорлая склянка с пришлифованной пробкой). Осад-
ки растворяют в 20 %-ном едком натре.
Образование тумана агрессивных реактивов требует хорошей вентиля-
ции. Часто возникающие при этом трудности могут быть преодолены сле-
дующим образом.
а. Если имеется большой шкаф с плохой тягой, от которого идет большое
число вытяжных коробов, то подключают кабину для опрыскивания, сварен-
ную из кислотоупорной пластмассы, к одному из них, закрыв все остальные
Гл. 2. Аппаратура для хроматографии в тонких слоях и ее применение 35
короба (рис. 29). В кабину помещают стойки из.пластмассы, на которые ста-
вят пластинки.
б. Если тяга вообще отсутствует, то за окно выставляют трубу из пласт-
массы диаметром около 25—30 см и монтируют в ней кислотоупорный и взры-
вобезопасный вентилятор. К этой трубе затем подключают кабину для опры-
скивания.
VI. СТАНДАРТНЫЕ УСЛОВИЯ ДЛЯ ХРОМАТОГРАФИИ В ТОНКИХ СЛОЯХ I
Стандартизация хроматографии в тонких слоях чрезвычайно важна.
Ниже приведены проверенные и оправдавшие себя стандартные условия.
Формат пластинки: 200 X 200 мм, 100 X 200 мм (для предва-
рительных опытов) *, 400 X 200 мм (стандартные опыты, микропрепаратив-
ное разделение).
Толщина сорбционного с'л о я (при нанесении слоя, перед
сушкой) ** 250 р для аналитических целей; 500 р, и 750 р, для. специальных
задач и для микропрепаративного разделения.
Сушкаслоя:
Предварительная сушка с помощью вентилятора 10 мин, сушка горячим
воздухом в вертикальном положении 30 мин при 110°.
Хранение: . - . >
Для защиты от паров лабораторной атмосферы хранить над силикагелем
в герметичном ящике. ,
Точка старта:’
15 мм от нижнего Края (расстояние пятен друг от друга 10 или 15 мм).
Длина пути пр од вижения пятна:
100 мм (старт — фронт).
Разделительные камеры:
а) Камеры с тщательно пришлифованными стеклянными крышками и на-
сыщением атмосферы камеры; б) С-камеры; БН-камеры.
Глубина погружения слоя в растворитель: около
5 мм.
Сорбенты:
Стандартизованйые сорбенты, разработанные для определенной мето-
дики (см. стр. 39).
Эталонные вещества:
Применяют имеющийся обычно в продаже 2—3 чистых хорошо окрашен-
ных или флуоресцирующих вещества, которые хорошо разделяются в обла-
сти величины Rf 0,2—0,8, например эталонная смесь трех красителей (масля-
ный желтый, судан красный G, индофенол). (Проверенные «методики рабо-
ты» на предыдущих и последующих страницах выделены мелким шрифтом).
VII. ОСНОВНОЕ ОБОРУДОВАНИЕ ДЛЯ ХРОМАТОГРАФИИ В ТОНКИХ СЛОЯХ
Для потребностей современных лабораторий составлен необходимый
основной набор рабочих приспособлений для хроматографии в тонких слоях,
не принадлежащий к обычному оборудованию ***. Этот набор позволяет
использовать метод непосредственно, избегая тяжелого и дорогостоящего
пути самостоятельного изготовления приборов. Такой набор обеспечивает
также стандартизацию метода, что весьма важно при проведении анализов.
* Рекомендуемые в настоящее время вновь небольшие форматы (предметное стекло
и т. д.) пригодны лишь для проведения специальных анализов.
♦♦ При сушке слоя происходит усадка, степень которой зависит от величины частиц
сорбента. Слои силикагеля Г толщиной 275 рпри нанесении имеют после сушки тол-
щину около 150 ц.
*** Изготовитель — фирма «Desaga» (Гейдельберг).
3*
36
Общая часть
Набор № 600 (рис. 30), изготавливаемый фирмой «Desaga», состоит из
следующих частей:
1 — приспособление для нанесения тонких слоев марки DS 200/0 — 2 с
регулировкой толщины слоя;
2 — рабочий шаблон из пластмассы длиной 1,1 м, например для 5 пла-
стинок размером 200 X 200 мм;
Рис. 30. Основное оборудование для тонкослойной хроматографии.
Цифры относятся к отдельным деталям, перечисленным в тексте.
3—10 стеклянных пластинок-носителей (200 X 200 мм) одинаковой тол-
щины, а также начальная и конечная пластины (50 X 200 мм);
4 — прямоугольная стеклянная камера с утолщенными краями и при-
шлифованной стеклянной крышкой;
5— шаблон для надписей из плексигласа с выгравированным масштабом,
линией старта и линией фронта;
6'— стойка для сушки из легкого металла для 10 пластинок размером
200 X 200 мм или 20 пластинок размером 200 X 100 мм;
7— две специальные градуированные пипетки каждая емкостью 10 .и.й3;
8— склянка с эталонной смесью (масляный желтый, суДан красный G
и индофенол) для определения активности силикагеля и окиси алюминия,
а также для первых хроматографических опытов;
9— банка с 500 г силикагеля Г для ХТС по Шталю фирмы «Merck».
ДОПОЛНЕНИЕ К ОСНОВНОМУ НАПОРУ
Специальный опрыскиватель (из двух частей), подключаемый к источнику
сжатого воздуха, со шлифом NS24, емкостью 10 мл (рис. 27) или с колбой
Эрленмейера емкостью 50 мл.
С-камера по Шталю для пластинок 10 X 20 и 20 X 20 см, а также для
пластинок шириной 20 и 40 см (состоит из лотка с держателем, покровной
пластинки с припаянной стеклянной полоской и двух зажимов).
БН-камера по Бреннеру и Нидервизеру для пластинок размером 20 X
X 20 см, состоящая из лотков из стали марки V2A, покровной пластинки
и зажимов.
Вакуум-эксикатор модель «Новус» с краном (диаметр 30 см) для хране-
ния стойки с пластинками.
Для лабораторий, которые лишь изредка применяют метод ХТС, этой
же фирмой разработан «малый набор» для ХТС.
ГЛАВА 3
СОРБЕНТЫ ДЛЯ ХТС
Д. Валъди
Под сорбентами подразумевают все твердые вещества, используемые
в колоночной хроматографии для заполнения разделительных трубок. Наря-
ду с собственно адсорбентами, играющими активную роль в разделительном
процессе, к сорбентам относят инертные носители, а также химически реаги-
рующие обменники.
Часто бывает трудно определить, сводится процесс разделения веществ
к обменному действию, адсорбции или распределению, и во многих случаях
эти эффекты взаимно налагаются. Не следует ограничиваться также рас-
смотрением только одних сорбентов, не обращая внимания при этом на
физико-химические свойства разделяемых веществ и растворителей для
хроматографического разделения [68].
На рис. 31 показано, как взаимосвязаны сорбент, разделяемые вещества
и растворитель, т. е. какое влиянии оказывают эти факторы друг на друга,
что обозначено двухконечными стрелками. Действие, с одной стороны, дви-
жущей силы (например, капиллярных сил или силы тяжести), перемещающей
избыток растворителя вперед, а с другой стороны, взаимодействие сил этих
трех факторов приводят к тому, что каждое из соединений'перемещается
с характерной для него скоростью.
При выборе сорбентов на практике исходят из свойств разделяемых
веществ. Вначале рассматривают растворимость хроматографически разделяе-
мых веществ, т. е. устанавливают, обладают ли они гидрофильными (раство-
римы в воде) или гидрофобными (растворимы в жирах) свойствами, которые
в основном определяются числом и природой функциональных групп (С/О-
индекс).
После этого определяют, какими свойствами — основными, кислыми или
нейтральными — обладает соединение и не существует ли амфотерный ион.
Наконец, следует проверить, может ли соединение химически реагировать
с сорбентом (или растворителем) и возможны ли химические изменения сое-
динения под действием сорбента или связующего материала.
Учитывая сказанное выше, разработаны три сорбента: силикагель Г по
Шталю для хроматографии в тонких слоях *, окись алюминия Г по Шталю
для хроматографии в тонких слоях *, кизельгур Г по Шталю для хромато-
графии в тонких слоях
Силикагель Г, согласно прописи на стр. 39, образует прочно прилипаю-
щий высокоактивный кислый ** слой носителя. Этот слой пригоден в первую
очередь для разделения не слишком гидрофильных, нейтральных и кислых
веществ. При соответствующем выборе растворителя (см. стр. 139) можно
* Фирма «Merck» (Дармштадт); подробности см. в каталогах этой фирмы.
*♦ Название «кислый» в случае силикагеля или «основной» в случае окиси алю-
миния относится не к измеренному значению pH, а к свойствам сорбента по отношению
к сильному основанию или сильной кислоте, удерживаемым в точке старта вместе с ней-
тральным растворителем.
38
Общая часть
хроматографически разделить также и основные соединения (например,
алкалоиды), а также гидрофильные соединения.
Наряду с выбором растворителя (кислые или основные добавки) имеется
возможность воздействовать на сорбент режимом сушки (воздушносухие слои,
Рис. 31. Взаимное влияние <<вап-дер-ваальсовых» сил в хроматографической среде
(ср. схему на рис. 69).
А — адсорбент; Р — растворитель; С — соединение (вещество).
более длительное время экспонированные на воздухе, активные слои), а также
с помощью специальных добавок (см. стр. 45).
Окись алюминия Г образует прочно прилипающий активный слабооснов-
ной слой носителя, пригодный в первую очередь для разделения нейтральных
Разделяли смесь 4 жирорастворимых красителей с использованием бензола в качестве раствори-
теля. Силикагель г обнаруживает наибольшую активность и дает наилучшие результаты разде-
ления.
и основных соединений (см. алкалоиды, гл. 14). Свойства этого сорбента мож-
но также изменить соответствующим подбором растворителя, сушкой и добав-
лением определенных веществ, после чего он, естественно, может быть исполь-
зован для разделения разных соединений.
В настоящее время фирмы «Fluka» (Швейцария) и «Woelm» [72] готовят
окись алюминия и другие сорбенты для хроматографии в тонких слоях,
обладающие значительно меньшим средним размером частиц и соответствен-
но большим временем прохождения разделяемых веществ.
Гл. 3. Сорбенты для ХТС 39
Кизельгур Г дает практически неактивный нейтральный прочно прили-
пающий слой носителя, предназначенный в первую очередь для четкого
разделения сильно гидрофильных соединений, а также амфотерных ионов.
Для разделения триглицеридов, кетокислот, лактонов, жирных оксикислот
Кауфман с сотрудниками [22, 23] разработали в настоящее время кизельгур
Г, пропитанный высококипящими нефтяными фракциями. Для разделения
антиокислителей Майер [35] применил смесь силикагеля Г и кизельгура
Г (2 + 1 или 25 4~ 5).
Нам удалось разделить ряд трудно разделяемых классов соединений,
например барбитуровых кислот, сахаров и красящих веществ, на смеси сили-
кагеля Г и окиси алюминия Г* (1 + 1).
1. ДРУГИЕ СВОЙСТВА СОРБЕНТОВ
Активность силикагеля Г и окиси алюминия Г в первую очередь зависит
от активной поверхности частиц, т. е. зернения^ и от диаметра пор, возникаю-
щих при образовании силикагеля. Чем меньше частицы, тем больше активная
поверхность. Как уже известно на примере колоночной хроматографии,
скорость продвижения фронта является функцией размеров частиц. Мелкие
частицы требуют длительного времени разделения, крупные частицы более
короткого, однако при этом наблюдается худшее разделение. Стандартизация <
сорбентов является весьма труднойзадачейЛоэтому следует считать^ что все
'без исключения значения Rf являются лищьрриентировочйыми (применение
этйлОНнбй смеси, см. стр. 36).
При разделении на указанных выше сорбентах следует, далее, учитывать,
что имеется еще связующий материал, который может оказать влияние на
разделительные свойства. Имеется в виду сульфат кальция, который, напри-
мер, прочно удерживает на линии старта ионы фосфорной кислоты. В таких
случаях приготовляют слои, не содержащие гипса, или пользуются органи-
ческим связующим.
Приготовление масс из силикагеля Г, окиси алюминия Г и кизельгура
Г фирмы «Merck» для 5 пластинок размером 20 X 20 см при толщине слоя
250 р.
25,0 г адсорбента насыпают в сухую фарфоровую ступку диаметром при-
мерно 10 см. При медленном перемешивании добавляют вначале 35 мл дистил-
лированной воды и растирают до образования однородной массы, не содержа-
щей пузырьков воздуха и комков. Только после этого добавляют еще 15 мл
дистиллированной воды также при перемешивании. Суммарное время пере-
мешивания не должно превосходить 100 сек. Затем быстро заполняют суспен-
зией цилиндр и проводят операцию нанесения слоя.
Можно также сорбент вместе с двойным по весу количеством воды загру-
зить в цилиндр для нанесения слоя, закрыть цилиндр путем поворота на 90°
гильзы и тщательно взболтать массу.
2. ДРУГИЕ СОРБЕНТЫ И КОМБИНАЦИИ СОРБЕНТОВ
Существует ряд веществ, описанных, например, в главе о витаминах, кото-
рые на высокоактивных адсорбентах претерпевают химические превращения.
Поэтому для витамина А рекомендуют силикагель Г, пропитанный парафи-
новым маслом [71], или смесь силикагеля Г с фосфатом кальция (1 4- 1).
Для каротиноидов пригодна смесь гидроокиси кальция и силикагеля (6 4-
+ 1), вторичный фосфат магния или чистая гидроокись кальция [71].
♦ В ФРГ носит название алусила.
40
Общая часть
Длгя неорганической ХТС необходим силикагель *, очищенный от желе-
за (см. гл. 22). Хессе с сотрудниками [18] предложил в качестве сорбентов
соединения на базе гидроокиси железа, а также угли.
Среди органических сорбентов следует назвать целлюлозные порошки
фирмы «Macherey, Nagel <S Со» (Дюрен).
а) Сорта без добавки гипса Емкость, м&кв/г
MN 300 MN 300 Ас Обычная целлюлоза Ацетилированнан целлюлоза (около
MN 300 СМ 10%) Карбоксиметилцеллюлоза -0,7
MN 300 Р Фосфорилированная целлюлоза —0,7
MN 300 DEAE Диэтиламиноэтилцеллюлоза -0,7
MN 300 ECTEOLA Анионный обменник -0,35
MN 300 G б) Сорта с добавкой гипса Обычнан целлюлоза
MN 300 G/Ac Ацетилированная целлюлоза, (около < —
MN 300 G/CM 10%) Карбоксиметилцеллюлоза -0,7
MN 300 G/P Фосфорилированная целлюлоза -0,7
MN 300 G/DEAE Диэтиламиноэтилцеллюлоза -0,7
MN 300 G/ECTEOLA Анионный обменник ~ 0,35
Методика работы
При приготовлении, разделительных слоев используют прибор, описанный на стр. 16.
Перед нанесением следует тщательно очистить стеклянную пластинку. Весьма полезна
промывка пластинок концентрированным раствором соды с последующим ополаскива-
нием дистиллированной водой. Для получения совершенно гладких слоев целесообразно
перемешивать суспензию электрической мешалкой в течение примерно 1 мин.
Ниже следуют проверенные, однако не обязательные указания в отношении опера-
ции смешения для нанесения слоя на 5 стеклянных пластинок размером 200 X 200 см,
а также указания в отношении температуры и времени сушки.
MN 300 или MN 300 G (обычная целлюлоза, сорт 300 G с добавлением гипса)
15 г порошка + 90 мл диет. воды. Сушка намазанных пластинок
10 мин при 105°.
MN 300 Ас или MN 300 G/Ac (ацетилированная целлюлоза, сорт 300G/Ac с добавкой
гипса)
10 г порошка + смесь из 50 г метанола и 5 мл диет. воды. Сушка
намазанных пластинок 5—10 мин при 60°.
Целлюлозные ионные обменники:
MN 300 G/СМ (карбоксиметилцеллюлоза с добавкой гипса)
15 г порошка+90 мл диет. воды. Сушка намазанных пластинок
40 -иикпри 50°.
MN 300 G/Р (фосфорилированная целлюлоза с добавкой гипса)
15 г порошка + 70 мл- диет. воды. Сушка намазанных пластинок
при 50° 40 мин. Для получения совершенно гладких слоев при
использовании этого порошка смесь необходимо интенсивно пере-
мешивать с водой примерно 5 мин электрической мешалкой.
MN 300 G/DEAE (диэтиламиноэтилцеллюлоза с добавкой гипса)
10 г порошка + 90 мл диет. воды. Сушка намазанных пласти-
нок 40 мин при 50°.
MN 300 G/ECTEOLA (анионный обменник с добавкой гипса)
10 г порошка + 95 мл диет. воды. Сушка намазанных пласти-
нок 40 мин при 50°.
Целлюлозные ионообменники не образуют идеального сплошного слоя без добавки
гипса. Поэтому рекомендуется к ионообменным порошкам добавлять небольшое коли-
чество обычного целлюлозного порошка MN 300.
* По сообщению фирмы «Merck» (Дармштадт), в настоящее время имеются в про-
даже: силикагель Н (прочно прилипающий без добавки гипса), а также два силикагеля
с флуоресцирующим индикатором (силикагель GF254 и силикагель HF254).
Таблица 1
Сорбенты, используемые для ХТС
Сорбент Свойства/ Разделяемые классы веществ
кислотность активность разделительное действие
Силикагель Кислый Активный Адсорбция, распределение (обмен) Практически все
Окись алюми- ния Основная Активная Адсорбция, распределение (обмен) Главным обра- зом основания стероиды
Кизельгур ewiop-Фосфат магния Трисиликат магния Нейтральный Неактивный Слабо ак- тивный Слабо ак- тивный Распределение Адсорбция » Сахара, лекар- ственные вещест- ва, триглицери- ды, высшие жир- ные кислоты j Каротиноиды
Гидроокись кальция Фосфат каль- Основнан Слабо основ- Слабо ак- тивная Слабо ак- » » Токоферол
ция Сульфат каль- ция [24] НОЙ тивный Слабо ак- тивный » Для жирных кислот и глице- ридов подверга- ют гидрофобиза- ции
Силикагель -|- окись алюминия (1+1) Кислый -|- основная Активный Распределение (обмен) Красящие ве- щества, барбиту- ровые кислоты
Гидроокись же- леза Угли Активная Активные Адсорбция Полярные ве- щества Неполярные вещества
Порошок цел- люлозы Практически нейтральный Неактивный Распределение (обмен) Красящие ве- щества, амино- кислоты
Полиамид Нейтральный Неактивный (Обмен?) Флавоны
Полиакрилнит- рил [4] Нейтральный Неактивный (Обмен, рас- пределение?) Антоцианы и ДР-
Обменник *, Кислый 4- щелочной Неактивный Обмен (распре- деление) ; Нуклеиновые кислоты
Автор не сообщает, какой обменник. — Прши: ре0.
. .у-,. ) , , ~ .'V- <• .
42 Общая часть .
MN 300 СМ (карбоксиметилцеллюлоза)
8 г порошка MN 300 СМ + 2 г порошка MN 300 + 60 мл дисТ.
воды, Сушка намазанных пластинок 40 мин при 50®.
MN 300 Р (фосфорилированная целлюлоза)
12 г порошка MN 300 Р + 3 г порошка MN 300 + 70 мл диет,
воды. Сушка намазанных пластинок при 50° 40 мин. Для полу-
чения совершенно гладких слоев при использовании этого порош-
ка смесь необходимо интенсивно перемешивать с водой примерно
5 мин электрической мешалкой.
MN 300 DEAE (диэтиламиноэтилцеллюлоза)
8 £ порошка MN 300 DEAE + 2 г порошка MN 300 + 90 мл
диет. воды. Сушка намазанных пластинок 40 мин при 50°.
MN 300 ECTEOLA (анионный обменник) '
8 г порошка MN 300 ECTEOLA + 2г порошка MN 300 + 95 мл
диет. воды. Сушка намазанных Пластинок 40 мин при 50°.
Фирма «Ехсогпа» (Майнц) выпускает целлюлозный порошок с добавкой
гипса для «аналитической хроматографии», который обычно можно исполь-
зовать для ХТС.
Слои из полиамида * и полиакрилнитрила ** применяли для разделения
флавонглюкозидов и антиокислителей [4, 10, 11, 13]. Для хроматографи-
ческого разделения нуклеиновых кислот Рандерат (47, 48] рекомендует
наряду с обычными сорбентами применение обменников, в особенности
слоев ECTEOLA.
Все до сих пор предложенные сорбенты для ХТС приведены в Табл. 1.
Для большинства разделений достаточно применение силикагеля Г или окиси
алюминия Г,
3. ХРАНЕНИЕ И ОБРАБОТКА СОРБЕНТОВ
Крупнозернистый силикагель известен в качестве осушителя, т. е. он
поглощает влагу из воздуха, поэтому его обычно хранят в закрытых склян-
ках. Силикагель Г, окись алюминия Г и кизельгур Г содержат еще несколько
частей гипса, который также поглощает воду, в результате чего теряет свои
связующие свойства. Поэтому склянки, с исходными материалами следует
всегда держать закупоренными. Сорбенты, связующие вещества в которых
частично разрушаются под действием влаги воздуха, образуют слои, хуже
цристающие к пластинкам.
Важно, чтобы слои предварительно высушивались и затем уже активи-
ровались (стр. 19). Если слои нагревать при 100° без предварительной сушки,
могут возникнуть трещины и щели. При более продолжительном нагревании
при температуре свыше 125° возникает опасность, что гипс слишком обезво-
дится и его связующая способность уменьшится. Во всех случаях активные
сорбционные слои следует предохранять от влаги и паров, находящихся
в лабораторной атмосфере, поскольку в противном случае слои постепенно
теряют активность. Поэтому пластинки необходимо хранить в герметичном
сосуде над хорошим осушителем.
* Порошки поликапролактама (полиамид или перлон) (Farbwerke Hoeckst,
Werk Bobingen) (см. также [72]). !
•* Порошок полиакрилнитрила (Farbenfabriken Bayer, Werk Domagen).
ГЛАВА 4
СПЕЦИАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ
Э. Шталъ
1. ПРОТОЧНЫЙ МЕТОД, МНОГОКРАТНОЕ ХРОМАТОГРАФИРОВАНИЕ,
СТУПЕНЧАТЫЙ МЕТОД
Если величины Rf разделяемых веществ после обычного однократного
прохождения растворителя лежат в области значений меньших 0,5 и при этом
обнаруживается начало разделения, то можно либо перейти к проточной
Рис. 33. Ступенчатый метод разделения веществ, содержащих подофилум, на слое
• силикагеля Г [64].
Растворитель 1-я ступень: хлороформ + 10% метанола, 2-я ступень: хлороформ + 35% ацето-
на. 1 — а-пелтатин-0-глюкозид; г — подофилотонсинглюкозид; 3 — р-пелтатин-р-О-глюнозид;
4 —4'-диметилподофилотоксин; б —а-пелтатин; в — подофилотоксин; 7 —р-пелтатин; s —1-де-
зоксиподофилотоксин. В случае чистых веществ наносили по 1,0 цз, в случае подОфилинов и ле-
карственных веществ — по 0,5 мм> 10%-ной спиртовой вытяжни. Обнаружение: смесь серная
кислота — ангидрид уксусной кислоты (1 + 3), 15 мин, 100°. Пунктиром обозначены зоны, которые
реагируют дополнительно с диавониевыми солями.
хроматографии в БН-камере (стр. 31), либо провести повторное хроматогра-
фирование после предварительного испарения растворителя. В большинстве
случаев при малых временах анализа процесс можно повторить несколько
раз. Ступенчатый метод применяют в случая^, когда при использовании одно-
го растворителя часть веществ не может быть разделена и обычно сжата в обла-
сти низких (0—0,2) или высоких (0,8—1) значений Rf. В этом случае оты-
скивают растворитель, в котором неразделенные вещества обнаруживают
хорошее различие в величинах Rf. Тогда можно провести разделение, приме-
няя последовательно вначале один, а затем другой растворитель. Два приме-
ра пояснят сказанное: а) имеется смесь лигнанов и их глюкозидов (вещества,
содержащие Podophyllum). На ступени 1 (расстояние старт — фронт 6 см)
разделяются глюкозиды, а аглюконы находятся вместе в области фронта
растворителя. Их разделяют затем с менее полярным растворителем на ступе-
44
Общая часть
ни 2 (расстояние старт — фронт 12 см) [64]. (рис. 33); б) смесь каротинов
ф-каротин, ликопин, кантаксантин и биксин) разделяют хлороформом уже на
небольшом расстоянии, но р-каротпп и ликопин находятся вместе в области
фронта. Опыт прерывают после прохождения расстояния в 5 см (ступень 1)
и проводят хроматографическое разделение, используя гексан. На этой
ступени (расстояние старт — фронт 10 см) оба каротиновых углеводорода
разделяются [60].
2. МЕТОД КЛИНОВИДНЫХ ПОЛОС
В хроматографии на бумаге лучшее разделение дает предложенный перво-
начально Райнделем и Хоппе [49] и получивший широкое распространение
благодаря работам Матиаса [33] «метод клиновидных полос». При нареза-
нии бумаги в виде язычков вещества вынуждены перемещаться в виде полос.
Перенос этого метода на тонкие сорбционные слои не вызывает затруднений.
При этом необходимо только уз-
Рис. 34. Тонкослойные хромато-
граммы в форме клиповидных полос.
Разделение происходит в виде отдельных
полос, и только в случае больших коли-
честв (середина) наблюдается А-образное
искривление.
ким металлическим шпателем про-
чертить в слое граничные линии
шириной 0,5—1 мм [57].
Рис. 35. Шаблоны из плекси-
гласа (толщина 2—3 мм) для раз-
метки контура.
Выпиливают заштрихованные пяти-
угольники.
Были проверены различные формы язычков и их расстояния друг от дру-
га. Изображенные на рис. 34 и 35 формы дали наилучшие результаты.
Вырезание пятиугольников облегчается применением шаблона из плексигла-
са (рис. 35). Его кладут близко к нижнему краю пластинки для ХТС и очерчи-
вают пятиугольник, затем из верхних углов проводят продольные линии,
применяя для этого шаблон для надписей. Пробу наносят в узкой части
язычка. Вследствие сужения полосы в месте, где подается растворитель, время
хроматографирования увеличивается.
I
3. ДВУМЕРНОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ, МЕТОД РРР
Двумерный метод является ценным вспомогательным средством для разде-
ления многокомпонентных смесей. Вначале проводят разделение в напра-
влении 1, а затем, повернув пластинку для ХТС на 90°, в направлении 2.
Однако это имеет смысл, только если эффект разделения в направлении 2 отли-
чен от эффекта разделения в направлении 1. Только в этом случае имеются
оптимальные условия применения этого метода. Рис. 131, 149 и 168 хорошо
поясняют суть данного метода. Используя только что изложенные соображе-
ния, Кауфману с сотрудниками [22], осуществившими комбинацию адсорбци-
Гл. 4. Специальные методы
45
онной ХТС (в направлении 1) и распределительной ХТС (в направлении 2),
и Хонеггеру, осуществившему комбинацию электрофореза в ТС (в напра-
влении 1) и адсорбционной или распределительной ХТС (в направлении 2),
удалось значительно обогатить метод двумерной ХТС (см. гл. 19, VI).
В противоположность этому, в случае метода РРР (разделение — реак-
ция — разделение) в обоих направлениях разделение проводят при точно
одинаковых условиях (например, одинаковые растворители). Поэтому соеди-
нения, не разлагающиеся при разделении, должны лежать на одной линии,
а именно на диагонали между направлением 1 и 2. Таким способом можно
просто установить, происходит ли в данном растворителе изменение какого-
либо вещества смеси. Если на основании хроматографического разделения
в направлении 1 предположить протекание реакции, приводящей к струк-
турным изменениям одного или нескольких компонентов, то, проводя разделе-
ние с этим же растворителем в направлении 2, можно твердо установить,
идет эта реакция или нет. Этот простой метод позволяет быстро определить
изменение отдельных компонентов смеси под действием излучения (у-, рент-
геновские, УФ-лучи), газов и температуры. Итак, дело касается вопросов,
представляющих весьма большой интерес (защита от излучения, фотохи-
мия, испытание на стабильность). Этот уже давно известный в хроматогра-
фии на бумаге метод РРР был успешно использован при изучении дезактива-
ции перетрина (рис. 149) [60].
4. ИЗМЕНЕНИЕ РАЗДЕЛИТЕЛЬНОЙ СПОСОБНОСТИ СЛОЯ
(см. «Сорбенты», стр. 37—42)
Опыты по адсорбционной хроматографии с «основными», «нейтральными»
и «кислыми» окислами алюминия и аналогичные опыты по хроматографии
на бумаге (буферирование или пропитка бумаги) можно перенести на ХТС.
Чаще всего применяемые в ХТС слои силикагеля Г являются слабокислыми.
Слои окиси алюминия Г, наоборот, дают основную реакцию. Смешивая оба
адсорбента (1 + 1, весовые части), можно получить, согласно В альди, иногда
весьма удобные нейтральные слои. Точно так же получают сильно'кислые
или основные слои. Для приготовления массы берут адсорбент и вместо воды,
например, 0,1—0,5 н. щавелевую кислоту или 0,1—0,5 н. раствор едкого
кали. Аналогичным образом получают забуференные слои, используя соот-
ветствующие буферные растворы.
«Кислые» слои силикагеля Г успешно применяют для разделения соеди-
нений с кислой реакцией (фенолы, кислоты), а основные слои — для алкало-
идов и аминов. Последовательное применение подобных слоев позволяет
установить реакцию неизвестного соединения. Если вещества образуют соли
с пропиточным раствором, то последние, как правило, не перемещаются
в слабо полярном растворителе или, во всяком случае, перемещаются мед-
леннее, чем свободные основания или фенолы [58].
Для специальных задач может оказаться полезной пропитка бисульфитом
(задержка альдегидов), солями ртути (аддукты), борной кислотой (комплексо-
образование) или мочевиной (соединения включения, клатраты).
Гидрофобизация. При хроматографировании липидов в тонких слоях,
так, же как и в хроматографии на бумаге, оказалась удобной методика «обра-
щения фаз». При этом сорбционный слой гидрофобизуют неполярным липо-
фильным «маслом» и в качестве подвижной фазы выбирают несмешивающий-
ся или плохо смешивающийся полярный растворитель. Значение величи-
ны Rf для гомологических рядов (например, убихиноны С5— С50) на таких
слоях закономерно уменьшается с увеличением числа атомов углерода. В зави-
симости от «летучести» можно говорить о временной или постоянной про-
питке. Мангольд [30, 31], Винтерштейн [71], а также Кауфман [23] предпо-
46
Общая часть
читают постоянную гидрофобизацию. Для этого хорошо высушенные пла
стинки для XTG погружают в 5—10%-ный раствор пропитывающего веществ
(стеклянная фотографическая кювета) и затем удаляют легко летучий раство
ритель (т. кип. 40—60°). При пропитке следует обратить внимание на то
чтобы пластинки и пропиточный раствор имели одинаковую температуру
чтобы пластинки были длительное время погружены и чтобы время окунании
было примерно одинаковым. Гидрофобизованные силиконовым маслом ил1
парафином пластинки можно хранить длительное время. До настоящей
времени были использованы следующие гидрофобизующие вещества.
Силиконовое масло 10с St (фирма «Dow Corning», США), 5% в эфире
Силиконовое масло 50с St и 1,5с St (фирма «Wacker Chemie», Мюнхен
22), 7 % в петролейном эфире.
Жидкий парафин для ИК - спектроскопии (фирма «Merck», Дармштадт),
5—10% в петролейном эфире.
Ундекан (для временной гидрофобизации), 15% в петролейном эфире,
Тетрадекан = станд. фракция нефти с т. кип. 240—250° (фирма «Halter-
тапп», Гамбург), 5% в цетролейном эфире.
Силиконизация и закрепление слоя описано Кауфманом [23]. Пластинку
для ХТС помещают в вакуум-эксикатор, Содержащий 3—5 мл дихлордиме-
тилсилана (в бюксе), и выдерживают под вакуумом 300 мм рт. ст. в течение
15—30 мин. После этого пластинки 30 мин выдерживают на воздухе. Сили-
конизованные слои можно использовать так же, как и в хроматографии
на бумаге. Избыток реактива смывают водой.
ЛИТЕРАТУРА к гл. 1—4
1. Applewljite Т. И., Diamond М. J., Goldblatt L. A., J. Am. Oil
Chem. Soc., 38, 609 (1961). 1
2. Baehler В., Schweiz. Apotheker Ztg., 99, 543 (1961).
3. Barbier M., Jager H., Tobias H., Wyss E., Helv. Chim. Acta, 42,
2440 (1959). ;
4. BirkoferL., Kaiser Ch., Meyer-Stoll H.-A., S u p p a n F., Z. Natur-
forsch., 17b, 352 (1962).
5. Bolliger A., Bolliger J. E., The Roy. Austr. Chem. Inst. Proc. Feb., 1962,
p. 78.
6. Brenner M., Niederwieser A., Experientia (Basel), 17, 237 (1961).
7. Brenner M., N iederwieser A., P a t a k i G., Fahmy A. R., Expe-
rientia (Basel), 18, 101 (1962).
8. Consden R., Gordon A. H., Martin A. I. P., Biochem. J., 38, 224 (1944),
9. Crowe M. O’L., Anal. Chem., 13, 845 (1941).
10. Davidek J., Davidkova E., Pharmazie, 16, 352 (1961).
11. Davidek J., Prochazka Z., Collection Czechoslov. Chem. Commun., 26»
2947 (1961).
12. D e m о 1 e E., J. Chromatogr., 6, 2 (1961).
13. Egger K., Z. analyt. Chem., 182, 161 (1961). • ,
14. Goppelsroeder F., Anregungen zum Studium der auf Capillaritats- und Adsor-
ptionserscheinungen beruhenden Capillaranalyse, Basel, Verlag Helbing und Lichten-
hahn, 1906.
15. H a i s I. M., M a с e k K., Handbuch der Papierchromatographie, Bd. I,u. II, Jena,
VEB Fischer Verlag. 1958 u. 1960.
16. Halpaap H., частное сообщение.
17. Hausser H., Mitt.-Bl. Ges. Dtsch. Chem. Lebensmittelchem. gerichtl. chem.,
13, 194 (1959).
18. Hesse G., AlexanderM., Vortragsreferat «Joumee internationale d’Etude
des Methodes de separation immediate et de Chromatographie», 13, 14, 15 Juni 1961,
Paris.
19. H о n e g g e r C. G., Helv. Chim. Acta, 44, 173 (1961).
20. Измайлов H. А., Шрайбер M. С., Фарм., 3, 1 (1938).
21. Jensen A., Tidsskr. Kjemi, Bergvesen Met., 1, 14 (1961).
22. Kaufmann H. P., M a k u s Z., Fette, Seifen, Anstrichmittel, 62, 1014 (1960).
23. К a u f m a n n H. P., M a k u s Z., К h о e T. H., Fette, Seifen, Anstrichmittel,
63, 689, 807, 828 (1961).
Гл. 4. Специальные методы
47
24. Kaufmann Н. Р., К hoe Т. Н., Fette, Seifen, Anstrichmittel, 64, 81 (1962).
25. К i г с h n е г I. G., К е 11 е г G. I., J. Am. Chem. Soc., 72, 1867 (1950),
26. К i г с h n е г I. G., М i 11 е г J. М., Keller G. I., Anal. Chem., 23, 420 (1951).
27. L a g о n i H., Wortmann A., Milchwiss., 10, 360 (1955).
28. L a g о n i H., Wortmann A., Milchwiss., 11, 206 (1956).
29. Macha t a G., Mikrochim. Acta, Heft 1, 79 (I960).
30. M a n g о 1 d H. K., Fette, Seifen, Anstrichmittel, 61, 877 (1959).
31. M a n g о 1 d H. K., J. Am. Oil Chemists Soc., 38, 708 (1961). (
32. M a r t i n A. I. P., Synge R. L. M., Biochem. J., 35, 91 u. 1358 (1941).
33. Matthias W., Naturwiss., 41, 18 (1954).
34. M e i n h a r d J. E., H a 1 1 N. F., Anal. Chem., 21, 185 (1949).
' 35. M e у e r H., Dent. Lebensm.-Rundschau Heft, 7, 170 (1961).
36. M i 11 e r J. M., Kirchner J. G., Ch. A., 24, 1480 (1952).
37. M i 1 1 e r J. M., Kirchner J. G., Anal. Chem., 25, 1107 (1953).
38. M i 11 e r J. M., Kirchner J. G. Anal. Chem., 26, 2002 (1954).
39. M i s t г у u к о v E. A., Collection Czechoslov. Chem. Commun., 26, 2071 (1961).
• 40. M о 11 i er M., Mitt. Gebiete Lebensm. u. Hyg., 47, 372 (1956).
41. Mot tier M., Mitt. Gebiete Lebensm. u. Hyg., 49, 453 (1958).
42. Neubern-de Toledo T. A., W a s i с к у R., Correio do Mundo Farmaceutico
(Brasilien), 1961.
43. Pastuska G., Trinks H., Chemiker-Ztg., 85, 535 (1961).
44. P a s t u s к a G., Trinks H., Chemiker-Ztg., 86, 135 (1962).
45. P e e r e b о о m J. W. C., Chem. Weekblad, 49, 625 (1961). ✓
46. P г о c h a z к a Й., Chem. Listy, 55, 974 (1961).
47. Randerath K., Angew. Chem., 73, 436 (1961).
48. Randerath К., J. Chromatogr., 6, 365 (1961).
49. R e i n d e 1 F., H o p p e W., Naturwiss., 40, 245 (1953).
50. R e i t s e m a R. H., J. Am. Pharm. Assoc., 43, 414 (1954).
51. R e i t s e m a R. H., Anal. Chem., 26, 960 (1954).
52. Ritter F. J., Meyer G. M., Nature, 193, 941 (1962).
53. RSCO Review, 3, 18 (1961).
54. S c h о r n P. J., Glas-Instr.-Tech., 5, 43 (1961).
55. Stahl E., Pharmazie, 11, 633 (1956).
56. Stahl E., Chemiker.-Ztg., 82, 323 (1958).
57. Stahl E., Parfiimerie u. Kosmetik,. 39, 564 (1958).
58. Stahl E., Arch. Pharmaz., 292, 411 (1959).
•59. Stahl E., Pharmaz. Rundsch., 1, Nr. 2, 1 (1959).
60. S t a h 1 E., Arch. Pharmaz., 293, 531 (1960).
61. Stahl E., Z. analyt. Chem., 181, 303 (1961).
62. S t a h 1 E., Angew. Chem., 73, 646 (1961).
63. S t a h 1 E., неопубликованные данные.
64. S t a h 1 E., К a 11 e n b a c h U., J. Chromatogr., 5, 458 (1961).
65. S t a n 1 e у W. L., V a n n i e r S. H., G e n t i 1 i B., J. Assoc. Offic. Agr. Che-
mists, 40, 282 (1957).
66. S t a n 1 e у W. L., V a n n i e r S. H., J. Assoc. Offic. Agr. Chemists, 40, 582 (1957).
67. T e i j g e 1 e r C. A., Pharmac. Weekblad, 97, 43 (1962).
68. U m 1 a n d F., Kirchner K., Z. anorg. Chem., 280, 211 (1955).
69. Wagner H., Mitt. Gebiete Lebensm. u. Hyg. 51, 416 (1960).
70. Williams T. L, Introduction to chromatography, Glasgow, Blackie & Son, 1947.
71. .W interstein A., Studer A., Riiegg R., Chem. Her., 93, 2951 (1960).
72. Wo elm M., Mitteilungen AL, 10 (1961).
73. W о 1 1 i s h E. G., Schmall M., Hawrylyshyn M., Anal. Chem., 33,
1138 (1961).
74. Zechmeister L., CholnokyL. v о n, Die chromatographisch^ Adsorptions-
analyse, 2. Aufl., Wien, Springer Verlag, 1938.
ГЛАВА 5
ДОКУМЕНТАЦИЯ ПРИ ХРОМАТОГРАФИИ
В ТОНКИХ СЛОЯХ
X. Генсхирт,
Хроматограммы в тонких слоях в противоположность хроматограммам
на бумаге чувствительны к механическим повреждениям, и окрашенные
пятна выцветают обычно быстрее, чем на бумажных хроматограммах. Поэто-
му, а также потому что стеклянные пластинки могут быть использованы
повторно, не рекомендуется хранение готовых тонкослойных хроматограмм.
Оно описано в конце этого раздела лишь для отдельных случаев при препа-
ративной хроматографии. Установление положения пятна на хррматограм-
ме, как при хроматографии на бумаге, путем определения значения величины
Rf, не является достаточным. Значения Rf в случае ХТС представляют собой
лишь ориентировочные величины, которые передают относительное положе-
ние пятна внутри хроматограммы. При ХТС условия опыта должны быть
указаны возможно точнее. Для этого целесообразно пользоваться бланком,
который приведен на рис. 36.
Все значения Rf в этой книге умножены на коэффициент 100. При стан-
дартной длине пути, равной 100 мм, это сразу дает расстояние стартовой
точки до середины пятна (зоны) в миллиметрах. Если, однако, в некоторых
случаях при разделении сложных смесей веществ и оказывается необходимым
использование всей длины пластинки, то обычно предпочитают использовать
расстояние 100 мм. Согласно опыту, при больших расстояниях пятна с боль-
шими значениями Rf смещены в сторону фронта растворителя. Если приво-
дятся значенця Rf, то небольшие различия в этих величинах не позволяют
установить, действительно ли вещества смеси разделяются. Если получаются
резкие пятна, то это^принято указывать поперечной чертой. Если четкое
разделение невозможно, то приводимые величины берутся в скобки.
При проведении серии хроматографических разделений рекомендуют
в качестве веществ сравнения использовать эталонные вещества для опреде-
ления положения пятна — метод, который уже известен в хроматографии
на бумаге сахаров. При этом пользуются величиной Rst, определяемой сле-
дующим образом:
r ___Расстояние анализируемого вещества от старта
st Расстояние пятна стандарта от старта
Если в качестве вещества сравнения используют одно из веществ разделяемой
смеси, то получаемые при этом значения Rst являются более воспроизводимы-
ми, чем величины Rf.
Наряду с этим наиболее распространенным способом документации при
хроматографии в тонких слоях в отличие от хроматографии на бумаге бла-
годаря формату пластинок имеется возможность графического изображения
данных или получения фотокопий.
Простейшим и наиболее, распространенным методом является снятие
хроматограмм на кальку (рис. 37). Пятна, которые обнаруживаются только
в УФ-свете, накалывают с помощью иглы и затем переносят на кальку. Пят-
на веществ можно планиметрировать и изображать в виде соответствующих
прямоугольников одинаковой ширины, получая таким образом полуколи-
чественные данные [34, 35, 26] (см. рис. 37). Если два или несколько боль-
Гл. 5. Документация при хроматографии в тонких слоях
49
ших пятен лежат близко друг к другу, то масштаб изображения следует
увеличить, чтобы сохранить длину основной линии и иметь возможность изо-
бразить пятна разделенными.
Если хроматограммы в тонких слоях дают контрастные пятна, то можно
использовать метод рефлексного копирования, применив, например, копи-
ровальное устройство фирмы «Agfa» [31], чтобы получить черно-белое изобра-
жение хроматограммы (рис. 37). При этом способе в процессе проявления,
Тонкослойная хроматограмма №
Класс веществ:----------------------------------------------------------,-------
Литература:---:-----------------------------------------------------------------
Слой сорбента:----------------------------------------------------------------------
Толщина слоя: ------------------------ Размер пластинки: ---------------------------
Приготовление и сушка:.--------------------------------------------------------:___
Разделительная камера: ----------------- Метод разделения: ------------,------------
Состояние насыщения камеры:.--------------------------------------------------------
Расстояние старт — фронт: ------------------- Время анализа: ----------------------
Растворитель: ---------------------------------------------------------------------
Раствор пробы (растворитель и концентрация): --------------------------------------
Количество пробы:-------------------------------------------------------------------
Примечания: ------------------------------------------------;--------------------
Д ата: -----------------------------------------------------------------------------.
Вещество RfX XI00 RyX Х100 RfX Х100 Границы определения Способ обнаружения
1
2
3
4

Рис. 36. Схема бланка для регистрации необходимых данных тонкослойной
хроматограммы.
длящегося несколько секунд, негативный слой автоматически переходит
в так называемый переходный слой, образуя позитивное изображение [14].
При применении этого метода важен выбор реактива для опрыскивания,
поскольку прямой контакт хроматограммы и копировальной бумаги застав-
ляет избегать применения агрессивных реагентов. Иногда удается избежать
порчи копировальной бумаги, приложив прозрачную пластмассовую пленку.
Ряд авторов также указывает на такую возможность [10, 13].
Для фотографического воспроизведения хроматограмм, подвергнутых
опрыскиванию агрессивными реактивами, и хроматограмм, пятна которых
4 Заказ № 734
50
Общая часть
могут быть локализованы только в УФ-свете по собственной флуоресценции
или на флуоресцирующих пластинках по гашению флуоресценции, следует
применять обычную пересъемку.
Чтобы избежать дополнительного увеличения, применяют в качестве съемочного
аппарата зеркальный фотоаппарат с насадочными линзами. Черно-белые фотографии
контрастных хроматограмм лучше всего получать, применяя съемку на просвет. Таким
образом, например, были сфотографированы нятна липидов, окрашенные хлоридом
сурьмы [15]. При этом часто выступают дефекты слоя. Пластинки с дефектами слоя можно
фотографировать при комбинированном освещении. Для контрастных хроматограмм
применяют только верхнее освещение. Источники света в этом случае следует разместить
с двух сторон, причем угол падения должен составлять 45°. Для черно-белой съемки
пятен с собственной флуоресценцией применяют источники УФ-света в области длин
волн вблизи 254 мц, аналогично описываемому ниже, и работают с верхним светом. Пленка:
Agfa AGP или JFF. Чтобы исключить рассеянный и отраженный свет, перед объективом
Рис. 37. Способы документации тонкослойных хроматограмм.
а — снятая на кальку хроматограмма (снова переносится на обычную бумагу); б — документа-
ция с помощью приспособления «копирапид»; в — документация путем планиметрирования в фор-
ме прямоугольников соответствующей величины. Пример: разделение бромсодержащих снотворных
смесью циклогексан — хлороформ — пиридин (20 + 60 +' 5) на пластинках с силикагелем
Г. С — старт, Ф — фронт. 1 — адалин; 2 — абазин; з — бромурал.
помещают ультрафиолетовый и желтый фильтр средней плотности. Для съемки темных
пятен на светящемся слое (стр. 61) используется аналогичный метод [8].
Для цветной съемки хроматограмм в тонких слоях пригодна пленка Agfacolor СТ 18
[6]. С позитивных диафильмов на цветной обратимой бумаге можно получить отпечатки
(Agfa-CT-копии) в любом числе. В качестве источника света для цветной съемки исполь-
зуют осветитель с газоразрядной импульсной лампой. Для съемок пятен флуоресцирую-
щих веществ в качестве источников света применяют ртутные вакуумные лампы (Гереус)
с ультрафиолетовым фильтром UG 5 и областью длин волн вблизи 254 мц. Перед объек-
тивом фотоаппарата следует установить комбинацию фильтров WG 2 (2 мм), GG 13 (5 мм)
и GG 3 (4 мм) (фирма «Schott»), чтобы отфильтровать рассеянное и отраженное ультра-
фиолетовое излучение. Точные указания об устройстве фотоаппарата и источниках света
можно найти в оригинальной работе [6].
Как уже упоминалось выше, оригинальную хроматограмму можно сохра-
нять после специальной обработки. Хроматограммы аминокислот были закон-
сервированы Баролье [2] путем заливки слоя 4%-ным раствором коллодия,
к которому добавлено 7,5% глицерина. Адсорбционный слой может быть
снят с пластинки в виде пленки.
На хроматограмму размером 20 х 20 см после окрашивания осторожно
наливают 50 мл указанного выше раствора. Во избежание утечки хромато-
грамму обрамляют тесьмой из лейкопластыря шириной 1 см. После сушки
коллодийную пленку разрезают вдоль полоски лейкопластыря. Хромато-
грамму затем легко снимают с пластинки в виде упругой пленки. Для оконча-
тельного хранения эту пленку наклеивают на лист бумаги с помощью про-
зрачной пластмассовой ленты.
Гл. 5. Документация при хроматографии в тонких слоях 51
Пленки коллодия обладают свойством скручиваться и склеиваться,
поэтому для консервирования лучше применять водную эмульсию полимера
(эфира полиакриловой кислоты, поливинилиденхлорида и поливинилпропио-
ната), напыляемую на готовую хроматограмму [20]. Подобная эмульсия
имеется в продаже под названием неатан (фирма «Merck», Дармштадт).
Для лучшего распыления удобнее эту эмульсию разбавить метанолом.
На высушенную тонкослойную хроматограмму размером 20 х 20 см
напыляют 10 мл смеси неатан — метанол (5 4-5) до полного смачивания
хроматограммц. После этого пластинки сушат на воздухе и снимают слой
одним из следующих способов.
1. Готовую хроматограмму, покрывают тонкой прозрачной клейкой плен-
кой (тезафильм), погружают на короткое время в воду и осторожно отделяют
слой от пластинки.
2. Окантовывают края хроматограммы тонкой клейкой лентой, погружа-
ют пластинку на короткое время в воду и осторожно отделяют слой.
3. На короткое время погружают хроматограмму в воду и отделяют слой
ножом или шпателем.
После окончательной сушки на воздухе хроматограммы наклеивают на
картон и в таком виде сохраняют.
4*
ГЛАВА 6
КОЛИЧЕСТВЕННАЯ ОЦЕНКА ХРОМАТОГРАММ
В ТОНКИХ СЛОЯХ ,
X. Генсхирт,
Условием успешных количественных хроматограмм является стандарти-
зация метода ХТС путем использования сорбентов с определенным разме-
ром частиц и определенной степени чистоты, а также воспроизводимой тол-
щины слоя. В остальном требуется выполнение тех же предварительных
условий, что и в случае хроматографии на бумаге. Для нанесения пробы
следует применять соответствующее приспособление, а именно калиброван-
ный стеклянный капилляр или стеклянный поршневой шприц с микрометри-
ческой подачей (см. стр. 21).
Исследование ошибок, происходящих при нанесении пробы с применени-
ем подобных стеклянных поршневых шприцев, было проведено с растворами
эфиров бензойной кислоты [7]. При нанесении 0,05 мл раствора, содержащего
около 60 Це вещества, относительное стандартное отклонение состав-
лялось 1,2%. Сюда включена ошибка спектрофотометрического опреде-
ления.
Следует ли наносить пробу в виде пятна или полосы, зависит в основном
от наносимого объема раствора. При пользовании вспомогательным шабло-
ном (ср. стр. 22) сравнительно просто нанести пробу определенного объема
в виде полосы, не повредив поверхности силикагеля.
Для количественного определения веществ, разделенных методом ХТС,
в настоящее время имеются следующие методы, приведенные в табл. 2 и 3.
Таблица 2
Методы количественной оценки хроматограмм в тонких слоях
без экстракции разделенных веществ
Методы I группы Исследуемый класс соединений Использо- ванное коли- чество, цг® Ошибка, % Литера- тура
1. Визуальное срав- нение окрашенных пятен с пятнами эталонных веществ 3 Витамины D 0,1—1 Полуколич. 16
Алкалоиды спо- рыньи ряда клавинов 0,1—30 Полуколич. 18
Ретинен 0,05—0,1 „ _ Около ЬЗО в 40
Слабо полярные сте- роиды 0,1—150 Полуколич. 5
Продолжение табл. 2
Методы I группы Исследуемый класс соединений Использо- ванное коли- чество, Ошибка, % Литера- тура
Антиокислители (З-бутил-4-оксианизол) 20—150 Около ^5 32
2а. Получение фото- копий и измерение площадей пятен Токоферолы 10—60 Около ±5 33
Синтетические али- фатические содержа- щие азот, фосфор и серу липиды 10—130 на каждый класс веществ Около J;5 22
26. Слой делают про- зрачным. Получение светокопии и ее спект- рофотометрическое оп- ределение Содержание менто- фурана в масле переч- ной мнты 5—15 Около ^5 12
3. Фотодеяситометри- ческое определение Моно-, ди- и три- глицериды 2—10 Около ^5 27а
Продукты разложе- ния глицеридов и альдегидов 2—30 Около ±5 27
Эфиры холестерина 5—10 (±1.5)-(±5) 41
Модельные смеси синтетических алифа- тических азотсодер- жащих липидов 5—35 Около ±8 22
4. Радиоавтографи- ческое определение ме- ченых веществ Липиды Следы — 21
а Здесь приведены лишь отдельные работы в качестве примеров возможности определения.
® Если не привйено других данньц^го указанные числа относятся к количеству отдельных
компонентов в смеси. “ & jjja
в При отсутствии в работе данетвгч^ючности определения приводятся приблизительные зна-
чения. *
Таблица 3
Методы количественной оценки хроматограмм в тонких слоях
с экстракцией разделенных веществ
Методы II группы Исследуемый класс , соединений Использованное количество а, цг Ошибка, % Литера- тура
1а. Взвешивание пос- ле локализации по соб- ственной флуоресценции в УФ-свете Нейтральные ли- пиды из Faeces и Faecalithen 20000—50 000 на пластинку Полуколич. 39
16. УФ-Спектрофото- метрическое определе- ние после локализации по собственной флуо- ресценции в УФ-свете Алкалоиды рау- вольфии 50—70 ±(3)-(5) 30
1в. Колориметричес- кое определение после локализации по собст- венной флоуресценции в УФ-свете Алкалоиды спо- рыньи 100—2000 ±(0,5)-^4) 19
2а. Взвешивание пос- ле локализации в УФ- свете на флуоресцирую- щих пластинках а- й Р-5-Холе- станол 10 000 на пластинку Около ±10 6 4
26. УФ-Спектрофото- метрическое определе- ние после локализации на флуоресцирующих пластинках Эфир п-оксибен- зойной кислоты 20—70 ±(3)-(5) Ср. табл. 5 [7]
Дифенил (в цит- русовых и издели- ях из них) 2—120 — 17
2в. Колориметричес- кое определение после локализации на флуо- ресцирующих плас- тинках Гидрокортизон и гидрокортизонаце- тат 10—100 ±(2)-(16) 8 '
За. Окраска радио- активных веществ и из- мерение счетчиком Гей- гера Меченые произ- водные липидов 0,1—100 Около ±5 21, 24
36. Локализации об- работкой парами вода, колориметрическое оп- ределение железного комплекса гидроксамо- вой кислоты Эфиры жирных кислот и оксикис- лот, а также моно-, ди- и триглицери- ды 100—1000 ±5 37 !
Гл. 6. Количественная оценка хроматограмм в тонких слоях 55
Продолжение табл. 3
Методы II группы Исследуемый класс соединений Использованное количество а, цг Ошибка, % Литера- тура
Зв. Окраска бромти- моловым синим и коло- риметрическое о преде- ление после экстракции антроном Гликолипоидная часть липоидов мозга 10—40 ( ±8 17
Зг. Окраска бромти- моловым синим и коло- риметрическое опреде- ление; определение со- держания фосфора пос- ле озолении Плазма-фосфоли- поиды 0,2—25Р ±0,01Р 11
Сфингомиелин из липоидов мозга 10—50 — 17
4а. УФ-Спектрофото- метрическое определе- ние после локализации с помощью направляю- щей хроматограммы Фолликулярные гормоны Около 5 ±10 36
46. Колориметриче- ское определение после локализации с помощью направляющей хрома- тограммы Сахара 50 Около ±5 25
4в. Колориметриче- ское определение после локализации опрыски- ванием водой и нагре- вания с серной кисло- той Желчные кисло- ты 10—60 ±(1,5)—(3,0) 9
а Если не приведено других данных, то указанные числа относятся к количеству отдельных
компонентов в смеси.
б При отсутствии в работе данных о точности определения приводятся приблизительные зна-
чения.
I. ОПРЕДЕЛЕНИЕ Б&ЯЬсСТРАКЦИИ РАЗДЕЛЕННЫХ ВЕЩЕСТВ
(ЯИОДЫ I ГРУППЫ)
1. ВИЗУАЛЬНЫЙ МЕТОД СРАВНЕНИЯ
В этом случае на место старта попеременно наносят равные количества
анализируемого раствора и прстепенно увеличивающиеся количества эта-
лонного раствора определяемого компонента известной концентрации и про-
водят хроматографическое разделение. После этого сравнивают величину
56
Общая часть
окрашенных или флуоресцирующих (использование УФ-лампы) пятен. Пят-
но эталонного раствора, по своей величине совпадающее с пятном анализи-
руемого раствора, дает искомый результат. Большинство проведенных таким
образом определений носит полуколичественный характер (ср. табл. 2).
Этот- метод, которым на бумаге при соответствующих условиях можно
получить довольно точные данные [38], в случае ХТС приводит к неудовле-
творительным результатам. Как показывает рис. 38, при хроматографии
в тонких слоях в отличие от хроматографии на бумаге лишь в сравнительно
узкой области концентраций имеется визуально различимая зависимость
Рис. 38. Зависимость площади пятна от количества наносимой пробы (алкалоида)
при постоянной длине пути.
I — разделение на бумаге, пропитанной формамидом; II — разделение на слое силикагеля
Г. Точки символизируют число молекул Г35].
между нанесенным количеством вещества и площадью пятна. Этот метод
может быть использован при быстром изменении окраски пятен или при
наличии столь малых количеств веществ, что при их определении другими
методами нельзя ожидать воспроизводимых результатов.
2 ФОТОГРАФИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
Хроматограммы в тонких слоях, дающие при окраске в результате опры-
скивания контрастные пятна с неизменяющейся (по крайней мере во время
опыта) окраской, можно объективно оценить способом «Agfa-Copyrapid».
Полученные при этом темные пятна планим^тпируют и оценивают, исполь-
зуя калибровочную кривую, построенную при использовании различных
количеств анализируемого вещества. Этот метод был использован Зеэром
[32] для определения в продажном загрязненном З-бутил-4-оксианизоле
биологически активного вещества и для количественного анализа токоферола
[331 (ср. табл. 2). Из этих исследований вытекает, что для каждой тонкослой-
ной хроматограммы необходимо строить свою калибровочную кривую,^посколь-
ку часто обнаруживается некоторое различие в толщине слоя (см. рис. 39).
Гл. 6. Количественная оценка хроматограмм в тонких слоях
57
С учетом этого в данных опытах было получено совпадение результатов с точ-
ностью ± 5%, когда в предварительных опытах количество анализируемого
компонента было подобрано так, что определяемая величина находилась
в оптимальной области калибровочной кривой.
Рассмотрим проведение такого анализа на примере определения чистоты 3-бутил-
4-оксианизола. 6 пятен непрерывно увеличивающихся количеств чистого соединения
и между этими пятнами еще 6 пятен постоянного количества анализируемого вещества
наносятся на линию старта тонкослойной пластинки, разделяются растворителем и окра-
шиваются раствором фосфорномолибденовой кислоты. После приготовления фотокопии
способом Agfa-Copirapid темные пятна планиметри-
руются. Из полученных при планиметрировании
шести значений площадей пятен анализируемого
вещества вычисляется среднее значение. По величи-
нам пятен чистого вещества строится калибровочная
кривая. По этой кривой определяется абсолютное
количество анализируемого вещества.
Пурди и Тратер [28] обработали имею-
щиеся в литературе [3, 33, 356] и собствен-
ные данные и нашли зависимость между ве-
личиной пятна, полученной планиметрирова-
нием, и нанесенным количеством вещества.
Приведены графический и расчетный методы
количественного определения, показываю-
щие, что существует прямая пропорциональ-
ность между логарифмом количества вещества
в граммах и корнем квадратным из вели-
чины пятна в мм2.
Для количественной оценки хроматограмм
в тонких слоях использовался также так на-
зываемый метод фотопринта. После разделе-
ния пятна окрашивали и затем делали про-
Р и с. 39. Зависимость площади
пятна от нанесенного количества
(З-бутил-4-оксианизола) на двух
пластинках силикагеля (по Зе-
геру).
зрачным сорбционный слой, обработав его со-
ответствующим растворителем. После этого готовили светокопию, которую
разрезали на соответствующие полоски и промеряли спектрофотометром.
В этом методе, кроме наличия контрастных полос и постоянства в процессе
анализа окраски пятен, предполагается также, что прозрачность сорбцион-
ных слоев может быть достигнута без повреждения пятен. Поэтому этот вид
количественной оценки хроматограмм имеет ограниченное применение. Он
был использован Хефенделем [12] для определения содержания ментофу-
рана в масле перечной мяты. И в этом методе желательно для каждой
хроматограммы строить отдельную калибровочную кривую.
3. ФОТОДЕНСИТОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПОСЛЕ ОКРАСКИ
Прайвет и Бланк [27] переводили смеси насыщенных и ненасыщенных
глицеридов с помощью реакций окисления и расщепления в вещества различ-
ной полярности, разделяли их хроматографически на пластинках с силика-
гелем Г и после обугливания серной кислотой количественно определяли
денситометрически (см. рис. 40 Е^табл. 2). В другой работе эти авторы вместе
с Лундбергом [27а] разделяли главным образом насыщенные моно-, ди-
и триглицериды и определяли их денситометрически (см. табл. 2). При этом
моно-, ди- и триглицериды подвергались хроматографическому разделению
с помощью соответствующего растворителя, состоявшего из эфира и скелли-
зольва в различных соотношениях.
Методика. После проявления пластинки сушили при комнатной температуре, опры-
скивали 50%-ным водным раствором серной кислоты и нагревали. Образовавшиеся
58
Общая часть
пятна промеряли денситометром [фирма «Photovolt» 52-С и 521 А (рис. 40)] с устрой-
ством для полуавтоматической съемки кривых. Ширина щели денситометра составляла
1X5 или 1 X 7,5 мм. Промеры проводили по всей длине хроматограммы через каждый
1 лг!и. Фильтры не применяли. Погрешности, обусловленные фоном, были невелики.
В определенной области была обнаружена линейная зависимость между количеством
Рис. 40. Денситометр фирмы «Photovolt».
вещества и площадью пятна. Разумеется, площади пятен (при постоянной величине
пробы) глицеридов с одинаковым или почти одинаковым числом углеродных атомов, но
различной структуры не во всех случаях одинаково велики. Поэтому оказалось необхо-
димым для каждого глицерида построить вначале соответствующую калибровочную
кривую (рис. 41).
В том случае, если, как в описанной работе, «фон» не вызывает сильных
помех и в определенной области имеется хорошо воспроизводимая зависи-
мость между площадью пятна и количеством нанесенного вещества, при
1200
е. W00
\ 800
С
а
S
| 600
'I 400
я
<5
200
о
2 4 6 8
Количество пробе) иг
Рис. 41. Зависимость площади пятна от количества наносимой пробы для различных
глицеридов жирных кислот (по Прайвету с сотрудниками [27а]).
• триолеин; О трипальмитин; А дипальмитин; х монопайьмитин.
наличии соответствующего измерительного прибора быстро получают коли-
чественные результаты. Так, после обработки соответствующими реактивами
были денситометрически промерены тонкослойные хроматограммы синтети-
Гл. 6. Количественная оценка хроматограмм в тонких слоях &9
ческой смеси азот- фосфор- и серусодержащих алифатических липидов [22].
Модельные смеси насыщенных липидов с аминами, амидами и нитрилами
в количествах от 5 до 35 рг на каждый класс соединений были проанализиро-
ваны с погрешностью ±8% (ср. табл. 2). Можно также получить фотокопии
таких хроматограмм и использовать метод нахождения площадей пятен, опи-
санный на стр. 57. При работе с количествами, равными 30—130 цг на каж-
дый класс соединений, ошибка анализа составляет ±5%.
Цолнером и сотрудниками [41] методом ХТС на силикагеле эфиры холе-
стерина были разделены на пять основных фракций, окрашены треххлористой
сурьмой и определены фотометрически с использованием различных приборов
(прибор, используемый при электрофорезе, фирмы «Bender и Hobein», прибор
для промеров хроматограмм к фотометру фирмы «Eppendorf» и самодельное
устройство к прибору DUG 4700 фирмы «Beckman)». Согласно сообщению
Шталя с сотрудниками [35а], для количественной оценки тонкослойных хро-
матограмм пригоден двухлучевой саморегистрирующий и интегрирующий
денситометр марки «Chromoscan»* после переделки его на формат пластинок
10 х 20 см.
4. РАДИОАВТОГРАФИЧЕСКИЙ МЕТОД
Меченые липиды (см. стр. 77) после разделения на отдельные классы
определяются радиоавтографически [21] (ср. стр. 73). Для этого фотографи-
ческие пленки накладывают в темной комнате на хроматограммы и через
соответствующее время проявляют и фиксируют. Затем пленки промеряют
денситометрически.
II. ОПРЕДЕЛЕНИЕ РАЗДЕЛЕННЫХ ВЕЩЕСТВ ПОСЛЕ ЭКСТРАКЦИИ
(МЕТОДЫ II ГРУППЫ)
Способ оценки хроматограмм в тонких слоях, состоящий в опрыскивании
окрашивающим реактивом с последующей экстракцией окрашенных веществ
и фотометрическим определением, часто вызывает трудности, как и в случае
хроматографии на бумаге. Соотношение концентраций реактива и определяе-
мого вещества различно в центре и у края хроматографического пятна,
поэтому ход реакции может быть различным. Часто также образующиеся
окрашенные вещества экстрагируются значительно труднее, чем сами раз-
деленные вещества. Кроме того, сам слой часто также окрашивается реакти-
вом, вследствие чего возникает необходимость учета фона. Наоборот, лока-
лизация путем окраски разделенных веществ может применяться без огово-
,рок, если на последующее количественное определение, например методом
газовой хроматографии (ср. стр. 63), используемый для опрыскивания реак-
тив не влияет.
Если, однако, можно локализовать разделенные вещества без их даль-
нейшего превращения, например по их собственной флуоресценции или по
поглощению в ультрафиолете на пластинках, покрытых флуоресцирующим
составом, и если после экстракции вещества имеются в количествах, доста-
точных для применения физико-химических методов определения, то эту
возможность обычно следует использовать.
Во многих случаях после экстракции проводят фотометрическое опреде-
ление в ультрафиолетовой области или, после окраски, в видимой области,
как это показано на рис. 42 на примере кислот желчи. Вначале целесообраз-
но определить холостую пробу путем обработки выбранного сорбента
экстрагентом. Такие опыты описаны, например, для силикагеля Г в каче-
* Фирма «Joyce, Loebl а. Со» (Гейтсхед, Англия).
60
Общая часть
стве сорбента и метанола в качестве экстрагирующего веществу при коли-
чественном определении в УФ-области [7]. При экстракции силикагеля
возникают трудности с применением гидрофильных экстрагентов. Силика-
гель в виде коллоида переходит в раствор, однако во многих случаях его
Рис. 42. Спектрофотометрическое определение желчных кислот после экстракции
разбавленной серной кислотой, которая одновременно служит реактивом.
а — спектры холевой (-----), дезоксихолевой (—----) и хенодезоксихолевой (—•—) кислот
после разделения и окраски; б — зависимость поглощения от количества анализируемой про-
бы; х холевая кислота (386 мр.), Q дезоксихолевая кислота (386 му.), • хенодезоксихолевая кислота
(381 мц).
можно отделить фильтрованием раствора через кизельгур. Далее следует
иметь в виду, что связующий материал, сульфат кальция, почти количествен-
но растворяется в воде.
После этих предварительных исследований следует определить, извле-
кается ли определяемое вещество выбранным экстрагентом полностью. Для
Таблица 4
Применение этанола в качестве экстрагента для извлечения
гидрокортизонового спирта и гидрокортизонацетата
с пластинок со слоем силикагеля Г
Нанесен- ное коли- чество, цг Экстрагиро- ванное количество, цг Стандартное отклонение о, отн. %
Гидрокортизоновый спирт 100 99,1 1,4
Гидрокортизонацетат . . . 100 101,2 1,4
Относительно колориметрического определения после эк-
стракции см. стр. 62.
о — стандартное отклонение;
/ — отклонение отдельного изме-
а-100 / рения от среднего значения;
аотн= дорр у n______। 7V —число измерений (в данном
случае 10);
MW — среднее значение.
Гл. 6. Количественная оценка хроматограмм в тонких слоях 61
этого пробы вещества наносят на пластинку, покрытую соответствующим
сорбентом. Проведя сушку в условиях, соответствующих условиям прове-
дения собственно хроматографического разделения, экстрагируют вещество
и определяют экстрагированное количество, затем вычисляют ошибку, воз-
никающую при повторении опыта (см. табл. 4).
В общем при надлежащем выборе экстрагента около 95% нанесенной про-
бы экстрагируется вновь. Следует только избегать длительной выдержки
пластинок с нанесенной пробой перед разделением, поскольку при этом
из-за весьма большой поверхности соприкосновения анализируемогб веще-
ства и сорбента под действием воздуха может произойти изменение анализи-
руемой пробы.
Если после разделения и экстракции получают в ультрафиолетовой обла-
сти завышенные значения или разброс при определении холостых проб,
то следует иметь в виду, что это может быть связано с недостаточным удале-
нием компонентов растворителя, поглощающих в УФ-области.
1. ЛОКАЛИЗАЦИЯ ПО СОБСТВЕННОЙ ОКРАСКЕ
ИЛИ СОБСТВЕННОЙ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ ОПРЕДЕЛЯЕМОГО ВЕЩЕСТВА
Если разделенные вещества обладают собственной окраской или флуорес-
цируют при облучении УФ-светом, то после хроматографического разделе-
ния их можно просто обнаружить.
При работе с флуоресцирующими веществами следует по возможности
всегда приводить длину волны возбуждающего излучения.
Таким образом, были проанализированы модельные смеси резерпина
и ресцинамина [30] (ср. табл. 3). После локализации с применением УФ-све-
та (254 или 366 .иц) алкалоидные пятна и находящиеся на той же высоте
пустые зоны сорбента соответствующей величины (холостые пробы) были
соскоблены с пластинки, экстрагированы- и определены методом УФ-спек-
трофотометрии. Таким же способом были проанализированы экстракты
Secale cornutum, содержащие алкалоид спорыньи [19]. После экстракции
и добавки окрашивающего реактива алкалоиды определяли фотометрически
в видимой области. Аналогичным образом в полумикроопытах (20—50 мг)
количественно определены липиды из фекалий и фекальных камней [39].
Липиды были локализованы после разделения на пластинках с силикагелем
по их собственной флуоресценции в ультрафиолетовом свете и экстрагирова-
ны. Остатки после экстракции были взвешены (см. табл. 3).
2. ПРИМЕНЕНИЕ ФЛУОРЕСЦИРУЮЩИХ СЛОЕВ
В большинстве случаев после разделения в тонких слоях вещества нельзя
обнаружить без дальнейшей обработки. Поскольку, однако, многие органи-
ческие вещества поглощают в ультрафиолетовой области, существует воз-
можность или опрыснуть хроматограммы специальными растворами органи-
ческих флуоресцирующих красок, переходящих в возбужденное состояние
под действием УФ-света, или предварительно смешать сорбент с неоргани-
ческими флуоресцирующими веществами. В обоих случаях поглощающие
УФ-излучение органические вещества можно определить в виде темных
пятен, гасящих флуоресценцию на флуоресцирующем фоне. В то время как
опрыскивание должно производиться весьма равномерно для обеспечения
чувствительности определения, добавление неорганических флуоресцирую-
щих красок к сорбенту — очень простая операция, причем при экстракции
идентифицируемых разделенных органических веществ осложнений не возни-
кает [17а]. Весьма удобно перед перемешиванием наносимой массы добавле-
ние к сорбенту 2—5% светящегося вещества «ZS-супер» (фирма «Riedel
62
Общая часть
de Наел») * [7J. После локализации вещества, поглощающие в ультрафиоле-
те, можно экстрагировать и определить, например, спектрофотометрически.
Подробно эта возможность локализации с последующим спектрофотометри-
ческим определением экстрагированных компонентов в УФ-области была
проверена на модельной смеси метилового и пропилового эфиров п-оксибен-
зойной кислоты [7J. В качестве коэффициентов поглощения можно подставить
удельное поглощение анализируемого вещества в максимуме поглощения.
Можно показать экспериментально, что ошибка меньше в том случае, когда
на каждой пластинке одновременно с пробой хроматографируется эталон-
ное количество анализируемого вещества; при этом неизвестная концентра-
ция пробы может быть рассчитана по измеренной величине поглощения
(табл. 5).
, Таблица 5
Количественный анализ смеси метилового н пропилового эфиров
га-оксибензойной кислоты после разделения методом ХТС
Проба содержала около 50 цг каждого из веществ
Определение по постоян- ным коэффи- циентам поглощения. В среднем извлечено, % Стан- дартное отклоне- ние, аотн’ % Определение с использо- . ванием эта- лонных количеств отдельных компонентов, которые хро- матографи- . руются одновременно с пробой. В среднем извлечено, % Стан- дартное отклоне- ние, аотн’ %
Метиловый эфир .... 96,0 ±6,7 100,4 ±3,2
Пропиловый эфир . . . 93,6 ±5,7 98,0 ±4,8
_ п-100
а°тн“ MW
<т — стандартное отклонение;
/ — отклонение отдельного измерения от
среднего значения;
N— число измерений (в данном случае 14);
MW — среднее значение.
Методика. 22 г силикагеля Г фирмы «Merck» смешали с 0,5 г светящегося вещества
ZS-супер» и нанесли обычным способом на пластинки (стр. 16). Нанесли в виде пятен
пробы (50 цг) из метанольных растворов разделяемых смесей эфиров и отдельных ком-
понентов. После разделения отметили иглой адсорбционные пятна, локализуемые при
облучении коротковолновым УФ-светом (254 лц). Эти пятна и находящиеся на одной
с ними высоте равновеликие «пятна» в области свободного силикагеля, используемые
для холостых промеров, соскоблили лезвием безопасной бритвы и перенесли в малень-
кие пробирки (G5) по Горбаху, после чего несколько раз обработали порциями экстра-
гента (метанол) по 2 мл, используя магнитную мешалку. Экстракты профильтровали
с помощью устройства Горбаха через стеклянные фильтрующие таблетки G4, применяя
небольшой вакуум, и собрали в мерные колббчки емкостью 10 мл. После заполнения
мерных колбочек экстрагентом провели измерения спектрофотометром в области макси-'
мума поглощения, учитывая значения для холостых проб.
Аналогичным образом можно осуществить фотометрическое определение
и в видимой области, после разделения соответствующим проявителем, лока-
лизации в УФ-свете и экстракции. Этот метод был использован при анализе
смесей гидрокортизонового спирта и гидрокортизонацетата. Окраску прово-
* Относительно силикагеля с флуоресцирующим индикатором см. примечание
на стр. 40.
Гл. 6. Количественная оценка хроматограмм в тонких слоях 63
дили после экстракции 3,3'-дианизил-6ис-4,4'-(3,5-дифенил) тетразолиумхло-
ридом [8] в основных растворах. Измерения осуществляли при 520 .ир
(ср. табл. 3).
При обстоятельном исследовании разделения стероидов на свободно насы-
панных слоях окиси алюминия или силикагеля с добавкой флуоресцирующе-
го вещества, но без связующего материала были также проведены количест-
венные определения [4]. На почти горизонтальной пластинке, помещенной
в хроматографическую камеру, вещества были разделены и затем локализо-
ваны в УФ-свете, экстрагированы и взвешены (ср. табл. 2 и стр. 256). Посколь-
ку свободно насыпанные слои сорбента весьма чувствительны к толчкам и их
опрыскивание реактивами можно проводить только во влажном состоянии,
применение свободных слоев- не рекомендуется.
3. ОКРАСКА РАЗДЕЛЕННЫХ ВЕЩЕСТВ ПЕРЕД ЭКСТРАКЦИЕЙ
Как уже упоминалось, нецелесообразно проводить окрашивание разде-
ленных веществ на хроматограмме, после чего окрашенные вещества экстра-
гировать и фотометрировать. Тем не менее этот метод был использован Бар-
ролье [2] при количественном разделении аминокислот по Бреннеру и Нидер-
визеру [3], причем, по-видимоМу, с успехом. Данные о воспроизводимости
этого метода анализа не приведены,
В отдельных случаях для локализации разделенных веществ можно
использовать такие реактивы, которые не мешают последующему примене-
нию (после экстракции пятен) второй цветной реакции, необходимой для
колориметрического определения. Для второй цветной реакции применяют
другой реактив, действующий на другую функциональную группу опреде-
ляемого соединения. Так можно разделять эфиры жирных кислот, локали-
зовать их парами иода и после проявления количественно определить
колориметрически, переведя эфиры в окрашенные железные комплексы гид-
роксамовых кислот [37] (см. стр. 159). Воспроизводимость метода была
проверена на смеси метиловых эфиров пальмитиновой, 6-оксистеариновой
и 9, 10-диоксистеариновой кислот. При применении 100—1000 рг отдельных
компонентов, наносимых на линию старта в виде полос, стандартное откло-
нение для 10 определений составляло 4—7%. Этим же методом были проана-
лизированы смеси моно-, ди- и триглицеридов [37] (ср. табл. 3). Гликолипо-
идные фракции липоидов мозга были окрашены аммиачным раствором бром-
тимолового и определены колориметрически после экстракции антронсерной
кислотой [17] (ср. табл. 3). Для получения воспроизводимых результатов
при работе с небольшими количествами растворителя была использована
стандартная микропосуда для ультрамикроанализа фирмы «Beckman Instru-
ments» [29]. Фракции липидов человеческой плазмы [11] и сфингомиелиновые
компоненты липоидов мозга [17] были окрашены на хроматограмме амми-
ачным раствором бромтимолового Синего и озолены, и затем в их зоне коло-
риметрически определено содержание фосфора (ср. табл. 3). При анализе
липидных фракций плазмы Габерман и сотрудники обнаружили от 88 до
102% суммарного фосфора. Определяемые количества: 0,2—25 цг фосфора
на пятно при ошибке определения 0,1 цг Р. Холостое значение для 1 см2
силикагеля составляет 0,05—0,1 рг фосфора.
Был описан также газохроматографический промер окрашенной хро-
матограммы. Комбинируя хроматографию в тонких слоях и газовую хромато-
графию, удалось разделить и количественно определить смеси метиловых эфи-
ров насыщенных и ненасыщенных жирных кислот [23] (см. стр. 179 и табл. 3).
При обработке тонкослойных хроматограмм радиоактивных веществ так-
же можно провести вначале окраску этих веществ и после экстракции изме-
рить интенсивность излучения счетчиком Гейгера — Мюллера. Этим мето-
64
Общая часть
дом были проанализированы смеси липидов [21, 24]. Количества 0,1—
100 цг отдельных липидов определяют этим методом с точностью ±5%
(ср. табл. 3). Если необходимо определить еще меньшие количества, следует
применить радио автографический промер непосредственно на хроматограмме
(см. гл. «Метод радиоактивных изотопов»). .
4. ДРУГИЕ МЕТОДЫ ЛОКАЛИЗАЦИИ РАЗДЕЛЕННЫХ ВЕЩЕСТВ
Простейшим образом можно осуществить анализ кислот желчи (ср. табл. 3).
После разделения хроматограмму опрыскивают водой, в результате чего
плохо смачиваемые пятна желчных кислот становятся видимыми. Для коли-
чественного определения экстрагируют 65%-ной серной кислотой, являю-
щейся одновременно и окрашивающим реактивом, после нагревания спек-
трофотометрируют [9] (см. стр. 60).
Как и в случае хроматографии на бумаге, при ХТС можно локализовать
разделенные вещества с помощью так называемой «направляющей» хрома-
тограммы. При этом рядом с пятном анализируемой смеси наносят пятно
эталонной смеси анализируемых веществ. После разделения закрывают ана-
лизируемую хроматограмму, а направляющую хроматограмму окрашивают.
На высоте пятен окрашенных эталонных веществ в анализируемой хромато-
грамме отмечают соответствующие площади и после экстракции проводят
количественное определение. Этот метод может быть использован только в том
случае, когда качественный состав анализируемого раствора и эталонной
смеси одинаков, поскольку находящиеся в анализируемом растворе сопут-
ствующие и балластные вещества могут при определенных условиях значи-
тельно изменить значения Rf определяемых веществ.
Кроме того, следует отобрать равномерно покрытые пластинки и выпол-
нить все предварительные условия, обеспечивающие постоянную скорость
движения фронта растворителя (см. стр. 35). Этот метод был использован
для разделения и количественного определения эстрона, 170-эстрадиола
и 16а, 170-эстриола [36] (ср. табл. 3 и стр. 258). Чтобы уменьшить попадание
окрашивающего реактива (12%-ной треххлористой сурьмы) на закрытую хро-
матограмму, не проводят опрыскивание, а наносят раствор реактива на пресс-
папье, покрытое фильтровальной бумагой, и накатывают его на направляю-
щую хроматограмму. С анализируемой хроматограммы соскабливают зоны
при соответствующих значениях Rf, экстрагируют и проводят количествен-
ное определение методом УФ-спектрофотометрии.
Направляющие хроматограммы были также использованы для количест-
венного анализа сахаров [25] (см. табл. 3 и разд. 21,4). Поскольку при этом
пластинки готовились вручную и поэтому не были выполнены указанные
выше условия, этот метод должен быть, плохо воспроизводимым. Так же на
силикагелевых пластинках, изготовленных вручную с использованием в каче-
стве связующего вещества крахмала из природной смеси, был выделен ипомеа-
марон, локализован с помощью направляющей хроматограммы, экстрагиро-
ван и после окрашивания 2,4-динитрофенилгидразином определен колори-
метрически [1].
Перечисленные ниже вещества могут быть обнаружены на тонкослойных
хроматограммах биологическими методами. '
1. Бактериостатические и бактерицидные соединения (см. разд. 15, I, 4).
2. Инсектициды (см. разд. 17, II, 4).
3. Гемолизуемые соединения (см. разд. 18, VI).
4. Горечи (см. разд. 18, VI).
Далее следует указать на описанное Велером [1а] устройство для обнару-
жения в результате прямой возгонки из слоя и сублимации на вторую пла-
стинку.
Гл. в. Количественная оценка хроматограмм в тонких слоях
65
В заключение следует еще упомянуть применявшуюся Гейнсом и Грютц-
махером [12а] комбинацию хроматографии в тонких слоях и масс-спектро-
метрии. При этом соскобленные с хроматограммы пробы конденсированных
ароматических и гетероциклических соединений стероидов и производных
сахаров и аминокислот в маленьких стеклянных капиллярах непосредствен-
но вводили в масс-спектрометр. В применяемом интервале температур 150—
200° эти соединения возгоняются прямо в электронном пучке.
ЛИТЕРАТУРА к гл. 5 и 6
1. A k a z a w a Т., Wada К., Agr. Biol. Chem. (Japan), 25, 30 (1961).
la. В a e h 1 e r Br., Helv. Chim. Acta, 45, 309 (1962).
2. В а г г о 1 i e r J., Naturwiss., 48, 404 (1961).
3. Brenner M., Niederwieser N., Experientia (Basel), 16, 378 (1960).
4. Cerny V., J о ska J., L abler L., Collection Czechoslov. Chem. Common.,
26, 1658 (1961).
5. D a m M. J. D., van, KI e u v e r G. J. de, Heus J. G. d e, J. Chromatogr.,
4, 26 (1960).
6. E g g e r s J., Phot, und Wiss., 10, 40 (1961).
7. Ganshirt H., Morianz K., Arch. Pharm., 293/65, 1065 (1960).
8. Ganshirt H., Morianz К., неопубликованные данные.
9.
10.
11.
12.
12a. Hey ns K., Griitzmacher H. F., Angew. Chem., 74, 387 (1962).
13......... ’ ................. ' " "" x'""
14.
G a n s h i
G e t z J.
Habermann E., В an d 11 о w G., KruscheB., Klin. Wschr., 39, 816 (1961).
Hefendehl F. W., Planta med., 8, 65 (1960).
Hilton J., Hall W. B., J. Chromatogr.,° 7, 266 (1962).
Hornung W., Handbuch der Agfa-Photopapiere, Dusseldorf, Karl Knapp Ver-
lag, 1955.
Huhnstock K., Weicker H., Klin. Wschr., 38, 1249 (1960).
J ane eke H., Maa s-G о e b e 1 s I., Z. analyt. Chem., 178, 161 (1960).
Jatzkewitz H., Hoppe Seyler’s Z. physiol. Chem., 326, 61 (1961).
rtH., Koss F. W., M о r i a n z K., Arzneimittel-Forsch., 10, 943 (1960).
R. H., Lawson D. D., J. Chromatogr., 7, 266 (1962).
~ ’ "г.. К r u s c h e B., Klin. Wschr., 39,816 (1961).
15.
16.
17.
17a. Kirchner J. G., Miller J. M., R ice. R. G., J. Agr. Food Chem., 2, 1031
klavehn M., Rochelmeyer H., Dent. Apotheker Ztg., 101, 477 (1961).
H., Rochelmeyer, Seyfried J., Dent. Apotheker Ztg.,
gerJV., Z. analyt. Chem., 185, 111 (1962).
K.’
K.,
K.,
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
(1954).
I”
Klavehn M.
101, 75 (1961).
Lichtenb
Mangold
Mangold
Mangold
Mangold
e r
H.
H.
H.
H.
Fette, Seifen, Anstrichmittel, 61, 877 (1959).
Kammereck R., J. Am. Oil Chemists’ Soc., в печати.
Kammereck R., Chem. and Ind., 1961, 1032.
Kammereck R., M a 1 i n s D. C., Microchem. J., Sym-
posium II, в печати.
25. P a s t u s k a G., Z. analyt. Chem., 179, 427 (1961).
26. P e t г о w i t z H. J., Materialpriifung, 2, 309 (1960).
27. P r i v e t t O. S., В 1 a n k M. L., J. Lipid Research, 2, 37 (1961).
27a. Privett O. S., Blank M. L., Lundberg W. O., J. Am. Oil Chemists’ Soc.,
38, 312 (1961).
28. P u r d у J., Truter E. V., Chem. and Ind., 1962, Heft 11, 506.
29. S a n z M. C., Beckman report, 1, 4 (1960).
30. Schlemmer F., Link E., Pharmaz. Ztg., 104, 1349 (1959).
31. Seher A., Fette, Seifen, Anstrichmittel, 61, 345 (1959).
32. Seher A., Nahrung, 4, 466 (1960).
33. Seher A., Mikrochim. Acta (Wien), 1961, 308 [2].
34. Stahl E., Chemiker-Ztg., 82, 323 (1958).
35. Stahl E., Naturwiss., 47, 114 (1960).
35a. Stahl E., Mitarb., частное сообщение.
356. Stahl E., Z. analyt. Chem., 181, 303 (1961).
36. Struck H., Mikrochim. Acta (Wien), 1961, 634 [4].
37. V i о q u e E., H о 1 m a n R. T., J. Am. Oil Chemists’ Soc., 39, 63 (1962).
38. Waldi D., Chromatographie, S. 67, E. Merck, Darmstadt, 1959.
39. Williams J. A., Sharma A., Morris L. J., H о 1 m a n R. T., Proc.,
Soc. Exptl. Biol. Med., 105, 192 (1960).
40. Winterstein A., H e g e d ii s B., Hoppe Seyler’s Z. physiol. Chem., 321,
97 (1960).
41. Z 6 11 n e r N., Wolfram G., Amin G., Klin. Wschr., 40, 273 (1962).
5 Заказ № 734
ГЛАВА 7
МЕТОД РАДИОАКТИВНЫХ ИЗОТОПОВ
X. Мангольд
Особое преимущество применения радиоизотопов в химических исследо-
ваниях известно: это большая чувствительность обнаружения радиоактив-
ных элементов, на которую не влияет природа их химической связи.
В последние годы хроматографические методы были использованы для
разделения и выделения радиоактивных элементов, весьма близких по хими-
ческим свойствам [17]. Эти методы неоднократно использовались также для
фракционирования меченых органических веществ. В обзорной работе Роше,
Лисицкого и Михеля [44] показано, как важно использовать в различных
хроматографических методах изотопы, в особенности при биохимических
исследованиях. Многие авторы описали специальное биохимическое приме-
нение разных радио хроматографических методов [2, 14]. Особенное впе-
чатление производят исследования Кальвина [13] по ассимиляции радио-
активного углекислого газа и анализ методом хроматографии на бумаге
меченых первичных продуктов фотосинтеза в водорослях и других зеленых
растениях. С тех пор как Финк, Дент и Финк [16] описали фотографический
способ локализации радиоактивных веществ на бумажной хроматограмме,
радио автография стала незаменимым вспомогательным средством при иссле-
дованиях механизма фотосинтеза [5, 6, 13] и других проблем биохимии.
Пригодна ли ХТС для разделения веществ, меченных изотопами? Автор
считает, что ХТС в ближайшие годы вытеснит другие радиохроматографи-
ческие методы. Следующие преимущества ХТС обосновывают зто предполо-
жение.
Методы ХТС отличаются от других микропрепаративных методов боль-
шой емкостью разделительного слоя. На одной пластинке (20 X 20 см)
можно легко разделить несколько миллиграммов смеси и выделить радио-
активные соединения в количествах, достаточных для большинства дальней-
ших измерений.
Если использовать ХТС в качестве аналитического метода, то можно ука-
зать и на другие преимущества.
В противоположность всем методам колоночной хроматографии при ХТС,
так же как и при хроматографии на бумаге, весь путь, на котором происходит
разделение, лежит открытым, и поэтому почти все вещества (за исключением
легко летучих) могут быть обнаружены.
Фракционирование методом ХТС в большинстве случаев значительно
более четкое, чем при колоночной хроматографии и хроматографии на
бумаге.
Чувствительность обнаружения выше, чем в случае хроматографии на
бумаге, поскольку разделяемые вещества концентрируются в значительно
меньших пятнах. Поэтому на тонкослойных хроматограммах могут быть
обнаружены также значительно менее активные вещества и избтопы с мень-
шей энергией излучения. Эффект самопоглощения в адсорбционном слое,
по-видимому, играет небольшую роль.
Метод весьма прост, и большинство разделений требует менее одного часа.
Гл. 7. Метод радиоактивных изотопов 67
Эти преимущества ХТС особенно ценны при работе с очень «горячими»
и короткоживущими изотопами.
При химических и биологических исследованиях используются почти
исключительно долгоживущие радиоизотопы, испускающие главным образом
мягкие Р-лучи. Особенно важен радиоуглерод С14 (период полураспада
5568 лет, максимальная энергия 0,155 Мэв) и радиоактивный водород Н3 (три-
тий) (период полураспада 12,2 года, максимальная энергия 0,018 Мэв). Часто
прйменяют также радиофосфор Р32 (14,3 дня, 1,701 Мэв), радиосеру S35
(87,1 дня, 0,167 Мэв) и радиоиод I131 (80,4 дня, 0,608 Мэв (0)).
I. РАЗДЕЛИТЕЛЬНЫЕ СЛОИ, РАСТВОРИТЕЛИ И ХИМИЧЕСКИЕ
МЕТОДЫ ОБНАРУЖЕНИЯ
Приведенные в специальной главе этой книги условия разделения при-
годны и в случае различных классов соединений, меченных радиоизотопами.
Фракционирование может быть осуществлено методом адсорбции или распре-
деления на слоях адсорбентов, методом распределения в обращенных фазах
на гидрофобизованных слоях, методом ионного обмена, методом тонкослой-
ного ионофореза и при сочетании тонкослойного ионофореза с ХТС; раство-
рители во всех случаях также аналогичны.
В случае хроматограмм в тонких слоях, содержащих радиоактивные веще-
ства, для обнаружения также применимы химические реактивы. Наряду
с этим следует использовать различные радиометрические методы для обна-
ружения и количественного определения меченых соединений. Одну и ту же
хроматограмму всегда необходимо исследовать и химическим, и радиометри-
ческим методом, чтобы иметь представление о химической и радиохимической
чистоте анализируемых веществ.
/
II. МЕТОДЫ ОБНАРУЖЕНИЯ РАДИОАКТИВНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ
Для определения радиоактивных веществ на пластинках, покрытых сло-
ем, лучше всего использовать радиоавтографию. Возможно обнаружение
счетчиком Гейгера — Мюллера, но оно требует больше времени, значительно
менее точно и поэтому сейчас используется редко. Это же относится к про-
порциональным счетчикам.
1. РАДИОАВТОГРАФИЯ
Фотографические эмульсии чернеют под действием а-, и у-лучей. Для
фотографического обнаружения радиоактивных веществ к высушенной хро-
матограмме прижимают рентгеновскую, пленку и хранят этот «сэндвич»
завернутым в черную материю в темноте *. Следует обратить внимание на
то, что небольшие количества некоторых из содержащихся в растворителе
реактивов могут остаться в слое и обусловить ложную картину на пленке.
Поэтому растворитель необходимо всегда тщательно удалять, перед тем как
привести хроматограмму в соприкосновение с пленкой.
При обработке большого числа хроматограмм в тонких слоях пластинки
рекомендуется пометить светящейся краской, хорошо регистрируемой рент-
геновской пленкой.
Чаще всего используют пленку «No-Screen Medical X-Ray Safety Film» **.
Эмульсия этой пленки достаточно чувствительна, и разрешающая способ-
* Контакт пленки со слоем должен быть надежным, пленку следует 'прижать
сверху стеклом и притянуть резиновыми лентами.— Прим. рвд.
** Фирма «Eastman Kodak» (Рочестер, США).
5*
68
Общая часть
ность [49] удовлетворяет требованиям, предъявляемым к ХТС. Подходящие
пленки изготавливаются также и другими фирмами *. Для проявления
пленок используют проявитель «Supermix» фирмы «General Electric» **
или другие проявители рентгеновских пленок (см. примечания 1 и 2). Рабо-
тают в темноте или при красном свете. Время проявления зависит от темпе-
ратуры и возраста проявителя. При 20° оно составляет 3—6 мин. Фиксаж для
рентгеновской пленки также производится указанными фирмами ***. Пленки
фиксируются от 20 до 30 мин, затем промываются проточной водой 0,5—
1 час.
Время экспозиции определяется активностью разделяемых веществ, видом
и энергией излучения изотопа, используемого для метки, и требуемым ре-
зультатом. Достаточного почернения пленок достигают, если за время экспо-
зиции на 1 см2 попадает 1—10 миллионов р-частиц (в зависимости от изотопа)
[23, 71]. При работе с радиоактивным углеродом следует принять в качестве
эмпирического правила, что количества вещества, которые на счетчиках
Гейгера — Мюллера дают удвоенное значение фона, вызовут значительное
почернение рентгеновской пленки при более чем двухдневной экспозиции.
В случае бумажных хроматограмм обнаружение радиоактивйых углеродных
соединений с помощью рентгеновских пленок является в 10—100 раз менее
чувствительным.
Обычно одинаковые хроматограммы с соединениями, меченными С14,
приводят в контакт с рентгеновской пленкой на 1, 2, 4 и 8 дней. Так полу-
чают радиоавтографы, которые довольно правильно передают количественное
соотношение компонентов разделенной смеси веществ, а также радиоавтогра-
фы, на которых пятна от основных компонентов переэкспонированы; неболь-
шие загрязнения при этом отчетливо выявляются. Таким образом получают
полную картину качественного состава хроматографируемой смеси.
При необходимости проводить экспонирование в течение нескольких
недель хроматограмму в тонких слоях с пленкой хранят в холодильном
шкафу.
Тонкослойные хроматограммы веществ, меченных тритием, экспонируют
обычно более одной недели, в то время как соединения, содержащие Р32
и I131, дают хорошие радиоавтографы часто за ЗОлшн и в большинстве случаев
менее чем за 6 час.
Часто необходимо обнаружить на хроматограммах соединения, содержа-
щие различные радиоизотопы, а также дважды меченные вещества [5, 27].
Это легко осуществить методом радиоавтографии, если два изотопных эле-
мента значительно отличаются по периоду полураспада или по жесткости
P-из л учения.
Хроматограмма, содержащая соединения, меченные С14 и S35, приводится
в соприкосновение с рентгеновской пленкой сразу же и несколько месяцев
спустя. Первый радиоавтограф обнаруживает почернение, вызванное излу-
чением обоих изотопов, а второй радиоавтограф имеет только пятна, вызван-
ные радиоактивным углеродом, поскольку изотоп серы полностью распался.
Как правило, второй радиоавтограф следует снимать по прошествии 5—10-
кратного времени полураспада короткоживущего изотопа.
Метод, основанный на использовании различия в энергии излучения,
можно пояснить классическим примером, заимствованным из работы Бенсо-
на и Кальвина [5]. На бумажную хроматограмму, содержащую вещества,
* Фирма «Agfa» (Леверкузен, ФРГ); фирма «Ansco» (Бингемтон, США); фирма
«Е. I. du Pont de Nemours» (Уилмингтон, США); фирма «Schleussner Fotowerke» (Франк-
фурт-на-Майне, ФРГ).
** Фирма «General Electric X-Ray Department» (Милуоки, США).
*** Конечно, все работы с успехом могут быть выполнены с отечественными мате- ,
риалами.— Прим. ред.
Гл. 7. Метод радиоактивных изотопов 69
меченные С14 и Р32, помещают две рентгеновские пленки одна на другую. Пос-
ле проявления пленка, соприкасавшаяся с хроматограммой, обнаруживает
почернение, вызванное С14 и Р32. Поскольку p-излучение радиоуглерода
обладает слабой энергией и не проникает через первую пленку, на второй
j пленке видны пятна, которые следует отнести к жесткому излучению радио-
фосфора.
Аналогичным образом можно обнаружить I131 одновременно с S36 или
С14 [27, 28, 63, 65]. Алюминиевая фольга толщиной <0,1 мм экранирует
мягкое излучение радиоактивной серы и углерода, в то время как излучение
радиойода с большой энергией легко проходит через тонкие слои алюминия.
Радиоавтографы хроматограмм на бумаге и хроматограмм в тонких слоях
могут быть количественно промерены фотоденситометрически или по величине
пятна. Возможности этого метода анализа будут нами рассмотрены ниже.
Здесь следует указать, что нерадиоактивные соединения могут быть обна-
ружены на хроматограмме радиоавтографически после нейтронной актива-»
ции или в виде меченых производных. Эти опыты подробнее рассмотрены
в разделе «Анализ с применением радиоизотопов»*.
2. СЧЕТНЫЕ ТРУБКИ И СЦИНТИЛЛЯЦИОННЫЕ СЧЕТЧИКИ
Устройства для количественной оценки хроматограмм на бумаге радио-
активных веществ счетными трубками Гейгера — Мюллера, пропорцио-
нальными проточными счетчиками и сцинтилляционными счетчиками описа-
ны неоднократно. В продаже имеются приборы для обнаружения радиоак-
тивного излучения с приспособлением для автоматического перемещения
Рис. 43. Разделение методом ХТС двух тритированных по Вильцбаху стероидов [51].
Сорбент силикагель Г (толщина слоя 0,9 мм); растворитель циклогексан — этилацетат (60 + 40);
время анализа 40 'мин; проба — 8 мг реакционной смеси. Распределение активности измерялось
непосредственно на пластинке с помощью, специальной счетной трубки. Зоны, содержащие актив-
ность, соскабливали и экстрагировали.
бумажных полос или 2-мерных хроматограмм и для регистрации результатов
измерения. Почиари и Росси [42] в обзорной статье описали наиболее
известные из этих приборов. Менее подробное рассмотрение можно найти
в различных учебниках [19, 26, 49].
Соответствующие приборы для применения в ХТС еще не известны, хотя
уже многие исследовательские группы занимаются вопросом прямого коли-
чественного расчета радиохроматограмм в тонких слоях.
Шульце и Венцель [51] сконструировали счетную трубку для измерения
активности соединений, меченных тритием, на пластинках для ХТС. На
рис. 43 показана кривая, зарегистрированная этим прибором.
* Нерадиоактивньге соединения, выделяющие летучие сульфиды или перекиси,
при большой экспозиции могут также вызвать почернение пленки.— Прим. ред.
70
Общая часть
Количественное определение по таким кривым недостаточно точнр.В насто-
ящее время чаще предпочитают экстрагировать радиоактивные вещества
с сорбента и затем уже измерять активность обычными счетчиками. Если
разные фракции содержат различные количества носителя (что, как прави-
ло, имеет место при биологических исследованиях), то обязательно следует
проводить измерения жидкостным сцинтилляционным счетчиком, чтобы
исключить самопоглощение.
Некоторые растворы, применяемые в сцинтилляционных счетчиках, при-
годны, согласно Снайдеру и Стефенсу [53], в качестве растворителей. Это
облегчает количественный промер радиохроматограмм в тонких слоях. Два
часто применяемых «коктейля» имеют следующий состав:
а) 5 г 2,5-дифенилоксазола («РРО») в качестве первичного светящегося вещества
и 0,3 г-диметил-1,4-бис [2(5-фенилоксазол)бензола] («диметил-РОРОР») в качестве вто-
ричного светящегося вещества, растворенные в 1 л толуола;
б) 104 г нафталина, 6,5 г РРО и 0,130 г РОРОР, растворенные в смеси 5 мл толуола,
500 мл диоксана и 300 мл метанола.
Чтобы избежать образования осадка в сцинтилляционном растворе,
измерение проводят при + 10°.
Согласно Снайдеру и Стефенсу [53], активность меченых соединений
можно определить и без предварительного элюирования с силикагеля Г.
Соскабливают адсорбированные радиоактивные вещества с силикагелем Г
с пластинки и промеряют суспензию, для получения которой адсорбент энер-
гично встряхивают с гелем, полученным в результате гомогенизации 4%
«кабосила»* с указанным выше раствором а) [раствор в)]. Благодаря этому
активность желатиноподобного препарата измеряется в сцинтилляционном
счетчике с большей эффективностью счета. Количество силикагеля
до 100 мг (соответствующее примерно 10 см2 разделительного слоя) на 15 мл
сцинтилляционного геля в случае веществ, меченных С14, не обнаруживает
само по глощения.
в) 5 г РРО, 0,3 г диметил-РОРОР и 40 г кабосила, растворенные в 1 л толуола.
Разработанный Снайдером и Стефенсом метод, по мнению автора, превос-
ходит другие радиометрические методы определения.
Непосредственное определение активности на разделительных слоях вслед-
ствие сильного самопоглощения излучения, а также вследствие «мягкости»
подкладки (стекло) нечувствительно и непригодно в качестве количественно-
го метода.
Степень элюирования каждый раз неопределенна.
Количественные измерения радиоавтографов на фотоденситометре зани-
мают много времени. Вещества, присутствующие в небольших количествах,
трудно определить на радиоавтографах наряду с главными компонентами
анализируемой смеси, поскольку излучение основных компонентов приводит
к переэкспонированию материала пленки, прежде чем удается обнаружить
излучёние побочных продуктов. Фотоденситометрический или планиметри-
ческий промер радиоавтографов совершенно непригоден, если разные радио-
активные фракции разбавлены различными количествами носителя.
III. ПОЛУЧЕНИЕ ВЕЩЕСТВ, МЕЧЕННЫХ РАДИОИЗОТОПАМИ
Используя химические синтезы, удается пометить молекулы соединений
в одном или нескольких местах. Прописи для получения радиоактивных
органических веществ можно найти во многих руководствах [2, 14, 66],
в первую очередь в монографии Меррея и Вильямса [41].
* Фирма «Packard Instrument» (США).
Гл. 7. Метод радиоактивных изотопов 71
Неспецифически, или «равномерно», меченные вещества получаются при
биологическом синтезе [2, 14, 74]. Для получения углеводов, меченных С14,
экспонируют, например, листья растения Саппа indica на 10—20 час для
ассимиляции радиоактивного углекислого газа [2, 14]. Аналогичным фото-
синтезом можно получить «горячий» крахмал из листьев табака [14, 34].
Радиоактивные пептиды или аминокислоты, получают из дрожжей Torula
utilis [25], но чаще Из водорослей, например Chlorella vulgaris [33] или
Chlorella pyrenoidosa [46], которые в течение многих дней ассимилировали
радиоактивный углекислый газ. В питательной среде, обедненной азотом,
последний вид водоросли вырабатывает прежде всего липиды; поэтому этот
организм представляет собой превосходный объект для получения радио-
активных жиров и жирных кислот [36]. Грибковая плесень Phycomyces
blakesleeanus также применяется для получения жирных кислот, меченных
С14 [8]. «Горячие» нуклеиновые кислоты, нуклеотиды и нуклеозиды получа-
ют из Torula utilis [25]. Соя также пригодна для биосинтеза моченых природ-
ных веществ [15].
Многие специфические меченые соединения имеются в продаже. В прода-
же имеются также радиоактивные дрожжи и водоросли, а также протеиновые
гидролизаты и экстракты сахаридов и липидов из этих организмов. Брошю-
ра, изданная международной Комиссией по атомйой энергии, содержит
список имеющихся в продаже препаратов, их удельные активности, а также
адреса изготовителей [25].
Продажные радиоактивные препараты часто бывают весьма загрязнены
и могут быть использованы для химических и биохимических исследований
только после тщательной очистки.г
Часто классические методы очистки сырых продуктов синтеза являются
неудовлетворительными, если их приходится применять к небольшим коли-
чествам радиоактивных препаратов. В связи с этим следует указать на пред-
ложенный Рапортом и Лернером [43] критерий эффективности фракционной
кристаллизации: перекристаллизацию загрязненного соединения, часто при-
водящую к большим потерям, обычно проводят до тех пор, пока некоторые
физические константы основной фракции не перестанут измеряться. Ука-
занные авторы рекомендуют проводить фракционную кристаллизацию так,
чтобы только 1—5% вещества оставалось в маточном растворе. Путем
сравнения результатов анализа остатка с результатами анализа основ-
ной фракции получают более полное представление в отношении успе-
ха операции очистки по сравнению с до сих пор использованными крите-
риями.
ХТС особенно пригодна для очистки радиоактивных соединений. Это
препаративное использование метода будет более подробно описано в специ-
альном разделе.
Вильцбах [69] предложил изящный метод метки тритием органических
соединений. Вещество вместе с газообразным тритием запаивают в стеклян-
ный сосуд и оставляют на много дней и даже недель. При этом часть атомов
Н молекулы, подлежащей метке, замещаются атомами Н3. Одновременно,
однако, всегда протекают побочные химические реакции. Ненасыщенные
соединения частично или полностью гидрируются. Метод Вильцбаха подроб-
но описан в недавно вышедшей монографии [50]. Многие фирмы производят
меченые вещества этим способом [25].
Затруднения при осуществлении метода Вильцбаха состоят в выделении
тритированных веществ, а также в очистке их от соединений, возникающих
в результате распада при длительном радиолизе. Шульце и Венцель [51]
указали, что для этих задач можно с успехом использовать хроматографию
в тонких слоях. Примеры очистки соединений, меченных тритием, приведены
в следующем разделе (см. также рис. 43).
72
Общая часть
IV. ВЫДЕЛЕНИЕ РАДИОАКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ МЕТОДОМ ХТС
В большинстве случаев для радиохимических исследований необходимо
лишь несколько миллиграмм меченого соединения. Такие небольшие коли-
чества легко выделить методом ХТС. Мангольд, Камерек и Малина [39]
использовали ХТС для анализа и очистки липидов, меченных С14, Н3 и I131.
На рис. 44 показан радиоавтограф тонкослойной хроматограммы имеющихся
в продаже различных жирных кислот, меченных в карбоксильной группе.
Каждый такой препарат содержит большое число примесей. Удивитель-
но, что большинство этих соединений — промежуточных продуктов синтеза —
сильно полярны. Это облегчает выделение чистых кислот методом хромато-
графии в тонких слоях.
Подходящий растворитель для элюирования разделенных хроматографи-
чески радиоактивных соединений находят, проводя хроматографический
анализ рассматриваемых соединений в различных полярных растворителях.
Растворитель, уносящий соединение в зону фронта, пригоден для выщелачива-
ния, сорбент соскабливают с пластинки и элюируют не менее чем тремя
порциями растворителя. Прозрачные растворы по мере надобности деканти-
руют и фильтруют через небольшой стеклянный фильтр. Применение филь-
тровальной бумаги в большинстве случаев приводит к потерям.
В качестве примера опишем здесь очистку стеариновой кислоты, мечен-
ной тритием. Этот продажный препарат содержит не менее 7 примесей [39].
4,4 мг стеариновой кислоты-9,10-Н3 нанесли в виде ряда точек на пластинку
20 X 20 см, покрытую слоем силикагеля, и хроматографировали смесью петролейного
эфира (60—70°), диэтилового эфира и ледяной уксусной кислоты (80 + 20 + 1) в тече-
ние часа. Разделенные вещества перевели в видимую форму действием паров иода. После
этого радиоактивную стеариновую кислоту вместе с сорбентом соскребли с пластинки
и элюировали тремя порциями по 10 мл смеси диэтилового эфира, метанола и ледяной
уксусной кислоты (80 + 20 + 1). Объединенные элюаты профильтровали и упарили.
Выход 2 мг (45%).
Если очищаемые вещества загрязнены соединениями с весьма близкой
полярностью, от которых они плохо отделяются, то для их отделения с успе-
хом можно использовать ХТС соответствующих производных. Кислоты,
например, можно очистить в виде метиловых эфиров, а спирты и амины —
в виде ацетилпроизводных. Такие производные также легче элюируются,
чем исходные полярные продукты.
На рис. 45 приведены фотоденситометрические кривые радиоавтографа
тонкослойной хроматограммы трипальмитина, меченного С14, до и после
очистки [39].
В этих опытах установлено, что для хроматографического разделения
веществ, содержащих сложнезфирные группы, выгодно использовать сорб-
ционные слои, дезактивированные в результате экспозиции на воздухе в тече-
ние не менее одного дня. Свежий и высокоактивный силикагель в процессе
хроматографического разделения эфирных соединений гидролизуется менее
чем на 2%.
7,8 мг трипальмитин а-1-С+ были разделены в течение одного часа на пластинке
размером 20 X 20 см, покрытой слоем силикагеля Г, с помощью смеси, состоявшей
из петролейного эфира (т. кип. 60—70°), диэтилового эфира и ледяной уксусной кислоты
(90+ 10+ 1). Триглицерид локализовали радиоавтографически, затем элюировали
тремя порциями по 10 мл смеси диэтилового эфира и метанола (90 + 10), и элюаты
профильтровали через небольшой стеклянный фильтр. Фильтрат затем упарили до не-
большого объема и дважды хроматографировали. Выход 3,8 мг (48%).
Если необходимо очистить количество в несколько грамм, то выгоднее
использовать колоночную хроматографию. На рйс. 46 показан радиоавтограф
тонкослойной хроматограммы меченого триолеинд (глицерилтридииодо-
9, 10-1131-стеарат) до и после очистки методом колоночной хроматографии.
Гл. 7. Метод радиоактивных изотопов
73
В числе других примесей продажный препарат содержит иодированные
моно- и диолеины, соответствующие ацетильные соединения, а также иоди-
рованную олеиновую кислоту и немного метилолеата [61]. Этот продукт,
Рис. 44. Радиоавтография тонкослойной
хроматограммы меченых жирных кислот.
Сорбент силикагель Г. Растворитель петролейпый
эфир (т. кип. 60—70°) — диэтиловый эфир —
ледяная уксусная кислота (90 + 10 -|- 1); вре-
мя анализа 40 мин, пленка фирмы «Eastman
Kodak», а — лауриновая кислота-1-С.Ы; б—ми-
ристиновая кислота-1-fili; в — пальмитиновая
кпслота-1-GlT; г — стеариновая кислота-1-С14;
д — олеиновая кислота -1-С14; е — линолевая
кислота-1-С14; ж — линоленовая кислота-1-СЫ.
Рис. 45. Очистка радио-
активного трипальмитина
методом ХТС [39]. Денси-
тометрические кривые ра-
диоавтографов тонкослой-
ных хроматограмм продаж-
ного (— —) и очищенного
(------) трипальмитина.
так же как и растительное масло, меченное радиоиодом, используется
в клинике для пробы на поглощение «жира».
На рис. 43 показано разделение на силикагеле Г меченных тритием-
стероидов, осуществленное Шульце и Венцелем [51]. Авторы определяли
Р и с. 46. Радиоавтограф тонкослойной хроматограммы
продажного (я) и очищенного (б) «радиойодированного
триолеина» [61].
распределение активности специальной счетной трубкой прямо на пластинке,
соскабливали затем зону, содержавшую активность, и элюировали отдель-
ные вещества. Однородность веществ, очищенных методом ХТС, обяза-
тельно следует доказать другим методом. Вещества, выделенные методом
адсорбционной ХТС, следует всегда анализировать методом распредели-
тельной ХТС, хроматографии на бумаге или газовой хроматографии.
74
Общая часть
V. АНАЛИЗ С ПРИМЕНЕНИЕМ РАДИОИЗОТОПОВ
/
В зависимости от способа применения радиоактивного вещества разли-
чают следующие радиохимические методы анализа [2, 10, 11, 26, 49]:
индикаторный анализ,
метод изотопного разбавления,
активационный анализ и
метод радиоактивных реактивов.
Эти методы особенно часто используют в комбинации с хроматографией
на бумаге; до настоящего времени известно лишь небольшое число примеров
применения их в ХТС.
1. ИНДИКАТОРНЫЙ АНАЛИЗ
Этот метод пригоден для проверки четкости хроматографического разде-
ления и часто использовался при хроматографии на бумаге (см. [63, 65]).
Туна, Камерек и Мангольд [62], применив индикаторный анализ, пока-
зали, что фракции природных липидов, разделенные методом ХТС, не загряз-
няют друг друга. Небольшие количества «горячего» трипальмитина были
смешаны с жиром печени акулы и затем разделены методом адсорбционной'
ХТС. Радиоавтограф хроматограммы показал, что вся радиоактивность
находится во фракции триглицеридов. Весьма близкие по структуре к три-
глицеридам алкоксидиглицериды не были ими загрязнены (см. рис. 72, стр.
152).
2. МЕТОДЫ ИЗОТОПНОГО РАЗБАВЛЕНИЯ
Этот метод используется в особенности в биохимии для количественного
анализа небольших количеств соединений, которые другими методами опре-
деляются очень неточно. Анализируемое вещество необходимо пометить
и его активность должна быть известна. Взвешенное количество радиоактив-
ного соединения смешивают с анализируемым веществом и затем выделяют
определяемое вещество в чистом виде. Зная количество (М2) и активность
(А2) добавленного вещества и удельную активность (А3) выделенного соеди-
нения, можно рассчитать исходное количество анализируемого вещества по
следующей формуле:
Добавленное количество радиоактивного вещества обычно настолько ма-
ло, что им можно пренебречь по сравнению с количеством вещеотва, нахо-
дящимся в «холодной» форме. Это означает, что отношение активностей добав-
ленного и выделенного веществ дает долю выделенного вещества, и, таким
образом, можно легко рассчитать количество определяемо го вещества.
Метод изотопного разбавления пригоден для количественного определе-
ния веществ, выделяемых методом ХТС, лишь с небольшими выходами.
При обращенном методе изотопного разбавления радиоактивное анализи-
руемое вещество разбавляется известным количеством определяемого «холод-
ного» соединения.
3. АКТИВАЦИОННЫЙ АНАЛИЗ
Некоторые элементы могут быть переведены в радиоактивные изотопы
облучением нейтронами в реакторе, циклотроне или в генераторе ван де
Граафа и затем обнаружены радиометрическими методами. Этим методом
на бумажных хроматограммах были обнаружены в числе прочих фосфор
Гл. 7. Метод радиоактивных изотопов, 75
[59], сера [59] и хлорсодержащие [71] соединения. Для количественного
определения следов какого-нибудь соединения известное количество этого
соединения облучают на этой же хроматограмме.
Применение активационного анализа в ХТС еще не известно. Поскольку
кальций и сера активируются нейтронами, применение гипса в качестве
связующего для разделительных слоев исключено. Из этих же соображений
вместо стеклянных пластинок следует применять пластмассовые.
4. МЕТОД РАДИОАКТИВНЫХ РЕАКТИВОВ
Когда классические методы определения непригодны вследствие слишком
малого количества анализируемого вещества или вследствие слишком малой
концентрации определяемого вещества в смеси, можно выйти из затруднения,
используя метод радиоактивных реактивов. Даже в случае неприменимости
метода изотопного разбавления из-за того, что определяемые вещества нель-
зя получить в радиоактивной форме, можно воспользоваться методом радио-
активных реактивов.
Принцип метода радиоактивных реактивов состоит в том, что неактивный
элемент, радикал или молекула взаимодействуют с радиоактивным реактивом
и поэтому могут быть обнаружены и количественно определены радиометри-
ческими методами в виде «горячих» соединений.
Анализ может быть осуществлен следующими способами.
а. Фракционирование перед введением радиоактивной метки. Полученные
при разделении неактивной анализируемой пробы фракции переводят радио-
активными реактивами в вещества, которые могут быть определены радио-
метрически. Например, аминокислоты на бумажных хроматограммах лока-
лизуют реакцией с иодистым метилом СН31131 [71] или ацетатом меди
Спв4(СН3СОО)2 [68]. Применяют также бромистый метил СН3Вг82 [70]. Многие
ненасыщенные соединения обнаруживают по реакции присоединения радио-
иода [12]. '
Этот способ до настоящего времени не был использован дЛя ХТС.
б. Разделение радиоактивных производных. 1 мг или меньшее количество
смеси соединений вначале обрабатывают радиоактивным реактивом и «горя-
чие» производные затем подвергают фракционированию. В качестве радио-
активных реактивов для метки неактивных окси- и аминосоединений реко-
мендуется 3-хлоранизоилхлорид-3-С1зв [54], 4-иодбензоилхлорид-1131 [57]
и особенно ацетангидрид-1-С14 или -2-Н3 [3, 7, 24, 29, 38, 39, 67]. Методика
ацетилирования стеринов и алифатических липидов приведена на стр. 77.
Кислоты могут быть обработаны 4-хлоранилином-С1зв [55] или диазометаном,
меченным С14, C14H2N2 [4, 37, 39, 47, 48, 52, 58]; тритированный диазометан
применять не следует [4, 32]. Методика этерифицирования высших жирных
кислот радиоактивным диазометаном приведена на стр. 77.
Автором, [38] описана схема анализа радиоактивно меченных производных
липидов методами ХТС, колоночной хроматографии и хроматографии на
бумаге. Смеси жирных спиртов, моно- и диглицеридов и других ацетилируе-
мых липидов обрабатывают радиоактивным ацетангидридом и ацетильные
производные фракционируют на отдельные классы соединений методом адсорб-
ционной хроматографии на пластинах или на колонках с силикагелем.
Количественное соотношение классов ацетилированных липидов определяют,
проводя радиометрию элюатов. Каждую такую группу соединений можно
подвергнуть дальнейшему разделению на силиконизованной бумаге. Коли-
чественный промер хроматограммы на бумаге радиоактивных производных
липидов осуществляют проточным пропорциональным счетчиком, снабжен-
ным приспособлениями для автоматического перемещения полос бумаги
и регистрации результатов измерений.
76
Общая часть
Мангольд, Камерек и Малинз [39] анализировали подобным образом
жирные кислоты, выделенные из касторового масла. Кислоты обрабатывают
радиоактивным диазометаном. Адсорбционная ХТС была использована для
отделения метиловых эфиров обычных жирных кислот от метиловых эфиров
моноокси- и диоксикислот (рис. 47).
Три класса метиловых эфиров элюируют и, измеряя интенсивность их
излучения, определяют количественные соотношения. Смесь эфиров неоки-
сленных кислот повторно фракционируют методом хроматографии на бумаге
с обращенной фазой, и количественно определяют состав путем регистрации
радиоактивности полос бумаги в проточном пропорциональном счетчике.
Соотношение моноокси- и диоксикислот лучше определять с помощью «горя-
чих» ацетилированных кислот или эфиров. Небольшие количества жирных
Р и с. 47. Радиоавтограф тонкослойной
хроматограммы метиловых-О4 эфиров из
касторового масла [39].
Сорбентсиликатель Г; растворитель петролейный
эфир (т. кип. 60—70°) — диэтиловый эфир —
ледяная уксусная кислота (70+ 30 + 2); время
анализа 40 мин; пленка фирмы «Eastman
Kodak».
а — эфиры обычных жирных кислот; б — эфиры
монооксикислот; в — эфиры диоксикислот.
диоксикислот можно пометить двумя радиоактивными ацетильными группа-
мп на молекулу. Это означает удвоение удельной активности, благодаря
чему можно достигнуть более точных результатов измерений.
Принципиально анализы такого рода могут быть осуществлены со всеми
классами соединений, содержащими активные группы (см., например, [3, 29,
48, 67]).
Метиловые эфиры кислот и ацетильные производные спиртов и ами-
нов являются менее полярными по сравнению с исходными анализируемыми
веществами, поэтому их легче количественно элюировать с сорбента.
в. Фракционирование после добавления радиоактивного производного
к смеси немеченых производных. Анализируемое вещество обрабатывают
нерадиоактивиым реактивом и к смеси производных добавляют небольшое
количество меченого производного определяемого соединения. Количество
этого вещества в исходном материале можно рассчитать после выделения
и определения активности смеси неактивного и активного производного,
используя уравнение, выведенное для метода изотопного разбавления
(стр. 74) [48, 54, 55].
Этот способ до настоящего времени не был использован в сочетании
с ХТС.
г. Разделение после добавления неактивного производного к смеси мече-
ных определяемых соединений. Этот метод представляет собой обращение
метода изотопного разбавления. Производное определяемого вещества выде-
ляется радиохимически чистым, из его активности и активности добавленного
производного можно рассчитать концентрацию неизвестного вещества в нс-
Гл. 7. Метод радиоактивных изотопов 77
ходной пробе. Этот метод был разработан уже в 1946 г. [27] и оказался весь-
ма подходящим для анализа протеиновых гидролизатов [60].
Применение с использованием в качестве метода разделения ХТС пока
не описано.
д. Применение двух радиоактивных изотопов. Анализируемый материал
обрабатывают радиоактивным реактивом. К продуктам реакции добавляют
затем определяемое вещество в виде соединения, химически идентичного
производному, находящемуся в смеси, но меченного другим изотопом. После
фракционирования смеси по результатам независимых измерений интенсив-
ности излучения обоих радиоактивных изотопов в одной фракции и измерения
суммарной радиоактивности этой фракции рассчитывают эффективность раз-
деления и первоначально имевшееся количество определяемого вещества.
Этот способ был разработан для анализа протеиновых гидролизатов. В каче-
стве радиоактивных реактивов использовались меченный I131 иодфенилсуль-
фонилхлорид и меченный S35 n-иодфенилсульфонилхлорид (I131 и 835-пипсил-
хлорид) [27, 28, 63—64], а также меченный Н3 и С14 ацетангидрид [3, 67].
Вероятно, и этот аналитический прием можно с успехом комбинировать
с разделительным методом хроматографии в тонких слоях.
VI. СПОСОБЫ ВВЕДЕНИЯ РАДИОАКТИВНОЙ МЕТКИ
Приводимые прописи пригодны для введения радиоактивной метки
в небольшие количества неактивных кислот и спиртов с помощью «горячего»
этерифицирования. Кислоты обрабатывают радиоактивным диазометаном,
а спирты — радиоактивным ацетангидридом.
1. ЭТЕРИФИЦИРОВАНИЕ КИСЛОТ ДИАЗОМЕТАНОМ C44H2N2
Радиоактивный диазометан может быть получен из нитрозометил-С14-
мочевины [52]. Чаще, однако, используют более устойчивый п-толилсульфо-
нилметил-С14-нитрозамид [4, 37, 58] (радиоактивный «диазалд»). Пропись
получения этого соединения из метил-С14-амина приведена СтоллОм с сотруд-
никами [58] (см. также [9]). Радиоактивный диазалд имеется в продаже *.
Для получения и перегонки радиоактивного диазометана используют
реакционный сосуд с припаянным боковым отростком [47] или газовый
микрогенератор [45].
Методика работы
Раствор 10 мг (0,05 ммоля) п-толилсульфонилметил-С14-нитрозамида удельной
активностью около 0,6 мкюри/ммолъ в 2 мл диэтилового эфира обрабатывают 2 мл охла-
жденного до 0° раствора 0,1 г гидроокиси натрия и смеси этанола с водой (10+1) и нагре-
вают на водяной бане при 60—70° в токе азота. Перегнанный диазометан улавливают
в две последовательно соединенные ловушки, содержащие каждая 1-2 мл охлажденного
льдом диэтилового эфира. Оба эфирных раствора диазометана объединяют и сразу же
используют для этерификации жирных кислот в смеси диэтилового эфира и метанола
(9 + 1) [39, 47, 58].
Диазометан лепр образует полиэтилен и соединения еще неизвестного
строения [40]. Чистые метиловые эфиры можно отделить от этих побочных
продуктов методом адсорбционной ХТС [62].
В некоторых случаях предпочитают количественно восстанавливать ки-
слоты или эфиры до спиртов с литийалюминийгидридом, а спирты затем
метить ацетангидридом.
* Фирма «New England Nuclear Corp.» (Бостон. США).
78
Общая часть
2. АЦЕТИЛИРОВАНИЕ СПИРТОВ АЦЕТАНГИДРИДОМ, (С1«Н3СО)2О
ИЛИ (СЩСО)2О
Реакцию ацетилирования особенно легко осуществить. Ацетангидрид,
меченный С14 или Н3, поставляется рядом фирм [25].
Методика работы
10—20 мг липидов, содержащих амино- или спиртовые группы, запаивают с 20%-ным
избытком раствора ацетангидрида-1-С14 удельной активностью 0,6 мкюри /ммоль в пири-
дине (1 + 10) в стеклянной трубочке 5/150 мм. Эту трубочку нагревают на водяной
бане 30—60 мин при 100°. После охлаждения трубочку вскрывают и разбавляют реак-
ционную смесь 10 мл 1 н. серной кислоты. Ацетилированные липиды промывают до
нейтральной реакции несколькими порциями диэтилового эфира и Сушат над безвод-
ным сульфатом натрия [7, 24, 38].
Соединения, содержащие эфирные группы, например моно- и диглицери-
ды, подвержены в небольшой мере ацетолизу, и поэтому описанный метод
ацетилирования в случае таких соединений следует применять с осторожно-
стью. Реакция с радиоактивным кетеном может дать более чистые продукты
ацетилирования [1].
Прибор для мягкого ацетилирования аминокислот описан Уайтхедом
[67].
VII. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ХТС В ХИМИЧЕСКИХ И БИОХИМИЧЕСКИХ
ИССЛЕДОВАНИЯХ С ПРИМЕНЕНИЕМ РАДИОИЗОТОПОВ
Махадеван и Лундберг [35] использовали радиоавтографию хроматограмм
в тонких слоях для установления чистоты синтетически полученных холе-
стерилолеатов-С14. Другие примеры применения ХТС в синтетических рабо-
тах с радиоизотопами уже упоминались [39, 51].
Во многих лабораториях при биогенетических исследованиях с радио-
активным углеродом применяют ХТС. Гризбах с сотрудниками [20—22]
исследовали образование изофлавонов в различных растениях с помощью
радиоактивно меченных исходных веществ. Они использовали хроматографию
на бумаге и двумерную ХТС для разделения и обнаружения методом радио-
автографии изофлавона, биоханина А и формононетина, а также промежуточ-
ных продуктов. Кратцл и Пушман [30] впрыснули кониферин-З-С14 в ветви
березы и выделили методом ХТС два радиоактивных продукта, которые обра-
зовались в растении в результате метоксилирования. Кратцл [31] описал
применение радиоавтографии хроматограмм в тонких слоях в обзорной рабо-
те по биогенезу лигнина.
Фулько и Мид [18] применяли ХТС при исследовании образования окси-
кислот в мозгу крысы. Штейн и Штейн [56] исследовали этим же методом
внедрение радиоактивных жирных кислот в кожное сало крысы. В этой связи
следует отметить две недавно появившиеся публикации Допешваркара и Ми-
да, рассмотренные в главе «Алифатические липиды».
Винтерштейн, Штудер и Рузгг [72] выделили пз природных веществ ряд
каротиноидных альдегидов. В некоторых случаях удалось получить однород-
ные каротиноидные фракции, используя только ХТС в микропрепаративном
масштабе. В обзорной работе Винтерштейн [73] подчеркнул, что только
благодаря существенному улучшению методики, в особенности благодаря
использованию ХТС по Шталю и применению радиоактивных производных,
могли быть достигнуты эти новые успехи.
Гл. 7. Метод радиоактивных изотопов
79
ЛИТЕРАТУРА
1. Alderhout J. J. Н., К о с h G. К., Aten А. Н. W., jr., Rec. trav. chim.,
76, 7/2 (1957).
2. Aranoff S., Techniques 'of Radiobiochemistry, Ames, The Iowa State University
Press 1956
3. A v i v i P., S i m p s о n S. A., Tait J. F., Whitehead J. K., 2nd Radio-
isotope Conference, Vol. I, p. 313, London, Butterworth’s Scientific Publications,
1954.
4. Baumgartner W. E., Lazer L. S., D a 1 z i e 1 A. M., Cardinal E. V.,
Varner E. L., J. Agr. Food Chem., 7, 422 (1959).
5. В e n s о n A. A., Calvin M., Cold Spring Harbor Symposia Quant. Biol., 13, 6
(1948).
6. В e n s о n A. A., Bassham J. A., Calvin M., Goodale T. C.,
Haas V. A., Stepka W., J. Am. Chem. Soc., 72, 1710 (1950).
7. Berliner D. L., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 94, 126 (1957).
8. Bernhard K., Ro thlin M., Vuilleumier J. P., Wyss R., Helv.
Chim. Acta, 41, 1017 (1958).
9. В о e r T h. J. d e, В а с к e r H. J., Org, Syntheses, 34, 96 (1954).
10. Bro da E., Schonfeld T., in Handbuch der mikrochemischen Methoden
Band II, S. 130, herausgegeben von F. Hecht und M. K. Z a c h e r 1, Wien,
Springer-Verlag, 1955.
11. В г о d a E., Schonf eld T., Die technischen Anwendungen der Radioaktivi-
tat, Berlin, VEB-Verlag Technik; Munchen, Porta-Verlag, 1957.
12. Budzynski A. Z., Zubrzycki Z. J., Campbell I. G., Nature, 182,
178 (1958).
13. Calvin M., Nobel-Verlag, 1961, s. Angew. Chem., 74, 165 (1962).
14. Calvin M., Heidelberger Ch., Reid J. С., T о 1 ber t В. M., Yank-
w i c h P. E., Isotopic Carbon, New York, John Wiley and Sons, Inc.: London, Chap-
man and Hall, Ltd., 1949.
15. C h о r n e у W., Scully'N. J., Mason L. H., Dutton H. J., готовится
к печати.
16. Fink R. M., Dent С. E., Fink, K., Nature, 160, 801 (1947).
17. F i n s t о n H. L., Miskel J., Ann. Rev. Nuclear Sci., 5, 269 (1955).
18. Fulco A. J., Mead J. F., J. Biol. Chem., 236, 2416 (1961).
19. G 1 a s s t о n e S., Sourcebook on Atomic Energy, 2nd ed., Princeton — Toronto —
London — New York, D. van Nostrand Company, Inc., 1958.
20. Grisebach H., Doerr N., Z. Naturforsch., 15b, 284 (1960).
21. Grisebach H., Patschke L., Chem. Ber., 93, 2326 (1960).
22. Grisebach H., Brandner G., Z. Naturforsch., 16b, 2 (1961).
23. H e r z R. H., Nucleonics, 9, 24 (1951). •
24. Hollander V. P., V i n e с о u r J., Anal. Chem., 30, 1429 (1958).
25. International Directory of Radioisotopes, Vol. I and II.‘ The International Atomic
Energy Agency, Wien, 1959.
26. К a m e n M. D., Isotopic Tracers in Biology, 3rd ed., New York, Academic Press
Inc., Publishers, 1957.
27. К e s t о n A. S., U d e n f r i e n d S., C a n n a n R. K., J. Am. Chem. Soc., 68,
1390 (1946).
28. К e s t о n A. S., L e v у M., J. Am. Chem. Soc., 72, 748 (1950).
29. К liman B., Peterson R. E., J. Biol., 235, 1639 (I960).
30. Kratzl K., Puschmann G., Holzforschung, 14, 1 (1960).
31. Kratzl K., Holz, Roh- und Werkstoff, 19, 219 (1961).
32. L e i t c h L., G a g n о n P. E., C am bion A., Can. J. Research, 28B, 256 (1950).
33. Liebster J., DobiaJova M., Kopoldova J., Ekl J., Collection
Czechoslov. Chem. Commun., 26, 1700 (1961).
34. L i v i n g s t о n e L. G., Medes G., J. Gen. Physiol., 31, 75 (1947).
35. Mahadevan V., Lundberg W. O., J. Lipid Res., 3, 106 (1962).
36. Mangold H. K., Schlen к H., J. Biol. Chem., 229, 731 (1957).
37. Mangold H. K., Geller man J. L., Schlenk H., Federation Proc., 17,
268 (1958).
38. M a n g о 1 d H. K., Fette, Seifen, Anstrichmittel, 61, 877 (1959).
39. Mangold H. K., Kammereck R., M a 1 i n s D. C., Microchem. J., Sympo-
sium, Vol. II (im Druck).
40. Morrison W. R., Lawrie T. D. V., Blades J., Chem. and Ind., 1961,
1534.
41. Murray A. Ill, Williams D. L., Organic Sytheses with Isotopes, Vols. I
and II, New York — London, Interscience Publishers, Inc., 1958.
42. P о с c h i a r i F., Rossi C., J. Chromatog., 5, 377 (1961).
43. R a p p о r t M. M., Lerner B., J. Biol. Chem., 232, 63 (1958).
80
Общая часть
44. Roche J.,Lissitzky S., Michel R., in Chromatographic en chimie orga-
nique et biologique, Vol. I,.p. 321, sous la direction de E. Lederer, Paris, Masson et Cie
Editeurs, 1959.
45.
46.
47.
48.
Roper R., Ma T. S., Microchem. J., 1, 245 (1957).
Schieler L., McClure L. E., Dunn M. S., J. Biol. Chem., 203, 1039 (1953).
Schlenk TT " - ' ' T т
Schlenk
rissette
547 (I960).
49. S chm e is
Gottingen — Heidelberg, Springer-Verlag, 1957.
50. Schulze E., Wenzel M., Tritium-Markierung. Herstellung, Messung und
Anwendung nach Wilzbach 3H-markierter Verbindungen, Berlin, Walter de Gruyter
Verlag, 1962.
51. Schulze E., Wenzel M., частное сообщение, 1961.
H., Ge 11 er man j. L., Anal. Chem., 32, 1412 (I960).
H., Mangold H. K., G e 11 e r m a n J. L., L ink W. E., M о r-
R. A., Holman R. T., Hayes H., J. Am. Oil Chemists’ Soc., 37,
er K., Radioaktive Isotope, ihre Herstellung und Anwendung, Berlin —
E., Wenzel M., Tritium-Markierung. Herstellung, Messung und
52. Смирнов Б. П., Попова Р. А., Нисканен Р. А., Биохим., 25, 368 (1960).
53. Snyder F., Stephens N., Oak Ridge Institute of Nuclear Studies Report Nr.
41 (1962), Anal. Biochem., в печати.
54. S о r e n s e n P., Anal. Chem., 27, 388 (1955).
55. Sorensen P., Anal. Chem., 28, 1318 (1956).
56. S t e i n Y., Stein O., Biochim. et Biophys. Acta, 51, 555 (1961).
57. S t о k e s W. M., Hickey F. C., Fish W. A., J. Am. Chem. Soc., 76, 5174
(1954).
58. S t о 11
Acta, 39, 993 (1956).
59. S t r i c k land E. H., Bens
60. T h о m p s о n E. О. P., T h о
seher Naturstoffe, Band XII, S.
Springer-Verlag, 1955.
61. T u n
62. Tun
63. Ude
64. Ude
65. U d e , , , ... . ,
66. W e у g a n d F., Simon H., in Methoden Дет organischen Chemie, Band IV/2,
S. 539, herausgegeben von E. M ii 11 e r, 4. Aufl. Stuttgart, Georg Thieme Verlag, 1955.
Whitehead J. K., Biochem. J., 68, 662 (1958).
Wieland T., Schmeiser K., Fischer E., Maier-Leibnitz H.,
A., Rut
s c h m a n n
J., Wartburg A. v., R en 4 J., Helv. Chim.
on A. A., Arch. Biochem. Biophys., 88, 344 (I960),
mpson A. R., in Fortschritte der Chemie organi-
297, herausgegeben von L. Zechmeister. Wien,
a
a
n
n
n
N., Mangold H. К., M о s s e r D., Lancet, в печати.
Kammere c k R., Mangold H. К., неопубликованные данные,
e
e
N.,
f r i
f r i , , ....
friend S., Clark T. C., Titus E., Experientia, 8, 379 (1952),
S., J. Biol. Chem., 187, 65 (1950)'.
S., Velick S. F., J. Biol. Chem., 190, 733 (1951).
n d
n d
67.
68.
Naturwiss., 36, 280 (1949).
69. Wilzbach К. E., J. Am. Chem. Soc., 79, 1013 (1957).
70. W i n t e r i n g h a m F. P. W., J. Chem. Soc., Suppl., 1949, 416.
71. W i n t e r i n g h a m F. P. W., Harrison A., Bridges R. G., Analyst, 77,
19 (1952).
72. Winterstein A., Studer A., R ii e g g R., Chem. Ber., 93, 2951 (1960).
73. Winterstein A., Angew. Chem., 72, 902 (1960).
74. W о о d r u f f N. H., Fowler E. E., Nucleonics, 7, 26 (1950).
ГЛАВА 8
ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ХРОМАТОГРАФИИ
В ТОНКИХ СЛОЯХ
М* Бреннер, Л. Нидервизер, Г, Патаки и Р. Вебер
Во всех хроматографических процессах разделения основной принцип
один и тот же. Подвижная фаза движется сквозь неподвижную фазу, и при
этом разделяемые компоненты перемещаются с различной скоростью в напра-
влении движения потока. В зависимости от метода рабрты различают элю-
ционную хроматографию, вытеснительную хроматографию и фронтальный
анализ [1].
Хроматография в тонких слоях в обычной форме ее осуществления при-
надлежит к первому из рассматриваемых в этой главе вариантов. В идеаль-
ном случае ее можно описать следующим образом: в процессе разделения
неизменное количество данного вещества под действием потока подвижной
фазы движется независимо от сопутствующих веществ вдоль неподвижной
фазы. В процессе этого движения вещество непрерывно распределяется между
двумя фазами. Между попаданием молекулы в подвижную фазу и последую-
щим выходом из нее протекает некоторое время. Сумма этих интервалов
времени составляет определенную долю времени хроматографического про-
цесса, которую мы обозначим как время пребывания этой молекулы в под-
вижной фазе. Определенное таким образом время пребывания колеблется для
одинаковых молекул около некоторого среднего значения, которое опреде-
ляется их физическими свойствами и условиями опыта. Перемещение вперед
с потоком наступает только тогда, когда молекула находится в потоке, и поэ-
тому это происходит скачкообразно. Скорость в направлении потока также
колеблется около некоторого.среднего значения, которое одинаково для всех
частиц и соответствует скорости перемещения растворителя.
Различные скорости перемещения веществ обусловлены только различи-
ем во времени пребывания. Путем умножения средней скорости на среднее
время пребывания получают различные отрезки пути, которые отдельные
вещества проходят во время хроматографического процесса. Таким образом,
речь идет о средних значениях; колебание около средних значений является
результатом наложения колебаний скоростей продольного перемещения моле-
кул и колебаний во времени пребывания.
Отсюда следует, что не все молекулы вещества S пройдут в направлении
Потока одинаковый путь. Их совокупность образует на хроматограмме зону
(которая называется также полосой) с максимальной концентрацией веще-
ства в середине зоны или, при осложнениях *, зону с несимметричным распре-
делением вещества. Если имеется также возможность расширения в напра-
влении, перпендикулярном потоку (хроматография на бумаге или хромато-
графия в тонких слоях), то в результате дополнительной поперечной диффу-
зии зоны превращаются в «пятна». Возможность поперечной диффузии про-
является тем отчетливее, чем более длительное время осуществляется хро-
* Например: зависимость сродства вещества к неподвижной фазе от концентра-
ции, перегрузка хроматограммы, неисправность в конструкции или работе хроматогра-
фического устройства.
6 Заказ № 734
82
Общая часть
матографический процесс: зоны или пятна с увеличением времени опыта
становятся более диффузными. Расширение наступает также в том случае,
когда отношение количества вещества к количеству неподвижной фазы неве-
лико. Оно качественно не зависит от емкости неподвижной фазы *.
Физико-математическое рассмотрение этих процессов приводит в зави-
симости от подхода к различным общим теориям хроматографии, которые,
хотя имеют различную форму, родственны друг другу и в своей основе
применимы к любому хроматографическому методу, следовательно, и к хрома-
тографии в тонких слоях. В разделе I мы даем краткое изложение способа
рассмотрения, основанного на наглядной модели хроматографического про-
цесса. Несмотря на наглядность в нем отсутствуют априорные положения
(например, теоретические тарелки); этот способ в той мере, в какой адсорб-
ционные и распределительные явления не зависят от концентрации, нашел
безупречное математическое выражение. Мы увидим ниже, какое распре-
деление вещества имеет место в движущейся зоне, каким образом скорость
движения или значения Rf зависят от коэффициентов распределения или
адсорбции и почему происходит деформация зоны.
В разделе II будет рассмотрена эмпирически найденная зависимость
между хроматографическим поведением (значение Rf) и химическим строе-
нием. Задачей данного исследования является рациональное описание этой
зависимости, которая в принципе может служить (сравнение величин Rf)
для решения вопросов строения вещества. Установление теоретической зави-
симости между химическим строением и коэффициентом распределения, зна-
чение которого обычно позволяет предсказать хроматографическое поведение,
является задачей, которая еще ждет своего разрешения и здесь не может
быть обсуждена более подробно.
В разделе III мы подробно рассмотрим особенности хроматографии
в тонких слоях.
I. ОБЩАЯ ТЕОРИЯ ХРОМАТОГРАФИИ
Хроматография является непрерывным процессом. Для теоретического
рассмотрения его обычно разбивают на ряд периодических, следующих
друг за другом единичных процессов.
Рис. 48. Противоточное распределение (Крег) на 201 пробирке при различных
коэффициентах распределения и отношении фаз, равном 1.
Со — исходная концентрация в пробирке Л 1; сг — концентрация в пробирке Mi г через
200 ступеней распределения (биномиальное распределение). (Из книги LinskensH. F.,
Papierchromatographle in der Botanlk, S. 4, Berlin, 1959.)
* Ширина зоны увеличивается при наличии помех пропорционально корню квад-
ратному из времени. Этот результат можно сравнить с формулой Эйнштейна — Смолу-
ховского для броуновского движения частицы; см. также [2].
Гл. 8. Теоретические основы хроматографии в тонких слоях
83
По-видимому, особенно наглядна картина, предложенная Мартином
и Синджем, которые мысленно разделили хроматографическую колонку на
отрезки, так называемые теоретические тарелки, и затем описали получе-
ние хроматограммы как биномиальное распределение [3]. Аналогия в отно-
шении противоточного распределения Крега [4] кажется полной. Она
наблюдается до того момента, когда при дальнейшей обработке следует
сделать предельный переход от биномиального распределения к распреде-
лению Пуассона. Читатель, не подготовленный в области физико-математи-
ческих наук, понимает этот результат только в той мере, что при этом возни-
кают зоны веществ, которые перемещаются. Распределение вещества внутри
7
6
5
1
К—'/з
О &0 80 120 160 200
Номер торелки^ Г
Рис. 49. Непрерывное распределение (Мартин — Синдж) на 201 «теоретической тарелке»
при различных коэффициентах распределения и отношении фаз, равном 1. (из книги
Linskens Н. F., Papierchromatographie in der Botanik, S. 4, Berlin, 1959.)
co— исходная концентрация на тарелке Wi 1; cr— концентрация на тарелке № г при
нахождении фронта растворителя на тарелке М 201; ср. формулу (9) при р = к/(1 +
+ К) и п = 201 (распределение Пуассона).
зоны получается, однАко, совсем иным, чем в приборе Крега. Это видно сразу
при сравнении рис. 48 и 49. Согласно другим авторам [5—17], проявление
хроматограммы может быть описано чисто математически.
Авторы этого раздела считают, что для исследователей-практиков хрома-
тографическое разделение следует продемонстрировать на модели, в основе
которой лежит непрерывный процесс. В этом смысле данные рассуждения
примыкают к соображениям, развитым Сигнером в Институте органической
химии Бернского университета, где построен лабораторный прибор для
непрерывного многократного распределения веществ между двумя несмеши-
вающимися жидкостями [18].
1. ПЕРВЫЙ ОСНОВНОЙ ОПЫТ
При предварительном отказе от всяких внешних аналогий для хромато-
графии следует вначале рассмотреть лоток (объемом vm), заполненный жид-
костью, например водой, с двумя отверстиями для ввода и вывода и при-
способлением для энергичного перемешивания (рис. 50, а). Если теперь
необходимо заменить воду в лотке окрашенной жидкостью, например черни-
лами, то быстрее всего это можно осуществить, опорожнив лоток и затем
заполнив его чернилами. Для достижения этого конечного состояния необ-
ходим объем vm чернил. Возможен также другой способ: чернила длитель-
ное время вводят через подводящее отверстие и одновременно с другого
конца отводят воду и разбавленные чернила. Каждый понимает, что при
таком способе необходимо больше чернил для заполнения лотка. Что же
произойдет, если лоток, согласно рис. 50, бив, разделить на камеры одной,
6*
84
Общая часть
двумя или большим числом перегородок с отверстиями? Опыт приводит
к следующему выводу: необходимый для достижения конечного состояния
объем чернил будет уменьшаться с ростом числа камер. При очень большом
числе камер он стремится к величине vm, которая сравнима с объемом каме-
ры; единственной возможностью для перемешивания в направлении потока
является перемешивание в результате продольной диффузии. Рассматривая
математически процесс как задачу перемешивания, можно написать *,**:
v
v У 1 / у \п~1'
Ут I 1 • ' • 1 (п — 1)! 1 ут ]
п ' ' n z -
(1)
Здесь cn(V) — концентрация раствора, вытекающего из лотка с п камера-
ми, как функция уже протекшего объема V; с — концентрация исходного
Рис. 50. Перемешивание растворителя и вытесняющего раствора в лотках
с постоянным объемом vm и различным числом камер п [18].
раствора; п — число камер; V — объем, вытекший с момента начала опыта;
vm — общий объем жидкости в лотке.
При п > 25 можно использовать значительно более удобную приближен-
ную) формулу (1а):
Mn--r{,+2®[(£-1)v"]}’ (1а)
где величина
Ф ------1)/» ] =Ф(и) с Ф( —и) = -Ф(и)
* Глур, Математический семинар университета в Берне.
♦* Мы отдаем себе отчет, что основные формулы в этой работе могут быть записаны
в значительно более сжатой форме путем объединения нескольких величии в виде вспо-
могательных переменных. Мы выбрали, однако, форму записи формул, при которой
переменными являются непосредственно измеряемые физические величины.
Как следствие этого переменные представлены в виде сложных дробей. Отсюда
вытекает, например, что величина -—означает «объем отдельной камеры», а величина
— меру повышения емкости вследствие добавления нижней фазы,
лр
Гл. 8. Теоретические основы хроматографии в тонких слоях 85
соответствует известному, часто приводимому в таблицах интегралу ошибок:
1 2
Ф(и) = ——— \ е 2 dr.
На рис. 51 приведены рассчитанные концентрационные кривые сп (V)
как функции V/vm при различном числе камер п. Из рисунка видно,
что для вытеснения воды из лотка в случае 5 камер теоретически необходимо
примерно 3, в случае 25 камер — примерно 1,6, а в случае 125 камер —
примерно 1,3 объема vm чернил.
При выводе формулы (1) предполагалось, что перемешивание входящего
в данную камеру раствора с уже находящейся там жидкостью происходит
Рис. 51. Повышение концентрации раствора, вытекающего из лотков с 1, 5, 25 и 125
камерами [18].
Сплошные кривые рассчитаны по формуле (1) или (1а); кривые с крестиками и кружками —
экспериментальные данные (см. текст).
мгновенно, так что в каждой камере всегда имеет место однородная концен-
трация, и что выходящий из камеры раствор имеет эту концентрацию.
Достижимы ли эти идеальные соотношения на практике? Как будет обстоять
дело, если указанные предположения практически не выполняются? Сигнер
, нашел следующий ответ: лоток с 29 камерами дает на выходе эксперимен-
тальную концентрационную кривую (например, определенную колориметри-
чески), которая на рис. 51 для первого случая (оптимальные скорости потока
и перемешивания) изображена кружками, а для второго случая (скорость
потока та же, однако 4-кратная по сравнению с прежней скорость переме-
шивания) — крестиками. Кривая, изображенная кружками, соответствует
теоретической концентрационной кривой при п = 30 ± 2; таким образом,
требуемые математиками при анализе идеальные соотношения в первом
случае довольно хорошо осуществляются. Во втором случае это, очевидно,
не имеет места. Кривая, изображенная крестиками, как видно, соответствует
лотку, разделенному на 13 ±2 камеры. Этот последний результат можно
выразить двумя способами:
а) эффективность лотка составляет 45 ± 7 %;
б) лоток работает с п' = 13 ± 2 идеальными эффективными камерами.
На рис. 52 несколько подробнее изображена зависимость эффективности
от условий опыта. Из этого рисунка и из экспериментальных кривых на
рис. 51 мы можем сделать следующие выводы.
1. Положенное в основу расчета предположение об идеальном переме-
шивании внутри камеры практически осуществляется (эффективность 100%),
если соотношение скорости потока и и скорости перемешивания со пра-
вильно.
86
Общая часть
2. Неидеальное перемешивание камеры при слишком малых значени-
ях со и слишком больших значениях и или вследствие турбулентности
(большие со, большие и) уменьшает эффективное число камер.
3. Смешение содержимого соседних камер при слишком малых значени-
ях и (продольная диффузия), слишком больших значениях и и слишком
больших значениях со (турбулентность) также уменьшает эффективное число
камер.
4. Величина отверстий между камерами, очевидно, также является
важным параметром.
Эти данные можно обобщить таким образом, что c(F) — изменение
концентрации раствора, выходящего из лотка,— зависит единственно от
того, насколько эффективно может быть уменьшено перемешивание по всему
лотку. Кривая повышения концентрации вытесняющего раствора (чернил)
на выходе тем круче, чем больше создано камер, и при данном числе камер
Рис. 52. Эффективность лотка с 29 камерами (ут = 550 мл, диаметр отверстий в стен-
ках камер 2 мм, заполнение — 7,5%-ны1д> раствор бензоата аммония, протекающая
вода) при различных скоростях потока и скорости перемешивания со [18].
Изменение концентрации вытекающего раствора прослеживали по изменению коэффициента
преломления.
тем более полога, чем сильнее проявляются случайные *, препятствую-
щие перемешиванию внутри камер факторы: продольная диффузия и тур-
булентность **. Эффективное число камер п , таким образом, является
чисто расчетной величиной, которая может быть определена по положению
кривой с (F) при графическом изображении согласно рис. 51. Система из п
сконструированных камер ведет себя при неидеальных условиях так, как
если бы она состояла из п идеально работающих камер, причем п меньше п.
В нашем мысленном эксперименте возьмем теперь вертикально уста-
новленную стеклянную трубку, заполненную стеклянными бусами или
другим инертным материалом и водой. Будем сверху подавать чернила
и следить за повышением концентрации чернил на выходе. Это повышение
концентрации, при прочих равных условиях, будет тем более резким, чем
мельче наполнитель и чем равномернее его упаковка; из крутизны кривой
можно определить эффективное число камер п , или «число теоретических
тарелок». Последнее устройство соответствует устройству при так называе-
♦ Систематические отклонения, например, расслоение в камерах вследствие боль-
шого различия в плотности между раствором и растворителем, приводят к появлению
кривых с (7), пересекающих семейство кривых на рис. 51. Эти случаи уже нельзя рас-
сматривать как чистую проблему перемешивания, и наше определение эффективного
числа камер утрачивает силу.
** Турбулентность проявляется в том, что отдельные элементы объема переме-
щаются обходным путем, в то время как другие проходят через одну или несколько камер
кратчайшим путем.
Гл. 8. Теоретические основы хроматографии в тонких слоях 81
мом хроматографическом фронтальном анализе [1] с тем отличием, что
наш наполнитель не адсорбирует чернила. Качественно для нашей кри-
вой вымывания * это различие не имеет значения; к количественному влия-
нию адсорбции мы ниже- еще вернемся.
2. ВТОРОЙ ОСНОВНОЙ ОПЫТ
Аппаратура, изображенная на рис. 50, может быть использована: для
следующего эксперимента. Пронумеруем камеры слева направо цифра-
ми 1, 2... г ... п-; заполнив камеру № 1 чернилами, а остальные камеры водой,
будем пропускать в камеру № 1 воду и следить эа изменением концентра-
ции на выходе из камеры п. Поскольку в камерах от № 2 до № п, как и в пре-
дыдущем опыте, вода вытесняется чернилами, мы можем вначале ожидать
точно такого же повышения концентрации, как и в предыдущем опыте. Так
как, однако, не чернила, а вода подается в камеру № 1, концентрация чер-
нил на выходе после достижения максимума должна постепенно > падать,
пока в конце концов не будет вытекать одна вода. Весьма вероятно пред-
положение, что повышение и понижение концентрации должно происходить
по закону зеркального изображения. В случае большого числа камер это
действительно реализуется на практике.
Математическое выражение для сп (F) дается здесь как частный случай
общей математической теории противоточной экстракции [21]; и здесь пред-
полагается мгновенное перемешивание в каждой камере. Для лотка с п каме-
рами (пронумерованными от 1 до п) формула (40) Хадвигера в наших обозна-
чениях имеет следующий вид *:
/ v \
— /
^F) = C»A-A(tlj!--------’ (2)
гдесо=— — начальная концентрация в камере № И; Мо — количество
vm *
п
вещества, введенное в камеру № 1; V — протекший с начала опыта объем
жидкости; vm — общйй объем жидкости в лотке.
cn(V) подчиняется распределению Пуассона. Эта функция для лотков
1000
с 1, 5, Ю, 20 и 29 камерами при vm = 1000 мл и со = 1 г на мл изобра-
жена на рис. 53. Видно, что распределение вещества на выходе при увели-
чении числа камер принимает форму .симметричной полосы с концентраци-
онным максимумом в середине.
Такие с(У)-кривые действительно могут быть получены эксперименталь-
но. Так же как и в первом основном опыте, эффективное число камер п'
зависит от условий работы аппарата. В случае вертикальной заполненной
инертным наполнителем и водой «хроматографической колонки» это означа-
ет, что при загрузке небольшим количеством чернил с последующим вымыва-
нием водой получают типичную элюционную хроматографическую кривую
в отсутствие адсорбционных или распределительных процессов. Достаточно,
чтобы перемешивание веществ вдоль колонки было резко уменьшено благо-
даря наличию наполнителя. Иэ хода концентрационной кривой элюата или
♦ Было бы правильнее использовать выражение «кривая до проскока», поскольку
чернила прорываются сквозь колонку, являющуюся для них препятствием.
88
Общая часть
Рис. 53. Элюционные кривые по уравнению (2) при различном числе камер п [22].
Объем жидкости в лотке ет = 1 л; количество вещества в камере М 1 в начале опыта 1 а; начальная
концентрация в камере Xs 1/Cq = п г/л. Площади под кривыми соответствуют введенному количе-
СО
р fl 1
ству вещества, т. е. \ Cn(V) dV = 1. Максимумы расположены при V„„„„=----- vm- Сравните ве-
V ША1К с fl
личины максимумов с соответствующими начальными концентрациями со. Разбавление значи-
тельно м увеличивается с увеличением п. Однако это увеличение меньше одновременного увели-
чения со- Поэтому с увеличением п максимумы становятся выше, а кривые соответственно круче.
путем сравнения ширины эоны чернил на старте и на выходе иэ колонки
можно рассчитать «число теоретических тарелок» (см. ниже), которое пред-
ставляет для нашей колонки степень уменьшения перемешивания. Это
число теоретических |тарелок, очевидно, не имеет физического смысла.
3. МОДЕЛЬ
Какую роль играет присутствие неподвижной фазы, которая может
в соответствии с коэффициентами распределения или адсорбции обратимо
поглощать растворенное вещество? Снова рассмотрим лоток Сигнера. Вне-
сем теперь небольшое изменение, состоящее в том, что изготовим лоток
несколько более глубоким и полученный таким образом, дополнительный'
объем va используем для введения жидкой или твердой неподвижной фазы
(рис. 54). Объем vm первоначально имевшейся жидкой фазы, который теперь
обозначим как подвижную фазу, остается при этом неизменным; это пред-
положение, так же как и увеличение объема лотка, имеет своей целью только
упростить математическое рассмотрение эффектов распределения или адсорб-
ции.
В уравнении (2) с(У) при данном п является функцией величины V/vm,
причем V и vm представляют собой количества, относящиеся к одной и той
же фазе. V — объем, вытекший из. лотка к моменту наблюдения J a vm —
объем жидкости в лотке. Отношение этих двух величин в каждый отдель-
ный момент определяет положение концентрационного максимума. Если
V sg Vm' т0 максимум находится еще в лотке, если Vбольше, макси-
мум покинул лоток.
Если теперь vm, который мы принимаем постоянным, привести в сопри-
косновение с неподвижной фазой объемом va, так что растворенное в объе-
Гл. 8. Теоретические основы хроматографии в тонких слоях
8»
ме vm вещество до установления распределительного или адсорбционнога
равновесия может переходить в неподвижную фазу и обратно в vm, это
будет равносильно, эффективному увеличению vm, поскольку неподвижная
фаза до некоторой степени представляет собой резервуар для вещества.
Поэтому вместо vm в формулу (2) следует подставить исправленную величину
1 1
+ *’ ** или vm — *, а вместо со — исправленную величину сор *.
к р
Тогда получают уравнение (3).
cn (7) = сор -i-
п₽и
/ V
У \П \ пр
пр J
(3)
Со
(п-1)!
Мо
п
Сравнение выражений (3) и (2) показывает, что едицственное существен-
ное влияние неподвижной фазы в лотке Сигнера состоит в том, что соответ-
и
Ч
Рис. 54. Усовершенствованный по сравнению с приведенным'на рис. 50, в лоток
с дополнительным объемом va для неподвижной ’фазы.
Пунктирная линия обозначает границу раздела фаз. Соседние камеры сообщаются только в области
ст', если vs представляет собой твердую фазу, нижние мешалки отсутствуют.
ствующее максимуму концентрации распределяющегося вещества отношение
Vlvm. (см. выше) уменьшается до (V/vm) р, причем в соответствии с К и q,
* К — независимый от концентрации коэффициент распределения или адсорбции
(последний можно рассматривать как независимый от концентрации только при очень
малых значениях с0); va — количество жйдкой или твердой неподвижной фазы; р —
доля общего количества вещества, находящаяся в подвижной фазе; q — доля общего
количества вещества,
Эти величины связаны
отсюда следует:
р+?=1;
находящаяся в неподвижной фазе; ~~ = р — отношение фаз.
соотношениями:
p!vm р 1_ = к
q/Vs q Q ’
1 ^7П
__ KQ
Р i + Kq
1
— ~vrvs получаем из условия равенства количеств вещества
Л
Р
Поправку Дрт
находящихся в подвижной и неподвижной фазах при данных значениях К и vs-, условием
является соотношение = /С.
Лот. / vs
90
Общая часть
так что при постоянстве всех прочих параметров только К определяет поло-
жение центра зоны вещества.
Поэтому два различных вещества, одновременно введенных в камеру № 1,
можно отделить друг от друга, если их коэффициенты распределения или
адсорбции достаточно отличаются и если отношение фаз q выбрано правиль-
но. Это предположение было подтверждено экспериментально. При этом
также можно установить условия опыта, при которых эффективное число
камер (га') почти соответствует числу созданных камер (га) (рис. 55) [22].
Если п' <С п, что может быть результатом неполного установления
равновесия между двумя фазами, должно получиться (также на основании
Рис. 55. Разделение 200 мг бензамида и 200 мг никотинамида в лотке с 29 камерами [18].
Подвижная фаза этилацетат; скорость потока 60 мл/час; отверстие для перетока 2 мм; неподвижная
фаза вода; скорость перемешивания 25 об/мин; vm = 580 мл; р 1; Кбен8а^ида = 3,59;
-^никотинамида^ 0,216. По точкам построена экспериментальная кривая, другие кривые построе-
ны по уравнению (3) для 5 и 29 эффективных камер.
аналогии с первым основным опытом) при практически неизменном положе-
нии максимума более пологое распределение. Сравните, например, кривые
для 5 и 29 камер на рис. 55 *. Более размытое распределение вещества
означает более широкие полосы веществ и, следовательно, уменьшение
разделительной способности.
К наглядному рассмотрению разделительной способности приводит следующее
рассуждение. Дифференцируя функцию (3) по V, находят максимум сп (7) при] V /
/ пр
= п — 1 (ср. рис. 53; 7Макс ~ ~~ ПРИ Р ~ Б- Это является ожидаемым или сред-
ним значением М распределения Пуассона .(3). Среднее отклонение от М в случае рас-
пределения Пуассона а = /М, в данном случае а = Уп — 1. С ростом ожидаемого
значения пуассоновское распределение становится все более симметричным. Оно при-
ближается при этом к нормальному распределению (колоколообразная кривая по Гауссу)
и при М а 30 может быть аппроксимировано этой кривой **. Подставляем М = п — 1,
а= /л-1 ив качестве переменной V / — в общую форму нормальной функции и полу-
/ пр
чаем
СП(Ю«*
СрР
У2л(га—1)
13
2 (п-1)
(4)
* При расчете следует иметь в виду, что с0 при переходе от п к п’ также изменяется
[ср. формулу (3)].
** [20], стр. 1195 и [3], стр. 1361.
Гл. 8. Теоретические основы хроматографии в тонких слоях
91
Переменная в уравнении (4) является отношением объемов. Это уравнение становится
более наглядным, если экспоненту разложить по с 7 в качестве переменной полу-
чаем
[У-(П-О>]2
сп(у)ъ-—-X е
/2л (п — 1)
(5)*
или
умакс)2
2
е п-i v макс
сп(7)^—- °оР -
’ /2л(п-1)
В выражении (5а) мы имеем нормальное распределение со средним значением
г/ _ п~1 vm
' макс — ----”
п р
(5а)*
(6)
и средним отклонением
а
т
п р
Обе величины выражены в единицах объема.
Ордината для 7макс имеет значение
(7)*,**
, или 0,3989-—, или 0,3989-^- **
/2л (п— 1) У п—1 о
На рис. 56 представлена функция (5а) для А-лейцина (А) и А-валина (В), когда
имеется 29 эффективных камер общим объемом 950 мл, с н-бутанолом в качестве подвиж-
ной фазы и водой в качестве неподвижной фазы; отношение фаз р равно 5. Разделение,
как всегда при разделении фракций А и В, является неполным. Насколько оно является
неполным и на каком этапе можно остановиться, чтобы простейшим образом выразить
разделительную способность?
Для рассмотрения этого вопроса измерим сначала отрезок ординаты 7макс в — /акс 4
(рис. 56) в единицах суммы (ад + пв) = 2; подставим, таким образом, 7макс в—
— /такс А = Величина Z может быть вычислена по двум кривым на^рис. 56 или,
лучше, из соотношений (6) и (7) по следующей формуле:
7_ т/Т,_4 _____аа ав______
К Aa + Ab+2AaAbq
(8)***
где Ад> Кв.
v Z, как мы сейчас увидим, является мерой’разделительной способности. Обычно,
если Z а 3,5, разделение фракций|А и В практически полное. В нашем случае (рис. 56)
Z равно 1,55. Анализ, справедливый для всех значений Z, даёт следующую зависимость
между Z и разделительной способностью.
1
* Если вместо сор подставить идентичную величину Мо / , то получим в каче-
стве множителя пропорциональности для высоты ординаты
Мо 1 = Мо_______________
/2л(п—!) /^1^/Йг”
пр ' Пр '
** Если, например, эффективное число камер лотка уменьшается с п до п', то а
увеличивается, 7макс остается практически постоянным и ордината уменьшается. Кри-
вая распределения вещества с уменьшением п становится более пологой, как это видно
уже из рис. 53 и 55. Если, однако, с уменьшением п уменьшается также vm, а с0 поддер-
живается постоянной, то а уменьшается и ордината увеличивается!
♦♦* При больших значениях п в уравнения (4) — (8) подставляют п — 1 я» п.
92
Общая часть
Если мы отделяем фракцию А в момент времени, когда протек объем Vt,
Уу — Умакс А 4~ ^<7 д— Умакс А 14" --j , или
Уу==Умакс в — 2ав = ^макс В 1— г >
т. е. собираем вытекающий раствор после Vt в отдельный сосуд (и если кривые рис. 5&
точно передают изменение концентрации, площади под кривыми точно соответствуют'
распределению вещества в выходящем растворе), то фракция А количественно равна
фракции В и загрязнение фракции А фракцией В (горизонтально заштрихованный участок
площади) равно по величине загрязнению фракции В фракцией А (вертикально заштри-
хованный участок площади). Это вытекает из особого свойства нормального распределе-
Р и с. 56. Ориентировочные кривые (Гаусс) изменения концентрации лейцина (А)
и валина (В) в вытекающем растворе в случае лоТка Сигнера с 29 камерами.
Мо Лей = 100 мг’ м0 Вал = 10° мг; подвижная фаза н-бутанол; J>m=0,75 л; неподвижная фаза
водй; Os = 0,15 л; р=5; п = 29; Кдей =0,18; Кдал=0,07; У^акс -В ^макс 1,55 (Яд+Яд ),
Z = 1,55; VT= 1,976 л; до Уу— фракция лейцина, после Уу— фракция валина. Если бы кривые
описывали эффективное распределение концентрации, то в области под кривой А находилось^бы
100% лейцина и в области под кривой В 100% валина. В лейциновой фракции находилось бы
93,9% лейцина + 6,1% валина, а в валиновой фракции —93,9% валина + 6,1% лейцина. В дей-
ствительности количество веществ и их отношение в вытекающем растворе до и после У у различны:
в лейциновой фракции находится 92,0 мг лейцина и 3,1 мг валина, в валиновой фракций 96,9 мг
валина и 8,0 мг лейцина (планиметрический расчет площадей пуассоновских кривых на рис. 57;
разделение фракций при VT).
ния: если отрезок абсциссы от Гмакс д До начала вертикально заштрихованного участка
составляет величину, равную Z од-единиц, а отрезок от горизонтально заштрихованного
участка до Гмакс в составляет величину, равную Z ав-единиц, то на горизонтально
заштрихованную часть площади приходится доля / (Z) = 100 [0,5 — Ф (Z)] в процентах
от всей площади В и точно так же на вертикально заштрихованную часть — доля / (Z) =
= 100 [0,5 — Ф (Z)] в процентах от всей площади А. Незаштрихованные участки содер-
жат, таким образом, по 100 — / (Z) = 100 [0,5 + Ф (Z)] процентов площади А или В.
Ф (Z) представляет собой интеграл ошибок (см. табл. 6). При Z = 1,55 (рис. 56) / (Z) =
= 6,1% и 100 — f (Z) = 93,9%. Мы можем теперь, естественно, разделить фракции при
Vt и удовлетвориться возможностью грубо оценить степень разделения, используя
значение / (Z). Метод прост и нагляден; ошибка (см. подпись к рис. 56) тем меньше, чем
больше п, и имеет тем меньшее значение, чем больше величина Z.
С другой стороны, мы можем попытаться разделить фракции в момент, когда в обеих
фракциях будет содержаться одинаковое количество вещества (при равной величине
проб А и В) * и затем сравнить оцененную с помощью / (Z) разделительную способность
с фактической разделительной способностью. На рис. 57 показано, как в действитель-
ности выглядит разделение лейцина и валина при проведении опыта в условиях, соот-
* При разделении на равные фракции, но различных величинах проб А и В фрак-
ция А, например, содержит (100 — ж)% А и ж% В; фракция В, сж% А и (10О — ж)% В,
по весу отличается от фракции А. Следует обратить внимание на то, что значения
(100 — х) и х в этом случае не соответствуют процентному составу фракции А, который
Гл. 8. Теоретические основы хроматографии е тонких слоях 93
ветствующих рис. 56; для сравнения нанесены кривые рис. 56 *. Отклонение от идеаль-
ного распределёйия, согласно рис. 56, связано с тем, что мы при аппроксимации функ-
ции (3) функцией (5а) заменили несимметричное распределение симметричным. Очевидно,
Р7и с. 57. Сравнение действительной (Пуассон---) и аппроксимативной (Гаусс —--)
кривых изменения концентрации лейцина (Л) и валина (В) в вытекающем растворе в слу-
чае лотка Сигнера с 29 камерами. Условия опыта те же, что на рцс. 56. До Vt, испр —
фракция лейцина, после Ут, испр — фракция валина; Гт, испр = 2,022 л (о расчете
Гт, испр см. текст).
Состав фракций, мг
Вытекший объем определено по / (Z) определено планиметри- чески
лейцин|валин лейцин|валин
До v't. иепр (лейциновая 93,9 6,1 92,6 3,9
фракция) После Vrp „„„„(валиновая 6,1 93,9 7,4 96,1
фракция) До VT опт а (лейциновая 93,9 6,1 94,7 5,3
фракция) После опт (валиновая 6,1 93,9 5,3 94, 7
фракция)
а Оптимальное значение испр (одинаковое количество
вещества в обеих фракциях), определенное планиметрически
и равное 2,083 л.
для достижения желательного состава фракций (% В во фракции А = % А во фрак-
ции В) фракцию В следует отделить после прохождения объема Ут + ДУ = Ут, испр-
Поправку ДУ можно оценить в случае большого числа камер (п > 100) **:
может быть рассчитан по формулам
(100 —ж) (проба А)-100
(100— х) (проба А)+х (проба 0) '°
________ж (проба В)-100________
(100—ж) (проба А)+ж (проба В) /0
То же относится к фракции В.
* У Мартина й Синджа [3] на рис. 1 сравнивается распределение Гаусса и Пуас-
сона при п= 100. Различие уменьшается с увеличением п.
** Эта оценка величины ДУ, основанная на поправочной формуле, позволяющей
использовать величины площадей нормального распределения для приближенного рас-
чета площади под кривыми Пуассона, была дана Мартином и Синджем [3] в числе про-
чих. Неизбежное различие при введении поправок для кривых А и В (различные Умакс)
было учтено произвольной подстановкой средней арифметической величины. При очень
больших значениях п различие между гауссовскими и пуассоновскими кривымй столь
мало, что поправкой можно пренебречь.
94
Общая часть
KV ~ макс А ~Ь ^макс В
2 4(ге—1) ’
При небольшом числе камер такой расчет является грубым. В нашем случае (ге = 29}
разделение при приближенно рассчитанной величине Ут, испр все же лучше, чем раз-
деление при Vt- Первая величина имеет преимущество равного распределения веще-
ства между фракциями А и В. Если впрочем площади под кривыми Пуассона А и В при
значении Vt, испр перекрываются точно так же, как и площади под кривыми Гаусса А
и В при Vt, то функция / (Z) передает степень разделения, правда не очень точно, однако
лучше, чем в случае разделения фракций при Vt (сР- подпись к рис. 57).
На величину Z в качестве меры, определяющей расстояние между полосами двух
веществ, и ее расчет не влияет различие между функциями (3) и (5а). Обозначим Z как
параметр разделения, а / (Z) как степень перекрывания полос. Зная Vt, испр и используя
формулу (8), можно с помощью / (Z) с хорошим приближением предсказать разделитель-
ную способность лотка с п камерами для данной смеси А + В. Заметим, что величина Z
при данной разнице Ад — Ав тем больше, чем меньше Ад и отношение фаз р. В табл. 6
показана зависимость параметра разделения Z [расчет по формуле (8)] от р, а также
зависимость между величиной Z и степенью перекрывания фракций f (Z) (% В во фрак-
ции А и % А во фракции В) на примере разделения лейцина и валина.
Таблица 6*
Расчетная зависимость между отношением фаз Q,
параметром разделения Z и степенью перекрывания
фракций /(Z) на примере разделения лейцина и валина
в смеси «-бутанол — вода
Ср. рис. 56 п = 29; АЛей==0,18; АВал = 0,07;
разделение фракций при Vt, испр (ср. текст)
р Z Ф (Z) а f(Z)6
12 1,05 0,3539 14,6
5 1,55 0,4392 6,1
1 2,12 0,4828 1,7
0,2 2,28 0,4887 1,1
z
а Интеграл ошибок Ф(г) ——- \ e^/^dx. Таблицы в «Hand-
book of Chemistry and Physics» ([19] стр. 210—213) и «Biochemisches
Taschenbuch» ([20] стр. 1199).
6 7 (Z)= 100' [0,5-®(Z)]%.
* Следует сравнить несколько отличный метод рассмотрения
Э. глюкауфа в изложении А. Кейлеманса [23].
На рис. 55 приведено изменение концентрации на выходе из последней
камеры лотка. Таким образом, здесь мы имеем «алюционную кривую»; расчет
величины с осуществляют по формуле (3), подставляя переменную V и пара-
метры Мо, п, р и vm. Полагая величину (п — 1)! в знаменателе постоянной,
мы концентрируем свое внимание на изменении концентраций в вытекающем
из камеры № п растворе.
В хроматографической практике не всегда представляют интерес только
кривые злюции. В частности, при хроматографии в тонких слоях и хромато-
графии на бумаге процесс прерывают, когда фронт растворителя достиг конца
слоя или бумажной полосы. Несмотря на то что слой и бумага в начале
хроматографического разделения, как правило, не на всю длину заполнены
Гл. 8. Теоретические основы хроматографии в тонких слоях
95
жидкой фазой (см. разд. III), такое устройство во многих отношениях можно
сравнить с аппаратом Сигнера, который остановлен в тот момент, когда
основное количество подвижной фазы из камеры № 1 достигает в виде фрон-
та камеры № п. Тогда протекший объем равен
Где находится теперь вещество? Ответ мы найдем, если обратимся теперь
к выражению (3), определяя не величину сп {V), а величину су(г), причем
переменная г (номер камеры) меняется от 1 до п, a V= vm — V~ = vmr'—^~
постоянная величина. Изменяем соответственно выражение (3) и получаем
после алгебраических упрощений формулы для изменения концентрации
в подвижной фазе:
Cv(r) = cop[-i- (r-iji----’ (9)> (ср-рис. 49>
для распределения вещества в подвижной фазе
Сг(г).^=Л/..р (9а>
и для распределения вещества в лотке
м^=м.{Р+я) . (9б)
В случае неидеальных условий работы следует, очевидно, в формуле (96)
заменить п (число сконструированных камер) величиной п' (эффективным
числом камер).
