Л. А. Лутова, X А, Ежова,
И. Е. Додуева, М. А. Осипова

ГЕНЕТИКА
РАЗВИТИЯ РАСТЕНИЙ

Учебник для студентов
высших учебных заведений

Под ред. С. Г Инге-Вечтомова

ИЗДАТЕЛЬСТВО Н-Л
УДК 575

ББК 28.54

Л86

Лутова Л. А.

Л86 Генетика развития растений: для биологических специаль-
ностей университетов / Л. А. Лутова. Т. А. Ежова, И. Е. До
дуева, М. А. Осипова; ред. С. Г. Инге-Вечтомов. — 2-е изд.
перераб. и доп. — СПб.: Изд-во Н-Л, 2010. —432 с.: ил.

ISBN 978-5-94869-104-6

15 Ь 5 й 5 3

Генетика развития растений является одним из наиболее бурно развивающихся
направлений современной генетики, которое имеет огромное фундаментальное
и прикладное значение. В настоящее время в ряде отечественных вузов биологиче-
ского и сельскохозяйственного профиля осуществляется подготовка специалистов
для работы в различных областях биологии и генетики развития растений, однако
учебная литература на русском языке по данным вопросам практически полностью
отсутствует. Этим и объясняется выпуск учебника по генетике развития растений.
Авторы прекрасно понимают, что изложенный материал устаревает и каждый день
появляются все новые и новые факты. Однако он может стать основой для пополне-
ния знаний в этой области генетики.

В учебнике изложены современные представления о закономерностях морфогенеза
и дифференцировки, о молекулярно-генетических механизмах развития растений.
Учебник состоит из введения, пятнадцати глав и заключения, в котором изложены
основные принципы развития растений.

Учебник предназначен в первую очередь для студентов и аспирантов биологиче
ских факультетов, кеда огических и сельскохозяйственных вузов, а также для на-
учных сотрудников, работающих в области генетики растений.

К учебнику прилагаются презентации каждой лекции на CD-диске.

Рекомендовано Учебно-методическим объединением по классическому универ-
ситетскому образованию в качестве учебного пособия для студентов высших
учебных заведений, обучающихся по направлению 020200 «Биология» и биологи-
ческим специальностям 16 декабря 2010 г.

НАУЧНдя"ВйБЛИОТЬКЛ

Сгрглскогс госудгрствеияого
на^оньльнигс исследовательского
___ уиидерсичга

ISBN 978-5-94869-104-6

УДК 575

ББК 28.54

© ООО «Издательство Н-Л», 2010
© Коллектив авторов, 2010
Оглавление

Предисловие ко второму изданию......................  7

Введение..............................................9

Раздел 1. Введение в генетику развития растений.........14

Глава 1. Методы генетики развития растений...........19

1.1.	Методы классической генетики..................19

1.2.	Методы обратной генетики......................25

1.3.	Изучение экспрессии генов у растений........ .34

1.4.	Методы получения химерных растений ...........45

Глава 2. Общие принципы регуляции развития растений .51

2.1.	Основные группы рецепторов растений...........53

2.2.	Основные компоненты путей передачи сигнала....65

2.3.	Основные группы транскрипционных
факторов растений..................................73

2.4.	Эпигенетическая регуляция активности
генов у растений.................................  77

Раздел II. Генет ические основы регуляции развития растений
фит о гормон ами........................................89

Глава 3. Ауксины.....................................94

3.1.	Биосинтез, катаболизм и инактивация ауксинов..95

3.2.	Полярный транспорт ауксинов.................. 97

3.3.	Рецепция и передача сигнала ауксинов..........106

3.4	Функции ауксинов в развитии растений...........114

Глава 4. Цитокинины.................................130

4.1.	Биосинтез, катаболизм и инактивация цитокининов ... 131

4.2.	Транспорт цитокининов .......................134

4.3.	Рецепция и передача сигнала цитокининов .....136

4.4.	Функции цитокининов в развитии растений .....145

Глава 5. Этилен.....................................157

5.1.	Биосинтез этилена ...........................158

5.2.	Рецепция и передача сигнала этилена .........161

5.3.	Функции этилена в развитии растений .........170

Глава 6. Гиббереллины...............................180

6.1.	Биосинтез и инактивация гиббереллинов........181

6.2	Рецепция и передача сигнала гиббереллинов.....187

6.3.	Функции гиббереллинов в развитии растений.....193
Глава 7. Абсцизовая кислота ...........................200

7.1.	Биосинтез, инактивация и катаболизм
абсцизовой кислоты ...............  ................201

7.2,	Рецепция и передача сигнала абсцизовой кислоты. 204

7.3.	Функции абсцизовой кислоты в развитии растений.219

Раздел III. Генетический контроль морфогенеза растений...228

Глава 8. Эмбриогенез..................................230

8	1. Формирование апикально-базальной оси зародыша ....231

8.2.	Контроль развития разных доменов зародыша......239

8.3.	Контроль созревания зародыша___________________ .252

8.4.	Контроль развития эндосперма..................259

Глава 9. Развитие апикальной меристемы побега.........263

9	1. Меристемы растений, стволовые клетки
и принцип организации ниши стволовых клеток........263

9.2.	Строение апикальной меристемы побега..........265

9.3.	Мутанты с нарушением развития апикальной
меристемы побега ..................................267

9.4.	Роль транскрипционных факторов
в регуляции активности меристемы побега.............269

9.5.	Система WUS-CLV и ее роль в поддержании
стволовых клеток растений ..........................271

9.6.	Взаимодействие гормонов и транскрипционных
факторов в апикальной меристеме побега..............274

9.7.	Регуляция клеточного цикла в апикальной
меристеме побега....................................277

9	8. Связь процессов пролиферации и дифференцировки

в меристеме побега: регуляция функции меристемы
листовым примордием ...............................279

Глава 10. Развитие листа............................ .. 281

10.1.	Инициация листового примордия................281

10.2	Определение границ листового примордия........290

10.3.	Контроль идентичности доменов листа..........291

10.4.	Развитие рассеченного и сложного листа.......301

Глава 11. Развитие корня..............................306

11.1	Организация меристемы корня. Покоящийся центр
и стволовые клетки в меристеме корня...............306

11.2.	Регуляция активности покоящегося центра
меристемы корня ...................................308

11.3	Генетический контроль дифференцировки
клеток эндодермы и первичной коры .................311
11.4.	Генетический контроль дифференцировки
клеток эпидермы..................................313

11.5.	Регуляция развития бокового корня .........316

Глава 12. Инициация цветения......................  323

12.1.	Фотопериодическая регуляция перехода к цветению 324

12.2.	Индукция цветения холодом..................335

12.3.	Автономный путь индукции цветения..........341

12.4.	Гормональная индукция цветения.............342

12.5.	Онтогенетическая регуляция цветения........343

12.6.	Интеграция путей инициации цветения и переход
на последующие этапы развития цветка__________ 344

Глава 13. Развитие меристемы цветка.................347

13.1.	Ген LEAFY (LFY) — интегратор информации,
инициирующей переход растений

на репродуктивную стадию развития................347

13.2.	Ген TERMINAL FLOWER! (TFL1) - антагонист LFY.... 351

13.3.	Ортологи генов LFY и TFL1 из других видов растений,
их роль в определении структуры соцветия ........353

13.4.	Ген UNUSUAL FLORAL ORGANS (UFO) —
корегулятор гена LFY.............................357

13.5.	Ген APETALA1 (API) и его паралог —
ген CAULIFLOWER (CAL)............................358

Глава 14. Развитие органов цветка...................361

14.1.	АВС-модель............................ ....361

14.2.	Особенности структуры и экспрессии генов
А ВС-классов.................................... 365

14.3.	Подтверждение ABC-модели путем исследования
трансгенных растений ............................368

14.4.	Генетические механизмы, определяющие время
и место экспрессии гомеозисных генов.............370

14.5.	Определение границ между органами цветка...373

14.6.	Роль гена AG в подавлении пула стволовых клеток
в меристеме цветка.............................. 375

14.7.	АВС^-модель..... .... .........____.ХА.......375

14.8.	Мишени генов АВС-классов...................378

14.9.	Консервативность функции АВСЕ-генов
и эволюция структуры цветка......................379

14.10.	Генетический контроль симметрии цветка....385

Глава 15. Клональный анализ в изучении морфогенеза
высших растений................................  ...389

15.1.	Основные понятия и термины.................389
15.2.	Генетические химеры, классификация..........391

15.3.	Способы получения химер ....................394

15.4.	Использование химер для изучения явления
детерминации клеток...............................400

15.5.	Изучение закономерностей морфогенеза методами
клонального анализа................................405

15.6.	Выявление организующих центров морфогенеза..409

15.7.	Выявление генов, продукты которых могут играть
роль индуктивных сигналов.........................410

15.8.	Поиск доменов, обуславливающих способность
белка к передвижениям.. ..........................414

15.9.	Изучение взаимодействия клеток и тканей
методами генетически направленного апоптоза.......415

Заключение.............................................420

Предметный указатель...................................425

Регуляторы развития растений...........................428
Предисливие ко второму изданию

Генетика развития растений является одним из наиболее бурно
развивающихся направлений современной генетики, которое имеет
огромное фундаментальное и прикладное значение. В настоящее
время в ряде отечественных вузов биологического и сельскохозяй-
ственного профиля осуществляется подготовка специалистов для
работы в различных областях биологии и генетики развития рас-
тений, однако учебная литература на русском языке по данным во-
просам практически полностью отсутствует. Этим и объясняется
выпуск учебника по генетике развития растений. Авторы прекрасно
понимают, что изложенный материал устаревает и каждый день по-
являются все новые и новые факты Однако он может стать основой
для пополнения знаний в этой области генетики.

Учебник подготовлен коллективом преподавателей, работаю-
щих в Санкт-Петербургском государственном университете. Ав-
торы учебника имеют большой опыт преподавательской и научно-
исследовательской работы в различных областях биологии и генетики
развития растений. Отдельные главы учебника написаны профессо-
ром кафедры генетики Московского государственного университета
Т. А. Ежовой, которая также читает этот курс. В учебнике изложены
современные представления о закономерностях морфогенеза и диф
ференцировки, о молекулярно-генетических механизмах развития
растений. Учебник состоит из введения, пятнадцати глав и заключе-
ния, в котором изложены основные принципы развития растений.

В первой глазе изложены основные методы, которые используют
в генетике развития растений. Основной упор сделан на современ-
ные методы молекулярной биологии и генной инженерии. Последу-
ющая глава 2 посвящена основным принципам регуляции развитая
растений.

Второй раздел книги (главы 3-7) посвящен фитогормональной
регуляции развития высших растений. В этом разделе описаны му-
танты по синтезу и рецепции основных гормонов (ауксины, цитоки-
нины, гиббереллины, этилен, абсцизовая кислота), обобщены сведе-
ния о структуре и механизмах экспрессии соответствующих генов.

Раздел 3 (главы 8-15) посвящен генетике онтогенеза высших
растений. Рассмотрены закономерности эмбрионального развития,
формирования меристем, морфогенез листьев, цветков и корней.
8 Предисловие ко второму изданию

Подробно дана информация о растительных мутантах с нарушени-
ями развития различных органов. Большое внимание уделено раз-
витию цветка как наиболее полно разработанной модели генетики
развития

Учебник предназначен в первую очередь для студентов и аспи-
рантов биологических факультетов, педагогических и сельскохо-
зяйственных вузов, а также для научных сотрудников, работающих
в области генетики растений.

Предлагаемый вариант учебника является вторым. Первый вари-
ант (Л. А. Лутова, Н. А. Проворов, О. Н. Тиходеев, И. А. Тихонович,
Л. Т. Ходжайова, С. О Шишкова «Генетика развития растений, под
ред. С. Г. Инге-Вечтомова, 539 с.) был издан в 2000 г. издательством
«Наука» тиражом 1000 зкз., который разошелся в течение первого
года. Безусловно, материал первого учебника уже устарел, поэтому
на сегодняшний день в России нет современного учебника но гене-
тике развития растений на русском языке. Предлагаемый новый ва-
риант учебника меньше по объему (приблизительно 350 листов А4),
так как написан только на основе курса лекций «Генетика развития
растений», который читается в СПбГУ и МГУ. К учебнику прилага-
ются презентации каждой лекции на CD-диске.
Введение

Генетика развития изучает процесс реализации генетической
информации в ходе индивидуального развития, т. е. изучает путь от
гена к признаку.

Развитие организма включает в себя такие понятия, как рост
и дифференцировка. Рост — это количественные, а дифференци-
ровка — качественные изменения в организме. Дифференцировка
может осуществляться на всех уровнях организации — клеточном,
тканевом, органном. Органный уровень дифференцировки часто
обозначают термином «морфогенез».

На первых этапах своего существования, в 20-50-е годы XX века,
генетика развития носила описательный характер, отвечала на во-
прос «как выглядит объект» и носила название «феногенетика».
С 60-х годов XX века начался новый этап генетики развития, ко-
торый можно обозначить как «молекулярно-генетический». Сейчас
мы уже можем отвечать на вопрос «почему так выглядит объект».

Большой вклад в создание основ генетики развития внесли наши
отечественные ученые. Так, М. Е. Лобашов (заведующий первой ка-
федрой генетики в России) предложил называть процесс индивиду-
ального развития «онтогенезом». Несомненная роль в развитии этой
науки принадлежит Н. К. Кольцову, Б. Л. Астаурову, Н. В. Тимофееву-
Ресовскому. Этими исследователями установлена важная роль взаи-
модействия генов в онтогенезе и сформулированы такие понятия, как
экспрессивность (степень проявления гена в пределах одного орга-
низма); пенетрантность (доля организмов, у которых этот признак
проявляется); специфичность действия гена, которая определяется
временем и местом его действия; и норма реакции, в пределах кото-
рой возможно изменение действия гена в зависимости от факторов
окружающей среды. Таким образом, каждый ген может характеризо-
ваться разной экспрессивностью, пенетрантностью, специфичностью
и может подвергаться действию генов-модификаторов.

Сегодня благодаря реализации геномных проектов и развитию
новых молекулярно-генетических методов начали вскрываться
молекулярно-генетические механизмы, лежащие в основе вышепере-
численных принципов управления развитием многоклеточных орга-
низмов, кроме того, был выявлен целый ряд новых закономерностей.
В частности, ранее предполагалось, что в разных таксонах геномы
будут сильно различаться по числу генов. Расшифровка же геномов
выявила, что (I) сложность прокариот в целом коррелирует с раз-
мерами геномов и их числом генов; (2) наблюдаются рост размера
геномов и числа генов при переходе от прокариот к эукариотам и от
одноклеточных к многоклеточным; (3) у эукариот отсутствует связь
между биологической сложностью, размером генома и числом генов
Последний результат был обескураживающим. Например, Drosophila
melanogaster содержит всего 13 600 генов, а более простой круглый
червь Caenorhahditis elegans — 19000 генов. Удивительно, что чело-
век и рыба фугу имеют примерно равное количество генов — 30000-
40000. С другой стороны, оказалось, что базовые процессы жизне-
деятельности кодируются сравнительно небольшим числом генов
Остальной геном представляет собой в лучшем случае регулятор-
ную надстройку, в худшем — некодирующую ДНК. Следовательно,
основной вклад в уровень сложности организма вносит не количе-
ство генов, а количество способов регуляции их экспрессии.

Наиболее важные для развития организмов гены называют генами
развития', к ним, прежде всего, относятся гены, кодирующие транс-
крипционные факторы, а также гены рецепторов и других компонентов
путей передачи сигналов. Эти гены являются эволюционно консерва-
тивными. Сходство структуры и функции генов у разных организмов
может быть прослежено даже на уровне генных ассоциаций — так,
у всех млекопитающих обнаружены синтенные гены (их еще называ-
ют консервативными ассоциациями), которые практически полностью
сходны у млекопитающих. Эти факты приводят нас к заключению, что
онтогенез различных видов базируется на функционально сходных го-
мологичных генах, сохраняющих консерватизм в силу эффективности
тех механизмов развития, которые ими определяются. Сегодня генети-
ки пытаются ответить на вопрос о том, почему при эволюционной кон-
сервативности наиболее важных для развития генов разные виды так
нс похожи друг на друга по морфоло1ии. Эти различия, по-видимому,
кроются в особенностях экспрессии генов в онтогенезе.

Палитра экспрессии генов в онтогенезе отражает реализацию
определенных программ развития, под которыми понимается стро-
го упорядоченная во времени и пространстве скоординированная
экспрессия сотен и тысяч генов. Расшифровка программ развития
является основной целью генетики развития. Реализация каждой про-
граммы развития — это результат взаимодействия генов, которое
может осуществляться на разных уровнях. В каждой программе раз-
вития основная роль отводится транскрипционным факторам, доля
которых по результатам расшифровки геномов невелика и составляет:
у дрозофилы — ~5 %, у нематод — ~2,5 %, у арабидопсис - ~7 %.
Проведенные подсчеты говорят, что на каждый регуляторный ген
приходится ~40-50 генов-мишеней. Возникает вопрос: как такое не-
большое число генов-регуляторов может контролировать экспрессию
солидного количества генов-мишеней9 В литерагуре описан специ-
альный класс так называемых «селекторных» транскрипционных
факторов, которые взаимодействуют с цис-регуляторными последова-
тельностями генов-мишеней и объединены в единую регуляторную
сеть (genetic regulatory network), что и приводит к координированной
экспрессии генов У растений вместо термина «селекторные» гены
употребляют термин «master genes».

Таким образом, можно сказат ь, что любая программа развития —
это результат работы определенного фрагмента генной сети, которая
включает в себя: 1) центральные регуляторные гены (master genes),
кодирующие регуляторы транскрипции, которые могут быть как бел-
ковой природы, так и нуклеиновой (например, микро-РНК), 2) гены,
которые содержат в своих регуляторных районах сайты связывания
регуляторов транскрипции, и .3) путей передачи сигналов от факто-
ров внешней среды через рецепторы к генам-регуляторам. Отсюда
следует, что сложность организации регуляторных элементов генов
и их насыщенность сайтами связывания транскрипционных факто-
ров должны коррелирован ь со сложностью генных сетей. Действи-
тельно, регуляторные районы генов эукариот велики по сравнению
с таковыми в генах прокариот. Более того, размер регуляторного рай-
она гена эукариот может быть на порядки больше его кодирующей
части. Очевидно, что в многоклеточном организме один и тот же ген
в зависимости от стадии клеточного цикла, типа клетки, ткани, ор-
гана, стадии развития организма должен имет ь разный характ ер экс-
прессии. Один из способов роста сложности генных сетей — увели-
чение числа уровней иерархии их регуляции. Так, если у прокариот
регуляция экспрессии генов идет в основном лишь на уровне транс-
крипции и трансляции, то у эукариот она возможна также на уровнях
1) структуры хроматина, 2) транспорта мР1 IK, 3) сплайсинга мРНК,
4) процессинга мРНК, 5) стабильности мРНК (напоимер, регуляция
с участием микроРНК). В плане регуляции экспрессии генов важно,
что у эукариот экзо.ч-интронная структура свойственна большин-
ству расшифрованных генов. Показано, что интроны не являются
генетически инертной ДН К, так как содержат большое разнообразие
регуляторных элементов, влияющих на экспрессию генов — сайты
связывания транскрипционных факторов, энхансеры, альтернатив-
ные промоторы, сайты метилирования и т. д. Также у эукариот суще-
ствуют специальные механизмы перестройки структуры хроматина
(chromatin remodeling), меняющие нуклеосомную «разметку» ДНК
в зависимости от дифференцировки и функционального состояния
клетки. Ремоделинг хроматина, большую роль в котором играют бел-
ки семейства Polycomb, — важный фактор регуляции экспрессии ге-
нов эукариот. Таким образом, наличие у эукариот комбинированных
механизмов регуляции транскрипции, экзон-интроиной структуры,
механизмов альтернативного сплайсинга и эпигенетических меха-
низмов создало основу для исключительно эффективного способа
кодирования огромного биологического разнообразия.

В пределах эукариот серьезные различия в организации генных
сетей выявлены между растениями и животными. Особенности ре-
гуляции развития растений связаны, прежде всего, с уникальными
особенностями их строения и жизненной стратегии.

Для развития растения крайне важную роль играют факторы внеш-
ней среды. Их множество: свет, направление вектора силы тяжести,
контакт с патогенными микроорганизмами и т. д. Возможность проти 
вое гоя гь внешним воздействиям — основной фактор выживания, и это
особенно актуально для растений, так как они ведут прикрепленный
образ жизни. В результате этой особенности в эволюции растений вы-
работалась собственная жизненная стратегия сохранение высокою
уровня адаптации за счет множества механизмов (программ) защиты,
которые реализуются в онтогенезе. Результаты расшифрованного ге-
нома арабидопсис свидетельствуют, что 14% всех генов вовлечены
в обеспечение защитных реакций, 32% генов контролируют вторич-
ный метаболизм, среди которых, например, гены, контролирующие
синтез фитоалексинов, обеспечивающих иммунитет растений.

Еще одна особенность, отличающая развитие растений от разви-
тия животных, эго отсутствие миграции клеток вследствие наличия
клеточной стенки. Поэтому для растений крайне важно направление
деления клеток, которое и определяет направление дифференциров-
ки. У расгений описано два типа деления клеток — антиклинальное
(перпендикулярно поверхности) и периклинальное (параллельно по-
верхности). Первый тип деления увеличивает число клеток в слое,
второй — число слоев клеток в ткани. Сочетание разных типов
деления клеток определяет развитие отдельных тканей и органов
растения. В связи с этим для растений характерна жесткая про-
странственная детерминация, которая также является следствием
наличия жесткой клеточной стенки и отсутствия миграции клеток.
Клетка растений в течение всего онтогенеза «остается на одном ме-
сте», и ошибку дифференцировки может компенсировать только за
счет скорости и направления деления.
По сравнению с животными растение просто организовано. Так,
у животных описано более 100 типов клеток, а у растений не более 40.
Для животных характерно 4 основных тина тканей, а у растений — 3
(отсутствует нервная ткань). Кроме того, для растений характерно
модульное строение организма: например, модуль надземной части
растения включает в себя лист, междоузлие и боковую почку Каж-
дый такой модуль возникает как вздутие на апикальной меристеме,
на определенном расстоянии от другого модуля, его возникновение
и развитие зависит от градиента концентрации фитогормонов. Сово-
купность модулей определяет структуру растения, поэтому раст ение
часто сравнивают с колонией.

К особенностям развития высших растений также следует от
нести тот факт, что морфогенез протекает в течение всей жизни
растения, а не только в процессе эмбриогенеза, как у животных.
У животных репродуктивные и соматические органы закладывают-
ся в раннем эмбриогенезе, т. е. для них характерно наличие заро-
дышевой линии. У растений зародышевая линия отсутствует,
т. е. у них нет специализированных клеток для формирования ге-
неративных органов. «Растянутость» морфогенеза растений во вре-
мени определяется наличием меристем — образовательных тканей,
которые являются резервуаром стврловых клеток. У растений выде
ляют несколько типов меристем, основными из которых являются:
1) недетерминированные меристемы, к которым относят апикаль-
ную меристему побега и корня, и 2) детерминированные меристе-
мы — пазушные или вставочные — эти меристемы сохраняют эм-
бриональное состояние до момента формирования органа.

Безусловно, важной особенностью растений является тотипо-
тентность клеток — т. е. способность воссоздать новый организм
практически из любой клетки растения. Тотипотентность раститель-
ных клеток — эго основной фактор, который определяет регенера-
ционную активность растений, а потому лежит в основе методов
генной и клеточной инженерии. Способность к регенерации явля-
ется основой вегетативного размножения растений, а также важным
фактором адаптационного потенциала, обеспечивающего выжива
ние растений в стрессовых условиях.

Итак, онтогенез растений определяется интеграцией консерватив-
ных принципов контроля развития, общих для всех эукариот, и уни-
кальных способов регуляции развития, которые определяются осо-
бенностями растений В разделах данного учебника мы рассмотрим
механизмы, лежащие в основе регуляции основных стадий развития
растений, а также формирования отдельных органов и тканей.
Раздел I

Введение в генетику развития растений

Как отмечалось во Введении, главной целью генетики развития яв-
ляется расшифровка программ развития, т. е. изучение молекулярно-
генетических механизмов, лежащих в основе принципов управления
онтогенезом. Можно выделить 5 основных проблем генетики раз-
вития растений.

1.	Изучение генетического контроля онтогенеза.

Эта проблема занимает центральное место среди всех проблем,
поскольку в отличие от других является чисто генетической. Для ре-
шения этой проблемы необходимо:

•	выявить гены, контролирующие разные этапы и уровни онтоге-
неза (гены, контролирующие деления клеток, апоптоз, эмбриоге-
нез, гистогенез, развитие органов на постэмбриональной стадии
развития и дифференцировку клеток);

•	изучить функцию выявленных генов на уровне организма, тка.чи,
клетки, молекулярную функцию;

•	выяснить иерархию (последовательность) действия генов, что
возможно с помощью анализа генных взаимодействий;

•	построить генетическую схему (модель, генную сеть) процессов
развития

2.	Изучение генетического контроля сигнальных путей, т. е.
изучение генетических механизмов восприятия и передачи внешних
и внутренних сигналов.

Изучение сигнальных путей, обеспечивающих координацию раз-
вития растений с условиями внешней среды, а также с состоянием
собственного организма (фитогормонального статуса, статуса пита-
ния, возраста), — важнейшая проблема, которой занимаются био-
химики и физиологи. Вместе с тем выявление сигнальных генов,
контролирующих белковые компоненты сигнальных путей, установ-
ление их функции на уровне организма практически невозможно без
генетических исследований.

3.	Изучение генетических механизмов дифференциальной ре-
гуляции действия генов в онтогенезе.

Эта проблема решается генетиками вместе с молекулярными био-
логами. Если молекулярные биологи изучают уровни и механизмы
регуляции экспрессии генов (транскрипционный, посттранскрипци-
онный, трансляционный и пр ), то генетики выявляют гены, кото-
рые участвуют в этой регуляции, в том числе и те, которые являются
компонентами сигнальных путей и опосредуют регуляцию развития
растений факторами внешней среды и внутренними физиологиче-
скими факторами. Важной задачей является и выявление регулятор-
ных участков гена (цис-регуляторных элементов), обуславливающих
специфичность экспрессии гена.

4.	Изучение генетических механизмов, контролирующих вза-
имодействие клеток и тканей (клональный анализ).

Поскольку взаимодействия клеток основаны на обмене опреде-
ленными индуктивными сигналами, главная задача генетиков в про-
блеме клонального анализа — выявление генов, контролирующих
образование этих сигналов, а также изучение особенностей струк-
туры генов и их продуктов, которые обеспечивают их способность
к перемещению между клетками. Дополнительной задачей является
создание химер с использованием современных методов, основан-
ных на получении трансгенных растений.

5.	Изучение генетических основ эволюции онтогенеза.

К решению проблемы эволюционной биологии онтогенеза гене-
тики обратились совсем недавно. Это стало возможным благодаря
успехам в изучении генетики развития модельных объектов (араби-
допсис, в первую очередь), поиску и изучению структуры и функции
гомологичных генов развития у других видов растений.

Все проблемы генетики развития тесно взаимосвязаны. Напри-
мер, при изучении генетического контроля перехода растений к цве-
тению невозможно не учитывать действие сигнальных световых
и гиббереллиновых путей и обусловленных ими механизмов диф-
ференциальной экспрессии генов, способности к передвижениям по
тканям некоторых из компонентов этих путей. Тем не менее решение
разных проблем требует использования разных методических под-
ходов, поэтому обычно разные лаборатории сосредоточены на реше-
нии одной из проблем.
В учебнике представлены основные результаты исследований
по всем обозначенным проблемам. Наибольшее внимание уделено
генетическому контролю морфогенеза и гормональных сигнальных
путей. При рассмотрении этих результатов будет показано и все раз-
нообразие механизмов дифференциальной активности генов, ко-
торое используется растениями. Кроме того, для наиболее хорошо
исследованных онтогенетических признаков (развитие цветка и раз-
витие листа) приведены результаты изучения эволюции онтогенеза.
Проблеме клонального анализа посвящена отдельная глава.

Успех в изучении генетики развития растений был достигнут бла-
годаря использованию модельных объектов, на которых были вы-
явлены ключевые регуляторы развития растений.

В зависимости от задачи исследования к модельным объектам
предъявляют разные требования, но основные являются общими
для всех. Обязательным условием является половое размножение,
диплоидность, высокая плодовитость, наличие большого числа му-
таций (генетической коллекции), наличие генетических и молеку-
лярных карт, высокая способность к регенерации и трансформации,
наличие транспозонов, небольшой по размеру геном. В последние
десятилетия излюбленным объектом во многих лабораториях мира
стала резушка Таля (или арабидопсис) Arahidopsis thaliana — рас-
тение, которое обладает всеми вышеперечисленными качествами.

Геном арабидолсис был секвенирован первым из геномов рас-
тений. Работа по секвенированию генома арабидопсис была начата
в 1996 г. международным консорциумом, в который вошли научные
группы из США, Японии, Италии, Великобритании. 14 декабря
2000 года в журнале Nature была опубликована статья, подводившая
итог определения первичной струкгуры генома арабидопсис.

Из множества растительных организмов вид арабидопсис был
выбран первым благодаря тому, что его геном сравнительно невелик
по сравнению с геномами других высших растений и в нем относи
тельно немного повторяющихся последовательностей. Диплоидный
набор арабидопсис состоит из пяти пар хромосом, хромосомы равно-
ценны по длине, плотность генов, уровень экспрессии и распределе-
ние повзоров также равномерны по всем пяти хромосомам. Общий
размер секвенированной области, за исключением теломер, центпо-
мерных повторов и блоков рРНК составил 115,4 Мб, 10 Мб прихо-
дится на центромерные, теломерные и рРНК области, что вместе со-
ставляет полный размер ядерного генома 125 Мб. На хромосомах 2
и 4 располагаются 2 ядрышковых организатора. Теломеры хромо-
сом арабидопсис представлены повторами, их размер не превыша-
ет 3 Кб. На хромосомах 2 и 4 теломеры прилегают к ядрышковому
организатору, на остальных хромосомах отделены от кодирующих
последовательностей субтеломерными повторами. Несовершенные
теломер-подобные повторы обнаружены в разных местах генома
арабидопсис, показано, что они могут влиять на экспрессию распо-
ложенных рядом генов и, возможно, являются результатом древних
перестроек — инверсий. Центромеры хромосом арабидопсис, так
же как и многих высших эукариот, содержат многочисленные повто-
ряющиеся мобильные элементы. В центромерах было обнаружено
47 экспрессирующихся генов.

Для арабидопсис выявлено свыше 26 000 белковых продуктов ге-
нов Число выявленных белков у арабидопсис оказалось значитель-
но выше, чем у дрозофилы и нематоды, что является результатом
дупликаций с образованием новых белковых семейств.

Анализ транскрипционных факторов арабидопсис показал, что
только небольшая их часть имеет «двойников» у других эукариот,
что отражает независимую эволюцию растительных транскрипци-
онных факторов. Всего у арабидопсис было выявлено около 150
уникальных растительных транскрипционных факторов. В то же
время белки, вовлеченные в контроль синтеза белка у арабидопсис,
оказались высококонеервативными для всех эукариот.

Сравнительный анализ геномов ядра, митохондрий и пластид ара-
бидопсис показал, что эти три генома в растительной клетке заметно
отличаются по числу генов, стабильности и организации. Пластид-
ные гены высоко консервативны для всех растений, тогда как мито-
хондриальные гены менее консервативны, т. к. чаще подвергаются
рекомбинационным событиям Некоторые из белков, которые рабо-
тают в органеллах, но кодируются в ядре, изначально были закоди-
рованы в геномах органелл, а затем в процессе эволюции перенесе-
ны в ядро. Однако в геноме органелл также были выявлены гены,
которые возникли уже в эукариотическом организме — например,
компоненты белкового импорта, которые, скорее всего, были не нуж-
ны свободноживущим предкам эндосимбионтов.

У арабидопсис обнаружены все основные типы мобильных эле-
ментов, встречающиеся у растений. Мобильные элементы в геноме
арабидопсис составляют по меньшей мере 10%, среди них обнару-
жены как ретротранспозоны, так и ДНК-транспозоны.

В эволюции у арабидопсис происходило увеличение числа ко-
пий отдельных генов и генома в целом. Это могло происходить как
в результате независимой амплификации генов, так и в результате
предковой дупликации всего генома, отдельных хромосом или их
сегментов. Сегодня арабидопсис принято считать древним поли-
плоидом, геном которого по крайней мере дважды удваивался, после
чего происходила эрозия части генетического материала.

Сегодня уже секвенированы геномы большого числа видов рас-
тений, однако арабидопсис остается классическим модельным объ-
ектом б генетике развития растения.

К числу широко используемых модельных объектов генети-
ки развития растений также относят ся рис (Oryza sativa), который
используется для изучения особенностей развития однодольных,
в частности злаков; томат (Lycopersicon esculentum), на примере ко-
торого были выявлены гены, участвующие в развитии рассеченного
листа, а также созревании плодов. Важное место среди модельных
растений занимает львиный зев (Antirrhinum majus), ставший клас-
сическим объектом для изучения генетической регуляции развития
цветка, бобовые растения, такие как люцерна (Medicago truncatula),
лядвенец (Lotus japonicus), горох (Pisum sativum), являются моделя-
ми для изучения развития сложного листа и регуляции растительно-
микробных симбиозов (в частности, симбиоза с почвенными азот-
фиксирующими бактериями ризобиями). С помощью этих моделей
исследуют механизмы развития клубеньков у бобовых растений, но-
вых симбиотических органов, в которых происходит фиксация моле-
кулярного азота. Использование многих объектов генетики развития
растений определяется их практической ценностью, которая позво-
ляет применить последние достижения генетики развития в селек-
ции сельскохозяйственных растений.

Для изучения основных принципов генетики развития на расти-
тельных объектах широко используется ряд методов классической
генетики, а также молекулярно-генетических методов, с которыми
вы можете ознакомиться в следующей главе.
Глава 1

Методы генетики развития растений

1.1. Метод >i классической генетики

Среди м ?тодов классической, или «прямой», генетики особое ме-
сто занимает мутационный анализ, который позволяет выявлять
новые гены на основе получения, генетического и всестороннего
фенотипического изучения мутантов. В зависимости от исследуе-
мою признака для характеристики проявления мутации могут ис-
пользоваться не только качественные и количественные описания
внешней морфологии всего растения, его органов, тканей, клеток,
но и физиологические и биохимические характеристики. Например,
без изучения физиологических и биохимических параметров не-
возможно исследовать генетический контроль гормональных и све-
товых сигнальных путей. От точности описания фенотипа на всех
уровнях его проявления зависит вывод о функции гена.

В понятие функции гена входит не только представление о моле-
кулярной функции продукта гена, как это часто понимается молеку-
лярными биологами, но и информация о функции гена на уровне це-
лого орт анизма, на уровне ткани и клетки. Чтобы пояснить важность
этой информации, приведем пример по изучению функции гена
A. thaliana P1NO1D1 (PIDi). Этот ген кодирует серин-треониновую
прогеинкиназу (ее молекулярная функция — фосфорилирование
белков в цитоплазме клетки), которая участвует в обеспечении по-
лярною транспорта ауксина из клетки (клеточная функция — регу-
ляция выхода ауксина из базальной части клетки в апопласт, что свя-
зано с участием белка PJDI в установлении правильной локализации
другого белка PINI на мембране базальной части клетки). Мутации,
полностью нарушающие работу гена РЮЦ блокируют полярный
2С * Раздел I. введение в генетику развития растений
транспорт этого гормона по цветоносу (функция на уровне ткани —
нарушение базипетального транспорта ауксина по цветоносу) и при-
водят к недоразвитию цветков на цветоносе, который у мутантов
pidl становится похожим на булавку. Т. е. функцией гена PIDI на
уровне всего растения является регуляция развития цветков, а точ-
нее — разметка мест их расположения на цветоносе, которая пред-
шествует образованию меристем цветка. Ген PIN1 работает вместе
с геном PID1 и имеет ту же функцию на клеточном, тканевом и ор-
ганизменном уровне. В то же время его молекулярная функция —
совершенно иная. Этот ген кодирует белок, который обеспечивает
трансмембранный транспорт ауксина. Гомологи гена PIN1 (P1N2
PIN8) имеют сходную молекулярную функцию, но работают в дру 
гих тканях и органах растений (большинство — в корне), т. е. имеют
иную функцию на уровне ткани и организма.

Установление функции гена на уровне организма, котсоое осно-
вано на анализе мутантов или трансгенных организмов, является
специфическим предметом генетических исследований и четко раз-
граничивает генетику и молекулярную биологию, возможности ко-
торой 01 раничиваются представлениями о молекулярной функции
гена и его продукта. Для получения мутантов генетики используют
индуцированный мутагенез (химические мутагены, радиацию), а
также транспозонный мутагенез, который связан со спонтанными
перемещениями по геному транспозонов. Транспозоны есть в гено-
ме всех растений, однако активные перемещения, вызывающие му-
тации, характерны не для всех видов. Так, спонтанные транспозон-
ные мутации у арабидопсис очень редки, а у львиного зева, петунии
и кукурузы многие спонтанно возникающие мутации — результат
транспозонного мутагенеза. У львиного зева перемещениями неко-
торых транспозонов можно управлять, изменяя температурные усло-
вия (активные транспозиции ТатЗ наблюдаются только при 15°С,
а при 25°C ТатЗ не активен). У химического мутагенеза есть два
бесспорных преимущества перед транспозонным (а также Т-ДНК-
мутагенезом, см. ниже) — высокая частота и возможность получе-
ния мутаций с разной экспрессивностью и с нарушениями функции
отдельных доменов.

Для получения мутаций используется и инссрционный мутаге-
нез, вызванный инсерцией Т-ДНК в геном растений в процессе их
трансформации. Внедрение Т-ДНК в геном может иметь разные по-
следствия. Чаще всего инсерции не вызывают фенотипического про-
явления, т. к. доля некодирующих последовательностей выше, чем
кодирующих, и инсерции в межгенные участки не нарушают функ-
ции генов. При встраивании инсерций внутрь или рядом с геном мо
жет наблюдаться полное нарушение функции генов. Это отличает
Т-ДНК-мутагенез от химического, который позволяет получать мно
жественные аллели с разным фенотипическим проявлением.

В то же время у инсерционного мутагенеза, вызванного встраи-
ванием в геном растения Т-ДНК и транспозонов, есть неоспоримое
достоинство по сравнению с химическим: он позволяет легко иден-
тифицировать ген, в который произошла вставка, за счет «вытягива-
ния» гена за транспозон/Т-ДНК на основании определения нуклео-
зидных последовательностей, фланкирующих вставку. С помощью
инсерционного мутагенеза были идентифицированы многие гены,
контролирующие развитие растений. Так, например, с помощью
транспозонного мутагенеза (транспозона ТатЗ — Transposone of
Antirrhinum majus) был идентифицирован ген Ft OElCAljLA (FLO)
у львиного зева, ответственный за развитие меристемы цветка. Так-
же с помощью транспозонного мутагенеза у кукурузы был иденти-
фицирован ген KNOTTED, ключевой регулятор развития меристемы
побега.

При использовании для Т-ДНК-мутагенеза векторов активатор-
ного типа (когда в состав векторных молекул на основе Ti-плазмиды
входят энхансерные элементы), могут быть получены не только ре-
цессивные мутации, связанные с нарушением работы генов, но и до-
минантные. вызванные их эктопической активностью (т. е. более
высоким уровнем экспрессии или нарушением временных и про-
странственных особенностей экспрессии). Отметим, что исследова-
ния, которые начинаются с получения и изучения мутаций, затра-
гивающих интересующий исследователя признак (независимо от
метода получения мутаций), являются методами прямой генетики.
Инсерционный мутагенез превращается в метод обратной генетики
только при направленной инактивации гена, нуклеотидная последо-
вательность которого уже известна.

Генетический анализ — важнейший из методов генетики раз-
вития и обязательный этап исследования мутантов. Без генетиче-
ского анализа невозможно установить число затронутых мутацией
генов, исследовать характер наследования мутации (рецессивный,
доминантный). Комплеменгационные тесты необходимы для выяв-
ления множественных аллелей, которые особенно важны в исследо-
ваниях процессов развития. Кроме того, по частоте встречаемости
аллельных мутаций, затрагивающих интересующий признак, мож-
но судить об относительном числе контролирующих его генов. Чем
реже аллельные мутации, тем большее число генов контролируют
признак. При ограниченном числе генов аллельные мутации будут
представлены в коллекциях мутантов часто. Следовательно, при на-
личии множественных аллелей в коллекции мутантов с изменения-
ми интересующего признака можно утверждать, что выявлены все
основные гены, контролирующие данный признак.

Без проведения генетического анализа невозможно правильно су-
дить о функции гена на уровне организма. При формулировке пер-
вичной гипотезы о функции гена генетик использует мощнейший
инструмент генетики — формальную генетическую логику. Пояс-
ним это на простых примерах. Если моногенная мутация проявляет
рецессивный характер наследования (он обычно связан с нарушени-
ем функции гена) и вызывает карликовый фенотип (или, например,
фасциацию побега), то функцией аллели дикого типа является под-
держание нормального роста стебля (ограничение пролиферации
клеток апикальной меристемы побега). При тех же фенотипических
особенностях при условии доминантного наследования мутаций, ко-
торые приводят к эктопической (избыточной) активности гена1 *, а не
ее отсутствию, гипотезы меняются на противоположные. В случае
карликовой мутации можно предполагать, что функция нормально
функционирующей аллели дикого типа — ограничение роста сте-
бля, а в случае фасциированного фенотипа можно сделать вывод об
участии гена дикого типа в поддержании пролиферации клеток апи-
кальной меристемы побега.

Чем полнее охарактеризовано проявление мутации, тем точнее
будет формулировка функции гена. Если исследователь знает, на-
пример, с чем связано снижение роста — нарушением растяжения
клеток или клеточных делений, низким содержанием гормонов у му-
танта или уменьшенной чувствительностью к гормонам, то функ-
цию гена можно детализировать, однако изменения общей первич-
ной формулировки не произойдет.

Поскольку у гена может быть несколько разных функций, важно
исследовать несколько аллельных мутантов Исследование аллелей
с высокой экспрессивностью мутантного признака (для крат кости их
часто называют «суровыми», или «жесткими», аллелями), т. е. алле-
лей, вызывающих полное нарушение функции гена, позволяет найти

1 К доминантному фенотипу могут приводить и некоторые мутации, вызывающие
частичное нарушение функции гена. Это характерно для генов, продукты которых

участвуют в образовании белковых комплексов. Мутат ный белок успешно конку-
рирует с продуктом нормальной аллели в гетерозиготном организме, что приводит
к нарушению функции белкового комплекса и проявлению мутантного фенотипа
в гетсрозиготе.
ту критическую стадию онтогенеза, на которой необходим продукт
исследуемого гена. Изучение аллелей с низкой экспрессивностью
(«мягких», или «слабых», аллелей), т. е сохраняющих остаточную
активность и не останавливающих развитие на критической стадии,
позволяет исследовать влияние мутации на всех стадиях онтогенеза.
Кроме того, аллельные мутации в разных участках гена позволяют
исследовать функцию разных доменов белкового продукта. Анализ
мутантов позволяет также делать предположения о месте экспрес-
сии гена — ген должен проявлять активность в тех органах и на тех
стадиях онтогенеза, изменения которых наблюдаются у мутантов.

Мутации в разных участках гена часто имеют разные проявления.
Это приводит к тому, что гену присваивают разные названия (напри-
мер, ген CARPEL FACTORY/SHORT NTEGUMENTSI/SUSPENSOR 1),
не подозревая, что речь идет об одном полифункциональном гене.
Генетическое картирование позволяет определить локализацию
гена на генетической карте и провести тесты на аллелизм мутаций,
расположенных в одном районе генетической карты. Генетическое
картирование открывает возможность и для позиционного клониро-
вания гена2. Изучение структуры гена позволяет понять его молеку-
лярную функцию и приступить к изучению особенностей экспрес-
сии гена, а значит, и к анализу правильности гипотезы о функции
гена, выдвинутой на основании генетической логики.

Анализ взаимодействия генов — важнейший метод классиче-
ской генетики, позволяющий исследовать связи между генами. По
определению, наличие взаимодействия генов А и В свидетельствует
о взаимодействии их продуктов, которое может осуществляться на
разных уровнях:

1)	на уровне взаимодействия белковых продуктов генов А и В;

2)	на уровне взаимодействия конечного продукта, образующегося
под контролем гена А, и фермента, кодируемого геном В. для ко-
торого этот продукт является субстратом;

3)	на уровне взаимодействия конечных продуктов (метаболитов,
в образовании которых участвовали белки А и В, морфологиче-
ских структур); 3

3 Для выделения генов, выявленных на основании мутантного фенотипа, кроме ме-
тода позиционного клонирования используются и другие методы, выбор которых
зависит от природы мутационного изменения. Для клонирования генов, маркиро-
ванных протяженными делениями, используется метод геномного вычитания, а
для маркированных интерциями — метод «вытягивания» за инсерцию. При отсут-
ствие информации о природе мутации может использоваться метод позиционною
клонирования, который является самым универсальным
4)	на уровне взаимодействия белка А и ДНК или РНК гена В (когда
белок А осуществляет регуляцию гена В на уровне транскрипции
или на посттранскрипционном уровне соответственно).

В отличие от молекулярных методов (например, анализа белок-
белковых взаимодействий, анализа влияния мутационного измене-
ния в одном гене на уровень транскрипции другого гена), класси-
ческий анализ взаимодействия генов на уровне фенотипа позволяет
оценить наличие взаимодействия генных продуктов на всех возмож-
ных уровнях сразу, поскольку оценивает конечный результат всех
возможных взаимодействий. Поэтому его разрешающая способность
значительно выше, чем у молекулярно-генетических методов, хотя
и не позволяет вскрыть молекулярный механизм взаимодействия.

Анализ генных взаимодействий в генетике развития основан на
сравнительном анализе фенотипа одиночных и двойных мутантов
(мутанты скрещивают, в F2 отбирают двойные мутанты, анализи-
руют их фенотип в F2, F3 и последующих поколениях). Результаты
можно трактовать однозначно только при анализе взаимодействия
рецессивных мутаций, затрагивающих одну и ту же сторону морфо-
генетического процесса.

Если гены контролируют последовательные этапы одной цепи
биохимических или морфологических превращений, то между
рецессивными мутантными аллелями этих генов обычно наблю-
даются эпистатические взаимодействия (9:3:4 — рецессивный
эпистаз3). Причем на основании фенотипа двойного мутанта мож-
но установить последовательность генного действия: если двойной
мутант имеет фенотип а, т. е. рецессивная аллель а эпистатична по
отношению к рецессивной аллели b (расщепление 9 дикого типа:
3 b 4 а), то продукт гена А участвует в контроле более раннего
этапа одного морфогенетического нуги, чем продукт гена В (А—>В).
Причем эти рассуждения верны при работе с любыми объектами (и
микроорганизмами) и при работ е с любыми признаками (биохими-
ческими, морфологическими).

Если гены контролируют разные цепи биохимических (морфо-
логических) превращений, каждая из которых участвует в становле-
нии признаков, то взаимодействий между мутантными генами на-
блюдаться не будет, и фенотип двойных мутантов будет аддитивным.

' Из курса общей генетики вы помните, что один и тот же тип расщеплений при
взаимодействии неаллельных 1енов можно трактовать по-разному, так как это
формальный анализ. В генетике развития к анализу генных взаимодействий при-
ступают тогда, когда уже многое известно о бункиии генов, поэтому трактовка
становится более однозначной.
Если гены контролируют пересекающиеся цепи биохимических
превращений, внося совместный вклад в становление признака, то
у двойных мутантов должен появиться новый фенотип (комплемен-
тарное взаимодействие доминантных аллелей, синергистическое
взаимодействие). Па основании полученных результатов строятся
элементарные генные сети, которые усложняются по мере выявле-
ния новых компонентов.

Методы прямой генетики позволяют также осуществлять на-
правленный поиск дополнительных компонентов исследуемой
генной сети, взаимодействующих с ранее идентифицированными
генами. Для этого осуществляют поиск мутаций, которые способ-
ны усилить или ослабить (супрессировать) фенотип ранее полу-
ченного мутанта.

Все перечисленные выше классические генетические подходы
(путь прямой генетики: оз признака/фенотипа — к гену) позволя-
ют осуществить построение генной сети, контролирующей тот или
иной онтогенетический признак. Создание такой генной сети и кло-
нирование ее компонентов у модельных видов открывает путь для
исследований генетики морфогенеза у других видов (в том числе
и мало исследованных) методами обратной генетики.

1.2.	Методы обратной генетики

В насзоящее время в связи с бурным развитием методов мо-
лекулярной биологии, секвенированием геномов модельных объ-
ектов накапливается информация о последовательностях генов,
создаются базы данных последовательностей для различных
объектов — и накопление такой информации опережает исследо-
вания по изучению функции гена. Именно поэтому в настоящее
время часто для выявления функции гена используют обратный
подход — исследователи манипулируют последовательностями
генов, изменяя или выключая тот или иной ген, и анализируют,
к каким изменениям это приводит, выясняя, таким образом, функ-
цию гена. Эз о путь обратной генетики: от гена к признаку/феноти-
пу. Причем на заключительном этапе для изучения функции гена
на уровне организма чаще всего получают трансгенные растения
с измененной активностью исследуемого гена, либо осуществля-
ют поиск мутаций в исследуемом гене среди представительных
коллекций мутантов, полученных путем химического или инсер
ционного мутагенеза Таким образом, прямая и обратная генети-
ка — не взаимоисключающие подходы, а дополняющие друг дру-
га в изучении функции гена.
Остановимся более подробно на основных методах обратной ге-
нетики, методах, основанных на изучении функции гена путем ма-
нипулирования его последовательностями. К ним относят:

•	замещение гепа/дизрупция гена путем гомологичной рекомбина-
ции;

•	РНК-интерференция/генный сайленсинг;

•	Т-ДНК-инсерционный мутагенез/T-DNA tagging;

•	TILLING (Target Induced Local Leisons IN Genomes).

Замещение гена/дизрупция гена путем гомологичной
рекомбинации

Удобный подход для изучения функции гена — целенаправлен-
ное изменение его последовательности и исследование последствий
таких изменений. У бактерий, животных, дрожжей для этой цели
используют трансформацию клеток, основанную на гомологичной
рекомбинации. Однако у растений гомологичная рекомбинация
практически неосуществима. Встраивание экзогенной ДНК по го-
мологии у растений — очень редкое событие, его частота составляет
от 10 4 до 10 ”. Это объясняется особенностями системы рекомби-
нации у растений. Существуют два основных механизма восста-
новления двуцепочечных разрывов — нсгомологичное соединение
концов (Nonhomologous End-Joining) и гомологичная рекомбинация.
У растений преобладает первый механизм, NHEJ, тогда как система
гомологичной рекомбинации не очень эффективна. Именно поэтому
при трансформации растений экзогенная ДНК встраивается в уча-
сток ДНК хозяина случайным образом, а встраивание по гомологии
происходит очень редко.

В последние годы исследователи пытались увеличить частоту го-
молог ичной рекомбинации у растений — получали трансгенные рас-
тения, содержащие гены, кодирующие белки, вовлеченные в реком-
бинацию’ например, белок бактерий КесА и белок дрожжей RAD54
Так, известны работы, в которых достигали увеличения частоты
встраивания экзогенной ДНК но гомологии на порядок у трансген-
ных растений, содержащих ген Е. coli RecA. Но данные результаты
воспроизводились не во всех экспериментах. У трансгенных расте-
ний, содержащих ген фактора ремоделирования хроматина дрожжей
RAD54, достигали увеличение частоты встраивания по гомологии
на 1-2 порядка (от 10 2до 10’). В этих экспериментах осуществля-
ли трансформацию растений арабидопсис, содержащих ген RadS4
дрожжей, конструкцией, содержащей ген GFP, фланкированный
последовательностями гена круциферина арабидопсис, белка, на’
канливающегося в семенах. При этом с высокой частотой (до 10 ')
происходило встраивание такой конструкции по гомологии в ген
круциферина арабидопсис. В результате специфичного встраивания
GFP в ген круциферина наблюдали свечение семян арабидопсис, об-
условленное накоплением гибридного продукта круциферина-GFP.

Также следует упомянуть о новом методическом подходе, позво-
ляющем осуществлять специфичное встраивание или разрушение
гена — этот подход основан на использовании искусст венно скон-
струированных белков — ферментов нуклеаз, «сшитых» с доменом
«цинковые пальцы». Домен цинковые пальцы способен узнавать
специфичные последовательности ДНК, при этом различные доме-
ны способны узнавать различные последовательности ДНК (один
домен узнает один триплет нуклеотидов). Мультидоменный белок,
образованный в результате обьединения нескольких таких доменов,
будет узнавать более протяженные последовательности. К таким до-
менам пришивают нуклеазу, и образующийся в результате гибрид-
ный белок может специфично узнавать и осуществлять разрезание
ДНК по конкретным последовательностям. Таким образом, исполь-
зование таких белков позволяет вносить мутации в интересующий
ген и осуществлять направленное изменение генов у растений.

Как мы обсудили, у растений процессы гомологичной рекомби
нации идут в целом не очень эффективно. Однако существует ис-
ключение из этого правила, а именно гаплоидный мох Physcomitrella
patens, у которого частота гомологичной рекомбинации достигает
100%. Этот мох оказался очень удобным модельным объектом для
изучения базовых процессов биологии растений, в частности, боль-
шое количество данных о роли генов, контролирующих работу ап-
парата фотосинтеза, было получено именно на этом объекте. Phys-
comitrella называют «зелеными дрожжами». И действительно, мхи
характеризуются общими с другими высшими растениями типами
гормонов, механизмами ответа на стресс и действие света, особен-
ностями дифференцировки клеток. Другим преимуществом исполь-
зования в качестве модельного объекта Physcomitrella patens являет-
ся относительно непродолжительный жизненный цикл (2-3 месяца)
с преобладанием гаметофитной стадии, что позволяет фенотипиче-
ски оценить действие мутаций, являющихся рецессивными для ди-
плоидных организмов. Почему же у Physcomitrella и родственных
мхов столь эффективны процессы гомологичной рекомбинации?
Точного ответа на этот вопрос еще не дано, возможно, это связано
с особенностями регуляции клеточного цикла мхов — поскольку из-
вестно, что собственно трансформация — встраивание экзогенной
ДНК — происходит на определенной стадии клеточного цикла —
переход G2/M, и для встраивания по гомологии необходимо сопря-
жение трансформации с гомологичной рекомбинацией.

РНК-интерференция

Другой метод, позволяющий осуществлять выключение актив-
ности гена, основан на РНК-интерференции: использовании малых
РНК для регуляции активности генов. Этот механизм, называемый
РНК-интерференцией, или замолканисм (сайленсингом) гена, пред-
ставляет собой природный механизм регуляции активности генов,
опосредованный малыми дчуцепочечными РНК, их называют ма-
лыми интерферирующими РНК (small interfering RNA) и малыми
РНК (microRNA), последовательности которых комплементарны
последовательности гена, активность которого они регулируют.
Замолкание генов может осуществляться за счет различных ме-
ханизмов на различных этапах реализации генетической инфор-
мации: как на уровне транскрипции, так и на уровне трансляции
гена. Малая двуцецочечная РНК, образующаяся либо в результа-
те экспрессии в клетке, либо экзогенная двуцепочечная РНК, на-
пример представляющая собой генетический материал различных
вирусов растений, взаимодействует в клетке с целым комплексом
белков, участвующих в ее процессинге. В результате формируется
комплекс RISC (RNA-induced silencing complex) — комплекс ма-
лой РНК с белками-рибонуклеазами. Этот комплекс осуществляет
подавление транскрипции гена-мишени (гена, содержащего после-
довательности, комплементарные малойРНК) либо за счет разреза-
ния транскрипта, либо за счет репрессии трансляции. Эти явления
относят к посттранскрипционпому замолканию генов. Кроме того,
комплекс малых РНК с белками может опосредовать репрессию
транскрипции гена-мишени в результате его воздействия на хро-
матин (рис. 1.1).

Такие существующие в природе механизмы используют для по-
давления транскрипции гена-интереса. Растения трансформируют
конструкцией, содержащей фрагменты гена-мишени в прямой и об-
ратной ориентации. В результате экспрессии такой конструкции об-
разуется формирующая шпильки двуцепочечная РНК. Часто между
инвертированными повторами помещают интрон — для стабилиза-
ции структуры двуцепочечной РНК. Такая молекула взаимодейству-
ет с белками в клетке, претерпевает процессинг и вместе с белками
образует комплекс RISC, подавляющий экспрессию гена-мишени.
Основные типы замолквния гена (сайленсинга)

Пост транскрипционное замолкание
(регуляция экспрессии гена на уровне
трансляции)
PI GS — Post-transcriptional gene silencing

Транскрипционное замолкание
(регуляция экспрессии гена на уровне
транскрипции)
1GS — Transcriptional gene silencing

Специфическое
разрезание мРНК (А)

Связывание с протяженными
комплементарными
участками в кодирующей
и некодирующих областях

Репрессия трансляции(В)

Связывание с короткими
комплементарными
участками е 3'
некодирующей области

Mem клевание гистонов
1е>ерохроматинизация(С)

Взаимодействие с ДНК

Активный хроматин



а,

Сар&А- а--	—-	А,

J Метилирование гистонов

«Молчащий» хроматин

Рис. 1.1 Основные механизмы «замолкание» генов с участием михроРНК

Просмотры, используемые для экспрессии таких двуцепочечных
молекул РНК, могут быть различного типа. Это может быть консти-
тутивный промотор, тканеспецифичный или специфичный для опре-
деленной стадии развития промотор. Часто, например, если продукт
гена является жизненно важным и необходим для развития расте-
ний, требуется выключение экспрессии гена в определенный момент
времени. Для этого ген, кодирующий двуцепочечную РНК, помеща-
ют под контроль регулируемого (ичдуцибельного) промотора. Рас-
смотрим в качестве примера, как можно осуществить направленное
«замолкание» гена фитоен-десатуразы (phytoene deasalurase, PDS)
(рис 1.2). Б нашем примере растения трансформируют конструкци-
ей, содержащей инвертированный повтор фрагмента гена фитоен-
десатуразы PDS, кодирующий микроРНК, под контроль оператора,
регулируемого транскрипционным фактором (ТФ). Таким ТФ явля-
ется модифицированный транскрипционный фактор, полученный
на основе глюкокортикоидного рецептора (LhGR) Удобством тако-
го ТФ является то, что его активность можно регулировагь лиган-
дом — стероидным гормоном дексаметазоном. В отсутствие лиганда
ТФ находится в связанном состоянии с белком HSP90 и неактивен.
В результате он не активирует экспрессию гена, кодирующего ма-
лую РНК. При добавлении индукгора дексаметазона ТФ активиру-
ется, связывается с оператором и запускает экспрессию малой РНК.
Результатом действия малой РНК является подавление гена PDS.
Нет ИНДУКТОРА

PDS PHYTOENE
TTASATURAE'*

pHELLSTOP

intron

Ь-глюкоронидаза

35S iflGR

оператор

Неактивный ТФ

LhGR—транскрипционный фактор (ТФ)

HSF96

Добавление ИНДУКТОРА: + DEX дексаметазон (стероидный лиганд)

Рис. 1.2. Регулируемое «замолкгние>- гена фитоен-десатуразы POS с помощью
малых Рнк

Кроме того, под контроль оператора также помещают реиортерный
ген — например, ген глюкоронидазы, — и экспрессия репортерно-
го гена является маркером того, что произошла активация ТФ и, как
следствие, экспрессия малой РНК и подавление гена-мишени.

