российская академия

СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК (РАСХН)

ДЕПАРТАМЕНТ ВЕТЕРИНАРИИ МИНСЕЛЬХОЗА РФ

ЖИВОТНАЯ КЛЕТКА В КУЛЬТУРЕ

(Методы и применение в биотехнологии)

Под общей редакцией

Заслуженного деятеля науки РФ, профессора Л.П. Дьяконова,
Заслуженного ветеринарного врача РФ, профессора В.И. Ситькова

Москва 2000
ББК 30.16

Ж 67

Рецензенты:

доктор ветеринарных наук, профессор
Университета дружбы народов Сухарев О.И.,
доктор биологических наук, ВНИИТиБП Ереме ц В.И.

Животная клетка в культуре (Методы и применение в био-
Ж 67 технологии) / Под ред. проф. Дьяконова Л.П., проф. Ситько-
ва В.И.- М.: Компания Спутник+, 2000 - 400 с.

ISBN 5-93406-084-8

ББК 30.16

© Дьяконов Л.П., Ситьков В.И., 2000

© Оформление, верстка «Компания Спутник +», 2000
АННОТАЦИЯ

«Животная клетка в культуре» (методы и применение в биотехнологии)
Под редакцией заслуженного деятеля науки Российской Федерации, доктора

биологических наук, профессора Л.П.Дьяконова и заслуженного ветеринарного
врача РФ, доктора ветеринарных наук, профессора В.И.Ситькова

В книге обобщены современные материалы по клеточной биотехно-
логии и использованию культур клеток животных для исследований в био-
логии, инфекционной патологии, производстве вирусвакцин и диагностику-
мов.

Обстоятельно изложены данные о первичных, диплоидных, переви-
ваемых культурах клеток, методах их получения, поддержания и культиви-
рования, а также массовом культивировании клеток (роллерное, суспензи-
онное и др.) и промышленного производства клеток и вирусвакцин.

Значительное место уделено изготовлению и контролю питательных
сред, растворов и сывороток.

Освещены проблемы клеточной инженерии: методы реконструкции и
гибридизации клеток, получения гибридом и моноклональных антител, ге-
нетической трансформации клеток. Отдельные разделы посвящены транс-
генным животным, эмбриональным стволовым клеткам и культивированию
ооцитов и зигот.

Контаминация клеток микоплазмами - постоянная проблема в работе
с культурами клеток. В книге даны исчерпывающие данные по диагностике
и деконтаминации от микоплазм. Учитывая актуальность проблем, даны
материалы по прионам и хламидиям и их цитопатогенному действию.

Читатель найдет здесь сведения по криогенезации клеточных культур,
методам цитологических исследований, вопросам цитопатологии. Освеще-
ны также проблемы безопасности работы с культурами клеток и жидким
азотом.

Завершается книга разделом по терминологии, используемой в кле-
точной биотехнологии и генетике клеток.
Оглавление

Глава 1. Помещения, оборудование, приборы и инструменты, необходимые для работы с

' культурами клеток. В.И.Ситьков, И.Л.Куликова, В.И.Заерко, Л.П.Дьяконов.........7

1.1	.Условия работы с культурами клеток..........................................7

1.2.	Основные приборы, оборудование и реактивы..................................17

1.3.	Обработка посуды, резиновых изделий и инструментов.........................23

1.4.	Стерилизация посуды........................................................25

1.5.	Правила работы в лаборатории культур тканей, питательных сред и техника безопасно-
сти..............................................................................28

Глава 2. Животная клетка. Морфология, физиология, поведение в культуре. Л.П.Дьяконов....31
Глава 3. Некоторые особенности метаболизма клеток в культуре. Л.П.Дьяконов,

Г.Н.Строкина............................................................42

Глава 4. Питательные среды и растворы для культивирования клеток. Л.П.Дьяконов,
Г.Н.Строкина, В.И.Ситьков, Г.Ф.Денисенко, И.А.Яблонская..................47

4.1.	Синтетические (стандартные) питательные среды..............................52

4.2.	Бессывороточные питательные среды..........................................59

4.3.	Кондиционированные питательные среды.......................................64

4.4.	Наборы питательных сред на основе гидролизатов.............................64

4.5.	Сыворотка крови животных как компонент питательных сред....................67

Глава 5. Вещества межклеточного матрикса и их роль в культивировании клеток.

А.В.Федотов..............................................................82

Глава 6. Первичные культуры клеток. Т.В.Гальнбек, Л.П.Дьяконов, И.Л.Куликова,
А.А.Поздняков............................................................89

6.1.	Методика приготовления однослойной культуры клеток почки эмбрйона коровы (ПЭК). 89

6.2.	Методика приготовления однослойной культуры клеток тестикулов бычков (ТБ)...92

6.3.	Методика приготовления однослойной культуры клеток тестикулов поросят (ТП)..93

6.4.	Методика приготовления однослойной культуры клеток тестикулов эмбриона овцы и

тестикулов ягненка..........................................................94

6.5.	Методика приготовления однослойной культуры клеток почки теленка (ПТ)......94

6.6.	Методика приготовления однослойной культуры клеток почки эмбриона лошади (ПЭЛ) 95

6.7.	Методика приготовления однослойной культуры клеток почки эмбриона свиньи (ПЭС) .96

6.8.	Методика приготовления однослойной культуры клеток почки эмбриона овцы (ПЭО) ....96

6.9.	Методика приготовления однослойной культуры клеток почки овцы..............96

6.10.	Методика приготовления однослойной культуры клеток из лимфоидных органов...97

6.11.	Методика получения первичных культур клеток из субкультур репродуктивных орга-

нов самок крупного рогатого скота..........................................97

6.12.	Методика приготовления однослойной культуры клеток почек новорожденных телят..100

6.13.	Методика приготовления однослойной культуры клегок из почек морских свинок.100

6.14.	Методика приготовления однослойной культуры клеток из почек мыши...........101

6.15.	Методика получения культур клеток из ткани гусиных эмбрионов.............101

6.16.	Методика получения культур клеток из тканей куриного и перепелиного эмбрионов.. 102

6.17.	Культура клеток из ткани кишечника.........................................104

6.18.	Культура эпидермальных клеток............................................107

6.19.	Культура клеток из ткани легкого плода коровы (ЛЭК)........................109
6.20.	Культура клеток сосудов сердца эмбриона коровы (КСТ)...................111

6.21.	Культура клеток из ткани щитовидной железы.............................113

6.22.	Методики получения и поддержания субкультур............................120

6.23.	Методика перфузионной трипсинизации....................................121

6.24.	Органные культуры......................................................124

Глава 7. Роллерное и суспензионное культивирование клеток. Л.П.Дьяконов, В.И.Ситьков,
В.И.Заерко...................................................................124

Глава 8^Дишюидные культуры клеток Л.П.Дьяконов...............................133

Глава 9. Постоянные (стабильные) клеточные линии. Л.П.Дьяконов...................139

Глава 10. Методы культивирования тканей и клеток рыб. По материалам И.И.Рудикова.148

Глава 11. Промышленное культивирование клеток животных и вирусов при производстве
вакцин. Е.А.Рубан, А.Я.Самуйленко, В.И.Заерко................................159

Глава 12. Контроль стерильности и контаминации клеточных культур. Л.П.Дьяконов...169

Глава 13. Методы цитологических исследований. Л.П.Дьяконов, Т.В.Гальнбек,
И.Л.Куликова..........................................................171

Глава 14. Идентификация видовой принадлежности клеток в культуре. Л.П.Дьяконов,
Т.В.Гальнбек, И.Л.Куликова............................................183

Глава 15. Методы клеточной инженерии. А.А.Куш, Л.П.Дьяконов, Ш.М.Тугизов,
Е.В.Майджи, И.Л.Куликова..............................................187

15.1.	Получение генетических маркированных мутантных клеточных линий млекопитаю-
щих..........................................................................187

15.2.	Слияние цитоплазматических мембран клеток млекопитающих и получение гибрид-
ных клеток...................................................................198

15.3.	Гибридомы и моноклональные антитела в диагностике инфекционных болезней....215

15.4.	Генетическая трансформация клеток. Л.П.Дьяконов, А.А.Куш, ЦГМ.Тугизов,
Е.В.Майджи...................................................................218

Глава 16. Оогенез млекопитающих и культивирование ооцитов. Л.Ф.Курило........227

Глава 17. Эмбриональные стволовые клетки в биологии и биотехнологии. И.П.Савченкова. 244

17.1.	Характеристика эмбриональных стволовых клеток (ЭСК), полученных из эмбриобла-
ста предымплантационных зародышей мыши и их культивирование..................246

17.2.	Генетическая трансформация ЭСК.............................................253

17.3.	Гомологичная рекомбинация и методы её определения......................261

17.4.	ЭС-подобные клетки сельскохозяйственных животных...........................264

17.5.	Примордиальные зародышевые клетки млекопитающих............................266

Глава 18. Контаминация культур клеток животных микоплазмами и их цитопатогенное дей-

ствие. ИЛ.Куликова, Л.П.Дьяконов, Т.В.Гальнбек, И.А.Яблонская........274

18.1.	Методы диагностики и видовой идентификации микоплазм...................277

18.2.	Деконтаминация культур клеток от микоплазм.............................293

Глава 19. Создание криобанка штаммов и линий клеток и коллекций клеточных культур.
Л.П.Дьяконов........................................................\292/

Глава 20. Хламидии и их цитопатогенное действие. И.А.Калугина....................312

Глава 21. Прионы и их цитопатогенное действие. А.В.Дагданова.................315

Глава 22. Выделение вирусов в культуре клеток и методы их идентификации. Т.В.Гальнбек,
И.Л.Куликова, А.А.Поздняков, Л.П.Дьяконов.............................333

Глава 23. Терминология. Л.П.Дьяконов.............................................351
ВВЕДЕНИЕ

Культуры клеток животных стали неотъемлемой частью биотехнологии, они
используются для решения научных проблем общей биологии, цитологии, генетики,
вирусологии, иммунологии и инфекционной патологии.

Разработка методов культивирования клеток in vitro, освоение этих методов
специалистами биофабрик позволила решить многие вопросы реального производст-
ва вирусвакцин и диагностикумов. Биофабрики, фирмы, НИИ России выпускают
более 40 биопрепаратов, используя первичные культуры клеток, субкультуры, дип-
лоидные и постоянные линии клеток животных.

Однако, необходимо дальнейшее совершенствование методов культивирования, по-
лучение новых культур клеток, обладающих высокой чувствительностью к вирусам, создание
новых клеточных систем на основе гибридизации и генетической трансформации клеток.

Для нынешнего этапа развития клеточной биотехнологии и изучения биоло-
гии клеток в культуре характерно с одной стороны стремление получить конкретные
результаты в производстве биопродукции, а с другой - более углубленного изучения
клетки в условиях искусственного выращивания.

Дело в том, что культура клеток in vitro - это динамичная система взаимодейст-
вующих составляющих элементов (клеток), которые находятся в постоянном размноже-
нии, развитии, отмирании. Создание оптимальных условий жизнедеятельности клеток
вне организма - одна из основных проблем клеточной биотехнологии.

В восьмидесятые годы издано ряд книг, монографий, учебно-методических
пособий, в которых был обобщен опыт работы с культурами клеток. За прошедшие
10-12 лет накопилось много новых данных по получению штаммов и линий клеток,
широко используются методы гибридизации для получения гибридом, продуцирую-
щих моноклональные антитела не только к антигенам вирусов, бактерий, иммуног-
лобулинам, гормонам, ферментам. Развивается новое направление - получение гиб-
ридных культур клеток сельскохозяйственных и других крупных животных и гене-
тическая трансформация клеток с целью получения антигенов вирусов, бактерий,
простейших, а также клеток и животных, устойчивых к заражению вирусами.

Требуют обобщения материалы по культивированию ооцитов и зигот, эм-
бриональных стволовых клеток и других клеточных систем.

Таким образом, значительно расширился спектр культивируемых клеток, ко-
торые могут использоваться не только в научных целях, но и в биотехнологическом
производстве вакцин и диагностикумов.

Весьма важно при этом иметь данные о чувствительности к вирусам и компе-
тентности тех или иных клеток к восприятию чужеродной генетической информа-
ции, что позволит создать культуры клеток - продуценты антигенов, гормонов, фи-
зиологически активных веществ.

Прионовые болезни - скрепи, губкообразная энцефалопатия парнокопытных,
пушных зверей - серьезная угроза экономике животноводства и возможная опасность
для здоровья людей. По крайней мере, в Англии, Франции зарегистрированы случаи
заболевания и смерти людей от так называемого нового варианта болезни Крейцфельда-
Якоба, которая характеризуется тем, что выделяемый при этом прионовый белок полно-
стью совпадает по электрофоретической подвижности с белком, выделенным от больных
коров. Обобщение данных об изучении цитопатогенного действия инфекционных при-
онов (РгР50), ряда новых вирусов, хламидий крайне необходимо для разработки методов
прижизненной диагностики заболеваний и контроля культур клеток, используемых в
биотехнологии, на отсутствие приона скрепи и других патогенов.

Предлагаемая книга, мы надеемся, будет полезным пособием для ученых, врачей,
специалистов биопредприятий, других производителей биопродукции, диагностических
лабораторий, преподавателей и студентов ветеринарных ВУЗов и техникумов.

Авторы
Глава 1. Помещения, оборудование, приборы и инструменты,
необходимые для работы с культурами тканей

1.1. Условия работы с культурами клеток /чистые помещения/

В наши дни, на рубеже XXI века, чистые помещения прочно воШли в
жизнь человека. Без них немыслимо производство микроэлектронных схем,
изготовление лекарственных средств, вакцин, культур тканей, во многих
случаях эффективное лечение больных и т. д.

Прообраз первых чистых помещений связан с медициной. Уже давно
было установлено положительное влияние чистого воздуха на больного.
Примерно 150 лет назад в Крыму появились первые больничные палаты с
подводом чистого воздуха к больному. Позднее вентиляция и кондициони-
рование воздуха стали широко применяться.

Чистым помещением или чистой комнатой называется такое помеще-
ние, в котором счетная концентрация аэрозольных частиц, и при необходи-
мости, число микроорганизмов в воздухе прддерживаехоя д ШЦ1еД£Децрых
пределах.

Окружающий нас воздух содержит большое количество как живых,
так и неживых частиц, отличающихся по своей природе и размерам. Микро-
загрязнения выделяются персоналом, ограждающими конструкциями, обо-
рудованием, проникают в чистое помещение из окружающей среды.

Работа с клеточными культурами проводится в стерильных условиях
со строгим соблюдением правил асептики и антисептики, т.к. «загрязнение»
- контаминация бактериями, микоплазмами, вирусами, грибами приводит к
гибели клеточных культур или их непригодности для специальных исследо-
ваний в научных, биотехнологических и диагностических целях. Поэтому в
лаборатории необходимо иметь «стерильные» /асептические/ комнаты или
боксы, оборудованные для работы с клеточными культурами.

Требования к чистоте воздуха по стандарту 150/Д1 13408-1
«Асептическое производство продукции здравоохранения»

производственная зона	максимально допуст. число тип зоны по частиц разм. 0,5 мкм и более GMP ЕС в 1 м3 воздуха в эксплуатации
критические зоны	3500	А
другие производственные зоны	350000	В
не стерильные вспомогательные	зоны	3500000	С/Д

Для производства стерильных лекарственных препаратов можно, как
правило, выделить четыре типа зон:

Тип А: Локальные зоны для операции с высокой степенью риска, на-
пример, зоны наполнения, укупорки, вскрывания ампул, осуществление со-
единения в асептических условиях. Как правило, такие условия обеспечи-
ваются рабочей зоной с ламинарным потоком воздуха.
Тип В: Для случая асептической подготовки и наполнения простран-
ства, окружающее зону А.

Тип С и Д: Чистые зоны для выполнения менее ответственных этапов
производства стерильных продуктов.

Предотвращение микробной контаминации через человека достигает-
ся применением защитной (рабочей) одежды (костюм или комбинезон, по-
вязка или респиратор, соответствующая обувь и головной убор.)

Дезинфекция является обязательной процедурой при работе в сте-
рильных условиях.

На практике наиболее широко применяются следующие виды дезинфи-
цирующих средств: фенолы, галогеносодержащие вещества (хлорамин, йод и
др.), щелочи (КОН, NaOH), перекись водорода (растворы 3%, оказывающие
бактерицидное действие и 6% спороцидное действие), формалин (40% раствор
формальдегида), спирт этиловый - 70% (только бактерицидное действие).

Применяются следующие способы дезинфицирования:

Протирка поверхностей тканью, смоченной раствором дезинфици-
рующего средства.

Орошение горизонтальных поверхностей раствором дезинфицирую-
щего средства с дальнейшим удалением жидкости с помощью вакуума по-
сле определенного времени выдерживания.

Аэрозольная обработка. Применяется для дезинфекции воздуха и
труднодоступных мест помещений, благодаря способности аэрозолей про-
никать в тесные пространства, а также достаточно высоко по стенам.

Погружение в раствор. Для небольших объектов, как контейнеры с
препаратами (флаконы, ампулы, бутыли и т.д.).

Эффективным бывает предварительное облучение УФ - лучами (бак-
терицидные лампы).

Правильная организация потоков воздуха является одним из решающих
факторов, определяющих эффективность чистых помещений. Воздушный по-
ток должен уносить из помещения все частицы, которые выделяются людьми,
оборудованием и материалами. При этом не должно быть застойных зон с пло-
хим обменом воздуха. Поток воздуха должен обтекать все поверхности в поме-
щении и удалять частицы из прилегающего материала к поверхностям.

Существуют пространства двух принципиально разных видов пото-
ков воздуха:

1	.Однонаправленный поток, который часто называют ламинарным.

2	. Не однонаправленный поток, часто называют турбулентным.

Однонаправленный поток может быть вертикальным и горизонталь-
ным (рис. 1.1).

Места притока и вытяжки однонаправленного потока воздуха должны
располагаться, по возможности, друг против друга, чтобы обеспечить пря-
мое течение потока.

Следует иметь ввиду, что поток воздуха по-разному обтекает по-
верхности различной формы (рис. 1.2).
Рис. 1.1. Однонаправленные потоки воздуха:

а) вертикальный

б) горизонтальный
Причины нарушения
однонаправленности
потока воздуха

Способы улучшения
аэродинамической картины

а)	расположение рабочих мест и мебели,
перфорирование горизонтальных поверхностей

4 4 4 4 4 4 4

б)	исключение горизонтальных “полок”, ниш, консолей и пр.

в)	организация рабочего места,
исключающая наклонное положение оператора над столом

г) учёт влияния источников тепла

Рис. 1.2. Влияние рабочих мест на однонаправленный поток воздуха.
На качество однонаправленного потока воздуха большое влияние оказы-
вает конструкция распределителя, через который воздух проходит в чистое по-
мещение. Важное значение имеет размер отверстий и расстояние между отвер-
стиями, через которые проходит воздух. Чем больше это расстояние, тем боль-
ше "мертвые зоны" и тем хуже качество воздуха. Одним из лучших решений
этой проблемы являются сетчатые распределители воздуха.

Периодически необходимо проводить контроль чистоты помещения.
Планы контроля предусматривают планы отбора проб, выбор приборов-
пробоотборников и питательных сред, соответствующих задачам и объемам
контроля.

Основные этапы контроля: отбор проб, инкубирование отобранных
проб, анализ и оценка.

Кроме того, анализ микробной загрязненности может проводиться
методами иммунологическими, химическими или физическими, как имму-
нофлюоресценция, окрашивание, калориметрия или сканирование с помо-
щью электронной микроскопии.

Для контроля биологического загрязнения воздуха используются
приборы, основанные на инерционном, седиментационном методах и методе
фильтрации.

Инерционный метод: основан на осаждении частиц микробного аэ-
розоля из воздушного потока на поверхность питательного агара с после-
дующим инкубированием осевших микроорганизмов в термостате. Через
некоторое время на агаре появляются видимые глазом колонии микроорга-
низмов, число которых нетрудно подсчитать. Конструкции приборов-
пробоотборников инерционного типа весьма разнообразны, но принцип у
них один - частица аэрозоля при набегании на препятствие (поверхность
агара) в силу инерции не следует линии тока и не отклоняется вместе с воз-
духом, а прямолинейно движется с препятствием.

Седиментационный метод: заключается в определении микробных
частиц, оседающих на поверхности чашек Петри с агаром. Этот метод не
дает количественной характеристики обсемененности и служит лишь до-
полнением к методам проб отбора, т.к. на чашке Петри оседают лишь час-
тицы большого размера, в это время как мелкие частицы продолжают витать
в воздухе и седиментационным способом не идентифицируются.

Метод фильтрации: имеются два типа фильтров. Первый "абсо-
лютный", отверстия в котором имеют калибровочный размер. Такой фильтр
задерживает все частицы, размер которых больше размера отверстий. Даль-
нейшая оценка микробной загрязненности может проводиться путем микро-
скопирования или методов отпечатков на питательную среду. Второй тип
фильтров - объемный, представляющий собой тонковолокнистую структуру
со случайным расположением волокон. Фильтры такого типа часто изготав-
ливают из водорастворимых материалов, например, желатины. В этом слу-
чае при последующем посеве пробы на твердую питательную среду полу-
чают оценку числа клеток, а не частиц, содержащих несколько клеток.
Стерильность воздуха проверяют систематически (не реже 1 раза в неде-
лю) с помощью чашек Петри с 1%-ным агаром Хоттингера (2 чашки) и агаром
Сабуро (2 чашки), помещенных в открытом виде в разных местах бокса на
уровне 1 -1,5 м от пола на 20 минут. Число колоний, выросших после 48 часов
инкубации при 37°С или при комнатной температуре, не должна превышать 10
в одной чашке. При обнаружении большого числа колоний в чашках бокс под-
вергают дополнительной обработке парами фенола или формалина и бактери-
цидными лампами (включать на ночь в течение 2-3 суток подряд).

Для более точного контроля микроорганизмы из воздуха улавливают
с помощью аппарата Кротова на твердые баксреды (МПА, кровяной агар),
разлитые в чашки Петри. После суточной инкубации чашек при 37°С про-
сматривают и подсчитывают колонии и в соответствии с инструкцией, при-
лагаемой к прибору, определяют микробное.число воздуха. Во время работы
этот показатель не должен превышать 100 м.т. в 1м3

Для улавливания быстрооседающего крупнодисперсного бакте-
риального аэрозоля, преимущественно вызывающего аэрогенную кон-
таминацию питательных сред и культур клеток, пробы воздуха отбирают
методом седиментации микроорганизмов на открытые чашки Петри со сте-
рильным МПА и кровяным агаром, выставляемые на стол в боксе при экс-
позиции в 15-30 минут. Результаты исследований учитывают после суточно-
го выдерживания проб в термостате. Количество микробных тел, оседаю-
щих за I минуту на 1м2 поверхности рассчитывают по формуле:

N 104
л. —

S.c.t

где

X - искомое число микроорганизмов;

N - общее число колоний, выросших на чашках Петри;

S - площадь одной чашки Петри в см2

С - число чашек Петри;

t - время экспозиции чашек в минутах.

Обсемененность воздуха боксов не должна превышать 10 м.т. на 1м2 в
минуту на протяжении всей работы.

Превышение отмеченных предельно допустимых концентраций мик-
роорганизмов в воздухе резко увеличивает вероятность бактериальной кон-
таминации изготовляемых в боксах питательных сред и культур клеток, да-
же при работе с ними в непосредственной близости от пламени горелки, и
вызывает необходимость дополнительной дезинфекции таких помещений.
Ее проводят при помощи аппарата САГ -1 или других приборов аналогично-
го назначения путем аэрозольного распыления смеси, состоящей из 3% пе-
рекиси водорода в 0,5% водном растворе молочной кислоты при расходе
жидкости 5 мл на I м3 Применение этой смеси обеспечивает надежное обез-
зараживание боксов и, в отличие от других известных дезинфектантов (фор-
малин, фенол, уксусная кислота и др.), не сопровождается накоплением в
помещении токсических для клеток продуктов.
При появлении в посевах из воздуха колоний плесени проводят обра-
ботку боксового помещения насыщенным раствором тимола.

Стерильные рабочие места. Обеспечение стерильности при работе с
клеточными культурами обычно достигается путем помещения объекта ис-
следования вместе с экспериментатором в так называемое боксовое поме-
щение в виде изолированной комнаты, имеющую прихожую (предбоксник)
и обеспеченную необходимым общим и специальным освещением, систе-
мами приточной и вытяжной вентиляции, горячим и холодным водоснабже-
нием, а также подводами газов и сжатого воздуха. Стены, пол и потолок
подобных помещений покрыты не сорбирующими пыль и моющимися по-
крытиями.

Создание боксовых помещений, как правило, требует значительных
капитальных затрат и не обеспечивает необходимой организационно-
технологической гибкости при переходе к отличным от первоначальных
методам исследований. Помещения не дают должной стерильности. Кроме
того, неизбежны прямые контакты между объектом работы и оператором,
что часто нежелательно.

Альтернативой является использование так называемых ламинар-
боксов или стерильных рабочих мест. В этом случае в любом помещении
может быть создан локальный стерильный объем, необходимый для работы
и создающий биологическую защиту пользователей. Технически задача ре-
шается путем постоянного обдува места проведения работ (например, стола)
ламинарным потоком воздуха, содержащего не более четырех частиц за-
грязнений с размером 0,3 - 0,5 мкм в 1 дм3 Избыточное давление воздуха в
рабочем объеме и специальные конструктивные меры исключают возмож-
ность попадания воздуха из помещения на место, где расположен биологи-
ческий материал. При работе с заведомо непатогенными материалами поток
обеспыленого воздуха из рабочей зоны выходит непосредственно в окру-
жающее пространство. В случае работы с потенциально патогенным мате-
риалом воздух перед выходом из рабочей зоны дополнительно фильтруется.
Возможность обдува при этом оператора исключена. В зависимости от уст-
ройства ламинар-бокса поток обеспыленного воздуха в рабочей зоне может
быть горизонтальным, вертикальным или наклонным. Использование лами-
нар-боксов обеспечивает оперативное переоборудование рабочих помеще-
ний при реализации новых методик и не требует дорогих и длительных
строительно-монтажных работ. Ниже приводится описание отечественных
приборов этого класса.

Ламинар-бокс с горизонтальным потоком обеспыленного воздуха ти-
па УО-БГ (установка обеспылевания биологическая с горизонтальным пото-
ком) имеет следующие параметры: габариты 1280x1120x2000 мм; размеры
рабочей зоны 1140x670x700 мм, масса 250 кг. Электропитание 220/380 В, 50
Гц, потребляемая мощность 1,1 кВ. Установка обеспечивает очистку возду-
ха, подаваемого в рабочую зону, до уровня не более четырех частиц разме-
ром 0,5 мкм в 1 дм3 Очистка проводится путем фильтрации на фильтрах
грубой и тонкой очистки, встроенных в прибор. По мере их загрязнения
фильтр грубой очистки может промываться, фильтр тонкой очистки должен
заменяться на новый. Прибор имеет встроенный источник освещения и УФ-
облучения (для стерилизации рабочей зоны в перерывах между использова-
нием бокса), регулятор скорости воздушного потока и столешницу с него-
рючим покрытием. Со стороны оператора рабочий объем имеет подъемное,
прозрачное ограждение. Шум при работе УО-БГ не превышает 65 дБ.

Ламинар-бокс с вертикальным ламинарным потоком обеспыленного
воздуха типа УО-БВ (установка обеспылевания биологическая с вертикаль-
ным потоком) имеет следующие параметры: габариты 1300x930x2570 мм,
рабочая зона 1280x800x1700 мм, масса 245 кг. Электропитание 220/380 В,
потребляемая мощность 1,1 кВ. Качество очистки воздуха и правила замены
фильтров, наличие источников света и УФ облучения, регулировка скорости
потока воздуха аналогичны боксу УО-БГ Прибор комплектуется специаль-
ным столом типа ЮАС, представляющим самостоятельное изделие, поме-
щаемое внутрь рабочей зоны установки. УО-БВ поставляется в разобранном
виде. Наибольшая транспортная единица - блок фильтровентиляционной
установки - имеет габариты 1250x870x930 мм и массу 100 кг. Шум при ра-
боте бокса не превышает 65 дБ.

Ламинар-бокс для работы с потенциально патогенными культурами
типа БП-4-004 («Бокс-P») обеспечивает подачу нерабочую зону ламинарного
потока воздуха, содержащего не более 3-4 частиц загрязнений размером бо-
лее 0,3 мкм в 1 дм3 В приборе обеспечивается так называемая рециркуляция
воздушного потока, заключающаяся в том, что воздух из рабочего объема
попадает на специальный фильтр тонкой очистки, откуда часть его выходит
в окружающее пространство, а остальной поток повторно проходит через
фильтр тонкой очистки и вновь поступает в рабочий объем (Рис.1.3.). Этим
достигается невозможность выноса обрабатываемого материала в помеще-
ние. Возможность попадания выходящего воздуха на оператора предотвра-
щается созданием зоны подсоса на открытой стороне рабочего объема бок-
са. Поток воздуха в рабочем объеме может быть направлен сверху вниз или
слева на право. Параметры установки: наружные размеры 1400x900x2375
мм, размер рабочей зоны 1150x610x700 мм, масса 480 кг, электропитание
220/380 В, 50 Гц, потребляемая мощность 1,0 кВ. Прибор имеет встроенные
источники света и УФ облучения, столешницу из нержавеющей стали. Пе-
редняя часть рабочего объема закрыта прозрачным стеклом, перемещаемым
по высоте. Бокс снабжен системой регулирования скорости потока воздуха и
индикаторами загрязнения фильтра тонкой очистки. Уровень шума, созда-
ваемого установкой не превышает 65 дБ.

Лаборатория культур тканей должна размещаться в отдельном здании
или в отдельном крыле здания, с изолированными от других лабораторий
инфекционного профиля входом и выходом. Запрещается вносить в произ-
водственные помещения и работать с какими-либо штаммами вирусов или
бактерий.
Рис. 1.3. Ламинар-бокс для лабораторных работ с культурами клеток
Для успешного приготовления клеточных культур и работы с ними
необходимо иметь отдельные боксы с предбоксниками для приготовления и
стерилизующей фильтрации питательных сред и растворов, проведение
трипсинизации, поддержания и пересева перевиваемых клеточных линий.
Боксы и предбоксники должны быть оснащены бактерицидными лампами
марки БУФ в количестве, обеспечивающем стерильность этих помещений £2
ватта на 1 куб метр). Облучение ультрафиолетовыми лучами проводят в те-
чение 30 минут перед началом работы. На этот же срок лампы включают в
перерывах работы в боксах. Работа в боксах производится с подачей сте-
рильного воздуха, обеспечивающего более высокое давление в боксе по
сравнению с другими помещениями. Воздух, нагнетаемый с улицы в боксы,
должен фильтроваться через ткань Петрянова или фильтр «Лайк», либо дру-
гие системы фильтрации. Желательно (особенно в жаркое время года), что-
бы была обеспечена подача кондиционированного воздуха. Температура в
закрытой комнате (боксе), где работает несколько человек, может очень бы-
стро подниматься. Постоянная температура не выше 20 - 22°С необходима
не только для удобства работы персонала, но и потому, что повышение тем-
пературы воздуха выше 30°С отрицательно сказывается на ростовых свой-
ствах и качестве клеточных культур.

Приводим примерное размещение рабочих помещений лаборатории
культур тканей с отделом питательных сред для вирусологических целей
(рис.2.1., 2.2).

Рис.2.1. Схема примерного размещения оборудования и приборов в
помещении для работы с культурами клеток
Рис. 2.2. Схема примерного размещения приборов и оборудования в
помещении по изготовлению сред и растворов для культур
клеток в лабораторных условиях.

1.2. Основные приборы, оборудование и реактивы

Перечень оборудования, сред, реактивов:

1.	Центрифуга горизонтальная с охлаждением - ЦЛР-1, К-70 и др., с рото-
ром на стаканы емкостью 500 мл.

2.	Центрифуга настольная Т-32 со стаканами емкостью до 100 мл.

3.	Термостаты.

4.	Сосуды Дьюара емкостью 5, 10, 20, 35 и 50 литров.

5.	Холодильники /2С-4С/ бытовые.

6.	Низкотемпературный холодильник /-20-40°С/

7.	Водяная баня /ВР-2/.

8.	Шкаф с вертикальным или горизонтальным ламинарным потоком сте-
рильного воздуха.

9.	Стерильная комната /бокс/.

10.	Микроскопы МБИ-3, МБР-3, МБИ-1 для подсчета клеток и других ис-
следований, инвертированный микроскоп для просмотра монослоя кле-
ток, люминесцентный микроскоп /МЛ-3, МЛ-4 и др./.

11.	Счетная камера Горяева.

12.	Дистилятор.

13.	Аппарат для получения апирогенной воды производительностью 25 л/час
и 10 л/час.

14.	Аппарат для получения сверхчистой воды типа ’’Миллипор”.
15.	Кондуктрометр для определения электропроводности дистиллированной
воды типа ЛК-563 или ОК-102/1 или мегометр для определения удельно-
го сопротивления воды.

16.	Лабораторный pH-метр /ионометр/.

17.	Весы аналитические.

18.	Весы технические с точностью до 1-5 мг.

19.	Фильтры мембранные миллипоровые и другие или стерилизующие ас-
бестовые пластины.

20.	Аппаратура для фильтрации и стерилизации сред, растворов.

21.	Автоклав.

22.	Сушильные шкафы типа ШСС-250.

23.	Шкафы для реактивов, сред, посуды, растворов.

24.	Контейнеры металлические, бюксы.

25.	Сейф металлический.

26.	Магнитная мешалка с магнитами типа ММ-5.

27.	Аппарат для трипсинизации.

28.	Система диффузной трипсинизации.

29.	Шланг силиконовый или резиновый с грушей.

30.	Инструменты: стерилизатор электрический типа Э-22, ножницы прямые,
ножницы изогнутые, пинцеты хирургические и анатомические, пинцеты
кровоостанавливающие, корцанг, шприцы разные и иглы к ним.

31.	Бактерицидные лампы БУФ-30.

32.	Одеяло шерстяное.

33.	Защитная одежда: костюм или комбинезон, стерильная повязка или рес-
пиратор, соответствующая обувь или головной убор.

34.	Спиртовка обычная.

35.	Спиртовка-факел.

36.	Колбы на 0,25; 0,5; 1л.

37.	Бутыли разные на 1; 2; 3; 5; 10; 16 л со стеклянными пробками.

38.	Флаконы на 100; 200; 500мл.

39.	Матрасы /флаконы бактериологические или культуральные/ на 100; 250;
500; 1000; 1500мл.

40.	Флаконы Карреля /диаметром 4-60мм/.

41.	Банки широкогорлые 250; 500; 1000 мл.

42.	Пластиковые панели для культивирования клеток 96-луночные, 24-
луночные, 12-луночные, 6 и 4-луночные, стерильные, одноразовые.

43.	Стерильные одноразовые пластиковые матрасы на 25; 50; 100; 250; 500
мл и более.

44.	Пипетки градуированные на 1; 2; 5; 10 мл.

45.	Пипетки бактериологические.

46.	Пипетки автоматические на 0,1; 0,5; 1,0; 2,0; 5,0 мл.

47.	Пипетки Морра на 25; 50; 100мл.

48.	Среды и растворы: ГЛА, ИГЛА, 199, ФГМ-С, RPMI-1640, ИГЛА-МЕМ,
ИГЛА-ДМЕМ, растворы Хенкса, Эрла, 5-7,5% раствор бикарбоната на-
трия, однозамещенный фосфорнокислый калий, физиологический рас-
твор /0,85% NaCl/; дистиллированная, бидистиллированная и сверхчис-
тая вода, 0,25% раствор трипсина, 0,02% раствор версена
/этилендиаминтетрацетат натрия (трилон Б)/; другие среды и растворы,
которые изготавливают или приобретают по мере необходимости.

49.	Сыворотка крупного рогатого скота, сыворотка теленка, сыворотка пло-
дов коровы, овцы и другие.

50.	Краски: Романовского-Гимза, кристаллвиолет, трипансинь, трипафла-
вин, гематоксилин, эозин, акридиновый оранжевый и другие.

51.	Реактивы: спирт этиловый, спирт метиловый, уксусная кислота, ксилол,
фенол, соляная кислота и др.

52.	Соли: натрий фосфорнокислый двухзамещенный; то же однозамещен-
ный, калий фосфорнокислый однозамещенный, калий хлористый, магний
хлористый, магний сернокислый, натрий хлористый, HEPES-буфер и
другие.

53.	Пробки резиновые и шланги резиновые или поливиниловые разных раз-
меров /в зависимости от потребности/.

54.	Пробки ватно-марлевые разных размеров.

55.	Пробки бактериологические разных размеров.

56.	Флаконы емкостью 20 мл для культивирования клеток на стеклах.

57.	Стекла предметные.

58.	Стекла покровные.

Лабораторные термостаты для культивирования клеток должны от-
вечать ряду специальных требований: обеспечивать высокую стабильность
поддержания заданной температуры, создавать минимальный градиент тем-
пературы по полезному объему, обладать системой быстрого восстановле-
ния температуры после кратковременного открывания полезного объема,
внутренний объем должен изготавливаться из биологически пассивных ма-
териалов, т.е. не влияющих на жизнедеятельность клеток и стойких к воз-
действию компонентов питательных сред.

Материалы и покрытия внутренних и наружных частей конструкции
термостата должны позволять деконтаминацию водными растворами спирта
ректификата и стерилизацию УФ облучением.

Современные модели этих приборов имеют полезный объем от 20 до
1400 л. Полезный объем образуется пластинами полированной нержавею-
щей стали или меди.

Температура в рабочей камере термостатов обычно может задаваться
в диапазоне от превышающей комнатную на 5°C до 80°С. В некоторых мо-
делях термостатов имеется встроенная холодильная установка, позволяю-
щая задавать температуру в диапазоне от -10 до 80°С и поддерживать ее при
помещении в полезный объем приборов, выделяющих дополнительное теп-
ло, например роллерных установок, встряхивателсй и т. п.

Точность поддержания заданной температуры гарантируется только
для одного значения рабочей температуры, обычно для 37°С, и равняется
±0,2°С. При других рабочих температурах эта величина достигает ±0,5°C.
Следует иметь в виду, что подобная точность справедлива лишь в 1 -2 точках
полезного объема прибора и, естественно, будет хуже во всем остальном
объеме термостата. Градиент температуры по полезному объему в лучших
моделях термостатов равен ±0,3°С и обеспечивается при незагруженном
приборе. Низкое значение градиента создается принудительным перемеши-
ванием воздуха в камере термостата от встроенных в него вентиляторов.

По своей конструкции лабораторные термостаты делятся на жидкост-
ные и воздушные. В первых из них полезный объем окружен емкостью, на-
полненной дистиллированной водой, которую собственно и нагревают. Воз-
душные термостаты имеют рабочий объем, непосредственно контактирую-
щий с электронагревательными элементами. Жидкостные термостаты обес-
печивают малые значения температурного градиента в камере, но имеют
очень большую тепловую инерцию и поэтому очень длительное время вхо-
ждения в рабочий режим. Масса их значительна, а эксплуатация сложна.
Воздушные термостаты, ранее уступавшие жидкостным по ряду основных
параметров (точность поддержания температуры, ее градиент), теперь зна-
чительно усовершенствованы и составляют большую часть серийно произ-
водимых моделей.

С02-инкубаторы. Необходимость поддержания постоянной величи-
ны pH в питательной среде и не минимального испарения в период инкуба-
ции клеток привела к разработке специальных приборов для этой цели, так
называемых углекислотных или СО2 - инкубаторов (Рис.3.1.). По своей кон-
струкции и основным параметрам эти приборы полностью соответствуют
описанным выше термостатам. Главной их отличной чертой является нали-
чие систем создания и поддержания определенного состава газовой среды в
полезном объеме и высокой относительной влажности в нем.

Газовая среда в камерах СО2-инкубатора содержит повышенную кон-
центрацию кислорода и углекислого газа, а в большинстве случаев только
углекислого газа; величина концентрации задается по условиям культивиро-
вания и поддерживается автоматически с точностью ±0,1%. Современные
модели этих приборов (фирм "Heraues", "Hotpact","Flow" и др.) позволяют
регулировать количество О2 и СО2 в диапазоне от 1 до 95% (объемных).

В настоящее время ряд фирм ("Joan", "Ikemoto Scientific","Hewlett-
Packard") используют лазерные датчики, ликвидировавшие необходимость
учета и коррекции показаний в зависимости от влажности.

Из приборов этого вида в России разработан и выпускается
газопроточный СО2- инкубатор типа ГПИ-1 со следующими параметрами:
объем рабочей камеры - 150 дм3, диапазон избыточной концентрации СО2
до 20%, погрешность поддержания данной концентрации СО2 ±0,2%,
диапазон рабочих температур 25-70°С, погрешность поддержания заданной
температуры ±0,15°С при 37°С, градиент температуры по рабочему объему
±0,3°С при 37°С.
Рис.3.1. Водяной СО2 - инкубатор (”NBS”, США)

Лабораторные встряхиватели. Как известно, принудительное пере-
мешивание питательных сред с помещенными в них клеточными культурами
обеспечивает лучший газообмен и, следовательно, повышает эффективность
культивирования. Во многих случаях этот эффект возрастает при сочетании
перемешивания с содержанием в оптимальной для данной культуры темпера-
туре. Приборы, осуществляющие эту операцию, называются лабораторными
встряхивателями (Рис.3.2.). Конструктивно они состоят из платформы, на ко-
торой крепятся сосуды, заполненные суспензией, и приводного механизма,
придающего платформе вращательное или возвратно-поступательное движе-
ние. При необходимости платформа помещается в воздушный термостат или
водяную баню. Невзирая на внешнюю принципиальную простоту, эти прибо-
ры относятся к достаточно сложным и дорогим техническим устройствам, что
вытекает из ряда специальных требований к их работе, главным из которых
является строгое плоскопараллельное перемещение платформы без толчков и
вибраций. Большинство современных приборов этого вида имеет следующие
характеристики: частота возвратно-поступательного движения платформы от
10 до 300 колебаний в 1 мин, частота вращательного движения платформы от
40 до 400 об/мин, радиус вращения 20-25 мм, ход возвратно-поступательного
движения от 10 до 40 мм, стабильность поддержания заданных параметров не
хуже ±1% от заданной величины.
Рис.3.2. Качалка типаОЗЗ ("NBS”, США)

Большинство моделей встряхивателей позволяет перемешивание в
одном режиме - вращательном или возвратно-поступательном. Наиболее
современные модели (фирмы “Infors”) являются универсальными, т.е. могут
работать в любом из приведенных режимов перемешивания.

Во многих случаях встряхиватели имеют комплект сменных плат-
форм, обеспечивающих возможность работы с сосудами различных типов
(колбами, пробирками, чашками Петри, и т.п.). Сосуды на платформе могут
крепиться и в наклонном положении, что способствует газообмену за счет
увеличения площади контакта жидкость - воздух.

Импортные приборы этого класса изготавливаются фирмами “NBS”,
“Infers”, “В. Braun Melsungen”, “GFL”, “Luckham” и др.

Инвертированные микроскопы. Оперативное исследование состоя-
ния культивируемых клеток наиболее удобно осуществлять с помощью ин-
вертированных микроскопов.

Принцип инвертированности (перевернутости) заключается в том, что
в подобных микроскопах объект наблюдения освещается сверху, наблюда-
ется через окуляры, расположенные под объективом. Это конструктивное
новшество дало возможность наблюдения живых клеток в культуре, т.е. не-
посредственно в сосудах, где происходит их рост. Микроскоп обычной оп-
тической схемы исключал возможность помещения таких сосудов между
столом и объективом из-за недостаточных размеров этого расстояния.

Инвертированные микроскопы выпускаются многими фирмами
(Nikon-Япония, Leitz-ФРГ, Opton-ФРГ, Olimpus-Япония). В зависимости от
количества реализуемых методов наблюдения и конструктивной сложности,
а, следовательно, и цены, инвертированные микроскопы могут быть условно
разделены на микроскопы для общелабораторных работ, или скрининговые,
и микроскопы для ведения научно-исследовательских работ.

К микроскопам первой группы могут быть отнесены приборы «Теле-
вал» («К.Цейсс, Йена», Германия) и «Биолам-П» (ЛОМО, Россия). Приборы
этой категории позволяют осуществлять наблюдения с увеличением до 250-
300 крат. Тринокуляр обеспечивает возможность микрофотографирования.

Инвертированные микроскопы для научно-исследовательских работ
позволяют осуществлять перечисленные выше методы наблюдения и, кроме
того, дают возможность использовать методы фазово-дифференциального
контраста (по Номарскому), люминесценции. Эти приборы имеют специ-
альную оптику для присоединения фото или киноприставок и устройства
автоматической установки экспозиции. Увеличение наблюдаемого объекта
лежит в пределах от 20 до 1500 крат. Микроскопы могут снабжаться специ-
альными камерами для термостатирования сосуда с клетками и создания
необходимого состава газовой атмосферы в нем. Системы электромеханиче-
ского управления положением объекта наблюдения и фокусировкой дают
возможность использовать подобные микроскопы в устройствах для автома-
тического анализа изображений. Фотометрическая приставка обеспечивает
количественный цитофотометрический анализ.

Независимо от класса инвертированных микроскопов им присущи
следующие, кроме описанных выше, конструктивные особенности: наличие
объективов с большим фокусным расстоянием (от 6 до 24 мм. с численной
апертурой 0,1 - 0,6) и устройствами коррекции на толщину стекла сосуда;
фокусировка изображения путем перемещения головки с объективами, что
позволяет применять прибор с устройствами для микрохирургии, требую-
щими, как известно, неподвижного стола микроскопа; микроскопы имеют
стол большого размера (до 220x330 мм), обеспечивающий размещение и
фиксацию различных видов культуральной посуды; осветители инвертиро-
ванных микроскопов поставляются с конденсорами, фокусное расстояние
которых до 70 - 80 мм и более. Мощность и тип источников света позволя-
ют работать с использованием всех методов, реализуемых прибором.

1.3.	Обработка посуды, резиновых изделий и инструментов

При выращивании культур клеток и возбудителей болезней животных
- вирусов, бактерий, грибов, простейших в культуре клеток - используют
бутыли, колбы, флаконы, матрасы, пипетки, резиновые трубки и пробки.
Посуда для выращивания клеточных культур должна быть из нейтрального
или натриевого стекла, пробки - из очищенной резины или силиконовые. В
качестве моющих средств применяют гексаметофосфат, тринатрийфосфат,
двууглекислую соду, нетоксичные стиральные порошки, соляную и серную
кислоты, раствор двухромовокислого калия в серной кислоте /хромпик/.

Приготовление хромпика: берут 40 г двухромовокислого калия, по-
мещают в фарфоровую кружку и растворяют в небольшом количестве воды.
Затем осторожно добавляют концентрированную серную кислоту до общего
объема один литр. Раствор хромпика должен быть желтовато-коричневого
цвета. Хромпик считается отработанным тогда, когда его цвет изменится в
зеленый. Это свидетельствует о том, что хромовая кислота восстановилась.
Такие растворы непригодны к употреблению и бракуются. Хромовая смесь
обладает крайне едкими свойствами, поэтому с ней надо работать, соблюдая
большую осторожность.

Обработка стеклянной посуды. Успех культивирования клеток во
многом зависит от строгого соблюдения правил проведения подготовитель-
ных работ по мойке, стерилизации лабораторной посуды и инструментов.
Основным требованием к стеклянной посуде для выращивания клеточных
культур является хорошая ее обработка, так как методика культивирования
клеток непосредственно на стекле требует абсолютно чистой поверхности.

В каждой лаборатории используется метод наиболее удобный, эконо-
мичный и дающий наилучшие результаты. Наиболее распространенными
способами обработки посуды являются следующие:

Первый способ.

Новую посуду очищают от загрязнения ершами механическим путем,
ополаскивают водой и обрабатывают хромовой смесью /хромпиком/. Хро-
мовую смесь вносят в сосуд, ею обводят внутреннюю поверхность сосуда.
Избыток ее сливают. Контакт хромпика со стеклом продолжается 2-3 часа.
После обработки хромпиком посуду необходимо промыть водопроводной
водой /не менее 10 раз/ и ополоснуть 8-10 раз в дистиллированной воде.
При этом необходимо внимательно следить за тем, чтобы вода равномерно
стекала со стенок посуды.

Второй способ.

Новую стеклянную посуду ополаскивают теплой водопроводной во-
дой и помещают в ванну с 25% серной кислоты на ночь (на 12-13 часов),
затем тщательно промывают 10 раз теплой проточной водопроводной водой
до полного удаления кислоты. Посуду ершат в теплом растворе перечислен-
ных выше моющих средств (10-20 г на 10 л водопроводной воды) и ополас-
кивают 10 раз в теплой водопроводной воде. Затем на 20-30 минут помеща-
ют в 1-2% раствор соляной или уксусной кислот или 3-4 раза ополаскивают
в этих растворах. Вновь ополаскивают водопроводной водой, а затем в 3-4
сменах дистиллированной воды. Новые пипетки обрабатывают так же, как и
стеклянную посуду, с той лишь разницей, что при промывании пипеток
пользуются резиновыми грушами (объемом 25-50 мл).

Третий способ.

Посуду, бывшую в употреблении, замачивают на ночь в теплом растворе
3% перекиси водорода с 0,1-0,2% содержанием моющего средства или в 0,1-
0,2%-м растворе моющего средства, а затем моют, как и новую посуду, исключая
обработку серной, соляной и уксусной кислотами. Загрязненные вакцинным
вирусом посуду и пробки для обезвреживания обрабатывают кипячением в те-
чение одного часа в дистиллированной воде, содержащей 0,05% моющего сред-
ства. Затем замачивают в ночь в теплом растворе (40°С) 3%-ной перекиси водо-
рода с 0,1% - 0,2% содержанием моющего средства (10 - 20 г на 10 л воды) или в
0,1% - 0,2%-ном растворе моющего средства. На следующий день посуду ершат,
ополаскивают 10 раз водопроводной водой и в трех сменах дистиллированной
воды. При визуальном контроле мойки наблюдают равномерное стекание воды
со всей поверхности посуды и отсутствие капель воды на стенках, это является
показателем того, что посуда хорошо вымыта. Для физико-химического контро-
ля в посуду после ополаскивания наливают несколько капель десятикратного
разведения основного раствора бромкрезолового кислого пурпура (основной
раствор готовят из расчета 1 г на литр деминерализованной воды). В случае не-
правильного ополаскивания наблюдается изменение окраски рН-метрического
раствора к голубому, зеленому, фиолетовому цвету. При изменении окраски по-
суда подвергается вторичной мойке. В промышленности широко используются
моечные машины, например, РАП Электроник, Gillow и др.

1.4.	Стерилизация посуды

Вымытую посуду сушат в сухожаровых боксах или шкафах (60-80°С) 1-
2 часа, устанавливая вниз горлышками. После остывания высушенную посуду
монтируют: матрасы, флаконы, бутыли и колбы закрывают тремя слоями пер-
гаментной бумаги или одного слоя бумаги и одного слоя фольги. Каждый кол-
пачок фиксируют на горлышке сосуда шпагатом или суровой ниткой. Пробир-
ки с ватно-марлевыми пробками завертывают в бумагу по 30-50 штук, а 10 мл
флаконы закладывают в биксы в несколько рядов. Предназначенные для по-
следующего закрывания стерильной посуды резиновые пробки по 5 штук за-
вертывают в пергамент. Каждый номер пробок упаковывается отдельно. На
пакеты карандашом делают надписи с указанием номера пробок и даты стери-
лизации. В верхние концы пипеток вставляют вату, затем каждую пипетку за-
вертывают в бумагу по 10 штук и помещают в стеклянные или металлические
пеналы. На обертке надписывают емкость пипеток. Чашки Петри завертывают
в бумагу по 1 - 5 штук. Воронки, ступки и пестики, а также халаты, колпаки,
маски или спецкостюмы и полотенца завертывают в бумагу каждый предмет
отдельно. Фильтр Сальникова помещают в мешок из полотна. Фильтр Зейтца
монтируют на бутыли и накрывают бумажным мешком (Крафта), в области
горлышка бутыли его плотно перевязывают шпагатом. Бумагу и марлю наре-
зают кусочками нужных размеров, а вату сворачивают в виде шариков или
тампонов. Каждый вид материала отдельно, небольшими порциями, заверты-
вают в бумагу. Стеклянную посуду стерилизуют в суховоздушных шкафах,
посуду с резиновыми пробками и трубками, халаты, колпаки, маски, спецкос-
тюмы, полотенца, фильтры Сальникова, Зейтца, сифоны, марлю, вату, резино-
вые пробки, мембранные фильтры, фильтродержатели - в автоклавах.

Посуду в стерилизационном шкафу размещают таким образом, чтобы
воздух свободно циркулировал п< всей камере. Для этого полки шкафа запол-
няют посудой в один ряд, оставляя одну треть отверстий открытыми. На все
полки с посудой помещают контрольные ампулы с порошкообразной сахаро-
зой. Дверки шкафа плотно закрывают. Шкаф устанавливают на режим стери-
лизации и включают в электросеть, показания температуры через каждый час
записывают в специальном журнале. Стерилизацию проводят при достижении
180°С в течение трех часов. При этом пергаментная бумага не должна обугли-
ваться. Она может лишь слегка пожелтеть под влиянием высокой температу-
ры. Стерилизовать посуду при температуре выше 180°С нельзя, т. к. это при-
водит к обугливанию монтировочных материалов, в результате чего внутрен-
няя поверхность посуды покрывается токсическим для клеток налетом смоло-
образных веществ. После окончания стерилизации и остывания посуды от-
крывают дверки шкафа и проверяют контрольные ампулы с сахарозой. Саха-
роза должна быть оплавленной, черного цвета. Изменение цвета этого инди-
катора позволяет судить о достижении необходимой температуры в камере
шкафа и правильности стерилизации данной партии посуды.

Стерилизация под давлением в автоклаве надежно обезвреживает
микроорганизмы в материале только при соблюдении режима стерилизации
и соответствии показаний на манометре давления пара, температуре внутри
автоклава. Ежегодно соответствие давления и температуры проверяют в
официальных государственных учреждениях.

Ниже приводятся соотношения между показателями манометра, выра-
женными в различных единицах и температуры внутри автоклава (табл. 1).

Таблица 1

Зависимость температуры от давления пара в автоклаве

Температура насыщеного пара в камере, °C	Давление пара, в атм или кг/см-	Давление пара в гектопаска- лях, (гПа)	Давление пара в мм рт. столба	Давление пара в фунтах на кв. дюйм
100	0	1013	760	0
111,8	0,5	1470,9	1103,3	7,0
115	0,7	1621,2	1216,0	9,0
120,6	1,0	2016,0	1520,0	14,0
127,8	1,5	2522,0	1910,0	21,0
133,9	2,0	3110,0	2280,0	28,0

По показаниям манометра, регистрирующего давление в автоклаве,
можно судить о температуре насыщенного пара в камере в градусах Цель-
сия. Чем выше упругость пара, тем энергичнее он проникает в стерилизуе-
мый материал, вытесняет из него воздух и быстрее прогревает материал до
соответствующей температуры.

Фактическое достижение заданной температуры контролируют с помо-
щью порошкообразных индикаторов с известной температурой плавления: бен-
зонафтола - 110°С, антипирина - 115°С, резорцина - 118°С, серы - 119°С, бен-
зойной кислоты - 121 °C. К навеске 100 г. индикатора для его подкраски добав-
ляют 0,01 г сафранина или 0,005 г фуксина, перемешивают, расфасовывают по 1
- 2 г и запаивают в ампулы. Если автоклавирование ведут при 1 атм, то вместе с
материалом в камеру помещают ампулы с резорцином и бензойной кислотой, а
если при 0,5 атм, то с бензонафтолом и антипирином. Наличие окрашенного
сплава или порошка в ампулах позволяет судить о фактической температуре в
стерилизационной камере. Посуду, резиновые изделия и другие материалы сте-
рилизуют в автоклаве при 1,5 - 2,0 атм в течение 1,5 - 2,0 часов.

Обработка резиновых изделий. Новые, не бывшие в употреблении
резиновые трубки и пробки в течение суток выдерживают в растворе мою-
щего средства (10 - 20 г на 10 л воды). Сливают раствор и дважды промы-
вают теплой водопроводной водой. После этого резиновые изделия поме-
щают в эмалированный бак и кипятят 1 час в 0,3% растворе двууглекислой
соды, промывают многократно горячей водопроводной водой. Затем рези-
новые трубки и пробки кипятят в 0,2% растворе соляной кислоты 20 - 30
минут, промывают многократно в проточной водопроводной и дистиллиро-
ванной воде, 30 минут кипятят в дистиллированной воде, 3-4 раза промы-
вают дистиллированной водой, высушивают в сушильном шкафу при 40 -
50°С, монтируют и автоклавируют 1,5 - 2,0 часа при 2 атм.

Не рекомендуется одновременно проводить обработку черных рези-
новых пробок и резиновых трубок. Резиновые пробки и трубки, бывшие в
употреблении, промывают 0,1 - 0,2% раствором моющего средства, водо-
проводной затем, дистиллированной водой, кипятят 3 раза по 10 минут в
дистиллированной воде, заливая каждый раз свежей дистиллированной во-
дой, монтируют и автоклавируют.

Обработку и мойку металлических конструкций фильтров производят
следующим образом: фильтры после употребления демонтируют и тщатель-
но очистив, хорошо промывают проточной водопроводной водой, потом
моют мягким тампоном в теплом растворе детергента, опять проточной во-
допроводной водой, затем не менее 5 раз дистиллированной водой, сушат
при 50 - 60°С 1,5 - 2,0 часа. Сборку фильтра производят в специальной
монтажной комнате, а затем стерилизуют.

Асбестовые фильтры (EKS - 1, EKS - 2, СФ) стерилизуют при 1,5 атм
- 1,5 часа.

Метилцеллюлозные фильтрующие пластины «Миллипор», и другие
им подобные, стерилизуют при 0,9 атм (не выше 119°С) - 30 минут.

Патронные фильтры "Миллипор”, "Палл" и другие стерилизуют при 1
атм (121 °C) - 1 час.

Пластиковая посуда одноразового использования

Начиная с 1965 года для культивирования клеток применяется пла-
стиковая посуда одноразового использования. Ассортимент ее все время
увеличивается и постоянно модифицируется. Мотивы, вызвавшие использо-
вание пластиковой посуды, вероятно, могут заключаться в следующем:

1.	производство такой посуды дешевле, чем стеклянной (экономиче-
ски выгоднее, что позволяет удовлетворять возросшую потребность в связи
с развитием исследований на культивируемых ^клетках);

2.	свойства материала позволяют методом литья технологически
достаточно просто изготавливать изделия любой конфигурации;
3.	возможность выпускать стерильные изделия, сразу же готовые к
использованию;

4.	структура поверхности пластиковой посуды более пригодна для
некоторых клеточных линий.

Характеристика и свойства материала. Различные полимерные мате-
риалы могут использоваться для изготовления посуды и пленок одноразово-
го применения при культивировании клеток. Наиболее предпочтительным
является полистирол, получаемый в результате полимеризации стирола:

- СН2 - СН(С6Н5) - СН2 - СН(С6Н5) -

Полистирол прозрачен, прочен, имеет хорошую стабильность простран-
ственной структуры, ударопрочен, высокоустойчив к водным растворам.

Способы стерилизации. Как уже говорилось выше, одним из пре-
имуществ пластиковой посуды является возможность стерилизации ее в
процессе изготовления. Способы стерилизации могут быть физической и
химической природы.

Самый распространенный физический способ, применяемый в промыш-
ленности, - облучение у - лучами дозой 25 кГр (2,5 Мрад). Все пластики выдер-
живают стерилизацию УФ - светом (не менее 30 мин) с длиной волны 254 нм.
Но этот способ чаще всего применяется в лабораторных условиях, а в техноло-
гии только в профилактических целях для снижения инициального уровня кон-
таминации изделий, поступающих на сборку, а также исходных материалов.
Этот способ стерилизации с экономической точки зрения невыгоден.

Химическая стерилизация может быть выполнена с помощью газа и
жидкостей. Газовая стерилизация осуществляется с помощью окиси этилена.
Минимальная концентрация в стерилизационной камере составляет 450 мг/л в
течение 6-16 часов. Повышение концентрации до 1000 мг/л позволяет сокра-
тить время стерилизации вдвое, но при этом стерилизация будет эффективней,
если повысить температуру воздействия. Можно использовать окись этилена в
сочетании с бромистым метилом в течение 4-6 часов, но пары этих веществ
токсичны и приводят к деструкции материала. В качестве стерилизующих жид-
костей используют этиловый спирт (70 - 96%-ный раствор, 15-20 мин), рас-
твор пергидроля (10%-ный 4-6 часов), формалин (5%-ный раствор, 1 час).

1.5.	Правила работы в лаборатории культур тканей
и питательных сред и техника безопасности

Одним из главных условий работы с культурами клеток является
обеспечение стерильности на всех этапах культивирования, предотвращение
возможной контаминации вирусами, бактериями, микоплазмами, грибами.

Сотрудники, приходя на работу в лабораторию, обязаны полностью
заменить верхнюю одежду и обувь на производственную. Чистота в боксах
и предбоксниках достигается проведением ежедневной влажной уборки и
дезинфекции в боксе столов, инструментария, посуды и других предметов 1
- 3%-ными растворами хлорамина и другими дезосредствами. Один раз в
неделю проводят более тщательную влажную обработку боксов 1 - 3%-
ними растворами хлорамина (протирание стен, столов, стульев, пола и т.д.)
и выпаривание по окончании уборки концентрированного раствора фенола
(карболовой кислоты) или формалина в течение 20 - 30 минут.

Перед началом работ необходимо включить в боксе УФ-лампы на 30
минут.

Запрещается работать в боксе, когда включены бактерицидные лам-
пы, ввиду вредного действия ультрафиолетовых лучей при длительном об-
лучении, особенно на глаза. В случае пролива спирта на стол или падения
спиртовки необходимо прекратить доступ воздуха к загоревшемуся участку,
накрыв его одеялом, которое должно находиться в каждом боксе. В случае
загорания одежды на человеке, работающем в боксе, необходимо накрыть
этот участок одеялом для прекращения доступа воздуха.

При работе в боксе используют спиртовки (не рекомендуется пользо-
ваться спиртом-денатуратом) или газовые горелки.

Прежде чем открыть бутыли, флаконы, колбы и другую посуду с пита-
тельной средой, сывороткой, растворами или клеточной суспензией, резино-
вые пробки и горлышко флакона протирают тампоном, смоченном в спирте, и
прожигают; в конце работы в боксе неиспользованные флаконы и матрасы со
средами, растворами и сывороткой закрывают колпачками из стерильной бу-
маги или фольги, обвязывают шпагатом и оставляют для последующего упот-
ребления. За 30 минут до работы в боксе всю необходимую посуду, инстру-
ментарий, среды и растворы вносят в бокс, а затем включают бактерицидные
лампы. Растворы версена и трипсина должны быть предварительно подогреты
до температуры 35 - 37°С. Перед работой в боксе производят обработку рук
продолжительным и интенсивным мытьем их с мылом под струей теплой во-
ды, с последующим протиранием их в боксе тампонами, смоченными 70%-
ным этиловым спиртом. Входить и работать в боксе разрешено только в спе-
циальных халатах, косынках-чепчиках, марлевых масках и тапочках. Халаты
и шапочки стерилизуются или в боксе под бактерицидными лампами, или
автоклавированием при 1 атм - 30 минут. Маски ежедневно стирают с мылом,
кипятят, сушат, проглаживают утюгом или автоклавируют. Перед работой
поверхность стола фламбируют ватным тампоном со спиртом. Работа в боксе
проводится в обстановке асептической предосторожности с соблюдением всех
приемов, обеспечивающих стерильность при пересеве культур ткани, трипси-
низации, розливе питательных сред.

В целях противопожарной безопасности и соблюдения правил асептики
рабочий стол не должен быть заставлен лишним оборудованием и посудой.

После работы проводят механическую уборку бокса, удаляют отрабо-
танную посуду, ткани, выносят корзину с мусором, после чего проводят
влажную уборку бокса с использованием 2%-ного раствора хлорамина. При
работе с эмбрионами, почками, тестикулами и другими тканями все отходы
помещают в целлофановые мешки, которые ставят в контейнер и в таком
виде переносят в специальное помещение для последующей утилизации.

В боксе на подсобном столе следует иметь стеклянные банки емкостью 3 -
5 литров для чистых и отработанных пипеток. В каждом боксе необходимо иметь
раствор 3%-ного хлорамина. Вся кулыуральная посуда должна храниться в ме-
таллическом застекленном (хирургическом) шкафу. В шкафах для стерильной
посуды не допускается хранение не стерильной посуды и других предметов.

Отработанную бумагу и вату следует собирать в корзину для мусора, а
затем утилизировать. Необходимо соблюдать осторожность при работе с газо-
вой горелкой, спиртом, эфиром и другими огнеопасными веществами. Во время
работы своевременно убирают в контейнер использованную посуду, резиновые
и ватно-марлевые пробки, другие материалы. Загрязненную поверхность стола
протирают салфеткой или ватой, смоченной спиртом, и прожигают.

В чистое помещение должен входить только подготовленный для
работы персонал, полностью понимающий смысл применяемых правил.

Персонал не должен вносить в чистое помещение загрязняющие
предметы и материалы. В целом, в чистое помещение разрешается вносить
только используемые для работы предметы, причем только такого типа, ко-
торый не вносит в чистое помещение загрязнений.

У людей, которые собираются работать в чистом помещении, не
должно быть негативной реакции на то, что необходимо носить одежду, ко-
торая закрывает все или практически все тело, и что придется работать в
помещении, которое может не иметь естественного освещения или окон.

Персонал должен понимать, что в чистых помещениях не допускается
использование косметики, пудры, аэрозолей для волос и других аналогич-
ных материалов.

Персонал не должен использовать лак для ногтей, так как он может
отслаиваться и попасть в продукт.

Люди, не соблюдающие правил личной гигиены, мало подходят для
работы в чистых помещениях.

В биологических чистых помещениях может возникнуть необходимость
проверить, нс является ли персонал носителем микроорганизмов, которые мо-
гут развиваться в продукции и вызывать ее порчу или болезни. Пригодность
персонала к работе в чистом помещении должна рассматриваться, исходя из
чувствительности продукции к специфическим типам микроорганизмов.

Категорически запрещается входить в боксовые помещения в верхней
одежде, хранить в производственных помещениях продукты, принимать
пищу и курить. После окончания работы необходимо выключить все элек-
троприборы: водяные бани, магнитные мешалки, вентиляторы, центрифуги,
электронасосы и др. Каждый сотрудник в помещениях лаборатории должен
строго соблюдать правила противопожарной безопасности. Не реже 2 раз в
год все сотрудники должны проходить инструктаж по технике безопасно-
сти. К эксплуатации электрических установок и оборудования допускаются
лица, прошедшие необходимый инструктаж. Пользование неисправным
электрическим оборудованием категорически запрещается.

Выдача культур, клеточных суспензий и питательных сред проводит-
ся в соответствии с планом работ исследовательских, диагностических ла-
бораторий или биоцехов в установленные дни и в потребном количестве.
Глава 2. Животная клетка. Морфология, физиология,
поведение в культуре

Клетка животных элементарная живая система, состоящая из 2-х
основных частей; эукариотического ядра с оболочками и цитоплазмы с ор-
ганоидами и включениями, окруженной цитоплазматической (плазматиче-
ской) мембраной.

В световом микроскопе на окрашенных препаратах в цитоплазме
клетки можно различить митохондрии, комплекс Гольджи, включения,
имеющие различную интенсивность окраски (лизосомы, фогосомы) и ва-
куоли. Плазматическая мембрана ограничивает клетку и видна как темная
линия. Ядро в стадии интерфазы ограниченно ядерной мембраной, в нук-
леоплазме различают интенсивно окрашенный хроматин, обычно около
оболочки ядра, и ядрышко, расположенное в центре ядра или эксцентрично.
Иногда ядрышек бывает несколько (2-5 и более). (Рис.4.)

Рис.4. Культура клеток СПЭВ

Изучение ультраструктуры клетки в электронном микроскопе на
сверхтонких срезах, фиксированных с использованием контрастирующих
веществ (осмий, цитрат свинца, уранил-ацетат и др.) позволило уточнить
строение эукариотической клетки. (Рис.5).

На приведенном рисунке и схеме видно, что клетка - это сложно уст-
роенная единица живого. Плазматическая мембрана представлена в виде
трехслойной структуры: наружный и внутренний слои которой интенсивно
окрашены, а промежуточный слой - более светлый.
Рис.5 Ультраструктура животной клетки (гепатоцит):

1	.Липофусциновые гранулы

2	. Микротел а (пероксисомы)

3.Внеклеточное пространство

4.Митохондрии

5	.Центриоли

б	.Комплекс Гольджи

7	. Глад кий эндоплазматический ретик

8	. Шероховатый эндоплазматический
ретикулум

9	.Синусоиды

10	.Ретикулоэндотелиальная клетка

11	.Цитоплазматические микротубулы

12	.Гликогеновые гранулы

13	. Внутриклеточный соединитель
ный комплекс

14	.Желчные каналы

15	.Микровилли

16	. Филаменты

17	.Плазматическая мембрана

18	.Рибосомы

19	. Лизосомы;,

20	.Ядро

21.Внутренняя Ядерная мембрана

22	.Ядрышко

23	.Хроматин

24	. Наружная ядерная мембрана

Биохимический и рентгенографический анализ показал, что плазма-
тическая мембрана представляет собой белково-липидную структуру, на-
ружный и внутренний слой которой представлен белками, а промежуточный
2-мя слоями липидов, в основном фосфолипидов, (Рис.6.1, 6.2., 6.3.). Тол-
щина плазматической мембраны 6-10 нм.
Рис.6.1. Строение плазматиче-
ской мембраны (по теории Дав-
сона-Даниэлян).

Два слоя фосфолипидных молекул,
обращенных гидрофобными полюса-
ми друг к другу и покрытых двумя
слоями молекул гло булярного белка

Illllll
mini

Рис.6.3. Строение плаз-
матической мембраны
(по Ленар-Зингеру)
А- непрерывная мембрана
Б-участок мембраны с порой

Рис.6.2. Строение эле-
ментарной мембраны (по

Робертсону)

Два слоя фосфолипидных
молекул, контактирующих
гидрофильными концами со
слоями белковых молекул

Внешний слой мембраны покрыт тонким слоем - гликокаликсом, состоя-
щим из полисахаридов, мукополисахаридов, гликопротеидов (Рис.6,4; 6.5). Эти
вещества выполняют защитную роль, а также участвуют в формировании меж-
клеточных контактов, ’’узнавании” клеток, являются антигенами мембран.

Установлено, что белковые молекулы моту! пронизывать билипидный
слой, что имеет значение для проницаемости мембран (Рис.6.6). Под действием
различных веществ строение мембраны может притерпевать изменения. Плазма-
тическая мембрана выполняет важную роль в физиологии клетки, обеспечивая
обмен с окружающей средой, с ионами и молекулами химических веществ, воды,
аминокислот. Эти процессы происходят либо за счет осмоса (диффузии), либо
пассивного транспорта молекул - по электрохимическому градиенту, либо актив-
ного переноса с затратой энергии (рис. 7.1, 7.2, 73, 7.4). Важную роль в этом вы-
полняют белки-переносчики, которые специфически связывают и транспортиру-
ют растворенные молекулы через липидный бислой.

Рис.6.4. Электронная микрофотография поверхности лимфоцита, ок-
рашенного рутениевым красным с целью получить контрастное изображе-
ние клеточной оболочки (гликокаликса).
Рис.6.5. Схематическое изображение клеточной оболочки (гликокалик-
са), состоящей из боковых полисахаридных цепей, гликолипидов, интеграль-
ных, мембранных гликопротеинов и полисахаридных цепей протеогликанов.

Рис.6.6. Схематическое трехмерное изображение небольшого участка
клеточной мембраны.
Межклеточное
пространство

Рис. 7.1.Схема взаимодействия между гормонами, клеточной поверх-
ностью и АМФ.

1ируемвя молекул

Внеклеточное
пространство

Липидный
бислой

Цитоплазма

Простая Диффузия

I

I

Диффузии,

диффузия через канал

I

опосредуемая
бел ком-переносчиком

।

Пассивный транспорт
(облегченная диффузия)

Активный транспорт

Рис. 7.2. Схематическое изображение пассивного транспорта моле-
кул по электрохимическому градиенту и активного транспорта против. Про-
стая диффузия и пассивный транспорт, осуществляемый транспортными белками (облег-
ченная диффузия) протекают самопроизвольно. Для активного транспорта необходимо
использовать метаболическую энергию. Только неполярные и маленькие незаряженные
полярные молекулы могут проходить через липидный биослой пгтем простой диффузии.
Перенос других полярных молекул осуществляется со значительными скоростями белка-
ми-переносчиками или каналообразующими белками.
Рис.7.3. Кинетика простой диффу-
зии при участии белка-переносчика.
В первом случае скорость всегда пропорцио-
нальна концентрации транспортируемого ве-
щества, а во втором скорость достигает макси-
мального значения Vmax при насыщении бел-
ков-переносчиков. Концентрация, при которой
скорость составляет половину максимального
значения, принимается равной константе свя-
зывания Км молекул транспортируемого веще-
ства данным переносчиком (аналогично Км для
системы фермент-субстрат).

з@

Рис.7.4. (Na+ + К+) - АТФаза активно качает Na+ наружу, а К+ внутрь
клетки против их электрохимических градиентов. При гидролизе внутри клетки
каждой молекулы АТФ три иона Na+ выкачиваются из клетки и два иона К+ накачи-
ваются в клетку. Специфический ингибитор насоса уабаин и ионы К+ конкурируют
за общий участок на внеклеточной стороне АТФазы.

-----100 мм- — >

Кзмллгкс ядарнои лоры

Рис.7.5. Схема, показывающая расположение ядерных поровых комплек-
сов в ядерной оболочке. Вид сверху и поперечное сечение по центру поры.
Считается, что гликопротеидный покров плазматической мембраны
обеспечивает отрицательный заряд на поверхности клетки. Основными
структурами, которые выявляются в цитоплазме ’’нормальной” клетки явля-
ются: гладкий и шероховатый эндоплазматический ретикулум (сеть), ком-
плекс Гольджи, рибосомы, митохондрии, полирибосомы, центросома (кле-
точный центр) с двумя центриолями, включения, вакуоли, а также микро-
фибриллы и микротрубочки.

Ядро окружено наружной и внутренней ядерными мембранами, ко-
торые по строению сходны с плазматической мембраной. Перенуклеарное
пространство, расположенное между ядерными мембранами соединяется с
эндоплазматической сетью. Кроме того, в мембране ядра имеются много-
численные ядерные поры, через которые осуществляется ’’связь” с цито-
плазмой клетки (Рис.7.5). В структуре ядра различают ядерный матрикс (ка-
риоплазму, нуклеоплазму), в которой содержится хроматин - ДНК клетки в
виде дезоксирибонуклеопротеида и ядрышко, содержащее РНК и РНП.

Плазматическая мембрана помимо анатомической функции и функции
обмена веществ клетки с окружающей средой выполняет функции адгезии
(прикрепления), участвует в движении клетки, клеточных взаимодействиях и
клеточных контактах, выполняет защитные функции. Клетка с помощью цито-
плазматической мембраны помимо осмоса и активного переноса ионов способ-
на к поглощению веществ путем пиноцитоза, фагоцитоза (Рис.8).

1 и 2 - крупные и мелкие частицы
в среде, окружающей клетку; 3 и 4
- захват частиц путем пиноцитоза;
5 и 6 - возникновение лизосом и
их микроферментативного содер-
жимого; 7 - изливание ферментов
лизосом в микропиноцитозные
вакуоли; 8 и 9 - расщепление со-
держимого вакуолей; 10 - выделе-
ние из продуктов расщепления; 11
- некротизировавший участок
цитоплазмы, подвергшийся такому
же расщеплению.

Рис.8. Связь циноцитоза с лизосомами (по Де Дюву)

Поглощенные вещества в цитоплазме окружены мембраной. Эти
структуры называют фагосомами. Другие внутриклеточные структуры, ок-
руженные мембраной лизосомы содержат протеолитические ферменты
гидролазы и другие и участвуют в процессах переваривания питательных
веществ, внутриклеточных структур и в процессах старенкя и деления. Со-
единяясь с фагосомами, лизосомы формируют фаголизосомы, в которых и
осуществляются процессы ’’переваривания”.

Цитоплазма (гиалоплазма) представляет собой коллоидную систему,
образованную водой, белками, нуклеиновыми кислотами, липидами, угле-
водами, неорганическими соединениями и др. веществами. В цитоплазме
происходит синтез белков, углеводов, липидов, витаминов, ферментов, осу-
ществляются процессы дыхания и обмена веществ, поддерживается клеточ-
ный гомеостаз.

Клетки, помещенные в питательную среду, способны передвигаться
по субстрату. Движение осуществляется с помощью выступов цитоплазмы:
псевдоподий, филоподий, ламеллоподий и других структур, формируемых
мембраной клетки (Рис. 9).

Клетки в тканях или в культуре in vitro соединяются друг с другом по-
средством щелевых контактов, плотных контактов или десмосом (Рис. 10, 11).

Рис. 10. Объединение клеток типа
гистиоцитов путем переплетения их
пластинчатых псевдоподий.

Рис.9. Основные виды выростов
А-почковидные выросты;

Б-микрошипы; В-пластинчатые
выросты; Г-псевдоподии.

Рис. 11. Межклеточные связи.

А - контакт со щелью при наличии межклеточного пространства; Б - тесный контакт;
В - десмосома.
Для клеток, растущих в культуре свойственно такое явление, как кон-
тактное торможение, которое наблюдается, когда свободно лежащие клетки
вступают в контакт, приближаясь друг к другу. Когда сформирован сплош-
ной монослой клеток, то контактное торможение приводит к приостановке
деления клеток. Такое состояние называют зависимым от плотности насы-
щения (Феннер). В формирующихся островках клеток фибробластоподоб-
ные клетки делятся по пер ферии пласта и мигрируют по субстрату, а эпи-
телиоподобные клетки делятся внутри пласта и увеличение его площади
происходит как бы за счет раздвигания клеток изнутри, а лежащие по краям
клетки участвуют в этом процессе с помощью псевдоподий.

Одной из важнейших функций клетки является способность к де-
лению - митозу. Клеточный цикл (митотический) подразделяется на интер-
фазу (период от окончания деления клетки до начала нового деления) и фазу
собственно деления - митоз. Интерфаза включает в себя периоды: предсин-
тетический (G1 - период), синтетический (S - период) и постсинтетический
(G2 - период) и период митоза (Рис. 12.1, 12.2).

Рис. 12.1.Схема митотического цикла клетки

G1 - предсинтетический период; S - синтетический	Рис. 12.2.Клеточный цикл.

период; G2 - постсинтетический период или преми-	Схема.

тотический; М - период митоза (состоит из профа-
зы, метазы, анафазы и телофазы).

В интерфазе, морфологически в ядре не отмечается видимых су-
щественных изменений. Однако интерфаза - это период активного функциони-
рования ядра и клетки в целом — период подготовки к делению - к фазе митоза
или митотическому циклу, как части клеточного цикла. В G1 периоде происхо-
дит реконструкция структуры клетки после завершения митоза и накопления
веществ, необходимых для синтеза ДНК, S - период, характеризуется удвоени-
ем ДНК - основного вещества наследственности и формирования двойного на-
бора хромосом, G2 - период - это период накопления в клетке энергетического
материала и белка, необходимого для построения митотического веретена и
процессов митоза. Клеточный цикл занимает 16-24 часа, иногда более, интерфа-
за 15-23 часа, фаза митоза 30-60 минут. В митотическом цикле - митозе - разли-
чают 4 основные стадии: профаза, метафаза, анафаза,телофаза. (Рис. 13).
Рис. 13.Схема последовательных стадий митоза.

1 - период между двумя делениями - интерфаза: хромосомы имеют вид длинных тонких
нитей; каждая из двух родительских центриолей находится в паре с маленькой дочерней
центриолью; 2 в какой-то момент между двумя делениями хромосомы удваиваются,
центриоли начинают расходиться и начинается образование веретена; 3-4-профаза: хро-
мосомы свертываются в спираль и сильно уплотняются; ядерная оболочка и ядрышко
распадаются, а центриоли расходятся и образуют полюсы, к которым будут перемещаться
xpoMiu ома, в это время образуются связи между центромерами и полюсами; 5-метафаэа:
хромосомы располагаются по экватору; 6-анафаза, после расщепления сестринские хро-
мосомы направляются к полюсам; 7-5—телофаза: хромосомы раскручиваются, образуют-
ся ядерные оболочки и ядрышки дочерних клеток. Каждая центриоль дает новую центри-
оль. После окончания деления обе клетки вступают в интерфазу (1).
В профазе митоза разрушается ядрышко, происходит частичное разруше-
ние оболочки ядра, формируются нити веретена деления и происходит редупле-
цирование хромосом. В метафазе происходит оформление нитей веретена деле-
ния и хромосомы перемещаются в центр клетки - располагаясь в виде экватори-
альной пластинки. Анафаза характеризуется расхождением дочерних хроматид к
противоположным полюсам клетки и началом формирования оболочки ядер. В
телофазе, когда новые ядра окружены оболочкой, происходит цитотомия - разде-
ление клетки на две дочерние. В период митоза клетка в культуре округляется и
отслаивается от субстрата, сохраняя связь с ним с помощью филаментов. Подоб-
ные явления способствуют миграции клеток после окончания деления.

В культуре клеток in vitro клетки в зависимости от их свойств (нормальные
или трансформированные) ведут себя по-разному. Нормальные, в том числе дип-
лоидные клетки растут по поверхности субстрата (стекла, пластика) в один слой и
такие культуры называют монослойными (однослойными).

Трансформированным (особенно онкогенным) клеткам свойственна бес-
порядочность роста и формирования многослойных напластований (Рис. 14).

। и

Рис. 14. Схематическое изображение монослойных (I) и трансформированных (И) клеток.

Многослойность иногда наблюдается и у постоянных линий клеток,
полученных из немалигнизированных тканей, например в культуре клеток
почки плода свиньи (СПЭВ) или щитовидной железы свиньи (ЩС), когда
культуры, как бы формируют гистотипические (фоликулярные) структуры,
и ряде других постоянных линий клеток.

Литература

1.	Алов И.А., Брауде А.И., Аспиз М.Е.- "Основы функциональной морфологии клетки",
Медицина, Москав,1966.

2.	Биологические мембраны. Методы. (Дж.Финдлей, У.Эванс, ред.) Перевод с анг., М.
"Мир", 1990, 424с., ил.

3.	Васильев Ю.М., Гельдфанд И.М.- "Взаимодействие нормальных и неопластических
клеток со средой", "Наука", М.,1981,222с.,ил.

4.	ДеРобергис Э., Новинский В., Саэс Ф.- "Биология клетки" (пер.с англ.).М.,"Мир", 1973,488с. дш.

5.	Жданов В.М. (ред). "Атлас вирусной ципопатологии", Медицина.,М.,1975, 260с.,ил.

6.	"Молекулярная биология клетки".-Б.Альбертс, Б.Брей, Д.Ж.Льюис, М.Рефф,
К.Робертс, Дж.Уотсон.-М., "Мир", 1994, т.1-3.	,

7.	Поликар А. Молекулярная цитология животной клетки и её микроокружение, (пер. с
французского). "Наука", Новосибирск, 1975,184с., ил.

8.	Ровенский Ю.А.- "Растровая электронная микроскопия нормальных и опухолевых
клеток".-М.,"медицина", 1979,152 с., ил.

9.	Герци М.- "Генетика и животная клетка (Пер. с англ), М., "Мир", 1977,292с,илл.

10.	Хромосома эукариотической клетки. (К.Босток, Э.Самнер), Пер. с англ. М.,"Мир", 1981,598с.,ил.
Глава 3. Некоторые особенности метаболизма клеток в
культуре

Изолированные от внутренней среды организма клетки животных со-
храняют основные требования к создаваемой искусственной среде.

Фундаментальные исследования по определению метаболических по-
требностей клеток в культуре были проведены Морганом, Мортоном и Пар-
кером (1950).

Специальными исследованиями Игл и сотр. установили, что для роста
и развития клеток позвоночных вне организма необходимы 13 аминокислот.
Живому организму необходимы 8 незаменимых аминокислот (изолейцин,
лейцин, лизин, метионин, фенилалан, треонин, триптофан, валин), изолиро-
ванной клетке кроме этих аминокислот требуются еще пять: аргинин, глю-
тамин, гистидин, тирозин, цистин.

Рассматривая аминокислоты, входящие в состав питательных сред,
следует отметить ряд функций, которые они способны выполнять в про-
цессе культивирования: включаться в синтез белка, превращаться в другие
аминокислоты, если этих аминокислот нет или они присутствуют в недоста-
точном количестве, служить источником энергии, если количество глюкозы
падает ниже критического уровня, служить исходным материалом для по-
строения других структур, отличных от белков, например, нуклеиновых ки-
слот, и подвергаться целому ряду других превращений (С.Waymouth, 1956).

Выполнение аминокислотой той или иной функции во многом зави-
сит от условий культивирования. Одной из причин необходимости присут-
ствия в среде пяти аминокислот, не требующихся для целого организма,
является ограниченный их синтез в культуре. Исследованиями Игла и сотр.
установлено, что скорость синтеза в культуре во многом зависит от плотно-
сти популяции клеток.

Критическая плотность популяции клеток, при которой исчезают ме-
таболические потребности, не одинакова для разных аминокислот. Некото-
рые клетки (при условии высокой плотности засева - более 2x1V5 кл/мл) в
состоянии синтезировать цистин из метионина и глюкозы (Н.Eagle, K.Plez,
1962).

Потребность в глицине в клетках первичных культур почек обезьян
отсутствовала при высокой плотности засева и появлялась при ее снижении.
Это объясняется частичным блокированием синтеза глицина из серина в
результате низкой скорости синтеза метаболически активной восстановлен-
ной формы фолиевой кислоты, катализирующей процесс превращения сери-
на в глицин, с добавлением в среду фолиевой кислоты потребность в глици-
не компенсировалась (H.Eagle, 1958; Н.Eagle, K.Plez, 1962).

Некоторые перевиваемые линии клеток (фибробласты сердца курино-
го эмбриона, клон клеток Hela) нуждается в тирозине при низкой концен-
трации этой аминокислоты в среде. При высокой концентрации этой амино-
кислоты в среде клетки способны синтезировать её из фенилаланина. Для
большинства клеток тирозин незаменим при их росте и размножении, ника-
кие другие соединения, близкие по структуре к тирозину, не способны заме-
нить его. Клетки погибают при исключении этой аминокислоты из состава
питательной среды (J.Morgan, J.Morton, 1960).

Глютамин выполняет также многочисленные функции в клеточном
обмене. Углеродный скелет глютамина служит предшественником глюта-
миновой, аспарагиновой кислот, аспарагина, пролина и, в меньшей степени,,
серина и аланина.

Н.Eagle, K.Plez, (1962) показали, что многие клетки млекопитающих
способны синтезировать глютамин из глютаминовой кислоты в количествах
достаточных для роста и развития при высокой концентрации клеток в куль-
туре и при достаточном количестве в них глютаминсинтетазы.

В присутствии достаточного количества глютамина, способного за-
менять глюкозу в качестве энергетического источника, снижение концен-
трации последней даже в 10 раз, не влияет на темп пролиферации клеток
(M.Dounelly, J.Scheffler 1976).

Глютамин может включаться непосредственно в клеточный белок,
участвует в биосинтезе нуклеиновых кислот. Приблизительно 40% пирими-
динового углерода образуется из глютамина (предположительно через аспа-
рагиновую кислоту), а также половина азота пуриновых и пиримидиновых
оснований образуется из аминного азота глютамина. При замене 90% глю-
тамина на глютаминовую кислоту возрастает потребление других незаме-
нимых аминокислот (Н.Eagle, 1965).

Глютамин может служить доступным источником энергии для мно-
гих синтетических процессов, происходящих в изолированной клетке. Су-
ществуют различные варианты использования L-глютамина. Эпителиальные
клетки пупочной вены человека растут в среде, дефицитной по глютамину
(M.A.Gimbrone е.а., 1974). Чаще всего в культуральную среду добавляют не
более 2 мМ L-глютамина, увеличение количества ведет к ухудшению каче-
ства среды в процессе хранения (С.Busch е.а., 1982). Концентрация глюта-
мина в питательных средах колеблется от 0,68 до 10 мМ (W.Hall е.а., 1980).

Клетки ВНК-21 в среде Игла с диализованной сывороткой останавли-
ваются в росте из-за отсутствия серина (R.Allen, М.Moskowitz, 1978), хотя с
другой стороны, его отсутствие мало сказывается на синтезе в них ДНК при
применении бессывороточной питательной среды (W.Melwin е.а., 1979).

Богатая по числу компонентов среда 199 оказывается недостаточной
для роста культур по концентрационным показателям. Для многих первич-
ных культур эта среда дефицитна по предшественникам тимидина (фолие-
вая кислота) и его добавление стимулирует пролиферацию (J.Faylor-
Papadimitriou, 1979).

Особо важную роль для жизнедеятельности клеток играют основные
аминокислоты - лизин, гистидин, аргинин (С.Waymouth, 1972).

Незаменимость отдельных компонентов для развития клеточных
культур нельзя рассматривать как абсолютный факт, так как потребность в
определенных веществах может возникнуть в связи с отсутствием каких-
либо интермедиантов или из-за низкой плотности популяции. Так, дефицит
в среде фолиевой кислоты делает незаменимыми глицин, отсутствие пиро-
доксаля, имеющего большое значение в биосинтезе заменимых аминокислот
(аланина, серина, глицина, пролина) вызывает необходимость внесения в
питательную среду для поддержания роста клеток этих, считающихся заме-
нимыми, аминокислот. Такие незаменимые факторы как цист(е)ин, глюта-
мин, инозитол при высокой концентрации клеток становятся заменимыми и
могут синтезироваться клетками (Н.Eagle, K.Plez 1962).

В процессе культивирования клеток происходит не только утилиза-
ция питательных веществ, что приводит к истощению среды, но и выход в
питательную среду продуктов обмена. В результате этого происходит до-
полнение состава среды продуктами метаболизма клеток, в частности неко-
торыми аминокислотами (R.Holley, 1975).

Клетки, утилизируя аминокислоты среды, создают свой внутрикле-
точный фонд свободных аминокислот; в культурах клеток содержание сво-
бодных аминокислот находится в динамическом равновесии с окружающей
средой, которое устанавливается через 10-15 мин. после помещения клеток в
среду. При этом 70% аминокислот от их максимального значения проника-
ют в клетку и снова выделяются в среду. При оптимальной концентрации
(0,1 мМ) аминокислот в среде они концентрируются клетками в 5 - 10 раз
выше, чем в окружающей среде. С.С.Рыбаков (1970) установил 3-10-кратное
увеличение концентрации свободных аминокислот в клетках ВНК-21/13 по
сравнению со средой культивирования. Н.В.Бабиковой (1970) при изучении
аминокислотного обмена клеток НЕР-2, выращенных в среде 199 и модифи-
цированной среде, не содержащей заменимых аминокислот, установлено,
что концентрация заменимых аминокислот в клетках, выросших на полно-
ценной среде, в 10 -20 раз выше, чем в окружающей среде. Клетки, вырос-
шие на модифицированной среде, приобрели способность еще сильнее кон-
центрировать аминокислоты, особенно заменимые, их количество в 2-5 раз
превышало количество заменимых аминокислот в клетках, выросших на
полноценной среде. Н.Eagle е.а., (1961) отмечают, что глютамин слабо кон-
центрировался клетками, в то время как заменимые аминокислоты, синтези-
рованные клетками из глюкозы и глютамина, очень интенсивно накаплива-
лись клетками. Их содержание в клетках в 20 - 50 раз превышало содержа-
ние в среде. Степень концентрации в значительной мере зависела от типа
аминокислоты, концентрации ее в среде и характера роста клеток. J.Griffiths
(1970) отмечал, наиболее интенсивное потребление из среды клетками мле-
копитающих таких аминокислот как глютамин, лейцин, изолейцин,
цист(е)ин, аргинин. R.Kuchler (1964) изучал состав аминокислотного фонда
в фибробластах мыши штамма 1, выращенных на среде 199. Отмечено, что
незаменимые аминокислоты лейцин, изолейцин, метионин, фениладанин
активно участвуют в процессе метаболизма, приблизительно 80% этих ами-
нокислот концентрировались клетками.

H.Eagle е.а.,(1961) установили, что синтез белка и размножение кле-
ток в культуре может происходить в том случае, если концентрация незаме-
нимых аминокислот в клетках не ниже 0,01 - 0,04 мМ. Если концентрация
этих аминокислот падает ниже указанного уровня, то несмотря на наличие
резервов в питательной среде, образование белков и рост клеток прекраща-
ется. Общая концентрация всех свободных аминокислот должна достигать
0,1 -0,2 мМ. Более высокое их содержание не ускоряет синтез белка.

Пока неизвестно, каким образом внутриклеточный запас аминокислот
влияет на белковый синтез и рост клеток. Содержание белка в клетках зави-
сит от их типа, плотности популяции и состава питательной среды.

Для нормального роста in vitro важным компонентом питательной
среды являются витамины. Большинство из них принадлежит группе В: ни-
котинамид, тиамин, патентонат, пиридоксаль, рибофлавин, фолиевая кисло-
та, никотиновая кислота, холин, инозитол, биотин (E.Rozengurt, 1979). Все
эти витамины являются активными группами ферментов, участвующих в
обменных процессах клетки. Исключение витаминов из состава питательной
среды отрицательно влияет на пролиферацию клеток. Зависимость синтеза
ДНК и деления клеток от содержания в питательной среде биотина и вита-
мина В12 выявил в своих исследованиях О Farrel (1979).

Недостаток витаминов в ереде можно компенсировать введением сы-
воротки крови или эмбриональных экстрактов (К.С.Хаертынов.1986).

Клетки растут значительно лучше, если витамины присутствуют в
виде коэнзимов: АДФ, АТФ, коэнзима А и др. (M.Akerib, 1971).

Для поддержания специальных функций клеток в состав питательных
сред включают жирорастворимые витамины А, Д, Е, К (С.Waymouth, 1972).

В качестве источника энергии в питательных средах чаще всего ис-
пользуют Д-глюкозу. Клетки используют углеводы для синтеза некоторых
заменимых аминокислот: аланина, серина, аспарагиновой и глютаминовой
кислот, а также для синтеза жирных и нуклеиновых кислот. Мортон и Мор-
ган, кроме глюкозы, в список активных сахаров включают еще и галактозу,
маннозу, фруктозу, бетта-глюкозу, глюкозо-1-фосфат, глюкозо-6-фосфат.

Ввиду того, что глюкоза является предшественником молочной ки-
слоты, которая закисляет питательную среду, для ее замены использовали
галактозу (R.Jcobs, 1966). Д-глюкозу могут заменить дисахара мальтоза,
фруктоза, но не сахароза, пентозы или другие интермедианты цитратного
цикла (С.Waymouth, 1972). На рост клеток in vitro оказывали положительное
влияние также сложные сахара - крахмал и гликоген.

Исключение глюкозы из культуральной среды ведет к прогрессивным
изменениям эпителиальных клеток крысиного сердца (D.Acosta, 1979). Кро-
ме того, концентрация глюкозы оказывает большое влияние на содержание
витамина С, гликопротеиновый и инсулиновый метаболизм эпителиальных
клеток сердца эмбрионов коровы. 2 г/л глюкозы в культуральной среде, вы-
зывает 5-кратное снижение усвоения аскорбиновой кислоты эпителиальны-
ми клетками (A.J.Verlanieri, J.Sestito, 1981).

Повышение концентрации глюкозы, так же как её дефицит, вызывает(
увеличение ее потребления растущими клетками и образование молочной и
пировиноградной кислот, токсичных для клеток, при этом наблюдается зер-
нистость клеток и меньший прирост их числа (3.Сорокина, 1972).

Проникновение гексоз в клетку, по данным Игла зависит от их спо-
собности вступать в гексокиназную реакцию, которая оказалась наибольшей
у глюкозы и наименьшей у галактозы. В.А.Агол (1960) считает, что клетки с
различной интенсивностью утилизируют гексозы, в зависимости от их про-
ницаемости через клеточную мембрану.

Значение гормонов для клеточных культур еще мало изучено. Хотя
клетки хорошо растут в их отсутствии, есть данные о том, что гормоны ока-
зывают выраженное действие на клеточную пролиферацию. Предполагают,
что для поддержания роста необходимы гормоны, связанные с белками сы-
воротки (W.H.Zapf et al., 1981; G.H.Satc, 1982).

Скорость пролиферации и максимальное накопление клеток доста-
точно сильно зависит от сравнительно небольших изменений pH среды. Хо-
тя стандартные среды и стандартные условия культивирования рассчитаны
на одинаковые значения pH, есть сообщения о том, что для различных ли-
ний клеток оптимумы pH отличаются (Н.Eagle, 1973).

Обычное атмосферное давление кислорода, как и наличие глюкозы,
скорее избыточно, чем оптимально для роста клеток. При повышении дав-
ления кислорода пролиферация фибробластов человека тормозится, а при
снижении его почти полностью (до 16%) практически не изменяется
(A.Balin et al., 1978).

М.Donnelly et al., (1976) показали возможность получения мутантных
линий клеток млекопитающих, обеспечивающих свои энергетические по-
требности в отсутствие кислорода.

В заключение следует отметить, что несмотря на общие закономерно-
сти, установленные в развитии и размножении клеток вне организма, каждая
отдельная клеточная культура проявляет свои специфические особенности
метаболизма.
Глава 4. Питательные среды и растворы
для культивирования клеток

Одной из важных предпосылок успешного применения метода куль-
тур клеток в различных сферах биологии является разработка питательных
сред, пригодных для длительного культивирования клеток животных тканей
вне организма.

Питательные среды в подавляющем большинстве включают: воду,
неорганические соли, низкомолекулярные синтетические вещества, сыворо-
точные или серозные компоненты.

Степень и стабильность очистки воды при приготовлении пита-
тельных сред для культивирования клеток представляют важнейший фактор,
определяющий их качество.

В настоящее время разработаны компактные, эффективные и вы-
сокопроизводительные установки для очистки воды, примером которых мо-
гут быть системы: Milli-Q, Super-Q, фирмы Millipore и других фирм. Очист-
ка воды на них проходит 4 стадии: очистка от механических загрязнений на
префильтре из пористого стекла и асбеста на акриловой смоле; очистка от
органических загрязнений на активированном угле; деионизация на ком-
плексе синтетических ионообменных смол, содержащих катионы и анионы;
стерилизация на фильтре “Миллипор" с размером пор 0,22 мкм или 0,45
мкм. При вводе предварительно однократно дистиллированной воды уста-
новка позволяет получать на выходе 5-15 л/мин стерильной, свободной от
органических загрязнений апирогенной воды с удельным сопротивлением
до 18 МОм.

Существуют различные системы (приборы) для определения электро-
проводности (кондуктометры) и удельного сопротивления воды (Ом-метры,
МОм-метры). Кондуктометром является электропроводность, выражаемая в
единицах: Сименс (S), микросименс (mS), ОМ-метром или мегометром оп-
ределяется удельное сопротивление воды в омах (ОМ), килоомах (КОм),
мегаомах (МОм) (табл.2).

Для правильного расчета и определения пригодности воды для изго-
товления питательных сред приводим таблицу, позволяющую сопоставить
величины измерений.

Таблица 2

Перерасчет единиц: проводимость-сопротивление

ps	Ом	КОм	МОм
2000	500	0,5	0,0005
1000	1000	1	0,001
500	2000	2	0,002
200	5000	5	0,005
100	10 000	10	0,1
50	20 000	20	0,02
25	40 000		40		0,04
20	50 000	50	0,05
10	100 000	100	0,1
5	200 000	200	0,2
3,33	300 000	300	0,3
2,5	400 000	400	0,4
2,0	500 000	500	0,5
1,66	600 000	600	0,6
1,426	700 000	700	0,7
1,25	800 000	800	0,8
1,11 1	900 000	900	0,9
1,0	1 000 000	1 000	1
0,5	2 000 000	2 000	2
0.33	3 000 000	3 000	3
0,25	4 000 000	4 000	. _4
0,2	5 000 000	5 000	5
0,166	6 000 000	6 000	6
0,142	7 000 000	7000	7
0,125	8 000 000	8 000	8
0,11	9 000 000	9 000	9
0,1	10 000 000	10 000	10
0,05	20 000 000	20 000	20
0,038	26 000 000	26 000	26

Обозначения:

p,s - микросименс, Ом - Ом, КОм - килоом, МОм - Мегаом

Для приготовления растворов и питательных сред желательно полу-
чить воду с удельным сопротивлением 12-18 МОм.

Неорганические соли создают необходимое осмотическое давление,
ионный баланс, определенный pH и буферную емкость сре^ы. Осмоти-
ческое давление обеспечивается, в основном, хлоридом натрия.

Соли, входящие в состав питательных сред и растворов, должны быть
химически чистыми, допускается применение однозамещенного фосфорно-
кислого натрия квалификации ч.д.а. К отдельным соединениям солей, со-
держащим кристаллизационную воду, требуется особый подход, например,
MgSC^xTbbO является сильно выветриваемым веществом и может терять
значительное количество воды в этом соединении и если не сделать пере-
расчет на истинное содержание кристаллизационной воды в этом соедине-
нии, то может возникнуть магнезиальная токсичность в среде. Хлориды
кальция и магния, напротив, очень гигроскопичны и поглощают влагу из
воздуха, в результате чего может возникнуть дефицит этих катионов в среде
из - за уменьшения их содержания в навесках. Во избежание этого готовят
концентрированные растворы хлоридов, оттитровывают их и добавляют в
среду рассчитанное количество, соответствующее указанному в прописи.

В качестве буферной системы чаще всего употребляют фосфатно
бикарбонатные буферы, однако они требуют насыщения среды угле-
кислотой и последующим культивировании в герметически закрытых сосу-
дах или инкубации культур в термостатах с атмосферой, содержащей регу-
лируемые количества СО2, близкие к 5%.

Этих трудностей можно избежать, если использовать нелетучие бу-
феры на основе фосфатов или, что более перспективно, замещенных суль-
фоновых кислот: - 4 - (2 - оксиэтил) - 1 - пиперазинэтан - сульфоновой (HE-
PES) и N — трис (оксиметил) метил - 2 - аминометан-сульфоновый (TES).

Следует учитывать, что HEPES не предотвращает изменений pH сре-
ды, но делает эти изменения более медленными, значительно повышает ус-
тойчивость буферной системы, особенно в условиях контакта с открытой
атмосферой. Присутствие в среде бикарбоната натрия существенно влияет
на pH, но учитывая то, что бикарбонат и СО2 являются необходимыми ком-
понентами, играющими важную роль в метаболизме большинства клеток, в
присутствии HEPES бикарбонат не удаляют полностью, но в зависимости от
состава среды, в различной степени снижают его содержание.

Согласно имеющейся информации примерно 42% питательных сред
содержат 16мМ HEPES буфера, 9% сред - 20мМ и 25% - 25мМ (Р.Д.Bowman
е.а. ,1981; P.J.Del Veccio е.а., 1982; D.G.S.Thilo-komer е.а., 1980). Предпола-
гают, что HEPES инертен для клеточных культур (H.Eagle, 1971), однако
имеются сведения об определенном его влиянии на функционирование кле-
ток. Так, минимальное количество, оказывающее токсическое действие, а
именно: изменение клеточных мембран (E.L.Medzon, A.Gedies, 1971;
J.E.Morris,1971), изменение гликопротеинового синтеза (P.M.Davison
е.а., 1980; J.M.Megaw, L.D.Mohnson, 1979), составляет 30 - 40 мМ.

Заслуживают внимания сведения о том, что трициновый буфер может
предотвращать развитие в клеточных культурах микоплазм (R.S.Spendlave
е.а., 1971).

Концентрация бикарбоната, используемого в качестве буфера, в пита-
тельных средах может колебаться от 0,35 до 2,2 г/л (G.Z.Fry е.а., 1980;
J.C.Goldsmith е.а., 1981).

Группа компонентов низкого молекулярного веса, растворимых в во-
де, число которых в некоторых прописях сред достигает 60, содержит энер-
гетический источник, как правило, глюкозу, необходимые аминокислоты,
витамины, гормоны. В более сложные среды включают необходимые ами-
нокислоты, расширяют круг витаминов, вводят коэнзимы, промежуточные
метаболиты, микроэлементы, например, цинк, селениум. Подбор состава
этих компонентов строится на основе учета особенностей метаболизма кле-
ток в культуре и их сбалансированного взаимодействия.

В практике культивирования клеток in vitro наиболее широко исполь-
зуют сбалансированные солевые растворы Хенкса (J.H.Hanks, 1975) или Эр-
ла (J.C.Bryant, 1975). В таблице 3 приведен состав этих растворов. Соли рас-
творяют в строгой последовательности, указанной в прописи. Последую-
щую соль добавляют только после полного растворения предыдущей.
Состав сбалансированных солевых растворов

Компонент	Эрла		Хенкса, г/л	Дульбек- ко и Фог- та, г/л	Тироде, г/л	Hepes буфер, г/л
	10*3 м	г/л				
NaCl	116,50	6,80	8,00	8,00	8,00	8,00
KCI	5,35	0,40	0,40	0,20	0,20	0,40
СаС12	1,80	0,20	0,14	0,10	0,20	-
MgSO4x7H2O	0,83	0,20	0,10	-	-	-
MgCl2x6H2O		-	0,10	0,10	0,10	-
NaH2PO4xH2O	1,01	0,14	-	-	0,05	-
Na2HPO4xl2H2O	-	-	0,12х	2,90хх		0,1 Охх
KH2PO4	-	-	0,06	0,20	-	-
NaHCO3	26,10	2,20	0,35	-	Г 1,0	-
Глюкоза	5,56	1,00	1,00	-	1,0	1,00
Феноловый красный р-р	ххх		0,02		0,02	
pH	7,4-7,6		6,9-7,2		7,00	-
Hepes (порошок)	-	-	-	-	-	2,38

Примечания: х - соответствует 0,06г/л Na2HPO4x 2Н2О;

хх - соответствует 1,15 г/л Na2HPO4 (безводный);

ххх - феноловый красный не является компонентом раствора Эрла, но может
быть добавлен к нему.

Приготовленный раствор стерилизуют фильтрованием. Хранят рас-
творы при t° -4°С - 2 месяца. Солевые растворы Хенкса, Эрла можно стери-
лизовать автоклавированием при 0,7 атм. 30 мин., но с условием, что рас-
творы СаС12, MgCl2 и глюкозы стерилизуют каждый отдельно и после ос-
тывания все 3 раствора соединяют в стерильных условиях с растворами ос-
тальных солей.

Буферный (рабочий) раствор Хенкса (для промывания тканей при
трипсинизации без солей кальция). При приготовлении рабочего раствора
Хенкса последовательно растворяют (г/л): NaCl - 8,0; КС1 - 0,4; MgCI2x
6Н2О - 0,06; MgSO4x7H2O-0,1; Na2HPO4x 2Н2О - 0,06; КН2РО4- 0,06; фенол -
рот - 0,02 (или 2мл 0,5% водного раствора). Приготовленный раствор (уп-
рощенный без СаС12, глюкозы и бикарбоната натрия) стерилизуют автокла-
вированием при 0,7атм. 30 мин. Перед работой pH раствора Хенкса доводят
до 7,2 стерильным раствором 7,5% бикарбоната натрия.

Растворы, применяемые для подведения pH среды

Раствор двууглекислого (бикарбоната) натрия (NaHCCh). Для приго-
товления 7,5% раствора соответствующую навеску соды МаНСОз высыпают
в бутыль с отмеренным количеством теплой бидистиллированной или
сверхчистой воды, тщательно перемешивают и после полного растворения
соды раствор разливают во флаконы и стерилизуют автоклавированием при
0,7атм. 30 мин.
Растворы 10%-го фосфорнокислого калия однозамещенного (К2НРО4)
и 3%-ной уксусной кислоты (С2Н4О2,) используют для подкисления среды.
3%-й раствор С2Н4О2 готовят из ледяной уксусной кислоты. Оба эти раство-
ра стерилизуют автоклавированием при 0,7 атм. 30 мин.

Растворы для дезагрегации тканей

Раствор трипсина. Его готовят по следующей прописи (г/л):КаС 1-8,0;
КС 1-0.2; Na2HPO4x 2Н2О - 1,42; К2НРО4- 0,2; трипсин "Дифко", ’’Ферак”
2,5 или других фирм 2,5- 5,0; бидистиллированной воды до литра. К раство-
ру добавляют: пенициллин 100 тыс.ед/л; стрептомицин 100 мг/мл; устанав-
ливают pH 7,4 - 7,6 добавлением 1% раствора NaOH и фильтруют через пла-
стины "СФ", "EKS-2" или миллипоровые или другие мембранные фильтры.
Готовый раствор хранят при t +4°+6°С в течение 2-6 недель или в заморо-
женном состоянии (-20°С) до 6 месяцев. При разливе трипсина после
фильтрации делают высевы на МПА, МПБ (контроль стерильности), а также
делают отливы раствора трипсина во флаконы, которые оставляют при t
+37°С до использования трипсина в работе.

Раствор версена или трилона Б - ЕДТА (натриевая соль этилен диа-
минтетрауксусной кислоты) - применяют для дезагрегации тканей и снятия
монослоя клеток с субстрата. Для приготовления 0,02% раствора версена
последовательно растворяют (г/л): NaCl 8,0; КС1 0,2; Na2HPO4x2H2O-
1,15; КН2РО4 0,2; версена - 0,2. Приготовленный раствор разливают во
флаконы и стерилизуют автоклавированием при 0,7атм. 30 мин. Хранят рас-
твор при t 4-6°С 2-3 месяца. Другие диспергирующие растворы: натрия
лимоннокислого трехзамещенного, коллагеназы, проназы и др. готовят по
прописям, предусмотренным для соответствующих работ.

Ценность питательных сред и возможность их использования в спе-
цифических целях могут быть повышены за счет различного рода добавок.
Признание специалистов получили 10- и 100-кратные концентраты необхо-
димых и заменимых аминокислот, витаминов. Триптозофосфатный бульон
входит обычным компонентом в среды, применяемые для выращивания кле-
ток ВПК и вируса ящура. Кроме того, добавление его к среде повышает чув-
ствительность клеток к вирусам, что рекомендуется учитывать в диагности-
ческой вирусологии и биопроизводстве.

Дрожжевой экстракт в концентрациях 0,1 - 0,5% усиливает рост кле-
ток и продлевает срок их жизни в культуре без подкормки. Метилцеллюлоза
обладает разносторонним защитным действием на клетки, особенно расту-
щие в суспензии и, добавляемая в концентрации 0,1%, способствует раз-
множению клеток и вирусов в безбелковых питательных средах.

Ростстимулирующая активность питательных сред в значительной
степени зависит от условий и сроков хранения. В таблице 4 приведены ос-
новные условия сохранения стабильности питательных сред и ее компонен-
тов.
Стабильность питательных сред при хранении.

Питательная среда и её компоненты	t хранения, °C	Длительность сохр. основных свойств
Жидкие синтетические питательные среды без глютамина и без сыворотки	4	6 месяцев
Жидкие синтетические питательные среды с глютамином и без сыворотки	4	2 месяца
Жидкие синтетические питательные среды с глютамином и сывороткой	4	2месяца
Сыворотки нелиофилизированные	20	более 6 мес.
Сыворотки лиофилизированные	4	более года
Сбалансированные солевые растворы	-20-22	около года
Гидролизат лактальбумина в растворе	4	3 месяца
50- и 100-кратный концентрат (без глютамина)	4	более 6 мес.
100-кратный концентрат глютамина	-20	более 6 мес.
100-кратный концентрат витаминов	-20	более 6 мес.
Растворы антибиотиков	-20	6 месяцев
Сухие синтетические питательные среды	4	не менее года в отсут- ствии контакта с от- крытой атмосферой

Антибиотики и антигрибковые препараты добавляются в культураль-
ную среду сообразно их типу. Чаще всего используют пенициллин и стреп-
томицин в количестве 100 ед/мл и 100 мкг/мл соответственно. Гентамицин
добавляют в дозе 50 мкг/мл, однако, его концентрацию в культуральной
среде в последнее время повышают. Антигрибковые препараты разбавляют
до конечной их концентрации от 0,25 до 325 мкг/мл (Y.Hashimoto, E.R.Hurd,
1981; J.S.Makarski, 1981).

В зависимости от культивируемых клеток антибиотики и антигрибко-
вые препараты добавляют и в больших количествах (D.E.Bowyer, 1981;
K.Shimada 1981).

4.1.	Синтетические (стандартные) питательные среды

В таблице 5 приведен состав наиболее часто используемых в культи-
вировании клеток in vitro синтетических питательных сред (они производят-
ся промышленностью) и некоторых сред, оптимизированных для клеток
определенного типа. Для сравнимости концентрация компонентов выражена
в миллиграммах на литр.
Таблица 5

Прописи основных синтетических питательных сред

Ингредиенты мг/л	Основы, среда Игла (ВМЕ) (модерни- зированная) на р-ре Эрла	Основы, среда Игла (ВМЕ) (модерни- зированная) на р-ре Хенкса	Среда ИглаМЁМ\ (минимальная) на р-ре Эрла или Хен- кса
аминокислоты:			
1-аргинин НС1	21.06	21.06	126.40
1 -цистин	14.21	14.21	
1-цистин 2Н2О 1-глютамин	292.3	292.3	31.30  292.3
1-гистидин НС1 Н2О	10.50	10.50	41.90
1-изолейцин	26.23	26.23	52.50
1-лейцин	26.23	26.23	52.50
1-лизин НС1	36.53	36.53	73.06
1-метионин	7.46	7.46	14.90
1-фенилаланин	16.51	16.51	33.02
1 -треонин	23.82	23.82	47.64
1-триптофан	4.08	4.08	10.20
1-тирозин	22.51	22.51	36.22
1-валин	23.43	23.43	46.90
витамины:			
биотин	1.00	1.00	
D-Ca пантотенат	1.00	1.00	1.00
солин хлорид	1.00	1.00	1.00
фолиевая кислота	1.00	1.00	1.00
i-иноситол	2.00	2.00	2.00
никотинамид	1.00	1.00	1.00
пуридоксал НС1	1.00	1.00	1.00
рибофлавин	0.10	0.10	0.10
тиамин НС1	1.00	1.00	1.00
неорганические соли: р-р Эрла:			
СаСЬ х 2Н2О	264.9		265.0
КС1	400.0		400.0
MgCO4 X 7Н2О	200.0		200.0
NaCl	6800.0		6800.0
NaHCO	850.0		1860.0
NaH2PO4 х Н2О	140.0		158.3
р-р Хенкса:			
СаСЬ х Н2О		185.5	185.5
КС1		400.0	400.0
КН2РО4		60.0	60.0
MgCO4 X 7Н2О		200.0	200.0
NaCI		8000.0	8000.0
NaH2PO4 х 2Н2О NaHCO3		47.50	60.0  350.0
О(+)глюкоза х Н2О D-глюкоза	1000	1000	1100.0
феноловый красный	17.0	17.0	10.6
сукциновая к-та	17.0	17.0	-
Ингредиенты мг/л	Игла ДМЕМ	среда 199	среда F10	РПМИ-1640
аминокислоты:				
1-аргинин НС1	84.0	70.0	211.0	
1 -аргинин				200.0
1-цистин 2 НС1	62.57	26.069		65.17
1-цистеин HCI х Н2О	0.11			
1-цистеин 2НС1	-		31.5	
1 -глютамин	584.0	100.0	146.2	300.0
глицин	30.0	50.0	7.51	10.0
1 -гистидин HCI Н2О	42.0	21.88	21.0	
1-изолейцин	104.8	20.0	2.6	50.0
1-лейцин	104.8	60.0	13.1	50.0
1-лизин НС1	146.2	70.0	29.3	40.0
1 -метионин	30.0	15.0	4.48	15.0
1-фенилаланин	66.0	25.0	4.95	15.0
1-серин	42.0	25.0	10.50	30.0
1-треонин	95.2	30.0	3.57	20.0
1-триптофан	16.0	10.0	0.60	5.0
1-тирозин	72.0	40.0	1.81	20.0
1-валин	93.6	25.0	3.5	20.0
1-аланин		25.0	8.91	
аспарагиновая к-та		30.0	13.3	20.0
глютаминовая к-та		66.82	14.7	20.0
1 -гидроксипролин		10.0		20.0
1-пролин		40.0	11.50	20.0
1-аспарагин			15.0	
1-аспарагин Н?О				56.82
глютацин				1.0
витамины:				
D-биотин		0.01	0.024	0.2
Са-В(+)пантотенат	4.0	0.01	0.715	0 25
солинхлорид	4.0	0.05	0.698	3.0
фолиевая кислота	4.0	0.01	1.32	1.0
мезо-инозит	7.0	0.05	0.541	35.0
никотиновая к-та	4.0	0.025	0.615	1.0
пиридоксал НС1	4.0	0.025		
пиридоксин НС1			0.376	1.0
рибофлавин	0.4	0.01	0.376	0.2
тиамин НС1	4.0	0.01	1.012	1.0
1-аскорбиновая к-та		0.5		
кальциферол (вит.Д)		0.1		
глютатион		0.05		
менадион-Ма-бисульфит		0.05		
р-аминобензоат. к-та		0.05		
вит.А		1.1147		
DL-а-токоферолфосфат		0.01		
вит. В			1.36	0.005
Б(+)глюкоза Н2О	1100.0	1100.0	1210.0	2200.0
Na-пируват	110.0		110.0	
аденинсульфат	-	10.0	-	-
ATPNa		1.0		•
А-5-МР		0.2		
феноловый красный	15.9	15.9	1.24	5.3
Е)-(-)рибоза		0.5		
тимин		0.3		
твеен 80		20.0		
урацил		0.3		
гипоксантин		0.3	4.08	
СаС12 х 2Н2О	265.0		44.1	
Fe(NO3)3 х 9 Н2О  Fe(NO3)3 х 7 Н2О	0.1		0.834	-
КС1	400.0		285.0	400.0
MgSO4 X 7 Н2О	200.0		152.8	100.0
NaCl	6400.0		7400.0	6000.0
NaHCO3	3700.0		1200.0	2000.0
NaH2PO4 х Н2О  Na2HPO4 х 2 Н2О	125.0		192.0	1003.0
CuSO4 х 5 Н2О			0.0025	
КН2РО4	-	-	83.0	-

Различные культуры клеток культивируются также в смеси МЕМ и
ДМЕМ в соотношении 1:1, цинковой оптимальной среде Рихтера, NCTC
135, ДМЕ/М-16 или в среде 199 в модификациях.

В таблице 6 приведены сведения об особенностях состава и примене-
ния наиболее широко используемых синтетических питательных сред
(P.F.Kruse, M.K.Patterson, 1973; В.А.Сергеев, 1976).

Таблица 6

Наиболее широко используемые питательные среды

Питательная среда	Особенности состава и применение
Среда 199	Широко используемая многокомпонентная среда, оригиналь- но предназначалась и использовалась для производства по- лиовируса. Рекомендуется для применения в диагностике вирусных инфекций.
Основная среда Игла, ВМЕ	Обычно используемая среда с минимальным набором амино- кислот и витаминов. Оригинально предназначалась для куль- тивирования клеток HeLa, КВ и т.п.
Основная среда Игла для культиви- рования диплоид- ных клеток, ВМЕ- диплоид	По сравнению с ВМЕ MgSO4 заменен на MgCl2i удален i- инозитол.
Минимальная среда Игла МЕМ	По сравнению с ВМЕ в 5 раз увеличено содержание аргинина, в 4 раза - гистидина, двукратный набор остальных аминокислот, кроме глютамина, удален биотин. Используется для культивиро- вания большинства перевиваемых линий клеток с повышенными требованиями к составу питательной среды. Позволяет поддер- живать культуры длительное время без подкормки.
Минимальная среда Игла для суспензи- онных культур, MEMS	По сравнению с МЕМ удален СаС12, повышено содержание NaH2PO4, зачасую дополняется карбоксиметил целлюлозой.
Среда Игла в мо- дификации Дюль- бекко, ДМЕМ	По сравнению с ВМЕ вдвое увеличен глютамин, добавлен глицин и серин, витамины и аминокислоты увеличены при- мерно в 4 раза. Присутствуют минимальные количества Fe(NO3)3. Оригинально использовалась для выращивания вируса полиомы в первичных культурах клеток эмбрионов мыши.
Среда Хэма, F-10, F-12	Имеет сбалансированный оптимизированный состав, поддер- живающий при добавлении б'елковых фракций сыворотки клональный рост диплоидных клеток китайского хомячка. При добавлении сыворотки представляет собой одну из са- мых питательных сред, пригодную для выращивания боль- шинства клеточных линий.
Среда Мак-Коя, McKoy 5а (RPM- 1629)	Среда используется для культивирования лейкоцитов, мате- риала биопсий и наиболее требовательных первичных и пере- виваемых культур. Требует добавления 10-30% эмбриональ- ной телячьей сыворотки.
Среда Фишера	Поддерживает рост ряда линий мышечных лейкемических клеток.
Среда Лейбовица L-15	В буферной системе отсутствует бикарбонат натрия, что по- зволяет выращивать клетки в условиях контакта с открытой атмосферой. Глюкоза заменена галактозой.
Среда NCTC 109	Оригинально создана как химически определенная среда для выращивания клеток Z-929. При добавлении сыворотки хо- рошо поддерживает рост клеточных линий. Среда СТС 135 идентична ей по составу, но содержит 1-цистин.
Среда МВ 752/1  .. . .	Предназначалась для культивирования клеток Z-929. Широко используется для обычного культивирования быстрорасту- щих клеток.

Нестандартные питательные среды.

Наряду с решением чисто научных проблем, метод клеточных куль-
тур нашел широкое применение при производстве культуральных вакцин.
Для этого требуется большое количество питательных сред. В практике са-
мое широкое распространение подучили питательные среды на основе фер-
ментативных гидролизатов, которые эффективны при выращивании первич-
ных культур клеток и используются как добавки к другим средам. Кроме
того, при культивировании субкультур, эксплантатов, постоянных линий
клеток, синтетические среды в массовом биопроизводстве не всегда эконо-
мически выгодны.

Для культивирования клеток почки обезьян в 1952 году Мельник и
Риордан впервые предложили среду на основе гидролизата лактальбумина.
В гидролизате содержались все необходимые клеткам аминокислоты, а ус-
ловия гидролиза гарантировали незначительные колебания в их содержании.

Для приготовления этой питательной среды в 1 л сбалансированного
солевого раствора Хенкса растворяют 5,0 г порошка ГЛ А, pH доводят до 7,1 -
7,2, добавляют антибиотики (пенициллин, стрептомицин или канамицин) и
фильтруют через стерилизующие пластины. Перед фильтрованием фильтро-
вальные пластины промывают бидистиллированной водой из расчета 3 л воды
на 300 мм пластину. Первую порцию фильтруемой среды (1,5 - 2 л) отбрасы-
вают, поскольку фильтры в своем составе содержат растворимые детергенты,
такие как тритон - х 100 (мембранные пластины) и соли (асбестоцеллюлозные
пластины), которые токсичны для клеток. После фильтрации, при розливе
среды, для проверки на стерильность делают высевы среды на сахарный
бульон и МПА. Всю серию среды оставляют на 7 дней при t + 37°С, а затем на
10 дней при t +16+18°С для проверки на бактериальную и грибковую конта-
минацию. Хранят питательную среду при t + 4°С до 12 месяцев.

Д.А.Цуверкалов, Г.Е.Панкова, С.П.Сергеева, Л.П.Дьяконов,
Н.Д.Скичко и др. (1970-1983) предложили ферментативный гидролизат мы-
шечных белков (сухой) -ФГМ-С. Для приготовления питательной среды на
основе ферментативного гидролизата мышечных белков в 1 л солевого раст-
вора Хенкса растворяют 2,5-3 г препарата ФГМ-С. Как и при приготовлении
среды с ГЛ А в среду добавляют антибиотики и фенол - рот, pH среды дово-
дят до значения 7,0-7,2. Стерилизуют среду ФГМ-С фильтрованием через
пластины ”СФ”, ’’EKS-2” или миллипоровые пластины.

Питательная среда с гемогидролизатом выпускается предприятием
Минского эпидемиологического института. Указанный препарат выпускает-
ся в 3-х формах: ’’гемогидролизат 5% для культур тканей”, ’’гемогидролизат
2,5% для культур тканей” и ’’гемогидролизат - поддерживающая среда”. В
состав среды входит 5% гемогидродизата -продукта ферментативного рас-
щепления сгустков крови крупного рогатого скота или человека (отходы
производства у-глобулинов) и 8 витаминов. Солевой основой служит рас-
твор Хенкса. Среда представляет собой стерильную, прозрачную жидкость,
окрашенную в желтый или оранжевый цвет, среда имеет кислую реакцию.
При наличии в ней небольшого осадка не следует взбалтывать жидкость во
флаконе, следует лишь декантировать верхний слой жидкости. Хранят среду
при t +2 + 4°С, срок годности - 1 год. Среда ”Гемогидролизат 5% для ткане-
вых культур” и ’Темогидролизат 2,5% для культур клеток” используется для
выращивания первичных и перевиваемых клеточных культур.

Гидролизат белков сыворотки молока (ГСБМ) как основа пита-
тельных сред для культивирования клеток, вирусов и биотехнологии пред-
ложен А.Н.Простяковым, Ю.Я.Свириденко, Л.П.Дьяконовым,
С.П.Сергеевой, Д.Абрамовым, В.А.Сергеевым (1983) и выпускается в виде
сухого порошкообразного препарата в НПО ’’Углич” Гидролизат содержит
18 аминокислот, в т.ч. все незаменимые, до 15 - 17% лактозы.
Питательную среду с содержанием 0,5% ГСБМ готовят на солевом
растворе Хенкса, стерилизуют фильтрованием.

Среда на основе ГСБМ пригодна для культивирования как первич-
ных, так и перевиваемых линий клеток животных, выращивания в них виру-
сов, по эффективности культивирования первичных культур ГСБМ не усту-
пает гидролизату лактальбумина, ФГМ-С.

Важной особенностью ГСБМ является возможность изготовления
сред без добавления глюкозы и длительное поддержание оптимума pH сре-
ды в процессе культивирования клеток.

Для культивирования клеток животных и вирусов эффективны также
гидролизаты белков сои (ГБС), и гороха (ГБГ), разработанные
Н.Н.Гизитдиновым с соавт. (1970-1990 г.г.). Используются также гидролиза-
ты казеина и др. белков (табл.7, 8).

Таблица 7

Физико-химическая характеристика сухих ферментативных
белковых гидролизатов

Показатели	ФГМ-С Щелковский биокомбинат	ГСБМ НПО ’’Уг- лич"	Г идролизат гороха и сои	ГЛА "Дифко"
Внешний вид	тонко- дисперсный сыпучий порошок	тонко- дисперсный сыпучий порошок	тонко- дисперсный сыпучий порошок	тонко- дисперсный сыпучий по- рошок
Цвет	светло- желтый	светло- желтый	светло- желтый	от белого до светло - жел- того
Растворимость, %	6,0+ 0,1	не менее 10	не исследов.	25,0
pH 1% раствора	7,0 ±0,5	6,3+ 0,3	не исследов.	6,5 ±0,1
Влажность, %	3,03 + 0,5	10,3 ±0,2	не более 5	5,2 ± 0,78
Массовая доля золы, %	7,7 ±0,6	4,7 ±0,2	10,0	2,59 + 0,55
Массовая доля общего азота,%	14,09 ± 0,35	10,7 + 0,5	не менее 9,0	12,65 ±0,65
Массовая доля амин- ного азота, %	7,4 ± 0,24	5,9 ±0,2	9,5	6,7 ±0,2
Массовая доля оста- точного азота, %	13,8 ±0,5	9,9 ± 0,3	8,0	12,65 + 0,65
Аминный коэффициент	0,52 + 0,01	0,56 ± 0,01		0,53 ±0,01
Коэффициент протео- лиза	1,0 + 0,02	0,92 ± 0,05		1,0
Полипептиды, %		50,0 ± 2,5		70,0
Массовая доля угле- водов, %		15,3 + 0,7		
Хлориды, %	не исследов.	4,3 ± 0,6	не исследов.	
Таблица 8

Содержание аминокислот в ферментативных гидролизатах белков (в %)

№ п/п	Аминокислота	ГСБМ	ФГМ-С	ГЛА "Дифко"
1.	Аргинин	1,07-1,51	2,2-3.5	2,6
2.	Цистин	0,35-0,85	следы-0,5	следы
3.	Глутаминовая кислота	1,84-2,84	3,5-8,0	2,3-2,6
4.	Гистидин	0,33-0,89	1,4-3,16	2,3-3,1
5.	Изолейцин	2,04-2,52	2,59-3,3	1,6-5,8
6.	Лейцин	4,76-5,74	7,4	8,3
7.	Лизин	3,21-5,05	5,2	6,4
8.	Метионин	0,64-0,92	0,76-1,6	1,0
9.	Фенилаланин	1,70-2,28	1,1-2,6	1,9
10.	Треонин	1,14-1,88	2,3-2,85	1,97-2,5
11.	Триптофан	6,49-10,45	0,7-4,5	1,18
12.	Тирозин	0,88-1,24	0,86-1,3	1,5-2,9
13.	Валин	2.39-2,75	1,9-3,1	2,65-5,6
14.	Аспарагиновая кислота	0,77-1,57	1,25-2,7	0,9-1,7
15.	Серин	1,69-1,99	2,6-3,3	2,0
16.	Пролин	0,26-0,76	3.6	1,0-1,9
17.	Аналин	1,53-3,03	1,5-3,4	2,06-3,0
18.	Глицин	0,27-0,73	1,03-2,4	0,38-0.47
	Всего аминокислот	39,49-42,05	40,6-62,1	41,6-50,8

Для комплектования сред для выращивания клеток предложены про-
теингидролизаты - супплименты В и Т как источники азота. С использова-
нием супплиментов достигается стабильный коэффициент размножения
первичных и перевиваемых культур клеток, образуется полноценный моно-
слой. Среды с супплиментами пригодны для научных исследований и про-
изводства противо-вирусных вакцин (К.Х.Клудас, Б.Штахе, 1984).

4.2.	Бессывороточные питательные среды

Бессывороточные питательные среды условно подразделяют на 4 ви-
да. Первый тип - среды химически известного состава, компонентный про-
филь их поддается почти полностью лабораторному анализу. Второй - это
среды, в состав которых включают нативные или частично очищенные
сложные белковые продукты и синтетические полимеры. К третьему при-
числяют среды, содержащие уменьшенное количество сыворотки. Четвер-
тый - кондиционированные питательные среды с продуктами метаболизма
гомологичных и гетерологичных клеток.

Идеальная бессывороточная среда должна иметь определенный хи-
мический состав, быть автоклавируемой, поддерживать рост многих видов
клеток, важно, чтобы культивирование клеток проводилось без периода
адаптации к питательной среде, клетки не должны изменять своих свойств,
таких как морфология, кариотип, чувствительность к вирусу, антигены кле-
точной поверхности и т.д.
Состав некоторых химически определенных питательных сред приве-
ден в таблице 9.

Таблица 9

Состав химически определенных бессывороточных питательных сред
для культивирования клеток млекопитающих

Компонент	Среда NCTC-109	Среда Хигучи, 1970	Среда Бирча и Пита	Среда Нейгла	Среда Хигучи, 1973
	мг/л	мг/л	мг/л	мг/л	мг/л
1	2	3	4	5	6
/-аминокислоты					
аргинин	31,0	87,09	450	100	32
цистин	10,49	-	75	-	-
цистеин	259,9	144,2	-	75	22
глутамин	135,73	878,0	100	-	198
глицин	13,51	-	15	-	-
изолейцин	19,73	46,5	99	60	63
лейцин	18,04	98,4	180	150	33
лизин НС1	20,44	146,0	180	300	26
метионин	4,44	45,0	30	60	15
фенилаланин	16,53	50,0	70	120	30
треонин	18,93	47,06	100	135	12
триптофан	17,50	12,25	20	60	6
тирозин	16,44	54,4	70	120	46
валин	25,00	93,7	150	150	35
аналин	31,48	-	90	400	-
серин	10,75	105,1	20	300	105
аспарагиновая кислота	9,91	-	-	-	-
глутаминовая кислота	8,26		-	150	-
оксипролин	4,09	-	-	-	-
пролин	6,13	-	-	300	115
аспарагин	8,09	-	♦	300	150
глутамат натрия	-	-	1530	-	-
гомоцистеин	-	-	-	-	-
глутатион	10,1	-	-	-	-
у - аминомасляная ки- слота	5,51				
глюкозамин	3,2	-	-	-	-
Орнитин	7,28	-	-	-	-
таурин	4,18	-	-	-	-
Витамины					
холинхлорид	1,25	40,0	20,0	50,0	10,0
фолиевая кислота	0,025	1,0	1,0	1,0	1,0
инозитон	0,125	1,0	2,0	1,0	1,0
никотинамид	0,0625	1,0	1,2	1,0	0,1
никотиновая кислота	0,0625	-	-	-	-
пантотенат кальция	0,025	1,0	1,2	1,0	0,2
пиридоксаль	0,0625	1,0	-	-	0,05
рибофлавин	0,025	0,1	0,2	0,1	0,1
тиамин	0,025	1,0	2,0	1,0	0,2
биотин	0,025	1,0	0,1	1,0	0,002
гьаминобензойная ки- слота	0,125				
аскорбиновая кислота	49,9		-	-	-
витамин А	0,025	-	-	-	-
витамин Д2	0,025	-	-	-	-
витамин Е	0,025	-	-	-	-
витамин К	0,25	-	-	-	-
витамин В12	10	0,002	1,0	0,002	1,36
Коферменты					
НАД	7,0	-	-	-	-
НАДФ	1,0	-	-	-	-
кофермент А	2,5	-	-	-	-
тиамин пирофосфат	1,0	-	-	-	-
ФАД	1,0	-	-	-	-
УТФ	1,0	-	-	-	-
Предшественники нуклеиновых кислот					
дезоксиаденозин	10,0	-	-	-	-
дезоксицитидин	10,0	-	-	-	-
дезоксигуанозин	10,0	-	-	-	-
тимидин	10,0	-	10,0	-	-
5-метилцитозин	0,4	-	-	-	-
гипоксантин	-	-	10,0	-	-
Предшественники липидов					
твин-80	22,5	-	-	-	-
холестерин	-	-	-	-	5x106М
лецитин	-	-	-	1	-
ацетат натрия	50,0	-	-	-	-
олеиновая кислота	-	-	-	0,5	-
Источники углеводов					
глюкоза	1000	4500	2000	3000	1800
пируват натрия	-	1мМ	-	но	НО
глюкуронолактон	1,8	-	-	-	178
глюкоронат натрия Н2О	1,8				
этанол абсолютный	-	-	2,0 мл/л	-	-
метилцеллюлоза	-	500	-	500	600
глюконат натрия Н2О	-	1М	-	-	-
протамин сульфат	-	-	-	-	2,0
гидрокортизон	1	-	-	-	10'8М
Z-тирокеин	-	-	-	-	2,5x10’8М
ЕДТА	-	-	-	-	10‘5М
инсулин	-	-	-	-	0,064 ед.
Соли и буферные растворы					
Хепес	-			-	2980
NaCl	2800	6500	5900	7400	7400
NaHCO3	2200	840	2500	1000	1140
KCl	400	4110	400	400	400
NaH2PO4 H2O	140	280	500	300	100
CaCl2	200	ИЗ	0,8	200	200
MgCb 6H2O	-	300	200	275	275
MgSO4 7H2O	200	-	-	-	-
FeNH4(SO4)2 12H2O	-	10’5М			' 4,8
FeSO4 7H2O	-	10'6М	1,0	-	-
MnCl2 4H2O	-	-	0,1	-	-
MnSO4 H2O	-	-	0,5	-	
ZnSO4 H2O	-	10бМ	1,0	0,3	0,28
Аммониевый цитрат железа			*	3,0	

Разработаны, производятся и предлагаются рядом фирм (Сигма, ICN и
др.) различные ростовые факторы: фактор роста нервной ткани (FGN), тром-
боцитарный фактор роста (PGF), эпидермальный фактор роста (EGF), инсули-
ноподобные факторы роста (IGF-1, IGF-И), соматомедины, трансформирую-
щие ростовые факторы типа аир (а-TGF, р -TGF), гормоны, интерлейкины и
др. и вещества межклеточного матрикса, обладающие адгезивными свойства-
ми и действующими как факторы дифференцировки - фибронектин, ламинин,
витронектин и др. В зависимости от задач эксперимента или биопроизводства
эти факторы могут быть использованы в клеточной биотехнологии, как до-
бавки к питательной среде. Так например, действие одного из них - инсулина
в культурах клеток многогранно, он регулирует транспорт и метаболизм глю-
козы, жирных кислот и аминокислот, стимулирует активность ряда фермента-
тивных процессов (J.P.Mather, G.N.Sato, 1979). Однако, присутствие одного
инсулина недостаточно для начала клеточного деления, для этого питательная
среда должна содержать другие гормоны или активирующие комплексы, по-
ступающие из сыворотки (C.R.Osbome е.а.). Установлено, что скорость деле-
ния клеток усиливается в результате синергического действия инсулина и
некоторых сывороточных факторов (W.G.Pledger е.а., 1977; G.Z.Bradshaw,
G.R.Dubes, 1983; S.N.W.Mochamed е.а., 1983). Добавление инсулина в виде
протамин-2п-инсулина в среду 199 в концентрации 0,05 - 0,5 ед/мл повышает
прикрепляемость клеток куриного эмбриона и усиливает их рост (J.Hayashi
е.а., 1978; патенты США, 1974, 1978; патент Великобритании, 1975; патент
ФРГ, 1975).