При г — 1 = (п — 1) р величина Mv (г) достигает максимального значе-
ния * **, а именно в камере № г = (и—1)р + 1 = пр + q = гмакс. Величи-
ны (гмакс—1) и (п—1) можно рассматривать как длины пути вещества и фрон-
та. Их отношение обозначено через Rf, причем видно, что Rf = р.
Аппроксимирование (96) распределением Гаусса возможно, только если
(г — 1) 30, причем оно имеет смысл лишь в случае лотка с очень большим
числом камер. Ниже мы к этому еще вернемся.
4. ХРОМАТОГРАФИЧЕСКАЯ КОЛОНКА
а) Сравнение с моделью
Хроматографическая колонка, «закрытая» или «открытая» (см. гл. А
стр. 11), может рассматриваться как лоток Сигнера с и'эффективными каме-
рами. Величина п' может быть определена из распределения вещества,
получаемого при хроматографическом разделении. Значение величины п'
отражает процессы перемешивания внутри колонки. В табл. 7 сопоставле-
ны параметры, определяющие п' для лотка Сигнера, с соответствующими
параметрами хроматографической колонки.
* Ср. выражение (2) и рис. 53. Движение подвижной фазы, выходящей из камеры
Ks 1, точно соответствует движению раствора из камеры № 1.
** Если (n—1) р представляет собой целое число, это может быть легко показано
путем подстановки величины (г — 1) = (п — 1) р или г — 1 = (п — 1) 1 в формулу
(96); (п — 1) р является целым числом, если (п — 1) является целочисленным, кратным — .
Таблица 7
Условия перемешивания и продольном и поперечном направлениях
и аффективное число камер в модели (лоток Сигнера)
и в хроматографической колонке
Модель Хроматографическая колонка Эффект Изменение п' (увели- чение или посто- янство +; умень- шение —)
Стенки камер Набивка колонки Уменьшают перемешивание в продольном направлении +
Камеры Промежутки между зернами Содействуют перемешива- нию в поперечном направле- нии +
Мешалка Конвекция и диффу- зия в промежутках, каскадные колонки а Содействуют перемешива- нию в поперечном направ- лении +
Отверстия в стен- ках камеры Промежутки между зернами Содействуют продольному переносу ±
Подвижная фаза Поток жидкости Продольный перенос, вы- равнивание концентрации и межфазовое равновесие в поперечном направлении
а) Оптимальная скорость Минимальные помехи ±.
б) Слишком большая скорость Недостаточное перемеши- вание и неполное установле- ние равновесия в поперечном направлении, турбулентность —
в) Слишком малая скорость - Становится заметной прот дольная диффузия —
Оптимальная ско- рость перемешивания Набивка достаточно мелкозернистая и рав- номерная Равномерное ' перемешива- ние в поперечном направ- лении ±
Слишком большая скорость перемеши- вания (турбулент- ность) Неравномерная на- бивка Неравномерное распределе- ние н поперечном направле- нии, помехи в продольном направлении —
Слишком малая -скорость перемеши- вания Набивка слишком, крупнозернистая Недостаточное перемеши- вание и неполное установле- ние равновесия в поперечном направлении —
а Ср. сноску 1 на стр. 101.
Гл. 8. Теоретические основы хроматографии в тонких слоях 97
Различная поглотительная способность неподвижных колоночных наби-
вок по отношению к различным веществам приводит, как и в случае лотка,
к тому, что для элюирования этих веществ требуются различные объемы
подвижной фазы. Эти объемы, которые .для данной колонки при данных
условиях являются специфичными для веществ, называют удерживаемыми
объемами. Это понятие особенно часто используется в газовой хроматогра-
фии. Удерживаемый объем в лотке Сигнера является не чем иным, как уже
знакомой нам величиной Емакс. Она выражается формулой (6):
FMaKc = (n-l)-g-. (6)
В случае хроматографической колонки с большим числом п * удерживае-
мый объем VR определяется соотношением (6а):
= (6а)
Величина 'vF обозначает постоянный объем подвижной фазы внутри данной
колонки, т. е. разность объемов колонки и неподвижной набивки. Вперемен-
ном множителе проявляется различие в способности неподвижных фаз
поглощать вещество. Как р, так и р' изменяются в зависимости от вещества,
подвижной и неподвижной фазы и отношения фаз в пределах от 0 до 1 **.
При таком методе рассмотрения безразлично, основано ли поглощение
вещества на адсорбции (Фрейндлих), обогащении на поверхности раздела
между жидкими фазами (Гиббс, Ленгмюр), распределении (Нернст) или на
сочетании этих механизмов.
Роль хроматографической колонки при перемещении вещества с под-
вижной фазой сводится к суммарному воздействию ряда факторов: помех
перемешиванию, перемешивания и поглотительной способности. Качест-
венно (а при благоприятных условиях также количественно) эта картина
соответствует переносу вещества в лотке Сигнера. Очевидно, имеет смысл
использовать математические формулы, выведенные при рассмотрении лотка
Сигнера, для решения определенных задач колоночной хроматографии.
ГТ 1
При этом оставим пока в силе важное предположение, что множитель
не зависит от концентрации, и примем, как и в случае лотка, что движение
подвижной фазы сквозь колонку происходит равномерно.
Практическое отличие от случая лотка состоит, очевидно, в том, что
вещество приходится вводить в колонку так, что уже в начале хроматогра-
фического процесса существует какая-то ширина полосы. Если эта шири-
на не превосходит некоторого значения, то «стартовая полоса» исчезает
в результате дисперсии при распределительном процессе. В качестве точки
старта (камера № 1) можно рассматривать середину стартовой полосы.
Мысленно можно перемещать все вещество начиная с этого места ***. Если
рассматривают стартовую полосу уже как нормальное распределение с дис-
персией, равной от ее ширины, и если эта величина составляет не более
чем у у п’р (получение хроматограммы на отрезке, равном п эффективных
* В этом случае (ге' — 1) п’.
** Математически р и р' представляют собой одну и ту же величину; р относится
к модели (механизм распределения известен); р' — к хроматографической колонке (меха-
низм распределения часто неизвестен).
*** Ср. аналогичный способ при противоточном распределении, Э. Геккер (24].
7 Заказ № 734
98
Общая часть
камер) или 4—7=4/^—1- (злюционная кривая, снятая на выходе из колонки
° у р' V п'р’
с п' эффективными камерами), то «конечная полоса» всего лишь на 10% шире,
чем в нормальном случае; этот расчет справедлив для величин и', при кото-
рых Уп'р' < п' *. |
б) Получение хроматограммы
Под получением хроматограммы понимают формирование распределе-
ния вещества внутри хроматографической колонки. Хроматографический
процесс прекращают, как только фронт подвижной фазы прошел всю длину
хроматографической колоки (V ~ vF, ср. стр. 97).
Этот случай представляет интерес для практика, в частности с точки
зрения хроматографии в тонких слоях и хроматографии на бумаге. Чтобы
рассмотреть его в представлениях нашей модели, разделим мысленно длину
колонки на п' секций и пронумеруем их от 1 до и' текущим номером г. Теперь
принципиально применима формула (96), причем, основываясь на том, что
опытная установка такого рода обладает высокой эффективностью разделе-
ния, мы должны сделать вывод о достаточно высоком значении п . Поэтому
аппроксимирование злюционной кривой распределением Гаусса является
законным. С ожидаемым значением М = п'р' и средним отклонением
о = У п'р' из формулы (96) [причем вместо («' — 1) для упрощения подстав-
ляем п'] получаем для количества вещества в секции № г выражение (10).
(г-п'р')«
Му (г) «= л ° . е 2п'Р' . (10)**
v V 2яп'р' v '
Вспомним теперь, что п'р' = гмакс — положение максимума вещества в полосе ***.
Ее видимая ширина составляет примерно ia= i У п'р' секции колонки, поскольку область
М ± 2а охватывает примерно 95% общей площади под кривой Гаусса ****. Как и в слу-
чае злюционной кривой (5а), степень разделения двух веществ А и В можно записать
в виде отношения
у_ гмаксА гмаксВ
Z_---------------- .
' В результате подстановки получаем v
Z = /re7'--РА~~Рв--- (Ц)
УУА+У^
или, поскольку р' = Rf,
гДе .
Положив видимую ширину полосы равной 4а и пренебрегая шириной полосы в начале
хроматографического процесса, в случае смеси А + В можно ожидать появления двух
дискретных полос при Z г 2. Если, с другой стороны, вещества А и В появляются на
выходе разделенными, то можно рассчитать по формуле (11а) при Z = 2 число теоре-
тических тарелок п'.
При хроматографировании перемещается не только вещество, но и
фронт; п' при этом непрерывно увеличивается и ширина полосы растет
* Соображение основано на предположении, что <*кон == стнорм + стстарт
** Замена р на р' означает только обобщение метода рассмотрения (ср. стр. 97).
*** См. стр. 95.
в случае очень пологих кривых эта область, пожалуй, не совсем отчетливо видна.
В этих случаях, может быть, полезно напомнить определение области 4а как отрезка на
Оси абсцисс, отсекаемого касательными в точках перегиба; ср', также стр. 100.
Гл. 8. Теоретические основы хроматографии в тонких слоях 99
пропорционально Yn P - Одновременно ордината при гмакс уменьшается
в 1/]/п'р' раз *. Такое уменьшение Мгмакс рано или поздно обусловливает
предал возможного определения вещества на хроматограмме, поэтому хрома-
тографическую колонку нельзя безгранично удлинять. Другие соотношения
имеют место при увеличении и', если фактическое расстояние между стартом
и фронтом остается при этом неизменным. Этот случай осуществляется,
например, при хроматографии в тонких слоях с использованием разных
адсорбционных слоев или при хроматографии на бумаге с использованием
разной бумаги. Ширина полюсы, естественно, по-прежнему остается функ-
цией ]/п'. Однако отношение ]/5Г' : п’ уменьшается с ростом и', так что
полосы фактически получаются более резкими. Одновременно с этим, разу-
меется, увеличивается плотность вещества в полосе.
При обычном проведении хроматографического процесса на бумаге или
в тонких слоях растворитель попадает на сухой носитель (см. разД. III). Это
обусловливает вначале слишком медленное продвижение вещества. Однако,
как только фронт в конце концов перегонит вещество, этот недостаток
устраняется. Дальнейший процесс протекает, однако, не в соответствии
с выражением (10), поскольку пройденное фронтом расстояние растет, как
правило, не пропорционально величине t (ср. стр. 107). Поэтому число тео-
ретических тарелок п' на сантиметр пути меняется вдоль хроматограммы.
Вот почему не следует ожидать количественного соответствия с формулой (10)
и следствиями, вытекающими из нее **.
в) Элюирование
Дополнительно к выводам о закономерностях элюирования, сделанным при
рассмотрении лотка Сигнера, напрашивается упрощение формул (3) и (5а)
путем использования величины- VR (удерживаемые объемы) *** и замены
величины п — 1 на п'. Подставляя
-pJ» и -1'„,
1/ 1 р р
V ~VR I
Т п “
получаем соотношение
,--------------------------------- -г2
(12)
где выражение в квадратных скобках может быть взято из таблицы ординат
нормального распределения****.
Почти симметричные злюционные кривые, требуемые теорией, получа-
ются при газовой хроматографии [23], хроматографии аминокислот на ион-
ных обменниках по методу Штейна и Мура [25], а также при фильтрации
через гели [26, 27]. Симметрию можно ожидать, если реализуются условия,
при которых величина р' не зависит от концентрации.
Для оценки разделительной способности по отношению к смеси двух
веществ А и В используют следующее соотношение, которое, как и (11а),
получено на основании предыдущих рассуждений *****;
-у*- Г«А
(13)
* При этом МТ макс = АГ0/У 2лп'р'.
I ** Ср. по этому поводу «Выводы и заключительные замечания», етр. 101.
**•* См. стр. 97.
**** [19], стр. 209; [20], стр. 1198.
***** Стр. 91—94.
7*
100
Общая часть
г) Определение числа теоретических тарелок
и высоты теоретической тарелки
Число теоретических тарелок п' и длина L хроматографической колонки
определяют величину Н = Un . Н соответствует длине отрезка колонки,
действие которого при разделении веществ равнозначно действию одной
камеры. Обычно Н обозначают как высоту теоретической тарелки *. Зная Н
или п', можно в какой-то степени предсказать разделительную способность
хроматографической колонки. Точно сделать зто невозможно, так как п или
Н зависит не только от условий работы колонки, но и от специфической
для данного вещества скорости установления концентрационного равновесия
между подвижной и неподвижной фазами. Таким образом, даже при задан-
ных условиях работы, п' иЯне являются константами и поэтому для каж-
дого вещества должны быть определены в отдельности. При близких значе-
ниях р' различия, разумеется, невелики, так что, например, для расчета
разделительной способности можно воспользоваться общим значением для п .
Величину п можно определить методом визуального сравнения элюцион-
ной кривой с семейством расчетных кривых (см. рис. 53) или методом расче-
та, сравнивая пройденное расстояние и ширину полос одного из хромато-
графируемых веществ. Если пренебречь шириной стартовой полосы **, то
для расчета могут быть использованы:
а) формула (14) в случае распределения вещества на колонке после
хроматографирования;
б) формула (15) в случае концентрационного распределения в элюате.
7,2
я=шсл<’ (14)
где Ь — измеренная в сантиметрах ширина полосы и d — измеренное в сан-
тиметрах расстояние, пройденное максимумом полосы.
"=0 й)’- <15>
где VR — измеренный в миллилитрах удерживаемый объем и VB — измерен-
ная в миллиметрах ширина полосы.
Численные коэффициенты в формулах (14) и (15) получены из произволь-
ного, приведенного и обоснованного на стр. 98 определения видимой шири-
ны полосы, где она приравнена 4-кратному значению величины о. Если
злюционные кривые являются безупречно симметричными, то на хромато-
граммах нет никаких нарушений и область в 4о можно ограничить точками
пересечения касательных к точкам перегиба с осью абсцисс. Очевидно, что
расчет по формулам (14) или (15). при существующей неопределенности
в отношении ширины полосы дает лишь оценочную величину п'. Подобную
неопределенность можно, однако, в значительной мере исключить, если
несколько усовершенствовать способ рассмотрения (ср. [23], стр. 113—114);
при этом соображения, приведшие к формулам (14) и (15), в принципе не
меняются. В качестве примера приведем вывод формулы (14).
Рассмотрим хроматограмму. По формуле (10) путь, пройденный вещест-
вом от старта до максимума полосы, составляет п'р', путь, пройденный
фронтом,— п' и среднее отклонение о от максимума полосы (= х/4 ширины
полосы, см. выше) — Уп’р’ единиц г. Измеренный в единицах длины (см)
путь вещества равен d, путь, пройденный фронтом, —L, ширина полосы — Ъ
* По-английски height equivalent to a theoretical plate (ПЕТР).
** См. стр. 97.
Гл. 8. Теоретические основы хроматографии в тонких слоях
101
и высота теоретической тарейки — Н. Тогда
Ъ кЦп'р' Т , и , d
-т = .; L = n Н; р = —РЙ
d пр' ’ г п'Н
№ 16 16Я
-□»- = -г-, = —j— и т. д.
й2 п'р’ d
Аналогично получаем формулу (15).
д) Осложнения
Осложнения возникают, если один или несколько параметров уравне-
ния (10) или (12) систематически изменяются в процессе хроматографического
разделения. Часто причиной является перегрузка колонки веществом или
изменение набивки и степени смачивания по длине колонки, изменения
температуры, расслоение комбинированной жидкой фазы, изменения скоро-
сти протекания, неравномерность распределения вещества по сечению *
и зависимость поглотительной способности неподвижной фазы от концен-
трации. При тщательном проведении эксперимента и соответствующем
выборе условий опыта можно исключить все упомянутые источники ошибок,
кроме последнего. Постоянство же коэффициентов распределения и адсорб-
ции (К') является идеальным случаем, который часто имеет место (особенно
при адсорбции) лишь в области малых и очень малых концентраций. Для
большинства веществ сродство к твердой неподвижной фазе уменьшается
с ростом концентрации уже задолго до достижения состояния насыщения;
изотермы адсорбции при этом обычно изогнуты в сторону оси концентрации.
В случае распределительных изотерм возможно искривление в сторону как
одной, так и другой оси. Это явление объясняется, как правило, процес-
сами ассоциации. Так как константа распределения вещества в хромато-
графической колонке охватывает все значения между 0 и некоторым макси-
мумом, искривление изотермы неизбежно. Если, например, ЦК' умень-
шается с ростом концентрации, то максимум зоны имеет тенденцию перего-
нять фронт зоны, в результате чего образуется асимметричное распределение
с резким фронтом и более или менее вытянутым хвостом. Последний возни-
кает из-за того, что скорость перемещения в заднем конце зоны уменьшается
с уменьшением концентрации в той же мере, что и К. Хвост кончается в том
месте, где К' становится постоянным. Это, часто обременительное, явление
имеет место в принципе только при изменении условий хроматографического
разделения. Соответствующий градиент концентрации в подвижной фазе
может, например, это все возрастающее влияние усилить до такой степени,
что этот эффект будет в точности компенсировать уменьшение кривизны
изотермы. Такая специальная методика носит название градиентного элюи-
рования [32].
5. ВЫВОДЫ И ЗАКЛЮЧИТЕЛЬНЫЕ ЗАМЕЧАНИЯ
Наша модель, лоток Сигнера, позволяет хорошо объяснить поведение ,
хроматографической колонки.
Скорость перемещения вещества оказывается наглядной функцией спо-
собности неподвижной фазы поглощать вещество, а также функцией соот-
* Особенно на это следует обратить внимание в случае больших сечений колонн.
Указанный недостаток устраняется при применении несплошных колонн [28], и в осо-
бенности при применении каскадного принципа (сложные колонки) [29—31]. Успешное
применение каскадного принципа предполагает искривленные адсорбционные изотермы.
102 Общая часть
ношения фаз и отношения между скоростью протекания растворителя и объе-
мом растворителя, находящимся внутри хроматографической колонки.
Образование типичных полос с колоколообразным распределением веще-
ства является следствием — при условии эффективного выравнивания кон-
центрации по сечению — уменьшения перемешивания вдоль колонки.
Случайные нарушения изменяют эту картину, в результате чего распреде-
ление вещества становится более пологим. При систематических наруше-
ниях распределение становится асимметричным.
Таким образом, на основе нашей модели Мы можем рассматривать хрома-
тографию как комбинацию процессов перемешивания и имеем возможность
предсказать поведение вещества в идеальном случае; при этом, однако,
приходится ограничиться экспериментальной регистрацией осложнений,
анализировать качественно их причины и создавать полузмпирическую
теорию, подбирая соответствующее число теоретических тарелок и'. При
зависимости степени поглощения от концентрации теория, вообще говоря,
позволяет делать лишь количественные предсказания.
Рассмотрим теперь еще раз формулу (14) для определения числа теоре-
тических тарелок. Поставив Ь/2 — Д, получим
Я = » = ^, (14а)
16d 4d ’ '
где Д — расстояние между максимумом полосы и ее передним или задним
краем. Скорость перемещения <в вещества при применении ранее использо-
ванных обозначений *
L d
^=R!~ = T.
Умножение обеих частей уравнения (14а) на удвоенную скорость перемеще-
ния со дает
Левая часть имеет размерность коэффициента диффузии и уравнение
в целом напоминает уравнение диффузии Эйнштейна. Поэтому Д можно
рассматривать как положительное или отрицательное смещение вещества
относительно максимума полосы, вызванное диффузией. В самом деле,
расширение полосы при хроматографии можно рассматривать как диф-
фузионную задачу [2, 33], причем такая трактовка ближе к физической
реальности, чем рассмотренная нами выше модель. В случае газовой хрома-
тографии удается, например, определенные осложнения (неравномерность
упаковки, продольная диффузия, замедленное установление равновесия) рас-
сматривать отдельно и учитывать вклад каждого из них в суммарный эффект,
который можно непосредственно связать с величиной Н 111, 16, 23, 34—36]
и таким образом дать Н молекулярно-кинетическую трактовку. Обсуждение
всех точек зрения, существующих в этом отношении в хроматографии,
выходит за рамки настоящей главы. Нам хотелось бы в заключение указать,
что при проведении и анализе хроматографических процессов никоим обра-
зом не следует игнорировать фактор времени: он выступает не только
в скорости перемещения вещества и фронта, но и в явлении расширения
полосы. Формально простая связь между этими величинами существует
только при равномерном движении растворителя.
* t — время; в отношении остального см. стр. 95 и 101.
Гл. 8. Теоретические основы хроматографии в тонких слоях 103
П. ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЕ ПОВЕДЕНИЕ И ХИМИЧЕСКОЕ СТРОЕНИЕ
1. ВЛИЯНИЕ КОЭФФИЦИЕНТА РАСПРЕДЕЛЕНИЯ И ОТНОШЕНИЯ ФАЗ
НА ВЕЛИЧИНУ Rf И УДЕРЖИВАЕМЫЙ ОБЪЕМ
Согласно изложенному в предыдущей главе, хроматографическое поведе-
ние соединения в данной хроматографической системе * целесообразнее всего
описать с помощью величины Rf (получение хроматограммы) или удер-
живаемого объема VR (элюирование). Обе величины являются функциями
распределительного (или адсорбционного) коэффициента К', причем в случае
распределения между двумя жидкими фазами, согласно определяющим
уравнениям на стр. 89 и обозначениям на стр. 97, справедливы следующие
соотношения:
При этом практически важно, что для данной пары фаз в хроматографической
колонке и в делительной воронке величина К' может иметь различные зна-
чения. Соотношения в хроматографической колонке вследствие возможного
влияния твердой фазы («носителя») гораздо сложнее, чем в воронке [38]
(ср. [39], стр. 10-11) [40].
Для случая адсорбции можно из адсорбционной изотермы Фрейндлиха
и определений, приведенных на стр. 89 (при р' + q’ — 1), вывести анало-
гичные соотношения, причем вместо отношения фаз р появляется функция
соотношения между количеством сорбента н объемом подвижной фазы.
В этом случае К’ сильно зависит от концентрации. Это, однако, ничего не
меняет в отношении указанной аналогии.
Теперь p' — Rf (стр. 95), а также
[стр. 97 формула (6а)].
Тогда
<16>
при получении хроматограммы и
при элюировании.
Причем VR — vF означает легко определяемый, например в газовой
хроматографии, «кажущийся удерживаемый объем» **.
2. КАЧЕСТВЕННЫЕ ПРАВИЛА
При сравнении веществ известного строения часто на основании обще-
принятых правил растворимости *** можно сделать качественные предска-
зания о соотношении соответствующих величин К'. Согласно формулам (16)
и (17), большим значениям К’ соответствуют большие значения Rf или
* «Хроматографическая система» определяется такими условиями, как хромато-
графическая методика, неподвижная фаза, растворитель, температура и т. д. Это выраже-
ние предложено Полудвком-Фабини и Вольманом [37].
** См. [23], стр. 16; см. также, например, [41]. Кейлемане использует обозначение
Уд, Ковач — обозначение У^.
*** См., например, «Классы растворимости» [42]; ем. далее, [39] (етр. 8—11),
а также [41, 43, 44].
104
Общая часть
меньшие удерживаемые объемы. В этом смысле можно иногда сделать полез-
ные качественные прогнозы в отношении поведения веществ при распре-
делительной хроматографии.
Адсорбционнохроматографическое поведение точно так же подчиняется
определенным правилам. Полярные адсорбенты предпочтительно адсорби-
руют полярные вещества, и наоборот. Растворители так же адсорбируются
и конкурируют с адсорбируемым веществом. Опыт Показывает далее, что
сродство к адсорбируемому веществу увеличивается с увеличением точек
соприкосновения молекулы адсорбируемого вещества с адсорбентом.
3. КОЛИЧЕСТВЕННАЯ СВЯЗЬ. СООТНОШЕНИЕ МАРТИНА
Количественная связь между строением и К' становится во многих слу-
чаях явной, если построить график зависимости
1g 1) или !g (Vr—Vf)
для членов гомологических рядов от числа гомологических структурных
элементов *, ** (или соответствующего логарифма) [43]: часто точки
лежат на одной прямой! Поведение других соединений данного ряда можно
предсказать путем интер- или экстраполяции.
а) Определение величины Rm
Линейная зависимость между 1g — 1^ и числом гомологических струк-
турных элементов может быть понята на основании соображений, которые
впервые были выдвинуты Мартином [39]. Коэффициент К' (распределение
между двумя жидкими фазами или между жидкостью и газом) является
константой равновесия и как таковая, согласно легко получаемому термо-
динамическому соотношению х
Аобр = 7?7’[1п^-1п^'] , (18)
является мерой обратимой работы, которую необходимо затратить для
перехода 1 моля вещества при постоянном объеме из неподвижной фазы
с концентрацией c’s в подвижную фазу с концентрацией с'т при абсолютной
температуре Т. Если ограничиться распределением между жидкими фазами
и обозначить обратимую работу для случая ст = c's = 1 молъ/л как AF, тогда
\F= — RT In/Г. (19)
I
Можно теперь подставить значение из (16) или (17) в формулу (19).
Используя выражение (17), получаем результат, который здесь подробно не
будем обсуждать, поскольку он представляет интерес только для случая
элюирования ***. Используя выражение (16), получаем
или
f (20)
AF = 2,3/?7’lg 1)] •
* Например, число СН2-групп в нормальном парафине.
**lg Ql__ 1) [45-49], lg (Vr-vf) [50 - 52].
*** Записанная в форме AG = RT Га К' (AG — свободная энтальпия) формула (19)
в сочетании с формулой (17) имеет большое значение для газовой хроматографии. (См.,
например, [41, 53].)
Гл. 8. Теоретические основы хроматографии. в тонких слоях 105
Формула (20) может быть применена к замещаемому веществу So. Запи-
шем поэтому мысленно АЕо вместо \F. Введем теперь в So заместитель X.
В результате свободная энергия перехода АЕо изменится на величину АЕу.
Другой заместитель Y будет приводить к изменению на величину АТ'у. Если
теперь принять, что одновременное введение X и Y приводит к аддитивному
изменению и что аддитивность в случае введения нескольких X (например,
тХ) или Y (например, nY) сохраняется, то получим следующее общее выра-
жение для энергии перехода производного от So:
2,3/27’ lg [ q -1) ] = А7г0 + m\Fx + пА/’у + ... (21)
Откуда после преобразования получим
+ + (21а)
ИЛИ
= Go 4- mGx. 4- nGy 4~ • • • 4~ (22)
при
/?m==lg<J—1 [45, 54, 55]. (Таблица пересчета
Rf в Rm и наоборот находится
в конце книги.)
Go= &F0/2,3RT Постоянная основной группы S* [54, 55]
Gy. = А2?'(Х/2,3/?7’ Постоянная груяпа ц(р, = Х, Y...)* [54, 55]
G = lgl/p Основная постоянная **
б) Применение величины Rm
Согласно формуле (22), величина Rm является линейной функцией числа
одинаковых групп при постоянном числе остальных групп. Вклад опреде-
ленной группы в величину Rm данного соединения должен быть поэтому
независимым от молекулярного остатка и от положения этой группы в моле-
куле. Это, конечно, справедливо только приближенно. Поскольку отдель-
ные группы влияют друг на друга, имеют место отклонения от этого. Хоро-
шего согласия с формулой (22) можно ожидать, собственно говоря, только
в гомологических рядах и только в той мере, в какой пространственное
расположение гомологических структурных элементов обеспечивает одина-
ковую возможность сольватации, причем одновременно остаток молекулы
в каждом члене ряда остается одинаковым. Таким образом, под гомологи-
ческим рядом в узком смысле слова подразумевается ряд нормальных карбо-
новых кислот, спиртов, сложных эфиров, аминов, аминокислот и т. д.;
точно так же образуют гомологический ряд бензол, толуол, этилбензол, но
не бензол, толуол и ксилол [56]. Щавелевая, малоновая, янтарная кислоты
и т. д., согласно упомянутому критерию, также не образуют гомологического
ряда, поскольку изменяется не только длина цепи, но и взаимодействие
карбоксильных групп. В пределах подобных ограничений, как указывалось
выше ***, требуемая, согласно (22), аддитивность часто подтверждалась
экспериментально. При систематической обработке по формуле (22) можно
---------- ।
* Если, например, So — бензол и X — С1 и в соответствии с этим производное
представляет собой хлорбензол, то основной группой является бензол или фенил. Бензол
и фенил поэтому не отличаются друг от друга.
* * Отношение фаз q в случае хроматографии на бумаге или ХТС зависит, кроме •
растворителя, также от бумаги или слоя. Поэтому величина G носит название постоянной
бумаги или постоянной слоя [56].
* ** См. сноску 2 на стр. 104.
106 Общая часть
определить эмпирические константы, знание которых позволяет рассчитать
величины Rт или Rf. Райхл [55], Парди [46] и Мур и Бейкер [57] обнару-
жили очень хорошее совпадение между рассчитанными и найденными значе-
ниями/?/. Шаузр и Булирш [58—60], введя некоторые практические оговор-
ки, определили из обратной функции (22) вид и число функциональных
групп в неизвестном соединении с известным значением Rf.
Все константы в формуле (22) зависят от используемой «хроматографи-
ческой системы» *. Изменение системы связано, таким образом, с измене-
нием величины Rm. Эта величина А7?т может быть разной в случае изомер-
ных или эпимерных соединений. Мацек [61] показал на девяти примерах,
что А7?пг для резерпоидов нормального ряда в системе формамид/форм-
амид — формиат аммония на бумаге имеет значение 0,71—0,86; в случае
резерпоидов изомерного ряда зта величина составляет &,38—0,48, и поэтому
ее можно йспользоватв для определения строения (эпимерия у углеводород-
ного атома № 3). Относительное постоянство величины R т внутри стерическо-
го ряда соответствует предположениям, положенным в основу вывода
формулы (22); они выполняются тем лучше, чем отчетливее влияние, оказы-
ваемое эпимерией на форму молекулы.
Изомерные соединения, т. е. соединения с идентичными структурными
элементами,часто могут быть разделены хроматографически**. Это не проти-
воречит формуле (22), а, наоборот, является выражением различных взаимо-
действий со средой, которыми пренебрегают при выводе формулы (22).
Теоретически это можно будет учесть только тогда, когда будет накоплено
больше сведений в отношении взаимодействия со средой и взаимного влияния
одинаковых, но различным образом расположенных структурных элемен-
тов. Эмпирическое изучение этой проблемы, однако, возможно уже сегодня;
можно ввести в формулу (22) экспериментально определяемые константы
изомерии и обобщить таким образом имеющийся материал [62].
Наконец, зависимость, выраженная формулой (22), позволяет прозталони-
ровать материал слоя или бумагу различного качества, руководствуясь
постоянными слоя или бумаги. Таким образом удается расчетным образом
подобрать стандартные значения Rf [56, 63].
в) Исключения
Имеются случаи, где зависимость (22) странным образом не выполняется.
Как указывалось, величина Rm иногда изменяется внутри гомологического
ряда пропорционально логарифму числа гомологических структурных эле-
ментов. Таким образом, влияние, приходящееся на один структурный эле-
мент, падает с ростом молекулярного веса. Нам хотелось бы рассмотреть
справедливость утверждения, согласно которому в таких случаях дело идет
скорее не о распределительной, а об адсорбционной хроматографии и поэто-
му использование формулы (22), вероятно, ведет к ошибкам. В нашей лабора-
тории мы среди 20 исследованных примеров до сих пор обнаружили только
один случай, который описывается билогарифмической • зависимостью: зто
случай с ДНФ-аминами (Cj — С5) на силикагеле Г, с бензолом в качестве
растворителя***. С другой стороны, всюду, где из химических соображений
можно предположить распределительную хроматографию, удалось подтвер-
дить зависимость (22). Это удалось, однако, лишь после того, как было
установлено, что на хроматограммах в тонких слоях часто происходит раз-
деление растворителя вследствие различной адсорбции его отдельных ком-
* См. примечание 1 на стр. 103.
** Примеры в работе [62].
*** Горизонтальная методика; ср. [64].
Гл. 8. Теоретические основы хроматографии в тонких слоях 107
понентов (фронтальный анализ) и величины Rf не следует относить к перед-
нему фронту растворителя. Впрочем, при учете этих обстоятельств и те
примеры, в которых мы думали найти зависимости для Ra [62], могут быть
сведены к чистой зависимости для Rm, согласно (22) [56].
Таким образом, прежде чем теоретически обработать величины Rf, сле-
дует, безусловно, иметь отчетливое представление о надежности экспери-
ментальных данных. Особенно в случае более старых литературных данных
это часто бывает невозможным. Поэтому к выводам, основанным на интер-
претации литературного опытного материала *, следует относиться с опреде-
ленной осторожностью. На задаче определения величин Rf мы остановимся
.подробнее в следующем разделе.
Ш. ОСОБЕННОСТИ ХРОМАТОГРАФИИ В ТОНКИХ СЛОЯХ
Хроматографический процесс может соответствовать разделительному
процессу в лотке Сигнера лишь в том случае, когда условия опыта прин-
ципиально идентичны. При хроматографии в тонких слоях, в ее обычной
форме, зто предположение не выполняется: в начале опыта «колонка» не
содержит растворителя и имеется возможность размытия вещества в резуль-
тате поперечной диффузии. При теоретическом рассмотрении этим различием
не следует пренебрегать. Аналогичная проблема возникает, естественно,
и при хроматографии на бумаге. Излагаемый ниже анализ основан поэтому
на опытах, проведенных обоими методами. Параллельно с этим имеются
различия между хроматографией в тонких слоях и хроматографией на
бумаге. Кратко коснемся также этого вопроса и в заключение укажем на
практически важную связь между хроматографией в тонких слоях и колоноч-
ной хроматографией.
1. СХОДСТВО С ХРОМАТОГРАФИЕЙ НА БУМАГЕ
а) Движение растворителя, распределение растворителя,
' величины Rf и Rm
а) ОДНОКОМПОНЕНТНЫЙ РАСТВОРИТЕЛЬ
В разделе, относящемся к растворению хроматограммы (разд. I, стр. 98—
99), уже упоминалось, что движение растворителя и вещества при хромато-
графии в тонких слоях или при хроматографии на бумаге протекает во вре-
мени иначе, чем в лотке Сигнера. Причина заключается в том, что слой
является сухим. Мы обнаруживаем в этом случае особую временную
зависимость для движения фронта растворителя, изменяющееся распределе-
ние растворителя вдоль пути и в результате этого неравномерные относи-
тельные скорости перемещения хроматографируемых веществ. Последнее
обстоятельство означает, что величины Rf меняются во время хромато-
графического процесса.
Движение фронта растворителя. Временная зависимость движения фронта
растворителя определяется для данной хроматографической системы хрома-
тографическим методом (восходящий, горизонтальный, нисходящий). Для
случая горизонтальной и восходящей хроматографии на бумаге между
пройденным фронтом путем z/и необходимым для этого временем t для корот-
кого начального периода существует относительно простая зависимость:
(z/)2 = «+^,
* Ср., например, Франц и Йокл [43]. Работа этих авторов, несмотря на указан-
ное выше сомнение, заслуживает особого внимания.
108
Общая часть
где а и b — константы [14, 65—68]. Мы смогли подтвердить эту зависи-
мость на силикагеле (покрытые пластинки) в случае восходящего и гори-
зонтального метода (см. рис. 58, а и б).
Из практики вытекает, что формулы, в которых предполагается равно-
мерное движение фронта растворителя, неприменимы для определения числа
теоретических тарелок при имеющихся в настоящее времй методах хромато-
графии в тонких слоях. Высота теоретической тарелки непостоянна. Она
Рис. 58. Скорости движения фронта растворителя при 20° на слоях с воздушиосухим
силикагелем Г при горизонтальном (покровные пластинки [64], рис. 58, а) и восходя-
щем (разделительная камера фирмы «Desaga», насыщение камеры, рис. 58, б) методах.
Уменьшение скорости движения в случае горизонтальной методики следует, по-видимому, отнести
на счет тормозящего эффекта фильтровальной бумаги, служащей в качестве мостика для подвода
жидкости, а: 1 —диэтиловый эфир; 2 —диэтиловый эфир — уксусная кислота (95 + 5); з — этил-
ацетат; 4 — бензол; 3 — четыреххлористый углерод; в — н-бутанол; б: 1 — диэтиловый эфир —
уксусная кислота (95 + 5); 2 — четыреххлористый углерод; 3 — фенол — вода (75 г + 25/г).
Увеличивается при увеличении пройденного пути. Поэтому эффективность
разделения наиболее высока в начале процесса. В этой связи следует еще
раз напомнить, что расширение пятна в процессе движения вещества пропор-
ционально (см. разд. I, стр. 102).
Профиль растворителя. Как движение фронта растворителя, так и распре-
деление растворителя вдоль пути зависят от хроматографической методики
[67,68]. Гиддингс с сотрудниками [68] использовали для такого распределе-
ния название «профиль растворителя». Они исследовали некоторые профили
при горизонтальной * хроматографии на бумаге с радиальным и односторон-
ним распространением растворителя. В этой связи особенно интересно одно-
стороннее распространение, когда растворитель движется перпендикулярно
линии старта. На рис. 59 для этого случая приведены кривые, соответствую-
щие различным интервалам времени. Интересно и важно, что следующие
друг за другом в течение хроматографического процесса профили могут
быть сведены к общему, характерному для данной хроматографической
системы **, основному профилю. Для этого заменяют расстояние z из рис. 59
приведенным расстоянием z/zf. Здесь z обозначает расстояние- от линии
старта (линия погружения) до наблюдаемой точки, a Zf — расстояние от
линии погружения до фронта растворителя (рис. 60).
Из рис. 60 видно, что для каждой из наблюдаемых степеней смачивания
бумаги имеется зона, которая, хотя и меняет при проявлении свое место,
сохраняет, однако, свое положение относительно фронта. Вещество с любым
* В случае восходящей и нисходящей хроматографии соотношения совершенно
не наглядны (ср. [68]).
** См. примечание 1 на стр. 103.
Гл. 8. Теоретические основы хроматографии в тонких слоях 109
данным значением Rf, которое начинает движение с общей линии старта
одновременно с растворителем, будет обнаруживать в течение всего времени
хроматографического процесса одинаковое отношение фаз р. Вещества
с различными значениями Rf попадают в зависимости от формы основного
профиля на места с различным отношением фаз. Если линия старта раствори-
теля (линия погружения) и линия старта вещества не совпадают (что обычно
при проведении хроматографии на бумаге и хроматографии в тонких слоях),
Рис. 59. Распределение растворителя (про-
филь) в зависимости от времени и расстоя-
ния между линией старта (линия погруже-
ния) и точкой наблюдения (по Гиддингсу
и др. [68]).
Вода, ватман 3 мм,
2
Рис. 60. Приведенное распределение рас-
творителя (основной профиль) (по Гиддинг-
су и др. [68]).
н-Бутанол, насыщенный водой, ватман 3 лш.
О 40,5 см; х 30,0 см; Д 21,0 см.
то величина р для данного вещества в процессе хроматографического разде-
ления не является более константой: в зависимости от расстояния между
линией погружения и линией старта, формы основного профиля и природы
вещества величина р быстрее или медленнее увеличивается от 0 до некото-
рого постоянного конечного значения.
Скорость движения растворителя за фронтом; истинные и наблюдаемые
значения Rf. Итак, вдоль основного профиля меняется не только отноше-
ние фаз р, но и в зависимости от р — локальная скорость растворителя. Произ-
ведение обеих величин, т. е. пропитка растворителем сечения, перпендику-
лярного направлению движения, уменьшается с увеличением отношения
z : Zf [68]. Поэтому отношение фаз р и скорость движения растворителя даже
в том случае, когда они в данном месте или в данный момент изменяются
в противоположных направлениях, не просто обратно пропорциональны друг
другу. Вследствие этого на измеряемую обычным методом величину * 7?/Набл
какого-либо вещества сложным образом влияет ряд параметров. Было обна-
ружено, что Я/набл всегда меньше «истинной» величины Rf, определенной
на основании выбранной модели (аппарат Сигнера) и положенной в основу
соотношения (22), выведенного в разд. II. Разницагсоставляет приблизи-
тельно 10—20%.
Чтобы это понять, необходимо рассмотреть элементарный'’отрезок ds, пройденный
пятном вещества при его движении; сумма таких отрезков составляет суммарный путь s,
пройденный пятном вещества. Тогда
V ds
^/набл —~, (23)
z^ —50
причем s0 представляет собой расстояние между линией старта растворителя и точкой
старта пятна вещества, Zf — суммарный путь, пройденный растворителем от старта до
* Отношение расстояний точка старта — середина пятна и точка старта — фронт
растворителя.
но
Общая часть
фронта. Согласно, разд. I (стр. 95), величина Rf определена как отношение р двух рас-
стояний *; если разделить оба расстояния на прошедшее с начала опыта время, то Rf
выразится как отношение двух скоростей. Если теперь это отношение скоростей во время
движения вещества непостоянно, то выражение, отнесенное к элементарному пути ds,.
все еще соответствует указанному определению величины
_ Скорость движения вещества в данный момент
J Скорость движения растворителя в месте
расположения пятна
Согласно разд. II (стр. 103), справедливо соотношение Rf = — [ср. формулу (16)]..
Вследствие зависимости от величины о запишем это соотношение в следующей форме:
Rf внутр~ ' Rf внутр обозначает «внутреннюю» величину Rf **, определяемую
величинами К' и Q, в момент наблюдения. Очевидно, величина Rf внутр и определенная
в разд. I величина Rf тождественны. Поэтому справедливо определение
________ Скорость движении вещества в данный момент
f внутр Скорость движения растворителя в месте
расположения пятна
Если вещество находится в точке z за фронтом, uz — скорость его движения в точке uz
т Vf — скорость движения растворителя в точке z, то можно написать
uz~vz'Rf внутр 2- _ (24}
vz отличается от скорости движения фронта растворителя Vf. Согласно Гиддингсу,
_ Az
Vz-vf~V/^'
(25>
д
где ^у— локальный коэффициент, зависящий от положения; его численное значение-
всегда меньше 1. Из рис. 59 видно, что W представляет собой локальное распределение-
растворителя. А т— переменный коэффициент пропорциональности, связывающий вели-
чину смачивания растворителем в любом месте хроматограммы со скоростью движения
фронта vf, таким образом, смачивание растворителем в точке z представляет собой про-
изведение Azty. Гиддингс рассчитал величину А длн случая приведенного профиля на
рис. 60 и привел численные значения величины уу для значений— отО до 1 (ср. рис. 4
в работе Гиддингса [68]; верхняя кривая с индексом с — 0). Подставив выражение (25}
в формулу (24), получим
_ Аг п
UZ--Vf уу ' zif внутр. z>
(26>
и, умножив на dt,
dsz—"уу Rf внутр. z'd-Zf-
Весь пройденный веществом путь s выражается, таким образом, интегралом
фронт
растворителя
Г ,
•’= "уу Rf внутр. Z'dZf.
(27>
(28>
Стартовая
точка
вещества
Расстояние, пройденное растворителем от места старта вещества до фронта, равно
Фронт растворителя
dzf = Zf — s0,
Стартовая точка
вещества
* Отношение расстояний точка старта — середина пятна и точка старта — фронт-
растворителя.
** Английское слово «intrinsic».
Гл. 8. Теоретические основы хроматографии в тонких слоях Hi
(29)»
и, согласно выражению (23),
Фронт растворителя
fy внутр, z'd-zf
Стартовая точка
п вещества
, Д/набл-
Важно представить себе значение интегрируемой функции (29). При перемещении
фронта на dzf в точке z происходит перемещение растворителя на
^-dzt [(ср. (25)].
и, следовательно, перемещение пятна вещества на
Rf внутр, Z lCP- (27)].
Согласно выражению (26), интегрируемая функция соответствует отношению
uz___Скорость движения вещества в данный момент
Vf Скорость движения фронта
Численное значение этого отношения — кроме таких постоянных, как К’, и характе-
ристик используемой хроматографической системы * ** — определяется свойствами про-
филя в точке z.
В момент, когда движущийся фронт растворителя проходит точку старта пятна веще-
ства, вследствие того что Qz = 0 и Rf внутр, z = 0, скорость движения вещества uz = 0.
Непосредственно вслед за этим вещество приходит в движение (qz> 0, Л^внутр, 2 > 0).
При uz > 0 и uz/vf > 0. Если мы проследим теперь за численным значением uz/vf при
непрерывно увеличивающемся Zf, то обнаружим, что его начальный рост постепенно
затухает. В конце концов достигается конечное значение, которое при дальнейшей подаче
растворителя остается постоянным. Это объясняется следующим.
При Zf в качестве единицы пути в процессе подачи растворителя линейный масштаб
изменяется, подобно тому как изменялся бы масштаб, изготовленный из резины, дли-
ной Zf при растягивании со скоростью Vf. Метка, нанесенная в любом месте, изменяет
при этом свое абсолютное (но не относительное) положение. Если положение метки опре-
, z
делено заданным отношением z/Zf, то скорость перемещения метки составляет —• гу.
Пятно вещества, находящееся на этом же месте, будет двигаться, согласно выражению (26),
со скоростью .
D ^Z n ^Z , Z
Rf внутр, z _ vf- Если теперь К/ внутр, z <,
Поэтому абсолютное перемещение пятна вещества отличается от абсолютного переме-
щения рассматриваемой в данный момент метки (положение z/zy в Приведенном профиле).
Пятно движется медленнее и находится поэтому в точке с меньшим значением z/zf. Если
это меньшее значение все же отличается от теперь уже истинного нового значения
„ __________________________________________
^-•Rf внутр, z, то имеет место дальнейшее перемещение; это продолжается до дости-
жения состояния
X. /внутр, z ууг Уконечн. знач \ Zf уконечн. звач '
Нанесенная в точке (z/zy) конечн. знач метка перемещается с той же скоростью, что
и пятно вещества, которое больше не меняет своего положения в приведенном профиле.
Определяемый величиной (z/zf) конечн. знач профиль в окрестности пятна вещества
* Как легко показать путем алгебраических преобразований, интегрируемая
функция ^r^Rf внутр, z идентична величине -=Д-— , численно рассчитанной Гиддингсом
для случая прцведенного профиля (согласно рис. 60) для всех значений z : Zf и различных
значений с (ср. рис. 4 у Гиддингса [68]). Параметр с представляет собой использованную
в этой работе функцию распределения и соответствует отношению
Граммы неподвижной фазы на грамм носителя
Коэффициент распределения К’
** См. примечание 1 на стр. 103.
412
Общая часть
остается постоянным, так же как и интегрируемая функция (29) и отношение скоростей
uz/vf. Таким образом, достигнуто стационарное состояние.
Рассмотрим теперь еще раз уравнение (29). С увеличением интегрируемой функции
от 0 до Д/ внутр’z конеч. знач получаем
lim Л/набл = внутр, z • (30)
z^->co \ wz Уконечн. знач
Как показал Гиддингс, на практике это конечное значение в большинстве случаев почти
достигается при обычных условиях хроматографирования (расстояние линия погруже-
ния — старт расстояние старт — фронт растворителя). Если имеется возможность
численно рассчитать величину ^конечн. знач> то получают стационарное, истинное
значение Rf.
Rf ист — Rf внутр, конечн. знач —
lim Rf набл
7 Аг \
k, wz У конечн. знач
(31)
или, проще,
л Л/Набл
Rf ИСТ
\ W )Венабл
(32)
где
k W уЯ^набл k Wz У конечн. знач
Разумеется, каждое значение Rf внутр, г является «истинным» значением Rf. Величи-
на Rf внутр, конечн. [определение (31)] имеет, однако, преимущество перед величи-
ной Rf ист, ввиду того что она связана с отношением фаз Q, которое примерно одинаково
для всех веществ, движущихся стационарно в средней области профиля (рис. 60). Если
конечн. знач можно определить в этой области *, то величина Rf ист, согласно фор-
муле (31), является основой, позволяющей с хорошим приближением провести количе-
ственное сравнение хроматографического поведения многих веществ. Ниже мы еще
встретимся с эмпирическим соотношением, подобным соотношению (31) или (32).
Для непосредственного сравнения различие между /?/Набл и истинным
значением Rf не, играет роли. Если необходимо, однако, установить зави-
симость между хроматографическим поведением и химическим строением
(см. разд. II), то наблюдаемые величины Rf не являются надежной мерой
коэффициента распределения^' и отношения фаз р и, следовательно, в форму-
лу (16) их следует подставлять с осторожностью (см. ниже). Поэтому удиви-
тельно, что наблюдаемые при хроматографии на бумаге величины
Rf (Rf набл) во многих случаях удовлетворяют зависимости Мартина для **.
Согласно нашим данным, это справедливо также в отношении Rf набл на
тонкослойных хроматограммах аминокислот (см. рис. 61) [56].
Чем объясняется это расхождение между теорией и практикой? Первое
объяснение можно найти, сравнивая величины 7?/Набл, которые, согласно
формуле (22), дают пригодные значения йт, с величинами Rf набл, не
удовлетворяющими соотношению (22). Справедливо правило, согласно кото-
рому при использовании соотношения (22) должно соблюдаться неравенство
0,1 < Rf набл < 0,7 [69]. Это как раз та область, в которой приведенный
профиль растворителя является до известной степени горизонтальным (см.,
например, рис. 60). Предварительные исследования авторов, по-видимому,
* В рассмотренном Гиддингсом численном примере (рис. 60) величина ( -sr ) D
\ w JRf набл
колеблется между 0,85 и 0,9 при изменении Rf Набл от 0,2 до 0,7; таким образом, эта
величина почти постоянна.
** См. примечание 2 на стр. 104.
Гл. 8. Теоретические основы хроматографии в тонких слоях 113
подтверждают то, что такой профиль образуется на слоях силикагеля при
горизонтальном и вертикальном методах [56, 70]. Вещества, движущиеся
в «горизонтальной» области профиля, попадают примерно на одно и то же
отношение фаз р. Таким образом, выполняется основная предпосылка при-
менимости соотношения (22). Дальнейшее объяснение дает следующее
наблюдение. Если после прохождения пути в 10—15 см воспрепятствовать
дальнейшему продвижению растворителя на слое силикагеля путем проведе-
ния разделительной черты, то поток растворителя прекращается не сразу.
Профиль не исчезает даже через 24 час
(восходящий метод), однако в значитель-
ной мере выравнивается. Все Rf набл
увеличиваются при этом с одинаковым
коэффициентом (около 1,1) и стремятся,
таким образом, к конечному значению
[72]. Идеальное конечное значение было
бы достигнуто при полном исчезновении
профиля и, очевидно, являлось бы
истинной величиной Rf согласно опре-
делению (16) (р всюду одинаково).
Связь Rm набл с Rm и Rm. Аддитив-
ность Я™ набл- Если ПрИНЯТЬ, ЧТО В об-
ласти значений Rf от 0,1 до 0,7 вели-
чины Rf, в особенности вычисленные по
отдельным наблюдаемым Л/Набл средние
значения Rf, удовлетворяют зависимости
7?/ набл£ = Rf ист, ,(33)*
и если подставить постоянное значение
коэффициента | между 1,1 и 1,2, то
можно показать, что соотношение
Rm набл 1g ( = 1
набл у
позволяет получить расчетное уравне-
ние
^ = igBf-H—1),
X nf ист У
которое довольно хорошо передает за-
кон аддитивности и поэтому во многих
случаях является практически пригод-
ным [56].
Из формулы (21а), учитывая соотношение (33) и добавляя к обеим частям
1g получаем
18ECs±T-‘)“^r+^+-+14’ <216>
где ,
igsQ-!——е) (34)
''“/наблъ ' ''“/набл ' 1
И
----0 = 18(Н—‘)+s (35)
_______ 'к^на(5Л У rtf набл z
* Обращает на себя внимание формальное соответствие с теоретически обоснован-
ным соотношением (32). Эмпирический коэффициент £ соответствует также количественно
почти постоянному в средней области профиля коэффициенту набл.
8 Заказ № 734
Рис. 61. Линейная зависимость между
Rm и числом СН2-групп в ряду «-амино-
кислот С2 — С8. Прямые регрессии
являются расчетными [56].
Ометанол — вода ] 70 + 30; силикагель Г,
А этанол — вода [ восходящий метод (отно-
-4- н-пропанол — । сительно методики см.
вода J [71])
Каждая точка соответствует среднему значе-
нию из 18 наблюдений; 6 аминокислот хро-
матографировались каждая 2 раза на одной
пластинке (любая последовательность) и опыт
повторялся 9 раз. Добавление 2-, 4-, 8- или
16%-ной ледяной уксусной кислоты не ока-
зывает влияния на линейность, но изменяет
наклон и положение прямых.
114
Общая часть
ИЛИ
Rm — Rm набл + б, Rm = Rm !СР- (22)].
б представляет собой ошибку, которую мы допускаем при замене левой части
уравнения (216) легко вычисляемой величиной 1g (=—^-------1\ Величину б,
V Rf набл
являющуюся функцией £ и 7?уНабл> следует определить из рис. 62 как
разность между R'm и Rm набЛ для наиболее неблагоприятного случая
£ = 1,2; R'm и 7?mнабл изображены в виде полос для учета разброса при
экспериментальном определении величин Rf. Стандартное отклонение от
Rf набл составляет в случае хроматограмм в тонких слоях и на бумаге
Рис. 62. Сравнение RmHafa с «тео;
ретической» величиной R'm при раз-
личных значениях Яунабл с учетом
ошибок измерения [56].
См. текст и формулы (216), (34), (35).
Дтнабл=^ (й/набл±ЗзД/на“-1) ;
/ ”2 । \ -
\ й/набл* у 3йК/набл j
£=1, 2.
Чисм СНг-групп
Рис. 63. Сравнение рассчитанных
(Ят набл) и визуально определен-
ных прямых регрессии (R’m) для
гомологического ряда а-аминокислот
Са-С8 [56].
Эспериментальныё данные рис.67. Раство-
ритель этанол — вода;------R ,
г д. т набл.;
т-
в среднем «Я/набл =» 0,0037 (18 отдельных значений); взятое выборочно
среднее значение попадаете большой вероятностью в область Rf Набл ±
0,011 [71].
Как видно, в пределах ошибки опыта величины Rm и R т набл при
0,1 < Rf дабл < 0,3, совпадают, б увеличивается равномерно до Rf набл —
= 0,6 и затем резко при К/набл>0,7. В области 0,1 <Z Rf набл < 0,6
величина RmnaSn фактически представляет собой приближенное значе-
ние R'm. Применимость этой величины видна из рис. 63, где значения сред-
него примера рис. 61 еще раз сопоставлены (правда, в несколько другом
масштабе) с соответствующими величинами R'm (£ = 1,2) и для всех величин
Гл. 8. Теоретические основы хроматографии в тонких слоях
115
ошибка измерения изображена равной ±3 sRm- Аппроксимирование R’m
с помощью Ящнабл удовлетворительное в отношении аддитивности и весьма
хорошее в отношении наклона регрессионных прямых; вертикальное смеще-
ние б незначительно. Таким образом, наш анализ показывает, что J? nt набл
в пределах необходимой экспериментальной точности для средних значе-
ний Rf является аддитивной величиной, которая может быть заменена величи-
нами Rm или R'm. Это подтверждают соответствующие эмпирические данные.
Можно было бы думать при сравнении Rm Набл с Rm на рис. 63, что
всегда возможно осуществить замену 1g (= —1) величиной lg(А —
Rf набл Rf набл
—|) и определить, в случае надобности, лучшие значения £ (лучшая линей-
Р и с. 64. Величина Нт набл не является аддитивной, поскольку Rf надл, несмотря
на разделение растворителя, обычно относят к переднему фронту [56,ч70].
а — гомологический ряд а-аминокислот (глицин — а-аминокаприловая кислота); метанол!— вода —
аммиак 34% (70 + 30 +ля); силикагель Г; восходящий метод [71]; б — гомологический ряд
М-2,4-динитрофениламивокислот (глицин-а-аминокаприловая кислота) в 4 многокомпонентных
растворителях
+ хлороформ — этилацетат — ледяная
уксусная кислота (80 + 20 + 1);
О хлороформ — метанол — ледяная
уксусная кислота (95 + 5 + 1);
Д толуол — ледяная уксусная кислота
(90 + 10);
• Диэтиловый эфир — ледяная уксусная
кислота (95 + 5).
Силикагель Г,
горизонтальный
метод (закрытая
пластинка)
[64], ср. [71].
ность), т. е. как можно лучше использовать соотношения (22) и (216). Мы
считаем это ввиду принятых нами допущений (горизонтальный профиль,
-R/набл! = -R/ист) неверным. Приведенное выше исследование преследо-
вало единственную цель защитить эмпирически полученные значения Rm
от критики строгой теории. Соотношение Мартина (22) в хроматографии
в тонких слоях вряд ли удастся использовать в такой же степени, как
в газовой хроматографии; было бы, однако, неправильным совершенно
отказаться от возможностей, вытекающих из действительной аддитив-
ности Rm набл’ '
Эта аддитивность при известных условиях обнаруживается там, где ее
совсем не ожидают. В случае примеров, приведенных на рис. 64, а и 64, б,
величины J? m набл Для членов гомологических рядов лежат определенно не
на прямых. Причина этого заключается не в несостоятельности теории,
8*
116
Общая часть
а в неучете осложнений, возникающих в результате хроматографического
разделения применяемых комбинированных растворителей (фронтальный ана-
лиз). Обычно измеряемые величины Rf (7?/Набл) не удовлетворяют больше
предположению [ср. формулу (33)]
ист = набл-
₽) МНОГОКОМПОНЕНТНЫЙ РАСТВОРИТЕЛЬ; ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ
РАСТВОРИТЕЛЯ
Комбинированные растворители при попадании на сухой адсорбент(актив-
ный тонкий слой или заполненная хроматографическая колонка) частично
разделяются на составляющие компоненты. Это явление хорошо известно *;
соответствующий процесс лежит в основе специальной хроматографической
аналитической методики, созданной Тизелиусом и получившей название
«фронтальный анализ» [75—78].
Несколько фронтов растворителя. Разделение основано на том, что ком-
поненты в соответствии с их адсорбционными коэффициентами и концен-
трациями постепенно поглощаются адсорбентом из движущегося растворителя.
Таким образом, фронт изменяет свой состав. Через некоторое время —
иногда очень быстро — полностью исчезает один компонент (задний фронт),
затем второй (второй задний фронт) и т. д. до тех пор, пока не останется
только последний компонент, который движется дальше не изменяясь (перед-
ний фронт). Из сосуда с растворителем непрерывно подается свежий раство-
ритель. От линии погружения до заднего фронта, который в свою очередь
движется, смоченный адсорбент находится в равновесии с растворителем
постоянного состава. Далее, до второго заднего фронта следует зона,
которая находится в равновесии с растворителем, содержащим на один
компонент меньше, и т. д. Растворитель из п компонентов образует, таким
образом, как правило, п различных зон, которые отделены друг от друга
(п — 1) фронтами. Обозначим их, начиная спереди, а-, £-, у-, ... со-фронтами.
Если aZf, ^Zf и т. д. представляют собой пути, пройденные соответствую-
щими фронтами к моменту наблюдения, а и т. д. — их скорости
перемещения, то упрощенно можно записать
ifizf daZf
-1Г=к»-аГ' или fy^k^zf,
d^Zf daZf
-dT = kt^F' или
k&, kv, кю — коэффициенты замедления, которые при умножении на ско-
рость перемещения со-фронта дают скорости остальных фронтов.
Растворитель, состоящий из двух компонентов, взаимодействие которых незначи-
тельно, можно рассматривать как идеальный раствор одного компонента в другом. В этом
случае состав целесообразно выражать через концентрацию см в молярных процентах.
Зависимость между концентрацией см (сильнее) сорбирующегося компонента, его адсорб-
ционным коэффициентом и коэффициентом к$ можно вывести из изотермы адсорбции
Фрейндлиха [70]:
(36)
где х и $ — константы; х содержит адсорбционный коэффициент Фрейндлиха и отноше-
ние фаз. В системе бензол — пиридин (область концентраций 1—42 мол.% пиридина)
и толуол — ледяная уксусная кислота (область концентраций 2—32 мол.% ледяной
уксусной кислоты) мы смогли экспериментально подтвердить зависимость (36) [70].
* В связи с этим см. [73, 74].
Гл. 8. Теоретические основы хроматографии в тонких слоях
117
При применении горизонтальных воздушносухих слоев (относительная влажность воз-
духа 40%) силикагеля Г толщиной 0,3 мм получены следующие значения констант
при 20°: '
х С
Бензол—пиридин 0,65 0,84
Толуол—ледяная уксусная кислота 0,91 0,82
При см = 5 мол.% Ар = 0,32 (толуол — ледяная уксусная кислота) или 0,47 (бензол —
пиридин). Таким образом, компонент растворителя (даже при небольшом процентном
содержании) при соответствующем соотношении полярностей может оказывать суще-
ственное влияние на p-фронт, обусловливая высокое значение Ар. Если компоненты
отличаются по полярности менее сильно, чем в приведенных выше примерах (как в про-
явителе спирт — вода), то значения Ар становятся еще значительно больше.
Образованные в результате разделения фронты только в редких случаях
заметны непосредственно (рис. 65), однако могут быть легко обнаружены,
а-Фронт
ДНФ-н-Амиламин ф
ДНФ-н-Пропшюмин *
2,4-Динитрофвнол в
ДНФ-а-Аминомосля- •
ноя кислота ж
ДНФ-Аланин •
-р-Фронт
- - у-фронт
ДНФ-Гяицин
Ди-ДМ-гистидин
Линия погружения
Рис. 65. Разделение проявителя при горизонтальном тонкослойном хроматографи-
ровании (покрытые пластинки [64]) смеси 2,4-динитрофенола и некоторых 2,4-динитро-
фенильных производных ДНФ-соединений в хлороформе — метаноле — уксусной кис-
лоте (95 + 5 4- 1) [70]. .
Нанесено несколько проб смеси веществ на непрерывно увеличивающемся расстоянии от линии
погружения. Точки старта лежат, таким образом, на прямой, проходящей из левого нижнего угла
в правый верхний, а-, 0- и у-фроиты видны при освещении УФ-светом. Зоны, разделенные фронтами,
обнаруживают различный состав проявителя; чистый хлороформ между а- и 0-фронтом (а-зона),
хлороформ — метанол между 0- и у-фронтом (0-зона), хлороформ — метанол — ледяная уксусная
кислота между у-фронтом и линией погружения (у-зона).
если подробнее рассмотреть хроматографическое поведение соответствующих
веществ и их смесей.
Растворитель хлороформ — метанол — ледяная уксусная кислота (95 +
5 + 1) * образует на силикагеле один а-, один р- и один у-фронт. В соответ-
ствии с этим на хроматограмме в этом растворителе образуется одна а-зона
(СНС13), одна p-зона (СНС13 — СН3ОН) и одна у-зона (СНС13 — СН3ОН —
— СН3СООН) (95 + 5 + 1). Путь, пройденный каким-либо веществом при
хроматографическом разделении, зависит от того, с какой зоны оно начало
свое движение, как быстро и как долго оно двигалось с этой зоной и не
тормозилось ли оно при своем движении одной или несколькими зонами.
На рис. 65 приведены некоторые примеры. При подобранной точке стар-
* Следует напомнить, что везде (кроме специально отмеченных случаев) речь
идет об объемных долях (мл).
118
Общая часть
та * и подобранном составе хроматографической смеси веществ последова-
тельность разделения растворителя выявляется особенно четко.
Полярные вещества (динитрофенол, ДНФ-аминокислоты) практически
приходят в движение лишь тогда, когда у-фронт настигает данную точку
старта. Таким образом, они движутся почти исключительно в у-зоне; поэтому
их величины Rf набЛ имеет смысл отнести к какому-либо расстоянию точка
старта — у-фронт (эталонный путь). Мы обозначаем такие величины как
yRf набл- Если стартовые точки лежат на наклонной прямой (наклонная
линия старта), то конечные точки, определяемые для каждого вещества
произведением ’VR/Ha6n X эталонный путь, также должны лежать на
наклонной прямой (соединительная прямая) **. В точке пересечения наклон-
ной линии старта с соединительной прямой пройденный путь равен нулю.
Эта точка должна лежать на фронте у-зоны; она определяет положение у-фрон-
та. В самом деле на рис. 65 у-фронт приблизительно *** проходит через точку
пересечения 6 кривых: наклонной линии старта, соединительной прямой
пятен ДНФ-гистидина, соединительной кривой пятен ДНФ-глицина и т. д.
Менее полярные вещества (ДНФ-амины) приходят в движение, уже когда
a-фронт достигает точки старта. Поскольку эти пятна двигаются исключи-
тельно в a-зоне, обе соединительные прямые с хорошим приближением схо-
дятся в точке пересечения наклонной линии старта и a-фронта (рис. 65).
При этом при нахождении обычным способом величин Rf в качестве эта-
лонного пути допускается использование расстояния точка старта —а-фронт.
Мы обозначаем такое значение Rf через “R/набл и придерживаемся этого
обозначения и дальше, когда выбор расстояния до a-фронта в качестве
эталонного расстояния является уже неверным. Растворителем в a-зоне хро-
матограммы, приведенной на рис. 65, является чистый хлороформ. Это легко
доказать, проводя хроматографическое разделение ДНФ-амиламина и
ДНФ-пропиламина с чистым хлороформом в качестве растворителя: величины
R/набл идентичны величинам aRf набл, полученным в описанных выше
опытах.
(3-Фронт на рис. 65 не играет роли, поскольку все содержащиеся в смеси
вещества двигаются либо впереди, либо позади (3-зоны. Точка старта внутри
этой зоны не настигается у-фронтом; поэтому полярные соединения просто
остаются на месте. То же справедливо для полярных соединений с точками
старта между (3- и а-фронтами.
Из сказанного выше следует, что обычные измерения величин R/ при
использовании расстояния точка старта — a-фронт в качестве эталонного
пути могут привести к значениям R/, не имеющим физического смысла.
Таким образом, неправильно относить движение вещества к а-фронту
и характеризовать величиной “R/набл» если вещество движется не с а-зо-
ной ****. Правильным эталонным расстоянием для измерения величин R/
является расстояние между точкой старта и (3-фронтом или точкой старта
и у-фронтом, если вещество движется в [3- или в у-зоне. Предпосылкой при-
годности измеренных таким образом значений R/ (мы обозначаем их, как уже
указывалось, через PR/набл или 'VR/Ha6n) является условие, чтобы веще-
ства во время всего процесса хроматографического разделения двига-
лись практически только в рассматриваемой зоне.
* В связи с этим см. [73, 74].
** Предварительным условием является отсутствие заметной зависимости ХЯ/Набл
от расстояния линия погружения — старт; это условие выполняется (ср. стр. 121).
*** Степень приближения в числе прочего зависит и от того, как точно определен
фронт. Мерилом является крутизна градиента концентрации при переходе от одной
зоны к другой.
**** Дальше, однако, мы увидим, что ошибка иногда слишком мала, чтобы ее стоило
принимать в расчет.
Гл. 8. Теоретические основы хроматографии в тонких слоях
119
Резкие фронты * образуются прежде всего в том случае, когда выравнивание кон-
центраций в паровой фазе так или иначе уменьшается. Это в первую очередь справедливо
для покрытых пластинок, поэтому они были использованы в опыте, приведенном на
рис. 65. Если работать, используя в разделительной камере восходящую методику,
фронты размываются тем сильнее, чем больший объем занимает газовое пространство.
С увеличением газового пространства увеличивается, естественно, запас растворителя
в паровой фазе, способствующий выравниванию концентрации. При больших запасах
пара определяется только состав растворителя за со-фронтом и при теоретическом анализе
используется только величина “Я/ набл-
Аддитивность величин $Rm и yRm. Рассмотрим данные, представленные
на рис. 64, а и б, с этой новой точки зрения. Точки, соединенные кривыми,
Рис. 66. Величина Rm аддитивна, так как при определении величины Rf набл учтено
разделение растворителя (см. текст) [56, 70].
а — условия опыта соответствуют рис. 64, а; растворитель из 3 компонентов, наблюдаются только
фронты а и у; Rf набл = ^Rf набл- 6 — условия опыта соответствуют рис. 64, б; растворитель из
2 компонентов: оба фронта наблюдаются. Rf набл ~.&Rf Набл; растворитель из 3 компонентов; все
фронты наблюдаются, Rf набл = ’vRfHa6a. '
должны лежать на прямых. Они не лежат на прямых, поскольку величины
Я/набл, лежащие в основе расчета Rm, были условно отнесены к а-фронту.
Однако еСЛИ Вместо “Я/набл ПОДСТаВИТЬ Величину РД/набл или Т^/набл, т0
получим
= 1g (-Б—--------1) или = —*--------1Y
4 *Rf набл 7 4 Rf набл 7
Если нанести полученные результаты на график в зависимости от числа
СН2-групп, то оказывается, что в интервале от 1 до 6 СН2-групп точки лежат
* См. примечание 3 на стр. 118.
120
Общая часть
на прямой (рис. 66, а и б) [56, 70]. Отклонение для соединения с 7 СН2-груп-
пами следует приписать ненадежности определения Rf в области Rf са 1.
При условии правильно найденной величины Rf набл соотношение Марти-
на (22) применимо также в определенных случаях при разделении комби-
нированного растворителя. _
Если подставить, согласно (33), Иабл1 = ш^/ист> то часто можно
заметить, что величина | близка к 1. Величины aRf иабл примерно до значе-
ний 0,95 дают аддитивные величины вйт. Очевидно, наблюдавшееся в слу-
чае a-фронта раннее уменьшение отношения фаз * в данном случае начи-
нается лишь в непосредственной близости к фронту.
Допустимое и недопустимое использование измеренных обычным обра-
зом величин Rf. Вернемся еще раз к рис. 65. Если измерить для находя-
щихся в у-зоне пятен величины aRf Иабл, то можно заметить, что они изме-
няются с изменением отношения линия погружения — точка старта: линия
a й
Рис. 67. Разделение растворителя из 2 компонентов. Пятно вещества движется
за 0-фронтом (а) или перед 0-фронтом (6) [70].
погружения — а-фронт. Весьма полезно подробнее рассмотреть эту зави-
симость ** и связь между aRf иабл и отнесенной к истинному фронту величи-
ной Rf. Наиболее наглядны эти соотношения в случае разделения растворите-
ля, состоящего только из двух компонентов.1 На рис. 67, а и б схематически
изображены соответствующие хроматограммы. На рис. 67, а пятно вещества
в момент наблюдения движется позади, а на рис. 67, б — впереди 0-фронта.
Если обозначить расстояние линия погружения — старт через s0, рас-
стояние старт — a-фронт через А, расстояние старт — 0-фронт через В
и расстояние старт — средняя точка- пятна через С, то, согласно рис. 67, а
[70], весь путь растворителя aZf = zf = A -f-sp; путь, пройденный 0-фронтом,
₽z/ = kf,Zf — В + s0; далее,
•Я/набл А В fy-zj s0 а-п ^&'zf so
"a-'-------~r~ — ~ ; и B.f набл — ~ ; Tty набл,
₽d C A zf — z0 Zf — s0
“/набл -p-
(37)
aRf иабл достигает своего максимального значения при s0 = 0. Таким обра-
зом, “Я/иабл не может превысить величину
Rf макс = kf^Rf иабл- (37а)
* См. рис. 59 и 60.
** Она не имеет ничего общего с изменяемостью Я/Иаблг, согласно формуле (30)
(стр. 112).
Гл. 8, Теоретические основы хроматографии в тонких слоях
121
₽Л/набл ПРИ Данном ₽z/ практически ие зависит от s0. Правда, и здесь необ-
ходимо вести расчет по локальным, изменяющимся степеням пропитки
(ср. рис. 59 и 60). Возможно, однако, что отношение фаз вблизи линии раз-
деления менее сильно изменяется, чем вблизи а-фр опта.
Любое различие между “Я/Набл и “Я/макс можно наглядно выразить
в виде отношения зтих двух величин. Оно равно
Ае-2/—so р
% набл 4~s0 Мабл
Rf макс ^-(3 -Я? набл
В результате преобразования получаем
“я
. набл
~ »Г~
макс __ s0
1 •“/ набл 1
I н макс
Согласно выражению (38), отношение aRf набл : “Я/Макс является функ-
цией параметра к& и переменных solzf. На рис. 68 это изображено графи-
чески, причем “Л/набл отложено непосредственно в процентах от “Я/макс-
Практически важной является область абсцисс от 5 до 20 (длина пути 18—
4 см при s0 — 1 см).
Таблица 8
Неточность при измерении и сравнении двух средних
(из 8 отдельных измерений) значений Rf (см. текст)
(X р я набл Возможная процентная ошибка а 0,022-100 * СГ5 /о “f набл °Rf набл а Возможная процентная ошибка а , 0,022-100
aRf набл
0,9 2,5 0,5 4,5
0,8 2,8 0,4 5,6
0,7 3,2 0,3 7,5
0,6 3,8 0,2 11,3
а При сравнении табличных значений с значениями, взятыми из рис. 68, следует
обратить внимание на то, что аЯ/набл всегда меньше feg. ''
Первое следствие из рис. 68. Процентное изменение “Я/Набл ПРИ переходе
от значения абсциссы 5,2 к значению 9,1 (рис. 68) при к$> 0,5 лежит в пре-
делах ошибки измерения * (табл. 8) и поэтому им можно пренебречь. Если
* Средняя ошибка s Rf среднего значения Я/Набл составляет приблизительно
0,015 „ „ „
, где п — число отдельных измерении Rf )71 J. С учетрм статистического закона
V п: , _
для сравнения двух средних значений получаем при п = 8 амплитуду колебаний Я/набл,
равную ± y^2-3-sRf = ± 0,022 единицы Rf. Эта «экспериментальная ошибка» почти
ие зависит от численного значения Я/Набл’> ПРИ использовании рис. 68 ее следует пере-
считать с, учетом «процентной ошибки», отнесенной к численному значению Я/набл
(табл. 8).
122
Общая часть
расширить область абсцисс от 5,2 до 20, то это справедливо еще при кр, > 0,9.
По другую сторону указанной границы величина “Й/Набл заметно зависит
от отношения линия погружения — старт: линия погружения — а-фронт.
I’ н с. 68. Зависимость набл от отношения расстояний линия погружения — старт:
линия погружения — фронт (s 0': zy) при разделении растворителя (2 компонента) и дви-
жении вещества за Р-фронтом [70].
представляет собой отношение скоростей движения а-и р-фронта.
Второе следствие из рис. 68. В области абсцисс 5,2—9,1 при /гр> 0,85 ве-
личины “Я/„абл 11 “Я/ Макс в пределах ошибки опыта совпадают (ошибка
измерений > При 2%) и не зависят от s0 : Zf. ^/макс маке ~ набл (37а)
справедливо также приближение О / > 3 /> Л. f пабд-гт /1^
Если теперь &Bf набл пст, (Стр. 120) ?!
тогда “ТС набл/. ЛГ^/ист- (39)
или “Л/наблё' ^%нст. (39а)
В отличие от £ д' относится к хроматографической системе с разделяю-
щимся растворителем [70]. Причисленном значении V, находящемся в интер-
вале 1—1,2, из соотношения (39а) можно получить те же выводы, что и из
Гл. 8. Теоретические основы хроматографии в тонких слоях 123
соотношения (33). Действительно, следует предположить, что аддитивность
величин Rm на рис. 61 или рис. 63 объясняется фактической правильно-
стью соотношения (39а).
Использованный в этих экспериментах растворитель, несомненно, также подвергается
разделению. Хотя (3-фронты не заметны, их можно обнаружить методом, иллюстриро-
ванным рис. 65. Они лежат вследствие близости свойств спирта и воды вблизи а-фронта.
Для смеси метанол — вода (70 + 30), например для Ар, было получено значение 0,95 [56].
Упомянутая в подписи к рис. 61 добавка ледяной уксусной кислоты, без сомнения, вызы-
вает образование незаметного у-фронта, который также должен соответствовать высокому
значению kv.
Обратимся в заключение к изображенному на рис. 67, б случаю.
С
ай/набл — 2 (см- СТР- ^20) и, следовательно, также
Rf наблВ = Rf ист- (33)
В процессе хроматографического разделения отношение s0 : z/ уменьшается,
при этом возможны три случая.
1. (3-Фронт не может догнать пятно, поскольку
мпятна м0-фронта (^ СКОРОСТЬ),
a D dA , dA
itiKa^~dF>^~dF ’
Rf набл /ср.
Наблюдаемая в случае комбинированного растворителя величина “R/набл
в течение всего опыта остается равной величине 7?/Набл, которую находят,
когда вещество хроматографируется только быстро перемещающимся компо-
нентом растворителя.
2. Пятно перемещается на постоянном расстоянии от (3-фронта, поскольку
ипятна = Kg-фронта,
Rf набл =
Как и выше, нет отличия от хроматографического разделения в чистом
компоненте данного растворителя.
3. Расстояние между пятном и (3-фронтом уменьшается, поскольку
Кпятна < ^р-фронта,
Rf набл /ср
и фронт догоняет пятно, когда
Л So(l — fcp)
Д —-----—------.
/ср— Rf набл
Относительная скорость перемещения пятна -Мпятна изменяется. В предель-
ма-фронта
ном случае она соответствует относительной скорости перемещения (3-фронта
(₽Ry = 1); обычно она меньше (₽Ry < 1). Так или иначе при наблюдении
после окончания опыта уже нельзя легко подобрать для пятна разумную
величину Rf.
Практические правила. Резюмируя, можно сказать следующее относи-
тельно определения значения Rf в случае разделения комбинированного
растворителя [70]. Вещества, движущиеся перед (3-фронтом, не подвергаются
влиянию процесса разделения растворителя. Величину aRf набл определяют
обычным способом. Величина aRm является аддитивной.
124
Общая часть
При движении веществ за p-фронтом следует различать несколько случаев.
1. Ав > 0,85. Можно пренебречь p-фронтом и определять величину
“й/набл обычным способом. Величина aRm является аддитивной.
2. «Нижняя граница» < кй < 0,85, причем нижнее значение должно
лежать между 0,2 и 0,4. Если движение вещества начинается лишь после
того, как P-фронт перейдет точку старта, следует определять ^Я/набл»
величина $Rm является аддитивной. Если, однако, заметное движение
начинается уже раньше, то никакое разумное измерение величины Rf невоз-
можно.
3. к6 < меньше «нижней границы». В этом случае можно хорошо опре-
делить величину ₽й/набл» однако соответствующая величина Rm не являет-
ся аддитивной.
4. Если, кроме p-фронта, имеется еще и у-фронт, то соотношения не
являются наглядными; на опыте придерживаются при этом правил 1—3.
5. Если пятна движутся за ю-фронтом, то справедливы правила 1—3
с кш вместо fcB; поэтому вначале следует определить кш aaRfB)l5n. Соотноше-
ния являются справедливыми в той мере, в какой состав проявителя соот-
ветствует его составу в сосуде, содержащем растворитель.
б) Количественная оценка хроматограмм в тонких слоях
Количественный расчет колоночных хроматограмм не вызывает затруд-
нений. Если при разделении веществ на хроматографической колонке
в любой момент удается измерить без ошибок концентрацию веществ в элюате,
достаточно построить графические зависимости концентраций от объемов
и пропланиметрировать полученные кривые. В случае кривых Гаусса пла-
ниметрирование можно заменить двумя измерениями длины. Площадь F
равна
F — wi/Ji-'Ч2 =wi/2h-1,0645,
где h — высота пика концентрационной кривой; wi/2 — ширина кривой,
измеренная на половине высоты. Площади под кривыми пропорциональны
количеству вещества.
В случае хроматографии в тонких слоях и хроматографии на бумаге
положение оказывается более сложным. Можно, конечно, разделить хрома-
тограмму на сегменты, каждый из которых промыть растворителем, опре-
делить концентрацию отдельных злюатов и дальше поступить, как опи-
сано выше. Если имеются окрашенные пятна, то методика упрощается,
поскольку вместо сегментов можно элюировать отдельные пятна. Неокра-
шенные вещества прежде всего следует сделать видимыми. Если этот про-
цесс выявления вещества связан с химическими реакциями, которые при-
водят к колориметрируемому окрашенному веществу, то необходимы уже
особые предосторожности, чтобы гарантировать стехиометрические или по
крайней мере пропорциональные превращения *. Все зто является чрез-
вычайно утомительным и нё идет ни в какое сравнение с изяществом качест-
венного анализа методами хроматографии в тонких слоях и хроматогра-
фии на бумаге. Часто поэтому предпочитают измерять пятна «in situ», т. е.
по возможности связывают их величину и интенсивность с количеством
вещества.
Нам хотелось бы предпослать применяемым здесь методам краткое тео-
ретическое рассмотрение этого вопроса. При этом предположим — что само
собой разумеется только для окрашенных веществ — пропорциональность
* См., например, [79].
4V -jJ»
Гл. 8. Теоретические основы хроматографии в тонких слоях 125
между интенсивностью окраски и количеством вещества. В идеальном слу-
чае пятна веществ на бумажных и тонкослойных хроматограммах имеют
эллиптическую форму (80]. Распределение вещества меняется не только
(как в случае элюатов колоночной хроматографии) в направлении потока,
но и перпендикулярно ему. Это основано на возможности протекания попе-
речной диффузии, отсутствующей в «закрытых» колонках.
При этом целесообразно исходить из идеализированного представления
о распределении плотности окраски внутри пятна и рассчитать, каких
результатов можно ожидать при определении концентрации по интенсив-
ности окраски и при определении по площади пятна. Отклонения реально
наблюдаемого по сравнению с идеализированными предположениями можно
иногда легко обнаружить и затем учесть при оценке надежности метода
измерения.
Предположим, что для случая тонкослойных и бумажных хроматограмм
при условии точечного нанесения пробы и эллиптической формы пятна [80]:
1) оптически измеряемое поглощение пропорционально плотности веще-
ства в пятне;
2) распределение плотности веществу Y вдоль осей эллипса хну являет-
ся гауссовским:
«а i/2
Y = 2t?« и W = ke2av ;
3) время t в параметрах
ож = У 2Z)^,
Dx — «коэффициент диффузии» в направлении х\
oy = y2Dyt ,
Dy — «коэффициент диффузии» в направлении у для сравниваемых пятен
одинаково. '
Денситометрия. Денситометры имеют измерительную щель или измерит
тельную точку. Важно, чтобы измеряемая плотность окраски в области
этого отверстия была не слишком неравномерной. Для денситометрии пятен
веществ на хроматограммах имеется точечный измерительный элемент
(например, очень маленький кружок). Если вести эту точку вдоль одной из
осей эллипса пятна, то расчет показывает, что при строгом выполнении
требований 1—3 площадь получающейся кривой поглощения пропорцио-
нальна количеству вещества.
Если необходимо сравнивать пятна с различными временами разделения,
то требование 3 (см. выше) уже больше не выполняется. В случае эллипти-
ческих пятен можно ожидать пропорциональности между количеством
вещества и выражением ; Fx и Fv -- площади под кривыми
£макс
поглощения, полученными при промере пятен вдоль осей эллипса, а Емакс —
поглощение в общей вершине кривых (средняя точка зллипса).
В некоторых встречающихся на практике случаях пятна имеют не эллип-
тическую форму. Несмотря на это, указанная пропорциональность может
существовать, если соответствующим образом выбрать линии промера.
В случае часто встречающихся серпообразных пятен целесообразно выбрать
ось симметрии. Совершенно неравномерные пятна лучше, пожалуй, изме-
рить, используя измерительную щель, длина которой должна примерно
соответствовать диаметру пятна; требуется тщательная калибровка. Ее сле-
дует провести во всем исследуемом интервале концентраций.
Измерение площади пятна. Визуально определяемый непосредственно
или после фотографической репродукции край пятна соответствует, очевидно,
126
Общая часть
переходу от уже более не определяемой к еще заметной небольшой, всюду
одинаковой плотности окраски. Площадь определенного таким образом
«эллипса» пропорциональна при условии выполнения требований 1—3 (см.
выше) логарифму количества вещества [80]; коэффициент пропорционально-
сти представляет собой константу для данного вещества и данной хромато-
графической системы * при постоянных времени и температуре. С точки
зрения измерительной техники проще всего и практически наиболее целесо-
образно [80] использовать в качестве меры площади эллипса произведение
осей. В случае неравномерных пятен подобные измерения представляют
собой большой произвол. В таких случаях особенно важно применять кали-
бровку и учитывать ошибки измерения.
Опыт показал, что в широкой области логарифм количества вещества
пропорционален корню квадратному из площади пятна [83]. Практически
площадь пятна увеличивается с ростом количества вещества быстрее, чем
требует теория. Это отклонение объясняется, без сомнения, запаздыванием
установления концентрационного равновесия между подвижной и неподвиж-
ной фазами: чем больше количество вещества, тем, очевидно, длительнее это
запаздывание (пока все количество вещества в точке старта не придет
в движение). Измерение площади пятен по сравнению с денситометрией имеет,
пожалуй, то преимущество, что при окрашивании хроматограммы можно
обойтись воспроизводимостью окраски только на границе пятна, где избыток
реактива наибольший.
Следует подчеркнуть, что изложение в данном разделе ограничено поло-
жениями, справедливость которых связана с неоднократно упоминаемыми
предположениями. На практике в каждом случае необходима критическая
проверка. Упоминавшаяся статья Гиддингса [80] содержит литературный
обзор опытных данных по измерению площади пятен на бумажных хромато-
граммах. Результаты из области хроматографии в тонких слоях описаны
в гл. 6, стр. 52 (см. также [83]).
2. РАЗЛИЧИЕ МЕЖДУ ХРОМАТОГРАФИЕЙ В ТОНКИХ СЛОЯХ
И ХРОМАТОГРАФИЕЙ НА БУМАГЕ
Практические преимущества хроматографии в тонких слоях силикагеля
известны. Они обусловлены главным образом — это касается хроматографи-
ческого процесса разделения — меньшим расширением пятен веществ (см.
рис. 39, 159, 160). В результате этого:
а) уменьшается минимально определяемое количество хроматографиру-
емых веществ;
б) становится возможным осуществить разделение на меньшем рас-
стоянии;
в) как следствие б), время, необходимое для хроматографического анализа,
значительно сокращается.
Можно было бы искать причину более слабой тенденции к расширению
пятен в принципиальном различии между силикагелем и целлюлозой. Спе-
циально полученный порошок целлюлозы ** дает, однако, тонкие слои,
* См. примечание на стр. 103.
** В качестве сырья используют целлюлозу с высоким содержанием сс-формы. Этот
порошок, не обработанный кислотой, с остатком после прокаливания, равным при-
мерно 1000 ч. на миллион, содержит около 90% частиц размером менее 20 ц. Только при
такой тонине получаются гладкие и безукоризненные разделительные слои. Особое зна-
чение для разделительной способности имеет величина удельной поверхности. В данном
случае она превышает величину 15 000 см2/г (по Блейну). Обычный целлюлозный поро-
шок обладает значительно меньшей удельной поверхностью и, следовательно, дает слои
с худшей разделительной способностью (частное сообщение фирмы «Macherey, Nagel
& Со», Дюрен).
Гл. 8. Теоретические основы хроматографии в тонких слоях 127
свойства которых ближе к свойствам тонких слоев силикагеля, чем к свой-
ствам фильтровальной бумаги. Это заставляет предположить, что отличие
силикагеля от бумаги носит скорее количественный, чем качественный
характер. Согласно нащим представлениям, Особенности фильтровальной
бумаги в первую очередь следует объяснять их волокнистой структурой.
Хорошо известно, что вдоль поверхности раздела возможно быстрое пере-
мещение вещества. Действующей силой является изменение поверхностного
натяжения. В противоположность порошкам волокна обладают продоль-
ными сплошными поверхностями, вдоль которых может происходить распро-
странение пятна. Под действием диффузии преодолевается лишь простран-
ство между волокнами. В случае порошков диффузия является единственным
возможным механизмом расширения пятна. В случае порошкообразных
веществ, обладающих большой удельной поверхностью, рассматриваемое
явление может осложняться повышенной поглотительной способностью.
Предположение, согласно которому различие состоит в том, что хромато-
графия в тонких слоях основана на адсорбции, а хроматография на бума-
ге — скорее на распределении между жидкими фазами, кажется нам мало-
вероятным. Согласно нашим опытам, преимущества хроматографии в тонких
слоях сохраняются при переходе от растворителей, способствующих адсорб-
ции, к растворителям, для которых можно предположить распределительный
механизм.
3. СВЯЗЬ С КОЛОНОЧНОЙ ХРОМАТОГРАФИЕЙ
Известно, что по поведению вещества при хроматографии на бумаге можно
составить примерную картину его поведения на целлюлозных колонках *.
Первым, легко выполнимым условием является выбор сравнимых отношений
количества вещества и количества бумаги или целлюлозного порошка.
Вторым, труднее реализуемым условием надежного сравнения является
одинаковая скорость движения и одинаковое распределение подвижной
фазы вдоль разделительного слоя **. Это условие наверняка не выцолняется,
если, как обычно, применять колонку, предварительно пропитанную раство-
рителем [79]. В принципе то же самое относится к попыткам в целях увеличе-
ния пропускной способности по веществу перейти от тонких слоев к колон-
кам с силикагелем. В последнее время разработан, однако, вариант колоноч-
ной хроматографии [81], позволяющий считать более или менее выполненным
также и второе из упомянутых условий. Это! вариант характеризуется тем,
что растворитель, как и в случае горизонтальных тонких слоев [64], прони-
кает в силикагель исключительно под действием капиллярных сил после
полного смачивания, как и в случае проточной методики [64] с закрытыми
пластинками. Затем он перемещается дальше вследствие испарения в конце
колонки. Как показывает практика, во многих случаях, согласно Дану
и Фуксу [81], величины Rf для закрытых нластинок сравнимы с величинами
для колонки. Поэтому зависимости на колонке должны быть особенно близки
к зависимостям на закрытых пластинках, поскольку и в том и в другом'
случае понятие насыщение камеры не имеет смысла.
ДОПОЛНЕНИЕ. ВЫТЕСНЕНИЕ И ИОННЫЙ ОБМЕН НА ХРОМАТОГРАММАХ
‘В ТОНКИХ СЛОЯХ
Вещества с близкими значениями RT, поглощение которых основано на
одинаковом механизме, оказывают влияние друг на друга при распределе-
нии между подвижной и неподвижной фазами. При этом наблюдаются явле-
* См., например, [79].
** См. соображения на стр. 107 по поводу распространения растворителя и формы
профиля растворителя при хроматографии в тонких слоях и хроматографии на бумаге.
128•Общая часть1. <'
ния вытеснения, которые особенно отчетливо выступают при хроматографи-
ровании вещества А в постепенно возрастающем количестве с добавкой
одного и того же количества сопутствующего вещества В (2?д а < Rft в).
При этом пятно А увеличивается и вытесняет собой пятно В, причем измеря-
емое значение Rf (Rf Набл) сопутствующего вещества постоянно увели-
чивается. - , ’ -
Силикагель в ограниченной степени обладает свойствами ионообменника,
что будет рассмотрено подробнее в главе, посвященной неорганической
хроматографии в тонких слоях. При хроматографическом разделений соле-
образных органических соединений ионообменные свойства проявляются
прежде всего в том, что соли часто расщепляются на кислоты и основания,
которые затем перемещаются независимо друг от друга. Разбавление раство-
рителем, естественно, способствует этой диссоциации. Поэтому для гидро-
хлоридов наблюдают значения Rf, равные значениям Rf для свободных
оснований. То же самое справедливо для щелочных солей карбоновых кислот;
Например, цезиевая соль 2, 4-динитрофенилглццина в кислых, нейтральных
или основных растворителях дает точно такое же пятно, как и свободный
2,4-динитрофенилгдицин, плюс пятно цезия на точке старта (обнаружено
методом радиоавтографии Cs134) [70].
Соли поливалентных кислот или оснований дают вследствие возможности
частичного расщепления несколько пятен; это последнее явление (сложные
пятна) в прицципе наблюдается в том случае, когда вещество встречается
в нескольких формах (различная степень ионизации, образование комплек-
са, таутомерия). Этот вопрос подробно рассмотрен Йегером, Рамелем и Шинд-
лером [82], а также ^Келлером и Гиддийгсом [13].
ОБОЗНАЧЕНИЯ
А — расстояние старт— а-фронт;
АОбр — обратимая работа;
—коэффициент пропорциональности между ло-
кальной скоростью растворителя и скоростью
фронта;
а, b — коэффициенты;
В — расстояние старт — р-фронт;
Ъ—ширина полос;
С — расстояние старт — центр пятна;
с — концентрация;
с — используемый Гиддингсом параметр распре-
деления;
см — концентрация в мол. %;
су(г) — концентрация в камере № г после прохож-
дения постоянного оъема V — vm — ;
с0 — исходная концентрация в пробирке (тарелке,
камере) № 1;
сг — концентрация в пробирке (тарелке, каме-
ре) № г;
с (V) — концентрация раствора, вытекающего из .уотка
Сигнера, после прохождения объема V,
сп (V)—c(V) при числе камер п;
с’т — произвольная концентрация в подвижной фазе:
Гл. 8. Теоретические основы хроматографии в тонких слоях 129
с'в — произвольная концентрация в неподвижной
фазе;
Dx—коэффициент диффузии в направлении х;
Dv — коэффициент диффузии в направлении у,
d—путь, пройденный максимумом полосы;
ЕмаКс— поглощение окрашенного пятна в максимуме;
F— площадь под кривой c(F) (Гаусс);
Fx 1
„ f — площади под кривой поглощения;
f (д) — степень перекрывания;
G, Go, Gp — константы соотношения Мартина;
Н — высота теоретической тарелки = ВЭТТ (высота,
эквивалентная теоретической тарелке);
h—высота вершины кривой c(F) (Гаусс);
К — коэффициент распределения или адсорбции,
не зависящий от концентрации (последний
можно рассматривать как не зависящий от
концентрации только в случае очень малых
концентраций);
К' — К при известном точном механизме распре-
деления (хроматографическая колонка);
Ар, А?, Аш—коэффициенты замедления;
L — длина хроматографической колонки;
М — среднее (ожидаемое) распределение Пуассона;
Мо — навеска вещества;
Мг Макс — количество вещества на участке колонки
с наибольшей плотностью вещества;
Му (г) — количество вещества в камере № г (лоток
Сигнера) после прохождения объема F;
п — число камер;
п' — эффективное число камер;
р—доля общего количества вещества, находя-
щаяся в подвижной фазе камеры (теорети-
ческой тарелки, отрезка колонки);
р' — р в случае неизвестного точно механизма
распределения (хроматографическая колонка);
q — доля общего количества вещества, находя-
щаяся в неподвижной фазе камеры (теоре-
тической тарелки, отрезка колонки);
R— газовая постоянная;
Ra—величина Rm при ассоциации;
Rf — определение см. стр. 13;
R/ набл — условно измеренная величина Rf
/Путь, пройденный веществом \ .
< Путь, пройденный фронтом ) ’
Rf набл — среднее значение из отдельных величин Rf набл;
Rf внутр — «внутреннее» значение Rf,
Rf внутр., конечн. знач — конечное значение переменной величины
Rf внутр!
Rf ист — Rf внутр, конечн. знач!
9 Заказ Кг 734
130 Общая часть
“Я/набл, набл ••• “Я/набл — условно измеренная величина Rf, отнесен-
ная к а-, 0- и ©-фронтам;
“Я у набл, ₽Я/ набл • • • ш Rf набл — среднее значение из отдельных величин “77/наб л,
^7?/набл, • • •, Rf набл!
aRf макс — верхняя граница “7?/ набл при исчезающем s0;
fiRtист, yRfист ••• wRfист — истинные значения Rf, отнесенные к 0-, у-
й ©-фронтам;
Rm^= 1g 1 ;
Rm набл Rm ПЭ Rf набл!
Rm — среднее значение из отдельных значений 7?т;
R'm— Ятп + lgl;
aRm, ^Rm ... aRm—рассчитанное из aRf, $Rf... “7?/значение 7?m;
г — номер камеры (тарелки, сегмента);
гмакс —г с максимальной плотностью вещества;
So — замещаемое вещество;
з— путь, пройденный веществом;
з0 — расстояние линия погружения — старт;
sRf набл — стандартное отклонение от7?/Набл;
sRm — стандартное отклонение от 7?т;
Т — абсолютная температура в °К;
t — время;
и — скорость протекания;
uz — скорость пятна в точке z;
V — объем, протекший с начала опыта;
Ув—ширина полосы в единицах объема;
Ул —удерживаемый объем (хроматографическая
колонка);
VT—объем при фракционировании (описывается
с (Г) по Гауссу);'
Vt, нспр—исправленное значение VT;
Гмакс —объем, протекший (лоток Сигнера) до макси-
мума концентрации, идентичный удерживае-
мому объему;
vp — объем растворителя внутри хроматографиче-
ской колонки;
Vf — скорость фронта растворителя;
vm — общий объем подвижной фазы в лотке Сиг-
нера;
vs — общий объем неподвижной фазы в лотке
Сигнера; -
vz— скорость растворителя в точке z;
wi/2 — ширина кривой Гаусса на половине высоты
вершины;
Гл. 8, Теоретические основы хроматографии в тонких слоях ' 131
Z —параметр разделения;
z — расстояние от линии старта растворителя до
наблюдаемой точки вдоль пути растворителя;
Zf — путь, пройденный фронтом растворителя;
azf, %, ... az}, — путь, пройденный а-, 0- и ©-фронтом;
а-, Р"» У* • • • ©-фронт—обозначение фронтов при разделении раство-
рителя;
Д— половина видимой ширины полосы;
Д/1— обратимая работа (энергия перехода) при
стандартных условиях;
Д/’о — Д/1 для замещаемого вещества So;
ДУХ, Д/’у — изменение энергии перехода вследствие вве-
дения заместителей (X, Y .. .) в Se;
Д/’р. — изменение свободной энергии перехода Д/*в
вследствие введения заместителя р, в заме-
щаемое вещество So;
ДС — свободная энтальпия при переходе вещества
из жидкой в газовую фазу;
Д2?т— изменение Rm при изменении хроматографи-
ческой системы; 4
Дрт, ДУ — объемная поправка;
,6—ошибка в определении R™, обусловленная
применением Я/набл!
С, х — коэффициенты;
| — поправочный коэффициент для
— g при разделении растворителя;
р — отношение фаз;
q' — изменяющееся отношение фаз;
2 == ^вещество А 4“ ^вещество В>
о — среднее отклонение от нормальной функции
распределения (стандартное отклонение);
т— независимая переменная в нормальной функ-
ции распределения;
Ф (и) — интеграл ошибок;
Y — плотность вещества;
ю — скорость перемешивания;
ю—скорость движения.
ЛИТЕРАТУРА
1. М а г t i n A. J. Р., Endeavour, 6, 21 (1947).
2. Giddings J. C., J. Chromatog., 2, 48 (1959).
3. Martin A. J. P., Synge R. L. M., Biochem. J., 35, 1358 (1941).
4. Weissberger A., Technique of organic chemistry, Vol. 3, p. 529—311, Inter-
science Publishers Inc., 1950.
5. W i 1 s о n J. N., J. Am. Chem. Soc., 62, 1583 (1940).
6. W a u 1 t D. d e, J. Am. Chem. Soc., 65, 532 (1943).
7. Gliickauf E., Disc. Faraday Soc., 7, 12 (1949).
8. S m i t W. M., Disc. Faraday Soc., 7, 38 (1949).
9. Gliickauf Ё., Trans. Faraday Soc., 51, 34 (1955).
10. Gliickauf E., Trans. Faraday Soc., 51, 1540 (1955).
•9*
132
Общая часть
11. Deem ter J. J. van, Zuiderweg F. J., Klinkenherg A., Chem.
Eng. Sci., 5, 271 (1956).
12. G i d d i n g s J. C., J. Chromatog., 2, 44 (1959).
13. Keller R. A., Giddings J. C., J. Chromatog., 3, 205 (1960).
14. R u о f f A. L., Giddings J. C., J. Chromatog., 3, 438 (1960).
15. Bogue D. C., Anal. Chem., 32, 1777, (1960).
16. H a m i 11 о n P. B., Bogue D. C., Anderson R. A., Anal. Chem., 32, 1782
(1960).
17. G i d d i n g s J. C., J. Chromatog., 5, 46 (1961).
18. Signer R., Allemann K., Kohli E., Lehmann W., Meyer H.,
Ritschard W., Dechema-Monograph., 27, 32—44 (1956).
19. Handbook of Chemistry and Physics, 38. AufL Cleveland, Ohio, Chemical Rubber
Publishing Co., 1956—1957.
20. Biochemisches Taschenbuch, Berlin — Gottingen — Heidelberg, Springer, 1956.
21. Hadwiger H., Experientia, 9, 391 (1953).
22. Meyer H., Diss., Universitat Bern, 1956.
Кейлеманс А., Хроматография газов, Издатинлит, 1959.
Hecker E., Verteilungsverfahren im Laboratorium, S. 87. Weinheim, Verlag Che-
mie, 1955.
Spackman D. H., Stein W. H., Moore S., Anal. Chem., 30, 1190 (1958).
Stepanov V., Handschuh D., AndererF. A., Z. Naturforsch., 166,
626 (1961).
В e n n i c h
Wieland
Claesson
H a g d a h 1
H a g d a h 1
Alm R. S.,
25.
26.
27.
28.
29.
30.
31.
32.
H., Biochim. et Biophys. Acta, 51, 265 (1961).
" , Merz H., Chem. Ber., 85, 731 (1952).
Arkiv Kemi Mineral. Geol., A24, 16 (1947).
Acta Chem. Scand., 2, 574 (1948).
Th.
S.,
L.,
L., Sci. Tools, 1, 21 (1954).
Williams R. J. P., Tiselius A., Acta Chem. Scand., 6, 826
(1952).
33. К a u m a n W. G., В a k A., Nature, 182, 743 (1958).
34. Khan M. A., Nature, 186, 800 (1960).
35. Kieselbach R., Anal. Chem., 32, 880 (1960).
36. G i d d i n g s J. C., J. Chromatog., 5, 61 (1961).
37. Pohloudek-Fabini R., Wollmann, Pharmazie, 15, 590 (1960).
38. Moore S., Stein W. H., Ann. N>Y. Acad. Sci., 49, 265 (1948).
39. M a r t i n A. J. P., Biochem. Soc. Symposia (Cambridge, Engl.), 3, 4 (1950).
40. M a r t i n A. J. P., Ann. Rev. Biochem., 19, 518—520 (1950).
41. Kovats E., Helv. Chim. Acta, 41, 1915, 1928 (1958).
42. S h r i n e r R. L., F u s о n R. С., C u r t i n D. Y., The Systematic identification
of organic compounds, 4ed., New York, John Wiley and Sons Inc., 1956, Chap. 6.
43. F r a n c J., J о k 1 J., J. Chromatog., 2, 423 (1959) и более ранние работы.
44/Kovats Е., Helv. Chim. Acta, 42, 2709 (1959).
45. Bate-Smith E.C., WestallR. G., Biochim. et Biophys. Acta, 4, 427 (1950).
46. Pardee A. B., J. Biol. Chem., 190, 757 (1951).
47. Gaspari c J., Vecera M., Collection Czechosl. Chem. Commun., 24, 1822 (1959).
48. Roux D. G., Evelyn S. R., J. Chromatog., 1, 537 (1958).
49. Grebenovsky E., Z. anal. Chem., 185, 290 (1962).
50. J a m e s A. T., Martin A. J. P., Biochem. J., 50, 679 (1959).
51. Ray N. H., J. Appl. Chem., 4, 21 (1954).
52. James A. T., Biochem. J., 52, 242 (1952).
53. Kovats E., Z. anal. Chem., 181, 351 (1961).
54. French D., Wild G. M., J. Am. Chem. Soc., 75, 2612 (1953).
55. R e i c h 1 E. R., Monatsh. Chem., 86, 69 (1955).
56. P a t a k i G., Diss., Universitat Basel, 1962.
57. Moore T. B., Baker C. G., J. Chromatog., 1, 512 (1958).
58. Schauer H. K., Bulirsch R., Z. Naturforsch., 10b, 683 (1955).
59. S c h a u e r H. K., Bulirsch R., Naturwiss, 43, 34 (1956).
60. S c h a u e r H. K., Bulirsch R., Z. Naturforsch., 13b, 327 (1958).
61. Macek K., Experientia, 17, 162 (1961).
62. Brenner M., Pataki G., Helv. Chim. Acta, 44, 1420 (1961).
63. Brenner M., Pataki G., Helv. Chim. Acta, в печати.
64. Brenner M., Niederwieser A., Experientia, 17, 237 (1961).
65. Muller R. H., Clegg D. L., Anal. Chem., 23, 296 (1951).
66. Kowkabaly G. M., Cassidy H. G., Anal. Chem., 22, 817 (1950).
67. W о о d S. E., S t r a i n H. H., Anal. Chem., 26, 260 (1954).
68. G i d d i n g s J. C., S t e w a r t G. H., Ruoff A. L., J. Chromatog., 3, 239
69. I'ranc J., J о k 1 J., Collection Czechoslov. Chem. Commun., 21, 1161 (1956).
70. Niederwieser A., Diss., Universitat Basel, 1962.
Гл. 8. Теоретические основы хроматографии в тонких слоях 133
71. Brenner М., Niederwieser A., PatakiG., Fahmy, A. R., Ехре-
rientia, 18, 101 (1962).
72. Brenner M., Niederwieser A., Experience, 16, 378 (1960).
73. Boman H. G., Nature, 170, 703 (1952).
74. Bungenberg de Jong H.'G., Hoogeveen J. Th., Proc. Acad. Sci.
(Amsterdam), Series В 64, 1, 18, 167, 183 (1961); 63, 228, 243, 383 (1960).
75. Tiselius A., Arkiv Kemi, Mineral. Geol., 14 B, Nr. 22 (1940).
76. С 1 a e s s о n S., Arkiv Kemi, Mineral. Geol., 23 A, Nr. 1 (1946).
77. С 1 a e s s о n S., Arkiv Kemi, Mineral. Geol., 24 A, Nr. 7 (1947).
78. Griffiths J., James D., Phillips C., Analyst, 77, 897 (1952).
79. Brenner M., Vetterli A., Helv. Chim. Acta, 40, 943—949 (1957).
80. Calvin J., Giddings J. C., Keller Roy A., J. Chromatog., 2, 626 (1959).
81. Dahn H., Fuchs H., Helv. Chim. Acta, 45, 261 (1962).
82. J a g e r H., R a m e 1 A., Schindler O., Helv. Chim. Acta, 40, 1310 (1957).
83. Purdy S. J., Truter E. V., Chem. and Ind., 1962, 506.
СПЕЦИАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА 9
ВВЕДЕНИЕ
Э.' Шталъ
При работе со смесями веществ весьма важно применение соответствую-
щих методов разделения и обнаружения. Простейший и чаще всего используе-
мый метод разделения основан на различии растворимости веществ в жид-
костях. Так, например, неизвестная многокомпонентная смесь веществ может
быть легко разделена на липофильную и гидрофильную части. Используя
другие методы разделения, делят смесь на группы веществ, т. е. на смеси
[ Разделяемая смесь
Рис. 69. Схема зависимости трех основных параметров хроматографического процесса,
рассмотренная на примере адсорбционной хроматографии -£124].
Объяснения см. в тексте.
с довольно близким составом. В настоящее время, прежде чем перейти
к длительным и требующим затрат методам, часто для дальнейшего разделе-
ния используют хроматографию.
В качестве быстрого метода, сначала для ориентации и затем уже для
точного анализа, все чаще используют хроматографию в тонких слоях
(ХТС). Благодаря возможности изменения как разделительных слоев, так
и растворителей в этом случае удается исключительно быстро решать многие
задачи разделения. Следует, однако, отчетливо представлять себе, что и этот
метод никоим образом не является универсальным. При наличии сложных
смесей в идеальном случае — исходя из пространственных соображений —
на одной хроматограмме можно обнаружить максимум 20 пятен веществ.
Поэтому в случае сложных смесей целесообразно проводить предварительное
^фракционирование.
Казалось целесообразным последующие специальные разделы располо-
жить в соответствии с Липофильным и гидрофильным характером групп
138 Специальная часть ,
веществ, т. е. начать с липидов и-закончить данную книгу рассмотрением
гидрофильных соединений *.
Внутри групп веществ в большинстве случаев рассматриваются вначале
менее полярные соединения, а затем более полярные. Этот принцип располо-
жения непосредственно вытекает из метода. Вспомним здесь наглядно пред-
ставленную на рис. 69 зависимость между тремя основными параметрами
хроматографического процесса. Это схематическое изображение базируется
в первую очередь на опытных данных адсорбционной хроматографии, кото-
рые могут быть сформулированы следующим образом.
1. РАЗДЕЛЯЕМАЯ СМЕСЬ
а) Насыщенные углеводороды либо совсем не адсорбируются, либо
адсорбируются в очень малой степени и поэтому движутся в слое наиболее
быстро. Ненасыщенные углеводороды адсорбируются тем сильнее, чем
больше в них содержится двойных связей и чем больше имеется при этом
сопряженных связей.
В этом случае для разделения следует использовать наиболее активный
адсорбент и малополярный растворитель. Другой возможностью является
«обращение фаз», при этом неподвижная фаза пропитывается липидом
и в качестве подвижной фазы используется гидрофильный растворитель.
б) Если вводят в углеводород функциональные группы, то адсорбцион-
ное сродство повышается в следующем порядке:
—СН3, —О—алкил, >С=О, —NH2, —ОН, —СООН
На слоях силикагеля или окиси алюминия при применении в качестве
растворителя, например, бензола простые или сложные эфиры располагаются
в верхней части хроматограммы, кетоны и альдегиды примерно в середине,
спирты ниже, а кислоты остаются в точке старта. Таким образом, последо-
вательность разделения соответствует полярности соединений. Органические
кислоты и сильные основания можно хроматографировать либо в виде их
. менее полярных производных, либо применяя кислые или основные раство-
рители.
2. РАСТВОРИТЕЛЬ
Растворители можно расположить по их «элюирующему» действию в так
называемые элюотропные ряды [128]. И здесь, очевидно, имеется непосред-
ственная зависимость между полярностью и элюирующим действием. В каче-
стве отправной точки для оценки полярности можно использовать величину
диэлектрической проницаемости и поэтому она также приведена в табл. 9.
3. СОРБЕНТ
В принципе и сорбенты можно расположить в ряд, причем различают
сорбенты с высокой адсорбционной активностью и сорбенты с незначительной
активностью. Подробности приведены в разделе «сорбенты» (стр. 37).
Для начинающего существующие здесь зависимости легко понять из
изображенной схемы, которая может оказаться полезной в той или другой
форме**: при этом надо себе представить, что заштрихованный треугольник
* Ряд глав, в том числе глава, посвященная витаминам, нарушает этот основной
принцип.
** Эту схему можно перенести и на другие хроматографические методы. Если у индек-
са «неподвижная фаза» заменить «активность» при переходе I на «липофильная», или
«неполярная», а при переходе V на «гидрофильная», или «полярная», и у индекса «по-
движная фаза» заменить «полярная», пли «гидрофильная», на «неполярная», или «липо-
фильная», и т. д., тогда схема пригодна для случая «обращения фаз».
Гл. 9. Введение
139
Таблица 9
Элюотропный ряд
7 Растворитель а Температура кипении (при 760 мм pm. ст.) •С Диэлектри- ческая проница- емость е (20°)
н-Гексая 68,7 1,890
Гептан 98,4 1,924
Циклогексан 81,4 2,023 —
Четыреххлористый углерод . . . 76,8 2,238
Бензол 80,1 2,284
Хлороформ 61,3 4,806~
Диэтиловый эфир 34,6 4,34 .
Этилацетат . . . 77,1 6,026
Пиридин 115,3 12,3 6
Ацетон 56,5 20,7 6
Этанол 78,5 24,306
Метанол .... 64,6 33,62
Вода 100 80,37
а О других растворителях см. Biochem. Taschenbuch, Springer-Ver-
lag, Berlin — GSttingen — Heidelberg, 1956; Handbook of Chemistry and
Physics, Chemical Rubber Publishing Co., Cleveland, Ohio, 1959.
6 При 25°.
может вращаться. Если, например, имеют дело со смесью липидов, то уста-
навливают вершину треугольника на область «разделяемая смесь», «липо-
фильная»; две другие вершины указывают тогда, что при этом необходим
неполярный растворитель и активный адсорбент. При установке вершины на
область смеси полярных веществ две другие вершины треугольника указы-
вают, что следует применять гидрофильный растворитель в сочетании со
слабоактивным адсорбентом.
При современном состоянии знаний невозможно указать оптимальные
условия разделения многочисленных смесей веществ, тем более что метод
еще находится в развитии и непрерывно публикуются- новые эксперимен-
тальные данные. Расположенный ниже опытный материал не позволяет, одна-
ко, получить отправные данные для решения конкретных задач разделения.
Поскольку хроматография в тонких слоях, так же как и хроматография
на бумаге, используется в качестве метода идентификации отдельных соеди-
нений, для характеристики веществ приводятся величины Rf, иногда умно-
женные на 100 (hRf). Следует особенно подчеркнуть, что эти данные являются
лишь ориентировочными. Для упрощения в случае комбинированных раство-
рителей —' если -это специально не оговорено — всегда приводятся четные
объемы, причем сумма в большинстве случаев составляет 100 мл (запол-
нение нормальной разделительной камеры).
ГЛАВА 10
АЛИФАТИЧЕСКИЕ ЛИПИДЫ
X. Мангольд
I. ВВЕДЕНИЕ
1. НЕЙТРАЛЬНЫЕ ЛИПИДЫ И ПРОДУКТЫ ИХ ГИДРОЛИЗА
Углеводороды с длинной цепью, спирты, альдегиды и кислоты широко
распространены в растительном и животном царстве.
Н3С—(СН2)Я—СН3
Углеводород
Н1
Н3С-(СН2)Ж,,-С< '
ХО
Альдегид
Н3С—(СН2)Я—СН3ОН
Спирт
/О
Н3С-(СН2)Я,„-С<
хон
Кислота
х, х' • • • >8
В каждом из этих 4 классов липидов содержатся насыщенные и одно- и мно-
гократно ненасыщенные вещества с прямой и разветвленной цепью. Извест-
ны также бифункциональные соединения, например эпокси- и оксикислоты.
Спирты, альдегиды и кислоты встречаются в природе в основном в свя-
занном виде. Спирты образуют с кислотами воски (сложные эфиры):
Н
Н3С-(СН2)Я-С-О-С-(СН2)Я,-СН3.
Н II
о
Сложный эфир
Особенно широко распространены соединения алифатических спиртов,
альдегидов и кислот с глицерином. Спирт и глицерин образуют эфир. Аль-
дегиды образуют с глицерином полуацетали или виниловые эфиры, а кис-
лоты -г моноглицериды, диглицериды и триглицериды:
н н
Н2С—О—С—С—(СН2)Я—сн3
| н н
нс—он
н2с—он
Простой эфир глицерина
Н2С—О—С = СН(СН2)„,—сн3
| н
НС—он
I
Н2С—он
Простой виниловый эфир"
Н2С“—О—с—(СН2)Я—сн3
I II
L 0
нс₽ — он
Н2С“'—он
а-Моноглицерид
Н2С—О— С—(СН2)Я—сн3
I 11
°
НС—О— С—(СН2)Я,—сн3
Н2С—О—С—(СН2)Ж—сн3
I 4
НС—О—С—(СН2)Ж,—сн3
I о
Н2С—он
а,3-Диглицерйд
Н2С—О — С—(СНг)*,,—СН3
О
Триглицерид
Гл. 10. Алифатические липиды
141
Простые эфиры глицерина, виниловые эфиры и моноглицериды могут нахо-
диться в а- и p-форме. Диглицериды могут быть построены симметрично
(а, а') или асимметрично (а, р).
Простые и виниловые эфиры глицерина в природе встречаются в этери-
фицированном виде, как алкоксидиглицериды и «альдегидогенные триглице-
риды» (нейтральные плазмалогены). Триглицериды кислот с длинными цепя-
ми являются основной составной частью жиров и масел — они являются
«жирами» в узком смысле этого слова.
2. ФОСФОЛИПИДЫ, СУЛЬФОЛИПИДЫ И ГЛИКОЛИПИДЫ
В фосфолипидах одна из гидроксильных групп глицерина этерифициро-
вана фосфорилхолином, фосфорилэтаноламином или фосфорилсерином. Эта-
ноламинфосфолипиды существуют в следующих трех формах:
Н Н
Н2С—О—С—С—(СН2)Ж—сн3
| н н
НС—О —С—(СН2)Ж—сн3
Н2С—О—С = С—(СНгК— СНд
| н н
НС—О—С—(СНг) СН3
II
О
Н2С—РА
Алкоксимоноглицеридфосфатид
Н2С—РА
Виниловый эфир моноглицеридфосфатида
Н2С—О—С—(СН2)Ж—СН3
I О.
НС—О—С—(СН2)Ж. — сн3
I II
0
Н2С—РА
Диглицеридфосфатид (коламин-кефалин)
РА — фосфорилэтаноламин:
О
t Н Н
— О— Р—О—С—С—NH2
| н н
0-
Следует принять; что и холинфосфолипиды, и серинфосфолипиды могут
находиться в форме алкоксимоноглицеридов, виниловых эфиров, моноглице-
ридов и диглицеридов.
Глицерилфосфорилхолин, глицерилфосфорилэтаноламин и глицерилфос-
форилсерин, которые этерифицированы только одним кислотным остатком
и благодаря этому содержат свободную гидроксильную группу, носят наз-
вание лизосоединений. В качестве примера приведем лизолецитин
Н2С —О —С—(СН2)Ж —СН3
НС —он
о
t НН СН3
Н2С—О —Р—О —С—С— N+Z-CH,
1)_ Н Н Хсн3
Лизолецитин
Фосфатидные кислоты образуют группу фосфолипидов, не содержащих
основания. Они встречаются в природе, по-видимому, в виде продуктов
142
Специальная часть
гидролиза холин-, этаноламин- и серинфосфатидов:
Н2С—О — С—(СН2)Ж—СН3
&
НС - О — С — (СН2)Ж—сн
[I
0 /О'
Н2С--О—Рг>0
\ о-
3
а-Фосфатидная кислота
Фосфатидилглицерин, кардиолипин и фосфо инозит также не содержат осно-
ваний:
Н2С—О—С—(СН2)Ж—сн3 н2с—он
НС — О — С—(СН2)Ж- — СН3
II
О
о
t
Н2С—о--------Р-----о —
Н3С - (СН2)Ж - С—О — сн2 о—
11 Фосфатидилглицерин
НС—ОН
сн2
Н2С—О — С—(СН2)Я>— снэ
о
Н3С-(СН2)Ж- — С —о —CH НС—О—С—(СНг)х-----СН3
(У о 0 0
t Н Н Н t
Н2С—о —Р —о—С —С—С—о —Р —О—СН2
| Н | Н I
О- ОН О-
Кардиолипин
Н2С—О —С—(СН2)Я —СН3
НС-О-С-(СН2)Я- -СН3
II
О
о он ОН 0
t Z----X t
Н2С —О ------Р-----о-----/ 0Н--( —О —Р —OR)
. in <Lh
Фосфатидилинозит и дифосфоинозит
Сфингомиелины—другая группа фосфолипидов—построены из многоатом-
ного аминоспирта, например сфингозина, фосфорилхолина и жирной кислоты:
HN—С —(СН2)Х—СН3
Н
Н3С—(СН2)12 — С = С — С—С—СН2
Н Н | Н |
ОН О
о ч- Р—О-
Н Н /СН3
6—C-C--N+^CH3
Сфингомиелин Н Н
Гл. 10. Алифатические липиды
Ш
Гликолипиды, например Цереброзиды и ганглиозиды, содержат сфингозин
и сахар:
HN- С- (СН2)Х- СН3
'А
н
Н3С—(СН2)12-С=С—с—с-сн2
Н Н I Н I
он I
О —Глюкоза
Цереброзид
HN—С—(СН2)Ж —СН3
О
н
Н3С-(СН2)12— С=С—С—С — сн2
Н Н I н
он
Галактоза
I
Глюкоза — Нейр аминокислота
Гексозамин
Ганглиозид
Строение различных сульфолипидов еще не выяснено. Были предложены
следующие формулы:
HN—С—(СН2)Ж—СН3
О
Н
Н3С—(СН2)12—С=С—С—С—СН2
о о
I t
Глюкоза — S — 0“
4
О
Цереброзидсульфат
О <
t
Н2С—О — Галактоза—S—О-
I 4
НС—ОН О-----( —О—С —(СН2)Ж-— СН3)
Н2С- О - С- (СН2)Ж - СН3-
Растительный сульфолипид
3. СТАРЫЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА ЛИПИДОВ
Исключительно сложный состав природных смесей липидов делал безна-
дежной задачу количественного разделения групп этих соединений или
отдельных соединений в таких смесях химическими методами. Примерно
10 лет назад для химической характеристики смесей липидов приводились
суммарные дацные, как, например, кислотные числа, числа омыления,
иодные, родановые и диеновые числа. Определение количества «неомыляе-
мых» после щелочного гидролиза было стандартным методом при анализе
144 Специальная часть
жиров. Фосфолипиды и сульфолипиды количественно анализировались после
озоления в виде неорганических фосфатов и сульфатов. Эти методы допол-
нялись цветными реакциями для определения «веществ, сопутствующих
жирам», например липохромов, стеринов и смоляных кислот.
Физические методы для характеристики липидов включают определение
температур плавления и затвердевания, плотности, твердости, вязкости,
поверхностного натяжения, растворимости, температуры воспламенения. Эти
классические методы анализа жиров подробно описаны Хилдичем [33]
и Кауфманом [56].
В последние годы разработаны многочисленные методы фракциониро-
вания смесей липидов. Особенно пригодными оказались фракционная
кристаллизация при низких температурах и фракционирование с помощью
соединений включения мочевины, например для разделения насыщенных
и ненасыщенных жирных кислот и их эфиров. Для выделения метиловых
эфиров жирных кислот с одинаковой длиной цепи была использована ваку-
умная дистилляция, а молекулярную дистилляцию применяли для разде-
ления моно-, ди-и триглицеридов. Противоточное распределение между двумя
жидкими растворителями использовалось для фракционирования жирных
кислот в соответствии с длиной цепи или в соответствии со степенью нена-
сыщенности, а также для разделения моно-, ди- и триглицеридов и фосфоли-
пидов. Разделение нейтральных и кислых липидов осуществляли диализом
через каучуковые мембраны.
Применение этих методов разделения обычно требует количеств от 1 до
100 г липида. В большинстве случаев эти методы позволяют достигнуть лишь
обогащения компонентом или осуществить полуколичественное фракциони-
рование. Для определения эффективности фракционирования использовали
УФ- и ИК-спектроскопию.
4,'НОВЫЕ МЕТОДЫ РАЗДЕЛЕНИЯ ЛИПИДОВ
В настоящее время хроматографические методы в значительной степени
вытеснили все другие методы]фракционирования липидов в аналитическом
и микропрепаративном масштабе. Для разделения сложных смесей липидов
на отдельные классы соединений использовали адсорбционную и распре-
делительную хроматографию на колонках с силикагелем, на целлюлозных
фильтрах, импрегнированных силикагелем, и на бумаге из стекловолокна.
Распределительная хроматография с обращенными фазами использовалась
для разделения членов винилогомологического ряда на гидрофобизованной
колонке или на гидрофобизованной бумаге. Газовую хроматографию исполь-
зовали в виде распределительно-хроматографического варианта в первую
очередь для разделения метиловых эфиров жирных кислот. Разделение
смеси липидов по степени ненасыщенности можно осуществить путем хрома-
тографического разделения на силикагеле комплексных ртутноацетатных
соединений ненасыщенных липидов. Для выделения кислот и для фрак-
ционирования сильно полярных липидов была использована ионообменная
колоночная и ионообменная бумажная хроматография. Методом хромато-
графии на колонках с мочевиной или на бумаге, пропитанной мочевиной,
можно отделить жирные кислоты с прямой цепью от кислот с разветвленной
цепью. Эффект разделения основан на образовании соединений включе-
ния неразветвленных жирных кислот с мочевиной. Различные хромато-
графические методы разделения липидов описаны в многочисленных обзорах
[23, 86, 96, 100].
Каждый из этих принципов хроматографического разделения может быть
перенесен на хроматографию в тонких слоях. ХТС позволяет достигнуть зна-
чительно лучшего разделения за более короткое время, и поэтому этот метод
Гл. 10. Алифатические липиды
145
стал незаменимым в лабораториях, в которых исследуют липиды. Большие
преимущества хроматографии в тонких слоях могут быть использованы
полностью лишь в том случае, если этот метод комбинируется с другими
методами. В особенности рекомендуется последовательно применять к одной
и той же смеси адсорбционную ХТС и распределительную хроматографию,
а также ХТС с обращенными фазами, бумажную хроматографию и газовую
хроматографию. Группы соединений, которые нельзя фракционировать
адсорбционным методом, следует разделять методом распределительной
хроматографии, и наоборот.
Методом ХТС можно осуществить следующие виды фракционирования
липидов: разделение на классы соединений, фракционирование винилого-
мологических рядов, разделение по степени ненасыщенности, разделение
цис- и игранс-изомеров и изомеров положения.
5. ПОДГОТОВКА МАТЕРИАЛА
Лучшие методы разделения не достигают цели, если анализируемый
материал испорчен в результате несоответствующей обработки. Поэтому
здесь подробно описаны некоторые методы выделения липидов из расти-
тельных и животных материалов и правила обращения с экстрактами.
а) Получение волокнистой массы и экстракция
Проблема экстракции липидов сегодня снова является предметом подроб-
ных исследований. Приводимые ниже, проверенные в течение многих лет
стандартные методы после создания ХТС были во многих лабораториях
проверены методом Шталя. Теперь известно, что эти методы приводят
к ошибочным результатам и имеют ряд других недостатков [103, 129]. До
настоящего времени, однако, не опубликовано лучших прописей.
Выделение растительных липидов. Растительные масла получают из
семян и фруктов после измельчения на прессах или терках и последующей
экстракции растворителями.
Чтобы избежать выделения масла в процессе измельчения, в результате
чего образуется паста, при работе с сильно маслянистыми частями растения
целесообразно предварительно отжать основную часть масла. Остаток затем
измельчают и прессуют. Соответствующие прессы и мельницы описаны
в учебниках по химическим методам, там же можно найти адреса поставщи-
ков этих приборов [56, 115]. В лаборатории простая кофейная мельница
(а при работе с очень мягкими частями растений кухонный смеситель) выпол-
няет эту задачу не хуже, чем дорогие специальные машины. Применяется
также истирание пробы в ступке с морским песком.
Мацерирование продукта после прессования горячими растворителями
и окончательная экстракция в аппарате Сокслета или аналогичном приборе
дает в остатке липиды. Экстракторы и их применение описаны в многочислен-
ных руководствах [14, 49, 56].
Измельченную растительную пробу или остаток после прессования
экстрагируют безводными растворителями, как правило гексаном, петролей-
ным эфиром с температурой кипения 60—70° или бензолом, в течение 4—
6 час на водяной бане; пригоден также хлороформ, четыреххлористый угле-
род, трихлорэтилен и диэтиловый эфир. В некоторых случаях для выделения
растительных липидов используют этанол [121], «-пропанол и изопропанол
[51, 144], а также насыщенный водой м-бутанол [90]. Иногда целесообраз-
но провести экстракцию последовательно двумя или тремя растворителями
различной полярности, например диэтиловым эфиром, бензолом и петро-
10 Заказ № 734
146 Специальная часть
лейным эфиром. Для зашиты ненасыщенных липидов экстракцию следует
проводить в атмосфере азота.
Кейтс [51] показал, что алифатические простые и сложные эфиры и кето-
ны активируют фермент фосфатидазу С. Этот фермент гидролизует фосфоли-
пиды, и поэтому, согласно Кейтсу, для экстракции растительных липидов
следует использовать не диэтил овый эфир, ацетон и этил ацетат, а н-пропанол
или изопропанол.
Полученные таким образом липиды Содержат часто также свободные
аминокислоты и пептиды, сахар и другие гидрофильные природные вещества,
которые попадают в экстракт при добавлении веществ, способствующих
растворению, например лецитинов. Отделение этих примесей затруднитель-
но. Для отделения липидов от нелипидов пригодна хроматография на колон-
ках с целлюлозой по Леа и Родесу [70] и препаративная хроматография на
бумаге с применением растворителей, описанных Вестлеем, Вреном и Мит-
челлом [139]. Рекомендуется противоточное распределение [9, 53, 105].
Методы выделения липидов и прописи очистки липидного экстракта
особенно тщательно разработаны для животных тканей. Подробно описанные
в следующем разделе методы обработки животных проб применимы также
и к растительным пробам.
Выделение животных липидов. Подробное описание методов экстракции
липидов из человеческого и животного организмов дано Сперри [121] и Энтен-
маном [19]. Следует рекомендовать изучение этих работ, в особенности
критического исследования Энтенмана.
При обработке органов животных следует обратить внимание на следую-
щие 8 основных правил.
1. Все операции (гомогенизация, экстракция и т. д.) всегда прово-
дят в атмосфере азота, чтобы избежать автоокисления ненасыщенных ли-
пидов.
2. Применяют только очищенный и свежеперегнанный растворитель.
Метанол и этанол для удаления альдегидов перегоняют над едким кали.
Особенно важно, чтобы применялся только свежеперегнанный хлороформ.
Диэтиловый эфир освобождают от перекисей дистилляцией над гидроксилами-
ном или сульфатом железа (II) и хранят над железной или натриевой
проволокой. Хлороформ и диэтиловый эфир лучше всего хранить во взрыво-
безопасном холодильнике. Петролейный эфир следует перегонять над кон-
центрированной серной кислотой.
3. Исследуемое животное вскрывают сразу после умерщвления.
4. Сразу гомогенизуют анализируемый орган.
5. Следует придерживаться предписанного соотношения массы, получен-
ной при измельчении органов, и экстрагирующего раствора.
6. Растворы, содержащие липиды, нагревают только в случае крайней
необходимости.
7. Из липидных экстрактов удаляют все нелипиды без потерь липидов.
8. Экстрагированный материал хранят в условиях, которые могут вызвать
лишь минимальное изменение липида, т. е. по возможности хранят липиды
в растворах в петролейном эфире, в атмосфере азота в холодильнике.
Сперри [121], так же как и Энтенман [19], описывает приборы для гомо-
генизации ткани и приводит адреса поставщиков этих приборов. Наиболее
известен гомогенизатор по Поттеру и Эльвейему [106], обеспечивающий
полное измельчение тканей. Этот прибор состоит из пестика, пришлифован-
ного к толстостенной пробирке так, что остается щель менее 1 мм. Ткань,
подлежащую измельчению, помещают в виде суспензии в пробирку, затем
вводят пестик и с помощью электромотора осуществляют вращение с боль-
шой скоростью. Ткань между пестиком и стеклянной стенкой полностью
измельчается.
Гл. 10. Алифатические липиды , 147
Экстракция липидов по Блуру [4]. К 1 ч. гомогенизата ткани добавляют 20—30 ч.
смеси этанола с диэтил овым эфиром (3 + 1) и оставляют на 12 час при комнатной тем-
пературе в атмосфере азота. Липидный экстракт отфильтровывают от выпавшего белка,
концентрируют в вакууме в атмосфере азота при температуре ниже 50° (упаривают не
полностью) и повторно экстрагируют липиды тремя порциями петролейного эфира. Про-
дукт, нерастворимый в петролейном эфире, отбрасывают. Раствор липидов в петролей-
ном эфире Сушат безводным сульфатом натрия.
Для полного выделения липидов из довольно жирной ткани гомогенизат следует
слегка нагреть в смеси этанола с эфиром. Липиды мозга экстрагируются смесью Блура,
не полностью.
Экстракция липидов по Фольху, Асколи, Леесу, Миту и ле Барону [21]. Этот метод
дает особенно хорошие выходы" в случае таких сложных липидов, как протеолипиды
и ганглиозиды, которые не могут быть выделены полностью методом Блура.
Масса из тканей экстрагируется 20 ч. смеси хлороформа с метанолом (2+1) при
' комнатной температуре. Нелипиды отделяют, по Фольху с сотрудниками [22], диффу-
зионным методом, описанным ниже.
Небольшой стеклянный стакан ставят на дно стеклянного стакана 10-кратной емко-
сти, почти целиком заполненного дистиллированной водой. Затем с помощью пипетки
небольшой погруженный стакан на 2/3 заполняют хлороформ-метанольным экстрактом.
При стоянии в течение 12 час метанол и другие примеси, растворимые в воде, диффун-
дируют из липидного экстракта в воду. Очищенные таким образом липиды остаются
в хлороформе и в хлопьевидном слое на границе раздела обеих жидкостей. Водный рас-
твор затем возможно быстрее сливают сифоном. При этом следует обратить внимание
на то, чтобы упомянутый хлопьевидный слой не перемешался. Меньший стакан затем
вновь заполняют таким количеством метанола, которое находилось в нем первоначально.
При перемешивании метанола со слоем хлороформа хлопья переходят в райтвор.
Для выделения протеолипидов, фосфатидолипопептидов, ганглиозидов, сульфидов
и трифосфоинозитов подробно разработаны более совершенные методы [72, 73].
В редких случаях скелеты животных целиком растворяют кипяченйем
в этаноле, содержащем соляную кислоту. Этот метод имеет преимущество,
заключающееся в том, что ткань тщательно измельчается и липиды при этом
могут быть легко экстрагированы. Этот метод, однако, часто приводит
к слишком грубым изменениям липидов и поэтому не рекомендуется.
б) Омыление и этерификация
Растительные или животные ткани, богатые жирами, можно также
растворить в щелочи, чтобы гидролизовать содержащиеся в них липиды.
Одиако обычно вначале все липиды выделяют одним из вышеописанных
методов и затем подвергают гидролитическому расщеплению.
Классы соединений изолируют хроматографическими методами, напри-
мер методом ХТС, и после щелочного гидролиза определяют состав жирных
кислот, а также долю нейтральных веществ. Большинство липидов можно
элюировать с силикагеля Г диэтиловым эфиром или смесью эфир — метанол
(9 + 1). Для выделения фосфолипидов применяют смеси хлороформа и мета-
нола .
Щелочной гидролиз («омыление») - жировых веществ дает растворимые
в воде щелочные соли жирных кислот этих липидов и неомыляемые нейтраль-
ные соединения, например углеводороды, спирты и альдегиды. Неомыля-
емые вещества удаляют из щелочной водно-спиртовой фазы неполярными
растворителями, затем жирные кислоты выделяют в свободном состоянии
путем подкисления водно-спиртового раствора их солей и также экстраги-
руют органическими растворителями.
Щелочной гидролиз липидов. Растворяют 1 вес. ч. емкого кали в .1 вес. ч. дистилли-
рованной воды и после охлаждения разбавляют этот концентрированный раствор 3—4 ч.
метанола. Омыляемую пробу липида обрабатывают 10-кратным количеством раствора
гидроокиси калия и оставляют на 12 час при комнатной температуре. Это «холодное
омыление» следует особенно рекомендовать, если имеют дело с липидами, содержащими
витамины, или с производными сопряженно ненасыщенных жирных кислот. Чаще всего
проводят нагревание с обратным холодильником в течение 1—12 час в токе азота. Про-
должительность кипячения зависит от природы омыляемых липидов. Если имеют дёЛо
10*
148
Специальная часть
с очень трудно гидролизуемыми липидами, то можно добавить 10—20% толуола или
ксилола и таким образом повысить температуру омыляемой смеси.
Для контроля реакции гидролиза лучше всего использовать адсорбционную ХТС;
с интервалами в полчаса наносят небольшие пробы реакционной смеси на узкие плас-
тинки с силикагелем Г и разделяют смесью петролейный эфир (т. кип. 60—70°) — диэти-
ловый эфир — ледяная уксусная кислота (70 + 30 + 2). В начале омыления на хрома-
тограмме прежде всего видны пятна менее полярных веществ, расположенные над пят-
нами жирных кислот. После полного омыления видны только пятна кислот (выше непо-
лярные углеводороды и ниже сильно полярные соединения — одно- и многоатомные
спирты).
После окончания омыления большую часть метанола упаривают в вакууме при тем-
пературе ниже 50° и водный остаток разбавляют двойным объемом воды. При этом в при-
сутствии повышенных количеств неомыляемых веществ происходит помутнение раствора.
Неомыляемые вещества затем несколько раз экстрагируют диэтиловым эфиром порциями,
равными половине объема раствора. Эмульсии могут быть разрушены добавкой спирта
или путем многократного охлаждения до 55° и последующего нагревания. Полнота
экстракции проверяется методом адсорбционной ХТС. Объединенные эфирные вытяжки
промывают дистиллированной, прокипяченной в токе азота и вновь охлажденной водой
до нейтральной реакции. После сушки раствора и упарки эфира неомыляемую липидную
фракцию сплавляют в атмосфере азота или растворяют в соответствующем растворителе
и хранят в холодильнике.
Освобожденный от нейтральных веществ водный раствор калийных солей высших
кислот подкисляют затем 5 н. серной кислотой под слоем эфира. Выделенные таким
образом свободные жирные кислоты экстрагируют большим числом порций диэтилового
эфира. Объединенные вытяжки жирных кислот промывают дистиллированной прокипя-
ченной водой и затем сушат безводным сульфатом натрия. Эфир отгоняют и жирные
кислоты сплавляют в атмосфере азота или растворяют в петролейном эфире и хранят
в холодильнике.
До последнего времени обычно было принято омылять жиры водно-
спиртовым раствором едкого кали или этанольным раствором алкоголята
калия. В настоящее время вместо этанола применяют метанол. Это объясняет-
ся тем, что жирные кислоты в большинстве случаев анализируются газо-
хроматографически в виде метиловых эфиров, а небольшие количества
этиловых эфиров, которые могут образоваться при применении этанола,
мешают газохроматографическому определению метиловых эфиров жирных
кислот с нечетным числом атомов углерода и разветвленной цепью.
Этерификация жирных кислот. Особенно пригодными оказались три
метода:
1) реакция жирных кислот с диазометаном, который получается из
N-нитрозометилмочевины [114] или из п-толилсульфонилметилнигроз-
амида [5];
2) обработка жирных кислот 2,2-диметоксипропаном в метаноле и водной
соляной кислотой Ц13];
3) этерификация кислот метанолом в присутствии концентрированной сер-
ной кислоты или бортрифторида [91].
Жирные кислоты глицеридов или других липидов могут быть без предва-
рительного омыления переведены в- метиловые эфиры следующими мето-
дами:
1) переэтерификация липидов метанолом в эфире в присутствии едкого
кали [68];
2) алкоголиз липидов метанольным раствором соляной кислоты [126].
Каждый из этих методов подробно описан в доступных оригинальных
работах и во многих учебниках. Методика этерификации небольших коли-
честв жирных кислот диазометаном приведена на стр. 77 этой книги. В этой
же главе можно найти пропись для ацетилирования липидов, содержащих
спиртовые и аминогруппы (см. стр. 78).
Здесь следует подчеркнуть, что метиловые эфиры жирных кислот перед
газохроматографическим анализом всегда следует подвергать очистке мето-
дом ХТС. В качестве растворителя оказалась пригодной смесь петролейного
эфира (т. кип. 60—70°) с диэтиловым эфиром (19 + 1) в качестве сорбента —
Гл. 10. Алифатические липиды
149
силикагель Г. После разделения эфиры сразу экстрагируют смесью петролей-
ного эфира с диэтиловым эфиром (1 + 1) [129].
Липиды, содержащие ацетилпроизводные окси- и аминогрупп, также
следует очищать методом ХТС [80].
II. ТОНКОСЛОЙНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ ЛИПИДОВ
1. РАЗДЕЛЕНИЕ ЛИПИДОВ НА ОТДЕЛЬНЫЕ КЛАССЫ СОЕДИНЕНИЙ
Около 20 лет назад Траппе [128 и др. работы] показал, что липиды можно
элюировать с адсорбционных колонн в виде отдельных классов соединений
последовательным применением ряда растворителей различной полярности.
Он расположил различные полярные растворители по их элюирующему
действию в ряд и назвал эту серию «элюотропным рядом растворителей».
Ряд Траппе и аналогичные ряды, предложенные другими авторами, приведе-
ны на стр. 139.
Шредер [120] обнаружил, что вместо ряда индивидуальных растворите-
лей лучше применять смеси петролейного и диэтилового эфира в различных
соотношениях. Мид и Филрап [20, 88, 89], а также Хирш и Аренс [34] опи-
сали тщательно разработанную методику адсорбционнохроматографического
разделения сложных смесей липидов на колонках с силикагелем при исполь-
зовании этих двух растворителей. Оба метода были позднее проверены в раз-
личных лабораториях и в настоящее время используются в качестве стан-
дартных методов анализа липидных экстрактов человека и животных [86, 96].
После создания Шталем [122—124] ХТС многие авторы [46, 80, 137]
применяли новый метод для липидов и обнаружили, что он исключительно
пригоден для разделения соединений этой группы природных веществ.
В обзорных работах Виоке [130] и Морриса [96] описаны первоначальные
исследования по ХТС липидов.
За последние несколько лет методы ХТС и газовой хроматографии почти
полностью вытеснили другие хроматографические методы разделения
липидов.
Жиры, масла, воски и другие нейтральные липиды в большинстве случа-
ев разделяют на классы соединений методом адсорбционной ХТС на силика-
геле Г. В качестве растворителя, как правило, применяют смеси петролейного
и диэтилового эфиров. Для разделения сильно полярных липидов на слоях
силикагеля Г используют спиртовые и водные растворители, поэтому фрак-
ционирование подобных соединений на отдельные классы часто происходит
по механизму распределения, а не адсорбции. В некоторых случаях для
разделения липидов на отдельные классы соединений применяют обращен-
ные фазы на гидрофобизованном силикагеле Г (см. рис. 88).
а) Нейтральные липиды и продукты их гидролиза
Углеводороды с длинной цепью, спирты, альдегиды, кислоты, моно-
глицериды, диглицериды, триглицериды и аналогичные липиды можно
разделять методом адсорбционной ХТС на классы соединений, обладающих
различной полярностью, в зависимости от природы и числа функциональных
групп в них. Большие различия в длине цепи и степени ненасыщенности
компонентов данного класса соединений в редких случаях могут приводить
к дополнительному фракционированию внутри этого класса соединений.
Подобное дополнительное фракционирование выражено, однако, не столь
отчетливо, чтобы это могло осложнить разделение на отдельные классы
соединений.
150 Специальная часть
На рис. 70 схематическипоказано разделение отдельных типичных липидов
на классы соединений. Как и следовало ожидать, разделение различных
типов соединений происходит в соответствии с правилами, сформулирован-
ными Брокманом и Фольнерсом [6]: углеводороды не адсорбируются, эфиры
адсорбируются слабо, альдегиды находятся впереди спиртов и кислот —
Рис. 70. Разделение нейтральных липидов и продуктов их гидролиза методом
адсорбционной ХТС на силикагеле Г [76].
Растворитель петролейный эфир,(т. кип. 60—70°)—диэтиловый эфир — ледяная уксусная кислота
(S0 + Ю + 1); время анализа 40 мин, реактив для опрыскивания 2',7'-дихлорфлуоресцеин в эта-
ноле; пробы по 20 да каждая. 1 — октадецен-9; 2 — олеиловый спирт; 3 — олеиловый альдегид;
4 — олеиновая кислота; 5 — метилолеат, в — холестерилолеат; 7 — моноолеин; 8 — диолеин;
9—триолеин; 10—трилинолеин; 11—трилиноленин; 12—трикапроин (а) и тристеарин (В);
13 — холестерин; 14 — селахиловый спирт; 15 — селахилдиолеин; 16 — олеилолеат; IV — дио-
леиллетицин.
соединения с короткими цепями адсорбируются сильнее соединений с длин-
ными цепями, а ненасыщенные сильнее насыщенных (см. стр. 138). На рис. 70
в качестве примера приведена степень дополнительного фракционирования
внутри класса триглицеридов.
Условия разделения
Сорбент. Чаще других сорбентов для фракционирования липидов при-
меняют силикагель. Врен [145] описал свойства и преимущества этого сор-
бента. На пластинке размером 20 X 20 см с нанесенным на нее силикаге-
лем Г можно разделить 10—20 мг сложной смеси липидов. При необходимо-
сти фракционирования лишь небольшого числа веществ, сильно отличаю-
щихся по полярности, можно наносить на стандартную пласгинку до 50 мг
вещества. Окись алюминия применяют редко, поскольку липиды вй ней
гидролизуются [128] и изомеризуются [119]. Для разделения методрмХТС
можно также использовать «флорисил»— синтетический силикат Магния,
часто применяемый в колоночной хроматографий' липидов {8]. Весьма
подходящий адсорбентом для липидов является также вторичный фосфат
магния (см. стр. 219). Для разделения липидов на классы соединений
Катен [52] применял сахар. Этот адсорбент обладает хорошими раздели-
тельными свойствами, однако емкость его мала. Его хорошая растворимость
в воде облегчает извлечение адсорбированных липофильных веществ. Поэто-
му следует изучить применимость сахара для ХТС липидов.
Растворитель. Выбор р астворителя определяется полярностью компонентов
Смеси липидов и необходимым аффектом разделения. Перечень растворителей
для разделения нейтральных липидов методом ХТС приведен в табл. 10. Для
разделения углеводородов, сложных алкилэфиров, стерилэфиров и полиенол-
эфиров на классы соединений особенно пригодны смеси петролейного эфира
Гл. 10. Алифатические липиды 151
’ , Таблица 10
Растворители для разделения нейтральных липидов и их продуктов гидролиза
методом адсорбционной ХТС на силикагеле Г
Растворитель Соотношение объемов Литература
Петролейный эфир а — бензол 95-f-5 85
Четыреххлористый углерод 1 -— 47, 58
Гексан — тетралин 6 3+1 59
1+1 - 59
Петролейный эфир — диэтиловый эфир . 95+5 26, 81, 84
90+10 2, 76, 95
80+20 26, 83, 93
70+30 2, 47, 109
.50+50 2, 108
Петролейный эфир — диэтиловый эфир — ледяная уксус-
аая кислота 90+10+1 77, 81,97
80+20+1 84, 140
70+30+2 81, 84, ЮЗ
Бензол — диэтиловый эфир 50+50 2
Дихлорэтан 47, 58
Хлороформ 47, 103
Диэтиловый эфир — 47,58
Диизопропиловый эфир — • 58, 59
Хлороформ — ледяная уксусная кислота 24+1 47
Диизопропиловый эфир — ледяная уксусная кислота . . 100+1,5 58, 59
Бензол — метанол 85+15 2 '
и — Пропанол — конц. гидроокись аммония 2+1 .
Хлороформ — бензол 3+2 37, 137, 147
Четыреххлористый углерод в —
а В большинстве случаев петролейный эфир с температурой кипения 60—70°, т. е. главным
образом генсан. х. ?. j . '
® Для дополнительного фракционирования холестериновых эфиров высших жирйых кислот.
в Применяется в ступенчатом методе. *• v v
» ' ...................... . . /
с 1—5% бензола или диэтилового эфира [26, 75, 80, 811. При применении
такого растворителя соединения, содержащие одну или несколько свободных
функциональных групп? задерживаются на старте. . ,
Для фракционировайия спиртов и альдегидов, моно-, ди- И триглицеридов.
применяют смеси петродейного эфира и 10—50% диэтилового эфира [81, 95,-
108, 109 и др.]. Некоторые полярные липиды движутся в подобных раство-
рителях вблизи фронта, и их трудно отделить друг от друга. При хромато-
графическом разделении в тонких слоях смесей лцпидов, содержащих сво-
бодные жирные кислоты, следует применять упомянутый выше растворитель
с добавкой 1—2% ледяной уксусной кислоты для снижения образования
полос и хвостов, вызываемых жирными кислотами [76, 81, 95, 140[.
Поскольку большинство природных смесей липидов содержат вещества,
сильно отличающиеся по полярности, часто бывает невозможно достигнуть
полного разделения на классы соединений, используя один растворитель.
Более полную картину состава сложной Смеси: липидов получают, про-
водя хроматографическое разделение при использовании двух иди трех
152
Специальная часть
растворителей различной полярности. Эти же растворители могут быть
использованы в ступенчатом методе на одной и той же хроматограмме; точно
так же лучшего разделения достигают, используя двумерную ХТС [58].
— Углеводороды
Эфиры аперинов
SjlleifittlP?Витамин А (зфир)
ШШЯШШЖ j J J« «»
< J j' 'is ( - .длкоксидиглицериды
— Тригтщериды
— Жирные кислоты
з ' ‘4 / s ,, ? a »
Рис. 71. Тонкослоёная хроматограмма жира морских животных.
Сорбент силикагель Г; растворитель петролеГшый эфир (т. кип. 69— 70°) — диэтиловый эфир —
ледяная уксусная кислота (90 -|- 10 -j- 1); время анализа 1 час; обнаружение: обугливание хромовой
смесью при нагревании; пробы по 200 — 300 рг. 1 — Squalus aeanthias, жир печени; 2 — Hydrolagus.
colliii, жир печени; 3 —Ci-torhinus maximus, жир печени; 1 —Galeorhinus galeus, жир печени;
5 — Physeter macrocephalus; в — Kngraulis rnordax-, 7 — Thunnus thynnus; 8 — (Jnocrhynchus
gorbuscha, икра; P — Gadus morrhua, жир печени.
Можно также проводить ХТС, используя растворитель с постепенно увели-
чивающейся полярностью для разделения классов липидов, значительно
отличающихся по полярности *.
Р и с. 72. Доказательство эффективности разделения методом ХТС [129].
Сорбент силикагель Г; растворитель летролейный эфир (т. кип. 60—70°) — диэтиловый эфир — ледя-
ная уксусная кислота (80 -|- 20 1); время анализа 1 час-, индикатор а — пары иода; б — ра-
диоавтографин; пробы примерно по 200 цт природного липида. 1 — холестерилпальмитат-1-CU,
трипальмит111(-1-С14 и пальмитиновая кпслота-1-С14; 2 —жир, отлагающийся в организме человека,
и трипальмитии-1-CU; 3 — жир печени акулы и трипальмитии-1-CU; 4 — липидный экстракт
склеротической аорты человека и холестерилиальмитат-1-С14.
Хроматографический анализ растительных и животных восков особенно
хорошо удается на силикагеле Г при использовании растворителя, представ-
ляющего собой смесь петролейного и диэтилового эфиров 95 + 5. Наиболее
* См. также [162].
Гл. 10. Алифатические липиды 153
часто для разделения липидов методом ХТС применяют растворитель петро-
лейный эфир — диэтиловый эфир — ледяная уксусная кислота 90+10 + 1.
Этот растворитель особенно пригоден для хроматографического разделения
животных жиров (рис. 71 и 73). Растительные жиры, часто содержащие
эпокси- и оксисоединения и поэтому являющиеся более полярными по срав-
нению с большинством животных жиров, как правило, следует хроматогра-
фировать смесью петролейный эфир — диэтиловый эфир — ледяная уксусная
Тригтщериды
обычны»
,, кислот
Триглицериды
эпоксикиелот
Жирные кисианы
Триглицериды
* енстиитп
Р и с. 73. Тонкослойная
хроматограмма липидов
тканей человека [129].
1—сыворотка; 2 — костный
мозг; з - • печень; 7 — ноч-
ки; .5—жир, отлагающийся
в организме; в --селезен-
ка; 7 —склеротическая аор-
та (пробы но 300 иг)- Стан-
дартные слои силикагеля Г;
растворитель петролейный
эфир (т. кин. 60—70°)—диэ-
тиловый эфир — ледяная
уксусная кислота (90 +
1 и 1); время анализа
1 час; обнаружение: обугли-
вание хромовой смесью (ре-
актив 34) при нагрева-
нии.
Р и с. 74. Тонкослойная хроматограмма масел
различных семян [97].
1 — Olea europata', 2 — Malope trifida} 3 — Vernonia anthel-
mintica', 1 — Artemisia absinthium} 3 — Ceiba pentandra}
6 — Ccphulocroton cordo/anus', 7 — Dimorphotheca auranti-
аса', 8 — Onguekoa Gore', .9 — Ricinus communis (пробы но
200 jio). Стандартные слои силикагеля Г; растворитель пе-
тролейный эфир (т. кип. 60 — 70°) — диэтпловый эфир —
ледяная уксусная кислота (70 30 + 2); время анализа
1 час; обнаружение: обугливание хромовой смесью при
нагревании.
кислота 80 + 20 + 1 или 70 + 3 0+ 2 (рис. 74). По-
следний растворитель пригоден также для ХТС
спиртов и диолов «неомыляемых» растительных и
животных жиров и для ХТС жирных кислот, эпо-
кси-, окси- и диоксикислот и их метиловых эфиров.
Метод обнаружения. Почти все индикаторы, применяемые при хромато-
графии липидов на бумаге [54, 78], можно использовать также для обна-
ружения липидов на разделительных пластинках. Кроме того, при опры-
скивании можно применять реагенты для обугливания всех органических
веществ.
Нейтральные липиды можно сделать видимыми на пластинке, применяя
пары иода [80, 81], 2', 7'-дихлорфлуор'есцеин [76] или родамин В [58, 135],
а также хромовую смесь [85, 129].
Иод окрашивает все ненасыщенные липиды и некоторые азотсодержащие
насыщенные липиды в темно-коричневый цвет на светло-желтом или белом
фоне. Действием паров иода можно обнаружить менее 1 цз простого нена-
сыщенного соединения; большинство насыщенных липидов окрашиваются
слабо. На воздухе коричневые пятна исчезают через несколько минут. Их
можно, однако, получить вновь, действуя парами иода.
Почти все липиды обнаруживаются в УФ-свете (270 .иц) в виде светло-
зеленых флуоресцирующих пятен на темно-фиолетовом фоне после опрыс-
кивания хроматограммы 0,2%-ным спиртовым раствором 2', 7'-дихлор-
флуоресцеипа. Этим реактивом можно обнаружить 1 — 5 цз соединения.
Опрыскивание 0,05%-ным раствором родамина В в 96%-ном этаноле также
применяют для обнаружения липидов в УФ-свете. Как правило, 1 цз лили-
154 Специальная часть
да надежно определяется в виде темно-фиолетового пятна на розово-крас-
ном фоне.
Хромовая смесь особенно пригодна для озоления всех нелетучих органи-
ческих соединений при нагревании над электрической плиткой (рис. 71).
Меньше 1 ре липида можно обнаружить при озолении в виде серого или
черного пятна на белом фоне. Окраска зависит от степени нагревания: холе-
стерин и холестериновый эфир, например, окрашиваются вначале в красный
цвет, затем в коричневый и наконец в черный; витамин А и его эфиры окра-
шиваются вначале в голубой цвет, а при более высокой температуре в серый
и наконец в черный.
На одну и ту же хроматограмму можно последовательно нанести иод,
2', 7'-дихлорфлуоресцеин и хромовую смесь. Обработка тремя индикатора-
ми повышает вероятность того, что все вещества на тонкослойной хромато-
грамме будут открыты.
Реже применяемыми реактивами для опрыскивания (гл. 23) являются
растворы бромтимолового синего, фосфомолибденовой кислоты, треххлори-
стой сурьмы, пятихлористой сурьмы, а-циклодекстрина с парами иода,, флуо-
ресцеина с парами брома и гидроксиламина с хлоридом трехвалентного
железа. Липиды, которые благодаря наличию системы сопряженных двойных
связей поглощают УФ-свет, можно обнаружить в УФ-свете на слоях силика-
геля Г, содержащих флуоресцирующие вещества. Гидроксил- или амино-
содержащие липиды следует хроматографировать в виде меченых радио-
активных ацетильных производных, жирные кислоты — в виде радиоактив-
ных метиловых эфиров. Радиоактивные производные липидов локализуют
методом радиоавтографии (см. стр. 67).
Большинство индикаторных реакций для липидов на тонкослойных
хроматограммах примерно в 10—100 раз чувствительнее, чем йа бумажных
хроматограммах. Некоторые из упомянутых выше реактивов для обнару-
жения, как, например, 2', 7'-дихлорфлуоресцеин и родамин В, не вызывают
химического изменения липидов, что позволяет выделять последние мето-
дом ХТС.
Применение и результаты
а) Жиры, масла, воски. Мангольд и Малинз [81 ] применяли адсорбцион-
ную ХТС для разделения растительных жиров и восков, рыбьего жира,
а также продуктов их гидролиза — жирных кислот и «неомыляемых»— на
отдельные классы соединений. Две типичные хроматограммы изображены
на рис. 71 и 74.
Особенно следует отметить, что методом ХТС удается анализировать
такие близкие в химическом отношении классы липидов, как сложные
алкилэфиры, стерилзфиры, полиенолэфиры, и обнаружить их раздельно.
Можно разделить даже алкоксидиглицериды и триглицериды. Такого чет-
кого фракционирования нельзя достигнуть даже с большими количествами
исследуемого материала методом колоночной или бумажной хроматографии
или каким-либо другим методом. Поскольку ХТС требует лишь части того
количества вещества, которое необходимо для получения колоночной хрома-
тограммы, рассматриваемый метод весьма пригоден для микробиологических
и энтомологических исследований. Патель, Хайдак и Ловелл [102] сообщи-
ли об анализе методом ХТС маточного корма пчел. Для разделения липофиль-
ных веществ бактерий и вирусов также следует применять метод ХТС.
Чтобы проверить, действительно ли разделение методом ХТС является
полным, и убедиться, что различные классы соединений не загрязняют друг
друга, Туна, Камерек и Мангольд [129] применили радиоактивно меченные
соединения. Радиоактивный трипальмитин-1-С14 хроматографировался в сме-
Гл. 10. Алифатические липиды’ 155
си с липидами жировых отложений человека и жиром печени акулы; к Липид-
ному экстракту известковых отложений человеческой аорты был добавлен
холестерилпальмитат-1-С14. Хроматограмму сначала обработали парами
иода (рис. 72, а), а затем определили на ней распределение радиоактивности.
На рис. 72, а приведена фотография хроматограммы, обработанной парами
иода, а на рис. 72, б — радиоавтограф.
Легко заметить, что как на хроматограмме жира человека, так и на
хроматограмме рыбьего жира вся радиоактивность содержится во фракций
триглицеридов. Таким образом, пятна выше триглицеридных пятен не
являются результатом дополнительного фракционирования триглицеридов.
На хроматограмме липидного экстракта человеческой аорты радиоактивно
только пятно холестеринового эфира.
Эти результаты показывают, что взаимное загрязнение различных липид-
ных фракций, вообще говоря, минимально. Особенно обращает на себя
внимание тот факт, что даже алкоксидиглицериды, которые по химическому
строению и физическим свойствам столь близки к триглицеридам, не загряз-
нены ими. Диацетилглицериновые эфиры и диацетилмоноглицериды также
разделяются методом ХТС [80]. Однако значительно более полярные не-
этерифицированные простые моноэфиры глицерина и соответствующие им
моноглицериды разделяются неполностью.
Исключительно высокая четкость разделения позволяет выделить мето-
дами ХТС группы липидов из какого-либо экстракта и определить состав
жирных кислот. Малинз фракционировал жир печени акулы методом ХТС
и выделил триглицеридную и алкоксидиглицеридную фракции. Он омылил
оба класса липидов, выделил смесь жирных кислот и анализировал ее после
этерификации методом газовой хроматографии. Мангольд и Туна [82], так же
как и Туна, Камерек и Мангольд [129], определяли состав жирных кислот
холестериновых эфиров, триглицеридов и фосфолипидов из липидного
экстракта человеческих тканей.
ХТС оказалась особенно ценной для стандартных анализов липидов
•сывороток и органов человека и животных. Вайкер первым применил этот
метод для анализа липидов сывороток человека [137—138]. На стр. 255
- описано также применение этого метода Цольнером с сотрудниками [146—
148]. Вильямс, Шарма, Морис и Хольман [140] исследовали липиды из
•содержимого человеческой слепой кишки и сравнили их состав с составом
липидов стула. Многие исследовательские коллективы обнаружили, что
липидные экстракты тканей человека и животных содержат ряд артефактов,
например метиловые эфиры жирных кислот [12, 103, 104, 129] и в неко-
торых случаях тримерные альдегиды (1,3,5-триоксан) [129]. Многие клас-
сы соединений, которые не могут быть обнаружены другими методами,
были найдены методом ХТС в тканях человека. К этим веществам относятся
алкоксидиглицериды и небольшие количества «альдегидогенных триглицери-
дов», которые, по-видимому, находятся во всех человеческих органах, и сте-
рпим, менее полярные, чем холестерин, которые были найдены в аорта
человека [129]. На рис. 73 приведенахроматограмма липидных экстрактов
тканей человека.
Усовершенствованный Хиршем и Аренсом [34] метод хроматографиче-
ского фракционирования сложных липидных экстрактов на колонках с сили-
кагелем, по мнению этих авторов, не пригоден для разделения алкоксиди-
глицеридов и триглицеридов. Однако анализ методом ХТС фракций элюата
таких колонн доказывает отчетливое фракционирование этих двух классов
липидов. На рис. 75 приведена хроматограмма фракций «триглицеридного»
элюата из человеческого жира. На пластинке видно обогащение двух менее
полярных классов липидов в первых фракциях триглицеридного элюата,
однако оно отсутствует на соответствующей весовой кривой.
156
Специальная часть
Клинически-медицинское применение ХТС подробно описано в другом
месте (см. гл. 16). В этой связи следует, однако, указать на появившуюся
во время издания книги интересную работу Хонеггера [154] по хромато-
графическому исследованию липидов, выделенных из тканей мозга больных
склерозом и здоровых людей.
Допешваркар и Мид [18а] описали опыты, указывающие на то, что
метиловые эфиры высших жирных кислот встречаются в качестве природной
составной части животных тканей и не обязательно представляют собой
артефакты, возникающие при экстракции липидов метанольными смесями.
Этп авторы показали также, что метиловый эфир как таковой (не подвергну-
тый гидролизу) может быть абсорбирован животной тканью [18а, б]. Интере-
сен следующий опыт: они скармливали радиоактивный метилэлаидат-1-С14
Р и с. 75. Тонкослойная хроматограмма первых фракций элюата жира, отлагающегося
в организме человека, фракционированного на колонке [129].
Обращает па себя внимание обогащение двух классов липидов впереди триглицеридной фракции.
морским свинкам. Через 4 часа животных умерщвляли и липиды из крови,
печени, почек, легких, сердца, селезенки и жира экстрагировали по методу
Фольха, Лееса и Слоан-Стенли [22]. Методом колоночной хроматографии на
силикагеле были выделены холестериновые эфиры, триглицериды, стерины
и фосфолипиды и измерена их радиоактивность. Почти вся активность была
Таблица 11
Поглощение элаидиновой кислоты в теле животного
(исследование элюата колонки с силикагелем методом ХТС [18а])
Элюирующий раствор Идентифицировано методом ХТС Удельная радиоактив- ность, имп, в сек/мг
2% диэтилового эфира Холестериновые эфиры 0,5
в пентане Метиловые эфиры высших жирных кислот 708
5% дпэтилового эфира в пентане Триглицериды 4,1
20% диэтилового эфира в пентане Метанол Стерины Фосфолипиды 0,4 3
Холестериновые и метиловые эфиры были разделены методом ХТС
ле Г. Растворитель — смесь гексана и диэтилового эфира (98,54-1,5).
на силикате-
Гл. 10. Алифатические липиды
157
найдена во фракции холестериновых эфиров. Методом ХТС можно было
показать, что «холестериновые эфиры» содержат радиоактивный метилэлаи-
дат, причем именно он и является «горячим». Этот результат наглядно виден
из табл. 11, заимствованной из работы указанных авторов.
На рис. 76 приведена весовая кривая распределения в элюате колоноч-
ной хроматограммы жира печени акулы. Чистота отдельных фракций
элюата определялась методом ХТС.
Рис. 76. Анализ фракций элюата, полученного при разделении
на хроматографической колонке жира печени Hydrolagus colliei
(ср. с рис. 71).
1 — алкоксидлглицериды; 2 — триглицериды.
Применение ХТС для контроля эффективности колоночно-хроматогра-
фического разделения описывалось неоднократно [2, 35, 92, 129].
Тонкослойная хроматограмма необычных жиров семян приведена на
рис. 74. Следует отметить отделение триглицеридов обычных жирных кислот
от триглицеридов эпокси- и (или) оксикислот
Моррис и Мангольд [97] применяли ХТС для определения носителя цвет-
ных реакций, применяемых в анализе жиров, как, например, реакции
Гальфена.
Нельсон [99] применял ХТС в комбинации с адсорбционной хромато-
графией на колонках с силикагелем для анализа липидов пшеницы. Он
применял газовую хроматографию для определения кислотного состава
триглицеридной фракции липидов пшеницы. Янистин [41] исследовал неомы-
ляемую фракцию из метанольных экстрактов проросшей пшеницы.
Прайвет, Бланк и Лундберг [109] описали фотоденсцтометрический
метод количественного анализа смесей, содержащих моно-, ди- и триглице-
158 , Специальная часть
риды. На рис. 77 приведена типичная кривая, полученная на искусственной
смеси моно-, ди- и трипальмитина.
Симметричные (а, а') и асимметричные (а, р) моноглицериды, после
расщепления последних иодной кислотой или ацетатом свинца (IV), могут
быть разделены на гликольальдегидэфиры и количественно определены [108].
Симметричные и асимметричные диглицериды непосредственно отделяются
Рис. 77. Денситометрическая кривая тон-
кослойной хроматограммы >моно-, ди- и
трипальмитина ji [109].
Сорбент силикагель Г; растворитель петролейный
вфир (т. кип. 40—60°)—диэтиловый[эфир (70+30);
время анализа 40 мин; обнаружение: обуглива-
ние 50%-ной серной кислотой при нагревании.
Рис. 78. Денситометрическая кривая
тонкослойной хроматограммы 1,2-дипаль-
митина и 1,3-дипальмитина [109].
Условия разделения те же, что иа рис. 77.
друг от друга (рис. 78); однако а- и 0-моноглицериды не разделяются. Гоф-
ман [36] осуществил разделение а- и Р-моноглицеридов на слоях гидро-
ксилапатита.
Фотоденситометрический метод еще позволяет определить 0,1% три-
глицерида в моноглицериде (рис. 79).
Р и'_с. 79. Денситометрическая кривая тонкослойной хроматограммы монопальмитина,
содержащего 0,1% трипальмитина [109].
Условия рааделения те же, что на рис. 77,
Последние из названных авторов переводят липиды в видимое состояние
путем обугливания полуконцентрированной серной кислотой. Хроматограм-
мы были промерены фотоденситометром, изображенным на стр. 58. Для
каждого класса соединений необходимо построить отдельную калибровоч-
ную кривую. Соединения одного класса липидов, отличающиеся степенью
ненасыщенности, дают различные калибровочные кривые. Это означает, что
природные смеси могут быть количественно проанализированы этим методом
только после предварительного гидрирования. Описанный Фиоке и Холь-
Тл. 10. Алифатические липиды
159
маном [134] метод определения эфиров по реакции с гидроксамовой кисло-
той в значительной мере не зависит от степени насыщенности этерифициро-
ванных кислот.
0) Жирные кислоты и простейшие производные жирных кислот. Неодно-
кратно описано применение ХТС для отделения обычных жирных кислот
и их метиловых эфиров от эпокси-, окси- и кетокислот и их метиловых эфиров.
Рис. 80. Тонкослойная хроматограмма (копия-на рефлексной фотобумаге) природных
жирных эпокси- и оксикислот и их метиловых эфиров [95].
Сорбент силикагель Г; растворитель петролейный эфир (т. кип. 60—70°) —диэтиловый эфир (9 + 1>
для эфиров; петролейный эфир (т. кип. 60—-70°) — диэтиловый эфир — ледяная уксусная кислота
(90 4- 10 + 1) для кислот; время анализа 40 мин', обнаружение: обугливание 50%-ной серной
кислотой при нагревании; пробы по 50 цг. 1 — пальмитиновая и олеиновая кислоты; 2 — uuc-9,10-
эпоксистеариновая кислота; 3—^ис-12,13-эпоксиолеиновая кислота; 4—цис, цис,'-9,10; 12,13-диэпо-
ксистеариновая кислота с двумя примесями; 5 — 12-оксиолеиновая кислота; в — трео-12,13-дио-
ксиолеиновая кислота; 7 — трео-12, хлор-13-оксиолеиновая и трео-13-хлор-12-оксиолеиновая кисло-
ты; 8—кислоты из Artemisia absynthium.
Мангольд и Малинз [81] отделяли неокисленные кислоты от окси- и ди-
оксикислот касторового масла на пластинках с силикагелем Г, а для отделе-
ния неокисленных кислот от кетокислот ойтицикового масла использовали
окись алюминия. Эти три типа кислот касторового масла были количествен-
но проанализированы методом радиоактивных реактивов (см. стр. 75)
в комбинации с ХТС в виде меченых метиловых эфиров [84]. Эфиры неокис-
ленных кислот были элюированы и затем фракционированы методом газо-
вой хроматографии [81] и хроматографии на бумаге [84]. Таким образом
в касторовом масле была впервые обнаружена линоленовая кислота.
Фиоке и Хольман [134] определили количественное соотношение метило-
вых эфиров неокисленных кислот и моно- и диоксикислот касторового
масла гидроксамовым методом после разделения методом ХТС (см. стр. 54).
160
Специальная часть
Моррис, Хольман и Фонтель в нескольких работах [93—95] сообщали
о применении ХТС для анализа эпокси- и оксикислот в масле семян. Эти
исследования привели к обнаружению двух изомерных оксикислот, а именно
9-окси-транс-10-цис-12- и 13-окси-цпс-9-щра«с-11-октадекадиеновых кислот.
Моррис, Хольман и Фонтель [93] нашли методом ХТС по крайней мере
по три различных эпоксикислоты в шести маслах семян. На рис. 80 приведе-
ны 2 хроматограммы кислот из этих масел и их метиловых эфиров.
Фиоке, Моррис и Хольман [132] обнаружили щра«с-9,10-эпоксиолеино-
вую кислоту в побочном продукте производства оливкового масла. Шаль-
варджан, Моррис и Хольман [11], а также Допешваркар и Мид [18] и Фуль-
ко и Мид [25] использовали метод ХТС в опытах по физиологии питания
для обнаружения замещенных жирных кислот.
Некоторые из описанных Хольманом с сотрудниками результатов раз-
деления были затем подтверждены Кауфманом и Макусом [58] на модель-
ных смесях. Аплеуайт, Дайэмонд и Гольдблат [2] также описали анализ
методом ХТС эпокси- и оксикислот.
Моррис, Хольман и Фонтель [94] смогли показать методом ХТС, что
метиловые эфиры трижды сопряженноненасыщенных жирных кислот в газо-
хроматографическом процессе изомеризуются, а эфиры смежноненасыщенных
оксикислот дегидратируются. Ненасыщенные гидроперекиси из метиловых
эфиров — первичные продукты автоокисления — также дегидратируются
в газохроматографическом процессе и мешают, таким образом, определению
эфиров более ненасыщенных кислот.
Моррис, Хейс и Хольман [92] использовали метод ХТС для наблюдения
за процессом препаративного разделения эпоксикислот.
Адсорбционная ХТС в особенности пригодна для контроля синтезов.
Поскольку все виды адсорбционной хроматографии делят липиды в первую
очередь на классы соединений, нет необходимости разрабатывать синтез
с чистой кислотой, например, с олеиновой Кислотой. Гругер, Малинз и Гауг-
литц [29] применили метод ХТС для проверки чистоты ацетилированных
моно- и диглицеридов, полученных из жира сельди и лосося. Гауглитц
и Малинз [26] использовали метод ХТС для анализа промежуточных
продуктов, получающихся при синтезе альдегидов из рыбьего жира. Эти
авторы конденсировали метиловые эфиры кислот, полученных из рыбьего
жира. Они восстанавливали полученные таким образом ацилоины в диолы
и расщепляли последние до альдегидов. Гауглитц и Малинз показали, что
смеси метиловых эфиров, а также ацилоинов и альдегидов при адсорбционной
ХТС благодаря большим различиям в длине цепи и степени ненасыщенности
обнаруживают отчетливое дополнительное фракционирование (рис. 81).
Сильно полярные диолы не обнаруживают этого дополнительного фракцио-
нирования.
Применение метода ХТС для анализа промежуточных и конечных про-
дуктов химических синтезов липидов упоминалось также и другими авто-
рами [69, 74, 133]. Анализ методом ХТС во многих случаях облегчает пони-
мание механизма препаративных методов и позволяет правильно оценить
чистоту конечных продуктов органических синтезов. ХТС часто использу-
ют для дополнительной проверки эффективности «проверенных» методов
очистки. Аплеуайт, Дайэмонд и Гольдблат [2] обнаружили, что каталити-
ческая (никель Ренея) изомеризация метил-12-оксиолеата (метилрицинолеат)
в метил-12-кетостеарат приводит к образованию в качестве побочных про-
дуктов метилстеарата, метил-12-оксистеарата и по крайней мере еще одного
не идентифицированного соединения. Восстановление метил-9-окси-10,12-окта-
декадионата (метилдиморфекулата) водородом на двуокиси платины,
согласно Аплеуаиту, Дайэмонду и Гольдблату [2], дает в результате реак-
ций гидрогенолиза, изомеризации и восстановления наряду с желательным
Гл. 10. Алифатические липиды 161
9-оксистеаратом, также стеарат и кетостеарат. Упомянутые авторы использо-
вали всегда три индикатора: флуоресцирующий минерал в адсорбционном
слое для обнаружения с помощью УФ-лампы сопряженноненасыщенных
соединений и бромфлуоресцеиновую пробу для обнаружения соединений
с изолированными двойными связями, 2',7'-дихлорфлуоресцеин был исполь-
зован для обнаружения в УФ-свете всех липидов, как насыщенных, так
и ненасыщенных. Поскольку адсорбционная ХТС не позволяет отделить друг
от друга насыщенные и ненасыщенные соединения определенного класса,
для обнаружения насыщенных и ненасыщенных липидов, находящихся
Фронт
Дикетоны -------= ______ ____ =
Зфиры
Ацилоины ЯЯ
Кислоты гх',
Продукты &: е
окисления •
1 2 3 4 5 6
Рис. 81. Тонкослойная хроматограмма промежуточных продуктов одного из синтезов
альдегидов [26].