Наличие регуляторных элементов, таких как промоторы и энхан-
серы, специфичных для определенной ткани, для конкретного типа
клеток или стадии развития, является важным инструментом изуче-
ния процессов развития растения, изучения функции гена в опреде-
ленном месте и в определенный момент времени. Одним из подхо-
дов для поиска таких регуляторных последовательностей является
использование Т-ДНК, содержащей реиортерный ген.

Использование Т-ДНК в качестве «зендов» для выявления
кодиоующих и регуляторных областей (Т DNA tagging)

Важным инструментом для выявления генов, ответственных за
тот или иной признак, является инсерционный мутагенез. В этом
разделе мы не будем в деталях рассматривать варианты применения
инсерционного мутагенеза для клонирования генов у растений, а
ограничимся рассмотрением возможностей, которые предоставляет
Т-ДНК-инсерционный мутагенез для идентификации не только ко-
дирующих, но и регуляторных областей. Для Т-ДИК-инсерционного
мутагенеза используют различные варианты агробакгериальных
векторов, полученных на основе Ti-плазмиды Agrobacterium tume
faciens, в зависимости от задач исследований. В наиболее распро-
страненном варианте Т-ДНК-инсерционный мутагенез используют
для получения knock-out мутантов (рецессивных мутаций). В этом
случае для трансформации используют вектора, область Т-ДНК ко-
торых содержит, как правило, только селективный маркер, необходи-
мый для скрининга трансформантов. При трансформации растений
Т-ДНК встраивается случайным образом в геном растения. Встраи-
вание Т-ДНК в последовательность гена, как правило, вызывает на-
рушение его работы и приводит к потере выполняемой им функции.
Другим вариантом векторов, используемых для Т-ДНК-мутагенеза,
являются активалорные конструкции, область Т-ДНК которых со-
держит регуляторные элементы (например, энхансеры) (рис. 1.3: 2).
Встраивание такого регуляторного элемента рядом с последователь-
ностью гена приводит к активации экспрессии этого гена или изме-
нению паз терна его экспрессии (такие изменения, как правило, но-
сят доминантный характер). Третий тип векторов, используемых для
Т-ДНК-мутагснсза, используют для поиска регуляторных элементов
у растений. В этом случае встраиваемая Т-ДНК содержит репортер-
ный ген. Если в результате встраивания в геном растения участок
Т-ДНК, содержащий репортерный ген, попадает в зону действия ре-
гулятора транскрипции, то экспрессия репортерного гена активиру-
ется. В таком варианте Т-ДНК представляет собой «ловушку» для
регуляторных элементов (рис. 13: 3, 4, 5). Репортерный ген может
встраиваться в кодирующую область растительного гена, в этом слу-
чае при экспрессии такой конструкции может наблюдаться образова-
ние гибридного белка, включающего белковый продукт, кодируемый
растительным геном, в который произошла вставка, слитый с репор-
терным белком (рис. 1.3: 4, 5).

Рассмотрим более подробно один из вариантов таких конструк-
ций, который часто используют для изучения различных аспектов
развития растений, а именно «ловушки для энхансеров» GAL4:GFP.
В этой системе используют дрожжевой ген, кодирующий белок-
активатор GAL4, связывающийся с UAS и активирующий экспрес-
сию генов, в премоторной области которых содержится UAS. В ре
зулыате активируется экспрессия репортерного гена GFP. Когда
такая конструкция попадает под действие энхансера, мы видим све-
чение GFP (рис. 1.4).

Таким образом был выявлен целый ряд тканеспепифичных эн-
хансеров, и для арабидопсис, в частности, получена целая коллекция
1. Геномноя ДНК дикого типе

Энхансер	1A f Д

2. Активипуьищоя последовательность (activation tag)

3. «-Ловушка для энхснсеро» (enhancer trap)

4. «Ловушка для промотора» (pr omoter trap) — 1

Инссрция в экзон

Энкангч ТАТА

5 «Г овушко для промотора» (promoter trap) — 2

Энхонге TATA

Sb SA

гибгид bit'
бглок

Инссрция в интрон

сл

сплайсинг

Splice aceptor sequrnce

гибрид МИ
& лок

Рис. 1.3. Примеры испэльззвания Т ДНК в качестве «зондов» для выявления
(«ловушек») кодирующих и регуляторных областей (Т DNA tagging)

линий, содержащих конструкцию CAL4.GFP под действием различ-
ных энхансеров. Такие линии широко используются для изучения
различных аспектов развития растений. Конструкция GAL4:GFP под
контролем I канеснецифичного энхансера может активировать экс-
МП - Минимальный промотор

Т - Терминатор

—Солектииныймаркер например,
—	устойчивость к антибиотику

Рис. 1 4. Принцип работы системы GAL4:GFP под контролем энхансера,
специфичного для конкретного типа клеток: активация экспрессии гена-мишени
(ген X) в клетках конкретного типа (специфичность определяется работой энхансера)

прессию гена мишени в клетках конкретного типа (специфичность
определяется энхансером). Так, растение с GAL4:GFP можно скре-
стить с растением, содержащим другую конструкцию UAS:reH X,
и в результате такого скрещивания в геноме происходит объедине-
ние двух систем. В результате у потомка-гибрида GAL4 запускает
не только экспрессию белка-репортера, но и гена интереса (ген X),
поскольку ген X находится под контролем GAS.

«Ген X» может предст авлять собой любой ген. В некот орых слу-
чаях такую систему используют для генетически направленного
удаления определенных групп клеток растений (generic ablation),
аналогичного выжиганию конкретных клеток лазером (см. главу
«Клональный анализ»). «Ген X» может кодировать белок-токсин, на-
пример дифтерийный токсин А, в этом случае его экспрессия в клет-
ках определенного типа ткани (а эта специфичность определяется
энхансером) приводит к их апоптозу.

TILLING - Target Induced Local telsons IN Genomes

Метод TILLING позволяет идентифицировать толковые мутации
в генах с известной последовательностью, т. е. также является ме-
тодом обратной генетики. Этот метод сочетает мутагенез с исполь-
зованием, например, этилметансульфоната, вызывающего точковые
мутации, такие как замены оснований, с эффективными методами
скрининга мутаций на уровне ДНК в гене интереса. Рассмотрим
один из примеров использования такого метода. Из мутантных форм
растений выделяют ДНК и проводят амплификацию гена инте-
реса (обычно выбирают его консервативный участок, важный для
функционирования гена) с использованием праймеров, меченных
флуоресцентным красителем. Затем смесь нагревают, денатуриру-
ют и охлаждают. Если в амплифицированных продуктах содержа-
лись какие-либо замены, реассоциация молекул после денатурации
приводит к образованию гетеродуплексов с неспаренностями. Суще-
ствуют специфические рестриктазы, осуществляющие разрезание
ДНК по неспаренностям, например CELL Далее продукты иссле-
дуют с помощью денатурирующего электрофореза или денатури-
рующей высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
Результаты анализируют и выявляют те образцы, которые содержали
неспаренности, и проверяют у них наличие точковой мутации в гене
интереса путем секвенирования.

1.3.	Изучение экспрессии генов у растений

Изучение экспрессии генов является необходимым этапом работы
по исследованию функции того или иного гена, позволяет выявить
факторы, регулирующие работу изучаемого гена, его взаимодейст вие
с известными регуляторными молекулами. Наряду с методами, раз-
работанными для изучения экспрессии отдельных генов, в настоя-
щее время все большее применение находят подходы по крупномас-
штабному изучению экспрессии генов, позволяющие одновременно
выявить целый спектр экспрессирующихся генов в анализируемом
образце с помощью технологии микрочипов. Такие исследования
позволяют выявить гены, задействованные в тех или иных морфо-
генетических процессах, гены-мишени тех или иных регуляторных
факторов и т. п.

Изучение экспрессии генов возможно на разных этапах реали-
зации генетической информации: на уровне мРНК (посттранскрип-
ционный уровень), на уровне белка (посттрансляционный уровень).
Рассмотрим основные методы, использующиеся для анализа экс-
прессии генов у растений.

Изучение экспрессии генов нг уровне мРНК

Метод Нозерн-блот анализа, разработанный еще в 1977 г., ис-
пользуют для изучения экспрессии генов интереса и определения
размера мРНК, кодируемых генами интереса. Этот метод включа-
ет следующие стадии: выделение РНК из анализируемого образца,
разделение молекул РНК ио размеру с помощью гель-элсктрофореза
(как правило, используют агарозный гель, содержащий формальде-
гид в качестве денатурирующего агента, препятствующего обра-
зованию вторичных структур РНК), перенос молекул РНК из геля
на нейлоновую мембрану (собственно «блоттинг») и последую-
щую детекцию исследуемых молекул РНК с помощью меченых
зондов. Зонды представляю! собой молекулы нуклеиновых кислот
(как правило, представляющие собой РНК, в некоторых случа-
ях в качестве зондов используют кДНК, ДНК), комплементарные
исследуемым молекулам РНК. В Нозерн-блот анализе использу-
ют радиоактивно меченные зонды (радиоактивным изотопом 32Р),
обеспечивают высокую чувствительность детекции, но также воз-
можно использование и нерадиоактивно меченных зондов (напри-
мер, мечение с помощью биотина, дигоксигенина) с последующей
хемилюминесцентной/колориметрической детекцией. Нозерн-блот
анализ является довольно трудоемким методом, техническая слож-
ность при работе с РНК заключается в предотвращении деградации
РНК под воздействием РНКаз. Преимущество Нсзерн-блот анали-
за заключается в возможности определения размера исследуемой
мРНК, этот метод позволяет выявить продукты альтернативного
сплайсинга.

Другим методом, широко используемым в настоящее время для
изучения экспрессии генов у растений, является полимеразная
цепная реакция, сопряженная с обратной транскрипцией (ОТ-
ПОР) Этот метод основан на выделении РНК из анализируемого
образца, проведении обратной транскрипции и последующей поли-
меразной цепной реакции на матрице полученной кДНК. При про-
ведении обратной транскрипции используется фермент обратная
транскриптаза (РНК-зависимая ДНК-полимераза, ревертаза), по-
лученный генно-инженерным способом на основе последователь-
ности гена ревергазы ретровирусов (наиболее широко используется
ревертаза вируса мышиного лейкоза Молони (M-MuL V) и вируса
миелобластоза птиц (AMV)). Для работы обратной транскриптазы
необходимо наличие олигонуклеотидной затравки (праймеров). Для
этой цели часто используют олиго (dT) праймеры, которые отжига-
ются с поли-А «хвостом» на 3’ конце мРНК, также для некоторых за
дач (особенно для синтеза протяженных молекул кДНК) используют
случайные гексануклеотидные праймеры и специфичные прайме-
ры, комплементарные известным последовательностям изучаемой
мРНК. Затем па матрице полученной кДНК проводят ПЦР с исполь-
зованием праймеров, подобранных к последовательностям изучае-
мых генов.
При сравнительном анализе экспрессии генов в различных об-
разцах параллельно с оценкой экспрессии гена интереса необходи-
мо также исследовать экспрессию контрольного («референсного»)
гена, уровень экспрессии которого, как ожидается, должен быть
одинаков в сравниваемых образцах. В качестве таких контрольных
генов часто выбирают конститутивно экспрессирующиеся гены
«домашнего хозяйства»: ген актина, убиквитина, глицеральдегид-
3-фосфатдегидрогеназы (ГАФД) и др Стандартная ОТ-ПЦР, по-
зволяющая судить об уровне экспрессии анализируемого гена
по интенсивности свечения продуктов ПЦР в геле, представля-
ет собой полуколичественный метод анализа экспрессии генов.
Для количественной оценки экспрессии генов используют метод
ОТ-ПЦР в реальном времени (Real-time PCR), позволяющий
оценить количество образовавшегося продукта ПЦР. Варианты
ПЦР в реальном времени основываются на двух подходах: 1)
применение интеркалирующих флуоресцентных агентов, связы-
вающихся с двуцепочечной ДНК (SYBR Green), 2) использование
меченных флуоресцентными агентами олигонуклеотидных проб,
комплементарных участку продукта ПЦР (TaqMan, «молекуляр-
ные биконы»). Прибор для проведения ПЦР в реальном времени
представляв! собой амнлификатор, снабженный детектором флуо-
ресценции. В ходе проведения реакции строятся кривые, соответ-
ствующие изменению интенсивности флуоресценции в каждой
конкретной пробирке. Увеличение интенсивности флуоресценции
соответствует увеличению количества образовавшегося продукта
ПЦР. Для количественной оценки используют значение «порого-
вого цикла», соответствующего номеру цикла ПЦР, на котором
интенсивность флуоресценции достигает некоего порогового
значения. Значение порогового цикла обратно пропорционально
логарифму исходных копий мРНК/кДНК, содержащихся в про-
бирке. При проведении ОТ-ПЦР синтез кДНК на матрице кДНК
и последующая ПЦР в реальном времени на матрице кДНК могут
представлять собой две отдельные стадии реакции. Такой вари-
ант удобен, когда на матрице кДНК необходимо проведение ПЦР
с большим набором различных праймеров для анализа экспрессии
различных генов. Также возможен вариант ОТ-ПЦР «в одной про-
бирке», когда в реакционную смесь для ПЦР в реальном времени,
дополнительно содержащую фермент для эффективного синтеза
кДНК, добавляют непосредственно РНК, выделенную из анали-
зируемого образца. Такой вариант позволяет уменьшить трудоем-
кость и минимизировать контаминацию при проведении ОТ-ПЦР.
ОТ-ПЦР в реальном времени широко используется для анализа
экспрессии генов у растений.

Анализ экспрессии генов с помощью микрочипов позволяв!
получить информацию об экспрессии не одного или нескольких, а
многих (тысяч) генов одновременно, иными словами, получить про-
филь (паттерн) экспрессии генов в анализируемом образце. В основе
технологии микрочипов лежит принцип параллельной гибридиза-
ции смеси меченых нуклеиновых кислот (молекул мРНК) с тысяча-
ми специфичных фрагментов нуклеиновых кислот (зондами), им-
мобилизованных на подложке в определенном порядке. Существует
несколько технологий изготовления микрочипов. Зонды могут быть
синтезированы in situ непосредственно на поверхности микрочипа.
Кроме того, зонды могут быть синтезированы независимо и затем
нанесены на химически модифицированные поверхности чипов.
Наиболее распространенными в настоящее время вариантами ми-
крочипов, в изготовлении которых используется технология синтеза
зондов in situ, являются чипы, выпускаемые компанией Affymetrix.
Зонды синтезируются уникальным фотолитографическим способом
и состоял из коротких 20-25 олигонуклеотидов, комплементарных
последовательностям исследуемых генов. При этом каждому гену
соответствует несколько таких олигонуклеотидов (обычно 14-20),
что повышает точность и воспроизводимость анализа. Технология
Affymetrix обеспечивает изготовление чипов с большой плотностью
нанесенных на них зондов (порядка 500000 зондов на одной под-
ложке размером 1,28 * 1,28 см). Для проведения анализа экспрессии
генов с помощью микрочипов выделяют РНК из двух сравниваемых
образцов (например, опыт и контроль) и получают на их основе мо-
лекулы кДНК, меченные двумя флуоресцентными красителями (наи-
более часто используют красители СуЗ и Су5). После этого кДНК из
двух сравниваемых образцов, меченные различными флуоресцент-
ными красителями, смешивают и гибридизуют с размещенными на
одной подложке зондами. После гибридизации осуществляют ска-
нирование микрочипов, детектируя сигналы флуоресценции и опре-
деляя их относительные интенсивности в каждой содержащей зонд
«точке» чипа. На выходе получают данные об относительных уров-
нях экспрессии множества генов (вплоть до всех генов ор1анизма)
в анализируемых образцах

Завершение проекта по секвенированию генома арабидопсис
в декабре 2000 года позволило создать микрочипы, позволяющие
исследовать экспрессию генов у этого объекта на уровне целого ге-
нома. Например, компанией Affymetrix совместно с Институтом ге-
номных исследований (The Institute for Genomic Research, TJGR) раз-
работан микрочип ATH1, позволяющий одновременно исследовать
активность 23 750 генов арабидопсис. Результаты многочисленных
исследований экспрессии генов с помощью технологии микрочи-
пов сводят в базы данных, доступные в Интернете, например базы
данных по экспрессии генов ArrayExpress Европейского института
биоинформатики (European Bioinfonnatics Institute, EBI), Gene Ex-
pression Omnibus (GEO) Национального центра биотехнологической
информации (National Center for Biotechnology Information (NCB1))
и др., объединяющие результаты исследования различных исследо-
вательских институтов всего мира. Кроме того, разработаны специ-
альные интернет-ресурсы, включающие базы данных по анализу
экспрессии генов, позволяющие «виртуально» исследовать, на каком
этапе развития экспрессируется ген интереса, в каком органе или
ткани, какое влияние на его экспрессию оказывают факторы внеш-
ней среды. Примером такого ресурса является GENEVESTIGATOR
(https://www.gcnevestigator.com, ЕТН, Цюрих).

Ограничением описанных выше подходов является то, что они не
позволяют выявить локализацию экспрессии анализируемых генов:
данные о локализации экспрессии гена ограничиваются точностью
взятия растительного материала для выделения РНК. Современным
подходом для локального взятия растительного материала для вы-
деления РНК является метод лазерной диссекции, позволяющий под
микроскопом выбрать группы клеток для последующего анализа.
Такой подход позволяет оценить уровень экспрессии анализируе-
мых генов в единичных клетках.

При изучении экспрессии генов у растений часто стоит задача
определить, в какой именно ткани, в каком типе клеток и в каком
клеточном компартменте экспрессируется анализируемый ген. Для
этой цели используют два основных подхода — гибридизацию in situ
и анализ активности гена с помощью репортерных конструкций.

Гибридизация in situ позволяет локализовать зоны экспрессии
изучаемого гена прямо на срезах фиксированной ткани растения.
Для проведения гибридизации in situ используют меченые зонды,
комплементарные мРНК анализируемого гена. Размер т аких зондов
составляет обычно 200 500 п. о. Как правило, зонды представляют
собой молекулы одноцепочечной антисмысловой РНК, меченные
с помощью радиоактивных изотопов или нерадиоакт ивным способом
(с помощью биотина, дигоксигепина, флуоресцентных красителей).
Зонды гибридизуют на препаратах предварительно фиксированных
образцов анализируемой ткани и анализируют под микроскопом
с использованием подходящих систем детекции сигнала. Гибриди-
зация in situ представляет собой надежный, но довольно трудоемкий
и технически сложный метод локального анализа экспрессии генов.

Относительно новый подход для локального анализа экспрессии
генов представляет собой ОТ-ПЦР in situ, сочетающий черты мето-
да гибридизации in situ и ОТ-ПЦР. Для проведения ОТ-ПЦР in situ
также требуется получение срезов образцов ткани, их специальная
обработка (в том числе ферментами ДНКазами). После этого кусочек
ткани помещают в пробирку, добавляют смесь для реакции обратной
транскрипции со специфичными праймерами и последующей ПЦР
со специфичными праймерами и мечеными (например, с помощью
дигоксигенина (DIG)) нуклеотидами. После ПЦР фрагмент ткани
извлекают из пробирки, осуществляют детекцию метки (например,
при использовании в качестве метки DIG используют специфич-
ные к DIG антитела) и проводят микроскопический анализ. Вместе
с этим наличие продуктов в смеси после ПЦР анализируют с помо-
щью гель-элекгрофореза. Метод ОТ-ПЦР in situ является технически
трудным, однако в литературе описаны случаи его успешного при-
менения для анализа экспрессии генов растений.

Другим подходом, активно используемым для анализа экспрес-
сии генов у растений, является анализ активности гена с помо-
щью репортерных конструкций, содержащих репортерный ген,
«слитый» с промотором изучаемого гена (promoter-reporter fu-
sion). Для изучения транскрипции с использованием реиортерных
генов, акгивность которых легко детектируется, сливают кодирую-
щую часть репорт epnoi о гена, включающую сайт инициации транс-
ляции ATG, с промоторной и регуляторной областью растительного
гена, транскрипцию которого хотят исследовать. Поскольку особен-
ности экспрессии юнов растений чаще всего определяются регуля-
торными цис-элементами, которые расположены в 5'-области гена,
репортерный ген сливается с фрагментом около 1500-2500 п. н.,
содержащим как премоторную область, необходимую для инициа-
ции транскрипции, так и регуляторную 5'-область гена (рис. 1.5, а).
Если цис-элементы, определяющие специфичность транскрипции,
расположены в интроне или З'-области, эти регуляторные участки
сливают с промотором, который можно взять как от исследуемого
растительного гена, так и от репортерного гена (рис. 1.5, б). Можно
использовать и минимальный промотор от гена 35S вируса мозаики
цветной капусты (рис. 1.5, в).

Все эти варианты слияния генов называют транскрипционными
слияниями: они приводят к образованию химерного транскрипта,
АТС

растительный ген

ATG

репортерный ген

Рис. 1.5. Транскрипционные слияния репортерню гена с регуляторными участками
растительного гена (пояснения в тексте)

Рис. 1.6 Выявление регуляторных цис-злементов с помсщьи! транскрипционных
слияний репортерного гена с регуляторными участками растительного гена.

Цифрами 1-3 обозначены регуляторные элементы в 5’- облает и гена, латинскими
буквами - ткани, где наблюдае1ся экспрессия гена (пояснения в тексте)

но не химерного белка. Такие генные конструкции позволяют ис-
следовать особенности транскрипции генов в онтогенезе, изучать ее
зависимость от разных генетических, физиологических, средовых
факторов.

Транскрипционные слияния с репортерными генами — важней-
ший инструмент поиска и изучения регуляторных последовательно-
стей в генах растений. Мы уже упоминали этот подход в подглаве
«Методы обратной генетики», говоря об использовании Т-ДНК в ка-
честве зондов для выявления регуляторных последовательностей
(использование Т-ДНК, содержащей репортерный ген, в качестве
«ловушки» для промоторов/энхансеров). С помощью этого подхода
можно изучать особенности регуляции экспрессии изучаемого гена.
На первом этапе исследователь выявляет участки тела, содержащие
регуляторные элементы (5'-область, интроны, З'-область), сравнивая
профиль экспрессии слитых генов с тем, который выявляется мето-
дом гибридизации in situ. На втором с помощью генно-инженерных
методов получает измененные варианты выявленной регуляторной
области (делении, а затем и нуклеотидные замены). Исследуя влия-
ние делений и мутаций в регуляторной области гена на особенности
транскрипции слитого гена, можно выявить цис-элементы, обеспе
чивающие эти особенности (рис. 1.6). Так, например, показанное
на рисунке 1.6 сравнение паттернов транскрипции целетированпых
версий регуляторных участ ков, слитых с репоргерным геном, позво-
ляет сделать следующие выводы: цис-элемент 3 обеспечивает транс-
крипцию в тканях В, элемент 2 — в тканях D, Е и F, а элемент 1
подавляет транскрипцию в тканях D.

Для изучения всех пространственных и временных особенностей
транскрипции гена необходимо получение стабильных трансфор-
мантов (наиболее эффективна агробактсриальная трансформация).
Для поиска регуляторных элементов можно использовать времен-
ную (транзитную) экспрессию трансгена в клетках. Для этой цели
проводят трансформацию тканей растений баллистическим методом
или вводят трансгены в протопласты с помощью электропорации.
Трансгены могут транскрибироваться в цитоплазме в течение не-
скольких часов (до 48 ч), даже не встраиваясь в геном. С помощью
такого подхода можно выяснять, какие внешние (свет, температура,
стрессовые воздействия) и внутренние условия (например, фитогор-
моны) влияют на транскрипцию гена, и какие цис-элементы важны
для ответа гена на эти воздействия.

Чаще всего в качестве репортерных генов используют гены
Р-глюкуронидазы (GUS), зеленого флуоресцентного белка (GFP),
люциферазы (LUC). У трансгенных растений по локализации про-
дукта гена-репортера судят об активности промотора анализируемо-
го гена, запускающего экспрессию гена-репортера: считается, что те
клетки/ткани, в которых присутствует продукт гена-репортера, соот -
ветствуют клеткам/тканям, в которых экспрессируется анализируе-
мый ген.

Рассмотрим основные гены-репортеры, используемые для ана-
лиза активности промоторов. Ген ^-глюкуронидазы (GLS) (ген
uidA (gusA) из Escherichia coli) широко используется для изучения
активности промоторов, поскольку позволяет выявить слабый уро-
вень экспрессии гена и определить локализацию продукта на кле-
точном и тканевом уровне. Белок GUS является стабильным и на-
капливается в тканях трансгенных растений, чю затрудняет его
использование для исследования тонкой динамики экспрессии гена.
Продукт гена GUS представляет собой фермент, гидролизующий
p-глюкурониды. Наиболее распространенным субстратом для GUS
является Xglue (5-бром-4-хлор-3-индолил-бета-О-глюкуронид),
в результате ферментативного гидролиза которого и последующих
реакций окисления и димеризации образуется нерастворимый про-
дукт синего цвета. У ^трансформированных растений продукты
растительных глюкуронидаз практически не выявляются. Для вы-
явления активности GUS у трансгенных растений ткани растений
помещают в раствор для окрашивания, содержащий субстрат X-
gluc, а также другие необходимые для реакции реагенты, включая
ферри- и ферроцианиды, необходимые для образования конечного
нерастворимого продукта реакции, и инкубируют до появления си-
него окрашивания. При окрашивании происходит повреждение тка-
ней растений, поэтому в тех случаях, когда требуется проследить
динамику экспрессии гена «прижизненно» без разрушения тканей
растений, используют другие гены-репортеры, в частности, коди-
рующие различные флуоресцентные белки, выявляемые методами
флуоресцентной микроскопии.

Наиболее широко распространенным репортерным геном, ко-
дирующим флуоресцентный белок, является GFP (Green Fluores-
cent Protein) из медузы Aequorea victoria. Флуоресцентный белок
GFP является достаточно стабильным и позволяет определить ло-
кализацию продукта на клеточном и тканевом уровне. Существует
несколько вариантов GFP с измененными последовательностями
аминокислот в области хромофора и соответственно измененными
спектрами поглощения и возбуждения флуоресценции: YFP(желтый
флуоресцентный белок), BFP (синий флуоресцентный белок), CFP
(циановый флуоресцентный белок) и другие.

Также известны флуоресцентные белки, полученные из кораллов,
например DsRED, выделенный из коралла рода Discosoma. Флуо-
ресцентные белки, такие как GFP, DsRED, являются достаточно
стабильными (например, период полужизни GFP составляет около
1 дня, a DsRED — около 4 6 дней), что затрудняет их применение
для анализа временной динамики активности генов. В связи с этим
интересной модификацией белка DsRED является мутантный вари-
ант DsRED- Е5. Особенность этой формы белка состоит в том, что
в процессе созревания белка DsRED-E5 происходит сдвиг максиму-
ма его флуоресценции из зеленой в красную область спектра. Такая
особенность позволяет использовать DsRED-E5 для анализа вре-
менной динамики активности промотора: соотношение «зеленой»
и «красной» форм белка DsRED-E5 служит показателем того, как
давно произошла индукция экспрессии гена (активация промотора
исследуемого гена) в анализируемой ткани.

Использование в качестве репортера гена люциферазы (LUC)
светлячка позволяет определить локализацию продукта на ткане-
вом уровне. Преимуществом использования гена-репортера LIJC
для анализа активности промотора является возможность количе-
ственной оценки уровня экспрессии анализируемого гена. Кроме
того, люцифераза является короткоживущим белком, в связи с этим
ген-репортер LUC может использоваться для изучения динамиче-
ских процессов. В частности, с использованием гена-репортера LUC
возможно наблюдать суточные колебания в активности промоторов
генов растений, экспрессия которых регулируется циркадными рит-
мами.

Транскрипционные слияния с генами-репортерами широко при-
меняются для изучения временной и пространственной экспрессии
генов. Однако при проведении такого рода исследований данные по
активности гена-репортера должны быть соотнесены с данными по
анализу экспрессии изучаемого гена, полученными с помощью дру-
гих методов анализа, поскольку не всегда результаты, полученные
с помощью анализа активности промоторов, соответствуют реаль-
ной картине экспрессии гена в тканях растений. Цис регуляторные
премоторные области генов имеют сложную организацию и не во
всех случаях последовательности размером 2000--3000 п. н., распо-
ложенные до старт-кодона (которые обычно используются в такого
рода исследованиях), достаточны для осуществления «правильной»
транскрипции с анализируемою промотора. Кроме того, в ряде слу-
чаев в регуляции экспрессии гена, помимо премоторных регулятор-
ных последовательностей, также задействованы последовательно-
сти, расположенные внутри гена, например, в составе интронов, а
также в 3’-некодирующих областях гена. Как уже отмечалось, такие
репортерные белки, как GUS и GFP. характеризуются относительно
продолжительным периодом полужизни в клетках растений, вслед-
ствие чего активность репортерного гена может сохраняться в клет-
ках растений в течение некоторого времени после прекращения
транскрипции с анализируемого промотора.

Изучение экспрессии генов на уровне белка

В дополнение к данным по анализу активности изучаемого
гена на уровне мРНК также важно изучение экспрессии генов
АЮ

растительный ген

АТО

репортерики ген

ATG

ГАТА

трансляционное слияние

Рис. 1.7. Трансляционные слияния

на уровне белка. Например,
данные по локализации мРНК
и белкового продукта исследу-
емого гена могут не совпадать
вследствие посттранскрипцн-
онной регуляции экспрессии
гена (например, регуляции экс-
прессии гена с помощью ми-
кроРНК), перемещения белка
за пределы клеток, в которых
он был синтезирован, и других
причин.

Методические подходы для из-

репортерного гена с регуляторными
участками и растительного гена
(пояснения в тексте)

учения экспрессии геноз на уров-
не белка включают; Вестерн-блот
анализ, иммунолокализацию бел-
ков, использование флуоресцент-

ных «меток», «пришиваемых» к аминокислотной последовательности
белка генно-инженерным способом, и другие.

Веетсрн-блот анализ представляет собой метод выявления изу-
чаемого белка в образце. Метод основан на разделении нативных или
денатурированных белков в геле путем электрофореза с последую-
щим переносом белков на мембрану (например, из нитроцеллюлозы)
и детекции исследуемого белка с помощью специфичных антител.
Определить локализацию исследуемого белка в тканях растений по-
зволяет иммуногистохимический анализ — иммунолокализация
белка в тканях растения на микроскопических препаратах. В этом
методе также используют антитела, специфичные к анализируемо-
му белку. Как правило, в таких исследованиях используют два типа
антител: немеченые первичные антитела, специфичные к анализи-
руемому белку, и содержащие метку (например, флуоресцентную)
вторичные антитела, специфично связывающиеся с первичными
антителами. Так, например, если первичные антитела, специфичные
по отношению к исследуемому белку, были получены в организме

кролика, то для их детекции используют вторичные антитела, по-
лученные против белков кролика (нротивокроличьи), полученные
в организме другого неродственного животного, например, мыши
или козла. Однако в настоящее время развивающиеся технологии
иммуногистохимических исследований позволяют осуществлять
мечение непосредственно антител, специфичных к анализируемым
белкам, что повышает специфичность анализа.
Кроме того, для изучения экспрессии генов на уровне белка также
используют репортерные гены. В этом случае в состав слитого гена
включаются не только регуляторная и премоторная части раст отель-
ного гена, но и начало кодирующей части, обязательно включающий
сайт инициации трансляции. Кодирующая часть репортерного гена
не должна иметь ATG-сайт, что приводит к образованию не только
химерного транскрипта, но и химерного белка (рис. 1.7). Это позво-
ляет изучать локализацию белка в клетке и оценивать влияние на его
содержание разных факторов (например, гормонов).

Отметим, что такие трансляционные слияния репортерных генов
с растительными генами, которые кодируют белки, имеющие разную
внутриклеточную локализацию, представляют большую ценность
для цитологов. Сейчас выявлены гены, продукты которых можно ис-
пользовать как маркеры плазмалеммы, клеточный стенки, цитоске-
лета, митохондрий, хлороплас гов, ядра

Представленное описание современных методов изучения экс-
прессии генов у растений является далеко не полным. Технические
средства для анализа экспрессии генов постоянно развиваются и со-
вершенствуются.

1.4.	Методы получения химерных растений

Важным направлением генетики развит ия растений является изуче-
ние факторов, влияющих на путь дифференцировки клеток, в том числе
роли клеточного окружения в определении судьбы клетки. Инструмен-
том такого рода исследований является клональный анализ, которо-
му посвящена отдельная глава нашего учебника. Клональный анализ
основан на исследовании поведения отдельных групп клеток, имеющих
общую клональную историю, в ходе развития целого организма. Для
проведения клонального анализа необходимо «маркировать» клетку
(или ipyniiy клеток) таким образом, чтобы в дальнейшем было воз-
можно «проследить» судьбу этой клетки и се потомков. Основным спо-
собом такого «маркирования» клеток является получение структурно-
генетических химер, то есть получение таких растений, у которых часть
клеток генетически и структурно отличается от остальных клеток. Рас-
смотрим основные методы получения химер у растений.

Получение структурно-генетических химер с гомощью
транспозонного мутагенеза

Для получения химер растения с использованием одного
транспозона (однокомпонентная система) достаточно получить
клон клеток, маркированных GUS

Рис. 18. Маркирование клеток
репортерлым геном с использованием
транспозона кукурузы Ас Стрелками
обозначены повторы, фланкирующие

транспозон

одну линию трансгенных рас-
тений, содержащую автоном-
ный транспозон в составе век-
торной плазмиды. Например,
для получения химерных рас-
тений A. ihaliana транспозон
кукурузы Ас можно встроить
в векторную плазмиду (в об-
ласть Т-ДНК модифицирован-
ной Ti-нлазмиды агробактс-
рии Agrohacterium tumefaciens)
между репортерным геном
и конститутивным промото-
ром вируса мозаики цветной
капусты 35S РНК. У трансфор-
мированных растений Т-ДНК
интегрирована в геном, и в от-
дельных клетках автономный
транспозон может выходить из
ее состава. Это восстанавли-
вает активности репортерного

гена в этих клетках и у всех их
потомков, т. к. репортерный
ген оказывается под контролем
35S промотора. В результате
возникают клоны клеток, мар-

кированных активностью ре-

портерною гена (рис. 1.8).

Недостатком использования однокомпонентных систем транспозо-

нов является невозможность контроля за перемещением транспозона
и, как результат, невозможность четкого разграничения клонов, ко
торые имеют независимое происхождение, но возникли в результате
пролиферации клеток, расположенных рядом.

Двухкомпонентные системы транспозонов являются более
удобными для клонального анализа. Они позволяют контроли-
ровать перемещение транспозона, позволяют индуцировать мо-
заицизм на любой интересующей исследователя стадии онтоге-
неза. Чтобы процесс транспозиции мобильного элемента сделать
индуцибельным, сначала получают две отдельные трансгенные
линии: (1) линию с неавтономным элементом, который не имеет
функционально активного гена транспозазы (например, с элемен-
клон клет ок, маркирован ных YFP флус ресценция YFP в ядре

Рис. 1.9. Маркирование клеток репортер ным геном H2B::YFP с использованием Ac/Ds
трансгозоьов кукурузы

Ген транспозазы находится под промстсром гена теглоьсгс шока (HSP) Репортерный
ген YFP, слитый с участком гена гистона Н2В. необходимым дгя транспортировки
белка в ядро (H2B: YFP), дает возможность просматривато сразу несколько слоев
клеток (при экспрессии в цитоплазме такой просмотр затруднен)

том Ds кукурузы), разделяющим 35Х-промотор и репортерный
ген; (2) линию с геном транспозазы под контролем индуцибель-
ного промотора (обычно используют промоторы генов теплово-
го шока A. thciliona или сои). В качестве источника транспозазы
часто используют модифицированный Яс-элемент, который не
способен к транспозициям из-за делении одного из фланкирую-
щих повторов.

Растения полученных линий скрещивают и получают гибридное
потомство, имеющее в геноме оба элемента. После температурного
воздействия на растения в клетках гибридов начинает работать ген
транспозазы. Активность транспозазы вызывает эксцизию неавто-
номного элемента и приводит к восстановлению активности репор-
терною гена (рис. 1 9). Достаточно 20 30-минутной инкубации при
37-42°C, чтобы примерно половина проростков A. thaliana показы-
вали химерность по экспрессии репортерного гена в корнях, гипо-
котилях, семядолях и листьях. Температурное воздействие можно
сделать локальным, воздействуя лазерным излучением на отдель-
ные участки проростка.
Получение структурно-генетических химер с nt мощью
индуцированной соматической рекомбинации

Метод основан на использовании генов рекомбиназ дрожжей,
бактерий и бактериофагов. Эти ферменты способны узнавать корот-
кие специфические повторы и вырезать фрагменты ДНК, заключен-
ные между ними.

Управлять этим процессом можно, подставив ген рекомбиназы
под индуцибельный промотор (например, промотор гена теплового
шока). Следить за процессом вырезания удобно с использованием
репортерных генов, встроенных в трансген. На первом этапе полу-
чают две линии трансгенных растений: (1) линию с геном рекомби-
назы; (2) линию, содержащую специфические повторы, узнаваемые
рекомбиназой. Снаружи от повторов по разные стороны расположе-
ны конститутивный промотор 35S и кодирующая часть репортерного
гена. Гибриды от скрещивания этих линий объединяют в геноме оба
трансгена. После температурного шока в гибридных клетках начи-

клон маркированных кпоток

голубая окраска

Рис 1.10. Маркирование клеток репортерным геном GUS с использованием гена
рекомбиназы FLP Экспрессия гена GUS возможна после делении под действием
рекомбиназы маркерного гена устойчивости к гигромицину HYG, отделяющего
ре портерный ген от промотора 3bS. Нуклеотидные повторы, распознающиеся
рекомбиназой FLPобозначены стрелками
Рис. 1.11. Использование генов рекомбиназ для получения химер по интересующему
растительному гену (е данной схеме, по гену LFY)

Показаны генные кассеты е гибридном растении, которые получены от скрещивания
исход-ых трансгенных линий, гомозиготных по мутации Ify и содержащих по одной
генной кассете До использования теплового шока гибриды (А) имели мутантный
фенотип Ify (побегоподобные цветки), т. к. трансген LFY не экспрессируется Гибриды (Б)
имеют нормальный фенотип т. к. экспрессируют ген LFYпод собственным промотором.
Остальные пояснения в тексте.

нает экспрессироваться ген рекомбиназы, акт ивность которого при
водит к удалению участка трансгенной ДНК, заключенной между
повторами (рис 1.10). В результате репортерный ген соединяется
с промотором 35S, и его активность маркирует отдельные клоны
клеток, В зависимости от стадий онтогенеза, на которых проводится
гипотермическое воздействие и наблюдение за растениями, можно
обнаружить мозаичные растения разной структуры — от миксохи-
мерных и секторных до периклинальных.

С помощью рекомбиназ можно не только маркировать отдельные
клеточные клоны, но и получать химеры по любому интересующему
исследователя гену. С этой целью в генную кассету между повторами
или снаружи от них включают исследуемый ген Как и в описанном
выше варианте, сначала получают 2 линии растений (одна — с геном
рекомбиназы под индуцибельным промотором, вторая — с повтора-
ми, которые рекомбиназа распознает). Химерность у гибридов от
скрещивания двух линий индуцируется тепловым шоком, который
активирует ген рекомбиназы. Для получения исходных родительских
линий в обоих случаях используют растения, у которых собственный
ген инактивирован (гомозиготные по мутации исследуемого гена).

На рисунке 1.11 в качестве примера показано получение химер
по гену LFY и приведены схемы двух разных вариантов генных кас-
сет. которые можно использовать для получения химер, у которых
на фоне мутантных тканей появлялись клоны клеток дикого типа
(рис. 1.11 А) или на фоне тканей дикого типа — мутантные клетки
(рис. 1.11 Б). В первом случае используют растительный ген без про-
мотора. После температурного люка в тканях гибридных растений
появлялись клоны клеток, в которых в результате действия реком-
биназы происходит делеция гена GUS, который находится между
повторами и отделяет оастительный ген от промотора 35S. Клетки
и ткани, в которых начинает экспрессироваться растительный ген
(в данном примере ген LFY), можно отличить по отсутствию экс-
прессии в них репортерного гена (появляются неокрашенные клоны
клеток на фоне тканей, которые имели синюю окраску в результате
активности [3-глюкуронидазы).

Во втором случае для получения химер с мутантными клетками на
фоне тканей дикого типа в генную кассету между повторами вместе
с репортерным геном, работающим под контролем 35 S-иромотора,
включают функционально активный растительный ген под собствен-
ным промотором, что обеспечивает нормальное развитие растений
как исходной родительской, так и гибридной линии. Тепловое воз-
действие приводит к активации гена рекомбиназы и удалению всей
кассеты, что видно по появлению клеток, которые не проявляют ак-
тивности репортерного гена и исследуемого растительного гена.
Глава 2

Общие принципы регуляции развития
растений

В основе реализации принципов координированного раз-
вития растений лежит регуляция экспрессии генов в каждой
отдельной клетке в зависимости от разнообразных сигналов
внешней и внутренней среды. Жизненная стратегия растений
не предполагает активного избегания неблагоприятных усло-
вий, в связи с этим рост и морфогенез растений зависят от
множества внешних факторов, таких как уровень освещения,
температура, доступность воды и источников минерального
и органического питания. Отдельные сигнальные механизмы
растений связаны с ответом на разные виды стрессовых воз-
действий абиотических (отсутствие воды, засоление, резкие
изменения температуры, поранение и т. д) и биотических (за-
ражение патогенными организмами или поедание насекомы-
ми). К внутренним Лакторам, регулирующим все этапы разви-
тия растений, относятся фитогормоны: ауксины, цитокинины,
гиббереллины, абсцизовая кислота (АБК), этилен, жасмонаты,
брассиностерсиды и т. д. Синтез, метаболизм и передача сиг-
налов фитогормонов в растительном организме регулируется
в зависимости от внешних факторов и стадии развития.

Передача практически любого сигнала в клетке включает в себя
три основных этапа:

I.	Рецепция сигнала.

2.	Передача и усиление сигнала (путь сигнальной трансдукции).

3.	Изменение экспрессии генов.
На первом этапе сигнал специфически взаимодействуете белком-
рецептором.

Рецептор должен обладать следующими основными свой-
ствами.

1.	Специфически и с высокой аффинностью связывать определен-
ные сигнальные молекулы.

2	Не менять химической структуры сигнальной молекулы.

3.	При рецепции сигнальной молекулы запускать работу нижеле-
жащей системы передачи сигнала.

В растительной клетке рецепторы могут быть локализованы на
мембранах (как правило, на плазмалемме), в цитоплазме, в ядре,
в хлоропластах, иногда в других компартментах клетки.

У растений выявлены практически все основные типы рецеп-
торов, ранее обнаруженные у животных, наиболее распространен-
ными среди них являются:

1.	Рецепторы с ферментативной активностью (наиболее распро-
странены протеинкиназы). При связывании сигнала рецепторы
этого типа катализируют изменение химической структуры
следующего компонента пути передачи сигнала.

2.	Рецепторы, ассоциированные с G-белками. Связывание сигна-
ла рецепторами этого типа вызывает диссоциацию гетеротри-
мера G-белков с образованием свободных субъединиц а и Ру,
которые передают сигнал дальше

3.	Рецепторы — компоненты системы убиквитинирования бел-
ков. Связывание сигнала этими рецепторами вызывает убикви-
тинирование и последующий протеолиз репрессоров передачи
сигнала.

Кроме перечисленных вариантов, у растений имеются и другие
типы рецепторов. Пожалуй, единственный тип рецепторов, не вы-
явленный у растений, — это рецепторы, выполняющие функцию
транскрипционных факторов (аналогично рецепторам стероид-
ных гормонов животных). Таким образом, любая рецепция сигна-
ла у растений предполагает наличие системы передачи сигнала,
которая активируется при связывании сигнальной молекулы ре-
цептором.

Путь передачи сигнала, как правило, включает в себя после-
довательное изменение активности нескольких эффекторных бел-
ков, это могут быть ферменты, белки-переносчики, компоненты
системы убиквитинирования и т. д.

Особое место в передаче сигнала в клетке занимают вторичные
мессенджеры, или вторичные посредники, — небольшие сигналь-
ные молекулы, синтез которых запускается при рецепции и пере-
даче сигнала; они перемещаются по клетке и запускают работу
белков, участвующих в сигнальной трансдукции. Большинство
систем вторичных мессенджеров, изученных у животных, были
обнаружены и у растений. Список вторичных мессенджеров, ко-
торые используются для передачи сигналов в клетках растений,
включает в себя G-бслки, цАМФ (циклический аденозин-3',5'-
монофосфат), цГМФ (циклический гуанозин-3',5'-монофосфал),
производные фосфолипидов, ионы Н+ и Са2', закись азота (NO),
вещества группы ROS (Reactive Oxygen Species) и другие химиче-
ские соединения биогенного и небиогенного происхождения.

Одной из функций вторичных мессенджеров является усиле-
ние сигнала, что приводит к организации сигнального каскада,
в котором интенсивность сигнала усиливается на каждом этапе.
Например, одна а субъединица G-белков может активировать бо-
лее 10 молекул фосфолипазы С; одна молекула ауксина, активи-
руя работу Н+-АТФазы, приводит в движение около 10000 прото-
нов (см. ниже). За счет наличия сигнальных каскадов первичный
сигнал, воспринимаемый рецептором, может вызвать физиоло-
гический ответ, даже действуя в очень маленькой концентрации.
Другой важной функцией вторичных мессенджеров является воз-
можность взаимодействия и перекрестной активации нескольких
сигнальных путей, что важно для координированного развития
растений в зависимости от различных сигналов.

На последнем этапе передачи сигнала имеет место изменение
активности транскрипционных факторов и, как следствие, из-
менение уровней экспрессии генов. Каждый конкретный сигнал,
активируя свой путь сигнальной трансдукции, влияет на актив-
ность определенной группы транскрипционных факторов. Транс-
крипционные факторы разных групп взаимодействуют с консер-
вативными последовательностями в промоторных областях генов,
меняя уровень их транскрипции.

Ниже мы рассмотрим некоторые типы рецепторов, транскрип-
ционных факторов и компонентов сигнальных путей, которые,
как было показано, играют ключевую роль в развитии растений.
Их более детальному рассмотрению посвящены разделы 2 и 3 дан-
ного учебника.

2.1. Основные группы рецепторов растений

У растений наиболее широкое распространение получили рецеп-
торные протеинкиназы, рецепторы, ассоциированные с G-белками,
Таблица 2.1

Основные группы рецепторов, участвующих в регуляции развития растений

Молекулярная при- рода рецепторов		Основные представители	Функция
Рецепторные протеинкиназы	Рецептор- ные His- протеинкиназы	АНК2, АНКЗ, AHK4/CRF.1/WOL	Рецепторы цито- кинина
		ETR1, ETR2, EIN4, ERS1 и ERS2	Рецепторы эти- лена
		Фитохромы PHYA, PHYB, PHYC, PHYD и PHYE	Рецепторы крас-  ного света
	Рецептор- ные Ser/Thr- протеинкиназы	CLV1 и CLV2	Рецепторы CLV3, поддержание ак- тивности ПАМ
		BRI1 и ВАК	Рецепторы брас- си ностероидов
		NB-LRR, цитоплазматические RLK	Рецепторы Avr белков, распозна- вание патогена
Рецепторы, ас- соци про ванные с G-бел кам и		АВР1	Рецептор ауксина
		GCR2, GTGi, GTG2	Рецепторы абсци- зовой кислоты
Компоненты систе- мы убиквитиниро- ваичя		TIR1 — F-бокс-содержащий белок SCF-комплекса ЕЗ убиквитин-лигазы	Рецептор ауксина
		GID1 — растворимый ядерный белок, связывающийся с F-бокс-содержащим белком SCF-комплекса ЕЗ убикви~ин- лигазы	Рецептор гиббе- реллина

и рецепторы, взаимодействующие с системой убиквитинирования
белков (табл. 2.1).

Рецепторные протеинкиназы

Значительная часть рецепторов растений представлена проте-
инкиказами, Рецепторные прозеинкиназы (РПК) эукариот делятся
на три больших класса на основании субстратной специфичности:
тирозип-киназы (Tyr-киназы), серин/треонин-киназы (Ser/Thr-
киназы) и гистидин-киназы (His-киназы). У животных большую
часть РПК составляют Tyr-киназы, тогда как у растений наиболее
распространены Ser/Thr- и His-киназы. В частности, к His-киназам
относятся рецепторы фитогормонов этилена и цитокининов. Значи-
тельную часть Ser/Thr-киназ растений составляют протсинкиназы
с лейцин-богатыми повторами (LRR киназы), молекулы которых со-
держат трансмембранный домен, киназный домен и экстраклеточную
сигнальную последовательность LRR (Leucin-Rich Repeat). К этой
группе относятся рецепторная киназа CLAVATA1, необходимая для
контроля развития апикальной меристемы побега, рецептор брасси-
ностероидов BRI 1, а также большое семейство рецептороподобных
цитоплазматических киназ, лишенных лиганд-связывающе! о доме-
на, которые играют ключевую роль в контроле защиты растений от
патогенов. Помимо перечисленных групп рецепторных протеинки-
наз, у растений имеются протеинкиназы с двойной специфичностью:
например, киназа PRK1, работающая в пыльцевых зернах, которая
может автофосфорилироваться по остаткам Ser и Тут, и протеинки-
наза SFRK, участвующая в контроле соматического эмбриогенеза,
которая фосфорилирует белки-мишени по остаткам Ser, Thr и Туг.

Рецепторные гисгидинкиназы — элементы двукомпонент-
ных сигнальных систем

Двукомп >нентные системы —один из консервативных вариантов
организаци i сигнальных путей, распространенный у про- и эукари-
от. В частности, у растений двукомпонентные системы участвуют
в передаче сигнала фигогормонов (цитокининов и этилена), а также
в ответе на стресс и световой сигналинг.

Простые двукомпонентные системы очень распространены
у прокариот и играют основную роль в адаптации к изменяющимся
условиям внешней среды (хемотаксис, осмотическая регуляция, вы-
работка поринов и т. д.). Известно, что у Esherichia coli примерно
1 % генов кодирует бсщки-участники двукомпонентных систем, что
свидетельствует об их важности в жизни бактерий.

Простая двукомпонентная система бактерий состоит из двух бел-
ков:

•	сенсорной гистидин-киназы (Hystidine Kinase, НК);

•	регулятора ответа (Response Regulator, RR).

Сенсорная гисгидин-киназа выполняет функцию рецептора
(как правило — трансмембранного). В состав молекулы сенсор-
ной гистидин-киназы входят лиганд-связывающий домен и пере-
дающий домен, который обладает гистидин-киназной активностью.
При связывании лиганда происходит димеризация белков НК и их
перекрестное фосфорилирование по консервативным остаткам ги-
стидина (His) в передающем домене. Следующим шагом является
передача фосфатной группы с передающею домена НК на регуля-
тор ответа. Регулятор ответа выполняет функцию транскрипционно-
го фактора. Его молекула включает в себя воспринимающий домен
на консервативный остаток аспарагиновой кислоты (Asp) в составе
которого передается фосфатная группа с НК, и ДНК-связывающий
эффекторный домен — регулятор транскрипции При фосфорилиро-
вании воспринимающего домена RR происходит активация регуля-
тора транскрипции.

Двукомпонентные системы эукариот и некоторых бактерий (на-
пример, система контроля вирулентности у Agrobacterium tumefa-
ciens) организованы по принципу фосфореле и отличаются более
сложной структурой. Фосфореле включает в себя:

1)	сенсорную гистидин-киназу (НК);

2)	гисгидин-фосфотрансферазный белок (ПР);

3)	регулятор ответа (RR).

Таким образом, в работе систем фосфореле имеется допел
нительный шаг — перенос фосфатной группы с помощью His-
фосфотрансферазпого белка (HP). Кроме того, у эукариот сенсорная
His-киназа приобретает дополнительный воспринимающий домен,
рецепторы такого типа называют гибридными сенсорными His-
киназами. После автофосфорилирования киназного домена гибрид-
ная сенсорная His-киназа передает фосфатную группу на остаток
Asp в составе своего воспринимающего домена, затем фосфатная
группа передается на остаток Asp белка HP, который, в свою очередь,
переносит се на воспринимающий домен белка RR (рис. 2.1).

В геноме арабидопсис идентифицированы 54 гена, кодирую-
щие сенсорные His-киназы (АНК), His-фосфотрансферазные белки
(АНР) и регуляторы ответа (ARR).

Примеры рецепторных His-киназ у растений

Семейство рецепторов к цитокиникам у арабидопсис включает в себя 6 ги-
бридных сенсорных His-киназ: АНК1. АНК2, АНКЗ, AHK.4/CRE1/WOL, АНК5
(CKI2) и СКВ Среди них трансмембранные His-киназы АНК2, АНКЗ и АНК4
явля.отся функциональными рецепторами к цитокинину. Трансмембранный белок
CKI1 и цитоплазматический белок AHK5/CKI2, лишенный трансмембранного до-
мена, не связывают цитокинины in vitro, но также предположительно участвуют
в передаче сигнала при ответе на эти гормоны. Белок АНК1 принимает участие
в осмосенсинге.

Сенсорные His-киназы АНК2, АНКЗ и AHK4/CRE1/WOL при связывании ци-
токинина осуществляют автофосфорилирование, после чего передают фосфат-
ную группу на His-фосфопереносящие белки АНР, которые выполняют функцию
цитоплазматически-ядерных челноков и переносят фосфатную группу на ARR
белки двух типов: ARR В-типа, которые являются транскрипционными факторами,
и ARR A-типа. которые действуют как репрессоры ответа на цитокинины.

Семейство рецепторов к этилену у арабидопсис включает в себя пять бел-
ков: F.TR1, E1R2, E1N4, ERS1 и ERS2, которые являются функциональными рецеп-
Кропая iinKOMiuHieiiuiaw сшна 1ымя сисюма (бактерии)

Input Transmitter

< енсирная I m твдии-кана ia

активация
транскрипции

Receiver Output 1

регулятор ответа

1в> кочпипен I пая сиг „ильная ruci ема. оргаци юпанная но иринцину фосфоре ю
(растения)

__. активация
транскрипции

1 иГ рядная сенсорная	фосфпп< рсяося тай

1 HcrniuH-Knuaia	белок (КНР)

регулятор ответа (ARR)

(АНК)

Рис. 2.1. Сравнение организации дву компонентных систем передачи сигнала

у бактерий и растений (модифицировано по Ferreira and Kieber, 2005)

Обозначения доменов: Input — трансмембранный лиганд связывающий домен белков
НК, Transmitter — передающий домен, обладающий гистидин-киназной активностью,
Receiver — воспринимающий домен, на который передается фосфатная группа
с передающего домега, Output — эффекторный ДНК-связыва-сщий домен белков RR

торами к этилену. Все они имеют трансмембранный лиганд-связывающий домен
и His-киназный домен; в то же время у большинства рецепторов этого семейства
потерян ряд типичных характеристик гибридных сенсорных His-киназ: например,
у ETR2, EIN4 и ERS2 потеряны большинство консенсусных мотивов в составе
His-киназного домена, у ERS1 и ERS2 отсутствует воспринимающий домен. При
связывании этилена происходит автофосфорилирование His-киназных доменов эти-
леновых рецепторов, что приводит к активации нижележащих компонентов пути
передачи сигнала. Помимо His-киназной активности, рецепторы этилена обладают
также серин-треониновой (Ser-Thr) киназной активностью. При этом передача сиг-
нала при ответе на этилен не связана с передачей фосфатных групп и организова-
на совершенно по иному принципу, не имеющему отношения к двукомпонентным
системам (см. главу «Этилен»), Вместе с тем показано, что рецептор ETR1 может
передавать фосфатные группы на белки АНР, задействованные в пути передачи
сигнала цитокининов (рис. 2.2). Вероятно, это взаимодействие сигнальных путей
цитокининов и этилена важно для многих онтогенетических процессов, в контроле
которых эти две группы гормонов действуют в одном направлении.

Фитохромы — растительные фоторецепторы, относящиеся к группе сен-
сорных His-киназ и играющие ключевую роль в координации роста и развития
растений в зависимости от условий освещения. В клетках арабидопсис работа-
ют пять фитохромов' PHYA, PHYB, PHYC, PHYD и PHYE. В состав их молекул
CRE1	СКП	ETR1

Рис. 2.2. Взаимодействие путей передачи сигнала цитокининов и этилена через дву-
компонектные системы передачи сипела (модифицировано по Lohrmann, Harter, 2002)
His-фосфопбреносящие белки АЧР1 и АНР2 могут принимать фосфатные группы
как от рецепторов цитокинина CRE1 и СКП, так и oi рецептора этилена ETR1,
и передавать их на ARR В-типа (ARR2), так и ARR А типа (ARR4).