Доказано, что инсулин, эпидермальный фактор роста и инсулоподоб-
ный фактор роста ингибируют распад белков и стимулируют белковый син-
тез в культивируемых клетках. Отмеченный эффект наблюдается сразу по-
сле добавления указанных веществ и легко обратим, однако чувствитель-
ность клеточных линий варьирует (F.J.BaHard).

В качестве заменителей сыворотки крови испытывали стероидные
гормоны, среди которых положительное влияние на культивируемые клетки
оказывают кортикостероиды: гидрокортизон,- стимулирует рост клеток
хряща (C.N. Caston, R.K.Prince, 1964) и диплоидных клеток легкого эмбрио-
на человека (C.R.Fharach, D.D.Canninghani, 1973), увеличивает продолжи-
тельность пролиферации клеток WJ-38 (V.J.Cristafalo е.а., 1977) и время пе-
реживания некоторых других типов клеток (G.С.Yuan, R.S.Chang, 1969).
Однако, для проявления митогенного действия гидрокортизона необходимо
некоторое количество сыворотки или дополнительных факторов роста из
фибробластов, мозга или гипофиза (P.S.Rudland е.а., 1971; Н.А.Armelin,
1973; E.V.Caffney, O.Pigott, 1978).

Другие стероидные гормоны эстрадиол, андростанолон, диэ-
тил стилбестрол в концентрации 10-30 мМ увеличивают скорость деления
клеток GH (J.Hayashi, G.Sato 1976), а также повышают адгезивные свойства
и скорость роста клеток L929 в среде F - 12, дополненной введением глута-
мина, глутаминовой кислоты, глюкозы, гипоксантина, тимидина, NaHCCh,
хепес-буфера.

При культивировании клеток проксимальных трубочек почки свиньи
перевиваемой линии клеток LLc-PK бессывороточная питательная среда
дополнялась трансферрином, инсулином, селеном, гидрокортизоном, трии-
одтирозином, вазопрессином, простагландином Е и холистерином. Эту гор-
мональную среду использовали для получения первичной культуры эпите-
лиальных клеток проксимальных канальцев почек кроликов без примеси
фибробластов (Z.Chuman е.а., 1982).

Известно, что ряд гормонов и факторов роста специфичен для каждо-
го типа клеток, а некоторые компоненты (инсулин и трансферрин) требуют-
ся для большинства исследованных типов клеток (S.C.Nagle, 1969;
H.W.Hsuch, M.Moskowitz, 1973; S.E.Hutchings, G.H.Sato, 1978). Уникаль-
ность комплексов гормонов и факторов роста, необходимых для культиви-
рования каждой линии клеток, можно объяснить рецепторными свойствами
тканей и особыми регуляторными механизмами метаболизма (D.Zitvin,
1979; D.Barnes, G.Sato, 1980; G.Z.Bradshaw, G.R.Dubes, 1983). Существует
мнение, что гормоны действуют через рецепторы, характерные для опреде-
ленного типа клеток, изменяя их чувствительность к ростовым факторам
(D.S.Salamon, 1980; В.М.Wyse, A.Y.Chang, 1982). Рост каждого типа клеток
стимулирует определенное сочетание гормонов и факторов роста. Подбор
этого соотношения позволяет временно повысить скорость роста клеток, их
метаболические возможности.
4.3.	Кондиционированные питательные среды

Культуральная жидкость, полученная после выращивания клеток оп-
ределенного типа, содержит метаболиты, являющиеся факторами роста для
гомологичных и гетерологичных клеток. Питательные среды, дополненные
такой культуральной жидкостью, называются кондиционированными.

Известно, что некоторые линии клеток из легкого мыши и печени
крысы способны расти в среде без сыворотки крови. Эти клетки сами сти-
мулируют свой рост (N.C.Dular, H.M.Temin, 1973). Кондиционированные
среды с культуральной жидкостью после культивирования клеток печени
крысы представляют богатый источник фактора роста, который является
белком, состоящим из четырех активных полипептидов молекулярной мас-
сой 10 кД (A.Vizrachi, A.Shanar, 1977; M.Kato е.а., 1980). По биологическим
свойствам он сходен с соматомедином (K.Hall, 1980).

В практике культивирования клеток перевиваемых линий КВ, HeLa,
ВНК-21 используют кондиционированные среды, полученные после выра-
щивания гомологичных клеток в средах, обогащенных сывороткой крови
(А.Н.Курносов, 1980). Клетки ВНК-21 способны так же расти в среде, кон-
диционированной клетками линии L (M.Shodell, K.Jssel-bacher, 1973).

Одновременно с разработкой технологии производства ряда гормонов и
ростовых факторов, актуальным и реальным является использование питатель-
ных сред с уменьшенным содержанием сыворотки крови до 1 -2%, либо заме-
ной её на пептиды, альбумин, гидролизаты животных белков и др. компоненты.

С целью обеспечения надежности питательных сред и проверки сы-
вороточных заменителей на ряде клеточных линий созданы аналоги сыво-
ротки - Серекс и Ультросер - Г (заменитель сыворотки Ультросер фирмы
JBF-LKB, 1983; патент США, 1981).

4.4.	Наборы питательных сред на основе гидролизатов

В практике могут быть успешно использованы наборы сухих пита-
тельных сред на основе ФГМ-С и ГСБМ. Прописи наборов и порядок приго-
товления жидких сред приводится ниже.

Питательная среда на основе ФГМ-С для культивирования первичных

культур и субкультур на 10 л (в г)

ФГМ-С	30,0

Состав солевого раствора Хеикса (в г)

Натрий хлеристый (NaCl)	80,0

Калий хлористый (КС 1)	4,0

Кальций хлористый (СаС 12)	1,4

Магний хлористый (MgC 1 2)6Н2)	1,0

Магний сернокислый, двузамещенный (MgS04.7H2O)	1,0

Натрий фосфорнокислый двузамещенный (Na2HPO4 . 12Н2О	1,5

Калий фосфорнокислый однозамещенный (КН2РО4)	0,6

Глюкоза	10,0

Фенолрот (водорастворимый)	0,2

Натрий двууглекислый (NaHCO3)	20,0
В подогретой бидистиллированной воде растворяют вначале ФГМ-С
и соли. Значение pH питательней среды доводят до требуемого показателя
(обычно 7,2-7,4) двууглекислой содой. Стерилизацию среды проводят
фильтрацией через стерилизующие пластины типа EKS -2 иди мембранные
стерилизующие пластины типа ’’Миллипор” или "Владипор” и др. с диамет-
ром пор 0,22 мкм.

Стерильность среды проверяют путем высева на МПБ и МПА. Всю
серию оставляют на 5 дней при 37°, а затем на 10 дней при температуре
20±2°С для дополнительного выявления бактериальной и грибковой конта-
минации. После этого срока среду используют в работе.

Сыворотку крови в количестве 5-10% к объему среды и антибиотики
(пенициллин 100 ед/мл, стрептомицин 100 мг/мл) добавляют при необходи-
мости перед высевом клеток.

Среда на основе ФГМ-С может быть приготовлена методом раздель-
ного автоклавирования 1,5%-го раствора ФГМ-С и раствора Хенкса
(Е.Г.Андрюк, 1997). Для этого в отдельные флаконы наливают 1,0 л 1,5%-го
раствора ФГМ-С, а в другие 4 л раствор Хенкса, в которых разведена навес-
ка солей и фенолрота из расчета на 5 литров. Растворы автоклавируют при
температуре 115° (0,6 атм) и после остывания в стерильных условиях гото-
вят среду, добавляя 100 мл 1,5% раствора ФГМ-С к 400 мл раствора Хенкса.
После контроля на стерильность среда используется в работе.

Готовая сухая обогащенная питательная среда на основе ФГМ-С (0,3%)
для культивирования перевиваемых линий клеток и вирусов на 10 л (в г)

Флакон № I

а)	ФГМ-С	30,0

б)	Состав солевого раствора Хенкса (г) и витаминов

Натрий хлористый (NaCl)	80,0

Калий хлористый (КС 1)	4,0

Кальций хлористый (СаС 12)	1,4

Магний хлористый (MgC 12)	1,0

Магний сернокислый (MgSO4.7H2O)	1,0

Натрий фосфорнокислый двузамещенный (Na2HP04.12H2O) 1,5

Калий фосфорнокислый однозамещенный (КН2РО4)	0,6

Глюкоза	10,0

Фенолрот (водорастворимый)	0,2

Холинхлорид	0,01

Фолиевая кислота	0,01

Л-инозитол	0,004

Никотинамид	0,01

Д-пантотенат кальция	0,01

Пиродоксаль гидрохлорид	0,01

Рибофлавин	0,001

Тиаминхлорид	0,01
Флакон № 2

Натрий двууглекислый (NaHCOj)	20,0

Приготовление среды аналогично предыдущей,
стерилизуется фильтрованием

Изготовление и использование 10-ти кратного концентрата эксперименталь-
ной питательной среды ФГМ-С (обогащенной) для культивирования пер-
вичных и перевиваемых культур клеток и вирусов

Бидистиллированную воду по 900 мл наливают во флаконы (клин-
ские), закрывают ватно-марлевой пробкой и автоклавируют в течение 30
минут при 0,5-0,6 атм. После автоклавирования охлаждают и в стерильных
условиях в каждый флакон приливают по 100 мл 10-ти кратного концентра-
та ФГМ-С, стерилизованного фильтрованием или автоклавированием и пе-
рекрывают резиновой пробкой. После этого среда готова к работе. Перед
использованием среды pH доводят до требуемого значения добавлением к
ней стерильного 7,5%-го раствора двууглекислого натрия (NaHCO3).

Аналогичным образом готовят питательную среду из 10-кратного
концентрата экспериментальной питательной среды ГСБМ и 10-кратного
концентрата среды 199, стерилизованных фильтрованием.

Если готовят питательную среду из 5-кратных концентратов, то к 800
мл простерилизованной сверхчистой воды добавляют 200 мл концентрата.

Приготовление сухой питательной среды на основе гидролизата сы-
вороточных белков молока (ГСБМ) для культивирования первичных и пере-
виваемых культур клеток и вирусов на 10 л (в г)

Флакон 1

ГСБМ	50,0

Состав солевого детвора Хенкса (г)

Натрий хлористый (NaC 1)	80,0

Калий хлористый (КС 1)	4,0

Кальций хлористый (СаС 12)	1,4

Магний хлористый (MgC 12)	1,0

Магний сернокислый (MgSO4.7H2O)	1,0

Натрий фосфорнокислый двузамещенный (Na2HP04.12Н2О)	1,5

Калий фосфорнокислый однозамешенный (КН2РО4)	0,6

Глюкоза	10,0

Фенолрот (водорастворимый)	0,2

Флакон 2

Натрий двууглекислый (NaHCCh)	20,0

Порядок приготовления этой среды такой же,
как и среды на основе 0,3%-го ФГМ-С.

Приготовление полужидкой среды для культивирования микоплазм
на основе ФГМ-С

Для приготовления среды для микоплазм берут (г):

ФГМ-С	20,0
Раствор Хенкса:

Натрий хлористый (NaCl)	8^0

Кадий хлористый (КС 1)	0,4

Кальций хлористый СаС 12.4Н2О	0,185

Магний сернокислый (MgSO4.7H2O)	0,2

Бикарбонат натрия NaHCO3	0,35

Магний хлористый MgC12-2H2O	0,06

Натрий фосфорнокислый двузамещенный (Na2HP04.12Н2О) 0,06

Калий фосфорнокислый однозамещенный (КН2Р04 )	0,06

Глюкоза	1,0

агар "Дифко"	3,0

Все ингредиенты растворяют в I л дистиллированной воды, доводят
до кипения, фильтруют через бумажный фильтр, разливают по флаконам,
стерилизуют в автоклаве при 115°С 30 мин. Перед употреблением добавля-
ют 10% дрожжевого экстракта и 20% сыворотки крупного рогатого скота
или лошади.

4.5.	Сыворотка крови животных, как компонент
питательных сред

Сыворотка является необходимым компонентом большинству пита-
тельных сред для культивирования клеточных и органных культур. Сыво-
ротка играет роль предохранительного физиологического буфера, участвует
в процессах адгезии, распластывания и миграции клеток, является источни-
ком питательных веществ.

Высокомолекулярные фракции сыворотки служат источником защит-
ных веществ, предохраняющих клетки от повреждений (у- и Р- глобулины).

Сыворотка выполняет целый ряд других важнейших функций: стиму-
лирует усвоение регуляторных молекул, воздействуя на клеточную мембра-
ну, участвует в регуляции плотности культуры и контактной ингибиции,
стимулирует внутриклеточное содержание критически необходимых для
роста клеток питательных компонентов, регулирует уровень внутриклеточ-
ных циклических нуклеотидов, посредством чего, в частности, стимулирует
фосфорилирование ядерных белков, активирует ассоциированные с мембра-
ной системы протеаз, играет роль носителей для низко-молекулярных ком-
понентов и др. (А.С.Новохатский, 1979; И.И.Круман, 1981).

Различные клетки могут нуждаться в различных компонентах сыворотки
- глобулинах, стероидных гормонах, инсулине, фетуине. Эмбриональная теля-
чья сыворотка богата фетуином и добавление ее к питательным средам карди-
нально изменяет их свойства и обеспечивает длительное культивирование раз-
личных клеток животных и человека. Эмбриональная сыворотка по сравнению
с сыворотками особей различных возрастов содержит повышенное количество
эстрадиола, эстриола и прогестерона, хотя содержание их варьирует в широких
пределах от партии к партии. Добавление 5-15% сыворотки эмбрионов крупно-
го рогатого скота, новорожденных телят, сыворотки лошадей, т.е. сывороток,
оказавшихся оптимальными при выращивании различных клеток и вирусов,
остается неизбежной необходимостью.

Одним из важнейших факторов в культивировании клеток остается
выбор, состояние и концентрация добавляемой в культуральную среду сы-
воротки (E.L.Schneider е.а., 1978; R.G.Ham, W.L.Keehan,1979; О.Barnes,
Н.Masui, 1981). Для культивирования первичных или субкультур клеток
различного происхождения используют 10-20% фетальной сыворотки круп-
ного рогатого скота (FBS), 10 или 20% сыворотки крови человека (PHS) или
20% инактивированной теплом FBS. Для FBS концентрация находится в
пределах между 5 - 40%, для PHS между 10 и 30%, для кроличьей сыворотки
между 5 и 20%, для новорожденных телят между 10 и 20% и для сыворотки
инактивированной теплом (56°С, 30 мин) между 10 и 30%. При субкульти-
вировании концентрация сыворотки составляет приблизительно 10 или 20%.
В основном при культивировании эпителиальных клеток человека в пита-
тельную среду добавляют 20% сыворотки, для других клеток - 10%. Имеют-
ся сведения об использовании комбинаций сывороток: 20% FBS и 10% PHS
(E.R.Ashida е.а., 1981), 10% FBS и 5% телячьей (D.Gosporadowicz е.а., 1981;
D.Gosporadowicz , C.M.Zui,1981; N.Savion е.а., 1981), 25% FBS и 5% челове-
ческой сыворотки типа АВ (J.NR.Maynard е.а., 1977), 20% сыворотки лоша-
диной (инактивированной теплом) и 10% сыворотки крови человека
(Е.А.Jaffe е.а., 1976). Добавление сыворотки в культуральную среду изменя-
ет метаболизм клеток и функции клеточных культур.

Сыворотка плода коровы обладает протеолитической активностью
(N.W. Steal, Р.А. Мс Кее, 1978), которая исчезает после тепловой инактива-
ции. Многие другие факторы также ликвидируют это свойство. Фетальная
сыворотка, подвергнутая тепловой инактивации при 61 °C в течение 60 мин.
теряет ферментативную активность (P.J.Del Vecchio, J.R.Smith, 1981).

Имеются различные сведения, которые характеризуют сыворотки по
содержанию белка и химическим компонентам (таблица 10, 11).

В фетальных сыворотках концентрация натрия варьирует от 87 до 172
ммоль/л, калия между 10,5 и 19,6 ммоль/л, хлора от 69 до 129 ммоль/л, фос-
фора от 2,6 до 5,2 ммоль/л, щелочной фосфатазы от 244 до 425 Е/л и лактат-
дегидрогеназы между 343 и 1,184 Е/л. Дифференциация белковых фракций в
различных сыворотках показана в таблице.

pH сывороток разнится от 7,0 (FBS) до 8,0 (сыворотка новорожденных
телят) и до 8,1 для донорской сыворотки крови человека. Осмомолярность раз-
личается от 212 mOsm (кроличья сыворотка) до 339 mOsm (собачья сыворотка).

Маловероятно, что аналитический подход к определению роли такой
сложной смеси как сыворотка, удовлетворяющей многочисленным функци-
ям клетки при культивировании и содержащей сотни компонентов, концен-
трация которых значительно изменяется от партии к партии, будет успеш-
ным (таблица 12).

Однако такие исследования позволяют стандартизировать физико-
химические свойства сыворотки.
Белки сыворотки, обеспечивающие прикрепление, распластывание и
движение, найдены в сыворотке эмбриона коровы, свиньи, кролика, цып-
ленка и др. (L.Weiss е.а., 1975; F.Grinnell е.а., 1976). Фактор прикрепления,
выделенный из сыворотки плода коровы, является гликопротеидом, содер-
жащим около 10%углеводов (А.С.Новохатский, 1979).

Ростстимулирующая активность сыворотки крови связана с альбуми-
новой и глобулиновой фракциями, причем наибольшую активность прояв-
ляют гамма-глобулины. Альбуминовые и глобулиновые фракции белков
сыворотки уменьшают свободную диффузию низкомолекулярных соедине-
ний через мембраны клеток и влияют на утилизацию углеводов, аминокис-
лот и липидов (G.M.Healu, R.P.Parker, 1970; M.R.Framacere е.а., 1977;
A.F.Borghetti е.а., 1977; Патент США, 1980).

Белки сыворотки крови как носители многих веществ способны стабили-
зировать и моделировать действие ряда биологически активных продуктов, ко-
торые они транспортируют, а также снижать токсичность сырья, связывая тя-
желые металлы, комплексы или пирогены (Б.К.Гаврелюк, В.П.Сафонов, 1981;
W.G.Faylor, 1974; G.Rocrwell е.а, 1980; J.P.Mather, 1982).

Таблица 10

Химический состав различных сывороток

Вещество	Единица	Человеческая	Человеческая 	(сборн.)	Человеческая АВ	Птичья	Собачья	Козлиная	Свиная	Овечья	Новор. телят	Телячья асепт.	Фетальная крс	Фетальная крс
Na	ммоль/л	134	120	144	134	152	149	151	146	144	141	87	172
К	ммоль/л	11,2	8,5	0,5	5,6	7,8	9,5	9,6	9,1	5,1	4,6	10,5	19,6
Са	ммоль/л	2,5	2,1	2,7	2,1	2,5	1,6	2,1	1,9	2,2	2,3	2,2	4,4
С1	ммоль/л	102	93	131	109	120	108	119	116	102	105	69	129
Р	ммоль/л	1,8	1,7	0,3	2,1	2,0	2,9	4,2	3,0	2,7	2,2	2,6	5,2
Щелочная фосфатаза	Е/л	200	13	86	1,45	80	99	144	141	420	87	244	425
у - глютами- новая к-та	Е/л	105	12	16	10	3	22	22	30	309	12	4	7
Креатин	Е/л	101	3	83	738	60	89	3,409	48	85	42	14	39
Лактатде- гидрогеназа	Е/л	365	149	108	488	319	270	842	334	1,02	1,11	343	1,184
Амилаза	Е/л	12	75	61	528	1,18	159	4,09	56	151	103	7	21
Холин	мг/дл	60	169	141	106	148	80	91	68	85	105	27	64
Триглицерид	мг/дл	43	149	72	_56	54	26	45	32	122	14	61	118
Белок	г/л	47	68	56	32	65	78	73	69	69	69	22	51
Таблица 11

Фракционный состав белка различных сывороток

Сыворотка	Бе- лок	Альбумин		Глобулины									
						а2		01		02		*	Г
	г/л	%	г/л	%	г/л	%	г/л	%	г/л	%	г/л	%	г/л
Плода человека	68	66,8	45,4	2,2	1,5	11,1	7,5	8,3	-	-	5,6	11,4	7,8
Человек AB(F)	71	60,4	42,4	3,5	2,5	9,7	6,9	9,4	6,7	2,4	1,7	14,2	10,1
Человек АВ (G)	56	62,5	35,0	3,9	2,2	9,1	5,1	11,3	-	-	6,3	12,8	7,2
Человек	58	62,0	36,0	4,1	2,4	9,5	5,5	12,0	-	-	7,0	12,0	7,0
FCS (F) плода	51	64,5	32,9	7,2	3,7	11,5	5,9	2,7	1,4	13,7	7,0	-	-
FCS (F) плода коровы	22	65,2	14,3	4,7	1,0	5,0	1,1	4,4	1,0	20,2	4,4		
FCS (S) плода коровы	25	65,6	16,4	14,3			3,6	3,0	0,8	13,6	3,6	3,4	0,9
Новорожден- ный теленок	69	40,5	27,9	16,4			11,3	42,9					29,6
Теленок	63	57,1	36,0	15,6	-	-	9,8	22,6	-	-	14,2	4,5	2,8
Теленок (асепт.)	69	48,9	33,7	13,7			9,5	10,3	7,1	10,9	7,5	16,0	11,0
Птица	32	59,3	19,0	15,2	-	-	4,9	18,6	-	-	6,0	6,6	2,1
Собака	65	46,5	30,2	20,9	-	-	13,6	21,0	-	-	13,7	11,3	7,3
Коза	78	49,2	38,4	7,8	6,1	11,2	8,7	7,1	5,5	24,4	-	-	19,0
Лошадь	47	44,9	21,1	13,2	-	-	6,2	12,7	6,0	9,3	4,4	19,6	9,2
Овца	69	51,7	35,6	18,5	-		12,8	5,4	3,7	8,2	5,7	15,8	10,9
Свинья	73	45,4	33,1	22,5	-	-	16,4	18,8	13,7	13,0	-	-	9,5
Кролик	40	67,6	27,0	7,2	-	-	2,9	15,2	-	-	6,1	9,8	3,9

Таблица 12

Метаболический профиль эмбриональной сыворотки

Вещество	Среднее значение	Предел изменений	Число анализов
Эндотоксин	0,356 нг/мл	0,008-10,0	39
Г емоглобин	11,6 мг/10 л	2,4-18,1	17
Глюкоза	125 мг/100 мл	85-247	43
Натрий +	137 мкг-экв	125-143	43
Калий + Хлориды	11,2 мкг-экв  103 мкг/экв	10,0-14,0 98-102	43
Азот мочевины	16 мг/100 мл	3,2-7	43
Суммарный белок	3,8/100 мл	3,2-7,0	43
Альбумин	2,3/100 мл	2,0-3,6	43
Кальций	13,6 мг/100 мл	12,6-14,3	43
Неорганический фосфор	9,8/100 мл	4,3-11,4	43
Холестерол	31 мг/100 мл	12-63	43
Мочевая кислота	2,9/100 мл	1,3-4,1	43
Креатин	3,1/100 мл	1,6-4,3	43
Билирубин: суммарный свободный	0,4 мг/100 мл  0,2 мг/100 мл	0,3-1,1  0,0-0,5	43
Щелочная фосфатаза	255 МЕ/мл	111-352	43
Лактатдегидрогеназа	864 МЕ/мл	260-1215	43
Гл ютаматоксалоацетат- трансамилаза	130 МЕ/мл	20-201	43
Селен	0,026 мкг-экв	0,014-9,038	25
Кортизон	0,5 мкг/л	0,1-2,3	43
Инсулин	10 МЕ/мл	6-14	40
Паратироидный гормон	1718 пг/мл	85-6180	41
Прогестерон	8 нг/10 л	0,3-36	42
ТЗ	119 нг/10 л	56-233	41
Т4	12,1 нг/10 л	7,8-15,6	42
Тестостерон	40 нг/10 л	21-99	42
Простагландин Е	5,91 нг/мл	0,50-30,48	37
Простагландин I	12,33 нг/мл	3,77-42,00	38
Тироидный гормон	1,22 нг/мл	0,2-4,5	40
Фолликулостимули- рующий гормон	9,5 нг/мл	2,0-33,8	34
Гормон роста	39 нг/мл	18,7-31,6	40
Пролактин	17,6 нг/мл	2,0-49,55	40
Лютенизирующий фак- тор роста	0,79 нг/мл	0,12-1,8	38
Витамины: А  Е	9 мкг/10 мл 0,11 мг/10 мл	1-35 0,10-0,42	16  16

Сывороточный альбумин служит переносчиком и депо жирных ки-
слот. Лучшими ростовыми свойствами обладают ненасыщенные жирные
кислоты; насыщенные, за исключением стеариновой и некоторых других,
подавляют рост клеток. Ростстимулирующее действие моно - и диненасы-
щенных жирных кислот сильнее при увеличении двойных связей в этих ки-
слотах (K.Higuchi, 1973).

Сыворотка крови является источником не только белков, ростовых и ад-
гезивных факторов, но также антител, микоплазм, бактерий, вирусов и ряда
токсических продуктов, которые не позволяют проводить различные тонкие
исследования в области эволюции клеток, канцерогенеза, в познании механизма
дифференцировки, роста и развития половых клеток, отдельных сторон имму-
ногенеза и особенно процесса взаимодействия вируса и клетки. Это обуславли-
вает необходимость создания бессывороточных питательных сред, потребность
в них все более возрастает в области медицины, ветеринарии, цитологии, виру-
сологии, иммунологии, молекулярной биологии и генной инженерии.

Сыворотку крови в составе питательной среды пытались заменить раз-
личными белковыми гидролизатами животного происхождения, такими как
гидролизат казеина, пептический гидролизат легкого эмбриона крупного рога-
того скота, пептон Витте, бактопептон. Из них наиболее эффективными оказа-
лись бактопептон, пептический гидролизат легкого коровы и пептон Витте
(WJ.Faylor е.а., 1972), растворимые протеины (Р.Я.Подчерняева и др. 1996).
Гидролизат лактальбумина частично заменяет сыворотку в среде. Сырая
фракция молока, полученная стерилизующей фильтрацией заменяет сыворотку
крови в среде МЕМ при культивировании клеток L, Vero, MDSK и ВВМ
(K.Centell,D.R.Fovell,1971; R.MMacnell е.а., 1978; A.C.Fassolitis е. а., 1981).

Фосфолипидная фракция соевых бобов обеспечивает культивиро-
вание клеток миеломы МРС -11 в бессывороточной среде, дополненной
трансферрином и селенитом, названные клетки сохраняют способность ин-
дуцировать иммуноглобулин (Н.Murakami е.а., 1983).

Для накопления вируса ящура в культуре клеток может исполь-
зоваться бессывороточная питательная среда из гидролизата белков сои
(10%) и среда 199, которая практически не влияет на уровень продуцирова-
ния и активность вируса (K.Cantell, D.R.Fovell,1971; Н.Н.Гизитдинов,1970).

Бактопептон, мясной бульон и бактотриптоза в концентрации 0,5%
вполне полноценные заменители сыворотки в среде МЕМ, которая исполь-
зовалась для выращивания клеток L (L.Keay, 1975). Для культивирования
клеток ВНК-21 лучшей оказалась среда F-12, дополненная 0,5% бактопепто-
на и 300 мг/мл детергента Дарван.

Бессывороточные среды состава МЕМ + 1% бактопептона, МЕМ +
1% бактопептона +0,23 МЕ/мл инсулина с успехом применялись для куль-
тивирования клеток ЗТЗ, BSC-1, HeLa, КВ, причем клетки, полученные в
таких бессывороточных условиях, не утратили чувствительности к вирусам
(L.Keay, 1975, 1976).

Автоклавированная среда МЕМ с бактопептоном поддерживает также
рост клеток L60 TM,Vero и клеток печени, пораженных болезнью Чанга
(А.С. Новохатский, 1979).

Ростстимулирующая активность бактопептона, получившего более
широкое применение из всех гидролизатов, предположительно обус-
лавливается низкомолекулярными пептидами (K.Z.Amborski, M.Moskowitcz,
1968; N.W.Hsuch, M.Moskowitcz, 1973; M.Fouad е.а.,1981).

Фактор роста, выделенный из бактопептона, состоит в основном из
глицина и серина (K.Z Amborski, M.Moskowitcz, 1968). Ростстимулирующая
активность бактопептона связана также с присутствием 6,8 - дигидроксипу-
рина (M.Fouad е.а., 1981).

Некоторые типы клеток, подученные в бессывороточных средах, сохра-
няют свои специфические функции. Лимфоциты человека типа Т и В, получен-
ные в среде Игла ДМЕМ с добавлением бычьего сывороточного альбумина и
трансферрина, сохраняли маркеры клеточной поверхности - иммуноглобулин,
антигенный фенотип, набор хромосом, комплементарные рецепторы. Замена
среды на бессывороточную также не вызывала существенных изменений и
ферментативной активности клеток (J.Carlson е.а., 1982).

Активные пептиды и низкомолекулярные белки содержатся также и в
гидролизатах белков молока, но эти препараты изучены еще недостаточно.

Сыворотку крови получают из крови клинически здоровых животных
или их плодов, доставленных из убойных пунктов, благополучных по ин-
фекционным заболеваниям скота.
Получение крови и ее переработка проводятся в соответствии с рег-
ламентом, изложенным в нормативно-технических документах.

Кровь берут у животных из яремной вены стерильным полым ножом
с резиновым шлангом (в условиях мясокомбината) в стерильные бутыли ем-
костью 5 литров. В каждую бутыль вносят по 3 литра крови.

Для полного отделения сыворотки кровь выдерживают при 37°С в те-
чение 30-60 минут, а затем ее ’’обводят” и оставляют при 4°С на 24 часа,
после чего сыворотку сливают и центрифугируют (2500 - 3000 об/мин в те-
чение 20 мин., иногда 2 -3 раза), чтобы получить прозрачную сыворотку. В
промышленных условиях кровь сепарируют или центрифугируют на освет-
ляющих центрифугах.

Качественные сыворотки, в т.ч. от плодов, получают путём взятия
крови в стеклянные или пластиковые флаконы, объемом 0,5 или 1,0 л. После
выдерживания в термостате +37°С 1-2 часа флаконы со сгустком крови цен-
трифугируют при 1500-2000 об/мин. 30 минут, сыворотку сливают в сте-
рильные флаконы и замораживают при - 20°С, либо сразу фильтруют для
получения стерильной сыворотки, которую замораживают. Если в сыворот-
ке имеется примесь эритроцитов, то её следует предварительно отцентрифу-
гировать для осаждения эритроцитов во избежание гемолиза.

В работе с культурами клеток используются сыворотки, подвергну-
тые стерилизующей фильтрации через асбестовые пластины ”СФ” или
EKS—2 или мембранные фильтры, либо стерилизованные ускоренными
электронами, гамма-бета-лучами.

В связи с тем, что одним из основных назначений сыворотки является
способствование росту и размножению клеток, необходимым параметром при
контроле ее качества является проверка биологических свойств по ростовым
свойствам, физико-химический контроль и показатель цитотоксичности.

Перед фильтрацией сыворотки осветляют до состояния оптической
прозрачности. Для обработки необходим предварительный фильтр и два
устройства для гиперфильтрации (схема 1) и набор патронных фильтров
фирмы Pall (рис. 15).

Для предварительной фильтрации требуется несколько фильтрующих
элементов. Фильтровальная мембрана состоит из пакета мембранных
фильтров (1,2 мкм, 0,8; 0,65; 0,45 мкм) с промежуточными дренажными
слоями. По мере прохождения потока последовательно обеспечивается за-
держание частиц от 3-х до 0,2 мкм. Технологически гиперфильтрация про-
изводится в два этапа и в стерильной зоне поток имеет ламинарную форму.
Площадь фильтрующей поверхности каждого элемента должна превышать
требуемую. Стерилизующая фильтровальная мембрана состоит на двух сло-
ев: 0,2+0,2 мкм без разделительного слоя.

Фильтры в сборе подвергаются стерилизации в течение около 45 ми-
нут под давлением порядка 2 бар (0,9 атм.). Для предварительной промывки
применяется диминерализованная вода или изотонический солевой раствор.
Схема 1: а) Держатель фильтра ’’Миллипор”, диаметр 142 мм.
б) Схема сборки деталей фильтродержателя.
Рис. 15. Набор патронных фильтров и фильтродержателей фирмы Pall.

Давление при фильтрации медленно повышается до 0,15 бар, а при
контроле - до 0,3 бар.

Обычно скорости фильтрования превышают общепринятые, так как
процесс должен быть проведен быстро и безостановочно, однако продолжи-
тельность фильтрации в значительной степени зависит от качества продукта
и начального дифференциального давления.
После фильтрации контрольные флаконы сыворотки выдерживают в
термостате в течение 10 дней и проводят затем контроль на отсутствие кон-
таминантов (микоплазм, бактерий, грибов, вирусов), физико-химические
показаткли, ростобеспечивающие свойства в соответствии с нормативно-
техническими документами, в том числе фармстатьями и "Методическими
указаниями”, утвержденными Минздравом СССР (1988).

Контроль стерильности питательных сред, растворов и сывороток

Использование в работе контаминированных сывороток недопустимо. В
связи с этим, их подвергают тщательному и многоэтапному контролю на сте-
рильность. Каждую серию сыворотки, наряду с установлением ростстимулирую-
щей активности и наличия вируснейтрализующих антител, необходимо контро-
лировать на бактериологическую, микоплазменную и вирусную контаминацию.

Во всех случаях при исследовании на обсемененность микроорганизмами
культуральных питательных сред, сывороток и культур клеток используют сле-
дующий минимальный набор бактериологических сред: мясопептонный бульон
(МПБ) с 0,5% глюкозы, кровяной агар, жидкая среда Сабуро, Чапека, тиогликоле-
вая среда, среда Китг-Тарроци, Эдварда-Хейфлика, или ее модифицированный
вариант - 2%-ный раствор мышечного ферментативного гидролизата (ФГМ-С) на
растворе Хенкса с добавлением 10% сыворотки крови лошади или крупного рога-
того скота и 10% дрожжевого экстракта.

Микробиологические высевы на бактерии и микоплазмы помещают
на 14 суток в термостат при 37°С, а среду Сабуро, Чапека на микроскопиче-
ские грибы выдерживают в течение такого же срока при 20-22°С и ведут за
ними повседневное наблюдение.

При отрицательных результатах бактериологических высевов во всех
пробах и отсутствии визуальных признаков обсемененности, контролируе-
мую серию среды, сыворотки или раствора считают стерильной и передают
для использования или до употребления выдерживают в холодильнике (в
холодной комнате) при 4°С в пределах установленных сроков хранения.
Большую партию стерильной сыворотки можно хранить в замороженном
состоянии при температуре - 20°С.

Проверяемую серию выбраковывают, если отмечают рост микроор-
ганизмов на бактериологических средах, опалесценцию или помутнение
сред, сыворотки и растворов, наличие плесени или изменения pH в кислую
сторону более чем на 30% единиц посуды.

Культуральные среды, изготавливаемые в реакторах большой емкости
(100,250,630 и более литров) и стерилизуемые фильтрованием или термиче-
ским способом, контролируют на стерильность методом осаждения возмож-
ных контаминантов на мембранные фильтры ("Владипор”, ’’Миллипор”,
’Тельман”) с размером пор 0,20-0,22 микрон. Для этого в асептических усло-
виях из реактора берут пробы среды по 0,5 литра и пропускают их через сте-
рильные фильтры, чем достигается концентрирование микроорганизмов на
поверхности. По окончании этой процедуры фильтрующую мембрану (или ее
часть) захватывают стерильным пинцетом и накладывают на кровяной агар в
чашке Петри, а также помещают в МПБ с 0,5% глюкозой или в тиоглюколе-
вую среду. Далее исследования проводят по обычной методике.

Ростовые среды компонуют из заранее проверенных и заведомо сте-
рильных материалов (нативная культуральная питательная среда, сыворот-
ка, различные добавки). Тем не менее, после объединения всех компонентов
проводят дополнительный бактериологический контроль готовой среды пу-
тем высева взятых из нее проб на бактериологические среды. Кроме того, в
процессе испытания питательной ценности и токсичности каждой новой
серии ростовой среды, проводимого в течение 5-6 последовательных пасса-
жей на эталонной клеточной культуре (постоянно используемые в лаборато-
рии перевиваемые штаммы и линии клеток с известными свойствами) в ряде
случаев удается выявить обсемененность среды бактериями, плохо или со-
всем не размножающимися на обычных бактериологических средах. Нали-
чие таких контаминантов устанавливают по изменениям в культуре клеток
(незначительная опалесценция среды, замедленный рост клеток, стертость
межклеточных границ и т.д.) и подтверждают с помощью фазовоконтраст-
ной микроскопии или других специальных методов исследований.

При бактериологическом контроле сыворотку (1мл) высевают на
жидкие среды (10мл), использование более высоких доз инокулята (25 мл) и
среды (100 мл) значительно повышает чувствительность метода.

Универсальную полужидкую тиогликоливую среду разливают по 20
мл в 4 пробирки, в каждую из которых вносят 1 мл исследуемого материала
(в толщу среды), 2 пробирки, предназначенных для обнаружения бактерий,
(аэробы или анаэробы), ставят в термостат с температурой 37°С, а 2 пробир-
ки для выявления микроскопических грибов оставляют при 20 - 22°С.

Для лучшего обнаружения аэробных бактерий и микроскопических
грибов в общую схему контроля стерильности рекомендуется дополни-
тельно вводить 1% раствор гидролизата лактальбумина или плацентарно-
эмбрионально-маточного гидролизатов (производится Казанским ветери-
нарным институтом) с 1% раствором глюкозы.

Каждую пробу сыворотки высевают в 4 флакона со средой. Из них поло-
вину инкубируют при 120-22°С, вторую половину ставят в термостат при 37°С.

Микоплазменную контаминацию устанавливают на бульоне Эдварда-
Хейфлика или на его модифицированных вариантах, среде с 2% ФГМ-С с
добавлением 10% дрожжевого экстракта и 100 ед/мл пенициллина.

Для этого высевают 25 мл сыворотки во флаконы со 100 мл бульона. Сле-
дует иметь ввиду, что микоплазмы лучше растут в атмосфере 5% СО и 95% азота.

Для контроля сыворотки на культуре клеток с целью исключения ви-
русной контаминации составляют контрольную систему, которая включает
культуру клеток (перевиваемые штаммы и линии клеток), питательную сре-
ду с исследуемой сывороткой, растворы версена или трипсина (для снятия и
диспергирования клеток). В этой системе неизвестным элементом является
только сыворотка. Другие компоненты должны быть заведомо проверенны-
ми и соответствовать предъявляемым требованиям. Клетки, используемые в
контрольной системе, должны иметь характеристику (морфология, кариоло-
гия, пролиферативная активность), полученную при культивировании в при-
сутствии заведомо хорошей сыворотки; они также должны обладать широ-
ким диапазоном чувствительности к наиболее вероятным вирусам - конта-
минантам (для сыворотки крупного рогатого скота ими являются вирусы
парагриппа-3, ринотрахеита и диарреи). Исследование неизвестной сыво-
ротки следует проводить в течение 5 последовательных пересевов клеток с
использованием одних и тех же компонентов контрольной системы. Клетки
5-го пересева в нативном состоянии, окрашенных препаратах и в метафаз-
ной пластинке исследуют для выявления общих морфологических измене-
ний в культуре, посторонних включений в цитоплазме, нарушений структу-
ры хромосом. Исследования сыворотки на контаминацию миксо-
паромиксовирусами проводят в реакции гемагглютинации и гсмадсорбции.

В таблице 13 представлена сводная информация по контролю качест-
ва сывороток крови различных животных, по данным каталога фирмы ’’Сиг-
ма” (США).

Таблица 13

Показатели тестирования сывороток крови животных
(выборка из каталога фирм "Сигма", 2000 г.).

Показатели	Человек	Плодов коровы	Новорожд. телят до 10 дн.	Телят	Телят и КРС	Лошадь	Цыпленок	Кролик	Коза ।		Свиньи	Овца ।
Стериль- ность	*	*	*	*	*	*	*	*	*	*	*
Вирусы	*	*	*	*	*	*	*	*	*	*	*
Микоплаз- мы	*	*	*	*	*	*	*	*		*	*
Бактерио- фаг	*										
Эндоток- син, МЕ/мл	10	10	100	100	150	10	20	100	20	20	100
Гемогло- бин, мг%		20	20	20	30	20	50	70	20	50	50
Общий бе- лок, гр%	6,4-  7,8	3,0-  4,5	4,5-  6,0	5,0-  8,0	6,0- 8.5	6,0-  7,5	2,5- 4,0	4,5-  6,5	6-7	7,0-  8,5	6,0-  7,5
pH при25°С	7,0- 8	6,7 - 8	7-8	7,0- 8,0	7,0-  8,0	7-  8.2	7,3 -  8	7,0- 8,0	7-8	7,2- 8	7-  8,5
Осмомоляр.	260-  340	260-  340	240-  340	240-  340	260-  340	260-  340	275-  375	260-  340	260-  340	280-  345	Г 260-  340

Примечание: * - отсутствие вирусов, бактерий, микоплазм, бактериофага.

- сыворотки от крупного рогатого скота всех возрастов и плодов исследуют
на отсутствие вирусов ИРТ, ВД, ПГ-3

- сыворотку лошадей на вирус ИН АП.
Вопрос о необходимости прогревания сыворотки (при 56°С в течение
30-45 мин) решается индивидуально с учетом результатов контрольных ис-
следований и требований к данной культуре клеток; прогревание снижает
ростовые свойства сыворотки, однако оно необходимо для инактивации ин-
гибиторов роста клеток, вирусов, микоплазм.

Определение ростстимулирующей активности сыворотки

В качестве тест-культур используют диплоидные штаммы переви-
ваемых линий клеток животных или первичную культуру клеток куриных
эмбрионов. О ростстимулирующей активности сывороток судят по скорости
формирования монослоя, индексу пролиферации, отсутствию в клетках де-
генеративных изменений: изменения общего вида (рисунка культуры, ва-
куолизации, грубой зернистости цитоплазмы).

Контроль ростобеспечевающей способности сыворотки проводят с
использованием культур клеток тестикулов быка (ТБ), легкого плода коровы
(ЛЭК), легкого плода человека (ЛЭЧ) и других культур, предусмотренных
нормативно-технической документацией, регламентом либо фармокологи-
ческой статьей (для каждого типа сывороток).

Для снятия клеток со стекла используют смесь 0,02% раствора версена и
0,25% раствора трипсина в соотношении 9:1. Подсчет клеток производят в ка-
мере Горяева. Сыворотка считается пригодной, если она обеспечивает образо-
вание сплошного монослоя клеток на 3-4 сутки от начала культивирования, не
вызывая в клетках изменений дегенеративного характера (вакуолизация, темная
зернистость) и обеспечивает индекс пролиферации не менее 2-3.

Индекс пролиферации — это отношение числа выросших к коли-
честву засеянных клеток. Снятые клетки пипетируют в определенном объе-
ме среды. Из полученной суспензии отбирают 1 мл, добавляют 1 мл. 0,1%
раствора кристалвиолета, приготовленного на 0,1 м растворе лимонной ки-
слоты и подсчитывают выросшие клетки в камере Горяева. Для подсчета
клеток пользуются следующей формулой:

X = а 111 1111 х в, где

X - общее количество выросших клеток

а - количество клеток в камере Горяева

в - объем суспензии в мл.

111 - коэффициент пересчета

1111 - степень разведения,

х

Индекс пролиферации = —

у

где у - количество засеянных клеток в определенном объеме среды (или
на 1 см2 рабочей поверхности).

х - количество выросших клеток в определенном объеме (или на 1 см2
рабочей поверхности).

Контроль цитотоксичности. Контроль цитотоксичности проводят на
первично-трипсинизированных и перевиваемых клетках. Для этого из пар-
ных матрасов с образовавшимся монослоем сливают среду и заливают не-
разведенной сывороткой из такого расчета, чтобы она полностью закрыла
монослой. Образцы оставляют на 96 часов в термостате при 37°С, после
чего проводят сравнение клеток в испытуемых образцах с контролем. Кон-
тролем служит сыворотка, заранее отконтролированная на цитотоксичность,
с которой проводят те же манипуляции, что и с испытуемой. О цитотоксич-
ности сывороток судят по индексу пролиферации и отсутствию в клетках
дегенеративных изменений: изменения общего вида (рисунка культуры)
отслойки монослоя, вакуолизации, округление клеток и наличие в их цито-
плазме грубой зернистости.

Подсчет индекса цитотоксичности. Клетки снимают раствором вер-
сена с трипсином 9:1 и ресуспендируют в питательной среде. Затем, после
тщательного пипетирования, к 1мл клеточной суспензии вносят 1 мл или 0,5
мл 1% раствора трипанового синего, приготовленного на фосфатном буфере
pH 7,2 - 7,3. Через 5 минут внесения краски подсчитывают количество жи-
вых (неокрашенных) и мертвых (окрашенных в голубой цвет) клеток в ка-
мере Горяева и по формуле определяется количество клеток в 1 мл, учиты-
вая кратность разведения клеточной суспензии раствором краски.

Индекс цитотоксичности (ИЦ) — это отношение числа живых клеток,
сохранившихся после экспонирования их на сформировавшемся монослое ис-
пытуемой сывороткой в течение 96 часов при 37°С, к количеству засеянных
клеток. Сыворотка считается пригодной, если она не вызывает в клетках изме-
нений дегенеративного характера и обеспечивает индекс цитотоксичности для
клеток куриного эмбриона не - менее 0,7, для СПЭВ - не менее 0,5.

Все среды и растворы, используемые для выращивания культур кле-
ток, должны быть стерильными, прозрачными и не иметь осадка. Растворы и
среды, содержащие индикатор фенол-рот, имеют красно-оранжевый цвет.

Питательные свойства вновь приготовленных серий среды и сыворотки
проверяют путем сравнения с заведомо качественными образцами сред и сыво-
роток. Смесь заведомо известных сред и сывороток или вновь приготовленных
и проверенных используют для выращивания культур клеток.

Пригодность среды и сыворотки оценивают, методом исключения по
схеме 2.

Схема 2

Среда	Сыворотка	Рост клеток почки эмбриона коровы в однослойной куль- туре
Известная	Неизвестная	(отмечается время сформиро- вания монослоя)
Неизвестная	Известная	
Известная	Известная	

Среда ГЛ А с 10% сыворотки крупного рогатого скота должна обеспечи-
вать образование монослоя клеток ПЭК в матрасах в течение 4-5 дней при по-
севной дозе 350000-400000 клеток/мл со сменой среды через сутки культивиро-
вания. Концентрация клеток ПЭК и других культур при высеве на пробирке
должна быть на 100—150 тыс.кл/мл выше, чем в матрасах, т.е. 450—500 тыс/мл.
Литература

1.	З.Е.Бердникова, Е М Петручук, Н.В,Шалунова, В.Т.Ночевный. Методические указа-
ния ’'Контроль сыворотки крови крупного рогатого скота на отсутствие вирусов-
контаминантов и микоплазм” Утверждении Минздравом СССР 1988, 18 с.

2.	Н З.Хазипов, К.С.Хаертынов, Т.В.Гальнбек, С.Х.Хаертынов. Методические рекомен-
дации по ускоренному получению сыворотки крови животных для культивирования
клеток и вирусологических исследований методом центрифу-гирования, М.,1985 2 с

3.	Л.И. Хижняк. Разработка технологии изготовления, методов контроля исследования
свойств сыворотки крови плодов овец, Автореферат к.б н. М, 1995 г.

4.	А К.Мусаева, Л.П.Дьяконов. Применение фетальной сыворотки крови овец для цито-
морфологической характеристики культур клеток. Новости науки Казахстана. Серия:
развитие современной науки. Будущее науки, Вып. I Алматы, 1996, с. 65-67. Казах-
ский ГНИИ научно-технической информации.

5.	А.К.Мусасва, К.Ш.Досанов, С.К.Салахова. Способ получения овечьей фетальной
сыворотки крови. А.С Республика Казахстан N53 от 26.08 93.

6.	А.К.Мусаева, Л.П.Дьяконов, Г.М.Строкина и др. НТД на изготовление и контроль
фетальной сыворотки крови овец; жидкой для клеточной биотехнологии Утверждена
21 сентября 1995.

7.	Н.Н.Никольский., А.Д Соркин, А.Б.Соркин. Эпидермальный фактор роста. Л. "Наука'',
1987, 200 с. ил.

8.	Л.П.Дьяконов, А.Ф.Конюхов, Е.Н.Васмлевич, Ю.И.Костина, Л.А.Коротеева,
О.Ш.Расулев. Методические рекомендации по изготовлению и использованию пита-
тельных сред и растворов для микробиологических целей, культивирования клеток и
вирусов, М. 1988,68 с

9.	В.М.Попова. Усовершенствование технологии изготовления и изучение свойств трип-
сина сухого для вирусологических целей. Автореферат дисс. канд.биол,наук.,М.,1999.

10.	НТД, Фармакопейная статья, Сыворотка крови плодов коров, жидкая. Утверждено
4.04.85

11.	НТД, Фармокопейная статья, регламент. Сыворотка крови телят доноров, жидкая для
клеточной биотехнологии. Утверждено 11.10.93.

12.	НТД, Регламент, Сыворотка крови новорожденны* телят (до приема молозива) жид-
кая для клеточной биотехнологии. Утверждена 22.04 89

13.	НТД, Экспериментально-производственный регламент, Сыворотка крови плодов овец
жидкая для клеточной биотехнологии. Утверждено 24.07.90

14.	Н.И.Гурьянов, Усовершенствование технологий получения сывороток крови кур,
бычков, эмбрионов коров и изучение их свойств при культивировании клеток и виру-
сов. Автореферат, к.б.н. Казань,1992

15.	НТД Временная инструкция по изготовлению и контролю фетальной сыворотки кро-
ви овец жидкой для клеточной биотехнологии. Утверждено 21.09.95.

16.	Витакер А.-Среды для культивирования клеток млекопитающих в кн. "Новые методы
культуры животных тканей”.М.,"Мир",1976.

17.	Пригода А., Коренева А. и др.-Конструирование бессывороточных питательных сред
для культивирования клеток млекопитающих.- Биотехнология, 1991, №№ 4,5,6.

18.	Сергеев В.Л. -Репродукция и выращивание вирусов животных. М.,Колос,1976.

19.	Сергеева С.П.- Потребности культур клеток в пластических веществах и некоторые
вопросы конструирования питательных сред. Бюллетень ВИЭВ, №33,М.,1978.

20.	Строкина Г.М.- Биохимические и ростообеспечивающие свойства питательных сред
на основе ГСБМ. Дисс канд.биолог.наук, М.,1986.

21.	Реактивы для биохимии и исследований в области естественных наук. Каталог
"Sigma", Корпорация Сигма-Алдрич,2000.

22.	Наставление по изготовлению и применению наборов сухих питательных сред на
основе стандартных компонентов для культивирования клеток, вирусов и бактерий.
Утверждено ГУВ Госагропрома СССР, 26 августа 1988.

23.	Methods for preparation of media, supplements and substrate for serum-free animal ceil
culture./Cell Cult. Mol/and Cell Bio. Vol.l.).

24.	Методические рекомендации по ускоренному получению сыворотки крови животных
для культивирования клеток и вирусологических исследований методом центрифуги-
рования Рекомендованы секцией "Биология, общая и сравнительная патология жи-
вотных", ВАСХНИЛ, М ,1985.
Глава 5. Вещества межклеточного матрикса и их роль
в культивировании клеток

Изучение факторов адгезии на протяжении вот уже 50 лет, с момента
открытия Мозессоном фибронектина в 1948 году, привело этот раздел к вы-
делению нового направления в биотехнологии клеточных культур а именно:
адгезивные факторы межклеточного матрикса и их роль в создании тканес-
пецифических структур. Помимо фибронектина сюда включены коллагены
всех типов, ламинин, витронектин, тенасцин и др. Значительный интерес
здесь проявляют исследователи по фундаментальным направлениям биоло-
гической науки: биология развития, эмбриогенез, межклеточные взаимодей-
ствия, канцерегенез и ряд др.

Как практическое использование так и научно-исследовательские раз-
работки требуют ясного понимания теоретической концепции: биологическая
специфическая адгезия. Ранее нами была сформулирована, а затем развита
более подробно, формулировка понятия биоспецифическая адгезия, под кото-
рой следует понимать совокупность динамических процессов взаимодействия
экспрессированных в премитотический период рецепторов (интегринов), ок-
ружающих клетку лигандов и субстратов, обеспечивающих ей последова-
тельность эффективного прикрепления, распластывания, пролиферации, диф-
ференцировки и обновления в данном окружении. В этой связи становится
понятным, почему субстраты роста, подложки и окружение клетки являются
определяющими для успешного культивирования клеток особенно при зада-
чах получения нормальных дифференцированных клеток и тканеспецифиче-
ских структур. Состав субстрата клеток определяет их поляризацию, образо-
вание взаимных контактов, клеточную коммуникацию и многое другое, что в
конечном итоге приводит к нормальному росту клеточной популяци до со-
стояния монослоя а в дальнейшем - дифференцированного состояния и про-
дукции биологически активных соединений и собственных факторов межкле-
точного матрикса. Схематическое представление о процессах, происходящих
в начальный период взаимодействия клеток с субстратами in vitro, представ-
лен на рис. 16.1. На схеме представлена теоретически идеальная ситуация ста-
дийности всех процессов при взаимодействии клетки с биоспецифическим
субстратом. В этом случае совершаются последовательно стадии: а) прикреп-
ления и б) распластывания. Началом процесса прикрепления служит время
образования первых фокальных контактов, а его завершением считается вре-
мя полной фокальной адгезии или время, образования такого количества фо-
кальных контактов, которое переводит клетку в следующую стадию распла-
стывания. Началом этой стадии является момент образования ламмелярной
(пластинчатой) структуры, которая, распространяясь в свободное пространст-
во, растягивает клетку на максимально возможное (необходимое) расстояние
и переводит ее в следующую стадию жизненного цикла. Более подробные
сведения о биологии этого процесса приведены в литературе.
-/ 'tsj’.hh ipKf’MLqe’r.HH rroin

лозание

ланмелолоди":

Рис. 16.1. Схема процесса специфической биологической адгезии, состоящей из стадий:
а) прикрепление клеток к субстрату; б) распластывание на двумерном субстрате (Sigma, 1999)

раслластрвуии t

Дальнейшие исследования экстрацеллюлярного матрикса различных тка-
ней ин витро показывают стабильное присутствие основных его компонентов:
коллагенов I, III, и IV типа, клеточного фибронектина, ламинина. Присутствие
других компонентов зависит от вида, возраста, физиологического состояния и др.
факторов, определяющих специфику тканевого роста и развития. На рис. 16.2
представлена схема типичного эпителия с базальной мембраной и экстрацеллю-
лярным матриксом слоя клеток, находящегося под базальной мембраной.

экстрацеллюлярный матрикс

1. Эпителиальные клетки

2. Базальная мембрана

3. Коллаген типа I

Рис. 16.2.Схематическое строение эпителиев:

4.	Фибронектин.

5.	Фибробласты

Современное состояние биологии клеточного культивирования по-
зволяет исследователю ставить сложные задачи изучения межклеточного и
клеточно- субстратного взаимодействия. При этом следует учитывать поло-
жения, которые достаточно прочно утвердились в этой области, а именно:
межклеточные и клеточно-субстратные взаимоотношения in vitro
помимо геномного программирования в большой степени зависят от сигна-
лов со стороны межклеточного матрикса;

ку	льтивируемые клетки достаточно быстро нарабатывают и выде-
ляют в межклеточное пространств свои собственные компоненты, которые и
формируют фенотипический ’’образ” клеток с учетом их генотипа;

вся совокупность факторов, находящихся в окружении клеток
претерпевает состояние структурирования и модификации под воздействием
окружения (протеолиз, полимеризация и др.).

1.	Характеристика основных факторов межклеточного матрикса и
особенности их применения при культивировании клеток in vitro.

Основным требованием при исследовании контролируемого состава
клеточного окружения является бессывороточнос культивирование клеток
или применение заменителей сыворотки. В некоторых случаях, где нс сле-
дует выделение очищенных продуктов из создаваемых моделей, возможно
применение эмбриональных сывороток и сред с пониженным их содержани-
ем до 1 - 2 %. В ряде случаев, когда количество конечного целевого продук-
та ничтожно мало - применяют адгезивные пептиды, заменяющие эффекты
целой молекулы или синтетические аналоги, например RGD- пептид ана-
лог фибронектина или L.-полилизин синтетический адгезивный фактор,
заменяющий действие адгезивных макромолекул.

Приведенные ниже характеристики коммерческих адгезивных факто-
ров позволят в некоторой степени целеполагающим образом использовать
их при разработке экспериментальной и прикладной работы в области био-
технологии культивирования клеток.

Коллаген тип I. содержится в большинстве органов и тканей с преобла-
дающим содержанием в коже, связках и костях. Применяют как фактор прикреп-
ления и фактор адаптации клеток к условиям ин витро. Его вводят, как компонент
в большинство видов подложек для экспрессии морфо-физиологических функций
in vitro При культивировании клеток в монослое используют, как фактор специ-
фической клеточной адгезии КлАд. Применение коллагенового геля для исследо-
вательских целей рекомендовано для изучения механизмов инвазии, фибриллоге-
нсза, получении (очистке моноцитов), культивировании секреторного эпителия и
поперечно-полосатых мышечных клеток птиц.

Фибронектин: семейство высокомолекулярных гликопротеидов /Гп/Фн/.- с
молекулярной массой, равной примерно 400 + 40 кД, синтезируемые всеми типа-
ми клеток, за исключением клеток нервного гребня в виде димера с ассиметрич-
ными полипептидными цепями, объединенными на N-концевой части молекулы
двумя дисульфидными связями. Вновь синтезированный Фн распределяется на
поверхносности Кл в виде так называемого нерастворимого Клфн и в ЭКМ, в том
числе в базальных мембранах, а другая его часть распределяется в многочислен-
ных биологических жидкостях. Описан механизм такого распределения фибро-
нектинов на уровне альтернативного сплайсинга шести матричных РНК, коди-
рующих для обоих типов Фн гомологичную экстрадоменную последовательность
ЕД-Ш, которая у изоформы растворимого Фн имеет дополнительную мРНК, от-
сутствующую в механизме сборки Клфн. Электрофореграмма фибронектина бо-
висного представлена на рис. 17.
Рис. 17. Электрофореграмма фибронек-
тина бовисного в полиакриламидном
геле 7,5% концентрации с разделяющим
гелем 3,5% до обозначения -1.

Количество фибронектина, нанесенного на
стартовую полосу, 10 мкг. Гель не содео-
жит ДСН и редуцирующих веществ. Фиб-
ронектин мигрирует в виде одной гомо-
генной полосы, обозначенной - 2. Время
поного разделения около 12 часов. Ориен-
тиром служит продвижение красителя,
обозначенного цифрой 3.

Ламинин (Лн). Облигатный гликопротеин Бм с исключительно изме-
няющимися функциями. Как фактор Ад используют при культивировании
нервных клеток, для определения подвижности Шванноских клеток, а также
для стимуляции их ростовых и морфо-физиологических свойств in vitro. Такие
же свойства Лн проявляет в области регенерирующих тканей ин витро. Особая
роль принадлежит Лн при формировании и росте эпителия молочной железы,
печеночной ткани, эпителия хрусталика. Он значительно изменяет интенсив-
ность роста некоторых опухолевых клеток меланомы, карциномы и др. Лн ин-
дуцирует ростстимулирующие возможности ряда нормальных лейкоцитов и
используется при создании моделей клеточных культур многослойного эпите-
лия и так называемых мультицеллюлярных комплексов наподобие нормальных
тканей. Его используют при культивировании клеток на различных поверхно-
стях, обладающих пониженной Ад способностью: пластик, различные виды
микроносителей для культивирования клеток в суспензии.

2.	Методики использования факторов адгезии при культивировании
клеток и опыт конкретного их использования.

Раствор желатина 2% стерильный. Представляет собой денатуриро-
ванные типы коллагена, на 90% это тип I коллагена. Изготавливается из ко-
жи телят, поросят и из крысиных хвостов. Для приготовления рабочего раз-
ведения ампулу желатина выдерживают в термостате при 37°С-30 мин. и
разводят в стерильных условиях до необходимой концентрации: обычно 2-3
мг/мл. Наносят на поверхность культуральной емкости из расчета 5-10 мкл/
см“. Дают влаге высохнуть в потоке стерильного воздуха и затем производят
посадку клеток необходимой плотности. В случае приобретения и использо-
вания желатина в порошковой форме - этапы приготовления рабочего рас-
твора выглядят следующим образом:

а)	приготавливают 2% раствор желатина на ультрачистой воде;

б)	производят стерилизацию полученного раствора автоклавировани-
ем при 121°С в течение 30 мин.

в)	после остывания раствора до Т = 37°С его разводят культуральной
средой до концентрации 0,1 - 0,2 мг/мл;

г)	далее поступают как в случае стерильного 2% желатина.
Эти же растворы возможно вносить непосредственно в среду культивиро-
вания, если это отвечает интересам исследования. При использовании этих рас-
творов в новых экспериментах следует применять раститровку концентраций
вверх и вниз по 2 - 3 шага и учитывать адгезивные или деадгезивные свойства по
рекомендуемым методикам. Производитель адгезивных факторов помимо серти-
фиката должен предоставлять подробную методику подготовки и испытания ад-
гезивного фактора, а также литературу и публикации по испытанию.

Применение Коллагена тип I. Чаще всего используют 0,1% раствор из
крысиных хвостов с указанием "стерильный" или "не стерильный". Для испыта-
ния его свойств делают рабочие разведения коллагена из маточного раствора:

а)	разводят коллаген в 0,1М уксусной кислоте до концентрации 0,01%
или 100 мкг/мл. Для этой цели 0,1% раствор коллагена разводят 1:10, и так
до рабочей концентрации.

б)	если раствор не стерильный, то его стерилизуют хлороформом, до-
бавляя в рабочий раствор коллагена хлороформ до 10% концентрации, а за-
тем эту смесь переливают в стерильную открытую культуральную посуду,
которую вставляют на ночь при 4°С в холодильнике абсорбционного типа.
Раствор коллагена нельзя встряхивать. Нарушается его естественный про-
цесс самополимеризации. Стерильной фильтрации коллаген также не под-
вержен но причине большого размера молекул в состоянии полимеризации.
Растворы коллагена нельзя стерилизовать автоклавированием по причине
его денатурации и превращения в желатин;

в)	получив рабочее разведение стерильного коллагена, его наносят на
поверхность культурального сосуда из расчета 6-10 мкг/см2 и оставляют для
высыхания в потоке стерильного воздуха в ламинаре или под ультрафиолето-
вым облучением при 37°С или при комнатной температуре. После высушива-
ния выше приведенными методами поверхность культурального сосуда промы-
вают стерильным раствором культуральной среды без добавок или стерильной
ультрачистой водой под контролем РН до необходимого уровня.

г)	вносят клеточную суспензию.

Применение фибронектина.

Коммерческий препарат фибронектина представляет собой стерильный,
лиофильно высушенный белок с концентрацией 1,5, 10 и т.д. мг в ампулах евро-
стандарта, или стерильный раствор с такой же концентрацией в I мл. Вскрыв ампу-
лу в стерильных условиях, содержимое растворяют если это порошок в стерильной
бидистилированной воде при 37°С до концентрации 0,01 - 0,02 мг/мл. Полученным
раствором заполняют культуральный сосуд из расчета I мл раствора на см2 площади
и дают испариться влаге любым вышеописанным методом. Обработанные сосуды
можно хранить при комнатной температуре в течение недели. При необходимости
использовать рабочий раствор сразу его концентрацию увеличивают до 0,15 мг/мл
и внося в культуральный сосуд из расчета I мл на каждые 10 см2 площади, выдер-
живают при комнатной температуре в течение 30-40 мин. Надосадочную жидкость
сливают, а культуральный сосуд промывают однократно стерильным 0,02М фос-
фатным буферным раствором с pH 7,4 или стерильной культуральной средой. Да-
лее вносят суспензию клеток и культивируют как обычно.

Собственные исследования роли адгезивных факторов и их влияния
на ростовые характеристики клеточных линий из криобанка ВИЭВ: ПТ-80,
ЛЭК,СПЭВ, ТЭК, ЩС, ТЯ, ПЭФ, а также TNH-3T3 из банка РАН (рис. 18)
показывают, что фибронектин увеличивает адгезивный потенциал субстр
тов /БАП/ на 35-45% в концентрациях 4-30 мкг/см2

Нами также было показано, что избыточное содержание фибронекти
подавляет адгезию клеток к субстратам в дозовой зависимости, что в ряде сл
чаев совпадало с высоким содержанием фибронектина в добавляемой сыворс
ке к.р.с. В этой связи предложено в тех случаях, когда сыворотка не обеспеч
вает адгезивных свойств при культивировании в лабораторных условиях и ос
бенно важно - в производственных условиях, помимо других показателей пр
верять ее на содержание фибронектина иммунологическими методами.

си

Рис. 18.
Литература

1.	Гиллен И., Кастелл Ж.З., Гомез Н. Л Концентрация фибронектина в сыворотке крыс
при регенерации печени. 16 конференция ФЕБО,М., 1984,реф. 1У-012,с.225.

2.	Овчарук И.Н., Федотов А.В., Федоров Н.А. Фибронектин.Материалы докладов регио-
нальной научной конференции: "Медицинские проблемы биохимии", Кемерово, 1985,
с. 45 - 47.

3.	Овчарук И.Н., Федотов А.В.., Федоров Н А. Роль печени и РЭС в регуляции уровня
фибронектина плазмы крови. Материалы Всесоюзной конференции: "Актуальные
проблемы гемостаза", М.,1987., с. 199.

4.	Овчарук И.Н.,Федотов А В.Федоров Н.А.. Клиническое значение определения анти-
триптической активности и уровня фибронектина в крови. Тезисы Докладов Всесоюз-
ного совещания: "Медицинские проблемы энзимологии".М.,!986.,с.141.

5.	Строкина Г.М., Дьяконов Л.П., Гальнбек Т.В., Федотов А.В. Конструирование пита-
тельных сред на основе ГСБМ. Тезисы докладов Всесоюзной конференции "Пита-
тельные среды и сыворотки для культивирования клеток." 14-17 окт., 1991, Кольцово,
Новосибирской обл., с. 12.

6.	Светличная Н. И., Любимов А.В. Организация белков внеклеточного матрикса и их
рецепторов в культурах эпителиальных клеток печени крыс на подложках из фибро-
нектина и ламинина. Тезисы докладов Всесоюзного совещания "Актуальные вопросы
клеточной биологии; факторы роста, дифференцировки, злокачественной трансфор-
мации". 17-19 окт. 1989.,Л.,с.66.

7.	Федотов А.В., Дьяконов Л.П.., Розанцев Э.Г и др. Адгезивные свойства модифициро-
ванных коллагеном и фибронектином латексных подложек для культивирования кле-
ток. Тезисы док, III всесоюзной конференции "Культивирование клеток животных и
человека", Пущино , М., 1990, с. 143.

8.	Федотов А.В. и др.,Сравнительная характеристика фибронектитинов животных. Фи-
зико-химические и биологические свойства. Вестник АМН CCCP.-I99I, №2 с.42 - 44.

9.	Федотов А.В, и др., Ферментативный гидролиз фибронектина на иммобилизованной
папаин-сефарозе - 4В. Тезисы докладов Всесоюзной конференции: "Химические пре-
вращения пищевых полимеров ".Калининград, 1991. с. 13.

10.	Федотова А.В., Снежко А.Г., Федотов А.В. и др. Культивирование клеток млекопи-
тающих на биологически активном полимерном субстрате. "Биотехнология" -1992., №
4., с. 15-17.

11.	Черноусов М., Метсис М., Котельянский В. Изучение экстрацеллюллярного матрикса
в живущих фибробластах с флуоресцентным фибронектино'м и желатиной. 16 -ая кон-
ференция ФЕБО.М.,1984, реф.ГУ-013,с225.

12.	Fibronectins. Springer Publisher, 1990.

13.	Horman К. Fibronectin - modulator betwinn cells and connective tissue. Klin. Wochenscnft,
V.60, 1982, p.1263 - 1277.

14.	Fedotova A,Fedotov A., Snezko A., Rozantcev E. Colostrum - a source of fibronectin re-
ceiving. 24-th Int.Dairy Congress 18- 22 sept., 1994,Melbum, Australia,, p/348, ref, 121.

15.	Fedotov A.V., Dyakonov L.P. To the mechanism of cell mobility in vitro on model layers
vith fibronectin. Int.Conferenc:"Cell Interaction in Malignancy, Development and Differen-
tiation. 2-5 April, 1995,Heidelberg,p,38,

16.	Fedotov A.V.Hypotetic mechanism of in vitro motyliti of cells on the fibronectin coated
modell camers.ln.Abst. Intern, Symp.TCOEC, 26-28 June, Kracow, 1997, p.37.

17.	McAbee D., Grinnell F. Fibronectin-mediated binding and fagocytosis of polystyrene latex
beads by hamster kidney cells.J.Cell Biol., 1983,v.97,№ 5,1515-1523.
Глава 6. Первичные культуры клеток

Первичной называется культура, полученная из ткани и выращивае-
мая in vitro до начала субкультивирования, то есть до первого посева. Первич-
ная культура лишена многих клеток, присутствующих в исходной!ткани, по-
скольку не все клетки способны прикрепляться к субстрату и выжить in vitro.
В процессе культивирования клеток происходит относительное обеднение
культуры неделящимися или медленно делящимися клетками.

На первом этапе получения первичной культуры проводят стерильное
удаление фрагмента ткани, органа животного и его механическую или фер-
ментативную дезагрегацию. Ткань измельчается до кусочков объемом до 1 - 3
мм, кусочки ткани отмываются от эритроцитов раствором Хенкса с антибио-
тиками. Для дезагрегации ткани используют трипсин (0,25% неочищенный
или 0,01 - 0,05% очищенный) или коллагеназу (200 - 2000 ед/мл, неочищен-
ная) и др. протеолитические ферменты. Такой способ получения культуры
обеспечивает высокий выход клеток.

Первичные культуры могут быть также получены от кусочков ткани,
объемом 1 мм, которые прикрепляются к поверхности субстрата благодаря
собственной адгезивности или наличию насечек на чашке, или с помощью
сгустка плазмы. В этих случаях будет происходить рост клеток из фрагмен-
тов. Клетки, мигрирующие из эксплантатов могут использоваться для пасси-
рования. Фрагменты ткани (эксплантаты) переносятся на новые чашки, миг-
рирующие клетки могут удаляться пересевом, смесью версена и трипсина, а
остающиеся эксплантаты будут образовывать новые выросты.

6.1.	Методика приготовления однослойной культуры клеток
почки эмбриона коровы (ПЭК)

В целях соблюдения правил асептики вся работа с клеточными культу-
рами производится в стерильных условиях.

Используют эмбрионы 2-7 месяцев, доставленные с мясокомбината в
стерильных бидонах не позднее 2 - 3 часов после убоя животного. Эмбрионы
раскладывают на стерильные эмалированные кюветы, поверхность эмбрионов
фламбируют горящим ватным тампоном, смоченным в спирте, разрезают в
области поясничных позвонков (со стороны спины) и извлекают почки на сте-
рильные чашки Петри.

Подготовка ткани. После извлечения почек следует удалить капсулу,
почку разрезать ножницами вдоль, вырезать почечную лоханку и, поместив
почки в стерильные стеклянные банки, измельчить на кусочки величиной 1 -3
мм. Кусочки ткани тщательно (6-7 раз) отмывают от эритроцитов и обрывков
ткани рабочим раствором Хенкса с антибиотиками (пенициллин и стрептоми-
цин по 500 ед/мл) и помещают в колбу для трипсинизации (колба стерильная,
под резиновой пробкой с магнитом). На 10 - 15 граммов ткани добавляют 150
- 200 мл 0,25% раствора трипсина фирмы "Дифко" pH 7,4 - 7,6, подогретого до
32 - 35°С, и помещают колбу на инкубацию при 37°С на 30 - 40 мин. После
этого колбу с кусочками ткани и трипсином помещают на магнитную мешал-
ку для дезагрегации кусочков.

Дезагрегацию проводят дробно до полного "истощения" ткани: через
каждые 10 - 15 минут перемешивания производят слив суспензированных
клеток в центрифужные флаконы, куда добавляют 5 мл сыворотки на 250 мл
клеточной суспензии для инактивации трипсина, а в колбу с кусочками ткани
заливают свежую порцию трипсина. В течение 5 - 6 экстракций происходит
полная дезагрегация кусочков ткани. Выход клеток из 1 г ткани составляет 40
50 млн. Центрифугирование суспензии производят при 800 - 1000 оборо-
тов/мин. в течение 10 минут в центрифужных флаконах емкостью 0,25 - 0,5 л.

После центрифугирования над осадочную жидкость сливают (выбрасы-
вают), а осадок клеток ресуспендируют в определенном объеме питательной
среды -0,5% ГЛ А без сыворотки с антибиотиками по 100 ед/мл (пенициллин и
стрептомицин). После подсчета клеток суспензию разбавляют до требуемого
объема питательной средой с 10% сыворотки pH - 6,9 - 7,0. Эмбриональная
почечная ткань после измельчения и промывания может быть оставлена на
ночь в растворе 0,1% - ного трипсина в рефрижераторе при t +2 + 4°С. Трип-
синизацию в этом случае проводят на следующий день.

Определение концентрации клеток. Концентрацию клеток определяют
путем подсчета в камере Горяева. К 1 мл пробы суспензии клеток добавляют 1
мл раствора краски (0,1% раствор кристаллвиолета на 0,1 мл растворе лимон-
ной кислоты).

Состав краски для окрашивания клеток в суспензии:

Кристаллвиолет - 100 мг

Лимонная кислота	- 2,4 г

Вода бидистиллированная - до 100 мл

После перемешивания суспензии клеток с раствором красителя, окра-
шенную суспензию вносят в камеру. При этом методе все клетки окрашива-
ются в темный цвет и подсчитывается количество клеток. Подсчет производят
при увеличении микроскопа: окуляр 7, объектив 20, по всей площади камеры,
четырехкратно, каждый раз, заряжая камеру вновь, причем во внимание бе-
рутся только те клетки, которые расположены в камере, в границах, очерчен-
ных сеткой (225 больших квадратах). Подсчитывают только клетки с хорошо
выраженным ядром и неповрежденной цитоплазмой, конгломераты клеток,
количество которых четко не выражено, принимают за одну клетку. Когда
концентрация клеток в суспензии большая и подсчет затруднен, суспензию
предварительно разводят питательной средой до удобной концентрации.

Число клеток в 1 мл среды определяют по формуле:

а хЮОО х 2

Х =-----------

0,9

где: X - число клеток в 1 мл;

а - среднее число клеток в 4х пробах;

1000 - число кубических миллиметров в см;

2 - коэффициент разведения суспензии раствором красителя;

0,9 - объем камеры Горяева в кубических миллиметрах.
Для упрощения подсчета среднее количество клеток в одной сетке ум-
ножают на 2200. Если суспензия предварительно разводилась в 2, 3 или 5 раз,
число клеток в камере умножают на разведение, а затем на 2200. Например,
если среднее количество клеток в камере 140, суспензия предварительно была
разведена тремя объемами среды, то 140 х 3 = 420; 420 х 2200 = 924000 клеток
в одном мл. После подсчета суспензию клеток дополнительно разводят до
нужной посевной концентрации в 1 мл среды. Например, 150 мл суспензии (в
каждом миллилитре по 924000 клеток) необходимо развести до концентрации
350000 в одном мл. Общее количество клеток 924000 х 150 =138600000. Не-
обходимо знать, до какого количества необходимо развести питательной сре-
дой суспензию 138600000 350000 = 396, т.е. объем суспензии доводят до 396
мл и каждый миллилитр такой суспензии будет содержать 350000 клеток. В
соответствии с результатами подсчета общий объем суспензии доводят до
требуемой концентрации клеток добавлением той же питательной среды. В
таблице 14 приведено определение концентрации клеток во взвеси при под-
счете в камере Горяева.

Таблица 14

Определение концентрации клеток во взвеси
при пользовании камерой Горяева.

Среднее количе- ство клеток в сет- ке	Количество кле- ток в 1 мл взвеси	Среднее количе- ство клеток в сет- ке	Количество кле- ток в 1 мл взвеси
30	66660	80	177760
35	77770	85	188870
40	88880	90	199980
45	99990	95	211090
50	111110	100	222200
55	122210	ПО	244420
60	133320	120	266640
50	111110	100	222200
55	122210	ПО	244420
60	133320	120	266640
65	144430	130	288860
70	155540	140	311080
75	166650	150	333310

Жизнеспособность клеток в суспензии определяют с помощью 0,5%
водного раствора трипановой сини (в 100 мл бидистиллированной воды рас-
творяется 500 мг краски, после этого раствор фильтруется через бумажный
фильтр). При этом методе живые клетки не окрашиваются, а мертвые окра-
шиваются в синий цвет.

Процент жизнеспособности клеток в суспензии определяют по формуле:

общее число клеток - число мертвых клеток
-------------------------------------- X 100
общее число клеток
Например: общее количество клеток в I мл 462000, из них число мерт-
вых клеток 23000.

462000 - 23000

------------- х 100 = 95%

462000

Таким образом, жизнеспособность клегок в этой суспензии 95%.

Жизнеспособность клеток в первично-трипсинизированной суспензии
колеблется в пределах 65 - 90%, в суспензии перевиваемых линий при пересе-
вах 95 -100%.

Для приготовления однослойной культуры концентрированную сус-
пензию фильтруют через двухслойный марлевый или однослойный маркизе-
товый фильтр, разводят средой ГЛ А с 10% сыворотки крупного рогатого ско-
та (при посеве pH 6,9 - 7,0; при смене среды 7,2 - 7,3), чтобы в 1 мл содержа-
лось 350 - 400 тысяч клеток, и засевают культуральные сосуды: в 1 л матрасы
-по 100 мл, в 1,5 л матрасы - по 200 мл; в пробирки - по 1 мл. Сосуды закры-
вают резиновыми пробками, на верхней поверхности матраса или пробирки
делают надпись (почка эмбриона коровы, сокращенно ПЭК), с указанием да-
ты посева, и инкубируют при t = 37°С надписью вверх до образования сплош-
ного клеточного слоя. Через 24 - 48 часов следует производить смену среды в
культурах на 0,5% ГЛА, с 10% сыворотки крупного рогатого скота, pH 7,2 -
7,3. Культура ПЭК формирует монослой на 4 - 5 сутки. При смене среды с
культурой ПЭК производят слив культуральной жидкости в стерильные мат-
расы. В этих матрасах отмечено формирование монослоя на 4 - 5 сутки.

Перед заражением вирусом клеточные культуры просматривают мак-
ро- и микроскопически.

Макроскопически - среда в матрасах должна быть прозрачной и иметь
красноватый цвет с легкой опалесценцией.

Микроскопически культура должна покрывать стенку сосуда сплош-
ным пластом фибробластоподобных и эпителиоподобных клеток (рис. 19).

Примечание: так как при фильтрации клеточной суспензии происходит
потеря не менее 1/3 клеток, вместо фильтрации можно использовать отстаи-
вание суспензии и разлив готовой суспензии после подсчета клеток и доведе-
ния ее до необходимого объема.

6.2.	Методика приготовления однослойной культуры клеток
тестикулов бычков (ТБ)

Подготовка ткани.

1.	Вариант.

Тестикулы бычков 2-3 месячного возраста от убойных животных ис-
пользуют не позднее чем через 2-3 часа после убоя животного. Если тестику-
лы доставили вместе с мошонкой, то их, обхватив пинцетами, обжигают над
пламенем горелки. Затем на весу кожу мошонки обжигают тампоном со спир-
том. После чего срезают ножницами кончик кожи мошонки и, подтягивая тес-
тикул, извлекают его.

2.	Вариант.

Тестикулы получают путем кастрации с соблюдением правил асептики
и доставляют в лабораторию в растворе Хенкса с антибиотиками. Извлечен-
ные тестикулы помещают на стерильную чашку Петри, разрезают вдоль бе-
лочную оболочку и вылущивают паренхиму тестикула в стерильную стеклян-
ную банку. Ткань тестикулов тщательно промывают рабочим раствором Хен-
кса с антибиотиками (пенициллин и стрептомицин по 300 сд/мл). Измельчен-
ную ткань промывают раствором Хенкса до просветления жидкости. Клетки,
находящиеся в растворе Хенкса, сливают стерильно в центрифужные стаканы
и центрифугируют при 1000 об/мин. в течении 10 минут. К отмытым кусоч-
кам ТБ добавляют раствор трипсина.

Соотношение ткани и трипсина 1:10 - 1:15. Для трипсинизации тести-
кулов следует использовать 0,15% раствор трипсина на фосфатном буфере.
Дезагрегацию ткани производят щадящим методом, дробно, длительность
каждой экстракции 5	7 минут. Первую экстракцию проводят раствором

трипсина, вторую - только раствором Хенкса, затем повторяют процесс в та-
кой же последовательности.

После центрифугирования надосадочную жидкость сливают, а осадок
клеток ресуспсндируют в питательной среде (0,5% ГЛА с антибиотиками по
100ед/мл), pH 6,9-7,0.

Подсчет клеток тестикулов производят вышеописанным методом.

После подсчета клеток суспензию разбавляют до требуемого объема
питательной средой с 10% сыворотки крупного рогатого скота. Для приготов-
ления однослойной культуры концентрированную суспензию разводят 0,5%
ГЛА с 10% сыворотки крупного рогатого скота до концентрации 200 -300 тыс.
клеток и засевают в культуральные сосуды. Смену среды с 10% сывороткой и
pH 7,0 - 7,2 следует производить через сутки. Монослой формируется на 2 - 3
сутки.

Перед заражением клеточные культуры просматривают макро- и мик-
роскопически, как указано для культуры ПЭК.

6.3.	Приготовление однослойной культуры клеток тестику-
лов поросят (ТП)

Подготовку ткани и дезагрегацию проводят также, как указано для тес-
тикулов бычков.

Приготовление рабочей суспензии клеток. Полученную при дезагрега-
ции ткани концентрированную суспензию клеток ТП разводят ростовой сре-
дой (0,5% ГЛА с 10% сыворотки крупного рогатого .скота и антибиотиками,
pH 6,9 - 7,1) до определенной посевной концентрации и засевают в сосуды для
культивирования. При засеве в пробирки клеточную суспензию разводят так,
чтобы в 1 мл ее содержалось 400 - 500 тыс. клеток, при засеве в матрасы по-
севную концентрацию доводят до 200 - 300 тыс. клеток в 1 мл.

Через 24-48 часов инкубирования образуются островки клеток различ-
ной величины. К этому времени ростовая среда истощается, происходит сдвиг
pH среды в кислую сторону. Поэтому через сутки после засева в целях под-
держания дальнейшего роста клеток производят смену ростовой среды: сли-
вают среду из пробирок и матрасов в стерильных условиях после фламбиро-
вания пробок, и заливают равное количество свежей среды (pH 7,2
7,4).Растущую культуру вновь помещают в термостат.
Сплошной монослой при нормальном росте культуры образуется на 4 -
5 сутки выращивания. Если формирование монослоя затягивается, производят
повторную смену ростовой среды на 5 - 6 сутки после засева клеток.

6.4.	Методика приготовления однослойной культуры клеток
тестикулов плода овцы (4-4,5 месяца) (ТЭО) и тестику-
лов ягненка (ТЯ)

Взятие материала. Плод овцы помещают на стерильный кювет на спи-
ну. Горящим спиртовым тампоном фламбируют кожу тестикулов и кожу ок-
ружающих участков. Асептически с помощью ножниц и хирургического пин-
цета разрезают вдоль кожно-мышечную ткань мошонки и извлекают семен-
ники в чашку Петри. Затем разрезают оболочку семенника и вылущивают
содержимое, помещая его в стерильный химический стакан или банку с рас-
твором Хенкса.

При взятии тестикулов от ягнят 1 - 2 мес. после убоя мошонку перевязы-
вают у основания, отрезают и в таком виде доставляют в лабораторию. Подго-
товку ткани проводят так, как указано для ТБ. Отмытые от крови и слизи кусоч-
ки ткани переносят в колбу для трипсинизации, заливают 0,15% раствором
трипсина и ставят на инкубацию в термостат при t+37°C на 30 мин. Дезагрега-
цию проводят при t +32-35°С на магнитной мешалке, pH трипсина 7,3-7,4. Про-
должительность каждого цикла 7-10 мин.(при увеличении времени одного цик-
ла дезагрегации в надосадке образуется слизистая суспензия, которая не оседает
в процессе центрифугирования. Такую суспензию нужно развести в 2 раза рас-
твором Хенкса, добавить 2-4% сыворотки и только затем центрифугировать).
После каждого цикла дезагрегации суспензию клеток собирают в центрифуж-
ные флаконы, добавляют 2-4% сыворотки и если сразу не центрифугируют, то
сохраняют на холоде (t = 4°С). Трипсинизацию проводят до полной дезагрега-
ции ткани. Клетки из суспензии осаждают центрифугированием при 800
1000об/мин. в течение 10 мин. Полученный осадок ресуспендируют в неболь-
шом объеме питательной среды, подсчитывают количество клеток в 1 мл и раз-
водят суспензию до требуемого объема. Посевная концентрация клеток 200 -
300 тыс/мл для флаконов (матрасов) и 400 тыс/мл для пробирок.

Для выращивания первичной культуры клеток тестикулов ягненка и
эмбрионов овцы используют среды: 0,5% ГЛ А, ИГЛА; 0,25 -0,3% ФГМ -С, к
которым добавляют 10% сыворотки крупного рогатого скота. Смену среды
проводят через сутки. Монослой формируется на 3 - 5 сутки культивирования.

Субкультивирование. Проводят по общепринятым методикам.

Для выращивания субкультур используют смесь питательных сред
ГЛА и ИГЛА (1:1) с 5	10% сыворотки КРС. Коэффициент пересева Г.2.

Обычно субкультура вырастает без смены питательной среды на 3 сутки
культивирования.

6.5.	Методика приготовления однослойной культуры почки
теленка (ПТ)

Используют почки телят до 2	4 месячного возраста, иногда более

старшего возраста, доставленные в стерильной посуде в растворе Хенкса с
антибиотиками (по 500 ед/мл пенициллина, стрептомицина) не позднее 2-3
часов после убоя животного. Почки помещают в стерильный эмалированный
кювет, фламбируют поверхность ватным спиртовым тампоном, удаляют кап-
сулу, срезают ножницами корковый слой каждой доли почки и, поместив его
в стерильную стеклянную банку, измельчают до кусочков величиной 1 - 3 мм.
Кусочки тщательно (6-7 раз) промывают рабочим раствором Хенкса с анти-
биотиками (пеницилинном и стрептомицином по 500 ед/мл) и помещают в
колбу для трипсинизации. На 10 -15 г ткани добавляют 150 200 мл 0,25%
раствора трипсина фирмы ’’Дифко” (pH 7,4 - 7,6), подогретого до t=32-35°C.
Ткань инкубируют в трипсине 40 - 60 мин. при t=37°C, после чего колбу с
кусочками ткани и трипсином помещают на магнитную мешалку для дезагре-
гации кусочков. Дезагрегацию проводят дробно, теплым трипсином; через 15
- 20 минут перемешивания производят слив суспензированных клеток в цен-
трифужные флаконы, а в колбу заливают свежую порцию трипсина; дезагре-
гацию проводят до полного ’’истощения” кусочков. Можно проводить дезаг-
регацию ткани одномоментным способом: кусочки ткани заливают и колбу
помещают на магнитную мешалку на 1 час для дезагрегации, по истечении 1 -
го часа суспензию клеток в трипсине сливают в центрифужные пробирки и
центрифугируют. Центрифугирование суспензии производят в центрифуге К-
70 (или другой центрифуге) при 800 - 1000 об/мин в течении 10 минут, в цен-
трифужных флаконах емкостью 0,25 -0,5 л. После центрифугирования надо-
садочную жидкость сливают, а осадок ресуспендируют в определенном объе-
ме питательной среды с антибиотиками, но без сыворотки. В этот флакон со-
бирают осадки из всех центрифужных флаконов для подсчета клеток.

Для приготовления однослойной культуры концентрированную сус-
пензию фильтруют через 2-х слойный марлевый или однослойный маркизето-
вый фильтр и разводят 0,5% ГЛА с 10% сыворотки крупного рогатого скота
(pH 7,0 -7,1), чтобы в 1 мл содержалось 300 - 400 тыс. клеток и засевают в
культуральные сосуды. Сосуды инкубируют при t+37°C, через 48 72 часа
производят смену среды на 0,5% ГЛА с 10% сыворотки крупного рогатого
скота (pH 7,2 - 7,4). В целях получения дополнительного количества клеток
при смене среды культуральную жидкость с неприкрепившимися клетками
ПТ (слив) высевают в стерильные матрасы для повторного выращивания
культур. В этих матрасах отмечается хороший рост клеток и формирование
монослоя на 6 - 7 сутки. Культура клеток почки теленка формирует монослой
на 5 - 6 сутки (Рис.20).

6.6.	Методика приготовления однослойной культуры клеток
почки эмбриона лошади (ПЭЛ)

Для получения культуры клеток используют почки эмбриона лошади
до 6 - 8 месяцев.

Все остальные операции производят, как указано для эмбрионов коро-
вы. Для выращивания клеток используют среды 199 или Игла с 10% сыворот-
ки крупного рогатого скота. Смену среды проводят на вторые сутки культи-
вирования. Монослой образуется на 4-5 сутки при концентрации клеток 300-
350 тыс.кл/мл. В матрасах со сливами монослойная культура формируется в
те же сроки, что и при высеве первичной суспензии.

6.7.	Методика приготовления однослойной культуры клеток
почки эмбриона свиньи (ПЭС)

Для получения культуры клеток используют почки эмбрионов свиньи,
2 - 3 месяцев.

Подготовку ткани проводят также, как указано для ПЭК.

Для дезагрегации ткани используют смесь 0,25% трипсина и раствора
Хенкса в соотношении Г. 1. Слив суспензированных клеток проводят каждые
7-10 минут.

Монослой формируется на 3-4 сутки культивирования, при посевной
концентрации 400-500 тыс.кл/мл на средах 0,5% ГЛА, Игла в соотношении 3:1
- 5:1 с 10% сыворотки крупного рогатого скота. Смену среды проводят через
24 часа.

Первичная культура клеток почки эмбриона свиньи представлена
клетками смешанного типа - эпителио-и фибропластоподобными (рис.21,22).

6.8.	Методика приготовления однословной культуры клеток
почки эмбриона овцы (ПЭО)

Используют эмбрионы овцы 1-4 месяцев. Все остальные операции по
подготовке эмбрионов и ткани производят, как указано для эмбрионов коровы
и свиньи.

Процесс трипсинизации ткани и определение концентрации клеток
производят так, как указано для тканей эмбрионов коровы. Для приготовле-
ния однослойной культуры почки эмбриона овцы (ПЭО) концентрированную
суспензию клеток после фильтрации через 2-х слойный марлевый фильтр и
подсчета клеток разводят 0,5% ГЛА с 10% сыворотки крупного рогатого скота
или овец (pH 7,0 - 7,2), чтобы в 1 мл содержалось 300 - 400 тыс. клеток и засе-
вают в культуральные сосуды.

Через 24-48 часов культивирования производят смену среды на 0,5%
ГЛА с 10% сыворотки. Культура ПЭО формирует монослой на 3 и 4-е сутки.
При смене среды в культуре ПЭО производят слив культуральной жидкости с
неприкрепившимися клетками в стерильные матрасы. В матрасах со сливом
формируется монослой на 3 и 4-е сутки (рис.23).

6.9.	Методика приготовления однослойной культуры клеток
почки овцы (ПО)

Используют почки овцы от 1 до 9 месячного возраста.

Все операции по подготовке ткани проводят, как указано для почки те-
ленка.

Дезагрегацию ткани проводят 0,25% раствором трипсина, дробно, при t
30-32°С, до полного истощения ткани с продолжительностью цикла 20-30
минут. Суспензию клеток собирают в центрифужные флаконы, добавляя 1-2%
сыворотки для нейтрализации трипсина и хранят в холоде.
Клетки осаждают центрифугированием при 1000 об/мин. в течение 10-
15 минут. Осадок рссуспензируют в питательной среде - гидролизатной или
синтетической, и доводят концентрацию клеток до 300-400 тыежл/мл.

Монослой формируется на питательных средах 0,5% ГЛА, 0,3% ФГМ-
С, 0,5% ГСБМ, а также на гидролизатных средах с добавлением 20-30% син-
тетической среды Игла, 199 и 10% сыворотки крупного рогатого скота на 4-5
сутки культивирования, представлен клетками смешанного типа с преоблада-
нием эпителиоподобных (Рис.24).

6.10.	Методика приготовления однослойной культуры кле-
ток из лимфоидных органов (тимуса, селезенки)

В качестве исходных тканей используют: тимус и селезенку 4-5-
месячных эмбрионов коровы и тимус теленка 3-4-месячного возраста. Для
создания первичных культур отбирают клетки, полученные путем вымывания
из измельченной ткайи, а также в процессе трипсинизации. Для механическо-
го вымывания клеток из измельченной ткани к тканевым кусочкам добавляют
раствор Хенкса, колбу ставят для перемешивания на магнитную мешалку и
оставляют до помутнения раствора Хенкса.

Затем суспензию клеток в растворе Хенкса сливают стерильно в цен-
трифужные стаканы и клетки осаждают центрифугированием при 1000
об/мин в течение 10 минут. Такую процедуру повторяют 2—3 раза. К ос-
тавшейся ткани добавляют раствор трипсина. Трипсинизацию лимфоидной
ткани проводят дробно с помощью 0,25%-ного раствора грипсина на магнит-
ной мешалке при 37°С. Раствор трипсина добавляют к ткани в соотношении
10:1. Продолжительность одного цикла трипсинизации 15-20 минут. Суспен-
зию клеток в трипсине с сывороткой (2-4%) цен грифугируют при 1000
об/мин. Клеточный осадок рссуспендируют в среде Игла с 10% сыворотки.
Посевная концентрация должна составлять 2-4 105 клеток в мл. На вторые су-
тки после засева отмечают рост клеток и в это время производят смену пита-
тельной среды. Сплошной слой клеток при нормальном росте из лимфоидной
ткани образуется на 4-5-й день (рис.25,26).

6.11.	Методика получения первичных культур клеток и суб-
культур из репродуктивных органов самок крупного ро-
гатого скота

Взятие материала и приготовление первичной культуры клеток из тка-
ни эндометрия и плаценты коровы методом трипсинизации.

При убое или вскрытии животного на 3-4 месяце стельности участок
рога матки туго перевязывают скрученным стерильным бинтом и отсекают
стерильным инструментом. Место отреза на отсеченном участке прижигают
шпателем и ткань транспортируют в лабораторию в сухом виде в посуде (сте-
рильной) при 2-4°С. В стерильной комнате фламбируют противоположный от
перевязанного участок. Делают Т-образный неглубокий надрез и отпрспаро-
вывают серозную оболочку. Затем рассекают глубжележащие ткани и через
образовавшееся отверстие иссекают стерильными ножницами фрагменты эн-
дометрия или плаценты, коюрые помещаются в стерильную емкость с рас-
Iвором Хенкса и антибиотиками (пенициллин 200 ед./мл, стрептомицин 200
мкг/мл). Затем несколько раз промывают и измельчают ткань ножницами до
размеров кусочков 1-2 мм. Повторно промывают раствором Хенкса и дезагре-
гируют 6,25% раствором трипсина на магнитной мешалке при 35°С, pH трип-
сина в первых трех циклах трипсинизации устанавливают 7,6. Продолжитель-
ность каждого цикла 30-35 минут для ткани эндометрия и 20-25 мин. для тка-
ни плаценты. Суспензию от первых трех циклов сливают, т. к. она содержит
70—80% нежизнеспособных клеток. В последующих циклах pH трипсина
снижают до 7,3 и время воздействия сокращают на 10— 15 мин. Суспензия
клеток, получаемая при таком режиме дезагрегации, содержит 60-70% жизне-
способных клеток. Центрифугирование для осаждения клеток проводят после
добавления сыворотки крупного рогатого скота 2-4% (при 1000 об/мин.) 15
минут с последующим ресуспендированием осадка и подсчета клеток. Полу-
ченную суспензию клеток эндометрия разводят до концентрации 400 тыс./мл,
а плаценты до 250—300 тыс./мл, разливают в культуральные флаконы в пита-
тельной среде (0,5% ГЛА+Игла 3:1 с 15—20% сыворотки крупного рогатого
скота). Инкубацию проводят при 37°С. Первую смену среды проводят через
24-48 часов культивирования в зависимости от интенсивности роста клеток.

Взятие материала и приготовление первичных культур клеток из
репродуктивных органов плода коровы (по В. Н. Бахареву)

В стерильной комнате эмбрион 3-4-месячного возраста помещают в
стерильную кювету на спине. Горящим спиртовым тампоном фламбируют
кожу в области живота. Вскрытие брюшной полости производят ножницами.
Первый разрез по белой линии живота от мечевидного хряща к лонному сра-
щению. Второй перпендикулярно первому от белой линии к поясничному
отделу позвоночника. Образовавшийся лоскут брюшной стенки помощник
захватывает пинцетом и отводит в сторону. Для взятия материала петли ки-
шечника сдвигают пинцетом или шпателем в сторону, осторожно корнцангом
захватывают тело матки, отсекают его и отделяют от посторонних тканей.
Извлеченную матку (с яичниками и яйцеводами) помещают в стерильную
колбу с раствором Хенкса и антибиотиками (пенициллин 500 ед./мл, стрепто-
мицин 500 мкг/мл) и промывают несколько раз. После этого переносят в сте-
рильную чашку Петри, где при помощи препаровальных игл и глазного
скальпеля отделяют матку, яичник, яйцеводы и освобождают их от остатков
посторонних тканей.

Эмбриональный яйцевод помещают в стерильную чашку Петри, где
под лупой расправляют и разрезают на фрагменты длиной 1-2 мм, которые
помещают на стерильные покровные стекла (18x18 мм) в количестве 3-5 на
одно стекло, покрывают другим покровным стеклом и вносят в стерильные
пенициллиновые флаконы или флаконы Карреля с питательной средой (Иг-
ла+ГЛА с 15—20% сыворотки крупного рогатого скота и антибиотиками
(пенициллин 100 ед./мл, стрептомицин 100 мкг/мл).

Фрагменты эмбрионального яичника после аналогичных манипуляций
помещают либо между двумя покровными стеклами, либо распределяют по
дну флакона Карреля в количестве 15-20 на один флакон (диаметром 5 см) и
после 20-25-минутной экспозиции в термостате осторожно заливают пита-
тельной средой.
Эмбриональную матку или измельчают острыми ножницами в сте-
рильной посуде и фрагменты инокулируют в культуральные флаконы, или из
тела рогов матки с помощью стерильной бритвы готовят поперечные срезы
толщиной около 1 мм и помещают между стерильными покровными стеклами
по одному срезу из тела матки и по 2-3 среза из рогов матки на одно стекло,
после чего стекла с материалом вносят в пенициллиновые флаконы с ростовой
питательной средой.

Наблюдения за ростом первичной культуры из эксплантатов проводят в
течение 2-3 недель периодически, в случае закисления питательной среды
проводят ее смену в соотношении 1:2 к кондиционированной среде (Рис.27).

Приготовление первичной культуры клеток стенки фолликула из
яичника коровы

Приготовление и посев суспензии изолированных клеток. Яичник про-
тирают ватным спиртовым тампоном и прижигают участок капсулы у основа-
ния фолликула, через который в полость фолликула вводят пипетку Пастера и
круговыми движениями проводят скарификацию внутренней стенки фолли-
кула. Фолликулярную жидкость с содержащимися в ней клетками аспириру-
ют и вносят в сосуд с 0,02% раствором версена, который помещают на маг-
нитную мешалку на 10-15 минут при комнатной температуре. Перемешивание
должно быть таким, чтобы суспензия находилась в мягком движении. Необ-
ходимо избегать высокой скорости вращения магнита, т. к. это повреждает
клетки. Центрифугируют при 1000 об/мин. 5 минут после добавления 2-4%
сыворотки крупного рогатого скота.

Суспензию клеток в концентрации 400—500 тыс./мл в среде ГЛА+Игла
с 15-20% сыворотки крупного рогатого скота разливают в культуральные
флаконы и помещают в термостат при 37°С.

Посев фрагментов гранулезы и кумулюса

Полученную при аспирации фолликулов фолликулярную жидкость вно-
сят в стерильную чашку Петри с 0,02% раствором версена и под бинокулярной
лупой при помощи пипетки Пастера, проводят отбор фрагментов гранулезной
мембраны и кумулюса, которые затем переносят на покровные стекла, расправ-
ляют препаровальной иглой, удаляют избыток раствора версена и, накрыв по-
кровным стеклом, помещают в пенициллиновый флакон с питательной средой.

Цитологический контроль атрезии фолликулов

При приготовлении культур клеток из стенки фолликула необходимо
проводить цитологический контроль фолликулярной атрезии, т.к. клетки, взя-
тые из атретического фолликула, имеют ограниченную жизнеспособность in
vitro. Для этого несколько фрагментов гранулезной мембраны помещают на
предметное стекло, фиксируют метанолом и окрашивают азур-эозином по
Романовскому, гематоксилин-эозином или каким-либо другим методом. На-
личие на препарате значительного количества пикнотических ядер свидетель-
сьвуют об атрезии фолликула. В этом случае исследуют другой фолликул.

Пересев культур клеток, полученных из тканей фрагментов матки,
яичника и яйцевода эмбриона

Первый пересев клеток проводят, когда площадь зон роста первичных
клеток составит 50-70% от общей площади культурального флакона. Флакон с
культурой клеток несколько раз встряхивают и отделившиеся эксплантаты
удаляют вместе с питательной средой. Клетки отделяют от стекла способом,
описанным выше, и оставляют для дальнейшего культивирования в этом же
флаконе. По мере сформирования монослоя проводят последующее субкуль-
тивирование.

Для культивирования первичных культур и субкультур клеток из ре-
продуктивных органов используют среду Игла и гидролизат лактальбумина в
соотношении 1:3 с 10—20% сыворотки крупного рогатого скота. Для суб-
культивирования на более поздних пассажах (10—30 пассаж) количество сре-
ды Игла постепенно увеличивают до 50% при том же количестве сыворотки.

6.12.	Методика приготовления однослойной культуры кле-
ток почек новорожденных крольчат

Для приготовления культуры клеток берут 2-5-дневных крольчат.
Крольчат наркотизируют, обезглавливают, отрезают лапки, хвост, снимают
шкуру, а тушки кладут на стерильную салфетку, на кювет. В боксе спинк}
обрабатывают горящим тампоном, вскрывают на уровне поясничных поз-
вонков, извлекают почки и помещают их в стерильную чашку Петри, снима-
ют капсулу и почки измельчают ножницами на кусочки величиной 1-3 мм.
Тщательно отмывают кусочки ткани от остатков крови солевым раствором
Хенкса или фосфатно-буферным раствором и подвергают дезагрегации в
0,25%-ном растворе трипсина. Трипсинизация может быть Дробной или од-
номоментной с предварительной инкубацией кусочков при 37°С 30—40 ми-
нут. Центрифугируют клетки при 800—1000 об/мин в течение 10 минут. По-
сле центрифугирования надосадочную жидкость сливают, а осадок ресуспен-
дируют в питательной среде. Посевная доза клеток - 300-400 тыс. в 1 мл. Для
роста клеток используют среды: Игла, 0,5%-ный гидролизат лактальбумина,
0,3%-ный гидролизат мышечных белков с добавлением 10% сыворотки круп-
ного рогатого скота, pH ростовой среды должен соответствовать: при посеве
клеток 7,0-7,2, при смене - 7,3-7,4. Монослой формируется на 3-4-е сутки. Ан-
тибиотики добавляют в тех же концентрациях, что и для других видов тканей.

6.13.	Методика приготовления однослойной культуры кле-
ток из почек морских свинок

Одно-двухдневных морских свинок наркотизируют, обезглавливают,
обрезают лапки, снимают шкуру, тушки кладут на обожженную парафиновую
доску, прикалывают спиной вверх, фламбируют, разрезают в области пояс-
ничных позвонков, извлекают почки. Почки помещают в чашку Петри, сни-
мают капсулу, разрезают вдоль, удаляя почечную лохань. Кусочки измельча-
ют до величины 1—3 мм, промывают в колбе солевым раствором Хенкса или
буферным раствором до отхождения прозрачных промывных вод. Трипсини-
зируют кусочки ткани в 0,25%-ном растворе трипсина обязательно с предва-
рительной инкубацией ткани в течение 30 минут при 37°С в растворе трипси-
на. Трипсинизацию целесообразно проводить дробно до полного «истоще-
ния» кусочков ткани. Сливы производят через 15-20 минут, центрифугируют
при 800-1000 об/мин, в течение 10-15 минут. Посла центрифугирования надо-
садочную жидкость удаляют, а осадок ресуспендируют в питательной среде.
Посевная доза клеток почки морской свинки 250—300 тыс/мл. Культивируют
клетки в средах: Игла, 0,5%-ном гидролизате лактальбумина, 0,3%-пом гид-
ролизате мышечных белков с 10% сыворотки крупного рогатого скота. Моно-
слой формируется на 3-4-е сутки.

6.14.	Методика приготовления однослойной культуры почек
мыши

Для получения однослойной культуры используют мышей 6-10-
дневного возраста. Мышей наркотизируют, обезглавливают, тушки прикалы-
вают к парафиновой доске спинкой вверх и обрабатывают горящим спирто-
вым тампоном. Вскрывают тушку ножницами на уровне поясничных позвон-
ков и извлекают почки в стерильные чашки Петри. С почек снимают капсулу,
почки измельчают ножницами на кусочки величиной 1—3 мм, измельченную
ткань промывают в стеклянной банке растворим Хенкса, перекладывают ку-
сочки в колбу с магнитом и 0,25%-ным раствором трипсина. Трипсинизация
дробная, желательно с предварительной инкубацией в течение 30 минут. Ка-
ждая экстракция по 10—15 минут, центрифугируют при 1000 об/мин в тече-
ние 10 минут. Надосадочную жидкость сливают, а осадок ресуспендируют в
питательной среде, подсчитывают клетки. Посевная доза клеток почек эм-
брионов мыши 250—300 тыс. в 1 мл. Сплошной монослой формируется на
3—4-е сутки. Для культивирования используют среды: 0,5%-ный гидролизат
лактальбумина, 0,3%-ный гидролизат мышечных белков с 10% сыворотки
крупного рогатого скота (pH 7,0-7,1).

6.15.	Методика получения культур клеток из тканей гусиных
эмбрионов

Для получения культуры клеток используют 12-14-дневные гусиные
эмбрионы (ГЭ). В день трипсинизации их просматривают на овоскопе, отби-
рая яйца с подвижными эмбрионами и с хорошо выраженными сосудами. По-
верхность их обрабатывают йодированным спиртом и обжигают. Ножницами
срезают скорлупу над пугой, пинцетом извлекают эмбрионы и переносят в
чашку Петри. Удаляют головной мозг, глаза, внутренние органы и конечно-
сти. Остальные ткани эмбриона измельчают ножницами на фрагменты вели-
чиной 2-3 мм. Тканевую массу промывают в колбе 4-5 раз раствором Хенкса с
антибиотиками (пенициллина 300 ед/мл, стрептомицина -300 мкг/мл или
канамицин 200 мкг/мл) от слизи и кровяных элементов. Ткань дезагрегируют
0,25% раствором трипсина при постоянном перемешивании на магнитной
мешалке. Продолжительность одного цикла 5-7 минут, процесс трипсиниза-
ции проводят до полного ’’истощения” ткани (6-8 циклов). К ткани добавляют
раствор трипсина в соотношении 1:8-1:10.

Суспензию клеток в растворе трипсина после каждого цикла собирают
в центрифужные флаконы, в которые добавляют 2-3% сыворотки крупного
рогатого скота. Клеточную суспензию центрифугируют при 1000 об/мин в
течение 10 минут. Осадок клеток ресуспендируют в небольшом количестве
среды 199. Подсчет клеток проводят в камере Горяева. Посевная концентра-
ция клеток составляет 600-700 тыс/мл. Клеточную суспензию готовят на среде
199 с 10% сыворотки крупного рогатого скота и фильтруют через 2-3-
слойный марлевый филыр. В питательную среду вносят канамицин по 100
мкг/мл. Образование монослоя наступает на 2-3 сутки.

Выход клеток из 1 г ткани колеблется от 50 до 55 млн. Масса тушки 12-
дневного ГЭ составляет 7-8 г. Средний выход клеток из ткани одного 12-
дневного ГЭ составляет 300-400 млн.

Первичную культуру клеток гусиного эмбриона можно субкультивиро-
вать по общепринятым методикам.

Субкультура, как правило, культивируется в течение 8-10 пассажей.
Концентрация клеток в суспензии при посеве в матрасы составляет 150-200
тыс./мл и в пробирки 300-400 тыс./мл. Субкультура растет без смены пита-
тельной среды. Монослой клеток субкультуры имеет более однородную по-
пуляцию клеток, чем первичные культуры и состоит в основном из фибробла-
стоподобных клеток, обладающих ориентированным ростом. С одного литро-
вого матраса получают «урожай» клеток 40-45 млн. Длительное субкультиви-
рование не оказывало влияния на рост клеток и чувствительность к вирусу
энтерита гусей.

Указанные субкультуры клеток представляют простую удобную мо-
дель для размножения, выделения и идентификации вируса энтерита гусей,
позволяющую проводить вирусологические исследования на протяжении
длительного времени.

6.16.1	. Методика получения культур клеток из тканей куриных эм-
брионов

Куриные и перепелиные эмбрионы могут служить исходным материа-
лом для приготовления различных культур клеток. Чаще всего используют
целые эмбрионы из хозяйств, благополучных по инфекционным заболеваниям
или из СПФ-ферм. Для получения суспензии клеток берут куриные эмбрионы
(КЭ) 9-11-дневного возраста, которые просматривают на овоскопе, отбирая
яйца с подвижными эмбрионами и с хорошо выраженными сосудами. На
скорлупе простым карандашом отмечают воздушное пространство (пугу).
Яйца помещают на металлический лоток, поверхность их протирают йодиро-
ванным спиртом и обжигают спиртовым факелом. Ножницами срезают скор-
лупу над пугой, пинцетом разрывают скорлупу и хорионаллантоисную обо-
лочку, извлекают эмбрионы и переносят в чашку Петри, удаляют голову, ко-
нечности и внутренние органы. Ткань измельчают ножницами на фрагменты
величиной 1-2 мм. Полученную массу 3-5 раз промывают раствором Хенкса с
антибиотиками: пенициллином и стрептомицином по 300 ед/мл от слизи и
кровяных элементов. Ткань КЭ дезагрегируют 0,15%-ным раствором трипси-
на, подогретым до 35°С, с помощью пипетирования или при постоянном пе-
ремешивании на магнитной мешалке. Один цикл трипсинизации продолжает-
ся 10-15 минут. Процесс трипсинизации продолжают до полного «истощения»
ткани. Клеточную суспензию в трипсине центрифугируют при 1000 об/мин 10
минут. Надосадочную жидкость сливают, а осадок клеток ресуспендируют в
питательной среде 0,5%-ного гидролизата лактальбумина в растворе Хенкса с
добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота. Затем суспензию кле-
ток фильтруют через 2 слоя стерильной марли и отбирают 1 мл суспензии для
подсчета клеток. После подсчета клеток взвесь разводят питательной средой
до концентрации 500-600 тыс. в одном мл среды. Средний выход клеток из
ткани одного 10-дневного эмбриона составляет 35-40 млн. Сплошной моно-
слой клеток в культурах образуется через 2-3 дня при температуре 37°С.

Для получения культуры куриной эмбриональной почки используют
18-19-дневные куриные эмбрионы. Яйца помещают на металлический лоток,
поверхность их увлажняют спиртом и обжигают спиртовым факелом. На ту-
пом конце делают надлом, вводят в него браншу ножниц и срезают скорлупу.
Пинцетом извлекают эмбрион, обрезают ножницами желточный мешок, а
эмбрион помещают в чашку Петри (не более 5 эмбрионов в чашку).

При вскрытии следят за подвижностью эмбрионов. Неподвижные эм-
брионы в работе не используются. По одному эмбриону переносят во вторую
чашку Петри, переворачивают спиной вверх и, придерживая пинцетом, нож-
ницами с изогнутыми браншами срезают спинку, захватывая ее с каудального
конца, разрез делают до середины спинки и пинцетом отворачивают наружу
срезанную часть. Другими стерильными ножницами извлекают почки, осто-
рожно отделяя их браншами ножниц. Почки хорошо заметны, имеют харак-
терную зеленовато-желтую окраску и величину 1-1,5 мм. Почечная ткань рас-
полагается по обе стороны от позвоночника в лунках, похожих на песочные
часы. Их помещают в чашки Петри с раствором Хенкса. Инструменты посто-
янно обтирают ватным тампоном, смоченным спиртом, от перьев и крови и
обжигают в пламени горелки. Собрав почки от 30-50 эмбрионов, их освобож-
дают от посторонних кусочков ткани, промывают в 2-3 сменах раствора Хен-
кса и переносят с помощью Пастеровской пипетки с грушей в 200 мл кониче-
скую колбу для трипсинизации и заливают почки подогретым раствором
трипсина. Пастеровской пипеткой с оттянутым концом разрушают их, сильно
пипетируя. Диспергирование ткани проводят на магнитной мешалке в течение
10-15 минут. Суспензию клеток сливают во флаконы с 0,5% ГЛА, центрифу-
гируют 10 мин. при 800-1000 об/мин. Посевная концентрация клеток 700-800
тыс./мл. Сплошной монослой формируется через 48-72 часа. Ростовая среда
0,5% ГЛА с Игла (1:1) с 10% сыворотки крупного рогатого скота.

6.16.2	. Методика получения культур клеток из тканей перепели-
ных эмбрионов

Для получения первичной культуры клеток используют эмбрионы пе-
репелов 8-9-дневного возраста из хозяйств, благополучных по заразным бо-
лезням.

Перед вскрытием поверхность яиц, уложенных в лотки, обрабатывают
2%-ной настойкой иода и фламбируют.

При сильном загрязнении скорлупы яиц их можно обрабатывать по-
гружением на 2 минуты в теплый (40°С) 2,5%-ный раствор дезоксона при по-
следующем выдерживании на воздухе в боксе под стерильными марлевыми
салфетками 30 минут.

Эмбрионы асептически извлекают в стерильные чашки Петри или бан-
ки с раствором Хенкса и антибиотиками (стрептомицин -200мкг/мл, пени-
циллин - 200 ед/мл). У перепелиных эмбрионов удаляют головы. Тушки со-
бирают в сосуд и трехкратно промывают указанным раствором. Перепелиные
эмбрионы не измельчают. Масса тушки составляет в среднем 0,34-0,36 г.
Ткань эмбрионов переносят в плоскодонную колбу емкостью 0,5 л, в которую
заливают теплый 0,15%-ный раствор трипсина. На 40-50 тушек эмбрионов
берут 100 мл раствора трипсина.

Стерильный магнит осторожно до стенке сосуда опускают на дно и
ставят колбу на магнитную мешалку на 20 минут (при однократной трипсини-
зации) или 2 раза до 10 минут (при двукратной трипсинизации). Скорость пе-
ремешивания должна быть такой, чтобы в жидкости над магнитом образова-
лась небольшая воронка и отсутствовала пена.

Через указанное время непрерывного перемешивания в результате фер-
ментативного разобщения клеток наблюдают помутнение раствора трипсина.
Суспензию клеток сливают в центрифужные флаконы, в которые заранее вно-
сят сыворотку КРС из расчета, чтобы концентрация ее составляла 2-3%.

Клеточную суспензию после фильтрации немедленно центрифугируют
10*15 мин при 1000 об/мин. После центрифугирования трипсин сливают, а к
клеточному осадку добавляют ростовую среду, содержащую 10% сыворотки
КРС. В качестве среды используют 0,5% р-р гидролизата лактальбумина и
среду ИГЛА /1:1/. Концентрированную клеточную суспензию собирают в
один флакон, тщательно перемешивают, фильтруют под факелами через сте-
рильный 2-3-слойннй марлевый фильтр.

После подсчета клеток в камере Горяева суспензию клеток разводят
ростовой питательной средой до посевной концентрации 700-800 тыс. в.мл и
расливают в матрасы, флаконы и бутыли, которые помещают в термостат при
37-38°С. Выход клеток из I г ткани в среднем составляет 45-50 млн.

Флаконы и бутыли можно помещать в роллерные аппараты со скоро-
стью вращения 10-12 об/час. Монослой клеток образуется во всех культу-
ральных сосудах на вторые сутки.

Клеточные культуры перед заражением вирусом тщательно контроли-
руют макро- и микроскопически. Необходимо просматривать каждый сосуд с
клеточной культурой. Клеточный слой должай быть сплошным, фибробласты
должны быть характерной веретенообразной формы, без зернистости.

6.17.	Культуры клеток из ткани кишечника

При изучении вирусов, поражающих желудочно-кишечный тракт, и их
взаимодействия с клеткой in vitro наибольший специфический ответ можно
ожидать в том случае, когда применяется ткань наиболее поражаемая при ин-
фекционном процессе. Несмотря на это, культуры клеток из ткани кишечника
недостаточно широко применяются в вирусологической практике, что связа-
но, главным образом, с трудностями, которые возникают при получении и
культивировании клеток кишечника in vitro и обусловлено особенностями
строения и физиологии энтероцитов. Способность клеток кишечника культи-
вироваться in vitro важна для исследований направленных на изучение факто-
ров пролиферации и дифференциации клеток, а также использование их в
качестве модели для изучения ряда вопросов, связанных с особенностями от-
ношения клеток хозяина с возбудителями кишечных инфекций (Жданова Л.Г.,
Грубер И.М., 1965; Сухомлинов Б.Ф. с совт., 1983; Burrill Р.Н., 1981; Ohto
Chikako et al., 1981; Mothes T. et al., 1985; Hahn U. et al., 1988). Клетки кишеч-
ника после изоляции сохраняют достаточную жизнеспособность, но время их
жизни in vitro ограниченно, и часто наступает гибель клеток через несколько
часов после их высева. Harrer D.S. et al (1964) получали энтероциты, воздейст-
вуя на ткань протеолитическими ферментами либо растворами лимонокисло-
го натрия. Harrison D.S., Webster H.L. (1964, 1969), Mackenzie N.M. (1985)
описали физический метод выделения эпителиальных клеток кишечника кры-
сы, используя низкоамплитудную вибрацию в растворе версена.

Положительные результаты получены при применении совместного
использования механического воздействия и протеолитичссих ферментов при
получении суспензии энтероцитов мышей (Kzemski V.C. et al., 1977), эмбриона
человека (Жданова Л.Г., Грубер М.М., 1965), однако получение и длительное
культивирование клеток кишечника затруднительно и только Quaroni A. et al
(1979, 1980) получили штамм эпителиоподобных клеток нормальной слизи-
стой оболочки тонкого кишечника крыс-гнотобиотов. В качестве дезагреги-
рующего фактора и фактора, подавляющего рост фибробластов, применяли
коллагеназу. Рост клеток и выделение клоновых колоний энтероцитов осуще-
ствляли при культивировании их в газовой среде - воздух+5% СО2.

Литературные данные по вопросу получения клеток кишечника из тка-
ни сельскохозяйственных животных немногочисленны. Wilson М., Hofman
A.F. (1974) для выделения эпителиальных клеток из ткани кишечника поросят
использовали низкоамплитудную вибрацию в буферном растворе, а
Mohammed К.A., Sonders J. (1977) получали суспензию клеток кишечника
крупного рогатого скота вымыванием их в фосфатнобуферном растворе при
осторожном перемешивании на магнитной мешалке, а также, используя 0.25%
раствор трипсина. Гололобова М.Т. с соав. (1983), Лобунцова Д.В., Дьяконов
Л.П. с соав. (1984), Субаев Г.Х. с соав. (1986) получили первичные культуры
клеток и субкультуры из ткани кишечника эмбрионов крупного рогатого ско-
та, свиней, овец, используя для выделения клеток различные соотношения
дезагрегирующих растворов,,

Работы Mohammed К.А. (1977), Гололобовой М.Т. с соав. (1983) пока-
зали возможность культивирования ротавируса в культуре клеток кишечника
эмбриона коровы. Культура клеток кишечника эмбриона свиньи чувствитель-
на к вирусу трансмиссивного гастроэнтерита свиней (Гальнбек Т.В., 1992).

Работы зарубежных исследователей свидетельствуют о высокой чувст-
вительности органных культур кишечника к вирусам. Для выращивания энте-
ро- и короновирусов использованы органные культуры кишечника плода че-
ловека, кроликов, кур (Stenhouse А.С. 1970; Dolin et al., 1970), свиней
(Djurickovic S., 1977), мышей (Rubenstein D. et al., 1972), крупного рогатого
скота (Bridger J.C., 1978). Ohto Chikaka et al. (1981) культивировали в орган-
ной культуре клеток кишечника утят и цыплят вирус гриппа.

6.17.1.	Приготовление первичной культуры клеток кишечника
эмбрионов коровы (КЭК)

Подготовка эмбрионов. Работа с клеточными культурами проводится
в стерильных условиях бокса с соблюдением правил асептики.

Используют эмбрионы крупного рогатого скота 3-8 месячного возрас-
та, не позднее 2-3 часов после убоя животного. Плоды раскладывают на сте-
рильные кюветы, тщательно обрабатывают место разреза горящим ватным
тампоном, смоченным в спирте, и разрезают по белой линии в области живо-
та, извлекают тонкий отдел кишечника и помещают в стерильные флаконы.

После извлечения кишечник промывают стерильным раствором Хенкса
с антибиотиками (пенициллин 100 ед/мл и стрептомицин 100 мкг/мл). Затем
кишечник разрезают вдоль стерильными ножницами и вновь промывают сте-
рильным раствором Хенкса до полного просветления надосадочной жидкости.
Кишечник измельчают, размер кусочков 1-2 мм. На 10 г ткани добавляют 100-
150 мл 0,25% раствора трипсина pH 7,4-7,6 с раствором Хенкса 1:1, подогре-
тым до 32-35°С помещают на инкубацию при 37°С на 15 мин. После этого
колбу с кусочками ткани кишечника и трипсином с раствором Хенкса поме-
щают на магнитную мешалку для дезагрегарации ткани. Дезагрегарацию тка-
ни производят щадящим методом, дробно, с продолжительностью цикла 7-10
мин при комнатной температуре. К полученной клеточной взвеси добавляют
4-5% сыворотки крови крупного рогатого скота и центрифугируют при 800-
1000 об/мин в течение 10 минут. Надосадочную жидкость сливают, а осадок
ресуспендируют в питательной среде. В качестве питательной среды исполь-
зуют 0,5% раствор гидролизата лактальбумина в равных соотношениях со
средой Игла с добавлением 15-20% сыворотки крови крупного рогатого скота
и антибиотиков пенициллина и стрептомицина по 100 мкг/мл. После подсчета
клеток, суспензию разбавляют до посевной концентрации, равной 500-600
тыс/клеток в 1 мл.

Суспензию клеток кишечника разливают в культуральные флаконы.
Для повышения адгезивной способности клеток в культуральные флаконы
наливают небольшое количество сыворотки крупного рогатого скота и поме-
щают их в термостат на 3-5 часов и используют для выращивания культуры.
Смену питательной среды проводят через 24-48 часов. Монослой формирует-
ся через 3-5 суток после смены среды (Рис.28). Субкультивирование проводят
по общепринятым методикам с концентрацией клеток 200-250 тыс.кл/мл.

6.17.2.	Приготовление культуры клеток кишечника эмбриона сви-
ньи (КЭС)

Взятие материала. Работу проводят в стерильных условиях с соблюде-
нием правил асептики. Для приготовления культуры клеток кишечника ис-
пользуют эмбрионы свиньи 2-3 месячного возраста, не позднее 3-х часов по-
сле убоя животного. Эмбрионы помещают на стерильные кюветы на спине.
Горящим спиртовым тампоном фламбируют поверхность эмбриона. Вскры-
тие брюшной полости проводят по белой линии живота, извлекают тонкий
кишечник в стерильные флаконы с питательной средой и антибиотиками (пе-
нициллин 100 ед/мл, и стрептомицин 100 мкг/мл).

Подготовка ткани. Ткань тщательно отмывают в растворе Хенкса с
антибиотиками и разрезают на фрагменты 0,2-0,5 см, предварительно разрезав
вдоль. Отмытые кусочки ткани помещают в колбу для трипсинизации и зали-
вают подогретым до 32-35°С раствором версена, смешанным с 0,25% раство-
ром трипсина и Хенкса в равных соотношениях. На 10 г. ткани добавляют 100
мл смеси и помещают на инкубацию в термостат на 10-15 мин при 37°С. По-
сле инкубации колбу с кусочками ткани и дезагрегирующей смесью помеща-
ют на магнитную мешалку. Дезагрегацию проводят дробно с интервалом 7-10
мин при комнатной температуре. Полученную суспензию клеток после добав-
ления 2-4% сыворотки для инактивации трипсина, центрифугируют при 800-
1000 об/мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость сливают, а осадок
хранят до окончания трипсинизации при температуре +4°С в небольшом ко-
личестве питательной среды. Подсчитывают количество клеток и доводят
концентрацию клеток до 300-400 тыс/мл.

Для культивирования клеток кишечника эмбрионов свиней применяют
среды Игла и 0,5% раствор гидролизата лактальбумина в равных объемах с
15-20% сыворотки крупного рогатого скота. Полученную рабочую суспензию
клеток вносят в культуральные сосуды и культивируют в термостате при
37°С. Через 48 часов после прикрепления клеток в матрасах, производят сме-
ну питательной среды. Формирование монослоя происходит на 5-7 сутки
культивирования (Рис.29,30).

Первичная культура клеток КЭС чувствительна к коронавирусу свиней,
возбудителю трансмиссивного гастроэнтерита свиней.

Анализ цитологических препаратов

Первично-трипсинизированные клетки КЭК и КЭС не имеют резких
различий по структуре монослоя и представлены клетками эпителио - и фиб-
робластоподобного типа. На окрашенных препаратах по общепринятой мето-
дике эпителиоподобные клетки имеют полигональную форму, границы кле-
ток плотно прилегают друг к другу. Ядро клеток крупное, округлой формы с
ядрышками. Количество ядрышек от 3 до 7, реже больше. Хроматин ядра
имеет крупносетчатую структуру, цитоплазма - с мелкой вакуолизацией.
Фибробластоподобные клетки имеют вытянутую форму веретена или вытяну-
той пирамиды, удлиненное ядро и многочисленные ядрышки. Величина мито-
тического индекса (МИ) в культуре клеток КЭК изменялась от 5,2 °/оо в пер-
вые дни культивирования до 12,5 700 на 3-4 день роста. Средний митотический
индекс в культуре КЭС равен 6-8 °/OQ.

6.18.	Культура эпидермальных клеток

Кожа является сложным органом тела и состоит из двух частей
эпителиальной и соединительнотканной, которые прочно соединены между
собой. Эпителий кожи называют эпидермисом, а соединительнотканный слой
- дермой. Между эпидермисом и дермой находится базальная мембрана, на
которой расположены клетки базального слоя эпидермиса.

Эпидермис - одна из главных обновляющихся клеточных систем орга-
низма. Известны четыре типа клеток эпидермиса, содержание которых может
изменяться в коже разных участков тела. Большая часть клеток имеет экто-
дермальное происхождение и называется эпидермоцитами (кератиноцитами в
зарубежной литературе).

Клетки эпидермиса образуют 5 слоев: базальный, шиповатый, зерни-
стый, блестящий и роговой.

Основным клеточным компонентом дермы являются фибробласты, ко-
торые синтезируют основной белок дермы - коллаген. Кроме коллагена, фиб-
робласты синтезируют гликозаминогликаны. Фибробластоподобные клетки
не утрачивают подвижность в культуре.
Культура кожной ткани является одной из первых органных культур.
Еще в 1898 году культивировали в асцитной жидкости кусочки человеческой
кожи. Позднее многие исследователи культивировали эксплантаты кожи,
применяя различные способы, причем развитие методов культивирования
кожи шло параллельно развитию общих методов культивирования (Гаврилюк
Б.К. с соавторами, 1988).

В последние годы достигнут значительный прогресс в изучении про-
лиферации и дифференцировки клеток в культуре. Первые успехи в культи-
вировании клеток эпидермиса связаны с именем Грина, который выращивал
эпидермоциты в присутсвии фидерных клеток, в качестве которых были ис-
пользованы фибробласты ЗТЗ (Reinqald J., Ureen Н.,1975). В дальнейшем по-
пытки культивирования были связаны с подбором питательных сред, росто-
вых факторов, подложек, температурного режима и т.д. (Поздняков А.А. с
соавторами, 1985; Баранова С.П. с соавторами, 1987; Терских В.В.,1992; Рыс-
мендеева К.К.,1992). Следует выделить влияние ионов Са ++ на процессы
пролиферации эпидермоцитов в культуре (Tso М.С et al, 1982). При низких
концентрациях внеклеточного Са ++ культуральная среда становится селек-
тивной.

Культуры клеток эпидермоцитов могут быть использованы в вирусоло-
гии и биотехнологии. Отмечена высокая чувствительность культуры клеток
кожи кролика, овцы к вирусу контагиозной эктимы овец. Кроме того, культу-
ра клеток эпидермоцитов может быть применена для исследования таких про-
блем, как: концерогенез, регенерация, взаимодействия вирус - клетка, аллер-
гические реакции, трансплантология и многих других.

Методика получение первично - трипсинизированных культур
клеток, из кожной ткани плодов овцы (КПО) и крольчихи (КПКр).

В работе используют кожную ткань плодов овцы (2,5 - 3 мес.) и плодов
крольчихи (25-27 день беременности). Плоды овцы доставляются в лаборато-
рию в термосах с раствором Хенкса с добавлением антибиотиков.

В лабораторных условиях крольчих предварительно наркотизируют,
вскрывают брюшную полость, извлекают матку с плодами. Матку в стериль-
ных условиях вскрывают и от плодов берут кусочки кожи. Кожу крольчат и
плодов овцы помещают в стерильные стеклянные банки, измельчают до раз-
меров 1 - 3 мм. Измельченную ткань тщательно промывают раствором Хенкса
с антибиотиками (пенициллин и стрептомицин по 500 ед/мл) и помещают в
колбу для трипсинизации. В колбу добавляют смесь 0,25% трипсина и 0,02%
раствора версена в соотношении 2:1 и оставляют на 30 минут для инкубации
при t 18 -20°С. Дезагрегацию проводят дробно при t 30-32°С, до полного ис-
тощения ткани, с продолжительностью цикла 10 минут. Суспензию клеток
собирают в центрифужные флаконы, добавляя 1- 2 % сыворотки для нейтра-
лизации трипсина.

Центрифугирование проводят при 800 - 1000 об/мин. в течение 10 ми-
нут. После центрифугирования надосадочную жидкость сливают, а осадок
клеток рессуспендируют в питательной среде (199 или 199 и ГСБМ ( 1:1) с
10% сыворотки крупного рогатого скота и с антибиотиками (пенициллин
100ед/мл и стрептомицин 100мкг/мл.). Для культивирования клеток, получен-
ных из кожи плода овцы (КПО) может быть использована сыворотка овец.
Для приготовления однослойной культуры клеток суспензию фильт-
руют через 2-слойный марлевый фильтр, разводят ростовой средой до кон-
центрации 250 - 300 тыс.клеток/мл и засевают в культуральные среды.

Смену среды проводят через 24 - 48 часов культивирования. Монослой
формируется на 3 - 4 сутки культивирования.

Первичная культура (КПО и КПКр) представлена гетерогенной попу-
ляцией фибробластоподобных и эпителиоподобных клеток. Субкультивиро-
вание проводят по общепринятым методикам.

Культуры клеток КПО и КПКр используются в производстве вирус -
вакцины против контагиозной эктимы овец на Ставропольской биофабрикс.