Сорбент силикагель.Г; растворитель петролейный эфир (т. кип. 40—60°)—диэтиловый эфир (90-4-10);
время анализа 30 мин-, индикатор пары иода; пробы примерно по 100 цг. 1 — метиллиноленат,
2 — линоленоин, сырой продукт; 3 — очищенный линоленоин; 4 — метиловые эфиры кислот из
рыбьего жира; 5 — ацилоины из рыбьего жира, сырой продукт; в—очищенные ацилоины из рыбьего
жира. Обратите внимание на дополнительное фракционирование метиловых эфиров и ацилоинов
из рыбьего жира.
рядом, при изучении реакции гидрирования помогает применение специ-
фичных индикаторов. Ван Денен и сотрудники [150, 153] использовали
метод ХТС в качестве вспомогательного средства для контроля синтезов
лецитинов, де Хасс и ван Денен [152] следили за ферментативным гидроли-
зом этих соединений, также используя метод ХТС.
Результаты классических методов органического анализа также следует
проверить современными методами разделения. Моррис [98] анализировал
моноацетилрициниловый спирт — недавно найденное привлекающее веще-
ство насекомых — методом ХТС и показал, что «чисто сгорающий» и имею-
щий резкую температуру плавления синтетический препарат представлял
собой эквимолярную смесь рицинилового спирта с его моно- и диацетилпроиз-
водными. Этот пример отчетливо показывает, что при некоторых обстоя-
тельствах результаты элементарного анализа смеси соединений могут соот-
ветствовать суммарной формуле какого-либо из компонентов.
Мангольд и Каммерек [85] описали условия разделения методом ХТС
смесей технически важных липидов, например условия отделения первич-
ных, вторичных и третичных аминов от четвертичных аммонийных основа-
ний, амидов и нитрилов (рис. 82).
Сильно полярные липиды, например алкилсульфаты и алкилсульфонаты,
алкилфосфаты и алкилфосфонаты, и другие моющие вещества были хромато-
графированы упомянутыми выше авторами на смеси из 9 ч. силикагеля Г
и 1 ч. сульфата аммония с растворителем из хлороформа и метанола, раство-
ренного в разбавленной серной кислоте. Метод ХТС должен значительно
облегчить сложный до сих пор анализ моющих веществ.
Подробное изучение механизма автоокисления ненасыщенных липидов
побудило Прайвета [107] использовать также ХТС для этой цели. Обычно
принято считать, что гидроперекиси представляют собой первичные про-
11 Заказ № 734
162
Специальная часть
дукты автоокисления. Прайвет, в содружестве с Бланком [110], сумел
показать методом ХТС, что при автоокислении метиллинолеата образуются
неизвестные продукты, прежде чем удается обнаружить гидроперекись. Это
означает, что следует пересмотреть современное представление об иницииро-
вании автоокисления ненасыщенных соединений. Прайвет и Бланк разрабо-
тали также новое фундаментальное представление о роли металлов при
автоокислении липидов и о действии антиокислителей и синергистов. Следует
указать на недавно появившиеся публикации Рихе и сотрудников [161],
а также Фиоке и Хольмана [164].
Образующиеся в- результате окисления жирных высыхающих масел
олифы и лаки содержат кислород в форме различных функциональных групп.
Рис. 82. Тонкослойная хроматограмма технически важных производных жирных
кислот [85].
Сорбент силикагель Г; растворитель хлороформ — 1 н. гидроокись аммония (10 1) с метанолом
(97 + 3); время анализа 40 жт; обнаружение: обугливание хромовой смесью при нагревании;
пробы примерно по 40 цг. 1 —триалкиламин; 2 — ацетилированный N-2-этоксиамид; 3 — ацетили-
рованный первичный амин; 4 — диалкиламин; 5 — амид; в — ^лкилдиметиламин; 1 — оксиэтил-
амид; s — алкиламин.
Фрейтас [24] восстанавливал такие пленки литийалюминийгидридом и анали-
зировал образующиеся спиртовые соединения методом ХТС. И в этой области
исследования жиров применение ХТС за короткое время привело коновым
многообещающим результатам.
б) Фосфолипиды, сульфолипиды и гликолипиды
Различные более старые методы хроматографического фракционирова-
ния этих групп веществ описаны Ханааном [32]. Сильно полярные природ-
ные липиды и синтетические вещества с аналогичными свойствами разделяют-
ся методом ХТС на классы соединений. Фракционирование таких соедине-
ний осуществляют как адсорбционным, так и распределительным методом.
Особенно хорошее разделение было достигнуто при применении дезактиви-
рованных слоев (для подавления адсорбционных эффектов, ведущих к обра-
зованию хвостов). Силикагель, не содержащий гипса (см. примечание на
стр. 40), оказался при этом более подходящим, чем силикагель Г.
Плазмалогены не полностью отделяются от соответствующих диэфирных
соединений. Подобные альдегидогенные фосфолипиды несколько менее
полярны, чем диэфирфосфолипиды и поэтому на тонкослойных хроматограм-
мах всегда обогащаются в верхнем крае фосфатидных пятен. О хромато-
графическом поведении очень сложно построенных липидов пока мало
данных. Следует ожидать, что интенсивное применение метода ХТС поможет
выяснить строение этих соединений.
' i J * 5 б 7
Гл. 10. Алифатические липиды, 163
Фосфолипиды наносят на пластинки в большинстве случаев в виде 0,1
или 1%-ных растворов в хлороформе или в смеси хлороформа с метано-
лом (1 + 1).
Условия разделения
Сорбент. Различные классы фосфолипидов, сульфолипидов и гликолипи-
дов фракционируют методом ХТС на силикагеле Н или силикагеле Г. Рас-
пределительная ХТС на «мокром» силикагеле Г приводит, согласно Шаль-
варджану [11], к более четкому разделению, чем хроматография на высушен-
ных и активированных слоях этого
адсорбента. Добавка сульфата аммо-
ния позволяет также получить
дезактивированные слои. Методом
распределительной ХТС на одной
пластинке можно разделить макси-
мум 10мг липидов, т. е. значительно
меньше, чем методом адсорбционной
хроматографии.
Для приготовления пластинки
с силикагелем Г, содержащим суль-
фат аммония, используют тонкую
суспензию, состоящую из 25 г сили-
кагеля Г и раствора 2,5 г сульфата
аммония в 60 мл воды. Слой следует
наносить быстро, поскольку эта
смесь затвердевает быстрее, чем
обычная чисто водная суспензия.
Пластинки вначале сушат на воз-
духе и затем при 120°. Скипский,
Петерсон и Барклай [163] рекомен-
дуют добавлять к силикагелю Г
вместо сульфата аммония немного
ацетата или карбоната натрия.
Для разделения методом распре-
делительной хроматографии фосфа-
тидов и других полярных липидов
могут быть пригодны также порошки
целлюлозы (см. стр. 40). Весьма
перспективно также применение
ионообменных слоев (см. стр. 40).
Растворитель. Для проведения анализа фосфолипидов методом ХТС
в качестве растворителя применяют смеси хлороформа и метанола с неболь-
шим количеством воды. Эти растворы применяются в течение многих лет для
разделения фосфолипидов на пропитанной кремнекислотой целлюлозной
бумаге [87], на бумаге из стеклянного волокна [31] и колонках с силикаге-
лем- [71].
Вагнер [135] и Вагнер, Хорхаммер и Вольф [136] рекомендуют для
разделения эфиров фосфатов на классы соединений растворитель в виде смеси
хлороформа, метанола и воды (65 4~ 25 4~ 4). На рис. 83 приведена получен-
ная этими авторами хроматограмма (см. также табл. 13).
Шлеммер [116] использовал также смесь хлороформа — метанола —
воды в соотношениях 75 + 22 + 3 или 65 + 30 + 5.
Дайн, Вайкер, Шмид и Танхаузер [15, 138] предпочитают водно-амми-
ачные смеси хлороформа с метанолом 1 4- 3 или 3 4- 1, при концентра-
ции гидроокиси аммония 40 мл на литр. Яцкевич, которыйпервый исполь-
11*
Рис. 83. Тонкослойная хроматограмма
полярных липидов [135, 136].
Сорбент силикагель Г; растворитель хлороформ —
метанол — вода (65 -j- 25 -j- 4); время анализа
2 час, реактивы для опрыскивания: родамин В
в этаноле и раствор Драгендорфа; пробы по
50—100 цг. 1 — лизолецитин; 2 — сфингомиелин;
з — лецитин; 4 — коламин-цефалин; 5 — церебро-
зид; в кардиолипин; 7 — модельная смесь сое-
динений 1—6.
164
Специальная часть
зовал метод ХТС для разделения фосфолипидов, сульфолипидов и гликолипи-
дов [46, 47], рекомендует применение аммиачного раствора «-пропанола;
Яцкевич и Мел [47 ] применяли три последовательных растворителя в ступен-
чатой методике. Состав этих растворителей и других растворителей для
разделения сильно полярных липидов приведен в табл. 12.
Таблица 12
Растворители для разделения сильно полярных липидов на силикагеле Г
Растворитель Соотношение объемов Литература
Хлороформ — метанол — вода 75+22+3 116
i 65+30+5 116
65+25+4 30, 135, 136
60+35+8 135, 136
Бензол—1 н. гидроокись аммония 10+1 85
Щелочной раствор хлороформа и метанола а (40 мл конц. 3+1 15, 36
(14 н.) гидроокиси аммония на литр) 1+3 15, 36
Кислый раствор хлороформа и метанола 6 97+3 85
Метанол, содержащий 5% 0,1 н. серной кислоты . . . 4+1 85
Ацетон — конц. (14. н.) гидроокись аммония 10+1 85
н-Пропанол— вода 7+3 67
н-Пропанол—12 я. гидроокись аммония 4+1 46, 47
н-Пропанол— конц. (14 н.) гидроокись аммония .... 7+3 47
н-Пропанол—12 н. гидроокись аммония 4+1 47, 48
этиленхлорид — метанол 49+1
хлороформ—ледяная уксусная кислота (96%) .... 95+5
н-Бутанол — пиридин — вода 3+2+1 63
а Тйкой растворитель готовят следующим образом: хлороформ смешивают с нормальным рас-
твором гидроокиси аммония в соотношении 10-j-l и используют смесь из 87 об. ч. этого раствора
с 3 ч. метанола [85].
б Силикагель Г, содержащий 5% сульфата аммония (см. стр. 163).
Метод обнаружения. Для обнаружения разделенных классов фосфолипи-
дов в большинстве случаев служат реактивы для опрыскивания, применяе-
мые обычно в хроматографии на бумаге: раствор нингидрина для аминфос-
фатидов [136], реактив Драгендорфа для фосфатидов, содержащих холин
[136], и реактив молибдат аммония — хлорная кислота для фосфолипи-
дов [136]. В качестве универсальных индикаторов для липидов используют
спиртовый раствор родамина В [136], слегка подщелоченный раствор бром-
тимолового синего [47] и пары иода. Фосфолипиды и большинство других
органических соединений можно обуглить, опрыскивая хроматограммы
полуконцентрированной серной кислотой или хромовой смесью и затем
нагревая; при этом получают черные пятна. Применение этого и других
реактивов для опрыскивания описано подробно в специальной главе этой
книги (см. главу 23).
Следует настоятельно рекомендовать последовательное опрыскивание
одной и той же хроматограммы несколькими реактивами, чтобы ни одно
вещество не осталось необнаруженным. Это видно из табл. 13, которая заим-
ствована из работы Вагнера, Хорхаммера и Вольфа [136].
Особенно важно обнаружение органических соединений способом обугли-
вания (см. рис. 71. 73, 74).
Гл. 10. Алифатические липиды
165
Вещество
Величина Нингид-
Лу рин
Таблица 13 [136]
Реактив
Драген-
дорфа
Молибдат
аммония—
хлорная
кислота
Аминокислоты . .
Лизолецитин . .
Лецитин ........
Сфингомиэлин . .
Коламин-цефалин
Цереброзиды . . .
Кардиолипин . .
0—0,10
0,21±0,037
0,39+0,055
0,29+0,055
0,57+0,075
0,78+0,075
0,92+0,015
+ положительная реакция; — реакция отсутствует.
Применение и результаты
Яцкевичу [46] удалось осуществить методом ХТС на силикагеле Г раз-
деление цереброзидов и отделение их сернокислых эфиров типа цереброна
от эфиров типа керазина. Этим методом он проанализировал цереброзидные
сернокислые эфиры, выделенные из мозга нормальных людей и из патологи-
ческих мозгов, и нашел, что они, по-
видимому, являются идентичными. Ваг-
нер, Хорхаммер и Вольф [136] через не-
которое время подтвердили методом ХТС,
что все цереброзиды, включая нервоны,
содержатся в нормальном мозге в виде
их сернокислых эфиров. Рис. 84 пока-
зывает, что как этерифицированные, так
и неэтерифицированные цереброзидные
фракции разделяются на силикагеле Г
при применении в качестве растворителя
смеси хлороформ — метанол — вода
(60 + 35 + 8) на три зоны.
Кочетков, Жукова и Глуходед [65]
также описали анализ цереброзидов ме-
тодом ХТС.
Габерман, Бандтлоу и Круше [30]
использовали предложенный Вагнером,
Хорхаммером и Вольфом [136] раствори-
тель для разделения фосфолипидов сы-
воротки крови человека методом ХТС
и затем для колориметрического опреде-
ления отдельных фракций после озоле-
ния в виде фосфатов. Яцкевич [48] раз-
работал метод количественного опреде-
ления различных сфинголипидов. О ко-
личественном определении лецитина и
коламин-цефалина методом ХТС кратко
сообщает Вагнер [166].
ХТС с большим успехом была исполь-
зована для выделения и определения
строения ганглиозидов. Вагнер, Хорхам-
Р и с. 84. Тонкослойная хроматограм-
ма сфинголипидов [136].
Сорбент силикагель Г; растворитель хлоро-
форм — метанол — вода (60 + 35 + 8);
время анализа 2 час; реактивы для опрыс-
кивания: раствор дифениламина, реактив
Драгендорфа для обнаружения сфинго-
миелина; пробы по 50 — 100 цг. 1 —
смесь сфинголипидов из бычьего мозга;
2 — неэтерифицированные цереброзиды;
3 — сернокислые эфиры цереброзидов;
4 — сфингомиелин; 5 — ганглиозиды (абвгд).
166
Специальная часть
мер и Вольф [136] разделяли на силикагеле Г ганглиозидную фракцию из
мозга крупного рогатого скота на два основных компонента и три другие
зоны меньшей интенсивности. Авторы считают доказанным, что два основ-
ных компонента (рис. 84, а тз. б) идентичны двум ганглиозидам, которые
выделили раньше Кун [66] и Кленк и Гиелен [63]. Кун, Вигандт и Эгге
[67 ] и Кленк и Гиелен [64] вскоре затем смогли обнаружить методом ХТС
четыре ганглиозида, выделить их и установить их строение. Использован-
ные Куном и сотрудниками, а также. Кленком и сотрудниками раствори-
тели приведены в табл. 12. Там приведены также и другие растворители для
разделения более простых сфинголипидов и сложных гликолипидов.
в) Применение хроматографии в тонких слоях
для определения строения липидов
Прайвет и Бланк [108] описали остроумный метод анализа насыщенных
и ненасыщенных а- и p-моноглицеридов. Этот «метод хроматографии в тонких
Рис. 85. Тонкослойная хроматограмма смеси ганглиозидов (1) и индивидуальных
ганглиозидов (2—5) из мозга человека [64].
Пробы примерно по 50 цз; слой силикагеля Г; растворитель н-бутанол — пиридин — вода
(3 + 2 + 1), время анализа 2,5—3 час, реактив для опрыскивания: реактив Биалса.
слоях с использованием восстановительного озонирования» позволяет коли-
чественно определять следующие четыре типа моноглицеридов (I—IV):
-----S ------- --------1 ------U
----- -----S -------и ---------
I II III IV
S—насыщенная жирная кислота,
U—ненасыщенная жирная кислота.
Эти моноглицериды разделяются методом ХТС или другим каким-либо
методом. Прайвет и Бланк фракционировали, как упоминалось выше, вна-
чале а- и p-моноглицериды после отщепления гликолей в виде гликольальде-
гидэфиров и неизменяемых p-моноглицеридов. Ненасыщенные гликольаль-
дегидэфиры и моноглицериды переводят затем путем восстановительного
озонирования в альдегидные фрагменты:
Восстановительное
озонирование
---- /Н
' О — С—(СН2)Ж —
О
+ Альдегиды с короткой цепью
Гл. 10. Алифатические липиды
167
Эти «альдегидные ядра» более полярны, чем не меняющиеся под действи-
ем озона гликольальдегидэфиры и моноглицериды насыщенных кислот.
Поэтому эти группы веществ легко разделить методом адсорбционной ХТС
(рис. 86).
Прайвету и Бланку [108] удалось количественно определить методом
ХТС с использованием восстановительного озонирования шесть из семи
1,3-диолеина,
хроматограммы
кослойной
1,2-диастеарина и 1,3-дистеарина после восста-
новительного озонолиза [108].
Сорбент силикагель Г; растворитель петролейный
эфир (т. кип. 40—60°) — диэтиловый эфир (3 + 2);
время анализа 40 мин; обнаружение: обугливание
50%-ной серной кислотой при нагревании. «Альде-
гидные ядра»: А —из 1,3-диолеина; В—из
1,2-дистеарина; С —из 1,3-дистеарина.
кривая тонкослойной хромато-
граммы монопальмитина и моно-
олеина после восстановительного
озонолиза [108].
Сорбент силикагель Г; растворитель
петролейный эфир (т. кип. 40—60°) —
диэтиловый эфир (1 + 9); время ана-
лиза 40 мин; обнаружение: обуглива-
ние 50%-ной серной кислотой при
нагревании. «Альдегидные
А —из моноолеина; В —гиз
пальмитина.
ядра»:
моно-
возможных диглицеридов и четыре из шести возможных триглицеридов.
На рис. 87 приведены результаты анализа смеси 1,3-диолеина, 1,2-дистеари-
на и 1,3-дистеарина.
«Альдегидные ядра» из моно-, ди- и триглицеридов дают одинаковые
калибровочные кривые с насыщенными моно-, ди- и триглицеридами при
учете поправки на потерю углерода в результате озонолиза. Это облегчает
количественный анализ сложных смесей, содержащих насыщенные глицери-
ды и глицериды ненасыщенных кислот, сильно отличающихся степенью
ненасыщенности (см. стр. 57).
Прайвет и Бланк [111] использовали свой метод также для количествен-
ного определения четырех типов лецитинов:
-----S
-----S
-----PC
----PC
-----и
-----S
-----PC
----и
----и
----PC
S — насыщенная жирная кислота,
U — ненасыщенная жирная кислота,
PC — фосфорилхолин.
Полученные из лецитина при восстановительном озонолизе «альдегидные
ядра» отделяют друг от друга методом ХТС на силиконизованном силика-
геле Г [76]. На рис. 88 приведены фотоденситометрические кривые тонко-
слойных хроматограмм «альдегидных ядер» из яичного лецитина, лецитинов
спинного мозга крупного рогатого скота и лецитинов сои и пшеницы.
168
Специальная часть
Прайвету и Никелю [112] удалось показать методом ХТС, что озониро-
вание метил олеата, метилэлаидата и других цис- или транс-ненасыщенных
эфиров жирных кислот приводит к образованию двух изомерных озонидов.
Рис. 88. Денситометрическая кривая «альдегидных ядер» из природных смесей
лецитинов [111].
Сорбент силикон на силикагеле Г; растворитель ледяная уксусная кислота — вода (4 4- 1); время
анализа 1,5 час; обнаружение: обугливание 50%-ной серной кислотой при нагревании, а — леци-
тины из куриного яйца; б — лецитины из спинного мозга крупного рогатого скота; в — лецитины
из сои; г —лецитины из пшеницы. I — насыщенные лецитины; II —«альдегидные ядра» из
насыщенно(а)-ненасыщенных(|}) лецитинов; III — «альдегидные ядра» из яасыщенно(£)-ненасыщен-
яых (а) лецитинов (а); IV — «альдегидные ядра» из лецитинов, содержащих две ненасыщенные
кислоты.
Озонирование ненасыщенных липидов всегда контролируется в Институте
Хормеля методом ХТС; «переозонирование» легко доказать этим же хрома-
тографическим методом.
2. ФРАКЦИОНИРОВАНИЕ ВИНИЛОГОМОЛОГИЧЕСКИХ РЯДОВ
Летучие соединения гомологического ряда фракционируют в виде их
производных методом адсорбционной ХТС. Соединения с длинной цепью —
«липиды»— в большинстве случаев разделяют методом распределительной
ХТС с обращенными фазами в соответствии с длиной цепи и числом двой-
ных связей.
а) Методы разделения соединений с короткими цепями
Летучие альдегиды и метилкетоны встречаются в качестве продуктов
ферментативного и автоокислительного разложения липидов в жирах
и маслах и частично обусловливают их запах и вкус. Следы спиртов и кислот,
даже аминов и меркаптанов, в первую очередь содержатся в рыбьем жире.
Небольшие количества этих дурно пахнущих соединений очень трудно
обнаружить химически и идентифицировать. Метод ХТС представляется
идеальным для анализа этих нежелательных сопутствующих жирам веществ,
в особенности в комбинации с газовой хроматографией.
Гл. 10. Алифатические липиды
169
В первую очередь метод ХТС пригоден для анализа осколков, получаю-
щихся при определении химического строения ненасыщенных липидов.
Восстановительное озонирование ненасыщенных жирных кислот дает аль-
дегиды и <о-альдегидокислоты с короткой цепью. Оба класса соединений
можно разделить методом ХТС в виде производных в соответствии с длиной
цепи. Этим же методом легко идентифицируют кислотные остатки, образую-
щиеся при окислительном расщеплении ненасыщенных липидов.
Соединения с короткой цепью какого-либо гомологического ряда отделяют
друг от друга в виде нелетучих производных методом адсорбционной ХТС. На

$4 ' 1 о J о о о о о о © ' 7Af
1 2 3 1 ~5 ~6 7 д
Рис. 89. Разделение производных соединений с короткой цепью одного
гомологического ряда методом адсорбционной ХТС на силикагеле Г.
Растворитель петролейный эфир (т. кип. 60—70°) — диэтиловый эфир (7 + 3); время анализа
40 лиш; индикатор — 1 % флуоресцирующего вещества в разделительном слое, УФ-свет; пробы
по 5 рг; 2,4-динитрофенилпроизводные следующих аминов: 1 — метиламин; 2 — этиламин;
з — пропиламин; 4 — бутиламин; 5 — амиламин; в — гексиламин; 7 — гептиламин; 8 — октиламин.
рис. 89 в качестве примера показано разделение на силикагеле Г динитро-
фенилпроизводных первичных аминов с числом углеродных агомов 1—8.
Спирты можно фракционировать в виде 3,5-динитробензоатов, а легко-
летучие альдегиды и кетоны — в виде 2,4-динитрофенилгидразонов. Кислоты
разделяют в виде анилидов или N-метиланилидов. 3,5-Динитробензоаты из
меркаптанов с длиной цепи Ct— С6 также анализируют методом адсорбци-
онной ХТС.
Условия разделения
Сорбент. Силикагель Г и окись алюминия Г применяют для разделения
методом ХТС производных соединений с короткой цепью.
Растворитель. В качестве растворителей применяют смеси гексана или
петролейного эфира (т. кип. 60—70°) с диэтиловым эфиром или этилацетатом.
Метод обнаружения. Поскольку ароматические производные либо окра-
шены в интенсивный желтый цвет, либо сильно поглощают УФ-свет, то,
для того чтобы обнаружить пятна, не требуется никаких реактивов для
опрыскивания. Лучше всего применять силикагель Г, содержащий 0,5 —2%
флуоресцирующей добавки, и локализовать соединения, используя УФ-
лампу. Нелетучие органические примеси можно обнаружить в виде серых
или черных пятен после опрыскивания хроматограммы хромовой смесью
и нагревания. В большинстве случаев сами производные очень трудно
озолять: например, 2,4-динитрофенилгидразоны альдегидов и кетонов окра-
шиваются при нагревании с хромовой смесью, но при охлаждении, как
и прежде, их можно обнаружить в виде желтых пятен.
Анализ методом ХТС производных короткоцепочечных соединений како-
го-либо гомологического ряда удовлетворителен только при длине цепи до
170
Специальная часть
С6 или С7. Ступенчатая или двумерная ХТС дает несколько лучшие резуль-
таты. Производные соединений с 10 и большим числом атомов углерода
разделяются только на классы.
ХТС алифатических соединений с короткой цепью и их производных
описана в других главах.
б) Методы разделения соединений с длинной цепью
Смеси алифатических соединений с длинной цепью какого-либо винилого-
мологического ряда фракционируют методом распределительной ХТС с обра-
щенной фазой.
Применение метода «обращенной фазы» предполагает, что анализируемые
винилогомологи совершенно не содержат веществ других классов соедине-
ний. Только в очень редких случаях и только методом распределительной
хроматографии можно разделить сложные смеси соединений, отличающихся
как по природе, так и по числу функциональных групп, а также по длине
цепи и степени ненасыщенности. Поэтому последовательное применение
адсорбционной и распределительной ХТС с обращенной фазой является
идеальной комбинацией при разделении сложных смесей липидов: группы
соединений, не отделяющиеся друг от друга адсорбционной ХТС, разделяют-
ся затем методом распределительной хроматографии. Газовая хроматогра-
фия служит для определения состава жирных кислот из липидов, выделяе-
мых методом адсорбционной и распределительной ХТС с обращенной фазой.
Применение этих трех хроматографических методов в комбинации поз-
воляет осуществить «трехмерный анализ липидов» [129]. Еще раз кратко
сформулируем принцип такого анализа.
Сложные смеси липидов предварительно разделяют методом адсорбцион-
ной ХТС на силикагеле Г на классы соединений, например холестериновые
эфиры, триглицериды, кислоты.
Каждый из этих классов соединений разделяют методом распредели-
тельной ХТС на гидрофобизованных носителях на индивидуальные соедине-
ния, например трипалъмитин, олеодипалъмитин, палъмитодиолеин и три-
олеин.
Отдельные соединения гидролизуют и их конституционные жирные
кислоты идентифицируют- и количественно определяют (после омыления
и метилирования) в виде метиловых эфиров методом газовой хроматографии.
На рис. 90 показано разделение метиловых эфиров высших жирных кис-
лот методом распределительной ХТС с обращенной фазой. Для гидрофоби-
зации пластинок, покрытых слоем силикагеля Г, использовали силикон.
Из этого рисунка видно, что методом распределительной ХТС с обращен-
ной фазой удается разделить соединения с одинаковой длиной цепи и одного
типа, например метиловые эфиры ненасыщенных С18-кислот, по степени
ненасыщенности. Многократно ненасыщенные липиды одного класса про-
двигаются дальше, чем однократно ненасыщенные или насыщенные соеди-
нения с такой же длиной цепи. Этим методом можно разделить и отдельные
члены гомологического ряда: насыщенные метиловые эфиры разделяются
в соответствии с длиной цепи. Величины Rf падают с ростом длины цепи.
Интересно, что величины Rf при распределительной ХТС с обращенной
фазой более воспроизводимы, чем при адсорбционной ХТС.
Как и в случае других распределительных методов — противоточного
распределения [1], распределительной хроматографии с обращенной фазой
на колонках [118] или на пропитанной бумаге [117] — при ХТС на гидро-
фобизованных слоях определенные насыщенные и Ненасыщенные соединения
перемещаются в виде одного пятна. Например, одно пятно образуют метил-
олеат (С18, одна двойная связь) и метилпальмитат (С1в, насыщенное соедине-
Гл. 10. Алифатические липиды
171
ние), а также метиллинолеат (С18, две двойные связи) и метилмиристат
(С14, насыщенное соединение). Триолеин и трипальмитин, трилинолеин
и тримиристин и пары соответствующих свободных кислот или альдегидов
также являются «критическими партнерами» [78]. Как правило, липиды
определенного класса соединений, имеющих две метиленовые группы и одну

9, ° о i 0 • SOO ООО о QO 0 0 0 б м ч/ 0 о J s
1 2 ~3 9 ~5 6 7 8 9 Ю
Рис. 90. Фракционирование класса липидов методом распределительной ХТС
с обращением фаз [76].
Сорбент силикон на силикагеле Г; растворитель ацетонитрил —ледяная уксусная кислота —вода
(70 + 10 + 25); время анализа 40 мин; обнаружение: пары иода (-), затем а-циклодекстрин-
иод (-----); пробы по 20 цз. 1 — метиллаурат; ‘ 2 — метилмиристат; з — метилпальмитат;
4 — метилстеарат; 5 — метиловые эфиры насыщенных кислот; 6 — метиловые эфиры кислот Cis
из рыбьего жира; 7 — метиловые эфиры ненасыщенных кислот Cie; 8 — метилолеат; 9 — метилли-
нолеат; 10 — метиллиноленат.
двойную связь, движутся совместно. Большинство критических партнеров
можно разделить методом низкотемпературной хроматографии [57, 117] или
методом хроматографии с перекисным растворителем [79]. Эти специальные
методы описаны ниже.
Условия разделения
Сорбент. Для гидрофобизации пластинок с силикагелем Г автор рекомен-
дует силиконовое масло, применяемое в хроматографии липидов на бумаге,
«Dow Corning 200 Fluid» (см. стр. 46). Вместо него в качестве гидрофобных
пропиточных средств можно использовать некоторые углеводороды, на!при-
мер ундекан [58], тетрадекан [62] или сквалан [10], или смесь высоко-
молекулярных парафинов [142].
Высокомолекулярные гидрофобизующие пропитки, согласно опыту автора,
превосходят легколетучие углеводороды. Слои, пропитанные силиконом,
парафином или скваланом, не меняют своих свойств в течение нескольких
недель; в противоположность этому при пропитке ундеканом содержание
неподвижной фазы разделительных слоев непрерывно уменьшается, резуль-
тат разделения является всегда неопределенным, и поэтому пластинки
следует всегда держать в атмосфере, насыщенной ундеканом. Пропись для
пропитки пластинок, покрытых слоем силикагеля Г или кизельгура Г, при-
ведена на стр. 45. Там же приведены адреса поставщиков соответствующих
силиконовых и парафиновых препаратов.
Недавно в продаже появились мелкозернистые полиэтиленовые и поли-
амидные порошки для ХТС (см. стр. 42). Эти пластмассы очень хорошо
зарекомендовали себя при фракционировании на колонках жирных кйс-
лот [28] и жирорастворимых витаминов [143]. Некоторые работы по приме-
нению полиамидного порошка для хроматографии в тонких слоях уже
172
Специальная часть
опубликованы [16, 17]. Другие пластмассы, например тефлон [3], должны
оказаться пригодными для разделения липидов методом распределительной
ХТС с обращенными фазами.
Растворитель. Поведение класса липидов на адсорбционных слоях позво-
ляет судить о их полярности и облегчает, таким образом, выбор соответ-
ствующего растворителя для фракционирования этих соединений методом
распределительной ХТС с обращенными фазами.
Большинство смесей растворителей, применяемых при хроматографии
липидов на бумаге, пригодны также для ХТС на гидрофобизованных сло-
ях [58, 76]. Триглицериды и менее полярные липиды (см. рис. 70) обычно
можно разделить в соответствии с длиной цепи и степенью ненасыщенности,
применяя ледяную уксусную кислоту или ацетонитрил, которые содержат до
10% воды. Хорошими растворителями для фракционирования слабо поляр-
ных классов липидов являются также смеси хлороформ — метанол с 5% воды
и смеси ацетона или метилэтилкетона с ацетонитрилом. Для разделения
полярных липидов в соответствии с длиной цепи и степенью ненасыщенности
пригодна смесь: ледяная уксусная кислота — ацетонитрил, а также смеси
ледяной уксусной кислоты и ацетонитрила или тетрагидрофурана с 10—
50% воды. Сильно полярные липиды, например алкилсульфаты или четвер-
тичные аммонийные основания, фракционируют на целлюлозе с водным
этанолом в качестве растворителя.
Малинз и Мангольд [76] использовали смесь ледяной уксусной кислоты
с водой (17+3) для разделения высших жирных кислот на силиконизованном
силикагеле Г. Эти же авторы провели хроматографическое разделение мети-
ловых эфиров высших жирных кислот на силиконе в качестве неподвижной
фазы, применяя в качестве растворителя смесь ацетонитрил — ледяная уксус-
ная кислота — вода (70 + 10 + 25). Хакрабарти [10] нашел, что этот
растворитель может быть также использован при пропитке силикагеля Г
скваланом вместо силиконового масла.
Кауфман и Макус [58] работали с силикагелем Г, пропитанным ундеканом.
Они применяли в качестве растворителя для разделения высших жирных
кислот смеси ледяная уксусная кислота — вода (24 + 1) и ледяная уксусная
кислота — ацетонитрил (1 + 1). Эти же авторы разделяли жирные спирты
на силикагеле Г, пропитанном ундеканом, применяя смесь ледяной уксусной
кислоты с ацетонитрилом (1+3), и жирные эпокси- и эписульфидокислоты,
применяя смесь ледяной уксусной кислоты с водой (4 + 1).
Кауфман и Макус [58] сообщили также о разделении диглицеридов
и триглицеридов методом распределительной ХТС с обращенными фазами.
Смесь хлороформ — метанол — вода (5 + 15 + 1) использовалась для фрак-
ционирования диглицеридов, смесь ацетон — ацетонитрил (7 + 3) исполь-
зовалась для разделения синтетических триглицеридов на силикагеле, про-
питанном ундеканом.
Кауфман и его сотрудники перешли затем к использованию высокомоле-
кулярных гидрофобизующих пропиток. Вместо ундекана они использовали
тетрадекан [62]. В дальнейшем они применяли для пропитки нефтяную
фракцию (т. кип. 240 — 250°) и затем перешли в основном на силиконовое
масло [61]. Кауфман, Макус и Дейке [59], используя двумерную ХТС,
смогли разделить 15 холестериновых эфиров (см. стр. 257). Кауфман, Макус
и Дас [61] разделяли на пропитанном кизельгуре Г смеси синтетических
триглицеридов, а также фракции триглицеридов, выделенных из природных
жиров и масел. Растворителями служили смеси ацетон — ацетонитрил (4 + 1),
метанол — ацетонитрил — пропионитрил (10 + 8 + 3). Кауфман и Дас
[156] сообщили о разделении триглицеридов методом ХТС на гидрофобизо-
ванном кизельгуре Г в работе, появившейся во время издания настоящей
Таблица 14
Растворители для распределительной ХТС с обращенными фазами
Растворитель а Соотношение объемов Неподвижная фаза Фракционируемый класс липидов Литера- тура
Метанол — Парафин 6 Каротинали 142 (см. также стр. 220)
Ледяная уксусная
кислота — вода .... 24+1 Ундекан 6 Жирные кислоты 58
3+1 Силикон 6 Жирные кислоты и их метиловые эфиры 76
Д7 ' 3 » Жирные кислоты и их метиловые эфиры, «альдегидные ядра» из лецитинов д 76 111
Ледяная уксусная 17+3 Сквалан 6 Жирные кислоты и их метиловые эфиры 10
кислота — ацетонитрил Ледяная уксусная 1 + 1 Ундекан б>в Жирные кислоты 58,60
кислота — ацетонит-
рил — вода 2+14+5 Силикон 6 Метиловые эфиры высших жирных кислот 76
2+14+5 Сквалан 6 То же 10
Ацетон — этанол — 129
вода 6+1+3 Полиэтилен г » »
Ледяная уксусная кислота — муравьиная
кислота — вода е ... 2+2+1 Силикон б Жирные кислоты насыщенные/ненасы- щенные 76
Ледяная уксусная кислота — надуксусная
кислота — вода .... 15+2+3 » То же 76
Метилэтил кетон—
ацетонитрил 7+3 Парафин б Холестериновые эфи- ры высших жирных кислот 59
Ледяная уксусная
кислота — вода .... 4+1 Ундекан в Жирные кетокисло- ты, лактоны 62
Ледяная уксусная 4+1 Парафин в Жирные кетокисло- ты, лактоны 62
кислота—вода . , , . 9+1 Тетрадекан в Жирные оксикислоты 62
3+1 Парафин в То же 62
Хлороформ — метанол—
вода 5+15+1 Ундекан б Диглицериды 58
Метанол — ацетонитрил Метанол — ацетонит- 5+4 Силикон в Триглицериды 61
рил — пропионитрил 10+8+3 61
174
Специальная часть
Продолжение табл. 14
Растворитель а Соотношение объемов Неподвижная фаза Фракционируемый класс липидов Литера- тура
Ацетон — ацетонит- рил 4+1 Парафин в » 60,61
7+3 Ундекан » 58
а Все растворители следует насытить неподвижной фазой (гидрофобизующим средством),
б На силикагеле Г.
в На кизельгуре Г.
г Непосредственно на стеклянной пластинке.
д Разделение на классы соединений.
е Хроматографическое разделение при 4—6°.
книги. Следует указать также на две другие публикации по гидрированию
и бромированию ненасыщенных липидов на пластинках, покрытых слоем,
а также по разделению «критических» смесей жирных кислот и «критических»
смесей триглицеридов после химических реакций [158]. Кауфман и Коэ
[158] описывают применение гипса в качестве адсорбента для пластинок.
Критические партнеры можно разделить методом низкотемпературной
хроматографии или хроматографии с использованием перекисных растворите-
лей. Оба эти метода будут описаны подробно в следующих разделах. Третий
метод основан на образовании продуктов присоединения ацетата ртути
к ненасыщенным липидам (см. стр. 175—179).
Шленк с сотрудниками [117], а вскоре затем Кауфман и Мор [57] пока-
зали, что критические пары насыщенных и ненасыщенных липидов могут
быть отделены друг от друга низкотемпературной хроматографией на сили-
конизованной или пропитанной ундеканом бумаге. Малинз и Мангольд [76]
использовали этот метод для фракционирования на силиконизованном силика-
геле смеси пальмитиновой и олеиновой кислот. Смесь ледяная уксусная
кислота — муравьиная кислота — вода (2+2+1) отделяет в течение
примерно 8 час при 4—6° олеиновую кислоту (7?/ 0,10) от пальмитиновой,
которая остается на точке старта.
Для разделения критических пар насыщенных и ненасыщенных липидов и
на силиконизованной бумаге могут быть, согласно Мангольду, Гелерману и
Шленку [79], использованы перекисные растворители. Этот метод был исполь-
зован многократно [7, 80, 85]. Малинз и Мангольд [76] описали метод ХТС
с окислительными растворителями: в водном растворителе следует заменить
1 ч. воды пергидролем, в уксуснокислом — 1ч. кислоты надуксусной кис-
лотой. Эти растворители окисляют все ненасыщенные липиды в процессе хро-
матографического разделения; сильно полярные продукты реакции вымы-
ваются фронтом одновременно, а насыщенные липиды движутся, не пре-
терпевая изменений, и в полезной области хроматограммы отделяются друг
от друга. Типичными перекисными растворителями являются смеси: ледяная
уксусная кислота — надуксусная кислота — вода (15 + 2 + 3) и ледяная
уксусная кислота — вода — перекись водорода (17 + 1 + 2).
Для разделения методом распределительной ХТС с обращенными фазами
требуется обычно 3—4 часа; быстрее движется только растворитель, содер-
жащий ацетонитрил.
В табл. 14 приведена сводка растворителей, используемых для ХТС с об-
ращенными фазами.
Гл. 10. Алифатические липиды
175
Метод обнаружения. Для обнаружения ненасыщенных липидов на
гидрофобизованных пластинках могут быть использованы пары иода [80].
Большинство органических веществ обнаруживаются на силиконизованных
слоях силикагеля Г способом озоления хромовой смесью [111]. Кауфман
с сотрудниками [58, 59] предпочитают в качестве реактива для опрыскивания
родамин В и спиртовый раствор фосфорномолибденовой кислоты.
2', 7'-Дихлорфлуоресцеин, часто применяемый для обнаружения липидов
на адсорбционных слоях, не пригоден в случае гидрофобизованных пла-
стинок [76].
Применение и результаты
На рис. 90 (6) в качестве примера показано применение гидрофобизован-
ных слоев для разделения жирных кислот из рыбьего жира в виде их метило-
вых эфиров. Идентичность различных эфиров была доказана одновремен-
ным хроматографированием известных эталонных веществ и с помощью
УФ-спектров полиеновых эфиров, подвергнутых изомеризации щелочью.
Выделено неизвестное соединение, которое нельзя было идентифицировать
ни методом щелочной изомеризации, ни методом газовой хроматогра-
фии [76].
Кауфман, Макус и Коэ [60] фракционировали методом распределитель-
ной ХТС с обращенной фазой триглицериды льняного масла, а также соевого
масла и суррогата масла какао. Кауфман, Макус и Дас [61] сообщили
о разделении триглицеридов маисового масла. Эти же авторы фракциониро-
вали методом обращенной фазы также триглицеридные фракции подсолнеч-
ного, кунжутного и оливкового масел, свиного и говяжьего сала. В каждом
случае получалось несколько резко ограниченных пятен более простых
смесей триглицеридов. Маисовое масло, например, было разделено на
8 триглицеридных фракций, льняное масло дало даже 10 пятен.
В связи с этим следует указать также на работы Винтерштейна с сотруд-
никами [141, 142] по разделению каротиналей (см. стр. 220).
3. РАЗДЕЛЕНИЕ ЛИПИДОВ В СООТВЕТСТВИИ
СО СТЕПЕНЬЮ НЕНАСЫЩЕННОСТИ
Методом адсорбционной хроматографии липиды разделяют прежде всего
на классы соединений. Распределительная хроматография с обращенной
фазой позволяет фракционировать смеси веществ одного класса в соответ-
ствии с длиной цепи и степенью ненасыщенности. Границы возможного
применения последнего метода определяются тем обстоятельством, что
соединения, имеющие одну двойную связь и две метиленовые группы, напри-
мер метил олеат и метилпальмитат, движутся совместно. В определенных
случаях подобные «критические партнеры» могут быть отделены друг от
друга методом низкотемпературной хроматографии. Смеси насыщенных
и ненасыщенных липидов одного класса можно разделить также путем
образования производных ненасыщенных компонентов. Проще всего окислить
все ненасыщенные липиды. В качестве примера можно привести отмеченное
на стр. 174 окисление ненасыщенных липидов перекисными растворителями
в процессе хроматографического разделения. Этот метод является коли-
чественным, но имеет недостаток, заключающийся в том, что ненасыщенные
соединения не могут быть регенерированы из продуктов окисления.
Имеются также опыты по получению таких производных ненасыщенных
липидов, которые можно вновь подвергнуть расщеплению. Особенно легко
получить ацетоксимеркуриметоксипроизводные [13] — продукты присоеди-
нения, образующиеся в результате реакции ненасыщенных соединений со
176
Специальная часть
слабым уксуснокислым раствором ацетата ртути в метаноле:
Н Н
Hg(CH3COO)2
CH3OH
н н
I I
--С----С —
I I
ОСН3 HgOCOCH3
Эта реакция присоединения протекает при комнатной температуре
с количественным выходом [43]. г^с-Соединения реагируют в 10—20 раз
Рис. 91. Тонкослойная хроматограмма продуктов присоединения ацетата ртути
на силикагеле Г [83].
Растворитель: I —петролейный эфир (т. кип. 60—70°) —диэтиловый эфир (4 + 1); II —н-про-
панол —ледяная уксусная кислота (100 + 1); время анализа: I 1,5—2 час; II 3—4 час; обнаруже-
ние: s-дифенилкарбазон в этаноле и затем пары иода; пробы: по 20 ц.г метиловых эфиров, 50—100 ц.г
продуктов присоединения. 1 — метилстеарат; 2 — метилолеат; 3 — мётиллинолеат; t — метилли-
ноленат; 5—70 — продукты присоединения ацетата ртути к метиловым эфирам кислот Cis из
Chlorella -pyrenoidosa (5), метиловым эфирам кислот Cis из Chlorella (б), метиловым эфирам
суммы кислот из Chlorella (7), метилолеату («), метиллинолеату (9), метиллиноленату (70);
II — ацетат ртути.
быстрее, чем соответствующие транс-изомеры [43]. Ненасыщенные соедине-
ния могут быть регенерированы путем реакции аддуктов с соляной кислотой,
не ^вызывающей ^ас-транс-изомеризации или смещения двойных свя-
зей [42, 45].
Инуйе с сотрудниками разделяли методом хроматографии на бумаге
продукты присоединения ацетата ртути к метиловым эфирам высших жирных
кислот [38], а также продукты присоединения к лецитинам [39] и три-
глицеридам [40, 101]. Кауфман и Поллерберг [55] фракционировали также
на бумаге аддукты аллиловых эфиров жирных кислот с очень длинной цепью.
Янцен и Андреас [42, 44] и Янцен, Андреас, Моргенштерн и Рот [45]
отделяли метиловые эфиры насыщенных жирных кислот от продуктов при-
соединения ацетата ртути к метиловым эфирам ненасыщенных жирных кислот
методом адсорбционной хроматографии на колонках с силикагелем. Эти же
авторы показали, что продукты присоединения ацетата ртути к эфирам
ненасыщенных кислот независимо от длины цепи разделяются строго в соот-
ветствии со степенью ненасыщенности (или в соответствии с числом ацето-
ксимеркуриметоксигрупп, приходящихся на молекулу).
Напрашивается применение этого метода фракционирования также
в случае покрытых слоем пластинок. На рис. 91 схематически показана
возможность применения метода ХТС к продуктам присоединения ацета-
та ртути.
Гл. 10. Алифатические липиды
177
Даже смеси различных классов липидов можно разделить методом ХТС
в виде продуктов присоединения ацетата ртути в соответствии со степенью
ненасыщенности, однако при условии, что соединения не слишком различают-
ся по полярности. Например, углеводороды, эфиры восков и ацетаты спиртов
настолько слабо полярны, что хроматографическое поведение их продуктов
присоединения целиком определяется числом ацетоксимеркуриметоксигрупп,
приходящихся на молекулу. Поэтому продукты присоединения ацетата
ртути к октадецену-9, цетил олеату и олеилацетату перемещаются не разде-
ляясь, точно так же как продукты присоединения к октадекадиену-9,12,
цетиллинолеату и линолеилацетату.
а) Получение продуктов присоединения ацетата ртути
Оправдала себя следующая методика Янцена и Андреаса [43 , 44].
Реактив представляет собой раствор 14 г ацетата ртути (II) в 250 мл метанола, содер-
жащего 2,5 мл воды и 1 мл ледяной уксусной кислоты. Для обработки липидов с неболь-
шим иодным числом 40 мл этого раствора смешивают с 1 г пробы. Для липидов с иод-
ным числом, превышающим 100, применяют 0,4 X и. ч. мл раствора реагента на 1 г
пробы. Реакционную смесь хранят в склянке с атмосферой азота в темноте.
Если все ненасыщенные соединения находятся в ^wc-форме, то реакция протекает
до конца при комнатной температуре в течение 12 час; для реакции транс-соединений
требуется не менее 2 дней.
После окончания реакции большую часть метанола упаривают при температуре
ниже 30° в вакууме. Остаток растворяют в 10—20 мл хлороформа, несколько раз про-
мывают водой для удаления избытка ацетата ртути и сушат хлороформный раствор про-
дуктов присоединения безводным сульфатом натрия.
Леннартц разработал усовершенствованную методику. Она описана
подробно Гольдфайном и Блохом [27].
Большей частью продукты присоединения ацетата ртути к ненасыщен-
ным липидам представляют собой прозрачные бесцветные масла. Для раз-
деления методом ХТС их наносят в виде растворов в хдороформе.
б) Условия разделения
Сорбент. Для фракционирования продуктов присоединения ацетата
ртути к липидам, содержащим до трех двойных связей, весьма пригоден
Рис. 92. Тонкослойная хроматограмма продуктов присоединения
ацетата ртути к метиловым эфирам жирных кислот из водоросли
Chlorella pyrenoidosa (ср. рис. 91 и 93).
силикагель Г [83]. Другие адсорбенты еще не испробованы. Весьма жела-
тельно подобрать разделительные слои, обеспечивающие также фракциони-
рование продуктов присоединения более ненасыщенных липидов.
Продукты присоединения в большинстве случаев подвергаются хромато-
графическому разделению в препаративном масштабе: на стандартной пла-
стинке 20 X 20 см разделяют до 10 мг этих соединений (см. рис. 92).
12 Заказ X. 734
178
Специальная часть
Растворитель. Петролейный эфир (60—70°)— диэтиловый эфир (4 + 1) за
1,5—2 часа отделяет метиловые эфиры насыщенных жирных кислот от
^продуктов присоединения ацетата ртути к эфирам ненасыщенных кислот.
За это время фронт достигает высоты 15—18 см. Второй растворитель — смесь
н-пропанола и ледяной уксусной кислоты (100 + 1)— служит для фрак-
ционирования продуктов присоединения к ненасыщенным эфирам. За
3—4 часа он перемещается на 12—14 см.
Насыщенные и ненасыщенные углеводороды, эфиры восков, ацетаты
спиртов, нитрилы и другие слабо полярные липиды, а также удивительным
образом и спирты, моноглицериды и даже жирные кислоты при этих же
условиях фракционируются в виде продуктов присоединения.
Метод обнаружения. Продукты присоединения к ненасыщенным липидам
можно обнаружить в виде пятен, окрашенных от фиолетового до пурпур-
ного цвета на светло-розовом фоне при опрыскивании 0,1%-ным раствором
s-дифенилкарбазона в 96%-ном этаноле. Насыщенные эфиры локализуют
2', 7"-дихлорфлуоресцеином или парами иода (реактивы № 42 и № 72).
Ацетоксимеркуриметоксисоединения моноенов (hRf 85), диенов (двойное
пятно, hRf 55 и 45) и триенов (hRf 15) четко отделяются друг от друга —
длина цепи различных эфиров не оказывает никакого влияния на хромато-
графическое поведение продуктов присоединения. Приведенные здесь вели-
чины Rf хорошо воспроизводятся; по-видимому, при хроматографии со
смесью н-пропанол — ледяная уксусная кислота процесс распределения
преобладает над адсорбционными эффектами.
Насыщенные эфиры с различной длиной цепи располагаются между дву-
мя фронтами растворителей.
в) Обработка продуктов присоединения
Силикагель Г соскребают с пластинки для ХТС с тремя группами адсор-
бированных продуктов присоединения в виде полос шириной 2—3 см. Каж-
дую из трех фракций встряхивают в пробирке с 10 мл метанола и 0,5 мл
концентрированной соляной кислоты в атмосфере азота. После непродолжи-
тельного стояния адсорбент оседает и почти прозрачный раствор декантируют
и фильтруют. Осадок повторно обрабатывают смесью метанола с соляной
кислотой. Объединенные фильтраты фракций разбавляют 25 мл воды, экстра-
гируют один раз порцией 25 мл и затем четыре раза порциями по 10 мл
диэтилового эфира. Эфирные вытяжки сушат сульфатом натрия. После
декантации растворитель отгоняют и получают группы соединений с одной,
двумя и тремя двойными связями и более ненасыщенные липиды. Насыщен-
ные липиды элюируют смесью петролейного эфира и диэтилового эфира
(1 + 1) или диэтиловым эфиром.
г) Применение и результаты
Разделение продуктов присоединения ацетата ртути к липидам методом
ХТС использовали прежде всего для смесей метиловых эфиров [83]. Этот
метод идеально дополняет газовую хроматографию: сложные смеси эфиров
высших жирных кислот, не разделяемые газохроматографически, можно
предварительно разделить методом ХТС продукты присоединения ацетата
ртути. Степень чистоты групп эфиров насыщенных кислот, а также кислот
с двумя и тремя двойными связями превышает 98%. Каждая группа в отдель-
ности была разделена методом газовой хроматографии в соответствии с дли-
ной цепи. Газовая хроматография таких групп эфиров облегчает идентифи-
кацию отдельных компонентов и позволяет также обнаружить следы эфиров,
которые не были обнаружены при хроматографировании общей пробы.
Рис. 93 схематически иллюстрирует принцип описанного здесь метода.
Гл. 10. Алифатические липиды
179
Рис. 93. Схема газохроматографического анализа метиловых эфиров жирных кислот
после предварительного разделения методом ХТС продуктов присоединения ацетата
ртути (см. рис. 92) [83].
Комбинированное применение методов ХТС и газовой хроматографии
приводит к более надежному количественному анализу, чем при исполь-
зовании только метода газовой хроматографии (см. также [155]).
4. РАЗДЕЛЕНИЕ ЦИС-ТРАНС-ИЗОМЕРОВ
Как показали Моррис, Хольман и Фонтел [93], методом ХТС на силикаге-
ле Г в редких случаях удается фракционировать эфиры цмс-трпмс-изомерных
жирных кислот.
Недавно стал известен общий метод разделения цмс-трпмс-изомеров
липидов: ненасыщенные соединения образуют с ионами серебра комплексы,
имеющие различную растворимость.
Никольс [160] еще в 1952 г. указал на то, что метилолеат (г^ис-октадеценоат)
и метилэлаидат (транс-октадеценоат) можно разделить способом распределения между
двумя несмешивающимися жидкостями, содержащими небольшое количество нитрата
серебра. Датмон, Шолфилд и Джонс [151] несколько лет спустя осуществили такое
разделение.
Заслуга де Ври [165] состоит в том, что он впервые показал, что г^мс-транс-изомеры
разделяются также на слоях силикагеля, пропитанных нитратом серебра. Он осуще-
ствил фракционирование смеси метилстеарата, метилэлаидата и метилолеата и смеси
элаидодипальмитина и олеодипальмитина на колонках с силикагелем Г, содержавшим
нитрат серебра. Далее, ему удалось показать, что метиловые эфиры кислот различной
степени насыщения, например метилолеат, метиллинолеат и метиллиноленат, также
разделяются в виде комплексов с ионами серебра. Четко можно разделить также три-
стеарин, олеодипальмитин, стеародиолеин и триолеин.
Моррис [159] использовал этот принцип для фракционирования метило-
вых эфиров кислот с одной и несколькими двойными связями. Он отделял
также олефиновые эфиры от эфиров с одной тройной связью, цис-транс-
Изомеры метилолеата и метилэлаидата, а также соответствующие эпокси-
и оксиэфиры были хорошо разделены на слоях силикагеля Г, пропитанного
12*
180
Специальная часть
нитратом серебра. В качестве растворителя применяли смесь петролейный
эфир (т. кип. 60—70°) — диэтиловый эфир (60 + 40), для обнаружения
использовали 2',7'-дихлорфлуоресцеин (реактив № 42).
Моррис [159] продемонстрировал дальше, что трео- и эритро-формы
насыщенных диоксиэфиров можно разделить в виде боратных комплексов
на слоях силикагеля Г, пропитанного водным раствором борной кислоты.
Этот же автор совместно наносил раствор нитрата серебра и борной кислоты
на пластинки, покрытые силикагелем Г, и фракционировал насыщенные
и ненасыщенные трео- и эрмтро-диоксиэфиры. Смесь петролейный эфир
(т. кип. 60—70°) — диэтиловый эфир (40 + 60) использовалась в качестве
растворителя, а 2',7'-дихлорфлуоресцеин — в качестве индикатора.
Баррет, Даллас и Падли [149] сообщили о фракционировании синтетиче-
ской смеси триглицеридов, а также свиного сала, масла какао, масла хлоп-
кового семени и других жиров и масел методом ХТС на слое силикагеля Г,
пропитанного нитратом серебра.
5. ВЫВОДЫ
ХТС применяется при исследовании липидов в первую очередь в виде
адсорбционного метода для разделения сложных смесей на классы соеди-
нений. При использовании этого изящного метода один сотрудник в течение
1 дня может легко фракционировать в десять раз больше проб, чем при
использовании колоночной хроматографии в течение недели. Разделение
методом ХТС является значительно более четким, чем разделение методом
колоночной хроматографии. Для количественного анализа разделяемых
липидов существует уже много методов [84, 108, 109, 134, 140] (см. также
стр. 52). Отдельные классы липидов могут быть элюированы и выделены.
Путем омыления этих липидов легко выделить жирные кислоты и затем
провести их фракционирование и количественное определение в виде мети-
ловых эфиров методом газовой хроматографии [76, 77, 82, 129].
Метод адсорбционной ХТС может быть дополнен методом распредели-
тельной ХТС на дезактивированных, содержащих воду адсорбентах и мето-
дом распределительной ХТС с обращенными фазами на гидрофобизованных
слоях: распределительная ХТС на дезактивированных адсорбентах позволяет
разделять сильно полярные липиды (см. стр. 163). Методом распредели-
тельной ХТС с обращенными фазами можно фракционировать соединения
одного класса липидов (см. стр. 170—175).
Фракционирование липидов по степени ненасыщенности методом ХТС
продуктов присоединения ацетата ртути представляет собой дальнейшее
усовершенствование метода. Таким образом удается разделять цис-транс-
изомеры (см. стр. 175—180).
Большие преимущества метода ХТС: простота, быстрота, четкость разде-
ления, чувствительность метода обнаружения разделяемых веществ и высо-
кая емкость слоев полностью используются только в случае сочетания раз-
личных вариантов ХТС. В первую очередь следует последовательно приме-
нять адсорбционную ХТС и распределительную ХТС с обращенными фаза-
ми: смеси липидов, не разделяющиеся на адсорбентах, можно разделить
распределительным методом, и наоборот.
ХТС липидов на ионообменниках еще пока не описана. Можно полагать,
что ионообменная ХТС может оказаться весьма полезной при фракциони-
ровании сильно полярных липидов. Для осуществления подобных разделе-
ний, вероятно, пригоден ионофорез в тонких слоях и хроматография и ионо-
форез в тонких слоях (см. стр. 32). Перспективна также хроматография на
тонких слоях мочевины или других веществ, способных образовать соедине-
ния включения. Вероятно, на слоях мочевины можно отделить неразвет-
Гл. 10. Алифатические липиды 181
вленные липиды от многократно разветвленных, а также насыщенные от
ненасыщенных.
Вещество, оказавшееся однородным после применения различных мето-
дов хроматографического разделения, можно рассматривать как «хромато-
графически чистое». На рис. 44 приведен радиоавтограф тонкослойной
хроматограммы меченых жирных кислот. Фирма-изготовитель указала, что
«чистота» каждой такой кислоты была подтверждена методом газовой хрома-
тографии. Рис. 44 показывает, однако, что эти продажные препараты, все
без исключения, представляют собой смеси. Почти все загрязнения —
промежуточные продукты синтеза этих кислот — более полярны, чем сами
жирные кислоты. Они, по-видимому, застревают в газохроматографической
колонке и не регистрируются в элюате.
То обстоятельство, что при ХТС весь разделительный путь расположен
открыто, представляет особое преимущество метода. В противоположность
всем колоночнохроматографическим методам ни одно вещество не может
ускользнуть от наблюдения, даже если оно является летучим. Было показа-
но, что смеси летучих веществ (и даже газы) могут быть фракционированы
методом ХТС в форме производных (см. стр. 168—170).
Махадеван [75] исследовал окисляемость ненасыщенных липидов в про-
цессе хроматографического разделения в тонких адсорбционных слоях.
Однако даже самыми чувствительными химическими методами он не смог
доказать автоокисления жирных кислот с несколькими двойными связями
и их холестериновых эфиров в процессе разделения методом ХТС. Напротив,
он обнаружил, что метод ХТС весьма пригоден для быстрой чистки автоокис-
ляющихся липидов.
Легко также показать методом двумерной ХТС, что при нормальных
условиях автоокисление в процессе хроматографического разделения не
оказывает влияния. Если разделить сильно ненасыщенные нейтральные
липиды методом двумерной хроматографии, используя один и тот же раствори-
тель, то разделенные вещества лежат на одной диагонали [84]. Полярные
продукты окисления, перемещающиеся очень медленно, можно обнаружить
только после того, как пластинка, обработанная в одном направлении, хро-
матографируется затем не менее 10 мин в другом направлении. Ъ,- ,
При выделении липидов методом ХТС весьма важно как можно быстрее
соскрести еще влажный адсорбент и сразу же элюировать. Автоокисление
наступает быстро, если хроматограмма не содержит защитной пленки рас-
творителя. Поэтому ненасыщенные липиды на гидрофобизованных слоях
значительно более устойчивы, чем на сухих адсорбционных слоях.
Пригодные для липидов растворители выбирают, проводя хроматографи-
ческое разделение этих веществ при использовании нескольких полярных
растворителей. Растворитель, который перемещает данный класс липидов
вблизи фронта, следует применить в качестве элюирующего вещества (см.
стр. 138). Для элюирования нейтральных липидов наиболее пригоден диэти-
ловый эфир, иногда с добавкой 10—20% метанола. Сильно полярные липи-
ды имеют склонность образовывать трудно растворимые соли и комплексы
с ионами кальция адсорбента, к которому в качестве связующего добавлен
гипс. Однако, применяя специальные растворители, можно количественно
элюировать и такие классы соединений, как, например, фосфолипиды [111].
Сильно полярные липиды Чс1сто имеет смысл подвергнуть хроматографическо-
му разделению в форме слабо полярных производных, которые элюируются
затем без затруднений [80, 84].
В случае разделения метиловых эфиров высших жирных кислот методом
газовой хроматографии часто, руководствуясь только удерживаемыми
объемами, «идентифицируют» вещества как эфиры разветвленных жирных
кислот. В действительности, однако, эти вещества являются альдегидами
182
Специальная часть
содержащимися в животных тканях в свободном состоянии или в виде
альдегидогенных липидов наряду с эфирными липидами или альдегид-
диметилацеталями, которые образуются из альдегидов в процессе этери-
фикации жирных кислот смесью метанола с соляной кислотой. Метод адсорб-
ционной ХТС позволяет легко доказать присутствие таких загрязнений
в метиловых эфирах и выделить чистые эфиры перед газохроматографиче-
ским анализом [129]. По мнению автора, предварительная очистка анализи-
руемого материала методом адсорбционной хроматографии является необ-
ходимым условием каждого газохроматографического анализа. Только это
условие обеспечивает разделение методом газовой хроматографии действи-
тельно одного класса соединений.
Метод ХТС оправдал себя также при анализе и очистке радиоактивно
меченных липидов. Некоторые типичные примеры применения метода рас-
смотрены на стр. 72.
Отделение методом ХТС алициклических жирных примесей рассмотрено
в ряде разделов настоящей книги. Особенно следует отметить значение мето-
да для химии стеринов (стр. 251), каротинов (стр. 218), жирорастворимых
витаминов (стр. 213—236), терпенов и смол (стр. 186—211).
ЛИТЕРАТУРА
1. Ahrens Е. Н., jr., Craig L. С., J. Biol. Chem., 195, 299 (1952).
2. Applewhite T. H., Diamond M. J., Goldblatt L. A., J. Am. Oil
Chemists’ Soc., 38, 609 (1961).
3. A r c u s A. C., D u n c k 1 e у G. G., J. Chromatog., 5, 272 (1961).
4. Bloor W. R., J. Biol. Chem., 77, 53 (1928).
5. Boer Th. J. d e, В a ck e r H. J., in Organic Syntheses, Vol. 34, p. 96, W. S. J о h n-
s о n, Editor, New York, John Wiley and Sons, Inc., London, Chapman and Hall.,
Ltd., 1954.
6. Brockmann H., Volpers F., Chem. Ber., 82, 95 (1949).
7. Buchanan M. A., Anal. Chem., 31, 1616 (1959).
8. Carroll К. K., J. Lipid Res., 2, 135 (1961).
9. C a r t e r H. E., M с C 1 u e r R. H., S 1 i f e r E. D., J. Am. Chem. Soc., 78, 3735
(1956).
10. Chakrabarty M., частное сообщение, 1961.
11. Chalvardjian A., Morris L. J., Holman R. T., J. Nutrition, 76 52
(1962).
12. Chalvardjian А., частное сообщение, 1961.
13. Chatt J., Chem. Revs., 48, 7 (1951).
14. C r a i g L. C., Craig D., in Technique of Organic Chemistry, Vol. Ill, p. 171,
A. Weissberger, Editor, New York, Interscience Publishers Inc., 1950.
15. Dain J.A., Weicker H., Schmidt G.,Thannhauser S. J., in Sympo-
sium on Sphingolipidoses and Allied Diseases, p. 289, Academic Press, New York, 1961.
16. Davidek J., Davidekova E., Pharmazie, 16, 352 (1951).
17. Davidek J., Pokorny J., Z. Lebensm.-Untersuch. und -Forsch., 115, 113
(1961).
18. Dhopeshwarkar G. A., Mead J. F., J. Am. Oil Chemists’ Soc. 38, 297
(1961).
18a. Dhopeshwarkar G. A., Mead J. F., J. Lipid Res., 3, 238 (1962).
186. Dhopeshwarkar G. A., Mead J. F., Proc. Soc. Exptl. Biol. Med., 109,
425 (1962).
19. E n t e n m a n C., J. Am. Oil Chemists’ Soc., 83, 534 (1961).
20. F i 1 1 e r u p D. L., M e a d J. F., Proc. Soc. Exptl. Biol. Med., 38, 574 (1953).
21. Folch J., Ascoli I., Lees M., Meath J. А., В a г о n F. N. 1 e, J. Biol.
Chem., 191, 833 (1951).
22. Folch J., Lees M., Sloan-Stanley G. H., J. Biol. Chem., 226, 497 (1957).
23. Font ell K., Holman R. T., L a m b e r t s e n G., J. Lipid Res., 1, 391
(1960).
24. F r e i t a s A. d e, Thesis, Univ, of Minnesota, 1962.
25. Fulco A. J., Mead J. F., J. Biol. Chem., 236, 2416 (1961).
26. G a u g 1 i t z E. J., jr., M a 1 i n s D. C., J. Am. Oil Chemists’ Soc., 37, 425 (1960).
27. Gold fine H., Bloch K., J. Biol. Chem., 236, 2596 (1961).
Гл. 10. Алифатические липиды
183
28. Green Т., Howitt F. О., Preston R., Chem. and Ind., 1955, 591.
29. G r u g e r E. H., jr., M a 1 i n s D. C., G augli t z E. J., jr., J. Am. Oil Che-
mists’ Soc., 37, 214 (1960).
30. Habermann E., Bandtlow G., Krusche B., Klin. Wschr., 39, 816
(1961).
31. H a m i 1 t о n J. G., M u 1 d г e у J. E., J. Am. Oil Chemists’ Soc., 38, 582 (1961).
32. H a n a h a n D. J., Lipide Chemistry, New York — London, John Wiley and Sons,
Inc., 1960.
33. H i 1 d i t c h T. P., The Chemical Constitution on Natural Fats, 3rd Edition, Lon-
don, Chapman and Hall, Ltd., 1956.
34. H i r s c h J., Ahrens E. H., jr., J. Biol. Cbem., 233, 311 (1958).
35. H i r s c h J., Federation Proc., 20, 269 (1961).
36. Hofmann A. F., J. Lipid Res., 3, 391 (1962).
37. Huhnstock K., Weicker H., Klin. Wschr., 38, 1249 (1960).
38. I n о u у e Y., Noda M., H i г a у a m a O., J. Am. Oil Chemists’ Soc., 32, 132
(1955).
39. Inouye Y., Noda M., Arch. Biochem. Biophys., 76, 271 (1958).
40. I.n о u у e Y., Noda M., J. Agr. Chem. Soc. Japan, 33, 452 (1959).
41. Janistyn H., Parfumerie und Kosmetik, 41, 371 (1960).
42. J a n t z e n E., A n d r e a s H., Angew. Chem., 70, 656 (1958).
43. Jantzen E., Andreas H., Chem. Ber., 92, 1427 (1959).
44. Jantzen E., Andreas H., Chem. Ber., 94, 628 (1961).
45. Jantzen E., Andreas H., Morgenstern K., Roth W., Fette, Seifen,
Anstrichmittel, 63, 685 (1961).
46. Jatzkewitz H., Hoppe-Seyler’s Z. physiol. Chem., 320, 134 (1960).
47. Jatzkewitz H., Mehl E., Hoppe-Seyler’s Z. physiol. Chem., 320, 251 (1960).
48. Jatzkewitz H., Hoppe-Seyler’s Z. physiol. Chem., 326, 61 (1961).
49. J ii be rman n O., in Methoden der organischen Chemie, Bd. 1/1, S. 223, heraus-
gegeben von E. Muller, 4. Aufl., Stuttgart, Georg Thieme Verlag, 1958.
50. Kammereck R., неопубликованные данные.
51. Kates M., Can. J. Biochem. and Physiol., 35, 127 (1957).
52. К a then H., Arch. Mikrobiol., 14, 602 (1949).
53. Kauffmann T., Kodding R., Z. Naturforsch., 12, 735 (1957).
54. Kaiifmann H. P., Nitsch W. H., Fette, Seifen, Anstrichmittel, 56, 154 (1954).
55. Kaufmann H. P., P о lie r be rg J., Fette, Seifen, Anstrichmittel, 59, 815
56.
57.
58.
59.
a n n H. P. (Herausgeber), Analyse der Fette und Fettprodukte, Berlin —
— Heidelberg, Springer-Verlag, 1958.
ann ” ~
a n n
ann
H.
H.
H.
P., M о h r E., Fette, Seifen, Anstrichmittel, 60, 165 (1958).
" " Fette, Seifen, Anstrichmittel, 62, 1014 (1960).
Dei eke F., Fette, Seifen, Anstrichmittel,
P., M a k u s
P., M a k u s
Z., ]
Z'., D e i c k e
(1957).
К a u f m
Gottingen
К a u f m
К a u f m
К a u f m
63, 235 (1961).
Kaufmann
63, 689 (1961).
61. Kaufmann
807 (1961).
62. Kaufmann
63. К 1 e n k E., G
64. К 1 e n k E., G i e 1 e n W., Hoppe-Seyler’s Z. physiol. Chem., 326, 144 (1961).
65. Кочетков H. К., Жукова И. Г., Глухо дед И. С., ДАН СССР, 139,
605 (1961).
Kuhn ”
Kuhn R
Kurz
60.
66.
67.
68.
R.
H.
H.
H.
i e
P., M a k u s
P., M a k u s
Z., К h о e T.
Z., Das B.,
H., Fette, Seifen, Anstrichmittel,
Fette, Seifen, Anstrichmittel, 63,
Y., Fette, Seifen, Anstrichmittel, 63, 828 (1961).
P., Su Ko ’ , ,
1 e n W., Hoppe-Seyler’s Z. physiol. Chem., 323, 126 (1961).
Naturwiss., 46, 43 (1959).
Wiegandt H., Egge H., Angew. Chem., 73, 580 (1961).
H., Fette und Seifen, 44, 144 (1937).
69. L a w s о n D. D., Getz H. R., Chem. and Ind., 1961, 1404.
70. Lea С. H., Rhodes D. N., Biochem. J., 54, 467 (1953).
71. L e a С. H., R h о d e s D. N., S t о 1 1 R. D., Biochem. J., 60, 353 (1955).
72. Baron F. N. le, Rothleder E. E., in Biochemistry of Lipids, p. 1, G. P o-
p j a k, Editor, New York — Oxford — London — Paris, Pergamon Press, 1960.
73. Lees M., Folch J., Sloan-Stanley G.H., Carr S., J. Neurochem., 4,
9 (1959).
74. Mahadevan V., Lundberg W. O., J. Lipid Res., 3, 106 (1962).
75. Mahadevan, частное сообщение, 1961.
76. M a 1 i n s D. C., Mangold H. K., J. Am. Oil Chemists’ Soc., 37, 576 (1960).
77. Malins D. C., Chem. and Ind., 1960, 1359.
78. M a n g о 1 d H. K., Lamp B. G., Schlenk H., J. Am. Chem. Soc., 77, 6070
(1955).
79. M a n g о 1 d H. K., Gellerman J. L., Schlenk H. Federation Proc., 17,
268 (1958).
184
Специальная часть
80.
81.
82.
83.
84.
Mangold Н. К., Fette, Seifen, Anstrichmittel, 61, 877 (1959).
Mangold H. К., М а 1 i n s D. C., J. Am. Oil Chemists’ Soc., 37, 383 (1960).
Mangold H. K., Tuna N., Federation Proc., 20, 268 (1961).
Mangold H. K., Kammereck R., Chem. and Ind., 1961, 1032.
Mangold H. K., Kammereck R., Malins D. C., Proceedings — 1961
International Symposium on Microchemical Techniques. Microchem. J., Symposium
85. M a n g о 1 d H. K., Kammereck R., J. Am. Oil Chemists’ Soc., 39, 201 (1962).
86. M a n g о 1 d H. K., in Progress in the Chemistry of Fats and other Lipids,
R. T. H о 1 m a n., W. O. Lundberg, T. Malkin, Editors, London — New
York — Paris, Pergamon Press, 1963.
87. Marinetti G. V., Erbland J., Kochen J., Federation Proc., 16, 837
(1957).
88. Mead J. F., Fillerup D. L., Proc. Soc. Exptl. Biol. Med., 86, 449 (1954).
89. Mead J. F., F i 1 1 e r u p D. L., J. Biol. Chem., 227, 1009 (1957).
90. M e c h a m D. K., Mohammad A., Cereal Chem., 32, 405 (1955).
91. Metcalfe L. D., Schmitz A. A., Anal. Chem., 33, 363 (1961).
)92 . Morris L. J., Hayes H., Holman R. T., J. Am. Oil Chemists’ Soc., 38,
316 (1961).
93. Morris L. J., Holman R. T., Font ell K., J. Am. Oil Chemists’ Soc.,
37, 323 (1960).
94. M о r r i s L. J., H о 1 m a n R. T., F о n t e 1 1 K., J. Lipid Res., 1, 412 (1960).
95. M о r r i s L. J., H о 1 m a n R. T., F о n t e 1 1 K., J. Lipid. Res., 2, 68 (1961).
96. Morris L. J., in Chromatography, p. 428. E. Heftman n, Editor, New York,
Reinhold Publishers, 1961.
97. Morris L. J., Mangold H. К., неопубликованные данные.
98. Morris L. J., частное сообщение, 1961.
99. Nelson J., Thesis, Univ, of Minnesota, 1961.
100. Noda M., J. Agr. Chem. Soc. Japan, 33, 417 (1959).
101. Noda M., Hirayama O., Y u.k a g a k u, 10, 24 (1961).
102. Patel N. G., Haydak M. H., Lovell R., Nature 191, 362 (1961).
103. Peifer J. J., Mikrochim. Acta, 1962, 529.
104. Peifer J. J., Muesing R. A., jr., Janssen F. W.,J. Am. Oil Chemists’
Soc., в печати.
105. Polonovski J., D ouste-B lazy L., in Proceedings of the 2nd Interna-
tional Conference on Biochemical Ptoblems of Lipids, p. 64, G. P о p j a k, E. 1 e
Breton, editors, New York — London, Interscience Publishers Inc. and Butter-
worth Scientific Publications, 1956.
106. Potter V. R., Elvehjem C. A., J. Biol. Chem., 114, 495 (1936).
107. Privett O. S., in Proceedings of the Flavor Chemistry Symposium, p. 147, Cam-
den, New Jersey, Campbell Soup Company, 1961.
108. Privett O. S., Blank M. L., J. Lipid. Res., 2, 37 (1961).
109. Privett O. S., В 1 a n k M. L., L u n d b e r g W. O., J. Am. Oil Chemists’
Soc., 38, 312 (1961).
110. Privett O. S., Blank M. L., J. Am. Oil. Chemists’ Soc., в печати.
111. Privett O. S., Blank M. L., частное сообщение, 1961.
112. Privett О. S., Nickell Ch., J. Am. Oil Chemists’ Soc., в печати.
113. Radin N. S., Ha jra A. K., A k a h о r i Y., J. Lipid Res., 1, 250 (1960).
114. Roper R., M a T. S., Microchem. J., 1, 245 (1957).
115. Rumpf H., Lange Th., Stroh W., in Methoden der organischen Chemie,
Bd. 1/2, S. 3, herausgegeben von E. Muller, 4. Aufl., Stuttgart, Georg Thieme, 1959.
116. Schlemmer W., Boll. Soc. ital. Biol. Sperm., 37, 134 (1961).
117. Schlenk H., G e 11 e r man J. L., Tillotson J. A., Mangold H. K.,
J. Am. Oil Chemists’ Soc., 34, 377 (1957).
118. Schlenk H_, Gellerman J. L., J. Am. Oil. Chemists’ Soc., 38, 555 (1961).
119. Schmid M. E., В о 1 1 i g e r H. R., Helv. Chim. Acta, 37, 884 (1954).
120. Schroeder W. A., Ann. N. Y. Acad. Sci., 49, 204 (1948).
121. Sperry W. M., in Methods of Biochemical Analysis, Vol. II, p. 83, D. Glick,
editor, New York, Interscience Publishers Inc., 1955.
122. Stahl E„ Chemiker Ztg., 82, 323 (1958).
123. Stahl E., Parfumerie und Kosmetik, 39, 564 (1958).
124. Stahl E., Pharm. Rdsch., 1, Nr. 2 (1959).
125. Stein Y., Stein O., Biochim. Biophys. Acta, 54, 555 (1962),
126. Stoffel W., C h u F., A hr ens E. H., ir., Anal. Chem., 31, 307 (1959).
127. Strickland E. H., Benson A. A., Arch. Biochem. Biophys., 88, 344 (1960).
128. Trappe W., Biochem. Z., 305, 150 (1940).
129. Tuna N., Kammereck R., Mangold H. К., неопубликованные данные.
130. Vioque E., Grasas у Aceites (Seville, Spain), 11, 223 (1960).
131. Vioque E., частное сообщение, 1961.
Гл. 10. Алифатические липиды
185
132. Vioque Е., Morris L. J., Holman R. Т., J. Am. Oil Chemists’ Soc., 38,
489 (1961).
133. Vioque E., Holman R. T., Anal. Chem., 33, 1444 (1961).
134. Vioque E., Holman R. T., J. Am. Oil Chemists’ Soc., 39, 63 (1962).
135. Wagner H., Fette, Seifen, Anstrichmittel, 62, 1115 (1960).
136. Wagner H., Horhammer L., Wolff P., Biochem. Z., 334, 175 (1961).
137. Weicker H., Klin. Wschr., 37, 763 (1959).
138. Weicker H., D a i n J. A., Schmidt G., Thannhauser S. J., Federa-
tion Proc., 19, 219 (1960).
139. Westley J., W r e n J. J., M i t c h e 1 1 H. K., J. Biol. Chem., 229, 131 (1957).
140. Williams J. A., Sharma A., Morris L. J., Holman R. T., Proc.
Soc. Exptl. Biol. Med., 105, 192 (1960).
141. Winterstein A., H e g e d ii s B., Hoppe-Seyler’s Z. physiol. Chem., 321,
97 (1960).
142. Winterstein A., Studer A., R ii e g g R., Chem. Ber., 93, 2951 (1960).
143. W i s s O., G 1 о о r U., Hoppe-Seyler’s Z. physiol. Chem., 310, 260 (1958).
144. Wren J. J., M i t c h e 1 1 H. K., J. Biol. Chem., 234, 2823 (1959).
145. Wren J. J., J. Chromatog., 4, 173 (1960).
146. Zollner N., Kirsch K., Amin G., Verh. dtsch. Ges. inn. Med., 66, 677
(I960).'
147. Zollner N., Wolfram G., Klin. Wschr., 39, 817 (1961).
148. Zollner N., W о 1 f r a m G., A m i n G., Klin. Wschr., 40, 273 (1962).
Литература, появившаяся во время издания книги:
149. Barrett С. В., Dallas М. S. J., Pad ley F. В., Chem. and Ind., 1962,
1050.
150. D e e n e n L. L. M. v a n, G i e r J. de, H a a s G. H. d e, Koninkl. Ned. Akad.
Wetenschap. Proc. Ser., В 64, 528 (1961).
151. Dutton H. J.,Scholfield C. R., Jones E. P., Chem. and Ind. 1961, 1874.
152. Haas G. H. d e, D e e n e n L. L. M. v a n, Rec. trav. chim., 80, 951 (1961).
153. Haas G. H. d e, D e e n e n L. L. M. v a n, Koninkl. Ned. Akad. Wetenschap.,
Proc. Ser., C 64, 592 (1961).
154. Honegger C. G., Helv. Chim. Acta, 45, 281 (1962).
155. Jensen R. G., S a in p u g n a J., J. Dairy Sci., 45, 435 (1962).
156. Kaufmann H. P., Das B., Fette, Seifen, Anstrichmittel, 64, 214 (1962).
157. Kaufmann H. P., M a k u s Z., К h о e T. H., Fette, Seifen, Anstrichmittel.
64, 1 (1962).
158. Kaufmann H. P.\ К h о e T. H., Fette, Seifen, Anstrichmittel, 64, 81 (1962).
159. Morris L. J., Chem. and Ind., 1962, 1238.
160. Nichols P. L., jr., J. Am. Chem. Sos., 74, 1091 (1952.)
161. Rieche A., Schulz M., Seyfarth H. E., Gottschalk G., Fette,
Seifen, Anstrichmittel, 64, 198 (1962).
162. RybickaS. M., Chem. and Ind., 1962, 308.
163. Skipski V. P., Peterson R. P., Barclay M., J. Lipid Res., в печати.
164. Vioque E., Holman R. T., Arch. Biochem. Biophys., в печати.
165. Vries В. d e, Chem. and Ind., 1962, 1049.
166. Wagner H., Fette, Seifen, Anstrichmittel, 63, 1119 (1961).
ГЛАВА 11
ПРОИЗВОДНЫЕ ТЕРПЕНОВ, ЭФИРНЫЕ МАСЛА,
БАЛЬЗАМЫ И СМОЛЫ
Э. IIГ таль и X. Йорк
В данной главе будут рассмотрены возможности разделения липофиль-
ных природных смесей, составные части которых формально можно
вывести из изопрена и, следовательно, «изопренового правила» Ружич-
ки [58]. Рассматриваемые здесь углеводороды и их производные, согласно
Валаху [81], делят на следующие группы:
Гемитерпены С5Н8 и производные
Монотерпены С10Н16 и производные,
т. кип. 140 —180°
Сесквитерпены С15Н24 и производные,
т. кип. выше 200°
Отгоняются с водяным паром; ос-
новные составные части эфирных
масел, включая фенилпропановые
ядра
Дитерпены С2оН32 и производные,
т. кип. 300°
Тритерпены С30Н48 и производные
Политерпены* (С10Н16)ж и производные
Не отгоняются или слабо отго-
няются с водяным паром; со-
ставные части бальзамов, смол,
восков, каучука
После гемитерпеновых производных следует поставить важную группу
природных соединений С9, которые формально можно рассматривать как
фенил пропанпроизводные.
Многочисленные соединения каждой группы отличаются друг от друга
видом циклизации (соединения с открытой цепью, моно-, бициклические
и т. д.), числом и положением двойных связей, центрами асимметрии и при-
родой и числом функциональных групп. Поэтому целесообразно осущест-
вить дополнительную разбивку внутри терпеновых групп по функциональным
группам, расположив их в ряд с увеличивающейся полярностью: углеводоро-
ды, сложные эфиры, альдегиды, кетоны, спирты, кислоты.
Структурные различия, а также физические и химические свойства
терпен- и фенилпропанпроизводных, встречающихся в эфирных маслах,
рассмотрены в капитальных трудах Гильдемайстера-Гофмана [14], Грю-
нера [17], Симонсена [60], Каррера [31] и Морица [42]. О сескви- и дитер-
пенах сообщает Хааген-Смит [20]. Подробный обзор тритерпеновых соедине-
ний дают Штейнер и Хольтцем [72], а также Джонс и Халсолл [29].
I. ОТДЕЛЕНИЕ СМЕСЕЙ ЛИПОФИЛЬНЫХ ВЕЩЕСТВ,
ОТГОНЯЮЩИХСЯ С ВОДЯНЫМ ПАРОМ
Во многих случаях требуется выделить из реакционной смеси или из
растительного и животного материала терпены и их производные и лишь
затем подвергнуть их разделению. Как указывалось вначале, эти вещества
Ся — С15 отгоняются с водяным паром, и поэтому таким способом их можно
31 Мы не проводим здесь деления на тетра-, пента- и собственно политерпены.
Гл. 11. Производные терпенов, эфирные масла, бальзамы и смолы 187
Рис. 94. Прибор «Карлсруэ» для оп-
ределения небольших количеств липи-
дов, отгоняющихся с водяным паром
[69].
1 — нормальный шлиф 29; 2 — вертикаль-
ная трубка; 3 — отверстие для промывки;
4 — холодильник; 5 — трубка для выравни-
вания давления с градуировкой на 1 мл',
6 — измерительный капилляр с делениями
1/200; 7 — оливка; 8 — 3-ходовой кран;
9 — сливная трубка; 10 — отросток для за-
полнения; 11 — микроколбочка для грави-
метрического определения уловленного ли-
пида; 12 — уровень воды в колбе.
отделить в соответствующем приборе [18, 42а]. Для определения небольших
количеств (1—1000 мг) таких смесей оказалось удобным использовать при-
бор «Карлсруэ» (рис. 94). После перегонки с водяным паром можно отде-
лить липофильные компоненты от воды
в микроколбочке для взвешивания и за-
тем осуществить дальнейшее исследова-
ние. Дополнительно можно, правда ме-
нее точно, провести волюмометрическое
исследование. Подробности могут быть
заимствованы из оригинальной работы
[69].
П. ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЕ
РАЗДЕЛЕНИЕ СМЕСЕЙ
ЛИПОФИЛЬНЫХ ВЕЩЕСТВ,
ОТГОНЯЮЩИХСЯ С ВОДЯНЫМ ПАРОМ
Довольно обширный опытный мате-
риал о колоночной хроматографии сме-
сей терпенов был собран Риганезисом
[55]. В большинстве случаев в качестве
сорбента использовали окись алюминия
различной степени активности, а также
гель кремневой кислоты. Адсорбцион-
нохроматографическое разделение рас-
сматриваемых смесей может быть ус-
пешным только в том случае, когда
отдельные компоненты этих веществ
значительно отличаются по полярности.
Отправной точкой для определения по-
лярности может служить величина ди-
электрической проницаемости. Следует,
однако, отметить, что лишь для немно-
гих соединений этого класса веществ
значения диэлектрической проница-
емости приведены в литературе, а неко-
торые старые данные следует использо-
вать лишь с оговоркой. Значения ди-
электрической проницаемости семи ис-
следованных монотерпеновых углеводородов лежат между 2,24 и 2,76,
и понятно, что эта группа без труда может быть отделена от более полярных
веществ. Поэтому в специальной части, там, где это возможно, приведены
величины диэлектрических проницаемостей. На основании большого опыт-
ного материала было показано, что методом адсорбционной хроматографии
(ХТС на силикагеле Г) нельзя разделить большое число соединений одной
«группы полярности» *. Так, например, терпеновые и сесквитерпеновые
спирты при применении бензола или хлороформа в качестве растворителя
обладают практически одинаковой величиной Rf. Лишь в отдельных случаях,
применяя смеси растворителей, удается разделить некоторые соединения
такой группы. Указанные трудности возникают при простых анализах неко-
торых смесей, содержащих лишь одно соединение из названной выше груп-
пы. Комбинируя различные хроматографические разделительные методы,
* «Группа полярности» объединяет соединения с одинаковым числом функциональ-
ных групп одного вида.
188
Специальная часть
можно, однако, преодолеть указанные затруднения. Соответствующие опыты
показали, что плохо разделяемые методом адсорбционной хроматографии
группы полярности можно легко разделить при определенных условиях
методом распределительной хроматографии в газовой фазе [68]. Если
имеется около 1 г смеси, то лучше всего проводить разделение на фракции
(группы полярности) на колонках с силикагелем или с окисью алюминия
и затем исследовать их методом газовой хроматографии. В обоих случаях
фракции проверяют методом ХТС. Для установления принадлежности
к данной группе можно использовать, кроме величин Rf, также и цветные
реакции. Миллер и Кирхнер показали, что для идентификации функцио-
нальных групп можно проводить превращения, например дегидратацию,
окисление, восстановление, омыление, непосредственно в тонких слоях.
Следует, однако, всегда дополнительно охарактеризовать соединения одним
из проверенных микрометодов (производные, температуры кипения, враще-
ние плоскости поляризации, УФ- и ИК-спектры).
1. МОНО- И СЕСКВИТЕРПЕНОВЫЕ УГЛЕВОДОРОДЫ
Как уже указывалось, значение диэлектрической проницаемости является
отправной точкой для характеристики адсорбционного сродства разделяе-
мых веществ, причем значения этой величины для группы монотерпенов
Таблица 15
Величины hRf (Я/ХЮО) некоторых моно-
и сесквитерпенов по Миллеру и Кирхнеру [39]
1а RyXlOO
иа Ша IVa
Монотерпены
n-Цимол (е=2,24) 38 41 62 69
Лимонен (е=2,3) 41 55 54 59
Терпинолен 64 67 60 65
0-Пинен 80 75 80 85
а-Пинен (е=2,7) 83 85 84 90
Камфен (е = 2,33) 84 76 79 80
С есквитерпены
а-Кариофиллен 50 35 47 33
(5-Кариофиллен 62 60 52 65
у-Кариофиллен 80 82 87 90
Цедрен 82 80 83 85
а Растворители:!—гексан; II—2,2-диМетилбутан; III—циклогексан;
IV—метилциклогексан.
Приведенные значения hR? следует использовать с оговоркой, по-
скольку при их определении были лишь частично известны факторы,
оказывающие влияние на их величину. Требуется их новое определе-
ние. В качестве цветного вещества сравнения пригоден имеющийся
в продаже азулен (гваязулен фирмы «Dragoco», Хольцминден, Везер).
лежат между 2,24 и 2,76. Из табл. 15, заимствованной из работы Миллера
и Кирхнера [39], следует, что разделения можно ожидать только при при-
менении растворителей, обладающих еще меньшими значениями диэлектри-
Гл. 11. Производные терпенов, эфирные масла, бальзамы и смолы
189
ческой проницаемости (б = 1,844—2,023). Кроме того, требуются высоко-
активные слои силикагеля. Для дальнейшей активации поело обычной сушки
в вакуум-эксикаторе при давлении 3 мм рт. ст. их следует хранить над
пятиокисью фосфора. Поскольку Миллер и Кирхнер работали с узкими
полосками и толстыми слоями, опасность дезактивации под действием влаги
воздуха при нанесении была не столь велика, как в случае рекомендуемых
в настоящее время больших пластинок с тонкими слоями. Особо следует
указать на возможность разложения или перегруппировок веществ на
высокоактивных слоях.
При применении более полярных растворителей, например бензола (е =
= 2,284) или хлороформа (s = 4,806), моно- и сесквитерпены обнаруживают
неразделенными в верхней области хроматограммы (hRj 80—100). Согласно
«овременному опыту, смеси этой группы выгоднее разделять методом
газовой хроматографии [68].
Обнаружение можно осуществить серной кислотой иногда с добавкой
альдегида, пробой с бромфлуоресцеином (реактив № 101А), а также хлори-
стой сурьмой (V) (реактив № 13).
Низкомолекулярные летучие олефины. В связи с терпеновыми углеводородами сле-
дует отметить работу Прея, Бергера и Бербалка [49] по разделению ненасыщенных
низкомолекулярных олефинов. Рассмотренный как здесь, так и в главе о липидах (стр. 175)
метод ХТС, касающийся продуктов присоединения ацетата ртути, можно также с успе-
хом перенести на производные терпенов.
Поскольку первые члены гомологического ряда алкенов до бутилена газообразны,
а следующие легколетучи, их подвергают хроматографическому разделению в форме
нелетучих ртутных соединений. Наиболее стабильными являются продукты присоеди-
нения ацетата ртути.
Получение. Газообразные олефины пропускают через 1%-ный метанольный
раствор ацетата ртути; жидкие олефины вводят непосредственно. Реакция протекает
количественно и почти мгновенно. Этот метанольный раствор может быть непосредственно
использован для хроматографического разделения. Наносят 5—10 |лг каждого продукта
присоединения.
Разделение. На полученных стандартным методом (стр. 35) слоях силика-
геля Г производят разделение продуктов присоединения ацетата ртути к олефинам,
используя растворитель, состоящий из н-пропанола, триэтиламина и воды (50 + 25 + 25).
Получены следующие величины hRf. этилен 7, пропилен 13, бутилен-1 17, амилен-2 22,
амилен-1 29, гексен-1 31 (время опыта 90 мин).
Обнаружение. Хроматограмму опрыскивают 2%-ным спиртовым раствором
дифенилкарбазида и затем в течение короткого времени нагревают в сушильном шкафу
при 80°. Продукты присоединения окрашиваются в сине-фиолетовый цвет.
2. ОКИСИ И ПЕРЕКИСИ
Окиси и перекиси могут встречаться в многочисленных эфирных маслах.
Наиболее известными примерами являются 1,8-цинеол (эвкалиптол) и полу-
чающийся фотосинтетически из а-терпинена пероксид-аскаридол. Послед-
нее соединение является главной составной частью ядовитого масла цитвар-
ного семени. На слое силикагеля Г при применении бензола два названных
соединения не разделяются (hRf 13 и 15), однако полностью разделяются
при применении хлороформа: аскаридол 63; 1,8-цинеол 54. С реактивом
хлорида сурьмы получают окрашивание в серый цвет. Для обнаружения
перекисей проба с иодистым калием, уксусной кислотой и крахмалом (реак-
тив № 85) часто более пригодна, чем проба с роданидом железа (II) [65].
Для отделения и обнаружения ментофурана в эфирных маслах проводят
хроматографическое разделение на слоях силикагеля Г петролейным
эфиром или, лучше, гексаном, одновременно нанося в качестве эталонного
вещества гваязулен (см. Терпены, стр. 188) [64]. Оба пятна лежат примерно
на одной высоте. Для обнаружения можно, как и в случае азулена, исполь-
зовать реактив ЕР (№ 47).
190
Специальная часть
3. СЛОЖНЫЕ ЭФИРЫ ТЕРПЕНОВЫХ СПИРТОВ
Наряду с терпеновыми спиртами в эфирных маслах часто встречаются
также соответствующие сложные эфиры. Чаще всего это ацетаты, реже
формиаты, пропионаты, бутираты и сложные эфиры валериановой и выс-
ших кислот.
Согласно данным опытов более чем с 20 различными сложными эфирами,
на слоях силикагеля Г при использовании бензола, хлороформа и подобных
растворителей значения Rf для сложных эфиров лежат значительно выше
значений Rf для соответствующих спиртов. Наибольшая разница значе-
ний Rf наблюдается при применении лотковых камер без специального
насыщения (NS). В лотковых камерах с насыщением атмосферы (KS) при
применении хлороформа значения Rf для сложных эфиров примерно в 2,5 раза
выше, чем соответствующие значения для спиртов (табл. 16). Интересно
отметить, что ацетаты перемещаются медленнее соответствующих формиатов,
пропионатов и бутиратов и поэтому могут быть легко отделены от последних.
Таблица 16
Разделение сложных эфиров терпеновых спиртов
на слоях силикагеля Г
НуХЮО
Эфиры
бензол, KS хлороформ, KS
Ацетаты (9 различных)
Формиаты, пропионаты,
бутираты (11 различных)
Спирты (см. табл. 20)
Масляный желтый, Судан
красный, индофенол (эта-
лонные вещества) ....
25—33
42—47
(линалилформиат
37)
5—8
40; 15; 5
63—65
71—74
26—33
(линалол 38)
73; 63; 58
Остается еще проверить, можно ли методом ХТС разделить соответствую-
щие гидроксамовые кислоты.
Обнаружение
а. Реакция обменного разложения. При определении в каждом конкрет-
ном случае наличия сложного эфира, кроме указанных выше способов,
можно воспользоваться еще следующими.
1. Омыление спиртовым раствором едкого кали; образуется свободный
спирт и калийная соль кислоты.
2. Обработка литийалюминийгидридом; получаются терпеновый спирт
и кислота, восстанавливающаяся до соответствующего спирта. Это восста-
новление может быть осуществлено непосредственно на слое [39]. При этом
на точку старта наносят сначала сложный эфир, а затем одну каплю 10 %-ного
раствора LiAlH4 в диэтиловом эфире. Затем проводят хроматографическое
разделение. Пятно сложного эфира больше не появляется, вместо него обра-
зуется пятно в области спиртов.
3. Демоле [7] описал следующий опыт, который при соответствующем
навыке хорошо воспроизводится.
Гл. 11. Производные терпенов, эфирные масла, бальзамы и смолы 191
После разделения освобожденный от растворителя слой опрыскивают
водой до прозрачного состояния; затем слой покрывают свежепропитанной
гидроксиламином, еще влажной фильтровальной бумагой, которую плотно
прижимают стеклянной пластинкой. Закрытую пластинку со слоем помеща-
ют на нагревательную поверхность с температурой 35—45°. Эфиры испаря-
ются и превращаются на бумаге в гидроксаматы калия. Через 15—30 мин
гидроксаматы обнаруживают на бумаге при опрыскивании 5%-ным раство-
ром хлорида железа(Ш) в 0,5 н. соляной кислоте. Для пропитки фильтро-
вальной бумаги применяют смесь 3,5 г солянокислого гидроксиламина
в 50 мл воды и 16 г едкого кали в 50 мл метанола.
б. Цветная реакция. Для обнаружения сложных эфиров можно с успе-
хом применять все цветные реакции, описанные для терпеновых спиртов
(стр. 196), а также реактив фосфорномолибденовой кислоты. Чувствитель-
ность обнаружения и цвета примерно одинаковы. Различия в окраске эфиров
уксусной, муравьиной, пропионовой и масляной кислот не наблюдалось.
4. АЛЬДЕГИДЫ И КЕТОНЫ
Наряду с терпеновыми спиртами в эфирных маслах обнаруживают
многочисленные альдегиды и кетоны, отличающиеся характерным запахом.
Некоторые из них легко получаются синтетически и в настоящее время
часто применяются в промышленности душистых веществ. В качестве хорошо
известных примеров можно назвать коричный альдегид с типичным запахом
корицы, ванилин с запахом ванили и карвон с запахом тмина. Как видно
из приведенных в табл. 24 работ по альдегидам и кетонам, их часто разде-
ляли в форме легкодоступных 2,4-динитрофенилгидразонов (2,4-ДНФГ) на
тонких сорбционных слоях.
Уже в 1952 г. Оноэ [45] применял для этого силикагелевые слои толщи-
ной 60 ц, высушенные при 60°, ииспользовал в качестве связующего 2,5%-ный
водный раствор поливинилового спирта. Наряду с четырнадцатью гидразо-
нами альдегидов жирного ряда (С2 — С10) хроматографировались акролеин,
кротоновый альдегид и цитраль бензолом, насыщенным водой.
Донт и Руи [9] разделяли ряд 2,4-дигидрофенилгидразонов по стан-
дартному методу на слоях силикагеля Г и относили получаемые значения
к значению для эталона, в качестве которого применяли краситель масляный
желтый (величины RB, см. стр. 196). В качестве растворителя они использо-
вали: А) смесь бензола с легким бензином (т. кип. 60—80°) (75 + 25)
и В) более полярную смесь бензол — этиловый эфир уксусной кислоты
(95 + 5).
При применении двумерной методики можно, используя растворитель А
в одном и растворитель В в другом направлении, разделить смеси ванилина,
вератрового альдегида и этилванилина (табл. 17).
На рис. 95 этими же авторами показано, что 2,4-ДНФГ алифатических
альдегидов можно разделить в соответствии с длиной цепи, применяя раство-
ритель А.
Петрович [48] использовал для разделения некоторых оксиальдегидов
приготовленные «вручную» более толстые слои силикагеля Г, не сообщив
более подробно условия опыта. Длина разделительного слоя составляла
12 см, а растворителем служила смесь бензол +5% метанола. Приводятся
следующие значения величины Rf: протокатеховый альдегид 0,06; сирене-
вый альдегид 0,14; и-оксибензальдегид 0,17; ванилин 0,27; вератровый альде-
гид 0,45; о-ванилин 0,53; анисовый альдегид 0,65; салициловый альде-
гид 0,91.
Сравнение (при стандартных условиях) остальных альдегидов и кетонов
можно сделать по данным, приведенным в табл. 18.
7 аблица 17
Величины Hr 2,4-ДНФГ ароматических альдегидов [9]
Соединение Величина RB а Соединение Величина RB а
А В А в
Ванилин 0,06 0,17 Коричный альдегид 0,83 1,04
Вератровый альдегид 0,0 0,45 Бензальдегид .... 1,06 1,03
Этилванилин 0,0 Полосы а- и 0-Ионон .... 1,40 1,14
Салициловый альдегид 0,50 0,85 Анисовый альдегид — 0,88
а Слой силикагеля Г; А: бензол — легкий бензин (75+25), В: бензол — этиловый эфир уксус-
ной кислоты (95+5); лотковая камера, насыщенная.
Таблица 18
Величины Rf и обнаружение альдегидов и кетонов
Соединение RyXlOO Цветная реакция (5 цг) с
бензол а хлороформ а 2,4-ДНФГ о-дианизидином
Ванилин 5 29 Оранжевый Желто вато-оранже-
вый
2,4,5-Триметоксибен-
зальдегид 6 39 Оранжево-ко- Оранжевый
ричневый
Фурфурол 10 50 Оранжевый Фиолетовый
Цитраль 10 56 Желтый Желтовато-корич-
не вый
Анисовый альдегид 13 55 Оранжевый Желтый
Пиперональ 14 55 »
Коричный альдегид 15 60 » Оранжево-коричне-
ВЫЙ
Бензальдегид .... 25 59 Желтый —
Куминовый альдегид 25 65 Оранжевый Желтый
Пиперитон 8 43 — А
Фенхон 9 42 — 1
Карвон 10 56 Оранжево- При количест-
желтый I вах 20—50 цг от
Метилгептенон . . . 13 56 Желтый серого до корич-
Метилгексилкетон . . 14 57 » невого цвета
Метилнонилкетон . . 16 57 »
Ментон 20 60 — у
Масляный желтый . . 38 75 .
Судан красный G . . 13 65
Индофенол 5 58
Слой силикагеля Г толщиной 250 ц; лотковая камера с насыщением.
Гл. 11. Производные терпенов, эфирные масла, бальзамы и смолы
193
При применении силикагеля Г и хлороформа значения hRf часто встре-
чающихся альдегидов и кетонов лежат между 55 и 65. В этой области [63—65]
могут также лежать ацетаты терпеновых спиртов (табл. 16). Дальнейшую
идентификацию альдегидов и кетонов в эфирных маслах можно осуществить,
используя метод РРР (см. стр. 44). При этом хроматографируют смесь
в направлении 1, применяя хлороформ, затем, после покрытия остальной
части хроматограммы, проводят опрыскивание (заштрихованное поле
на рис. 149) 0,5%-ным раствором 2,4-динитрофенилгидразина в метаноле,
к которому добавлен 1% 25%-ной соляной кислоты. Альдегиды и кетоны
Рис. 95. Величины Кд 2,4-динитрофенилгидразонов алифатических альдегидов
в зависимости от длины цепи [9].
Растворитель: х бензол — легкий бензин (75 + 25), О бензол—этиловый эфир уксусной кислоты
(95 + 5).
реагируют на слое, давая желто-оранжевое окрашивание. Через 10—15 мин
проводят хроматографическое разделение в направлении 2, применяя бензол.
При этом некоторые 2,4-динитрофенилгидразоны разделяются, однако не все.
При решении некоторых специальных задач разделения следует подумать
об использовании «реакционных слоев», которые, например, легко пригото-
вить, добавляя бисульфит натрия в наносимую массу.
Обнаружение. Для обнаружения на хроматограммах альдегидов и кетонов
чаще всего используют кислый раствор 2,4-динитрофенилгидразина (реак-
тив № 53). Вскоре при комнатной температуре образуются соответствующие
гидразоны в виде окрашенных пятен. Нециклические альдегиды и кетоны
в большинстве случаев дают желтую, а циклические — оранжевую и оран-
жево-коричневую окраску. Чувствительность обнаружения различна.
В большинстве случаев весьма отчетливые пятна получают уже при коли-
чествах 1 — 5 р,г. В случае ментона, фенхона и пиперитона необходимо нано-
сить большие количества. К сожалению, следует отметить, что при приме-
нении этого реактива ряд соединений, не содержащих альдегидной и кетонной
групп, дает окраску от желтой до оранжевой, например оксифенилпропан-
производные азарон, апиол, миристицин и т. д.
Фосфорномолибденовая кислота — не очень чувствительный реактив
на альдегиды и кетоны (5 р,г). Не вызывает осложнений опрыскивание после
применения 2,4-динитрофенилгидразина хорошо зарекомендовавшим себя
реактивом, состоящим из смеси хлоридов сурьмы(Ш) и (V).
Для обнаружения альдегидов пригоден насыщенный раствор о-дианизи-
дина в ледяной уксусной кислоте, использованный Васики и Феденом [82].
При этом альдегиды, в особенности фурфурол, уже на холоду обнаруживают
13 Заказ К. 734
194
Специальная часть
указанные в табл. 18 окраски. При нагревании окраска усиливается и слой
темнеет. Приведенные в табл. 18 кетоны реагируют лишь при наличии боль-
ших количеств. И этот реактив не является специфичным; окрашивание
наблюдается, например, в случае аскаридола, 1,8-цинеола, оксифенилпропа-
новых ядер и некоторых терпенов.
5. МОНО- И СЕСКВИТЕРПЕНОВЫЕ СПИРТЫ
При хроматографировании хлороформом на слоях силикагеля Г, полу-
ченных стандартным методом, большое число спиртов этой группы обнаружи-
вают примерно одинаковые значения Rf. В основном можно отделить фракцию
спиртов С1о от фракции С15. Поэтому внутри данной группы не удалось обна-
ружить различия в величинах Rf.
Таблица 19
Адсорбционнохроматографическое разделение
терпеновых спиртов на слое силикагеля Г с применением
хлороформа
Число исследованных спиртов НуХЮО
NSa KSa С-камера
11 терпеновых спиртов 30—45 25—35 20—25
5 сесквитерпеновых спиртов 45—55 35—40 25—30
а Лотковая камера (NS — без насыщения; KS — с дополнительным
насыщением).
Пример разделения стереоизомерных ментолов [16, 25, 47] показывает,
что, несмотря на определенные ограничения, некоторые задачи в этой области
могут быть решены.
Рис. 96. Структурные формулы стереоизомерных ментолов.
I — ментол; II — неоментол; III — изоментол; IV — неоизоментол (см. текст).
Уже в 1957 г. Ито [25] обнаружил, что на слоях силикагеля Г эпимерные
ментолы с аксиальными (а) ОН-группами отчетливо отделяются от аналогич-
ных соединений с экваториальными (а) ОН-группами. Ито использовал
в качестве растворителя смесь гексан —этилацетат (85 + 15). Петрович [47]
Гл. 11. Производные терпенов, эфирные масла, бальзамы и смолы 195
рекомендует смесь бензол — метанол (95 + 5). При стандартных условиях
на слоях силикагеля Г нами получены следующие значения Rf. Эти резуль-
таты были подтверждены в работе Графа и Хоппе [16]. Со смесью анисовый
Величина Я/Х100
Хлороформ а Гексан — этил- ацетат (90 + 10) б
Ментол (I) 32 47
Изоментол (III) . . 29 41
Неоментол (II) . . . 40 64
Неоизоментол (IV) 36 68
а Лотковая камера с насыщением (KS).
® Лотковая камера без насыщения (NS).
альдегид — серная кислота (реактив № 96) получается сине-фиолетовая
окраска, хлоридами сурьмы(Ш) и (V) (реактивы № 11 и 13) ментол окра-
шивается в коричнево-серый цвет, неоментол — в серо-зеленый.
Поэтому при решении специальных задач, кроме хлороформа, исполь-
зовали ряд близких к хлороформу изоэлюотропных смесей растворителей,
величины диэлектрической проницаемости которых лежат примерно между
3 и 5. При этом соответствующие эфиры и углеводороды движутся в области
фронта. При применении менее полярных растворителей, например бензола
(б = 2,24), спирты движутся слишком медленно (С-камера, hRf = 10—15;
лотковая камера KS 5—10).
Таблица 20
Разделение спиртов на слое силикагеля Г, пропитанного парафином,
с испдльзованием 70%-лого метанола
Число атомов углерода Спирты НуХ100а
20 Фитол, изофитол 2—5
15 Фарнезол, неролидол, цедрол, гвайол, элемол (hRf 25) 17—20
10 Гераниол, нерол, линалоол, ментол, терпинеол, фенхол, борнеол, изобор- неол, куминовый спирт (hRf 50) . . . 42—48
9 Коричный спирт 55 1 Выделены из
7 Бензиловый спирт 59
5 Фурфуриловый спирт 63 Г смеси
а Величины Ry уменьшаются с увеличением числа атомов углерода, и поэтому
их значения следует рассматривать лишь как ориентировочные.
13*
196
Специальная часть
Обращение фаз. Путем пропитки слоев силикагеля парафином или сили-
коновым маслом иприменения соответствующих гидрофильных расстворителей
(«обращение фаз») удается достичь хорошего разделения спиртов на группы
с равным числом атомов углерода (табл. 20). Трудный в микромасштабе
вопрос о проверке наличия геми-, моно-, сескви- или дитерпеновых спиртов
может быть при этом решен легче, чем при применении непропитанного
слоя. Необходимым условием, однако, является наличие в исследуемой смеси
только спиртов. Терпеновые углеводороды при этих условиях образуют
длинную полосу. Фенольные эфиры обнаруживают почти «обратные» вели-
чины Rf по сравнению с величинами на непропитанных слоях силикагеля Г,
т. е. сафрол лежит ниже спиртов С15, эвгенол — в области спиртов С10 — С7
и между обеими группами лежат исследуемые альдегиды.
Следует предположить, что при разделении на слоях силикагеля Г,
пропитанных липофильными веществами, наряду с процессом распределения
значительную роль играет адсорбция на силикагеле. При применении в каче-
стве носителя неактивного кизельгура Г и при прочих равных условиях
обнаруживают, что спирты располагаются в верхней области хроматограммы
неразделенными (hRf 80).
Метод. Пластинку с высушенным и охлажденным до комнатной температуры слоем
силикагеля Г помещают на 1 мин в 5%-ный раствор парафина или силиконового
масла DC 550 в петролейном эфире (см. стр. 45) и после 15-минутного упаривания петро-
лейного эфира (т. кип. 40—60°) применяют в горизонтальном положении.
В качестве растворителя рекомендуется смесь 70 мл метанола и 30 мл дистиллирован-
ной воды, насыщенная жидким парафином или силиконовым маслом DC 550.
Приведенные в табл. 20 величины hRf получены в С-камере длиной 40 см. Наносили
пробы (5 р,г) всех веществ и смеси спиртов с различным числом атомов углерода.
Другая возможность идентификации спиртов и фенолов требует их обра-
ботки 3,5-динитробензоилхлоридом (получение см. разд. 17, II, За) и разде-
ления методом ХТС образующихся динитробензоатов (ДНБ). Донт и Руи
[10] показали, что перечисленные ниже ДНБ можно разделить на слоях
силикагеля Г со смесью бензол — петролейный эфир (50 + 50). В качестве
эталонного вещества был выбран масляный желтый (я-диметиламиноазобен-
зол) и получены величины RB-.
D Путь, пройденный исследуемым веществом
J~l р. = -77---------7-------------------- •
Путь, пройденный эталонным веществом
Динитробензоаты спиртов дают следующие значения RB: ДНБ фурфу-
рилового спирта 0,71; ДНБ бензилового спирта 0,76; ДНБ мальтола 0,92;
ДНБ гераниола 1,26; ДНБ цитронеллола 1,69.
ДНБ ментола и изоментола можно разделить при стандартных условиях
на слоях силикагеля Г при длине пути 15 см, применяя смесь петро-
лейный бензин (т. кип. 105 — 120°) — изопропиловый эфир (95 Д- 5) [16].
Фенолы: ДНБ эвгенола 0,55; ДНБ изоэвгенола — 0,56; ДНБ тимола —
1,42. Для обнаружения опрыскивают 1%-ным раствором нафтиламина в эта-
ноле; возникают пятна желтого и оранжевого цвета.
Обнаружение. Весьма чувствительный, однако, неспецифический метод
перевода разделяемых веществ в видимое состояние состоит в использовании
реактивафосфорномолибденовой кислоты (реактив № 120). Уже при наличии
количеств 0,05—1 цг после опрыскивания и нагревания на слоях силикагеля
можно обнаружить голубые пятна. Несколько менее чувствителен реактив
из хлоридов сурьмы(Ш) и (V) (реактивы № 11, 13). При применении этого
реактива хроматограмму, как перед нагреванием, так и после нагревания,
следует рассматривать в дневном свете, а также в длинноволновой ультра-
фиолетовой области. Без нагревания реагируют с образованием от серой
до фиолетовой окраски следующие из исследованных спиртов (5 цг): гера-
Гл. 11. Производные терпенов, эфирные масла, бальзамы и смолы
197
ниол, нерол, линалоол, терпинеол, неролидол, фарнезол, гвайол и фитол.
После нагревания эти спирты в большинстве случаев окрашиваются в корич-
невый цвет. Остальные спирты (табл. 20) окрашиваются в коричневый цвет
лишь при нагревании. В длинноволновом ультрафиолетовом свете почти все
спирты и их эфиры — в противоположность фенольным эфирам — обнару-
живают коричнево-красную флуоресценцию.
Большую чувствительность обнаружения и определенные различия
в окраске наблюдают при применении смеси анисовый альдегид — серная
кислота (реактив № 96). При нагревании следующие вещества дают окрашива-
ние от синего до фиолетового: ментол, гвайол, фитол; фиолетово-серое: гера-
ниол, нерол, неролидол, фарнезол; фиолетово-красное: цитронеллол, тер-
пинеол, цедрол; серое: коричный спирт, линалоол; розово-красное: кумино-
вый спирт; особенно поразительна коричневая, переходящая через некоторое
время в зеленую окраска борнеола, изоборнеола и фенхола.
6. ПРОИЗВОДНЫЕ ФЕНИЛПРОПАНА И ФЕНОЛА
В этой группе представляет интерес в первую очередь разделение окси-
фенилпропанпроизводных, используемых в медицине и промышленности
душистых веществ. Подобные соединения являются причиной использования
Рис. 97. Разделение оксифенилпропанпроизводных (по 4 рг) на слоях силикагеля Г
с бензолом.
С-камера; длина пути 10 см; время анализа 35 мин; реактив для опрыскивания: раствор фосфор-
номолибденовой кислоты (реактив № 120а), Т — эталонная смесь фирмы «Desaga»; 1 — сафрол;
2 — метилкавикол: 3 — миристицин; 1 — апиол; 5 — эвгенолметиловый эфир; 6 — азарон;
7 — аллилтетраметоксибензол; 8 — элемицин; .9 — пирокатехин; G — смесь (по 2 ц,г).
zafe.
W
t
Ж
• •
♦ • ♦
8 3 G
ряда растений или получаемых из них эфирных масел: в качестве аптекарских
товаров можно упомянуть гвоздику, ямайский перец, анис, фенхель, пет-
рушку, укроп, аир и сассафрас. Хроматографического разделения ряда
подобных соединений можно достичь на пластинках со слоем силикагеля Г
толщиной 250 ц, полученных стандартным методом, с бензолом в качестве
растворителя. На рис. 97 приведена тонкослойная хроматограмма важнейших
фенольных эфиров этой группы.
Поскольку при адсорбционнохроматографическом разделении состояние
насыщения и форма камеры оказывают существенное влияние на величину
Rf, эти значения приведены в табл. 21 как для С-камер, так и для лотковых
камер (с насыщением и без насыщения камеры). В остальном соблюдены обыч-
ные стандартные условия (стр. 35).
Фенол- и оксифенилпропанпроизводные,
(Слой силикагеля Г, стандартная
Соединение В/Х100 Цветные
лотковая камера С-камера Смесь хлоридов сурьмы (III)
с насы- щением без насы- щения при комнатной температуре
Сафрол 57 •90 89 —
Изосафрол 57 90 89 Серо-фиолетовый
Анетол 56 87 83 —
Метилхавикол 55 85 80 —
Миристицин 46 70 61 Свет ло-коричн евый
Изомиристицин (транс) . . 46 70 61 —
Диметильный эфир резорцина 40 72 56 С еро-коричневый
Апиол . 35 58 45 Светло-коричневый
Изоапиол (транс) 35 58 45 Фиолетовый
Диметиловый эфир гидрохи-
нона 31 • 54 45 —
Карвакрол 25 . 47 33 —
Тимол . 23 47 33 —
Диэтиловый эфир пирока-
техина 22 47 32 —
Гваякол 18 40 27 Серый
Эвгенол 18 40 27 Фиолетово-коричневый
Метиловый эфир эвгенола 15 31 22 Фиолетово-зеленый
Метиловый эфир изоэвгенола 15 31 22 —
Вератрол 13 29 17 —-
Аллилтетраметоксибензол И 20 12 —
Фенол 10 19 13 —
Изоазарон (транс) 10 20 13 Серый
ЭлемиЦин 8 И 7 Серо-фиолетовый
Пирокатехин 0 0 0 —
Г омопирокатехин 0 0 2 Коричнево-серый
Резорцин 0 0 0 —
Гидрохинон 0 0 0 —
Масляный желтый .... 32 60 53
Судан красный G 10 24 17
Индофенол 3 10 8
а 10 лин до 100-105°.
° Перед нагреванием цветная реакция отсутствует.
Время разделения для пути в 10 см: лотковая камера с насыщением 50 мин, без насыщения
Таблица 21
величины Rf и цветные реакции
методика, растворитель — бецзол)
реакции Смесь анисового альдегида с серной кислотой (реактив № 96), после нагревания
и (V) 1 + 1 (реактивы Ла 11, 13)
после нагревания а УФ-флуоресценция через 24 часа
Серо-фиолетовый Сине-фиолетовый Фиолетово-серый Оливково-зелено-серый Серо-коричневый Коричнево-фиолетовый Коричнево-зеленый Оливково-серый Коричнево-фиолетовый Коричнево-красный (свет- лая кайма) Фиолетово-серый (свет- лая кайма) Фиолетово-розовый Розовый Темный (красноватая кайма) Коричнево-фиолетовый Темный » » Синевато-зелено-серый Серо-фиолетовый Серо-красный (синяя кайма) Фиолетово-серый Коричнево-зелено-серый Серо-коричневый Красный Фиолетово-серый Сине-фиолетовый
От желто-зеленого до ко- ричневого От красного до коричне- вого Синевато-красный » Красный Красно-фиолетовый Бледно-фиолетово-серый Светло-красный, краснова- то-коричневый Красный
Синева то-серый Серо-черный Коричнево-серый Коричнево-фиолетовый Фиолетовый Сине-черный Оливково-зеленый Серо-коричневый Серо-зеленый Коричнево-черный Бледно-красновато-лило- вый Коричневый » Желто-коричневый Темный Темный Фиолетово-серый Бежевый (зеленоватая кайма) Красновато-коричнева- тый (светлая кайма) Темный » » » Коричневый (светлая кайма) Темный » Темно-фиолетовый Темный » Коричнево-серый Грязно-зеленый Коричневый (голубоватая кайма) Темно-фиолетовый Бледно-красновато-лиловый Бежево-коричневый Красно-оранжевый Красновато-лиловый Темно-фиолетовый Красный » Красновато-оранжевый К оричнево-серый
35 мин, С-камера 40 мин.
200
Специальная часть
Для перевода в видимое состояние приведенных в табл. 21 веществ
можно воспользоваться различными реактивами для опрыскивания. При
применении фосфорномолибденовой кислоты (реактив № 120а) все соединения
окрашиваются при нагревании в синий цвет (рис. 97). Наибольшего различия
в окраске достигают при применении смеси хлоридов сурьмы (III) и (V)
(1 Д-1, реактивы № 11, 13) или смеси анисового альдегида с серной кисло-
той (реактив № 96). Добавка раствора хлорида сурьмы (V) к раствору хло-
рида сурьмы(Ш), с одной стороны, приводит к усилению окраски, с другой
стороны, однако, имеет тот недостаток, что окрашенные пятна вначале
не обнаруживают флуоресценции в длинноволновом ультрафиолетовом
свете; она появляется только через сутки. Некоторые соединения можно
отличить по различной окраске флуоресценции; в качестве примера можно
указать на уже отмеченные раньше метиловый эфир эвгенола с зеленовато-
желтой флуоресценцией и метиловый эфир изоэвгенола (цис-транс-смесъ)
с красновато-коричневой флуоресценцией. При пользовании реактивом
хлорида сурьмы(Ш) флуоресценция наступает сразу же после нагрева-
ния [65].
В общем в отношении упомянутых цветных реакций следует заметить,
что они зависят от количества вещества и реактива, а также от температуры
и длительности нагревания. Часто опрыскивают слишком малым количеством
реактива; для пластинки 20 X 20 см следует использовать 10—15 мл. Для
выяснения наличия соединения со свободной фенольной группой можно про-
вести опрыскивание щелочным раствором диазониевой соли (реактивы № 37,
61). Фенолы, так же как и некоторые другие соединения, например азулен,
сочетаются и образуют окрашенные продукты.
Можно также синтезировать 3,5-динитробензоаты и подвергнуть эти
эфиры разделению методом ХТС (см. стр. 196). Дальнейшую помощь при
обнаружении фенолов, дающих кислую реакцию, оказывает хроматографи-
ческое разделение на слоях силикагеля, подвергнутых щелочной обработке.
В противоположность фенольным эфирам с нейтральной реакцией, фенолы
обнаруживают, вероятно вследствие образования фенолятов, отчетливое
уменьшение величин Rf. На более кислых слоях наблюдают повышение
величин Rf по сравнению с нейтральными слоями [66].
При разделении и идентифицировании фенилпропан- и фенолпроизводных
при указанных условиях справедливы следующие эмпирические правила:
1. На адсорбционное сродство оказывают сильное влияние свободные
фенольные группы. При применении бензола монофенолы перемещаются по
пластинке, но дифенолы уже задерживаются на точке старта.
2. Фенольные эфиры обнаруживают значительно меньшее адсорбционное
сродство, чем соответствующие фенолы. С увеличением числа метоксильных
групп величина hR* уменьшается (анетол, 1 ОСН3, hRf 83; метиловый эфир
эвгенола, 2ОСН3, hRf 22; азарон, 3 ОСН3, hRf 13).
3. При экранировании двух фенольных оксигрупп метиленовым мостиком
их влияние на величину R: значительно повышается (пирокатехин hRf 0,
сафрол hRf 89).
4. Введение алифатической боковой цепи (метил-, этил-, алил-,пропенил-
группы) в ядро лишь незначительно изменяет адсорбционное сродство и тем
самым величину Rf.
5. При смежном расположении функциональных групп адсорбционное
сродство каждой отдельной группы уменьшается и, таким образом, повы-
шается величина Rf соединения.
Применение. Метод ХТС является способом быстрого установления бога-
тых биологически активными веществами «химических пород» в случае
* hRf = Rf X 100.
Гл. 11. Производные терпенов, эфирные масла, бальзамы и смолы 201
лекарственных растений, содержащих оксифенилпропановые ядра. Напри-
мер, было обнаружено, что эфирные масла различных «хромосомных пород»
аира (Л corus calamus L) сильно отличаются по своему составу (рис. 99) [87].
Рис. 98. Сравнение методом ХТС 22 различных масел петрушки на тонкослойной
пластинке шириной 40 см.
Зоны верхнего ряда — миристицин, среднего — апиол, нижнего — аллилтетраметоксибензол; слева
и справа — эталонные смеси фирмы «Desaga». Слой силикагеля Г; С-камера; растворитель: три-
хлорэтилен — хлороформ (90 + 10); длина пути 12 см.
Исследования эфирных масел семян петрушки семнадцати различных проис-
хождений показало, что можно различать составные части трех пород: мири-
стициновой, апиоловой, тетраметоксибензольной.
На рис. 98 приведена тонкослойная хроматограмма различных масел
петрушки, полученная в С-камере шириной 40 см. Точно такие же различия
Рис. 99. Схематическое изображение различий эфирных масел из листьев (а)
и корневищ (б) различных видов аира.
2п — диплоидные; Зп — триплоидные; 4п — тетраплоидные растения различного происхождения;
н — нижняя, в — верхняя половина листа. Слой силикагеля Г; растворитель бензол; лотковая
камера, нормальное насыщение; обнаружение реактивом№ И, пробы по 400 цг. ns геранилацетат;
изоэвгенолметиловый эфир; те азарон; О масляный желтый; 0 судан красный G-.
были выявлены при разделении методом ХТС экстрактов ряда других расте-
ний, содержащих в качестве главных биологически активных веществ фенол-
или фенилпропанпроизводные. Следует отметить часто наблюдаемые коли-
чественные и качественные различия между эфирными маслами, выделен-
ными из разных частей растения, например из корня, корневища и листа
(рис. 99).
202
Специальная часть
' 7. ДИТЕРПЕНОВЫЕ ПРОИЗВОДНЫЕ
О разделении 4 дитерпеновых производных сообщили Демоле и Ледерер
[8]. Они проводили хроматографическое разделение на слоях силикагеля,
приготовленных в принципе по методу Райцема [52], со смесью w-гексан —
этиловый эфир уксусной кислоты (85 + 15). Приводимые ниже величины
Rf X 100, заимствованные из схематического рисунка, следует рассматри-
вать лишь как ориентировочные: фитол 68, иэофитол 56, гераниллиналол 46,
фитилацетат 36 (?) Для обнаружения пятен хроматограммы опрыскивают
водным раствором перманганата калия (0,25—0,5%-ным). После сушки
на красно-фиолетовом фоне появляются желтые пятна. Указанные соедине-
ния лучше открывать смесью анисовый альдегид — серная кислота (реак-
тив № 96) или хлоридом сурьмы(Ш) (реактив № 11).
8. ТРИТЕРПЕНЫ И ПРОИЗВОДНЫЕ
По разделению методом хроматографии на бумаге часто встречающихся
в растительном царстве смесей тритерпенов имеется сравнительно мало
работ [77]. Чеше с сотрудниками подробно изучили методом ХТС тритерпе-
новые кислоты и ряд нейтральных тритерпеновых производных [77]. Исполь-
зуя уже простейшие смеси растворителей, например бензол и метиленхлорид,
получают в случае нейтральных тритерпеноидов очень хорошее разделение
на слоях силикагеля Г. Для разделения тритерпеновых кислот следует,
по-видимому, применять более полярные растворители, например смесь дииэо-
пропиловый эфир — ацетон (75 + 30). В случае некоторых кислот имеет
место образование хвоста, которое в большинстве случаев можно устранить
добавкой пиридина или, лучше, диэтиламина.
Таблица 22
Величины Rf тритерпеновых кислот на слоях силикагеля Г [77]
Кислота H/X100 Кислота RfXiOb
1а па 1а IIя
Ацетилурзоловая . . . 76 Хинная 55
Урзоловая 68 50 Мастикад иеноновая 47
Олеаноловая » 68 50 Изомастикадиеноновая 47
Бетулиновая 68 Гваяволовая .... 35
Олеаноновая 68 Байогенин 31
Сиарезиноловая .... 66 Акантоловая .... 29
Мороловая 59 Медикагеновая . . . 29в 35
Бредемоловая 596 Махаэриновая .... 23в 25
Эммоловая 59 Кохаловая .... 18в 45
а Растворители: I — диизопропиловый’эфир — ацетон (75 + 30); II — этилацетат —
метанол — диэтиламин (70+20+15).
б Образование хвоста.
В отношении приведенных «величин 7?/» следует заметить, что слои нано-
сились с помощью шпателя, поэтому они неравномерны по толщине, кроме
того, отсутствуют данные о конструкции камеры и об условиях ее насыщения.
Рекомендуется проводить хроматографирование с эталонным веществом
(олеаноловой кислотой). В случае нейтральных тритерпеноидов можно при
этом применять трехцветную эталонную смесь фирмы «Desaga».
Гл. 11. Производные терпенов, эфирные масла, бальзамы и смолы
203
Из данных табл. 22 следует, что изомерные олеаноловая, урзоловая
и бутилиновая кислоты не разделяются в указанных условиях. Однако их
удается разделить на анионообменной бумаге другим растворителем, напри-
мер смесью метилциклогексан — хлороформ (80 + 20), насыщенной
99%-ной муравьиной кислотой [77]. Получаемые пятна вытянуты в длину.
Вполне вероятно, что результат разделения можно улучшить, применяя
тонкозернистые обменные слои.
Таблица 23
Величины Rf нейтральных тритерпеноидов на слоях силикагеля Г [77]
Тритерпеноид Я/Х 100
ша IVs Vя
Р-Амирин 38 12
Р-Амиринацетат 45
а-Амиренон 31
Ланостерин 75 40 14
Цигидроланостеринацетат .... 43
Метиловый эфир урзоловой кислоты,
ацетат 77 26
Метиловый эфир олеаноловой кислоты,
ацетат 77 24
Метиловый эфир урзоновой кислоты . . . 85 51 Растворитель1а
Метиловый эфир кратеголовой кислоты,
моноацетат 40 13 80
Метиловый эфир кратеголовой кислоты,
диацетат 72 37 92
Метиловый эфир дегидрократеголовой кисло-
ты, диацетат 69 39
Метиловый эфир 11-кетократеголовой кис-
лоты, моноацетат 77
Метиловый эфир акантоловой кислоты,
моноацетат 73
Метиловый эфир эхиноцистовой кислоты 59 15
Диметиловый эфир эммоловой кислоты 73
а Растворители: I —см. табл. 22; III — диизопропиловый эфир; IV — метиленхлорид; V—бензол.
Обнаружение. В качестве реактива для опрыскивания особенно пригодна
хлорсульфоновая кислота (реактив № 33) [77], позволяющая обнаружить
еще 0,02 рг олеаноловой кислоты. Кроме того, применяют также смеси
хлоридов сурьмы(Ш) и (V) (реактивы № 11, 13) и четыреххлористое олово
(реактив № 156). В большинстве случаев при этом возникают окрашенные
зоны, от красновато-фиолетовых до коричневых.
Применение. Слои силикагеля Г применяли для разделения тритерпено-
вых кислот из Bredemeyera floribunda Вильда [76] и диоксикислот и их эфи-
ров из Crataegus oxyacantha L [76а]. Томас и Мюллер [74] контролировали
этим методом процесс очистки метиловых эфиров тритерпеновых кислот из
Commiphora glandulosaHlvmup. Они работали на слоях силикагеля Г и при-
меняли в качестве растворителя смесь хлороформ — этиловый эфир уксусной
кислоты (80 + 20), а для обнаружения использовали „концентрированную
Таблица 24
Разделение эфирных масел и производных терпенов методом ХТС
(период от 1938 г. до середины 1962 г.)
Год Автор Литера- турная ссылка Использовано для разделения
1938 Измайлов и Шрайбер 24 Настойка перечной мяты и корицы
1951 Кирхнер, Миллер и Келлер 32 Величины Rf 14 производных терпе- нов, разделение простых смесей
1952 Миллер и Кирхнер 38 Фракции, полученные на колонках
1952 Оноэ 45 2,4-Динитрофенилгидразоны
1953 Фукуши 12 Азулены
1953 Генсхирт 13 Эфирные масла Aristolochia clematitis L
1953 Лаба и Монт 34 2,4-Динитрофенилгидразоны и 3,5-динит- робензоаты
1953 Миллер и Кирхнер 39 Величины Rf 38 производных терпе- нов в различных растворителях
1954 Грюнер и Шпайх 17 Эфирные масла Arnica montana и тритер- пены
1954 Ито, Вакаматзу и Ка- вахара 26 Японское масло перечной мяты и его со- ставные части
1954 Райцема 52 Величины Rf терпеновых производных эфирных масел, содержащих карвон
1954 Райцема 53 Эфирные масла из видов Mentha
1955 Брайан 4 Круговая хроматограмма масел Eucalyptus на слоях магнезии
1955 Ковеней, Метьюз и Пиккеринг 5 Эфирные масла Strobilanthopsis linifolia
1955 Гогроф 15 Сесквитерпены Pogostemon Patschuli
1955 Кайзер 30 Эфирные масла и смолы породы Grindelia
1955 де Надаль 43 Терпены, сесквитерпены и терпеноиды
1955 Ригби и Бетюн 56 Фракции масла хмеля(цветная таблица 22 хроматограмм)
1955 Вагнер 80 Некоторые летучие фенолы
1955 Уотерспун и Бедукьян 85 Определение окисленных соединений в эфирных маслах
1956 Демоль 6 Жасминовое масло, отделение от изофитола
1956 Луйендийк 36 Эфирные масла некоторых Uinbellijeren
1956 Шпигельберг 61 Эфирное масло шалфея
1956 Шпрехер 62 Эфирное масло (метилнонилкетон) Ruta graveolens
1956 Шталь 63 Эфирные масла, проазулены и производ- ные хамазулена
1957 Фридман, Монт, Тро- паревски И Многочисленные эфирные масла и чистые вещества
1957 Ито 25 Разделение ментола, неоментола, изомен- тола, неоизоментола
1957 Райцема, Крамер и фасе 54 Изменение эфирного масла в органах не- которых растений
1957 Стенли и Ванир 70 Цитрусовые масла
1957 Стенли с сотрудниками 71 Кумарин цитрусовых масел, дифенил
Продолжение табл. 24
Год Автор Литера- турная ссылка Использовано для разделения
1958 Демоль и Ледерер 1 8 Жасминовое масло, дитерпеновые произ- водные
1958 Клор-Майнхардт 33 Эфирные масла прививок Petroselinum и Levisticum
1958 Навс 44 Эфирные масла
1958 Прайор и Брайан 50 Масла Eucalyptus на магнезии
1958 Шталь 65 Аирные масла, валериановое масло, пере- КИСИ и т. д.
* 1958 Шталь 64 Возможные добавки в промышленности душистых веществ; эфирные масла, смолы, бальзамы
1959 Шталь 66 Фенолы и простые эфиры на «кислых» и «основных» слоях
1959 Винклер и Лунау 84 Эфирные масла Curcuma xanthorriza и С. longa
1960 Бризкорн и Венгер 3 Эфирное масло шалфея
1960 Хефендель 21 Масло перечной мяты; количественное оп- ределение ментофурана
1960 Петрович 48 Изомеры ментола (см. Ито, 1957)
1960 Шталь 67 Пиретрины
1960 Шталь и Тренхойзер 68 Оксифенил пропанпроизводные, терпены (комбинация с газовой хроматографией)
1960 Чеше и Сен-Гупта 76 Тритерпеновые кислоты
1960 Чеше, Ламперт и Снатцке 77 Тритерпеновые кислоты и нейтральные тритерпеноиды, величины Rf
1960 Венгер 83 Масло далматского и испанского шалфея (методы ХТС и газовой хроматографии)
1960 Вульф и Шталь 86 Эфирные масла пород Calmus
1961 Аказава и Вада 1 Ипомеамароны из батата, пораженного грибом
1961 Батайл с сотрудниками 2 Биосинтез составных частей масла переч- ной мяты
1961 Брискорн, Клингер и Полониус 2 Р-Ситостерин, урзоловая кислота
1961 Донт и де Рой 9 2,4-Динитрофенилгидразоны
1961 Доит и де Рой 10 3,5-Динитробензоаты
1961 Хорхаммер, Вагнер и Лей 22 Олеаноловые кислоты, Р-ситостерин корня Radix Panax Ginseng
1961 Джасперсен-Шиб 28 Масла Mentha, компоненты
1961 Нойберн де Толедо и Уасики 44а Некоторые эфирные масла
1961 Парис и Годон 46 Различные эфирные масла (сравнение с хроматографией на бумаге)
1961 Занини, Даль Поццо и Данси 87 Эфирное масло Pini pumilionls
1962 Граф и Хоппе 16 Изомеры ментола
1962 Габель, Мюллер и Шокнехт 12а Определение тимола и карвакрола
1962 Шанц 59 21 эфирное масло
206
Специальная часть
серную кислоту. Хунек [23] выделял тритерпены из коры Sorbus torminalis
на слоях волокнистого глинозема со смесью эфир — этанол (98 + 2). Другие
применения указаны в табл. 24.
9. ПОЛИТЕРПЕНЫ
Возможности разделения методом ХТС смесей политерпенов, в особен-
ности каротинов и каротиноидов, а также убихинонов, описаны в следующей
главе.
10. ЭФИРНЫЕ МАСЛА
(Природные смеси производных терпенов)
Эфирные масла представляют собой отгоняющиеся с водяным паром смеси
природных липофильных веществ из растений, отличающихся особым запа-
хом. С точки зрения физиологии растений мы имеем дело с выделениями,
образующимися в особых клетках, например в железистых волосках губо-
цветных и сложноцветных или в протоках зонтичных. Во многих про-
мышленных производствах занимаются разведением этих растений с целью
получения эфирных масел. Довольно дорогой метод выделения обусловли-
вает относительно высокую цену и является причиной многочисленных
фальсификаций. Для обнаружения подобных фальсификаций наряду с ана-
лизом по запаху и установлением физических констант представляют интерес
простые и доступные методы, которые могут быть использованы для опре-
деления состава эфирных масел *.
Еще в самых первых опытах по микроаналитической характеристике
эфирных масел методами ХТС и газовой хроматографии необходимо обра-
тить внимание на следующее.
1. Имеющиеся в продаже эфирные масла почти во всех случаях следует
подвергнуть ректификации, чтобы они соответствовали требованиям в отно-
шении запаха и вкуса. При этом часто удаляются низко- и высококипящие
фракции. Особую ценность представляют эфирные масла, очищенные от тер-
пенов и сесквитерпенов. Нередко смешивают эфирные масла различного
качества.
2. Состав эфирных масел зависит от большого числа факторов:
а) от ботанической однородности использованного растительного мате-
риала («химические породы»);
б) от использованной части растения (например, стебель, лист, корень
и т. д.), от места произрастания, климата, урожая и способа хранения мате-
риала;
в) от метода выделения и использованных условий.
3. Только комбинация нескольких аналитических методов позволяет
с уверенностью идентифицировать и количественно определить отдельные
компоненты.
Нам пришлось бы выйти за рамки настоящей главы, если бы мы захотели
рассмотреть все приведенные в табл. 24 работы. Кроме того, это вряд ли
имело бы смысл, поскольку в большинстве случаев там рассматриваются
отдельные частные задачи. Из новых работ (см. табл. 24) следует выделить
исследование масел Mentha, проведенное Джесперсен-Шибом [28]. Оно
подтвердило опыт, указывающий на то, что практически в случае любого
эфирного масла приходится проводить подробное исследование, позволяю-
* Наряду с одним или несколькими главными компонентами, характерными для
данного масла, могут присутствовать многочисленные другие соединения, указанные
в предыдущих разделах (1—6).
Гл. 11. Производные терпенов, эфирные масла, бальзамы и смолы 207
щее получить общие выводы, которые могут быть использованы в дальнейшем.
Для большинства масел такие подробные микроаналитические исследования
пока еще отсутствуют. Это объясняется тем, что работа с чистыми эталон-
ными веществами часто вызывает большие затруднения. Поэтому в каждом
отдельном случае стремятся получить данные о главных составных частях
и характерных сопутствующих компонентах, а также об их количественном
соотношении. При этом существенную помощь может оказать изложенное
в предыдущих разделах.
11. СМОЛЫ И БАЛЬЗАМЫ
Природные смолы и бальзамы, так же как эфирные масла, являются про-
дуктами выделения растений. В большинстве случаев они образуются в ткани
коры под действием внешних раздражений, например при повреждениях.
В противоположность эфирным маслам эти смеси веществ не перегоняются
с водяным паром или перегоняются в очень небольшой степени. Смолы пред-
ставляют собой твердые хрупкие и аморфные массы с окраской от желтой
до коричневой, размягчающиеся лишь при повышенной температуре и не
имеющие определенной точки плавления. В воде они не растворимы, в спирте
растворимы лишь частично, а лучше всего растворяются в хлороформе или
этиловом эфире уксусной кислоты. В то время как смолы содержат лишь
небольшие количества эфирных масел, бальзамы содержат их в больших
количествах и поэтому в большинстве случаев являются вязкими.
В случае смол и бальзамов мы имеем дело со сложными, весьма трудно
анализируемыми смесями производных терпенов в широком смысле слова.
Поэтому понятно, что ни одна из до сих пор существующих классификаций
не является удовлетворительной — ни ботаническая, ни химическая, пред-
ложенная Чирком [78]. Согласно последней, различают эфирные смолы,
резиноловые смоляные кислоты и ка'учукообразные, или цветные, смолы.
Имеются 'также опыты, в которых пытались охарактеризовать смолы
и бальзамы хроматографически. Ротенхаймер [57] и Шток [73] применяли
капиллярный анализ, Валентин [79] — хроматографию на колонках с окисью
алюминия, Милз и Вернер [40, 41], а также Роулингз и Вернер [51] — метод
обращения фаз на бумаге. При этом был достигнут лишь частичный успех
и ни один из этих методов не нашел сколько-нибудь значительного приме-
нения на практике. Несколько лет назад были проведены первые опыты
по разделению смол и бальзамов методом ХТС, которые показали, что таким
образом может быть достигнут лучший эффект разделения [64, 66а]. Даль-
нейшее развитие этих исследований на большом числе лекарственных мате-
риалов подтвердило эти данные.
Условия разделения. Было проведено хроматографическое разделение
в стандартных условиях на слоях силикагеля Г толщиной 250 ц и устано-
влено, что при применении С-камер (стр. 27) достигается значительно
лучшее разделение, чем при применении лотковых камер. В случае смол
и бальзамов вместо круглых пятен получают узкие эллиптические, а иногда
полосообразные зоны (рис. 100).
В качестве растворителя наиболее пригоден бензол с добавкой 5% мета-
нола в случае как лотковых, так и С-камер. Для получения хорошего распре-
деления на пути в 10 см обычно двукратно^хроматографируют, т. е. про-
пускаютрастворитель два раза (рис. 100). Ни с одной другой из испробованных
смесей не было достигнуто такое же хорошее разделение даже при двукрат-
ном хроматографировании. Это справедливо также для опытов с «обра-
щенными фазами» на слоях силикагеля Г, пропитанных парафином.
Для сравнительных исследований смол и бальзамов лучше всего гото-
вить 3,0%-ный раствор в этилацетате или в хлороформе и наносить 1 мм3
208
Специальная часть
(= 30 иг). В каждом случае, одновременно с эталонной смесью красителей
следует хроматографировать также аутентичную пробу с такой же концен-
трацией.
Обнаружение. Для перевода в видимое состояние компонентов смолы
или бальзама лучше всего использовать хлорид сурьмы (III) (реактив №11).
Рис. 100. Сравнение методом ХТС наиболее важных смол и бальзамов
на тонкослойной пластинке шириной 40 см (подробности в тексте).
1 — сиамская бензойная смола; 2 — суматрская бензойная смола; з — стиракс; 4 — перуанский
бальзам; 5 — перуген; 6 — толуанский бальзам; 7.— асафетида; 8 — гальбан; 9 — мирра;
10 — ладан; 11 — мастике; 12 — даммара; 13 — терпертин; 14 — колофониум; 15 — канадский
бальзам; 10 — искусственный канадский бальзам; 17 — сандарак; 18 — копайский бальзам;
19 — гуммигут.
При добавлении раствора хлорида сурьмы (V) к реактиву № 11 окраска
становится более интенсивной, однако происходит нежелательное ослабле-
ние флуоресценции.

Рис. 101. Снятая в УФ-свете тонкослойная хроматограмма смол и бальзамов.
Условия разделения и обозначения те же, что и на рис. 100.
До и после опрыскивания хроматограмму рассматривают при дневном
и в длинноволновом УФ-свете и маркируют зоны: лишь затем проводят
нагревание, примерно в течение 10 мин до 110°. На рис. 100 приведена
тонкослойная хроматограмма некоторых смол и бальзамов, сфотографиро-
ванная в видимом свете после нагревания. Зоны в большинстве случаев
коричневые, фиолетовые или серые. В особенности поразительны желтые
пятна искусственного перуанского бальзама (перугена). Большинство смол
и бальзамов можно различать по числу, величине и окраске зон. Для даль-
нейшей идентификации хроматограмму рассматривают в длинноволновом
Гл. 11. Производные терпенов, эфирные масла, бальзамы и смолы
209
УФ-свете. При этом, как видно из рис. 101, многие зоны флуоресцируют.
На практике этим и другими способами можно хорошо отличить сиамскую
и суматрскую бензойную смолу.
Для перевода в окрашенное состояние можно использовать и ряд других
реактивов, однако они менее чувствительны, чем предложенный. Были
использованы, например, проба Хальфена — Хикса, реакция Ноллера,
«природный реактив» (№ 55) и концентрированные кислоты с добавкой
альдегида.
Примечание
Полученные хроматограммы смол и бальзамов позволяют сделать оценку продуктов,
поставляемых немецкой торговлей аптекарскими товарами за последние 5 лет. В боль-
шинстве случаев существует 5—-10 различных сортов. Утверждение о подлинной аутен-
тичности материала практически может быть сделано только тогда, когда точно известен
весь путь продажного продукта, вплоть до исходного растения. При сравнении следует
учесть, что метод выделения, разбивка на «сорта», возраст пробы и многое другое может
оказывать влияние на состав. Эти вопросы могут быть изучены методом ХТС.
На основании полученных хроматограмм можно, например, установить,
что старое деление смол по Чиршу является неудовлетворительным.
В настоящее время в числе прочих описан метод ХТС для анализа гидро-
лизатов искусственных смол [37а]. Продукты расщепления можно разделить
на слоях силикагеля Г, используя смесь метанол — ледяная уксусная кис-
лота (904-10).
ЛИ Е РАТ УРА
1. Akazawa Т., Wada К., Agr. Biol. Chem. Japan, 25, 30 (1961).
2. В a t a i 1 e J., Mitarb., Biochim. Biophys. Acta, 51, 538 und 545 (1961).
3. Brieskorn Ch.. Klinger H., Polonius W., Arch. Pharm., 294, 389
(1961).
3a. Brieskorn Ch., Wenger E., Arch. Pharm., 293, 21 (1960).
4. Bryant L. H., Nature, 175, 556 (1955).
5. Coveney R. D., Matthews W. S. A., P i c k e r i n g G. B., Colonial Plant
and Animal Prods. (Gt. Brit.), 5, 150 (1955).
6. D e m о 1 e E., Compt. rend., 243, 1883 (1956).
7. D e m о 1 e E., Theses de Doctorat, Paris, Ser. A. n° 844, № d’Ordre 870 (1958).
8. Demole E., Lederer E., Bull. soc. Chim. France, 1958, 1128.
9. D h о n t J. H., Rooy C. d e, Analyst, 86, 74 (1961).
10. D h о n t J. H., Rooy C. d e, Analyst, 86, 527 (1961).
11 F r m у d a n B. J., M о n t e s A. L., T г о p a г e v s k i A., Anales asoc. quim.
(arg.), 45, 248, 257, 261 (1957).
12. Fukushi S., О b a t a Y., J. Agr. Chem. Soc. Japan, 27, 353 (1953); Ch. A.,
50, 15027 (1956).
12a. Gabel E., Muller К. H., Schoknecht L, Dtsch. Apotheker Ztg., 102,
293 (1962).
13. Gan shirt H., Pharm. Ind., 15, 177 (1953).
14. Gildemeister E., Hoffmann Fr., Die atherischen Ole. Berlin, Akademie-
' Verlag, 1956—1962.
15. Gogrof G., Pharmazie, 12, 38 (1957).
16. Graf E., Hoppe W., Dtsch. Apotheker Ztg., 102, 393 (1962).
17. Griiner S., Spaich W., Arch. Pharm., 287, 243 (1954).
18. G s t i r n e r F., Priifung und Verarbeitung von Arzneidrogen, Bd. I, Berlin — Got-
tingen — Heidelberg: Springer, 1955.
19. G^u e n t h e r E., The Essential Oils, New York, D. van Nostrand Company, 1952—
20. H a a g e n-S m i t A. G., in I,. Z e c h m e i s t e r, Fortschritte der Chemie orga-
nischer Naturstoffe, Bd. XII. Wien, Springer, 1955.
21. H e f e n d e h 1 F., W. Planta Med., 8, 65 (I960).
22. Horhammer L., Wagner H., Lay B., Pharm. Ztg., 106, 1308 (1961).
23. H u n e c k S., J. Chromatog., 7, 561 (1962).
24. И з м а й л о в H. А., Шрайбер M. С.,, Фарм. № 3, 1 (1938).
25. Ito M., J. Chem. Soc. Japan, Pure Chem. Sect., 78, 172 (1957); Ch Z., 42, 11595
(1957).
14 Заказ № 734
210
Специальная часть
26. Ito М., Wakamatsu Sh., Kawahara H., J. Chem. Soc. Japan, Pure Chem.
Sect., 75, 413 (1954); Ch. A., 48, 13172 (1954); Schimmel Ber., 1956 91.
27. Janistyn H., Parfumerie und Kosmetik, 41, 371 (1960).
28. Jaspersen-Schib R., Pharm. Acta Helv., 36, 141 (1961).
29. Jones E. R. H., Halsall T. G., inL. Zechmeister, Fortschritte der Chemie
organischer Naturstoffe, Bd. XII, Wien, Springer, 1955.
30. Kaiser H.-H., Diss., Karlsruhe, 1955.
31. К a r r e r W., Konstitution und Vorkommen der organischen Pflanzenstoffe, Basel —
Stuttgart, Birkhauser, 1958.
32. Kirchner J. G., M i 11 e r J. M., Keller G. I., Anal. Chem., 23, 420 (1951).
33. К 1 о h r-M e i n h a r d t R., Planta Med., 6, 203, 208 (1958).
34. L a b a t J., M о n t e s A. L., Anales asoc. quim. arg., 41, 166 (1953).
35. L u о m s W. D., Biochem. Biophys. Acta, 51, 538 (1961).
36. Luyendijk E. N., Diss., Leiden, 1956.
37. M a r b e t R., Saucy G., Chimia, 14, 362 (1960).
37a. Meckel L., Milster H., Krause U., Textil-Praxis, 16, 1032 (1961).
38. M i 1 1 e r J. M., Kirchner J. G., Anal. Chem., 24, 1480 (1952).
39. M i 11 e r J. M., К i r c h n e r J. G., Anal. Chem., 25, 1107 (1953).
40. M i 1 1 s J. S., Werner A. E., Nature, 169, 1064 (1952).
41. M i 1 1 s J. S.. Werner A. E., J. Chem. Soc., 1955, 3132.
42. Moritz O., in Ruhland W., Handbuch der Pflanzenphysiologie Bd. X, Ber-
lin — Gottingen — Heidelberg, Springer, 1958.
42a. Moritz O., in P a e c h K.,Tracey M. V., Moderne Methoden der Pflanzenana-
lyse, Bd. Ш, Berlin — Gottingen — Heidelberg, Springer, 1955.
43. Nadal G. N. d e, Am. Perf. Ess. Oil. Rev., 65, Nr. 6, 17 (1955).
44. Naves Y.-R., France et ses parfums 1, 10 (1958); 2, 18 (1959); nach M. R.'Pari s,
M. G о d о n.
44a. Neubern de Toledo T. A., Was icky R., Tribuna Farm. Nr., 7, 44
(1961).
45. О n о e K., J. Chem. Soc. Japan, Pure Chem. Sect., 73, 337 (1952).
46. P a r i s M. R., Go don M., Ann. pharm. frang., 19, 86 (1961).
47. Petrowitz H. J., Angew. Chem., 72, 921 (I960).
48. Petrowitz H. J., Z. analyt. Chem., 183, 432 (1961).
49. Prey A., Berger A., В e r b a 1 к H., Z. analyt. Chem., 185, 113 (1962).
50. Pryor L. D., Bryant L. H., Proc. Linnean Soc. N. S. Males, 83, 55 (1958).
51. R a w 1 i n g s F. I. G., Werner A. E., Endeavour, 13, 140 (1954).
52. R e i t s e m a R. H., Anal. Chem., 26, 960 (1954).
53. R e i t s e m a R. H., J. Am. Pharm. Assoc. Pract. Pharm. Ed. Sci. Ed., 43, 414 (1954).
54. R e i t s e m a R. H., Cramer F. J., F a s s W. E., Agr. and Food Chem., 5, 779
(1957).
55. R i g a n e s i s M. D., Essenze deriv. agrumari, 26, 29 (1956).
56. Rigby F. L., В e t h u n e J. L., Proceedings of Amer. Soc. of Brewing Chemists,
p. 174 (1955).
57. R о t h e n h e i m e r C., Pharm. Ztg., 74, 712 (1929).
58. Ruzicka L., Experientia, 9, 357 (1953).
59. S c h a n t z M. v., Farmaseuttinen Aikakauslehti, 2, 52 (1962).
60. S i m о n s e n J. L., The Terpenes, Bd. I — V, Cambridge, University Press, 1953—
1957.
61. Spiegelberg Ch., Diss., Berlin, 1956.
62. Sprecher E., Diss., Karlsruhe, 1956.
63. Stahl E., Pharmazie, 11, 633 (1956).
64. Stahl E., Parfumerie und Kosmetik, 39, 564 (1958).
65. Stahl E., Chem. Ztg., 82, 323 (1958).
66. Stahl E., Arch. Pharm., 292, 411 (1959).
66a. Stahl E., Pharmaz. Rundschau 1, Heft 2, 1 (1959).
67. Stahl E., Arch. Pharm., 293, 531 (1960).
68. Stahl E., Trennheuser L., Arch. Pharm , 293, 826 (1960).
69. Stahl E., Mikrochim. Acta, 40, 367 (1953).
70. Stanley W. L., Vannier S. H., J. Am. Chem. Soc., 79, 3488 (1957).
71. Stanley W. L., Vannier S. H., G e n t i 1 i B., J. Ass. Offic. Agr. Chemists,
40, 282 (1957).
72. Steiner M., H о 1 t z e m H., in P a e c h K., Tracey M. V., Moderne Me-
thoden der Pflanzenanalyse, Bd. Ш, Berlin — Gottingen — Heidelberg, Springer, 1955.
73. S t о с к E., in D i e t e r i c h K., Stock E., Analyse der Harze, Balsame und
Gummiharze, 2. Aufl., Berlin, Springer, 1930.
74. T h о m a s A. F., M ii 1 1 e r J. M., Experientia, 16, 62 (1960).
75. T r e n n h e u s e r L., Diss., Saarbriicken, 1962.
76. Tschesche R., Sen Gupta A. K., Chem. Ber., 93, 1903 (1960).
76a. Tschesche fl., Pop pel G., Chem. Ber., 92, 320 (1959).
Гл. 11. Производные терпенов, эфирные масла, бальзамы и смолы 211
77. Tschesche R., Lambert F., Snatzke G., J. Chromatog., 5, 217 (1961).
78. Tschirch A., Die Harze, Leipzig, Borntrager, 1933/36.
79. V a 1 e n t i n H., Chromatographische Adsorptionsanalyse in der Pharmazie I, Pharm.
Ztg., 80, 469 (1935).
80. Wagner G., Pharmazie, 10, 302 (1955).
81. Wallach 0., Terpene und Campher, 2. Aufl., Leipzig, 1914.
82. Was icky R., Fehden O., Mikrochim. Acta. 1, 55 (1937).
83. Wenger E., Diss., Tubingen, 1960.
84. Winkler W., Lunau E., Pharm. Ztg., 104, 1407 (1959).
85. Wotherspoon P. A., Bedoukian P. Z., Am. Perfumer Essent. Oil Ref.,
66, Nr. 5, 17 (1955).
86. Wulff H. D., Stahl E., Naturwiss., 47, 114 (1960).
87. Z a n i n i C., DalPozzo A., D a n s i A., Boll. Chim. Farm., 100, 83 (1961).
14*
ГЛАВА 12
ВИТАМИНЫ
X. Боллигер
I. ВВЕДЕНИЕ
Многие витамины можно определить биологическими методами. Однако
в отношении точности, экономии времени и расходов эти методы оставляют
желать лучшего. Поэтому для определения все чаще применяют физико-
химические методы, например колориметрию, спектрофотометрию и т. д.
Это требует, однако, чтобы витамины, экстрагированные из питательных
веществ, фармацевтических препаратов и из растительных и животных мате-
риалов, перед определением были освобождены от сопутствующих веществ,
мешающих анализу. В качестве методов очистки оправдали себя колоночная
хроматография (адсорбция, распределение, ионный обмен) и особенно хро-
матография на бумаге (адсорбция, распределение) и электрофорез, описан-
ные в соответствующих руководствах [23, 34, 65].
Указанные методы очистки и анализа дополняются методами ХТС; пре-
имущество последних заключается в экономии времени и отчасти в большей
чувствительности. Благодаря разнообразным возможностям эти методы
используются также для решения других задач, например при исследовании
стабильности природных и синтетических витаминов и изучении химических
реакций.
Ниже мы опишем новые возможности определения витаминов с исполь-
зованием метода ХТС *.
II. МЕТОДЫ РАБОТЫ (ОБЩИЕ ПРИЕМЫ)
Методы переработки для выделения подвергаемых хроматографическому
разделению экстрактов определяются свойствами исходного материала,
формой применения и количеством находящихся в нем витаминов. В при-
родных продуктах витамины находятся не в свободном состоянии, а каким-то
образом связаны. Искусственно полученные препараты для стабилизации
часто заключают в желатину. Из однородных проб (раствор, порошок) вита-
мины известным способом экстрагируют непосредственно или после гидро-
лиза. Полученные таким образом экстракты после концентрирования и даль-
нейшей очистки (например, методом вымораживания или колоночной хрома-
тографии) наносят на пластинки для ХТС и подвергают одно- или двумер-
ному хроматографированию, используя соответствующие растворители. Обна-
ружение витаминов на пластинке осуществляют либо при рассматривании
в свете с различной длиной волны, либо при опрыскивании соответствую-
щими реактивами **. Для количественных расчетов целесообразно проводить
сравнение со стандартом, прошедшим стадии хроматографического разделе-
ния, элюирования и последующего физико-химического определения. Для
определения витаминов можно использовать также биоавтографию, т. е.
* В частности, речь пойдет о наших собственных еще не опубликованных работах.
** Приготовление реактивов описано в конце книги.
Гл. 12. Витамины
213
микробиологический метод, который был, например, описан Мартином
[34] для хроматографии на бумаге витамина В.
Источниками ошибок, на которые следует обратить внимание, являются:
чувствительность некоторых витаминов к кислороду воздуха (прежде всего
витамины A, D, Е, К и С), свету (витамин A, D, Е, К, В, В2, В6 и С), актив-
ным адсорбентам (витамины A, D и К), теплу и растворителям (в особенности
витамин D). Вызванные при этом эффекты можно легко установить методом
ХТС и, приняв специальные меры предосторожности, уменьшить или
исключить.
Согласно нашим данным, анализ витаминов целесообразно проводить
в помещениях с постоянной температурой (20—23°) и при мягком свете.
Лучшую защиту от света обеспечивает прозрачная, поглощающая коротко-
волновую часть света пленка увекс *, которой заклеивают окна. При ярком
солнечном свете дополнительно устанавливают жалюзи. Далее, следует
применять только чистые, дважды перегнанные растворители. Продажный
абсолютный этиловый спирт и чистый петролейный эфир содержат, напри-
мер, еще следы загрязнений, которые при обработке проб концентрируются.
Эти примеси флуоресцируют на слое адсорбента, окрашиваются и поэтому
мешают определению.
При хроматографии в тонких слоях работают стандартным методом
(стр. 35). К адсорбенту добавляют 2% светящегося вещества «ZS-супер» **,
вследствие чего слои в УФ-свете в области 254 флуоресцируют. Пластинки
с нанесенными на них слоями должны обладать одинаковой активностью,
должны иметь слой одинаковой толщины и одинакового состава, поскольку
уже небольшое различие слоев может привести к искажению и смещению
пятен. Аналогичные эффекты могут быть вызваны также сопутствующими
веществами или слишком концентрированными растворами, вследствие
перегрузки слоев. Для соблюдения стандартных условий камеры, оклеенные
фильтровальной бумагой (насыщение камеры), для каждого хроматографи-
ческого анализа насыщаются свежим растворителем. Поскольку величины Ду,
которые следует рассматривать как ориентировочные, могут сильно
колебаться, в экстракт для сравнения необходимо добавить чистый витамин.
Перед опрыскиванием хроматограммы рассматривают в коротковолновом
УФ-свете (254 жц) на поглощение, в длинноволновом УФ-свете (365 жц)
на флуоресценцию и с помощью лампы дневного света для установления
собственной окраски.
Если экстракты наряду с жирами и другими сопутствующими веществами
содержат лишь небольшие количества витаминов, разделение удается осуще-
ствить при нанесении относительно больших количеств экстракта (0,1—1 мл)
в виде полос (стр. 22) на более толстых слоях (0,4—3 мм). Эти слои можно
получить очень равномерными, используя приспособление для нанесения
слоев с регулируемой толщиной (см., например, раздел «Витамин D»).
Оказалось выгодным выделить из витаминного комплекса водораство-
римую и жирорастворимую части, благодаря чему одновременно достигают
очистки. В этом случае при хроматографическом разделении носитель не пере-
гружен и обе группы витаминов можно без потерь разделить на пластинке
за более короткое время.
Ш. ТОНКОСЛОЙНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ ЖИРОРАСТВОРИМЫХ ВИТАМИНОВ
При разделении этих сильно липофильных веществ метод ХТС оказывает
исключительную помощь и, по-видимому, превосходит в этом случае метод
* Специальную пленку UVEX поставляет фирма «Cellpack» (Швейцария).
** Фирма «Riedel de Наёп» (Ганновер).
214
Специальная часть
хроматографии на бумаге. В короткое время можно хроматографировать
относительно большие количества экстракта и перевести вещества в видимую
форму, обрабатывая агрессивными специфическими реактивами. При про-
ведении хроматографического разделения следует иметь в виду, что пред-
варительно очищенные экстракты часто еще содержат жиры и масла,_ затруд-
няющие интерпретацию, поскольку они флуоресцируют в УФ-свете и легко
окрашиваются. Далее, каротиноиды и витамины A, D и К на сухих активных
слоях не являются стабильными, и поэтому с ними следует обращаться
осторожно при нанесении пробы и соскребании зоны для количественного
определения, иными словами, они должны лишь короткое время находиться
на носителе. Скорость разложения витамина на пластинке можно, например,
проследить, нанося по каплям все увеличивающееся со временем количество
его и проводя хроматографическое разделение.
1. СМЕСИ ЖИРОРАСТВОРИМЫХ ВИТАМИНОВ
Смеси жирорастворимых витаминов можно разделить в различных систе-
мах в зависимости от конкретной аналитической задачи*. На силикагеле Г
(«Merck») со смесью циклогексан — эфир (80 + 20) и на окиси алюминия
ф ф р ларотин
Витамин А (па/тмитат)
Витамин К j
Витамин Д t ацетат s
Рис. 102. Разделение жирорастворимых витаминов на силикагеле Г (с добавкой флуо-
ресцирующего вещества) со смесью циклогексан — эфир (80 + 20).
Снято в коротковолновом УФ-свете; время анализа 60 мин. 1 — 20 цг полностью транс-вита-
мина А (спирта); 2 — 20 ца витамина D2; з — 3Q иг dl-a-токоферола; 4 — 20 цг полностью транс-
витамина А (ацетата); 5 — 30 ца витамина Ki, 6’ —20 цг полностью транс-витамина А (пальмитата);
7 — 20 ца полностью транс-₽-каротина; 8 — вещества и количества 1—7.
(фирма «Fluka» или «Merck») с бензолом возможно разделение различных вита-
минов при времени анализа 60 мин (см. табл. 26 и рис. 102). Используя
смесь циклогексан — эфир, можно, варьируя отношения в смеси, достигнуть
* Смеси Р-каротина и витамина А можно разделить по Лагони и др. [32, 33 [, а-токо-
ферол и витамин А — по Фонтелу и др. [14], а смеси а-токоферола, Р-каротина, вита-
мина К и убихинона — по Вагнеру и др. [64]. Давидек и др. [7] на свободных слоях
окиси алюминия без связующего материала хроматографически разделили витамины А
(спирт, ацетат и пальмитат), D2, Е (ацетат), Kj, К2, Кз, а также провитамины — а-
и p-каротин. С помощью четырнадцати растворителей были разделены модельные смеси
и определены значения величины Rf.
Гл. 12. Витамины
215
новых эффектов разделения. Лежащие близко друг к другу пятна витамина А
(спирта) и витамина D на пластинках с силикагелем при использовании
смеси циклогексан — этилацетат (80 + 20) или (70 + 30) отдаляются друг
от друга, а вещества с более высокими значениями Rf перемещаются сов-
местно. Это разделение удается также на более толстых слоях (0,4—3,0 мм)
и с большими количествами витамина или экстракта (0,1—1,0 мл). В каче-
стве других растворителей можно использовать петролейный эфир и хлоро-
форм. Известные из области колоночной хроматографии носители, например
фосфат кальция, а также слои силикагеля, пропитанные парафиновым маслом
(обращенные фазы), пригодны при использовании подходящих растворителей.
Таблица 25
Цветные реакции жирорастворимых витаминов с хлорной
и серной кислотами на слоях окиси алюминия [3,7]
Витамин Окраска
70%-ная хлорная кислота 98%-ная серная кислота
А Фиолетовая Сине-фиолетовая
d2 Оранжево-коричневая Оранжево-красная
Е Коричневая Коричневая
Ki Желто-коричневая Желто-коричневая
к2 » »
К3 » »
Провитамины А Синяя Синяя
Таблица 26
Ориентировочные величины Rf X 100 и непосредственное обнаружение
жирорастворимых витаминов на слоях с добавкой флуоресцирующего вещества
Сорбенты: силикагель Г фирмы «Merck», окись алюминия фирмы «Пика»
Витамин RyXlOO Окраска минимально обнаруживае- мое количе- ство, ца
на сили- кагеле со смесью цикло- гексан— эфир (80+20) на окиси алюми- ния с бензолом УФ-свет (254 лц) УФ-свет (365 мц) дневой свет
Р-Каротин 84 89 Темная Темная Оранже- вая 0,03—0,04
Витамин А, спирт . . . 10 16 » Желто- — ч
зеленая
Витамин А, ацетат . . 45 72 Желтая — 0,2/0,03
Витамин А, пальмитат 72 84 » » —
Витамин D2 или D3 , . 15 22 » — — 0,5
а-Токоферол 32 53 » — — 10
а-Токоферол, ацетат . . 40 71 » — — 10
Витамин Kj 61 79 » Темная Желтая 0,5/1/20
Растворимые в жирах биологически активные вещества в малых коли-
чествах можно обнаружить при освещении по собственной окраске (кароти-
ноиды), по поглощению или флуоресценции (см. табл. 26). Эти данные пред-
ставляют большую ценность при последующем элюировании и количествен-
216
Специальная часть
ном определении. Чтобы избежать фотохимического разложения, облучение
УФ-светом должно быть кратковременным.
Следы витаминов можно открыть, используя фосфорномолибденовую
кислоту (реактив № 1206) и получая серовато-голубые пятна, а также
обрабатывая хлором с реактивом о-толидин — иодид калия (реактив № 32)
и получая белые пятна на серовато-голубом фоне. Ниже будут указаны наи-
более выгодные, специфические вещества для обнаружения.
Различные биологически активные вещества можно окрасить индиви-
дуально, как это, например, показали Генсхирт и Мальцахер [15] для водо-
растворимых витаминов (стр. 236) и Блатна и Давидек для жирорастворимых
витаминов [3, 7] (см., например, табл. 25, заимствованную из оригинальных
работ [3, 7]).
Используя описанную выше методику, можно качественно и отчасти
количественно определить жирорастворимые витамины в сложных пре-
паратах.
2. КАРОТИНОИДЫ (ПРОВИТАМИНЫ А)
Из трех перечисленных основных групп этого класса природных соеди-
нений можно получить другие каротиноиды по реакциям дегидрирования,
циклизации, ароматизации и введения кислородных функций или окисли-
тельного расщепления.
А + В + А'-г ликопин
А + В + С - Y- каротин
С + В + С = р - каротин
Каротиноиды широко распространены в растительном и животном мире
и представляют собой красящие вещества, от желтого до ярко-красного цвета,
принадлежащие к классу терпенов. В настоящее время известно примерно
100 таких соединений. Их можно подразделить на чисто углеводородные
соединения — каротины — и кислородсодержащие производные (спирты,
альдегиды, карбоновые кислоты, эпоксиды); часто встречаются также цис-
траис-изомеры. Некоторые каротиноиды следует рассматривать как про-
витамины А (например, Р-каротин, криптоксантин, торулародин, эхиненон
и апокаротиналь и т. д.), поскольку они в человеческом и животном орга-
низме переходят в витамин А.
Метод ХТС может сыграть здесь большую службу при идентификации
и определении. Методом ХТС можно легко анализировать синтетические
каротиноидные препараты, но при анализе природных экстрактов оказалось
полезным предварительно отделить сопутствующие вещества, например
методом колоночной хроматографии, и дальше исследовать отдельные
фракции.
Поскольку каротиноиды на сухом слое подвергаются быстрому измене-
нию, их следует хроматографировать сразу же после нанесения; для без-
опасности можно наносить пробу в атмосфере СО2. Кроме того, чтобы избе-
жать превращений, следует пользоваться свежеприготовленными раство-
рами каротиноидов или проводить сравнительное исследование [53].
Гл. 12. Витамины
217
а) Условия разделения и результаты
Еще Мотье [38] на свободных слоях окиси алюминия, используя бензол
выделял каротиноиды моркови. Шталь [52] хроматографировал Р-каротин
на силикагеле Г с бензолом (Rf X 100 ~ 99); он продемонстрировал также
применение «ступенчатой методики», используя растворители с различной
элюирующей способностью. С хлороформом (1 ступень) и затем с гексаном
(2 ступень) удалось отделить.биксин и кантаксантин от p-каротина и лико-
пина. Согласно Зеэру [49], p-каротин перемещается на активированном
силикагеле Г с хлороформом дальше, чем различные токоферолы (7?у X 100 ~
~ 80).
Монтаг [37а] кратко описал возможность применения метода ХТС для
обнаружения в продуктах питания некоторых искусственных и природных
жирных красящих веществ, например биксина, норбиксина, каротина, кап-
сантина и корцина. На слоях силикагеля Г, полученных стандартным методом,
он осуществлял разделение тремя различными растворителями.
Для разделения различных каротиноидов Демоле [9, 10] использовал
слои силикагеля с рисовым крахмалом в качестве связующего и проводил
разделение смесью н-гексан — эфир (30 + 70). Излер с сотрудниками [28]
применял гидроокись кальция + силикагель Г (6 + 1). Используя в каче-
стве растворителя смесь петролейный эфир — бензол (98 + 2), они разделяли
каротиноидные углеводороды, применяя бензол — каротиноидные кетоны,
а используя смесь бензол — метанол (98 + 2) — гидроксилированные каро-
тиноиды. На активированных слоях силикагеля Г при разделении смесью
петролейный эфир (т. кип. 90—110°) — бензол (50 + 50) различные каро-
тиноиды перемещаются с разной скоростью (см. табл. 27).
Шталь, Болигер и Ленерт [53] нашли, что, используя только один адсор-
бент и один растворитель, нельзя разделить встречающиеся смеси кароти-
ноидов. Применяя слои гидроокиси кальция, фосфата магния и силикагеля Г
и соответствующие растворители, удалось разделить группы каротиноидов
на отдельные соединения (почти тридцать различных производных, см. таб-
лицу 27). Для проверки этой схемы анализа одновременно хроматогра-
фировались неизвестные растительные экстракты, содержащие каро-
тин, которые можно было непосредственно или косвенно проанализировать
количественно. Нанесение осуществляли в виде полос на слои толщиной
0,5 мм (длина разделительного слоя 10—12 см, время анализа около 15 мин).
По-видимому, целесообразно по приведенной схеме провести классификацию
еще большего числа каротиноидов и другие группы расположить в таком же
порядке. Во всех опытах при применении С-камер * были достигнуты лучшие
результаты по сравнению с до сих пор применяемыми стеклянными лотками.
Эта система разделительной камеры делает излишним насыщение атмосферы
камеры и позволяет на пластинке шириной 40 см параллельно анализировать
более 30 смесей, чтобы сравнить их.
Для разделения и определения каротиноидных альдегидов в растениях,
микроорганизмах и животных тканях Винтерштейн и др. [67—69] приме-
няли в качестве сорбента смесь гидроокись кальция — силикагель Г
(80 + 20), а в качестве растворителя,— как правило, смесь петролейный
эфир — бензол (50 + 50). Содержание бензола в определенных случаях
менялось, иногда добавляли 1 % метанола. Часто применяли также пластинки
со слоем силикагеля, пропитанным парафиновым маслом (активированный
слой окунался в раствор 5% парафинового масла в петролейном эфире
и сушился); затем осуществлялось разделение метанолом, насыщенным
парафиновым маслом.
* Изготовитель — фирма «Desaga», Гейдельберг.