входят: сенсорный домен, ковалентно связанный с тетраииррольным хромофо-
ром, два PAS домена и His-кипазоподобный сигнальный домен. Помимо высших
растений, фитохромы имеются также у водорослей и цианобактерий. У фото-
синтезирующих прокариот ключевую роль в фоторецепции играют простые
двукомпонентные сигнальные системы: в частности, фитохром цианобактерий
Cphl является типичной сенсорной His-киназой и передает фосфатную груп-
пу на белок группы RR Rcpl В то же время у фитохромов высших растений,
несмотря на высокий процент гомологии с бактериальными фитохромами, от-
сутствуют важные для функции консенсусные мотивы в His киназном домене.
Тем не менее этот домен необходим для функции растительных фитохромов,
так как его удаление ведет к элиминации активности фоторецептора. Для ряда
фитохромов растений была продемонстрирована нс His-, а Ser/Thr-киназная ак-
тивность сигнального домена.

Серин-треониновые рецепторные прогеинкиназы

У высших растений представители класса Ser/Thr протеинкиназ
играют важную роль в контроле различных онтогенетических про-
цессов, а также в обеспечении защиты от патогенов. Значительную
часть их составляют рецепторные Ser/Thr протеинкиназы.

Одной из наиболее известных ipynn Ser/Thr протеинкиназ расте-
ний является семейство CI AVATA-подобных рецепторных киназ.
У арабидопсис выявлено более 20 белков этого семейства. Наиболее
изученными среди них являются киназы CLAVATA1 и CLAVATA2
(CI.V1 и CLV2), играющие ключевую роль в обеспечении баланса
пролиферации и дифберенцировки клеток в апикальной меристеме
побега. Белок CLV1 состоит из лиганд-связываюшего экстраклегоч-
ного LRR-домена и киназного цитоплазматического домена и об-
разует гетеродимерный рецепторный комплекс с белком CLV2, ли-
шенным киназного домена Лигандом этого рецепторною комплекса
является белок CLV3 (более подробно см. в главе 9).

Формирование рецепторных комплексов для связывания лиганда
типично для Ser/Thr прогеинкиназ растений. Аналогично рецептор-
ным киназам CLV1 и CLV2 гетеродимерные рецепторные комплексы
формируют рецепторы брассиностероидов: киназа BRI1, включа-
ющая в себя цитоплазматический киназный домен и экстраклеточ-
ный лиганд-связывающий LRR-домен, и цитоплазматическая киназа
ВАК, лишенная лиганд-сзязывающего домена.

Рецепторные Ser/Thr про1еинкиназы — ключевые регуляторы устойчиво-
сти к патогенам

Одну из наиболее распрос траненных групп Ser/Thr иротеинкиназ составляет
семейство NB-LRR, консервативное для всех эукариот. Эти цитоплазматические
белки содержат нуклеотид-связывающий (NB) домен и домен LRR и играют роль
в обеспечении иммунного ответа как у растений, так и у животных. Функцией ре-
цепторных киназ NB-lRR является узнавание и связывание определенных белков
патогена (так называемых белков РАМР, от Pathogen-Associated Molecular Patterns)
и активация сигнального каскада, приводящего к развитию защиты от патогена
Кроме того, белки NB-LRR могул транспортироваться в ядро и взаимодействовать
с транскрипционными факторами WRKY, которые, в свою очередь, активируют
работу генов, обеспечивающих защиту от патогена. Значительная часть R генов
растений, составляющих основу защитной системы «ген на ген» (или R-Avr, от
Resistance-Avirulence) кодирует рецепторные киназы семейства NB-LRR. Соответ-
ственно, секреторные; беджи патогенов, которые узнаются и связываются NB-LRR
киназами, являются продуктами Avr генов патогенных организмов.

Сходным образом могут действовать цитоплазматические рецепторо-
подобные Ser/Thr-киназы, лишенные LRR-домена, которые также участвуют
в распознавании патогена и индукции защитных реакций. Для связывания белков
патогена они образуют гетеродимсры с LRR-содержащими киназами. Например,
при обеспечении защиты риса от патогенной бактерии Xanthomonas oryzae цито-
плазматическая рецептороподобная киназа Xa21-D образует рецепторный комплекс
с LRR содержащей рецепторной киназой Ха21.

Рецепторы, ассоциированные с G-белками

G-белки — широко распространенная у всех эукариот группа
белковых вторичных мессенджеров, которая широко использует-
ся для передачи различных сигналов в клетке. G-белки делятся на
две группы: гетеро гримерные G-белки и мономерные, или малые,
G-белки.

Гетеротримерные комплексы G-белков передают сигналы от
рецепторов на поверхности клетки к нижележащим эффекторам,
в качестве которых выступают ферменты. У растений G-бслки ис-
пользуются для передачи внутриклеточных сигналов гораздо менее
широко, чем у других многоклеточных эукариот, тем не менее ре-
цепторы, ассоциированные с G-белками, играют важную роль в пе-
редаче сигнала фитогормонов (ауксинов и АБК).

Типичная структура рецептора, ассоциированного с G-белками
(GPCR G-Protein Coupling Receptor), включает в себя 7 транс-
мембранных доменов, между которыми располагаются цитоплазма-
тические консервативные последовательности для взаимодействия
с G-белками — так называемые DRY-мотивы. Необходимой характери-
стикой рецепторов GPCR является гуанозин- обменная активность.

Комплекс G-белков состоит из трех субъединиц: Ga, G (3 и Gy. Субъ-
единица Ga обладает способностью к связыванию гуаниновых нукле-
отидов — ГТФ и ГДФ, а также собственной ГТФазиой активностью.
При связывании ГДФ с Ga происходит сборка гетеротримера G-белков
и взаимодействие его с рецептором GPCR. Связывание лиганда с ре-
цептором GPCR индуцирует обмен ГДФ на ГТФ, что влечет за собой
диссоциацию гетеротримера с образованием свободной Ga и димера
G^-Gy. Свободная активированная субъединица Ga непосредственно
взаимодействует с различными ферментами-эффекторами, меняя их
активность (рис. 2.3). Гетеродимер G0-Gy также может влиять на ак-
тивность ферментов-эффекторов. В ряде случаен Ga и G|3-Gy взаимо-
действуют с одними и теми же эффекторами, причем метут быть как
синергистами, так и антагонистами в контроле их активности

Как уже было сказано выше, к группе GPCR относятся некото-
рые рецепторы фитогормонов, например рецептор ауксина АВР1
и рецептор абсцизовой кислоты GCR2. При передаче сигнала этих
фитогормонов имеет место взаимодействие свободной Ga с наибо-
лее распространенными эффекторами гетеротримерных G-белков —
фосфолипазами, которые осуществляют гидролиз фосфолипидов,
входящих в состав мембраны, с образованием различных типов
липидных сигнальных молекул (см. ниже). Кроме того, мишенями
субъединиц Ga и GJ3-Gy могут быть кальциевые ионные каналы.

Своеобразными представителями GPCR являются рецепторы
АБК GTG! и GTG2 (GPCR-Туре G-proteins 1 и 2), гомологичные
одной из групп GPCR млекопитающих. Характерной чертой бел-
Рис. 2.3. Схема работы рецептом, асгоцчировангого с i етератримеаными G белками
(пояснения в тексте)

ков GTGJ и GTG2 является наличие ГТФ-связывающего домена, а
также собственной ГТФазной активности.

Малые G-белки растений

Малые мономерные G-бслки, или малые ГТФазы, имеют очень небольшой раз-
мер (20- 30 кДа) и состоят из одной полипептидной цепи, которая гомологична Ga
субъединице гетеротри мерных G-бслков. Малые G-белки от носятся к консеративно-
му для всех эукариот суперссмейству белков Ras, которое у растений включает в себя
подсемейства Rab, Arf и Rafi, консервативные для всех эукариот, а также семейство
Rop (Rho-like proteins in Plants), гомологичное малым ГТФазам Rho животных.

)1ля функции малых G-белков необходимы вспомогательные белки GAP и GEF.
Белки GEF (Guanine nucleotide Exchange Factors) ускоряю! обмен ГДФ на ГТФ и таким
образом активируют G-белки. Белки GAP (GTPase Activating Proteins) ускоряют гидро-
лиз 1ТФ и инактивацию G-белков, что важно для их «перезапуска». Вспомогательные
белки также усиливаю! передачу сигнала гетсротримерными G-белками Наиболее из-
вестны среди них белок RGS (Regulator of G-protein Signaling), относящийся к семей-
ству GAP, и белок GNOM, относящийся к семейству GEF. Последний играет ключевую
роли в контроле полярного транспорт а ауксинов (более подробно см. в главе 3).

Малые G-белки являются компонентами многих сигнальных путей в растительных
клетках, их функции связаны с контролем динамики актина, везикулярным транспор-
том, ростом пььльцевой трубки, от телом на фикя ормоны (АБК) и разные стрессы (в том
числе патогенез). В отсутствии сигнала малые G-белки связывают ГДФ и находятся в не-
активной форме. При восприятии сигнала от вышележащих компонентов сами малые
ГТФазы или вспомогательные белки GEF индуцируют обмен ГдФ на 1ТФ. Активиро-
ванная ТТФ-содержащая форма малого G-бедка взаимодействует с белком эффектором,
меняя его активность. Поскольку малые G-белки обладают слабой ГТФазной активно-
стью, для гидролиза ГТФ и возврата малою G-белка в неактивное состояние необходи-
ма активность вспомогательною белка GAP Прямыми или непрямыми эффекторами
малых G-белков могут быть белки цитоскелета, фосфолипазы, МАР-киназы.

Среди наиболее известных представителей малых ГТФаз растений — белки под
семейства Rop, которые играют важную роль в CLAVATA-зависимой репрессии гена
WUS (см. главу 9), а также участвуют в ответе на патогенез: установлено, что не-
которые Rop белки взаимодействуют с Scr/Thr киназами LRR-NB, отвечающими за
распознавание патогена. Важнейшую роль в развитии растений играет белок группы
GEF GNOM. Его функцией является контроль везикулярного транспорта, который
траст ключевую роль в определении клеточной локализации белков PIN, от которых
зависит направление полярного транспорта ауксинов и в конечном итоге — поляр-
ность развития растения.

Компоненты системы убиквитинирсвачия белков

Протеасомная деградация определенных бел ков необходима в кон-
троле многих онтогенетических процессов у высших растений. Этот
процесс регулирует система убиквитинирования белков (UPS — от
Ubiquitine Protcasomc System), которая обеспечивает присоединение
к мишеням нескольких молекул маленького (76 аминокислот) высоко-
консервативного белка убиквитина (Ub), который является сменной
мишенью для 26S протеасомы. Убиквитинирование белков включает
в себя три этапа, которые контролируются тремя разными комплекса-
ми ферментов: убиквитин-активирующий фермент (Е1), убиквитин-
связывающий фермент (Е2) и убиквитин-лигаза (ЕЗ). На первом
этапе фермент Е1 активирует Ub с гидролизом молекулы АТФ и об-
разованием тиоэфирного промежуточного продукта El-S~Ub, в кото-
ром С-концевая группа Ub связана с Е1 тиолэфирной связью. После
этого активированный El-S~Ub переносится на молекулу Е2 путем
трансэтерификации, в итоге образуется промежуточный продукт Е2-
S~Ub. На последнем этапе осуществляется перенос Ub с E2-S~Ub на
остаток лизина в молекуле белка-мишени, этот процесс катализирует-
ся убиквитин-лигазой ЕЗ. Убиквитин-лигаза ЕЗ осуществляет поли-
убиквитинированме белков, при котором каждая последующая моле-
кула Ub прикрепляется к ранее присоединенной — в итоге к молекуле
белка мишени оказывается подвешенной полиубиквитиновая цепь.
Полиубиквитинированные белки узнаются 26S протеасомой и под-
вепгаются протеолизу, a Ub отсоединяется и используется повторно.

В геноме арабидопсис выявлены 2 гена, кодирующие ферменты
ЕЗ, 45 генов для Е2 и около 1200 генов, кодирующих компоненты
ферментных комплексов ЕЗ.
Многочисленные убиквитин-лигазы ЕЗ растений определяют
субстратную специфичность UPS системы и делятся на несколько
категорий, основными из которых являются:

•	Е3-убиквитин-ли1 азы, состоящие из одной субъединицы — к этой
группе относятся белки СОР1 (Constitutive Photomorphogenesis
1), играющий ключевую роль в процессах фоюмсрфогенеза и ре-
гуляции цветения, и ARC1 (Arm Repeat-Containing 1), негативно
регулирующий работу системы самонесовместимосги;

•	Мультисубъединичные ЕЗ убиквитин-лигазы — к ним относятся
комплексы белков АРС (Anaphase Promoting Complex), SCF (Skp-
Cullin-F-box) и CUL3-BTB (Broad-complex - Tramtrack — Bric-a-
Brac).

Убиквитин-лигазы принимают участие в контроле множества
различных сигнальных путей в клетках растений (рис. 2.4).

Примеры убиквитин-лигаз растений

Белок COI’l относится к группе моносубъединичных убиквитин-лигаз, со-
держащих RING домен, который взаимодействует с белком мишенью. Его
основной функцией является репрессия фотоморфогенеза, так как он опосредует
убиквигин-зависимый протеолиз ключевых регуляторов этого процесса. В част-
ности, прямыми мишенями СОР1 являются транскрипционный фактор HY5
(Long HYpocotyl 5), позитивно регулирующий экспрессию генов фогоморфоге-
неза, и фитохром A (PHYA). Анализ экспрессии генов арабидопсис с помощью
метода microarray показал, что более 20% его генов, участвующих в контроле 28
известных сигнальных путей, негативно регулируются белком СОР1 в темноте.
Таким образом, вероятно, что большая часть свсторегулируемых генов растений
является прямыми или непрямыми мишенями СОР1, что свидетельствует о роли
этой убиквитин-лигазы как основного негативного регулятора фотоморфогенеза.

Белок ARC1 относится к группе моносубъединичных убиквитин-лигаз с U-бокс
доменом, который выполняет ту же функцию, что RiNG-домен СОР1. Основной ми-
шенью ARC1 является протеинкиназа SRK (S-Receptor Kinase), которая отвечает за
реакцию самопесовмсстимости в пестике при проникновении пыльцы со сходным
генотипом Белок ARC1 вызывает убиквитинирование и протеолиз SRK, что делает
возможным самоопыление.

К этой же группе убиквитин-лигаз относятся белки группы SUMO (Small Ubiq-
uitin-related Modifier), для одного из которых — SIZ1 (SAP and Miz) — показана
важная роль в негативной регуляции передачи сигнала абсцизовой кислоты (АБК),
поскольку он вызывает убиквитин-зависимый протеолиз АБК-зависимого транс-
крипционного фактора ARI5.

Комплексы SCF являются наиболее широко распространенной группой
убиквитин-лигаз растений. В состав SCF-комплекса входят белки SkPI (ASK in
plants for Arabidopsis SKPI), Cullin (он же CDC53), белок с RING-домсном RBX1 (for
Ring-Box 1) и белок с F-боксом. Каждый из компонентов SCF-комплекса выполняет
свою функцию, например белок RRX1 связывает белок Е2, а F-бокс-содержащий
Рис. 2.4. Роль убиквитин-лигэз и контроле сигнальных путей у растений (модифициро
ваю по Moon et al., 2004)

А — в контроле фотоморфогенеза свет препятствует деградации транскрипционного
фактсра HYb за счет подавления активности убиквитин-лигазы С0Р1

Б — ауксин стимулирует деградацию транскрипционных репрессоров AUX7 АА через
убиквитин-лигазу SCFTIB1, компонентом которой является рецептор ауксина T|R1.

Б — гиббереллины стимулируют деградацию транскрипционных репресссрсв DCLLA
через убиквитин-лигазу SCF9LV.

Г — убиквитин-лигаза ВIВЕТ0 контролирует биосинтез этилена через протеолиз фер-
ментов ACS. Этилен препяiciвуег деградации транскрипционного фактора EIN3 с по-
мощью подавления актиенос1И убикеитин-лигаз SCFEBF.

Д — убиквитин-лигаза SIZ1 негативно регулирует передачу сигнала АБК, споссбствуя
прстеолизу транскрипционного фактора ABI5

белок присоединяет молекулы Ub к белкам-мишеням. Субстратная специфичность
убиквитин-лигаз SCF определяется F-бокс-содержащими белками, особенностью
которых является консервативный домен F-бокс, необходимый для взаимодейст вия
с белками-мишенями. В геноме арабидопсис выявлены по крайней мерс 700 генов,
кодирующих различные F-боксовые белки, для ряда которых установлено участие
в передаче сигнала фитогормопов, а также в контролю некоторых онтогенетических
процессов.

Один из F -бокс-содержащих белков арабидопсис — TIRI (Transport Inhibitor Re-
sponse 1), а также его гомологи — AFB 1 -3 (Auxin signaling F-Bcx proteins 1,2 и 3) явля-
ются рецепторами ауксинов При связывании молекулы ауксина TIR1 взаимодействует
с белками семейства Aux/IAA, которые связаны с промоторами ауксин-регулируемых
генов и выполняют функцию репрессоров транскрипции. Белки убиквитин-лигазного
комплекса SCFTIRI осуществляют полиубиквитинирование Aux/IAA белков, что приво-
дит к их протеолизу и снятию репрессии ауксин-регулируемых генов.

Аналогичным образом действуют F-бокс-содержащие белки SLY1 (SLEEPY 1)
арабидопсис и GID2 (Giboereilin-Inscnsitive Dwarf?.) риса, которые взаимодейству-
ют с рецептором гиббереллинов GID1 и опосредуют протеолиз DELLA-белков —
репрессоров транскрипции гиббереллин-регулируемых генов.

На последних этапах передачи сигнала этилена действуют F-бокс-содержащие
белки EBF. В отличие от TIR1 и SLY/GJD2, они активируются при отсутствии
этилена и запускают убиквитинирование и деградацию белка E1N3 — основного
этилен зависимого транскрипционного фактора

F-бокс-содержащий белок UFO (UNUSUAL FLORAL ORGANS) арабидопсис
и его гомолог FIM (F1MBRIATA) львиного зева играют важную роль в развитии
цьетка. Субстраты убиквитин-лигаз UFO/FJM не выявлены, тем не менее установ-
лено, что эти белки являются позитивными регуляторами экспрессии генов группы
В и являются антагонистами основного гена группы C-AGAMOL/S.

Помимо перечисленных примеров, убиквитин-лигазные комплексы SCF игра-
ют роль в передаче большого количества других сигналов у растений: например,
F-бокс-содсржащий белок СОИ (COronatine insensitive 1) является центральным
компонентом передачи сигнала при ответе на фитогормоны жасмонаты.

Одна из убиквитин-лигаз группы CUL3-BTB — ВТВЕТО| — является ключе-
вым регулятором уровня этилена в тканях растения. Ее основной компонент — бе-
лок с ВТВ-доменом ETOI (EThylene Overproducing 1) — опосредует убиквитин-
зависимую деградацию ферментов ACS (ACC-синтаз), которые катализируют
лимитирующую стадию биосинтеза этилена.

Комплекс АРС (Anaphase Promoting Complex) — еще один тип убиквитин-
лигазных комплексов растений. Он состоит из 11 субъединиц, среди которых точная
функция установлена для АРС2 — гомолога куллина и APCil — белка с RING-
доменом, при этом потеря функции любой из субъединиц приводит к нарушени-
ям развития (пример — мутант hobbit с аномалиями эмбриогенеза — результат
потерн функции АРСЗ). Мишенями комплексов АРС являются молекулы цикли-
нов — основных регуляторов клеточного цикла. Регуляция клеточного цикла че-
рез убиквитин-зависимый протеолиз циклинов — путь, общий для всех эукариот:
большинство типов циклинов как у растений, так и у животных содержат в своих
молекулах консервативный D-бокс (Destruction box) для присоединения АРС.

2.2.	Основные компоненты путей передачи сигнала

Пути сигнальной трансдукции в растительной клетке, как пра-
вило, включают в себя много этапов. Широко распространенными
компонентами сигнальных путей являются белки с разнообразной
ферментативной активностью: протеиккиназы (в частности, МАР-
киназы), протеинфосфатазы, фосфолипазы и т. д., также широко рас-
пространена активация сигнальных путей с помощью компонентов
Табл1ща 2.2

Основные компе центы путей сигнальной трансдукции в клетках растений

Путь передачи сигнала	Участники	Примеры	Функции
МАР-киназный каскад	МАРККК МАРКК МАРК	CTR1 — МКК.9, МРКЗ/6	Передача сигнала этилена
		ANP — ?	Контроль клеточ- ного цикла
Фосфолипид- ные сигнальные каскады	PLA, PLC, PL D фосфатидные кис- лоты, DAG, PIP, Ins3P, лизофосфо- липиды, жирные кислоты	PLD — фосфатид- ные кислоты — ABI3	Передача сигнала АБК
		PLA -лизофосфо- липиды, жирные кислоты — ?	Передача сигнала ауксинов
Са2+-сигнальный каскад	Ионы Са2+, СаМ, CDPK, СаМ- зависимые про теинкиназы, Са2, СаМ-зависимые протеинкиназы	Са24 — N1G1	Регуляция ответа на стресс
		Са21 — СаМ7 — СВКЗ — HSF	Регуляция ответа на стресс
		Са21 — CDPK — RSG	Регуляция био- синтеза гибберел- линов
? — точные мишени неизвестны			

системы убиквитинирования белков. На активность компонентов
сигнальных путей влияют разнообразные вторичные мессенджеры,
к которым у растений относятся субъединица G-белков Ga, липид-
ные сигнальные молекулы, ионы Са2 и т. д. (табл. 2.2).

МАР-киназный каскад

Одним из наиболее распространенных способов передачи сигна-
ла в различных путях является фосфорилирование/дефосфорилиро-
ванис белков, модулирующее их активность.

MAP-киназный каскад (от МАРК — Mitogen Activated Protein Ki-
nase) — наиболее распространенный у эукариот линейный каскад
фосфорилирования, включающий в себя три последовательно дей-
ствующих Ser/Thr протеинкиназы: MAP-киназу (МАРК), которая
фосфорилирует разнообразные белки мишени, киназу МАР-киназы
(МАРКК, или МАР2К) и киназу киназы МАР-киназы (МАРККК, или
МАРЗК). Антагонистами MAP-киназ в передаче сигналов являются
Ser/Thr протеинфссфатазы семейства РР2С (Protein Phosphatase2C)
и Tyr-протеинфосфатазы РТР (Protein Tyrosine Phosphatase).
В геноме арабидопсис идентифицировано более 20 генов, коди-
рующих МАРК, более 10 генов, кодирующих МАРКК и более 60
генов, кодирующих МЛРККК, а также около 50 генов протеинфос-
фатаз РР2С и РТР. Роль компонентов МАР-киназного каскада в пере-
даче разнообразных сигналов у растений чрезвычайно велика — они
участвуют в передаче сигналов фитогормонов (ауксинов, АБК и эти-
лена), контроле клеточного цикла, ответе на абиотический стресс,
поранение и проникновение патогена.

Дополнительная информация

В развитии апикальной меристемы побега MAP-киназный каскад активиру-
ется ГТФазой Rop, которая, в свою очередь, является мишенью рецепторного
комплекса CLAVATA. Активация МАР-киназного каскада в этом сигнальном
пути необходима для подавления экспрессии гена WUS и ограничения пула ство-
ловых клеток.

У животных МАР киназы обычно действуют ниже рецепторов, ассоцииро-
ванных с G-белками, для активации МАР-киназного каскада необходимо взаимо-
действие активированного малого G-белка Ras или Rtiol с МАРККК. У растений
точные механизмы активации МАР-киназного каскада изучены гораздо слабее. По-
тенциальными мишенями МАРК растений являются очень разнообразные белки:
транскрипционные факторы, рецепторы, гистоны, факторы сплайсинга и т. д.

Наиболее изученным примером МАР-киназного каскада у растений являются
киназы CTR1 (МАРККК), МКК9 (МАРКК) и МРКЗ/6 (МАРК), последовательно
действующие на начальных этапах передачи сигнала этилена. Мишенями этих
MAP-киназ являются транскрипционные факторы EIN3/EIL, активирующие транс-
крипцию этилен-регулируемых генов Интересно, что в этом каскаде МАРККК
CTRi негативно регулирует нижележащие МАРКК и МАРК, поэтому необходимым
условием передачи сигнала этилена является подавление активности киназы CTR1
взаимодействующими с ней рецепторами этилена.

У животных MAP-киназы играют важную роль в контроле клеточного цикла.
Примером участия МАР-киназного каскада в контроле пролиферации клеток рас-
тений являются киназы ANP (Arabidopsis NPKl-iike Proteins), относящиеся к группе
МАРККК. Мутанты по любому из кодирующих их генов ЛУР/, ANPIwANPJ феноти-
пически нс отличаются от дикого типа, двойные мутанты демонстрируют серьезные
аномалии развития, а тройные мутанты характеризуются полным блоком деления
клеток и не развиваются дальше зиготы. Мишени МАРККК ANP неизвестны.

Фэсфолипазы и липидные сигнальные молекулы

Фосфолипиды — основные структурные компоненты мембран,
кроме того, их производные используются в качестве вторичных
мессенджеров в регуляции развития у всех эукариот. Ферменты, ка-
тализирующие превращения фосфолипидов, являются компонента-
ми большого количества сигнальных каскадов в клетках растений.
I

I
жасмонаты

Рис. 2.5 Схема синтеза липидных вторичных мессенджеров из фосфолипидов
Вторичные мессенджеры обозначены красным шрифтом в рамках.

Фосф-липаза Л2 (PLA2) отщепляет одну из ацильных цепей с образованием лизофосфсги
пидов (LPL) и свободных жирных кисгст. Фосфолипаза С (PLC) отщепляет 1лидеринсвый
оыаток с образованием диацитилицерола (DAG); при 1Идролизе ей фосфа идилинозгтола
получается инозитолтрифосфат (Ins3°). Фосфолипаза D (PLD) отщепгяе’ спиртовую труп
пу с образованием фосфатидных кислот (РА). Фосфоинозитад-киназы (PIK) фосфорили-
руют фосфатидилинозитол с образованием сЬосФатидилинсзитолтрифосФата (Ptdlns3P)

Гидролиз мембранных фосфолипидов осуществляют ферменты
фосфолипазы, которые делятся на четыре класса в зависимости от по-
ложения гидролизуемой связи (рис. 2.5). Фосфолипазы AI и А2 отще-
пляют одну из жирнскислотных целей в молекуле фосфолипида, при
этом образуются лизофосфолипид и свободная жирная кислота Лизо-
фосфолипиды являются потенциальными вторичными мессенджера-
ми, свободные жирные кислоты, — в частности, линоленовая — пред-
шественники биосинтеза фитогормонов жасмонатов.

Фосфолипаза С гидролизует связь между глипериновым остатком
и полярной группой, при этом образуются вторичный мсссенджеп
диацилглицерол (DAG) и фосфат-содержащая полярная группа. При
гидролизе одного из типов фосфолипидов — фосфатидилинозито-
ла — фосфолипазами С образуется еще один вторичный мессен-
джер — инозитол-грифосфаг (lns3P), который играет важную роль
в передаче различных сигналов в клетке.

Фосфолипаза D гидролизует связь между фосфатной группой
и спиртовой группой, при этом получаются фосфатидная кислота
и спирт. Фосфагидные кислоты, производимые фосфолипазами D,
также являются важными вторичными мессенджерами.

Кроме того, мембранный фосфатидилинозитол является субстра-
том для фосфоинозтид-киназ, присоединяющих фосфатную группу
к гидроксильным группам инозитольного кольца. При этом получа-
ются разнообразные фесфатидилинозиголфосфаты (PIP), ряд кото-
рых, в частности, фосфатидилинозигол-3-фосфат (Ptdlns3P) — яв-
ляются вторичными мессенджерами в различных сигнальных путях.

Примеры использования липидных вторичных мессенджеров для переда-
чи сигналов в клетках растений

Нарушения продукции липидных сигнальных молекул у мутантов с посерей
функции перечисленных ферментов приводят к изменению ответа на фитогормо-
ны, в особенности на ауксины и АБК. Действительно, фосфолипазы и производи-
мые ими липидные сигнальные молекулы являются необходимыми компонентами
передачи сигнала АБК и ауксинов. Один из двух рецепторов к ауксину и один из че-
тырех типов рецепторов к АБК относятся к группе GPCR. Связывание этими рецеп-
торами молекулы фитоюрмона ведет к диссоциации гетсротримерного комплекса
G-бслков, после чего свободная субъединица Ga активирует фосфолипазы.

При ответе на АБК имеет место активация фосфолипазы D. В результате этого
синтезируются фосфатидные кислоты, которые активируют АБК-зависимый транс-
крипционный фактор ABI3.

При ответе на ауксины субъединица Ga активирует фосфолипазу А2, что приводит
к синтезу лизофосфолипидов и свободных жирных кислот, которые предполокительцо
контролируют ауксин-зависимую активацию МАР-кипазного каскада и Са2' ионных ка-
налов. Липидные сигнальные молекулы участвую-, также в контроле полярного транс-
порта ауксинов: фосфатидные кислоты и PIP взаимодействуют с протеинкипазой PI-
N'OlD — одним из основных рс,уляторов системы полярного транспорта. В частности,
накопление Ins3P необходимо для развития ауксин-зависимого гравит ропического с вета,
в основе которого лежит изменение направления транспорта ауксинов.

Помимо ответа на фитэгормоны, липидные сигнальные молекулы играют роль
в ответе растений на различные виды стресса. Установлено, что экспрессия ге-
нов PLC и PLD, а также накопление фосфатидных кислот и PIP у растений усилива-
ется в ответ па поранение, низко температурный и осмотический стресс.

Наконец, фосфолипидные сигнальные молекулы играют центральную роль
в регуляции структуры и динамики цитоскелета. ins3P способствует полимери-
зации актина, взаимодействуя с актин-связывающими белками, такими как профи-
лин и филамин. В то же время фосфатидные кислоты взаимодействуют с негатив-
ным регулятором полимеризации актина — белком AtCP (Actin-Capping Proiein),
ин, ибируя его активность.
Ионы Са2х и их сенсоры

Ионы Са2+ используются в качестве вторичных мессенджеров
при передаче большого количества разнообразных сигналов в рас-
тительной клетке, причем для контроля разных процессов может
быть важно как возникновение пиков концентрации кальция в клет-
ке, так и осцилляция концентрации кальция в разные промежутки
времени.

Клеточная стенка, окружающая клетки рас гений, является мощ-
ным источником хелатированного кальция, связанного с пектином.
Кроме того, в растительной клетке имеется внутриклеточное депо

Рис. 2.6. Роль ионов Са2* в передаче сигналов в растительной клетке (модифицирова-
но по Kim et al., 2009)

Ионы Са2* повышают активность калиевых и анионных каналов (1), а также взаимодей-
ывуют с транскрипционными факторами (3), кальмодулином (СаМ) и Са’*-зависимыми
протеинкиназами (CDPK). Комплексы Са2*/СаМ и Ca2*/CDPK влияют на динамику актино-
вых филаментов (2), а также прямо иг и опосредованно (через кзльмодулип-зависимые
протеинкиназы (СаМРК) и притеинфссфатазы (РР)) взаимодействуют с транскрипци
онными факторами (4 -7).

экспрессия геноп
ионов Са2+ — центральная вакуоль. Все это позволяет быстро повы-
сить уровень ионов Са2 ' в клетке в ответ на разнообразные сигналы.
Повышение концентрации Са24 в цитозоле стимулируется при ответе
на фитогормоны (ауксин, АБК, этилен), а также на разные варианты
биотического и абиотического стресса. Долгое время считалось, что
в растительной клетке нег специализированных Са2+ каналов, сход-
ных с селективными Са2+ каналами в клетках животных. Действи-
тельно, значительная часть Са2+ проникает в растительную клетку
через неселсктивные катионные каналы. Недавно у арабидопсис был
охарактеризован белок катионного канала ТРС1, который содержит
Са2'-связывающий мотив EF-hand и используется преимущественно
для транспорта ионов Са2+.

Ионы Са2* в растительной клетке взаимодействуют с большим
количеством разнообразных белков. Одной из наиболее известных
функций ионов Са2+является активация калиевых и анионных ка-
налов плазмалеммы, необходимая для деполяризации мембраны за-
мыкающих клеток, которая играет центральную роль в закрывании
устьиц. Также ионы Са2+ играют важную роль в динамике цитоске-
лета. Наконец, ионы Са2+могут прямо или опосредованно влиять на
экспрессию ряда генов (рис. 2.6).

Сенсоры ненов Са2+. Роль ионов Са?*в регуляции экспрессии генов

Для регуляции экспрессии генов растений ионами Са21 существует несколь-
ко путей. Первый путь представляет собой прямую активацию некоторых транс-
крипционных факторов ионами Са21. У арабидопсис к Са2+-связывающим транс-
крипционным факторам относятся транскрипционный фактор семейства bZIP (см.
ниже) NIG1 (NaCl-Inducible Gene 1), в молекуле которого имеется мотив EF-hand.
Транскрипционный фактор NIG1 принимает участие в контроле экспрессии стресс-
индуцирусмых генов.

Более распространенным вариантом является связывание ионов Са24
с белками-эффекторами, которые прямо или опосредованно влияют на актив-
ность транскрипционных факторов и экспрессию генов. В клетках растений
работают несколько групп белков-эффекторов, связывающих ионы Са24, основ-
ными из них являются консервативный для всех эукариот белок кальмодулин
(СаМ) и специфичные для растений кальций-зависимые г.ротеинкиназы (CDPK,
от Calcium-Dependent Protein Kinases). Особенностью этих белков является на-
личие консервативного мотива EF-hand, с высокой аффинностью связывающего
ионы Са24. Связывание Са24 вызывает изменение конформации и/или фермента
тивной активности эффекторов.

Кальмодулин не имеет собственной ферментативной активности, но может
влиять на активность целого ряда белков (гтротеинкиназ, протеинфосфатаз, транс-
крипционных факторов). Связывание Са2' с СаМ приводит к изменению его кон-
формации, что позволяет ему взаимодействовать с белками-мишенями.
Среди эффекторов СаМ можно назвать несколько групп транскрипцион-
ных факторов, наиболее известными из которых является специфичное для
растений семейство транскрипционных факторов с GCl-доменом. Прямыми
мишенями транскрипционных факторов с GCl-доменом являются гены tt'RKY,
кодирующие еще одно семейство транскрипционных факторов, играющих клю-
чевую роль в контроле старения, программируемой клеточной смерти и ответа
на стресс.

Недавно было обнаружено, что некоторые изоформы кальмодулина име-
ют собственную ДНК-связывающую активность и могут выполнять функцию
транскрипционных факторов: например, белок СаМ7 регулирует экспрессию
ряда ключевых генов-регуляторов фотоморфогенсза (например, гена RBCS1A,
кодирующего субъединицу белка RUBISCO), напрямую связываясь с их промо
торами.

Помимо прямей регуляции экспрессии генов за счет связывания Са24 или
комплексов Са27СаМ с транскрипционными факторами, существует непрямая
СаМ-зависимая регуляция экспрессии генов за счет взаимодействия Са27СаМ
комплексов с белками, влияющими на активность транскрипционных факто-
ров, — в частности, с различными протеинкиназами и протеинфосфатазами.
Первой обнаруженной СаМ-зависимсй протеинфосфатазой растений была
Ser/Thr фосфатаза РР7. Ес функцией является дефосфорилирование молекул
транскрипционного фактора HSF (Heat Shock Factor), регулирующего экспрес-
сию генов IISP, которые кодируют бел ки теплового шока. Фосфатаза РР7 являет-
ся негативным регулятором активности HSF; взаимодействие с СаМ ингибирует
ее активность, запуская экспрессию HSP-генов. Антагонистом фосфатазы РР7
является кальмодулин-зависимая Ser/Thr протеинкиназа СВКЗ (СаМ-Binding
protein Kinase 3), которая фосфорилирует транскрипционный фактор HSF, по-
вышая его активность

Еще одним широко распространенным эффектором ионов Са2+ в клетках рас-
тений являются кальций-зависимые про геинкиназы (CDPK, от Calcium-Depen-
dent Protein Kinases), которые относятся к надсемейству Ser/Thr протеинкиназ.
Активность CDPK повышается при связывании ионов Са24 с EF-hand мотивами
в их молекулах; кроме того, их активность регулируется фосфолипидными сиг-
нальными молекулами и фосфорилированием другими киназами. Основное место
локализации CDPK в растительной клетке — ядро, где их мишенями являются
многие транскрипционные факторы, участвующие в контроле ответа на абио-
тический стресс. К числу мишеней CDPK относятся также белки, участвующие
в перестройках цитоскелета: например, белок ADF (Actin-Depolymerizing Factor)
фосфорилируется киназой CDPK, что приводит к повышению его активности.
Кроме того, предполагается участие CDPK в передаче сигнала ряда фитогормонов
(ауксинов, АБК), поскольку повышение концентрации этих гормонов приводит
к быстрой активации CDPK. Киназа CDPK1 играет ключевую роль в негативной
регуляции концентрации гиббереллинов: она фосфорилирует Ser/Thr киназу RSG
(REPRESSION OF SHOOT GROWTH), которая является позитивным регулятором
биосинтеза этих фитогормонов.
2.3.	Основные группы транскрипционных факторов
растений

В настоящее время в геноме арабидопсис идентифицировано
около 2000 генов, кодирующих транскрипционные факторы (ТФ),
что составляет около 7% от общего числа генов. Существуют спе-
циальные интернет-ресурсы, обобщающие данные по всем извест-
ным транскрипционным факторам модельных объектов, например
DAI F (The Database of Arabidopsis Transcription Factors). Транскрип-
ционные факторы объединяют в группы (семейства) на основании
сходства ДНК-связывающих доменов, а также наличия других кон-
сервативных доменов. Менее половины семейств ТФ растений явля-
ются уникальными для растений, большинство из них встречается
и у представителей других царств эукариот. Среди изученных ТФ
растений ключевую роль в развитии играют семейства ТФ, содер-
жащие MADS-домен, гомеодомен, GRAS-домен, а также некоторые
другие транскрипционные факторы (табл. 2.3).

Транскрипционные факторы с MADS-дом с кем

ТФ с MADS-доменом являются важными регуляторными молеку-
лами у растений, животных, грибов. Название M ADS произошло от
МСМ1, AG AMOL'S, DEFICIENS и SRF, типичных представителей
ТФ этой группы у эукариот. В геноме арабидопсис существует около
100 генов с MADS -боксом, многие из которых контролируют различ-
ные аспекты развития Экспрессия генов с MADS-бсксом регулиру-
ется специфичным образом во времени и пространстве с участием
других генов или сигнальных событий. Наиболее изучена роль ТФ с
MADS-доменом в развитии цветка, на модели которого было пока-
зано, что взаимодействия между различными ТФ с MADS-доменом
определяют идентичность органов цветка.

Транскрипционные факторы с гомеодоменом

Транскрипционные факторы с гомеодоменом играют важную
роль в регуляции развития эукариот. У животных гены, кодирующие
транскрипционные факторы с гомеодоменом, называют гомеозис-
ными (гомеотическими), поскольку мутация в таких генах приводит
к гомеозису, т. е. изменению программы развития органа, в резуль-
тате которого на месте одного органа развивается другой, сходный
(«гомологичный») орган. Хорошо изученным примером гомеозис-
ной мутации является мутация дрозофилы Antennapedia, при кото-
рой происходит развитие ног на месте антенн. У растений транс-
Таблица 2.3

Основные группы транскрипционных факторов растений

Группа транскрипци- онных факторов	Основные представители		Функция
Транскрипционные факторы с MADS- доменом	SOC1		Регуляция перехода к цветению
	FLC1		
	CAL		
	API		Развитие органов цветка
	АРЗ		
	PI		
	AG		
	SEP1,2,3		
	РНЕ		Развитие эндосперма
Транскрипционные факторы с гомеодо- меном	KNOX	STM	Поддержание активности ПАМ
		ВР/  KN ATI	Поддержание активности ПАМ, развитие листа
	WOX	WUS	Поддержание активности ПАМ
		W0X5	Поддержание активности КАМ
		WOX2, WOX7	Идентичность доменов зародыша
		NS/PRS	Развитие ла1еральных органов побега
	HD- ZIPIII	PHB,  PHV. REV	Идентичность адаксиальной стороны листа
Транскрипционные факторы семейства GRAS*	SCR  SHR		Поддержание активности КАМ, развитие коры и эндодермы
	НАМ		Предотвращение дифференцировки клеток ПАМ
	Семейство DELLA		Репрессия транскрипции гиббсрсллин регулируемых генов
Транскрипционные факторы MYB	LHA, ССА1		Поддержание циркадных ритмов
	ASI		Инициация листового примордия
	GA MY В		Регуляция ответа на гиббереллины
bZIP	Семейство ABF		Регуляция ответа на АБК
	RSG		Регуляция биосинтеза гиббереллинов
	HY5		Регуляция фотсморфогзнеза
Таблица 2.3 (окончание)

Группа транскрипци• онных факторов	Основные представители	Функция
Транскрипционные факторы с NAC- доменом*	NA.M, CUC 1,2,3	Развитие ПАМ, развитие листа
АР2-подобные транскрипционные факторы*	АР2	Развитие цветка
	ERF	Регуляция ответа на этилен
	PLETHORA (PLT1, PLT2, PLT3), BABY BOOM (ВВМ)	Развитие меристемы корня, поддер- жание градиента ауксина в корне
	ANT	Развитие латеральных органов побега
	DREB	Отвез на абиотический стресс
Транскрипционные факторы с GARP доменом*	Семейство ARR-B	Регуляция ответа на цитокинины
	KANADY l^t	Идентичность абаксиальной сторо- ны листа
Транскрипционные факторы с ВЗ- домепом*	Семейство ARF	Регуляция ответа на ауксины
	ABI3, LEC2, f US3,	Регуляция ответа на АЬК
	VALI	Контроль созревания зародыша
LBD*	AS2  LOB, JLO	Развитие листа
YABBY*	FIL, YAB2, YAB3	Развитие листа
EIN3/EIL*	EIN3, EIL1	Регуляция ответа на этилен
ССААТ- связывающие транскрипционные факторы*	LECq	Контроль морфогенеза и созрева- ния зародыша
* — транскрипционные факторы, специфичные для растений		

крипционные факторы с гомеодоменом также шраюг важную роль
в развитии, но в отличие от животных мутации в генах растений, ко-
дирующих ТФ с гомеодоменом, не приводят к гомсозису. У растений
наиболее изученными представителями гомеодомен-содержащих ТФ
являются ТФ семейства KNOX и WOX, важной функцией которых
является регуляция развития и поддержание активности меристем.

ТФ семейства KNOX относятся к гомеодомен-содержащим
транскрипционным факторам семейства TALE (Three Amino Acid
Loop Extension). В отличие от типичного гомеодомена, состоящего
из 60 аминокислот, гомеодсмены транскрипционных факторов се-
мейства TALE содержат 3 дополнительных аминокислоты между 1
и 2 спиралями. Транскрипционные факторы семейства TALE, к ко-
торым относятся белки KNOX растений, широко распространены
и у животных. У животных транскрипционные факторы TALE пред-
ставлены четырьмя основными группами: РВС/РВХ, MEIS, TGIF,
IRO. У грибов также обнаружены белки надкласса TALE (в частно-
сти, белки M-ATYP, определяющие тип спаривания).

У растений семейство TALE представлено, главным образом,
двумя классами KNOX (KNOTTEDI-like homeobox) генов: KNOX I
и KNOX II. Помимо консервативного ДНК-связывающего гомео-
домена (HD) продукты KNOX генов содержат KNOX-домен, необ-
ходимый для белок-белковых взаимодействий. Также в структуре
KNOX транскрипционных факторов выделяют GSE (обогащен-
ный аминокислотами Gly (G), Ser (S), Glu(E)) и ELK (обогащенный
аминокислотами Glu (Е), Leu (L), Lys(K)) домены. Предполагаемой
функцией GSE-домена является регуляция стабильности белка,
поскольку в этом домене локализуется РЕЗТ-последовательпость,
служащая сигналом для убиквитин-зависимой деградации белков.
Функция ELK-домена не ясна, предполагается, что он необходим
для белок-белковых взаимодействий или служит сигналом ядер-
ной локализации

Одним из первых идентифицированных генов из данного семей-
ства у растений был ген KNOTTED! кукурузы, гомологи которого
сейчас описаны у других растений, относящийся к классу KNOX I
генов. В геноме арабидопсис выявлено несколько KMZY-генов, по-
лучивших название KNAT(Knottcd-like of Arabidopsis thaliana). Эти
гены арабидопсис, в свою очередь, подразделяются на два класса —
I и II. При этом гены I класса [STM, KNAT1/BP (BREVIPEDICELLUS),
KNAT2 и KNAT6) экспрессируются преимущественно в меристемах,
а гены II группы (KNAT3, KNAT4, KNAT5) имеют более широкую об-
ласть экспрессии В частности, известно, что гены KNAT3, KNAT4,
KNAT5 экспрессируются в корнях арабидопсис.

ТФ семейства WOX представляют собой юмеодомен-содержащие
транскрипционные факторы с атипичным гомеодоменом, состоящим
из 66 аминокислотных остатков. Наиболее хорошо охарактеризованны-
ми представителями ТФ WOX являются WUSCHEL ( WUS) и WOX5
(WUSCHEL relatedhomeobox 5), регулирующие активность ПАМ и КАМ
соответственно. У арабидопсис семейство ТФ WOX включает 14 пред-
ставителей.
Рис. 2.7. Структура транскрипционною фактора семейства GRAS

Транскрипционные факторы семейства GRAS

Транскрипционные факторы семейства GRAS (рис. 2.7) содер-
жат консервативный G RAS-домен, название которого произошло от
первых ovkb типичных представителей ТФ этой группы: GAI, RGA,
SCR.

К семейству транскрипционных факторов GRAS относятся
DELLA белки, которые участвуют в передаче сигнала гибберелли-
нов, белки SCARECROW (SCR) и SHORTROOT (SHR), контроли-
рующие дифференцировку клеток эндодермы, и ТФ HAIRY MER-
ISTEM (НАМ), блокирующий дифференцировку клеток апикальной
меристемы побега. Кроме того, ТФ GRAS у бобовых растений (Mt-
NSP1 и MtNSP2, PsSYM7) играют важную роль в развитии бобово-
ризобиального симбиоза и являются ключевыми регуляторами,
индуцирующими экспрессию генов растений в ответ на сигналы,
выделяемые симбиот ическими почвенными бактериями ризобиями
(липохитоолигосахариды, Nod-факгсры).

2.4.	Эпигенетическая регуляция активности генов
у растений

К эпигенетическим изменениям относят изменение актив
ности (подавление экспрессии) гена, не связанное с изменени-
ем его нуклеотидной последовательности, которое может со-
храняться в течение ряда клеточных поколений

Термин «эпиген» был предложен В. А. Ратнером и F. Н. Чураевым
в 1975 г. Этот термин авторы использовали для описания математической
модели регуляции экспрессии генов бактериофаге X. В этой модели «эпи-
ген» представляет собой «единицу наследственности, циклическую систему,
имеющую не менее двух режимов функционирования подчиненных ей генов,
способную сохранять каждый из режимов в последовательном ряду поколений»
(цит. по Голубовский, 2000). Таким образом, «эпиген» представляет собой систе-
му более высокого уровня организации, чем просто «ген»: помимо «наследуемо-
сти» (свойства, присущего гену), включает также «регуляцию» работы этого гена
(определяющую альтернативные режимы функционирования гена). В современной
генетике развития термин «эпиген» в основном используют в общем смысле при-
менительно к наследуемым механизмам регуляции активности генов, и называют
такие механизмы «эпигенетическими».

Основными эпигенетическими механизмами являются:

•	метилирование ДНК;

•	модификация гистонов;

•	изменение активности генов с помощью малых РНК.

Белки, контролирующие метилирование ДНК и модификацию
гистонов

Два первых способа связаны с изменениями хроматидной уклад-
ки ДНК, влияющими на се доступность для транскрипционных фак-
торов. Фундаментальной единицей хроматина является нуклеосома,
представляющая собой результат укладки небольшого участка ДНК
вокруг октамера гистонов. Нуклеосомная компактизаиия ДНК пре-
пятствует присоединению ТФ — в результате промоторы многих
конститутивно экспрессирующихся генов «домашнего хозяйства»
в клетках эукариот имеют участки, лишенные нуклеосом. Экспрес-
сия множества других генов регулируется путем временных изме
нений нуклеосомной укладки ДНК, которые зависят от различных
сигналов. Изменения состояния хроматина у эукариот контролиру-
ют несколько групп белков, получивших общее название «факторы
ремоделинга хроматина» (chromatin remodeling factors) или «моди-
фикаторы хроматина» (chromatin modifiers). Это ферменты, катали-
зирующие изменение структуры ДНК и гистонов с использованием
энергии АГФ, — таким образом, их общим свойством является АТФаз-
ная активность. Две основные группы модификаторов хромат ина эт о
ДНК-метилтрансфсразы, метилирующие ДНК по цитозину, и моди-
фикаторы гистонов, катализирующие ацетилирование и метилиро-
вание гистонов в составе нуклеосом (табл. 2.4).

Метилирование ДНК осуществляется ферментами ДНК-
метилтрансферазами. Для растений характерно метилирование ци-
тозина в контексте CpG, CpMpG и CpNpN (N — отличный от гуа-
нина нуклеотид). У эукариот известно два типа метилирования.
К первому типу относят метилирование de novo, происходящее,
как правило, во время эмбриогенеза и обуславливающее клеточную
Таблица 2.4

Факторы ремоделинга хроматина, участвующие в контроле развития растений

Белок			Функция	Гены-мишени	Роль в развитии
Белки HDАС-комплексов		PKL	Деадети- лирование гистонов	LEC1	Переход проростка к вегетативному развитию
		SER		KNOX	Развитие цельного листа
		HIRA		KNOX	Инициация листового примордия
		LUG		AG	Развитие лепестков и чашелистиков
		TPL		PIN1	Инициация первично- го корня
и  Ье  1=  2 с  X  Е с		EMF-комплекс: EMF2, CLF/SWN, FIE, MSI1	Метили- рование гистонов	FT AGL19	Подавление раннего цветения
		VRN-комплекс: VRN2, CLF/SWN, FIE, MSI1		FLO	Вгрнализация
		FIS-комплекс: МЕА/ SWN, FJE, F1S2, MSI1		PHE1	Координация развития зародыша и эндо- сперма

дифференцировку. Второй тип представляет собой поддерживаю-
щее метилирование, обеспечивающее сохранение уже имеющегося
характера метилирования ДНК после репликации. Благодаря этому
метилированное состояние может наследоваться в ряду клеточных
поколений.

Метилирование ДНК является одним из вариантов замолкания
(сайленсинга) гена и может быть опосредовано действием малых
двухиепочечных РНК (см. ниже), это особенно важно при метилиро-
вании de novo. Такие РНК (малые интерферирующие РНК — siRNA
или микроРНК — miRNA) в комплексе с другими белками опосре-
дуют посадку ДНК-метилгрансфераз на участки ДНК, нуклеотидная
последовательность которых комплементарна последовательности
самих малых РНК, таким образом определяя специфичность мети-
лирования.

Метилирование ДНК играет важную роль в регуляции активно-
сти генов. В частности, метилирование ДНК в промоторном участ-
ке гена и сопутствующие изменения структуры хроматина могут
создавать препятствия для посадки ТФ и, как следствие, снижают
активность соответствующего гена. Кроме того, у эукариот суще-
ствует особый класс регуляторных белков с метил-связывающим
доменом (methyl domain binding proteins, MDBP). Чаще всего свя-
зывание с метилированным цитозином этого белка и является
основной причиной нарушения связывания ТФ с регуляторными
участками ДНК и подавления транскрипции генов. Метилирование
ДНК тесно связано со структурой хроматина и опосредует моди-
фикацию гистонов

Модификации гистонов — метилирование и ацетилирование —
также приводят к изменению структуры хроматина, обусловливаю-
щему изменение уровней экспрессии генов. Как правило, ацетили-
рованное состояние гистонов облегчает доступ регуляторных белков
к ДНК и характерно для транскрипционно активных участков хро-
матина, тогда как деацетилированное состояние гистонов ассоции-
ровано с транскрипционно неактивным хроматином.

Процессы ацетилирования/деацетилирования гистонов осу-
ществляют временную активацию/подавление экспрессии генов,
модифицируя гистоны на локальных участках хроматина, обыч-
но соответствующих промогорным районам гена. Регуляцию
транскрипционной активности хроматина путем ацетилирования/
деацетилирования гистонов осуществляет у растений группа фер-
ментов гистон-ацегилтрансфсраз (HAT) и гистон-деацетилаз
(1IDAC), уровень активности которых контролируется различ-
ными сигналами, включая свет, стресс, атаку патогенов и т. д.
Например, у арабидопсис изменение активности НАГ-фермента
НАС1 необходимо для активации экспрессии генов IISP, кодиру-
ющих белки теплового шока; активность HDA19 (фермент груп-
пы HDAC) необходима для экспрессии PR генов при ответе на
патогенез.

Более сложно организованным вариантом модификаторов хро-
матина у растений являются белки CHD3, включающие в себя
хроматин-модифицирующий домен с гистон-деацетилазной актив-
ностью, АТФазный домен и ДНК-связывающий гомеодомен, сход-
ный с таковым у гомеодомен-ссдержащих транскрипционных фак-
торов. Примером C1ID3 является белок PICKLE (PKL) — один из
ключевых регуляторов вегетативного развития растений, функция
которого связана с репрессией генов, регулирующих поздние этапы
эмбриогенеза.

С гистон-деацетилазами взаимодействует большое количество
белкоз, облегчающих их взаимодействие с генами-мишенями —
таким образом, можно говорить о мультисубъединичных гистон-
деацетилазных комплексах, потеря функции любого из компонентов
в составе которых приводит к нарушениями морфогенеза.

Особой группой регуляторов транскрипции генов у эукариот яв-
ляются белки-корепрсссоры, которые осуществляют взаимодей-
ствие между транскрипционными факторами и модификаторами
хроматина. Примерами транскрипционных корепрессоров растений
являются:

•	белок LEUNIG (LUG), который взаимодействует с HDAC и опре-
деленными ТФ с MADS доменом и подавляет активность гена
AGAMOUS (AG) в первом и втором круге цветка:

•	белок TOPLESS (TPL), который в комплексе с HDAC и репрессо-
рами транскрипции Aux/IAA подавляет экспрессию генов, регу-
лирующих развитие базального домена зародыша;

•	белок HIRA, взаимодействие которого с HDAC и транскрипци-
онными факторами ASYMMETRIC LEAF (AS) необходимо для
подавлег чя транскрипции меристем-спецнфичных генов KNOX
при закладке листовых примордиев.

Более длительное замолкание генов, наследуемое при митотиче-
ских и даже мейотических делениях клеток, связано с процессом ме-
тилирования гистонов по определенным остаткам лизина, который
обеспечивает подавление транскрипционной активности протяжен-
ных участков хроматина. Например, в основе механизма вернализа-
ции (индукции цветения после длительного воздействия низкой тем-
пературы) лежит подавление экспрессии гена FLOWERING LOCUS
С (FLC), кодирующего репрессор цветения, за счет метилирования
гистонов белками группы Polycomb.

Белки Polycomb (Polycomb-group proteins, PcG) были впервые
идентифицированы у дрозофилы как регуляторы активности гомео-
зисных генов, играющих ключевую роль в развитии. Для взаимодей-
ствия с ДНК белки PcG образуют мультисубъединичные комплексы.
У дрозофилы идентифицировано много белков PcG, которые образу-
ют три типа Polycomb-комплексов: PRC1, PRC2 и PRC3 (Polycomb
Repressive Complex 1,2 и 3). У растений обнаружены белки, гомоло-
гичные субъединицам комплекса PRC2:

•	белки CURLY LEAF (CLF), MEDEA (MEA) и SWINGER (SWN)
являются гомологами метилтрансферазы Enhancer ofZesfe (E(z));

•	белки EMBRYONIC FLOWER 2 (EMF2), FERTILISATION INDE-
PENDENT SEED2 (F1S2) и VERNALIZATION 2 (VRN2) гомоло-
гичны белку дрозофилы Suppressor of zeste (Su(z));

•	белок FERTILIZATION INDEPENDENT ENDOSPERM (FIE) яв-
ляется гомологом белка дрозофилы Extra sex combs (Esc);
Рис. 2.8. Рель Polycomb-комглексов в развитии растений (модифицировано по Hennig
and Derkacheva 2009). Пояснения в тексте

•	пять белков MSI (MSI1-MSI5), гомологичные субъединице PRC2
дрозофилы р55.

Перечисленные Poly comb-белки растений формируют три вари-
анта РКС2-подобных комплексов: EMBRYONIC FLOWER (EMF),
VERNALIZATION (VRN) и FERTILISATION INDEPENDENT SEED
(FIS). Все три комплекса выполняют разные функции в развитии
растений: EMF контролирует баланс вегетативного и генеративного
развития, VRN участвует в одном из путей индукции цветения, FIS
необходим для координированного развития зародыша и эндоспер-
ма в семенах (рис. 2 8).

Функция комплекса EMF, состоящего из белков EMF2, CLF/
SWN, FIE и MSI1, связана с подавлением преждевременного цве-
тения и заключается в репрессии транскрипции основных генов-
ак1 иваторов цветения - FLOWERING LOCUS Т (FT) и AGAMOUS-
LJKE 19 (AGL19). Комплекс VRN состоит из белков VRN2, CLF/
SWN, FIE и MSI1 и подавляет транскрипцию гена-репрессора цве-
тения FLOWERING LOCUS С (FLC) при вернализации. Комплекс
F1S включает в себя субъединицы MEA/SWN, FIE, F1S2 и MSI1, его
мишенью является ген PHERES1 (РНЕ1), кодирующий транскрип-
ционный фактор с MADS-боксом, который предположительно явля-
ется центральным регулятором развития эндосперма.