6.19.	Культуры клеток из гкани легкого плода коровы

6.19.1.	Методика получения первичной культуры клеток из ткани
легкого плода коровы (ЛЭК) (по Б.П.Аспанидзе с соавт., 1987)

Для получения первичнотрипсинизпрованных культур клеток исполь-
зуют 2-7-мес. плоды коровы не позднее 2-3 часов после убоя животного. Их
раскладывают на стерильные кюветы, фламбируют спиртовым тампоном и
разрезают для изъятия легкого со стороны спины и области грудной клетки.
После извлечения легкое тщательно промывают стерильным раствором Хен-
кса с антибиотиками (пенициллин 100 ед/мл и стрептомицин 100 мкг/мл),
удаляют плевру, бронхи, мелкие кровеносные сосуды и измельчают на кусоч-
ки размером 1-3 мм, 5-6 раз отмывают рабочим раствором Хенкса и помеща-
ют в колбу для трипсинизации. На 10 г ткани добавляют 100-150 мл 0,25%
раствора трипсина, pH 7,4-7,6 с раствором Хенкса (1:1), подогретым до 32
35°С, и помещают на инкубацию при 37°С на 15 мин. После этого колбу с
кусочками ткани и трипсином помещают на магнитную мешалку для дезагре-
гации кусочков легкого.

Дезагрегацию проводят дробно до полного истощения ткани, через ка-
ждые 10-15 мин. перемешивания производят слив суспензированных клеток в
центрифужные флаконы, куда добавляют 4-5% сыворотки крупного рогатого
скота для инактивации трипсина, а в колбу с кусочками ткани заливают све-
жую порцию дезагрегирующего раствора. В течение 4-5 экстракций происхо-
дит полная дезагрегация кусочков ткани. Последнюю экстракцию можно про-
водить в одном растворе Хенкса или питательной среде, что позволяет по-
лучать клетки с преобладанием эпитслиоподобного типа. Выход клеток из I г
ткани составляет 40-50 млн. Центрифугирование суспензии производят при
800-1000 об/мин в течение 10 минут в центрифужных флаконах.

После центрифугирования надосадочную жидкость сливают, а осадок
клеток ресуспсндируют в питательной среде без сыворотки с антибиотиками.
После подсчета клеток суспензию разбавляют до требуемого объема пита-
тельной средой с 10% сыворотки крупного рогатого скота. Посевная конден-
сация равна 300-400 тыс./мл.

Суспензию клегок разливают в культуральные флаконы: в I л матрас -
100 мл, 1,5 л - 200 мл, в 500 мл - 50 мл. Смену ростовой среды проводят через
24-48 ч. Ростовая среда: 0,3% ФГМС, среда 0,05% ГЛА в равных соотношени-
ях со средой Игла или 199, с добавлением 10% сыворотки и антибиотиков.
Культуры инкубируют при +37°С. Монослой формируется через 24-48 ч. по-
сле смены среды.

Первичнотрипсинизированные клетки легкого плода Kopoih>i (ЛЭК) по
структуре монослоя представлены клетками смешанного типа, с преобладани-
ем фибробластоподобных. Монослой с клетками эпител иоподобного типа
рыхлый.

На окрашенных препаратах клетки имеют полигональную форму, гра-
ницы клеток плотно примыкают друг к другу. Ядро клеток крупное, округлой
формы с 2-5 ядрышками. Ядро имеет крупно-сетчатую структуру, цитоплазма
с мелкой вакуолизацией. Фибробластоподобные клетки имеют форму верете-
на или вытянутой пирамиды, удлиненное ядро и многочисленные ядрышки.
Встречаются клетки двух- и трехъядерные (рис. 31.)

При субкультивировании используют концентрацию клеток 200-250
тыс./мл. Монослой 1-5 пассажей формируется через 3-5 суток, затем через 3
суток при пересеве 1:2.

6.19.2.	Получение диплоидного штамма и постоянной линии кле-
ток ЛЭК

Для выведения диплоидного штамма брали первичные культуры и суб-
культуры ЛЭК с преобладанием (70-80%) клеток эпителиоподобного типа. В
дальнейшем либо длительно культивировали клетки без пересева, либо в про-
цессе пересева проводили селекцию на увеличение числа клеток эпителиопо-
добного типа. В первом случае в течение трех недель через каждые 4-5 суток
проводили смену среды на 30-50% с добавлением 3%-го глутамина (5 мл на
500 мл среды) и 10-15% телячьей сыворотки.

В результате длительного культивирования без пересева наблюдали
постепенное отмирание клеток фибробластоподобного типа и во флаконах
оставались клетки эпителиоподобного типа, которые формировали колонии
однородных клеток. Размножение клеток в колониях происходят медленно и
только через 4-5 недель от начала культивирования накопление клеток было
достаточным для пересева в том же флаконе 1:1. Последующие пересевы де-
лали в соотношении 1:2, концентрация клеток составляла 150-200 тыс. кл/мл.

Первые 3-4 пассажа монослой в культуре формировался в течение 2-3
недель. В это время каждые 5-6 дней проводили частичную смену среды на
30-50%. Культура стабилизировалась на 5-6 пассаже.

На окрашенных гематоксилином-эозином препаратах культура клеток
на уровне 5; 10; 20; 25; 45 пассажах представлена преимущественно однород-
ными крупными клетками полигональной формы. Границы клеток плотно
прилегают друг к другу. Ядро клеток крупное, округлой формы, с 3-5 ядрыш-
ками (рис. 32, 33.)

Описанный метод позволял надежно выводить диплоидные культуры
легкого плода коровы с характеристикой клеток эпителиоподобного типа.

Метод длительной селекции эпителиоподобных клеток в процессе пе-
ресевов также оказался пригодным для выведения штамма диплоидных кле-
ток.

Методом длительной селекции уже к 8-10 пассажам удается отобрать
культуры с преобладанием до 98-100% клеток эпителиоподобного типа.
Дальнейшие пассажи, по существу, не вносят изменений в состав кле-
точной популяции и культура сохраняет однородность, т.е. характерные для
эпител ио подобных клеток культурально-морфологические свойства.

В 5-10 пассаже, когда культура еще не стабилизировалась, митотиче-
ская активность составила 8-12%о на 2-3 сутки культивирования по сравне-
нию с 15-45 пассажами, когда культура стабилизировалась и наибольшая ми-
тотическая активность составляла 15-177оона третьи сутки культивирования.

Распределение числа хромосом в клетках диплоидной культуры легко-
го плода коровы колебалось от 46 до 61 хромосомы. На уровне 45 пассажа
модальный класс хромосом диплоидной культуры легкого плода коровы
2п=г60 составил 72-76%.

В процессе дальнейшего пассирования культуры ДЛЭК в пределах 70-
88 пассажей (срок наблюдения) модальный класс хромосом стабилизировался
на уровне 2п=55-56 (до 53,5%), т.е. культура стала гиподиплоидной и превра-
тилась в постоянную клеточную линию - ЛЭК.

Чувствительность культуры клеток ЛЭК к вирусам

Первичная культура клеток ЛЭК, ее субкультуры, диплоидная культура
и постоянная клеточная линия чувствительны к ротавирусу, ВИРТ, ПГ-3
крупного рогатого скота, вирусу ринопневмонии лошадей (Б.П.Аспанидзе с
соавт.,1987).

Титр вируса ринопневмонии лошадей достигал 105'5 - 106’6 ТЦД5о/мл.,
вируса ИРТ 106’6 ТЦД5о/мл., вируса парагриппа -3 - 1О6,0 ТЦДзо/мл., ротави-
руса - 107 0 ТЩЬо/мл (Рис. 90).

Характерными особенностями действия ротавируса была задержка
деления на стадии телофазы и образование околоядерных и вокругядерных
вакуолей в клетках с последующей дегенерацией монослоя по типу апоптоза.

Культура клеток ЛЭК чувствительна и пригодна для первичного выде-
ления вирусов из патологического материала и используется в научной и ди-
агностической работе, рекомендуется для биофабричного производства вирус-
вакцин стационарным и роллерным культивированием.

В серии исследований показана высокая чувствительность культуры
ЛЭК к химическим веществам. Она рекомендована и используется для кон-
троля качества сред и сывороток.

6.20.	Культура клеток сосудов сердца эмбриона коровы

В практике вирусологических исследований преимущественное рас-
пространение получили культуры клеток почечного происхождения - ПЭК
(эмбриона коровы), ПЭС (эмбриона свиньи), ПЭО (эмбриона овцы), ПТ (те-
ленка), СПЭВ (свиньи), ПТ-80 (теленка), МДВК (коровы).

Получение культур клеток из сосудистой ткани представляет опреде-
ленные трудности. Чаще всего получают клетки фибробластоподобного типа
с коротким сроком культивирования.

Для получения диплоидного штамма клеток эпителиоподобного типа
из коронарных сосудов используют эмбрионы крупного рогатого скота 3-8
месячного развития, не позднее 3 часов после убоя животного. Соблюдая все
условия стерильной работы плоды разрезают по белой линии живота и извле-
кают сердце с коронарными сосудами в стерильный флакон. 6-7 раз промы-
вают стерильным раствором Хенкса с антибиотиками (пенициллин и стреп-
томицин по 300 мкг/мл). Затем стерильными ножницами измельчают сердце и
сосуды на мелкие кусочки и переносят в колбу с 0,25% раствором трипсина
pH 7,4-7,6 и 0,02% версена (1:1). Колбу ставят на магнитную мешалку.

Дезагрегацию ткани проводят дробно с интервалом 10-15 мин. при
комнатной температуре. После окончания трипсинизации к клеточной взвеси
добавляют 2-4% сыворотки крупного рогатого скота и центрифугируют при
1000 об/мин, в течение 10 мин., надосадочную жидкость сливают, а осадок
ресуспендируют в питательной среде. В качестве питательной среды исполь-
зуют 0,5% раствор гидролизата лактальбумина со средой Игла в равных соот-
ношениях с добавлением 20-30% сыворотки крупного рогатого скота и анти-
биотиков. После подсчета клеток суспензию разводят до посевной концентра-
ции, равной 500-600 тыс. кл./мл. Концентрацию клеток определяют по обще-
принятой методике. Суспензию клеток разливают в теплые культуральные
флаконы.

Через 48-72 часа проводят смену питательной среды. Монослой фор-
мируется медленно, через 7-10 суток после смены среды и представлен клет-
ками смешанного типа (фибробласто- и эпителиоподобными клетками)
(рис.34).

При субкультивировании используют концентрацию клеток 200-300
тыс/мл. Монослой в первых пассажах субкультивирования образуется через
48-72 часа. После 5 пассажа коэффициент пересева увеличивается до 1:2-1:5.
Таким образом получен диплоидный штамм клеток сосудов сердца коровы,
которые субкультивировали до 15-30 пассажей (рис.35).

Получен перевиваемый штамм клеток эпителиоподобного типа из ко-
ронарных сосудов плода коровы (И.Л.Куликова с соавт.,1990).. Клетки обла-
дают высокой пролиферативной активностью. Индекс пролиферации 4,0-6,0.
Наибольшая митотическая активность наблюдается на вторые сутки культи-
вирования, достигая 23-26 %0.

Культура КСТ (коронарные сосуды теленка) хорошо пассируется, об-
разуя сплошной монослой через 3-4 суток на питательных средах Игла, ГСБМ
(гидролизат белков сыворотки молока), 199 с 10% сыворотки крупного рога-
того скота. Монослой культуры сохраняется в термостате при 37°С на среде
без сыворотки до 15 дней без признаков дегенерации.

Цитологический анализ препаратов КСТ показал, что культура пред-
ставлена в монослое клетками эпителиоподобного типа (рис.36,37). На препа-
ратах, окрашенных гематоксилин-эозином, по Романовскому-Гимза, на ульт-
ратонких срезах эпителиоподобные клетки имеют полигональную форму:
квадратную, прямоугольную, округлую. Клетки плотно прилегают друг к дру-
гу. Ядро крупное, округлой формы с 2-3 ядрышками.

Модальный класс хромосом 2п=60 составляет 82%, что соответствует
диплоидному кариотипу крупного рогатого скота.

Бактерий, микоплазм и грибов в культуре не выявлено. Проведенные
электронномикроскопические исследования подтвердили «чистоту» клеточ-
ной линии. Клетки хорошо сохраняются при глубоком замораживании (-
196°С). Для этого суспензию клеток в концентрации не менее 5x106 в ампуле
замораживали в крио защит ной среде, состоящей на 50% из среды Игла, 40%
сыворотки телят, 10% ДМСО. Через 20 дней хранения в жидком азоте (-
196°С) проводили размораживание культуры клеток и ее рекультивирование.
Через 24-48 часов рекультивирования формировался монослой, не отличав-
шийся от исходной культуры.

Штамм КСТ высокочувствителен к вирусу диареи - болезни слизистых
оболочек (ВД-БС) крупного рогатого скота. Титр вируса достигает 7,0-7,51g
ТЦД50/мл. Причем, цитопатогенное действие вируса появлялось уже через 24
часа, в то время как в первичной культуре ПТ (почка теленка) дегенеративные
изменения наступали лишь на 5 сутки и титр составлял 4,5-5,5 ^ТЦД50/мл
(И.Л.Куликова, С.А.Жидков,1990).

Преимущество этой культуры еще и в том, что она может быть исполь-
зована для выделения вируса из патматериала при проведении диагностиче-
ских исследований.

6.21.	Культуры клеток из ткани щитовидной железы

До начала 80-х годов 20-го столетия для изучения вирусов, выделяе-
мых от свиней, использовали в основном культуры клеток почки плодов сви-
ньи или поросят (первичные или постоянные линии).

С выявлением новых вирусов-возбудителей болезней свиней:
корона-, парвовирусов и других, потребовалось получение наиболее чувстви-
тельных клеточных систем, которые обеспечивали бы высокое накопление
вируса с сохранением его биологических свойств. В этой связи представляло
научный и практический интерес получение культуры клеток из ткани щито-
видной железы животных.

Щитовидная железа довольно сложно устроенный орган внутренней
секреции. Снаружи щитовидная железа покрыта соединительнотканой капсу-
лой, от которой вглубь органа отходят перегородки, разделяющие паренхиму
органа на дольки. Функциональной и структурной единицей щитовидной же-
лезы являются фолликулы. Стенка фолликула состоит из однослойного эпи-
телия, расположенного на базальной мембране. Форма клеток обусловлена
функциональной активностью щитовидной железы и может быть плоской,
кубической или цилиндрической. Внутренняя выстилка фолликулов пред-
ставлена клетками двух типов: фолликулярными клетками (тироцитами) и
околофолликулярными клетками (К-клетками). Последние встречаются реже
и могут располагаться в межфолликулярных прослойках. Функция тироцитов
сводится к синтезу йодосодержащих гормонов тироксина и трийодтиронина.
Гормонообразовательная функция фолликулярных клеток стимулируется ти-
ротропными гормонами.

Апикальная поверхность тироцита образует микроворсинки, выдаю-
щиеся в просвет фолликула. Фолликулярные клетки имеют светлое, цен-
трально расположенное округлое ядро. В цитоплазме базального полюса на-
ходятся хорошо развитые мембранные структуры гранулярной эндоплазмати-
ческой сети, митохондрии с незначительным числом крист. Над ядром или
около него лежит комплекс Гольджи, лизосомы. В цитоплазме имеются мел-
кие капли коллоида.

Околофолликулярные клетки К расположены в стенке фолликулов
или в составе межфолликулярных островков, лежащих в межфолликулярной
соединительной ткани. Это светлые, крупные овальные клетки, апикальная
поверхность которых нс контактирует с полостью фолликула. В К-клетках
хорошо развиты гранулярная эндоплазмотическая сеть, комплекс Гольджи.

Составными клетками межфолликулярных островков также являются
эпителиальные клетки, которые выполняют функцию источника развития
новых фолликулов.

В 1967 г. Witte К.Н была получена первичная культура клеток щито-
видной железы свиньи. Для дезагрегации ткани щитовидной железы требо-
вался длительный срок воздействия трипсином. В дальнейшем по этой мето-
дике получены первичные культуры клеток из ткани шитовидной железы
взрослой свиньи (Лабутинас А.В. с соавг. 1976, дьяконов Л.II. с соавт. 1985.
Thomas Р.С. et al., 1976, Bachman Р.А. et al, 1979) и других видов животных и
человека: цыплят, бычков, овцы, крысы (Avivi A. et al,1982; Payet Y,et el, 1986;
Pic P et al.,1984; Mathersill C. et al, 1985).

Для дезагрегации ткани щитовидной железы барана, собаки использо-
вали раствор коллагеназы (Kerkof Paul R.,1982, Yartner R., et al, 1985 и др.).

Трудность дезагрегации, неоднородность состава получаемых клеток в
первичной культуре сдерживали применение этой клеточной системы в прак-
тике. Имеются сведения о получении постоянных культур клеток из ткани
щитовидной железы человека, птиц, крупного рогатого скота, овцы, крысы
(Kostrauch L. et al. 1984; Fayet Y. et al; 1986).

Для культивирования клеток щитовидной железы используют синтети-
ческие питательные среды Игла или Игла ДМЕМ, 199, F-12 или комбинации
сред ДМЕМ, F-12, МСДВ 104 в соотношении 2:1:1 с 10-15% сыворотки телят
или сыворотки эмбрионов крупного рогатого скота.

Изучение влияния тиротропина, внесенного в питательную среду, на
дифференциацию и пролиферацию клеток щитовидной железы в культуре,
дало противоречивые результаты. В одних случаях тиротропин не стимулиро-
вал фолликулообразование, но вызывал реорганизацию цитоскелета. Появля-
лась ’’разветвленность” цитоплазмы, которая отсутствовала в контроле. ’’Раз-
ветвленность" цитоплазмы - это характерный ответ некоторых типов клеток
на специфическую гормональную стимуляцию, механизм которой сводится к
увеличению внутриклеточной концентрации А МФ с последующим разруше-
нием микрофиламентных связей (Kostrauch L, et al, 1984; Kraiew L, et al, 1988;
Roger P.P. et al, 1984).

Наблюдается разный ответ тиреоцитов на стимуляцию тиротропином.
Он может ингибировать рост нормальных тиреоцитов и тиреоцитов человека
при зобе в культуре клеток и в тоже время является необходимым фактором
роста для тиреоцитов крысы. (Kostrauch L.et al, 1984; Valente et al, 1983).

Внесение тиротропина в культуральную среду первично-
трипсинизированных клеток щитовидной железы собаки увеличивало конеч-
ную клеточную плотность в 2 раза, по сравнению с контролем. По мнению
Eggo М.С. et al. (1984) он не является фактором роста, а влияет на регенера-
цию и дифференцировку клеток.

Морфологически клетки, культивируемые с тиротропином, пред-
ставляли собой кубический эпителий с околоядерными вакуолями. Внесение
инсулина в питательную среду стимулировало размножение клеток, реконст-
рукцию фолликулов щитовидной железы и восстановление их функциональ-
ной активности, но не влияло на дифференцировку.

Т.В.Гальнбек, Л.П.Дьяконовым, Г.Х.Субаевым в 1980-1991 г.г. получе-
ны первичные культуры, субкультуры, диплоидный штамм и постоянные ли-
нии клеток щитовидной железы плода свиней, поросят и взрослых животных,
которые выращивались на среде 199 с 7-10% сыворотки крупного рогатого
скота.	k

В культуре клеток щитовидной железы свиньи преобладает популяция
из эпителиоподобных клеток. Ядра крупные, овальной или округлой формы,
содержат 1-3 ядрышка. Цитоплазма неоднородна, в большинстве клеток со-
держатся вакуоли различного размера. Отмечается наличие клеток, имеющих
2 ядра. Наблюдается формирование структур, напоминающих ’’фолликулы”
ткани щитовидной железы. Клетки, формирующие фолликулярные структуры
цилиндрической или округлой формы, однотипны (рис.38,39).

При электронной микроскопии ультратонких срезов монослоя клеток
щитовидной железы свиньи выявлены в основном два типа эпителиоподоб-
ных клеток, имеющих полигональную или цилиндрическую форму, с четко
выраженным ядром, занимающим до 50% площади цитоплазмы клетки
(Т.В.Гальнбек, Л.П.Дьяконов) (рис.39.). Цитоплазма в основном гомогенная с
множеством относительно равномерно расположенных или в виде скоплений
рибосом, многочисленными митохондриями, шероховатым эндоплазматиче-
ским ретикулумом. На поверхности клетки много микроворсинок. По пери-
ферии цитоплазмы клеток встречаются множество везикулярных структур,
которые, вероятно, содержат секрет. Эти структуры как бы отпочковываются
от периферии клетки в виде отдельных пузырьков или ворсинок, содержащих
подобные пузырьки.

Культура клеток щитовидной железы представляет интерес с точки
зрения возможности использования её в биотехнологии для получения гормо-
нов щитовидной железы - трийодтиронина, тироксина.

В первичных культурах, субкультурах, диплоидной культуре и переви-
ваемых клеточных линиях, полученных Т.В.Гальнбек (1991) регистрируется
продукция тиреоидных гормонов. Содержание трийодтиронина (Т-3) наблю-
далось в интервале от I до 6,1 нмоль/л, а тироксина (Т-4) от 54,4 до 400
нмоль/л и более. (Таблица 15).

Таблица 15

Содержание тиреоидных гормонов в культуральной жидкости
клеток щитовидной железы

Культуры кл. гормоны	Первичная		Субкультуры			Перевиваемая		
	на среде с сыворот- кой	на бессыво- роточной среде	1	2	3	на среде с сыворот- кой	на бессы- вороточ- ной среде
Т-3 нмоль/л	2,16-8,82	0-0,93	0-1,16	2,9-3,5	2,8-3,5	1,5-2,7	3,4-8-3
ТЛ нмоль/л	36,2-364,3	309,1-400	30,3-100	88,9-  297,7	73,6-400	63,7-99,6	>400  -
6.21.1.	Методы получения культур клеток щитовидной железы

6.21.1.1.	Получение первичной культуры клеток ткани щитовид-
ной железы плода свиньи

Подготовка материала: Плоды свиньи доставляют в лабораторию в сте-
рильной емкости сразу после убоя животного. Их раскладывают на стериль-
ные эмалированные кюветы спиной вниз. Перед вскрытием кожу поверхности
шеи и груди фламбируют горящим ватным тампоном, смоченным в спирте.
Извлеченную щитовидную железу помещают в стерильную банку с раство-
ром Хенкса с антибиотиками (пенициллин 200 ед/мл и стрептомицин 200
мкг/мл), промывают несколько раз рабочим раствором Хенкса и измельчают
ножницами до размеров 2-3 мм, переносят в коническую колбу и дополни-
тельно промывают раствором Хенкса до получения прозрачного сливного
раствора. Кусочки ткани заливают смесью растворов трипсина (0,25%) и Вер-
сена (0,02%) в соотношении 2:1 и оставляют на 20-40 мин. при температуре
37°С.

Дезагрегацию ткани щитовидной железы плода свиньи проводят дроб-
но на магнитной мешалке при температуре 30-32°С. Продолжительность од-
ного цикла 40-60 мин. Полученную взвесь клеток сливают в центрифужные
флаконы, добавляют 3-4% сыворотки крупного рогатого скота для прекраще-
ния действия трипсина и центрифугируют 20 мин. при 1000 об/мин. Надоса-
дочную жидкость сливают, а осадок ресуспендируют в небольшом объеме
питательной среды и хранят при температуре 4°С. К оставшейся ткани вновь
добавляют смесь трипсина и версена и ставят на магнитную мешалку для
дальнейшей дезагрегации клеток. Такую процедуру повторяют до полного
’’истощения” ткани.

Ресуспендированные осадки собирают в общий сосуд. Из полученной
взвеси отбирают пробу для подсчета клеток.

После подсчета клеток концентрированную суспензию доводят до ра-
бочей концентрации (350-400 тыс. в I мл для матрасов, 600 тыс. для пробирок)
и высевают в культуральные флаконы. Культивирование клеток проводят в
термостате при температуре + 37°С.

Ростовой средой могут служить смеси сред ГЛА+199, ГЛА+Игла, среда
0,3% ФГМ-С с 10% эмбриональной сыворотки или сыворотки крупного
рогатого скота. Смену среды проводят через 2-3 суток после посева клеток.

Первичная культура клеток щитовидной железы формирует монослой
на 5-7 сутки культивирования и представлена клетками смешанного типа с
преобладанием клеток эпителиоподобного типа. Ядра крупные, округлой или
овальной формы, содержат 1-3 ядрышка. Цитоплазма неоднородна, большин-
ство клеток содержит вакуоли. Отмечено наличие клеток, имеющих 2 ядра.

6.21.1.2.	Получение первичной культуры клеток из ткани щито-
видной железы поросенка (ЩЖП)

Взятие материала, предварительная обработка ткани

Для получения этих культур используют клинически здоровых, хорошо
развитых поросят, желательно I-2-х месячного возраста.

Поросят подвергают убою и обескровливанию перерезкой сонных ар-
терий, раскладывают на эмалированные кюветы спиной вниз. Кожу вентраль-
ной поверхности шеи и груди фламбируют горящим ватным тампоном, смо-
ченным в спирте. После этого делают разрез кожи и подкожной клетчатки по
срединной линии нижней трети шеи, рассекают грудинно-челюстную и гру-
динно-подъязычную мышцы, под которыми каудальнее щитовидного хряща
находят щитовидную железу.

Щитовидную железу отпрепаровывают от окружающих тканей, извле-
кают на стерильную чашку Петри, освобождают (глазными пинцетами) от
жира и соединительной ткани. Затем перекладывают её в стерильную баноч-
ку, содержащую 20-40 мл раствора Хенкса с антибиотиками (пенициллин 400
ед/мл, стрептомицин 400 мкг/мл) и измельчают острыми ножницами до полу-
чения частиц размером 1-3 мм.

Измельченную ткань тщательно (4-7 раз) промывают раствором Хенкса
с антибиотиками.

Тщательно промытые кусочки ткани переносят в трипсинизационную
колбу, заливают подогретой до 30-32°С смесью 0,25% раствора трипсина и
0,02% раствора версена (в соотношении 2:1) и дважды промывают этим дис-
пергентом. Затем в колбу с тканью наливают свежую порцию указанного дис-
пергента из расчета 15-20 мл на 1г ткани. Колбу ставят на магнитную мешал-
ку, регулируют скорость вращения магнита, как указано выше.

Дезагрегацию ткани проводят при комнатной температуре (20-22°С) в
течение 2-4 часов непрерывно. Суспензию клеток в диспергирующей жидко-
сти фильтруют через 2-слойный марлевый фильтр и центрифугируют при 800-
1000 об/мин, в течение 10 мин. Надосадочную жидкость сливают, а осадок
ресуспендируют в 15-20 мл питательной среды (0,5% ГЛА) с антибиотиками,
определяют концентрацию клеток и разводят ростовой средой (0,5% ГЛА
45%, среды Игла - 35%, сыворотки крупного рогатого скота - 20%, пеницил-
лина - 100 ед/мл, стрептомицина - 100мкг/мл) до оптимальной посевной кон-
центрации, а именно: при засеве в пробирки 400-500 тыс/мл, при засеве на
матрасы - 300-400 тыс/мл; pH при посеве -7,0, при смене среды - 7,2-7,4.

Культуры выращивают в термостате при температуре 37°С. Смена рос-
товой среды - через 48-72 часа. Монослой образуется на 4-6 сутки после засе-
ва. Если за этот промежуток времени монослой не сформировался, производят
повторную смену ростовой среды с 10% сыворотки на 4-5 сутки после засева
клеток.

6.21.1.3.	Получение первичной культуры клеток щитовидной желе-
зы свиньи (ЩЖС)

Взятие материала, предварительная обработка ткани

У взрослых свиней щитовидную железу извлекают обычно на мясоком-
бинате или бойне, где трудно создать асептические условия. Извлеченную
железу обжигают над спиртовым факелом, помещают в широкогорлую
стерильную банку с раствором Хенкса, содержащим антибиотики
(пенициллин 400 ед/мл и стрептомицин 400 мкг/мл). Банку над пламенем
горелки закрывают резиновой пробкой и транспортируют в термосе со льдом.

В лаборатории банку с щитовидной железой вынимают из термоса, об-
рабатывают ее поверхность ватой, смоченной 3% раствором едкой щелочи или
спирта, передают в стерильный бокс. Щитовидную железу извлекают из банки,
проводят через пламя горелки, помещают в чашку Петри; пинцетом и ножни-
цами освобождают ее от жира и соединительно-тканных тяжей, измельчают
ножницами на мелкие кусочки (2-3 мм) и переносят в стерильную колбу, где
тщательно (5-7 раз) промывают раствором Хенкса с антибиотиками (пеницил-
лин 200 ед/мл и стрептомицин 200 мкг/мл). Обработку щитовидной железы
можно провести и другим способом. Извлеченную из раствора Хенкса щито-
видную железу освобождают от окружающей ткани и жира. Подготовленную
щитовидную железу опускают в 96% спирт и затем обжигают. Стерильными
инструментами срезают узкую полоску ткани и вырезают внутреннюю непо-
врежденную во время обработки ткань, которую измельчают и переносят в сте-
рильную колбу, где промывают раствором Хенкса с антибиотиками.

Измельченную ткань щитовидной железы свиньи после тщательной
промывай помещают в трипсинизационную колбу с магнитом, заливают дис-
пергентом (20°-22°С) в соотношении 1:20. В качестве диспергирующего аген-
та используют 0,25% раствор трипсина или смесь 0,25% раствора трипсина и
0,02% раствора Версена в соотношении 2:1. Колбу ставят на магнитную ме-
шалку и устанавливают скорость вращения магнита. Через 2 часа переме-
шивания при комнатной температуре (20-22°С) надосадочную жидкость с
клетками, большая часть которых бывает разрушена, удаляют. Ткань в колбе
заливают таким же количеством свежего диспергента, ставят на магнитную
мешалку, установленную в холодильнике, и перемешивают при температуре
4-6°С в течение 16-20 часов. Взвесь клеток и диспергирующей жидкости
фильтруют через 2-х слойный марлевый фильтр и центрифугируют при 800-
1000 об/мин в течение 10 мин. Осадок клеток ресуспендируют в 40-50 мл пи-
тательной среды (0,5% ГЛ А) без сыворотки, определяют в ней концентрацию
’клеток путем подсчета в камере Горяева. Выход клеток из 1 г ткани щитовид-
ной железы свиней колеблется от 15 до 60 млн.

Состав ростовой среды: 0,5% ГЛА-45%, среды Игла-35%, сыворотки
крупного рогатого скота - 20%. Антибиотики добавляют в обычной дозировке.

Посевная концентрация клеток в 1мл суспензии: для пробирок - 400-
500 тыс. для матрасов - 300-400 тыс. Засеянные клеточной суспензией культу-
ральные сосуды закрывают и инкубируют в термостате при 37°С в стационар-
ном положении. Через 72 часа в культурах производят смену ростовой среды.
Образование монослоя наступает на 6-8 сутки. При необходимости делают
повторную смену среды с 10% сыворотки на 4-5 день после засева клеток.

Субкультивирование клеток щитовидной железы проводят по общей
методике.

Субкультуры растут обычно без смены среды, формируют монослой
через 2-3 суток, имеют более однородную популяцию клеток, чем первичные
культуры; по чувствительности к вирусам они не уступают первичным кле-
точным культурам.

6.21.2.	Диплоидная культура клеток щитовидной железы свиньи
(ЩС-ВИЭВ)

Диплоидная культура клеток щитовидной железы свиньи представлена
клетками эпителиоподобного типа. Ядра крупные, овальной или округлой формы,
содержат 2-4 ядрышка. В цитоплазме содержатся вакуоли различного размера.
Рост клеток многослойный. Клетки плотно прилегают друг к другу. Сплошной
монослой образуется на 3-4 сутки культивирования на среде 199 с 10% сыворотки
КРС при посевной дозе 2x10s в мл, без смены среды. Только при культивирова-
нии ЩС-ВИЭВ в роллерных установках требуется дополнительная смена среды
на 3 сутки культивирования. Концентрация клеток для матрасов 1,5x105 в мл,
пробирок 2,0-2,5х105 в мл, в условиях роллера 3,5-5х105 в мл.

Наибольшая митотическая активность диплоидного штамма ЩС-
ВИЭВ отмечена через 48 часов культивирования и составляет 22-25°/оо
(Т.В.Гальнбек, 1991).

Пересев культуры ЩС проводят бесцентрифужным методом по мере
формирования монослоя. Из матрасов с выросшим монослосм удаляют питатель-
ную среду, вносят в них подогретую до 36°С смесь растворов версена (0,02%), с
трипсином (0,25%) в соотношении 9:1 и оставляют на столе на 1-2 мин. Количе-
ство добавляемой смеси зависит от площади поверхности, на которой выращены
клетки. В 1,5 литровый матрас наливают 80 мл смеси, в 1,0 литровый матрас - 50
мл, в 0,5-литровый 30 мл и т.д.). Затем сливают избыток смеси и оставляют не-
большое её количество до полного отделения клеток от стекла.

При дополнительном пипетировании образуется однородная масса.
Коэффициент пересева 1:2-1:3. Клетки, снятые с одного матраса, рассеивают на 2-
3 аналогичных матраса. При обнаружении неравномерного, недостаточного
роста, а также дегенеративных изменений в клетках такие культуры выбрако-
вываются. На случай загрязнения культуры необходимо иметь в запасе резервные
дубликатные культуры, которые сохраняются в термостате, при комнатной
температуре и в замороженном состоянии в условиях жидкого азота (-196°С).

6.21.3.	Постоянная клеточная линия щитовидной железы свиньи

При регулярных пересевах диплоидная линия клеток эпителиоподобного
типа может перейти в постоянную клеточную линию (Т.В.Гальнбек, 1991).

Монослой постоянной линии ЩС представлен эпитслиоподобными
клетками полигональной формы, формируется на средах: 199, 0,3% ФГМС,
0,5% ГСБМ с 10% сыворотки крупного рогатого скота на 3-4 сутки культиви-
рования при посевной концентрации 70-80 тыс. кл/мл. Культура пересевается
с коэффициентом 1 *3-1:5, индекс пролиферации 3,9-4,8.

На окрашенных гематоксилин-эозином цитологических препаратах
культура клеток представлена эпителиоподобными клетками 3-х типов: ок-
руглые, цилиндрические и палигональные. Заметны упорядоченные структу-
ры как бы формирующие ’’фолликулярные структуры”, они цилиндрической
формы, однотипны. Ядро клеток крупное округлой или овальной формы с 1-3
ядрышками. Культура клеток псевдодиплоидная с большим разбросом числа
хромосом от 22 до 60. Модальный класс, представленный 38 хромосомами,
составляет 22% (Т.В.Гальнбек, 1991).

Культуры клеток щитовидной железы свиньи используются для выделе-
ния, идентификации и титрования вирусов - возбудителей заболеваний свиней, а
также для накопления больших количеств вируса и изготовления вирус-вакцин и
диагностикумов. Перед внесением вируса в культуру клеток производят смену
ростовой среды на поддерживающую: ростовую среду из сосудов сливают, моно-
слой клеток отмывают от сыворотки, ополаскивают его раствором Хенкса с анти-
биотиками. В сосуды с клеточной культурой вносят поддерживающую среду,
состоящую из тех же компонентов, что и ростовая, но без сыворотки, и вносят
соответствующий вируссодержащий материал для культивирования.

Если культура со сформировавшимся монослоем не может быть ис-
пользована в течение 1-2 суток, также следует произвести смену ростовой
среды на поддерживающую. По сравнению с почечными культурами в куль-
туре клеток щитовидной железы вирус ТГС накапливался в более высоких
титрах - на 0,5-1 1g в стационарной культуре и на 0,8-1,2 ig в условиях ролле-
ра. Серийное пассирование вируса ТГС в культуре клеток щитовидной желе-
зы не сопровождается снижением иммуногенных свойств вируса.

6.22.	Методика перфузионной трипсинизации

Этот метод предложен группой авторов (А. Н. Курносов и др., 1972) и
имеет ряд преимуществ по сравнению с существующими методами трипсини-
зации. При значительной экономии диспергирующего раствора, фермента
трипсина и сокращения времени трипсинизации выход клеток на 1 г ткани
выше, чем при других методах трипсинизации. Этот метод следует использо-
вать при получении вакцин в условиях биофабрики.

При перфузионном методе необходимо иметь закрытую систему сооб-
щающихся сосудов: 1) сосуд с трипсином; 2) сосуд с рабочим раствором Хен-
кса; 3) сосуд с перфузируемой почкой; 4) сосуд для сбора отмывочной жидко-
сти; 5) воздушные фильтры и зажимы для резиновых трубок, канюли для кре-
пления почки; 6) аппарат для нагнетания растворов в почку («Диспенсор»),
шары Ричардсона или шприцы с насадками.

Системы должны быть соединены в определенной последовательности,
как показано на схеме (рис. 40).

Рис.40. Рабочая схема проведения перфузионной дезагрегации изоли-
рованных почек животных
А сосуд с трипсином; Б - сосуд с рабочим раствором Хенкса; В - аппарат для стерильно-
дозированного розлива жидкости «Диспснсор»; Г - сосуд с перфузируемой почкой; Д - сосуд
для сбора отмывочной жидкости; 1- воздушные фильтры; 2 зажимы; 3 всасывающий
трубопровод; 4 - нагнетающий трубопровод; 5 - почка; 6 - возвратный трубопровод; 7 - за-
жимы па отводящем трубопроводе; 8 - пусковой тумблер; 9 - шприц-дозатор; 10 - регулятор
объема подачи раствора; 11 - регулятор скорости (из монографии Д. Ф. Осидзе)

Изолированную почку, не повреждая капсулы и почечной артерии, от-
препаровывают от жирового сальника, отсекают почечную вену и мочеточ-
ник, оставляя культи длиною 1,5-2 см, после чего в артерию вводят канюлю,
через которую в сосудистую сеть органа нагнетают для промывания сначала
раствор Хенкса, а затем раствор трипсина (0,25%). Время перфузии в зависи-
мости от вида и возраста доноров почек колеблется в пределах 10-35 минут.
Перфузию прекращают, когда под капсулой появляются многочисленные сети
«трещин», что расценивается как показатель достаточного разрыхления па-
ренхимы органа. Затем почки освобождают от капсулы, измельчают на круп-
ные кусочки и дезагрегируют их в питательной среде на магнитной мешалке
или в гомогенизаторе от 2 до 15 минут до полного «истощения» ткани. Кле-
точную суспензию без предварительного центрифугирования фильтруют,
разбавляют до посадочной концентрации и высевают в культуральную посу-
ду. Установлено, что почки разных видов животных в процессе перфузионно-
го диспергирования обладают неодинаковой резистентностью к воздействию
трипсина. При определении оптимальных концентраций диспергента этот
метод позволяет по сравнению со стандартным способом трипсинизации бо-
лее чем в 2 раза увеличить выход жизнеспособных клеток (в среднем
123,1x106 клеток из грамма почечной ткани поросят против 46,5x106 при
стандартной трипсинизации и 118x106 клеток из почек телят), уменьшить
фракцию клеточного детрита, почти в 10 раз сократить расход трипсина и
понизить общие затраты времени на приготовление клеточной суспензии.
Первичные культуры клеток, полученные этим способом, в среднем на сутки
раньше контрольных культур образуют монослой и сохраняют чувстви-
тельность к адаптированным вирусам. Во время перфузии изолированных
почек раствором трипсина увеличивается площадь контакта диспергента с
тканью, значительно ускоряется процесс дезагрегации почечной ткани живот-
ных и уменьшается травматизация клеток, что и обеспечивает увеличение
выхода жизнеспособных_клеток и их лучший рост в культуре.

6.23.	Органные культуры

Органные культуры можно рассмативать как первичные культуры. Ме-
тод органных культур заключается в культивировании фрагментов органов на
границе жидкой (или твердой) и газовых фаз. Питательные вещества прони-
кают в эксплантат путем диффузии снизу. Именно это создает условия для
сохранения органоспецифической дифференцировки эксплантата. Количество
проникающих веществ должно быть достаточным для того, чтобы клеточные
элементы эксплантата были бы способны функционировать подобно тому, как
они функционируют в организме. При органном культивировании из эксплан-
тата не должна формироваться зона роста. Для изучения патогенеза вирусных
инфекций, понимания идущих в организме взаимодействий между вирусами и
клетками этот момент существенен.

Сохранение клетками в органной культуре свойств, присущих им в ор-
ганизме позволяет решить ряд вопросов вирусной цитопатологии и вирусоло-
гии, а также многие химиотерапевтические вопросы (Иржанов С.Д. 1977;
Гайнулина С.М. с соавт. 1990 г.).

Родоначальником метода органных культур являются Strangeways и.
Fell (1926), описавшие способ культивирования зачатков конечностей курино-
го эмбриона на поверхности плазменного сгустка, нанесенного на стенки про-
бирки.

Fell и Robinson (1929) культивировали фрагменты тех же органов на
поверхности сгустка, образованного куриной плазмой и эмбриональным экс-
трактом в часовом стекле со сменой питательной среды каждые 2-3 дня.

Wolff и Haffen (1952) выращивали мезонефрос куриного эмбриона на
поверхности платного субстрата, образованного 1 -2% агаром, эмбриональным
экстрактом, сывороткой и солевым раствором.

Дальнейшая технология получения органных культур основывалась на
применении жидкой питательной среды, на поверхности которой находится
’’плот” В качестве ’’плота” использовалась папиросная бумага, искусственный
шелк, обработанный силиконом, крупнопористая бумага из рейона, милли по-
ровские фильтры.

Trowel (1954) применил специальную мелкосстчатую платформу из не-
ржавеющей стали для поддержания ’’плота” из бумаги, которая позднее заме-
нена слоем 2% агара. В качестве платформы применяли пластмассовые коль-
ца с круглыми отверстиями диаметром 5-7 мм с использованием миллипоров-
ских фильтров (0,6-0,9 мкм), культивирование проводилось при t°36°C с 5%
СО2 (Лурия Е.Л., 1972).

Для культивирования фрагментов в качестве подложки применяли слой
стеклянных бусинок, внесенных в чашку Петри, пенистый фибрин, пенистые
губки из геля, коллагеновые подложки. Размер эксплантатов 1-3 мм. Культи-
вирование ткани проводят в стационарном положении, либо на слегка накло-
ненном вращающемся диске.

Г.П.Жилова с соавторами (1971) предложила применять поперечные
кольцевидные срезы трахеи толщиной в I мм, которые помещают во флаконы
из-под пенициллина. Культивирование проводили на среде 199 (1мл) при t
33°C в стационарном положении с ежедневной сменой среды.

В исследованиях Иржанова С.Д. с соавтр. (1977) открытые пеницилли-
новые флаконы помещали в специальную камеру из оргстекла, которую под-
ключали к системе для непрерывной подачи О2 (98%) и СО2 (2%), что позво-
лило культивировать в течение 10 дней без смены питательной среды экс-
плантаты трахеи плода человека, морских свинок, телят, поросят и др. живот-
ных. С использованием этой системы проводилось культивирование на "пло-
ту”, как тканей эмбрионов, так и взрослых животных (С.Д.Иржанов с соавтр.
1977, Э.И.Лежнев с соавтр. 1990).

Для выращивания органных культур используют те же питательные
среды» что и для культуры тканей. Это синтетические и полусинтетические
питательные среды - Игла МЕМ, ДМЕМ, 199 и др. Но в зависимости от ткани
чаще всего приходится подбирать состав питательной среды.

С целью обогащения в синтетические питательные среды включают
0,1-0,5% альбумина бычьей плазмы, 5-10% куриного эмбрионального экс-
тракта, глюкозу, витамин С, глютамин, гидролизат лактальбумина и т.д. (Ир-
жанов С.Д. с соавт. 1977; Низамов Р.С., 1990). Оптимальный pH среды в зави-
симости от культивируемой ткани составляет 7,2-7,4. Во избежание контами-
нации в среду добавляют антибиотики.

В настоящее время для промышленного культивирования вирусов ис-
пользуется метод тканевых эксплантатов. Так для получения больших объе-
мов антигенов перспективным является метод культивирования вирусов в
суспензии тканевых эксплантатов, размером от 2,5-4,0 мм.

Тканевые эксплантаты получают с использованием электрических мя-
сорубок с определенным диаметром отверстий. На специальной технологиче-
ской линии можно получать высокое накопление вируса трансмиссивного
гастроэнтерита свиней (8,5-9,0 1g ТЦДзо/мл). Система воздушных фильтров
обеспечивает получение стерильного антигена. В качестве питательной среды
используется 1% раствор лактальбумина, а также возможно использование
раствора Хенкса (без СаС12) с поддержанием pH среды 7,0-7,4. Использование
тканевых эксплантатов дало возможность применить двухстадийное культи-
вирование вируса ТГС. При этом выход антигена увеличивается в 1,8 раза без
изменения активности вируса и дополнительного расхода доноров ткани
(Шкабура Ю.П., Ночевный В.Т., 1997; Шкабура Ю.П. 1999).

Метод получения плазменных культур (фиксированных кусочков)

Для приготовления плазмы используют кровь, взятую у птиц из под-
крыльцовой веры, сонной артерии или сердца. Лучше использовать самцов,
так как у них более постоянный уровень кальция в крови и легче проводить
взятие крови из сонной артерии. Предпочтительнее использовать птиц в воз-
расте до года. Кровь набирают шприцем через иглу № 18 или № 19, наливают
в пробирку с гепарином (для предотвращения свертывания крови) в количест-
ве 25 мг% раствора, чтобы его конечная концентрация составляла в крови 0,2
мг% и центрифугируют 5-10 минут при 2500 об/мин. После центрифугирова-
ния плазму отсасывают пастеровской пипеткой, переносят в стерильные, об-
работанные силиконом или парафином пробирки и сохраняют в рефрижера-
торе при 4-6°С. Культивировать кусочки органов можно с применением жид-
ких и твердых питательных сред.

Кусочек органа отсекается, тщательно промывается физиологическим
раствором с антибиотиками, измельчается до величины фрагментов не более
0,5-2 мм в диаметре. В стерильные пробирки или чашки Карреля тонким сло-
ем наносят пастеровской пипеткой плазму и распределяют кусочки ткани на
расстоянии I см, затем сверху на каждый кусочек наносят по капле эмбрио-
нального экстракта. После того, как кусочки зафиксируются, на них наносят
по капле питательной среды, сосуды закрывают резиновой пробкой и по-
мещают в термостат для выращивания. Через 24 часа можно наблюдать зону
роста клеток вокруг каждого кусочка ткани. Культуры можно просматривать
под микроскопом.
Средой может служить: солевой раствор Тироде I часть + I часть сыво-
ротки + 1 часть эмбрионального экстракта; среда с 0,5% гидролизатом лак-
тальбумина и 10% сыворотки; среда с 0,3 %-ным гидролизатом мышечных
белков и 10% сыворотки.

Через 2-3 суток культивирования следует производить смену среды в
культурах: осторожно пастеровской пипеткой отсосать культуральную среду
и внести несколько капель свежей среды.

Бесплазмеиный метод выращивания кусочков ткани. Он является раз-
новидностью метода фиксированных кусочков. При этом используют нагре-
вание стенок пробирки или частичное подсыхание кусочков на поверхности
стекла. Мелкие кусочки ткани, величиной не более 2 мм, распределяют пасте-
ровской пипеткой на поверхности стенки культурального сосуда и через 10-15
минут осторожно вносят в сосуд питательную среду с сывороткой (среду с
ГЛ А или с гидролизатом мышечных белков и 10% сыворотки крупного рога-
того скота). Через 48-72 часа можно наблюдать прикрепление и рост клеток от
кусочков ткани.

Метод выращивания фрагментов ткани в суспензии. Этот метод при-
меняется в вирусологии, особенно при изготовлении вакцин. При этом органы
измельчают на кусочки величиной 2-5 мм и помещают в колбу с магнитом.
Ткань заливают питательной средой и перемешивают на магнитной мешалке
или в Шуттель-аппарате. В этом случае получают не растущую, а пережи-
вающую ткань. При использовании кусочков ткани в суспензии вирус вносят
в систему одновременно.

6.24.	Методики получения и поддержания субкультур

Субкультуры - культуры, получаемые путем пересева (пассажа) клеток
первичных культур в свежую питательную среду. Субкультуры можно полу-
чить практически из всех первичных культур. Экономичность субкультур
очевидна. По чувствительности к вирусу субкультуры не уступают первич-
ным клеточным культурам. При получении субкультур отделять клетки от
стекла можно механическим (соскабливанием пипеткой, скребком) или хими-
ческим путем воздействия смеси 0,02%-ного раствора версена и 0,25 %-ного
раствора трипсина в соотношении 9:1, подогретых до температуры 35-37°С.

Можно использовать центрифужный и бесцентрифужный метод, при
получении субкультур. Предпочтительнее использовать бесцентрифужный
метод, при котором наблюдается меньшая потеря клеток и меньше опасности
контаминировать клетки вирусами и микроорганизмами.

Из сосудов с выросшим клеточным монослоем удаляют ростовую сре-
ду, добавляют смесь, указанную выше, в количестве 50-100 мл в однолитро-
вый матрас, 25-50 мл в 0,5-литровый и 10-15 мл во флаконы емкостью 100 мл
и оставляют флаконы с культурой для взаимодействия с диспергирующим
раствором на 5-10 мин.

После микроскопически видимого набухания клеток диспергирующую
смесь удаляют, оставляя в 1-литровом матрасе 5-10 мл, в 0,1-литровом 1-2 мл
до полного отделения клеток от стенок сосуда.

После полного отделения клеток их тщательно дезагрегируют градуи-
рованной пипеткой до получения однородной взвеси, вносят свежую пита-
тельную среду с 5-10% сыворотки крупного рогатого скота, разливают с?
пензию в сосуды для выращивания и помещают в термостат. Через 2-3 сут
субкультура формирует монослой. Субкультура, как правило, культивирует
в течение 5-8 пассажей. Легко субкультивируются клетки первичных культ
ПТ, ПЭК, ТБ, ПЭО и ПЭЛ. Для их выращивания чаще используется сре,
ГЛА с 10% сыворотки крупного рогатого скота, могут применяться и друп
среды: Игла, 199 и их смеси. При пересеве культур на матрасы берется козе
фициент 1:2, а при пересеве на пробирки -1:1.

Концентрация клеток в суспензии при посеве в матрасы составляет 5(
75 тыс/мл и в пробирки 100-120 тыс/мл; обычно субкультура вырастает бе
смены питательной среды. Монослой клеток субкультуры имеет более одне
родную популяцию клеток, чем первичные культуры (рис.41,42).

Литература

1.	Баранова С.П., Вихреев Б.С., Малахов С.В. и др. ’'Культивирование эпителиальных
клеток кожи человека” Цитология, 1987, номер 9.стр.29.

2.	Гаврилюк Б.К., Рочев Ю.А., Николаева Т.Н. в кн. "Культура клеток и реконструкция
ткани (на примере кожи), Пущино, 1988.

3.	Гальнбек Т.В. Культуры клеток щитовидной железы и кишечника свиньи и их ис-
пользование в вирусологии и биотехнологии. Автор.дисс. к.б.н. М. 1991.

4.	Гололобова М.Т. Лобунцова Д.В., Гальнбек Т.В., Плешанова Г.Ю. Опыт
культивирования клеток кишечника эмбрионов животных. Бюлл., ВИЭВ, Москва,
1983, вып. 49, с. 18-20.

5.	Дьяконов Л.П, Субаев Г.Х., Гальнбек Т.В. и др. Методические рекомендации по по-
лучению и культивированию клеток из щитовидной железы и других органов свиньи,
М.,1985.

6.	Дьяконов Л.П., Гололобова М.Т., Лобунцова Д.В., Гальнбек Т.В. и др. Методические
рекомендации по культивированию первичных культур, субкультур и органнных куль-
тур из ткани кишечника плодов крупного рогатого скота и свиней. Москва, 1984 г.

7.	Дьяконов Л.П., Глухов В.Ф., Поздгняков А.А., Денисенко Г.Ф., Калмыкова Т.П. Куль-
тивирование клеток и тканей животных. Учебно-методическое пособие. Ставрополь,
часть 1,1986,96с. и часть 2,1988,96с.

8.	Дьяконов Л.П., Бахарев В.Н. Методические рекомендации по получению и субкуль-
тивированию культур клеток из репродуктивных органов самок крупного рогатого
скота. М. 1983 г.

9.	Дьяконов Л.П., Лобунцова Д.В., Аспанидзе Б.П., Плешанова Г.Ю., Гоголев М.М., и
др. Методические рекомендации по культивированию первичных культур клеток и
субкультур из ткани легкого плодов крупного рогатого скота.,М.,1985.

10.	Жданова Л.Г., Грубер И.М. Получение однослойных клеточных культур эмбриональ-
ной кишечной ткани человека, /ж. Микробиология, эпидемиология, иммунобиология -
1965, №9, с. 71 -75/.

11.	Иржанов С.Д., Хесин Я.Е. "Органные культуры в вирусологических исследованиях"
Москва, "Медицина”, 1977.

12.	Лабутинас А.В., Серейка В.И. Культивирование энтеро-вирусов в культуре клеток
щитовидной железы. В кн. Актуальные вопросы ветеринарной вирусологии, ч.
1,1976,125-126.
13.	Петелина Е.А., Надточей Г.А., Горбатов В.А. Методические указания по получению,
культивированию и использованию в вирусологической практике субкультур клеток
гусиных эмбрионов. Москва, 1983 г.

14.	Поздняков А.А., Гвозденко Н.И., Бутаханов А.Б. ’’Получение культур клеток из раз-
личных тканей и органов кролика", 2-ое Всесоюзное совещание. Пущено 26 - 28 но-
ября. 1985. Тезисы докладов стр.47 - 48.

15.	Рысмендеева К.К. "Получение и длительное субкультивирование клеток кожи плода
крольчихи" Бюлл.ВИЭВ, М. 1992. Выпуск 78, стр. 113-116.

16.	Субаев Г.Х. Штамм культивируемых клеток КЩС для выращивания энтеро- и коро-
навирусов свиней. Авт.свид. № 1394712,1985.

17.	Субаев Г.Ф., Жуковский А.Н., Прискока В.А. Способ получения культуры клеток
эпителия кишечника эмбрионов свиней. /Авт. свид. №1332814. 22,01.86г./

18.	Сухомлинов Б.Ф, Федорович А.Н., Чайка Я,П. К методике получения интактных эн-
тероцитов слизистой двенадцатиперстной кишки крыс. Украинский биохимический
журнал 1983 г., №2, с. 199-201.

19.	Терских В.В., Терехов С.М., Деревянко В.П., Васильев А.В. "Культивирование и об-
ратная трансплантация эпидермальных кератиноцитов человека" Материалы 3-го
Всесоюзного совещания "Культивирование клеток животных и человека" Пущено,
1992 с. 75 -81.

20.	Федорова Е.С., Непоклонов Е.А., Гальнбек Т.В. Культуральные свойства вируса
трансмиссивного гастроэнтерита свиней. Бюлл.ВИЭВ, 1985, вып., с. 29-32.

21.	Федорова Е.С. Культуральные и антигенные свойства вакцинного штамма ТМК виру-
са трансмиссивного гастроэнтерита свиней. Автореф.дисс. М., 1988.

22.	Шкабура ЮЛ., Ночевный Т.П. Глубинное культивирование вируса трансмиссивного
гастроэнтерита свиней "Профилактика и меры борьбы с инфекционными болезнями
молодняка крс и свиней" Тезисы докладов научно-профилактической конференции,
15-16 октября 1996г. Новосибирск, 1997, с. 66-67.

23.	Ambesi Lmpiombato F.S, Saverio F., Giovanni V. "The FRFL-5 thyroid cell strain as model
for studies on thyroid cell growth" Acta endocrinol. 1987,281, 242-245.

24.	Aviva A., Schlessinger J., Shemesh M. et al. The interaction of cultured thyroid cells of
early bovine embryos with thyrotropin an not thyroglobulin. Endocrinology,
1982,111,2,589-598.

25.	Burrill P M., Bemarolini I., Kleinan Н.К. Effect of serum, fibronectin, and lamilin on adhe-
sion of rabbit intestinal epithelial cells in culture. /J.SupromoL Struct, and Cell Biochem. -
1981,16,№ 4,p. 385-392/.

26.	Garther R., Greil W., Stubner D. et al, Preparation of porcine thyroid glandes with preserved
polarity: functional and morphological in comparison to inside out follicues. Mol. and Cell
Endocrinol, 1985,40,1, 9-16.

27.	Kerkof P.R. Preparation of primary cultures of ovine thyroid gland cells. J.Tissue
Cult.Meth,, 1982,7,1,23-26.

28.	A Methods in. Cell Biology. Academic Press, N.Y. ,Vol. 21,A. -323p., B-512p. (C.C.Harris,
B.F. Trump,.Y.D,Stoner,Eds).

29.	Mothes T., Muhle W., Muller F., Schmidt W. The cells fetal intestine in tissue cul-
ture.Biomed. biochim., acta. -1985, v.44, № 4, 561-571.

30.	Mothersill C., Seymour C., Moriarty Cullen M.J„ Longterm culture differentiated human
thyroid tissue. Acta. Endocrinol., 1985,108,2,192-199.

31.	Reinwald J.Y., Yrin H. "Serial cultivation of strains of human keratinocytes. The formation
keratinizing colonies from single cell". Cell.,V.6,331-342.

32.	Tsao M.C., Walthall B.J., Ham R.Y. "Clonal growth of normal human epidermal keratino-
cytes in defined medium". J.Cell Physol.1982, V.l 10,219-229.

33.	Quaroni A., May R. Establishment and characterization of intestinal epithelian cell cultures.
Meth. Cell. Biol. New-York-1980, V.21,403-427.
Глава 7. Роллерное и суспензионное культивирование
клеюк

Роллерное культивирование клеток. До недавнего времени ткане-
вые культуры применялись в вирусологии преимущественно в виде одно-
слойных стационарных культур. Во многих случаях этот метод выращива-
ния клеток является незаменимым. Многолетний опыт показывает, что при
использовании однослойных стационарных культур встречается ряд трудно-
стей, связанных с огромными затратами рабочего времени и материалов. С
этой точки зрения, более выгодны роз черные культуры, которые эко-
номичны, характеризуются оптимальным отношением полезной площади
культивирования к объему питательной среды и открывают благоприятные
возможности для накопления клеточной массы.

Гермин «роллерные культуры» обозначает метод культивирования, при
когором клеточный монослой pacnouai аеюя по всей цилиндрической поверхно-
сти горизонтально вращающихся сосудов и периодически омывается питательной
средой. В силу определенных причин некоторое количество клеток может в от-
дельных случаях быть взвешено в культуральной среде. В подобном варианте
культуру клеток называют роллерно-суспензионной. ’’Урожайность” клеточной
культуры будет тем больше, чем больше площадь, с которой собирают клетки.
Исследователи использовали различные пути увеличения площади поверхности,
на которой происходило прикрепление и размножение клеток. Для этого приме-
няли различного характера основы с большой удельной поверхностью: твердую,
губчатую, из шерсти, коллагена, на стеклянных спиралях и т. д. Широкого рас-
пространения эти методы не получили, так как значительно затрудняли манипу-
ляции с клетками, но следует отметить описанную Л. С. Ратнером и В. А. Крику-
ном методику многоярусного культивирования. Клетки культивировали в 1,5, 10
и 15-литровых бутылях, полностью загруженных овальными стеклянными труб-
ками, расположенными параллельно продольной оси сосудов. Полезная площадь
при этом возрастала по сравнению со стационарными однослойными культурами
в сосудах того же объема в 20 раз. Культивирование проходило в 2 этапа. На пер-
вом этапе бутыли вращали вокруг горизонтальной оси с целью равномерного
распределения клеток. В дальнейшем, когда клетки прикреплялись к стеклу,
культивирование продолжалось в стационарном положении. Описанная культу-
ральная система была успешно использована для культивирования вируса ящура.

Более эффективным оказалось вращение сосудов, в которых происхо-
дило размножение клеток. Вначале клетки выращивали в пробирках, но с
развитием технического оснащения возросли объемы культуральных сосу-
дов, и от выращивания клеток во вращающихся пробирках исследователи
перешли к вращающимся бутылям. Роллерные культуры стали применяться
как для накопления клеток, так и размножения вирусов.

Для роллерного культивирования используются специальные стел-
лажно-ярусные аппараты для вращения бутылей или барабаны. Чаще всего
для культивирования используют 0,5—3-литровые бутыли. В производст-
венных условиях объем их может достигать 20 литров и более. Аппараты
для роллерного культивирования просты, надежны и обслуживание их не-
сложно. Важное значение имеет скорость вращения бутылей. Она не должна
быть слишком большой, чтобы не препятствовать прикреплению клеток, но
и не слишком низкой, так как длительное нахождение клеток в газовой фазе
ухудшает условия их питания. В работах разных авторов скорости вращения
бутылей варьировали от 8—12 об/час, до 1 об/мин. Наиболее пригодной для
различных клеточных культур оказалась скорость вращения флаконов в
пределах 0,5—1 об/мин. Рекомендуется в течение первых 30 мин. после за-
сева клеток обеспечить высокую скорость вращения флаконов (0,5—1,0
об/мин) для равномерного распределения материалов, затем перевести их на
низкую скорость вращения (20—30 об/час).

Посевная концентрация в 1 мл среды составляет для клеток СПЭВ,
ВНК-21, HeLa, L - 60-80 тыс., для диплоидных клеток 100-200 тыс., для
первичных культур - 200-300 тыс. Объем ростовой среды должен составлять
1/10, 1/20 часть объема роллерного флакона. Роллерный метод культивиро-
вания позволяет получить большее количество клеток. Так, с флакона емко-
стью 3 л можно получить урожай клеток HeLa в 8 раз, ВНК-21 - в 9 раз, АО -
в 11 раз больший, чем с монослойной стационарной культурой флакона ем-
костью в 1 л. Кратность экономии сред при использовании 3-литровых фла-
конов составляет для клеток HeLa 2,8; ВНК-21 - 5,0, АО - 4,0. Способно-
стью к росту и размножению в роллерных условиях обладают субкультуры,
перевиваемые культуры и реже первичные, а также диплоидные штаммы
клеток. Для лучшего размножения клеток в роллерных аппаратах необхо-
дима адаптация их к новым условиям культивирования. Роллерный метод
культивирования позволяет получить большие количества клеток. Преиму-
ществом роллерных культур по сравнению с традиционными стационарны-
ми культурами является, в частности, более экономичное использование
питательных сред и более высокий выход вирусного антигена (на 1—2 1g).

Суспензионное культивирование клеток. В 1953 году Оуене с со-
трудниками впервые показал способность клеток размножаться в жидкой
среде в свободно суспендированном состоянии. С тех пор метод суспензи-
онного культивирования привлекает внимание исследователей в связи с его
высокой эффективностью при накоплении больших количеств клеток. Ока-
залось, что клетки перевиваемых линий, в отличие от остальных типов кле-
точных культур, могут длительно культивироваться во взвешенном состоя-
нии. Клетки в этих условиях размножаются, не прикрепляясь к стенкам
культурального сосуда, находясь в суспензионном состоянии, благодаря
постоянному перемешиванию среды. При оптимальном режиме выращива-
ния клетки в суспензиях быстро размножаются имеют более высокий «уро-
жай», чем в стационарных культурах. Первичные и перевиваемые линии
клеток имеют неодинаковую способность роста в суспензии. Так, гетероп-
лоидные и анеуплоидные постоянные линии, в отличие от псевдодиплоид-
ных линий, адаптируются быстрее к росту в суспензии.

Суспензионные культуры готовят из однослойных культур. Клетки от-
слаивают от стекла с помощью растворов версена и трипсина. Осадок клеток по-
сле центрифугирования (1000 об/мин.) ресуспендируют в свежей питательной
среде. Приготовленную суспензию помещают в культуральные сосуды (реакто-
ры, ферментеры) и выращивают при постоянном перемешивании. В научных
исследованиях концентрация клеток в исходной суспензии колеблется от 0,3 до
10x105 в 1 мл. Оптимальная концентрация клеток в исходной суспензии должна
быть 2-5x105 в 1 мл. По мнению Эрла и его сотрудников, концентрация клеток в
суспензированной культуре должна быть такой, чтобы фаза логарифмического
роста наступала не позднее 16-24 часов после приготовления культуры. Суспен-
зионные клеточные культуры проходят характерные стадии: лаг-фазу, фазу лога-
рифмического роста, стационарную фазу и фазу логарифмического отмирания. В
первой стадии, как правило, количество клеток уменьшается, во второй стадии
популяция клеток увеличивается (логарифмическая стадия роста), в третьей ста-
дии увеличения количества клеток не наблюдается (стационарная фаза). Если
культивирование продолжить дальше, то обнаружится период уменьшения чис-
ленности клеток-фаза логарифмического отмирания (фаза разрушения). Скорость
размножения клеток в логарифмической фазе роста выражают временем генера-
ции. Под временем генерации имеется в виду период, необходимый для удвоения
популяции клеток в культуре. Для суспензионного выращивания клеток важным
условием является перемешивание жидкости, которое должно быть непрерывным
и достаточно интенсивным, чтобы поддерживать клетки во взвешенном состоя-
нии, препятствовать их осаждению и прикреплению к стенкам сосуда и в то же
время не вызывать их механического повреждения.

Перемешивание суспензионных культур проводят лопастными магнитны-
ми мешалками, а также круговыми качалками. В настоящее время широко при-
меняют вращение флаконов и бутылей вокруг продольной оси (15-40 об/мин). На
магнитных мешалках скорость вращения составляет 100—200 об/мин. Скорость
перемешивания зависит от объема культуры; малые объемы культуры требуют
невысокой скорости, тогда как ее необходимо увеличить при больших объемах.
Для предотвращения оседания клеток на внутренней поверхности сосуда произ-
водят силиконирование. Силиконовое покрытие в силу своей гидрофобности
препятствует прикреплению клеток к стенке сосуда.

Внутренние стенки культурального сосуда смачивают 5% или 10%-
ным раствором силикона и после испарения растворителя (бензолового, аце-
тонового) сосуды выдерживают при 85°С и 200° (соответственно в течение
30 и 60 мин). После охлаждения сосуды наполняют горячей бидистиллиро-
ванной водой и оставляют на 2 часа, затем их 3 раза ополаскивают биди-
стиллированной водой и высушивают при 100°С. Сосуды стерилизуют в
сушильном шкафу при 170°С в течение 2 часов.

Максимальный рост клеток в суспензии наблюдают при pH 7,0-7,2.
Питательные среды, применяемые для выращивания клеток в суспензии, не
отличаются от сред, используемых для выращивания клеточных линий в
однослойной культуре. Чаще всего при культивировании клеток в суспензи-
ях берут среду Игла с двукратной концентрацией аминокислот и витаминов.

Суспензионные культуры потребляют в 2-7 раз больше глюкозы, чем
монослойные. В процессе потребления глюкозы клетки выделяют в среду
токсичную для них молочную кислоту. Потребление клетками глюкозы и
выработка молочной кислоты идут параллельно и находятся в прямой зави-
симости от плотности клеточной популяции. Полезным оказалось прибавле-
ние к питательной среде инсулина в количестве от 40 до 200 ЕД на 1 л. При-
бавление к питательной среде инсулина изменяет соотношение между коли-
честном поглощенной глюкозы и выделенной молочной кислоты. Для кле-
ток линии L указанный коэффициент может быть снижен с 74-81 до 37-38%.

9 Различные аминокислоты потребляются из питательной среды рас-
тущими клетками с неодинаковой скоростью. Отмечено, что регулярное
прибавление аргинина (20-40 мг/л) и увеличение количества глутамина до
450 мг/л благоприятствуют росту взвешенных культур.

Прибавление инозитола (0,4 мг/л) позволяет ускорить рост культур
амниотических клеток человека. Желательным является добавление к среде
каталазы (1 мг/л) и тироксина (12 мг/л).

Большой интерес представляют работы, посвященные получению
взвешенных культур клеток в синтетической среде, не содержащей сыво-
ротки крови. Предпринимаются попытки увеличить вязкость питательной
среды за счет безбелковых ингредиентов. С этой целью используется метил-
целлюлоза и гиалуроновая кислота.

Метилцеллюлоза в концентрации 0,1-0,2% обладает максимальным за-
щитным действием на взвешенные в среде клетки. Протективное действие ме-
тилцеллюлозы заключается в том, что молекулы образуют защитный слой вокруг
клетки, предотвращающий повреждение клеток при перемешивании среды.
Весьма важным показателем состояния суспензионной культуры является парци-
альное давление кислорода в жидкой фазе. Концентрация кислорода в газовой
фазе зависит от плотности клеточной популяции и нередко бывает ниже атмо-
сферной. Недостаток кислорода ведет к появлению грануляции цитоплазмы,
клетки теряют правильную округлую форму. При небольшом избытке кислорода
клетки имеют хорошо очерченную, правильную, округлую форму, и становятся
очень крупными при повреждающем действии избытка кислорода. Оптимальная
концентрация кислорода для различных клеточных культур находится в пределах
от 9 до 17% или 293 мм рт. столба. При концентрации кислорода выше 20% про-
исходит ингибиция клеточного роста. Так, при концентрации кислорода 24% раз-
множение клеток почек эмбриона кролика (линия ERK) снижалось наполовину, а
при 30% сводилось к нулю. Повышение концентрации кислорода токсически
воздействует на клеточный метаболизм.

Таким образом, размножение клеток в суспензии зависит от концен-
трации клеток в исходной суспензии, аэрации и pH среды, состава питатель-
ной среды, способа перемешивания, объема суспензии и других факторов.

Однородность суспензии, возможность длительного поддержания
клеток в логарифмической фазе роста, перспективы математического моде-
лирования процессов клеточного роста в зависимости от влияния факторов
внешней среды, удобство многократного исследования физиологического
состояния культуры клеток в суспензии, высокая экономичность метода
вот далеко не полный перечень преимуществ суспензионных культур.

Суспензионные культуры широко используется в вирусологических
исследованиях и для накопления больших количеств вируссодержащего ма-
териала, при изготовлении вакцин и диагностических препаратов.

Культивирование клеток на микроносителях

В 1967 г. Van Werel предложил метод культивирования, сочетающий эле-
менты монослойного и суспензионного выращивания клеток, который он назвал
методом «микроносителей». Суть его заключается в том, что клетки прикрепля-
ются и размножаются на поверхности полимерных шариков-частиц «микроноси-
телей» (МН), которые содержатся в суспензии с помощью перемешивающего
устройства, например мешалки. На одной частице МН диаметром 160—230 мм
может поместиться 350-630 (или в среднем 460) клеток. В одном мл среды можно
суспензировать несколько тысяч частиц микроносителя, при этом общая площадь
их составит от нескольких до 50 см7мл.

Инокулированные в культиватор клетки прикрепляются к по-
верхности частиц МН и размножаясь, образуют сплошной монослой на каж-
дой отдельной частице.

Основными преимуществами этого метода являются:

1) создание равномерных условий по всему объему сосуда, что делает воз-
можным эффективно контролировать необходимые параметры (pH, рС>2 и др.); 2)
получение высокой плотности клеточной популяции до 5-6 млн. клеток в 1 мл; 3)
культивирование одновременно несколько сот миллиардов клеток; 4) введение
постоянного контроля за динамикой роста клеток; 5) снижение роста контамина-
ции в связи с сокращением операций, связанных с разгерметизацией культураль-
ного сосуда; 6) значительная экономии питательных сред; 7) возможность сохра-
нять выросшие клетки непосредственно на частицах при низких температурах; 8)
возможность искусственно создавать различные концентрации МН с выросшими
на них клетками; 9) возможность пассирования культуры без применения трип-
сина путем добавления свежих порций микроносителя.

Микроносители должны иметь:

-	небольшой положительный заряд в пределах 1,5-1,8 МЭКВ/г.

В связи с тем, что большинство клеток животных имеют слабо отри-
цательный заряд, они легче будут прикрепляться к такому МН:

-	плотность 1,05—1,15 г/см3; указанная плотность является оптималь-
ной для поддержания МН во взвешенном состоянии;

-	диаметр частиц от 100 до 250 мкм, что обеспечивает площади для
роста нескольких сотен клеток;

-	гладкую поверхность;

-	прозрачность;

-	отсутствие токсичности компонентов для клеток;

-	незначительное впитывание компонентов среды;

-	универсальность, обеспечивающую возможность использования их для
первичных, диплоидных и гетероплоидных клеток. Немаловажное значение
имеют свойства МН, которые позволяют использовать их многократно.

Проведено исследование многих гранулированных препаратов раз-
личной химической природы, в том числе из поперечно-сшитого (ПС) дек-
страна, ПС-агарозы, ПС-поливинилпиролидона, полиакрилнитрита, порис-
того селикагеля, полистирола, капрона, нейлона, алюмосиликата с целью
использования их как микроносителей.

Пригодными являются только некоторые из них, главным образом
имеющие в своей основе ПС-декстран.

Несколько зарубежных фирм разработали коммерческие препараты
микроносителей, готовые к употреблению: Цитодекс-1, 2, 3 (Франция, Шве-
ция), Супербит (США, Англия), Биосилон (Дания). Стоимость перечислен-
ных препаратов довольно высока, поэтому необходимо проводить исследо-
вания по разработке и производству отечественных МН.

Культивирование клеток на микроносителях проводят в обычных
ферментерах для суспензионного культивирования. В ферментере не долж-
но быть каких-либо выступов, карманов, чтобы предотвратить накопление
микроносителей в застойных зонах. Поэтому разумно использовать фермен-
теры с круглым дном и гладкими стенками. Внутренняя поверхность фер-
ментера должна быть силиконизирована для предотвращения прилипания
микроносителей к стеклу или нержавеющей стали ферментера.

Для контроля за окружающими культуру условиями такими, как pH и
О2, может быть использовано стандартное оборудование. Скорость переме-
шивания суспензии с носителем должна быть 40-60 об/мин. Для выращива-
ния на МН применяются различные типы клеток.

Концентрация цитодекса может варьировать от 0,5 до 5 мг/мл. Одна-
ко, при производстве профилактических вакцин, применяют обычно конеч-
ную концентрацию цитодекса, не превышающую 1 мг/мл. Повышение кон-
центрации до 3 мг/мл и выше создает дополнительные трудности, связанные
с необходимостью перфузии питательной среды и частичной ее замены, что
осложняет технологический процесс.

Посевная концентрация клеток, а также условия культивирования на
МН в первые часы в значительной степени определяют оптимальные пара-
метры для пролиферации и максимального накопления клеток. Показано,
что посев 105 клеток/мл перевиваемой линии почек обезьян (Vero) и дипло-
идных клеток фибробластов эмбриона человека (MRC-5) в уменьшенном до
1/3 объема питательной среды и при периодическом включении мешалки
(30 об/мин) на одну минуту через каждый час в течение 4 часов, с после-
дующим добавлением питательной среды до конечного объема, ведет к уве-
личению пролиферации клеток и их количества по сравнению с контролем
(полный объем питательной среды в момент посадки клеток и непрерывная
работа мешалки с начала культивирования).

Важное значение для культивирования клеток на МН имеет питательная
среда. Правильный подбор питательной среды также будет способствовать опти-
мизации процесса пролиферации клеток и их качество. Необходимо проводить
подбор питательных сред для культивирования клеток на различных типах МН.
Показано, что перевиваемая линия клеток почек обезьян (Vero) на цитодексе дает
наибольший выход при использовании среды Игла ДМЕ (посадочная концентра-
ция клеток 105 мл) но сравнению со средой ВМЕ и 199. Если же количество кле-
ток при посадке снизить до 104, то лучшие результаты дает среда 199. Все испы-
туемые среды содержали 10% фетальной сыворотки.

Литература

1.	Бенюмович М.С.-Суспензии клеток человека и животных.,ч.1 Итоги науки и техники.
ВИНИТИ, серия "Цитология", М.,1990, Т.6,300с.

2.	Сипер Р.Е., Гриффитс Дж.Б.-'Ъиотехнология клеток животных", Агропромиздат, М., 1989.

3.	Тутов И.К., Ситьков В.И.-"Основы биотехнологии ветеринарных препаратов", Ставрополь, 1997.
Глава 8. Диплоидные культуры клеток

Все соматические клетки животных в норме имеют диплоидный
(двойной) набор хромосом, обозначаемый, как 2п. Гаплоидный набор хро-
мосом (In) имеют зародышевые клетки - сперматозоиды и яйцеклетки. Пер-
вичные культуры клеток, полученные из нормальных (неопухолевых) тка-
ней и их субкультуры до 5-10 пассажей имеют, как правило, диплоидный
набор хромосом.

Однако, как самостоятельная культуральная система, диплоидные
культуры (диплоидные штаммы клеток) была введена в терминологическое
понятие Хайфликом в 1961 году для фибробластоподобной культуры, выде-
ленной из легких ткани человека - штамм Wi - 38. Выделенный штамм имел
период жизни 50+10 пассажей и широко использовался для биологических
исследований и в производстве вирусвакцин во многих странах на всех кон-
тинентах.

В соответствии с требованиями Международного Комитета по кле-
точным культурам ’’Культура диплоидных клеток (штамм ДК) должна обла-
дать морфологически однородной популяцией клеток, стабилизированной в
процессе культивирования in vitro, имеющая ограниченный срок жизни, ха-
рактеризующаяся 3-мя фазами развития (стабилизации, активного роста,
старения и смерти), сохраняющая в процессе пассирования кариотип, свой-
ственный исходной ткани, свободная от контаминантов и необладающая
туморогенной активностью при трансплантации хомячкам”

Терминологический Комитет Ассоциации тканевых культур (см. in
vitro, 1984, т.20, №1, с. 19-24) предложил для диплоидных клеток следую-
щую характеристику: ’’Диплоид (Diploid) - клетка, в которой все хромосомы,
кроме половых, представлены двумя хромосомами и структурно идентичны
хромосомам того вида, от которого получена культура. При определении
диплоидного статуса культуры должны учитываться следующие параметры:
а) отклонения от нормального числа хромосом донора; б) отклонения от
нормального кариотипа донора (с использованием дифференциального ок-
рашивания); в) отклонения от генетических (биохимических и др.) маркеров
донора. Если есть стандартная номенклатура для хромосом, её следует при-
держиваться. При определении диплоидности культуры следует приводить
данные о распределении по числу хромосом, модальном классе и репрезен-
тативном кариотипе”

В этих определениях не указан тип клеток, хотя со времени работ
.Хайфлика (1961-1967) название ’’диплоидный штамм” ассоциировалось с
, фибробластоподобными культурами клеток, однако в равной мере это могут
быть эпителиоподобные, лимфоцитоподобные и др. клетки.

В таблице 14 приведены данные о количестве хромосом в соматиче-
ских клетках человека, домашних, диких и лабораторных животных.
Таблица 14

Количество хромосом у человека, домашних, некоторых видов
диких и лабораторных животных (2п)

№ п/п	Наименование	Количество хромосом
1.	Человек	46
2.	Лошадь	64
3.	Осел	62
4.	Корова, як, зебу	60
5.	Буйвол	50
6.	Овца	54
7.	Коза	60
8.	Двугорбый верблюд	74
9.	Свинья	38
10.	Кролик	44
11.	Морская свинка	64
12.	золотистый хомячок (сирийский)	44
13.	Китайский хомячок	22
14.	Крыса	42
15.	Кошка	38
16.	Собака	78
17.	Северный олень	70
18.	Пятнистый олень	66
19.	Лось	68
20.	Зеленая мартышка	60
21.	Шимпанзе	48
22.	Горилла	48
23.	Лисица	34 (+0+8)
24.	Песец	48-50
25.	Норка	30
26.	Соболь	38
27.	Домашний хорек	40
28.	Мышь домовая	40
29.	Гусь	82
30.	Г олубь	80
31.	Индейка	82
32.	Курица	78
33.	Цесарка	74
34.	Жаба	22
35.	Лягушка	26

Диплоидные культуры имеют ряд преимуществ перед первичными
культурами и постоянными линиями клеток.

От первичных культур их отличает однородность популяции и ста-
бильность культурально-морфологических свойств, отсутствие возможной
вирусной и другой контаминации, высокая чувствительность к вирусам, не
уступающая первичным культурам, возможность масштабирования и дли-
тельного хранения в жидком азоте (-196°С).

Постоянные линии клеток обычно являются трансформированными,
часто содержат латентные вирусы (онкорнавирусы и др.), которые трудно
выявляются, и их чувствительность к вирусам может быть ниже диплоид-
ных культур.

Следовательно, диплоидные культуры клеток - это экологически чистая
клеточная система, обеспечивающая отсутствие возможных посторонних кон-
таминантов при научных исследованиях и биотехнологических процессах.

Диплоидные штаммы клеток получают из различных тканей: почек,
кожи, легкого, сердца, селезенки, тимуса, щитовидной железы и других ор-
ганов разных видов животных и человека. Получено большое количество
диплоидных штаммов из тканей и органов человека и животных (более 300),
которые используются для изучения биологии клетки в культуре, цитологи-
ческих исследований, вирусологических и биотехнологических целей.

А.А.Поздняковым с соавт. (1976-1978) получены диплоидные культу-
ры из тестикулов жеребенка и почки плода коровы; В.А.Сологубом,
В.Н.Бахаревым (1990) - из кожи плода лошади (Рис.43);

Г.Е.Панковой, Л.П.Дьяконовым, Т.Гомбосуренгийном (1974-1991)
получены диплоидные культуры фибробластоподобного типа из сердца,
легких, почек, селезенки, тестикулов и др. органов плодов овцы, изучены их
чувствительность к респираторным вирусам (ИРТ, ПГ-3, РСВ и др.), вирусу
висна-мэди, хламидиям (Рис.44);

Л.П.Дьяконовым, Р.В.Белоусовой с соавт. (1980) получена диплоид-
ная и постоянная культура клеток почки теленка (ПТ-80), эпителиоподобно-
го типа, высокочувствительные к респираторным вирусам крупного скота.
Клетки ПТ-80 продуцируют активатор плазминогена тканевого типа;

Б.П.Аспанидзе с соавт. (1987) получена диплоидная культура клеток
легкого плода коровы - высокочувствительная к вирусам ИРТ, ПГ-3, диареи,
РСВ крупного рогатого скота;

Т.В.Гальнбек с соавт. (1985-1992) получены диплоидные культуры
клеток щитовидной железы плода свиньи и поросенка - перспективные для
культивирования рота-, корона-, энтеро и парвовирусов свиней, чувстви-
тельные к вирусу ринопневмонии лошадей и другим вирусам. Культуры
клеток щитовидной железы продуцируют гармоны - трийодтиронин (Т-3) и
тироксин (Т-4).

Л.Л.Миронова с соавторами (1990) получили диплоидный штамм
почки теленка ”Таурус-1"

В процессе субкультивирования выявляются различия в пролифера-
тивной активности клеток фибробластоподобного и эпителиоподобного ти-
па. Если в культуре фибробластов после стабилизации (5-10 пассаж) индекс
пролиферации составляет 1,5-2,0, то эпителиоподобные клетки более актив-
ны и ИП равен 3-5. В зависимости от вида животных продолжительность
жизни фибробластоподобной культуры различна: для свиней - 25-40 пасса-
жей, овец -30-35, крупного рогатого скота 30-45; лошади 50-60 пассажей.
Затем культура дегенерирует. По Хайфлику (1967) число пассажей in vitro
диплоидной культуры фибробласта человека равна примерно 50, что со-
ответствует средней продолжительности жизни людей (60 лет), однако не-
обходимы поправки на среднюю продолжительность жизни мужчин и жен-
щин в странах с разным уровнем жизни и качеством медицинского обслу-
живания. Правда, П.А.Гаврилов и Н.С.Гаврилова (1982) подсчитали, что в
культуре клеток после очередного пересева часть клеток делится несколько
раз, а другие, сохраняя жизнеспособность не делятся, и поэтому клетки ак-
тивной популяции за 50-60 пассажей могут делиться 180 и более раз.

В культуре клеток эпителиоподобного типа по мере пересевов обыч-
но снижается число клеток, сохраняющих модальный класс хромосом, и
возрастает число гетероплоидных клеток с уменьшенным или увеличенным
числом хромосом. В оптимальных условиях культивирования диплоидная
культура клеток животных эпителиоподобного типа претерпевает, как пра-
вило, спонтанную неонкогенную трансформацию и через 65-80 пассажей
становится стабильной (постоянной) линией клеток. Наши наблюдения
(Л.П.Дьяконов и соавт.,1983) показывают, что временем перехода таких ди-
плоидных культур в постоянную линию клеток можно считать период, когда
модальный класс хромосом уменьшается или увеличивается на 1-3 хромо-
сомы (+1-3). Например, модальный класс хромосом в культуре клеток
СПЭВ - 37, при норме 2п = 38; в культуре ПТ-80 = 59, при норме 2п = 60; в
культуре ТР-61, при норме 2п = 60.

Наблюдается также смещение в сторону уменьшения или увеличения
числа гипо- и гипердиплоидных клеток.

Число клеток с нормальным кариотипом (2п=38) в диплоидном
штамме эпителиоподобных клеток щитовидной железы свиньи (ДЩС) сни-
зилось к 92 пассажу с 98% до 22% со значительным разбросом количества
хромосом - от 22 до 60 и культура стала псевдодиплоидной постоянной ли-
нией клеток (Т.В.Гальнбек, 1991).

Методики получения диплоидных штаммов

Для получения диплоидных штаммов клеток животного проис-
хождения используют как эмбриональные, так и постнатальные ткани, но
лучшей потенцией роста обладают эмбриональные ткани. Используют эм-
брионы коров 1-3 месяцев, эмбрионы овец 1-2 месяцев, эмбрионы свиней до
2 месяцев. Эмбрионы получают путем кесаревого сечения или доставляют с
мясокомбината не позднее 2-3 часов после убоя животного, раскладывают
на стерильные эмалированные кюветы, фламбируют спиртовым тампоном и
разрезают для изъятия почек со стороны спины в области поясничных по-
звонков; для изъятия сердца или легкого эмбрион разрезают со стороны
грудной клетки. Органы извлекают на стерильные чашки Петри.

Подготовка ткани. После извлечения органов их измельчают в стек-
лянной банке до величины кусочков 1-3 мм, тщательно 5-6 раз отмывают ра-
бочим раствором Хенкса с антибиотиками (пенициллин и стрептомицин по
500 ед/мл) и помещают в колбу для трипсинизации. Используют два метода
дезагрегации ткани при получении диплоидных клеток в зависимости от воз-
раста эмбрионов: трипсинизации) проводят путем пипетирования кусочков
(эмбрионы до месячного возраста) или механическим способом. В колбу с
кусочками ткани заливают 5-10 мл трипсина и пипетируют кусочки до полно-
го их расщепления в 1-2 порциях трипсина, после чего суспензию клеток сли-
вают в центрифужные флаконы, добавляют 2-3% сыворотки и центрифуги-
руют при 800-1000 об/мин в течение 10 минут, надосадочную жидкость уда-
ляют, а клетки ресуспендируют в среде Игла с 10% (pH 7,2-7,3) фетальной
сыворотки или сыворотки крупного рогатого скота, прогретой 30 минут в во-
дяной бане +56°С. После подсчета клеток их засевают в культуральные фла-
коны для выращивания монослоя. Если эмбрионы имеют возраст более меся-
ца, трипсинизацию следует проводить на магнитной мешалке дробно, т.е. ка-
ждую экстракцию клеток сливать через 5-7 минут перемешивания кусочков
ткани и трипсина. Центрифугируют клетки при 800-1000 об/мин в течение 10
минут, надосадочную жидкость сливают, а осадок ресуспендируют в среде
Игла (pH 7,2-7,3) с 10% фетальной сыворотки или сыворотки крупного рога-
того скота. Подсчитывают клетки в камере Горяева, как описано ранее, ресус-
пендируют до конечной концентрации (300-400 тыс. кл/мл для клеток почек,
500-600 тыс. кл/мл для клеток сердца и легкого) и разливают в культуральные
флаконы, которые помещают при 37°С для выращивания в термостате.

Через 3-4 суток после формирования монослоя ростовую среду уда-
ляют из сосуда, пласт клеток заливают подогретым до 35-37°С раствором
трипсина или смесью трипсина с версеном в соотношении 9:1 и оставляют
для контакта на 3-5 минут. После набухания клеток, что устанавливается
при макроскопическом наблюдении, жидкость сливают и оставляют часть
этой смеси во флаконе. После полного отделения клеток от стекла их тща-
тельно пипетируют градуированной пипеткой, добавляют свежей питатель-
ной среды и после перемешивания клеток до однородной взвеси ее разбав-
ляют средой с 10% сыворотки 1:2 и разливают во флаконы. Флаконы с кле-
точной суспензией помещают в термостат надписью кверху, где подпи-
сывают название штамма, номер пассажа и дату пересева. Обычно клетки
пересевают в разведении 1:2, а если через 4-5 дней не сформировался моно-
слой, то следует произвести очередной пассаж, но не уменьшая концентра-
ции клеток, т.е. производят пересев 1:1с предварительной неполной сменой
среды в культуре за 1 -2 суток до очередного пассажа.

Наиболее активное размножение фибробластоподобных клеток дип-
лоидных штаммов наблюдают в период от 5 до 20 пассажей, затем актив-
ность клеточного метаболизма снижается, что можно наблюдать по измене-
ниям pH ростовой среды в щелочную сторону. Необходимо отметить, что
клетки диплоидных штаммов не обладают такой высокой метаболической
активностью, как клетки перевиваемых линий, и резкого закисления среды в
период роста диплоидных клеток до формирования монослоя не наблюдает-
ся, что свойственно перевиваемым клеткам. Пересев клеток проводят через
3-4 суток после того, как сформировался монослой. Этот процесс называет-
ся пассированием. В диплоидной культуре в результате митотического де-
ления образуются генетические равноценные дочерние популяции клеток,
которые сохраняют диплоидный набор хромосом. Диплоидные штаммы пу-
тем пересева можно поддерживать в течение 50-55 пассажей.

На уровне 5-10-20-го пассажей клетки высевают во флаконы со стек-
лами для цитоморфологического и цитохимического контроля. Ежедневно,
начиная с I суток и до формирования монослоя, стекла с культурой фикси-
руют в растворе Буэна и окрашивают гематоксилин-эозином. Для кариоло-
гических исследований готовят метафазные пластинки, подсчитывают не
менее 50 пластинок, определяют количество хромосом и составляют карио-
логическую характеристику диплоидного штамма (кариотип), выделяя ство-
ловую линию клеток. Сохранение у штамма однородных клеток фиброла-
стоподобного или эпителиоподобного типа и набора хромосом исходных
клеток свидетельствует о диплоидности штамма.

Таким образом, для получения ДШ, следует провести первичную
трипсинизацию ткани или фрагментацию, затем выросшую монослойную
культуру периодические поддерживать в пассажах 1-2 раза в неделю.

При получении диплоидных штаммов следует устранять не прове-
ренные на контаминанты органы и сыворотки с целью получения активного
штамма клеток.

Для поддержания диплоидных клеток на разных уровнях пассажей с
целью более длительного использования штаммов, широко пользуются кон-
сервированием клеток, созданием криобанка и хранением клеток в условиях
низких температур (-70°- 196°С); наиболее широко используют метод глу-
бокого замораживания при сверхнизких температурах (-196°) в жидком азо-
те. При замораживании клеток используют криозащитные среды, состоящие
из криопротектора, сыворотки и питательной среды.

Хорошими криопротекторами являются диметилсульфоксид, гли-
церин, поливинил-пироллидон и другие.

После 1-3-х лет хранения в жидком азоте рекультивированные клетки
формируют монослой в обычные сроки (2-5 дней) без изменения морфоло-
гических свойств.

Жизнеспособность клеток ДШ в процессе хранения составляет 70-90%.

Литература

1.	Аспанидзе Б.П. Первичные и диплоидные культуры клеток плода коровы для вирусо-
логических исследованийю Авт.дисс.канд.вет.наук, М.,1987.

2.	Куликова И.Л., Жидков С.А. Культура клеток сосудов сердца теленка и их чувствитель-
ность к вирусу диареи крупного рогатого скота. Ж.Цитология,1992., т.34. №9.

3.	Поздняков А.А., Юров К.П., Мутузкина З.П. и др. Методика получения диплоидного
штамма клеток тестикулярной ткани жеребят и испытание его чувствительности к не-
которым вирусам. Бюлл.ВИЭВ,1976. вып.24, С.46-48.

4.	Панкова Г.Е., Сологуб В.К., Гололобова М.Т., Резова Т.П. Штамм диплоидных клеток
эмбриона лошади. Ж.Ветеринария,1978.,№3, с.42-43.

5.	Л.П.Дьяконов, А.А.Поздняков.- ’’Исследования по совершенствованию методов куль-
тивирования клеток и тканей животного происхождения” Труды ВИЭВД978,
Т.47,с.154-169.
Глава 9. Постоянные /стабильные/ клеточные линии

Клеточная линия /Cell line/ культура клеток, которая возникает
спонтанно или искусственно из первичной культуры после первого пересе-
ва, адаптированная к условиям существования вне организма. В случаях,
когда культура способна субкультивироваться определенное число пасса-
жей, её называют культурой с ограниченным сроком жизни /"finite”/. Если
культура обладает способностью к неограниченному размножению
/субкультивированию/, то её называют постоянной перевиваемой /continuous
/ или стабильной клеточной линией "Established line"

Следует отметить, что нет единого мнения о становлении первичных,
диплоидных культур стабильной (постоянной) линией клеток, как и теории,
объясняющей возможность их выведения. Как правило, постоянные линии
клеток возникают спонтанно. Известно, что большинство стабильных кле-
точных линий контаминированы микоплазмами. Является ли присутствие
микоплазм, латентных вирусов, как трансформирующих агентов, либо мито-
генов обязательными условиями получения длительно (беспредельно) пере-
виваемых линий клеток? На этот вопрос нет однозначного ответа. Вероятно,
велика роль в этом процессе онкогенов и известных трансформирующих
факторов (онкогенных вирусов, химических веществ-мутагенов).

Получение постоянных линий клеток из опухолевых (малигнизирован-
ных) тканей относительно несложно и объяснимо наличием онкогенов, онко-
генных вирусов, присутствием большого числа трансформированных, в т.ч. и
дефектных по ряду ферментов клеток (Т.П.Игнатова). В качестве митогенов и
трансформирующих агентов для лимфоидных клеток животных могут быть
внутриклеточные паразиты, например, тейлерии крупного рогатого скота и нут-
талии у лошадей. (В.Т.Заблоцкий, 1973; Л.С.Ратнер с соавт., 1975; Шейн с со-
авт., 1981 и др.). Лимфоциты, зараженные шизонтами этих паразитов, превра-
щаются в бластные клетки и беспредельно долго пассируются в культуре. Од-
нако, в организме животного после выздоровления проходят стадии обратного
превращения в нормальные лимфоидные клетки и у таких животных не разви-
вается онкологического процесса. Введение культуры клеток с шизонтами дру-
гому животному, вызывая легкое переболевание, приводит к формированию
стойкого иммунитета без нежелательных последствий для организма животно-
го. В данном случае, внутриклеточные простейшие выступают как митогены и
бласттрансформирующие агенты для лимфоидных клеток.

Наряду с этим, получение стабильных эпителиоподобных клеточных
линий, вероятно, необязательно должно быть обусловлено присутствием
биологического митогена (вирусы, микоплазмы, хламидии, простейшие).
При этом использование различных приемов культивирования, селекции,
клонирования и т.п., позволяя в одних случаях успешно получать новую
линию клеток, не приводит к успеху в других случаях.. Гетерогенность (+ 1-
3 хромосомы к нормальному кариотипу) является одним из показателей
превращения диплоидной культуры клеток в постоянную немалигнитизиро-
ванную линию клеток, обладающую стабильными культурально-
морфологическими свойствами с сохранением чувствительности к вирусам,
и не являющуюся туморогенной (Л.П.Дьяконов, 1983).
В силу стабильности своих свойств постоянные /перевиваемые/ ли-
нии клеток стали повседневным объектом исследований по биологии и ре-
конструкции клетки, изучению поведения клеток в культуре и взаимодейст-
вия вирусов, хламидий, простейших и др. патогенов с клеткой, в работах по
трансформации клеток, токсикологии и фармакологии, по выяснению дей-
ствия апатогенных, радиационных и др. факторов в превращении нормаль-
ной клетки в опухолевую, по скринингу лекарственных веществ, по выведе-
нию клеток-продуцентов физиологически активных веществ (ФАВ), клеточ-
ной инженерии, производству вирус-вакцин и для других целей.

Недостатком постоянных линий клеток является их возможная кон-
таминация латентными вирусами и микоплазмами, которые влияют на свой-
ства клеток и могут изменять характер взаимоотношений клеток с вирусами
(Г.Я.Каган, И.В.Раковская, 1968; Д.Ф.Осидзе, 1970; Л.П.Дьяконов,
В.В.Гриценко, 1979,1980 и др.)

Кроме того, выведение линий клеток из опухолевой ткани, таких как
HeLa, Нёр-2/ ВНК-21 ^лимфома Беркитта и др., их высокая трансфбрМПрован-
ность и туморогенность делают такие линии непригодными для многих работ.

Для ветеринарной науки и практики представляют значительный ин-
терес стабильные линии перевиваемых клеток сельскохозяйственных и про-
мысловых животных, выведенные в СССР, России и других странах из раз-
личных органов и тканей плодов или молодых животных, т.е. из тканей не-
опухолевого происходения (немалигнизированные) (Рис.45-48.). В таблице
17 представлены некоторые наиболее часто используемые постоянные ли-
нии клеток сельскохозяйственных животных.

Достаточно много исследований проведено по изучению чувствитель-
ности разнообразных культур клеток к вирусам, вызывающим патологию у че-
ловека и животных. По сути дела, вирусы, как ДНК-, так и РНК-геномные, яв-
ляясь облигатными внутриклеточными паразитами, представляют собой ’’есте-
ственную” чужеродную генетическую информацию для клетки. Со встраивания
вирусного генома в геном клетки начинается перестройка метаболических про-
цессов последней, в результате чего происходит репликация вирусных нуклеи-
новых кислот, синтез вирусных белков и сборка структур вирионов.

Накопилось достаточно много данных, свидетельствующих о том, что как
in vivo, так и in ovo и особенно in vitro вирусы способны размножаться в гомоло-
гичных и гетерологичных системах. Следовательно, и в гетерологичных систе-
мах на мембранах клеток имеются эпитопы, обеспечивающие связывание и за-
хват клеткой вирионов и их репродукцию. В таблице 18 представлена информа-
ция о чувствительности к различным вирусам некоторых культур клеток сель-
скохозяйственных и промысловых млекопитающих из специализированной кол-
лекции культур клеток ВИЭВ. Приведенные данные указывают на то, что одна
культура клеток может быть чувствительна к нескольким вирусам, вызывающим
заболевания у того же вида животных, от которого получена эта культура кле-
ток, а также к вирусам, поражающим другие виды животных и часто далеко от-
стоящие друг от друга в эволюционном ряду. Например, постоянная линия кле-
ток почки плода свиньи /СПЭВ/ высокочувствительна к вирусам, поражающим
свиней - энтеро-, корона-, рота-, энцсфаломиокардита, ящура, а также ринопнев-
монии лошадей типа I и др. Культура клеток почки кролика /RK-13/ чувстви-
тельна к такому вирусу парнокопытных, как ящур, но также и к вирусам просто-
го герпеса человека, парагриппа-3 /ВПГ-3/, кори человека, энтерита норок, ин-
фекционного бурсита /болезнь Гамборо/, синдрома снижения яйценоскости кур,
ринопнсвмонии лошадей, диареи крупного рогатого скота /ВД/, инфекционного
ринотрахеита /ИРТ/, реовирусу типа 3, аденовирусу типа 7 и др.

Культура клеток почки сибирской горной козы /ПСГК/ обеспечивает
репродукцию вирусов классической чумы свиней, болезни Тэшена, болезни
Ауески, катаральной лихорадки овец, геморрагической болезни оленей и др.

Таблица 17

Характеристика основных свойств некоторых постоянных перевивае-
мых линий клеток, полученных из немалигнизированных органов и
тканей некоторых видов животных

Наиме- нование	Исходная ткань	Вид животн ого	Тип клегок в куль- туре	Метод вы- ращивания	Питательная среда
СПЭВ	почка эмбрио- на свиньи	свинья	эпителиоподобный	в монослое	199, с 5-10% сыво- ротки к.р.с.
ППЭС	почка эмбрио- на свиньи	свинья	эпителиоподобный	в монослое	ГЛА (60%) с 10% сыворотки к.р.с.
ПО	почка овцы	овца	эпителиоподобный	в монослое	ИГЛА с 10% сыво- ротки к.р.с.
ПТ	почка теленка	к.р.с.	эпителиоподобный	в монослое	ГЛА с 10% сыворотки к.р.с.
ТР(ГВТ)	трахея эм- бриона коровы	к.р.с.	эпителиоподобный	в монослое	ИГЛА с 10% сыво- ротки к.р.с.
СЭК	селезенка эм- бриона коровы	к.р.с.	фибробластопо- добный	в монослое	ИГЛА с 10% сыво- ротки к.р.с.
ПТ-80	почка теленка	к.р.с.	эпителиоподобный	в монослое	ГЛА+ИГЛА (по 50%) с 5-10% сыворотки к.р.с.
МДВК	почка теленка	к.р.с.	эпителиоподобный	в монослое	ИГЛА с 10% сыво- ротки к.р.с.
КСТ	клетки сердца теленка	к.р.с.	эпителиоподобный	в монослое	ИГЛА с 10% сыво- ротки к.р.с.
ЩС	щитовидная железа свиньи	свинья	эпителиоподобный	в монослое	199 с 10% сыворотки к.р.с.
ЛЭК	легкое плода коровы	к.р.с.	эпителиоподобный	в монослое	ИГЛА с 10% сыво- ротки к.р.с.
С-ПС	почка свиньи	свинья	эпителиоподобный (поли-гональные и округлые)	в суспензии и монослое	0,5% ФГМ-с с вита- минами или ИГЛА с 10% сыворотки к.р.с.
ПС-ФГМ	почка сайги	сайга	эпителиоподобный	в монослое	199 ил и ИГЛА с 0,1% ФГМ-с и 10% сыво- ротки к.р.с.
ТЭБ	тестикулы бычка	к.р.с.	эпителиоподобный	в монослое	ИГЛА МЕМ, ИГЛА ДМЕМ с 10% сыво- ротки к.р.с.
Таурус-1	почка теленка	к.р.с.	эпителиоподобный	в монослое	ИГЛА МЕМ с 10% сыворотки к р.с.
Таблица 18

Чувствительность некоторых диплоидных, гибридных и постоянных
клеточных линий сельско-хозяйственных и промысловых животных к
вирусам различной этиологии

Культура клеток	Вирус
Почка эмбриона свиньи версенизированная /СПЭВ/	Вирусы трансмиссионного гастроэнтерита свиней /ТГС/, ящура, ринопневмонии лошадей, энцефаломиакардита сви- ней, рота- корона-вирусы и др.
Почка теленка /ПТ-80/	Вирусы парагриппа-3 /ПГ-3/, диареи /ВД/, корона- и парво- вируса крупного рогатого скота
Трахея плода коровы /ТР/	Вирусы инфекционного ринотрахеита /ВИРТ/, ВПГ-3, пар- но-, коронавирусы крупного рогатого скота
Легкое плода коровы (ЛЭК)	ИРТ, ПГ-3, вирус ринопневмонии лошадей, герпес-вирус - тип 1, ротавирус
Клетки сердца теленка /КСТ/	ВД, ИРТ, ПГ-3
Щитовидная железа свиньи /ЩС/	Энтеро-, корона-, рота-, парвовирусы свиней, вирус энцефа- ломиокардита свиней, герпесвирус лошадей /тип 1 /
Легкое плода овцы /ЛЭО/	ВПГ-3, респираторно-синтициальный вирус /РСВ/, висна-мэди
Почка плода овцы /ПЭО/	ПГ-3, вирусы висна-мэди, классической чумы свиней /КЧС/, герпесвирусы и др.
Невринома гасерова узла крысы /НГУК-1/	КЧС, прион скрепи (РгР^)
Почка плода свиньи /ПК-15/	КЧС
Клетки кожи плода кобылы /ККЭК/	Вирус инфекционной анемии лошадей /ВИНАН/
Лимфоциты лошади /ЛЛ/	ИНАН
Почка сайги /ПС/	Хламидии, вирусы чумы крупного рогатого скота, бешенства
Легкое плода коровы /ЛЭК- ВИЭВ90/	Продуцент вируса лейкоза
Почка плода овцы /ПЭО/	Герпес-, тоговирусы, вирусы клещевого энцефалита, кокса- ки, ПГ-3 и др.
Кожа эмбриона овцы /КЭО/	Вирус контагиозной эктимы овец
Кожа эмбриона кролика /кэк/	Вирус контагиозной эктимы овец
Почка эмбриона свиньи /ППЭС-91/	Вирусы болезней свиней, КЧС
Почка зеленой мартышки /VERO/	Вирусы плотоядных
Почка собаки /МДСК/	Вирусы гриппа /А, В, С/, чумы собак
Почка новорожденного кро- лика /ПНК-89/	Вирус простого герпеса, ПГ-3, аденовирус /тип 7/
Почка кролика /RK-13/	Вирусы ящура /А, О, С, Азия/, инфекционного бурсита кур, энтерита норок, синдрома снижения яйценоскости кур, кори
Почка сирийского хомячка /ВНК-21/	Вирусы ящура и бешенства
Почка сибирской горной козы /ПС ГК/	Вирусы катаральной лихорадки овец /КЛО/, геморрагиче- ской болезни оленей, болезни Ауески /ВБА/, болезни Тэше- на /БТ/, КЧС
Межвидовая гибридная культура /свинья х лошадь/: СПЭВ ТК х лимфоциты лошади /А4 х Л/	Вирусы ринопневмонии лошадей /герпес типа 1/, герпеса /тип 3/, реовирус-3
Мутантная культура клеток СПЭВ ТК'	ТГС и др. вирусы свиней
Внутривидовая гибридная культура клеток свиньи /СПЭВ ТК' х лимфоциты свиньи / Д4 х С/	ТГС, рота-, энцефаломиокардит, КЧС, ринопневмонии ло- шадей. Продуцент вирусиндуцированных интерферонов

Паспортные данные на депонированные в коллекциях культур линии
клеток, приведены в Каталоге Российской Коллекции культур клеток
/РККК/, Омск, 1999 г. и Каталогах культур: Американской /АТСС/, Европей-
ской /ЕСАСС/ и др.

Условия культивирования перевиваемых линий клеток

Работа с постоянно перевиваемыми культурами клеток должна прово-
дится в специальных помещениях /стерильных комнатах/, изолированных от
всех других, где работают с вирусами. В процессе работы следует строго со-
блюдать правила асептики. При одновременной работе с различными линиями
клеток следует принять меры для предотвращения перекрестной контаминации
одной линии клеток другой. Поддержание клеток перевиваемых линий достига-
ется периодическими пассажами. В процессе многократных перевивок не ис-
ключена возможность контаминации культур бактериями, микоплазмами и
грибами, что может привести к потере клеточных линий. Поэтому при работе с
перевиваемыми клеточными линиями необходимо тщательно контролировать
стерильность питательных сред, растворов и особенно сыворотки.

Все среды, растворы, сыворотки и клеточные культуры, оказавшиеся
нестерильными по результатам исследований, признаются непригодными и
из работы исключаются. Все имеющиеся в лаборатории культуры необхо-
димо регулярно проверять на наличие микоплазм.

В настоящее время наиболее распространенным способом культиви-
рования перевиваемых клеток является метод выращивания их во флаконах
из стекла или пластика. Обычно для поддержания матричных культур - для
размножения клеток в больших количествах - пользуются матрасами разли-
чной емкости /от 100 мл до 1-1,5 л/.

Полноценная популяция может быть получена только от культуры,
состоящей из жизнеспособных клеток. Поэтому просмотр и оценка качества
монослоя имеют решающее значение при выборе культур для пересева. О
характере роста в матрасах /пробирках/ судят на основании просмотра их
под малым увеличением микроскопа /об. 10, ок.7/.

При хорошем состоянии культуры между клетками четко различают-
ся границы, а сами клетки имеют типичную для данной культуры морфоло-
гию. Наличие в поле зрения большого количества округленных клеточных
элементов, появление клеток с вакуолями, включениями и другими призна-
ками цитопатологии делает данную культуру непригодной для пассажа.

На случай загрязнения перевиваемых культур необходимо иметь в
запасе резервные /дубликаты/ культуры, которые сохраняют при комнатной
температуре, в рефрижераторе, в термостате, в условиях жидкого азота
/минус 196°С/. Пересевы клеток осуществляют после образования сплошно-
го слоя через каждые 3-4 дня.

Для этого из матрасов с выросшим монослоем клеток удаляют пита-
тельную среду, промывают монослой теплым /36-37°С/ раствором Хенкса и
вносят подогретую до 36°С смесь растворов Версена /0,02%/ с трипсином
/0,25%/ в соотношении 9:1 и помещают в термостат на 5-10 минут при 37°С,
за это время матрасы несколько раз слегка покачивают.

Существуют два метода пересева после отделения клеток от стекла с по-
мощью диспергирующего раствора: центрифужный и бесцентрифужный метод.

Центрифужный метод. Как только клетки в результате воздействия
диспергирующего вещества начнут отделяться от стекла и переходить в сре-
ду, матрас осторожно встряхивают и клетки полностью отслаиваются от
стекла. Для того, чтобы прекратить действие версена и трипсина на клетки,
к суспензии добавляют 2-3% сыворотки крупного рогатого скота. Взвесь
клеток помещают в центрифужные стаканы и центрифугируют при 800
1000 об/мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость сливают, а осадок
клеток ресуспендируют в небольшом количестве питательной среды, затем
берут I мл клеточной суспензии и подсчитывают клетки.

Бесцентрифужный метод широко используется при работе с клеточ-
ными культурами. Во флаконы с монослоем клеток вносится диспергирующий
раствор /смесь версена с трипсином/, их (флаконы) помещают на короткое вре-
мя /5 минут/ в термостат и как только небольшая часть клеток начнет отслаи-
ваться от стекла, матрасы осторожно переворачивают так, чтобы клеточный
пласт находился вверху. Через 3-5 минут основную часть /90-95%/ этого рас-
твора сливают. Во время слива диспергирующий раствор должен находиться на
поверхности, свободной от клеток. С целью отделения клеток от стекла матрасы
энергично встряхивают и к полученной суспензии добавляют небольшое коли-
чество свежей питательной среды без сыворотки, матрасы ещё раз встряхивают
и берут пробу для подсчета общего количества клеток.

В соответствии с результатами подсчета общий объем суспензии доводят
до требуемой концентрации клеток добавлением той же питательной среды.
При этом учитывают добавление к общему объему стерильной сыворотки
крупного рогатого скота в количестве 10%, предварительно подогретой при
56°С в течение 30-45 минут. Во все питательные среды и растворы при пересе-
вах необходимо добавлять антибиотики: пенициллин, стрептомицин по 100
ед/мл, можно использовать канамицин, линкомицин, тилан по 50 мкг/мл.

При выращивании культур в пробирках концентрация клеток в сус-
пензии должна быть Ю5 в 1 мл. При засеве в пробирки суспензию клеток
необходимо постоянно перемешивать с помощью пипетирования или пе-
риодическим встряхиванием клеток вручную, чтобы поддержать равномер-
ную концентрацию клеток. После внесения в пробирки по I мл взвеси их
плотно закрывают резиновыми пробками, укладывают в лоток в слегка на-
клонном положении /под углом 5°/ пробкой вверх и помещают в термостат.

Для посева в матрасы используют суспензию с концентрацией клеток
5-10x104 в I мл. Матрасы укладывают на полки термостата в горизонтальном
положении. Важно, чтобы пробки плотно закрывали матрасы и пробирки,
иначе за счет поступления воздуха извне произойдет сдвиг pH среды в ще-
лочную сторону. Последнее обстоятельство неблагоприятно сказывается на
росте клеток. На одной из сторон матрасов /пробирок/ делается отметка ка-
рандашом по стеклу /верхняя поверхность/. Культуры клеток выращивают
при температуре 37°С в стационарных условиях. Полученные перевиваемые
культуры растут без смены питательной среды. Клетки, осев на поверхности
стекла, прикрепляются к нему в течение нескольких часов.

При просмотре пробирок /флаконов/ под микроскопом на другой день
можно наблюдать образование островков в результате размножения при-
крепившихся клеток. Размеры островков постепенно увеличиваются, далее
они сливаются, образуя сплошной слой. Выращивание клеток продолжается
в течение 3-4 дней, после чего культура клеток может быть использована
для очередного пассажа и для вирусологических работ.

При использовании клеточной культуры для работы с вирусами из
матрасов и пробирок удаляют ростовую питательную среду и заменяют её
поддерживающей средой, не содержащей сыворотки. При поддержании
матричной культуры пересев производится не менее чем в 2 матраса. Один
из них служит для последующего пассажа, а второй сохраняется до тех пор,
когда в пассажных культурах будет установлен удовлетворительный рост.

При обнаружении неравномерного, недостаточного роста, а также де-
генеративных изменений в клетках такие культуры выбраковываются. Ми-
тотическая активность перевиваемых клеточных культур через 24-48 часов
культивирования составляет, например, для культур СПЭВ и ПТ - ЗО-4О°/оо,
а для культуры ПО и СЭК - 12- 16°/оо Индекс пролиферации клеток тимуса и
почки равен 4-6, а клеток селезенки 2-3.

Культурально-морфологические свойства и условия культивиро-
вания некоторых перевиваемых линий клеток сельскохозяйственнных
животных

Линия клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ)

Перевиваемая линия клеток СПЭВ получена в 1959г. К.С.Куликовой и
др. в Московском научно-исследовательском институте вирусных препаратов.

Клетки выращивают на среде 199 с 10% сыворотки крупного рогатого
скота. Сплошной монослой образуется через 3-4 дня после посева. Коэффи-
циент посева культур 1:4 - Г.6. Для снятия клеток со стекла используют
0,02%-ый раствор версена. Культура снимается бесцентрифужным методом.
Время контакта с клетками при 37°С -10-20 мин. Легкое покачивание куль-
турального флакона ускоряет процесс версенизации. Версенизацию прово-
дят до тех пор, пока при микроскопическом исследовании (об. 10, ок.7) не
будет обнаружено, что большая часть клеток отслоилась.

Культура представлена эпителиоподобными клетками. Цитоплазма
клеток в основном гомогенная, иногда мелко вакуолизирована.

В цитоплазме около ядра отдельных клеток встречаются эозинофильные
образования. Ядра клеток округлой или овальной формы с 2-5 ядрышками.
Культура пересевается 2 раза в неделю. Если культура выращивается 6-7 дней,
то при этом питательная среда слегка мутнеет за счет отслоения клеток. Мут-
ность среды повышается при удлинении сроков инкубации с одновременным
изменением pH среды в кислую сторону. Во всех подозрительных случаях не-
обходим бактериологический контроль для выяснения причин помутнения.

Клетки, снятые с одного матраса Ру, можно высеять в 200 пробирок
или 4-6 аналогичных матраса. Сбор клеток с одного литрового матраса дос-
тигает в среднем 35 -40 млн.

Линия клеток почки овцы (ПО)

Получена в ВИЭВ в лаборатории культур тканей и питательных сред
в 1968 г. З.П.Мутузкиной.

Культура клеток выращивается на 0,5%-ном гидролизате лактальбу-
мина в растворе Хенкса с 10% сыворотки крупного рогатого скота. Форми-
рование монослоя происходит на 4 - 5 сутки. Выросшая культура отделяется
от стекла смесью раствора вереена с трипсином бесцентрифужным спосо-
бом. Коэффициент пересева культуры 1:2 - 1:3. Культура представлена эпи-
телиоподобными клетками и пересевается один раз в неделю. Митотический
индекс этой культуры равен 16-2О°/оо

Линия клеток почки овцы прошла более 500 пассажей.

Линия почки теленка (ПТ)

Получена в ВИЭВ, в 1971 г. А.А.Поздняковым. Клетки выращиваются в
среде ИГЛА с 10% сыворотки. Монослой формируется на 4-5 сутки, пересев
осуществляется один-два раза в неделю. Клетки отделяют от стекла смесью
раствора версена с трипсином 9:1 бесцентрифужным методом. Коэффициент
пересева 1:4 - Г.6. Клетки ПТ эпителиоподобного типа, полигональной формы с
хорошо выраженными границами. Линия пассируется более 150 пассажей.

Линия клеток почки эмбриона свиньи (ППЭС)

Получена в Казанском ветеринарном институте в лаборатории культур
тканей и питательных сред в 1975 г. С.Х.Хаертыновым и др., ВНИИВиМ,
ВИЭВ. Клетки выращиваются на среде ГЛА (60%) и среде 199 (30%) с 10%
сыворотки. Монослой формируется на 3-4 сутки, пересев осуществляется два
раза в неделю. Монослой клеток отделяется от стекла смесью версена с трипси-
ном 9:1 бесцентрифужным способом. Коэффициент пересева клеточной линии
1:2 -1:3. Клетки, снятые с одного матраса, рассевают на 2-3 аналогичных матра-
са. С одного литрового матраса Ру получают ’’урожай” клеток 20-25 млн. Ука-
занная линия представлена клетками эпителиоподобного типа.

Линия клеток трахеи эмбриона коровы (TR)

Получена из Ветеринарной школы г.БРНО (ЧССР). Культивируется
на среде Игла с 10% сыворотки. Клетки образуют монослой на 3-4 сутки,
пересев проводится два раза в неделю. Культура отслаивается от стекла сме-
сью версена с трипсином 9:1 бесцентрифужным способом. Коэффициент
пересева 1:2 - 1:3. С одного литрового матраса Ру получают ’’урожай” клеток
23-28 млн. Линия представлена клетками эпителиоподобного типа.

Линия клеток почки теленка (ПТ-80)

Получена в ВИЭВ в 1980 г. Л.П.Дьяконовым, Р.В.Белоусовой,
Д.В.Лобунцовой и др.

Клетки выращивают на среде ГЛА с ИГЛА (1:1) с 10% сыворотки
крупного рогатого скота. Монослой формируется на 3-4 сутки, пересев осу-
ществляется два раза в неделю. Монослой клеток отделяется от стекла сме-
сью версена с трипсином 9:1 бесцентрифужным способом. Коэффициент
пересева клеточной линии 1:2-1:3.

С одного литрового матраса получают ’’урожай” клеток 30-40 млн.
Линия клеток ПТ-80 представлена клетками эпителиоподобного типа. Клет-
ки ПТ-80 продуцируют активатор плазминогена тканевого типа.

Линия клеток почки теленка /Таурус-1/

Получена в институте полиомиелита и вирусных энцефалитов в
1987г. Мироновой Л.Л.

Культивируется на среде Игла МЕМ с 10% сыворотки крупного рогатого
скота. Монослой формируется на 3-4 сутки культивирования. Коэффициент
пересева 1:3. Культура снимается бесцентрифужным методом. Для снятия кле-
ток со стекла используют раствор хемопсина /50 мг/ в 500 мл 0,04% версена.
Линия клеток Таурус -I представлена клетками эпителиоподобного типа.

Линия клеток тестикулов бычка /ТБ/

Получена в 1989г Петручук Е.М., Шалуновой Н.В., Грабовской И.Л.,
Ночевным В.Т. /ГИСК им. Л.А.Тарасовича, ВГНКИ ветпрепаратов /.

ТБ культивируется на среде Игла МЕМ,Игла ДМЕМ с 10% сыворотки
крупного рогатого скота. Монослой формируется на 3-4 сутки культивиро-
вания. Коэффициент пересева 1:2-1:3. Для снятия клеток со стекла исполь-
зуют смесь 0,02% раствора версена и 0,25% раствора трипсина /9:1/. Линия
клеток ТЭБ представлена клетками эпителиоподобного типа. Форма клеток
полигональная или округлая, цитоплазма - светлая с легкой зернистостью,
ядра округлой формы, хроматин расположен в ядре равномерно.

Сведения о постоянных линиях клеток легкого плода коровы, щитовид-
ной железы свиньи (ЖС), сосудах сердца теленка (КСТ) приведены в главе 8.

Литература

1.	Дьяконов Л.П., Поздняков А.А., Гололобова М.Т. Методические указания по получе-
нию и применению в вирусологической практике перевиваемых линий клеток из
лимфоидных органов крупнго рогатого скота и почки теленка, М., 1977г.

2.	Дьяконов Л.П.,Егоров Б.Б., Плешанова Г.Ю. и др. Штамм клеток почки теленка используе-
мый в качестве продуцента активатора плазминогена. Авт.свид. № 1212043,1985 г.

3.	Дьяконов Л.П, Поздняков А.А.,Гололобова МЛ.Данкова Г.Е. Методические реко-
мендации по получению и культивированию первичных и перевиваемых клеток жи-
вотного происхождения.-М.,1978 г.

4.	Методические рекомендации по применению перевиваемых клеточных культур для
диагностики вирусных заболеваний сельскохозяйственных животных. ВИЭВ, МВА,
Респуб. научно-производ. ветеринарная лаб. Госагропрома РСФСР .М., 1988

5.	Дьяконов Л.П. Проблемы культивирования клеток животных и некоторые вопросы
цитопатологии. Бюлл, ВИЭВ,выпуск 49,1983 г.стр.3-8

6.	Игнатова Т.Н. Трансформация клеток. В кн. ’’Биология клетки в культуре” Ленинград,
1984,стр. 101-194.

7.	фридлянская И.И. Постоянные клеточные линии, дифференцирующиеся ин витро. В
кн. "Биология клетки в культуре." Ленинград, 1984,стр. 50-100.

8.	Методы культивирования клеток .Под ред. Пинаева Г.П.. Ленинград, "Наука” 1988г.,319стр.
9. Биология клетки в культуре. Под ред. Трошина А.С., Ленинград, ’’Наука" 1984г., 277стр.
Глава 10. Методы культивирования тканей и клеток
рыб (по материалам И.И. Рудикова)

Для решения задачи - выяснения причин краснухи и других болезней
рыб с вирусологической точки зрения - необходимо иметь соответствующий
объективный инструмент исследования, каким являются культуры клеток и
тканей рыб. Поэтому в первую очередь была начата их разработка и внедрение
в практику лаборатории, что завершилось положительными результатами.

Культуры фиксированных кусочков тканей

Материалы и методы

Изучали возможность приготовления эксплантатов из недифференци-
рованных гонад, почек, сердца, селезенки, плавательного пузыря, жабр и
плавников радужной форели, почек, селезенки и сердца карпа, при этом
пользовались методом капельно-плазменных культур и методом экспланта-
тов во флаконах (пробирках).

В качестве опорной субстанции была испытана плазма крови курицы
и радужной форели. Для свертывания плазмы брали куриный эмб-
риональный экстракт и почечно-селезеночный экстракт форели. Были оце-
нены различные питательные среды, сыворотки животных, а также разные
температуры инкубации эксплантатов.

Питательные среды готовили на растворах Хенкса или Эрла и они
включали следующие компоненты: солевой раствор с 0,5% гидролизата лак-
тальбумина - 45%, раствор Хенкса - 10%, среда 199 - 30%, сыворотка КРС -
10%, тканевой экстракт - 5%, пенициллин - 200ед/мл и стрептомицин - 200
мкг/мл. Испытали также существующие среды и растворы без тканевого
экстракта с содержанием сыворотки от 5 до 40%. В питательные среды до-
бавляли сыворотки крупного рогатого скота, форели и карпа.

Рыб вскрывают асептически. Внутренние органы извлекали в сте-
рильную посуду, измельчали на кусочки размером 1-2 мм и несколько раз
промывали солевым раствором или питательной средой. Кусочки органов
прикрепляли к стеклу плазмой, свернутой тканевым экстрактом, а затем в
пробирку или флакон добавляли питательную среду.

В серии опытов было установлено, что для выращивания культур из
тканей форели и карпа оптимальными являются питательные среды и рас-
творы, разработанные для теплокровных животных. Рост отмечается также
при гипотоническом разведении сред и растворов (до 0,6%-ной концентра-
ции солей), так как большее их разбавление или гипертонические растворы
не поддерживают оптимального роста. Не обязательно добавлять в среды
тканевые экстракты. При фиксации кусочков на .стекле куриный эмбрио-
нальный экстракт с равным успехом можно заменять почечно-селезеночным
экстрактом рыб, а куриную плазму - плазмой крови радужной форели. Ко-
личество сыворотки крови в среде может не превышать 10%, одинаково
приемлемы сыворотки крупного рогатого скота, радужной форели и карпа.

Удовлетворительный рост наблюдали в эксплантатах почек, селезен-
ки плавательного пузыря и жабр радужной форели, а также почек и селе-
зенки карпа. Наиболее равномерные, прочные и относительно широкие зоны
роста, которые можно было использовать в опытах вирусологического ис-
следования, давали эксплантаты почек и селезенки указанных видов рыб.

Отмечалось, что вокруг эксплантатов почек вначале появляются не
связанные между собой мигрирующие клетки, затем образуется зона роста
эпителиальных клеток, ширина которой к 7-10-му дню достигает 2-3 мм, а к
14-му дню эпителиальные клетки начинают замещаться соединительноткан-
ными. Эксплантаты селезенки дают разрастание только соединительноткан-
ных клеток с шириной зоны роста 5 мм и более, а эксплантаты жабр-зону
роста одних эпителиальных клеток. Между близко расположенными кусоч-
ками тканей рост, как правило, наиболее обильный.

При смене питательной среды через 6-7 дней клетки пролиферируют
в течение 28-32 дней при температуре инкубации 19°С для тканей форели и
20-25°С для тканей карпа. Отдельные эксплантаты сердца карпа продолжали
пульсировать в течение 26 дней после заключения в сгусток плазмы и по-
мещения в питательную среду.

Таким образом, было отработано приготовление эксплантатов почек и
селезенки карпа и радужной форели. При этом использовали среды, разра-
ботанные для тканей и клеток теплокровных животных, что облегчает рабо-
ту по культивированию эксплантатов рыб. Необходимо учитывать опти-
мальную для жизнедеятельности рыб температуру, так как рост экспланта-
тов находится в прямой связи с этим фактором. Для увеличения массы кле-
ток следует учитывать явление тропизма клеток: кусочки однородной ткани,
помещенные на стекло близко друг к другу, дают встречный и довольно
обильный рост клеток.

Однослойные культуры клеток рыб

Культуры клеток являются необходимым методом при проведении виру-
сологических исследований болезней рыб. В связи с этим была поставлена за-
дача изучить условия приготовления однослойных культур из различных тка-
ней и органов таких пресноводных рыб, как карп, карась, радужная форель и
вьюн. При разработке культур клеток рыбного происхождения были проведены
многочисленные опыты, направленные на уточнение различных моментов про-
цесса выращивания клеток, при этом применялись общепринятые в медицин-
ской и ветеринарной вирусологии приемы и методики, а также растворы и пи-
тательные среды с учетом особенностей организма рыб.

Материалы и методы

Виды рыб, ткани и органы

В опытах использовали ткани карпа, карася, радужной форели, вьюна. В
различных опытах испытаны ткани сердца, почек, печени, селезенки, яичников
(гонад), семенников, плавательного пузыря, мышц, жабр и кожи от названных
рыб разного возраста (сеголеток ’’годовиков” двухлеток), а также эмбриональ-
ная икра и личинки радужной форели, вьюна и карпа. Внутренние органы и
ткани брали от рыб асептически: кожу, жабры, икру и личинок обрабатывали
антибиотиками и химиопрепаратами (малахитовый зеленый, этанол, мертиолят
и др.) с целью уничтожения микрофлоры (бактерий и грибов).

Диспергирование тканей. Испытаны растворы трипсина разной кон-
центрации (0,05; 0,10; 0,15; 0,20; 0,25; 0,30; 0,50%) с разным содержанием
солей в них (от 0,604 до 0,876%).
Диспергирование тканей вели на электромагнитной мешалке при
двух температурах 18-22°С (комнатная температура) и 4°С (в бытовом хо-
лодильнике). При комнатной температуре циклы диспергирования про-
должались 3, 5, 10, 20, 30, 45, 60 минут, при температуре 4°С в течение 18-
20 часов. В отдельных случаях в растворы трипсина добавляли 2% сыворот-
ки крупного рогатого скота,5% среды Игла или 199.

Растворы и питательные среды. Определяли оптимальную концен-
трацию солей в растворах и средах для клеток рыб, для чего использовали
обычные среды и растворы или разведенные стерильной дважды дистилли-
рованной водой до 0,604%-ной концентрации солей

В опытах были испытаны среда 199, среда Игла (основная и ми-
нимальная), 0,5%-ный раствор гидролизата лактальбумина и среда Пака-
Робинсона. В среды добавляли сыворотки карпа, крупного рогатого скота
или лошади, амниотическую жидкость коровы, тканевые экстракты и др.

Испытаны среды с 1; 3; 3,5; 4; 7, 5; 10 или 20% сыворотки карпа, с 10, 12,
15, 25, 30, 33, 35 или 40% сыворотки крупного рогатого скота, с 15 или 20%
сыворотки лошади и с 10% амниотической жидкости коровы. В отдельных
опытах использовали среды с 30%-ным куриным эмбриональным экстрактом
(2,5-5,0%), 30%-ным почечным и почечно-селезеночным карповым экстрактом
(4,0-6,3%), а также с цистеином (от 0,003 до 0,02%), глутамином (от 0,0005 до
0,015%), глюкозой (0,1%), рибозой (от 0,0003 до 0,02%) и др.

Для выяснения оптимума испытали среды со следующими значения-
ми pH: 7,0; 7,1; 7,2; 7,25; 7,3; 7,45; 7,53; 7,6 и 7,8.

Оптимальную дозу клеток для посева в пробирку определяли при
следующих концентрациях их в I мл: 250, 340, 380, 500, 600 и 900 тыс.; 1,00;
1.29; 1,35; ,80; 1,91; 2,00, 2,10; 2,15; 2,20; 2,49; 2,90; 3,20; 3,40; 3,80; 4,00;
5,00 и 5,38 млн.клеток.

Смену питательных сред проводили через 1, 2, 3 или 5 суток после
посева клеток, а повторную смену - через 4-5 суток после первой.

Температура инкубации. Культуры клеток карпа и карася выра-
щивали при температурах от 20 до 32°С, культуры клеток радужной форели
- от 12,5 до 22°С, а культуры клеток вьюна - при 20-26°С.

Приготовление культур клеток

Установлено, что наибольшее количество клеток можно получить из
тканей почек, селезенки и гонад рыб, несколько хуже диспергируется жаберная
ткань и плохо, с низким выходом клеток - все остальные ткани и органы.

Ткань почек лучше диспергировать 0,10-0,15%-иыми растворами
трипсина на холоду, при этом меньше травмируются клетки, и они лучше
растут. Высокие концентрации трипсина дают большой выход клеток из
почечной ткани, но значительное количество клеток разрушается. Ткань
гонад удовлетворительно диспергируется 0,25 и 0,5%-ными растворами
трипсина, при этом предпочтительнее пользоваться 0,5%-ным раствором,
который быстрее переваривает ткань без сильного повреждения клеток.

Кратковременные перемешивания и добавки нормальной сыворотки
или среды в раствор трипсина имеют положительное значение для ткани
почек, но не для других тканей. Трипсинизация на холоду не является обяза-
тельной для гонад и эмбрионов рыб.
Посевная доза зависит от адгезивной способности клеток. Клетки се-
лезенки обладают слабой способностью прикрепляться к стеклу. Клетки
гонад и почек легко прикрепляются к поверхности стекла, и оптимальной
посевной дозой являются 600-800 тыс.клеток в 1 мл среды.

Для клеток карпа, карася и радужной форели вполне пригодны обыч-
ные питательные среды. Для клеток вьюна среды должны быть несколько
гипотоничными. Рост клеток стимулируют как гомологичная, так и гетеро-
логичные сыворотки: наличие в среде тканевых экстрактов и других добавок
не усиливают пролиферацию клеток, однако глутамин (0,15 г/л) во всех слу-
чаях является благоприятным. pH среды оптимальна в пределах 7,2-7,4.

Температура выращивания клеточных культур зависит от вида рыбы.
Клетки радужной форели, как холодноводной рыбы, растут при тем-
пературах, не превышающих 20°С. Клетки карпа требуют температуру в
пределах 25-29°С, а клетки карася - до 30°С.

На основании проведенной работы разработаны методики приготов-
ления культур клеток почек карпа, гонад карпа, карася, радужной форели и
вьюна, эмбрионов вьюна.

Для приготовления культур отбирают клинически здоровую рыбу из
благополучного по заразным болезням водоема.

Отобранных карпов обездвиживают путем разрушения продолговатого
мозга через черепную полость, а затем обескровливают, отрезая хвостовой сте-
бель. Чтобы рыба лучше обескровилась, ее на некоторое время оставляют в ка-
кой-либо посуде с небольшим количеством воды. После этого обрезают груд-
ной и брюшной плавники на левой стороне тела, удаляют чешую, рыбу обмы-
вают водой и обтирают сухой салфеткой. Левую сторону тела и брюшко тща-
тельно протирают 2-3 раза ватным тампоном, смоченным спиртом-
ректификатом или 70%-ным изопропиловым спиртом. Подготовленную таким
образом рыбу помещают на чистый кювет и вносят в стерильный бокс, где пе-
ред вскрытием кожу вновь дезинфицируют 1-2 раза спиртом.

Мелких рыб (вьюнов, карасей) и радужную форель оглушают, обти-
рают досуха и привязывают кверху брюшком к доске с отверстиями. Для
этого одну тесьму с помощью анатомического пинцета вводят в полость рта
через жаберную щель и конец тесьмы из полости рта выводят наружу через
другую жаберную щель. Концы тесьмы пропускают в отверстия доски и
таким образом прикрепляют к доске голову рыбы. Другую тесьму привязы-
вают к хвосту позади анального отверстия, рыбу вытягивают и тесьму завя-
зывают на обратной стороне противоположного края доски. На одной доске
можно привязать несколько рыб брюшком кверху,

У рыб обрезают грудные, брюшные и анальный плавники, удаляют
чешую; брюшко и бока тщательно протирают спиртовым тампоном, чтобы
полностью удалить слизь с поверхности тела. Очищенную кожу вновь де-
зинфицируют спиртовым тампоном, и привязанных к доске рыб вносят в
стерильный бокс, где проводят заключительную обработку.

Культура клеток гонад карпа

Для получения клеточных культур следует брать гонады (яичники)
неполовозрелых рыб. Клетки гонад обладают высокой потенцией роста и
дают хорошие первично трипсинизированные однослойные культуры.
Отбор доноров. Для получения гонад отбирают неполовозрелых са-
мок рыб из благополучного по инфекционным болезням рыбоводного хо-
зяйства. Яичники у них должны иметь II или H-Ш стадии развития по шкале
Киселевича. Согласно этой шкале, первые три стадии развития характери-
зуются следующими признаками:

I стадия. Неполовозрелые юношеские особи. Половые железы в виде
узких шнуров или лент, прилегающих к стенкам полости тела. Невооружен-
ным глазом определить пол невозможно.

II стадия. Созревающие особи или рыбы, половые продукты которых
развиваются повторно после размножения. Железы малы; яичник имеет не-
сколько зернистый вид, но икринки неразличимы; по внутренней стороне
яичников проходит кровеносный сосуд, который не заметен на семенниках.

III стадия. Железы еще не зрелые, но уже сравнительно развиты. Яич-
ники занимают от трети до половины объема брюшной полости и имеют
мелкие непрозрачные икринки, хорошо видимые простым глазом; при раз-
рыве стенки яичника икринки образуют комки по несколько штук.