Таблица 27
Ориентировочные значения R? х 100 различных каротиноидов
Разделяемая система 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Каротиноидные углеводороды а-Каротин Р-Каротин 7,7 '-Дигидро-р-каро- тин 15,15' - Дегидро-0-ка- ротин у-Каротин Ликопин 3,4-Дегидроликопин 3,4,3' ,4 '-бис-Дегид- роликопин .... Торулин Кислородсодержащие каротиноиды Р-Апо-12'-кароти- наль Р-Апо-8'-каротиналь Р-Апо-8' - ликопина ль Р-Апо-Ю'-кароти- наль Ликопиналь .... Кроцетиндиальде- гид Метиловый эфир то- руларгодина . . . Метилбиксин .... Кантаксантин . . . Криптоксантин . . . Ксантофилл .... Антераксантин . . Зеаксантин .... Виолаксантин . . . Капсантин Капсорубин .... Биксин Азафрин Эхиненон Родоксантин .... Метиловый эфир р-апо-8 '-каротино- вой кислоты . . . Изозеаксантин . . . 96 38 17 51 63 88 84 82 74 40—50 10—20 43 34 82 16 74 55 57 94 82 70 74 15 0 10 26 84 69 55 а а 0 0 0 75 75 75 65 56 51 0 0—7 97 Ф 0 70 64 58 53 43 7,5 83 13 0 100 (98) 94 81 63 54 10—11 I 100 100 97 90 75 35 .32 24 21 16 13,5 5,5 2,0
Гл. 12. Витамины
219
Продолжение табл. 27
Разделяемая система 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Масляный желтый 35а 32 94 95 100
Индофенол .... — — — — — 10 3 58 86 100
Судан красный . . — — — — — 0 8 68 90 100
Слой (0,25 1. Силикагель (с рис< мм) )вым крахмалом), н-гексан- Растворитель - эфир (30 + 70) [9, 10]
2. Гидроокись кальция — силикагель петролейный эфир — бензол (98 + 2 [28]
Г (6+1), 3. Гидроокись кальция — силикагель бензол [28] Г (6 + 1), 4. Гидроокись кальция — силикагель бензол—метанол (98 + 2) [28] Г (6 + 1), 5. Силикагель Г, петролейный эфир (т. кип. 90—110°) — бензол (50 + 50) 6. Гидроокись кальция, смесь углеводородов — метиленхлорид (95 + 5) 7. Силикагель Г, ундекан — метиленхлорид (80 + 20) 8. emop-Фосфат магния, четыреххлористый углерод 9. emop-Фосфат магнии, бёнзол 10. Силикагель Г, метиленхлорид—этилацетат (80+20) 6—10. Групповое разделение по Шталю, Боллигеру и Ленерту [53].
а Образование полосы (хвоста).
Следует еще отметить своеобразные адсорбционные свойства каротиноид-
ных альдегидов [67, 681. Адсорбционное сродство на непропитанных слоях
является функцией не числа двойных связей, как, например, в случае угле-
водородов, а скорее строения. Ретинен (витамин Аь альдегид) с пятью сопря-
женными двойными связями значительно сильнее адсорбируется, чем
Р-апо-8'-каротиналь с девятью двойными связями. Сравнительная хромато-
грамма синтетически полученных альдегидов (рис. 103) показывает, что
альдегиды С4о, С35, С3о и С25 адсорбируются значительно слабее альдегидов
С37, С32, С27, в которых одной двойной связью меньше. Величины адсорб-
ционного сродства в этом случае зависят от того, находится в а-положении
к альдегидной группе метильная группа или атом водорода. Наоборот, в слу-
чае слоев силикагеля, пропитанных парафиновым маслом, величины Rf X 100
каротиноидных альдегидов увеличиваются в соответствии с тем, что можно
было ожидать исходя из теории:
Альдегид С40 С37 С35 С32 С30 С27 С25 С2о
Ориентировочное значение Я/Х100 28 34 38 47 49 63 69 85
Наличие р-апо-8'-каротиналя и р~апо-8'-каротиновой кислоты, являю-
щихся красящими элементами яичного желтка, было доказано Томменом [56]
также методом ХТС. Встречающийся у многих птиц в красных перьях кан-
таксантин [63] также был отчетливо идентифицирован этими авторами [57]
в органах семейства фламинговых. В этом случае оказалось, что кантаксан-
тин находится прежде всего в печени и, в меньших количествах, в сердце
и почках. Этим же методом Томену [58] удалось обнаружить и определить
в соке и кожуре свежих апельсинов наряду с цитраурином Р-апо-10'-каро-
тиналь, $-апо-2'-каротиналь и прежде всего р-апо-8'-каротиналь.
220
Специальная часть
Гудвин [17] использовал метод ХТС для исследования биогенеза кароти-
ноидов в микроорганизмах и бактериях. Девис, Гудвин и Мерчер [8] смогли
обнаружить этим методом ликоперсен в Rhodes pir ilium rubrum. Гроб и др.
[21, 22] иАйхенбергер и Гроб [13] провели аналогичные исследования с расте-
ниями и грибами. Было изучено образование и превращение каротиноидов
в листьях, цветах и плодах (ср. рис. 104) и доказано наличие природного лико-
персена в Neurospora crassa.
Рис. 103. Хроматограмма ряда p-апокаротиналя (С25 — С40) на силикагеле Г,
при использовании смеси петролейный эфир — бензол (40 -р 60) [29].
Метод ХТС пригоден также для определения г{пс-транс-изомерных соеди-
нений. На активных слоях силикагеля Г при разделении метанолом пол-
ностью тра«с~р-каротин, например, остается на точке старта, а 15,15'-цис-fi-
каротин перемещается (Rf X 100 65). Образование полос определенно
указывает на изомеризацию в процессе хроматографического разделения.
Рис. 104. Разделение экстракта из зеленых листьев клена (Acer platanoid.es)
на силикагеле Г со смесью петролейный эфир (т. кип. 50—70°) — бензол — этанол
(100 + 20 4- 7) [21].
Вторичный фосфат магния в качестве сорбента (пластинки приготовлены
по Шталю) и смесь петролейный эфир (т. кип. 30—45°) — эфир (95 + 5)
в качестве растворителя пригодны для разделения полностью транс- и 15,15'-
г|пс-р-апо-8'-каротиналей (С3о)(7?/ X 100 65 и 88). Продукты разложения,
которые могут возникнуть во время пребывания вещества на сухом слое,
адсорбируются сильнее. транс-Кантаксантин, 15,15'-г|пс-кантаксантин,
Гл. 12. Витамины
221
эхиненон и p-каротин можно разделить на силикагеле Г, используя смесь
метиленхлорид — эфир (90 + 10)(/?у X 100 56, 48, 80 и 90). Для каждой
смеси изомеров следует подыскать подходящую систему для разделения,
поскольку не существует общих правил выбора системы.
б) Обнаружение и возможность количественного определения
Даже небольшие количества пигментов можно обнаружить при дневном
свете при наличии собственной интенсивной окраски ив УФ-свете при 254
и 365 л«р, в виде темных адсорбционных пятен (см. табл. 26). В случае веществ,
окрашенных в желтый и оранжевый цвет, на хроматограмме можно обнару-
жить 0,1 рг, а в случае интенсивно окрашенных в красный цвет каротинои-
дов — до 0,01 рг. Путем опрыскивания смесью парафиновое масло — гептан
можно сделать окраску более интенсивной и прочной [53]. Определенные
продукты разложения при освещении кварцевой лампой флуоресцируют.
Обычно применяемые для опрыскивания растворы, например хлорид сурьмы
(III) (реактивы № 11, 12), хлорид сурьмы (V) (реактивы № 13; 20% в хлоро-
форме) и концентрированная серная кислота дают небольшую чувствитель-
ность обнаружения. Они обладают, однако, тем преимуществом, что кароти-
ноиды окрашиваются при этом по-разному.
Для идентифицирования каротиноидных альдегидов хроматограмму
опрыскивают спиртовым раствором роданина (реактив № 130), а затем кон-
центрированным водным раствором аммиака или едкого натра, после чего
сушат. Благодаря характерной интенсивной окраске продуктов конденсации,
можно, например, обнаружить ретинен в количествах 0,02—0,03 рг в виде
красновато-оранжевых пятен. Так удалось доказать наличие р-апо-8'-каро-
тиналя в слизистой оболочке кишок и ретинена в экстрактах глаза [69].
Для количественного определения можно проводить сравнение с хрома-
тографическим анализом стандартной серии или же соскабливать сорбент
сразу после разделения (иногда в атмосфере СО2 [53]), элюировать, центри-
фугировать и затем измерять на спектрофотометре.
3. ВИТАМИН А
Витамин А
Витамин А встречается в организмах человека и животных преимуще-
ственно в виде свободного спирта или эфира жирной кислоты. В раститель-
ном мире он встречается в виде провитамина (каротиноиды) и витамина А,
альдегида (ретинен). Последний был обнаружен Винтерштейном и др.
[67—69] методом ХТС и рассмотрен в разделе, посвященном каротиноидам.
Под названием «витамин А» подразумевается полностью транс-форма или
витамин А, представляющий собой также физиологически наиболее активное
соединение группы витамина А. К настоящему времени многие из теорети-
чески возможных цис-транс-изомеров витамина Aj найдены в природе или
синтезированы в лаборатории. 13-г|ис-витамин А был найден в качестве
постоянного спутника витамина А1? например, в рыбьем жире, где его содер-
жание может дойти до 35% от общего содержания витамина А. В этих маслах
содержится также витамин А2, имеющий дополнительную двойную связь
в замещенном кольце циклогексена. Для исследования методом ХТС эти
соединения витамина А следует вначале выделить из природных и фармацев-
222
Специальная часть
тических объектов или кормовых веществ и подвергнуть экстракты предва-
рительной очистке.
а) Условия разделения и результаты
Витамин А (спирт, ацетат, пальмитат)- и другие производные можно
быстро разделить, используя различные системы * (см. табл. 28). Этисоеди-
Таблица 28
Ориентировочные значения К? х 100 различных соединений витамина А
Стандартные условия (время опыта около 60 мин, длина пути 18 см)
Соединение витамина А Окись алюминия Силикагель Г Силикагель Г 4- втор-фос- фат кальция 1 4- 1 Силикагель Г, пропитан- ный пара- финовым маслом
бензол 'циклогек- сан—этил- ацетат (904-10) циклогек- сан—эфир (80+20) циклогек- сан—эфир (854-15) ацетон— вода (90 + Ю)
полностью транс-Вита- мин А, спирт .... полностью транс-Вита,- 16 11 10 10 97
мин А, ацетат . . . полностью транс-Вита- 72 46 45 45 79
мин А, пальмитат . . 84 69 72 66 10
Ангидровитамин А . . 13-^мс-Витамин А, аце- — 73 75 75 —
тат — — —А— 50 —
Ретровитамин А, ацетат 13-^мс-Витамин А, паль- — — — 45 —
митат — — — 64—66 —
нения чувствительны и малостабильны на сухих слоях. Наряду с ангидро-
витамином А быстро образуются многие продукты разложения, которые
удерживаются на сорбенте сильнее. Поэтому важно, чтобы сразу же после
нанесения раствора витамина А пластинки были помещены в разделительную
камеру и хроматографированы. Рассматриваемый метод оказался весьма
полезным для определения витаминов А в фармацевтических препаратах,
кормовых веществах и продуктах питания.
Отличного разделения синтетически полученных изомеров витамина А
достигли недавно Планта и др. [42]. На слои активированного силикагеля Г
[51] наносили 0,4 рг вещества и в течение 60 лш/* хроматографировали смесью
петролейный эфир (т. кип. 30—45°) — метилгептенон (11 + 2) или (11 + 3)
(см. также рис. 105—107). Этот метод должен быть в особенности пригоден
для исследования природных концентратов витаминов А и А2 и родопсина
различных живых организмов. Изомеры с заторможенной г^ыс-двойной связью
(11-цис и 11,13-ди-цис) перемещаются значительно быстрее, чем незатормо-
женные г|ис-формы (ср. рис. 105 и 106). Соединения витамина А2 движутся
медленнее соответствующих изомеров витамина А (см. рис. 107). Неудовлет-
* Давидек и др. [7], используя различные растворители, хроматографировали на сво-
бодных слоях окиси алюминия наряду с другими жирорастворимыми витаминами и вита-
мин А (спирт, ацетат и пальмитат). Согласно Мангольду и др. [35], витамин А паль-
митат отделяется от липидных компонентов на силикагеле Г при использовании смеси
петролейный эфир — эфир — уксусная кислота.
Гл. 12. Витамины
223
ворительно только отделение полностью транс- от 9-г|ис-соединений, а также
11-цис- от 13-г|ис-соединений.
б) Обнаружение и возможности количественного определения
При оценке хроматограмм их прежде всего рассматривают в УФ-свете.
Многие соединения витамина А обнаруживают при 365 .wit желто-зеленую
флуоресценцию (порог чувствительности 0,03 цг), исключая, однако, ангид-
ровитамин А, витамин А альдегид и производные витамина А2, которые
наблюдаются в виде коричневатых пятен. При 254 л«р эти вещества можно
обнаружить в количествах до 0,2 рг в виде пятен на слоях с флуоресцирую-
щей добавкой. Витамин А под действием фосфорномолибденовой кислоты
(реактив № 1206) окрашивается в серовато-синий цвет, под действием хлорида
сурьмы (III) (ЭЬС13-реактив по Карру — Прайсу, № 11, 12) — в голубой
цвет и под действием концентрированной серной кислоты — вначале в темно-
синий цвет (минимально определяемое количество, 0,1—0,3 рг). Стабилен
только комплекс с фосфорномолибденовой кислотой. Окрашенный в интен-
сивно желтый цвет витамин А альдегид (ретинен) на силикагеле Г при дей-
ствии SbCl3 дает грязновато-коричневую окраску. Более специфичен реактив
роданина (реактив № 130) [68, 69]. Полуколичественную оценку осущест-
вляют, используя метод сравнения. Пока еще не достигнуто безупречное
количественное определение вследствие исключительно легкого разложения
соединений витамина А на активных сорбентах.
Методом ХТС с применением универсальных реактивов можно идентифи-
цировать наряду с витамином А также й другие витамины и сопутствующие
вещества (например, масла, антиокислители, синергисты и т. д.), что оказа-
лось очень полезным при исследовании продуктов, содержащих витамин А.
Брюгеман, Краус иТьюз [5, 59] выдвинули предположение, что не хлорид
сурьмы (III), а находящиеся .в нем следы хлорида сурьмы (V) вызывают при
взаимодействии с витамином А голубую окраску. Мы проверили его в наших
опытах следующим образом. На активированный силикагель Г наносили
хлороформные растворы, содержавшие 20% чистого SbCl3 и SbCl5 и разде-
ляли эфиром, после чего опрыскивали 0,5%-ным раствором витамина А
пальмитата в хлороформе. Оба соединения сурьмы дали пятна голубого цвета.
В случае SbCl3 получились равномерно окрашенные пятна (Rf X 100 46),
а в случае SbCl5 образовалась зона из трех пятен (Rf X 100 0, 15, 31)
(см. рис. 108). Таким образом было доказано, что как при действии SbCl3,
так и при действии SbCl 5 витамин А окрашивается в голубой цвет. .
4. ВИТАМИНЫ D
Витамин D2
(Кальциферол,
эргокальциферол)
СН3
Н3С | СН3
\/\/\/
R= i |
сн3
Витамин D3
(Холикальциферол)
Рис. 105. Разделение 6 изомеров витамина А (спирта) на силикагеле Г смесью
петролейный эфир (т. кип. 30—45°) — метилгептенон (И + 2).
Рис. 106. Разделение 5 изомеров витамина А2 (спирта) на силикагеле Г смесью
петролейный эфир (т. кип. 30—45°) — метилгептенон (11 + 3).
Рис. 107. Разделение заторможенных и транс-изомеров витаминов А и А2 (спиртов)
на силикагеле Г смесью петролейный эфир (т. кип. 30—45°)— метилгептенон (11 -ф- 22).
Гл. 12. Витамины
225
Витамины D принадлежат к группе стеринов. В растительном и живот-
ном- мире они образуются при облучении в качестве промежуточных про-
~ “ мало отличаю-
дуктов. Биологически наиболее активные витамины D2 и D3,
щиеся по химическому строению, в небольших количествах
встречаются в организме человека и животных. В большом
количестве витамин D3 содержится в жире печени и в жире
потрохов различных рыб. Оба витамина представляют собой
весьма чувствительные вещества. Трудность при определе-
нии их физикохимическими методами заключается прежде
всего в наличии мешающих сопутствующих им веществ.
Известно много методов определения обоих витаминов;
описанс> также разделение этих витаминов на бумаге [23,
65]. В качестве недостатков всех до сих пор применяв-
шихся методов можно отметить их трудоемкость, частично
неполное разделение и нестабильность соединений на носи-
телях. Методом ХТС можно оценить пригодность существую-
щих в настоящее время аналитических методов и выяснить
отношение витамина D к различным воздействиям.
Рис. 108. Хроматограмма SbCl3 и SbCl5 (см. текст).
1 — SbCl3; 2 — SbCl5.
а) Условия разделения' и результаты
Янеке и Маас-Гебельсом [301 опубликовано полезное исследование вита-
мина D методом ХТС. Они работали с силикагелем Г фирмы «Merck», исполь-
зуя в качестве растворителей гексан, гексан — этйлацетат (90 + 10) и хло-
роформ (см. табл. 29). В результате удалось достигнуть отличного отделения
витаминов D2 и D3 от других стеринов, продуктов расщепления и каротинои-
дов. Последние перемещаются с фронтом растворителя. Исследование методом
Таблица 29
Ориентировочные величины R? х 100 для витаминов D и некоторых стеринов
в различных разделительных системах
Слои получены стандартным методом, длина пути 12—16 см
Соединение Силикагель Г Окись алюми- ния Силикагель Г, пропитан- ный парафи- новым маслом
гексан- этил- ацетат (90+10) [30] хлоро- форм [30] цикло- гексан- эфир (50+50) цикло- гексан этилаце- тат (90 + 10) бензол ацетон— вода (80+20)
Витамин D2 13 43 40 15 22 57
Витамин D3 13 43 40 15 22 54
Превитамин d2 21 53 50 23 30 54
Превитамин D3 21 53 50 23 30 50
Эргостерин мин D2) (провита- 9 33 30 60
7-Дегидрохолестерин (про- витамин D3) 33
Холестерин 9 35 30 — — 45
15 Заказ № 734
226
Специальная часть
Рис. 109. Хроматограмма
чистого витамина D2 до и после
нагревания в хлороформном
растворе. Снята в УФ-свете
(254 .ир).
1 — 400 Jis витамина D2 (крис-
таллического необработанного);
2 — 400 цг витамина D2 (кристал-
лического, после 5-часового нагре-
вания при 60° в хлороформном
растворе в отсутствие света и воз-
духа).
ХТС процессов, самопроизвольно протекающих при химическом определе-
нии витамина D, привело к интересным результатам. При щелочном омылении
и хроматографическом разделении на активных адсорбентах, например
на флоридиновой земле, суперфильтроле и окиси алюминия (щелочной),
образуются многочисленные продукты превращения, которые, однако,
не удается однозначно идентифицировать. Выбор используемого для очистки
адсорбента имеет исключительное значение; не рекомендуется энергичной
омыление [601.
На пропитанном силикагеле Г (слой погружается в раствор 5% парафи-
нового масла в петролейном эфире и затем сушится) с применением смеси
ацетон — вода (80 + 20) разделяют витамины
D2 и D3 (см. табл. 29). При решении многих
задач оказалось целесообразным использовать,
более толстые слои силикагеля (толщиной
0,4—3,0 мм, получены стандартным методом
с применением прибора, позволяющего регули-
ровать толщину) и растворитель циклогексан—
эфир (50 + 50). Так можно отделить сопутс-
твующие вещества, продукты расщепления,
а также другие витамины; причем дополнитель-
ное преимущество заключается в том, что в этом
случае можно наносить большие количества
экстракта (0,1—1 мл). Все встречающиеся на
практике смеси витамина D с витамином А
эфиром при этом разделяются. При нанесении
пробы в виде полосы можно, например, иденти-
фицировать и определить менее 400 ИЕ * вита-
мина D в 100 000 ИЕ и более витамина А. Эта
система пригодна как для проверки на чистоту,
так и для открытия и определения витаминов D.
Методом ХТС можно легко проследить тер-
мическую изомеризацию, открытую Фелюцом
идр. [61]. Если, например, проводить умерен-
ный нагрев в темноте в атмосфере азота в бен-
зольном или хлороформном растворе, витамины
D при 60° переходят примерно на 15% в провитамины D, а остаток остается
неизменным (см. рис. 109). Провитамин D при этих условиях в свою очередь
переходит в витамин D. Отношение витамин D : провитамин D при равнове-
сии и скорость установления этого равновесия зависят от температуры. Так,
например, превращение витамина D3 в провитамин D3 протекает в этаноле
при 20° значительно медленнее, и равновесная смесь содержит только 7 % про-
витамина D3 [24]. Витамины D2 и D3 ведут себя при этом одинаково. В кри-
сталле содержится продолговатая молекула формы I (стр. 223) [6]. Для
объяснения термической изомеризации в растворе следует принять суще-
ствование равновесия формы I с цис-формой (П) [26].
* ИЕ — интернациональная единица.— Прим. ред.
Гл. 12. Витамины
227
Изомеризацию витаминов D2 и D3 в провитамины D2 и D3 можно наблю-
дать также при щелочном омылении (при этом в очень небольшой степени
происходит разложение) и при хранении препаратов витамина D.
Витамины D и провитамины D на сухих слоях силикагеля нестабильны.
При выдерживании нанесенного на активный слой соединения перед хрома-
тографированием в течение одной минуты на пластинке уже можно опреде-
лить небольшие количества сильнее адсорбирующихся продуктов разложе-
ния. При разделении никаких изменений не происходит. Поэтому для надеж-
ности идентификации и определения важно, чтобы сразу же после нанесения
пробы витамина пластинка была помещена в разделительную камеру и хрома-
тографирована, а зоны витамина D или превитамина D непосредственно
после локализации соскоблены с пластинки и элюированы хлороформом.
Таким образом были количественно проанализированы 24 пробы витаминов
(колориметрическое или спектрофотометрическое определение).
Биологическая активность превитаминов D значительно ниже биологи-
ческой активности соответствующих витаминов D (около 40%) [50]; правда,
вследствие взаимного превращения абсолютная активность может быть опре-
делена только приблизительно. Согласно Ханевальду и др. [24], активность-
чистого превитамина D3 составляет 35% антирахитной активности чистого
витамина D3. Этот результат объясняется кинетическим превращением пре^
витамин D3 витамин D3; наблюдавшаяся активность объясняется образо-
вавшимся в испытуемом животном витамином D3. В наших собственных
опытах найдено, что активность превитамина D2 после очистки методом ХТС
равна 56% активности чистого витамина ,D2.
При экстракции витаминов D следует избегать омыления, и нагревание
раствора в процессе анализа должно быть по возможности непродолжитель-
ным и умеренным. Из смесей биологически активное вещество лучше всего
извлекать хлороформом или, после мягкой обработки (вода — аммиак),
петролейный эфиром (т. кип. 30—45°). Затем этот экстракт можно сконцент-
рировать в вакуумном вращающемся испарителе при 40—50°, причем изоме-
ризуется лишь 1—2% имеющегося витамина.
Если подвергнуть растворы витамина D действию света и воздуха, то
наряду с упоминавшимися продуктами изомеризации образуются и другие
соединения. Кристаллический витамин D в листом состоянии более стабилен.
Даже после 24-часового действия света и воздуха при 45° методом ХТС
нельзя обнаружить никаких химических изменений. В холодном темном
месте в атмосфере инертного газа чистый витамин D сохраняется в течение
нескольких лет.
б) Обнаружение и возможности определения
Янеке и Маас-Гебельс [30] получают видимые пятна витамина D путем
опрыскивания раствором фосфорномолибденовой кислоты (реактив № 121)
с последующим нагреванием (20 мин) при 70° (витамины D2 и D3 образуют
желто-коричневые пятна, предел чувствительности 1,0—0,2 цг), причем
другие стерины окрашиваются по-разному. Для обнаружения рекомендуют
также SbCl3 (реактив № И). Полуколичественное определение небольших
количеств витамина D путем визуального сравнения еще заметных пятен
(0,1—0,2 рг) со стандартной серией, согласно нашим опытам, затрудни-
тельно. Жирная часть и продукты разложения витамина А перемещаются
с такой же скоростью, реагируют с теми же реактивами для опрыскивания
и поэтому мешают определению.
Для идентификации витаминов D можно рассматривать флуоресцирующий
слой в коротковолновом УФ-свете (в виде темного пятна обнаруживается
0,5 рг) и проводить опрыскивание различными цветными реактивами
15*
228
Специальная часть
(см. табл. 30). Витамины D2 и D3 можно отличить (если они присутствуют
в количествах не менее 30 цг), применяя концентрированную серную кислоту,
• в
в ‘ 4 .'г Т
Кмачество витамина 1>г,МЕ
0025fit)
Рис. 110. Предел обнаружения витамина D на пластинке после опрыскивания SbCl3
и нагревания (определено в длинноволновом УФ-свете).
.поскольку при этом возникают соответственно коричневые и зеленоватые
пятна. Наиболее чувствительно обнаружение с применением SbCl3 при
Таблица 30
Обнаружение витамина D реактивами для опрыскивания иа слоях силикагеля Г
Перевод в видимое состояние Окраска пятен витаминов Dg И Dg Примерное мини- мально обнаружи- ваемое количество
реактив степень опрыскива- ния обработка или промер через в длинно- волновом УФ-свете (флуоре- сценция) при дневном свете J13 ИЕ
SbCl3 (№ 11) Сильно 5 мин, 120° Оранжевая Серо-синяя 0,025 1
SbCl5 (№ 13, в хлороформе) H2SO4 конц. Слабо » 1 мин 5 мин, 120° 3 мин Оранжевая Оранжево- красная 1), коричне- вая D3 зеленая 0,3 0,3 | 30 12 12 1200
Умеренно 5 мин, 120° Оранжевая Серо-сияяя 0,3 12
Фосфорно- вольфрамовая кислота (№ 121) » 20 мин, 70° Серо-корич- невая 0,2 8
Фосфорномо- либденовая кислота (№ 1206) » 1 мин Серо-синяя 0,3 12
Трихлор- уксусная кис- лота (№ 143, 1%) » 5 мин, 120° Синеватая 0,1—0,2 4—8
Трифтор- уксусная кис- лота (№ 144) » 5 мин, 120' 0,1—0,2 4—8
Гл. 12. Витамины
229
нагревании до 120° (0,025 цг; см. табл. 30 и рис. 110). Провитамины D ведут
себя точно так же, как соответствующие изомеры витамина D, но другие
стерины различными реактивами окрашиваются по-разному.
Таким способом можно идентифицировать витамин D во многих препара-
тах и после элюирования определить колориметрически или спектрофото-
. метрически [31].
в) Определение витамина D в различных препаратах
После многочисленных опытов нам удалось разработать относительно
простой метод определения витамина D в концентратах масла и применяемых
препаратах, который описан здесь лишь кратко *. Методика специфична, чув-
ствительна и хорошо воспроизводится. Витамин D при этом почти не изме-
няется, и двукратный анализ можно осуществить за 3—6 час (в зависимости
от способа получения экстракта).
Рис. 111. Хроматограмма поливитаминного драже.
Пробы по 0,5 мл экстракта (около 800 ИЕ витамина D2); снято после соскабливания полосы витами-
на D (слева). Чистый витамин Dg хроматографирован на направляющей хроматограмме (справа)
один и с экстрактом. 1 — экстракт; 2 — витамин Эг-стандарт (50—100 цз).
В зависимости от состава пробы витамин D экстрагируют и концентри-
руют сразу же или после мягкой обработки водой и аммиаком и (или) вымо-
раживания жиров. Количества 0,1 —1,0 мл экстракта, после нанесения в виде
полос на слои силикагеля Г толщиной 0,4—3,0 мм хроматографируют
смесью циклогексан — эфир (50 -]- 50). После локализации полосы вита-
мина D соскабливают шпателем непосредственно в хроматографическую
колонку, элюируют хлороформом и отгоняют при 40° в вакуумном вращаю-
щемся испарителе. Остаток,, содержащий витамин D, растворяют в соот-
ветствующем количестве хлороформа, обрабатывают по известной методике
[60] реактивом SbCl3 в ацетилхлориде ** и проводят колориметрическое изме-
рение. Можно также осуществить спектрофлуорометрическое определение [31].
В каждом отдельном случае следует специально проверить метод обра-
ботки пробы для выделения экстракта, подвергаемого хроматографическому
разделению. Для двукратного определения окраски в оптимальной области
измерения колориметра достаточно количество экстракта, содержащее
не менее 800 ИЕ (= 20 цг) витамина D. В качестве растворителя для цветной
* Подробное описание этого метода будет приведено в другом месте.
** Для стабилизации окраски к этому реактиву добавляют 2% уксусного
ангидрида.
230
Специальная часть
реакции служит хлороформ. Реактив SbCl3 в ацетилхлориде (3 мл) следует
добавить к раствору, содержащему витамин D (2 мл, содержащие 200—400 ИЕ)
в специально подобранной кювете размером 2 см, перемешать и полученный
окрашенный комплекс промерить через 15—45 сек после добавления (макси-
мум интенсивности) на спектрофотометре «Спектроник 20» * при 500лщ одно-
временно с холостой пробой. Расчет проводят, используя свежеприготовлен-
ный и непосредственно определяемый стандартный раствор витамина D2
или D3.
Ошибки, возникающие из-за неотделенных продуктов разложения вита-
мина А, мешающих цветной реакции, исключают, добавляя вещество, ста-
билизующее окраску. Содержащиеся следы жира реагируют лишь через
минуту и при нашем методе работы не измеряются.
Этим методом анализировались масло- и порошкообразные концентраты,
содержащие только витамин D или наряду с ним витамин А, поливитаминное
драже, шоколад, атакже диэтические средства для похудания (100 ИЕ D2/25a).
Результаты хорошо совпадают со сравнительными биологическими измере-
ниями. При анализе раствора экстракта, содержащего около 800 ИЕ вита-
мина D, можно рассчитывать на стандартное отклонение, равное примерно
2,8% (ср. пример и рис. 111).
Пример анализа
Поливитаминное драже 150 ИЕ D2
Биологически найдено: 152 ИЕ D2
После экстракции, анализа методом ХТС и колориметрического изме-
рения найдено:
166/164/164/156/ А
161/170/166/168/ I 16, „Е D
155/164/166/168/ ( lb4 U2
160 J
5 . ТОКОФЕРОЛЫ (ВИТАМИН Е)
Строение известных в настоящее время встречающихся в природе токо-
феролов [1]:
СН,
I
R= —(СНг—СН2—СН2—СН)3—СН3 Токол
сн3
R = — (СН2— СН2—СН=С)3-СН3 Т окотриен ол
Токоферол Химическое название
а 5,7,8-триметилтокол
Р 5,8-диметилтокол
у 7,8-диметилтокол
С2 5,7-диметилтокол
6 8-метилтокол
ц 7-метилтокол
Ci 5,7,8-триметилтокотриенол
е 5,8-диметилтокотриенол
(5-метилтокол, синтезирован)
Токоферолы широко распространены в природе. Они являются опти-
чески активными производными 6-хроманола, которые отличаются числом
* Фирма «Bausch and Lomb» (Рочестер, Нью-Йорк, США).
Гл. 12. Витамины
231
и положением метильных заместителей, а также, как недавно обнаружено
[19, 20, 37], терпеновой боковой цепью. В то время как встречающиеся
в природе токоферолы являются стерически однородными, синтетические
препараты в зависимости от метода приготовления состоят из более или менее
сложных смесей диа-стереоизомеров.
Биологические функции токоферолов весьма разнообразны. Наиболее
активным является а-токоферол, встречающийся в природе наиболее часто.
Стабильность токоферолов можно повысить этерификацией фенольных
гидроксильных групп. Поэтому для многих целей часто используют эфиры
(уксусной, янтарной кислоты и т. д.).
Определение токоферолов является сложным, поскольку нужно экстра-
гировать без потерь материал, чувствительный к окислению, а также ввиду
того что сопутствующие вещества мешают колориметрическому определе-
нию [12]. Для устранения сопутствующих веществ и артефактов [4] можно
использовать как хроматографию на бумаге, так и метод ХТС.
Рис. 112. Разделение токоферо-
лов и родственных соединений
(по 50 уг) на силикагеле Г смесью
бензол — метанол (98 + 2).
Высота подъема 18 см; время анализа
50 мин (ср. табл. 31).
а) Условия разделения и результаты
При определении антиокислителей на слоях силикагеля Г с толуолом,
бензолом и хлороформом в качестве растворителей Зеэр [47] отделил а-токо-
ферол методом одно- и двумерной хроматографии. Этот же автор [48, 49]
смог определить различные токоферолы на
силикагеле Г фирмы «Merck», используя
хлороформ, и на окиси алюминия фирмы
«Fluka», используя бензол (см. табл. 31).
Применение этой методики в случае природ-
ных концентратов витамина Е дало возмож-
ность не только хорошо разделить а-, |3-
+у-,б-токоферолы, но и одновременно отде-
лить сопутствующие вещества, содержащиеся
в неомыляемых масел и жиров или в молеку-
лярных дистиллятах. Содержание а-токофе-
рола определяли после опрыскивания мето-
дом планиметрирования- пятен.
Токоферолы перемещаются по-разному
на силикагеле Г при использовании смеси
бензол — метанол (98 ф 2) и на вторичном
фосфате магния при использовании смеси
петролейный эфир (т. кип. 30—45°) — эфир
(85 + 15) (см. табл. 31 и рис. 112). Эти си-
стемы оказались пригодными для анализа
природных концентратов и экстрактов, а также для исследования продуктов
окисления и разложения. Оптимальное разделение критических партнеров,
например |3- и у-токоферолов, было достигнуто с использованием метода
клиновидных полос. а-Токоферол и его эфиры можно успешно анализировать
на силикагелевых пластинках с использованием смеси циклогексан — эфир
(80 + 20); согласно Вальди [66], пригодна также смесь циклогексан — хлоро-
форм — ледяная уксусная кислота (60 + 30 + 10). На более толстые слои
(0,4—3,0 мм) можно наносить 10—20 цг, и при этом образуются компактные
пятна.
По-видимому, различные токоферолы можно также выделить методом
распределительной хроматографии на пропитанных слоях или провести
одно- или двумерное разделение их нитрозопроизводных, как это делают
в случае хроматографии на бумаге [36].
232
Специальная часть
Таблица 31
Ориентировочные величины R? X 100 различных токоферолов
Время опыта 45 мин-, путь, пройденный фронтом, 12—18 см
Слой (стандартный метод) Силикагель Г Окись алюминия Силикагель Г втпор-Фосфат магния Силикагель Г
Растворитель хлороформ бензол бензол— петролейный эфир (т. кип. циклогек-
[48, 49] [48, 49] метанол (98+2) 30—45°)— Эфир (85 + 15) сан—эфир (80+20)
Токол 19 — 28 —
а-Токоферол 58 56 65 86 32
Р-Токоферол 35 34 51 76 30
у-Токоферол 37 31 48 71 26
^-Токоферол 49 48 59 82 29
б-Токоферол 23 21 32 61 21
ц-Токоферол 32 28 41 — 23
8-Токоферол 32 30 46 — 26
5-Метилтокол 27 24 40 — 26
а-Токоферол, ацетат — 71 — — 40
а-Токоферол, сукцинат — — — — 30—40 (хвост)
а-Токоферол, фосфат — — • — — 0
б) Обнаружение и возможности количественного определения
Зеэр [47—49] использовал для окрашивания а-токоферола и ацетата
а-токоферола 1%-ный раствор 2,6-дихлорхинонхлоримида в этаноле (соот-
ветственно желтовато-коричневая и розовая окраска). С сульфатом церия(1У)
(реактив № 25) ^-токоферол дает коричневые, а у-токоферол — голубые
пятна. Ацетат а-токоферола окрашивается этим реактивом после 10-минут-
ного нагревания при 120° в розовый цвет и в УФ-свете дает яркую светлую
флуоресценцию. Свободные токоферолы дают с фосфорномолибденовой кис-
лотой (реактив № 1206) уже на холоду серовато-голубые пятна, причем
вначале появляется a-соединение. Эфиры реагируют лишь после более про-
должительного нагревания при 110° и слабее. После обработки пластинок
(спустя 2—3 мин после опрыскивания) парами аммиака фон светлеет и все
соединения принимают равномерную серовато-голубую окраску (минимально
определяемое количество 1 цг, (а при нагревании — 0,5 цг). Для грубого
количественного определения Зеэр [48, 49] одновременно хроматографиро-
вал растворы чистого а-токоферола различной концентрации (10, 20, 40
и 60 ца) и после перевода в видимое состояние проводил сравнение площадей
пятен, определяемых планиметрически.
Красный комплекс, получающийся при действии реактива дипиридила
железа * (обнаруживается 0,5 цг а-токоферола; другие токоферолы реаги-
руют с различной скоростью и интенсивностью), может быть использован
для количественного определения, для чего его экстрагируют водой и фото-
метрируют. Токоферолы различают с помощью реактива хлорида сурьмы (V)
(№ 13, в хлороформе), поскольку окраска зависит от положения и числа
* Реактив дипиридила железа:! 0,5%-ный раствор а,а'-дипиридила в этаноле
и 0,2%-ный раствор хлорида железа (III) в этаноле (хранится в темноте) смешивают
перед употреблением в отношении 1 : 1 (опрыскивают сильно).
Гл. 12. Витамины
233
метильных групп в хромановом ядре и от природы боковых цепей
(см. табл. 32). Цветные комплексы SbCl5 нестабильны.
Таблица 32
Окраска токоферолов при умеренном опрыскивании сухих слоев раствором хлорида
сурьмы (V)
Промер примерно через 3 лши; минимально определяемое количество около 2 рг,
оптимальный интервал 20—50 рг
Токоферол (d- или dl- форма) Цветная реакция с SbClg на
силикагеле окиси алюминия emop-фосфате магния
а Оранжево-красный Оранжево-розовый Оранжево-розовый
₽ Светло-коричневый Коричневый Желто-коричневый
Y Зеленый Зеленый Лиловый
?2 Оранжево-желтый Бежевый Оранжевый
6 Красновато-корич- невый Фиолетовый Фиолетовый
п Ржаво-коричневый Лиловый »
В Коричневый Оливково-коричне- вый Коричневый
5-Метилтокаль Лиловато-серый Лиловато-серый —
Токол » — —
На слоях силикагеля с добавкой флуоресцирующего вещества «ZS-супер»
в коротковолновом УФ-свете еще можно обнаружить в виде темных пятен
10 рг токоферола. Так же как в случае хроматографии на бумаге [62], к сили-
кагелю можно добавить флуоресцеин (0,02%), что позволяет обнаружить токо-
ферол в виде фиолетовых пятен на флуоресцирующем фоне в УФ-свете (пре-
дел определения около 0,2 рг) и в виде красноватых пятен при дневном свете
(предел определения 2 рг).
Для количественного определения лучше всего локализовать пятна
в УФ-свете, элюировать и измерить колориметрически цветной комплекс
с дипиридилом железа, как в соответствующем хроматографическом методе
на бумаге [62]. Таким образом, было определено содержание а-токоферола
в различных применяемых препаратах и природных концентратах. Для
определения меньших количеств витамина (минимально 0,01 рг/лы) можно,
использовать также спектрофлуорометрические методы [11].
6. ВИТАМИНЫ К И УБИХИНОНЫ
R= — СН2 — СН = С—(СН2— СН2—СН= С)6 — сн3
R=—Н
Витамин Ki
Витамин К-2(35)
Витамин К3 (менадион)
В скобках указано число атомов углерода в боковой цепи.
234
Специальная часть
Витамины К( иК2 широко распространены в природе. Известны различ-
ные витамины К2, отличающиеся числом изопреновых звеньев в боковой
цепи. Синтетически полученный витамин К3 в кишечнике человека и живот-
ного претерпевает превращения, приобретает полиизопреноидную боковую
цепь и обнаруживает при этом полную биологическую активность витамина К.
Для определения необходимо осторожно обработать и выделить чувстви-
тельные витамины К. Для разделения используют колоночную хроматогра-
фию и хроматографию на бумаге [23, 65]. В последнее время используют
также метод ХТС, требующий меньшей затраты времени.
а) Условия разделения и результаты
Витамины К можно хроматографировать в различных системах
(ср. табл. 26 и рис. 102). На силикагеле Г со смесью циклогексан — эфир
(80 + 20) витамин К3 (Rf X 100 ~ 38) отделяется от витамина К! и К2(35)
(Rf X 100 ~ 61). Эту систему можно использовать для идентификации
витаминов К в применяемых препаратах. Как и другие витамины, раство-
римые в жирах, эти соединения малостабильны на активном слое и требуют
соответствующего обращения.
Глур [16] хроматографировал витамины К! и К2 с боковыми цепями
различной длины и родственные бензохиноны на пропитанном силикагеле Г
(пластинки погружали в раствор 5% парафинового масла в петролейном
эфире и затем высушивали), используя смесь ацетон — вода (95 5)
Таблица 33
Ориентировочные величины Н? х 100 убихинонов
в различных разделительных системах
Длина пути 10—16 см
Силикагель Г, пропитанный ' парафиновым маслом Силикагель Г — кизельгур Г (1 + 1), пропитанные пара- финовым маслом
Убихиноны ацетон — вода (95 + 5) [16] ацетон — вода, насыщенная парафиновым маслом (90 + 10) [64] смесь метанол — изопропанол (90 + + 10), насыщенная парафиновым мас- лом [53]
(5) — — 90
(Ю) — — 85
(15) — — 78
(20) — — 68
(25) — — 60
(30) 74 71 44
(35) 69 63 35
(40) 63 55 -« 25
(45). 52 42 14
(50) 43 31 8
(см. рис. 113 и табл. 33). Гомологические ряды при этом закономерно раз-
деляются, в то время как витамины К1; К2(3о> и убихинон (45) располагаются
на одинаковой высоте. Этим методом удалось обнаружить в бациллах тубер-
кулеза витамин К2 (45) и в гомогенате печени крыс 90% убихинона (45)
наряду с убихиноном (50) и (40). Биллетер и др. [2] использовали метод
Гл. 12. Витамины
235
ХТС также при изучении превращения витаминов}К2(3о) и К2(10) в витамин
К2(20) в организмах птиц и млекопитающих.
О
II
Н3СО -,<>1- СН3 сн3 сн3
I I
Н3СО-'>ч/1|-СН2-СН = С-(СН2-СН2-СН = С)ж-СН3 убихиноны: х=0-9
II
О
о
II
Н3С—СН3 СН3
Н3С СН2 СН=С (СН2 — СН2—СН=С)в — СН3 пластохинон (45)
II
О
На смешанных слоях удается разделение убихинонов (5) — (50) (рис. 114).
Вагнер и др. [64] также сообщили о разделении различных убихинонов
(см. табл. 33).
Для обнаружения убихинонов в биологических объектах (например, уби-
хинона (50) в сердечных мышцах крупного рогатого скота) Вагнер и др. [64]
Рис. 113. Разделение витаминов К, и
К2, а также родственных бензохинонов
(см. текст) [44].
Время анализа 1 час; пластинки после нагре-
вания при 130° опрыскивали серной кислотой;
пробы по 20 рг. 1 —убихинон (30) х= 5;
2 — убихинон (35) х = 6; 3 — убихинон (40)
х = 7; 4 — убихинон (45) х = 8; 5 — убихинон
(50)х=9; в—пластохинон (45); 7 — витамин
Кг (30)1 « —витамин К2(35>; 9 — витамин К2(45);
JO — витамин КД.
Рис. 114. Разделение убихинонов (5) —
(50) на смешанных слоях, пропитанных
парафиновым маслом (ср. табл. 33) [53].
Т — эталонная смесь фирмы «Desaga»; G — смесь
убихинонов. Пробы по 2 цг каждого вещества;
обнаружение фосфорномолибденовой кислотой
(реактив JVfi 120 б).
применили комбинированную методику, по которой вначале отделяют
липоиды от убихинонов (Rf X 100 86) на силикагеле Г, используя смесь
бензол — хлороформ (50 + 50) и затем убихиноны подвергают специаль-
ному анализу.
б) Обнаружение и возможности определения
Витамины К можно обнаружить в коротковолновом УФ-свете на слоях,
пропитанных флуоресцирующим индикатором, в виде темных абсорбцион-
236
Специальная часть
ных пятен (минимально определяемое количество 0,5 р,г). После 10-минут-
ного облучения на небольшом расстоянии кварцевой лампой пятна обнару-
живают желтую флуоресценцию (минимально определяемое количество
0,3 цг витамина К^). При опрыскивании горячих пластинок концентриро-
ванной серной кислотой витамины К и убихиноны окрашиваются в фиоле-
товый цвет (около 3 рг) [16]. Также неспецифичным, однако более чувстви-
тельным реактивом является фосфорномолибденовая кислота (реактив
№1206). Витамины К могут быть также идентифицированы с помощью
диэтилдитиокарбамата натрия [27], ксантанового водорода [46] и 2,4-динит-
рофенилгидразина. Убихиноны обнаруживаются на пропитанных слоях
в УФ-свете в виде коричневых фулоресцирующих пятен. Их можно также
обнаружить SbCl3 (реактив № 11, в хлороформе) с последующей сушкой
в течение 10 мин при 110° в виде серо-фиолетовых пятен или родамином (реак-
тив № 129) в УФ-свете в виде фиолетовых флуоресцирующих пятен [64]. Для
количественного определения витаминов К и убихинонов можно исполь-
зовать сравнительный метод.
IV. ТОНКОСЛОЙНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ ВОДОРАСТВОРИМЫХ ВИТАМИНОВ *
Здесь также применяют ХТС в качестве аналитического метода, который
отличается простотой осуществления и экономией времени. Метод исполь-
зуют во многих лабораториях, хотя по этому поводу опубликовано мало
работ [15, 39, 40]. Витамины, растворимые в воде, можно разделить с помощью
предложенных систем, правда, как указывалось выше, величины Rf могут
несколько колебаться.
Растворимость биологически активных веществ весьма различна. Знание
этой величины играет большую роль как при экстракции, так и при нанесе-
нии и разделении. Водорастворимые витамины на высушенном слое силика-
геля значительно стабильнее жирорастворимых витаминов, что облегчает
нанесение и количественное определение.
1. СМЕСИ ВОДОРАСТВОРИМЫХ ВИТАМИНОВ
Различные витамины группы В и витамин С были разделены Генсхиртом
и Мальзахером [15] методом одномерной хроматографии на слое силика-
геля Г с 2% флуоресцирующего индикатора «ZS-супер», приготовленном по
методу Шталя. Наилучшиё результаты получены со смесью растворителей
ледяная уксусная кислота — ацетон — метанол — бензол (5 + 5 + 20 + 70)
(см. табл. 34). Метод был разработан для комбинаций витаминов (группа В
1—10 ра и витамин С 5—30 цг), имеющихся в фармацевтике. Этот метод
обычно применим для наносимого количества смеси 50—100 цг. Для точного
определения всех компонентов необходимо из каждой пробы нанести на пла-
стинку по два пятна. Высушенные хроматограммы (длина пути 19 см) рас-
сматривают в длинноволновом УФ-свете, где рибофлавин можно определить
по желтой флуоресценции на темном фоне. В коротковолновом УФ-свете
можно обнаружить витамин Bt, витамин С и амид никотиновой кислоты в виде
темных пятен, витамин В2 — в виде желтоватого, а витамин В6 — в виде
темно-синего пятна на светлом флуоресцирующем слое. Для идентификации
биотина одну хроматограмму закрывают, а другую обрабатывают иодо-
платинатом (реактив № 76), причем биотин обнаруживается в виде белого
пятна на розовом фоне. При этом витамин Bi окрашивается в серый цвет,
амид никотиновой кислоты — в светло-желтый и витамин С — в желтый.
* См. общий материал о витаминах и методах работы (стр. 212).
Гл. 12. Витамины
237
Таблица 34
Ориентировочные величины х 100 и непосредственное обнаружение
водорастворимых витаминов с использованием различных источников освещения
на слоях силикагеля с флуоресцирующей добавкой
Витамин В#Х100 Окраска Прибли- зительные границы определе- ния, /лг
ледяная уксусная кислота — ацетон — метанол — бензол (5 + 5+ +20+70) [15] вода в УФ-свете (254 м/л) в УФ-свете (365 м/л) при дневном свете
В4 (Тиамин-HCl и
HNO3) 0 5 Фиолетовая — — 2
В2 (Рибофлавин) Be (Пиродоксоль- 35 38—45 Желтая Желтая Желтая 0,1/0,01/ 0,3
НС1) Никотиновая 15 52 Темно- синяя Темно- синяя — 3/10
кислота Амид никотиновой 75 78 Темная — — 3
кислоты Пантотеновая кис- 65 49 » — — 3
лота (Na- и Са-соль) В12 (Цианокобал- 57 89 — — — —
амин) 0 22 Темная Фиолетовая Красная 1/0,5 /0,3
Фолиевая кислота 0 0 » Темно- синяя Желтая 2/2/2
Биотин С (1-Аскорбиповая 80 70 — — — —
кислота) 30 96 Темно- синяя — — 3
Для обнаружения витамина В6 и пантотеновой кислоты нижнюю часть вто-
рой, до этого времени защищенной хроматограммы опрыскивают дихлор-
хинонхлоримидом (реактив № 41 0,1%) и обрабатывают парами аммиака,
в результате витамин В6 окрашивается в голубой цвет. Затем 0,5 час нагре-
вают при 160°, опрыскивают верхнюю часть полосы нингидрином (реактив
№ 108; 0,5% в этаноле). После повторного кратковременного нагревания
до 160° появляется пантотеновая кислота в виде фиолетового пятна.
На таком же слое силикагеля возможно частичное разделение этих биоло-
гически активных веществ при разделении водой (ср. рис. 115). Этот раст-
воритель передвигается примерно с такой же скоростью, что и упомянутые
выше (см. рис. 116), и к тому же позволяет осуществить хроматографический
анализ сразу после нанесения водного экстракта. В табл. 34 представлены
сравнительные результаты прямой идентификации водорастворимых вита-
минов с помощью света различных длин волн и приблизительные пределы
обнаружения их на необработанной реактивом хроматограмме. Эти соединения
можно обнаружить так же, как упомянуто выше, реактивами для опрыски-
вания, в частности после обработки хлором, раствором о-толидин — иодид
238
Специальная часть
' ----------—I
Аскорбиновая
кислота i
ж Никотиновая
кислбта
Як Пирибоксол
Д1 Амий никотиновой
“ кислоты
lB™lSE4rt;8S»
. Рибофлавин
Л * Тиамин ' В
Рис. 115. Одномерная хроматограмма водорастворимых витаминов.
Разделение водой на слое силикагель + флуоресцентный индикатор (время анализа около
40 мин); снято в коротковолновом УФ-свете. 1 — 30 цг тиамина НС1; 2 — 3 цг рибофлавина-
3 — 30 рг пиридоксола - НС1; 4 — 30 Щ" никотиновой кислоты: 5 — 30 рг амида никотиновой
кислоты; в —30 цг 1-аскорбиновой кислоты; 7—10 рг цианокобаламина; 8 —вещества и коли-
чества 1 — 7.
калия (реактив № 32), которым большинство витаминов окрашиваются
уже при малых концентрациях: Вь В6, пантотеновая кислота и биотин —
в голубой цвет, В2 — в оливково-зеленый, никотиновая кислота, амид нико-
тиновой кислоты и фолиевая кислота — в серый, В12— в фиолетовый (вита-
Время, мин
Рис. 116. Скорости перемещения различных растворителей на слое силикагеля
(толщина ~0,25 мм) при 20—23° [39].
1 — вода; 2 — Циклогексан — эфир (80 + 20); 3 — ледяная уксусная кислота — ацетон —
метанол — бензол (5 + 5 Ч- 20 Д. 70) [15]; 4, — пиридин — ледяная уксусная кислота —
вода (10 + 1 + 40); 5 — и-пропанол — 10%-ный аммиак (95 Д- 5).
мин С не реагирует; аммиак и сода мешают определению). Следует еще отме-
тить, что при наличии больших количеств витаминов В 2 и В6 образуются хвосты.
Гл. 12. Витамины
239
Прочно адсорбирующиеся на силикагеле вещества — витамин Bj и фолие-
вую кислоту — можно идентифицировать при последующем хроматографи-
ровании в другом направлении, используя соответствующий растворитель.
Используя обе системы, можно быстро обнаружить перечисленные соеди-
нения в фармацевтических препаратах и природных экстрактах. Как видно
из других примеров, известные витамины можно при этом определить
визуально, путем сравнения со стандартной серией.
Некоторые возможности разделения и селективного определения отдель-
ных водорастворимых витаминов будут рассмотрены в следующих разделах.
2. ТИАМИН (ВИТАМИН Bj)
А-СН2 —
н3с —nh2-hci
N
N---п— СН3
сн2—СН2ОН
sz
Тиамин-гидрохлорид
В природных продуктах тиамин содержится в свободной форме (моно-, ди-
и триэфиры фосфорной кислоты), в форме тиаминдисульфида, а иногда также
в соединении с другими серусодержащими веществами; для фармацевтиче-
ских препаратов он используется в виде гидрохлорида, мононитрата и эфира
пирофосфорной кислоты (кокарбоксилаза). Из большинства проб витамин Bi
экстрагируется водой. Следует иметь в виду, что переработку нужно про-
водить в области значений pH 4—6, чтобы не разрушить чувствительные
производные тиамина.
а) Условия разделения и результаты
Тогда как тиамин перемещается на пластинках силикагеля раствори-
телями ледяная уксусная кислота — ацетон — метанол — бензол (5 + 5 +
+ 20 + 70) [15] и вода очень медленно, тиамин-гидрохлорид и тиамин-
мононитрат (Rf X 100 56, более компактные пятна) отделяются смесью
пиридин — ледяная уксусная кислота — вода (10 + 1 + 40) (pH 5,8) от
кокарбоксилазы (Rf X 100 33, образование зоны). Аналогичные резуль-
таты получил Штрохекер [55] на таких же слоях, используя смесь 20%-ный
раствор мочевины — 85%-ная муравьиная кислота — н-пропанол (14-2+ 3).
Хорошее разделение всех соединений тиамина (даже в больших количе-
ствах и в присутствии многих примесей) обещает хроматография на слоях
ионообменников [43] и электрофорез в тонких слоях, которые оказались
пригодными в случае фенолов, фенолкарбоновых кислот [41] и аминокислот
[25].
б) Обнаружение и возможности определения
Флуоресцирующий фиолетовым светом тиамин обнаруживается на слое
в коротковолновом УФ-свете в количестве, превышающем 2 рг. Более чув-
ствительным и специфичным реактивом является свежеприготовленный гек-
сацианоферрат (III) калия (реактив № 81); при освещении кварцевой лам-
пой (365 .яр) еще можно обнаружить 0,03 рг окисленного тиамина (тиохрома)
в виде светло-голубой флуоресценции. Тиамин окрашивается также иодо-
платинатом (реактив № 76) (серая или коричневая окраска на слое, содер-
жащем пиридин) и другими реактивами [65].
Количественное определение образовавшегося тиохрома можно осуще-
ствить непосредственно на хроматограмме путем сравнения со стандартной
серией тиамина (0,03—2,0 цг), а также путем элюирования изобутанолом
и измерения флуоресценции.
240
Специальная часть
3. РИБОФЛАВИН (ВИТАМИН В2)
О
N ||
TJ Г _
ПзЬ I И I NH Рибофлавин
НзС~\/ /'Ч /=0
N N
СН2 — СНОН-СНОН — СНОМ — СН2ОН
Кроме свободной формы, рибофлавин встречается большей частью в виде
рибофлавин-5'-фосфорнокислого эфира (флавинмононуклеотид) и фермента
d-аминокислого оксида (флавинадениндинуклеотид). Рибофлавин трудно
растворим в воде. Для количественного определения его можно экстрагиро-
вать, например, смесью пиридин — ледяная уксусная кислота — вода
(10 + 1 + 40).
а) Условия разделения и результаты
На пластинках с силикагелем со смесью пиридин — ледяная уксусная
кислота — вода (10 + 1 + 40) была определена величина Rf X 100 для
рибофлавина (82) и для рибофлавин-5'-фосфата натрия (45). В малых коли-
чествах оба соединения можно также разделить водой (Rf X 100 40 и 28)
и смесью ледяная уксусная кислота — ацетон — метанол — бензол
(5 + 5 + 20 + 70) 115] (Rf X 100 35 и 0) и отделить от побочных про-
дуктов и продуктов разложения. Для разделения можно также использовать
хроматографию на слоях ионообменников [43] и электрофорез в тонком слое
[25, 41]»
б) Обнаружение и возможности определения
Окрашенные в желтый цвет флавины при освещении кварцевой лампой
дают интенсивную желтоватую флуоресценцию. На слое при освещении
УФ-светом с длиной волны 365 -ир еще можно обнаружить 0,01 р,г рибофла-
вина, при длине волны 254 мр — 0,1 рг, а при дневном свете — 0,3 рг.
Используя визуальный метод сравнения, можно сделать полуколичествен-
ную оценку, а наиболее перспективным является колориметрическое и флуо-
рометрическое определение после соскабливания и экстракции пятен.
4. ВИТАМИН В6
R
| Пиридоксол 11=—СН2ОН
НО—СН2ОН ,, „ „„„
I । 2 Пиридоксаль R = — СНО
Пиридоксамин R = —CH2NH2
Витамин В6 находится во всех растительных и животных клетках в трех
формах: пиридоксол (пиридоксин), пиридоксаль и пиридоксамин, которые
в живых организмах большей частью связаны в виде 5-эфира фосфорной
кислоты в белке и там легко переходят друг в друга.
а) Условия разделения и результаты
Прекрасное разделение этих трех производных витамина В6 описано
Нюрнбергом [40]. С помощью «ступенчатого» метода, предложенного Шта-
лем [52], на воздушносухом слое в камере с насыщением разделяют сначала
чистым ацетоном (длина пути 14 см) и после его испарения при слабом нагре-
Гл. 12. Витамины
241
вании смесью ацетон — диоксан — 25%-ный аммиак (45 — 45 — 10) в том же
направлении (длина пути 14 см). Снятие хроматограммы длится 1,5—2 час
и пятна с 2—3 рг вещества можно точно определить по окраске. В то время
как пиридоксол • НС1 и пиридоксамин-2НС1 после растворения в горячем
метаноле можно нанести на пластинку, присутствующий в виде «внутреннего
полуацеталя» также растворимый пиридоксаль неустойчив. Он склонен
к образованию ацеталя и дает на хроматограмме два (или три) пятна. Если,
например, такой раствор в метаноле нагревать в течение часа на водяной
бане, то пиридоксаль количественно переходит в пиридоксаль-метилацеталь,
который легко отделить от других компонентов витамина В6.
ОН О —СН3
I I
НС — О НС — о
1 I I I
НО —/X- СН2 СНзОН I ю сн2
-----------------------* I
сн2-^>1----------------н3с-^)1
N N
Пиридоксаль («внутренний полуацеталь») Пиридоксаль (метилацеталь)
Оставшийся без изменения пиридоксаль можно обнаружить только после
нанесения водного раствора, что, однако, не рекомендуется вследствие труд-
ностей при нанесении и малой интенсивности окраски пятен. Хорошего
разделения достигают на активированном слое силикагеля, используя
в качестве растворителя воду или 0,2%-ный раствор аммиака (компактные
пятна), причем пиридоксол • НС1, пиридоксаль-5'-фосфат, пиридоксамин-
•2НС1 и пиридоксаль-этилацеталь-НС1 (по 2—3 рг) разделяются за корот-
кое время (см. табл. 35).
Таблица 35
Величины 7?^ X 100 соединений группы В6 на силикагеле Г
Соединение Растворитель
ацетон- диоксан — 25%-ный аммиак (45+45+10) [40] 0,2%-ный аммиак вода
Пиридоксол-НС1 . . . 30 53 52
Пиридоксамин • 2Н С1 60 16 19
Пиридоксаль-5 '-фосфат Пиридоксаль (соотв. — 75 64
изомеры) Пиридоксаль-метил- -60 -66
ацеталь Пиридоксаль-этилаце- 45 — —
таль-НС1 — 44 36
б) Обнаружение и возможности определения.
На сухих слоях силикагеля с флуоресцирующей добавкой в УФ-свете
видна темно-синяя первичная флуоресценция, позволяющая определить
16 Заказ № 734
242
Специальная часть
при длине волны 254 .ир еще 3 цг, а при 365 .ир — 10 рг пиридоксола и пири-
доксамина. После опрыскивания 0,4%-ным раствором 2,6-дибромхинонхлор-
имида в метаноле (реактив № 40) или 0,1%-ным раствором 2,6-дихлорхинон-
хлоримида в этаноле (реактив № 41) и последующей обработки парами
аммиака все соединения витамина В6 окрашиваются в голубоватый цвет
(граница определения 0,1 рг), причем пиридоксаль дает наиболее слабую
окраску (0,5—1 рг). Можно также применять для обнаружения более рас-
пространенные цветные реактивы [23, 65]. Используя концентрационные
серии чистых веществ, можно оценить содержание различных компонентов В6.
в) Определение витамина Be в поливитаминах
После экстракции водой из фармацевтических препаратов эти соединения
можно разделить и количественно определить, используя в качестве раствори-
теля воду или 0,2%-ный аммиак. Э. Нюрнберг [40] предложил для пиридок-
саля следующий способ: пробу (содержащую 10 рг пиридоксаля-НС1) нагре-
вают с абсолютным метанолом в течение часа и получают при этом пиридок-
саль-метилацеталь; метанол удаляют при пониженном давлении, а осадок
растворяют в 50 мл воды. 5 мл этого раствора смешивают с 5 мл буфера pH
1 и 2%-ным водным раствором тетрафенилбората натрия и оставляют на
12 час. Выпавшие кристаллы пиридоксаль-метилацетальтетрафенил-
бората отсасывают, растворяют в 50 мл ацетона и наносят на воздушносухой
слой силикагеля рядом с аналогично обработанным чистым пиридоксалем
(ряд с различной степенью разбавления). Затем хроматографируют смесью
хлороформ — этанол (99 + 1) и после опрыскивания проводят количествен-
ное определение (Rf X 100 40—50).
5. НИКОТИНОВАЯ КИСЛОТА И АМИД НИКОТИНОВОЙ КИСЛОТЫ
—R Никотиновая кислота R =—СООН
у Амид никотиновой кислоты R=—CONH2
N
Оба соединения широко распространены в природе. Свободная кислота
обладает такими же свойствами витаминов, как и амид. В организме кислота
переходит в амид, последний в связанном состоянии является составной
частью важнейших ферментов.
а) Условия разделения и результаты
Нюрнберг [39] описал простой метод выделения никотиновой кислоты
и амида никотиновой кислоты из различных фармацевтических препаратов
на воздушносухом слое силикагеля Г без насыщения камеры с использо-
ванием свежеприготовленной смеси н-пропанол — 10%-ный аммиак (95+5).
В этой системе фронт растворителя примерно за 60 мин поднимается на 8 см,
ориентировочная величина Rf X 100 составляет для никотиновой кислоты 35
и для амида никотиновой кислоты 60—70, и оба пиридиновых соединения
можно после опрыскивания точно идентифицировать и определить количе-
ственно.
Оба витамина можно разделить и количественно определить, используя
несколько быстрее перемещающийся растворитель (см. табл. 36 и рис. 115)
на активированных слоях силикагеля.
Гл. 12. Витамины
243
Таблица 36
Величины В? X 100 для никотиновой кислоты
и амида никотиновой кислоты
Слой Воздушно- сухой слой силикагеля Активированный слой силикагеля
Растворитель н-пропанол — 10%-ный аммиак (95+5) [39] ледяная уксусная кислота — метанол — бензол (5+5+20+70) [15] вода
Никотиновая кислота Амид никотиновой кис- 35 75 78
лоты 60—70 65 49
б) Обнаружение и возможности количественного определения
Оба производных пиридина еще в количестве 3 рг каждого локализуются
в коротковолновом УФ-свете на флуоресцирующей пластинке в виде темных
абсорбционных пятен. Более специфичное и чувствительное определение
по Нюрнбергу заключается в удалении паров пиридина при опрыскивании
воздушносухого слоя раствором и-аминобензойной кислоты с последующей
обработкой парами хлорциана (реактив № 88). Максимальное окрашивание
достигается примерно через 6 мин. Амид никотиновой кислоты окрашивается
в оранжево-красный, а никотиновая кислота — в красный цвет. В случае
никотиновой кислоты при нормальной толщине слоя (—0,25 мм) еще можно
определить 0,1 цг вещества.
Возможна полуколичественная визуальная оценка путем сравнения с кон-
центрационной серией чистого вещества [39]. Определение можно также
осуществить с хлорцианом или бромцианом после соскабливания и элюиро-
вания необработанных пятен [54].
6. ПАНТОТЕНОВАЯ КИСЛОТА И ПАНТЕНОЛ
СН3 О
I II
НОН2С—С—СНОН—СО—NH—СН2—СН2 —R Пантотеновая кислота R=—С — ОН
<2Н3 Пантенол R= —СН2ОН
Пантотеновая кислота широко распространена в растительном и живот-
ном мире и встречается как в свободном состоянии, так и в виде соединений,
из которых наиболее известным является кофермент А. Соответствующий
пантотеновой кислоте спирт, пантенол, лучше всасывается организмом
и переходит в пантотеновую кислоту.
а) Условия разделения и результаты
Предложенная Генсхиртом и Мальзахером [15] смесь ледяная уксусная
кислота — ацетон — метанол — бензол (5 + 5 + 20 + 70) позволяет осу-
ществить хроматографический анализ и идентификацию на слоях силикагеля
пантотеновой кислоты (соответственно ее Na- или Са-соли) и пантенола
(величина Rf X 100 для обоих веществ зй 57). При использовании в качестве
16*
244
Специальная часть
растворителя воды пантотеновая кислота и пантенол перемещаются с раз-
личной скоростью (Rf X 100 89 и 67), причем отделяются также от про-
дуктов расщепления, |3-аланина и аминопропанола. В качестве растворителя
пригоден также абсолютный этанол (Rf X 100 40 и 65).
б) Обнаружение и возможности определения
Пантотеновая кислота и пантенол расщепляются на пластинках при
нагревании в течение 30 мин при 160°. После опрыскивания 0,5%-ным раство-
ром нингидрина в этаноле (реактив № 108) и повторного кратковременного
нагревания до 160° [15] образующийся |3-аланин приобретает фиолетовую
окраску, а аминопропанол — винно-красную. Количественное расщепление
достигается также при обработке 10%-ным раствором трихлоруксусной
кислоты и сушкой в течение 10 мин при 110° (минимально определяемое коли-
чество 2 рз).
Этими методами можно быстро и специфично обнаружить пантотеновую
кислоту (соответственно ее соли) и пантенол наряду с продуктами расще-
пления в различных фармацевтических и косметических препаратах. Вита-
мины и образующиеся при разложении вещества определяются путем срав-
нения со стандартными сериями чистых веществ. Окрашенный нингидрин-
ный комплекс можно колориметрически измерить после соскабливания
пятен, элюирования 96%-ным этанолом и стабилизации раствором нитрата
меди. ,х
7. ЦИАНКОБАЛАМИН (ВИТАМИН В12)
Цианкобаламин— биологическое вещество из группы кобаламина, нося-
щее название витамина В12,— широко распространен в природе. По срав-
нению с другими витаминами В витамин В12 всюду присутствует в значи-
тельно меньших количествах.
а) Условия разделения и результаты
При использовании смеси Генсхирта и Мальзахера [15] на силикагеле
цианкобаламин остается в точке старта (см. табл. 34), а водой перемещается
(Rf X 100 22).
б) Обнаружение и возможности определения
Для идентификации относительно больших количеств цианкобаламина
можно рассматривать хроматограмму при различном освещении. При днев-
ном свете по красной окраске можно определить еще 0,3 рг, в УФ-свете при
длине волны 365 .яр — 0,5 рг и при длине волны 254 .ир — 1 рз в виде тем-
ных пятен на флуоресцирующем фоне. После хлорирования и опрыскивания
раствором о-толидин — иодид калия (реактив № 32) можно еще обнаружить
даже 0,2 рз в виде фиолетовых пятен. Для микроопределения следует также
использовать биоавтографию.
8. ФОЛИЕВАЯ КИСЛОТА
N N
H2N —соон
N К у_СН2—NH — CO —NH—CH—СН2—СН2—COOH
у N .=/
он
Фолиевая кислота
Гл. 12. Витамины
245
Фолиевая (птероилглутаминовая) кислота всюду распространена в при-
роде в очень небольших количествах в свободном состоянии и в виде соеди-
нений, в которых пептидоподобный остаток глутаминовой кислоты соединен
с птероиловым скелетом фолиевой кислоты. В животном организме фолиевая
кислота под действием фермента переходит из этих производных в свободное
состояние. В воде и органических растворителях кислота малорастворима,
но хорошо растворяется в щелочах и карбонатах щелочных металлов с обра-
зованием солей.
а) Условия разделения и результаты
Нейтральный растворитель очень медленно перемещает фолиевую кис-
лоту на пластинке силикагеля (см. табл. 34). Скорость перемещения значи-
тельно увеличивается при использовании 1%-или 10 %-ного раствора аммиака
(Rf X 100 =5 95 и 85 соответственно). При испытании чистого витамина
возможно отделение сопутствующих веществ в виде голубоватой флуорес-
ценции (обнаруживается в длинноволновом УФ-свете).
б) Обнаружение и возможности определения
При дневном свете можно обнаружить 2 рг желтой фолиевой кислоты,
такое же количество в УФ-свете в виде абсорбционных пятен и после обра-
ботки хлором и опрыскивания смесью о-толидин — иодат калия (реактив
№ 32) — 0,5 цг в виде серого пятна. Этой цветной реакции мешает, однако,
обработка пластинки аммиаком, поэтому было бы очень желательно исполь-
зовать более подходящий растворитель. Обнаружение можно осуществить
и с помощью других реактивов [65]. Для определения пригодны также чув-
ствительные биоавтографические методы.
9. БИОТИН
О
II
HN NH
СН2— СН2 - СН2 — СН2—СО ОН
Биотин
Этот витамин встречается в очень малых концентрациях, вероятно,
во всех живых клетках, где он существует в свободном состоянии и в виде
действующих как коферменты соединений. Биотин малорастворим в орга-
нических растворителях и воде, но хорошо растворяется в разбавленных
щелочах.
а) Условия разделения и результаты
Согласно табл. 34, биотин отделяется от других водорастворимых вита-
минов при хроматографировании на силикагеле Г смесью ледяная уксусная
кислота — ацетон — метанол — бензол (5 + 5 + 20 + 70) [15] или водой
(Rf X 100 80 и 70 соответственно).
6) Обнаружение и возможности определения
Реактивом № 76 еще можно обнаружить 5—10 рг биотина в виде белых
пятен на розовом фоне, а раствором о-толидин — иодид калия после хлориро
246
Специальная часть
вания (реактив № 32) 0,2 рг биотина в виде голубых пятен. Меньшие
количества можно обнаружить и определить микробиологически.
10. АСКОРБИНОВАЯ КИСЛОТА (ВИТАМИН С)
С=О
НО —С
II О
НО — С I ,
। I (+ )-аскорбиновая кислота
Н-С-----1
I
НО —С —н
I
сн2он
I (-(-)-Аскорбиновая кислота является распространенным во всех клетках
биологически активным веществом. В растениях аскорбиновая кислота также
существует в виде белкового соединения «аскорбигена», от которого легко
отщепляется путем гидролиза. Для фармацевтических целей ее используют
в виде солей и эфиров. Будучи сильным восстановителем, аскорбиновая кис-
лота нестабильна и может обратимо переходить, с отщеплением водорода
(уже под действием воздуха), в дегидроаскорбиновую кислоту. Поэтому
в процессе экстракции рекомендуется применять защитную атмосферу
(N2, СО2).
а) Условия разделения и результаты
Аскорбиновую кислоту и ее производные можно частично разделить
на активированном слое силикагеля, применяя различные растворители.
Опубликованные ориентировочные величины Rf X 100 приведены в табл. 37.
Таблица 37
Величины Н? X 100 производных аскорбиновой кислоты
на силикагеле Г
Растворитель
ледяная уксусная кислота — ацетон — метанол — бензол (5 + 5+20 + 70) [15] вода этанол
Z-Аскорбиновая кис- лота (Na- и Са-соль) 30 96 22
Изоаскорбиновая кислота 35 96 29
Аскорбилпальмитат 85 0 55
Штрогеккер [55] перевел аскорбиновую кислоту в динитрофенилгидразон-
производное и осуществил хроматографическое разделение на воздушно-
сухом слое силикагеля Г, используя смесь хлороформ — этилацетат
(50 + 50) (Rf х 100 25).
Гл. 12. Витамины
247
б) Обнаружение и возможности определения
По собственному поглощению на пластинке в коротковолновом УФ-свете
можно определить 3 рг кислоты, которая после непродолжительного нагре-
вания до 120° при 365 мц флуоресцирует голубоватым светом. Нижний пре-
дел чувствительности с иодоплатинатом (желтоватое пятно на розовом фоне),
фосфорномолибденовой кислотой (серо-синее пятно) и смесью молибдат
аммония — цитратный буфер (голубое пятно) — величина того же порядка,
а щелочной раствор нитрата серебра (реактив № 137) (серо-черное пятно)
является менее чувствительным. В качестве специфичных растворов для
опрыскивания упоминаются также какотелин и хлорид титана (II), дающие
фиолетовое и соответственно оранжевое окрашивание [34].
Эти методы применяют для быстрой и селективной идентификации аскор-
биновой кислоты в смеси витаминов. Количественное определение, как
и в случае хроматографии на бумаге [34], следует проводить титрометрически
или фотометрически после локализации пятна (непосредственной или
с использованием метода направля!ощей полосы), соскабливания и элюиро-
вания. Таким способом Штрогеккер [55] определил аскорбиновую кислоту
в продуктах питания в смеси с растворимыми углеводами, соскабливая окра-
шенные в кирпично-красный цвет пятна динитрофенилгидразона аскорбино-
вой кислоты , элюируя 85 %-ным раствором серной кислоты, фильтруя и фото-
метр ируя.
ЛИТЕРАТУРА
1. В a ch ага ch A. L., Green J., Chem. and Ind., 1961, 2135.
2. Billeter M., Martins C., Biochem. Z., 334, 304 (1961).
3. Blattna J., Davidek J., Experientia, 17, 474 (1961).
4. В о о t h V. H., Analyt. Chem., 33, 1224 (1961).
5. Briiggem ann J., Krauss W., T i e w s J., Chem. Ber., 85, 315 (1952).
6. Crowfoot C., D u n i t z J. D., Nature, 162, 608 (1948).
7. Davidek J., Blattna J., J. Chromatog., 7, 204 (1962).
8. D a v i e s В. H., Goodwin T. W., M e r c h e r E. I., Biochem. J., 81, 40 p.
(1961).
9. D e m о 1 e E., J. Chromatog., 1, 24 (1958).
10. Demote E., Chromatog. Rev., 1, 1 (1959).
11. Duggan D. E., Arch. Biochem. Biophys., 84, 116 (1959).
12. E d w i n E. E., D i p 1 о c k A. T., В u n у a n J., G r e e n J., Biochem. J., 75,
450 (1960).
13. Ei chenberger W., Grob E. C., Helv. Chim. Acta, 45, 974 (1962).
14. F о n t e 1 1 K., Holman R. T.,Lambertsen G., J. Lipid Res., 1, 391 (1960).
15. G a n s h i r t H., Malzacher A., Naturwiss., 47, 279 (1960).
16. G 1 о о r U., частное сообщение.
17. G о о d w i n T. W., (Англин), частное сообщение.
18. Green J., J. Sci. Food Agric., 9, 801 (1958).
19. Green J.,McHale D.,MarcinkiewiczS.,Mamalis P., W a 11 P. R.,
J. Chem. Soc., 1959, 3362.
20. Green J., M amalis P., M a r ci nk i e w i c z S., McHale D., Chem. and
Ind., 1960, 73.
21. Grob E. С., E i chenberger W., Pf lugshaup t R. P., Chimia, 15, 565
(1961).
22. G г о Ъ E. С., В о s c h e t t i A., Chimia, 16, 15 (1962).
23. Хроматография на бумаге, под ред. И. М. Хайса и К. Мацека, Издатинлит, 1962.
24. Н a n е w а 1 d К. Н., Rappold М. Р., Roborgh J. R., Rec. trav. chim.. 80,
1003 (1961).
25. H о n e g g e r C. G., Helv. Chim. Acta, 44, 173 (1961).
26. I n h о f f e n H. H., Angew. Chem., 72, 875 (1960).
27. Irreverre F., Sullivan M. X., Science, 94, 497 (1941).
28. Isler O., Mitarb., частное сообщение.
29. Isler О., Riiegg R., Sc hud el P., Chimia, 15, 208 (1961).
30. J a n e c k e H., Maas-Goebels L, Z. anal. Chem., 178, 161 (1960).
31. Jones S. W., Chem. Eng. News. 38, Nr. 39, 57 (1960).
32. Lagoni H., Wortmann A., Milchwiss., 10, 360 (1955).
248
Специальная часть
33. Lagoni Н., Wortmann A., Milchwiss., 11, 206 (1956).
34. Linskens Н. F., Papierchromatographie in der Botanik, 2. Aufl., Berlin —
Gottingen — Heidelberg, Springer-Verlag, 1959.
35. Mango 1 d H. К., M ali ns D. C., J. Am. Oil Chem. Soc., 37, 383 (1960).
36. Mar cinkiewi cz S., G r e e n J., Analyst, 84, 304 (1959).
37. McHale D., Green J., Marcinkiewicz S., Chem. and Ind., 1961, 555.
37a. Montag A., Z. Lebensmitt.-Untersuch., 116, 413 (1962).
38. M о t ti e r M., Mitt. Gebiete Lebensm. und Hyg., 43, 118 (1952).
39. Nurnberg E., Dtsch. Apoth. Ztg., 101, 142 (1961).
40. N firn berg E., Dtsch. Apoth. Ztg., 101, 268 (1961).
41. Pastuska G., Trinks H., Chemiker Ztg., 85, 535 (1961).
42. P 1 a n t a C. v., Schwie ter U., C h о p a r d-d i t-j e a n L., R fi e g g R.,
Ko tier M., Isler O., Helv. Chim. Acta, 45, 517 (1962).
43. Randerath K., Angew. Chem., 73, 436 (1961).
44. Riiegg R., Isler O., Planta Med., 9, 386 (1962).
45. S a t h e V., Dave J. B., Ramakrishnan С. V., Nature, 177, 276 (1956).
46. Schilling K., Dam H., Acta Chem. Scand., 12, 347 (1958).
47. Seher A., Fette und Seifen, Anstrichmittel, 61, 345 (1959).
48. Seher A., Nahrung, 4, 466 (1960).
49. Seher A., Mikrochim. Acta, 1961, 308.
50. Shaw H. W. C., J e f f e r i e s J. P., Holt T. E., Analyst, 82, 2 (1957).
51. Stahl E., Chemiker Ztg., 82, 323 (1958).
52. Stahl E., Arch. Pharm., 292/64, 411 (1959).
53. Stahl E., Bolliger H. R., Lehnert L., Vortrag fiber Dfinnschicht-Chro-
matographie, Symposium uber Carotine und Carotinoide der Dtsch. Ges. f. Ernahrung
in Mainz (Oktober 1961).
54. Strohecker R., Vitaminanalysen, E. Merck AG, Darmstadt (1960).
55. Strohecker R., E. Merck AG, Darmstadt, частное сообщение.
56. Thommen H., Chimia, 15, 433 (1961).
57. Thommen H., частное сообщение.
58. Thommen H., Naturwiss., в печати.
59. Tiews J., Vitamine und Hormone, 8, 185, 297 (1959).
60. z. B. United States Pharmacopeia XVI, 910 (1960).
61. V e 11 u z L., A m i a r d G., Petit A., Bull. soc. chim. France, 1949, 501.
62. Vitamin E-Panel, Analyst, 84, 356 (1959).
63. V б 1 к e r O., Naturwiss., 48, 58 (1961).
64. Wagner H., Horhammer L., Dengler B., J. Chromatog., 7, 211 (1962).
65. W a 1 d i D., Chromatographie, E. Merck AG, Darmstadt (1959).
66. W a 1 d i D., частное сообщение.
67. Winterstein A., Studer A., R uegg R., Chem. Ber., 93, 2951 (1960).
68. Winterstein A., Hegedus B., Hoppe-Seyler’s Z. physiol. Chem., 321, 97
(1960).
69. Winterstein A., Hegedus B., Chimia, 14, 18 (1960).
ГЛАВА 13
СТЕРОИДЫ
Стерины, производные прегнана, андростана, эстрана,
желчные кислоты и сердечные глюкозиды
Д, Валъди
I. ОБЩЕЕ ВВЕДЕНИЕ
1. СТРУКТУРНЫЕ РАЗЛИЧИЯ И НОМЕНКЛАТУРА
Вещества рассматриваемых здесь классов относятся к соединениям с основ-
ным скелетом в виде циклопентано-пергидрофенантреновой системы.
12 18 17
Основной скелет
стероидов •
Основной скелет стероидов состоит из трех шестичленных колец А, В, С
и пятичленного кольца D. Атомы углерода обозначаются арабскими цифрами
в приведенной выше последовательности. При атомах С1о иС13 в большинстве
случаев расположены метильные группы. У важных в терапевтическом
отношении стероидов предпочтительными для функциональных групп
(—ОН, = О) положениями являются положения С3, Сп и С17, причем b4Gj7
часто имеется боковая цепь.
В результате соединения колец А, В, С, D возможно образование ряда
стероизомерных соединений [15, 23, 40, 42].
Условились обозначать, что метильная группа (С19) у Сю всегда изобра-
жается выступающей вперед из плоскости чертежа и таким образом нахо-
дится в p-положении. Дополнительно Прелог и сотрудники [56, 57] показали,
что абсолютная конфигурация фактически совпадает с ранее предложенной.
Если водород у С5 также поместить в p-положение (обозначается сплошной
линией), то это будет означать, что кольца А и В соединены друг с другом
в ц.uc-положении. Если соответствующий водород у С5 расположен в a-поло-
жении (обозначается прерывистой линией или пунктиром), то имеет место
соединение колец А и В в транс-положении. Практически в случае всех
стероидов ВС - и .ОС-кольца соединены в транс-положении, за исключением
карденолидов и буфадиенолидов (кольца DC-цис).
Боковая цепь у С17 природных стероидов находится обычно в р-положе-
нии. Водород у Ct 4 находится в а-положении.
Атомы углерода шестичленных колец не лежат в одной плоскости, как,
например, у бензола, а несколько смещены в противоположные стороны
относительно этой плоскости (рис. 117). Поэтому возможно образование
формы «ванны» или «кресла». В случае стероидов в основном встречается
форма «кресла», как это схематически показано на рис. 118.
Бартону и Моррисону [7] удалось показать, что большое значение имеет
«конформация» заместителя, т. е. находится ли он в плоскости кольца или
расположен перпендикулярно к ней. Так, например,’ группа ОН при С3
250
Специальная часть
может лежать в плоскости кольца (экваториально, по-английски equatorial),
или перпендикулярно к нему (аксиально; axial). Функциональные группы,
лежащие в плоскости кольца (э), не только более полярны, но и более реак-
ционноспособны (например, легче этерифицируются и омыляются).
Рис. 117. Пространственное строение скелета андростана7(по Физеру) [15].
Вследствие различной возможности соединения колец (цис- или тпранс-
соединение) и различной конформации в случае холестанола, например,
существует 4 соединения, которые отличаются друг от друга полярностью
и которые поэтому можно разделить хроматографически.
Рис. 118. 4 возможных холестанола.
Согласно Черни, Йоска и Лаблеру [12], 5а-холестан-3а-ол перемещается
на слоях окиси алюминия при использовании смеси бензол — эфир (7 + 3),
быстрее всех, затем следует 5|3-холестан-3а-ол, затем — 5|3-холестан-3|3-ол
и, наконец, 5а-холестан-3|3-ол (наиболее полярное соединение — медленнее
.других).
2. ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЕ ПОВЕДЕНИЕ [1, И, 53, 70]
Характер основного скелета обусловливает слабую полярность стероидов.
Полярность зависит, однако, от числа функциональных групп или от
Гл. 13. Стероиды
251
С/О-индекса (отношение числа атомов углерода к числу атомов кисло-
рода). Стероиды с длинными углеводородными боковыми цепями, например
стерины или эфиры жирных кислот и холестерина, являются особенно липо-
фильными и перемещаются наиболее быстро. Их разделяют поэтому гидро-
фобными растворителями. Полярность функциональных групп увеличивается
в следующем порядке: CH = CH, ОСН3, COOR, С = О, СНО, ОН, СООН.
Стероиды с большим числом ОН- или СООН-групп гидрофильны, в особен-
ности этерифицированные в положении С3 сахаром или сахарной кислотой,
о которых известно, что они сильно полярны и растворимы в воде. В этой
форме или в виде сульфоэфиров стероиды выделяются из биологических
объектов [70, стр. 414].
После ферментативного расщепления или кислотного гидролиза стероид-
ные вещества экстрагируют из водных растворов органическими раствори-
телями (см. стр. 270) и разделяют затем методом адсорбционной ХТС.
Негер [53, стр. 150] подробно изучал побочные реакции, протекающие
на различных адсорбентах, в особенности на активной окиси алюминия
(основной).
Обычно при малых временах анализа на слоях силикагеля не протекают
побочные реакции. В отдельных случаях группы ОН, находящиеся по сосед-
ству с другими функциональными группами, защищают ацетилированием,
если возникает опасность перегруппировки. В большинстве случаев биолога
не интересует природа обнаруженного им метаболита; обычно он исследует
качественно и количественно, не имеет ли место в условиях опыта изменение
в одном из направлений.
В соответствии с увеличением полярных свойств мы рассмотрим в настоя-
щей главе:
Стерины и их эфиры.............................стероиды С27—-С29
Прогестерон и гормоны надпочечника (корти-
костероиды) ...................................стероиды С21
Андростерон, тестостерон и их производные . стероиды С19
Эстрогены......................................стероиды С18
Желчные кислоты................................стероиды С24
II. СТЕРИНЫ
Раньше стерины в зависимости от их нахождения в природе делили на зоо-
и фитостерины. Формально их можно разделить на [54]:
Монооксистерины: С27-стерины, например холестерин; С28-стерины, напри-
мер эргостерин; С29-стерины, например стигмастерин;
Ди- и триоксистерины: например холестантриол.
Основным веществом является холестан:
Холестан
Как видно из рис. 118, холестан с группой ОН в положении 3 может нахо-
диться в 4 стерических формах, которые можно отделить друг от друга хро-
матографически (см. стр. 250 и 252).
252
Специальная часть
1. УСЛОВИЯ РАЗДЕЛЕНИЯ, ОБНАРУЖЕНИЕ И ВЕЛИЧИНЫ hR}
Мы разделяли различные стерины, используя найденные нами и приве-
денные в литературе раствортели. В табл. 38 приведены величины Rf(hRf),
Таблица 38
Разделение стеринов на слое силикагеля Г при стандартных условиях
Соединение Окраска флуоресцен- ции (реактив № 123) ВуХЮО в растворителе
I II III IV V VI VII Jviii IX X
Холестерилаце- тат От розовой до ржаво-красной 100 90 79 86 70 71 69 70 61 45
Эпигидрохоле- стерин (эпихоле- станол) Желтая 78 60 43 45 34 31 26 25 23
Копростерин (копростанол) » 72 56 49 38 31 26 25 22 18 2
Холестерин От розовой до ржаво-красной 65 48 35 25 22 21 19 15 13 0
Р-Ситостерин То же 63 45 35 25 20 20 12 13 И 2
Дегидрохоле- стерин Сине-фиолетовая — 45 31 25 — — — — — —
Дигидрохоле- стерин (холеста- нол) Бледно-фиолетовая 58 45 36 23 17 19 15 13 и 2
Диэлектри- ческая про- ницаемость
I — Хлороформ — ацетон (90-|—10) [89] 6,75
II — Бензол — этилацетат (60-]-30) [13] 3,5
Ill—Циклогексан — этилацетат (70 + 30) [5] 3,3
IV — Хлороформ [73] 5,0
V — Бензол — этилацетат (90 +10) [13] 2,6
VI —Толуол — этилацетат (90 + 10) [13] 2,7
VII — Циклогексан — этилацетат (85 + 15) [5] 2,65
VIII — Циклогексан — хлороформ (50 + 50) [89] 3,6
IX — Бензол — хлороформ (40 + 60) [90] 4,0
X — Циклогексан — хлороформ (70 + 30) [89] 3,0
полученные при стандартных условиях. Растворители расположены в порядке
уменьшения полярности. Уменьшение полярности не всегда соответствует
уменьшению рассчитанной диэлектрической проницаемости. Величины Rf
уменьшаются в этом же направлении, так что получается ряд элюирую-
щей способности для этих растворителей. Величины Rf не всегда совпадают
с величинами, приведенными в литературе. Это, по-видимому, обусловлено
несколько другими условиями опыта, например большей или меньшей актив-
ностью слоев.
Гл. 13. Стероиды
253
Табл. 38 показывает, что величины Rf уменьшаются с увеличением гидро- '
фобных свойств растворителя. Эта закономерность выполняется, за исклю-
чением растворителей III и IV в случае холестерилацетата. Некоторые из при-
веденных в литературе величины hRf (Rf X 100) лежат значительно выше,
чем полученные в наших Опытах. Так, например, Дам нашел для холестерина
в растворителе II hRf, равную 72, в растворителе V — 39 (22), в раствори-
теле VI — 40 (21). Поскольку зависимость выполняется не очень хорошо,
следует предположить, что слои, на которых мы работали, значительно более
активны. Наши слои были подвергнуты предварительной сушке на воздухе
в течение 2 час и затем активированы в течение 1 час при 110—120°.
Поэтому на практике рекомендуется совместно хроматографировать холе-
стерин и холестерин-ацетат в качестве стандарта и отнести к полученным
величинам значения, приводимые в литературе.
Найденная Висом и сотрудниками [5] при несколько других условиях
величина hRf для копростерина в случае растворителя III, равная 16 (49),
лежит слишком низко. Сравнение невозможно, поскольку в этой работе
отсутствуют данные о величине hRf для холестерина.
Последние четыре соединения из приведенных в табл. 38 нельзя непосред-
ственно разделить, используя применяемые в настоящее время сорбционные
слои и растворители, однако цветные реакции обнаруживают различие, благо-
даря чему идентификация становится возможной (окраска см. стр. 269).
Используя растворитель I, Брискорн с сотрудниками [10] сумели методом
ХТС обнаружить в листьях Salvia triloba viPirus mdlus p-ситостерин. Обна-
ружение можно осуществить хлоридом сурьмы (реактив № 11) или методом
ИК-спектров. Хорхаммер, Вагнер и Лай [25], используя метод ХТС, нашли
в корне жень-шеня наряду с олеаноловой кислотой р-ситостерин.
Таблица 38а
Величины других стеринов
Соединение ЯуХЮО Раствори- тель Метод Лите- ратура
Холестанон 86 VII Частично измененные стан- 5
Копростанон 71 VII дартные условия То же 5
4-Холестенон 63 VII » » 5
5-Холе стен-3р-7а-диол . . . 21 II Стандартные условия 13
5-Холестен-30-25-диол . . . 41 II То же 13
26-Нор-5-холестен-Зр- ол-25-он 63 II » » 13
Зр-Ацетокси-26-нор-5-холе- стен-25-он 74 V » » 13
Зр-Ацетокси-5-холестеи- 7-он 93 V » » 13
2. ХОЛЕСТЕРИН И ХОЛЕСТЕРИНОВЫЕ ЭФИРЫ
Холестерин и холестериновые эфиры в больших количествах содержатся
в органах и внутритканевых жидкостях человека и животных. Общее коли-
чество холестерина в организме человека составляет около 200—250 г.
Холестерин является относительно стабильным соединением. При гидри-
ровании двойной связи С516 получается копростерин, который в небольших
количествах содержится, например, в кале.
254
Специальная часть
Группа ОН у Сз может быть этерифицирована стеариновой, пальмитино-
вой, олеиновой, линолевой, архидоновой и другими высшими жирными кис-
лотами.
а) Отношение холестерин/холестериновые эфиры
Знание отношения количеств холестерина и холестериновых эфиров
в органах и внутритканевых жидкостях организма важно для медицинского
диагноза определенных болезней и может быть определено различными мето-
Р и с. 119. Липиды сыворотки, экстрагированные непосредственно (а) и после кислого
гидролиза (б) и разделенные на слоях силикагеля Г смесью циклогексан — хлороформ
(50 + 50).
Обнаружение!! реактив №123 и затем реактив № 120 в (Е. Merck AG).
связан с плазмопротеином, возникает известная трудность количественного
определения холестерина и холестериновых эфиров.
Эти эфиры расщепляются при кипячении с разбавленной соляной кислотой в тече-
ние 30 мин только примерно на 20%.
Как видно из рис. 119, при кислом гидролизе в различных количествах могут обра-
зовываться продукты распада, например эфир линолевой кислоты или 3-холестерил-
хлорид.
При подобных количественных методах определения чрезвычайно важен
выбор соответствующего способа экстракции и в дальнейшем знание опти-
мальных условий омыления. При разработке соответствующих методов
весьма полезна ХТС.
Гл. 13. Стероиды
255
Описанные в литературе методы экстракции дают различное содержание
холестериновых эфиров, которое легко можно определить методом ХТС. Из
табл. 39 далее видно, что при фотометрическом определении (общее содер-
жание холестерина и холестериновых эфиров) также получают отличное
значение.
Таблица 39
Сравнение различных методов определения холестерина и его эфиров
Цольнер [93] Экстракции, ХТС Шмидт фон Элмен- дорф [71] Экстракция ХТС Сирси и Берквист [63] Фотометрия Экстракция после кис- лого гидро- лиза, ХТС*
са Da С D С D С
Холестерин . . 48 82 48 92 52 70 62
Холестериновые эфиры 278 375 213 350 219 295 168
Суммарный хо- лестерин .... 206 298 169 297 178 240 159
Холестерин: суммарный холе- стерин 1 : 4,3 1 : 3,6 1 : 3,5 1 : 3,2 1 : 3,4 1 : 3,4 1 : 2,6
Холестерин: холестериновые эфиры 1 : 5,7 1 : 4,5 1 : 4,4 1 : 3,5 1 : 4,2 1 : 4,2 1 : 2,7
Эфирный индекс 76,5 72,5 71,5 69,0 70,5 70,5 61
Сыворотка собак С и D, величины приведены в мг на 100
г сыворотки.
Величины, приведенные в табл. 39, получены следующим образом. 2 мл
сыворотки собаки экстрагируют по Цольнеру и Киршу [93] смесью хлоро-
форм — метанол и упаренную вытяжку доводят хлороформом до объема 5 мл.
Из этой же сыворотки экстрагируют по 2 мл (3 пробы) по Шмидту фон Элмен-
дорфу [71] смесью хлороформ — этанол — эфир (3 + 1 + 1) и упаренный
экстракт также доводят хлороформом до объема 5 мл. Общее содержание
холестерина и холестериновых эфиров определяют в 3 следующих пробах
по Сирси и Берквисту [63].
Для гидролиза 2 мл сыворотки в течение 25 мин кипятят с 30 мл 10%-ной
соляной кислоты с обратным холодильником и после охлаждения экстраги-
руют 3 раза 50 мл этилацетата. Высушенный над сульфатом натрия экстракт
упаривают и остаток разбавляют 5 мл хлороформа.
Для сравнительного определения холестерина на пластинку с силикаге-
лем Г наносят по 20 цл экстракта одновременно с постепенно увеличиваю-
щимся количеством 0,01%-ного стандартного раствора холестерина. В каче-
стве растворителя используют хлороформ. Для определения эфиров холесте-
рина наносят по 10 цл экстракта и постепенно возрастающее количество
0,1%-ного стандартного раствора эфира холестерина.
В качестве растворителя используют смесь бензол — хлороформ (95 -[- 5)
или циклогексан — хлороформ (50 + 50).
Обнаружение осуществляют фосфорной кислотой (реактив № 123)
с дополнительной обработкой фосфорномолибденовой кислотой (реактив
№ 120в) (см. рис. 120).
На рис. 119, а показано разделение липидов сыворотки при экстракции
по Шмидту фон Элмендорфу [71]. Полярные липиды, остающиеся на точке
256
Специальная часть
старта, можно разделить по Габерману, Бандлоу и Круше [19] на дигли-
цериды, кефалин, лецитинплазмалоген, сфингомиелин и лецитин. Более
высокие значения холестериновых эфиров при экстракции по Цольнеру
и Киршу [93] были подтверждены другими определениями. Не удалось полу-
чить сравнительных величин по методу, предложенному Дамом [13, 13а],
при непосредственном нанесении 3—10 рл сыворотки на пластинки с силика-
гелем.
б) Разделение фракции холестериновых эфиров
Дальнейший успех принесло разделение методом ХТС содержащейся
в сыворотке фракции холестериновых эфиров. Байкер [90] впервые описал
подобное разделение, используя четыреххлористый углерод на пластинах
Рис. 120. Разделение холесте-
риновых эфиров аорты человека
(выделены методом колоночной
хроматографии) на слое силика-
геля Г смесью четыреххлористый
углерод — хлороформ (96 + 4).
Обнаружение: реактив № 123, затем
реактив № 120 в. Холестериновый
эфир: 1 — жирной кислоты с одной
двойной связью; 2 — кислоты с двумя
двойными связями; 3 — кислоты
с тремя двойными связями и т. д.
Рис. 121. Разделение холестерино-
вых эфиров на слое силикагеля Г,
пропитанного парафиновым маслом,
по описанному Кауфманом с сотруд-
никами [38] методу обращенных фаз
со смесью метилэтилкетон — ацето-
нитрил (70-J-30). -
Обнаружение: реактив М5 123, затем
реактив 120 в.
с силикагелем Г. Согласно нашим собственным опытам, разделение пяти
различных компонентов становится более воспроизводимым, если к четырех-
хлористому углероду добавить 4—5% хлороформа (рис. 120). В особенности
рекомендуется хорошее насыщение камеры парами растворителя. '
в) Количественный расчет результатов разделения
холестериновых эфиров
Цольнер с сотрудниками [95, 96], занимавшиеся разделением мето-
дом ХТС холестериновых эфиров, пытались идентифицировать отдельные
пятна и осуществить количественное определение. В своих ранних публика-
циях авторы [94] наносили для этого на пластинки с силикагелем Г 0,04 мл сы-
воротки в виде полосы шириной 1 ели трижды хроматографировали четырех-
хлористым углеродом. Зоны были соскоблены, и холестерин определен
по Заку и др. [92]. В более поздней работе [96] вещества наносили на более
узкие и более тонкие слои. Растворителем служил петролейный эфир
Гл. 13. Стероиды
257
(т. кип. 50—70°), к которому добавляли 1% изопропилового спирта. Окра-
шенная хлоридом сурьмы хроматограмма непосредственно фотометрировалась
с помощью прибора, используемого для промера электрофоретических полос.
Полученные значения приведены в первой графе табл. 40 и сравниваются
с данными других методов.
Таблица 40
Процентное содержание холестериновых эфиров в нормальной
сыворотке человека (сравнение различных методов определения)
Холестериновый эфир ХТС по L [94] 'ольнеру [96] Колоночная хромато- графия по Аренсу и др. ‘ [2] Хромато- графия по Клейну и Янссену [39]
Стеариновой кислоты Пальмитиновой кислоты Олеиновой кислоты } 9 14,1 10,1 6,3
Пальмитолеиновой кислоты р 25 22,9 18,1 22,2
Линолевой кислоты 56 48,5 62 60
Архидоновой кислоты .... 8,5 12,9 6 10,5
Докозапентаеновой кислоты 1,5 1,6 1 —
г) Двумерная ХТС холестериновых эфиров
Двумерное разделение модельных смесей холестериновых эфиров описано
Кауфманом, Макусом и Дайке [38]. На слое силикагеля Г вначале в напра-
влении 1 проводят адсорбционно-
хроматографическое разделение,
а затем, после пропитки,— рас-
пределительнохроматографическое
разделение в направлении 2, при-
меняя метод обращения фаз. Мож-
но надеяться, что этот метод раз-
деления будет использован для
анализа природных смесей холе-
стериновых эфиров и таким обра-
зом будет осуществлена дальней-
шая дифференциация этих соеди-
нений.
Смесь холестериновых эфиров вна-
чале разделяют смесью тетралин —
гексан (25 + 75) и растворитель затем
полностью удаляют в вакуумном шкафу
(5 мм рт. ст.) при 110° в течение
45 мин. Для охлаждения пластинки
помещают в эксикатор над Р2О6. Затем
правой стороной В (см. рис. 122) пла-
стинку осторожно погружают в смесь
петролейный эфир — парафин (95 + 5)*.
Петролейный эфир удаляют с помощью
фена на холоду в течение 5 мин. В на-
правлении 2 хроматографируют смесью
метил этилкетон — ацетонитрил (70 +
+30). Растворитель должен быть на 80%
насыщен парафиновым маслом, поэтому
70 мл кетона смешивают с 30 мл ацетонитрила, 80 мл этой смеси насыщают парафино-
вым маслом и после отделения избыточного парафина добавляют оставшиеся 20 мл смеси.
1 1 1 __
1 1 1 1 1 1 1 1 1 , ! о' 1 1 1 1
2 12 см
Рис. 122. Схема двумерной тонкослойной
хроматограммы холестериновых эфиров (по
Кауфману с сотрудниками [38]).
Подробности см. в тексте.
* Жидкий парафин для ИКС (фирмы «Merck», Дармштадт), петролейный эфир
(т. кип. 40—60°).
17 Заказ № 734
258
Специальная часть
Таблица 41
Величины Rj, х 100 различных эфиров холестерина по Кауфману [38]
Номер на рис. 122 Холестериновый эфир Растворитель а Номер на рис. 122 Холестериновый эфир Растворитель а
I II Ш I II III
1 Холестерин 2 2 64 9 Лаурат . . . 43 58 33
2 Формиат . . — 30 60 10 Миристат . . 45 59 29
3 Ацетат . . . 10 16 58 И Пальмитат 48 62 25
4 Пропионат 25 25 55 12 Стеарат . . . 50 64 23
5 Бутират . . 20 30 52 13 Линоленат 26 42 39
6 Капронат . . 30 40 47 14 Линолеат . . 32 48 33
7 Каприлат . . 36 47 42 15 Олеат .... 40 55 28
8 Капринат . . 40 54 38
а Растворители: I — тетралин — гексан (25+75); II — тетралин — гексан (50+50); III—метил-
этилкетон — ацетонитрил (70+30), на 80% насыщенный парафиновым маслом.
По Кауфману [38] можно обнаружить холестериновые эфиры фосфорно-
молибденовой кислотой (реактив № 120а). Кроме того, рекомендуют трех-
хлористую сурьму (реактив № 12), родамин В (реактив № 129), фосфорноволь-
фрамовую кислоту (реактив № 121), фосфорную кислоту (реактив № 123),
смесь ванилин — серная кислота (реактив № 151) и пятихлористую сурьму
(реактив № 13).
д) Определение кислот холестериновых эфиров
{щелочное омыление)
Для точной идентификации кислой части фракции холестериновых эфиров
проводят щелочное омыление и выделяют жирные кислоты для дальнейшего
их разделения.
Экстракт, полученный из 1 г органа или 1 мл сыворотки по Блуру (см. стр. 147),
Шмидту фон Элмендорфу [71] или Цольнеру и Киршу [93], упаривают досуха, пропуская
азот, затем обрабатывают 1 мл 2 н. раствора КОН в метаноле и при дальнейшем пропус-
кании азота в течение 2 час кипятят на водяной бане. Щелочную смесь подкисляют 2 мл
2 н. серной кислоты, и жирные кислоты трижды экстрагируют 2 мл петролейного эфира
(т. кип. 60—80°). Объединенные экстракты сушат безводным сульфатом натрия, фильтрат
осторожно упаривают и остаток растворяют в определенном объеме хлороформа.
Выделенные таким образом жирные кислоты можно затем разделить
методом, приведенным в главе, посвященной липидам.
Разработкой метода ХТС для разделения холестериновых эфиров ара-
хидоновой кислоты занимались Махадеван и сотрудники [43].
Для полноты здесь следует указать относящиеся сюда работы по хрома-
тографии на бумаге Лабаррера с сотрудниками [41], Михалика [48—50],
Кауфмана с сотрудниками [28—37], Боллигера с сотрудниками [9], Зоти
с сотрудниками [97], Мартина [45], Пирибума с сотрудниками [55], а также
Свартаута с сотрудниками [80]. Необходимо еще установить, обеспечивают ли
лучшее разделение слои из порошков целлюлозы по сравнению с бумагой.
О возможности колоночнохроматографического разделения сообщают Шон
и Гей [72].
Гл. 13. Стероиды
259
III. СТЕРОИДЫ С21, С» и С18
Систематика
Основные ядра стероидов С21
Прегнановые соединения (прогестероны) и кортикостероиды
5₽-Прегнан (г{ис-форма)
5а-Прегнан (транс-форма), аллопрегнан
Основные ядра стероидов С19
Андростановые соединения
5а-Андростан 50-Андростан,этиохолан,тестан
Основное ядро стероидов С18
Примеры:
Стероиды C2i
(нумерация соответствует табл. 42)
Аллопрегнан-За, 20а-диол
Прегван-За, 20а-диол
17*
Прегненолон
Кортикостероиды
СН2ОН
Ао
№ 22 I
О
СН2ОН
I
С°,ОН
№ 34 О
Кортизон
Дезоксикортикостерон, кортексон
СН2ОН
СН2ОН
К» 41 О I
Н-> II со
О СН |
Альдостерон
Преднизон
№ 38 СН2ОН
Кортизол, гидрокортизон
о
Стероиды С^9
Этиохолан-3,17-днон
Андростан-3,17-дион
Гл. 13. Стероиды
261
Тестостерон
Стероиды С]8 (эстрогены)
R17
-Ri6
rw
но-7^-74-7
№ 6 Эстрон Ri7=O, Rie=H
№ 21 Эстрадиол Ri7=0H, Rie=H
A'l 37 Эстриол R17=OH, Rie=OH
Вещество с эстрогенным действием
№ 20
СгНз
Z Z\Z
' III
azw
он
Диэтилстильбоэстрол, эстромон
1. ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЕ ПОВЕДЕНИЕ СТЕРОИДОВ
НА СЛОЯХ СИЛИКАГЕЛЯ Г
(Рассмотрение данных табл. 42 и сравнение с величинами Hf,
полученными в хроматографии на бумаге)
На стр. 250 уже было рассмотрено поведение стероидов при распредели-
тельной хроматографии на бумаге с использованием различных систем,
а также при адсорбционно-хроматографическом разделении на различных сор-
бентах в колонках. Используя данные табл. 42, следует вывести закономер-
ности, наблюдаемые в тонкослойной хроматографии.
Стероиды ведут себя на слоях силикагеля Г так же, как и в случае других
хроматографических методов, т. е. слабополярные соединения перемещаются,
как и следовало ожидать, более быстро.
Наибольшие значения Rf показывают дикетоны (табл. 42, № 2, 3 и 4).
Последовательность в ряду растворителей I—VI обычно соблюдается, транс-
Формы (№ 2, андростан-3,17-дион) значительно гидрофобнее г^мс-форм
(№ 4, этиохолан-3,17-дион). На фильтровальной бумаге прогестерон (№ 3)
перемещается в случае A-системы Буша быстрее (hRf = 77) по сравнению
с обоими дионами № 2 и 4, которые находятся на одинаковой высоте с hRf=70.
Из табл. 42 отчетливо вытекает, что 4-адростен-3,17-дион (№ 9) более гидро-
филен, чем соединения № 2 и 4, в случае системы Буша № 9 расположен при
hRf = 54.
4-Андростен-3,17-дион (№ 9) имеет сопряженную двойную связь. Подоб-
ные соединения обнаруживают и на фильтровальной бумаге меньшие значе-
ния Rf по сравнению со стероидом с изолированной двойной связью (№ 3).
Как на бумаге, так и на слоях силикагеля Г разделение насыщенных стерои-
дов и стероидов с одной двойной связью фактически нельзя осуществить.
Так, например, 5-андростен-За-ол-17-он (№ 15) и андростан-За-ол-17-он
(№ 17) практически всеми растворителями перемещаются с одинаковой ско-
ростью. Экваториальная группа ОН этихолан-За-ол-17-она (№ 23) является
сильнополярной, и поэтому это соединение отстает от названных выше.
Величины hR? стероидов в различных растворителях и цветные реакции [89]
Таблица 42
Стероид (курсивом даны эфиры) атомов О ь уХ100 в растворителе Фосфорная кислота (реактив № 123) Ледяная уксусная кислота — серная кислота (реактив № 63) Трихлорид сурьмы (реактив .'Е 12) Ванилин- серная кислота (реактив
И о № 151)
R о S д УФ ДС УФ Дс УФ ДС ДС
tr
1 Тестостеронпропио-
наш — 31 65 72 75 83 86 <80 <80 сл-з, ж з-сер с ор т-сер, с п-кр св-г т-з
кор
2 Андростан-3,17-дион 2 30 62 72 72 80 82 <80 <80 бл-ф ж-кор св-г, 3 сер-з с ф св-г, 3 ор-ж
3 Прогестерой 2 28 59 71 68 77 80 <80 <80 бл-г, ф сл-ж с ж св-ж св-з, г сл-ж, ор-кор
кор
4 Э тиохолан-3,17-дион 2 17 59 69 70 79 75 <80 <80 кор-ж ж-кор т-ж ж-з сл-ф — т-кор
5 1-Д егидротестосте-
ронпропионат — 18 58 68 70 75 73 <80 <80 кр-кор св-кр с кор-ф ор-кр с ж-кор р кр-ф
6 Эстрон 2 13 56 58 63 72 65 <80 <80 с ор кр с ж-ор кк сл бл-ф р ф
7 6-Хлор-6-дегидро- 17а-оксипрогестеронаце-
тат ......... — 20 55 70 75 75 75 <80 <80 Т-3, г т-з т-з, г т-г, кор с ж-з 3, г п-ф
8 Холестерин 1 25 52 69 67 — 73 <80 <80 с кк сер с ор-кр р-кр с ф-г ф-г п-ф
9 4-Андростен-3,17-дион 2 18 50 69 65 70 70 <80 <80 т-сер-з з, г с кр т-кор-кр бл-ф — кор-кр
10 Дегидротестостерон 2 19 48 68 67 67 68 <80 <80 т-з, г т-з, г рк т-сер-з сл-бл-з — беж
И Этиохолан-ЗР-ол-17-он 2 16 48 55 53 66 68 <80 <80 бл-ж-з сл-ж-кор т-сер-з з-кор бл-ф св-г т-з, г
12 Прегненолон .... 2 17 41 52 58 66 66 <80 <80 с ф ж-кор с ф ф т-сер-г сер-г ф
13 4-Прегнен-За-ол-20-он 2 18 40 49 60 65 67 <80 <80 ф св-ф, 3 бл-ф кор-сер с кор-кр сер-г т-ф
14 Прегнан-3,20-дион- 21-ол 3 18 37 53 59 62 66 <80 <80 беж сл-ж ж-з ж-з бл-ф — ж-кор
15 5-Андростен-За-ол-17- он (дегидроандростерон) 2 16 37 48 54 55 63 <80 <80 с ор кор-ф п, ж-ор ф-кр р п кр-ф
16 Дегидроэпиандросте-
рон 2 13 36 48 53 55 56 <80 <80 с ф св-ф п, ж-ор ф-кр р-кр п кр-ф
17 Андростан-За-ол-17-он (андростерон) 2 14 34 46 52 53 65 <80 <80 ж-кор св-беж т-з, сер кр-кор С кр-ф з-сер ф
18 17а-Оксипрогестерон 3 И 31 47 60 54 64 <80 <80 т-кор-ж беж с ф-г г с ф-кр ж-з кк
19 17а-Метилтестостерон 2 12 30 46 50 54 69 <80 <80 бл-ж-кор ж-кор с ж-кор кор с п-кр п кор-кр
20 Эстромон (не стероид) 2 4 28 45 45 54 31 <80 <80 т-г т-кор-ф кор-ф кр-ф п т-ф-кор г
21 Эстрадиол 2 5 32 35 47 45 56 <80 <80 с ж ж-ор с 3 св-кр св-ж-кор с св-кр 3
22 11-Дезоксикортико- стерон 3 15 28 45 52 55 70 <80 <80 т-з-сер т-сер-кор с кк т-сер-г т-кор кор-кр кр-ф
23 Этиохо лан-За-ол-17-он 2 9 27 38 45 50 60 <80 <80 сл-з-сер сл-св-сер т-кор бл-кор- бл-ф св-г сер
кр
24 6-Дегидро-17а-окси- прогестерон 2 12 27 42 59 59 66 <80 <80 с ж-з ж-кор св-з-кор сер-з с кр-кор сер кк
25 4-Андростен-3,11,17-
трион 3 19 26 60 56 58 78 <80 <80 сл-з-сер бл-св-сер бл~з-ж св-ж-сер с л бл-ф — беж
26 Тестостерон .... 2 15 26 45 48 50 66 <80 <80 т-з-г т-з-г с ж-ор сер-кор с ж-кор г кор-кр
27 Аллопрегнан-3а,-20а-
ДИОЛ 2 10 22 39 44 46 62 71 <80 бл-р слбл-кр сл бл-ж сл кор-кр бл-ф св-сер-г св-з-г
28 Прегнан-За, 20а-диол 2 5 12 24 34 35 61 65 75 бл-сер-з сл св-сер с ж-з св-кор- б л-ж-з св-сер п
сер
29 Кортизонацетат . . . — — 10 30 44 58 60 55 68 Ф ж-кор бл-ф св-кор бл-з — кор-кр
30 Преднизонацетат . . . — — 8 29 42 54 56 55 70 т-кор кор т-кор-кр кор-ф бл-ф — кор-кр
31 16-Метилен-1-дегидро- 110, 17а-диоксипроге- стерон 4 5 18 34 45 42 43 35 кр-кор р-кр кр-кор р-кр кр-ф ф-г кр-ф
32 Гидрокортизонацетат — — 4 20 36 45 55 44 38 ж-кор з-сер с з-ж ж-сер бл-ж ж-кор кор-кр
33 Преднизолонацетат — — — 15 30 38 49 36 29 з-сер кор т-кор-кр кор-ф кор ф-кор з-сер
34 Кортизон 5 — — 10 20 23 31 20 15 сл-ф св-ж сл-ж св-з сл-з-г — св-кор-
кр
Продолжение табл. 42
Стероид (курсивом даны эфиры) атомов О I SyXIOO в растворителе Фосфорная кислота (реактив № 123) Ледяная уксусная кислота — серная кислота (реактив Трихлорид сурьмы (реактив 12) Ванилин- серная кислота (реактив
Кй 33)
№ п/п. Число й й |> VIII УФ ДС УФ Дс УФ ДС М 151) ДС
35 Преднизон 5 — — 8 17 18 18 16 12 т-кор т-беж т-кор ф-кор св-кор св-беж св-кор
36 Дексаметазон .... 5 — — 6 И 8 16 10 10 т-кор кор т-кор т-г-з св-кор св-беж св-з
37 Эстриол 3 — — 4 9 15 17 13 19 с ор кр-кор с ф-кр кк сл бл-ф СВ-3 т-ф
38 Гидрокортизон . . . 5 — •— 3 6 8 23 8 И ж-кор ж-кор т-кор св-кор св-кор — св-кор- кр
39 40 Преднизолон .... 16-Метиленпреднизо- 5 — — — 4 5 14 8 8 ж-кор кор т-кор кор с ж-кор св-кор т-з
лон 5 — •— — 3 12 17 8 И кор-кр кр-кор т-кор кр-кор кор кор-ф кр-ф
41 Алдостерон 5 6 25 12 20 22 С 3 ж-кор т-кор кор бл-з 3
Пояснения к табл. 42. Активные слои силикагеля Г готовились стандартным методом, приведенные величины hR. являются средними из многих опы-
тов.
Растворители: I — хлороформ; II — хлороформ — этилацетат (80+20); III — хлороформ — ацетон (90+10); IV — хлороформ — ацетон (80+20); V — цикло-
гексан — хлороформ—ледяная уксусная кислота (70+20 + 10); VI — метиленхлорид — ацетон (80+20); VII — хлороформ — ледяная уксусная кислота (90+-
+ 10); VIII — метиленхлорид — ледяная уксусная кислота (90+10).
Окраска: ДС — дневной свет; т — темная; св —светлая; с — светящаяся; бл — бледная; сл —слабая; г — голубая; б — бежевая; кор — коричневая;
ж —желтая; з — зеленая; сер —серая; кр —красная; рк — ржаво-красная; р —розовая; кк — кирпично-красная; ор — оранжевая; п — пурпурная; ф — фиоле-
товая.
Гл. 13. Стероиды
265
В то время как экваториальная группа ОН при С3 в случае этиохолан-За-
ол-17-она (№ 23) придает сильнополярные свойства молекуле по сравнению
с этиохолан-Зр-17-оном (№ 11) с аксиальной группой ОН, стероиды № 15 и 16
вследствие незначительных различий в величине Rf разделяются с трудом.
При разделении методом хроматографии на бумаге стероиды № 15 и 16 рас-
полагаются на одинаковой высоте {hRf = 42). Андростерон (№ 17), наоборот,
расположен на фильтровальной бумаге в случае A-системы Буша выше
{hRf = 57).
Не считая холестерина (№ 8), который в некоторых растворителях пере-
мещается быстрее, эстрон (№ 6) — наиболее гидрофобный стероид с одной
группой ОН. Здесь мы имеем дело с фенольной группой ОН, не обладающей
такими сильными гидрофильными свойствами, как спиртовая группа ОН.
Эстрадиол (№ 21) имеет две группы ОН: одну фенольную и одну спирто-
вую, и интересно, что эстромон (диэтилстильбоэстрол, № 20) ведет себя в хро-
матографическом отношении подобно эстрадиолу.
Прегнан-3,20-дион-21-ол (№ 14) является наиболее быстро перемещаю-
щимся из приведенных в табл. 42 стероидов с 3 кислородными атомами, затем
следует 17а-оксипрогестерон (№ 18). Различие в полярности стероидов № 14
и 18 обусловлено сопряженной двойной связью.
Дезоксикортикостерон (№ 22) является следующим, приведенным в таб-
лице стероидом с тремя атомами кислорода. Он более гидрофилен, чем прег-
нан-3, 20-дион-21-ол (№ 14), однако лишь незначительно гидрофильнее
17а-оксипрогестерона (№ 18).
Определенная последовательность стероидов № 22 , 23 и 25 (все с 3 ато-
мами кислорода) не может быть установлена растворителем II. При рассмот-
рении других растворителей приходят к следующей последовательности:
№ 25 (3 кетогруппы), затем № 22 и наконец № 24.
В случае A-системы Буша адреностерон (№ 25) расположен на бумаге
{hRf = 11) еще ниже, чем тестостерон {hRf = 19). Метилтестостерон (№ 19)
лежит, как и на фильтровальной бумаге, выше тестостерона (№ 26). Для
стероидов № 14, 18, 22 и 24 возможны водородные связи, и поэтому соот-
ветствующие молекулы не обнаруживают сильных гидрофильных свойств.
В случае В*-системы Буша дезоксикортикостерон (№ 22, hRf = 36) рас-
положен на фильтровальной бумаге значительно ниже прегнандиола (№ 28,
hRf= 50). Аллопрегнандиол (№ 27) и прегнандиол (№ 28) хорошо разде-
ляются на слоях силикагеля Г. На обнаружении методом ХТС этих двух
стероидов в моче основано описанное в гл. 16 определение раннего периода
беременности.
Значительно гидрофильнее и соответственно медленнее перемещаются
стероиды с 5 атомами кислорода в молекуле, например кортизон и кортизол.
Эти соединения умеренной полярности обычно хорошо разделяются раство-
рителями V—VII.
Алдостерон (№ 41) в хлороформном растворе изменяется через несколько
часов. В растворителях, к которым добавлена ледяная уксусная кислота,
соединение № 41 обнаруживает особенно высокие значения Rf, превышающие
значения для кортизона (№ 34). На бумаге стероид № 41 с В*, С* и Е2В*
перемещается не так быстро, как стероид № 34. В В5 он расположен над
кортизолом (№ 38), в С перемещается одинаково со стероидом № 38,
а в Е2В остается на месте.
Эстриол (№ 37) расположен на слое силикагеля Г между кортизоном
(№ 34) и кортизолом (№ 38).
Обозначения растворителей системы Буша в бумажной хроматографии.
266
Специальная часть
2. ПРОВЕДЕННЫЕ РАНЕЕ РАБОТЫ ПО ПРИМЕНЕНИЮ МЕТОДА ХТС
ДЛЯ 'РАЗДЕЛЕНИЯ СТЕРОИДОВ
В некоторых случаях удалось разделить кортикостероиды, а также и менее
полярные стероиды путем повторного (многократного) хроматографирования
неполярными растворителями [58, 89].
Вместо чистых стероидов, которые или слишком полярны, или слишком
чувствительны к окислению, можно хроматографировать соответствующие
липофильные эфиры: ацетаты, формиаты, бензоаты и т . д.
Для получения ацетата 20 |хг стероида растворяют в пиридине и добавляют одну
каплю ангидрида уксусной кислоты. Через 12 час избыток растворителя удаляют в вакуу-
ме при слабом нагревании.
Мангольд [44] предложил переводить ненасыщенные стероиды и ненасы-
щенные жирные кислоты в продукты присоединения ацетата ртути и затем
разделять их методом ХТС. С получением других производных и методами
работы со стероидами, в частности с выделением их из биологических мате-
риалов, можно познакомиться по работам Смита [70] и Ганча [23].
За это время опубликованы различные работы по разделению стероидов
методом ХТС. При сравнении величин Rf, которые следует рассматривать
лишь как ориентировочные, можно заметить, что использованные методы
частично отличаются от приведенных в настоящей книге, и поэтому величины
Rf лишь при определенных условиях совпадают с величинами, приведен-
ными в табл. 42.
Барбье с сотрудниками [5], которые наряду с различными стеринами хро-
матографировали также стероиды, применяли, например, водную суспен-
зию (1:3), и слои поэтому должны были быть значительно более тонкими.
Растворители и величины Rf указаны в табл. 43. Длина пути составляла
14 см. Для обнаружения применяли реактивы № 12, 52 и 120.
Как нам удалось установить в случае других классов соединений, вели-
чины R/, а также последовательность отдельных соединений на тонком неза-
крепленном слое сильно отличаются от величин Rf и последовательности
на прочно связанном тонком слое (см. также стр. 12). По сравнению с многими
преимуществами, которыми обладают прочно закрепленные слои (также
и те, в которых не используется гипс *), меньшие времена анализа в случае
незакрепленных слоев не имеют большого значения. Первые результаты
разделения стероидов на незакрепленных слоях, полученные Ахремом
и Кузнецовой [3, 4], приведены в табл. 43. Наряду с концентрированной
серной кислотой для обнаружения были использованы также реактивы
№ 12, 52 и 120.
На незакрепленных слоях, состоящих в основном из окиси алюминия,
проводили хроматографическое разделение Черни, Лоска и Лаблер [12],
а также Германек, Шварц и Чекан [24].
Черни с сотрудниками [12] разделяли стерины, стероиды (прегнановые
и андростановые соединения) и генины, используя растворители: гексан —
бензол (70 + 30), бензол, бензол — эфир (70 + 30), эфир, эфир — этанол (98+ 2
или 96 + 4). В соответствии с увеличением полярных свойств растворителя
для слабополярных стеринов используют первые из перечисленных раствори-
телей, а для полярных стероидов — последние. Для обнаружения наряду
с серной кислотой применяется реактив Драгендорфа (реактив № 60) и морин
(реактив № 90е).
Растворители, использованные Германеком с сотрудниками [24], пред-
ставляют собой смеси петролейный эфир — бензол и бензол — этанол раз-
личного состава. Для обнаружения стероидов применяют треххлористую
* Силикагель Н и окись алюминия Н фирмы «Merck», см. стр. 40.
Таблица 43
Дополнительная сводка литературных данных по величинам hR?
№
п/п
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
Соединение RyX xioo Раст- вори- тель а Метод
14-Этиен-ЗР-ол-17Р-метиловый эфир карбоновой кислоты-3-ацетат 47 I Измененные стан-
8,14-Эти ен-Зр-ол-17-метиловый эфир карбоновой кислоты-3-ацетат 47 I дартные условия То же
Этиан-ЗР-ол-17р~метиловый эфир карбоновой кислоты-3-ацетат . . 47 I » »
Этиан-Зр, 14р-диол-17р-метило- вый эфир карбоновой кислоты-3- ацетат 22 I » »
14,15-а-Этиан-ЗР-ол-17р-метило- вый эфир карбоновой кислоты-3- ацетат 23 I » »
8,14-а-Этиан-Зр-о л-17р-мети ло вый эфир карбоновой кислоты-3-ацетат 18 I » »
Этиан-Зр, 15а-диол-17р-метило- вый эфир карбоновой кислоты-3- ацетат 16 I » »
Этиан-Зр, 12р-диол-17Р-метило- вый эфир карбоновой кислоты . . 54 II » »
Этиан-Зр, 12р-диол-17р-метило- . вый эфир карбоновой кислоты-3- ацетат 8 40 III III » »
Этиан-Зр, 12Р-диол-17Р-метило- вый эфир карбоновой кислоты- 3,12-диацетат 52 III » »
Этиан-Зр, 12р, 14Р-триолметило- вый эфир карбоновой кислоты- 3,12-диацетат 42 III » »
Этиая-Зр, 14р-диол-12-он-17р-ме- тиловый эфир карбоновой кислоты- 3-ацетат 41 IV »
Этиан-Зр-ол-12-он-17р-метиловый эфир карбоновой кислоты-3-ацетат 48 III » »
Этиан-Зр, 12р-диол-11-он-17р-ме- тиловый эфир карбоновой кислоты- 3,12-диацетат 32 III » »
Прегнан-За-о л-11,20-дион-З-ацетат 43 III » »
Этиан-За-ол-11-он-17р-метиловый эфир карбоновой кислоты-3-ацетат 58 III » »
Этиан-3а-11р-диол-17р-метиловый эфир карбоновой кислоты-3-ацетат 52 III » »
5-Андростен-Зр-ол-17-он .... 28 V Незакрепленные слои
5-Аядростея-Зр-ол-17-он-3-ацетат 59 V а »
268
Специальная часть
Продолжение табл. 43
№ п/п Соединение iRjiX Х100 Раст- вори- тель3 Метод Лите- ратура
20 17а-Этинил-5-андростен-Зр,17[3-
ДИОЛ 35 V Незакрепленные слои
21 17а-Этинил-5-андростен-Зр,17[3-
диол-3-ацетат 55 V » >>
22 17а-Этинил-5-андростен-Зр,17[3-
диол-3,17-диацетат 75 V
23 17а- Дибромэтинил-5-андростен-
5[3-бром-3[3, бр, 17[3-триол-3,17-ди-
ацетат 27 V » » з, 4
24 5,6а-Оксидоандростан-ЗР-ол-17-
он-3-ацетат 34 V » »
66 VI » »
25 5,бр-Оксидоандростан-3[3-ол-17-
он,3-ацетат 38 V » »
59 VI » »
26 5,6а-Оксидо-17а-этиниланд ростан-
3р,17р-диол-3-ацетат 80 VI » »
27 5,6[3-Оксидо-17а-этиниландро-
стан-Зр, 17[3-диол-3-ацетат .... 69 VI
28 Кортизон 78 V » >>
29 17а-Этинил-4-андростен-17[3-ол-3-
он-17-ацетат 51 V
86 VII
30 17а-Дибромацетил-4-андростен-
17[3-ол-3-он-17-ацетат 39 V
75 VII
31 17а-Ацетил-4-андростен-17[3-ол-3-
он-17-ацетат 35 V
68 VII
32 4-Андростен-3,17-дион 34 V » »
65 VII » >>
а Растворители: I — циклогексан — этилацетат (854-15); II — н-гексан—этилацетат (254-75);-
III — циклогексан — этилацетат (704-30); IV — циклогексан — этилацетат (754-35); V — циклогек-
сан — этилацетат (674-33); VI — циклогексан — этилацетат (50-[-50); VII — циклогексан — этилаце-
тат (404-60).
сурьму (реактив № 12). Разделение и количественное определение эстрона,.
17|3-эстрадиола и 16а, 17|3-эстрадиола описал Штрук [79]. Согласно стан-
дартному методу, разделение осуществляют смесью бензол — этанол
(90 + 10) (эстрон, Rf 0,51, эстрадиол Rt 0,30 и эстриол Rf 0,11) и опреде-
ляют спектрофотометрически при 242 мц после экстракции пятен 0,5 и.
водно-спиртовым (80%) раствором NaOH. В дальнейшем анализом экстроге-
нов методом ХТС занимался также Барбье с сотрудниками [6].
Бейлевельд [8] использовал метод ХТС для определения чистоты стерои-
дов и для исследования соответствующих препаратов. Прекрасные резуль-
таты разделения документально подтверждены семью фотографиями. Матис
с сотрудниками [461 показали, что можно разделять кортикостероиды также
Гл. 13. Стероиды
269
на слоях сульфата кальция (гипса). Метод ХТС Егер с сотрудниками [26а]
используют для изучения превращений, а Даннёнберг и Нейман [14] — для
исследования диено-бензойной перегруппировки стероидов. Верли [90а]
использовал наряду с хроматографией на бумаге также метод ХТС в качестве
вспомогательного средства для идентификации.
В общем оказалось, что при исследовании стероидов все научно-исследо-
вательские группы с наибольшим успехом применяли метод ХТС.
3. ОБНАРУЖЕНИЕ РАЗДЕЛЕННЫХ СТЕРОИДОВ РЕАКТИВАМИ
ДЛЯ ОПРЫСКИВАНИЯ
Часть стероидных соединений можно открыть уже по цветным реакциям.
Накопленный в настоящее время опыт, во всяком случае, не столь велик,
чтобы имелась возможность уже по окраске определить строение, как это,
например, можно делать в случае сердечных глюкозидов, посредством реак-
ции со смесью хлорамин — трихлоруксусная кислота (стр. 277).
Имеется ряд указаний на то, что как раз на слоях силикагеля можно
осуществить специфические и селективные цветные реакции. Сибликова
и Хайе [64] исследовали цветные реакции 85 различных стероидов на фильтро-
вальной бумаге. Ваксмут и Кекховен [88] также занимались цветными реак-
циями стероидов. Для обнаружения стероидов на неорганических тонко-
слойных пластинках в первую очередь пригодны: фосфорная кислота (реак-
тив № 123), ангидрид уксусной кислоты — серная кислота (реактив № 63),
треххлористая сурьма (реактив № 12) и ванилин — серная кислота (реак-
тив № 151).
Нашими собственными опытами установлено, что для обнаружения всех
стероидов особенно специфичной является 15%-ная фосфорная кислота,
предложенная впервые Негером и Ветштейном [52, 53] для бумаги. Для
опрыскивания тонкослойной хроматограммы выгоднее использовать 30—
40%-ную о-фосфорную кислоту. Опрыскивание обычно проводят до тех
пор, пока слой не оказывается равномерно смоченным. Зоны липидов можно
уже обнаружить непосредственно в виде беловатых «жирных пятен». После
7—15-минутного нагревания при ПО—120° стероиды интенсивно флуорес-
цируют в УФ-свете (365 жр). Окраска вначале слабая, затем постепенно уси-
ливается; поэтому необходимо снять кинетическую кривую увеличения интен-
сивности окраски в процессе нагревания. Примерно через 8 мин пластинки
рассматривают при дневном свете и под аналитической кварцевой лампой,
после чего нагревают еще 7 мин при 110°. Более длительное нагревание
невыгодно.
Холестерин и его эфиры, которые при первом нагревании имеют в длин-
новолновом УФ-свете розово-красную окраску, становятся позже ржаво-
красными.
Эстрогены в УФ-свете вначале становятся желтыми, затем оранжевыми
и наконец оранжево-красными. Ярко-фиолетовую окраску имеют прегнено-
лон и дегидроандростерон. Тестостерон и дигидротестостерон окрашены при
дневном свете в темно-серо-синий цвет. Вначале окраска сзетло-синяя, при
дальнейшем нагревании переходит в темно-зеленовато-синюю и затем
темно-серо-синюю. При слишком длительном нагревании пятна становятся
серо-черными. Такие соединения, как прегнандиол, аллопрегнандиол и про-
гестерон, обнаруживают в УФ-свете слабую флуоресценцию. Алдостерон,
наоборот, флуоресцирует ярко-зеленым светом.
Указанные цвета устойчивы лишь непродолжительное время. Слои,
опрыснутые фосфорной или серной кислотой, поглощают воду из воздуха,
так что пятна постепенно расплываются. Поэтому слои сразу покрывают
второй стеклянной пластинкой и таким образом достигают болыпей|устой-
чивости окраски. Для документации рекомендуется цветная фотография.
270
Специальная часть
Стероиды, которые фосфорной кислотой (7 мин, 100°) открываются не
очень отчетливо, можно обнаружить в виде темно-синих пятен при последую-
щем слабом опрыскивании свежеприготовленным 1,5%-ным спиртовым рас-
твором фосфорномолибденовой кислоты (реактив № 120 в) и 3-минутном
нагревании. Уже при использовании одной фосфорномолибденовой кислоты
можно получить цветную реакцию, однако лучше предварительно обрабо-
тать пластинку фосфорной кислотой.
Другим специфичным реактивом для обнаружения стероидов является
усовершенствованный реактив Либермана — Бурхарда (№ 63). После интен-
сивного опрыскивания слоя хроматограмму нагревают в течение 15—20 мин
при 110°. Во время нагревания наблюдают окраску как при дневном свете, так
и в длинноволновом УФ-свете.
Треххлористая сурьма (реактив № 12) не дает со стероидами характер-
ных различий в окраске. После опрыскивания и нагревания в течение 15—
20 мин появляются пятна, дающие неспецифическую флуоресценцию в УФ-
свете.
Для идентификации можно прежде всего использовать реактив № 151,
ванилин — серная кислота. Реактив должен быть свежеприготовленным,
и его следует наносить на слой в не слишком больших количествах. При нагре-
вании в течение 5—10 мин при 110° появляются окрашенные пятна стерои-
дов, которые в УФ-свете не дают флуоресценции. Если покрыть хромато-
грамму второй стеклянной пластинкой, окрашенные пятна сохраняются про-
должительное время.
4. СПЕЦИАЛЬНОЕ ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА ХТС В ХИМИИ СТЕРОИДОВ
а) Определение стабильности при хранении
производных эстрена в таблетках
Исследованием производных эстрена занимались Фокенс и Полдерман
[16]. Соединения 17|3-окси-4-эстрена, имеющие различные заместители в по-
ложении 17а, проверялись на стабильность. Большие различия в стабиль-
ности могут быть выравнены путем добавки антиокислителей (EDTA).
Разделение осуществляли стандартным методом смесью н-гептан —
ацетон (50 + 25) и обнаруживали стероиды в виде флуоресцирующих пятен,
опрыскивая треххлористой сурьмой (реактив № 12), причем были получены
следующие величины RfX 100:
17а-этинил-4-эстрен-17|3-ол............................................48
17а-метил-4-эстрен-17|3-ол.............................................50
17а-этил-4-эстрен-17|3-ол..............................................57
17а-пропил-4-эстрен-17|3-ол............................................57
17а-аллил-4-эстрен-17|3-ол.............................................59
б) Экспресс-анализ для контроля ферментативных
превращений стероидов
При ферментативных синтезах стероидов, например при введении гидро-
ксильных групп в стероидный скелет с помощью культуры соответствующих
микроорганизмов, чрезвычайно важен контроль реакции. Необходимо опре-
делить наличие нежелательных побочных реакций и точно установить конеч-
ную точку желаемой реакции. Метц [47] описал стандартный контроль подоб-
ных растворов культур. В промышленности 200 мл 0,05%-ной суспензии
экстрагируют хлороформом и полученный экстракт исследуют методом ХТС.
В лабораторных опытах с небольшими количествами из пробы в 2 мл суспен-
зии можно получить достаточное количество стероидов для идентификации.
Гл. 13. Стероиды
271
Для этого экстракт вначале наносят на язычок фильтровальной бумаги
и с его кончика переносят на слой силикагеля.
Метц разделял стероиды на слоях силикагеля, используя смесь хлоро-
форм — ацетон или хлороформ — этилацетат. В качестве реактивов для
обнаружения он предложил фосфорную кислоту (реактив № 123), ванилин
и фосфорную кислоту (реактив № 149), анисовый альдегид и серную кислоту
(реактив № 9) и треххлористую сурьму (реактив № 12). Для количествен-
ных сравнительных определений используется хлорная кислота (2%-ный
водный раствор; после опрыскивания нагревают в течение 10 мин при 150°),
а в случае восстанавливаемых стероидов 2,3,5-трифенилтетразолийхлорид
(реактив № 145).
в) Обнаружение стероидов в моче человека
В разделе, посвященном медицине (гл. 16), описана проба на ранний
период беременности, основанная на обнаружении прегнан-3а,20а-диола
и аллопрегнан-3а,20а-диола в моче.
Проба может быть положительной также и в том случае, когда исследуе-
мый больной принимает гестаген или когда почки вследствие перегрузки
вынуждены работать с большим напряжением (Стресс). В этих случаях мето-
дом ХТС можно обнаружить и другие стероиды, например прегнантриол.
При нормальной беременности такие стероиды почти не появляются в моче.
Появление больших количеств прегнантриола в моче является указанием,
что имеет место адреногенитальный синдром. Старка с сотрудниками [75]
осуществили эту пробу на свободных слоях окиси алюминия. В случае синд-
рома Кашинга выделяется пониженное количество 17-кетостероидов, кото-
рые были разделены Райзертом с сотрудниками [61] на слоях силикагеля Г
длиной 50 см.
80% стероидов мочи находится в виде глюкуронидов, а остаток — в виде сульфата
(эстрон) пли в свободном состоянии. Кислотный гидролиз имеет перед ферментативным
преимущество, заключающееся в большей скорости расщепления. Однако в случае чув-
ствительных стероидов кислоты могут вызвать химические изменения. Для выделения
кортикостероидов необходима специальная защита, поскольку возможны изменения
окислительного типа в боковой цепи 17 и даже отщепление, боковой цепи, приводящее
к образованию андрогенов (17-кетостероидов). Гестагены (производные прогестерона)
в общем несколько более стабильны, как показывает проба на раннюю стадию беремен-
ности. Во всех случаях выгоднее проводить гидролиз по возможности в мягких усло-
виях, в атмосфере азота.
IV. ЖЕЛЧНЫЕ КИСЛОТЫ
Подобно кортикостероидам желчные кислоты хроматографируются в со-
ответствии с их полярностью. Если желчная кислота связана с аминокисло-
той пептидной связью, как, например, таурохолевая или гликохолевая кис-
лота, то следует использовать растворитель, содержащий сильно гидрофиль-
ный компонент, например метанол или воду.
Холевая кислота, R?=OH
Дезоксихолевая кислота, R7—Н
Дегидрохолевая кислота
272
Специальная часть
Генсхирт, Косс и Морианц [17] впервые разделили различные желчные
кислоты на слоях силикагеля, используя растворители: толуол — ледяная
уксусная кислота — вода (табл. 44а № IX и X) и бутанол — ледяная
уксусная кислота — вода (XI) (рис. 124 и 125). Отдельные пятна количест-
венно определяли фотометрически.
Таблица 44а
Разделение желчных кислот на силикагеле Г с различными растворителями
Желчная кислота 100 в рстворителеа
I-( НН й >> г* VIII Й X й
1. Холевая 0 0 0 0 0 12 13 55 21 53 73
2. Дезоксихолевая . . 12 16 13 25 25 54 70 85 38 65 81
3. Дегидрохолевая . . 4. 3,12-Диацетоксихо- 14 21 70 65 65 78 90 97 37 65 70
лановая 5. За-Окси-(7,8)-11,12- 19 25 — 66 — — — — 20 — 75
холадиеновая . . . 6. За-Окси-(8,14)-11,12- 28 33 — 78 — — — — 38 — 77
холадиеновая . . , 22 33 — 75 — — — — 39 — 67
а Растворители: I — циклогексан — хлороформ — ледяная уксусная кислота (70+204-10); II —
толуол — хлороформ — ледяная уксусная кислота (70+20 + 10); III — метиленхлорид — ледяная ук-
сусная кислота (90+10); IV —хлороформ — ледяная уксусная кислота (90 + 10); V — метиленхло-
рид — этилацетат — ледяная уксусная кислота (70+20+10); VI — хлороформ — ацетон — ледяная
уксусная кислота (70+20+10); VII — метиленхлорид — ацетон — ледяная уксусная кислота (70+
+20+10); VIII — циклогексан — хлороформ — метанол — ледяная уксусная кислота (20+60+10+10);
IX — верхняя фаза: толуол—ледяная уксусная кислота — вода (50+50 + 10) [17], X — толуол —
ледяная уксусная кислота — вода (50+50 + 5) [17], XI — бутанол — ледяная уксусная кислота —
вода (100 + 10 + 10) [17].
Цветные реакции желчных кислот
Таблица 446
Желчная кислота Обнаружение
ванилин — серная кислота (№ 15) уксусный ангид- рид — серная кисло- та G№ 63) фосфорная кислота (№ 23) треххло- ристая сурьма (№ 12)
ДС ДС УФ ДС УФ УФ
1. Холевая г-сер ж с ж Ж с ж бл-ф.
2. Дезоксихолевая г-сер ж с з-ж ж с ж —
3. Дегидрохолевая кор — — — — —
4. 3,12-Диацетоксихолановая т-сер ж-з т-ж — — —
5. За-Окси-(7,8)-11,12-холадие- новая ф ж-кор т-кор — — бл-ф
6. За-Окси-(8,14)-11,12-хола- диеновая ф ж-кор т-кор — — бл-ф
Сокращения при обозначении окраски см. в табл. 42.
Рис. 124. Разделение свободных желчных ки-
слот и отделение от связанных желчных ки-
слот на силикагеле Г с верхней фазой толуол —
ледяная уксусная кислота — вода (50 + 50 + 10)
(по Генсхирту с сотрудниками [17]).
Обнаружение: реактив № 120 а. 1,12 — смеси следую-
щих кислот: 2 — холевой; 3 — дезоксихолевой;
4 — хенодезоксихолевой; 5 — литохолевой; б — гли-
кохолевой; 7 — гликодезоксихолевой; 8 — гликоген-
дезоксихолевой; 9 — таурохолевой; 10 — тауродезо-
ксихолевой; 11 — таурохенодезоксихолевой.
Рис. 123. Разделение некоторых
свободных желчных кислот на слое
силикагеля Г смесью хлороформ —
ледяная уксусная кислота (90+10).
Обнаружение: фосфорная кислота (реак-
тив № 123), затем фосфорномолибденовая
кислота (реактив № 120 в). 1 — холевая
кислота; 2 — дезоксихолевая кислота;
3 — дегидрохолевая кислота; 4 — 3,12-
диацетоксихолановая кислота; ,5 — За-
окси-(7,8)-11,12-холадиеновая кислота;
в — За-окси-(8,14)-11,12-холадиеновая
кислота.
Рис. 125. Разделение связанных желчных кислот и отделение от свободных желчных
кислот на силикагеле Г смесью бутанол — ледяная уксусная кислота — вода (100 +
+ 10+10) [17].
Обнаружение: реактив 120а. Обозначения те же, что на рис. 124.
18 Заказ № 734
274
Специальная часть
Рис. 123 показывает, что холевая, дегидрохолевая и дезоксихолевая
кислоты без труда разделяются на слоях силикагеля Г растворителем хлоро-
форм—ледяная уксусная кислота (90+10). Связанные желчные кислоты лучше
всего обнаруживаются реактивом ванилин — серная кислота (№ 151).
Реактив Либермана — Бурхарда (№ 63) дает при дневном свете окрашенные
пятна, флуоресцирующие различным цветом в УФ-свете. При этом дегидро-
холевая кислота, как и с фосфорной кислотой (реактив № 123), реагирует
слабо; при последующем опрыскивании фосфорномолибденовой кислотой
(реактив № 120в) и нагревании она становится видимой. Цветные реакции
с треххлористой сурьмой (реактив № 12) являются менее специфичными.
Во время издания настоящей книги появилась работа Гофмана [26],
в которой также описывается анализ желчных кислот методом ХТС.
Разделением и определением желчных кислот методом хроматографии
на бумаге занимался прежде всего Соэвай [65—69]. Гамильтон и Диккерт
[20] осуществили разделение желчных кислот, стероидов [21] и сапонинов
[22] на бумаге из стеклянного волокна.
V. СЕРДЕЧНЫЕ ГЛЮКОЗИДЫ
Ряд растений содержит оказывающие влияние на сердечную деятельность
ядовитые смеси глюкозидов. Эти так называемые сердечные глюкозиды
используются терапевтически для лечения декомпенсации кровообращения,
вызванной болезнью сердца. Сердечные глюкозиды представляют собой
соединения со стероидным скелетом, имеющим в большинстве случаев пяти-
членное лактоновое кольцо в положении Ci7. Находящаяся в положении С3
группа ОН эфирно связана с одним или несколькими сахарами (см. табл. 45).
Наиболее известными лекарственными растениями, содержащими эти
соединения, являются Digitalis purpurea L и D. lanata Ehrh., Strophanthus
kombe Oliv. и Str. gratus (Wall, et Hook ) Franch. и Urginea maritima (L).
Baker (Scilla maritima L.). Наряду с этим используют вытяжки лекарствен-
ных растений Convallaria majalis L., Adonis vernalis L., Nerium oleander L.
и др. Содержание глюкозидов в этих растениях и, следовательно, действие
соответствующих препаратов зависят от ряда факторов, например от окру-
жающей среды, возраста растения, времени сбора и прежде всего от способа
сушки. В настоящее время обнаружены сверхспецифические, химические
сорта («химические породы»). Поскольку отдельные глюкозиды по своему
биологическому действию сильно отличаются и поскольку в растениях нахо-
дятся смеси глюкозидов, безусловно требуется разработка метода установ-
ления величины активного действия. В настоящее время для этого исполь-
зуют определенный биологический тест (например, доза лягушки). Однако
уже в течение длительного времени стремятся заменить дорогостоящие био-
логические методы испытания более точными физико-химическими методами.
Возможности для этого открывает хроматография при условии количествен-
ного определения находящихся в смеси сердечных глюкозидов.
Уже Штоль с сотрудниками [78] смогли хроматографически разделить
эти вещества различной полярности на силикагелевых колонках. С ростом
числа групп ОН, находящихся в основном скелете, а также с ростом числа
глюкозидно связанных сахаров увеличивается полярность и, следовательно,,
растворимость в воде (табл. 45).
Цафарони [91] впервые осуществил разделение смесей стероидов на филь-
тровальной бумаге, пропитанной формамидом и этиленгликолем. Райх-
штейн, Шиндлер и сотрудники [59, 60] использовали этот метод для хрома-
тографического разделения глюкозидов дигиталиса и строфантуса и смогли
таким образом обнаружить многочисленные новые вещества. Систематическое
Таблица 45
Расположение глюкозидов дигиталиса по их полярности
(D— дигитоксоза, Ас— ацетил, G— ^-глюкоза, ОН—оксигруппа)
Увеличение полярности —>
НО— 1 2 3 4 5
Аглюконы D—D—D—O— дигитоксигенин гиталоксигенин гитоксигенин дигоксигенин дигинатигенин а н о
Вторичные глю- 3 4 7 8 12 и йн к
козиды Ас 1 G—D—D—D—O— дигитоксин гиталоксип гитоксин дигоксин дигинатин ч о Й ф и й ф р й
Первичные глю- 10 И 13 15 18 ч ф
козиды Digitalis lanata ланатозид А ланатозид Е ланатозид В ланатозид С ланатозид D я
g-d-d-d-o-
Первичные глю- 14 16 17 19 20
козиды дезацетилланатозид А (пурпуреа- Г дезацетил- П дезацетилланато- Г дезацетил- П Г дезацетил- '1
Digitalis purpurea глюкозид А) L ланатозид Е J зид В (пурпуреа- глюкозид В) L ланатозид С J L ланатозид D _
276
Специальная часть
исследование глюкозидов дигиталиса методом хроматографии на бумаге
было проведено Кайзером в 1955 г. [27]. По полученным им результатам уда-
лось составить табл. 45. Как показали дальнейшие работы, эта таблица
является чрезвычайно полезной при исследованиях смесей сердечных глю-
козидов методом ХТС.
Чеше с сотрудниками [81—87] первыми использовали метод ХТС для
разделения и идентификации различных смесей стероид-глюкозидов.
Шталь и Кальтенбах [74] показали затем, что на слоях силикагеля Г
можно разделить важнейшие сердечные глюкозиды, используя смесь
метиленхлорид — метанол — формамид (80 + 19 + 1). При длине слоя в 10 см
можно полностью разделить смесь из 14 различных веществ (рис. 126).
Рис. 126. Анализ сердечных глюкозидов по Шталю с сотрудниками на силикагеле
со смесью метиленхлорид — метанол — формамид (80 + 19 + 1) [74].
1 —ацетилдигитоксин; 2 —дигитоксин; 3 —гитоксин; 4 —дигоксин; 5 —дигиланид А; 6 —ди-
гиланид В; 7 — дигиланид С; 8 — дезацетилдигиланид А; 9 — дезацетилдигиланид В; 10 — деза-
цетилдигиланид С; 11 —k-строфантозид; 12 — цимарин; 13 — просцилларидин; 14 — сциларен А;
1—14Л—смесь. Обнаружение: реактив № 31; окраска в УФ-свете (365 мц): □ светло-желтая;
Е1 коричнево-желтая; цц светло-синяя; фиолетово-синяя.
При этом необходимо, чтобы количество наносимого вещества, соответствую-
щее отдельному глюкозиду, было весьма невелико и лежало в пределах 1 рг;
кроме того, следует обратить внимание на хорошее насыщение камеры
(стр. 24). Для обнаружения авторы рекомендуют реакцию со смесью три-
хлоруксусная кислота — хлорамин (реактив № 31).
Штайнегер и ван дер Валт [77] нашли, что сердечные глюкозиды белого
и красного морского лука (Uriginea maritima) можно разделить на слоях
силикагеля Г (стандартный метод) с верхней фазой в виде смеси этилацетат —
пиридин — вода (50 + 10 + 40) и привели фотографию. Штайдле [76] описал
УФ-спектрометрическое определение сердечных глюкозидов, разделенных
методом ХТС. Во время издания настоящей книги появилась заслуживающая
внимания работа Сьёхолма [72а], в которой подробно описывается разделение
методом ХТС 28 глюкозидов дигиталиса. На слоях силикагеля Г, получен-
ных стандартным методом для двумерной тонкослойной хроматографии были
использованы растворители: этилацетат—метанол — вода (80 + 5 + 5) и хлоро-
форм—пиридин (60-J-10). При одномерной хроматографии глюкозосодержащие
глюкозиды дигиталиса разделялись смесью метилэтилкетон — хлороформ —
формамид (50 + 20 + 10).
Разделение методом ХТС стероид-глюкозидов из Nerium oleander L.
и последующее колориметрическое определение разделенных соединений
Гл. 13. Стероиды
277
описал Горлих [18]. Было показано, что два растворителя обеспечивают
очень хорошее разделение экстракта олеандра на слоях силикагеля Г:
этилацетат — хлороформ (90 + 10) и этилметилкетон — толуол — метанол —
ледяная уксусная кислота — вода (80 + 10 + 5 + 2 + 6). На двумерной хрома-
тограмме (направление 1 — растворитель II, направление 2 — растворитель I)
можно было отчетливо разделить 14 стероид-глюкозидов.
Для количественного определения разделенных методом ХТС сердечных
глюкозидов рекомендуется наносить большие количества вещества. В наших
опытах [89] было обнаружено, что для этого наиболее подходящим является
многократное хроматографирование. Мы работали при стандартных условиях
на слоях силикагеля Г и использовали простейшие смеси, состоявшие
из растворителей различной полярности.
Для глюкозидов с небольшим различием в полярности оказалось необходимым исполь-
зовать возможно менее полярный растворитель и осуществлять разделение многократно.
При таком многократном разделении смесью циклогексан — ацетон — ледяная
уксусная кислота (49 + 49 + 2) на слоях силикагеля Г были получены следующие
результаты.
При первом разделении аглюконы глюкозидов дигиталиса перемещаются примерно
до середины разделительного слоя в 10 см; вторичные глюкозиды располагаются ниже
и также разделяются. В качестве ориентировочных величин + X 100 получают для
дигитоксигенина 68, гитоксигенина 51, дигоксигенина 48, дигитоксина 42.
При втором разделении вторичные глюкозиды лежат в области значений hR? 40—70,
первичные глюкозиды лежат еще ниже 20.
При третьем и четвертом разделении первичные глюкозиды хорошо разделяются
и расположены в том же порядке, что и на бумажной хроматограмме.
Если в качестве растворителя используют смесь хлороформ—метанол (90 + 10), то при
трехкратном разделении получают следующие значения: дигитоксин — 73, гитоксин —
55, дигоксин — 47.
Кроме сердечных глюкозидов, методом ХТС были исследованы ряд дру-
гих стероид-глюкозидов и аглюконов. Так, например, Сандер [62] исполь-
зовал стандартный метод и, применяя смесь циклогексан—этилацетат (70+30),
отделил диозгенин (hRf 60) от гитогенина (hRf 20). Обнаружение проводи-
лось реактивом ванилин — фосфорная кислота (реактив № 149). Подробно
о разделении тритерпеноидов см. стр. 202.
Для обнаружения сердечных глюкозидов особенно пригодна предложен-
ная Кайзером [27] смесь хлорамин — трихлоруксусная кислота (реактив
№ 31). Менее чувствителен реактив треххлористой сурьмы (реактив № 11
или 12). Хорошие результаты можно получить также с фосфорной кислотой
(реактив № 123) и смесью серная кислота — ангидрид уксусной кислоты
(реактив № 63). Согласно опыту, различные ряды глюкозидов дигиталиса
можно отличать по их различной окраске флуоресценции.
Глюкозиды дигиталиса Окраска флуоресценции после опрыскивания смесью хлорамин — трихлоруксусная кислота Окраска по реакции с фос- форной кислотой при дневном свете (ср. рис. 126)
Ряд А Коричнево-желтая Г олубовато-черная
Ряд В Светло-голубая Фиолетово-коричневая
Ряд С Фиолетово-голубая Фиолетово-серая
Приведенные выше цвета отличаются однако от описанных в случае
хроматографии на бумаге. Для обнаружения глюкозидов дигиталиса на
тонкослойных хроматограммах Сьёхолм [72а] рекомендует следующую
смесь: 0,5 мл анисового альдегида, 5 мл 70%-ной перхлоруксусной кислоты.
10 мл ацетона и 40 мл воды. После опрыскивания пластинки в течение 4—
5 мин нагревают при 75—80° и затем отмечают окраску при дневном свете
278
Специальная часть
и в УФ-свете (365 лц). Важно знать также изменение окраски и флуоресцен-
ции в течение первого часа. Минимально обнаруживаемое количество при
дневном свете лежит в области 0,1 цг, в УФ-свете — в области 0,02 цз.
ЛИТЕРАТУРА
1. Abelson D., Brooks R., Paper Chromatography of Steroids, London, Cambridge
Univ. Press, 1960.
2. A h r e n s E. H., jr., I n s u 11 W., jr., Hirsch J., Stoffel W., Peter-
son M. L., Farquhar J. W., Miller T., Thomasson H. J., Lancet,
1959 I 115.
3. A x p e м А. А., Кузнецова А. И., Мед. пром. СССР, 15, 57 (1961).
4. A x p e м А. А., Кузнецова А. И., ДАН СССР, 138, 591 (1961).
5. Barbier M., Jager H., Tobias H., Wyss E., Helv. Chim. Acta, 42, 2440
(1959).
6. Барбиер M., Завьялов H., Изв. АН СССР, OXH (7), 1960, 1309.
7. В a r t о n D. H. R., Morrison G. A., Zechmeister L., Fortschr. Chem.
org. Naturstoffe, 19, 165 (1961).
8. Beijl eveld W. M., Pharm. Weekblad, 97, 190 (1962).
9. Bolliger H. R., Q u a i f e M. L., G e у e r R. P., Anal. Chem., 31, 950 (1959).
10. Brieskorn С. H. Klinger H., Polonius W., Arch. Pharm., 294, 389
(1961).
11. Bush J. E., The Chromatography of Steroids, Oxford, 1961.
12. Cerny V., J о s k a J., L a b 1 e r L., Collection Czechosl. Chem. Commun., 26,
1658 (1961).
13. Dam M. J. D., v a n et al., J. Chromatog., 4, 26 (1960).
13a. Dam M. J. D., v a n, Bull. soc. chim. Beiges, 70, 122—124 (1961).
14. Dannenberg H., Neumann H.-G., Liebigs Ann. Chem., 646, 148 (1961).
15. Физер Л., Физер M., Стероиды, Издатинлит, 1964.
16. F о к к е n s J., Р о 1 d е г m a n n J., Pharm. Weekblad, 96, 657 (1961).
17. Ganshirt Н., К о s s F. W., M о r i a n z K., Arzneimittel-Forsch., 10, 943 (1960).
18. G о r 1 i c h B., Planta Med., 9, 442 (1961).
19. Habermann E., В and 11 о w G., Krusche B., Klin. Wschr., 39, 816 (1961).
20. H a milton J. G., Dieckert J. W., Arch. Biochem. Biophys., 82, 203 (1959).
21. H a m i 1 t о n J. G., Dieckert J. W., Arch. Biochem. Biophys., 82, 212 (1959).
22. H a m i 1 t о n J. G., Dieckert J. W., Arch. Biochem. Biophys., 82, 220 (1959).
23. Hanc O., Hormone, 2. Aufl., Jena, VEB Fischer Verlag, 1959.
24. Hermanek S., S chwarz V., Cekan Z., Collection Czechoslov. Chem. Com-
mun., 26, 1669 (1961).
25. Horhammer L., Wagner H., Lay B., Pharm. Ztg., 106, 1307 (1961).
26. H о f m a n n A. F., J. Lipid Research, 3, 127 (1962).
26a. I m m e r H., Mihailovic M. L., Schaffner K., A r i g о n i D., J e-
ger O., Helv. Chim. Acta, 45, 753 (1962).
27. Kaiser F., Chem. Ber., 88, 556 (1955).
28. Kaufmann
29. Kaufmann
473 (1955).
30. Kaufmann
985 (1956).
31. Kaufmann
32. Kaufmann
1046 (1958).
33. Kaufmann
34. Kaufmann
523 (1959).
35. Kaufmann
1 (1960).
36. Kaufmann
37. Kaufmann
38. Kaufmann
H. P., Nitsch W. H., Fette, Seifen, Anstrichmittel, 56, 154(1954).
H. P., Nitsch W. H. u. a., Fette, Seifen, Anstrichmittel, 57,
H. P., N i t s c h W. H., Fette, Seifen, Anstrichmittel, 58, 234, 492,
H. P., Mohr E., Fette, Seifen, Anstrichmittel, 60, 165 (1958).
H. P., Schnurbusch H., Fette, Seifen, Anstrichmittel, 60,
H. P., C h о w d h u г у D. K., Chem. Ber., 91, 2117 (1958).
H. P., Schnurbusch H., Fette, Seifen, Anstrichmittel, 61,
H. P., Schnurbusch H., Fette, Seifen, Anstrichmittel, 62,
H. P., Makus Z., Fette, Seifen, Anstrichmittel, 62, 153 (1960).
H. P., Schmidt G., Fette, Seifen, Anstrichmittel, 62, 164 (I960).
H. P., Makus Z., Dei eke F., Fette, Seifen, Anstrichmittel,
63, 235 (1961).
39. К 1 e i n P. D., J a n s s e n E. T., J. biol. Chem., 234, 1417 (1959).
40. К 1 у n e W., The Chemistry of the steroids, Methuen and Co., Ltd., London — New
York, John Wiley and Sons Inc., 1957.
41. Labarrere J. A., Chipault J. R., Lundberg W. O., Anal. Chem., 30,
1466 (1958).
Гл. 13. Стероиды
279
42. Lettre — Inhoffen — Tschesche, Ober Sterine, Gallensauren und verwandte Naturstof-
fe, Bd. I und II, Stuttgart, Ferd. Enke Verlag, 1959.
43. Mahadevan V., Lundberg W. O., Lipid Research, 3, 106 (1962).
44. Mangold К. H., частное сообщение.
45. Martin A. P., Biochem. Biophys., 25, 408 (1959).
46. Matis J., Adamec O., Galvanek M., Nature, 194, 477 (1962).
47. Metz H., Naturwiss., 38, 569 (1961).
48. Michalec C., Naturwiss., 42, 509 (1955).
49. Michalec C., J i r g 1 V., P о d z i m e к J., Experientia, 13, 242 (1957).
50. Michalec 6., Strasek J., J. Chromatog., 4, 254—257 (1960).
51. M о t t i e r M., Potterat M., Anal. Chim. Acta, 13, 46 (1955).
52. Neher R., Wettstein A., Helv. Chim. Acta, 34, 2278 (1951).
53. Neher R., Chromatog., 1, 122, 205 (1958).
54. Neher R., Chromatog., 1, 231 (1958).
55. P e e r e b о о m J. W. C., Roos J. В., В e e к e s H. W., J. Chromatog., 5, 500
(1961).
56. Prelog V., Helv. Chim. Acta, 36, 308 (1953).
57. P r e 1 о g V., Meier H., Helv. Chim. Acta, 36, 320, 325 (1953).
58. Prusikova M., Experientia, 15, 460 (1959).
59. Reichstein T., Schindler O., Helv. Chim. Acta, 34, 108 (1951).
60. Reichstein T., Schenker E., Hunger A., Helv. Chim. Acta, 37, 680
(1954).
61. Reisert P., Mitarb., Experientia, в печати.
62. Sander H., Naturwiss., 48, 303 (1961).
63. Searcy R. L., Bergquist L. M., Clin. Chim. Acta, 5, 192 (1960).
64. Sibliko v а О., H a i s I. M., Ceskoslov. Farmac., 7, 1—13 (1958).
65. Sjoe vail J., Acta Chem. Scand., 6, 1552 (1952); 13, 711 (1959).
66. Sjoevall J., Haslewood G. A. D., Biochem. J., 57, 126 (1954).
67. Sjoevall J., Ark. Kemi, 8, 317 (1955).
68. Sjoevall J., Clin. Chim. Acta, 4, 652; 793 (1959).
69. S j о e v a 1 1 J., Clin. Chim. Acta, 5, 33 (1960).
70. Smith I., Chromatographic and Electrophoretic Techniques, Volume I, S. 355—362
und 409—460, Heinemann W., Medical Books Ltd., London, 1960.
71. Schmidt v. Elmendorff H., Z. ges. exp. Med., 130, 142—145 (1958).
72. Schon H., Gey F., Hoppe Seyler’s Z. physiol. Chem., 303, 81 (1956).
72a. Sjoholm I., Svensk Farm. Tidskr., 66, 321 (1962).
73. Stahl E., Pharmaz. Rdsch., 1, Nr. 2, 1 (1959).
74. Stahl E., Kaltenbach U., J. Chromatog., 5, 458 (1961).
75. S t a г к a L., Malikova J., J. Endocrinol., 22, 215 (1961).
76. Steidle W., Planta Med., 9, 435 (1961).
77. Steinegger E., van der Walt J. H., Pharm. Acta Helv., 36, 599 (1961).
78. Stoll A., Angliker E., Barfuss F., Kussmaul W., Renz J., Helv.
Chim. Acta, 34, 1460 (1951).
79. Struck H., Mikrochim. Acta, 1961, 634.
80. Swarthout R. R., Dieckert J. W., Miller O. N., Hamilton J. G.,
81.
82.
83.
84.
85.
J. Lipid Research,
Tschesche R.,
Tschesche R.,
Tschesche R.,
Tschesche R.,
Tschesche R.,
1, 281 (1960).
F г e у t a g W., Snatzke G., Chem. Ber., 92, 3053 (1959).
Snatzke G., Ann. Chem., 636, 105 (1960).
Gupta A. K. S., Chem. Ber., 93, 1903 (1960).
Lampert F., S n a t z к e G., J. Chromatog., 5, 217 (1961).
Hammerschmidt W., Snatzke G., Ann. Chem.,
642, 199 (1961).
86. Tschesche R., Schwarz H., Snatzke G., Chem. Ber., 94, 1699 (1961).
87. Tschesche R., Wulf G., Chem. Ber., 94, 2019 (1961).
88. Wachsmuth H., Koeckhoven L. van, Anal. Chim. Acta, 22, 41 (1960).
89. W a 1 d i D., неопубликованные данные.
90. Weicker H., Klin. Wschr., 37, 763 (1959).
90a. W e h r 1 i W., Helv. Chim. Acta, 45, 1206 (1962).
91. Zaffaroni A., Burton R. B., Keutmann H. E., J. Biol. Chem., 177,
109 (1949).
92. Zak B., D ieken man R. C., W h i t e E. G., Burnett H., C h e r n e у P. J..
Am. J. Clin. Pathol., 24, 1307 (1954).
93. Zollner N., Kirsch K., Z. ges. exp. Med., 134, 10 (1960).
94. Zollner N., Kirsch K., Amin G., Verhandl. deut. Ges. inn. Med., 66, 677
i (1960).
95. Zollner N., Wolfram G., Klin. Wschr., 39, 817 (1961).
96. Zollner N., Wolfram G., Amin G., Klin. Wschr., 40, 273 (1962).
97. Zotti G. de, Capella P., Jacini G., Fette, Seifen, Anstrichmittel. 61,
1114 (1959).
ГЛАВА 14
ОРГАНИЧЕСКИЕ ОСНОВАНИЯ
I. АЛКАЛОИДЫ
Д. Валъди
1. ВВЕДЕНИЕ
Большинство алкалоидов являются растительными основаниями сред-
ней силы и в свободном состоянии (в форме оснований) обладают липофиль-
ными свойствами, т. е. экстрагируются в большинстве случаев хлороформом,
эфиром и другими растворителями из водно-щелочной фазы. Методом хрома-
тографии на бумаге алкалоиды вначале были разделены в виде солей при ис-
пользовании кислых растворителей. После введения метода пропитки бумаги
формамидом их удалось разделить также в виде свободных оснований. Ока-
залось, что многочисленные описанные разделения на бумаге, пропитанной
формамидом, могут быть очень хорошо осуществлены на слоях силикагеля Г
или окиси алюминия Г методом адсорбционной хроматографии. Для этого
на основных слоях окиси алюминия .используют в большинстве случаев
нейтральные растворители, например хлороформ. На слоях силикагеля, имею-
щего слабокислые свойства, алкалоиды в зависимости от основности и кон-
станты диссоциации удерживаются сильнее. Это, однако, легко исправить,
если приготовить «основной» слой силикагеля (стр. 45) или если добавить
к растворителю сильное основание, например диэтиламин.
Если в этих условиях алкалоиды не разделяются хлороформом, то к нему
добавляют более полярный растворитель, например 5—20% метанола.
Если, наоборот, при применении хлороформа алкалоиды лежат в области
фронта, то к хлороформу добавляют менее полярный циклогексан.
Кроме чисто неорганических сорбционных слоев, можно также с успе-
хом использовать слои из порошка целлюлозы [41].
Большой интерес представляет быстрая идентификация одного или не-
скольких алкалоидов при анализе лекарственных веществ, особенно при
наличии ядов.
С этой целью в хроматографии на бумаге разработан систематический
ход анализа [45], который при дальнейшем упрощении и значительной эко-
номии времени может быть перенесен на метод ХТС [46]. В разработанных
методах используют преимущественно силикагель Г и пропитка слоя больше
не является необходимой. Чтобы исключить влияние различия в свойствах
сорбционных слоев на величины Rt, одновременно с пробой хроматографи-
руют хорошо известный продажный алкалоид или краситель родамин В
и относят^ полученные значения к значению для стандарта (величины Rst)-
2. ПРОВЕДЕНИЕ СИСТЕМАТИЧЕСКОГО АНАЛИЗА
ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ АЛКАЛОИДОВ [46]
Работают при стандартных условиях, описанных на стр. 35, на слоях
силикагеля Г толщиной 250 ц. Анализируемый раствор должен содержать
алкалоиды в области концентраций между 0,05 и 5%. Нет необходимости
переводить соответствующие соли в свободные основания, поскольку исполь-
зуемые растворители являются сильнощелочными.
Гл. 14. Органические основания
281
а) Определение принадлежности к определенной группе
и оптимальное наносимое количество
В предварительном опыте наносят на место старта непрерывно увеличи-
вающиеся количества раствора алкалоида, например от 1 X 5 мм3 до
10 X 5 раствора алкалоида, и в качестве эталонного вещества 5 лили3
0,5%-ного спиртового раствора родамина В или, лучше, 5 .и.и3 1%-ного рас-
твора стрихнина или резерпина. Разделение осуществляют растворителем III,
представляющим собой смесь циклогексан — хлороформ — диэтиламин
(50 + 40 + 10). После того как хроматограмма доведена до воздушносухого
состояния, ее рассматривают в УФ-свете (365 л«ц) и затем опрыскивают рас-
твором иодоплатината (реактив № 76). Уже через короткое время появляются
пятна алкалоидов, окрашенные в отличие от случая реактива Драгендорфа
(№ 60 и 60а) различным образом (табл. 46). При этом часто наблюдают харак-
терное изменение окраски. Это изменение может быть дальнейшим средством
идентификации.
Затем определяют величины Rf. Эталонные вещества, родамин В и резер-
пин, в растворителе III дают величины hRf, равные 20. Алкалоиды с величи-
нами hRf, превышающими 30, относят к группе II, а алкалоиды с меньшими
величинами hRf— к группе I. В зависимости от принадлежности к группе
проводят хроматографический анализ с соответствующим образом выбран-
ным растворителем. Наиболее подходящее наносимое количество вещества
лежит в пределах 50 уг.
б) Группа I, алкалоиды с величинами hRf 0—30 (табл. 46)
Для идентификации наряду с цветными реакциями используют величины
Rf, полученные на слоях силикагеля Г с растворителями I — хлороформ —
ацетон — диэтиламин (50 + 40 +10) и II — хлороформ — диэтиламин
(90 +10). Целесообразно одновременно хроматографировать в качестве эта-
лонного вещества родамин В или алкалоид, наличие которого можно подо-
зревать на основании предварительного опыта. Используя данные табл. 46,
можно определить принадлежность неизвестных алкалоидов к данной груп-
пе. В сомнительных случаях можно провести хроматографический анализ
дополнительно на окиси алюминия Г или на силикагеле Г, обработанном
щелочью, используя растворители VI и VIII. Величины hRf, растворители
и эталонные красители приведены в табл. 46.
в) Группа II, алкалоиды с величинами hRr>30
Если определенное в предварительном опыте ориентировочное значение
величины hRf превышает 30, то хроматографический анализ проводят на
слоях силикагеля Г с растворителями IV циклогексан — диэтиламин
(90 + 10) и V бензол — этилацетат — диэтиламин (70 + 20 + 10) или еще
раз, как и в предварительном опыте, используя растворитель III. Величины/?;
можно взять из табл. 46 или рис. 127. Одновременно с анализируемым рас-
твором следует хроматографировать один из предполагаемых алкалоидов
в качестве эталонного вещества. Следует наносить исследуемое вещество на
несколько точек старта. В этом случае имеется возможность использовать
различные специфические реактивы для опрыскивания (например, диазо-
тированные сульфаниловые кислоты). При опрыскивании остальную часть
разделительного слоя покрывают двумя стеклянными пластинками, и, таким
образом, на одной пластинке можно осуществить несколько реакций. В каж-
дом случае можно определить до и после опрыскивания окраску флуоресцен-
ции (365 лиц) (табл. 46).