Роль малых РНК в регуляции активности генов у растений

В послед тие десятилетия появляется все больше данных о роли
малых пеке диру юших РНК в регуляции экспрессии генов (это явле-
ние также называют «РНК-сайленсингом»), «Замолкание» работы
гена, опосредуемое малыми некодирующими РНК, осуществляется
на различных уровнях реализации генетической информации: на
уровне транскрипции (метилирование гистонов, гетсрохромати-
низация) или на уровне трансляции (разрезание транскрипта, ре-
прессия трансляции). Для описания явления «РНК-сайленсинга»
у различных организмов используются различные термины: РНК-
интерференция (в основном применительно к животным), косу-
прессия (у растений), «подавление» (quelling) (у грибов).

У растений можно выделить следующие группы малых РНК
(основываясь на их происхождении).

1	. Малые интерферирующие РНК (siPHK — small (short) interfer-
ing RN As), имеющие «экзогенное» происхождение: от вирусов,
трансгенов или транспозонов. Эти малые РНК контролируют «за-
молкание» транспозонов и трансгенов или опосредуют противо-
вирусный ответ.

2	МикроРНК (miPHK — microRNAs), кодируемые собственными
генами растений («эндогенные»). Они регулируют экспрессию
генов за счет разрезания транскрипта или репрессии трансляции
и играют важную роль в развитии растений.

Открытие явления «замолкания» генов у растений

Явление «замолкания» генов у растений было открыто при трансформации пе-
туньи генетическими конструкциями 35S::DFR и 35S::CHS, содержащими гены,
обеспечивающие окраску венчика цветка и отвечающие за синтез флавоноидов
(ген DPR — кодирует дихлорфлавонол-4-редуктазу; ген CHS — кодирует халкон-
синтазу). В противоположность ожиданиям исследователей, у трансгенных рас-
тений часто обнаруживалось подавление экспрессии генов DFR и CHS, при этом
оказывались подавленными не только введенные трансгены, но гомологичные им
гены петуньи. Это явление было названо «косупрессией».

Процессинг микроРНК у растений, МикроРНК образуются
в результате транскрипции miR генов растений. Первичный транс-
крипт miРПК, размером в среднем около 1000 п. н., процессируется
с участием РНКазы III DICER-LIKE 1 (DCL-1), которая является го-
мологом белка животных Dicer. Образовавшаяся пре-микроРНК мо-
жет транспортироваться из ядра с участием белка HST (HASTY —
гомолог белка животных Exportin-5) или оставаться в ядре, где
локализуются белки HEN1 (HUA ENHANCER 1) — метилтрансфе-
раза, осуществляющая модификацию метильной группы на З’-конце
miPHK), и HYL1 (HYPONAST1C LEAVES) белок,Связывающийся
с двухцепочечной РНК, который взаимодействует с DCL1. Эти бел-
ки способствуют формированию двухцепочечных промежуточных
дуплексов miPHK. При расплетании двухцепочечных miPHK обра-
зуются одноцепочечные miPHK размером 21-24 нуклеотида, кото-
рые присоединяются к рибонуклеиновому комплексу, называемому
RISC (RNA-Induced Silencing Complex), основу которого у растений
составляет белок AGO1 (ARGONAUT I). Комплекс RISC узнает
комплементарные мишени мРНК и осуществляет их разрезание.
Известно, что RISC также способен опосредовать ингибирование
трансляции и модификацию хроматина, но конкретные механизмы
этих процессов неизвестны (рис. 2.9). Мутанты по гену DCL-1 не-
жизнеспособны, у мутантов по генам AGO/, HEN1 и HYL1 наблюда-
ются различные аномалии развития.

Роль микроРНК в развитии растений. Особенность «замолка-
ния» генов с участием малых РНК у растений состоит в том, что ма-
лые РНК способны перемещаться по растению, транспоотироваться из
клетки в клетку через плазмодесмы. Дальний транспорт малых РНК
осуществляется по флоэме в комплексе с белком PSRP1 (phloem small
R.NA binding protein). В результате транспорта малых РНК возможно
распространение сигнала для «замолкания» гена по всему растению.
Такое явление называют «системным замолканием/сайленсингом».

Перемещение РНК из одной клетки в другую осуществляется
также при клеточных делениях. При делении дочерние клетки на-
следуют мРНК материнской клетки. Была предложена модель, ил-
люстрирующая участие miPHK в дифференцировке клеток расте-
ЦИТОПЛАЗМА
ЯДРО

Ге. „од,|руюшии микрорНК

—"У	J Poll!?

Рис. 2.9 Процессинг микроРНК у расгений (модифицировано по Kidner and Martienssen,
2005)

ний. Согласно этой модели miPHK могут являться своеобразными
«переключателями» программы развития клетки (рис. 2 10). В одной
из дочерних клеток синтезируются rmPHK, которые опосредуют раз
резание соответствующих им мишеней (например, мРНК генов, ко-
дирующих транскрипционные факторы). Это приводит к формиро-
ванию различного профиля транскриптов в дочерних клетках, что
определяет их различный путь развития.

Большинство генов, кодирующих miPHK, были идентифициро-
ваны с помощью компьютерных методов при анализе нуклеотидных
последовательностей, имеющихся в базах данных. Многие гены, экс-
прессия которых регулируется miPHK, кодируют транскрипционные
факторы, контролирующие развитие растений (табл. 2.5).
материнская клетка

i.'PHK гена
кодирующего ТФ

дочерние клетки с различным профилем
экспрессии генов транскрипционных факторов

Рис 210 Модель, иллюстрирующая
участие миироРНК в дифференцировке
клеток (модифицировано по Bartel, 2004)

МикроРНК играют важную
роль в различных морфогенети-
ческих процессах растений. Так,
например, в контроле развития
листа важно взаимодействие
miR3!9a (JAW) с транскриптами
генов TCP, контролирующими
пролиферацию клеток листово-
го примордия, а также miR 165
и miR 166 с транскриптами генов
РНВ, PHV и REV, контролирую-
щими адаксиально-абакиальную
симметрию листовой пластинки.

Другой пример регуляции
экспрессии гена с участием
miRNA — регуляция экспрессии
гена АР2 с участием miR172. Ген
АР2 участвует в формировании
цветка: он работает в двух внеш-
них кругах цветочной меристе-
мы, у мутантов ар2 отсутствуют
чашелистики и лепестки. miR 172
связывается с комплементарным
ей участком транскрипта АР2
и ингибирует трансляцию АР2
и АР2-подсбных транскриптов.

Этот случай является своего рода исключением, поскольку у рас-
тений miPHK в основном опосредуют деградацию мРНК. Транс-
крипция гена АР2 наблюдается во всех кругах меристемы цветка,
ген miR 172 экспрессируется во внутренних кругах. В результате это-
го белок АР2 встречается только в двух внешних кругах цветка, где
стимулирует развитие зачатков чашелистиков и лепестков.

Кроме того, miPHK регулирует экспрессию генов, кодирующих
белки, задействованные в метаболизме самих miPHK Так, miR162
и miR 168 подавляют экспрессию генов DCL и AGO соответственно.

Эволюционное происхождение микроРНК

Для объяснения происхождения микроРНК предложена гипотеза инвертирован-
ных дупликаций (inverted duplication hypothesis). Согласно этой гипотезе, в процес-
се эволюции происходит инвертированная дупликация гена-основателя, при этом
дуплицированные последовательности целого гена или его части оказываются рас-
Таблица 2.5

МикроРНК, участвующие в контроле развития растений

МикроРНК	Гены-мишени микроРНК	Функция
miR .64	CUC1. CUC2	Регуляция развития листа
mi R165	PH В. РНК REV	
miR 319а	TCP2-4, TCPIO, TCP24	
miR172	AP2 и АР2-псдобные гены	Регуляция развития цветка
miRNA EAT	TOE	
miR170, miR17l	SCL (SC A RECROW-like) (кодирует ТФ семейства GRAS)	Регуляция развития корня
miR.64	NAC1	
miR160 и miR167  miR393	ARF  TtRl	Регуляция ответа на ауксины Регуляция рецепции ауксина
miR i 62	DCE	Регуляция метаболизма микроРНК
miR168	AGO	

положенными либо «голова к голове», либо «хвост к хвосту». Возможна как дупли-
кация непосредственно геномной последовательности ДНК, так и интеграция псев-
догеноподобной последовательности после обратной транскрипции. В результате
транскрипции полученного локуса образуется РНК с вторичной структурой в виде
шпильки с двуцепочечным фрагментом. В процессе эволюции происходит диверген-
ция, накапливаются нуклеотидные замены в гене такой малой РНК, но в целом сохра-
няется структура, узнаваемая ферментами биогенеза малых РНК. Дупликации локуса
микроРНК привозят к формированию целого семейства генов микроРНК. В процессе
эволюции у генов-мишеней может происходить утрата домена взаимодействия транс-
крипта с микроРНК, что приводит к изменению рефляции гена.

Подтверждением этой гипотезы стало обнаружение у арабидопсис так назы-
ваемых «эволюционно молодых» микроРНК (miR161, miR 163). Гены таких «моло-
дых» микроРНК имеют протяженные участки гомологии с генами мишенями. При-
мером такой «молодой» miRNA является miR.163 — регулятор экспрессии генов
S-адечозилмстионин-зависимых метилтрансфераз (SAMT). Гены miR163 распола-
гаются на хромосоме в пределах кластера генов-мишеней, что свидетельствует об
их возможном эволюционном родстве.

Итак, в передаче сигналов в клетках растений и регуляции экс-
прессии генов принимает участие большое количество белков и РН К
с разнообразными функциями. В этой главе мы рассмотрели ряд
основных компонентов сигнальных путей высших растений. В сле-
дующих разделах учебника мы ознакомимся с их дейст вием в соста-
ве генных сетей, регулирующих различные программы развития.
Источники рисунков, использованных в главе

1.	Bartel D MicrcRNAs: Genomics, Biogenesis, Mechanism, and Function II Cell.
2004, Vol. 116. P. 281-297.

2	Ferreira F. J., Kiebei J. J. Cytokinin signaling // Current Opinion in Plant Biology.
2005. Vol. 8. P. 518-525.

3.	Hennig L„ Derkacheva M. Diversity of Polycomb group complexes in plants: same
rules, different players? //Trends in Genetics. 2009. Vol.25. P.414--423.

4.	Kidner C., Martienssen R. The developmental role of microRNA ir. plants // Current
Opinion in Plant Biology. 2005. Vol. 8. P. 38 -44.

5.	Kim M. C, Chung W. S, Yun D.-J. et al. Calcium and calmodulin mediated
regulation of gene expression in plants // Molecular Plant 2009. Vol. 2. P. 13-21.

6.	Lohrmunn J., Harter K. Plant two-component signaling systems and the role of
response regulators // Plant Physiology. 2002. Vol. 128. P 363-369.

7.	Moon J., Parry G., Estelle M. The ubiquitin-proreasome pathway and plant
development // Plant Cell. 2004. Vol. 16. P 3)81-3195.

Рекомендованная литература

1.	Голубовский M. Д. Век генетики: эволюция идей и понятий. СПб.: Борей Apr,
2000.

2.	Chen J. G Heterotrimeric G-proteins ip plant development // Frontiers in bioscience.
2008, Vol. 13. P. 3321-3333.

3.	Chow B., McCourt P. Plant hormone receptors: perception is everything // Genes and
Development. 2006. Vol.20. P. 1998-2008.

4.	Colcombet J, Hirt H. Arabidopsis MAPKs: a complex signalling network involved
in multiple biological processes // Biochemical Journal. 2008. Vol.413. P. 217-226.

5.	De Falco T. A., Bender K. W, Snedden W. A. Breaking the code: Ca2h sensors in
plant signalling // Biochemical Journal. 2009. Vol. 425. F.27- 40.

6.	De Smet I., Poss U., Jurgens G., Beeckman T. Receptor-like kinases shape the plant.
Nalure reviews //Molecular cell biology. 2009. Vol. 11. P. 1166-1173.

7.	Hay A., Tsiantis M. A KNOX family TALE // Current Opinion in Plant Biology.
2009 Vol. 12. P. 593-598.

8.	Hirsch S., Oldroyd G E. GRAS-domain transcription factors that regulate plant
development // Plant Signaling and Behavior. 2009. Vol. 4. N 8. P. 698-700.

9.	Kidner C, Martienssen R. The developmental role of microRNA in plants // Current
Opinion in Plant Biology. 2005. Vol. 8. P. 38-44.

10.	Kuppusamy К. T, Walcher C. L., NemhauserJ. L. Cross-regulatory mechanisms in
hormone signaling // Plant Molecular Biology. 2009. Vol. 69. P. 375--381.

11	Rijpkema A. S., Gerats T, Vandenbussche M. Evolutionary complexity of MADS
complexes // Current Opinion in Plant Biology. 2007. Vol. 10. P 32-38

12.	van der Graaff E., Laux T, Rensing S A. The WUS homeobox-containing (WOX)
protein family//Genome Biology. 2009 Vol 10. P.248-258.

13.	Fierstra R. D. The ubiquitin-26S proteasome system at the nexus of plant biology.
Nature reviews // Molecular cell biology. 2009. Vol. 10. P 385-397.

14.	Xue H.-W., ChenX. Mei Y. Function and regulation of phospholipid signalling in
plants // Biochemical Journal. 2009. Vol. 421. P. 145-156.
Раздел II

Генетические основы регуляции развития
растений фитогормонами

Помимо генетической программы, рост и развитие растения зави-
сят от интеграции многочисленных сигналов внешней и внутренней
среды.Фитогормоны являются основными эндогенными сигналами,
регулирующими развитие растений. Это небольшие мобильные мо-
лекулы, легко перемещающиеся между органами растения или даже
от одного растения к другому (например, газообразные гормоны:
этилен, эфиры жасмоновой кислоты). По своей природе фитогор-
моны представляют собой разнообразную группу веществ: к ним
относятся газообразный углеводород (этилен), терпеноиды (гиб-
береллины и абсцизовая кислота (АБК)), производные азотистых
оснований нуклеотидов (цитокинины — производные аденина) и ами-
ноксислот (ауксины — производные триптофана), небольшие белки
(СЬАУАТАЗ-подобные пептиды) и т. д.

Основными свойствами фитогормонов являются:

1.	Способность влиять на процессы жизнедеятельности
и^развитие растений в очень низких концентрациях. На-
пример, действующей концентрацией брассиностероидов
является 10 6—10 12 М.

2.	Наличие собственного рецептора, специфически связываю-
щего данный фитогормон. В ряде случаев для одного фито-
гормона имеется несколько рецепторов, относящихся к одному
семейству белков (как в случае с цитокининами и этиленом)
или к разным (что характерно для ауксинов и АБК). Рецепторы
фитогормонов очень разнообразны: это могут быть протеинки-
назы, локализованные на плазмапемме и связывающие гормон
на поверхности клетки (рецепторы цитокининов АПК, рецептор
брассиностероидов BRI 1 и рецепторы этилена ETR), рецепторы,
ассоциированные с G-белками (рецептор ауксинов АВР и рецеп-
торы АБК GPCR), ядерные белки, входящие в состав убиквитин-
__дигазных комплексов (рецептор ауксинов TIR1) и т. д.

3.	Наличие собственной системы передачи сигнала, работа ко-
т орой активируется при связывании гормона с рецензором.

В пути передачи сигнала разных фитогормонов могут действовать
очень разные компоненты. Последним звеном этой цепи является
транскрипционный фактор. Б отличие от гормонов животных для
фигогормонов характерно наличие длинных многокомпонентных
путей передачи сигнала; зо всяком случае, у растений не обна-
ружено примеров, когда рецептор к гормону является одновре-
менно транскрипционным фактором (как рецепторы стероидных
гормонов животных). Система рецепции и передачи сигнала при
ответе на фитогормоны включает в себя как минимум три ком-
понента (например, для рецептора к ауксинам TIR1 и рецептора
к гиббереллинам GID1) или же является очень длинной и слож-
но организованной (например, передача сигнала при ответе на
этилен включает в себя шесть последовательно действующих
компонентов). Наличие многокомпонентных систем передачи
сигнала при ответе на фитогермоны дает возможность регулиро-
вать интенсивность сигнала на нескольких этапах, что важно для
адаптации растений к меняющимся условиям среды. Кроме того,
системы передачи сигнала разных фитогормонов могут взаимо-
^^действовать между собой.

4.	Способность специфически влиять на экспрессию опредслен-
генов Экспрессия множества генов, участвующих в контро-
~ле развития растений, напрямую регулируется транскрипцион-
ными факторами, которые активируются при передаче сигнала
фитогормонов. В промоторах этих генов имеются короткие кон-
сервативные последовательности, с которыми специфически вза-
имодействуют гормон-зависимые транскрипционные факторы
(например, в промоторах генов запасных белков, которые важ-
ны для созревания зародыша, имеются последовательности RY,
ABRE и СЕ, необходимые для связывания разных групп АБК-
зависимых транскрипционных факторов). Зачастую в промоторах
гормон-рсгулируемых генов имеется несколько последовательно-
стей для связывания транскрипционных факторов, зависящих от
разных фитогормонов, что дает возможность для взаимодействия
гормонов в регуляции их экспрессии и контроле развития. По-
мимо генов, контролирующих развитие растения, гормоны могут
напрямую регулировать экспрессию генов, участвующих в пере-
даче своего сигнала. Как правило, имеет место петля негативной
обратной связи, когда фитогормоны позитивно регулируют экс-
прессию генов, кодирующих репрессоры передачи их сигнала,
что дает возможность для десенситизации всей системы при дли-
тельном воздействии. Зачастую репрессор транскрипции явля-
ется необходимым звеном цепи передачи сигнала фитогормоков
и связан с промоторами гормон-регулируемых генов при отсут-
ствии фитогормонального сигнала. При рецепции фитогормона
и активации нижележащих путей передачи сигнала происходит
диссоциация репрессора и освобождение промотора, к которому
сразу же присоединяется гормон-регулируемый транскрипцион-
ный фактор. Обычно репрессор при этом подвергается убиквити-
нированию и протеасомной деградации; компоненты убиквитин-
лигазных комплексов являются важными компонентами путей
передачи сигнала многих фитогормонов.

Среди фитогормонов — регуляторов роста растений, отвечающих
четырем вышеперечисленным требованиям, условно выделяют
так называемую «классическую пятерку» фитогормонов: это аук-
сины, цитокинины, гиббереллины, абсцизовая кислота и этилен. Все
эти гормоны были идентифицированы в начале-середине XX века,
и в настоящий момент генетический контроль их метаболизма, ре-
цепции и передачи сигнала изучен достаточно подробно. Именно на
этих гормонах мы остановимся вс втором разделе учебника. В го же
время, помимо гормонов «классической пятерки», в последние два
десятилетия у растений выявлено большое количество других фи-
тогормонов: брассиностероиды, жасмоновая кислота, салициловая
кислота, несколько групп пептидных гормонов (системин, ENOD40,
СЬАУАТАЗ-подобные белки и т. д.), монооксид азота (NO). Поми-
мо фитогормонов, обладающих своими собственными системами
рецепции и передачи сигнала, в растительном организме действует
большое количество других регуляторов роста и развития: напри-
мер, сахароза — основной источник органического питания расте-
ний, и различные вторичные метаболиты (например, алкамиды, ко-
торые, по данным последних лет, являются важными регуляторами
пролиферации клеток и развития разных органов растения; сгриго-
лактоны — регуляторы ветвления, играющие важную роль в кон-
троле развития боковых почек). Исследования, связанные с поиском
и изучением новых регуляторов роста растений ведутся постоян-
но — так что, вероятно, через несколько лет наши представления
о фитогормонах будут значительно расширены.

' Фактически каждый этап морфогенеза растений — от ранних эта-
нол эмбриогенеза до цветения и завязывания семян — находится под
влиянием фитогормонов. Например, асимметричность первого де-
ления зиготы, которое крайне важно для дальнейшего нормального
хода эмбриогенеза, зависит от градиента концентрации ауксинов; а
созревание зародыша и период покоя семян невозможны без А БК.

। В контроле большинства морфогенетических процессов фито-
гормоны взаимодействуют между собой, при этом они могут быть
как синергистами, так и антагонистами (например, цитокинины
п~ауксины совместно контролируют деление клеток, но действуют
в противоположных направлениях в контроле развития апикаль-
ных меристем побега и корня). Как правило, антагонистические
взаимодействия между двумя фитогормонами являются основным
механизмом регуляции того или иного процесса в зависимости от
меняющихся условий среды (например, регулируемый внешними
сигналами баланс гиббереллинов и АБК, которые являются антаго-
нистами в контроле периода покоя семян, определяет, будет ли про-
растать семя в конкретных условиях).

Тем не менее у каждого фитогормона имеется «своя область дей-
ствия» — процесс, в контроле которого этот гормон играет основ-
ную роль. Например, для гормонов «классической пятерки» эти уни-
кальные функции таковы:

1.	Ауксины (единственные фитогормоны, для которых существует
система поляэного транспорта) контролируют направления ро-
ста (что особенно четко видео на примере фото- и гравитропиз-
мов) и полярность развития всех органов растения (апикально-
базальную полярность стебля и корня, симметрию листа и т. д.).

2.	Цитокинины контролируют пролиферацию клеток, что особенно
важно для развития меристем — пулов недифференцированных,
быстро делящихся стволовых клеток, па периферии которых про-
исходит закладка новых органов растения.

3.	Этилен является «гормоном стресса» и играет важнейшую роль
в запуске ответа на патогены и механические повреждения. Яв-
ляясь газообразным гормоном, он может диффундировать между
органами растения и запускат ь стрессовый ответ во всем расти-
тельном организме.

4.	Гиббереллины — стимуляторы вегетативного развития (в особен-
ности прорастания) и генеративного развития (перехода к цвете-
нию).
5.	Абсцизовая кислота является регулятором созревания и покоя се-
_мян, а также необходима для защиты растений от дегидратации.
Наличие таких функций у каждого фитогормона облегчает иден-
тификацию мутантов по генам, контролирующим метаболизм или
передачу сигнала того или иного гормона: например, растение с на-
рушением фото- и гравитропических реакций с высокой вероятно-
стью имеет дефекты в метаболизме или передаче сигнала ауксинов,
а растение, у которого семена прорастают внутри плода (явление
вивипарии) является мутантом по АБК. Как правило, все эти му-
танты являются жизнеспособными, поскольку для растений в свя
зи с их жизненной стратегией характерна некоторая «избыточность
генома», благодаря которой практически каждый компонент пути
передачи сигнала фитогормонов кодируется небольшим семейством
генов, которые характеризуются разным пространственным и вре-
менным характером экспрессии и могут частично замещать функции
друг друга

Благодаря идентификации и изучению мутантов с нарушением
определенных гормон-зависимых процессов был достигнут боль-
шой прогресс в изучении систем передачи сигнала фитогормонов,
а также регуляции их метаболизма. По снижению или усилению
интенсивности определенных процессов идентифицируют мутан-
тов с потерей функции генов, участвующих в метаболизме или от-
вете на фитогормоч (loss-of-function mutants, LOE), или с усилением
функции этих генов (gain-of-funclion mutants, GOF). Как правило,
мутации LOF являются рецессивными, а мутации GOF — доминант-
ными. Изучение эпистатических взаимодействий между мутациями
по генам, контролирующим передачу сигнала определенного фито-
гормона, позволило установить порядок действия соответствующих
белков в цепи передачи сигнала.

Изучение генетических механизмов действия регуляторов роста
растений, в том числе фитогормонов, является одним из основных
разделов генетики развития растений, которому будут посвящены
следующие пять глав нашего учебника.
Глава 3

Ауксины

Ауксины входят в число фитогормонов, контролирующих разви-
тие растения на всех стадиях. Ауксины можно назвать «гормонами
направлений»: это единственная группа фитогормонов, контроли-
рующая направленные ростовые движения растений (тропизмы),
а также асимметричность деления клеток в эмбриогенезе и поляр-
ность развития всех органов растений. Кроме того, ауксины контро-
лируют клеточный цикл, стимулируют активность ионных каналов,
рост клеток растяжением и дифференцировку специфических тиков
клеток (сосудов, корневых волосков), играют ключевую роль в раз-
витии корневой системы и закладке примордиев латеральных орга-
нов побега. Таким образом, для мутантов с потерей функций генов,
контролирующих метаболизм или передачу сигнала ауксинов, харак-
терны нарушения полярности органов, апикального доминирования,
развития корней, грави- и фототропических реакций.

Первое предположение о существовании вещества, контроли-
рующего фототропизм (направленное ростовое движение растений
в сторону источника света), выдвинул Чарлз Дарвин в своей работе
«О способности растений к движению» (1880). В опытах по зате-
нению разных частей стебля Дарвин пришел к выводу, что гипоте-
тический регулятор поста растений, который он назвал ауксином,
синтезируется в апексе и перемещается в надземной части растения
полярно (сверху вниз). В 1931 г. из человеческой мочи было выде-
лено вещество, способное вызывать изгибы стебля у растений, этим
веществом оказалась индолилуксусная кислота (ИУК); вскоре ИУК
была выделена из тканей растений и грибов.

По своей химической природе ИУК является производной ами-
нокислоты триптофана. ИУК — основной натуральный ауксин, ко-
торый составляет 80- 95% всех ауксинов в тканях растений разных
видов. Все прочие природные ауксины (индолбутировая кислота,
хлориндолилуксусная кислота) близки к ИУК но своей химической
формуле и связаны с ней происхождением. Получены также синте-
тические вещества с ауксиновой активностью, многие из которых
значительно отличаются от ИУК

3.1.	Биосинтез, катаболизм и инактивация ауксинов

Основное место биосинтеза ИУ К в растении — молодые листья
и их примордии. Помимо растений, способностью к биосинтезу
ИУК обладают некоторые грибы и патогенные бактерии (например,
представители родов Agrobacterium и Pseudomonas, поражение кото-
рыми вызывает аномальное разрастание тканей растения-хозяина).

У растений существуют два пути синтеза ИУК: подробно изучен-
ный триптофан-зависимый путь и триптофан-независимый путь, ко-
торый до сих пор является гипотетическим.

Триптофан-зависимый путь представляет собой синтез ИУК
из триптофана в несколько этапов. Существует несколько вариантов
триптофан зависимого пути биосинтеза ИУК, основными из которых
являются синтез через индолпировиноградную (IPA) кислоту, через
индолацетамид (1АМ), через триптамин (ТАМ) и через индолаце-
тальдоксим (1АОх) (рис. 3.1). У разных видов растений преобладает
тот или иной вариант триптофан-зависимого биосинтеза ИУК — на-
пример, у арабидопсис и других крестоцветных преобладающим яв-
ляется путь синтеза через ТАОх; для Agrohactenum и Pseudomonas
характерен путь синтеза через 1АМ. Триптофан-зависимый путь био-
синтеза ИУК изучен весьма подробно; у растений и бактерий выде-
лены ферменты, катализирующие все стадии разных его вариантов,
выявлена значительная часть генов, кодирующих эти ферменты.

Интересно, что мутанты с потерей функции генов, действующих
на разных этапах триптофан-зависимого пути биосинтеза ИУК. ча-
сто характеризуются не пониженным, а повышенным содержанием
ауксинов в тканях. Причиной этого является резкая активация дру-
гих вариантов триптофан-зависимого пути синтеза ИУК при об-
рыве одного из них.

Помимо триптофан-зависимого пути биосинтеза ИУК, у расте-
ний существует триитофан-независимый путь, про который, не-
смотря на длительность изучения этого вопроса, абсолютно ничего
не известно. Доказательством существования такого пути является
получение жизнеспособных мутантов арабидопсис {trpl, 2, 3, 4 и 5)
и кукурузы {огр), дефектных по синтезу триптофана. Это мутанты
Рис. 3.1 Пути биосинтеза ИУК и триптофана у растений (модифицировано по Wood-
wan and 3artel, 2005)

Биосинтез триптофана (красные стрелки); триптофан-зависимые пути биосинтеза

ИУК: через триптамин (зеленые стрелки), через индслпн ровиноградную кислоту
(желтые стрелки), через индолацетамид (голубые стрелки), через индслацетальдоксим
(оранжевые стрелки); триптофан-независимый путь биосинтеза ИУК (серые стрелки).

с потерей функции генов, контролирующих разные стадии синтеза
триптофана из его предшественника хоризмата. У них не синтезиру-
ется триптофан, но тем не менее наблюдается нормальный или даже
многократно повышенный уровень ИУК. Вероятно, при невозмож-
ности работы у таких мутантов триптофан зависимого пути биосин-
теза ИУК у них происходит активация гипотетическою пути синтеза
ИУК без использования триптофана.

У растений также существует несколько путей инактивации ИУ К:
во-первых, это образование индолбутировой кислоты (ИБК) — запас-
ной формы ауксинов, во-вторых образование конъюгатов с амино-
кислотами и сахарами. Конъюгаты обладают слабовыраженной аукси-
новой активностью и также являются запасными формами ауксинов.
Синтез конъюгатов осуществляет большая группа ферментов GH3-1.
Экспрессия генов GH3-1 позитивно регулируется ауксинами — таким
образом, имеет место негативная образная связь в конгроле уровня
активной ИУК. Кроме того, у арабидопсис выявлены многочисленные
ферменты, осуществляющие гидролиз конъюгатов с образованием ак-
тивной ИУК, клонированы кодирующие их гены. Му ганты с потерей
функции этих генов накапливают соответствующие конъюгаты и об-
ладают повышенной чувствительностью к ним.

3,2.	Полярный транспорт ауксинов

Поскольку основным местом биосинтеза ИУК являются апи-
кальные части побега, необходим базипетальный транспорт ИУК
в нижележащие органы растения. Существуют два вида транспорта
ауксинов

1.	Быстрый транспорт по флоэме, представляющий собой переме-
щение ауксинов с потоком метаболитов и питательных веществ.
Таким способом могут перемещаться по растению как активная
ИУК, так и ее конъюгаты.

2.	Полярный транспорт ауксинов (ПАТ) характерен только для ак-
тивной ИУК и происходит в основном по клеткам перицикла
и молодым (живым) сосудистым элементам. При полярном транс-
порте имеет место вход ИУК в клетку с одной стороны и выход
из нее с противоположной, в обоих процессах задействованы раз-
ные группы белков-переносчиков. Это транспорт более медлен-
ный и имеет строго выраженную направленность: в частности,
в побеге он направлен базипетально, от апикальной меристемы
и молодых лист ьев к корню; в кончике корня происходит разворот
ПАТ, и дальше ИУК движется акропетально до зоны образования
боковых корней (рис. 3.2). ИУК — единственный фитогормон, об-
ладающий слсжноорганизованной системой полярного транспор-
та; от направления ПАТ в различных ор1анах растения зависит
полярность их развития.

Определенные вещества, например нафтилфталамовая кислота
(NPA) и 2,3,5-трийодбензойная кислота (Т1ВА), специфически бло-
кируют ПАТ. При этом происходит накопление ИУК внутри клеток,
что позволило предположить существование по-разному организо-
ванных входных и выходных (influx и efflux) каналов для полярного
транспорта ИУК, причем направление ПАТ связано с расположени-
ем входного и выходного канала на разных сторонах клетки (соответ-
ственно, на апикальной и базальной). Блокирование ПАТ с помощью
NPA и TIB А связано с их влиянием на работу выходного канала.
Рис 3 2 Схем? организации полярного транспорта ИУК

Слева — Хениосмотический механизм входа протонированной формы ИУК в клетку
Справа — OchoBHnie направления полярного транспорта ИУК в стебле и корне.
Пояснения в тексте

Хемиосмотмческая гипотеза

Первой физико-химической моделью, объясняющей механизм
полярного транспорта ауксина, была так называемая хемиосмотиче-
ская гипотеза (рис. 3.2), суть которой состоит в следующем.

Ауксины представляют собой слабые органические кислоты,
поэтому их молекулы подвержены обратимой диссоциации, равно-
весие которой зависит от pH среды. Недиссопиированная неполяр-
ная молекула ауксина может проникнуть через клеточную мембрану
даже за счет пассивной диффузии, тогда как для прохождения через
мембрану аниона требуется активный транспортер. При pH 5,5, ха-
рактерном для межклеточного пространства, большой процент мо-
лекул ИУК оказывается в недиссоциированпом виде и может про-
никнуть в клетку. Внутри клетки pH цитозоля составляет около 7,0,
что приводит к диссоциации молекул ИУК. Проникнуть обратно за
счет диффузии анионы не могут, следовательно, требуется допол-
нительный транспортер для выхода их из клетки. Асимметричное
расположение «входного» и «выходного» транспортеров на разных
поверхностях клетки создает возможность для направленного пото-
ка ауксинов — то есть полярного транспорта. В дальнейшем было
установлено, что входной и выходной каналы ПАТ действительно
состоят из разных белков с разными функциями.

Белки AUX1/LAX - входной канал полярного транспорта ауксинов

Входной канал ПАТ образует белок AUX1, относящийся к семей-
ству аминокислотных пермеаз LAX, которые осуществляют пере-
нос в клетку триптофана. Фенотип мутанта с потерей функции auxl
типичен для мутантов с повышенной чувствительностью к аукси-
нам. Основное место экспрессии гена AUX1 — зоны, прилегающие
к примордиям латеральных органов в апикальной меристеме побе-
га, апикальная меристема корня, примордии боковых корней. Инте-
ресно, что для белка AUXI не выявлена полярная локализация —
таким образом, входной канал ПАТ может располагаться на всех
поверхностях клеток.

Белки РИ - выходной канал полярного транспорта ауксинов

В то же : .ремя для белков выходного канала ПАТ была продемон-
стрирована четкая полярная локализация — следовательно, именно
их расположение определяет направление полярного транспорта
ауксинов. Основу каждого выходного канала ПАГ составляет белок
PIN Белки PIN — небольшое семейство трансмембранных белков
(например, у арабидопсис выявлено 8 белков PIN), принадлежащих
к группе memtrans белков — одному из типов вторичных транспор-
теров, которые встречаются как у про-, так и у эукариот.

PIN-белки являются эволюционно очень древней группой белков,
они обнаружены у всех растений начиная с харовых водорослей.
Первый из PlN-белкоз арабидопсис — PIN1 — был выявлен при
изучении мутанта с пот ерей функции pinl (pinformed), который имел
нарушения в закладке латеральных органов побега: у мутанта разви-
валось очень небольшое количество листьев и цветков и происходи-
ла ранняя терминация апикальной меристемы побега с образованием
структуры, похожей на шпильку. В дальнейшем по гомологии с P1N1
у арабидопсис было выявлено еще семь /V/V-гснов.

Несмотря на то что функции белков PIN частично перекрываются,
для них характерна тканеспецифичность экспрессии соответствую-
щих генов и, вероятно, разные механизмы контроля локализации на
полюсах клетки. В связи с этим функции PIN-белков в контроле раз-
вития растений несколько различаются.

PIN1 является основным PIN-белком в растении и участвует
в контроле развития всех его органов на всех этапах (рис. 3.3) —
в связи с этим мутация с потерей функции pinl имеет более
Рис. 3.3. Роль белка PINП а контроле полярности развития растения

(модифицировано по Benkova et al„ 2003)

А — эмбриогенез: стадии глобулы (слева) и сердца (справа), Б — инициация
листового примордия, В — развитие бокового корня.

Вссрху — локализация белка PIN1 на поверхности клеток с помощью репортернсй
конструкции PIN-:GFP. Внизу — схематическое изображение направлений полярного
транспорта ауксинов. Зеленым цветом отмечены максимумы концентрации ИУК

сильное фенотипическое проявление по сравнению с осталь-
ными />т-мутациями. Именно белок PINJ играет центральную
роль в базипетальном транспорте ауксинов от молодых ли-
стьев к корню. Кроме того, с активностью белка PIN1 связано
появление локальных максимумов концентрации ауксинов на
периферии апикальной меристемы побега — механизм, лежа-
щий в основе закладки примордиев листьев и цветков. Именно
с этой функцией белка PIN1 связан своеобразный фенотип му-
танта pinl.

В кончике корня, где происходит разворот полярного транспор-
та ИУК, имеет место локализация трех Р1М-белков — PIN1, PIN2
и PIN3 — на различно ориентированных поверхностях клеток: PIN1
локализуется на базальной стороне, PIN2 — на апикальной, PIN3 —
на латеральной (рис. 3.4). С изменением локализации белков PIN2
и PIN3 на поверхности клеток корня связаны его гравитропические
реакции: две из грех мутантных аллелей гена PIN2 — agr (agravit-
ropic root) и eir (ethylene insensitive root) были выделены именно по
нарушению гравитропизма корня. Для белка PIN3 показано быстрое
изменение локализации при изменении вектора силы тяжести — бе-
лок перемещается на ту сторону, которая будет латеральной при но-
вой ориентации корня.

Ген PIN7 является одним из наиболее ранних регуляторов эмбрио-
генеза: его экспрессия начинается в зиготе (возможно, он участвует
в обеспечении полярности ее деления), на стадии двух клеток белок
PIN7 локализуется на апикальном полюсе базальной клетки, обеспе-
чивая транспорт ИУК к будущему зародышу. На стадии двух кле-
ток в апикальной клетке зародыша начинает экспрессироваться ген
PINI, который играет важную роль на переходе зародыша от стадии
глобулы к стадии сердца, контролируя накопление ауксина в зонах
закладки семядолей и первичного корня.

Регуляция полярного транспорта ауксинов

Существует несколько путей регуляции интенсивности и направ-
ления ПАТ:

•	через регуляцию экспрессии генов PIN;

•	через контроль активности PIN-белков путем их пост-
грансляционных модификаций;

•	через контроль убиквитин-зависимой деградации PIN-белков:

•	через контроль локализации белков PIN на разных сторонах клетки.

Как видно, все пути регуляции ПАТ связаны с контролем работы
белков выходного канала.

Регуляция экспрессии PJ/V-генов. Контроль ПАТ через регу-
ляцию уровней экспрессии Р/Д7-генов изучен на примере развития
латеральных органов побега (лиегьев и цветков). Одним из необ-
ходимых условий их закладки является возникновение небольших
зон высокой концентрации ауксинов на периферии ПАМ — именно
в этих зонах происходит закладка примордиев. Для возникновения
локальных максимумов концентрации ауксинов необходимо локаль-
ное усиление ПАТ, которое достигается за счет повышения уровня
экспрессии гена P1N1. На экспрессию гена PIN1 в апикальной мери-
стеме побега влияет несколько групп транскрипционных факторов:
это ауксин-зависимый транскрипционный фактор MPAARF5, репрес-
сор транскрипции ауксин-регулируемых генов BDI./IAA12, а также
транскрипционные факторы РНВ, PHV. REV и KAN, принимающие
участие в контроле полярности листа.

Аналогично, при закладке первичного корня зародыша, а также
боковых и придаточных корней взрослого растения имеет место ло-
кальное повышение уровней экспрессии генов PINI, PIN2, PIN3,
PIN4 и PIN7, причем все эти гены демонстрируют различный про-
Рис. 3.4. Различные функции PIN белков в контроле развития корья

А — тканеспецифичность экспрессии PIN генов в корне На фотографии представлена
экспрессия регортерных конструкции PIN1 :GUS, PIN2::GUS и PIN3:GUS в разных зонах
развивающегося боксвогс корня (по Bcnkova et al.. 2003).

Ь — локализация PlN-белкоз на разных полюсах ю еток эндодермы корня: PIN1 (на
базальной стороне), PIN2 (на апикальной), PIN3 (на латеральной) (по Blnou et al., 2005)

странственный характер экспрессии в разных слоях клеток при*
мордия (рис 3 4). При закладке первичного корня зародыша ключе-
вую роль играет контроль экспрессии гена PIN1 белками MP/AR.F5
и BDL'IAA12, а также взаимодействующим с ними фактором ремо-
делипга хроматина TPL. Механизмы регуляции экспрессии разных
/VA-генов в разных зонах развивающегося корня в настоящее время
не выяснены.

Контроль посттрансляционной модификации белков PIN.
Важную роль в регуляции 1IAT играет также посттрансляционная
модификация PlN-белков путем фосфорилирования Ser/Thr проте-
инкиназой PID (PINOID). В гидрофильных цитоплазматических до-
менах PlN -белков имеются по два консервативных мотива, важных
для фосфорилирования. Фосфорилирование PlN-белков киназой
PID важно для определения их полярной локализации.

Мутант с потерей функцииpidимеет фенотип, сходный с феноти-
пом мутанта с рйл1\ в то же время сверхэкспрессия гена P1D у транс-
генных растений арабидопсис вызывает нарушение гравитропизма
стебля и корня. В обоих случаях имеет место нарушение полярной
локализации PlN-белков — таким образом, для нормальной лока-
лизации PIN-бслков важно поддержание определенного уровня экс-
прессии гена P1D. Более детальные исследования позволили устано-
вить, что протеинкиназа PID имеет пороговый уровень активное™:
активность ниже порогового уровня направляет PIN-белки на ба-
зальную поверхность клетки, тогда как активность выше порогового
уровня — на апикальную.

Возможным антагонистом протеинкиназы PID является белок
RCN — регуляторная субъединица протеинфосфатазы 2А. У мутан-
та с потерей функции rcn (root curling in NPA) нарушено распределе-
ние белков PIN и наблюдается нарушение гравитропизма.

Экспрессия гена РЮ и активность киназы PID позитивно регу-
лируется ауксинами — таким образом, протеинкиназа PID может
играть роль в обратной связи, регулирующей распределение аукси-
нов в тканях растения. Передача сигнала ауксинов связана с актива-
цией фосфолипаз и синтезом липидных сигнальных молекул. Одной
из мишеней липидных вторичных мессенджеров является Ser/Thr
протеинкиназа PDK1 (Phosphoinositide-Dependent Kinase 1), которая
регулирует активность киназы PID.

Регуляция локализации PIN-белков на илазмалемме. Ключе-
вое значени ? для обеспечения полярности развития растительного
организма t меет направление ПАТ, которое, в свою очередь, зависит
от правильной локализации PIN-белков на полюсах клетки. В про-
цессе развития, а также в ответ на внешние стимулы (например, из-
менение вектора силы тяжести) PIN-белки могут менять свою ло-
кализацию на плазмалемме — таким образом, в клетках растений
постоянно происходит процесс циркуляции PIN-белков. Циркуляция
всех мембранных белков, в том числе белков PIN, зависит от процес-
сов экзоцитоза, эндоцитоза и везикулярною транспорта. В контроле
этих процессов участвует множество белков с различными функция-
ми (рис. 3.5).

У всех эукариот важнейшую роль в ориентировке везикуляр-
ного транспорта играет цитоскелет. Движение везикул осущест-
вляется вдоль актиновых филаментов, перестройки цитоскелета
важны для экзо- и эндоцитоза. В соответствии с этим структу-
ры цитоскелета участвуют в регуляции ПАТ через контроль по-
лярной локализации PIN-белков. Действительно, вещества, пре-
пятствующие полимеризации актина, такие как цитохалазин D
и латрункулин В, нарушают везикулярный транспорт PIN-белков
и подавляют ПАТ.

Транспорт везикул вдоль актиновых филаментов — энергоемкий
процесс, требующий активности ГТФаз. Важнейшую роль в контро
ле везикулярного транспорта белков PIN играет ген GNOM: мутанты
с потерей функции gnom демонстрируют аномалии, связанные с пол
ной потерей способности к полярному развитию, начиная с ранних
этапов эмбриогенеза, за счет нарушения локализации PIN-белков на
Рис. 3 5 Основные пути регуляции полярного транспорта ауксинов

1	— контроль экспрессии генов PIN позитивные регуляторы — транскрипционные
факторы MP/ARF5 и HD-ZIPIII (PUB, PHV, REV), негативный регулятор — BDI /1АА12,
антагонист MP/ARF5. Активность этого пути позитивно регулируется ауксинами: за
счет активации MP/ARF5 MAP-киназами и за счет протолиза BDL/IAA12 опосредо-
ванней рецептором TIRV

2	— контроль Фосфорилирования PIN-белков: фосфорилирование осуществляет
киназа PID, ее антагонистом является фосфатаза RCN Активность этсго пути по-
зитивно регулируется ауксинами: за счет киназы PDK, связывающей фосфолипидные
сигнальные молекулы (PIP), которые синтезируются ауксин-актияируемыми фосфо-
липазами (PL).

3	— контроль убиквитин-завиг.имой деградации PIN-белков: рецептор ауксинов TIR1
стимулирует их убиквитинирование и протеолиз.

4	— контроль локализации PIN-белков на плаз мал емме: везикулярный транспорт
и экзоцитоз регулируются ГТФазой GN0M, экзоцитоз — фитотропином T|R3/B’G, до-
кинг— стеролметилтрансферазой SMT/ORC

различно ориентированных полюсах клеток. Продуктом гена GNOM
является белок группы GEF (Guanosine Exchange Factor), его актив-
ность необходима для ГТФ-зависимого направленного везикулярно-
го транспорта белков PIN.
В последние годы получены данные о других белках, вхо-
дящих в состав выходного канала ПАТ наряду с PIN-белками
и имеющих значение для нормальной полярной локализации
PIN-белков. Информация о таких белках была получена при изу-
чении влияния ингибиторов ПАТ на выходной канал. Все инги-
биторы ПАТ можно разделить на две группы: в первую входит
TIBA, которая по своей природе сама является слабым ауксином
и может конкурировать с ИУК в выходном канале ПАТ. Вторую
группу ингибиторов ПАТ составляют вещества, получившие на-
звание фитотронинов, механизм действия которых на транспорт
ауксинов до настоящего времени не выяснен. Типичным предста-
вителем фитотропинов является NPA. По-видимому, механизм
действия фитотропинов на ПАТ связан с их взаимодействием со
специфическими белками, входящими в состав выходного кана-
ла ПАТ и получившими название NBP (NPA Binding Proteins).
NBP — периферические мембранные белки, локализованные на
внутренней поверхности плазмалеммы и взаимодействующие
с актиновыми филаментами. Так же, как и белки PIN, NBP де-
монстрируют полярную локализацию (на базальной поверхности
клетки). У арабидопсис был выделен ряд мутантов tir (transport
ingihitor response) с измененной чувствительностью к ингибито-
рам ПАТ, один из которых — tir3 — имел специфическую не-
чувствительность только к NPA. Продуктом гена TfR3 является
белок из группы NBP, получивший название BIG за чрезвычайно
большой размер молекулы (560 kDa). Белок BIG/TIR3 является
гомологом белка дрозофилы CALOSSIN/PUSHOVER (CAL/O),
который участвует в контроле эндоцитоза.

Таким образом, процесс экзоцитеза PIN-белков зависит от актив-
ности белка GNOM/GEF, тогда как процесс эндоцитоза, по-видимому,
контролируется белками NBP, в том числе BIG/TIR3.

Помимо интенсивности экзо- и эндоцитоза, большое значение
в контроле ПАТ играет точная локализация PIN-белков в определен
ных микродоменах клеточной мембраны со специфической стероль-
ной композицией. Эти данные были получены благодаря изучению
мутанта арабидопсис orc/cephalupod, аномалии полярности разви-
тия у которого связаны именно с нарушением локализации белков
PIN в «правильных» микродоменах. Продукгом гена ORC/CPH яв-
ляется стеролметилтрапсфераза (SMT). Точные механизмы докинга
PIN-белков в настоящее время нс изучены.

Регуляция убиквитин-зависимой деградации PIN-белков.
Еще один путь регуляции ПАТ связан с контролем стабильности
PIN-белков. Установлено, что некоторые из них, в частности белок
PIN2, после эндоцитоза могут подвергаться убиквитин-зависимой
прогеасомной деградации, причем этот процесс позитивно регули-
руется ауксинами. Протеасомная деградация PIN-белков опосредо-
вана убиквитин-лигазным комплексом SCFTIRI, в состав которого
входит ауксин-связывающий белок TLR1, более подробно о котором
будет сказано ниже.

3.3.	Рецепция и передача сигнала ауксинов

Несмотря на длительное изучение ауксинов, в рецепции и пере-
даче сигнала этих фитогормонов в настоящее время остается много
нерешенных вопросов.

При длительном изучении ауксинов было выделено большое ко-
личество ауксин-связывающих белков (АВР) с разными функциями.
В настоящее время функция в качестве рецепторов ауксина была
продемонстрирована для двух белков:

•	трансмембранного белка АВР1, взаимодействующего
с G-белками;

•	белка TIRi. входящего в состав убиквитин-лигазною комплекса
SCF.

Каждый из этих белков при связывании ауксина запускает экс-
прессию ауксин-регулируемых генов, причем потеря функции
каждого из них приводит к потере жизнеспособности растения.
О взаимодействии этих двух независимых рецепторных систем или
каком-либо разделении функций между ними в настоящее время ни-
чего не известно.

Кроме того, в настоящее время не выявлены «средние» компонен-
ты пути передачи ауксинового сигнала, действующие между рецеп-
тором АВР1 и ауксин-зависимыми транскрипционными факторами.
При ответе на ауксин имеет место активация МАР-киназного каска-
да и киназы PID, но точное место этих протеинкиназ в пути переда-
чи сигнала ауксинов не установлено.

Белок АВР1 и фосфолипаза А2

АВР1 (Auxin Binding Protein 1) — первый из изученных рецеп-
торов к ауксину — был впервые выделен из колеоптилей куку-
рузы и в дальнейшем обнаружен у других видов растений. Этот
белок локализован в основном на мембранах эндоплазматической
сети, только небольшое количество белка АВР1 секретируется на
поверхность плазмалеммы, где, вероятно, и происходит его свя-
зывание с ауксином. Долгое время АВР1 считался единственным
рецептором к ауксину, так как мутантов с потерей его функции
получить не удавалось, а трансформация антисмысловой последо-
вательностью гена АВР1 вызывала гибель трансгенных растений
на стадии зиготы.

Белок АВР1 относится к рецепторам, сопряженным с гете-
ротримерными G-белками (GPCR). При связывании молекулы
ауксина с АВР1 происходит обмен ГДФ на ГТФ и диссоциация
гетеротримера G-белков с высвобождением субъединицы Ga,
которая выступает в качестве сигнальной молекулы при пере-
даче различных внутриклеточных сигналов. Вероятно, именно
с тем, что в передаче сигнала при ответе на ауксины использует-
ся а-субъединица G-белков, а нс какие-нибудь уникальные для
ауксинового сигналинга молекулы, связаны трудности в изуче-
нии ответа на ауксин.

Предполагается, что следующим звеном этой цепи является
фосдолипаза А2, которую активирует субъединица Ga. Дей-
ствительно, фосфолипаза А2 быстро (в течение 1 минуты) ак-
тивируется после обработки растения ауксинами; кроме того,
моноклональные антитела против белка АВР) ингибируют
ауксин-зависимую активацию фосфолипазы А2. Блокирова-
ние активности фосфолипазы А2 ингибирует многие ауксин-
зависимые реакции растений.

Фосфолипаза А2 катализирует расщепление фосфолипидов
с образованием лизофосфолипидов и свободных жирных кис-
лот. Оба типа веществ широко используются в растительной
клетке как вторичные мессенджеры для передачи различных
сигналов.

Возможно, в качестве вторичных мессенджеров при передаче аук-
синового сигнала также используются ионы Н' и Са2'. Действитель-
но, активация ионных каналов является наиболее ранним ответом
клетки на ауксин (см. ниже).

Протеинкичазы

Итак, передача сигнала ауксинов сопряжена с большим количе-
ством вторичных мессенджеров, среди которых могут быть ионы
Са2' и липидные сигнальные молекулы. Обычными мишенями ио-
нов Са2', а также лизофосфолипидов и жирных кислот в клетках
растений являются кальций-зависимые протеипкипазы CDPK. Кро-
ме того, ауксины вызывают активацию некоторых других протеин-
киназ в частности, MAP-киназ и киназы PID, которая влияет на
полярный транспорт’ ауксинов. Предполагается, что все эти гтроте-
Рис. 3.6. Рецепции ауксинов белком А0Р1 и начальные этапы передачи сигнала

1 и 2 — белок AUX 1 транспортирует ауксин в клетку, ауксин связываемся рецептором
АВР1 на плазмалемме или на мембране ЭР. Связывание ауксина вызывает диссоциз
цию комплекса G-белков, субъединица а активирует фссфолипазу А2 (PLA2).

3 — ауксин активирует кальциевые каналы.

4 — лизофосфолипиды, жирные кислоты и ионы Са1'* активируют протеинкиназы
CDPK, МАРК и РЮ

инкиназы могут быть звеньями цепи передачи сигнала при ответе
на ауксины (рис. 3.6), тем не менее их точная функция в передаче
сигнала ауксинов неизвестна.

Гораздо лучше изучены последние этапы пути передачи сигнала
ауксинов, на которых действуют три группы белков:

•	транскрипционные факторы ARF,

•	репрессоры транскрипции Aux/IAA,

•	убиквитин-лигазный комплекс SCFTIRI.
ARF (Auxin Response Factors) и Aux/iAA (Auxin insensitive/ Indole
acetic acid insensitive) — две группы белков-антагонистов, которые
выполняют функции соответственно активаторов и репрессоров
транскрипции ауксин-регулируемых генов. Компоненты комплекса
SCFTIRI необходимы для дерспрессии ответа на ауксин.

Белки ARF и Aux/IAA

Среди генов, экспрессия которых зависит от уровня ауксина, осо-
бую группу составляют ранние ауксин-зависимые гены, или гены
первичного ответа на ауксины — экспрессия этих генов непосред-
ственно регулируется компонентами пути передачи ауксинового
сигнала. Характерной чертой генов первичного ответа на ауксины
является наличие в их промоторах регуляторной последовательно-
сти AuxRE (Auxin-Responsive Element), организованной в виде тан-
демного повтора.

С последовательностью AuxRE взаимодействуют транскрипци-
онные факторы ARF, которые могут выполнять функции как акти-
ваторов, так и репрессоров транскрипции генов. Транскрипционные
факторы ARF относятся к специфическому для растений семейству
ДКК-связывающих белков с ВЗ доменом. В состав молекул боль-
шинства белков ARF входят N концевой ДНК-связывающий домен
и С-концевые консервативные домены III и IV, необходимые для
белок-белковых взаимодействий. ARF-белки могут связываться с по-
следовательностями AuxRE в виде гомодимеров, димеров с другими
ARF, а также гетеродимсров с белками Aux/IAA, у которых также
имеются домены III и 1Y, нужные для димеризации.

В геноме арабидопсис выявлены 22 гена, кодирующие транс-
крипционные факторы ARF, большинство из них характеризуются
тканеспеиифичностью экспрессии. Например, гены ARF1 и ARF2
экспрессируются только во флоральных органах, ARF5 - на ранних
стадиях эмбриогенеза и в дальнейшем в сосудистой ткани, ARF16 —
в базальном домене зародыша и в дальнейшем в апикальной мери-
стеме корня. Экспрессия некоторых генов ARF зависит от внешних
сигналов, таких как свет и концентрация этилена, уровень транс-
криптов ряда .4RF’-reHOB также контролируется микроРНК.

Для большинства ДЛ^-генов получены мутации с потерей функ-
ции. Мутанты с потерей функции разных ARF имеют очень разные
фенотипы, что также свидетельствует о том, что разные ARF-белки
участвуют в контроле разных ауксин-зависимых процессов в разви-
тии растений. Например, мутация по гену ETT/ARF3 (ETTIN) вы-
зывает аномалии развития цветка, потеря функции гена MP/ARF5
(MONOPTEROS) приводит к нарушению закладки семядолей и ла-
теральных органов побега, мутант по гену NPH4/ARF7 (NON РНО-
TOTROPHIC HYPOCOTYLE 4) имеет нарушения фототропизма,
закладки латеральных корней и развития листа. Для белка ARF8 вы-
явлена узкоспецифичная функция, которая заключается в позитив-
ной регуляции транскрипции генов GII3, которые кодируют синтазы
конъюгатов ИУК — таким образом, этот белок участвует в негатив-
ной обратной связи, важной для регуляции уровня ауксинов в тканях
растения.

Aux/IAA семейство короткоживущих белков, родственных
транскрипционным факторам ARF, которые выполняют противопо-
ложные ARF функции в регуляции экспрессии генов первичного от-
вета на ауксины. На С-конце молекул Aux/IAA белков имеются доме-
ны III и IV, гомологичные таковым у белков ARF — с помощью этих
доменов белки Aux/IAA могут образовывать гомо- и гетеродимеры
друг с другом, а также с ARF-белками; на N-конце находятся домен
I, называемый также EAR-доменом (ERF-associated Amphiphilic Re-
pression), который выполняет функцию репрессора транскрипции,
и домен II, важный для стабильности этих белков. Связывание диме-
ров IAA/IAA и 1AA/ARF с последовательностями AuxRE приводит
к репрессии транскрипции генов первичного от вета на ауксин Обыч-
но при отсутствии ауксина большинство молекул транскрипционных
факторов ARF включено в состав димеров IAA/ARF, высвобождение
их происходит только при активации пути передачи сигнала ауксина
(рис. 3.7). В геноме арабидопсис идентифицировано около 30 генов
Aux/IAA, для большинства из которых показана тканеспецифичность
экспрессии. Мутации с потерей функции генов Аих/1АА, как прави-
ло, не имеют фенотипического проявления; в то же время мутации
с усилением функции Аих/IAA генов имеют фенотипы, сходные с фе-
нотипами мутантов с потерей функции ^RF-генов.

Фенотипические изменения у мутантов, а также сходный про-
странственный характер экспрессии позволяет предположить, что
по крайней мере некоторые белки Aux/IAA и ARF работают «в паре»
и выполняют комплементарные функции в контроле тех или иных
аспектов развития растения. Например, белок BDL/1AA12 (BODEN-
LOS) действует в контроле полярности развития растения через ре-
гуляцию экспрессии P/V-генов совместно с транскрипционным фак-
тором MP/ARF5 и является антагонистом MP/ARF5 в этом процессе.
Точно гак же белок MSG2/1AA19 (MASSUGU 2) является антаго
нистом NPH4/ARF7 в контроле фототропизма гипокотиля. Поддер-
жание равновесия ARF- и Aux/IAA-белков, по-видимому, является
инструментом, позволяющим тонко контролировать уровень ответа
на ауксин в разных тканях растения. Интересно, что гены Aux/IAA
являются генами первичного ответа на ауксины, при повышении
концентрации ауксинов их экспрессия усиливается очень быстро,
создавая негативную обратную связь в контроле интенсивности от-
вета на эти фитогормоны.

В регуляции транскрипции генов первичного ответа на аук-
син участвуют также несколько белков, входящих в состав гистон-
деацетилазных комплексов: белок TOPLESS (TPL) взаимодействует
с BDL/IAA12 и является негативным регулятором развития первич-
ного корня зародыша, белок PICKLE (PKL) предположительно взаи-
модействует с SLR/1AA14 (SOLITARY-ROOT) и ингибирует иници-
ацию боковых корней (см. ниже).