Для определения пола надавливают на брюшко и одновременно по-
глаживают в направлении от головы к анальному отверстию. У самок при
этом выделяются экскременты и слизь, а у самцов - молоки.

Взятие гонад. В стерильном боксе кожу рыбы вновь протирают 1 -2 раза
спиртовым тампоном; стерильными ножницами вскрывают брюшную полость
так, чтобы создать достаточно удобный подход к гонадам. Для этого вначале
прокалывают брюшную стенку выше и спереди анального отверстия, затем
ножницами делают два разреза вверх - вперед и вниз - вперед к основанию жа-
берной крышки. Образовавшийся лоскут брюшной стенки срезают.

Гонады расположены в брюшной полости под тонким слоем жира
между плавательным пузырем и пищеварительными органами с левой и
правой стороны. Они представляют розоватый тяж различной ширины, на-
чинающийся от концевого отдела кишечника и продолжающийся до пище-
вода. В зависимости от стадии зрелости гонады могут представлять одно-
родную студневидную ткань (II стадия) или такую же ткань с наличием раз-
ного количества икринок (П-Ш стадия).

Анатомическими пинцетами из брюшной полости извлекают левый
яичник и помешают в чашку Петри. Затем удаляют плавательный пузырь и
извлекают правый яичник. В чашке Петри гонады освобождают от жира и
серозных оболочек.

В зависимости от стадии зрелости дальнейшая подготовка гонад для
трипсинизации будет различной.

Подготовка гонад для трипсинизации. Если гонады имеют II стадию
развития, т.е. представляют однородную студневидную ткань, их измельча-
ют ножницами или бритвой, промывают 2-3 раза стерильным солевым рас-
твором (фосфатно-буферным, Хенкса или гидролизата лактальбумина) и
переносят в трипсинизационную колбу.

В случае, если гонады имеют И-Ш стадию зрелости, т.е. в них уже
имеются сформировавшиеся икринки в различных количествах, ткань гонад
измельчают, затем растирают (в пробирках - стеклянной палочкой, в ступке
- пестиком и.т.п.) до полного разрушения всех икринок. После этого ткань
многократно отмывают от содержимого икринок - жироподобного вещества
путем многократного взбалтывания и отстаивания в свежих порциях солево-
го раствора. После того как над осадком ткани раствор станет довольно про-
зрачным, отмытую ткань переносят в трипсинизационную колбу.

Трипсинизация ткани гонад. Диспергирование ткани проводят в
0,25%-ном или, предпочтительно, в 0,5%-ном растворе трипсина на эле-
ктромагнитной мешалке при комнатной температуре.

После первого 10-15-минутного перемешивания раствор трипсина над
осадком отбрасывают, а затем проводят несколько 30-60-минутных экстракций
ткани (до ее истощения) в растворе трипсина. Каждую порцию трипсина с клет-
ками сливают во флакон, который хранят на льду в холодильнике.

Ткань гонад карпа можно трипсинизировать также при температуре
4°С в течение 18-20 часов.

По окончании диспергирования клетки осаждают из раствора трипсина
путем центрифугирования в течение 5-10 минут при 1000-1500 об/мин. Раствор
трипсина сливают, а осадок суспензируют в питательной среде без сыворотки.

Подсчёт клеток: После энергичного взбалтывания берут I мл полу-
ченной взвеси клеток, добавляют равный объем 0,5%-го раствора трипанб-
лау и подсчитывают клетки в счетной камере Горяева.

В пяти больших квадратах счетной камеры подсчитывают неокрашен-
ные клетки с неповрежденной цитоплазмой и, исходя из полученного числа,
рассчитывают количество клеток в I мл взвеси по общепринятой методике.

Посев клеток в пробирки и флаконы. Клетки высевают в концентрации
600-800 тыс./мл среды. Для получения указанной концентрации клеток к под-
считанной взвеси добавляют соответствующее количество среды и сыворотки.

Применяют среды 199, Игла или 0,5%-ный раствор гидролизата лакталь-
бумина с 10-15% сыворотки, по 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрепто-
мицина. Используют сыворотки - эмбриональную, телят или взрослого крупно-
го рогатого скота. В пробирки вносят по 1 мл, в 50-миллилитровые флаконы -
по 8 мл и в матрасы - по 150-200 мл взвеси клеток.

Клетки инкубируют при температуре 28-29°С. Наблюдение за ростом
культур ведут при малом увеличении микроскопа (объектив в 8х, окуляр 7х).
При указанной температуре монослой образуется на 3-5 день после посева
клеток и представляет смешанную культуру, состоящую из эпителио- и
фибробласто-подобных клеток.

Хранение клеток. Взвесь клеток гонад карпа можно хранить дли-
тельное время в холодильнике при температуре 4°С, что позволяет более
рационально использовать клеточные культуры.

После центрифугирования при 1000-1500 об/мин в течение 10 минут оса-
жденные клетки отделяют от раствора трипсина, и осадок взвешивают в среде 199
или 0,5%-ном растворе гидролизата лактальбумина с 10-20% сыворотки крови
крупного рогатого скота. Затем клеточную взвесь фасуют в 50-миллилитровые
флаконы по 25-30 мл и хранят в холодильнике при температуре 4°С. Более благо-
приятной для хранения является концентрация клеток до 10 млн/мл.

При хранении количество живых клеток постепенно уменьшается, но
длительное время (до 199 дней) остается такое их количество, которого дос-
таточно для посева и выращивания монослоя.
При этом количество сыворотки в среде (10 или 20%) не оказывает су-
щественного влияния на выживаемость клеток. Более важное значение имеет
механическое воздействие на них. После нескольких энергичных встряхиваний
флакона (при взятии части клеток для посева или подсчета) количество клеток
во взвеси быстро уменьшается, особенно в первые две недели хранения.

После подсчета клетки засевают в пробирки или флаконы в концен-
трации 600- 700 тыс/мл неокрашенных трипансинью живых клеток. Раз-
множение клеток и образование монослоя наступают в обычные сроки, при
этом чем дольше хранились клетки в холодильнике, тем меньше клеток эпи-
телиоподобного типа отмечается в монослое. Монослой, выращенный из
клеток через 119 дней после трипсинизации, полностью состоит из клеток
фибробластоподобного типа.

Транспортировка культур клеток позволяет проводить вирусологиче-
ские исследования рыб непосредственно в рыбоводных хозяйствах.

Культуры клеток следует перевозить через 2-3 дня выращивания их
при температуре 29°С. Флаконы с клетками полностью заполняют пи-
тательной средой. Пробирки вначале просматривают под микроскопом, от-
мечают верхнюю границу прикрепления и роста клеток на стекле и налива-
ют среду не ниже отметки. Питательная среда при этом должна содержать
2% сыворотки. После этого культуры клеток в пробирках и флаконах пере-
возят по мере надобности в вертикальном положении.

Культура клеток гонад карася

У привязанных кверху брюшком, подготовленных для вскрытия кара-
сей, вскрывают брюшную полость двумя сагиттальными разрезами, которые
начинаются впереди брюшных плавников и заканчиваются перед основа-
ниями грудных плавников. Лоскут брюшной стенки отворачивают вперед и
отрезают. Из вскрытой брюшной полости извлекают анатомическими пин-
цетами гонады и помещают в чашку Петри.

Последующая работа проводится точно так же, как при приготовле-
нии культуры клеток гонад карпа, однако эффективнее использовать 0,25%-
ный раствор трипсина.

Культуры клеток гонад карася выращивают при температуре 29-31 °C.

Культура клеток гонад радужной форели

Гонады на стадиях зрелости бывают у радужной форели при
средней массе около 200 г (5-6 рыб на I кг). Гонады находятся в передней
части брюшной полости в виде двух небольших тяжей, прилегающих к обе-
им сторонам позвоночного столба.

Рыб подготавливают и вскрывают так же, как и карасей. При работе с
гонадами радужной форели желательно, чтобы температура окружающей среды
была около 15°С. Порядок работы такой же, как при приготовлении культур
клеток гонад карпа, однако следует пользоваться 0,25%-ным раствором трипси-
на и выращивать клетки при температуре 18-20°С (максимум 22°С).

Однослойные культуры клеток гонад радужной форели можно пере-
возить в таком же порядке, как перевозят культуры клеток гонад карпа.

Культура клеток гонад вьюна

У самок вьюнов при содержании в аквариумах и бассейнах гонады li-
ft стадии бывают осенью и в начале зимы у молодых некрупных особей. У
них отсутствуют ’’половые бугорки” на спине у заднего конца спинного
плавника, углы плавников закругленные.

Подготовка рыб к вскрытию такая же, как и у других рыб, однако че-
шую не соскабливают из-за малого ее размера. У подготовленных рыб
вскрывают брюшную полость двумя сагиттальными разрезами от брюшины
к грудным плавникам и лоскут отворачивают вперед, к голове. Гонады об-
наруживаются на поверхности кишечника и внутренних органов.

Порядок приготовления клеточных культур такой же, как у других
рыб, но существуют следующие особенности:

1)	к растворам и средам, предназначенным для культур теплокровных
животных, необходимо добавить стерильную дважды дистиллированную
воду в соотношении 1:5 (I часть воды+4 части среды или раствора);

2)	для выращивания культур клеток оптимальной является темпе-
ратура 2 5 °C.

Культура клеток почки карпа

Для одной трипсинизации берут несколько карпов. Стерилизованны-
ми инструментами вскрывают брюшную полость рыб, удаляют плаватель-
ный пузырь и ткань почек переносят в химический стакан, где измельчают
ножницами, несколько раз промывают раствором Хенкса или Эрла, а в зак-
лючение - раствором трипсина. Затем ткань переносят в трипсинизацион-
ную колбу и проводят многократные 3-5-минутные или однократную 1-1,5-
часовую экстракции клеток 0,10-0,15%-ным раствором трипсина на элек-
тромагнитной мешалке (колбу ставят в кристаллизатор со льдом). Взвесь
клеток в растворе трипсина собирают во флакон, который хранят на льду в
холодильнике. Клетки осаждают центрифугированием при 800-1000 об/мин
в течение 10 минут, осадок клеток промывают, а затем взвешивают в пита-
тельной среде в соотношении 1:200 и высевают в пробирки или флаконы.

В качестве ростовой среды используют среду Игла, среду 199 или
0,5%-ный раствор гидролизата лактальбумина с 10'15% сыворотки телят
или взрослого крупного рогатого скота.

Культуры инкубируют при температуре 26-29°С. Клетки почек карпа
быстро прикрепляются к поверхности стекла. В течение 3-4 дней образуют-
ся неплотные островки и зоны (поля) роста, которые нередко соединяются
между собой, однако сплошной слой клеток получать не удавалось. Культу-
ры характеризуются нестабильностью, островки и зоны начинают разру-
шаться через 9-12 дней.

Культура клеток эмбрионов вьюна

Эмбриональные ткани теплокровных животных отличаются более
быстрым ростом, чем ткани взрослого организма (В. Д.Соловьев,
Т.А.Бектемиров, 1963).Таким же свойством обладают и ткани рыб, поэтому
приготовление культур клеток из эмбрионов (развивающейся икры или эмб-
рионов живородящих рыб) всегда является перспективным. Однако инку-
бируемая икра обсеменена разнообразными бактериями и грибами, осво-
бодиться от которых трудно. Возможна дезинфекция поверхности крупной
икры радужной форели и других лососевых этиловым спиртом, другими
антисептиками, красками и антибиотиками. Мелкую икру (карпа, вьюна)
деконтаминировать практически невозможно, поэтому для приготовления
клеточной культуры необходимо иметь стерильную развивающуюся икру.

Нами разработана методика приготовления клеточной культуры из
эмбрионов вьюна, которая включает искусственное индуцирование созре-
вания икры у самок, стерильное осеменение и инкубацию икры, приготов-
ление культуры клеток. Как и при использовании гонад вьюна применяют
растворы и среды, разбавленные стерильной дважды дистиллированной во-
дой в соотношении 1:5.

Отбор рыб для получения икры и молок. Клинически здоровых вью-
нов разделяют по полу. Самцы имеют ’’половые бугорки” на спине позади
спинного плавника примерно на уровне анального отверстия, их грудные
плавники выглядят крупнее, чем у самок, и имеют более острые углы. У
самок нет ’’половых бугорков”, их плавники более закругленные.

Созревание икры у самок. Чтобы вызвать созревание икры, самкам
вьюна вводят хориогонин (200 ЕД на самку) или суспензию гипофиза сазана
(3-5 мг) внутримышечно в область спины у переднего края спинного плав-
ника. Суспензию ацетонизированных гипофизов готовят стерильно в ступке
на физиологическом растворе поваренной соли. Как правило, такая суспен-
зия не требует дополнительной обработки.

Введение гормональных препаратов самцам вьюна не обязательно.

Рыб содержат раздельно в воде при комнатной температуре. При та-
ких условиях икра у самок созревает через 36-48 часов после введения пре-
парата, при этом при совместном содержании самок и самцов возможно са-
мопроизвольное выметывание икры.

Получение половых продуктов. Вьюнов оглушают, обтирают досуха
чистой салфеткой, привязывают кверху брюшком к доске с отверстиями и под-
готавливают к вскрытию брюшной полости. Возможно фламбирование поверх-
ности тела вьюнов, но оно должно быть весьма умеренным, так как перегрева-
ние икры в брюшной полости приводит к плохому ее оплодотворению.

Ножницами у самок прокалывают брюшную стенку на белой линии
на 1-2 см впереди брюшных плавников и делают небольшой разрез по на-
правлению к голове. Из-за сильного напряжения в брюшной полости из раз-
реза самопроизвольно выходит икра. Ее собирают ложкой и помещают в
стерильную сухую банку с крышкой (бумажной или ватно-марлевой проб-
кой). После уменьшения напряжения разрез по белой линии увеличивают,
не доходя 1-2 см до оснований грудных плавников, из брюшной полости
выбирают ложкой всю созревшую икру.

Для получения молок брюшную полость самцов вскрывают двумя
саггитальными разрезами, которые начинаются в 1-2 см впереди брюшных
плавников и заканчиваются за 1-2 см до оснований грудных плавников.
Лоскут брюшной стенки отворачивают вперед или удаляют. Из вскрытой
брюшной полости анатомическими пинцетами извлекают молоки, которые
представляют два белых тяжа, и помещают на стерильную фильтровальную
бумагу в чашке Петри.

Осеменение и инкубация икры. Поверхность молок очищают от сгустков
крови и осушают фильтровальной бумагой, на которую они были помещены.
Затем бумагу из бактериологической чашки удаляют, молоки измельчают, рас-
тирают ножницами в этой же чашке, переносят в банку с икрой и перемешива-
ют. После этого к икре добавляют небольшое количество кипяченой водопро-
водной воды и осторожно, но тщательно перемешивают путем покачивания и
вращения банки. Смесь икры и молок с водой выдерживают в течение 5 минут,
после чего икру многократно промывают кипяченой водопроводной водой, рас-
кладывают в стерильные чашки Петри в таком количестве, чтобы икра распре-
делилась в один слой, и заливают такой же водой.

Осемененную икру инкубируют при комнатной температуре, но не
выше чем при 22°С. В течение всего срока чашки не открывают, защищают
от света и резких движений воздуха. За развитием икры наблюдают в одной-
двух чашках, и впоследствии икру из них для приготовления культуры кле-
ток не используют.

В зависимости от окружающей температуры из икры вылупляются
эмбрионы в срок от 2 до 5 суток. За это время часть икры погибает, однако
погибшую икру не выбирают, так как при всех предосторожностях икра мо-
жет загрязниться ‘микроорганизмами из воздуха.

В связи с тем, что при сравнительно одинаковой способности к росту
из более развитых, а также выклюнувшихся эмбрионов получается большее
количество клеток, икру для приготовления клеточной культуры берут сразу
же после появления в чашках отдельных свободных эмбрионов.

Подготовка и трипсинизация эмбриональной ткани. Икру вместе с
водой отсасывают пипеткой из чашек Петри и переносят в колбу. Воду сли-
вают, а икру промывают 0,5%-ным раствором трипсина, изотоничным для
тканей теплокровных животных, затем заливают таким же раствором и ста-
вят на электромагнитную мешалку. В этом растворе оболочки здоровой ик-
ры и вся погибшая икра перевариваются, а здоровые эмбрионы остаются
неповрежденными. Мутный раствор трипсина сливают, а эмбрионы промы-
вают 2-3 раза раствором Хенкса, переносят в пробирки и растирают проф-
ламбированной и остуженной стеклянной палочкой до такой степени, чтобы
разрушить желточные мешки всех эмбрионов. Затем эмбрионы промывают
двух-трехкратно раствором Хенкса или приготовленной питательной сре-
дой, чтобы освободиться от содержимого раздавленных желточных мешков.
После этого эмбриональная ткань готова для трипсинизации.

Диспергирование ведут в растворе следующего состава: 0,5%-ный
раствор трипсина, приготовленный на фосфатно-буферном растворе для
теплокровных животных 300 мл; 0,5%-ный раствор гидролизата лакталь-
бумина для теплокровных животных 100 мл; трижды дистиллированная
вода 100 мл; пенициллин 200 ед/мл; стрептомицин 200 мкг/мл. По-
лучается 0,3%-ный раствор трипсина, содержащий около 0,75% солей.

В первой порции раствора трипсина эмбриональную ткань переме-
шивают на электромагнитной мешалке в течение 10-15 минут, затем - после
отстаивания - раствор трипсина отбрасывают, ткань заливают свежим рас-
твором трипсина и диспергируют в течение 90 минут при комнатной темпе-
ратуре. За это время эмбриональная ткань переваривается почти полностью,
и взвесь клеток в растворе трипсина центрифугируют в течение 10 минут
при 800-1000 об/мин, жидкость над осадком сливают, клетки промывают
раствором Хенкса или питательной средой путем центрифугирования, и
осадок взвешивают в питательной среде.

Подсчет и посев клеток:

Клетки подсчитывают в гемоцитометре. Клетки эмбрионов вьюна от-
личаются крупными размерами, а также амебоидными движениями: многие
из них изменяют свою форму, образуя псевдоподии. Клетки засевают в про-
бирки по 1,0-1,5 мл и в 50-миллилитровые флаконы по 10-12 мл. Использу-
ется питательная среда следующено состава : среда Игла (199) или 0,5%-ный
раствор гидролизата лактальбумина - 350 мл, сыворотка телят или крупного
рогатого скота - 50 мл, трижды дистиллированная вода - 100 мл, пеницил-
лин - 100 ед/мл, стрептомицин - 100 мкг/мл, pH приготовленной среды до-
водят до 7,4-7,6 с помощью 5%-ного раствора двууглекислой соды.

Культуры выращивают при температуре 25°С. Первые островки роста
появляются через 12 часов, на третьи сутки образуются крупные зоны роста,
которые на 5-6-й день сливаются, образуя удовлетворительный монослой.
Вначале клетки весьма чувствительны к механическим воздействиям, по-
этому культуры следует просматривать через 3 дня, а менять среду, если
необходимо, не ранее пятого дня инкубации. В последующем смены среды
возможны через неделю. Признаки старения культуры (зернистость клеток,
очаговая дегенерация) появляются на 4-й неделе инкубации.

При комнатной температуре (17-23°С) рост культур происходит мед-
ленно, и образование монослоя завершается к 8-10-му дню, а при 37°С роста
и размножения клеток не отмечается: они остаются круглыми, не прилипают
к стеклу, хотя среда меняет pH в кислую сторону.

Для вирусологических исследований, наряду с первичными культу-
рами, используются постоянные линии клеток рыб, полученные в ряде ла-
бораторий мира: AS /внутренние органы атлантического лосося/, ASH
/сердце атлантического лосося/, ASO /гонады атлантического лосося/,
CHSE-14 /эмбрионы чавыки/ и др. Наиболее широко применяемые линии
клеток для выделения вирусов рыб являются ЕРС /оспенное поражение кар-
па/, FHM /кожно-мышечная ткань пимефала/. RTG-из гонад радужной форе-
ли является универсальной культурой для вирусов лососевых рыб.

Литература

1.	Архангельский Д.С., Полякова О.В. Получение первичных культур клеток из гонад
судака для вирусологических исследований. Биол.основы рыбных хозяйств, водоемов
Средней Азии, Казахстана, Фрунзе, 1978,с.244-245.

2.	Гончаров Г.Р., Зубкова Л.А..Степанова М.А. Однослойная клеточная культура почеч-
ной ткани леща. Биол. внутр.вод. Информ.бюллетень, 1970, № 6,с.60-64.

3.	Рудиков Н.И. Весенняя вирусная болезнь рыб (этиология, диагностика и профилакти-
ка). Дисс... на соискание Д.В.Н.,М.1987.

4.	Сборник инструкций по борьбе с болезнями рыб.Часть 1.Мин-во сельского хоз-ва и
продовольствия РФ,М.,1998.

5.	Пичугина Т.Д. Антигенные свойства возбудителя весенней вирусной болезни рыб и разра-
ботка серологических методов диагностики. Автореферат дис. кан.вет.наук, 1991г.
Глава 11. Промышленное культивирование клеток
животных и вирусов при производстве вак-
цин (способы, материалы, оборудование)

Промышленное производство биопрепаратов представляет собой
сложный комплекс взаимосвязанных физических, химических, биохимиче-
ских, физико-химических процессов, происходящих в разнообъемном и раз-
нотипном оборудовании, связанном в технологические линии. Характер
этих связей весьма разнообразен.

В биологическом производстве имеются несколько видов технологи-
ческих линий, различающихся материальными, энергетическими, информа-
ционными потоками и аппаратурным оформлением, в силу специфичности
технологических процессов изготовления различных препаратов.

Одной из самых сложных стадий производства биопрепаратов, явля-
ются процессы культивирования клеток животных и вирусов. И если про-
цессы, оборудование и методы масштабирования процессов культивирова-
ния микроорганизмов в настоящее время решены на достаточно высоком
научно-техническом уровне, то при промышленном культивировании кле-
ток животных и вирусов еще необходимо решить целый ряд проблем.

Наличие реальной гибели клеток и присутствие остатков клеток в
культуре - основная проблема культивирования клеток животных. Это слу-
жит препятствием в достижении высокой продуктивности и в оптимальном
протекании процесса. К тому же, это может сказаться на качестве продукта
и вызвать проблемы в дальнейших технологических процессах.

Различают два основных способа культивирования клеток вы-
ращивание на поверхности твердой фазы (монослой) и глубинное культиви-
рование.

Типичным приемом при лабораторных исследованиях является вы-
ращи-вание клеток, и вирусов в однослойной стационарной культуре.

Существует несколько методов глубинного культивирования - стати-
ческое и динамическое. При статическом культивировании массопередача
между клетками, питательной средой и газом осуществляется за счет диф-
фузии. Система статического культивирования в основном применяется для
всех типов клеток при небольших масштабах производства.

Необходимо различать три основных метода динамического глу-
бинного культивирования. При первом методе поверхность для куль-
тивирования клеток (матрица) движется, а питательная среда (жидкость)
находится в статическом состоянии. При втором методе поверхность (мат-
рица) находится в статическом состоянии, жидкость движется. И, наконец,
при третьем способе в движении находятся все фазы культивирования
(клетка-жидкость-газ).

Одной из основных проблем при культивировании клеток и вирусов
была и остается проблема повышения эффективности использования ком-
понентов питательной среды и увеличение продуктивности клеток.
Сосуды Карреля, предложенные в 1923 г., относятся к статическим
системам культивирования. Другие исследователи отказались от использо-
вания таких сосудов. В частности, в 1926 г. Странгевейс и Фелл использова-
ли для этой цели наклонные сосуды трубчатого типа, которые открыли путь
для созданных Ловенштадтом систем культивирования на основе вращаю-
щихся пробирок. Позднее, в 1933 г., Гей опубликовал характеристики своего
варианта таких систем. Разработанный им вариант при полной комплекта-
ции соответствующей установки имеет рабочую площадь поверхности, на
которой могут выращиваться клетки, 4700 см2, что эквивалентно 24 бутылям
Роукса. Такая аппаратура явилась прототипом современных установок для
культивирования, состоящих из рам с размещенными в них обоймами с
большим количеством вращающихся сосудов (так называемые роллерные
установки или роллеры). Установки указанного типа выпускаются серийно.
Начиная с этого периода (публикация Гея), можно проследить истоки со-
временных многоэлементных процессов и аппаратов, применяемых в произ-
водстве монослойных клеток в целях коммерческого выпуска различных
вакцин. Биологическим субстратом для выращивания вирусов при этом
обычно служат клетки куриных или перепелиных эмбрионов и клеточные
штаммы, диплоидных и постоянных культур клеток животных и человека.

Первые вакцины для людей были приготовлены из культур, выра-
щенных непосредственно в цельном организме животных. Следует иметь в
виду, что до начала использования для этой цели (1798 г.) телят и овец ис-
точником получения вакцины против оспы был сам человек. Ветеринарные
вакцины сначала получали также с использованием животных. Затем,
вплоть до настоящего времени, вакцины против ящура, выпускаются на ос-
нове вируса, получаемого в эксплантатах ткани языка пораженных живот-
ных, по методам, которые разработал Френкель в 1947 г. Начало использо-
вания для этой цели клеточных культур относится к 1960 г., когда при полу-
чении вакцин против ящура стали применять диспергированные с помощью
трипсина клетки тканей почки телят. Дальнейшее развитие ознаменовалось
применением линий клеток, которые можно пассировать практически неог-
раниченно (клетки ВНК) и использовать в качестве биологического субстра-
та для получения вируса ящура. Такие системы культивирования были ос-
нованы на клетках, выращиваемых на поверхности стационарных или вра-
щающихся стеклянных бутылей. Важное изменение в такую технологию
было введено после того, как стало возможным выращивать клетки без под-
держивающей поверхности, т.е. в суспензии.

Первые суспензионные культуры клеток животных, как правило, ос-
новывались на клетках злокачественных тканей. Это клетки HeLa, выде-
ленные из раковой опухоли шейки матки человека, а также L-клетки мыши-
ных фибробластов. Позднее (1962 г.) системы культивирования были рекон-
струированы таким образом, что стало возможно использовать клетки «нор-
мальной» ткани, а сами клетки выращивать в суспензи. Возможности систем
суспензионного культивирования можно иллюстрировать хотя бы тем, что
масштабный переход от 0,2-литровой системы к 8000-литровым современ-
ным системам потребовал очень небольших изменений технологии.

Успехи в культивировании клеточных культур за последние годы свя-
заны с достижениями в аппаратурном оформлении этого процесса.

Всю аппаратуру для поверхностного и глубинного культивирования
клеток животных и вирусов можно подразделить на следующие группы:

-	культурально-тканевые контейнеры;

-	качалки, роллеры, магнитные мешалки (спиннеры), инкубаторы;

-	биореакторы.

В таблице 19 и на рис.49 и 50 приведены характеристики некоторых
культурально-тканевых контейнеров, предлагаемых для использования при
культивировании клеток животных.

Таблица 19

Культурально-тканевые контейнеры

Наименование	Емкость, мл	Назначение	Тип, марка	Фирма, страна
Флакон бифаз- ный	100, 150,  250, 500	Для одновременного культи- вирования клеточных куль- тур, бактерий и гибридом	Т 150  PL-732	"Giboo" (США)
Многослойные флаконы	от 100 до  500	Для наработки большого ко- личества клеток и гибридом		Патент  США
Бутыль для аэробного культивирова- ния клеток	2000	Для роллерного выращивания культур. Поверхность для роста! 760 см“ Материал: стекло, полимер	2Х	’’Baxter Travenol” Lab. (США)
Набор проби- рок, флаконов, бутылей	от 5 до 3000	Для исследования роста куль- туры клеток		"Belico Bio- technology” (США)

До последнего десятилетия роллерные культуры являлись одним из
распространенных способов производства клеток и вирусов в промышлен-
ных масштабах. Они привлекали своей простотой и надежностью, однако
при их использовании сохраняется значительная трудоемкость производства
в целом. Более сложным путем являются попытки увеличить культуральную
поверхность о помощью наполнителей (стеклянные трубки, шарики, кру-
пинки сефадекса и т.д.), причем наиболее пригодным для культивирования
на наполнителях являются диплоидные и перевиваемые клетки.

Назначение и характеристики некоторых типов качалок, роллеров,
магнитных мешалок, спиннеров и инкубаторов приведены в таблице 20 и на
рис.51-53.
Таблица 20

Качалки, роллеры, магнитные мешалки, спиннеры, инкубаторы

Наименование, фирма, страна. Тип, марка	Назначение, ссылка	Технические характеристики
Качалка термостатиро- ванная ”LH Termenta- tion” (Швеция) (серии ХА, ХВ, ХС, X)	Культивирование в суспензии микроор- ганизмов, клеток животных и вирусов	Флаконы и колбы от 100 до 2000 мл Количество: от 12 до 72.  Температура: 4-75°С+0,5  Скорость: 40-400 об/мин
Роллеры Rollacell RC "NBS" (США)	Культивирование клеток и вирусов	Бутыли и флаконы до 4 л  Количество: 16 Скорость: 0,8-14 об/мин
Многоярусный роллер Multiple Tier ”NBS” (США)	Культивирование клеток и вирусов	Бутыли и флаконы диаметром 257 и 500 мм  Количество: до 72  Скорость: 0,8-14 об/мин
Спинненры  Sci/ERATM "Belico  Biotechnology” (США)	Культивирование клеток и вирусов	Емкость: 0,1; 0,25; 0,5; 1,0; 3,0; 6,0; 8,0; 15,0; 36,0 л  Температура: 5-50°С+0,5
Инкубатор RL-CO2 ”NBS” (США)	Инкубирование яиц	Емкость: 173-10%+0,2 СО2: 0- 20%+0,5  Температура: 5-60°С+0,25

Принципиальным шагом в развитии методов выращивания клеток и
вирусов является переход к суспензионному культивированию.

Системы суспензионного культивирования подразделяются на замк-
нутые и открытые. Замкнутыми являются системы периодического (цикли-
ческого) культивирования и периодического культивирования с подпиткой
(отьемно-доливное). К открытым системам культивирования относятся диа-
лизная (с фильтрацией), перфузионная (гетерогенная), перфузионная с ре-
циркуляцией (квазигомогенная), непрерывная гомогенная (хемостат) и не-
прерывная гетерогенная (турбидостат).

Хотя конструкция биореакторов для культивирования и не поддается
шаблону, однако, можно предварительно сформулировать ряд следующих тре-
бований к ним: обеспечение стерильности процесса культивирования; обеспе-
чение стерильности посева и взятия проб; гомогенность культуральной среды и
культуры; оптимальные массо- и теплообменные характеристики по потребле-
нию питательных веществ и отводу продуктов метаболизма; простота наладки
обслуживания; стандартность блоков оборудования для культивирования; воз-
можность осуществления масштабного перехода; возможность автоматического

контроля регулирования основных параметров культивирования.

Для обработки поверхностей аппаратов для культивирования, в том
числе 'и биореакторов при выращивании клеток млекопитающих использу-
ют декстраны, метилцеллюлозу, коллагены, желатин, альбумины, альгинат-
натрия, L-лизин, поли-Ь-аргинин, гепарин и поли-винилпирролидон.

Для культивирования в суспензии поверхностнозависимых клеток ши-
роко используются микроносители (псевдосуспензионное культивирование). В
производстве используются следующие микроносители: декстрановые (Cytodex
4,2) для выращивания различных клеточных линий тканей животных и челове-
ка, микроносители, покрытые коллагеном или желатином (Oytodex 3), поли-
стироновые микроносители (Biosilion.Gytosperes), стеклянные с пониженной
сорбцией компонентов питательной среды на их поверхности (Bioglass) и ДЕАЕ
- целлюлозные микроносители (ДЕ-53) для выращивания первичных и дипло-
идных культур, склонных к образованию агрегатов. Эффективность культиви-
рования клеток на микроносителях зависит от адгезии на их поверхности, кото-
рая определяется физико-химическими свойствами этой поверхности (заряд,
виды связей поверхности групп и т.д.).

Особое внимание при выборе конструкции биореактора для культи-
вирования клеток животных и вирусов следует уделять характеристикам их
констуктивных соотношений, материалам узлов биореактора и гидродина-
мическим условиям культивирования при гарантированном соблюдении
асептических условий при длительном культивировании.

Масштабирование - наиболее легкая проблема для обычных реакто-
ров, как, например, реакторы для непрерывного культивирования (CSTR),
барботажные колонные и эрлифтные реакторы, по сравнению с другими
типами реакторов на основе пустотелых волокон и керамических носителей.
Эти, серийно выпускаемые биореакторы, обладают преимуществом из-за
несложности их конструкции, удобства в обслуживании и ремонте. В них
легко поддерживать гомогенные условия и, поэтому, имеется возможность
использовать серийные образцы реакторов и системы контроля и регу-
лирования жизнедеятельности клеток.

Одной из основных проблем масштабирования при использовании
обычных биореакторов является снабжение культуры клеток растворенным
кислородом. Так как потребление кислорода клетками значительно ниже,
чем у микробной культуры, то пределы лимитирования кислородом нахо-
дятся в более широком диапазоне.

При слабом перемешивании в биореакторах небольшого объема (до
10 л) можно обеспечить достаточное количество кислорода для культуры
клеток животных, даже при помощи только поверхностной аэрации. Коэф-
фициент массопереноса кислорода (Кьа) в этих системах можно повысить
аэрацией путем барботажа газа. Дальнейшее его увеличение можно полу-
чить при использовании механического перемешивания для лучшего рас-
творения воздушных пузырьков в жидкости.

Присутствие воздушных пузырьков так же как и механическое пере-
мешивание является причиной возникновения гидродинамических сил.
Клетки животных в зависимости от их размера и прочности их клеточных
стенок, в той или иной мере чувствительны к этим силам. Поэтому, интен-
сивное перемешивание и аэрация неизбежно приводят к повреждению кле-
ток и их воздействия должны быть сведены к минимуму.

Таким образом, обычный биореактор с механическим перемешиванием
используется только для небольших объемов культивирования, когда можно
обеспечить культуру кислородом с помощью только поверхностной аэрации.
В эрлифтных петлевых биореакторах нет механического перемешивания
и они являются более простой конструкцией и в них более низкие значения сил
сдвига по сравнению с обычным биореактором с механическим перемешивани-
ем. Кроме того, эрлифтные петлевые реакторы имеют, даже при больших объе-
мах, хорошие кислородные и массообменные характеристики. В целом, эр-
лифтный петлевой реактор является более подходящим оборудованием для
культивирования клеток животных в больших объемах.

Расширение выпуска рекомбинантных и гибридомных клеточных
систем делает необходимым увеличение объемов их выпуска за счет повы-
шения производительности систем культивирования с использованием се-
рийно выпускаемых биореакторов с рядом конструктивных усовершенство-
ваний и использованием защитных веществ (рис.54,55.).

Отмечено защитное влияние сыворотки на выживаемость культуры
клеток при гидродинамических воздействиях. При изменении концентрации
сыворотки в культуральной жидкости с 5% до 2% и ниже наблюдалось
уменьшение количества жизнеспособных клеток.

Защитное действие сыворотки от гидродинамических сил основано на
двух механизмах: (1) физический механизм, работающий мгновенно после
добавления сыворотки; (2) физиологический механизм, который требует
определенное время для адаптации клеток к новой концентрации сыворотки
для того, чтобы проявился эффект защиты.

Такова же физическая природа защитного действия силиконовых пе-
ногасителей.

Предложено специальное поверхностно-активное защитное вещество,
являющееся сополимером полиэтилена и полипропилена типа Pluronic F-68.
Защитный эффект от гидродинамических напряжений сдвига, оказываемый
на каетки Pluronic F-68, в основном, при непосредственном контакте его с
клетками, обусловлен образованием защитных пленок вокруг клеток и по-
вышением поверхностного натяжения жидкости. Хорошее защитное дейст-
вие Pluronic F-68 как при барботировании, так и при перемешивании пред-
лагается в качестве основного метода при масштабировании процесса вы-
ращивания клеточных культур в серийно выпускаемых реакторах.

Широко используется компьютерная технология как в процессе куль-
тивирования, так и для проведения иммунологических и молекулярно-
биологических исследований с использованием ЭВМ.

Важным шагом в усовершенствовании методов выращивания клеток
и вирусов является использование мембранных биореакторов.

Иммобилизованные культуральные системы с использованием мембран-
ных биореакторов обеспечивают более высокий выход клеточных культур. Мем-
бранные биореакторы снабжены ростовой камерой с полимерными или керами-
ческими матриксами. Для этих целей используются различные носители, заклю-
чение клеток в полимеры и выращивание в микрокапсулах или матриксах.

В мембранных биореакторах используют мембраны, пропускающие
вещества с молекулярной массой от 6000 до 10000 дальтон и позволяющие
диффундировать внутрь капилляров питательные вещества с низкой моле-
кулярной массой и обеспечивающие диффузию растворенных в среде газов.
Продукты метаболизма клеток диффундируют через стенки капилляров, а
продукты с высокой молекулярной массой остаются в питательной среде и
могут быть удалены вымыванием под давлением.

В таблице 21 показаны соотношения поверхности субстрат-носитель
(S) к объему питательной среды (V) для поверхностно-зависимых клеток в
различных системах культивирования.

Таблица 21

Отношение S/V у различных видов субстрат-носителей для культиви-
рования поверхностно-зависимых клеток

Субстрат-носитель	Отношение S/V(см2/мл)
Стационарная однослойная культура	0,29
Роллерная культура	0,35
На микроносителях (псевдосуспензия)	6,0
На микрокапиллярах мембранных реакторов	30,7

Посевная концентрация в 1 мл среды зависит от вида культуры, спо-
соба культивирования и конечной цели исследований и промышленного
производства и может колебаться от 60-80 тыс.клеток СПЭВ, ВНК-21, Hela,
для диплоидных клеток 100-200 тыс., для перевиваемых культур - 200-300
тыс. и до 2-5x105 в научных исследованиях.

В таблице 22 приведены данные по сравнительной эффективности
различных систем культивирования.

Таблица 22

Средняя продуктивность различных систем
культивирования клеток животных

№ п/п	Системы культивирования	Съем клеток с 1 мл питательной среды
1.	Биореактор с перемешиванием и протоком среды	5 106
2.	Эрлифтный биореактор	5 106
3.	Биореактор с биофильтром и протоком среды	7 106
4.	Культивирование в микрокапсулах	107 (перфузия)
5.	Биореактор с пористыми ячейками	108 (перфузия)
6.	Биореактор с полыми волокнами	108 (перфузия)
7.	Мембранные биореакторы (керамический модуль)	109 (перфузия)

Расширение выпуска рекомбинантных и гибридомных клеточных
систем делает необходимым увеличение объемов их выпуска за счет повы-
шения производительности систем культивирования.

Оптимальные соотношения объемов биореакторов для достижения
максимальной плотности при культивировании гибридом приведены в таб-
лице 23.
Таблица 23

Оптимальное соотношение объемов биореактора/среды для достижения
максимальной плотности культуры гибридом

Культу- ральные методы	Клеточ- ный уро- жай, кл/мл	Клеточ- ная плот- ность, кл/мл	Объем биореак- тора, м3	Степень раз- ведения пер- фузии среды, м3/день	Среда м3/день	МоноАТ* мг/мл
Периоди- ческий	2 106	2 106	20	4	5	30-300
Хемостат	5 10° 107	510е 107	4  2	0,5  0,5	2  1	100-700 200-1400
Перфузия	10' 5106	10® ю8	0,1  0,1	10 5	1  0,5	200-1400  400-2800

♦МоноАТ - моноклональные антитела.

Из данных таблицы 23 следует, что физиологическая потребность
культуры клеток различается в зависимости от способов культивирования.
Наименьшая плотность как и продуктивность клеточной культуры отмеча-
ется при периодическом культивировании, а наибольшая была достигнута
при использовании хемостатной и перфузионной систем культивирования.
Оптимальной системой с максимальной продукцией моноклональных сис-
тем является перфузионный метод в сочетании с иммобилизацией клеток.

В последнее время значительно возрос интерес к крупномасштабному
выращиванию клеток животных для производства таких биопрепаратов как
плазминоген, урокиназа, гормоны, интерферон, моноклональные антитела,
опухолевые антигены и т.д.

На продуктивность клеток влияют массобменные характеристики
системы культивирования, которые обеспечивают клеточную культуру ки-
слородом, углекислым газом и поддержанием концентрации водородных
ионов (pH) и необходимые окислительно-восстановительные условия (еН).

Для обеспечения массообменных характеристик биореакторов ис-
пользуются три метода:

1.	Аэрация культуры газовой смесью путем ее барботирования в пи-
тательную среду с образованием пузырьков;

2.	Аэрация через газопроницаемые мембраны;

3.	Диффузионный перенос О2 и СО2 через газо-жидкостные интерфазы.

Первый метод нашел широкое распространение при масштабиро-
вании процессов культивирования клеток животных и вирусов при произ-
водстве противовирусных препаратов. Однако, барботирование культураль-
ной жидкости часто приводит к механическому разрушению части клеток
животных. Наиболее перспективен метод аэрации клеточных культур через
проницаемые (гидрофобные) мембраны, в которых не происходит образова-
ние пузырьков на границе раздела фаз газ-жидкость. Диффузионный массо-
перенос наблюдается в биореакторах с пленочным матриксом и широко ис-
пользуется при роллерном культивировании.

Основные характеристики и область применения некоторых конст-
рукций мембранных реакторов для культивирования клеток животных при-
ведены в таблице 24 и на рис. 56,57.
Таблица 24

Типы мембранных биореакторов и фирмы, производящие их

№ п/п	Фирмы	Характеристика биореакторов
1.	Amicon Danvers, МА (Ве- ликобритания)	Полые волокна, которые используются также для ультрафильтрации
2.	Belico Biotechnology Veneland. NJ (США)	Полые волокна, связанные в пучки для транспорта среды, сыворотки и удаления целевого продукта
3.	Bend Research Bend DR (США)	Содержит мембраны для удаления токсических компонентов
4.	Bioguest Intemation Schenectady, NY (США)	Содержит мембранно-разделительные ком- плексы, функционирующие под давлением жидкости. Включает полые волокна, разрабо- танные на базе приборов, созданных в Нацио- нальном институте здоровья
5.	Celico Advanced Bioreactors Rockville, MD (США)	Создан на базе приборов, разработанных На- циональном институте здоровья. Снабжен по- лыми волокнами
6.	C.D. Vedical Miami Lakes, FL (США)	Включает полые волокна на основе целлюлозы и ацетата целлюлозы, поставлемых фирмой Dow Chemical (Midland, MI)
7.	Kinetek Systems St. Louis, MD (США)	Включает полые волокна из полисульфоновых мембран для культивирования клеток млекопи- тающих, которые планируют выполнить более гидрофильными
8.	Mioron Laguna Hills, CA	Включает микропористые мембраны для куль- тивирования клеток млекопитающих
9.	Millipore Bedford, MA (США)	Включает мембранный перфузионный модуль
10.	New Brunswick Scientific Edison, NJ (США)	Включает тангенциальный проточно- фильтрационный модуль
11.	Cepracor Marlborough, MA	Включает мембранные элементы с входящими в их состав ферментами для биокатализа
12.	Setec Livermore, CA	Включает полые волокна, в которых клетки растут между внутренней и внешней поверхно- стями волокон. Мембраны для этих реакторов производятся в ФРГ фирмой Enka (Оренбург)
13.	Sulzer Biotech Woodbary, NY (США)	В реакторы введены мембранные модули для улучшения выделения биопрепаратов
14.	W.H.E. Bio-Systems Weston Ontario	Биореактор циклонного типа, в котором рецир- кулирующее устройство снабжено мембраной. Цирконий-керамические мембраны для этих целей выпускаются фирмой Tech-Sep (Лион, Франция)
15.	Chemap (Швейцария) Gerogen	Биореактор горизонтального типа с мембрана- ми в виде пористых полупроницаемых стек- лянных трубок

Для повышения плотности культуры клеток предложено несколько

технологических и технических приемов:

при крупномасштабном культивировании для повышения выхода
клеток может быть использован мембранный биофильтр и схема, при-
веденная на рис. 58;
-	биореакторы с использованием фибрил в качестве твердого субстра-
та для прикрепления клеток;

-	перфузионные биореакторы для длительного (непрерывного) культиви-
рования клеток (рис.59). Данная система состоит на перфузионного хемостата
для суспензионных культур, биореактора с микроносителями и стационарного
поддерживающего биореактора для иммобилизированных клеток;

-	гибкая блочно-модульная система для глубинного суспензионного и
псевдосуспензионного (на микроносителях) культивирования клеток живот-
ных и вирусов, включающая биореакторы емкостью от 5 до 680 л с механи-
ческим перемешиванием, самовсасывающей мешалкой, модуля технологи-
ческой обвязки и блока автоматического управления.

Существуют два основных подхода к созданию любого необходимого
оборудования. Первый подход предполагает создание оборудования, предназна-
ченного для ведения в оптимальных условиях только данного специфического
процесса. Второй подход заключается в том, чтобы сконструировать многоцеле-
вое оборудование, способное выполнять любой вид работы из заданной програм-
мы. Примером первого подхода может служить создание биореакторов для куль-
тивирования клеток животных, иммобилизованных в виде бусинок, и способных
к генерированию целевых продуктов. Альтернативная методология, предусмат-
ривающая иммобилизацию клеток на поверхности элементов насадочного слоя,
заключается в содержании клеток внутри пористых матриц. Такие системы были
проверены в биореакторах для производства антител гибридомными клетками.

На стадии глубинного культивирования клеток и вирусов осу-
ществляется автоматический контроль и регулирование температуры, pH, еН,
парциального давления растворенного в жидкости кислорода (рО2), скорости
вращения мешалки, расхода воздуха на аэрацию и интенсивности ценообразо-
вания (Пе). В аппаратах для культивирования, кроме перечисленных парамет-
ров, осуществляется контроль концентрации глюкозы в культуральной жидко-
сти (Гл), парциального давления растворенного СО2 (рСО2), давления в рубаш-
ке, содержания микроэлементов (М), О2 и СО2 в отходящем из аппаратов возду-
хе и концентрации клеток в культуральной жидкости.

Литература

1.	Адамс Р. Методы культур клеток для биохимиков.-М.:Мир, 1983. с. 846.

2.	.Бейли Дж., Оллис Д. Основы биохимической инженерии, т.2, - М.: Мир, 1989. - 590 с.

3.	Биотехнология клеток животных, под ред. Р.Д. Спиера и Дж.Б. Гриффита, т.1, М.:
ВО "Агропромиздат", - 1989. - 365 с.

4.	Биотехнология, под ред. Хигтинса И., Беста Д. Джонса. - М.: Мир, 1988. - 479 с.

5.	Культивирование клеток животных и человека, 2-е Всесоюзное совещание. //Тезисы
докладов. - Пущино, 1985. - 184 с.

6.	Рубан Е.А. Оптимизация и масштабирование процессов глубинного культивирования микро-
организмов и клеток животных. //Тезисы научно-производственной конференции ”100 лет
Курской биофабрике и агробиологической промышленности. Россия: Курск, 1996. -с. 42-57.

7.	Рубан Е.А., Соколова Н.В. Использование турбинной самовсасывающей мешалки для
глубинного культивирования на микроносителях. //Экспресс-информация "Передовой на-
учно-производственный опыт в биологической промьшленности” N5, М.; 1982. с. 18-21.

8.	Martens,D.E., Coco-MartinJ., van der Veldende Broot.C.A.M., Beuvery.E.C., de Gooljer.G.D.,
Tramper J. To an optimal design of an air-lift loop reactor for the cultivation of hybridomas. In: From
clone to clinic, Amsterdam, The Netherlands, 1990, (Crommelin.DJ.A., Schellekens,H.Eds.).

9.	Martens D.E., Qooijer C.D., de Beuvery E.G., Tramper J. Effect of serum concentration on
hybridoma viable cell density and production of monoclonal antibodies in CSTRs and on
shear sensitivity in air-lift loop reactors Biotechnol. Bioeng., 1992. - pp. 891-897.

10.	Rief K.., Tramper J., Basic bioreactor disign. Marcel Dekker Inc , New York, 1991, p. 231.
Глава 12. Контроль стерильности и контаминации
клеточных культур

Стерильность клеточных культур на всех этапах их приготовления и хра-
нения обеспечивается не только тщательным выполнением изложенных выше
мероприятий, но и бактериологическими исследованиями донорских тканей, мат-
ричных и производственных линий клеток, а также клеточных расплодок, что
позволяет своевременно отбраковывать контаминированные материалы.

Контроль на стерильность клеточных культур осуществляют:

при изготовлении первичных культур клеток (образцы исходных
тканей, готовая суспензия свеже изолированных клеток);

п	ри поддержании перевиваемых линий клеток матричных культур
через 5-10 пассажей, но не реже одного раза в месяц, а производственных
культур - во время рассадки каждой партии;

-	при крупномасштабном суспензионном культивировании клеток - в
каждом пассаже;

-	при закладке на хранение в условиях жидкого азота и восстановле-
ния клеточных расплодок после низкотемпературной консервации;

-	при поступлении культур клеток из других учреждений и лабораторий;

-	во всех случаях возникновения признаков контаминации (опалесценция
или помутнение культуральной среды, ее резкое закисление, изменение ростовых
характеристик и морфологии клеток, неспецифическая дегенерация клеточного
монослоя, или массовая гибель клеток в суспензионных культурах и т.д.)

L Стерильность клеточных культур проверяют посредством высевов на бак-
териологические среды проб растворов (по 0,5 мл), использованных для промыв-
ки и диспергирования тканей, а также клеточной суспензии и культуральной
жидкости. Для бактериологического контроля суспензионных культур, выращи-
ваемых с применением антибиотиков, отобранную пробу в количестве 25-100 мл,
с целью освобождения от клеток, предварительно центрифугируют при 1000
об/мин, в течение 10 минут, а надасадочную жидкость затем исследуют методом
мембранного фильтрования , как это указано выше.

Материал на контаминирование вирусами исследуют в вирусо-
логических лабораториях, используя приводимые ниже методы.

Общее обследование культуры на наличие характерных цитопато-
генных изменений (ЦПД, симпласты, трансформация и т.д.).

Методы, основанные на прямом или косвенном связывании антиге-
на-контаминанта со специфическими антителами имунной сыворотки (реак-
ции нейтрализации, связывания комплемента, преципитации, иммунофлуо-
ресценции, иммунопероксидазный, радиоиммунный). Для установления
контаминанта в реакции нейтрализации и РСК требуется значительное ко-
личество антигена. При использовании других приведенных методов расхо-
дуется меньше антигена, чувствительность их выше. Эти методы универ-
сальны, практически пригодны для выявления различных видов вирусов. К
их недостаткам следует отнести необходимость наличия большого набора
гипериммунной сыворотки к различным штаммам и видам контаминантов.

Заражение исследуемым материалом лабораторных животных, по-
явление характерной клиники, образование специфических антител и изуче-
ние их одной из реакций, указанной в предыдущем пункте. Метод универса-
лен, может быть использован для установления многих видов контаминан-
тов. К его основным недостаткам следует отнести трудоемкость. Более того,
контаминанты, персистирующие длительное время в культуре, изменяются
и могут не вызывать заболевание животного. Если заболевание и наступает,
клиническое течение инфекции может быть не характерным.

Исследование окрашенных препаратов под световым и люминес-
центным микроскопами на тельца-включения(аденовирусы, инфекционного
ринотрахеита, бешенства), респираторно-синцитиального вируса (РСВ) и др.
По техническому выполнению метод прост, доступен и легко осуществим в
условиях обычных лабораторий.

Электронная микроскопия: данный метод универсален, позволяет
обнаружить практически все виды вирусной контаминации, за исключением
тех вирусов, которые инкорпорированы в нуклеопротеидные нити хромо-
сом. Процесс определения контаминанта несложен, требует мало времени.
Недостатком электронно-микроскопического метода исследования является
трудность обнаружения вируса при слабой инфицированности.

-	Гемадсорбция и гемагглютинация - эти две реакции позволяют выявлять
вирусы, несущие на своей поверхности рецепторы-агглютинины, взаимодейст-
вующие с комплементарными рецепторами поверхности эритроцитов, в резуль-
тате чего они склеиваются. При гемадсорбции эритроциты обнаруживаются при-
крепленным к поверхности инфицированных клеток. Реакцию гемагглютинации
ставят отдельно с культуральной жидкостью или вместе с разрушенными клетка-
ми. При исследовании контаминированной культуры эритроциты, связываясь с
вирусами, агглютинируются и оседают на две лунки панели в виде круга с изъе-
денными краями. Вначале эти реакции использовались для обнаружения миксо-
вирусов Впоследствии было доказано, что при подборе условий и эритроцитов
соответствующих видов животных при помощи реакций гемагглютинации и ге-
мадсорбции можно обнаруживать и другие вирусы, а также микоплазмы.

Феномены экзальтации (усиление активности одного вируса при
взаимодействии с другим), интерференция (подавление активности одного
вируса при взаимодействии с другим вирусом), интерферонообразования
(подавление активности одного вируса благодаря стимулированию интер-
феронообразования другим вирусом), предусматривающие широкое приме-
нение равных вирусов, больше используют при разработке научных вопро-
сов и малопригодны для практика вирусологического контроля.

-	Определение обратнотранскриптазной активности, и реакция гибри-
дизации между нуклеиновыми кислотами клетки и вируса используют для
выявления контаминирования клеток онкогенными вирусами, локализован-
ными в геноме клетки. Оба метода сложны и могут быть выполнены в спе-
циализированных лабораториях. Приобретение клетками трансформирован-
ного фенотипа в результате взаимодействия их с онкогенными вирусами
устанавливают на основания способности трансформированных клеток раз-
множаться в полужидкой агаровой среде (в этих условиях нормальные клет-
ки не растут) и агглютинироваться в присутствии лектинов.

-	Метод равновесного центрифугирования в градиенте сахарозы кон-
центрированной культуральной жидкости, инкубированной в присутствии
радиоактивных предшественников синтеза нуклеиновых кислот,

-	Полимеразно-цепная реакция (ПЦР) также может быть использована
для выявления латентных вирусов в культурах клеток.

При выборе метода исследования учитывают вид предполагаемого
вируса-контаминанта, срочность получения ответа и реальные возможности
использования того или иного метода.
Глава 13. Методы цитологических исследований

Учет активности роста и морфологических свойств клеток произво-
дится в пробирках и матрасах. При микроскопировании нативных препара-
тов клеточных культур учитывается степень вакуолизации, наличие вклю-
чений и морфологический состав. Наблюдения за культурами проводят до
момента образования монослоя, при этом отмечается время его формирова-
ния. Для цитологических исследований суспензия клеток высевается в пе-
нициллиновые флаконы со стеклышками. Концентрация клеток в суспензии
должна быть 1,5-2х105 в мл, объем суспензии 1,5-2 мл. Через определенные
промежутки времени (1,2,3 и т.д. сутки культивирования) покровные стекла
вынимают, промывают в теплом растворе Хенкса или физиологическом рас-
творе (pH 7,0-7,2), подсушивают фильтровальной бумагой и фиксируют
клетки в одной из фиксирующих смесей: растворе Буэна, фиксаторе Карнуа
или Ценкера, метиловом спирте или других фиксаторах.

В метиловом спирте фиксируют препараты 15 минут. При этом обя-
зательным условием является тщательное просушивание стекол с клетками
(после промывки в физрастворе) не только фильтровальной бумагой, но и
струей теплого воздуха (вентилятором).

Методы окраски цитологических препаратов

После фиксации препаратов одним из приведенных выше фиксирую-
щих растворов клетки окрашивают.

I.	Окраска гематоксилин-эозином является одной из наиболее доступ-
ных и широко применяемых окрасок цитологических препаратов.

Для окраски ядер клеток можно использовать гематоксилины, приго-
товленные по различным прописям: гематоксилин Майера, гематоксилин
Эрлиха, гематоксилин Карацци и др.

-	Гематоксилин Майера: I г гематоксилина растворяют в I л дистиллиро-
ванной воды. В раствор добавляют 50 г калийных квасцов, 50 г хлоралгидрата,
0,2 г йодноватокислого натрия, I г кристаллической лимонной кислоты: раствор
тщательно перемешивают и оставляют “созревать” на 10-14 дней.

-	Гематоксилин Эрлиха: 2 г гематоксилина растворяют в 100 мл 96°-
ного спирта и добавляют 100 мл дистиллированной воды, 100 мл химически
чистого глицерина, 3 г калийных квасцов и 10 мл ледяной уксусной кисло-
ты; раствор тщательно перемешивают и оставляют “созревать” на 2 недели.

-	Гематоксилин Карацци готовят как смесь: 0,5 г гематоксилина, 25 г
калийных квасцов, 0,01 г йодноватокислого натрия, 100 мл химически чис-
того глицерина, 400 мл дисциллированной воды. Преимуществом гематок-
силина Карацци является то, что им можно пользоваться уже через сутки
после приготовления. Кроме того, этот гематоксилин красит прогрессивно,
не перекрашивая ядер.

Способ окраски препаратов гематоксилин-эозином.

Зафиксированные на покровных стеклах клетки (после хранения в 70°-
ном спирте) ополаскивают в дистиллированной воде и погружают на 5-15 ми-
нут в один из приготовленных гематоксилинов. Время окрашивания подбирает-
ся эмпирически для каждого из гематоксилинов. Особо нужно помнить, что
“старые” краски окрашивают быстрее, чем вновь приготовленные. Если ядра
клеток окажутся перекрашенными, их можно дифференцировать соляно-
кислым спиртом (к 100 мл. 70°-ного спирта добавляют несколько капель HCI).
После окраски гематоксилином препараты несколько раз отмывают водой, а
затем помещают на 1 -2 мин. в аммииачную воду. Для ее приготовления на 200
мл дистиллированной воды добавляют 2-3 капли аммиака - в щелочной среде
ядра клеток приобретают синий цвет. Для окраски цитоплазмы обычно готовят
0,1%-ный водный раствор эозина - им докрашивают клетки сразу после окраски
гематоксилином и ополаскивания в аммиачной воде. Время окраски эозином
обычно не превышает 30-60 секунд. Ополаскивать стекла после окраски эози-
ном не следует, так как эозин быстро вымывается - нужно только снять фильт-
ровальной бумагой лишнюю влагу и провести далее препарат по бюксам со
спиртами возрастающей концентрации: 70°, 80°, 96°, 100°+ксилол (1:1), ксилол
1, ксилол 2, заключение в бальзам. В каждом из спиртов и ксилолах препараты
даржат не более 1 мин, что соответствует времени 2-3 ополаскиваний стекла в
данном реактиве. Совершенно обязательно перед перенесением стекла с клет-
ками в следующий бюкс снимать с него лишнюю влагу фильтровальной бума-
гой - иначе спирты будут обводняться.

Можно использовать другой вариант докраски клеток. Для этого го-
товят 0,1%-ный раствор спирторастворимого эозина в 96°-ном спирте (100
мг эозина на 100 мл 96°-ного спирта). Часть растворенного в спирте эозина
необходимо профильтровать и поставить бюкс с 0,1%-ным эозином в “бата-
рею” вместо бюкса с 96°-ным спиртом. В этом случае после окраски препа-
рата гематоксилином и ополаскивания аммиачной водой стекла с клетками
сразу проводят по спиртам возрастающей концентрации: 70°, 80°, 96° 96°
+эозин (здесь стекла приобретают розовый оттенок), 100°-ный спирт+ксилол
(1:1), ксилол, заключение в бальзам. При окраске гематоксилин-эозином
ядра клеток окрашиваются в синий цвет, цитоплазма - в розовый.

Окраска препаратов по методу Романовского-Гимза дает хорошие ре-
зультаты после фиксации клеток в смеси Карнуа, метиловом спирте или
смеси спирта и ледяной уксусной кислоты (3:1). Основным условием, как
уже отмечалось выше, является хорошее подсушивание препарата сразу по-
сле фиксации в метиловом спирте или после последующей промывки в 96°-
ном спирте (если фиксация была в смеси Карнуа или спирт-уксусной смеси).
Если стекла с клетками хранили после фиксации в 70°-ном спирте, то необ-
ходимо провести их в 96°-ном спирте и подсушить.

Для окраски препаратов можно использовать готовый краситель Рома-
новского-Гимза (азур П-эозин по Романовскому): на 100 мл дистиллированной
воды берется 5 мл готового раствора краски Романовского-Гимза и 0,5-0,7 мл
1%-ного раствора соды (для доведения pH краски до нейтральной). Препарат
погружается в краску на 10-15 мин, затем ополаскивается дистиллированной
водой, тщательно высушивается (лучше под струей воздуха), проводится через
ксилол 1, ксилол 2 и заключается в бальзам. При такой окраске клеток крови,
костного мозга или культур клеток из лимфоидных органов ядра клеток имеют
оттенки красного цвета, а цитоплазма - разную степень синего.

Краткая морфологическая характеристика окрашенных препаратов

Первый просмотр окрашенных цитологических препаратов проводят
при малом увеличении микроскопа (об. ЮХ, ок. 7Х). При описании препа-
рата вначале необходимо отметить: много ли клеток выросло к данному
сроку роста культуры, можно ли назвать количество клеток, приходящихся
на одно поле зрения микроскопа и указать распределение этих клеток: лежат
ли изолированно друг от друга, небольшими группами, средними или боль-
шими группами, клетки образуют монослой и т.д.

Более подробная характеристика препарата может быть дана при
большем увеличении микроскопа (об. 4ОХ, ок. 7Х). Здесь нужно обратить
внимание на преобладающую форму клеток (веретеновидные, многоуголь-
ные, круглые) и процентное их отношение, дать описание морфологии пре-
обладающих по количеству клеток, указать приблизительное соотношение
размеров диаметра ядра и цитоплазмы (1:1, 1:2 и т.д.).

При характеристике ядра клетки необходимо обратить внимание на пре-
обладающую форму ядер (овальные, круглые, лопастные и т.д.), дать описание
структуры хроматина ядра (хроматин мелкосетчатый, крупносетчатый, глыбки
хроматина) и отметить количество ядрышек, их размер, форму.

При описании цитоплазмы клетки следует обратить внимание на
структуру ее; гомогенная, имеется вакуолизация, зернистость и другие
включения.

Для общей характеристики препаратов важно отметить количество
делящихся клеток (много, мало или число их на одно поле зрения) и патоло-
гические митозы.

Обратить внимание на атипичные формы клеток (мелкие, пикнотиче-
ские, многоядерные, фрагментация ядер, почкование и т.д.).

При необходимости описание включений цитоплазмы следует прово-
дить при наибольшем увеличении микроскопа масляной иммерсии (об. 9ОХ,
ок. 7-ЮХ). Здесь можно подробно отметить характер включений; окраши-
ваются эозином или гематоксилином, размер и формы включений (с обод-
ком, без ободка), лежат группами, изолировано друг от друга и т.д. Для ха-
рактеристики включений можно рекомендовать гистохимические методы
окрашивания: на ДНК, РНК, гликоген, жиры и т.д.

Подобная схема морфологического описания окрашенного цитологи-
ческого препарата может быть предложена для контрольных культур клеток
(без воздействия), так и для случаев внесения в культуру каких-либо экзо-
генных факторов. Сравнение характеристики в двух протоколах поможет
выявить различия опытного и контрольного материала.

Определение митотического индекса

Известно, что все монослойные культуры клеток будь то перевивае-
мые, диплоидные или первично-трипсинизированные, проходят в своей ди-
намике роста несколько фаз развития: 1) лаг-фаза, 2) фаза логарифмического
роста, 3) стационарная фаза и 4) фаза отмирания (дегенерации).
Каждая из этих фаз имеет свою пролиферативную активность, а значит,
может быть охарактеризована количественным показателем - величиной мито-
тического индекса. Митотический индекс вычисляется как отношение числа
митотически делящихся клеток к общей сумме подсчитанных клеток

Л/%1000 0/

МИ =---------х 4ю » где

KL

МИ - митотический индекс

М - сумма митозов

KL - сумма клеток

Митотический индекс (МИ) выражается обычно не в процентах, а в про-
милле (°/оо), поэтому в числителе дроби сумма митозов (М) умножается на 1 000.

В первые дни после пересева размножение клеток культуры на по-
кровном стекле происходит от первичных очагов прикрепления их к стеклу,
т.е. наблюдается неравномерность роста. Поэтому для того, чтобы избежать
ошибки в истинном числе делящихся клеток, нужно вести подсчет по всей
поверхности стекла, т.е. и по периферии препарата, и по центру.

В перевиваемых линиях клеток можно ограничиться подсчетом 1-1,5
тыс. клеток на каждый препарат, тогда как в субкультурах и диплоидных
штаммах необходимо считать не менее двух тысяч клеток, т.к. чем меньше в
культуре митозов, тем больше “цена” каждого из них, а следовательно, и
случайное изменение величины митотического индекса. На каждый изучае-
мый срок роста культуры следует подсчитывать не менее пяти препаратов,
т.к. только средняя величина из пяти подсчитанных может дать более объек-
тивную и точную величину митотического индекса.

Методика приготовления препаратов хромосом для цитогенетическо-
го анализа

В основу приготовления препарата положен метод Мурхеда (1960),
который предусматривает накопление в культуре клеток с помощью колхи-
цина метафазных пластинок, обработку клеток гипотоническим раствором,
фиксацию препаратов и их окрашивание.

За 4-6 часов до окончания культивирования в культуральный флакон
вводят колхицин в дозе от 0,3 до 1 мкг/мл в зависимости от типа кльтуры.
Через указанное время питательную среду сливают, а на монослой клеток
наслаивают теплый раствор (38°С), состоящий из 0,25%-ного трипсина и
0,2%-ного версена в соотношении 9:1. Через 5-10 минут, когда клетки начи-
нают отслаиваться от стекла, раствор версена с трипсином удаляют, а клетки
суспендируют в 6-8 мл гипотонического раствора.

В качестве гипотонического раствора могут быть использованы: раствор
Хенкса с дистиллированной водой (1:4, 1:5); смесь питательной среды Игла с
дистиллированной водой (1:5, 1:6); 0,95% раствор лимоннокислого натрия;
0,56% раствор хлористого калия; 0,17% раствор хлористого натрия; смесь инак-
тивированной бычьей сыворотки с дистиллированной водой (1:3) с добавлени-
ем 70 мг цитрата натрия на 20 мл раствора. Гипотонизация в зависимости от
культуры и применяемого раствора длится от 10 до 25 минут. Суспензию кле-
ток в гипотоническом растворе переносят в центрифужную пробирку и цен-
трифугируют при 800-900 об/мин в течение 5 минут. Надосадочную жидкость
сливают, а на осадок осторожно по стенке пробирки, чтобы не разбить осадок,
добавляют фиксатор, состоящий из одной части ледяной уксусной кислоты и
трех частей метилового спирта. Первая фиксация длиться 20-30 минут при 4°С,
после чего клетки ресуспендируют пипетированием пастеровской пипеткой и
центрифугируют в течение 5 минут при 900 об/ мин. Повторная фиксация длит-
ся 15-20 минут. Количество фиксирующей жидкости зависит от количества
осадка и может колебаться от 2 до 5 мл. По окончании фиксации клетки ресус-
пендируют в небольшом количестве фиксатора; одну-две капли суспензии кле-
ток наносят на охлажденное предметное стекло и подсушивают над пламенем.

Способы окраски хромосомных препаратов

Получение хорошо окрашенных хромосомных препаратов является
одним из важнейших этапов хромосомного анализа. При правильной окра-
ске большинством красителей, хромосомы имеют интенсивный красно-
фиолетовый цвет, а под микроскопом с зеленым фильтром - черный с чет-
кими не размытыми краями.

Окраска азур-эозином. Для окраски препаратов используется готовый
краситель азур-эозин по Романовскому. К 100 мл свежеприготовленной дис-
тиллированной воды прибавляют 5 мл готовой краски и 2-3 мл 0,1% раство-
ра двууглекислого натрия для создания нейтральной среды (рЙ=6,8-7,2).
Предметные стекла помещают в стаканчик с краской и выдерживают 20-25
минут. Затем стекла ополаскивают в дистиллированной воде, высушивают и
проводят через этиловые спирты восходящей крепости и ксилол. После это-
го наносят каплю канадского бальзама и закрывают покровным стеклом.

Окраска орсеином. Готовят 2%-ный раствор ацетат-орсеина; 2 г сухого
орсеина растворяют в 45 мл горячей ледяной уксусной кислоты и после охлаж-
дения добавляют 55 мл дистиллированной воды. Затем свежеприготовленный
раствор орсеина фильтруют, наносят на предметное стекло и покрывают по-
кровным. В таком виде стекла помещают в чашку Петри с парами уксусной
кислоты и ставят в холодильник на 2-3 суток. Затем покровное стекло снимают,
а препарат проводят последовательно через 45%-ную уксусную кислоту, этило-
вый спирт и два ксилола, после чего заключают в бальзам.

Дифференциальная окраска хромосом (G-окраска). Методы диффе-
ренциальной окраски хромосом открывают новые возможности в цитогене-
тике. Молекулярные механизмы, вызывающие образование специфической
поперечной исчерченности хромосом еще не ясны. Установлено, что харак-
тер поперечной исчерченности специфичен для каждой хромосомной пары и
не зависит от степени спирализации хромосом. Все это позволяет строго
идентифицировать все пары хромосомного набора и проследить хромосом-
ные перестройки, сравнивая при этом кариотипы родственных видов живот-
ных. Метод окраски хромосом красителем Гимза, разработанный Раджабли
и Крюковым (1973), позволяет выявить довольно тонкую картину исчерчен-
ности,. Обычным способом приготовленные препараты хромосом помещают
в 0,25%-ный трипсин, подогретый до 30°С. После этого препараты ополас-
кивают в буферном растворе (в 1 л дистиллированной воды растворяют
17,53 г хлористого натрия и 8,82 г цитрата натрия) и помещают в термостат
в свежем буферном растворе на I час при 62°С. Затем препараты окрашива-
ют красителем Гимза (1 мл красителя на 50 мл дистиллированной воды).

С-окраска. Для структурного гетерохроматина наиболее широко ис-
пользуется метод, предложенный Самнером (1972). Свежеприготовленные
препараты (1-2-дневные) обрабатываются 0,2н HCI при комнатной темпера-
туре в течение 10-60 минут. Затем препараты ополаскиваются в дистиллиро-
ванной воде и помещаются в вертикальном положении в 5%-й раствор
Ва(ОН)2 при температуре 62-65°С на время от 1 до 15 минут. После инкуба-
ции в Ва(ОН)2 препараты отмываются в 0,2н HCI и под проточной водой
переносятся в чашку Петри с буфером 2xSSC на 1-1,5 ч при температуре 62-
65°С. Сразу из буфера препараты помещают в краску Гимза, приготовлен-
ную как описано выше. Время окраски варьируют от 30 минут до 1,5 часов.

Препараты хромосом видов животных с небольшим количеством
структурного гетерохроматина требуют щадящих предобработок и быстро
утрачивают способность к С-окрашиванию, а с большим количеством гете-
рохроматина (мышь, крупный рогатый скот, лошадь) хорошо окрашиваются
С-методом почти во всех режимах и долго сохраняют способность к окра-
шиванию. В тоже время у одного и того же вида степень окрашивания мо-
жет значительно отличаться по времени предобработок.

Ag-окраска ядрышкообразующих районов хромосом. Из многих ва-
риантов окраски ядрышкообразующих райнов с помощью азотнокислого
серебра выбраны два метода.

По первому методу препараты на 30-40 минут помещают в боратный
буфер (0,1М Na2S04+0,005M Na2B4O7), ополаскиваются в воде и высушивают-
ся. Затем на препарат наносится несколько капель 50%-ного раствора AgNO3,
препарат накрывают покровным стеклом и помещают в горизонтальном поло-
жении во влажную камеру при 60-65°С на 12 часов и более. Степень окраски
контролируется под микроскопом. После окраски покровное стекло удаляется
путем ополаскивания препарата в воде и препарат высушивается. Хромосомы
можно подкрашивать красителем Гимза в течение 15-30 секунд.

По второму методу на препарат наносится две капли проявляющего
раствора (200 мг желатина в 10 мл воды+0,1 мл муравьиной кислоты), до-
бавляется 3-4 капли 50% раствора AgNO3, препарат накрывается покровным
стеклом и помещается во влажную камеру при 60-65°С на 3-5 мин, после
чего покровное стекло удаляется, ополаскивается в воде и препарат высу-
шивается. Проявляющий раствор и раствор азотнокислого серебра могут
храниться в закрытых сосудах довольно долго.

Недостатком первого метода является неравномерное окрашивание пре-
парата под покровным стеклом. Метод с проявителем существенно более наде-
жен и производителен, препарат под стеклом окрашивается равномерно.

Для идентификации хромосом, несущих ядрышковый организатор, в
лаборатории клеточной биотехнологии ВИЭВ используются два способа
переокраски препаратов:

После окраски серебром: 1) препараты помещаются в раствор трип-
сина и затем окрашиваются красителем Гимза. В этом случае на одном и
том же препарате выявляются и окрашенные ядрышкообразующие районы и
G-дифференциальная окраска хромосом. Время обработки трипсином такое
же (или чуть больше), как для этой фиксации до окраски серебром;

2) метафазные пластинки с окрашенными ядрышковыми организаторами
фотографируют, затем препараты отмывают от иммерсионного масла в ксило-
ле, проводят черех метанол-уксусный фиксатор и высушивают. Серебро удаля-
ется ополаскиванием препарата в 5-10% растворе красной кровяной соли. От
последней препарат отмывается проточной водой и высушивается. Обработан-
ный таким образом препарат можно использовать для рутинной G- и С-окрасок.
Время обработки в трипсине при G- окрашивании иногда приходится умень-
шить в 2-3 раза по сравнению с установленным для этой фиксации.

Микроскопирование и учет аберраций хромосом. Микроскопирова-
ние проводят при помощи светового микроскопа с иммерсионной системой.
В начале под малым увеличением (10x20x2,5) выбирают метафазные пла-
стинки, отвечающие следующим требованиям анализа: 1) все хромосомы
должны быть четко окрашены и равномерно расположены; 2) в поле зрения
не допускается наличие случайных хромосом; 3) метафазные пластинки
должны’ иметь округлую форму; большой диаметр не должен превышать
двух малых; 4) уровень спирализации хромосом должен быть таким, чтобы
малые акроцентрические хромосомы были в виде оформленных хромосом, а
не в виде точек; 5) допускается только поперечное наложение длинных плеч
хромосом; 6) все хромосомы должны располагаться в одной плоскости.

После того, как выбрана пластинка, отвечающая всем указанным требо-
ваниям, анализ аберраций проводят с помощью иммерсионной системы микро-
скопа при увеличении 10x90x2,5. Учитывают аберрации хромосомного и хро-
матидного типов по классификации, предложенной Н.П. Бочковым (1972).

Аберрации хромосомного типа. 1).Парные ацентрические фрагменты
могут иметь вид как очень меленьких точек, так и коротких палочек, лежащих
параллельно друг другу. 2.)Точковые фрагменты или интерстициальные деле-
нии- это парные округлые образования, диаметр которых не менее, чем попе-
речник хроматиды. 3).Ацентрические кольца представляют собой участки
хромосом от одного плеча и относятся к группе обменов. 4).Кольцевые
хромосомы замкнутые структуры, включающие участки большей или
меньшей велечины из обоих плеч. 5).Хромосомы, имеющие более одной
центромеры /дицентрики, трицентрики и т.д./, являются межхромосомными
асимметрическими транслокациями. 6).Хромосомы, нс нормальные для данного
кариотипа по длине или соотношении плеч /перицентрические инверсии,
симметрические межхромосомные транслокации, реципрокные транслокации/.

Аберрации хроматидного типа. Это аберрации одной хроматиды по-
врежденной хромосомы.

1.Одиночные ацентрические фрагменты. Могут лежать рядом с по-
врежденной хромосомой или отдельно от нее, представляют собой концевые
хроматидные делеции.

2.Обмен хроматидного происхождения. Представляет группу много-
образных форм обмена между хроматидами.

3	.Разрывы по центромере.
4	. Хроматидные и изохроматидные пробелы (синонимы: гены, бреши,
щели), представляют собой неокрашенные участки хромосом.

При цитогенетическом анализе, как правило, учитывают: число ис-
следованных метафаз; число аберраций; число аберрантных клеток; типы
аберраций и их чистота; распределение аберраций по группам хромосом.

Так на рисунке представлены патологические формы митоза при кармо-
логическом анализе клеток культуры почек эмбрионов свиньи при воздействии
на них фенилмеркурацетата (ФМА) без предварительного введения колхицина.
Преобладающей формой патологии митоза явилось отставание хромосом в ме-
тафазе, хроматидные мосты и К-метафазы. Отставание хромосом в метафазе
возникает при повреждении хромосом в области центромеры, а хроматидные
мосты являются следствием фрагментации хромосом. К-митоз и рассеивание
хромосом в метафазе характеризуется блокадой деления клетки в метозе в связи
с повреждением митотического аппарата. Многополюсные митозы вызваны
аномалией репродукции центриолей. Эта патология приводит к неравномерно-
му распределению хромосом между дочерними клетками и образованию анеуп-
лоидных клеток. Полая метафаза имеет вид широкого кольца хромосом, кото-
рые располагаются по периферии ядра клетки. Возникновение и последствия
этой формы патологии митоза пока не ясны. Результаты изучения показали, что
фенилмеркурацетат вызывает патологию митозов, связанных с нарушением
веретена деления и повреждением структуры хромосом.

При цитогенетическом анализе клеток культуры ПЭС при воздействии
на них фенилмеркурацетата и лейкоцитов периферической крови овец, полу-
чавших циклофосфан, была установлена фрагментация хромосомных наборов и
расхождение хромосом в центромере, а также хроматидные разрывы и обмены
между хромосомами. Расхождение хромосом в центромерном участке под
влиянием ФМА, видимо, связано с асинхронным расщеплением хромосом в
процессе деления и накопления мутагена в районе центромеры. Зона возле цен-
тромеры, по данным ряда авторов (M.Cohen, 1966; В. Kihlman, 1973), обладает
повышенной чувствительностью к химическим веществам. Фрагментация це-
лых хромосомных наборов, видимо, связана с нарушением нуклеопротеидного
обмена и биосинтеза ДНК. Возникновение фрагментации хромосом в рассмат-
риваемых случаях связано ингибированием дисульфидных мостиков хромосо-
мальных белков, которые связывают ДНК с белком. Разрывы дисульфидных
мостиков в полипептидных цепях белка в участках связи с молекулой ДНК и
обусловили фрагментацию хромосом.

Появление полиплоидных клеток в культуре клеток ПЭС под влиянием
ФМА также связано с остановкой митоза на стадии метафазы, с повреждением
веретена деления, т.е. со статмокинетическим эффектом. (Т.П. Калмыкова).

Методы подготовки препаратов для электронной микроскопии
культур клеток

Реактивы и растворы. В качестве фиксирующих жидкостей использу-
ется 1 -6%-ные растворы глутарового альдегида и 1 -2%-ные растворы четы-
рехокиси осмия (Os О4). Глутаровый альдегид выпускается в виде 20%-ного
водного раствора, который хранят в холодильнике и в темноте. Для удале-
ния продуктов кислой природы к глутаровому альдегиду необходимо доба-
вить активированный уголь. Перед использованием уголь удаляют путем
фильтрования. Растворы глутарового альдегида готовят на фосфатном, ка-
кодилатном или S - коллидиновом буфере с нейтральным pH.

1.Приготовление фосфатного буфера по Миллонигу

Основные растворы:

А.	2,26%-ный раствор NaH2PO4 Н2О;

Б. 2,5%-ный раствор NaOH;

В.	5,4%-ный раствор глюкозы;

Г 1%-ный раствор СаС12.

К 8,5 мл раствора Б прибавляют 41,5 мл раствора А; pH полученного
раствора 7,3. Для увеличения осмотического давления к 45 мл этого раство-
ра прибавляют 5 мл раствора В. К полученному раствору с целью сохране-
ния некоторых клеточных структур прибавляют 0,25 мл раствора Г

2.	Приготовление 0,2 М какодилатного буфера pH 7,2.

Основной раствор А: 0,2 М раствор какодилата натрия готовят, рас-
творив 4,28 г Na (CH3)2ASO23H2O в 100 мл дистиллированной воды в хими-
чески чистой посуде.

Основной раствор Б: 0,2 М раствор.

К 50 мл раствора А прибавляют 4,2 мл раствора Б (до получения pH
7,2) и доводят объем раствора до 200 мл дистиллированной водой.

3.	Приготовление 0,2 М S - коллидинового буфера pH 7,45.

В химически чистую мерную колбу на 100 мл вносят 2,67 мл S - кол-
лидина, приливают 50 мл дистиллированной воды, а затем добавляют 9 мл
IM HCI и доводят дистиллированной водой до метки.

Для получения 3%-ного раствора глутарового альдегида берут 12 мл этого
реактива и приливают к 88 мл одного из приведенных выше буферных растворов.
Полученный раствор фиксатора хранят во флаконе, закрытом плотно пробкой
при температуре 4°С. К буферному раствору, используемому для отмывания тка-
ни от фиксатора, можно прибавить сахарозу (7,3 г на 100 мл раствора).

Рабочий осмиевый фиксатор приготавляют перед использованием на
веронал-ацетатном буфере по Паладу, буфере по Миллонигу или 0,2М S-
коллидиновом буфере.

Предварительно готовят основной 2%-ный водный раствор четырех-
окиси осмия, для чего ампулу OsC>4 вскрывают в химически чистый сосуд и
добавляют необходимое количество бидистиллированной воды. Флакон за-
крывают и оставляют при комнатной температуре в темном месте на 2-3
суток до полного растворения осмия.

Пропись веронал-ацетатного буфера:

Раствор А, веронал натрия (медиал) 2,88 г.

Ацетат натрия 1,15г.

Бидистиллированная вода до 100 мл.

Раствор Б. 0,1М раствор HCI.

Для приготовления буферного раствора 10 мл раствора А смешивают с
10 мл раствора Б и 5 мл дистиллированной воды. Получается раствор pH 7,4.
а)	1%-ный осмиевый фиксатор на веронал-ацетатном буфере или бу-
фере по Миллонигу. Буферный раствор и 2%-ный водный раствор осмия
смешивают 1:1 по объему.

б)	1,33%-ный осмиевый фиксатор на S-коллидиновом буфере. Берут 1
мл S-коллидинового буфера и добавляют 2 мл 2%-ного раствора четырех-
окиси осмия.

Рабочие осмиевые фиксаторы хранят при температуре 2-4°С непро-
должительно (2-3 дня). Фиксатор имеет светло-желтый цвет.

Почернение раствора указывает на его непригодность.

Для обезвоживания фиксированных клеток, тканей готовят 30, 50, 70,
90 и 100%-ные растворы ацетона на бидистиллированной воде.

Контрастирующие растворы:

а)	2%-ный раствор уранил-ацетата на 30%-ном ацетоне. В химически
чистый флакон вносят 200 мг уранил ацетата - UC^CFbCOO^ и приливают
10 мл 30%-ного раствора ацетона. Раствор хранят в темном месте при ком-
натной температуре.

б)	0,03%-ный раствор цитрата свинца.

В химически чистый стеклянный сосуд вносят 30 мг цитрата свинца
ООССОН (СНэСОО)2 РЬЗНгО и приливают 10 мл свободной от углекисло-
ты, дистиллированной воды и 0,12 мл ЮМ раствора NaOH. Флакон плотно
закрывают пробкой и перемешивают до полного растворения цитрата свин-
ца. Раствор перед окрашиванием срезов выдерживают 12 час. при 4°С.

Пропитывающие и заливочные среды.

а)	Приготовление среды Эпон по Лафту. Смесь А. Эпон 812-62 мл +
додецилянтарный ангидрид (ДДБА) 100 мл. Смесь Б. Эпон 812-100
мл+метилнадиевый ангидрид (MNA) - 89 мл.

Смеси можно приготовить заранее и хранить в холодильнике. Перед
применением компоненты А и Б тщательно смешивают в соотношении 7:3
или 1:1, добавляют катализатор (ускоритель) ДМР-30 в объеме 1,5% и
вновь тщательно перемешивают. Плотность получаемых блоков зависит от
соотношения смеси А и Б.

б)	Приготовление заливочной среды эпон-аралдит.

Эпон-812 - 5 мл ;

Аралдит М - 3 мл;

ДДБА - 11 мл; дибутилфталат - 0,2 мл; ДМР-30 - 0,3 мл.

Перед добавлением каждого последующего компонента смесь тща-
тельно перемешивают.

в)	Приготовление заливочной среды аралдит.

Запасной раствор. Аралдит СУ212 (502)+уплотнитель НУ964 (ДДБА)
(поровну) тщательно перемешать. Смесь может храниться при комнатной
температуре несколько недель.

Заливочная среда.

1.	20 мл запасного раствора

2.	0,4 мл аралдит-акселератор (Д4064)

3.	0,6 мл дибутилфалат, тщательно перемешать.
Подготовка культур тканей и фиксация.

Клеточные культуры выращивают во флаконах (матрасах), пробирках
или на покровных стеклах, миллипоровных фильтрах по принятой методике.

Для исследования материал фиксируют в виде клеточной взвеси
(осадка) или непосредственно в культуральных сосудах на 1-5 день культи-
вирования в зависимости от условий опыта.

Подготовка и предварительная фиксация взвеси клеток.

В культуральный сосуд емкостью 100 мл после слива питательной
среды приливают 1-2 мл глутарового фиксатора на 10 минут. Затем фикса-
тор выливают в центрифужную пробирку, а клетки (монослой) снимают
механически (шпателем) и смывают их буферным раствором в те же цен-
трифужные пробирки.

Суспензию клеток центрифугируют при 1500 g 10-15 минут, надоса-
дочную жидкость удаляют.

Клетки ресуспендируют в 1-2 мл телячей сыворотки и вновь центри-
фугируют. Сыворотку осторожно удаляют, а на осадок клеток наслаивают
глутаровый фиксатор на 20-30 минут. Зафиксированный кусочек извлекают
из пробирки и лезвием разрезают на кусочки толщиной 1-2 мм. Затем мате-
риал трижды отмывают от фиксатора в буферном растворе с сахарозой по 10
мин, или оставляют на 12 час при 4°С в этом буфере. После этого клетки
фиксируют 1-2 часа в осмиевом фиксаторе.

Подобным способом фиксируют клетки и из суспензионных культур.

Фиксация однослойных клеточных культур.

Питательную среду из пробирок с монослоем или с монослоем на
стеклах удаляют и заливают на 20-30 минут глутаровый фиксатор. Затем
отмывают 3 раза по 10 минут буферным раствором с сахарозой и дофикси-
руют осмиевым фиксатором 1-2 часа при 4°С. Последующее обезвоживание
и пропитывание проводят непосредственно во флаконах (пробирках). Перед
заливкой стекла с монослоем извлекают и заливают их в специальном при-
способлении или помещают на заполненные заливочной средой капсулы
монослоем вниз. По окончании заливки и получении блоков пробирки с мо-
нослоем и капсулы со стеклами (только с монослоем) опускают в жидкий
азот. Стекло трескается, и на поверхности блоков располагается залитый
монослой, который доступен для приготовления ультратонких срезов.

Последовательность подготовки материала и получения блоков с
препаратами:

а)	материал (осадок клеток или монослой) фиксируют в 3%-ном за-
буференном растворе глутарового альдегида не менее часа;

б)	трижды по 10 минут промывают буферным раствором, содержа-
щим сахарозу;

в)	фиксируют в 1%-ном забуференном растворе OsO4 1-2 часа (не более);

г)	материал трижды отмывают от осмиевого фиксатора в 30%-ном
растворе ацетата на 10 минут;

д)	материал обезвоживают в растворах ацетона нарастающей концен-
трации - 30°, 50°, 80°, 90° по 10-30 мин., затем проводят через 2 смены 100%-
ного ацетона по 30 мин.;
е)	материал проводят через смесь эпоксидных смол с катализатором в
такой последовательности:

1 ч. рабочей смеси+3 ч. 100%-ного ацетона
2 ч. рабочей смеси+2 ч. 100%-ного ацетона
3 ч. рабочей смеси+1 ч. 100%-ного ацетона
Рабочая смесь без ацетона

-	30 минут.

-	30 минут.

-	30 минут.

-	60 минут.

ж)	кусочки материала извлекают из рабочей смеси, удаляют остатки
смолы и помещают в пронумерованные капсулы, заполненные на две трети
объема свежей порцией рабочей смеси заливочных смол; капсулы с материалом
помещают в термостат при 37°С на ночь, а затем при 60°С - на 24 часа.

В случае обезвоживания материала в этаноле его перед пропитывани-
ем и заливкой проводят через окись пропилена (пропиленоксид).

Приготовление ультратонких срезов.

Ультратонкие срезы готовят на ультратоме фирмы LKB (Швеция) или
других фирм с помощью стеклянных ножей и помещают на сетки-подложки.
Контрастирование осуществляют уранилацетатом и цитратом свинца.

Техника контрастирования уранилацетатом.

На дно чашки Петри или пластинку из воска наносят каплю насы-
щенного водного раствора уранилацетата и на поверхность помещают сетку
со срезом. Через 15 минут сетку снимают, тщательно промывают дистилли-
рованной водой и препарат высушивают. Контрастируют также 1%-ным
раствором уранилацетата в спирте с водой 1:1.

Техника контрастирования цитратом свинца.

После контрастирования уранилацетатом срезы контрастируют цит-
ратом свинца по такой же методике, помещая срезы на каплю раствора этого
вещества на 15 минут. Затем препараты попеременно промывают дистилли-
рованной водой и 0,02 раствором NaOH, просушивают, исследуют под элек-
тронным микроскопом.

Для просмотра в световом микроскопе можно готовить “полутонкие”
срезы (0,5-2 мкм) и окрасить их толуидиновым синим (Рис.бОа).

Раствор красителя: 1 мл 1%-ного раствора толуидинового синего пе-
ред использованием смешивают с 20 мл 2,5%-ного бикарбоната натрия,
смесь фильтруют; на предметное стекло наносят каплю воды и на нее поме-
щают срез; стекло медленно нагревают пока не испариться вода и срез не
опустится на поверхность стекла; на срез наносят каплю красителя и ставят
препарат на 10-20 минут в термостат при 45-50°С; препарат промывают,
сушат и заключают под покровное стекло в масло или канадский бальзам.

Вертикальные ультратонкие срезы клеток в монослое - эффективный
метод для электронной микроскопии клеток (Kruze Patterson et al., 1973),
рис. 60 б.
Глава 14. Идентификация видовой принадлежности
клеток в культуре

Одной из проблем клеточной биотехнологии является возможная пе-
рекрестная контаминация клеточных линий. Вначале 70-х годов 20-го столе-
тия в лабораториях США и ряда других стран была выявлена перекрестная
(’’заместительная”) внутрилабораторная контаминация культивируемых
штаммов и линий клеток другими клетками, например HeLa, обладающими
высокой пролиферативной активностью.

Во избежание этого и для контроля за состоянием культур необходи-
мо строго соблюдать правила работы и, в частности, за маркировкой куль-
туральных флаконов, ампул и т.п., чтобы она точно соответствовала объекту
культивирования.

Кроме того, важно регулярно проводить кариологический контроль. Ис-
пользуют также метод антивидовой иммунофлуоресценции. Однако, этого мо-
жет быть недостаточно для выявления ’’заместительной” контаминации.

Эффективным методом может быть определение спектра изоферентов
в клетках.

Анализ изоферментов, проведенный в гомогенатах линий клеток 25
видов показал, что этот биохимический признак можно использовать для
подтверждения вида. Определяя спектры трех изоферментных систем (глю-
козо-6-фосфат дегидрогеназы (Г6ФД), лактат-дегидрогеназы (ЛДГ) и нук-
леозидфосфорилазы (НФ) с помощью вертикального электрофореза в крах-
мальном геле, можно с высокой степенью надежности определить вид, от
которого происходит линия клеток. Этот метод относительно прост, дает
воспроизводимые результаты и не требует дорогого оборудования.

Метод получения экстрактов клеток приведен в сжатой форме ниже.
Состав исходных буферов для электрофореза в крахмальном геле приведен в
табл. 25 Компоненты для электрофоретического разделения и выявления в
геле трех ферментов представлены в табл. 26.

Получение клеточных экстрактов

1.	Получите клеточную суспензию стандартными методами и трижды
промойте клетки переосаждением в 0,9%-ном растворе NaCl (pH 7,1), со-
держащем 6,6 * 10 4 М ЭДТА.

2.	Ресуспендируйте промытые клетки в солевом растворе с ЭДТА до
концентрации 2-5 107 клеток/мл.

3.	Разрушьте клетки тремя циклами замораживания и оттаивания в
жидком азоте или смеси сухого льда с этанолом. Можно также разрушить
клетки ультразвуком или смешиванием с равным объемом октилового спир-
та (при 4°С в течение ночи).

4.	Разлейте гомогенат по пробиркам Эппендорфа, осветлите центри-
фугированием на микроцентрифуге в течение 1-2 мин и храните при - 70°С
для пос л едущего анализа.
Таблица25

Буферные растворы для электрофореза

Трис-цитратный буфер (ТЦ)	Рабочий раствор
Трис	17г
Лимонная кислота (моногидрат)	9,1 г
Дистиллированная вода	1000 мл
pH	7,1
Трис-ЭДТА-боратный буфер (ТЭБ)	5-кратный концентрат
Трис	109,0 г
ЭДТА-Na2	7,6 г
Борная кислота	6,2 г
Дистиллированная кислота	1000 мл
pH	8,6
Буфер для геля: 50 мл однократного концентрированного буфера + 450 мл Н2О	
Буфер для камеры: однократный концентрированный буфер	

Рекомендуется следующий порядок приготовления крахмального геля:

I.	Суспензируйте 60 г крахмала для электрофореза в 500 мл соответ-
ствующего буфера и получите однородную суспензию путем перемешива-
ния при нагревании до 90°С. Этого можно достигнуть, используя кипящую
водяную баню, горячую мешалку и вакуумный или микроволновый нагрева-
тельный шкаф. Перемешивание должно быть постоянным, чтобы избежать
образования комков и пригорания.

II.	Поместите в вакуум на 60 минут для удаления пузырьков воздуха и
медленно и равномерно охладите до 60°С при слабом помешивании.

III.	Для систем ЛД и ГФД добавьте на этом этапе NADP и осторожно,
но тщательно перемешайте.

IV.	Перенесите крахмал в форму для геля, руководствуясь ин-
струкциями изготовителей, и дайте остыть в течение 2-3 час. при комнатной
температуре, избегая толчков. В лаборатории автора используется аппарат
Бачлера для вертикального электрофореза в геле ( Buehler Instruments Inc.,
Fort Lee, New Jersey).

Таблица 26

Процедуры для выявления ЛДГ, Г6ФД и НФП

Ферментная система	Электрод- ный буфер	Буфер геля	Окрашивающий раствор 2)
ЛД	ТЦ	ТЦ(0,1Х)	Н2О(Юмл)  0,5 М трис pH 7,5 (5 мл)  1,0 М лактат натрия (5мл)  NAD 3) (10 нг/мл) (5 мл)  МТДТ3>(5мг)  ФМС4 (2мг)
ГДФ	ТЭБ	ТЭБ (0,1 X)	Н2О (5мл)  0,5 М трис pH 7,5 (5 мл) * 0,025 М глюкозо-6-фосфат (5мл) 0,lMMgC12 6Н2О (5 мл) 0,005 М NADP ’* (5 мл) МТДТ3’(5мг) ФМС3* (2мг)
НФ	ТЭБ	ТЭБ (0,2 X)	Н2О (20 мл) 0,lMNaH2PO4 Н2О (5 мл)  Инозин (50 мл)  Ксантиноксидаза4) (100 мкл)  МТДТ3* (5мг)  ФМС3* (2мг)

1)	Во всех гелях разделение идет в течение 16-18 ч при 4°С и градиенте
напряжения 4-5 В/см (160-180 В). NADP (5 мл в концентрации 0,005 М) добав-
ляется к катодному буферу и к окрашиващему раствору при анализе Г6ФД.

2)	Эти концентрированные растворы смешиваются непосредственно
перед использованием с равным объемом (25 мл) 2%-ной водной суспензии
агара, после чего смесь разжиживаетоя и охлаждается до 45-50°С.

3)	NAD - никотинамиддинуклеотид ; NADP - NAD - фосфат ;

4)	МТДТ -диметилтиазолдифенилтетразолий; ФМС феназинмето-
сульфат. Концентрация 100 мг/мл; добавлять непосредственно перед сме-
шиванием с агаром.

Рекомендуется следующий порядок проведения электрофореза:

Разморозьте экстракт клеток и центрифугируйте на микроцентри-
фуге в течение 1-2 мин.

Осторожно удалите гребенку с 10 ячейками из формы для геля,
руководствуясь инструкциями изготовителей, и добавьте в каждую ячейку
0,03-0,04 мл экстракта, используя тонко оттянутую пастеровскую пипетку
или шприц с иглой калибра 26. Не допускайте попадания избытка экстракта
в соседние ячейки.

Покройте всю поверхность геля, обнажившуюся при удалении
гребенки, нагретым керосином.

Добавьте буфер в электродные камеры и установите форму для
геля на место с помощью удерживающей пружины.

Приложите матерчатые тампоны, установите прибор в помещении
при 4°С и начните разделение, используя градиент напряжения на пластине
геля 4-5 В/см.

Рекомендуется следующий порядок обнаружения изоферментов:

Выньте пластинку геля из формы, удалите по 5 см с обоих концов
и разрежьте гель горизонтально на три идентичные части, используя специ-
альное приспособление для разрезания геля.

Разделите три слоя и уложите в ванночки для окрашивания.
Покройте всю поверхность геля смесью агара с соответствующим
красителем и инкубируйте при 37°С в темноте. Полосы начнут появляться'
через 1-3 часа в зависимости от типа фермента и активности экстракта.

Зимограммы, представленные на рисунке 61 иллюстрируют типич-
ную картину разделения изоферментов в обычно используемых линиях кле-
ток от различных видов млекопитающих.

Вид

Человек (В)_______

Человек (А)_______

Африканская зеленая
мартышка__________

Макака-резус______

Лаб мышь__________

Крыса_____________

Кролик____________

Собака____________

Кошка ____________

Китайский хомячок

Лошадь____________

Свинья____________

Корова____________

Лактатдегидрогеназа
(ЛД>

Глюкозо-6-фосфат -
дегидрогеназа (ГФД)

Нуклеозидфосфо-
рилаза (НФ)

Рис. 61. Зимограммы изоферментов лактатдегидрогеназы (ЛД), глю-
козо-6-фосфат дегидрогеназы (ГФД) и нуклеозидфоофорилазы (НФ), пока-
зывающие типичное расположение полос в препаратах линий клеток наибо-

лее часто используемых видов.

Литература

1.	Графодатский А.С., Раджабли С.И. “Хромосомы сельскохозяйственных и лаборатор-
ных млекопитающих”. ’’Наука”, Сибирское отделение, Новосибирск, 1988 г.

2.	Дьяконов Л.П., Поздняков А.А., Денисенко Г.Ф. и др. ’’Культивирование клеток и
тканей животных” (Учебно-методическое пособие). Ставрополь, 4.1.1986, 96с;
ч.II.1988, 96 с. илл.

3.	Макгрегор Г., Варли Дж.. ’’Методы работы с хромосомами животных” "Мир",
М.-1986,272с.,илл.

4.	Мамаева С.Е. Цитогенетика клеток в культуре. В кн.: Биология клеток в культу-
ре. Отв. ред А.С.Трошин.,Л.,”наука", 1984,280с.

5.	Kruse P.F., Patterson М.К., Е. ds "Tissue culture methods and application”, Academic
Press, New York., San Francisco, London, 1973, 868 p, ill.
Глава 15. Методы клеточной инженерии

15.1.	Получение генетически маркированных мутантных
клеточных линий млекопитающих

Генетически маркированные мутантные клеточные линии широко ис-
пользуются для изучения фундаментальных и прикладных вопросов совре-
менной биологии. Клеточные линии, имеющие генетически стабильные
маркерные свойства, являются важнейшей и часто незаменимой модельной
системой для исследований по клеточной биотехнологии.

В популяции клеток, культивируемых in vitro, могут возникать разнооб-
разные мутантные варианты как спонтанно, так и в результате индукции. Индук-
торами генетических мутаций могут быть агенты различной природы - химиче-
ской, физической или биологической. Мутационный процесс может вызвать из-
менение на уровне всего генома (изменение числа хромосом), отдельной хромо-
сомы (нарушение структуры хромосомы) и одного гена (изменение в последова-
тельностях ДНК). Мутации могут возникнуть за счет изменения даже одной пары
оснований (путем замены, делеции, вставки), вызывая нарушение лишь в одном
кодоне затронутого гена. Мутации могут затрагивать жизненно важные функции
клеток, и в большинстве случаев это является причиной гибели появившихся в
популяции мутантных вариантов. В результате мутации, совместимой с жизнью
клетки, может произойти изменение биологических свойств продукта гена - бел-
ка. Такие мутации в ряде случаев приводят к утрате способности выполнять свою
нормальную биологическую функцию. Примером таких мутантов являются клет-
ки млекопитающих, несущие мутации в генах, кодирующих ферменты - фосфо-
рибозилтрансферазы и нуклеотидкиназы. В клеточной биотехнологии чаще всего
используют клетки - мутанты по ферментам гипоксантингуанинфосфорибозил-
трансферазе (ГФРТ) и тимидинкиназе (ТК). Эти ферменты участвуют в биосинте-
зе нуклеиновых кислот, и клетки, дефектные по ГФРТ и ТК, становятся
биохимически маркированными. Генная мутация в данном случае не является
летальной для клеток, так как существует другой, альтернативный путь
биосинтеза нуклеиновых и пиримидиновых нуклеотидов. Наличие двух путей
биосинтеза нуклеиновых кислот в эукариотических клетках и возможность
блокировки одного из них послужило основой для создания Дж. Литтлфилдом
первой селективной системы-ГАТ, широко используемой в биотехнологии.

15.1.1.	Принципы отбора мутантных клеток, дефектных по фер-
ментам ГФРТ и ТК, и использование их в экспериментах по клеточной
инженерии

В основе методических подходов, разработанных для отбора клеток
млекопитающих, имеющих генные мутации, лежат наблюдения за опухоле-
выми клетками, обработанными антиметаболитами in vitro. Было установле-
но, что в клеточной популяции, подвергшейся воздействиям противоопухо-
левых препаратов, появляются устойчивые клетки, которые дают начало
новой популяции. Последние часто сохраняют приобретенные фенотипиче-
ские признаки в отсутствии лекарственного препарата.

Мутантные клетки, дефектные по ферментам ГФРТ и ТК, могут нор-
мально размножаться, благодаря синтезу нуклеотидов по основному (эндоген-
ному) биосинтетическому пути из сахаров и аминокислот. Если блокировать
основной путь биосинтеза пуринов и пиримидинов с помощью ингибиторов
фолатредуктазы, то мутантные клетки погибают, так как для использования
запасных путей у них отсутствует один из ферментов - ГФРТ или ТК. Искусст-
венный перенос биологически активного аналога гена в мутантные клетки пу-
тем гибридизации или трансфекции приводит к восстановлению функции де-
фектного фермента, и такая "генотерапия” позволяет выжить клеткам в услови-
ях "блокады”. Этот принцип лежит в основе селективной системы ГАТ, вклю-
чающей ингибитор фолатредуктазы - аминоптерин и нормальные нетоксиче-
ские аналоги азотистых оснований - гипоксантин и тимидин (рис.62.).

Рис.62

Пути биосинтеза нуклеотидов

Основные биосинтетические пути синтеза:

пуринов пиримидинов

Запасные пути

Аминоптерин

ГФРТ

Гипоксантин

Рибонуклеотиды

> РНК

Гуанин + ФРПФ

Тиамин +АТФ

Дезоксинуклеотиды

Для отбора мутантных клеток, дефектных по ГФРТ, чаще всего исполь-
зуют один из следующих токсических пуриновых нуклеозидов: 8-азагуанин (8-
AG), 6-тиогуанин (6-TG), 6-меркаптопурин (6-МР), 2-6-диаминопурин (2-6
DAP), 2-фтораденин (2-FA). В нормальных клетках 8-AG, 6-TG и 6-МР катали-
зируются ферментом ГФРТ и проходят тот же путь, что и гуанин, гипоксантин
и ксантин. 2-6 DAP и 2-FA катализируются ферментом, специфичным для аде-
нина - аденозинфосфорибозилтрансфсраза (АФРТ). Цитотоксическое действие
пуриновых аналогов наблюдается после превращения их с помощью фосфори-
бозилтрансфераз в токсические нуклеозиды, которые включаются в ДНК и вы-
зывают гибель клетки. Если соответствующий фермент отсутствует или утра-
чивает функциональную активность, клетки приобретают способность размно-
жаться в присутствии токсических веществ.

Для селекции мутантных клеток, дефектных по ферменту тимидинки-
надзе (ТК ) используют также токсические аналоги пиримидиновых нуклеози-
дов: 5-бром-2-дезоксиуридин (5-БДУ), 5-иод-2-дсзоксиуридин (5-ИДУ), 3-
фтортимидин (3-ФТ), 6-азауридин (6-АУ) и 5-азацитидин (5-АЦ). Все нуклео-
зиды, кроме 6-АУ и 5-АЦ, фосфорилируются с помощью фермента ТК. Мета-
болизм 6-АУ и 5-АЦ осуществляется с участием фермента уридинкиназы и де-
зоксицитидинкиназы, соответственно. Пиримидиновые аналоги оказывают ци-
тотоксический эффект, включаясь в нуклеиновые кислоты в виде трифосфатов.
Мутагенный эффект этих антиметаболитов может проявляться как за счет оши-
бок в спаривании оснований, так и в результате хромосомных разрывов.

Клеточные линии, несущие мутации по ферментам ГФРТ, АФРТ и
ТК, могут быть дополнительно маркированы по ферменту Na+ К+ - зави-
симой АТфазы. В-результате устойчивые клетки приобретают устойчивость
к уабаину. Мутантные клетки, имеющие два биохимических маркера (на-
пример, дефектность по ТК и устойчивость к уабаину), представляют осо-
бую ценность, так как они могут служить универсальным партнером по гиб-
ридизации с клетками, не имеющими маркерных свойств. Селекция гибрид-
ных клеток в этом случае осуществляется в среде ГАТ с уабаином.

15.1.2.	Факторы, влияющие на селекцию мутантных клеток млеко-
питающих, устойчивых к токсическим аналогам азотистых оснований

Селекция мутантных клонов, устойчивых к токсическим аналогам пури-
новых и пиримидиновых оснований, из популяции клеток в культуре - процесс
довольно сложный и трудоемкий. Частота возникновения мутантов в разных кле-
точных линиях широко варьирует (от 104 до 10'7) и зависит от многих факторов,
связанных с генетическими и биохимическими характеристиками культур. Мно-
гие мутантные клоны клеток человека, а также мыши, хомячка и других живот-
ных получены из хорошо изученных исходных клеточных линий. Такие сведения,
как кариотип клетки, способность к онкогенной трансформации, эффективность
клонирования, проявление межклеточных (щелевых) контактов, во многом об-
легчают проведение опытов по получению мутантных клонов. Большинство кле-
точных линий сельскохозяйственных животных, культивируемых вне организма,
изучены недостаточно. Поэтому прежде, чем начинать эксперименты по селекции
мутантных клеток, необходимо изучить свойства клеточных линий, наиболее
важные для успешного достижения поставленной цели. К таковым относятся:
хромосомная изменчивость и генетическая структура популяции, эффективность
клонирования, сведения о контаминантах.

Одной из серьезных проблем, возникающих при селекции мутантов, явля-
ется контаминация исследуемой линии микоплазмами и латентными вирусами.
Микоплазменная и вирусная контаминации могут негативно влиять на возникно-
вение и выживаемость мутантных клонов в селективных условиях. Механизм
этих явлений может быть разным: комплементация неактивных ферментов в му-
тантных клетках за счет соответствующих фосфорилаз и киназ контаминантов;
повышение частоты реверсии, перестройка мутировавших генов или их фланки-
рующих последовательностей. Было показано также, что аналоги пуриновых и
пиримидиновых оснований могут активировать латентные вирусы в клетках. Ес-
ли такой процесс происходит в ходе селекции, он может приводить к гибели му-
тантных клеток, но результаты его не являются критическими и вероятность не-
высока. Проблема становится более острой, если контаминируется уже выделен-
ный и хорошо изученный мутантный клон. К сожалению, в таких случаях очень
трудно осуществить как вирусную, так и микоплазменную деконтаминацию.

Из изложенного выше следует, что перед началом опытов по получе-
нию мутантных клеток необходимо проверить клеточные линии на наличие
контаминантнов. Для выявления микоплазмы желательно использовать ре-
комендуемые методы (см.главу 18) радиоавтографический и выделение на
селективных питательных средах. В случае обнаружения инфекции следует
деконтаминировать клетки с помощью одного из эффективных методов.
Убедившись в том, что клетки освободились от микоплазм, их необходимо
криоконсервировать в количестве 20-30 ампул. Из-за угрозы повторной кон-
таминации не следует постоянно поддерживать клетки в культуре, при не-
обходимости их следует воссанавливать из криобанка.

Для успешного отбора мутантов важное значение имеет изучение конта-
минации клеток латентными, персистирующими вирусами (парамиксовирусами,
парвавирусами, герпесвирусами и др.). Латентные вирусы в селективных услови-
ях могут активироваться, оказать влияние на мутационный процесс и снизить
биотехнологическую ценность маркированных линий. При выявлении контами-
нирующих вирусов необходимо учитывать, что источниками заражения клеток
могут быть сыворотки, научный персонал, вирусы и клетки, с которыми работают
в лаборатории. Для того, чтобы обнаружить в клетках латентные вирусы, их не-
обходимо активировать. Одним из способов вызвать реактивацию вирусов явля-
ется обработка клеток токсичными препаратами, концентрацию которых и время
обработки подбирают эмпирически. Можно использовать антиметаболиты в вы-
сокой концентрации, вызывающей гибель 50-60% клеток в течение 2-3 дней, или
те же препараты в низкой концентрации, не оказывающей цитотоксического эф-
фекта. В таком случае клетки можно обрабатывать в течение 7-10 дней. После
этого культуральную жидкость и клетки следует изучить на наличие подозревае-
мого вируса с помощью иммунологических, вирусологических или молекулярно-
морфологических методов. При обнаружении в клетках латентного вируса инфи-
цированную линию следует заменить или, если это невозможно, то, как исключе-
ние, попытаться освободить от вируса путем клонирования в присутствии вирус-
специфических антител.

15.13. Методы отбора мутантных клеток и оптимизация условий селекции

Для отбора мутантных клонов из популяции существует два основ-
ных метода селекции: одношаговый (одноступенчатый) и многошаговый
(многоступенчатый). Одношаговый метод состоит в отборе мутантов в ре-
зультате обработки клеток токсическим препаратом в одной определенной
концентрации в ходе одного эксперимента, как правило, в течение 7-12
дней. Принцип многошаговой селекции заключается в многократной обра-
ботке клеток препаратом в постоянно возрастающей концентрации.

Одношаговый метод может обеспечить быстрый отбор мутантных
клеток при двух условиях: при быстром темпе мутирования и при высокой
клонообразующей способности клеток. Однако этот способ не всегда позво-
ляет провести отбор стабильных клонов, устойчивых к высоким концентра-
циям лекарственных препаратов. Так, наши неоднократные попытки изоли-
ровать мутантные клоны из немагнизированных культур клеток с/х живот-
ных путем одношагового метода не привели к успеху.

Отбор мутантных клеток с помощью многошагового метода в боль-
шинстве случаев позволяет изолировать клоны, высокоустойчивые к токси-
ческим аналогам, однако при этом эксперименты могут продолжаться до-
вольно долго - от 2-3 месяцев до одного года.

В опытах по получению мутантных клеточных линий необходимо ис-
пользовать питательные среды, не содержащие аналогов азотистых основа-
ний. В зависимости от специфических культуральных характеристик клеток
для работы с ними можно использовать среду Игла в различных модифика-
циях: среда Игла МЕМ (минимальная), среда Игла ВМЕ (основная), и среда
ДМЕМ (модификация Дульбекко). Для рутинного поддержания клеток в
культуре можно использовать сыворотки крупного рогатого скота. При про-
ведении экспериментов необходимо использовать сыворотку эмбрионов
коровы, диализованную против дистиллированной воды в течение 48 час.
при +4°С, так как в составе сыворотки имеются пуриновые и пиримидино-
вые нуклеозиды. Для пересева клеток используют стандартные дисперги-
рующие растворы трипсина (0,25%) и версена (0,02%).

При работе с аналогами пуриновых и пиримидиновых нуклеозидов
можно использовать концентрированные (50-кратные или 100-кратные) раство-
ры. Поскольку известно, что токсические аналоги могут оказывать канцероген-
ный эффект, с ними необходимо работать в перчатках. Препараты лучше рас-
творяются при высоких значениях pH. Растворы стерилизуют фильтрацией че-
рез нитроцеллюлозные фильтры с диаметром пор 0,22 мкм и хранят при -20°С.

Для поддержания линий клетки культивируют в стеклянных или пла-
стиковых флаконах (матрасах), строго соблюдая условия культивирования.
Эксперименты удобнее проводить, используя пластиковые чашки Петри
(диаметром 60 мм и 100 мм) или панели: 96-, 24-, 12- или 6-ти луночные.

При низкой частоте образования мутантных клонов в культурах (10'5-10’6)
клетки необходимо предварительно обрабатывать мутагенами. Для индукции
мутаций, определяющих устойчивость к пуриновым и пиримидиновым нуклео-
зидам, применяют такие классические мутагены, как N-mctwi-N-
нитрозогуанидин - МНГ, этилметансульфонат - ЭМС, бромурацил - БУ, N-
метил-М-нитрозомочевину - МНМ Мутагены обычно плохо растворяются в воде,
поэтому их сначала растворяют в одном из органических растворителей (ДМСО,
ацетон, этанол), а затем - в растворе Хенкса или в среде без сыворотки. Растворы
мутагенов следует готовить непосредственно перед употреблением. Для опреде-
ления оптимальной дозы мутагена, индуцирующей максимальную частоту мута-
ций, необходимо выяснить зависимость выживаемости клеток от концентрации
мутагена. Концентрация мутагена, вызывающая гибель 50-80% клеток, является
оптимальной для индукции мутантов. Время инкубации клеток с мутагенами оп-
ределяется с учетом времени их распада. Например, производные МНГ и МНМ
распадаются быстро (в течение 0,5-1,0 часа), поэтому обработка клеток этими
препаратами проводится в течение нескольких (до 4-х) часов. При использовании
относительно стабильных мутагенов, таких как ЭМС или БУ, время инкубации
должно соответствовать продолжительности клеточного цикла (18-24 час.).

Мутагенами обрабатывают клетки, сформировавшие субконфлюентный
монослой, на стадии логарифмичского роста. Для этого клетки трижды промы-
вают раствором Хэнкса и добавляют среду без сыворотки с мутагенами, инку-
бируют при 37°С в атмосфере 7,5% СО2. В контрольные клетки добавляют рас-
творитель без мутагена. Через определенное время, которое устанавливается в
зависимости от стабильности мутагена и продолжительности клеточного цикла,
клетки трижды промывают раствором Хэнкса, снимают с субстрата, определя-
ют число жизнеспособных клеток и высевают в свежую среду с сывороткой.
Через 1-2 пассажа клетки можно использовать в опытах по селекции.

Для выделения появившихся единичных мутантных клонов из общей
популяции клеток необходимо создать условия, способствующие их выжи-
ванию. На выживание уже образовавшихся мутантных клонов существенно
влияют два параметра: концентрация токсического нуклеозида и число по-
сеяных клеток. Оптимальной концентрацией является такая, при которой
основная масса чувствительных клеток погибает и в то же время единичные
устойчивые клетки остаются жизнеспособными. Слишком низкая концен-
трация препарата может привести к выживанию чувствительных клеток на-
ряду с устойчивыми, тогда как слишком высокая концентрация может убить
все, в том числе и резистентные, мутантные клетки.

Распространенной формой межклеточных взаимодействий в культуре
является метаболическая кооперация - обмен низкомолекулярными вещества-
ми. Степень проявления метаболической кооперации зависит от наличия между
клетками щелевых контактов, обеспечивающих прохождение через клеточную
мембрану низкомолекулярных веществ с М.м. до 10 КД. Благодаря метаболиче-
ской кооперации мутантные клетки могут включать антиметаболиты, если они
находятся в контакте с чувствительными клетками. В селективных условиях это
приводит к их гибели одновременно с чувствительными клетками.

Противоположное явление - выживаемость чувствительных клеток в се-
лективных условиях, может наблюдаться при проявлении контактного тормо-
жения в культуре. Это свойство характерно для диплоидных и минимально
трансформированных клеток. Контактное торможение может возникнуть также
при образовании щелевых межклеточных мостиков. В любом случае контакт-
ное торможение индуцирует ряд биохимических изменений, приводящих к рез-
кому снижению макромолекулярных синтезов и уменьшению проницаемости
мембран. Эти изменения приводят к прекращению клеточных делений и резко-
му снижению метаболической кооперации. При этом чувствительные клетки не
могут включать токсические нуклеозиды и не погибают.

Указанные выше трудности можно преодолеть, высевая клетки в низкой
концентрации, что однако может снижать число образующихся мутантных кло-
нов. Основной причиной снижения эффективности образования мутантных
клонов при разреженном посеве является нехватка некоторых дефицитных пи-
тательных веществ, не содержащихся даже в эмбриональной сыворотке, но син-
тезируемых самими клетками. При редком посеве количество синтезируемых
веществ снижается и не удовлетворяет потребности клеток. В присутствие ток-
сических пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов это явление приобретает
более выраженный характер и препятствует росту и размножению образовав-
шихся мутантных клеток. Потребность клеток в ростовых факторах и эффек-
тивность их клонирования в значительной мере зависят от степени трансфор-
мации и гетерогенности клеточной популяции. Высокотрансформированные
клеточные линии отличаются от менее трансформированных меньшей зависи-
мостью от ростовых факторов и более высокой эффективностью клонирования.

Успех в опытах по отбору мутантных клонов в культуре во многом зави-
сит от степени выраженности межклеточных взаимодействий, которые могут
осуществляться, по крайней мере, двумя путями. Во-первых, с помощью мета-
болической кооперации, которая проявляется при образовании физических кон-
тактов между клетками, и, во-вторых, с помощью межклеточного обмена рос-
товыми факторами через питательную среду. Такие межклеточные взаимодей-
ствия в значительной степени определяют ’’автономность” клеток культуры.
При более тесных межклеточных взаимодействиях клетки становятся менее
автономными и не обладают способностью к размножению при редком посеве.
У более автономных клеток, активно растущих при разреженном посеве, меж-
клеточные взаимодействия менее выражены.

Отбор мутантных клонов из клеток культур с низкой эффективностью
клонирования представляет особые трудности. Такие клетки необходимо либо
адаптировать к росту и размножению при редком посеве, либо клонировать для
того, чтобы выделить из популяции более автономную сублинию.

Дозу нуклеозида и плотность посева, оптимальные для выявления ис-
тинных мутантов, определяют путем обработки культур препаратом в различ-
ных концентрациях при одновременном варьировании числа высеянных клеток.
Предварительно определяется доза препарата, вызывающая цитотоксический
эффект и подавляющая рост клеток. Доза препарата, подавляющая рост клеток,
является начальной концентрацией в экспериментах по оптимизации условий
отбора. Минимальное число клеток для первого посева обычно колеблется от
2.102 до 5.10“ клеток на см2 с учетом эффективности клонирования. Затем в ходе
эксперимента число клеток и концентрацию препарата увеличивают в 2 раза.
Для каждого варианта опыта используют не менее 5 чашек Петри, смену среды
проводят через каждые 2-3 дня. Параллельно контролируют эффективность
клонирования культур. Ввиду большого объема работы при проведении много-
вариантного эксперимента, его можно осуществить поэтапно.

Через 10-12 дней чашки промывают раствором Хэнкса, клетки фик-
сируют 70% этанолом и окрашивают по Гимза. Подсчет выросших клонов
для каждого варианта эксперимента проводится с учетом количества обра-
зовавшихся клонов при посеве 100-200 клеток на чашку Петри без препара-
та в данный период. Доза препарата и число клеток, обеспечивающие наи-
более высокое количество устойчивых клонов, являются оптимальными для
селекции мутантов из исследуемой популяции в данный период.

В результате количественного анализа можно определить частоту
возникновения мутатных клонов по изучаемому локусу на одну клетку и на
одну генерацию. Частота возникновения мутаций при индукции мутагенами,
как правило, значительно увеличивается.

В селективных условиях могут возникать клональные варианты с различ-
ной пролиферативной потенцией. Для осуществления каждого очередного шага
селекции необходимо выбирать наиболее активно размножающиеся клоны, и экс-
перимент следует продолжать, строго контролируя посевную концентрацию кле-
ток и постепенность повышения концентрации препарата. Для изолирования от-
дельных, независимо выросших клонов их вначале помечают (маркером или ка-
рандашом по стеклу) с наружной стороны чашки Петри. Затем клетки промывают
раствором Хэнкса, и поверх клонов помещают металлические цилиндры диамет-
ром 0,5 см, покрытые вазелином, так, чтобы клон оказался внутри цилиндра. Ци-
линдры и вазелин должны быть предварительно стерилизованы. Каждый клон в
цилиндре обрабатывается подогретым раствором версена (0,02%) и трипсина
(0,25%) в соотношении 1:1. После снятия клонов их, в зависимости от числа кле-
ток, переносят в лунки 96- или 24-луночных панелей и добавляют ростовую среду.
Когда в лунках образуется монослой, клетки снимают и переносят в лунки боль-
шего объема (в 12-луночные и 6-луночные панели). Часть клеток используют для
продолжения селекции в присутствии более высоких концентраций нуклеозидов.

После получения мутантных клонов, устойчивых к высоким концен-
трациям нуклеозидов (100-200 мкг/мл), необходимо изучить стабильность
проявления ими приобретенного свойства, так как природа устойчивости
клонов к препаратам может определяться как мутационными событиями,
так и эпигенетическими изменениями. В последнем случае клетки при куль-
тивировании без нуклеозида могут быстро терять устойчивость к ним.

Возникновение нестабильных вариантов в популяции клеток, устойчи-
вых к нуклеозидам, может быть следствием изменения проницаемости мембран
к данному препарату или изменения структуры фермента за счет непосредст-
венного действия на него токсического нуклеозида. Возможная потеря устойчи-
вости клеток может быть связана также с возникновением нестабильной пере-
стройки гена - мишени вследствие инсерции мобильных генетических элемен-
тов или за счет супрессивного влияния фланкирующих последовательностей.

Для проверки сохранения прибретенных признаков мутантные клетки
культивируют в течение 40-50 генераций без селективного агента, после чего
анализируют клонообразующую способность в присутствии препарата. Сниже-
ние эффективности клонирования клеток в этих условиях свидетельствует о
нестабильности проявления фенотипического признака в изученных клетках.
Такие клоны не могут использоваться в экспериментах по клеточной биотехно-
логии, так как соответствующие ферменты, определяющие их маркерные свой-
ства, могут находиться в функционально активном состоянии.

Определение биохимической природы резистентности в отобранных кло-
нах изучают по проявлению функциональной активности ферментов в среде ГАТ,
содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин, или в других селективных
средах в зависимости от того, какой фермент затронут мутацией. Клетки высажи-
вают в концентрации 104 кп/см2, смену среды проводят через каждые 2-3 дня. Де-
генерация и гибель мутантных клеток в среде ГАТ наступает на 4-7 сутки культи-
вирования, что свидетельствует об инактивации или отсутствии соответствующе-
го фермента. Клоны, образующиеся и растущие в среде ГАТ, являются ревертан-
тами, в которых возобновился синтез нормально функционирующего фермента.
Реверсионный анализ следует проводить через каждые 20-30 пассажей (40-60
генераций). С этой целью клетки вначале обрабатывают мутагеном для повыше-
ния частоты образования ревертантов и облегчения их выявления, а затем культи-
вируют в среде ГАТ. Мутантные клетки, ревертирующие с высокой частотой (102
- 104), не пригодны для экспериментов по гибридизации, трансфекции и других
опытов по передаче генов. Для предотвращения роста и размножения ревертантов
через каждые 20-30 пассажей клетки следует культивировать в течение 2-3 пас-
сажей в присутствии нуклеозидов.

15.1.4.	Примеры селекции мутантных клеток сельскохозяйствен-
ных животных, дефектных по ферментам ТК и ГФРТ

15.1.4.1.	Приготовление растворов

1.	8-азагуанин (8-АГ): 4 мг 8 АГ растворяют в 1,5 мл деионизован-
ной воды, добавляя по каплям I N NaOH, объем доводят до 2 мл деионизо-
ванной водой;

2.	5-бром-2-дезоксиуридин (БДУ): 10 мг БДУ растворяют в 2 мл
деионизованной воды или среды Игла;

3.	N-метил- N-нитро- • нитрозогуанидин (МННГ): 0,5 мг МННГ рас-
творяют в 1 мл ДМСО и сразу используют;

4.	Этилметансульфонат (ЭМС): 1,0 г ЭМС растворяют в 1 мл ДМСО
и сразу используют.

Приготовление среды Г АТ:

- 100-кратный раствор гипоксантина: 150 мг гипоксантина растворя-
ют в 10 мл деионизованной воды, добавляя по каплям I N NaOH, доводят
объем до 100 мл деионизованной водой;

100-кратный раствор аминоптерина: 10 мг аминоптерина растворя-
ют в 10 мл деионизованной воды, добавляя по каплям I N NaOH, доводят
объем до 100 мл;

100-кратный раствор тимидина: 50 мг тимидина растворяют в 100
мл деионизованной воды.

Для приготовления среды ГАТ к 97 мл ростовой среды добавляют по 1
мл каждого из 100-кратных растворов гипоксантина, аминоптерина и тимидина.
Все растворы, кроме мутагенов (МННГ и ЭМС), стерилизуют фильтрацией че-
рез фильтры с диаметром пор 0,22 мкм (фирма Millipore, США). Приготовлен-
ные стерильные растворы хранятся при -20°С и при соблюдении условий хра-
нения не теряют своей активности в течение 6 и более месяцев. В настоящее
время ряд зарубежных фирм, в частности фирма Sigma (США), выпускают го-
товые стерильные компоненты среды ГАТ, а также их смесь. Наш опыт работы
с реагентами фирмы Sigma показал их высокое качество и позволяет рекомен-
довать для работы по клеточной биотехнологии в том случае, если имеется дос-
таточное для этого финансирование.

15.1.4.2.	Селекция ТК-дефектных клонов перевиваемой линии
клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ)

Клеточная линия СПЭВ состоит из эпителиоподобных клеток, среди
которых иногда встречаются единичные фибробластоподобные клетки.
Клетки характеризуются четко выраженными границами и небольшим раз-
бросом по числу хромосом в кариотипе: модальный класс составляют клет-
ки с диплоидным или гиподиплоидным числом хромосом - 37-38 (2п=38).
Эффективность клонирования клеток СПЭВ составляет 16-25%. По культу-
рально-морфологическим свойствам клетки СПЭВ относятся к высоко-
трансформированным, так как они способны размножаться в полужидком
агаре и характеризуются многослойным ростом. Концентрационный эффект,
определяющий метаболическую кооперацию, в селективных условиях на-
блюдается при посеве 3 - 5 103 кл/см2 Оптимальная концентрация селектив-
ного агента - 5-БДУ для начала селекции составляет 3,5 мкг/мл. Частота об-
разования спонтанных ТК-дефектных мутантных клонов в культуре СПЭВ
составляет 1,5-2,0 10'5, индуцированных - 7- 8 10'5

Для получения мутантных клонов клетки высевают в чашки Петри (с диа-
метром 60 мм или 100 мм) в концентрации 1 1,5 105 кл/мл в ростовой среде и
инкубируют в СО2-термостате при 37°С и концентрации СО25%. На следующий
день клетки промывают раствором Хэнкса и добавляют мутаген МННГ в концен-
трации 1 мкг/мл или ЭМС в концентрации 200 мкг/мл. Через 3 часа чашки с
МННГ трижды промывают раствором Хэнкса и вносят свежую ростовую среду.
Чашки с ЭМС оставляют до следующего дня. Концентрацию СО2 повышают до
7,5 - 10%. На следующий день чашки с ЭМС трижды промывают и вносят росто-
вую среду. Клетки ежедневно просматривают и по мере надобности отмывают от
погибших клеток. Через 4-5 дней клетки пересевают. Для восстановления культур
после обработки мутагенами требуется провести 2-3 пассажа.

После полного восстановления морфо-физиологических свойств клетки
высевают в чашки Петри по 3-5 103 кл/см2 в ростовую среду, содержащую 3,5
мкг/мл 5-БДУ и инкубируют в СО2-термостате при 37°С и концентрации СО2
7,5%. Через каждые 3-4 дня производят смену среды. Через 7-10 дней при про-
смотре можно наблюдать клоны клеток, устойчивых к 3,5 мкг/мл 5-БДУ

Наиболее активно растущие клоны изолируют, переносят в 24-луночные
панели, после чего эксперимент повторяют, внося 5-БДУ в концентрации 6
мкг/мл. Опыт продолжают, постепенно повышая концентрацию селектирующего
агента в течение 4-5 месяцев. Таким образом удается получить мутантные клоны,
устойчивые к 200-300 мкг/мл 5-БДУ. Функциональную активность тимидинкина-
зы проверяют, помещая устойчивые клоны в среду ГАТ. Полная дегенерация
мутантных клеток наблюдается на 8-10 сутки культивирования при посеве 3-5 103
кл/см2 Для проверки мутантных клеток на сохранение устойчивости к 5-БДУ их
культивируют в течение 2,5-3 месяцев без препарата, после чего проверяют эф-
фективность клонирования в присутствии 100 мкг/мл 5-БДУ. Если эффектив-
ность клонирования не снизилась по сравнению с контрольными клетками, кото-
рые культивировали в этот период с 5-БДУ, клетки подвергают реверсионному
анализу. Реверсионный анализ проводят в среде ГАТ после предварительной об-
работки клеток мутагеном и без него. Стабильные, неревертировавшие клоны
отбирают для дальнейших исследований. Оптимальные параметры для селекции
мутантных клонов клеток СПЭВ приведены в табл.27. (Рис.63).

Таблица 27

Оптимальные параметры селекции мутантных клонов -ТК'

Клетки	Концентрация 5- БДУ, вызывающая LD90 клеток (мкг/мл)	Посевная концен- трация клеток (кл/см")	Эффективность клонирования(%)
PLC/PRF/5	3	4,5 102	0,5-1,0
U373MG	1	1-210"	40-60
CV-1	3	2 103	50-70
СПЭВ	3	5 103	80-90
15.1.4.3.	Селекция ГФРТ-дефектных клонов перевиваемой линии
трахеи эмбриона коровы (ТР)

Культура клеток ТР представлена эпителиоподобными клетками.
Клетки располагаются тесно, границы клеток просматриваются плохо. Мо-
дальный класс хромосом в кариотипе - 59, диплоидное количество для вида
60 хромосом. Эффективность клонирования колеблется от 4% до 15%.
Концентрация клеток, обеспечивающая максимальный выход мутантных
клонов в селективных условиях, составляет 2 - 2,5 103 кл/см2. Первоначаль-
ная доза селективного агента - 8-АГ - 5 мкг/мл.

Клетки высевают в концентрации 5 104 кл/мл в ростовую среду, содержа-
щую в качестве мутагена 15 мкг/мл 5-БДУ. Чашки инкубируют в СО2-термостате
при 5% СО2. Через 48 часов среду заменяют на свежую, не содержащую 5-БДУ.
Клетки культивируют в течение 5-7 дней, при необходимости пересевают.

Затем клетки высевают в концентрации 2-2,5 103 кл/см2 в ростовую среду,
содержащую 5 мкг/мл 8 АГ. Чашки помещают в СО2-термостат с 7,5% СО2. Му-
тантные клоны, устойчивые к 5 мкг/мл 8-АГ, появляются на 14-16 сутки. Их изо-
лируют, переносят в 24-луночные панели и повторяют эксперимент, повышая
концентрацию 8-АГ до 7 мкг/мл. Продолжая таким образом опыт в течение 7-8
месяцев, можно отобрать клоны, устойчивые к 100 мкг/мл 8-АГ. Отсутствие
функционально активного фермента ГФРТ в отобранных клетках проверяют пу-
тем культивирования в среде ГАТ, в которой мутантные клетки, дефектные по
ГФРТ, погибают. Затем проводят реверсионный анализ мутантных клонов и от-
бирают наиболее стабильные мутантные клоны, пригодные для экспериментов по
клеточной биотехнологии. Оптимальные параметры для селекции трех мутант-
ных клонов клеток ТР приведены в табл.28 (Рис.64).

Таблица 28

Оптимальные параметры селекции мутантных клонов -ГФРТ

Клетки	Концентрация 5- БДУ, вызывающая LDy0 клеток (мкг/мл)	Посевная концен- трация клеток (кл/см2)	Эффективность клонирования (%)
PLC/PRF/5	АГ-3	ЗЮ2	0,5-1,0
PLC/PRF/5	ТГ-0,5	ЗЮ2	0,5-1,0
PLC/PRF/5	МП-1	31 о2	0,5-1,0
ТР	АГ-3	5102	3-5
ТР	ТГ-0,1	5 102	3-5
ТР	МП-0,5	5 102	3-5

Путем многошаговой селекции нами было получено более 50 мутант-
ных клонов клеток СПЭВ и ТР, устойчивых к токсическим пуриновым и
пиримидиновым аналогам нуклеиновых кислот. Данные приведены в табл
29. Все изученные мутантные клоны клеток СПЭВ стабильно сохраняли
фенотипические признаки в течение 4-х лет (время наблюдения). Реверси-
онный анализ показал, что частота реверсии составляет 1-2 10'7, ревертантны
обнаружены только в одном клоне из 16 изученных.
Таблица 29

Мутантные клетки человека и млекопитающих,
дефектные по генам ТКи ГФРТ

Наименование кле- ток	Мутагены	Селек- тивные агенты	Частоты возникно- вения мутации	Фенотипи- ческий признак	Частота ревер- сии
PLC/PRF/5-A7-4-TK"	Не использ.	5-БДУ	1-3 10’6	Дефект по ТК	1-2 10'7
PLC/PRF/5-A7-14- ТК’	Не использ	5-БДУ	1-3 10'6	Дефект по ТК	1-210'7
PLC/PRF/5-A7-1-3- ГФРТ"	ЭМС	8-АГ	5-6 105	Дефект по ГФРТ	2-3 10'7
PLC/PRF/5-A7-1-13- 2-ГФРТ	МННГ	8-АГ	5-6 10'5	Дефект по ГФРТ	1-2 10'7
U373MG-6- ТК"	ЭМС	5-БДУ	7-8 105	Дефект по ТК	0,9-  1,510'7
СЕМ-4- ТК	Не использ	5-БДУ	Не исслед.	Дефект по ТК	Не ис- след.
СПЭВ-Д5- ТК"	Не использ	5-БДУ	5-6 КУ4	Дефект по ТК	1-2 10'8
СПЭВ-А4- ТК"	Не использ	5-БДУ	5-6 10"1	Дефект по ТК	3-5 10'“
CV-17- ТК	Не использ	5-БДУ	1-210'5	Дефект по ТК	3-4 10'7
ТР-АГ-9- ГФРТ"	5-БДУ	8-АГ	5-6 106	Дефект по ГФРТ	4-6 1О'?
ТР-АГ-13- ГФРТ"	5-БДУ	8-АГ	5-6 10'6	Дефект по ГФРТ	1-310'7

Мутантные клоны клеток трахеи эмбриона коровы также стабильно
проявляли фенотипические признаки в течение 2,5 лет (время наблюдения),
однако в 2 из 9 исследованных клонов ревертанты были обнаружены с вы-
сокой частотой - 0,5 - 1,0*10"5

Представляет интерес тот факт, что в процессе селекции из клеточ-
ных популяций СПЭВ и ТК были изолированы мутантные клоны, сущест-
венно отличавшиеся от исходных линий по некоторым морфологическим и
культуральным характеристикам. Так, нами были обнаружены ТК-
дефектные клоны СПЭВ, размножавшиеся в среде с низкой концентрацией
сыворотки (0,1 - 0,5%) и с тенденцией к суспензионному росту. Из линии
клеток ТР были изолированы мутантные клоны, проявлявшие свойства кле-
ток с минимально трансформированным фенотипом: контактное торможе-
ние, высокая потребность в ростовых факторах. В двух клонах ТР был обна-
ружен ретровирус типа С, отсутствовавший в исходной линии.