Таблица 46
Величины х 100 и обнаружение алкалоидов
1 № п/п I Сорбент а С с с С с ОА ОА с Окраска флуо- ресценции в УФ-свете (36 5 л«ц) Окраска при опрыскива- нии реактивом подоплати- ната Форма пятна Число по- боч- ных пятен Чис- лен- ная по- следо- ва- тель- ность в хро- мато- гра- фии на бумаге
Предваритель- ная обработка — — — — — — — 0,1н. NaOH
Растворитель I II III IV V VI VII VIII
1 Нарцеин . . 3 0 0 0 0 0 г 0 РУ П п 0 а I Темпо-голубая Круглое 2
2 Купреин . . 3 0 0 0 0 0 0 46 Коричневато- Красно-коричневая » — 5
3 Сарпагин 12 4 0 0 0 0 0 0 желтая Бежевая » — 1
4 Эргометрин 14 6 0 0 2 3 0 64 Фиолетово- Белая (розовый фон) » — 3
5 Морфин . . 10 8 0 0 3 3 0 34 голубая Темно-голубая » — 4
6 Дигидро- эроготамин 21 ' 12 0 0 3 7 0 61 Фиолетово- Коричневатая — 13
7 Серпентин 24 15 0 0 4 0 0 0 голубая Темно-корич- Красно-коричневая » — 7
8 Эрготамин 24 16 0 0 3 10 5 59 левая Фиолетово- Розовая » — 14
9 Болдип . . 16 16 3 0 5 24 6 58 голубая Фиолетовая Бежевая » — 9
10 Дигидромор- фипон .... 24 23 8 1 И 5 8 16 Коричневато-желтая » — 8
11 Эргометрин и и 42 25 3 0 8 12 10 62 Фиолетово- Фиолетово-голубая » —- И
12 Эфедрин . . — — — — — — — голубая Светло-коричневая Вытянутое! — 43
13 Хинин . , , 19 26 7 0 17 9 18 43 Голубая Желто-белая Круглое — 41
14 Дигидроэр- гокристин . . 42 30 3 0 7 15 7 69 Фиолетово- голубая Коричневатая Круглое — 18
15 Горденин . 33 36 14 5 28 0 15 35 — Белая (розовый фон) » — 36
16 Зргокристип 51 38 14 5 13 46 15 70 Фиолетово- Бежевая — светло- » — 16
17 Хинидин 33 40 15 0 25 12 18 50 голубая Г олубая коричневая Светло-желтая » 1 44
18 Атропин . . 38 40 16 5 12 0 10 17 Фиолетово-голубая » — 37
19 Колхицин 47 41 4 0 4 11 0 57 — Светло-серая » — 12
20 Аймалин 47 42 12 3 30 6 13 56 Голубоватая Бежеван » 2 33
21 Цинхонин 38 44 17 7 27 0 22 40 — Бежево-коричневая » — 45
22 Гоматропин 37 45 15 5 23 4 24 15 — Фиолетово-голубая » — 35
23 Эрготаминин 24 51 0 0 14 42 15 68 Фиолетово- Розовая » — 15
24 Пилокарпин 41 52 9 0 13 32 25 55 голубая Светло-коричневая » — 6
25 Кодеин . . 38 53 16 4 26 12 27 35 — . Лилово-розовая » — 30
26 Дигидроко- деин 38 54 18 6 28 10 30 25 Голубая Фиолетово-голубая » — 32
27 Серпептинин 53 56 8 0 10 0 3 12 Желто-зеле- Желто-коричневая Вытянутое — 19
28 Эргокристи- нии 61 57 13 0 20 0 27 70 пая Фиолетово- Светло-коричневая Круглое — 17
29 Скополамин 56 60 19 3 34 30 0 52 голубая Фиолетовая » — 28
30 Йохимбин 63 62 18 3 37 33 15 60 Зелено-голу- Светло-желтая » — 31
31 Бруцин . . 42 63 18 0 19 50 54 12 бан Фиолетово-коричне- » 1 20
32 Цефаелип 56 63 19 2 23 25 17 37 Фиолетово- вая Белая (розовый фон) » 3 22
33 Раувольцин 55 63 18 4 36 36 15 68 СИНЯЯ Желто-зеле- Бледно-бежевая » 1 42
34 Дигидроко- деинон . . . 51 65 21 4 30 48 43 18 ная Фиолетовая » 2 25
Сорбент а с с С с с ОА ОА с
Предваритель- ная обработка — — — — — — — 0,1н. NaOH
в в4 5? Растворитель I II III IV V VI VII VIII
35 Апоатропин 54 67 40! 20 26 15 40 16
36 Стрихнин 53 76 28 5 38 57 60 22
37 Резерпин 72 80 20 0 46 63 35 69
Групп
38 Физостигмин 65 >90 32 4 44 59 50 46
39 Аконитин 68 >90 35 3 49 36 60 65
40 Бульбокап- нин 65 >90 35 7 54 78 70 48
41 Эметин . . 67 >90 40 6 45 38 58 50
42 Папаверин 67 >90 42 2 47 85 84 70
43 Котарнип 60 >90 43 31 45 0 25 0
44 Скополин 60 >90 44 20 44 46 50 37
45 Лобелии . . 68 >90 48 14 48 55 60 55
46 Наркотин 72 >90 51 10 57 81 79 72
47 Тебаин . . 65 >90 51 16 50 71 76 40
48 Аспидоспер- мин 65 >90 54 20 49 50 60 65
49 Тропакока- ин 65 >90 56 34 45 58 78 35
50 Ареколин 66 >90 56 34 48 0 0 0
Продолжение табл. 46
Окраска флуо- ресценции в УФ-свете (3 65 ,иц) Окраска при опрыскива- нии реактивом иодоплати- ната Форма пятна Число по- боч- ных пятен Чис- лен- ная по- . следо- ва- тель- ность в хро- мато- гра- фии на бумаге
Фиолетово-голубая Круглое 52
- Желтая Вытянутое — 24
Желто-зеле- ная Белая (розовый фон) Круглое 3 34
а II
— Розовая Красно-коричпевая Круглое » 1 23 46
Синяя Белая (розовый фоп) » — 29
Синяя Красно-коричпевая » 3 39
Желтоватая Желтая » — 26
Зелено-жел- Фиолетовая Вытянутое 1 21
тая
— Белая (розовый фон) Круглое — 27
— Красно-коричневая » — 47
Синяя Светло-желтая » — 40
— Красно-коричневая » — 38
— Белая (розовый фон) » 49
— Фиолетовая » — 50
— Белая (розовый фон) — —
51 Гидрастинин 66 >90 58 41 50 0 25 0 Синяя Фиолетово-синяя Вытянутое 1 . 10
52 Псикаин . . 66 >90 60 35 53 83 82 59 — Желтая Круглое — 51
53 Кокаин Nen 73 >90 65 36 58 84 77 62 — Фиолетовая » — 48
54 Спартеин 70 >90 68 68 55 0 55 5 » » 54
Растворитель □талонное вещество ВуХЮО
I Хлороформ — ацетон — диэтиламин (50 + 40 +10) Родамин В 58
II Хлороформ — диэтиламин (90 + 10) » » 49
III Циклогексан — хлороформ — диэтиламин (50 + >40>10) » » 20
IV Циклогексан — диэтиламин (90 + 10) Масляный желтый 45
V Бензол — этилацетат — диэтиламин (70 + 20+10) » » 44
VI Хлороформ )> » 85
VII Циклогексан—хлороформ (30 + 70) + 0,05% ди- этиламипа (3 капли) » » 85
VIII Метанол Родамин В 53
а С —силикагель Г; ОА — окись алюминия.
Нумерация алкалоидов JM5 1—37 соответствует возрастанию величины ЛВу в графе II; нумерация алкалоидов № 38—54—возрастанию величины hRj
в графе III.
53,
45,37
34.
45.39^
42;
^51.52
49484140.38
' 30
28
44,43-
32,29
33
35
36,27
34,16
20,19
п
ш
(38 Ш'
23,10,7,8
6
13
9
4
3
5
37,14,11-
24
25,26,21,18
22
17,15
36
07
34
51
14
34
72
7,2,3,4,5/7,8,23
42
22
27
20
IS
17,18
16
15
13
11
' 10
53
52
50,49
43
5
4
3
1.2,3,4,5.6,78,9,11,13,14,16
17,19,23,24,27^8,31,37
48,44,35
47
45
33.32,31-8
307
29
28
27
26-
33,3130,25* 2
'^<3'26А22,17
'5о128
24
/6
/9
Рис. 127. Величины Rf алкалоидов № 1—54 (группы I и II) на слоях силикагеля Г с растворителями I—IV (см. стр. 285).
35
54
53
£2
5/
49,50
48
46,47
45
44
45
9,8
7
6
46
38,40,21
22,15.18
15,33,34,36
42,39,36,2920
10
0,0
Гл. 14. Органические основания
287
Примечание. Лишь немногие алкалоиды нестабильны в рекомендованных основных
растворителях. Четвертичные основания, например берберин, в таких средах обладают
несколькими стабильными формами с различной растворимостью, вследствие чего при
хроматографическом разделении возникают размытые пятна. Поэтому в случае четвер-
тичных оснований диэтиламин заменяют ледяной уксусной кислотой.
Рис. 128. Сравнение величин Rf некоторых алкалоидов (нумерация табл. 46) на
слоях окиси алюминия Г (VI и VII) и на щелочных слоях силикагеля Г (VIII).
Растворители: VI — хлороформ; VII — циклогексан — хлороформ (30 + 70) -|- 0,05% диэтиламина;
VIII — метанол.
Капсаицин (hRf 57) обладает еще одной фенольной группой ОН. С растворителем
циклогексан — хлороформ — ледяная уксусная кислота (70 + 20 + 10) на силика-
геле Г получают два пятна. Побочное пятно при hRf 22, так же как и основное пятно,
окрашивается реактивом иодоплатината (№ 76).
Эфедрин (hRf 49) тоже не может быть подвергнут хроматографическому анализу
с Основным растворителем (табл. 46). При использовании растворителя хлороформ — мета-
нол — ледяная уксусная кислота (25 + 65 + 10) пятно имеет круглую форму и окра-
шивается 2,7-дихлорфлуоресцеином (реактив № 42).
288
Специальная часть
Ниже рассмотрены полученные в настоящее время результаты по разде-
лению методом ХТС отдельных классов алкалоидов, причем результаты для
удобства сведены в таблицы.
3. КЛАССЫ АЛКАЛОИДОВ
а) Алкалоиды опия
Еще в 1953 г. Борке и Кирш [2] сообщили о разделении смеси алкалоидов
опия методом хроматографических полос [12]. Они использовали слои из
смеси кремневой кислоты, окиси магния, гипса и неорганического светяще-
Таблица 47
Величины hRf алкалоидов опия на различных слоях при применении
растворителей I — XI
(Сорбенты: С—-силикагель Г, ОА—-окись алюминия Г, Ц — целлюлозный порошок)
Слой с С с ОА С 0,1 н. NaOH С с С 0,5 н. КОН С ц форм- амид с
Растворитель а I II ш IV V VI VII VIII IX X XI
Нарцеин . . 3 0 0 0 0 23 — — — — —
Дигидромор- финон (дилау- дид) 24 23 8 8 16 28 5 13 27 6 14
Дигидроко- деинон (дико- дид) 51 65 21 43 18 29 10 28 34 63
Морфин . . 10 8 0 0 34 40 2 2 27 0 24
Морфинэти- ловый эфир (дионин) . . 37 14 37 44 57 —.
Дигидроко- деин (парако- дин) 38 54 18 30 25 6 22 34
Кодеин . . 38 53 16 27 35 43 12 33 41 37 26
Ацетилди- гидрокодеинон (ацедикон) . . — 24 59 90
Дигидроок- сикодеинон (эукодал) . . . 47 70 79 75
Тебаин . . 65 90 51 76 40 — — — — — —
Папаверин 67 90 42 84 70 82 74 78 86 89 74
Котариин 60 90 43 25 0 — — — — — —
Наркотин х 72 90 51 79 72 82 78 81 92 94 69
а Растворители: I — хлороформ — ацетон — диэтиламин (50 + 40 + 10) [46]; II — хлороформ — Ди-
этиламин (90 + 10) [46]; III — циклогексан — хлороформ — Диэтиламин (50+40 + 10) [46]; IV —цик-
логексан — хлороформ (30+70), с 0,05% диэтиламина [46]; V — метанол [46]; VI — метанол — аце-
тон— триэтаноламин (50+50+1,5) [1]; VII — хлороформ — этанол (90+10) [41]; VIII — хлоро-
форм—этанол (80+20) [41]; IX — диметилформамид — диэтиламин — Этанол — этилацетат (5+2+
+20+75) [41]; X — бензол — гептан — хлороформ — диэтиламин (60+50+10+0,2) [41]; XI — мета-
нол [19].
Гл. 14. Органические основания 289
гося вещества, на которых с помощью фосфатного буфера устанавливалась
величина pH 6,6. Растворителем служил диоксан. В 1956 г. Шталь обратил
внимание на возможность разделения смесей алкалоидов методом ХТС.
В 1960 г. Махата [19] разделил метанолом на силикагеле Г наряду с алка-
лоидами опия различные другие лекарственные вещества (см. стр. 330).
Он обнаружил этим методом настой опия в желудке самоубийцы. Затем Бойм-
лер и Рипштейн [1] подробно занимались анализом алкалоидов мака мето-
дом ХТС. Они работали со слоями силикагеля Г по стандартному методу
и использовали гидрофильный растворитель VI (см. табл. 47). Для обнаруже-
ния проводили опрыскивание реактивом Драгендорфа (№ 60 и 60а) или реак-
тивом иодоплатината (№ 76) и, кроме того, наблюдали частично возникаю-
щую флуоресценцию. Повторная проверка обнаружила очень хорошую вос-
производимость величин Rf. Тайхерт, Мучлер и Рохельмейер [40—42] реко-
мендуют для разделения морфина и сопутствующих ему алкалоидов щелоч-
ные слои силикагеля и смесь хлороформ — этанол (90 + 10). Они указывают
далее на применимость слоев из порошка целлюлозы. В случае слоев целлю-
лозы, пропитанных формамидом, они использовали растворитель X, а в слу-
чае непропитанных слоев — растворитель IX (табл. 47). Если разде-
ление должно завершаться количественным фотометрическим определе-
нием алкалоидов, то предварительно следует предпринять очистку сор-
бента.
Некоторые алкалоиды Papaver rhoeas, например роэадин, были разделены
Винклером и Аве [47] наряду с гидрастинином на слоях окиси алюминия Г
с растворителем хлороформ — метанол (90 +10) или бензол — тетрагидро-
фуран (95+5).
Нейбауэр и Мотес [21] разделили 10 важнейших алкалоидов мака на
слоях силикагеля Г (10 X 20 см), приготовленных «вручную», с растворите-
лем бензол — метанол (80 + 20). Они приводят следующие ориентировочные
величины hRf: морфин И, кодеин 21, лауданин 26, криптопин 34, прото-
пин 38, тебаин 40, лауданозин 42, наркотилин 58, папаверин 63, наркотин 68.
Эти авторы использовали количественную методику, разработанную для
отбора «химических пород» различных сортов Papaveraceen.
На слоях силикагеля Г, полученных стандартным методом, ван Пинксте-
рен и Ферлуп [25] провели хроматографическое разделение алкалоидов
настойки опия, используя смесь четыреххлористый углерод—бутанол —
метанол — 6н. раствор аммиака (40 + 30 + 30 + 2). Для разделения методом
ХТС псевдоморфина (hRf 4), морфина (35) и наркотилина (85) они исполь-
зовали упомянутый выше растворитель, повысив содержание раствора аммиа-
ка до 3,3.
Резюмируя, можно сказать, что разделение методом ХТС алкалоидов
опия лучше всего проводить на слоях силикагеля Г. В зависимости от постав-
ленной задачи разделения используют наиболее пригодный из упомянутых
растворителей.
б) Алкалоиды группы тропана
В первой работе Шталя [34] по ХТС указывалось на возможность разде-
ления алкалоидов группы тропана бутанолом, насыщенным ледяной уксус-
ной кислотой. Результаты последующих работ суммированы в табл. 48.
Примечание. Тропановую кислоту можно хроматографировать на пластинках с сили-
кагелем, используя растворитель циклогексан — хлороформ —ледяная уксусная кислота
(60 + 20 + 20) ‘(hRf 47). Обнаружение: цер-реактив № 25 (флуоресцирующее пятно
сине-фиолетового цвета).
19 заказ № 734
Таблица 48
J Величины hRf алкалоидов группы тропана
(Сорбенты: С — силикагель Г, ОА — окись алюминия Г, Ц — целлюлозный порошок)
Слой с С с ОА С 0,1 н. NaOH С с с 0,5 н. КОН ц форм- амид
Растворитель а I II ш IV V VI VII VIII IX
Тропин — —- — — — — 16 3 13
Атропин 38 40 16 10 17 17 37 36 15
Гоматропин 37 45 15 24 15 — — — —
Апоатропин 54 67 40 40 16 — 44 44 74
Белладоннин — — — — — — 26 17 69
Кокаин 73 90 65 77 62 61 — — —
Скополамин 56 60 19 0 52 — 73 83 53
Скополин 60 90 44 50 37 — — — —
Тропакокаин 65 90 56 78 35 — — — —
Псикайн Neu 66 90 60 82 59 — — — —
а Растворители: I — хлороформ — ацетон — диэтиламин (504-40+10) [46]; II — хлороформ — ди-
этиламин (90+10) [46]; III — циклогексан — хлороформ — диэтиламин (50+40+10) [46]; IV —цик-
логексан — хлороформ (30+70) с 0,05% диэтиламина [46]; V — метанол [46]; VI — метанол — аце-
тон — триэтаноламин (50+50+1,5) [1]; VII — диметилформамид — диэтиламин — этанол — этилаце-
тат (5+5+30+60) [41], VIII —70%-ный этанол — 25%-ный аммиак (99 + 1) [41]; IX —1. Длина пу-
ти 15 см гептан — диэтиламин (100+0,2), 2. длина пути 10 см бензол — гептан — хлороформ — ди-
этиламин (60+50+10+0,2) [41].
Таблица 49
Величины hRf алкалоидов раувольфии
(Сорбенты: С — силикагель Г, ОА — окись алюминии Г,
Ц — целлюлозный порошок)
Слой с с с ОА с 0,1 н. NaOH н форм- амид
Растворитель а I II III IV V VI
Сарпагин 12 4 0 0 0 3
Серпентин 24 15 0 0 0 6
Аймалин 47 42 12 13 56 28
Серпентинин 53 56 8 3 12 —
Йохимбин 63 62 18 15 60 33
Раувольцин 55 63 18 15 68 —
Ресциннамин — — — — — 51
Резерпин 72 80 25 35 69 59
Резерпинин — — — —* 89
а Растворители; I — хлороформ — ацетон — диэтиламин (50+40+10)
[46 ]; II — хлороформ — диэтиламин (90+10) [46]; III — циклогексан—
хлороформ — диэтиламин (50+40+10) [46]; IV — циклогексан — хлоро-
форм (304-70)4-0,05% диэтиламина [46]; V — метанол [46]; VI — геп-
тан— метилэтилкетон (50+50) в атмосфере аммиака [41].
Гл. 14. Органические основания
291
в) Алкалоиды группы индола
При разделении смесей алкалоидов группы индола методом ХТС целесо-
образно наносить пробу в защитной атмосфере, не содержащей кислорода,
и, кроме того, исключить воздействие УФ-лучей при разделении. Соответ-
ствующее устройство описано и изображено на стр. 21. В течение короткого
времени разделения не возникает опасности изомеризации. Проверенные
к настоящему времени слои и растворители для алкалоидов раувольфии све-
дены в табл. 49 и аналогичные данные для алкалоидов спорыньи —
в табл. 50. Другие алкалоиды группы индола приведены в табл. 52.
Таблица 50
Величины НН? алкалоидов спорыньи
(Сорбенты: С — силикагель Г, Ц — целлюлозный порошок)
Слой С С Ц форм- амид Обнаружение
Растворитель а I II IV окраска флуо- ресценции в I УФ-свете окраска реакти- вом ван Урка (№ 50)
Дигидроэрготамин . . Дигидроэргокристин . . Эргометрин Эргометринин .... Эрготамин Эргозин Эргокристин Эргокорнин Эргокриптин Эрготаминин Эргозинин Эргокристинин .... Эргокорнинин .... Эргокриптинин .... 0 0 3 8 13 13 28 28 28 34 34 45 45 45 11 14 17 30 51 51 69 69 69 75 75 81 81 81 6 11 67 73 83 50 65 90 93 97 _ б _ б Светло-синяя Синяя
Слой С с С
Растворитель а I и III
Ханоклавия Элимоклавин Пениклавин Изопениклавин .... Агроклавйн Сетоклавин Изосетоклавин .... 0 2 4 8 15 18 20 2 13 17 30 38 42 46 4 15 20 35 45 50 60 -1 1 ++1++ Зеленая » Синяя Зеленая »
а Растворители: I — хлороформ — этанол (954-5) [11]; II — хлороформ — этанол.
(904-10)|Ч1]; III — хлороформ — этанол (804-20) [И]; IV —двукратное проявление;
1. гептан—бензол — хлороформ (254-304-15); 2. гептан — бензол (254-30) [40].
б После интенсивного ультрафиолетового облучения желтая флуоресценция.
19*
292
Специальная часть
А. Гофман [7] разделял алкалоиды группы индола из мексиканского
«волшебного лекарства» Ololiuqui на слоях окиси алюминия, полученных
стандартным методом, растворителем хлороформ — метанол (95 + 5) или на
слоях силикагеля Г растворителем хлороформ — метанол (70 + 30). После-
довательность, составленная в порядке возрастания величины Rf, образует
следующий ряд: ханоклавин — вещество Е — амид d-лизергиновой кисло-
ты — элимоклавин, лизергол — амид d-изолизергиновой кислоты — веще-
ство F. На слоях окиси алюминия Винклеру [48] удалось также разделить
основные алкалоиды Voacanga africana Stapf. и продукты их распада. Алка-
лоиды Pleiocarpa были разделены Кумпом и Шмидтом [13] на слоях сили-
кагеля Г при использовании смеси хлороформ — метанол (96+4). Для
обнаружения применяли насыщенный раствор сульфата церия (IV) в 60 %-ной
серной кислоте. Анализом алкалоидов спорыньи подробно занимались в ла-
боратории Рохельмейера [11, 11а, 40].
Так называемые простые производные индола рассмотрены в заключи-
тельном разделе (стр. 295).
Многие алкалоиды группы индола проще всего обнаружить в УФ-свете,
часть алкалоидов уже сама по себе флуоресцирует, другие превращаются
в флуоресцирующие продукты при УФ-облучении. Для обнаружения алка-
лоидов раувольфии часто применяют реактив хлорная кислота — хлорид
железа (III). Сарпагин можно обнаружить при опрыскивании концентриро-
ванной азотной кислотой. Для алкалоидов спорыньи рекомендуют усовер-
шенствованный реактив ван Урка (№48). В этом реактиве вместо п-диметил-
аминобензальдегида можно использовать n-диметиламинокоричный альде-
гид или ванилин. Очень удобно описанное на стр. 300 дополнительное окис-
ление парами царской водки. Минимально обнаруживаемое количество со-
ставляет величину порядка 0,05 цг. Для обнаружения алкалоидов на слоях
целлюлозного порошка, пропитанных формамидом, следует предварительно
удалить формамид при нагревании в вакуумном сушильном шкафу.
О количественном спектрофотометрическом определении (см. стр. 54)
алкалоидов раувольфии, разделенных методом ХТС, сообщили Шлеммер
и Линк [31], а также Ульман и Касалицкий [43]. Последние показали, что
разделение методом ХТС и количественное определение резерпина и ресцин-
намина возможно также при наличии увеличивающих растворимость
веществ типа продуктов присоединения полиэтиленоксида.
Количественное определение алкалоидов спорыньи после разделения методом ХТС
а. Визуальный метод примерной оценки площади пятна (полуколичественный). Для
этого необходимы очень небольшие количества (—0,1—30 цг); метод описан на стр. 52.
б. Фотометрический метод после элюирования зоны алкалоида [11а]. Смесь алкалои-
дов (0,1—3 мг алкалоидов) наносят в виде полосы (см. стр. 22) и после разделения зоны
быстро маркируют при УФ-освещении. Затем соскабливают зоны шпателем, боковые
стороны которого загнуты как у лопаты для угля, а передняя сторона заточена (не менее
100 |хг алкалоида), и помещают их в центрифужные пробирки. Для экстракции добав-
ляют в каждую пробирку 2,00 мл смеси метанол — вода — ледяная уксусная кислота
(45 + 45 + 10) и дают постоять 8—10 мин при частом помешивании стеклянной палоч-
кой. Затем добавляют 4,00 мл модифицированного реактива ван Урка (125 мг — п-ди-
метиламинобензальдегида растворяют в охлажденной смеси 65 мл концентрированной
серной кислоты + 35 мл дистиллированной воды и добавляют 0,05 мл 10%-ного рас-
твора хлорида железа (III), можно хранить в течение недели). После тщательного пере-
мешивания центрифугируют в течение 7 мин при 3500—4000 об/мин. Можно измерить
поглощение прозрачного голубого реакционного раствора при 550 сравнивая с холо-
стым опытом. Если полученные величины слишком велики, то проводят разбавление
смесью, состоящей из 2 об. ч. реактива и 1 об. ч. и экстракционной смеси.
г) Алкалоиды ипекакуаны [37]
Алкалоиды ипекакуаны можно разделять на слоях силикагеля Г (стан-
дартный метод), используя растворитель хлороформ — метанол (85+15)
Гл. 14. Органические основания
293
. • ♦
• • • • ' » ' •
. . шнц
* • 11н • • <
ЛЛдаггл-
гкимтрин
.W®
Рис. 129. Тонкослойная хроматограмма алкалоидов ипекакуаны (—0,1 иг) в УФ-свете
(365 л«|х) [37].
Сфотографировано после реакции с иодом; другие подробности см. в тексте. 1 — цефаэлин;
2 — психотрин; 3 — эметин; 4 — О-метилпсихотрин; 5 — протоэметин; 6 — эметамин; 1—10 — вы-
тяжки из корня Uragoga acuminata Karsten; и—13 — вытяжки из корня Uragoga ipecacuanha Ball.
(рис. 129). Работают в условиях насыщения камеры. При длине пути 10 см
время разделения составляет около 30 мин. В качестве наиболее чувстви-
тельной реакции обнаружения рекомендуется опрыскивание примерно 10 мл
0,5%-ного раствора иода в хлороформе с последующим нагреванием в течение
сСРосо о
Фронт
15
/4
13 О
12 О
6 1
18*1
п о |
2 Q I
1+3+ЭНО о I
С 2
100
7<аР5
с ^04
2
ю® ^9 .
С.1
20 мм
Рис. 130. Двумерная тонкослойная хроматограмма 14 «простых» производных индола
и антраниловой кислоты [36].
Нанесенная на точки старта (С I, 1, 2) смесь содержала по 0,5 цг каждого из веществ. Из срав-
нительной хроматограммы с С 1 виден результат разделения основным растворителем, а из
хроматограммы с С 2 — разделения кислым растворителем. 1 — 5-окситриптофан; 2 — [5-оксиндолил
(3)1-уксусная кислота; з — триптофан; 4 — индолил-(3)-уксусная кислота; 5 — 0-индолил-(3[-ак-
риловая кислота; 6 — р-индолил-(3)-пропионовая кислота; 7 — ^-[индолил (3)]-масляная кислота;
8 — антраниловая кислота; 9 — серотонин; ю — триптамин; н — индолил-(3)-ацетамид; 12 — 3-ок-
симетириндол; 13 — индолил-(3)-ацетонитрил; 14 — индол; is — скатол.
15 мин при 60°. В УФ-свете (365 ми) эти алкалоиды можно обнаружить по
их интенсивной флуоресценции (табл. 51).
Чтобы отличить ипекакуану из Рио-де-Жанейро от ипекакуаны из Карфа-
гена, Шталь предлагает следующую методику.
Таблица 61
Тонкослойная хроматография алкалоидов'ипекакуаны на силикагеле Г
Алкалоид hRf Окраска с иод-реактивом Граница обнару- жения, J10
дневной свет УФ-свет
Цефаэлин . . . 13 Светло-коричневая Светло-синяя 0,006
Психотрин . . . 16 » » Желтая (синяя кайма) 0,001
2-Дегидроизо- эметин .... 18 (Светло-бежевая) Бирюзовая 0,002
2-Дегидроэметин 21 » » » 0,002
Эметин .... 28 Желтая Желто-синеватан 0,002
О-Метилпсихо- трин ..... 47 » Желтая 0,0008
Протоэметин . . 63 Слабая бежевая Синяя 0,01
Эметамин . . . 67 Светло-бежевая Желтая 0,003
Таблица 52
Различные классы алкалоидов
Слой С с с ОА с 0,1 н- NaOH с 0,5 н КОН ц форм амид- с с
Растворитель3 I II III IV V VI VII VIII IX
Бруцин 42 63 18 54 12 — — 17 —
Стрихнин 53 76 28 60 22 — — 19 —
Физостигмин ...... 65 90 32 50 46 — — — —
Аспидоспермин б .... 65 90 54 60 65 — — — —
Лобеланидин — — — — — — 24 — —
Лобелии ........ 68 90 48 60 55 — 69 — —
Лобеланин — — — — — — 92 — —
Спартеин 70 90 68 55 5 1 — — —
Кониин — — — — — 9 — — —
Анабазин — — — — — 16 — — —
Никотин — — — — — 44 — 57 —
Ареколин — — — — — 50 — — —
Хинин 19 26 7 18 43 — — 56 36
Хинидин 33 40 15 18 50 — — — 42
Цинхонин ....... 38 44 17 22 40 — — — 31
Цинхонидин . . . . . . — — — — — — — —• 23
а Растворители: I — хлороформ — ацетон — диэтиламин (50+404-10) [46]; II — хлороформ —
диэтиламин (90+10) [46]; III — циклогексан — хлороформ — диэтиламин (50+40+10) [46]; IV —
циклогексан — хлороформ (30+70) +0,05% диэтиламина [46]; V — метано л [46]; VI—хлоро-
форм—этанол (90+10) [41]; VII — бензол — гептан — диэтиламин (10+60+0,2) [41]; VIII —мета-
нол — ацетон — триэтаноламин (50+50+1,5) [1]; IX — хлороформ—этанол (90+10).
6 Об успешном разделении методом ХТС других алкалоидов аспидоспермы на слоях силика-
геля Г с метилцеллозольвом в качестве растворителя сообщили Ленер и Шмутц [16].
Гл. 14. Органические основания
295
Обрабатывают 100 мг тщательно измельченного растительного вещества в маленьком
Химическом стаканчике одной каплей концентрированного раствора аммиака, затем
добавляют 5,0 мл хлороформа и тщательно перемешивают стеклянной палочкой. Через
3—4 часа фильтруют и для анализа методом ХТС из фильтрата отбирают пробы по 5мм3.
Для сравнения наносят 5 мм3 0,01%-ного раствора смеси эметин — цефаэлин (1 + 1).
В случае лекарственного сырья из Карфагена размеры зон соответствуют сравнитель-
ному раствору, в случае сырья из Рио-де-Жанейро цефаэлиновая зона значительно меньше
(рис. 130).
д) Алкалоиды различных классов
В табл. 52 приведены условия разделения некоторых алкалоидов группы
индола, алкалоидов лобелии, алкалоидов, отгоняющихся с водяным паром,
а также важнейших веществ, содержащихся в хинной коре.
Флуорометрическое определение смесей хинина и хинидина, разделенных
методом ХТС, описано Мюллером и Хонерлагеном [20]. Рекомендованная
в этой работе методика получения массы для слоя с использованием ацетона
вместо воды в других случаях себя не оправдала.
Кроме того, метод ХТС был с успехом использован для очистки, иденти-
фикации и проверки чистоты алкалоидов [3, 10, 16, 22, 22а, 28—30] [см. так-
же Arch. Pharm., 295, 524, 605 (1962)].
II. «ПРОСТЫЕ» ПРОИЗВОДНЫЕ ИНДОЛА
Э. Шталь
1. ВВЕДЕНИЕ
Для удобства соединения группы индола разделяют на так называемые
простые производные индола (без дополнительных колец, см. табл. 53)
и на часто довольно сложно построенные алкалоиды (стр. 291) и красители.
Переход от одной подгруппы к другой, естественно, не является резким.
В биологических средах некоторые простые производные индола выпол-
няют важные физиологические функции [39].
Серотонин, например, рассматривается как третье физиологическое
вещество, которое наряду с ацетилхолином и адреналином является актив-
ным при передаче нервного раздражения по нервной системе человека. Основ-
ное количество серотонина, вероятно образованного из триптофана через
5-окситриптофан, находится в организме в виде физиологически неактивного
соединения с белком. При действии ряда соединений, например индоло-
вого алкалоида резерпина и прежде всего диэтиламида лизергиновой кисло-
ты, это белковое соединение может разрушаться. Свободный серотонин под-
вергается действию аминооксидазы и превращается в моче в [5-оксиндолил-
(3)]-уксусную кислоту [15].
Кёгль с сотрудниками [14] при поисках растительного ауксина выделили
из мочи очень активный стимулятор роста, который они назвали гетероаук-
син. После обнаружения этой индолил-(3)-уксусной кислоты возник вопрос,
не является ли это или другие «простые» производные индола важными регу-
ляторами роста [9, 17, 33, 39].
Далее, весьма важным является обнаружение простых производных индола
при опытах для выяснения биогенеза алкалоидов группы индола.
Если, несмотря на большие усилия в только что описанной области работ,
остается еще много открытых вопросов, это прежде всего следует объяснить
весьма малыми концентрациями данных веществ в организмах животных
и растений. При выделении этих соединений весьма затрудняющим обстоя-
тельством является малая стабильность производных индола.
Для идентификации производных индола в экстрактах органов животных
и в экстрактах растений хроматография на бумаге [18] и электрофорез на
296
Специальная часть
Величины hRf, цветные реакции (1цг
(длина пути 10 см) прос
№ п/п й I /=\ // 1 й R R' R/X 100 в растворителе
дб ss
1 Индол —н —H 84 73
2 Скатол -СН3 —H 87 78
3 З-Оксиметилиндол —СН2ОН —H 84 45
4 Индолальдегид-(З) —СНО —H 81 20
5 Индолил-(3)-ацетальдегпд —СН2СНО —H 86 46
6 Индолил-(3)-уксусная кислота . . . —СН2СО2Н —H 31 28
7 Р-[Индолил-(3)]-пропионовая кислота -(СН2)2СО2Н —H 38 34
8 у-[Индолил-(3)]-масляная кислота - (СН2)3СО2Н —H 40 38
9 |3-[Индолил-(3)]-акриловая кислота —СН=СНСО2Н —H 33 29
10 [5-Оксиндолил-(3)]-уксусная кис-
лота —СН2СО2Н —OH 19 4
И Индолил-(3)-ацетонитрил -ch2cn —H 85 46
12 Триптамин ~(CH2)2NH2 —H 77 0
4
13 Серотонин -(CH2)2NH2 —OH 65 0
14 Грамин -CH2N(CH3)2 —H 77 0
15 «ZZ-Триптофан —CH2CH(NH2)CO2H —H 23 0
16 «ZZ-5-Метилтриптофан —CH2CH(NH2)CH2O -CH3 28 0
17 cZZ-5-Окситриптофан —CH2CH(NH2)CO2H —OH 14 0
18 Индолил-(3)-ацетамид —ch2conh2 —H 83 12
19 Изатин 75 27
20 Антраниловая кислота а 33 40
21 Смесь алкалоидов спорыньи (эрго- тамин, эргокристин, эргометрин)а 83 4
а В УФ-свете (365 мц) интенсивно синяя флуоресценция.
6 На силикагеле Г (толщина слоя 250 ц), камера насыщена.
бумаге [4] являются весьма важным методическим подспорьем. Дальнейшим
важным шагом вперед в этой области было осуществление хроматографии
на тонких стандартизованных слоях силикагеля. При небольших временах
анализа (15—35 мин) разложение стабильных соединений значительно умень-
шается. Кроме того, разделение существенно лучше по сравнению с преж-
ними методами, причем сопутствующие вещества оказывают меньшее влия-
ние, чем при проведении анализа на бумаге. Наиболее существенным, одна-
ко, является то, что, используя метод ХТС, можно значительно сместить
Гл. 14. Органические основания
297
вещества) и нижняя граница обнаружения
тых производных индола [36]
Таблица 53
Окраска с п-диметил- аминобензальдегидом (реактив № 48) Нижняя граница обнару- жения, рг Окраска с формаль- дегидом (реактив •N-j 64) Окраска флуоресцен- ции в УФ-свете (с формальдегидом) Нижняя граница об- наружения, цг
От темно-красной до фиолетовой о,1 Светло-зеленая Зеленая 0,01
Синяя 0,1 Желтая Желтая 0,01
Розовая 0,1 Желто-розовая » 0,1
» 1 Оранжевая с 2,4-динитрофенилгидразином
Красновато-корич- 1 Желтая с 2,4-динитрофенилгидразином
невая
Фиолетово-синяя 0,05 Желтая Желтая (зеленая кайма) 0,005
Синяя 0,1 » Желтая 0,01
» 0,1 » » 0,01
Розовая 0,5 Светло-бежевая Зеленая 0,1
От синей до фио- 0,05 От светло-желтой Т емно-фиолетовая 0,05
лотовой до бежевой
Серая 0,1 Светло-бежевая Желтая 0,1
Сине-зеленая 0,1 Желтая Желтая (синяя кайма) 0,01
Серая 0,1 » Коричневая 0,01
(От желтой до бе- жевой) (1) Серо-синяя Зеленая 0,5
Сине-зеленая 0,05 Желтая Желтая (синяя кайма) 0,005
Синяя 0,05 Бирюзовая Желто-зеленая 0,005
Сине-серая 0,05 От светло-желтой до бежевой Желтая 0,005
Синяя 0,1 То же » 0,01
Остается оранжевая 1 — — —
Становится интен- 0,1 Светло-бежевая Синяя (затем ко- 0,01
сивно желтой ричневан)
Сине-фиолетовая — Синяя Зеленая
границу минимально определяемого количества вещества (непосредствен-
ное обнаружение) в область миллиардных долей грамма (1-Ю-3 рг).
2. ПОДГОТОВКА АНАЛИЗИРУЕМОГО МАТЕРИАЛА
В предварительном опыте проводят хроматографическое разделение анали-
зируемого раствора, наносят постепенно увеличивающиеся пробы (например,
1, 10, 50 лл3). Если концентрация производных индола слишком мала, мож-
298
Специальная часть
но провести концентрирование раствора при комнатной температуре во вра-
щающемся испарителе в атмосфере азота. Во всех случаях целесообразно
вначале провести предварительное разделение анализируемого материала
на гидрофильные и липофильные соединения, а также соединения кислого,
основного и нейтрального характера. Большинство простых производных
индола в недиссоциирующей форме можно ступенчато экстрагировать из
соответствующим образом забуференной водной среды, используя этилаце-
тат (а также эфир или хлороформ). В водной фазе остается триптофан, окси-
триптофан, некоторые меланогены мочевины и продукты разложения аскор-
бигена.
Здесь мы не приводим общей методики работы, поскольку процесс должен
быть приспособлен для решения специальной задачи в соответствии с иссле-
дуемым материалом. При этом результат каждого отдельного этапа работы
контролируют методом ХТС.
3. РАЗДЕЛИТЕЛЬНЫЙ СЛОЙ И РАСТВОРИТЕЛЬ
Наилучшие результаты разделения получены в случае слоев силикагеля
Г, приготовленных стандартным методом (стр. 35). Только для смеси ней-
тральных или основных веществ можно успешно использовать также слои
окиси алюминия Г. При выборе растворителя в первую очередь следует попы-
таться использовать часто применяемую в хроматографии на бумаге смесь
изопропанола, аммиака (25%-ный раствор) и воды (85+5+15). Время ана-
лиза при этом растворителе составляет около 2 час. Из многочисленных дру-
гих смесей наилучшими оказались следующие три для соединений, приведен-
ных в табл. 53.
А (щелочная смесь): метилацетат — изопропанол — 25%-ный аммиак
(45+35+20) [36].
S (кислая смесь): хлороформ — 96%-ная уксусная кислота (95+5) [36].
Для более полярных продуктов обмена триптофана в смеси уменьшают
долю хлороформа и заменяют ее метанолом [5].
Sp (кислая, полярная смесь): хлороформ — метанол — ледяная уксус-
ная кислота (75+20+5).
Таблица 54
Величины hRf и обнаружение 10 триптофановых продуктов обмена веществ [5]
Вещество hRf с растворителем Обнаружение
А Sp окраска флуоресцен- ции окраска с п-диметил- аминобензальдегидом
Триптофан 25 7 — Фиолетовая
Индол 90 98 Синяя »
Индикан мочи .... 61 14 Коричневая Коричневая
dZ-Кинуренин .... 32 И Зелено-синяя Желто-коричневая
З-Оксикинуренин . . 16 6 Желто-зеленая Оранжевая
Кинуреновая кислота Ксантуреновая кисло- 45 18 Зеленая через 12 час —
та 45 26 Серая —
Антраниловая кислота З-Оксиантраниловая 45 91 Светло-синяя Желтая
кислота З-Амино-З-оксиацето- 31 75 » »
фенон 88 93 Синяя Желто-коричневая
Гл. 14. Органические основания
299
Ежедневно готовят свежие смеси из чистых растворителей и применяют
наполнение Камеры максимум для 10 хроматограмм (20 X 20 см). Работают
в несколько затемненном помещении по методу восходящего проявления
в лотковой камере с насыщением. Обычная длина разделительного слоя
в 10 см в случае специальных задач может быть уменьшена вдвое. Благодаря
этому уменьшается минимально определяемое количество вещества и сокра-
щается время анализа. В табл. 53 приведены результаты, полученные при
данных условиях. Значения Rt следует рассматривать как ориентировочные.
Они увеличиваются при более высокой влажности воздуха и при наличии
в рассматриваемой области других веществ (вытеснение).
Диамантштейн и Эрхарт [5], используя смеси А и Sp, разделяли ряд
триптофановых метаболитов на слоях силикагеля Г толщиной 300 ц. Они
работали с насыщением камеры и наносили вещества на расстоянии 2 см
от края пластинки; длина пути составляла 12—15 см. В табл. 54 приведены
величины Rf, окраски флуоресценции и цветные реакции с реактивом Эрлиха
(цветная реакция ван Урка).
Поскольку при этом одновременно проводили хроматографическое разде-
ление триптофана, индола и антраниловой кислоты, можно провести сравне-
ние с данными, полученными Шталем и Кальдевеем [36] (табл. 53).
4. ДВУМЕРНОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ
Каждый раз в случае неизвестной смеси природных веществ после одно-
мерной хроматографии следует осуществить двумерное разделение, исполь-
зуя растворители А иЭ . В табл. 53 и на рис. 131 показано, что как основным
Р и с. 131. Тонкослойная хроматограмма производных индола после перевода их
в видимое состояние по реакции Прохазки [36].
Сфотографировано в УФ-свете; силикагель Г, растворитель S. 1 — скатол; г — индолил-(3)-ацето-
нитрил; 3,— индолил-(3)-масляная кислота; 4 — индолил-3-пропионовая кислота; 5 — индолил-
(З)-уксусная кислота; в — индолил-(3)-ацетамид; 7 — триптофан (старт).
растворителем (рис. 130, старт!), так и кислым (рис. 130, старт 2) можно раз-
делить лишь часть веществ. Поэтому сочетают эффекты разделения обоих
растворителей; таким образом можно выявить свыше 15 простых производ-
ных индола.
В точку старта I наносят исследуемую смесь, а в точки 1 и 2 — смесь про-
изводных индола известного состава. При исследовании «индол-ауксинов»
300
Специальная часть
целесообразно вначале в направлении 1 осуществить разделение основным
растворителем. Затем со слоя следует удалить аммиак. Для этого пластинку
помещают в эксикатор с концентрированной серной кислотой, откачивают
до 10—15 мм рт. ст. и заполняют азотом, причем повторяют эту операцию
многократно. Затем оставляют пластинку на 60 мин в вакууме. Наконец,
хроматографируют в направлении 2, используя кислую смесь.
Из рис. 131 видно, что при указанных условиях вещества разделяются
в соответствии со своей полярностью. Кислоты (4—8) лежат, например,
в определенной области. Слабо полярные соединения (14, 15) перемещаются
в обеих системах на наибольшее расстояние. Более основные амины (9, 10)
и исследуемый амид расположены в одной группе рядом друг с другом. Силь-
нее всего удерживаются кислоты, содержащие дополнительно в молекуле
одну амино- или гидроксильную группу (1—3).
Диамантштейн и Эрхарт [5] разделяли приведенные в табл. 54 10 трипто-
фановых продуктов обмена веществ, также проводя двумерное разделение'.
В направлении 1 (15 см) они применяли смесь хлороформ — метанол — ледя-
ная уксусная кислота (Sp), затем сушили 60 мин при комнатной температуре
и в заключение хроматографировали в направлении 2 (12 см), используя
основной растворитель А. Примерное расположение веществ можно видеть
из приведенных в таблице величин.
5, ОБНАРУЖЕНИЕ
Простые производные индола дают цветные реакции с многочисленными
реактивами. Нередко уже при экспозиции пластинки на воздухе после хро-
матографического разделения кислым растворителем образуются окрашенные
или флуоресцирующие зоны.
а) Химические методы обнаружения
Из описанных в литературе многочисленных реакций обнаружения цвет-
ная реакция ван Урка (реактив № 48) является наиболее специфичной, а флуо-
ресцентная реакция Прохазки (реактив № 64) — наиболее чувствительной.
Для получения оптимальной окраски в случае реакции ван Урка следует
точно соблюдать приведенные условия (см. № 48). Окончательную обработку
парами царской водки следует осуществлять осторожно: уже следов царской
водки достаточно для усиления окраски, при избытке слой желтеет.
Согласно Пому [26], здесь мы имеем дело с реакцией конденсации произ-
водного индола (положение 2) с диметиламинобензальдегидом, которая при-
водит к образованию голубых или красных розиндоловых красителей. В слу-
чае реакции Прохазки [27] с реактивом формальдегид — соляная кислота
(№ 64) получают лишь желтоватые продукты реакции, которые, однако,
в УФ-свете обнаруживают очень сильную флуоресценцию (рис. 131).
Минимально определяемое количество (длина пути 10 см) в случае произ-
водных индола, замещенных в положении 3 группой — СН2— R, составляет
0,005—0,01 рг. Значительно более слабая флуоресценция наблюдается при
этой реакции для производных индола с диметиламино-, альдегидной или
спиртовой группой.
Согласно Джепсону и Стивенсу [8], для серотонина и триптамина весьма
чувствительным реактивом является 0,25%-ный раствор нингидрина в аце-
тоне с добавкой 10% уксусной кислоты. При нагревании (2—3 мин при 90—
100°) возникает сине-зеленая флуоресценция. На бумаге, таким образом,
можно еще обнаружить 0,02 рг серотонина.
При исследовании растительных и животных экстрактов не следует мед-
лить с исследованием хроматограммы перед опрыскиванием в коротко- и
длинноволновом УФ-свете и маркировкой флуоресцирующих зон (рис. 132).
ХЛОРОФОРМНАЯ ФАЗА
УФ флуоресценция Окраска после
после до
опрыскивания реактивом НгОв
С-. красная -|- красная + желто- зеленая
Р: светлая светлая —
зеле нова
тая
о: синяя + синяя —
н: слабая светлая или синяя
б-. светлая —
а' — — фиолетовая
в' светлая или зеленоватая светлая или зеленоватая оранжевая
е; желтая + желтая желтая *
Ж: — —- розовая
и: — — синяя
л: светлая светлая желтоватая
At: светлая светлая
Тест на
изгиб
СЫРОЙ ЭКСТРАКТ
Окраска после УФ -флуоресценция
до | после
опрыскивания реактивом
желтовато- зеленоватая красная красная +
— синяя синяя
— синяя или светлая слабая
— — светлая или желтая
М1№- Фиолетовая — —
— темная темная
розовая* синяя или светлая желтая
красная синяя | светлая от светлой ► до зеленоватой
желтоватая зеленоватая
синяя синяя *
коричневая желтая + желтая
Эталонная
смесь
Окраска
с реактвом
№8
(ид/Л С6Р°‘
фиолетовая
@ красно-
фиолетовая
синяя
синяя
синяя
сине-
фиолетовая
зеленовато-
синяя
Зоны, см
Рис. 132. Визуальная и биологическая оценка тонкослойной хроматограммы экстракта молодых плодоножек Frilillaria meleagris
(по Калдевею [9]).
Слой силикагеля Г, растворитель изопропанол — 25%-ный аммиак — вода (85 + 5 Д- 15); эталонная смесь: ИУК —индолил-(3)-уксуспая кислота,
ИПК — р-индолил-(3)-пропионовая кислота, ИМК — индолил-(3)-масляная кислота, ИАН — индолил-(3)-ацетонитрил, Т — триптофан, И —индол,
С — скатол. * слабая, Д- интенсивная.
302
Специальная часть
б) Биологический метод обнаружения действия
стимуляторов роста растений
Для обнаружения биологического действия стимуляторов роста в боль-
шинстве случаев используют колеоптили овса. Показателем интенсивности
биологического действия служит изгиб обезглавленного колеоптиля, на кото-
рый с одной стороны помещают кубик агара, содержащий стимулятор роста
(тест на изгиб).
Можно также измерить удлинение цилиндра колеоптиля, помещенного
в исследуемую жидкость (тест на прирост). Подробности можно найти у Зо-
динга [33] и Линзера и Кирмайера [17]. Калдевей [9] показал, что обоими
этими методами можно проверить биологическое действие, соскобленных
с тонкослойной хроматограммы зон силикагеля, содержащих стимуляторы
роста.
После проведения хроматографического разделения определяют границы слоя, на
котором проводилось разделение. Для этого металлическим шпателем шириной 3—4 мм
с помощью шаблона для маркировки проводят толстые разделительные линии справа
и слева от разделительного слоя. Осыпавшийся силикагель сдувают. Затем хроматогра-
фическую дорожку шириной примерно 10 мм размечают тонкими поперечными линиями
(игла) на 10 отрезков (Rf 0—0,1; 0,1—0,2 и т. д.). Соскабливают один участок за дру-
гим, начиная от старта. Отделив определенный участок слоя в виде небольшой кучки,
пластинку ставят в вертикальное положение и легким постукиванием переносят сили-
кагель на лист целлулоида. При тесте на изгиб порошкообразный силикагель с каждого
участка хроматограммы равномерно насыпают на блок из 6—19 кубиков агара. После
добавления 1 капли воды оставляют эти кубики агара на 30 мин во влажной камере
в темноте. После этого кубик укрепляют сбоку на колеоптиле. В холостых опытах с сили-
кагелем не наблюдается искривления; в контрольных опытах с зонами индолил-(3)-уксус-
ной кислоты определенной концентрации наблюдается ожидаемый угол искривления.
Для испытания на прирост силикагель с листа целлулоида можно пере-
нести непосредственно в буферный раствор испытательного лотка, в который
помещены в перевернутом положении колеоптили. На каждую хромато-
грамму наряду с известным эталонным раствором следует одновременно на-
нести лишнюю пробу исследуемой смеси, чтобы использовать ее для пере-
вода веществ в видимое состояние обычным способом. На рис. 132 Наглядно
представлены результаты этого метода, разработанного Калдевеем. Этим мето-
дом были исследованы как сырой экстракт, так и растворимая в хлороформе
часть экстракта молодых плодоножек Fritillaria meleagris. Из обеих хрома-
тограмм видно, что экстракты содержат большое число веществ *. На рисун-
ке приведена окраска до и после опрыскивания для обеих хроматограмм; при-
ведены также результаты испытаний на изгиб. В обоих случаях наиболее силь-
ное биологическое действие как стимулятор роста оказывает отрезок 4.
Справа приведена хроматограмма эталонной смеси. Приведенные здесь лишь
кратко результаты указывают на необходимость большой осторожности при
оценке биологического действия сырых растительных экстрактов [9].
6. ДРУГИЕ ПРИМЕРЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ
Гмелин и Виртанен [6] использовали метод ХТС для разделения про-
дуктов расщепления глюкобрасицина (первый «связанный стимулятор рос-
та»). На слоях силикагеля Г, полученных стандартным методом, с растворите-
лем хлороформ +1% этанола получены следующие величины 7?уХ 100:
индол 66, скатол 70, 3,3'-дииндолилметан 55, индолил-(3)-ацетонитрил 42,
индолальдегид-(З) 14,5,3-оксиметилиндол 9,5. Являющаяся также продук-
том расщепления сера (RfX 100 = 75) была обнаружена аммиачным раство-
* В полученных точно таким же образом хроматограммах на бумаге можно пере-
вести в видимое состояние лишь некоторые зоны веществ.
Гл. 14. Органические основания
303
ром нитрата серебра с последующим кратковременным нагреванием (черно-
коричневое пятно).
Диамантштейн и Эрхарт [5] использовали этот метод для обнаружения
в моче продуктов обмена триптофана, например у больных хронической
миелозой, которым давали триптофан. Они наносили 50—80 ж3 пробы
мочи и проводили хроматографический анализ, используя в большинстве
случаев восходящий метод и кислый растворитель (Sp, см. стр. 298). Предва-
рительное концентрирование мочи не требуется. Природные неорганические
и органические компоненты мочи не оказывают влияния на величины Rf.
Ш.АМИНЫ
По разделению аминов методом хроматографии на бумаге существует
богатый опытный материал, рассмотренный Стейном и Каминским [38].
В их обзоре рассмотрено также выделение аминов из анализируемого расти-
тельного материала, и в качестве дополнительной возможности идентифика-
ции указано получение характерно кристаллизующихся и частично сублими-
рующихся соединений 2,4-динитро-а-нафтола и пикролонатов (см. также
рис. 82).
1. АНАЛИЗ АМИНОВ МЕТОДОМ ХТС
Разделение аминов на слоях силикагеля Г и целлюлозного порошка описа-
но Тейхертом, Мучлером и Рохельмайером [40]: растворенные в 70%-ном
спирте гидрохлориды аминов можно наносить непосредственно (1—10 р,г).
Величины hRf и другие подробности можно найти в табл. 55 (см. также
рис. 82).
Таблица 55
Величины hRf аминов на различных слоях и с различными
растворителями а [40]
Амин Слой силикагеля Г Забуференный слой силикагеля Г Слой цел*- люлоз- ного порошка VI
I II ш IV V
Метиламин . . . — И 10 10 7 12
Этиламин . . . — 15 13 20 14 19
н-Пропиламин — 30 19 30 23 31
Изоамиламин . . — 49 39 45 44 58
Кадаверин . . . 3 6 \2 1 1 —
Путресцин . . . 3 4 2 1 1 —
Этаноламин . . . 30 18 И 10 10 7
Гистамин .... 41 26 2 3 3 2
Тирамин .... 56 44 38 55 40 28
Фенилэтиламин 66. 56 37 55 42 —
Бензиламин . . 70 49 36 50 42 —
Триптамин (стр. 296) . . . 60 54 43 90 45 —
а Растворители: I—96%-ный этанол — 25%-ный аммиак (80+20), II — фенол — во-
да (80+30), III — верхняя фаза: бутанол — ледяная уксусная кислота — вода (40 +
+ 10+50), IV—70%-ный этанол на забуференном фосфатом слое, V — растворитель
III на забуференном ацетатом слое, VI — верхняя фаза: амиловый спирт — ледяная
уксусная кислота — вода (40 + 10+50).
304
Специальная часть
Для забуферивания слоев силикагеля в одном случае использована смесь
равных частей 0,2 М раствора первичного фосфата калия и 0,2 М раствора
вторичного фосфата натрия, а в других случаях — 0,15 М ацетат натрия.
Для лучшей идентификации первичных и вторичных аминов можно также
провести хроматографическое разделение 3,5-динитробензамидов (ДНБ)
на обычных слоях силикагеля растворителем хлороформ — 96%-ный этанол
(99+1). Были получены следующие величины hRf [40]: метиламин-ДНБ 14,
диметиламин-ДНБ 47, зтиламин-ДНБ 22, диэтиламин-ДНБ 68, н-пропил-
амин-ДНБ 38, изобутиламин-ДНБ 42, изоамиламин-ДНБ 50.
Получение 3,5-динитробензамидов (ДНБ). 50 мг гидрохлорида амина или 25 мг
свободного амина растворяют в 5 мл воды в делительной воронке, наливают 15 мл эфира,
затем добавляют 0,25 мл пиридина и 250 мг 3,5-динитробензоилхлорида в 1 мл бензола.
При постепенном охлаждении и помешивании добавляют 5,5 г карбоната калия. Через
20 мин сливают водную фазу, а эфирную фазу дважды встряхивают с 5 мл 1%-ной сер-
ной кислоты, затем с водой. Высушенный над сульфатом натрия и профильтрованный
эфирный раствор упаривают и ДНБ перекристаллизовывают из 50%-ного этанола. Для
анализа методом ХТС готовят из этого препарата 1%-ный раствор в эфире или хлоро-
форме и наносят от 5 до 25 рг.
2. ТОНКОСЛОЙНЫЙ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ АМИНОВ
Используя устройство, описанное на стр. 32, в настоящее время снабжен-
ное охлаждающим приспособлением (см. рис. 26), Пастуска и Тринкс [23]
разделяли на слоях силикагеля Г, пропитанных борной кислотой, следующие
амины, движущиеся к катоду: метиламин (величина Mq = 1,00), этиламин
(0,69), н-бутиламин (0,82), этаноламин (1,09), этилендиамин (0,32) и триэта-
ноламин (0,51). Полученные величины Mq отнесены к метиламину и спра-
ведливы для следующих условий опыта.
Масса из силикагеля Г готовится не на воде, а на 3%-ном растворе борной кислоты
и наливается на стеклянные пластинки размером 8 X 20 см. Через 20—25 мин на еще
влажный слой наносят вещества (5—10 цг) в виде солей на расстоянии 7 см от анода.
Электролитом служит смесь 80 мл этанола, 30 мл дистиллированной воды и 2 г безвод-
ного ацетата натрия, которая 40%-ным раствором NaOH доводится до значения pH 12.
Безусловно, необходимо в каждом опыте обновлять электролит. При напряженности
поля 10 в/см длительность опыта составляет 2 час.
Особо следует отметить описанную Хонеггером [7а] в разд. 19.VI комби-
нацию тонкослойного ионофореза (электрофореза) с двумерным разделе-
нием при ХТС. Рис. 176 иллюстрирует успех этого метода при разделении
сложной смеси аминов и аминокислот. Там же приведены условия опыта.
3. ОБНАРУЖЕНИЕ
Для обнаружения аминов используют нингидрин (реактив № 108), проч-
ную голубую соль (реактив № 61), нитропруссид натрия (реактив № 112),
азотную кислоту (реактив № 132) и ванилин (реактив № 147). 3,5-Динитро-
бензамиды можно сделать видимыми, используя раствор иода в хлороформе
(реактив № 73) или а-нафтиламин (реактив № 98). Они появляются также
в виде фиолетовых пятен после 15-минутного облучения ртутной лампой без
фильтра.
IV. СМОЛЯНЫЕ ОСНОВАНИЯ
Анализ смоляных оснований методом ХТС особенно пригоден для быстро-
го наблюдения за соответствующими превращениями при органических син-
тезах. Еще раньше было указано [34а, 35] на возможность разделения камен-
ноугольных и древесноугольных смол (см. рис. 136). Петрович [24, 24а]
Гл. 14. Органические основания 305
при анализе смоляных масел провел хроматографическое разделение некото-
рых из этих оснований, в том числе изомерных метилхинолинов, на слоях
силикагеля Г, приготовленных «вручную» (толщина слоя около 750 р).
В нашей лаборатории Шорн [32] исследовал другие смоляные основания при
стандартных условиях на слоях силикагеля Г и определил возможности их
обнаружения. Величины hRf приведены в табл. 56.
Таблица S6
Величины hRf 18 смоляных оснований
Слой силика- гель Г силикагель Г+ 4-0,1 М ацетат натрин Труп-
Растворитель а I II III па
Анилин 38 —
л-Ксилидин 44 — —
Р-Нафтиламин 44 72 86 I
Акридин 50 (45) 6 38 89
Карбазол 58 (97) 85 92
Дифениламин 69 87 91
2-Метилхинолин (хинальдин) . . . 40 (27) 18 74
4-Метилхинолин (лепидин) .... 33 (22) 25 74 II
Изохинолин 30 (22) 35 74
Хинолин 35 (30) 39 79
2,4,6-Триметилпиридин (2,4,6-кол-
лидин) 24 7 23
2,6-Диметилпиридин (2,6-лутидин) 28 6 36
2,4-Диметилпиридин (2,4-лутидин) 22 8 38
2,5-Диметилпиридин (2,5-лутидин) 26 10 48 III
4-Метилпиридин (у-пиколин) . . . 21 10 49
Пиридин 22 13 55
З-Метилпиридин (0-пиколин) . . . 24 15 59
2-Этилпиридин 30 12 62
Время перемещения на 10 см 25 мин 35— 30—
40 мин 35 мин
а Растворители: I — бензол — метанол (95 + 5), II — этилацетат — метанол — мура-
вьиная кислота (80+Ю+Ю), III — этилацетат — метанол —уксусная кислота
(75+20+5).
б В скобках приведены значения Петровича [24].
Для анализа методом ХТС оснований, приведенных в группе I, наиболее
пригодны обычные слои силикагеля и растворитель I. Разделение ряда произ-
водных хинолина и пиридина лучше всего осуществлять на слоях силика-
геля Г, приготовленных не на воде, а на 0,1 М ацетате натрия. Кислый рас-
творитель II обеспечивает наилучшее различие величин Rf для приведенных
производных хинолина, а растворитель III — для производных пиридина.
Очень важно наносить как можно меньше вещества. Используют 0,1%-ные растворы
оснований и наносят 0,5—3 льч3. Следует избегать сильного активирования слоя. Хоро-
шие результаты получены на слоях, высушенных только на воздухе.
20 Заказ К- 734
306
Специальная часть
Обнаружение. В качестве неспецифичного реактива для обнаружения
оснований, приведенных в табл. 56, можно использовать раствор иода в хло-
роформе (реактив № 73); образующиеся коричневые пятна исчезают очень
быстро. Для обнаружения оснований, указанных в группе I табл. 56, очень
хорошо использовать хлорид сурьмы (V) (реактив № 13): акридин реагирует
с образованием желтой окраски, карбазол — зеленой, анилин — розовой,
п-ксилидин — слабо-фиолетовой, дифениламин — синей и 0-нафтиламин —
серой. С модифицированным реактивом Драгендорфа для алкалоидов (реак-
тив № 60а) основания групп II и III окрашиваются в оранжевый — красный
цвета.
ЛИТЕРАТУРА
1. Banmler J., RippsteinS., Pharm. Acta Helv., 36, 382, (1961).
2. В о r k e M. L., Kirch E. R., J. Am. Pharm. Assoc. Sci. Edit., 42, 627 (1953).
3. C h о c h i n J., Daly J. W., Experientia, 18, 294 (1962).
4. D e n f f e r D. v., Behrens M., Fischer A., Naturwiss., 39, 258 (1952).
5. Diamantstein T., Ehrhart H., Hoppe-Seyler’s Z. physiol. Chem., 326,
131 (1961).
6. G m e 1 i n R., Virtanen A. J., Ann. Acad. Sci. Fennicae Ser. A, II. Chem. Chem.,
107 (1961).
7. Hofmann A., Planta Med., 9, 354 (1961).
7a. Honegger C. G., Helv. Chim. Acta, 44, 173 (1961).
8. J e p s о n J. B., Stevens В. I., Nature, 172, 772 (1953).
9. Kaldewey H., Habilitationsarbeit Saarbriicken, 1961.
10. К h a n n a K. L., Schwarting A. E., R о t h e r A., Bobbitt J. M., Lloy-
dia, 24, 179 (1961).
11. К 1 a v e h n M., Rochelmeyer H., Deut. Apotheker Ztg., 101, 477 (1961).
На. К 1 a v e h n M., Rochelmeyer H., Seyfried I., Deut. Apotheker Ztg.,
101, 75 (1961).
12. Kirchner J. G., M i 11 e r J. M., Keller G. J., Anal. Chem., 23, 420 (1951).
13. К u m p Ch., Schmid H., Helv. Chim. Acta, 45, 1090 (1962).
14. Kogi F., H a a gen-S m i t A. I., Erxleben H., Hoppe-Seyler’s Z. physiol.
Chem., 228, 90 (1934).
14a. Kogi F., Kostermans D. G. F. R., Hoppe-Seyler’s Z. physiol. Chem., 235,
301 (1935).
15. L e w i s G. P., «5-Hydroxy-tryptamine», London — New York, Pergamon Press, 1958,
s. a. V. Erspamer in Fortschritte der Arzneimittelforschung, Bd. 3, Basel — Stuttgart,
Birkhauser, 1961.
16. Lehner H., Schmutz J., Helv. Chim. Acta, 44, 444 (1961).
17. Linser H., Kiermayer O., Methoden zur Bestimmung pflanzlicher Wuchs-
stoffe, Wien, Springer, 1957.
18. L i n s k e n s H. F., Papierchromatographie in der Botanik, 2. Aufl., Berlin — Gottin-
gen — Heidelberg, Springer, 1959.
19. M a c h a t a G., Mikrochim. Acta, 1960, 79.
20. M ii 1 1 e г К. H., Honerlagen H., Arch. Pharm., 293/30, 202 (1960).
21. Neubauer D., Mothes K., Planta Med., 9, 466 (1961).
22. P a i 1 e r M., К u m p W. G., Arch. Pharm., 293, 646 (I960).
22a. P a i 1 e r M., Libiseller R., Monatsh. Chem., 93, 403, 511 (1962).
23. Pastuska G., Trinks H., Chem. Ztg., 86, 135 (1962).
24. P e t г о w i t z H. J., Materialpriifung, 2, 309 (1960).
24a. Petrowitz H. J., Chemiker-Ztg., 85, 143 (1961), s. a. Erdol und Kohle, 14, 923
(1961).
25. Pinxteren J. A. C., Verloop M. E. van, Pharm. Weekblad, 97, 1 (1962).
26. P 6 h m M., Arch. Pharm., 286, 509 (1953).
27. P г о c h a z k a Z., in H a i s J. M., Macek K., Handbuch der Papierchromato-
graphie, Jena, VEB Fischer, 1958.
28. Ristic S., Thomas A., Arch. Pharm., 295, 524 (1962).
29. Robles M. A., W i e n t j e s R., Pharm. Weekblad, 96, 379 (1961).
30. R о t h e r A., Bobbitt J. M., Schwarting A. E., Chfem. and Ind., 1962.
654.
31. Schlemmer F., Link E., Pharm. Ztg., 104, 1349 (1959).
32. S c h о r n P. J., неопубликованные данные.
33. Soding H., Wuchsstofflehre, Stuttgart, G. Thieme-Verlag, 1952.
34. Stahl E., Pharmazie, 11, 633 (1956).
34a. Stahl E., Parf. und Kosm., 39, 564 (1958).
Гл. 14. Органические основания
307
35. Stahl Е., Arch. Pharm., 292, 411 (1959).
36. Stahl Е., Kaldewey Н., Hoppe-Seyler’s Z. physiol. Chem., 323, 182 (1961).
37. Stahl E., in P a e c h K., Tracey M. V., Moderne Methoden derPflanzenanalyse,
Bd. V, Berlin — Gottingen — Heidelberg, Springer-Verlag, 1962.
38. Stein von Kamienski E., in Li nskens H. F., Papierchromatographie
in der Botanik, Berlin — Gottingen — Heidelberg, Springer — Verlag, 1959.
39. Stowe В. B., in Fortschritte organischer Naturstoffe, Bd. 17, S. 249, Wien, Sprin-
ger, 1959.
40. Teichert K., Mutschler E., Rochelmeyer H., Dent. Apotheker Ztg.,
100, 283 (1960).
41. Teichert K., Mutschler E., Rochelmeyer H., Deut. Apotheker
Ztg., 100, 477 (1960).
42. Teichert K., Mutschler E., Rochelmeyer H., Z. anal. Chem., 181,
325 (1961).
43. U 1 1 m a n n E., Kassali tzky H., Arch. Pharm., 295, 37 (1962).
44. Urk H. W. van, Pharm. Weekblad, 66, 473 (1929).
45. Waldi D., Arch. Pharm., 292, 206 (1959).
46. Waldi D., Schnackerz К., M u n t e r F., J. Chromatog., 6, 61 (1961).
47. Wink lie r W., Awe W., Arch. Pharm., 294, 301 (1961).
48. Winkl'er W., Naturwiss, 48, 694 (1961).
20*
ГЛАВА 15
ЛЕКАРСТВЕННЫЕ ВЕЩЕСТВА
X. Генсхирт
Метод ХТС все чаще используется для идентификации и количественного
микроопределения смесей лекарственных веществ, поскольку он требует мало
места и времени, дешев и, кроме того, при этом методе нет ограничений
в выборе реактива для опрыскивания, как в случае хроматографии на бумаге.
Метод может быть использован как для контрольно-аналитических, так
и для токсикологических исследований. Для осуществления анализов произ-
водственного контроля необходимо полное разделение известных веществ
при использовании всего разделительного пути, в то время как при токсико-
логических исследованиях ставится особая задача: проанализировать с про-
стыми растворителями возможно большее число сильнодействующих
лекарств и ядов и идентифицировать эти вещества после выделения их из со-
держимого органов по величинам Rf с помощью различных специфических
реактивов для опрыскивания. В этих двух направлениях исследования исполь-
зуют ряд методов.
Для удобства лекарства подразделены на группы с фармакологической
точки зрения (см. разд. I). Методы, разработанные главным образом для
контрольно-аналитических целей, собраны в разд. II, а для токсикологиче-
ских исследований — в разд. III. Поскольку исследования лекарств на ста-
бильность приобретают все большее значение и метод ХТС может в этом
отношении быть весьма полезным, эта возможность применения подробно
описана в разд. IV. Для определения лекарственного сырья и обнаружения
фальсификации также с успехом можно использовать метод ХТС (см.
стр. 376).
Применение метода ХТС к витаминам, алкалоидам, стероидам и другим
частично используемым также в медицине природным веществам рассмотрено
в специальных главах этой книги.
I. ГРУППЫ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ
1. ОБЕЗБОЛИВАЮЩИЕ, ЖАРОПОНИЖАЮЩИЕ,
ПРОТИВОРЕВМАТИЧЕСКИЕ СРЕДСТВА
Приведенные в табл. 57 и на рис. 133 биологически активные вещества
подробно изучены методом ХТС, поскольку некоторые из этих веществ имеют
исключительно важное значение [14]. Используют пластинки с силикаге-
лем Г, полученные стандартным методом (стр. 35) при добавлении к сор-
бенту 2% флуоресцирующего вещества ZS-cynep. После разделения все
вещества можно обнаружить в виде пятен поглощения в УФ-свете при
254 мц. Пластинки, приготовленные без добавки флуоресцирующего
вещества, можно опрыскивать растворами флуоресцирующих индикаторов,
например флуоресцеина Na, морина, родамина В и т. д. (реактив № 90).
Ряд оснований реагирует с иодоплатинатом (реактив № 76). После хлориро-
Гл. 15. Лекарственные вещества
309
Таблица 57
Величины Hf различных обезболивающих, жаропонижающих и
противоревматических веществ в некоторых растворителях [14]
№ п/п метил- этилке- тон • циклогек- сан — аце- тон (40+50) BfXlOO
циклогек- сан — хлоро- форм — ледя- ная уксус- ная кислота (40 + 50 + Ю) циклогек- сан — хлоро- форм — пи- ридин (20+60+5)
1 1-Фенил-2,3-диметил-4-метилами- нопиразолон-(5)-М-метансульфоно- вокислый натрий (норамидопирин- метансульфонат натрия, новальгин) 0 0 0
2 2-Фенилхинолин-4-карбоновая кислота (цинкофен, атофан) . . . 3 0 24 —
3 Ацетилсалициловая кислота (ас- пирин) и 13 42 10
4 1-Фенил-2,3-диметилпиразолон-(5) (феназон, антипирин) 19 32 15 30
5 1-Фенил-2,3-диметил-4-диметил- амино-5-пиразолон (амидопирин, пирамидон) 30 58 4 45
6 n-Этоксиацетанилид (фенацетин) 57 64 24 37
7 Амид о-этоксибензойной кислоты 58 — 40 50
8 N-Ацетил-п-аминофенол (параце- тамол) 60 0 10
9 3,5-Д иоксо-1,2-дифени л-4-н-бути л- пиразолидин (фенилбутазон, бута- золидин) 65 57
10 Амид о-оксибензойной кислоты (салициламид) 69 70 27 21
вания и заключительного опрыскивания раствором бензидина и йодистого
калия все вещества могут быть обнаружены в виде различно окрашенных
Рис. 133. Тонкослойная хромато-
грамма различных обезболивающих,
жаропонижающих и противоревмати-
ческих веществ, полученная с метил-
этилкетоном на силикагеле [14].
Цифровые обозначения см. в табл. 57.
пятен (реактив № 32). Однако этот метод обнаружения сильно зависит от
времени хлорирования, которое должно составлять примерно 10 сек. При
применении упомянутых растворителей норамидопиринметансульфонат (но-
вальгин) из-за высокой полярности остается в точке старта.
310
Специальная часть
Обезболивающее санома (М-изопропил-2-метил-2-н-пропил-1,3-пропанди-
олдикарбамат) можно хроматографировать, используя смесь циклогексан —
хлороформ — ледяная уксусная кислота (4+54-1) на пластинках силикаге-
ля Г. В качестве реактива для опрыскивания следует использовать иодопла-
тинат (реактив № 76).
2. СТИМУЛЯТОРЫ НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ
а) Пурины
Теобромин, теофиллин и кофеин можно разделять на забуференных слоях
силикагеля (pH 6,8) с растворителем хлороформ — 96%-ный этанол (9 + 1)
[38] (см. табл. 58). При опрыскивании спиртовым раствором йодистого
калия и затем смесью 96 %-ного этанола и 25 %-ной соляной кислоты в равных
долях (кофеин и теофиллин окрашиваются в красноватый цвет, теобромин —
в серый, а антипирин — в коричневый) достигается чувствительное обнару-
жение; чувствительность менее 1 рг.
Таблица 58
Величины hRf пуринов
Пурин Хлороформ — 96%-ный этанол (90 + 10) [38] Этилацетат — метанол — 12 н. НС1 (90 + 10 + 0,25) [1] Этилацетат — метанол—ле- дяная ук- сусная кис- лота (804-104-10) [1] Хлоро- форм—ме- танол (95 + 5) [1]
Теобромин . . 22 25 36 26
Теофиллин . . 37 41 50 23
Кофеин .... 57 36 41 51
Получение забуференных слоев силикагеля: 25 г силикагеля Г тщательно переме-
шивают с 50 мл смеси равных частей 0,2 М первичного фосфата калия и 0,2 М вторич-
ного фосфата натрия и намазывают 5 пластинок. После предварительной сушки с при-
менением обогреваемого вентилятора проводят окончательную сушку пластинок в сушиль-
ном шкафу при ИО9.
Белер [1] осуществил разделение трех пуринов на слоях силикагеля,
приготовленных обычным способом, используя различные растворители (см.
табл. 58). После разделения проводили обнаружение путем сублимирования
пуринов на охлаждаемую пластинку, накладываемую на хроматограмму.
Чувствительность 1—5 рг. Таким же образом были обнаружены барбитуро-
вые кислоты. Другими авторами [7] были разделены методом ХТС мочевая
кислота, ксантин, гипоксантин и 6-меркаптопурин, а также кофеин, теофил-
лин и ксантин.
б) Корамин, кардиазол, микорен, эу кратон,
камфара, лобелии
Эти вещества совершенно различны по строению. При разделении метил-
этилкетоном и кислой смесью на слоях силикагеля Г, приготовленных
с флуоресцирующим веществом (стр. 62), они имеют величины Rf, приведенные
в табл. 59 [14]. Как видно из рис. 134, пятно полярного основания лобелина
в случае чисто адсорбционной хроматографии с метилэтилкетоном несколько
вытянуто. В кислом растворителе циклогексан — хлороформ — ледяная уксус-
ная кислота микорен разделяется на 3 пятна, причем два расположенных
Гл. 15. Лекарственные вещества
311
Таблица 59
Величины hRf и обнаружение различных стимуляторов нервной системы [14]
№ п/п В/Х100 Обнаружение
метил- этилке- тон циклогек- сан—хлоро- форм—ледя- ная уксус- ная кислота (40 + 50+10) активный водород (реактив № 32) УФ (254 -иц) реактив Драген- дорфа (№ 6 0)
1 Микорен Aj52 — + —
Пятно А 51 { А260 — + —
2 Пятно В (диметиламид N-крото- нилэтиламиномасляной кислоты и диметиламид N-кротонилпропиламино- масляной кислоты) .... Лобелии (лобелингидро- 5 2 Оранже- вый
3 хлорид) Корамин (диэтиламид пиридин-р-карбоновой кис- 20 5 — + »
лоты) 33 . 22 Синий + »
4 5 Кардиазол Эукратон (имид р,р-ме- тилэтилглутаровой кислен 55 ? — —‘ —
ты) 65 55 Темно-си- ний —— —
6 Камфара 73 85 — —— Оранже- вый
Слой: силикагель Г с добавкой 2% флуоресцирующего вещества ZS-cynep.
Проба: 20—50 цг каждого вещества (в виде экстракта или раствора соответствующего лекар-
ственного вещества).
Разделительный путь 10 слц + положительная, — отрицательная реакция.
рядом пятна, которые нельзя разделить, используя метилэтилкетон, сле-
дует отнести к амидам кислот, содержащихся в микорене. Эти пятна не
окрашиваются реактивом Драгендорфа в противоположность третьему, кото-
рое при использовании указанных двух растворителей остается на месте старта
Рис. 134. Тонкослойная хроматограмма раз-
личных стимуляторов нервной системы, по-
лученная с метилэтилкетоном на силикагеле
Г [14].
Цифровые обозначения см. в табл. 59.
312
Специальная часть
и которое пока не удалось идентифицировать. Камфару и кардиазол нельзя
обнаружить на слоях с добавкой флуоресцирующего вещества. Используя
имеющиеся в настоящее время реактивы для опрыскивания, достигают весь-
ма невысокой чувствительности обнаружения — количества менее 30 рг
не могут быть отчетливо определены. Более чувствительным является обна-
ружение на флуоресцирующих пластинках с последующим опрыскиванием
родамином В и раствором карбоната натрия (реактив № 101 б), как это
описано Вальди на стр. 364.
3. АНАЛИЗ МЕТОДОМ ХТС РАЗЛИЧНЫХ
ПРОТИВОГИСТАМИННЫХ ПРЕПАРАТОВ ФЕНОТИАЗИНОВОГО РЯДА
И УСПОКАИВАЮЩИХ ЛЕКАРСТВ
Боймлер и Рипштейн [4] исследовали фенотиазины и психически дей-
ствующие лекарственные вещества, используя смесь метанол — ацетон —
триэтаноламин (50 + 50 + 1,5), на пластинках силикагеля Г (см. табл. 60).
Критические партнеры можно различить, используя несколько реактивов.
Таблица 60
Величины hRf и цветные реакции различных противогиетаминных веществ
фенотиазинового ряда и успокаивающих лекарственных веществ [4]
ЛуХЮО Окраска пятен
1. 2 3
Ацепромазин 33—35 Оранжевая Красная Кра сно-коричне- вая
Промазин 37—39 Синяя Оранжевая Фиолетовая
Тофранил 44—46 Светло-си- няя » Белая
Тиоридазин 47—49 То же Красная Красно-коричне- вая
Хлорпромазин .... 49—50 » » Оранжевая То же
Диэтазин 53—55 Синяя Фиолетовая
Прометазин 55—57 » » »
Тарактан 55—57 Светящаяся синяя » Желтоватая
Изотиазин 57—59 Синяя Фиолетовая
Левомепромазин .... 62—64 » » »
Либриум 84—86 Коричневатая » Желтая
Фенотиазин 89—91 Темная Красно-фиоле- товая Синяя
Слой силикагеля Г, приготовленный стандартным методом.
Разделительный путь 10 СЛ1.
Обнаружение: 1 — УФ-свет, 2 — реактив Драгендорфа, 3 — хлорид палладия (0,5%-ный сла-
бокислый раствор).
Успокаивающее мепробамат (2-метил-2-н-пропил-1,3-пропандиолдикар-
бамат) выделили из мочи и проанализировали методом ХТС [10]. Слои были
получены вручную из силикагеля с рисовым крахмалом в качестве связую-
щего материала. В качестве растворителя использовали смесь циклогексана
и абсолютного этанола (85 + 15). Идентификацию проводили опрыскива-
нием концентрированной серной кислотой. После экстракции из силикагеля
Гл. 15. Лекарственные вещества
313
вещество было также определено количественно цветной реакцией
с 0,2%-ным раствором гидрохинона в концентрированной серной кислоте,
причем в работе отсутствуют данные о воспроизводимости метода. Мепро-
бамат может быть также проанализирован на пластинках с силикагелем,
полученных стандартным методом, с использованием растворителя хлоро-
форм — диэтиламин (90 + 10) или циклогексан — ацетон—диэтиламин (70 +
+ 20 + 10). Идентификацию можно осуществить в УФ-свете при опрыски-
вании 0,2%-ным раствором 2',7'-дихлорфлуоресцеина (реактив № 42). Успо-
каивающее децентан можно проанализировать стандартным методом на сили-
кагеле Г с растворителем, представляющим собой смесь хлороформа с диэтил-
амином (90 + 10), и обнаружить при опрыскивании родамином В (реактив
№ 129) или иодоплатинатом (реактив № 76).
4. БАКТЕРИОСТАТИЧЕСКИЕ И БАКТЕРИЦИДНЫЕ ВЕЩЕСТВА
а) Используемые в фармацевтике фенолы, смолы
и составные части смоляных масел
Возможности разделения фенолов, встречающихся в эфирных маслах,
рассмотрены уже на стр. 197 (см. табл. 21), а разделение методом ХТС смоля-
ных оснований было изложено на стр. 304 (см. табл. 56).
Хроматографическое поведение многочисленных фенолов, фенолкарбо-
новых кислот, фенолальдегидов, диметилфенолов и двухъядерных фенолов
исследовано Пастуской и Петровичем на слоях силикагеля Г, приготовлен-
ных вручную (толщина около 0,5 мм), и результаты этих работ были изло-
жены в обзоре, в котором особое внимание уделено зависимости величины
Rf от строения фенола (ср. со стр. 200) [31, 32]. Для фенолов и фенолкарбо-
новых кислот использовали растворители, указанные в табл. 61; в этой таб-
лице приведены величины hRf некоторых фармацевтически особенно инте-
ресных веществ этого класса соединений. Фенолальдегиды, диметилфенолы
Таблица 61
Величины hRf некоторых фенолов в двух растворителях [31, 32]
Фенол ЯуХ 100 Фенол ЯуХЮО
диоксан — бензол— ледяная уксусная кислота (25+90 + +4) метанол — бензол — ледяная уксусная кислота (8 + 45 + + 4) диоксан — бензол — ледяная уксусная кислота (25+90+ + 4) метанол — бензол — ледяная уксусная кислота (8+45+ +4)
Пирогаллол . . . 32 45 Фенол 76 60
Резорцин .... 56 52 Гваякол .... 83 72
и соответствующие метиловые эфиры хроматографировали, используя бензол
и бензол — метанол (95 + 5). Поведение некоторых двухъядерных фенолов
было исследовано с растворителями, указанными в табл. 62.
Пастуска и Тринкс [30] разделяли фенолы и фенолкарбоновые кислоты
методом тонкослойного электрофореза. В числе продуктов метилирования
^-резорциновой кислоты были анализированы методом ХТС другие много-
численные фенольные вещества [22]. По Вальди [42], разделение фенола,
о-, м- и n-крезолов на слоях силикагеля Г или окиси алюминия, полученных
стандартным методом, возможно, если уменьшить соответствующими спосо-
бами летучесть этих веществ.
•314
Специальная часть
Отгоняющиеся с водяным паром спирты и фенолы, содержащиеся в про-
довольственных продуктах, были подвергнуты хроматографическому разде-
лению после перевода в соответствующие динитробензоаты [9] (стр. 358).
Эта методика пригодна для обнаружения небольших количеств фенолов или
высших спиртов в спирто-водных растворах, однако не годится для разделе-
ния гомологических рядов спиртов или фенолов. Так, например, был обна-
ружен тимол в растворе, содержавшем 5 мг тимола в 1 мл этанола и 1000 мл
воды.
На слоях силикагеля Г с метилизобутилкетоном в качестве растворителя
можно разделить гексилрезорцин и гексахлорофен [14]. Если слои приго-
товлены с флуоресцирующим веществом, то после разделения компоненты
можно обнаружить в УФ-свете (254 мр,) в виде абсорбционных пятен. Оба
фенола можно обнаружить при опрыскивании растворами диазониевых солей
Рис. 135. Распознавание применяемых в медицине смол (по Шталю).
1 — каменноугольная смола; 2 — древесная смола; з — смола можжевельника; 4 — березовая
смола; е — масло смолы бука; Т — эталонная смесь (верхнее пятно — масляный желтый, ниж-
нее пятно — суцан красный).
(реактив № 37 или № 61). Гексахлорофен: 7?/Х 100 = 50, гексилрезорцин:
RfX 100 = 90. Дихлорофен и гексахлорофен можно разделить к-гептаном,
насыщенным ледяной уксусной кислотой, на приготовленных вручную сили-
кагелевых адсорбционных слоях, содержащих крахмал в качестве связую-
щего [6]. Идентификацию осуществляют реактивом хлорид железа (III) —
гексацианоферрат калия (III) [50 мг гексацианоферрата калия (III) и 1000 мг
хлорида железа (III), растворенных в 10 мл воды]. Реактив всегда должен
быть свежеприготовленным. Возможен количественный анализ смеси веществ
методом УФ-спектрофотометрии после соскабливания и экстрагиро-
вания пятен (ср. стр. 59—63).
Каменноугольная смола, древесная смола DAB 6, смола можжевельни-
ка, березовая и буковая смолы были проанализированы Шталем [36, 37]
на пластинках с силикагелем Г, полученных стандартным методом, с исполь-
зованием бензола в качестве растворителя без насыщения камеры (рис. 135);
было показано, что таким образом эти смолы можно отличить друг от друга.
Наносили 10%-ный раствор смолы в бензоле или в хлороформе. Реактивом для
опрыскивания служила пятихлористая сурьма (реактив № 13). Для получения окраски
в заключение нагревали в течение 10 мин при 110°.
Смоляные масла были исследованы Петровичем [33]. Часть компонентов
смол представляет интерес с фармацевтической точки зрения; данные для
этих вещертв приведены в табл. 62. Поскольку пластинки были приготов-
Гл. 15. Лекарственные вещества
315
лены «вручную», приведенные величины отличаются от величин, получен-
ных стандартным методом.
Таблица 62
Величины hRf и обнаружение компонентов смоляного масла
Компонент смолы Я^ХЮО Обнаружение
хлоро- форм бензол бензол — метанол (95 + 5)
Изохинолин .... — 7 22 Реактив Драгендорфа, оранжевая окраска
0-Нафтол 16 21 38 Диаз, бензидин, крас- но-фиолетовая окраска
а-Нафтол 23 28 46 Диаз, бензидин, си- не-фиолетовая окраска
Хинолин 30 9 30 Реактив Драгендор- фа, оранжевая окраска
Акридин 36 8 45 То же
8-Метилхинолин . . 59 — — » у>
Растирают 4 г силикагеля с водой в виде разбавленной кашицы и наносят вручную,
по возможности равномерно, на стеклянные пластинки 17,5 X 4,5 см. Равномерность
слоя проверяют затем эталонными веществами. Для разделения наносят 2000 рг смоля-
ного масла на расстоянии 2,5 см от нижнего края и погружают пластинки в соответ-
ствующий растворитель.
б) Анализ сульфонамидов методом ХТС
Сульфонамиды разделяют методом хроматографии на бумаге, используя
кислые или основные смеси растворителей. При этом величины 11, и форма
Рис. 136. Сульфонамиды с растворителем хлороформ — метанол (80 + 15) [14].
Цифровые обозначения см. в табл. 63.
пятен сильно зависят от концентрации летучих основания или кислоты
в газовой фазе камеры [18]. Поэтому разделение сульфонамидов методом
ХТС представляет исключительный интерес. Величины Rf исследованных
сульфонамидов для нескольких растворителей приведены в „табл. 63
Таблица 63
Величины hRf сульфонамидов в различных растворителях [14]
№ п/п Сульфонамид ВуХЮО
хлоро- форм — метанол (80+15) циклогек- сан — аце- тон — ледя- ная уксус- ная кислота (40+50+10) метил- этилкетон— ледяная уксусная кислота (75+5) ацетон — метанол — диэтил- амин (90+10+ +Ю) | метил- этил- кетон — пиридин (75+5)
1 Сульфадимидин (сульф- анилиламино-4,6-диме- тилпиримидин) 66 56 76 41 63
2 Сульфафуразол (5-сульф- анилиламино-3,4-диме- тилизоксазол) 47 55 79 30 67
3 Сульфапиридин (2-сульф- анилиламинопиридин) 55 54 71 39 63
4 Сульфагуанидин (сульф- анилилгуанидин) .... 13 28 53 33 43
5 Сульфизомидин (4-сульф- анилиламино-2,6-диме- тилпиримидин) 45 33 46 32 39
6 Сульфацетамид (сульф- анилилацетамид) .... 37 49 72 21 59
7 Сульфатиазол (2-сульф- анилиламинотиазол) . . 46 38 64 32 49
8 Сульфаниламид (п-ами- нобензолсульфонамид) 33 43 68 69 67
9 Сульфотиомочевина (сульфанилилтиомочевина] 20 56 72 49 65
Таблица 64
Разделение некоторых сульфонамидов
с растворителем хлороформ — гептан — этанол
(1+1+1) [43]
Сульфонамид ByXlOO
Г+-Ацетил-(3,4-диметил-5-изокса-
зил)сульфаниламид (ацетилгантри-
зин).............................
№-(3,4-диметил-5-изокса зил)-
сульфаниламид (гантризин) . . . .
2,4-Диметокси-6-сульфаниламидо-
1,3-диазин (мадрибон).............
n-Аминобензолсульфоновая кисло-
та (сульфаниловая кислота) . . . .
90
70
40
2
Слой силикагеля Г, приготовленный стандартным
методом (стр. 35).
Проба: 1 |лз в 0,01 мл ацетона.
Обнаружение: n-диметиламинобензальдегид (реак-
тив № 48).
Гл. IS. Лекарственные вещества
317
[14] . Как следует из рис. 136, уже одним растворителем удается разделить
ряд смесей, составленных произвольно из перечисленных выше сульфонами-
дов. Поскольку минимально определяемое количество при опрыскивании
n-диметиламинобензальдегидом невелико, целесообразно наносить лишь
небольшие количества (менее 10 цг), благодаря чему достигается очень хоро-
ший эффект разделения.
За исключением сульфизомидина, сульфамиды экстрагируют из продажных табле-
ток, содержащих сульфонамиды, ацетоном. Раствор сульфизомидина получают, разбав-
ляя этанолом ампулы с аристамидом. Наносят объемы, содержащие около 10 цг данного
сульфонамида. Пластинки силикагеля готовят стандартным методом с добавкой флуоре-
сцирующего вещества (стр. 35). Длина пути 10 см. После разделения сульфонамиды
обнаруживают в виде абсорбционных пятен в УФ-свете (254 -ир). Кроме того, их можно
окрасить в желтый цвет n-диметиламинобензальдегидом (реактив № 48).
В обзорном реферате по ХТС Уолиш с сотрудниками [43] сообщили о раз-
делении других сульфонамидов. В качестве растворителя применяли смесь
хлороформ — гептан — этанол (1 + 1 + 1). Разделенные сульфонамиды
и найденные величины Rf приведены в табл. 64. Сульфонамид паллидин
(5-метилсульфадиазин) можно хроматографически проанализировать с рас-
творителем циклогексан — метанол — диэтиламин (60 + 30 + 10) на слоях
силикагеля или окиси алюминия [42].
в) Антибиотики
а) ПЕНИЦИЛЛИНЫ
Различные пенициллины можно разделять на слоях силикагеля Г при
условиях, приведенных в табл. 65 [И]. Локализацию пенициллинов после
разделения осуществляют азидом иода — реактивом на органическую серу.
Как видно из табл. 65, для некоторых производных пенициллина получаются
двойные пятна. Происхождение этих пятен было изучено на примере прокаин-
пенициллина, однако пока полностью не выяснено. Поскольку полное разде-
ление этим методом всех исследованных пенициллинов невозможно, Нусбау-
мер [28] пытался идентифицировать часто применяемые производные пени-
циллина путем хроматографического разделения продуктов их кислого гид-
ролиза. Однако и при этом методе разделение возможно лишь в отдельных
случаях. Николаус и сотрудники [25] отделяли 6-аминопенициллин, имею-
Таблица 65
Величины hRf различных пенициллинов [11]
Пенициллин Ацетон — метанол (50+80) Изопропанол — метанол (30+70)
белое пятно желтое пятно белое пят: о желтое пятно
Бензилпенициллин 16 22
48
Феноксиметилпенициллиновокис- лый калий 68 64
Феноксиметилпенициллиновая
кислота 68 54 74 24
а-Феноксиэтилпенициллиновокис- лый калий 72 68
n-Ме тилфен оксиме тилпенициллин 62 58
318
Специальная часть
Продолжение табл. 65
Пенициллин Ацетон — метанол (50 + 80) Изопропанол — этанол (30-f-70)
белое пятно желтое пятно белое пятно желтое пятно
Фенилмеркаптометилпенициллин . 4 8
58 54
Прокаин-пенициллин NN'-Дибензилэтилендиаминдипе- 62 52 60 42
нициллин G 58 52 56 24
NN'-Дибензилэтилендиаминдипе- нициллин V 64 52 64 24
Диэтиламиноэтаноловый эфир гидроиодид пенициллина V . . . . 72 4
60
С1-Бензилпирролидилметилбензи- мидазол—пенициллин G 64 91 60 84
100
Слой силикагеля Г, приготовленный стандартным методом (см. стр. 35).
Разделительный путь: 12 см, камера с насыщением.
Обнаружение: азид иода (реактив № 7.5).
Граница определения 1—2 цг.
щий основной характер, от пенициллинов G, V и диметоксипенициллина,
применяя кислый растворитель бутанол — вода — ледяная уксусная кислота
(40 + 40 + 1) на пластинках с силикагелем Г. Количественная оценка хро-
матограммы проводилась микробиологическим способом, как в случае тетра-
циклинов. Поскольку 6-аминопенициллин практически не обнаруживает
микробиологической активности, для количественного определения после
разделения его переводят в бензилпенициллин. Минимальное определяемое
этим методом количество составляет около 0,1 цг.
3) ВЕЩЕСТВА РАЗЛИЧНЫХ КЛАССОВ СОЕДИНЕНИЙ
Метод ХТС был с успехом использован для разделения различных рифо-
мицинов [35]. В ряду рифомицинов известны следующие превращения:
окисление
Рифомицин В < ~Рифомицин О
восстановление
восстановление
Рифомицин SV < ~ Z Т Рифомицин S
окисление
Рифомицин В при обработке окислителем переходит в рифомицин О,
который может быть снова восстановлен в рифомицин В. Как рифомицин В,
так и рифомицин О превращаются в водном растворе в вещество с большей
антибиотической активностью — рифомицин S, который путем мягкого
восстановления аскорбиновой кислотой может быть переведен в рифоми-
цин SV.
Гл. 15. Лекарственные вещества
319
При попытке разделения этих 4 веществ методом хроматографии на бу-
маге вследствие слабых восстановительных свойств хроматографической
бумаги рифомицин О восстанавливается в рифомицин В, а рифомицин S —
в рифомицин SV, что удалось доказать УФ-спектрометрией при элюирова-
нии пятен. Методом ХТС на слоях силикагеля Г можно отделить рифомицин
В от рифомицина О, рифомицин SV — от рифомицина S и рифомицин
В — от рифомицина SV. Подходящим растворителем оказался ацетон. Рифо-
мицины можно обнаружить по их собственной окраске при нанесении пробы
не менее 10 цг. Более чувствительным является микробиологический метод
обнаружения (0,1—0,5 цг), как это описано в случае анализа тетрациклинов
методом ХТС. Если работают с безводными растворителями, то целесообразно
перед количественным определением подвергнуть пластинки воздействию
атмосферы, насыщенной парами воды. Благодаря этому облегчается диффу-
зия антибиотиков в агаре.
Метод ХТС был использован для перевода в форму, удобную для анали-
тического определения, цитрстатически высокоактивных антибиотиков из
семейства Myrothecium (так называемые Verrucarine и Roridine), а также
для отделения туберкулостатически активного вещества 2-(п-хлоранилино)-
5-(п-хлорфенил)-3-(изопропилимино)-3,5-дигидрофеназина от промежуточ-
ных и сопутствующих продуктов синтеза [34].
V) ТЕТРАЦИКЛИНЫ
Многие тетрациклины были хроматографически исследованы с примене-
нием ряда растворителей, причем были использованы также многочисленные
сорбенты [25].
На слоях силикагеля Г 10%-ной лимонной или 10%-ной винной кислотой
можно отделить:
1. Дезокситетрациклин от тетрациклина, окситетрациклина, хлорте-
трациклина и диметилтетрациклина.
2. Окситетрациклин от тетрациклина, хлортетрациклина, диметилтетра-
циклина и дезокситетрациклина.
На этих же слоях 10%-ной лимонной кислотой, насыщенной бутанолом,
можно отделить окситетрациклин и диметилтетрациклин от тетрациклина,
хлортетрациклина и дезокситетрациклина.
На слоях кизельгура Г можно отделить тетрациклин и хлортетрациклин
от соответствующих ангидропроизводных.
Количественная оценка хроматограммы может быть осуществлена хими-
ческим или микробиологическим методом. При химическом определении
хроматограмму опрыскивают 1 н. соляной кислотой и нагревают в течение
нескольких минут при 50°, причем тетрациклины обнаруживаются в виде
желтых пятен. Дезокситетрациклин можно сделать видимым, проводя соче-
тание с диазониевой солью. Чувствительность при этом количественном
определении составляет 0,1—1 цг. При микробиологическом определении
(см. ниже) с помощью питательной среды на агаре, которой поливается хро-
матограмма и которая затем обрабатывается трифенилтетразолом и засе-
вается Bacterium subtilis, можно значительно повысить чувствительность;
однако этот метод требует значительной затраты труда и времени.
Приготовление пластинок с силикагелем и кизельгуром. 25 г силикагеля Г или кизель-
гура Г тщательно встряхивают с 50 мл воды в течение 30 сек в колбе на 200 мл. Эту
суспензию с помощью прибора для нанесения тонких слоев фирмы «Desaga» наносят на
хроматографические пластинки. Оставляют схватываться на 10 мин и активируют затем
30 мин при 110°. Пластинки хранят в эксикаторе над силикагелем.
Проведение микробиологического количественного определения по хроматограмме.
Тонкослойные пластинки помещают в специально изготовленный сосуд из плексигласа.
50 мл стерильного питательного раствора агара (при применении Sarcina lutea pH 5,9,
320
Специальная часть
при применении Bacterium subtilis и Staphylococcus aureus pH 7) вносят при 50° в колбу
на 500 мл и добавляют 0,7 мл 5%-ного раствора трифенилтетразола в 50%-ном метаноле.
Для анализа рифомицинов засевают 0,3 мл 30—35 %-ной суспензии Sarcina lutea,
а для анализа тетрациклинов и пенициллинов — 0,5 мл 35%-ной суспензии Staphy-
lococcus aureus. Смесь тщательно перемешивают 30 сек и затем осторожно наливают на
пластинку и разравнивают слой. Оставляют пластинку на 15 мин при комнатной тем-
пературе в стерильных условиях до затвердевания агара. Чтобы исключить доступ воз-
духа, который снижает восстановление соединений тетразолия до формазана, засеян-
ную питательную среду заливают 25 мл защитного слоя агара (15 г агара, 1000 мл дис-
тиллированной воды, стерилизовано) при 50°. Дают слою затвердевать в течение 15 мин
и ставят полученные пластинки на 1 час при 0° в холодильник. За это время антибиотик
диффундирует в агар прежде, чем успевают развиться микроорганизмы. Затем пластинки
помещают в термостат при 37° не менее чем на 16 час. Разделенные антибиотики можно
затем наблюдать в виде желтых зон на коричнево-красном фоне.
5. СНОТВОРНЫЕ СРЕДСТВА
Приведенные в табл. 66 барбитураты были исследованы с использова-
нием многочисленных растворителей [42J. В качестве сорбента особенно под-
ходящей оказалась смесь силикагеля Г и окиси алюминия Г1 : 1 (см. стр. 39).
Таблица 66
Величины hRf барбитуратов [42]
Барбитурат ВуХЮО Барбитурат ВуХЮО
Люминал................
Барбитал ..............
Аллобарбитал ..........
Фанодорм ..............
Проминал ..............
Апробарбитал ..........
39
43
44
45
51
52
Фенобарбитал ...........
Амобарбитал ............
Баитинал ...............
Тиогенал................
Ревонал (не барбитурат)
55
58
67
68
90
Растворитель: циклогексан — изопропанол — 25%-ный аммиак (25+65+10).
Слой: силикагель Г+окись алюминия Г (1 + 1).
При одномерном способе не удается разделить все указанные барбиту-
раты, как в случае хроматографии на бумаге. Однако результаты, получен-
ные с растворителем изопропанол—циклогексан — 25%-ный аммиак (65 +
+ 25 + 10) (см. табл. 66), можно во многих случаях использовать для кон-
трольных анализов препаратов, содержащих комбинации отдельных барби-
туратов. Если к сорбентам добавить неорганические флуоресцирующие ве-
щества (реактив 90 г, з), то в УФ-свете можно обнаружить барбитураты в виде
абсорбционных пятен. В других случаях можно использовать специальные
реактивы для опрыскивания. Поведение большого числа барбитуратов и дру-
гих снотворных было исследовано также и другими авторами [4] с исполь-
зованием растворителя хлороформ — ацетон (90 4- 10) на слоях силикагеля Г
(см. табл. 67, см. также разд. III, стр. 328).
Известные бромсодержащие снотворные — абазин, адалин и бромурал —
полностью разделяются на слоях силикагеля (см. рис. 37).
Методика. По 30 рг отдельных веществ в соответствующем растворителе наносят
на пластинку с силикагелем, полученную стандартным методом с добавлением флуоресци-
рующего вещества (стр. 35). Для удаления растворителя, содержащего пиридин, после
разделения сушат в течение 15 мин при 150°. Снотворное можно обнаружить затем
в УФ-свете (254 мр) в виде абсорбционного пятна; пятна получаются особенно контраст-
ными после хлорирования и опрыскивания раствором толидин — иодид калия (реак-
тив № 32).
Таблица 67
z '
ХТС барбитуратов и других снотворных [4]
Барбитурат ВуХ100 Окраска с нитратом ртути (I)
Эзанина 26—28 Слабо-серая
Нолудар 34—36 Белая
Софтенон 44—46 Белая (в УФ-свете
желтая)
Барбитал 48—50 Черная
Фенобарбитал 53—55 Белая
Циклобарбитал 54—56
Медомин 54—56 »
Амобарбитал 55—57 Черная
Апробарбитал 56—58 »
Перзедон 57—59
Сандоптал 59—61 »
Пентобарбитал 62—64 »
Аллобарбитал 62—64 »
Гидантал 67—69 Белая
Секобарбитал 69—71 Черная
Дориден 77—79 »
Гексобарбитал 84—86. »
Растворитель: хлороформ — ацетон (90+10).
Слой силикагеля Г, из которого на ' мелком сите отсеяны более
крупные частицы, приготовленные стандартным методом (см. стр. 35).
Обнаружение: 1 — после опрыскивания флуоресцеином (реактив
№ 90 в) все вещества можно обнаружить в УФ-свете в виде абсорб-
ционных пятен, 2 — раствор нитрата ртути (I) (реактив № 127).
а Препарат эзании содержит три биологически активных веще-
ства, из которых здесь было идентифицировано только одно.
Таблица 68
Величины hRf некоторых веществ
для местной анестезии на. щелочных слоях
Вещество для местной анестезии ВуХ100
хлороформ — метанол (80+10) циклогек- сан — хлоро- форм — метанол (50+30+10)
Прокаин (новокаин) . . 60 32
Петракаин (пантокаин) 65 32
Бензокаин (анестезин) 74 44
Слой: 25 г силикагеля и 0,5 г флуоресцирующего веще-
ства растирали с 50 мл 0,5 н. NaOH и из зтой массы
обычным способом (стр. 35) готовили 5 пластинок. Слои
сушили в течение 2 час при 120°.
21 Заказ № 734
322
Специальная часть
Для хроматографического разделения многих барбитуратов и «не барби-
туратов» Фрам и сотрудники [13] рекомендуют метод ХТС на слоях силика-
геля Г с растворителем изопропанол — 25%-ный аммиак — хлороформ (45 +
+ 10 + 45). В качестве реактива для опрыскивания используют 1%-ный
раствор нитрата ртути. Ориентировочные значения Rf не приведены.
6. ВЕЩЕСТВА ДЛЯ МЕСТНОЙ АНЕСТЕЗИИ
До настоящего времени проведены лишь предварительные исследования
[14]. При этом установлено, что вещества для местной анестезии дают четкие
пятна на сильно щелочных слоях силикагеля Г, приготовленных с приме-
нением 0,5 н. NaOH вместо воды при использовании приведенных в табл. 68
нейтральных растворителей. Анестезин можно отделить от новокаина и пан-
токаина. При приготовлении пластинок с добавлением 2% флуоресцирую-
щего вещества разделенные компоненты можно обнаружить в УФ-свете
(254 л«р.) в виде темных абсорбционных пятен. Для окрашивания пригодны
диметиламинобензальдегид и реактив Драгендорфа (реактивы № 48,
60а); ср. стр. 329.
7. ГОРМОНАЛЬНЫЕ ПРЕПАРАТЫ
2-Тиоурацил, 3,5-дииод-/-тирозин, «й-тироксин и 2-меркаптобензимидазол
были хроматографически разделены с использованием приведенных в табл. 69
Таблица 69
Величины hRf некоторых гормональных препаратов
в различных растворителях
Препарат НуХЮО
I бутанол — метанол — 5 н. NHs (60 + 20 + 20) II хлороформ — ацетон — бутанол — метанол — 5 н. NHg (20+12+20+ + 20 + 18) III циклогек- сан —аце- тон — пири- дин (40+ + 50+10)
3,5-Дииод-/-тирозин (датская фармакопея 48, правовращающий в 1 н. HCI) 37 41 2
2-Тиоурацил 46 50 53
Трииодтиронин «//-Тироксин (3,5,3',5'-тетра- 50 а _ б _ б
иод-(П-тиронин) 51 51 4
2-Меркаптобензимидазол .... 72 88 70
Дииодтиронин 75 а _ б _ б .
Слой силикагеля Г с добавкой [14] и без добавки [42] флуоресцирующего вещества.
а Данные Д. Вальди [42].
б Данные отсутствуют.
растворителей [14]. Комбинируя два растворителя (I и Щили II и III), эти
вещества удалось отличить друг от друга. Наилучшая форма пятна была
достигнута при применении растворителя II. Возможности обнаружения
видны из табл. 70.
Гл. 15. Лекарственные вещества
323
Таблица 70
Обнаружение некоторых гормональных препаратов [14]
2-Тиоурацил ..........
2-Меркаптобензими да-
зол ..................
3,5-Дииод-/-тирозия
dZ-Тироксия...........
УФ-свет (254 лцх) (реактив № 90г) Реактив Драгендорфа (реактив № 60а) Родамин В (реактив № 129) Иодоплати- нат (реактив № 76)
+ — — . + (Белая ок- раска)
+ + (Оранжевая) + (Синяя) -ь (Белая)
+ — — —
+ — — —
2-Тиоурацил, 3,5-дииодтирозин и di-тироксин растворяли в аммиаке, 2-мер-
каптобензимидазол — в метаноле. Наносили объем, содержащий около 50 цг веще-
ства.
Было исследовано также поведение трииодтиронина и дииодтиронина
в растворителе I [42]. В данном случае обнаружение производится диазоти-
рованной сульфаниловой кислотой (реактив № 37).
8. АДРЕНОМИМЕТИЧЕСКИЕ СРЕДСТВА
Адреналин и норадреналин можно хроматографически разделить, исполь-
зуя в качестве растворителя 70%-ный этанол [38]. Чтобы исключить возмож-
ность изменения вследствие окисления в процессе хроматографического раз-
деления, к сорбенту добавляют бисульфит натрия. После опрыскивания
раствором иода (реактив № 73) еще можно обнаружить в УФ-свете 0,005 цг
каждого из веществ.
Методика. 25 г силикагеля Г растирают с 50 мл буферного раствора Сёренсена
(pH 6,8) при добавлении 500 мг бисульфита натрия, сразу заполняют сосуд для нане-
сения тонких слоев и производят намазывание пластинки. После предварительной сушки
обогреваемым вентилятором пластинки сушат в шкафу при 110°.
Оба вещества можно также разделить после ацетилирввания на пластин-
ках с силикагелем Г, прйменяя нейтральный растворитель [42] (стр. 344).
II» КОМБИНИРОВАННЫЕ ПРЕПАРАТЫ
Опыты по анализу методом ХТС в фармацевтических лабораториях описа-
ны Либихом [21]. Здесь большее значение придается не полному разделе-
нию данных смесей биологически активных веществ одним растворителем,
а быстрой идентификации применяемых лекарственных веществ и смесей
лекарственных веществ путем приготовления нескольких хроматограмм
с различными простыми растворителями и обнаружения соответствующими
реактивами для опрыскивания. Описано обнаружение ацетилсалицило-
вой кислоты, этоксибензамида, этилового эфира n-аминобензойной кислоты,
антипирина, ацетилхолин-гидрохлорида, ..а^инофеназона, кофеина, кодеин-
фосфата, хинин-сульфата, эфедрина, натрийдиэтилбарбитуровой кислоты,
наркотин-гидрохлорида, фенилэтилбарбитуровой кислоты и салициламида.
Хроматографический анализ осуществляли на слоях силикагеля Г, получен-
ных стандартным методом (стр. 35).
21*
Разделение методом ХТС смесей лекарственных веществ
Таблица 77
1 п/п 5К Смесь RyX Х100 Идентификация Сорбент Растворитель Литература и (если известно) форма лекарства, из которого выделено биологически активное вещество
1 Кофеин Бензойная кислота 25 77 УФ (254 лщ) и реак- тив № 30 УФ (254 .ир) и хлорид железа (III) — перекись (реактив № 118) Силикагель Г («Merck») -|-2% флуоре- сцирующего вещества ZS-cynep > («Ridel de Наеп») Хлороформ 80 Циклогексан 20 Ледяная уксусная кислота 10 14, ампулы кофеина с бензоатом натрия (со- держание ампул можно анализировать хромато- графически непосредст- венно)
2 Р-Дифенгидрамин 8-Хлортеофиллин 40 80 УФ (254 м/л) или ре- актив Драгендорфа (№ 60а) То же н-Бутанол 60 Ледяная уксусная кислота 15 Вода 15 14, таблетки
3 З-Бутоксиэтиловый эфир никотиновой кис- лоты Ваниллиламид нонан- карбоновой кислоты 64 , 93 Бромциановое расщеп- ление (реактив № 88) Прочная голубая В (реактив № 61) Силикагель Г Ледяная уксусная кислота 10 Бутанол 90 15, линимент
4 Кофеин Ильвин Изопропилфеназон 30 55 75 Родамин В (реактив № 129) или иодоплати- нат (реактив № 76) То же Хлороформ 60 Циклогексан 30 Диэтиламин 10 42
5 Теофиллин Папаверин 17 50 УФ (254 лщ) Силикагель Г -|-2% флуоресцирующего ве- щества Бензол 80 Этанол 12 15, свечи
Люминал 78
6 N-Ацетил-п-аминофе- нол Кофеин Аминофеназон 23 39 57 Хлорид железа (III)— гексацианоферрат (III) калия (см. стр. 314) Реактив № 30 Хлорид железа (III)— гексацианоферрат (III) калия’(см. стр. 314)
7 Ильвин, З-(бромфенил) N, N-диметиламинопро- панмалеат Кодеин N-Метилэфедрин Фенилдиметилпира- золон 29 40 51 70 i Раствор иода (реактив № 73) и иодоплатинат (реактив № 76) (опры- скивать поочередно)
8 Хлорамфеникол Гидрокортизон Привин, 2(1-нафтил- метил)-Д2-имидазолин- нитрат Ильвин 5 15 35 60 Родамин В (реактив № 129) или иодоплати- нат (реактив № 76)
9 Кофеин Фенацетин Салициламид 16 45 57 Реактив № 30 Хлорид железа (III)— гексацианоферрат (III) калия (см. стр. 314) Хлорид железа (III) (реактив № 62)
ZS-супер Ледяная уксусная кислота 5
Силикагель Г Диэтиламин 5 Метилэтилкетон 85 14, свечи
Силикагель Г Метанол 30 Ацетатный буфер 70 (pH 4,6) 26
То же Диэтиламин 10 Хлороформ 90 42
Силикагель Г +2% флуоресцирующего ве- щества ZS-cynep Метенол 1 Ледяная уксусная кислота 18 Эфир 60 Бензол 120 14, 15, таблетки (мож- но определить еще око- ло 2 цг свободной сали- циловой кислоты)
и и Смесь RfX Х100 Идентификация
9 Ацетилсалициловая 75 Хлорид железа (III)
кислота (реактив № 62)
Салициловая кислота 85 То же
10 Ацетилсалициловая 9 Флуоресцирующие
кислота индикаторы (реактив
Эфедрин 11 № 90) или родамин В
Кодеин 36 (реактив № 129)
Антипирин 46
Кофеин 61
11 а-Бромизовалерил- карбамид (бромурал) 15 УФ (254 alp)
Ацетилбромдиэтилаце- тилкарбамид (абазин) 28
Диэтилдиоксотетра- гидропиридин (перзедон) 44
Фенацетин 74
Аминофеназон 83
12 Витамин Bj 0 Иодоплатинат (реак- тив № 76) или прочная голубая В (реактив № 61)
Витамин Be 15 Дибромхинонхлори- мид (реактив № 40)
Витамин С 30 Иодоплатинат (реак- тив № 76)
Витамин В2 35 УФ (366 Л1|1), желтая флуоресценция
Пантотенат кальция 57 После термического
разложения нингидрин (реактив № 108)
Никотинамид 65 Бромциановое расщеп- ление (реактив № 88)
Биотин 90 Иодоплатинат (реак- тив № 76)
Продолжение табл. 11
Сорбент Растворитель Литература и (если известно) форма лекарства, из которого выделено биологически активное вещество

Окись алюминия Г («Merck») Хлороформ 42
Окись алюминия Г 4-2% флуоресцирующе- го вещества ZS-cynep Хлороформ 14, таблетки (длина пути 12 см)
Силикагель Г Ледяная уксусная кислота 5 Ацетон 5 Метанол 20 Бензол 70 16, таблетки (см. так- же стр. 236)
Гл. 15. Лекарственные вещества 327
При необходимости разработки прописи для анализа лекарственных
препаратов известного состава в лаборатории промышленного контроля
обычно требуется отчетливое разделение определяемых компонентов с ис-
пользованием всего разделительного пути. При этом в случае разделения
сложных смесей, например приведенного в табл. 71 поливитаминного пре-
парата, необходимо провести многочисленные предварительные опыты
с учетом изложенных выше теоретических основ (стр. 81). При получении
большого числа хроматограмм их переносят на кальку, как описано на
стр. 50, и путем сравнения таких копий находят подходящие условия разде-
ления. Важным предварительным условием является выбор соответствую-
щего .экстрагента для отделения смеси биологически активных веществ от
вспомогательных лекарственных веществ. Следует, по возможности, исполь-
зовать нейтральный растворитель или смесь растворителей с низкой темпе-
ратурой кипения, чтобы избежать изменения разделяемых веществ в про-
цессе экстракции и при нанесении на тонкослойные пластинки. С другой
стороны, при выборе экстрагента следует обратить внимание на то, чтобы
экстрагируемые при этом вспомогательные вещества не мешали хроматогра-
фическому разделению. Это обстоятельство было подробно обсуждено Нус-
баумером [29] при испытании пенициллиновых препаратов.
В отношении наносимого количества разделяемых веществ необходимо
учесть следующее: поскольку комбинация лекарств заранее задана, следует
нанести такое количество, чтобы после разделения можно было отчетливо
идентифицировать наиболее трудно уловимые компоненты. Если количествен-
ное соотношение веществ хуже чем 1 : 10, то целесообразно нанести несколь-
ко проб с различной концентрацией. Объем растворителя, в котором раство-
рено биологически активное вещество, должен составлять 0,002—0,010 мл.
В табл. 71 приведено разделение комбинаций лекарственных веществ,
разработанное с учетом изложенных соображений. В то время как состав
приведенных растворителей должен строго выдерживаться, данных в отноше-
нии идентификации можно придерживаться лишь приблизительно.
Важное значение имеют следующие указания в отношении формы лекарств и мето-
дов экстракции.
Смесь 7 (см. табл. 71): сок ильвико «Merck». Состав:
фосфорнокислый кодеин...................................................10 мг
ильвин................................................................ 3 мг
(1-(2'-пиридил)-1-(п-бромфенил)-3-диметиламинопропан)-Х-метил эфедрин
солянокислый......................................................7,5 мг
себион (аскорбиновая кислота) .....................................50 мг
фенилдиметилпиразолон.................................................150 мг
салицилат натрия в 5 мл сока ..................................... 50 мл
При таком составе содержание фосфорнокислого кодеина, ильвина и N-метилэфед-
рина (после извлечения оснований раствором щелочи и разделения методом ХТС на
слое силикагеля) можно определить способом визуального сравнения с эталонными
количествами отдельных биологически активных веществ, наносимыми на те же пла-
стинки (ср. стр. 55). При извлечении часть фенилдиметилпиразолона также переходит
в неорганическую фазу и может быть качественно обнаружена наряду с анализируе-
мыми компонентами. Фенилдиметилпиразолон можно определить объемноаналитическим
методом, аскорбиновую кислоту и салицилат натрия — колориметрическим методом.
Смесь 5. Эта комбинация содержится в основной массе ректальных свечей с витеп-
солом Н. Чтобы выделить биологически активное вещество, кусочки растворяют при
нагревании в смеси воды и метанола (20 + 80); смесь вымораживают при многочасовом
стоянии в холодильнике и центрифугируют.
Смесь 3. Биологически активные вещества содержатся в жидких мазях, используе-
мых при лечении ревматизма. Из соответствующего количества мази готовят суспензию
в метаноле и наносят на место старта.
Смесь 12. Длина пути, проходимого растворителем, для достижения полного разде-
ления должна составлять около 19 см. Для однозначной идентификации всех компонен-
тов следует получить 2 хроматограммы. Хроматографическое разделение проводят в тем-
ноте. Относительно дальнейших подробностей метода и других возможностей разде-
ления водорастворимых витаминов см. гл. 12.
328
Специальная часть
Ш. ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА ХТС В ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИХ
ИССЛЕДОВАНИЯХ
Махата [23] описал разделение различных лекарственных веществ, исполь-
зуемых для токсикологических и клинических целей. Чтобы осуществить
указанное разделение, алкалоиды должны быть в виде свободных основа-
ний, а кислые яды — в виде свободных кислот. Поэтому для хроматографи-
ческого разделения производят извлечение в делительной воронке по методу
Стаса — Отто. Хроматографический анализ осуществляют на пластинках
силикагеля Г, полученных с помощью описанного в оригинальной работе
вспомогательного устройства для намазывания. Использованные расворители
и исследованные вещества приведены в табл. 72.
Таблица 72
Величины hRf при разделении различных лекарственных веществ
в токсикологических исследованиях [23]
Вещество Ку X 100 в мета- ноле Вещество Ку X 100 в смеси хлоро- форм— эфир (85 + 15)
Дилаудид 14 Салициловая кислота . . 9
Первитин 16 • Теофиллин 20
Гептадой 18 Антипирин 30
Морфин 23 Пирамидон 36
Кодеин 26 Кофеин 38
Долантин 36 Теобромин 40
Прелудин 38 Люминал 42
Никотин 50 Фенацетин 45
Антипирин . 67 Веронал 48
Пирамидон . 67 Фанодорм 48
Наркотин 69 Аллилизопропилбарбиту-
Папаверин 73 рат 50
Диал 54
Адалин 67
Методика. 30 г силикагеля Г «Merck» встряхивают с 60 мл воды и намазывают стек-
лянные пластинки, используя упомянутое приспособление. Толщина мокрого слоя состав-
ляла 0,27 мм, сухого — 0,25 мм. После сушки в течение 30 мин при 100° пластинки
активируют. После нанесения проб основные вещества разделяют метанолом, а кислые,
полученные по методу Стаса — Отто, — смесью хлороформ — эфир (85 + 15). При
хроматографическом разделении сложных смесей длина пути составляла 14 см.
В качестве реактивов для опрыскивания использовали: 1) реактив Драгендорфа,
2) раствор иода и йодистого калия в ледяной уксусной кислоте (для алкалоидов), 3) рас-
твор уксусной кислоты и перманганата калия (для восстановленных веществ), 4) раствор
флуоресцеина (Na-соль) (для обнаружения веществ, поглощающих УФ-излучение),
5) уксуснокислый раствор хлористого железа (для пиразолонов), 6) реактивы Цвиккера
(для барбитуратов).
В качестве примера приведено обнаружение алкалоидов опия в содержи-
мом желудка (см. также алкалоиды, стр. 288). Этим же методом растворите-
лем хлороформ — эфир (85 + 15) Махатой и Киссером [24] были разделены
производные гидантоина (фенилэтилгидантоин hRf 15, дифенилгидантоин
hRf 25 и N-метилфенилэтилгидантоин hRf 45).
Боймлер и Рипштейн [4] описали анализ методом ХТС алкалоидов и ле-
карственных веществ основного характера (табл. 73), а также алкалоидов
Гл. 15. Лекарственные вещества
329
опия и синтетических заменителей (табл. 74), в особенности для токсиколо-
гических целей. В обоих случаях использовали смесь метанол — ацетон —
триэтаноламин (50 + 50 + 1,5).
Таблица 73
Анализ методом ХТС алкалоидов и лекарственных веществ
основного характера [4]
Вещество Rf X 100 Обнаружение и окраска
УФ-свет реактив Драгендорфа (реактив № 60а) раствор FeCls (реактив № 62)
Атропин 15—19 — Фиолетовая
Бруцин 16—18 — Оранжевая
Стрихнин 18—20 Темная »
Хинин 55—57 Светящаяся свет- ло-синяя Красная
Риталин 55—57 — »
Никотин 56—58 Темная Красно-фио- летовая
Новокаин 58—60 — Оранжевая
Кокаин 60—62 — »
Прокаин 60—62 — Красная
Новезин 60—62 Синяя ' Оранжевая
Кофеин 68—70 — —
Антипирин 70—72 Темная Оранжевая Оранжевая
Дипирин 74—76 » Фиолетовая Красно-фио- летовая
Изопропилантипирин . . . 83—85 » Красная Бледно-жел- тая
Резерпин 85—87 Светящаяся зе- леная Желтая
Слой силикагеля Г, из которого на мелком сите отсеяны более крупные частицы, приготов-
ленный стандартным методом.
Длина пути 10 см.
Растворитель: метанол — ацетон — триэтаноламин (50 + 50 + 1,5).
Из исследуемых объектов готовят виннокислые и щелочные экстракты и обрабаты-
вают их в делительной воронке эфиром. Если подозревают наличие производных мор-
фина, то после кислого извлечения в делительной воронке эфиром его обрабатывают
аммиаком и в течение 30 мин кипятят с обратным холодильником с хлороформом. Оста-
ток, полученный после отгонки эфира и хлороформа, растворяют в 1 мл метанола или
метиленхлорида и аликвотную часть (1/1000, 1/100, 1/20) наносят на точку старта.
Боймлер [2] также описал встречающиеся на практике различные при-
меры использования ХТС. Так, в одном случае самоубийства в содержимом
желудка после извлечения эфиром с примесью серной кислоты было найдено
снотворное (дориден). В моче отравленного человека методом ХТС в кислом
эфирном экстракте была найдена изобутилаллилбарбитуровая кислота,
в щелочном эфирном экстракте — пирамидон, два компонента препарата
опталидона. При анализе найденных таблеток на компоненты опия спирто-
вый экстракт сравнивался со спиртовой вытяжкой из порошка опия, а так-
же с папаверином, наркотином, кодеином, тебаином, морфином и эфедрином.
В содержимом таблеток были определены опий, ипекакуана и эфедрин.
Метод ХТС был использован также и другими авторами для определения
наркотических веществ в моче и в ампулах [41].
330
Специальная часть
Таблица 74
Анализ методом ХТС алкалоидов опия и синтетических
заменителей [4]
Вещество By X 100 Обнаружение и окраска
УФ-свет реактив Драгендорфа
Нарцеин 22—24 Синяя Фиолетовая
Декстрометорфан 22—24 — Красная
Леворфанол 27—29 — »
Дигидроморфинон 27—29 Темная Желтая
Дигидрокодеинон 28—30 — Оранжевая
Тебакон 29—33 Желтоватая »
Этилморфин 36—38 — Красная
Морфин 39—41 Темняя Оранжевая
Тебаин 40—42 » Красная
Кодеин 42—44 — ?>
Метадон (поламидон) 47—49 — »
Кетобемидон 55—57 Темная Оранжевая
Петидин 55—57 — Красная
Наркотин 81—83 Светящаяся синяя Оранжевая
Папаверин 81—83 Светящаяся желтая
Декстроморамид 86—88 — »
Слой силикагеля Г, из которого на мелком сите отсеяны более крупные частицы,
приготовленный стандартным методом.
Длина пути 10 с.и.
Растворитель: метанол — ацетон — триэтаноламин (50 + 50 4- 1,5).
Видик [39] отделил от других наркотических веществ декстроморамид
(2,2-дефенил-3-метил-4-морфолинобутирилпирролидин) различными метода-
ми хроматографии на бумаге и дополнительно исследовал его методом ХТС
на пластинках с силикагелем (см. табл. 75).
Таблица 75
Анализ методом ХТС декстроморамида и других наркотических
веществ [39]
Вещество By X 100 Вещество Ву X 100
Ромилар (декстрометорфан) 26 Тикарда 59
Поламидон 42 Декстроморамид 85
Слой силикагеля Г, приготовленный стандартным методом (стр. 35).
Растворитель: 1 н. раствор NH3 в метаноле.
Метод ХТС Видик и Шютте [40] использовали также в качестве дополне-
ния к бумажнохроматографическому методу анализа свыше 70 токсиколо-
гически важных основных отравляющих и лекарственных веществ.
Применяя описанный метод извлечения в делительной воронке и повтор-
ной экстракции, можно достичь предварительного эффективного разделения
Гл. 15. Лекарственные вещества
331
и осуществить анализ, используя весьма небольшое количество исследуемого
материала. Для идентификации 16 различных болеутоляющих веществ
в пробах мочи Кохии и Дали [7а] рекомендуют слои силикагеля Гиб рас-
творителей.
Об анализе методом ХТС инсектицидов см. стр. 361.
IV. ПРОВЕРКА СТАБИЛЬНОСТИ ЛЕКАРСТВ МЕТОДОМ ХТС
При создании лекарственного препарата огромное значение имеет его
стабильность. Чтобы согласовать свойства вещества носителя с особыми
свойствами биологически активных веществ, важно знать поведение этих
веществ при различных значениях pH и отношение к окислителям, действию
света и т. д. Для этого растворяют вещества в соответствующих растворите-
лях и подвергают их действию определенных условий при различных тем-
пературах. Через определенные интервалы времени отбирают пробы, которые
можно быстро анализировать методом ХТС качественно, а при соответствую-
щей постановке опыта и количественно (стр. 52). Таким образом можно изу-
чить кинетику превращения биологически активного вещества. Поскольку
на хранение готовых препаратов оказывают влияние и другие факторы,
затрудняющие расчет длительности хранения, необходимо испытать гото-
вый препарат при различных температурах хранения. Через определенные
интервалы времени само лекарственное вещество или его экстракт хромато-
графируют и оценивают полученные результаты с помощью специальной
пробы на биологическую активность.
1. ИСПЫТАНИЕ НА СТАБИЛЬНОСТЬ ЛЕКАРСТВ, СОДЕРЖАЩИХ
ЭФИР НИКОТИНОВОЙ КИСЛОТЫ
Благодаря возможности чувствительного и селективного обнаружения
пиридина хлор- или бромцианом, когда после раскрытия кольца образуется
глутаконовый альдегид, конденсирующийся с первичными ароматическими
аминами с образованием окрашенных оснований Шиффа, методом ХТС можно
хорошо определить многие производные пиридина.

сн
V +2Н2О
СгГ^Вг
сн
нс сн
I II +2NH2R
о=сн снон
I
о=сн
сн
II +NH,CN + HBr
снон
сн
// X
нс сн
I II +2Н2О
RN=CH CHNHR
II
Эту цветную реакцию в сочетании с методом ХТС использовали для опре-
деления стабильности эфиров и амида никотиновой кислоты в фармацевти-
ческих препаратах. Наряду с другими была проверена стабильность 3-бу-
токсиэтилового эфира никотиновой кислоты в мазях, причем непрореаги-
ровавший эфир и образующаяся при омылении свободная никотиновая кис-
лота были разделены методом ХТС и наличие обоих было доказано описанной
выше цветной реакцией [15].
Методика. Тонкослойные пластинки готовят обычным методом (стр. 35). Мазь экстра-
гируют ацетоном, линимент — метанолом, фильтруют и наносят на пластинку с сили-
332
Специальная часть
нагелем Г пробу экстракта, содержащую около 100 |гг смеси биологически активных
веществ. Растворитель: н-бутанол — ледяная уксусная кислота (10 + 1). Длина пути
10 см. После разделения пластинку подвергают действию паров бромциана и опрыски-
вают 0,05%-ным раствором бензидина в 2 и. уксусной кислоте. З-Бутоксиэтиловый эфир
никотиновой кислоты окрашивается в красный цвет, никотиновая кислота — в корич-
невый.
2. ИСПЫТАНИЕ НА СТАБИЛЬНОСТЬ ЛЕКАРСТВ, СОДЕРЖАЩИХ
ЭФИРЫ ФЕНОЛА
Интересным примером испытания эфиров на стабильность является испы-
тание лекарств, содержащих (4,4'-диацетоксидифенил)-(пиридил-2)метан
(дульколакс), причем методом ХТС удалось отделить от неомыляемого ве-
щества наряду с деацетилированным веществом и полуэфир [15].
Методика. Из ацетоновых или этанольных экстрактов лекарственных веществ нано-
сят пробы, содержащие около 100 |гг дульколакса, на тонкослойные пластинки, при-
готовленные стандартным методом с добавкой флуоресцирующего вещества. Растворитель:
ксилол — метилэтилкетон (1 + 1). Высота подъема 10 см. Количественный промер осу-
ществляют в УФ-свете (254 лщ). Частично омыленный дульколакс дает три пятна, в то
время как сам дульколакс и полностью деацетилированное соединение дают только одно
однородное пятно. Для контроля пятно экстракта на старте опрыскивают концентриро-
ванным аммиаком и нагревают пластинку до 100°.
3. ИСПЫТАНИЕ НА СТАБИЛЬНОСТЬ ЛЕКАРСТВ, СОДЕРЖАЩИХ
СТЕРОИДНЫЙ ЭФИР [14]
Используя растворитель этилацетат — ксилол — метанол (90 + 5 + 5),
можно отделить кортикостероидные спирты от их 21-эфиров (рис. 137).
На более толстых слоях силикагеля Г (500 ц) достигается несколько лучшее
Рис. 137. Разделение гидрокорти-
зонового спирта и ацетата раствори-
телем этилацетат — ксилол — мета-
нол (90 + 5 + 5) на пластинках с си-
ликагелем Г (толщина слоя 500 ц)
[14].
1 — гидрокортизонацетат; 2 — гидрокор-
тизоновый спирт; G — смесь.
разделение, чем на слоях нормальной толщины. Если содержание образую-
щейся при омылении спиртовой части превышает 10%, то после разделения
методом ХТС имеется возможность экстракции (см. стр. 59) с последующим
количественным определением в УФ- или в видимой области после окраши-
вания соединениями тетразолия. Этот метод особенно интересен, поскольку
другие известные до настоящего времени методы требуют большой затраты
времени и связаны с ошибками. Копе [8] указал на затруднения, возникаю-
щие при разделении методом хроматографии на бумаге и последующем коло-
риметрическом определении. Если образующаяся спиртовая часть состав-
ляет менее 10%, то достаточно хорошие результаты можно получить, исполь-
зуя визуальный сравнительный метод (см. стр. 55).
Гл. 15. Лекарственные вещества
333
Методика. Исследуемое лекарственное вещество экстрагируют этанолом. Для полу-
чения пяти пластинок (20 X 20 см) с толщиной слоя около 500 р, следует приготовить
гомогенную массу из 50 г силикагеля Г, 1 г флуоресцирующего вещества ZS-cynep и
104 мл воды и использовать прибор для нанесения тонких слоев, описанный на стр. 17.
После схватывания слоев силикагеля на воздухе и сушки в течение 1 час при 120° плас-
тинки следует перед употреблением выдержать 4 час над КОН. Растворитель: этилацетат—
ксилол — метанол (90 + 5 + 5), «камера с насыщением» (стр. 24), высота подъема 14 см.
Пятна можно затем обнаружить в УФ-свете и количественно определить, как описано
выше (ср. стр. 61).
Разделение возможно также с использованием других растворителей [5].
4. ИСПЫТАНИЕ НА СТАБИЛЬНОСТЬ ПРОИЗВОДНЫХ
АМ70-ОКСИЭСТРЕНА
Таблетки лекарств, содержащих стероиды основной формулы I (4-эстрен-
17р~ол), в которой R представляет собой алкил (аллил, пропил, этил или
этинил), после хранения в различных условиях исследовали методом ХТС
на слоях силикагеля Г, приготовленных стандартным методом [12].
_ОН
•R
В качестве растворителя использовали смесь гептан — ацетон (90 + 10).
Из приведенных в работе фотографий хроматограмм отчетливо видно, что
при неблагоприятных условиях хранения исследуемые вещества быстро
разлагаются с образованием многочисленных продуктов разложения. Распад
существенно зависит от характера 17-алкилгруппы, и его скорость можно
регулировать добавкой антиокислителей.
5. ИСПЫТАНИЕ НА СТАБИЛЬНОСТЬ ЛЕКАРСТВ. СОДЕРЖАЩИХ АМИД
НИКОТИНОВОЙ КИСЛОТЫ
Как и в случае эфиров никотиновой кислоты, можно провести испытание
лекарств, содержащих амид никотиновой кислоты (пилюли комбионта,
ампулы никобион, капли мультибионта, пилюли гормогеробион и ампулы
полибион) [27].
С помощью эталонных смесей вначале была найдена граница определе-
ния никотиновой кислоты в присутствии амида никотиновой кислоты при
анализе методом ХТС. В смеси, состоящей из 10 цг амида и 0,1 цг свободной
кислоты, кислота еще может быть обнаружена.
Методика. Объем экстракта, содержащий 5—10 иг амида никотиновой кислоты,
наносят на слой силикагеля Г, высушенный на воздухе и приготовленный стандартным
методом (стр. 35). Растворитель: н-пропанол— 10%-ный раствор аммиака (95 4- 5); обна-
ружение: реактив № 88. При 60—70 образуются оранжево-красные пятна (амид
никотиновой кислоты), а при hltf 35 — красные пятна (никотиновая кислота).
6. ИСПЫТАНИЕ НА СТАБИЛЬНОСТЬ ДЕЦЕНТАНА,
[1-(2-ОКСИЭТИЛ)-4-(3-ХЛОР-Ю-ФЕНОТИАЗИЛ)-ПРОПИЛ ПИПЕРАЗИНА]
Спиртовые и водные растворы этого нейролептического средства чув-
ствительны к свету. Поэтому на хроматограммах растворов децентана, под-
вергнутых длительной экспозиции на свету, обнаруживают децентансульфо-
ксид и неизвестное соединение в качестве продуктов разложения [26].
334
Специальная часть
Методика. Слой силикагеля Г, полученный стандартным методом (стр. 35). Величина
пробы около 20 рг децентана. В процессе разделения вещество предохраняют от даль-
нейшего разложения, обертывая разделительную камеру бумагой. Растворитель: н-бута-
нол — ледяная уксусная кислота — вода (4 4- 1 + 1). Длина пути 14 см. После разде-
ления хроматограмму опрыскивают смесью га-диметиламинобензальдегид — серная кис-
лота с добавкой FeCl3. В центре хроматограммы обнаруживают непрореагировавший
децентан, ниже — неидентифицированный продукт разложения и вблизи точки старта —
децентансульфоксид.
7. ИСПЫТАНИЕ НА СТАБИЛЬНОСТЬ
1-К-МЕТИЛПИПЕРИДИЛ-(4')-ПИРАЗОЛОНОВ
Чувствительность к окислению 1-Х-метилпиперидил-(4')-3-фенил-4-окси-
4-бензилпиразол-5-она (I) была исследована Джукером и Линдеманом [19].
При длительном стоянии раствора этого соединения в 75 %-ном этаноле или
Ори взаимодействии с перекисью водорода щелочного раствора I в реакцион-
ной смеси образуется вещество, которое можно отделить от исходного на
пластинках окиси алюминия, приготовленных стандартным методом (стр. 35),
применяя в качестве растворителя аммиачную смесь изопропанол — диоксан
(50 + 100). При изучении химических свойств, ИК-спектров и применении
методов синтеза удалось выяснить, что N-оксид при этом не образуется и рас-
крытия кольца не происходит. Имеет место гидроксилирование в положе-
нии 4 при сохранении исходного заместителя.
ОН
Выделенное из спиртового и щелочного растворов вещество II и синтети-
чески полученное соединение обнаружили при разделении методом ХТС оди-
наковые свойства.
8. РАСЩЕПЛЕНИЕ ЛИБРИЯ (МЕТАМИНОДИАЗЭПОКСИДА)
В КИСЛОЙ СРЕДЕ
Боймлер и Рипштейн [3] сумели выделить образующееся при обработке
либрия (I) водным раствором соляной кислоты желтое вещество, которое
на основании физико-химических свойств можно идентифицировать как
2-амино-5-хлорбензофенон (II).
Гл. 15. Лекарственные вещества
335
При анализе методом ХТС на слоях силикагеля Г были получены сле-
дующие значения:
Ву X 100
метанол — ацетон — триэтанол-
амин (10 + 10 + 0,3)
бензол
Либрий.................85 О
Продукт расщепления . . 80 50
Либрий окрашивается реактивом Драгендорфа, а продукт расщепления
не реагирует ни с реактивом Драгендорфа, ни с раствором .и-динитробен-
зола или хлорида железа. Но после диазотирования и сочетания с р-нафто-
лом можно определить уже небольшие количества. Расщепление кислотой
можно использовать для обнаружения в моче или крови небольших количеств
либрия после обработки кислотой и щелочной эфирной вытяжки.
9. ИСПЫТАНИЕ НА СТАБИЛЬНОСТЬ ПРЕПАРАТОВ,
СОДЕРЖАЩИХ АЛКАЛОИДЫ СПОРЫНЬИ (Guttae Secalis «Stada»)
При этом удалось методом ХТС количественно проследить за процессом
изомеризации алкалоидов при хранении в течение многих недель [20]:
эргометрин
эрготамин
эргокристин
эргометринин
эрготаминин
эргокристинин
Для определения алкалоидные основания переводили в свободное состояние
добавкой бикарбоната и извлекали метиленхлоридом. После упаривания
определенный объем раствора наносили в виде полосы на слои силикагеля Г.
Зоны алкалоидов, видимые по собственной флуоресценции в УФ-свете,
после хроматографирования соскабливали с пластинок," элюировали и ко-
лориметрически определяли содержание вещества в элюате, добавляя соот-
ветствующий реактив (см. стр. 54 и 292).
ЛИТЕРАТУРА
1. Baehler Вт., Helv. Chim. Acta, 45, 309 (1962).
2. Baumler J., Praxis, 50, 841 (1961).
3. Baumler J., R i p p s t e i n S., Helv. Chim. Acta, 44, 2208 (1961).
4. Baumler J., Rippstein S., Pharm. Acta Helv., 36, 382 (1961).
5. Beijleveld W. M., Pharm. Weekbl., 97, 190 (1962).
6. В r a v о R. O., Hernandez F. A., J. Chromatog., 7, 60 (1962).
7. Cerri O., Maffi G., Boll. chim. farm., 100, 940 (1961).
7a. С о c h i n J., D a 1 у J. W., Experientia (Basel), 18, 294 (1962).
8. С о p e C. L., Quantitative Paper Chromatography of Steroides, S. 18, Cambridge,
University Press, 1960.
9. D h о n t J. H., R о о у C. d e, Analyst, 86, 527 (1961).
10. Fiori A., Marigo M., Nature, 182, 943 (1958).
11. Fischer R., Lautner H., Arch. Pharm., 294/66, 1 (1961).
12. F о k k e n s J., Poldermann J., Pharm. Weekbl., 96, 657 (1961).
13. Frahm M., Gottesleben A., So eh ring K., Arzneimittel-Forsch., 11,
1008 (1961).
14. Ganshirt H., неопубликованные данные.
15. Ganshirt H., Malzacher F., Arch. Pharm., 293/65, 925 (1960).
16. Ganshirt H., Malzacher F., Naturwiss., 47, 279 (1960).
17. Harri E., Loeffler W., Sigg H. P., Stahelin H., Stoll Ch.,
Tamm Ch., Wiesinger D., Helv. Chim. Acta, 45, 839 (1962).
336
Специальная часть
18. Н a i s J. М., М асек К., Handbuch der Papierchromatographie I, S. 614, Jena,
VEB Gustav Fischer Verlag, 1958.
19. J u с к e r E., Lindemann A., Helv. Chim. Acta, 44, 1249 (1961).
20. Klavehn M., Rochelmeyer H., Seyfried J., Deut. Apotheker
Ztg., 101, 75 (1961).
21. L i e b i c h H., Deut. Apotheker Ztg., 99, 1246 (1959) und 100, 393 (1960).
22. L у m a n R. L., Livingston A. L., Bickoff E. M., Booth A. N., J.
org. Chem., 23, 756 (1958).
23. M acha t a G., Mikrochim. Acta, 1960, 79.
24. M achat a G., Kisser W., Arch. Toxicol., 19, 327 (1962).
25. N i с о 1 a u s B. J. R., Corone Hi С., В i n a g h i A., Il Pharmaco. Ed. Pr.
16, 349 (1961).
26. Nurnberg E., Arch. Pharm., 292/64, 610 (1959).
27. Niirnberg E., Deut. Apotheker Ztg., 101, 142 (1961).
28. Nussbaumer P. A., Pharm. Acta Helv., 37, 65 (1962).
29. Nussbaumer P. A., Pharm. Acta Helv., 37, 161 (1952).
30. Pastuska G., T rinks H., Chemiker Ztg., 85, 535 (1951).
31. P a s t u s к a G., Z. anal. Chem., 179, 427 (1961).
32. Pastuska G., Petrowitz H.-J., Chemiker Ztg., 86, 311 (1962).
33. Petrowitz H.-J., Materialpriifung, 2, 309 (1960).
34. Ragazzi E., Boll. Chim. Farm., 100, 402 (1961).
35. S e n s i P., Coronelli C., Nicolaus B. J. R., J. Chromatog., 5, 519 (1961).
36. Stahl E., Pharm., Rundschau 1, № 2, 1 (1959).
37. S t a h 1 E., Parfiimerie und Kosmetik, 39, 564 (1958).
38. Teichert K., Mutschler E., Rochelmeyer" H., Deut. Apotheker
Ztg., 100, 283 (1960).
39. Vidic E., Arch. Toxikol., 19, 254 (1961).
40. Vidic E., Schutte J., Arch. Pharm., 295, 342 (1962).
41. Volksen W., Krankenhaus-Apotheker, 11, 5 (1961), Beilage zur Deut. Apotheker
Ztg.
42. W a 1 d i D., неопубликованные данные.
43. W о 11 i s h E. G., Schmall M., Hawrylyshyn M., Anal. Chem., 33,
1138 (1961).
ГЛАВА 16
АНАЛИЗ МЕТОДОМ ХТС В КЛИНИЧЕСКОЙ
ДИАГНОСТИКЕ И ФАРМАКОЛОГИИ
Д. Валъди
I. ВВЕДЕНИЕ
В медицинских исследовательских лабораториях весьма необходимы
простые и надежные микрометоды определения изменений в обмене веществ.
Анализы следует проводить быстро и серийно. С зтой точки зрения ока-
зался подходящим метод хроматографии на бумаге, нашедший применение
в медицинских лабораториях сразу после того, как были успешно разделены
смеси аминокислот. Ценным вспомогательным диагностическим средством
при разделении ионогенных смесей оказался затем и электрофорез (ионофо-
рез) на различных слоях носителей *. Этот метод нашел широкое примене-
ние благодаря высокой эффективности процесса разделения белков. Для
количественного расчета состава разделенных смесей, нанесенных в виде
полос, используют регистрирующие фотоэлектрические приборы.
Для быстрого разделения липидов, содержащихся в небольших количе-
ствах во всех жидкостях организма и в больших количествах в экстрактах
органов, в настоящее время нет какого-либо стандартного метода. Здесь
существенную помощь оказывает анализ методом ХТС. Однако не только
липиды, но и представляющие интерес с медицинской точки зрения классы
гидрофильных веществ, например аминокислоты, нуклеиновые кислоты
Исходный материал Возможности определения
Моча Кровь (сыворотка) Кал Другие жидкости организма (секреты) Экстракты органов Микроорганизмы Жиры (стр. 140) Витамины (стр. 212) Стерины, стероиды, желчные кислоты (стр. 249) «Простые» индольные производные (стр. 295) Производные порфирина [1] Аминокислоты, амины, протеины (стр. 392) Нуклеиновые кислоты, нуклеотиды (гл. 20) Сахара (гл. 21)
и сахара, методом ХТС анализируются легче и быстрее, чем каким-либо
другим методом.
В ряде глав уже приведены примеры разделения групп веществ, важных
также для установления медицинского диагноза. Следующая сводка пока-
* Ориентировочные опыты по электрофорезу при высоком напряжении показы-
вают, что слои силикагеля Г и кизельгура Г обеспечивают более быстрое и лучшее раз-
деление отдельных полос, чем слои ацетата [3] (см. по этому поводу стр. 32).
22 Заказ № 734
338
Специальная часть
зывает возможности применения ХТС в клинической диагностике и фарма-
кологии. Предварительным условием при этом является изучение оптималь-
ных методов обогащения (см., например, холестерин, холестериновые эфиры,
стр. 255) и затем качественное и количественное сравнение на большом числе
нормальных и патологических случаев.
В этой главе будут описаны специа'льные методы ХТС, применяемые при
диагнозах, и стандартные условия, не рассмотренные достаточно подробно
в других главах. Поскольку метод ХТС.можно использовать также для изу-
чения продуктов превращения лекарств в организме и для выявления проис-
ходящих при этом изменений в обмене веществ, рассмотрены соответствую-
щие работы. Вследствие короткого времени развития метода ХТС здесь будут
приведены лишь некоторые прописи и соображения.
П. ПРОДУКТЫ ВЫДЕЛЕНИЯ В МОЧЕ
1. ВЕЩЕСТВА, НАХОДЯЩИЕСЯ В ОРГАНИЗМЕ (СТЕРОИДЫ)
а) Наблюдение за овариально-менструальным циклом
5,0
4,5
4,0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 Ани
Рис. 138. Физиологические изменения в про-
цессе овариально-менструального цикла (по
Нибургсу).
а — гонадотропные гормоны (и фолликулостиму-
лирующий гормон, ЕЗ гормон желтого тела);
б — активность яичников; в — эстрогены; г — про-
гестерон; д — эндометрий; е — содержание глико-
гена в тканях влагалища; ж — pH влагалищного
секрета.
В отдельные периоды овариально-менструального цикла в организме
образуются различные стероидные гормоны, что регулируется гипофизом.
Установленные в настоящее время
закономерности изображены на
рис. 138.
В секреционной фазе можно
обнаружить максимум выделения
прогестерона (примерно на 21-й
день). Одновременно прогестерон
выделяется с мочой в форме своих
метаболитов — прегнандиолглюку-
роната и аллопрегнандиолглюку-
роната. День максимума образо-
вания и высота максимума для
прогестерона и выделяемого в мочу
прегнандиола претерпевают инди-
видуальные колебания, обуслов-
ленные биологическими особенно-
стями. Гинекологов интересуют
в первую очередь осложнения, ко-
торые можно обнаружить по уве-
личению или уменьшению выде-
ления прегнандиола. Методом ХТС
можно легко и быстро количест-
венно определить прегнандиол и
другие стероиды во время цикла
[6].
Проба на цикл аналогична опи-
сываемому ниже испытанию на
беременность. При наблюдении за
изменением протекания цикла че-
рез каждые 4 дня исследуют сте-
роидные выделения и получают
хроматограмму, приведенную на
рис. 139.
Наконец, следует указать, что определение прегнандиола при известных
условиях является полезным указанием начала беременности [4]. При
Гл. 16. Анализ методом ХТС в клинической диагностике и фармакологии 339
таких исследованиях следует иметь в виду, что, с одной стороны, смеси эстро-
ген — гестаген в виде таблеток прописываются в качестве диагностического
средства при определении беременности и, с другой стороны, различные сте-
роиды используются в качестве противозачаточных средств. Вследствие это-
го, естественно, в той или ийой мере нарушается нормальное стероидное
Рис. 139. Обнаружение ненормально высокого выделения прегнандиола во время
овариально-менструального цикла.
Примерно через каждые 4 дня получали экстракт: 1—4 дня; 2—8 дней, з—13 дней; 4 — 16 дней;
5 — 21 день; 6 — 24 дня; 7 — эталонный раствор прегнандиола. Сорбент силикагель Г; раствори-
тель хлороформ — ацетон (90 4- 10); время анализа 30 мин', обнаружение: опрыскивание фосфорной
кислотой, затем фосфорномолибденовой кислотой.
было определено содержание прегнандиола и аллопрегнандиола при введе-
нии в организм веществ, содержащих эстроген, а также при лечении корти-
зоном при беременности; при этом в повышенном количестве выделяется
ряд других стероидов, например прегнантриол. Следует, однако, заметить,
что подобные опыты находятся на самой начальной стадии и еще многое
необходимо выяснить.
б) Определение ранней стадии беременности
Из многочисленных опубликованных в течение длительного периода
времени биологических и химических проб на симптомы беременности лишь
немногие могут быть использованы на практике. Известные биологические
методы Ашхейма-Зондека (мыши), Зульмана и Блека, а также Купермана
и Гринблата (кролики) и, наконец, Галли-Майнини (жабы) основаны на опре-
делении больших количеств гонадотропного гормона. Эти биологические
методы требуют подопытных животных, уход за которыми довольно дорог,
кроме того, для определения требуется от 2 до 100 час (при этом чувствитель-
ность довольно различна); всегда следует учитывать определенную процент-
ную долю ошибок.
Согласно описываемому ниже определению раннего периода беременности
методом ХТС, в моче беременных обнаруживается повышенное количество
прегнан-За,20а-диола и аллопрегнан-3а,20с«-диола.
Через несколько дней (5—8) после зачатия содержание прегнандиола
в моче значительно превышает максимальное содержание в секреционной
фазе, затем оно непрерывно увеличивается и лишь к концу периода беремен-
ности начйнает падать. Если проанализировать полученные данные, то сле-
22*
340
Специальная часть
дует признать, что этот тест является исключительно надежным. Надежность
показаний 99—100% была подтверждена на основании примерно 800 про-
веденных опытов.
МЕТОДЫ [5, 6]. а) ГИДРОЛИЗ И ЭКСТРАКЦИЯ ИЗ МОЧИ
Для стандартных определений достаточно 25 мл мочи. В начале работы
рекомендуется использовать от 50 до 100 мл. 100 мл отфильтрованной мочи
в круглодонной колбе на 500 мл обрабатывают 10 мл концентрированной
соляной кислоты (в случае меньших проб — меньшим объемом) и после
добавления пористого материала для равномерного кипения кипятят в тече-
ние 20 мин с обратным холодильником в тяге. Охлажденный гидролизат *,
также в тяге, трижды экстрагируют в делительной воронке соответствую-
щей величины порциями по 80—100 мл циклогексана. Объединенные цик-
логексановые экстракты дважды встряхивают с порциями по 100 мл
10—15%-ного раствора натриевой щелочи и затем промывают водой. Очи-
щенный таким образом циклогексановый экстракт упаривают в чашке на
водяной бане досуха, остаток растворяют в нескольких миллилитрах хло-
роформа и упаривают до 0,3 мл в малейькой пробирке (в случае меньших
проб — до соответственно меньшего объема).
₽) АНАЛИЗ ЭКСТРАКТА МЕТОДОМ ХТС
На слои силикагеля Г, приготовленные стандартным методом, наносят
40 мм3 экстракта и соответствующее количество эталонного раствора. Рас-
творителем служит смесь хлороформ—ацетон (90 + 10). Работают с насыще-
нием камеры (стр. 24), длина пути 10 см, время разделения — около 25 мин.
При разработке метода наносят на тонкослойную пластинку следующие пробы:
1) 1 мм3 эталонного раствора прегнандиола=1 рг (5' шприца Agla),
2) 30 .ил3 экстракта исследуемой мочи (соответствует 10 мл мочи),
3) 40 мм3 экстракта мочи беременной женщины,
4) 50 мм3 экстракта исследуемой мочи,
5) 2 мм3 эталонного раствора прегнандиола=2 рг (10'),
6) 40 Л4Л43 экстракта исследуемой мочи,
7) 3 мм3 эталонного раствора прегнандиола=3 рг (15'),
8) 40 мм3 экстракта мочи беременной женщины,
9) 40 Л4Л3 экстракта нормальной мочи небеременной женщины.
При стандартных исследованиях можно наносить рядом пробы по 40 мм3
20 различных экстрактов и 2 пробы эталонного раствора по 2 и 3 mm3s
у) ОБНАРУЖЕНИЕ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ
Основные стероиды можно обнаружить в виде жирных пятен при опры-
скивании фосфорной кислотой (реактив № 123). Равномерное опрыскивание
следует производить до тех пор, пока слой не станет прозрачным; при этом
реактив для опрыскивания не должен стекать. Прегнандиол и аллопрегнан-
диол находятся в нижней области хроматограммы. Величины hRf помещены
в табл. 42 за № 27 и 28. Аллопрегнандиол дает отчетливое пятно цвета сло-
новой кости. В нормальной моче это пятно находится только в секрецион-
ной фазе в случае лечения гормонами и патологических случаях (воспаление
придатков).
* При гидролизе сильными кислотами разрушается около 75% исходного прег-
нандиола. В настоящее время исследуются условия проведения более мягкого гидро-
лиза. После успешного завершения начальных анализов в целях экономии раствори-
телей можно работать с меньшими пробами мочи.
Гл. 16. Анализ методом ХТС в клинической диагностике и фармакологии 341
После опрыскивания фосфорной кислотой пластинки сушат при 110°.
Через 10 мин половину хроматограммы можно дополнительно опрыскивать
фосфорномолибденовой кислотой (реактив № 120) и еще раз 2—3 мин нагреть
при той же температуре. Эта реакция настолько чувствительна, что прегнан-
диол может быть обнаружен практически в каждом экстракте. При расчете
состава пробы основное количество вещества падает на прегнандиол, причем
наличие аллопрегнандиола должно быть доказано описанным выше методом
с фосфорной кислотой. Экстракты, не подвергнутые опрыскиванию реакти-
вом фосфорномолибденовой кислоты, обнаруживают после нагревания при
100° (всего 25—30 мин) в длинноволновом УФ-свете характерную блеклую
серо-зеленую флуоресцентную окраску прегнандиола, однако только в слу-
чае, когда в результате беременности (или лечения гормонами) этот стероид
присутствует в достаточном количестве. При опрыскивании пластинки смесью
ванилин — серная кислота (реактив № 151) и нагревании в течение 7—
10 мин при 110° также можно хорошо определить содержание прегнандиола
путем сравнения с эталонным раствором. Эта окраска сохраняется дольше
на хроматограмме, покрытой второй стеклянной пластинкой (см. окраску
стероидов, стр. 269).
в) Обнаружение других стероидов
(адреногенитальный синдром, синдром Кашинга)
В главе «Стероиды» (стр. 271) уже указывалось на возникновение боль-
ших количеств прегнантриола и 17-кетостероидов при адреногенитальном
синдроме. При отсутствии одного или нескольких ферментов андрогены
образуются в повышенных количествах (Блок). Методом ХТС установлено,
что при синдроме Кашинга имеет место обратный эффект, т. е. понижение
содержания 17-кетостероидов (например, андростерона) в моче. Эта болезнь
обусловлена повышенной функцией коры надпочечников, причем образуется
повышенное количество кортикостероидов.
2. ЧУЖДЫЕ ОРГАНИЗМУ ВЕЩЕСТВА
(метаболиты лекарственных веществ)
Как уже упоминалось во введении, изучение изменений лекарственных
веществ в больном и здоровом организме имеет большое значение. Метод
ХТС существенно облегчил анализ метаболитов. Можно привести два при-
мера.
Медомин Метаболит 1а
Рис. 140. Структурные формулы медомина и одного из его метаболитов.
а) Вагнер [8] сообщил об опытах Бикеля и Вюилломиера по определе-
нию метаболитов медомина (см. рис. 140). При введении меченого медомина
в моче находят суммарную активность введенного вещества. На бумажной
радиограмме экстракта мочи обнаруживаются четыре радиоактивные зоны,
т. е. образуется4метаболита. Метаболит I может быть разделен на слое сили-
342
Специальная часть
кагеля растворителем хлороформ — ледяная уксусная кислота (98, 5 + 1,5)
на две зоны одинаковой величины (la hRf 85 и 16 hRf 73). Для выяснения
структуры большие количества экстракта хроматографировали на колонке
при условиях, соответствующих методу ХТС (силикагель около 100 меш,
эфир + 2% ледяной уксусной кислоты), и фракции проверяли на однород-
ность методом ХТС. Выяснение структуры показало, что метаболит 1а пред-
ставляет собой 5-этил-5-(3'-оксо-А1-циклогептенил)-барбитуровую кислоту
(рис. 140). В случае метаболита 16 кетогруппа восстановлена до спирта.
Н3С СН3
Дигидрогераниол С—СН2 — СН2—СН2—С=СН—СН2—ОН
НдС7
Н3С СН3 О
л \ I Z
Дигидрогильдебрандтовая О С—СН2—СН2—СН2—С = СН—С
кислота \ ' \
С ОН
но
Н3С СНд О
\ I //-
Гильдебрандтовая О С = СН—СН2—СН2—С=СН— С
кислота \ / \
С ОН
но"7
Рис. 141. Дигидрогераниол и два его метаболита, найденные в моче.
б) Если скармливать крысам дигидрогераниол, меченный С14, то после
кислого гидролиза и извлечения эфиром на тонкослойной хроматограмме
пробы мочи обнаруживают 4 метаболита. Два из этих соединений следует
отнести к дикарбоновым кислотам (см. рис. 141).
III. ЛИПИДЫ В ФЕКАЛИЯХ И ФЕКАЛЬНЫХ КАМНЯХ
В работе Вильямса, Шарма, Морриса и Хольмана [9] состав липидов
фекалиев сравнивается с составом липидов фекальных камней слепой кишки
(см, табл. 76).
Вначале проводят экстракцию смесью хлороформ — метанол (2 + 1)
и полученный экстракт липидов разделяют на слоях силикагеля Г смесью
Таблица 76
Состав липидов фекалиев и фекальных камней [9]
/iRy Вещество % в фекалиях % В камнях
'80—95 ' Холестериновые эфиры и др. 5—10 10—25
65—75 Триглицериды 10—15 2—5
45—50 Свободные жирные кислоты 12—20 25—36
30—35 Неизвестное вещество 22—32 24—29
26 Холестерин и др. 10—15 4—10
12—22 Неизвестные вещества 10—15 3—8
0—10 Фосфолипиды и др. 8—10 5—10
Гл. 16. Анализ методом ХТС в клинической диагностике и фармакологии 343
петролейный эфир — эфир — ледяная уксусная кислота (80 + 20 + 1).
Для обнаружения опрыскивают раствором фосфорная кислота — фосфор-
номолибденовая кислота и затем проводят количественное определение.
Фекальные камни содержат значительно больше холестериновых эфиров
и свободных жирных кислот. Смесь эфиров жирных кислот, переведенных
в метиловые эфиры, дополнительно анализируют методом газовой хромато-
графии.
IV. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВЕЩЕСТВ В КРОВИ (СЫВОРОТКЕ)
Определение спирта в крови
На стр. 358 уже описывалась возможность разделения и обнаружения
методом ХТС очень небольших количеств спиртов в форме эфиров динитро-
бензойной кислоты. Напрашивается распространение этого метода на опре-
деление спирта в крови, поскольку метод ХТС все чаще используется для
«быстрого определения лекарств в крови.
Методы
а) Экстракция и этерификация
1,0 мл крови обрабатывают 10 мл физиологического раствора поварен-
ной соли (0,9%) и спирт экстрагируют в делительной воронке объемом 50 мл
5—6 порциями по 10 мл эфира, очищенного от спирта (получение стр. 358).
Высушенный над прокаленным сульфатом натрия эфирный экстракт филь-
труют, промывают эфиром и затем обрабатывают 500 мг 3,5-динитробензоил-
хлорида. При кипячении в течение 30 мин с обратным холодильником проис-
ходит этерификация. Для разложения избыточного количества хлорангид-
рида кислоты к охлажденному эфирному раствору добавляют 30 мл воды
и подщелачивают 5—10%-ным едким натром до pH 9—10. Отделяют эфир-
ную фазу, содержащую динитробензоаты. Оставшиеся в водной фазе динитро-
бензоаты экстрагируют 3—4 раза бензолом, очищенным от спирта. Затем
объединяют эфирные и бензольные экстракты, сушат над прокаленным суль-
фатом натрия и фильтруют. Фильтрат упаривают до 5 мл, переносят коли-
чественно в мерную колбочку на 10 мл и доводят до метки бензолом.
б) Приготовление эталонного раствора
1,0 мл точно приготовленного 0,1 %-ного водного раствора этанола обра-
батывают, как описано выше. 1 мм3 этого раствора ДНБ-эфира соответствует
0,1 рг спирта.
в) Нанесение исследуемого раствора ДНБ-эфиров
и сравнение величины пятен
На слой силикагеля 20 X 20 см, полученный стандартным методом,
наносят на точки старта № 1, 3, 5, 7 и т. д. по 50 мм3 исследуемого раствора
ДНБ-эфиров, а на точки старта с четными номерами — по 1—10 лл3 эталон-
ного раствора (0,1—1,0 цг спирта = 0,2—2°/00 спирта в крови). Затем про-
водят хроматографическое разделение с растворителем четыреххлористый
углерод — циклогексанэтилацетат (75 + 10 + 15) в лотковой камере с насы-
щением камеры; длина пути 10 см. Для обнаружения ДНБ-эфиров проводят
-опрыскивание раствором родамина В (реактив № 129). Визуальное сравне-
ние величин пятен позволяет достаточно точно определить содержание
344
Специальная часть
спирта. Если, например, 1 мл крови содержит О,8°/оо спирта, то при данных
условиях величина пятна будет соответствовать количеству нанесенного
спирта 0,4 [ле (4 мм3 эталонного раствора).
Об анализе липидов сыворотки методом ХТС см. гл. 10, стр. 153, игл. 13,
стр. 254.
V. ЭКСТРАКТЫ ИЗ ОРГАНОВ
Определение адреналина и норадреналина из надпочечников
Адреналин и норадреналин являются известными веществами, количе-
ственное определение которых в жидкостях организма и органах имеет боль-
шое значение. Эти гидрофильные соединения, однако, весьма чувствительны
Рь'и с. 142. Обнаружение адреналина и норадреналина в надпочечниках кошки.
Сорбент силикагель Г; растворитель хлороформ — метанол (90 +10); обнаружение: реактив № 151.
Наносили триацетилированные продукты. 1 и в — смесь чистого адреналина (верхнее пятно)
и норадреналина (нижнее пятно); 2—S—постепенно увеличивающиеся количества экстракта органа.
к окислению и уже кислородом воздуха окисляются в окрашенные адрено-
хромы. Диберн и Пихер [2] описали химические методы определения имею-
щихся в продаже растворов адреналина.
Значительно стабильнее соответствующие ацетильные соединения.
В формезтих сравнительно легко получаемых производных адреналин и нор-
адреналин можно разделить на обычных слоях силикагеля Г, используя
растворитель хлороформ — метанол (90 + 10). Для обнаружения проводят
опрыскивание смесью ванилин — серная кислота (реактив № 151). Триаце-
таты дают следующие величины hRf и окраску: адреналин ~56 (розовая),
норадреналин — 43 (серая) [7].
В качестве примера можно привести выделение и ацетилирование адре-
налина и норадреналина из надпочечников кошки.
После извлечения органы помещают в 0,1%-ный раствор пиросульфита натрия и по
возможности сразу перерабатывают. Ткань растирают в ступке до полной гомогени-
зации с 1 г раствора, 10 г морского песка и 0,5 г пиросульфита натрия. После добавле-
ния 0,5 мл 6 н. соляной кислоты и 10 мл воды еще раз проводят гомогенизацию
в течение 5—7 мин. Затем раствор отфильтровывают от морского песка, который дважды
промывают 5 мл воды. Слабо мутный фильтрат обрабатывают несколькими каплями рас-
твора крахмала и по каплям добавляют раствор 3 г йодистого калия и 2 г иода в 45 мл
воды до постоянного синего окрашивания. Затем избыточный иод сразу разрушают
0,1 н. раствором тиосульфата натрия (обесцвечивание).
После этого фильтрат нейтрализуют путем добавления по порциям бикарбоната нат-
рия (контроль pH-бумагой) и вводят, наконец, избыток 2 г бикарбоната натрия и 1 мл
ангидрида уксусной кислоты. Содержимое интенсивно встряхивают в течение 7—10 мин
Гл. 16. Анализ методом ХТС в клинической диагностике и фармакологии 345-
в делительной воронке, периодически выпуская образующийся углекислый газ. Поело
5-минутного стояния 4 раза экстрагируют метиленхлоридом (порциями по 15 мл). Объе-
диненные метиленхлоридные экстракты сушат над 5 г свежепрокаленного сульфата нат-
рия и фильтруют, промывая небольшим количеством метиленхлорида. Фильтрат упа-
ривают на водяной бане в чашке и остаток в пробирке на 3 мл доводят до объема 0,3 мл.
В зависимости от содержания адреналина наносят 25 или 50 mmz этого раствора (рис. 142).
Используя сравнительный метод, можно количественно определить содержание адре-
налина и норадреналина [7].
Возможность экстракции и последующего анализа методом ХТС липи-
дов из органов описаны в гл. 10 и 12.
ЛИТЕРАТУРА
1. Demole Е., J. Chromatog., 1, 24 (1958).
2. Dibbern Н. W., Р i с h е г Н., Arzneimittel-Forsch., 11, 317 (1961).
3. М а г t i n Н., частное сообщение.
4. Reimann-Hunziker R., Wild W., Miinch. med. Wschr., 103, 1264 (1961).
5. W a 1 d i D., Mun ter F., Wolpert E., Med. exp. (Basel), 3, 45 (1960).
6. Wai di D., Klin. Wschr., 40, 827 (1962).
7. Wald i D., Arch. Pharm., 295/32, 125 (1962).
8. Wagner H., Mitt. Gebiete Lebensm. u. Hyg., 51, 416 (1960).
9. Williams J. A., Sharma A., Morris L. J., Holman R., Proc. Soc.
Exptl. Biol. Med., 105, 192 (1960),
ГЛАВА 17
ОРГАНИЧЕСКИЕ СИНТЕТИЧЕСКИЕ ВЕЩЕСТВА
(Вспомогательные вещества в промышленности)
X, Генс.гиргп, Д. Валъди, Э. Шталь
В многочисленных отраслях промышленности в настоящее время исполь-
зуют органические синтетические продукты. Часть этих веществ добавляется
лишь в небольших количествах к конечным продуктам для получения опре-
деленных свойств. Определение таких соединений и их изменение представ-
ляет большой интерес.
Особое положение занимают «вспомогательные вещества», опасные для
здоровья, с которыми в большей или меньшей мере приходится соприкасаться
человеческому организму.
Для удобства эта глава разбита на разделы: «I. Синтетические красите-
ли», «II. Вспомогательные вещества», встречающиеся прежде всего в пище-
вых продуктах и предметах широкого потребления, и «III. Другие вспомога-
тельные и синтетические продукты».-
I. СИНТЕТИЧЕСКИЕ КРАСИТЕЛИ *
Уже в течение ряда лет смеси красителей разделяли на окиси алюминия,
которую наносили в виде тонких слоев на стеклянные пластинки. Наиболее
детально этим методом занимался Мотье с сотрудниками [29, 29а]. В каче-
стве растворителей используют водноспиртовые растворы. Лагони и Борт-
ман [21] описали круговой метод, также на незакрепленных слоях, для обна-
ружения красителей в продуктах питания.
Наши собственные опыты подтвердили наряду с известными недостатками
незакрепленных слоев невозможность непосредственного использования ука-
занных растворителей [54]. В дальнейшем возможность разделения была,| ис-
следована на большом числе красителей. Наряду с силикагелем и окисью
алюминия для анализов методом ХТС оказался пригодным «алусил» **,
а также целлюлозный порошок.
1. ЖИРОРАСТВОРИМЫЕ КРАСИТЕЛИ
Уже Шталь [50] показал, что жировые красители можно разделять на
стандартизованных слоях силикагеля Г; однако он привел только черно-
белую фотографию тонкослойной хроматограммы. Цветная вкладка показы-
вает возможности разделения смесей жировых красителей [22]. Уже на длине
пути 5—6 см можно разделять многочисленные жирорастворимые красители. •
Для идентификации целесообразно выдерживать стандартные условия
* Возможности анализа методом ХТС природных смесей красителей рассмотрены
в соответствующих главах: каротиноиды стр. 218 и антоцианы стр. 379; далее следует
отметить недавно появившуюся работу Монтага [28].
** Смесь окиси алюминия Г и силикагеля Г (1 + 1).
Гл. 17. Органические синтетические вещества
347
(стр. 35) и одновременно проводить хроматографический анализ эталонных
смесей «жировых красителей» фирмы «Desaga». В табл. 77 приведены вели-
чины hRf и характеристические номера ряда жировых красителей [54].
Таблица 77
Величины hRf жировых красителей на силикагеле Г
(растворитель — бензол)
Краситель Номер по Шульцу Цветной индекс Rf X 100 Окраска основного пятна
основное пятно побочное пятно
Судан оранжевый .... 31 11920 4 — Желто-оранжевая
Судан III 532 26 100 12 30, 41 а Карминно-красная
Судан В 149 12 150 13 32 То же
Судан синий G — 61525 20 12, 35 Синяя
Судан черный В — 26 150 28 0, 4, Серо-синяя
16 а, 63 а
Судан оранжевый RR . . . 92 12 140 29 14 Светло-красная
Масляный желтый .... 28 11020 40 — Оранжево-желтая
Судан фиолетовый BR . . — 61705 53 — Фиолетово-синяя
а Едва заметно.
Рис. 11 на стр. 22 иллюстрирует зависимость четкости разделения от
метода нанесения пробы на пластинку.
В этих же условиях Шорн и Шталь [45] определили величины hRf ряда
других красителей. Наносили по 0,2 цг вещества на слой силикагеля и раз-
деляли бензолом при стандартных условиях (KS). Для дальнейшей иденти-
фикации проводили опрыскивание концентрированной соляной кислотой
(см. табл. 78).
Таблица 78
Величины hRf некоторых производных азобензола на силикагеле Г
(растворитель — бензол)
Краситель Rf X 100 Окраска после опрыски- вания концентриро- . ванной соляной кислотой
n-Оксиазобензол, транс- 12 Оранжево-желтая
n-Аминоазобензол, транс- 19 Оранжевая
Бензолазонафтол, транс- 44
п-Диметиламиноазобензол, транс- .... 55 Красная
n-Диметиламиноазобензол, цис- 39 »
n-Метоксиазобензол, транс- 64 Оранжево-желтая
n-Метоксиазобензол, цис- 12 То же
Азобензол, транс- 72 Желтая
Азобензол, цис- 30 »
Гваязулен | 76
Судан красный G > эталон 22
Индофенол 1 8
Таблица 79
Величины hRf индикаторных красителей на алусиле [54]
Краситель Яу X 100 Окраска пятна
Хлорфеяоловый красный 27(78)а 40(0) | Фиолетовая (желтая) а
Бромкрезоловый пурпуровый . . . Фиолетовая (желто-коричневая)
Крезоловый красный 42(60 и 77) Оранжево-желтая (светло-красная и желтая)
.ч-Крезоловый пурпуровый .... 43 (71) Оранжево-желтая (желтая)
Бромфеноловый синий 48 (39) Сине-фиолетовая (красно-фиолето- вая)
Бромхлорфеноловый синий .... 48 Сине-фиолетовая
Бромтимоловый синий 65 Зелено-коричневая
Бензиловый оранжевый 67 Желтая
Метиловый оранжевый 67 Желто-оранжевая
Тимоловый синий 74 Оранжево-желтая
Фенолфталеин 83 Бесцветно, в щелочн. раств. крас- ная
п-Этоксихризоидия 84 Оранжевая
а В скобках приведены величины ЛЯу и окраска примесей.
Таблица 80
Величины hRf красителей для микроскопии [54]
Краситель Номер по Шульцу Цветной индекс Rf X 100 Окраска
Акридиновый оранжевый .... 902 46005 41 Желтая
Щелочной голубой 811 42 765 16 и 34 Синяя (синяя) а
Бриллиантовый зеленый .... 760 42 040 59 (0) а Зеленая
Бриллианткрезиловый синий . . 992 51010 21 и 52 Зеленая (зеленая)
Эрихромазурол S Хромазурол S У 841 43825 39 Темно-фиолетовая
Гентиановый фиолетовый .... Метиловый фиолетовый 2В . . . У 783 42 535 43 и 48 Красная (фиолетовая)
Кристалл фиолетовый . 785 42 555 43 Фиолетовая
Светло-зеленый желтоватый . . 765 42 095 11 (0) Зеленая
Малахитовый зеленый 754 42 000 35 (0) »
Метаниловый желтый 169 13 065 39 Желтая
Метиленовый синий В 1038 52 015 9 Сине-зеленая
Метиленовый зеленый 1040 52 020 18 Зеленая
Виктория синий 822 44 045 51 Синяя
а В скобках приведены величины ЛДу и окраска побочных пятен.
Гл. 17. Органические синтетические вещества 349
Об обнаружении методом ХТС некоторых синтетических и природных
жирорастворимых красителей в продуктах питания имеется сообщение Мон-
тага [28]. Приведены подробные методики для идентификации каротина
и биксина в маргарине и сыре, а также красителей паприка и куркума
в колбасе.
Шетти и Кустеру [41] удалось разделить на слоях окиси алюминия,
используя метанол, изомеры 1,2-хром- и кобальтовые комплексы о-окси-о'-
карбоксиазоряда. Также успешно был использован метод ХТС для анализа
изомеров 1,2-металлических комплексов азо- и азометиновых красителей
142].
Давидек [6а] также описал уже отмеченное во введении разделение жиро-
растворимых красителей в продуктах питания на незакрепленных слоях
окиси алюминия.
Специальные применения: красители в карбюраторном горючем. Поставщики неко-
торых марок бензинов вынуждены добавлять к ним красители, чтобы отличить их от
других. Эти красители, по Хойсеру 116], а также по Махата [23], лучше всего проанали-
зировать методом ХТС в виде остатков после отгонки бензина. Хойсер предпринимает
промежуточную очистку. Он упаривает пробу бензина 5—10 лгл на х/3 и проводит хро-
матографическое разделение на колонке, заполненной активной окисью алюминия,
используя петролейный эфир; затем экстрагирует окрашенные зоны вытолкнутого
столбика ацетоном, фильтрует и упаривает досуха. Обогащенный краситель растворяет
в нескольких каплях ацетона и наносит на слой силикагеля Г. Растворителем служит
бензол. Таким образом можно проанализировать имеющиеся в продаже бензины:
арал, аралин, ВР-супер, DEA, DEA-супер, ESSO, ESSO-экстра, FANAL, FANAL-
cynep, NORD-OL спец., SHELL, SHELL-супер. В работе Приведены величины Rf. Этот
метод представляет большую ценность для выявления кражи горючего.
Кроме того, труднолетучие компоненты бензина могут быть определены в фильтро-
ванном УФ-свете.
2. ВОДОРАСТВОРИМЫЕ КРАСИТЕЛИ
Смеси красителей, растворимых в воде или спирте, можно разделить,
используя более полярные кислые или основные растворители. Нередко эти
красители состоят из нескольких компонентов, и наряду с основным пятном
на хроматограмме получают одно или два побочных пятна.