Убиквитин-лигазный комплекс SCF и рецептор TIR1

Репрессоры транскрипции ауксин-регулируемых генов Апх/
IAA являются нестабильными белками, поскольку подвергают-
ся убиквитин-зависимой протеасомной деградации. Известно, что
убиквитин ковалентно присоединяется к своим мишеням в результа-
те трехступенчатого процесса, опосредованного белковыми комплек-
сами El, Е2 и ЕЗ. Одним из типов убиквитин-лигазного комплекса
ЕЗ, действующего на последней стадии убиквитиниоования белков,
являются комплексы SCF (Skpl-Cullin-F-box). Важнейшая часть лю-
бого SCF-комплекса — это F-бокс-содержащий белок, который от-
вечает за присоединение белков-мишеней к убиквитин-лигазному
комплексу SCF.

Установлено, что в присутствии активного ауксина происходит
присоединение белков Aux/IAA к одному из SCF-комплексов, что
приводит к убиквитинированию Aux/IAA и деградации через 26S
протеасому. Мишенью для SCF-комплекса является домен II Лих/
IАА-белков: мутации, изменяющие его структуру, приводят к обра-
зованию белков Aux/IAA с повышенной стабильностью, что приво-
дит к репрессии ответ а на ауксин (практически все вышеперечис-
ленные мутанты с усилением функции генов Aux/IAA имеют замены
аминокислот в домене II). В результате деградации белков Aux/IAA,
опосредованной SCF-комплексом, транскрипционные факторы ARF
высвобождаются из димеров с Aux/IAA-белками, что приводит к уси-
лению экспрессии генов первичного ответа на ауксин (рис. 3.7).

Долгое время был неизвестен механизм, по которому ауксин кон-
тролирует связывание убиквитин-лигазного комплекса SCF с белка-
ми Aux/IAA. В дальнейшем было установлено, что молекулы аук-
Рис. 3.7. Роль транскрипционных факторов ARF, репрессорор транскрипции Aux/IAA
и убиквитин-лигазного комплекса SCR1"1 в регуляции экспрессии генов первичного
ответа на ауксин

При низком уровне ауксина транскрипционные факторы ARF образую! гетерсдимеры
с белками Aux/IAA, что приводит к репрессии транскрипции генов первичного ответа
на ауксин. При связывании молекулы ауксина с рецептором TIR1 белки Aix/IAA при
соединяются к убиквитин-лигазному комплексу SCF™1, что приводит к их прстеолизу
26S прстеасомой. Освобожденные белки ARF образуют гомодимсры и стимулируют
транскрипцию генов первичного ответа на ауксин, в том числе генов Aux/IAA

синов напрямую связываются с F- бокс-содержащим белком TIR1,
входящим в состав некоторых SCF-комплексов. Таким образом, бе-
лок TIR1 является еще одним рецептором к ауксинам, так как выпол-
няет основные функции фитогормональиых рецепторов: 1) специ-
фически и с высокой аффинностью связывает гормон и 2) вызывает
запуск экспрессии гормон-регулируемых генов.

Белок TIR1 принадлежит к небольшому семейству F-бокс-
содсржащих белков, к которому помимо него относятся три белка
AFB (Arabidopsis F-Box proteins). В дальнейшем было показано,
что белки AFB, наряду с TIR1, т акже способны связывать ауксины
и взаимодействовать с транскрипционными репрессорами Aux/IAA
Таким образом, функции белков T1R1 и AFB перекрываются, в связи
с чем одиночные мутанты tirl, afbl, afb2 и ajb3 имеют сходный фе-
нотип и нормальную жизнеспособность. В то же время множествен-
ные мутации по генам T1R1 и AFB приводят к серьезным дефектам
и остановке развития зародыша, что свидетельствует о ключевой
роли T1R1- и AFB-белков в ответе на ауксины.

Гены первичного ответа на ауксины

К генам первичного ответа относятся гены, которые содержат
в своих промоторах последовательности AuxRE, и являются прямы-
ми мишенями транскрипционных факторов ARE Это гены с весьма
разнообразными функциями, которые условно можно разбить на не-
сколько групп.

1.	Гены, функции которых связаны с метаболизмом, транспортом
и передачей сигнала ауксинов. К этой группе относятся гены
GH3, которые кодируют ферменты, катализирующие образование
конъюгатов ИУК с аминокислотами; гены PIN, продукты которых
составляют основу выходных каналов ПАТ; а также гены транс-
крипционных репрессоров Аих/1АА, которые играют важную роль
на последних этапах ответа на ауксин.

2.	Гены клеточного цикла. Последовательности AuxRE были об-
наружены в промоторах ряда генов, контролирующих клеточ-
ный цикл у растений — в частности, гена циклин-зависимой
протеинкиназы A (CDK.A), которая контролирует прохожде-
ние всех стадий клеточного цикла, и генов циклинов класса А
(СусА), функция которых связана с контролем S-фазы клеточ-
ного цикла.

3.	Гены органогенеза. В качестве примера можно привести ген AS2,
функция которого связана с инициацией примордиев латераль-
ных органов (листьев, цветков) в апикальной меристеме побега.

4.	Гены с неизвестной функцией. Одними из первых обнаруженных
ауксин-индуцируемых транскриптов являются продукты генов
SAUR (Small Auxin Up-iegulated RNAs). Это короткоживущие
небольшие некодируюшие молекулы РНК, которые быстро на-
капливаются в клетке при повышении концентрации ауксинов.
В геноме арабидопсис присутствует несколько десятков генов
SAUR. Мутации по этим генам, а также опыты по стабилизации
транскриптов SA UR не приводили к каким-либо фенотипическим
изменениям — таким образом, функция генов SA UR до настояще-
го времени остается неизвестной.

Помимо генов первичного ответа на ауксин, существуют гены,
жспрессия которых регулируется ауксином не напрямую и требу-
ет подключения других путей передачи сигнала. Примером таких
генов являются гены KNOX, контролирующие пролиферацию кле-
ток в апикальной меристеме побега. Ауксины репрессируют рабо-
ту генов KNOX опосредозанно; один из путей ауксин-зависимого
подавления ААОА-генов осуществляется через транскрипционный
фактор AS2, который кодируется геном первичного ответа на ауксин.
Ауксин-зависимое подавление экспрессии АМЛ¥-генов является не-
обходимым условием перехода клеток на периферии побеговой ме-
ристемы от пролиферации к дифференцировке, что необходимо для
инициации листовых примордисв.

3.4.	Функции ауксинов в развитии растений

Функции ауксинов многообразны и связаны с такими характери-
стиками этих гормонов, как наличие полярного транспорта, стиму-
ляция работы ионных каналов и контроль экспрессии определенных
генов. К основным функциям этих фитогормонов относятся: кон-
троль клеточного цикла, стимуляция роста клеток растяжением, кон-
троль полярности развития растительного организма, фото- и грави-
тропические реакции, стимуляция закладки боковых и придаточных
корней, стимуляция закладки и развития латеральных органов в апи-
кальной меристеме побега.

Активация ионных каналов

К числу наиболее быстрых ответов клетки на ауксины относит-
ся активация потока различных ионов через клеточную мембрану.
Причина этого — ауксин-зависимая активация ряда белков ионного
транспорта:

•	мембранных Н+-АТФаз, которые осуществляют выкачивание
ионов Н+ из клетки;

•	калиевых каналов, осуществляющих вход в клетку ионов К';

•	кальциевых каналов, осуществляющих вход в клетку ионов Са2 .

Помимо активации работы ионных каналов, ауксины также сти-
мулируют экспрессию ряда генов, кодирующих белки ионных кана-
лов (рис. 3.8).

Активация Н'-АТФаз лежит в основе ряда физиологических функ-
ций ауксинов — в частности, ауксин-зависимого роста клетки рас-
тяжением, а также фото и гравитропизмов (см. ниже). Известно, что
активация Н+-АТФаз индуцируется ауксином даже на изолирован-
ных мембранных фракциях, но гораздо менее эффективно, застав-
ляя предполагать существование неких клеточных факторов, опо-
средующих действие ауксина на протонные помпы. Таким фактором
Рис. 3.8 Схема влияния зухсинов на работу ионных каналов

Связывгясь с ADP1 и А5Р57, ауксины стимулируют активность Н*-АТФаз что
приводит к гиперполяризации мембраны. Гиперполяризация мембраны активирует К*
и Са2* ионные каналы. Ауксины также стимулируют экспрессию генов, колирующих
Н*-АТФазы и белки К* каналов

могут быть некоторые ауксин-связывающие белки (АВР — Auxin
Binding Proteins). Действительно, в присутствии некоторых из них,
например трансмембранного ауксинового рецептора АВР1 и цито-
плазматического белка АВР57, повышается эффективность актива-
ции Н+-АТФаз в мембранах. Кроме того, для белка АВР57 показана
способность непосредственного взаимодействия с Н+-АТФазами на
клеточной мембране. Ауксины вызывают также повышение количе-
ства мембранных Н’-АТФаз за счет позитивной регуляции экспрес-
сии их генов.

Активация калиевых каналов также относится к числу быстрых
событий при ответе клетки на ауксин. Работа калиевых каналов за-
висит от мембранного потенциала, в связи с этим считается, что их
ауксин-зависимая акгивация происходит за счет гиперполяризации
мембраны вследствие активации протонных помп. Для одного из
двух генов калиевых каналов кукурузы, ZMK1, показана позитивная
регуляция экспрессии ауксинами.
Активация кальциевых каналов лежит в основе ауксин-зависимого
огкрывания устьиц. Их активация является более медленным ответом по
сравнению с активацией Н-АТФаз и калиевых каналов, что свидетель-
ствует об опосредованном влиянии ауксинов на их работу. Активация
кальциевых каналов также требует изменения мембранного потенциа-
ла, который возникает вследствие активации мембранных Н-АТФаз.

Контроль клеточного цикла

Наряду с цитокининами, ауксины относятся к гормонам, участву-
ющим в контроле клеточного цикла у растений. Несмотря на то что
основными индукторами пролиферации растительных клеток явля-
ются цитокинины, многие ауксины (в особенности синтетический
ауксин 2,4-D) при добавлении в культуральную среду также способ-
ствуют усилению деления клеток. В растительном организме аукси-
ны способствуют делению клеток апикальной меристемы корня, а
также развивающегося листового примордия. Механизмы влияния
ауксинов на клеточный цикл иные, чем у цитокининов.

Клеточный цикл всех эукариот находится под контролем циклин-
зависимых протеинкиназ (CDK, от Cyclin-Dependent protein Kinases),
которые фосфорилируют нижележащие регуляторы клеточного цикла
(гистоны, белки пререпликационных комплексов, белок Retinoblastoma
и т. д.). Для активности CDK необходимы их сменные каталитические
субъединицы — циклины. Разные классы цикликов, присоединяясь
к CDK. регулирую! разные фазы клеточного никла. Основными класса-
ми циклинов у растений являются циклины А, В и D: циклины класса
А контролируют ход S-фазы клеточного цикла, циклины В — переход
G2-M, а также нормальный ход и завершение митоза, циклины D кон-
тролируют переход G1-S, а также осуществляют связь клеточного цик-
ла с внешними сигналами. Экспрессия генов D-циклинов — основных
индукторов пролиферации растительных клеток регулируется цито-
кв нинами и сахарозой (подробнее см. главу «Цитокинины»).

В промоторах генов циклинов А (Су с.4), а также гена CDKA, кото-
рый кодирует основную С1Ж растений, обнаружены последователь-
ности AuxRE для связывания транскрипционных факторов ARF. Тем
не менее в опытах с синхронизированными суспензионными культу-
рами растительных клеток не было выявлено значительного усиле-
ния экспрессии этих генов при добавлении в культуральную среду
ауксинов. При этом было показано, что повышение концентрации
ауксинов повышает количество активных комплексов CDKA-циклин
за счет усиления ассоциации этих молекул или за счет стабилизации
их связи. Молекулярные механизмы этого явления не выяснены.
Контроль роста клетск растяжением

Одной из наиболее известных функций ауксинов на клеточном
уровне является стимуляция роста клеток растяжением, которое ле-
жит в основе ауксин-зависимого удлинения стебля.

Ауксин-зависимое растяжение клеток связано с повышением ла-
бильности клеточных стенок. Один из механизмов ослабления кле-
точной стенки получил название «рост под действием кислоты» (или
«кислый рост») и осуществляется за счет стимуляции ауксинами ра-
боты мембранных Н+-АТФаз. Н+-АТФазы выбрасывают ионы Н+ из
клетки, что приводит к закислению узкого пространства между плаз-
малеммой и клеточной с генкой. Под действием кислой среды происхо-
дит активация экспансинов — белков, ассоциированных с клеточной
стенкой, которые разрушают водородные связи между целлюлозными
микрофибриллами, что позволяет клетке расширяться под действием
тургорного давления. Направление роста клетки зависит от ориента-
ции целлюлозных фибрилл, которая также контролируется ауксинами
(механизм неизвестен). Помимо усиления каталитической активности
экспансинов, ауксины позитивно регулируют’ экспрессию их генов:
в промоторах ряда генов ЕХР имеются последовательности AuxRE.

Дифференцировка специфических типов клеток: развитие
проводящей системы

Проводящая система высших растений — протяженная кле-
точная сеть, необходимая для транспорта растворенных веществ
и механической стабильности. Сосудистые пучки, составляющие
проводящую систему, включают в себя флоэму, по которой транс-
портируются главным образом фотоассимиляты, и ксилему, по ко 
торой перемещаются растворенные в воде минеральные вещества.
Сосуды ксилемы дифференцируются из клеток прокамбия, которые
имеются в любом органе растения и появляются в примордиях орга-
нов на самых ранних стадиях их развития.

Дифференцировка сосудов из прокамбия находится под контро-
лем ауксинов — например, установлено, что места дифференциров-
ки сосудов в развивающейся листовой пластинке совпадают с зонами
максимальной концентрации ауксинов. Ключевую роль в создании
зон повышенной концентрации ауксинов, необходимых для развития
сосудов, играет полярный транспорт ауксинов, который осуществля-
ется ко клеткам прокамбия. О точном молекулярном механизме диф-
ференцировки сосудов в настоящее время данных нет, вместе с тем,
был выявлен ряд ключевых регуляторов этого процесса.
У арабидопсис среди мутаций по генам, участвующим в передаче
сигнала при ответе на ауксины, три мутации — тр, bdl и ахгб — вы-
зывают недоразвитие сосудистых пучков. Таким образом, развитие
сосудов зависит от активности транскрипционнсго фактора ARF5/MP
и его антагониста транскрипционного репрессора IAA12/BDL. Кроме
того, важную роль в этом процессе играет белок AXR6/CUL1, кото-
рый является компонентом убиквитин-лигазного комплекса SCFT,RI.
Другой группой регуляторов развития сосудов у арабидопсис являют-
ся транскрипционные факторы Atl IB8 и AtHB20, относящиеся к се-
мейству HD-ZIP (другие представители этого семейства транскрип-
ционных факторов — РНВ, PHV и REV — играют ключевую роль
в формировании адаксиально-абаксиальной полярности листовой
пластинки; подробнее см. в главе «Развитие листа»). Экспрессия ге-
нов А1НН8 и AtHB20 индуцируется ауксином позже, чем экспрессия
генов IAA — это может быть связано с тем, что в контроле развития
сосудов транскрипционные факторы AtHB8 и AtIIB20 действуют
ниже белков ARF и Aux/IAA. Действительно, у трансгенных растений
35S..MP с повышенным уровнем экспрессии гена MP/ARF5 наблюда-
ется повышенный уровень экспрессии генов AtHBS и А1НВ20.

Контроль фото- и гравитропизма

Ауксины были открыты как вещества, контролирующие направ-
ленные ростовые движения растений — тропизмы. Выделяют грави-
тропизм — например, изгиб стебля и корня при изменении вектора
силы тяжести, фототропизм — примером является изгиб гипокоти-
лей по направлению к свету, хемотропизм — рост корней в сторону
больших концентраций питательных веществ в почве и т. д. Все эти
изгибы контролируют ся ауксинами и связаны с изменением направ-
ления градиента их концентрации, которое, в свою очередь, зависит
от изменения направления полярного транспорта ауксинов (ПАТ),
опосредованного PIN-белками.

Изгибы стебля и корня при возникновении всех тропизмов зависят
от асимметричного распределения ауксинов в радиальном направле-
нии, благодаря которому одна сторона стебля или корня накапливает
больше ауксинов, чем другая, что приводит к неравномерности растя-
жения клеток и формированию изгиба. Эта модель, получившая назва-
ние «гипотеза Холодного-Вента», была впервые предложена в 1928
году и в дальнейшем была подтверждена экспериментами с радио-
активно меченым ауксином. На примере гравитропизма корня было
установлено, что центральную роль в обеспечении радиального рас-
пределения ауксинов шрает белок PIN3, который в норме локализо-
Рис. 3.9. Роль амилопластов в гравлтропизме корня (А) и стебля (Б)

А — колумелла (вверху) является грависенсором корня, тогда как ростовой из-
гиб возникает в зоне роста корня (внизу); амилопласты, присутствующие в клетках
кслумелгы, опускаются в базальную часть клетки при лервориентировке корня вдоль
вектора силы тяжести (в центре) (по Biancaflor, Masson, 2ОСЗ)

Б — динамика амилопластов в клежах эндодермы стебля при изменении векюра
силы тяжести (по Tanimoto et al, 2003). амилопласты скапливаются в базальной ча-
сти клетки у растений арабидопсис дикого типа (слева) и равномерно распределены
по клерке у мутанта с нарушением функции амилопластов sgr5 (справа)

Б

ван на «боковой», ориентированной в сторону проводящей системы,
поверхности клеток эндодермы, и контролирует центрипетальное на-
правление ПАТ. Роль PIN-белков, в частности PIN3, в фототропизме не
выяс йена — несмот ря на то, что асимметричное распределение аукси-
нов играет центральную роль в фототропических изгибах стебля.

Гравитропизм. Первым этапом в развитии любого тропизма яв-
ляется рецепция сигнала. Гравирецепция в надземной части расте-
ний осуществляется в клетках эндодермы, тогда как в корне функцию
основного грависенсора выполняют клетки корневого чехлика (при
этом ростовые изгибы корня при изменении вектора силы тяжести
происходят выше, в зоне удлинения корня). В клетках эндодермы
и корневого чехлика (колумеллы) имеются крупные, наполненные
крахмалом пластиды — амилопласты, которые играют роль статоли-
тов (рис. 3.9). Под действием силы тяжести амилопласты опускаются
вниз, что приводит к активации трансмембранных гравирецепторов.
При изменении направления вектора силы тяжести «низом» стано-
вится другая сторона клеток, соответственно, амилопласты переме-
щаются на нее, активируя ее рецепторы, при этом гравирецепторы
на той стороне клеток, которая была «низом» ранее, инактивируют-
ся. Мутанты с нарушением дифференцировки эндодермы scarecrow
(scr) и shortroot {shr}, а также мутанты с нарушением развития ами-
лопластов shoot gravitropism (sgr) демонстрируют аг равитропиче-
ский рост стебля, тогда как к серьезным нарушениям грзвитропизма
корня приводит выжигание лазером клеток колумеллы.

В последние годы установлено, что перемещение амилопластов
под действием силы тяжести — гораздо более сложный процесс, чем
считалось раньше. В частности, обнаружено, что их перемещение
зависит от актиновых филаментов цитоскелета и актин-миозинового
«молекулярного мотора». Являясь регулятором перемещения амило-
пластов, актиновый цитоскелет играет роль также в негативной ре-
гуляции гравитропизма, что важно для «перезапуска» всей системы
при изменении направления силы тяжести.

Функцию гравирецелторов растений выполняет специфический
тип ионных каналов — механочувствительные кальциевые кана-
лы, активация которых при контакте с амилопластами стимулирует
вход в KneiKy ионов Са2 . Предполагается, что ионы Са2' активируют
фосфолипазы С, что приводит к активации синтеза инозитол-3,4,5-
трифосфата (InsP3) — липидной сигнальной молекулы, которая вы-
полняет функцию вторичного мессенджера в контроле передачи ши-
рокого спектра сигналов. В многочисленных экспериментах показано,
что InsP3 неравномерно распределен в клетках «верхней» и «нижней»
стороны корня при изменении вектора силы тяжести. Позитивно ре-
гулируя активность протеинкиназ PDK и PID (см. выше), InsP3 вы
зывает изменение локализации белка PIN3 на полюсах клетки: напри-
мер, в клетках колумеллы вертикально ориентированного корня белок
PIN3 равномерно распределен по всей мембране клетки, при измене-
нии направления силы тяжести он перемещается на «нижнюю» сторо-
ну (рис. 3.10 А, 3.11 А). Эго приводит к изменению направления ПАТ
и созданию неравномерного распределения ауксинов на разных сто-
ронах корня. Недавно было показано, что изгиб корня под действием
силы тяжести вызывает закладку бокового корня вблизи от места гра-
витропического изгиба (подробнее о механизмах инициации боковых
корней см. в главе «Развитие корпя»); корегуляция обоих процессов
важна для построения корневой системы взрослого растения.
А



Рис. 3.10. Роль полярного транспорта ауксинов в гравитропизме (А) и фототропизме (Б)
А — распределение PlN-белков при гравк тропическое ответе корня (по Blancahor,
Masson, 2003). Базипетальный солярный транспорт ауксина (ПАТ) в керне зависит от
белков PIN1 (зеленый цвет) и PIN4 (желтый цвет), в клетках колумеллы происходит
разворот ПАТ за счет белка PIM3 (красный цвет), ПАТ в акропетальном направлении
до зоны удлинения корня осуществляется по клеткам эпидермиса за счет белка PIIM2
(синий цвет). В керне, ооиентированном вдоль вектора силы тяжести, белок PIN3
равномерно распределен по поверхностям клеток колумеллы (вверху), при переори-
ентировке корня вдоль вектора силы тяжести белок PIN3 перемещается из базальную
стрсну клеток, что приводит к неравномерному распределению ауксинов (внизу).
Б — доказательство роли полярного транснопта ауксинов (ПАТ) в формировании фотс-
трогического изгиба у гипокотиля (по Taiz, Zeiyer, 2ССЗ): у контрольного проростка экс-
прессия репортерной конструкции DR5.:GUS (DR5 — минимальная последовательность
поомотора гена первичного ответа на ауксин) наблюдается только на «теневой» сторо-
не стебля, что свидетельствует о неравномерном распределении ауксинов; у проростка,
обработанного ингибитором ПАТ NPA, DP5::GJS экспрессируется на обеих сторонах
стебля — то есть ауксины распределены равномерно, изгиб не формируется

Фототропизм. Контроль фототропизма — первая из установленных
физиологических функций ауксинов Механизмы изгиба стебля по на-
правлению к свету примерно те же, что механизмы его гравитропмческо-
го изгиба при изменении вектора силы тяжести: неравномерное распре-
Рис. 3.11. Предлагаемые механизмы трави тропизма (А) и фотлропизма (Б).

Пояснения в тексте

деление ауксинов в радиальном направлении, за счет которого клетки на
одной сюроне стебля растут быстрее, чем на другой (рис. 3.10, Б).

Многочисленные опыты показали, что для регуляции фототропиз-
ма наиболее важна синяя часть спектра. Рецепция синего света осу-
ществляется фоторецепторами PI1CT1 и РНОТ2 (фстотропины 1 и 2),
которые помимо фототропизма контролируют и другие процессы, за-
висящие от синего света, такие как открывание устьиц, движение хло-
ропластов и ингибирование роста гипокотиля. РНОТ1 и РНОТ2 —
практически идентичные по структуре белки, которые кодируются
двумя копиями дуплицированного гена. В состав их молекул входят
фотосенсорные домены LOV1 и LOV2 (от Light, Oxygen, Voltage) на
N-конце и Ser/Thr протеинкиназный сигнальный домен на С-конце.
Функцией каждого из LOV-доменов является связывание молекулы
хромофора FMN (blue light-absorbing Flavin MonoNucleotide), который
является непосредственной мишенью фотонов синего света. В темно-
те с каждым из LOV-доменов нековалентно связана одна молекула
FMN—такое состояние РНОТ-белков является светочувствительным.
При возбуждении FMN. связанного с LOV-доменом, фотоном синего
света, происходит образование триплета FMN, после чего образуется
ковалентная связь между FMN и консервативным остатком цистеи-
на в составе LOV-домена. Это приводит к изменению конформации
РНОТ-белка и запускает протеинкиназную активность С-концевого
сигнального домена (рис. 3.11, Б). С-концевой домен осуществляет
авуофосфорилирование РНОТ-белков и фосфорилирование белков-
мишеней, о которых до настоящего времени ничего не известно.

С белком РНОТ1 взаимодействуют белки семейства NRL (NPH3/
RPT2 Like), в частности NPII3 (NON-PHOTOTROPIC HYPOCOTYL
3) и RPT2 (ROOT PHOTOTROPISM 2), причем это взаимодействие не
включает в себя фосфорилирование NRL-белков киназным доменом
РНОТ1. NRL — семейство белков с неизвестной функцией, отдель-
ные представители которою могут взаимодействовать с белком CUL3
(CULLIN 3) — ключевым компонентом ряда убиквитин-лигазных ком-
плексов. Предполагается, что NRL-белки могут быть адаптерными ком-
понентами СИ.З-убиквитин-лигаз и играть роль в передаче сигнала
ауксинов. Кроме того, NRL-белок ENP (ENHANCER OF P1NOID) взаи-
модействует с протеин киназой PINOID, играющей роль в контроле ло-
кализации PIN-белков на мембранах. Таким образом, влияя на полярный
транспорт и передачу сигнал.а ауксинов. NRL-белки могут быть регуля-
торами неравномерного распределения ауксинов при фототропизме.

Среди компонентов передачи сигнала ауксина основную роль
в контроле фототропических изгибов стебля играют транскрипци-
онный фактор NPH4/ARF7 и его антагонисты — транскрипционные
репрессоры MSG2/IA А19 и AXR5/IAA1. При повышении концентра-
ции ауксина белки MSG2/IAA19 и AXR5/IAA1 подвергаются 26S-
протеасомной деградации, опосредованной убиквигин-лигазным
комплексом SCFTIRI, это влечет за собой образование гомодимеров
NPH4/ARF7 и транскрипцию ауксин-регулируемых генов, задейство-
ванных в контроле фототропизма. В частности, к непосредственным
мишеням транскрипционного фактора NPH4/ARF7 относятся гены
экспансинов, регулирующие растяжение клеточных стенок,

Контроль полярности развития растительного организма

Полярность развития — необходимое условие онтогенеза рас-
тений. Определение апикального и базального полюсов зародыша
происходит на самых ранних этапах эмбриогенеза и в дальнейшем
определяет развитие апикальных меристем побега и корня (ПАМ
и КАМ). В течение всей жизни у растения закладываются новые
латеральные органы — листья и цветки, которые инициируются
на периферии ПАМ, и боковые корни, которые закладываются на
некотором расстоянии от КАМ, в зоне дифференцировки корня.
В развитии примордиев латеральных органов побега и корня опре-
деление апикально-базальной полярности также имеет первосте-
пенное значение. Кроме того, в развитии листьев важно также
определение адаксиально-абаксиальной полярности, необходимой
для правильной дифференцировки тканей «верхней» и «нижней»
сторон листа (подробнее см. главу «Развитие листа»).

Полярность развития растения целиком и полностью контроли-
руют ауксины — единственная группа фитогормонов, обладающая
системой полярного транспорта и одновременно способная к кон-
тролю пролиферации и дифференцировки клеток. Таким образом,
ключевыми регуляторами полярности являются:

•	PIN-белки, от расположения и активности которых зависит на-
правление ПАТ;

•	компоненты передачи сигнала ауксина, специфически контролирую-
щие экспрессию PZV-генов — транскрипционный фактор MP/ARF7
и его антагонист транскрипционный репрессор BDL/IAA12;

•	белки, контролирующие внутриклеточную локализацию PIN-
белков — протеинкиназа PID и GEF-белок GNOM.

Экспрессия генов, кодирующих эти белки, начинается на самых
ранних этапах эмбриогенеза (например, гены P1N1 PIN7, МР и BDL
экспрессируются уже на стадии двух клеток) и определяет первич-
ную размегку доменов зародыша. Закладка первых органов заро-
дыша — семядолей и первичного корня — связана с изменениями
ориентировки полярного транспорта ауксинов, что приводит к обра-
зованию локальных максимумов концентрации ауксинов, в которых
начинается дифференцировка специфических типов клеток (подроб
нее см главу «Эмбриогенез»),
Формирование

Закладка

Проксимально
дистальная ось

Формирование
пре чэдяшеи
системы листа

Адаксиальная сторона

Абаксиальная сторона

Рис. 3.12 Зоны компетенции и локальные максимумы концентрации ауксинов
при определении полярности развития растения и его отдельных органов
(модифицировано по De Smet, Jurgens, 2007)

Зоны компетенции заштрихованы, локальные максимумы концентрации ауксинов
отмечены синим цветов, основные направления полярного транспорта ауксинов
обозначены белыми стрелками, онтогенетические процессы, связанные с полярностью
развития, обозначены красным шрифтом

Развитие
латерального
корня

меристемы корня

Закладка латеральных органов, которая имеет место в постэмбрио-
нальном развитии растения, также связана с созданием локальных мак-
симумов концентрации ауксинов в результате изменения направлений
ПАТ (подробнее см. главы «Развитие листа» и «Развитие корня») Эти
изменения происходят в строго определенных участках, называемых
зонами ком петенции (рис. 3.12) — нат тример, при закладке лат ералытых
органов побега зоной компетенции является периферия ПАМ, а при за-
кладке боковых корней — зона дифференцировки корня В развитии
листа новые локальные максимумы концентрации ауксинов возникают
при формировании лопастей сложного листа, а также при ветвлении
центральной жилки, зоной компетенции при этом является краевой до-
мен листа. По-видимому, общим свойством зон компетенции является
определенный характер экспрессии генов-рауляторов ПАТ.

Контроль развития корня

Одна из наиболее известных функций ауксинов — стимуляция
корнесбразования в кулыуре изолированных органов и тканей —
связана со стимулирующим влиянием этих гормонов на развитие
корневой системы. Ауксины способствуют поддержанию нищи
стволовых клеток апикальной меристемы корня (КАМ), а также за-
кладке боковых и придаточных корней (подробнее см. в главе «Раз-
витие корня»). Цитокинины являются ингибиторами корнеобразова-
ния и антагонистами ауксинов в этом процессе (рис. 3.13).

Рис. 3.13. Схема действия белков ARF и Aux/IAA в кон гриле развития корня (пояснения
в тексте)
Развитие корня связано с ауксинами начиная с ранних стадий эм-
бриогенеза: центральным событием в спецификации КАМ первич-
ного корня является изменение направления ПАТ, за счет которого
создается максимум концентрации ауксинов в базальном домене за-
родыша (подробнее см. главу «Эмбриогенез») Организация КАМ
вдоль вергикалыюй оси зависит от градиента концентрации ауксина
и находится под контролем АР2-подобных транскрипционных фак-
торов PLETHORA (PLT). Экспрессия генов PLTпозитивно регулиру-
ется ауксинами и следует градиенту концентрации ауксинов в корне
с максимумом в районе ниши стволовых клеток КАМ.

Создание градиента концентрации ауксинов в развивающемся кор-
не зависит от PIN-белков, локализация которых определяет направ-
ление ПАТ. Экспрессию генов PIN регулируют транскрипционные
факторы ARF и транскрипционные репрессоры Аих/1АА, при этом
основную роль играют гены-антагонисты ARF5/MP и IAA12/BDL.
Помимо пары MP-BDL, на развитие корня также оказывают влияние
гены SIIY2/IAA3, AXR3/IAA17 и AXR2/IAA7. При этом транскрипци-
онный репрессор SHY2/IAA3 (SHORT HYPOCOTYL 2) играет цен-
тральную роль в цитокипин-зависимом подавлении развития корня,
поскольку экспрессия гена SHY2/1AA3 находится под прямым контро-
лем цитокинип-зависимого 1 ранскрипционно! о фактора ARR1. Мута-
ции shy2 и arrl приводят к сходным фенотипическим эффектам в раз-
витии корня, связанным с расширением зоны экспрессии P/Y-генов.

В закладке боковых корней у аоабидопсис ключевую роль играют
транскрипционные факторы ARF? и ARF19, антагонистом которых яв-
ляется белок SLR/IAA14 (SOLITARY ROOT): мутации с погерей функ-
ции arf7 atf) и усилением функции sir специфически блокируют заклад-
ку латеральных корней. Мишени транскрипционных факторов ARF7
и ARF19 неизвестны, возможно, одной из них являются гены PIN.

Помимо ARE и Aux/lAA, в ауксин-зависимом контроле разви-
тия корневой системы участвуют также белки, входящие в состав
гистон-деацетилазных комплексов, которые подавляют экспрессию
генов-мишеней, влияя на структуру хроматина.

Белок TOPLESS (TPL) — негативный регулятор развития пер-
вичного корня зародыша — относится к группе корепрессоров
транскрипции. Белок TPL связывается с EAR-доменом белка BDL/
IAA12, а также с гистон-деацетилазами; его активность необходима
для BDL-зависимого подавления транскрипции генов, экспрессия
которых зависит от транскрипционного фактора MP/ARF5. Одна из
основных мишеней TPL, BDL/1AA12 и MP/ARF5 — ген P1N1, кон-
тролирующий полярный транспорт ауксинов к месту инициации
корня. У мутанта с потерей функции tpl возникает зона эктопиче-
ской активации PIN1 в апикальной части зародыша, что приводит
к формированию дополнительного корня на месте ПАМ (см. главу
«Эмбриогенез»).

Белок PICKLE (PKL) относится к CHD3 семейству факторов ре-
моделинга хроматина и играет ключевую роль в контроле вегетатив-
ного развития растений, подавляя экспрессию генов-регуляторов
эмбриогенеза на постэмбриональной стадии развития (см. паву
«Эмбриогенез»), Кроме того, белок PKL, по-видимому играет важ-
ную роль в регуляции закладки боковых корней. Потеря его функции
у мутанта pkl/ssl2 (pikle/ suppressor of sir 2) супрессирует проявление
мутации sir с потерей функции IAA14, при этом мутация pkl не вос-
станавливает способность к развитию латеральных корней у мутан-
тов arf7 arf!9. Таким образом, в подавлении закладки латеральных
корней белок PKL действует совместно с IAA14 и является анта-
гонистом ARF7 и ARF19; предполагается, что он взаимодействует
с JAA14 так же, как белок TPL взаимодействует с JAA12 при пода-
влении закладки первичного корня зародыша.

Подавление развития апикальной меристемы побега

Являясь основными позитивными регуляторами поддержания
апикальной меристемы корня, ауксины в то же время негативно ре-
гулирую! развитие апикальной меристемы побега (ПАМ). В пода-
влении ПАМ ауксины действуют совместно с гиббереллинами, а ан-
тагонистами их в этом процессе являются цитокинины — основные
позитивные регуляторы развития ПАМ. Ауксин-зависимое подавле-
ние развития ПАМ лежит в основе явления апикального доминиро-
вания, когда верхушечная почка за счет синтезирующихся в ней аук-
синов подавляет развитие нижележащих боковых почек. Основное
место биосинтеза ауксинов в растении — периферические участки
ПАМ. листовые примордия и молодые листья, при этом в централь-
ной части ПАМ, содержащей нишу стволовых клеток, ауксины от-
сутствуют.

Одна из функций ауксинов в ПАМ связана со стимуляцией диф-
ференцировки специфических типов клеток при закладке приморди-
ев латеральных органов побега и частично зависит от контроля экс-
прессии генов AS1 и AS2 (подробнее см. в главе «Развитие листа»).

Другая функция ауксинов — подавление пролиферации клеток
ПАМ и негативный контроль ниши стволовых клеток. Точные ме-
ханизмы этого подавления до настоящего времени неизвестны. От-
части они связаны с позитивным влиянием ауксинов на биосинтез
и передачу сигнала гиббереллинов, которые т акже негативно регу-
лируют поддержание ниши стволовых клеток ПАМ. Кроме того,
влияние ауксинов на развитие ПАМ может быть связано с контро-
лем экспрессии гена TOPLESS (ТРЕ), который предположительно
является ключевым регулятором идентичности ПАМ (подробнее см.
главу «Эмбриогенез»),

Итак, ауксины — фитогормоны, основной особенностью которых
является наличие сложно регулируемой системы полярного транс-
порта, благодаря которой они являются основными регуляторами
направленного роста и развития растений.

Источники рисунков, использованных в главе

I.	Benkova Е., Michniewicz М., Sauer М. et al. Local, efflux-dependent auxin gradients
as a common module for plant orgar formation // Cell. 2003. Vol 115. P. 591-602.

2.	Blancaflor E. B., Masson P. ll. Plant gravitropism. Unraveling the ups and downs of
a complex process // Plant Physiology. Vol. 133 P.' 677-1690.

3.	Blilou /., Xu J. Wildwater M. Willemsen V. et al The PIN auxin efflux facilitator
network controls growth and patterning in Arabidopsis roots // Nature. 2005.

Vol. 433. P 39-44.

4.	De Smet I.. Jurgens G. Patterning the axis in plants — auxin in control // Current
Opinion in Genetics and Development 2007. Vol. 17, P. 337-343.

5.	Holland J. J., Roberts D„ Liscttm E. Understanding phototropism: from Darwin to
today // Experimental Botany. 2G09. Vol. 60 P. 1969- 1978.

6.	Tanimoto M., Tremblay R., Colasanti J. Altered gravitropic response, amyloplast
sedimentation and circumnutation in the Arabidopsis shoot gravitropism 5 mutant
are associated with reduced starch levels Plant Molecular Biology. 2008.

7.	Woodward A. W., Bartel B. Auxin: regulation, action, and interaction // Annals of
Botany. 2005. Vol. 95. P. 707-735.

Рекомендованная литература

1.	Mockaitis К., Estelle M. Auxin receptors and plant development: a new signaling
paradigm // Annual review of cell and developmental biology. 2008. Vol. 2.4
P.55-80.

2.	Motthayidin L, Di Mambro R., Sabatini S Cytokinin-auxin crosstalk // Trends
in Plant Science. 2009. Vol. 14. P. 557-562.

3.	PetrdsekJ., Fnml J. Auxin transport routes in plant development // Development
2009. Vol. 136. P. 2675-2688.

4.	Vanneste S., FrimlJ. Auxin: a trigger for change in plant development // Cell. 2009
Vol. 136. P 1005-1016.

5.	Woodward A. W., Bartel B. Auxin: regulation, action, and interaction // Annais
of Botany. 2005. Vol. 95. P. 707-735.
Глава 4

Цитокинины

Цитокинины — группа фитогормонов, обнаруженных благода-
ря способности стимулировать пролиферацию растительных клетск.
С этой способностью цитокининов связаны их основные функции
в развитии растений — например, поддержание апикальной меристемы
побега. Кроме того, к физиологическим функциям цитокининов отно-
сятся стимуляция транспорта питательных веществ в клетку, ипгибиро
вание апикальной меристемы корня, замедление старения листьев.

Первое вещество с цитокининовой активностью, способное вы-
зывать пролиферацию клеток в культуре, было обнаружено в 1948 г.
в составе кокосового молока. Вскоре после этого способность влиять
на пролиферацию растительных клеток была продемонстрирована
для аденина и его производных, в частности 6-фурфриламиноиурина,
или кинетина. Первый натуральный цитокинин — зеатин - был вы-
делен в 1974 г.

По своей химической природе все натуральные цитокинины яв-
ляются ^-замещенными производными аденина. Основным актив-
ным цитокинином в растении является транс-зеатин. Ьго изомер
цис-зеатин обладает слабой физиологической активностью и его
точные функции в развитии растений до конца не выяснены. К фи-
зиологически активным цитокининам относятся также дигидрозса-
тин и предшественник в биосин тезе всех природных цитокининов
изопентеииладенин. Слабой цитокининовой активностью обладают
рибозиды цитокининов. Среди синтетических цитокининов имеют-
ся как производные аденина (кинетин, 6-бензиламинопурин), так
и вещества иной химической природы, например производное фе-
нилмочевины тидиазурон.
4.1.	Биосинтез, катаболизм и инактивация цитокининов

Биосинтез цитокининов

В настоящее время у растений выделены ферменты, контролиру-
ющие все стадии биосинтеза этих гормонов, выявлены кодирующие
их гены (рис. 4.1). Помимо растений, к синтезу цитокининов способ-
ны некоторые фитонагогенные бактерии, в частности Agrobacterium
tumefaciens, Pseudomonas savastanoi и Pantoea agglomerata и грибы.
У перечисленных видов бактерий выявлены гены биосинтеза цитоки-
нинов, гомологичные таковым у растений.

} CYP735A ]	эмари

ATP iPRTP - ► tZRTP	*

TFHK
нуклеотидазы?	[тРНК-IPT |

преиил-т₽НК

DMAFF + < ADP —► IPRDP —»- tZRDP
цис-гр-енил-тРЧК

Активные формы ;p

Рис. 4.1. Основные этапы биосинтеза цитокининов (модифицировано по Hirose el al., 200?)
Ферменты IPT осуществляют синтез зеатинрибозид и изопентенилрибозид гри-, ди
и монофосфатов из DMAPP и АТФ, АДФ и А МФ соо-вест венно. Ферменты тРНК-1РТ
осуществляют синтез дис зеатинрибозид л/снофосфгтэ из DMAPP и адениновых нуклеоти-
дов 1 РНК. Ферменты CYP735A синтезируют зеатиновые нуклестиды из изопет пен иловых.
Фермент IGG осуществляет дефосфорипировэние и дерибозит ирование зеатинрибозид-
и изопентенилрибозид-монофосфстов. В биосинтезе цитокининов мщут также учаывовать
нухтеотидазы (серые вертикальные стрелки), осуществляющие дефосфорилирсватие
три- и дифосфаюв с образованием зеатин рибозид- и изо, енгенилрибозид монофосфатов,
которою являются субстратами .OG и нуклесзидаз (зеленые вертикальные стрелки)
Предшественниками биосинтеза цитокининов в растениях являют-
ся свободные АТФ и АДФ, а также тРНК. Первая стадия биосинтеза
цитокининов — синтез изопентенил-нуклеотидов из АТФ или АДФ
и диметилаллилпирофосфата (DMAPP) — катализируется фермен-
том изопентенилтрансферазой (1РТ). Кроме IPT, у растений выявлены
ферменты тРНК-IPT, использующие в качестве субстрата тРНК — они
используются для синтеза цис-зеатина. В дальнейшем изопентенил-
нуклсотиды могут превращаться в зеатин-нуклеотиды с пемошью
фитохром Р450-монооксигеназ. Наконец, последней стадией являет-
ся получение активных цитокининов из цитокининовых нуклеотидов
путем дефосфорилирования и дерибозилирования — эта реакция ка-
тализируется ферментом 5’монофосфат-фосфорибогидролазой, кото-
рый кодируется геном LOG.

По последним данным, разные этапы биосинтеза цитокининов
осуществляются в разных тканях растения. Основным местом син-
теза цитокининовых нуклеотидов является кончик корня, небольшое
их количество синтезируется также в апексе побега, цветках и пло-
дах. По ксилеме цитокининовые нуклеотиды доставляются в апекс
побега, который является основным местом синтеза активных сво-
бодных цитокининов.

На первом этапе биосинтеза цитокининов действуют ферменты
IPT. Этот этап биосинтеза является лимитирующей стадией, на ко-
торой контролируется концентрация цитокининов в тканях расте-
ния Изменение уровня экспрессии генов IPT наиболее значительно
отражается на содержании цитокининов.

Впервые гены IPT были идентифицированы у бактерий, индуци-
рующих аномальное разрастание тканей (опухоли, галлы) у заражен-
ных растений. Ферменты IPT бактерий, в отличие от растительных
IPT, используют в качестве субстрата не АТФ или АДФ. а АМФ.

У изученных видов растений ферменты IPT кодируются неболь-
шими мультигенными семействами (9 генов AtIPT у аоабидопсис
и 8 генов OsIPT у риса). Для генов IPT характерна тканеспецифич-
ность экспрессии и разделение функций. Например, ген AtlPT3
экспрессируется преимущественно во флоэме, и его экспрессия
регулируется в зависимости от концентрации нитратов, фосфатов
и сульфатов — таким образом, этот ген важен для функции цито-
кининов как регуляторов минерального питания растений. Другой
ген — AtlPT7 — экспрессируется в апикальной меристеме побега
(ПАМ), и его экспрессия напрямую регулируется транскрипцион-
ными факторами KNOX, функция которых связана с пролиферацией
клеток ПАМ. Потеря функции отдельных генов AtiPT не отражает-
ся на фенотипе растений из-за перекрывания их функций, в то же
время сверхэкспрессия любого из /РТ-генов приводит к развитию
характерного «цитокининового» фенотипа, который включает в себя
карликовость, темно-зеленую окраску листьев, редукцию корневой
системы и усиленное побегообразование.

Продуктами генов AtIPT2 и AtIPT9 арабидопсис являются тРНК-
1РТ, которые синтезируют цис-зеатин из аденина, находящегося
в составе тРНК.

Таким образом, в настоящее время выделяют три группы 1Р'1-фср-
ментов- ОМЛРР::АТФ/ЛДФ-1РТ (продукты генов AtIPTI и AtlP'13-8
арабидопсис и их гомологи у других видов растений), Е>МАРР::АМФ-
IPT (продукты бактериальных генов JPT) и тРИК-IPT (продукты генов
AtIPT2 и AtIPT9 арабидопсис, а также их гомологи). Первые две груп-
пы ферментов выявлены у растений, грибов и некоторых бактерий,
тогда как тРНК-1РТ широко распространены у всех эукариот, и основ-
ной их функцией является контроль созревания тРНК.

Превращение изопентенил-нуклеотидов в зеатин-нуклеотиды
катализируют цитохром-Р450 монооксигеназы CYP735A. Гены,
кодирующие эти ферменты, также обладают тканеспецифичным
характером экспрессии: например, у арабидопсис ген CYP735A2
экспрессируется преимущественно в корне, а ген CYP735A1 —
в надземной части растения

Цитокининовые нуклеотиды обладают слабой физиологической
активностью — таким образом, важным этапом биосинтеза цито-
кининов является их активация путем отщепления рибозы и фос-
фатной группы. Эту реакцию катализирует фермент LOG, который
имеет фосфорибогидролазную активность и превращает цитоки-
ниновые нуклеотиды iPRMP и tZRMP в свободные активные изо-
пентениладенин и зеатин. Этот фермент был выявлен при изучении
мутанта риса log {lonely guy), который имеет аномалии в развитии
апикальной меристемы побега: нерегулярное ветвление, сниженное
количество цветков, в цветке отсутствует пестик и развивается един-
ственная тычинка. Ген LOG экспрессируется в небольшом участке
вегетативной меристемы побега, соответствующей зоне стволовых
клеток, а также в местах закладки цветочных примордиев в меристе-
ме соцветия, тогда как гены IPT, действующие на первом этапе био-
синтеза цитокининов, экспрессируются в основном в корне. Таким
образом, цитокинины, синтезированные в корне, транспортируются
по ксилеме к месту активации цитокининов — апикальной меристе-
ме побега, которая одновременно является основной мишенью дей-
ствия этих гормонов.
Кроме ферментов LOG, расщепление цитокининовых нуклеоти-
дов может осуществляться и другими ферментами. Например, у рас-
тений обнаружены ферменты нуклеотидазы, осуществляющие де-
фосфорилирование нуклеотидов, и нуклеозидазы, осуществляющие
дсрибозилирование, но роль их в биосинтезе активных форм цито-
кининов в настоящее время не доказана.

Катаболизм и инактивация цитокининов

Основные ферменты катаболизма цитокининов — цитокинин-
оксидазы (СКХ), которые локализованы в вакуолях и ЭР и осу-
ществляют расщепление цитокининов с образованием аденина.
Субстратами цитокинин-оксидаз являются свободные цитокинины
(зеатин, изопентениладенин) и их рибозиды. В геноме арабидопсис
выявлено 8 генов AlCKX, экспрессия которых позитивно регулиру-
ется цитокининами, что важно для регуляции уровня цитокининов
в тканях растения. Повышение уровней экспрессии генов AlCKX
у трансгенных растений вызывает снижение жизнеспособности,
увеличение размеров меристемы корня и уменьшение апикальной
меристемы побега.

Помимо расщепления цитокинин-оксидазами, возможна обрати-
мая или необратимая инактивация цитокининов путем образования
конъюгатов. Известно три основных пути инактивации цитокини-
нов: 1) необратимое образование конъюгатов с аминокислотами,
2) необратимое N-гликозилирозание по пуриновому кольцу и 3) об-
ратимое О-гликозилирование по боковой цепи. О-гликозиды являют-
ся запасными формами цитокининов, тогда как конъюгазы с амино-
кислотами и N-гликозиды являются катаболитами и впоследствии
расщепляются цитокинин-оксидазами.

4.2.	Транспорт цитокининов

Поскольку основным местом биосинтеза цитокининов является
корень, а основным местом активации — апекс побега, наибольшее
значение в дальнем транспорте цитокининов между органами рас-
тения имеет ксилемный транспорт, который действует в акропеталь-
ном направлении (от корня к надземной части растения). Основной
транспортной формой цитокининов является зеатин-рибозид. Кроме
того, существует транспорт цитокининов по флозме, благодаря кото-
рому свободные цитокинины и их конъюгаты могут перемещаться
по растению в обоих направлениях.

Транспорт цитокининов между клетками растения осуществляют
две группы белков (рис. 4.2):
Рис. 4.2 Схема участия белков PUP и EN г в транспорте цитокининов между проводя-
щей системой и окружающими тканями (модифицировано по Buikle et aL, 2003)
В корне фермеры IPT осуществляют синтез цитокининовых нуклеотидов, в агексе
г обе га происходит их активация ферментами LCG. Велки ЕНТ осуществляют транспорт
нуклеозидов между подводящей системой и окружающими тканями, белки PUP2 —
транспорт свободных цитокининов, белки PUP1 —транспорт цитокининов из гидатод.
ZR — зеатин рибозид (основная транспортная форма цитокининов), Z — транс-зеатин

•	пуринпермеазы (PL’P), которые транспортируют в клетку свобод-
ные цитокинины, а также аденин;

•	равновесные транспортеры нуклеозидов (Equilibrative Nucleoside
Transporters, ENT), которые осуществляют транспорт в клетку
цитокинин-рибозидов
В геноме арабидопсис присутствуют три гена пуринперме-
аз - AtPUPl, AtPUP2 и AtPUP3, которые различаются по про-
странственному характеру экспрессии: AtPUP2 экспрессируется
во флоэме надземной части растения, тогда как AtPUPl — только
в гидатодах листа и AtPUP3 — только в пыльцевых зернах. Та-
кой характер экспрессии свидетельствует о разной роли пурин-
пермеаз арабидопсис в транспорте цитокининов: предполагает-
ся, что AtPUP2 является основным белком, осуществляющим
обмен цитокининами между проводящей системой и окружаю-
щими тканями; тогда как AtPUPl выполняет узкоспецифичную
функцию, препятствуя потере цитокининов при выводе воды че-
рез гидатоды.

Белки ENT (Equiiibrative Nucleoside Transporters) широко рас-
пространены у всех эукариот. Помимо транспорта цитокинин-
нуклеозидов, ENT-белки у растений осуществляют межклеточный
транспорт других нуклеозидов, например аденозина и уридина. В ге-
номах изученных видов растений белки ENT кодируются небольши-
ми мультигенными семействами — например, у арабидопсис 8 генов
AtENT, у риса — 4 гена OsENl: Экспрессия генов ENT наблюдается
в ксилеме стебля и корня. Кроме того, экспрессия гена OsENT2 риса
выявлена в эндосперме прорастающих семян, что свидетельствует
о его важной роли в транспорте цитокининов в развивающийся про-
росток.

4.3.	Рецепция и передача сигнала цитокининов

Путь передачи сигнала при ответе на цитокинины у растений ор-
ганизован по принципу фосфореле (рис. 4.3) и имеет сходство с дву-
компонентными сигнальными системами бактерий.

Рецепторы цитокининов

Рецепторы цитокининов относятся к группе гибридных сенсор-
ных His-киназ, которые действуют на первом этапе систем фосфо-
реле. У арабидопсис выделено три активных рецептора к цитокини-
нам: АНК2 (AKABIDOPS1S HISTIDINE KINASE 2), АНКЗ и АНК4/
CREl/WOL (ARABIDOPSIS HISTIDINE KINASE 4/CYTOKININ
RESPONSE I/WOODEN LEG). Все они локализованы на плазмалем-
ме и включают в себя три домена:

•	лиганд-связывающий трансмембранный домен CHASE (Cyclase
His-Kinase-Associated Extracellular) на N-конце;

•	гистидин-киназный домен, который осуществляет автофосфори-
лирование по консервативному остатку гистидина;
гень' первичного ответ.

Hi цяокннины

севр
д мен

CHASE- кинамый косачи
дскев домен домен

Рис. 4.3 Схема организации пути передачи сш нала при ответе на цитокинины
(модифицгровано го Ferreira and Kieber, 2005;

При связывании цитокинина рецегторы димеризуются и автофссфорилируются, а
затем передают срссфатную группу на His-фосатотрансферазные белки АНР Белки
АНР перемещаются в ядро и передают фосфатную группу на регуляторы ответа ARR
А- и Б-типа. ARR A-типа являюгся репрессорами передачи сигнала цитокининов. ARR
В-типа являются транскрипционными факторами и регулируют экспоессию генов
первичного ответа на цитокинины, в том числе — генов ARR А-типа

•	воспринимающий домен на С-конце, который переносит фосфат-
ную группу на белок АНР.

После взаимодействия молекулы цитокинина с сайтом его узна-
вания в CHASE-домене происходит димеризация двух рецепторов
Изменение конформации CllASE-домсна приводит к активации
гистидин-киназного домена и перекрестному фосфорилированию
рецепторов по консервативным остаткам His с последующей переда-
чей фосфатной группы на остаток Asp в воспринимающем домене.
В настоящее время неизвестны механизмы инактивации цитокини-
новых рецепторов после восприятия сигнала. Общепринятой явля-
ется реостатная модель работы этих рецепторов, которая заключает-
ся в прямой регулировке интенсивности сигнала в зависимости от
концентрации цитокинина. Эта модель объясняет продолжительную
активацию пути передачи цитокининового сигнала в тех случаях,
когда в течение долгого периода отсутствуют изменения в концен-
трации «лиганда.

Функции трех цитокининовых рецепторов арабидопсис перекры-
ваются, о чем свидетельствует слабое фенотипическое проявление
одиночных мутаций с потерей каждого из генов, кодирующих белки
АНК. При этом гены CRE1, АНК2 и АНКЗ обладают тканеспецифич-
ным характером экспрессии: CRE1 преимущественно экспрессиру-
ется в корневой системе и в очень незначительных количествах —
в розеточных листьях, АИК2 — в жилках листьев, цветоносе и на
более низком уровне в корнях, АНКЗ — во всех органах растения,
причем наиболее высокий уровень его экспрессии наблюдается в ро -
зеточных листьях. Тройной мутант crel ahk2 ahk3 с потерей функции
всех трех генов цитокининовых рецепторов характеризуется серьез-
ными аномалиями, связанными со снижением ответа на цитокинины
(рис. 4.4); тем не менее жизнеспособность этого мутанта свидетель-
ствует о наличии других рецепторов к цитокининам.

Помимо рецепторов АНК2, АНКЗ и AHK4/CRE1/WOL, у ара-
бидопсис выделены белки СКП (CYTOKININ INSENSITIVE I)
и CKI2/AHK5, имеющие высокую степень гомологии с цитокини-
новыми рецепторами АНК2, АНКЗ и АНК4, но лишенные транс-
мембранного С1 IASE-домена. В отличие от АНК2. АНКЗ и АНК4/
CRE1/WOL, белки СКП и CKI2 не связывают цитокинины in vitro,
но могут влиять на интенсивность ответа на цитокинины.

СКП был первым белком, для которого предполагалась функция
цитокининового рецептора. Сверхэкспрсссия гена СКП в каллусной
ткани приводит к конститутивному ответу на цитокинины при их от-
сутствии в среде. Показано, что при экспрессии СКП в клетках Sac-
charomyces cerevisiae этот рецептор активен конститутивно, вне за-
висимости от наличия цитокининов в среде. В интактном растении
ген СКП экспрессируется только в женском гаметофите и эндоспер-
ме незрелых семян: у мутанта с потерей функции ckil не развивается
женский гаметофит. В связи с этим предполагается, что СКП может
являться тканеспецифичной формой цитокининового рецептора.
WT

ahk2
crel

ahk3
crel

ahk?
ahk3

ahk?

ahk3

crel

Рис. 4.4. Фенотипы двойных и тройных мутантов арабидопсис с потерей функции
рецепторов цитокинина (модифицировано по Rieflor at al., 2006)

У белка СК12/АНК5 трансмембранный домен замещен на два спи-
ральных домена, предположительно участвующих в белок-белковых
взаимодействиях. У мутанта с потерей функции cki2 не отмечены
видимые изменения в фенотипе, но сверхэкспрессия CKI2 также
приводит к цитокинин -независимому росту каллуса.

Фгсфопереносящие белки AIIP

Следующим звеном в цепи передачи сигнала при ответе на ци-
токинин являются His-фосфоперепосящие белки АИР (Arabidopsis
Histidine Phosphol ransfer Proteins), которые передают фосфатную
группу от трансмембранных рецепторов к регуляторам ответа, кото-
рые находятся в ядре. АНР — небольшие белки молекулярной мас-
сой около 12 кДа, которые выполняют функцию цитоилазматически-
140 & Раздел 11. Регуляция развития растений фитогормонами
ядерных челноков, так как благодаря небольшому размеру могут
свободно диффундировать через ядерные поровые комплексы. Дей-
ствительно, для белков АН?! и АНР2 было показано кратковремен-
ное накопление в ядре после применения цитокинина.