Ряд мутантных клонов СПЭВ и ТР были с успехом использованы в
экспериментах по генетической трансформации клеток.

15.2. Слияние цитоплазматических мембран клеток млеко-
питающих и получение гибридных клеток

Методы слияния целых клеток и клеточных фрагментов позволяют
создавать новые модельные клеточные системы, представленные гибрид-
ными клетками разной природы. Такие клетки позволяют решать важные
фундаментальные проблемы биологии и медицины, они являются также
незаменимым инструментом для решения многих актуальных проблем ви-
русологии, иммунологии и биотехнологии.

Гибридные клетки образуются в результате слияния двух целых клеток в
одну с общей цитоплазмой и единым ядром. В слиянии могут участвовать самые
различные клетки: эмбриональные и взрослого организма, нормальные и злокаче-
ственные, активно размножающиеся и не способные делиться. Гибриды соматиче-
ских клеток используются для исследования действия генов и их регуляции, меха-
низмов клеточной дифференцировки, картирования хромосом, проблем злокачест-
венности, а также для изучения взаимодействия вирусов и клеток хозяина. Гибрид-
ные клетки стали основой для развития одной из важнейших отраслей биотехноло-
гии - получения моноклональных антител с помощью гибридомной технологии.

Путем слияния клеточных фрагментов (ядра, цитоплазмы, хромосом),
окруженных плазматической мембраной, можно создать новую, до того в
природе не существовавшую гибридную клетку. Слияние безъядерной ци-
топлазмы одной клетки с ядром другой клетки приводит к образованию ре-
конструированной клетки. Такие клетки могут служить удобной модельной
системой для изучения таких проблем, как взаимодействие ядра и цито-
плазмы, цитоплазматическая регуляция дифференцировки, функции мито-
хондриального генома, роль цитоплазмы в репликации вирусов.

В основе образования гибридных и реконструированных клеток лежит
слияние плазматических мембран. Биологического барьера, возникающего при
слиянии различных мембран эукариот, прокариот и вирусов, по-видимому, не
существует. Хорошо сливаются мембраны клеток млекопитающих, различаю-
щихся по видовому и органному происхождению. Известно, что генетический
материал многих вирусов (ортомиксовирусы, тогавирусы, рабдовирусы, пара-
микровирусы, ретровирусы, герпесвирусы и др.) попадают внутрь клеток после
слияния их поверхностной оболочки с мембраной клетки хозяина. После удале-
ния клеточной стенки мембраны бактерии также хорошо сливаются с плазмати-
ческой мембраной клеток высших эукариот. Искусственные бислойные липид-
ные мембраны обладают способностью сливаться с различными клетками мле-
копитающих как in vitro, так и in vivo.

Слияние клеток происходит в организме при его онтогенетическом раз-
витии. Оплодотворение женских и мужских половых клеток (ооцитов и сперма-
тозоидов) происходит в результате слияния их мембран. Слияние клеток бла-
стоциты с клетками стенки матки матери обеспечивает имплантацию зародыша,
и тем самым создается возможность для дальнейшего развития нового организ-
ма. Формирование многоядерных мышечных трубочек, составляющих основу
мышечной ткани, также связано со слиянием одноядерных мышечных клеток.

Слияние мембран возбудителей многих инфекционных болезней (вирусов,
бактерий, хламидий) с клетками макроорганизма приводит к развитию патологи-
ческих процессов. Еще в конце прошлого столетия образование гигантских мно-
гоядерных клеток наблюдали при оспе, кори, паротите, парагриппе, герпесе, ту-
беркулезе. Внутриклеточная локализация бруцелл, микобактерий, хламидий яв-
ляется следствием слияния их мембран с плазматической мембраной клетки.

Довольно успешно сливаются внутриклеточные мембранные струк-
туры: первичные лизосомы сливаются с фагоцитарными вакуолями, мем-
браны эндоплазматической сети сливаются с мембранами аппарата Голь-
джи. Слияние мембран клеточных органелл необходимо для регуляции про-
цессов биосинтез'а и транспорта белковых молекул.

15.2.1	.Методологические основы получения гибридных и реконструи-
рованных клеток млекопитающих и пояснение основной терминологии

Слияние плазматических мембран двух или более целых клеток приводит
к образованию двуядерных или многоядерных клеток с общей цитоплазмой.
Многоядерные клетки называют также поликарионами. Процесс образования
многоядерных клеток в вирусологической литературе получил название "симпла-
стообразование, или синцитиеобразование” Если поликарионы образуются в
результате слияния родительских клеток одной природы (несущих одинаковую
генетическую информацию), их называют гомокарионами. Многоядерные клет-
ки, имеющие ядра от двух или более слившихся родительских клеток разного
происхождения, являются гетерокарионами. Когда в гетерокарионах вслед за ци-
топлазмой объединяются (сливаются) ядра и образуются делящиеся клетки ново-
го типа, их называют истинными гибридными клетками, или синкарионами.

Гибридные клетки можно создавать путем слияния плазматических
мембран клеток самых различных типов как одного вида (например, нейро-
ны и лимфоциты мыши), так и разных видов (например, свиньи и лошади,
или мыши и курицы). Гибридные клетки можно получать также путем слия-
ния клеток от представителей различных царств - эукариот и прокариот
(клетки животных и бактерий, клетки животных и растений).

Гибридные клетки могут содержать генетическую информацию не
только от двух родительских клеток, но и от трех и более клеток одного или
различных видов. Например, путем слияния гибридных клеток (свинья +
корова) с клетками лошади можно получить гибриды, имеющие генетиче-
скую информацию от трех животных - свиньи, коровы и лошади. При этом
для получения новых гибридов следующего порядка необходимо предвари-
тельно генетически маркировать родительские гибридные клетки.

Гибридные клетки, полученные путем слияния клеток различных
тканей одного вида животного, называются внутривидовыми (например,
клетки, образующиеся в результате слияния лимфоцитов и фибробластов
мыши). Межвидовые клеточные гибриды получают из клеток различных
видов животных (например, свинья + корова, или человек + мышь).

Реконструированная клетка - это вновь созданная клетка из ядра и
цитоплазмы разных клеток. Для этого сначала получают клеточные фраг-
менты: ядро, окруженное небольшим количеством цитоплазмы и ядерной
мембраной (кариопласт), и безъядерную цитоплазму (цитопласт).

Слияние целых клеток с цитопластами приводит к формированию циб-
ридов. Кариобриды получают путем слияния кариопластов с целыми клетками.
Цитопласты и кариопласты получают путем энуклеации клеток в присутствии
цитохалазина В, который вызывает экструзию (выбрасывание) ядер. Процесс
энуклеации завершается образованием цитопласта и кариопласта. Разработаны
различные методы энуклеации клеток и выделения клеточных фрагментов.

Частота спонтанных слияний мембран клеток in vitro невелика, по-
этому для ее увеличения необходимо индуцировать слияние мембран с по-
мощью биологических, химических или физических сливающих агентов.
Большинство РНК и ДНК геномных вирусов (герпесвирусы, парамик-
совирусы, ретровирусы) обладают способностью индуцировать слияние
плазматических мембран клеток эукариот, благодаря присутствию у них
гемагглютинина или нейраминидазы. Среди них наиболее широкое приме-
нение нашел вирус Сендай представитель семейства парамиксовирусов.
Было установлено, что слияние мембран клеток могут вызывать липиды и
липидоподобные вещества, такие как лизолецитин. Однако, токсические и
повреждающие свойства этих веществ на клетки препятствовали широкому
их применению в качестве индукторов слияния.

Некоторые синтетические полимеры (полиэтиленгликоль, поливинил-
пирролидон, полиглицерол) и некоторые детергенты также обладают способно-
стью сливать клеточные мембраны. Наиболее хорошо изучена сливающая ак-
тивность полиэтиленгликоля. В многочисленных работах, начиная с первой
работы Понтекорво, доказано, что этот агент является универсальным индукто-
ром слияния мембран эукариотических, бактериальных и растительных клеток.

Бурное развитие методов клеточной инженерии стимулировало поиск
новых эффективных методов слияния мембран. Было установлено, что им-
пульсное воздействие на клетки электрического поля высокой напряженности
приводит к слиянию их мембран. Метод основан на кратковременном воздейст-
вии электрическим импульсом на близко расположенные клеточные мембраны,
за счет чего происходит снижение толщины плазматических мембран и нару-
шение их целостности с образованием трансмембранных пор. Эти изменения
приводят к перемещению мембранных структур, и в результате - к их слиянию.

Главным условием для слияния клеточных мембран, независимо от того,
какой используется индуктор, является образование физического контакта меж-
ду мембранами, подвергаемыми слиянию. Почти все клеточные линии, за ис-
ключением лимфоидных, размножаются в культуре, прикрепляясь к субстрату
и образуя между собой межклеточные контакты. Клетки, растущие в прикреп-
ленном виде, можно сливать, совместно высевая в определенной концентрации,
обеспечивающей межклеточные контакты. Клетки, растущие в суспензии
(лимфоидные и некоторые линии нелимфоидного происхождения, адаптиро-
ванные к суспензионному росту), также должны образовывать плотные контак-
ты. Этого добиваются путем центрифугирования.

Учитывая специфику сливаемых клеток или клеточных фрагментов,
необходимо отрабатывать условия слияния. Одним из условий успешного
слияния являются: оптимальная концентрация сливаемых родительских кле-
ток и их соотношение. При слиянии в монослое слишком низкая или слиш-
ком высокая посевная концентрация приводят к отсутствию межклеточных
контактов или к их чрезмерному развитию, соответственно. Соотношение
клеток - партнеров по слиянию определяется в зависимости от их размеров и
культурально-морфологических свойств.

В зависимости от адгезивной способности сливаемых клеток необходи-
мо определить способы и время культивирования клеток перед проведением
процедуры слияния. Если партнеры обладают высокой адгезивной способно-
стью, то их можно высевать совместно за несколько часов (6-24 час.) до слия-
ния. Для слияния клеток, обладающих высокой адгезивной способностью (на-
пример, клетки СПЭВ), с клетками, характеризующимися низкой адгезивной
способностью (например, лимфоциты лошади), необходимо высевать высоко-
адгезивные клетки за 18-24 час. до эксперимента, и на их субкофлюентный мо-
нослой наслаивать низкоадгезивные клетки. Через 1-4 час. после того, как низ-
коадгезивные клетки осядут на высокоадгезивные клетки и между ними образу-
ется физический контакт, клетки подвергают процедуре слияния.

Если оба партнера по слиянию являются низкоадгезивными (например,
суспензионные клетки), необходимо создавать условия, обеспечивающие их
сближение до или после обработки культур сливающими агентами. Для этого
суспензионные клетки (например, клетки плазмоцитомы и лимфоциты) совме-
стно высевают в чашки Петри с диаметром 40-60 мм в определенной концен-
трации, помещают в специальные держатели и центрифугируют в течение 3-10
мин. при 1000 об/мин. Клетки оседают, образуя между собой тесные контакты,
и после этого их подвергают воздействию сливающего агента.

Слияние суспензионных клеток можно проводить также после предвари-
тельной обработки суспензии клеток сливающим агентом с последующим цен-
трифугированием для обеспечения тесных контактов. В некоторых случаях для
сближения цитоплазматических мембран и их слипания используют раститель-
ные лектины фитогемагглютинин (ФГА) или конканавалин-А (Кон-А), полика-
тионы (полиаргинин) и другие неспецифические агенты агглютинации клеток.

15.2.2	Слияние мембран с помощью вируса Сендай

Вирус Сендай в отличие от других индукторов слияния цитоплазматиче-
ских мембран (ПЭГ, электрический пробой) является наиболее «природным», т.е.
не вызывает сильного повреждения обрабатываемых клеток. Однако использова-
ние вируса Сендай для слияния имеет определенные недостатки: а) ограниченный
спектр клеток, имеющих рецепторы к вирусу; б) внутриклеточные изменения,
возникающие в результате взаимодействия вируса и клетки; в) сложность стан-
дартизации препарата вируса и оптимизации условий слияния, что связано с от-
сутствием однозначной зависимости между концентрацией вируса, его гемагглю-
тинирующими свойствами и фузогенной активностью; г) трудоемкость приготов-
ления вирусных препаратов, пригодных для эффективного слияния клеток.

Вирус Сендай культивируется в различных клетках млекопитающих, од-
нако высокий его "урожай” можно получить на 7-9 - дневных куриных эмбрио-
нах. Этот объект является наиболее доступным и удобным для получения ви-
русных препаратов в больших количествах. Перед заражением куриные эм-
брионы овоскопируют для выбраковки яиц без зародышей и с геморрагически-
ми повреждениями. Для культивирования вируса используют яйца с хорошо
выраженной сетью кровеносных сосудов и подвижными зародышами. Скорлу-
пу над воздушной камерой обрабатывают 70% этанолом, обжигают над пламе-
нем и после этого производят прокол острием скальпеля или ножниц. Опти-
мальная концентрация вируса для заражения определяется в зависимости от
гемагглютинирующей и инфекционной активности исходного материала. Если
титр вируса в реакции гемагглютинации (РГА) составляет Ю " - 10'3, для зара-
жения эмбрионов его необходимо развести до 104 - 10’5 и лучше использовать
несколько разведений исходного вируссодержащего материала.

Заражение удобно осуществлять с помощью туберкулинового шприца или
пастеровской пипетки, вводя 0,1 -0,2 мл вируссодержащего материала в алланто-
исную полость на глубину 2-3 мм ниже границы воздушной камеры. Прокол в
скорлупе заливают расплавленным парафином. Эмбрионы инкубируют при 39°С
в течение 3-4 дней и перед вскрытием оставляют на ночь при 4°С для осаждения
эритроцитов. Вирус накапливается, в основном, в аллантоисной жидкости.
Вскрытие зараженных яиц производится с соблюдением правил асептики и анти-
септики. Аллантоисную жидкость отсасывают пастеровской пипеткой. От одного
эмбриона можно получить до 10-12 мл аллантоисной жидкости, которая не долж-
на содержать кровь и желток и должна опалесцировать. Аллантоисную жидкость
осветляют при 4000 g в течение 20 мин., после чего приступают к концентрирова-
нию вируса. Для этого аллантоисную жидкость центрифугируют в ультрацен-
трифуге при 60 000 g в течение 30 мин. Надосадок ресуспендируют в минималь-
ном объеме раствора Эрла, содержащего 1% бычьего сывороточного альбумина,
и еще раз осветляют при 4000 g в течение 20 мин., затем титруют в РГА.

РГА проводится в круглодонных лунках 96-луночных панелей. Разведе-
ние вируссодержащей жидкости можно провести в 2, 5, или 10 раз, при этом
необходимо учитывать, что объем жидкости в лунке должен составлять 50 мкл.
В контрольные лунки вносят физиологический раствор. После этого во все лун-
ки добавляют по 25 мкл 1% раствора куриных эритроцитов в физиологическом
растворе. Панели встряхивают и помещают в холодильник при 4°С. Через 40-60
мин. реакцию можно учитывать. При отсутствии агглютинации (отрицательный
результат) эритроциты оседают на дно лунки, образуя плотную «пуговку», то-
гда как при положительной реакции осадок эритроцитов имеет «размытый» вид
и покрывает все дно. За титр вируса в РГА принимают такую степень агглюти-
нации, при которой диаметр осадка эритроцитов составляет одну треть диамет-
ра лунки. Показателем гемагглютинирующей активности вируса Сендай явля-
ется гемагглютинирующая единица (ГАЕ) - количество вирионов, вызывающее
агглютинацию куриных эритроцитов, находящихся в 1 мл 1%-ой суспензии, что
соответствует приблизительно 4 107 вирусным частицам. В среднем, титр виру-
са в аллантоисной жидкости в РГА составляет 1500 - 2000 ГАЕ. Для инактива-
ции вируса Сендай можно использовать (3-пропиолактон или УФ-облучение.

Р-пропиолактон разбавляют до 10% деионизованной водой и доводят
до 2% с помощью бикарбонатно-солевого раствора (1,68 г NaHCO2 и 0,9 г
NaCl растворяют в 100 мл деионизованной воды, добавляют 20 мкл 1% рас-
твора фенолового красного). Вируссодержащую жидкость разбавляют в 10
тыс. раз раствором Р-пропиолактона, конечная концентрация (3-
пропиолактона должна составлять 0,05%. Суспензию встряхивают в течение
10 мин. при 4°С и инкубируют 2 час. при 37°С, затем в течение ночи осто-
рожно перемешивают при 4°С на шейкере или на роллерной установке.

Инактивацию вируса облучением проводят с помощью УФ-лампы в лами-
нарном боксе, куда помещают пластиковую чашку Петри диаметром 40 мм и рас-
пределяют по ее дну 1 мл вирусной суспензии. Чашку помещают под лампу на рас-
стоянии 15 см и облучают в течение 5 мин. при помешивании. После инактивации
вируса необходимо проверить отсутствие инфекционной активности путем зараже-
ния куриных эмбрионов (как описано выше). Инактивированный вирус в куриных
эмбрионах не размножается, и соответственно РГА должна быть отрицательной.

Инактивированный вирус разливают по 0,5-1,0 мл в ампулы и быстро за-
мораживают в смеси сухого льда и 96% этанола, хранят при -70°С. Для слияния
клеток используется вирус Сендай с титром 1000-2000 ГАЕ, что составляет около
300-400 вирионов на клетку. Так как вирус Сендай является частым контам инан-
том клеточных культур и возбудителем парагриппа у лабораторных животных
(мышей, крыс, хомячков, хорьков и др.), работа с ним должна проводиться в спе-
цйальном вирусологическом боксе с соблюдением всех необходимых правил.

15.2.2.1.	Слияние клеток с помощью вируса Сендай в монослое

1	вариант. Наиболее эффективен для высоко адгезивных клеток.

а)	Клетки обоих партнеров по слиянию высевают совместно в оптималь-
ных концентрациях и соотношениях, определенных в предварительных опытах
(например, по 100 тыс. клеток в 1 мл при соотношении 1:1) в пенициллиновые
флаконы* с покровными стеклами и культивируют в течение 6-18 час.

* Здесь и далее: клетки можно выращивать в 24- или 12-луночных панелях.
При этом культивирование проводится в СО2-инкубаторе с 5-7% СО2.

б)	Клетки трижды промывают раствором Хэнкса и на них наслаивают
0,3 мл охлажденной вируссодержащей жидкости с титром 1000 ГАЕ, инку-
бируют 10 мин. при 4°С. Затем флаконы переносят в термостат и инкубиру-
ют при 37°С в течение 40 мин. Клетки отмывают от неадсорбированного
вируса, добавляют ростовую среду.

2	вариант. Более эффективен при слиянии низкоадгезивных клеток
или клеточных фрагментов (лимфоцитов, кариопластов, цитопластов, мик-
роклеток) с высокоадгезивными клетками:

а)	Высокоадгезивные клетки в определенной концентрации (например,
5 103 кл/мл) высевают в пенициллиновые флаконы с покровными стеклами и
культивируют в течение 18-24 час. до образования субконфлюентного монослоя.

б)	Затем клетки промывают раствором Хэнкса, добавляют 0,3 мл вируссо-
держащей жидкости с титром 2000-2500 ГАЕ и инкубируют в течение 10 мин.
при 4°С и еще 40 мин. при 37°С. После адсорбции вирусных частиц клетки про-
мывают и на них наслаивают низкоадгезивные клетки. Инкубируют в течение
1,5-2,0 час, затем осторожно отсасывают жидкость и добавляют ростовую среду.

15.2.2.2. Слияние клеток с помощью вируса Сендай в суспензии

а)	Клетки (или клеточные фрагменты) - партнеры по слиянию снима-
ют с субстрата, центрифугируют 10 мин. при 1000 об/мин., промывают рас-
твором Хэнкса, повторно центрифугируя.

б)	Клетки объединяют в 0,5 мл раствора Хэнкса (или в большем объ-
еме, если количество клеток превышает 5 млн.), помещают в силиконизиро-
ванную посуду, перемешивают, осторожно пипетируя, и добавляют 0,5 мл
вируссодержащей жидкости с титром 2000 ГАЕ. Суспензию инкубируют в
течение 30 мин. при 40С, добавляют 1 мл среды без сыворотки. Клетки пе-
реносят в термостат и инкубируют при 370С в течение 45-60 мин.

в)	Суспензии клеток разводят в 10 раз средой без сыворотки и цен-
трифугируют 10 мин. при 1000 об/мин. Осадок клеток ресуспендируют в
ростовой среде, и клетки высевают во флаконы или панели.

Через 16-20 час. можно оценивать эффективность гибридизации кле-
ток после слияния как в монослое, так и в суспензии. Для этого клетки на
покровных стеклах фиксируют 70% этанолом и окрашивают красителем
Гимза. Препараты заключают в канадский бальзам и анализируют под мик-
роскопом. Морфологический анализ клеток, подвергшихся процедуре слия-
ния, позволяет выявить двуядерные и многоядерные клетки и по их присут-
ствию и процентному содержанию судить о сливающей (фузогенной) актив-
ности использованного вирусного препарата.

15.2.3.	Слияние клеток с помощью полиэтиленгликоля (ПЭГ)

Широкая доступность ПЭГ с различной молекулярной массой (от 300
до 6000) и различной степенью чистоты, его высокая эффективность как
сливающего агента, а также возможность упростить, стандартизировать и
повысить надежность процедуры слияния убедительно продемонстрирова-
ли, что этот водорастворимый полимер является универсальным и чрезвы-
чайно удобным индуктором слияния.

Эффективность слияния клеток с помощью ПЭГ зависит от его концен-
трации, молекулярной массы, степени чистоты, времени обработки, температу-
ры и других факторов, связанных со спецификой изучаемых клеток. Используя
ПЭГ, следует иметь ввиду, что он может оказывать токсическое действие. В
связи с этим в ряде случаев целесообразно применять методы, позволяющие
снижать токсичность ПЭГ и повышать эффективность его действия. Так, вы-
полнение процедуры слияния в безкальциевой среде с последующей инкубаци-
ей клеток в среде, не содержащей Са++, существенно снижает токсический эф-
фект ПЭГ. Известно также, что ДМСО в концентрации до 16% заметно снижает
токсичность ПЭГ и повышает выход гибридных клонов. Указанные методиче-
ские приемы оказывают положительный эффект при слиянии одних клеток и не
влияют на выход гибридных клонов - в других. Поэтому для каждой пары сли-
ваемых клеток необходимо подбирать оптимальные условия слияния: молеку-
лярную массу и концентрацию ПЭГ, продолжительность и способ обработки
клеток, соотношение клеток-партнеров по слиянию.

Для слияния с помощью ПЭГ используются два основных способа - в
монослое и в суспензии.

15.2.3.1.	Слияние клеток с помощью ПЭГ в монослое

Выбор методики слияния клеток зависит от адгезивной способности
клеток-партнеров.

1	вариант. Слияние высокоадгезивных клеток.

а)	Суспензии клеток обоих партнеров объединяют и высевают в пе-
нициллиновые флаконы с покровными стеклами в определенной концентра-
ции (например, по 105 клеток каждой линии в 1мл).

б)	Через 24 час. клетки просматривают под микроскопом и при образова-
нии субконфлюентного монослоя трижды отмывают от сыворотки раствором
Хэнкса. Во флаконы вносят 0,3-0,5 мл 50% раствора ПЭГ, нагретого до З/С,
встряхивают в течение 1 мин. Затем в течение 2-3 мин. постепенно добавляют 10
мл теплой (37°С) среды без сыворотки при непрерывном покачивании флакона.
Оставляют флаконы на 3-10 мин. при 37°С. После этого среду, содержащую ПЭГ,
удаляют, клетки трижды отмывают раствором Хэнкса. Во флаконы вносят росто-
вую среду, содержащую 3-5% сыворотки и культивируют в течение 24 час. Затем
производят смену среды на свежую, содержащую 10-15% сыворотки.

2	вариант. Слияние высокоадгезивных клеток, растущих в монослое,
с низкоадгезивными клетками, не прикрепляющимися к субстрату.
а)	Высокоадгезивные клетки высевают во флаконы в соответствую-
щих концентрациях (например, 105 кл/мл) и культивируют в течение 20-24
час. до достижения субконфлюэнтного монослоя;

б)	Затем трижды отмывают раствором Хенкса. На клетки, растущие в
монослое, наслаивают низкоадгезивные клетки (например, лимфоциты) и
инкубируют при 37°С в течение 1-1,5 час.;

в)	Культуральную жидкость сливают и дважды осторожно промывают
клетки раствором Хенкса. Затем во флакон вносят 0,3-0,5 мл 50% раствора ПЭГ,
встряхивают в течение 1 мин. В течение следующих 2-3 мин. во флакон вносят
10 мл теплой среды без сыворотки и инкубируют 3-10 мин. при 37°С;

г)	Клетки трижды отмывают, во флаконы вносят среду, содержащую
3% сыворотки. На следующий день среду заменяют на свежую, содержа-
щую 10-15% сыворотки.

15.2.3.2.	Слияние клеток в суспензии

а)	Клетки обоих партнеров по слиянию смешивают, предварительно опре-
делив их оптимальное соотношение, и совместно центрифугируют при 1000
об/мин. в течение 10 мин. Надосадочную жидкость отсасывают, оставляя не более
50 мкл, осадок разбивают поколачиванием по дну центрифужного стакана;

б)	К осадку медленно (в течение 1 мин.), покачивая центрифужный
стакан, добавляют 1 мл 50% раствора ПЭГ. Далее, в течение 5 мин. во фла-
кон вносят 10 мл теплой (37° С) среды без сыворотки. Затем центрифугиру-
ют клетки при 1000 об/мин.;

в)	Надосадок удаляют, клетки ресуспендируют в ростовой среде и
высевают в пеницилиновые флаконы с покровными стеклами.

15.2.4.	Методы электрослияния клеточных мембран

Методы электрослияния клеточных мембран различаются в зависимости от
типа импульсов* и характера создаваемого электрического поля. Электрическое
поле может быть неоднородно или однородно переменным, импульсы - прямо-
угольными или экспоненциальными. В качестве источника электричества для про-
боя клеточных мембран применяют генератор импульсов высокого напряжения.
Электрическое поле создается в специальных ячейках или в чашках Петри. Элек-
троды изготавливаются из пластин никеля или нержавеющей стали. Амплитуда
импульсов измеряется вольтметром, форма импульсов контролируется с помощью
осциллографа. Длительность и напряжение импульсов подбирают путем регули-
рования расстояния между электродами, а также путем изменения ионной силы
раствора, в котором находятся клетки. Установка для электрослияния включает
генератор, прибор для формирования импульсов, а также ячейки для помещения
клеток. В настоящее время ряд зарубежных фирм производят коммерческие при-
боры для генной и клеточной инженерии, в том числе установки для электрослия-
ния (электропробоя) мембран клеток и для инъекции в клетки высокомолекуляр-
ных соединений (ДНК, РНК, полипептидов, ферментов, антител).

15.2.4.	1.Электрослияние клеток в суспензии.

Для того, чтобы произошло слияние клеточных мембран в электриче-
ском поле, необходимо привести их в тесный физический контакт. Плотное
сближение мембран сливаемых клеток или их фрагментов можно осуществить
двумя путями. Первый - диэлектрофорез, основанный на способности клеток
образовывать контакты в области максимальной напряженности поля в среде с
низкой ионной силой под воздействием переменного тока. При этом клетки
втягиваются в участки максимальной напряженности электрического поля и
образуют цепочки с плотными контактами мембран. В этот момент необходимо
приложить импульс высокой амплитуды, который индуцирует слияние мем-
бран в местах клеточных контактов. Все этапы эксперимента (диэлектрофорез,
слияние мембран) можно контролировать под микроскопом. Для слияния мож-
но использовать небольшое количество клеток (несколько тысяч) в маленьком
объеме суспензии (50-100 мкл). Для обработки большого числа клеток (3-5 млн.
в 1 мл) диэлектрофорез необходимо осуществлять в однородном электрическом
поле, а затем использовать импульсы высокой амплитуды. Существуют ячейки
различной конструкции: микроячейки, помещаемые на предметное стекло (что
позволяет наблюдать процесс слияния), и макроячейки, предназначенные для
обработки больших объемов суспензии (0,5-1,0 мл).

Последовательность процедур при электрослиянии клеток.

а)	Клетки-партнеры по слиянию снимают с субстрата, перемешивают
в определенном соотношении в зависимости от их свойств, промывают цен-
трифугированием .

б)	Клетки ресуспендируют в среде с низкой ионной силой (0,28 М ино-
зит, 10’3 М фосфатный буфер, 5 Iff4 М Mg(CH3COO)2,104 М Са(СН3СОО)2. Для
этого можно использовать 10’3 М фосфатный буфер (К2НРО4/КН2РО4) с добав-
лением 0,25 М инозита, 5 10"4 М соли магния Mg(CH3COO)2 и 104 М уксусно-
кислого кальция Са(СН3СОО)2 или 0,3 М раствор сахарозы.

в)	Клеточную суспензию переносят в ячейку и создают неоднородное
переменное электрическое поле (для обработки небольшого количества кле-
ток) или однородное переменное электрическое поле (для обработки боль-
шого количества клеток) с амплитудой 0,2-1,2 кВ/см и частотой 0,5-2,0 мГц.
Диэлектрофорез проводят в течение 0,5-5,0 мин., за этот период между элек-
тродами формируются цепочки клеток.

г)	В ходе диэлектрофореза клетки обрабатывают несколькими после-
довательными импульсами с амплитудой 2,5-5,0 кВ/см в течение 5-50 мкс.
После этого переменное поле не отключают еще в течение 1,0-1,5 мин. для
поддержания целостности цепочек.

д)	Через 2-5 мин. после отключения переменного тока в ячейку добавля-
ют 100-500 мкл изотонического буфера следующего состава: 0,132 М NaCl, 810'
3 М КС1, 0,01 М фосфатный буфер (Na2HPO4/NaH2PO4), 5 104 М Mg(CH3COO)2
и 104 М Са(СН3СОО)2. Клетки инкубируют 20-30 мин. при 37°С, после чего
ресуспендируют в ростовой среде для дальнейшего культивирования.

Второй способ приведения в тесный контакт клеток, подвергаемых элек-
трическому пробою, осуществляется путем центрифугирования суспензии кле-
ток. Учитывая размеры клеток и площадь ячейки, необходимо подбирать опти-
мальные концентрации клеток так, чтобы после центрифугирования не образо-
вывались многослойные конгломераты клеток. Идеальным результатом цен-
трифугирования является образование двуслойного плотного осадка клеток,
который затем подвергается воздействию электрического импульса. Конструк-
ция ячеек при этом способе существенно отличается от таковой, используемой
для диэлектрофореза. Основное требование к ячейкам в этом случае состоит в
том, что они должны помещаться в центрифужный стакан.

Последовательность процедур, выполняемых при элсктрослиянии:

а)	Клетки отмывают в изотоническом буфере и помещают в ячейки
для центрифугирования.

б)	Клетки центрифугируют в течение 10 мин. при 200 g, после чего
подают 1-3 импульса с амплитудой 2,5-5,0 кВ/см в течение 5-100 мкс.

в)	Клетки инкубируют 10-50 мин. при 37°С, затем на клетки осторожно на-
слаивают изотонический раствор и далее инкубируют еще 10 мин. Затем клетки
осторожно ресуспендируют в ростовой среде для дальнейшего культивирования.

15.2.4.2. Электрослияние клеток в монослое.

Высокоадгезивные клетки, прикрепляясь к субстрату, образуют межкле-
точные контакты. В результате обработки монослоя электрическим разрядом,
происходит слияние их мембран. Наслаивание низкоадгезивных клеток или их
фрагментов на монослой высокоадгезивных клеток в присутствии неспецифиче-
ских агглютиногенов (ФГА, Кон А) создает возможность слияния мембран в
электрическом поле. Таким образом, в монослос можно сливать как высокоадгс-
зивныс клетки между собой, так и высокоадгезивные клетки с низкоадгезивными
Последовательность процедур электрослияния приводится ниже.

а)	Клетки обоих высокоадгезивных партнеров по слиянию высевают
совместно за день до эксперимента в чашки Петри в предварительно опре-
деленных соотношениях (например, 1:1 или 1:2);

б)	На следующий день ростовая среда заменяется на буфер низкой
ионной силы или на 50% раствор 0,3 М сахарозы в растворе Хэнкса;

в)	На монослой клеток помещают два электрода на соответствующем
расстоянии (4-10 мм) друг от друга. Клетки обрабатывают 1-5 импульсами с
амплитудой 1,5-5,0 кВ/см в течение 30-100 сек. Чашки инкубируют при 37°С
в течение 10-20 мин., после чего клетки промывают раствором Хэнкса и за-
ливают ростовой средой;

г)	При слиянии высокоадгезивных клеток с низкоадгезивными (на-
пример, клетки СПЭВ с лимфоцитами лошади) высокоадгезивные клетки
высевают за день до эксперимента в такой концентрации, чтобы на следую-
щий день клетки образовали 40-50% монослой;

д)	Клетки промывают раствором Хэнкса и на них наслаивают низко-
адгезивные клетки в среде без сыворотки и добавляют агглютиноген (на-
пример, 5-30 мкг/мл ФГА). Через 10-30 мин. среду осторожно удаляют и в
чашки заливают буфер низкой ионной силы. Электрообработку проводят
как описано в п. «в». Клетки инкубируют в течение 10-20 мин. при 37°С,
затем буфер удаляют и заливают ростовую среду.

Параметры элсктрообработки клеток (напряжение, характер и длитель-
ность импульсов) для различных клеток могут варьировать в широких пределах.
Ионная сила буфера, используемого в процессе элсктрообработки, сильно влияет
на эффективность слияния мембран и на жизнеспособность образовавшихся гиб-
ридных клеток. Из этого следует, что для каждого конкретного типа клеток необ-
ходимо определять оптимальные условия электрообработки. Об эффективности
электрослияния судят по числу образовавшихся двуядерных или многоядерных
гетерокарионов. Увеличение числа гетерокарионов при снижении гибели слив-
шихся клеток свидетельствует о правильном подборе условий слияния.

15.2.5.	Оценка эффективности слияния клеток

Качественная и количественная оценки слияния клеточных мембран
различных культур необходимы для выбора наиболее эффективного индук-
тора слияния. Тщательный анализ эффективности слияния клеток или кле-
точных фрагментов является первым и важным этапом экспериментов по
гибридизации и реконструкции клеток.

Прижизненная оценка эффективности слияния клеточных мембран
может проводиться следующим образом:

а)	Клетки после слияния высевают в пенициллиновые флаконы (или 24-
луночные панели, или чашки Петри) с покровными стеклами. Через 6-12 час. по-
сле слияния клетки инкубируют в среде без сыворотки, содержащей флюорохром
акридиновый оранжевый (АО) в концентрации 2 10'5 М в течение 5 мин. при 37°С;

б)	После окраски клетки отмывают раствором Хэнкса, и стекла с клетка-
ми, не подсушивая, помещают на предметное стекло клетками вниз, следя за
тем, чтобы между покровным и предметным стеклами был слой жидкости;

в)	Окрашенные клетки просматривают с помощью люминесцентного
микроскопа при возбуждении флюоресценции синим светом. В живых клет-
ках АО аккумулируется в лизосомах и флюоресцирует в виде мелких крас-
ных гранул в цитоплазме. Слившиеся клетки имеют 2, 3 или более ядер,
имеющих бледнозеленую окраску. Этот метод позволяет оценить не только
эффективность слияния, но и жизнеспособность слившихся клеток.

Оценку эффективности слияния можно проводить также на фиксиро-
ванных препаратах. Для этого:

а)	Клетки высевают во флаконы с покровными стеклами. Через 6-12 час.
клетки отмывают от сыворотки и фиксируют 70% этанолом (или раствором Бу-
эна, или смесью (1:1) абсолютного ацетона и абсолютного этанола. Окрашивают
быстрым гематоксилином по Майеру (или по Романовскому, или АО при pH 4,4).
Заключают в бальзам или в нефлюоресцирующую среду для заключения;

б)	Препараты изучают с помощью светооптического или флюоресцент-
ного микроскопов. Анализ окрашенных препаратов позволяет провести количе-
ственную оценку эффективности слияния за исключением тех случаев, когда
клетки-партнеры не отличаются по размеру и морфологии ядер. В последнем
случае морфологический анализ популяции клеток, образовавшихся в результа-
те слияния, не позволяет отличить гетерокарионы от гомокарионов и следует
использовать другие, например, иммунохимические подходы.

Количественная оценка частоты слияния (в %) осуществляется путем
подсчета индекса слияния (ИС) по формуле:

ИС = (А1/В1 - А2/В2) 100,

где А1 - число ядер в поликарионах в экспериментальной популяции,
А2 - число ядер в поликарионах в исходной популяции, В1 - число ядер во
всех клетках в экспериментальной популяции и В2 число ядер во всех
клетках в исходной популяции.
15.2.6.	Селекция гибридных и реконструированных клеток

В популяции клеток, образующейся в результате слияния цитоплазматиче-
ских мембран, присутствуют клетки нескольких субпопуляций. Так, после слия-
ния целых клеток популяция состоит из неслившихся клеток обеих родительских
линий, гетерокарионов, гомокарионов и гибридных клеток. В результате слияния
кариопластов и цитопластов в популяции можно обнаружить не слившиеся кле-
точные фрагменты, слившиеся кариопласты, слившиеся цитопласты и реконст-
руированные клетки. Для отбора гибридных и реконструированных клеток пред-
ложены селективные и неселективные системы. Наибольшее распространение в
настоящее время получили селективные системы, главным образом - селективная
среда ГАТ и ее модификации. Ограничение этой системы состоит в необходимо-
сти использования клеток, имеющих генетические дефекты (см. 15.1.). Этого не-
достатка лишены селективные системы, позволяющие использовать клетки, не
несущие генетических дефектов. В этих системах используют метаболические
ингибиторы (например, иодацетат и диэтилпирокарбонат), токсины и антитела к
ним, инфекционный вирус и интерферон. Отбор гибридных клеток в таких сис-
темах основан на принципе «спасения» отравленных или зараженных клеток в
результате гибридизации с интактными здоровыми клетками.

Существуют неселекгивные методы отбора гибридных и реконструиро-
ванных клеток. В таких случаях используются отличительные признаки роди-
тельских клеток: температурозависимость, способность расти в суспензии, на-
личие стабильных легко узнаваемых фенотипических свойств (например, мор-
фология ядра и цитоплазмы) или генетических признаков (например, продукция
специфичного для данных клеток белка). Для селекции гибридных клеток при-
меняют также маркирование клеток или клеточных фрагментов перед слияни-
ем. Для этих целей используют флюорохромы, пластиковые или магнитные
шарики разного размера, радиоактивные изотопы. Последующий отбор произ-
водится с помощью специальных приборов - сортировщиков клеток по флюо-
ресценции, или с помощью магнитов. Пластиковые шарики и изотопная метка
хорошо видны под микроскопом внутри поглотивших их клеток.

15.2.6.1.	Методы отбора гибридных клеток с помощью селектив-
ной системы ГАТ.

Создание системы ГАТ привело к значительному прогрессу в реше-
нии вопроса о выделении гибридных клеток после слияния. Эта система,
подробно описанная в главе 15.1, удобна в работе, и ее применение позволя-
ет избирательно выживать только гибридным клеткам, которые в результате
комплементации содержат активно функционирующие гены обеих роди-
тельских клеток (ТК и ГФРТ).

Помимо селективной системы была разработана также полуселсктивная
система. Ее отличие от системы ГАТ состоит в том, что генетически маркирован-
ным может быть только одна из родительских клеток-партнеров по слиянию. Это
возможно в тех случаях, когда другой партнер представлен неразмножающимися
клетками (например, эритроцитами, лимфоцитами, нервными клетками) или
клетками с ограниченной продолжительностью жизни (например, диплоидными
фибробластами человека). В среде ГАТ мутантные родительские клетки нс вы-
живают из-за отсутствия фермента ТК или ГФРТ, клетки второго родителя поги-
бают из-за отсутствия способности к длительному размножению in vitro, тогда
как гибридные клетки выживают и дают начало гибридным клонам.

Для отбора гибридных клеток помимо собственно селективной среды
ГАТ используют различные ее модификации. Три из них, наиболее распро-
страненные, описаны ниже.

1.	Среда ГАТ- уабаин (ГАТ-У).

Эта среда позволяет проводить селекцию гибридов, полученных пу-
тем слияния родительских клеток, одна из которых имеет двойное маркиро-
вание (дефектность по ТК или ГФРТ и устойчивость к уабаину), тогда как
вторая может не содержать генетического дефекта. Гибридные клетки в
этом случае проявляют промежуточную устойчивость к уабаину, достаточ-
ную для выживания в селективной среде ГАТ-У. Маркированные родитель-
ские клетки не выживают из-за отсутствия фермента (ТК или ГФРТ), немар-
кированные родительские клетки погибают под действием уабаина.

2.	Среда ГАМ (гипоксантин, аминоптерин, 5-метилдезоксицитидин).

Среда используется для отбора гибридов при условии, что одна из
родительских клеток дефекта по ферменту дезоксицитидиндезаминазе
(ДЦД). ДЦД-дефектные клетки погибают от тимидинового голодания (из-за
неспособности синтезировать тимидин из 5-метилдезоксицитидина) при
блокировке эндогенного синтеза пиримидинов аминоптерином. Концентра-
ция компонентов в среде ГАМ следующая: 0,1 мкМ гипоксантина, 1 мкМ
аминоптерина, 48 мкМ 5-метилдезоксицитидина.

3.	Среда ГАМА (гуанин, аденин, микофеноловая кислота, азасерин).

Гибридные клетки, полученные путем слияния клеточных линий, де-
фектных по ГФРТ и АФРТ, можно отбирать в среде ГАМА. Родительские
клетки погибают из-за аденинового и гуанинового голодания при блокиров-
ке их биосинтетического пути азосерином и микофеноловой кислотой, а
гибридные клетки выживают, так как содержат функционально активные
ферменты ГФРТ и АФРТ. Среда ГАМА содержит 0,2 мМ гуанина, 0,1 мМ
аденина, 6 мкМ микофеноловой кислоты и 10 мкМ азасерина.

15.2.6.2.	Получение гибридных клеток сельскохозяйственных жи-
вотных.

Приготовление растворов.

1	.Приготовление раствора ПЭГ:

а)	взвешивают 1 г ПЭГ (М.м. 1000 - 4000), помещают в пробирку, за-
крывают ватно-марлевой пробкой;

б)	стерилизуют автоклавированием при 0,6 атм. 30 мин.;

в)	охлаждают до 50°С и добавляют 1 мл стерильного раствора Хэнкса
или среды без сыворотки.

Можно использовать готовые растворы ПЭГ, продаваемые рядом за-
рубежных фирм.

2	.Приготовление 100-кратных концентратов компонентов среды ГАТ
описано выше. Перед началом опыта или при его проведении готовят среду
ГАТ в рабочем разведении, добавляя отдельные компоненты в ростовую
среду. В настоящее время готовые концентраты среды ГАТ можно приобре-
сти в ряде зарубежных фирм.
3	.Получение межвидовых гибридных клеток свиньи и крупного рога-
того скота.

В качестве родительских клеток были использованы клетки почки
эмбриона свиньи, дефектные по ТК (СПЭВ-ТК-), клетки трахеи эмбриона
коровы (дефектные по ГФРТ ТР-ГФРТ-) и лимфоциты свиньи, коровы. Про-
токол опыта приводится ниже:

а)	Клетки мутантных родительских линий и лимфоцитов высевают в
чашки Петри диаметром 60 мм в соотношении 1:1 в концентрации 105 кл/мл
в среде Игла МЕМ с 10% сыворотки эмбриона коровы;

б)	Через 24 час. клетки просматривают под микроскопом и при обра-
зовании субконфлюентного монослоя трижды отмывают от сыворотки. В
чашки вносят 2 мл 50% раствора ПЭГ, нагретого до 37°С, в течение 1 мин.
Затем медленно добавляют 10 мл теплой (37°С) среды Игла без сыворотки,
все время покачивая чашки. Оставляют чашки при 37°С на 3-5 мин., после
чего сливают среду, содержащую ПЭГ, и трижды отмывают клетки. В чаш-
ки вносят свежую среду Игла МЕМ, содержащую 5% сыворотки эмбриона
коровы. Чашки инкубируют в СОг-инкубаторе с 5% СО2 при 3 7°С;

в)	Через 16-24 час. культивирования клетки снимают с субстрата дис-
пергирующим раствором (смесью 0,25% трипсина и 0,02% версена в соот-
ношении 1:7) и высевают в чашки Петри диаметром 100 мм в концентрации
103	104 кл/мл в среду ГАТ. Каждые 3-4 дня клетки просматривают под

микроскопом и проводят смену среды ГАТ. На 14-21 день культивирования
можно наблюдать появление колоний гибридных клеток. Для выделения
моноклонов гибридные клетки клонируют с помощью цилиндров для кло-
нирования. Клоны гибридных клеток пассируют 2-3 раза на среде, содержа-
щей гипоксантин и тимидин и не содержащей аминоптерина (среда ГТ).

4	. Получение межвидовых гибридных клеток свиньи и лошади.

В качестве родительских клеток использовали клетки свиньи СПЭВ-
ТК‘ и лимфоциты лошади. Протокол опыта приведен ниже:

а)	Клетки СПЭВ-ТК’ высевают в чашки Петри диаметром 60 мм в кон-
центрации 1-2105 кл/мл в среде Игла МЕМ с 10% сыворотки эмбриона коровы;

б)	Через 24 часа клетки просматривают под микроскопом и при обра-
зовании редкого монослоя (30-50%) трижды отмывают раствором Хэнкса.
На клетки СПЭВ-ТК' наслаивают лимфоциты лошади в концентрации 5 106 -
2 107 кл/мл. Чашки с клетками помещают на 1,0-1,5 час. в СС^-инкубатор;

в)	Культуральную жидкость сливают и клетки дважды осторожно
промывают раствором Хэнкса. Затем в чашки вносят 2 мл 50% раствора
ПЭГ и встряхивают в течение 1 мин. В течение следующих 2-3 мин. в чашки
вносят теплую среду Игла МЕМ, после чего клетки трижды отмывают от
ПЭГ. В чашки вносят среду Игла МЕМ, содержащую 5-7% сыворотки плода
коровы и инкубируют в СО2-инкубаторе с 5% СО2 при 37°С;

г)	Через 16-24 час клетки снимают и высевают в концентрации 1-3-
104 кл/мл в среду ГАТ. Каждые 3-4 дня проводят смену среды ГАТ. На 10-14
сутки наблюдают образовавшиеся колонии гибридных клеток. Клетки кло-
нируют как описано в п.З в. На рис. 65.1. показаны гибридные культуры
клеток с лимфоцитами лошади.
С помощью методов, подробно описанных выше, нами были получе-
ны серии межвидовых и внутривидовых гибридных клеточных линий сель-
скохозяйственных животных и изучена их чувствительность к некоторым
вирусам (Л.П.Дьяконов, А.А.Кущ., Ш.М.Тугизов., Е.В.Майджи). Показано,
что гибридные клетки, полученные путем слияния клеток почки эмбриона
свиньи и лимфоцитов лошади, проявляют высокую чувствительность к ви-
русу герпеса лошадей 1 типа. Эти же гибриды оказались чувствительными к
реовирусу и вирусу герпеса лошадей 3 типа, тогда как исходные родитель-
ские клетки свиньи не обеспечивали репликацию этих вирусов. Это свиде-
тельствует об экспрессии в гибридной клетке генов лошади, клетки которой
чувствительны к реовирусу и вирусу герпеса лошадей.

Было установлено, что гибридные клетки, полученные путем слияния
клеток СПЭВ-ТК с лимфоцитами крупного рогатого скота, инфицированными
вирусом бычьего лейкоза, продуцировали антигены р24 и gp 69 этого вируса.

Цитоморфологический анализ гибридных клонов, полученных путем
слияния клеток СПЭВ-ТК и лимфоцитов сельскохозяйственных животных
(лошади, крупного рогатого скота и свиньи) показал, что гибридные популяции
были представлены двумя субпопуляциями клеток, одна из которых напомина-
ла эпителиоподобные клетки и высокоадгезивными свойствами, тогда как дру-
гая напоминала лимфоидные клетки, растущие в суспензии (Рис.65.1, 65.2.,
65.3.). С помощью метода иммуно-флюоресценции в гибридных клетках была
обнаружена экспрессия генов иммуноглобулинов соответствующих животных.

Внутривидовые гибридные клетки, подученные путем слияния клеток
СПЭВ ТК' с лимфоцитами свиньи, сохраняют как и исходный мутантный парт-
нер высокую чувствительность к вирусу трансмиссивного гастроэнтерита сви-
ней. Поскольку лимфоциты свиньи являются хорошими продуцентами интер-
ферона, гибриды были исследованы на способность к вирус-индуцированному
интерфероногенезу. Титр интерферона, продуцируемого гибридными клетками
и и тестированного на диплоидных фибробластах человека М-19, достигает
значений 256-1024 ед/мл, тогда как клетками СПЭВ ТК’ 64-128 ед/мл
(Д.Н.Дудар,1990). Эти же гибридные клетки оказались чувствительными к ви-
русу классической чумы свиней с выраженным цитопатогенным действием
(Л.П.Дьяконов, Т.В.Гальбек, В.Н.Герасимов и др., 1993; Л.П.Дьяконов,
Н.Д.Скичко, Т.В.Гальбек, И.В.Щекалева и др., 1995), а также к вирусу энцефа-
ломиокардита свиней и вирусу ринопнемонии лошадей.

Накопление жизнеспособных клеток лимфоидного типа в суспензии созда-
ет перспективы разработки суспензионного метода культивирования этих клеток.

Для культивирования энтеропатогенных вирусов свиней и крупного ро-
гатого скота получены гибридные клетки СПЭВ ТК' с клетками кишечника эм-
бриона свиней и СПЭВ ТК' уабаиноустойчивые с клетками эмбриона коровы.

Для изучения респираторных вирусных инфекций крупного рогатого ско-
та получены межмутантные гибриды клеток СПЭВ ТК- и ТР ГФРТ- (Рис. 66).

Поскольку исследователей интересуют стабильные гибридные клоны,
обладащие определенными маркерными свойствами, предложен метод количе-
ственного хромосомного анализа сублиний гибридных клеток с целью опреде-
ления стабильности проявления их свойств (Сельхозбиология, № 6, 1990).
Гибридные культуры с лимфоцитами животных не туморогенны, облада-
ют интерфероногенностыо. Отселекционированы популяции клеток, стабильные
по культурально-морфологическим, кариологическим и другим характеристикам;
они перспективны для научных исследований и биофабричного производства
вирус-вакцин и физиологически активных веществ (интерферонов, интерлейки-
нов). Подучена гибридная культура с лимфоцитами от больной лейкозом коровы,
которая продуцировала вирус лейкоза in vitro. Культуры клеток депонированы в
криобанке Российской коллекции клеточных культур (СХЖ РАСХН) в ВИЭВ и
могут быть переданы заинтересованным организациям, а также специалистам.

Использование гибридных культур в биотехнологии позволит осуще-
ствлять эффективное биопроизводство вирусных антигенов и физиологиче-
ски активных веществ.

Одним из условий успешного использования гибридных культур клеток
в биотехнологии является их "чистота” - отсутствие контаминации латентными
вирусами, микоплазмами. Поскольку микоплазмы убиквитарны, то практически
все постоянные линии клеток животных контаминированы этим микроорганиз-
мом. Известны трудности деконтаминации культур клеток от микоплазм, пред-
ложено много способов, которые не всегда эффективны.

Наличие мутантных культур, дефектных по ТК иди ГФРТ, позволило
разработать комплексный метод деконтаминации с применением 5-бром-2
дезоксиуридина, поверхностно активного вещества (ПАВ) - этония и анти-
биотиков. Показано, что эффективность слияния с лимфоцитами клеток
СПЭВ ТК-, деконтаминированных от микоплазм при гибридизации, в 1,5-
2,0 раза выше, чем в контроле. Это позволило успешно получать гибридные
культуры сельскохозяйственных животных, свободные от микоплазм.

После получения гибридов важно было создать криобанк гибридных куль-
тур. Отработан режим глубокого замораживания в жидком азоте (минус 196°С) и
установлено, что гибридные культуры в рекомендованных режимах хорошо со-
храняются в процессе замораживания, в период глубокого анабиоза и при размо-
раживании, а в дальнейшем активно растут, сохраняя биологические свойства.

Можно определить несколько перспективных направлений развития ис-
следований по гибридизации клеток сельскохозяйственных животных и получе-
нию клеточных систем для биотехнологии и ветеринарной медицины: создание
гибридов с макрофагами, гепатоцитами, нервными клетками, ядерными и неядер-
ными эритроцитами животных; гибридов-продуцентов вирусных антигенов, в
частности ретровирусов и других медленных и латентных вирусов; гибридов,
продуцирующих in vitro иммуноглобулины животных; изучение стабильности
генома гибридных культур и использование их для картирования генов в хромо-
сомах сельскохозяйственных животных, а также взаимодействия вируса с клет-
кой, цитопатологии и чувствительности гибридных культур к вирусам для широ-
кого их использования в вирусологии и производстве вирусных антигенов; разра-
ботка систем массового культивирования гибридных культур для биотехнологии.

Суммируя данные, приведенные выше, можно заключить, что метод
гибридизации соматических клеток позволяет создавать клеточные линии с
новыми генотипическими и фенотипическими свойствами, пригодные для
изучения широкого круга проблем клеточной биологии, вирусологии, им-
мунологии и патологии сельскохозяйственных животных.
15.3.	Гибридомы и моноклональные антитела в диагности-
ке инфекционных болезней и микоплазм животных.

Классический метод получения антител для клинических и диагностиче-
ских исследований заключается в повторных введениях животным специфиче-
ских антигенов: вирусов, бактерий, микоплазм и т.д. Когда количество специ-
фических антител в крови достигает высокого уровня, животных обескровли-
вают, антитела выделяют, концентрируют и используют для идентификации
возбудителя инфекции. Но такие антитела имеют ряд недостатков. Поэтому в
течение многих лет велись интенсивные поиски возможности получения высо-
коспецифических однородных (моноклональных) антител.

Теоретической основой для получения гибридом и моноклональных
антител послужила селекционно-клональная теория иммунитета Бернета
(1971), основанная на том, что все антитела, секретируемые одним лимфо-
цитом, обладает одним и тем же антигенсвязывающим участком.

В 1975 г. G.Kohler и C.Milstein впервые добились слияния (гибридизации)
короткоживущих лимфоцитов гипериммунизированных мышей, продуцирующих
антитела, с постоянно растущими клетками плазмоцитомы (миелома мыши).

Основные этапы работы по получению гибридом схематично можно
представить в виде схемы (Рис.67).

Рис. 67

Общая схема получения гибридом
по К.И.Галактионову, И.В.Фриндлянской, 1986.

Антиген

Животное

В-лимфоциты

(селезенка, лимфоузлы)

X
СЛИЯНИЕ
(ПЭГ, электрошок и др.)

Миелома

Гибридомы

Селекциянасреде ГАТ

Тестирование (ГОА, ИФА и др.)

Клонирование (2 -3 раза)

Криоконсервация

Культивирование

Массовое культивирование гиб-
ридом для получения

Культивирование в животных в виде
асцитных опухолей

большого кол-ва антител

Получение моноклональных антител в настоящее время является од-
ним из наиболее интенсивно разрабатываемых направлений биотехнологии.
Использование моноклональных антител позволило уже сейчас получить
новые данные об антигенном строении вирусов, бактерий, простейших, ан-
тигенных маркерах различных субпопуляций лимфоцитов, опухолевых тка-
ней (К.Masamichi et al, 1988; W.J.A.Boersma, 1988).

Гибридомную технологию для диагностики микоплазменных инфек-
ций разрабатывают в институте Цитологии РАН, г. Санкт-Петербург;
(Ф.М. Летучая, И.И.Фриндпянская и соавт.,1990); ВИЭВ, г.Москва
(И.Л.Куликова, Л.П.Дьяконов и соав. 1990); Научно-исследовательском ин-
ституте экспериментальной ветеринарии, г.Казань (Х.З.Гаффаров и соав.)

Для получения гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к
микоплазмам И.Л.Куликова., Т.А.Феоктистова и соав.(1989) использовали мы-
шей линии BALB/c в возрасте 1-4 месяца и мембранный антиген M.agrinini.

Перед введением брали 0,15 мл/50 мкг белка/ суспензии антигена, тща-
тельно смешивали с равным объемом неполного адъюванта Фрейнда и инокули-
ровали по 0,3 мл на мышь внутрибрюшинно, а через 14 дней проводили повтор-
ное введение антигена. Спустя еще 14 дней, определяли титр антител в ИФА по
отработанной методике и если он был ниже 1:800 -1:1000, то проводили дополни-
тельную иммунизацию. Мышам, у которых титр антител превышал указанные
показатели, вводили внутривенно антиген в дозе 0,15 мл (50 мкг белка) без адъю-
ванта за 3 дня до взятия материала (спленоцитов) для гибридизации.

Мышь убивали и в стерильных условиях извлекали селезенку, измельчали
в гомогенизаторе для получения суспензии клеток. Клетки промывали в ростовой
среде, а затем обрабатывали холодным раствором 0,83% NH4CI (для разрушения
эритроцитов) в течение 5 минут. Суспензию разводили средой (ДМЭМ) с 10%
фетальной сыворотки до объема 10 мл и центрифугировали при 1000 об/мин в
течение 10 минут. Осадок клеток ресуспендировали в среде без сыворотки.

В качестве другого партнера для слияния использовали клетки мие-
ломы мыши Sp2/0-Agl4. Клетки миеломы выращивали на среде ДМЭМ с
10% фетальной сыворотки, 1% глутамина и 100 ед/мл пенициллина.

Для гибридизации миеломные клетки брали в экспоненциальной фазе
роста, т.е. через 24 часа после очередного пересева. Питательную среду сли-
вали и заливали средой без сыворотки, осторожным встряхиванием снимали
клетки и центрифугировали 10 минут при 1000 об/мин.

Слияние клеток проводили по методике Р.ГКеннет (1983) с небольшими
модификациями. Лимфоциты селезенки и миеломные клетки смешивали в со-
отношении 9:1-5:1, центрифугировали 10 минут при 1000 об/мин при комнат-
ной температуре. Надосадочную жидкость отсасывали, оставляя 0,1 мл, в кото-
ром ресуспендировали клетки. Затем добавили 1 мл 50% раствора ПЭГ4000.

Клеточную суспензию с добавленным раствором ПЭГ инкубировали
1,5-2 минуты при комнатной температуре, центрифугировали при 1000
об/мин 2-3 мин. и отсасывали ПЭГ Затем медленно, по каплям, добавили
среду без сыворотки до 20 мл. Центрифугировали 10 мин. при 1000 об/мин,
надосадочную жидкость удаляли, клетки ресуспендировали в среде ГАТ и
разводили данной средой до конечной концентрации 1х106кл/мл.

Инкубацию клонов проводили в СО2-инкубаторе при 37°С в увлаж-
ненной атмосфере с 5% С02 в селективной среде.
Через 3 недели среду ГАТ заменяли на ГТ, а через месяц на обычную
среду для культивирования клеток.

Для дальнейшей работы отбирали клоны с наиболее высокими титра-
ми моноклональных антител в ИФА. Отбор положительных клонов прово-
дили методом предельного разведения на фидерном слое спленоцитов не
иммунных мышей линии BALB/C или меломной линии клеток Sp2/0-Agl4.

В результате проведенных исследований (И.Л.Куликова, Т.А.Феокгистова,
Л.П.Дьяконов и др., 1989) были отобраны два клона гибридом с наиболее высоким
титром антител (Рис.68). Клон А-1, продуцировал моноклональные антитела в
высоких титрах только к антигенам M.arginini (1:256 -1:512), не давая перекрест-
ных реакций с антигенами других видов микоплазм. Клон F-5, по-видимому, про-
дуцирует моноклональные антитела к общей белковой детерминанте, чем объяс-
няются перекрестные реакции к антигенам M.arginini, A.laidlawii, M.homims. При
этом титр моноклональных антител к антигену M.arginini был в пределах 1:16-
1:128, а к A.laidlawii и M.hominis 1:4-1:8.

Для определения принадлежности моноклональных антител к классам
иммунотобулинов проводили иммуноэлектрофорез. В лунки пластины с агаром
(диаметром 4 мм) вносили препарат моноклональных антител, полученный из
культуральной жидкости гибридом методом высаливания сульфатом аммония.

После проведения электофореза в канавки на пластинах вносили ан-
тисыворотку к глобулинам мыши. По форме и расположению линий преци-
питации определяли класс моноклональных антител.

Иммуноглобулины клона А-1 можно отнести к классу М, а иммуног-
лобулины клона F-5 к классу G.

Для получения препаративных количеств моноклональных антител
индуцируют образование опухолей у мышей линии BALB/c. Для получения
асцита мышам предварительно вводили внутриперитонеально 0,5 мл при-
стана, а через 10 -14 дней вводили гибридомные клетки (не менее 1х107
кл/мл). Образование асцита происходило в среднем за 10-16 суток. Количе-
ство асцитной жидкости колебалось от 4,0 до 5,0 мл. Титр антител, опреде-
ленный методом ИФА, в асците составлял 1,024 х 106 - 5,12 х 105, что в 500-
1000 раз превышало титр антител в культуральной жидкости.

Для диагностики микоплазма-контаминации непосредственно в культу-
ральной жидкости лучше использовать моноклональные антитела. При постанов-
ке ИФА использовали твердофазный сендвич-метод. На твердую фазу адсорби-
ровали антимикоплазменные антитела, после отмывания, для предотвращения
неспецифической адсорбции наносили на плашку 2% БСА (бычий сывороточный
альбумин) и инкубировали 1 час при 37°С. Отмывали фосфатным буфером (ФБ) с
0,05% Твин-20. Образцы культуральной жидкости в двукратных разведениях
вносили в лунки и инкубировали 18 часов при 4°С. После тщательного отмыва-
ния ФБ вносили коньюгат из моноклональных антител в рабочем разведении.
После двухчасовой инкубации при 37°С и отмывания добавляли субстратную
смесь (5-ацетилсалициловая кислота 0,08% и 0,005% Н2О2, pH 5,8).Через 30 мин.
учитывали реакцию по интенсивности окрашивания.
Для увеличения чувствительности метода в качестве подложки ис-
пользовали моноклональные антитела и гипериммунную сыворотку кроли-
ка, иммунизированного мембранным антигеном M.arginini.

Клеточные гибриды на основе клеток миеломы мышей и антитело-
продуцирующих спленоцитов мышей BALB/c широко используются для
получешая моноклональных антител к различным антигенам, включая виру-
сы, бактерии, паразиты, клетки крови, иммунологически активные белки.
Гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела заданной специ-
фичности, в настоящее время используются в различных областях ветерина-
рии и, прежде всего, в совершенствовании диагностики инфекционных бо-
лезней животных. Получение неограниченного количества стандартных,
высокоспецифических антител открывает возможности использования их в
качестве иммунодиагностических реагентов для индикации возбудителей
инфекционных болезней животных, в качестве средств иммунопрофилакти-
ки и иммунотерапии, оценки иммунного статуса организма животных.

Получены мышиные гибридомы, продуцирующие моноклональные анти-
тела к вирусам ящура, лейкоза, ринопневмонии лошадей, классической и афри-
канской чумы свиней, вирусу трансмиссивного гастроэнтерита свиней, ротавиру-
су крупного рогатого скота, бруцеллам, микобактериям, листериям, сальмонел-
лам, антигенам эхинококка, интерферонам, микоплазмам, иммуноглобулинам
отдельных классов, соматотропину крупного рогатого скота и другие. На их ос-
нове разработаны различные диагностические тест-системы, позволяющие осу-
ществлять индикацию и идентификацию вирусов, бактерий, микоплазм, парази-
тов, биологически активных веществ и иммунологически активных белков.

15.4.	Генетическая трансформация клеток животных

Минуло более 50 лет со времени первого экспериментального доказа-
тельства возможности трансформации бактериальной клетки с помоцью ДНК.
Первое успешное клонирование ДНК эукариотов в бактериальной клетке осуще-
ствлено немногим более 20 лет назад Morrow и др. Последующие годы могут
быть охарактеризованы как ’’годы молекулярно-генетической лихорадки”, по-
скольку число работ по генетической трансформации клеток, изучению функцио-
нирования встроенных генов постоянно возрастает. Инженерные работы с генами
эукариот позволили интенсивно развивать современную биотехнологию на осно-
ве использования рекомбинантных ДНК и клонированных генов.

Первые положительные результаты искусственной трансформации клеток
были получены при использовании вирусов, метафазных хромосом или изолиро-
ванной ДНК, однако они были нечеткими. Возможность участия в опытах реком-
бинантных ДНК с индивидуальным геном позволила решить многие проблемы,
связанные с введением чужеродных генов в геном клетки животных.

Перспективным оказалось использование вирусов (ретровирус, SV-
40, основакцины и др.) в качестве векторов для инфекции и интеграции чу-
жеродных генов в геном эукариот. При этом ретровирусы обеспечивали
наиболее стабильную интеграцию чужеродных генов в геном эукариот бла-
годаря особенностям взаимодействия с клеткой.
Компетентность зигот животных различных видов к восприятию чужеродных генов

Таблица 30

Аббревиатура генной конст- рукции	Название гена	Промотор, регулятор	Получено трансгенных животных, гол.	Автор, год публикации
Свиньи				
МТ-1/hGRF	Резилинг-фактор гормона роста человека	МТ-1	9	Брем с соавт., 1995
МТ-1/HbsAg	Поверхностный антиген вируса гепатита	МТ-1	2 (без наследования)	Шихов с соавт., 1987  Эрнст с соавт., 1995
МТ-1/bGH	Соматотропин крупного рогатого скота	МТ-1	2 (без наследования)	Эрнст с соавт, 1995
МТ-1/ASV-pv	Антисмысловая РНК (асРНК) к парвови- русу свиней	МТ-1	2(без наследования)	Эрнсте соавт., 1995
МТ-1/hGRF	Резилинг-фактор гормона роста человека	МТ-1	44	Медведев с соавт., 1995
Кролики				
МТ-1/bGH	Соматотропин крупного рогатого скота	МТ-1	4	Эрнст с соавт., 1995
МТ-1/hGftF	Резилинг-фактор гормона роста человека	МТ-1	1	
МТ-1/HBsAg	Ген вируса гепатита В	МТ-1	34 (5 потомков)	Эрнст с соавт., 1995
рМТ-1/blFNy	Ген бычьего у-интерферона	МТ-1	22 (51,2%)	Чистяков с соавт., 1995
pMT-1/hlFNpl	Ген pl- интерферона человека	МТ-1	3/10 бластоцисты кро- лика	Дагданова, 1993
МТ-1/hlFNPi	Ген pl- интерферона человека	МТ-1	8 (16%) (12 потомков- 24%0	Бондарчук, 1994
ТКВПГ-1/AGR BLV	асРНК к вирусу BLV	ТК простого герпеса	2 (40%0 (4 потомка-  6,3%)	Сураева, 1991
MT-hGH	Ген соматропина человека	МТ-1	3 (44%) кролик	Сураева, 1991
Плазмиды PG МА ppSV-neo	асРНК к аденовирусу человека	МТ-1	1/15-кролик, 2/20- кролик	Сураева, 1991
RSV/lacZ	Ген lacZ	Вирус саркомы Рауса	3/46-эмбриона кролика (потомство в FLF2.F3)	Гоголевский, 1992
pAGR	асРНК к вирусу BLV	Промотор ТК вируса герпеса типа I		Прокофьев с соавт., 1994
Рекомбинантный вариант ВОВ		Рекомбинантный вари- ант ВОВ	Продукция протеино- вых белков gp30 - gp51	Альнштейн с соавт., 1995
Протективный env-ген BLV	env BLV	Протективный env-ген BLV (конструкция К4 BLV, BLV-601		Иванова, 1996
Примечание. Мг	’-1 - металлотионеиновый промотор, BLV - вирус лейкоза крупного рогатого скота, ВОВ - вирус осповакцины			
Таблица 31

Компетентность культур клеток с/х животных к восприятию чужеродной генетической информации

Ген, генная конструкция	Культура клеток	Титр антигенов, экспрессия физиологически-активных веществ (ФАВ)
HBsAg	Почка трансгенного хряка	1,8
bGH	Легкое трансгенного кролика	7 нг/мл
Ген асРНК к вирусу BLV	Лимфоидная линия клеток RSV-asRl из крови трансгенного кролика	Интеграция гена асРНК против вируса BLV
Ген асРНК к парвовирусу свиней	Щитовидная железа свиньи (ЩС)	Снижение титра гемагглютинина от 1:1024 (контроль) до 1:128 (опыт)
МТ-1/ HbsAg, LTR RSV/ HBsAg	Мутантная культура-почка эмбриона свиньи (СПЭВ ТК)	Продукция поверхностного антигена HbsAg до титра 1:8- 1:512
МТ-1/ HbsAg, LTR RSV/ HbsAg (маркер- ный ген pSV-gpt)	Мутантная культура-трахея плода коровы (ТР ГФРТ)	1:4 - 1:8 - усиление продукции антигена до титра 1:32 - 1:64 под дейст-вием глюкокортикоидов (LRT RSV) и со- лей тяжелых металлов (МТ-1)
pSV2-neo	СПЭВ	Устойчивость к генетициду (G418)
pUC/hlNFoa	СПЭВ	Продукция lNFCi2 15 МЕ/мл
pSV2-neo/pABB	СПЭВ, ТР	Устойчивость к G418 и положительная ДНК-проба
pSV2-neo	СПЭВ, ТР	Устойчивость к G418 и положительная ДНК-проба
PUC-TK^hlNFcefMT-l и RSV-промоторы)	СПЭВ ТК	Продукция INFce до 30 МЕ/мл
pSV2-neo/pAGOTK+	СПЭВ ТК	Устойчивость к G418
pSMV/lacZ	СПЭВ, ТР	Положительная окраска на (3-галактозидазу
pSV2/lacZ	СПЭВ, ТР	Положительная окраска на р-галактозидазу
pRC/CMV-US9 (селективный ген neo)	Почка собаки (МДСК)	Выявление мембранного белка HMB-US9
LTR RSV/HbsAg	Клетки почки сурка	Продукция антигена (титр 1:4 - 1:8)
MT-l/HbsAg, pSV2-neo, pSV2-gpt, (pM12 вируса бычьей папилломы)	Почка теленка (ПТ-80)	Положительная проба
Рекомбинантный вариант ВОВ- протективный ген env BLV	Клетки зеленой мартышки (CV-1)	Продукция протеиновых белков gp 30 - gp 51
pSV2-gpt	ТР ГФРТ	
pFF	СПЭВ ТК'	
pRPAS с геном S ВГБ, pFF с геном tk ВПГ 1 человека (LTR RSV-промотор)	СПЭВ ТК	Продукция HbsAg (титр 1:4 - 1:512)
HbsAg (Mt-1 мыши-промотор)	СПЭВ ТК	1:8-1:256
Известно большое число систем клонирования чужеродных генов в
составе генома ретровирусов и показана не только эффективная и устойчи-
вая интеграция генов в культурах клеток животных, но и их стабильная экс-
прессия (Seliger et al, 1986; Wagner et al, 1985).

Для инфекционной патологии важны исследования, связанные с получе-
нием животных, устойчивых к определенным заболеваниям, в геном которых
встроены гены асРНК, блокирующие развитие соответствующих вирусов.

Эмпирические данные указывают на способность клеток млеко-
питающих к восприятию чужеродных вирусных нуклеиновых кислот (ДНК
и РНК) и их репродукции в культурах клеток. Эти результаты как бы предо-
пределили возможность искусственной интеграции чужеродной генетиче-
ской информации, в частности рекомбинантных ДНК, в геном клетки раз-
личных видов животных.

Получение трансгенных сельскохозяйственных животных одно из
приоритетных направлений исследований по биотехнологии, проводимых в
СССР и России. Интенсивно подобные работы проводятся в США, ФРГ,
Австрии и других странах. Опубликованные материалы весьма обширны и
разнообразны, и их анализ указывает на очевидную компетентность зигот
мышей, кроликов, свиней, овец, крупного рогатого скота к восприятию как
гомологичных, так и гетерологичных генов, введенных методом микроинъ-
екции в составе рекомбинантных конструкций, либо пересадкой в зиготу
ядер генетически трансформированных клеток (клонирование) (табл. 30,31.).
Так, ген соматотропина человека был встроен и интегрирован в зиготы сви-
ньи и крупного рогатого скота. В работах по получению трансгенных жи-
вотных в России показана принципиальная возможность интеграции чуже-
родной ДНК в зиготы сельскохозяйственных животных. При этом было по-
лучено трансгенное потомство и в ряде случаев - наследование встроенного
гена в Fi и F2. Вопрос о перспективности таких исследований и ограничени-
ях - предмет специального обсуждения.

В настоящее время исследования по получению трансгенных сель-
скохозяйственных животных с целью ускорения селекционного процесса
ведутся в следующих направлениях:

Повышение продуктивности животных и улучшение качества жи-
вотноводческой продукции интеграцией в их геном дополнительных генов
соматотропинового каскада (СТГ, РГ-СТГ, соматотропинов). Разработка
этого направления начата несколько раньше других и уже получены опреде-
ленные результаты;

Повышение устойчивости сельскохозяйственных животных к ин-
фекционным заболеваниям за счет введения в их геном антисмысловых РНК
(асРНК), комплементарных функционально важным участкам информаци-
онной РНК (иРНК) вируса, или введения генов, ответственных за синтез
факторов, обеспечивающих устойчивость животных к различным вирусным
инфекциям (Мх-ген, гены интерферонов, иммуноглобулинов и др.). Важ-
ность и сложность этого направления обусловлены тем, что методами обыч-
ной селекции до сих пор не достигнуто сколько-нибудь существенных успе-
хов в повышении устойчивости сельскохозяйственных животных к инфек-
циям вирусной природы, против которых трудно или почти невозможно
добиться устойчивости соответствующей вакцинацией;

-	Получение трансгенных животных, продуцирующих лекарственные
биологически активные вещества с молоком. Эти животные-супер-
продуцснты могут стать высокопродуктивными экологически чистыми био-
фабриками по производству биологически активных веществ, необходимых
для медицины и сельского хозяйства, по низкой себестоимости. Кроме того,
терапевтические препараты, которые традиционно получают из тканей че-
ловека, могут быть заражены вирусами СПИД, гепатита, прионами и други-
ми инфекционными агентами, тогда как препараты, полученные из молока,
будут лишены этого недостатка;

-	Повышение качества продукции (молока, шерсти и др.) за счет инте-
грации в геном животных отдельных генов (или групп генов), кодирующих
ключевые ферменты метаболизма белков, жиров и углеводов.

От трансгенных животных получены культуры клеток, в которых
встроенные гены экспрессировали. В частности, выявлена продукция по-
верхностного антигена вируса гепатита человека ВГБ (HbsAg) культурой
клеток почки трансгенного хряка и бычьего соматотропина - культурой кле-
ток из ткани легкого трансгенного кролика (М.М.Мусиенко, 1992).

Большинство исследований по генетической трансформации проведено
на культурах клеток лабораторных животных. В связи с этим представляет ин-
терес рассмотреть работы по получению генетически трансформированных
клеток и выявлению экпрессии генов в культурах клеток сельскохозяйственных
животных. Так, показано, что культура клеток почки теленка (ПТ-80) компе-
тентна к чужеродной ДНК. В эксперименте были использованы векторы pSV2-
neo,pSV-gpt и плазмида PMI2 (последовательность вируса бычьей папилломы).

Ген асРНК против парвовируса свиней удалось трансфицировать в куль-
туру клеток щитовидной железы свиньи (ЩС), а затем проверить чувствитель-
ность этой культуры к парвовирусу. Генетически трансформированная культура
оказалась менее чувствительной к вирусу, а титр гемагглютининов в ней не
превышал 1:128, в то время как в контрольной культуре он составлял 1:1024.

Осуществлена генетическая трансформация клеток СПЭВ и мутантной
культуры СПЭВ ТК', для чего использовали генные конструкции рИС-а2-
интерферона человека с М-1 и rsv -промоторами. С целью селективного отбора
трансформантов методом контрансфекции в клетки культуры СПЭВ ТК' вводи-
ли ген тимидинкиназы вируса простого герпеса (pAgO ТК), а в клетки СПЭВ -
ген устойчивости к антибиотикам неомицинового ряда (pSV2-neo). Трансфор-
мацию осуществляли кальций-фосфатным и полибреновым методами, которые
не различались по эффективности трансфекции конструкций рИС- аз-
интерферона, pSV2-neo , pAgO ТК в геном клеток СПЭВ и СПЭВ ТК', но поли-
бреновый метод оказался более простым для использования. Культуры клеток
СПЭВ ТК' были более компетентными к восприятию чужеродной генетической
информации, чем СПЭВ. Методом котрансфекции получена генетически
трансформированная культура клеток СПЭВ с геном сь интсрферона человека,
что подтверждено методом ДНК-ДНК-гибридизации, а экспрессия гена выяв-
лена продукцией а?.интерферона человека в культуральной среде методом им-
муноферментного анализа (Г.Н.Ларина,1992).

Клеточная культура СПЭВ ТК' оказалась компетентной к восприятию
гена HBsAg и активно экспрессировала чужеродный белок. Установлено, что по
эффективности трансформации, продукции HBsAg и стабильности экспрессии
гена HBsAg более эффективным в клетках СПЭВ ТК' является промотор Itr ви-
руса саркомы Рауса, чем промотор МТ-1 мыши. После обработки клонов-
трансформантов СПЭВ дексаметазоном и гидрокортизоном продукция HBsAg
возрастала в 3-4 раза. Соли тяжелых металлов оказывали аналогичное действие
на клетки, содержащие ген HBsAg под контролем промотора гена МТ-1 мыши.
Клетки СПЭВ ТК, ГР ГФРТ' и другие оказались компетентными к большому
числу чужеродных генов (И.П.Савченкова,1993).

к Масштабные и наиболее важные в теоретическом и практическом от-
ношении эксперименты по структурно-функциональному анализу мембран-
ных белков вирусов в генетически трансформированных культурах клеток
животных и человека осуществлены Тугизовым Ш. М.(1996). При этом по-
казано, что мутантные по генам ферментов тимидинкиназы (ТК) клетки
СПЭВ и гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансферазы (ГФРТ) клетки тра-
хеи плода коровы (ТР) и другие являются хорошей клеточной моделью для
генетической трансформации с использованием конструкций рекомбинант-
ных ДНК и клонированных генов HBsAg, HBcAg и др.

Проведены успешные исследования с немутантными культурами
СПЭВ и ТР для трансфекции генов пео и lacz, подтвердившие возможность
встраивания генов в геном клетки методами ДНК-ДНК-гибридизации, а
также оценка устойчивости к генетицину (G418) или специфическому ок-
рашиванию на фермент Р-галактозидазу в случае трансфекции гена lacz.

Анализ результатов описанных экспериментов показывает, что получен-
ные культуры клеток крупного рогатого скота (ПТ-80) и свиньи (ЩС, СПЭВ
ТК-), как и культуры СПЭВ, ТР и ТР ГФРТ-, пригодны для генно-инженерных
работ и могут быть использованы в биотехнологии. Необходимы дальнейшие
исследования в этом направлении, в частности, для получения клеток - проду-
центов протективных антигенов вирусов, бактерий, простейших, грибов, а так-
же гормонов, ферментов и других биологически активных веществ. Перспек-
тивным направлением генетической трансформации клеток и получения транс-
генных животных является трансформация зигот млекопитающих, в том числе
сельскохозяйственных животных. Для инфекционной патологии наибольший
интерес представляют работы по получению животных, устойчивых к опреде-
ленным заболеваниям, в геном которых встроены гены асРНК, блокирующие
развитие соответствующих вирусов.

Новые возможности в клеточной инженерии и биотехнологии от-
крывают эмбриональные стволовые клетки (ЭСК). Плюрипотентные ЭСК
используют как модель эмбрионального развития in vitro, а также для полу-
чения трансгенных животных, клеток, тотипотентных ядер и идентифика-
ции регуляторных генов развития. Получено три линии мышиных ЭСК с
генотипом C57BI/6, плюрипотентность которых подтверждена тестом на
специфическую активность щелочной фосфатазы, а также способностью
образовывать эмбриоидные тельца in vitro при культивировании без фидер-
ного слоя (И.П.Полежаева, 1995.). Описаны культурально-морфологические
свойства ЭСК крупного рогатого скота. Авторами выделены эбриоидные
тела различной сложности, проведена спонтанная дифференцировка ЭСК с
образованием клеток, имеющих нейро-, энтодермо- и фибробластоподобную
морфологию. Показана возможность их использования для генно-
инженерных работ и получения трансгенных и клонированных животных.

И.П.Савченковой (1998) получены ЭСК кролика и мыши. Осуществлена
генетическая трансформация ЭСК мыши, для которой была использована плаз-
мида pGMVlacZ, причем экспрессия гена lacz (продукция 3 - галактозидазы)
обнаружена у 38% клеток. При использовании плазмид pRSTlacZ и pPGKlacz
ген lacz экспрессировали соответственно 23 и 27% ЭСК мыши. Представляет
интерес возможность сайт-специфического мутагенеза ЭСК посредством гомо-
логичной рекомбинации между введенной рекомбинантной ДНК и гомологич-
ным районом в геноме ЭСК (gene targeting).

Проведенные исследования свидетельствуют о том, что ЭСК могут
служить как для клонирования и получения сельскохозяйственных живот-
ных с выдающимися продуктивными качествами, так и для изучения прион-
ных инфекций (скрепи, BSE - бычья спонгиоформная энцефалопатия и др.),
инфекционной патологии раннего эмбрионального развития животных, в
том числе патологии беременности.

Современные методы клеточной биотехнологии и генетической инжене-
рии - гибридизация и генетическая трансформация клеток сельскохозяйствен-
ных животных - стала неотъемлемой частью исследований в области биологии
клетки, позволяющих решать многие проблемы животноводства и инфекцион-
ной патологии. Наряду с гибридомами-продуцентами моноклональных антител,
разработаны методы гибридизации соматических клеток сельскохозяйственных
животных на основе выведенных новых мутантных культур из немалигнизиро-
ванной (не опухолевой) ткани, которые высокочувствительны в широкому
спектру вирусов и перспективны для продукции интерферонов и других физио-
логически активных веществ. Клетки сельскохозяйственных животных (свиньи,
коровы) оказались компетентными к восприятию чужеродной генетической
информации, что позволило подучить генетически трансформированные клет-
ки, зиготы с встроенными рекомбинантными генами, а также трансгенных жи-
вотных. Перспективны для генно-инженерных работ эмбриональные стволовые
клетки (ES- клетки).

Необходимы дальнейшие исследования в этом направлении, в част-
ности для получения клеток-продуцентов протективных антигенов, вирусов,
бактерий, простейших, грибов, а также гормонов, ферментов и других фи-
зиологически активных веществ.
Литература

1.	Биотехнология Наука, М., 1984,318с. (отв.рсд.БаевА.А).

2.	Верховский О.А.. Верховская Л.В., Ю.Н Федоров, Е.Д Захаров, В.И.Уласов,- Иммуно-
химическая характеристика моноклональных антител к структурным белкам аденови-
руса собак серотипа-1 (САУ-1) и их использование для диагностики инфекционного
гепатита плотоядных С.Х биология, 1996, № 2, с.87-94.

3.	Верховский О.А - Поли-и моноклональные антитела в анализе гуморального
иммунного ответа, структуры и функциональных свойств иммуноглобулинов
животных. Дисс. докт.биолог. наук., 1998.

4.	Генноинженерные сельскохозяйственные животные. Сборник научных трудов, М.,
1995, 404 с. (составитель И.Гольдман).

5.	Глебов О.К., Д.С.Абрамян - Природа фенотипической изменчивости соматических клеток
в культуре: нестабильные фенотипические изменения. Цитология, 1984, т.26, с 235-251.

6.	Дагданова А.В.-Культивирование зигот крупного рогатого скота и кролика, микро-
инъецированных генами асРНК к вирусу лейкоза крупного рогатого скота и интерфе-
роном человека Дисс.к б.н., М., 1993.

7.	Дагданова А.В. - Определение чужеродного гена в ранних эмбрионах кролика мето-
дом ПЦР. Тезисы докладов научной конференции ’’Актуальные проблемы биотехно-
логии в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии” М., 1996, с. 19.

8.	Дьяконов Л П., "Гибридные и генетически трансформированные культуры клеток в
биотехнологии и ветеринарной медицине", С/Х биология 4,1994,стр. 26-31.

9.	Дьяконов Л.П.- Основные достижения и перспективы развития клеточной биотехно-
логии. Труды ВИЭВ, 1998, т.71, с.149-161.

10.	Дьяконов Л.П., Гальнбек Т.В., Щекалева И.В., Антипова Т.А., Ярных Е.В. - Внутри-
видовая гибридная культура клеток СПЭВ ТК'х . лимфоциты свиньи.Ж.С.х. биология,
1996, №2, с. 25-30.

11.	Зеленин А.В, Кущ А.А , Ниязматов А А., Прудовский И.А. Быстрое вступление в S-
период ядер лимфоцитов лимфоузлов в гетерокарионах и реконструированных клет-
ках. - ДАН СССР, 1979, т. 246, с. 1489-1492.

12.	ЗеленинА.В., Кущ А.А , И. А. Прудовский И.А. Реконструированная клетка. М., "Нау-
ка", 1982, 207 с.

13.	Липосомы в биологических системах. (Ред. Г Грегориадис, А. Аллисон), М., "Меди-
цина", 1983, 384 с.

14.	Майджи Е.В. "Гибриды соматических клеток сельскохозяйственных животных и их
чувствительность к некоторым вирусам" Дисс. канд. биолог.наук.,М.,1987

15.	Майджи Е.В., Тугизов Ш.М., Дьяконов Л.П. - Количественный хромосомный анализ
сублиний гибридных клеток некоторых сельскохозяйственных животных в связи с
чувствительностью к различным вирусам. Ж.С.х. биология, № 6, 1990, с.52-57.

16.	Майджи Е.В., Ш.М.Тугизов, Л.П.Дьяконов и др. - Оптимизация условий гибридизации
мутантных клеток свиньи и лимфоцитов лошади..С.х. биология, 1990, №2, с. 182-187.

17.	Малоголовская С.А., Васильев Д.А., Макаров В.В.-"Моноклональные антитела (Учеб-
ное пособие), Ульяновск, 1998,30с.

18.	Маршак М.И., Варшавер Н.Б.. - Спонтанный темп возникновения мутаций резистент-
ности к 8-азагуанину в диплоидных и анеуплоидных клетках человека. Генетика,
1970, т.7, с.130-138.

19.	Методические рекомендации по получению мутантных штаммов перевиваемых ли-
ний клеток с/х животных, пригодных для гибридизации. М., 1984, 16 с. (Авторы
Л.П.Дьяконов, А.А.Кущ, Ш.М.Тугизов).

20.	Методические рекомендации по гибридизации соматических клеток с/х животных. М.,
1988, (Авторы: Л.П.Дьяконов, А.А.Кущ, Ш.М.Тугизов, Е.В.Майджи, О Ш.Расулев)

21.	26. Методы культивирования клеток. Сборник научных трудов. Л., Наука, 1988, 319 с.
(отв.редакор Пинаев Г.П ).
22.	Моноклональные антитела. Гибридомы: новый уровень биологического анализа. (Ред
Р.Г.Кеннет, Т.Дж. Мак-Керн, К.Б.Бехтол), М ,Медицина, 1983, 416 с.

23.	Новохатский А.С. Моноклональные антитела в микробиологии. Итоги науки и техни-
ки Сер.Микробиология. ВИНИТИ, М., 1983, с 12.

24.	Прудовский И.А., Зеленин А.В.. Влияние энуклеации на структурно-функциональное
состояние цитоплазмы L-клеток. - Цитология, 1978, т. 20, с. 952-956.

25.	Рингерц Н., Р.Сэвидж. - Гибридные клетки. М., Мир, 1979, 416 с.

26.	Спиер Р.Е., Гриффитс Дж.Б.,- Биотехнология клеток животных. Агропромиздат, М., 1989.

27.	Трофимова М.Н., Новиков В.В., О.М.Сандова и др. Наработка моноклональных анти-
тел в асцитной форме и методы их очистки. Биотехнология, 1987, 3, 6, с.735-737.

28.	Тугизов Ш.М. Мутантные и гибридные клетки крупного рогатого скота и свиньи для
вирусологических исследований. Дисс.канд. биол.наук, М., 1985.

29.	Тугизов Ш.М. Использование электрического пробоя мембран для гибридизации и
трансфекции эукариотических клеток. В кн. Молекулярная биология и генетическая
инженерия вирусом. М , 1989, с.93-98.

30.	Тугизов Ш.М. Структурно-функциональный анализ мембранных белков вирусов в
генетически трансформированных клетках. Автореф дисс.докт.биол. наук, М., 1996.

31.	Тутов И.К., Ситьков В.И. - Основы биотехнологии ветеринарных препаратов. Ставро-
поль, 1997.

32.	Шапиро Н.И., Н.Б.Варшавер О темпе спонтанного мутационного процесса в
соматических клетках млекопитающих и о некоторых вопросах с ним связанных.
Генетика, 1976. т. 12, с. 132-149.

33.	Шей Дж.В. Методы генетики соматических клеток (пер. с англ). изд.Мир, 1985. t.I,
312 с., т.2, 313-630 с.

34.	Щекалева И.В. - Внутривидовая гибридная культура клеток АдхС (СПЭВ ТК'х спле-
ноциты свиньи) биологическая система для вирусологических исследований. Тезисы
докладов научной конференции, Махачкала, 1997.

35.	Эрнст Л.К., М. И. Прокофьев, Дьяконов Л.П, Дагданова А.В., Сураева Л.М. - Микро-
инъекция чужеродных генов, ответственных за устойчивость организма к инфекцион-
ным заболеваниям. Вестник Росс. Акад, с/х наук, 1995. № I, с.56-58.

36.	R.M. Baker, V Ling. Membrane mutants of mammalian cells in culture. - Metods in mem-
brane biology, New York, 1978, Vol. 9, p. 337-384.

37.	M. Harris and K. Collier. Phenotypic evolution of cells resistant to bromodeoxiuridine. -
Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1980, Vol. 77, p. 4206-4210

38.	G.Kohler, C.Milstein, Continuous cultures of fuseg cells secreting antibody predefined
specificity. Nature, 1975, 256,55, 17, 495-497.

39.	J.W. Littlefield. Selection of hybrids from mating of fibroblasts in vitro and their presumed
recombinants. - Science, 1964, Vol. 41, p. 190-196.

40.	J.W. Littlefield. The use of drug resistant markers to study the hybridization of mouse
fibroblasts. - Exp. cell res., 1966, Vol. 41, p. 88-95.

41.	J.W. Littlefield. Hybridization of hamster cells with high and low folate- reductase activity.
- Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1969, Vol. 62, p. 88-95.

42.	Y. Okada, F. Murayama. Fusion of cells by HVJ: Requirement of concentration of virus particles
at the site of contact of two cells for fusion. - Exp. cell res., 1968, Vol. 52, p. 34-42.

43.	G. Pontecorvo. Production of indefinitely multiplying mammalian somatic cell hybrids by
polyethyleneglycol (PEG) treatment. - Somat. Cell Genet., 1976, Vol. 1, p. 397-400.

44.	M. Wakanara. Polyethylene glycol- and lysolecithin-induced cell fusion between follicle
cell and very small oocyte in Xenopus laevis. - Exp. Cell res., 1980, Vol. 128, p. 9-14.

45.	J. White. Viral and cellular membrane fusion proteins. - Ann. Rev. Physiol., 1990, Vol. 52,
p. 675-697.
Глава 16. Оогенез млекопитающих и культивирование
ооцитов in vitro

Гаметогенез - ключевое событие в развитии организма. При естественном
оплодотворении ДНК именно половых клеток обеспечивает программой развития
новый организм. В целях обеспечения здоровья поколений имеет большое значе-
ние сохранение целостности гамет, их наследственного материала.

Доказано внегонадное развитие первичных половых клеток (гоноци-
ты), которые обособляются от соматических клеток эмбриона на ранних
стадиях его развития и мигрируют (из области первичной эктодермы через
энтодерму желточного мешка) к половому зачатку с током крови и путем
амебоидного движения (Семенова-Тян-Шанская,1973).

Гоноциты отличают от прочих клеток по содержанию гликогена, вы-
сокой активности щелочной фосфатазы и ряду цитологических особенно-
стей (Семснова-Тян-Шанская,1973). В процессе миграции они многократно
митотичсски делятся, часть их дегенерирует, оставшиеся внедряются в за-
чатки половых желез (гонады), расположенные на вентромедиальной сторо-
не первичной почки - мезонефроса.

Оогенез млекопитающих: Предполагают, что в гонаде после нескольких
митотических делений гоноциты трансформируются в оогонии, которые также
несколько раз делятся и затем переходят в ооциты 1 порядка. В отличие от муж-
ских гамет, женские гаметы проходят через стадии профазы 1 мейоза в ранний
период онтогенеза у эмбриона и плода. У некоторых видов млекопитающих
завершение дифференцировки ооцитов через стадии профазы 1 мейоза до дик-
тиотены продолжаются и на ранних сроках постнатального периода онтогенеза.
Динамика оогенеза с количественным анализом соотношения женских гамет на
разных последовательных стадиях их дифференцировки изучена лишь у 11 видов
млекопитающих (мыши, крысы, хорька, морской свинки, золотистого хомяка,
кролика, овцы, свиньи, коровы, обезьяны и человека). Пул женских гамет у мле-
копитающих формируется за счет митозов оогониев, достигает определенной
величины (имеющий видовую специфичность) еще во время внутриутробного
развития и в дальнейшем в онтогенезе этот пул расходуется посредством овуля-
ции (малой части гамет) и дегенерации ооцитов на всех этапах их развития, но,
как полагают, уже более нс восполняется (Курило, 1985).

В оогониях после последнего митотического деления развивается
премейотичсский синтез ДНК. Некоторые исследователи считают, что пре-
мейотический синтез ДНК развивается в ооците 1, на стадии прелептотены.

Мейоз - особый тип деления дифференцирующихся половых клеток, в
результате которого происходит рекомбинация генов, полученных от обоих
родителей (в пахитене профазы 1 мейоза и метафазе 1 и 2 мейоза) и редукция
(уменьшение) вдвое числа хромосом в зрелых гаметах (в метафазе 2 мейоза).

По общепринятой схеме ооцит в профазе 1 мейоза проходит стадии
прелептотены (недавно признанная стадия), лептотены, зиготсны, пахитены,
диплотены, диктиотены, диакинеза (рис.68).
Рис.68. Динамика оогенеза в антенатальный период развития коровы.
Количественное распределение ооцитов на стадиях профазы 1 мейоза в яич-
никах эмбрионов и плодов коровы на последовательных этапах внутриут-
робного развития. По горизонтали - возрастные группы эмбрионов и пло-
дов, недели внутритробного развития; по вертикал и-количество ооцитов
каждой из стадий профазы 1 мейоза, % от общего числа подсчитанных по-
ловых клеток. Вертикальные штрихи - ошибка средней. 1- ооциты на стадии
прелептотенной конденсации и деконденсации хромосом; 2 - ооциты на
стадии лептотены; 3 - ооциты на стадии зиготены; 5 - ооциты на стадии па-
хитены (Курило, 1985).

С помощью количественного анализа было показано, что фолликуло-
образование развивается только вокруг ооцитов на стадии диплотены. Это
принципиальный биологический факт, еще до конца не расшифрованный
(Курило, 1985; Теплякова, 1987). Ряд исследователей считает целесообраз-
ным и принципиальным различать между диплотеной и диакинезом само-
стоятельную стадию диктиотену, которая характеризуется интенсивной
транскрипционной активностью хромосом (Кикнадзе и соавт., 1980; Зыби-
на, 1969,1970; Грузова, 1977), т.е. в ооците на этой стадии протекают прин-
ципиально иные метаболические (цитофизиологические) процессы (Айзен-
штадт, 1984)

Динамика и хронология развития ооцитов дофолликулярных
стадий у некоторых видов млекопитающих. Дофолликулярный оогенез
у коровы

Количественные исследования оогенеза и фолликулогенеза коров на
53 эмбрионах и плодах женского пола 1,5-9 месяцев позволили нам впервые
составить представление о динамике этих процессов в зависимости от про-
грессии внутриутробного развития коровы (Курило, 1985,1986; Курило и
соавт., 1986; Теплякова, 1987) (рис.69); (табл.32,33). У 1,5-месячных зароды-
шей гонады уже дифференцированы по полу. У коров фолликулообразова-
ние происходит только вокруг ооцитов в диплотене и начинается у 4-
месячных плодов, а интенсифицируется у 5-месячных плодов. В яичниках 5-
месячных плодов коров среди примордиальных фолликулов появляются уже
более прогрессивно развитые единичные первичные фолликулы (Кури-
ло, 1985; Теплякова, 1987). Таким образом, ко времени рождения фоллику-
лярная система яичников плодов коровы уже содержит сформированный
пул половых клеток - ооцитов в диплотене профазы 1 мейоза, заключенных
в примордиальные фолликулы. Лишь малая доля фолликулов (единичные)
вступает на этих сроках в дальнейшее развитие. Как и у других, изученных в
плане динамики овариогенеза, оогенеза и фолликулогенеза нескольких (все-
го 11-ти) видов млекопитающих (Baker, 1966; Курило, 1980; 1985) у коров все
эти ключевые события гаметогенеза - формирование пула женских гамет,
особенности мейоза -конъюгация и кроссинговер, фолликулогенез развива-
ются как функция времени и в дорзовентральном направлении (т.е.по дорзо-
вентральному градиенту), от мезонефроса, от мозгового вещества гонады в
сторону покровного эпителия. У всех изученных видов дофолликулярный
оогенез протекает асинхронно, т.е. в каждый момент внутриутробного раз-
вития в яичнике находятся гаметы на нескольких «соседних» стадиях разви-
тия - оогонии и ооциты в прелептотене и зиготене, затем часть их переходит
в пахитену и диплотену; постепенно все оогонии переходят в прелептотен-
ные ооциты, затем - ооциты в прелептотене и лептотены переходят в зиготе-
ну и т.д., пока все женские гаметы не трансформируются в ооциты на стадии
диплотены, заключенные в примордиальные фолликулы.

Нами для начальных этапов фолликулообразования у коров выявлено,
что этот процесс интенсивнее (различия статистически достоверны) разви-
вается в правых яичниках плодов, по сравнению с левыми (Курило, 1985;
Теплякова, 1987).
ДОФОММРИ M3BUM ООЦИТА I ПОИИия.диТЕНДтаЛЬНЫй ПИМА ТОШ

„ ГОИШГ оогоиий nPfrOTOTDWQ ЛЕПТОТЕНА ЗЮТЕНА , MJH.'Siftp)
шжДцд «оидсисад ДЕУСКИСАЦМ П1(и (имъктиА) ^симгоегр)

^«ШЛРМГЖ. <«££">— .. - - 2.S„^.J“HTt,?4SI/- -------zr------------------

Ш1иМУП0ГМЗ,ВНУТР1Ш1ЙУУ/ЮРЦ0[ PA3BUTUE. и СОЗРСМИ ООЦИТА IПОРЯДУА

MUNATfiflbUbW

ОДЩЯ №

%

э

COUUT в ДЦДкиМЕЗЕ ИЗ
ПйдаУЛАТОРНОГО ФОЛЛШАИЙ

BT0PU4W (лодстмой) ССЗРЕМЮщш«МШ((
(в OOUyTT-<WWUP0BAHl«: xpowombdu rvrra
- -ИАРИОС4>ЕРЫС'

.0

3

Л1

/ШПЛОТЕНА В ЛРЦРКИШ- /шитиошм в

#***	ПЕРВИЧНОМ ФОЛЛиичЛС

ооцит и ПОРЯДИЛ ПОСЛЕ

ВЫДЕЛЕ мм I ПиЛаРноГОЛМЩ

ГГГШЗА Я

МАЛОГО ФОШЫЛА

~OODuU

ПЕРВичНУй wocnounwu Ф&ЩЫ1



Рис. 69. Схема оогенеза млекопитающих (по Л.Ф.Курило,1985).

1 - прозрачная оболочка; 2- клетки лучистого венца; 3 - полость фолликула; 4 -
клетки яйценосного бугорка; 5 - прибазальный слой клеток гранулёзы; 6 - базальная
мембрана; 7 - внутренняя оболочка.
Таблица 32

Количественная характеристика половых клеток яичников зародышей и плодов на разных сроках
развития у крупного рогатого скота (Курило, Теплякова,!986).

Возраст плодов  Мес	Исследовано яичников	Проанализировано половых клеток	оогонии %	Ооциты %	Доля ооцитов на разных стадиях профазы 1 мейоза от общего числа подсчитанных половых клеток. %					Митотическ ий индекс оогониев, %	Число дегенерирующих ооцитов, %	
					Прелепто- тсна	Лептотена	Зиготена	Пахитена	Диплотена		зиготена- пахитена	ДИПЛотена
1Д0	2,00	2106	96.2+1,1	3,84+1,09	3,84+1.09	-	-	-	-	2,8711,02	-	•
2-2.5	8.00	6365	50,25110,16	49,75+10.16	43,9618,13	2,1410.57	3,01 + 1,59	0,6410,21	-	1,8110,67	23,4718,75	
3,00	8,00	8738	50,0416,96	49,96+6.96	35,0414,34	2,78+0,65	6,38+1,67	5,69+1,55	0.07+0,02	3,3310.70	22,6214,44	
4,00	8,00	8483	19,2111,85	80,7911,85	33,1313,25	3,11+0,90	17 9911,72	22,0711,40	4,49+0,54	3,75+0,99	29,0912,28	13,6012,88
5,00	5,00	2674	4,02+0,89	95,98+0,89	40,2714,44	7,9911,19.	16,9212,38	18,8912,96	И, 9115,50	9,5111,84	17,8712,78	8,5213,34
6,00	8,00	3401	0,4910,15	99,51+0,19	15,4513,48	0,92+0.53	16,0510.01	21,0812,57	46,0117,16	30.00113,28	27,9015,17	12,7313.80
7,00	8,00	3451	0,1610.08	99,84+0.09	13.9412,41	1,42+0,34	10.8013.27	11,39+1,84	62,2916.56	25,00+14,16	24.0lt3.90	4,84+1,16
9,00	6,00	1074	-	100.00	-	-	•	-	100,00	-		24,56+3,54
												
												
												
Таблица 33

Сравнительный анализ динамики фолликулообразования в яичниках пло-
дов коров разного возраста (%, п=10, М=т) (Теплякова и соавт.,1984)

Показатель динамики фолли- кулогенеза	Возраст плодов (мес.)				
	4	5	6	7	9
общее число подсчитанных ооцитов	8642	179195	35223	14853	7969
Количество ооцитов в стади- ях прелептотены-пахитены	94.8±0,6	93.1 ±0,4	55,0±1.8	17,2±1.3	
Количество ооцитов в стадии диплотены (%)	5,2±0,6	6,9±0,4	45,0+1.8	82,8±1,3	100
Ооциты в стадии диплотены					
не окруженные фолликуло- цитами	74,1 ±6,5	17,7±1,5	14.8±1.1	7.1 ±0,3	
с 2-3 фолликулоцитами	25,9±6.5	22,0±1,7	11,9±1,3	8,0±0,3	5,0±0,4
с 4-9 фолликулоцитами	-	40,7±1,6	44,2±0,8	40,6±2,6	16,8±1,3
заключенные в приморди- альные фолликулы		18,4±1,4	25,7±1,0	38,6+1,1	53,1+1,3
в первичных фолликулах		1.2±0,2	2,1 ±0,4	3,6±0,6	13.3±1,1
в первичных двух- многослойных фолликулах			1,3±0,2	2.1 ±0.4	8,5±0,9
в полостных фолликулах	-	-		-	3,3±0,4

Фолликул о генез и оогенез в половозрелый период жизни млеко-
питающих

Вопрос о состоянии фолликулярной системы яичников в зависимо-
сти от фазы цикла (менструального цикла, МЦ - у человека и обезьяны, эст-
рального цикла, ЭЦ - у других видов млекопитающих) более детально изу-
чен у человека, обезьяны и мелких лабораторных грызунов. Мы провели
количественный анализ состава фолликулов на разных стадиях их роста и
созревания у человека и зеленой мартышки в зависимости от фазы цикла и с
помощью морфометрического анализа ядрышка, ядра, ооцита и фолликула
изучили динамику развития ооцита и преобразований его хромосомно-
ядрышкового комплекса в процессе созревания (Курило, 1985). Выявлены
следующие закономерности: 1) В фолликулярную фазу МЦ (проэструс ЭЦ)
среди вторичных полостных фолликулов (см. схему оогенеза) в яичниках
содержатся в основном полостные фолликулы малого и среднего размеров.
2) По мере приближения к моменту овуляции значительно нарастает число
полостных фолликулов в целом и количество средних и крупных полостных
фолликулов. 3) В лютеиновую фазу МЦ (метаэструс ЭЦ) общее число вто-
ричных полостных фолликулов становится наименьшим, но в фолликуляр-
ной системе яичника остается определенное число средних и крупных фол-
ликулов, претерпевающих дегенерацию. Средний диаметр самого крупного
фолликула уменьшается, но он больше, чем у фолликулов в проэструсе. Эта
закономерность роста и развития фолликулов в зависимости от фазы цикла
обусловлена циклическим содержанием гонадотропных и стероидных гор-
монов в крови и развитием комплекса рецепторов соответствующих гормо-
цов, различающихся в фолликулах разных стадий развития.

По распространенному мнению, ооцит у млекопитающих находится
на стадии диплотены (диктиотены) вплоть до перехода его в созревшем
фолликуле на стадию диакинеза. Исследование ооцитов некоторых видов
млекопитающих (мыши, крысы, сони, норки, кролика) позволило выявить,
что в период большого роста ядерные компоненты ооцита претерпевают
сложные преобразования, обусловленные высокой синтетической активно-
стью хромосомо-ядрышкового комплекса, сменяющейся в ооцитах много-
слойных вторичных фолликулов инактивацией и конденсацией хромосом
вокруг ядрышка в виде компактной хроматиновой массы - кариосферы (Зы-
бина,1969, 1971; Кикнадзе и соавт.,1980). Однако авторы ряда работ рас-
сматривали такие ооциты как дегенерирующие (атретические). Мы проана-
лизировали хромосомно-ядрышковые преобразования в ооцитах человека,
обезьяны и коровы и сравнили результаты наблюдений трансформации
ядерных структур с уже известными событиями, детально описанными для
мыши и кролика (Зыбина, 1969; 1971). По состоянию ядерных компонентов
выделяются две категории ооцитов среди примордиальных и первичных
однослойных фолликулов: в одной - хромосомы в виде сети неравномерно
деконденсированных нитей распределены по всему ядру и выявляются од-
но-два ядрышка; во второй категории ооцитов хромосомы собраны в рых-
лый комок, маскирующий ядрышко и занимающий большую часть ядра.

В периоде большого роста (в первичном многослойном бесполостном
и вторичном полостном фолликуле, с полостью на 1/2 объема последнего)
ооцит (в диктиотене) характеризуется деконденсацией хромосом (приобре-
тение ими структуры типа ламповых щеток), связанной с их высокой транс-
крипционной активностью, накоплением РНК и белка, нуклеолонемной
структурой ядрышек. Это свидетельствует о высокой функциональной ак-
тивности деконденсированных хромосом и нуклеолонемного ядрышка. У
разных изученных нами видов млекопитающих прекращение роста ядра
ооцита совпадает с началом формирования полости в фолликуле (табл.34,35
рис.70). Причем по размеру таких фолликулов имеется межвидовое разли-
чие. У всех видов, изученных нами в плане закономерностей роста ядра и
ооцита и корреляции этих событий в зависимости от стадии развития фол-
ликула вначале прекращается рост ядра ооцита, а затем и рост самого ооци-
та. Эти два события могут происходить либо близко друг к другу по време-
ни и стадии развития фолликула, либо через определенные, по-видимому,
разные для разных видов временные интервалы. Момент прекращения роста
ядра ооцита коррелирует с началом конденсации хромосом, отражающей
снижение их транскрипционной активности. Прогрессирующая конденсация
хромосом ооцитов из вторичных малых полостных фолликулов, отхождение
их от ядерной оболочки и постепенная концентрация их вокруг гомогенного
ядрышка приводят к формированию хроматиновой массы, кариосферы
компактной локализации конденсированных хромосом в виде плотного ло-
пастновидного фельген-положительного кольца вокруг ядрышка (таблица
34, 35.) (Курило, 1985; Теплякова, 1987; Курило и соавт.,1986). Проведенный
нами (Tesarik et al., 1984) анализ синтеза белка (по включению 3-Н-
метионина) и РНК (по включению 3-Нуридина) в ооцитах (завершивших
свой рост) на этапе кариосферы из крупных не атретических полостных не-
овуляторных и преовуляторных фолликулов человека подтвердил гетеро-
генность их популяции. Результаты анализа свидетельствуют о том, что в
полноценных ооцитах из преовуляторных фолликулов 3-Н-уридин продол-
жает включаться в ооцит и ядро, метка выявляется и в области кариосферы.
Результаты экспериментов с оплодотворением ооцитов человека из таких
фолликулов in vitro (Tesarik et al., 1984) подтверждают предположение о том,
что преовуляторный синтез РНК не является необходимым для возобновле-
ния мейоза, а важен для последующих этапов: либо для цитоплазматическо-
го созревания, либо для первых стадий развития эмбриона разных видов
млекопитающих.

В пользу, возможно, опосредованной роли преовуляторного синтеза
РНК в развитии кортикальной реакции свидетельствуют наши наблюдения о
том, что в ооцитах ,подобных по морфологии гаметы и фолликула тем, что
включают метку З-Н-уридина и она локализуется в области кариосферы,
протекает нормальная кортикальная реакция при оплодотворении. В неову-
ляторных ооцитах из крупных полостных неатретических фолликулов, по
морфологии подобных тем, которые не включают 3-Н-уридин, при оплодо-
творении развивается полиспермия из-за недостаточности кортикальной
реакции, хотя в 8 из 10 таких ооцитов возобновлялся и завершался мейоз
(деления созревания) (Tesarik et al., 1984).Разногласия между нашими на-
блюдения (включение метки з-Н-уридина в область кариосферы) и вывода-
ми других исследователей о снижении синтетической активности ядрышек и
хромосом на стадии кариосферы можно объяснить гетерогенностью состава
ооцитов по их функциональному состоянию; не исключена вероятность де-
понирования иРНК в области кариосферы (Зыбина, 1971; Парфенов, 1995;
Почукалина, 1998).

Ультраструктурный анализ ядер и ядерных структур (ядрышка, хро-
матина, ядрышкоподобных телец) ооцитов из крупных полостных фоллику-
лов человека (диаметром от 2 до 32 мм) позволил исследователям (Парфе-
нов, 1995; Почукалина, 1998) подтвердить расположение объединенных в
единую массу хромосом вокруг ядрышка (в ооцитах, не имеющих визуально
признаков дегенерации). Предполагают, что одной из важных функций ка-
риосферы ооцитов является фиксация хромосом в определенном участке
клетки перед созреванием ооцита и растворением его ядерной оболочки
(Парфенов, 1995; Почукалина, 1998). По-видимому, наличие кариосферы
можно рассматривать как маркер физиологического состояния ооцита перед
диакинезом и 1 делением созревания, как морфофизиологический критерий
созревания ооцита и его готовности вступить в деления созревания.
NJ

Динамика роста фолликулов, ооцитов и их ядер и характеристика преобразований
хромосомно-ядрышкового комплекса в процессе созревания ооцитов в яичниках коров
(Курило и соавт.,1986)

	ДИАМЕТР(Х±зХ), мкм				Диаметр ядрышка, мкм	
Стадия развития фолликула	Число измер-х фол-лов	фолликула	ооцита	ядра		Состояние хромосомно-ядрышкового комплекса ооцитов
I	2	3	4	5	6	7
Примордиальные	14	30,4±1,2	20,6±1,1	Н,2±0,8	2,7-4.5	В одних фолликулах, хромосомы собраны в клубок. а примембранная зона кариоплазмы оптически пустая, в других хромосомы находятся в неравномерно деконденсированном состоянии и в виде сети распределены по всему ядру
Первичные однослойные	11	40.1+2,6	23,8+1,7	12,О±О,8	1.8-2,7	Тонкая сеть хроматина, пиронинофильное ядрышко с вакуолями разного размера
Первичные полутора- трехслойные	18	46 1+3,7	25.2± 1,6	11,9+0.3	1.8-3,6	Хроматин подобен предыдущей стадии развития фолликула, появляются фельгенположительные хромоцентры
Первичные многослойные безполостные (до 4-6 слоев)	6	108,0+10,4	42,0+4,7	16,3±2,1	2.7-3,6	На тонкодеконденсированных хромосомах слабо выявляется реакция Фельгена.
Втричные с полостью 1/2 его объема	17	294,7±13.5	64,2±3,8	24,4±1,5	3,5-13,3	Тонкодекнденсированные хромосомы, вакуолизированные ядрышки, в кариоплазме находятся белковые гранулы.
Вторичные полостные (тонкий яйценосный бугорок)	17	1442,5+202,1	94,0±4,0	29,0±1,5	5,4-9,0	Хромосомы начинают конденсироваться и концентрироваться вокруг ядрышка, в котором снижается вакуолиация.
Вторичные созревающие	20	12250,0+329 2	92,5±3.2	24,3+1,0		Ядро в одном из трех состояний’ 1 .кариосферогенез, 2 днакинез; 3. Метафаза.
236

Динамика роста фолликулов, ооцитов и их ядер и преобразования
хромосомно-ядрышкового комплекса в яичниках человека (Курило,1985)

Таблица 35

-		ДИАМЕТР, МКМ				
Стадия развития фолликула	Колич. измер-х фол-лов	фолликула	ооцита	ядра	ядрышка	Состояние хромосом (ХС) и ядрышка (ЯШ) ооцита
1	2	3	4	5	6	7
Примордиальные	28	40,7+1,1	38,5±1,1	15,4±0,4	2,9-3.6	Неравномерно деконденсированные тонкие нити ХС проявляют тенденцию локализоваться вокруг ЯШ или распределены по всему ядру.
Первичные однослойные	21	57,5+2,5	33,3±1,5	14.0+0,7	2.0-6.0	ХС имеют различную степень конденсации, хромомерное строение; ХС рассеяны по всему ядру. В ЯШ выявляются вакуоли
Первичные двух-трехслойные	21	95,0+5,4	52,5+3 3	25.7+1,1	5,9-6,0	Структура ХС и ЯШ без особых изменений. Диаметр ядра увеличивается в 1,5 раза
Первичные многослойные без полости	24	220,0+10,8	83,9+2,9	24.6+1.4	5,0-6.0	ХС мелкодисперсные; происходит интенсивная вакуолизация ЯШ. Формирование ядрышкоподобных телец. Ядро достигает максимального размера.
Втричные многослойные, с полостью на 1/2 объема фолликула	18	333 0+28.6	82,5+3,6	23.1 + 1,2	5,0-9,0	ХС мелкодисперсные. В крупном ЯШ размер и число вакуолей снижаются.
Вторичные с развитой полостью.	7	555,0+39,3	82,6+5,4	24.0+1,7	6,0-8,0	ХС мелкодисперсные и локализованы по всему ядру, либо начинают кнденсироваться и концентрироваться вокруг вакуолизированного ЯШ; выявляются несколько ядрышкоподобных телец разного диаметра
Вторичные с развитой полостью.	9	1080+102,5	94,1+6,5	24,9 + 2.3	7,0-10,0	Поведение и структура ХС и ЯШ ооцитов аналогичны изменениям ^Отмененным в предыдущей группе фолликулов
Вторичные с развитой полостью.	10	2495,2+231,0	96,3+3,4	25,7+0,93	6,0-10,0	Поведение и структура ХС и ЯШ различны. ХС либо локализованы по всему ядру, либо конденсируются и концентрируются вокруг ЯШ. Выявляются ядрышкоподобные тельца разного диаметра Кариосферогенез
Дегенерация половых клеток на всех этапах оогенеза млекопи-
тающих

За репродуктивный период жизни женского организма примерно
0.1% половых клеток используется для оплодотворения и деторождения,
подавляющее число гамет погибает, претерпевая дегенерацию, на разных
этапах своего развития. Такое перепроизводство половых клеток (женских и
мужских) отражает эволюционно сложившуюся естественную селекцию
наиболее жизнеспособных гамет. Их гибель развивается вследствие генных
или хромосомных мутаций, нарушения иных, чем хромосомы цитологиче-
ских структур и метаболических реакций. Высокий уровень селекции про-
должается и на ранних стадиях эмбрионального развития, предымплантаци-
онного и постимплантационного. Вышесказанное свидетельствует о том,
что и при естественном оплодотворении значительная часть зигот, развив-
шаяся из слияния жизнеспособных мужской и женской гамет, погибает до
или в первый триместр после имплантации по разным причинам, в том чис-
ле - из-за наличия генных и хромосомных мутаций и лишь меньшая часть
способна продолжать внутриутробное развитие, иногда и при наличии му-
таций, совместимых с продолжением жизни индивидуума.

Культивирование женских половых клеток дофолликулярных
стадий развития.

Возможности культивирования ооцитов, выделенных из преовуляторных
фолликулов с целью доведения их до созревания и способности к оплодотворе-
нию неоднократно подтверждены для человека и некоторых видов млекопи-
тающих животных. Для увеличения шансов развития большего, чем это обычно
происходит в естественных условиях, числа потомков от одного животного с
ценными признаками проводят поиск путей использования от особи макси-
мального числа половых клеток, остающихся обычно нереализованными. На
каком этапе оогенеза рационально получать половые клетки? Теоретически - на
стадии оогониев, относящихся к пулу активно митотически делящихся половых
клеток. По данным литературы, до перехода в мейоцит (прелептотенный ооцит)
оогоний делится несколько раз: одни исследователи предполагают -3-4 деления,
другие - до 30 раз. Разработаны методы культивирования эмбриональных гонад
in vitro и получена при этом прогрессия оогенеза, т.е. переход оогониев в мейо-
циты и прохождение последними стадий профазы 1 мейоза. Разработаны под-
ходы к культивированию оогониев. Их пул составляет до 10-15% от всех типов
клеток яичников эмбрионов ранних сроков развития сразу после половой
дифференцировки. Оогонии в этот период интенсивно митотически делятся.
Сделаны попытки получения суспензии одиночных половых клеток гонад без
использования детергентов и ферментов. Для этой цели гонады эмбрионов од-
ного пола сразу после половой дифференцировки (для мышей это -13 сутки
внутриутробного развития) механически измельчали и культивировали в среде
Игла с 10% эмбриональной телячьей сыворотки. Прикрепление эксплантата к
субстрату происходило в течение двух суток. Однако, 50-70% освобожденных
из ткани яичника половых клеток обнаруживали вне эксплантата, т.е. в культу-
ральной среде в суспензии. При этом после центрифугирования взвеси (в тече-
ние 5 минут) полученный осадок половых клеток использовали для исследова-
ния. De Fellici и McLaren (1982) применили три метода изолирования оогониев
из яичников: механическим измельчением и высвобождением оогониев; меха-
ническим путем с предобработкой ЭДТА (версен), что обеспечивало получение
большего числа изолированных половых клеток; выделение оогониев с помо-
щью коллагеназы в градиенте плотности с перколлом. Результаты свидетельст-
вовали в пользу метода выделения оогониев с ЭДТА/перколлом. При этом
оогонии сохраняли митотическую активность и жизнеспособность in vitro в
течение недели (De Fellici, McLaren, 1982).

Исследования эмбриональных стволовых клеток млекопитающих жи-
вотных и человека (1981-1998) показали перспективность их культивирова-
ния и выделения из клеточных колоний гоноцитов.

В связи с проблемой изолирования дофолликулярных незрелых по-
ловых клеток млекопитающих интересно сообщение об обнаружении экто-
пических половых клеток в корковом и мозговом веществе надпочечников
белых мышей. Эти данные могут свидетельствовать о том, что локализован-
ные вне гонады эктопические половые клетки млекопитающих способны
вступать в дальнейшую дифференцировку в мейоз вне гонад и могут диф-
ференцироваться в ооциты в организме мужского пола. Приведенные дан-
ные свидетельствуют о возможности дифференцировки гониев в мейоциты
в условиях культивирования их in vitro. Однако общеизвестно, что вступле-
ние гониев в мейоз регулируется мейоз-индуцирующим фактором. Поэтому,
возникает вопрос о том, возможен ли и насколько физиологично будет про-
текать премейотический синтез ДНК, конъюгация, синтез зиготенной ДНК ,
рекомбинация на стадии пахитены, фолликулообразование в условиях куль-
тивирования таких ооцитов вне организма? Встают проблемы: обеспечения
физиологичности взаимодействия ооцита с фолликулярными клетками (в
условиях их развития вне гонады); становления рецепторной системы ком-
плекса ооцит-фолликул для ответа на гормональные сигналы; цикличности
изменения определенной последовательности и уровня гормонов в ростовых
средах; поддержания баланса взаимодействия между мелкими (первичными
и вторичными) и растущими фолликулами и др.

Несколько иные задачи возникают при попытках получения созрева-
ния ооцитов in vitro. Известно, что в процессе созревания ооцита, находяще-
гося на стадии зародышевого пузырька в Граафовом фолликуле, происходит
ряд морфологических и цитофизиологичсских (метаболических) изменений
(событий), обусловливающих готовность ооцита нс только завершить 1 -е и
2-е деления созревания, индуцируемые повышением концентрации ФСГ и
ЛГ в организме, снижением уровня ингибиторов мейоза. Развивается цепь
событий, приводящих к появлению специфических рецепторов на прозрач-
ной оболочке, обеспечивающих связывание и проникновение сперматозоида
в яйцеклетку; в цитоплазме ооцита синтез белков и РНК обеспечивает про-
хождение оплодотворения и первых делений дробления: продуцируется ма-
териал кортикальных гранул, кортикальная реакция предотвращает поли-
спермию; синтезируется фактор, приводящий к деконденсации хроматина
мужского пронуклеуса (Tesarik et al., 1984). Проведен последовательный, с
хронологией времени при стимуляции овуляции у коров, анализ структур-
ных и функциональных преобразований созревающих ооцитов и фоллику-
лов, подтверждающий определенные вышеупомянутые преобразования со-
зревания комплекса ооцит-фолликул (Dielcman, Bevers,1993).

Имеются сообщения об успешном развитии и созревании in vitro ооцитов
коров, аспирированных из фолликулов диаметром 1-8 мм. В таких фолликулах ,
по нашим наблюдениям, ооциты и их ядра завершают рост, хромосомы конден-
сируются и концентрируются вокруг ядрышка, в котором снижается вакуолиза-
ция (Курило и соавт.,1986). Все эти признаки свидетельствуют о снижении
транскрипционной функциональной активности ядра (Зыбина, 1969; 1971), т.е. о
принципиальном завершении ооцитом определенного этапа - синтеза РНК для
дальнейшего синтеза белков, используемых в дальнейшем отчасти для ооцита,
но главным образом - после оплодотворения, на первых этапах эмбриогенеза.
Показано с помощью высокочувствительного двухмерного электрофореза по-
явление принципиально иных белков в ооцитах человека и коровы (из полост-
ных фолликулов диаметром 2-8 мм), созревающих in vitro от стадии зародыше-
вого пузырька к стадии метафазы 1 деления созревания. Подчеркивают сущест-
вование стадиоспецифичности по разному набору белков в незрелых ооцитах и
на стадии метафазы 2 деления созревания и видовой специфичности спектра
таких синтезируемых белков.

Технология культивирования незрелых женских половых клеток млекопи-
тающих для достижения созревания ооцитов привлекли внимание исследователей
как альтернатива получению созревших in vivo ооцитов, с помощью стимулиро-
вания яичников гонадотропными гормонами. Относительно женщин это является
важным моментом выполнения программы ЭКО (во всем многообразии методов
репродуктивной технологии) с целью избежать гормональной гиперстимуляции
яичников, не безразличной для здоровья женщины. Однако техника культивиро-
вания ооцитов с целью их созревания еще несовершенна и продолжает разраба-
тываться. Например, показано, что внесение в культивационную среду эпидер-
мального ростового фактора (ЭРФ) оказывает стимулирующее для созревания
ооцита на стадии зародышевого пузырька действие, подобно влиянию на вступ-
ление ооцита в деления созревания клеток яйценосного бугорка в присутствии
ФСГ, ЛГ и эстрадиола. Важной задачей является разработка условий культивиро-
вания для созревания ооцитов с целью последующего их криоконсервирования.
Исследования с этой целью ооцитов, полученных от женщин без гормональной
стимуляции овуляции свидетельствуют об отсутствии созревания ооцитов в при-
меняемых условиях и о том, что наивысший уровень сохранения (выживания)
ооцитов после криоконсервации был отмечен в тех случаях, когда аспирирован-
ный ооцит был заключен в компактный крупный яйценосный бугорок (10-50 сло-
ев клеток). Динамика поиска критериев оценки состояния фолликула и ооцита,
совершенствования условий их культивирования in vitro привели исследователей
к технике со-культивирования ооцитов с клетками эпителия фаллопиевых труб,
клетками гранулезы фолликула и пр. Результаты свидетельствуют о положитель-
ном эффекте со-культивирования, хотя имеются и отрицательные отзывы. Отме-
тим, кстати, сообщение о лучшем состоянии эмбрионов в случае, когда технику
1CSI проводили с ооцитами, имеющими интактный слой клеток лучистого венца.
Высокую долю бластоцист (56% и 30%) и рождения телят (65% и
5 7%,относительно 1 и 2 групп, соответственно) получали при развитии, созрева-
нии и оплодотворении in vitro ооцитов коров, аспирированных из фолликулов
диаметром 1-8 мм и переносимых после оплодотворения криоконсервированной
спермой для первых делений дробления либо в перевязанные яйцеводы овец с
гормонально синхронизированным циклом (1 группа), либо в сосуды на подлож-
ку из эпителиальных клеток (2 группа).В данном сообщении ценным являются
также наблюдения автора о том, что лучший результат и выход бластоцист полу-
чен от ооцитов из фолликулов диаметром более 4 мм (Galli et aL, 1991). Исследо-
ватели делают справедливый вывод о том, что не из всех ооцитов из антральных
фолликулов возможно получить жизнеспособное потомство (результат гаметиче-
ской селекции). Причем может быть большой интервал между временем (стади-
ей) произошедшего в гамете нарушения и сроком (стадией) ее гибели. Поэтому,
чем позднее по стадии развития ооцита и фолликула гамета будет аспирирована и
помещена в условия культивирования, тем ожидается выше частота оплодотво-
рения и нормального развития эмбриона и плода.

Вышеперечисленные достижения в культивировании ооцитов и ши-
рокое многообразие примененных приемов, продиктованных отчасти раз-
ными целями культивирования гамет, свидетельствует о быстром принци-
пиальном прогрессе этой области биотехнологии. Имеются первоклассные
обзоры на данную тему, написанные ведущими специалистами мира, опуб-
ликованные в переводе на русский язык и доступные читателю. Поэтому мы
вкратце приведем в данном разделе главные моменты применяющейся тех-
ники культивирования и оплодотворения ооцитов млекопитающих in vitro,
не претендуя на полноту охвата последних достижений в этой области.

Получение ооцитов осуществляют с помощью лапароскопа или ультра-
звуковой техники, трансвезикально, трансвагинально или трансуретрально. В
целях избежать разрыва мембраны фолликула не рекомендуют прокалывать фол-
ликул в его тонком участке. Аспирацию ооцита с фолликулярной жидкостью
(специальным вакуумным насосом при давлении 80-100 мм ртутного столба или с
помощью шприца объемом 20 см3) завершают при спадении стенки фолликула.
При подтверждении наличия ооцита прокалывают следующий фолликул. При
отсутствии ооцита в первом аспирате рекомендовано этот аспирированный фол-
ликул наполнить средой для вымывания ооцитов и вновь провести аспирацию, и
так повторять до момента обнаружения ооцита в аспирате. Подчеркивается, что
подготовка инструментов для забора ооцитов, также как и для их культивирова-
ния и иных манипуляций, играет важную роль в успехе культивирования и целе-
сообразно, чтобы осуществление контроля за этой технической работой проводил
эмбриолог. Для аспирации пользуются одно- или двухканальными иглами. Пред-
почтительнее проводить стерилизацию инструментов автокла-вированием, избе-
гать химические способы дезинфекции, являющиеся нередко токсическими.

Требования к культивационным средам детально обсуждаются, приве-
дены рецепты их приготовления, с дифференциацией сред на разных этапах
процедуры получения, культивирования, оплодотворения ооцитов. Исходными
являются сбалансированные солевые среды Эрла, Тб Уитгинхэма, В2 Менезо,
F10 Хэма и их модификации. В продаже имеются готовые среды в определен-
ной концентрации либо в порошке. Одним из важных моментов, влияющий на
успех культивирования и оплодотворения in vitro, который следует строго учи-
тывать, является состояние осмомолярности среды (допускаются колебания
280-285 мОсмоль/л) .По-прежнему дискуссионным остается вопрос о внесении
в культивационную среду сыворотки крови (донора ооцитов), поскольку нару-
шается стандартность среды, затрудняется сравнение и оценка результатов. Для
оплодотворения используют среды с 7,5-10% сыворотки, для культивирования -
10-15%.Отработана стандартизированная среда для оплодотворения, в которой
сыворотка крови заменена фракцией 5 БСА (бычий сывороточный альбумин) и
может быть также использована для культивирования эмбрионов до стадии
бластоцисты. Она удобна также тем, что покупается в большом объеме и хра-
нится годами замороженной. Не рекомендовано использование как сыворотки
крови, так и сыворотки спинномозговой жидкости вследствие риска передачи
инфекции эмбриону. Предложено добавление в питательную среду 2% диме-
тилсульфоксида (ДМСО) и инсулина с целью оптимизации условий созревания
ооцитов коровы in vitro.

Одним из ключевых моментов качества среды является качество ис-
пользованной для ее приготовления воды. Качества подземных вод вариа-
бельны, поэтому ее пригодность в большей степени зависит от источника
воды, чем от типа установки, используемой в лаборатории для очистки этой
воды. Поэтому рекомендуется закупка воды централизованного приготовле-
ния, например воды Anavar, требующая стерилизации. Столь же зависимы
успехи оплодотворения и культивирования ооцитов и эмбрионов in vitro от
качества парафинового масла, применяющегося в целях сохранения опреде-
ленной осмомолярности среды. Имеется риск токсичности масла для ооци-
тов и эмбрионов. Отработаны схемы его «отмывания», хранения и тестиро-
вания на токсичность. Для тестирования используют эмбрионы мыши до
стадии бластоцисты с блестящей оболочкой и без нее. Альтернативой мето-
ду культивирования ооцитов под парафиновым маслом является использо-
вание для оплодотворения и культивирования ооцитов в объемах до 1 мл
при увлажненной атмосфере тест-пробирок (Falcon 2001)

Следующим тонким моментом при получении, оплодотворении и
культивировании ооцитов и эмбрионов экстракорпорально считается вопрос
о применении антибиотиков в качестве антибактериальных средств для
сред. Как правило, используют стрептомицин и пенициллин. Последний
является аллергеном, что следует учитывать для соответствующих пациен-
тов. Учитывая повышение устойчивости микроорганизмов к антибиотикам,
по крайней мере, ставшим традиционными в эру антибиотикотерапии, реко-
мендуют к применению гентамицин (Sigma-Shering) в конечной концентра-
ции его в среде - 20 мкг/мл Однако, остается открытым чрезвычайно важ-
ный и малоизученный в целом вопрос об инфицировании самих гамет
(ооцитов и сперматозоидов), о целесообразности и возможностях их терапии
и пр.. Альтернативой использованию антибиотиков рассматривают приме-
нение бактериальных фильтров (Millex-GV, Millipore) (Брауде, 1990).

Существенным условием успеха оплодотворения и культивирования
ооцитов является решение проблемы оптимизации газовой фазы (5% СО2), обес-
печивающей pH 7,2-7ДОбсуждается вопрос о том, имеются ли межвидовые раз-
личия в потребности определенного соотношения СО2:О2: N2 в газовой фазе.

Необходимо также соблюдать рекомендации относительно оптимальной
температуры, требующейся при манипуляциях с ооцитами и эмбрионами (37-
37,5°С). Снижение температуры во время переноса аспирированного ооцита до
культивационной камеры может отрицательно повлиять на его метаболизм в
целом. Но одной из причин нарушения ооцита и эмбриона, одним из механиз-
мов блока их дальнейшего развития является чрезвычайная чувствительность
митотического аппарата как ооцита в делениях созревания, так и митотически
делящегося эмбриона к температуре и иным физическим и химическим факто-
ром окружающей их среды. Веретено деления, обеспечивающее механизм пра-
вильного расхождения гомологичных хромосом (хроматид) к противополож-
ным полюсам делящегося ооцита (мейотические деления) или эмбриона (мито-
тические деления) состоит из непрерывных и хромосомных волокон. Непре-
рывные волокна формируются между центриолями, локализованными на про-
тивоположных полюсах веретена деления. Хромосомные - одним концом при-
соединяются к центриоли, противоположным - к центромере (кинетохору) хро-
мосомы и обеспечивают разъединение хроматид и их перемещение к противо-
положным полюсам. Волокна состоят из микротрубочек, которые в свою оче-
редь формируются из макромолекул (белка-тубулина) с помощью лабильных
связей и распадаются при неблаго-приятных условиях. Нарушения клеточного
деления приводят к блоку этого процесса, к формированию дочерних клеток с
неравным числом хромосом между ними (с анеуплоидией хромосом). Этот
краткий экскурс в морфофизиологию деления клетки свидетельствует о важно-
сти отработки всех моментов для оплодотворения и культивирования ооцитов и
эмбрионов, которые еще далеки до оптимальных.