а) Индикаторные красители
Для идентификации и определения чистоты индикаторных красителей
были получены величины hRf при стандартных условиях на слоях алусила
(стр. 39) со смесью этилацетат — метанол — 5 н. аммиак (60 + 30 + 10)
(табл. 79). Время анализа составляло 30 мин. Из 0,25%-ного раствора кра-
сителя в метаноле наносили 2 леи3.
Пастуска и Тринкс [31] сообщают о тонкослойном электрофорезе инди-
каторных красителей.
б) Красители для микроскопии
В табл. 80 приведены определенные при стандартных условиях величины
hRf красителей, часто используемых в гистологии, бактериологии и биоло-
гии [54]. При применении слоев силикагеля в качестве растворителя использо-
вали хлороформ — ацетон — изопропанол — сернистая кислота (5—6%
SO2) (30 + 40 + 20 + 10). Из 0,25%-ного раствора красителя в метаноле
наносили пробу 2 мм3.
По Шорну и Шталю [45], приведенные в табл. 81 красители лучше всего
разделять на слоях силикагеля, используя растворитель w-пропанол — му-
равьиная кислота (80 + 20). При длине пути 10 см и KS время анализа
350
Специальная часть
Таблица 81
Величины hRf некоторых флуоресцирующих красителей [45]
Краситель hRf Краситель hRf
Метиленовый зеленый 0 Нильский голубой . . 49
Диазин зеленый . . . 12 Фуксин 55
Пиронин G а 20 Родамин В а 62
Акридиновый оранже- Флуоресцеина .... 74
вый G а 40
а Флуоресцентный краситель.
составляет 70—90 мин. Эти красители интенсивно флуоресцируют в УФ-све-
те (365 .ир.) и, таким образом, могут быть определены весьма малые коли-
чества.
в) Чернила и протравные красители
Анализ методом ХТС чернильных красителей очень хорошо проводить
по Волленвеберу [56] на слоях целлюлозного порошка 300 G с растворителем,
представляющим собой смесь «-бутанол — ледяная уксусная кислота —
вода (50 + 10 + 40).
Водорастворимые протравные красители типа производных антрахинона
можно, согласно этим же авторам [56], хроматографически анализировать
на слоях из порошка ацетилированной целлюлозы (MN 300 G/Ac, см. стр. 40).
Свежеприготовленный растворитель этилацетат — тетрагидрофуран — вода
(6 + 35 + 47) заливают в лоток за 2 час перед помещением в камеру пла-
стинки. При времени анализа 60 мин были получены следующие величины
hRf. 1,4-диоксиантрахинон 6; 4-амино-1-оксиантрахинон 11 и 1,4-диамино-
антрахинон 21.
г) Субстантивные красители для, целлюлозы и шерсти
Разделение субстантивных красителей для целлюлозы и шерсти, согласно
Меккелю и сотрудникам [24], можно осуществить на щелочных слоях сили-
кагеля Г и окиси алюминия Г, как это впервые было предложено Шталем [51 ].
Для приготовления массы адсорбент смешивают с равным количеством
2,5%-ного раствора карбоната натрия вместо воды. Растворителем служит
свежеприготовленная смесь бутилацетат — пиридин — вода (50 + 45 4-
+ 25). На щелочных слоях силикагеля Г разделение более четкое, чем на
слоях окиси алюминия Г. Минимально определяемое количество примерно
в 10 раз меньше, чем в случае применявшегося до сих пор метода хроматогра-
фии на бумаге. Исследуемые красители (например, сириусы, палатины, бен-
заминовые красители) состоят в большинстве случаев из нескольких различ-
но окрашенных компонентов.
д) Синтетические красители для пищевых продуктов
Чтобы охарактеризовать разработанные Комиссией по красителям Немец-
кого исследовательского общества (DFG) синтетические красители для пище-
вых продуктов, были использованы в числе прочих также и методы хрома-
тографии на бумаге. Для получения хроматограмм на бумаге в восьмом
Гл. 17. Органические синтетические вещества
351
Таблица 82
Величины hRf красителей для пищевых продуктов
на целлюлозном порошке MN [56]
Название (8-й доклад DFG) Общеупотребительные торговые названия Номер по Шульцу цветной индекс Индекс DFG-6 Rf X 100 в растворителе
I II
Желтый 1 Прочный желтый (эк- стра) 172 13 015 23 53(50)а 58 (-)
Желтый 2 Тартрацин 737 19 140 64 25 (-) 72 (-)
Желтый 3 Хинолиновый желтый (водорастворимый или экстра) 918 47 005 97 39 (27) 12 (20).
Желтый 4 Хризоин S Тропеолин О Резорциновый желтый 186 14 270 26 88 (-) 34 (->
Желтый 5 Желтый 27 175 N — — 30 31 (-) 29(-)
Оранжевый 1 Оранжевый GGN или GGL — 15 980 32 56 (69) 45 (-)
Оранжевый 2 Желто-оранжевый S — 15 985 29 55 (69) 42 (24)
Красный 1 Азорубин 208 14 720 38 64 (75) 12 (-)
Красный 2 Прочный красный Е 210 16 045 39 57(71) 20(-)
Красный 3 Амарант S Нафтоловый красный S 212 16185 40 27 (-) 31 (-)
Красный 4 Бриллиантовый пун- цовый 4RC Коншениловый крас- ный А 213 16 255 41 ЗЗ(-) 55 (-)
Красный 5 Понсо 6R 215 16 290 42 16 6 (-) 76 (-)
Красный 6 Ярко-красный GN — — 34 64 (73) 90J94)
Синий 1 Индантреновый синий RS 1228 69 800 104 0 0
Синий 2 Индиготин I или 1а Индигокармин 1309 73 015 105 26 (-) 19(7)
Черный 1 Бриллиантовый черный — 28 440 58 20 б (—) Ю(-)
а В скобках приведены величины hRy побочных пятен.
0 Вытянутое пятно (образование хвоста).
докладе указанной выше Комиссии был предложен ряд растворителей. Там же
приведены пробы и спектры красителей, а также цветные фотографии хрома-
тограмм.
Волленвебером [56], а также в других лабораториях [54] для идентифи-
кации был опробован анализ методом ХТС, причем было найдено, что при-
веденные в табл. 82 красители могут быть отчетливо разделены на слоях
целлюлозного порошка MN 300 G с использованием одного-единственного
растворителя. Растворители: I — «-пропанол — этилацетат — вода (60 +
+ 10 + 30) [54] и II — 2,5%-ный водный раствор ацетата натрия — 25%-ный
раствор аммиака (80 + 20) [56] отличаются по разделительной способности
и поэтому с успехом могут быть использованы для двумерной ХТС. Время
анализа для растворителя I составляет 90 мин.
352
Специальная часть
II. ВСПОМОГАТЕЛЬНЫЕ ВЕЩЕСТВА В ПРОДУКТАХ ПИТАНИЯ
И ПРОДУКТАХ ШИРОКОГО ПОТРЕБЛЕНИЯ
1. АНТИОКИСЛИТЕЛИ И КОНСЕРВИРУЮЩИЕ ВЕЩЕСТВА
Для хроматографического разделения антиокислителей и консервирую-
щих веществ их в первую очередь необходимо отделить от основного суб-
страта. При необходимости обнаружить окислители в животных или расти-
тельных жирах последние растворяют в циклогексане или петролейном
ОоОо©*
I. Хлороформ
Эталон
желтыц\
МГЦ
Проба
Эталон
1—20
'~С^>ЛФФЛ
ТФ
синий 1
Ыаллат
Ондгк —
Проба q
20-\^-40 - 4-20--I- —
-------------------— 200
желтый красный сцнии
пмох
т
Рис. 143. Шаблон для количественной обработки тонкослойных хроматограмм
антиокислителей (по Зеэру [46]).
Численные значения в мм. БА — бутоксианизол; БОТ — бутилокситолуол; ДБОА — дибутил-
оксианизол; ДФФД —дифенил-п-фенилендиамин; ТЭТД — тетраэтилтиурамдисульфид; ПМОХ —
пеитаметилоксихроман; БОА — бутилоксианизол; МГЦ — моноглицеридцитрат; НДГК — норди-
гидрогвайаретовая кислота; ГС — гваяковая смола; а-ТФ — а-токоферол; И — ионол.
эфире и извлекают 75%-ным этанолом. Большая часть антиокислителей пере-
ходит при этом в спиртовую фазу, которая может быть непосредственно
проанализирована хроматографически.
Раствор, содержащий 1 г жира в 1—2 мл циклогексана или петролейного эфира
(т. кип. 40—60°), встряхивают 2 мин с 1 мл 75%-ного этанола. После разделения фаз
нижний спиртовый слой собирают и 0,1—0,2 мл этого раствора разделяют хроматогра-
фически.
Этим методом нельзя определить некоторые антиокислители, например
бутилоксианизол, который может быть отделен перегонкой с водяным паром
(прибор см. на стр. 187). '
Если после хроматографического разделения необходимо обнаружить
пятна антиокислителей или консервирующих веществ, то одновременно сле-
дует хроматографировать соответствующие эталонные вещества или исполь-
зовать расчетный шаблон, как это описано Зеэром [46]. Если этого не
Гл. 17. Органические синтетические вещества
353
делать, то компоненты эфирных масел или веществ, добавляемых для улучше-
ния вкуса, могут маскировать антиокислитель (ср. рис. 143).
Пробы необходимо хранить в склянках с пришлифованными пробками,
чтобы избежать соприкосновения с резиной или пластмассой, из которых
в анализируемый материал легко переходят умягчители, антиокислители
и т. д.
Зеэр [46] разработал метод ХТС для обнаружения синтетических антио-
кислителей в пищевых жирах и кормовых концентратах. Применяя двумер-
ную хроматографию, можно разделить большую часть приведенных на рис. 143
веществ. Количественное определение неизвестных анализируемых материа-
лов осуществляют, используя шаблон (рис. 143). Чтобы использовать шаб-
лон, вначале были исследованы все факторы, оказывающие влияние на
анализ методом ХТС, и разработана описываемая ниже методика работы,
которой следует точно придерживаться.
Методика. Пластинки с силикагелем Г готовят, применяя приспособление для нама-
зывания слоев фирмы «Desaga» (толщина слоя 250 ц), и сушат при 120°. Для обеспечения
определенной влажности слоя силикагеля Г дают подняться хлороформу.до высоты 12 см
и сушат сначала на воздухе, а затем 20 мин в вакуумном эксикаторе. Далее изображен-
ным на рис. 143 способом наносят 3 пробы исследуемого вещества и 2 пробы трехком-
понентной эталонной смеси (условия разделения на стр. 35). Стартовые точки выделены
на рис. 143. Осуществляют разделение 1 (растворитель—хлороформ) и разделение 2 (рас-
творитель — бензол) и снимают двумерную хроматограмму. Одновременно для большей
надежности количественного определения проводят хроматографическое разделение
эталонной смеси. Длина пути для растворителя 1 (хлороформ) составляет 10 см: после
этого сушат на воздухе, повертывают пластинку на 90° и помещают в растворитель
2 (бензол). В этом случае длина пути также составляет 10 см.
Обнаружение. Воздушносухой слой равномерно опрыскивают 20%-ным раствором
фосфорномолибденовой кислоты (реактив № 120а), пока он не станет равномерно желтым.
Через 1—2 мин появляются голубые пятна легко восстанавливаемых антиокислителей.
После этого пластинки обрабатывают парами аммиака, причем фон становится чисто
белым, а вещества — отчетливые темно-голубые пятна (иногда с фиолетовым или зеле-
новатым оттенком); соединения меньшей реакционной способности могут быть обнару-
жены при 10-минутном нагревании пластинок при 120°.
Как видно из рис. 143, ионол и бутилокситолуол не разделяются.
Неидентифицированное пятно ниже ионола связано с загрязнением дифенил-
и-фенилендиамином. Остающиеся на старте компоненты: галлаты, нордигид-
рогваяретовую кислоту и компоненты гваяколовой смолы можно разделить
методом двумерной ХТС, правда, с определенными трудностями.
Описанным методом были исследованы различные препараты смесей
антиокислителей, имеющиеся в продаже. Кроме того, при исследовании
отдельных веществ было показано, что все имеющиеся в продаже бутилоксиа-
низолы (БОА) не являются однородными. Кроме не разделяемых этим мето-
дом изомеров бутилоксианизола: 2-щретте-бутил-4-оксианизола и 3-трет-
бутил-4-оксианизола, были обнаружены примеси 2,5-ди-ттеретте-бутил-4-окси-
анизол, гидрохинон монометиловый эфир и 4-ттеретте-бутоксианизол. Была
также определена степень чистоты веществ, т. е. процент примесей, для чего
одновременно хроматографировали эталонное вещество — чистый трет-
бутил-4-оксианизол. Фотокопии этих хроматограмм, полученные контакт-
ным методом, были количественно рассчитаны планиметрическим способом
(ср. стр. 50).
Поскольку БОА и примеси дают одни и те же цветные реакции и анало-
гичные спектры, ХТС является единственным методом, применимым для
испытания БОА на чистоту.
При дальнейших исследованиях Зеэр [47] разделил вышеупомянутые
полиоксисоединения, остающиеся на старте, другим методом. Для этого при-
меняли сорбционные слои, состоявшие из 95,5% силикагеля Г и 4,5% щаве-
левой кислоты. Наряду с другими антиокислителями Мейером [25] были раз-
делены галлаты на смешанных слоях из силикагеля и кизельгура раствори-
23 Заказ № 7 34
354
Специальная часть
телем гексан — ледяная уксусная кислота (рис. 144). Пластинки при этом
дважды хроматографировали одним и тем же растворителем. Опрыскивали
5%-ным раствором фосфорномолибденовой кислоты. Жирорастворимые
красители и другие вещества, растворимые в спирте, применяемом для экстрак-
ции, иногда мешают описанному одномерному разделению антиокислителей,
в особенности галлатов. В этом случае можно достичь желаемого результата,
Рис. 144. Тонкослойные
применяя двумерную хроматографию с хлорофор-
мом или смесью гексан — ледяная уксусная
кислота.
Давидек и Покорный [6] исследовали поведение норди-
гидрогваяретовой кислоты, пропилгаллата, тп/гетп-бутилок-
сианизола и аскорбилпальмитата на незакрепленных поли-
амидных слоях. Стеклянные пластинки, на которых находи-
лись сорбционные слои, помещали в хроматографическую
камеру почти горизонтально. Наиболее благоприятным рас-
творителем рказался метанол — ацетон — вода (60 + 20 + 20)
или (60 4- 10 + 30). Этим методом экстрагировали жиры,
к которым предварительно добавлен один или смесь упомяну-
тых антиокислителей, после чего качественно анализировали
антиокислители. Хотя были разделены только четыре назван-
ных выше антиокислителя, эти авторы считают, что их метод
имеет преимущество перед методом Зеэра [46] благодаря
простоте приготовления пластинок и лучшей разделительной
способности полиамида в сравнении с силикагелем. Однако,
поскольку эти слои весьма чувствительны к встряхиванию,
и, кроме того, дают плохое разделение и могут опрыскиваться
только во влажном состоянии, их применение не следует
хроматограммы антиоки-
слителей [25].
I: сорбент силикагель —
кизельгур (25 + 5), рас-
творитель гексан— ледяная
уксусная кислота (40 + 10);
II: сорбент силикагель —
кизельгур (20 + 10), рас-
творитель гексан— ледяная
уксусная кислота (60 + 10)-
I — нордигидрогвайарето-
вая кислота; 2 — пропил-
галлат; 3 — бутилгаллат;
4 — октилгаллат; 5 — до-
децилгаллат; в — ванилин;
7 — бутилоксианизол; 8 —
эвгенол; 9 — тимол; 10 —
б ути л о к сит о л у о л. С о е д и н е-
ния 6, 8 и 9 были хрома-
тографированы одновремен-
но потому, что эти вещест-
ва,улучшающие вкус или
являющиеся компонентами
эфирных масел, могут фаль-
сифицировать наличие до-
бавленных антиокислите-
лей.
рекомендовать.
Зеэр [48] описал далее анализ методом ХТС
токоферолов. Ему удалось не только разделить токо-
феролы, но и отделить их от сопутствующих веществ,
встречающихся в природе, например питостеринов.
Если одновременно проводить хроматографическое
разделение чистых эталонных веществ, то возможны
также количественные расчеты по хроматограммам.
Подробности приведены в главе «Витамины».
а) Обнаружение ингибиторов изоляционных масел
[37, 33]
Анализ методом ХТС был также использован
в качестве вспомогательного средства для лучшей
оценки изоляционных масел, которые используются
в высоковольтных трансформаторах и преобразо-
вателях. Изоляционные масла, состоящие из фрак-
ций нефти, можно разделить методом ХТС на парафины, нафтены и арома-
тику. Однако большее значение имеет возможность обнаружения ингиби-
торов, служащих для замедления процесса старения таких природных
масел. Ряд имеющихся в продаже ингибиторов был подвергнут хромато-
графическому разделению на пластинках силикагеля, полученных обычным
методом (см. табл. 83). При испытании изоляционных масел на стабильность
упомянутыми методами возможно проследить поведение ингибиторов без
предварительного отделения изоляционного масла.
б) Консервирующие вещества
Применяемые в качестве консервирующих веществ эфиры ге-оксибензой-
ной кислоты были проанализированы Генсхиртом и Морианцом [13]. В ка-
Гл. 11. Органические синтетические вещества
355
Таблица 83
Величины hRf и цветные реакции некоторых продажных
ингибиторов [38]
Химическое название ингибитора Ry X 100 Окраска с SbCls (реактив № 13) при 120°
бензол гексан
2,6-Ди-трет-бутил-4-метилфенол .... 81 ' 36 Фиолетовая
2,6-Ди-трет-бутилфепол 79 33 Желтая
4,4'-бис-(2,6-Ди-пгрепг-бутилфенол) .... 79 11 Канареечно-желтая
4,4'-Метилен-бпс-(2,6-ди-пгрст-бутилфенол) 78 10 Красная
Додецил-о-крезол 71 7 Темно-желтая
о-третп-Бутилфенол 65 — Желтая цвета охры
Г+Фенил-2-нафтиламин 63 — Коричневая
Додецилфенол 56 — Коричнево-красная
Дифенилпикрилгидразил 55 — Светло-желтая
4,4'-Тио-бпс-(6-пгрепг-бутил-о-крезол) . . . 47 — Желтая
N, N'-Дифенил-п-фенилендиамин . . . . 46 — Красная
4,4'-Метилен-бис-(6-пгрепг-бутил-о-крезол) 46 — Винно-красная
2,6-Ди-игрепг-бутил-1-метокси-7г-крезол) . . 41 — Красная
2-трет-Бутил-4-оксианизол 28 — Желто-коричневая
2,4,6-Три-пгрепг-бутилфенол 13 — Коричневая
2,+Ди-трет-1-диметиламипо-/г-крезол . 0 — Желтая
4,4'-Изопропилидендифенол 0 — Коричневатая
честве слоев для разделения использовали силикагель Г, к которому добав-
лено 2% флуоресцирующего вещества ZS-cynep, а в качестве растворителя—
смесь пентан—ледяная уксусная кислота (88+12).
После разделения консервирующие вещества
можно обнаружить в коротковолновом УФ-свете
(254 л«р,). Разделение четырех приведенных на
рис. 145 веществ можно провести при строгом
выполнении условий, приведенных ниже под руб-
рикой «методика». Наоборот, эфиры, спиртовые
части которых отличаются на 2 атома С,— речь
идет о неразветвленных спиртах — легко разде-
лить. Так, например, были проанализированы
методом ХТС смеси метил- и пропилэфиров, при-
чем после разделения отдельные эфиры элюирова-
ли и количественно определяли методом УФ-спект-
роскопии. Возможные при этом источники оши-
бок были подробно проанализированы (см. стр. 62).
Методика. Для получения 5 тонкослойных пластинок
20 X 20 см смешивают 25 г силикагеля Г, 0,5 г веще-
ства ZS-cynep фирмы «Riedel de Наёп» и 45жл
воды. Полученную после тщательного перемешивания
разбавленную суспензию сразу наносят на пластинки
с помощью прибора для намазывания слоев. После того
как слои силикагеля хорошо схватились, пластинки сушат
2 час при 160° в сушильном шкафу и затем хранят в ва-
куумном эксикаторе над едким кали. Строгое выполнение
условий сушки необходимо во избежание разделения рас-
Р и с. 145. Разделение эфи-
ров я-оксибензойной кисло-
ты [13].
1 — метиловый эфир; 2 — эти-
ловый эфир; 3—я-пропиловый
эфир; 4 — н-бутиловый эфир;
G — смесь.
творителя пентан —ледяная уксусная кислота (80+12) на пластинках. Из этих же сообра-
жений необходимо использовать абсолютно безводную ледяную уксусную кислоту. Длина
пути составляет 13 см. После разделения растворитель удаляют нагреванием в течение
1 час при 60°.
23*
356
Специальная часть
2. ПЛАСТИФИКАТОРЫ
При переработке пластмасс необходимы высококипящие органические
жидкости, так называемые пластификаторы. Часть этих вспомогательных
веществ обладает сильными токсическими свойствами и поэтому не может
быть использована при получении упаковочных материалов, соприкасаю-
щихся с продуктами питания или лекарственными веществами. Используя
метод ХТС, Пиребуму [32] удалось разделить допущенные в США пласти-
фикаторы для пластмасс, применяемых при упаковке продуктов питания,
из которых он выделил исключительно токсичные пластификаторы. Для луч-
шей идентификации к массе силикагеля Г, используемой для получения слоя,
добавляют 0,005% водорастворимого флуоресцентного индикатора ультра-
фор WT * и в остальном работают стандартным методом. Сами пластифи-
каторы и соответствующие экстракционные остатки из упаковочных мате-
риалов растворяют в эфире и наносят 10 мм3 примерно 5%-ных растворов.
Таблица 84
Величины Rgt пластификаторов в разных растворителях,
отнесенные к дибутнлсебацинату (100) [32]
Пластификатор Изооктан— этилацетат (90 + Ю) Бензол— этилацетат (95 + 5) Дибутил 0- вый эфир—гексан (80 + 20)
Триацетин (глицеринтриацетат) 18 34 17
Этилфталилэтилгликолят 22 66 30
Ацетилтриэтилцитрат 26 51 29
Трифенилфосфат 33 80 50
Трикре^глфосфат 42 86 69
Бутилфталилбутилгликолят 43 90 65
2-Этилгексилдифенилфосфат 46 77 58
Диэтилфталат 51 79 60
Ацетилтрибутилцитрат 53 85 70
Ди-н-бутилфталат 74 103 84
Диизобутиладипат 83 86 85
Дибутилсебацинат 100 100 100
Динонилфталат 101 118 114
Ди-2-этилгексилфосфат 114 116 115
Бутилстеарат 161 123 128
Парафлекс G62 (эпоксиды природных глицери-
дов) Несколько Несколько Несколько
пятен пятен i пятен
Для анализа используют приведенные в табл. 84 растворители. После
разделения некоторые пластификаторы можно обнаружить в УФ-свете
(366 .w|i) по их собственной флуоресценции, а фталатпроизводные — в виде
темных абсорбционных пятен. Кроме того, пластификаторы могут быть
идентифицированы по различным цветным реакциям (реактивы № 1206,
151 и др-)- Для обеспечения хорошей воспроизводимости вместо величин
Rf найдены величины Rst, отнесенные к дибутнлсебацинату (100). 3 крити-
ческие пары веществ 5—6, 5—7 и 7—9 (см. табл. 84) нельзя разделить в при-
веденных растворителях, однако их идентификация возможна с применением
* Оптический просветлитель фирмы «BASF» (Людвигсхафен на Рейне).
Гл- 17. Органические синтетические вещества
357
Таблица 85
Величины hRf пластификаторов на силикагеле Г
(растворитель — метиленхлорид) [3]
Эфиры фталевой кислоты Эфиры фосфорной кислоты
Дпметилфталат 38 Трпхлорэтилфосфат 13
Дибутилфталат 52 Триоктилфосфат . 24
Дигексилфталат 57 Дифенилоктилфосфат 38
Диоктилфталат 59 Трифенилфосфат 42
Динонилфталат 60 Дифенилкрезилфосфат 43
Дидецилфталат 63 Трикрезилфосфат 49
Ди-(2-этилгексил)-фталат 58 Эфиры лимонной кислоты
Бензилбутилфталат 53
Диметоксиэтилфталат 10 Триэтилцитрат 15
Дициклогексилфталат 53 Трибутилцитрат 20
Диметилциклогексилфталат .... 48 Ацетилтриэтилцитрат 19
Диизодецилфталат 57 Ацетилтрибутилцитрат 32
Диизононилфталат 56 Ацетилтри-2-этилгексилцитрат . . 52
Эфиры адипиновой кислоты Другие пластификаторы
Диоктиладипат 49 Метиловый эфир ацетилрицинолевой
Ди-(2-этилгексил)-адипат 50 КИСЛОТЫ . . 33
Динониладипат 50 Бутиловый эфир ацетилрициноле-
Бензилоктиладипат 50 ВОЙ кислоты 40
Полиэфир адипиновой кислоты . . 0 Бутиламид бензолсульфокислоты . 38
Эфиры себациновой кислоты N-Метиламид бензол сульфокис лоты Ди-(2-этилгексил)-эфир тиодимасля- 23
Дибутилсебацинат 35 ной кислоты 52
Диоктилсебаципат . 47 2-Этилгексиловый эфир ;г-оксибеп-
Ди-(этилгексил)-себацинат ..... 47 войной кислоты 16
Полиэфир себациновой кислоты . . 0 Глицериптриацетат 18
цветных реакций. Парафлекс, полученный из природного продукта, имеет
сложный состав и дает несколько пятен на хроматограмме.
Браун [3] осуществил на пластинках силикагеля Г, полученных стан-
дартным методом, хроматографический анализ большого числа пластифи-
каторов, используя в качестве растворителя метиленхлорид. При этом особое
внимание было обращено на возможность разделения близких по структуре
соединений различных классов (табл. 85). В случае каждого пластификатора
были приготовлены 1—5%-ные растворы в бензоле или эфире и наносились
объемы, содержащие около 100 цг вещества. Для анализа на содержание
пластификаторов пластмассовых пленок последние экстрагировали метилен-
хлоридом. В качестве стандартного реактива для опрыскивания использовали
пятихлористую сурьму (реактив № 13). Большинство пластификаторов
после опрыскивания и нагревания при 120° можно обнаружить в виде корич-
невых пятен на светлом фоне; другие пластификаторы обнаруживаются после
нагревания лишь в УФ-свете. Кроме того, эфиры фталевой кислоты можно
окрасить раствором резорцина, а эфиры фосфорной кислоты — реактивом
диазония (реактив № 37).
Примечание. При омылении эфирных пластификаторов наряду с соот-
ветствующими спиртами получают и кислоты. Оба компонента также могут
быть хроматографически идентифицированы, как это' описано в следующем
разделе.
358
Специальная часть
3. СПИРТЫ и кислоты
а) Спирты С1—
Легколетучие простейшие спирты можно анализировать методом ХТС
лишь в форме соответствующих производных и таким образом определять
их следы. Вальди 154] разработал для этого следующую методику.
Получение эфиров 3,5-динитробензойной кислоты (ДНБ-эфиров). Для
концентрации спиртов, часто находящихся в водном растворе, их экстра-
гируют эфиром, не содержащим спирта *. К эфирному экстракту, высушен-
ному над свежепрокаленным сульфатом натрия, добавляют затем 3,5-динит-
робензоилхлорид и кипятят с обратным холодильником 30 мин. Для раз-
ложения непрореагировавшего хлорангидрида кислоты смесь обрабатывают
Обнаружение: родамин В (реактив № 129).
водой и подщелачивают 5—10%-ной натриевой щелочью до величины pH
9—10. После этого отделяют эфирную фазу с находящимися в ней ДНБ-
эфирами в делительной воронке и 3—4 раза экстрагируют водную фазу бен-
золом, очищенным от спирта *. Объединенные и высушенные над сульфатом
натрия эфирные и бензольные экстракты упаривают досуха и остаток рас-
творяют в небольшом, точно измеренном объеме бензола. Этот раствор непо-
средственно может быть подвергнуть хроматографическому анализу.
Прежде чем приступить к анализу неизвестной смеси, целесообразно
параллельно с ней обработать описанным методом 1 мл 0,1 %-ного водного рас-
твора предполагаемых спиртов. В этом случае ДНБ-эфиры растворяют в 10 мл
бензола и для сравнения хроматографируют одновременно с исследуемой
пробой 5 мм? этого раствора (0,5 цг спирта).
* Смесь продажного эфира или бензола с избытком 3,5-динитробензоилхлорида
кипятят с обратным холодильником примерно 60 мин н затем перегоняют.
Гл. 17. Органические синтетические вещества 359
Анализ методом ХТС. На слой силикагеля Г, полученный стандартным
методом, наносят исследуемый раствор ДНБ-эфиров рядом с эталонным рас-
твором и достигают хорошего разделения, используя смесь циклогек-
сан — четыреххлористый углерод — этилацетат (10 + 75-}-15) (длина пути
10 см, насыщение камеры). На рис. 146 показаны результаты разделения,
полученные этим методом.
Для обнаружения пригоден сам по себе неспецифичный реактив родами-
на В (№ 129). Наряду с рассматриванием хроматограммы при дневном свете
можно проводить обнаружение ДНБ-эфиров в УФ-свете (темные пятна на
красном флуоресцирующем слое).
В качестве примера использования этого метода на стр. 343 приведено
описание определения спирта в крови.
б) Глицерин и гликоли
На воздушносухих слоях силикагеля Г можно разделить (длина пути
10 см, насыщение камеры) растворителем хлороформ — ацетон — 5 н. аммиак
(10 + 80 + 10) глицерин (hRf 35), этиленгликоль (hRf 70) и 1,2-пропилен-
гликоль (hRf 85) [54]. Для обнаружения используют реактив бензидин —
перйодат (№ 18).
Прей с сотрудниками [36] отделили на обычных слоях силикагеля Г гли-
церин (hRf 38) от гликоля(hRf 45), используя смесь бутанол — вода (90 +
+ Ю). Маннит и сорбит при этом остаются неразделенными вблизи точки
старта (hRf 5). Эффект разделения этих двух соединений может быть улуч-
шен пропиткой слоя борной кислотой (0,1 н.). Для обнаружения использо-
вали хромовую смесь иполучили белые пятна на желтовато-коричневом фоне.
Громатка и Ауэ [17] в случае диолов установили линейную зависимость
между 1g Rf и числом атомов углерода. Для разделения этиленгликоля,
1,3-пропиленгликоля, 1,6-гександиола, 1,7-гептандиола, 1,9-нонандиола,
1,10-декандиола и 1,13-тридекандиола на слоях силикагеля Г использо-
вали этанол или диоксан.
в) Карбоновые кислоты
На слоях силикагеля Г можно разделять смеси многоосновных карбо-
новых кислот, используя полярные основные и кислые растворители.
В настоящее время используют следующие смеси:
. I. Метанол — 5 н. аммиак (80 + 20) [54],
11. 96%-ный этанол — вода — 25%-ный аммиак (100. + 12 + 16) [4],
111. Бензол — метанол — ледяная уксусная кислота (90 + 16 + 8) [34],
IV. Бензол — диоксан — ледяная уксусная кислота (90 + 25 + 4) [34],
V. Диизопропиловый эфир — муравьиная кислота — вода (90 + 7+3),
насыщенная полиэтиленгликолем М 1000 (для слоев кизельгура Г с поли-
этиленгликолем) [19].
В работе Брауна и Гинена [4] приведены интересные экспериментальные
подробности: кислоты переводили в аммонийные соли и готовили 2%-ные
растворы в смеси метанол — вода (1 + 1), наносили 2 мм? (40 цг). В осталь-
ном работа проводилась стандартным методом. Хроматографический анализ
проводили на слоях силикагеля Г растворителем II при длине пути 10 см
без насыщения камеры (время анализа 120 мин). Только приведенные
в графе 111 табл. 86 кислоты были разделены при этих же условиях с насы-
щением камеры (время анализа 110 мин). Приводимые Петровичем и Пасту-
ской [34] величины были получены на более толстых слоях силикагеля, при-
готовленных «вручную». Эти данные следует рассматривать лишь как ориен-
тировочные.
360
Специальная часть
Таблица 86
Величины hRf карбоновых кислот на слое силикагеля Г
при применении различных растворителей (см. стр. 359)
Кислота Растворитель Кислота Растворитель
IIа III IV V* B II б
Щавелевая ..... 5 0 0 14 Лимонная . 5 15
Малоновая 14 13 5 21 Винная 8 —
Янтарная . 30 28 23 28 Фталевая 26 —
Глутаровая ..... 39 35 28 36 Трикарбалиловая . . . — 35
Адипиновая .... 43 42 34 43 Терефталевая 73 —
Пимелиновая .... 53 47 36 55 Бензойная . 76 —
Пробковая 54 50 40 67 п-Толуиловая 76 —
Азелаиповая .... 56 53 43 82 Метилянтарная .... — 80
Себациновая .... 67 55 47 92 о-Фосфорпая 0 —
а Стандартный метод, лотковая камера без насыщения.
б Стандартный метод, лотковая камера с насыщением.
в Стандартный метод, слой кизельгура Г с полиэтиленгликолем [19J.
В особенности полезной оказалась методика, разработанная Кнаппе
и Петери [19]:
30 г кизельгура Г + 0,05 г диэтилдитиокарбамата натрия тщательно смешивают
в ступке с 45 мл дистиллированной воды и 15 г полиэтиленгликоля М 1000 и наносят
стандартным методом (стр. 35) на 5 стеклянных пластинок 20 X 20 см. Сушат 30 мин
при 100°. После разделения (высота поднятия 12 см) пластинки 10 мин нагревают при
100°. После охлаждения опрыскивают раствором 0,04 г бромкрезолового пурпурового
в 100 мл 50%-ного этанола, величина pH которого доведена раствором едкого натра до
10: желтые пятна на голубом фоне.
Из табл. 86 видно, что величина hR^ дикарбоновых кислот как в основ-
ных, так и в кислых растворителях растет с ростом длины цепи. В то время
как цис-, транс-изомеры малеиновой {hRf ~ 7) и фумаровой (hRt= 23) кислот
можно разделить растворителем HI, нельзя осуществить разделение жирных
кислот С(— С10, С12, С14, С18 и Сю, применяя основную смесь (ср. гл. 10,
стр. 173).
Прей и сотрудники [36] разделяли на слоях силикагеля Г муравьиную,
уксусную, молочную и пировиноградную кислоты растворителем пиридин—
петролейный эфир (25-Н 50) или этанол — аммиак — вода (80 + 4 т
+ 16), причем щавелевая кислота в случае применения обоих растворителей
остается на точке старта. Для обнаружения пригоден эфир дигидроин-
дантроазиндисерной кислоты [44а].
В случае н-монокарбоновых кислот (С4— С10), которые были хроматогра-
фически разделены Громаткой и Ауэ [17] на силикагеле Г с абсолютным эфи-
ром, найдена линейная зависимость между 1g Rf и числом атомов углерода.
Для кислот с четным числом атомов углерода (С4 — С10) и кислот с нечет-
ным числом атомов углерода (С5 — С41) получены отличающиеся прямые.
Для обнаружения кислот или их солей, разделяемых кислыми или
основными растворителями, рекомендуется бромкрезоловый зеленый (реактив
№22). Хроматограммы, полученные с кислыми растворителями, следует пред-
варительно нагревать 60 мин при 120° для удаления уксусной кислоты.
После опрыскивания кислоты обнаруживают в виде синих пятен на желтом
Гл. 17. Органические синтетические вещества
361
фоне. При одинаковом количестве наносимого вещества величина пятна
и интенсивность окраски уменьшаются с ростом длины цепи. Минимально
определяемое количество в зависимости от кислоты лежит между 0,8 и 8 цз.
4. ИНСЕКТИЦИДЫ
Аналитическим обнаружением частично довольно токсичных веществ,
применяемых для защиты растений, занимается ряд организаций, например
секция защиты растений Всемирной организации здравоохранения. При
контроле продуктов питания весьма важно определение токсичности инсек-
тицидов, причем интересно знать, через какое время нанесенные на фрукты
и овощи вещества для опрыскивания переходят в неядовитую форму. Пока
еще из-за неправильного применения довольно больших количеств инсекти-
цидов наблюдаются случаи тяжелого отравления, и, таким образом, этим
вынуждены заниматься токсикологи.
Большинство применяемых в настоящее время химических методов
анализа являются неспецифичными. С успехом были использованы методы
колоночной хроматографии [2, 35, 40]. Для подобных разделений требуется,
однако, большое количество анализируемой смеси. Поэтому колоночная
хроматография используется главным образом для обогащения инсекти-
цидных фракций, которые идентифицируются затем — как указали Мюллер,
Эрнст и Шох [30] — методом хроматографии на бумаге или методом ХТС.
Применяя метод хроматографии на бумаге, можно обнаружить 15—50 цг
инсектицидов [9, 11, 27, 39, 55 и др.]. В комбинации с биологической пробой
чувствительность обнаружения можно повысить [26, 52]. Поскольку инсек-
тициды в большинстве случаев представляют собой сильно липофильные
вещества, требуется импрегнирование бумаги.
Липофильные соединения можно, однако, успешно разделять методом
адсорбционной хроматографии на активных слоях. Боймлер и Рипштейн
[1] впервые сообщили об анализе инсектицидов методом ХТС. Эфиры тиофос-
форной кислоты были разделены стандартным методом на слоях силикагеля
растворителем гексан—ацетон (80 + 20) (табл. 87). Обнаружение проводят
слабо кислым 0,5%-ным раствором хлорида палладия.
Таблица 87
Величины hRf инсектицидов на силикагеле Г с растворителем
гексан—ацетон (80 -j- 20)
Инсектицид В , X 100 И] В , X 100 [54] Инсектицид в, х юо СИ в, х юо [54]
Диазинон 76—82 — Хлортион 43—45 40—44
Паратион (Е 605) . . . 65—68 62—64 Фак 20—26 —
Метасистокс 62—64 —- Ротор 4—7 8
Малатион 52—54 50—54
Описанным способом [1] диазинон нельзя перевести в видимое состояние,
однако его можно окрасить родамином В (реактив № 129). Хлорированные
углеводороды не требуется анализировать на особенно активных пластинках
с окисью алюминия [54], поскольку с соответствующими растворителями
можно достичь хорошего разделения на нормальных пластинках с силика-
гелем (табл. 88 и 89). Для получения высокоактивной окиси алюминия пла-
стинки нагревали в течение 2 час при 200 — 220° [1].
При синтезе гексахлорциклогексана образуется смесь изомеров. Посколь-
ку отдельные изомеры по своему действию сильно отличаются, для аналити-
362
Специальная часть
Таблица 88
Величины hRf хлорированных углеводородов
Слой Окись алю- миния вы- сокоактив- ная [1] Окись алюми- ния Г 6 Силикагель Г
Растворитель а I I II III
Алдрин 78—82 Фронт 60—62 60—63
ДДТ 59—61 83 (94) 52—56 50—53
Пертан 48—50 — — —
у-Гексахлорциклогексен .... 39—40 35 27—28 24—26
Диэлдрин 17—19 28 15—16 12—14
Метоксихлор 10—12 — 8—10 5—8
а Растворители: I —н-гексан, II — циклогексан—хлороформ (80 + 20), III — петро-
лейный эфир —четыреххлористый углерод (50 + 50).
® Наши собственные результаты [54].
Таблица 89
Величины hRf 6 изомеров гексахлорциклогексана на силикагеле Г [54]
Изомер Растворитель а Изомер Растворитель а
I II I II
Гепта- 56—60 54—56 Эпсилон- .... 31—33 37—39
Альфа- 40—43 38—40 Бета- 25—28 28—30
Гамма- 33—36 37—39 Дельта- .... 14—17 14—16
а Растворители: I — циклогексан — хлороформ (80 + 20), II — петролейный эфир —
четыреххлористый углерод (50 + 50).
® На менее активных слоях получают более высокие значения, однако разделе-
ние при этом несколько хуже.
ка весьма важны методы разделения. Как видно из табл. 89 и рис. 147,
на слоях силикагеля Г (стандартный метод) при длине пути 14 см удается
разделить важнейшие изомеры.
Анализом методом ХТС некоторых хлорированных углеводородов зани-
мался также Петрович [33]. Он готовил слои силикагеля «вручную» и исполь-
зовал простые растворители, например н-гексан, циклогексан или петролей-
ный эфир (т. кип. 50—70°).
Детерс [7] кратко сообщает, что пентахлорфенол быстро перемещается
на кислых слоях силикагеля Г, приготовленных с использованием 0,05 н.
раствора щавелевой кислоты вместо воды. При разделении хлороформом
и насыщении камеры получают величины hRf, равные примерно 50.
В работе Фишера и Клингельхоллера [12] подробно описано выделение
эфиров тиофосфорной кислоты из органов и жидкостей организма, необхо-
димое для токсикологического обнаружения. Полученные таким образом
экстракты могут быть непосредственно разделены на слоях силикагеля Г,
полученных стандартным методом, при длине пути 12 см. Хроматографиче-
Гл. 17 .'Органические синтетические вещества
363
Таблица 90
Величины hRf 9 эфиров тиофосфорной кислоты
и некоторых продуктов расщепления [12]
Вещество Слой силикагеля Г
1а Па
Паратион 42 84
n-Нитрофенол 81 90
Диазинон 45 86
Потазан 42 и 56 88
Кумариновый остаток 80 92
Фенкаптон 40 и 68 98—100
Систокс 43 и 58 86
Хлортион 31 82
С1-Нитрофенол 67 90
Метасистокс 30, 40 и 48 87
Мелатион 32, 44, 58 и 66 99—100
Тиометон 34, 28 и 58 90
а Растворители: I — метиленхлорид — метанол — 10%-ный аммиак
(80 + 20 + 3), II — метиленхлорид — метанол — 10%-ный аммиак
(65 + 35 + 5).
ский анализ проводился при 30—31° при насыщении камеры (стр. 24). При-
менявшиеся растворители и полученные значения hRf приведены в табл. 90.
а
------Фронт
(li-см)
-»-а
-* £
♦ —Cmapin
6
------Фронт
(12 см)
Апарин
> -*ддт
sSg) -гиг
-^Лиэлдрин
Метоксихлор
• —Старт
Рис. 147. а — разделение изомерных гексахлорциклогексанов на силикагеле Г рас-
творителем I (табл. 89). Обнаружение: обработка флуоресцирующих пластинок родами-
ном В и карбонатом натрия, б — разделение различных хлорированных углеводородов
на силикагеле Г растворителем II (табл. 89). Обнаружение: см. выше.
Обнаружение инсектицидов. Если разделение указанных веществ мето-
дом ХТС не вызывает затруднений, то для обнаружения оказалось не просто
найти соответствующие цветные реакции.
Метод Боймлера и Рипштейна [опрыскивание раствором 0,5 г NN-диметил-
п-фенилендиамин-гидрохлорида в этилате натрия (1 г Na в 100 мл этанола),
в заключение пластинки увлажняют водой и в течение 1 мин экспонируют
перед УФ-лампой без фильтра] оказался успешным только в случае ДДТ.
364
Специальная часть
Нам удалось разработать значительно более чувствительную методику,
которая позволяет обнаружить 0,02 цг гексахлорциклогексана. Метод
окраски оказался пригодным еще для целого ряда других соединений (напри-
мер, для камфары), которые не могут быть непосредственно переведены
в видимое состояние. При этом исходят из слоев, импрегнированных флуорес-
цеином (реактив № 90е). Если после разделения выдержать такие пластинки
на воздухе 1—2 час, то хлорированные углеводороды обнаруживаются в виде
розовых пятен (при количестве нанесенного вещества, превышающем 5 цг)
в УФ-свете при голубовато-фиолетовом фоне. Эту окраску можно получить
также сразу после разделения, осторожно приведя слой в соприкосновение
с парами воды (кипящая водяная баня). Интенсивность окраски максимальна
лишь при определенной степени влажности. Необходимое увлажнение можно
привести повторно.
При опрыскивании реактивом родамина В (№ 129) можно обнаружить
часть хлорируемых углеводородов в УФ-свете в виде розовых флуоресцент-
ных пятен. При равномерном опрыскивании 10%-ным раствором карбоната
натрия обнаруживаются и другие соединения, дающие желтую флуоресцен-
цию в УФ-свете.
В дальнейшем мы усовершенствовали этот метод окраски следующим образом. Плас-
тинки, опрыснутые родамином В, покрывают влажной фильтровальной бумагой, кото-
рая предварительно была погружена в 10%-ный раствор карбоната натрия. Нужно сле-
дить, чтобы под бумагой не образовывалось пузырьков воздуха. Затем накладывают
второй лист фильтровальной бумаги, также пропитанной карбонатом натрия, и, нако-
нец, третий, сухой, который прижимают сверху стеклянной пластинкой. Через 15 мин
стеклянную пластинку удаляют и после сушки около 2 час снимают бумагу. Получен-
ные красные пятна инсектицидов сильно флуоресцируют в УФ-свете. На снятой филь-
тровальной бумаге те же пятна дают в УФ-свете желтую флуоресценцию. Бумагу и плас-
тинки можно сохранять в течение ряда лет для документации. Документы сохраняются
лучше, если 0,04%-ный водный раствор флуоресцеиновых пластинок содержит 0,5%
поваренной соли.
Для обнаружения хлорбензолов их следует предварительно нитровать. После этого
они реагируют описанным образом с родамином В или флуоресцеином.
Для обнаружения приведенных в табл. 90 эфиров тиофосфорной кислоты
Фишер и Клингельхоллер [12] рекомендуют опрыскивание концентрирован-
ным раствором азида иода (3%NaN3B0,l н. растворе иода). Образующиеся
при этом белые пятна следует сразу промаркировать (минимально определяе-
мое количество 1—5 рг). Нитрофенол переводят в видимое состояние обра-
боткой парами аммиака.
Петрович [33] для обнаружения ДДТ и изомеров гексахлорциклогексана
использует следующий метод: первоначально опрыскивают моноэтиламином
и нагревают пластинки 20 мин при 100°, затем опрыскивают смесью 0,1 н.
раствора нитрата серебра и азотной кислоты 1,4 (10 -% 1) и подвергают слой
действию УФ- или солнечного света.
Пиретрины и синергисты
Наряду с только что рассмотренными синтетическими продуктами исполь-
зуются во все возрастающем количестве растительные инсектициды, напри-
мер смеси пиретринов и ротеноны. В противоположность различным синте-
тическим средствам природные вещества не вредны для теплокровных. Кроме
того, при их применении не наблюдается резистентных явлений. В ряде
препаратов наряду с синтетическими содержатся также и растительные
инсектициды и так называемые синергисты (например, пиперонилбутоксид,
букарполат). Эти синергисты значительно усиливают инсектицидное дей-
ствие пиретринов. Природные пиретрины отличаются по эффективности
и чувствительности к автоокислению, катализируемому светом [51а].
Гл. 17. Органические синтетические вещества 365
При изучении инактивации пиретрина под действием света наиболее
успешно была использована двухмерная ХТС [51а]. Вначале на слой сили-
кагеля Г наносили пробы 5%-ного бензольного раствора пиретринов и
в направлении 1 разделяли пиретрин I и пиретрин II. Затем подвергали
действию ультрафиолетового или солнечного света (рис. 148, заштрихован-
ная зона) и разделяли тем же самым растворителем в направлении 2.
Эталонная смесь • S Смесь W’ '* " пиретринов В > 4 2 О
° w. Эталонная g • '#' я? % смесь Ш Смесь ti — пиретринов # \ \ Фронт 2 \ \ \ \ \ \ Пиретрин 7\ ° • \ W' Пиретрин И Перекись пир.1 $.• № Перекись пир. П ~------- 7~ у 'Лумипире/г^ины7''^^'///'^р///,'// '//^222/,'Л
Направление 1 —-----
Рис. 148. Тонкослойная хроматограмма (метод РРР) концентрата пиретрума.
Сорбент Гсиликагель Г. Облучение (заштрихованная площадь) осуществляют после разделения
в направлении 1. Реакции с хлоридом сурьмы (III), 2,4-динитрофенилгидразином и реактивом
иодистый калий — уксусная кислота — крахмал проводят последовательно (подробности в тексте).
Образующиеся при освещении более полярные продукты разложения лежат
под соответствующими пиретринами. Величина пятен позволяет судить
о скорости разложения. В качестве промежуточных продуктов можно обна-
ружить пиретриновые перекиси, которые уже не обладают инсектицидным
действием, и в качестве конечных продуктов — также биологически неактив-
ные лумипиретрины.
Применимость этого так называемого метода РРР уже рассматривалась
на стр. 44.
Растворитель и слой. Для разделения пиретринов и синергистов исполь-
зуют слои силикагеля Г, полученные стандартным методом. Для разделения
(насыщение камеры) пригодны растворители с элюирующим действием
хлороформа:
1) бензол — метилэтилкетон (90 + 10),
2) бензол — эфир уксусной кислоты (85 + 15),
3) четыреххлористый углерод — этилацетат (80 + 20),
4) гексан — метилэтилкетон (80 + 20),
5) гексан — этилацетат (75 + 25).
При применении последней из упомянутых смесей получают приведенные
в табл. 91 величины hRf.
366
Специальная часть
Величины hRf и реакции [51а]
Таблица 91
Вещество Ну X 100 (средние значения) SbCl3 (SbCl6) * РгО6 24МоОз 2,4- динитро- фенил- гидразин KF- крахмал
направ- ление 1 направ- ление 2
Пиретрин I 50 62 + + —
Пиретрин II 30 41 + + —
Изопиретрин I 57 72 -L + + —
Изопиретрин II 35 49 + + + —
Пиретрин-1-пероксид . . . — 23 (+) (+) + +
Пиретрин-П-пероксид . . — И (+) (+) + +
Изопиретрин-1-пероксид . — 37(23) (+) (+) + +
Изопиретрин-П-пероксид . — 17 (+) (+) + +
Лумипиретрины — 0 + + + +(+)
Аллетрин 48 — + * +
Пиперонилбутоксида . . 35 — + +
Букарполаты 23 — + * +
S421 67 — — — Обнаружение
ХЛ( эра
Масляный желтый .... 42 '53 Красное Красное Красное Красное
ПЯТНО
Индофенол 35 45 Желто- Желто- Желто- Желто-
ватое ватое ватое ватое
Судан красный G 27 36 Красное Красное Красное Красное
а При применении других указанных смесей удается достигнуть несколько лучшего отделе-
ния от пиретринов.
Обнаружение. Для обнаружения соединений, приведенных в табл. 91,
пригодны следующие реактивы:
1. Хлорид сурьмы (III) (реактив № 11), нагрев 10 мин при 110°. Пиретрины I и II
дают серо-зеленые зоны, изопиретрины — серо-коричневые. В УФ-свете (365 .ми) изо-
пиретрины обнаруживают синюю флуоресценцию, пиретрины — желтовато-коричневую.
Синергист пиретрина пиперонилбутоксид окрашивается в фиолетовый цвет. Минимально
определяемое количество пиретрина составляет 2—3 рг.
2. Хлорид сурьмы (V) (реактив № 13) реагирует уже на холоду; наблюдается, однако,
менее благоприятное различие в окраске. Прежде всего реактив используется для обна-
ружения аллетрина и букарполата (10 мин, 120°), дающих коричневые зоны.
3. Фосфорномолибденовая кислота (реактив № 1206). Пиретрины и синергисты
обнаруживаются после нагревания хроматограммы в виде синих пятен на желтом фоне
(неспецифично). Минимально определяемое количество пиретрина составляет около 1 иг.
4. 2,4-Динитрофенилгидразин (реактив № 52а). Пиретрины и продукты разложе-
ния реагируют с образованием желтой окраски, которая переходит в оранжевую.
5. Иодкрахмальная реакция (реактив № 85) используется для обнаружения пире-
триновых перекисей.
6. Обнаружение хлора в октахлордипропиловом эфире (синергист S 421 фирмы
«BASF») и аналогичных соединениях. Хроматограмму опрыскивают спиртовым раство-
ром 2 н. калийной щелочи и нагревают 20 мин при 120°. Затем следует провести опрыс-
кивание 1%-ным раствором нитрата серебра в азотной кислоте (30%;ной). При после-
дующем освещении (ультрафиолетовый или солнечный свет) возникает серо-фиолетовая
зона. Минимально определяемое количество 2—3 цг.
Гл. 17. Органические синтетические вещества 367
Исключительный интерес представляет биологический метод исследования
инсектицидного действия хроматографически разделенных смесей. Шталь
[51а! использует при этом высокочувствительный тест с личинками Aedes
Брухфилда и Харцелла [5]. Менее рекомендуется тест с дрозофилой.
Методика. Если положение инсектицидных веществ на хроматограмме неизвестно,
то, как и в случае, описанном на стр. 302, соскабливают последовательно зону за зоной
и помещают в сосуды с исследуемыми животными. Для пробы на Aedes в чашечки (диа-
метр 30 мм, емкость 0,4 мл) с 0,2 мл отстоявшейся дождевой воды помещают по 10 личинок
Aedes aegyptici (возраст 5—8 дней, длина 2—4 мм), затем добавляют исследуемую
пробу (соскобленный силикагель), накладывают покровное стекло и наблюдают за
личинками в течение 12 час. В случае биологически активных пиретринов I и II (коли-
чество около 1—10 и. г) личинки уже через 10 мин обнаруживают неподвижность и рез-
кие конвульсии (смерть наступает в течение 12 час). При одностороннем боковом осве-
щении только неотравленные личинки обнаруживают фотофобное поведение.
5. ВЕЩЕСТВА, ПРИДАЮЩИЕ ЗАПАХ И ВКУС
а) Искусственные заменители сахара (сахарин, дульцин) [54]
Для обнаружения сахарина или дульцина предварительно подкисленный
водный раствор экстрагируют этилацетатом. Отделенная этилацетатная
вытяжка содержит сахарин. Кислую водную фазу подщелачивают и экстра-
гируют дульцин также этилацетатом. Оба полученных таким образом экстрак-
та можно подвергнуть стандартному хроматографическому анализу на слоях
силикагеля. Применяя растворитель хлороформ — ледяная уксусная кислота
(90 + 10), получают величины hRf. сахарин 30, дульцин 50. Для обнаруже-
ния первоначально опрыскивают родамином В (реактив № 129) и затем рас-
твором нитрата серебра (реактив № 137).
б) Ароматические вещества
Относительно выделения и возможностей разделения часто встречающих-
ся в продуктах питания и косметических препаратах душистых веществ см.
гл. «Производные терпенов» (стр. 186).
III. ДРУГИЕ ВСПОМОГАТЕЛЬНЫЕ И СИНТЕТИЧЕСКИЕ ПРОДУКТЫ
1. СМЕСИ ПОЛИФЕНИЛОВ
(органические охлаждающие средства для реакторов)
Для охлаждения реакторов представляют интерес смеси полифенилов.
При высоких, порядка 400°, производственных температурах под действием
облучения могут возникать сложные смеси. О возможности анализа мето-
дом ХТС подобных полифенильных смесей типа С5Н6 — (С6Н4)ге — С6Н5
п>0 сообщают Гейс и Шлит [14]. Они работали при стандартных условиях
и установили, что выбор адсорбента и его активирование оказывают исклю-
чительное влияние на результат разделения. Так, например, о-, м- и п-тер-
фенилы можно разделить только на смеси окиси алюминия Г фирмы «Merck»
и окиси алюминия для ХТС фирмы «Fluka» (Швейцария). Слои активировали
2 час при 110° и охлаждали и хранили в эксикаторе над пятиокисью фосфора.
В ряде случаев пробы наносили на пластинки, подогретые до 40°. Чистые
вещества наносили в количестве 0,1 рг, а технические смеси — в количе-
стве 0,2—2 рг. В качестве эталона использовали о-терфенил, и отнесенные
к нему величины RSt приведены в табл. 92. Растворителем служил гептан,
а в некоторых случаях — w-пентан. Длина пути составляла 15 см; работали
исключительно с С-камерами (стр. 27).
368
Специальная часть
Таблица 92
Величины Hst и обнаружение полифенилов па слоях окпсн алюминия [14]
Полифенил Rst Окраска с сульфатом церия (IV) — HNO3
дневной свет УФ-свет (366 -ИЦ) а
Бифенил 1,10 — —
о-Терфенил (эталон) 1,00 Светло-желтая —
лг-Терфенил 0,92 Красная —
п-Терфенил 0,85 Коричневая —
2',2"-Кватерфенил 0,88 Светло-коричневая —
З',3"-Квдтерфенил 0,69 Фиолетовая —
4',4"-Кватерфенил 0,45 — Светлая
4',3",3"'-Квинквифенил . . . 0,36 Синяя —
4',4",4"'-Квипквифенил . . . 0,06 — Светлая
4',3",2"',4"'-Сексифенил . . . 0,29 Зелено-желтая —
Диксенилметап 0,56 Желтая —
Трифенилен 0,78 Коричнево-желтая о
а Окраска флуоресценции соответствует окраске, наблюдаемой при дневном свете.
Весьма чувствительным методом обнаружения является опрыскивание
0,3%-ным раствором сульфата церия (IV) в концентрированной азотной
Сг ♦ г* О ♦ '
’ О « О l»t ' ' ' ’
. J f
* в
Рис. 149. Фотография в УФ-свете тонкослойной хроматограммы технической смеси
полифенилов (по Гейсу и Шлиту [14]).
Пробы 0,2 или 2 цг. II —о-терфенил; III —м-терфенил; IV —п-терфенил;
V — 2',2" -кватерфенил.
кислоте. При этом уже при дневном свете видны различно окрашенные поли-
фенилы. В длинноволновом УФ-свете (366 .нр) наблюдается интенсивная
флуоресценция (рис. 149); минимально обнаруживаемое количество 0,05 рг.
Гл. П. Органические синтетические вещества
369
2. ПРОИЗВОДНЫЕ ФЕРРОЦЕНА
Для наблюдения за ходом реакции при синтезах производных ферроцена
Шлогль с сотрудниками [43, 44] использовали хроматографию на слоях сили-
кагеля Г. Многочисленные ферроценилкарбонильные соединения, ферро-
ценилкарбинолы и простые и сложные эфиры, а также азотсодержащие про-
изводные ферроцена можно разделить, используя в качестве растворителя
бензол и смеси бензола с этанолом. Особенно интересные с препаративной
точки зрения карбонильные соединения были разделены I бензолом и сме-
сями II бензол — этанол (30 + 1) и III бензол — этанол (30 + 2), причем
были определены величины Rf.
Обнаружение. Благодаря собственной окраске производных ферроцена
специальная методика перевода их в видимое состояние в большинстве слу-
чаев не нужна. Алкилферроцены и производные без хромофорной группы,
сопряженной с ферроценовым ядром, имеют желтую окраску, моноацилфер-
роцены — оранжевую, а диацилсоединения — красную. Менее интенсивно
окрашенные производные ферроцена можно обнаружить, переводя их в более
интенсивно окрашенные производные ферроциниум-иона действием окис-
лителя.
Величины Rf около 50 исследованных ферроценов графически представле-
ны в оригинальной работе [43]. Величины Rf растут с увеличением доли
этанола в растворителе и с ростом «углеводородного характера» исследуемого
вещества. 1,1'-Дизамещенные перемещаются медленнее соответствующих
монозамещенных, благодаря чему, например, ацилферроцены, получаемые
по реакции Фриделя — Крафтса, можно быстро проверить на содержание
моно- и дизамещенных форм.
Ферроцен и алкилферроцены можно анализировать, используя я-гексан
[44]. Поскольку ацилферроцены в этом растворителе остаются вблизи
старта, они хорошо отделяются от алкилферроценов; таким образом, можно,
например, хорошо проследить восстановление ацилферроценов в алкилфер-
роцены.
3. ОБНАРУЖЕНИЕ ОЛОВООРГАНИЧЕСКИХ СТАБИЛИЗАТОРОВ
В ПЛАСТМАССАХ
Для стабилизации ПВ в настоящее время используют прежде всего
оловоорганические соединения. Такие соединения были исследованы мето-
дом ХТС Тюрлером и Хоглем [53]. Дибутилдилаурат,-дихлорид,-дималеат,
-диолеат и трибутилхлорид олова были разделены смесью я-бутанол —
уксусная кислота (60+1), насыщенной водой. При этом дибутилсоединения,
независимо от кислотного остатка, движутся с одинаковой скоростью, а ток-
сичные трибутилсоединения (примеси) отделяются. Этим же методом можно
также отделить соли дибутилолова от солей диоктилолова. Соли дибутил-,
диоктил-, дибензил- и трибензилолова можно разделить на группы раствори-
телем вода — я-бутанол — этанол — уксусная кислота (40 + 20 + 20 + 2).
При опрыскивании раствором дитизона в хлороформе (10 лгг/100 мл) окраши-
ваются как диалкил-, так и триалкилсоединения олова. При опрыскивании
раствором дифенилкарбазона (реактив № 57) можно перевести в видимое
состояние только соли диалкилолова.
Примечание. Поскольку разделительные слои были приготовлены путем распыления
суспензии силикагеля сжатым воздухом, нельзя было обеспечить равномерной толщины
слоя. Было бы целесообразно повторить эти опыты в стандартных условиях для опре-
деления ориентировочных величин Rf.
24 Заказ .V» 734
370
Специальная часть
4. ЦИКЛОУРЕТАНЫ, ОКИСИ ФОСФИНОВ И ДРУГИЕ СОЕДИНЕНИЯ
Для определения чистоты циклодиуротанов их растворяют в циклогекса-
ноне и каждое вещество в количестве 70 ре наносят на слой силикагеля Г,
полученный стандартным методом [18]. Растворителем служит смесь бензол—
эфир уксусной кислоты — гексанон (50 + 10 + 20). После удаления раствори-
теля (2 час, 120°) для обнаружения опрыскивают насыщенным раствором
хлора в четыреххлористом углероде. Хлор, абсорбированный слоем, можно
удалить, если поместить пластинку на 1 час в вытяжной шкаф. После этого
проводят вторичное опрыскивание водным раствором иодистый калий —
крахмал. Минимально определяемое количество олигоуретана составляет
0,1 рз.
Эртель и Хорнер [10] занимались анализом окисей фосфинов и серни-
стых фенилбензилсоединений методом ХТС на слоях силикагеля Г. В каче-
стве растворителей они использовали ацетон, смеси ацетона с бензолом и хло-
роформ. Для обнаружения рекомендуется хромовая смесь (реактив № 34)
и смесь перманганат калия — серная кислота (реактив № 86а).
5. ВЗРЫВЧАТЫЕ НИТРАМИНЫ
Взрывчатое вещество гексоген (гексагидро-1,3,5-тринитро-3-триазин)
при синтезе Бахмана получается нитрованием гексаметилентетрамина. Чтобы
следить за ходом реакции и иметь возможность идентифицировать образую-
щиеся при синтезе побочные продукты, Хартон [15] разработал анализ мето-
дом ХТС для перечисленных в табл. 93 нитраминов.
Таблица 93
Ориентировочные величины hRf взрывчатых нитраминов
на силикагеле Г с растворителем петролейный эфир—ацетон
(20+12) [15]
Нитрамин Rf X 100
1-Ацетилоктагидро-3,5,7-трипитро-1,3,5,7-8-тетразин . . . 16
Октагидро-1,3,5,7-тетранитро-8-тетразип (октоген) . . . 48
3,7-Д ипитро-1,3,5,7-тетразабицикло-[3,5,1]-понан .... 62
Гексагидро-1,3,5-тринитро-8-триазин (гексоген) 71
2,4,6-Трипитро-2,4,6-триазагептан-1,7-диолацетат .... 93
2,4,6,8-Тетранитро-2,4,6,8-тетраза1юнац-1,9-диолацетат . . 93
Слои силикагеля Г готовят стандартным методом и каждое вещество
наносят в количестве 30 рз в виде метанольного раствора. Растворителем
служит смесь петролейный эфир (40—60°) — ацетон (20 + 12). После
разделения нитрамины обнаруживают при опрыскивании пластинки флуорес-
центным индикатором (реактивы № 90а — и) в виде темных абсорбционных
пятен. Малые количества (0,5 рз) можно обнаружить в виде синевато-фиоле-
товых пятен на слабо-коричневом фоне при опрыскивании 1%-ным раствором
дифениламина в этаноле и последующем облучении пластинок ртутной
лампой высокого давления на 125 вт.
6. ФОТОРЕАКТИВЫ
Для исследования довольно многочисленных реактивов, необходимых
при получении и проявлении цветных пленок, использовали анализ методом
ХТС; в соответствующих промышленных лабораториях накопился огромный
Гл. 17. Органические синтетические вещества 371
неопубликованный опытный материал. Только в одной работе Эгерса [8]
приведены цветные фотографии 7 тонкослойных хроматограмм без указания
условий разделения и обнаружения. Из этой работы следует, что на слоях
силикагеля Г можно разделить смеси о-, м-, n-аминофенолов и N-метил-п-ами-
нофенолов, а также ряд нафтиламин-(1)-моно- и дисульфокислот. Отправные
соображения для выбора растворителей для фенолов можно найти на стр. 313;
для сульфокислот необходимо использовать кислые растворители и начинать
с приведенных на стр. 378 сильно полярных растворителей.
Для обнаружения можно также использовать известные методы проявле-
ния цветных пленок.
ЛИТЕРАТУРА
1. Baumler J., Rippstcin S., Helv. Chim. Acta, 44, 1162 (1961).
2. В e c k m a n n II. F., Anal. Chem., 26, 922 (1954) und 20, 610 (1948).
3. Braun D., Kunststoffe, 52, 2 (1962).
4. Braun D., Geenen H., J. Chromatog., 7, 56 (1962).
5. Bruchfield, Harzell , J. Econ. Entomol., 48, 210 (1955), zit. nach [51].
6. Davidek J., P о k о rn у J., Z. Lebensm.-Untersuch. und Forsch., 115, 113(1961).
6a. Davidek J., Pokorny J., Janicek G., Z. Lebensm.-Untersuch. und
Forsch., 116, 13 (1961).
7. Deters R., Chem. Ztg., 86, 388 (1962).
8. E g g e r s J., Phot, und Wiss., 10, 40 (1961).
9. Eichenberger J., Gay L., Mitt. Gebiete Lebensm. und Hyg., 51, 423 (1961).
10. E r t e 1 H., Horner L., J. Chromatog., 7, 268 (1962).
11. Fischer R., Otterbeck N., Sci. Pharm., 27, 1 (1959).
12. Fischer R., Klingelholler W., Arch. Toxikol., 19, 119 (1961).
13. Ganshirt H., Morianz K., Arch. Pharm., 293, 1065 (1960).
14. G'e iss F., Schlitt H., Veroffentl. der EURATOM, AUR I-l-Chemistry, Nov.
1961.
15. H a r t h о n J. G. L., Acta Chem. Scand., 15, 1401 (1961).
16. H a u s s e r H., Arch. Kriminol., 125, 72 (1960).
17. Hr о ma tk a O., A u e W. A., Mh. Chem., 93, 503 (1962).
18. Kern W., Rauterkus K. J., Weber W., Makromol. Chem., 43, 98 (1961).
19. Knappe E., Peteri D., Z. anal. Chem., 188, 184 und 352 (1962).
20. Kroller E., Fette, Seifen, Anstrichmittel, 64, 85 (1962).
21. Lagoni H.,Wortmann A., Milchwiss., 10, 360 (1955), 11, 206 (1956).
22. Lichtenberger W., Z. anal. Chem., 185, 111 (1962), частное сообщение.
23. Ma chat a G., Arch. Toxikol., 127, 1 (1961).
24. M e c k e 1 L., M i 1 s t e r H., Krause U., Textil-Praxis, 16, 1032 (1961).
25. Meyer H., Deut. Lebensm. Rundschau, 57, 170 (1961).
26. M i 1 1 s P. A., J. Assoc. Offic. Agr. Chemists, 42, 734 (1959).
27. M i t c h e 1 1 L. C., J. Assoc. Offic. Agr. Chemists, 36, 1183 (1953), 40, 294 (1957); 41,
781 (1958).
28. Montag A., Z. Lebensm.-Untersuch. und Forsch., 116, 413 (1962).
29. M о t t i e r M., Mitt. Gebiete Lebensm. und Hyg., 47, 372 (1956).
29a. M о t t i e r M., Potterat M., Analyt. Chim. Acta, 13, 46 (1955).
30. M ii 1 1 e r R., Ernst G., Schoch H., Mitt. Gebiete Lebensm. und Hyg., 48,
152 (1957).
31. Pastuska G., Trinks H., Chem. Ztg., 86, 135 (1962).
32. P e e r e b о о m J. W. C., J. Chromatog., 4, 323 (1960).
33. P e t г о w i t z H. J., Chem. Ztg., 85, 867 (1961).
34. P e t г о w i t z H. J., P a s t u s k a G., J. Chromatog., 7, 128 (1962).
35. P r e s s J. M., Bull. World Health Organization, 20, 153 (1959).
36. Prey V., В e r b a 1 k H.,Kausz M., Mikrochim. Acta, 1962, 449.
37. Rey E., Erhart L., Bull, schweiz. elektrotech. Ver., 52, 401 (1961).
38. Rey E., Elektrotechn. Z., Ausg. В 13, 299 (1961).
39. S a n Antonio J. P., J. Assoc. Offic. Agr. Chemists, 43, 721 (1960).
40. Sandi E., Z. anal. Chem., 167, 241 (1959).
41. Schetty G., Kuster W., Helv. Chim. Acta, 44, 2193 (1961).
42. S c h e t t у G., Helv. Chim. Acta, 45, 809, 1095 (1962).
43. Schlogl K., Pelousek H., M о h a r A., Mh. Chem., 92, 533 (1961).
44. Schlogl К., M о h a r A., Pelousek H., Mh. Chem., 92, 921 (1961).
44a. Schlogl K., Naturwiss., 46, 447 (1959).
45. Schorn P. J., Stahl E., неопубликованные данные.
24:
372
Специальная часть
46. Seher A., Fette, Seifen, Anstrichmittel, 61, 345 (1959).
47. Seher A., Nahrung, 4, 275 und 466 (1960).
48. Seher A., Mikrochim. Acta, 1961, 308.
49. Spickett R. G., Chem. and Ind., 1957, 561.
50. Stahl E., Chem. Ztg., 82, 323 (1958).
51. Stahl E., Arch. Pharm., 292, 411 (1959).
51a. Stahl E., Arch. Pharm., 293, 531 (1960).
52. S t r a c h e F., I n d i n g e r J., Deut. Lebensm. Rundschau, 57, 197 (1961).
53. T ii r 1 e r M., H 6 g 1 0., Mitt. Gebiete Lebensm. und Hyg., 52, 123 (1961).
54. W a 1 d i D., неопубликованные данные..
55. Winteringham F. P., Harrisson A., Rridges R. G., Nature, 177,
86 (1956).
-56. Wollenweber P., J. Chromatog., 7, 557 (1962).
ГЛАВА 18
ГИДРОФИЛЬНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ ИЗ РАСТЕНИИ
(в первую очередь лекарственных)
Э. Шталъ, II. Шорн
Сравнительно большое число содержащихся в растениях веществ с более
или менее выраженным липофильным характером было уже рассмотрено
в предыдущих главах. Остались еще гидрофильные группы веществ, кото-
рые нельзя было отнести ни к предыдущим, ни к последующим главам.
Большинство из этих соединений отличается наличием свободных, метили-
рованных или этерифицированных сахарами фенольных гидроксильных
групп. Этанольные вытяжки растительных лекарственных веществ содер-
жат, как правило, смеси этих соединений. По-видимому, при выборе соот-
ветствующих условий большинство вытяжек лекарственных веществ из расте-
ний можно идентифицировать методом ХТС. Как раз в случае большого
числа «слабодействующих» лекарств это до сих пор являлось сложной
задачей.
I. ПРИРОДНЫЕ ПРОИЗВОДНЫЕ а- И у-ПИРОНА
Производные пиронов широко распространены в растительном мире.
В качестве важнейших представителей производных а-пирона следует назвать
кумарины, изомерные кумарины и 6,7- или 7,8-фурокумарины.
Кумарины
6,7-Фурокум арины
Формулы показывают, что речь идет о ненасыщенных ароматических
лактонах. Почти все природные кумарины имеют свободную или этерифици-
рованную группу ОН, главным образом в положении 7. Наряду с метиловы-
ми эфирами (эфиры винилогомологические карбоновых кислот) нередко встре-
чаются соответствующие гидрофильные глюкозиды. Многочисленные соеди-
нения этой группы обнаруживают, в большей или меньшей степени, флуорес-
ценцию, и многие производные можно непосредственно сублимировать из
растительного материала.
По своей полярности и хроматографическому поведению кумарины
близки к производным у-пирона, и поэтому найденные там зависимости
между строением и величиной Rf (стр. 379) в большинстве случаев можно
перенести на этот класс соединений.
Значительно чаще при анализе растительных материалов находят произ-
водные у-пирона. Для удобства большое число встречающихся здесь соеди-
374
Специальная -часть
нений
разделяют на группы природных хромонов и флаваноидов.
Хромоиы
(бензо-f-пирон)
Флавоны
(2-фенилбензо-7-пирон)
(от светло- до темно-
Изофла воны
(3-фе ни лбе изо у - пирон)
(бесцветный)
желтого)
Флавоны встречаются в различной степени окисления; при этом различают
Фл авонолы
(от светло- до
темно- желтого)
Флавононы
(бесцветный)
+
Антоцианидины
(красный, голу-
бой, фиолетовый)
Катехины
(бесцветный)
Дальнейшее подразделение проводят по числу и положению заместите-
лей, главным образом групп ОН. Этерификацию сахарами наблюдают чаще
всего при С3, реже при С5, С? и других положениях. Наиболее богат кисло-
родом найденный в природе 5,3'-диокси-3,6,7,8,4',5'-гексаметоксифлавон
(дигицитрин), выделенный недавно Мейером и Фюрстом [31]. Другие подроб-
ности можно найти в обзорах о флавоноидах у Венкатарамана [55], о кате-
хинах у Фройденберга и Вайнгеса [13] и о хромонах у Шмида [48]. Анали-
тические возможности, включая выделение, рассмотрены в обзоре Гайсмана
[14]. О встречающихся в природе кумаринах имеется сообщение Дина [9].
Хорошие примеры их выделения имеются в многочисленных работах Шпета
[49] и также у Байерхейма-Свендсена [2], а примеры идентификации мето-
дом хроматографии на бумаге — у Реппеля [44].
1. КОНЦЕНТРАТЫ ИЗ РАСТИТЕЛЬНЫХ МАТЕРИАЛОВ
Основные вещества, формулы которых приведены выше, почти все липо-
фильны; однако, поскольку они, как правило, содержат группы ОН, кото-
рые в свою очередь могут быть этерифицированы глюкозидами и поэтому
имеют гидрофильный характер, обычная система обогащения здесь непри-
менима.
а) Для экстракции антоцианов (антоцианидин + сахарный остаток)
обычно получают холодный мацерат измельченного материала с 1%-ным
водным или метанольным раствором соляной кислоты. После кислого гидро-
лиза (15 мин, 100°) антоцианидины можно извлечь амиловым спиртом. Дру-
гие подробности приведены Бейт-Смитом [3].
б) Флавоноиды и производные кумарина, включая многочисленные неже-
лательные сопутствующие вещества, можно извлечь при исчерпывающей
экстракции метанолом. Глюкозиды, наоборот, можно извлечь из раститель-
ного материала уже при кипячении с водой. Почти во всех случаях мета-
нольные экстракты значительно, но осторожно упаривают, затем разбавляют
слегка водой и несколько раз извлекают смесью эфир уксусной кислоты —
метанол (95 + 5). В водной фазе остаются ди- и триглюкозиды, а моноглю-
козиды и аглюконы переходят в эфирную фазу. Для дальнейшей очистки
Гл. 18. Гидрофильные соединения из растений
375
можно использовать реакции осаждения с нейтральным или основным ацета-
том свинца. В последние годы стало возможным отделить нежелательные
сопутствующие вещества, применяя полиамидную колоночную хроматогра-
фию (см. ниже), и получить хорошо кристаллизующиеся фракции [12, 15,
23, 35].
2. СОРБЕНТЫ И РАСТВОРИТЕЛИ
Согласно опыту, полученному в случае других групп веществ, результат
разделения при переходе к тонким мелкозернистым слоям значительно лучше,
чем при обычной колоночной хроматографии. Поэтому имеет смысл рассмо-
треть полученные ранее результаты и использовать найденные там сорбенты
и растворители для анализа методом ХТС.
а) Колоночная хроматография флавоноидов
Уже давно было найдено, что окись алюминия непригодна для хромато-
графического анализа флавоноидов, поскольку образуются довольно ста-
бильные комплексы с изменяющейся окраской. Более подходящим, по-види-
мому, является сульфат кальция, который был использован в колоночной
хроматографии антоцианов [26]. Хороший результат был достигнут при раз-
делении катехинов [6, 7] и синтетических антоцианидинов [49а] с исполь-
зованием влажного силикагеля в качестве неподвижной фазы и эфира в каче-
стве подвижной фазы. В качестве весьма подходящего сорбента во многих
работах рекомендуют «магнезол»— гидрат трисиликата магния * [24, 42].
На колонках, заполненных магнезолом, можно разделять смеси флавоноидов,
используя в качестве растворителя этплацетат,насыщенный водой. Для очистки
сырых экстрактов использовали также ионообменные смолы [с 14]. Разде-
ление на колонках, заполненных целлюлозным порошком, протекает удовле-
творительно только в случае простых смесей. Для препаративного предвари-
тельного разделения вместо обычной бумаги с большим успехом используют
фильтровальный картон. В последние годы делаются попытки оценить воз-
можности использования сорбционных свойств полиамидных порошков
(перлон, ультрамид, силон и др.).
Полиамид использовали для разделени смесей низкомолекулярных дубильных
веществ, флавонов, хальконов, флавононов, полиоксифенолов, хинонов, ДНФ-амино-
кислот. Соответствующие литературные ссылки имеются у Эндерса [12]. Из этих работ
видно, что полиамидная хроматография пригодна для разделения фенолов и их произ-
водных. Сорбционная способность обусловлена амидными группами полиамида, при
этом возникает водородная связь с ОН-группами фенола. Поэтому с увеличением числа
групп ОН, не расположенных рядом, фенолы удерживаются сильнее. о-Диоксигруппы
обнаруживают такое же действие, как и отдельные группы ОН. Для элюирования адсор-
бированных веществ проводят вытеснение соответствующим растворителем.
Хорхаммер [23] приводит ряд вытеснителей с увеличивающимся элюи-
рующим действием: вода — этанол — метанол — ацетон — разбавленная
щелочь — формамид — диметилформамид.
б) Анализ методом ХТС
В то время как о возможности разделения методом хроматографии на
бумаге кумаринов [2, 44] и флавоноидов имеется обширный опытный мате-
риал, обобщенный Хенселом [20] и Прохазкой [43], опыты по разделению
на слоях тонкого порошка целлюлозы до настоящего времени неизвестны.
Согласно имеющемуся в нашей лаборатории опыту [51], результаты разде-
ления на слоях силикагеля оказываются более благоприятными.
* Фирма «Woelm» (Эшвеге) выпустила силикат магния для ХТС; для приготовле-
ния массы для нанесения используют 15 г силиката магния и 45 мл воды.
376
Специальная часть
а) СЛОИ СИЛИКАГЕЛЯ Г
При изучении биогенеза изофлавонов Гризбахом {16, 17] были успешно
использованы слои силикагеля Г для очистки радиоактивно меченных фла-
воноидов. Растворителем служила смесь бензол — этанол (92 + 8). При
аналогичных исследованиях Биллека [5] был использован метод хромато-
графического анализа (растворитель — бензол) кумарина, выделенного из
пахучей смолки.
10 мг метанольного экстракта разделяют на слое силикагеля Г бензолом, зону кума-
рина соскабливают и элюируют хлороформом, а остаток сублимируют в пробирке.
В заключение проводят хроматографическое разделение на бумаге [5].
Эта операция очистки была с успехом использована Вейгандом с сотрудниками
[62, 63] для аналогичных исследований.
При открытии и идентификации недавно выделенного Мейером и Фюр-
стом [31] из Digitalis purpurea L. дигицитрина метод ХТС оказался весьма
ценным вспомогательным средством. На слоях силикагеля Г с растворителем
бензол — этилацетат (75 + 25) были получены следующие величины hRf.
5,3'-Диокси-3,6,7,8,4',5'-гексаметоксифлавон (дигицитрин) . . . 38—40
3,5,6,7,8,3',4',5'-Октаметоксифлавон .......................... 24—28
5-Окси-3,6,7,8,3',4',5'-гептаметоксифлавон ........... 64—66
5,3'-Дибензилокси-3,6,7,8,4',5'-гексаметоксифлавон .............. 68—71
2-Окси-и,3,4,5,6-пентаметоксиацетофенон ......................... 44—47
Парис [36—38] сообщил также' о хорошем разделении смесей флавонои-
дов на слоях силикагеля с крахмалом. При толщине слоя 1 мм он применял
смеси этилацетат — хлороформ или этилацетат — метанол (95 + 5) или
насыщенную водой смесь гексан — изопентанол — уксусная кислота.
Весьма важным является применение ХТС для идентификации лекар-
ственного сырья и быстрого выявления фальсификаций. Поэтому Хорхам-
мером, Вагнером и Леем [22] для обнаружения наиболее часто встречающейся
Таблица 94
Хроматографические различия Radix Pimpinellae и Radix Heraclei [22]
Корень Pimpinella Корень Heracleum
hR. SbCl6 (дневной свет) без опрыскивания (УФ-свет) hRf без опрыскивания (УФ-свет) SbCl5 (дневной свет)
8 — Темная окраска 8 Темная окраска —.
15 Светло-коричне- вая — 15 — Светло-коричне- вая
20 То же — 20 — То же
25 — — — Т емкая —
— — Пимпинеллин 40 Коричневая Синяя
— — Спондин 43 Светло-коричне- вая —
45 Коричневая — —• — —
— — Изопимпинеллин 50 Коричневая Желто-зеленая
— — Изобергаптеп 55 Темно-синяя »
60 — Темная 60 Темная —
70 Коричневая — 70 — Коричневая
90 » — 90 — »
Гл. 18. Гидрофильные соединения из растений
377
подмены Radix Pimpinellae корнем аканта (Heracleum spondylium L.)
были использованы слои силикагеля Г. Возможность обнаружения основана
на большом различии в содержании производных кумарина.
1 г лекарственного сырья в виде тонкого порошка обрабатывают в закрытом сосуде
10 мл петролейного эфира в течение 6—8 час при частом помешивании. Фильтрат затем
осторожно упаривают до объема 1 мл и на-
носят 10—15 мм3 на слой силикагеля, по-
лученный стандартным методом. Раствори-
телем служит хлороформ. При насыщении
камеры длина пути составляет 12 см. Хро-
матограмму первоначально рассматривают
в длинноволновом УФ-свете и затем опры-
скивают 10—20 мл раствора хлорида сурь-
мы (V) (реактив № 13) и нагревают
2—3 мин при 110°.
Различие приведено в табл. 94.
Для лучшей идентификации спир-
товых вытяжек из лекарственного
сырья (тинктуры, жидкостные эк-
стракты и т. д.) Шталь и Шорн [51]
исследовали возможности разделения
на слоях силикагеля Г свыше 50 про-
изводных пирона, ароматических
оксикислот, дубильных веществ, про-
изводных антрацена и веществ, со-
держащихся в лишайниках. Боль-
шие различия в полярности соедине-
ний указанных типов вызвали необ-
ходимость использовать ряд раство-
рителей различной элюирующей си-
лы. Если сравнить растворители для
Рис. 150. Влияние используемых прояви-
телей (I — V) на разделение эталонной
смеси красителей (слой силикагеля).
Из рисунка видно, что разделение может быть,
достигнуто со многими проявителями. Лишь
при тонком разделении различных классов ве-
ществ возникает необходимость изменения ос-
новного типа III. О масляный желтый; ® судам,
красный G-; ф индофенол.
анализа веществ, содержащихся в ли-
шайниках, то обнаруживаются довольно разнообразные основные типы:
Толуол
Бензол
Хлороформ v
Этиловый эфир уксусной
или муравьиной кислоты
(25 — 50)
Муравьиная
кислота
1 — 10%
Липофильная
часть
Основной компонент
Кислая часть
Растворители этого типа, по-видимому, могут быть столь же широко исполь-
зованы в случае слоев силикагеля, как и смесь Партриджа [41] в хрома-
тографии на бумаге. Это видно из поведения 3-компонентной эталонной
смеси в растворителях такого типа (рис. 150). Первоначально эталонную смесь
наносили только для определения адсорбционной активности слоев сили-
кагеля и окиси алюминия при применении бензола и других веществ в каче-
стве растворителей.
В табл. 95 приводятся условия разделения для различных классов сое-
динений. Путем дальнейшего варьирования основных типов можно подойти
к решению специальных задач разделения.
На рис. 151 приведены результаты, полученные с растворителем III,
а в подписи к рисунку даны величины hRf и методы обнаружения.
Из фотографии тонкослойной хроматограммы в УФ-свете (рис. 152)
видно, что этим методом удается получить важные результаты и при анализе-
спиртовых вытяжек лекарственного сырья. При использовании растворителя
III глюкозиды остаются на точке старта. Разделение флавонглюкозидов
•378
Специальная часть
Таблица 95
Растворители для гидрофильных веществ, содержащихся в растениях [51]
Растворитель Слой Группа веществ
I Бензол — хлороформ Силикагель Г, забу- Вещества, содержа-
II (50 + 50) Хлороформ — этилаце- ференный 0,5 н. щавеле- вой кислотой Силикагель Г щиеся в лишайнике Дубильные вещества
III тат — муравьиная кис- лота (50 40 + Ю) Толуол — этилформи- ат — муравьиная кисло- Силикагель Г, забуфе- ренный 0,3 М ацетатом а- и у-Пироны, окси- кислоты, производные
IV V та (50 + 40 + 10) Бензол — этилформи- ат — муравьиная кисло- та (75 + 24 + 1) Этилацетат — метил- этилкетон —муравьиная кислота — вода (50 + + 30 + 10 + 10) натрия Силикагель Г То же гидрохинона Производные антраце- на Флавонглюкозиды ан- тоцианы
и антоцианов возможно с растворителем V. На слоях силикагеля Г при стан-
дартных условиях были получены следующие величины: hRf робинии 16,
рутин 28, нарингин 41, гиперозид 47, апигенин-7-глюкозид 55, кверцитрин 63.
Рис. 151. Схематическое изображение тонкослойной хроматограммы производных
кумарина (7—8), флавоноидов (9—15) и производных гидрохинона (76—20).
Пробы 0,1 цг. В круглых скобках приведена окраска флуоресценции кумаринов, в квадратных —
окраска флуоресценции флавоноидов после опрыскивания «природным реактивом» (.№ 55).
Гидрохиноны переводятся в видимое состояние реактивом Миллона. Т — эталонная смесь: масля-
ный желтый (О) + судан красный (®) + индофенол (•).
1 — эскулин, hRf 6 (голубая); 2 — эскулетин, hRf 42 (голубая); 3 — скополетин, hRf 49 (голу-
бая); 4 — 4-метилумбеллиферон, hRf 52 (голубая); о — ксантотоксин, hRf 56 (желтая); 6 — бергап-
тен, hRf 61 (желтая); 7 — императорин, hRf 64 (желтая); 8 — атамаптин, hRf 68 (голубая);
Gi — смесь кумаринов (Г—s);
9 —робинетин, hRf 8 [оранжевая]; 10 —морин, hRf 12 [желто-зеленая]; 11—таксифолин, hRf 22
[оранжевая]; 12 — кверцетин, hRf 28 [оранжевая]; 13 — каэмпферол, hRf 40 [желто-серая];
14 — парингенин, hRf 46 [коричнево-серая]; 15 — хризин, hRf 52 [оранжевая]; Gj— смесь флаво-
ноидов (9—Г5);
16 — арбутин, hRf 5; 17 — метиларбутин, hRf 12; 18 — гидрохинон, hRf 35; 19 — монометиловый
эфир гидрохинона, hRf 46; 20 — диметиловый эфир гидрохинона, hRf 65; G3— смесь гидрохино-
нов (76— 20).
Гл. 18. Гидрофильные соединения из растений
379
Поскольку исследователи не имели чистого антоциана * для эталона, они
проверяли возможность применения растворителя V по цветочной вытяжке,
содержащей антоциан (холодный мацерат: 1 г порошкообразного лекар-
ственного вещества + 10 мл метанола + 0,01% соляной кислоты).
1ОСЛ1
Сяшрг
Рис. 152. Распознавание спиртовых вытяжек лекарственного сырья Umbellijeren.
Не подвергнутая опрыскиванию тонкослойная хроматограмма, сфотографированная
в длинноволновом УФ-свете.
1 — плоды Аттг majus L.; 2 — плоды Аггстг visnaga L. Величины hRf и флуоресценция наиболее
важных компонентов этих плодов: келлин (коричневая) hRf 47, келлол (желто-коричневая)
hRf 30, виснагин (желто-коричневая) hRf 45, келлол-глюкозид (голубая) hRf 0; 3 — корень
Angelicas', 4 — корневище Imperatoriae', 5 — корень Levistici', 6 — корень Pimpinellae.
На хроматограмме Flor. Paeoniae было получено 5 антоциановых пятен
(hRf = 17, 25, 39, 48, 62), на хроматограммах Flor. Malvae arboreae (hRf —
= 8, 13, 30, 44) и Flor. Malvae silvestris (hRf = 8, 15, 22, 43) — по четыре
пятна, три пятна наблюдали на хроматограмме Flor. Cyan! (hRf — 8, 14,
27) [53].
Зависимость между величинами Rf и строением. Согласно полученным
до настоящего времени результатам со слоями силикагеля Г и указанными
кислыми растворителями, по-видимому, справедливы те же эмпирические
правила, которые сформулированы еще в 1950 г. Бейт-Смитом и Вестолом [4]
для анализа флавоноидов методом хроматографии на бумаге. Для разделе-
ния флавоноидов на бумаге часто используют смеси н-бутанол — ледя-
ная уксусная кислота — вода (40 + 10 + 50) и at-к резол — ледяная уксус-
ная кислота — вода (50 2 + 48); приведенные ниже зависимости отно-
сятся именно к этим системам.
1. С увеличением числа свободных групп ОН уменьшается величина Rf.
Соединения С15 с одинаковым числом групп ОН имеют почти одинаковые
величины Rf (см. пункт 5).
2. Метилирование групп ОН приводит к повышению величины Rf,
которая в 1/з—1/2 раза меньше, чем при элиминировании группы ОН.
3. Ацетилирование в большинстве случаев сильно повышает величину Rf.
4. Образование глюкозида приводит к понижению величины Rf; этот
эффект (глюкоза) чаще всего перекрывается с введением одной группы ОН.
5. Орто- или смежное положение заместителей может привести к исклю-
чению из правила, поскольку часто наблюдают неожиданное повышение
величин Rf в результате образования внутренних водородных мостиков.
* Во время издания настоящей книги появилась работа Биркофера с сотрудни-
ками [5а] по анализу методом ХТС антоцианов на полиакрилнитрил-перлоновых слоях
(см. стр. 42). Кроме того, были сообщения о разделении оксикоричных кислот и сахаров.
380
Специальная часть
Р) ПОЛИАМИДНЫЕ СЛОИ
В результате успехов колоночной хроматографии напрашивается при-
менение мелкозернистых полиамидных слоев [50]. Согласно имеющемуся
у нас опыту, результаты в отношении четкости разделения и величины пятен
сравнимы с аналогичными величинами в хроматографии на бумаге, и поэтому
эти результаты нами не публиковались. В разделе «Полиамидная тонкослой-
ная хроматография» Давидек и Давидкова [8] сообщают о приготовлении
незакрепленных полиамидных слоев и разделении экстрактов бузины 80%-ным
метанолом на 3 зоны. В этом же году Эгером [И] было опубликовано под-
Р и с. 153. Разделение флавополглюкозидных форм
на полиамидном слое с проявителем 3 (см. текст).
Необработанная тонкослойная хроматограмма, сфо-
тографированная в прямом свете.
робное исследование возмож-
ности разделения флавонол-
глюкозидов на полиамидных
слоях.
Получение полиамидных слоев
[10]. Полиамидный порошок
РР 15/SP фирмы «BASF»(Людвигс-
хафен) суспендируют в этил аце-
тате, наносят суспензию на стек-
лянные пластинки и равномерно
распределяют (толщина слоя
варьируется между 200 и 500ц).
После сушки на точку старта на-
носят пробу 5—30 цг. Разде-
ляют при насыщении камеры
(стр. 24). Поскольку слои плохо
пристают к пластинке, рекомен-
дуется область старта увлажнять,
для этого пластинки погружают
в растворитель до линии старта.
При длине пути 20 см время ана-
лиза составляет 2—3 час.
Недавно фирмой «Woelm»
был выпущен в продажу по-
лиамидный порошок для тон-
кослойной хроматографии и
приведены следующие усло-
вия эксплуатации.
Для каждой из 5 стеклянных пластинок 20 X 20 см (толщина слоя, установленная
на приспособлении для нанесения слоев, составляла 300 и) смешивают 5 г полиамидного
порошка с 45 мл смеси хлороформ —• метанол (2 + 3) в колбе Эрленмейера и затем нано-
сят суспензию на пластинку.
В качестве растворителей Эгер [11 ] использовал смеси этанол — вода
(60 + 40), вода — этанол — ацетилацетон (40 4- 20 + 10) и вода — этанол —
этилметилкетон — ацетилацетон (65 + 15+15 + 5) и исследовал поведе-
ние 14 глюкозидов аглюконов кемпферола, кверцетина и мирицетина. Ока-
залось, что 3-монозиды отделяются от 3-биозидов и последние в свою оче-
редь — от 3,7-глюкозидов. Величины Rf, таким образом, зависят не от аглю-
кона, а в значительной мере от глюкозидируемого образца. В приведенных
выше растворителях 1 и 2 флавонол-3-монозиды дают величину hRf = 22,
3-биозиды — между 32 и 39 и 3,7-диглюкозиды — между 57 и 72. На рис. 153
показано разделение смеси глюкозидов на 3 указанные группы.
3. ОБНАРУЖЕНИЕ НА ХРОМАТОГРАММЕ
Некоторые производные пирона, например антоцианы, можно обнаружить
на хроматограмме по собственной окраске. Особенно важно перед приме-
Гл. 18. Гидрофильные соединения из растений
381
пением реагентов для опрыскивания рассмотреть хроматограмму в длин-
новолновом и коротковолновом УФ-свете и отметить иглой как флуоресци-
рующие, так и темные абсорбционные пятна. Затем в большинстве случаев
следует подщелачивание, вначале только парами аммиака, а потом и более
сильной щелочью. В обоих случаях отмечают окраску при дневном и УФ-свете.
Первоначальные ориентировочные сведения можно получить из приве-
денных в табл. 96 цветных реакций. Данные о более точной цветной иденти-
фикации можно найти у Хенселя [20] и Гайсмана [14].
Таблица 96
Окраска производных пирона до и после подщелачивания
при дневном и в ультрафиолетовом свете
Соединение Без обработки После подщелачивания
дневной свет УФ-свет (365 -иц) дневной свет УФ-свет (365 .мц)
Флавоны Отсутствует, желтая Коричневая, синяя Желтая Желтая
Флавонолы Светло-жел- тая — темно-жел- тая Желтая, жел- то-зеленая » »
Флавонол- 3-триглю- козиды Отсутствует, желтоватая Коричневая, темная » Желтая, желто- зеленая
Флавононы Отсутствует Отсутствует (254 лщ, темная) Отсутствует Желтая
Катехины Отсутствует Отсутствует (254 мр., темная) Отсутствует, частично темне- ющие Темная
Антоцианы Красная (кис- лая среда) Коричневая, темная Синяя Темная
Кумарины Отсутствует Отсутствует, синяя, желтая или темная Отсутствует, желтая Отсутствует, желто-зеленая, синяя или темная
Многочисленные описанные в литературе реакции обнаружения также
в значительной мере неспецифичны. В принципе можно использовать сле-
дующие группы реактивов: а) щелочи (пары аммиака и реактивов № 82),
б) соли металлов (образование комплексов) (реактивы № 2, 20, 62), в) неорга-
нические и органические соединения бора (образование комплексов) (реак-
тив № 55), г) кислоты (усиление флуоресценции) (реактивы № 142 и 143)
с добавлением цветных реакций альдегидов (реактив № 150), д) соли диазо-
ния, сочетаемые с фенолами (реактивы № 37а, 61); наиболее пригодны ста-
бильные соли диазония [34]. Кроме того, для обнаружения фенолов исполь-
зуют реактив № 40.
Майер и Фюрст [31] для обнаружения дигицитрина и производных проводили опрыс-
кивание 0,5%-ным водным раствором перманганата калия и получали желтые зоны на
фиолетовом фоне. Согласно Резнику и Эгеру [45], для обнаружения фенольных о-дио-
ксигрупп в кумаринах, флавоноидах и производных коричной кислоты весьма пригоден
реактив Бенедикта. Нефлуоресцирующий кумарин обнаруживают после слабого опрыс-
кивания 1 н. натриевой щелочью. Образуется натриевая соль кумариновой кислоты,
дающая интенсивную желтовато-зеленую флуоресценцию. После опрыскивания 1 н.
соляной кислотой обнаруженные таким образом вещества можно экстрагировать в их
первоначальной лактоновой форме хлороформом, соскоблив слой с пластинки.
Реакция со смесью перекись водорода — хлорид железа (III) (реактив № 118)
также пригодна для обнаружения кумаринов.
382
Специальная част ь
Наряду с простым подщелачиванием следует особенно рекомендовать
описанную Неем [33] смесь дифенилборная кислота — р-аминоэтиловый
эфир (реактив № 55 — природный реактив А фирмы «Roth», Карлсруэ).
II. ВЕЩЕСТВА, СОДЕРЖАЩИЕСЯ В ЛИШАЙНИКАХ
Благодаря высокому антибиотическому действию ряда лишайников
(их экстрактов) вещества, содержащиеся в лишайниках, заслуживают особо-
го внимания. Биологическая активность объясняется прежде всего наличием
d-усниновой кислоты, встречающейся в видах уснеа, эверниа, летариа и пар-
мелиа. Из лишайников выделено также около 70 других соединений, которые
можно отнести к депсидам, депсидонам, дибензофуранам и лактоновым кисло-
там. Качественные и количественные различия в содержании этих веществ
могут быть использованы для идентификации некоторых лишайников [21].
До настоящего времени для разделения использовался метод хроматографии
на бумаге [21, 57]. Для идентификации имеет смысл наряду с кислотами,
выделенными из лишайников, хроматографически анализировать и продук-
ты их гидролиза.
При относительно высоком содержании порядка 0,5—5% для идентификации лишай-
ника достаточно около 50 мг тонко измельченного высушенного материала; его несколько
раз кипятят с 0,5 мл бензола и несколько раз с 0,5 мл ацетона. Оба отфильтрованных
экстракта упаривают до 0,5 мл и наносят пробы по 10—100 мм 3. Для кислого гидролиза
к упаренному досуха экстракту добавляют 1—2 капли концентрированной серной кис-
лоты, затем через 5—10 мин разбавляют 2 мл воды и извлекают продукты расщепления
эфиром [57].
На кислых слоях силикагеля при стандартных условиях можно быстро
определить основные компоненты полученных промышленных экстрактов
лишайников и чистых веществ. При приготовлении слоев вместо воды исполь-
зуют 0,5 н. раствор щавелевой кислоты. Растворителем служит смесь бензол —
хлороформ (50 + 50). После испытания применявшихся до настоящего
времени реактивов для опрыскивания оказалось [57], что наилучшие резуль-
таты могут быть получены со смесью анисовый альдегид — серная кислота
(реактив № 9). Наиболее часто встречающиеся в лишайниках кислоты обна-
руживают следующие величины hRf и цветные реакции: вульпиновая кисло-
та 80 (желтая), усниновая кислота 65 (фиолетовая), эверновая кислота 11
(красная) и продукт расщепления орцин 3 (красный).
III. ФЛОРОГЛЮЦИНБУТАНОНЫ
(филикс-флороглюциды)
В случае биологически активного против ленточного глиста вещества
из корневища папоротника (Dryopteri.s filix-mas [L.] Шотт) мы имеем дело-
с флороглюцин-производным. Нынешнее состояние химического анализа
и возможности разделения методом хроматографии на бумаге рассмотрены
в работе Цвимпера и Бюхи [64]. Приведенные в табл. 97 филикс-флороглю-
циды сильно различаются по своему теницидному действию.
Для концентрирования этих веществ порошок лекарственного сырья экстрагируют
эфиром и из эфирного экстракта извлекают водой «Mg-рофилицин», связанный с окисью
магния. Путем добавления уксусной кислоты можно получить смесь, носящую название
рофилицин [1]. Для анализа методом ХТС из «нее готовят 1%-ный раствор и наносят
2—4 мм3.
Независимо друг от друга и примерно в одно и то же время двумя лабо-
раториями были опубликованы условия анализа. Шанц с сотрудниками [47]
использовал слои силикагеля Г, приготовленные со смесью 0,-1 М лимонной
Гл. 18. Гидрофильные соединения из растений
383
Таблица 97
Величины hRf флороглюцин-производиых, выделенных из вида Filix
Флороглюцин- производное Формула Силикагель Г (забуференный) Обра- щение фаз Окраска с прочной голубой В (соль)
I 11 III
Филициновая кислота (1)а С8Н10О3 — 0 100 Красная — фиолетовая
Дезаспидинол (1) СиН1зО4 — 75 87 Оранжевая — красная
Метилфлорбутирофе- нон 6 (1) С11Н14О4 — 55 83 Красная — фиолетовая
Бутаноя филициновой кислоты (1) C^HjgC^ — 5 81 Красная — оранжевая
Аспидинол (1) С12Н16О4 41 73 78 Красная — фиолетовая
Флоропирон (2) СгШгвОт — 50 72 Оранжевая
Флаваспидовая кислота (2) С24Н30О8 7 9 70 Оранжевая — красная
Дезаспидин (2) С24Нз0О8 82 12 70 Оранжевая
Аспидин (2) (Д'Л32()8 85 33 И Желтая
Альбаспидип (2) СгбЩЛг 87 26 И Оранжевая — красная
Филикс-кислота (3) СзвН44О12 90 16 3 То же
а В скобках указано число колец в молекуле.
6 =ПКЖ [52].
I — силикагель Г, забуференный кислотой (см. текст); растворитель — петролейный эфир — хло*-
роформ — безводный этанол (47,5 4- 47,5 + 5) [47].
II — силикагель Г, забуференный щелочью; растворитель — этилацетат, двукратное разделение,
в камере с насыщением [52].
III — силикагель Г, пропитанный парафином; растворитель — метанол — муравьиная кислота —
вода (75 -р 10 4- 15) [52].
кислоты и 0,2 М кислого динатрийфосфата (буфер Мак-Ильвейна, pH 6)..
В качестве растворителя они применяли смесь петролейный эфир — хлоро-
форм — этанол. Длина пути и состояние насыщения камеры в работе не при-
ведены. Хроматограмму извлекали из лотка через 60 мин. В нашей лаборато-
рии [52] слой силикагеля забуферивали 0,3 М натрийацетатом и для лучшего
разделения дважды разделяли этилацетатом (насыщение камеры; длина
пути 10 см). Кроме того, мы работали, используя метод обращения фаз.
Для этого обычный слой силикагеля Г пропитывали смесью парафин —
петролейный эфир (5 + 95) (стр. 40) и в качестве растворителя использовали
смесь метанол — муравьиная кислота — вода (75 + 10 + 15). Полученные
результаты приведены в табл. 97.
При сравнении величин hRf, полученных на слабокислых слоях (I),
с величинами, полученными на слабоосновных слоях (II), отчетливо видно
влияние забуферивания. В последнем случае отчетливо видны различия
в кислотности филикс-флороглюцидов [64]. Определенный интерес представ-
ляет замеченная в случае обращения фаз зависимость между числом флоро-
глюциновых колец и величиной hRf. В случае одного кольца величина hRf
лежит между 78 и 100. В случае двух колец (число атомов 24) она равна ~70
или, при наличии дополнительной метильной группы, -~10.
Обнаружение. При сочетании со стабильной солью прочной голубой В
(реактив № 61) получают окраску, указанную в табл. 97. Данные по окраске
для реакций с другими диазониевыми солями можно найти в работе Шанца [47].
384
Специальная часть
Кроме того, он использовал в качестве реактива для опрыскивания 1%-ный
раствор хлорида железа (III) + 1%-ный раствор гексацианоферрата калия
(III) (1 + 1) и добавлял к 10 мл этой смеси 10 капель концентрированной
азотной кислоты. При этом получают темно-синие пятна. Синюю окраску
дает также предложенный нами реактив Фолина — Чокальто (№ 122). В другой
работе Шанц описал возможность количественного расчета тонкослойной
хроматограммы. Для этого зоны соскабливают и экстрагируют. Элюат обра-
батывают раствором соли прочной голубой и образующийся окрашенный
раствор фотометрируют [47].
Применение. Методом ХТС удалось за сравнительно короткий срок обна-
ружить новое филикс-соединение (DFX), которое было идентифицировано
как метилфлорбутирофенон [52, 53]. Количественные измерения впервые
позволили получить данные о составе различным образом выделенных
рофилицинов [47].
IV. ПРОИЗВОДНЫЕ АНТРАЦЕНА
Производные 1,8-диоксиантрацена определяют слабительное действие
ряда лекарственных веществ. Они могут находиться в форме антрахинонов,
антронов и антранолов, а другие группы ОН могут быть этерифицированы
Ж*И+1В
. . * .• ЯП Н Я::
О '
О О j JffeM
11ЯИ’ОДя,г'’ ^ЯПoiFjf
Si.е+++г ж u :
о ..о!
я. я :: Я и‘
S j* s' s Я S..S s , ' Я ЯД ВИЗ
уЯяя5и*Ш
ЯЯ11д.*ДЯНЯг
Рис. 154. Разделение производных антрацена и соответствующих растительных
экстрактов (растворитель IV, слой силикагеля Г).
В скобках приведена окраска флуоресценции в длинноволновом УФ-свете после опрыскивания
-спиртовым раствором КОН. 1 — алоин, hRf 0 (оранжево-коричневая); 2 — сенидин A, hRf 2к
(желтовато-коричневая); 3 — эмодианантрон, hRf 34 (желтовато-коричневая); 4 — 1,8-диметокси-
антрахинонкарбоновая кислота-3-метиловый эфир (сандоза), hRf 38 (желтая — желтовато-красная);
5 — реин, hRf 49 (розовато-красная — оранжевая); в — эмодин, hRf 63 (розовато-красная — оран-
жевая); 7 — ализарин, hRf 83 (розовато-красная — оранжевая); А — тинктура алоэ; В — экстракт
Frangulae fluidum; С — тинктура Rhei vinosa.
сахарами [48, 56]. Сильное различие в биологической активности требует
определения в природных смесях отдельных соединений. На слоях силика-
геля Г можно разделить ряд таких соединений. На рис. 154 приведена тонко-
слойная хроматограмма, полученная с растворителем бензол — этилформиат—
муравьиная кислота (75 + 24 + 1). Проведенное одновременно хроматогра-
фическое разделение вытяжек лекарственных веществ позволяет установить,
что в них имеются еще многочисленные другие соединения. Для обнаруже-
ния служит 1 %-ный спиртовый раствор калийной щелочи. В длинноволновом
УФ-свете производные антрацена флуоресцируют главным образом желтым,
оранжевым или красным светом.
Гл. 18. Гидрофильные соединения из растений
385
В работе Тайхерта с сотрудниками [54] было подчеркнуто преимущество
количественного спектрофотометрического определения алоина после разде-
ления экстракта методом ХТС. Подробности эксперимента не приведены.
Это же относится к разделительному слою в работе Яниака и Бомерта [25],
в которой критически рассмотрены методы количественного определения
алоина. На слоях силикагеля Г смесью бензол — уксусная кислота (60 + 30)
были разделены сеннидин А + В (hRf 65) и реин (hRf 72), причем были про-
верены фотометрические методы определения сеннозида [32].
V. ФЕНО Л КАРБОНОВЫЕ КИСЛОТЫ И ПРОИЗВОДНЫЕ
Часть приведенных в табл. 98 фенолкарбоновых кислот находится в при-
родных смесях в свободном состоянии, а другие часто получают при щелоч-
ном плавлении лигнинов, дубильных веществ, кумаринов, флавоноидов,
лигнанов, кислот лишайников и т. д. Еще в 1957 г. Лиман с сотрудниками
[30] исследовал возможности разделения 26 производных фенола на слоях
силикагеля (метод «хроматографических полос»). Большая часть приведен-
ных в этой работе величин Rf помещена в табл. 98 (графы А4 — А3). Кратцл
и Пушман [29] использовали слои силикагеля Г для препаративного разде-
ления радиоактивно меченных продуктов расщепления лигнина.
Используя насыщенный водой раствор изоамиловый эфир — и-бутанол (75 + 25),
удалось, например, разделить ванилоилацетил (hRf 6), сиреневую кислоту (24), п-окси-
бензойную кислоту (31), ванилин (58), n-оксибен зоил ацетил (67), п-оксибензальдегид (67).
Насыщенный водой раствор и-бутиловый эфир — ледяная уксусная кислота (90 + 9)
используют для разделения методом ХТС смеси сиреневая кислота (ванилиновая кис-
лота) — я-оксибензойная кислота, а насыщенный водой раствор и-бутиловый эфир —
муравьиная кислота (99 +1) — для разделения феруловой (hRf 41) и синапиновой (27)
кислот.
Пастуска [39] довольно подробно разработал хроматографический ана-
лиз фенолов и фенолкарбоновых кислот на слоях силикагеля Г. Приведенные
в графах Bj иБ2 табл. 98 величины можно было несколько подробнее срав-
нить с данными оригинальной работы благодаря частному сообщению автора.
В другом сообщении [40] описывается тонкослойный электрофорез фенолов
и фенолкарбоновых кислот на забуференных слоях силикагеля Г и кизель-
гура Г. Отнесенные к .и-оксибензойной кислоте величины Мг для 17 фенол-
карбоновых кислот и соответствующие экспериментальные подробности
можно заимствовать из оригинальных работ. При разделении сложных сме-
сей используют предложенную Хонеггером (разд. 19 VI) комбинацию:
направление 1 — адсорбционная ХТС, направление 2 — тонкослойный
электрофорез. Другой прием, помогающий разделению весьма близких
фенолкарбоновых кислот, состоит в том, что слои силикагеля Г пропитывают
солями, образующими хелат. Халмекоский [19] исследовал влияние про-
питки слоев силикагеля молибдатом, вольфраматом и бурой, применяя
пять различных растворителей (табл. 98, В и Г). Показано эффективное
влияние образования хелатов. Следует сравнить данные граф В и Г с индек-
сом 0 с данными граф с индексами 1, 2 и 3.
Для «пропитки» сухой силикагель Г смешивают вместо воды с 0,01 М раствором
молибдата натрия, вольфрамата натрия или буры; полученную массу наносят при стан-
дартных условиях и сушат.
Для идентификации вытяжек из растительных лекарственных веществ
были получены хорошие хроматограммы смеси фенолкарбоновых кислот
на слоях силикагеля с растворителем, который уже был ранее использован
для разделения смесей кумаринов и флавонов [толуол — этилформиат —
муравьиная кислота (50 + 40 + 10) (рис. 155)]. Аналогичные результаты
25 Заказ № 734
Таблица 98
Величины hRf фенолкарбоновых кислот при различных условиях [19, 30, 39]
R1 1 ReWR2 Заместители Vih слоя и растворителя
Кислота
He-V-Rs
1 R1 R2 В3 Ш Кб At Аг Аз Б1 Бг Во Bi В2 В3 Го Г1 Г2 Г3
Салициловая —СООН —ОН _ _ — 72 88 48 64
Л4-Оксибензойная . . . —СООН — —ОН — — 49 51
п-Оксибензойная . . . —СООН — — —ОН — 55 60
Анисовая -СООН — — —ОСН3 — 63 92 39 84 69
п-Оксифенилуксусная . —СН2—СООН — — —он — 35 72 14
п-Кумаровая —СН=СН—СООН — — —ОН — 49 52
Протокатеховая .... -СООН — —ОН —он — 32 55 10 32 39 38 10 24 Ю 81 71 15 4
Гомокатеховая ..... —СН2—СООН — -он —он — 23 6 13 5 55 66 13 3
Гидрокофейная .... —СН2—СН2—СООН — —он —он — 27 14 19 9 57 80 23 3
Кофейная —СН=СН—СООН — —он —он — 24 43 31 14 22 8 65 85 31 2
Ванилиновая —СООН — —ОСН3 —он — 46 76 29 54 61 45 44 39 34 82 93 38 53
Гваяцилуксусная . . . —СН2—СООН — —ОСН3 -он — 29 22 24 10 59 69 19 21
Гваяцилпропионовая —СН2—СН2—СООН — —осн3 —он — 34 29 32 25 56 84 29 40
Феруловая —сн=сн—СООН — —осн3 —он — 42 76 16 50 58 35 34 36 28 63 87 37 50
Изоферуловая —СН = СН—СООН — —он —осн3 — 43 30 25 31 25 60 86 33 45
Вератровая —СООН — —ОСН3 —ОСН3 — 73 70
Гентизиновая —СООН —он — — —он 35 65 17 30 40
Гомогентизиновая . . . —СН2—СООН —ОН — — —ОН 67 85 43
а-Резорциловая .... —СООН — —ОН — —ОН 21 61 73 i
(5-Резорциловая .... у-Резорциловая .... —СООН -СООН —ОН -ОН •— —он R6—ОН 57 10 85 15 19 10 54 52
Г алловая Сиреневая Эвдесминовая —СООН —СООН —СООН — —он —осн3 —ОСН3 —он —он —ОСН3 —ОН —ОСН3 —ОСН3 33 43 57 75 16 31 18 48 23 60
Слои и растворители
А].: кремневая кислота с крахмалом ~0,5 мм; эфир — скеллизольв Ва (70 + 30) [30].
Аг: кремневая кислота с крахмалом ~0,5 мм; этилацетат — скеллизольв В (75 + 25) [30].
A3: кремневая кислота с крахмалом ~0,5 мм; ацетон — скеллизольв В (25 + 75) [30].
Bi: силикагель Г ~0,5 мм; бензол — диоксан — ледяная уксусная кислота (90 + 25 + 4) [39].
Бо: силикагель Г ~0,5 мм; бензол — метанол — ледяная уксусная кислота (90 +16 + 8) [39].
Bq: непропитанный силикагель Г (стандартные условия); н-бутиловый эфир (насыщенный водой) — ледяная уксусная кислота (90 + 9) [19].
Bi: силикагель Г, пропитанный 0,01 М раствором NazMoOi; растворитель такой же, как в Во [19].
Вг: силикагель Г, пропитанный 0,01 М раствором Na2WOx; растворитель такой же, как в Во [19].
В3: силикагель Г, пропитанный 0,01 М раствором буры; растворитель такой же, как в Во [19].
Го: непропитанный силикагель Г; этилацетат — изопропанол — вода (65 + 24 + 11) [19].
Гх: силикагель Г, пропитанный 0,01 М раствором NazMoOi; растворитель такой же, как в Го [19].
Гг: силикагель Г, пропитанный 0,01 М раствором NazWOx; растворитель такой же, как в Го [19].
Гз: силикагель Г, пропитанный 0,01 М раствором буры; растворитель такой же, как в Го [19].
а Скеллизольв В — фракция гексана фирмы «Skelly 011» (Канзас, Миссури, США).
25*
388
Специальная часть
были получены в этой же работе [51] по разделению некоторых дубильных
веществ и близких им продуктов на слоях силикагеля Г. Растворителем слу-
жила смесь хлороформ — этилацетат — муравьиная кислота (50 + 40 + 10).
При стандартных условиях (насыщение камеры) были получены следующие
величины hRf. эпигаллокатехин 14, эпикате-
хин 23, .и-дигалловая кислота 26, галловая
кислота 37, пирогаллол 49.
Обнаружение. Большинство производных
фенолов обнаруживает более или менее силь-
ную собственную абсорбцию в УФ-свете.
Если при этом использовать, как это делал
Лайман с сотрудниками [30], слои силикаге-
ля, содержащие неорганическое светящееся
вещество *, то в коротковолновом УФ-свете
(254 .ир) обнаруживают темные пятна фенолов
на светлом флуоресцирующем фоне. После
маркировки зон можно для получения цветных
пятен провести опрыскивание раствором диа-
зониевой соли. Оправдали себя имеющиеся
в продаже соли прочной голубой (реактив
№ 61). Сопоставление окрасок, получаемых
при различных реакциях сочетания, приведе-
но Пастуска [39]. Он рекомендует реактив
диазотированного бензидина. Еще большую
чувствительность имеет раствор фосфорномо-
либденовой кислоты (реактив № 120 а). Ко-
личества до 0,1 рг появляются в виде отчет-
ливых синих пятен (рис. 155). Таким же обра-
зом был использован реактив Фолина—Дениса
[19] и более чувствительный реактив Фолина—
характер фенолкарбоновых кислот позволяет
Т~1 ЗГ 3 i S. в Q Фронт1'
Юс,м
" Старт \
Рис. 155. Ароматические окси-
кислоты после разделения и пе-
ревода в видимое состояние фос-
форномолибденовой кислотой
{растворитель III, KS, слой си-
ликагеля Г).
1 — хлорогеновая кислота, hRf 7;
2 —’м-дигалловая кислота, hRf 27;
з —галловая кислота, ’ ~ •
4 — кофейная кислота,
5 — гентизиновая кислота,
€ — феруловая кислота,
G — смесь (I—в).
hRf 39;
hRf 47;
, hRf 51;
hRf 56;
Чокальто (№ 122). Кислый
обнаружить их бромкрезоловым зеленым (реактив № 22); разумеется, при
применении кислых растворителей кислота должна быть предварительно уда-
лена со слоя.
VI. ГОРЕЧИ И САПОНИНЫ
1. ГОРЕЧИ
Имеющие горький вкус природные вещества, содержащие кислород
и не содержащие азота и серы, которые не удается отнести ни к одному
из известных классов соединений, носят название горечей. Много интерес-
ных подробностей в этом отношении приведено Корте [27, 28]. При «коли-
чественном анализе» горечей определяют, согласно Васики [58], так назы-
ваемую границу горечи, т. е. то разбавление водой, при котором еще можно
обнаружить горечь на вкус. Таким образом, «горечь» можно выразить числен-
но. Квассия, например, еще обладает горьким вкусом при разбавлении
1 : 45 000, алкалоид бруцин — при разбавлении 1 : 4 500 000.
На слоях силикагеля растворителем хлороформ — метанол (90 + 10)
были разделены при насыщении камеры спиртовые экстракты (1 : 10) двух
разновидностей горького дерева (рис. 156). Чтобы определить, где на хро-
матограмме находится горькое вещество, были соскоблены флуоресцирую-
щие и другие зоны миллиметр за миллиметром, причем для каждой зоны
* Недавно фирма «Merck» (Дармштадт) выпустила в продажу силикагель с добав-
кой флуоресцирующего вещества (254 лщ). О других возможностях см. стр. 40.
Гл. 18. Гидрофильные соединения из растений
38»
было определено численное значение горечи [18]. Соскобленные зоны сили-
кагеля суспендировали в 0,5 мл чистого этанола, из которого готовили ряд
разбавленных водных растворов. Таким образом, было установлено,, что.
Рис. 156. Тонкослойная хромато-
грамма 2 различных квассий горь-
ких, сфотографированная до опры-
скивания в длинноволновом УФ-све-
те [61].
Справа — ямайская квассия, слева —
бразильская квассия.
в противоположность ранее распространенному мнению в ямайской квас-
сии (Picrasma excelsa Planchon) содержится несколько горечей, причем эти
соединения неидентичны соединениям, выделенным из бразильских деревьев
(Aeschrion creneta Vel.) [61].
Большой интерес для пивоваренной промышленности должен иметь
количественный анализ методом ХТС различных веществ, определяющих
хмелевую горечь. Согласно ориентировочным опытам [53], можно исполь-
зовать изложенные выше условия анализа. В более ранней работе анализ
методом ХТС был использован Ригби и Бетюн [46] для исследования хме-
левого масла.
2. САПОНИНЫ
Природные вещества, которые пенятся в водных растворах подобно
мылам, называются сапонинами. С химической точки зрения их следует
отнести к классу тритерпенглюкозидов [59] или стероидных глюкозидов
Рис. 157. Участок тонкослойной хроматограммы, залитый слоем кровяной желатины.
Гемолизованные цефанины можно обнаружить в виде светлых пятен. Сапонин фирмы
«Merck» (7) состоит из 2 компонентов и неидентичен бразильскому экстракту сапонина (2),
квилая-(З) или сарсапарилсапонину (4).
[60]. Особо следует отметить их свойства гемолизовать эритроциты. Различ-
ные способы «количественного определения» гемолизующего действия (индек-
са гемолизации) можно найти у Гстирнера .[18]. Там описаны также экспе-
риментальные подробности определения горечи по Васики.
Поскольку в растениях эти вещества находятся в смесях, разделение
и обнаружение отдельных сапонинов на хроматограмме представляет боль-
шой интерес для идентификации сапонинсодержащих растений и их пре-
паратов.
.390
Специальная часть
Разделение и обнаружение сапонинов [61]. Был проведен хроматогра-
фический анализ при стандартных условиях на слоях силикагеля со смесью
изопропанол — вода — муравьиная кислота (70 + 24 + 6) сапонина фир-
мы «Merck» и нескольких сапонинсодержащих вытяжек. Для обнаружения
гемолизующего соединения непосредственно на хроматограмме на пластинку
наливали желатиновый раствор крови и наблюдали образование гемолитиче-
ского ореола. В противоположность обычным мутным красным слоям жела-
тины с кровью зти зоны благодаря диффузии сапонина из хроматограммы
прозрачны и почти бесцветны. В оригинале этот эффект можно наблюдать
еще отчетливее, чем на сфотографированном участке тонкослойной хрома-
тограммы (рис. 157).
Приготовление раствора крови в желатине, а) К 4,5 г порошка желатины
добавляют 100 мл 0,9%-ного раствора хлористого натрия и после набухания,
в течение 30 мин студень нагревают до 80° в водяной бане при помешивании.
б) После охлаждения раствора желатины (а) до 45° добавляют при пере-
мешивании 6 мл дефибринированной бычьей крови (см. ниже) и наливают
эту суспензию из крови и желатины в виде тонкого слоя на исследуемую
тонкослойную хроматограмму. Чтобы налитая суспензия не стекала, края
пластинки обклеивают клейкой пленкой шириной в 1 см, благодаря чему
получается своеобразный противень. После заливания пластинку помещают
для застывания слоя на охлаждаемый блок точно в горизонтальном положе-
нии. Самое большее через 1 час желатиново-кровяной слой в тех местах,
где на хроматограмме находятся сапонины, становится прозрачным, а осталь-
ная часть слоя остается непрозрачно-красной (рис. 157).
Примечание. При применении кислых или основных растворителей их
необходимо полностью удалить с сорбционного слоя перед заливанием жела-
тины с кровью.
Дефибринированная бычья кровь. Из свежезаколотого рогатого скота
отбирают в литровую широкогорлую колбу около 300 мл крови и сразу же
интенсивно перемешивают деревянной палочкой до тех пор, пока фибрин
не выпадет в виде студня. Студень удаляют фильтрованием через несколько
слоев марли. Полученную таким образом дефибринированную кровь можно
хранить при 3—4° только в течение 1—2 дней. Как только сам по себе мут-
ный «раствор» становится прозрачным, кровь уже непригодна (гемолиз).
ЛИТЕРАТУРА
1. Ackermann М., Miihlemann М., Pharm. Acta Helv., 21, 157 (1946).
2. Baerheim Svendsen A., Zur Chemie norwegischer Umbelliferen, Diss.,
Oslo, 1954.
3. В a te-Sm i thE.C., Partition Chromatography, Biochem. Soc. Symposia (Cambridge),
3, 68 (1951).
4. В a t e-S m i t h E. C., Wes tall R. G., Biochim. et Biophys. Acta, 4, 427 (1950).
5. В i 1 1 e k G., частное сообщение.
5a. В i r k о f e r L., Kaiser Ch., M e у e r-S toll H.-A., S u p p a n F., Z. Natur-
forschg., 17b, 352 (1962).
6. Bradfield A. E., Penney M., Wright W. B., J. Chem. Soc., 1947, 32.
7. Bradfield A. E., Penney M., J. Chem. Soc., 1948, 2249.
8. Davidek J., Davidkova E., Pharmazie, 16, 352 (1961).
9. Dean F. M., inZechmeister L., Fortschritte der Chemie organischer Natur-
stoffe, Bd. 9, Wien, Springer-Verlag, 1952.
10. Egger К., частное сообщение.
11. Egger К., Z. anal. Chem., 182, 161 (1961).
12. Enders H., Z. anal. Chem., 181, 331 (1961).
13. Freudenberg K., Weinges Kl., in Zechmeister L., Fortschritte
der Chemie organischer Naturstoffe, Bd. 16, Wien, Springer-Verlag, 1958.
14. Geissmann T. A., inPaech K., Tracey M. V., Modeme Methoden
der Pflanzenanalyse, Bd. Ill, Berlin—Gottingen—Heidelber g, Springer-Verlag, 1955.
Гл. 18. Гидрофильные соединения из растений
391
15. Grassmann, W. u. Mitarb., s. bei [12].
16. Grisebach H., Z. Naturforsch., 14b, 802 (1959).
17. Grisebach H., Patschke L., Chem. Ber., 93, 2326 (1960).
18. G s t i r n e r F., Prfifung und Verarbeitung von Arzneidrogen, Bd. 1, Berlin —
Gottingen — Heidelberg, Springer-Verlag, 1955.
19. Ha Im ek о ski J., Suomen Kemistilehti, 35, 39 (1962).
20. Hansel R., in L i n s к e n s H. F., Papierchromatographie in der Botanik,
Berlin — Gottingen — Heidelberg, Springer-Verlag, 1959.
21. Hess D., Planta, 52, 65 (1958).
22. Horhammer L., Wagner H., Lay B., Pharmazie, 15, 645 (1960).
23. Horhammer L., Wagner H., L e e b W., Naturwiss, 44, 513 (1957), cm.
также [12].
24. Ice С. H., W e n d e r S. H., Anal. Chem., 24, 1616 (1952); J. Am. Chem. Soc., 75,
50 (1953).
25. J a n i а к В., В d h m e r t H., Arzneimittel-Forsch., 12, 431 (1962).
26. Karrer P., Strong F. M., Helv. Chim. Acta, 19, 25 (1936).
27. Korte F., Arch. Pharm., 286, 257, 295 (1953).
28. Korte F., Barkemeyer H., Korte L, inZechmeister L., Fort-
schritte der Chemie organischer Naturstoffe, Bd. 17, Wien, Springer-Verlag, 1959.
29. Kratzl K., Puschmann G., Holzforschung, 14, Heft 1, 1 (1960).
30. Lymann R. L., Livingston A. L., В i с к о f f E. M., Booth A. N., J.
Org. Chem., 23, 756 (1958).
31. Meier W., F first A., Helv. Chim. Acta, 45, 232 (1962).
32. M fl 1 1 e г К. H., Christ В., К fl h n G., Arch. Pharm., 295, 41 (1962).
33. Neu R., Naturwiss., 44, 181 (1957).
34. N e и R., Mikrochim. Acta, 1957, 196.
35. Neu R., Nature, 182, 660 (1958).
36. Paris R., Pharm. Acta Helv., 36, 176 (1961).
37. Paris R., (Vortragsreferat) Journees Internationales d’fitude des Methodes de Sepa-
ration Immediate et de Chromatographic, 13—15 Juin 1961, Paris.
Prod, pharm., 15, 347 (1960); no [36].
G., Z. anal. Chem., 179, 355 (1961).
G., Trinks H., Chem. Ztg., 85, 535 (1961).
S. M., Biochem. J., 42, 238 (1948).
a r i s R.
a s t и s к a
a s t и s к a
a t r i d g e
earl I. A., Dickey E. E., j. Am. Chem. Soc., 73, 863 (1951); 74, 614 (1952).
P
P
P
P
P
44.
45.
46.
47.
48.
38.
39.
40.
41.
42.
43. Хроматография на бумаге, под ред. И. М. Хайса и К. Мацека, Издатинлит, 1962,
статья Прохазки.
R е р р е 1 L., Pharmazie, 12, 654 (1957).
Reznik Н., Egger К., Z. anal. Chem., 183, 196 (1961).
Rigby F. L., В e t h u n e J. L., Proc. Am. Soc. Brewing Chem., 1955, 174.
Schantz M. v., Planta Med., 10, 22, 98 (1962).
Schmid H., inZechmeister L., Fortschritte der Chemie organischer Natur-
stoffe, Bd. 11, Wien, ’Springer-Verlag, 1954.
Spath E., Mitarb, s. bei Dean [9].
49. Spath E., Mitarb, s. bei Dean [9].
49a. Spath E., Rosenblatt D. H., Anal. Chem., 22, 1321 (1950); zit. nach [14].
.50. f ' ’ ’ " ” ' ----’ ~ ‘ .......... — .
51.
52.
53.
54.
Stahl E., Vortrag GDCH-Tagung, Fachgruppe Analyt. Chem., Mfinchen, 27. Okto-
ber 1960, ref. Z. anal. Chem., 181, 305 Г1961).
Stahl E., " ’ - * ~ ~ ~ ' ----------
Stahl
Stahl
T e i c h
181, 305 (1961).
Schorn P. J., Z. physiol. Chem., Hoppe-Seyler's, 325,263 (1961).
Schorn P. J., Naturwiss., 49, 14 (1962).
Schorn P. J., неопубликованные данные.
К., Mutschler E., Rochelmeyer H., Z. anal. Chem., 181,
E.,
E.,
e r t
325 (1961).
55. VenkataramanK., in Zechmeister L., Fortschritte der Chemie organi-
scher Naturstoffe, Bd. 17, Wien, Springer-Verlag, 1959.
56. Planta Med., 7, 336—449 (1959).
57. Wachtmeister C. A., in L i n s k e n s H. F., Papierchromatographie in der
Botanik, 2. Aufl., Berlin — Gottingen — Heidelberg, Springer-Verlag, 1959.
58. Wasicky R., Leitfaden ffir die pharmakognostischen Untersuchungen in Unter-
richt und Praxis, Leipzig — Wien, Deuticke-Verlag, 1936.
59. Steiner M., Hol t zem H., in Moderne Methoden der Pflanzenanalyse, Bd. Ill,
S. 67, Berlin — Gottinger — Heidelberg, Springer-Verlag, 1955.
60. Stoll A., Jucker E., in Moderne Methoden der Pflanzenanalyse, Bd. Ill, S.
176, Berlin — Gottingen — Heidelberg, Springer-Verlag, 1955.
61. W e i g e r t E., Schorn P. J., Stahl E., неопубликованные данные.
62. Weygand F., Wendt H., Z. Naturforsch., 14b, 421 (1959).
63. Weygand F., Simon H., Floss H. G., Mothes U., Z. Naturforsch., 15b,
765 (1960).
64. Zwimpfer G., Bflchi J., Pharm. Acta Helv., 37, 224 (1962).
ГЛ A BA 19
АМИНОКИСЛОТЫ И ПРОИЗВОДНЫЕ
И. Бреннер, Л. Нидервизер, Г. Патаки
I. ВВЕДЕНИЕ
Свободные аминокислоты и пептиды являются резко выраженными гид-
рофильными соединениями, малорастворимыми в органических раствори-
телях. Это следует учитывать при отборе проб и подготовке веществ, в слу-
чае анализа методом ХТС, а также при выборе растворителя. В табл. 99 про-
ведено сравнение растворимостей. Кроме того, аминокислоты амфотерны
Таблица 99
Растворимость некоторых аминокислот в различных растворителях
(моль/л при 25°) [1]
Глицин dZ-Норлей- цин Z-Аспараги- новая кислота
Вода 2,886 0,0866 0,0375
20%-ный этиловый спирт 1,343 0,0516 0,0149
80%-ный этиловый спирт 0,0278 0,0130 0,00070
Этиловый спирт 0,00039 0,00104 0,0000116
Метиловый спирт 0,00426 0,00854
Бутиловый спирт 0,0000959 0,000336
Ацетон 0,0000305 0,0000793
и образуют комплексы. Поэтому не безразлично, наносят аминокислоты на
хроматограмму в свободном виде, в виде гидрохлоридов, солей щелочных
металлов или в виде комплексов с ионами тяжелых металлов, в какой среде
(кислой, нейтральной или щелочной) хроматографируют и, наконец, при
каких значениях pH осуществляют цветные реакции, служащие для иден-
тификации пятен.
Особенного внимания заслуживает возможность гидролитического рас-
щепления солей аминокислот. Гидрохлорид аминокислоты, например, при
растворении в воде в зависимости от концентрации более или менее полно
расщепляется на амфотерный ион аминокислоты и НС1; при большем разбав-
лении происходит полное расщепление. Каждый хроматографический про-
цесс сопровождается разбавлением. Чтобы проанализировать соли без изме-
нения, необходимо слой и растворитель предварительно забуферить. Следует
учесть также химические изменения, которые могут происходить при опре-
деленных условиях на хроматограмме, причем в адсорбированном состоя-
нии на носителях они происходят гораздо быстрее и отчетливее, чем в стекле.
Примером может служить нингидриновая реакция на бумажной хроматограм-
ме и в растворе.
Необходимость решения задачи разделения аминокислот привела к раз-
витию бумажной хроматографии. В качестве основного процесса разделения
при этом принимали процесс распределения вещества между водой набуха-
Гл. 19. Аминокислоты и производные
393
ния целлюлозы фильтровальной бумаги и не смешивающейся с водой подвиж-
ной фазой, например насыщенным водой фенолом. Эта точка зрения со вре-
менем несколько изменилась ввиду применения однородного растворителя,
поскольку при этом менее подвижную жидкость набухания можно рассмат-
ривать как некоторый род фазы, отделенный от подвижной жидкости;
На бумаге
0,1 0,2 0,4 ! 2 5 Ю ’ 20 40 80 (к
На силикагеле
Рис. 158. Размытие пятна на силикагеле Г (толщина слоя 0,25 мм, воздушносухой)’
и бумаге ватман № 1 при нанесении ДНФ-серина в ацетоне.
и в том и в другом случае на поверхности целлюлозы может наблюдаться
переход к адсорбции по Фрейндлиху.
Специально разработанный для липофильных веществ метод ХТС на сили-
кагеле сначала казался менее пригодным для гидрофильных веществ. Но
силикагель, как и целлюлоза, содержит в зависимости от метода высушивания
{Рен \
'Илей'»
'ЛР°\
2
\Тир\
/Гли J \ ;
/Zwcso3h,' •
2
Фен О Про
°оИлей
° С>Вал
Тир
Оаа
9Ги‘
оери
Олу -Q ZM/SOjH
1 ЛпР &
Старт
Старт
Рис. 159. Сравнение тонкослойной хроматографии с хроматографией на бумаге.
Двумерные хроматограммы в 0,57 натуральной величины.
а — 10 аминокислот на бумаге ватман № 1, время анализа около 2—2,5 час; б — 14 аминокислот
на силикагеле Г, время анализа 1,5—2 час.
Пробы по 1 |лл водного раствора, содержащего по 1 рг каждой аминокислоты; восходящий метод;
н-бутанол — уксусная кислота — вода (80 + 20 4- 20) в направлении 1, фенол — вода (75 г + 25 г)
в направлении 2; обнаружение — нингидриновый реактив, усовершенствованный Моффатом и Лит-
лом [3] (реактив № 109).
воду набухания и сольватную воду, и поэтому его хорошо известные преиму-
щества при хроматографическом анализе аминокислот неудивительны.
Принципиальное сходство с методом хроматографии на бумаге проявляется
также и при практическом использовании. При применении метода ХТС
для анализа свободных аминокислот можно использовать богатый опытный
материал, накопленный в области хроматографии на бумаге. При отсутствии
каких-либо противопоказаний имеет смысл воспользоваться эмпирическими
правилами метода хроматографии на бумаге в отношении предварительной
’394
Специальная часть
подготовки материала, растворителей и реакций.обнаружения. Но эта анало-
гия ограничивается пока только применением силикагеля. К предваритель-
ному испытанию окиси алюминия для тонкослойной хроматографии фирмы
«Fluka» ниже мы еще вернемся снова.
Метод ХТС на силикагеле Г имеет по сравнению с хроматографией на
бумаге два определенных преимущества:
1. Меньшее размытие пятна:
а) при нанесении раствора на месте старта (см. рис. 158), а также
б) в процессе хроматографического анализа (более медленная диффузия
вещества; см. рис. 159, а также раздел о различии между методом ХТС
и методом хроматографии на бумаге в теоретической части).
2. Экономия времени.
II. ОБЩАЯ МЕТОДИКА
1. ПРИГОТОВЛЕНИЕ СЛОЯ
Общая методика приготовления слоя для разделения описана на стр.
15—35. Хотя там рекомендуется активировать слой нагреванием перед нане-
сением хроматографируемого вещества, такая предварительная обработка
кажется нам непригодной, во всяком случае для рассматриваемого здесь
класса соединений.
Уже при нагревании слоя несколько выше 100° содержащийся в силикагеле Г гипс
теряет свои свойства связующего материала. Это сказывается в том, что слой становится
непрочным, почти порошкообразным. Пластинки, которые «активируют» при более
высокой температуре (например, 2 час при 140° по Шербулье с сотрудниками [4]' или
даже 4 час при 140° по Николау [5]), становятся чувствительными к влажности возду-
ха [6] и не удивительно поэтому, что при работе с ними наблюдают большие колебания
величины Rj.
В противоположность общей прописи (стр. 35) мы оставляем пластинки
после нанесения слоя сохнуть на воздухе в течение 12 час. Описанные ниже
результаты разделения (аминокислоты, пептиды, ДНФ-аминокислоты
и ФТГ-аминокислоты) были получены на воздушносухих слоях [7—9].
Узкие пластинки (50 X 200 мм) пригодны только для ориентировочных опы-
тов, поскольку слои на таких пластинках большей частью не одинаковой
толщины.
При применении некоторых растворителей может оказаться необходимой
дальнейшая предварительная обработка слоя. К такому случаю мы еще
вернемся в разделе о хроматографическом анализе ДНФ-аминокислот
(см. стр. 418).
В предварительных опытах, проведенных с «алоксом» для тонкослойной хромато-
графии фирмы «Fluka» при приготовлении обычным способом суспензии ие 20 г алокса
и 60 мл воды, найдена меньшая скорость движения смеси н-бутиловый спирт — ледяная
уксусная кислота— вода (80+20+20), применявшейся в качестве подвижной фазы.
На 10 с.и растворитель перемещался за 4 час. Разделение аминокислот, однако, было срав-
нимо с разделением на силикагеле.
Мучлер и Рохельмайер [10], учитывая особенности аминокислот, растирали 25 г
силикагеля не с водой, а с 50 мл смеси равных объемов 0,2 АГ КН2РО4 и 0,2 М Na2HPO4
и не проводили активирования, а осуществляли сушку в течение 30 мин при 110°. Из на-
ших прежних опытов можно сделать вывод, что такое забуферивание излишне. Если
после хроматографического разделения предполагается элюирование, то такое забуфе-
ривание может довольно сильно помешать.
Мотье [11] в разработанном им варианте ХТС применял для приготовления слоев
окись алюминия. Он использовал окись алюминия для хроматографии фирмы «Merck»
(К» 1097), активировал ее 45 мин при 300—500° и наносил на пластинку в сухом состоя-
нии без связующего материала. На этом слое он анализировал не свободные аминокис-
лоты, а их натриевые соли и работал в другом направлении, исходя от совершенно дру-
гих отправных представлений, чем Шталь.
Гл. 19. Аминокислоты и производные
395
2. МЕТОДИКА ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО АНАЛИЗА [7, 8, 12]
а. Нанесение пробы. Пробу (оптимальное количество 0,5—2 иг в 0,5 цл) наносят
точно в 15 мм от нижнего края пластинки. Расстояние от боковой кромки должно быть
не менее 15 мм, расстояние между пятнами — не менее 8 мм. Перед установкой в разде-
лительную камеру пластинку выдерживают несколько минут, пока растворитель пол-
ностью не испарится (необходима осторожность в случае труднолетучих и кислых рас-
творителей!).
б. Растворитель. Применяют только свежеприготовленные смеси, состоящие из соот-
ветствующих растворителей возможно большей степени чистоты.
в. Восходящая методика. В герметичную разделительную камеру, выстланную филь-
тровальной бумагой, заливают 100—120 мл растворителя для пластинок 200 X 200 мм
и сильно встряхивают (насыщение камеры, стр. 24), прежде чем поместить пластинки.
Камеру следует плотно закрыть и во время хроматографического анализа ее нельзя
открывать.
г. Горизонтальная методика [13]. Она описана в общей части (стр. 30). В этом слу-
чае насыщения камеры не требуется.
д. Температура. Во время хроматографического анализа температура должна быть
постоянной. Ее абсолютная величина имеет меньшее значение. В случае вязких раст-
ворителей (например, фенол — вода) можно работать при более высокой температуре
для уменьшения времени опыта.
е. Длина пути. Обычно она составляет 10 см. Если же она больше или меньше этой
величины, то при публикации величины Ау это необходимо отметить (при применении
однокомпонентного растворителя это можно не указывать, см. стр. 107 и сл.). Если длина
пути ограничена линией разделана слое, то пластинку следует сразу же вынуть из камеры
по достижении растворителем этой границы (см. стр. 116).
III. АМИНОКИСЛОТЫ
1. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ИССЛЕДУЕМОГО РАСТВОРА
Аминокислоты следует по возможности освободить от сопутствующих
примесей. Если проводят контрольный опыт для сравнения величин Rf,
то применяют набор чистых аминокислот, который в настоящее время имеется
в продаже *, и готовят из них растворы, содержащие в 1 мл по 1 мг каждого
из исследуемых веществ. Растворителем служит преимущественно вода
с добавкой около 10% н-пропанола; такие растворы сохраняются в холо-
дильнике и даже при комнатной температуре в течение 2—4 недель. Трудно-
растворимые аминокислоты тирозин и цистин растворяют в 0,1 н. соляной
кислоте. Наносят 0,5 или 1 цл раствора, что соответствует 0,5 или 1 цг ами-
нокислоты. При применении солянокислых эталонных растворов рекомен-
дуется подкислять также неизвестные анализируемые пробы и перед хрома-
тографическим анализом в течение 15—20 мин обдувать пластинку возду-
хом для удаления избытка соляной кислоты. В методе хроматографии на бу-
маге обычно принято соляную кислоту нейтрализовать парами аммиака.
При этом, однако, необходима осторожность. Аммиак сравнительно легко
удерживается силикагелем, в результате чего при применении нейтральных
растворителей возникает опасность проведения анализавболее илименее ще-
лочной среде. Аминокислоты в кислом белковом или пептидном гидролизате
(см. ниже) почти всегда существуют в виде гидрохлоридов. Их раствор
в воде соответствует. приблизительно 0,1 н. раствору соляной кислоты.
Аминокислоты в экстрактах из животных и растительных тканей и в таких
жидкостях, как моча, сыворотка и т. д., перед нанесением необходимо отде-
лить от примесей и осуществить хроматографический анализ в виде ДНФ-ами-
* Фирмы: «Fluka, Buchs» (Швейцария); «Merck» (Дармштадт, ФРГ); «Cyclo Che-
mical Corp.» (Лос-Анжелос); «California Corp, for Biochemical Research» (Лос-Анжелос);
«Mann Research Labor. Inc.» (Нью-Йорк); «Nutritional Biochemicals Corp.» (Кливленд,
Огайо).
396
Специальная часть
нокислот. Приводимые ниже прописи были выработаны в случае хромато-
графии на бумаге; при количественных анализах они не гарантируют от воз-
можности получения ошибочных результатов.
2. ГИДРОЛИЗ ПРОТЕИНОВ И ПЕПТИДОВ
а . Кислый гидролиз. При неосторожно проводимом гидролизе могут быть большие
потери, в первую очередь тирозина. Осторожность в особенности необходима при нали-
чии углеводов (коричневое или черное окрашивание продуктов гидролиза, вызванное
образованием гумина). Кислый гидролиз в особенности разрушает триптофан (исключе-
ние см. «Сильнокислые ионообменники»); в меньшей степени, но также разрушается
серин и треонин (первоначальное содержание оксиаминокислот можно приближенно
установить, проводя количественный анализ 24- и 72-часового гидролизатов). При не-
обходимости хорошей воспроизводимости рекомендуются следующие методы, применяе-
мые нами при количественном анализе аминокислот *.
6 н. соляная кислота. Вещество в ампуле из прочного стекла, подготовленной для
откачки и запаивания, смешивают с 200-^500-кратным избытком (избыток рассчитывают
на протеиновую часть; в особенности большой избыток надо брать при наличии углево-
дов) 6н. соляной кислоты (перегнанной 2—3 раза) и содержимое ампулы сильно охла-
ждают в бане со смесью сухой лед — ацетон. После вытеснения воздуха чистым азотом
ампулу откачивают приблизительно до 1 мм рт. ст. и запаивают (при запаивании ампулу
помещают в деревянный сосуд с рукояткой, наполненный смесью сухого льда и снега).
Гидролиз проводят в течение 18—72 час в термостате при 110° 1°. После гидролиза
соляную кислоту удаляют, выдерживая гидролизат в откачанном эксикаторе над NaOH.
Сильнокислые ионообменники. Только недавно найден метод, позволяющий коли-
чественно определить после кислого гидролиза триптофан, а также, например, лизерги-
новую кислоту. Этот метод имеет и другое преимущество — практически исключено
образование гумина. По методу М. Пома [15] в стеклянной колбе сплавляют около’
0,05—0,2 г пептида с 1 г амберлита IR-112 вЗ—Ю-ил 80%-ного этанола в атмосфере азота
и нагревают 6—10 час при 90—95°. После охлаждения аминокислоты вымывают из ионо-
обменника 10%-ным раствором аммиака.
Более ранние опыты по гидролизу с дауэксом-50 в 0,05 н. соляной кислоте [16]
показали, что аспарагиновая кислота, серин и треонин выделяются очень быстро, а валин
и изолейцин — медленно по сравнению с гидролизом 6 н. соляной кислотой. Связи цис-
тин — и цистеиновая кислота — пептид должны быть очень устойчивы по отношению
к такому типу гидролиза. Приблизительно 25% глутаминовой кислоты превращается
в пирролидонкарбоновую кислоту. Основные аминокислоты неполностью элюируются
с ионообменники разбавленным раствором аммиака.
Дальнейшие сведения о методике гидролиза, в особенности применение добавок,,
например муравьиной кислоты, уксусной кислоты, хлорида олова (II), или применение
серной и иодистоводородной кислот, можно найти у Хайса и Мацека [2] (стр. 415, 482)
и Линскенса [17] (стр. 149).
б . Основной гидролиз. 5—10 мг вещества нагревают в течение 24 час в запаянной
трубке с 1 мл воды + 65 мг Ва (ОН)2-8Н2О при 125—130°. К охлажденной реакционной
смеси добавляют 2 н. H2SO4 до pH 6, нагревают до кипения и центрифугированием отде-
ляют осадок BaSO4. Этот осадок промывают небольшим количеством воды. Раствор
и промывные воды объединяют и выпаривают досуха; остаток растворяют в 0,5—1 мл
воды или 0,1 н. НС1. Цистин и Р-оксиаминокислоты при таком гидролизе частично раз-
рушаются, триптофан остается без изменения.
3. СВОБОДНЫЕ АМИНОКИСЛОТЫ В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ
Водные экстракты животных и растительных организмов, соки, извле-
ченные прессованием, гомогенаты и жидкости организма содержат в боль-
шинстве случаев наряду со свободными аминокислотами растворенные в воде
или эмульгированные пептиды **, белки, углеводы, мочевину, соли
и липоиды.
а. Отделение от белков и полисахаридов. Лучше всего использовать спирт [18] или
ацетон, поскольку эти вещества не мешают хроматографическому анализу и легко уда-
ляются. По методу Авапара [19] анализируемое вещество смешивают с 4—8 объемами
спирта, через несколько часов центрифугируют и осадок промывают 80%-ным спиртом.
* Хроматография на ионообменниках по Штейну и Муру [14].
** Отделение малых количеств пептидов от аминокислот обычно невозможно (см.
разд. «Пептиды», стр. 408).
Гл. 19. Аминокислоты и производные
397
По методу Хайса и Мацека [2] (стр. 780) «1 мл плазмы сушат в вакуумном эксика-
торе над H2SO4. Остаток оставляют стоять на 2 час с 8 мл ацетона, к которому добавлен
1% концентрированной НС1. Жидкость отделяют центрифугированием, осадок промы-
вают и центрифугируют; эту операцию повторяют 2—3 раза. Жидкость испаряют в токе
сухого воздуха при 37°. Остаток растворяют в 0,5 мл воды, раствор промывают 2—3 раза
равным объемом эфира. Водный раствор снова выпаривают в эксикаторе над H2SO4,
растворяют в 20—100 цл воды и наносят на пластинку».
Ионообменники, адсорбирующие аминокислоты, пригодны также для удаления
белков; протеины из-за пространственных препятствий адсорбируются очень слабо,
II поэтому основная часть проходит с углеводами, и неорганическими катионами или
анионами (сравни обессоливание).
Совершенно новым в разделении высокомолекулярных соединений является приме-
нение фильтров из сефадекса [20] * — набухающего декстрана, образующего сетчатую,
пористую структуру. В то время как большие молекулы в эти поры не проникают,
неорганические соли и небольшие молекулы беспрепятственно диффундируют в гель. При
пропускании водного раствора таких соединений через колонку с сефадексом первая
фракция содержит высокомолекулярные соединения, а небольшие молекулы некото-
рое время задерживаются в колонке, однако всегда количественно вымываются водой
или разбавленным раствором соли. Преимущество этого изящного метода «диализа»
заключается прежде всего в экономии времени: эта операция требует всего около 60 мин.
б. Разрушение мочевины. Добавкой следов уреазы мочевину мочи переводят в тече-
ние 24 час в СО2 и NH3, которые сразу удаляются с водяным паром при заключительном
концентрировании [25].
в. Обессоливание. Используют или электродиализатор, например, описанный Кон-
сденом, Гордоном и Мартином [26] **, или соответствующую ионообменную установ-
ку [27—29] ***.
При электролитическом обессоливании аргинин частично переходит в орнитин;
10—30% гистидина, лизина, метионина, пролина и тирозина теряется. Удаление солей
с помощью ионного обмена также приводит к потерям: аргинин и лизин не задерживаются
сильноосновными обменниками и трудно вымываются с кислых обменников.
В нашей лаборатории [31], как и у Дреце [32, 33], оправдали себя следующие методы
с использованием понообменников (при этом вместе с солями удаляются и растворимые
в воде углеводы):
Трубку (1 X 10 см~) заполняют слоем высотой 2 см, причем:
а) для обессоливания основных аминокислот или триптофана применяют дауэкс-50,
8% ДВБ, 200—400 меш (Н+-форма). Смолу обрабатывают 10 мл 1 н. НС1, промывают до
нейтральной реакции, вводят 1—4 мл анализируемого раствора, pH которого < 6 уста-
навливают соляной кислотой для удаления содержащегося в растворе СО2, пропускают
через колонку со скоростью 1 мл в 3 мин. Если раствор задерживается смолой, его вытес-
няют 20 мл 0,5 н. НС1. Затем адсорбированное вещество вымывают 4 н. НС1, первые 3 мл
отбрасывают, собирают 5 мл основной фракции и испаряют в вакууме досуха, много-
кратно добавляя воду. Растворяют в воде и хроматографируют;
Р) для обессоливания нейтральных и кислых аминокислот применяют дауэкс-2, 10%
ДВБ, 200—400 меш (ОН~-форма). Колонку обрабатывают 20 мл 2 н. NaOH (свободного
от СО2!), промывают до нейтральной реакции прокипяченной водой и вводят 1—4 мл
исследуемого раствора. Если раствор задерживается в колонке, его вытесняют 20 мл
воды, а затем 10 мл 1 н. уксусной кислоты (при этом окраска смолы изменяется от корич-
невой до светло-желтой). Когда фронт кислоты достигает конца колонки, отбирают про-
бу 5 мл. Раствор выпаривают и действуют дальше, как описано в пункте а).
г. Удаление липоидов [19]. В связи с удалением белков прозрачный отцентрифуги-
рованный раствор смешивают с 3 объемами хлороформа, встряхивают и отделяют в дели-
тельной воронке. Водный (верхний) слой должен содержать основную массу амино-
кислот.
д. Примеры. Ниже мы приводим новые литературные данные по определению амино-
кислот в сыворотке [34].
Для проверки извлечения проводили анализ после пропускания через ионообменник,
с одной стороны, аликвотной части сыворотки и соответствующей аликвотной части
сыворотки с добавкой известного количества аминокислот. С другой стороны, анализи-
ровали смесь аминокислот, по составу аналогичную сыворотке.
1,5 мл свежей сыворотки медленно фильтруют через колонку длиной 5 см и диа-
метром 0,4 см с сильнокислым ионообменником [цеокарб 225 (Н)]. Для удаления неорга-
нических анионов, протеинов, сахаров и других незаряженных примесей колонку про-
мывают 50 мл воды, затем элюируют аминокислоты 20 мл 10%-ного раствора аммиака
* Общая методика и обессоливание [21]; фильтрация через гелевый фильтр про-
теинов, пептидов и аминокислот [22, 23]; разделение пептидов [24].
** Ср. [17], стр. 32.
*** Ср. [2], стр. 415.
398
Специальная часть
и раствор досуха упаривают в вакууме. Нейтральные аминокислоты остаются в свобод-
ном состоянии, кислые присутствуют в виде моноаммонийных солей или в виде солей
с основными аминокислотами; последние из-за неполного вымывания частично теряются.
Таблица 100
Извлечение аминокислот при фильтровании через кислый ионообменник
(цеокарб 225) [34]
Аминокислота Извлече- ние до- бавлен- ной в сы- воротку кислоты, % Извлече- ние из синтети- ческой смеси амино- кислот, % Аминокислота Извлече- ние до- бавлен- ной в сы- воротку кислоты, % Извлече- ние из синтети- ческой смеси амино- кислот, %
Глутамин 113 — Лейцин — 88
Цитруллин 102 — Изолейцин 79 —
Треонин 74 93 Аланин . 101 122
Пролин 76 85 Глицин . — 124
Метионин — 41 Орнитин — 77
Фенилаланин 84 107 Аргинин 82 53
Серин 91 ПО
Валин 90 93 Средняя величина . , 89 83
Табл. 100, составленная по данным Цитированной работы, отчетливо показывает
неточности, которые приходится учитывать; авторы относят ошибки анализа в основном
на счет процесса разделения аминокислот в описываемом методе.
Таблица 101
Литературные данные по экстракции аминокислот
из биологических материалов
Материал Авторы
Картофель Рис Сок листьев картофеля Биологический материал Грибок и микроорганизмы Дент и др. [35] Парихар [36] Рейндел и Биненфельд [37] Бизерте и др. [38] Клозе [39]
Табл. 101 позволяет получить ориентировочные данные о некоторых других при-
менениях перечисленных методов.
4. РАСТВОРИТЕЛЬ И ЭФФЕКТ РАЗДЕЛЕНИЯ
Однофазные системы. Для хроматографического анализа свободных
аминокислот вследствие их ничтожно малой растворимости в органических
растворителях (см. табл. 99) используют только растворители, содержащие
воду. В качестве органического компонента напрашиваются в первую очередь
сильно полярные жидкости, например метанол, этанол или ацетон. При
этом достигают частичного разделения, однако такие растворители приво-
дят к относительно размытым пятнам и к образованию хвоста. Тенденцию
к образованию хвоста можно иногда с успехом подавить добавлением не-
скольких объемных процентов ледяной уксусной кислоты (растворитель VII,
Гл. 19. Аминокислоты и производные
399-
см. ниже); в случае чистых аминокислот следует еще проверить возможность
работы с меньшими количествами наносимого вещества (по 2 рг на амино-
кислоту). При переходе к высшим спиртам пятна становятся меньше, но зато,,
главным образом из-за повышенной вязкости, уменьшается скорость. Пятна
тем меньше (т. е. эффект разделения тем лучше), чем выше вязкость раствори-
теля. Хорошим примером является фенол. При замене спирта неполярной
жидкостью с меньшей вязкостью, которая плохо смешивается с водой, сле-
дует добавить вещество, повышающее растворимость, например метанол,,
пиридин или ледяную уксусную кислоту. При этом часто наблюдается очень
хорошее и быстрое разделение.
Двухфазные системы. Лучше всего избегать таких систем, поскольку их
нельзя использовать сразу же после смешения; кроме того, они чувстви-
тельны к температурным колебаниям. Во многих случаях достаточно
работать с органической фазой вблизи насыщения. Как мы, так и другие-
авторы нашли, что в системе фенол — вода величина Rf меняется незначи-
тельно при переходе от насыщенного водой фенола (около 71 %) к 80%-ному
фенолу. Поэтому мы использовали только 75%-ный фенол (табл. 102).
Таблица 102
Растворители а для аминокислот на силикагеле
Компоненты Соотношение
в граммах в миллилитрах
I 96%-ный этанол — вода 63+37 70+30
II н-Пропаяол •— вода 64+36 70+30
III н-Бутанол — ледяная уксусная кислота — вода 60+20+20 80+20+20
IV Фенол — вода 6 75+25 —
V н-Пропанол — 34%-ный аммиак 67+33 70+30
VI 96-ный этанол — 34%-ный аммиак 77+23 70+30
VII Метилэтилкетон — пиридин — вода — ледяная — 70+15+15+2
уксусная кислота
VIII Хлороформ — метанол — 17%-ный аммиак — 40+40+20
а Мучлер и Рохельмайер [10] применили следующие растворители на забуференном слое (см„
стр. 394): 70%-ный этанол, 96%-ный этанол — 25%-ный аммиак (80 + 20) и 96%-ный этанол —
25%-ный аммиак — вода (70 + 10 + 20). Нюрнберг [41] использовал для двумерной хроматограм-
мы смеси н-пропанол — вода (50 + 50) и фенол — вода (100 + 40). Для разделения тирозина, N-ме-
тилтирозина и О-метилтирозина Иост, Рудингер и Сорм [42] предложили смесь фенол — вода-
(90 + 30).
б 75 г расплавленного фенола смешивают с 25 мл воды и добавляют приблизительно-
го мг NaCN или другого антиокислителя. Смесь перед употреблением охлаждают до комнатной
температуры.
В табл. 102 сопоставлены некоторые растворители, пригодные для разде-
ления аминокислот. Они частично уже известны из хроматографии на бумаге.
В табл. 103 приведены соответствующие величины Rf.
На основании диаграмм рис. 160 можно легко выбрать подходящий для
определенной цели растворитель. Интересно, что в нейтральном растворителе
(смесь этанол — или w-пропанол — вода) кислые аминокислоты перемещают-
ся относительно далеко, а лизин и аргинин имеют очень малую величину Rf
(см. табл. 103). Можно предположить, что здесь оказывает влияние катионит.
Арланд и сотрудники [43] нашли, что кривые титрования силикагеля
Таблица 103
Величины Bf а важнейших аминокислот в растворителях I — VI табл, 102
(восходящий метод, длина пути растворителя 10 см) и величины Влей 6
в растворителе VII табл. 102 (горизонтальный метод в, продолжительность анализа,
включая время протекания, 4 час)
Пробы около 0,5 цг
Аминокислота Сокраще- ние Ry X 100 в растворителе Клей VII
I II III IV V VI
Аланин Ала 47 37 22 29 39 40 51
Р-Аланин Р-Ала 33 26 22 30 30 29 35
а-Аминоизомасляпая кислота а-АиМ 27 61
а-Амино-н-масляная кислота а-АнМ 27 59
Р-Аминоизомасляная кислота Р-АиМ 25 48
у-Амино-н-масляная кислота у-АнМ 27 45
е-Амино-н-капроновая кислота е-АКО 34 68
а-Амино-н-каприловая кислота а-АКИ 66 65 59 69 58 60 143
Аргинин Apr 4 2 6 19 10 6 19
Аспарагиновая кислота . . . Асп 55 33 17 6 9 7 18
Цистеиновая кислота .... ЦисЗО3Н 69 50 10 04 17 21 53
Цистин Цис 39 32 9 12 27 22 18
Дибромтирозин ДБТ 60 168
Глутаминовая кислота .... Глу 63 35 24 10 14 15 32
Глицин Г ли 43 32 18 24 29 34 45
Гистидин Гис . 33 20 5 32 38 42 18
Гомоцистин Гцис 17 28
Оксипролин Опро 44 34 16 38 28 31 50
Изолейцин Илей 60 53 43 49 52 58 92
Лейцин Лей 61 55 44 48 53 58 100
Лизин Лиз 3 2 3 9 18 И И
Метионин Мет 59 51 35 49 51 60 92
Метионинсульфон Мет О2 66
7-Метилгистидин Мгис 9
Норлейцин Илей 61 57 45 52 53 59 102
Норвалин Нвал 56 50 36 42 49 57 77
Орнитин Орн 4 14
Фенилаланин Фен 63 58 43 55 54 60 109
Р-Фенилсерин Р~Фсер 41 108
Пролин Про 35 26 14 50 37 30 40
Саркозин Сар 31 22 12 37 34 31 32
Серин Сер 48 35 18 20 27 31 47
Таурин Тау 18 79
Треонин . Тре 50 37 20 26 37 40 51
Триптофан ; . . Три 65 62 47 63 55 58 122
Тирозин Тир 65 57 41 47 42 51 107
Валин Вал 55 45 32 40 48 56 72
Аспарагин Асп NH2 14 43
Глутамин Глу NH2 15 47
Глицинамид Г ли NH2 16 62
а Данные величины являются среднеарифметическими из четырех (для растворителей I, II, IV—
VI) и из девяти (для растворителя III) отдельных измерений. О факторах, оказывающих влияние на
величину Ry, см. [12].
б нлей — величина Ry, отнесенная к величине Ry лейцина. Приведенные величины являются
среднеарифметическими из девяти параллельных измерений.
[13], см. также стр. 31.
26 Заказ №73 4
Рис. 160. Графическое изображение величин Rf [7] наиболее важных аминокислот в растворителях I—VI табл. 102.
402
Специальная часть
и слабокислого ионообменника аналогичны (см. главу о тонкослойной хрома-
тографии неорганических веществ). Было замечено также, что наличие одной
гидроксильной группы в молекуле не обязательно должно понижать вели-
чину R/, в зависимости от взаимодействия с растворителем может иметь место
даже обратный случай (ср. Сер/Гли, Тре/Ала, Опро/Про, Тир/Фен в раствори-
%
а
/5
Фен Тир
Фен Q
Мет
Q Илей
'''(уВал V „ „ ТР“
Тре Гис О •/7еи*^“
Цис SO3H Ол О MemQ2 7Up
А [)Ала
00пр° А
?-АнМ
О Г)4рг
Лиз 2
Тре
Вал
180 мин/15 см
Старт
О
Рис. 161. Двумерное разделение смеси
окисленных надмуравьиной кислотой 20 бел-
ковых аминокислот, p-аланина и у-амино-
н-масляной кислоты [44], полученное вос-
ходящим методом.
0,1 н. солянокислого раствора, со-
0,5 ца каждой кислоты, хлоро-
Проба 0,5 цл
держащая по ... ___,, __ ______
форм—метанол — 17%-ный аммиак (40 4- 40 4- 20)
в направлении 1, фенол — вода (75 а 4- 25 г) в на-
правлении 2. После разделения в направлении
1 пластинку на 20 мин помещают в вытяжной шкаф.
Пятно метионина (пунктирное) появляется лишь
при отсутствии окисления надмуравьиной кисло-
той. Обнаружение осуществляют нингидрином
(реактив № 108).
Р и с. 162. Одномерное
разделение в проточной
камере([13], стр. 24) для
обнаружения лейцина
и изолейцина наряду
с 18 белковыми амино-
кислотами, р-аланином
и у-амино-н-масляной
кислотой.
Проба 0,5 цл 0,1 н. соляно-
кислого раствора, содержа-
щая по 0,5 jll2 каждой ки-
слоты; растворитель метил-
этилкетон — пиридин — во-
да — ледяная уксусная ки-
слота (70 4- 15 4- 15 -j- 2);
время анализа 4,5 час; об-
наружение нингидрином.
При наличии метионина
необходимо окисление над-
муравьиной кислотой [44].
Для надежной идентифи-
кации лейцина и изолей-
цина параллельно хромато-
графируют каждую из этих
аминокислот в качестве эта-
лонных веществ.
белковые аминокислоты +
теле I и V). Наилучшего общего эффекта раз-
деления достигают со смесями хлороформ —
метанол — 17 %-ный аммиак (40 + 40 + 20),
н-бутанол — ледяная уксусная кислота — во-
да (80 + 20 + 20) и фенол — вода (75 г + 25 г).
Для двумерной хроматографии пригодна
смесь растворителей III и IV (рис. 159 [7]),
и в особенности смесь растворителей VIII и IV
(рис. 161 [9]). Они позволяют разделить все
fi-аланин + у-амино-«-масляная кислота, кроме лейцина и изолейцина.
Эти изомеры можно разделить в параллельном опыте при использовании
проточного метода [13] с растворителем VII (рис. 162).
Обычно поражает, что при анализе методом ХТС в одномерном варианте
наибольшая величина Rf аминокислот не превышает 0,7. В случае всех
исследованных нами растворителей было использовано для разделения только
приблизительно 2/3 имевшегося в распоряжении пути. Увеличение содер-
жания воды в растворителе приводило к большему росту малых величин Rf,
чем больших, в результате чего уменьшался эффективный путь разделения.
Гл. 19. Аминокислоты и производные
403
Дополнительные замечания. Замечено, что величина Rf чистого вещества
не постоянна, а зависит от ряда факторов [12]. На рис. 163 показана зави-
симость от количества нанесенного вещества.
Впрочем, величина Rf может изменяться в присутствии постороннего
вещества незначительно. Так, например, Rf увеличивается для кислых
аминокислот в растворителе и-пропанол — вода (70 + 30), если эти кислоты
находятся в смеси с другими аминокислотами. Для смесей ДНФ-аминокислот
также установлено значительное влияние на величину Rf соотношения коли-
честв, причем, как это известно из бумажной хроматографии [45], в осо-
бенности мешает динитрофенол. При разделении во втором направлении
в случае двумерной хроматографии соотношение компонентов оказывает
01 0,2 0,5 1 2 4 /2 16 32 54 130 260 рг
Рис. 163. Зависимость величины Rf чистого вещества (глицина) от количества пробы.
Место наибольшей плотности вещества обозначено точкой на пятне. Объем проб равен 1 цл;
проявитель н-пропанол — вода (70 4- 30); восходящий метод.
на величину Rf меньшее влияние, чем «предварительная обработка» слоя
(хроматографическое разделение в направлении 1, промежуточное высуши-
вание). Поскольку предварительную обработку слоя можно в дальнейшем
стандартизировать, величина Rf при разделении в направлении 2, в общем,
хорошо воспроизводится. Таким образом, в случае двумерной хроматогра-
фии смеси дают характерные пятна, мало искажающиеся при колебаниях
величины Rf. Поэтому целесообразно анализировать неизвестную пробу
одновременно со стандартной смесью, содержащей в каждом случае такое
количество исследуемого вещества, что после двумерного разделения
отдельные компоненты еще можно обнаружить. В большинстве случаев
соединение в исследуемом растворе определяется по интенсивности соот-
ветствующих пятен сразу и безукоризненно.
Замечание о промежуточном высушивании в случае двумерной хроматографии.
Промежуточное высушивание не является проблемой при применении I легколетучих
растворителей. В этом случае достаточно поместить пластинку на 15 мин в поток воздуха
(хорошая тяга), после чего ее можно сразу же подвергнуть хроматографическому разде-
лению в направлении 2. При высушивании хроматограмм с менее стабильными веще-
ствами существует опасность их разложения, если для удаления труднолетучего раст-
ворителя (например, фенола) необходимо нагревание. Было бы желательно выпускать
в продажу небольшие дешевые вакуум-аппараты для быстрого высушивания хромато-
грамм в мягких условиях. В настоящее время часто приходится применять трудно-
летучий растворитель только в направлении 2 или оставлять пластинку с нестойкими
веществами на 12 час в токе воздуха. При этом необходимо учитывать, что может прои-
зойти окисление и, кроме того, могут остаться еще значительные количества трудноле-
тучего растворителя, применявшегося в направлении 2 (ср. «косвенно» [найденные вели-
чины Rf ДНФ-аминокислот, табл. 109 и стр. 422).
Другая возможность состоит в том, что пластинки оставляют на 10 мин в токе воз-
духа, затем нагревают 15 мин в сушильном шкафу до 60° и охлаждают в токе воздуха
в течение 15 мин.
Если после промежуточного высушивания хроматограмму на некоторое время
необходимо сохранить, то ее покрывают стеклянной пластинкой и держат в темноте.
5. ОБНАРУЖЕНИЕ АМИНОКИСЛОТ НА ХРОМАТОГРАММЕ
Реактивы, которыми можно было бы перевести в видимое состояние только
аминокислоты, пока неизвестны. Существуют некоторые неспецифические
26*
404
Специальная часть
реактивы на азотсодержащие соединения и несколько специфически дей-
ствующих реактивов для открытия одной или немногих аминокислот. Ниже
описаны заслуживающие внимания подробности важнейщих методов.
а. Нингидрин. Нингидрин по-прежнему является самым распространен-
ным реактивом на аминокислоты. Хотя цветная реакция трикетогидринден-
гидрата с аминокислотами и низшими пептидами известна уже с 1910 г.
(Руэман), ее механизм еще и сегодня остается спорным. Были выдвинуты
многочисленные теории, описывающие этот механизм, обобщенные Калди-
ном [46]. Обработка комплексообразующими катионами (Си, Cd, Са) сдви-
гает получаемую нингидрином окраску в сторону красной и значительно
повышает ее стабильность. При обычной методике (см., например, [26, 47, 48])
появляется желтое (пролин и оксипролин) или фиолетовое (все остальные
а-аминокислоты) окрашивание, но при добавлении оснований (коллидин,
бензиламин) можно добиться специфического окрашивания. Это может
быть полезным при идентификации отдельных аминокислот, но связано
с уменьшением чувствительности.
Условия проведения реакции с нингидрином описаны в прописи для
реактива № 108. Добавление уксусной кислоты гарантирует необходимое
для нингидриновой реакции значение pH около 5 даже при использовании
щелочного растворителя. При более длительном нагревании и повышении
температуры (110°) фон становится розовым. Чувствительность определения
методом ХТС некоторых аминокислот приведена в табл. 104.
Таблица 104
Минимально определяемое количество (цг) аминокислот
по реакции с нингидрином (силикагель Г) [9]
Аминокис- лота (сокра- щения см. в табл. 103) Одномерная хромато- грамма с растворите- лем н-пропа- нол — вода (704-30) Двумерная хромато- грамма смеси ами- нокислот (рис. 161) Аминокис- лота (сокра- щения см. в табл. 103) Одномерная хромато- грамма с растворите- лем н-пропа- нол — вода (704-30) Двумерная хромато- грамма смеси ами- нокислот (рис. 161)
Ала . . . 0,009 0,05 Лиз . . . 0,005 0,03
(5-Ала . . 0,01 0,06 Мет . . . 0,01 0,4
Apr . . . 0,01 0,06 Фен . . . 0,05 0,2
Асп . . . 0,1 0,4 Про . . . 0,1 0,5
Цис SO3H 0,01 0,1 Сер .... 0,008 0,1
Глу . . . 0,04 0,2 Тре .... 0,05 0,1
Гли . . . 0,001 0,006 Три . . . 0,05 0,5
Гис .... 0,05 0,5 Тир . . . 0,03 0,1
Опро . . . 0,05 0,1 Вал .... 0,01 0,2
Лей ... 0,01 0,2
а) Стабилизация окраски, полученной с нингидрином. По методу Каверау
и Виланда [49] после обнаружения с нингидриновым реактивом, который
не должен содержать цитратного буфера (комплексообразователь), хрома-
тограмму опрыскивают раствором нитрата меди (реактив № 108). Образую-
щийся медный комплекс стабилен только в отсутствие свободной кислоты.
Поэтому после опрыскивания хроматограмму нужно обработать парами ам-
миака. Хроматограмму следует защищать от влаги, поскольку меднонингид-
риновый комплекс в щелочном растворе при pH 7—9 диссоциирует обрати-
мо, а при pH >9 — необратимо. Для этого можно применять предложен-
ный Барроллиером [50] раствор коллодия (см. также ДНФ-аминокислоты,
документация, стр. 422).