Функция белков АНР как переносчиков фосфатных групп была
доказана по способности переносить фосфатные группы с мем-
бранных препаратов Е. coli, а также восстанавливать жизнеспо-
собность мутантов Saccharomyces cerevisiae с потерей функции
фосфопереносящего белка YPD1. В геноме арабидопсис присут-
ствуют 6 генов АНР, для которых показана тканеспецифичность
экспрессии. Мутанты с потерей функции нескольких АНР, напри-
мер akplahp2aph3ahp4, нечувствительны к цитокининам и облада
ют пониженной жизнеспособностью. В то же время один из АНР-
белков арабидопсис — АНР6 — является негативным регулятором
передачи сигнала цитокининов. Ген AIIP6 экспрессируется в про-
водящей системе и является одним из центральных регуляторов
дифференцировки сосудистых элементов.

Для разных белков АНР показана способность специфически
связываться с определенным типом цитокининовых рецепторов.
Некоторые АНР, например АНР2 и АНРЗ, взаимодействуют также
с белком CKI1, что свидетельствует о его роли как функционального
цитокининового рецептора. Кроме того, некоторые АНР-белки взаи-
модействуют с рецептором к этилену ETR1, что позволяет предпо-
ложить перекрывание сигнальных путей этих двух фитогормонов.

Регуляторы ответа

Регуляторы ответа на цитокинины — белки ARR (Authentic Re-
sponse Regulators) — действуют на последнем этапе передачи сиг-
нала. В геноме арабидопсис обнаружено 23 гена семейства ARR,
которые делятся на две большие группы на основе своей последова-
тельности, способности к индукции цитокининами, а также домен-
ной структуры и функции соответствующих белков.

Белки ARR В-типа представляют собой транскрипционные
факторы, которые регулируют экспрессию генов первичного ответа
на цитокинины. В состав молекул ARR В-типа входит N-кснцевой
воспринимающий домен, на который передается фосфатная группа
с белков АНР, и С-концевой ДНК-связывающий домен GARP (на-
званный так по первым буквам названий белков, его содержащих:
Golden2 кукурузы, ARR арабидопсис и Psrl Chlamydomonas). При
передаче фосфатной группы на воспринимающий домен белков
ARR В-типа происходит их активация и взаимодействие с промото-
рами цитокин ин-регулирусмых генов. Транскрипционные факторы
ARR В-типа взаимодействуют с консервативными последователь-
ностями (G/A)GGAT(T/C), которые имеются в промоторах генов
первичного ответа на цитокинины. Экспрессия генов ARR В-типа
(ARR 1-2, ARR 10-14 и ARR 18-21 арабидопсис) нс изменяется в ответ
на повышение концентрации цитокининов. Сверхэкспрессия генов
ARR В-типа у трансгенных растений приводит к повышению чув-
ствительности к цитокининам и появлению фенотипа, характерного
для растений со сверхпродукцией цитокининов. Гены, кодирующие
ARR В-типа, характеризуются тканеспецифичностью экспрессии;
в последние годы было получено много данных об участии разных
ARR В-типа в реализации различных физиологических функций
цитокининов.

Белки ARR A-типа являются негативными регуляторами ответа
на цитокинины. Действительно, сверхэкспрсссия генов ARR А-типа
у арабидопсис вызывает снижение чувствительности к цитокини-
нам. Мутации с потерей функции отдельных генов ARR A-типа не
вызываю! видимых фенотипических изменений, тогда как у мно-
жественных мутантов наблюдается повышенная чувствительность
к цитокининам, причем степень фенотипических изменений корре-
лирует с количеством мутантных генов.

Гены ARR A-типа (ARR3-9 и ARR15-17 арабидопсис) относятся
к генам первичного ответа на цитокинины, их экспрессия много-
кратно усиливается при повышении концентрации этих гормонов.
Таким образом. ARR A-типа являются компонентами негативной об-
ратной связи, регулирующей интенсивность ответа на цитокинины.
Поскольку гены ARR A-типа являются одними из наиболее «ранних»
цитокинин-индуцирусмых генов, изменение уровня их экспрессии
используется в исследованиях как молекулярный маркер ответа на
цитокинины.

Помимо цитокинин-зависимых транскрипционных факторов
ARR В-типа, экспрессию генов ARR A-типа могут регулировагь
и некоторые другие регуляторы транскрипции. Например, в апи-
кальной меристеме побега (ПАМ) экспрессия генов ARR A-типа на-
прямую репрессируется гомеобокс-содержащим транскрипционным
фактором WUSCHEL, который является основным регулятором пула
ст воловых клеток ПАМ.

Молекулы белков ARR A-типа состоят из воспринимающего до-
мена и небольшого вариабельного С-концевого расширения Эти
белки не обладают ДПК-сназывающей активностью, но способны
к белок-белковым взаимодействиям Показано, что передача «рос-
фасной группы на воспринимающий домен ARR А-типа необходима
для их функции как репрессоров ответа на цитокинины, тем не ме-
нее точные молекулярные механизмы влияния ARR А-типа на пере-
дачу сигнала в настоящее время неизвестны.

Существуют две модели, объясняющие возможный механизм ре-
прессии цитокининового сигнала с помощью ARR A-типа: согласно
первой из них ARR А-типа конкурируют с ARR В-типа при приеме
фосфатной группы от АНР-белков; согласно второй, ARR А-типа
прямо или опосредованно взаимодействуют с компонентами пути
передачи цитокининового сигнала, негативно регулируя их работу.
Недавно было показано, что у растений арабидопсис, обработанных
ингибитором протеасом MG132, происходит накопление белков ARR
A-типа, что позволяет предположить участие убиквитин-зазисимой
протеасомной деградации в регуляции ответа на цитокинины через
контроль стабильности ARR А-типа.

Для многих белков ARR А-типа были выявлены более широкие
функции помимо репрессии ответа на цитокинин: например, неко-
торые ARR А-типа участвуют в модулировании ответа на красный
свет, при этом белок ARR4 напрямую взаимодействует с рецептором
красного света фитохромом В; ARR3, ARR4, ARR8 и ARR9 участву-
ют в контроле циркадных ритмов.

Помимо генов ARR А и В типов, у арабидопсис выявлена группа
генов, кодирующих псевдорегуляторы ответа (APRR), которые близ-
ки по структуре к ARR А-типа, но не участвуют в передаче сигнала
цитокининов. В воспринимающем домене белков APRR консерва-
тивный остаток Asp, на который у ARR-A ARR-В осуществляется
перенос фосфатной группы с АНР-белков, отсутствует либо замещен
остатком глутаминовой кислоты. Однако псевдорегуляторы ответа
также играют роль в контроле некоторых физиологических процес-
сов: например, APRR I участвует в регуляции циркадных ритмов.

Исследования последних лет показали, что разные белки, участву-
ющие в передаче сигнала цитокининов, принимают участие в реали-
зации разных функций этих гормонов в развитии растений (рис. 4.5):
например, цитокинин-зависимое подавление корнеобразования у ара-
бидопсис связано с активностью рецептора АНКЗ и транскрипцион-
ного фактора ARR1, который яозитизно регулирует экспрессию гена
SHY2/1AA3, кодирующего репрессор ответа на ауксины.

Гены первичного ответа на цитокинины

В многочисленных исследованиях было показано изменение
уровней экспрессии более чем тысячи растительных генов в ответ на
Рис. 4.5 Участие компонентов передачи сигнала цитокининов в реализации функций
цитскининэи о развитии растения (модифицирсвано по Perilli at al., 2009)

А — в ПАМ: действие цитокининов зависит от транскрипционных факторов STM, который
стимулирует биосинтез цитокининов, позитивно регулируя экспрессию гена !РТ7 и И'1/S.
обработку цитокининами. Особое место занимают гены первичного
ответа на цитокинины, экспрессия которых напрямую регулируется
транскрипционными факторами ARR В-типа. Экспрессия этих ге
нов усиливается или снижается в течение нескольких минут после
обработки растения цитокининами. Среди генов, экспрессия кото-
рых напрямую регулируется цитокининами, можно назвать:

1.	Гены, контролирующие метаболизм и передачу сигнала различ-
ных фитогормонов: цитокининов (гены цитокинин-сксидаз СКХ,
репрессоров ответа ARR A-типа и псевдорегулягоров ответа
APRR), ауксинов (гены синтаз конъюгатов GH3, некоторые гены
репрессоров ответа на ауксины Aux/IAA, ген, кодирующий белок
входного канала ПАТ AUX1), этилена (гены рецепторов к этилену
ETR2 и ERS2, а также этилен-зависимых транскрипционных фак-
торов EIN3 и ERF}, гиббереллинов (гены репрессоров передачи
сигнала GAI, RGA, SPY).

2	Гены, участвующие в световом сигналингс (ген фитохрома А
PHYA и взаимодействующего с ним белка PKS1).

3.	Гены некоторых хлоропластных белков (гены белков фотосисте-
мы 2, гены, контролирующие сплайсинг хлоропластной РНК).

4.	Гены, контролирующие клеточный цикл (гены циклинов класса D).

5.	Гены, контролирующие метаболизм и транспорт сахаров (гены
сахарозо-синтазы SUS, инвертазы 1NV и //'-моносахаридного
симпортера STP).

6.	Гены, контролирующие транспорт и метаболизм неорганических
солей (экспрессия гена нитрат-редуктазы NIA I позитивно регу

который стимулирует передачу сигналов цитокининов, негативно peiулируя экспрессию
генов ARR5 и ARR7. Одновременно STIV негативно регулирует биосинтез гиббереллинов,
подавляя диффьоенцировку клеток.

Б — в листовой пластинке: цитокинины увеличивают продолжительность жизни листа,
ингибируя процессы его старения через сигнальный пут_> AHK3/ARR2.

В — в проводящей системе: цитокинины стимулируют деление клеток камбия (Рс) и ин-
гибируют дифференцировку ксилемы (Рх). Ключевую роль в этом процессе играет анта-
гонизм рецептора CRE1 и негативного регулятора передачи сигнала цитокининов АНР6
Г — в апикальной меристеме корня: благодаря АНКЗ/АЙМ-зависимой стимуляции
экспрессии гена транскрипционного репрессора SHY2 цитокинины ингибируют
экспрессию генов, кодирующих белки полярного транспорта ауксинов Р'М, 3 и 7.
Ауксины стимулируют полярный транспорт за счет убиквитин-зависимого протеолиза
белка SHY2, опосредованного комплексом SCF™1.

Д — при инициации латерального корня (LR): цитокинины ингибируют полярный
транспорт ауксинов через репрессию транскрипции Р/Л’-генов
лируется цитокининами, а экспрессия генов, кодирующих белки-
переносчики ни гратов NRT, аммония АМТ, сульфатов SULTR
и фосфатов РНТ— негативно).

Большое количество цитокинин-регулируемых генов с различны-
ми функциями свидетельствует о роли цитокининов в разных аспек-
тах жизнедеятельности растений. В частности, цитокинины регу-
лируют экспрессию генов, участвующих в передаче сигнала других
фитогормонов, что свидетельствует об их роли в интеграции различ-
ных сигнальных путей у растений.

4.4. Функции цитокининов в развитии растений

Функции цитокининов в развитии растений очень многообразны:
это контроль пролиферации клеток, координация роста и развития
растения в зависимости от доступности минерального и органиче-
скою питания, поддержание апикальной меристемы побега и инги-
бирование развития корневой системы, предотвращение старения
листьев. В контроле большинства онтогенетических процессов ци-
токинины являются антагонистами ауксинов и гиббереллинов.

Ярким примером антагонизма цитокининов и ауксинов является
их противоположное действие в развитии апикальных меристем по-
бега и корня (ПАМ и КАМ). ПАМ и КАМ организованы по сходно-
му плану, включающему в себя пул недифференцированных стволо-
вых клеток в центральной части и зоны дифференцировки тканей на
периферии (подробнее см. в главах «Апикальная меристема побега»
и «Развитие корня»). Ауксины и цитокинины позитивно регулируют
клеточный цикл у растений, воздействуя на разные компоненты его
регуляции. При этом цитокинины стимулируют пролиферацию кле-
ток в ПАМ и ингибируют ее в КАМ; напротив ауксины стимулируют
пролиферацию клеток в КАМ и подавляют ее в ПАМ (одновременно
стимулируя дифференцировку клеток).

С антагонизмом цитокининов и ауксинов в контроле развития
апикальных меристем побега и корня связанс их действие на орга-
ногенез в культуре растительных тканей. В самых ранних экспери-
ментах но асептической культуре тканей и органов высших растений
было показано, что при равном соотношении цитокининов и аукси-
нов в'культуральной среде наблюдается стимуляция деления клеток
и образование каллуса, при повышении концентрации ауксинов про-
исходит дифференцировка корней, а при сдвиге баланса в сторону
цитокининов — образование побегов.

Несмотря на длительное изучение, механизмы антагонистическо-
го взаимодействия цитокининов и ауксинов в развитии ПАМ и КАМ
не выяснены. Отчасти они могут быть связаны с ингибирующим
действием этих гормонов на передачу сигнала друг друга.

Контроль пролиферации клеток

Цитокинины были впервые идентифицированы как вещества,
стимулирующие пролиферацию растительных клеток. Действи-
тельно, добавление цитокининов в культуральную среду стиму-
лирует деление клеток суспензионной культуры и каллусообра-
зование у эксплантов. В дальнейшем было показано, что одна из
основных функций цитокининов в растительном организме
контроль клеточного цикла в зависимости от условий внешней
и внутренней среды.

Одним из ключевых этапов регуляции клеточного цикла являет-
ся переход G1-S, то есть необратимый переход от покоя к делению.
Этот этап у растений находится год контролем циклинов класса D
(CycD), одна из групп которых — циклины D3 (CycD3) — осущест-
вляет связь между пролиферацией клеток и внешними сигналами.
Гены CycD3 относятся к цитокинин-регулируемым генам, их экс-
прессия напрямую контролируется транскрипционными факторами
ARR В-типа. Кроме того, показано, что экспрессия генов CycD3 ре-
гулируется сахарозой, причем сахароза является регулятором более
высокого порядка, чем цитокинины: цитокин ин завис и мая регуля-
ция их экспрессии зависит от уровня сахарозы. Таким образом, са-
хароза — один из основных источников органического питания рас-
тений определяет скорость пролиферации клеток, и ее влияние на
клеточный цикл опосредуется цитокининами. Эта схема регуляции
экспрессии генов CycD3 лежит в основе контроля роста и развития
растений в зависимости от доступности органического питания.

Цитокинин-зависимый контроль пролиферации клеток важен
для контроля баланса клеточных делений и дифференцировки, ко-
торый лежит в основе большинства онтогенетических процессов.
Примером является развитие меристем — образовательных тканей
растения, дающих начало дифференцированным тканям и органам.
Их развитие включает в себя два противоположных процесса: под-
держание меристемы за счет пролиферации недифференцирован-
ных клеток в центральных районах меристемы и дифференцировку
специфических типов клеток, которая имеет место на периферии.
В большинстве типов меристем (за исключением КЛМ) цитокинины
являются регуляторами первого процесса — пролиферации недиф-
ференцированных клеток, поскольку эти гормоны стимулируют экс-
прессию генов CycD3 и выход клеток из стадии G1. Действительно,
меристемы — основное место экспрессии генов CycD3; мутации по
этим генам вызывают уменьшение размеров меристем, а их свсрх-
экспрессия стимулирует пролиферацию дифференцированных кле-
ток и появление дополнительных меристем.

Примерами участия цитокининов в поддержании меристем яв-
ляется развитие апикальной меристемы побега (см. ниже), а также
камбия — меристематической ткани, необходимой для развития
проводящей системы.

Потеря функции ряда компонентов передачи сигнала цито-
кининов приводит к нарушению спецификации и поддержания
камбия: например, у мутанта wooden leg (wol) с потерей функции
цитокининового рецептора AHK/CRE1/WOL. Мутация crel/wol су-
прессируется мутацией с потерей функции А11Р6 — уникального
His-фосфопсреносящего белка, который является негативным регу-
лятором ответа на цитокинины. Антагонизм белков CRE1 и АНР6
лежит в основе регуляции дифференцировки сосудов (рис. 4.5 В):
цитокинины стимулируют деление клеток камбия, негативно регу-
лируя дифференцировку сосудистых элементов, тогда как АНР6,
ингибируя передачу сигнала цитокининов, препятствует пролифе-
рации камбиальных клеток и стимулирует дифференцировку ксиле-
мы. Сходный с crel/wol фенотип мутантов с потерей функции ARR
В-типа arrl, arrlf) и arr!2 позволяет предположить роль этих ARR
в контроле пролиферации клеток ксилемы. Экспрессия гена АНРб
негативно регулируется цитокининами и в норме ограничена прово-
дящей системой. В свою очередь, АНР6 снижает уровень экспрес-
сии генов ARP. В-типа.

Контроль развития апикальной меристемы побега

Основными регуляторами развития апикальной меристемы по-
бега (ПАМ) являются гомеобокс-содсржащис транскрипционные
факторы STM и WUS, важную роль в пролиферации клеток ПАМ
играет также транскрипционный фактор KNAT1 (подробнее см. гла-
ву «Апикальная меристема побега»). Функции STM, KNAT1 и WUS
в развитии ПАМ в значительной степени связаны с их влиянием на
биосинтез и передачу сигнала цитокининов.

Цитокинины контролируют деление клеток в апикальной мери-
стеме побега через позитивную регуляцию экспрессии генов CycD3,
основным местом экспрессии которых у растений являются меристе-
матические ткани. Таким образом, для пролиферации клеток ПАМ
необходимо поддержание высокой концентрации цитокининов.
Основным местом биосинтеза цитокининов является корень, кроме
того, небольшое количество цитокининов синтезируется непосред-
ственно в ПАМ, где экспрессируется ген IPT7. Последний этап био-
синтеза цитокининов — их активация с помощью фосфорпбозил-
гидролазы LOG — происходит в ПАМ, которая является основным
местом экспрессии гена LOG (рис. 4.6).

В поддержании концентрации цитокининов в ПАМ важную
роль играют транскрипционные факторы STM и KNAT1, которые
позитивно регулируют экспрессию гена биосинтеза цитокининов
IPT7, напрямую связываясь с его промотором. Другой мишенью
транскрипционного фактора STM являются гены, контролирую-
щие уровень гиббереллинов в ПАМ: ген биосинтеза гиббереллинов
Ga20Ox и ген гибберсллин-оксидазы Ga2Ox (подробнее см. главу
«Гиббереллины»), STM негативно регулирует экспрессию Ga20Ox
и позитивно — Ga2Ox. Поскольку цитокинины стимулируют про-
лиферацию клеток ПАМ, а гиббереллины ингибируют их проли-
ферацию и стимулируют дифференцировку, то STM-зависимое по-
вышение уровня цитокининов и снижение уровня гиббереллинов
в корпусе ПАМ необходимо для ее поддержания и нормального
функционирования.

Транскрипционный фактор WUS регулирует передачу сигна-
ла цитокининов, напрямую репрессируя транскрипцию генов ARR
A-типа. Вероятно, функция гена WUSкак основного регулятора пула
стволовых клеток ПАМ во многом связана со стимуляцией переда-
чи сигнала цитокининов — ключевых регуляторов пролиферации
клеток. Потеря функции этого гена у мутантов wus приводит к пре-
кращению пролиферации недифференцированных клеток и быстрой
терминации ПАМ.

Подавление развития апикальной меристемы корня

Одним из следствий повышения концентрации цитокининов яв-
ляется подавление развития корневой системы, связанное с ингиби-
рующим действием этих гормонов на работу апикальной меристемы
корня (КАМ). Механизмы этого явления на сегодняшний день изуче-
ны слабо.

Ключевую роль в пролиферации клеток КАМ играют ауксины,
которые доставляются сюда за счет базипетального полярного транс-
порта ауксинов, опосредованного PIN-белками. Один из важнейших
факторов, влияющих на полярный транспорт ауксинов, — экспрес-
сия генов PIN, которая контролируется балансом ауксин-зависимых
транскрипционных факторов ARF и транскрипционных репрессо-
ров Aux/IAA (подробнее см. в главе «Ауксины»). Ингибирующее
Рис. 4.6. Роль цитокининов в развитии апикальной меристемы пэбега

Цитокининовые нуклеотиды доставляются из корня и отчасти синтезируются в ПАМ
за счет активности фермента IPT7, активация цитокининов происходит в ЛАМ за
счет активности фермента L OG. 1ранскринционные факторы STM и KNAT1 работают
в корпусе ПАМ (ошечен фиолетовым), позитивно регулируют экспрессию i ена IPT7
и ограничивают экспрессию генов метаболизма гиббереллинов Са20 Ох и Ga2Ox до
зон дифференцировки (отмечены зеленым) и «буферных» зон на границе г.римор-
диев (отмечены серым). Транскрипционный фактор WUS работает в нише стволовых
клеток ПАМ (отмечен оранжевым) и негативно регулирует экспрессию генов ARR
А типа, стимулируя передачу сигнала цитокининов

действие цитокининов на развитие КАМ по крайней мере отчасти
связано с ингибированием базипетального полярного транспорта
ауксинов в кончик ксрня (рис. 4.5 Г, 4.7). Транскрипционные факто-
ры ARR В-типа позитивно регулируют экспрессию некоторых генов,
кодирующих Aux/IAA в частности, одной из их мишеней является
ген SHY2/IAA3, который является негативным регулятором экспрес-
сии генов PIN3 и PIN7. Установлено, что ключевую роль в SHY2-
зависимом ингибировании полярного транспорта ауксинов в КАМ
играют рецептор цитокининов АНКЗ, а также транскрипционные
факторы ARR1 и ARR2. Ауксины, в свою очередь, ингибируют пере-
Рис. 4.7 Ингибирующее действие цитокининов на экспрессию генов PIN арабидопсис
(по Ruzicka et al., 2009)

Экспрессии репортерных конструкций PIN1::GFP, PIN2 GFP и PIN3::QFP в корнях
растений арабидопсис, выращенных на безгормональной среде (MS) и среде
с синтетическим цитокинином бензиламиногурином (ВА)

дачу сигнала цитокининов в КАМ, позитивно регулируя экспрессию
генов ARR А-типа ARR7 и ARR15.

Сходным образом, через негативный контроль экспрессии P1N-
генов, цитокинины ингибируют инициацию боковых и придаточных
корней в перицикле. Ген PIN3 — основная мишень цитокининов
в этом процессе — является ключевым регулятором разворота по-
лярного транспорта ауксинов, необходимого для инициации лате-
рального корня (рис. 4.5 Д).

Антагонизм цитокининов и ауксинов в контроле развития КАМ
важен также для закладки первичного корня в эмбриогенезе. Зачаток
первичного корня зародыша возникает в результате спецификации
одной клетки — инициали гипофиза, при этом ключевую роль игра-
ет возникновение локального максимума концентрации ауксинов за
счет направленного полярного транспорта (подробнее см. в главах
«Эмбриогенез» и «Развитие корня»). Было показано, что при этом
в потомках первичной клетки гипофиза активируется экспрессия
двух генов ARR А-типа — ARR7 и ARR15, которые негативно регу-
лируют передачу сигнала цитокининов в зачатке первичного корня.
У мутантов с потерей функции этих генов нс формируется первич-
ный корень в эмбриогенезе.

Ингибирование старения листьев

Старение листа — нормальная конечная стадия его развития,
включающая в себя определенные физиологические и биохимиче-
ские изменения, которые регулируются генетической программой.
Рис 4.8. Ингибирующее влияние цитокиккна на старение листьев (модифицировано
го Zavaleta-Mancera et al., 2007)

А — старение листьев у растений табака' слева — растение дикого типа, справа —
трансгенное растение с конститутивной экспрессией гена/Р/ Agronacterium tumetaciens.
Б — фотографии хлоропласта из стареющего листа (д — граны, s — строма, р — пла-
стоглобулы, t— титлакоиды): внизу — после обработки синтетическим цитокинином
БАП в течение 4 дней /граны стабильны), вверху — без обработки (граны разрушены)

Одним из основных симптомов старения является разрушение хло-
рофилла, приводящее к пожелтению листа. Хлоропласт ы — первые
органеллы в клетках стареющего листа, которые демонстрируют
признаки деградации: диссоциацию гран, снижение числа пласто-
глобул и нарушение структуры наружной мембраны. Известно, что
все эти процессы могут быть остановлены при обработке стареюше-
го листа цитокининами. Например, обработка стареющих листьев
табака синтетическим цитокинином БАП приводит к повышению
уровня хлорофилла, хлорофилл-связывающих белков и субъединиц
RIJB1SCO, а также к стабилизации гран тилакоидов и внешних мем-
бран хлоропластов (рис. 4.8). Установлено, что механизм влияния
цитокининов на процесс старения листа в большей степени связан
не с усилением биосинтеза хлорофилла и хлоропластных белков, а
с предотвращением их разрушения, которое запускается при старе-
нии.

В процессе поглощения света в хлоропластах образуется большое
количество веществ группы R OS (Reactive Oxygen Species) таких как
супероксид-радикал (О2-), перекись водорода (Н2О2) и гидроксил-
радикал (ОН-). Вещества ROS окисляют белки и липиды, что приво-
дит к разрушению мембран и гибели клеток, кроме того, многие ROS
являются вторичными мессенджерами, запускающими экспрессию
генов, ассоциированных со старением (SAG, от Senescence-Associat-
ed Genes) (подробнее см. итаву «Этилен»),

В растительных клетках действуют механизмы защиты от окис-
лительною стресса, которые можно разделить на две группы: нс-
ферментные антиоксиданты — например, аскорбиновая кислота
и глутатион, которые реагируют и инактивируют ROS, и фермент-
ные антиоксиданты — каталаза (CAT), супероксид-дисмутаза (SOD)
и аскорбат-пероксидаза (АРХ), которые катализируют разрушение
ROS. При старении наблюдается закономерное снижение уровней
ферментных и неферментных антиоксидантов в клетках. Установле-
но, что цитокинины повышают активность ферментов CAT и АРХ,
что приводит к значительному снижению уровня ROS и останавли-
вает разрушение хлоропластов.

Регуляция развития растений в зависимости от источников
минеральнсго питания

Развитие растений в значительной степени определяется наличи-
ем источников минерального и органического питания. Координаци-
ей роста и развития в зависимости от источников питания занимают-
ся цитокинины, от которых зависит пролиферация клеток и развитие
меристем. В последние годы выявлена прямая взаимосвязь между
наличием источников питания и биосинтезом и передачей сигнала
цитокининов. Наибольшее количество информации имеется о связи
цитокининов с ответом растений на неорганический азот.

Основными источниками азотною питания растений являются
нитраты, нитриты и соли аммония; их доступность является одним из
лимитирующих фактов роста и развития растений. Среди генов, экс-
прессия которых позитивно регулируется нитратами, имеются гены,
контролирующие транспорт нитраг-ионов в клетку (гены нитратных
транспортеров NRT) и метаболизм нитратов (гены нитрат-редуктаз
N1A и Nil), транспорт и ассимиляцию аммония (гены транспоргсров
аммония АМТ), а также транспорт и метаболизм других неоргани-
ческих солей (гены сульфатных транспортеров SULTR и фосфатных
транспортеров РИТ), синтез аминокислот (гены аспарагин-синтетаз
ASN, глутамин-синтетаз GI.N, глутамат-дегидрогеназ GDH), синтез
белков (некоторые гены рибосомных белков и факторов элонгации
трансляции), метаболизм органических кислот и сахаров (гены
глюкозо-6-Pl-дегидрогеназ G6PDH). Среди нитрат-регулируемых
генов важное место занимают также гены TPS и ТРР, контролиру-
ющие метаболизм трегалозо-6-фосфата (Т6Р) сигнальной моле-
кулы, для которой в последние годы установлена важная функция
в координации роста растения в зависимости от уровня фотосинте-
за. Таким образом, нитраты являются центральными регуляторами
развития растений в зависимости от источников питания.

У растений имеется своя система детекции источников азотного
питания, передача сигналов с которой запускает экспрессию опре-
деленных генов и контролирует активность определенных фермен-
тов. Молекулярные механизмы нитратного сигндлингв подробно
изучены у Escherichia coli, цианобактерий, Saccharomyces cerevisiae
и Chlamydomonas reinhardtii, тогда как у высших растений компонен-
ты систем адаптивного ответа на источники неорганического азота
до настоящего времени не выявлены. Нитрат-ионы и ионы аммония,
которые являются сигнальными молекулами этой системы, могут
использоваться как сигналы «дальнего действия», координирующие
развитие надземной и подземной частей растения. Кроме того, было
установлено, что по крайней мере часть передачи сигнала при отве-
те на неорганический азот опосредуется системой передачи сигнала
цитокининов.

Нитраты позитивно регулируют биосинтез цитокининов через
контроль экспрессии гена IPT3: уровень транскрипции этого гена
в клетках проводящей системы зависит от уровня нитратов в кси-
леме (рис. 4.9). С другой стороны, экспрессия большого количества
генов, контролирующих транспорт или метаболизм неорганических
солей, позитивно или негативно регулируется цитокининами, при-
чем их цитокинин-зависимая регуляция зависит от уровня нитратов.
Таким образом, предполагается, что нитраты стимулируют биосин-
тез цитокининов через регуляцию IPT3, что приводит к запуску экс-
прессии цитокинин- и нитрат-регулируемых генов (рис. 4 10).

Итак, цитокинины - фитогормоны, координирующие развитие
растений в зависимости от доступности минерального и органиче-
fNO3]

7 mM

0.07 тМ

Рис. 4 9. Контроль экспрессии гена A1IPT3 нитратами (модифицировано по Hirose
et al., 2008). Экспрессия репоргерной конструкции AtlPT3::GFP в корнях растений
арабидопсис при различных концентрациях нитратов в среде

с кою питания. Эта функция цитокининов осуществляется благодаря
их ключевой роли в регуляции пролиферации клеток и развития апи-
кальной меристемы побега.

Источники рисунков, использованных в главе

1.	Buckle L., Cedzich A., Dopke С. et al. Transport of cytokinins mediated by purine
transporters of the PUP family expressed in phloem, hydathodes, and pollen of
Arabidopsis // Plant Journal. 2003. Vol. 34. P. 13-26

2.	Ferreira F -J., Kleber J. J. CytoKinin signaling // Current Opinion in Plant Biology.
2005. Vol. 8. P. 518-525.

3.	Hirose N., Takei K., Kuroha T. et al. Regulation of cytokinin biosynthesis,
compartmentalization and translocation // Experimental Botany. 2008. Vol. 59.
P. 75-83.

4.	Perilli S., Moubayidin L., Sabatini S. The molecular basis of cytokin.n function //
Current Opinion in Plant Biology. 2009.

5.	Riefler M., Novak O., Strnad M et al. Arabidopsis cytokinin receptor mutants
reveal functions in shoot growth, leaf senescence, seed size, germination, root
development, and cytokinin metabolism // Plant Cell. 2006. Vol. 18.

P. 40-54

6.	Ruzicka K., Simdskovd M., Duclercq J. et al. Cytokinin regulates root meristem
activity via modulation of the polar auxin transport // PNAS. 2009. Vol 106.

P. 4284-4289.

7.	Sakakibara H, Takei K., Hirose N. Interactions between nitrogen and cytokinin in
the regulation of metabolism and development//Trends in Plant Science. 200t>.
Vol.ll.P440 448.
iP-CK

бносин тез
цитокининов

CYPT35A
-------*tZ-CK

FD FNH
ассимиляция
азота

NM, CNX2

NII UPM

GLN.GLT

ASP.ASN

путь окислите
льнсио фосфори
пирования

GoP-77

6PGOH
TKL. TAL

метаболизм
органических кислот

РОН VH

PPG, МОН

ОМТ

•УПК

биосинтез гликолиз метаболизм сахаров
цитокининов PG^M	FK

PCI. ALD	INV

IPT5	РК

передача сигнала

\	фПОЮТНМНОН

HP

Type-В Type А
RR	(W

метаболизм трет алозы

IPS ТРР

►Т6Р ►Тге -►

TPS ТРР TRE

метаболизм ассимиляция
трегалозы серы

TPS	АРН

ТРР	SIH

Трансопрт неорганичеких солей

NRT1.1	AM l	SULTR35

NRT2:1	АМТ13	SULTR4-1

NHT22	SULTTM2

NRT2.4	SULTR12	SUITR6 I

SU ТЯ2.2

Трансопрт неорганических солей Метаболизм фитогорминов углеродный
нитраты сульфаты цитокинины ауксины гиббереллины ме,а6опизм
ННГ>3	> CYP73SA N)	PPDKNMi:

СКХ4
СКХ5

синтез белка

HPI. HPS
EF1B

соли аммония фосфаты передача сигнала цитокининов азотный метаболизм
г^ляя

ASN, ъ

Ответ на цитокинины

вторичный метаболизм
мептюлмн
фенилу опало ядов
и флг^интищов
ногамштизм Р1м*

синтез алкалоидов

растяясение
клеточной стенки

LXP

Транстфипционные
факторы

AG126 AGIO

SPL15 SPLS

CBF1. COL8

транскрипционные
факторы

НАГ1, НАТЗ

НАТ4 АР2
GATA families

метаболизм
трегалозы

7PS
ТРР
TRE

Рис. 4.10. Схема взаимодействия нитратов и цитокининов в контроле минерального
питания и развития растения (модифицировано по Sakakibara et al., 2006).

Транспорт и метаболизм азота (выделен в желтом квадрате) является ключевым
регулятором стеега растений на все остальные источники минерального
и органического питания. Нитраты позитивно регулируют экспрессию генов
углеродного метаболизма (выделены в красном квадрате), а также биосинтез
цитокининов Компоненты передачи сигнала цитокининов регулируют экспрессию
генов, контролирующих транспорт и метаболизм неорганических солей (выделены
в сером квадрате): позитивно (красный шрифт) или негативно (желтый шрифт)

8	Zavaleta-Mancera Н.А._ Lopez-Delgado Н., Loza-Tavera Н. et al. Cytokinin
promotes catalase and ascorbate peroxidase activities and preserves the
chloroplast integrity during dark-senescence // Plant Physiology 2007.

Vol 164. P. 1572-1582.
Рекомендованная литература

1.	Hirose N., Takei К. Kuroha Т. et al. Regulation of cytokinin biosynthesis,
compartmentalization and translocation // Experimental Botany 2008. Vol. 59.
P. 75-83.

2.	To J. P, KieberJ J. Cytokinin signaling: two-components and more //
Trends in Plant Science 2008. Vol. 13. P. 85 -92.

3	Werner T, Schmulling T Cytokinin action in plant development // Current Opinion
in Plant Biology 2009. Vol. 12. P. 527-538.
Глава 5

Этилен

Этилен (С2Н4) — первый из обнаруженных газообразных гормо-
нов растений. Этилен выполняет в жизненном цикле растений мно-
гообразные функции, среди которых контроль развития проростка,
созревания плодов, старения и опадения цветков и листьев. Этилен
называют также гормоном стресса, так как он участвует в реакции
растений на биотический и абиотический стресс, и синтез ею в ор
танах растений усиливается в ответ на разного рода повреждения.
Кроме того, являясь летучим газообразным веществом, этилен осу-
ществляет быструю коммуникацию между разными органами рас-
тений и между растениями в популяции, что важно, в частности, при
развитии стресс-устойчивости.

К числу наиболее известных функций этилена относится разви-
тие так называемого тройного ответа у этиолированных (выращен-
ных в темноте) проростков при обработке этим гормоном. Тройной
ответ (рис. 5.1) включает в себя три реакции: укорочение и утолще-
ние гипокотиля, укорочение корня и усиление апикального крючка
(резкий изгиб верхней части гипокотиля). Интересно, что у обрабо-
танных этиленом проростков (и у сверхчувствительных к этилену
мутантов) апикальный крючок развивается даже при нормальном
освещении, тогда как у мутантов с нарушением чувствительности
к этилену апикальный крючок в любых условиях отсутствует. Ответ
проростков на этилен крайне важен на первых этапах их развития —
обычно в этот период проросткам приходится пробиваться к свету
сквозь грунт, и апикальный крючок предохраняет их апикальные ме-
ристемы от повреждений. Если на пути проростка оказалось препят-
ствие (например, камень), его механическое воздействие вызывает
усиление биосинтеза этилена и вызывает у проростка тройной от-
Апикальный крючок

Укорочение и утолщение
гипокотиля

Ингибирование роста
главного корня

Рис. 5.1 Тройной ответ проростка арабидопсис на этилен (модифицировано no Taiz,
Zeiger, 2002)

вет: изгиб апикального крючка усиливается, гипокотиль становится
толще и крепче — в результате иногда растущий проросток вытал-
кивает камень. В том случае, если это не удалось, концентрация эти-
лена продолжает повышаться, гипокотиль искривляется и, «откло-
нившись от курса», огибает препятствие. При выходе верхней части
проростка на поверхность концентрация этилена снижается за счет
его диффузии в агмосферу, и апикальный крючок исчезает.

С тройным ответом связана история открытия функции этилена как
регулятора роста растений. В 1901 году профессор Дмитрий Николае-
вич Нелюбов, работавший в Санкг-Петербур1ском университете, об-
наружил, что при выращивании в лабораторных условиях проростки
гороха резко отличаются от тех же проростков, выращенных в теплице:
у них укорочен, утолщен и искривлен гипокотиль, не разгибается апи-
кальный крючок. Ученый сделал предположение о наличии в лабора-
торном воздухе некого вещества, влияющею на морфогенез рашений.
Помещения университета в то время освещались газом. Нелюбов про-
верил действие отдельных компонентов газовой смеси на разви тие про-
ростков и обнаружил, что тройной ответ вызывается этиленом.

5.1	. Биосинтез этилена

Биосинтез этилена на низком уровне имеет место во всех органах
и тканях растений на всех стадиях жизненного цикла и усиливается
на некоторых стадиях (ранние стадии развития проростка, старение)
и при стрессовых воздействиях (поранение, атака патогена). Кроме
того, биосинтез этилена регулируется циркадными ритмами (уро-
вень этилена в тканях растений достигает максимума в полдень), а
также некоторыми другими фигогормонами (например, цитокинины
и ауксины стимулируют биосинтез этилена, а гиббереллины снижа-
ют его уровень).

Предшественником в биосинтезе этилена является аминокис
лога метионин. Синтез этилена из метионина происходит в три
этапа: сначала синтезируется S-аденозил метионин, из него —
аминоциклопропан-1-карбоксилат (АСС), который в дальнейшем
превращается в этилен (рис. 5.2). Лимитирующим этапом является
синтез АСС из S-аденозил метионина, который катализируют фер-
менты ACC-синтазы (ACS); уровень биосинтеза этилена регулиру-
ется через контроль активности белков ACS. У арабидопсис были
изучены две группы мутантов с измененным уровнем активности
этих ферментов.

Мутации с in {cytokinin insensitive), которые вызывают понижен-
ный уровень этилена и неспособность к усилению его биосинте-
за в ответ на цитокинины, представляют собой мутации с потерей
функции генов ACS. Большинство из них приводит к замене одной
из четырех консервативных аминокислот в N-концевом каталитиче-
ском домене ACS белков.

Мутации eto {ethylene overproducing) влияют на стабильность
ферментов ACS, которые являются короткоживущими белками
(время полужизни от 20 минут до 2 часов). За стабильность белков
ACS отвечает их С-конпевой домен, который является мишенью для
убиквитин-зависимой протсасомной деградации; поэтому большая
часть мутаций eto связана с заменами аминокислот в С-концевых до-
менах ACS-белков.

На эффективность связывания ACS-белков с убиквитин-лигазным
комплексом влияет белок с ВТВ доменом ЕТО1, изменение структуры
которого также приводит к сверхпродукции этилена (мутация etol).

Основным путем стабилизации ACS-белков является их фосфо-
рилирование по консервативным остаткам Ser в С-концевых доме-
нах, которое делает невозможным присоединение убиквитин-лигазы
(рис. 5.3). Установлено, что фосфорилирование ACS-белков осу-
ществляют Са2+-зависимые протеинкиназы CDPK, а также МАРК,
активность которых у растений повышается при стрессовых воздей-
ствиях и поранении, что приводит, в свою очередь, к активации био-
синтеза этилена.
NH3‘

NH3+

CH3-S-CH2-CH2-CH-COO С'^,аЛ

Метионин a (	1

сн3Лсн2-сн2 CH-COO

AdoMet сн2

ACS

ATP

OHOH	MIA

AdoMet	▼

-----—цикл Янга

H2C\ /NH3‘
l/C<

H2C COO

ACC

O2 CO2

HCN

H2C=CH2

Этиген

Рис. 5 2 Схема биосинтеза этилена (модифицировано по Chae and Kieber, 2005)
Предшественником в биосинтезе этилена является метионин. Промежуточные про-
дукты: AdoMet (3-аденозил-мегионин), АСС (1 -аминециклопропан-1 -карбиоксиловая
кислота). Побочный продукт — М iА (метклтиоаденин), превращается обратно в ме-
тионин через цикл Янга Основные ферменты: AdoMet-синтаза, ACS (АСС синтаза),
АСО (АСС- оксидаза).

* — Лимитирующая стадия — синтез АСС из AdoMet. Регулируется двумя способами-
1) через экспрессию генов ACS — ауксинами брассинсстероидами, поранением;

2) через стабильность белков ACS (основной путь) — цитокининами

Другие пути

Поранение, патогены
и другие стрессы

ЗХРО4

Стабильный

Нестабильный

Рис. 5.3 Регуляция биосинтеза этилена через стабильность ACS белков
(модифицировано пс Chae and Kiebei, 2005)

Деградация ACS-белксв с помощью 2С8-прогегсомы начинается с присоединения
убиквитин-лигазнего комплекса ET01-CUL3 к С-кснцевой послеоовагелыюсти ACS.
Мутации по С концу ACS (eto2. 3) дают стабильный ACS-бепок. Возможна стабилизация
ACS-бегков путем фосфорилирования по консервативным остаткам Ser: с помощью
Са?*-заоисимых киназ CDPK {все ACS) и МАРКК-киназы МРК6 (ACS2 и 6)
5.2	Рецепция и передаче сигнала этилена

В настоящее время система рецепции и передачи сигнала при
ответе на этилен изучена достаточно подробно, охарактеризованы
практически все ее компоненты. Успех в этом направлении был до-
стигнут при изучении мутантов арабидопсис с измененным тройным
ответом проростков на этилен. Было выделено две основные группы
мутантов (рис. 5.4):

•	мутанты, нечувствительные к этилену, у проростков которых от-
сутствовал или был слабо выражен тройной ответ на этилен —
это группы мутантов ein (ethylene insensitive'), ers и etr (ethylene
resistant): etrJ, etr2, ersl, ers2, ein4 являются доминантными му-
тациями; ein2, ein3, ein5 — рецессивными;

•	мутанты с усилением тройного ответа на этилен, в том числе ре-
цессивный мутант Ctrl (constitutive triple response), у которого
проявляется конститутивный тройной ответ даже при отсутствии
этилена.

Изучение эпистатическою взаимодействия перечисленных му-
таций позволило установить следующий порядок действия генов
в передаче сигнала при ответе на этилен:

1.	ETRI,2—» 2. CTR1 —►	3. EIN2->	4. EIN5->	5. EIN3

ERS1,2

EIN4

Основными компонентами пути передачи сигнала при ответе на
этилен (рис. 5.5) являются:

Е Рецепторы этилена: ETR1, ETR2, ERSI, ERS2 и EIN4.

2.	Компоненты MAP-киназного каскада: прогеинкиназы CTR1,
МКК9, МРКЗ и МРК6.

3.	Белок с неизвестной функцией E1N2.

4.	Транскрипционный фактор EIN3.

5.	Компоненты убиквитин-лигазного комплекса EBFJ и 2.

6,	5’-3’-экзорибонуклеаза E1N5.

7.	Транскрипционные факторы ERF.

Рецепция этилена

Рецепторы этилена были исторически первыми из охарактеризо-
ванных рецепторов к фитогормопам. У арабидопсис известно пять
рецепторов этилена: ETR1, ETR2, ERSI, ERS2 и E1N4. Это транс-
мембранные белки, относящиеся к группе сенсорных His-киназ дву-
компонентной сигнальной системы. Они локализованы в клетке на
мембранах эндоплазматической сети и аппарата Гольджи. Рецепто-
ры присутствуют на мембранах в виде как гомо-, так и гетерсдиме-
ВОЗДУХ

ЭТИЛЕН

Рис. 5.4. Изменение тройного о тега на этилен у мутантов арабидопсис с нарушениями
работы различных компонентов пути передачи этиленового сигнала (модифицировано
по В nder et al.. 2007)

Col 0 — прорсстки дикого типа. Мутанты с пониженной чувствительностью к этилену
etr!, etr2, ers1, ers2 ein4 (доминантные), eir2, ein3, ein5 (рецессивные) Мутанты с уси-
лением тройного ответа: ebtl и eb(2 (рецессивные). Myrair с конститутивным тройным
ответом при отсутствии этилена — crt1 (рецессивный)

ров, после связывания этилена происходит автофосфорилирование
С-конпевых киназных доменов по консервативному остатку His. По-
казано, что кофактором этиленовых рецепторов является ион меди
Си2+, который непосредственно взаимодействует с молекулами ре-
цепторов и способствует связыванию этилена.
Эшлен-регулируемые
гены

Рис. 5.5 Современная модель передачи сигнала ери ответе на этилен
(модифицировано по Kendrick and Chang, 2008)

Рецепция этилена осуществляется на поверхности эндоплазматической сети (ЭР)
и аппарата Гольджи (АГ) сенсорными His-киназами, относящимися к двум разным под-
семействам. Кофакюрами рецепторов являются ионы Си2*, белки RAM и RГН. МАРККК-
киназа CTR1 негативно регулирует передачу сигнала этилена, репрессируя работу белка
EIN2, транскрипционных факторов EIN3/EIL1 и компонентов МАР киназного каскада
МКК9 и МРКЗ/6 При отсутствии этилена CTR1 связана с рецепторами и активна, при
связывании этилена осуществляется диссоциация и инактивация OTR'. за счет связыва
ния фосфатидных кислот (РА), а рецепторы подвергаются убиквитин-зависимому про-
теолизу. Белок EIN2 и MAP-киназный каскад активируют транскрипционные факторы
EIN3/EIL1. EIN3/EIL1 запускает экспрессию генаЕЯП, который кодирует транскрипци-
онный фактор, контролирующий экспрессию эгилен-регулируемых генов. Белки EBF
опосредуют убиквитин-зависимый протеолиз EIN3/EIL1. Экзорибонуклеаза EIR5/XFI\i
негативно регулирует экспрессию генов EBF

ядро
В состав молекул этиленовых рецепторов входят трансмембран-
ный этилен-связывающий домен, GAF-домен, необходимый для об-
разования димеров, и гистидин-киназный домен, функциями которо-
го является автофосфорилирование и взаимодействие со следующим
компонентом пути передачи сигнала — белком CTRL У рецепторов
ETR1, ETR2 и E1N4 также имеется воспринимающий домен, сход-
ный с таковым у цитокининовых рецепторов АНК У этиленовых ре-
цепторов передающий домен, по-видимому, не важен для функции,
так как клеточный ответ на этилен, в отличие от ответа на цитоки-
нины, не связан с передачей фосфатных групп. Тем не менее было
показано, что рецептор ETRI может передавать фосфатные группы
на гистидин-фосфопереносящие белки АНР, которые являются ком-
понентом передачи сигнала цитокининов. Возможно, функциональ-
ный воспринимающий домен у некоторых этиленовых рецепторов
важен для осуществления связи между системами передачи сигнала
этилена и цитокининов.

Рецепторы этилена делятся на два подсемейства в зависимо-
сти от строения С-концевого киназного домена. К подсемейству 1
относятся белки ETR1 и ERS1, для которых характерно наличие
в С концевом домене консервативного остатка His, по которому про-
исходит автофосфорилирование рецепторов. В настоящее время не-
понятно. важен ли этот остаток His для функции этиленовых рецеп-
торов подсемейства 1. С одной стороны, известно, что у двойного
мутанта etrl ersl нормальный фенотип восстанавливается только
при трансформации генами рецепторов подсемейства 1, но не под-
семейства 2. Тем нс менее восстановление нормального фенотипа
у этого мутанта происходит даже при трансформации дефектным
вариантом гена ETR1 с делецией триплета, кодирующего консерва-
тивный остаток His.

К подсемейству 2 этиленовых рецепторов относятся белки ETR2,
ERS2 и E1N4, которые отличаются от рецепторов подсемейства 1
отсутствием консервативного остатка His в С-концевом домене.
Установлено, что автофосфорилирование рецепторов подсемейства
2 при связывании этилена происходит по консервативному остатку
Ser. Более того, гистидин-киназа ERS1 из подсемейства 1 этилено-
вых рецепторов содержит в С-концевом домене оба консервативных
остатка (His и Ser) и может осуществлять автофосфорилирование по
любому из них.

Единичные мутации по любому из генов этиленовых рецепторов
не приводят к существенному изменению реакции на этилен, так
как функции рецепторов, по-видимому, перекрываются. При этом
у множественных мутантов с потерей функций нескольких этиле-
новых рецепторов, например etrl etr2 ein4, наблюдается конститу-
тивный тройной ответ проростков даже в отсутствии этилена. Такой
фенотип множественных мутантов свидетельствует о том, что эти-
леновые рецепторы, в отличие от прочих рецепторов к фи го гор-
монам, являются негативными регуляторами ответа на этилен.
Действительно, этиленовые рецепторы активны при отсутствии эти-
лена; связывание молекулы этилена и фосфорилирование являются
сигналом деградации рецептора 268-протеасомой.

Итак, несмотря на сходство организации рецепторов этилена
и цитокинина, а также перекрывание их сигнальных путей, в пере-
даче сигнала этих фигогормонов есть три существенных различия.
1. Клеточный отвез на этилен не связан с передачей фосфатных
групп от рецепторов к последующим компонентам, тогда как от-
вет на цитокинин организован по принципу фосфореле.

2.	Рецепторы этилена негативно регулируют нижележащие компо-
ненты пути передачи сигнала, в то время как при рецепции цито-
кининов имеет место активация нижележащих компонентов

3.	Рецепторы этилена инактивируются и деградируют при связыва-
нии лиганда, тогда как рецепция цитокинина приводит к актива-
ции рецепторов.

Основной функцией рецепторов этилена является взаимодей-
ствие со следующим звеном пути передачи сигнала — Ser/Thr про-
теинкиназой CTR1, которая является негативным регулятором всех
нижележащих компонентов пути передачи этиленового сигнала.
Взаимодействие осуществляется с помощью С-концевых доменов
рецепторов. В отсутствии этилена С-концевые домены рецепторов
взаимодействуют с белком CTRL, что приводит к запуску его киназ-
ной активности и репрессии нижележащих компонентов пути пере-
дачи сигнала. При связывании этилена рецепторы деградируют, что
приводит к высвобождению и инактивации CTR1, вследствие чего
активируется путь передачи сигнала этилена.

Помимо рецепторов, для связывания этилена важны еще два бел-
ка, усиливающие лиганд-связываюшую активность этиленовых ре-
цепторов. Первый из них — металлотранснортер RAN1 — белок,
локализованный в мембране аппарата Гольджи, который осущест-
вляет доставку ионов меди к этиленовым рецепторам. Мутант с по-
терей функции rani (responsive to antagonist /) имеет пониженную
чувствительность к этилену. Еще один фактор, влияющий на рецеп-
цию этилена — недавно обнаруженный трансмембранный белок
с неизвестной функцией RTE1 (REVERSION ТО ETHYLENE SEN-
SITIVITY), который также локализован в аппарате Гольджи и пози-
тивно регулирует передачу этиленового сигнала, опосредованную
рецептором ETR’.

Прстеиикиназа CTR1

Следующим звеном передачи сигнала при ответе на этилен явля-
ется белок CTR1, локализованный в эндоплазматической сети. Эго
Ser/Thr протеинкиназа, гомологичная МАРККК-киназам семейства
Raf. При этом у белка CTR1 имеются два серьезных функциональ-
ных отличия от прочих МАРККК:

•	белок CTR1 инактивирует нижележащие компоненты МАР
киназною каскада (МАРКК и МАРК), тогда как прочие
МАРККК — активируют;

•	взаимодействие белка CTR1 с фосфатидными кислотами приво-
дит к репрессии ею каталитической активности, тогда как Raf-
киназы активируются фосфатидными кислотами

В геноме арабидопсис имеется один ген CTR1, в геномах некою
рых других видов растений функционально идентичные белки CTR
кодируются несколькими генами. Экспрессия генов CTR1 позитивно
регулируется этиленом и АСС.

В сост ав молекулы белка CTR1 входит N-концевой домен, необхо-
димый для взаимодействия с этиленовыми рецепторами, и С-конпевой
каталитический домен. Мутант с потерей функции Ctrl демонстрирует
конститутивный тройной от вег проростков при отсутствии этилена —
таким образом, белок CTR1 также является негативным регулято-
ром ответа на этилен и инактивирует нижележащие компоненты пути
передачи сигнала. При отсутствии этилена N-концевой домен белка
CTR1 связан с С-концсвыми доменами этиленовых рецепторов; это
взаимодействие необходимо для активации С-конце во го прстеинкиназ-
ною домена CTR1. При связывании этилена происходит диссоциация
CTR1 от рецепторов, что приводит к инактивации каталитического до-
мена CTR1 и снятию негативной регуляции пути передачи сигнала.

Вероятно, важную роль в инактивации свободного белка CTR1
играют фосфатидные кислоты. Показано, что фосфатидные кислоты
связываются с киназным доменом CTR 1 in vitro, блокируя его ката-
литическую активность. Выработка фосфатидных кислот в тканях
растений повышается при биотических и абиотических стрессах,
к01да активация ответа на этилен становится наиболее актуальной.

Мишенями киназы CTR1 являются:

1.	EIN2 — белок с неизвестной функцией, итрающий ключевую
роль в передаче сигнала при ответе на этилен.
Рис. 5.6. Контроль стабильности транскрипционных факторов EIN3/EIL1
(модифицировано по Binder er al, 2007)

При отсутствии этилена киназа OTR 1 фосфорилирует транскрипционные факторы
EIN3/EI11 по Thr 592, что активирует их взаимодействие с белками EBF и убиквитин-
зависимый гротеолиз. При связывании этилена с рецептооами CTR1 инактивируися,
что приводит к активации МАР-кипаз МКК9 и МРКЗ/6 МКК9 и МРКЗ/0 фосфорилируют
EIN3/EIL1 пс Thr-174, что приводит к их стабилизации

2.	Этнлсн-зависимые транскрипционные факторы EIN3/EIL1. Ак-
тивируя гипотетические нижележащие прозеинкиназы, CTR1
запускает фосфорилирование этих белков по консервативному
остатку Thr-592, что приводит к их инактивации (рис. 5.6).

3.	Нижележащие компоненты MAP-киназного каскада. У арабидоп-
сис к ним относятся протеинкиназы МКК9 (МАРКИ) и МРКЗ/6
(МАРК). Роль МАР-кипазного каскада в пути передачи этилено-
вого сигнала связана с активацией работы EIN2 (механизм неиз-
вестен) и стабилизацией белков E1N3 путем фосфорилирования
по консервативному остатку Thr-174 (рис. 5.6).

Белбк с неизвестной функцией L-IN2

Несмотря на то что механизм его работы неизвестен, белок EIN2
является необходимым звеном пути передачи сигнала при ответе на
этилен и осуществляет связь между протеинкиназой CTR1 и транс-
крипционными факторами EIN3/EIL. Потеря функции этого белка
у мутанта арабидопсис ein2 приводит к полной потере чувствитель-
ности к этилену, что доказывает его абсолютную необходимость для
реализации ответа на этилен. Белок EIN2 у всех изученных видов
растений кодируется одним геном — таким образом, это наиболее
«узкое место» в пути передачи этиленового сигнала. В состав моле-
кулы белка E1N2 входят:

1.	N-концевой трансмембранный домен, гомологичныйМ-концсвому
домену семейст ва металлотранспортерив Nramp. При этом было
показано, что N-концевой домен белка EIN2 не способен к транс-
порту катионов.

2.	С-концевой цитоплазматический домен с неизвестной функцией,
который абсолютно необходим для передачи этиленового сигна-
ла. Сверхэкспрессия части гена EEN2, кодирующей С-концевой
домен соответствующего белка, у трансгенных проростков при-
водит к развитию конститутивного тройного ответа в отсутствие
этилена. При этом сверхэкспрессия части гена EIN2, кодирующей
N-концевой домен, не вызывает фенотипических изменений.

Транскрипционные факторы EIN3 и EIL1

Этилен-зависимый транскрипционный фактор EIN3, а также вы-
деленный по гомологии с ним ядерный белок EIL1 (EIN3-Like 1) яв-
ляются позитивными регуляторами пути передачи этиленового сиг-
нала и дейст вуют ниже белка EIN2. У мутантов ein3 eill с потерей
функции обоих генов отсутствуют фенотипические реакции на эти-
лен и не экспрессируются этилен-регулируемые гены; в го же время
сверхэкспрессия этих генов дает конститутивный этиленовый ответ.
В настоящее время изучены два гена, экспрессия которых напрямую
активируется транскрипционными факторами EIN3/EIL1:

1.	Ген ERF1, кодирующий транскрипционный фактор ERF1 (Ethyl-
ene Response Factor), который, в свою очередь, контролирует экс-
прессию различных этилен-регулируемых генов.

2.	Гены EBF1 и EBF2, кодирующие F-бокс-содержащие белки, по-
средством которых осуществляется протеасомная деградация
транскрипционных факторов EIN3/EIL1.

3.	Гены, участвующие в контроле старения и программируемой кле-
точной смерти (см. ниже).

Транскрипционные факторы EIN3/EIL1 — короткоживущие бел-
ки (время полужизни — 30 мин). Один из основных механизмов ре-
гуляции интенсивности ответа на этилен — контроль стабильности
E1N3/EIL1 белков (рис. 5.6) Этот процесс зависит от активности
вышележащих компонентов пути передачи этиленового сигнала —
EIN2, CTR1, МКК9 и МРКЗ/6.

F-бокс содержащие белки EBF

Белки EIN3/EIL1 в ядре подвергаются протеасомо-зависимой
деградации, которая индуцируется при связывании их с убиквитин-
лигазным комплексом SCF (рис. 5.6). Необходимыми компонентами
комплекса SCF являются F-бокс-содержащие белки EBF1 и FBF2
(EIN3-BindLng F-box), которые присоединяют транскрипционные
факторы E1N3/EIL1 к убиквитин-лигазному комплексу. Связыва-
ние EIN3/EIL1 с EBF активируется при фосфорилировании молекул
E1N3/EIL1 по консервативному остатку треонина ТЬг-592, которое
осуществляет киназа CTR1. Таким образом, один из путей негатив-
ной регуляции ответа на этилен протеинкиназой CTR1 связан с ак-
тивацией убиквитин-зависимого протеолиза транскрипционных
факторов EIN3/EIL1.