Для повышения частоты оплодотворения и дробления не малую роль иг-
рает качество эякулята, сперматозоидов. Поэтому важно соблюдать и определен-
ные требования к их получению и приготовлению для работы с ними: например,
оптимальным для эякулята человека является 2-3 суток полового воздержания
или от последней эякуляции; следует помнить о том, что первая аликвота наибо-
лее богатая сперматозоидами; образец при транспортировке должен находиться
при температуре +15-38°С. Анализ эякулята проводят после его разжижения (в
среднем - через 30 мин хранения при 37°С), измеряя объем, pH, отмечая цвет,
опалесценцию, подсчитывая число сперматозоидов, их подвижность. Например,
при анализе эякулята человека дифференцируют сперматозоиды с поступатель-
ной быстрой подвижностью (а), поступательной медленной (в), непоступательной
подвижностью (с) и неподвижные (d) (WHO, 1992). Определяют долю живых и
мертвых сперматозоидов при их прижизненной окраске 0,5% раствором эозина на
физрастворе при 37°С, и смешивании 1:1 раствора эозина и эякулята после раз-
жижения. Наносят каплю такой смеси на обычное чистое предметное стекло, по-
крывают покровным и микроскопируют, отмечая живые (неокрашенные эози-
ном), мертвые (розовые), а также - формы патологии сперматозоидов (долю мор-
фологически нормальных и патологических форм, расшифровку разных форм
патологии сперматозоидов). Одной из характеристик эякулята является количест-
во лимфоцитов, включений, лецитиновых зерен, клеток эпителия и незрелых по-
ловых клеток. В нашей лаборатории разработан (1986-1990) количественный ана-
лиз состава по стадиям развития незрелых половых клеток из эякулята, являю-
щийся по сути альтернативой анализу состояния сперматогенеза по биоптатам
яичка и позволяющий определять нарушение определеных этапов развития муж-
ских гамет. Для точного подсчета числа сперматозоидов важно получить низкую
вязкость семенной жидкости, для чего ее можно обработать раствором трипсина
либо пилотированием с помощью пастеровской пипетки или иглы от шприца.
Наличие в эякуляте тяжей приводит к неточному подсчету числа сперматозоидов.
Важным для правильного результата подсчета является работа с хорошими счет-
ными камерами. Их оптимальная глубина (высота) не должна превышать 0,1 мм,
что исключает многослойное расположение спермиев. Удовлетворяющими этим
условиям являются камеры Меклера (Sefi Medical Instruments), Хоруэлла (Horwell
Fertility Counting Chamber, A.R.Horwell) (Брауде, 1990). Камеры Вильсона, Беркера
и Нейбауэра имеют высоту 0,2-0,25 мм и подсчет в них может привести к иска-
жению истинного количества сперматозоидов в 1 мл эякулята и характеристике
подвижности. Более детальные моменты обработки и анализа эякулята, также как
и техника оплодотворения ооцитов и культивирования эмбрионов вне организма
приведены в обзоре Брауде (1990). Вопросы техники капацитации сперматозои-
дов приведены в большом числе сообщений и непосредственно не относятся к
теме нашего обзора.

Литература:

1.	Айзенштадт Т.Б. Цитология оогенеза. М.: Наука,1984, 247.

2.	Зыбина Е.В. Поведение хромосомно-ядрышкового аппарата в период большого роста
ооцитов кролика. Цитология, 1969; 11:1:2 5-31.

3.	Зыбина Е.В. Синтез РНК и белка в растущем ооците и фолликуле мыши. Цитоло-
гия,! 971 ;13:6:768-775.

4.	Кикнадзе И.И., Зыбина Т.Г., Зыбина Е.В., Железова А.И.Особенности структуры ядра
и формирование кариосферы в оогенезе норки. Цитология, 1980;22:2:127-133.

5.	Курило Л.Ф. Морфо-функциональные характеристики оогенеза млекопитающих и
человека. Дисс... докт. биол. наук, М.,1985; 415.

6.	Курило Л.Ф., Зеленина И.А., Схиртладзе З.Ш., Теплякова Н.П. Динамика роста и
созревания ооцитов и фолликулов в яичниках коровы. Биол.науки;1986:10:45-52.

6а. Дагданова А.В.- Культивирование in vitro зигот крупного рогатого скота и кролика,
микроинъецированных генами Pi-интерферона человека и асРНК к вирусу лейкоза
крупного рогатого скота. Дисс... канд. биол. наук, М.,1993.

7.	Парфенов В.Н. Преобразования ядерных структур в оогенезе некоторых позвоночных
(к вопросу о морфогенезе капсулы кариосферы).Дисс...докт. биол. наук,С.-П.,1995, 48.

8.	Почукалина Т.Н. Ядерные структуры в ооцитах человека: морфофункциональный и
иммуноцитохимический анализ. Автореф...дисс.канд.биол.наук.С.-П.,1998, 30.

9.	Теплякова Н.П. Морфологическая характеристика и хронология оогенеза и фоллику-
логенеза в яичниках крупного рогатого скота. Дисс...канд.биол.наук, М.,1987;216.

10.	Baker T.G. A quantitative and cytological study of oogenesis in the rhesus monkey.
J.Anat., 1966;100:761-775.

11.	Dieleman S.F., Severs M.M. Folliculogenesis and oocyte maturation in superovulated cattle.
Int.Symp.Anim.Biotechnol., Kyoto,X/l991; Reprod.and Dev., 1993;36:2:271-273.

12.	Dyakonov L.P., Dagdanova A.V., Emst L.K. The cultivation of early bovine embryo;
microinjected with human interferon pi gene, and determination of total ptotein biosynthe-
sis. J.Exptl Clinical Cancer Res., 1995; 14: Suppl: 1:95-97.

13.	De Fellici M., McLaren A. In vitro culture of mouse primordial germ cells. Exp. Cell Res.,
1983;144:417-427.

14.	Larsen J.K., Byskov A.G., Grinsted J. Growth and differentiation of foetal mouse gonads in
culture studied by flow cytometry on nuclear suspensions. Acts pathol. Micro-
biol.scand.,1981; A89: Suppl.;N274:178-182.

15.	McLaren A. Studies on mouse germ cells inside and outside the gonad. J.
exp.Zool.,1983;228:2:167-171.

16.	Tesarik J.,Kopecny V., Dvorak M., Pilka L., Kurilo L. Human Nonovulatory Oocyte-
Cumulus Complexes: Ultrastructure, Macromolecular Synthesis, and Developmental Poten-
tial. Gamete Res.,1984b;9:153-165.

17.	Сураева H.M. -Получение трансгенных кроликов co встроенными генами соматропи-
на и антисмысловой РНК против аденовируса. Дисс... канд. биол. наук, М.,1989.
Глава 17. Эмбриональные стволовые клетки в биоло-
гии и биотехнологии

Стволовыми клетками принято считать клетки, способные самоподдер-
живаться на протяжении длительного времени, по крайней мере, в течение жиз-
ни организма. Они необходиму организму в любом месте, где возникает по-
требность в новых высоко специализированных (дифференцированных) клет-
ках, которые, как правило, утрачивают способность пролиферировать. Стволо-
вые клетки предназначены для того, чтобы производить такие клетки. Посколь-
ку стволовые клетки не выполняют определенную специализированную функ-
цию, им не свойствен какой-либо характерный вид. Однако, не будучи внешне
дифференцированными, они, тем не менее, детерминированны. Клетку считают
детерминированной, если в ней произошло стойкое внутреннее изменение, ко-
торое делает ее и ее потомков отличными от других клеток эмбриона и предо-
пределяет развитие по специализированному пути. Для стволовой клетки опре-
деляющим будут следующие свойства:

-	способность к неограниченному делению - самообновлению;

-	детерминация, но не окончательная дифференцировка.

Из каждой стволовой клетки при митозе образуются две дочерние,
одна из которых является полной копией материнской клетки и способна
самообновляться, а вторая изначально детерминированна и обладает опре-
деленной потенцией к дифференцировке. Стволовые клетки, порождающие
только один вид дифференцированных клеток, называют унипотентными
(или монопотентными), а два - бипотентными. Те клетки, которые дают на-
чало нескольким видам разных специализированных клеток в пределах од-
ного тканевого типа (например, клетки крови), называют плюрипотентными
или полипотентными. Стволовые клетки, которые обладают неограничен-
ными потенциями к дифференцировке и способны реализовать генетиче-
скую информацию ядер клеток, обеспечивая их дифференцировку, а также
развитие до целого организма, называют тотипотентными. Такими свойст-
вами обладают эмбриональные стволовые клетки. К эмбриональным ство-
ловым клеткам относятся клетки зародыша, которые при определенных ус-
ловиях способны воспроизвести эмбриогенез.

Известно три типа эмбриональных стволовых клеток. Первый тип вклю-
чает клетки, полученные из эмбриобласта предымплантационных зародышей
млекопитающих. Именно их принято называть эмбриональными стволовыми
клетками (ЭСК). Вторым типом эмбриональных стволовых клеток являются
клетки эмбриональных карцином (ЭКК). К третьему типу эмбриональных ство-
ловых клеток относятся примордиальные половые клетки зародыша (ППКЗ).

Следует отметить, что в англоязычной литературе, для характеристи-
ки потенций эмбриональных стволовых клеток, часто употребляют термин
’’плюрипотентные” Применение этого термина представляется в вышеука-
занном смысле некорректным.

Основной постулат генетики развития предполагает, что дифференци-
ровка клеток происходит без генетических изменений. Следовательно, разные
типы дифференцированных клеток используют разные гены из тождественного
для всех клеток наследственного материала. Механизмы, лежащие в основе
регуляции дифференциальной экспрессии генов в развитии, пока мало изучены.
Один из наиболее интересных подходов к изучению дифференциальной экс-
прессии генов связан с получением культур ЭСК. Тотипотентность, постоянст-
во генетической природы и способность сохранять в культуре свойства ранних
эмбриональных клеток делают их перспективным материалом для моделирова-
ния и изучения механизмов эмбриогенеза и цитодифференцировки.

В последние годы все интенсивнее ведутся работы, цель которых - полу-
чение животных со стабильной интеграцией и экспрессией экзогенной ДНК в
геноме (трансгенные животные). Обусловленные переносом генов такие специ-
фические изменения генома млекопитающих имеют большое значение в срав-
нительной эмбриологии, биологии развития, медицине и биотехнологии.

Перенос генов в клетки животных возможен на различных стадиях эм-
брионального и постнатального роста организма. Для создания трансгенных жи-
вотных широкое применение нашли несколько методических приемов: ретрови-
русная трансфекция эмбрионов, микроинъекция ДНК в пронуклеус, использова-
ние трансгенной спермы в качестве вектора и получение эмбриональных химер с
помощью эмбриональных стволовых клеток (ЭСК). Наиболее часто используе-
мым методом, до сих пор, была микроинъекция рекомбинантной ДНК в пронук-
леус. Однако, этот метод далек от совершенства и имеет много недостатков.

Генетическая трансформация ЭСК с помощью векторов, которые со-
держат в своем составе НП ДНК гомологичные участкам ДНК в хромосомах
ЭСК (генный таргетинг), позволяет модифицировать уже известные гены в
геноме мыши, создавая направленные мутации, и изучать функции этих ге-
нов в развитии. Более того, генетически измененные в культуре ЭСК, также
сохраняют способность участвовать в формировании тканей и органов хи-
мерных животных и давать происхождение трансгенному потомству. По-
следние достижения в генном таргетинге позволяют получать генетически-
трансформированные ЭСК, которые показали способность стабильно интег-
рировать экзогенную ДНК и все более интенсивно используются для гене-
тических манипуляций, включая замену, мутации и выключение генов.

Нельзя недооценивать ЭСК и как источник тотипотентных ядер при
создании новых клеточных типов в процессе клонирования.

Савченковой И.П. (1996) впервые суммированы и обобщены основные
мировые достижения по получению и культивированию эмбриональных ство-
ловых клеток, выделенных из эмбриобласта предымплантационных зародышей
млекопитающих. Подробно изложены некоторые методические приемы их
культивирования и трансфекции. Обсуждаются вопросы генетических манипу-
ляций с ними -трансформация посредством гомологичной рекомбинации. При-
водятся примеры использования эмбриональных стволовых клеток для конст-
руирования эмбриональных химер и создания линий трансгенных животных.
Рассматриваются попытки выделения эмбриональных стволовых клеток до-
машних животных и их значение для генной инженерии в животноводстве.
Большое внимание уделяется второму типу эмбриональных стволовых клеток -
примордиальным половым клеткам зародышей млекопитающих. Каждый из
этих объектов вносит свои особенности в клеточную биологию и расширяет
спектр задач, которые она позволяет решать в настоящем и будущем.

17.1. Характеристика эмбриональных стволовых клеток
(ЭСК), полученных из эмбриобласта предымплантационных за-
родышей мыши и их культивирование.

Впервые об оригинальном выделении ЭСК из ранних эмбрионов мышей
(Сообщили в 1981 г. две независимые лаборатории (Evans M.J. and Kaufman
М.Н.; Martin G.R.,1981). Мышиные ЭСК получают из эмбриобласта предым-
план-тационных зародышей при различных условиях. Они могут быть создан-
ны из имплантационно-замедленных бластоцист в стандартной среде, которую
используют для культивирования эмбриональных карцином, из нормальных
бластоцист, культивируемых в стандартной среде с добавлением кондициони-
рованной среды, из нормальных бластоцист в стандартной среде и из морул,
культивируемых в стандартной среде. В настоящее время выделение эмбрио-
нальных стволовых клеток из внутренней клеточной массы предымплантаци-
онных зародышей мыши не представляет труда и во многих лабораториях но-
сит рутинный характер. Однако следует заметить, что существует некоторая
зависимость эффективности получения ЭСК от линии мышей, используемой в
качестве донора бластоцист. Анализ литературных данных показал, что наибо-
лее часто используются для этих целей линии мышей 129 и C57BL/6.

Считается, что ЭСК наиболее близко напоминают примитивную экто-
дерму ранних постимплантационных эмбрионов. Они обладают высокой про-
лиферативной активностью, способны самообновляться и поддерживаться в
недифференцированной форме в течение длительного периода. Для сохранения
недифференцированного фенотипа ЭСК в культуре требуется наличие фидер-
ного слоя, который может быть представлен первичными эмбриональными
фибробластами или перевиваемыми фибробластами мыши (STO клетки).

Смит и Хупер (Smith A.G. and Hooper M.L.,1994) установили, что добав-
ление кондиционированной среды из культуры клеток BRL (печень крысы) в
стандартную среду предупреждает дифференцировку ЭСК. При очистке конди-
ционированной среды BRL был выделен полипептид, препятствующий диффе-
ренцировке и получивший название (DIA) - фактор ингибирующий активность
дифференцировки. Выделенный несколько позже из клеток миеломы фактор
ингибирующий лейкемию (LIF) был полностью идентичен DIA

Опубликованы интересные данные о сохранении тотипотентности
ЭСК мыши в культуре под действием цитокинов: онкостатина М и цилиар-
ного нейротропного фактора.

ЭСК имеют две главные характеристики. Во-первых, по достижении вы-
сокой плотности монослоя или при удалении фидерного слоя они способны
формировать в суспензии клеточные агрегаты - эмбриоидные тела (ЭТ), кото-
рые представляют собой зачатки эндодермы, базальной ламины, эктодермы и
мезодермы и напоминают постымплантационное эмбриональное развитие мы-
ши. В суспензии такие агрегаты формируют цистические ЭТ, эквивалентные
висцеральному желточному мешку, с островками клеток крови. Со временем
наблюдаются мезодермальные производные, такие, как сокращающиеся мыш-
цы. Когда ЭТ прикрепляются к культуральному субстрату, клетки дифференци-
руются в широкий спектр тканей, включающий скелетные и гладкие мышцы,
нервы, меланоциты, кератинизированный и железистый эпителий.

Если ЭСК ввести в организм бестимусных мышей, они порождают тера-
томы, которые также состоят из широкого спектра дифференцированных тка-
ней: кожи, костей, хряща, секреторного эпителия, кератинизированного эпите-
лия, железистых структур и т.д. В тератомах присутствуют и стволовые клетки,
которые продолжают пролиферировать и создают эти дифференцированные
типы тканей. Из тератом получают перевиваемые линии злокачественных тера-
токарцином, которые также представляют смесь стволовых и дифференциро-
ванных клеток. Стволовые клетки эмбриональных тератокарцином можно
культивировать in vitro длительное время. При условиях индуцирующих диф-
ференцировку, они способны воспроизвести эмбриогенез в культуре.

Во-вторых, ЭСК могут быть реинтродуцированы микроиньекцией или
агрегацией в эмбрион и принимать участие в формировании всех тканей разви-
вающегося плода, давая начало химерным животным. Для химер, получаемых
после инъекции ЭСК в полость бластоцисты, отмечаются следующие законо-
мерности: частота рождения химер составляет 35% от общего числа получен-
ных животных; уровень пренатальной смертности довольно низкий: в среднем
70% всех инъецируемых эмбрионов развивается до рождения; доля присутствия
ЭСК у химерных мышей достигает 50%; как правило, химеризм распространя-
ется на все ткани и органы; частота участия ЭСК в формировании зародышевых
тканей химерных животных достаточно высока. Потенциально эти данные мо-
гут быть увеличены за счет использования, в качестве хозяина для ЭСК, эм-
брионов на более ранней стадии развития (8-16 клеток) и тетраплоидных бла-
стоцист (Nady A., Rossant I et al, 1993).

Известно несколько десятков стабильных линий ЭСК мыши, которые
уже в течение многих лет сохраняют свой эмбриональный фенотип.

Следует иметь в виду, что всякая культура ЭСК (даже без видимых мор-
фологических изменений) представляет собой смесь истинных, т.е. ’’нормаль-
ных”, обладающих тотипотентностью, и ’’ненормальных" клеток. Длительное
культивирование ЭСК приводит к прогрессии дифференцированных клеток,
потому, что с каждым пассированием усиливается гетероклональность клонов
ЭСК. Это может привести и к одновременной селекции "ненормальных" клеток,
характеризующихся более высоким ростом и тератокарцинома-подобным фе-
нотипом. Как известно, такие клетки имеют ограниченные способности для
формирования зародышевых линий химер, но часто индуцируют опухоли.

Дифференцировка ЭСК может быть выявлена по морфологическим
критериям. Все описанные линии ЭСК проявляют схожие морфологические
свойства, которые отличают их от других типов клеток. Это клетки округ-
лой формы, диаметром -15 мкм, с большим ядром, в котором видны 4-5 яд-
рышек и узким ободком цитоплазмы. Одной из характерных особенностей
ЭСК является рост компактными колониями с четко ограниченными края-
ми, высокая пролиферативная активность (18-20 ч). Второй особенностью
ЭСК мыши является высокая активность щелочной фосфотазы.
Используя метод клонирования клеток, с целью отобрать клоны ЭСК
с нормальной морфологией, Брэдли с коллегами получили интересные ре-
зультаты. Сравнение субклонированной популяции ЭСК API, АР2.1 и ССЕ с
неклонированной по способности формировать химеры (оценивался про-
цент химеризма; степень ЭС-формирования химер, частота зародышевых
трансмиссий на животное) различий не выявило. Тогда как, в экспериментах
по генному таргетингу, клонированная культура превосходила неклониро-
ванную по количеству клонов, показывающих трансмиссию генома ЭСК в
зародышевых линиях, почти в 10 раз.

Могут ли ЭСК сами автономно обеспечить полное развитие эмбрио-
на? Играют ли ключевую роль в определении их дальнейшей судьбы в эм-
брионе клетки внутренней клеточной массы зародыша-реципиента и меж-
клеточные сигналы, исходящие от них, или же ЭСК сохраняют свою собст-
венную программу, контролируемую в процессе развития, результатом чего
является сложное тело взрослого животного? К сожалению, нужно конста-
тировать, что эволюционный потенциал ЭСК очень мало изучен и остается
открытым из-за отсутствия четких экспериментальных данных.

Культивирование ЭСК мыши.

Известно, что условия культивирования и продолжительность пребы-
вания ЭСК в культуре могут влиять на их тотипотентные свойства. Каждая
из созданных вновь линий ЭСК имеет свои требования для продолжитель-
ного роста в культуре в недифференцированной форме. Сложности, возни-
кающие при культивировании ЭСК, связаны с постоянным стремлением
этих клеток образовывать в культуре трехмерные структуры, напоминаю-
щие начальные стадии эмбриогенеза.

Наши наблюдения привели к выводу, что для поддержания эмбрио-
нального фенотипа ЭСК важны такие параметры, как ростовая среда, коли-
чество клеток для посева в каждом пассаже и интервал пассирования куль-
тур. В наших эксперименах наилучшие результаты были достигнуты при
пассировании ЭСК каждые вторые сутки в соотношении (1:8-1:10) с еже-
дневной сменой среды. Культура поддерживалась при плотности 2 106 кле-
ток на чашку Петри с d-10 см (Савченкова И.П. и др., 1996).

Для культивирования ЭСК линии ДЗ использовали среду Игла в мо-
дификации Дюльбекко (ДМЕМ) с высоким содержанием глюкозы. Некото-
рые линии ЭСК (например , R1 или мутантный клон RK23 линии ДЗ) тре-
буют дополнительного введения в среду рекомбинантного LIF, в конечной
концентрации 1000 Ед/мл.

17,2.1. Среды и растворы,

-	ДМЕМ с 4,5 г/л глюкозы

-	15% сыворотки плода коров (СПК)

-	0,1 мМ 2-меркаптоэтанол

-	2 мМ L-глутамин*

-	0,1 мМ заменимых аминокислот (100-кратный раствор)

-	гентамицин (конечная концентрация 50 мкг/мл)**

Примечание: (*) - L-глутамин обновляйте через каждые две недели,
(**) - можно использовать 100х раствор антибиотика-антимикотика, однако
имейте в виду, что для некоторых линий ЭСК он является токсичным.

Для приготовления 100 мл рабочей среды налейте в мерный стериль-
ный цилиндр 15 мл СПК, 1 мл матричного раствора 2-меркаптоэтанола, 1 мл
100-кратного раствора L-глутамина, 1 мл 100-кратного раствора заменимых
аминокислот и 1 мл 100-кратного раствора антибиотика. Доведите объем
средой ДМЕМ до 100 мл.

Матричный раствор 2-меркаптоэтанола приготовьте, растворив 7 мкл
2-меркаптоэтанола в 10 мл фосфатно-солевого буфера (ФСБ). Фильтруйте и
храните при 4°С в течение недели.

Для промывания ЭСК перед снятием их с субстрата и для получения
первичных эмбриональных фибробластов мы используем неполный фос-
фатно-солевой раствор, без ионов Са2+ и Mg2+ (ФСБ).

-	lOrNaCI

-	025 гКС1

-	l,44rNa2HP04

-	0,25 г КН2Р04

Растворите в 1 л деионизированнойводы, доведите pH до значения 7,2
и автоклавируйте.

Для диссоциации ЭСК и снятия их с субстрата используйте раствор
трипсин/ЭДТА:

-	2,5 г трипсин

-	0,4 г ЭДТА

-	7,0 г NaCI

-0,3rNa2HP04 12Н2О

-	024г КН2Р04

-	0,37 г КС 1

-	1,0г Д-глюкоза

-	3,0 г Tris

1,0 мл феноловый красный

Растворите в 1 л деионизированной воды, pH-7,6, профильтруйте,
сделайте аликвоты и храните при -20 °C. Перед использованием подогрейте
раствор до 37°C.

Приготовление фидерных слоев

Наличие фидерных слоев является одним из необходимых условий
культивирования большинства существующих ЭСК. Фидерные слои необ-
ходимы как для обычного поддержания в культуре ЭСК, так и для выделе-
ния эмбриональных стволовых клеточных линий мыши и других видов мле-
копитающих. Фидерные слои готовят из митотически инактивированных
фибробластов линии STO или из первичных эмбриональных фибробластов
мыши (МЭФ). Заблокировать митоз у клеток можно двумя способами: воз-
действием гамма-излучений в кобальтовой пушке дозой 4000-6000 рад в
течение 1 мин или обработкой митомицином С, которую обычно мы исполь-
зуем.
Приготовление фидерных слоев из STO-клеток.

Выращивание STO-клетки в среде ДМЕМ, дополненной 10%-ми сы-
воротки крови крупного рогатого скота и гентамицином (конечная концен-
трация 50 мкг/ мл).

1.	Вылейте среду из чашки Петри с d-10 см с полным монослоем и
промойте клетки 5 мл ФСБ 2 раза.

2.	Добавьте 2 мл трипсин-ЭДТА и инкубируйте при 37 °C 1-3 мин.

3.	Нейтрализуйте трипсин добавлением 2 мл ростовой среды. Энер-
гично пипетируйте клетки, чтобы возникла единая клеточная суспензия, не
допуская появления пузырей.

4.	Добавьте суспензию к 100 мл ростовой среды и хорошо переме-
шайте.

5.	Распределите суспензию в чашки Петри с d-10 см (из расчета 10 мл
на чашку) и перенесите в инкубатор.

6.	Через 4 сут STO-фибробласты достигнут монослоя, в этот момент
их субкультивируйте. Увеличьте популяцию и заморозьте часть клеток, что-
бы иметь запас. Чашки с клетками, которые оставались более длительное
время без субкультивирования, советуем выбросить, поскольку такие клетки
утрачивают свойство контактной ингибиции и не могут быть использованы
для приготовления фидерного слоя.

Обработка STQ- фибробластов митомицином С.

Приготовьте матричный раствор митомицина С. Для этого добавьте к
2 мг митомицина С 100 мкл ДМСО и 1,9 мл ФСБ. Полученный раствор раз-
лейте в пластиковые эпиндорфы по 100 мкл и храните при -20 °C. Добавляй-
те в среду из расчета 100 мкл матричного раствора митомицина С на 10 мл
рабочей среды.

1.	Возьмите чашки Петри, в которых фибробласты достигли моно-
слоя, вылейте среду и замените на новую, содержащую ДМЕМ с 10% сыво-
ротки крови крупного рогатого скота и 10 мкг/ мл митомицина С.

2.	Инкубируйте клетки от 3 до 6 часов.

3.	Слейте среду с митомицином С с STO клеток, промойте их 3 раза
раствором Хенкса и используйте для культивирования ЭСК.

4.	Если Вам необходимо использовать культуральную посуду других
размеров, можно приготовить фидерные слои иным способом. Для этого
предварительно желатинизируйте чашки Петри, которые Вы будете исполь-
зовать для субкультивирования. Приготовьте 0,1% раствор желатина (сви-
ная кожа, тип1) и простерилизуйте раствор желатина автоклавированием.
Покройте чашки Петри приготовленным раствором (3 мл на чашку Петри с
d-б см) и оставьте на 1 час при комнатной температуре. Жидкость слейте,

5.	STO-клетки, заблокированные митомицином С (пункт 3), промойте
ФСБ и трипсинизируйте. Нейтрализуйте действие трипсина ростовой средой
и перенесите в центрифужные пробирки. Осадите клетки центрифугирова-
нием при 150g в течение 5 мин, сбросьте надосадочную жидкость и ресус-
пендируйте клетки в 2 мл ростовой среды.
6.	Посчитайте концентрацию клеток и приготовьте разведение
2 105клеток на мл.

7.	Перенесите суспензию в предварительно желатинизированные
чашки из расчета 3-4 х104 клеток на см~ (см. таблицу 36).

Примечание: Клетки прикрепляются в течение 20 мин и образуют монослой
через 10-12 час после посева. Плотность клеток контролируйте визуально. Фидерные
слои могут быть использованы до 7-10 сут после приготовления. Перед их использо-
ванием замените среду на новую. Не высевайте клетки в слишком высокой плотно-
сти, так как фидерный слой будет открепляться от субстрата и "скатываться" после
4-5 сут культивирования или при замене среды.

Таблица 36

Объем STO- клеточной суспензии, необходимый для посадки
в чашки Петри с разным диаметром

Диаметр чашки (см)	Площадь (см2)	мл среды на чашку
14	150	25
10	78	10
6	28	5
3,5	9,6	2
1.5	1.8	0.5

Получение эмбриональных фибробластов мыши (МЭФ).

1.	Забейте самку на 12-13 сут беременности путем смещения шейных
позвонков.

2.	Протрите брюшину 70% спиртом, вскройте брюшную полость и
перенесите рога матки в стерильный стаканчик, содержащий 10 мл ФСБ с
антибиотиками.

3.	Вскройте маточные стенки и освободите зародыши.

4.	Поместите зародыши в свежий раствор ФСБ с антибиотиками и
тщательно промойте.

5.	Стерильными ножницами освободите зародыши от плаценты и
плодных мембран и вновь тщательно промойте.

6.	Удалите из зародышей мягкие темно-красные ткани (печень, серд-
це, почки и другие внутренности) и отсеките голову и конечности.

7.	Тщательно промойте тело в трех сменах ФСБ и поместите в сво-
бодную чашку Петри, содержащую подогретый до 37°С 0,25% -ный трип-
син, из расчета 5 мл на зародыш. Измельчите ткань стерильными ножница-
ми и инкубируйте при 37°С в течение 10-15 мин периодически помешивая.

8.	Перелейте суспензию трипсинизированных клеток в стерильную цен-
трифужную пробирку, содержащую ростовую среду и центрифугируйте клеточ-
ную суспензию при 150g в течение 5 мин. Отбросьте надосадочную жидкость, а
осадок ресуспендируйте в ростовой среде и перенесите в культуральные матрасы.

9.	К тканевому осадку добавьте свежий раствор трипсина и процеду-
ру повторите.

10.	Когда клетки достигнут монослоя (1-2 сут), пересейте их с отно-
шением пассирования 1:3. Размножьте и заморозьте.
11.	Фидерные слои готовьте, используя метод, описанный для STO-клеток.

Субкультивирование ЭСК на фидерных слоях

1.	Когда клетки достигнут конфлуентного монослоя, промойте их
ФСБ, добавьте 2 мл раствора трипсин/ЭДТА и инкубируйте 2-3 мин (при
37°С, 5% СО2).

2.	Нейтрализуйте действие трипсина добавлением 5 мл ростовой
среды и осторожно разбейте клетки пипеткой до получения однородной
клеточной суспензии.

3.	Перенесите клеточную суспензию в центрифужные пробирки и
открутите (при 150g , 5 мин).

4.	Отбросьте супернатант, ресуспендируйте осадок и рассчитайте
концентрацию клеток.

5.	Перенесите клеточную суспензию в чашки с фидерными слоями
из расчета 2 106 клеток на 10 см чашку Петри и инкубируйте.

6.	На следующий день смените среду на новую. Пассируйте клетки
каждые вторые сутки.

Криоконсервирование и хранение ЭСК

Состав криозащитной среды:

-	50% среда ДМЕМ

-	40% сыворотка плода коров

-	10% криопротектора (ДМСО или глицерин)

1.	Соберите клетки с субстрата, как описано выше (шаг 1 -2).

2.	Посчитайте клетки и определите их концентрацию.

3.	Перенесите клеточную суспензию в центрифужную пробирку и
осадите при 150g в течение 5 мин.

4.	Отбросьте супернатант и растворите осадок в среде с криопротектором
из расчета 5 106- Г 107 клеток на 1 мл объемозамораживающих ампул.

5.	Распределите клеточную суспензию в ампулы для замораживания и по-
местите в воздушную фазу отделения сосуда с жидким азотом или в полистиро-
ловую коробку и охлаждайте при -70°С в холодильнике (1 ° в мин до -60° С).

6.	Храните замороженные клетки в полистироловых коробках при -70°С
или в жидком азоте при - 19б°С в сосудах Дьюара (для долгого хранения).

Размораживание ЭСК

1.	Возьмите ампулу из хранилища и немедленно поместите в водяную
баню при 37°С. Подождите, пока все ледяные кристаллы растворятся.

2.	Обработайте в ламинаре ампулу 70° спиртом и перенесите ее со-
держимое в центрифужную пробирку с 5 мл ростовой среды.

3.	Открутите клетки низкоскоростным центрифугированием (150g в
течение 5 мин). Слейте супернатант и ресуспендируйте клетки в ростовой
среде.

4.	Перенесите суспензию в чашку Петри с фидерным слоем и инкуби-
руйте. Смените среду на следующий день и субкультивируйте клетки, как
описано выше.
17.2.	Генетическая трансформации эмбриональных стволо-
вых клеток

Прошло 25 лет с момента открытия способности фенотипа соматических
клеток изменяться в результате экспрессии рекомбинантных молекул ДНК.

Серией успешных экспериментов было показано, что соматические
клетки в культуре, при определенных условиях, могут легко поглощать эк-
зогенную ДНК. Кроме того, такая ДНК может стабильно интегрировать в
хромосомы (геном) клеток и, в конечном счете, экспрессироваться как на
уровне транскрипции (в виде мРНК), так и на уровне трансляции (в форме
функционально-активного белка).

Введение, т. е. способ проникновения, рекомбинантной ДНК в эукарио-
тические клетки называется трансфекцией. Под генетической трансформацией
подразумевается включение в НП клетки чужеродной ДНК, с последующей их
репликацией, которая приводит к изменению генетических свойств клеток.

В настоящем разделе обобщен собственный опыт и дан анализ послед-
них литературных данных, которые характеризуют основные принципы и этапы
проведения генетической трансформации ЭСК. Рассматриваются современные
достижения, связанные с применением технологии гомологичной рекомбина-
ции в ЭСК, с целью направленного мутагенеза, и ее выявлением.

Способы введения рекомбинантных ДНК в эмбриональные ство-
ловые клетки в культуре

Возможность ввести экзогенную рекомбинантную ДНК в клетки мле-
копитающих, культивируемые in vitro, имеет большое значение для широко-
го ряда экспериментальных работ. Однако, без использования специальных
приемов введение экзогенной ДНК в клетки млекопитающих и ее выраже-
ние (экспрессия) происходят с малой эффективностью.

Первые эксперименты по трансфекции были выполнены простым до-
бавлением препаратов метафазных хромосом к суспензии клеток (McBride
O.W. and Ozen H.L.,1973). Однако этот метод был вскоре забыт, так как
имел большие недостатки. В 1977г. были продемонстрированы четкие экс-
периментальные доказательства генетической трансформации клеток мле-
копитающих с помощью кальций-фосфатного метода, который, как показа-
ли ранее Грэхем и Ван дер Эб, существенно повышал инфекционность ДНК
аденовируса. Попытки увеличить биологическую активность выделенных
генов привели к разработке других методов, которые увеличивали эффек-
тивность включения ДНК в геном и ее последующую экспрессию.

Существует много способов введения клонированных (экзогенных) ге-
нов в клетки млекопитающих in vitro (Титомиров А.В., Зеленин А.В.,1988).
Среди них широко распространены химические методы, в которых для облег-
чения проникновения в клетки и повышения внутриклеточной стабильности
ДНК применяют химические вещества - фосфат кальция, поликатион декстран-
ДЕАД, полибрен, фосфат стронция. Вторая группа объединяет методы, осно-
ванные на использовании физических агентов: импульсов электрического тока,
соскабливания, с последующей обработкой ультразвуком, микроинъекции и
микроукалывания клеток, высокоскоростного механического пробоя. Биологи-
ческие методы включают введение ДНК посредством слияния клеток с прото-
пластами бактерий, тенями эритроцитов или липосомами, содержащими необ-
ходимый вектор, и путем инфекции клеток рекомбинантными вирусами или
вирусными частицами, собранными in vitro.

Каждый из перечисленных методов введения чужеродной ДНК в
клетки млекопитающих имеет свои преимущества и недостатки. Одни мето-
ды позволяют получать стабильную интеграцию экзогенной ДНК плазмид,
другие более эффективны для достижения временной экспрессии генов (на-
пример, ДЕАД). В данный момент ни один из них не может претендовать на
универсальность. Поэтому выбор техники зависит от природы эксперимен-
та, доступности метода и целей исследователя.

Особый интерес представляет перенос клонированных генов в ЭСК, с ко-
торыми связаны надежды на развитие генной терапии и трансгенезиса (Савченко-
ва И.П..,1999). Для переноса экзогенной ДНК в ЭСК обычно используют те же
методы, что и для постоянных культур клеток млекопитающих. Следует отме-
тить, что технология гомологичной рекомбинации, которую применяют для ген-
ного таргетинга в ЭСК, предъявляет особые требования к способу трансфекции.
Во-первых, поскольку событие гомологичной рекомбинации довольно редкое
явление, важна, высокая эффективность используемого метода. Во-вторых, необ-
ходимо сохранение тотипотентных свойств ЭСК после проведенных манипуля-
ций, т. е. способ не должен индуцировать их дифференцировку.

Анализ литературных данных показывает, что для переноса рекомби-
нантных ДНК в ЭСК мыши используют такие методы трансфекции как
кальций-фосфатная преципитация ДНК, электропорация, ретровирусная
инфекция и микроинъекция.

Большинство успешных экспериментов по генетической трансформа-
ции клеток млекопитающих выполнены традиционным, ставшим уже ру-
тинным, кальций-фосфатным методом трансфекции. Принцип метода за-
ключается в соосаждении ДНК с фосфатом кальция и обработке клеток об-
разующимся преципитатом. Считается, что экзогенная ДНК в составе пре-
ципитата защищена и более устойчива к действию дезоксирибонуклеаз как
внеклеточных, так и внутриклеточных. Точный механизм проникновения
экзогенной ДНК в клетки неизвестен. Предполагают, что кристаллы каль-
ций-фосфатного преципитата ДНК фагоцитируются клеткой, и ДНК, таким
образом, сначала попадает в цитоплазму клеток (Loyter A., Scandos G.A. et
al., 1982). До сих пор непонятно, каким образом ДНК из цитоплазмы прони-
кает в ядро. Было показано, что кристаллы фосфата кальция могут вызвать
растворение фосфолипидных двухслойных мембран клеток, поэтому воз-
можно, что экзогенная ДНК прямо достигает ядра.

В последнее время кальций-фосфатный способ претерпел ряд силь-
ных изменений, которые привели к значительному улучшению эффективно-
сти этого метода (Томилин Н.В.,1987).

Однако, использование кальций-фосфатной процедуры для транс-
формации ЭСК оказалось недостаточно эффективным. Частота трансформа-
ции ЭСК мыши этим методом находилась в пределах 1-3 колонии на 106
использованных в эксперименте клеток. Обработка клеток химическими
агентами, позволяющими увеличить частоту трансформации многих пере-
виваемых линий клеток (например, ДМСО) может вызвать дифференциров-
ку ЭСК. Кроме того, при этом методе наблюдается многокопийное встраи-
вание трансгена в инсерционные сайты (до 30 млн пар оснований), которое
нежелательно при сайт-специфических модификациях генов.

В последние годы широкое распространение получил метод введения
ДНК в клетки электропорацией. Этот метод позволил эффективно ввести экзо-
генную ДНК в клетки лимфоидного происхождения, которые недостаточно
‘ эффективно поглощают ДНК с помощью других методов. Основные преиму-
щества электропорации заключаются в том, что этот метод дает возможность
ввести экзогенную ДНК в клетки любого происхождения. При этом, в ядерный
геном клетки встраивается всего несколько копий плазмидной ДНК (от 1 до 15),
что позволяет изучать ее в участке встраивания. В настоящее время он практи-
чески вытеснил другие методы из-за своей эффективности и быстроты. Частота
трансформации ЭСК электропорацией обычно составляет 1-7 колоний на 104
клеток, использованных в эксперименте.

Долгое время считалось, что самым эффективным методом трансфекции
является микроинъекция НП ДНК в ядро, поскольку частота трансформации
ЭСК при применении этого метода достигает значений 1-5 колоний на 102 кле-
ток. И, хотя эта процедура используется для переноса экзогенной ДНК в ЭСК, в
экспериментах по генному таргетингу (Zimmer A. and Gruss Р., 1989), остается
спорным вопрос о ее преимуществе по сравнению с электропорацией.

Большие надежды связаны с использованием конструкций на основе
ДНК (герпес-, адено-, папова-, покс-) вирусов и РНК (ретровирусов) (Glusman
Y., Highes S.H.,1988). Это объясняется высокой эффективностью заражения
широкого круга клеток-реципиентов: 80-100% клеток способны экспрессиро-
вать чужеродные гены и образовывать колонии на селективной среде, причем
селекция не всегда обязательна. Ретровирусные векторы рассматриваются сей-
час, как наиболее приемлемые для целей генной терапии, если удастся генно-
инженерным путем исключить возможность активации клеточных онкогенов,
экспрессия которых может привести к злокачественной трансформации клетки.

Введение рекомбинантных ДНК в ЭСК электрическим пробоем

При проведении трансфекции ЭСК следует учитывать два важных мо-
мента. Во-первых, ЭСК обычно культивируются на фидерном слое, представ-
ленным фибробластами МЭФ или STO. Некоторые линии ЭСК, как например
ДЗ, можно культивировать без фидерных клеток только в течение 1 -2 пассажей,
после чего необходимо перевести их на питательные слои клеток. Поэтому,
перед трансфекцией ЭСК необходимо иметь в наличии генетически трансфор-
мированные фибробласты, проявляющие резистентность к используемому се-
лективному агенту. Для этих целей лучше иметь перевиваемую линию фиброб-
ластов STO, эффективность трансформации которой выше, чем первичных эм-
бриональных фибробластов и ЭСК мыши. Перед трансфекцией необходимо
отделить ЭСК от фидерных клеток. Во-вторых, культивирование ЭСК требует
наличия в ростовой среде высокого содержания эмбриональной сыворотки
крупного рогатого скота (15% , а для некоторых линий ЭСК и 20%). Известно,
что сыворотка является источником экзогенных дезоксирибонуклеаз, и высокое
содержание сыворотки в момент трансфекции способствует разрушению неза-
щищенных экзогенных ДНК-плазмид. Поэтому мы советуем при трансфекции
ЭСК снижать содержание сыворотки в среде в предселективный период.

Материал и оборудование

-	Прибор для электрослияния (Bio-Rad, gene-pulser)

-	Электропорационные кюветы (Bio-Rad, Кат. N 860-181Ш)

-	Среда для ЭСК (см. разд. 2. 1.)

-	ФСБ без Са2+ и Mg2+

100 мм желатинизированные чашки Петри

-	генетицин (G418)

Метод:

Приготовление ДНК. Рекомбинантную ДНК вместе с ДНК-носителем
(если потребуется) в соотношении 1:10 внесите в пластиковый флакон (эпи-
ндорф), добавьте 0,5 мл 70° этанола и переосадите при 15 тыс. оборотов в
течение 15 мин. Процедуру повторите. После второго осаждения слейте в
стерильных условиях этанол, подсушите ДНК и растворите в стерильном
буфере (0,1 мМ ЭДТА, 1мМ трис-HCl, рН-8.0).

1.	За два дня перед трансфекцией отделите ЭСК от фибробластов. Для
этого трипсинизируйтс ЭСК, как описано в разд. 2.3. шаг 1-5 и инкубируйте
в течение 15-25 мин при 37°С с 5% СО2. За это время фибробласты прикре-
пляются к субстрату, а ЭСК находятся в суспензии.*

2.	Перенесите ЭСК (осторожно слейте) в новые желатинизированные
чашки Петри и культивируйте их с ежедневной сменой среды (желательно в
этот момент в ростовую среду добавить коммерческий LIF в концентрации
500-1000 Ед/мл).

3.	Непосредственно перед трансфекцией ЭСК трипсинизируйте, как
описано в разделе 2.3. шаг 1-3.

4.	Отбросьте супернатант, а клеточный осадок ресуспендируйте в среде
ДМЕМ без сыворотки. Подсчитайте концентрацию ЭСК (на чашке Петри (d-10
см) содержится приблизительно 2 107 клеток). Сделайте нужное разведение.

5.	Смешайте 800 мкл клеточной суспензии с 10-20 мкг экзогенной ДНК
(из расчета 20 мкг ДНК на 107 клеток) и перенесите в специальную кювету.

6.	Задайте параметры электрического тока на приборе д ля электрослияния:
300 В, 500 мкФ (см. разд. З.1.З.).

7.	Перенесите кювету в держатель для кювет с электродами и дайте
электрический пульс.

8.	Удалите кювету из держателя**. Разбавьте клеточную суспензию
ростовой средой, которая содержит 5% СПК и перенесите на новые желати-
низированные чашки Петри Клетки инкубируйте при 37°С с 5% СО2 в те-
чение 3-5 часов, а затем замените среду на стандартную.
9.	Через 24 ч после трансфекции трипсинизируйте ЭСК, пересейте клетки
из расчета 2 1()6 клеток на чашку Петри (d-Ю см) с фидерными слоями, представ-
ленными STO-фибробластами с фенотипом (Neo+) и культивируйте в селектив-
ной среде, содержащей генетицин в конечной концентрации 250-300 мкг/мл.

10.	Меняйте селективную среду каждые вторые сутки. Выросшие на
8-9 сут колонии выделите с помощью титановых цилиндров, нарастите и
заморозьте. Часть клеток отдайте для тестирования наличия рекомбинант-
ной ДНК в ПЦР-анализе.

Примечание (*)- отделить ЭСК от фибробластов можно непосредствен-
но перед трансфекцией описанным выше способом;

(**) _ длЯ эффективной трансфекции рекомендуем поставить клеточную
суспензию на лед в течение 10-15 мин.

Кальций-фосфатная методика трансфекции ЭСК мыши

Приготовление ЭСК. За сутки до трансфекции ЭСК отделите от фиб-
робластов (как описано выше) и субкультивируйте при плотности Г106 кле-
ток в желатинизированные культуральные матрасы площадью 25 см2

Приготовление ДНК-преципитата. В стерильный раствор ДНК в бу-
фере (0,9 мл) внесите 0,1 мл 2,5 М СаС12 и хорошо перемешайте. Медленно,
по каплям, при непрерывном потряхивании, добавьте этот раствор с ДНК к
1 мл буфера 2xHEPES (0,28 М NaCl; 1,5 mM Na2HP04; 50 мМ HEPES, РН-
7,1) во второй маленький флакон. Сразу перемешайте смесь встряхиванием
и оставьте ее при комнатной температуре на 20-30 мин, для образования
ДНК-преципитата (беловато-прозрачная взвесь).

Нанесение ДНК-преципитата на клетки. Среду из культуральных
матрасов слейте. Наслоите на клетки преципитат-ДНК (1,5 мл на матрас с
площадью 25 см2) и инкубируйте в течение 40-60 мин при 37°С. После ин-
кубации удалите с клеток ДНК-преципитат, клетки тщательно промойте
раствором Хенкса (3 раза) и внесите рабочую среду, содержащую 5% эм-
бриональной сыворотки крупного рогатого скота без антибиотиков. Клетки
инкубируйте при 37°С с 5% СО2 в течение 3-5 часов, а затем замените ее на
стандартную среду, применяемую для культивирования ЭСК. Культивируй-
те клетки в течение 24 час.

Селекция. Через 24 часа после трансфекции ЭСК трипсинизируйте,
как описано выше, подсчитайте концентрацию и перенесите на чашки Петри
(d-Ю см) с фидерными слоями ( STO [Neo+]) в концентрации 2-3 10‘6 клеток
в селективную среду. Селективную среду готовьте непосредственно перед
нанесением на клетки. Для этого, в ростовую среду для ЭСК (см разд. 2.1.)
добавьте генетицин в концентрации 300 мкг/мл для ЭСК линии ДЗ*.

Примечание: (*) для других клеточных линий ЭСК величину рези-
стентности к генетицину нужно определить предварительно путем титрования.

3.1.3. Введение рекомбинантных НП гена lacZ E.coli в мышиные ЭСК
линии ДЗ электропорацией.

При использовании вышеизложенных методов, нами были подобраны
оптимальные условия для введения молекул экзогенной ДНК в ЭСК мыши
линии ДЗ электропорацией (Савченкова И.П.,1996). Трансфекцию рекомби-
нантной плазмиды pCMVlacZ проводили двумя методами: кальций-
фосфатным и электропорацией. Результаты анализа влияния некоторых па-
раметров электропорации на жизнеспособность ЭСК линии ДЗ и эффектив-
ность временной экспрессии гена lacZ Е сой в них показали, что наилучшие
результаты получены при электропорации клеток в среде ДМЕМ при крат-
ковременном воздействии электрического тока с параметрами:300 В и 500
мкФ. Продукция прокариотической бета-галактозидазы выявлялась у 35%
клеток и при этом погибало 22 % клеток.

При использовании кальций-фосфатной методики трансфекции экс-
прессия гена lacZ Е0, coli обнаруживалась у 0,1-3% от общего количества
ЭСК, применяемых в опыте. Сравнительный анализ эффективности двух
методов трансфекции в системе временной экспрессии гена lacZ в ЭСК ли-
нии ДЗ выявил преимущество электропорации.

Получение генетически маркированных ЭСК мыши

В ЭСК линии ДЗ электропорацией вводили линейные формы плазмид
pRSVlacZ или pPGKlacZ , которые смешивали с ДНК вектора pSV2neo. В
качестве фидерного слоя использовали генетически трансформированные
фибробласты мыши STO с фенотипом (Neo+). В результате была получена
серия трансформантов ЭСК с фенотипом (Nco+) с частотой трансформации 1
колония на 104, использованных в эксперименте клеток. Для анализа экс-
прессии гена lacZ отбирали по 100 клонов из каждой серии трансформантов.
Результаты представлены в табл.37.

Таблица37

Эффективность экспрессии гена lacZ E.coli.. под контролем разных
промоторов в ЭСК мыши линии ДЗ

Показатели	pRSVlacZ	pPGKlacZ
Временная экспрессия гена lacZ Е. coli (ко- личество клеток с бета-галактозидазой, %)	23	27
Получено клонов с фенотипом (Neo+)	300; 597; 284	486; 203; 259
Из них проанализировано на экспрессию ге- на lacZ Е. coli	100	100
Получено клонов, положительных по бета- галактозидазе	14	38

Для оценки степени сохранности эмбрионального фенотипа ЭСК в
культуре после перенесенных манипуляций часть чашек с клонами ЭСК,
резистентными к генетицину, фиксировали и окрашивали на наличие ще-
лочной фосфатазы и эмбрионального антигена SSEA-1. Параллельно прово-
дили морфологическую оценку колоний. В результате было проанализиро-
вано 100 клонов. В 21 (21 %) из исследованных клонов отмечены признаки
дифференцировки. Большая часть клонов (79 %) ЭСК резистентных к гене-
тицину сохраняла свой эмбриональный фенотип после перенесенных мани-
пуляций. Отсутствие признаков морфологической дифференцировки сопро-
вождалось активностью щелочной фосфатазы и наличием эмбрионального
антигена мыши SSEA-1
Таким образом, мы получили гснстически-трансформированные ЭСК,
устойчивые к генстицину, продуцирующие бета-галактозидазу и сохранив-
шие свой эмбриональный фенотип, что, возможно, позволит изучить судьбу
маркированных ЭСК в нормальном эмбрионе.

Выделение генетически трансформированных эмбриональных
стволовых клеток в культуре

Экспериментально установлено, что экзогенная ДНК, вводимая с по-
мощью векторов, как способных к автономной репликации, так и нет, спустя
несколько часов после переноса в соматические клетки начинает экспресси-
роваться. Результаты ряда работ показали, что количество клеток, в которых
наблюдалась экспрессия чужеродного гена в форме мРНК или белка дости-
гает максимума через 24-48 час после введения и затем начинает умень-
шаться. Такую экспрессию клонированной ДНК в культуре клеток называют
временной, т. е. непостоянной. Причины динамики временной экспрессии
чужеродных генов до сих пор не изучены.

Известно, что для осуществления правильной транскрипции струк-
турного гена необходимы регуляторные элементы двух типов. Регуляторные
элементы первого типа называют цис-регуляторами. Они представляют со-
бой специфические последовательности ДНК на данной хромосоме, которые
оказывают действие только на ближние гены. Второй тип называют транс-
регуляторами. К ним относятся растворимые молекулы (белки и РНК), ко-
торые продуцируются одним геном, а взаимодействуют с другими генами
независимо от их положения.

Временную экспрессию трансгена часто используют для изучения
молекулярного контроля генной экспрессии. Для этих целей обычно исполь-
зуют вектор, который содержит промоторныс фрагменты ДНК интересуе-
мых структурных генов, сшитые с НП ДНК репортерного гена. Репортер-
ными генами называются вирусные или бактериальные гены, экспрессия
которых в клетках может быть легко выявлена с помощью простых и дос-
тупных методов (по ферментативной активности кодируемых ими белков,
или с помощью наличия антител к поверхностным белкам), например, ген
lacZ E.coli, гены поверхностного (S) и корового (С) антигенов вируса гепа-
тита Б человека; ген люцеферазы, ген поверхностного антигена вируса вези-
кулярного стоматита и др.

Наибольший интерес представляет постоянная (стабильная) экспрессия
трансгена, которая наблюдается в небольшом количестве трансфецированных
клеток. Она происходит, в основном, за счет интеграции вектора в ДНК клетки-
хозяина. Для выделения и идентификации стабильных генетически трансфор-
мированных клеток используют селектируемые маркеры. Селектируемые мар-
керы - гены, экспрессия которых в клетках легко определяется по их фермента-
тивным функциям и дает возможность проводить позитивную селекцию в сто-
рону трансформантов, с использованием специальных сред.

В генетике соматических клеток млекопитающих применяется большое
количество селективных генов, которые делятся на рецессивные и доминантные
(Глебов О.К.,1989). Рецессивные селективные маркеры, к которым относятся
ген тимидинкиназы вируса простого герпеса человека (tk ВПГ), ген гипоксан-
тин-гуанинфосфорибозилтрансферазы (hprf), ген аденин-фосфорибозилтранс-
феразы (aprt), ген дигидрофолатредуктазы (dhfr), требуют наличия соматиче-
ских клеток, дефектных по ферменту, кодируемому данным геном. Эти селек-
тивные маркеры не нашли пока широкого применения для выделения генетиче-
ски трансформированных ЭСК мыши, в силу недостаточного количества му-
тантных линий ЭСК дефектных по данным ферментам. Наиболее широкое рас-
пространение для генетической трансформации ЭСК получили доминантные
селективные маркеры. В таблице 38 суммированы основные доминантные гены
и среды, которые используются в настоящее время при выделении стабильных
генетически трансформированных ЭСК.

Таблица 38

Доминантные гены и селективные среды, используемые
при трансформации немаркированных ЭСК

Признак /белок		Ген	Селективный агент
Дигидрофолат-реуактаза		dhfr	метотрексат
Ксантин-гуанин- фосфорибозилтрансфераза		gpt	микофеноливая кислота +ГАТ
Аспарат-карбамоилтрансфераза		cad	N (фосфоноацетил)-Ь- аспарат
Тп5-аминогликозид- фосфотрансфераза		neo	G418 (генетицин)
Металлотионеин-1 или 2		mt-1; mt-2	тяжелые металлы, Zn2+; Cd2+
Гигромицин В-фосфотрансс	юраза	hph	гигромицин В
Аденозин-дезаминаза		ada	дезоксикоформицитин
Пуромицин N-ацетилтрансс	эераза	рас	пуромицин
Хлорамфеникол-ацетилтрансфераза		cat	хлорамфеникол
Множественная лекарственная устойчивость		mdr	колхицин, адриамицин и др.

Одной из самых удобных доминантных селективных систем для ЭСК
мыши является использование прокариотического гена аминогликозид-
фосфотрансферазы Tn5 (пео). Было обнаружено, что клетки различных ви-
дов проявляют высокую чувствительность к аминогликазиду, антибиотику
G-418 (генетицин), который блокирует в клетках эукариот синтез белков
путем фосфорилирования аминогликозидного остатка, а может быть с по-
мощью связывания с рибосомами 80-S. Клетки млекопитающих не содержат
эндогенных аминогликозид-фосфотрансфераз. Ген пео вводят в соматиче-
ские клетки, как гибридный ген, под контролем регуляторных последова-
тельностей других генов. Клетки, экспрессирующие ген пео можно отобрать
в ростовой среде с генетицином, которая убивает нормальные клетки. Сле-
дует отметить, что существует необходимость подбора оптимальной кон-
центрации антибиотика для разных культур клеток путем титрования. Ген
пео нашел большое применение в генетической трансформации ЭСК в каче-
стве позитивного маркера, позволяющего отбирать клоны, в которых про-
изошла гомологичная рекомбинация генов (см. дальше в разд. 3.3).
Недавно предложена интересная система селекции (Watanabe S., Kai N.,
et al, 1995). Было установлено, что антибиотик пуромицин является эффектив-
ным ингибитором белкового синтеза и ген пуромицин N-ацетил трасфераза
(рас) может использоваться в качестве доминантного селективного маркера.
Удобство применения этой доминантной селективной системы в том, что пуро-
мицин ингибирует рост ЭСК мыши в очень низких концентрациях и за очень
короткий период времени. Клетки млекопитающих проявляют различную рези-
стентность к антибиотику пуромицину. И если ЭСК мыши погибают в селек-
тивной среде, содержащей пуромицин в концентрации 0,1 мкг/мл, то клетки
первичных фибробластов мыши, которые используются в качестве фидерного
слоя для культивирования ЭСК мыши, погибают при концентрации этого анти-
биотика в среде более чем 1 мкг/мл. Это очень удобно, потому, что освобождает
исследователя от необходимости трансфецировать клетки первичных фиброб-
ластов, которые, как считается, обладают низкой компетентностью к поглоще-
нию молекул чужеродных ДНК.

В ядрах соматических клеток млекопитающих экзогенная ДНК под-
вергается процессам рекомбинации и лигирования. Встраивание клониро-
ванных генов в геном клеток-реципиентов происходит главным образом в
результате негомологичной рекомбинации, т.е. случайной. В этой связи осо-
бый интерес представляют методы специфического подавления негомоло-
гичной рекомбинации ДНК в ЭСК.

17.3.	Гомологичная рекомбинация и методы ее определения

Явление гомологичной рекомбинации между экзогенными ДНК и их
эндогенными хромосомными гомологами (генный таргетинг) было впервые
исследовано у дрожжей. В ранних экспериментах на клетках млекопитаю-
щих в качестве генов-мишеней (таргетных генов) использовались дефект-
ные копии маркерных генов, которые предварительно вводили в геном с
помощью негомологичной интеграции. Первым эндогенным геном, который
был модифицирован посредством гомологичной рекомбинации, был ген
бета-глобина: (Smithies О., Gregg R.G. et al, 1985) после трансфекции клеток
карциномы мыши генной конструкцией длиной 4,6 тыс. оснований, содер-
жащей последовательности локуса бета-глобина и ген пео, в 0,1% случаев
была доказана интеграция в эндогенный бета-глобин. Несколько позднее
технология гомологичной рекомбинации была применена на ЭСК с целью
манипулирования геномом у трансгенных мышей.

Гомологичная рекомбинация - довольно редкое явление. В среднем,
количество клеток, в которых произошло это событие из всей популяции
трансфЩированных клеток, низкое (106 для метода электропорации). Ожи-
дание того, что частоту генного таргетинга возможно существенно поднять
за счет увеличения количества копий вектора или гена мишени (таргетных
последовательностей в геноме) не оправдалось.

Для выявления клеток, в которых произошла гомологичная рекомби-
нация, требуется подход, который, с одной стороны, позволяет вести быст-
рый скрининг клонов, а с другой - делает возможным отличить гомологич-
ную и значительно чаще встречающуюся негомологичную рекомбинацию.
Один из подходов для нахождения клонов ЭСК, в которых, произошла
гомологичная рекомбинация, основан на введении в таргетный вектор маркер-
ных генов, лишенных промотора (Koctgen F. Stewart C.L.,1993). Экспрессия
таких маркерных генов требует наличия активного хромосомного промотора.
При этом белки, кодируемые маркерным и таргетным генами, могут экспресси-
роваться в виде гибридного продукта, а в случае, если перед старт-сигналом
маркерного гена помещается стоп-сигнал, экспрессия происходит в виде неза-
висимых протеинов. Для усиления селекции Яги и др.(^1 Т., Ikawa Y., et
al., 1990) предложили следующую стратегию: таргетный вектор состоял из го-
мологичного участка эндогенного гена в области старта трансляции, гена пео
без промотора, но с сайтом старта трансляции, второго гомологичного участка и
гена токсина дифтерии A (Dt-A) с промотором, старта стоп-сигналами трансля-
ции, но без сайта полиаденилирования. Отсутствие сайта полиаденилирования
предотвращало экспрессию гена Dt-A до интеграции вектора.

Второй подход основан на использовании векторов, которые делают
возможным селективное давление, направленное на интеграцию в общем, и
против негомологичной интеграции в частности. Этот метод получил назва-
ние позитивно-негативной селекции (ПНС) (Hasty Р. nd Bradley А., 1993).

Третий подход основан на использовании метода полимеразной цеп-
ной реакции (ПЦР) в сочетании с субселекцией (Kim H.-S., Smithies
О., 1988). Этот метод может быть применен как к популяции, растущей на
селективной среде, так и к предварительно неселектируемой популяции.

В зависимости от таргетного вектора можно добиться или инсерции,
или замены сегмента хромосомной ДНК. Замещающий вектор (Рис.70. А)
имеет два участка гомологии к таргетному гену, отделенных друг от друга
кассетой, содержащей маркерный ген. В инсерционном векторе, наоборот,
участок гомологии фланкируется последовательностями маркерного гена.
Различия между двумя этими событиями на молекулярном уровне заключа-
ются в том, что при интеграции по типу инсерции происходит простой крос-
синговер, а при интеграции по типу замены - двойной.

Была показана возможность введения в геном сайтспецифических му-
таций путем двух последовательных событий гомологичной рекомбинации
"in out”, некоторые авторы называют его еще ’’hit run" (Рис. 70.С) (Valanciuc
V., Smithies О., 1991). Используя представленный выше метод, Валанциус и
Смитис ((Valanciuc V., Smithies О., 1991) ввели в ЭСК инсерцию длиной 4
тыс. пар осн. в ген hprt.

Очень перспективна замена гена двойным ударом "double hit" (Bradley
А., 1994). Первый шаг этой стратегии позволяет (Рис.70.Е) с помощью обычного
замещающего вектора создать желаемую замену, например гена hprt в деффект-
ных по этому ферменту ЭСК. С помощью этой стратегии, только, названной (tag-
and-exchange) были введены точечные мутации в ген L - изо-формы гомолога Na,
К-АТФазы в мышиных ЭСК (Askew G.R., Doetschman t.,et al., 1993).

В принципе, фактически все генетические изменения (вставки, выре-
зания, обмен контролирующих районов и кодирующих последовательно-
стей) могли бы быть выполнены этими развивающимися приемами.
03

I

Рис. 70. Типы введения мутаций в геном ЭСК посредством гомологичной рекомбинации

ю

I

CQ
I
Опубликована элегантная методика универсальной сайт-специфической
модификации генов, основанная на системе рекомбинации Сге-loxP бактериофага
Р1 или на дрожжевой рекомбиназе Flp (Sauer В., 1993) (Рис.70Д). Рекомбиназа Сге
обусловливает сайт специфическую рекомбинацию в сайгах 1охР длиной 34 пар
осн. не только в бактериях, но и в эукариотических клетках, эффективно вырезая
при этом хромосомную ДНК, фланкированную двумя сайгами 1охР.

Было показано, что 40-80% ЭСК, временно экспрессирующих фер-
мент Сге, теряют генный фрагмент, локализованный между мотивами 1охР
(Gu Н., Lou j.R.,et al., 1993; Jung S., Rajewsky k.et al., 1993).

17.4.	Мутагенез у трансгенных мышей

Техника гомологичной рекомбинации открыла в последние годы новые
возможности для направленного мутагенеза. Как упоминалось выше, измене-
ния, создаваемые генным таргетингом, в мышиных ЭСК могут быть переданы
через зародышевые линии химер в течение одного года. Химерных животных
разводят и получают гомозиготное трансгенное потомство (F2), фенотип кото-
рых является результатом рекомбинационных событий в ЭСК. Анализ литера-
турных данных (по Medline) показал, что в 1995 г в мире уже существовало по-
головье трансгенных мышей с 327-ю специфическими мутациями генов, полу-
ченных с помощью генетически трансформированных ЭСК.

Преобладающее число работ связано с созданием трансгенных животных,
у которых в результате мутации произошло выключение индивидуальных генов.
Такие животные с отсутствием функций определенных генов имеют большое
значение как модели для изучения болезней человека, биологии репродукции и
других областях. Остановимся подробнее на некоторых из этих работ.

До сих пор апоптоз, или генетически запрограммированная гибель кле-
ток, является недостаточно понятым и изученным процессом, который имеет
место во многих тканях в течение раннего развития и во взрослой жизни у мно-
гих организмов. Ген протоонкогена bcl-2, чей продукт ингибирует определен-
ные формы апоптоза, экспрессируется в течение мышиного развития и в долго-
живущих клетках, таких, как нейроны или стволовые клетки многих тканей у
взрослых мышей. Ген bcl-x, член семейства гена bcl-2 может при альтернатив-
ном сплайсинге продуцировать две белковые изоформы (Bcl-Xj и Bcl-xs), одна из
которых (Bcl-Xj) ингибирует апоптоз. Ген bcl-x экспрессируется в течение раз-
вития мыши в мозге, тимусе и почках взрослых, в основном в форме Bcl-xl. Для
того, чтобы более точно оценить его функциональную роль в развитии, была
использована гомологичная рекомбинация в ЭСК, которая позволила создать
мышей, у которых этот ген был выключен (Motoyama N., Wang F.et al., 1995).
Гетерозиготные мыши (bcl-x+/ ), были здоровыми, но маленькими. Гомозигот-
ные мутантные мыши (Ьс1-х'Л) умирали в течение 13-ти суток беременности.
Интенсивная апоптотическая гибель клеток наблюдалась в постмитотических
незрелых нейронах развивающегося мозга (спинной мозг и основной дорсаль-
ный нервный узел) и гематопоэтических клетках печени. Кроме того, анализ
be 1 -х деффектных мышей показал, что у таких мышей уменьшалось созревание
лимфоцитов. Авторы предполагают, что основная функция гена bcl-x заключа-
ется в обеспечении жизнеспособности незрелых клеток в течение развития
нервных и гематопоэтических систем.
Для выяснения функции гена Рах5 в организме, в нем была создана му-
тация путем мишеневого разрыва в ЭСК (Urbanek Р., Wang Z.-Q et al., 1994). В
течение мышиного развития ген Рах5 экспрессируется в клетках центральной
нервной системы и в В-лимфоидных тканях. Мутантные гомозиготные мыши, у
которых был выключен этот ген, рождались живыми, но рост их был замедлен-
ным и они обычно умирали в пределах 3-х недель. Однако, около 5% таких
мышей выживали и давали потомство. Среди них было выявлено несколько
карликов. Фенотипический анализ Рах 5 деффектных мышей выявил морфоло-
гические изменения в заднем и среднем мозге, а также в передней доле мозжеч-
ка. Более того, все гомозиготные мыши, в отличие от гетерозигот были не спо-
собны продуцировать В-лимфоциты вследствие полного торможения развития
этих клеток на ранней стадии предшественников. Эти данные показали, что ген
Рах5 принимает участие в дифференцировке В-лимфоцитов и развитии мозга.

Среди членов семейства стероидных рецепторов выявлен транскрипци-
онный фактор-AHR, активируемый лигандами, который регулирует диоксин-
индуцибельные гены, включая ген Р450. Функциональный ген Ahr необходим
для того, чтобы опосредовать многие карцио- и терато-генетические воздейст-
вия токсических химических соединений, которые находятся в окружающей
нас среде (такие, как диоксин или вензопурин, выявленные в сигаретном дыме
или продукты других окислительных процессов). Используя технику гомоло-
гичной рекомбинации в ЭСК, были созданы гомозиготные мыши с инактивиро-
ванным геном Ahr (Fernandes-Salguero Р., Pineau Т. et al., 1995).

Такие мыши могут быть очень полезны для изучения канцерогенеза и
оценки риска организма по отношению к различным высоко-токсическим
веществам, которые загрязняют окружающую среду и воздействуют на пе-
чень и иммунную систему. Безусловно, это поможет прояснить природу и
некоторые механизмы (эпигенетические и генетические) в инициации, уси-
лении и прогрессии опухоли. Кроме того, такие животные помогут прояс-
нить роль гена Ahr в нормальном развитии печени и иммунной системы.

Гены семейства Hoxd позвоночных последовательно активируются в
течение морфогенеза и обусловливают формирование конечностей. Исполь-
зуя метод гомологичной рекомбинации в ЭСК Долле и др.(Dolle Р., Dierich
A.et al., 1993) ввели инсерционную мутацию в последний ген комплекса
Hoxd-13 с целью изучения функций этого гена. Гомозиготные мутантные
мыши имели локальные нарушения скелета, которые были обнаружены в
уменьшении длины пальцев обоих конечностей, появлении дополнительно-
го рудиментарного пальца у половины мутантных животных, деформации
всех фалангов и потере части из них. Работа этих авторов расширила пони-
мание развития и эволюции конечностей позвоночных и подтвердила роль
гена Hoxd - 13 в формировании как передних, так и задних конечностей.

Последнее достижение гомологичной рекомбинации в сочетании с
культурой ЭСК - создание тканеспецифических генных модификаций. Суть
метода заключается в попытке фланкировать сегменты гена в ЭСК последо-
вательностями ферментного узнавания гетерологичной рекомбиназой, не
затрагивая при этом функции самого гена. С использованием таких клеточ-
ных линий могут быть созданы мыши, таящие ’’безмолвные” мутации. Ли-
нии трансгенных мышей, экспрессирующие соответствующую рекомбиназу
под контролем тканеспецифического промотора, могут быть скрещены с
мутантными мышами, вследствие чего у потомства будет наблюдаться тка-
неспецифическое удаление сегмента геномной ДНК, который фланкирован
последовательностью, узнаваемой рекомбиназой. Орбан и др. (Orban Р.С.,
Chui D. ct al., 1992) сообщили о получении трансгенных мышей, экспресси-
рующих рекомбиназу Сге под контролем проксимального промотора lek.

17.5.	ЭС - подобные клетки сельскохозяйственных животных

Имеются сообщения, которые ясно показывают, что ЭСК могут быть
получены для большинства домашних животных, среди которых домини-
рующее положение занимают работы на свиньях и овцах (Anderson
G.В.,1992). Значительный прогресс достигнут в подборе оптимальных усло-
вий для выделения ЭС-подобных клеток свиней и овец и поддержания их
эмбрионального фенотипа в культуре с помощью различных методов изоля-
ции, подбора фидерных слоев, ростовых и подавляющих дифференцировку
факторов. Некоторые из созданных, предполагаемых ЭСК культивировали
более одного года. При этом, они проявляли высокую пролиферативную
активность, были позитивны по щелочной фосфатазе, при индукции форми-
ровали простые и цистические эмбриоидные тела.

В нашей лаборатории были начаты исследования по получению куль-
тур ЭСК из эмбрионов крупного рогатого скота. Есть сообщения о выделе-
нии медленно растущих ЭС-подобных клеток, которые терялись в течение
длительного культивирования (Васильева С.П. и Васильев И.М.,1995; Мита-
липова М.М.,1995; Полежаева И.А.,1992).

Данных о получения ЭСК из предымплантационных эмбрионов
крупного рогатого скота немного. Вероятно, это связано с высокой стоимо-
стью зародышей. Перспективным является выделение ЭСК из предымплан-
тационных эмбрионов крупного рогатого скота, которые развивались in vitro
из экстракорпорально оплодотворенных ооцитов. Однако, попытка исполь-
зовать такие эмбрионы для получения в культуре тотипотентного эпибласта
оказалась неудачной. Так, сравнение поведения клеток эпибласта, выделен-
ных из бластоцист крупного рогатого скота, развивающихся в организме с
бластоцистами in vitro показал, что только эмбрионы достигшие стадии бла-
стоцисты в организме являются идеальным источником для получения то-
типотентного эпибласта. В результате длительного культивирования наблю-
далось старение клеток эпибласта. Было выявлено, что условия, которые
применяют для культивирования мышиных ЭСК не могут поддерживать
эпибласт крупного рогатого скота в недифференцированной форме.

В клетках эпибласта бластоцист крупного рогатого скота обнаружи-
валась высокая активность щелочной фосфотазы. Следует заметить, что по-
лученные ЭС-подобные клетки крупного рогатого скота, о которых мы упо-
минали выше, не были позитивны по этому ферменту.

В последние годы внимание исследователей привлек кролик, как объ-
ект для получения ЭСК (Savchenkova I.. Sergeev N.,et а!., 1995). Успешное
выделение и поддержание ЭС-подобных клеток кролика, которые инъеци-
рованы в бластоцисты, описаны в работе Niemann Н. and Strelchenko N.
(1994). При пересадке 80 кроличьих бластоцист, содержащих исследуемые
ЭС-клетки, в рога матки шести синхронизированных реципиентов, было
получено потомство от двух крольчих, к сожалению, все погибшее в резуль-
тате райнего канибализма самок-реципиентов.

Если выделение ЭСК из эмбрионов мыши представляет собой прак-
тически рутинную процедуру и уже можно говорить и о существовании ста-
бильных ЭС-клеточных линий золотистого хомячка, то получение протес-
тированных на химеризм ЭСК сельскохозяйственных животных не было
еще продемонстрировано ни одной группой ученых. Поэтому пока, к сожа-
лению, можно говорить о существовании только ЭС-подобных клеток сель-
скохозяйственных животных.

В этом аспекте обещающим выглядит работа группы итальянских
ученых, которые сообщили о создании линии эмбриональных стволовых
клеток свиньи РЕ-1 (Notariani Е., Laurie S.,et al.,1997). В эти клетки электро-
порацией была введена рекомбинантная ДНК, содержащая НП бактериаль-
ного гена пео, в результате были получены стабильные генетически транс-
формированные клоны ЭСК с фенотипом (Neo+). При инъекции этих клеток
в полость бластоцист и последующей пересадкой в рога матки синхронизи-
рованных реципиентов было получено химерное потомство в двух поколе-
ниях. ДНК-анализ, выполненный с помощью блотта по Саузерну, выявил
наличие у химерных плодов рекомбинантного гена пео (25%).

Известно, что свойства бластомеров зародышей млекопитающих не оди-
наковы. Исходя из сравнения предымплантацного развития эмбрионов грызу-
нов и сельскохозяйственных животных, можно констатировать, что методы,
успешно используемые для выделения ЭСК мыши, не могут быть экстраполи-
рованы непосредственно на другие виды животных. Это особенно касается по-
лучения химерных животных с помощью ЭСК. У мышей наиболее часто ис-
пользуемым методом является микроиньекция 10-15-ти ЭСК в бластополость
бластоцисты хозяина и возврат эмбриона в рога матки синхронизированного
реципиента. Виллер и др.(\УЬее!ег М.В.,1994) показали, что этот метод может
быть применен без больших модификаций для предполагаемых свиных ЭСК.
Однако следует учитывать, что если у мышей весь объем работ по созданию
зародышевых линий химер занимает по времени один год, то для сельскохозяй-
ственных животных, таких, как крупный рогатый скот потребуется 3-4 года
только для того, чтобы узнать результат. Этот факт послужил толчком для по-
иска новых методов, которые отличаются от мышиных. Альтернативный, более
употребляемый подход, который применяют сейчас большинство исследовате-
лей, заключается в переносе ядер ЭСК в энуклеированные ооциты. В 1986 г.
Виладсен (Willadsen S.V.,1986) показал, что ядерный перенос, выполняемый
электрослиянием кариопласта (бластомеры на 16-64 клеточной стадии эмбрио-
нов овцы) с отдельными энуклеированными ооцитами (цитоплазма) получается
как in vitro, так и in vivo. Возможность применения этого метода на сельскохо-
зяйственных животных показали Смис и Вильмут (Smith L.C., Wilmut J., 1989).
Впервые в экспериментах по ядерному переносу культивируемых ЭСК (выде-
ленных из 9-суточных бластоцист и поддерживаемых in vitro в течение трех
пассажей) в зрелые яйцеклетки были получены живые химерные ягнята
(Campbele К., McWhir J.et al., 1995). Удобство этого способа заключается в га-
рантии исследователю, что все клетки в потомстве, включая зародышевые,
представлены генотипом ЭСК. Возможно, что в недалеком будущем у некото-
рых видов домашних животных, а именно овец, станет реальностью изменение
и исследование функций определенных генов с использованием ЭСК техноло-
гии, подобно тому, что достигнуто у мышей. В 1996 г группа Вильмута
(Campbele К., McWhir J.et al., 1996) сообщила о рождении живых ягнят, полу-
ченных посредством переноса ядер ЭСК, которые были созданы из эмбрионов
овец и культивировались в течение 6-13 пассажей. До переноса их ядер в энук-
леированные ооциты, клетки были индуцированы к покою сывороточным голо-
данием. Авторы предполагают, что индукция голодания в донорных клетках
может вызвать изменения в структуре хроматина, для того чтобы помочь ядрам
перепрограммироваться и позволить эмбриональное развитие.

Вселяет надежду (Stice S., Strelchenko N.et а!.,1994)на успех сообщение
об использовании ЭС-подобных клеток крупного рогатого скота (некоторые
ЭС-клеточные линии поддерживались в культуре в течение 9 мес) в экспери-
ментах по переносу ядер в зрелые яйцеклетки. Таким образом были получены
1 000 бластоцист и пересажены животным-реципиентам. Однако химерные пло-
ды успешно развивались в организме только в течение 85-200 суток стельности.

Эпигенетические факторы играют важную роль в ЭС-клеточной техно-
логии (Gandolfi F.,1994).. Известно, что малейшие изменения окружающей сре-
ды при развитии эмбрионов всех видов животных могут привести к ненормаль-
ному развитию или их вырождению. Для того, чтобы исключить обстоятельст-
ва, обусловленные влиянием культуральной среды или другими микроманипу-
ляционными процедурами при получении ЭСК и использовании их в трансге-
незе, необходимо проводить дальнейшие исследования, на клеточном и моле-
кулярном уровнях, направленные не только на технику выделения ЭСК из эм-
брионов сельскохозяйственных животных, но и на изучение полного спектра
факторов, характеризующих взаимодействие эмбриона с воспроизводительным
трактом на разных стадиях развития. Это могут быть ростовые факторы, цито-
кины, экстраклеточный матрикс и другие активные субстраты и субстанции.

17.6.	Примордиальные половые клетки зародышей млеко-
питающих

Вторым типом эмбриональных стволовых клеток являются примор-
диаль-ные половые клетки зародышей млекопитающих (ППКЗ).

Известно, что у большинства животных (насекомые и позвоночные)
обособление половых клеток от соматических происходит в ранние сроки
эмбрионального развития. У таких организмов половые клетки (гаметы)
возникают не в гонадах, а мигрируют туда в процессе развития зародыша.

У зародышей позвоночных гонады закладываются по бокам спинной
брыжейки кишечника в виде половых гребней, представленных продольными
складками эпителия, выстилающего полость тела. Сюда врастают тяжи мезен-
химных клеток из туловищной почки - мезонефроса, участвующие в образова-
нии стромы гонад, и наблюдается передвижение предшественников гамет - пер-
вичных половых клеток, которые еще называют примордиальными зародыше-
выми клетками. Примордий (от лат. primordium) - означает начало, возникнове-
ние, зарождение. Таким образом, первый этап гаметогенеза включает заселение
первичными половыми клетками половых гребней формирующихся гонад.

Большой вклад в изучение путей миграции ППКЗ у млекопитающих
сделан Baxter R.,1952, который впервые выявил наличие большого количества
щелочной фосфатазы в ППКЗ. Гистологический метод (приготовление срезов
на разных стадиях развития зародышей и их окрашивание на щелочную фосфа-
тазу) позволил проследить путь перемещения ППКЗ. Серией четких экспери-
ментальных данных было продемонстрировано, что ППКЗ мыши в количестве
10-100 клеток впервые можно увидеть в аллантоисе 7,5 сут. зародыша. На 9 сут.
они видны у основания аллантоиса и в прилегающем желточном мешке. Счита-
ется, что в этот момент они уже разделились на две популяции, которые будут
мигрировать в правую или левую гонады. После этого ППКЗ перемещаются
каудально от желточного мешка через новообразованную заднюю кишку и за-
тем вверх по дорсальному мезентерию в половой гребень. ППКЗ достигают
развивающиеся гонады к 11 сут. после оплодотворения мыши. Во время мигра-
ции ППКЗ претерпевают ряд клеточных делений и популяция их постепенно
возрастает. У зародыша мыши на 12 сут. развития их насчитывается около
2500-5000 клеток. Миграция ППКЗ длится в среднем 4-5 суток.

Оказавшись в гонаде ППКЗ продолжают митотически делиться и да-
ют начало миллионам потенциальных гамет, часть из которых будет про-
должать самоподдерживаться посредством митоза и представляет популя-
цию стволовых половых линий, а часть вступит на сложный путь цитодиф-
ференцировки. Дифференцировка ППКЗ, которая зависит от окружения в
гонаде, может происходить в двух направлениях. Первое включает сперма-
тогенез, конечным продуктом которого является дифференцированная муж-
ская половая клетка -спермий. Второе направление - оогенез, в результате
которого образуется ооцит П-го порядка.

Согласно принятому определению стволовые клетки, которые дают
начало двум видам специализированных клеток в пределах одного тканево-
го типа, называют бипотентными. Конечным итогом дифференцировки
ППКЗ в гонаде является наличие спермия или ооцита П-го порядка с гапло-
идным набором хромосом. Слившись при оплодотворении, они образуют
зиготу, которая имеет диплоидный набор хромосом и обладает неограни-
ченными потенциями к дифференцировке, результатом развития которой
является сложное тело животного. Таким образом, можно заключить, что
ППКЗ, как и клетки, выделенные из эмбриобласта предымплантационных
зародышей мыши, обладают уникальным свойством - тотипотентностью.

ППКЗ млекопитающих претерпевают длительную миграцию и нахо-
дятся в тесном контакте с другими соматическими клетками, по которым
они передвигаются. Кроме того, они способны проникать через клеточные
монослои и мигрировать по клеточным пластам.

Согласно существующим представлениям, миграция клеток на даль-
ние дистанции может происходить посредством хемотаксиса, гаптотаксиса,
гальвано-таксиса и контактного ориентирования (Гилберт С., 1995).
Механизмы, лежащие в оенове миграции ППКЗ млекопитающих в
половые гребни гонад зародыша пока не изучены. Возможно, что все опи-
санные выше явления имеют место. Ранние исследования продемонстриро-
вали, что половые гребни продуцируют растворимый фактор, который уси-
ливает пролиферацию ППКЗ в культуре и может стимулировать направле-
ние передвижения ППКЗ в гонады (Eddy Е.М., Clark J.M. et al.,1981). Иссле-
дования по изучению этого явления у зародышей Xenopus позволили обна-
ружить зависимость адгезии и миграции ППКЗ от концентрации молекул
фибронектина и от ориентации волокон этого гликопротеина во внеклеточ-
ном матриксе, которым выстлан путь передвижения предшественников по-
ловых клеток у зародышей лягушек (Heasman J., Hynes R.d. et al.,1981).

Исходя из выше изложенного, кажется не случайным факт, что куль-
тивирование незрелых ППКЗ млекопитающих требует наличия питающего
слоя, в качестве которого обычно используются монослои фибробластов, в
частности, линии STO. Известно, что фибробласты синтезируют фибронек-
тин. Считается, что монослой фидерных клеток обеспечивает незрелые
ППКЗ в культуре необходимыми метаболитами и увеличивает и^выживае-
мость in vitro. Попытки культивировать постмигрирующие ППКЗ без моно-
слоя фибробласто-подобных клеток приводили к гибели ППКЗ в течение
суток. Следует заметить, что в отличие от ЭСК, выделенных из эмбриобла-
ста мышиных зародышей, ППКЗ не прикрепляются к субстрату, а культиви-
руются в виде суспензии клеток над фидерным слоем (De Felici and McLaren
A.,1983; Donovan P.J., Stott D., et al.,1986).

Эти необычные клетки имеют некоторые морфологические особенности,
отличающие их от других. ППКЗ клетки шарообразной формы, диаметром
около 13 мкм, с низким ядерно-плазматическим соотношением. Следует отме-
тить, что среди популяции мигрирующих и постмигрирующих ППКЗ сущест-
вуют некоторые различия. Мышиные ППКЗ, которые мигрируют в зачатки го-
над зародыша, обладают поляризацией цитоплазмы и наличием псевдоподий.
ППКЗ, которые интегрировались в гонады зародыша, постепенно теряют эти
морфологические особенности в динамике развития гонад. Более того, по-
стмигрирующие клетки теряют способность передвигаться, уменьшается их
адгезия к фибронектину, изменяются и поверхностные рецепторы, в частности,
происходит потеря экспрессии антигена SSEA-1.

Исследования мышиных постмигрирующих ППКЗ в культуре выявили
уникальность их строения. Оказалось, что эти клетки не имеют на своей мем-
бране рецепторов адгезии. Считается, что рецепторы плазматической мембраны
играют основную роль в запуске экспрессии генов. Отсутствие же основных
рецепторов на плазматической мембране ППКЗ демонстрирует обособленность
этих клеток от прямого контакта с сигналами окружающего мира.

Анализ этих клеток обнаружил наличие на поверхности ППКЗ пока един-
ственного рецептора для цитокинов - трансмембранного белка gp 130(Koshimizu
U., Taga Т., et al., 1996). Поэтому эти клетки, как и ЭСК, оказались чувствитель-
ными к цитокинам. Добавление онкостатина и LIF к ППКЗ, помещенным на фи-
дерный слой, представленный клетками SI/S14-m220, одинаково усиливало вы-
живаемость и пролиферацию постмигрирующих (колонизирующих) ППКЗ.
Если ППКЗ мыши ввести нс в гонады, а в другие ткани реципиента,
то они, в отличие от ЭСК, вызывают образование опухолей, из которых в
дальнейшем можно получить стволовые клетки карцином. Этот факт еще
раз свидетельствует об изоляции ППКЗ от сигналов хаотических событий,
происходящих в соматических клетках.

Однако при введении ППКЗ в гонады зародыша, они способны принимать
участие в образовании всех органов и тканей химерных плодов и поэтому могут
быть использованы в качестве перспективного материала для геномных манипу-
ляций у млекопитающих. Более того, к преимуществам этого подхода относится
возможность предварительного прогнозирования их пола. Существующие мор-
фологические различия мужских и женских гонад зародыша позволяют легко
получить популяцию мужских или женских ППКЗ в культуре.

Анализ литературных данных показал, что ППКЗ редко используются
как вектор для переноса рекомбинантной ДНК. Возможно это связано с тем,
что, к сожалению, до сих пор не получены постоянные линии ППКЗ млеко-
питающих. С другой стороны, одной из причин этого, на наш взгляд, явля-
ется огромный интерес исследователей к ЭСК, полученным из эмбриобласта
зародышей млекопитающих, которые составили огромную конкуренцию
ППКЗ. Нужно констатировать, что вплоть до 1990 г работы велись по выде-
лению и изучению поведения мышиных ППКЗ в культуре. Что касается до-
машних животных, то исследования ППКЗ проводились только в образцах
фиксированных тканей гонад зародышей.

В 1990 году появилось сообщение группы немецких ученых о полу-
чении культур ППКЗ из гонад зародышей крупного рогатого скота, свиней и
кролика (Leichthammer F., Baunack Е. and Brem G.,1990). ППКЗ были выде-
лены из гонад зародышей на 18, 29 и 40 сутки беременности крольчих, сви-
ней и коров соответственно. Химико-механическая (0,5% раствор ЭДТА и
Игла) обработка гонад позволила получить популяции предполагаемых
ППКЗ исследуемых видов. Основными критериями отбора предполагаемых
ППКЗ были их морфологические особенности и наличие фермента щелоч-
ной фосфотазы (за исключением кроличьих ППКЗ). Было продемонстриро-
вано, что ППКЗ всех трех видов имели шарообразную форму и низкое ядер-
но-плазматическое соотношение. У 10% из всей популяции ППКЗ крупного
рогатого скота было выявлено наличие псевдоподий. Интересным оказался
факт, что в популяции ППКЗ, выделенных из гонад на более поздних стади-
ях развития зародыша, обнаруживалось исчезновение псевдоподий-
содержащих клеток. Было установлено, что диаметр клеток составлял 18, 13,
и 10,5 мкм у крупного рогатого скота, свиней и кроликов, соответственно.
Наблюдалась тенденция единичных ППКЗ по мере длительности культиви-
рования образовывать группы клеток. Остается непонятным факт группи-
ровки этих клеток, выделенных из гонад зародышей сельскохозяйственных
животных в динамике культивирования, так как считается, что мышиным
ППКЗ не свойственно объединение в группы.

Основная проблема, с которой сталкиваются исследователи при выделе-
нии ППКЗ из гонад, заключается в оптимальном подборе возраста зародыша.
Использование зародышей на ранних стадиях беременности позволяет легко
идентифицировать ППКЗ по морфологии, но популяция этих клеток очень ма-
ла. Гонады, полученные из плодов на более поздних стадиях развития, содержат
большое количество ППКЗ. Однако их очень сложно выделить из-за потери
морфологических особенностей, характеризующих ППКЗ.

Можно предположить, что потеря морфологических особенностей ППКЗ
млекопитающих при длительном культивировании соответствует процессам
дифференцировки ППКЗ в организме животных. Быстрая дифференцировка
ППКЗ млекопитающих представляет трудности при их культивировании и ис-
пользовании в качестве вектора для получения трансгенных животных.

В 1997 г. группе ученых из ABS (США) под руководством доктора Би-
тона впервые удалось получить клонированного теленка по кличке Тен"
(Strelchenko N.,1997), Исходным материалом для клонирования послужили ядра
примордиальных зародышевых клеток (ППКЗ) крупного рогатого скота, кото-
рые были получены ранее из закладок женских гонад 30 сут. плодов. Авторы
сообщают о высокой эффективности данного методического приема. Из 15 пе-
ресадок ядер ППКЗ в энуклеированные яйцеклетки крупного рогатого скота
была получена одна стельность, которая закончилась благополучно.

Вселяет надежду на успех работа ученых, в которой сообщается о полу-
чении культур ППКЗ свиней (Piedrahita J.A., Moor К. et al., 1998). Предваритель-
ные результаты показали, что ППКЗ, выделенные из гонад 25-27 сут. плодов
свиньи и поддерживаемые в культуре с добавлением в культуральную среду
трех ростовых факторов человека (LIF; фактор роста фибробластов и фактор
роста стволовых клеток), способны поглощать рекомбинантную ДНК. Генети-
чески маркированные ППКЗ были введены в бластоцисты реципиента, резуль-
татом чего явилось получение 20 химер, 3 из которых оказались трансгенными.

Таким образом, ППКЗ представляют в настоящее время перспективный
материал для конструирования новых клеточных типов у млекопитающих.

Литература

1.	Васильева С.Г., Васильев И.М.. Влияние стадии развития и условий культивирования эмбрионов
коров и мышей на получение ES-подобных клеток //Онтогенез. 1995. Т.26. N.3. С.206-212.

2.	ГилбертС.. Биология развития. М: "Мир” 1995. Т.З. 235с.

3.	Глебов О.К.. Генетическая трансформация соматических клеток. Л.: "Наука" 1989. 350 с.

4.	Мигалипова М.М.. Факторы, влияющие на развитие эмбриональных стволовых клеток крупного
рогатого скота и мыши в системе in vitro и in vivo// Автореф. канд. дисс.. Дубровины. 1995.

5.	Полежаева И. А. Получение, генетическая трансформация и использование эмбриональных
стволовых клеточных линий. Автореф. дис... канд. биол. наук. М. 1993.

6.	Репин В.С., Сухих Г.Т.. Медицинская клеточная биология//М. "БенБим" 1998. 199с.

7.	Савченкова И.П., Зиновьева Н.А., Булла Й., Брэм Г.. Эмбриональные стволовые клет-
ки, их генетическое изменение путем гомологичной рекомбинации и использование в
получении трансгенных животных//Успехи совр. биологии. 1996. Т. 116. N.I. С.78-92.

8.	Савченкова И.П., Эмбриональые стволовые клетки в биологии: настоящее и будущее.
Дубровицы, 1999.-100с.

9.	Савченкова И.П.. Введение гена lacZ Е. coli в эмбриональные стволовые клетки мыши
D3 электропорацией//Докл. РАСХН. 1996. N.6.C.36-37.

10.	Савченкова И., Фляйшманн М., Булла И., Брэм Г.. Использование эмбриональных
стволовых клеток (ЭСК) мыши для получения химерных животных// Цитология.
1996. Т.38. N10. С. 1118-1123.

11.	Тугизов Ш.М.. Структурно-функциональный анализ мембранных белков вирусов в
генетически-трансформированных клетках//Автореф. дис. докт. биол.. М. 1996.

12.	Филатов Ф.П., Тугизов Ш.М., Савченкова И.П.. и др.. Рекомбинантный поверхност-
ный белок вируса гепатита В, экспонирующий иммунодоминанту мембранного белка
вируса ВИЧ 1//ДАН. 1991 Т.327. Nl. С. 172-175.
13.	Anderson G.B.. Isolation and use embryonic stem cells from livestock species// Animal
Biotechnology. 1992 V.3. N.I. P. 165-175.

14.	Askew G.R., Doectschman T., Lingrel J.B.. Site-directed point mutations in embryonic stem cells:
a gene-targeting tag-and-exchange strategy// Mol. Cell. BioL 1993. V.13. P.4115Л124.

15.	Bollag R.J., Waldman A.S., liskay P.M.. Homolologous recombination in mammalian cdls//
Annu. Rev. Genet. 1989. V 23. P. 199-225.

16.	Buehr M.. The primordial germ cells of mammals: some current perspectives// Exp. Cell
Res.. 1997. V.232. P. 194-207.

17.	Cameron E.R. Recent advances in transgenic technology// Mol. Biotechnol. 1997. V.7. N.3. P. 253-265.

18.	Campbdl K., Me Whir J.. Ritchie B., TOlmut I.. Production of live lambs following nudear
transfer of cultured embryonic disc cdls//Theriogcnology. 1995. V.42. P. 181.

19.	Campbell K., McWhir J., Ritchie В et al.. Sheep cloned by nudear transfer from a cultured
cdl linc//Naturc. 1996. V.380. P.64-66.

20.	Doetschman T.. Gene transfer in embryonic stem cdls//Trans. Anim. Technol.. 1994. P. 115-146.

21.	Evans M.l, Kaufman M.H.. Establishment in culture of plunpotential cells from mouse
embryos//Nature. 1981. V.291 P. 154.

22.	Gossler A., Doctsdunan T.C , Кот R.. Transecncsis by means of blastocyst derived embry-
onic stem cell lines/ZPtoc. Natl. Acad. Sd. USA. 1986. V.83. P.9065-9069.

23.	Gu H., Zou Y. R., Rajewsky K.. Independent control of immunoglobin switch recombination at individ-
ual switch regions evidenced through Cre lox mediated gene taigeting// Cdl. 1993. V.73. P. 1155-1164.

24.	Hasty P. and BradleyA.. Gene-targeting vectors for mammalian ctlls/Лп: Joner A (Edt).
Gene Taigeting. A Practical Approach. LTR Press. Lancaster. 1993. P. 131.

25.	Hasty P., Ramirez-Solis R., Knimlauf R.. Introduction of a subtle mutation into the Hox-2.6
locus in embryonic stem cells// Nature (London). 1991. V.350. P.243-246.

26.	Hasty P., Rivcra-Pcrcz J., Bradley A.. The length ofhomology required for gene targeting in
embryonic stem cdls//Mol. Cdl. Biol.. 1991. V. 11. P.5586-5591.

27.	Hasty P., Rivera-Perez J., Chang C.. Target frequency and integration pattern for insertion
and replacement vectors in embryonic stem cells//Mol. Cdl.Biol.. 1991c. V.U. P.45094517.

28.	Heasman J., Hynes R.D., Swan A.P. et al.. Primordial germ cdls of Xenopus embryos: The
role of fibronectin in thdr adhesion during migration//Cdl. 1981. V.27. P.437-447.

29.	Higashi T., SasaiH., SuzukiF.. Hamster cells line suitable for transfection assay of trans-
forming genes//Ptoc.Natl.Sd. USA. 1990. V.87.P.2409-2413.

30.	Jacnisch R., Mintz B.. Simian Virus 40 DNA sequences in DNA of healthy adult mice derived from
predimplantation blastocysts injected with viral DNA// Proc. Natl. Acad.Sd.DSA. 1974. V.71. P. 1250-1254.

31.	Joyner A.L.. Gene taigeting and gene trap screens using embryonic stem cells: new ap-
proaches to mammalian development//Bioessays. 1991. V. 13. P.649-656.

32.	Joyner A.L., Skames W.C., Rossant J.. Production of a mutation in the mouse En-2 gene by
homologous recombination in ES cells//Nature (London). 1989. V.338. P. 153-156.

33.	Joyner AL., Hen-up K., Auerbach B.A.. Subtil cerebelly phenotype in mice homozygous for
a targeted deletion of the En-2 homeobox// Science. 1991. V.251. P. 1239-1243.

34.	JungS,, Rajewsky K., RadbruchA.. Shutdown of dass switch recombination by deletion of a
switch region control dement// Sdcncc. 1993. V.259. P.984-987.

35.	Kaufman M.H., Robertson E.J.. Handyside A.H.. Establishment of pluripotcntial cell lines
from haploid mouse embryos// J. Embryol. Exp. Morphol. 1983. V.73. P.249-261.

36.	Kaufman R.J.. Sdection and co amplification of heterologous genes in mammalian cells//
Methods Enzymol. 1990. V.185. P.537-566.

37.	Kim H.-S., Smithies 0.. Recombinant fragment assay for gene taigeting based on polymerase
chain reaction// Nud. Asids Research. 1988. V.I 6. P.8887-8903.

38.	.Klein T.M, Wolf E.D„ WuR.. High vdodty microprojectiles for delivering nuclei acids into
living cdls//Nature. 1987. V.327. P.70-73.

39.	Koetgen F., Stewart C.L.. Simple screening procedure to detect gene taggeting events in
embryonic stem cells// Methods in Enzymology. 1993. V.225. P.878-890.

40.	Koller B.H., Smithies 0.. Altering genes in animals by gene targeting// Annu. Rev. Immu-
nol.. 1991 V.10. P.705-730.

41.	Koshimizu U.. Taga T.. Watanabe M. et al.. Functional requirement ofgp!30-mcdiated sig-
naling for growth and survival of mouse primordial germ cdls in vitro and derivation of em-
bryonic genn (EG) cdls// Devdopmcnt 1996. V. 121 N.4. P. 1235-1241

42.	Lakco M., Sauer B., Mosinger B. et al.. Targeted oncogene activation by site specific re-
combination in transgonic micc//Proc.Matl. Acad. Sd. USA. 1991 V.89. P.6232-6236.
Глава 18. Контаминация культур клеток животных ми-
коплазмами и их цитопатогенное действие

Проблема микоплазма-контаминация культур клеток приобрела особое
значение в связи с широким использованием различного типа клеток в биотех-
нологии и, в частности, в гибридом ной технологии и в других новых направле-
ниях клеточной биотехнологии, при диагностике вирусных заболеваний и био-
промышленном производстве противовирусных вакцин и диагностикумов, что
вызывает настоятельную необходимость в разработке методов, обеспечиваю-
щих стабильность культуральных и морфо - функциональных свойств клеток.

В 1956 г. появилось первое сообщение L.Robinson с соавторами о ’’за-
грязнении” клеточных культур организмами из семейства Mycoplasmataceae.

Микоплазмы - класс самых мелких и наиболее просто организован-
ных прокариотов (класс Mollicutes), способных к самостоятельному воспро-
изведению, относящихся к отряду Mycoplasmatales. Они не имеют клеточ-
ной стенки, а имеют наружную оболочку в виде цитоплазматической мем-
браны, сходной с клеточной мембраной. Клетки микоплазмы могут быть
сферической или вытянутой формы 0,3 - 1,0 мкм в диаметре, но могут обра-
зовывать длинные нити (до 100 мкм), иногда ветвящиеся тяжи (L.G.Edward,
1967; Г.Ф. Коромыслов, Я. Мессарош,Л. Штипкович, и др. 1987).

Микоплазма - контаминанты вызывают изменение метаболизма клет-
ки - хозяина, извращая тем самым ответную реакцию клетки на различные
антигены, что приводит к получению недостоверных данных при использо-
вании культур клеток в вирусологии и биотехнологии.

Микоплазмы часто обнаруживаются в культурах клеток и тканей,
выращиваемых вне организма. К настоящему времени накопилось много
сведений о контаминаци культур клеток этими микроорганизмами (M.F.
Barile 1981; Д.Ф.Осидзе; Г.Я. Каган, 1983; Л.П. Дьяконов, 1980; О.Ш. Расу-
лев, 1987; G. Gallagher et al.,1988).

Уровень контаминации перевиваемых клеток микоплазмами в лаборатори-
ях США определяется в 10-15%. Этот показатель для первичных и малопассиро-
ванных культур ниже и составляет 1 -5%. В лабораториях Европы контаминиро-
ванность перевиваемых клеток микоплазмами существенно выше и обычно дости-
гает 25-30%. Обследование 57 клеточных культур в лабораториях КНР выявило
присутствие микоплазм в 63 % случаев. В некоторых лабораториях Японии кон-
таминация культур клеток микоплазмами составила 82% (G.J.Mc. Garity, 1987).

Первично трипсинизированные культуры клеток редко контамини-
рованы микоплазмами. М. Barile (1981) из 3200 проверенных первичных
культур только в 42 обнаружил контаминанты.

Контаминанты были обнаружены в первичных культурах почек, тес-
тикул и сыворотке телят, эмбриона кур,почки кролика, носовой органной
культуры хомячка, эмбриона крыс и мышей ( М. А. Башмакова,
В.М.Солдатова, 1971; J. Stipkovits et al., 1975 ; A. Yoshida, 1981).

Источником микоплазм могут быть компоненты питательных сред:
сыворотка крупного рогатого скота, лошадей, свиней, трипсин; инфициро-
ваны микоплазмами могут быть ткани и органы, которые используются для
получения клеточных культур. Однако, по-видимому, самым распрастра-
ценным способом контаминации является внутрилабораторная передача
микоплазм от культуры к культуре, а также человек (многие виды мико-
плазм локализуются в ротовой полости человека) (M.F. Barile, 1979; Е.Д.
Смирнова и др., 1985; Р Brams 1988).

Культивируемые клетки млекопитающих могут длительное время
сосуществовать с микоплазмами при множественности инфекции до сотни
микоплазм на клетку. При этом клетки продолжают нормально делиться и
инфекция может быть обнаружена только при специальном анализе. В про-
цессе длительного пассирования микоплазмы способны переходить к массо-
вому размножению, тогда клетки отслаиваются, агрегируют и гибнут.

Микоплазмы способны вызывать в культурах клеток острую, хрони-
ческую и латентную инфекцию ( Г Г Миллер, В. В. Раковская и др., 1985;
Л.П.Дьяконов, 1987).

Латентной считается такая контаминация, при которой, несмотря на
активное размножение микоплазм, не наблюдается макро- или микроскопи-
ческих изменений в культуре клеток.

Хроническая контаминация часто также не сопровождается выражен-
ными цитопатогенными изменениями в клетках, но отмечается снижение
адгезивной способности, замедление роста и уменьшение конечного выхода
количества клеток.

Острая контаминация характеризуется выраженными цитопатоген-
ными изменениями в культуре клеток и последующей дегенерацией.

Электронно-микроскопическое изучение спонтанно и экспериментально
инфицированных культур клеток показало, что микоплазмы локализуются глав-
ным образом на поверхности клеток и изредка обнаруживаются в цитоплазме
(D.K.F. Chandler et al., 1982; В.В. Гриценко, 1982, Л.ПДьяконов и др., 1980).

M.N.Abu - Zank et al. (1978) показали, что особенности взаимодействия
микоплазм и клеток зависят от количества микоплазм и их близости к поверх-
ности клеток. При большом количестве микоплазм, они располагаются на по-
верхности клеток очень плотно друг к другу, образуя коккобациллярную фор-
му. В том случае, если микоплазмы были отделены друг от друга, они имели
вид гранулярных, фибриллярных структур с терминальными пузырьковидными
окончаниями, которыми они прикреплялись к поверхности клеток.

Механизм цитопатогенного .действия микоплазм в контаминированных
культурах включает в себя; конкуренцию микоплазм и клеток за компоненты
питательной среды (аминокислоты, в частности аргинин, нуклеотиды - недоста-
ток их ведет к нарушению синтеза ДНК-клеток), продукты метаболизма мико-
плазм являются токсичными для клеток, размножение микоплазм на поверхности
клеток и в клетках может привести к деструкции цитоплазмы ( т.к. образование
молочной кислоты при гликолизе приводит к деструкции клеток) (К.Я. Каган, В.
Д. Тимаков, 1973), изменяется митотическая активность клеток, возрастает часто-
та разрывов хромосом, число их увеличивается или уменьшается, отмечается де-
градация ДНК клеток от нуклеаз микоплазм (Г.Г. Миллер и др., 1985).

Цитопатогенное действие микоплазма - контаминации выражается в округ-
лении и разрушении клеток, появлении зернистости в цитоплазме и ее вакуолиза-
ции (M.G. Gabridge et al., 1979; G.J. McGarrity et al., 1984; L. Stipkovits et al.,1987).
У всех проверенных микоплазм отсутствуют пути биосинтеза пуринов de
novo и пиримидинов через оротовую кислоту: микоплазмы усваивают пурины и
пиримидины из среды ,от клеток-хозяев, разлагая нуклеиновые кислоты послед-
них. Эксперименты по генетической трансформации клеток, зараженных мико-
плазмами, обычно не удаются именно из-за высокой активности микоплазменных
ДНКаз (B.K.Wolffing et al., 1979; E.J. Stranbridge et al., 1979; E.J. Stanbridge ,1982;
S. Upchurch et al., 1983). Особенно затруднены в присутствии микоплазм селекция
и выведение гибридом ,из-за высокой активности микоплазменных гипоксантин-
гуанинфосфорибозил- трансферазы и тимидинкиназы. При использовании среды
ГАТ ( содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин) микоплазмы могут
имитировать ауксотрофность клеток (С. Н. Борхсениус и др., 1987). Изучение
эффективности слияния клеток (Е.В. Майджи, 1987) показало, что свободные от
микоплазм клетки СПЭВ-1 З-Д5-ТК сливаются в 1,5-2 раза лучше, чем контами-
нированные. Поэтому перед постановкой экспериментов по гибридизации необ-
ходимо проводить освобождение мутантных клеток от микоплазм.

Известны примеры отрицательного влияния микоплазм, контамини-
рующих клетки, используемые в производстве вирусных вакцин, на выход
вирусов и на продукцию интерферона (Е.С. Воронин, 1986).

В конце 60-х годов появились данные о том, что микоплазмы могут
вызывать значительные изменения в метаболизме нуклеиновых кислот. На
перевиваемой линии фибробластов хомячка инфекция М. fermentans и М.
orale стимулировала часть клеток к потере контактного торможения и вызы-
вала способность к росту в полужидком агаре (Кузьмина С. В., 1983).

Однако роль микоплазм в опухолевой трансформации нормальных
клеток пока остается неясной, так как в присутствии микоплазм в условиях
длительного культивирования нельзя исключить того, что произошла селек-
ция предшествовавших опухолевых клеток, ни того, что трансформация бы-
ла вызвана опосредованным активирующим действием микоплазм на
имеющиеся в клетке вирусы или онкогены.

Работа с культурами клеток, их использование в вирусологических иссле-
дованиях, в биотехнологии требует постоянного контроля на отсутствие посто-
ронних агентов, в частности микоплазм, которые являются одними из наиболее
частых контаминантов, особенно в перевиваемых линиях клеток. Своевременное
выявление микоплазм и других микроорганизмов, вирусов в культуре клеток -
важное условие поддержания их высокого качества. Паспортизация стабильных
клеточных линий предусматривает в качестве необходимого теста - контроль на
отсутствие микоплазма-контаминации, что должно стать обязательным для всех
лабораторий, где постоянно работают с культурами клеток.

При работе с культурами клеток необходимо регулярно наблюдать за ди-
намикой роста клеток в культуральных матрасах. Если через 2-3 суток после пере-
сева клеток питательная среда во флаконах резко закислилась и приобрела опалес-
ценцию (помутнение), нужно сделать высев из питательной среды на мясопептон-
ный бульон (МПБ) и мясопептонный агар (МП) для исключения бактериального
пророста. При наличии бакпророста флаконы с культурой выбраковываются.

Резкое закисление питательной среды в культуральных флаконах и опа-
лесценция ее могут быть следствием контаминации культур клеток микоплазма-
ми. При просмотре таких флаконов под малым увеличением микроскопа (окуляр
7х, объектив Юх) можно наблюдать нарушение целостности монослоя, выра-
жающееся в появлении пустот (’’окон”). Эти пустоты являются следствием гибели
и отторжения от стекла клеток, инфицированных микоплазмами. По сравнению с
пустотами-незаростами пустоты-”окна” имееют более четко очерченные границы.

18.1.	Методы диагностики и видовой идентификации микоплазм

В связи с развитием биотехнологии клеточных культур и гибридом
Комиссия по клеточным культурам при АН СССР для достоверного уста-
новления микоплазм,с учетом мировой литературы, рекомендовала сле-
дующие методы (Т. Д. Смирнова и др., 1987):

микробиологический - посев на селективные среды;
цитохимический;

авторадиографии;

электронно-микроскопический.

Существуют и другие методы: ДНК-ДНК гибридизация, ПЦР ,которые
используют не только как диагностические, но главным образом, для более глу-
бокого изучения процессов, связанных с микоплазма-контаминацией, а также для
видовой идентификации и исследования свойств микоплазм.

Микробиологический метод.

Наиболее доступный метод выявления микоплазма- контаминации
непосредственное выделение микоплазм из культур клеток на бесклеточных
элективных питательных средах.

Испытано много различных питательных сред для выделения мико-
плазм из контаминированных культур клеток. Наиболее эффективны среды
Эдварда- Хайфлика, Хоттингера, модифицированная среда ВИЭВ на основе
среды Мартена, среда на основе 2% 3%ферментативного гидролизата
мышц сухого (ФГМ-С) на р-ре Хенкса, к которым добавляют 10% 25%-го
дрожжевого экстракта и 10-20% предварительно исследованной сыворотки
крови лошади или крупного рогатого скота (D. С. Edward, 1947; В. В. Гри-
ценко, 1982; Л. П. Дьяконов и др., 1980; A. Guruswamy et al., 1986).

Микоплазмы из культур клеток плохо растут на жидких средах, по-
этому высевы делают на плотные или полужидкие питательные среды соот-
ветственно с 1 1,3% или 0,05 - 0,3% агара высокого качества .

Для выделения контаминанта жидкие и полужидкие среды разливают
в пробирки по 5-10 мл, твердые - в чашки Петри до 15 мл. Материалом для
исследования (посевным материалом) служит суспензия подозреваемых на
контаминацию клеток, питательные среды культур клеток, взятые из куль-
туральных флаконов на 2-4 суток культивирования.

Материал для исследования отбирается стерильно. В одну пробирку с
10 мл питательной среды вносят 1 мл исследуемого материала. Посев на
полужидкие агары производят пипетками Пастера по уколу так, чтобы по-
севной материал равномерно распределялся по всему столбику среды. При
посеве на твердые среды посевной материал равномерно распределяют шпа-
телем на поверхности агара.

Инокулированные среды помещают в термостат при 37°С и просматри-
вают ежедневно в течение 10-15 дней. Видимый рост появляется обычно на 2-4
сутки. На жидких средах он проявляется в виде легкой опалесценции, слабого
осадка или нежной поверхностной пленки. На полужидких средах рост мико-
плазм характеризуется скоплением серовато-белых микроколоний по пути ино-
кулирования посевного материала. На твердых питательных средах микоплаз-
мы образуют характерные вросшие в агар, округлые колонии с вдавленным
центром и возвышенной переферией. Для выявления колоний на твердых сре-
дах чашки Петри просматривают под микроскопом (об. Юх, ок. 10, 12,5, 15х).
Колонии на твердых средах выявляются при окраске по Динсу.

Методика подготовки красителя по Динсу и процесс окрашивания.

2,5 г метиленового синего,

1,25 г азура II,

10,0 г мальтозы,

0,25 г карбоната натрия

растворяют в 100 мл дистиллированной воды.

Краску наносят непосредственно на колонии в агаре. Окрашенные
колонии исследуют под микроскопом (об. Юх, ок. 10-15х.). Колонии про-
крашиваются четко и имеют темно-голубой центр и светло-голубую пере-
ферию. Окрашенные колонии никогда не выцветают. Бактериальные коло-
нии могут иметь такую же окраску, но она выцветает за 30 минут. Однако
могут быть ошибки в оценке, когда окрашиваются погибшие бактерии.

Приготовление сред для выделения микоплазм

Приготовление модифицированной среды ВИЭВ. Среда состоит из
следующих компонентов: пептона Мартена, питательной воды (горячая экс-
тракция мяса или органов различных животных), дрожжевого экстракта и
стерильной сыворотки крови лошади или крупного рогатого скота.

Приготовление пептона Мартена: свежие желудки свиней без поражений
слизистой оболочки освобождают от жира и содержимого и пропускают через
мясорубку. На 250 г фарша добавляют 1 л теплой ( нс более 50°С) кипяченной
воды и 10 мл концентрированной соляной кислоты. Смесь выдерживают при
температуре 45-50°С в течение 24 часов, периодически взбалтывая , затем про-
гревают текучим паром 30 минут. После этого пептон оставляют в холодном
месте на 5 суток, прозрачную надосадочную жидкость сливают, фильтруют
через бумажный фильтр, разливают в колбы и стерилизуют при 115°С (0,7 атм)
30 минут. Жидкость можно хранить до 3-х месяцев при температуре 4°С.

Приготовление питательной воды: из мяса, без жира и сухожилий или ор-
ганов (легкие, печень, молочная железа) готовится фарш. К 500 г фарша добавля-
ют 1 л дистиллированной воды и смесь выдерживают при температуре 4-8°С в
течение 24 часов. После этого фарш кипятят на слабом огне 2 часа , постоянно
подливая воду до первоначального объема. Затем фарш отжимают, воду фильт-
руют через бумажный фильтр, разливают во флаконы и стерилизуют при темпе-
ратуре 115°С (0,7 атм) 30-40 минут. Хранят при 4-8°С до одного месяца.

Для приготовления бульона смешивают в равных объемах пептон
Мартена и питательную воду, устанавливают pH 10% раствором NaOH в
пределах 8,0-8,2 и разливают в колбы и стерилизуют при 115°С (0,7 атм) в
течение 30 минут. Бульон хранится не более 30 дней при комнатной темпе-
ратуре. Окончательная величина pH среды 7,8-8,0.
Перед применением к питательной среде добавляют 10% 25%-го
дрожжевого экстракта и от 10 до 20% стерильной сыворотки крови лошади
или крупного рогатого скота.

Приготовление среды Эдварда-Хайфлика.

Для приготовление отвара из мышечной ткани сердца крупного рогатого
скота: следует использовать мышечную ткань сердца от здоровых животных до
2-х лет. Мышцы сердца крупного рогатого скота очищают от жира, пропускают
через мясорубку и заливают бидистиллированной водой в расчете 1 л на 1 кг
мышц. Экстрагируют 16 часов при комнатной температуре, переодически по-
мешивая. После этого кипятят 40-50 мин., фильтруют через бумажный фильтр,
разливают и автоклавируют при 115°С (0,7 атм) 30 минут.

Для приготовления бульона к 500 мл отвара сердечной мышцы до-
бавляют 500 мл водопроводной воды, 5 г NaCl и 10 г пептона. Устанавлива-
ют pH 10% -ным раствором NaOH 8,2-8,4 и стерилизуют при 115°С (0,7
атм.) 30 минут, pH после стерилизации 7,8-8,0.

Приготовление среды из триптического перевара мышц сердца круп-
ного рогатого скота.

Для приготовления бульона триптический перевар разводят в несколько
раз бидистиллированной водой. Кратность разведения для каждой серии опре-
деляют экспериментальным путем, используя питательную среду в разведениях
от 1:4 до 1:10. К разведенному перевару добавляют 0,6% поваренной соли, ус-
танавливают pH 7,7- 7,8, фильтруют через бумажный фильтр и стерилизуют при
115°С (0,7 атм) 30 минут. Бульон хранят при комнатной температуре.

Состав среды на триптическом переваре бычьего сердца: (по Г.Я. Ка-
ган и И.В. Раковской)

гидролизат бычьего сердца - 200 мл,

мясная вода 1:2 - 400 мл,

дрожжевой экстракт 50% - 100 мл, хлористый натрий - 5 г,
дистилированная вода - 300 мл.

Если готовится полужидкий 0,3% агар, то к 1 л среды добавляется 3 г
агар-агара. Если готовится 1,3% полутвердый агар, то на 1 л среды берется
13 г агар-агара. Окончательный pH 7,6-7,8, стерилизация при 115°С - 30 ми-
нут. Сыворотку лошади или крупного рогатого скота - 10% стерильно до-
бавляют вместе с 100 ед/мл пенициллина перед использованием среды.

Приготовление усовершенствованной среды на основе сухого мы-
шечного ферментативного гидролизата (ФГМ-С) (В.В. Гриценко, 1983).

Мышечный ферментативный гидролизат сухой (ФГМ-С) готовят
биофабричным способом, согласно инструкции (Г.Е.Панкова, Л.П. Дьяко-
нов, В.А. Сергеев и др., 1983). Он представляет собой белый или слегка
кремовый гигроскопический порошок.

При приготовлении среды ФГМ-С для культивирования микоплазм навес-
ку сухого порошка растворяют в рабочем (упрощенном) растворе Хенкса для
получения 2%-3 % раствора. Раствор соломенного цвета, слегка пенится. Уста-
навливают pH 8,0-8,2 и после фильтрации через бумажный фильтр стериализуют
при 115°С (0,7 атм) 30 минут. При этом может образоваться небольшой осадок.
Перед применением добавить дрожжевой эктракт (10%) и сыворотку
лошади или крупного рогатого скота (10-20%). Среды хранят при комнатной
температуре 2-3 недели.

Приготовление рабочего (упрощенного) раствора Хенкса.

Для приготовления рабочего раствора Хенкса указанные соли после-
довательно растворяют в бидистиллированной или сверхчистой воде ( в
граммах на 1 л):

NaCl - 8,0;

КС1 - 0,4;

MgCl2 6Н2О-0,1;

MgSO4 7Н2О-0,1;

Na2HPO4 2Н2О - 0,06;

КН2РО4 - 0,06.

Приготовленный раствор стерилизуют автоклавированием при 115°С
(0,7 атм) в течение 30 минут.

Приготовление агаризированных сред.

Так как микоплазмы и Л-формы бактерий при своем росте на жидких
средах могут не давать выраженных изменений (по состоянию прозрачности
среды, образованию поверхностной пленки или осадка) применяют агаризиро-
ванные среды с различным содержанием агара: полужидкая (0,3% агара), плот-
ная (1,3% агара) и сочетание жидкой и агаризированной сред - двухслойная.

Для приготовления агаризированных сред соответствующие навески агар-
агара вносят в питательные бульоны и выдерживают взвесь на кипящей водяной
бане до полного растворения агар-агара. Горячую среду фильтруют и автоклави-
руют 30 минут при 115°С (0,7 атм). Перед использованием среды разогревают в
водяной бане и после охлаждения до 50°С добавляют дрожжевой экстракт (10%)
и сыворотку крови лошади или крупного рогатого скота (10-20%).

Двухслойные питательные среды применяют в основном для выделе-
ния контаминантов. Среду готовят путем комбинации в одной пробирке
(или чашке Петри) плотной и жидкой питательных сред. На дно пробирки
помещают 1 мл плотной питательной среды, предварительно разогретой и
после ее застывания наслаивают сверху 2 мл жидкой среды.

При использовании агаризированных питательных сред следует пом-
нить, что контаминанты могут не давать роста на плотных средах и не вы-
зывать изменений в жидких питательных средах, в таких случаях предпоч-
тительней полужидкие и двухслойные среды.

Приготовление дрожжевого экстракта.

Из плотной массы пивных и пекарских дрожжей готовят 25% суспен-
зию на дважды дистиллированной воде. Дрожжевую суспензию перелитую
в колбу, помещают в водяную баню при 60-65°С и доводят температуру во-
ды в бане до 90-95°С. При этой температуре суспензию выдерживают 1-1,5
часа периодически взбалтывая. По окончании экстрагирования суспензию
охлаждают при комнатной температуре (в течение 40-50 минут) и оставляют
при 4°С на ночь для отслаивания. На следующий день отсасывают надоса-
дочный слой экстракта, подщелачивают его до pH 8,0-8,2 и стерилизуют при
0,7 атм (115°С ) в течение 20 минут. Хранят при 4°С.
При сравнительном изучении ростовых свойств питательных сред: среда
Мартена, Хоттингера, 2%-3 %ФГМ-С и триптический перевар бычьего сердца
выделяемость контаминантов была выше на 2%-3% ФГМ-С, триптическом пе-
реваре бычьего сердца (В.В. Гриценко, 1983; О.Ш. Расулев, 1987) (таблица 39).

Таблица 39

Интенсивность роста музейных штаммов микоплазм и микоплазм, вы-
деленных из культур клеток на среде с 2-3% ФГМ-С и триптическом
переваре мышц сердца (среда № 8).

Вид микоплазм	2% ФГМ-С	3% ФГМ-С	Среда № 8
М. arginini	+++	++++	++++
М. orale	-I»	++++	+++
М. hominis (М-34)	+	+++	+++
M.hyorhinis	-	4“	4-
М. bovis	++	+++	4-4-+
A. laidlawii	++++	++++	++++

В дальнейшем показана пригодность сред 2-3% ФГМ-с и перевара
бычьего сердца для выделения микоплазм из культур клеток и для культи-
вирования музейных штаммов микоплазм ( И.Л.Куликова,1989).

Наблюдения проводят не менее 7 дней. Следует отметить, что микоплаз-
мы на среде №8 и 3% ФГМ-с начинают рост на 2 сутки культивирования.

К питательным средам в качестве добавочного источника энергии для
ферментирующих микоплазм добавляют глюкозу (до 1%) , а для большинства
неферментирующих микоплазм, способных к гидролизу аргинина, добавляют
аргинин (до 0,2%). При этом отмечено, что более высокие концентрации аргини-
на отрицательно сказываются на росте микоплазм (L.R. Washbum et al., 1977).

Штаммы микоплазм, способные к сбраживанию глюкозы, хорошо
растут при pH среды 8,0-8,5, а штаммы гидролизующие аргинин или моче-
вину лучше растут при pH среды 6,5. Однако при гидролизе мочевины и
аргинина выделяется значительное количество аммиака, что приводит к за-
щелачиванию среды - pH может достигнуть 8,0-8,5 и клетки при этом поги-
бают. Для поддержания pH в необходимых пределах в среды для выращива-
ния микоплазм вводят буферные системы.

Много данных по сравнительному изучению эффективности различ-
ных сред для выделения микоплазм из культур клеток: среда Herderschee
(A.A. Polak-Vogelzand et al., 1980); транспортные среды МТБ, в которых
микоплазмы могут сохранять жизнеспособность даже после 10-кратного
замораживания (F.Busolo et al., 1981), питательные среды, содержащие раз-
личные сахара, сыворотку свиней, телят, липиды, бычий сывороточный аль-
бумин (R.J. Miles et al., 1986; Л. П. Дьяконов и др., 1986). Наиболее эффек-
тивной для выделения микоплазм из культур клеток человека оказалась сре-
да VF с человеческой сывороткой, использование которой позволило сокра-
тить сроки выделения микоплазм до 3-х дней вместо 14-20 дней при исполь-
зовании других сред (J. Tomkins et al., 1975).
Некоторые авторы, для повышения чувствительности бесклеточной
питательной среды обогащали ее мышечными эмбриональными клетками и
клетками культуры ВНК-21

Отмечено, что при анаэробном культивировании микоплазмы обна-
руживали в 98,1%, при аэробном в 45,8% случаев.

Клонирование штаммов микоплазм.

Для получения клонов микоплазм используют метод предельных разве-
дений в полужидком агаре, с различным количеством колоний (от 1 до 10).

Инокулят (культуральную жидкость или бульонную культуру) в ко-
личестве 0,3 мл вносят в 2,7 мл стерильного физиологического раствора и
титруют с коэффициентом разведения равным девяти. После получения раз-
ведений в каждой пробирке оставляют по 1 мл физиологического раствора
(разведения) и заливают питательной средой (9 мл), содержащей 15-20%
сыворотки. Инкубируют в термостате в течение 4-5 суток при 37°С.

Практическими ограничениями микробиологического метода являются
длительность культивирования микоплазм, кратность, слепые ( не менее 3) пас-
сажы, ’’труднокультивируемыс” микоплазмы (М. hyorhinis, М. orale, М.
fermentans), требующие еще большего усложнения среды, но результаты не
всегда бывают положительными, так как , являясь мембранными паразитами,
они обладают способностью включать в свою цитоплазматическую мембрану
интегрированные белки клеток хозяина, теряя при этом способность к культи-
вированию в бесклеточных питательных средах (С. Novo et al., 1987).

Биохимические методы обнаружения микоплазм

Наряду с микробиологическим выявлением микоплазм, по биохими-
ческим изменениям в питательной среде можно судить о присутствии в ней
этих микроорганизмов.

С. Bonisol et al., (1984) предложили определять аденозин-фосфорилазную
активность в биологических средах для обнаружения микоплазм.

В числе биохимических методов обнаружения микоплазма-
контаминантов в клеточных культурах используют тесты на различные
ферментные системы, например, на присутствие аденозип-фосфорилазы
(фермент микоплазм, активность которого незначительна или отсутствует в
клетках млекопитающих), пиримидин-нуклеозид-фосфорилазной активно-
сти (E.J. Schneider et al., 1975; G.J. McGarrity et aL, 1979).

Установлена связь между многими метаболическими изменениями
клеток, вызванными микоплазмами, с уменьшением аргинина, наблюдаемом
в средах контаминированных культур (Т. Sasak et al., 1984).

Впервые расщепление аргинина в клеточных культурах, зараженных
овечьими штаммами микоплазм, обнаружил Powelson (1961).

Schimchc et al., (1963), Barile et aL, (1966) открыли аргинин-
дегидролазную систему ферментов, расщепляющую аргинин. Процесс гид-
ролиза аргинина показан на схеме:

аргинин аргининдезаминидаза цитрулин + NH3

цитрулин ф-орнитинтранскарбамидаза орнитин + карбамилфосфат
карбамилфосфат + АДФ карбамилфосфокиназа АТФ + NH3 + СО2
Эти исследования показали целесообразность использования этого
признака, как для диагностики, так и для идентификации микоплазм.

Исследование на присутствие контаминантов (GJ. McGarrity et al.,
1980) по количественному соотношению уридина к урацилу показало, что
соотношение уридин/урацил менее 100 соответствует контаминации, под-
тверждаемой на элективной питательной среде, электронной микроскопией
и флуорохромированием ДНК.

В контаминированных культурах клеток определяют тимидин-
фосфорилазную активность по скорости расщепления тимидина. Скорость
перехода тимидина в тимин в контаминированных культурах в несколько
раз выше, чем в "чистых” (Е. Schneider et al., 1975).

G.J. McGarrity с соавторами (1986) предложили новый способ выяв-
ления контаминации культур клеток микоплазмами. Для обнаружения ми-
коплазменной инфекции следует добавить в среду культивирования иссле-
дуемой клеточной культуры 6-метилпурин-дезоксирибозид, не токсичный
для микоплазм, но токсичный для неинфицированных микоплазмами куль-
тур клеток, так как в присутствии аденозинфосфорилазы микоплазм обра-
зуются два метаболита 6-метилпурин и 6-метилрибозид. Инкубация клеток
в присутствии 6-метилпурина-дезоксирибозида в течение 1-3 суток приво-
дит к разрушению клеточного пласта на 50-90%, а в клеточных культурах
инфицированных микоплазмами деструкции не происходит.

Выявление микоплазм на тест-культуре почки эмбриона свиньи ПЭС

Первичная культура почки эмбриона свиньи (ПЭС) оказалась высокочув-
ствительной к микоплазмам из перевиваемых культур клеток. На тест-культуре
ПЭС можно не только выделять микоплазмы, из подозреваемых в контаминиро-
вании культур, но и изучать цитопатогенное действие выделенных микоплазм.

Культуральная жидкость из исследуемых культур вносится на моно-
слой культуры ПЭС с питательной средой в соотношении 1:5-1:10. Уже че-
рез сутки отмечается отставание в росте зараженных культур, на третьи су-
тки появляются нарушения монослоя, а к 6 суткам наблюдается появление
’’окон” или дегенерации клеточного пласта (рис. 71.1.а,б). Уменьшается ми-
тотический индекс, увеличивается число патологических митозов.

Выделение микоплазм на элективных питательных средах из культу-
ральной жидкости тест-культуры ПЭС осуществляется легко.

Высокая эффективность выделения микоплазм из исследуемых культур
получена при внесении пробы культуральной жидкости из перевиваемых культур
непосредственно в суспензию первично-трипсинизированных клеток ПЭС перед
началом культивирования. Наблюдения за опытной и контрольной культурами
позволяют увидеть различие во времени формирования монослоя и возникающие
дегенеративные изменения в тест-культуре под действием микоплазм.

Цитологические методы исследования

Цитологические методы обнаружения микоплазм в клеточных куль-
турах осуществляются на препаратах, окрашенных по Романовскому-Гимзе,
орсеином, гсматоксилин-эозином.

Суспензию клеток высевают в пенициллиновые флаконы с покров-
ными стеклами. Концентрация клеток в суспензии должна быть 1,5-2 105 в
мл; объем суспензии 1,5-2 мл. Через определенные промежутки времени
(1,2,3, и т.д. сутки культивирования) покровные стекла промывают в раство-
ре Хенкса, подсушивают фильтровальной бумагой и фиксируют в одной из
фиксирующих смесей: жидкости Карнуа (96° спирт-ректификата - 6 частей;
хлороформа - 3 части; ледяная уксусная кислота - 1 часть), метиловом спир-
те или других фиксаторах с последующей окраской цитологических препа-
ратов.тематоксилин-эозином или по Романовскому-Гимзе.

На цитологических препаратах, окрашенных по Романовскому-Гимзе
или гематоксилин-эозином, при наличии микоплазма-инфекции видно, что
монослой разрыхленный, плотного прилегания клеток нет. На отдельных
участках наблюдаются пространства без клеток ’’окна” (Рис.71.2.). В цито-
плазме и в межклеточном пространстве обнаруживаются микоплазмы в виде
мелких фиолетовых зерен (М.Т. Гололобова, 1978; S. Razin 1983).

J. Fogh et al., (1969) предложили окрашивать препараты орсеином с
последующим просмотром их под фазово-контрасным микроскопом.

Питательную среду в пенициллиновых флаконах, где находятся по-
кровные стекла с монослоем клеток, заменить на 3 мл 0,6% раствора цитрата
натрия. Добавить по каплям I мл дистиллированной воды до конечной кон-
центрации 0,45% раствора. Время контакта 10 минут. Затем смесь сменить
на фиксатор Карнуа - 10 минут, стекла высушить - 5 минут, и окрасить 2%
раствором орсеина - 10 минут. Трижды отмывать в абсолютном спирте, про-
вести через два ксилола и заключить в бальзам. Смотреть препараты в фазо-
воконтрастном микроскопе: микоплазмы выявляются в виде черных точек.

Электронно-микроскопические исследования

Для электронно-микроскопического контроля клеточных культур на
зараженность микоплазмами исследуют ультратонкие срезы клеток
(Л.П.Дьяконов и др., 1980; Миллер Г.Г., Раковская И.В.,1983). С помощью
сканирующего электронного микроскопа микоплазмы обнаруживаются на
поверхности фибробластов, но их очень трудно отличить от сложных мем-
бранных структур лимфоцитов (D.M. Phillips, 1978).

Р.С. Hu et al., (1987) показали серологическое сходство белка М.
genitalium и М. pneumoniae. Эти белки имеют биологическое и структурное
сходство. Оба белка локализованы на поверхности цитоплазматической
мембраны микоплазм и имеют молекулярный вес 140 кД. Применяя моно-
клональные антитела с помощью электронной микроскопии удалось устано-
вить, что белки находятся на терминальных структурах.

С помощью электронной микроскопии можно определить количественное
соотношение клеток и микоплазм, концентрацию микоплазм (K.Ohno et al., 1983).

На срезах при просмотре в электронном микроскопе обращают вни-
мание на наличие микоплазм в межклеточных пространствах около цито-
плазматической мембраны или непосредственно в контакте с мембраной, в
цитоплазме клеток. Микоплазмы имеют округлую, овальную или вытяну-
тую форму, иногда в виде ракетки размер 0,1-1,0 мкм. Оболочка микоплазм
не имеет клеточной стенки и представляет собой элементарную цитоплазма-
тическую мембрану. Внутренняя структура представлена тяжами, микро-
фибриллами, рибосомоподобными структурами. Внутри клетки микоплазмы
расположены, как правило, в вакуолях-фагосомах Рис.72.1.,72.2.).
Но, несмотря на высокую чувствительность этого метода, в целом,
элекронномикроскопическйй контроль микоплазм достаточно сложен и тре-
бует высокой квалификации специалистов.

Цитохимические исследования с использованием флуорохромов
(ДНК-красителей)

Для цитохимических исследований используют флуорохромы (ДНК-
красители): акрифлавин, трипафлавин и риванол (В.В. Неустроева, 1969),
ДАР1 (4-6-диамино-2-финилиндол)(\У. Russel et aL, 1975); Hoechst 33258
(G.Berton et aL, 1985), акридиновый оранжевый (М.Т. Гололобова, 1978);
оливомицин (Г.Р. Михайлова и др., 1983).

Применение флуорохромов для выявления микоплазм в культурах клеток.

Для исследования на микоплазмы в люминесцентном микроскопе
клетки окрашивают по методу Фельгена (по В.В. Неустроевой, 1969). По-
следовательность обработки препарата следующая:

•	Фиксировать клетки в жидкости Карнуа в течение 15 минут. От-
мыть от фиксатора в 96° спирте.

•	Провести по спиртам убывающей концентрации до воды (96°, 70°,
50°, дистиллированная вода).

•	Поместить в 1 н НС1 на 10 минут при 60°С с целью гидролиза ДНК.

•	Сполоснуть в двух сменах дистиллированной воды по 3-5 минут.

•	Окрасить реактивом Шиффа для люминесцентной микроскопии в
течение 20 минут.

•	Отмыть в дистиллированной воде и провести через спирты 50°, 70°.

•	Дважды промыть в этаноле по 5 минут.

•	На предметное стекло нанести каплю дистиллированной воды и
опустить на нее покровное стекло клетками вниз. Препарат иссле-
дуют в люминесцентном микроскопе: в цитоплазме контаминиро-
ванных клеток, а также вне их на желтом фоне обнаруживаются
оранжево-красныезерна микоплазм.

Приготовление реактива Шиффа для люминесцентной микроскопии:

В 200 мл дистиллированна^ воды растворить 250 мг акридинового
оранжевого, 500 мг метабисульфшц калия н добавить 20 мл 1 н НС1.

Колбу с краской герметически закрыть и оставить в холодильнике
при 4°С на трое суток. Содержимое колбы периодически встряхивать.

Раствор Шиффа непосредственно перед использованием профильтро-
вать через стеклянный фильтр №4 под давлением. Первую порцию фильтра-
та выбросить. Реактив Шиффа повторно не используют.