Таблица 105а
Преимущественно неспецифические реактивы для обнаружения аминокислот
Примечание Номер реактива Реактив Авторы
Полихромати- ческий Полихромати- ческий Л Полихро- матиче- •! ский ч а Ср. стр. 41 108 109 X. 96 32 2. Нингидрин Нингидрин + хлорид ко- бальта (II) Нингидрин -|- нитрат ме- ди 4- коллидин Нингидрин 4- коллидин Нингидрин 4- циклогексил- амин или дициклогексиламин Нингидрин 4- фенол Изатин Изатин 4- ацетат цинка 4- пиридин Аллоксан Na-1,2-Нафтохинон-4-суль- фонат Ха-1,2-Нафтохинон-4-суль- фонат 4- ацетат цинка 4- хи- нолин 4,5-Диацетилциклогексен- (1) Хлор 4- толидин а Калдин [46], Цукамото, Ко- мори [48], Паттон, Хисм [54], Теннис, Колб [55], Консден и др. [47], Руэман [56—60] Виггинс, Вильямс [61] Моффат, Литле [3] Войвод [51] Харди и др. [52] Хайе [2] (стр. 419, 753) Зайфер, Орескес [62], Ново- ритко, Сарнека-Келлер [63], Ахер и др. [64] Грасман, Арним [65] Барроллие и др. [66] Зайфер, Орескес [62], Роуз- бик [67] Кофраний [68] Консден [69] Мутинг [70] Гири, Нагабусанам [71] Барроллие и др. [66] Римшнейдер, Прейс [72] Рейндел, Хоппе [73]
Таблица 1056 Относительно специфические реактивы для обнаружения аминокислот
Аминокислота Номер реактива Реактив Авторы
Аргинин 97 ИЗ а-Нафтол (или оксин)+ NaOBr (или NaOCl) «реакция Сакагучи» Нитропруссид натрин 4- гексацианоферрат (III) калия а-Нафтолат натрия 4- диа- цетил Бхаттачарин и др. [74] Рохе и др. [75] Джепсон, Смит [76] Ахер, Крокер [77] Сакагучи [78—80] Рохе и др. [75] Туппи [81]
Продолжение табл. 1056
Аминокислота Номер реактива Реактив Авторы
Орнитин 147 Ванилин
Пролин Изатин Нингидрин Ахер и др. [64]
Серин Периодат/ацетилацетон + ацетат аммония Шварц [97]
106 Периодат/реактив Несслера Периодат/KI + крахмал 1,2-Дини тробенз о л-ен дио л- реакция Консден [69], Консден и др. [99] Метценберг, Митчел [100] Фирон, Боггаст [101]
Треонин Периодат/нитропруссид натрия -J- пиперидин Периодат/нитропруссид натрия + пиперазин (реактив Римини) Шварц [97] Эдвард, Валдрон [102]
106 Периодат/реактив Несслера Периодат/KI + крахмал 1,2- Динитробензол-ендио л- реакция Консден [69], Консден и др. [99] Метценберг, Митчел [100] Фирон, Боггаст [101]
Триптофан 48 п- Диметиламинобензальде- гид + НС1 (реактив Эрлиха) Смит [103] Далглиш [104] Пашеко [105]
154 Коричный альдегид + НС1 Виланд, Бауэр [106]
NaNO2 + НС1 Ерхель, Мюллер [107] Фишер [108]
64 Формальдегидный реактив Измененный реактив Салковского Прохазка [109] Линсер [110]
37 Диазот. сульфаниловая кислота Эрспамер [111]
38 Диазот, п-нитроанилин Диазот, бензидин Диазот, этил-а-нафтиламин о-Фтальдиальдегид Эрспамер [111] , Клерк-Бори и др. [112] Далглиш [104] Экман [113] Паттон, Фореман [88]
Тирозин а-Нитрозо-Р-нафтол/ННО3 Ахер, Крокер [77] Гернгрос и др. [114]
• 37 61 Диазот, сульфаниловая кис- лота (реактив Паули) Соль прочной голубой В (диазореактив) Франк, Петерсен [89] Брай и др. [90] Кирби-Берри и др. [83]
Продолжение табл. 1056
Аминокислота Номер реактива Реактив Авторы
Цистеин 111 ср. 76 75 145 Нитропруссид натрия Иодоплатинат Азид иода Соли тетразолия п-Аминодиметиланилин -{- гексацианоферрат (III) калия Теннис, Колб [55] Винегард и др. [82] Теннис, Колб [55] Винегард и др. [82] Кирби-Берри и др. [83] Аве и др. [84] Чаргаф и др. [85] Бартон и др. [86] Тояда [87]
Цистин 111 ср. 76 75 Нитропруссид натрия+NaCN Иодоплатинат Азид иода п-Аминодиметиланилин + гексацианоферрат (III) калия Винегард и др. [82] Винегард и др. [82] Кирби-Берри и др. [83] Аве и др. [84] Чаргаф и др. [85] Тонда [87]
Глицин о-Фталдиальдегид Паттон, Фореман [88]
Гистидин 37 61 Диазот, сульфаниловая кис- лота или сульфаниламид (ре- актив Паули) Соль прочной голубой В (диазореактив) Диазот, п-хлоранилин Диазот, п-броманилин Диазот, п-анизидин Бром о-Фталдиальдегид Франк, Петерсен [89] Брай и др. [90] Кирби-Берри и др. [83] Паули [91, 92] Эдлбахер [93, 94] Зангер, Туппи [95] Кирби-Берри и др. [83] Паттон, Фореман [88]
Оксипролин Изатин + реактив Эрлиха Модификация нингидрина Перйодат ацетилацетон + ацетат аммония Нингидрин' Джепсон, Смит [76] Кларксон [96] Шварц [97]
Лизин 147 Ванилин
Метионин ср. 76 75 Иодоплатинат Азид иода Перманганат калия Винегард [82] Кирби-Берри и др. [83] Аве и др. [84] Чаргаф и др. [85] Далглиш [98]
408
Специальная часть
Продолжение табл. 1056
Аминокислота Номер реактива Реактив Авторы
Тирозин 122 Фосфорномолибденвольфра- мовая кислота (реактив Фо- лина — Чокальто) Реактив Фолина — Дениса Реактив Миллона Кудцин и др. [115], Фолин, Чокальто [116] Кудцин и др. [115] Фолин, Денис [117] Дурант [118], Миллон [119]
Р) Полихроматическая нингидриновая реакция. Для наших исследова-
ний оказался пригодным реактив Моффата и Литле [3] (реактив № 109).
Аналогичного эффекта достиг Войвод [51] с коллидином, а также Харди и др.
[52] с циклогексиламином и дициклогексиламином.
б. Хлор-толидиновый реактив (№ 32), Этим реактивом, служащим глав-
ным образом для обнаружения веществ с группой NH — СО и рассмотрен-
ным в главе о пептидах, действуют также на свободные аминокислоты; при
этом, однако, требуются относительно высокие концентрации.
в. Другие реактивы. Табл. 105 дает представление о некоторых опытах
из области хроматографии на бумаге. При некотором изменении эти методики
можно использовать и для ХТС. В тех случаях, когда необходимо специфи-
ческое определение отдельных аминокислот, бумажная хроматография те-
ряет свое практическое значение, поскольку метод ХТС обеспечивает луч-
шее разделение. Хроматография на бумаге может быть по-прежнему полезна
при необходимости определения аминокислот в пептидах, не подвергшихся
изменениям.
Используемая в случае хроматографии на бумаге флуоресцентная проба
основана, согласно исследованиям Опенска-Блаут и др. [53], на протекаю-
щей при нагревании реакции аминогрупп аминокислот с альдегидными груп-
пами углеводов и поэтому неприменима на силикагеле Г.
IV. ПЕПТИДЫ
Пептиды, подобно аминокислотам, как правило, гидрофильны. Поэтому
методика хроматографического анализа аминокислот в тонком слое в прин-
ципе применима также к пептидам. Эта аналогия справедлива в определен-
ных пределах. В случае высших пептидов на растворимость и адсорбцию
оказывает влияние число, природа и последовательность аминокислотных
остатков и поэтому в данном случае следует работать при других условиях
опыта или даже перейти к другим методам разделения. Пептиды с защищен-
ными функциональными группами (синтез промежуточных продуктов) менее
гидрофильны, чем пептиды без защитных групп.
Пептиды наряду с аминокислотами содержатся в биологических мате-
риалах (см., например, [120, 121]), большей частью в малых концентрациях
и часто в сопряженной форме (фосфопептиды, пептидилнуклеотиды, глюко-
пептиды, липопептиды, комплексы пептид — белок). Низшие свободные
пептиды при экстракции сопровождают фракцию аминокислот. Отделение
их от аминокислот весьма затруднительно.
В зависимости от обстоятельств смесь аминокислот и пептидов приходится анали-
зировать методом ХТС, используя двумерное разделение, отдельно элюировать раз-
деленные вещества и проверять их однородность повторным анализом методом ХТС,
Гл. 19. Аминокислоты и производные 409
а природу пептидов устанавливать посредством гидролиза. Часто для разделения такой
смеси с успехом применяют комбинацию хроматографии на бумаге и электрофореза на
бумаге (Анфинсен и др. [122]). Согласно Хонеггеру [123], можно комбинировать также
тонкослойный электрофорез с методом ХТС (стр. 431).
Новые перспективы в отношении эффективного предварительного фракционирова-
ния открывает колоночная хроматография на ионообменниках на основе целлюлозы*
и декстрана **.
Целлюлоза ДЭАЭ, содержащая диэтиламиноэтил-группы, не адсорбирует нейтраль-
ные и основные аминокислоты, но адсорбирует нейтральные пептиды, которые вымы-
ваются водой или водой, насыщенной углекислотой [125].
Разделение на фильтрах из геля сефадекса *** позволяет использовать различие
в молекулярном весе [21, 24, 126, 127]. Этот метод по своей эффективности приблизи-
тельно соответствует диализу, но может быть осуществлен гораздо быстрее. Линднер
и др. [128] экстрагировали сухой препарат задней доли гипофиза свиньи (активность
окситоцина и вазопрессина 2—3 Е /мг) пиридиноацетатным буфером. После нейтрали^
зации раствор пропускали через колонку с сефадексом G-25, элюировали этим же буфе-
ром и получили две фракции, дающие положительную реакцию с нингидрином. Первая,
более подвижная фракция содержит окситоцин и вазопрессин в виде комплексов пеп-
тид — белок; вторую фракцию, состоящую из низкомолекулярных неактивных соеди-
нений, отбрасывали. Десятиминутная обработка первой фракции 1 М муравьиной кис-
лотой при 70° приводит к диссоциации комплекса и при повторном пропускании через
сефадекс G-25 и элюировании 1 М муравьиной кислотой получили медленно передви-
гающуюся фракцию вазопрессина и окситоцина с активностью приблизительно 100 Е /мг.
Разделение аминокислот и пептидов и соответственно солей и пептидов происходит
на сефадексе менее отчетливо. Осложнения связаны с тем, что скорость передвижения
не определяется размером молекул, и поэтому условия опыта играют существенную
роль [22].
Предварительное фракционирование противоточным распределением Крега требует
более сложной аппаратуры ([129], стр. 290).
Пептиды, впрочем, образуются при частичном разложении протеинов.
Разделение такой смеси и установление последовательности аминокислот
в индивидуальных компонентах смеси является предпосылкой выяснения
химической структуры белков. Методы расщепления, приводящие к высшим
и низшим пептидам, рассмотрены Зангером [130] (частичный гидролиз),
Крегом с сотрудниками ([124], стр. 70) (окислительное расщепление мости-
ков S — S), X. Цубером [131] (ферментативный гидролиз), Сьёквистом
[132, 133] (пептиды как продукты расщепления по Эдману). С развитием
новых методов синтеза синтетические пептиды получают все большее зна-
чение, здесь можно упомянуть брадикинин и его аналоги [134—136] , аналоги
окситоцина [137], полимиксин [138, 139] и кортикотропно действующие
полипептиды [139а].
Если раньше во всех этих областях исследования в большом объеме
использовали хроматографию на бумаге, то в настоящее время в качестве
вспомогательного аналитического метода применяется и ХТС [134—139,
1396]. В табл. 106 и 107 приведено несколько примеров анализа пептидов
методом ХТС.
Для анализа методом ХТС сильнее защищенных пептидов (до 10 амино-
кислотных остатков) пригоден по Гуттману [143] слой из силикагеля и алокса
при разделении диметилформамидом или ледяной уксусной кислотой, содер-
* Целлюлоза ДЭАЭ, эктеола-целлюлоза, карбоксйметилцеллюлоза, фосфорил-
целлюлоза (см. [124], стр. 39, 43, 45, 47).
** Сефадекс ДЭАЭ, «АВ. Pharmacia» (Упсала, Швеция). <
*** Сефадекс состоит из молекул декстрана, образующих сетчатую структуру,
в сухом состоянии он представляет собой тонкий порошок, сильно набухающий в воде
и образующий при этом полупрозрачный гель, которым заполняют хроматографиче-
скую колонку, подобно тому, как это делают в случае окиси алюминия. Полярные свой-
ства следует отнести почти исключительно на счет содержания гидроксильных групп.
Увеличение степени сетчатости приводит к уменьшению пористости трехмерной решетки,
в результате чего поглотительная способность зависит от размера молекул. Молекулы
меньших размеров поглощаются в большей степени и поэтому при фильтрации через
гель движутся медленнее больших молекул.
410
Специальная часть
Таблица 106
Величина hRf а пар изомерных дипептидов на силикагеле Г
в двух растворителях 6 [140]
Дипептидная пара I II
Н-Ала-Гли-ОН/Н-Гли-Ала-ОН ..... 15—16 15—14
Н-Гли-Опро-ОН/Н-Опро-Гли-ОН . . . 8/13 12—13
Н-Гли-Лей-ОН/НЛей-ГлиОН ..... 37—35 27/33
Н-Ала-Лей-ОН/Н-Лей-Ала-ОН 45/37 30—31
Н-Гли-Фен-ОН/Н-Фен-Гли-ОН 36—38 32/37
Н-Гли-Про-ОН/Н-Про-Гли-ОН 8—9 8—7
Н-Гли-Сер-ОН/Н-Сер-Гли-ОН 12—14 12—14
Н-Фен-Ала-ОН/Н-Ала-Фен-ОН 48—45 42—40
Н-Гли-Вал-ОН/Н-Вал-Гли-ОН ..... 32/27 22—24
I — н-бутанол — ледяная уксусная кислота — вода (80 + 20 4- 20),
II — н-пропанол — вода (70 + 30).
а Величины hRf, связанные тире, можно отличить в параллельных
опытах, однако это различие не позволяет (без использования проточ-
ного варианта) добиться разделения.
б В качестве растворителя пригодны также смеси этанол — 34%-ный
аммиак (70 + 30) и н-пропанол — 34%-ный аммиак (70 + 30). Согласно
нашим опытам на 100 пептидах, их поведение при хроматографическом
анализе до нонапептидов безупречно.
жащей 5—10% воды. Были получены величины Rt между 0,3 и 0,9; обна-
ружение проводили, используя хлор-иодную реакцию. Величины Rf воспро-
изводятся не очень хорошо, но этот метод успешно применяют для испыта-
ния на чистоту. В качестве растворителей Шелинберг [144] рекомендует смеси
хлороформ — ацетон (90 + 10) и (80 + 20), циклогексан — уксусный эфир
(50 + 50) и хлороформ — метанол (90 + 10).
Согласно Воглеру [145], возможности разделения подобных комплекс-
ных пептидов ограниченны. Для выяснения строения полимиксина Bt Вог-
лер и сотрудники [146] синтезировали четыре изомерных циклодекапептида,
предложенных Гаусманном [147], а также Бизерте и Дотрево [148] в каче-
стве возможных структур для природного продукта. Эти циклические изо-
мерные олигопептиды, сокращенно обозначенные как 8у, 8а, 1у и 7а, частич-
но различающиеся видом связи боковой цепи и числом аминокислот в цикле,
могут быть подробно исследованы методом ХТС [145].
Восходящий метод. Следующие растворители в области величин Ry 0,5—0,9 не обна-
руживают различия между 7у, 7а и полимиксином Bj:
и-бутанол — пиридин — ледяная уксусная кислота — вода
30 20 6 24
15 5 8 12
15 3 10 12
30 3 23 24
и-бутанол — пиридин — ледяная уксусная кислота — вода — этилацетат
5 12 2 2
н-бутанол — ледяная уксусная кислота — вода (верхняя фаза)
4 1 5
изопропанол — пиридин — ледяная уксусная кислота — вода
/ 10 5 4 4
4 8 1 1
этанол — пиридин — ледяная уксусная кислота — вода — этилацетат
5 1 2 2 2
Таблица 107
ХТС пептидов и пептидов с защитными группами на силикагеле Г [141]
Ry X 100
I II
Н-Про-ОН 10 и
Z-Про-ОН 39 81
Н -Про • OC4H9-mpem 81 34
Z-Про • OC4H9-mpem 86 87
Z-Вал-Лиз (ВОС)-ОН 57 87
Z-Вал-Лиз-ОН 26 49
Z-Вал-Тир-ОСНз 86 82
Z-Вал-Тир-ОН 48 78
Z-Вал • Тир-Про-OC4H9-mpem 84 81
Z-Вал-Тир-Про-ОН 45 75
Z-Вал- Тир-Про- OC4Hg-mpem 73 58
Н-Вал-Тир-Про-ОН 30 46
Н-Вал-Тир-Вал-Гис-Про-Фен-ОСНз 76 22
Н-Вал-Тир-Вал-Гис-Про-Фен-ОН 47 18
И- Вал -Тир -Вал -Гис -Про Фен -ОН 51 24
Н-Асп-Apr-Вал-Тир-Вал-Гис-Про-Фен-ОН (гипертенсин II) . . 21 3
Н • Асп • Apr- Вал • Тир • Вал • Гис- Про • Фен - ОН 26 5
И • Acn(NH2) • Apr - Вал • Тир • Вал • Гис- Про • Фен • ОН 20 2
Н • Acn(NH2) • Apr • Вал • Тир • Вал • Гис • Про • Фен • NH2 19 3
И • Acn(NH2) • Apr - Вал • Тир • Вал • Гис • Про • Фен • ОСН3 21 5
•с-[Вал • Орн- Лей • Фен - Про • Фен Фен • Acn(NH2) Глу(Г4Н2) • Тир] (ти- роцидин А) 32 40
-(Вал-Орн-Лей-Фен-Про)2 (грамицидин) 45 36
-(Вал-Лиз-Лей-Фен-Про )2-Лиз (грамицидин) 38 31
Н-Арг-Про-Про-Гли-Фен-Сер-Про-Фен-Арг-ОН (брадикинин) 12 1
г-Глу(ОС4Н9-трет)-Гис-Фен-Apr(NO2)- Три-Гли- ОН 53 53
Z • Глу • Гис- Фен • Apr(NO2) • Три • Г ли • ОН 24 42
-ВОС-Сер-Тир -Сер-Мет-Глу(ОС4Н9-трет) - Гис - Фен - Apr • Три-Гли • • ОН 38 28
Н • Сер • Тир • Сер • Мет • Глу • Гис • Фен • Apr • Три • Гли • ОН 18
Н • Лиз(ВОС) • Про • Вал • Гли • Лиз(ВОС) • Лиз(ВОС) • Apr • Apr • Про • Вал • Лиз(ВОС) • Вал • Тир • Про • ОС4Н9-трет 32 22
Z • Глу(ОС4Н8-трет) • Гис • Фен • Apr(NO2) • Три • Гли • Лиз(ВОС) • Про • • Вал • Г ли • Лиз(ВОС) • Лиз(ВОС) • Apr • Apr • Про -Вал-Лиз(ВОС)- •Вал-Тир-Про-ОС4Н9-трет 39 43
:Z-Вал-Три-Вал-Гис-Про - Фен-ОСН3 77 а 816
Н-Вал-Тир-Вал-Гис-Про-Фен-ОСНз 59 а 66 6
I — втор-бутанол — 3%-ный аммиак (100 + 44), II — н-бутанол — ледяная уксусная кислота —
>вода (100 + 10 -(-около 30) : верхняя фаза.
а Диоксан — вода (90 + 10).
б Метанол.
в Вода, метанол, ацетон, диоксан и диметилформамид в чистом виде и в смеси оказались ма-
лопригодными для свободных пептидов и защищенных высших пептидов; образуются размытые
пятна и хвосты.
412
Специальная часть
Горизонтальный метод, проточный вариант. Проточная хроматограмма [ 13] в смеси
и-бутанол — пиридин — ледяная уксусная кислота — вода (30 + 20 + 6 + 24) с мак-
симальным временем 8—10 час (пятна на верхнем конце пластинки) не обнаруживает
значительного различия в величинах Rf. Смесь этилацетат — пиридин — ледяная уксус-
ная кислота — вода (50 + 10 + 10 + 10) перемещает эти три вещества за 14 час на
20 мм и дает отчетливые круглые пятна на одной высоте.
Для обнаружения пептидов целесообразно использовать методы, прове-
ренные в области хроматографии на бумаге. Часто применяемый реактив
нингидрина не всегда достаточно чувствителен, особенно для высших пеп-
тидов; в особенности он непригоден в случае циклических пептидов, посколь-
ку они содержат в боковой цепи свободные амино-группы. Гораздо болен
широко применимым и более чувствительным (минимально определяемой
количество 0,1 (гг) является N-галогенирование по методу Райнделя и Гоппе
[73] со следующими изменениями прописи [149, 81:
В фотографическую ванночку соответствующего размера вносят приблизительно’
равные объемы (по 20—50 .мл) 1,5%-ного раствора КМпО4 и 10%-ного раствора НС1.
и после перемешивания вставляют сетку из стеклянных палочек (высота ножек 2—3 см).
Пластинку с анализируемым веществом кладут на сетку. Ванночку покрывают большим
стеклом и оставляют на 15—20 мин. Затем перед опрыскиванием пластинку 2—3 мин
обдувают воздухом (запах хлора должен исчезнуть!). Реактив для опрыскивания № 32
нужно применять очень осторожно, так как это повышает чувствительность. Плохо
разделенные вещества в этом методе можно по крайней мере в первый момент обнаружить
в виде дискретных пятен. Применяемая в хроматографии на бумаге промывка 2%-ной
уксусной кислотой в этом случае не нужна. Если в распоряжении имеется баллон с хло-
ром, то проще заполнить хлором лотковую камеру и оставить обрабатываемую пластинку
на 5—10 мин в атмосфере хлора.
Можно также провести галогенирование иодом и локализовать пептиды
опрыскиванием раствором крахмала (реактив для опрыскивания № 72).
Особенно предпочтительна комбинация нингидриновой методики и хло-
рирования. Вначале проводят опрыскивание нингидрином, отмечают пятна,
а затем обрабатывают хлором, как указано выше; предварительная обработка
нингидрином не оказывает влияния на результаты. Вещества, обнаруживаю-
щиеся только при галогенировании, таким образом, можно легко отделить
от соединений, дающих положительную реакцию с нингидрином.
Шелленберг [144] использует вариант известной флуоресцентной пробы
с морином. Чувствительность относительно мала (минимально обнаруживае-
мое количество 2 ц.г). Флуоресцентный метод Зангера и Туппи [95] в отсут-
ствие целлюлозы кажется нам несколько неточным. В противоположность
хроматографии на бумаге здесь можно использовать также методы, основан-
ные на разложении органических веществ с обугливанием (реактивы для
опрыскивания № 34, 134).
Для элюирования веществ слой в соответствующих местах соскабливают,
отмучивают и фильтруют [150]. При этом в случае силикагеля Г воду при-
менять нельзя, поскольку гипс растворяется в ней и мешает дальнейшей об-
работке. До настоящего времени в качестве элюента использовали н-бутанол
и ледяную уксусную кислоту.
V. М-(2,4-ДИНИТРОФЕНИЛ)-АМИНОКИСЛОТЫ
И 3-ФЕНИЛ-2-ТИОГИДАНТОИНЫ
Динитрофенил аминокислоты (ДНФ-аминокислоты) и фенилтиогидантоины
(ФТГ-аминокислоты) образуются при действии динитрофторбензола [151 —
154] или фенилгорчичного масла [155] на протеины или пептиды; продукты
конденсации разделяют соответствующим методом. Их выделение из реак-
ционной смеси, и в особенности их идентификация, имеет большое практиче-
ское значение, так как указанная последовательность реакций делает воз-
Гл. 19. Аминокислоты и производные
413
можным систематический анализ пептидов. Этой проблемой занимались
многие авторы *.
Замещение амино- или карбоксильной группы или одновременно той
и другой превращает аминокислоты в кислоты, основания или нейтральные
вещества. При этом теряются амфотерные свойства. В зависимости от при-
роды заместителя производные остаются в той или иной мере полярными.
Это необходимо учитывать при выборе растворителя. Продукты замещения,
имеющие одну свободную карбоксильную и одну свободную амино-группу,
например моноацилпроизводные основных аминокислот, монозфиры кислых
аминокислот или эфиры оксиаминокислот, в хроматографии ведут себя
подобно свободным аминокислотам.
А. ДИНИТРОФЕНИЛАМИНОКИСЛОТЫ
Упомянутые выше методы получения динитрофенил аминокислот
(ДНФ-аминокислот) иллюстрируются схемой реакций, приведенной ниже.
Вместо протеинов или пептидов можно обрабатывать динитрофторбен-
золом (ДНФБ) свободные аминокислоты. Такая методика особенно пригодна
в случае, когда смесь аминокислот нельзя подвергнуть непосредственному
хроматографическому анализу из-за наличия примесей; ДНФ-аминокислоты
часто легче перевести в хроматографически разделяемую форму, чем сво-
бодные аминокислоты. Кроме того, собственная окраска этих производных
облегчает количественный анализ, поскольку отпадают все трудности,
связанные с последующим окрашиванием.
ДНФ-аминокислоты чувствительны к свету. Их следует хранить в тем-
ноте, подвергая только кратковременному непрямому освещению.
Схема определения концевых групп по Зангеру.
N02
O2N —F + NH2CHR'CO(NHCHRCO)xNHCHRCOOH
ттттгпп Пептид из (х+2) аминокислот
1. Основание
2. Кислота
/NO2
O2N —/___NHCHR'COCNHCHRCO^NHCHRCOOH-I-HF
ДНФ-пептид
Гидролиз
/N02
O2N—NHCHR'COOH + (a:+l)+NH3CHRCOO-
ДНФ-аминокислота аминокислоты
1. ДИНИТРОФЕНИЛИРОВАНИЕ
Различные методы динитрофенилирования отличаются условиями прове-
дения реакции и аппаратурным оформлением. Прекрасный обзор опубли-
кован Бизерте и сотрудниками [156]. Ниже мы приводим краткий обзор.
* Литературный обзор [8]; очень хороший обзор опубликован также Бизерте
и др. [156].
414
Специальная часть
а) Аминокислоты
а) Получение ДНФ-аминокислот *. По Леви и Чангу [157], к раствору 5 ммолей-
аминокислоты и 1 г безводного Na2CO3 в 20 мл воды добавляют 5 ммолей раствора 2,4-
динитрофторбензола (ДНФБ) в виде 10%-ного раствора в ацетоне (для аминокислот
с двумя реакционными группами необходимо двойное количество ДНФБ, для гистидина —
2,5-кратное). Суспензию интенсивно встряхивают 30—90 мин при 40° в темноте, капли
ДНФБ исчезают медленно. Избыток ДНФБ извлекают эфиром, водный раствор осто-
рожно подкисляют 1—2 каплями концентрированной соляной кислоты и образовавшуюся
в виде масла или кристаллов ДНФ-аминокислоту отделяют экстракцией эфиром или
фильтрованием. Чаще всего производные, полученные в виде масла, кристаллизуют
выпариванием эфирного раствора (особые трудности вызывает ДНФ-глутаминовая кис-
лота). Для перекристаллизации осадок растворяют в бензоле, содержащем небольшое
количество этанола, и к горячему раствору добавляют петролейный эфир. Сильно поляр-
ные ДНФ-аминокислоты перекристаллизовывают из водного раствора метанола, нерас-
творимые в эфире ДНФ-аминокислоты переосаждают из разбавленной соляной кислоты
нейтрализацией (например, пиридином).
Для получения ДНФ-цистеиновой кислоты и различных монопроизводных цистеина,
цистина, гистидина, лизина, орнитина и тирозина отсылаем читателя к упомянутому
обзору Бизерте [156]; растворимость в воде создает особые трудности.
Температуры плавления приведены в работах Портера и Зангера [154], Леви
и Чанга [157] и Виньо [158].
Р) Количественное динитрофенилирование смеси аминокислот (например, продуктов
гидролиза протеина). По Валленфелсу [159],.- сухой остаток после гидролиза 2—5 мг-
окисленного надмуравьиной кислотой воздушносухого протеина растворяют при ком-
натной температуре и сильном перемешивании (магнитной мешалкой) в 2 мл воды, не
содержащей СО2. Пипеткой переносят аликвотную часть (1,2 мл) в небольшой сосуд,
с магнитной мешалкой, разбавляют 1,8 мл воды, свободной от СО2, добавляют 0,1 мл
3,1 н. КС1 и нагревают при 40° Д; 0,1 (термостат). При сильном перемешивании уста-
навливают pH 8,90 добавлением 0,2 н. NaOH с помощью автотитратора. В темноте вно-
сят 0,1 мл (что соответствует небольшому избытку) 2,4-динитрофторбензола и с помощью-
автотитратора поддерживают pH 8,90 в течение 100 мин. Самописец титратора реги-
стрирует расход щелочи во времени: реакция заканчивается уже через 50 мин, вторая
половина опыта служит для установления скорости гидролиза динитрофторбензола (обра-
зование динитрофенола). После окончания реакции избыточный 2,4-динитрофторбензол
удаляют экстракцией эфиром, очищенным от перекисей, двумя порциями по 5 мл [160,.
161]. Реакционную смесь подкисляют 0,5 мл соляной кислоты (1 ч. НС1 й|° = 1,19 +
+ 1 ч. Н20) и эфирный раствор ДНФ-аминокислот 5 раз экстрагируют свободным от пере-
кисей эфиром порциями по 4 мл; экстракты объединяют и эфиром доводят объем точно-
до 25 мл. Отбирают 1 мл для хроматографического анализа, упаривают пробу и количе-
ственно наносят капиллярной пипеткой.
Водная фаза содержит растворимые в кислоте ДНФ-аминокислоты. После удаления
вакуумированием растворенного в водной фазе эфира объем доводят точно до 10 мл водой,,
не содержащей СО2. Для хроматографии Отбирают 0,5 мл, выпаривают в вакууме досуха,,
остаток растворяют в ацетоне с небольшим количеством соляной кислоты (2 мл 6 н. соля-
ной кислоты доводят ацетоном до 25 мл) и пробу количественно переносят на пластинку.
б) Пептиды
а) Динитрофенилирование по Локхартуи Абрахаму **. Растворяют 50—150 р,г пеп-
тида в 0,1 мл 1,5%-ного водного раствора карбоната триметиламмония (pH 9,3), добав-
ляют 0,2 мл 5%-ного спиртового раствора динитрофторбензола, оставляют стоять в тем-
ноте на 2,4 час, затем в вакууме отгоняют этанол, второй раз добавляют 0,24 мл раствора
карбоната триметиламмония и 1 мл эфира, перемешивают вибраторной мешалкой, цен-
трифугированием разделяют фазы, отделяют эфир и водный раствор выпаривают в вакуу-
ме досуха.
Р) Полный гидролиз ДНФ-пептида. К полученному по прописи а) остатку добав-
ляют 0,1 мл 6 н. соляной кислоты, запаивают в атмосфере азота, нагревают в течение
9 час при 105° и гидролизат разбавляют двумя объемами воды. Растворимые в эфире
ДНФ-аминокислоты извлекают трехкратным взбалтыванием с равными объемами эфира
или этилацетата (ди-ДНФ-гистидин).
в) Полипептиды и протеины
а) Динитрофенилирование. Леви и Ли [163] растворяют не менее 0,2 и.моля веще-
ства при 40° в 3 мл 0,05 н. водного раствора КС1, 0,05 н. раствором КОН с помощью
* Набор аминокислот можно приобрести у фирмы «Mann Research Laboratories»,-
Inc. (Нью-Йорк).
** Микрометод [162].
Гл. 19. Аминокислоты и производные
415
автотитратора устанавливают pH 8, добавляют около 0,1 мл динитрофторбензола и интен-
сивно перемешивают в темноте, причем pH и температура поддерживаются постоянными.
Реакция заканчивается в момент прекращения расхода щелочи. Раствор трижды экстра-
гируют эфиром и после этого подкисляют для выделения динитрофенилпроизводных.
Осадок отделяют центрифугированием, промывают водой, ацетоном, эфиром и высуши-
вают над Р2О5.
Р) Частичный гидролиз ДНФ-протеина. Частичный гидролиз ДНФ-протеина можно
осуществить обычным способом, используя соляную кислоту или ферменты, причем
гидролиз протекает значительно медленнее, чем в случае природных веществ. Гидролиз
позволяет получить ряд важных аналитических данных. При электрофоретической или
хроматографической очистке продуктов гидролиза уже по их собственной окраске обна-
руживаются интересные концевые N-группы, благодаря чему, применяя двумерную
хроматографию, их можно легко и точно элюировать. Разумеется, и не концевые пеп-
тидные осколки, содержащие, например, лизин, окрашиваются в желтый цвет за счет
своего s-ДНФ-остатка. В то время как отделение ДНФ-пептидов от свободных пептидов
и аминокислот можно осуществить без труда (подкисленный соляной кислотой тальк
адсорбирует только ДНФ-соединения [см. пункт 6)]), экстракция N-концевых а-ДНФ-
пептидов из кислого раствора органическими растворителями не обеспечивает достаточ-
ного отделения от не концевых ДНФ-пептидов, которые благодаря наличию у них сво-
бодных NH2-rpynn должны оставаться в водной фазе [164].
у) Полный гидролиз ДНФ-протеина. Для качественного определения концевых
групп ДНФ-протеин гидролизуют со стократным количеством 5,7 н. соляной кислоты
(дважды перегнанной) в течение 16 час при 105°. При этом ДНФ-глицин [165, 166]
и ДНФ-пролин — особенно в присутствии триптофана [168] — частично разрушаются.
Ди-ДНФ-тирозин теряет частично О-ДНФ-группу [166]; присутствующий ДНФ-цис-
тин предварительно окисляют надмуравьиной кислотой [44].
6) Выделение ДФН-аминокислот из продуктов полного гидролиза. Гидролизат раз-
бавляют так, чтобы он стал ~1 н. по соляной кислоте. 5 раз экстрагируют свободным
от перекисей эфиром [160, 161] и в присутствии гистидина 5 раз этилацетатом; экстракты
трижды промывают 0,1 н. соляной кислотой. Затем объединяют, с одной стороны, все
экстракты (фракция А: растворимые в эфире ДНФ-аминокислоты и динитрофенол) и, с дру-
гой стороны, водную фазу с промывными водами (фракция Б: свободные аминокислоты
и растворимые в кислоте динитрофенилпроивводные, такие, как ДНФ-аргинин, ДНФ-
цистеиновая кислота, моно-ДНФ-производные цистеина, цистина, гистидина, лизина,
орнитина и тирозина; если экстракцию проводили только эфиром, то в этой фракции
можно обнаружить также часть ди-ДНФ-гистидина).
Фракция А. Если в смеси много динитрофенола, то рекомендуется его удалить. Это
осуществляют двумя способами.
Возгонка. Большую часть динитрофенола отгоняют в глубоком вакууме при 70—80°
в специальном приборе, описанном Миллсом [169]. При этом может улететь немного
ДНФ-метионина и, по нашим наблюдениям, также ди-ДНФ-цистина. В зависимости от
необходимости возгонку прекращают, вещество растворяют в небольшом количестве
ацетона и выпариванием снова наносят на стенки сосуда в виде тонкой пленки.
Адсорбция (ионный обмен) [170]. Несколько микромолей ДНФ-аминокислоты
растворяют в 0,5 мл метанола и вносят в колонку (1 X 10 см) с анионотропной окисью
алюминия *. Пропускают еще 0,5 мл метанола и количественно вымывают динитрофенол
2%-ной уксусной кислотой. После этого ДНФ-аминокислоты элюируют сначала неболь-
шим количеством 0,1 н. NaOH (во избежание выделения СО2 и разрушения в колон-
ке), а затем 1%-ным раствором NaHCO3. После осторожного подкисления элюата соля-
ной кислотой ДНФ-аминокислоты опять экстрагируют эфиром. Экстракт выпаривают,
а сухой остаток после удаления динитрофенола растворяют в ацетоне (приблизительно
10 рмолей протеина в 1 .n.i). После этого возможно непосредственное хроматографиро-
вание (наносить следует около 1 р.л).
Фракция Б. Несмотря на присутствие свободных аминокислот, растворимые в кис-
лоте аминокислоты часто можно непосредственно идентифицировать хроматографически.
Для этого пробу несколько раз выпаривают досуха с добавлением воды и растворяют
в 0,5 н. соляной кислоте или в ледяной уксусной кислоте (приблизительно 10 рмолей
протеина в 1 мл, наносимое количество вещества ** около 1 р.л).
Для отделения свободных аминокислот остаток после выпаривания (см. выше) можно
растворить в 2 мл 1 н. соляной кислоты и этот раствор пропустить через колонку (диа-
метр 2,5 см), заполненную смесью 20 г геля гифло-супер и 50 г талька (предварительно
обработанных 0,01 н. и 1 н. соляной кислотой) [171]. В противоположность свободным
аминокислотам все ДНФ-аминокислоты, кроме ДНФ-цистеиновой кислоты, адсорби-
* Окись алюминия встряхивают 10 мин с избытком 1 н. НС1 и отмывают водой от
кислоты способом декантации.
** Перед хроматографическим анализом кислый растворитель должен быть полностью
удален с пластинки.
416
С пециалъная часть
руются. Колонку промывают 100 мл 1 н. соляной кислоты и сразу же элюируют ДНФ-
аминокислоты солянокислым спиртом (спирт — 1 н. соляная кислота, 40 + 10) или
лучше аммиачным спиртом (спирт — 0,3%-ный аммиак, 40 + 10); элюат выпаривают
досуха и для хроматографического анализа обрабатывают, как указано выше.
2. РАСТВОРИТЕЛЬ И ЭФФЕКТ РАЗДЕЛЕНИЯ
Для разделения методом ХТС свободных аминокислот можно непосред-
ственно воспользоваться растворителями, известными из хроматографии
на бумаге, тогда как для разделения ДНФ-аминокислот они оказались либо
совсем непригодными, либо применимыми весьма ограниченно. Определение
ДНФ-аминокислот методом хроматографии на бумаге является весьма слож-
ным процессом, поскольку наблюдается образование хвостов и величины
Rf сильно зависят от нанесенного количества вещества и присутствия дру-
гих ДНФ-аминокислот. Хорошим растворителем в хроматографии на бумаге
оказалась «толуольная» система по Бизерте и Осте [45], н-бутиловый спирт —
0,1%-ный аммиак по Браунитцеру [172] и 1,5 М фосфатный буфер по Леви
[173].
В методе ХТС «толуольная» система наряду с образованием тонкой
«бороды» * обнаруживает весьма незначительное элюирующее действие:
величина Rf для ДНФ-лейцина равна 0,25. Если слой дезактивируют, выдер-
живая пластинку перед нанесением пробы не менее 12 час в парах воды, то
величина Rf ДНФ-лейцина увеличивается до 0,66 и на двумерной хромато-
грамме достигают хорошего разделения, несмотря на отмеченное образо-
вание «бороды». Растворитель Браунитцера [172] приводит к образованию
длинных пятен, а фосфатный буфер [173] совсем непригоден для метода ХТС.
Размытые пятна и значительная диффузия делают разделение невозможным.
Забуферивание слоя бесполезно, а добавление небольших количеств ледяной
уксусной кислоты в этом случае помогает мало. Кроме усовершенствованной
«толуол»-системы, исследовали и другие, перечисленные в разделах а) и б)
растворители. При приготовлении систем следует применять растворители
определенного качества.
Качество некоторых компонентов растворителей
Аммиак 0,8 н. Аммиак 34%-ный mnem-Амиловый спирт 25%-ный аммиак фирмы «Merck», разбавленный дис- тиллированной водой Имеющийся в продаже Фракция 100,5—102°, отогнанная из mpem-амилового спирта фирмы «Fluka» на короткой колонке 2-Хлорэтанол чда Трижды экстрагируют концентрированной H2SO4 (0,1 ч. объема), промывают водой, 2 н. раствором соды, водой; сушат над СаС12 и перегоняют на короткой колонке Обрабатывают насыщенным раствором бисульфита, промывают 2 н. раствором соды, сушат над сульфатом натрия, перегоняют в вакууме в атмосфере азота на короткой колонке (примесь бензальдегида довольно сильно изменяет величину Rf) и-Бутанол для хроматографии Дважды перегоняют на короткой колонке или Про- пускают через колонку с А12О3 [202] непосредственно перед употреблением (при стоянии в хлороформе, очи- щенном от спирта, быстро образуется фосген) Продажные реактивы, перегнанные на короткой колонке 24 час кипятят над окисью бария и перегоняют на короткой колонке Обрабатывают так же, как и бензол
Этиленхлоргидрин Бензол Бензиловый спирт н-Бутанол Хлороформ Ледяная уксусная Метанол и-Пропанол Пиридин Тулуол кислота |
См. [2], стр. 147.
Гл. 19. Аминокислоты и производные
417
а) Растворитель для растворимых в кислоте и воде ДНФ-аминокислот,
не экстрагируемых эфиром
н-Пропиловый спирт — 34%-ный аммиак (70 + 30). В этой системе
ДНФ-аргинин, ДНФ-цистеиновая кислота, моно-ДНФ-цистин, а-ДНФ-гисти-
дин, ди-ДНФ-гистидин*, е-ДНФ-лизин и О-ДНФ-тирозин можно идентифи-
цировать методом восходящей хроматографии отдельно или, как это часто
Рис. 164. Разделение модельной смеси водорастворимых ДНФ-аминокислот из мочи
восходящим методом [175].
УФ-фотокопия (см. стр. 425); Пробы по 0,5 це; растворитель н-бутанол — 34%-ный аммиак
(80 + 20); сокращенные названия аминокислот см. в табл. 103, тау—таурин, цит — цитруллин.
случаетсЯ/на практике, в смеси друг с другом. Время анализа около 2 час.
Табл. 108 дает представление о величинах Rf и распознавании пятен. Хотя
Таблица 108
Идентификация растворимых в кислоте и воде ДНФ-аминокислот
восходящим методом ХТС в системе и-пропанол—34%-ный аммиак (70+30)
Длина пути 10 см, проба 0,5—1 рг
Ry X 100 a Окраска Погло- щение в УФ-свете (360 лцх) Окраска с нингидрином
Моно-ДНФ-Цис .... 29 Желтая + Коричневая
ДНФ-Цис SO3H . . . 29 » + Желтая
а-ДНФ-Арг ...... 43 » + »
е-ДНФ-Лиз 44 » + Коричневая
О-ДНФ-Тир 49 Бесцветный + б Фиолетовая
а-ДНФ-Гис 57 Желтая + Желтая
Ди-ДНФ-Гис 65 » + »
а Данные величины являются среднеарифметическими из 6 измерений,
б См. разд. «Документация», стр. 425.
* ДНФ-гистидин также принадлежит к группе растворимых в кислотах произ-
водных. По Цану и Пфанмюллеру [174], его нельзя обнаружить в гидролизатах соответ-
ствующих ДНФ-пептидов вследствие неустойчивости. Поэтому мы ограничили наше
исследование а-ДНФ- и ди-ДНФ-гистидином.
27 Заказ № 734
418
Специальная часть
ДНФ-аргинин и е-ДНФ-лизин разделяются не полностью, удается обна-
ружить оба соединения, используя различное поведение при реакции с нин-
гидрином. ДНФ-цистеиновая кислота и моно-ДНФ-цистин никогда не встре-
чаются вместе. Важно удалить избыточную кислоту после нанесения рас-
твора, для чего пластинку следует нагреть в токе воздуха в течение 10 мин
при температуре около 60°. Затем ее 15 мин охлаждают.
н-Бутанол — 3^%-ный аммиак (80 + 20). ДНФ-аргинин, ДНФ-цит-
руллин, ДНФ-цистеиновая кислота, ди-ДНФ-гистидин и ДНФ-таурин полу-
чают в качестве водорастворимых ДНФ-производных при динитрофенили-
ровании аминокислот мочи в присутствии избытка динитрофторбензола.
На рис.| 164 показано разделение модельной смеси.
б) Растворитель для нерастворимых в кислоте ДНФ-аминокислот,
экстрагируемых эфиром
Поскольку ДНФ-аминокислоты как карбоновые кислоты склонны в орга-
нических растворителях к ассоциации, то, как правило, в растворитель сле-
дует добавить небольшое количество ледяной уксусной кислоты, подавляю-
щей ассоциацию и этим устраняющей основную причину образования хвоста.
Следует отметить, что «эффект уксусной кислоты» наблюдается в растворите-
лях, содержащих большое количество пиридина и поэтому рассматриваемых
как основные. Наряду с этим ледяная уксусная кислота повышает «элюи-
рующую силу». Однако благоприятное действие ледяной уксусной кислоты
при анализе методом ХТС (силикагель Г) эфирорастворимых ДНФ-амино-
кислот наблюдается только в области концентраций от 0,5 до 5 об. %.
Более высокие концентрации действуют так же, как и большое содержание
воды, т. е. ухудшают разделительные свойства растворителя.
а) РАСТВОРИТЕЛИЗДЛЯЗОБЩЕГО РАЗДЕЛЕНИЯ
1. Толуол — пиридин —этиленхлоргидрин — 0,8 н. аммиак (100 +J30 +
+ 60 + 60) («толуол»-система [45]). Верхняя фаза служит для хромато-
графического анализа, нижняя — для предварительной обработки слоя
(см. стр. 422). Эта система дает пятна с длинной «бородой» *, что, естествен-
но, связано с известными потерями вещества. Благодаря прекрасным разде-
лительным свойствам этой системы мы используем ее в первом направлении
при двумерной хроматографии. Мы считаем пока эту систему незаменимой
и миримся с необходимостью предварительной обработки пластинок. Эта
система обеспечивает, например, отделение ДНФ-фенилаланина от ДНФ-ме-
тионина, ДНФ-норлейцина от ДНФ-валина, ДНФ-^-аланина от ДНФ-лей-
цина, ДНФ-а-амино-м-масляной кислоты от ДНФ-пролина, ДНФ-аланина
от ДНФ-саркозина; кроме того, отделение группы ,ди-ДНФ-аминокислот
(кроме ди-ДНФ-цистина) от низших ДНФ-аминокислот и ДНФ-производ-
ных низших аминокислот от ДНФ-производных кислых аминокислот, при-
чем последние остаются в точке старта.
2. Хлороформ — бензиловый спирт — ледяная уксусная кислота (70 +
+ 30 + 3). Этот растворитель дает симметричные пятна и позволяет отделять
2,4-динитрофенол** и 2,4-динитроанилин** от всех ДНФ-аминокислот.
3. Хлороформ — трет-амиловый спирт — ледяная уксусная кислота
(70 + 30 + 3). Этот растворитель позволяет добиться такого же разделения,
как и в случае растворителя № 2.
* Относительно этого термина см. [2], стр. 147.
** 2,4-Динитрофенол и 2,4-динитроанилин являются побочными продуктами при
интезе и кислом гидролизе ДНФ-пептидов.
Таблица 109
Величины Rfa X 100 эфирорастворимых ДНФ-аминокислот 6 в растворителях № 1—5
в случае одномерной восходящей или горизонтальной [13] хроматографии
Проба 0,5—1 рг
1 в 2 3 4 г 5 г
Вос- Восходящая Восходящая Вис- Горизон- тальная Вос- Горизон- тальная
ходя- щая кос- вен- кос- вен- ходя- щая кос- вен- ходя- щая кос- вен-
ная д ная д ная ная
Длина пути, см 15 10 10 10 10 15 ДНФ-Лей, 10 15 ДНФ-Лей, 10
ДНФ-а-АяМ 46 72 44 73 42 52 52 55 79 85 75
ДНФ-а-АКИ 79 92 66 83 57 105 108 109 108 101 106
ДНФ-Ала 34 54 35 60 34 32 33 38 59 66 58
ДНФ-Р-Ала 27 71 57 73 50 89 98 100 99 95 102
ДНФ-Асп 2 13 8 9 13 6 5 11 7 6 6
ДНФ-Глу 1 26 17 31 21 12 12 23 12 12 14
ДНФ-Гли 27 32 22 40 23 17 18 22 31 38 31
ДНФ-Илей 64 83 63 81 57 107 107 107 100 101 104
ДНФ-Лей 66 82 62 80 54 • 100 100 100 100 100 100-
ДНФ-Нлей 69 82 60 80 52 86 90 88 101 100 98
ДНФ-Мет 55 70 39 69 38 43 43 47 72 81 74
ДНФ-Мет О2 17 4 3 3 2 10 10 7
ДНФ-Фея 67 75 46 74 41 44 46 52 81 86 76
ДНФ-Про 29 65 41 67 38 58 59 62 78 84 75
ДНФ-Сар 23 56 35 57 32 34 35 41 59 65 60
ДНФ-Сер 15 И 10 И 10 9 10 14 7 8 7
ДНФ-Тре 20 17 13 15 12 12 14 20 9 11 И
ДНФ-Три 65 69 38 69 31 23 25 33 54 61 49
ДНФ-Вал 53 79 56 77 51 76 81 85 91 98 86
ДНФ-НВал 56 77 52 76 48 65 70 75 86 95 89
Ди-ДНФ-Цис — 3 2 1 1 00 00 2 00 2 2
Ди-ДНФ-Гис 53 11 9 8 4 5 4 8 12 16 14
Ди-ДНФ-Лиз 74 56 35 60 S0 12 13 19 66 73 65
Ди-ДНФ-Оря 70 34 23 40 20 6 6 10 39 46 39
Ди-ДНФ-Тир 76 58 35 60 30 17 16 19 57 65 57
2 4-ДНФ-ОН е 41 100 76 83 55 22 21 23 148 102 111
2,4-ДНФ-ГШ2 ж 90 90 84 72 63 115 128 129 131 101 115
а Данные величины являются среднеарифметическими из 6 измерений.
6 Сокращение названий аминокислот см. в табл. 103.
в См. замечание к использованию «толуол»-системы.
г Величины By отнесены к ДНФ-лейцину.
Д После «предварительной обработки» слоя хроматографированием в «толуол»-системе (№ 1)
и промежуточной сушки (см. текст).
е 2,4-ДНФ-ОН — 2,4-динитрофенол.
ж 2,4-ДНФ-МН2 — 2,4-динитроанилин.
27*
420
Специальная часть
ДНФ-валин и 2,4-динитрофенол движутся ближе к ДНФ-лейцину, зато
тцсш-амиловый спирт стабильнее и более летуч, чем бензиловый спирт.
4. Бензол — пиридин — ледяная уксусная кислота (80 + 20 + 2). При
проточной хроматографии [13] (см. стр. 31, 32) эта система в особенности
пригодна для разделения менее полярных ДНФ-аминокислот, например
изомерных производных лейцина. 2,4-Динитроанилин движется быстрее
других соединений (7?ДНФ-лейцин = 1,28).
5. Хлороформ — метанол — ледяная уксусная кислота (95 + 5 + 1).
,Ди-ДНФ-тирозин и ди-ДНФ-лизин, которые не разделяются приведенными
выше системами, можно отчетливо определить методом проточной хрома-
тографии [13] со смесью № 5.
В табл. 109 приведены ориентировочные величины Rf в названных раство-
рителях.
В табл. 110 сопоставлены времена анализа и указаны некоторые осо-
бенности, заслуживающие специального упоминания.
Таблица 110
Заслуживающие внимания эффекты разделения и времена анализа
при одномерной хроматографии в растворителях № 1—5
К» п/п Отделение ДНФ-аминокислот от Отделение ДНФ-производных от Отделение ди-ДНФ- производных от тирозина, лизина Время анализа
динитро- анилина динитро- фенола лейцина, изолей- цина, норлей- цина валина, норва- лина
1 + а 1 ^ас/15 см
2 + + — — — 1,5 час/10 см
3 д _ б — — — 1 час/15 см
4 е + в + + — 2—3 час
5е — г — + + 2—3 час
а 2,4-Динитрофенол лежит между ДНФ-валином и ДНФ-аланином.
6 2,4-Динитрофенол лежит около ДНФ-лейцина.
в 2,4-Динитрофенол лежит между ДНФ-аланином и ДНФ-глицином.
г 2,4-Динитрофенол и 2,4-динитроанилин лежат немного выше ДНФ-лейцина.
Д 2,4-Динитроанилин лежит между ДНФ-фенилаланином и ДНФ-метионином.
е Горизонтальная хроматография [13]; ДНФ-лейцин перемещается на 10 см за
2,5 час.
Разделительный эффект в двумерных опытах. Для надежной идентифи-
кации ДНФ-производных, принадлежащих к относительно большой группе
нерастворимых в кислоте и экстрагируемых эфиром ДНФ-аминокислот, как
правило, требуется двумерная хроматография. Для этого в первом напра-
влении мы применяем «толуол»-систему Бизерте и Остё [45] (система № 1),
а во втором направлении — системы № 2—5 на выбор. На рис. 165 пока-
зано разделение стандартной смеси по 2 рг ДНФ-аминокислот при комби-
нации растворителей № 1 и 2. Не делятся группа лейцина, "группа валина,
ди-ДНФ-лизин и ди-ДНФ-тирозин.
Для разделения последних применяют комбинацию растворителей № 1
и № 5 (рис. 166) или в некоторых случаях только растворитель № 5. Сочета-
ние № 1 с № 4 (рис. 167) позволяет разделить изомеры лейцинпроизводных
и изомеры валинпроизводных.
2
ди-Тир
ди -Лиз
NH.
1
ди-Тир
ди Орн • феч
ди-Гцс
Три f
Гл и
*Тре
у^Сер
ди-Цис
-ja-ЛКИ
£• Млей
V Илей
Ъдей
1 Нвал
" < вал
i.cc-АнМ ОН
1 Про
lfl-Ала
1
ди-Орм^
фа-АКИ
ди-Гис
Феи 9 °*
фТри Л™ Илей
Мет% 9Н°апл
9 Вал
ОН
Асп Глу
Старт
2
Ала
„ вГли
Мет иг w
Г'Тре
Сер
I ди-Нис
]Асп _
9 9 Про
2
Р и с. 165. Двумерная хроматограм-
ма стандартной смеси, содержащей
по 0,2 рг ДНФ-аминокислот [8].
УФ-фотокопия; размер оригинала 12 х
ХЮ ел. восходящий метод; «толуол»-си-
стема Ks 1 в направлении 1, хлороформ —
бензиловый спирт — уксусная кислота
(70 30 + 3) в направлении 2.
Обозначения; в случае моно-ДНФ-про-
изводных приводится только символ со-
ответствующей аминокислоты (см. табл.
103), ди —ди-ДНФ-производные, ОН —
2,4-динитрофенол, NH2 — 2,4-динитро-
анилин.
Старт
Рис. 166. Двумерная хроматограмма смеси,
содержащей но 1 рг ДНФ-аминокислот [8].
УФ-фотокопия. Экспозиция) более длительная, чем
на рис. 165, размер оригинала 13 X 13 см. «То-
луол»-система № 1 в направлении 1 (восходящий
метод) и хлороформ — метанол — уксусная кисло-
та (95 + 5-1-1) в направлении 2 (горизонталь-
но-проточный метод, 3 час [13]). Обозначения
см. на рис. 165.
ди-Тир
ди-Лиз ш
. V Феи нлей
V Три ф
ди-Орн f //щщф
Метф
0 фон ^а-АнМ
Af.rrir
а-ДКИф
♦ Вал
р-Ала^
Рис. 167. Двумерная хроматограмма смеси, содержащей по 1 рг ДНФ-аминокислот (8].
УФ-фотокопия, размер оригинала 15X14 см.
«Толуолл-система N 1 в направлении 1 (восходящий метод) и бензол — пиридин — уксусная ки-
слота (80 + 20 + 2) в направлении 2 (горизонтально-проточный метод [И]). Обозначения
см. на рис. 165.
422
Специальная часть
Характерные эталонные пятна слабо меняются при колебаниях величин
Rf. Поэтому неизвестную пробу можно подвергнуть хроматографическому'
разделению вместе со стандартной смесью, содержащей определяемые амино-
кислоты в таком количестве (0,2 рг), которое еще можно обнаружить при
двумерном разделении * (рис. 165). В большинстве случаев соединение
в .исследуемом растворе определяется сразу и безошибочно по интенсивности
соответствующего пятна. В табл. 109 наряду с полученными при одномерной
хроматографии величинами Rf приведены также величины, полученные при
разделении во втором направлении при предыдущем хроматографическом
разделении «толуол»-системой («косвенно» полученные величины Rf). Они
хорошо воспроизводятся, если соблюдать изложенные в следующем разделе
прописи для применения «толуол»-системы и промежуточного высушивания.
Замечание к применению «толуолъ-системы
Предварительная обработка тонких слоев («доведение до состояния равновесия»).
Разделительную камеру, оклеенную фильтровальной бумагой, заполняют нижней фазой
«толуолл-системы. На дно камеры помещают толстую стеклянную палочку, согнутую
в виде решетки. Две пластинки, покрытые слоем силикагеля Г, помещают на середину
решетки слоем наверх, причем каждая из них упирается верхним краем в стенку камеры.
Во избежание попадания растворителя с фильтровальной бумаги на слой последний
отделяют жирной чертой, проведенной карандашом параллельно верхнему краю. Остав-
ляют пластинки на 12 час. Силикагель поглощает при'этом много влаги, что определяют
не по внешнему виду, а благодаря тому, что нанесенные на пластинку вещества при такой
обработке перемещаются значительно быстрее.
Хроматографический анализ на пластинках, приготовленных таким образом, осно-
ван, вероятно, на разделении между двумя жидкими фазами. Каждый раз практически
уже через 45 мин пропадает действие предварительной обработки пластинок, оставлен-
ных на воздухе без защиты. Это следует учесть при использовании таких пластинок.
Нанесение проб. Если между предварительной обработкой и хроматографическим
разделением пластинку выдерживать на воздухе без защиты в течение различных перио-
дов времени и построить график зависимости логарифма величины Rf от логарифма вре-
мени, то оказывается, что уже приблизительно через 2 мин заметно линейное падение.
Поэтому предварительно обработанный слой после извлечения из камеры сразу покры-
вают стеклянной пластинкой, оставляя только кромку шириной 1,7 см от нижнего края.
Теперь сюда можно спокойно наносить пробу. Если для этого требуется не больше 5 мин,
то ошибка незначительна. Проба не должна превышать 1 рл, поскольку скорость испа-
рения растворов, нанесенных на предварительно обработанный влажный слой, меньше,
чем нанесенных на сухой. После нанесения покровную пластинку осторожно снимают
и немедленно проводят хроматографический анализ, используя 120 мл верхней фазы
«толуол»-системы (восходящая методика).
Промежуточное высушивание. На 10 мин пластинку помещают в тягу (хорошая
вентиляция), затем нагревают 10 мин в сушильном шкафу при 60° и охлаждают 15 мин
также в тяге. Затем можно сразу проводить хроматографический анализ во втором направ-
лении. Более длительное высушивание не рекомендуется, поскольку на воздухе про-
исходит частичное разложение ДНФ-аминокислот: окисление ДНФ-метионина может
привести к неправильному выводу о наличии ди-ДНФ-гистидина при последующем
хроматографическом анализе. Если после высушивания необходимо более длительное
хранение, то слой покрывают стеклянной пластинкой и хранят в темноте.
3) РАСТВОРИТЕЛЬ ДЛЯ СПЕЦИАЛЬНЫХ ЗАДАЧ РАЗДЕЛЕНИЯ
Для подбора растворителей со специальными свойствами полезны гра-
фики, приведенные на рис. 168—172.
3. ДОКУМЕНТАЦИЯ
Все исследованные здесь ДНФ-производные, за исключением О-ДНФ-ти-
розина, окрашены в желтый цвет. Количества 0,1 р.г (одномерная хромато-
грамма) или 0,5 р.г (двумерная хроматограмма) дают еще хорошо обнару-
* Раствор, содержащий по 1 мг ДНФ-аминокислот в 5 мл ацетона, хранится в холо-
дильнике не менее 4 недель. Для опыта отбирают 1 рл.
1,0 -
0,9 -
Рис. 168—170. ДНФ-аминокислоты, растворимые в эфире, 2,4-динитрофенол и 2,4-динитроанилин. Зависимость величин Rf
от соотношения хлороформа и R — ОН в системе хлороформ — R — ОН — ледяная уксусная кислота [(100 — х) -ф- х + 1].
R = СН3 (рис. 168), R = н-С3Н7 (рис. 169), R = С6Н5 — СН2 (рис. 170).
Восходящий метод; длина пути 10 см; пробы по 0,5 цг; обозначения см. на рис. 165 и в табл. 103.
Рис. 171. ДНФ-аминокислоты, раствори-
мые в эфире, 2,4-динитрофенол и 2,4-дини-
троанилйн. Зависимость величин 7? дНф_Лей
от соотношения ледяной уксусной кислоты
и пиридина в растворителе бензол — пири-
дин—ледяная уксусная кислота [70-Ь (30—
— х) -Ь ж].
1.2
’.О
09
О
08
0 7
0,6
а-ДнМ
0,5
0,3 -
0,2
0,7
0
Фен
04 -
Про
ди-АНФ-Цис
Ала
ди -ДНФ- Тир
диДНФ-Лиз
Асп
РдиАНФ-Гис
?nh2
Илей
а-АКИ
'Лей
л^-Ала
Илей
Вал
Ноал
Глу
, Гли
/
/ /irffOep
CH3C0DH2
C5H5N 8
С6Н6 90
6 ’0\1.4
24 40/
70 50
Рис. 172. ДНФ-аминокислоты, раствори-
мые в эфире, 2,4-динитрофенол и 2,4-дини-
троанилин. Зависимость величин 7?днФ.Лей
от соотношения бензола, пиридина^ ледя-
ной уксусной кислоты в растворителе с по-
стоянным (.отношением ледяная уксусная
кислота: пиридин.
* Величины Rf, отнесенные к Rf лейцина. При увеличении х величина Rf эталонного веще-
ства изменяется следующим образом:
X 1 0 1,5 | 3 | 5 | 10 15 20 25
Rf ДНФ-лейцина |о, 03 0,2в|о, 3?|о , 4б|о , 62 0,68 0,76 0,60
Восходящий метод; длина пути 14 cjh; пробы примерно по 0,5 цг. Обозначения см. на рис. 165
в табл. 103. Ди-ДНФ-лизин перемещается постоянно с такой же скоростью, как и ди-ДНФ-тиро-
зин; ДНФ-аланин везде обнаруживает величину RднФ-лей^ОЭ.
** Величины Rf, отнесенные к Rf лейцина. При уменьшении содержания бензола в растворителе
величинаЯ/ эталонного вещества изменяется следующим образом:
Содержание бензола, об. % [ 90 70 50
Rf ДНФ-лейцина | 0,t7 0,51 0,70
Восходящий метод; длина пути 14 слг, пробы примерно по 0,5 це. Обозначения см. на рис. 165
и в табл. 103.
Гл. 19. Аминокислоты и производные
425.
живаемые пятна при рассматривании пластинки в проходящем дневном
свете. Хроматограмму следует скопировать в течение часа, поскольку пятна
со временем бледнеют. Для фиксирования слой можно опрыскивать смесью
парафин — эфир [176] или лучше эмульсией из пластмассы [50, 177].
Получающуюся пластмассовую пленку легко отделяют от стеклянной пла-
стинки и обрабатывают как хроматограмму на бумаге.
Обычно мы накладываем на слой пергаминовую бумагу, применяя два
бумажных зажима, рассматриваем его в проходящем свете и обводим пятна
чернилами (мягким пером). При некоторой тренировке обнаруживают на
белом слое силикагеля даже самые слабые светло-желтые пятна. Во многих
случаях удобнее рассматривать пластинку в проходящем УФ-свете (источ-
ник света —> слой -> стеклянная пластинка -> очки -> глаз). При этом
ДНФ-аминокислоты обнаруживают в виде интенсивно темных пятен. Слаба
поглощающие вещества в малых концентрациях плохо просматриваются,
поскольку слой силикагель — гипс сам поглощает и поэтому дает также'
темный фон. Если добавить 0,5 г силиката цинка * к 25 г силикагеля Г,
то слой благодаря флуоресценции станет более светлым и О-ДНФ-ти-
розин можно будет обнаружить даже в небольших количествах (около.
0,06 цг).
В особенности рекомендуется изготовление УФ-фотокопий. Бумагу
«гевакопи» кладут чувствительной стороной непосредственно на слой и при-
жимают стеклянной пластинкой. Затем слой в течение нескольких секунд,
освещают УФ-светом (360 л«ц)** и проявляют позитив обычным способом.
Рис. 165—167 получены этим методом.. Самая большая чувствительность-
наблюдается при таком времени экспозиции, когда фон негатива получается
еще-не черным, а серым. При этом получают истинную копию. При более
длительном освещении фон негатива чернеет, одновременно уменьшается
радиус светлых пятен; при очень длительном освещении пятна исчезают
совсем, что можно использовать для того, чтобы превратить большие, частич-
но перекрывающиеся пятна в полностью разделенные пятна небольших
размеров.
Б. ФЕНИЛТИОГИДАНТОИНЫ
Указанные выше условия образования фенилтиогидантоинов (ФТГ-ами-
нокислот) иллюстрируются следующей реакционной схемой [178,
179].
Применение этой реакции было рекомендовано Эдманом [155]; впослед-
ствии реакция в виде общего метода [180, 181] была разработана в других
лабораториях.
Вместо протеинов или пептидов можно обрабатывать фенилгорчичным
маслом (фенилизотиоцианат, ФИТЦ) и свободные аминокислоты [182].
Как и динитрофенилирование, эту реакцию рекомендуется проводить в том
случае, когда смесь аминокислот из-за наличия примесей нельзя непосред-
ственно анализировать методом ХТС: ФТГ-аминокислоты часто легче пере-
вести в хроматографируемую форму, чем свободные аминокислоты. То обстоя-
тельство, что ФТГ-аминокислоты поглощают УФ-свет, облегчает количест-
венный анаЛиз аминокислот [182].
* Люминесцирующее вещество из силиката цинка Р 1, тип 118-2-7, фирмы «Gene-
ral Electric» (Кливленд, Огайо).
** Лабораторный прибор для УФ-анализа 57 US фирмы «W. Balz» (Хейльбронн,
Неккар).
426
Специальная часть
Схема расщепления по Эдману.
NH2CHRCO — NHCHR'CO ...
Пептид
pH 8-9 C6H5NCS (ФИТЦ)
V
C6H5NHCS —NHCHRCO — NHCHR'CO ...
Фенилтиокарбамилпептид
R/\^'XNHC6H5
Тиазолин
Г*
+ NH2CHR'CO ...
Пептидный остаток
Н+/НаО быстро
C6H5NHCS — NHCHRCO ОН
Фенилтиокарбамиламинокислота
нагревание
HW
------—>
медленно
Н
ФТ Г-аминокислота
1. ПОЛУЧЕНИЕ ФЕНИЛТИОКАРБАМИЛПРОИЗВОДНЫХ
И ПРЕВРАЩЕНИЕ ИХ В ФТГ-АМИНОКИСЛОТЫ
а) Аминокислоты
Сьёквист описал микрометод [181]. Для получения больших количеств можно соот-
ветствующим образом приспособить метод Сьёквиста или действовать по методу, описан-
ному Эдманом [183].
а) Приготовление ФТГ-аминокислот *. Растворяют 10 ммолей аминокислоты в смеси
25 мл воды и 25 мл пиридина, 1 н. раствором NaOH устанавливают pH =9 (по индикатор-
ной бумажке), нагревают до 40°, вносят 2,4 мл фенилгорчичного масла и при переме-
шивании 1 н. раствором NaOH поддерживают pH 9. Реакция заканчивается прибли-
зительно через 30 мин и расход щелочи прекращается. Избыток фенилгорчичного масла
и основное количество пиридина удаляют многократной экстракцией бензолом, обра-
батывают для нейтрализации щелочи соответствующим количеством соляной кислоты,
при необходимости упаривают и отфильтровывают выпавшие фенилтиокарбамил амино-
кислоты. Примечание: фенилкарбамиларгинин и фенилтиокарбамилгистидин выпадают
при pH 7 и 3,5 соответственно.
Для перевода в ФТГ-аминокислоты фенилтиокарбамилпроизводные растворяют
или суспендируют в 30 мл 1 н. соляной кислоты. 2 час кипятят с обратным холодильни-
ком, несколько раз с добавлением воды выпаривают досуха и сырую ФТГ-аминокислоту
(выход 80—90%) перекристаллизовывают из разбавленной уксусной кислоты, спирта
или воды. Температуры плавления для 18 ФТГ-аминокислот указаны в оригинальной
работе. Примечание: для получения триптофанпроизводных кипятят не с разбавленной
соляной кислотой, а с ледяной уксусной кислотой. ФТГ-производные диаминокислот
обладают фенилтиокарбамильным остатком у аминокислоты, расположенной не в «-поло-
жении; для производных Р-окси- и Р-меркаптоаминокислот наблюдается ясно выражен-
ная тенденция к отщеплению воды или H2S; ФТГ-треанин является, например, фенил-
тиогидантоином а-аминокротоновой кислоты. Все ФТГ-аминокислоты светочувствительны.
Оптически активные производные легко рацемизуются, хотя они довольно стабильны,
что позволяет определить их строение по измерению вращательной дисперсии [184].
* Набор ФТГ-аминокислот поставляется фирмой «Манн Research Laboratories 1нс».
Нью-Йорк).
Гл. 19. Аминокислоты и производные
427
Р) Количественный перевод смеси аминокислот (например, продуктов гидролиза
пептида) в ФТГ-аминокислоты [182]. 0,5—1 мг пептида или протеина запаивают с 0,3 мл
дважды перегнанной постоянно кипящей соляной кислоты (5,7 н.) в кварцевую ампулу
в атмосфере азота и для проведения гидролиза нагревают 22 час при 110°, охлажденный
в вакууме над гидроокисью калия гидролизат несколько раз выпаривают досуха, добав-
ляя воду. Остаток смешивают с 250 рл буферной смеси триэтиламин — уксусная кислота
(см. реактивы) и 250 рл ацетонового раствора фенилизотиоцианата (что соответствует
6 цл ФИТЦ), тщательно перемешиваемую пробу при герметичном затворе оставляют
на 2,5 час в водяной бане при 25°; затем отфильтровывают раствор с применением в тече-
ние 15 мин водоструйного насоса, после чего на 12 час оставляют в глубоком вакууме
над пятиокисью фосфора. Осадок (фенилтиокарбамилпроизводные аминокислот) раство-
ряют в 100 рл дистиллированной воды и 200 рл ледяной уксусной кислоты, насыщенной
хлористым водородом (HCl-ледяная уксусная кислота); полученный раствор выдержи-
вают 6 час в водяной бане при 25° и растворитель и кислоту удаляют, как описано выше,
над КОН. Остаток содержит ФТГ-аминокислоты; для хроматографического сравнения
проводят параллельный опыт без добавления аминокислоты. ФТГ-производные цистеина
и цистина по описанной методике получить нельзя. Для определения этих аминокислот
перед гидролизом следует провести окисление надмуравьиной кислотой; в этом случае
после гидролиза получают цистеиновую кислоту и из нее более или менее удовлетвори-
тельно — ФТГ-производное. Сьёквист применил для окисления несколько усовершен-
ствованный метод Хирса [44].
Реактивы
Буфер: 2 мл 2 н. уксусной кислоты (чда) и 1,2 мл триэтиламина ( 3 час кипятят
над 5 вес.% ангидрида фталевой кислоты и непосредственно перед употреблением пере-
гоняют на короткой колонке) доводят дистиллированной водой до 25 мл и раствор сме-
шивают с 25 мл ацетона (кипятят над перманганатом калия и непосредственно перед
употреблением перегоняют на короткой колонке); pH 10,1. Фенилизоти о-
цианат: перегнанный в вакууме. HCl-л едяная уксусная кислота:
ледяную уксусную кислоту (чда) насыщают в кварцевой колбе при комнатной темпера-
туре газообразным НС1 (промытым концентрированной серной кислотой),
б) Пептиды
Среди многочисленных прописей в литературе [132, 133, 155, 185—188] следует
рекомендовать, во-первых, «нормальный» метод расщепления Сьёквиста с сотрудни-
ками [132, 133] и, во-вторых, специальный метод Сьёквиста [133]; последний гаранти-
Р ис. 173. Одномерная хрома-
тограмма для обнаружения
ФТГ-аспарагиновой кислоты
и ФТГ-глутаминовой кисло-
ты.
Восходящий метод; растворитель
хлороформ — метанол — муравьи-
ная кислота (70 + 30 + 2); длина
пути 11 сл1; пробы по 0,5 це в
0,5 цл метанола; обнаружение:
клор/толидин илиУФ-свет(270 .иц).
Фен
Вал
Мет
Илей
Лей
Про
4ФТГ
\О>Глу NH,,
@ © Дсп nh2
Гис
Арг
—Qi—
Старт\
Асп
10см
Рис. 174. Двумерная хроматограмма смеси,
содержащей по 0,5 рг ФТГ-аминокислот, МФТГ
и ДФТГ в 0,5 рл метанола или ацетона.
Восходящий метод; хлороформ — метанол (90 + 10)
в направлении 1, хлороформ —муравьиная кислота
(100 + 5) в направлении 2; обнаружение: хлор/толи-
дин или УФ-свет (270 -мр). Видно, что только 3 из
13 пятен содержат несколько компонентов. По поводу
исследования пятен 9,2 и 13 см. текст, рис. 173 и
на рис. 175.
428
Специальная часть
рует максимальный выход ФТГ-аминокислот. Нам придется ограничиться следующими
краткими замечаниями.
При специальном методе особенно много образуется моно- и дифенилтиомочевины —
обычных побочных продуктов. Дифенилтиомочевина (ДФТМ) не мешает идентификации
ФТГ-аминокислот методом ХТС (см. рис. 175). Наоборот, монофенилтиомочевина (МФТМ)
хроматографически на бумаге и в тонком слое [189] ведет себя, как ФТГ-глицин (см.
рис. 174). Поэтому для обнаружения ФТГ-глицина мы применяем специфическую цвет-
ную реакцию, на которую не оказывает
влияния наличие МФТМ (см. «Обнаруже-
ние», стр. 429).
При обычной экстракции уксусным
эфиром для соответствующего отделения
ФТГ-аминокислот от укороченного пептида
ФТГ-гистидин, ФТГ-аргинин и продукты,
образующиеся в присутствии цистеиновой
Рис. 175. Двумерная хроматограмма сме-
си, содержащей по 0,5 цг ФТГ-аминокис-
лот, МФТГ и ДФТГ в 0,5 р.г метанола или
ацетона.
Восходящий метод; хлороформ в направлении 1,
«гептан»-система в направлении 2; обнаружение:
УФ-свет (270 -мц). Видно, что пятно Ка 13 на
рис. 174 разделено на компоненты: ФТГ-лейцин
и ФТГ-изолейцин, об идентификации 2 последних
веществ см. в тексте.
кислоты, остаются в водном кислом растворе. ФТГ-гистидин можно практически пол-
ностью экстрагировать, если сначала удалить основное количество кислоты осторожным
выпариванием, растворить в небольшом количестве воды и установить величину pH 7;
Для нейтрализации целесообразно применять триэтиламин.
Если в цепи имеется цистеиновая кислота, то, согласно нашим данным, возникают
затруднения при ее образовании в цикле расщепления *«
2. РАСТВОРИТЕЛЬ И ЭФФЕКТ РАЗДЕЛЕНИЯ '
Растворители, применяемые для разделения ФТГ-аминокислот в хрома-
тографии на бумаге [182, 190—192], непригодны для силикагеля Г. Удовлет-
ворительного эффекта разделения мы добились с помощью растворителей,
приведенных в табл. 111. Для разделения ФТГ-аспарагиновой и ФТГ-глута-
миновой кислот пригоден растворитель хлороформ — метанол —муравьи-
ная кислота (70 + 30 + 2) (см. рис. 173).
Шербулье и др. [4] рекомендуют смесь гептан — пиридин — этил ацетат
(50 + 30 + 20) (разделение ФТГ-глицина, ФТГ-пролина и ФТГ-лейцина).
Величина R/. Табл. 111 дает представление о величинах Rf в некоторых
проверенных нами растворителях. Эти величины в широких пределах не зави-
сят от нанесенного количества вещества. Для ФТГ-пролина, например, это
относится к интервалу между 0,05 и 72 цг (хлороформ — метанол, 90 + 10);
в указанном интервале концентраций площадь пятна (расчет на миллиметро-
вой бумаге) при нанесении пробы в 0,5 цл метанола приблизительно про-
порциональна логарифму количества вещества.
Разделение и идентификация. Полезно вместо описанного ранее метода [8]
применить следующую новую методику [193].
Одновременно снимают две двумерные (рис. 174, 175) и одну одномер-
ную (рис. 173) хроматограммы. При этом не разделяются ФТГ-глицин
и монофенилтцомочевина, а также ФТГ-лейцин и ФТГ-изолейцин.
Для обнаружения ФТГ-глицина в присутствии МФТМ (рис. 174) мы
рекомендуем цветную реакцию с аммиаком, описанную Шраммом с сотруд-
никами 1189], в несколько измененном виде (пропись см. на стр. 430).
* Расщепление глутаминпептидов, см. [203].
Гл. 19. Аминокислоты и производные
429
Таблица 111
Величины Rj X 100 ФТГ-аминокислот, моно- и дифенилтиомочевины
Сокращения см. табл. 103. Проба: 0,5 рг вещества в 0,5 рл метанола или ацетона;
восходящий метод, длина пути 10 см; приведенные величины
являются средними из 6 определений
ФТГ-производ- ное от Ry X 100 в растворителе ФТГ-производ- ное от Ну х 100 в растворителе
I II III IV I II III IV
Ала 16 68 39 И Мет 33 75 51 13
Apr 00 1 00 00 Мет О а ... 1 40 12 1
Асп 00 1 13 00 Фен 28 74 50 18
Асп (NH2) . . 00 23 7 00 Про 60 82 65 21
Глу 1 4 17 00 Тре 04 45 15 00
Глу(МН2) . . 1 28 8 00 Три 13 62 39 10
Гли 10 56 33 5 Тир оз- 47 21 01
Гис 1 29 00 2 Вал 32 74 55 23
Илей .... 40 77 57 37 МФТМ .... 12 >54 31 03
Лей 40 77 60 37 ДФТМ .... 43 76 67 22
Лиз 12 71 34 3
Растворители: I — хлороформ; II — хлороформ — метанол (90 4- 10), III — хлороформ — муравьи-
ная кислота (100 4- 5), IV—«гептан»-система: н-гэптан — этиленхлорид — муравьиная кислота —
пропионовая кислота (90 4- 30 4- 21 4- 18); берут 100 мл верхней фазы.
Качество растворителей
Хлороформа стабилизованный 1,5% этанола (фирма «Fluka» муравьиная кислота: безводная,
яда (фирма «Fluka»); гептан: н-гептан чистый (фирма «Fluka»); пропионовая кислота: чистая (фир-
ма «Flukia»); Этиленхлорид: 1,2-дихлорэтап чистый (фирма «Fluka»); метанол: продажный, перегнан-
ный на короткой колонке.
а Метионинсульфоксид.
б фирма «Fluka» (Швейцария).
Для идентификации ФТГ-лейцина и ФТГ-изолейцина (рис. 175) соскаб-
ливают видимое в УФ-свете пятно ФТГ-лейцин — ФТГ-изолейцин, элюи-
руют метанолом, выпаривают элюат досуха, остаток (не менее 1 рг на ФТГ-ами-
нокислоту) гидролизуют 6 н. НС1 в течение 12 час при 120° (ср. [8]). Из гид-
ролизата удаляют соляную кислоту многократным выпариванием в вакууме
с добавлением воды, остаток растворяют в воде, раствор небольшими пор-
циями (по 1 цл) наносят на слой с промежуточным высушиванием и затем
проводят проточное хроматографическое разделение смесью метилэтилке-
тон — пиридин — вода — ледяная уксусная кислота (70 + 15 + 15 +2)
(см. стр. 402).
3. ОБНАРУЖЕНИЕ ФЕНИЛГИДАНТОИНОВ
Весьма полезна уже описанная на стр. 412 в разд. «Пептиды» хлор-толи-
диновая проба (реактив № 32), минимально определяемое количество соста-
вляет примерно 0,05 рг ФТГ-аминокислоты. Можно использовать также
гашение флуоресценции в УФ-свете (270 жц). Она наблюдается при добав-
лении к силикагелю Г 0,8% флуоресцирующего силиката цинка *. Мини-
мальноопределяемое количество составляет около 0,1 рг ФТГ-аминокислоты.
* На бумаге тоже наблюдается гашение флуоресценции [192].
430
Специальная часть
Для специфического обнаружения фТГ-глицина слой опрыскивают до-
слабого увлажнения дистиллированной водой и действуют парами аммиака;
(достаточно открытой склянки с аммиаком); появляется устойчивое темно-
красное пятно. Минимально определяемое количество составляет 0,08 цз.
ПрименяемыйСьёквистом [191] и Шербулье [4] азид иода (реактив № 756),
по нашим данным, не является идеальным реактивом для ФТГ-аминокислот.
Мы получали на слоях силикагеля Г белые пятна на светло-синем фоне, кото-
рые трудно обнаружить и которые быстро исчезают. Реактив Гроте [194].
(реактив № 115) был бы лучше, если бы его применение не требовало так
много времени.
VI. ИОНОФОРЕЗ 3 ТОНКИХ СЛОЯХ И ИОНОФОРЕЗ — ХРОМАТОГРАФИЯ
В ТОНКИХ слоях
Ц. Хонеггер
1. ИОНОФОРЕЗ В ТОНКИХ СЛОЯХ (ИТС)
Ионофоретическое разделение смеси веществ на тонком неорганическом-
носителе — ионофорез в тонком слое — было описано независимо друг
от друга Пастуска и Тринксом [195] и нами [123]. После того как ХТС была;
разработана Шталем [196—200] в виде простой и стандартной методики,,
с таким исключительным успехом использованной в первую очередь для
разделения липофильных и гидрофильных веществ и превосходящей метод,
хроматографии на бумаге, казалось соблазнительным распространить эту
методику на метод ИТС. В принципе при осуществлении этой методики не
возникает трудностей; Консден, Гордон и Мартин [99] уже в 1946 г. успеш-
но применили силикагель в качестве носителя для разделения аминокислот
и пептидов методом ионофореза. Их еще слишком сложная методика не
нашла широкого распространения по сравнению с ионофорезом на бумаге..
Поскольку аппаратура была уже подробно описана на стр. 32, мы можем
здесь прежде всего обратить внимание на преимущества и недостатки ионо-
фореза в тонких слоях на различных носителях по сравнению с разделением
на бумаге.
В качестве преимуществ метода ХТС по сравнению с хроматографией,
на бумаге следует специально отметить следующее: а) небольшая диффузия
приводит к меньшим пятнам, благодаря чему достигается более высокая
чувствительность; б) меньшее время разделения; в) возможность применять,
самые агрессивные реагенты для обнаружения разделяемых веществ. Послед-
нее справедливо также для ионофореза в тонких слоях, а пункт б), умень-
шение времени разделения, имеет силу в первую очередь для низковольтного
электрофореза. Применение «свободных» неохлаждаемых стеклянных пла-
стинок в качестве носителей адсорбционного слоя имеет известные недо-
статки. Вследствие сравнительно большой толщины стеклянных пластинок
(3,5 мм) затрудняется эффективное охлаждение, совершенно необходимое-
для разделения при высоком напряжении (выше 500 в). При использовании
более тонких стеклянных пластинок этот недостаток в некоторой степени
устраняется. Из-за опасности повреждения слоя труднее осуществить охла-
ждение с верхней стороны, которое, в противоположность Пастуска и Тринк-
оу [195], мы считаем необходимым уже при напряжении 400—500 в.
Сравнение бумаги, силикагеля Г, кизельгура Г и окиси алюминия Г как
носителей. По возможности в одинаковых условиях было исследовано соот-
ношение скоростей перемещения и диффузии на одной смеси веществ (цистеин,
мецкалин, кадаверин, метиламин), которая разделялась ионофоретически
на бумаге (ватман № 1), силикагеле Г, кизельгуре Г и окиси алюминия Г
Гл. 1А. Аминокислоты и производные
431
(в течение 1 час в 0,1 М буферном растворе цитрата натрия, pH 3,8, 440 в),
и затем окрашивалась нингидрином. Строгая сравнительная оценка резуль-
татов затруднительна, поскольку, с одной стороны, после смачивания буфер-
ным раствором (pH 3,8) носители имеют различный pH: силикагель Г ~3,
кизельгур Г ~2,5, окись алюминия Г ~4,5, бумага -~3,5 и, с другой сто-
роны, влажность носителей также несколько различна. При сравнении ско-
рости движения можно установить, что величины на кизельгуре Г и бумаге
выше, чем на силикагеле Г и окиси алюминия Г, причем отдельные участки
могут при переходе от носителя к носителю сильно отличаться из-за различ-
ной адсорбционной способности. Например, как видно из формы * пятна
(образование кометы), кадаверин на силикагеле адсорбируется сильнее,
чем на бумаге. Самое маленькое пятно при нанесении малых количеств,
вещества (0,25—1 цг) образуется на’окиси алюминия Г, затем следует кизель-
гур Г < силикагель Г < бумага. Оценка затрудняется неодинаковой чув-
ствительностью нингидриновой’окраски на разных материалах, а также раз-
личным содержанием буферного раствора, оказывающего влияние на диф-
фузию.
При сравнении емкости носителей установлено, что силикагель Г и окись,
алюминия Г по сравнению с кизельгуром Г и бумагой обладают меньшей
емкостью, причем на оценку также могут оказывать влияние колебания
содержания буфера и окраски.
На основании этих данных можно сделать вывод, что ионофорез в тон-
ких слоях (по крайней мере в области низких напряжений) предпочтитель-
нее ионофореза на бумаге, причем кизельгур в качестве носителя обнару-
живает оптимальные свойства. Мы можем, однако, лишь условно принять,
указанные Пастуска и Тринксом [195] преимущества кизельгура Г и сили-
кагеля Г по сравнению с бумагой: большая скорость перемещения, меньшая
адсорбция и т. д.
По воспроизводимости ионофорез в тонких слоях не уступает разделению
на бумаге. При выборе ионофоретического метода в тонком слое или на бумаге
необходимо учесть все преимущества и недостатки относительно друг друга,
причем различие в разделительной способности носителей должно явиться
решающим фактором.
Ионофорез в тонких слоях до настоящего времени применяли только,
для разделения низкомолекулярных веществ. Пастуска и Тринкс [195]
специально занимались разделением органических кислот и опубликовали
величины Rf 36 веществ на силикагеле Г и кизельгуре Г (боратный буфер),.
Наши собственные опыты охватывают разделение аминов, аминокислот [123]
(буфер цитрат натрия, pH 3,8), эфиров фосфорной кислоты (буфер цитрат
натрия, pH 3,8) и сахаров (буфер борат натрия, pH 12,5 и 10) на силикагели
Г, кизельгуре Г и окиси алюминия Г.
2. ИОНОФОРЕЗ — ХРОМАТОГРАФИЯ В ТОНКИХ СЛОЯХ
Этот двумерный метод, при котором разделение в одном направлении
осуществляется ионофоретически, а в перпендикулярном к нему — хрома-
тографически, использует наряду со свойствами тонкослойного ионофореза
известные преимущества метода ХТС. Следовательно, этот метод превосходит
аналогичный метод на бумаге. Область его применения распространяется
так же, как и в случае ионофореза в тонких слоях, на ионогенные смеси
веществ или отдельные вещества, которые можно заставить перемещаться
в электрическом поле, и в этой области рассматриваемый метод должен пре-
* Ср. [201].
432
Специальная часть
восходить двумерную хроматографию благодаря тому, что в нем при разде-
лении используются два совершенно различных физических свойства. До
настоящего времени его использовали для разделения аминокислот и ами-
нов [123] (см. рис. 176).
Условия опыта при получении хроматограммы, рис. 176
На верхней части пластинки для контроля и расчета величин Ef* одно-
временно разделяли смесь Е ионофоретически.
1. Ионофорез. Буфер с pH 2: 2 н. уксусная кислота — 0,6 н. муравьиная
кислота (1 : 1), влажность 160%; 460 в,
12,6 Lua, 1 час.
2. Хроматография. н-Бутанол — ледя-
ная уксусная кислота—вода (80+20+20),
восходящий метод, 2,5 час, обнаружение:
нингидрин (реактив № 108).
К Мц Цис Е
О О Ол Старт
М
О
Ф Три
о о :
м д-АМтааал -
On п Тис <D §>Асп _
Ег. OVO/’ О Про^Стирт
Г -g 1 г 1 111 1 I Г 1 I 1 I
10____0,5_____о -0,2
0.5
0
Рис. 176. Тонкослойная ионофоретическая хро-
матограмма смеси аминов и аминокислот на
силикагеле Г (пластинка 20 X 20 см).
Проба 2 цл водного раствора, содержащего по 1—8 цг
веществ. Сокращенные названия аминокислот см.
в табл. 103, цис — цистеин, К — кадаверин, D — ди-
метиламин, Г—гистамин, М — метиламин, Мц — мец-
калин, Н — норадреналин, ф — фенилэтиламин,
П — 1,3-пропилендиамин.
ЛИТЕРАТУРА
1. Cohn Е. J., Е d s а 11 J. Т., Proteins, Amino Acids and Peptides as Ions and Dipo-
lar Ions, p. 203 and 201, Wew York, Reinhold Publishing Corporation 330 West
Forty-second St., 1943.
2. Хроматография на бумаге, под ред. И. М. Хайса и К. Мацека, Издатинлит, 1962.
3. М о f f a t Е. D., L у t 1 е R. i., Analyt. Chem., 31, 926 (1959).
4. Cherbuliez E., В a e h 1 e r Br., Rabinowitz J., Helv. Chim. Acta, 43,
1871 (1960).
5. N i с о 1 a u s B. J. R., J. Chromatog., 4, 384 (1960).
6. Kirk R. E., Othmer D. F., Encyclopedia of Chemical Technology, Vol. 2, p.
773, New York, Interscience Publishers Inc., 1948.
7. Brenner M., N iederwieser A., Experientia, 16, 378 (1960).
8. Brenner M., N iederwieser A., Pataki G., Experientia, 17, 145 (1961).
9. Fahmy A. R., Niederwieser A., Pataki G., Brenner M., Helv.
Chim. Acta, 44, 2022 (1961).
10. Mutschler E., Rochelmeyer H., Arch. Pharmaz., 292, 449 (1959).
11. Mot tier M., Mitt. Lebensm. und Hyg., 49, 454 (1958).
12. Brenner M., Niederwieser A., Pataki G., Fahmy A. R., Experien-
tia, 18, 101 (1962).
13. В r e n n e r M., Niederwieser A., Experientia, 17, 237 (1961).
14. M о о r e S., S p a c k m a n D. H., S t e i n W. H., Analyt. Chem., 30, 1185 (1958);
30, 1190 (1958).
15. P 6 h m M., Naturwiss., 48, 555 (1961).
16. P a u 1 s о n G., D e a t h e r a g e F. E., A 1 m у E. F., J. Am. Chem. Soc., 75, 2039
(1953).
17. L i n s k e n s H. F., Papierchromatographie in der Botanik, zweite Aufl., Berlin —
Gottingen — Heidelberg, Springer-Verlag, 1959.
18. V e r d i e r C.-H. de, A g r e n G., Acta Chem. Scand., 2, 783 (1948).
19. A w a p a r a J., Arch. Biochem., 19, 172 (1948).
20. Tiselius A., Experientia, 17, 433 (1961).
21. Flo din P., J. Chromatog., 5, 103 (1961).
* Относительный путь перемещения рассчитан как частное от деления величины
пути цистеин — вещество X на величину пути цистеин (£у = 0)— метиламин (Еу = 1).
В случае веществ, движущихся к аноду, получают величины £у с отрицательным знаком.
Гл. 19. Аминокислоты и производные
433
22. Porath J., Biochim. et Biophys. Acta, 39, 193 (1960).
23. Porath J., Clin. Chim. Acta, 4, 776 (1959).
24. S t e p a n о v V., Handschuh D., An der er F. A., Z. Naturforsch., 16b,
626 (1961).
25. Boissonnas R. A., Bianco S. Io, Experientia, 8, 425 (1952).
26. С о n s d e n R., Gordon A. H., Martin A. J. P., Biochim J., 41, 590 (1947).
27. R e d f i e 1 d R. R., Biochim. et Biophys. Acta, 10, 344 (1953).
28. Carsten M. E., J. Am. Chem. Soc., 74, 5954 (1952).
29. P i e z К. A., T о о p e r E. B., Fosdick L. S., J. Biol. Chem., 194, 669 (1952).
30. Stein W. H., Moore S., J. Biol. Chem., 190, 103 (1951).
31. Buchner H., Diss., Universitat Basel, 1957, S. 84.
32. D г e z e A., Boeck A. d e, Arch, intern, physiol, et biochem., 60, 201 (1952).
33. D г e z e A., Moore S., Bigwo о d E. J., Analyt. chim. Acta, 11, 554 (1954).
34. С о о к E. R., Luscombe M., J. Chromatog., 3, 75 (1960).
35. D e n t С. E., S t e p к a W., Steward F. C., Nature, 160, 682 (1947).
36. P a r i h a r D. B., Naturwiss., 41, 502 (1954).
37. R e i n d e 1 F., В i e n e n f e 1 d W., Z. physiol. Chem., 305, 123 (1956).
38. Biserte G., Boulanger P., Paysant P., Bull. soc. chim. bioL, 40, 2067
(1958).
39. Close R., Nature, 185, 609 (1960).
40. Knauf f H. A.,Schmair H.,Zickgraf H., Z. physiol. Chem., 318, 73 (1960).
41. Nurnberg E., Arch. Pharmaz., 292, 610 (1959).
42. Jost K., R u d i n g e r J., § orm F., Coll. Czech. Chem. Comm., 26, 2496 (1961).
43. Ahrland S., Grenthe I., Noren B., Acta Chem. Scand., 14, 1059, 1077 (I960).
44. Hirs С. H. W., J. Biol. Chem., 219, 611 (1956).
45. Biserte G., Osteux R., Bull. soc. chim. biol., 33, 50 (1951).
46. С a 1 d i n D. J. Me., Chem. Rev., 60, 39 (1960).
47. С о n s d e n R., Gordon A. H., Martin A. J. P., Biochem. J., 38, 224 (1944).
48. Tsukamoto T., Komori T., Chem. Pharm. Bull., 8, 913 (1960).
49. Kawerau E., Wieland Th., Nature, 168, 77 (1951).
50. В a г г о 1 1 i e r J., Naturwiss., 48, 404 (1961).
51. Woiwod A., J. Chromatog., 3, 278 (1960).
52. Hardy T. L., H о 1 1 a n d D. O., N а у 1 e r J. H.C., Analyt. Chem., 27, 971 (1955).
53. Opienska-Blauth J., Sanecka M.,Charezinski M., J. Chromatog.,
3, 415 (I960).
54.
55.
56.
57.
58.
59.
60.
61.
62.
63.
Patton A. R., Chism P., Analyt. Chem., 23, 1683 (1951).
T о e n n i e s G.
u
u
u
u
Ruh
Wiggins L.
Saifer A., О
Noworytko
Kolb J. J., Analyt. Chem., 23, 823 (1951).
’ Soc., 99, 792 (1911).
Soc.
She
Soc
Soc.', 97, 2025 (1910).
h
h
h
h
S., J.
S., J.
S., J.
S., J.
S., J.
F., W i 1 1 i a m s J. H., Nature, 1'70, 279 (1952).
reskes I., Analyt. Chem., 28, 501 (1956).
J., Sarneck a-K e 1 1 e r M., Acta biochim. Polon., 2, 91 (1955).
64. A c h e r R., Fromageot C., Ju t is z M., Biochim. et Biophys. Acta, 5, 81
(1950).
R
R
R
R
e m
e m
e m
e m
e m
ann
ann
ann
ann
ann
Chem.
Chem.
Chem.
Chem.
Chem.
99, 1306 (1911).
99, 1486 (1911).
97, 1483 (1910).
65. Grassmann W., Arnim K. v., Ann. Chem. Liebigs, 519, 192 (1935).
66. Barrolier J.,HeilmanJ.,Watzke E., Z. physiol. Chem., 304, 21 (1956).
67. R о s e b e e к S., Chem. Weekblad, 46, 813 (1950).
68. Kofrdnyi E., Z. physiol. Chem., 299, 129 (1955).
69. С о n s d e n R., Nature, 162, 359 (1948).
7.0 . Muting D., Naturwiss., 39, 303 (1952).
71. G i r i К. V., N agabhushanam A., Naturwiss., 39, 548 (1952).
72. Riemschneider R., Preuss K., Mh. Chem., 90, 924 (1959).
73. Rein del F., Hoppe W., Chem. Ber., 87, 1103 (1954).
74. Bhattacharya K. R., D a t t a J., R о у D. К., Arch. Biochem., 84, 377 (1959).
75. R о c h e J., T h о a i N. v a n, H a t t J. L., Biochim. et Biophys. Acta, 14, 71
(1954).
76. J e p s о n J. B., Smith I., Nature, 172, 1100 (1953).
77. Acher R., Crocker Ch., Biochim. et Biophys. Acta, 9, 704 (1952).
78. S a к a g u c h i S., J. Biochem., 5, 25 (1925).
79. Sakaguchi S., J. Biochem., 5, 133 (1925).
80. S a к a g u c h i S., J. Biochem., 37, 231 (1950).
81. T u p p у H., Sitzungsberichte, 162, 342 (1953).
82. W i n e g a r d H. M., Toennies G., Block R. J., Science, 108, 506 (1948).
83. К i r b y-B e г г у H., Sutton H. E., Cain L., В e г г у J. S., Univ. Texas
Pubs., 5109, 22 (1951).
28 Заказ № 734
434
Специальная часть
84. A w е W., R е i п е с к е I., Т h u m J., Naturwiss., 41, 528 (1954).
85. Chargaff Е., Levine С., Green С., J. Biol. Chem., 175, 67 (1948).
86. Burton R. B., Zaffaroni A., Kentmann E. H., J. Biol. Chem., 188,
763 (1951).
87. T о у a d a H., J. Bull. Chem. Soc. Japan, 9, 263 (1954).
88. P a t t о n A. R., Foreman E. M., Science, 109, 339 (1949).
89. Frank H., Petersen H., Z. physiol. Chem., 299, 1 (1955).
90. В г а у H. G., Thorpe W. V., White K., Biochem. J., 46, 271 (1950).
91. Pauly H., Z. physiol. Chem., 42, 517 (1904).
92. Pauly H., Z. physiol. Chem., 94, 288 (1915).
93. Edlbacher S.; Baur H., Staehelin FI. R., Zeller A., Z. physiol.
Chem., 270, 158 (1941).
94. Edlbacher S., Z. physiol. Chem., 157, 106 (1926).
95. S a n g e r F., T и p p у H., Biochem. J., 49, 463 (1951).
96. C 1 a г к s о n T. W., Biochim. et Biophys. Acta, 18, 453 (1955).
97. Schwartz D. P., Analyt. Chem., 30, 1855 (1958).
98. Dalgliesh С. E., Nature, 166, 1076 (1950).
99. Consden R., Gordon A. H., Martin A. J. P., Biochem. J., 40, 33 (1946).
100. Metzenberg R. L., Mitchell H. K., J. Am. Chem. Soc., 76, 4187 (1954).
101. Fearon W. R., Boggust W. A., Analyst, 79, 101 (1954).
102. Edward J. T., Waldron D. M., J. chem. Soc., 1952, 3631.
103. Smith I., Nature, 171, 43 (1953).
104. Dalgliesh С. E., Biochem. J., 52, 3 (1952).
105. Pacheco H., Bull. soc. chim. biol., 33, 1915 (1951).
106. Wieland Th., Bauer L., Angew. Chem., 63, 511 (1951).
107. Jerchel D., Muller R., Naturwiss., 38, 561 (1951).
108. Fischer A., Planta, 43, 288 (1954).
109. Prochdzka Z., Chem. Listy, 47, 1643 (1953).
110. Linser H., Mayr H., Maschek F., Planta, 44, 103 (1954).
111. Erspamer V., Boretti G., Arch. int. Pharmacodyn., 88, 296 (1951).
112. C 1 e г c-B о г у M Pacheco H., Mentzer Ch., Compt. rend., 238, 525
(1954).
113. Ekman B., Acta Chem. Scand., 2, 383 (1948).
114. Gerngr oss O., Voss К., H e r f e 1 d H., Ber. dtsch. chem. Ges., 66, 435 (1933).
115. К и d z i n S. F., В a и n R. M. de, N ord F. F., J. Am. Chem. Soc., 73, 4615
(1951).
116. Folin O., Ciocalteu V., J. Biol. Chem., 73, 627 (1927).
117. Folin O., Denis W., J. Biol. Chem., 12, 239 (1912).
118. Durant J. A., Nature, 169, 1062 (1952).
119. Millon E., Compt. rend., 28, 40 (1949).
120. В r i c a s E.' Fromageo t CL, Advances in Protein Chem., 8, 4 (1953).
121. Schachter M., Polypeptides which affect smooth muscles and blood vessels,
Pergamon Press, 1960.
122. Katz A. M.,Dreyer W. J., A n f i n s e n С. B., J. Biol. Chem., 234, 2897 (1959).
123. Honegger C. G., Helv. Chim. Acta, 44, 173 (1961).
124. Biochem. Preparations, 8 (1961).
125. Yanari S., Biochim. et Biophys. Acta, 45, 595 (1960).
126. Рога th J., Flodin P., Nature, 183, 1657 (1959).
127. Gelotte B. J., J. Chromatog., 3, 330 (1960).
128. Lindner E. B., Elmquist A., Рога th J., Nature, 184, 1565 (1959).
129. Weissenberger Technik of Organic Chem., Vol. Ill, part I, 2nd ed., New York, Inter-
science, 1956.
130. Sanger F., Advances in Protein Chem., 7, 1 (1952).
131. Zuber FL, Chimia, 14, 405 (1960).
132. S joquist J., Blomback B., W a 1 1 ё n P., Arkiv Kemi, 16, 425 (1961).
133. S joquist J., Arkiv Kemi, 14, 291 (1959).
134. V ogler K., Studer R. O., Lergier W., Helv. Chim. Acta, 44, 1495 (1961).
135. Guttmann St., Boissonnas R. A., Helv. Chim. Acta, 44, 1713 (1961).
136. Guttmann St., Pless J., Boissonnas R. A., Helv. Chim. Acta, 45, 170 (1962).
137. Huguenin R. L., Boissonnas R. A., Helv. Chim. Acta, 44, 213 (1961).
138. Vogler K., Studer R. O., Lergier W., Lanz P., Helv. Chim. Acta,
43, 1751 (1960).
139. Studer R. O., Vogler K., Lergier W., Helv. Chim. Acta, 44, 131 (1961).
139a. SchwyzerR., Kappeler H., Helv. Chim. Acta, 44, 1991 (1961).
139b. Schwyzer R., Dietrich H., Helv. Chim. Acta, 44, 2003 (1961).
140. Brenner M., P a t a к i G., Helv. Chim. Acta, 44, 1420 (1961).
141. R i n i к e r R., CIBA AG., Basel, частное сообщение.
142. Schwyzer R., Kappeler H., Helv. Chim. Acta, 44, 1137 (1961).
143. Guttmann St., SANDOZ AG., Basel, частное сообщение.
Гл. 19. Аминокислоты и производные
435
144. Schellenberg Р., Angew. Chem., 74, 118 (1962).
145. V ogler К., Н offmann-La Roche AG., Basel, частное сообщение.
146. V ogler К., Studer R. О., Lanz P., Lergier W., Bohni E., Expe-
rientia, 17, 223 (1961).
147. Hausmann W., J. Am. Chem. Soc., 78, 3663 (1956).
148. В i s e r t e G., Dautre vaux M., Bull. soc. chim. biol., 39, 795 (1957).
149. Brenner M., Zimmermann J. P., Wehrmiiller J., Quitt P.,
Hartmann A., Schneider W., Beglinger U., Helv. Chim. Acta, 40,
1497 (1957).
150. N iederwieser A., Pataki G., Chimia, 14, 378 (1960).
151. Sanger F., Biochem. J., 39, 507 (1945).
152. Sanger F., Biochem. J., 40, 261 (1946).
153. Sanger F., Biochem. J., 45, 562 (1949).
154. Porter R., Sanger F., Biochem. J., 42, 287 (1948).
155. Edman P., Acta Chem. Scand., 4, 283 (1950).
156. Biserte G., Holleman J. W., Holleman-Dehove J., Sauti-
ere P., J. Chromatog., 2, 225 (1959); 3, 85 (1960).
157. Levy A. L., C h u n g D., J. Am. Chem. Soc., 77, 2899 (1955).
158. D a v о 1 1 H., Turner R. A., Pierce J. G., Vigneaud V. du, J. Biol.
Chem., 193, 363 (1951).
159. Wallenfels K., Arens A., Biochem. Z., 332, 217 (1960).
160, Li С. H., A s h L., J. Biol. Chem., 203, 419 (1953).
161. T u p p у H., В о d о G., Mh. Chem., 85, 807 (1954).
162. Lockhart I. M., Abraham E. P., Biochem. J., 58, 633 (1954).
163. Levy A. L., L i С. H., J. Biol. Chem., 213, 487 (1955).
164. Desnuelle P., Fabre C., Biochim. et Biophys. Acta, 18, 49 (1955).
165. Porter R. R., Methods in Med. Research, 3, 256 (1951).
166. Middlebrook W. R„ Biochem. J., 59, 146 (1955).
167. S c a n e s F. S., T о z e г В. T., Biochem. .J., 63, 282 (1956).
168. Thompson A., Nature, 168, 390 (1951).
169. Mills G. L., Biochem. J., 50, 707 (1952).
170. Turba F., Gundlach G., Biochem. Z., 326, 322 (1955).
171. Bailey K., Bettelheim F. R., Biochim. et Biophys. Acta, 18, 495 (1955).
172. Braunitzer G., Chem. Ber., 88, 2025 (1955).
173. Levy A. L., Nature, 174, 126 (1954).
174. Zahn H., Pfannmiiller H., Biochem. Z., 330, 97 (1958).
175. Fahmy A. R., неопубликованные данные.
176. Hefendehl F. W., Planta Medica, 8, 65 (1960).
177. Lichtenberger W., Z. anal. Chem., 185, 111 (1962).
178. Edman P., Nature, 177, 667 (1956).
179. Edman P., Acta Chem. Scand., 10, 761 (1956).
180. Fraenkel-Conrat H., Harris J. J.,J. Am. Chem. Soc., 76, 6058 (1954).
181. S j 6 q u i s t J., Arkiv. Kemi, 11, 129 (1957).
182. S j 6 q u i s t J., Biochim. et Biophys. Acta, 41, 20 (1960).
183. Edman P., Acta Chem. Scand., 4, 277 (1950).
184. Djerassi C., Undheim K., Sheppard R. C., Terry W. G., S j 6-
berg B., Acta Chem. Scand., 15, 903 (1961).
185. Fraenkel-Conrat H., Methods of Biochem. Analysis, Vol. 2, p. 383, New York,
Interscience Publishers, 1955.
186. Cherbuliez E., Baehler Br., Lebeau M. C., Sussmann A. R.,
Helv. Chim. Acta, 43, 896 (1960).
187. Cherbuliez E., Sussmann A. R., Rabinowitz J., Pharmac. Acta
Helv., 36, 131 (1961).
188. Harris J. L, R о о s P., Biochem. J., 71, 434 (1959).
189. Schramm G., Schneider J. W., A n d e r e r A., Z. Naturforsch., 11b,
120 (1956).
190. Landmann W. A., Drake M. P., D i 1 1 a h a J., J. Am. Chem. Soc., 75,
3638 (1953).
191. S j 6 q u i s t J., Acta Chem. Scand., 7, 447 (1953).
192. Edman P.,' S j 6 q u i s t J., Acta Chem. Scand., 10, 1507 (1956).
193. Pataki G., Diss., Universitat Basel (1962).
194. Grothe J. W„ J. Biol. Chem., 93, 25 (1931).
195. Pastuska G., T r i n k s H., Chemiker Ztg., 85, 535 (1961).
196. Stahl E., Pharmazie, 11, 633 (1956).
E., Chemiker Ztg., 82, 323 (1958).
E., Parfumerie und Kosmetik, 39, 564 (1958).
E., Arch. Pharmaz., 292, 411 (1959).
E., Pharm. Rdsch., 1, Nr. 2, 1 (1959).
R., Helv. Chim. Acta, 36, 424 (1953).
197. Stahl
198. Stahl
199. Stahl
200. Stahl
201. Weber
28*
ГЛАВА 20
НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ И НУКЛЕОТИДЫ
X. Мангольд
I. ВВЕДЕНИЕ
1. НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ И ПРОДУКТЫ ИХ ГИДРОЛИЗА
Высокополимерные «истинные» нуклеиновые кислоты образуют в каче-
стве простетических групп нуклеопротеидов составную часть всех живых
организмов.
По принципу строения различают два типа полинуклеотидов: дезоксири-
бозы или дезоксирибонуклеиновые кислоты (ДНК) с молекулярным весом
до 10 миллионов и рибозы или рибонуклеиновые кислоты (РНК) с молеку-
лярным весом до 300 000.
Из дезоксирибонуклеиновых кислот, значительно более устойчивых
к действию щелочей, чем рибонуклеиновые кислоты, и требующих для
гидролиза других ферментативных систем, можно с помощью минеральных
кислот отщепить пурины и получить «тиминовые кислоты»; используя фер-
менты поджелудочной железы получают «олигонуклеотиды».
Оба типа нуклеиновых кислот состоят из мононуклеотидов, которые,
смотря по обстоятельствам, строятся по схеме:
основание — углевод — о-фосфорная кислота.
Если от мононуклеотидов, называемых иногда просто «нуклеиновыми»
кислотами, отщепить фосфорную кислоту, то образуются нуклеозиды.
Поскольку они происходят из дезоксирибонуклеиновых кислот, они содер-
жат пуриновые основания гуанин и аденин, а также пиримидиновые основа-
ния цитозин и тимин, присоединенные N-глюкозидной связью к дезоксири-
бозе, в некоторых дезоксирибонуклеиновых кислотах встречаются также
5-метилцитозин и 5-оксиметилцитозин. Четыре нуклеозида, получаемые
из рибонуклеиновых кислот, содержат те же пурины, а также пиримидино-
вые основания цитозин и урацил, связанные с рибозой.
Глюкозидная связь углеводофосфорных кислот в нуклеотидах имеет
место для пуринов у Ng, а для пиримидинов у N3. Остаток фосфорной кис-
лоты может быть присоединен к атомам С2 или С3 углевода.
Ниже приведены главные составные части нуклеиновых кислот:
Основания:
Пурины
Аденин (6-аминопурин)
Гуанин (2-амино-6-оксипурин)
Пиримидины
Цитозин (2-окси-6- аминопиримидин)
Урацил (2,6-диоксипиримидин)
Тимин (2,6-диокси-5-мети л пиримидин)
5-Метилцитозин и 5-оксиметилцитозин
Гл. 20. Нуклеиновые кислоты и нуклеотиды
437
Углеводы
Н Н Н Н ,Н
с—с—с—с—с<
1111 ^0
он он он он
Рибоза
н н н н ,н
Н- С -С- С— С — С/
1111 ^о
он он он н
2-Дезоксирибоза
Примеры нуклеозида и нуклеотида-.
Аденозин-2'-фосф ат
2. НУКЛЕОТИД-КОФЕРМЕНТЫ. . . .
Нуклеотид-коферменты по строению родственны мононуклеотидам, одна-
ко не являются составной частью высокомолекулярных нуклеиновых кислот.
К этой группе соединений относят аденозинтрифосфат (АТФ) и флавин-
адениндинуклеотид (ФАД), а также многие другие сложные фосфорные
эфиры, содержащие аденозин, гуанозин, цитидин или уридин. Известно,
например, только пять коферментов, которые происходят от цитидиндифос-
форной кислоты (ЦДФ): ЦДФ-холин, ЦДф-коламин, ЦДФ-диглицерид,
ЦДФ-глицерин и ЦДФ-рибит.
3. СТАРЫЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ
Определение содержания фосфора и азота всегда имело большое зна-
чение для анализа нуклеиновых кислот. Для идентификации и количествен-
ного определения пурина и пиримидина в продуктах гидролиза нуклеиновых
кислот использовали полупрепаративные методы выделения, различные
цветные реакции, а также полярографию и микробиологические методы.
В настоящее время эти методы анализа, за редким исключением, предста-
вляют только исторический интерес.
4. НОВЫЕ МЕТОДЫ РАЗДЕЛЕНИЯ ПРОДУКТОВ РАСЩЕПЛЕНИЯ
НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ И НУКЛЕОТИД-КОФЕРМЕНТОВ
В последние 15 лет были разработаны различные хроматографические
методы, позволяющие фракционировать высокомолекулярные нуклеиновые
кислоты; для этой же цели применяют электрофорез. Хроматографией на
бумаге и другими распределительными методами, а также ионообменной
хроматографией удалось выделить продукты гидролиза нуклеиновых кислот.
Определяя концентрации выделенных оснований, нуклеозидов, моно- и оли-
гонуклеотидов, в настоящее время проводят количественный анализ с очень
небольшим количеством гидролизата.
Эти современные методы подробно описаны Чаргафом и Давидсоном
[14] в первом томе опубликованного в 1955 г. труда по химии нуклеиновых
438
Специальная часть
Таблица 112
УФ-Спектры производных нуклеиновых кислот
Молеку- лярный вес Нормаль- ность раствора Максимум поглоще- ния, лцц Коэффи- циент экстинк- ции на милли- моль
Пурины и пиримидины Аденин . 135,13 0,1 НС1 262 13,1
Гуанин 151,13 0,1 НС1 249 11,1
Цитозин 111,10 0,1 НС1 276 10,0
Урацил 112,09 Вода 260 8,2
Тимин 126,11 0,1 НС1 265 7,95
5-Метилцитозин 125,13 0,1 НС1 283 9,8
5-Оксиметилцитозин . . . 141,14 0,1 НС1 279 9,7
Рибозиды Аденозин 267,25 Вода 259 15,4
Гуанозин 283,24 » 252 13,7
Цитидин 243,22 0,1 НС1 280 13,0
Уридин . 244,20 Вода 262 10,0
Рибозид-2'- и- 3'-монофос- фаты Аденозин-2' -монофосфат 347,23 Вода 260 15,0
Аденозин-3 '-монофосфат Гуанозин-2' -монофосфат 363,24 0,01 НС1 280 12,9
Гуанозин-3' -монофосфат Цитидин-2 '-монофосфат 323,21 0,01 НС1 278 12,7
Цитидин-3 '-монофосфат Уридин-2'-монофосфат . . 324,20 Na-Соль 260 10,0
Уридин-3'-монофосфат . . в воде
кислот. Соберье и Летерсон [81] опубликовали обзор по хроматографии нук-
леиновых кислот, а Кон [22] рассмотрел разделение производных нуклеиновых
кислот. В другой работе Кон [23] дал очень подробный анализ новейших
результатов и привел много еще не опубликованных данных. Химия нуклео-
зидполифосфатов хорошо представлена в справочнике, изданном Бойером,
Ларди и Мирбеком [6].
5. УФ-СПЕКТРЫ СОСТАВНЫХ ЧАСТЕЙ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ *
Значение УФ-спектров нуклеиновых кислот позволяет идентифицировать
и количественно анализировать отдельные производные нуклеиновых кислот
после разделения и элюирования. В табл. 112 приведены максимумы погло-
щения и молярные коэффициенты экстинкции этих веществ.
* Подробности можно найти в главе, написанной Бивеном, Холидеем и Джонсо-
ном, в 1 томе монографии «Нуклеиновые кислоты» Чаргафа и Давидсона [14]. Весьма
полезны также брошюры и таблицы, изданные следующими фирмамй: «Pabst Laborato-
ries, Division of Pabst Brewing Company», 1037 W. Me. Kinley Ave. (Милвоки 5, Вис-
консин, США), «California Corporation for Biochemical Research», 3625 Medford St. (Лос-
Анжелос 63, Калифорния, США); «Boehringer and Sohne G. m. b. Н.» (Мангейм, ФРГ).
Гл. 20. Нуклеиновые кислоты и нуклеотиды
439
6. ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ЦВЕТНЫЕ РЕАКЦИИ
Биуретовая реакция и проба с аргинином по Веберу [96] служат для
обнаружения пептидов в препаратах нуклеиновых кислот. Две другие цвет-
ные реакции — предложенная Дише проба на дезоксирибонуклеиновую
кислоту и флороглюциновая проба по Эйлеру и Хану — позволяют опре-
делить рядом оба вида нуклеиновых кислот.
а) Реакция Дише {29, 30]
50—500 Цг нуклеиновой кислоты растворяют в 1 мл воды и нагревают с 2 мл рас-
твора 1 г дифениламина и 2,75 мл концентрированной Н28СЦ в 100 мл ледяной уксусной
кислоты в течение 10 мин до 100°. В присутствии дезоксирибонуклеиновой кислоты рас-
твор окрашивается в синий цвет (максимум поглощения 595 лц). Трудногидролизуемые
пиримидиндезоксирибонуклеозиды и нуклеотиды в этих условиях не реагируют.
б) Реакция Эйлера и Хана [8, 32, 61]
Пробу, содержащую около 2 мг рибонуклеиновой кислоты в 1 мл, нагревают на
водяной бане с 8 мл 0,1%-ного раствора хлорида железа (III) в смеси концентрирован-
ной НС1 и ледяной уксусной кислоты (1 4~ 6) в течение 50 мин. Реакционную смесь охла-
ждают до комнатной температуры и добавляют 1 мл раствора 25% флороглюцина в смеси
концентрированной НС1, ледяной уксусной кислоты и воды (14-2 4-1). Спустя 20 мин
смесь нагревают Ь мин на водяной бане. При комнатной температуре окраска (максимум
поглощения 680 жц) достигает максимума через 10 час. Дезоксирибонуклеиновая кислота
при этом не окрашивается.
7. МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ
Различные методы получения нуклеиновых кислот дают продукты, сущест-
венно отличающиеся по составу и свойствам. Это объясняется присутствием
в большинстве растительных и животных тканей нуклеолитических фер-
ментов. Поэтому всегда работают при возможно более низкой температуре,
чтобы подавить действие ферментов, кроме того, пытаются добавлением
цитрата натрия [60] препятствовать образованию дезоксирибонуклеаз; рибо-
нуклеазы дезактивируют гуанидин-гидрохлоридом [95] или додецилсуль-
фатом [43].
Концентрированные растворы солей разрушают нуклеиновые кислоты,
вредно также нагревание. Разбавленные кислоты также разрушают нуклеи-
новые кислоты, разбавленные щелочи быстро гидролизуют рибонуклеиновые
кислоты.
Принимают, что ближе всего природным продуктам соответствуют высоко-
вязкие растворы нуклеиновых кислот* Хорошие препараты не должны содер-
жать протеинов, полисахаридов, липидов и неорганических солей. Чистые
нуклеиновые кислоты содержат около 9,2% фосфора и имеют максимум
поглощения в УФ-области в интервале 257—261 .пр при pH 7.
а) Приготовление дезоксирибонуклеата натрия
из зобной железы телят по Сигнеру и 1Пвандеру [76, 78]
Нуклеопротеид экстрагируют крепким раствором поваренной соли, затем
проводят расщепление, насыщая раствор поваренной солью, дезоксирибо-
нуклеат натрия повторно очищают осаждением этанолом из водного раствора.
450 г свежей зобной железы теленка нарезают маленькими кусочками и вместе
с сухим льдом пропускают через мясорубку. Эту кашицу измельчают при 0° небольшими
порциями в 4 л охлажденного льдом 1 М раствора хлористого натрия, содержащего
0,01 моль/л цитрата натрия в качестве яда фермента. Студенистую гомогенную смесь
несколько дней медленно перемешивают при 0° до образования красноватой весьма вяз-
440
Специальная часть
кой мутной жидкости. Этот раствор порциями по 830 мл наливают в 4,2 л охлажденной
льдом воды, для осаждения нуклеопротеидов. Осадок взмучивают в 0,01 М растворе
цитрата натрия и промывают способом декантации 8 л раствора 1%-ного по хлориду
натрия и 0,01|М по цитрату натрия. Затем нуклеопротеиды еще дважды растворяют,
каждый раз в 4 л раствора 1 М по хлориду натрия и 0,01 М по цитрату натрия, и вновь
осаждают, выливая в воду.
После переосаждения нуклеопротеид снова при перемешивании растворяют в 5 л
10%-ного раствора хлорида натрия, содержащего цитрат. Этот раствор насыщенным
раствором хлорида натрия доводят до объема 6 л и добавляют кристаллический хлори-
стый натрий до насыщения. После перемешивания в течение 4 дней при 0° раствор выдер-
живают еще две недели в холодильнике. Затем добавляют суспензию из 480 г целита 545
в 1,5 л насыщенного раствора хлорида натрия и смесь интенсивно перемешивают в тече-
ние 24 час. После этого раствор отсасывают через слой целита толщиной 5—10 мм между
двумя бумажными фильтрами при 40—50 мм рт. ст.
Осадок на фильтре, еще содержащий дезоксирибонуклеат, перемешивают с 1,5 л
насыщенного раствора хлорида натрия 24 час, а затем фильтруют. Оба фильтрата объ-
единяют, добавляют«гифлосуперцель» (10 г на 1 л), перемешивают несколько часов и вновь
фильтруют через слой целита. Для осаждения нуклеата прозрачный раствор вливают
в 1,5-кратное количество этанола, волокнистую массу многократно промывают 70%-ным
этанолом. Осадок отжимают и окончательно растворяют в 4,5 л воды, охлажденной
льдом, при многодневном перемешивании. Из этого водного раствора осаждают дезо-
ксирибонуклеат натрия при выливании в этанол (на 1 объем раствора 2 объема этанола).
Осадок промывают 80%-ным, 96%-ным, 100%-ным этанолом и наконец эфиром и высу-
шивают в вакууме над концентрированной H2SO4. Совершенно белый асбестоподобный
волокнистый препарат сохраняют в эксикаторе над насыщенным раствором хлористого
натрия. Он содержит меньше 0,5% протеина.
Выход дезоксирибонуклеата натрия, по данным авторов, равен 8 г, что составляет
1,8% от веса исходного материала.
Для получения дезоксирибонуклеиновых кислот часто применяют мето-
ды, предложенные Чаргафом и Цеменхофом [11] и Каем, Симмонсом и Доун-
сом [42].
б) Получение рибонуклеата натрия из органов животных
по Волъкину и Картеру [95]
Согласно этому методу, вначале удаляют дезоксирибонуклеиновую кис--
лоту в виде протеинового комплекса, затем из гуанидингидрохлоридного
раствора осаждают рибонуклеиновую кислоту и для дальнейшей очистки
ее обрабатывают хлороформом и повторно осаждают этанолом.
Готовят суспензию из 1 вес. ч. замороженной и хорошо измельченной животной
ткани и 3 вес. ч. охлажденного льдом буферного раствора (0,15 М хлорид натрия, 0,02 М
фосфат натрия pH 6,8) и 6—8 мин перемешивают при 2—5°. Во избежание образования
пены, рекомендуется добавление в суспензию нескольких капель октилового спирта.
Гомогенизат полчаса центрифугируют при температуре <5° и 3000 g. Осадок, содержа-
щий практически всю дезоксирибонуклеиновую кислоту в форме протеинового ком-
плекса, отбрасывают.
В отстоявшийся раствор при интенсивном перемешивании добавляют такое коли-
чество кристаллического гуанидин-гидрохлорида, чтобы создать 2 М концентрацию.
Этот раствор нагревают в течение получаса на водяной бане до 38°, а затем оставляют
на час при 0°. При этом образуется студенистый осадок, состоящий из рибонуклеиновой
кислоты и небольшого количества протеина.
Сырой продукт дважды промывают охлажденным до 0° 2 М гуанидин-гидрохлорид-
ным раствором в количестве, соответствующем введенному количеству ткани. Суспен-
зию рибонуклеиновой кислоты в водном растворе гуанидин-гидрохлорида встряхивают
в течение 30 мин с равным объемом 20%-ного раствора октилового спирта в хлороформе
при 40°, а затем центрифугируют. При этих же условиях еще два раза экстрагируют
верхнюю, водную фазу смесью октиловый спирт — хлороформ. После подкисления вод-
ного раствора гуанидин-гидрохлорида ледяной уксусной кислотой до pH 4,2—4,5 при
добавлении 2 объемов охлажденного до 0° этанола выпадает рибонуклеиновая кислота.
Белый хлопьевидный осадок отделяют центрифугированием и дважды промывают
70%-ным этанолом. Рибонуклеиновую кислоту растворяют в дистиллированной воде и pH
раствора осторожно, по каплям доводят разбавленной щелочью до 6,8. При этом может
образоваться осадок, состоящий из денатурированного протеина, легко отделяемый
центрифугированием. К прозрачному раствору рибонуклеата натрия добавляют столько
1 М хлорида натрия, чтобы его концентрация была 0,05 М. При добавлении 2 объемов:
Гл. 20. Нуклеиновые кислоты и нуклеотиды
444
охлажденного льдом этанола выпадает чистый рибонуклеат. Его еще дважды промывают
70%-ным этанолом и при вымораживании водного раствора получают в виде белого
порошка. Чистый продукт при концентрации 20 мг рибонуклеата натрия в 1 мл воды
не дает ни реакции Дише (см. стр. 439), ни биуретовой реакции (проба + 15% NaOH +
-j- 0,1%-ный раствор сульфата меди). Это доказывает отсутствие дезоксирибонуклеата
и протеина.
По данным авторов, выход составляет 20—30% от количества нуклеиновой кислоты,
имеющегося в исходном продукте.
Методы выделения рибонуклеиновых кислот, опубликованные Чаргафом
с сотрудниками [13], Крестфильдом, Смитом и Алленом [25], а также Каем
и Доунсом [43], использовались неоднократно.
8. МЕТОДЫ ГИДРОЛИЗА НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ
Гидролитическое расщепление нуклеиновых кислот может привести
к образованию олигонуклеотидов, мононуклеотидов, нуклеозидов, пури-
новых и пиримидиновых оснований, углеводфосфатов и свободных углево-
дов. Кроме того, всегда появляются еще вторичные продукты расщепления,
например продукты диаминирования аминопуринов и аминопиримидинов
или их нуклеозидов и нуклеотидов.
а) Кислый гидролиз
В обоих видах нуклеиновых кислот N-глюкозидная связь пурин — основание —
углевод особенно неустойчива к кислотам, тогда как пиримидиннуклеотиды и -нуклео-
зиды очень устойчивы по отношению к кислоте. Остаток фосфорной кислоты также-
легче отщепляется кислотой от пуриннуклеотидов, чем от пиримидиннуклеотидов. При
кипячении в течение 1—2 час с 0,5 н., 1 н. или 2 н. соляной или серной кислотой из рибо-
нуклеиновых кислот образуются пуриновые основания аденин и гуанин, а также пири-
мидиннуклеотиды, цитидиловая кислота и уридиловая кислота [54, 94].
Дезоксирибонуклеиновая кислота также образует с соляной кислотой при pH 1,6
аденин и гуанин, однако в большом количестве образуется высокомолекулярный остаток
нуклеиновой кислоты. Не содержащий пурина высокомолекулярный продукт, называе-
мый «тиминовой кислотой», имеет молекулярный вес около 15 000 и может быть очищен
диализом против раствора соляной кислоты при pH 1,6 и выделен в виде «апуриновой
кислоты» [86].
При нагревании в течение 3—5 час с метанолом, насыщенным НС1, при 50е из апу-
риновой кислоты или непосредственно из дезоксирибонуклеиновой кислоты можно полу-
чить цитозин- и тиминдезоксирибодифосфорные кислоты [53].
Расщепление пиримидиндезоксинуклеотидов и пиримидиннуклеозидов с умеренным
выходом осуществляют получасовым нагреванием при 175° с 98—100%-ной муравьиной
кислотой в толстостенной стеклянной трубке, запаянной с одного конца [94, 100]. Можно-
также проводить гидролиз с 72%-ной хлорной кислотой. Максимальный выход пуринов
и пиримидинов получают при нагревании в течение 1 час при 100° [59, 100].
б) Щелочной гидролиз'
Разбавленные водные растворы NaOH или КОН расщепляют рибонуклеиновые кис-
лоты до мононуклеотидов. Дезоксирибонуклеиновые кислоты при этих условиях почти
не реагируют, и поэтому обработкой 1 н. раствором NaOH при комнатной температуре-
или при 37° в течение часа можно отделить дезоксирибонуклеиновые кислоты от рибо-
нуклеиновых кислот [74, 85].
При нагревании в течение 3—4 час с концентрированным раствором аммиака до
175—180° или кипячении в течение 1 дня с пиридином можно перевести нуклеотиды
в нуклеозиды. Эта и аналогичные реакции идут с очень плохими выходами, и поэтому
в аналитических работах их нельзя использовать.
в) Ферментативный гидролиз
Ферментативное расщепление нуклеиновых кислот особенно хорошо зарекомен-
довало себя при исследовании структуры этих высокомолекулярных природных про-
дуктов.
442
Специальная часть
Фермент рибонуклеаза I из поджелудочной железы [41, 51] гидролизует рибону-
клеиновые кислоты до моно-, ди-, три- и тетра-нуклеотидов. Большая часть рибонуклеи-
новой кислоты постоянно остается непрореагировавшей. Рибонуклеаза I неактивна по
отношению к дезоксирибонуклеиновой кислоте, однако тиминовая кислота тоже час-
тично гидролизуется. Кристаллическая рибонуклеаза I имеется в продаже *.
Дезоксирибонуклеаза I из поджелудочной железы [2, 52] расщепляет высокомоле-
кулярные дезоксирибонуклеиновые кислоты до олигонуклеотидов и незначительно до
мононуклеотидов, большая часть скелета полинуклеотида остается без изменения. Рибо-
нуклеиновые кислоты при действии дезоксирибонуклеазы остаются без изменения. Кри-
сталлическая дезоксирибонуклеаза I имеется в продаже *.
Относительно низкомолекулярные продукты гидролиза рибо- или дезоксирибону-
клеиновых кислот можно отделить от высокомолекулярных осколков диализом.
Дезоксирибонуклеазы змеиного яда могут расщепить дезоксирибонуклеиновые
кислоты полнее, чем дезоксирибонуклеаза I поджелудочной железы.
Известны также ферменты нуклеотидазы, которые дефосфорилируют мононуклео-
тиды в нуклеозиды. Все эти ферменты еще недостаточно изучены.'
Относительно свойств и применения различных нуклеаз и нуклеотидаз отсылаем
читателя к специальной литературе [14, 51, 52, 60].
II. АНАЛИЗ МЕТОДОМ ХТС ПРОИЗВОДНЫХ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ
1. АНАЛИЗ МЕТОДОМ ХТС НА ЦЕЛЛЮЛОЗЕ И СИЛИКАГЕЛЕ
Разделение продуктов расщепления нуклеиновых кислот на фильтро-
вальной бумаге было описано впервые Фишером и Чаргафом [93, 94], а также
Хотчкиссом [40]. В лаборатории Чаргафа для количественного анализа
рибонуклеиновых кислот [13, 94], дезоксирибонуклеиновых кислот [12, 15]
и апуриновой кислоты [88[ использовали хроматографию на бумаге. Этот
метод развит и усовершенствован в основном Маркхамом и Смитом [57,
58], Картером [11, 19] и Уайаттом [100, 101].
Методом хроматографии на бумаге Уайатт [99,100] открыл 5-метилцитозин
в растительных и животных дезоксирибонуклеиновых кислотах, а Уайатт и
Коген [102] этим же методом обнаружили в дезоксирибонуклеиновой кислоте
одного бактериофага 5-оксиметилцитозин.
Методы хроматографии на бумаге для анализа нуклеиновых кислот под-
робно описаны во многих работах [5, 34], в особенности следует указать
на написанную Уайаттом главу в первом томе серии «Нуклеиновые кислоты»
[14].
Распределительную хроматографию на бумаге используют в качестве
быстрого стандартного метода анализа нуклеиновых кислот. Ионообменная
хроматография на колонках (см. стр. 446) нашла применение прежде всего
для препаративного выделения мононуклеотидов и высокомолекулярных
продуктов гидролиза дезоксирибонуклеиновых кислот. Опыты по фрак-
ционированию на крахмале [26, 31] или на адсорбенте [55, 56] не привлекли
достаточного внимания.
Рандерат первым описал анализ методом ХТС нуклеиновых оснований,
нуклеозидов и мононуклеотидов [68—71], а также анализ нуклеотид-поли-
фосфатов и нуклеотид-коферментов [71—73]. По эффективности разделения
ХТС на целлюлозе и силикагеле Г превосходит хроматографию на бумаге
[69, 70]. При получении хроматограммы на слое целлюлозы и хроматограм-
мы на бумаге при совершенно одинаковых условиях пятна на тонком цел-
люлозном порошке получаются меньше и более резко очерченными, чем
на волокнистой бумаге [71]. Кроме того, для разделения производных нук-
леиновых кислот методом ХТС затрачивается меньше времени, чем для раз-
деления методом хроматографии на бумаге [70—72].
* Фирма «Worthington Biochemical Corp.» (Фрихолд, США).
Гл. 20. Нуклеиновые кислоты и нуклеотиды
443
Условия разделения
а) Неподвижная фаза
Можно применять целлюлозный порошок, содержащий гипс в качестве
связующего материала (MN 300 G), или чистую целлюлозу (MN 300).
Целлюлозный слой, содержащий гипс, наносят в виде водной суспензии
(см. стр. 40) и высушивают 10—30 мин при 105—110° по прописи изготови-
теля. Рандерат [71] рекомендует сушить такие слои при комнатной темпе-
ратуре 12 час. Этот же автор наносит целлюлозный порошок без гипса в виде
суспензии в ацетоне. Пластинки с нанесенным слоем высушивают 3—5 мин
в токе теплого воздуха, после чего они сразу же пригодны к использованию.
Приготовление пластинок с силикагелем Г описано на стр. 39. Здесь
следует также отметить исследования Тайхерта, Мучлера и Рохельмайера
[89] по разделению важных в фармацевтическом отношении метилпуринов
на забуференном силикагеле Г (см. также стр. 310).
б) Растворитель
Согласно Тамму, Шапиро, Лифшицу и Чаргафу [88], дистиллированная
вода пригодна для разделения методом хроматографии на бумаге пурин-
и пиримидин-оснований и их нуклеозидов. Рандерат [69, 71], а также Ран-
дерат и Струк [70] нашли, что вода обеспечивает также хорошее разделение
на слое целлюлозы в течение 45 мин. Рандерат [69] использовал воду для
фракционирования нуклеооснований и нуклеозидов на силикагеле Г.
Изомерные пуринмононуклеотиды успешно разделяют на слоях целлю-
лозы по методу Рандерата [71, 73], используя следующие, предложенные
Маркхамом и Смитом [58] растворители. Растворитель насыщенный водный
раствор сульфата аммония — 1 М цитрат натрия — изопропанол (80 +
+ 18 + 2) в течение 90 мин поднимается на 10 см (см. рис. 177). Растворитель
трет-А мил о вый спирт — муравьиная кислота — вода (30 + 20 + 10), впер-
вые описанный Михельсоном [62], также обеспечивает, по Рандерату [71],
за 120 мин прекрасное разделение нуклеотидов на целлюлозе. Для разделе-
ния мононуклеотидов этот растворитель подходит лучше, чем все другие ука-
занные здесь системы (см. табл. 114).
Рандерат и Струк [70] рекомендуют для фракционирования нуклеозид-
монофосфатов, нуклеозиддифосфатов и нуклеозидтрифосфатов на бумаге
или слое целлюлозы смесь н-бутанол — ацетон — ледяная уксусная кис-
лота — 5%-ный аммиак — вода (9 + 3 + 2 + 2 + 4) (табл. 114). Если зти
же компоненты смешать в соотношении 7 + 5. + 3 + 3 + 2, то получится
растворитель, дающий хорошее разделение на слое целлюлозы (табл. 114)
и пригодный также для фракционирования нуклеотидов на слое силикагеля Г
[71]. Для достижения сравнимых результатов с этой системой в случае
слоя целлюлозы достаточно 90 мин, в то время как в случае силикагеля Г
необходимо 150 мин. Щелочные растворители, конечно, не могут быть непо-
средственно использованы на силикагеле Г для разделения сильнокислых
нуклеотидов. Рандерат [69] указывает, что добавка 15 г этилендиаминте-
трауксусной кислоты на 200 мл растворителя улучшает разделение.
в) Методы обнаружения
Как на бумажной хроматограмме [10, 38], так и на слое целлюлозы пурин-
и пиримидин-основания, нуклеозиды и нуклеотиды можно обнаружить в свете
коротковолновой УФ-лампы * [70]. Так еще можно обнаружить около
* «Mineralight» (максимальная эмиссия 260 мц фирмы «Ultraviolet Products, Inc.»
(Сан-Габриель, Калифорния, США).
444
Специальная часть
10~3 цмоля аденинпроизводного; для цитозин- и урацилсоединений предел:
обнаружения лежит несколько выше [72].
Сильное поглощение коротковолнового УФ-света неорганическим слоем
уменьшает чувствительность обнаружения осколков нуклеиновых кислот.
Добавкой флуоресцирующего вещества к силикагелю Г или последующим
опрыскиванием хроматограммы раствором флуоресцеина [98] (реактив
№90в) можно несколько понизить нижнюю границу обнаружения этих сое-
динений [73].
Метод фотокопий [57] для локализации и регистрации производных нук-
леиновых кислот непригоден в случае пластинок с нанесенными на них слоя-
ми [72]. Цветные реактивы, употребляемые в хроматографии на бумаге-
продуктов гидролиза нуклеиновых кислот, до настоящего времени не при-
менялись для тонкослойных хроматограмм. Все реактивы, служащие для
обнаружения пентоз в нуклеозидах и 5-нуклеотидах, а также реактивы,
реагирующие с эфирами фосфорной кислоты, являются весьма ценным допол-
нением к методу обнаружения в УФ-свете. Реактив тетраацетата свинца [9]
должен быть пригоден для обнаружения нуклеозидов и нуклеотидов на тон-
кослойных хроматограммах; для обнаружения нуклеотидов должна быть-
пригодна также реакция Хейнса и Ишервуда [37].
Применение и результаты
В табл. 113 проведено сравнение разделения нуклеооснований и нуклео-
зидов на слоях целлюлозы, силикагеля Г, эктеола (ионообменник) и бумаге.
Таблица 113
Разделение методом ХТС и методом хроматографии
на бумаге пуринов и пиримидинов, а также
их нуклеозидов (растворитель —• вода) [69]
R/X 100
СЛОЙ эктеолаа слой целлю- лозы® бумага® слой силика- геля Г2
Аденин . . 29 30 38 57
Аденозин 56 53 56 75
Гуанин . . 33 37 38 66
Г уанозин 50 58 57 80
Цитозин . . — — — —
Цитидин 82 80 77 76
Урацил . . 73 72 75 78
Уридин . . 84 81 84
а Емкость обменника 0,26 мг-экв N/г.
® «MN 300», фирма «Macherey, Nagel und Со».
в Эдерол «202», фирма «Binzer».
г Силикагель по Шталю для хроматографии в тонком
слое, фирма «Merck».
Поразительным является хорошее совпадение величин Rf пуриновых
оснований и пуриннуклеозидов на слое эктеола, на слое целлюлозы и на
бумаге (на силикагеле Г величины Rf оказались значительно выше). Раз-
личные пиримидины и пиримидиннуклеозиды имеют на этих трех раздели-
тельных слоях и на бумаге почти тождественные величины Rf.
Гл. 2 0. Нуклеиновые кислоты и нуклеотиды
445
На слоях эктеола и целлюлозы можно лучше отделить основания от соот-
ветствующих нуклеозидов, чем на силикагеле Г. В противоположность этому,
для фракционирования оснований неорганический слой подходит лучше,
чем слои эктеола или целлюлозы. В отношении разделения нуклеозидов
эти три различных материала оказываются примерно равноценными.
Рис. 177. Сравнение тонкослойнохроматографического и бумажнохроматографического
разделения в идентичных условиях по Рандерату [71].
•Слева —^разделение нуклеотидов на слое целлюлозы («MN 300 G»); справа — разделение этих же
веществ на бумаге (шляйхер и шюль № 2043 б). Растворитель: насыщенный водный раствор сульфата
аммония — 1 МЗацетат натрия — изопропанол (80 + 18 + 2); время анализа 1;5 час (ХТС), 2 час
(БХ); обнаружение: коротковолновый УФ-свет 260 лщ; пробы: АМФ, АДФ и АТФ по 10-2 ц-моля,
2'-, З'-АМФ и ГМФ по 1,5-10-2 цмоля, цитидил-и уридилкислота по 3-10-2 щмоля. 8 —адено-
зин-З'-фосфат, 9 —аденозин-2'-фосфат, 10 —гуанозин-З'-фосфат, 11 —гуанозип-2'-фосфат, 12 —ци-
тидинфосфаты, 13 — уридинфосфаты, 14 — аденозин-5'-монофосфат, 15 — аденозиндифосфат,
16 — аденозинтрифосфат.
Анализ нуклеиновых оснований и нуклеозидов на слоях эктеола, целлю-
лозы и силикагеля Г превосходит хроматографию на бумаге по чувствитель-
ности обнаружения разделяемых веществ, а также по четкости разделения
Таблица 114
Разделение 5'-моно-, ди- и трифосфатов на слоях
целлюлозы «MN 300» [69—71]
R/X 100
I* IIя Ша
Аденозин-5'-монофосфат 52 35 38
Аденозиндифосфат 29 17 26
Аденозинтрифосфат 16 8 16
Гуанозин-5'-монофосфат
Гуанозиндифосфат
Гуанозинтрифосфат . . .
Цитидин-5'-монофосфат 48 30 34
Цитидиндифосфат 27 13 22
Цитидинтрифосфат .... 13 7 13
Уридин-5'-монофосфат . . . 47 30 37
Уридиндифосфат 26 14 25
Уридинтрифосфат 13 8 17
а Растворители: I mpem-амиловый спирт — муравьиная кисло-
та — вода (3+2+1), время 120 мин; II н-бутанол — ацетон — ледя-
ная уксусная кислота — 5%-ный аммиак — вода (7-)-5-)-3-)-3-)-2),
время 90 мин; III н-бутанол — ацетон —ледяная уксусная кис-
лота — 5%-ный аммиак - вода (9+3+2+2+4), время 50-60 .мин.
446
Специальная часть
и затратам времени. Можно считать, что ХТС оправдала себя в химии нуклеи-
новых кислот и как микропрепаративный метод.
Разделение нуклеотидов — включая нуклеозидполифосфаты — методом
ХТС на целлюлозе также лучше, чем разделение методом хроматографии
на бумаге. Это следует из рис. 177.
Рандерат [71] указывает, что вес слоя целлюлозы на единицу площади
составляет от половины до трети веса фильтровальной бумаги, применяемой
при хроматографии на бумаге (4 мг!смг для слоя целлюлозы, 8—12 мг!см2 для
бумаги). Этот же автор предполагает, что заметное преимущество тонкослой-
ной хроматографии на целлюлозе по сравнению с бумажной хроматографией
определяется различием в тонкой, структуре обеих неподвижных фаз.
Описанные здесь методы разделения еще не применялись для анализа
продуктов гидролиза нуклеиновых кислот, однако вполне вероятно, что
метод ХТС скоро заменит бумажнохроматографические методы анализа.
Для фракционирования нуклеотидов ионообменные слои подходят еще
лучше, чем целлюлоза или силикагель Г. Ионообменная тонкослойная хрома-
тография производных нуклеиновых кислот описана в следующем разделе.
2. РАЗДЕЛЕНИЕ МЕТОДОМ ИОНООБМЕННОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
Продукты гидролиза нуклеиновых кислот содержат кислые и основные
группы. Общий заряд таких амфотерных молекул определяет значение pH
их раствора.
Кон, впервые сообщивший в 1949—1950 гг. о ионообменной хроматогра-
фии осколков нуклеиновых кислот на синтетических обменных смолах
[16—18], затем указал, что разделение этих веществ нужно проводить
методом анионо- или катионообменной хроматографии [23]. Он применил
оба вида хроматографии для разделения пуринов и пиримидинов [16],
нуклеозидов и нуклеотидов [17—19, 24, 46].
Ионообменная хроматография в колонках со смолой • дауэкс * привела
к открытию и разделению изомерных 2'- и 3'-мононуклеотидов [18]. Таким
же образом были найдены и другие новые мононуклеотиды [18, 20, 27, 28].
Смилли [79] фракционировал мононуклеотиды из рибонуклеиновой кислоты
на ионообменной бумаге. Он применил целлюлозную бумагу, пропитанную
обменником амберлит **.
Последовательность элюирования отдельных соединений должна опре-
деляться их зарядом, однако на практике она часто не соответствует теоре-
тически ожидаемой. В качестве причины указывают на адсорбирующее дей-
ствие ионообменника [18, 22]. Пурины вообще адсорбируются сильнее
пиримидинов. Можно, например, наблюдать, что производные урацила элюи-
руются раньше производных гуанина, хотя на основании общего заряда этих
соединений можно было ожидать обратной последовательности.
Петерсон и Собер [67, 80] несколько лет назад описали приготовление
двух типов ионообменников из целлюлозы. «ДЭАЭ-целлюлоза» (диэтилами-
ноэтилцеллюлоза) и «эктеола-целлюлоза» (приготовляется из алкалицел-
люлозы реакцией с эпихлоргидрином и триэтаноламином) с тех пор неодно-
кратно использовались для фракционирования протеинов. Бендих и сотруд-
ники [3, 4], Бредли и Рих [7], а также Клоувен и Вейфенбах [49] применили
этот обменник для фракционирования нуклеиновых кислот. Стехелин [83]
разделил нуклеозидмонофосфаты, -дифосфаты и -трифосфаты. Стехелин,
Петерсон, и Собер [82] провели хроматографический анализ ди- и тринуклео-
тидов из дрожжевой рибонуклеиновой кислоты на целлюлозе ДЭАЭ.
* Фирма «Dow Chemical Company» (Мидленд, Мичиган, США).
** Фирма «Reeve Angel and Со.» (Клифтон, Нью-Джерси, США).
Гл. 20. Нуклеиновые кислоты и нуклеотиды
447
Подробный анализ процесса хроматографии нуклеиновых кислот и их
продуктов гидролиза на ионообменнике был опубликован Коном [14, 22, 23],
а также Собером и Петерсоном [81]. Рандерат впервые описал фракциониро-
вание низкомолекулярных осколков нуклеиновых кислот (нуклеиновых
оснований, нуклеозидов и мононуклеотидов) на эктеола [68, 69, 73] и на
слоях ДЭАЭ [72, 73]. Он установил, что нуклеотиды можно разделить мето-
дом ионообменной ХТС значительно быстрее и лучше, чем при использовании
других методов; кроме того, метод ХТС значительно чувствительнее метода
хроматографии на бумаге.
Хроматографическое поведение различных продуктов расщепления нук-
леиновых кислот в данном растворителе можно предсказать с некоторой
точностью из физических данных. Рандерат [73] считает это существенным
преимуществом аналитической ионообменной хроматографии в тонком слое
по сравнению с распределительной и адсорбционной хроматографией. Ран-
дерат [73] указал на то, что метод ХТС на модифицированной целлюлозе
можно также использовать для микропрепаративного разделения.
Условия разделения
а) Ионообменный слой
Недавно две фирмы * выпустили на рынок ионообменный порошок для
хроматографии в тонком слое. Рандерат [73] использовал продукт фирмы
«Serva-Entwicklungslabor». Пока нет данных об их особых свойствах ионо-
обменников серии «MN» и об их применении для фракционирования продук-
тов расщепления нуклеиновых кислот.
• Приготовление слоев эктеола и ДЭАЭ подробно описано в разделе сор-
бенты на стр. 40.
Киясу [48] работал со слоями, состоявшими из смеси ионообменной
смолы ** дауэкс 1 или дауэкс 50 с силикагелем Г. Способность этого слоя
прилипать ничтожна, поэтому водный растворитель подается с полоски бумаги
шириной 2—3 см, укрепленной вдоль нижней кромки пластинки. Пригодность
такого смешанного слоя для разделения производных нуклеиновых кислот
еще не изучена систематически.
б) Растворитель
Для оптимального разделения продуктов гидролиза нуклеиновых кислот
на колонках с ионообменными смолами необходим градиент элюирования,
т. е. непрерывное или ступенчатое изменение концентрации ионов или pH
вымывающего раствора или того и другого. Рандерат [73] сообщает, что
на ионообменном слое из модифицированной целлюлозы (эктеола или ДЭАЭ)
можно добиться разделения, наблюдаемого на колонках с ионообменной
смолой (дауэкс) только при применении градиента элюирования. Этот автор
предполагает, что при использовании метода ХТС «вследствие фронтального
разделения растворителя на слое возникает градиент, которым и объясняется
хорошее разделение».
Хроматографический анализ проводят всегда в открытых сосудах,
заполненных растворителем на высоту 1 —1,5 см. За ходом процесса хромато-
графического разделения можно проследить с помощью УФ-лампы в отра-
женном свете. После достижения необходимого разделения пластинки сушат
в токе теплого воздуха и копируют хроматограмму в УФ-свете на целло-
фан [73].
* Фирмы «Serva-Entwicklungslabor» и «Machery, Nagel und Со.»
** Фирма «The Dow Chemical Company» (Мидленд, Мичиган, CHIA).
448
Специальная часть
Слой эктеола, в зависимости от растворителя, может служить в качестве
неподвижной фазы при распределительной хроматографии или в качестве
ионообменника. Дистиллированная вода в качестве растворителя пригодна
для разделения пуринов и пиримидинов, а также их нуклеозидов, на слоях
Р и с. 178. Разделение производных нуклеиновых кислот
на слое ионообменника [69]. Величина Rf как функция
концентрации поваренной соли в растворителе.
Ионообменник эктеола (емкость 0,26 мг-экв N/г); растворитель
0,1 — 0,7 М растворы поваренной соли; длина пути » 10 см;
время анализа 15 мин. А аденозин-5'-монофосфат, аденозинди-
фосфат, д аденозин, □ аденин.
эктеола — главным образом в распределительной хроматографии. Время
анализа составляет около 15 мин (см. табл. ИЗ) [69].
Мононуклеотиды и нуклеотидполифосфаты разделяют на слоях эктеола
методом ионообменной хроматографии; в качестве растворителя' пригоден
разбавленный водный раствор хлорида натрия (табл. 115 и 117). Как пра-
вило, удовлетворительного разделения достигают за 15 мин. Величины Rf
нуклеотидов являются функцией концентрации хлорида в растворителе;
•скорость движения нуклеиновых оснований и нуклеозидов не зависит от
концентрации хлорида. Это отчетливо видно из рис. 178, который заимство-
ван из работы Рандерата [69].
Таблица 115
Разделение мононуклеотидов на эктеола
методом ХТС [69]
Rf X 100 Rf X 100
Аденозин-3 '-фос- фат Гуанозин-3'-фос- фат Цитидин-3 '-фос- фат Емкость обменяй! рид натрия; время 15 48 44 71 са 0,41 мг- мин. Уридин-З'-фосфат Высокомолекуляр- ные рибонуклеи- новые кислоты 8KeN/a; растворитель 75 00 ), 15 М хло-
Таблица 116
Разделение нуклеозидполифосфатов на ДЭАЭ методом ХТС [72, 73]
Х100 хюо
1а на 1а па
Аденозинди фосфат 68 Аденозинтрифосфат 56
Гуанозиндифосфат 51 Гуанозинтрифосфат 41
Цитидиндифосфат . . — Цитидинтрифосфат 64
Уридиндифосфат . . 25 Уридинтрифосфат 18
а Растворители: I 0,03 н. соляная кислота, время 40 мин; II 0,04 н. соля-
ная кислота, время 100 мин.
Гл. 20. Нуклеиновые кислоты и нуклеотиды
449
0,15 М хлорид натрия пригоден для фракционирования нуклеозидмоно-,
-ди- и -трифосфатов [69] (см. табл. 117) и для отделения пуриннуклеозид-З'-
фосфатов от соответствующих пиримидовых соединений [69] (см. табл. 115).
В течение 15 мин растворитель поднимается приблизительно на 8 см.
Таблица 117
Разделение 5'-моно, ди- и трифосфатов на ионообменнике [68, 69, 72]
Эктеолаа Rf хЮО ДЭАЭ6 Rf Х100 Эктеолаа Rf Х100 ДЭАЭ6 Rf Х100
1 II 111 IV 1 II 111 1 IV
Аденозин-5 '-моно- фосфат 57 26 45 65 Цитидин-5 '-монофос- фат 74 31 46 65
Аденозиндифосфат . . 36 8 24 48 Цитидиндифосфат 51 И 31 53
Аденозинтрифосфа т 21 — 6 И Цитидинтрифосфат 34 — 9 13
Гуанозин-5 '-моно- фосфат 55 14 36 60 Уридин-5'-мон0фос- фат 80 13 31 49
Гуанозиндифосфат 37 3 9 27 Уридиндифосфат . . 63 0 7 15
Гуанозинтрифосфат 17 — 5 7 Уридинтрифосфат . . 44 — 4 4
а Емкость обменника 0,41 мг-экв N/г.
Растворители: I — 0,15 М хлорид натрия, время 15 мин; II — 0,01 н. соляная кислота, время 15 мин.
б Растворители: III — 0,01 н. соляная кислота, время 40 мин; IV — 0,02 н. соляная кислота,
время 40 мин.
Особенно хорошего, разделения нуклеотидов на эктеола достигали за
15 мин с 0,01—0,07 н. соляной кислотой в качестве растворителя [73] (см.
табл. 117). Смеси, содержащие по 0,1 рмоля аденозиндифосфата и аденозин-
трифосфата, разделяют полностью всего за 4—5 мин, используя 0,05—
0,07 н. соляную кислоту.
На слое ДЭАЭ в качестве растворителя также применяют водную соляную
кислоту [72] (см. табл. 117 и рис. 180, а — в). Время опыта на ДЭАЭ несколь-
ко больше, чем на эктеола: 0,1 н., 0,02 н. и0,03 н. соляная кислота разделяет
за 40 мин на пути 8,5—10 см нуклеозидмоно-, -ди- и -трифосфаты одинако-
вых оснований. Для разделения нуклеозидтрифосфатов 0,04 н. соляной кис-
лотой требуется 90 мин. Растворитель за это время перемещается на 12—13 см.
Микропрепаративное разделение смеси, содержащей по 2 мг аденозиндифос-
фата и аденозинтрифосфата, на пластинке 20 X 20 см 0,03 н. соляной кисло-
той требует около 90 мин.
в) Методы обнаружения
Слои эктеола и ДЭАЭ незначительно поглощают УФ-свет, и поэтому
при освещении коротковолновым УФ-светом (см. стр. 443) можно еще обна-
ружить 5 х 10“4 рмоля адениннуклеотида [73]. Производные аденина, цито-
зина и урацила появляются в виде темно-синих, производные гуанина —
в виде светло-синих флуоресцирующих пятен.
Применение и результаты
Результаты разделения методом ионообменной хроматографии в топких
слоях приведены в табл. 113—117 и на рис. 178 и 180. Различный отрица-
тельный заряд нуклеозидмоно-, -ди- и -трифосфатов обеспечивает групповое
разделение; монофосфаты движутся быстрее дифосфатов, дифосфаты — быст-
29 Заказ № 734
450
Специальная часть
рее трифосфатов. Общий отрицательный заряд внутри каждой такой группы
увеличивается в следующем ряду: цитидин-, аденин-, гуанин-, урацилпроиз-
водное (рис. 179).
Рис. 179. Зависимость между
общим зарядом и величи-
ной pH для мононуклеотидов
рибонуклеиновых кислот [14].
1 — З'-ЦМФ, 2 — 5'-АМФ
3 —З'-АМФ, 4 — З'-ГМФ
5 — 3-УМФ.
В самом деле наблюдается соответственное уменьшение скорости дви-
жения: при применении соляной кислоты в качестве растворителя цитозин-
и адениннуклеотиды имеют всегда более высокие величины Aj, чем соот-
ветствующие гуанинпроизводные, а последние — более высокие величины
Я/, чем урацилнуклеотиды (табл. 116 и 117, также рис. 180 и 181).
Рис. 180. Тонкослойные
хроматограммы на слоях целлюлозы ДЭАЭ[73].
Ионообменник ДЭАЭ, емкость 0,34 .чг-экв N/г; растворитель 0,01 н. (а), 0,02 н. (б), 0,03 н. (в) со-
ляная кислота; время анализа 40 (а, б) и 100 (в) мин', обнаружение: в коротковолновом УФ-свете
(260 лщ) 1 — аденозин-5'-монофосфат, 2 — аденозиндифосфат, з—аденозинтрифосфат, 4—гуано-
зин-5'-монофосфат, 5 — цитидин-5-монофосфат, в — уридин-5'-монофосфат, 1 — гуанозиндифос-
фат, з — цитидиндифосфат, 9 — уридиндифосфат, 10 — гуанозинтрифосфат, 11 — цитидинтри-
фосфат, 12 — уридинтрифосфат.
Эффект разделения в случае слоев эктеола и ДЭАЭ почти одинаков, но
на ДЭАЭ пятна получаются особенно небольшими и резко очерченными [731
(табл. 1,17).
0,05—0,12 М водным раствором хлорида натрия можно полностью разде-
лить аденин- и цитозиннуклеотиды одной группы, которая плохо фракцио-
нируется соляной кислотой [73]. При этом пятна менее размыты.
Анализ нуклеотидов на ионообменниках методом ХТС превосходит все
применяемые до настоящего времени аналитические методы разделения.
В особенности следует отметить значительную экономию времени при при-
менении этого нового метода. Высокая емкость обменного слоя позволяет
осуществить также микропрепаративное разделение.
Гл. 20. Нуклеиновые кислоты и нуклеотиды
451
Применение описанных здесь методов для ана-
лиза продуктов гидролиза нуклеиновых кислот
пока неизвестно.
3. ДИСКУССИЯ
Биологические свойства нуклеиновых кислот,
вероятно, определяются последовательностью их
осколков (см., например, [33, 35, 75]), и поэтому
большой интерес представляет установление по-
следовательности мононуклеотидов в молекуле
полинуклеотида [15].
Хроматографические методы, позволившие раз-
делить продукты химического или ферментативного
гидролиза нуклеиновых кислот, сделали возмож-
ным в последние годы объяснение строения послед-
них [14, 15, 44, 91], Эти методы служат также для
анализа мононуклеотидов [91, 92], олигонуклеоти-
дов и смесей полинуклеотидов, получающихся при
химическом синтезе [36, 44, 45, 90] или под дей-
ствием ферментов [50, 65, 66].
Ионообменная хроматография в колонках со
смолой дауэкс служит для аналитического и пре-
паративного фракционирования низкомолекуляр-
ных продуктов, в частности моно-, ди-, три-и тетра-
нуклеотидов. Нуклеотидполифосфаты и другие нук-
леотидкоферменты разделяют также главным обра-
Рес. 181. Тонкослойная
хроматограмма нуклео-
зидтрифосфатов на слое
целлюлозы ДЭАЭ$ [73].
Растворитель 0,04 н. соляная
кислота. Нумерацию см. на
рис. 180.
зом на дауэксе. Высокомолекулярные нуклеотиды, включая «неизменные»
нуклеиновые кислоты из растительных и животных тканей, фракционируют
чаще всего на колонках с модифицированной целлюлозой эктеола или ДЭАЭ.
Некоторые результаты, полученные в этой области, были приведены на
стр. 446; здесь следует еще раз указать на последний большой обзор Кона [23]
по хроматографическому анализу нуклеиновых кислот и родственных соеди-
нений. В этой работе излагаются теоретические основы ионообменной хрома-
тографии и приводятся многие не опубликованные результаты, полученные
в лабораториях Кона и Петерсона иСобера, а также Корана (см. также [44]).
Колоночная хроматография весьма тщательно разработана и позволяет
добиться прекрасного разделения; однако низкомолекулярные осколки нук-
леиновых кислот можно столь же успешно разделить и методом ХТС на ионо-
обменниках при меньшей затрате труда и времени. Хотя до настоящего вре-
мени метод ХТС применяли только для разделения пуриновых и пиримиди-
новых оснований, нуклеозидов и мононуклеотидов, можно полагать, что
на слоях эктеола и ДЭАЭ можно разделить также олигонуклеотиды, апури-
новые кислоты и высокомолекулярные рибо- и дезоксирибонуклеиновые
кислоты. Этот метод может оказаться пригодным также для анализа угле-
водных компонентов нуклеиновых кислот [84] (см. стр. 456) — в виде их
обратных комплексов (см, [21]),— а также о-фосфорной кислоты и полифос-
форных кислот [77] (см. стр. 473). В связи с этим следует отметить анализ
методом ХТС птеридинов [63], фармацевтически важных пуриновых и пири-
мидиновых производных (см. стр. 310) и водорастворимых витаминов
(см.стр. 236). Особенно важной является работа Нюрнберга по анализу мето-
дом ХТС витаминов группы В6 и амида никотиновой кислоты [64].
Метод ХТС облегчает открытие еще неизвестных пуринов и пиримидинов
[1, 97], а также их нуклеозидов и нуклеотидов [20, 27] в продуктах гидро-
лиза нуклеиновых кислот.
29*
452
Специальная часть
Если бы удалось полностью элюировать с сорбционного слоя продукты
расщепления нуклеиновых кислот, разделенных методом ХТС, то комби-
нация этого метода с УФ-спектрофотометрией обеспечили бы количествен-
ный анализ нуклеиновых кислот. Весьма перспективной кажется комбина-
ция метода ХТС с электрофорезом в тонких слоях [39] (см. стр. 430)
(ср. [14]).
ЛИТЕРАТУРА
1. Adler М., Weissmann В., Gutman А. В. J. Biol. Chem., 230, 717 (1958).
2. А г a k i Т., Hoppe-Seyler’s Z. physiol. Chem., 38, 84 (1903).
3. Bendich A., Fresco J. R., Rosenkranz H. S., Beiser S. M., J.
Am. Chem. Soc., 77, 3671 (1955).
4. Bendich A., Pahl H. B., Korngold G. C., Rosenkranz H. S.,
Fresco J. R., J. Am. Chem. Soc., 80, 3949 (1958).
5. Boulanger P., M on treuil J., in Chromatographie en chimie organique
et biologique, Vol. II,p. 471, sous la direction de E. L e d e r e r, Paris, Masson et Cie.,
Editeurs, 1960.
6. Boyer P. D., Lardy H., My r b ack K. (Editors). The Enzymes, Vol 2, 2nd
Edition, New York — London, Academic Press, 1960.
7. Bradley D. F., R i c h A., J. Am. Chem. Soc., 78, 5898 (1956).
8. В г о w n A. H., Arch. Biochem. Biophys., 11, 269 (1946).
9. Buchanan J. G., Dekker C. A., Long A. G., J. Chem. Soc. , 1950, 3162.
10. C a r t e г С. E., J. Am. Chem. Soc., 72, 1466 (1950).
11. Chargaff E., Zamenhof S., J. Biol. Chem., 173, 327 (1948).
12. Chargaff E., Vischer E., D о n i g e r R., Green С., M isani F.,
J. Biol. Chem., 177, 405 (1949).
13. Chargaff E.,M agasanik B.,Vischer E.,Green C., D о ni ger R.,
Elsdon D., J. Biol. Chem., 186, 51 (1950).
14. Chargaff E., Davidson J. N., (Editors) The Nucleic Acids, Chemistry and
Biology, Vols. I, II, III, New York — London, Academic Press, 1955, 1960.
15. Chargaff E., in Biological Structure and Function, Vol. I, p. 67, Good-
win T. W., Lindberg O., Editors, London — New York, Academic Press, 1961.
16. С о h n W. E., Science, 109, 377 (1949).
17. С о h n W. E„ J. Am. Chem. Soc., 71, 2275 (1949).
18. С о h n W. E., J. Am. Chem. Soc., 72, 1471 (1950).
19. С о h n W. E., C a r t e г С. E., J. Am. Chem. Soc., 72, 4273 (1950).
20. Cohn W. E., V о 1 k i n E., Nature, 167, 483 (1951).
21. С о h n W. E., Doherty D. G., J. Am. Chem. Soc., 78, 2863 (1956).
22. Cohn W. E., in Ion Exchangers in Organic and Biochemistry, p. 345, С a 1 m о n C.,
Kressman T. R. E., Editors, New York, Interscience Publishers Inc., 1957.
23. С о h n W. E., in Chromatography, p. 554, Heftmann E., Editor, New York,
Reinhold Publishers, 1961.
24. Cohn W. E., Bollum F. J., Biochim. Biophys. Acta, в печати.
25. Crestfield A., Smith К. C., A 11 e n F. W., J. Biol. Chem., 216, 185 (1955).
26. D a 1 у M. M., Mirsky A. E., J. Biol. Chem., 179, 981 (1949).
27. Davis F. F., Allen F. W., J. Biol. Chem., 227, 907 (1957).
28. Dekker C. A., Michelson A. M., Todd A. R., J. Chem. Soc., 1953, 947.
29. D i s c h e Z., Mikrochemie, 8, 4 (1930).
30. D i s c h e Z., Schwarz K., Mikrochim. Acta, 2, 13 (1937).
31. Edman P., Hammersten E., Low B., Reichard P., J. Biol. Chem.,
178, 395 (1949).
32. E u 1 e r H. v., H a h n L., Svensk Kem. Tidskr., 58, 251 (1946).
33. Fraenkel-Conrat H., Biochim. Biophys. Acta, 49, 169 (1961).
34. Fujisawa К., M a k i n о К., in Papierchromatographie in der Botanik, S. 198,
2. Aufl., herausgegeben von H. F. L i n s k e n s. Berlin — Gottingen — Heidelberg,
Springer-Verlag, 1959.
35. Gier er A., Mun dry K. W., Nature, 182, 1457 (1958).
36. G i 1 h a m P. T., К h о r a n a H. G., J. Am. Chem. Soc., 80, 6212 (1958).
37. Hanes C. S., I sherwood F. A., Nature, 164, 1107 (1949).
38. Holiday E. R., Johnson E. A., Nature, 163, 216 (1949).
39. Honegger C. G., Helv. Chim. Acta, 44, 173 (1961).
40. Hotchkiss R. D., J. Biol. Chem., 175, 315 (1948).
41. Jones W., Hoppe-Seyler’s Z. physiol. Chem., 41, 101 (1904).
42. Kay E. R. M., S i m m о n s N. S., D о u n ce A. L., J. Am. Chem. Soc., 74,1724 (1952).
43. Kay E. R. M., D ounce A. L., J. Am. Chem. Soc., 75, 4041 (1953).
Гл. 20. Нуклеиновые кислоты и нуклеотиды
453
44. КЬог an а Н. G., Some Recent Developments in the Chemistry of Phosphate Esters
of Biological Interest, New York — London, John Wiley and Sons, Inc., 1961.
45. К h о r a n a H. G., Vizsolyi J. P., J. Am. Chem. Soc., в печати.
46. Khym J. X., Cohn W. E., Biochim. Biophys. Acta, 15, 139 (1954).
47. К h у m J. X., D о h e r t у D. G., Cohn W. E., J. Am. Chem. Soc., 76, 5523 (1954).
48. К i у a s u J. Y., частное сообщение, 1962.
49. Klouwen H. M., Weiffenbach H., J. Chromaieg., 7, 45 (1962).
50. Kornberg A., Nobelvortrag 1959, Angew. Chem., 72, 231 (1960).
51. Kunitz M., J. Gen. Physiol., 24, 15 (1940).
52. К u n i t z M., J. Gen. Physiol., 33, 349 (1950).
53. L e v e n e P. A., Mandel H., Chem. Ber., 41, 1905 (1908).
54. Loring H. S., Fairley J. L., S e a g r a n H. L., J. Biol. Chem., 197, 823 (1952).
55. M a i n R. K., Cole L. J., Arch. Biochem. Biophys., 68, 186 (1957).
56. M a i n R. K., W i 1 k i n s M. J., С о 1 e L., J., J. Am. Chem. Soc., 81, 6490 (1959).
57. M a r k h a m R., Smith J. D., Biochem. J., 45, 294 (1949).
58. Markham R., Smith J. D., Biochem. J., 49, 401 (1951).
59. Marshak A., Vogel H. J., J. Biol. Chem., 189, 597 (1951).
60. McCarty M., J. Gen. Physiol., 29, 123 (1946).
61. Mejbaum W., Hoppe-Seyler’s Z. physiol. Chem., 258, 117 (1939).
62. M i c h e 1 s о n A. M., J. Chem. Soc., 1959, 1371.
63.
64.
65.
66.
67.
68.
69.
70.
71.
72.
73.
74.
75.
76.
77.
78.
79.
80.
81.
Nicolaus B. J. R., J. Chromatog., 4, 384 (1960).
Nurnberg E., Deut. Apotheker Ztg., 101, 142 (1961).
Nurnberg E., Deut. Apotheker Ztg., 101, 268 (1961).
Ochoa S., Federation Proc., 15, 832 (1956).
Ochoa S., Nobelvortrag 1959, Angew. Chem., 72, 225 (1960).
Peterson E. A., Sober H. A., J. Am. Chem. Soc., 78, 751 (1956):
"anderath
anderath
and
and
Rand
Rand
Schmidt
Schuster H
Schwander H., Signer R., Helv. Chim. Acta, 33, 1521 (1950).
Seiler H., Helv. Chim. Acta, 44, 1753 (1961).
Signer R., Schwander H., Helv. Chim. Acta, 32, 853 (1949).
Smillie R. M., Arch. Biochem. Biophys., 85, 557 (1959).
Sober H. A., Peterson E. A., J. Am. Chem. Soc., 76, 1711 (1954).
Sober H. A., Peterson E.A.,In Ion Exchangers in Organic and Biochemistry,
p. 318, C. Colman, T. R. E. К r e s s m a n, Editors, New York, Interscience
Publishers Inc., 1957.
R
R
R
R
e
e
e
e
r a
r a
r a
r a
th
t h
t h
t h
G.,
Angew. Chem., 73, 436 (1961).
Angew. Chem., 73, 674 (1961).
Stuck H., J. Chromatog., 6, 365 (1961).
Biochem. Biophys.• Res. Comm., 6, 452 (1961/62).
Nature, 194, 768 (1962) и частное сообщение.
Angew. Chem., 74, 484 (1962).
Th annhauser S. J., J. Biol. Chem., 161, 83 (1945).
, Schramm G., Z. Naturforsch., 13b, 697 (1958).
K.,
K.,
K.,
K.,
K.,
K.,
82. Staehelin M., Peterson E. A., Sober H. A., Arch. Biochem. Biophys.,
85, 289 (1959).
83. Staehelin M., Biochim. Biophys. Acta, в печати.
84. S t a h 1 E., Kaltenbach U., J. Chromatog., 5, 351 (1961).
85. Steudel H., Peiser E., Hoppe-Seyler’s Z. physiol. Chem., 114, 201 (1921).
86. T a m m С., H о d e s M. E., C h a r g a f f E., J. Biol. Chem., 195, 49 (1952).
87. Tamm C., S h a p i г о H. S., C h a r g a f f E., J. Biol. Chem., 199, 313 (1952).
88. T a m m C., S h a p i г о H. S., L i p s h i t z R., Chargaff E., J. Biol. Chem.,
203, 673 (1953).
89. Teichert K., Mutschler E., Rochelmeyer H., Deut. Apotheker
Ztg., 100, 283 (1960).
90. T e n e r G. M., Khorana H. G., Markham R., P о 1 E. H., J. Am. Chem.
Soc., 80, 6223 (1958).
91. T о d d A. R., in Perspectives in Organic Chemistry, p. 245, A. R. T о d d, Editor,
London — New York, Interscience Publishers, Inc., 1956.
92. Todd A. R., Nobelvortrag 1957, Angew. Chem., 70, 527 (1958).
93. V i s c h e r E., C h a r g a f f E., J. Biol. Chem., 168, 781 (1947).
94. Vischer E., Chargaff E., J. Biol. Chem., 176, 715 (1948).
95. V о 1 k i n E., Carter С. E., J. Am. Chem. Soc., 73, 1516 (1951).
96. Weber C. J., J. Biol. Chem., 86, 217 (1930).
97. Weissmann B., Bromberg P. A., Gutmann A. B., J. Biol. Chem.,
224, 407 (1957L
98. Wieland T., Bauer L., Angew. Chem., 63, 511 (1951).
99. W у a t t G. R., Biochem. J., 48, 581 (1951).
100. Wyatt G. R., Biochem. J., 48, 584 (1951).
101. Wyatt G. R., J. Gen. Physiol., 36, 201 (1952).
102. Wyatt G. R., Cohen S. S., Biochem. J., 55,“ 774 (1953).
ГЛАВА 21
САХАРА И ПРОИЗВОДНЫЕ
Э. Шталъ и У. Калътенбах
1. ВВЕДЕНИЕ
В 1946 г. Партридж показал, что при использовании соответствующего
растворителя можно разделить методом хроматографии на бумаге смесь саха-
ров. Затем этот метод оправдал себя и нашел применение в тысяче с лишним
работ. Интересно было изучить возможность разделения этой широко рас-
пространенной группы природных веществ на чисто неорганических слоях.
Уже основная формула простых углеводов (Н — С — ОН)П позволяет сде-
лать вывод о ясно выраженном гидрофильном характере таких сильнополяр-
ных соединений. Следовательно, можно предположить, что перемещения
сахара по слою можно добиться, используя соответствующий полярный
растворитель на неактивном слое. Теоретически при этом не имеет значения,
является ли слой неактивным сам по себе (кизельгур Г) или активный слой
(силикагель Г) в значительной мере дезактивируется во время прохождения
одного из компонентов растворителя (например, воды). На практике, однако,
оказывается, что адсорбционные эффекты на силикагеле и алусиле * подав-
ляются не полностью.
Мы склонны считать, что на слое кизельгура Г в случае растворителя,
применяемого нами, разделение осуществляется в основном за счет процес-
сов распределения.
Как и в случае хроматографии на бумаге, было обнаружено уменьшение
скорости перемещения по слою в следующем ряду: пентозы -^-гексозы —>
дисахариды -> трисахариды, а в случае гексоз было найдено, что фуранозы
имеют большие величины Rf, чем соответствующие пиранозы. На слое сили-
кагеля Г или алусила эта закономерность нарушается.
Недостаток слоя кизельгура Г — весьма малая величина наносимой пробы
(максимум 5 р,а сахара!). На слой силикагеля Г и алусила можно наносить
в 10 раз больше сахара. Из табл. 118 видно, что на практике разделяются
) только смеси определенного состава. Исследованные до сих пор сахара рас-
пределяются не по всей хроматограмме, а собираются группами (например,
Rf 50-70, 25-40 или 30-50).
При исследованиях методом ХТС наблюдали [8], что на непропитанных
слоях кизельгура Г некоторые сахара делятся на два пятна, явление, ко-
торое, по Пастуска и Тринксу [5], наблюдается на пластинках с силикаге-
лем Г.
Изменение строения (dl или a,[J) между тем можно экспериментально
исключить [5].
Принимается, что в одном пятне молекулы сахара находятся в виде
колец, а в другом — в виде открытых цепочек.