Противоположный процесс — стабилизация белков E1N3/EIL1
(рис. 5.6), которая происходит при повышении концентрации эти-
лена и зависит от фосфорилирования по другому консервативному
остатку треонина — Thr-174. Фосфорилирование по Thr-174 осу-
ществляется компонентами МАР-киназного каскада - киназами
МКК9 и МРКЗ/6. Активность МКК9 и МРКЗ/6 негативно регулиру-
ется МАРККК-киназой CTR1 —таким образом, еще один механизм
CTR1-зависимой репрессии передачи этиленового сигнала связан
со снижением стабильности E1N3/EIL1 белков через инактивацию
МАР-киназного каскада.

Интересно, что этилен стимулирует накопление белков EIN3/EIL1
даже у нулевых мутантов Ctrl — следовательно, кроме перечисленных
вариантов, возможен CTR1 -независимый путь регуляции их стабиль-
ности, который может быть связан с активностью белка EIN2.

5’-3’-зкзорибснуклеаза EIN5/XRN4

Продукт гена EIN5 арабидопсис, потеря функции которого при-
водит к нечувствительности к этилену, был идентифицирован как
5’-3’-экзорибонуклеаза XRN4. Установлено, что важную роль в ре-
гуляции интенсивности ответа на этилен играет контроль уровня
транскриптов генов EBF. Экзорибонуклеаза EIN5/XRN4 участвует
в деградации транскриптов ЕВР'1/2 и таким образом позитивно регу-
лирует передачу этиленового сигнала. У мутанта с потерей функции
ein5 накапливаются белки EBF, что приводит к снижению уровня
белка EIN3 и репрессии ответа на этилен. Механизмы, контролиру-
ющие активность нуклеазы E1N5/XR1N4 в настоящее время не вы-
яснены.

Транскрипционные фгкторы ERF

Одной из известных в настоящее время мишеней транскрипци-
онных факторов E1N3/EIL1, от стабильности которых зависит ин-
тенсивность ответа на этилен, является ген ERF1 (ETHYLENE RE-
SPONSE FACTOR). ERF1 — АР2-подобный транскрипционный
фактор, который контролирует экспрессию этилен-регулируемых
генов, связываясь со специфической последовательностью ERE
(Ethylene Responsive Element) в их промоторах. Транскрипционный
фактор ERF1 относится к небольшому (у арабидопсис выявлено
5 ERF1-подобных белков) семейству белков ERF/EREBPS (ERE-
binding proteins), которые, по-видимому, выполняют аналогичные
функции. ERF1-подобные этилен-зависимые транскрипционные
факторы обнаружены у всех изученных видов растений.

Основными мишенями транскрипционных факторов ERF явля-
ются гены, участвующие в ответе на биотический стресс (пораже-
ние различными патогенами), а также на разные виды абиотических
стрессов: поранение, высокую температуру, высыхание и т. д. Кроме
того, транскрипционные факторы ERF позитивно регулируют экс-
прессию генов, участвующих в контроле созревания плодов.

5.3. Функции этилена в развитии растений

Основными функциями этилена являются контроль развития
проростка на ранних этапах (тройной ответ), участие в защите рас-
тений от биотического и абиотического стресса, контроль старе-
ния и программируемой клеточной смерчи, регуляция созревания
плодов, а также опадение плодов, листьев и цветков. Большинство
этих функций связано с регуляцией экспрессии генов, играющих
центральную роль в обеспечении вышеперечисленных процессов,
этилен-зависимыми транскрипционными факторами ERF.

Развитие прорсстка

Функция этилена в раннем развитии проростка связана с «трой-
ным ответом», который развивается у проростка в темноте. Наиболее
важной частью тройного ответа является образование апикального
крючка, который необходим для защиты побеговой апикальной ме-
ристемы от механических повреждений о почву. Как и все ростовые
движения растений, развитие апикального крючка связано с измене-
нием направления роста клеток растяжением — в данном случае это
изменение роста в направлении, перпендикулярном силе тяжести.
Любые изменения направления роста клеток связаны с изменением
ориентации целлюлозных микрофибрилл клеточной стенки, которая,
в свою очередь, зависит от изменения ориентации микротрубочек
цитоскелета. При развитии апикального крючка происходит измене-
ние расположения значительного количества целлюлозных микро-
фибрилл с поперечного на продольное. Это связано с изменением
положения поперечно расположенных микротрубочек цитоскелета,
которое, впрочем, не включает в себя их деполимеризацию. Показа-
но, что такое изменение ориентации микротрубочек и целлюлозных
фибрилл начинается вскоре после обработки растения этиленом.
Механизмы этого явления тем не менее неизвестны.

Защита растений о г абиотического стресса

Важнейшая роль этилена в контроле защиты растений от стрес-
са известна достаточно давно. Биосинтез этилена резко усиливается
в ответ на разные виды стресса; мутанты с пониженной чувствитель-
ностью к этилену имеют резко пониженную жизнеспособность, тогда
как мутанты и трансгенные растения со сверхпродукцией этилена ха-
рактеризуются повышенной стрессоустойчивост ью (рис. 5.7 А).

Значительная часть генов, контролирующих ответ растений на
стресс, регулируется этилеп-зависимыми транскрипционными фак-
торами ERF. Несмотря на то что в исследованиях последних лет по-
казано повышение уровней экспрессии большого количества генов
в ответ на этилен и разные виды абиотического стресса, о точных
функциях этих генов на сегодняшний день известно немного.

Один из примеров ERF-регулируемых генов, участвующих в за-
щите растений от стресса, — гены глутатион-8-трансфераз (GST).
Глутатиоп-Б-трансфсразы — обширная группа многофункциональ-
ных белков, выполняющих как каталитические, так и неэнзимаги-
ческие функции в защите растений. Например, GST1 катализируют
расщепление органических гидоонсроксидов, а также участвуют
в расщеплении и детоксикации ряда гербицидов. Ген GST1 гвоздики
был первым растительным геном, для которого продемонстрирова-
на этилен-зависимая регуляция экспрессии за счет взаимодействия
ERF1-подобного транскрипционного фактора с последовательно-
стью ERE в его промоторе.

Помимо консервативных последовательностей ERE, транс-
крипционные факторы ERF могут взаимодействовать также с по-
следовазельностями DRE/CRT (Dehydration Responsive Element/
Контроль

CbPFl-W

CaPFl-\f>

А

Высокая
темперап/ра
(45“ С, 8ч)

высыхание
(400 гпМ маннитола,
2 недели)

°ис. 5.7. Роль зтилен-зависимых транскрипционных факторов ERF в обеспечении
устойчивости растений к абиотическим (А) и биотическим (Б) стрессам

А — реакция растений перца (Capsicum annuum) на повышенную температуру (45 °C
в течение 8 ч) — правая колонка; и высыхание (культивация на среде, содержащей 400
mWI маннитола в течение 2 недель) — левея колонка. Верхний ряд — растения дикого
тиса, средний и нижний ряды — две разные линии трансгенных растений с повышен-
ным уровнем экспрессии ERF1-подобного гена СаРИ (по Youm et al., 2008).

Б — реакция растений табака (Nicotiana tabacumj чэ поражение патогенным грибом
Ralstonia solanacearum Слева и вверху — растение дикого типа общий вид и фрагмент
листа; справа и внизу — грансгенноз растение с повышенным уровнем экспрессии
ERF1 -подобного гена TSRF общий вид и Фрагмент листа (по Zhang et al., 2004)

Cold-Repeat Element), которые присутствуют в промоторах многих
стресс-индуцируемых генов. Мотивы DRE/CRT ранее были иден-
тифицированы как последовательности, необходимые для взаимо-
действия с транскрипционными факторами DREB (Dehydratation
Responsive Elements Binding factors) — еще одной группой АР2-
подобных транскрипционных факторов, но структуре близких к ERF
и принимающих участие в защите от стресса.

К идентифицированным генам, которые содержат в промоторах
последовательности DRE/CRT и являются мишенями транскрипци-
онных факторов DREB и ERF, относятся гены, кодирующие белки
LEA (Late Embryogenesis Abundant) — семейство маленьких гидро-
фильных белков, играющих важную, но до сих пор непонятную функ-
цию в защите растений от высыхания. Их экспрессия в наибольшей
степени зависит от транскрипционных факторов DREB, которые ак-
тивируются при изменении водного баланса в тканях. Помимо DRE/
CRT, в г.ромоторах LEA-генов имеются последовательности ABRE
для связывания АБК-зависимых транскрипционных факторов ABF.
Регуляция экспрессии ££4-генов с помощью АБК крайне важна для
предохранения зародыша от высыхания при индукции периода по-
коя семян (подробнее см. главу «Абсцизовая кислота»).

Защита растений от патогенов

Жизнь растения проходит в постоянной борьбе с патогенами
бактериями, вирусами, грибами, нематодами, а также с раститель-
ноядными насекомыми. В эволюции растений было выработано не-
сколько способов защиты от патогенов, которые включают в себя как
вырабатывание устойчивости, так и уничтожение патогена. При за-
ражении происходит распознавание патогена растением, что приво-
дит к активации специальных сигнальных путей и синтезу большого
количества защитных молекул.

Один из самых эффект явных способов защиты, возникающих при
первичном проникновении патогена в растительный организм, —
реакция сверхчувствительности (HR, от Hypersensitive Response),
ассоциированная с образованием в месте инвазии некрозов, ограни-
чивающих распространение патогена. Наиболее важным событием
в развитии HR является связывание определенных белков патоге-
на (Avr белков, от Avirulence) R-белками растения (от Resistance).
R белки представляют собой рецепторные Ser/Thr протеинкиназы,
которые фосфорилируют и активируют компоненты сигнального
пути, приводящего к развитию устойчивости. Защита, опосредован-
ная R-белками, называется также защитой «ген на ген» (gene-for-
gene resistance). Она не является абсолютной — хотя бы потому, что
в эволюции патогенов постоянно происходит изменение Avr генов,
в результате чего появляются Avr-белки, не подлежащие распозна-
ванию R-белками.

При развитии реакции HR активируется синтез сигнальных мо-
лекул, вызывающих системную устойчивость растений к патоге-
нам. Одним из таких сигналов является этилен (рис. 5.8). Биосинтез
этилена усиливается при разного рода механических повреждениях
растения, в том числе при повреждениях, вызванных патогенами,
это одна из наиболее ранних реакций растения на проникновение
патогена. В дальнейшем его активный синтез продолжается в тка-
нях вокруг некротических очагов, возникающих при развитии HR.
Этилен принимает непосредственное участие в образовании некро-
зов при HR за счет стимуляции программируемой клеточной смерти
(подробнее см. ниже), а также в развитии системной устойчивости
растений к патогенам.
Рис. 5.8. Рель этилена в защите растений от патогенов и растительноядных насекомых
Поранение и P-Avr реакция индуцируют биосинтез этилена. Э^илен-зависимый *рагс-
крипционный фактср EIH3 индуцирует экспрессию генов, участвующих в прсгоам’ии-
руемой клеточной смерти (ПКС) Этилск-зависимые транскрипционные факторы ERF
активируют экспрессию генов PR-белков

Помимо локального ответа на патоген, в растительном организме
активируются механизмы системного иммунитета, которые могут
предохранить растение от последующих атак патогена. Это явление
называется системной приобретенной устойчивостью (SAR, от Sys-
temic Acquired Resistance). Развитие SAR связано с синтезом боль-
шою количества сигнальных молекул, основной из которых явля-
ется салициловая кислота — «гормон иммунитета», который и сам
по себе является антимикробным агентом, а также индуцирует экс-
прессию генов, связанных с развитием долговременного иммуните-
та. Роль в передаче сигналов при развитии SAR также играют этилен
и жасмонагы. Итогом развития SAR является активация экспрессии
генов PR-бслкон (Pathogenesis-Related proteins). PR белки сборная
группа белков, которые являются необходимой частью системной
приобретенной устойчивости растений. Экспрессия генов PR инду-
цируется при поражении растения патогенами, а также при поране-
нии. Точные функции установлены не для всех PR-белков, зачастую
они связаны с физическим уничтожением патогена (например, хити-
назы и J3- 1,3-глюканазы, разрушающие клеточную стенку патоген-
ных грибов). В промоторах генов большинства PR-белков имеются
последовательности для регуляции их экспрессии этиленом (ERE
последовательности), АБК, жасмонатами и салициловой кислотой.

Помимо SAR, у растений имеется еще один вид системкой защи-
ты — ISR (Induced Systemic Resistance), который индуцируется в от-
вес на непатогенные микроорганизмы — например, на ризосферные
бактерии; в дальнейшем активация этой системы дает защиту и от
патогенных бактерий Механизмы ISR отличаются от механизмов
SAR — в частности, реакция ISR не связана с повышением концен-
трации салициловой кислоты и синтезом PR-белков. Основными
сигнальными молекулами 1SR являются этилен и жасмонаты. С по-
мощью метода microarray было показано, что при развитии реакции
ISR этилен запускает экспрессию нескольких десятков генов — в то
же время точные функции ни одного из них в настоящее время не
установлены. Одной из характеристик ISR является синтез белков
дефенсинов — цистеин-богатых некаталитических белков с непонят-
ной функцией, которые повышают устойчивость растений к патоге-
нам, а также абиотическим стрессам. Экспрессия генов дефенсинов
напрямую регулируется жасмонатами. Вместе с тем многочислен-
ные опыты показали, что этилен действует в пути ISR раньше жас-
мокатов: в частности, обработка растений жасмонатами не приводит
к активации ISR у мутантов по рецепции и передаче сигнала этиле-
на — например, etrl и ein2. Таким образом, одной из функций этиле-
на в ISR является активация синтеза дефенсиноз через позитивную
регуляцию ответа на жасмонаты.

Созревание плодов

Созревание плодов — генетически обусловленный процесс,
в контроле которого задействовано большое количество генов. Давно
известно, что этилен играет важную роль в созревании плодов у рас-
тений с мягкими съедобными плодами (рис 5.9). Этилен-зависимая
регуляция созревания плодов была подробно изучена на томате:
у этого объекта практически все гены, участвующие в контроле от-
вета на этилен, были выявлены по замедленному созреванию плодов
у мутантов: например, ген этиленового рецептора NRj'LeETR4 (NEV-
ER RIPE) и его кофактора — белка GRJLeRTEl (GREEN RIPE).

Уровень биосинтеза этилена закономерно повышается в созрева-
ющих плодах за счет усиления экспрессии генов ACS. Тем не менее
о вышележащих путях контроля биосинтеза этилена при созревании
известно не много. Одним из центральных регуляторов созревания
плодов томата может быть ген RIN (RIPENING INHIBITOR), коди-
Рис. 5 9 Функции этилена в контроле старения и опадения листьев и .дозревания плодов

Ьиссичтез этилена индуцируется стрессом, механическими повреждениями а также
другими сигналами в зависимости от стадии развития (механизмы неизвестны). При
созревании плодов биосинтез этилена регулируется транскрипционным фактором Rfl\L
Старение листьев: этилен зависимый транскрипционный фаюор EIN3 авизирует экспрессию
гечсв протеолитических ферментсв, генов WRKY, геное NADPI--оксидаз, участвующих в про-
дукции ROS Старение листьев и созревание плодов: этилен-зависимые транскрип доенные
факторы LRF актив ируют экспрессию генов иелгюлаз и пектиназ, которые ослабляют клеточ-
ные стет тки отрелителы юго слоя и ст эмулируют опадет ие, а также размят чают ткани г пода

рующий транскрипционный фактор с MADS-боксом. У мутантов rin
с посерей функции этого гена не наблюдается активации биосинтеза
этилена в плодах, что приводит к замедлению их созревания.

Основная функция этилена в созревании плодов заключается
в позитивной регуляции экспрессии генов, кодирующих ферменты
гидролиза полисахаридов. Гидролиз полисахаридов (крахмала, а
также целлюлозы, пектина и гемицеллюлозы клеточных стенок) яв-
ляется одним из ключевых событий в созревании плодов и приводит
к размягчению их тканей при созревании. Среди этилен-зависимых
генов томата, экспрессия которых контролируется ERF1-подобными
транскрипционными факторами, — ген ЕЗ, продуктом которого яв-
ляется пектиназа, а также гены LeEXP, кодирующие экспансины —
ферменты, которые разрушают водородные связи между целлюлоз-
ными микрофибриллами клеточной стенки.
Являясь газообразным гормоном, эгилсн может свободно диффун-
дировать между плодами, вызывая «цепную реакцию» их созревания.
Биосинтез этилена резко повышается при механических повреждени-
ях и поражении патогенами — именно вследствие этого одно побитое
или гнилое яблоко может испортить весь мешок.

Старение и программируемая клеточная смерть

Программируемая клеточная смерть (ПКС) — генетически обу-
словленная гибель клеток, которая играет большую роль в развитии
всех многоклеточных эукариог. У высших растений выделяют три
основных вида ПКС: онтогенетическая ПКС, необходимая для раз-
вития органов растения (с помощью этого механизма, например, воз-
никают вырезки на листьях монстеры); пэтоген-ипдуцируемая ПКС
(этот процесс приводит к развитию некрозов в месте проникновения
патогена при реакции HR) и стресс-индунируемая ПКС. которая ин-
дуцируется абиотическими стрессами.

Генетически обусловленное старение органов растения относят
к медленно развивающейся онтогенетической ПКС, кроме того,
процессы старения усиливаются при различных стрессах. Наибо-
лее изучены механизмы старения листа (рис. 5.9). При старении ли-
стьев прекращается экспрессия генов, контролирующих фотосинтез,
и усиливается экспрессия генов группы SAG (Senescence-Associated
Genes) — к этой группе относятся, в частности, гены эндопротеаз,
участвующих в разрушении белков, РНКаз, участвующих в деграда-
ции мРНК, а также гены, кодирующие компоненты системы убикви-
тинирования. Также старение листьев сопровождается повышением
концентрации веществ группы ROS, которые окисляют белки и вы-
зывают повреждения различных органелл (в частности, накопление
ROS играет центральную роль в разрушении хлороплас гов).

Этилен является индуктором старения органов растения. Извест-
но, что у мутантов по биосинтезу или передаче сигнала этилена уве-
личена средняя продолжительность жизни листьев, напротив, повы-
шение концентрации этилена ускоряет процессы старения. С этим
же связано ускорение процессов старения в стрессовых условиях,
при которых повышается уровень биосинтеза этилена. Роль этилена
как регулятора процессов старения связана с этилен-зависимым кон-
тролем экспрессии генов SAG. Антагонистами этилена в контроле
старения являются цитокинины, их функция в этом процессе связа-
на с инактивацией ROS (подробнее см. главу «Цитокинины»),

Наиболее известными маркерами старения и ПКС у растений яв-
ляются капсазы группа эндопроаеаз, расщепляющих разнообраз-
ные белки по остаткам аспарагиновой кислоты. В норме эти белки
находятся в центральной вакуоли, при индукции ПКС вакуоль дегра-
дирует, что приводит к выходу капсаз и других литических фермен-
тов в цитоплазму. Значительная часть капсаз в вакуоли находится
в неактивной форме, одним из ранних событий ПКС является акти-
вация капсаз путем автокатализа. Эта дополнительная каталитиче-
ская активность капсаз делает их основными регуляторами актив-
ности других вакуолярных протеаз и центральными регуляторами
ПКС у растений Экспрессия генов капсаз позитивно регулируется
этиленом и зависит от активности транскрипционных факторов
EIN3/EIL.

Непосредственными регуляторами экспрессии генов SAG также
являются транскрипционные факторы WRKY — специфичная для
растений группа транскрипционных факторов, которые играют роль
в контроле экспрессии генов, связанных главным образом с ответом
на стресс. Экспрессия генов WRKY усиливается в ответ на разные
виды абиотических стрессов и регулируется этиленом и АБК.

Ппгдение листьев, цветков и плодов

Помимо процессов ПКС, при старении органов растения активи-
зируются процессы, приводящие к их отделению от растительного
организма. Этилен называют «гормоном листопада», так как одной
из его функций является контроль сезонного опадения листьев, а
также нсопыпенных цветков и созревших плодов. Мутанты по био-
синтезу и передаче сигнала этилена не способны к сезонному опа-
дению листьев.

Для опадения необходимо формирование отделительного слоя
клеток в черешке (он формируется заранее, при морфогенезе соот-
ветствующего органа) и в дальнейшем ослабление клеточных сте-
нок у клеток отделительного слоя (это этилен-зависимый процесс).
Ослабление клеточных стенок зависит от активности ряда фермен-
тов, таких как целлюлазы и полигалактуроназы. Экспрессия генов
этих гидролитических ферментов стимулируется этиленом и зави-
сит от транскрипционных факторов ERF (рис. 5.9).

Антагонистами этилена в контроле опадения листьев являются
ауксины. При нормальной жизнедеятельности листа в нем синтезиру-
ются ауксины, которые транспортируются через черешок в стебель.
В процессе старения синтез ауксинов в листовой пластинке прекра-
щается, что делает лист более чувствительным к этилену и стимули-
рует ослабление клеточных стенок в клетках отделительного слоя.
Действительно, при отделении листовых пластинок, которые явля-
ются основным местом синтеза ауксинов, черешки быстро опадают.
Тем не менее ауксины в высокой концентрации могут также быть
индукторами опадения листьев (например, сильный синтетический
ауксин 2,4,5-трихлорфеноксиуксусная кислота (2,4,5-Т) использо-
вался в качестве дефолианта во Вьетнамской войне). Это явление
связано с ауксин-зависимой стимуляцией биосинтеза этилена

Итак, этилен — один из самых маленьких и мобильных гормо-
нов растений, играющий ключевую роль в защите от разнообразных
стрессов, а также в процессах старения. Особенностью передачи
сигнала этилена является очень большое количество последователь-
но действующих компонентов, а также наличие нескольких репрес-
соров от вета.

Источники рисунков, использованных в главе

1.	Binder В. М., Walker J. М., Gagne J. М. et al. The Araoidopsis F.IN3 binding F Box
proteins EBF1 and EBF2 have distinct but overlapping roles in ethylene signaling И
Plant Cell. 2007. Vol. 19. P 509-523.

2.	Chae H. S., Kleber J. J., Eto Brute Role of ACS turnover in regulating ethylene
biosynthesis//Trends in Plant Science. 2005 Vol. 10. P. 291-296.

3.	Kendrick M. D., Chang C. Ethylene signaling, new levels of complexity and
regulation // Current Opinion in Plant Biology. 2008. Vol. 11. P 479-485.

4.	Taiz-L , Zeiger E. Plant Physiology, 3rd edition. 2003. Sinauer Associates. ISBN:
0878938230 P.690.

5	Youm J. W. Jeon J. H. Choi D. et al. Ectopic expression of pepper CaPFI in potato
enhances multiple stresses tolerance and delays initiation of in vitro tubcrization //
Planta. 2008. Vol.228 P.701-708.

6.	Zhang H., Zhang D., Chen J. et al. Tomato stress-responsive factor TSRFI interacts
with ethylene responsive element GCC box and regulates pathogen resistance
to Ralstonia solanacearum // Plant Molecular Biology. 2004. Vol. 55 P. 825-834.

Рекомендованная литература

I.	Chae H. S., KieberJ. J., Eto Brute Role of ACS turnover in regulating ethylene
biosynthesis //Trends in Plant Science. 2005. Vol. 10. P.291-296.

2.	Lin Z., Zhong S Grierson D. Recent advances in ethylene research // Experimental
Botany. 2009 Vol. 60. P.3311-3336.

3.	Stepanova A. N., Alonso J. M. Ethylene signaling and response: where different
regulatory modules meet // Current Opinion in Plant Biology. 2009. Vol. 12.

P. 548-555.

4.	Yoo S. D , Cho Y., Sheen J. Emerging connections in the ethylene signaling network
Trends in Plant Science. 2009. Vol. 14. P. 270-279.
Глава 6

Гиббереллины

Гиббереллины — группа фитогормонов дитерпеновой при-
роды, которые выполняют в растениях разнообразные функции,
связанные с контролем удлинения гипокотиля, прорастания се-
мян, зацветания и т. д. В контроле большинства морфогенетиче-
ских процессов гиббереллины действуют в одном направлении
с ауксинами и являются антагонистами цитокининов и абсцизо-
вой кислоты (АЬК).

Из тканей растений разных видов выделено более сотни раз-
личных гиббереллинов, но лишь небольшой процент из них яв-
ляется биологически активными фитогормонами^Наиболее рас-
пространенными активными гиббереллинами являются GAJ,
GA3, GA4 и GA7 (от Gibberellic Acid), более слабой активностью
обладают GA5 и GA6, которые тем не менее играют ключевую
роль в гиббереллин-зависимой индукции цветения у однодоль-
ных. Среди прочих гиббереллинов большинство является пред-
шественниками в биосинтезе активных гиббереллинов либо про-
дуктами их инактивации. '

История открытия гиббереллинов связана с изучением патоген-
ного гриба Gibberella fujikuroi, поражающего посевы риса и вы-
зывающего специфическое заболевание, при котором растения
имеют аномально удлиненные междоузлия и низкую продукцию
семян)В 1930-х годах японскими учеными были идентифициро-
ваны два дитерпеновых вещества, которые выделяются грибом,
они получили названия гиббереллин А и гиббереллин Вив даль-
нейшем оказались соответственно GA1 и GA3
6.Д. Биосинтез и инактивация гиббереллинов

Основное место синтеза гиббереллинов в растении листовые
примордии и молодые лисгьялБиосингез гиббереллинов очень
сложный многоэтапный процесс (рис. 6.1). Первым предшественни-
ком в пути биосинтеза гиббереллинов является вещество из клас-
са терпенов геранилгеранил-дифосфат (ГГДФ) — он же является
предшественником в биосинтезе АБК и хлорофилла. В результате
нескольких последовательных реакций из ГГДФ синтезируется пер-
вый гиббереллин — GA 12, из которого можно получить все осталь-
ные гиббереллины. Начальные стадии синтеза гиббереллинов про-
исходят в пластидах, конечные — в цитоплазме. Несмотря на очень
длинный и разветвленный путь биосинтеза гиббереллинов, в этом
процессе задействовано небольшое количество ферментов: напри-
мер, 12 последовательных реакций синтеза GA4 из GA12 катализи-
руют всего 6 ферментов, причем они же участвуют в синтезе других
активных гиббереллинов из GA12 Такая особенность достигается
за счет невысокой субстратной специфичности большинства фер-
ментов, участвующих в биосинтезе этих гормонов.

Можно выделить три основных этапа биосинтеза гиббереллинов.

1.	Синтез энт-каурена из ГГДФ — катализируется ферментами
группы терпен-синтаз (TPS): CPS (копалил-дифосфат-синтазой)
и KS (энт-каурен-синтазой). Эти же ферменты принимают уча-
стие в синтезе фитоалсксинов. Все ферменты TPS локализованы
в пластидах.

2.	Синтез GA12 из энт-каурена — катализируется ферментами
группы Р450-монооксигеназ: КО (энт-каурен-оксидазой) и КАО
(оксидазой энт-кауреновой кислоты). Этот этап биосинтеза гиб-
береллинов проходит в эндоплазматической сети.

3.	Синтез прочих гиббереллинов из GA12 происходит в цитозоле
и катализируется ферментами группы 2-оксоглютарат-зазисимых
диоксигеназ (2ODD). Среди ферментов 2ODD следует выделить
GA-20-оксидазы и GA-3-оксидазы, которые осуществляют синтез
биологически активных GA1, САЗ, GA4 и GA.7; а также GA-2-
оксидазы, катализирующие реакции инактивации гиббереллинов
(например, превращение активного GA1 в неактивный GA8).

У арабидопсис и риса каждый из ферментов, катализирующих пер-
вые этапы биосинтеза гиббереллинов, кодируется одним-двумя генами:
например, в геноме арабидопсис имеется по одному гену, кодирующему
ферменты CPS, KS и КО. Потеря функции этих генов у мутантов gal,
ga2 и ga3 соответственно приводит к серьезному сокращению уров-
ня гиббереллинов и развитию фенотипа, типичного для гиббереллин-
Рлс. 6.1. Схема биосинтеза гиббереллинов (по Yamaguchi, 2007?. Пояснения в тексте

дефицитных мутантов — это карлики с низкой плодовитостью, без
добавления экзогенных гиббереллинов их семена имеют низкую всхо-
жесть, а взрослые растения не формируют цветоноса. В то же время
ферменты 2ODD, действующие на последнем этапе биосинтеза гиббе-
реллиноц, кодируются большими мультигенными семействами, члены
которых обладают ткано- и органоспепифичсским характером экспрес-
сии, а также по-разному регулируются в зависимости от внешних усло-
вий и стадии онтогенеза. Мутации с потерей функции любого из этих
генов имеют более слабое фенотипическое проявление.

Основными путями инактивации гиббереллинов являются 2[3-
гидроксилирование с помощью GA-2-оксидаз; эпоксидирование
с помощью фермента из группы цитохром-Р450-монооксигеназ EUI
(Elongated Uppermost Internode, назван по фенотипу мутанта с по-
терей функции соответствующего гена) и метилирование с исполь-
зованием S-аденозил-метионина как донора метильных групп — эту
реакцию катализируют ферменты GAMT1 и GAMT2 (GA Methyl
Transferase). По-видимому, все эти пути инактивации имеют оди-
наково важное значение в регуляции пула активных гиббереллинов
в растении, так как потеря функции любого из перечисленных ге-
нов у мутантов eui, gamtl и gamt2. а также у трансгенных растений
с косупрессией генов GA2ox ведет к повышению концентрации ак-
тивных гиббереллинов в десятки раз. Кроме того, существует слабо
изученный путь инактивации гиббереллинов за счет образования
конъюгатов с глюкозой — GA-глюкозильных эфиров.

/ Пути регуляции уровня активных гиббереллинов в тканях растений

Последний этап биосинтеза — синтез активных гиббереллинов из
GA12 — играет ключевую роль в контроле уровня активных гиббе-
реллинов в растении. Действительно, повышение уровня экспрессии
гена GA2Gox у трансгенных растений арабидопсис вызывает резкое
повышение уровня гиббереллинов в тканях и серьезные фенотипиче-
ские изменения, тогда как сверхэкспрессия гена AtCPS приводит толь-
ко к накоплению энт- каурена, энт-кауреновой кислоты и GA12. В свя-
зи с этим основным способом регулирования концентрации активных
гиббереллинов в тканях растения является контроль экспрессии ге-
нов, кодирующих ферменты семейства 2ODD, разные представители
которого катализируют как реакции активации гиббереллинов (синтез
GAI, GA3, GA4 и GA7 из GA12, который катализируется GA-3- и GA-
20-оксидазами), так и реакции их инактивации (2Р-гидроксилирование
GAI, GA3, GA4 и GA7, которое катализируется GA-2-оксидазами).
В настоящее время изучены генетические механизмы регуляции уров-
ня экспрессии генов 2ODD в разных органах растений, а также в за-
висимости от определенных факторов внешней среды.

Регуляция конечным продуктом. Важную роль в поддержании
гомеостаза гиббереллинов играет регуляцир их биосинтеза конечным
продуктом. Например, у арабидопсис повышение концентрации актив-
184 & Раздел II. Регуляция развития растений фитогормонами
-----------------------------------------------•-----------

ных гиббереллинов вызывает репрессию транскрипции генов A tGA20ox
и AtGA3ox, а снижение их концентрации повышает уровень экспрессии
этих же генов. С другой стороны, активные гиббереллины позитивно
регулируют уровень экспрессии генов AtGA2ox, участвующих в их
инактивации. Точные механизмы, лежащие в основе регуляции экс-
прессии вышеперечисленных генов в зависимости от концентрации
активных гиббереллинов неизвестны, но показано, что в этот процесс
вовлечены компоненты пути передачи сигнала гиббереллинов: рецеп-
тор GID1, репрессоры гиббереллинового сигналинга DELLA-белки,
F-бокс-содержащий белок SLY/GID2 (подробнее см. ниже).

Кроме того, одним из компонентов поддержания гомеостаза гиббе-
реллинов может быть транскрипционный фактор семейства YARBY,
принимающий участие в контроле развития листа и вегетат ивных ме-
ристем (подробнее см. главу «Развитие листа»). Транскрипционные
факторы YABBY регулируют экспрессию генов 2ODD, напрямую
связываясь с их промоторами: показано, что они негативно регулиру-
ют экспрессию генов GA3ox, которые контролируют синтез активных
гиббереллинов, и позитивно регулируют экспрессию генов GA2ox,
контролирующих инактивацию гиббереллинов. В контроле экспрес-
сии генов 2ODD транскрипционные факторы YABBY действуют ниже
компонентов пути передачи сигнала гиббереллинов.

Регуляция другими гормонами. В контроле развития расте-
ний гиббереллины являются антагонистами цитокининов, эти-
лена и АЬК и действуют в одном направлении с ауксинами. Для
некоторых групп фитогормонов установлена способность регу-
лировать концентрацию активных гиббереллинов через контроль
экспрессии генов 2ODD. Например, ауксины, которые выполняют
сходные с гиббереллинами функции, могут регулировать концен-
трацию активных гиббереллинов путем позитивной регуляции
уровня экспрессии генов GA3ox и негативной регуляции экспрес-
сии генов GA2ox. Основную роль в ауксин-зависимом контроле
концентрации активных гиббереллинов играет транскрипцион-
ный фактор NPH4/ARF7, который регулирует экспрессию генов
2ODD, напрямую связываясь с их промоторами. Антагонистом
NFH4/ARF7 в этом процессе является транскрипционный репрес
сор MSG2/1AAJ9 (см. главу «Ауксины»),

Регуляция концентрации гиббереллинов в разных орг анах
растения. Помимо регуляции экспрессии генов 2ODD в зависимо-
сти от концентрации активных гиббереллинов и других гормонов,
существуют также механизмы регуляции их экспрессии в разных ор-
ганах растения.
Листовые	рр темнота

А	/примордии \	Б

GA

Корпус ПАМ

KNOX

Г	Т гк

гк	цк Т

Ga20ox

Ga2ox —| ГК

Нет прорастания

Прорастание

Рис. 6.2. Контроль биосинтеза гиббереллинов в разных органах растения -
роль в развитии (модифицировано по Yamaguchi, 2037)

А — в апикальной меристеме побега (ПАМ). Транскрипционные факторы KNOX напрямую
репрессируют экспрессию генов GA20ox, контролирующих биосинтез гиббеоеллинов
и позитивно регулируют экспрессию генсв IPT, контролирующих биосинтез цитокининов.
!ены KNOX экспрессируются в корпусе ПАМ, в результате батане гиббереллинов и цито-
кининов в центральной части ПАМ смещен в сторону цитокининов, что приводит к актив-
ной пролиферации клеток без диффеиенцировки. На периферии ПАМ, в зоне закладки
листовых примордиев, экспрессия генов KNOX подавляется, чтс приводит к экспрессии
гена GA20ox. повышению концентрации гиббереллинов и дифференцировке клеток.

В основании ПАМ экспрессируется ген GA2ox, контролирующий инактивацию гибберел
линов, что важно для поддержания конститутивно низкого уровня гиббереллинов в ПАМ.
Б — в семенах. В темноте, при отсутствии активного фитохрома, активируется белок
PIL5, который негативно регулирует экспрессию гена вАЗох и позитивно — экс-
прессию гена СА2ох\ снижение уровня активных гиббереллинов подавляет процесс
прорастания. На свегу активация фитохромов вызывает инактивацию PIL5. усиление
экспрессии вАЗох и подавление экспрессии СА2ох— в иезуль! ат е повышается уро
вень активных гиббереллинов, что приводит к прорастанию

В апикальной меристеме побега. Один из способов регуляции
уровня активных гиббереллинов в ПАМ связан с прямым негатив-
ным контролем экспрессии генов 2ODD гомедцомен-содержащими
транскрипционными факторами семейства KN( )Х (рис. 6.2 А). Бслки
KNOX — ключевые регуляторы развития ПАМ, их функции связа-
ны с пролиферацией клеток меристему, а также с поддержанием их
недифференцированного статуса (подробнее см. главу «Апикальная
меристема побега»). Эктопическая экспрессия генов KNOX у транс-
генных растений помимо развития эктопических меристем приводит
к карликовости и снижению уровня активных гиббереллинов. Было
показано, что один из KNOX-белков табака, NTH 15, репрессирует
транскрипцию гена GA20ox, напрямую связываясь с его первым ин-
троном. В дальнейшем обнаружили, что белки KNOX могут действо-
вать и как активаторы экспрессии некоторых генов 2ODD. Так, про-
дукт гена SHOOTMERISTEMLESS (STM), играющего центральную
роль в закладке и поддержании ПАМ у арабидопсис, напрямую акти-
вирует экспрессию генов GA2ox, продукты которых участвуют в инак-
тивации гиббереллинов. Обычное место экспрессии генов KNOX —
корпус ПАМ. в этой зоне полностью подавляется экспрессия генов
GA20ax и нет активных гиббереллинов. Напротив, снижение уровней
экспрессии генов KNOX на периферии ПАМ дает возможность для
синтеза активных гиббереллинов, которые способствуют закладке ла-
теральных органов побега (листьев и цветков). Считается, что роль
транскрипционных факторов KNOX в поддержании недифференци-
рованного состояния клеток ПАМ, механизмы которого не до конца
изучены, отчасти связана со снижением концентрации гиббереллинов
за счет изменения уровней экспрессии генов 2ODD.

Поскольку I иббереллины являются индукторами цветения, регу-
ляция концентрации этих гормонов в ПАМ важна также для контро-
ля перехода к цветению. Ключевую роль в терминации вегетативной
меристемы и развитии флоральных органов играет гомеозисный ген
AGAMOOS (AG), который начинает экспрессироваться сразу после
индукции цветения и кодирует транскрипционный фактор, контро-
лирующий развитие андпоцея и гинецея (подробнее см. главу «Раз-
витие цветка»). Установлено, что транскрипционный фактор AG по-
зитивно регулирует концентрацию гиббереллинов в развивающемся
цветке, напрямую связываясь с промоторами генов GA3ox. Повыше-
ние концентрации гиббереллинов во флоральной меристеме стиму-
лирует дифференцировку органов цветка.

В семенах. Гиббереллины являются антагонистами АБК в кон-
троле развития семян и прорастания: гиббереллины стимулируют
прорастание и дальнейшее вегетативное развитие растения, тогда
как функции АБК связаны с созреванием зародыша и периодом
покоя семян. Таким образом, для нормального развития семян не-
обходим механизм, регулирующий баланс этих двух фитогормо-
нов?)Этот механизм включает в себя транскрипционные факторы
LEAFY COTYLEDON 2 (LEC2) и FUSCA 3 (FUS3), играющие клю-
чевую роль в контроле процессов созревания зародыша (подробнее
см. главу «Эмбриогенез»), У мутантов с потерей функции/иуЗ и 1ес2
повышена концентрация гиббереллинов в семенах за счет актива-
ции экспрессии генов GA3ox и GA20ox, участвующих в биосинтезе
активных гиббереллинов. Кроме того, транскрипционный фактор
FUS3 стимулирует транскрипцию генов GA2ox, напрямую связыва-
ясь с их промоторами.
Другим регулятором экспрессии генов 2ODD в семенах являет-
ся транскрипционный фактор с MADS-боксом AGAMOUS-LIKE 15
(AGL15), который накапливается в тканях зародыша и играет не со-
всем понятную роль в эмбриогенезе высших растений. Прямой ми-
шенью транскрипционного фактора AGL15 являются гены GA2ox:
AGL15 повышает уровень их экспрессии, таким образом, одна из его
функций заключается в снижении уровня активных гиббереллинов
при развитии зародыша.	, _

Регуляция светом. Экспрессия генов 2ODD регулируется мно-
гими внешними факторами, такими как свет, температура и стресс
В настоящее время подробно изучена световая регуляция концентра-
ции активных гиббереллинов, которая крайне важна для прораста-
ния семян (рис. 6.2 Б), фотоморфогенеза, а также фотопериодиче-
ской регуляции удлинения стебля и цветения.

Прорастание семян под действием света характерно для растений
с маленькими семенами, таких как арабидопсис и томат. Ключевую
роль в этом процессе играют фитохромы А и В (phyA и phyB), ак-
тивация которых вызывает повышение уровней экспрессии генов
GA3ox, участвующих в активации гиббереллинов, и снижение уров-
ней экспрессии генов GA2ox, действующих в их инактивации. Это
приводит к резкому повышению концентрации активных гибберел-
линов в семенах.

Негативным регулятором фитохром-зависимого контроля уровня
активных гиббереллинов является белок PIL5 (Phytochrome-Interact-
ing factor-Like 5). При активации фитохромов красным светом проис-
ходит деградация взаимодействующего с ними белка PIL5, что вле-
чет за собой изменение уровней экспрессии генов GA3ox и GA2ox
P1L5 — основной белок с мотивом hclix-’oop-helix (bHLH), который
не связывается напрямую с промоторами генов 2ODD, что позво-
ляет предположить существование дополнительных компонентов
в этой цепи. Возможно, этими дополнительными звеньями являются
репрессоры передачи гиббереллинового сигнала — DELLA-белки,
гены которых напрямую активируются белком PIL5, взаимодей-
ствующим с их промоторами. Помимо регуляции уровня гибберел-
линов. белок PIL5 участвует также в контроле уровня АБК — таким
образом, он является ключевым фактором регуляции баланса этих
гормонов-антагонистов в семенах.

6.2. Рецепция и передача сигнала гиббереллинов

Путь передачи сигнала при ответе на гиббереллины включает
в себя четыре основных компонента (рис. 6.3):
SPY/SEC

J^cul
и -t

СтаЬилиэг имя
DELLA белков

GJD1

Fgras 1

убикьитин-пигазн ый V

комплекс SCF

ASK1

SLY/

GID2

DELLA

иА sly;

gW Gine<

43101

GRAS

GAMYB

ЭА-рсупируемые гены СА-регулгфуепые гены GA-pei упкфуемые гены

Репрессия транскрипции

Активация транскрипции

?R£

протеасома

U

U

Рис. 6.3. Схема передачи сигнала при ответе на гиббереллины

При отсутствии гиббереллинов с промоторами гиббереллин регулируемых генов
связаны репрессоры транскрипции DELLA, глюксзаминтрансферазы SPY/SEC стаби-
лизируют DELLA-белки. При связывании молекулы гиббереллина с рецептором GiD1
индуцируется его взаимодействие с DELLA-белком и F-бокс содержащим белком SLY/
GID2. В результате DEI LA-бслок присоединяется к убиквитин-лигазному комплек-
су SCFSLY/GID2, что стимулирует его убиквитин-зависимый прстеолиз. К промотсрам
гиббереплин-регулируемых генов присоединяется транскрипционный фактор GAMYB,
который запускает их экспрессию

1.	Рецептор GID1 — растворимый ядерный белок.

2.	Компоненты убиквитин-лигазного комплекса SCFSLY/GIL>2.

3.	Репрессоры ответа на гиббереллин белки DELLA, относящие-
ся к семейству транскрипционных факторов GRAS.

4.	Гиббереллин-зависимые транскрипционные факторы GAMYB, ко-
торые относятся к МYB-семейству транскрипционных факторов.

Белки DELLA - репрессоры ответа на гиббереллин

- Транскрипционные репрессоры семейства DELLA были пер-
выми из обнаруженных компонентов пути передачи сигнала гиб -
береллинов. Установлено, что ответ растений на гиббереллины
зависит от деградации DELLA-белков, которые при отсутствии
сигнала конститутивно связаны с промоторами гиббереллин-
регулируемых генов Мутанты с потерей функции генов, кодиру-
ющих DELLA-белки, обладают повышенной чувствительностью
к гиббереллинам, напротив, мутанты с усилением их функций
и трансгенные растения со сверхэкспрессней генов DELLA-
белков — карлики.

Белки DELLA — небольшое подсемейство белков, относящихся
к семейству GRAS (от GAI, RGA, SCARECROW), к которому также
принадлежат транскрипционные факторы SCARECROW и SHORT-
ROOT, участвующие в поддержании стволовых клеток апикальной
меристемы корня и формировании его радиальной структуры (см.
главу «Развитие корня»). Молекулы DELLA-белков включают в себя
ДИК-связывающий домен GRAS на С-концс и уникальный для это-
го подсемейства домен DELLA на N конце, необходимый для взаи-
модействия с рецептором GID1 и F-бокс-содержащим белком SLY1/
GID2. Мутации по GRAS-домену приводят к потерям функции
DELLA-белков и усиливают ответ на гиббереллин. В то же время
делеции в DELLA-домене приводят к накоплению DELLA-белков
и конститутивной репрессии передачи сигнала гиббереллинов.

Гены, кодирующие DELLA-белки, выявлены у всех изученных
видов растений: в частности, в геноме риса имеется три DELM-гена:
SLR (SLENDER RICE), SLRL1 и SLRL2 (SLR-Like l и 2), в геноме ара-
бидопсис — пять: RGA {REPRESSOR OF gal), GAI (GA-1NSENSI-
TIPE). RGL1, RGL2 и RGL3 (RGA-Like 1, 2 и 3). Максимум экспрес-
сии всех DELLA-rzww наблюдается во флоральной меристеме, что
доказывает основополагающую роль передачи сигнала гибберелли-
нов в контроле цветения. DELLA-белки контролируют разные функ-
ции гиббереллинов в развитии растений, например, у арабидопсис
RGL2 играет основную роль в репрессии прорастания семян, a RGA
репрессирует развитие органов цветка.

Вместе с тем функции DELLA-белков не ограничиваются ре-
прессией ответа на гиббереллины. Так, в геноме арабидопсис было
выявлено 14 генов, экспрессия которых позитивно регулируется
DELLA-белками, взаимодействующими с их промоторами, и быстро
(в течение нескольких минут) снижается при повышении концен-
трации гиббереллинов. Среди DELLA-индуцируемых генов значи-
тельную часть составляют гены, контролирующие синтез активных
гиббереллинов — GA20ox и GA3ox, а также гены, продукты кото-
рых принимают участие в передаче сигнала гиббереллинов: два из
трех генов гиббереллиновых рецепторов — GIDla и GIDlb, гены
убиквитин-лигазного комплекса SCFSLY/GID2, гены транскрипционных
факторов GAMYB Таким образом, помимо репрессии гиббереллин-
регулируемых генов, участвующих в контроле развития, DELLA-
белки играют центральную роль в обратной связи, которая имеет
место в контроле биосинтеза и передачи сигнала гиббереллинов.
Еще одной функцией DELLA-белков является связь между
передачей сигнала гиббереллинов и другими сигнальными пу-
тями в растительном организме: передачей сигнала других фито-
гормонов (в частности, ауксинов, АБК и этилена) и абиотических
сигналов (в частности, света). Эта функция DELLA-белков дает
возможность тонко регулировать уровень ответа на гиббереллины
в зависимости от факторов внешней и внутренней среды. Напри-
мер, у арабидопсис повышение концентрации ауксинов вызывает
быструю деградацию DELLA-белка RGA и дерепрессию ответа на
гиббереллины; в то же время АБК и этилен негативно регулируют
гиббереллин-зависимую деградацию DELLA-белков. Связь пере-
дачи сигнала гиббереллинов со световым сигналингом осущест-
вляется через взаимодействие DELLA-белков с транскрипционны-
ми факторами PIF3, PIF4 и PIF5 (Phytochrome Interacting Factors 3,
4 и 5), которые участвуют в регуляции роста растений в темноте.
Установлено, что взаимодействие с DELLA-белками препятствует
взаимодействию транскрипционных факторов PIF с промоторами
генов-мишеней.

Белек GID1 - рецептор гиббереллинов

По своей химической природе гиббереллины являются слабыми
органическими кислотами, которые могут проникать в клетку в виде
анионов путем пассивной диффузии, таким образом, рецепция гиб-
береллинов происходит внутри клетки.

Рецептором гиббереллинов является растворимый ядерный бе-
лок GID1J (Gibberellin Insensitive Dwarf 1), впервые выявленный
у риса. В геноме риса присутствует один ген OsGIDl, по гомологии
с ним были идентифицированы три гена гиббереллиновых рецепто-
ров арабидопсис — AtGIDla, ATGIDlh и AtGlDlc. Потеря функции
рецептора гиббереллинов у мутанта риса gidl приводит к развитию
фенотипа, характерного для гиббсрсллин-дефицитных растений: это
карлики, неспособные к развитию фертильных цветков. Гомозиго-
ты по «сильным» мутантным аллелям gidl полностью неспособ-
ны к проявлению каких-либо гиббереллин-зависимых реакций, та-
ких как удлинение колеоптиля, индукция прорастания и репрессия
транскрипции генов GA20ox; таким образом, G1D1, по-видимому,
является единственным рецептором к гиббереллинам.

По своей последовательности и структуре рецептор G1D1 от-
носится к семейству гормон-чувствнтельпых липаз, но не имеет
ферментативной активности. ; Активированный рецептор GID1
взаимодействует с DELLA белками. В результате происходит из-
менение конформации DELLA-белка, что делает возможным при-
соединение к нему ключевого компонента убиквитин-лигазного
комплекса SCF — F-бокс-содержащего белка SLY/GID2. Это
взаимодействие стимулирует убиквитинирование DELLA-белков
комплексом SCFSLY/GID2 с последующей их деградацией 26S-
протеасомой — таким образом происходит дерепрессия ответа на
гиббереллины.

Компоненты убиквитин-лигазного комплекса	—_

Убиквитин-лигазные комплексы SCF (Scpl-Cullin-F-box) вклю-
чают в себя четыре белка с разными функциями, за присоединение
к ним белков-мишеней отвечает F-бокс-содержащий белок/В де-
репрессии передачи сигнала гиббереллинов участвуют комплексы
SCFSLY арабидопсис и S(2FOIE>2 риса, в состав которых входят F- бокс-
содержащие белки SLY и GID2. Мутанты с потерей функции sly
(sleepy) и gid2 (gibberellm-insensitive dwarf 2) являются гиббереллин-
нечувствительчыми карликами; в то же время мутации с усилением
функции этих генов вызывают повышенную аффинность белков SLY/
G1D2 к белкам DELLA и супрессируюг мутации с делецией DELLA-
домена. Таким образом, F-бокс-содержащие белки SLY/GID2 играют
первостепенную роль в контроле стабильности DEI ,LA белков.

В то же время предполагается, что помимо SCFSLY/GIL>2 в переда
че сигнала гиббереллинов могут участвовать и другие убиквитин-
лигазы — в частности, мономерная убиквитин-лигаза PHOR1
(PHOTOPERIOD-REGULATED I). Репрессия транскрипции гена
PnORl у трансгенных растений приводит к развитию гиббереллин-
нечувствительного карликового фенотипа, тогда как его консти-
тутивная экспрессия под сильным промотором вызывает сверх-
чувствительность к гиббереллинам. Установлено, что повышение
концентрации гиббереллинов вызывает быстрое перемещение белка
PHOR1 из цитоплазмы в ядро. Все эти факты свидетельствуют об
участии белка PHOR1 в передаче сигнала гиббереллинов, но меха-
низм его действия пока не ясен.

Гибберсллин-зависимые транскрипционные факторы GAMYB

Транскрипционные факторы GAMYB, относящиеся к MYB-
семействутранскрипционныхфакторов,действуютвпередачесигнала
гиббереллинов ниже DELLA-белков и позитивно регулируют транс-
крипцию гиббереллин-зависимых генов. Первым из идентифициро-
ванных транскрипционных факторов этой г руппы был транскрипци-
онный фактор GAMYB 1 ячменя, действующий в алейроновом слое
эндосперма и позитивно регулирующий гиббереллин-зависимую
экспрессию генов а-амилаз. В дальнейшем было установлено, что
у ячменя, арабидопсис и риса транскрипционные факторы группы
GAMYB участвуют также в гиббереллин-зависимом контроле цве-
тения и развития органов цветка Например, у арабидопсис прямой
мишенью одного из белков GAMYB — GAMYB33 — является ген
идентичности органов цветка LEAFY; активация другого GAMYB-
белка GLABROUS 1 — необходима для гиббереллин-заьисимого
развития трихомов.

Другие известные компоненты передачи сигнала гиббереллинов

К числу негативных регуляторов передачи сигнала гиб-
береллинов у арабидопсис относятся белки SPY (SPINDLY)
и SEC (SECRET AGENT), которые принадлежат к семейству
N-ацетилглюкозаминтрансфсраз. Мутации с потерей функции со-
ответствующих генов приводят к фенокспиям растений, обработан-
ных гиббереллинами,^! супрессируют мутации по чувствительности
к гиббереллинам (например, мутацию gai, приводящую к стабили-
зации одного из DELLA-белков арабидопсис) Предположи тельной
функцией белков SPY и SEC является стабцдизация белков DELLA
путем их посттрансляционной модификации.кроме того, белок SPY
может участвовать также в регуляции ответа на цитокинины, так как
мутанты с потерей функции хру демонстрируют повышенную устой-
чивость к экзогенным цитокининам.

Позитивными регуляторами передачи сигнала гиббереллинов
являются гены D1 риса и GPA1 арабидопсис, которые кодируют
а-субъединицы G-белков О роли G-белков в передаче сигна-
ла гиббереллинов в настоящее время ничего не известно. Одной
из распространенных мишеней субъединицы Ga является фер-
мент гуанилатциклаза, который синтезирует циклическую ГМФ
(цГМФ) из ГТФ, в свою очередь, цГМФ стимулирует активность
Са2' ионных каналов и протеинкиназ, участвующих в передаче
различных сигналов. На примере гиббсреллин-зависимого кон-
троля прорастания семян было показано, что повышение кон-
центрации гиббереллинов вызывает быстрое повышение уровня
цГМФ и ионов Са2* в алейроновом слое эндосперма, а также усили-
вает фосфорилирование белков протеинкиназами. Таким образом,
описанный выше путь передачи сигнала гиббереллинов, включа-
ющий в себя рецептор GID1, убиквитин-лигазный комплекс SCF
и DELLA-белки, может быть не единственным путем сигнальной
трансдукции этих гормонов.
Гиббереллин-регулируемые гены

В геноме арабидопсис обнаружено более 500 гиббереллин-
регулируемых генов, половина из которых регулируется гибберел-
линами напрямую, через деградацию DELLA-белков и присоедине-
ние транскрипционных факторов GAMYB. К их числу относятся:
• гены, участвующие в контроле различных онтогенетических про-
цессов, — в частности, прорастания (гены а-амилаз) и цветения
(ген LEAFY)-,

•	гены, контролирующие метаболизм гиббереллинов — GA20ox,
GA3ox, GA2ox;

•	гены, контролирующие передачу сигнала гиббереллинов — GID1,
гены убиквитин-конъюгирующих ферментов El и убиквитин-
лигаз ЕЗ, гены транскрипционных факторов GAMYB;

•	гены, контролирующие метаболизм и передачу сигнала других
фитогормонов — например, убиквитин-лигаза XERICO, играю-
щая роль в метаболизме АЬК

6.3. Функции гиббереллинов в развитии растений

К числу наиболее известных функций гиббереллинов относятся
контроль прорастания семян, роста стебля в длину, перехода к цве-
тению и развития органов цветка. В настоящее время изучены мо-
лекулярные механизмы реализации этих функций: все они связаны
с деградацией DEEL А- белков, опосредованной рецептором GID1.

Контроль прорастания семян

Регуляция периода покоя и прорастания семян — один из процес-
сов, зависящих от баланса двух групп фитогормонов-антагонистов —
гиббереллинов и АБК. АЬК позитивно регулирует созревание за
родыша и переход его к периоду покоя (см. главу «Эмбриогенез»),
тогда как гиббереллины стимулируют прорастание и дальнейшее
вегетативное развитие.

Созревание семян связано с накоплением питательных веществ
в зародыше и эндосперме, при прорастании происходит лизис за-
пасных макромолекул эндосперма различными гидролитическими
ферментами. Основную функцию в гидролизе крахмала в эндоспер-
ме выполняют а- и Р-амилазы: Р-амилазы гидролизуют крахмал
до олигосахаридов, которые затем превращаются в мальтозу с по-
мощью а-амилаз. Эндосперм зрелого семени состоит из централь-
ной части, клетки которой наполнены крахмальными зернами, и по-
верхностного алейронового слоя, в клетках которого содержится
большое количество вакуолей с белками (так называемые белковые
тела). Большую часть белков алейронового слоя составляют гидро-
литические ферменты, в том числе амилазы, которые синтезируются
в алейроновом слое и оттуда секретируются в центральную часть
эндосперма. Еще до открытия гиббереллинов было известно, что
алейроновый слой эндосперма не может осуществлять эту функцию,
если из семени удален зародыш. Вскоре было установлено, что за-
родышевым сигналом-индуктором синтеза и секреции ферментов из
алейронового слоя являются гиббереллины.

J Гены а-амилаз были первыми генами, для которых установлен
прямой контроль экспрессии с помощью гибберсллин-зависимого
транскрипционного фактора GAMYB. Таким образом, гибберел-
лины, выделяемые зародышем, вызывают запуск экспрессии ге-
нов а-амилаз в алейроновом слое, что приводит к лизису крах-
мальных гранул эндосперма и обеспечивает молодой проросток
питательными вещеетвамш) Относительно связи гиббереллин-
зависимой экспрессии генов а-амилаз с индукцией прорастания
существуют два предположения. Во-первых, лизис запасных
макромолекул эндосперма может сам по себе быть индуктором
прекращения периода покоя, так как полученные при этом моно-
и дисахариды используются как сигнальные молекулы в клет-
ках растений. С другой стороны, возможно, что наряду с генами
а-амилаз гиббереллины запускают экспрессию каких-то других
генов-регуляторов вегетативного развития. Одним из кандидатов
на роль этих генов может быть ген EPR1 арабидопсис. кодирую-
щий белок из семейства экстенсинов, экспрессия которого быстро
повышается перед прорастанием и позитивно регулируется гиббе-
реллинами.