Оливомициновый метод (разработан Г.Р. Михайловой, А.С. Новохатским,
М.А. Родовой, 1983). Антибиотик оливомицин используется в качестве флуоро-
хрома для выявления ДНК микоплазм в контаминированных культурах клеток.

Приготовление растворов оливомицина. Рабочий раствор оливомици-
на (20 мкг на 1 мл) готовят на бидистиллированной воде: в 1 л воды раство-
ряют 20 мг препарата. Затем добавляют 20 мм ионов Mg2+ в виде солей
MgCl2 или Mg SO4, pH раствора не имеет значения. Раствор может хранить-
ся в холодильнике в течение года без изменения своих свойств и становится
непригодным к использованию только в случае появления в нем микроорга-
низмов - бактерий или грибов.

Техника окраски. Культуры клеток выращивают на покровных стек-
лах 1-2 суток и фиксируют один час охлажденным до 4,0°С этиловым спир-
том (70°) Стекла с культурой высушивают, наносят рабочий раствор оли-
вомицина и помещают в темное место при комнатной температуре на час.
Затем промывают дистиллированной водой и монтируют стекла с моносло-
ем на предметные стекла в глицерине с дистиллированной водой (1:1). Про-
сматривают в люминесцентном микроскопе при увеличении об. 90х, ок. Юх
(масляная иммерсия) или об. 70х, ок. Юх (водная иммерсия). Для анализа
препаратов используют светофильтры: ФС-1-4; СС 15-2; БС-8,2.

Для длительного хранения препарат можно обвести парафином или
лаком и поместить в холодильник при температуре 4°С. В случае необходи-
мости стекла с культурой отмывают водой и окрашивают повторно.

Оценка результатов. Микроскопически микоплазмы, как однородно-
окрашенные в желто-зеленый цвет тела сферической или эллипсоидальной
формы, одиночные, парные, четверные, цепочечные образования или скопления
микоплазм обнаруживают преимущественно над цитоплазмой клеток в виде
ярко светящейся мелкой зернистости на фоне не имеющей свечения цитоплаз-
мы, либо по границам клеток и межклеточном пространстве. Исследуют в сред-
нем 1000 клеток. Интенсивность контаминации условно обозначают в крестах:
+ - единичные микоплазмы в препарате; ++ - небольшие скопления микоплазм в
отдельных клетках в поле зрения; +++ - отдельные микоплазмы и скопления в
20-50% клеток; ++++ - максимальное количество микоплазм в виде скоплений в
цитоплазме большей части клеток и в межклеточных пространствах.

В качестве положительных контролей рекомендуется использовать
заведомо контаминированные микоплазмами клеточные культуры при дру-
гих методах определения. Отрицательный контроль свободные от мико-
плазм культуры клеток, в которых светящиеся образования не выявляются

При диффиренцировке микоплазм от других ДНК-содержащих обра-
зований клетки нужно учитывать следующие факторы:

1.	Клеточный монослой. Клетки должны быть полностью распласта-
ны, с хорошо выраженной цитоплазмой. При большой плотности клеточно-
го пласта (многослойном росте) яркое свечение ядер мешает выявлению
мелких микоплазм.

2.	Микроядра и ядерные фрагменты. На поздних стадиях развития
культуры начинаются процессы разрушения и дегенерации ядер, приводя-
щие к появлению фрагментов сферической формы, которые отличаются от
микоплазм своими большими размерами, варьирующей величиной и более
яркой флуоресценцией. Микроядра образуются при неправильном делении
ядер, они отличаются большими размерами и свечением, аналогичным све-
чению ядер, от которых они отделились.

3.	Стерильность. Бактериальная контаминация культур и реактивов
мешает определению микоплазм, так как бактерии, покрывающие клеточ-
ную поверхность, также имеют яркое желто-зеленое свечение.

Применение красителя Хёхст ( Hoechst - 33258).
Метод предложен Ченом (Chen, 1977). Клетки фиксируют на стеклах
жидкостью Карнуа следующим образом: вначале в пенициллиновый флакон
со средой, где находится покровное стекло с клетками, добавляют несколько
капель фиксатора и через 2-3 минут среду сливают и добавляют фиксатор
Карнуа на 3-5 минут.

Стекло с монослоем просушивают на воздухе и наносят рабочий раствор
красителя Хёхста на 15-20 мин. Затем два раза промывают дистиллированной
водой, просушивают и монтируют на предметном стекле клетками вниз. При
необходимости можно докрасить новой партией раствора (промежуточного).

Приготовление рабочего раствора красителя Хёхст: 0,5 мг сухого кра-
сителя разводят в 10 мл дистиллированной воды (основной раствор). Затем
готовят промежуточный раствор на растворе Хенкса, разводя основной рас-
твор 1:10. Стерильно приготовленный промежуточный раствор можно со-
хранять в холодильнике 2-4 недели.

Непосредственно перед применением готовится рабочий раствор пу-
тем разведения промежуточного раствора 1:50-1:100 на растворе Хенкса.
Этот рабочий раствор используется для окрашивания препаратов.

Оценка результатов. В препарате при просмотре в люминесцентном
микроскопе видны ярко-зеленого цвета ядра клетки на темном фоне и при
наличии микоплазм над цитоплазмой и в межклеточных пространствах вид-
ны ярко-зеленые точкоподобные образования, иногда в виде скоплений или
нитевидных структур (при интенсивной инфекции).

Флуоресценцию ДНК-микоплазм можно использовать для экспресс-
диагностики микоплазма-контаминации, так как непосредственная подго-
товка препаратов занимает не более часа.

Недостатками этого метода является неизбежная субъективность коли-
чественной оценки степени зараженности, возможность артефактов за счет
флуоресценции обломков клеточных ядер и фонового свечения, которое осо-
бенно сильно при культивировании клеток в присутствии антибиотиков.

Метод радиавтографии

П.В. Глан, В.В. Неустроева (1986), М.Т.Гололобова (1983), Т.Д.
Смирнова и др. (1987) использовали метод авторадиографии и показали, что
происходит включение Н? -тимидина в клетки культур зараженных мико-
плазмами. При этом зерна восстановленного серебра располагаются пре-
имущественно не над ядром, а над цитоплазмой или вне клеток (Рис.73).

Метод радиоавтографии основан на том, что клетки, контаминированные
микоплазмами, в значительной мере утрачивают способность включать тими-
дин в ядра. Этот феномен обясняется действием специфического микоплазмен-
ного фермента нуклеозидфосфорилазы, превращающего тимидин в тимин, и
способностью микоплазм активно включать тимин, в то время, как все клетки
млекопитающих тимин практически не включают (S.J. Geary, 1987).

Недостаток этого метода его сложность и большая продолжитель-
ность в зависимости от качества светочувствительной эмульсии. Кроме того
не все микоплазмы включают свободные основания и нуклеозиды напри-
мер A. laidlawii, М. arginini, М. hyorhinis включают аденин, урацил, гуанин,
но не цитозин и не тимин, а неферментирующие микоплазмы вообще не
способны включать нуклеозиды.
Иммунологические методы

Для постановки иммунологических тестов необходимо иметь антиге-
ны и видовые иммунные сыворотки. Для получения иммунных сывороток
проводят гипериммунизацию антигенами, однако, по данным ряда авторов,
иммунизация корпускулярным антигеном приводит к появлению антител,
которые дают большие перекрестные реакции в иммунологических исследо-
ваниях, так как корпускулярные антигены включают в себя много общих
детерминант. Поэтому иммунизацию лучше проводить мембранным антиге-
ном ( В.Н. Афанасьев, 1982, A.Horowits et al, 1987).

При центрифугировании в градиенте плотности сахарозы было обнару-
жено отличие препаратов мембран от интактных клеток: у мембран выявлены 2
фракции с плотностью 1,197 и 1,176 г/мл, а у интактных клеток - 1-1,286 г/мл.
Благодаря электрофорезу установлено наличие 7 поверхностных протеинов с
молекулярной массой 150, 94, 82, 78, 68,48,40 килодальтон (кД).

По результатам проведенных исследований было показано наличие у
мембранных антигенов микоплазм: М.arginini, A.laidlawii, M.orale, M.bovis,
M.hominis от 10 до 22 структурных полипептидов (И.Л. Куликова, 1989).

Молекулярная масса полипептидов составляла от 20 до 94 кД (Рис.74).

Анализ электрофореграмм показывает, что М. arginini (мембранный
антиген) содержит полипептиды с молекулярной массой от 20 до 94 кД,
причем следует отметить мажорные полипептиды с молекулярной массой
около 25, 30, 45, 49, 67, 94 кД. Корпускулярный антиген М. arginini содер-
жит большой спектр белков, в том числе примеси белков питательной среды
по сравнению с мембранными антигенами.

К.Е. Jahonsson et al., (1982) сообщил, что из 320 полипептидов
A.laidlawii, выявленных при двумерном электрофорезе, приблизительно 140
с молекулярной массой 15 до 200 кД относятся к мембранным белкам.

Отмечено наличие одинаковых полипептидов у разных видов микоплазм
с М.т. 30 кД, 45 кД (за исключением М. arthritidis), 67 кД ( за исключением М.
orale) и 94 кД. Полипептид М.м. 14 кД наблюдали только у М. bovis.

Наличием пептидов одинаковой молекулярной массы у разных видов ми-
коплазм, видимо, и объясняются перекресты в иммунологических реакциях при
использовании поликлональных антител. Поэтому использование мембранных
антигенов позволяет повысить чувствительность иммунологических методов.

Видовая и штаммовая идентификация микоплазм, контаминирующих
клеточные культуры, может осуществляться серологическими методами:в
реакции ингибиции роста , реакции ингибиции метаболизма ,двойной диф-
фузии и иммуноэлектрофореза в геле, реакции связывания комплимента и
иммунофлюоресценции микоплазм на поверхности клеток (G.Kenny,1983,N.
Cimola, .1987). Однако наиболее перспективными представляются приемы,
основанные на фиксации антигена (т.е. культуральной среды и клеток, про-
веряемых на присутствие микоплазм) на твердой подложке с последующим
выявлением антигена в реакциях с меченными антителами.

Среди высокочувствительных иммунологических методов исследования
широкое распространение получил иммуноферментный анализ-ИФА (А.Я. Куль-
берг, 1985). ИФА применяется для обнаружения и идентификации специфиче-
ских антител в сыворотке крови и антигенов в патологическом материале при
различных микоплазмозах, выявления микоплазменной контаминации культур
клеток (И.В. Бакуловидр. 1987;,О.Ш..Расулев, 1988; И.Л.Куликова, 1993).

E.Jacobs et al., (1986) и другие показали преимущество ИФА с поли-
моноклональными антителами.

Для получения поликлональных антител иммунизировали кроликов и
мышей мембранными антигенами M.arginini Иммунизацию проводили че-
рез 14 дней трехкратно внутрибрюшинно и последнюю иммунизацию
внутривенно. Кроликов обескровливали через 10 дней после последней им-
мунизации, а мышей через 3 дня, поскольку их использовали для выделения
спленоцитов из селезенки для опытов по получению гибридом, продуци-
рующих моноклональные антитела (И.Л.Куликова, 1989).

При использовании поликлональных антител в качестве антигенов в
ИФА использовали корпускулярный и мембранные антигены микоплазм и
отработали схему постановки ИФА (И.Л. Куликова, Т.А.Феоктистова,1993).

Постановка иммуноферментного анализа

В ячейки полистироловых плашек вносили по 100 мкл антигена, разведен-
ного 0,05 М карбонатным буфером pH 9,5, инкубировали в течение двух часов
при 37°С. После трехкратного отмывания ФБ в ячейки вносили по 250 мкл 2%
раствора БСА (бычий сывороточный альбумин) и инкубировали час при 37°С.

После однократного отмывания в лунки вносили по 100 мкл исследуе-
мой сыворотки кролика в разведении 1:200 на ФБ и инкубировали 2 часа при
37°С или в течение ночи при 4°С. Затем тщательно отмывали плашки и вносили
по 100 мкл антикроличьего пероксидазного коньюгата ( институт им. Н.Ф. Га-
малеи) в рабочем разведении. После двухчасовой инкубации при 37° С и пяти-
кратного отмывания в ячейки вносили по 100 мкл субстратной смеси (0,08%
раствор 5-аминосалициловой кислоты с 0,005% Н2О2, pH - 5,8). Реакцию учи-
тывали по образованию окрашенного продукта через 30 минут.

При использовании поликлональных антител наиболее высокий титр
1:12800-1:25600 отмечали со специфическими для данного антигена сыворотка-
ми, однако и в перекрестных реакциях титр был достаточно высоким 1:1600-
1:6400. Использование мембранного антигена позволило повысить чувствитель-
ность метода. Мембранные антигены так же дают перекрестные реакции, но они
ниже, а титры с гомологичными сыворотками высокие 1:12800-1:51200, что по-
зволяет более уверенно идентифицировать микоплазмы до вида (табл.40,41.).

И.Л.Куликовой,?.А. Феоктистовой и др.(1989) были получены гибри-
домы, продуцирующие моноклональные антитела к микоплазмам, выделен-
ным из культур клеток. Спленоциты, выделенные из селезенки мыши, после
месячного цикла иммунизации мембранным антигеном M.arginini, сливали с
миеломной линией клеток Sp20/Agl4 с использованием ПЭГ (Мм 4000).

Впоследствии отобраны 2 клона, обладающие повышенной продук-
цией моноклональных антител in vitro. Моноклональные антитела клона А-1
(Ig класса М) обладали высокой специфичностью в ИФА к антигенам М.
arginini (музейный штамм Г.512 и выделенный из культур клеток Г.256), но
не реагировали с антигенами микоплазм других видов (A. laidlawii, М.
hyorhinis, М. hominis, М-55, М. pneumonia).

Клон F-5 продуцировал МКА (Ig класса G) к М. arginini (к музейному
штамму 1:256, а к выделенному из культур клеток 1:128), но эти МКА дава-
ли перекрестные реакции с антигенами других видов микоплазм (М.
hominis, A. laidlawii в титре 1:8).

В опытах по получению препаративных количеств моноклональных
антител установлено, что гибридомы двух клонов (А1 и F5) индуцируют
образование асцитных опухолей у мышей линии BALB/c. Причем следует
отметить, что титр МКА в асцитной жидкости в 500-1000 раз превышал титр
антител в культуральной жидкости гибридом (512. 105-1.024 106).

На основе МКА выделенных из асцита был приготовлен коньюгат,
который использовали для выявления микоплазм в культуре клеток в ИФА .

Применяли сэндвич-метод, где в качестве подложки использовали поли-
клональные антитела (кроличьи), полученные против мембранного антигена М.
arginini, а в качестве конъюгата моноклональные антитела меченные пероксида-
зой. Использование в качестве подложки поликлональных антител позволило
повысить чувствительность данного метода, т.к. МКА, полученные к одной анти-
генной детерминанте обладают меньшей способностью к связыванию антигенов,
а поликлональные антитела полученные к набору антигенов, содержат в своем
составе антитела, обладающие разной аффиностью и имеют больше центров свя-
зывания с антигеном. Поэтому использование в качестве подложки гиперимму-
ной сыворотки кролика позволяет повысить чувствительность метода.

Таблица 40
Титр антител гипериммунных (поликлональных) сывороток кролика,
полученных к мембранным антигенам, при исследовании в ИФА с кор-
_______________пускулярными антигенами микоплазм.___________________

Корпускулярные антигены	Титр гипериммунных сывороток кролика,		
	полученных к мембранным антигенам микоплазм		
	A. laidlawii	М. bovis	М. arginini
М. orale	1:3200	1:6400	1:6400
М. hominis (М-34)	1:6400	1:1600	1:6400
М. laidlawii	1:12800	1:1600	1:3200
М. arthritidis	1:6400	1:3200	1:6400
М.hyorhinis	1:6400	1:6400	1:6400
М. arginini	1:1600	1:6400	1:6400
М. arginini (из культуры клеток) 1:1600		1:6400	1:12800

Таблица 41

Титр антител гипериммунных (поликлональных) сывороток кролика
при использовании в ИФА мембранных антигенов микоплазм.

Мембранные антигены	Титр гипериммунных сывороток кролика, по- лученных к мембранным антигенам микоплазм		
	A. laidlawii	М. bovis	М. arginini
A.laidlawii	1:25600	1:3200	1:3200
М. arginini (из культур клеток)	1:3200	1:3200	1:25600- 51200
Микоплазмы из культур клеток ПТ-80 (210 п)	1:3200	1:3200-6400	1:25600- 51200
Микоплазмы из культур клеток ЛЭК (125 п)	1:400-800	1:6400-12800	1:25600
Микоплазмы из культур клеток СПЭВ (185 п)	1:3200	1:6400	1:12800-  25600
Молекулярно-биологические методы

Одним из наиболее перспективных является метод, основанный на
гибридизации ДНК или РНК микоплазм с гибридизационным зондом, в каче-
стве которого могут быть использованы клонированные фрагменты ДНК для
тех или иных видов микоплазм. Имеются литературные данные о том, что
заражение культур клеток микоплазмами можно определить, используя ДНК-
ДНК гибридизацию на нитроцеллюлозных фильтрах. Высокая чувствитель-
ность этого метода основана на том, что гибридизуемость ДНК, выделенных
из микоплазм разных видов, не превышает l-5%(H.Neimark,1970) и ДНК ми-
коплазм почти не гибридизуется с ДНК эукариот.

Метод ДНК-ДНК гибридизации позволяет выявить микоплазменную
контаминацию на уровне зараженности от 0,1 -1,0 микоплазменной частицы
на клетку (С.Н.Борхсениус и др., 1989).

Опубликованы результаты, успешного применения плазмид рМС5,
рМа 13, Ra-132, pMh9, pMG 16 для выявления контаминации клеточных
культур микоплазмами (S.Razin et al, 1986,С.Н.Борхсениус и др., 1987).

Но, учитывая тот факт, что рибосомальные гены являются консерватив-
ными и наблюдается высокая гомология порядка 70-80% у различных видов мик-
роорганизмов (С.Р.Борхсениус и др., 1989), считается, что для точного выявления
именно микоплазменной контаминации следует использовать тотальную ДНК
микоплазм. (С.К. Артюшин и др., 1990). Метод ДНК-ДНК гибридизации с тоталь-
ной ДНК микоплазм позволяет выявить микоплазменную контаминацию в куль-
турах клеток с чувствительностью, не уступающей стандартным методам. В каче-
стве гибридизационных зондов использовали ДНК микоплазм, наиболее часто
контаминирующих культуры клеток: M.arginini, A.laidlawii, M.bovis, M.hominis.
Для ДНК-ДНК гибридизации использовали нативные ДНК микоплазм. Биомассу
накапливали на элективных питательных средах ,затем лизировали с помощью
SDS и протеинкиназы К. ДНК микоплазм из лизата культур клеток выделяли по
методу Мармура (J.Marmur,1961). Концентрацию и степень очистки нативных
ДНК определяли по спектру поглощения в области 210 -320 нм и характеру раз-
деления в геле агарозы. Для установления нуклеотидного состава ДНК (мол.%
ГЦ-пар) микоплазм используют метод тепловой денатурации (Mamur,Doty,1962).

ДНК-ДНК гибридизацию проводят по методу Денхарта (Т.Маниатис
и др., 1984). При подборе способа мечения зонда сравнили в качестве метки
3Н-тимидин, биотин и дезоксигенин, а так же различные методы их введе-
ния. В результате проведенных исследований лучший результат по чувстви-
тельности и специфичности достигается при мечении зонда дезоксигенином
с помощью рассеянной затравки (С.К.Артюшин, И.Л.Куликова, 1993).

Нуклеотидный состав ДНК музейных штаммов микоплазм

Штаммы микоплазм Содержание гуанина и цитозина (мол.%ГЦ)

M.bovis
M.laidlawii
M.hominis
M.arginini
M.orale

27,3 + 0,02

31,2 + 0,04

29,4 +0,02

28,6 + 0,03

28,4 + 0,07
Полученные образцы нуклеиновых кислот денатурировали нагрева-
нием и наносили на нитроцеллюлозные фильтры по 2 мкл в точку. Нитро-
целлюлозные фильтры высушивают и прижигают при 80°С в вакууме-2 ча-
са. Предгибридизацию проводят в растворе 2SSC,5x р-р Денхарта, 0,5%
SDS, фрагментированная ДНК-100мкг/мл (0,2-0,5 мл р-ра на 1 см фильтра)
при 60°С -2-4 часа. Гибридизацию проводят в растворе содержащим
2SSC,0,2%SDS, 5х р-р Денхарта, 100 мкг/мл ДНК спермы лосося и 100
мкг/мл меченной ДНК микоплазм. По окончании реакции нитроцеллюлоз-
ные фильтры отмываются, красятся. За положительные считают наличие
окрашенных пятен в местах нанесения образцов.

Разработаны методические указания по использованию ДНК-ДНК
гибридизации для диагностики микоплазма-контаминации.

Для постановки полимеразно-цепной реакции (ПЦР) в качестве мат-
риц можно использовать как препараты ДНК, специально очищенные, так и
ДНК в составе грубых клеточных лизатов. Реакцию амплификации можно
проводить в программируемом термоциклере PEA-3002 «Labotek».
(Е.Ю.Жуланова и др., 1993). Стандартная схема опыта включает в себя 25-30
циклов в режиме: денатурация-92°С, 2 минуты, отжиг-52°С,1 минута и син-
тез -72°С, 2 минуты. Реакционная смесь в обьеме 50 мкл содержала ЮмМ
трис-НС1, pH 8,4 ; 4,5 мМ КС1; 1,5 MgCl2; 90 мкг/мл бычьего сывороточного
альбумина, по 0,2 мМ каждого из четырех дезоксирибонуклеотидтрифосфа-
тов (дНТФ), 3 единицы ТТН-полимеразы и по 1,1 мкМ праймера. Количест-
во ДНК в пробе составляет, как правило, 10 нг. Продукты амплификации
анализируют электрофорезом в 2% агарозном или 5% полиакриломидном
гелях. Для включения метки в синтезируемый фрагмент в реакции ПЦР 80%
одного из дНТФ замещали на меченный 32Р-дНТФ.

По данным С.Н.Борхсениуса и др.(1993) пара праймеров 16L-16R
пригодны для выявления ДНК микоплазм любого вида на фоне больших
количеств эукариотной ДНК.

Нуклеотидные последовательности праймеров
и ожидаемый размер продуктов амплификации.

Праймер	Последовательность (5'-3v)	Ожидаемый резуль- тат амплификат п:н
16L	CCA GAC ТСС TAC GGG AGG CA	1000
16R	AAG TCG AGT TGC AGA CTT CA	
18L	TGC GTG CAT TTA TCA GAT CA	530
18R	CAC TCA GCTAAG AGC АТС GA	
16spL	CGG GAA CGT GCG GAT GGA TC	неизвестен
23spR	TAT CGC AGC TTA CCA CGT CC	
Mp3L	AGT CCG ACT CGC AAG GAT CT	663
Mp3R	GTT TGT CCT TCC CCA ACT AA	
Mp4L	AAA AAC CTG TTG GAC CCC AA	-
Mp4R	ACC CCC ACC ACT AAG CAC AC	154
Mp5L	TTT AGT GGT GAT ATG GC AG	
Mp5R	GCT TTG CCT TAA AGG TIT GG	214
Считается, что микоплазмы обладают всего I или 2 рибосомными
оперонами, причем гены 5S рРНК у микоплазм не располагаются внутри
спейсеров рибосомных оперонов (C.Christiansen,1987). Нуклеотидная после-
довательность рибосомного оперона, включающая в себя спейсер между
генами 16S и 23S рРНК (500 п.н.), определена только для M.hyopneumoniae,
причем гены тРНК внутри спейсера этой микоплазмы не выявлены, таким
образом, функциональный смысл этих спейсеров пока неясен.

Праймеры Mp3L и Mp3R могут быть применены для диагностики
М.pneumoniae.

На основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) разработаны тесты
для выявления микоплазменных заражений.

18.2. Деконтаминация культур клеток от микоплазм

С проблемой диагностики и видовой идентификации микоплазма-
контаминации тесно связан вопрос деконтаминации культур клеток от ми-
коплазм.

Наиболее распространенный способ деконтаминации клеточных ли-
ний от микоплазм - использование антибиотиков, однако их следует строго
дозировать и применять дифференцировано. Использование антибиотиков
является необходимым условием при возрастании риска контаминации в
процессе получения первичных клеточных культур, при крупномасштабном
суспензионном выращивании линий клеток, при массовом производствен-
ном культивировании перевиваемых при-стеночных популяций, а также во
всех случаях обьединения клеточного материала.

В отличие от этого депонированные в коллекции и пристеночные культу-
ры перевиваемых клеток выращиваются без применения антибиотиков, поэтому
для большей гарантии их сохранности всю партию флаконов делят на две равные
части, пересевы которых проводят в чередующейся последовательности.

При возникновении контаминации эти культуры уничтожают, не под-
вергая «лечению», а культивирование возобновляют из резервных распло-
док, хранящихся в жидком азоте. Только редкие и уникалльные культуры
подлежат деконтаминации.

При работе с культурами клеток используют многие антимикробные
препараты, оптимальные (нетоксичные) дозы и характер действия которых
представлены в таблице 42.

Выбор эффективного препарата или комплекса препаратов зависит от
чувствительности к ним конкретных контаминантов. В связи с этим предва-
рительно определяют чувствительность микроорганизмов, выделенных из
ткани, используемой при получении первичных культур клеток, а также вы-
деляемых в процессе бактериологического контроля воздуха, питательных
сред и культур клеток к возможно более широкому кругу рекомендованных
препаратов и имеющихся в распоряжении лаборатории. При изоляции одно-
типных или высокочувствительных к какому-либо из антибиотиков микро-
организмов часто бывает достаточным применение монопрепарата, тогда
как в случае выделения смешанных культур или резистентных форм микро-
организмов необходимо использовать комплекс препаратов.
Таблица 42

Противомикробные препараты, используемые для
деконтаминации культур клеток

Наименование препарата	Чувствительные микроорганизмы	Тип антимикробно- го действия	Оптимальные концентрации для культур клеток (ед/мл;мкг/мл)
Пеницилин	Б+	бактерицидное	100,0
Стрептомицин	Б-+		100,0
Мономицин	Б-+,М		100,0
Неомицин	Б-+,М		50,0
Канамицин	Б-+,М		200,0
Г ентамицин	Б-+,М		200,0
Полимиксин	Б-+		50,0
Фурагин	Б-+		8,0
Тетрациклин	Б-+,М	бактериостатическое	г	30,0
Эритромицин	Б-+		50,0
Линкомицин	Б-+,М		100,0
Левомицитин	Б-+,М		30,0
Тилозин	м		10,0
Олеандомицин	м		15,0
Астазилид(преп№1) М			10,0
Асиазиан(преп.№2) М			10,0
Нистатин	мг	фугнистатическое	50,0
Амфотерицин	мг		2,5
Тиамулин	Б-+,М	бактерицидное	10,0
Байтрил	Б-+.М	бактериостатическо	е	2,5
Тил микозин	Б-+,М ,МГ	бактерицидное	5,0-10,0

Примечание: Б+ -граммположительные бактерии; Б- граммотрицательные бак-
терии, М-микоплазмы; МГ-микроскопические грибы.

Чувствительность микроорганизмов к тем или иным препаратам оп-
ределяют с помощью стандартных дисков антибиотиков (согласно прила-
гаемым к ним инструкции) или методом серийных разведений веществ, как
это рекомендуется руководствами по микробиологии.

Выраженным противомикробным действием по отношению к наибо-
лее часто встречающимся контаминантам клеточных культур обладает ком-
плекс следующего состава: пеницилин 100,0; гентамицин 100,0; полимиксин
50,0;фурагин 5,0.Этот комплекс часто используют при получении большого
объема первичных культур на биофабриках, для профилактики контамина-
ции и в процессе пересева субкультур.

’’Лечение” контаминированных линий клеток проводят в момент пере-
сева ,либо в период формирования монослоя, внесением в свежую культураль-
ную среду необходимого количества маточного раствора антибиотиков, от 3 до
8 пассажей, до стабилизации культурально-морфологических свойств. Затем
культуры клеток переводят на среды, содержащие стандартные антибиотики:
пеницилин- 100ед/мл; стрептомицин-100мкг/мл. По мере необходимости обра-
ботку контаминированных культур повторяют или проводят периодически.
После обработки антибиотиками состояние культур заметно улучша-
ется: границы клеток становятся четко выраженными, исчезает помутнение
питательной среды и не происходит её значительного закисления. Клетки
интенсивно размножаются с большим коэффициентом пересева. Монослой-
ная культура формируется в более короткие сроки (на 1-2 дня быстрее).

Последующее пассирование клеток позволяет поддерживать их в хо-
рошем морфологическом состоянии и постоянно получать значительный
прирост клеток без видимых цитологических изменений.

Через 1 -2 месяца субкультивирования культуры обрабатываются повторно.

Контаминированные бактериями или дрожжами культуры уничто-
жаются автоклавированием.

Анализ литературных данных показывает, что чаще всего для элимина-
ции контаминированных культур клеток рекомендуют применять различные
антибиотики. Однако быстрое образование микоплазма-контаминантами тро-
фовариантов по отношению к используемым антибиотикам и цитотоксический
порог чувствительности культур клеток с другой стороны, не позволяет эффек-
тивно использовать существующие методы деконтаминации с применением
антибиотиков. Тем не менее в печати периодически появляются сообщения об
успехах деконтаминации с применением антибиотиков и последующего клони-
рования KneroK.(R.S.Gardella et al,1984).

Л.П.Дьяконов, Н.Н.Сухарева и др.(1981) предложили способ стаби-
лизации подвергаемых пересеву клеток, контаминированных микоплазмами
с использованием моноэфиров сахарозы и высших полиненасыщенных
жирных кислот, выделенных из свободно живущих простейших.

Успешным примером деконтаминации является освобождение 18 кле-
точных линий от M.orale, M.arginini, M.hominis, A.laidlawii и др.(ЗТеап55оп et
al, 1985).B этом случае были использованы кроличьи гипериммунные антисыво-
ротки, полученные в результате иммунизации животных мембранными антиге-
нами перечисленных видов микоплазм. Для этого сыворотку (от 5 до 10%) до-
бавляли в культуральную среду контаминированных клеток.

Новые возможности деконтаминации культур возникли, когда было ус-
тановлено, что микоплазмы чувствительны к действию поверхностно-активных
веществ (ПАВ) и требуют поддержания осмотического давления в питательной
среде в диапазоне от 10 до 14 миллиосмолей (A.W.Rodwell,1983). Установление
у поверхностно-активных веществ бактерицидных свойств послужило основа-
нием для использования их в различных областях ветеринарии и медицины.
ПАВ широко применяются в качестве препаратов для деконтаминации совме-
стно с другими лекарственными веществами, активизируя их действие и улуч-
шая тем самым специфические свойства.

Б.Ньютон (1969) разделял ПАВ на следующие классы:

1	.Анионные, содержащие гидрофобный остаток, сбалансированный
отрицательно заряженной гидрофильной группой.

2	.Катионные соединения, которые содержат тот же тип гидрофобных
групп, что и анионные, но несут положительно заряженную гидрофильную
группировку.

3	.Неионные соединения, в которых гидрофобный остаток сбаланси-
рован гидрофильной группировкой.
Наибольшую практическую ценность в качестве бактерицидных
средств представляют катионные соединения, относящиеся к группе четвер-
тичных амониевых соединений.

Механизм антибактериального действия ПАВ изучали многие исследова-
тели, в результате чего были предложены различные теории их действия, смысл
которых заключается в следующем: общая денатурация белков клетки, инактиви-
рование специфических ферментов, нарушение структуры клеточного барьера
проницаемости (М.В.Волькенштейн и др., 1970; Ю.С.Кривошеин и др., 1983).

По данным Г.Н.Першина (1952) и Б.Ньютона (1960) катионные ПАВ
угнетают кислотообразование и дыхание, дегидрогеназ ну ю активность как у
грамположительных, так и грамотрицательных микроорганизмов. Катион-
ные детергенты способны связывать активность анионных групп ферментов
и нарушать электрический заряд клеточной мембраны. Катионные детерген-
ты в основном воздействуют на цитоплазматическую мембрану, изменяя ее
функции, связываясь с жирными кислотами мембраны микробной клетки,
обусловливают изменение клеточной проницаемости(Я.Р.Коваленко,1976).

Катионные детергенты, воздействуя на микробные ферменты, ингибируют
дыхательную цепь клетки НАДФ-Н-оксидазы,причем ингибирование связано не с
повреждением начального фермента дыхательной цепи НАД-Н-дегидрогеназы, а
с солюбилизацией липофильного переносчика менахинона-9(Э.Я.Рудзит и
др., 1981). Одновременно указанные соединения нарушают мембранное фосфори-
лирование, угнетая ключевой фермент мембранного фосфорилирования, протон-
ную АТФ-азу на 100% в чрезвычайно низких концентрациях.

Угнетение протонной АТФ-азы микробной клетки влечет за собой не
только функциональное нарушение работы протонной помпы, обеспечивающей
поступление в клетку ионов К+, и выход из клетки ионов Na+ против градиента
концентрации,но и нарушение гидролиза АТФ, одна молекула которой приво-
дит к генерации двух ионов Н+, которые переносясь к наружней мембране соз-
дают градиент электрохимического потенциала, используемый клеткой в каче-
стве движущей силы для различных процессов, в том числе для транспорта раз-
личных соединений внутрь клетки (А.К.Гулков,1984).

Следовательно, один из механизмов противобактериального дейст-
вия катионных ПАВ заключается в том, что они вызывают изменение про-
ницаемости клеточных мембран, а также ингибируют дыхательные фермен-
ты микробной клетки и нарушают мембранное фосфорилирование, поэтому
микроорганизмы становятся более доступными для воздействия как самих
катионных детергентов, так и различных химиотерапевтических веществ.

Синтезированный в СССР этоний- 1,2-этилен-бис (диметил-
карбдецилоксиметил) аммония хлорид, обладает наибольшей поверхност-
ной активностью и наиболее выраженным противомикробным действием
(М.Д.Машковский, 1978).

Чрезвычайно важным свойством этония является значительное уси-
ление противомикробной активности различных химиотерапевтических
средств (В.Ф.Ковалев,1983).

Исследования проведенные на 26 тетрациклинорезистентных штам-
мах E.Coli в сочетании с этонием показали значительное повышение актив-
ности тетрациклинов (Е.Н.Ананьев идр., 1978).Авторы объясняют это увели-
чснием поглощения антибиотиков, что связано с повышением проницаемо-
сти клеточных мембран под воздействием этония.

О.Ш.Расулев (1987) использовал ПАВ (этоний) в дозе 7,5 мкг/мл с
тетрациклином в дозе 50мкг/мл и канамицином в дозе 250 мкг/мл для по-
давления роста микоплазм в перевиваемых линиях клеток ПТ-80 и СПЭВ в
течение 3 последовательных пассажей. Но затем концентрация микоплазм
восстанавливалась через 5 пассажей.

Клеточные линии, дефектные по тимидинкиназе СПЭВ-13-Д5 иС-
ПЭВ-13-А4, были контаминированы микоплазмами в количестве 2,4.107 и
2,0.107 КОЕ/мл соответственно. Культивирование этих клеток в присутствии
5-БДУ (5-бром-2 дезоксиуридин) в концентрации 200 мкг/мл, ПАВ-этония
(10,0 мкг/мл) и канимицина (250мкг/мл) позволило полностью освободить
эти культуры от микоплазм (Л.П.Дьяконов,О.Ш.Расулев и др., 1989).

Но этот метод не пригоден для деконтаминации обычных, не дефект-
ных по ТК, перевиваемых клеток.

Разработан метод деконтаминации перевиваемых линий клеток от
микоплазм с использованием антибиотика -тиамулина и ПАВ-этония
(Л.П.Дьяконов,И.Л.Куликова и др., 1989). Тиамулин-препарат фирмы Или-
Лилли(Пу-Ел11у, Indianapolis,США). Спектр действия тиамулина охватывает
прежде всего микоплазмы и спирохеты. Но он активен также против грам-
мположительных патогенных микроорганизмов, таких как стафилококки и
стрептококки, против видов Haemophilus и обычных анаэробных бактерий.

Этоний берут в количестве 5-7 мкг/мл и добавляют его только на моно-
слой клеток, а тиамулин 10 мкг/мл в суспензию при пересеве. Клетки обрабаты-
вают трехкратно, независимо от того, выделяются микоплазмы или нет.

Кроме деконтаминирующего действия, наблюдали увеличение пролифера-
тивной активности клеток в обрабатываемых культурах. Монослой в обработан-
ных культурах формировался на 2-3 сутки, в то время как в контроле на 4-5 сутки.
Клетки были с четкими границами, без зернистости и монослой без «окон».

Для деконтаминации клеточных культур от микоплазм предложены
хинолоны, к которым резистентность среди микоплазм пока не обнаружена
(J.Renaudin et al, 1986 и др.). В настоящее время для деконтаминации культур
клеток от микоплазм широко используются также антибиотик доксициклин,
ципрофлоксацин и фторхинолоновые препараты. Действующим началом
фторхинолоновых препаратов является энрофлоксацин.

Фирма «Вауеп> /Германия/ выпускает 2,5%;5%;10% байтрил, содержа-
щий 25, 50, 100 мг энрофлоксацина. Байтрил высокоэффективен в отношении
грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов, в том числе эше-
рихий, протея, сальмонелл, пастерелл, стафилококков, псевдомонад, коринебак-
терий, микоплазм. И.Л.Куликова, Л.П.Дьяконов (1990) провели работу по ис-
пользованию байтрила для деконтаминации культур клеток от микоплазм. Дозы
от 5 мкг/мл и выше вызывали 100% гибель клеток, дозы от 0,1 до 1 мкг/мл по-
давляли микоплазменную контаминацию, не вызывая гибели клеток. Для де-
контаминации использовали байтрил из расчета 1 мкг/мл среды культивирова-
ния. После пятикратной обработки культур клеток ЛЭК, ПТ-80, ТР микоплазмы
не обнаруживали. Проводятся исследования по выявлению эффективной дозы
препарата Энроксила /ENROXIL/, выпускаемого фирмой «КРКА» /Словения/.
Испытаны 2,55; 5%; 10% растворы энроксила с содержанием соответственно
25,50,100 мкг энрофлоксацина. В предварительных опытах получены положи-
тельные результаты подавления микоплазм в культурах клеток.

Культуры клеток после 4-5 последовательных пересевов исследуют и
считают их свободными от микоплазм на основании следующих показателей:

-	при посеве культуральной жидкости и разрушенных клеток на элек-
тивные среды, микроорганизмы не выделяются;

-	при исследовании монослойной культуры в нативном виде, в световом
микроскопе - цитоплазма гомогенная, прозрачная, без следов зернистости, при-
знаков тургора, благодаря чему контуры клеток четкие, с хорошо выраженной
рельефностью поверхности монослоя; по общей морфологии, кариологии, про-
лиферативной активности и чувствительности к вирусам деконтаминированные
клетки не должны отличаться от исходной здоровой родительской популяции;

при окрашивании клеток по Романовскому-Гимзе в цитоплазме не
должны быть посторонние включения; отсутстваие микоплазм подтверждается
цитохимическими исследованиями (ДНК-красители), иммунофлуоресценцией.

При необходимости, используются другие методы, в том числе электронная
микроскопия, ДНК-зонды,ПЦР, ИФА с поли- и моноклональными антителами.

Литература

1.	Артюшин С.К., Куликова И.Л., Дьяконов Л.П., Коромыслов Г.Ф. Диагностика микоплазма-
контаминации методом ДНК-ДНК гибридизации. Доклады ВАСХНИЛ ,2,1990,44^18.

2.	Афанасьев В.Н. Антигенная структура некоторых видов микоплазм крупного рогато-
го скота. Дис....канд.наук.,М.,1982.

3.	Борхсениус С.Н.,Чернова О А. Микоплазмы. Ж. Цитология, 1987, 29,4,с.379-390.

4.	Борхсениус С.Н., Чернова О.А. Микоплазмы.Л.: Наука, 1989, -156 с..

5.	Дьяконов Л.П. Микоплазмы-контаминанты культур клеток. В кн.: Микоплазмы в патологии
животных. Под ред.Г.Ф.Коромыслова, Я.Месароша, Л.Штипковича, М.,1987.

6.	Каган Г.Я.(ред) Микоплазмы в патологии человека., М., 1983.

7.	Куликова И.Л. Диагностика и видовая идентификация микоплазм в культурах клеток
животных методами иммуноферментного анализа с поли- и моноклональными анти-
телами и ДНК-ДНК гибридизации. Дис...канд.наук, М.,1989.

8.	Куликова И.Л., Феоктистова Т.А. ИФА для видовой идентификации микоплазм,
выделенных из культур клеток. Труды ВИЭВ,69, 1990.

9.	Куликова И.Л., Гальмутдинов Г., Дьяконов Л.П. Гибридомы и моноклональные анти-
тела в разработке высокоэффективных методов идентификации микоплазм и диагно-
стики микоплазмозов. Ж-л.Ветеринария, 9, 1993.

10.	Михайлова Г.Р., Зорина Е.В., Князева В.Ф. и др. Деконтаминация клеточных культур
от микоплазм. Вопросы вирусологии , М., 1985, 15.

11.	Расулев О.М. Совершенствование методов диагностики микоплазма-контаминации и
деконтаминации культур клеток животных. Дис... кан.наук, М., 1987.

12.	Жуланова Е.Ю., Вонский М.С., Лисин С.С. и др. Диагностика микоплазменных зара-
жений с помощью направленной амплификации. Оригинальные статьи, 1993, 9-13.

13.	Barile M.F. Mycoplasma infections of cell cultures. Amer. J.Med.Sci 1981,17,555-562.

14.	Chen T.R. In situ detection of Mycoplasma contamination in cell cultures by fluorescent
Hoechst 33258 stain.Exp.cell Res., 1977,107, 255-262.

15.	Gabridge M.G.,Lundin D.J.,Gladd M.F. Detection and speciation of common cell culture my-
coplasmas by an enzyme-linked immunosorbent assay with biotin-avidin amplification and micro-
porous membrane solid phase.In Vitro Cellular Developmental Biology, 1986,22 8,491-498.

16.	Mc.Garrity G.J.,Barranger J.A. Effect of Mycoplasma Infection of Pyruvate Dehydro-
genase.Complex Activity of Normal and Pyruvate Dehydrogenyse Complex-deficient Fi-
broblasts.Exp.Cell Res.,1984, 151,557-562.

17.	Me Garrity G.J.Mycoplasma in cell cultures.Isr.J.Med.Sci., 1987,23, 6,470-471.

18.	Razin Sn.,Hymon F.,Nur I. et al.DNA probes for detection and identification of mollicutes: ap-
proached and problems.The VI. Interm. Congr.of the IOM,Birmingham (Alabama), 1986,81.

19.	Razin Sh. Identification of mycoplasma colonies.Methods Mycoplasmol., 1983a, 1,83-88.
Глава 19. Создание криобанка штаммов и линий кле-
ток и коллекций клеточных культур

Начиная с 50-х годов 20-го столетия получены сотни различных
штаммов и линий клеток из органов и тканей домашних и диких млекопи-
тающих, человека, птиц, рыб и других холоднокровных, насекомых, клещей,
моллюсков и других животных. Одни линии клеток изначально получены из
опухолевых тканей, другие из нормальных (немалигнизированных) тканей.
Полученные линии и штаммы клеток могут быть размножены, заложены в
криобанк на длительное хранение и охарактеризованы для широкого ис-
пользования в научных исследованиях и биотехнологии.

Развитие важнейших и наиболее перспективных современных направле-
ний фундаментальных и прикладных исследований в области биологии, медици-
ны и ветеринарной медицины, а также создания новых биомедицинских техноло-
гий невозможно без широкого использования культур клеток человека, живот-
ных. Культивируемые клетки необходимы для изучения процессов клеточного
деления, дифференцировки и регуляции экспрессии генов. Они необходимы так-
же для выявления молекулярных механизмов канцерогенеза и наследственных
заболеваний человека, а также для развития новых медицинских технологий за-
местительной терапии и генотерапии тяжелых заболеваний человека.

Практической вирусологии клеточные культуры нужны для создания
диагностических и вакцинных препаратов и проведения диагностики на сер-
тифицированных культурах клеток человека и животных. Эпизоотическое
состояние отечественного животноводства во многом зависит от внедрения
клеточных культур в практику ветеринарии.

Все перечисленное невозможно осуществить без стабильного всесторон-
не охарактеризованного и доступного клеточного материала. Решение этой
проблемы могло быть достигнуто только путем создания и развития Нацио-
нальной коллекции клеточных культур, главной задачей которой должно было
быть выведение, сбор, характеристика и сохранение эталонных клеточных ли-
ний человека, животных и растений, а также обеспечение отечественных фун-
даментальных и прикладных исследований надежным клеточным материалом.

В развитых странах функцию обеспечения эталонными образцами куль-
тивируемых клеток выполняют Национальные коллекции клеточных культур.
Наиболее крупной мировой коллекцией является Американская коллекция ти-
повых культур (АТСС). Бурное развитие биоиндустрии и стремительно возрас-
тающая ценность клеточных линий с сопутствующим ограничением междуна-
родного распространения клеток, имеющих практическое применение, стиму-
лировало создание в течение последнего десятилетия ряда новых Националь-
ных коллекций клеточных культур в Германии, Англии, Японии, Китае. Созда-
ются коллекции во Франции, Италии, Дании. Таким образом, Национальные
коллекции становятся сейчас областью государственных и деловых интересов.

Как правило, Национальные коллекции являются некоммерческими
автономными бесприбыльными учреждениями, получающими целевое Го-
сударственное финансирование, а также финансовую поддержку от крупных
биотехнологических и фармацевтических компаний, использующих клеточ-
ные культуры для производства биологически-активных соединений.
В СССР, и России, основная идея проводившейся в течение более,
чем 20 лет работы, состояла в создании и развитии сначала Всесоюзной, а
затем Всероссийской коллекции клеточных культур человека, животных и
растений на основе организационного объединения уже существовавших в
то время коллекций при научных учреждениях различных ведомств (АН
СССР, АМН СССР, ВАСХНИЛ, М3 СССР).

Объединение на основе сохранения автономности уже существовавших
коллекций, имело важный практический смысл. Оно позволило, в результате дли-
тельной скрупулезной совместной работы, выработать общую стратегию и такти-
ку развития коллекций, унифицировать требования к паспортизации, контролю
качества и хранению клеточного материала на уровне современных международ-
ных норм, а также разработать общие правила работы с клеточными культурами.

Сохранение специализированных коллекций в научных учреждениях
соответствующего профиля, располагающих высококвалифицированными
специалистами в определенной области биологии, медицины, и сельского
хозяйства, позволило с самого начала поддерживать высокий профессио-
нальный уровень работы создаваемых и развивающихся коллекций.

Эта идея была поддержана Президиумом академии наук СССР и Гос-
комитетом по науке и технике СССР, и работа по созданию Коллекции кле-
точных культур была включена в число приоритетных направлений работ в
области науки и техники СССР и РФ.

В настоящее время работа по развитию Коллекции продолжается в
рамках подпрограммы ’’Биологическое разнообразие” ФЦНТП ’’Исследова-
ния и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники
гражданского назначения”

Российская коллекция клеточных культур человека, животных и рас-
тений состоит из 9 специализированных коллекций. В их число входят:

1.	Коллекция культур клеток позвоночных (Центральный банк клеточных
линий человека и животных. Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург);

2.	Коллекция клеток высших растений (Институт физиологии расте-
ний им. К.А.Тимирязева, РАН, Москва);

3.	Коллекция генетически-трансформированных корней высших рас-
тений (Институт физиологии растений им. К.А.Тимирязева РАН, Москва);

4.	Коллекция постоянных линий клеток беспозвоночных (Институт
общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН, Москва);

5.	Коллекция перевиваемых соматических клеток позвоночных (Ин-
ститут вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН, Москва);

6.	Коллекция диплоидных клеток человека и животных для исследо-
ваний в области вирусологии (Научно-исследовательский институт гриппа
РАМН, Санкт-Петербург);

7.	Коллекция соматических клеток человека от больных наследственны-
ми заболеваниями (Медико-генетический научный центр РАМН, Москва);

8.	Коллекция перевиваемых соматических клеток позвоночных меди-
цинского назначения (Екатеринбурский научно-исследовательский институт
вирусных инфекций М3 РФ, Екатеринбург);
9.	Коллекция перевиваемых соматических клеток сельскохозяйствен-
ных и промысловых животных (СХЖ РАСХН), (Всероссийский институт
экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко РАСХН, Москва).

Фонды коллекции насчитывают 1700 клеточных линий, из них около
700 являются референтными линиями, депонированными в связи с их патен-
тованием, и 170 имеют значение для промышленного культивирования.

Основные направления работы по созданию и развитию Российской
коллекции клеточных культур заключались в следующем:

1.	Непрерывное поддержание и развитие фондов Коллекции путем
выведения, сбора, паспортизации и хранения клеточных линий человека,
животных и растений.

2.	Разработка единых требований к качеству коллекционного материала,
единых паспортов, методов анализа, хранения и контроля клеточных линий.

3.	Совершенствование методов ведения коллекции на основе проведения
научных исследований, посвященных изучению влияния условий культивиро-
вания, криоконсервации и контаминации на генетическую изменчивость кле-
точных линий; получение новых клеточных линий и гибридом; разработка но-
вых методов криоконсервации; селекция клеточных линий, имеющих промыш-
ленное значение и разработка бессывороточных питательных сред.

4.	Депонирование уникальных клеточных линий и гибридом, патен-
туемых в связи с их практической ценностью.

5.	Создание информационных баз данных по клеточным культурам и
постоянно действующей службы информации путем регулярного издания
информационного бюллетеня.

6.	Обеспечение образцами стандартного и надежно охарактеризован-
ного клеточного материала фундаментальных и прикладных биологических,
медицинских, сельскохозяйственных и биотехнологических исследований, а
также биологической и медицинской промышленности.

7.	Оказание научно-методической помощи сотрудникам научных уч-
реждений страны по методам культивирования и анализа клеточных линий
путем проведения кратковременных и длительных стажировок в базовых
коллекциях, а также путем издания монографий, методических руководств,
проведения научных конференций, школ и совещаний.

Деятельность Российской коллекции клеточных культур имеет боль-
шой практический выход. Основными практическими достижениями Кол-
лекции являются:

1.	Сохранение биоразнообразия соматических клеток человека, жи-
вотных и растений путем постоянного расширения состава коллекционных
линий разного видового и тканевого происхождения;

2.	Регулярное обеспечение научных и прикладных исследований эта-
лонным охарактеризованным, стерильным клеточным материалом. Ежегод-
но выдается около 600 клеточных линий более чем 270 научным и произ-
водственным учреждениям 70 городов страны;

3.	Депонирование и длительное хранение 700 уникальных клеточных
линий и гибридом, имеющих ценные свойства для народного хозяйства;
4.	Отбор и селекция клеточных линий, чувствительных к вирусам, для
использования их в производстве иммунобиологических препаратов и соз-
дания новых методов для диагностики вирусных инфекций;

5.	Обеспечение качественным клеточным материалом санэпидстанций
83 регионов, ветеринарно-диагностических лабораторий и биофабрик России;

6.	Создание криобанка спермы трутней, изучение влияния длительно-
го криосохранения на качество потомства пчел от пчеломаток, искусственно
осемененных спермой, хранившейся при -196°С;

7.	Создание фонда из 340 клеточных линий человека от больных на-
следственными заболеваниями является ценным биологическим материалом
для выявления кариотипических изменений и молекулярных механизмов,
определяющих тяжелые заболевания человека.

Многолетними исследованиями выведены новые штаммы клеток и ли-
нии, от животных и человека, чувствительные к разным вирусам, пригодные
для научных исследований, производства вакцин и диагностических систем.

В 1991 году впервые опубликован краткий каталог клеточных линий
Всесоюзной коллекции клеточных культур. В 1999 году подготовлен к печа-
ти и издан расширенный полный каталог Российской коллекции клеточных
культур на русском и английском языках.

Российская коллекция клеточных культур отличается по способу органи-
зации от других коллекций, что имеет свои положительные и отрицательные сто-
роны. К положительным следует отнести несравненно более тесную связь спе-
циализированных коллекций с фундаментальной наукой соответствующих об-
ластей знаний. Благодаря этому, они имеют более высокий научный потенциал,
возможности использования научных и методических достижений данного науч-
ного учреждения и создания на этой основе новых современных клеточных тех-
нологий. К отрицательным относится постоянное отсутствие целевого Государст-
венного финансирования и финансовой поддержки со стороны промышленных
организаций, что значительно затрудняет кооперацию работы специализирован-
ных коллекций и создает большую зависимость их положения от финансового
состояния и научной политики учреждений, при котором они находятся.

По способу культивирования клеточных линий, методам их анализа,
паспортизации и криоконсервации Российская коллекция клеточных культур
вполне соответствует Международным нормам ведения коллекций. Об этом
свидетельствует опубликование фондов Коллекции в Международном каталоге
Interlab project ’’Human and animal cell lines catalogue” Edited by B.Parodi et
al., 1993, а также включение данных о депонированных гибридомах в Междуна-
родную базу данных Всемирной Федерации коллекции культур.

Российская коллекция клеточных культур является членом Всемирной
Федерации коллекций культур. Европейской Ассоциации коллекций культур и
включена в число Национальных коллекций клеточных культур мира.

Длительная и чрезвычайно трудоемкая работа по созданию и развитию
Национальной Коллекции клеточных культур была проведена своевременно, а
ее актуальность состоит в обеспечении независимости развития отечественных
биомедицинских исследований от коллекционных фондов других стран.
В ВИЭВ криобанк вирусов, простейших, культур клеток функциони-
рует с 1959 года, а специализированная коллекция культур получила статус
официальной Коллекции для депонирования патентуемых авторских штам-
мов и линий в 1982 году, как и другие коллекции.

Специализированная коллекция клеточных культур ВИЭВ (СХЖ
РАСХН) входит в состав Российской коллекции культур клеток (РККК) РАН.

Руководитель коллекции - заслуженный деятель науки РФ, профессор
Л.П.Дьяконов.

В коллекции культур клеток хранится более 200 штаммов и линий
клеток от 14 видов сельскохозяйственных, промысловых, диких и лабора-
торных животных. Депонировано с целью патентования 53 новых клеточ-
ных штамма, в том числе мутантные по ТК' и ГФРТ’ штаммы, внутривидо-
вые и межвидовые гибридные культуры с лимфоцитами сельскохозяйствен-
ных животных, гибридомы-продуценты МКА к антигенам вирусов, мико-
плазм, соматотропину, иммуноглобулинам (табл.43).

Таблица 43

Количество основных немалигнизированных культур клеток сельско-
хозяйственных и промысловых животных Американской коллекции
типовых культур (АТСС), Европейской коллекции культур клеток
(ЕСАСС) и специализированной коллекции культур клеток сельскохо-
зяйственных и промысловых животных ВИЭВ (СХЖ РАСХН) РККК

Вид животного	Количество штаммов и линий клеток			Количество субштаммов
	АТСС	ЕСАСС	СХЖ РАСХН (ВИЭВ)	СХЖ РАСХН (ВИЭВ)
Крупный рогатый скот	16	12	11	71
Овца	4	1	5	17
Свинья	11	6	18	65
Лошадь	2	1	1	2
Кролик	7	7	7	10
Сайга	-	-	2	9
Коза	2	1	1	1
Сибирский горный козерог	-	-	1	1
Карликовая коза	-	-	1	1
Кошка				
Гибридные культуры клеток с/х животных			3	16
Мутантные культуры клеток с/х животных			4	15
Обезьяна	-	-	2	5
Крыса	-	-	1	1
Мышь	-	-	1	2
Гибридомы (мышиные) про- дуценты МКА к антигенам микоплазм, вирусов, имму- ноглобулинов животных 				6	6
Всего		42	29	. .73 .	235
Депонированью с целью патентования культуры должны быть пас-
портизированные охарактеризованы кариологически по культурально-
морфологическим свойствам, отсутствию вирусных, бактериальных, мико-
плазменных и др. контаминантов, чувствительности к вирусам, или по про-
дукции МКА, гормонов, ферментов.

Однако авторы, передающие культуры в коллекции, не всегда могут
представить полную характеристику депонируемых культур, поэтому одной
из функций Коллекции является изучение стабильности свойств культур в
процессе длительного хранения в жидком азоте (-196°С).

Ежегодно 5-6 штаммов и линий клеток рекультивируются после размо-
раживания. При этом определяется процент жизнеспособных клеток, пролифе-
ративная и митотическая активность, модальный класс хромосом, отсутствие
микоплазма-контаминации. Мутантные культуры исследуются на наличие ре-
вертантов. Проводится описание морфологических свойств культур.

Установлено, что длительное хранение в жидком азоте (5-10 лет) не ока;
зывает отрицательного влияния на стабильность кариотипа, культурально-
морфологические характеристики как диплоидных штаммов, так и постоянных
клеточных линий, а также мутантных, гибридных культур и гибридом. Жизне-
способность культур, замороженных по разработанным методам, сохраняется
после длительного хранения в криобанке до 85-96%.

Преимущество работы с хорошо изученными линиями клеток, не зара-
женных микроорганизмами, бесспорно. Но возможны трудности, связанные с
использованием клеточных линий. Наблюдаются случаи, когда обмен клеточны-
ми линиями между разными лабораториями приводил к загрязнению одних
штаммов и линий клеток клетками других штаммов и линий (Хей Р., 1989). Бак-
териальные и грибковые загрязнения представляют дополнительные трудности,
но они легко выявляются и приводят к менее серьезным последствиям, чем более
незаметное заражение микоплазмами. Культуры клеток, полученные из других
лабораторий или от авторов, размножают для получения первого пробного мате-
риала, который должен быть охарактеризован по следующим показателям: про-
верка на контаминированность вирусами, микоплазмами и др., проверка видовой
принадлежности, кариология, эффективность клонирования, тесты на опухоле-
родность, культурально-морфологические показатели. Эти клетки составляют
эталонный запас. Дополнительно размножаются клетки для выдачи в другие уч-
реждения - ’’рабочий запас”. По мере его использования из эталонного запаса
клетки рассевают для дальнейшего размножения. Очень важно отделить эталон-
ный запас, который служит ’’резервуаром” для пополнения рабочего запаса при
распределении. В противном случае частые замены культивированного материа-
ла, могут привести к сокращению ценного ’’эталонного” запаса, который трудно, а
иногда невозможно восстановить. Проблемы, связанные с генетической неста-
бильностью, старением, трансформацией можно решать, если придерживаться
такого правила работы с культурами клеток в коллекции и криобанке.

Методика консервирования клеточных культур в жидком азоте

Повреждения клеток, происходящие при замораживании и оттаивании
культуры обусловлены образованием внутриклеточных кристаллов льда и из-
меняемого осмотического давления. Добавление криопротекторов, таких как
диметил сульфоксид (ДМСО) и глицерин, а также оптимальные скорости замо-
раживания, и оттаивания сводят повреждения клеток к минимуму.

Возможно кратковременное сохранение замороженных клеток в низ-
котемпературном холодильнике (-70°С), но оптимальные условия достига-
ются при хранении в жидком азоте (-196°С), либо в его парах (-120°С). Ме-
тод замораживания в жидком азоте имеет преимущество не только из-за
низкой температуры, обеспечивающей прекращение метаболизма в клетке,
почти неограниченного срока хранения, но и вследствие полного отсутствия
риска механического повреждения клеток.

Клеточные культуры. В опытах по длительному хранению клеток в
жидком азоте используются как перевиваемые клеточные линии, так и пер-
вичные, диплоидные культуры и субкультуры.

Приготовление клеточной суспензии. Первично^грипсинизированные
клеточные суспензии готовят с помощью метода дробной трипсинизации. Мо-
нослойные культуры клеток первичные, диплоидные, перевиваемые, выращен-
ные в матрасах, просматривают под малым увеличением микроскопа (об. 10, ок.
7) и отбирают те из них, которые находятся в хорошем морфологическом со-
стоянии. Клетки снимают со стекла смесью растворов версена (0,02%) и трип-
сином (0,25%) в соотношении 9:1. Для этого из матрасов с выросшим моносло-
ем клеток удаляют питательную среду, в них вносят подогретый до 36°С дис-
пергирующий раствор и помещают в термостат на 5-10 минут при 37°С, за это
время матрасы несколько раз покачивают. Как только клетки в результате дей-
ствия диспергирующего вещества начнут отделяться от стекла и переходить в
среду, матрас осторожно встряхивают и клетки полностью отслаиваются от
стекла. Для того, чтобы прекратить действие версена и трипсина на клетки,- к
суспензии добавляют 2-3% сыворотки крупного рогатого скота. Суспензию
клеток из матрасов собирают в один сосуд, измеряют объем суспензии для под-
счета клеток. Взвесь клеток помещают в центрифужные стаканы и центрифуги-
руют 10 минут при ЮООоб/мин. Надосадочную жидкость сливают, а осадок
клеток ресуспендируют в защитной среде.

Криозащитные среды. Все криозащитные вещества делятся на прони-
кающие в клетку, связывающие воду эндо- и экстрацеллюлярно, и не прони-
кающие, действующие лишь экстрацеллюлярно. Классическим кариозащитным
соединением является глицерин, а также диметилсульфоксид (ДМСО), быстро
проникающие в клетки и наиболее прочно связывающие воду внутри и вне ее.
Используют также поливилпорролидон (ПВП), полиэтилен оксид (ПЭО) и др.
криопротекторы. Механизмы защитного действия криофилактических веществ
основаны главным образом на их способности создавать прочные связи с моле-
кулами воды, более прочные, чем связи молекул воды между собой, что препят-
ствует формированию правильной кристаллической решетки льда и замедляет
рост кристаллов, если они образуются.

Для консервирования штаммов применяют защитную среду, состоящую из
питательной среды (50%), сыворотки крупного рогатого скота (40%) и димегил-
сульфоксида (10%). Допускается использование глицерина вместо диметилсуль-
факейда. Глицерин и ДМСО стерилизуют автоклавированием при 1,5 атм. 1 час.
Режим замораживания и оттаивания клеточных суспензий. Осадок
клеток разводят защитной средой до концентрации 3,5-5-106 в 1 мл, взвесь кле-
ток разливают в стеклянные или пластиковые стерильные ампулы емкостью 2; 5
мл с соблюдением правил асептики. На ампулы наклеивают этикетки из лейко-
пластыря. Стеклянные ампулы запаивают над пламенем газовой горелки и дер-
жат в рефрижераторе при 4°С в течение 1 -2 часов (для контакта клеток с консер-
вантами - процесс эквилибрации). Охлаждение ампул от 4°С до - 70°С проводят
в смеси сухого льда со спиртом, или спирта с жидким азотом. Замораживание
суспензий различных клеток осуществляют по 2-ступенчатому режиму пониже-
ния температуры от 0 до минус 30°С со скоростью 1°С в минуту, от минус ЗО°С
до минус 70°С со скоростью 4-6°С в минуту. Лучше пользоваться программным
замораживанием. Охлажденные до минус 70°С ампулы с суспензией клеток по-
мещают на хранение в сосуды Дьюара с жидким азотом в специальных кассе-
тах.. В случае необходимости ампулы с замороженными клеточными суспен-
зиями извлекают из сосудов Дьюара и для оттаивания помещают в водяную ба-
ню с температурой 37°С. Оттаянную суспензию клеток переносят из ампул в
матрасы, в которые вносят небольшое количество ростовой среды. Одновремен-
но производят подсчет клеток в камере Горяева с витальным красителем (трипа-
новой синью) и концентрацию клеток доводят средой до 10104 в 1 мл. Например,
объем суспензии 20 мл, в 1 мл концентрация клеток 750000, т.е. в 20 мл содер-
жится 15 mjIh. клеток. Для того, чтобы конечная концентрация клеток с суспен-
зии составляла 100000 в 1 мл, объем суспензии доводят питательной средой с
сывороткой до 150 мл. Это количество суспензии разливают по 100 мл в матрас
Ру емкостью 1 литр и 50 мл в матрас емкостью 0,5 литра. Через одни сутки роста
клеток в матрасах производят смену среды для удаления криозащитного вещест-
ва. Монослой клеток формируется на 3-4 сутки.

В.	Т.Стегний, Г.А.Красников, В.С.Белоконь предложили оригиналь-
ные методики замораживания первично трипсинизированных клеток и ку-
сочков органов. Приводим изложение методики:

-	Взятие тканей и их иссечение на кусочки толщиной 1-3 мм в среде
для частичной дегидратации ткани, состоящей из равных частей ГЛА, Игла
и 15% сахарозы

-	Инкубирование ткани в этой среде в течение часа при температуре 4°С.
Многоступенчатое эквилибрирование ткани в криозащитной среде,
состоящей из равных частей сыворотки крови и раствора Кребса-
Хенселайта, 25% ДМСО. 1-я ступень - 15% - 20 минут; 2-я ступень - 20% —
30 минут; 3-я. ступень - 25% - 30 минут (или в среде другого состава).

Расфасовка ткани в плоскопараллельные контейнеры из алюминие-
вой фольги или полиэтиленовые ампулы по 2-3 мл.

-	Охлаждение со скоростью 0,3-0,5°С в минуту до минус 70-80°С с
последующим понижением температуры до -196°С со скоростью 30-40° в
минуту, или же погружение в смесь спирта и жидкого азота (-25°С) на 30
минут с последующим погружением в жидкий азот.

-	Хранение ткани в сосуде Дьюара с жидким азотом.

-	Размораживание ткани в водяной бане при температуре 40°С, не до-
пуская нагревания выше 4-6°С.
Первоначальное отмывание ткани от криопротектера в растворе
Кребса-Хенселайта с содержанием 20% сахарозы (соотношение ткани к рас-
твору 1:200) путем перемешивания ее с помощью магнитной мешалки при
температуре 4-6°С в течение 30-40 минут.

-	4-5- часовое инкубирование ткани в суспензии с помощью магнитной
мешалки при температуре 37°С в среде, состоящей из равных частей сред Игла,
199, ГЛА, 20% сыворотки крови с содержанием на 1-ом этапе инкубирования
(первые 2-2,5 часа) 15% сахарозы, на 2- этапе -10% сахарозы..

Трипсинизация при температуре 32°С с помощью 0,2% раствора
трипсина с содержанием 5% сахарозы (5-6 циклов по 5 минут). Смешивание
суспензии свеже изолированных клеток с сывороткой крови 1:1, центрифу-
гирование при 1000 в течение 10 минут. Ресуспендирование клеток в росто-
вой среде в течение 2-3 минут.

-	Культивирование клеток по общепринятой методике.

Метод трехэтапного замораживания первичных клеточных культур

Предварительное 2-часовое суспензионное инкубирование клеток в
среде, состоящей из равных частей среды Игла, ГЛА, 199 и 15% сыворотки
крови при температуре 37°С.

-	Доведение плотности первично-трипсинизированных клеток в I мл
среды до 10x106, а их субкультуры до 30x106

-	Криозащитная среда, состоящая из равных частей раствора Кребса-
Хенселайта, среды Игла, ГЛА, 20% сыворотки крови, 7% ДМСО. ПВП 9000
и 5% ПЭО - 400.

-	Постепенное (в течение 5-7 минут) введение криопротектора в
клеточную взвесь.

Эквилибрирование клеточной суспензии в криозащитной среде в
течение 30 минут при температуре 4°С.

Расфасовка клеточной суспензии по 2-3 мл в полиэтиленовые или
стеклянные ампулы.

Погружение ампул с клеточной суспензией в смесь спирта и жид-
кого азота при температуре -23-25°С на 20-30 минут, последующее охлаж-
дение до -40°С со скоростью 8-10° в минуту и погружение в жидкий азот.

Долгосрочное хранение клеточных культур в сосуде Дьюара или
хранилище для длительного низкотемпературного хранения биоматериалов.

Дефростация в водяной бане при температуре 40°С.

Постепенное (в течение 15-20 минут) разбавление криопротектора
ростовой питательней средой в соотношении 1:20.

-	Культивирование в обычных условиях с добавлением 20-30% кон-
диционированной питательной среды. Замена питательной среды по истече-
нию 24 часов культивирования.

Сохраняемость клеток в жидком азоте. Жизнеспособность клеток
при длительном хранении различна и зависит от вида культур клеток. Так,
процент сохранения жизнеспособности перевиваемых клеток колеблется в
пределах 85-97, диплоидных клеток - 70-90, субкультур - 65-90. Наимень-
ший процент живых клеток (40-45) отмечается при хранении первично-
трипсинизированных суспензий.
Размороженные клетки формируют монослой примерно в те же сро-
ки, что и до замораживания. В течение 5-10 пассажей они без каких-либо
трудностей снимаются со стекла и пересеваются. На результаты культиви-
рования совершенно не оказывает влияние длительность сохранения клеток
в жидком азоте: нет существенной разницы в жизнеспособности клеток,
хранившихся от месяца до Зх лет и более. Восстановленные после размора-
живания культуры клеток сохраняют исходные морфологические признаки.

Степень чувствительности культур клеток после длительного хране-
ния в жидком азоте к вирусам практически не изменяется. Вирус болезни
Ауески накапливается в культурах в титре 1О6,о-1О6’5 ТЦД 50/мл, а вирус ин-
фекционного ринотрахеита крупного рогатого скота Ю5,5’6,0 ТЦД 50/мл как
до, так и после замораживания соответствующих культур.

Криогенное оборудование. В лабораторных условиях используют
сосуды Дьюара различной емкости и конструкции, изготавливаемые разны-
ми предприятиями страны и за рубежом. Наиболее распространенные из них
- сосуды Дьюара СД-50, СД-20 и СД-5 (Рис.75). Более крупные сосуды вы-
полняют в основном функцию стационарных хранилищ клеточных суспен-
зий, более мелкие служат для транспортировки клеток в жидком азоте, а
также используются в процессе замораживания клеток. В специализирован-
ных учреждениях также используются бункеры-хранилища емкостью 500
литров и более для длительного хранения замороженных клеток. Внутри
бункера имеются специальные кассеты для размещения алюминиевых гоф-
рированных контейнеров с материалом.

Для программного замораживания клеточных суспензий применяют
камеру АХК-4, а при отсутствии такой камеры понижение температуры кон-
тролируют по показаниям низкотемпературного термометра. Перевозка и
хранение жидкого азота осуществляется в специальных транспортных ре-
зервуарах типа ТРЖК (транспортный резервуар для жидкого кислорода).
Если завод-поставщик товарного жидкого азота расположен на большом
расстоянии от лаборатории, то необходимо иметь холодильно-газовые агре-
гаты ЗИФ-702 или ЗИФ-1002 для получения жидкого азота. В процессе дли-
тельного хранения клеточного материала в сосудах Дьюара, в них постоянно
доливают жидкий азот. В сосудах емкостью 20 литров его доливают через
каждые 2 недели, а в 50-литровые сосуды - через 3-4 недели. Хранят сосуды
Дьюара в специальном прохладном помещении.

Ряд фирм выпускает сосуды Дьюара емкостью 35-50 и более литров,
которые дозаправляют жидким азотом один раз в 2-3 месяца. Сконструиро-
ваны криогенные хранилища емкостью 500-1000 литров, позволяющие за-
правлять их 1-2 раза в год. Создание таких хранилищ значительно повысит
надежность хранения уникального клеточного материала.

Техника безопасности при работе с жидким азотом

При эксплуатации сосудов Дьюара и стационарных хранилищ необходимо
строго соблюдать правила техники безопасности. Обязательная защита глаз (оч-
ками, прозрачными щитками) и кожного покрова тела от попадания жидкого азо-
та. Заправка сосудов жидким азотом, а также загрузка или выгрузка кассет долж-
на проводиться только в халате и перчатках. Ампулы с клеточной суспензией
разрешается извлекать из кассет только пинцетом. Нс допускается заполнение
сосуда жидким азотом выше основания горловины. Не допускать падение сосу-
дов и ударов по ним. Применять для закрывания горловины сосудов только пено-
пластовые крышки, входящие в комплекты данных сосудов. Сосуды должны
быть установлены строго вертикально, в чистом изолированном помещении с
приточно-вытяжной вентиляцией и хорошим естественным и искусственным
освещением. Обслуживать хранилище биопродуктов в закрытом помещении
должны не менее двух человек, так как газообразный азот, выделившийся из хра-
нилища, при 87% концентрации, может вызвать удушье и потерю сознания. При
испытании на испаряемость все сосуды Дьюара, будучи залиты в теплом состоя-
нии жидким азотом испаряют в первые часы большое количество азота (в 4-5 раз
больше нормы). При этом горловина кожуха, крышка, а иногда и верхнее днище
кожуха покрываются (вследствие охлаждения большим количеством отходящих
паров азота) инеем и снегом вымерзающих из воздуха паров воды. У качествен-
ных сосудов Дьюара уже через 1,5-2 часа после заливки азота иней и снег тают
полностью. Но иногда у некоторых сосудов Дьюара слой снега продолжает расти
и достигает толщиной 4-5 мм. Это свидетельствует о том, что испаряемость азота
в несколько раз превышает норму, следовательно, сосуд потерял вакуум, и в стен-
ках сосуда произошла разгерметизация. Потеря вакуума может произойти и в
период эксплуатации сосуда. Первый признак этого - появление снеговой «шу-
бы» на кожухе сосуда. В сосуде СД-50 допустимая по паспорту испаряемость
азота равна 60 г/час или 29 суток до полного испарения. Периодически один раз в
шесть месяцев необходимо проверять процентное содержание кислорода в азоте,
находящемся в хранилище. В случае накопления кислорода более 15%, хранили-
ще освобождают от жидкого азота. По ГОСТу технический жидкий азот может
содержать до 4% кислорода.

При работе с ДМСО необходимо знать, что ДМСО может растворять
органические вещества и, проникая через резину и кожу, переносить их в
кровь. Поэтому, при работе с ДМСО следует соблюдать меры предосторож-
ности, чтобы избежать попадания в него вредных химических соединений и
свести до минимума его контакт с кожей.

Транспортировка и пересылка клеточных культур
Транспортировка культур в монослое

Культуры клеток выращивают по общепринятым методам в стеклян-
ных или пластиковых флаконах. Удобными для транспортировки являются
флаконы для кровезаменителей, в которых выращивают клетки на одной из
сторон. После сформирования монослоя перед отправкой флаконы с моно-
слоем заполняют ростовой средой, на которой выращивали клетки, с до-
бавлением 5% сыворотки. Пробки на пластиковых флаконах или плоских
флаконах для культивирования закрепляют колпачками из фольги или пер-
гамента и плотно обвязывают. Флаконы для кровезаменителей закрывают
стерильной пробкой и закатывают алюминиевыми колпачками, что обеспе-
чивает герметичность и надежность укупорки. Подготовленные флаконы с
культурой упаковывают в яшики (деревянные, фанерные или из плотного
картона) и пересылают по почте или транспортируют. Посылки сопровож-
дают надписями: ’’Осторожно стекло"„"Биопрепарат”, "Боится мороза",
"хранить при +4 +20°С" Если перевозка занимает не белее 2-3-х часов, то
верхний предел температуры может быть 30-35°С.
Транспортировка клеточных суспензий

Выращенную культуру клеток снимают с субстрата (стекла, пластика)
по общепринятой методике, используя растворы трипсина, версена, колла-
геназы, хемотрипиина или другие (применительно к культуре клеток), под-
считывают концентрацию и разводят ростовой питательной средой с 5-10%
сыворотки до концентрации 0,5-2,0 млн/мл. Полученную суспензию расфа-
совывают во флаконы, укупоривают, как указано выше и пересылают либо
транспортируют, соблюдая эти условия. Суспензию клеток лучше пересы-
лать во флаконах, покрытых селиконом.

Эффективный способ сохранения, пересылки и транспортировки
культур клеток в силиконированных флаконах предложили Т.И.Козыренко,
М.И.Яшенкина, Л.Л.Вертелецкий, Д.П.Дьяконев, Г.А.Надточей (Авторское
свидетельство № 3959343/30-13, 10.07.1985; Бюлл.изобр. и открытий № 35,
1987). Сущность метода заключается в следующем: суспензию клеток в пи-
тательней среде с 10% сыворотки в концентрации 300-500 тыс/мл, pH 7,2-
7,4, расфасовывают в емкости, внутренняя поверхность которых обработана
раствором силикона. Клеточную суспензию хранят при температуре
+4+20 С до 30 дней.

Транспортировка ампул с культурами клеток, хранящихся в
жидком азоте (-196°С)

Ампулы с культурами клеток переносят в специальный термос или сосуд
Дьюара емкостью 2, 5, 10 или белее и перевозят в нужнее место любым видом
транспорта, в т.ч. самолетом. Главное условие - в период транспортировки в
сосуде Дьюара должно быть достаточное количество жидкого азота.

Ампулы с замороженными клетками можно транспортировать в пре-
делах 1-24 часов в упаковке с сухим льдом (-70°).

На каждую культуру, отправляемую по запросу, выдается паспорт ус-
тановленного образца.

Восстановление клеток, выращенных и транспортируемых во флаконах,
проводят следующим образом: обработанный спиртовым тампоном флакон
вскрывают, сливают среду-наполнитель и вносят 30-40 мл 0,2% раствора версена,
подогретого до температуры 35-37°С. Через 3-5 минут, по мере ’’набухания” мо-
нослоя, версен сливают и флакон помещают в термостат до полного отторжения
клеток от стекла. Затем клетки суспендируют в 15-20 мл среды, подсчитывают
количество живых клеток во взвеси и переносят ее в посевные емкости.

Посев клеток необходимо проводить из расчета количества живых
клеток, сохранившихся в культуре. При относительно благоприятных усло-
виях транспортировки (время в пути 7-8 дней) клетки сохраняют жизнеспо-
собность до 80-90%.

Для накопления клеточной культуры и адаптации ее к тем условиям
культивирования, которые приняты в лаборатории, необходимо провести
два-три пассажа. Состав среды культивирования должен соответствовать
тому составу, который указам на этикетке, т.е. среде на которой данная
культура клеток культивировалась до транспортировки. При необходимости
перевод клеточных культур на среду нового состава следует проводить по-
степенно. Если доставлены замороженные клетки, то их размораживание и
дальнейшее культивирование проводят по методам, которые описаны выше.
ПАСПОРТ

на перевиваемую линию (штамм) клеток животных

1.	Название линии (штамма)

2.	Происхождение (автор, время и место получения, публикация)

3.	Пассаж

4.	Морфология

5.	Способ культивирования (монослойный, суспензионный и др.)

6.	Условия культивирования: - среда, pH

-	сыворотка

-	др. компоненты

-	процедура и коэффициент пересева

7.	Криоконсервация, жизнеспособность после консервации

8.	Контроль контаминации (вирусы, микоплазмы, бактерии, грибы)

9.	Видовая идентичность. Изоферментный анализ.

10.	Свойства: - эффективность клонирования

-	туморогенность

-	чувствительность к вирусам

-	биохимические маркеры

-	генетические маркеры

-	кариологическая характеристика

-	другие свойства

11.	Область применения

Руководитель коллекции (криобанка)

или автор клеточной линии (штамма)

Литература

1.	Дьяконов Л.П., Глухов В.Ф.,Поздняков А.К.-"Культивирование клеток и тканей жи-
вотных", Учебно-методическое пособие, Ставрополь,ч.1, 1986, 96с., ч.2, 1988.-96с.

2.	Дьяконов Л.П..- Специализированная Коллекция клеточных культур сельскохозяйственных и
промысловых животных (СХЖ РАСХН) РККК РАН и криобанк ВИЭВ, "Консервация генети-
ческих ресурсов", Материалы XIV рабочего совещания, Пущино, 28-30 мая 1996,76-79с.

3.	Каталог АТСС Cell Lines and Hybridomas,7th Ed,1992.

4.	Каталог ECACC Cell Line Catalgue,5th Ed, 1999.

5.	Каталог "Российская коллекция клеточных культур (РККК),-C-П., Омск, 1999, 227с.

6.	Козыренко Т.И., Яшенкина М.И., Вертелецкий Л.Л., Дьяконов Л.П., Надточей Г.А..-
"Способ сохранения культур клеток животных" А.С. №3950343/30 - 13, 23.09.87,
приоритет 10.07.85., Бюл.№35.

7.	Дьяконов Л.П., Поздняков А.К., Панкова Г.Е., Гололобова М.Т., Данишевский Д..А.. -
Методические рекомендации по консервированию культур клеток животного проис-
хождения в жидком азоте. М. 1978., 10с.

8.	Стегний Б.Т., Красников Г.А., Белоконь В.С.-"Консервирование клеток и фрагментов
тканей животных", Ж.Ветеринария,1982,№2.

9.	Стегний Б.Т. - Бю1опчш Властивост! i проблемы стабипзацп культур юптин тварин,
яю викаристовуються в биотехнологии", Автореф..докт.вет.наук, Харьков, 1995.

10.	Методические рекомендации по приготовлению, транспортировке и восстановлению клеточ-
ных культур, используемых в практике вирусологических исследований. Свердловск,
1977,25с. Глинских Н.П., Зусман Ф.Я., Колесникова Г.Г., Устьянов В.П., Курумчина С.Г.

11.	Цуцаева А.А., Петренко Т.Ф.-Криоконсервация культивируемых клеток животных. В
книге - Методы культивирования клеток, Ленинград, "Наука", 1988.
Глава 20. Хламидии и их цитопатогенное действие

Хламидии (Chlamydia), облигатные внутриклеточные паразиты теп-
локровных животных, отряда Rickcttsiales, являются возбудителями заболе-
ваний млекопитающих, птиц и часто выявляются при смешанных (ассоциа-
тивных) инфекциях.

В культурах клеток ЦПД часто недостаточно выражено (Г.Е.Панкова
и др., 1977) и о накоплении возбудителя судят по выявлению хламидий в
окрашенных по Романовскому-Гимза препаратах, используя метод имму-
нофлуоресценции или титрацию на куриных эмбрионах.

Г.П.Щербань и Т.Ф.Кравченко (I960) установили ЦПД при куль-
тивировании Ch.psittaci в роллерной первичной культуре куриных фиброб-
ластов. И.А.Калугина (1992) в серии экспериментов выяснила, что из посто-
янных линий клеток жвачных наиболее чувствительна к хламидиям культу-
ра клеток почки сайги (ПС), полученная во ВНИИСХ И.Г.Кекухом. Измене-
ния, вызываемые Ch.psittaci var.ovis штамма ВИЭВ в хронически инфициро-
ванной культуре клеток характеризуются рядом особенностей.

В первые 5-7 дней накопление хламидий в культуре сопровождается
увеличением размеров клеток и ядро как бы оттесняется к периферии
(Рис.76,77) На втором этапе (8-15 дней) происходит формирование симпла-
стов, однако при этом цитоплазма близлежащих клеток сливается, а ядра
оказываются расположенными вокруг цитопласта. (Рис.78). Одновременно
наблюдается слияние мелких симпластов с 3-6 ядрами в более крупные и
наконец на 3 этапе (16-20 дней) округлые клетки и симпласты отслаиваются
от субстрата и целостность монослоя нарушается. В условиях роллерного
культивирования процесс накопления хламидий и развитие ЦПД происхо-
дит быстрее.

Отмечается уплотнение и фрагментация ядер, что характерно для
апоптоза. Титр хламидий в культуре достирает 10 9,5 ТЦД/мл.

Приводим схемы 1 и 2 развития хламидий в культуре по
И.А.Калугиной (Рис.79, 80).

Электронно-микроскопически на ультратонких срезах в инфици-
рованной культуре присутствуют хламидии нормальной морфологии, а рав-
но и L - подобные формы (Рис.81, 82, 83), а также формы возбудителя в ста-
дии дегенерации, что указывает на определенное равновесие взаимоотноше-
ний в системе "хламидии-клетка"

Выращенные в персистентно-инфицированной культуре клеток ПС
хламидии сохраняли антигенные и иммуногенные свойства, что позволило
использовать их для изготовления культуральной инактивированной эмуль-
сии-вакцины против хламидиоза животных (Ю.Д.Караваев, И.А.Калугина,
Л.П.Дьяконов, И.Г.Кекух, 1997). Вакцина с положительными результатами
широко испытана в производственных условиях для профилактики хлами-
диоза крупного рогатого скота, овец, свиней, пушных зверей.
I-IV этапы последовательного развития хламидий в клетке и симпластообразования; 1 - утолщенная
мембрана паразитофорной вакуоли; 2 - включение («колония» хламидий), 3 - ядра слившихся клеток;

4 - концентрическая структура из ядер, прилегающих к симпласту клеток; ПВ - паразитофорная вакуоль;

ДФ - фигуры деления; ЭТ - элементарное тельце; К - колония хламидий; L - Л-формы хламидий.

Рис.79. Отдельные этапы симпластообразования в персистентно инфицированной хлами-
диями линии клеток почки сайги (по результатам световой и электронной микроскопии).

I - «продуктивное» размножение хламидий; 1а - деление хламидий путем почкования; 16 - бинарное
деление; П - образование L-подобных форм хламидий; Ш - деструкция хламидий, ПВ - паразитофорная
вакуоль; ЭТ - элементарное тельце; РТ - ретикулярное тельце; ДФ - делящаяся форма; К - «колония»
хламидий на разных стадиях развития под общей оболочкой; РФ - Разрушающая форма; L - подобная
форма; 1 - мембрана паразитофорной вакуоли, 2 - концентрическая мембрана паразитофорной вакуоли.

Рис.80. Возможные пути развития хламидийной инфекции в паразитофорных
вакуолях персистентно инфицированной линии клеток ПС.

Рис.81. Хламидии на фоне разру-
шенной цитоплазмы зараженной
клетки. Электроннограмма. Ув.Х
30.000
Рис.82. Клетка в инфицированной культуре ПС. Вакуоли в цитоплазме с
хламидиями. Электроннограмма. Ув.Х 10.000.

Рис.83. Л-форма хламидий в вакуоле зараженной клетки.

Электроннограмма. Ув.Х 40.000

Литература

1.	Панкова Г.Е., Залкинд С.Я., Караваев Ю.Д., Семенова Э.Н., Дьяконов Л.П. "Чув-
ствительность диплоидных штаммов клеток животных к хламидиям" Ж. "Ветери-
нария", 1977, 117, с. 39-41.

2.	Калугина ИЛ. - "Культивирование Chlamydia psittaci вариант ovis в перевиваемой
линии клеток почки сайги". Дисс. канд.биол.наук, М.,1992.

3.	Караваев Ю.Д., Калугина И.А., Дьяконов Л.П., Кекух И.Г "Вакцина для профи-
лактики и лечения хламидиоза сельскохозяйственных животных и пушных зве-
рей", Патент РФ № 2085213 от 27 июля 1997 г.
Глава 21. Прионы и их цитопатологическое действие

Прионовые болезни представляют собой группу нейродегенеративных
расстройств (трансмиссивных губкообразных энцефалопатий) человека и живот-
ных, к которым относят скрепи овец и коз, трансмиссивную губкообразную эн-
цефалопатию крупного рогатого скота (ТГЭ), куру, болезнь Крейцфельда-Якоба
(БКЯ), синдром Герштмана-Штройсслера (СГШ), летальную семейную бессони-
цу и некоторые другие (Gajdusek, 1977; Prusiner, 1991). Уникальность нейродеге-
неративных болезней заключается в том, что они способны к горизонтальной
передаче и гораздо реже встречаются в виде наследственной и спорадической
форм (Prusiner, 1993). Причина этих болезней - белковые инфекционные частицы
(proteinaceous infectious particles), иначе прионы (prions), которые не содержат
нуклеиновой кислоты (Prusiner, 1982). Основной компонент прионов - посттранс-
ляционно модифицированная изоформа (РгР^; Рис. 84) нормального прионового
протеина (РгР°; Oesch et al., 1985; Pan et al., 1993) клеточной поверхности.

Рис. 84. Предполагаемая модель третичной структуры РгР& человека (по
Huang Z., Prusiner S.B., Cohen F.E., 1996). В виде спирали представлены а-спирали, кото-
рые в большем количестве содержатся в РгРс; стрелками обозначены p-слои, превалирую-
щие в РгР&. Высокое содержание P-слоев в РгР& было предсказано на основании способно-
сти РгР27-ЗО полимеризоваться в амилоидные фибриллы. Проведенная впоследствии опти-
ческая спектроскопия подтвердила присутствие p-слоев в РгР^ и РгР 27-30.
Гликопротеин РгР0 закодирован в геноме (ген Ргпр) всех к настоящему
времени исследованных млекопитающих (Prusiner, 1991). После синтеза в эндо-
плазматическом ретикулуме РгР*2 транспортируется к клеточной поверхности, где
связывается с гликозилфосфатидилинозитолом. РгРс и РгР^ отличаются друг от
друга вторичной структурой (РгР0 состоит в основном из ос-спиралей, а РгР^ - из
р-слоев) и обладают различными биохимическими свойствами. Считается, что
репликация приона происходит в результате специфического взаимодействия
РгР*с, находящегося в инфекционном инокуляте, с РгР при помощи протеина X.
Эго взаимодействие катализирует превращение РгРс в РгР^. Предполагается, что
эта трансформация происходит спонтанно в PrP-молекулах, несущих мутации,
которые связаны с наследственными формами прионовых болезней (Рис. 85).
Высокая экспрессия гликопротеина РгР^ в норме выявлена в нейронах ЦНС
(Kretzschmar et aL, 1986), а более низкий уровень экспрессии - во многих перифе-
рических тканях животных и человека, начиная с раннего эмбрионального разви-
тия. Присутствие РгР0 на клеточной поверхности говорит о его возможной роли в
клеточной адгезии, трансмембранной передаче сигналов или поглощении экстра-
целлюлярных лигандов. Классические патологические признаки губкообразных
энцефалопатий (ГЭ): вакуолизация нейропиля, астроглиозис, отложение амило-
идных бляшек и гибель нейронов. Дегенерация нейронов может привести почти к
полной их утрате при БКЯ. Амилоидные бляшки, в основном, состоят из патоло-
гической, протеаза-резистентной, изоформы PrpC - РгР^ Несмотря на это, очень
мало известно о механизмах, лежащих в основе смерти нервных клеток при ГЭ.
Кроме того, все эти болезни характеризуются длительным инкубационным пе-
риодом, отсутствием специфического иммунного ответа, определенных биохи-
мических, гематологических признаков и 100% летальностью.

Результаты экспериментов с культурами клеток наводят на мысль,
что гибель нейронов происходит по типу апоптоза (Forloni et aL, 1993). Для
проверки этой гипотезы in vivo были использованы электронная микроско-
пия и техника мечения 3'-конца ДНК in situ (in situ end-labeling technique).
Были выявлены морфологические изменения, типичные для апоптоза, и на-
личие ядер с мечеными 3'-концами ДНК, что предшествует массивной гибе-
ли нервных клеток у мышей, инфицированных 79А штаммом скрепи (Giese
et aL, 1995). Остается неясным, чем был вызван апоптоз нервных клеток:
прогрессирующей утратой функций РгРс или усиливающейся токсичностью
PrPSc при болезни, или каким-то другим механизмом.

Bueler с соавторами (1992) впервые получили мышей, лишенных гена Ргпр
(РтР*™). Эти мыши оказались устойчивыми к заражению агентом скрепи. Мыши
нормально развивались и имели лишь незначительные отклонения в поведении.
Последующие исследования показали, что у них нарушены циркадные ритмы.

Фрагмент прионового протеина человека, состоящий из 21 аминокис-
лотного остатка (PrP106-126; KTNMKHMAGAAAAGAVVGGLG) и обра-
зующий фибриллы in vitro, оказывает токсическое действие на нейроны ам-
мониева рога крысы (Forloni et aL, 1993).

Было продемонстрировано, что синтетический пептид РгР106-126 в
концентрации 80 цМ обладает токсическим действием на клетки мозжечка
6-дневных мышей в присутствии микроглии. В ответ на воздействие РгРЮб-
126 микроглия увеличивала продукцию кислородных радикалов. Дополни-
тельное добавление в культуру клеток нормальной микроглии усиливало
токсичность пептида на клетки мозжечка, в то время как добавление микро-
глии, полученной от РгР0/()-мышей, или нормальных астроцитов - нет
(Brown et al., 1996а). Эти данные соответствуют результатам об устойчиво-
сти РгР0/0-мышей к PrPSc (Brandler et al., 1996).

Таким образом, основным в патогенезе различных нейродегенератив-
ных болезней является вопрос, связана ли функция микроглии, преимущест-
венно, с функцией скэвенджеров, то есть иммунокомпетентных клеток в
ЦНС, или они могут активироваться для деструкции нейронов при нейроде-
генеративных болезнях.

Микроглия является популяцией постоянно пребывающих в ЦНС имму-
нокомпетентных клеток, подобно другим тканевым макрофагам клеткам
Купффера в печени и клеткам Лангерганса в коже. Они происходят от циркули-
рующих моноцитов, которые внедряются в мозг и ретину в период эмбриональ-
ного и раннего постнатального периодов (Ling and Wong, 1993). Вместе с тем,
микроглия функционально отличается от макрофагов, которые в период разви-
тия мозга фагоцитируют клеточный дебрис, ассоциированный с естественно
происходящим апоптозом, реконструирующим фибриллярные структуры. По-
сле завершения стадии развития макрофаги трансформируются из шаровидной
и амебоидной, активно фагоцитирующих, форм в разветвленную покоящуюся
микроглию зрелого мозга (Ling and Wong, 1993), которая достигает 20% ней-
роглиальной популяции, присутствуя в большем количестве в коре головного
мозга, в аммониевом роге и в меньшем количестве - в таламусе. У микроглии
можно индуцировать проявление макрофагальной активности (Streit and Kreutz-
berg, 1987) в ответ на различные внешние и внутренние стимулы, результатом
которых является экспрессия цитокинов и других медиаторов воспаления. Мо-
лекулярные механизмы, преобразующие эти сигналы в специфические микро-
глиальные реакции, являются предметом интенсивных исследований. Изолиро-
вание и культивирование микроглии становится рутинным методом, что позво-
лит проводить более детальное изучение реакций по отношению к разнообраз-
ным субстанциям. Микроглия может быть активирована при помощи введен-
ных в мозг чужеродных субстанций: триметилтина, трансплантированной моз-
говой ткани или вирусов, например ВИЧ. Эти субстанции, тканевые или инфек-
ционные, сами по себе не обладают нейротоксичностью, но могут стимулиро-
вать микроглию к продукции веществ, аккумуляция которых в ЦНС индуциру-
ет нейродегенерацию (Giulian et al., 1994). 0-амилоид при болезни Альцгеймера
(БА) также вызывает активацию микроглии, стимулируя её к высвобождению
опухолевого некротического фактора-a (TNF-a) и кислородных радикалов, ко-
торые, как известно, являются нейротоксинами в высоких концентрациях. По-
этому можно предположить, что процессы нейродегенерации, которые проис-
ходят при БА, могут быть связаны с активацией микроглии. Кроме того, при
некоторых нейродегенеративных расстройствах, таких как болезнь Паркинсона,
прогрессирующий супрануклеарный паралич, мультисистемная атрофия и
амиотрофический латеральный склероз, наблюдают повышенную экспрессию
молекул главного комплекса гистосовместимости класса 11 (МНС class II). Ак-
тивация микроглии была выявлена в случаях спорадической БКЯ и экспери-
ментальной скрепи у мышей.

Способность РгР50 индуцировать механизм клеточной смерти впервые бы-
ла продемонстрирована Mueller et al. (1993) на культуре клеток коры головного
мозга эмбриона крысы. Изучение нейротоксичности PrP^ in vivo затруднено, так
как прионовый протеин является неотъемлемой частью инфекционного агента и
никогда не выявляется in vivo при отсутствии болезни. Поэтому дальнейшее изу-
чение механизмов нейротоксичности требовало использования культур клеток.

Культуры клеток мозга эмбрионов и новорожденных животных состоят
из смеси клеток: олигодендроцитов, астроцитов, микроглии и нейронов. Подоб-
ные культуры никогда ранее не применяли для изучения нейротоксичности хи-
мических агентов. Forloni с соавторами (1993) использовали культуру клеток
аммониева рога эмбриона крысы для изучения нейротоксичности пептидов
прионового протеина человека. Два пептида, состоящие из 106-126 и 127-147
аминокислотных остатков РгР человека, содержат, в основном, р-складчатые
слои. Однако только хроническое воздействие РгР 106-126 в концентрации 80
цМ уменьшало жизнеспособность клеток в культуре. Наблюдали фрагмента-
цию ДНК в дегенерирующих нейронах, означающую, что гибель клеток проис-
ходит по типу апоптоза. Апоптозные клетки имели отчетливую морфологию и
характерную картину фрагментации ДНК, которая происходит как результат
расщепления ядерной ДНК в интернуклеосомальных регионах. Окрашивание
ядер нервных клеток проводили флюорохромом Hoechst 33258, а анализ ДНК -
при помощи электрофореза в агарозном геле. Фрагментация ДНК была анало-
гична таковой, которую обычно выявляют в премиелоцитарных клетках HL-60
после их обработки актиномицином D. Культура HL-60 была использована в
качестве положительного контроля. Пептиды, гомологичные р-амилоиду БА,
обладают нейротоксичностью in vitro. Для того чтобы установить существова-
ние аналогичной корреляции у P].pSc

авторами была также изучена способность
пептида РгР106-126, обладающего нейротоксической активностью, образовы-
вать фибриллы. Оказалось, что пептид в дистиллированной воде легко форми-
рует густую сеть прямых филаментов диаметром 4-8 пт и длиной от 0,1 до 1
цт. Окрашенные конго красным, пептидные агрегаты обладают зелено-
золотистым свечением в поляризованном свете, что присуще конформационной
характеристике 3-складчатых слоев амилоида.

Нейротоксичность пептида РгР 106-126 была подтверждена на сме-
шанной культуре клеток коры головного мозга мыши (Brown et al., 1994).
Культура кортикальных клеток эмбриона мыши показала уменьшение коли-
чества МАР-2-позитивных клеток (MAP; mitogen-activated protein). Гибель
клеток, индуцированная РгР 106-126, происходила по типу апоптоза и зави-
села от концентрации пептида: максимальный эффект наблюдали при 80цМ.
Количество погибших клеток определяли стандартной ММТ (3,[4,5 di-
methyltheazol-2yl]2,5 diphenil-tetrazolium bromide)-npo6oft, которая оказалась
эффективной для количественного определения погибших клеток. Клетки,
подвергнутые воздействию пептида, инкубировали в растворе Хэнкса с 200
цМ ММТ в течение 1 часа при 37°С, затем лизировали в DMSO и измеряли
на спектрофотометре абсорбцию при 570 пт.
Оказалось, что для проявления нейротоксичности РгР1О6-126 необхо-
дима экспрессия PrPc (Brown et al., 1994). Была получена культура клеток
коры головного мозга РгР -мышеи, которую подвергали воздействию
РгР 106-126 в концентрации до 200 цМ в течение 10 и более дней. ММТ-
проба не определила в этой культуре присутствие погибших клеток; однако,
у клеток, полученных от мышей дикого типа, выявлено уменьшение их чис-
ленности до 65% от объема контрольных клеток. Аналогичные результаты
были получены Brandler с соавторами (1996) в системе in vivo. Нервная
РгР+/+-ткань была трансплантирована РгР0/0-мышам. Воздействие агента
скрепи приводило к нейродегенерации в имплантированной ткани, но не в
ткани хозяина, даже в том случае, когда пересаживали РгР5с-бляшки.

РгР106-126 токсичен также для гранулярных клеток мозжечка (Brown et
al., 1996а). В концентрации 80 цМ пептид более токсичен для клеток мозжечка,
чем для кортикальных клеток. Несмотря на это, РгР(И)-клетки мозжечка также
устойчивы к проявлению токсичности этого пептида. Эта разница может быть
связана с различным уровнем экспрессии РгР6 в разных отделах головного мозга.

Клеточные линии с нейрональным фенотипом чувствительны к ток-
сичности РгР 106-126, что может быть связано с уровнем экспрессии РгРс
(Hope et al., 1996). Чем выше была экспрессия РгРс, тем больше был процент
клеток, погибших в результате воздействия пептида.

Низкая конценрация (20 цМ) РгР106-126 нетоксична для клеток мозжечка
мышей дикого типа. Однако при их сокультивировании с микроглией эта концен-
трация становится для них токсичной. Токсический эффект прямо пропорцио-
нально усиливался с увеличением количества микроглии. Совместное культиви-
рование клеток мозжечка с астроцитами не показало подобного эффекта (Brown
et al., 1996b). Кортикальные клетки, полученные от РгР^-мышей, сокультивиро-
ванные с нормальной микроглией, оставались резистентными к воздействию 200
цМ РгР106-126. Очевидно, что микроглия играет существенную, но не самую
важную роль в проявлении нейротоксического эффекта прионового пептида: экс-
прессия РгР6 также необходима, по меньшей мере, в смешанной первичной куль-
туре клеток головного мозга, но и это недостаточно. Использование антиоксидан-
тов (витамин Е и N-ацетил-цистеин) позволило определить, что оксидативный
стресс также вовлекается в нейротоксический механизм РгР106-126 (Brown et al.,
1996а). Оба вещества полностью блокировали нейротоксичность прионового пеп-
тида на клетки мозжечка, полученные от нормальных мышей.

Sauer с соавторами (1999) выявили экспрессию РгР6 в 3D культуре
многоклеточных опухолевых сфероидов предстательной железы человека и
показали, что экспрессия прионового протеина коррелирует с уровнем внут-
риклеточного окислительно-восстановительного потенциала, что указывает
на его участие в антиоксидативной защите.

Роль микроглии в рамках токсического механизма пептида прионового
протеина РгР106-126, вероятнее всего, связана с индукцией оксидативного
стресса на нейроны посредством высвобождения нейротоксических субстан-
ций. Прионовый пептид стимулирует микроглию к продукции оксидативных
субстанций независимо от того, экспрессирует она РгР6 или нет. Однако, при
наличии источника оксидативного стресса, добавленного в культуру одновре-
менно с РгР1О6-126, наблюдали деструкцию клеток более сильную чем та, ко-
торая была индуцирована только оксидативным стрессом. Токсичность свобод-
ных радикалов, продуцированных ксантиноксидазой в присутствии ксантина,
на РгР()/0-клетки мозжечка не усиливалась действием РгР1О6-126. Таким обра-
зом, эти результаты объединяют две ранее сделанные находки. Так, оксидатив-
ный стресс, индуцированный в культуре посредством РгР1О6-126, воздействует
на микроглию. Кроме того, РгР1О6-126 оказывает нейротоксическое действие
только на клетки, экспрессирующие РгРс Эти результаты однозначно свиде-
тельствуют о причастности РгРс к резистентности клеток к оксидативному
стрессу. PrP106-126 in vitro усиливает проявление оксидативного стресса, акти-
вируя микроглию и, одновременно, препятствуя резистентности к токсическому
эффекту реактивных кислородных радикалов (ROS).

Глиозис (особенно, астроглиозис) является патологическим признаком
при ГЭ и проявляется в начале болезни (DeAnnond et al., 1987). В настоящее
время остается неясным: усиленная пролиферация глии происходит в ответ на
повреждение нейронов или на какой-то другой стимул. Тщательный анализ
показал, что участки астроглиозиса совпадают с участками аккумуляции РгР^*
(DeArmond et al., 1987). Островки астроглиозиса и повышенное содержание
мРНК глиального фибриллярного кислого протеина (ГФКП) являются хороши-
ми индикаторами присутствия РгР50 (Mackenzie, 1983). Некоторые данные ука-
зывают на то, что астроциты экспрессируют повышенный уровень некоторых
специфических протеинов при скрепи-инфекции, таких как ГФКП и глютамин-
синтетаза (Andres-Barquin et al., 1994).

Forloni с соавторами (1994) установили, что пептид РгР 106-126 индуциру-
ет пролиферацию астроцитов и повышенную экспрессию ГФКП в смешанной
глиальной культуре клеток крысы. Клетки были подвергнуты воздействию при-
онового пептида в течение 12 дней. Пролиферация астроцитов, индуцированная
РгР106-126, зависела от присутствия микроглии в экспериментальных условиях.
Цитокины, секретируемые активированной микроглией и индуцирующие проли-
ферацию астроглии, также могут быть вовлечены в этот механизм.

Явно выраженную микроглиальную активацию выявляли у мышей,
инфицированных различными штаммами скрепи. Эта активация была оце-
нена как модифицированный воспалительный ответ (Williams et al., 1994).
Некоторые работы указывают на то, что микроглия может быть ассоцииро-
вана с РгР5с-бляшками (Guiroy et aL, 1994).

Все проведенные эксперименты на культурах глиальных и нервных кле-
ток фокусируют внимание на микроглии. Активация микроглии прионовым
пептидом ведет к увеличенной продукции этими клетками ROS и цитокинов,
которые затем проявляют вторичный эффект на нервные клетки и астроциты,
представленные в культуре. РгР 106-126, добавленный в чистую культуру мик-
роглии, стимулирует ее пролиферацию (Рис. 86). То, что астроциты и нейроны
зависят от экспрессии РгРс в их чувствительности к прямому или опосредован-
ному воздействию РгР 106-126, может отражать факт их общего происхождения.
Результаты изучения этих клеточных систем показывают важную роль в пато-
генезе прионовых болезней, которую может играть микроглия.
Таким образом, микро глия выступает в роли промежуточного компо-
нента при нейродегенеративных нарушениях, таких как БА, амиотрофиче-
ский латеральный склероз и прионовые болезни. Активация микроглии и
продукция ROS как результат взаимодействия с нейротоксическими моле-
кулами (PrPSc или (3-амилоид) может привести к гибели нейронов. Контроль
микроглиального ответа может оказаться важным фактором при лечении
нейродегенеративных расстройств.

Несмотря на то, что изучение метаболизма прионового протеина на
культивируемых in vitro клетках улучшило наше понимание образования
PrPSc, недостаточное количество клеточных линий, персистентно инфициро-
ванных агентом скрепи, ограничивает эти исследования. Культура клеток
нейробластомы мыши N2a и культура клеток феохромоцитомы крысы PC 12,
инфицированные прионами мыши (Borchelt et al., 1990; Rubenstein et al.,
1991) - 2 наиболее используемые модели. Очень удачной для изучения суб-
клеточной локализации PrPSc оказалась культура клеток мозга, полученная
от скрепи-инфицированного сирийского хомячка, которая была реинфици-
рована после пассирования клеток в культуре (Taraboulos et al., 1992). Не-
смотря на то, что не была описана четкая цитопатология этих культур кле-
ток, были установлены существенные изменения стрессовых протеинов в
скрепи-инфицированных клетках нейробластомы, а также аттенуация уров-
ней внутриклеточного 1,4,5-инозитол трифосфата и высвобождение Са2+

Mellon с соавторами (1990) получили культуру нейронов гипоталамуса
GT1, иммортализованных посредством туморогенеза, индуцированного у
трансгенных мышей-доноров (ген SV40TAg под контролем GnRH). Клеточная
линия GT1 представляет собой культуру высоко дифференцированных нейро-
нов, продуцирующих гонадотропин-релизинг гормон (GnRH). Для того чтобы
привести клетки GT1 к способности активироваться под действием фактора
роста нейронов (nerve growth factor; NGF) их трансфицировали геном trkA, ко-
торый кодирует рецептор, обладающий высоким сродством к NGF.

Обработка полученных GTl-trk клеток ростовым фактором NGF стимули-
ровала рост нейритов и способствовала выживаемости клеток в бессывороточной
среде. Эти свойства GT1-клеток дали возможность их использования для изуче-
ния биологии прионов. Культуры клеток GT1 и GTl-trk были персистентно ин-
фицированы прионами: обе культуры аккумулировали PrPSc (Schaetzl et al., 1997).
В противоположность скрепи-инфицированным клеткам нейробластомы ScN2a, в
GT1 клетках установлены хорошо выраженные нейродегенеративные изменения,
напоминающие выявляемые при гистопатологических исследованиях ЦНС чело-
века и животных с прионовыми болезнями. Эта клеточная модель, вероятно, мо-
жет оказаться полезной для анализа молекулярных событий, характерных для
патогенеза прионовых болезней. Клетки GTl-trk, как и другие субклоны GT1,
обладали способностью реплицировать прионы.

Заражение GTl-trk клеток было выполнено очищенным штаммом (штамм
Rocky Mountain лаборатории; RML prions) мышиных прионов в титре от 50 до
100 единиц 50% инфекционной дозы (ED50) на клетку. Прионы выделяли из моз-
говой ткани инфицированных мышей (штамм CD-1 Swiss) с клиническими при-
знаками при помощи центрифугирования в ступенчатом градиенте сахарозы. За-
тем пробы подвергали ультрацентрифугированию при 24000 об./мин. в течение
24 часов. Осадок ресуспендировали в DMEM, содержащей 5% фетальной сыво-
ротки крупного рогатого скота и 5% сыворотки лошади, и преципитировали в
этаноле. После центрифугирования при 60000g в течение 1 часа финальный оса-
док отмывали в 70% этаноле и ресуспендировали в 500 ц! культуральной среды.

Дегенеративные изменения в инфицированных клетках напоминали апоп-
тоз автофагоцитарного субтипа, который не был описан ранее. Было выявлено
присутствие прионовой инфекционности и в кондиционированной культуральной
среде, что раньше также не выявляли. NGF значительно уменьшал морфологиче-
ские и биохимические признаки апоптоза и повышал жизнеспособность клеток.
Таким образом, ScGTl-trk клетки могли бы стать перспективной клеточной моде-
лью для изучения процессов нейродегенерации при прионовых болезнях и вме-
шательства в патологический процесс нейротропными факторами.

Ранее уже было высказано предположение (Brown et al., 1996а), что
апоптоз может иметь отношение к нейродегенерации. Действительно, у ScGTl-
trk клеток были выявлены ультраструктурные и биохимические особенности
апоптоза автофагоцитарного субтипа, очень напоминающие таковые, наблю-
даемые in vivo. Для изучения ультраструктуры инфицированные ScGTl-trk-
клетки обрабатывали как для обычной электронной микроскопии, за исключе-
нием процедуры осмикации. Для денатурации прионового протеина срезы об-
рабатывали в 3 М изотиоцианате гуанидина, растворенного в 50 mM Tris-HC!
(pH 7,4), в течение 10 мин. при комнатной температуре. Затем препараты отмы-
вали в фосфатно-солевом буфере (PBS) и окрашивали антителами. В качестве
первичных антител использовали кроличьи поликлональные антитела RO73.
Иммуноокрашивание антителами выполняли на 80-90 пт ультратонких срезах
трехшаговым методом: использование первичных антител, конъюгированных с
биотином; применение вторичных антител, меченых стрептавидином, в свою
очередь конъюгированного с микросферами коллоидного золота (Laszlo et al.,
1992). Контрольные препараты обрабатывали идентично, за исключением пер-
вичных антител, которые были заменены неиммунной сывороткой. Нормаль-
ные и иммуноокрашенные срезы были контрастированы уранилацетатом и ис-
следованы в электронном микроскопе JEOL 100-СХ. Клетки GTl-trk имели
нормальные гетерохроматиновые ядра, хорошо развитый аппарат Гольджи,
интактные митохондрии, маленькие секреторные гранулы и плотные (компакт-
ные) лизосомы обычного размера. У значительной части ScGTl-trk клеток вы-
являли цитопатологические изменения, включая многочисленные
автофагоцитарные вакуоли, большие вторичные лизосомы, содержащие
миелиноподобные мембранные структуры и множество гигантских вакуолей.
Реже обнаруживали группы компактного хроматина и пикноз ядер. Эти
ультраструктурные изменения напоминали те, которые обычно выявляют в
клетках, подверженных апоптозу (Clarke, 1990). Электронной микроскопией
также выявлено интенсивное накопление иммунореактивного материала в
структурах, связанных с эндосомами и вторичными лизосомами (Laszlo et al.,
1992). В 22% ScGTl-trk клеток выявляли вакуолизацию по сравнению с 2% в
контроле. Признаки автофагоцитоза с гигантскими плотными тельцами,
конденсацией хроматина и ядерной фрагментацией, которые коррелируют с
фрагментацией, которые коррелируют с апоптозом, были представлены только
у клеток ScGTl-trk. С течением времени наблюдали усиление автофагии.

Автофагия - важный процесс в интрацеллюлярном обороте протеинов и
органелл. Известно, что этот процесс происходит в нормальных клетках, но
автофагоцитарный лизосомальный компартмент значительно увеличен и у под-
верженных инволюции клеток позвоночных и непозвоночных. Автофагоцитар-
ные гигантские вакуоли у ScGTl-trk клеток, вероятнее всего, представляют со-
бой крайнюю форму автофагоцитоза и могут играть роль в клеточной деструк-
ции, вызывая разрывы лизосом и клеточную смерть (Clarke, 1990).

Ультраструктурная пластичность нейросекреторных ScGTl-trk-клеток
могла бы способствовать анализу стадий патологических изменений, транспор-
та прионового протеина и клеточных компартментов, вовлеченных в превраще-
ние РгРС в PrPSc. In vivo определение апоптоза затруднено, так как апоптозные
клетки быстро удаляются фагоцитозом. Однако фрагментация ДНК была также
установлена in vivo, в клетках мозга овец, инфицированных скрепи.

Анализ ДНК-фрагментации у ScGTl-trk клеток был выполнен в соответст-
вии со следующей методикой. Около 107 клеток дважды отмывали в холодном
PBS и лизировали в 1 ml гипотонического лизис-буфера (5 mM Tris-HCl (pH 7,4),
5 mM EDTA, 0,5% Triton Х-100) в течение 5 мин. Лизаты центрифугировали при
14 000g в течение 20 мин. Супернатанты инкубировали с 50 pg/ml РНКазы (сво-
бодной от ДНКазы) в течение 2 часов при 37°С. Пробы депротеинизировали сна-
чала экстракцией в фенол-хлороформе, а затем в хлороформ-изоамилалкоголе
(24:1) и преципитировали в 2,5 объемах этанола (96% этанол +1/10 объема 3 М
ацетата натрия). После центрифугирования при 3300g в течение 1 часа осадки
отмывали в 70% этаноле и ресуспендировали в 50 ц! Tris-EDTA-буфера (pH 7,5),
содержащего буфер для наслаивания на гель. Аликвоты образцов по 10 ц1 подвер-
гали электрофорезу в 1,9% геле агарозы. Окраску геля проводили этидийброми-
дом. Фрагментация ДНК, которая является одним из критериев апоптоза, была
постоянным признаком ScGTl-trk клеток. Фрагменты олигомерной ДНК длиной,
приблизительно, в 180 нуклеотидов (нт) служили признаком дегенерации внут-
ринуклеосомальной ДНК. Обработка монослоя инфицированных клеток 100
ng/ml NGF в течение 24 часов достоверно уменьшала фрагментацию ДНК, в то
время как у необработанных клеток мономерная форма процесса расщепления
ДНК продуцировала полосу, содержащую 170-180 нт.

Присутствие PrPSc также выявляли вестерн-иммуноблоттингом (Western
Blot), который проводили после 12 пассажей зараженной культуры GTl-trk.
Лизаты скрепи-инфицированных GTl-trk клеток после обработки протеиназой
К продуцировали 3 полосы на иммуноблотах, которые соответствовали выяв-
ляемым у ScN2a клеток. Эти три молекулы (ММ 27-30 kD), полученные после
переваривания протеиназой К белка-предшественника с молекулярной массой
33-35 kD, представляют собой дигликозилированные, моногликозилированные
и негликозилированные полипептиды. Через несколько месяцев после первона-
чальных экспериментов у ScGTl-trk клеток выявляли то же количество РгР50
При субклонировании ScGTl-trk- клеток не было получено ни одной клеточной
линии с пониженным содержанием PrPSt
Иммуноцитохимию проводили по следующей методике. Клетки были
посажены на покрытые поли-а-лизином пластиковые слайды в низкой кон-
центрации за 1-3 дня до иммуноокрашивания. Клетки дважды отмывали в
холодном PBS и фиксировали в 10% растворе формалина в PBS в течение 30
мин. Затем проводили последовательно трехэтапную обработку (каждый 5
мин.): в 1% растворе NH4C1 в PBS, в 0,5% растворе Triton Х-100 и, наконец,
в 3 М GdnHCl (только для окрашивания PrPSc). После 4-кратной отмывки в
PBS препараты блокировали инкубацией в 5% растворе сухого обезжирен-
ного молока (СМ) в PBS в течение 30 мин., а затем инкубировали с первич-
ными антителами, растворенными в 5% растворе СМ в PBS (1:1000), в тече-
ние ночи при 4°С. Инкубацию со вторичными антителами (1:50 в 5% СМ в
PBS), конъюгированными с изотиоцианатом флюоресцеина, проводили а
течение 1 часа при комнатной температуре.

Биопробу прионового агента на мышах штамма CD-1 Swiss проводи-
ли с использованием как GTl-trk, так и ScGTl-trk клеток в 3 независимых
экспериментах. После множества пассажей одинаковый титр прионов полу-
чали независимо от того, содержал инокулят 106 или 102 клеток ScGTl-trk. У
мышей, инокулированных клетками GTl-trk, скрепи не выявляли.

Клетки ScGTl-trk, пассированные 25 раз, имели титр 105,1 ID50U/107
клеток; 40 раз - 1О6,0; 55 раз - 106’5 Эти данные показывают, что прионовая
инфекционность после множества пассажей была продуцирована de novo и
не являлась результатом первого инокулята.

Таким образом, результаты работы с инфицированной культурой клеток
GTl-trk, в которой была получена характерная картина нейродегенерации, наблю-
даемая in vivo, вместе с признаками апоптоза, свидетельствуют о получении новой
клеточной системы, пригодной для изучения прионовых болезней.

Ройхель В.М. (1997), изучая развитие агента скрепи в перевиваемых
культурах клеток, установил, что в гибридной культуре (клетки опухоли почки
мыши RAC и диплоидные клетки кожно-мышечных фибробластов человека)
концентрация прионов нарастала к 91 пассажу, что проявлялось в укорочении
инкубационного периода у зараженных мышей BALB/c с 58 до 28-31 недели
при 100% гибели животных. Было проведено 98 пассажей в течение 658 дней:
клетки все время обрабатывали лизолецитином. Без этой обработки удалось
провести только 34 пассажа в течение 317 дней. На уровне 11-18 пассажей от-
мечали снижение митотической активности у зараженных клеткок и, соответст-
венно, скорости роста. Электронномикроскопически на 9, 51 и 94 пассажах в
клетках были обнаружены сложные миелиноподобные мембраны и крупные
вакуоли в цитоплазме, которые содержали мембранные образования разного
размера и дочерние вакуоли. Эти изменения походили на те, которые обычно
выявляют в головном мозге зараженных скрепи мышей. Описанные изменения
отсутствовали в клетках контроля.

В культуре клеток невриномы гассерова узла крысы (НГУК-1) была по-
лучена длительная персистенция агента скрепи (2 года). Проведен 121 пассаж.
Заражение мышей суспензией таких клеток было всегда положительным: инку-
бационный период составлял 9-10 месяцев. Отмечено увеличение пролифера-
тивной активности клеток; возрастание митотического индекса, начиная с 4
пассажа; изменения в клетках в виде характерной вакуолизации; патология
мембранных элементов. Электронномикроскопически также были выявлены
многослойные мембраны. Установлена интерференция с онкорновирусами -
снижение их накопления, что, возможно, связано с конкуренцией за мембран-
ные структуры, обусловленной тесной ассоциацией прионов с клеточными
мембранами. Изменения, возникающие в культуре НГУК-1 при её инокуляции
материалом биопсии головного мозга, взятого от больной БКЯ, сывороткой
крови и сгустком крови от больных БКЯ и СПИ, характеризовались увеличени-
ем митотического индекса (максимально в 7,5 раз) и появлением патологиче-
ских митозов (в 2,5 раза). Электронномикроскопически в клетках выявляли
многослойные мембраны. Их наличие можно рассматривать как свидетельство
накопления в клетках инфекционного прионового агента.

Таким образом, показано, что гибридная культура клеток опухоли
почки мыши RAS и диплоидных клеток кожно-мышечных фибробластов
человека, а также культура НГУК-1 могут быть использованы в исследова-
ниях, связанных с изучением прионов и прионовых инфекций.

Понимание молекулярных процессов, лежащих в основе клеточной дест-
рукции при прионовых болезнях, могло бы облегчить создание эффективных
терапевтических подходов. При передаче прионов от крупного рогатого скота
(ТГЭ) человеку (новый вариант БКЯ; nvCJD) разработка эффективной диагно-
стики и терапии приобретает особую важность. Определение носителей леталь-
ных мутаций гена Ртр сделает возможным за десятилетие до начала процессов
дисфункции ЦНС применение эффективной терапии у больных людей.

Появление ТГЭ и nvCJD, причиной которой, по-видимому, является
ТГЭ, существенно повысило необходимость в совершенствовании диагно-
стических методов, особенно доклинических, и в распознавании всех вари-
антов прионовых болезней человека и животных.

Получение поликлональных антител к скрепи-изоформе прионового про-
теина (ММ 27-30 kD; РгР 27-30) представило большие возможности для
проведения дальнейших успешных исследований в этой области (Bendheim et
aL, 1984; Bode et al., 1985). Индукция этих специфических антисывороток тре-
бует относительно высоких концентраций очищенного иммуногена. Необходи-
мость высокой концентрации говорит о существовании некоего уровня врож-
денной иммуносупрессии, или толерантности, к прионовым протеинам, что
наблюдают у лабораторных животных-грызунов. С установлением факта суще-
ствования нормальной (клеточной) и скрепи- изоформ прионового протеина
создание иммунологических зондов повышенной моноспецифичности стало
крайне важной проблемой. МА являются ценным инструментом как для диаг-
ностики, так и для проведения фундаментальных исследований.

Впервые мышиные моноклональные антитела (МА) к агенту скрепи,
адаптированного к хомякам при помощи пассирования, получены в 1986
году (Barry and Prusiner, 1986). Эти МА опознавали РгР 27-30, изоформы РгР
33-35с и РгР 33-35Sc на вестерн-иммуноблотах. Таким образом, создание
этих МА к РгР обеспечило проведение дальнейших работ по идентифика-
ции, характеристике и очистке прионовых протеинов.
Kascsak с соавторами (1987) впервые получили мышиные МА к различ-
ным эпитопам (это зависит от источника антигена) протеинов скрепи-
ассоциированных фибрилл (являются протеаза-устойчивыми белками - PrPSc).
Мыши неодинаково реагировали на инокуляцию PrPSc, изолированных от раз-
ных видов скрепи-инфицированных животных: гомологичных (мыши) и гете-
рогенных (хомяки). Так, МА (263К 3F4), полученные от мышей, которые были
иммунизированы штаммом 263К РгР$с хомяка, реагировали только со скрепи-
изоформой прионового протеина инфицированных хомяков. Кроме того, МА
распознавали нормальный прионовый протеин мозга хомяка и человека с моле-
кулярной массой 33-35 kD, но не РгРс крупного рогатого скота, мыши, крысы,
овцы или кролика. Антитела направлены против области, находящейся в пер-
вом предполагаемом хеликсе, который содержит 4 аминокислотных остатка
(met, lyz, his, met; 109-112). Таким образом, было продемонстрировано различие
эпитопов на РгРс разных животных.

Prusiner с соавторами показали, что РгР0/0-мыши синтезируют антите-
ла против прионовых протеинов после их иммунизации очищенным протеи-
ном (Prusiner et aL, 1993).

Krasemann с соавторами (1996) разработали технику иммунизации, осно-
ванную на инъекции нуклеиновой кислоты нетолерантным РгР°/0-мышам. Для
этого всю открытую рамку считывания Pmp-гена здоровых людей или пациен-
тов, страдающих прионовыми болезнями, амплифицировали полимеразной
цепной реакцией, клонировали в pCDNA3-eeKTop. Были клонированы три раз-
личных генотипа: ген клеточного, дикого, типа; прионовый ген, ассоциирован-
ный с Р102Ь-мутацией, выявляемой при СГШ; инсерционный мутант, содер-
жащий 14 октапептидных повторов в повторяющейся последовательности при-
онового гена. Пять различных мутаций Pmp-гена, ассоциированных с прионо-
выми болезнями человека, которые не удалось амплифицировать из ДНК паци-
ентов, были вставлены при помощи in vitro мутагенеза в открытую рамку счи-
тывания гена прионового протеина дикого типа. Эти мутации ассоциированы с
СГШ (alal 17vai; phe!98ser), БКЯ (aspl78asp в комбинации с 129val; glu2001ys) и
летальной семейной бессоницей (aspl78asp в комбинации с 129 met). Открытые
рамки считывания различных прионовых генов были субкпонированы в векто-
ры рВК под контролем промотора цитомегаловируса - CMV (pBK-CMV), а за-
тем - в pBS+ для того чтобы обеспечить совместимые рестрикционные BamHl-
сайты для последующего клонирования в вектор pSFV 1.

Для транскрипции in vitro ДНК-плазмиды pSFV-РгР линеализировали при
помощи Spel. Синтезированную РНК использовали для трансфекции клеток
ВНК (культура клеток почки новорожденного хомяка) или очищали для приго-
товления высоко концентрированной РНК с целью иммунизации мышей. Транс-
фицированные электропорацией клетки ВНК культивировали в теченеи 24 часов
и затем собирали всю культуральную среду. Супернатант содержал инактивиро-
ванный вирус. Добавлением химотрипсина выполняли активацию вируса-
реакцию останавливали апротинином. Раствор, содержащий, приблизительно,
105-106 инфекционных частиц/ml, немедленно инокулировали животным.

Полученные ДНК и РНК, кодирующие разные прионовые протеины
человека, в числе которых мутантные последовательности, ассоциирован-
ные с БКЯ, СГШ и летальной семейной бессоницей, инъецировали в регене-
рирующую мышечную ткань, предварительно обработанную кардиотокси-
ном. Мыши были сначала инокулированы ДНК-плазмидами, кодирующими
Prnp-ген, а затем вторично иммунизированы ДНК, РНК и частицами вируса
Semliki-Forest (SFV), экспрессирующими Ргпр, для усиления индукции по-
ликлональных антител у этих мышей и увеличения количества бластоцитов
в селезенке. После этого были получены гибридомы.

Для оценки способности гибридом синтезировать МА против линейных
и нативных (гипотетических) конформационных эпитопов прионового протеи-
на супернатанты были анализированы при помощи пептидной ELISA, вестерн
блота, иммунофлюоресценции и радиоиммунопреципитации. Для определения
специфичности полученных МА по отношению к РгР человека пептидную
ELISA выполняли с использованием панели из 16-ти пептидов, содержащих
участки с перекрывающимися последовательностями аминокислот. В отличие
от результатов исследований Kascsak с соавторами (1987), полученные в данной
работе МА распознавали эпитопы, распределенные по всей молекуле прионово-
го протеина. Была установлена их кросс-реактивность с РгР других видов. По-
лученные МА направлены против 4-х различных линейных эпитопов и могут
также опознавать прерывистые участки нативных конформационных эпитопов
прионового протеина. Таким образом, полученные МА могли бы помочь в ре-
шении вопросов, связанных с природой прионового протеина, с инициацией и
прогрессией прионовых болезней. Кроме того, эти моноклональные антитела
могут быть использованы в диагностике прионовых болезней человека и жи-
вотных и выявлении РгР50 в культурах клеток.

Zanusso с соавторами (1998) иммунизировали РгР^-мышей рекомбинант-
ным мышиным РгР^ и получили панель моноклональных антител, специфичных
для РгР*3 мыши. Эти МА распознают как нормальную, так и протеаза-
резистентную изоформы РгР. Некоторые МА являются видоограниченными, в то
время как другие реагируют с РгР мыши, человека, обезьяны, крупного рогатого
скота, овец, белки, хомяка. Более того, некоторые МА выборочно распознавали
различные гликоформы прионового протеина, а также метаболические фрагмен-
ты РгР0 (18 kD и 9 kD). Генерированные антитела были бы полезными для изуче-
ния биологии РгР^, локализации нормального, мутантного и патогенного РгР и
создания эффективной диагностики прионовых болезней человека и животных.

Kretzschmar с соавторами (1996) на основании продолжительных иссле-
дований, проведенных в 4-х лабораториях (Германия, Великобритания, Япония,
США), сформулировали общие диагностические критерии для спорадической
формы БКЯ. Это было вызвано необходимостью оценки существующих мор-
фологических и лабораторных диагностических методик для достижения кон-
сенсуса в точной постановке БКЯ. Так как все существующие поликлональные
и моноклональные антитела в иммунохимических реакциях распознают обе
изоформы прионового протеина (РгР6 и РгР50), методы иммунодетекции долж-
ны включать процедуру селективного исключения реактивности нормальной
изоформы РгР. РгР0 чувствителен к фиксации формалином и другим обычным
обработкам ткани и, следовательно, его нельзя выявить в ткани, фиксированной
в формалине, в то время как эпитопы на PrPSc в аналогичных образцах продол-
жают существовать после фиксации, автоклавирования, обработки муравьиной
кислотой и протеиназой К. Многочисленные исследования подтвердили, что
РгР* является чувствительным и специфическим маркером ТГЭ. Таким обра-
зом, иммуногистохимический анализ (ИГХ) с использованием направленных
против прионового протеина антител, наряду со специальной обоснрванной
стандартизированной предварительной обработкой ткани, дает надежные, дос-
товерные диагностические результаты и может быть использован в качестве
диагностического теста не только при БКЯ, но и всех других ГЭ. ИГХ является
лучшим методом для исследования фиксированной в формалине и заключенной
в парафин ткани по сравнению с другими методами, которые хотя и могут быть
более чувствительными, но требуют применения свежего нефиксированного
материала. Дополнительные специальные методы (гистоблот, электронная мик-
роскопия, вестерн блот, анализ Pmp-гена, определение специфических протеи-
нов спинномозговой жидкости), могут быть применены по необходимости.

В связи с появлением ТГЭ крупного рогатого скота в Англии и Европе и
ТГЭ оленей и лосей в США возникла острая потребность в создании высоко-
специфичных антител для диагностики ТГЭ жвачных. O'Rourke с соавторами
(1998а) получили мышиные МА (F89/160.1.5) к синтетическому пептиду, соот-
ветствующему аминокислотным остаткам 146-159 прионового протеина круп-
ного рогатого скота. Антитела взаимодействуют с прионовым протеином в тка-
нях, полученных от больных ГЭ овец, крупного рогатого скота, оленей и лосей.
МА распознавали сохраненный эпитоп на прионовом протеине в фиксирован-
ных формалином, заключенных в парафин и подвергнутых автоклавированию
гистосрезах, что дает возможность их использования в диагностике и изучении
патогенеза ТГЭ у этих видов жвачных.

Schreuder с соавторами (1996) сообщили о создании доклинического диаг-
ностического теста для прионовых болезней на основе скрепи овец, использован-
ных в качестве модели. Существующие прежде подходы для ранней диагностики
ТГЭ основаны на клинических признаках, электроэнцефалографии, ядерном маг-
нитном резонансе или на исследовании биопсии мозга. Подтверждение диагноза
при подозрении на болезнь, тем не менее, основано на гистологическом исследо-
вании мозга. ИГХ имеет много преимуществ над биопробой на мышах, хотя по-
следняя считается более чувствительным методом, но из-за своей громоздкости и
продолжительности не может стать практическим диагностическим тестом. Раз-
личные ткани (кровь, моча, тканевые фибробласты и лимфоидная ткань) были
протестированы при попытке создания метода ранней (прижизненной) диагно-
стики ГЭ. Большинство исследований дали отрицательные или недостоверные
результаты, хотя существует классическая работа Hadlow с соавторами (1982),
которые показали возможность выявления скрепи-инфекции в лимфоидной ткани
у естественно инфицированных овец в возрасте 10-14 месяцев, до того, когда ин-
фекцию можно определить в ЦНС. Однако, авторам удалось определить присут-
ствие РгР* в миндалинах овец, находящихся в доклинической стадии болезни,
задолго до начала проявления характерных симптомов.

В 1998 появилось сообщение о создании новой неинвазивной доклини-
ческой диагностики скрепи овец, основанной на детекции РгР50 в биопсии лим-
фатических узлов коньюнктивы глаза. Лимфатические узлы можно легко из-
влечь под местной анестезией. Предварительно обработанные срезы инкубиро-
вали с первичными антителами (F89/160.1/5; O'Rourke et al., 1998b), затем co
вторичными антителами, конъюгированными с биотином и комплексом ави-
дин-биотин-пероксидаза хрена. После обработки хромогенным субстратом сре-
зы контрастировали гематоксилином Майера и исследовали в световом микро-
скопе. Из 16 клинически нормальных овец 6 показали клинические признаки
болезни через 2-7 месяцев после тестирования; скрепи была подтверждена гис-
тологическими и иммуногистохимическими анализами некропсии мозга.

Schulz-Schaeffer с соавторами (2000) создали новый чувствительный метод
для детекции РгР50 в гистосрезах фиксированной формалином и заключенной в
парафин ткани - PET blot (paraffin-embeded tissue), приготовленных на нитроцел-
люлозной мембране. Этот метод позволяет определять очень низкую концентра-
цию РгР5* во время инкубационного периода, задолго до начала клинического
проявления болезни, у инфицированных штаммом скрепи МЕ7 мышей С57/В16.
При помощи этого метода в мозге инфицированных животных выявляли аккуму-
ляцию РтР* через 30 дней после интрацеребрального введения агента скрепи - за
145 дней до начала появления клинических признаков.

Таким образом, изложенные выше подходы и разработанные методы
позволяют выявлять прионы в организме животных до появления у них
клинических признаков заболевания, что открывает перспективы ранней
диагностики и проведения оздоровительных мероприятий в неблагополуч-
ных хозяйствах. Кроме того, можно ожидать, что применение новых чувст-
вительных методов с использованием моноклональных антител позволит
осуществлять эффективный контроль на отсутствие агента скрепи в культу-
рах клеток, используемых в научных исследованиях и в биотехнологии, а
также для сертификации культур клеток в коллекциях клеточных культур.

Рисунок 85. Модель клеточного механизма, вовлеченного в образование РгР30 (по Hams DA, 1999)
Обозначения О РгРс □ РгР80 © РгРс-муганг; П РгР&-муганг,

О △ промежуточные формы РгР
На рис. 85 показано взаимодействие на клеточной поверхности внекле-
точного РгР^ (в форме прионовой частицы; I) с РгРс (возможно, в детергент-
резистентных участках). Это взаимодействие катализирует превращение РгРс в
PrPSc (II), Трансформация также может происходить после поглощения протеи-
нов в эндосомальный компартмент (III). Некоторые сформированные PrPSc ак-
кумулируются в лизосомах (IV), хотя их также можно обнаружить и в других
отделах клетки. При наследственных формах прионовых болезней мутантные
РгР6 спонтанно трансформируются в Ргг с через ряд биохимических промежу-
точных продуктов: самая ранняя из них - PI-PLC-резистентная форма (фосфои-
нозитид-специфическая фосфолипаза С; PI-PLC), образованная в эндоплазма-
тическом ретикулуме (V). Мутантные РгР молекулы транспортируются к кле-
точной поверхности, где они становятся нерастворимыми в детергенте (VI) и,
затем, протеаза-резистентными (VII). Этапы VI и VII могут, по-видимому, про-
исходить и в эндоцитозных пузырьках.

Прямое действие

Нейроны	Микроглия

Пониженная резистент-
ность к оксидативному
стрессу

V
Опосредованное

действие

Смерть

Астроциты

пролиферация

Рисунок 86. Влияние РгР 106-126 на клетки в культуре.