* См. примечание на стр. 458.
Разделение сахаров методом ХТС
при различных условиях
Слой. Кизельгур Г пропитанный ацетатом натрия Силикагель Г, пропитанный борной кислотой Алусил(си.ли.кагель „активный слой ” пись алюминол Г, 1+1) неактивный слой ”
1 11 HI Va VC Vc VII
hRf 90 80 70 60 60 ' 90 30 20 Ю - •-Ди 99

•-Рам 62 •-Рам 67 Гл 63 . С “ 63 • Др 62 •-Рам 60 •-Кси 57 •-Гла 59
• Кси 59 • Ман 58 • Ла 56 • Га 55 •-Фр 52 • Со 5/ •-Рам 52 • Рам 59 •Рам 55 • Рам 59
• Ри 49 • ГЛК 43 .,Гл ь2 *'Ар 92 _-Ар 99 •'Гаа 99 +о 97 • Фр 97 ~Ман . 47 • Гл 95 •Са 49 •-Тр 43 • Га 42 • Кси 49 • Глк 48 •Со 93 • Ар,Фр 92 •Ман 9/ •Гаа 90 •Гл.Са 39 • Га.Тр 35 •Мал 31 • Кси 49 хАр.Фр 92 • МанСо 42 "Гла 42 • Кси 99 -г-Ар.Фр 43 •'Ман 43 • Со 42
•-Кси 39 • Гак 36 •-Кси 39 •-Глк 34 хМан 32 •Га 32 • Фр 31 • Мал 39 •-Глк 38 •Ла 39 • Раф 32 • Гл.Са 39 • Гаа 37 • Га 35 •Тр 31 • Гл 39 • Га 37 • Гла 33 •Са, Гаа 32
•-Ар 28 ♦-Со 26 ♦-Фр 25 ♦- Ман 23 •Са 29 •Ла 25 •СО 29 • Гак 27 • Глк 27 •Раф 26 •Ла 25 • Глк 29 •Ла 29 •Раф 23 • Мал 29 • Ла,Тр 26
•- Га 18 •- Гл /7 •-Гак 10 • Гак 19 • Гак 13 • Глк 15 • Гак 13
• Са в • Мал в • Ла 4
Ар — арабиноза
Ди — дигитоксоза
Фр — фруктоза
Га — галактоза
Гаа — галактозамин
Гак — галактуроновая кислота
Гл — глюкоза
Гла — глюкозамин
Г лк — глюкуроновая кислота
Ла — лактоза
Маи — манноза
Мал — мальтоза
Раф — рафиноза
Рам — рамноза
Ри — рибоза
Са — сахароза
Со — сорбоза
Тр — трегалоза
Кси — ксилоза
Растворители: I этилацетат-изопропанол-вода (65+23,5 + 11,5), II бензол - ледяная уксусная
кислота — метанол (20+20+60), III метилэтилкетон — ледяная уксусная кислота — метанол (60+
+20+20), Va н-пропанол - этилацетат - вода - 25%-ный аммиак (50+10+30+10), Vb то же, что
Va, но (60+10+30+10), VII м-бутанол — ледяная уксусная кислота — вода (60+30+10).
456
Специальная часть
2. РАЗДЕЛИТЕЛЬНЫЕ СЛОИ И РАСТВОРИТЕЛЬ
а) Слои кизельгура Г для анализа микроколичеств
по Шталю и Калътенбаху [8].
Слои для разделения толщиной 250 р готовят и высушивают по стан-
дартному методу. Кизельгур Г смешивают вместо воды с 0,02 М раствором
Аигитоксоза
РамнЬза
: Рибоза
. Ксилоза
А - Фруктоза
Ж,, Глюкоза
ICaaiw-i
Лактоза (Старт) \
Рис. 182. Тонкослойная хроматограмма сахаров (по 0,5 рг) на забуференном слое
кизельгура Г, снятая в проходящем свете [8].
Время анализа для длины пути 10 см 25—30 мин.
ацетата натрия и наносят на пластинки 20 X 20 см. Из многочисленных
растворителей самым лучшим оказалась смесь (№ 1) 65 мл этилацетата+
Р и с. 183. Тонкослойная хроматограмма смеси сахаров (рис. 182) [8].
Количество каждого сахара в пробе увеличивается слева (0,1 рг) направо (10 цг).
35 мл изопропанол — вода (2 : 1). С увеличением доли изопропанол — вода
увеличивается величина Rf и улучшается разделение ди- и трисахаридов„
При использовании лотковой камеры с насыщением атмосферы камеры
Гл. 21. Сахара и производные 457
( стр. 25) время разделения при длине пути 10 см составляет 20—30 мин.
На рис. 182 приведена хроматограмма, полученная в этих условиях, а
в табл. 118 — величины Rf. Применение пластинок другой формы (5 X 20 см)
и круглых разделительных камер приводит к увеличению величин Rf.
Чистые сахара растворяют в пиридине и наносят только 0,5 рг в качестве срав-
нительного вещества. Из рис. 183 видно, что количество анализируемой смеси должно
быть очень небольшим, так как иначе зонй перекрывают друг друга. Продукты с более
высоким содержанием сахара (фруктовый сок и т, п.) разбавляют пиридином (1 : 100)
до оптимальной концентрации (0,1—1 рг). Экстракт из солода и мед растворяют в пири-
дине до 0,1—0,5%-ной концентрации.
Этот метод — как большинство анализов с помощью распределительной
хроматографии — чувствителен к посторонним примесям (неорганические
соли и т. д.), встречающимся, например, в тканевых жидкостях.
Уже упоминавшееся разделение некоторых сахаров (например, глюкозы,
галактозы) на две зоны наблюдают на непропитанном слое кизельгура Г
при применении растворителя метиловый эфир уксусной кислоты — изопро-
панол — вода (90 4-5 4-5).
б) Слой силикагель Г — борная кислота по Пастуска [4]
Согласно опубликованным данным, для разделения смесей сахаров осо-
бенно пригоден слой силикагеля Г, приготовленный с 0,1 н. раствором бор-
ной кислоты вместо воды. Пастуска [4, 5] применил для разделения слои
толщиной около 1 мм, приготовленные «ручным способом», Прей и сотруд-
ники [6] работали стандартным методом и также получили хорошие резуль-
таты и в случае определенных смесей сахаров с растворителем, предложенным
Пастуска. В зависимости от требуемой точности разделения и содержания
сахара в вмеси наносят 50—250 рг. В этом случае также имеет смысл нано-
сить меньшие количества вещества, порядка 5—50 рг.
Таблица 119
Растворители для анализа сахаров методом ХТС на силикагеле Г
с добавкой 0,1 н. борной кислоты
№ Растворитель Время, (10 см) [6] Примечание Литера- тура
II Бензол—ледяная уксус- ная кислота—метанол (20-4 4-204-60) 80 мин Хорошее отделение глю- козы (hRf 63) от фруктозы (52) 4
III Метилэтилкетон — ледя- ная уксусная кислота—ме- танол (604-204-20) 60 мин Хорошее отделение глю- козы (hRf 49) от сахарозы (35) 4,6
IV Бутан ол—ацетон—вода (40 +504-10) 60 мин Хорошее отделение саха- розы и глюкозы (обе hRf 34) от фруктозы (14) 6
Растворитель IV применяли также для разделения ди- и трисахаридов.
Были получены следующие величины Rf. рафиноза 6, d-мелибиоза 17, лак-
тоза 26, мелицитоза 33, мальтоза и сахароза 44—45 [6]. Разделения смеси
глюкоза — фруктоза — сахароза — рафиноза можно достичь только методом
двумерной хроматографии с растворителями IV (направление 1) и III (на-
правление 2).
458
Специальная часть
в) Слои силикагеля Г и алусила * по Валъди [9]
Дальнейшие возможности быстрого разделения сахаров и сахарных спир-
тов, сахарных кислот и аминосахаров были найдены Вальди. Он работал
стандартным методом и впервые применил наряду со слоями чистого сили-
кагеля Г нейтральные «смешанные слои», состоящие из силикагеля Г (кис-
лый) и окиси алюминия Г (основная). По режиму высушивания Вальди
различал «активные» соли алусила (30 мин 110°) и «неактивные» слои алу-
сила. Последние высушивали только на воздухе при комнатной температуре.
Для установления величин Rf наносили 5 лл3 (50 рг) 1%-ного водного рас-
твора сахара и хроматографировали пластинки в лотковой камере с атмос-
ферой, насыщенной парами растворителя. Наиболее подходящими оказались
следующие растворители.
а) ДЛЯ «АКТИВНОГО» И «НЕАКТИВНОГО» СЛОЯ АЛУСИЛА
Va: н-пропанол — этилацетат — вода — 25%-ный аммиак (50 + 10 +
+ 30 + 10)
V6: то же, что Va с соотношением объемов (60+10 + 20 + 10),
Vb: то же, что Va с соотношением объемов (60 + 10 + 30 + 10).
Вайкер и Броссмер [10] наблюдали при анализе чистых сахаров методом ХТС на
слое силикагеля Г, с применением основного растворителя н-пропанол — концентри-
рованный аммиак—вода (60 + 20 + 10) по меньшей мере два пятна. Соответствую-
щие опыты заставляют предположить, что при использовании аммиачных растворите-
лей при каталитическом действии силикагеля происходит образование аминосахаров,
реагирующих положительно с нингидрином и реактивом Моргана — Эльсона (№ 45).
Это обстоятельство необходимо принимать во внимание при использовании указанных
выше растворителей.
Р) ДЛЯ «НЕАКТИВНОГО» СЛОЯ АЛУСИЛА
VI: н-пропанол — этилацетат — вода — ледяная уксусная кислота
(40 + 10 + 40 + 10),
VII: н-бутанол — ледяная уксусная кислота — вода (60 + 30 + 10),
у) ДЛЯ СЛОЯ СИЛИКАГЕЛЯ Г
VIII: хлороформ — ацетон —ледяная уксусная кислота (60 + 30 + 10)
(отделение ацетонсорбозы),
IX: н-пропанол — этилацетат — вода (70 + 20 + 10) [6].
Таблица 120
Разделение методом ХТС сахарных спиртов [9]
В, хюо Rf Х100
активный алусил неактивный алусил активный алусил неактивный алусил
Va Vb Vb VII Va Vb Vb VII
Сорбита .... 41 35 38 37 Дульцит3. . . 45 40 38 36
Маннита 46 41 42 39 Адонит .... 52 51 46 42
Инозит .... 29 21 — — Эритрит . . . 61 57 52 47
а Дульцит, маннит и сорбит удовлетворительно разделены только Вальди [9] методом бумаж-
ной хроматографии. Маннит отделяют от сорбита и дульцита на бумаге S & S 2043b, пропитанной
хлористым калием, в течение 50 час; растворитель этилацетат — пиридин — вода (бО+ЗО^-Ю). Дуль-
цит от маннита и сорбита отделяют на непропитанной бумаге проточным методом (48 час), исполь-
зуя смесь этилацетат — пиридин — вода (14-J-5-J-1). Слой мелкозернистой целлюлозы для этой
цели пока еще не применяли.
* Алусил — торговое название смеси окиси алюминия Г и силикагеля Г (1 + 1).
Гл. 21. Сахара и производные
459
Величины hRf для сахаров, полученные с растворителями Va, Vb и VII,
приведены в табл. 118, эти же величины для сахарных спиртов — в табл. 120.
Системой VIII можно разделить на слое силикагеля Г ацетонсорбозы:
1,2-моноацетонсорбоза hRf 25—35, 2,3-мо-
ноацетонсорбоза hRf 35—45, диацетонсорбо-
за hRf 80.
Для разделения смеси рафиноза — саха-
роза применяют обычный слой силика-
геля Г и растворитель IX [6]. Оказалось, что
при этом для получения разделения соотно-
шение рафиноза: сахароза в смеси должно
составлять не более чем 1 : 50. Для патоки
сахарной свеклы это соотношение гораздо
неблагоприятнее (1 :100). Анализ облег-
чается при использовании усовершенство-
ванного метода клиновидных полос (стр. 44).
Для этого клиньям придают V-образную
форму с заданным углом (рис. 184); таким
образом удается хорошо разделять 10—
40%-ные растворы кормовой патоки.
В работе [11], в которой пытались определить
Р и с. 184. Тонкослойная хрома-
тограмма’сахаров, встречающих-
ся при анализе мочи (по Ринку
и Герману [7]).
а —• обычный метод, б — метод кли-
новидных полос. 1 —глюкоза (сине-
фиолетовая зона), 2 — арабиноза
(синяя), 3 — лактоза (фиолетовая),
4 — фруктоза (красная).
малые количества трегалозы, при применении си-
ликагеля Г й emop-бутанола, насыщенного водой,
ее удалось отделить только от глюкозы {hRf 50).
В обзоре по методу ХТС Енсен [2] упоминает
о возможности разделении ряда сахаров, сахар-
ных кислот и продуктов гидролиза альгиновой
кислоты и приводит малоубедительное изображе-
ние такой хроматограммы. Герлих [1] применил
для отделения глюкозы от олеандрозы на силика-
геле Г смесь н-бутанол — метанол — леднная уксус-
ная кислота — вода (40+40-|-5-|-5). Для объяснения структуры сахар-компонентов ди-
гитоксина Лихти и сотрудники [3 а] весьма успешно применили метод ХТС.
3. ОБНАРУЖЕНИЕ
Известные в настоящее время многочисленные реактивы для обнаруже-
ния сахаров в бумажной хроматографии можно также с успехом применять
и в методе ХТС (реактивы № 7, 8, 9, 10, 18, 4С, 67, 110, 116, 120, 135, 137
и 145).
Выбирают, однако, наиболее чувствительные реактивы, причем следует
убедиться, что они не являются специфичными для данной группы веществ.
Хорошие результаты были получены, например, для восстановленных
сахаров с анилинфтал атом (реактив № 8). После нагревания сахара давали
в ультрафиолетовом свете желто-коричневые флуоресцирующие зоны.
Пастуска [4] показал, что реактивом 1,3-диоксинафталин (нафторезорцин) —
серная кислота (№ 44) можно обнаружить моно- и дисахариды, а также уро-
новые кислоты. Минимально определяемое количество, так же как и с ани-
линфталатом, составляет менее 4 цг. Цветные реакции сахаров приведены
в табл. 121. Значительно более чувствительным является применяемый Шта-
лем и Кальтенбахом [у] реактив анисовый альдегид — серная кислота
(№ 9). Этим реактивом можно определить до 0,05 цг сахара (в табл. 121
приведена окраска для 1 цг). Однако на слоях, содержащих борную кислоту,
зта реакция неприменима.
Моно- и диацетонсорбозыможно перевести в видимую форму фосфорно-
молибденовой кислотой (реактивам 120) по Вальди [9].
460
Специальная часть
Таблица 121 Цветные реакции некоторых сахаров на пластинках с тонкими слоями [8, 4]
Сахар Окраска
анисовый альдегид — серная кислота; слой силикагеля Г, пропитанный ацетатом натрия нафторезорцин — серная кисло- та; слой силикагеля Г, пропи- танный борной кислотой
d (-)-)- Дигитоксоза Синня
1 (-г)-Рамноза Зеленан Зеленая
d (—)-Рпбоза Синяя —
d (+)-Ксилоза Серая Светло-серая
1 (+)-Арабиноза Светло-зеленая Сине-зеленан
1 (—)-Сорбоза Фиолетовая Красная
d (—)-Фруктоза » Красяо-черная
d (-}-)-Манноза Зеленая Светло-синяя
d (+)-Глюкоза Светло-сине-серая Сине-фиолетовая
d (+)-Галактоза Зелено-серая »
Сахароза Фиолетовая Красная
Мальтоза » —
Лактоза Зеленоватая Красно-фиолетовая
d (4-)-Глюкуроновая кисло- та — Синяя
d (4-)-Галактуроновая кис- лота •—
4. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ
Пастуска [4] приводит пропись для титрометрического определения саха-
ров в хроматографических зонах, соскобленных с пластинки. Метод основан
на принципе «мокрого сжигания» смесью бихромат калия — серная кислота
и обратного титрования неиспользованного бихромата калия. Количество
сахара должно составлять около 0,5 мг.
С высушенной хроматограммы (толщина слоя 0,9 мм) соскабливают зону, содер-
жащую сахар, смешивают с избытком 0,05 н. или 0,01 н. раствора бихромата калия
в 70%-ной серной кислоте и нагревают 60 мин на водяной бане при 90°. Охлаждают
и в раствор добавляют 20 мл воды и 5 мл 5%-ного раствора KI. Выделившийся иод тит-
руют точно через 20 мин 0,01 н. раствором Тиосульфата натрия. Необходимо провести
параллельно холостой опыт с кусочком слоя такой же площади и на топ же высоте, где
была отобрана проба.
Титр раствора бпхромата калия определяют по реакции с 2%-ным раствором глю-
козы.
Ошибка метода меньше ±5%.
5. АНАЛИЗ ПРОИЗВОДНЫХ САХАРОВ МЕТОДОМ ХТС
Дальнейшие возможности для идентификации сахаров открывает анализ
методом ХТС соответствующих производных, например гидразонов, как
уже кратко упоминалось Рейхштейном и сотрудниками [3].
Приготовление Q-нафтилгидразонов. 1 мг сахара в течение 5 мин кипятят с обратным
холодильником с 1 мг свежесублимированного f-нафтилгпдр азина в 0,1 мл метанола.
Затем перегонкой с эфиром удаляют метанол. При охлаждении выпадает гидразон, кото-
рый промывают эфиром, высушивают и определяют температуру плавления.
Растворенный в метаноле p-нафтилгидразон анализируют хроматографи-
чески на слое силикагеля Г с растворителем этилацетат — н-бутанол (90 + 10)
и в ультрафиолетовом свете определяют положение вещества.
Гл. 21. Сахара и производные
461
Микропрепаративное разделение ацетатов сахаров удается осуществить
по методу Тейта и Бишопа [8а] на слое силикагеля Г со смесью бензол —
метанол (96 + 4) при двукратном пропускании растворителя (длина пути
17 см).
6. СПЕЦИАЛЬНОЕ ПРИМЕНЕНИЕ
Метод, описанный Шталем и Кальтенбахом, был разработан для ультра-
микроанализа смеси сахаров; этим методом удается разделить содержимое
отдельных растительных и животных клеток или очень небольших комплек-
сов клеток. Метод непригоден в случае обычно наносимых количеств,
равных 5—100 цг. Для анализа патоки, образующейся при получении свекло-
вичного сахара, следует воспользоваться опытными данными Прея и сотруд-
ников [6], добавив к этому методику количественного определения, пред-
ложенную Пастуска [4]. Для быстрого определения сахара, появляющегося
в моче главным образом в результате патологических отклонений, Ринком
и Германом был разработан специальный метод [7].
Разделительный слой готовили стандартным методом из силикагеля Г
и 0,1 М раствора борной кислоты (1 вес. ч. -J- 2 об. ч.) и высушивали. В ка-
честве растворителя использовали смесь н-бутанол — ацетон — 0,1 М рас-
твор борной кислоты (40 + 50 + 10). Длина пути была 12 см. Для срав-
нения наносили рядом с анализируемой мочой водный раствор фруктозы,
лактозы, арабинозы и глюкозы. Оптимальное наносимое количество сахара
составляет 5 цг. Как видно из рис. 184, наилучшие результаты дает уже
упоминавшийся метод клиновидных полос. Для обнаружения сахара исполь-
зуют смесь нафторезорцина и серной кислоты (реактив № 44).
ЛИТЕРАТУРА
1. Gorlich В., Planta Medica, 9, 451 (1961).
2. Jensen A., Tidsskr. Kjemi, Bergvesen Metallurgi, 1, 14 (1961).
3. Kowalewski Z., Schindler O., Jager Herb., Reichstein T.,
Helv. Chim. Acta, 43, 1280 (1960).
3a. L i c h t i H., Kuhn M., Wartburg A. v., Helv. Chim. Acta, 45, 868 (1962).
4. Pastuska G., Z. analyt. Chem., 179, 427 (1961).
5. Pastuska G., Trinks H., частное сообщение, 1961.
6. Prey V., В e r b a 1 k H., К a u s z M., Mikrochim. Acta H., 6, 968 (1961).
6a. Prey V., В e r b a 1 k H., К a u s z M., Mikrochim. Acta H., 3, 459 (1962).
7. Rink M., Hermann S, частное сообщение.
8. Stahl E., Kaltenbach U., J. Chromatog., 5, 351 (1961).
8a. Tate M. E., В i s h о p С. T., Can. J. Chem., 40, 1043 (1962).
9. W a 1 d i D., частное сообщение.
10. Weicker H., Brossmer R., Klin. Wochschr., 39, 1265 (1961).
11. W у s s-H uber M., Jager Herb., Weiss Ek.. Helv. Chim. Acta. 43, 1010 (1960).
ГЛАВА 22
АНАЛИЗ НЕОРГАНИЧЕСКИХ ИОНОВ МЕТОДОМ ХТС
X. Зайлер
I. ОБЩИЕ ЗАМЕЧАНИЯ
В предыдущих главах показано, что многие смеси органических веществ^
можно хорошо и быстро разделить на тонких слоях сорбента. Необходимо-
было подробно изучить, применимы ли эти методы и в какой мере для разде-
ления смесей неорганических ионов. Уже в 1949 г. Мейнхард и Холл [2]
использовали метод, названный ими «поверхностная хроматография», для
разделения простой смеси солей железа (III) и цинка.
Было высказано опасение, что слой прочно пристает к пластинке только
в случае применения относительно неполярных растворителей; поэтому пред-
полагалось, что в неорганической тонкослойной хроматографии возникнут
трудности; эти опасения, однако, не оправдались. Оказалось, что можно
применять даже чисто водные растворители и при этом не наблюдается отста-
вания слоя в случае использования в качестве связующего материала гипса,
крахмала [или агар-агара.
Трудность возникает вследствие загрязнения продажного силикагеля,
содержащего довольно большие количества железа, что может вызвать
значительные нарушения на хроматограмме. Поэтому оказалось необходи-
мой тщательная предварительная очистка сорбентов, применяемых для
тонкослойной хроматографии неорганических веществ (см. стр. 467). Бла-
годаря такой очистке, при которой применяют соляную кислоту, удаляются
посторонние примеси и, кроме того, силикагель активируется, поскольку
при обработке кислотой происходит травление поверхности частичек геля..
II. ТЕОРЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПРОЦЕССА ХТС НЕОРГАНИЧЕСКИХ
ВЕЩЕСТВ [6]
Для выяснения факторов, определяющих эффективность процесса при
анализе неорганических веществ методом ХТС, был проведен ряд опытов,
результаты которых изображены на рис. 185, а — г и 186, а — б.
Эти экспериментальные данные можно свободно объяснить на основе
следующих соображений.
Как было установлено Умландом и Кирхнером [13] для колоночной хро-
матографии, силикагель действует как катионный обменник. Этим объяс-
няется то, что в опытах с хлорной кислотой три катиона Сп2+, Со2+ и Ni2+
обнаруживают примерно одинаковые величины Rf. Перемещение в этом слу-
чае определяется только обменом в зависимости от pH и заряда ионов..
Влияние заряда видно из опытов с Fe2+ и Fe3+, когда при добавлении хлор-
ной кислоты величины Rf очень сильно отличаются друг от друга. При добав-
лении соляной кислоты вследствие образования анионного хлорного комплек-
са почти нет различия в величинах Rf.
Поскольку в солянокислой среде образуются хлорные комплексы катионов.
[3] — в противоположность этому перхлорат-ион не действует как лиганд,—
первоначальные катионы существуют в виде отрицательно заряженных анио-
Рис. 185. а — в — величины Rf Cu2+ (----), Со2 + (----) и Ni (. . .) в ацетоне с добавкой кислоты; г —величины Rf Fe2+ (-)
и Fe3+ (— — —) в ацетоне с добавкой кислоты.
Рис. 186. Величины Rf Cu2+ (---------), Со2+ (— — —) и Ni2+ (.......) в растворителях I—VIII с добавлением 10% 1 н. НС1 (а) и 10%
1 н. НС1О4 (б).
I — метанол, II — этанол, III — ацетон, IV — и-пропанол, V — изопропанол, VI — «-бутанол, VII — тетрагидрофуран, VIII — диоксан.
464
Специальная часть
нов и катионообменные свойства силикагеля, во всяком случае в опытах при
высокой концентрации соляной кислоты, не оказывают влияния. Распределе-
ние здесь определяется устойчивостью хлорного комплекса, поскольку кон-
центрация ионов СР непрерывно уменьшается снизу вверх, что оказывает
влияние на равновесие реакции образования комплекса. В соответствии
с этим для величин Rf справедлив ряд Си > Со > Ni.
Эти факты позволяют понять, почему и в случае двух катионов, которые
при нанесении в отдельности дают весьма близкие величины/?/, может иметь
место разделение вследствие взаимного вытеснения, благодаря чему ниже
расположенный катион вытесняет выше расположенный; при этом не
наблюдается перекрывания, между пятнами этих ионов образуются даже
пустые зоны. Это следует понимать так, что в результате насыщения обмен-
ника катионом выделяются ионы Н+, что понижает величину pH на границе
пятна этого катиона. Выделившиеся ионы Н+ вытесняют катион с меньшей
энергией связи со слоем.
На рис. 186, а и б приведены результаты опытов, в которых исследова-
лось влияние органических компонентов в растворителе на хроматографи-
ческое поведение катионов. Применяли диоксан, тетрагидрофуран, н-бута-
нол, изопропанол, н-пропанол, ацетон, этанол и метанол с добавкой 10%
1 н. соляной кислоты в одной серии опытов (рис. 186, а) и 10% 1 н. хлор-
ной кислоты в другой серии опытов (рис. 186, б).
При этом в опытах с соляной кислотой во всех исследованных растворите-
лях — за исключением метанола — обнаружена последовательность вели-
чин Rf. Си, Со, Ni. В опытах с метанолом все три катиона имеют одинаковые
величины Rf.
В опытах с хлорной кислотой аналогичной последовательности не наб-
людается. Как обнаружил Сансони [5] для неводных систем, селективность
ионообменника может очень сильно зависеть от природы применяемого
растворителя. По мнению этого автора, решающую роль играет основность
растворителя в льюисовском смысле. Поскольку в данном случае применяли
водный растворитель, нужно учесть также растворимость гидрата катиона
в органической составляющей растворителя. Как видно из рис. 186, б, в при-
сутствии хлорной кислоты можно путем подбора органических компонентов
также достичь селективности ионообменника и добиться таким образом
разделения ионов с одинаковым зарядом.
На основании этих опытов можно сделать вывод, что определяющими
факторами в тонкослойной хроматографии неорганических катионов явля-
ются ионообменные свойства силикагеля и образование комплексов катио-
нов с используемыми растворителями.
III. ПРИГОТОВЛЕНИЕ АНАЛИЗИРУЕМЫХ РАСТВОРОВ
И РАЗДЕЛИТЕЛЬНЫХ СЛОЕВ ДЛЯ АНАЛИЗА МЕТОДОМ ХТС
Обычно имеет смысл провести предварительное разделение исследуемой
смеси веществ на группы классическим методом анализа. Для этого лучше
всего воспользоваться следующим ходом анализа.
1. РАЗДЕЛЕНИЕ
Раствор 0,1—0,2 г вещества в 3—4 мл царской водки (3 ч. 6 М НС1 и 1 ч. 6 М HNO3)
разбавляют 2—3 мл дистиллированной воды. При выпадении осадка его отделяют центри-
фугированием и 2 раза промывают 0,5 мл дистиллированной воды. Отделенный от осадка
раствор и промывные воды объединяют и переносят в стакан на 25 мл; после добавления
5 капель 3%-ной Н2О2 осторожно кипятят 2 мин. В охлажденный раствор по каплям
добавляют 6 М раствор аммиака до щелочной реакции. Осторожно подкисляют 6 М НС1,
а затем добавляют еще 6,5 мл 6 М НС1. Раствор переносят в мерный цилиндр на 25 мл,
Гл. 22. Анализ неорганических ионов методом ХТС
465
доводят дистиллированной водой до 19 мл, добавляют 1 мл 1 М раствора тиоацетамида,
хорошо перемешивают и 10 мин нагревают в стакане на 50 мл на водяной бане. Осадок
сульфида центрифугируют, промывают 2 раза 1 мл дистиллированной воды, центри-
фугат и промывные воды объединяют. Осадок взмучивают в 2 мл дистиллированной
воды, добавляют 2 мл 15 М раствора аммиака и нагревают 10 мин на водяной бане.
Затем добавляют 1 мл 1 М раствора тиоацетамида и снова нагревают 10 мин на водя-
ной бане. Центрифугируют, промывают, центрифугат и промывные воды выбрасывают.
Осадок, содержащий катионы Cu-группы, смешивают с 2 мл 6 М HNO3, кипятят и полу-
ченный раствор разбавляют дистиллированной водой так, чтобы содержание сульфидов
в растворе составляло около 3%. Из этого раствора наносят 0,001—0,003 мл и проводят
хроматографический анализ.
Раствор и промывные воды после осаждения тиоацетамидом в кислой среде упари-
вают до 2—3 мл, затем точно нейтрализуют 6 М раствором аммиака и добавляют 1 мл
1 М раствора тиоацетамида. Добавляют 2 мл 6 М раствора аммиака и 10 мл дистилли-
рованной воды, нагревают 10 мин на водяной бане. Осадок, содержащий катионы
(NH4)2S-rpynnbi, отделяют центрифугированием, 2 раза промывают 1 мл дистиллиро-
ванной воды и растворяют в минимальном количестве 6 М НС1. Нагревают на водяной
бане до прекращения выделения H2S и разбавляют дистиллированной водой, чтобы
концентрация в растворе составляла около 3%. Такого раствора (II) наносят 0,001—
0,003 мл и проводят хроматографический анализ.
Схема разделения на аналитические группы
Органический материал
Озоление
Катионы, минеральные вещества
растворяют в царской водке
Днионы, минеральные вещества
сплавляют с содой. Плав
растворяют в дистил-
лированной воде
Кислое осаждение
тиоацет амидом
Центрифугат Осадок обрабатывают конц.
NHj и тиоацетамидом оста-
ток растворяют в 6м HNOj
Группа меди ( раствор 1 )
Щелочное осаждение тиоацетамидом
Центрифугат Осадок растворяют в 6МНС1
Группа (NH4)2S ( раствор В)
Амберлит JR-120
(Реформа)
Упаривают до выделения
паров кислоты,
нейтрализуют NaOH
Осаждение карбонатом аммония
Центрифугат Осадок растворяют в 6М
уксусной кислоте
щелочноземельная группа (раствор Ш)
Упаривают досуха, осадок
нагревают и растворяют
в небольшом количестве 6М
уксусной кислоты
Щелочная группа (растворIF)
Раствор и промывные воды последнего осаждения подкисляют 6 М НС1, нейтра-
лизуют 6 М раствором аммиака и добавляют еще 1 мл 6 М NH3. Затем добавляют
2—3 мл раствора карбоната аммония, нагревают 10 мин на водяной бане, охлаждают
и оставляют на 30 мин стоять, изредка перемешивая. Осадок отфуговывают и 2 раза
промывают 1 мл дистиллированной воды. Осадок растворяют в 6 М уксусной кислоте,
получая приблизительно 3%-ный раствор. Этот раствор (III) содержит катионы группы
карбоната аммония. 0,001—0,003 мл такого раствора наносят для хроматографического
анализа.
Центрифугат и промывные воды после осаждения карбонатом аммония объединяют,
подкисляют 6 М уксусной кислотой и осторожно выпаривают в фарфоровой чашке
досуха. Остаток нагревают 10—15 мин на треугольнике открытым пламенем. После
30 Заказ № 73 4
466
Специальная часть
охлаждения остаток при нагревании растворяют в минимальном количестве 6 М уксус-
ной кислоты и опять разбавляют таким количеством дистиллированной воды, чтобы
получился 3%-ный раствор. Этот раствор (IV) содержит ионы щелочных металлов и маг-
ния. Наносят 0,001—0,003 мл этого раствора и проводят хроматографический анализ.
2. ПЕРЕВОД В РАСТВОРИМУЮ ФОРМУ И ОЗОЛЕНИЕ
Если исследуемое вещество не растворяется в царской водке, его следует перевести
в растворимую форму.
Если в пробе содержится большое количество фосфатов или тартратов, то эти ани-
оны, мешающие дальнейшему ходу анализа и хроматографическому разделению, следует
удалить. Это лучше всего удается сделать на ионообменнике в хлоридной форме (напри-
мер, амберлит IR-400 Cl-форма). Слабокислый анализируемый раствор медленно (0,5—
1 мл/мин) пропускают через колонку с ионообменником достаточно большой емкости.
Затем колонку промывают приблизительно двойным по отношению к колонке объемом
дистиллированной воды.
В некоторых случаях, когда интерес представляет определение только отдельного
иона, предварительное разделение на аналитические группы является излишним. Так,,
например, можно хроматографически отделить и идентифицировать в горных породах
уран наряду с большим числом различных катионов [7], причем сопутствующие ионы
этому не мешают. Для этого расплавляют небольшую пробу горной породы в смеси фто-
рида натрия и сернокислого кислого калия на платиновой проволочке, перл раство-
ряют в нескольких каплях 4,7 н. HNO3 и наносят на пластинку постепенно увеличиваю-
щиеся количества полученного раствора.
Если исследуемые неорганические ионы находятся в биологической ткани, то необ-
ходимо предварительное сжигание. Рекомендуют сначала провести ориентировочное
сжигание, для определения содержания неорганических веществ. Для этого сжигают в пла-
тиновом тигле несколько граммов вещества до совсем белого остатка. Вещество полезно
предварительно сушить несколько часов в сушильном шкафу при 120—150°. Сжигание
следует проводить в муфельной печи при температуре около 600°, благодаря чему избе-
гают образования в тигле нерастворимой пленки. Для окончательного сжигания берут
такое количество вещества, чтобы получить 0,1—0,2 г неорганического остатка.
Для проведения окончательного сжигания существует два метода: сухое сжигание,
при котором материал обрабатывают в платиновом тигле, не добавляя окислителей, и мок-
рое сжигание, при котором проводят окисление концентрированной азотной кислотой.
При сухом сжигании высушенный и взвешенный материал нагревают в платино-
вом тигле при —600° до почти белого остатка. Затем остаток перемешивают с разбавлен-
ной HNO3 (1 : 1), добавляют (если не должен определяться калий) на кончике шпателя
хлорат калия и осторожно нагревают. Досуха выпаривают, добавляют еще раз разбав-
ленную (1 : 1) азотную кислоту и остаток растворяют при нагревании, добавляя испа-
ряющуюся кислоту. Осторожно выпаривают досуха и остаток растворяют в дистилли-
рованной воде. Дальнейшие операции теперь можно проводить, как описано в разд. В.
Если необходимо определить следы тяжелых металлов, то применяемую для сжигания
кислоту следует предварительно перегнать, так как она может содержать ионы, пере-
шедшие при длительном хранении из стекла. Прибор для перегонки необходимо пред-
варительно несколько дней кипятить с соответствующей кислотой.
Мокрое сжигание проводят в пирексовой круглодонной колбе с длинным горлом
или в специальном аппарате [4]. Все стеклянные приборы перед употреблением кипятят
несколько дней с концентрированной азотной кислотой. Высушенный и взвешенный
материал помещают в колбу. Затем добавляют на 1 г сухого материала 10 мл дымящей
азотной кислоты для анализа. Осторожно нагревают на песчаной бане, при этом выде-
ляются красно-коричневые пары. При замедлении реакции нагревают сильнее, до пол-
ной отгонки азотной кислоты. К остатку еще раз добавляют азотную кислоту. Добавле-
ние следует проводить осторожно, поскольку при этом вещество может воспламениться
и в результате вспышки возможны его потери. Сновадосуха выпаривают и эту операцию
повторяют до тех пор, пока остаток не станет совсем белым. Наконец его растворяют
в разбавленной HNO3, после чего можно осуществить групповое разделение.
Видоизменение метода мокрого сжигания состоит в том, что перед добавлением
азотной кислоты для ускорения процесса сжигания исследуемый материал смешивают,
с несколькими каплями концентрированной серной кислоты. Однако в присутствии
щелочноземельных металлов образуются труднорастворимые сульфаты.
Мокрое сжигание имеет перед сухим преимущество, которое заключается в том, что
при этом не образуется труднорастворимой пленки. Недостатком этого метода является
образование в присутствии белковых веществ прочных нптропродуктов, разрушающихся
только при сухом нагревании. Поэтому при необходимости определения неорганических
ионов в материале, содержащем белок, сжигание не проводят, а белок коагулируют,
лучше всего 10%-ным раствором трихлоруксусной кислоты. Осадок отделяют центри-
фугированием, промывают 10%-ной трихлоруксусной кислотой, раствор и промывные-
Гл. 22. Анализ неорганических ионое методом ХТС
467
воды упаривают досуха. Остаток растворяют в разбавленной соляной или азотной кис-
лоте и подвергают дальнейшей обработке.
Описанные до сих пор методы обогащения пригодны прежде всего для определения
катионов. При необходимости определения анионов успешно применяют следующий:
метод. Высушенный и взвешенный материал (о количестве см. выше) нагревают до 400°,.
причем полного сжигания ие достигают. Остаток хорошо смешивают примерно с 8-крат-
ным количеством Na2CO3 (чда) и нагревают 3 час на паяльной горелке. Лепешку плава
растворяют, кипятят в дистиллированной воде и отфильтровывают нерастворимые час-
тицы. Поскольку большие количества ионов натрия могут оказать влияние на разделе-
ние анионов, рекомендуется его удалить, пропустив раствор через катионит в Н-форме
(например, амберлит IR-120). Перед обработкой ионообменником необходимо опреде-
лить его емкость. Определенное количество свежерегенерированного ионообменника
смешивают с избытком раствора NaCl. Встряхивают 30 мин, фильтруют, промывают
дистиллированной водой и титруют ионы водорода раствором NaOH с фенолфталеином.
В конечный раствор добавляют 1,5-кратное количество ионообменника по отноше-
нию к взвешенному количеству соды, встряхивают 30 мин, отсасывают, промывают смолу
2—3 раза дистиллированной водой и осторожно упаривают объединенные фильтраты
(ИК-лампа) до удаления кислых паров (покраснение помещенной сверху влажной лак-
мусовой бумажки). Затем точно нейтрализуют разбавленным раствором NaOH. Полу-
ченный таким образом раствор доводят дистиллированной водой до определенного объема.
3. ОЧИСТКА СИЛИКАГЕЛЯ Г ДЛЯ АНАЛИЗА НЕОРГАНИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ
МЕТОДОМ ХТС [8]
Как уже отмечалось, для анализа неорганических веществ методом
ХТС сорбент следует подвергнуть очистке. Мы установили, что описанная
ниже методика очистки является наиболее простой, причем получают мате-
риал, достаточно чистый для хроматографического анализа .неорганических
ионов.
500 г силикагеля Г («Merck») смешивают в стакане с раствором соляной кислоты (500 мл
конц. НС1 и 500 мл дистиллированной воды). При этом происходит слабое выделение
газа и раствор окрашивается в желтый цвет (ионы железа). На поверхности раствора
можно наблюдать темные частицы угля. Из раствора, оставленного на 12 час, большая
часть силикагеля осаждается. Отстоявшийся слабо мутный желтый раствор декантируют.
Осадок снова взмучивают с 1000 мл дистиллированной воды. Слабо мутный отстоявшийся
раствор снова декантируют. Эту промывку дистиллированной водой повторяют 3 раза.
Затем силикагель отсасывают на фильтре Нутча и промывают дистиллированной водой
до нейтральной реакции фильтрата, затем 300 мл этанола и, наконец, 300 мл бензола.
Очищенный таким образом силикагель сушат в печи при 120° в течение 24 час.
Очищенный и высушенный силикагель необходимо просеять, так как при очистке
могут образоваться комки, что вызывает трудности при нанесении слоя. Для этой цели
мы применяли механическое сито 350 меш = 0,045 мм.
Большая часть первоначально присутствующего в качестве связующего материала
сульфата кальция при очистке переходит в раствор; приготовленный таким способом
силикагель может применяться для приготовления слоев с различными связующими.
4. ПРИГОТОВЛЕНИЕ МАССЫ ДЛЯ НАНЕСЕНИЯ НА ПЛАСТИНКИ
28 г очищенного, как описано выше, силикагеля растирают с 2 г CaSO4'2H2O (для
анализа) или 2 г растворимого крахмала, смешивают с 50 мл дистиллированной воды,
а затем добавляют еще 10 мл дистиллированной воды. Следует обратить внимание на
то, чтобы суспензия была совершенно однородна. Эту суспензию наносят с помощью
специального устройства. Данного количества достаточно для 5 пластинок размером
20 X 20 см или 20 пластинок размером 5 X 20 см.,Пластинки сначала сушат при ком-
натной температуре, а затем в сушильном шкафу при 110° в течение 2 час. Хранить
пластинки следует в неоткачанном эксикаторе над СаС12. '
IV. АНАЛИЗ МЕТОДОМ ХТС КАТИОНОВ, ПРЕДВАРИТЕЛЬНО
РАЗДЕЛЕННЫХ НА ГРУППЫ
В опытах, описанных ниже, разделение осуществлялось при использо-
вании одномерной восходящей методики. В наших опытах оказалось, что
при анализе неорганических веществ методом ХТС вообще нельзя приводить
30*
<468
Специальная часть
величины Rf, как в случае бумажной хроматографии. Значение Rf меняется
в зависимости от влажности сорбционного слоя. Однако относительная высо-
та подъема отдельных ионов, нанесенных рядом, есть величина постоянная.
G другой стороны, эта относительная высота подъема ионов при наличии
смеси нескольких ионов не является постоянной величиной, поскольку
различные ионы часто взаимно вытесняют друг друга. Это обстоятельство
заставило нас вообще отказаться от приведения величин Rf и указывать
только постоянную последовательность высот поднятия ионов. При обра-
ботке хроматограммы можно точно идентифицировать отдельные ионы по
известным реакциям обнаружения. В последующих опытах предполагается
уже описанное разделение ионов с помощью классических методов на ана-
литические группы.
Нанесение проб на хроматограмму лучше всего производить следующим
образом: наносят рядом на линию старта 2 или 3 пятна анализируемого
раствора разной концентрации. Это позволяет определить следы элементов
и избежать окклюзии в результате слишком высокой концентрации дру-
гих элементов. Кроме того, в каждом случае рекомендуется параллельно
наносить на хроматограмму контрольные пробы, содержащие ожидаемые
катионы, и провести с ними весь ход анализа.
Во всех опытах предполагается, что разделительная камера оклеена
изнутри фильтровальной бумагой для обеспечения насыщения паровой фазы.
1. РАЗДЕЛЕНИЕ ГРУППЫ МЕДИ (РАСТВОР I) [8]
Для разделения группы меди в качестве растворителя применяют смесь
100 мл н-бутанола, 20 мл 1,5 н. НС1 и 0,5 мл ацетонилацетона. Добавлением
слабого комплексообразователя добиваются значительного сокращения так
Рис. 187. Разделение группы Си.
называемых хвостов. При применении более сильного комплексообразовате-
ля, например ацетилацетона, катионы переходят во фронт, т. е. в относи-
тельно неполярную часть растворителя. В указанном растворителе по высоте
подъема получился следующий ряд ионов (рис. 187): Hg > Bi > Cd >
> Pb > Си.
Слой: силикагель — гипс (см. стр. 467).
Контрольные пробы: рядом наносят по 0,002 мл 0,1 М растворов Hg(NO3)2-
• 2Н2О, Cd(CH3COO)2- 2Н2О, BiONO3, Pb(NO3)2, Cu(CH3COO)2 -Н2О.
Гл. 22. Анализ неорганических ионов методом ХТС
№9
Время: около 2 час.
Обнаружение: опрыскивают 2%-ным раствором KI, сушат, держат над
парами аммиака и затем помещают пластинку в камеру, заполненную) газо-
образным H2S (табл. 122).
Таблица 122:
Цветные реакции ионов ряда меди
Ион Окраска I Ион Окраска
раствор KI H2s раствор KI H2S
Hg(II) Красная Коричнево- РЬ(П) Желто-корич- Коричневая
Bi(III) Cd (II) Желто-ко- ричневая черная » Желтая Сп(П) невая Коричневая Темно-ко- ричневая
2. РАЗДЕЛЕНИЕ ГРУППЫ (NH4)2S (РАСТВОР И) [8]
Для разделения группы (NH4)2S применяют смесь 100 мл ацетона, 1 мл
концентрированной НС1 и 0,5 мл ацетонил ацетона. Если поместить
Рис. 188. Разделение группы (NH4)2S.
в камеру небольшой кристаллизатор с водой, можно достичь лучшего эффекта
разделения. В указанном растворителе ионы располагаются по высоте подъема
в следующий ряд (рис. 188) Fe > Zn > Со > Мп > Cr> Ni > Al.
Цветные реакции ионов группы (NH4)2S
Таблица 123
Ион Окраска Ион Окраска
NH3 8-оксихино- лин УФ-свет NH3 8-оксихино- ЛИН УФ-свет
Fe (III) Zn (И) Со'(И) Мп (II) Синяя Коричневая Розовая Желтая Оранжевая Темная Желтая Темная Сг (II) Ni (II) Al (III) Зеленая Темная » Светло- желтая
470
Специальная часть
Слой: силикагель — гипс (см. стр. 467).
Контрольные пробы: рядом наносят по 0,002 мл 0,1 М растворов NiSO4«
-7Н2О, Co(NO3)2-6H2O, ZhSO4-7H2O, MnSO4-H2O, А1(СН3СОО)3, CrCl3-6H2O
и FeCl3.
Обнаружение: пластинки держат над парами аммиака и сразу опрыски-
вают раствором 0,5 а 8-оксихинолина в 100 мл 60%-ного этанола. Полученные
пятна рассматривают в УФ-свете (табл. 123).
3. РАЗДЕЛЕНИЕ ГРУППЫ (NH4)2CO3 (РАСТВОР III) [9]
' Поскольку наличие гипса в сорбционном слое привело бы к образованию
нерастворимых сульфатов этих ионов и обнаружение проводят с виолуро-
вой кислотой, в качестве связующего следует применять крахмал.
Р и с. 189. Разделение группы (МН4)2СОз.
Кроме того, ионы этой группы должны присутствовать в форме ацетатов,
что, однако, не вызывает затруднений, так как ацетаты легко получить
растворением карбонатов в 6 н. уксусной кислоте.
Трудность разделения этой группы заключается в том, что кальций
движется с образованием большого хвоста, что можно подавить, добавив
в каждое исходное пятно дополнительно 0,001 мл ледяной уксусной кислоты.
В системе из 37,5 мл этанола, 37,5 мл н-пропанола, 5 мл ледяной уксус-
ной кислоты, 1 мл ацетилацетона и 20 мл дистиллированной воды получается
по высоте подъема следующий ряд ионов Са > Sr > Ва (рис. 189).
Слой: силикагель — крахмал (см. стр. 467).
Контрольные пробы: рядом наносят по 0,001 мл! М растворов ацетатов
Са, Ва и Sr с добавкой 0,001 мл ледяной уксусной кислоты.
Время: 80—90 мин.
Обнаружение: после опрыскивания 1,5%-ным раствором виолуровой
кислоты в дистиллированной воде нагревают в сушильном шкафу (100°)
20 мин, что обеспечивает четкое окрашивание (табл. 124).
Таблица 124
Цветные реакции ионов группы (NH4)2CO3
Ион Са2+ Sr2+ Ва2*
Окраска с виолуровой кислотой Желто-оранжевая Розовая Красно-фиолето- вая
Гл. 22- Анализ неорганических ионов методом ХТС
471
4. РАЗДЕЛЕНИЕ ЩЕЛОЧНОЙ ГРУППЫ (РАСТВОР IV) [10]
Поскольку при определении ионов щелочной группы виолуровой кис-
лотой наличие гипса в слое мешает, в качестве связующего можно исполь-
зовать крахмал.
Далее, катионы этой группы должны находиться в форме ацетатов.
Щелочные соли сильных кислот обрабатывают один раз анионным обменни-
ком в ацетатной форме, что, однако, приводит к увеличению объема и к необ-
ходимости дополнительного концентрирования.
Поэтому мы пытались провести анионный обмен непосредственно на
пластинке. Оказалось, что ионы бария в указанном растворителе остаются
в исходном пятне. Поэтому поступают следующим образом: сначала наносят
ацетат бария в количестве, приблизительно эквивалентном ионам щелочных
металлов, а затем наносят сульфаты щелочных металлов. Происходит обмен,
и исследуемые щелочные ионы теперь' можно разделить и идентифицировать
см
5г
4 -
Рй с. 190. Разделение группы щелочных металлов.
виолуровой кислотой. В месте старта появляется красное пятно Ва2+. Раство-
рителю дают подняться несколько выше (15 см), чем в случае непосредст-
венного нанесения ацетатов (10 см). В системе из 100 мл абсолютного этанола
и 1 мл ледяной уксусной кислоты по высоте подъема получают следующий
ряд ионов (рис. 190): Li > Mg > Na > К.
Слой', силикагель — крахмал (см. стр. 467).
Контрольные пробы', рядом наносят по 0,001 мл 1 М растворов ацетатов
Li, Na, К, Mg, слегка подкисленных ледяной уксусной кислотой.
Время: ацетаты 50 мин, сульфаты 70 мин.
Обнаружение: после опрыскивания 1,5%-ным раствором виолуровой
кислоты в дистиллированной воде (при растворении виолуровой кислоты
не нагревать выше 60°) нагревают 20 мин в сушильном шкафу (100°), что
приводит к четкому окрашиванию (табл. 125).
Таблица 125
Цветные реакции ионов щелочной группы
Ион ы+ Mg2+ Na+ к+
Окраска с виолуровой Светло-крас- Желто-оран- Красно-фио- Сине-фиоле-
КИСЛОТОЙ нал жевал летовал товая
5. ВЫДЕЛЕНИЕ U (VI) И Ga (III) ИЗ СМЕСИ КАТИОНОВ [7]
Иногда представляет интерес определение только одного иона, независимо
от сопутствующих ионов. Так можно выделить UO2^ из смеси ионов Fe, Си,
Со, Ni, Cr, Al, Th и идентифицировать без предварительного разделения
на аналитические группы, причем концентрация сопутствующих ионов
472
Специальная часть
может быть значительно выше концентрации урана. Проводят хроматогра-
фический анализ на пластинке со слоем силикагель — гипс. В качеств»
растворителя применяют смесь 50 мл свежеперегнанного уксусного эфира
и 50 мл эфира, насыщенного водой, с добавлением 2 мл три-н-бутилфосфата.
Наносимый раствор должен быть 4,7 н. по азотной кислоте. В предложенном
растворителе образуется сольватный комплекс (три-н-бутилфосфат) уранил-
нитрата, и другие катионы при этом значении pH подобных комплексов
не образуют. Они задерживаются в исходном пятне или поднимаются очень-
см
Юг
9 -
8 -
7 -
Рис. 192. Разделение А1з+ и Ga3+.
U0a+
ЕШШиоГ
Рис. 191. Отделение UO|+ от смеси
катионов.
мало; урановый комплекс, наоборот, движется в области фронта и может
быть обнаружен пиридилазонафтолом (рис. 191). 1 р.г урана можно еще
очень хорошо отделить и определить.
Слой-, силикагель — гипс (см. стр. 467).
Контрольные пробы: наносят 0,001—0,004 мл раствора 0,527 г UO2(NO3)2-
•6Н2О в 50 мл 4,7 н. HNO3.
Время: 10—15 мин.
Обнаружение: 0,25%-ный раствор пиридилазонафтола в этаноле.
Отделить Ga3+ от больших количеств А13+ можно также на пластинках
со слоем силикагель — гипс [7]. Растворителем служит смесь 100мл свеже-
перегнанного ацетона и 0,Ьмл концентрированной НС1. В растворителе обра-
зуется GaCl3, который имеет сильно гомеополярный характер и переносится
неполярйой частью растворителя, а А13+ остается в точке старта. Оба иона
обнаруживаются после опрыскивания раствором оксина в УФ-свете. Этим
методом можно надежно отделить еще 0,5 % Ga3+ от А13+ и идентифициро-
вать 1 рг Ga3+ (рис. 192).
Слой: силикагель — гипс (см. стр. 467).
Время: 10—15 мин.
Обнаружение: опрыскивают 0,5%-ным раствором 8-оксихинолина в
в 60%-ном этаноле, помещают в пары аммиака и рассматривают в УФ-свете.
V. АНАЛИЗ АНИОНОВ МЕТОДОМ ХТС
1. РАЗДЕЛЕНИЕ ГАЛОГЕНИДОВ [И]
И в этом случае проводят анализ на слое силикагель — гипс. Исполь-
зуют галогениды натрия и калия. Идентификацию можно провести флуорес-
цирующим индикатором (аммиачный раствор AgNO3 и флуоресцеин) с после-
Гл. 22. Анализ неорганических ионое методом ХТС 473
дующим рассмотрением в УФ-свете или pH-индикатором (бромкрезоловый
пурпуровый). Для обнаружения фторидов применяют цирконализариновый
лак. При разделении анионов галогенидов растворитель должен быть более
полярным, чем при разделении катионов, поскольку катионы сольватируют-
ся сильнее анионов и благодаря этому могут образовать сольватные системы
с неводными растворителями, а у анионов эта способность выражена слабее.
см
э
4
3
2
1
О
□ г EF
§Вг- Ц Br-
ik ^СГ
ш?- El__m m шг-
Р и с. 193. Разделение галогенидов.
Только иодид перемещается и в неполярном проявителе, что, однако, объяс-
няется частичным окислением иодида до иода, поскольку соответствующее
желтое пятно появляется без применения реактива, для обнаружения.
В системе из 65 мл ацетона, 20 мл н-бутанола, 10 мл концентрированного'
NH3 и 5 мл дистиллированной воды получают следующий ряд анионов, рас-
положенных по их высоте подъема: F' < С1_ <; Вт- <; I- (рис. 193).
При применении pH-индикаторов в качестве реактива для обнаружения
видно, что анионы перемещаются в виде аммонийных солей, а ионы щелочных
металлов остаются в начальном пятне. Аммонийные соли анионов дают свет-
ло-желтые пятна, а ионы щелочных металлов — ярко-синие (на старте).
Фтор-ион остается в исходном пятне и обнаруживается цирконализариновым
лаком.
Слой-, силикагель — гипс.
Контрольные пробы: по 0,001 мл 1 М растворов NaF, NaCl, КВт и KI.
Время: 30—40 мин.
Обнаружение: 1. 0,1%-ный этанольный раствор бромкрезолового пурпу-
рового, к которому добавлено несколько капель разбавленного раствора NH3
до точки перехода.
2. 1%-ный раствор аммиачного нитрата серебра и 0,1%-ный раствор
флуоресцеина в этаноле.
3. 0,1%-ный раствор цирконализаринового лака в сильнокислой среде.
2. РАЗДЕЛЕНИЕ ФОСФАТОВ [12]
Как и в случае галогенидов, здесь также можно утверждать, что при
разделении анионов растворитель должен быть более полярным, чем при
разделении катионов.
При работе со слоем силикагель — гипс образуется нерастворимый фос-
фат кальция, который мешает разделению различных анионов фосфорной
кислоты. Поэтому, как и в случае катионов щелочных металлов, работают
на слоях силикагель — крахмал.
Применяют натриевые соли пиро- и ортофосфорной кислот, а также
фосфористой и фосфорноватистой кислот. Мы исследовали различные системы
растворителей — щелочные и кислые. При использовании кислой системы
(различные количества трихлоруксусной кислоты в различных спиртах)
можно наблюдать известную тенденцию к перемещению, однако разделение
смеси неудовлетворительно.
Alli
Специальная часть
^Хорошего разделения достигают в аммиачно-спиртовых растворителях.
Наилучшие результаты были достигнуты с системой, содержавшей для
забуферивания NH3 трихлоруксусную кислоту. Из использованных спиртов
наилучшие результаты дала система с ме-
Р и с. 194. Разделение фосфатов.
танолом, показавшая самое малое время.
Самым лучшим растворителем оказалась
смесь метанол — конц. NH3 — 10%-ная
трихлоруксусная кислота — вода (50 +
+ 15 + 5+ 30) (рис. 194).
Обнаружение анионов фосфорных ки-
слот проводят с помощью молибдата аммо-
ния и хлорида олова (II). При этой ре-
акции определяемые анионы дают синие
пятна.
Слой: силикагель — крахмал (см.
стр. 467).
Контрольные пробы: рядом наносят по
0,001 мл 0,1 М растворов Na2H2P2O7,
NaH2PO4, NaH2PO3-2,5Н2О и NaH2PO2X
X Н2О.
Время: 50—60 мин.
Обнаружение: высушенные пластинки опрыскивают 1%-ным раствором
молибдата аммония в воде, а затем 1%-ным раствором хлорида олова (II)
в 10%-ной соляной кислоте. В результате появляются синие пятна. В при-
сутствии гипофосфита синее окрашивание может появиться через некоторое
время.
ЛИТЕРАТУРА
1. К u n z i Р., Diss., Basel, 1962.
Н а Г1 N. F., Analyt. Chemistry, 21, 185 (1949).
2. M e i n h a r d J. E., H a 11 N. F., Analyt. Chemistry, 21, 185 (1949).
3. M о о r e G. E., Kraus K. A., J. Am. Chem. Soc., 74, 843 (1952).
4. Pedretti E., Ber. schweiz. bot. Ges., 68, 103 (1958).
5. Sansoni B., Angew. Chem., 66, 330 (1954); Z. Elektrochem., 57, 161 (1953);
Naturforsch., 11b, 117 (1956).
6. S e i 1 e r ” .............
7. Seiler
Seiler
e
e
e
e
Z.
Helv. chim. Acta, 45, 381 (1962).
Helv. chim. Acta, 44, 939 (1961).
Helv. chim. Acta, 43, 1939 (1960).
неопубликованные данные.
Ro thweiler W., Helv. chim. Acta, 44, 941 (1961).
К af f enberger T., Helv. chim. Acta, 44, 1282 (1961).
Helv. chim. Acta, 44, 1753 (1961).
H.
H.,
H.
H
H..
H.'
H.
d F., Kirchner K., Z. anorg. allgem. Chem., 280, 211 (1955); U
'., Schwab G. M., J о c k e r s K., Angew. Chem., 50, 546 (1937); U
8.
9.
10.
11.
12.
13. U m 1 a n
land F.,
land F., Kunin R., Myers R. J., Jon Exchange Resins, New York,' John Wiley
and Sons Inc.; London, Chapman and Hall, 2. ed., 1958, p. 59.
s
s
s
s
1
1
1
1
e
e
e
e
r
r
r
r
m-
m-
ГЛАВА 23
РЕАКТИВЫ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ
ПРИ АНАЛИЗЕ МЕТОДОМ ХТС
Д. Валъди
I. ОБ ОПЕРАЦИИ ОПРЫСКИВАНИЯ
Как уже сказано на стр. 33, при ХТС необходимо наносить на слой рас-
твор реактива в сильно распыленном состоянии, в виде аэрозоля. Само-
дельные приборы для распыления
реактивов часто непригодны, поскольку
образуются слишком большие кап-
ли. В особенности хороши имеющие-
ся сейчас в продаже банки для
Рис. 195. Распылитель со
сжатым газом и сменной
стеклянной бутылью для
жидкости для опрыскивания.
Рис. 196. Схема опрыскивания.
Струю распыляемого вещества пе-
ремещают над слоем в направле-
нии, указанном стрелкой.
спрыскивания для некоторых часто применяемых реактивов, например нин-
гидрина (реактив № 108), анилинфталата (реактив № 8), бромкрезоло-
вого зеленого (реактив № 22). Весьма удобен, по-видимому, также «Labo-
ratory Spray-Gun». Этот прибор имеет сосуд для сжатого газа, причем ра-
створ для опрыскивания можно в случае необходимости менять (рис. 195).
Для получения равномерного слоя при опрыскивании, необходимого для
количественных расчетов, в наших работах применялась определенная схе-
ма опрыскивания. На расстоянии 30—40 см над хроматограммой медленно
три раза передвигают разбрызгиваемую струю по схеме, показанной на
рис. 196. Соответствующий прибор для разбрызгивания описан Рейо [ J. Chro-
matogr. 1, ,338 (1958)].
Примечание. Трудности, связанные с определением вещества на темном
слое сорбента, например на угле, окиси железа и т. д., были устранены
Хессе и Александером следующим образом. На темный высушенный слой
равномерно наносили с помощью прибора для распыления фиксатива сус-
пензию из силикагеля Г с лигроином. На полученном таким образом белом
верхнем слое можно затем провести обнаружение с помощью обычных реак-
тивов для опрыскивания.
476
Специальная часть
II. О ПРИГОТОВЛЕНИИ РЕАКТИВОВ
Применяемые химические реактивы должны соответствовать определен-
ным требованиям в отношении чистоты, и в ряде случаев полезно исполь-
зовать реактивы, специально проверенные хроматографически. При
приготовлении некоторых реактивов требуется большая осторожность, и полу-
чение их должно проводиться только соответственно подготовленным пер-
соналом. В качестве примера здесь можно указать на опасность отравления
при работе с бромцианом (реактив № 88), а также на взрывоопасность диа-
зотированной сульфаниловой кислоты (реактив № 37) и реактива Толленса
(реактив № 137). В случае агрессивных растворов для опрыскивания (хро-
мовая смесь, царская водка, хлорид олова и т. д.), часто применяемых в ХТС,
следует рекомендовать защитные очки. Это же относится и к рассматрива-
нию хроматограммы в проходящем УФ-свете (опасность взрыва ртутной
лампы).
Ниже приведены в алфавитном порядке проверенные прописи пригото-
вления реактивов для обнаружения и способы их применения.
III. ПРИГОТОВЛЕНИЕ И ПРИМЕНЕНИЕ РЕАКТИВОВ
ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ
1. Ализарин для ионов лития, кальция, магния, алюминия, тория, циркония, аммония
и селена.
Раствор для опрыскивания I. Насыщенный спиртовой раствор ализарина.
Раствор для опрыскивания II. 1 н. раствор NaOH.
Проведение реакции. Хроматограмму опрыскивают раствором I, непродолжительное
время сушат и опрыскивают раствором II.
Последующая обработка. Хроматограмму помещают в камеру, насыщенную парами
аммиака.
2. Хлорид алюминия для флавоноидов.
Раствор для опрыскивания. 1%-ный раствор хлорида алюминия в этаноле.
Проведение реакции. Хроматограмму опрыскивают и рассматривают в монохрома-
тическом ультрафиолетовом свете.
3. Молибдат аммония — цитратный буфер для витамина С.
Раствор I. 15%-ный раствор молибдата аммония в 1%-ном аммиаке.
Раствор II (буфер pH 3,8). Смешивают 48,1 мл 0,1 н. соляной кислоты и 51,9 мл
0,1 М цитрата натрия (21,008 г лимонной кислоты + 200 мл 1 н. NaOH в литре).
Раствор для опрыскивания. Смешивают 15 мл раствора I и 10 мл раствора II. К сме-
си добавляют 15 капель серной кислоты (1,84). (Устойчивость: не более 2 дней.) Реак-
тив № 42 более чувствителен.
4. Молибдат аммония — хлорид олова (II) для фосфорных кислот.
Раствор для опрыскивания I. 1%-ный водный раствор молибдата аммония.
Раствор для опрыскивания II. 1%-ный раствор хлорида олова (II) в 10%-ной соля-
ной кислоте.
Проведение реакции. Опрыскивают раствором I и после высупшвания опрыскивают
раствором II; в случае необходимости 3—5 мин нагревают при 105°.
5. Роданид аммоиия — сульфат железа (II) для перекисей.
Раствор для опрыскивания. 0,2 г роданида аммония растворяют в 15 мл ацетона.
Непосредственно перед употреблением добавляют 10 мл свежеприготовленного 4%-
ного водного раствора сульфата железа (II).
Примечание. Только быстрое появление красно-коричневого пятна или зоны указы-
вает на присутствие перекиси. Спустя некоторое время весь слой окрашивается в крас-
новато-коричневый цвет.
6. Тиоцианат аммония для перекисей.
Раствор для опрыскивания 1. 0,4 г тиоцианата растворяют в 30 мл ацетона.
Раствор для опрыскивания II. 1,2 г сульфата железа (II) растворяют в 30 мл- воды-
Проведение реакции. Сначала опрыскивают раствором I, недолго сушат, а затем опры-
скивают раствором II.
Гл. 23. Реактивы для обнаружения при анализе методом ХТС 477
7. Анилин — фосфорная кислота для восстановленных сахаров.
Раствор для опрыскивания. 1 объем 2 н. раствора анилина в насыщенном водой бута-
ноле-1 смешивают с 2 объемами 2 н. раствора ортофосфорной кислоты в бутаноле-1.
Последующая обработка. Хроматограмму нагревают 10 мин при 105°.
-8. Анилинфталат для восстановленных сахаров.
Раствор для опрыскивания. 0,93 г анилина и 1,66 г о-фталевой кислоты растворяют
в 100 мл насыщенного водой бутанола-1.
Последующая обработка. Пропитанную хроматограмму нагревают 10 мин при 105°.
•9. Анисовый альдегид — серная кислота для стероидов, терпенов, сахаров и т. д.
Раствор для опрыскивания. Свежеприготовленный раствор 0,5 мл анисового альде-
гида в 50 мл ледяной уксусной кислоты с добавкой 1 мл серной кислоты (1,84).
Последующая обработка. 5—10 мин нагревают при 100—110°. Розовый фон можно
осветлить действием водяных паров (водяная баня). (Вещества, содержащиеся в лишай-
никах, фенолы, терпены, сахара и стероиды окрашиваются, в зависимости от соеди-
нения, в фиолетовый, синий, красный; серый или зеленый цвет).
Варианты:
а) Раствор для опрыскивания. 1 мл анисового альдегида вносят в 97 мл ледяной уксус-
ной кислоты и к смеси добавляют 2 мл концентрированной серной кислоты.
Последующая обработка. Нагревают 6 мин при 120°.
б) 0,5 мл анисового альдегида растворяют в смеси 10 мл ледяной уксусной кислоты +
+ 85 мл метанола и добавляют 5 мл концентрированной серной кислоты. Для обна-
ружения производных терпена и др. около 10 мл этой смеси распыляют на пластинке
20 X 20 см и нагревают приблизительно 10 мин при 100° .
в) Для обнаружения сахаров применяют свежеприготовленную смесь 0,5 мл анисо-
вого альдегида + 9 мл этанола (95%-ного) + 0,5 мл концентрированной серной кис-
лоты + 0,1 мл ледяной уксусной кислоты. После опрыскивания нагревают 5—10 мин
при 90—100°.
10. Антроновый реактив для кетоз.
Раствор для опрыскивания. 0,3 г антрона растворяют в 10 мл ледяной уксусной
кислоты и в раствор добавляют 20 мл 96%-ного этанола, 3 мл фосфорной кислоты
(1,7) и 1 мл воды. Этот раствор устойчив в холодильнике в течение нескольких
недель.
Проведение реакции. После опрыскивания хроматограмму 5—6 мин нагревают до
температуры ~110°. Кетозы и кетозы, содержащие олигосахариды, появляются
в виде желтых пятен.
11. Хлорид сурьмы (III) для стероидных глюкозидов и витамина А.
Раствор для опрыскивания. 25 г хлорида сурьмы (III) растворяют в 75 г хлороформа,
очищенного от этанола. Для очистки от этанола хлороформ пропускают через колонку
с активной окисью алюминия. Как правило, применяют насыщенный раствор хло-
рида сурьмы (Ш) в хлороформе или в четыреххлористом углероде.
Последующая обработка. После опрыскивания хроматограмму нагревают 10 мин
при 100° (рассматривают хроматограмму в монохроматическом ультрафиолетовом
свете).
12. Хлорид сурьмы (III) — ледяная уксусная кислота для стероидов.
Раствор для опрыскивания. 1 вес. ч. хлорида сурьмы (III) растворяют в 1 вес. ч.
ледяной уксусной кислоты.
Последующая обработка. Нагревают 5 мин при 95°.
13. Хлорид сурьмы (V) для терпенов, масел и смол.
Раствор для опрыскивания. 2 объема хлорида сурьмы (V) смешивают с 8 объе-
мами четыреххлористого углерода.
Проведение реакции. После опрыскивания пластинки с тонким слоем нагревают при
120° до появления пятен.
14. Ауринтрикарбоновая кислота (аммонийная соль) для ионов алюминия, хрома и литии.
Раствор для опрыскивания. 0,1%-ный раствор аммонийной соли ауринтрикарбо-
новой кислоты в 1%-ном водном растворе ацетата аммония.
Последующая обработка. Хроматограмму помещают в камеру, насыщенную парами
аммиака.
15. Бензидин для терпенальдегидов, флавоноидов, углеводов.
Раствор для опрыскивания. 0,5 г бензидина растворяют в 20 мл ледяной уксусной
кислоты и 80 мл этанола.
Последующая обработка. Нагревают 15 мин при 100° (ванилин приобретает окраску
от желтой до оранжевой). Пятна некоторых веществ окрашиваются еще сильнее,
если после нагревания провести опрыскивание разбавленной соляной кислотой.
16. Беизидии для персульфатов.
Раствор для опрыскивания 1. 50 мг бензидина растворяют в 100 мл 1 н. уксусной
кислоты. После опрыскивания персульфаты окрашиваются в синий цвет.
478
Специальная часть
17. Бензидин — сульфат меди для пиридинмонокарбоновых кислот.
Раствор для опрыскивания I. 0,3 г сульфата меди растворяют в 100 мл смеси, сос-
тоящей из 5 объемов воды и 4 объемов этанола.
Раствор для опрыскивания II. 0,1%-ный раствор бензидина в 50%-ном этаноле.
Проведение реакций. После опрыскивания раствором I хроматограмму высушивают
при 60°, а затем опрыскивают раствором II (синие пятна).
18. Бензидин —метапериодат натрия для кислот, сахаров и сахарных спиртов.
Раствор для опрыскивания I. 0,1%-ный водный раствор метапериодата натрия.
Раствор для опрыскивания II. К раствору 2,8 г бензидина в 80 мл 96%-ного этанола
добавляют 70 мл воды, 30 мл ацетона и 1,5 мл 1 н. соляной кислоты.
Проведение реакции. После опрыскивания раствором I влажную хроматограмму
опрыскивают раствором II.
19. Бензоилхлорид — хлорид цинка для стероидов.
Раствор для опрыскивания I. Раствор 20 г хлорида цинка в 30 мл ледяной уксусной
кислоты.
Раствор для опрыскиваний II. 50 г бензоилхлорида растворяют в хлороформе. Рас-
твор доводят до 100 мл хлороформом.
Проведение реакции. Опрыскивают раствором I, нагревают 5 мин при 90% сухую
хроматограмму опрыскивают раствором II и нагревают 2—3 мин при 90° (пятна
рассматривают в видимом и ультрафиолетовом свете).
20. Основной'ацетат свинца для уроновых кислот и флавоноидов.
Раствор для опрыскивания. Отфильтрованный насыщенный водный раствор ацетата
свинца.
Последующая обработка. Сушат в течение 10 мин при 110°.
21. Борная кислота — лимонная кислота для хинолинов.
Раствор для опрыскивания. 0,5 г борной кислоты и 0,5 г лимонной кислоты раство-
ряют в 20 мл метанола.
Последующая обработка. 10 мин нагревают при 100°. (Наблюдение в монохромати-
ческом ультрафиолетовом свете; 8-оксихинолин желтовато-зеленый).
22. Бромкрезоловый зеленый в качестве индикатора.
Раствор для опрыскивания. 0,04 г бромкрезолового зеленого растворяют 'в 100 мл
96%-ного этанола. К раствору добавляют 0,1 н. раствор натриевой щелочи до ясно
выраженного синего окрашивания.
23. Бромкрезоловый пурпуровый для галоген-ионов.
Раствор для опрыскивания. К 0,1%-му раствору бромкрезолового пурпурового
в этаноле добавляют несколько капель разбавленного раствора аммиака до ясно
выраженного изменения окраски.
24. Бромтимоловый синий для липидов.
Раствор для опрыскивания. 0,04 г бромтимолового синего растворяют в 100 мл 0,01 н.
NaOH.
25. Сульфат церия (IV) — серная кислота (на солнечном свету реактив изменяется)
для алкалоидов, органических соединений, содержащих иод, и токоферолацетатов.
Раствор для опрыскивания. 0,1 г сульфата церия (IV) растворяют в 4 мл воды. После
добавления 1 г трихлоруксусной кислоты нагревают до кипения и медленно по кап-
лям добавляют серную кислоту (1,84) до полного растворения.
Последующая обработка. Несколько минут нагревают при 110° до появления пятен.
Примечание. Реактив окрашивает алкалоиды, апоморфин, бруцин, колхицин, папа-
верин и физостигмин. Его также можно применять для обнаружения органических
соединений, содержащих иод, и токоферолацетатов.
26. Фосфорномолибденовая кислота — хлорид олова (II) для холина и веществ, содер-
жащих холин.
Раствор для опрыскивания 1.1г фосфорномолибденовой кислоты растворяют в 100 мл
смеси равных объемов этанола и хлороформа.
Раствор для опрыскивания II. 1 г хлорида цинка (II) растворяют в 100 мл 3 н. соля-
ной кислоты. Каждый раз приготовляют свежий реактив.
Проведение реакции. Опрыскивают раствором I, 3 мин сушат, опрыскивают раство-
-ром II и вновь сушат 10 мин.
27. Хинидин, общий реактив для кислот.
Раствор для опрыскивания. 0,3%-ный раствор хинидина в хлороформе.
Предварительная обработка. При обработке хроматограммы растворителем, содер-
жащим летучие кислоты (нелетучие использовать нельзя), следует нагревать затем
в токе воздуха до 60—80°.
Гл. 23. Реактивы для обнаружения при анализе методом ХТС
479»
Проведение реакции. После интенсивного опрыскивания хроматограмму нагревают
в течение 10 мин при 110—120° в сушильном шкафу и рассматривают в моно-
хроматическом ультрафиолетовом свете.
28. Хинидин — сульфат меди (реактив на барбитуровую и тиобарбитуровую кислоты)..
Раствор для опрыскивания. 200 мг сульфата меди, 2 мл пиридина и 20 мг хинидина
растворяют в 100 мл воды.
Последующая обработка. Высушенную хроматограмму устанавливают в токе паров
соляной кислоты (темное пятно в фильтрованном ультрафиолетовом свете).
29. n-Хинон для этаноламина.
Раствор для опрыскивания. 0,5 г n-хинона (бензохинона) растворяют в смеси 10 мл
пиридина и 40 мл н-бутанола.
Примечание. Сразу после опрыскивания появляется красное пятно этаноламина.
Холин не реагирует.
30. Хлорамин Т для кофеина.
Раствор для опрыскивания I. 10%-ный водный раствор хлорамина Т.
Раствор для опрыскивания II. 1 н. соляная кислота.
Проведение реакции. Опрыскивают раствором I и после непродолжительного высу-
шивания опрыскивают раствором II. Нагревают при 96—98° до исчезновения запаха
хлора. Пластинку помещают во влажную камеру, насыщенную аммиаком (5 мин),.
и еще раз слегка нагревают до появления интенсивной розово-красной окраски.
31. Хлорамин-трихлоруксусная кислота для дигиталисглюкозидов.
Раствор для опрыскивания. 10 мл свежеприготовленного 3%-ного водного раствора'
хлорамина смешивают с 40 мл 25%-ного раствора трихлоруксусной кислоты в 96%-
ном этаноле (трихлоруксусная кислота устойчива несколько дней).
Проведение реакции. После опрыскивания 7 мин нагревают при 110° в сушильном
шкафу. В монохроматическом ультрафиолетовом свете голубоватые пятна, глюко-
зиды ряда А появляются в виде желтых пятен.
32. Хлор-толидиновый реактив.
Хлорирование. Пластинку выдерживают в атмосфере хлора (хлор из баллона 5—
10 мин, хлор при сливании равных частей 1,5%-ного раствора КМпО4 и 10%-ной’
соляной кислоты 15—20 мин), а затем оставляют на 3—5 мин на воздухе для удале-
ния избытка хлора. _
Раствор для опрыскивания. 160 мг о-толидина растворяют в 30 мл ледяной уксусной
кислоты, дистиллированной водой доводят до 500 мл и добавляют 1 г KI.
Проведение реакции. Сначала осторожно опрыскивают раствором край хромато-
граммы: если фон становится голубым, то необходимо несколько повременить с окон-
чательным опрыскиванием.
33. Хлорсульфоновая кислота — ледяная уксусная кислота для тритерпенов, стеринов
и стероидов.
Раствор для опрыскивания. 5 мл хлорсульфоновой кислоты при осторожном охла-
ждении растворяют в 10 мл ледяной уксусной кислоты.
Последующая обработка. 5 мин нагревают при 130° и флуоресценцию определяют
в монохроматическом УФ-свете (365 лц).
34. Хромовая смесь для арнламинов и т. д.
Раствор для опрыскивания. 5 г бихромата калия растворяют в 100 мл 40%-ной
серной кислоты (различная окраска, в зависимости от амина).
35. а-Циклодекстрин для липидов с прямой цепью.
Раствор для опрыскивания. 1%-ный раствор а-циклодекстрина в 30%-ном этиловом;
спирте.
Последующая обработка. После опрыскивания пластинку помещают в сосуд с парами,
нода.
36. Диэтиламин—сульфат меди для тиокислот.
Раствор для опрыскивания. 0,5 г сульфата меди растворяют в 100 мл метанола и добав-
ляют 3 мл диэтиламина.
Примечание. Перед употреблением взбалтывать; устойчив несколько дней. (Тио-
барбитуровые кислоты дают зеленые пятна.)
37. Диазотированная сульфаниловая кислота для фенолов и аминов, применяемых в реак-
циях сочетания.
Приготовление соли диазония. 25 г сульфаниловой кислоты растворяют в 125 мл
10%-ного раствора КОН. Охлажденный раствор смешивают с 100 мл 10%-ного рас-
твора нитрита натрия. Этот раствор постепенно, по каплям при помешивании при-
бавляют к охлажденной соляной кислоте (40 мл НС1 (d 1,19) в 20 мл воды). Тем-
пература реакционной смеси не должна быть выше 8°. Образовавшуюся диазониевую
соль отсасывают на пористом фильтре, промывают последовательно ледяной водой,.
480
Специальная часть
этанолом, эфиром и высушивают. Полученная таким образом соль, сохраняемая
в холодильнике в банках из темного стекла, устойчива несколько месяцев. Вслед-
ствие ограниченной устойчивости во многих случаях предпочитают прочную голубую
В (реактив № 61).
Раствор для опрыскивания. 0,1 г диазониевой соли перед употреблением растворяют
в 20 мл 10%-ного водного раствора соды.
Примечание. При этом следует учесть все общие правила техники безопасности при
получении и хранении взрывоопасных диазониевых солей.
38. Диазотированный и-нитроанилин для фенолов.
Исходный раствор. 0,7 г и-нитроанилина растворяют в 9 мл концентрированной
соляной кислоты (1,19) и разбавляют до 100 мл водой.
Раствор для опрыскивания. 4 мл исходного раствора по каплям при охлаждении
льдом смешивают с 5 мл 1%-ного водного раствора нитрита натрия, а затем доводят
до 100 мл водой, охлажденной льдом.
Примечание. Каждый раз перед употреблением готовят свежий раствор.
39. Диазотирование и сочетание с Р-нафтолом для обнаружения сульфонамидов.
Раствор для опрыскивания I. 1 г нитрита натрия в 100 мл 1 н. соляной кислоты.
Раствор для опрыскивания II. 0,2%-ный раствор Р-нафтола в 1 н. КОН.
Проведение реакции. Опрыскивают свежеприготовленным раствором I, спустя 1 мин
опрыскивают раствором II и высушивают хроматограмму при 60°.
40. 2,6-Дибромхинонхлоримид для витамина Вв.
Раствор для опрыскивания. 0,4%-ный раствор 2,6-дибромхинонхлоримида в мета-
ноле.
41. 2,6-Дихлорхинонхлоримид для антиокислителей, цианамида и его производных.
Раствор для опрыскивания. 1 г 2,6-дихлорхинонхлоримида растворяют в 100 мл
абсолютного этанола. Раствор в холодильнике устойчив в течение трех недель. Для
мочевины неприменим.
42. 2', 7'-Дихлорфлуоресцеин как флуоресцирующий индикатор для насыщенных и не-
насыщенных липидов.
Раствор для опрыскивания. 0,2%-ный раствор 2',7'-дихлорфлуоресцеина в 96%-ном
этаноле.
43. 2,6-Дихлорфенолиндофенолнатрий для органических кислот.
Раствор для опрыскивания. 1%-ный раствор 2,6-дихлорфенолиндофенолнатрия в эта-
ноле. (Красное пятно на светло-голубом фоне быстро бледнеет.)
44. 2,6-Дихлорфенол — индофенол — нитрат серебра для неорганических анионов.
Раствор для опрыскивания (перед употреблением готовят свежий раствор). 0,2 г-
2,6-дихлорфенолиндофенолнатрия растворяют в 100 мл 96%-ного спирта, добав-
ляют 3 г нитрата серебра, хорошо встряхивают и фильтруют.
45. 1,3-Диоксинафталин (нафторезорцин) — трихлоруксусная кислота для кетоз и уро-
новых кислот.
Раствор для опрыскивания. 1 объем спиртового раствора нафторезорцина (0,2 г нафто-
резорцина в 100 мл этанола) перед употреблением смешивают с 1 объемом 20%-ного
водного раствора трихлоруксусной кислоты.
Последующая обработка. Для обнаружения кетоз нагревают 5—10 мин в сушильном
шкафу при 100—105°, для обнаружения уроновых кислот нагревают 10—15 мин
во влажной атмосфере (водяная баня) при 70—80°.
Примечание. Окраске мешает присутствие коллидина и пиридина. Вместо нафто-
резорцина можно применять резорцин, орцин, флороглюцин или а-нафтол. 1 объем
трихлоруксусной кислоты можно заменить 0,1 частью ортофосфорной кислоты (d 1,7).
46. 4-Диметиламинобензальдегид — ацетилацетон для аминосахаров.
Раствор для опрыскивания I. 0,5 мл смеси из 5 мл 50%-ного водного раствора КОН
и 20 мл этанола непосредственно перед употреблением добавляют к 10 мл смеси из
0,5 мл ацетилацетона и 50 мл и-бутанола.
Раствор для опрыскивания II. 1 г 4-диметиламинобензальдегида растворяют в 30 мл
этанола. Раствор смешивают с 30 мл соляной кислоты (1,19). Перед употреблением
разбавляют 180 мл бутанола-1.
Проведение реакции. После опрыскивания раствором I нагревают 5 мин при 105°,
а после опрыскивания раствором II сушат 5 мин при 90°.
47. Диметиламинобензальдегид — ледяная уксусная кислота — фосфорная кислота для
проазуленов и азуленов.
Раствор для опрыскивания. 0,25 г и-диметиламинобензальдегида (бесцветные кри-
сталлы!) растворяют в смеси 50,0 г ледяной уксусной кислоты для анализа, 5 г о-фос-
форной кислоты (85%-ная) и 20 мл воды (в темной склянке устойчив в течение месяца).
Последующая обработка. Азуленовые углеводороды реагируют уже при комнатной
Гл. 23. Реактивы для обнаружения при анализе методом ХТС 481
температуре, давая ярко-голубое окрашивание. Проазулены появляются только
после 10-минутного нагревания при 80° в виде голубых пятен. Через некоторое время
окраска бледнеет и становится от зеленой до желтой. Действием паров воды (водяная
баня) можно снова вызвать интенсивное голубое окрашивание.
48. 4-Диметиламинобензальдегид — соляная кислота по Шталю для производных индола.
Раствор для опрыскивания. 1 г 4-диметиламинобензальдегида растворяют в 50 мл
соляной кислоты (1,19) и смешивают с 50 мл этанола.
Последующая обработка. Сразу после разделения пластинки интенсивно опрыски-
вают, пока они не станут прозрачными (около 10 мл на каждую пластинку 20 X
Х20 см). Пластинки, обработанные щелочным летучим растворителем, перед опрыс-
киванием нагревают 5 мин при 50°. В заключение над слоем продувают пары цар-
ской водки. Царская водка: 3 объема соляной кислоты (1,19) + 1 объем азотной
кислоты (1,40).
49. 4-Диметиламинобензальдегид — соляная кислота (реактив Эрлиха) для цитруллина,
мочевины, триптамина, триптофана.
Раствор для опрыскивания (водный). Реактив Эрлиха на уробилиногене фирмы
«Merck».
Раствор для опрыскивания (спиртовый). 1%-ный раствор 4-диметиламинобензаль-
дегида в 96%-ном этаноле.
Проведение реакции. В зависимости от условий опрыскивают водным или спиртовым
раствором.
Последующая обработка. Обработанную раствором хроматограмму помещают на
3—5 мин в сосуд, насыщенный парами соляной кислоты.
50. 4-Диметиламинобензальдегид — соляная кислота для алкалоидов спорыньи.
Раствор для опрыскивания. 0,5 г 4-диметиламинобензальдегида растворяют в 100 мл
горячего циклогексана.
Последующая обработка. После опрыскивания хроматограмму помещают в камеру,
насыщенную парами соляной кислоты (голубое окрашивание).
51. 3,5-Динитробензойная кислота для реакции Кедде на дигпталоидные пятичленные
лактоны.
Раствор для опрыскивания. 1 г 3,5-динитробензойной кислоты растворяют в смеси
50 мл метанола и 50 мл водного 2 н. раствора КОН.
52. 2,4-Динитрофенилгидразин для свободных альдегидных и кетонных групп, а также
для кетоз.
Раствор для опрыскивания а. 0,4%-ный раствор 2,4-динитрофенилгидразина в 2 н.
соляной кислоте.
Раствор для опрыскивания б. 1 г 2,4-динитрофенилгидразина в 1000 мл этанола
смешивают с 10 мл соляной кислоты (1,19) (желтое пятно).
Примечание. Можно применять раствор а или б.
53. Дифениламин для гликолипидов.
Раствор для опрыскивания. Готовят смесь из 20 мл 10%-ного раствора дифенил-
амина в этаноле, 100 мл концентрированной соляной кислоты и 80 мл ледяной уксус-
ной кислоты.
Последующая обработка. Нагревают 5—10 мин при 100°.
54. Дифениламин-4-сульфоновокислый барий как флуоресцирующий индикатор для саха-
ров, барбитуровых кислот и т. д.
Раствор для опрыскивания. Готовят насыщенный раствор (~0,2%-ный) дифенил-
аминсульфоновокислого бария в метаноле.
Последующая обработка. Если после интенсивного опрыскивания пятно не флуо-
ресцирует в УФ-свете (254 мр), то пластинку нагревают 5—10 мин при 110°. Очень
многие вещества можно таким образом сделать видимыми.
55. Р-Аминоэтиловый эфир дифенилборной кислоты для а- и у-пирона.
Раствор для опрыскивания. 1,0 г [}-аминоэтилового эфира дифенилборной кислоты
растворяют в 100 мл метанола.
Проведение реакции. Распыляют около 10 мл раствора п рассматривают флуорес-
ценцию в монохроматическом УФ-свете (360 мр).
56. Дифеиилкарбазид для ионов серебра, свинца, меди, олова, марганца, цинка и кальция-
Раствор для опрыскивания I. 1%-ный раствор дифенилкарбазида в 96%-ном этаноле.
Раствор для опрыскивания II. 25%-ный раствор аммиака.
57. Дифенилкарбазон для ионов серебра, цинка и кадмия и продуктов присоединения
ртути к ненасыщенным липидам.
Раствор деля опрыскивания I. Насыщенный раствор дифенилкарбазона в 96%-пом
эт аноле.
1/4 31 Заказ № 73 4
482
Специальная часть
Раствор для опрыскивания II. 25%-ный раствор аммиака или 1 н. NaOH.
Проведение реакции. Опрыскивают раствором I, а затем раствором II.
Примечание. Для продуктов присоединения ртути достаточно опрыскивать 0,1%-ным
этанольным раствором дифенилкарбазона.
58. Дипикриламин для холина.
Раствор для опрыскивания. 0,2 г дипикриламина растворяют в смеси 50 мл ацетона
и 50 мл бидистиллята (холин и производные появляются в виде красных пятен на
желтом фоне).
59. Дитизон для ионов свинца и других тяжелых металлов.
Раствор для опрыскивания I. 0,05%-ный раствор дитизона в четыреххлористом
углероде.
Раствор для опрыскивания II. 25%-ный раствор аммиака.
60. Реактив Драгендорфа по Брегоффу — Дельвиче для четвертичных оснований (холин).
Исходный раствор. 8,0 г нитрата висмута растворяют в 20—25 мл 25%-ной азотной
кислоты (1,15). К раствору медленно при помешивании добавляют смесь 20 г иодида
калия с 1 мл 6 н. соляной кислоты и 5 мл воды. К темному осадку добавляют воду
до появления оранжево-красной окраски раствора. Объем раствора должен состав-
лять 95 мл. В случае образования нерастворимого осадка его отфильтровывают и рас-
твор доводят до 100 мл. Такой раствор устойчив в холодильнике несколько недель,
если его хранить в темной склянке.
Раствор для опрыскивания. В указанной последовательности добавляют: 20 мл воды,
5 мл 6 н. соляной кислоты, 2 мл исходного раствора и 6 мл 6 н. NaOH. Если при
встряхивании не вся гидроокись висмута растворится, то добавляют еще несколько
капель 6 н. соляной кислоты.
Примечание. Раствор для опрыскивания выдерживается в холодильнике около
10 дней.
60а. Реактив Драгендорфа для алкалоидов.
Исходный раствор. 2,6 г карбоната висмута и 7,0 г иодида натрия кипятят несколько
минут с 25 мл ледяной уксусной кислоты. Приблизительно через 12 час обильно
выпавшие кристаллы ацетата натрия отфильтровывают (фильтр Нутча). 20 мл про-
зрачного красно-коричневого фильтрата смешивают с 8 мл этилового^ эфира уксус-
ной кислоты и хранят в темной склянке.
Раствор для опрыскивания. 10 мл исходного раствора смешивают с 25 мл ледяной
уксусной кислоты и 60 мл этилового эфира уксусной кислоты. При опрыскивании
5—10 мл появляются в виде оранжевых пятен алкалоиды и ряд частично не содер-
жащих азот веществ.
Последующая обработка. Заметного повышения чувствительности достигают после-
дующим опрыскиванием 0,1—0,05 н. раствором серной кислоты. В предварительном
опыте устанавливают концентрацию и количество кислоты. Фон становится серым,
пятна — от интенсивно оранжевых до красных.
61. Прочная голубая соль В для фенолов и применяемых для реакции сочетания аминов
(диазореактив).
Раствор для опрыскивания. Свежеприготовленный 0,5%-ный водный раствор проч-
ной голубой соли В.
Последующая обработка. Опрыскивают 0,1 н. NaOH.
62. Хлорид железа (III) для гидроксамовых кислот и фенола.
Раствор для опрыскивания. 1%-ный водный раствор хлорида железа (III).
63. Ангидрид уксусной кислоты — серная кислота для тритерпеноидглюкозидов и холе-
стерина (реакция Либермана — Бурхарда).
Раствор для опрыскивания. Осторожно при охлаждении смешивают 5 мл ангидрида
уксусной кислоты и 5 мл концентрированной серной кислоты. Смесь при охлаждении
медленно доводят до объема 50 мл абсолютным спиртом. Перед употреблением гото-
вят свежий раствор.
Последующая обработка. После опрыскивания пластинки около 10 мин нагревают'
прп 110°.
Пятна рассматривают в монохроматическом УФ-свете.
Флуоресцирующие индикаторы, см. № 90.
64. Формальдегид — соляная кислота (реактив Прохазкп) для производных индола.
Раствор для опрыскивания. Готовят свежую смесь из 10 мл раствора формаль-
дегида (~35%-ного), 10 мл чистой 25 %-ной соляной кислоты и 20 мл этанола.
Последующая обработка. Нагревают 5 мин при 100°.
Флуоресценцию в УФ-свете (365 .ни., желто-оранжево-зеленоватая) можно усилить
действием паров царской водки. (Относительно приготовления царской водки см.
реактив № 48.)
Гл. 23. Реактивы для обнаружения при анализе методом ХТС 483
65. Глюкоза — анилин для кислот.
Раствор для опрыскивания. 2 г глюкозы растворяют в 20 мл воды; растворяют также
2 мл анилина в 20 мл этанола. Оба раствора сливают в мерную колбу на 100 мл
и доводят до метки н-бутанолом.
Проведение реакции. После опрыскивания хроматограмму нагревают 5—10 мин
при 125°. Темно-коричневое пятно на белом фоне.
66. Глюкоза — фосфорная кислота для ароматических аминов.
Раствор для опрыскивания. 2 г глюкозы растворяют в смеси 10 мл ортофосфорной
кислоты (1,70) и 40 мл воды. В раствор добавляют 30 мл этанола и 30 мл н-бутанола.
Последующая обработка. Нагревают около 10 мин при 115°.
67. Мочевина — соляная кислота для кетоз.
Раствор для опрыскивания. 5 г мочевины растворяют в 20 мл 2 н. соляной кислоты.
Раствор смешивают с 100 мл этанола. Кетозы и кетозы, содержащие олигосахариды,
приобретают синюю окраску. Непродолжительное нагревание способствует реакции.
68. Гидразин-сульфат для пиперонала и ванилина.
Раствор для опрыскивания. 90 мл насыщенного водного раствора гидразин-сульфата
смешивают с 10 мл 4 н. соляной кислоты. Влажную хроматограмму рассматривают
под кварцевой лампой до и после действия паров аммиака.
69. Гидроксамовая кислота — хлорид железа для ацетилхолина и других эфиров холина.
Раствор а. 20 г хлорида гидроксил аммония растворяют в 50 мл воды. Раствор дово-
дят до 200 мл этанолом и хранят в холодильнике.
Раствор б. 50 г гидроокиси калия растворяют в возможно меньшем количестве
воды, затем этанолом доводят до 500 мл.
Раствор для опрыскивания I. 1 объем раствора а смешивают с 2 объемами раствора б.
Выпавший хлорид калия отфильтровывают. Приготовленный таким образом раствор
хранят в холодильнике (устойчив около 2 недель).
Раствор для опрыскивания II. 10 г тонкоизмельченного порошка хлорида железа
(FeCl3-6H2O) растворяют в 20 мл 10 н. соляной кислоты. Раствор встряхивают
' с 200 мл диэтилового эфира до образования однородного раствора. Хорошо закрытый
раствор для опрыскивания II устойчив в течение длительного времени.
Проведение реакции. Хроматограмму опрыскивают раствором I, высушивают непро-
должительное время при комнатной температуре, а затем опрыскивают раствором II.
70. 8-Оксихинолин (оксин) для ионов бария, стронция и кальция.
Раствор для опрыскивания. 0,5 г 8-оксихинолина растворяют в смеси 60 мл этанола
и 40 мл воды.
Последующая обработка. Опрыскивают 25%-ным раствором аммиака или помещают
хроматограмму в насыщенную аммиаком сырую камеру (наблюдение в монохро-
матическом УФ-свете).
71. 8-Оксихинолин — койевая кислота для ионов магния и алюминия.
Раствор для опрыскивания I. Раствор 2,5 г 8-оксихинолина и 0,5 г койевой кислоты
в 500 мл 90%-ного этанола.
Раствор для опрыскивания II. 25%-ный раствор аммиака (наблюдение в монохро-
матическом ультрафиолете).
72. Иод в качестве общего реактива для обнаружения.
Хроматограмму помещают в закрытый сосуд, на дне которого находятся несколько
кристалликов иода. При нагревании сосуда на водяной бане образуются пары иода,
при действии которых большинство органических соединений обнаруживается в виде
коричневых пятен.
Модификация. Хроматограмму помещают на 5 мин в атмосферу иода. При стоянии
на воздухе (около 5 мин) избыток иода удаляется. При опрыскивании 1%-ным вод-
ным раствором крахмала пятна становятся синими. Если иод на слое все еще нахо-
дится в избытке (проба с краю или на непокрытой части пластинки), то окраши-
вается также и фон.
73. Раствор иода для органических соединений.
Раствор для опрыскивания. 0,3 г иода в 100 мл 5%-ного водного раствора иодида
калия; для хроматографии в тонких слоях предпочтительнее раствор 0,5 г иода
в 100 мл хлороформа.
74. Раствор иода для N-замещенных имидазолов.
Раствор для опрыскивания. 1 г иода растворяют в 100 мл 96%-ного этанола.
Последующая обработка. Нагревают 30 мин при 100°.
75. а) Раствор азида иода.
Раствор для опрыскивания. Готовят свежий раствор 3,5 г азида натрия в 100 мл
0,1 н. раствора иода. (Примечание: азид иода в сухом состоянии легко взрывается.)
31*
484
Специальная часть
75. б) Реактив азида иода.
Раствор для опрыскивания I. Готовят свежий раствор 1 г азида натрия в 100 мл,
0,005 н. раствора иода.
Раствор для опрыскивания II. 1%-ный водный раствор крахмала.
Проведение реакции. Сначала опрыскивают раствором I, затем раствором II.
76. Иодоплатинат, модифицированный для алкалоидов и различных N-содержащих
гетероциклов.
Раствор для опрыскивания. 3 мл 10%-ного раствора платино(1У)хлористоводородной
кислоты смешивают с 97 мл воды и прибавляют 100 мл 6%-ного водного раствора
иодида калия. В темной склянке сохраняется длительное время.
77. Родамин В для ионов калия.
Раствор для опрыскивания I. 0,1 н. NaOH.
Раствор для опрыскивания II. 1%-ный спиртовый раствор реактива на калий.
Раствор для опрыскивания III. 0,5%-ный спиртовый раствор родамина В.
Проведение реакции. Опрыскивают реактивом I, сушат, опрыскивают реактивом II
и в заключение опрыскивают реактивом III. (Интенсивная темно-синяя флуорес-
ценция в монохроматическом УФ-свете. Большое количество калия обнаруживается
уже в видимом свете в виде светло-красного пятна на темно-красном фоне.)
78. Гексацианоферрат (II) калия для ионов железа (III).
Раствор для опрыскивания. Свежеприготовленный 2%-ный водный раствор гекса-
цианоферрата (II) калия.
79. Гексацианоферрат (II) калия — хлорид коэальта (II) для холина.
Раствор для опрыскивания I. Свежеприготовленный 1%-ный водный раствор гекса-
цианоферрата (II) калия.
Раствор для опрыскивания II. 0,5%-ный водный раствор Флорида кобальта (II).
Проведение реакции. Опрыскивают раствором I, непродолжительное время сушат
и опрыскивают раствором II. Холин становится зеленым.
80. Гексацианоферрат (III) калия — хлорид железа (III) для тиосульфатов.
Раствор для опрыскивания I. 1%-ный водный раствор гексацианоферрата (III) калия.
Раствор для опрыскивания II. 1%-ный водный раствор хлорида железа (III).
Проведение реакции. Опрыскивают сначала раствором I, затем раствором II и рас-
сматривают хроматограмму под аналитической кварцевой лампой. ;
81. Гексацианоферрат (III) калия для витамина Bj (реакция с тиохромом).
Раствор для опрыскивания. Перед употребленйем смешивают 1,5 мл 1%-ного вод-
ного раствора цианоферрата (III) калия, 20 мл дистиллированной воды и 10 мл 15%-
ного раствора NaOH. (После высушивания рассматривают в длинноволновом ультра-
фиолетовом свете.)
82., Гидроокись калия для кумаринов.
Раствор для опрыскивания. 1%-ный раствор КОН в этаноле.
Проведение реакции. Высушенную после опрыскивания хроматограмму рассматри-
вают под аналитической кварцевой лампой.
83. Иодат калия для симпатикомиметических аминов (фенилэтиламинов).
Раствор для опрыскивания. 1%-ный водный раствор йодата калия.
Проведение реакции. После опрыскивания хроматограмму нагревают 2 мин при
100—110°.
84. Йодистый калий — сероводород. для тяжелых металлов.
Раствор для опрыскивания. 2%-ный водный раствор йодистого калия.
Проведение реакции. После опрыскивания пластинку сушат и помещают в сосуд
с парами аммиака. Через несколько минут пластинку переносят в другой сосуд,
заполненный сероводородом. (Осторожно! Сероводород ядовит и взрывает. Лучше
всего заполнять сосуд газом из аппарата Киппа в тяге.)
85. Иодид калия — крахмал для перекисей.
Раствор для опрыскивания I. 10 мл 4%-ного водного раствора иодида калия смеши-
вают с 40 мл ледяной уксусной кислоты и добавляют немного (на кончике шпателя)
цинковой пыли.
Раствор для опрыскивания II. 1%-ный свежеприготовленный водный раствор крах-
мала.
Проведение реакции. После отфильтровывания цинковой пыли опрыскивают раство-
ром I. Через 5 мин проводят интенсивное опрыскивание реактивом II, пока слой
не станет прозрачным, причем перекись можно обнаружить по выделившемуся иоду
в виде голубого пятна.
86. Перманганат калия — уксусная кислота.
Раствор для опрыскивания. Смесь равных объемов 0,1 н. раствора перманганата
калия и 2 н. уксусной кислоты.
Гл. 23. Реактивы для обнаружения при анализе методом ХТС 485
86а. Перманганат калия — серная кислота (универсальный реактив).
Раствор для опрыскивания. 0,5 г перманганата калия в 15 мл концентрированной
серной кислоты (осторожно! опасность взрыва).
Проведение реакции. Хроматограмму освобождают от растворителя и опрыскивают
реактивом: вещества появляются в виде белых пятен на розовом фоне.
87. Нитрат кобальта — аммиакат для барбитуровых кислот.
Раствор для опрыскивания. 1%-ный раствор нитрата кобальта в абсолютном этаноле.
Последующая обработка. Высушивают и помещают в сосуд с газообразным аммиа-
ком, насыщенным водяными парами.
Варианты:
а) Раствор для опрыскивания. 2%-ный спиртовый раствор ацетата кобальта.
Последующая обработка. Помещают хроматограмму в сосуд с парами пиридина.
б) Раствор для опрыскивания I. 0,5%-ный раствор ацетата кобальта в метаноле.
Раствор для опрыскивания II. 0,5%-ный раствор гидроокиси лития в метаноле.
Проведение реакции. Опрыскивают раствором I и затем раствором II.
88. Реактив Кёнига для алкалоидов с пиридиновым кольцом.
Предварительная обработка. Перед опрыскиванием хроматограмму выдерживают
в течение часа в камере, в которой находится стакан с раствором бромциана (яд!)
Раствор бромциана готовят из охлажденной насыщенной бромом воды, в которую
добавляют 10%-ный раствор цианида натрия до исчезновения окраски брома.
Раствор для опрыскивания. 2 г n-аминобензойной кислоты растворяют в 75 мл 0,75 н.
соляной кислоты. Раствор 96%-ным этанолом доводят до 100 мл.
89. Койеяая кислота для ионов металлов.
Раствор для опрыскивания. 0,1 г койевой кислоты растворяют в 100 мл 60%-ного
этанола.
Проведение реакции. После опрыскивания наблюдают флуоресценцию в УФ-свете.
90. Флуоресцирующие индикаторы в качестве общих индикаторов для обнаружения.
а) Дифениламиносульфонат бария в качестве реактива для опрыскивания (№ 54).
б) 2',7'-Дихлорфлуоресцеин в качестве реактива для опрыскивания (№ 41).
в) Флуоресцеин (0,2%-ный раствор в этаноле) в качестве реактива для опрыски-
вания. у
г) Вещество ZS-cynep (1%-ная добавка к сорбенту).
д) Морин (0,1%-ный раствор в этаноле) в качестве, реактива для опрыскивания.
е) Флуоресцеин натрия (0,04%-ный водный раствор).
ж) Родамин В в качестве реактива для опрыскивания (№ 129).
з) Силикат цинка в качестве 0,8%-ной добавки к сорбенту.
и) Метилумбеллиферон в качестве реактива для опрыскивания (№ 94).
91. Ацетат магния для оксиантрахинонов.
Раствор для опрыскивания. 0,5%-ный раствор ацетата магния в метаноле.
Проведение реакции. После опрыскивания нагревают в течение 5 мин до 90°. Окра-
шивание от оранжевого до фиолетового.
92. /Малоновая кислота — салициловый альдегид для азотсодержащих гетероциклов
и аминов.
Раствор для опрыскивания. 0,2 г малоновой кислоты и 0,1 г салицилового альдегида
растворяют в 100 мл абсолютного этанола.
Последующая обработка. Пластинки нагревают в течение 15 мин до 120°, а затем рас-
сматривают в фильтрованном ультрафиолетовом свете (желтое флуоресцирующее
пятно).
93. Метиловый красный с бромтимоловым синим, индикаторы.
Раствор для опрыскивания. 0,2 г метилового красного и 0,2 г бромтимолового синего
растворяют в смеси 100 мл раствора формальдегида и 400 мл 96%-ного этанола.
0,1 н. щелочью (NaOH) устанавливают pH 5,2.
Последующая обработка. Многократно опрысканную бумагу вносят в пары аммиака.
94. 4-Метилумбеллиферон для азотсодержащих гетероциклов (флуоресцирующий инди-
катор).
Раствор для опрыскивания. 20 мг 4-метилумбеллиферона растворяют в 35 мл эта-
нола. Раствор в мерной колбе на 100 мл доводят до метки водой.
Последующая обработка. Хроматограмму помещают в сосуд с парами аммиака,
а затем рассматривают под аналитической кварцевой лампой.
95. Морин для ионов алюминия.
Раствор для опрыскивания. 1%-ный раствор морина в ледяной уксусной кислоте
(яркая светло-зеленая флуоресценция под аналитической кварцевой лампой).
х/а 31 Заказ № 734
486
Специальная часть
96. Р-Нафтохинон-4-сульфокислота (натриевая соль) для аминокислот. Раствор для
опрыскивания. 0,2 г натриевой соли Р-нафтохинон-4-сульфокислоты растворяют
в 100 мл 5%-ного раствора карбоната натрия. Опрыскивание следует проводить
приблизительно через 10—15 мин после приготовления раствора для опрыскивания.
Без последующей обработки.
97. а-Нафтол для аргинина и других производных гуанидина.
Раствор для опрыскивания I. 0,1%-ный раствор а-нафтола в 1 н. NaOH.
Раствор для опрыскивания II. Смесь 100 мл 5%-ного водного раствора NaOH и 2 мл
брома.
Проведение реакции. Сначала опрыскивают раствором I, затем раствором II.
При обнаружении стрептомицина рекомендуют вместо раствора II использовать
смесь 50 мл водного раствора гипохлорита натрия (13% активного хлора)
и 50 мл этанола.
98. а-Нафтиламин для эфиров 3,5-динитробензойной кислоты.
Раствор для опрыскивания I. 1%-ный раствор а-нафтиламина в этаноле.
Раствор для опрыскивания II. 10%-ный раствор едкого кали в метаноле. Красно-
коричневое окрашивание. Окрашивание происходит также с родамином В (реак-
тив № 129).
99. Дитионат натрия для ионов сурьмы и висмута.
Раствор для опрыскивания. 0,1%-ный водный раствор дитионата натрия.
100. Флуоресцеин натрия для ароматических и гетероциклических соединений.
Раствор для опрыскивания. 50 жг флуоресцеина натрия растворяют в 100 мл 50%-
ного метанола.
Примечание. При равномерном опрыскивании можно обнаружить на хроматограмме
различные соединения с помощью кварцевой лампы.
101а. Флуоресцеин-бромная проба для ненасыщенных соединений.
Массу для нанесения готовят с 0,04%-ным водным- раствором флуоресцеина натрия
вместо воды. После разделения продувают над высушенной пластинкой пары брома.
В результате образования эодина флуоресценция гасится всюду, за исключением
пятен веществ (которые присоединяют бром).
1016. Флуоресцеин натрия — родамин В — карбонат натрия для хлорированных угле-
водородов, камфоры, гетероциклических соединений и т. д.
Раствор для опрыскивания I. 0,5%-ный раствор родамина В в этаноле.
Раствор для опрыскивания II. 10%-ный водный раствор карбоната натрия.
Проведение реакции. Пластинки с флуоресцеином натрия (см. реактив № 101а)
опрыскивают после разделения реактивом I, сушат и интенсивно опрыскивают
реактивом II. Некоторые пятна лучше обнаруживаются в виде флуоресцирующих
пятен в свете аналитической кварцевой лампы (см. также инсектициды, стр. 363).
102. Гидроокись натрия для Д4-3-кетостероидов.
Раствор для опрыскивания. 10%-ный водный раствор NaOH.
Проведение реакции. После опрыскивания хроматограмму высушивают в течение
”10 мин при 80°. Дельта4-3-кетостероиды дают желтую флуоресценцию в монохро-
матическом ультрафиолете.
103. Родизонат натрия для ионов бария и стронция.
РасгЛвор для опрыскивания I. 1%-ный водный раствор родизоната натрия.
Раствор для опрыскивания II. 25%-ный раствор аммиака.
104. Сульфид натрия для ионов сероводородной группы, (см. также реактив № 84).
Раствор для опрыскивания. 0,5%-ный раствор сульфида натрия, свежеприготов-
ленный.
105. Тиосульфат натрия — ацетат меди для ионов сурьмы.
Раствор для опрыскивания I. Насыщенный водный раствор тиосульфата натрия.
Раствор для опрыскивания II. 0,4 г ацетата меди растворяют в смеси 2 мл ледяной
уксусной кислоты и 48 мл воды.
Проведение реакции. Опрыскивают раствором I, слегка нагревают, избыточный
тиосульфат натрия смывают водой, опрыскивают раствором II.
106. Реактив Несслера для оксиаминокислот (серин, треонин, оксипролин).
Раствор для опрыскивания I. 1%-ный водный раствор метапериодата натрия.
Раствор для опрыскивания II. Реактив Неслера.
Проведение реакции. Опрыскивают раствором I, затем хроматограмму высушивают
при комнатной температуре и опрыскивают реактивом II.
107. Реактив Несслера для алкалоидов.
Раствор для опрыскивания. Реактив Несслера.
Гл. 23. Реактивы для обнаружения при анализе методом ХТС CiT
Примечание. По данным Шульца и Штрауса, с реактивом Несслера реагируют апо-
морфин, гидрастинин и физостигмин.
108. Нингидрин для аминокислот и аминов.
Раствор для опрыскивания. 0,3 г нингидрина растворяют в 100 мл н-бутанол.а
и добавляют 3 мл ледяной уксусной кислоты. '
Последующая обработка. Нагревают около 30 мин при 60° или 10 мин при 110°.
Чувствительность: от 0,1 цг пролина до 0,001 иг глицина.
Стабилизации окрашенного нингидрином пятна.
Раствор для опрыскивания. 1 мл насыщенного водного раствора нитрата меди с добав-
кой 0,2 мл 10%-ной азотной кислоты растворяют в 100мл этилового спирта (96%-ный).
Проведение реакции. На нингидриновое пятно напыляют раствор до максимально
интенсивного окрашивания и помещают пластинку в закрытый сосуд, содержащий
стакан с концентрированным аммиаком.
Образующийся красный комплекс меди устойчив только в отсутствие свободных
ионов водорода и сильных комплексообразователей.
109. Нингидрин—нитрат меди для аминокислот (полихроматический реактив).
Раствор I. 0,1 г нингидрина растворяют в 50 мл абсолютного спирта и добавляют
10 мл ледяной уксусной кислоты и 2 мл 2, 4, 6-коллидина.
Раствор II. 0,5 г нитрата меди [Cu(NO3)2-ЗН2О ] растворяют в 50 мл абсолютного
спирта.
Раствор для опрыскивания. Перед употреблением смешивают растворы I и II в отно-
шении 50 : 3.
Последующая обработка. Хроматограмму нагревают 4 мин до 110° и появившееся
пятно сразу же отмечают, так как уже через 10 мин оно изменяется и бледнеет
(чувствительность около 0,5—1 рг аминокислоты).
110. п-Нитроанилин — периодная кислота для дезоксисахаров.
Раствор для опрыскивания I. 1 объем насыщенного водного раствора метаперио-
дата натрия разбавляют 2 объемами воды.
Раствор для опрыскивания II. Ь объема 1%-ного раствора n-нитроанилина в эта-
ноле смешивают с 1 объемом соляной кислоты (1,19).
Проведение реакции. После опрыскивания раствором I ждут 10 мин, затем опрыс-
кивают раствором II. Дезоксисахара и гликали дают желтое сильно флуоресци-
рующее в УФ-свете пятно. При опрыскивании 5%-ным метанольным раствором
NaOH окраска переходит в зеленую.
111. Нитропруссид натрия для SH-соединений (цистеин), и S — S-соединений (цистин)
и для производных цианамида (аргинин).
Раствор для опрыскивания I. 1,5 г нитропруссида натрия (динатрийпентациано-
нитрозилферрат) растворяют в 5 мл 2 н. соляной кислоты. После добавления95 мл
метанола и 10 мл раствора аммиака фильтруют.
Раствор для опрыскивания II. 2 г цианида натрия растворяют в 5 мл воды. Этот
раствор доводят метанолом до 100 -ил в мерной колбе. Следует принять меры пре-
досторожности при опрыскивании раствором цианида натрия.
Проведение реакции. При опрыскивании раствором I SH-соединения появляются
в виде красных пятен. Аргинин становится оранжевым, а позже серо-голубым.
При опрыскивании раствором II появляются соединения с мостиками — S — S
в виде красных пятен на желтом фоне.
Вариант для связи S — S:
Раствор для опрыскивания 1.5 г цианида натрия и 5 г карбоната натрия растворяют
в мерной колбе на 100 мл в 25%-ном этаноле.
Раствор для опрыскивания II. 2 г нитропруссида натрия растворяют в 100 мл
75%-ного этанола.
Проведение реакции. Сначала опрыскивают раствором I, сушат на воздухе в тече-
ние короткого времени, а затем опрыскивают раствором II.
112. Нитропруссид натрия для вторичных алифатических и алициклических аминов.
Раствор для опрыскивания. 5 г нитропруссида натрия растворяют в 100 мл 10%-ного
водного раствора ацетальдегида. Перед употреблением 1 объем этого раствора сме-
шивают с 1 объемом 2%-ного раствора карбоната натрия.
113. Нитропруссид натрия — гексацианоферрат (III) калия для цианамида и производных.
Раствор для опрыскивания. По 1 объему 10%-ного раствора NaOH, 10%-ного
раствора нитропруссида натрия и 10%-ного раствора гексацианоферрата (III)
калия смешивают с 3 объемами воды. Раствор оставляют стоять при комнатной
температуре самое малое на 20 мин. В холодильнике этот раствор сохраняется
в течение нескольких недель.
Вариант.
Раствор для опрыскивания. 2 мл 5%-ного водного раствора нитропруссида натрия
смешивают с 1 мл .10%-ного раствора NaOH и 5 мл 3%-ного раствора пер-
31*
488
Специальная часть
гидроля, затем эту смесь разбавляют 15 мл воды. Каждый раз надо готовить све-
жий реактив. Цианамид — фиолетовый, дицианамид — карминно-красный, гуанил-'
мочевина — желто-оранжевая, гуанидин — красно-оранжевый, аргинин — светло-
красный, креатин — карминно-красный, креатин желто-коричневый, агматин —
розовый, гуанидинуксусная кислота — карминно-красная, тиомочевина — фиолето-
вая, мочевина — светло-розовая.
114. Нитропруссид натрия — NaOH для а, 0-ненасыщенных лактонов.
Раствор для опрыскивания. 1%-ный раствор нитропруссида натрия в 1 н. растворе
NaOH, который готовят с 50%-ным этанолом (пятна от красных до красно-фио-
летовых) .
115. Нитропруссид натрия — гидроксиламин для производных тиомочевины.
Раствор для опрыскивания. 0,5 г нитропруссида натрия растворяют в 10 мл воды.
К раствору добавляют 0,5 г хлорида гидроксиламмония и 1 г бикарбоната натрия.
После прекращения выделения газа добавляют 2 капли брома и водой доводят, до
25 мл. Реактив сохраняется около двух недель.
116. Нитропруссид натрия — перйодат натрия для дезоксисахаров.
Раствор для опрыскивания I. Смесь 1 объема насыщенного водного раствора перйо-
дата натрия и 2 объемов воды.
Раствор для опрыскивания II. Смесь 1 объема насыщенного водного раствора нитро-
пруссида натрия, 3 объемов воды и 20 объемов насыщенного раствора пиперазина
в 96%-ном этаноле.
Проведение реакции. Опрыскивают раствором I, 10 мин сушат при комнатной тем-
пературе и затем опрыскивают раствором II.
Примечание. Максимальная голубая окраска дезоксисахаров наблюдается спустя
5—10 мин. Чувствительность обнаружения повышается при замене раствора для
опрыскивания II смесью 4 объемов 1%-ного раствора n-нитроанилина в этаноле
и 1 объема 36 %-ной соляной кислоты (желтое флуоресцирующее пятно в моно-
хроматическом УФ-свете).
117. Хлорная кислота для стероидов.
Раствор для опрыскивания. 2%-ный водный раствор хлорной кислоты.
Последующая обработка. Нагревают 10 мин при 150°.
Примечание. Йолучают однородное коричневое пятно, годное для количественного
определения. Более чувствительным может быть обнаружение фосфорной кислотой
(реактив № 123) с последующим опрыскиванием фосфорномолибденовой кислотой
(реактив № 120в). ‘ \
118. Перекись — хлорид железа (III) для кумаринов.
Раствор для опрыскивания I. 0,5%-ный пергидроль, свежеприготовленный.
Раствор для опрыскивания 1П 0,2%-ный водный раствор хлорида железа (III).
Проведение реакции. Сначала опрыскивают раствором I, высушивают при 105°,
а затем опрыскивают раствором II. Нагревают при 105° в сушильном шкафу до
появления пятен.
119. о-Фенилендиамин трихлоруксусная кислота для а-кетокислот.
Раствор для опрыскивания. 50 мг о-фенилендиамина растворяют в 100 мл 10%-
ного водного раствора трихлоруксусной кислоты.
Проведение реакции. После опрыскивания хроматограмму нагревают не более 2 мин
в сушильном шкафу при 100°, после чего флуоресцирующие пятна рассматривают
под аналитической кварцевой лампой.
120. Фосфорномолибденовая кислота для восстановителей.
а) Раствор для опрыскивания. Свежеприготовленный раствор 5 г фосфорномолиб-
деновой кислоты в 100 мл этанола.
Последующая обработка. 5 мин нагревают при 80—90°.
б) Раствор для опрыскивания. Свежеприготовленный раствор 10 г фосфорномолиб-
деновой кислоты в 100 мл этанола.
Последующая обработка. 5 мин нагревают при 80—90°.
в) Раствор для опрыскивания. Свежеприготовленный раствор 1,5 г фосфорномолиб-
деновой кислоты в 100 мл этанола.
Последующая обработка. Нагревают 5 мин при 120°.
Примечание. Обработка парами аммиака обесцвечивает фон.
121. Фосфорновольфрамовая кислота для липидов.
Раствор для опрыскивания. 20%-ный раствор фосфорновольфрамовой кислоты
в этаноле.
Последующая обработка. Нагревают 20 мин в сушильном шкафу при 70°.
122. Фосфорномолибденовая кислота для фенолов.
10 г вольфрамата натрия и 2,5 г молибдата натрия растворяют в 70 мл воды и добав-
ляют последовательно 5 мл 85%-ной фосфорной кислоты и 10 .«.г концентрированной
Гл. 23. Реактивы для обнаружения при анализе методом ХТС
489
соляной кислоты (1,19). Смесь кипятят с обратным холодильником в течение 10 час.
Затем добавляют 15 г сульфата лития, 5 мл воды и 1 каплю брома и еще раз кипя-
тят 15 мин, после охлаждения доводят до 100 мл в мерной колбе (исходный рас-
твор). Раствор не должен иметь зеленой окраски.
Раствор для опрыскивания I. 20%-ный водный раствор карбоната натрия.
Раствор для опрыскивания II. Перед употреблением смешивают 1 часть исходного
раствора с 3 объемами воды.
Проведение реакции. Опрыскивают раствором I, немного сушат и опрыскивают
раствором II.
123. Фосфорная кислота для стероидов.
Раствор для опрыскивания I. 1 объем o-фосфорной кислоты (1,70) разбавляют 1 объе-
мом воды.
Проведение реакции. Опрыскивают пластинку, пока она во влажном состоянии не
станет прозрачной, затем нагревают 10—20 мин при 120° и флуоресцирующие пятйа
рассматривают под кварцевой лампой. Ненасыщенные стероиды и стерины можно
получить в виде голубых пятен в видимом свете, если пластинки после опрыскива-
ния фосфорной кислотой нагреть 10 мин и в еще горячем состоянии опрыснуть
реактивом № 120в (свежеприготовленным). Последующее нагревание в течение
2—5 мин увеличивает интенсивность окраски.
124. Пикриновая кислота — щелочь для креатинина, гликоциамидина и лактамов а-гуа-
нидиновых кислот.
Раствор для опрыскивания I. 1%-ный раствор пикриновой кислоты в этаноле.
Раствор для опрыскивания II. 5%-ный спиртовой раствор КОН.
Проведение реакции. Опрыскивают раствором I и после высушивания — раство-
ром II (окрашивание в оранжевый цвет).
125. Пиридилазонафтол для уранил-ионов.
Раствор для опрыскивания. 0,25%-ный этанольный раствор пиридилазонафтола
[1-(2-пиридилазо-)-2-нафтола].
126. Ацетат ртути — дифенилкарбазон для пуринов.
Раствор для опрыскивания I. 0,25 г ацетата ртути (II) растворяют с добавлением
нескольких капель ледяной уксусной кислоты в 100 мл 96%-ного этанола.
Раствор для опрыскивания II. 0,05 г дифенилкарбазона растворяют в 100 мл 96%-
ного этанола.
Проведение реакции. Сначала опрыскивают раствором I, а затем раствором II. Хро-
матограмма становится фиолетовой, но на месте, где находится пурин, появляется
потемнение. При нагревании до 120° в сушильном шкафу с окошком фон постепенно
обесцвечивается.
Примечание. Отдельные ртутные пятна имеют различную устойчивость и постепенно
исчезают при нагревании, вследствие чего в процессе нагревания необходимо непре-
рывное наблюдение. Лучше всего обвести карандашом пятна сразу же после их
появления.
127. Нитрат ртути (I) дли барбитуровых кислот.
Раствор для опрыскивания. 1%-ный водный раствор нитрата ртути (I).
128. Кверцетин дли иоиов сурьмы, меди, никеля, железа, хрома, марганца, калия, лития,
бериллия.
Раствор для опрыскивания. 0,2%-ный раствор кверцетина в 96%-ном этаноле.
Последующая обработка. Опрыскивают 25%-ным раствором аммиака или поме-
щают в камеру, насыщенную парами аммиака (наблюдение в монохроматическом
У Ф-свете).
129. Родамин В. Общий реактив для обнаружении.
Раствор для опрыскивания. 0,5 г родамина В растворяют в 100 мл этанола.
130. Роданин (диметиламинобензилиденроданин) для катионов.
Раствор для опрыскивания.' 1—5%-ный раствор роданина в этаноле.
Последующая обработка. Опрыскивают 25%-ным раствором аммиака или поме-
щают во влажную камеру, насыщенную парами аммиака (наблюдение в монохро-
матическом УФ-свете).
131. Рубеановый водород для ионов меди, кобальта, никеля и марганца.
Раствор для опрыскивания I. 0,5%-ный раствор рубеанового водорода в 96%-ном
этаноле.
Раствор д-ля опрыскивания II. 25%-ный раствор аммиака.
Проведение реакции. Опрыскивают раствором I, сушат, опрыскивают раствором II
или помещают хроматограмму во влажную камеру, насыщенную аммиаком.
490
Специальная часть
132. Азотная кислота для алкалоидов и аминов.
Раствор для опрыскивания. К 100 мл абсолютного этанола добавляют приблизи-
тельно 50 капель азотной кислоты (1,40). (Наблюдение продуктов разложения
в монохроматическом ультрафиолетовом свете.)
Примечание. Раствор для опрыскивания этой концентрации или большей может
найти применение также для открытия других органических соединений при хро-
матографии в тонких слоях. Флуоресцирующие пятна появляются часто только
после длительного нагревания при 120°.
133. Соляная кислота для гликалей.
Раствор для опрыскивания. 1 объем соляной кислоты (1,19) смешивают с 4 объе-
мами этанола.
Проведение реакции. При нагревании до 90° появляется гликаль в виде розового
пятна.
Можно также использовать в качестве общего реактива для опрыскивания.
134. Серная кислота для алкалоидов и аминов.
Раствор для опрыскивания. К 100 мл абсолютного этанола добавляют 50 капель
серной кислоты (1,84).
Примечание. Благодаря отщеплению воды от таких соединений, как глюкозиды,
алкалоиды и амины, образуются продукты разложения, которые флуоресцируют
в монохроматическом УФ-свете.
135. Нитрат серебра для сахаров и сахарных спиртов.
Раствор для опрыскивания. 1 мл насыщенного водного раствора нитрата серебра
при помешивании добавляют к 20 мл ацетона, а затем медленно по каплям прибав-
ляют воду до полного растворения выпавшего нитрата серебра.
Последующая обработка. Пластинку помещают приблизительно на 15 мин в камеру,
насыщенную аммиаком (в темноте) и сразу после этого нагревают при 80° до появ-
ления отчетливых темных пятен.
136. Нитрат серебра — аммиак — (флуоресцеин для галоген-ионов.
Раствор для опрыскивания I. 1 г нитрата серебра растворяют в 100 мл 0,5 н. рас-
твора аммиака.
Раствор для опрыскивания II. 0,1 г флуоресцеина растворяют в 100 мл этанола.
Проведение реакции. Сначала опрыскивают раствором I и после непродолжитель-
ного подсушивания — раствором II.
137. Нитрат серебра — аммиак для восстановленных веществ.
а) Раствор для опрыскивания. 1 объем 0,1 н. раствора нитрата серебра смешивают
по мере необходимости с 1 объемом 5 н. раствора аммиака.
Осторожно! при длительном стоянии образуется взрывчатый азид серебра.
Последующая обработка. 5—10 мин нагревают при 105° до появления отчетливых
темных пятен.
138. Нитрат серебра — аммиак — хлорид натрия для тиокислот.
Раствор для опрыскивания. 50 мл 0,1 н. раствора смешивают перед употреблением
с 50 мл 10%-ного раствора аммиака. Эту смесь хранить нельзя.
Раствор для опрыскивания II. 10%-ный водный раствор хлорида натрия.
Проведение реакции. Сначала опрыскивают раствором I, затем сушат и опрыски-
вают раствором II. Хроматограмму оставляют на дневном свету на некоторое время,
до появления максимальной окраски пятен.
139. Нитрат серебра — бромфеноловый синий для пуринов.
Раствор для опрыскивания. 0,2 г бромфенолового синего растворяют в 50 мл аце-
тона. Раствор смешивают с 50 мл 2%-ного водного раствора нитрата серебра (устой-
чив около недели).
Проведение реакции. После обработки восходящим кислым раствором хромато-
грамму следует высушить и поместить в пары аммиака. Затем пары аммиака уда-
ляют теплым воздухом и опрыскивают.
140. Нитрат серебра — формальдегид для диэльдрина, альдрина, линдана.
Раствор для опрыскивания I. 0,05 н. раствор нитрата серебра.
Раствор для опрыскивания II. 35%-ный раствор формальдегида.
Раствор для опрыскивания III. 1 н. раствор КОН в метаноле.
Раствор для опрыскивания IV. Смесь равных объемов пергидроля и азотной кис-
лоты 1,40 (каждый раз готовят свежую).
Проведение реакции. Сначала опрыскивают раствором I, 30 мин сушат на воздухе,
опрыскивают раствором II и снова 30 мин сушат на воздухе. После опрыскивания
раствором III сушат 30 мин в сушильном шкафу при 130—133°. Наконегпрнрыс-
кивают хроматограмму раствором IV и выдерживают 12 час в темноте,"а затем
на солнечном свету (темно-коричневые пятна).
Гл. 23. Реактивы для обнаружения при анализе методом ХТС 491
141. Нитрат серебра — пирогаллол для кислот.
Раствор для опрыскивания I. 0,17 г нитрата серебра растворяют в 1 мл воды, добав-
ляют 5 мл раствора аммиака и разбавляют до 200 мл этанолом.
Раствор для опрыскивания II. 6,5 мг (0,0005 моля) пирогаллола растворяют в 100 мл
этанола.
Проведение реакции. Сначала опрыскивают раствором I, потом раствором II.
142. n-Толуолсульфокислота для стероидов и флавоноидов.
Раствор для опрыскивания. 20 г толуолсульфокислоты растворяют в 100 мл абсо-
лютного этанола.
Проведение реакции. После опрыскивания несколько минут нагревают при 100°,
хроматограмму рассматривают в монохроматическом УФ-свете.
143. Трихлоруксусная кислота для стероидов и их глюкозидов.
Раствор для опрыскивания. 25 г трихлоруксусной кислоты растворяют в 100 мл
хлороформа.
Проведение реакции. После опрыскивания хроматограмму сушат в сушильном
шкафу при 100® и рассматривают под кварцевой лампой.
144. Трифторуксусная кислота для стероидов и глюкозидов.
Раствор для опрыскивания. 1%-ный раствор трифторуксусной кислоты в хлоро-
форме.
Последующая обработка. 5 мин нагревают при 120°. '
145. 2,3,5-Трифенилтетразолийхлорид (ТФТХ) для восстановленных сахаров, стерои-
дов, глюкозидов, тиокислот.
Раствор для опрыскивания. Перед употреблением 1 объем 4%-ного раствора ТФТХ
в метаноле смешивают с 1 объемом 1 н. раствора NaOH в метаноле.
Последующая обработка. Нагревают 5—10 мин при 110°. Каждый раз нагревают
до появления отчетливых красных пятен, при этом фон остается практически бес-
цветным.
146. Надхлорная кислота (перхлорная кислота) — хлорид железа (III) для производ-
ных индола.
Раствор для опрыскивания. 100 мл 5%-ной перхлорной кислоты смешивают с 2 мл
0,05 М раствора хлорида железа (III).
Примечание. Не реагирует с изатином и другими производными оксиндола.
147. Ванилин для аминокислот (орнитин, лизин) и аминов.
Раствор для опрыскивания 1.2 г ванилина растворяют в 100 мл н-пропанола.
Раствор для опрыскивания II. 1%-ный раствор КОН в спирте.
Проведение реакции. Хроматограмму опрыскивают раствором I и 10 мин нагре-
вают при 110° в сушильном шкафу. Орнитин дает яркую желто-зеленую флуоресцен-
цию в монохроматическом УФ-свете, лизин — слабую желто-зеленую флуоресценцию.
После опрыскивания раствором II еще раз нагревают. Орнитин сначала окраши-
вается в розовый цет, а затем бледнеет, а пролин, оксипролин, пипеколиновая кис-
лота и саркозин через несколько часов окрашиваются в красный цвет, гликоколь
становится сине-зеленым, остальные аминокислоты окрашиваются в светло-корич-
невый цвет.
148. Ванилии — хлорная кислота для прегнаитриола и родственных соединений.
Раствор для опрыскивания. 1 %-раствор ванилина в 10%-ном водном растворе
хлорной кислоты.
Последующая обработка. 5—7 мин нагревают при 110°.
Вариант.
1 г ванилина, 15 г толуолсульфокислоты и 15 мл 60%-ного водного раствора
хлорной кислоты в мерной колбе доводят водой до 100 мл.
Последующая обработка описана выше.
149. Ванилин — фосфорная кислота для стероидов.
Раствор для опрыскивания. 1 г ванилина растворяют в 100 мл 50%-ной о-фосфор-
ной кислоты.
Последующая обработка. 10—20 мин нагревают при 120°.
150. Ванилин.— соляная кислота для катехинов.
Раствор для опрыскивания. 0,5 г ванилина растворяют в 50 мл соляной кисло-
ты (1,19).
На высушенной при комнатной температуре хроматограмме катехин окрашен
в красный цвет.
151. Ванилин — серная кислота для высших спиртов и кетонов.
Раствор для опрыскивания. 3 г ванилина растворяют в 100 мл абсолютного спирта
и в раствор добавляют 0,5 мл серной кислоты (1,84).
492
Специальная часть
Последующая обработка. Нагревают при 120° до появления зелено-голубых
пятен.
В ар и ант. Вместо серной кислоты можно применять 1,5 г п-толуолсульфокис-
лоты.
152. Виолуровая кислота для щелочных п щелочноземельных ионов.
Раствор для опрыскивания. 1,5%-ный водный раствор виолуровой кислоты.
Проведение реакции. При растворении виолуровую кислоту нельзя нагревать выше
60°! После опрыскивания хроматограмму нагревают 20 мин при 100°.
Для бария и стронция см. также реактив № 70.
Для лития и калия см. также реактив № 128.
Для магния и кальция см. также реактив № 1.
153. Коричный альдегид — ангидрид уксусной кислоты — серная кислота для стероид-
сапонинов.
Раствор для опрыскивания 1.1г коричного альдегида растворяют в 100 мл абсо-
лютного этанола.
Раствор для опрыскивания II (свежеприготовленный). Смесь 12 объемов ангид-
рида уксусной кислоты и 1 объема серной кислоты (1,84).
Проведение реакции. Опрыскивают раствором I, 5 мин сушат при 90° и опрыски-
вают раствором II. Сначала хроматограмму на 1—2 мин оставляют при комнатной
температуре, а затем помещают в сушильный шкаф при 90° до появления окрашен-
ных пятен.
154. Коричный альдегид — соляная кислота для производных ицдола.
Раствор для опрыскивания. 5 мл коричного альдегида растворяют в 96%-ном
этаноле и добавляют 5 мл соляной кислоты (1,19) (готовят свежий).
155. Хлорид олова (II) — иодид калия для золота.
Раствор для опрыскивания. 5,6 г хлорида олова (II) растворяют в 10 мл соляной
кислоты (1,19), разбавляют водой до 100 мл. и добавляют 0,2 г иодида калия.
Черное пятно.
156. Хлорид олова (IV) для тритерпенов, стеринов и стероидов.
Раствор для опрыскивания. К 160 мл смеси равных объемов хлороформа и ледя-
ной уксусной кислоты добавляют 10 мл хлорида олова (IV).
Последующая обработка. Нагревают 5—10 мин при 100° и рассматривают хрома-
тограмму в фильтрованном УФ-свете (365 ми).
157. Цирконализариновый лак — соляная кислота для фтор-ионов.
Раствор для опрыскивания. 0,05 г цирконилхлорида (2гОС12-8Н2О) и 0,05 г али-
заринсульфоната натрия растворяют в 100 мл 2 н. соляной кислоты.
ОСНОВНЫЕ ТЕРМИНЫ ХРОМАТОГРАФИИ
В ТОНКИХ СЛОЯХ
Английский Немецкий * Французский
to scratch off, to scrape off descending to wash, to rinse to adsorb; adsorption aerosol package alumina sample, mixture inorganic to apply, application aligning tray to dissolve to resolve, to separate; resolution ascending to apply, to spot abkratzen, abschaben absteigend abwaschen, spiilen adsorbieren; Adsorption Aerosolpackung Aluminiumoxid Analysenmaterial, Ge- misch an organ isch anwenden, Anwendung Arbeitsschablone auflosen (eine Substanz in einem Losungsmittel) auflosen; Auflosung (Trennscharfe) aufsteigend auftragen (eine Substanz) detacher descendant laver, rincer adsorber; adsorption cartouche d’aerosol 1’alumine I’echantillon, la prise d’essai, le melange mineral utiliser, utilisation le gabarit dissoudre separer, separation ascendant appliquer
band alkaline to coat to mark templet for marking and sample application binder BN-chamber, S-chamber thickness thin-layer chromato- graphy, TLC separated by TLC Band basisch, alkalisch beschichten beschriften, markieren Beschriftungsschablone Bindemittel BN-, S-Trennkammer Dicke Diinnschicht-Chromato- graphie, DC diinnschichtchromatogra- phisch getrennt la bande, la zone basique, alcalin recouvrir d’une couche marquer gabarit de marcage le liant la cuve de separation BN, S 1’epaisseur la chromatographie en couches minces, CCM separe par chromagraphie en couches minces
uniform, even to dip, dipping technique to eluate; eluate einheitlich, gleichmafiig eintauchen; Eintauchen eluieren; Eluat homogene, regulier immerger; 1’immersion eluer; I’eluat
* Немецкие термины расположены в алфавитном порядке.
32 Заказ № 734
494
Продолжение
Английский Немецкий Французский
eluent demixing to develop, developer desiccator Elutionsmittel Entmischen entwickeln; Entwickler Exsiccator I’eluant, 1’agent d’elution le demelange (demixtion) reveler; le revelateur le dessicateur
colored colorless color reagent fixer spot ' solvent (mixture) (solvent) front volatile farbig farblos Farbreagens Fixierbad Fleck FlieBmittel FleiBmittelfront fliichtig colore incolore le reactif colorant le bain de fixation la tache, le «spot» le solvant le front du solvant volatil
gas-liquid chromatogra- phy GLC, gaschromatogra- phy jar, tank, trough, vessel calcinated calcium sul- phate, gypsum, Plaster of Paris to identify; identification ion exchanger Gaschromatographie, GC GefaB zum Entwickeln, Trennkammer, Tank Gips (G) identifizieren; Identifi- zierung lonenaustauscher la chromatograph ie en phase gazeuse, CG la cuve sulfate de calcium identifier; 1’identifica- tion I’echangeur d’ions
wedged-tip technique tape, adhesive tape silica gel diatomaceous earth, kie- selguhr column chromatography grain size, particle size Keilstreifen-Technik Klebeband Kieselgel Kieselgur Kolonnen- oder Saulen- chromatographie KorngroBe la technique des bandes en cone la bande adhesive le gel de silice le kieselguhr la chromatographie sur colonnes la grosseur des grains ou des particules
speed of migration, tra- velling speed length of run Laufgeschwindigkeit Laufstrecke la vitesse de migration, de deplacement le parcours
to mix; mixture mortar and pestle mischen; Mischung Morser und Pistill melanger; le melange le mortier et le pilon
495
П родолженив
Английский Немецкий Французский
detection neutral Nachweis neutral la detection, le revelati- on, la determination, le do- sage qualitatif neutre
paper chromatography, PC the -wick for chambersa- turation powder quantitative evaluation quantitative estimation, determination Papierchromatographie, PC Papierstreifen zur Kam- mersattigung Pulver quantitative Auswertung quantitative Bestimmung la chromatograph ie sur papier, CSP la bande de papier servant a la saturation de la cuve la poudre 1’evaluation quantitative le dosage quantitatif
edge X-ray film Rand Rontgenfilm le bord le film pour rayons X
to saturate, saturated acidic layer tail, treak tailing, tail formation to make visible, to visu- alize, to indicate, to locate sorbent syringe trace to spray; atomizer, spray- er, vaporizer, spray gun spray reagent, indicator standard, reference mate- rial starting point, point of application (of the sample) (TLC-) spreader, applica- tor strip streak gradual development (technique) subfractionation sattigen, gesattigt sauer Schicht Schwanz, Streifen Schwanzbilduug sichtbar machen, kennt- lich machen, nachweisen Sorptionsmittel Spritze Spur spriihen; der Spriiher Spriihreagens Standard (Vergleichs-) Start (-punkt) Streicher (Diinnschicht-), Streichgerat fiir DC Streifen Strich Stufentechnik Subfraktionierung saturer, sature acide la couche la queue de comete, la trainee la formation de trainee d’une queue de comete reveler 1’adsorbant, 1’agent, d’ad- sorption la seringue la trace vaporiser; le vaporisateur le reactif a vaporiser 1’etalon, le temoin le point de depart le dispositif d’etalement, a etaler, le dispositif d’ap- plication la bande la ligne technique par Stapes le sous-fractionnement
32*
496
Иродолжение
Английский Немецкий Французский
day light test dyes low-temperature chroma- tography the (glass) plate resolution, sharpness of separation to separate, to fractiona- te, to resolve; separation, fractionation separation-react ion-s ope- ration (SRS-) technique drying rack, storage rack to dry Tageslicht Testfarben Tieftemperaturchromato- graphie Tragerplatte Trennscharfe trennen; Trennung Trennung-Reakt ion-Tren- nung (TRT-) Technik Trockengestell trocknen la lumiere du jour les couleurs temoins la chromatographie a bas- so temperature le plaque support la precision de separation separer; la separation la technique separation- reaction-separation (SRS) le sechoir secher
non-polar to differentiate, to distin- guish UV-light unpolar, nicht polar unterscheiden UV-Licht non polaire differencier, distinguer la lumiere U. V., 1’U. V.
compound to dilute standard ratio adjustable partition reversed phase partition direction, procedure Verbindung (chemische) verdiinnen Vergleichssubstanz (Test- substanz) Verhalthis (Mischungs-) verstellbar Verteilung Verteilung in umgekehr- ter Phase Vorschrift (Arbeits-) le compose chimique diluer I’etalon, le temoin le rapport reglable le partage le partage en phase unver- see la mode operatoire
aqueous migration rate, speed of migration wafirig Wanderungsgeschwindig- keit aqueux la vitesse de migration, de deplacement
гопе two-dimensional Zone zweidimensional la zone, la bande bi-dimensionel «
Таблица пересчета Rf в Rm и наоборот
w-l 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
ад
00 со 3,000 2,698 2,522 2,396 2,299 2,219 2,152 2,093 2,042 —1,996 99
01 1,996 1,954 1,916 1,881 1,848 1,817 1,789 1,762 1,737 1,713 —1,690 98
02 1,690 1,669 1,648 1,628 1,609 1,591 1,574 1,557 1,540 1,525 —1,510 97
03 1,510 1,495 1,481 1,467 1,453 1,440 1,428 1,415 1,403 1,392 —1,380 96
04 1,380 1,369 1,358 1,347 1,337 1,327 1,317 1,307 1,297 1,288 —1,279 95
05 1,279 1,270 1,261 0,252 1,243 1,235 1,227 1,219 1,211 1,203 —1,195 94
06 1,195 1,187 1,180 1,172 1,165 1,158 1,151 1,144 1,137 1,130 —1,123 93
07 1,123 1,117 1,110 1,104 1,097 1,091 1,085 1,079 1,073 1,067 —1,061 92
08 1,061 1,055 1,049 1,043 1,038 1,032 1,026 1,021 1,015 1,010 —1,005 91
09 1,005 1,000 0,994 0,989 0,984 0,979 0,974 0,969 0,964 0,959 —0,954 90
10 0,954 0,949 0,945 0,940 0,935 0,931 0,926 0,922 0,917 0,913 —0,908 89
11 0,908 0,904 9,899 0,895 0,891 0,886 0,882 0,878 0,874 0,869 —0,865 88
12 0,865 0,861 0,857 0,853 0,849 0,845 0,841 0,837 0,833 0,829 —0,826 87
13 0,826 0,822 0,818 0,814 0,810 0,807 0,803 0,799 0,796 0,792 —0,788 86
14 0,788 0,785 0,781 0,778 0,774 0,770 0,767 0,764 0,760 0,757 —0,753 85
15 0,753 0,750 0,747 0,743 0,740 0,736- 0,733 0,730 0,727 0,723 —0,720 84
16 0,720 0,717 0,714 0,711 0,707 0,704 0,701 0,698 0,695 0,692 —0,689 83
17 0,689 0,685 0,682 0,679 0,676 0,673 0,670 0,667 0,665 0,662 —0,659 82
18 0,659 0,656 0,653 0,650 0,647 0,644 0,641 0,638 0,635 0,633 —0,630 81
19 0,630 0,627 0,624 0,621 0,619 0,616 0,613 0,610 0,607 0,605 —0,602 80
20 0,602 0,599 0,597 0,594 0,591 0,589 0,586 0,583 0,580 0,578 —0,575 79
21 0,575 0,572 0,570 0,567 0,565 0,562 0,560 0,557 0,555 0,552 —0,550 78
22 0,550 0,547 0,545 0,542 0,540 0,537 0,535 0,532 0,530 0,527 —0,525 77
23 0,525 0,523 0,520 0,518 0,515 0,513 0,511 0,508 0,506 0,503 —0,501 76
24 0,501 0,499 0,496 0,494 0,491 0,489 0,487 0,484 0,482 0,479 —0,477 75
25 0,477 0,475 0,472 0,470 0,468 0,465 0,463 0,461 0,459 0,456 —0,454 74
26 0,454 0,452 0,450 0,447 0,445 0,443 0,441 0,439 0,436 0,434 —0,432 73
27 0,432 0,430 0,428 0,425 0,423 0,421 0,419 0,417 0,414 0,412 —0,410 72
28 0,410 0,408 0,406 0,404 0,402 0,399 0,397 0,395 0,393 0,391 —0,389 71
29 0,389 0,387 0,385 0,383 0,381 0,378 0,376 0,374 0,372 0,370 —0,368 70
30 0,368 0,366 0,364 0,362 0,360 0,357 0,355 0,353 0,351 0,349 —0,347 69
31 0,347 0,345 0,343 0,341 0,339 0,337 0,335 0,333 0,331 0,329 —0,327 68
32 0,327 0,325 0,323 0,321 0,319 0,317 0,316 0,314 0,312 0,310 —0,308 67
33 0,308 0,306 0,304 0,302 0,300 0,298 0,296 0,294 0,292 0,290 —0,288 66
34 0,288 0,286 0,284 0,282 0,280 0,278 0,277 0,275 0,273 0,271 —0,269 65
35 0,269 0,267 0,265 0,263 0,261 0,259 0,258 0,256 0,254 0,252 —0,250 64
36 0,250 0,248 0,246 0,244 0,242 0,240 0,239 0,237 0,235 0,233 —0,231 63
37 0,231 0,229 0,227 0,225 0,224 0,222 0,220 0,218 0,217 0,215 —0,213 62
38 0,213 0,211 0,209 0,207 0,205 0,203 0,202 0,200 0,198 0,196 —0,194 61
39 0,194 0,192 0,190 0,189 0,187 0,185 0,183 0,181 0,180 0,178 —0,176 60
498
И родолжение
Bj-100 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
40 0,176 0,174 0,172 0,170 0,169 0,167 0,165 0,163 0,162 0,160 —0,158 59
41 0,158 0,156 0,154 0,153 0,151 0,149 0,147 0,145 0,144 0,142 —0,140 58
42 0,140 0,138 0,136 0,135 0,133 0,131 0,129 0,127 0,126 0,124 —0,122 57
43 0,122 0,120 0,119 0,117 0,115 0,113 0,112 0,110 0,108 0,107 —0,105 56
44 0,105 0,103 0,101 0,100 0,098 0,096 0,094 0,092 0,090 0,089 —0,087 55
45 0,087 0,085 0,084 0,082 0,080 0,078 0,077 0,075 0,073 0,072 —0,070 54
46 0,070 0,068 0,066 0,065 0,063 0,061 0,059 0,057 0,056 0,054 —0,052 53
47 0,052 0,050 0,049 0,047 0,045 0,043 0,042 0,040 0,038 0,037 —0,035 52
48 0,035 0,033 0,031 0,030 0,028 0,026 0,024 0,022 0,020 0,019 —0,017 51
49 0,017 0,015 0,014 0,012 0,010 0,008 0,007 0,005 0,003 0,002 ±0,000 50
9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 оГ
При значениях Rf 0 — 0,5 Rm положительно.
При значениях Rf 0,5 — 1,0 (курсив) Rm отрицательно.
„ Rf 10,04010,3461 0,510 а 10,654 а
Примеры: —,38о!о,27?1—0,017 |— 0,277
а Курсивная шкала Rf .
ОГЛАВЛЕНИЕ
Предисловие.............................................. . . 5
Предисловие к немецкому изданию.......................... ..... 7
ОБЩАЯ ЧАСТЬ
Глава’1. История развития хроматографии в товких слоях. Э. Шталь . . . . 11
Глава 2. Аппаратура для хроматографии в товкихслоях и ее применение. Э. Шталь 15
I. Нанесение тонких разделительных слоев на пластинки.............. 15
Прибор для нанесения тонких слоев................................ 16
II. Сушка, хранение и переноска пластинок с тонкими слоями.......... 19
III. Подготовка для хроматографического анализа пластинок с тонкими слоями 20
IV. Разделительные камеры и насыщение атмосферы в них............... 23
1. Насыщение камеры и краевые эффекты.............................. 24 •
2. Изготовление камер (температура, освещение, защита от окисления) 25
3. Камеры для восходящего хроматографирования .................... 26
а) Прямоугольные камеры . 26
б) С-камера .................................................. 27
4. Устройства для нисходящего хроматографирования................. 28
5. Устройства для горизонтального хроматографировании............. 29
а) Круговой метод............................................. 29
б) Метод горизонтальных закрытых камер........................ 30
в) Проточный метод (БН-камера)................................ 31
6. Камеры для электро- или ионофореза в тонких сорбционных слоях 32
V. Приспособление для опрыскивания и вентиляции..................... 33
VI. Стандартные условия для хроматографии в тонких слоях ....... 35
VII. Основное оборудование для хроматографии в тонких слоях.......... 35
Дополнение к основному набору..................................... 36
Глава'3. Сорбевты для ХТС. Д. Вальди ................................. . 37
1. Другие свойства сорбентов...................................... 39
2. Другие сорбенты и комбинации сорбентов......................... 39
3. Хранение и обработка сорбентов................................. 42
Глава 4. Специальные методы. Э. Шталь ................................... 43
1. Проточный метод, многократное хроматографирование, ступенчатый метод 43
2. Метод клиновидных полос........................................ 44
3. Двумерное разделение, метод РРР................................ 44
4. Изменение разделительной способности слоя...................... 45
Литература к гл. 1—4..................................................... 46
Глава 5. Документация при хроматографии в тонких слоях. X. Генсхршп .... 48
Глава 6. Количественная оценка хроматограмм в тонких слоях. X. Генсхршп . . 52
I. Определение без экстракции разделенных веществ (методы I группы) ... 55
1. Визуальный метод сравнения..................................... 55
2. Фотографические методы......................................... 56
3. Фотоденситометрическое определение после окраски............... 57
500
Оглавление
4. Радиоавтографический метод.................................. 59
И. Определение разделенных веществ после экстракции (методы II группы) 59
1. Локализация по собственной окраске или собственной флуоресценции
определяемого вещества............................................ 61
2. Применение флуоресцирующих слоев.............................. 61
3. Окраска разделенных веществ перед экстракцией.................. 63
4. Другие методы локализации разделенных веществ.................. 64
Литература к гл. 5 и 6................................................... 65
Глава 7. Метод радиоактивных изотопов. X. Мангольд....................... 66
I. Разделительные слои, растворители и химические методы обнаружения 67
II. Методы обнаружения радиоактивного излучения..................... 67
1. Радиоавтография............................................... 67
2. Счетные трубки и сцинтилляционные счетчики.................... 69
III. Получение веществ, меченных радиоизотопами...................... 70
IV. Выделение радиоактивных соединений методом ХТС.................. 72
V. Анализ с применением радиоизотопов.............................. 74
1. Индикаторный анализ............................................ 74
2. Методы изотопного разбавления................................. 74
3. Активационный анализ........................................... 74
4. Метод радиоактивных реактивов.................................. 75
VI. Способы введения радиоактивной метки............................ 77
1. Этерифицирование кислот диазометаном C14H2N2.................. 77
2. Ацетилирование спиртов ацетангидридом, (С14Н3СО)2О или (СН|СО)2О 78
VII. Использование ХТС в химических и биохимических исследованиях с при-
менением радиоизотопов ........................................ 78
Литература............................................................... 79
Глава 8. Теоретические основы хроматографии в тонких слоях. М. Бреннер,
А. Нидервизер, Г. Патаки и Р. Вебер............................... 81
I. Общая теория хроматографии...................................... 82
1. Первый основной опыт.......................................... 83
2. Второй основной опыт.......................................... 87
3. Модель........................................................ 88
у 4. Хроматографическая колонка...................................... 95
а) Сравнение с моделью........................................ 95
б) Получение хроматограммы.................................... 98
в) Элюирование................................................ 99
г) Определение числа теоретических тарелок и высоты теоретической
тарелки...................................................... 100
д) Осложнения................................................ 101
5. Выводы и заключительные замечания............................. 101
II. Хроматографическое поведение и химическое строение.............. 103
1. Влияние коэффициента распределения и отношения фаз на величину
Rf и удерживаемый объем...................................... 103
2. Качественные правила.......................................... 103
V 3. Количественная связь. Соотношение Мартина...................... 104
а) Определение величины Rm................................. 104
б) Применение величины Rm................................. 105
в) Исключения................................................ 106
v III. Особенности хроматографии в тонких слоях......................... 107
1. Сходство с хроматографией на бумаге........................... 107
а) Движение растворителя, распределение растворителя, вели-
чины Rf и Rm................................................. 107
а) Однокомпонентный растворитель......................... 107
Оглавление
501
Р) Многокомпонентный растворитель; хроматографическое раз-
деление растворителя ......................................... 116
б) Количественная оценка хроматограмм в тонких слоях............. 124
2. Различие между хроматографией в тонких слоях и хроматографией
на бумаге....................................................... 126
3. Связь с колоночной хроматографией................................. 127
Дополнение. Вытеснение и ионный обмен на хроматограммах в тонких слоях 127
Обозначения.......................................................... 128-
Литература ................................................................ 131
СПЕЦИАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Глава 9- Введение. Э. Шталь.................................................. 137
1. Разделяемая смесь................................................. 138
2. Растворитель ..................................................... 138
3. Сорбент.......................................................... 138
Глава 10. Алифатические липиды. X. Мангольд ................................. 140
I. Введение........................................................ 140
1. Нейтральные липиды и продукты их гидролиза........................ 140'
2. Фосфолипиды, сульфолипиды и гликолипиды............................ 141
‘ 3. Старые методы анализа липидов................................. 143
4. Новые методы разделения липидов................................... 144
5. Подготовка материала.............................................. 145
а) Получение волокнистой массы и экстракция...................... 145
б) Омыление и этерификация....................................... 147
II. Тонкослойная хроматография липидов................................... 149
1. Разделение липидов на отдельные классы соединений................. 149
а) Нейтральные липиды и продукты их гидролиза.................... 149
Условия разделения........................................... 150-
Применение и результаты....................................... 154
б) Фосфолипиды, сульфолипиды и гликолипиды....................... 162
Условия разделения............................................ 163
Применение и результаты...................................... 165-
в) Применение хроматографии в тонких слоях для определения строе-
ния липидов................................................. 166
2. Фракционирование винилогомологических рядов....................... 168
а) Методы разделения соединений с короткими цепями............... 168
Условия разделения............................................ 169
б) Методы разделения соединений с длинной цепью.................. 170
Условия разделения . . ..................................... 171
Применение и результаты....................................... 175
3. Разделение липидов в соответствии со степенью ненасыщенности . . . 175
а) Получение продуктов присоединения ацетата ртути............... 177
б) Условия разделения............................................ 177
в) Обработка продуктов присоединения............................. 178
г) Применение и результаты....................................... 178
4. Разделение цис-транс-изомеров..................................... 179
5. Выводы ........................................................... 180
Литература................................................................... 182
Глава 11. Производные терпенов, эфирвые масла, бальзамы и смолы. Э. Шталь
и X. Йорк............................................................... 186
I. Отделение смесей липофильных веществ, отгоняющихся с водяным паром 186>
II. Хроматографическое разделение смесей липофильных веществ, отгоняю-
щихся с водяным паром..................................................... 187
.502
Оглавление
1. Моно- и сесквитерпеновые углеводороды....................... 188
2. Окиси и перекиси............................................. 189
3. Сложные эфиры терпеновых спиртов............................. 190
4. Альдегиды и кетоны........................................... 191
5. Моно- и сесквитерпеновые спирты.............................. 194
6. Производные фенилпропана и фенола............................ 197
7. Дитерпеновые производные..................................... 202
8. Тритерпены и нроизводные..................................... 202
9. Политерпены................................................. 206
10. Эфирные масла................................................ 206
11. Смолы и бальзамы............................................. 207
Литература.............................................................. 209
Глава 12. Витамины. X. Боллигер ....................................... 212
I. Введение.................................................... . 212
П. Методы работы (общие приемы).................................... 212
III. Тонкослойная хроматография жирорастворимых витаминов.......... 213
1. Смеси жирорастворимых витаминов.............................. 214
2. Каротиноиды (провитамины А)................................. 216
а) Условия разделения и результаты.......................... 217
б) Обнаружение и возможность количественного определения . . . 221
3. Витамин А.................................................. 221
а) Условия разделения и результаты.......................... 222
б) Обнаружение и возможности количественного определения . . . 223
4. Витамины D................................................... 223
а) Условия разделения и результаты....................... . 225
б) Обнаружение и возможности определения.................. 227
в) Определение витамина D в различных препаратах............ 229
5. Токоферолы (витамин Е)....................................... 230
а) Условия разделения и результаты.......................... 231
б) Обнаружение и возможности количественного определения . . . 232
6. Витамины К и убихиноны....................................... 233
а) Условия разделения и результаты.......................... 234
б) Обнаружение и возможности определения.................... 235
IV. Тонкослойная хроматография водорастворимых витаминов.......... 236
1. Смеси водорастворимых витаминов ............................. 236
2. Тиамин (витамин В4).......................................... 239
а) Условия разделения и результаты.......................... 239
б) Обнаружение -и возможности определения................... 239
3. Рибофлавин (витамин В2)...................................... 240
а) Условия разделения и результаты.......................... 240
б) Обнаружение и возможности определения................... 240
4. Витамин Вв .................................................. 240
а) Условия разделения и результаты.......................... 240
б) Обнаружение и возможности определения.................... 241
в) Определение витамина Вв в поливитаминах.................. 242
5. Никотиновая кислота и амид никотиновой кислоты............... 242
а) Условия разделения и результаты.......................... 242
б) Обнаружение и возможности количественного определения .... 243
6. Пантотеновая кислота и пантенол.............................. 243
а) Условия разделения и результаты.......................... 243
б) Обнаружение и возможности определения.................... 244
7. Цианкобаламин (витамин В12).................................. 244
а) Условия разделения и результаты.......................... 244
б) Обнаружение и возможности определения.................... 244
Оглавление 50 3
8. Фолиевая кислота............................................ 244
а) Условия разделения и результаты.......................... 245
б) Обнаружение и возможности определения.................... 245
9. Биотин ..................................................... 245
а) Условия разделения и результаты.......................... 245
б) Обнаружение и возможности определения................... 245
10. Аскорбиновая кислота (витамин С)............................. 246
а) Условия разделения и результаты.......................... 246
б) Обнаружение и возможности определения.................... 247
Литература...?......................'................................... 247
Глава 13. Стероиды. Стерины, производные прегнана, андростана, эстрана, жел-
чные кислоты и сердечные глюкозиды. Д. Валъди........................... 249
I. Общее введение ................................................ 249
1. Структурные различия и номенклатура.......................... 249
2. Хроматографическое поведение .............................. 250
II. Стерины........................................................ 251
1. Условия разделения, обнаружение и величины hRf............... 252
2. Холестерин и холестериновые эфиры........................... 253
а) Отношение холестерин/холестериновые эфиры................ 254
б) Разделение фракции холестериновых эфиров................. 256
в) Количественный расчет результатов разделения холестериновых
эфиров ..................................................... 256
г) Двумерная ХТС холестериновых эфиров...................... 257
д) Определение кислот холестериновых эфиров (щелочное омыление) 258
III. Стероиды C2i> С19 и С18........................................ 259
1. Хроматографическое поведение стероидов на слоях силикагеля Г . . . 261
2. Проведенные ранее работы по применению метода ХТС для разделения
стероидов....................................................... 266
3. Обнаружение разделенных стероидов реактивами для опрыскивания 269
4. Специальное применение метода ХТС в химии стероидов.......... 270
а) Определение стабильности при хранении производных эстрена
в таблетках................................................. 270
б) Экспресс-анализ для контроля ферментативных превращений сте-
роидов ................................................. . . . 270
в) Обнаружение стероидов в моче человека................... 271
IV. Желчные кислоты................................................ 271
V. Сердечные глюкозиды ........................................... 274
Литература ............................................................. 278
Глава 14. Органические основания........................................ 280
I. Алкалоиды. Д. Вальди.....................г..................... 280
1. Введение .................................................... 280
2. Проведение систематического анализа при определении алкалоидов 280
а) Определение принадлежности к определенной группе и оптимальное
наносимое количество........................................ 281
б) Группа I, алкалоиды с величинами hRf 0—30 (табл. 46)..... 281
в) Группа II, алкалоиды с величинами hRf > 30 .............. 281
3. Классы алкалоидов............................................ 288
а) Алкалоиды опия........................................... 288
б) Алкалоиды группы тропана................................. 289
в) Алкалоиды группы индола.................................. 291
г) Алкалоиды ипекакуаны..................................... 292
д) Алкалоиды различных классов.............................. 295
504
Оглавление
II. «Простые» производные индола. Э. Шталь ...............t............ 295
1. Введение ........................................................ 295
2. Подготовка анализируемого материала.............................. 297
3. Разделительный слой и растворитель............................. 293
4. Двумерное разделение .................................... 2991
5. Обнаружение ..................................................... 300
а) Химические методы обнаружения............................... 300
б) Биологический метод обнаружения действия стимуляторов роста
растений..................................................... 302
6. Другие примеры использования..................................... 302
III. Амины.............................................................. 303
1. Анализ аминов методом ХТС........................................ 303
2. Тонкослойный электрофорез аминов................................. 304
3. Обнаружение ..................................................... 304
IV. Смоляные основания................................................. 304
Литература.................................................................. 306
Глава 15. Лекарственные вещества. X. Генсхирт .............................. 303
I. Группы биологически активных веществ............................... 303
1. Обезболивающие, жаропонижающие, противоревматические средства 308
2. Стимуляторы нервной системы...................................... ЗЮ'
а) Пурины........................................................ ЗЮ
б) Корамин, кардиазол, микорен, .эукратон, камфара, лобелии . . . ЗЮ
3. Анализ методом ХТС различных противогистаминных препаратов
фенотиазинового ряда и успокаивающих лекарств..................... 312
4. Бактериостатические и бактерицидные вещества..................... 313
а) Используемые в фармацевтике фенолы, смолы и составные части
смоляных масел........................................ .... 313
б) Анализ сульфонамидов методом ХТС............................. 315
в) Антибиотики.................................................. 317
а) Пенициллины .............................................. 317
р) Вещества различных классов соединений..................... 318
у) Тетрациклины .............................................. ЗЮ
5. Снотворные средства ........................................... 320'
6. Вещества для местной анестезии................................... 322
7. Гормональные препараты......................................... 322
8. Адреномиметические средства ..................................... 323
II. Комбинированные препараты.......................................... 323
III. Применение метода ХТС в токсикологических исследованиях. 328
IV. Проверка стабильности лекарств методом ХТС......................... 331
1. Испытание на стабильность лекарств, содержащих эфир никотиновой
кислоты........................................................... 331
2. Испытание на стабильность лекарств, содержащих эфиры фенола . . . 332
3. Испытание на стабильность лекарств, содержащих стероидный эфир 332:
4. Испытание на стабильность производных Д4-17р-оксиастрена .... 333
5. Испытание на стабильность лекарств, содержащих амид никотиновой
кислоты........................................................... 333
6. Испытание на стабильность децентана, [1-(2-оксиэтил)-4-(3-хлор-10-
фенотиазил)-пропилпиперазина]..................................... 333
7. Испытание на стабильность 1-М-метилпиперидил-(4')-пиразолонов . . . 334
8. Расщепление либрия (метаминодиазэпоксида) в кислой среде .... 334
9. Испытание на стабильность препаратов, содержащих алкалоиды спо-
рыньи (Guttae Secalis — «Stada»).................................. 335
Литература.................................................................. 335
Оглавление 505
Глава 16. Анализ методом ХТС в клинической диагностике и фармакологии.
Д. Вальди........................................................... 337
I. Введение....................................................... 337
II. Продукты выделения в моче........................ 338
1. Вещества, находящиеся в организме (стероиды).................. 338
а) Наблюдение за овариально-менструальным циклом........... 338
б) Определение ранней стадии беременности.................... 339
Методы [5, 6]. а) Гидролиз и экстракция из мочи........... 340
р) Анализ экстракта методом ХТС........................... 340
у) Обнаружение и определение.............................. 340
в) Обнаружение других стероидов (адреногенитальный синдром,.
синдром Кашинга)........................................... 341
2. Чуждые организму вещества (метаболиты лекарственных веществ) 341
III. Липиды в фекалиях и фекальных камнях........................... 342
IV. Определение веществ в крови (сыворотке). Определение спирта в крови 343
Методы
а) Экстракция и этерификация................................. 343
б) Приготовление эталонного раствора......................... 343
в) Нанесение исследуемого раствора ДНБ-эфиров и сравнение величи-
ны пятен...................................................... 343
V. Экстракты из органов. Определение адреналина и норадреналина из над-
почечников ....................................................... 344
Литература............................................................... 345
Глава 17. Органические синтетические вещества (Вспомогательные вещества
в промышленности). X. Генсхирт, Д. Вальди, Э. Шталь.................... 346
I. Синтетические красители........................................ 346
1. Жирорастворимые красители..................................... 346
2. Водорастворимые красители..................................... 349
а) Индикаторные красители.................................... 349
б) Красители для микроскопии................................. 349
в) Чернила и протравные красители............................ 350
г) Субстантивные красители для целлюлозы и шерсти............ 350
д) Синтетические красители для пищевых продуктов............. 350
II. Вспомогательные вещества в продуктах „питания и продуктах широкого
потребления......................................................... 352
1. Антиокислители и консервирующие вещества...................... 352
а) Обнаружение ингибиторов изоляционных масел................ 354
б) Консервирующие вещества................................... 354
2. Пластификаторы............................................... 356
3. Спирты и кислоты.............................................. 358
а) Спирты Cj — С4............................................ 358
б) Глицерин и гликоли........................................ 359
в) Карбоновые кислоты........................................ 359
4. Инсектициды................................................... 361
Пиретрины и синергисты....................................... 364
5. Вещества, придающие запах и вкус . ................ 367
а) Искусственные заменители сахара (сахарин, дульцин)........ 367
б) Ароматические вещества.................................... 367
III. Другие вспомогательные и синтетические продукты................ 367
1. Смеси полифенилов (органические охлаждающие средства для реакторов) 367
2. Производные ферроцена......................................... 369
3. Обнаружение оловоорганических стабилизаторов в пластмассах . . . 369
4. Циклоуретаны, окиси фосфинов и другие соединения............. 370
5. Взрывчатые нитрамины.......................................... 370
506
Оглавление
6. Фотореактивы.................................................... 370
Литература................................................................. 371
Глава 18. Гидрофильные соединения из растений (в первую очередь лекарст-
венных). Э. Шталъ, П. Шорн............................................. 373
I. Природные производные а- и у-пирона............................... 373
1. Концентраты из растительных материалов.......................... 374
2. Сорбенты и растворители......................................... 375
а) Колоночная хроматография флавоноидов........................ 375
б) Анализ методом ХТС.......................................... 375
а) Слои силикагели...................................... 376
р) Полиамидные слои......................................... 380
3. Обнаружение на хроматограмме.................................... 380
II. Вещества, содержащиеся в лишайниках............................... 382
III. Флороглюцинбутаноны (филикс-флороглюциды)......................... 382
IV. Производные антрацена ............................................. 384
V. Фенолкарбоновые кислоты и производные............................. 385
VI. Горечи и сапонины.................................................. 388
1. Горечи .......................................................... 388
2. Сапонины......................................................... 389
Литература................................................................. 390
Глава 19. Аминокислоты и производные. М. Бреннер, А. Нидервизер, Г. Па-
таки. ................................................................. 392
I. Введение.......................................................... 392
II. Общан методика.................................................... 394
1. Приготовление слоя.............................................. 394
2. Методика хроматографического анализа............................ 395
III. Аминокислоты...................................................... 395
1. Приготовление исследуемого раствора . .......................... 395
2. Гидролиз протеинов и пептидов................................... 396
3. Свободные аминокислоты в биологическом материале................ 396
4. Растворитель и эффект разделения................................ 398
5. Обнаружение аминокислот на хроматограмме........................ 403
IV. Пептиды............................................................ 408
V. Х-(2,4-Динитрофенил)-аминокислоты_ и З-фенил-2-тиогидантоины . . . 412
А. Динитрофениламинокислоты.......................................... 413
1. Динитрофенилирование............................................ 413
а) Аминокислоты................................................ 414
б) Пептиды . .................................................. 414
в) Полипептиды и протеины...................................... 414
2. Растворитель и эффект разделения................................ 416
а) Растворитель для растворимых в кислоте и воде ДНФ-аминокис-
лот, ие экстрагируемых эфиром............................... 417
б) Растворитель для нерастворимых в кислоте ДНФ-аминокислот,
экстрагируемых эфиром ...................................... 418
а) Растворители для общего разделения....................... 418
р) Растворитель для специальных задач разделения............ 422
3. Документация.................................................... 422
Б. Фенилтиогидантоины................................................ 425
1. Получение фенилтиокарбамилпроизводных и превращение их в ФТГ-
аминокислоты .................................................. 426
а) Аминокислоты................................................ 426
б) Пептиды..................................................... 427
2. Растворитель и эффект разделения................................ 428
Оглавление
507’
3. Обнаружение фенилгидантоинов............................... 429
VI. Ионофорез в тонких слоях и ионофорез — хроматография в тонких
слоях. Ц. Хонеггер........................................... 430
1. Ионофорез в тонких слоях (ИТС) . . . ...................... 430*
2. Ионофорез — хроматография в тонких слоях................... 431
Литература............................................................ 432'
Глава 20. Нуклеиновые кислоты и нуклеотиды. X. Мангольд............... 436-
I. Введение ...................................................... 436
1. Нуклеиновые кислоты и продукты их гидролиза................ 436-
2. Нуклеотид-коферменты....................................... 437
3. Старые методы анализа нуклеиновых кислот................... 437
4. Новые методы разделения продуктов расщепления нуклеиновых кис-
лот и нуклеотид-коферментов..................................... 437
5. УФ-Спектры составных частей нуклеиновых кислот............... 438
6. Используемые цветные реакции................................. 436
а) Реакция Дише ............................................. 4Й9
б) Реакция Эйлера и Хана................................... 439-
7. Методы выделения нуклеиновых кислот.......................... 439
а) Приготовление дезоксирибонуклеата натрия из зобной железы
телят по Сигнеру и Швандеру.............................. 439’
б) Получение рибонуклеата натрия из органов животных по Воль-
кину и Картеру............................................. 440>
8. Методы гидролиза нуклеиновых кислот........................ 441
а) Кислый гидролиз........................................... 44Г
б) Щелочной гидролиз......................................... 441
в) Ферментативный гидролиз................................... 44Г
II. Анализ методом ХТС производных нуклеиновых кислот............... 442
1. Анализ методом ХТС на целлюлозе и силикагеле............... 442
Условия разделения......................................... 443
а) Неподвижная фаза.......................................... 443
б) Растворитель ............................................. 443
в) Методы обнаружения........................................ 443
Применение и результаты ................................... 444
2. Разделение методом ионообменной хроматографии.......... 446-
Условия разделения......................................... 447
а) Ионообменный слой......................................... 447
б) Растворитель ............................................. 447
в) Методы обнаружения....................................... 449'
Применение и результаты................................... 449-
3. Дискуссия.................................................... 451
Литература............................................................. 452.
Глава 21. Сахара и производные. Э. Шталь и У. Калътенбах ............. 454
1. Введение..................................................... 454
2. Разделительные слои и растворитель........................... 456
а) Слои кизельгура Г для анализа микроколичеств по Шталю и Каль-
тенбаху .................................................... 456-
б) Слой силикагель Г — борная кислота по Пастуска.......... 457
в) Слои силикагеля Г и алусила по Вальди................... 458
3. Обнаружение ................................................. 459
4. Количественное определение .................................. 466
5. Анализ производных сахаров методом ХТС....................... 466
6. Специальное применение....................................... 461
Литература............................................................ 461
508
Оглавление
Глава 22. Анализ неорганических ионов методом ХТС. X. Зайлер............. 462
I. Общие замечания................................................. 462
II. Теоретический анализ процесса ХТС неорганических веществ........ 462
III. Приготовление анализируемых растворов и разделительных слоев для
анализа методом ХТС ................................................. 464
1. Разделение.................................................... 464
2. Перевод в растворимую форму и озоление........................ 466
3. Очистка силикагеля Г для анализа неорганических веществ методом
ХТС ............................................................ 467
4. Приготовление массы для нанесения на пластинки................ 467
IV. Анализ методом ХТС катионов, предварительно разделенных на группы 467
1. Разделение группы меди (раствор I)............................ 468'
2. Разделение группы (NH4)2S (раствор II)........................ 469
3. Разделение группы (NH^COg (раствор III)...................... 470
4. Разделение щелочной группы (раствор IV)....................... 471
5. Выделение U (VI) и Ga (III) из смеси катионов................. 471
V. Анализ анионов методом ХТС...................................... 472
1. Разделение галогенидов....................................... 472
2. Разделение фосфатов......................................... 473
Литература............................................................... 474
Глава 23. Реактивы для обнаружения при анализе методом ХТС. Д. Валъди . . 475
I. Об операции опрыскивания....................................... 475
II. О приготовлении реактивов . . . ................................ 476
III. Приготовление и применение реактивов для обнаружения............ 476
Основные термины хроматографии в тонких слоях............................ 493
ХРОМАТОГРАФИЯ в тонких слоях
Редактор Л. Г. Чучукина
Художник Л. Г. Ларский
Художественный редактор Ю. Л. Максимов
Технический редактор Л. II. Кондюкова
Сдано в набор 25/XII 1964 г. Подписано к печати 20/V 1965 г.
Бумага 70X108/ie=16,13, бум. л. 4,45 усл. печ. л., + 1 вкл.
Уч.-изд. л. 43,7. Изд. Ж 3/2227. Цена 3 р. 24 к. Зак. 734
(Темплан 1965 г. изд-ва «МИР», пор. № 94)
ИЗДАТЕЛЬСТВО «МИР»
Москва, 1-й Рижский пер., 2
Московская типография № 16 Главполиграфпрома Государственного
комитета Совета Министров СССР по печати
Москва, Трехпрудный пер., д. 9