На приведенном рисунке показан механизм прямого воздействия РгР Юб-
126 на нейроны и микроглию. Это зависит от экспрессии РгРс и выражается в
снижении нейронами их устойчивости к оксидативному стрессу. Прямое дейст-
вие прионового пептида на микроглию вызывает продукцию ROS и цитокинов.
Через микроглию РгР 106-126 воздействует на нейроны и астроглию, в результа-
те чего происходит гибель нейронов и пролиферация астроглии.
Литература

1.	Копюшко О.И., Миронова Л.Л., Дьяконов Л.П. Метод контроля клеточных субстратов
на присутствие агента скрепи. Бюлл. ВИЭВ, 1.77 «Прионные и ретровирусные инфек-
ции животных», М., 1996, 31-33.

2.	Методические указания по контролю перевиваемых культур клеток из органов и тканей
овец на отсутствие агента скрепи. Утверждены Департаментом ветеринарии Минсельхоз-
прода РФ 23 августа 1996 г. (авторы. Дьяконов Л.П., Миронова Л.Л., Конюшко О.И.)

3.	Монке О., Костелло А., Вивере Э., Авилов В.М., Рыбаков С.С. Контроль губкообраз-
ной энцефалопатии крупного рогатого скота в Ирландии. Ветеринария, 1998, 1, 16-22.

4.	Орлянкин Б.Г Структура и биология прионов (обзор). Сельскохозяйственная Биоло-
гия, 1998,2,46-58.

5.	Ройхель В.М. Патогенез и диагностика некоторых медленных прионовых инфекций.
Дисс. д. м. н., М., 1997.

6.	Andres-Barquin P.J., LePrince G., Fages C. et al. Expression of glia! fibrillary acidic protein
and glutamine synthetase genes in the natural scrapie of sheep. Mol. Chern. Neuropathol.,
1994, 22, 57-65.

7.	Barry R.A. & Prusiner S.B. Monoclonal antibodies to the cellular and scrapie prion proteins.
J. Inf. Dis., 1986,3,518-521.

8.	Borcheit D.R., Scott M., Taraboulos A. et al. Scrapie and cellular prion protein differ in
their kinetics of synthesis and topology in cultured cells. J. Cell. Biol., 1990, 110, 743-752.

9.	Brandler S., Isenmann S., Raeber A. et al. Normal host prion protein necessary for scrapie-
induced neurotoxicity. Nature, 1996, 379, 339-343.

10.	Brown D.R., Herms J. and Kretzschmar H.A. Mouse cortical cells lacking cellular PrP sur-
vive in culture with a neurotoxic PrP fragment. Neuroreport, 1994, 5, 2057-2060.

11.	Brown D.R., Schmidt B., Kretzschmar H.A. Role of microglia and host prion protein in
neurotoxicity of a prion protein fragment. Nature, 1996a, 380, 345-347.

12.	Brown D.R., Schmidt B., Kretzschmar H.A. A neurotoxic prion protein fragment enhances
proliferation of microglia but not astrocytes in culture. Glia, 1996b, 18, 59-67.

13.	Bueler H., Fischer M., Lang Y. et al. Normal development and behaviour of mice lacking
the neuronal cell-surface PrP protein. Nature, 1992, 356, 577-582.

14.	Clarke P. Developmental cell death: morphological diversity and multiple mechanisms.
Anat. Embryol., 1990, 181, 195-213.

15.	DeArmond S.J., Mobley W.C., DeMott D.L. et al. Changes in the localization of brain prion
protein during scrapie infection. Neurology, 1987, 37, 1271-1280.

16.	Forloni G., Angeretti N., Chiesa R. et al. Neurotoxicity of prion protein fragment. Nature,
1993,362, 543-546.

17.	Forloni G., Del Bo K., Angeretti N. et al. A neurotoxic prion protein fragment induces rat
astroglial proliferation and hypertrophy. Eur. J. Neurosci., 1994, 6, 1415-1422.

18.	Gajdusek D.C. Unconventional viruses and the origin and disappearance of kuru. Science,
1977, 197, 943-960.

19.	Giese A., Groschup M.H., Hess B. and Kretzschmar H.A. Neuronal cell death in scrapie-
infected mice is due to apoptosis. Brain Pathol., 1995, 5, 213-221.

20.	Giulian D., Li J., Leara B. and Keenen C. Phagocytic microglia release cytokines and cytotoxins
that regulate the survival of astrocytes and neurons in culture. Neurochem. Int. 1994,25, 227-233.

21.	Guiroy D.C., Wakayama I., Liberski P.P. and Gajdusek D.C. Relationship of microglia and
scrapie amyloid-immunoreactive plaques in kuru, CJD and GSS. Acta Neuropathol. (Berl.),
1994, 87,526-530.

22.	Hadlow W.J., Kennedy R.C., Race R.E. J. Infec. Diseases. 1982, 146, 657.

23.	Harris D.A. Cellular biology of prion diseases. Clinical Microbiol. Rev., 1999, 12, 427-444.

24.	Hope J., Shearman M.S., Baxter H.C. et al. Cytotoxicity of prion protein peptide (PrP106-
126) differs in mechanism from the cytotoxic activity of the Alzheimer's disease amyloid
peptide A25-55. Neurodegeneration, 1996, 5, 1- 11.

25.	Huang Z, Prusiner S.B. and Cohen F.E. Structures of prion proteins and conformational
models for pnon diseases. Curr. Top. Microbiol Immunol., 1996, 207, 49-67.
26.	Kascsak R.J., Rubenstein R., Merz P.A. et al. Mouse polyclonal and monoclonal antibodies
to scrapie-associated fibril proteins. J. Virol., 1987, 12, 3688-3693.

27.	Krasemann S., Groschup M.H., Harmeyer S. et al. Generation of monoclonal antibodies
against human prion protein in PrP0/0 mice. Mol. Med., 1996, 6, 725-734.

28.	Kretzschmar H.A., Prusiner S.B., Stowring L.E. and DeArmond S.J. Scrapie prion protein
are synthesized in neurons. Am. J. Pathol., 1986, 122, 1-5.

29.	Kretzschmar H.A., Ironside J.W., DeArmond S. et al. Diagnostic criteria for sporadic CJD.
Arch. Neurology, 1996, 53, 913-920.

30.	Laszlo L., Lowe J., Self T. et al. Lysosomes as key organells in the pathogenesis of prion
encephalopathies. J. Pathol., 1992, 166, 333-341.

31.	Ling E.-A. and Wong W.-C. The origin and nature of ramified and amoeboid microglia, a
historical review and current concepts. Glia, 1993, 7, 9-18.

32.	Mackenzie A. Immunohistochemical demonstration of glial fibrillary acid protein in scrapie.
J. Comp. Pathol., 1983, 93, 251-259.

33.	Mellon P.L., Windle J.J., Goldsmith P.C. et al. Immortalization of hypothalamic GnRH
neurons by genetically targeted tumorigenesis. Neurons, 1990, 5, 1-10.

34.	Mueller W., Ushijima H., Schroder H. et al. Cytoprotective effect of NMDA receptor an-
tagonists on prion protein (PrPSc)-induced toxicity in rat cortical cell cultures. Eur. J. Phar-
macol, 1993, 246, 261-267.

35.	Oesch B., Westaway D., Walchli M. et al. A cellular gene encodes scrapie PrP 27-30 pro-
tein. Cell, 1985,40, 735-746.

36.	O'Rourke K.I., Baszler T.V., Miller J.M. et al. Monoclonal antibody F89/160.1.5 defines a
conserved epitope on the ruminant prion protein. J. Clin. Microbiol., 1998a, 36, 1750-1755.

37.	O'Rourke K.I., Baszler T.V., Parish S.M. and Knowles D.P. Preclinical detection of PrP50 in
nictitating membrane lymphoid tissue of sheep. Vet. Rec.; 1998b, 142, 486-491.

38.	Pan K.-M., Baldwin M., Nguyen J. et al. Conversion of a-helices into P-sheets features in the
formation of the scrapie prion protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90,10962-10966.

39.	Prusiner S.B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science, 1982,216,136-144.

40.	Prusiner S.B. Molecular biology of prion diseases. Science, 1991, 252, 1515-1522.

41.	Prusiner S.B. Genetic and infectious prion diseases. Arch. Neurol., 1993, 50, 1129-1153.

42.	Prusiner S.B., Groth D., Serban A. et al. Ablation of the prion protein gene in mice prevents
scrapie and facilitates of anti-РгР antibodies. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993,90,10608-10612.

43.	Rubenstein R., Deng H., Scalici C.L. et al. Alterations in neurotransmitter-related enzyme
activity in scrapie-infected PC12 cells. J. Gen. Virol., 1991, 72, 1279-1285.

44.	Sauer H., Dagdanova A., Hescheler J. and Wartenberg M. Redox-regulation of intrinsic
prion expression in multicellular prostate tumor spheroids. Free Radical Biology & Medi-
cine, 1999, 27, 1276-1283.

45.	Schaetzl H.M., Laszlo L., Holtzmann D.M. et al. A hypothalamic neuronal cell line persis-
tently infected with scrapie prions exhibits apoptosis. J. Virology, 1997, 71, 8821-8831.

46.	Schreuder B.E., van Keulen L.J., Vromans M.E. et al. Preclinical test for prion diseases.
Nature, 1996,381,563.

47.	Schulz-Schaeffer W.J., Tschoeke S., Kranefuss N. et al. The paraffin-embedded tissue blot
detects PrPSc early in the incubation time in prion diseases. Am. J. Pathol., 2000, 156, 51-56.

48.	Streit W.J. and Kreutzberg G.W. Lectin binding by resting and reactive microglia. J. Neuro-
cytol, 1987, 16, 249-260.

49.	Taraboulos A., Raeber A.J., Borchelt D.R. et al. Synthesis and trafficking of prion proteins
in cultured cells. Mol. Biol. Cell., 1992, 3, 851-863.

50.	Williams A.E., vanDam A.-M., Man-A-Hing W.K. et al. Cytokines, prostaglandins and
lipocortin-1 are present in the brains of scrapie-infected mice. Brain Res., 1994,654,200-206.

51.	Zanusso G., Liu D., Ferrari S. et al. Prion protein expression in different species: analysis
with the panel of new mAbs. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95, 8812-8816.
Глава 22. Выделение вирусов в культурах клеток и ме-
тоды их идентификации.

Выбор клеточной культуры для вирусологических исследований опреде-
ляется в зависимости от того, от какого вида животного доставлен материал для
экспертизы. Так, если в лабораторию поступил материал от телят, то для работы
необходимо иметь первичную культуру клеток почки эмбриона коровы (ПЭК)
или почки телят. При отсутствии указанных культур можно использовать пере-
виваемые линии клеток почки теленка (ПТ, ПТ-80, МДВК), легкое эмбриона
коровы (ЛЭК), коронарные сосуды теленка (КСТ).

Для исследования материала, взятого от свиней, необходимо исполь-
зовать первичную культуру почек эмбрионов свиней (ПЭС) или перевивае-
мые линии клеток почки эмбрионов свиньи (СПЭВ), тестикулов поросенка
(ПТП), щитовидной железы свиньи (ЩС), почки свиньи (IBRS) и др.

Материал от лошадей можно исследовать на первичных культурах (суб-
культурах) клеток почки, тестикулов, легких, кожно-мышечной ткани, селезенки
эмбриона лошади. В случае отсутствия этих культур, обнаружение вируса, выде-
ленного от лошади в патологическом материале проводят на первичных культурах
(субкультурах) ПЭК, ПЭС, СПЭВ, ЩС, гибридных культурах (А4хЛ, А4хС).

Для заражения клеточных культур используют вируссодержащий ма-
териал, полученный от больных или павших животных. Источником вируса
может быть кровь, содержимое кожных высыпаний, носоглоточная слизь и
смывы, кусочки органов и тканей от трупов или вынуждено убитых живот-
ных, либо пробы фекалий (на обнаружение рота-, корона-, парвовирусов).
Пробы для выделения вирусов должны быть правильно взяты и быстро дос-
тавлены в лабораторию (не позднее 48 час.).

Из тканевого материала готовят 10%-ную суспензию на стерильном
фосфатно-буферном растворе, pH 7,4-7,6. Ткань растирают в стерильной
фарфоровой ступке с битым стеклом до полной гомогенизации. К взятой
навеске материала добавляют 9 частей буферного раствора, чтобы получить
10%-ную концентрацию исходного материала. После добавления антибио-
тиков (по 300-500 ед/мл пенициллина и стрептомицина и 100 ед/мл канами-
цина) суспензию выдерживают при 4°С в течение 2-3 часов. Центрифуги-
руют 30 минут при 3000 об/мин. Надосадочную жидкость сливают в сте-
рильные флаконы и хранят в замороженном состоянии до использования.

Надосадочную жидкость проверяют на стерильность (высевы на МПА,
МПБ, МППБ) и при отсутствии бактериального загрязнения, ее используют для
заражения культур клеток. Для этих целей берут не менее 4 пробирок с моно-
слойной культурой. Контролем служат незараженные культуры. Из отобранных
пробирок с монослойной культурой сливают питательную ростовую среду. Куль-
туру промывают 2-3 раза поддерживающей средой для удаления остатков сыво-
ротки. В каждую пробирку вносят по 0,1-0,2 мл вируссодержащего испытуемого
материала. После 30-60 минут контакта вируса с клетками при температуре 37°С
в пробирки вносят по 0,8-0,9 мл поддерживающей среды. Испытуемый материал
может оказать токсическое действие на клетки (отслоение или округление и деге-
нерация через 6-8-часов после заражения). Поэтому после заражения клеток (че-
рез 30-60 минут адсорбции) удаляют посевной материал и вносят поддерживаю-
щую среду. В контрольные пробирки с культурой вносят после промывания под-
держивающую среду по I мл. Если материал нестерильный, то полученную жид-
кость фильтруют через мембранный фильтр, Д-0,22 мкм.

В качестве поддерживающих сред наиболее часто используют сле-
дующие: 1) 0,5%-ный гидролизат лактальбумина в растворе Хенкса без сы-
воротки или 0,25-0,3% ФГМ-с на растворе Хенкса, 2) среда Игла без сыво-
ротки, 3) среда 199 без сыворотки. Иногда добавляют до 2% сыворотки за-
ведомо не содержащей антител к вирусам.

Зараженные и контрольные культуры инкубируют в термостате при
37°С. Культуры исследуют микроскопически ежедневно в течение 6-8 дней.
Многие вирусы при размножении в культурах вызывают дегенерацию кле-
ток, т.е. оказывают цитопато генное действие (ЦПД). Время развития и ха-
рактер цитопатогенных изменений в инфицированных культурах клеток
определяются свойствами и дозой инокулированного вируса. При наличии
вируса в малых концентрациях в первом пассаже ЦПД не проявляется, по-
этому рекомендуется провести 2-3- слепых пассажа.

Для исключения токсической природы дегенерации клеток проводят
один пассаж. Для этого культуральную жидкость из пробирок с дегенериро-
ванными клетками вносят в пробирки со свежими культурами клеток. Если
дегенерация вызвана токсическим фактором испытуемого материала, то де-
струкция клеток в пассажной культуре не проявится.

При микроскопировании зараженных культур отмечают различные деге-
неративные изменения в клетках. На основании деструктивных изменений, вы-
зываемых вирусами в клеточных культурах, ориентировочно определяют, к
какой группе они относятся. Окончательный диагноз о видовой принадлежно-
сти вируса можно сделать путем типирования его специфической сывороткой.

Вирус парагриппа крупного рогатого скота (ПГ-3)

Выделение вируса парагриппа-3 проводят на культуре клеток: ПЭК
(почка эмбриона коровы), ПТ, СЭК (селезенка эмбриона коровы), ЛЭК, ПЯ
(почка ягненка), ПЭО(почка эмбриона овцы), СЯ (сердце ягненка), FLK.

Зараженные и контрольные клеточные культуры инкубируют при
температуре 37°С до 7 суток, ежедневно просматривая под микроскопом
для выявления ЦПД вируса ПГ-3.

Первые изменения наблюдаются через 18-24 часа. Как правило, отмеча-
ют округление отдельных клеток, изменение рисунка монослоя (растягивание
клеток, появление «окон»), наблюдаются «плавающие» клетки в питательной
среде. На 48-72 час ЦПД усиливается, в монослое появляются большие участки
дегенерации (до 70-75%). Образуются крупные многоядерные симпласты с ро-
зовыми цитоплазматическими включениями и светлой зоной вокруг них (при
окраске гематоксилин-эозином) (рис87,88, 89). На поверхности сохранившихся
участков монослоя располагаются округлые или вытянутые дегенерирующие
клетки с интенсивно окрашенной цитоплазмой и пикнотичными ядрами.

Полная гибель клеток наступает на 4-5 сутки после проявления ЦПД. В
случае высокой концентрации вируса в исследуемом материале ЦПД наступает
в первом или втором пассаже. При отсутствии ЦПД в первых пассажах или при
слабом его проявлении проводят три последовательных пассажа, каждый пас-
саж проверяют в реакции гемадсорбции с эритроцитами морской свинки.

Идентификацию вируса ПГ-3 проводят в реакции гемадсорбции, ре-
акции непрямой гемаглютинации (РИГА).

Ротавирус крупного рогатого скота

Выделение ротавируса крупного рогатого скота проводят на культу-
ре клеток ЛЭК, СПТ (субкультура почки теленка). Монослой клеток отмы-
вают поддерживающей средой ГЛА и выдерживают в термостате при 37°С в
течение 24-48 часов.

В культуре клеток ЛЭК под воздействием ротавируса через 8 часов
культивирования обнаруживается нарушение межклеточных контактов у
отдельных клеток. Границы клеток плохо выражены. В цитоплазме хорошо
прокрашены в розовый цвет микрофиламенты. Обнаруживаются светлые
зоны вокруг ядра и крупные вакуоли с одной или двух сторон ядра. С появ-
лением светлой зоны вокруг ядра, ядрышки в ядре исчезают. Цитоплазма
приобретает ярко красный цвет (при окраске гематоксилин-эозином). Появ-
ляются симпласты с 2-мя и реже с 3-5 ядрами.

Через 12-16 часов культивирования дегенеративные процессы активи-
зируются, увеличиваются размеры пустот в монослое. Характерно наличие
двухядерных клеток, в которых ядра плотно прилегают друг к другу, отме-
чается пикноз ядер в других клетках. В крупных ядрах появляются сетчатые
тяжи, ядерный матрикс просветлен.

Через 16 часов после заражения по краям разрушенного монослоя от-
дельные клетки напоминают так называемые «серповидные клетки». В мо-
нослое встречаются клетки на различных стадиях митоза.

В большинстве клеток характерно наличие вакуолизации цитоплазмы в
околоядерной зоне, проявление пустот на местах дегенерированных ядер
(Рис.90). Через 48 часов монослой, в основном, разрушен. Оставшиеся клетки
располагаются в виде тяжей, соединенных между собой. Ядра овальные, напо-
минающие ядра фибробластов. В конгломератах клеток, стянутых цитоплазма-
тическими тяжами, границы клеток трудно различимы, по существу, они пред-
ставляют симпласты, в которых часть ядер не имеет заметных изменений, дру-
гие же ядра пикнотизированы. Эти изменения характерны для апоптоза.

Выделение вируса инфекционного ринотрахеита (ИРТ)

Проводят в культуре клеток ПЭК, СЭК, ПТ, ТБ (тестикулы бычков),
ЛЭК, ПТ-80, МДВК. Пробирки с монослоем клеток отмывают поддержи-
вающей средой ГЛА и заражают по 0,2-0,3 мл каждым испытуемым мате-
риалом. Для адсорбции вируса пробирки с клетками выдерживают в термо-
стате при 37°С в течение 60-90 минут, а затем из них удаляют испытуемый
материал и добавляют 1 мл поддерживающей среды, содержащей 200 ед/мл
пенициллина и 200 мкг/мл стрептомицина. Для контроля оставляют пять
пробирок, в которых заменяют ростовую среду на поддерживающую. Зара-
женные и контрольные культуры инкубируют при 37°С до 7 суток, еже-
дневно просматривая их с целью выявления ЦПД. Вирус ИРТ вызывает
ЦПД, как правило, через 24-36 часов (рис.91,92 ).
При наличии ЦПД вируса ИРТ на субкультуру клеток почки эмбрио-
на коровы установлено, что первые морфологические изменения в клетках
обнаруживаются уже через 6-9 часов. Отдельные клетки приобретают спо-
собность ярче окрашиваться. Ядрышки в пораженных клетках набухшие и
увеличены в размере. Через 12-18 часов увеличивается количество клеток,
содержащих 2-3 и большее количество ядер.

В ядрах происходит перераспределение хроматина - он распределяет-
ся вдоль ядерной оболочки (маргинация хроматина) и в виде глыбок внутри
ядер. Во многих ядрах отсутствуют ядрышки.

Через 21-24 часа обнаруживаются крупные внутриядерные включе-
ния, занимающие почти все ядро (рис.91). Через 36-48 часов почти все клет-
ки полностью дегенерируют (рис.92). Электронномикроскопически на ульт-
ратонких срезах обнаруживаются скопления вирионов ИРТ в цитоплазме и
межклеточных пространствах (Рис.93).

В культурах клеток, зараженных вирусом ИРТ, митотический индекс
постепенно снижается с 14,8 до 6,6°/оо. Увеличивается количество патологи-
ческих форм митозов.

При отсутствии ЦПД в первых пассажах или слабом его проявлении
проводят три последовательных пассажа. Если ЦПД не обнаруживается,
результаты выделения вируса считают отрицательными. Идентификацию
вируса проводят в реакции нейтрализации.

Нередко встречается ассоциированная инфекция вируса ПГ-3 и ИРТ
(рис 94).

Вирус диареи

Выделение вируса диареи проводят в первично-трипсинизированной
культуре ПЭК, ПТ, ТБ, либо постоянной линии клеток КСТ. Заражение
культур клеток вируссодержащим материалом проводят аналогично опи-
санному при выделении вируса ИРТ. ЦПД вируса диареи выражается в по-
явлении мелкозернистой инфильтрации, округлении и отторжении клеток от
стекла (Рис.95,96). Часто обнаруживают вакуолизацию цитоплазмы пора-
женных клеток. Идентификацию выделенного вируса диареи проводят в
реакции нейтрализации (РН), ИФА.

Аденовирус телят

Выделение аденовируса у телят проводят в культуре клеток ПЭК, ТБ.
Длительность культивирования инфицированных клеток 10-12 дней. Раз-
множение аденовирусов в культуре клеток сопровождается медленным раз-
витием ЦПД. В начале отдельные клетки, а затем группы клеток увеличи-
ваются в обьеме, становятся рефрактерными, приобретают округлую форму,
собираются в конгломераты, похожие на гроздья винограда. ЦПД сопрово-
ждается образованием внутриядерных включений и никогда не приводит к
полному разрушению клеток. При отсутствии ЦПД на протяжении 4-х дней
делают 2-3 слепых пассажа с интервалом 3-4 дня. На третьей пассаже срок
наблюдения удлиняют на 10-15 дней, пока не появится неспецифическая
дегенерация ЦПД, результат считают отрицательным. Идентификацию вы-
деленного вируса проводят в РСК, РДП, РТГА, ИФ.
Коронавирус крупного рогатого скота

In vitro коронавирус культивируется с трудом. Только немногие ли-
нии клеток могут быть использованы для его культивирования. Эти трудно-
сти связаны вероятно с тем, что обладая выраженным тропизмом они при-
способились к размножению в дифференцированных клетках эпителия ки-
шечника. Коронавирус размножается в первично-трипсинизированных
культурах трахеи, щитовидной железы, легких, почки эмбриона коровы, а
также в перевиваемых линиях клеток ЛЭК, МДВК, аденокарцинома прямой
кишки человека (НРТ-18), а также в органных культурах трахеи 1-2 месяч-
ных телят и кишечника эмбриона крупного рогатого скота (КЭК). Однако не
все штаммы коронавируса вызывают цитопатологию. Дальнейшая адапта-
ция этих нецитопатогенных вирусов может привести к появлению цитопа-
тологии в одних клеточных культурах и в персистенции вируса в других.

Отмывание монослоя клеток средой, содержащей трипсин(до 25мкг/мл)
перед заражением усиливает цитопатогенность в 2 раза (Соколова Н.Л.,1993).

У адаптированных штаммов первые признаки ЦПД ( в частности в
культуре МДВК) проявляются через сутки после заражения, наблюдается
разрушение монослоя. Через 48 часов появляются зоны интенсивно окра-
шенных клеток, пикноморфные клетки и бесклеточные пространства. Через
4 суток монослой имеет вид сети, сформированный из групп клеток и цито-
плазматических тяжей. Гемаглютинины обнаруживают в культуральной
жидкости через 6 часов после инфицирования.

При положительной РГАд (реакции гемадсорбции) эритроциты ад-
сорбируются на монослое и образуют характерные скопления в виде цепей,
розеток или отдельных аггрегатов.

На культуре НРТ-18 через 2 часа после заражения единичные эритроци-
ты располагаются равномерно по всему клеточному монослою. Через 24-36
часов после заражения адсорбция эритроцитов нарастает, к 48 часам наблюда-
ется слой адсорбировавшихся эритроцитов по всему клеточному монослою.

Для диагностики коронавирусной инфекции крупного рогатого скота ис-
пользуются реакции РГАд, РГА, РТГА, а также иммунофлюоресцентный метод,
выявляющий локализацию вирусного антигена в инфицированных клетках.

Ринопневмония лошадей ( Герпес вирус 1 типа)

Выделение герпес вируса, вызывающего ринопневмонию лошадей, про-
водят на первичных культурах и субкультурах клеток почки эмбриона лошади
(ПЭЛ), почки жеребенка(ПЖ), тестикуов жеребенка (ТЭЛ), ПЭК, ПТ, ЩС,
СПЭВ, гибридной культуры клеток с лимфоцитами лошади (А4хЛ), внутриви-
довой гибридной культуре со спленоцитами свиньи (А4хС).

Зараженные и контрольные клеточные культуры инкубируют при 37°С
3-4 суток. Первые признаки ЦПД после заражения вирусом герпеса 1-го типа
проявляются через 16-20 часов. Наблюдается округление клеток, образование
многоядерных симпластов, ядра деформированы, пикнотизированы, в них по-
являются внутриядерные включения. Через 72 часа практически все клетки по-
гибают. В частности, на культуре клеток А4хС через сутки наблюдается округ-
ление клеток, образование многоядерных плотных разного размера симпластов,
отслаивание от стекла, разрушение монослоя. Ядра клеток деформированы,
пикнотизированы, в них выявляются внутриядерные включения. Дегенерация
клеток выражалась просветлением ядерного матрикса, фрагментацией хрома-
тина, уменьшением ядрышек и смещением их на край ядра. Через 48 часов мо-
нослой практически разрушается, наблюдается пикноз ядер (Рис.97 а,б).

Для диагностики вируса герпеса 1 типа используются РТГА и РН.

Выделение вируса респираторно-синцитиальной инфекции (PC) про-
водят в первичной культуре клеток, субкультуре ПЭК, ТБ, ТЯ, СЯ, переви-
ваемых линиях ВНК-21,ЛЭК, органных культурах легкого и трахеи крупно-
го рогатого скота.

Характерное для PC вируса цитопатогенное действие - это образование
синцитиев (симпластов). Однако формирование синцития наблюдается далеко
не всегда, характер ЦПД определяется многими факторами - штаммом вируса,
условиями культивирования, типом клеток. Даже в условиях, оптимальных для
формирования симпластов этому образованию часто предшествует образование
округлых клеток. Симпласты имеют чаще веретенообразную форму, распола-
гаются по ходу клеток и отличаются крайней неустойчивостью. Они быстро
распадаются, и на месте остаются гроздья сморщенных темных клеток.

Особенностью PC-вирусной инфекции диплоидных культур является
образование отросчатых веретенообразных гигантских клеток с 40-50 ядра-
ми с эозинофильными включениями в цитоплазме. При иммунофлуорес-
центном исследовании культур клеток находят яркое гранулярное свечение
цитоплазмы, которое наблюдается через 10-24 часа после заражения.

В культуре клеток СЯ вирус PC не вызывает типичных цитоморфоло-
гических изменений, которые характерны для действия этого вируса в дру-
гих чувствительных культурах. В ней более интенсивно происходит дегене-
рация клеток с частичным разрушением монослоя, сопровождавшимся пик-
нотизированием ядер, уплотнением и округлением цитоплазм отдельных
клеток, пораженных вирусом. Через 72-96 часов наблюдается усиление де-
генеративных процессов, отмечается увеличение межклеточных про-
странств, формирование небольших, но уплотненных симпластов (Рис.98),
появляются цитоплазматические включения (рис.99).

Идентификация выделенного вируса проводится в РДП, РСК, РИФ, ИФА.

Парвовирус свиней (ПВС)

Для выделения ПВС используют первичные культуры и субкультуры
клеток ПЭС, почек поросят, ЩС, а также перевиваемые линии клеток ТП,
почки свиньи РК-15, ППЭС, ППК. Культура клеток СПЭВ не чувствительна
к парвовирусу.

Учитывая, что ПВС размножается только в делящихся клетках, зара-
жение вирусом проводят в момент посева или через 24 часа после него. ЦПД
проявляется на 3-5 сутки культивирования. В клетках полностью сформиро-
ванного монослоя ПВС практически не размножается.

ЦПД парвовируса в культурах клеток характеризуется диффузной
зернистостью и округлением клеток, отделением их от стекла и частичным
или полным разрушением монослоя. Полное разрушение монослоя наблю-
дается в том случае, если все делящиеся клетки инфицированы вирусом.
При окраске инфицированной культуры клеток гематоксилинэозином
обнаруживаются внутриядерные тельца включения. Они образуются через
18-24 часа после заражения и распределяются по всему ядру.

Для диагностики парвовируса свиней используют РГА, РТГА..

Вирус трансмиссивного гастроэнтерита свиней (ВТГС)

Выделение коронавируса свиней, возбудителя ТГС проводят в основном
в культуре клеток свинного происхождения ПЭК, СПЭВ, ТП, ЩС, ЩЖС,
КЩС, монослойных и органных культурах кишечника плода свиньи (КЭС),
внутривидовой гибридной культуре АдхС. Кроме того, возможно выделение
вируса в гетерогенных культурах - почки крольчонка (ПК), ПЭК, почки собаки.

Зараженные и контрольные клеточные культуры инкубируют при
температуре 37°С до 4 суток, ежедневно просматривая под микроскопом
для выявления ЦПД. Полная гибель клеток наступает на 3-4 сутки культи-
вирования. При отсутствии ЦПД в первом пассаже или слабом его проявле-
нии проводят 2-3 последовательных пассажа.

Цитопатогенное действие вируса ТГС свиней в культуре клеток от-
четливо выражено через 18-24 часа после заражения. Цитоплазма клеток
уменьшается, нарушаются межклеточные связи. Это приводит к разрыхле-
нию монослоя. В ядрах наблюдается перераспределение и образование глы-
бок хроматина. Прекращается размножение клеток (Рис. 100).

Через 48 часов монослой значительно нарушается, в нем образуются
пустоты «окна» за счет отторжения клеток от стекла, 50-60% клеток имеют
округлую форму. В округлившихся клетках, параллельно с изменениями
хроматина ядра, наступают изменения в цитоплазме. В цитоплазме появля-
ется зернистость, наблюдается разрушение ядра. Клетки приобретают вид
пустого сморщенного шара.

Через 72 часа наблюдается незначительное количество клеток, закре-
пленных на стекле, лежащих изолированно друг от друга, округлой формы с
патологически измененными ядром и цитоплазмой (рис. 101).

Для выявления вируса ТГС используют РН, ИФА.

Цитопатологические изменения, наблюдаемые в культурах клеток,
зараженных вирусами, хламидиями, либо возникающие в процессе старения
клеток при длительном культивировании без пересева, или под действием
химических веществ, в соответствии с современными представлениями об-
щей патологии клеток могут быть охарактеризованы как апоптоз, некроз
или цитотоксичность.

Учитывая недостаточное количество публикаций по этому вопросу в
научной литературе на русском языке, особенно применительно к патологии
клетки в культуре, считаем необходимым дать описание понятий этих тер-
минов (см. также раздел ’’терминология”).

Апоптоз характеризуется, как запрограммированный процесс смерти кле-
ток. Апоптоз занимает ведущее место в эмбриогенезе и инволюции тканей, в под-
держании клеточного баланса в физиологических условиях и при удалении кле-
ток с генетическими повреждениями, при лучевых поражениях, росте и терми-
нальной дифференцировке. Он запрограммирован в развитии, включая рождение
и старость, здоровье и болезнь. Следовательно, он проявляется в нормальном кле-
точном развитии, гибели клеток, вызванной проявлением иммунной толерантно-
сти, при развитии нервной системы и эндокринно-зависимой тканевой атрофии.
Изменения по типу апоптоза проявляются характерной аггрегацией хроматина,
конденсацией ядра и цитоплазмы. В ядре и цитоплазме появляются мембраноок-
руженные структуры (апоптические тела), которые содержат рибосомы, морфо-
логически интактные митохондрии и ядерный материал.

Ряд вирусов, например герпесвирусы, вирус классической чумы сви-
ней и ряд других проникая в клетки и развиваясь в них, вызывают измене-
ния по типу апоптоза. По такому же типу могут изменяться клетки при мас-
совом культивировании в суспензии под влиянием стрессовых воздействий.

Некроз рассматривается как патологическая гибель клеток, когда клетки
подвергаются сильным физическим или химическим воздействиям, в частности
так погибают клетки от ряда цитолитических вирусов, например от вируса ящура.

Изменения по типу некроза характеризуются набуханием клетки и ее ли-
зисом, потерей целостности плазматической мембраны, разбуханием и дезинте-
грацией органелл, флюктуацией хроматина, фрагментацией ДНК и др.

Сравнение изменений по типу апоптоза и некроза приводятся на рис.
102, и табл. 44.

Таблица 44

Морфологические, биохимические показатели (изменения) в клетках
при апоптозе и некрозе.

Апоптоз	Некроз
Морфологические показатели (признаки)	
- Мембрана набухает (пузырится), не нару- шается её целостность	- Потеря целостности мембраны
- Аггрегация хроматина около ядерной мембраны	- Флоккуляция хроматина
- Конденсация клеток (клетка сжимается)	- Набухание клетки и лизис
- Образование окруженных мембранами пу- зырьков (апоптозные тела)	- Дезинтеграция (распухание органелл)
- Нет дезинтеграции органелл: органеллы остаются интактными	- Не образуется везикул, полный лизис
Биологические показатели	
- Усиление регуляторных процессов, вклю- чающие активацию и ферментные реакции	- Потеря регуляции ионного гомеостаза
- АТФ-зависимая энергия (активный процесс не наблюдается при 4°С)	- Отсутствие регуляции энергии (пас- сивный процесс, наблюдается при 4°С)
- Небеспорядочная моно- и олиго-нуклеосомаль- ная фрагментация ДНК по д лине (увеличение числа полос после гель-электорфореза в агарозе)	- Беспорядочное разрушение ДНК (пятно ДНК после гель-электорфореза в агарозе)
- Долитическая фрагментация ДНК (= раньше клеточной смерти)	- Постлитическая фрагментация ДНК (= происходит даже после смерти)
Физиологическое значение	
- Смерть одиночных, отдельных клеток	- Смерть групп клеток
- Включение физиологического стимулирования	- Возникают нефизиологические нарушения
- Фагоцитоз примыкающими клетками или макрофагами	- Фагоцитоз макрофагами
- Не наблюдается воспалительной реакции	- Значительный воспалительный ответ
НЕКРОЗ

Раэр ушение

АПОПТОЗ

ный НРКРОЭ.

Рис. 102. Сравнение изменений по типу апоптоза и некроза

Цитотоксичность гибель клеток, когда не включаются естественные
механизмы клеточной смерти. Это простое, убивающее клетки действие хими-
ческих компонентов или клеточных медиаторов, таких как цитотоксичность
клеток. В частности по этому типу происходит разрушение инфицированных,
мутантных и др. клеток клетками иммунной системы :Т-клетки, NK-клетки (на-
туральные киллеры), клетки, активированные лимфокинами (LAK).

При этом возможны два цитоцидных механизма:

1.	Апоптический механизм, при котором эффекторные клетки дейст-
вуют на аутолитические процессы, характеризующиеся долитической фраг-
ментацией геномной ДНК.

2.	Литический механизм, в котором литические молекулы, такие на-
пример, как перфорин секретируются эффекторными клетками в межкле-
точное пространство и вызывает литические поры в клеточной мембране.

Оба механизма могут действовать комплементарно, т.е. одновременно.

Предложены методы изучения клеточной смерти в популяциях кле-
ток, основанные на исследовании изменений ДНК, ферментов клетки, дина-
мике процесса, в частности, изучение роли нового класса протеаз - каспаз
(caspase) и других механизмов.
Изложение этих методов и процессов является предметом специаль-
ного рассмотрения, что не позволяет сделать объем настоящей книги.

Определение титра вируса и его титрование

Морфологические критерии цитопатогенного действия вирусов дают ос-
нования для предварительного определения их присутствия в исследуемом мате-
риале и по характерным изменениям ориентировочно установить группу вирусов.

Определение титравируса и его титрование. Для типирования и опреде-
ления титра вируса обычно используют культуральную жидкость первично
зараженных культур. Неразведенную или разведенную в 10 раз культуральную
жидкость смешивают с равным объемом типовой иммунной сыворотки, разве-
денной 1:5 или 1:10, смесь оставляют на 1-1,5 часа при комнатной температуре
и после этого вносят к клеточные культуры. На одну пробу используют 4 про-
бирки с монослойной культурой, вносят в каждую пробирку по 0,2 мл смеси и
0,8 мл под держивающей среды. Ставят два контроля: 1 - 4 пробирки заражают по
0,1 мл выделенного вируса в исследуемом разведении и в каждую пробирку
добавляют по 0,9 мл поддерживающей среды; 2- 4 пробирки с той же культурой
заражают смесью вируса и нормальной сыворотки. Все пробирки инкубируют в
стационарном положении под углом 5° при температуре 37°С и ежедневно про-
сматривают в течение недели до появления дегенеративных изменений. Тормо-
жение ЦПД в присутствии одной из типовых сывороток указывает на тип выде-
ленного вируса. Если ни одна из иммунных сывороток не дает подавление ЦПД
вируса, то возможно, во-первых, что выделенный агент не принадлежит к из-
вестным типам и штаммам вируса, или, во-вторых, что выделенный вирус, со-
держащийся в культуральной жидкости, имеет очень высокий титр. В послед-
нем случае необходимо протитровать вирус и повторно провести типирование
со 100 ТЦД50 (тканевая цитопатическая доза), после чего делают вывод о приро-
де выделенного вируса. Титрование вируса проводят с целью количественного
определения содержания его в патологическом материале, определения его ви-
рулентности, подбора точных доз вируса в опыт, количественного определения
антител при постановке РН.

Титрование вируса состоит из 4 последующих этапов:

1) приготовление и отбор культур со сплошным монослоем клеток; 2)
приготовление 10-кратного разведения вируса 3) заражение культур разны-
ми разведениями вируса; 4) учет результатов титрования вируссодержащей
суспензии (10-кратное разведение) или культуральной жидкости на поддер-
живающей среде без сыворотки (pH 7,4-7,5), общепринятым методом.

На каждое разведение вируса обычно используют по 4 пробирки с куль-
турой клеток. Предварительно из отобранных пробирок сливают питательную
ростовую среду. Культуру в пробирках промывают поддерживаюжей средой,
затем в каждую пробирку вносят по 0,1 мл разведенного вируса и 0,9 мл пита-
тельной среды без сыворотки. В первом случае титр вируса устанавливают в 1
мл, во втором - 0,1 мл. На пробирках с зараженным моиослоем указывается
номер исследуемого материала (числитель) и разведения вируса (знаменатель).
Пробирки складывают в специальные лотки в горизонтальном положении (под
ут лом 5°) и инкубируют при 37°С. Одновременно ставят контроль - культуру
тканей с поддерживающей средой. На противоположной стороне пробирки от
культуры делается пометка карандашом по стеклу. При укладывании пробирок
в лоток отметка должна быть сверху пробирки. В этом случае поддерживающая
среда будет покрывать клеточную культуру.

Через 24 часа проводят первый учет результатов титрования. Каждую
пробирку просматривают под малым увеличением (об.10,ок.7х) микроскопа
и определяют ЦПД вируса (условно в крестах).

Степень дегенеративных изменений клеток в зараженной культуре
условно оценивают крестами. Деструкцию всех клеток в пробирке обозна-
чают ++++, большей части клеток +++, половины клеток ++, меньше поло-
вины клеток +, отдельных клеток +-, отсутствие дегенерации -.

Результаты титрования вируса считают положительными, когда в кон-
трольной, т.е. незараженной культуре, дегенеративные изменения клеток не на-
блюдаются. За титр вируса принимают его наибольшее разведение, которое вы-
зывает дегенерацию 50% культур. Титр вируса выражают количеством тканевых
цитопатических доз в 2 мл, вычисляют его по методу Рида и Менча. (1938).

В 1955 г. комитет экспертов по полиемиелиту ВОЗа рекомендовал при
вычислении ТЦД 50/мл использовать метод Рида и Менча. Его сущность сво-
дится к предложению, что в культурах клеток, в которых вирус вызывает ЦПД
после заражения небольшими дозами, ЦПД должно обязательно проявиться при
инфицировании их более концентрированными разведениями вируса, и наобо-
рот, в клеточных культурах, оставшихся без изменений после заражения наи-
большими разведениями вируса, ЦПД не будет проявляться, если их инфициро-
вать еще меньшими дозами вируса. При этом принимают во внимание не толь-
ко количество пробирок с культурой, в которых вызвано ЦПД или оно отсутст-
вует в них при введении данного разведения вируса, но и те, в которые внесены
все испытывавшиеся в данном опыте разведения.

Принцип кумуляции позволяет увеличить число подопытных объектов и
тем самым повышает точность эксперимента. ЕД50- доза вируса, которая дает
50% эффект. Интервалы между испытуемыми дозами должны быть одинако-
выми. Вычисление ЕД50 из кумулятивных данных производится только в том
случае, если они имеют симметричное расположение относительно 50%. На-
пример, когда испытуемые разведения вызывали дегенерацию культуры от 0 до
100% (50+50%), от 10 до 90% (50+-40%) или от 20 до 80% (50+30%). Дозы, рас-
полагающиеся не симметрично, учитывать не следует.

Значение ЕД50 по методу Рида и Менча определяют прямолинейной ин-
терполяцией. Интерполирование проводят между двумя дозами, которые вызы-
вают эффект наиболее близкий к 50%. Одна из них должна обуславливать эффект
более 50% (доза В), другая меньше 50% (доза А). Расчет производят по формуле:

В-50 л

1ёЕД5о = 1ёВ +----- xd

в-а

где В - доза, дающая эффект больше 50%; в - эффект дозы В, %; а - эффект
дозы А,%; d - интервал между логарифмами двух соседних доз.
Разберем на примере расчет ЕД50.

Протокол титрования вируса ящура в однослойной культуре клеток СПЭВ.

Штамм	№ про- бирок	Разведение вируса						
		10'2	10'3	10“	10‘5	1(У6	10'7	10“
А22	1	++++	++++	++++	++++	++++	++++	0
	2	++++	++++	++++	++++	++++	0	0
663	3	++++	++++	++++	++++	++++	0	0
	4	++++	++++	++++	++++	0	0	0

Обозначение: ++++ - полное разрушение клеток; 0 - клетки нормальные, без изменений.

Представлены результаты титрования вируса ящура А22 шт.663 в од-
нослойной культуре клеток СПЭВ. Вирус разводили на среде 199 без сыво-
ротки и вносили в каждую пробирку по 1 мл. Результаты учитывали на 5-й
день. Как видно из данных таблицы, вирус в разведении 10‘2; 10‘3; 10‘4; 10'5
вызывал разрушение культуры во всех пробирках. После введения вируса в
разведении 10'6 ЦПД отмечали в 3 пробирках из 4; при введении вируса в
разведении 10‘7 дегенерацию клеток наблюдали лишь в одном случае.

Рассмотрим, в какой мере данные приведенного опыта удовлетворя-
ют требованиям, которые должны соблюдаться при расчетах по методу Рида
и Менча. Интервалы между логарифмами во всех случаях составляют еди-
ницу, каждое разведение вируса вносят в 4 пробирки с клеточной культурой.
Следовательно, первые два из трех условий соблюдены. Для выполнения
третьего условия отбрасываем разведения 10‘2; 10 "3; 10'4 Оставшиеся дозы
вызывают дегенерацию в 100, 75, 25 и 0% случаев. Иными словами, их эф-
фекты расположены симметрично по отношению к 50% , что дает право
провести расчеты по методу Рида и Менча. Вычисляем кумулятивные дан-
ные для каждой испытанной дозы вируса (таблица 45).

Таблица 45

Обработка результатов титрования вируса ящура
в культуре клеток по методу Рида и Менча

Раз- веде- ние виру- са	Число нор- маль- ных куль- тур	Число культур, разру- шенных вирусом	% куль- тур с дегене- рацией клеток	Кумулятивные данные		Отношение числа деге- нер культур к общему числу зара- женных	% куль- тур в деге- нерац. клеток
				Число нор- мальных культур	Число культур с дегенера- цией кле- ток		
10“	0	4	100	-	-	-	-
10’3	0	4	100	-	-	-	-
10“	0	4	100	-	-	-	-
ю5”	0	4	100	0	8	8:8	100
10'6	1	3	75	1	4	4:5	80
10'7	3	1	25	4	1	1:5	20
10 s	4	0	0	8	0	0:8	0

В разведении 10'8 кумулятивное значение летальности, т.е. число
пробирок с разрушенной вирусом клеточной культурой будет равно 0. При
испытании указанного разведения использовано 4 пробирки с нормальной
культурой. Однако к ним следует прибавить 3 пробирки, в которых клетки
не разрушены после добавления вируса в разведении 10'7, и 1 пробирку, в
которой клетки не разрушены после добавления вируса в разведении 10‘6
Таким образом, предполагая, что культуры, не разрушенные большими до-
зами вируса, не будут инфицированы при внесении меньших количеств ин-
фекционного материала, определяем кумулятивное число пробирок с нор-
мальными клетками для разведения 10 8 Рассуждая аналогичным образом,
устанавливаем, что для дозы 10‘7 число пробирок, в которых клетки не раз-
рушены после добавления вируса, составляет 4, для дозы 10‘6 - 1.

При определении кумулятивного значения летальности к общему числу
пробирок с разрушенной культурой ткани после заражения данной дозой следует
прибавить пробирки с культурой ткани, в которых наблюдали дегенерацию после
внесения меньших доз. Так к 4 пробиркам с клетками, дегенерированными после
инокуляции вирусом в разведении 10‘5 мы должны прибавить 3 пробирки с раз-
рушенными клетками при испытании разведения 106 и 1 пробирку, в которой
был отмечен цитопатогенный эффект после внесения вируса в разведении 10‘7

Таким образом, кумулятивное число пробирок с пораженными клетками
для разведения 10‘5 равнялось 8. На основании полученных кумулятивных дан-
ных определяем кумулятивный процент летальности к сумме кумулятивной ле-
тальности и выживаемости. Полученная величина должна быть умножена на 100.
Для разведения 10‘5 кумулятивная летальность равна 8, выживаемость 0, их сумма
8. Процент кумулятивной летальности для указанной среды равняется:

8

--------х 100= 100

0 + 8

Для разведения 10"6 процент летальности составляет 80, для дозы 10‘7 - 20,
для дозы 10‘8 - 0. По-видимому, доза, вызывающая дегенерацию в 50% заражен-
ных пробирках с клетками, находится между разведением Ю'6 и 10*7 ТЦЩо,
Определяем по формуле:

80-50

Ig ТЦД 50 = Ig 106 +---- х(-1);

80-20

Ig ТЦД50 = - 6,5.

Таким образом, для исследуемого штамма вируса ящура А22 шт. 663
50% цитопатогенная доза равна 10-6,5 Учитывая, что объем каждого испы-
танного разведения составляет 1 мл, легко вычислить концентрацию вируса
в не разведенном материале. Она равняется 106,5 ТЦД 50 в 1 мл

Когда вирус титруется в объеме меньше, чем (0,1; 0,25; 0,3 мл и т.д.),
это необходимо учитывать при определении содержания вируса в исходном
материале. Так, если титр равен 10‘5,9, а культуру ткани заражали 0,2 мл ин-
фекционного материала, то конечная концентрация вируса будет равна 10‘5’9
х 5 в 1 мл. Путем логарифмирования приходим к более простому выраже-
нию: 5 х 105’9 =0,64 +5,9. Таким образом, в I мл содержится 10 6,54 ТЦД50.
При необходимости можно определить абсолютное число ТЦД50. По табли-
це антилогарифмов находим интересующую нас величину. Для конкретного
примера она составляет 3890000 ТЦД 50/мл.
Постановка реакции гемаглютинации (РГА)

Для обнаружения антигена в фекалиях и в органах и тканях павших
животных и вирусов в зараженной культуре клеток применяют РГА, кото-
рую ставят в микро- (0,025 мл -1 капля) и макро- (0,25 мл)- модификациях
при комнатной температуре. Для этого во все лунки панели из прибора То-
качи или Титертека вносят по 0,025 мл (1 капля) ФБР и делают двукратные
разведения исследуемого материала. Затем во все лунки вносят по 1 капле
0,5% суспензии эритроцитов.

Учет реакции проводят через час после оседания эритроцитов в кон-
трольных лунках, которые содержат 1 каплю ФБР и 1 каплю 0,5% суспензии
эритроцитоов. Учет проводят по четырехбальной системе:

++++ эритроциты оседают в виде зонтика с неровными зубцами;

+++ зонтика не образуется, эритроциты находятся в виде хлопьев;

++ эритроциты в виде хлопьев оседают на дно лунки

+	на дне лунки образуется диск,окруженный хлопьями эритроцитов;

эритроциты оседают на дно в виде диска с ровными краями.

За гемаглютинирующий титр вируса принимают наибольшее его раз-
ведение, которое вызывает аглютинацию эритроцитов не меньше чем на ++.

Если титр гемаглютининов в исследуемом материале составляет 1:32
и выше, то для подтверждения специфичности реакции (т.е. принадлежно-
сти гемаглютининов к определенному вирусу) ставят РТГА со специфиче-
ской сывороткой. Для этого в первый ряд лунок панели вносят по 1 капле
ФБР, а во второй -по 1 капле специфической гипериммунной сыворотки,
разведенной 1:10 ФБР. Затем в обоих рядах лунок готовят двукратные раз-
ведения испытуемого антигена. Через час контакта испытуемого материала
с гипериммунной сывороткой и ФБР, во все лунки обоих рядов панели раз-
ливают по 1 капле 0,5% суспензии эритроцитов.

Реакцию учитывают через час. Реакция считается положительной,
если специфическая сыворотка тормозит гемаглютинацию исследуемого
материала не меньше чем на 16 АЕ, т.е. если титр гемаглютининов в первом
ряду составил 1:128, то во втором ряду он должен быть не выше 1:8.

Постановка реакции гемадсорбции (РГАд)

РГАд ставят с 0,5% суспензией эритроцитов мышей или крыс, приго-
товленных на ФБР. Поддерживающую среду в пробирках с зараженной
культурой клеток не менее чем через 72 часа после заражения вирусом за-
меняют равным объемом суспензии эритроцитов и инкубируют в термостате
в течение 1 часа. Затем монослой трижды отмывают раствором Хенкса (или
ФБР) и исследуют под микроскопом. Результаты РГАд учитывают по 4-х
крестной системе. Положительной считается гемадсорбция, учтенная не
ниже чем на ++ при отрицательном результате в контроле. Контролем слу-
жит незараженная культура клеток обработанная как указано выше.

Подготовка препаратов для индикации коронавируса КРС в ин-
фицированной культуре клеток методом иммунофлуоресценции

Культуру клеток ПЭК или перевиваемой линии аденокарциномы прямой
кишки человека (HRT), выращенные на предметных стеклах промывают рас-
твором Хенкса, вносят в каждую пробирку по 0,3 мл испытуемого материала,
проводят адсорбцию в течение 1 часа при 37°С, после чего добавляют 1,7 мл
поддерживающей среды Игла (или ГЛА) и инкубируют в течение 48-72 часов
при тех же условиях. По истечении указанного времени предметные стекла вы-
нимают из пробирок, промывают в 2-3 сменах ФБР, фиксируют ацетоном в те-
чение 10 минут при 4°С. Допускается хранение фиксированных препаратов в
морозильной камере бытового холодильника в течение месяца.

Для подтверждения иммунологической специфичности используют
следующие контроли:

•	неинфицированная культура клеток, обработанная нормальной, им-
мунной и люминесцентной сыворотками;

•	инфицированная культура клеток, обработанная гетерологичными
сыворотками;

•	инкубация препаратов непосредственно с люминисцирующей сыво-
роткой, минуя инкубацию их с иммунной сывороткой.

При исследовании инфицированной суспензионной культуры клеток на
тщательно обезжиренных предметных стеклах готовят мазки, подсушивают на
воздухе, фиксируют в течение 10 минут в охлажденном до 4°С ацетоне, пропола-
скивают в ФБР pH 7,2-7,4 и затем исследуют в реакции иммунофлуоресценции.

Реакция связывания комплемента (РСК)

РСК широко применяют при диагностике ящура, вирусной диареи
крупного рогатого скота, аденовирусной инфекции, гриппа и др. В основе
реакции лежит связывание комплемента специфическим комплексом анти-
ген + антитело, об отсутствии свободного комплемента в этой системе судят
по задержке гемолиза эритроцитов в индикаторной системе.

В РСК участвуют 2 системы: исследуемая (исследуемый антиген +
стандартная диагностическая сыворотка) и индикаторная, или гемолитиче-
ская (гемолитическая сыворотка + взвесь эритроцитов барана). Связующим
компонентом между этими системами является комплемент. Эритроциты
подвергаются гемолизу только в присутствии комплемента.

Если исследуемый антиген гомологичен антителам, то образуется ком-
плекс антиген + антитело и комплемент ими связан. В результате отсутствия сво-
бодного комплемента эритроциты не могут быть лизированы и будет задержка
гемолиза (эритроциты находятся во взвеси - жидкость мутная, красного цвета).
Если антиген не гомологичен антителам, комплекс не образуется и при наличии
свободного комплемента наблюдается полный гемолиз эритроцитов (лизис эрит-
роцитов - жидкость прозрачная, красного цвета). Между этими двумя крайними
результатами может быть задержка гемолиза разной степени выраженности.

РСК применяют для обнаружения и идентификации антигена (вируса)
в исследуемом материале, а также для выявления и титрования антител в
сыворотке крови.

Для постановки РСК необходимы следующие компоненты: стандартные
специфические сыворотки, стандартные специфические антигены, гемолизин,
(гемолитическая сыворотка), комплемент, исследуемый материал (антиген или
сыворотки), эритроциты барана (2-3%. взвесь), 0.85% раствор NaCl.
Условием получения точных и сравнимых результатов является ис-
пользование в реакции стандартных компонентов. В значительной степени
это требование удовлетворяется биопромышленностью, выпускающей пер-
вые 4 компонента из указанных выше. Несмотря на то, что эти компоненты
имеют точное обозначение активности и срока годности, в условиях лабора-
тории рекомендуется периодически проверять их пригодность в РСК.

Иммуноферментный метод

Суть метода та же, что и при реакции иммунофлуоресценции (РИФ),
с тем отличием, что специфические антитела конъюганта мечены фермен-
том (пероксидазой из хрена или щелочной фосфотазой). Здесь, так же как
при РИФ, применяют 2 способа: прямой и непрямой.

Вирусные антигены в мазках, гистосрезах или инфицированных клеточ-
ных культурах по "прямому способу" обнаруживают следующим образом:

1)	препарат промывают фосфатно-буферным солевым раствором и фикси-
руют в спирте (30 минут) или ацетоне (10 минут) при комнатной температуре;

2)	препарат высушивают на воздухе, наносят 2-3 капли пероксидазно-
го конъюгата (антитела, меченые пероксидазой) и помещают во влажную
камеру при t - 37°С на 1-6 часов;

3)	препарат тщательно промывают фосфатно-буферным солевым рас-
твором, затем дистиллированной водой и высушивают на воздухе;

4)	наносят на препарат несколько капель бензидинового субстрата
для обнаружения пероксидазы;

5)	через 5-10 минут препарат промывают и просматривают под обыч-
ным микроскопом.

Бензидиновый субстрат состоит из хлористого аммония, раствора
ЭДТА, раствора бензидина и перекиси водорода.

Бензидин в присутствии прероксидазы и перекиси водорода окисля-
ется и возникший продукт реакции - осадок окисленного бензидина - имеет
голубовато-коричневый цвет и виден под обычным микроскопом. При "не-
прямом способе" используют конъюгант против гамма- глобулинов, кото-
рые были связаны с антигеном в первой фазе реакции.

Большим преимуществом этих способов при рутинных исследованиях яв-
ляется возможность просмотра препаратов под обычным микроскопом. Однако
обнаружение вирусного антигена в мазках и гистосрезах несколько ограничено из
за наличия эндогенной пероксидазы, которая дает довольно интенсивное фоновое
окрашивание, что может привести к получению ложноположительиых результа-
тов. Для инактивирования эндогенной пероксидазы используют азид натрия, фе-
нилгидрозин. Этот цитохимический метод является качественным.

Реакция непрямой гемагглютинации (РИГА)

Целый ряд вирусов, адсорбируясь на эритроцитах, не вызывает агг-
лютинацию. Гемагглютинация в этом случае наступает лишь при смешива-
нии предварительно «нагруженных» вирусом (антигеном) эритроцитов со
специфической для него сывороткой. Этод метод гемагглютинации в отли-
чие от реакции гемагглютинации Херста получил название реакции непря-
мой, или пассивной, гемагглютинации.
Впервые эту реакцию разработали А.К.Кравченко и М.И.Соколов
(1945) для обнаружения антигенов бактерий. С вирусными антигенами
РИГА впервые описали Бернет и Андерсен (1946). Дальнейшее развитие
этот метод получил после работ Бойдена (1951), предложившего использо-
вать в этой реакции эритроциты, обработанные танином.

В настоящее время РИГА применяют для диагностики аденовирусной
инфекции, заболеваний, вызываемых корона-, арбо-, герпесвирусами, парва-
вирусами и др. По наблюдениям ряда авторов, РИГА наиболее чувствитель-
на и позволяет выявить малое количество антител.

В основу РИГА положена адсорбция антигенов на поверхности эрит-
роцитов и последующая их гемагглютинация гомологичными к антигену
антителами.

Методика постановки РИГА включает следующие основные этапы:
приготовление взвеси эритроцитов; обработку их формалином, акролеином или
глютаральдегидом для их стабилизации; танизацию эритроцитов (танизирован-
ные эритроциты приобретают свойство необратимо адсорбировать на поверх-
ности белки, в том числе и вирусные); сенсибилизацию эритроцитов вирусом и
постановку главного опыта. Обычно в производственных лабораториях ставят
главный опыт, а все предыдущие этапы (приготовление сенсибилизированных
эритроцитов) проводят на предприятиях биологической промышленности.

Для приготовления эритроцитарного диагностикума (сенсибили-
зированных эритроцитов) чаще используют эритроциты барана или че-
ловека группыО, которые обрабатывают по специальной методике (соответ-
ствующей виду вируса).

Так, аденовирусный эритроцитарный диагностикум готовят следующим
образом: отмытые эритроциты (50%-ной концентрации) соединяют с равным
объемом 50%.-ного раствора формалина и после 2-часового контакта при 37°С
периодическим встряхиванием эритроциты 3-х кратно отмывают 0,15 М рас-
твором NaCl - (pH 7, 2). Танизацию формалинизированных эритроцитов осуще-
ствляют путем смешивания равных объемов 3 % взвеси эритроцитов и раствора
танина (1:20000). После 10-15 мин. контакта при 137°С смесь центрифугируют,
осадок трехкратно промывают фосфатным буфером (pH 7,2). Для сенсибилиза-
ции формализированные танизированные эритроциты (pH 6,4) смешивают с
равным объемом вируссодержащей жидкости. Смесь выдерживают в течении
60 минут при t 37°С, периодически встряхивая, затем центрифугируют и 2-3
раза отмывают 0,15 М раствором фосфатного буфера. Осадок отмытых сенси-
билизированных эритроцитов разводят до 1 % концентрации в фосфатном бу-
ферном растворе (pH 7,2), содержащем 1% нормальной кроличьей сыворотки.
Полученные таким образом эритроцитарные антигены используют в РИГА.

Реакцию непрямой гемагглютинации ставят в пробирках или лунках
пластин из оргстекла. Для этого исследуемые и контрольные сыворотки раз-
водят двукратно в объеме 0,5 мл на физиологическом растворе (pH 7,2-7,4),
содержащем 1 % нормальной сыворотки кролика, к каждому разведению
сыворотки добавляют по 0,1 мл эритроцитарного антигена. Смесь встряхи-
вают и выдерживают при комнатной температуре. Учитывают реакцию че-
рез 3-5 часов по осаждению эритроцитов в контроле.
Опыт сопровождают следующим контролем:

1)	на спонтанную гемагглютинацию эритроцитарного антигена (сен-
сибилизированные эритроциты + физиологический раствор с 1 %, кроличь-
ей сыворотки);

2)	на отсутствие в сыворотках неспецифических гемагглютининов
(исследуемые сыворотки + несенсибилиэированные эритроциты);

3)	на активность сенсибилизированных эритроцитов (сенсибили-
зированные эритроциты + положительная сыворотка);

4)	на специфичность сенсибилизированных эритроцитов (сенси-
билизированные эритроциты + нормальная сыворотка или другая негомоло-
гичная для данного антигена сыворотка).

При положительной реакции эритроциты равномерно распределяются
по дну пробирки или лунки в виде зонтика, а при отрицательной оседают в
виде компактного осадка или колечка в центре лунки. Достоверные резуль-
таты получают при отсутствии гемагглютинации с нормальными эритроци-
тами с заведомо отрицательной сывороткой, при положительной реакции с
заведомо положительной сывороткой.

За титр антител в сыворотке принимают наибольшее ее разведение,
которое вызывает аглютинацию сенсибилизированных эритроцитов.

Литература

1.	Аспанидзе Б.П. Первичные и диплоидные культуры клеток легкого плода коровы для
вирусологических исследований. Дисс...канд.вет. наук,М.,1987.

2.	Гомбусуренгийн Т. Цитопатогенное действие вируса парагриппа-3, РС-инфскции и вируса
висна-меди овец на гомологичные культуры. Автореферат дис...канд.вет.наук,М.,1990.

3.	Данишевский Д.А. Цитопатогенное действие вирусов ИРТ И ПГ-3 крупного рогатого
скота в культуре клеток. Дисс... канд. вет.наук, М.,1981.

4.	Дьяконов Л.П.,Глухов В.Ф..Поздняков А.А. и др. Культивирование клеток и тканей
животных. Ставрополь,ч.1,1986,96 с.; ч.2.1988,96с.

5.	Орлянкин Б.Г Диагностика и специфическая профилактика парвовирусной болезни
свиней. Автореферат докт.дисс....,М.,1988.

6.	Соколова Н.Л. Коронавирусный энтерит телят (лабораторная диагностика и специфи-
ческая профилактика). Автореферат докт. дисс..., 1993.

7.	Сюрин В.Н.,Самуйленко А.Я.,Соловьев Б.В.,Фомин Н.В. Вирусные болезни живот-
ных, М.,ВНИИГ и т, 1998,927 с.

8.	Сюрин В.Н, Белоусова Р.В., Фомина Н.В. Ветеринарная вирусология,-М.,” Колос”, 1984.

9.	Филатов В.А., Лобунцова Д.В., Гололобова М.Т., Выделение вируса . трансмиссивно-
го гастроэнтерита в клеточных культурах. Бюлл.ВИЭВ,. 1982,46,стр. 11-13.

10.	Методические указания по применению перевиваемых клеточных культур для диаг-
ностики вирусных заболеваний сельскохозяйственных животных. Утверждено Глав-
ным управлением ветеринарии Госагропрома СССР, 12 октября 1987 г., №432-3.

11.	Применение полимеразной цепной реакции для диагностики заболевания животных. Ме-
тодические указания по диагностике заболеваний сельскохозяйственных животных мето-
дом полимеразной цепной реакции. Под редакцией члена-корреспондента РАСХН, про-
фессора А А.Гусева и члена-корреспондента РАСХН, профессора А.Н.Панина. Допущена
Департаментом ветеринарии Министерства сельского хозяйства и продовольствия РФ в
качестве пособия для работников ветеринарных диагностических лабораторий. М.,1988.
Глава 23. Терминология

Аберрации хромосом (хромосомные аберрации) патологические изме-
нения хромосом, часто наблюдаемые при воздействии радиации, химических
веществ и вирусов.

Абсолютная эффективность посева (абсолютная эффективность клонооб-
разования) - процент клеток, образующих колонии после посевов в культураль-
ные сосуды; следует указать общее число клеток в инокуляте, тип культураль-
ного сосуда и условия культивирования (культуральная жидкость, температура,
содержание газов в газовой фазе и т.д.).

Авторадиография - см. Радиоавтография

Агаровая культура культура, в которой поддерживающим субстратом
является агар. Имеются следующие виды агаровых культур: культуры на твер-
дом агаре, культуры на мягком (полутвердом, полужидком) агаре, двухслойные
агаровые культуры.

Адипоцитная Колониеобразующая "Единица" (А-КОЕ) - клетка костного
мозга, образующая колонию адипоцитов.

Адаптация приспособление; имеется в виду приспособление клеток к
существованию вне организма; высоко адаптированными являются клетки по-
стоянных линий.

Адгезия - способность клеток культуры прикрепляться к твердому суб-
стату (например, к стеклу).

Аксеничная - полностью свободная от взаимосвязи с другими организмами.

Аксенная культура - культура без примеси нежелательных живых форм.
Аксенная культура может считаться таковой и при немедленном совместном
культивировании эмбрй&нов, целых организмов, эксплантатов или клеток.

Аллосомы - хромосомы, отличающиеся от остальных хромосом (аутосом)
набором по величине, форме, поведению; в настоящее время аллосомами часто
называют половые хромосомы.

Аминопептид - ферментативный гидролизат белков крови; готовится из
цельной крови крупного рогатого скота.

Анафаза третья стадия митоза, на которой происходит расхождение
хромосом к полюсам.

Анеуплоиды - клетки с увеличенным или уменьшенным, не кратным гап-
лоидному, числом хромосом; при классификации анеуплоидных хромосом ис-
пользуются приставки "гипо" и "гипер"

Анеуплоидная клеточная линия (анеуплоидная линия) - линия, не менее
75% клеток которой содержит число хромосом, отклоняющееся от основного
числа (х) или точного кратного от х.

Аппарат митотический - совокупность структур, носящих название "хромати-
новых" фигур; митотический аппарат может быть изолирован из клетки при помощи
детергентов (дигитонин и др). К ахроматической части аппарата относятся: веретено,
звезды центросомы, центриоль; а к хроматиновой фигуре - хромосомы.

Апоптоз - способ клеточной смерти, который наблюдается в естественных
физиологических условиях, в развитии клеток, в эмбриогенезе, в развитии нервной
системы и эндокриннозависимой тканевой атрофии, а также при патологии.

Асептическая культура - культура, в которой отсутствуют грибы, бакте-
рии, вирусы, микоплазмы и другие микроорганизмы.
Аутотрофная клетка клетка, способная делиться в питательной среде,
содержащей низкомолекулярные предшественники белка и несодержащей сы-
воротку и заменяющих ее высокомолекулярных веществ.

Аутосомы - основные (не половые) хромосомы кариотипа.

Ацидофильный - окрашивающийся кислыми красителями; ацидофильные
клетки - окрашивающиеся кислыми красителями (эозином).

Базофильный - окрашивающийся основными красителями; базофильные
клетки отличаются высоким содержанием РНК; интенсивно окрашиваются то-
луидиновым синим, пиронином и другими.

Бесплазменные тканевые культуры - культуры кусочков ткани, помещен-
ные непосредственно на стенку стеклянного сосуда в жидкой питательной среде
без добавления плазмы.

Бластоидная трансформация лимфоцитов (бласт-трансформация лимфоцитов,
реакция бласт-трансформации) - морфологические и биохимические изменения, в
частности, увеличение размеров, появление обильной цитоплазмы, хорошо различи-
мых ядрышек, усиление синтеза ДНК, РНК и белка у малых лимфоцитов, культиви-
руемых в присутствии антигена, воздействию которого они ранее подвергались, или
неспецифических стимуляторов, таких как растительные митогены (например, фито-
гемагглютинина); результатом этих изменений является митотическое деление.

Вакуолизация - образование в цитоплазме клетки вакуолей, возникающих
в результате накопления и последующего растворения (при обработке препара-
та) каких-либо веществ (жиров, липидов, ферментов и др.); является часто при-
знаком неспецифической (возрастной) дегенерации или вызывается действием
некоторых вирусов и других патогенов.

Вакуоль - пузырек в клетке, наполненный жидкостью или газом.

Вариант культура, характеризующаяся стабильным фенотипическим
изменением, генетическим или эпигенетическим.

Версен - (ЭДТА - натриевая соль этилендиамин - тетра - уксусной кислоты) -
вещество, с помощью которого первичные и перевиваемые клетки могут быть отделе-
ны от стекла; раствор версена оказывает более щадящее действие и в меньшей степени
влияет на жизнеспособность клеток, чем раствор трипсина; обычно используют 0,02%
раствор версена; клетки отделяются от стекла лучше при pH раствора версена 7,3-7,4.

Витальный краситель краситель, прижизненно окрашивающий клетки,
не нарушая их нормальной жизнедеятельности; наиболее известный витальный
краситель - нейтральный красный.

Включения - образования в цитоплазме или ядре, обнаруживаемые обыч-
но под световым микроскопом; могут быть скоплениями вирусных частиц, ор-
ганоидов клетки (митохондрий, лизосом), секреторных или резервных веществ;
иногда специфически окрашиваются некоторыми красителями; часто использу-
ются для диагностики конкретной вирусной инфекции.

Вращательная суспензионная культура - перемешиваемая суспензионная
культура, поддерживаемая в условиях вращения.

Время генерации интервал между следующими друг за другом деле-
ниями клеток; время генерации можно определить авторадиографически (повто-
рение аналогичного периода митотического цикла для всей популяции) или не-
посредственно путем микрокиносъемки (для отдельной клетки).
Время клеточного цикла интервал между последовательными делениями
клетки. В настоящее время его наиболее точно можно определить с помощью кино-
съемки. Этот термин не является синонимом термину ’’время удвоения популяции".

Время удвоения популяции промежуток времени, в течение которого
происходит удвоение числа клеток в культуре.

Газовая фаза - газовая смесь, находящаяся в культуральном сосуде, с ко-
торой соприкасаются жидкость культуры, эксплантаты или клетки.

Гаплоидная клеточная линия - а) см. термин "моноплоидная клеточная линия";
б) клеточная линия, полученная из гамет (символ числа хромосом у гамет: п).

Гемогидролизат (ростовая и поддерживающая 2,5;5,0%, питательная сре-
да) - готовится путем гидролиза крови животных, содержит витамины; исполь-
зуется для культивирования первичных и перевиваемых клеток, чаще - в виде
10-50% добавки к другим средам.

Гетерокарионы клетки, в цитоплазме которых существуют генетически
различные ядра; гетерокарионы могут быть получены, чаще всего, слиянием прежде
самостоятельных клеток (например, под действием некоторых вирусов, лизолеци-
тина, полиэтиленгликоля); гетерокарионы могут быть получены также путем пере-
садки дополнительного ядра в клетку с помощью микроманипулятора.

Гетерогибридома	гибридома, полученная из клеток разного видового

происхождения.

Гетероплоид - термин применяют для клеточной культуры, клетки кото-
рой имеют ядра с числом хромосом, отличающимся от диплоидного числа. Этот
термин используется только для описания культур, а не индивидуальных клеток.
Таким образом, гетероплоидная культура - это культура анеуплоидных клеток.

Гетеропикноз - неодинаковая степень уплотнения при спирилизации це-
лых хромосом (полный гетеропикноз) или участков хромосом (частичный гете-
ропикноз); в последнем случае хромосомы продольно дифференцированы на эу-
и гетерохроматиновые сегменты.

Гетероплоидная клеточная линия (гетероплоидная линия, анеуплоидная)
клеточная линия, в которой диплоидным числом хромосом обладает менее
75% клеток.

Гетерохромосомы (аллосомы) - первоначально этим термином обозначали
хромосомы, по величине, форме или поведению отличающиеся от обычных хромо-
сом (аутосом или эухромосом); этим термином чаще всего обозначают половые
хромосомы, отличающиеся от аутосом по степени конденсации (гетеропикноз), и, в
особенности, по их ориентации и движению в веретене (гетерокинез).

Гибридная клетка одноядерная клетка (синкарион), полученная в ре-
зультате слияния различного типа клеток, обладающих признаками обоих парт-
неров, выраженными в той или иной степени, и отличающаяся от них по своим
культурально-морфологическим и другим свойствам.

Гибридизация - процесс получения гибридных клеток в результате слия-
ния клеток разных типов; одним из партнеров обычно является мутантная по ТК
или ГГФРТ, или другим ферментом клеточная культура, а другими партнерами -
неделящиеся в культуре клетки - лимфоциты, энтероциты, гепатоциты, эритро-
циты и др., либо другая немутантная перевиваемая клеточная линия.

Гибридизация культивируемых клеток - слияние двух или более разно-
родных культивируемых клеток, ведущее к образованию синкариона.
Гибридома - гибридная клетка, полученная в результате слияния клетки куль-
тивируемой линии из миеломы и сенсибилизированного лимфоцита (обычно сплено-
цита). Гибридомы, как правило, являются продуцентами моноклональных антител.

Гибрид соматических клеток клетка, возникающая при слиянии живот-
ных клеток или протопластов, происходящих из генетически различающихся
соматических клеток.

Гидролизат лактальбумина готовится из белков молока; содержит не
менее 17 аминокислот, а также наиболее важные витаминные комплексы; для
культивирования клеток используется в 0,5% концентрации.

Гидролизат мышечных белков ФГМ С (мышечный гидролизат Хот-
тингера, сухой, приготавливается по специальной технологии) - используется в
качестве питательного субстрата для культивирования различных первичных
культур клеток, субкультур и поддержания перевиваемых клеточных линий;
применяется в 0,25 - 0,30% концентрации.

Гиперплоидия наличие клеток, содержащих сверхкомплектные хромо-
сомы или хромосомные сегменты.

Гиперхроматоз - повышение окраски хроматина в клетках (обычно деге-
нерирующих)

Гистогенез - развитие ткани; в культурах выражается в появлении отсут-
ствующих на первых этапах культивирования специализированных элементов
(миобластов, эндотелиальных клеток и т.д.)

Гистотипический (гистиотипический) напоминающий in vitro ткань по
форме или по функции. Этот термин не предназначен для использования вместе
со словом "культура” и употребляется в качестве описательного термина. О
культуре, в которой выявляются структура или функция, типичные для ткани in
vivo, говорят как об имеющей гистотипические свойства.

Гистотипический рост образование в культуре клеточных структур,
соответсвующих элементам ткани (тяжи, пласты, синцитий, симпласты и др.)

Гомогибридома - гибридома, полученная из клеток одного видового про-
исхождения.

Гомокарион клетка, образованная путем межклеточного слияния и
содержащая генетически идентичные ядра.

Гранулоцитарно - Эритроцитарно - (Моноритарно) - Макрофагально -
Мегакариоцитарная (Полипотенциальная) Колониеобразующая "Единица"
(ГЭММ-КОЕ) - клетка - предшественник, образующая в культуре колонию, со-
держащую гранулоциты, эритроциты, моноциты - макрофаги и мегакариоциты.

Гранулообразование - образование (или выявление) гранул в цитоплазме,
обычно под влиянием проникающих в клетку веществ (например, витальных
красителей).

Гранулы - образования (зерна) в цитоплазме или ядре.

Двухмерная культура - культура, разрастание клеток которой происходит
по плоскости.

Дедифференцировка утрата специализированными клетками их специ-
фических свойств, возврат к примитивной организации.

Деления - потеря хромосомного или хроматидного фрагмента в результа-
те разрывов.
Детерминация - стойкое закрепление основных свойств клетки; в резуль-
тате детерминациии ограничивается или становится невозможным развитие
клетки в новом направлении, даже при меняющихся условиях существования;
детерминация обусловливает дифференцировку клетки.

Детрит - продукт распада клеток.

Диплоиды (диплоидные клетки) - клетки, обладающие полным набором
гомологичных пар хромосом, происходящих от обоих родителей.

Диплоидная клеточная линия (диплоидный штамм) - клеточная линия, в
которой не менее 75% клеток имеют диплоидный кариотип, полностью соответ-
ствующий нормальному диплоидному кариотипу клеток вида животного, по-
служившего источником клеток.

Дифференцировка проявление в клетке определенных морфологиче-
ских, физиологических и биохимических свойств, отличающих ее от других
клеток и придающих ей конкретную специализацию; дифференцировка может
быть явной или скрытой, проявляющейся только при определенных условиях.

Долгоживущие (стабильные, постоянные) клеточные линии - клеточные ли-
нии, сохраняющиеся в течение длительного времени (не менее нескольких лет).

Жидкая фаза культуры - жидкость, находящаяся в сосуде с культурой.

Жизненный цикл клеточных культур - период существования культуры от ре-
активации в свежей питательной среде до естественной (возрастной) дегенерации;
жизненный цикл может быть разделен на периоды: латентный (лаг-фаза); становления
(логарифмическая фаза); расцвета (стационарная фаза); старения (дегенерация).

Зависимость от сыворотки неспособность культивируемых клеток де-
литься и сохранять жизнеспособность в отсутствие сыворотки крови.

Замена среды - процесс удаления из культуры кондиционированной сре-
ды и внесения среды с иным составом по сравнению с исходной.

Замораживание клеток культур поэтапное замораживание клеточных
суспензий с определенной скоростью до -70°С и затем помещение их в сосуд
Дьюара с жидким азотом (-196°С) для длительного хранения с последующим
быстрым размораживанием (погружение ампул с клетками в водяную баню,
подогретую до 37-38°С).

Звезда - симметрическая система нитей вокруг центросомы во время ми-
тоза и мейоза.

Зона роста - совокупность клеток, мигрировавших из эксплантата (вклю-
чает как делящиеся, так и неделящиеся клетки).

Злокачественная трансформация в культуре (злокачественная трансфор-
мация in vitro) - приобретение культивируемыми клетками способности образо-
вывать злокачественные опухоли при введении животным.

Идиограмма - графическое изображение отдельных хромосом набора со
всеми их структурными характеристиками (расположение центромеры, наличие
спутников, расположение хромомеров и гетерохроматина, длина плеч и т.д.)

Изменение культуры появление у культивируемых клеток стойко сохра-
няющихся новых свойств; изменения могут затрагивать морфологию клеток, число
и структуру хромосом, чувствительность к вирусам, потребность в питательных
веществах, пролиферативную активность, межклеточные взаимоотношения, свойст-
во злокачественности и др.; при употреблении термина ’’токсические изменения"
нужно описывать и сам эффект (изменения морфологии клеток, утрата ими способ-
ности прикрепляться к субстрату, изменения скорости роста, гибель клеток и т.д ).

Имплантационная культура (культура клеток или тканей в организме) - систе-
ма клеток или тканей, культивируемых в организме экспериментальных животных: в
подкожной клетчатке, передней камере глаза, брюшной полости и др.; к этому же виду
культур относятся культуры, культивируемые в диффузионных камерах.

Ингибирующая плотность насыщения - плотность насыщения, при кото-
рой прекращается размножение клеток в суспензионной культуре.

Индикатор - окрашенная жидкость, добавленная в культуральную среду
для определения концентрации водородных ионов (pH); в качестве индикатора
чаще всего используется феноловый красный.

Интервал субкультивирования - промежуток времени между следующи-
ми друг за другом пассажами эксплантатов или клеток.

Интерфаза (интеркинез) - промежуток времени между двумя митотическими
делениями клеток; для интерфазы характерны два периода: аутосинтетический, ко-
гда происходит репродукция хромосомного и других клеточных материалов, и гете-
росинтетический, когда клетка выполняет свои специфические функции.

Инфекция инапарантная - внешне не проявляющаяся.

Инфекция латентная - сохранение инфекционного агента (микоплазм, ви-
руса) в скрытом виде и активация его при провоцирующих условиях.

Инфекция хроническая медленная репродукция вируса (микоплазм,
бактерий) в зараженных клетках культуры без отчетливых морфологических
нарушений, но с цитофизиологическими изменениями, улавливаемыми более
тонкими методами (гистохимическими).

Кариопласт - ядро, удаленное из клетки.

Кариограмма - 1) кариотип данной систематической единицы (вида или
рода); 2) совокупность хромосом данной клетки с учетом их числа и формы.

Кариокластическое вещество, в определенных концентрациях подав-
ляющее клеточное деление, не убивая клетку. Из кариокластических веществ
наиболее известны колхицин и его производные.

Кариолизис - растворение поврежденного клеточного ядра.

Кариоплазма (ядерный сок, кариолимфа) - жидкая составная часть ядра,
заполняющая пространство между хроматиновыми и ядрышковыми элемента-
ми; содержит белковые вещества (глобулиновая фракция ядерных белков нахо-
дится почти исключительно в ней) и небольшое количество РНК.

Кариорексис распадение хроматина на обломки и гранулы, разрыв
ядерной оболочки и дегенерация остатков ядра. (см. апоптоз).

Кариотип - совокупность признаков (число и форма) хромосом, харак-
терных для клеток данного вида организмов.

Клазматоз - отторжение периферических участков клетки; наблюдается
при различных формах ее патологии.

Клетки-кормилицы монослой, состоящий из клеток, лишенных репро-
дуктивной способности (обычно путем облучения) и используемых для улучше-
ния выживаемости культивируемых клеток (кондиционирования).

Клеточный штамм - клеточный штамм получают из первичной культуры или из
клеточной линии при селекции или клонировании клеток со специфическими свойства-
ми или маркерами. Эти свойства или маркерные признаки должны сохраняться при
последующем культивировании. Пр»	итакхма допжикт ппррдрпртли^ггг
сдедующем-исужтивировании» При описании штамма должны быть определены его
характерные особенности. В публикациях, при описании штамма, необходимо приво-
дить его характеристику или историю, либо давать ссылку на исходную публикацию.
Если культура получена из другой лаборатории, следует сохранять исходное обозначе-
ние штамма и описывать любые отклонения при культивировании.

Клеточная линия культура, полученная в результате последовательного
пассирования клеток первичной культуры; допустимо применение терминов: крат-
ковременные пассируемые культуры или линии (кратковременные субкультуры),
длительно пассируемые культуры или длительные субкультуры, диплоидные куль-
туры (штаммы), перевиваемая (постоянная или стабильная) клеточная линия.

Клеточные культуры культуры отдельных, изолированных (диссоции-
рованных) клеток.

Клеточный цикл - промежуток времени от конца одного митоза до конца
следующего; цикл включает период интерфазы и идущий за ней митоз и разде-
ляется на 4 периода: пресинтетический (постмитотический) - G1, синтетический
- S, постсинтетический (премитотический) G2, и митоз М.

Клон популяция клеток, происходящая путем митозов от отдельной
клетки и характеризующаяся генетической однородностью своих элементов.

Клонирование - экспериментальное получение потомства одной клетки; осуще-
ствляется путем работы с микроманипулятором или методом придельных разведений.

К-Митоз - патологическая форма митоза при задержке образования вере-
тена и нарушении расхождения хромосом.

Колония клеток - сообщество рядом лежащих, совершенно самостоятель-
ных клеток.

Колоний техника - засев клеточной взвеси на твердую питательную среду
(агар) с образованием отдельных колоний, являющихся скоплением клеток; в случае
предшествующего клонирования колония состоит из потомства одной клетки.

Кондиционированная среда - жидкость, полученная в результате инкуба-
ции питательной или культуральной среды с культивированными органами,
тканями или клетками, и содержащая продукты их метаболизма.

Конечная точка летальности эмбрионов в культуре (конечная точка ле-
тальности эмбрионов in vitro) - концентрация (доза) агента, вызывающая гибель
определенной части культивируемых эмбрионов (например, средняя (50%)
смертельная доза для эмбрионов в культуре).

Консервация клеток культуры - сохранение клеток культуры на опреде-
ленное время без изменения их свойств; достигается замораживанием при очень
низких температурах (-70°; -196°С).

Контактное ориентирование клеток (контактное ориентирование) - спо-
собность клеток передвигаться по субстрату соответственно направляющим
рельефа его поверхности.

Контактное торможение движения клеток (контактное торможение движе-
ния) - прекращение движения культивируемых клеток после их соприкосновения.

Контактное торможение деления клеток (контактное торможение деления) -
прекращение деления культивируемых клеток после их соприкосновения и (или)
образование пласта, покрывающего всю площадь поддерживающего субстрата.

Контаминация - заражение (загрязнение) культуры клеток каким-либо пато-
генным агентом (вирусом, микоплазмами, бактериями, грибами, простейшими).
Краевая зона - периферический участок эксплантата, в котором происхо-
дит рост и развитие клеток.

Кризис культуры - стадия трансформации культивируемых клеток. Эта стадия
характеризуется сниженной пролиферацией культуры, анормальными митотическими
фигурами, образовавши многоядерных и (или) гигантских клеток и массивной дегенера-
цией культуры. Кризис заканчивается гибелью всех клеток или выживанием клеток
(часто в составе колоний в однослойных культурах и в составе агрегатов в суспензион-
ных культурах), способных делиться в процессе следующего культивирования.

Криозащитные среды - среды, предохраняющие клетки от повреждения
при замораживании (содержат глицерин, диметилсульфоксин или другие крио-
защитные вещества).

Криопротекторы - криозащитные вещества.

Культуры органные - культуры целых маленьких органов, их эмбриональных за-
чатков или частей более крупных органов (например, легкого, трахеи, пищеварительного
тракта); средой служат агар, жидкие синтетические и другие питательные среды.

Культуры первичные (первично-трипсинизированные, первично-
эксплантированные) - культуры клеток, получаемые из тканей и органов, непо-
средственно извлеченных из организма.

Культура в коллагеновом геле культура, в которой поддерживающим
субстратом является коллагеновый гель.

Культура на микроносителе - культура, в которой клетки прикреплены к
мелким частицам (например, к частицам из полимера).

Культура эксплантата - поддержание или рост эксплантата в культуре.

Культура эмбрионов - развитие или поддержание изолированных зрелых
или незрелых эмбрионов.

Культуры переживающие - культуры клеток, тканей и органов, которые
остаются живыми, не развиваясь в течение сравнительно короткого времени (до
нескольких суток).

Культуры перманентные - см. "перевиваемые клеточные линии"

Культуры размножающиеся (истинные) культуры клеток, тканей, органов,
вполне жизнеспособные, обладающие потенцией к развитию, росту и размножению. В
зависимости от объекта разделяются на три типа: культуры клеток (клеточные культу-
ры), культуры тканей (эксплантаты), культуры органов (органные культуры).

Культуры роллерные - клеточные культуры, выращенные на внутренней
поверхности вращающихся сосудов (10-12 об./час).

Культуры смешанные - совместное культивирование двух культур, обыч-
но, различного происхождения; широко используются для получения гетерока-
рионов; культуры суспензионные и стационарные, в которых часть клеток спон-
танно находится во взвешенном состоянии, а другая прикрепляется к стенкам
сосуда; культуры клеток, способные существовать нормально во взвешенном
состоянии (лейкоциты, клетки асцитного экссудата).

Культуральная среда жидкость, содержащая ингредиенты, обеспечи-
вающие существование и развитие культивируемых тканей или клеток, а также
факторы, тем или иным образом действующие на них.

Культура тканей (эксплантаты) - культура кусочков разнообразных тканей
эмбрионов, взрослых животных и человека, помещенных в питательной среде в
культуральный сосуд (флакон) или в специальные камеры (предметные стекла с
углублением, многолуночные панели, флаконы Карреля, чашки Петри); в состав
питательной среды часто вводят плазму крови и эмбриональный экстракт.

Латентный период развития культуры - время от засева культуры до на-
чала размножения клеток.

Лейкозная Колониеобразующая "Единица" (Л-КОЕ) - лейкозная бластная
клетка, образующая колонию в культуре.

Лимфобластоподобные клетки - клетки неизвестного происхождения и с не-
известными потенциямим, обнаруживаемые в суспензионных культурах и других
культурах и по морфологическому строению напоиминающие лимфобласты.

Магнитная мешалка - прибор для механической дезагрегации клеток,
подвергаемых воздействию протеолитических ферментов (трипсина и др.).

Макрофагоподобные клетки (гистиоцитоподобные клетки) - клетки неиз-
вестного происхождения и с неизвестными потенциями, имеющие округлую или
неправильную форму и содержащие инородные частицы.

Малигнизация - злокачественное перерождение клеток; малигнизирован-
ные клетки не используются для приготовления живых вирус - вакцин и профи-
лактических препаратов, применяемых в медицине.

Маргинация краевое расположение хроматина в ядре, чаще всего, при
воздействии патологических факторов, например, герпес - вирусов.

Маркеры - определенные признаки, по которым можно отличить данную клет-
ку или ее потомство; очень часто этот термин относят к хромосомам данного кариоти-
па, отличающимся по величине, по форме, патологическим изменениям от других
хромосом того же набора. Генетическим маркером может служить дефект по фермен-
там, участвующим в синтезе нуклеиновых кислот - тимидинкиназе (ТК) или гипок-
сантингуанинфосфорибозилтрансферазе (ГГФРТ). Биохимическим факультативным
маркером может быть продукция клетками in vitro гормонов, ферментов, например,
урокиназы (активатора плазминогена), трийодтиронина, тироксина, инсулина.

Мегакариоцитарная (мегакариоцитная) Колониеобразующая "Единица"
(Мег-КОЕ) - клетка, образующая в культуре колонию мегакариоцитов.

Метакинез - перемещение хромосом к экваториальной плоскости клетки
при подготовке к метафазе митоза.

Метафаза вторая стадия митоза; хромосомы располагаются в центре
клетки (в экваториальной плоскости).

Метод перфузионной трипсинизации - основан на пропускании ферментно-
активного раствора (трипсина, коллагеназы и др.) через сосудистую систему органа.

Миграция клеток - перемещение клеток эксплантата при "выползании" из цен-
трального участка на периферию; "выползают" активные клетки (лейкоциты, гистио-
циты, эпителиальные, фибробластоподобные и др.), образующие краевую зону.

Микрокиносъемка используется для изучения биологических свойств
живых клеток в динамике.

Микросомы мелкие частицы, осаждающиеся при фракционировании
гомогенатов клетки (ускорение центробежной силы свыше 20000g, обычно
54000g); представляют собой обломки элементов эндоплазматической сети, ри-
босом и др., содержат основную массу РНК и липидов клетки.

Микроядра - мелкие ядра, образованные отдельными хромосомами и не-
большими их группами; одна из форм патологии митоза.
Микроядерная клетка - клетка, блокированная в состоянии митоза, у ко-
торой мелкие группы хромосом функционируют как очаги для воссоздания
ядерной мембраны, в результате чего образуются микроядра. Пробу на микро-
ядерные клетки используют для выявления нестабильности кариотипа, напри-
мер, у опухолевых клеток, а также для изучения генотоксичности.

Микроразмножение термин является синонимом термину ’’размноже-
ние” in vitro.

Микроклетка полученный в результате энуклеации или разрушения
микроядерной клетки фрагмент, содержащий от 1 до нескольких хромосом.

Миксоплоидная клеточная линия (миксоплоидная линия) - линия, содер-
жащая две или более стволовые субпопуляции с различными числами хромосом.

Митогены - вещества, стимулирующие клеточное деление; один из наи-
более известных представителей митогенов - фитогемагглютинин (ФГА).

Митоз (кариокинез) - непрямое деление ядра с образованием хромосом;
основной способ размножения животных и растительных клеток; митоз включа-
ет 4 последовательные стадии: профазу, метафазу, анафазу, телофазу.

Митоз многополюсный патологический митоз, возникающий вследст-
вие повреждения митотического аппарата; в зависимости от числа образовав-
шихся полюсов различают разные формы многополюсных митозов (трехполюс-
ный, четырехполюсный и т.д.).

Митозы неправильные (патологические) - наблюдаются в культуре в виде раз-
личных форм: отставание хромосом в метафазе, анафазные мосты, многополюсные ми-
тозы и т.д.; особенно часто неправильные митозы наблюдаются при действии вирусов.

Митотическая активность (митотический индекс) - интенсивность мито-
тического размножения клеток в культуре; определяется по числу ядер, находя-
щихся в митозе на 1000 ядер культуры.

Митотический пул - совокупность клеток культуры, способных к синтезу ДНК и
размножению; определяется путем длительного пребывания в культуральной среде Н3 -
тимидина, постепенно метящего все способные к синтезу ДНК клетки культуры.

Митотические яды - вещества разнообразной химической природы, на-
рушающие ход митоза.

Митохондрии - органоиды, ведающие энергетическим обменом; встречаются
в подавляющем большинстве животных и растительных клеток; при просмотре в
световом микроскопе митохондрии имеют вид гранул, палочек, нитей.

Модальное число преобладающее число хромосом, характеризующее
кариотип данной категории клеток.

Моноплоидная клеточная линия (моноплоидная линия) - линия, не менее
75% клеток которой содержат число хромосом, равное гаплоидному числу хро-
мосом (или основному числу хромосом полиплоидной серии; символ: х) в клет-
ках организма, послужившего источником исходных клеток этой линии (часто
используется термин "гаплоидная клеточная линия").

Монослой - растущий на поверхности субстрата клеточный пласт толщи-
ной в одну клетку.

Морфогенез -а) процесс роста и развития дифференцированных структур;
б)превращение структур из недифференцированного в дифференцированное состояние.

Мутагены - агенты, вызывающие генные и хромосомные изменения - му-
тации; наряду со спонтанным мутагенезом, вызываемым действием самого ге-
нотипа, в качестве мутагенов действуют температура, различные виды излуче-
ния и ряд разнообразных химических веществ.

Мутации изменения хромосом, передающиеся потомству и влияющие
на определенные признаки; мутации возникают как спонтанно, так и под дейст-
вием мутагенов; спонтанные мутации имеют эволюционное значение.

Мутантные клетки (пригодные для гибридизации) - клетки, дефицитные по
ферментам: тимидинкиназе (ТК), уабаину, гипоксантингуанинфосфорибозинсферазе
(ГГФРТ), которые пригодны для гибридизации соматических клеток в культуре при
использовании селективной среды ГАТ (гипоксандин-аминоптерин-тимидин).

Мутантная подлиния или мутантный субклон (мутант) - вариантная подли-
ния или вариантный субклон с фенотипическими изменениями, вызванными гене-
тическими причинами (изменение гена, утрата гена или появление нового гена).

Нейроноподобные клетки - клетки неизвестного происхождения и с неиз-
вестными потенциями, имеющие в зоне роста тканевых культур или в одно-
слойных культурах ветвящиеся отростки.

Неопластическая трансформация - приобретение культивированными клетка-
ми способности образовывать опухоли (доброкачественные или злокачественные) при
инокуляции их животным. Многие трансформированные клеточные популяции, воз-
никающие in vitro спонтанно или при экспериментальных воздействиях, образуют
только доброкачественные опухоли, т.е. опухоли без инвазирования и метастазирова-
ния. Термин "злокачественная неопластическая трансформация" может быть исполь-
зован в случае, если клетки дают метастазирующие и инвазирующие опухоли.

Некроз - патологическая смерть клеток, когда клетки помещены в экс-
тремальные условия, отличающиеся от физиологических (т.е. гипертермия, ги-
поксия и др.), которые могут вызывать повреждения плазматической мембраны.
В физиологических условиях повреждающими агентами могут быть вещества,
подобные комплементу или литическим вирусам. При этом нарушается гомео-
стаз, наблюдаются изменения в органеллах, митохондриях и т.д., клетка набуха-
ет и плазматическая мембрана разрывается (лизис клетки).

Некробиоз - процесс медленного отмирания клетки.

Непрерывная клеточная культура (непрерывная культура) - культура, по-
пуляция клеток которой преимущественно находится в логарифмической фазе
роста; такой культурой в идеальном случае является проточная перемешиваемая
суспензионная культура.

Нуклеоид - ядерное вещество вирусов, бактерий, некоторых водорослей;
состоит из компактных нитей ДНК или РНК ( у РНК- содержащих вирусов);
выполняет функцию генетического аппарата.

Нуклеолонема - нитчатая структура, вместе с аморфной частью входящая
в состав ядрышка.

Нуклеосомы (нуклеолы) - см. "ядрышко".

Окраска препарата - окраска фиксированного препарата специфическими кра-
сителями, что облегчает их микроскопическое изучение; основана на избирательной
способности определенных красителей окрашивать разные компоненты клетки.

Органотипический рост образование характерных для данного органа
структур в эксплантате или зоне роста. Органотипическим ростом считают так-
же эпителизацию эксплантата (возникновение капсулы вокруг эксплантата из
клеток , сходных с эпителиальными).
Органотипический напоминающий орган по форме или функции. Этот
термин не предназначен для использования вместе со словом ’’культура" и упот-
ребляется в качестве описательного термина.

Опухолевая трансформация в культуре (опухолевая трансформация in vi-
tro) - приобретение культивируемыми клетками способности образовывать доб-
рокачественные или злокачественные опухоли при введении животным.

Опухолеобразующая способность наличие у культивируемых клеток или
приобретение ими способности образовывать опухоли при введении животным. Ха-
рактеризуя опухолеобразующую способность, нужно приводить следующие данные:
описание животного, подвергшегося инокуляции (вид, штамм, пол, возраст); предва-
рительное воздействие на животное, если оно имело место; область введения и число
введенных клеток; описание роста введенных клеток; гистологическое описание опу-
холи. Тесная связь между морфологической трансформацией и опухолеобразующей
способностью выявлена в культурах клеток эмбриона мыши.

Оплодотворение (фертилизация) в культуре - оплодотворение культиви-
рованного in vitro ооцита.

Пассаж перенос клеток из одного культурального сосуда в другой, (с
разбавлением или без разбавления). Этот термин может быть синонимом терми-
ну "пересев" и ’’субкультивирование".

Паранекроз - обратимое повреждение клетки, характеризующееся дена-
турационными изменениями цитоплазмы; внешне выражается усилением грану-
лярной реакции.

Пассирование клеток (субкультивирование, пересев) перенос эксплан-
татов или клеток из одного культурального сосуда в другой.

Перевиваемые (стабильные) линии - культуры, возникающие спонтанно
или искусственно из первичных культур, полностью адаптированные к услови-
ям существования вне организма и обладающие способностью к практически
неограниченному размножению (субкультивированию).

Перенос эмбриона - перенос культивируемого эмбриона, развивающегося
после оплодотворения ооцита in vitro, в полость матки.

Переживающая культура - культура, клетки которой остаются живыми,
но не делятся и не дифференцируются.

Периодическая клеточная культура (периодическая культура) - культура, попу-
ляция клеток которой проходит через различные стадии роста и развития: латентную
фазу (лагфазу), логарифмическую и стационарную фазы, фазу дегенерации и гибели.

Пикноз - дегенерация ядра, сопровождающаяся его сжатием, уплотнени-
ем и сморщиванием.

Питательные среды - жидкости сложного химического состава (физиоло-
гический раствор солей, аминокислоты, витамины) в которых осуществляют
культивирование клеток, тканей и органов.

Питательные среды поддерживающие (поддерживающие среды) - среды
в которых не происходит деления клеток, способных размножаться при культи-
вировании вне организма, но сохраняется их жизнеспособность; используются
при заражении культуры вирусом.

Питательные среды полусинтетические - среды сложного органического
состава с добавлением некоторого количества (обычно 2-10%) сыворотки круп-
ного рогатого скота, лошади или человека.
Питательные среды размножения полноценные питательные среды, в
которых клетки культуры способны размножаться.

Плотность популяции - число клеток на единицу поверхности или объема
культурального сосуда. Для суспензионных культур это число клеток на едини-
цу объема культуральной среды.

Плотность насыщения - количество клеток на единицу площади (обычно
на 1 кв. см.)

Плотность суспензии - количество клеток в единице объема (в 1 куб. см.
или в 1 куб. мм.)

Полиплоидия - увеличение диплоидного числа хромосом путем спонтан-
ного или направленного добавления целых хромосомных наборов; в зависимо-
сти от числа добавочных наборов говорят о триплоидии, тетраплоидии и т.д.

Полисомия - некратное увеличение числа отдельных хромосом.

Полиплоидная клеточная линия (полиплоидная линия) - линия, не менее
75% клеток которой содержат число хромосом, кратное основному числу (х) и
большим, чем диплоидное.

Популяция клеток - совокупность клеток одного происхождения.

Почкование ядер - неравномерное деление ядра с образованием выроста,

значительно меньшего, чем исходное материнское ядро.

Пролиферативная активность (активность пролиферации) - интенсивность при-

роста числа клеток в культуре определяется обычно подсчетом клеток в счетной камере.

Пролиферация - деление клеток.

Проточная культура - культура с постоянной сменой среды и удалением
части клеток (последнее осуществляется в суспензионных культурах).

Профаза - первая фаза митоза; в ядре видны нити хромосом; на послед-
них этапах этой стадии ядерная оболочка отсутствует.

Псевдо диплоидная (квазидиплоидная) клеточная линия (псевдодиплоид-
ная линия) - клеточная линия, в которой не менее 75% клеток содержат дипло-

идное число хромосом, соответсвующее числу хромосом в клетках животного,
послужившего источником линии; при этом, в качественном отношении карио-

тип клеток отличается от исходного кариотипа.

Псевдометафаза метафаза при отсутствии типичной экваториальной
пластинки; хромосомы беспорядочно располагаются в центре клетки, псевдоме-
тафаза вызывается действием химических веществ, например, хлорал-гидрата.

Пульверизация хромосом - распад хромосом обычно при патологических
условиях на отдельные, очень мелкие фрагменты; наблюдается, например, при
воздействии некоторых вирусов.

Радиоавтография - фотографическая регистрация излучения радиоактив-
ных изотопов, соединенных с биохимически активными веществами и вклю-

чающимися в клетки организма.

Реактор - Ферментер аппарат для культивирования клеток, тканевых
эксплантатов и вирусов в суспензионном состоянии в строго регламентирован-
ных условиях стерильности, перемешивания, аэрации, температуры, pH среды и
уровня растворенного в среде кислорода (р02).

Регенерация - возрождение, восстановление клеток ткани.

Режим размножения культуры (митотический режим) характеристика
размножения клеток культуры; складывается из интенсивности митотической
активности, продолжительности митотического цикла, а также морфологии ми-
тозов (число и характер аберрантных форм).

Рекультура - а) культура, полученная из эксплантатов или клеток опухо-
ли, развившейся после имплантации культивированных клеток животному;

б) культура, полученная в результате переноса эксплантата или монослоя
без разделения в другой сосуд со свежей питательной средой.

Реконструированная клетка (рекой) - клетка, образовавшаяся при слия-
нии кариопласта и цитопласта.

Роллерный аппарат устройство для культивирования клеток во вра-
щающихся сосудах различной емкости; скорость вращения при выращивании
пристеночных культур 10-12 об./час и при выращивании клеток в суспензии -
20 - 30 об./час. Постоянное чередование жидкой и газовой фаз обеспечивает
хорошую аэрацию и улучшает физиологическое состояние культуры.

Роллерные культуры - см. культуры роллерные.

Сбалансированный рост (стационарное состояние) - нахождение клеточ-
ной популяции в таком состоянии, когда количество новообразованных клеток
приблизительно соответствует количеству убывших элементов.

Свободный от вирусов - отсутствие в культуре тех вирусов, для которых
разработаны методы идентификации.

Свободный от патогенов - заключение об отсутствии патогенных организмов,
основанное на результатах проведения специальных тестов для их определения.

Свободный от специфических патогенов - синоним "свободный от патогенов".

Симпласт - обширная зона цитоплазмы без клеточных границ; ограничение
этого термина от термина "многоядерные клетки" является условным; обычно под
симпластами понимают многоядерные клетки, содержащие более 10 ядер.

Синтетические питательные среды - имеют в основе изотонический соле-
вой раствор (чаще всего раствор Хенкса) и большое число органических ве-
ществ, главным образом аминокислот, но не содержат высокомолекулярных
белковых веществ (сывороток).

Синхронизация клеток культуры - достигается воздействием (температу-
ры, химических веществ, радиации), при котором все клетки блокируются в оп-
ределенном пункте их жизненного цикла, а затем, после снятия воздействия,
одновременно "запускаются со старта".

Синкарион - гибридная клетка, у которой ядра двух исходных клеток
слились в одно.

Синтиций - группа клеток, связанных своими отростками; в литературе
на английском языке этим термином обозначается то, что в отечественной гис-
тологической литературе называют симпластом.

Смена среды - процесс удаления из культуры кондиционированной среды
и внесение среды первоначального состава.

Смешанная культура - культура, в которой можно установить присутст-
вие клеток, происхоящих из различных органов, и тканей.

Собственно тканевая культура (тканевая культура) - система, состоящая
из эксплантата и зоны роста.

Соматические клетки - клетки тела, не принимающие участия в половом
размножении.
Спиннер - Культуры - суспензионные культуры в специальных приспо-
соб-лениях для выращивания.

Спирализация спиральное скручивание хромонем хромосомы, дости-
гающее своего максимума во время метафазы.

Среда 199 - синтетическая среда; была предложена Морганом, Паркером
и Мортоном (1960г): в неё входят более 60 компонентов, в том числе 20 амино-
кислот, 17 витаминов, составные части нуклеиновых кислот (пурины и пирими-
дины), 9 минеральных солей, глюкоза и некоторые другие ингредиенты; при-
годна для культивирования различных клеточных культур.

Среда Игла - синтетическая среда, предложенная Иглом (1960г); упот-
ребляется для выращивания первичных и перевиваемых клеточных культур.

Среда установленного (известного) химического состава питательная
среда, каждый компонент которой можно охарактеризовать, в идеале - указать
его химическую структуру.

Стабильная клеточная линия (стабильная линия) - клеточная линия, об-
наружившая способность к неограниченному пассированию (чаще претерпев-
шая трансформацию).

Становление постоянной клеточной линии - совокупность и последователь-
ность событий, в результате которых образуется постоянная клеточная линия.

Стерилизующая фильтрация сред - проводится через асбестовые пласти-
ны (EKS-2, СФ) и калиброванные мембранные фильтры с заданным диаметром
пор (0,1; 0,2; 0,45 и т.д. микрометров), (Миллипор, Дюрапор, Палл и др.)

Субкультуры культуры, получаемые путем пересева (пассажа) из
первичных культур при снятии клеток с твердого субстрата (с помощью
трипсина или версена) в свежую питательную среду.

Сублинии клеток - дочернин линии клеток, получаемые из исходной ли-
нии путем клонирования.

Субштамм - получают из штамма при изоляции единичной клетки или группы
клеток, отличающихся от клеток родительского штамма по каким-то свойствам.

Субстрат - зависимые клетки или культуры - (см.клетки, зависимые от
прикрепления).

Суспензионные (взвешенные) или глубинные культуры - тип культуры, в
которой клетки растут во взвешенном состоянии в жидкой питательной среде;
различают спонтанные (самопроизвольно находящиеся во взвешенном состоя-
нии) и искусственно перемешиваемые суспензионные культуры.

Суспензионное угнетение (зависимость от опоры) прекращение раз-
множения клеток после перевода их из однослойной в суспензионную культуру.

Счетная камера - приспособление для подсчета числа клеток в суспензии;
используются счетные камеры (гемоцитомер), применяемые для подсчета числа
клеток крови: камера Горяева, Цейсса, Бюркера и др.

Твердая фаза культуры твердый или полутвердый органический суб-
страт, вносимый в культуру. Служит для улучшения выживаемости культиви-
руемых клеток (например, плазменный сгусток, коллагеновый гель, агар), оцен-
ки зависимости от опоры (например, мягкий агар), предупреждения прикрепле-
ния клеток к поверхности стекла, пластика (например, твердый агар).

Телофаза - четвертая, конечная стадия митоза, на которой происходит ре-
конструкция дочерних ядер и разделение клеток.
Тканевая культура - клетки, ткани или органы, эксплантированные из организма
животного, сохраняющие жизнеспособность или растущие in vitro более, чем 24 часа.

Торможение роста в зависимости от плотности - торможение митотиче-
ской активности при увеличении плотности клеток.

Тотипотентность - способность клетки сохранять потенции к развитию
всех клеточных типов взрослого организма.

Трехмерная культура - культура, в которой клетки существуют, контак-
тируя с субстратами, имеющими объем (ячейки губчатого материала, мелкие
стеклянные или пластиковые предметы).

Транслокация - структурные изменения хромосом, в ходе которых происходит
перемещение сегмента хромосомы в пределах данной или другой хромосомы, или об-
мен двумя сегментами между гомологичными или негомологичными хромосомами.

Трансформант - клетка, претерпевшая трансформацию.

Трансфицированный ген (трансген) - чужеродный ген, внесенный в клетку.

Трансфекция культивируемых клеток внесение чужеродной ДНК в
культуру клеток.

Трансфектант - клетка, подвергшаяся трансфекции.

Трансформация культуры - изменение морфологических свойтсв клеток первич-
ной культуры с приобретением ими некоторых признаков злокачественных клеток.

Трипсин - вещество, которое применяется для дезагрегации тканей; явля-
ется протеолитическим ферментом, разрушающим межклеточные связи; чаще
всего применяют 0,25%, 0,3% и 0,5% растворы препарата, приготовленные по
различным прописям.

Трипсинизация - применение трипсина с целью дезагрегации тканей,
предназначенных для культивирования, или монослоя до отдельных клеток.

Уровень удвоения популяции - общее число удвоений популяции с мо-
мента получения клеточной линии или штамма. Формула для подсчета удвоен-
ной популяции: число удвоенной популяции = (Log 10 N/N0)x3,33, где

N - число клеток в сосуде в конце периода роста.

No - число клеток, посеянных в сосуд.

Фенотип - совокупность всех признаков клетки, которые могут быть опи-
саны морфологическими и физиологическими методами.

Фетуин - гамма-глобулин, получаемый из сыворотки крови эмбриона ко-
ровы; используется в качестве стимулятора при культивировании клеток, в ча-
стности, диплоидных штаммов.

Фибробласты - клетки веретеновидной или неправильной формы, образующие
волокна. В органных культурах, где связи между клетками сохранены, фибробласты
легче идентифицировать, чем в зоне роста тканевых культур или в однослойных культу-
рах, где клетки иных типов часто принимают фибробластоподобную форму.

Фиброблатоподобные клетки - клетки веретеновидной или неправильной фор-
мы, наблюдаемые в зоне роста тканевых культур и в однослойных культурах. Понятие
’’фибробластоподобный" применяют в тех случаях, когда единственным признаком,
используемым при описании таких клеток, является их форма. Образование волокон не
отмечается. Фибробластоподобную форму могут приобретать в культурах клетки раз-
ных типов. Поэтому при упоминании термина "фибробласгоподобные клетки" имеют в
виду клетки неизвестного происхождения и с неизвестными потенциями.
Фибробластная Колониеобразующая "Единица" (Ф - КОЕ) - клетка кост-
ного мозга, образующая в культуре колонии фибробластоподобных клеток.

Фиксация клеток - умерщвление клеток с сохранением, по возможности,
неизменной структуры; в качестве фиксаторов используются формалин, спирт,
уксусная кислота, хлороформ и др. вещества.

Фильтр миллипоровый - фильтр, изготовленный из нитроклетчатки или
других пластмасс, с калиброванным диаметром пор определенного размера.

Фитогемагглютинин (ФГА) - вещество, получаемое из фасоли, обладает
способностью вызывать клеточные деления; особенно широко используется при
изучении культур лимфоцитов, которые под действием этого вещества резко
изменяются морфологически, превращаясь в лимфобласты; последние начинают
энергично размножаться митозом.

Фрагментация разделение ядра на несколько (иногда много) мелких
частей; наблюдается в клеточных культурах как форма патологии (см. апоптоз).

Химически определенная среда - раствор питательных веществ для куль-
тивирования клеток, в котором известна химическая структура каждого компо-
нента, а также даже самые чистые химические соединения могут содержать
примеси, следует использовать высоко очищенные реактивы с известными, если
это возможно, аналитическими данными о примесях.

Химопсин вещество, ферментативные свойства которого аналогичны
свойствам трипсина. Химопсин выпускается в виде стерильного порошка. Чаще
всего используется химопсин в концентрациях от 0,1 до 0,025% в зависимости
от вида тканей, подвергаемых дезагрегации.

Хроматида - одна из двух продольных единиц хромосом (полуединица), в
свою очередь состоящая из фибриллярных единиц - хромонем.

Хроматин - ядерное вещество, из которого состоят хромосомы, способ-
ные окрашиваться специфическими красителями; состоит в основном из ДНК и
гистонов; в небольшом количестве в нем содержатся белки и РНК; различают
эухроматин и гетерохроматин.

Хроматолиз распад хроматина и ядрышка с потерей способности
окрашиваться.

Хромомеры - видимые под микроскопом конечные структурные единицы
хромосом.

Хромонема - непрерывный субмикроскопический пучок нуклеопротеид-
ных волокон.

Хромосомы - структурные элементы ядра, состоящие из ДНК и белка.

Хромосомы акроцентрические - центромеры которых расположены близ-
ко к одному из концов; такие хромосомы в метафазе имеют палочковидную
форму, так как второе, очень маленькое, плечо на этой стадии не различимо.

Хромосомы метацентрические - с центромерой, расположенной прибли-
зительно посередине.

Хромосомы телоцентрические - с абсолютно терминальным положением
центромеры: в естественных условиях наблюдается очень редко.

Хромосомные мутации - структурные изменения хромосом, возникающие в ре-
зультате перемещения, выпадения или повреждения сегментов хромосом после разры-
вов и соединения концов; структурные перестройки могут происходить как в пределах
одной хромосомы, так и между гомологичными и негомологичными хромосомами.
Хромосомные яды - вещества, нарушающие нормальную структуру хромосом и
вызывающие пикнозы, образование мостов, псевдомитозы, появление микроядер.

Хромоцентры - гетерохроматиновые зоны хромосом.

Центральный участок эксплантата - центральная неразвивающаяся часть
эксплантата, где происходят некротические процессы.

Центриоль - мелкая структура, чаще округлой формы, распологающаяся
в центре центросомы (обычно в конце предыдущей телофазы); делится на две
дочернин структуры, которые в профазе митоза и мейоза определяют полюса
деления; при оплодотворении вносится в зиготу спермием.

Центромера (кинетохор) - механический центр хромосомы, к которому прикреп-
ляются нити веретена в мета-анафазе митоза и мейоза; потеря или повреждение центро-
меры ведет к инактивации хромосомы и, затем, выбрасыванию ее из клетки.

Центросома (клеточный центр) - структура, обнаруживаемая в цитоплаз-
ме клетки, которая содержит центриоли.

Цитопласт - интактная цитоплазма, остающаяся после энуклеации клетки.

Центросфера - сферический видоизмененный участок цитоплазмы, окру-
жающий центриоли и входящий в состав центросомы (клеточного центра), орга-
ноида, играющего важную роль в процессе клеточного деления.

Циклоз - постоянное круговое движение цитоплазмы растительных и не-
которых животных клеток, играющее важную роль в перемещении веществ
внутри клетки и обеспечивающее процессы клеточного метаболизма.

Цитокинез (цитотомия) - разделение клеточного тела с образованием до-
черних клеток.

Цитолиз - растворение и гибель клетки, сопровождающееся отмиранием
не только ее содержимого, но и оболочки.

Цитопатология раздел цитологии, изучающий патологические измене-
ния клеток; особенно развита вирусная цитопатология, предметом которой явля-
ется всестороннее изучение изменений клеток культуры под действием вирусов.

Цитопатогенное действие (цитопатогенный, цитопатический эффект),
проявляющееся морфологически специфическое повреждающее действие виру-
са, патогена на клетку.

Цитотоксическое действие - воздействие какого-либо фактора (радиации,
химических веществ и т.д.), вызывающее неспецифическое повреждение клеток.

Цитоплазматический гибрид гибридная клетка, полученная слиянием
клетки, содержащей ядро, и цитопласта.

Число пассажей - термин, обозначающий количество переносов эксплан-
татов или клеток из одного культурального сосуда в другой.

Штаммы диплоидных клеток (диплоидные штаммы) - морфологически одно-
родные культуры клеток, стабилизированные в процессе культивирования; сохраняю-
щие при пассировании кариотип, свойственный исходной ткани; свободные от контами-
нации и не обладающие онкогенной активностью при трансплантации хомячками.

Экваториальная пластинка - скопление хромосом в медиальной плоско-
сти веретена во время деления.

Эксплантат - удаленный фрагмент ткани или органа, который использо-
ван для того, чтобы начать культивирование.

Эксплантация - процесс первичного помещения органов, тканей и клеток
в условия культуры тканей.
Эмбриогенез - процесс развития эмбрионов.

Эмбриональный экстракт - вещество, получаемое из эмбрионов; содер-
жит витамины и некоторые специфические стимуляторы роста; используется
при эксплантации кусочков ткани.

Эндомитоз - увеличение числа хромосом без деления ядра или клетки;
расхождение хромосом происходит внутри ядра с сохранением ядерной оболоч-
ки и без образования веретена.

Эндоредупликация форма эндомитоза, происходящая иногда в ядрах,
без диспирализации хромосом, в следствие чего признаки митоза отсутствуют.

Эпителиоциты (эпителиальные клетки) - клетки многоугольной формы,
образующие мозаикоподобные структуры с незначительным количеством меж-
клеточного вещества. В органных культурах эпителиоциты легче идентифици-
ровать, чем в зоне роста тканевых культур и в однослойных культурах, где клет-
ки иных типов часто принимают эпителиоподобную форму.

Эпигенетическое изменение наследуемая изменчивость, имеющая не
мутантную природу.

Эпителиоподобные клетки - клетки культуры, имеющие различное про-
исхождение, но по своей морфологии напоминающие эпителиальные и плотно
располагающиеся друг около друга.

Эозинофильная Колониеобразующая "Единица" (Эо-КОЕ) - поздний пред-
шественник эритроцита, образующий в культуре колонию эритроидных клеток.

Эуплоидия - кратное увеличение числа целых хромосомных наборов; эу-
плоиды клетки с одним хромосомным набором или такие, у которых число
хромосом является кратным этому набору.

Эухроматин - часть хроматина, бесследно исчезающая в интерфазе, гене-
тически, по-видимому, более активен, чем гетерохроматин.

Эффективность абсолютная посева процент индивидуальных клеток,
которые при посеве образуют колонии.

Эффективность относительная посева - процент высеянных одновремен-
но клеток, образующих колонии, по отношению к контролю, в котором абсо-
лютная эффективность посева принимается за 100%.

Эффективность колониеобразования - процент высеянных клеток, образую-
щих колонии. Должны быть указаны число клеток в инокулуме, тип культурального
сосуда и условия окружающей среды (среда, температура, открытая или закрытая
система). Этот термин часто употребляют для обозначения числа индивидуальных
клеток в сосуде, дающих колонии. Если есть уверенность в том, что каждая колония
возникает из единичной клетки, можно применять термин "эффективность клониро-
вания". Термин часто путают с термином "эффективность посева".

Эффективность посева (прикрепления) -’количество клеток (в процен-
тах), прикрепляющихся после посева за определенный период времени к по-
верхности культурального сосуда. Обязательно следует указывать условия, при
которых проводилось такое определение; этот термин часто путают с термином
"эффективность колониеобразования"

Ядрышко - важный органоид ядра, встречающийся в том или ином числе
практически во всех клетках; состоит из рибонуклепротеидов (РНП), предшест-
венников рибосом, ядрышкового хроматина, который содержит ДНК. В ядрыш-
ке содержатся некоторые ферменты, необходимые для синтеза белков.
ПРИЛОЖЕНИЕ

ИЛЛЮСТРАЦИИ
Рис. 19. Культура клеток почки эмбриона коровы. Окраска гематоксилинэозин.

Ув. ок.10, об.Ю.

Рис.20. Первичная культура клеток почки теленка (6-е сутки культивирования).

Полностью сформированный монослой. (Ув.х900). Гематоксилин-эозин.

Рис.21. Первичная культура почки эмбриона свиньи (ПЭС).

Гематоксилин-эозин. (Ув.х900).
Рис.22. Первичная культура клеток почки эмбриона свиньи (ПЭС). Преобла-
дание клеток эпителиоподобного типа, вакуолизация цитоплазмы. Ок-
раска гематоксилин-эозин. Ув. ок. 10, об.40.

Рис.23. Первичная культура клеток ПЭО. В монослое клетки смешанного ти-
па: эпителио-и фибробластоподобного типа. Окраска гематоксилин-
эозин. Ув. ок. 10, об.20.

Рис.24. Культура клеток почки овцы. Окраска гематоксилин-эозин. Ув. ок. 10, об.40
Рис.25. Первичная культура клеток селезенки эмбриона коровы (5-е сутки куль
тивирования). Гематоксилин-эозин. (Ув.х 125).

Рис.26. Первичная культура клеток тимуса эмбриона коровы (5-е сутки
культивирования). Гематоксилин-эозин. (Ув.х 125).

Рис.27. Культура клеток магки эмбриона коровы. 20 пассаж.

Окраска гематоксилин-эозин. У в. ок. 10, об.20.
Рис.28. Культура клеток кишечника эмбриона коровы (КЭК).
Гематоксилин-эозин. Ув. ок.20, об. 10.

Рис.29. Первичная культура клеток кишечника эмбриона свиньи на 5 сутки
культивирования. Фибробластоподобные и эпителиоподобные клетю
Гематоксилин-эозин. У в. ок. 10, об.20.

Рис.30. Первичная культура клеток кишечника эмбриона свиньи на 10 сутки
культивирования. Фибробластоподобные и эпителиоподобные клетк]
Гематоксилин-эозин. Ув. ок. 10, об.20.
Рис.31. Первичная культура клеток легкого плода коровы.

Гематоксилин-эозин. У в. ок. 10, об.20.

Рис.32. Диплоидная культура клеток ЛЭК(легкое эмбриона коровы). Клетки
эпителиоподобного типа. Окраска гематоксилин-эозин. Ув. ок. 10, об. 10.

Рис.33. Диплоидная культура клеток ЛЭК32 пассаж. Клетки эпителиоподобного
типа. Нативный препарат. У в. ок. 10, об. 10.
Рис.34. Перевичная культура клеток сосудов сердца теленка (КСТ).
Нативный препарат Ув. ок. 10, об. 10.

Рис.35. Диплоидный штамм клеток сосудов сердца теленка (КСТ). Эпителиопо-
добные клетки, окраска гематоксилин-эозин. Ув. ок. 10, об.20.

Рис.Зб.Перевиваемая культура клеток сосудов сердца теленка (КСТ). Эпителиоподоб-
ные клетки, сильное напластование. Гемагоксилин-эозин. У в. ок. 10, об. 10.
Рис.37. Перевиваемая культура клеток КСТ. Гематоксилин-эозин. Ув. ок. 10, об. 100

Рис.38. Щитовидная железа свиньи. Фолликулоподобные структуры.
Гематоксилин-эозин. Ув. ок. 10, об.20.

Рис.39. Культура клеток ЩС. Эпителиоподобные клетки.
Гематоксилин-эозин. У в. ок. 10, об.20.
Рис.41. Субкультура клеток почки теленка. Гематоксилин-эозин. У в. ок. 10, об.20

Рис.42. Суспензионный штамм клеток почки свиньи - С-СП.
Гематоксилин-эозин. У в. ок. 10, об.40.

Рис.43. Диплоидный штамм клеток кожи эмбриона лошади.
Гематоксилин-эозин. У в. ок. 10, об.20.
Рис.44. Диплоидный штамм клеток сердца ягненка.

Гематоксилин-эозин. У в. ок. 10, об.40.

Рис.45. Перевиваемая линия клеток СПЭВ. Эпителиоподобный тип клеток.

Окраска гематоксилин-эозин. Ув. ок. 10, об.90.

Рис.46. Перевиваемая культура клеток трахеи крупного рогатого скота ТР.
Окраска гематоксилин-эозин. Ув. ок. 10, об.20.
Рис.47. Перевиваемая линия клеток почки теленка ПТ-80.

Окраска гематоксилин-эозин. У в. ок. 10, об.40.

Рис.48. Перевиваемая культура клеток почки теленка - ПТ(60 пассажей).

Гематоксилин-эозин. (Ув 150).

Рис.49. Бифазный культуральный флакон ("Gibco”, США).

А - вертикальное; Б - рабочееположение; 1 - стенка флакона; 2 - пробка;

3 - культуральная бактериальная среда; 4 - культурально-тканевая среда.
Рис.50. Многослойные флаконы для культивирования клеток (Патент США).
А - базовый флакон; Б.В - варианты культурального сосуда. 1 - флакон,
2 - отверстие для внесения и отбора клеток; 3 - поверхности для культивирования

Рис.51. Роллерная установка типа ’’Rollacell” (”NBS”, США).
Рис.52. Оборудование фирмы "Bellco Biotechnology” (США) для культивирова-
ния культуры клеток и вирусов.

а,Ь - для исследования тканевых культур и вирусов
с - для культивирования клеток и вирусов.
Рис. 53. Модуль с девятью дистанционно-
управляемыми Спиннерами ("Bellco
Biotechnology” США).

в

Рис.54. Биореактоы для глубинного культивиро-
вания клеток.

a) Stirred-tank ("L.H.Fermentation", Великобритания).

б) Airlift ("NBS", США).

в) Bubble-column ("Bellco Biotechnology", США).
a

б

Рис.55. Промышленные установки для культивирования клеток животных.

а)	общий вид установки для культивирования (600 л) фирмы ”NBS” (США).

б)	схема барботажной колонны (100 л) для культивирования фирмы ’’Marubishi"
(Япония).

в)	схема промышленной линии производства противовирусных препаратов.
Рис.56. Общая схема мембранного биореактоа (полые волокна)

A-общий вид, Б-схема
устройства, В-изменение
пространственного рас-
положения культураль-
ной камеры и капилля-
ров, 1 -ввод и вывод пита-
тельной среды и вырос-
ших клеток, 2-
культуральная камера,
3-капилляры, 4-
фиксаторы капилляров.

Рис.57. Схема мембранного биореактора культивирования клеток млекопитающих.

Рис.58. Схема перфузионного культивирования с использованием ультрафильтрации.
1-свежая среда; 2-биореактор; 3-ультрафильтрационный блок (лимит молекул массы
10000); 4- фильгрованная масса.
Рис.59. Схема непрерывного перфузионного культивирования.

1-сосуд для питательной среды; 2-биореактор; 3-сосуд для продукции; 4-насос.

б) ультратонкий срез клетки в митозе X 5000.

Рис.60. Вертикальные срезы для электронной микроскопии.
Рис. 63. Мутанный штамм клеток СПЭВ-13-А4ТК'. 78 пассаж.
Окраска гематоксилин-эозин. Ув. ок. 10, об.40.

Рис. 64. Мутанный штамм клеток ТР-ТГ-СЗ-ГФРТ. 11 пассаж.
Окраска гематоксилин-эозин. Ув. ок. 10, об.20.

Рис.65.1. Межвидовая гибридная культура СПЭВ-13-Д5 х лимфоциты лошади

20 пассаж Окраска гематоксилин-эозин. У в. ок. 10, об.40.
Рис.65.2. Межвидовая гибридная культура СПЭВ! К' х лимфоциты коровы.

20 пассаж Окраска гематоксилин-эозин. Ув. ок. 10, об.20.

Рис.65.3. Внутривидовая гибридная культура СПЭВТК' х спленоциты свиньи
(АдхС). Окраска гематоксилин-эозин. Ув. ок. 10, об.20.

Рис.66. Межмутантный гибрид СПЭВТК' х трахея плода коровы TP i ФР Г
Окраска гематоксилин-эозин. Ув. ок. 10, об.20.
a.

б.

Рис.71.1, а,б. Дегенеративные изменения в контаминированной микоплпзмами
культуре клеток ПТ-80. Окраска гематоксилинэозином. Микрофото

а. Ув.: ок.10 х об.Ю; б. Ув.: ок.10 х об.90

Рис. 71.2. Дегенеративные изменения в монослое тест-культуры ПЭС после
инфицирования контаминантом их перевиваемой культуры СПЭВ.
Рис.72.1. Свободные микоплазмы в культуре клеток СПЭВ. Ультратонкии срез.
Электронная микроскопия. (Увеличение X 80.000).

Рис.72.2. Культура СПЭВ, 70 пассаж. Микоплазмы около цитоплазматических
выступов. Электронная микроскопия. (Увеличение X 63.000).
Рис.73. Радиоавтография. Микоплазменная контаминация культуры клеток
СПЭВ. Метка не только над ядром, но и над цитоплазмой, и в межклеточном
пространстве. X. ок. 10, об.90.

Рис.74. Электрофореграмма белков музейных штаммов микоплазм.
Обозначения: 1 - М. arthritidis; 2- M.arginini; 3- М.laidlawii; 4- M.hominis; 5-
М.hyorhinis; 6- M.orale; 7-M.bovis; 8,9 - контроль среды и сыворотки; 10-
M.arginini (мембр.)
Рис.75. Сосуды Дьюара для хранения в жидком азоте (-196°С) культур клеток и
других биологических объектов.

Рис.76. Инфицированная хламидиями культура клеток ПС. Формирова-
ние симпластов. Гематоксилин-эозин. У в. ок.10, об. 10.
Рис.77.То же. Нативный препарат. Гематоксилин-эозин. Ув. ок. 10, об. 10.

Рис.78. Клетки ПС, в цитоплазме которых скопление хламидий. Ядро
оттеснено на периферию. У в. ок. 10, об.90.

Рис.87. Цитогснное действие вируса парагриппа-3 на культуру клеток ЛЭК че-
рез 21 час. Мелкие внутрицитоплазматические включения. Окраска ге-
матоксилин-эозин. У в. ок. 10, об.90.
Рис.88. Культура клеток ЛЭК через 72-96 часов с вирусом парагриппа-3.

Крупные внутрициюплазматические и мелкие внутриядерные включения
со всетлым ободком. Окраска гематоксилин-эозин. Ув. ок. 10, об.90.

Рис.89. Симпластообразование и внутрицитоплазматические включения, вы-
званные в культуре ПТ вирусом ПГ-3. 96 часов. Окраска гематоксилин-
эозин. (Ув. 7х2,5х.9О).

Рис.90. Цитопатогенное действие ротавируса на культуру клеток ЛЭК через 24
часа после заражения. Околоядерные и вокругядерные светлые зоны
(вакуоли), пикноз ядер. Окраска гематоксилин-эозин. Ув. ок. 10, об.90.
Рис.91. Внутриядерные включения при заражении культуры ПТ вирусом ИРТ.

24 часа. Окраска гематоксилин-эозин. (Ув. 7x2,5x90).

Рис.92. ИРГ. 36 часов - дегенерация монослоя. Окраска гематоксилин-эозин.
(Ув. об. 29, ок. 19).

Рис.93. Скопление вирионов ИРТ в цитоплазме клеток ПТ и в межклеточном
пространстве. Ультратонкий срез. Электронная микроскопия х 50.000
Крупный многоядерный симпласт
клеток с характерными для вируса
ИРТ внутриядерными включениями
и большим внутрицитоплазматиче-
ским включением, вызванным виру-
сами ПГ-3. (Ув. 7x2,5x40). Гематок-
силин-эозин.

Рис.94. Изменения в куоьтуре ПТ при смешанной инфекции вируса ИРТ и ПГ-3.

Рис.95. Начальный период дегенерации монослоя, пикноз ядер в культуре кле-
. Ув. ок. 10, об.20.

ток КСТ под действием вируса диареи

Частичное разрушение монослоя, пик-
ноз ядер до стадии дегенерации, кон-
трастность межклеточных контактов,
просветление цитоплазмы от клеточ-
ной мембраны к ядру и уплотнение
цитоплазмы в околоядерной зоне (ви-
русные включения). Ув.об.100. ок.10

Рис.9б.Изменения в культуре клеток КСТ на 24 часа под действием вируса диареи.
a

б

Рис.97. Действие вируса ринопневмонии на клетки гибридной культуры А4 х С
36 часов культивирования. Окраска гематоксилин-эозин. У в. ок. 10, об.40.
а) начало формирования симпласта; б) симпласт

Рис.98. Начало процесса симпластообразования в культуре клеток СЯ под дей-
ствием вируса (24 часа). Ув.об. 10,ок. 10.
Рис.99. Симпласт в культуре клеток СЯ под действием PC вируса (96 часов).

Ув.об.100, ок.10.

Рис. 100. Действие вируса ТГС на культуру клеток щитовидной железы свиньи
18 часов после внесения вируса. Ув.ок.10, об.20.

Рис. 101. Полное разрушение монослоя культур клеток щитовидной железы сви-
ньи под действием вируса ТГС. 72 часа. Ув.ок.10, об.20.
Издательство «Компания Спутник +» приглашает
к сотрудничеству авторов произведений любой тематики.

Издадим Вашу книгу отдельным тиражом.

Выпускаем сборники научных трудов аспирантов, кандидатов наук.

Обращайтесь потел.: (095) 174-32-31

Авторы:

профессор Л.П. Дьяконов, профессор В.И.Ситьков
кандидат биологических наук Т.В.Галънбек
кандидат биологических наук И.Л.Куликова

доктор ветеринарных наук В.И.Заерко, профессор Л.А.Кущ
доктор биологических наук Ш.М.Тугизов

кандидат биологических наук Е.В.Майджи, профессор Г.Ф.Денисенко
доктор биологических наук И.П.Савченкова
кандидат биологических наук А.В.Дагданова

кандидат биологических наук И.А.Калугина

доктор биологических наук Е.А.Рубан, профессор Самуйленко А.Я.

кандидат биологических наук Поздняков А.А.
кандидат биологических наук Строкина Г.М.
кандидат ветеринарных наук И.А.Яблонская

Животная клетка в культуре
(Методы и применение в биотехнологии)

Под ред. проф. Дьяконова Л.П., проф. Ситькова В.И.

Верстка: Чернышова В.В.

ЛР №066478 от 30.03.99.

Гигиенический сертификат № 77.99.2.953.П. 11082.5.00 от 06.05.2000 г.

Налоговые льготы в соответствии с ОК 005-93 Том 2 95 3000 - Книги и брошюры

Издательство “Компания Спутник +”

113208, Сумской пр., д. 8, кор. 2. Тел. (095) 174-32-31

Генеральный директор

кандидат экономических наук А.А. Васькин

Главный редактор

кандидат экономических наук А.В. Моденов

Сдано в набор 10.09.2000 г. Подписано в печать 12.10.2000 г.

Формат 60x84/16. Бумага типографская. Печать офсетная. Гарнитура «Таймс»
Кегль 10. Усл. печ. л. 25.

Тираж 1000 Заказ № 4724

Воскресенская типография Комитета по делам издательств, полиграфии и книжной торговли
Московской области: 140200, г. Воскресенск Московской области, ул. Центральная, д. 30