АБК является антагонистом гиббереллинов в контроле про-
растания семян (рис. 6.4) Во-первых, АБК активирует транс-
крипционные факторы ABI3, FUS3 и LEC2, которые являются
основными позитивными регуляторами созревания зародыша
и предположительно осуществляют запуск экспрессии «генов пе-
риода покоя?> и репрессию «генов прорастания». Во-вторых, АБК
снижает концентрацию свободных гиббереллинов через позитив-
ную регуляцию экспрессии генов GA2ox. В-третьих. АБК репрес-
сирует передачу сигнала гиббереллинов, участвуя в стабилизации
DELLA-белка RGA. Наконец, передача сигнала АБК связана с ак-
тивацией группы протеинкиназ SnRK2 (см. главу «Абсцизовая
кислота»), для одной из которых — киназы РКАВА1 пшеницы —
установлена ключевая роль в репрессии транскрипции генов
GAMYB (точные механизмы не выяснены).
Актирные
гиббереллины

Деградация

DELLA белков

Ga2ox-*—ДБК

*РКАВА1

прорастание

I?

Активация
GAMYB

???

а-амилазы

ABI3, FUS3, LEC2 —► покой

Рис. 6.4. Схема взаимодействия гиббереллинов и АБК в контроле периода гокоя
и прорастания семян (пояснения в тексте)

Рост стебля ! длину

Стимуляция роста стебля в длину — первая из открытых физио-
логических функций гиббереллинов. По изменению длины стебля
обычно выявляют мутантов по биосинтезу и передаче сигнала гиб-
береллинов, а также изучают взаимодействие между различными
мутациями (рис. 6.5).

Обработка растений гиббереллинами стимулирует пролиферацию
клеток междоузлий и их рост растяжением. Гибберсллин-зависимое
повышение частоты митозов наиболее хорошо заметно в субаникаль-
ных районах побега при переходе к цветению у розеточных растений
длинного дня, а также в интеркалярных меристемах риса, растущего
в глубокой воде. При этом в апикальной меристеме побега гибберел-
лины выполняют строго противоположную функцию — ингибируют
пролиферацию и стимулируют дифференцировку клеток, благодаря
чему для нормального развития растения важно поддержание кон-
ститутивно низкой концентрации гиббереллинов в ПАМ (см. выше)
Таким образом, гиббереллины могут выполнять противоположные
функции в контроле развития разных меристем. ____

На интеркалярных меристемах риса было показано, что гиббе-
реллины стимулируют деление клеток благодаря позитивной регу-
ляции экспрессии генов, кодирующих регуляторы клеточною цик-
ла: гена Cdc2Os-3, продуктом которого является циклин-зависимая
протеинкиназа A (CDKA), контролирующая все этапы клеточного
цикла у растений, и гена СусА1;1, участвующего в контроле S-фазы
и перехода G2-M. В промоторах генов CDKA арабидопсис и риса
были обнаружены консервативные последовательности для свя-
зывания MYB транскрипционных факторов, к которым относятся
гиббереллин-зависимые транскрипционные факторы GAMYB.
P>ic. 6.5. Нарушение роста стебля в длину у мутантов по метаболизму и передаче
сигнала гиббереллинов

А — фенотип мутанта prcaff/rfJ с потерей функции гиббереллинового рецептора (по
Uecuchi lanaka ot al., 2005). Б — пример изучения взаимодействия мутаций арабидопсис.
нарушающий рост стебля в длину: gal (потеря функции гена, действующего на первых
этапах биосинтеза гиббереллинов), gai (усиление функции одно-с из генов DELLA-
белков), rga (потеря функции одного из генсв DELLA-белков), spy (потеря функции гена,
контролирующего стабилизацию DFLLA-белков) (модифицировано по Taiz, Zefger, 2003)

Основные события, связанные с гиббереллин-зависимым ростом
клеток в длину, также имеют место в инт еркалярных меристемах меж •
доузлий. Механизмы стимуляции роста клеток гиббереллинами иные,
чем у ауксинов: гиббереллины не вызывают активацию Н+-АТФаз
и закисления клеточной стенки. Стимуляция роста клетск гибберел-
линами — гораздо более медленная реакция, чем ауксин-зависимое
растяжение клеток, механизмы ее до настоящего времени не выяснены
окончательно. С одной стороны, гиббереллин-зависимый рост может
быть отчасти связан с ауксин-зависимым его контролем, так как гиб-
береллины стимулируют повышение концентрации ауксинов в тканях
растений. С другой стороны, гиббереллины независимо от ауксинов
позитивно регулируют экспрессию ряда генов, контролирующих ла-
бильность клеточной стенки: некоторых генов ЕХР, кодирующих
экспапсины (см. главу «Ауксины»), а также генов ХЕТ, продуктами
которых являются ферменты ксилоглюкан-эндотрапсгликозилазы,
играющие роль в метаболизме полисахаридов клеточной стенки.
Регуляция зацветания

Согласно многочисленным исследованиям существуют четыре
основных пути регуляции зацветания: путь длинного дня, отвечаю-
щий за переход к цветению при увеличении продолжительности све-
тового периода; автономный путь, который контролирует зацветание
как при длинном, так и при коротком дне; путь вернализаиии, запу-
скающий цветение после кратковременного периода низких темпе-
ратур, и гиббсреллин-зависимый путь, который наиболее важен для
перехода к цветению в условиях короткого дня (подробнее см. главу
«Переход к цветению»),	____

Все эти пути могут взаимодействовать между собой — например,
у арабидопсис, который может цвести как при длинном, так и при
коротком дне. В связи с ослаблением гиббереллин зависимого пути
контроля зацветания, гиббереллин-дефицитные go-мутанты араби-
допсис совсем не цветут при коротком дне, а также демонстрируют
задержку цветения в условиях длинного дня.

В основе гиббереллин-зависимого контроля зацветания лежит
позитивная регуляция экспрессии генов, играющих ключевую роль
в интеграции процессов цветения: индуктора экспрессии гомеозис-
ных генов цветка — гена LEAFY(LFY), основного инициатора цвете-
ния — гена FLOWERING LOCUS Т (Fl) и его мишени — гена SUP
PRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS 1 (SOC1) (см. главу
«Индукция цветения») (рис. 6.6).

В промоторе гена LFY обнаружена GAMYB-связывающая после-
довательное гь, с которой напрямую взаимодействует транскрип-
ционный фактор GAMYB33. Мутации по GAMYB-связывающей
последовательности делают невозможным повышение уровня
экспрессии LFY в условиях короткого дня. В то же время транс-
формация гиббереллин-дефицитных ga-мутантов геном LFY под
конститутивным промотором запускает их цветение при корот-
ком дне, Интересно, что в регуляции зацветания действуют строго
определенные формы гиббереллинов: у двудольных главную роль
в этом процессе играет GA4, а у однодольных — менее активные
GA5 и GA6.

У растений длинного дня роль гиббереллинов в контроле за-
цветания менее понятна. У этих растений увеличение продолжи-
тельности светового периода стимулирует рост стебля в длину
(особенно хорошо это заметно у розеточных растений) с после-
дующей индукцией цветения. Причиной этого, по-видимому, яв-
ляется фитохром-зависимое повышение уровня экспрессии генов
GA20ox, которое приводит к увеличению концентрации свобод-
Рис. 6 6. Роль гиббереллинов в регуляции перехода к цветению (модифицировано
по Muiasa-Gottgens and Het den, 2009)

1 — Фитохром-зависимое повышение концентрации GA20ox в листьях вызывает по-
вышение концентрации гиббереллинов, которое, в свою очередь, вызывает повышение
концентрации белка FT Этот процесс может также регулироваться сротопериодом, через
ТФ 00. Бегок FT перемещается из листьев в ПАМ. 2 — Повышение уровне, гиббереллинов
е ПАМ вызывае1 усиление экспрессии гена SOC, который негативно регулируется DELLA-
белками GA) и RGA. Этот процесс негативно регулируется ТФ KNOX, которые стимулируют
экспрессию генов йА2ох в Rib-зоне ПАМ. 3 — Экспрессия гена 1_Г¥ напрямую гозити вно
регулируется гибберелгин-зависимым ТФ GAMYB33. DELLA-белки GAI и RGA негатив-
но регулируют эют процесс через miPHK 159.4,5 — Белки S0C1 и AGAMCUS-LIKE 24
(AGL24) формируют гетеродгмер и позитивно регулирую" экспрессию гена LFY; 1Ф LFY
позитивно ре|улирует экспрессию генов SOC1 и AGI24

ных гиббереллинов в побегах. На арабидопсис было показано, что
повышение концентрации гиббереллинов в листьях приводит к
усилению экспрессии гена FT, кодирующего белок-флориген, ко-
торый синтезируется в листьях и в дальнейшем перемещается в
ПАМ (см. главу «Инициация цветения»). К сожалению, молеку-
лярные механизмы влияния гиббереллинов на экспрессию FT в
настоящее время не выяснены.
Кроме того, снижение уровня экспрессии гена SOC1 у гиббереллин-
дефицитных мутантов и восстановление ее до нормального уровня
при наличии дополнительных мутаций по DELLA-белкам позволяет
предположить, что гиббереллины стимулируют экспрессию SOC1 че-
рез подавление активности DELLA-белков GAI и RGA.

Помимо контроля зацветания, гиббереллины необходимы для
нормального роста и развития органов цветка, но для первичной
спецификации этих органов гиббереллины не требуются.

Итак, функции гиббереллинов связаны со стимуляцией вегетатив-
ного развития растений (г.рорасгание, рост стебля в длину) и генера-
тивного развития (перехода к цветению). Гиббереллины действуют
в одном направлении с ауксинами и стимулируют биосинтез и пере-
дачу сигнала друг друга; кроме того, системы их рецепции передачи
сигнала организованы по одному плану (рецепторы взаимодейству-
ют с компонентами убиквитин-лигазных комплексов ЕЗ и индуциру-
ют протеолиз транскрипционных репрессоров). Цитокинины и АБК,
напротив, являются антагонистами гиббереллинов.

Источники рисунков, использованных з глазе

1.	Taiz L , Zeiger Е. Plant Physiology, 3rd edition. Sinaaer Associates. 2003. 690 p.

2.	Ueguchi-Tanaka M., Ashikari M., Nakajima M. et al. GIBBERELLIN

INSENSITIVE DWARF1 encodes a soluble receptor for gibberel.in // Nature 2005.
Vol. 437. P. 693-698.

3.	Yamaguchi S Gibberellin metabolism and its regulation //Annual Review of Plant
Biology. 2008. Vol. 59. P. 225-251

Рекомендованная литература

1.	Mutasa-Gottgens E., Hedden P. Gibberellin as a factor in floral regulatory
networks // Experimental Botany. 2009. Vol. 60. P. 1979-1989.

2.	Hartweck L. M. Gibberellin signaling // Planta. 2008. Vol. 229. P. 1-13.

3.	Yamaguchi S. Gibberellin metabolism and its regulation //Annual Review of Plant

Btology. 2008 Vol. 59. P. 225-251.
Глава 7

Абсцизовая кислота

Абсцизовая кислота (АБК) — впервые была обнаружена в экспе-
риментах по поиску вещества, которое получило название дормин,
или абсцизин, — по способности вызывать опадение листьев и коро-
бочек хлопчатника. Первые препараты абсцизовой кислоты были не-
зависимо выделены в 1963 г. Ф Эддикотгом и сотрудниками (США)
и Ф. Уорингом и сотрудниками (Великобритания).

Абсцизовая кислота особенно важна для поддержания водного ба-
ланса в условиях засухи; недостаток влаги ведет к резкой активации
синтеза АБК и ее выходу из мест депонирования во внутри- и вне-
клеточное пространство. К числу быстрых эффектов АБК, которые
имеют место через несколько минут после повышения ее концен-
трации, относится асимметричный транспорт ионов калия, кальция
и анионов через мембрану замыкающих клеток устьиц, в результате
чего замедляется поступление воды в клетки, их тургор падает, что
приводит к закрытию устьичной щели. Одновременно абсцизовая
кислота активирует всасывание воды корнями. Помимо этого, АБК
является одним из ключевых регуляторов развития семян. АБК регу-
лирует созревание зародыша, препятствует преждевременному про-
растанию семян при их созревании, продлевает период покоя зрелых
семян, спящих почек, клубней и корнеплодов. В соответствии с пере-
численными функциями АБК, для мутантов с нарушением биосин-
теза и передачи сигнала этого гормона характерные два основных
типа нарушений развития: 1) вивилария (прорастание семян внутри
плода) в связи с редукцией стадий созревания зародыша и периода
покоя и 2) «увядающий» фенотип в связи с большой потерей влаги
из-за постоянно открытых устьиц.
В контроле многих онтогенетических процессов АЬК кислота яв-
ляется антагонистом ауксинов, гиббереллинов и цитокининов Со-
вместно с этиленом АБК усиливает процессы старения и опадения
цветков и плодов, а также играет роль в защите от стресса

7.1.	Биосинтез, инактивация и катаболизм абсцизовой
кислоты

Биэсинтез АБК

По своей химической природе АБК, как и гиббереллины, яв-
ляется терпеноидом; у этих двух групп гормонов-анз агонистов
есть общий предшественник — геранилгеранил-дифосфат
(ГГДФ), который также является предшественником хлорофил-
ла. Из ГГДФ синтезируются каротиноиды, их производным яв-
ляется зеаксантин, который является первым предшественником
в пути биосинтеза АБК. Мутанты по биосинтезу каротиноидов
характеризуются сниженным уровнем АБК, следствием чего яв-
ляется вивипария, а также пониженным содержанием хлорофил-
ла (фенотип «albino») — к этой группе относится большинство
мутантов viviparous кукурузы.

Мутанты по нижележащим этапам биосинтеза АБК имеют ха-
рактерный «увядающий» фенотип и дают семена, прорастающие
без периода покоя. Благодаря изучению АБК-дефицитных мутантов
у разных видов растений удалось выявить большинство генов, уча-
ствующих в контроле биосинтеза АБК (рис. 7.1).

Биосинтез АБК в растении происходит в основном в молодых со-
судистых пучках, а также в замыкающих клеткал устьиц.

Основными этапами биосинтеза АБК являются:

1.	Синтез виолоксантина из зеаксантина, который катализируют
ферменты зеаксантин-эпоксидазы (ZEP).

2.	Синтез неоксантипа из виолоксантина, который катализиру-
ют две группы ферментов: неоксантин-синтазы (NSY) и изо-
меразы, важные для синтеза цис-изомеров виолоксантина
и неоксактина.

3	Синтез ксангоксина из цис-несксантина, который катализируют
9-цис-эпоксикаротеноид-диоксигеназы (NCED).

4.	Синтез АБК из ксантоксина через АБК-альдегид, две после-
довательные стадии которого катализируются ксангоксин-
дегидрогеназой АВА2 и АБК-альдегидоксидазой ААОЗ.

Первые три этапа биосинтеза АБК, как и синтез каротиноидов,
проходят в пластидах, последний — в цитозоле.
абсцизовый альдегид

абсцизовая кислота

Araoidopsis thalianaAtABA2

Arabidopsis thaliana: ААСЗ
Lycopersrson esculent urn: SITIENS

Arabidopsis thahani AtABA3
Lvcopersicon esculentum Fl ACCA
Nicotiana plumbaginifolia: NpABA 1

Рис. 7.1. Основные этапы биосинтеза АБК из зеаксантина (по Nambara and Marion-
Poll, 2005)

Пояснения в тексте Справа отмечены гены, кодирующие соответствующие ферменты

У изученных видов растений ферменты NCED кодируются муль-
тигснным семейством — например, у арабидопсис выявлено 9 NCED-
генов. Напротив, гены АВЛ2 и АООЗ, а также гепы ZEP в геномах расте-
ний представлены только одной копией. Потеря функций любою из этих
генов у мутантов приводит к развитию АБК-дефицитного фенотипа.
Для каталитической активности альдегидоксидазы ААОЗ необхо-
дим молибден-содержащий белок-кофактор МоСо, мутации с поте-
рей функции которого (flacca тома га, аЬаЗ арабидопсис) также при-
водят к дефициту АБК.

Инактивация и катаболизм АБК

Существует два типа реакций, приводящих к инактивации
АБК, — ццдрокеилирование и синтез конъюгатов.

С-7, С-8 и С-9-гидроксилирсванные формы АБК обладают сла-
бой биологической активностью, кроме того, гидроксилирование по
С-8 является первым шагом в образовании конъюгатов АБК с глюко-
зой. Среди генов арабидопсис, контролирующих гидроксилирование
АБК, в настоящее время выявлен ген CYP707A, продуктом которого
является АЬК-С- 8 -гидроксилаза.

АБК и ее С-8-гидроксилированная форма являются мишенью для
образования конъюгатов с глюкозой, наиболее распространенным
среди которых является АБК-глюкозильный эфир. Как правило, конъ-
югаты АБК физиологически неактивны и накапливаются в вакуолях
при старении; В то же время АБК-глюкозильный эфир играет роль
в дал'ьпемтранспорте АБК» Фермент АБК-глюкозилтрансфераза, ко-
торый катализирует образование конъюгатов АБК, кодируется у ара-
бидопсис одним геном AOG.

Контроль метаболизма АБК

Метаболизм АБК регулируется большим количеством внешних
и внутренних сигналов и зависит от конкретной стадии развития,
органа и ткани. Регуляция концентрации АБК особенно важна для
контроля таких физиологических процессов, как период покоя се-
мян и устойчивость растений к стрессу.

Основным путем регуляции концентрации АБК в растении явля-
ется контроль экспрессии двух групп генов — NCED и CYP707A —
на уровне транскрипции Определенную роль в контроле уровня
АБК в семенах играет также регуляция экспрессии некоторых ге-
нов, кодирующих ферменты биосинтеза каротиноидов (ген фигоен-
синтазы) и ксантофилового цикла (гены ZEP).

Генетический анализ мутации sad! (supersensitive to АВА and
drought) арабидопсис показал, что биосинтез АБКрегулируется
также на уровне стабильности мРНК ААОЗ и AtABA3. Продуктом
гена 5Х£>Гя*вляется белок snRNP; который позитивно регулиру-
ет экспрессию генов ААОЗ и AtABA3, участвуя в сплайсинге их
мРНК
7.2.	Рецепция и передача сигнала абсцизовой кислоты

Несмотря на длительный период изучения, в настоящее время нет об-
щей схемы рецепции и передачи сигнала АБК.1 Поиск мутантов по чув-
ствительности на основании способности их семян к прорастанию в при-
сутствии АБК позволил создать коллекцию nbi (АВА insensitive) мутантов
арабидопсис. Для продуктов некоторых идентифицированных л5/-генов
было установлено участие в передаче сигнала АБК. Например, гены АВ11
и ABI2 кодируют 2С-фосфатазы, что позволило предположить важную
роль процессов фосфорилирования-дефосфорилирования в передаче
сигнала АЬК; продукты генов ABJ3, ABI4 и ABI5 — транскрипционные
факторы, относящиеся к трем разным группам. Изучение эпистатических
взаимодействий «7и-мутаций не позволило создать четкою представле-
ния о порядке действия белков АВ1 в передаче сигнала АБК. Более того,
в дальнейшем были выявлены еще несколько групп т раискрипционных
факторов, участвующих в ответе на АБК, — например, транскрипцион-
ные факторы WRKY. В дальнейшем были получены данные о том, что
выявленные белки действуют в разных путях передачи сигнала, опосре-
дованных разными рецепторами к АЬК.

При поиске белков, специфически связывающих активную АБК.
в последние пять лет выявлены четыре независимых рецептора
к АБК — это белки разных групп, для которых характерна локали-
зация в разных частях клетки и участие в регуляции разных физио-
логических функций АБК.

1.	FCA (Flowering time Control locus A) — ядерный PH К-связь вающий
белок, ингибитор экспрессии гена FLC (репрессора цветения).

2.	ABAR/CHLH (CHLH-субъединица магний-протопорфирин-
хелатазы) — белок, локализованный в хлоропластах, который
участвует в метаболизме хлорофилла и передаче сигналов от
хлоропластов к ядру.

3.	GPCR (G-Protein Coupled Receptors) — трансмембранные рецепто-
ры, ассоциированные с G-белками, локализованы на плазмалемме.

4.	RC’AR/'PY R/PYL (Regulatory Components of АВ A Receptor/Py robac-
tin Resistant/ Pyrobactin Resistant-Like) — цитозольные рецепторы
АБК, относящиеся к одному из семейств белков-ингибиторов
протеинФосфатаз.

Каждый из типов рецепторов АБК индуцирует «свой» путь переда-
чи сигнала, приводящий к активации разных трупп транскрипционных
факторов. Таким образом, возможно, что АБК является уникальным
фитогормонбм, который может запускать разные системы рецепции
и передачи сигналадтя реализации разных физиологических функций.
Б последнее время получены данные о взаимодействии двух
последних рецепторных систем АБК на уровне отдельных компо-
нентов путей передачи сигнала (см. ниже). Разные группы транс-
крипционных факторов также взаимодействуют в контроле многих
АБК-зависимых процессов: например, для контроля экспрессии ге-
нов, связанных с ответ ом на абиотический стресс, большое значение
имеет взаимодействие транскрипционных факторов ABI4 и АВ15;
для контроля поздних этапов эмбриогенеза — взаимодействие ABI3
и ABI5. В промоторах многих АБК-рсгулирусмых генов имеется по
несколько последовательностей для связывания разных групп транс-
крипционных факторов.

Вполне вероятно, что дальнейшее изучение передачи сигнала
АБК позволит получить более подробные данные о взаимодействии
разных путей передачи сигнала АБК.

 FCA - ядерный рецептор АБК, участвующий в контроле цветения

Одной из функций АБК является ингибирование цветения. При
изучении роли АБК в этом процессе было обнаружено, что эта функ-
ция АБК реализуется через ее непосредственное связывание с бел-
ком FCA, который является позитивным регулятором цветения

Всего у растений выявлено четыре пути регуляции перехода
к цветению: фотопериодический путь, связанный с индукцией цве-
тения при увеличении длины дня; путь вернализации, запускающий
программу цветения после окончания низкотемпературного перио-
да; гиббереллин-зависимый путь, контролирующий зацветание при
повышении концентрации гиббереллинов в апикальной меристеме,
и автономный путь, не зависящий от вышеперечисленных сигналов.
Работа всех этих путей связана с регуляцией экспрессии нескольких
генов — ключевых регуляторов цветения'Ащнтральным из которых
является ген LEAFY (Z ГУ) (подробнее см. главу «Переход к цвете
нию»). В интеграции пути вернализации и автономного пути уча-
ствует белок FLC (Flowering Locus С) — транскрипционный фактор
с МADS-боксой, который репрессирует тпанскрипцию гена LFY.
В основе автономного пути регуляции зацветания лежит репрессия
гена FLC посредством РНК-связывающего белка FCA.

Функцией белка FCA является процессинг З’конца мРНК., В со-
став его молекулы входят РНК-связы лающий N концевой домен
и С-концевой домен, необходимый для взаимодействия с белком FY
(Flowering Locus Y), который выполняет сходные с FCA функции. Вза-
имодействие FCA-FY необходимо для контроля экспрессии гена FLC
и является одним из ключевых процессов в регуляции зацветания.
ген LFY

цветение

ген LFY

?; цветение

Рис. 7.2. Действие рецепте pa FCA в АЬК зависимой репрессии цветения

А — в отсутствии АБК рецептор FCA совместно с белком CY осуществляет процессинг
мРНК гена FLC, з итоге репрессор транскрипции FLC не связывается с промотором
гена LFY, экспрессия гена LFY инициирует переход к цветению

Б — при связывании АБК с рецептором FCA происходит диссоциации комплекса
FCA-FY и высвобождение мРНК FLC; белок FLC связывается с промотором гена LFY,
репрессируя его транскрипцию, что приводит к репрессии цветения

В экспериментах in vitro и in vivo было показано, что ASK связы-
вается с С-конпевым доменом белка FCA, нарушая взаимодействие
FCA- FY, что приводит к усилению экспрессии гена FLC и репрес-
сии перехода к цветению (рис. 7.2).

Помимо контроля цветения,(рецептор FCA также участвует в ре-
прессии роста боковых корней fe ответ на АБК^йо не в друг их АБК-
зависимых физиологических процессах, таких как созревание заро-
дыша, период покоя семян и закрывание устьиц.

Дополнительная информация

С конца 2008 г. функция FCA в качестве рецептора АБК подвергается сомнению:
сразу две группы исследователей указали на ошибку первооткрывателей рецептора
FCA как при определении характеристик связывания АБК, так и в отношении спо-
собности АБК блокировать взаимодействие FCA и FY.

A8AR/CKLH - пластидный рецептср АБК, участвующий с контроле
эмбриогенеза и работы устьиц

АБК-связывающий белок ABAR (АВА receptor) был обнаружен
при изучении функции АБК в замыкающих клетках устьиц. Вы-
Рис. 7.3 Субъединица Мд-протопорфирин-хелатазы CHLH - хлоропласгный рецептор АЬК
CHLIi участвует в присоединении иона Мд2* к протопсрфирину-IX (PP-IX). Мд
нрстопорб)ирин-1Х — сигнальная молекула, играющая основную роль в регуляции
экспрессии ядерных генов, кодирующих хлоропластные белки (мэханизмы неизвест-
ны). CHLH также выполняет функцию рецептора к АБК (нижележащие компоненты
пути сигнальной трансдукции неизвестны). Предполагается, что Мд-нротспорфирин-
IX участвуе* в передаче сигнала АБК через взаимодействие с другими вторичными
мессенджерами

явленный белок оказался Н-субъединицей М§-протопорфирин-1Х-
хелатазы (CHLH) (рис. 7.3).

М§-протопорфирин-1Х-хелатаза — фермент, состоящий из трех субь
единиц: CHLD, СНЫ и CHLH,1, который катализирует первый этап био-
синтеза хлорофилла — присоединение иона Mg2+ к протопорфирину-
IX. Центральную роль в этом процессе играет субьединица CHI Н,
которая взаимодействует с протопорфирином-IX.

Помимо биосинтеза хлорофилла, каталитическая функция CHLH
играет ключевую роль в передаче сигнала от пластид к ядру — это
особенно важно'в стрессовых условиях, когда сигнал из повреж-
денных пластид запускает экспрессию ядерных генов, кодирующих
пластидные белки. Природа этого сигнала в настоящее время не
установлена; возможно, что сигнальной молекулой является Mg-
протопорфирин-1Х. Действительно, потеря каталитической актив-
ности CHLH у мутанта арабидопсис genomes uncoupled5 (gun5} при-
водит к прекращению пластидно-ядерных коммуникаций.

Белок CHLH у арабидопсис и других видов растений кодируется
единственным геном.

Рецепторная функция белка CHLH по отношению к АЬК нс за
висит от его каталитической активности, более того, эти активности
определяются разными доменами белка CHLH: его N-концевая часть
несет каталитическую функцию, а С-концевая связывает АБК..

Важная роль репептора CHLH в АБК-зависимых физиологи-
ческих процессах была подтверждена на растениях с измененным
уровнем экспрессии гена CHLH. Полученный с помощью Т-ДНК-
инсерционпого мутагенеза муганг ahar-1 с полной потерей рецеп-
торной активности CHLH демонстрирует летальность на поздних
эмбриональных стадиях,.лтр доказывает чрезвычайную важность
рецепторной функции CHLH в эмбриональном развитии растений.
Тем не менее какие-либо компоненты сигнальной трансдукции, дей-
ствующие в передаче сигнала АБК ниже рецептора CHLH, в настоя-
щее время не выявлены.

RCAR/PYR/PYL - цитозольные рецепторы АБК, участвующие
в контроле большинства АБК зависимых процессов

Совсем недавно, в 2009 году, была обнаружена еще одна группа
рецепторов АБК — семейство белков RCAR/PYR/PYL.pTH рецеп-
торы были выявлены в процессе поиска белков, взаимодействую-
щих с протеинфосфатазами 2С АВ11 и ABI2, для которых была дав-
но известна роль б передаче сигнала АБК. Было установлено, что
выявленные! белки, которые получили название RCAR (Regulatory
Components Of АВА Receptor), специфически связывают активную
АБК(и являются новым типом рецепторов к АБК, а протеинфос-
фагазы 2С являются первым звеном в запускаемой этими рецепто-
рами цепи передачи сигнала Одним из специфических ингибито
ров передачи сигнала АБК, опосредованной протеинфосфатазами
2С, является синтетическое вещество пиробактин. При изучении
устойчивого к пиробактину мутанта арабидопсис pyrl (pyrobactin
resistant 1) было установлено, что эффект пиробактина связан с его
взаимодействием с цитозольным белком PYR1, относящимся к се-
мейству рецепторов RCAR. В дальнейшем по гомологии с RCAR
и PYR1 у арабидопсис было выявлено семейство из четырнадца-
ти PYL (PYRI Like) белков, для большинства из которых показа-
но специфическое связывание с активной АБК и взаимодействие
с протеинфосфагазами 2С.. Увядающий фенотип множественных
мутантовpyrl руГ1 pyl~2ру№с потерей функции четырех RCAR/PYR/
PYL геновдюдтверждает важную роль рецепторов RCAR в контро-
ле закрывания устьиц и устойчивости к высыханию.

Рецепторы RCAR принадлежат к так называемому START-
семейству белков-ингибиторов протеинфосфатаз; их обшей особен-
ностью является наличие START-домена, который используется для
белок-белковых взаимодействий.

Изучение кристаллической структуры рецепторов RCAR устано-
вило, что сайт связывания АБК представляет собой участок внутри
START-домена, который образует гидрофобный «карман». Связыва-
ние АБК меняет конформацию рецепторов RCAR, что необходимо
для их взаимодействия с г.ротеинфосфатазами 2С. При этом гидро-
фобный «карман» START-домена RCAR-белка закрывает каталити-
ческий сайт прогеинсЬосфатазы, подавляя его активностр.

Сигнальная трансдукция АБК, опосредованная рецепторами
RCAR/PYR/PYL

В настоящее время выявлены несколько компонентов пути пере-
дачи сигнала, опосредованного рецепторами RCAR: это протеин-
фосфагазы 2С, прогеинкиназы SnRK2, транскрипционные факторы
ABF (рис. 7.4).

I Просеинфоефатазы 2С (РР2С) — первый компонент пути пере-
дачи сигнала АБК, действующий после рецепторов RCAR) У ара-
бидопсис выявлено 80 белков РР2С, шесть из которых, относящи-
еся к подсемейству A (ABI1, ABI2, НАВ1, НАВ2, AHG1 и РР2СА/
AHG3), участвуют в передаче сигнала АБК. (Первыми из выявлен-
ных белков этого подсемейства являются фосфатазы ABI1 и ABI2,
которые, по-видимому, регулируют все АБК-зависимые онтогенети-
ческие процессы, гак как усиление функции соответствующих генов
у доминантных мутантов abil и abi2 приводит к развитию фенотипа,
характерного для АБК-дефицитных растений.

Прогеинфосфатазы 2С являются негативными регуляторами от-
вета на АБКт— таким образом, подавляя фосфа) азную активность
РР2С, рецепторы RCAR активируют следующие компоненты переда-
чи сигнала АБК. Одним из этих компонентов являются протеинкина-
зы SnRK.2 (SNF1 Related protein Kinase 2) — позитивные регуляторы
передачи сигнала АБК.,При отсутствии активной АБК РР2С подавля-
ют активность SnRK2 киназ,1дефосфорилируя их молекулы по много-
численным остаткам Ser и Thr в каталитическом домене. |В присут-
ствии активной АБК рецепторы RCAR связывают и инактивируют
РР2С, снимая репрессию SnRK2 киназ и запуская ответ на АБК,
ABF-регулирусмые гены

Рис. 7.4. Передача сигнала АБК. опосредованная рецепторами RCA-i

А — при отсутствии АБК фосфатазы РР2С дсфпсфорилируют протеинкиназы SiiRK2. что
приводит к их инактивации и невозможности дальнейшей передачи сигнала АБК.

Б—при связывании активной АБК рецептор RCAR подавляет фосфатазную активность
РР2С по отношению к SnRK2. Активные протеинкиназы SnRK2 фосфорилируют и ак
тивируют |ранскрипиионные Факторы ABF. Транскрипционные факторы АВГ образуют
гомо и гетеродимеры и связываются с пссгедователоностями ACRE в громотсрах АБК-
регуп/руемых _енов На эффективность связывания АВААВРЕ влияют белки ARIA и ADAP.
Негативным регулятором ответа на АБК являетсг убиквитин-лигаза SIZ1, опосредующая
убиквитин-зависимый прс1еог.из ABF

Протеинкиназы SnRK2 — специфическая для растений труппа
Ser/Thr-протеинкиназ. Первой из выявленных 8пКК2-протеинкиназ
была киназа РКАВА1 (Protein Kinase ABA 1) пшеницы, в дальнейшем
ее гомологи были идентифицированы у всех изученных видов расте-
ний: например, у арабидопсис и риса выявлено по 10 8пКК2-киназ.

Фенотипы мутантов с потерей функции отдельных SnRK2 про-
теинкиназ свидетельствуют о том, что для разных 8nRK2 характер-
на специализация в контроле строго определенных АБК-зависимых
процессов. Так. у арабидопсис киназа SnRK2.6/()8Tl действует как
регулятор АБК-индуцируемого закрывания устьиц, и мутант с по-
терей ее функции ostl (open stomata Г) имеет постоянно открытые
устьица и увядающий фенотип; киназы SnRK2.2 и SnRK2.3 уча-
ствуют в АБК-зависимой репрессии прорастания семян и роста
корня. Мутант арабидопсис с потерей функции трех SrRK2 про-
теинкиназ (snrk 2.2 snrk 2.3 snrk 2.6) имеет нарушение всех АБК-
зависимых процессов и демонстрирует фенотип, характерный для
АЬК-нечувствительных растений; у него подавлена экспрессия
большинства известных АБК-регулируемых генов, что свидетель-
ствует о функции киназ SnRK2 как ключевых регуляторов передачи
сигнала АБК.

В передаче сигнала АБК протеинкиназы SnRK2 действуют после
протеинфосфатаз 2С, которые негативно регулируют их активность.
Кроме того, по крайней мере с некоторыми протеинкиназами SnRK?
могут непосредственно взаимодействовать рецепторы RCAR: на
пример, для белков PYR1 и SnRK2.3 характерна коиммунопреци-
питация, независимая от связывания АБК, что свидетельствует об
их физическом взаимодействии. Данные по коиммунонреципитации
рецепторов RCAR, фосфатаз РР2С и киназ SnRK2 позволяют пред-
положить, что эти белки, действующие на ранних этапах ответа на
АБК, могут образовывать сигналосомные комплексы

Транскрипционные факторы ABF (ABA-responsive element Bind-
ing Factors) откосятся к семейству b-ZIP и являются основными ми-
шенями прогеинкиназ SnRK2. Семейство ABF арабидопсис включает
в себя транскрипционные факторы ABF 1, ABF2/AREB1, ABF3, ABF4/
AREB2 и АВ15, которые специфически связываются с консервативной
последовательностью ABRE (ABA-Responsive Element) в промоторах
АБК-регулируемых генов;

Интересно, что последовательности ABRE не работают «пооди-
ночке»: для регуляции экспрессии генов транскрипционными факто-
рами ABF необходимо наличие в их промоторах как минимум двух
ABRE, которые, вероятно, взаимодействуют между собой при связы-
вании ABF. Транскрипционные факторы ABF связываются с ABRE
последовательностями в виде гомо- и гетеродимеров.

Протеинкиназы SnRK.2 осуществляют фосфорилирование белков
ABF по консервативным остатками Ser и ТЬг. Ингибитор протеинки-
наз ставроспорип препятствует активации транскрипционных фак-
торов ABF — таким образом, фосфорилирование является основ
ным способом контроля их активности.

/Для генов ABF характерна тканеспецифичность экспрессии, для
некоторых белков ABF показано преимущественное взаимодействие
с определенными представителями протсинкиназ SnRK2; кроме
того, разные ABF могут индуцировать экспрессию разных ABF-
регулируемых генов.
Основными мишенями транскрипционных факторов ABF явля-
ются гены, регулирующие ответ растений на биотический и абио-
тический стресс (см. ниже). К первой группе относятся гены, коди-
рующие PR (Pathogen Related) белки, которые играю! важную роль
в защите от паюгснов. Ко второй группе относятся гены LEA (Late
Embryogenesis Abundant) белков, которые защищают растение от де-
гидратации^

Регуляция активности транскрипционных факторов ABF.
Фосфорилирование транскрипционных факторов ABF протеинки-
назами SnRK.2 является основным путем регуляции их активности.
Кроме того, интенсивность ABF-опосредованного ответа на АБК
может регулироваться и другими способами.

Одним из таких способов является регуляция экспрессии генов
ABF, которая запускается в ответ на повышение концентрации АБК.
дегидратацию и солевой стресс. Основным регулятором экспрессии
ABF-генов является АР2-подобный транскрипционный фактор
ABI4, который шрает важную, но не до конца понятную роль в от-
вете на АБК и ряд других сигналов (например, сахарозу). В геномах
арабидопсис и риса транскрипционный фактор ABI4 кодируется уни-
кальным геном. Потеря функции гена АВ14 у мутанта ABA-i>isensitive
4 (ahi 4) вызывает снижение чувствительности к АБК в процессах
созревания семян н прорастания, при этом другие АБК-зависимые
процессы (например, закрывание устьиц) остаются незатронутыми.
Экспрессия гена ABI4 приурочена к строго определенным момен-
там развития растения: в частности, этот ген экспрессируется на вы-
соком уровне на поздних стадиях эмбриогенеза и на самых ранних
этапах прорастания. Вышележащие механизмы, приводящие к ак-
тивации транскрипционного фактора ABI4, неизвестны. Мишенями
транскрипционного фактора АВ 14 являются короткие последова-
тельности СЕ (Coupling Elements) в промоторах ряда генов. Одной
из мишеней АВИ является ген ABI5, кодирующий транскрипцион-
ный фактор из группы ABF. Кроме того, транскрипционный фактор
АВ14 позитивно регулирует экспрессию своего собственного гена;
в промоторе гена АВ14 также присутствуют последовательности СЕ.
Интересно, что наличие последовательностей СЕ наряду с последо-
вательностями ABRE в промоторах АБК-регулируемых генов уси-
ливает связывание с ними транскрипционных факторов ABF, хотя
механизмы взаимодействия этих последовательностей в настоящее
время не выяснены.

Активность транскрипционных факторов ABF регулируется
также через взаимодействие с различными белками. С помощью
дрожжевой двугибридной системы были обнаружены дополнитель-
ные компоненты пути передачи сигнала АБК — белки ARIA (ARM
Repeat protein interacting with ABF2), ADAP (ARIA-interacting Dou-
ble AP2-domain Protein), взаимодействующие с транскрипционными
факторами ABE Точные функции этих, белков неизвестны,доба они
обладают собственной ДНК-связызающей активностью и являются
позитивным регулятором отвела на АБК.

- Еще один способ регуляции активности транскрипционных фак -
торов ARF связан с их убиквитин-зависимым протеолизом, который
контролируют убиквигин-лигазы группы SUMO (Small Ubiquitin-
related Modifier). SUMO убиквитин-лигаза SIZ1 является негатив-
ным регулятором передачи сигнала АБК: она присоединяет молеку-
лы убиквитина к транскрипционному фактору ABI5, что делает его
мишенью для деградации 268-протеасомой. Мутанты арабидопсис
с потерей функции sizl демонстрируют сверхчувствительность к АБК
в таких процессах, как ингибирование прорастания семян и роста кор-
ня. К развитию такого же фенотипа приводит замещение консерватив-
ного остатка лизина в молекуле ABI5, которое делает невозможным
его взаимодействие с SIZ1 и повышает стабильность белка АВ15.

GCR и GTG - плазмалемные рецепторы АБК, участвующие
в контрсле созревания зародыша и периода покоя семян

Последняя группа [рецепторов АБК —- белки семейства GPCR
(G-Proteins Coupled Receptors). Рецепторы этого типа широко рас-
пространены у растений — в частности, к GPCR-белкам принад-
лежит рецептор ауксинов АВР1.

Рецептор АБК GCR2 — трансмембранный плазмалемный бе-
лок, взаимодействующий с гетеротримерным комплексом G-белков
При связывании активной АБК происходит диссоциация комплекса
G-белков с образованием свободной субъединицы Ga и G0/Gy димера,
которые активируют следующие компоненты сигнальной трансдук-
ции АБК (рис. 7.5). Потеря функции рецептопа GCR2 у мутанта ара-
бидопсис gcr2 приводит к ослаблению большинства АБК-зависимых
процессов — таких как период покоя семян и закрывание устьиц, тог-
да как сверхэкспрессия гена (jCR2 у трансгенных растений вызывает
сверхчувствительность к АБК. Вместе с тем мутант gcr2 имеет «ела
бый» АБК-нечувствительный фенотип — вероятно, в связи с наличи-
ем нескольких рецепторов к АБК в растительной клетке.

Действительно, помимо GCR2, у арабидопсис существуют и дру-
гие белки GPCR, участвующие в ответе на АБК. Например, белок
Рис 7.5 Передача сигнала АБК, опосредованная рецептором GCH2

Рецептор GCR2 взаимодействует с G белками Связывание АБК с GCR2 вызывает диссоциа-
цию гстсротримера G-белков ла и и ру субъединицы. Субъединица a G белков активирует
фосфолипазу D (PLD), которая кататизирует гидролиз фосфолипидов (PL) с образованием
фосфатидных кислот (РА). Фосфатидные кислоты взаимодействуют с транскрипционным
фактором ABI3, который связывается с RY-последовательностями в промоторах АБК-
регулируемых генов, связанных с контролем созревания семян (гены запас! ых белков
и LFA- белков), при этом происходит диссоциация транскрипционного рспресссра VAI. с RY-
гсспедовательностей. РА могу* подвер'аться катаболизму с помощью киназы фосфатид-
ных кислот (РАК) и лиг идфосфат-фосфатазы (LPP), в результате образуются диацилглице-
рол (DAG) и диацилтицерол-пирофосфат (DGPP) — вторичные мессенджеры, позитивно
рейдирующие передачу сигнала АБК (точные механизмы неизвестны). Субьединица ру
G-белков негативно регулирует гередачу сигнала АБК (точные механизмы неизвестны)

GCR1, как и GCR2, взаимодейст вует с гетеротри мерным комплексом
G-бслков, но является негативным регулятором АьК-зависимых про-
цессов. В то же время в отличие от GCR2 GCR1 не связывает АБК —
тацсим образом, точная функция этого белка остается неизвестной.

Недавно у арабидопсис были выявлены АБК-связывающие белки
GTG1 и GTG2 (GPCR-Туре G-proteins 1 и 2), также относящиеся к
труппе GPCR. Это плазмалемные белки,]имеющие 9 трансмембран-
ных доменов (в отличие от остальных XjPCR, молекулы которых про-
низывают мембрану 7 раз),^которые обладают высокой гомологией с
рецептором GPR89 в клетках человека. Характерной особенностью
GTG1 и GTG2 является наличие собственных ГТФ связывающей и
ГТФазной активностей: очищенные рекомбинантные GTG1 и GTG2
не только специфически связывают ГТФ, но и гидролизуют ее. Бо-
лее того, оба белка физически взаимодействовали с Ga арабидоп-
сис — белком GPAI.(Белки GTG1 и GTG2 специфически связывают
активную АБК in vivo и in vitro, потеря функции обоих GTG-белков
у двойных мутантов gtgl gtg2 приводит к снижению чувствитель-
ности к АБК.

Дополнительная информация

Последние данные, полученные при изучении GPCR-рецепторов АБК, поставили
под сомнение рецепторную функцию белка GCR2, а также гомологичных ему белков
GCL1 и GCL2: способность их к взаимодействию с АЬК не была подтверждена более
поздними исследованиями, более того, были получены данные об отсутствии у этих
белков'7 трансмембранных доменов, характерных для всех GPCR. Эти данные объ-
ясняют слабый АБК-нечувствительный фенотип у мутанта с потерей функции gcr2.
Таким образом, в качестве функциональных GPCR-рецепторов АБК в настоящее вре-
мя рассматриваюгея только недавно выявленные белки арабидопсис GTG1 и GTG2.
Данные о взаимодействии GTG1 и GTG2 с нижележащими путями сигнальной транс-
дукции АБК в настоящее время являются неполными. Вероятно, в основе активации
нижележащих сигнальных путей лежит взаимодействие GTG1 и GTG2 с Ga.

Сигнальная трансдукция АБК опосредованная рецепторами GPCR

Путь сигнальной трансдукции, опосредованной рецепторами
GPCR, включает в себя фосфолипазы D и синтезируемые ими ли-
пидные вторичные мессенджеры, которые активируют транскрип-
ционный фактор АВ13.

Фосфолипазы D и липидные вторичные мессенджеры. Пер
вым компонентом пути передачи сигнала АБК, опосредованного ре-
цепторами GPCR, являются фосфолипазы D (PLDal), с которыми
напрямую взаимодействует а-субъединица G-белков. Фосфолипазы
D гидролизуют фосфолипиды с образованием фосфатидных кис-
лот — вторичных мессенджеров, участвующих в регуляции переда-
чи сигнала АБК. У арабидопсис выявлено 12 изоформ фосфолипа-
зы D — PLDa, PLDP и т. д., которые имеют разные каталитические
свойства и особенности регуляции, основную роль в передаче сигна-
ла АБК играет PLDal.

Основная функция фосфатидных кислот, продуцируемых PLD,
в передаче сигнала АБК — активация транскрипционных факто-
ров ABA-INSENSITIVE 3 (ABI3), LEAFY COTYLEDONE 2 (LEC2)
и FUSCA 3 (FUS3), которые являются ключевыми регуляторами со-
зревания зародыша. Кроме того, фосфатидные кислоты участвуют
в коммуникации между разными путями передачи сигнала АБК: они
взаимодействуют с протеинфосфатазой ABI1, кот орая является ре-
прессором пути передачи сигнала, опосредованного рецепторами
RCAR, и ингибируют ее фосфатазную активность.

В передаче сигнала АБК также принимают участие липидные
вторичные мессенджеры, образованные при кагаболизме фосфа-
тидных кислот. Фермент липидфосфат-фосфатаза катализирует пре-
вращение фосфатидных кислот в диацилглицерол (D AG),.который
действует в передаче сигнала АБК через активацию транскрипци-
онного фактора АВИ. Еше один фермент - киназа фосфатидной
кислоты — фосфорилирует фосфатидные кислоты с образованием
диацилглицерол-пирофосфата (DGPP), который, по последним дан-
ным, играет ключевую роль в АБК-зависимом ингибировании про-
растания. Также имеются данные о том, что, помимо фосфолипа-
зы D, в передаче сигнала АБК играет рольДюсфрлипаза С, которая
катализирует синтез фосфатидилинозитолби- и трифосфатов (PIP).
Эти сигнальные молекулы принимают участие в контроле ряда АБК-
зависимых процессов, в частности в открывании устьиц.

Транскрипционный фактор ABI3. Последним звеном цепи сиг-
нальной трансдукции, опосредованной рецепторами GCR2 и GTG,
является транскрипционный фактор ABI3. Этот белок относится
к группе транскрипционных факторов с ДНК-связывающим ВЗ-
доменом, к которой также принадлежат транскрипционные факторы
ARF, действующие в передаче сигнала ауксинов Кроме ToroJ|AJ313
является близким гомологом транскрипционных факторов LEC2
и FUS3, играющих ключевую роль в созревании зародышэ^см. главу
«Эмбриогенез»), Активность LEC2 и FUS3 также индуцируется фос
фатидными кислотами и зависит от АБК—таким образом, функции
всех грех транскрипционных факторов в контроле эмбриогенеза ча-
стично перекрываются.

Транскрипционный фактор ABI3 связывается с последовательно-
стями RY, которые имеются в промоторах ряда АБК-регулируемых
генов. Основными мишенями транскрипционного фактора ABI3 яв-
ляются гены, связанные с процессом созревания зародыша— в част
ности, гены запасных белков семян.

Другой важной функцией транскрипционного фактора ABI3 яв-
ляется активация взаимодействия транскрипционных факторов
ABF, действующих в сигнальном пути, опосредованном рецеп-
торами RCAR, с их мишенями. Несмотря на то что в промоторах
многих АБК-регулируемых генов имеются как RY-, так и ABRE-
последовательности, установлено, что в контроле экспрессии
АБК-индуцируемых генов транскрипционный фактор ABI3 дей-
ствует раньше транскрипционных факторов ABF: например, для
ABF-зависимой активации экспрессии LEA генов в созревающем
зародыше арабидопсис необходим активный белок АВ13.

' Регуляция активности транскрипционною фактора ABI3. По-
мимо основного способа регуляции активности ABI3 с помощью фос-
фатидных кислот, существует его регуляция на уровне экспрессии.
Регулятором экспрессии гена ABI3, так же как и генов LEC2 и FUS3,
является транскрипционный фактор LEAFY COTYLEDONE 1 (LEC1),
который запускает экспрессию этих трех генов при переходе зароды-
ша от морфогенеза к созреванию (см. главу «Эмбриогенез»).

При изучении взаимодействия транскрипционных факторов A BI3,
LEC2 и FUS3 было показано, что АВ 13 сам по себе не может связы-
ваться с RY-последовательностями in vitro, тоща как LEC2 и FUS3
могут. Недавно было установлено, что для взаимодействия с RY-
последовательностями необходимо фосфорилирование транскрип-
ционного фактора ABI3, поскольку взаимодействие ABI3-RY пре-
кращается в присутствии ингибитора протеинкиназ ставрослорина.
В настоящее время нет данных о том, какие именно протеинкиназы
катализируют фосфорилирование ABI3. Дефосфорилирование и нега-
тивную регуляцию транскрипционного фактора ABI3 осуществляют
протеинфосфатазы РР2С, которые играют ключевую роль в передаче
сигнала АБК, опосредованной рецепторами RCAR. Дефосфорилиро-
вание меняет конформацию белка ABI3, в результате чего он теряет
возможность взаимодействия с RY-последовательностями.

Еще одним негативным регулятором активности ABI3 является
белок VALI (VPl/AB13-Like ВЗ) арабидопсис, который относится
к той же группе транскрипционных факторов с ВЗ-доменом, что
и ABI3, LEC2 и FUS3. Особенностью белка VAL1 является наличие
EAR-домена, который функционирует как репрессор транскрипции.
Мишенями репрессора транскрипции VAL1 являются гены запасных
белков: связывание VAL1 с RY-песладовательностями в их промото-
рах препятствует присоединению ABI3, LEC2 и FUS3. Недавно было
установлено, что механизм VAL-зависимой репрессии транскрипции
связан с деацетилированием гистонов, поскольку EAR-домен белка
VAL1 взаимодействует с гистон-деацетилазными комплексами.

Взаимодействие путей передачи сигнала АБК

Несмотря на существование четырех независимых путей переда-
чи сигнала АЬК, в последнее время были получены данные, свиде-
тельствующие о взаимодействии разных путей в контроле экспрес
сии АБК-регулируемых генов (рис. 7.6).

Взаимодействие ABI3-AB15. Два АБК-зависимых транскрип-
ционных фактора, действующие в разных путях передачи сигнала
АБК, — ABI3, действующий в пути, опосредованном рецепторами
GPCR, и ABI5, действующий в пути, опосредованном рецепторами
RCAR, — напрямую взаимодействуют друг с другом и совместно
регулируют экспрессию генов, контролирующих созревание семян.
В это взаимодействие вовлечен домен В1 белка ABI3 и N-концевой
домен белка ABI5, с помощью которого транскрипционные факторы
ABF образуют гомо- и гетеродимеры для связывания с последова-
тельностями АВВЕ/Дранскринционный фактор АВ13 выступает как
коакгивагор связывания транскрипционного фактора ABI5 с его ми-
шенями. В свою очередь, ABF-белки также могут быть активатора-
ми связывания ABI3 с RY-последовательностями.

\ Взаимодействие ABF-ABI4. Гены, регулируемые транскрипци-
онными факторами ABF,t могут экспрессироваться не только при
наличии в их промоторах двух и более взаимодействующих ABRE-
последовательностей, но также шри наличии одной последователь-
ности ABRE и одной последовательности СЕ (Coupling Element),
с которой связывается АР2 подобный транскрипционный фактор
АВ14. Таким образом, предполагается, что роль транскрипционного
фактора ABI4 в ответе на АБК не ограничивается позитивной регу-
ляцией экспрессии генов ABF (см. выше): помимо этого АВ14 может
также быть коактиватором экспрессии АВF-регулируемых генов,
взаимодействуя с транскрипционными факторами ABF.

Взаимодействие LEC1-ABF. Недазно были получены данные
о взаимодействии транскрипционных факторов ABF с транскрип-
ционным фактором LEC1, который является ключевым регулятором
процесса созревания зародыша, индуцируя экспрессию генов А В13,
FUS3 и LEC2. В экспериментах по иммунопреципитации было пока-
зано, что белки LEC1 иАВЕ формируют комплекс in vivo и совмест-
но регулируют экспрессию генов запасных белков, в промоторах ко-
торых имеются ABRE-последовательности. Взаимодействие LEC1
и ABF не связано с активацией последнего в ответ на АБК и может
быть использовано как АБК-независимый путь регуляции генов за
пасных белков/

Взаимодействие АВ13-РР2С. В АВ13-зависимой регуляции экс-
прессии ряда генов большое значение имеет дефосфсрилированпе
транскрипционного фактора ABI3 протеикфеефатазами РР2С, кото-
рые действуют в пути сигнальной трансдукции АБК, опосредованной
Рис. 7.6. В заикедействие путей передачи сигнала АБК. опосредованных редел горами

RCAR/PYR/PY- и GCPR. Пояснения в тексте

рецепторами RCAR. Установлено, что дефосфорилирование АВ13
играет ключевую роль в подавлении экспрессии генов запасных бел-
ков при переходе зародыша к периоду покоя. Фосфатидные кислоты,
которые в передаче сигнала АБК действуют выше транскрипционного
фактора ABI3, подавляют фосфатазную активность РР2С.

Таким образом, в настоящее время выявлено взаимодействие двух
путей передачи сигнала АБК, опосредованных рецепторами RCAR
и GCR2/GTG. Такое взаимодействие играет важную роль в контроле
процессов созревания зародыша (см. ниже), а также, возможно, дру-
гих АБК-зависимых процессов.

В то же время данных о взаимодействии путей передачи сигна-
ла АБК, опосредованных рецепторами FCA и CHLH, до настоящею
времени получено не было. '

7.3.	Функции абсцизовой кислоты в развитии растений

Среди функций АБК наиболее известными являются контроль
закрывания устьиц, стимуляция созревания зародыша и периода по-
коя семян, ингибирование прорастания. Кроме того, АБК является
одним из центральных регуляторов адаптации растений к абиотиче-
ским стрессам — таким, как высыхание, засоление и низкая темпе-
ратура.
Ком роль закрывания устьиц

Закрывание устьиц — АБК-зависимый процесс, необходимый
для снижения потери влаги путем прекращения устьичной транспи-
рации Уровень биосинтеза ЛБК в листьях повышается в ответ на
высыхание, что приводит к падению тургора замыкающих клеток
и закрыванию устьиц. Это быстрый ответ на АБК: он не требует из-
менения экспрессии генов и основан на АБК-зависимой деполяри-
зации плазмалеммы замыкающих клеток за счет изменения работы
ионных каналов (рис. 7.7). Мутанты с нарушением биосинтеза или
передачи сигнала АБК не способны к закрыванию устьиц, для них
характерна усиленная транспирация и «увядающий» фенотип.

Центральным событием в закрывании устьиц является повыше-
ние уровня ионов Са?+ в клетке, которое достигается за счет входа

Рис 7.7. АБК-зависимые изменения работы ионных каналов в замыкающих клетках
устьиц

А — схема, иллюстрирующая последовательность событий при активации ионных
канг лов (пояснения в тексте). Б — крат ксвременное повышение уровня ионов Са2’ в за-
мыкающей клетке при добавлении АБК (по Marten ei al, 2007). На фотографии видно
свечение Са2+-репортера FUHA2, цветовая шкала показывает концентрацию ионов Са2+
ионов Са24 через кальциевые каналы плазмалеммы, а также выброса
их из центральной вакуоли. Оба эти процесса зависят от АБК.

Основными активаторами Са21-каналов являются вещества груп-
пы ROS (Reactive Oxygen Species), в частности О2- и Н,О.. Уровень
этих веществ в замыкающих клетках устьиц контролируется АБК
за счет позитивной регуляции экспрессии генов NADPH-оксидаз
ферментов, играющих ключевую роль в продукции ROS. Другая
группа регуляторов Са2'-каналов - липидные сигнальные молеку-
лы, синтез которых активируется при связывании АБК с рецептора-
ми группы GPCR.

Ионы Са21 активируют работу калиевых каналов; выброс ионов К
из клетки вызывает первичную деполяризацию плазмалеммы. Депо-
ляризация, а также ионы Са2+ необходимы для активации медленных
Са2н-активируемых анионных каналов (каналов S-типа), осуществля-
ющих выброс из клетки ионов С1- и малат2'. Активация каналов S-типа
приводит к длительной деполяризации плазмалеммы. Деполяризация
мембраны, а также повышенный внутриклеточный уровень ионов
Са2' влекут за собой изменения актинового цитоскелета замыкающих
клеток, приводящие к закрыванию устьиц^ Роль в динамике цито-
скелета при закрывании устьиц играют также липидные сигнальные
молекулы, которые синтезируются при активации рецепторов GPCR:
в частности, фосфатидилинозитол-трифосфат (PtdIns3P) и фосфатид-
ные кислоты являются ре1уляторами реорганизации актиновых фила-
ментов в клетках всех эукариот благодаря своей способности взаимо-
действовать с белками, участвующими в полимеризации актина.

Контроле созревания зародыша

В контроле развития зародыша АБК играет двоякую роль: на
ранних стадиях эмбриогенеза АБК стимулирует рост и морфогенез
зародыша, тогда как на поздних стадиях, когда уровень АБК в за
родыше значительно повышается, она блокирует рост зародыша,
стимулирует накопление в его тканях питательных веществ и пере-
ход к периоду покоя.. Экспрессия генов ZEP, NCED и АВА2, контро-
лирующих разные этапы биосинтеза АБК, у арабидопсис выявлена
в женском гаметофите и в зародыше на ранних стадиях развития.
При переходе зародыша к созреванию в семенах активируется био-
синтез каротиноидов, а также резко возрастает уровень экспрессии
генов ZEP и NCED, что приводит к повышению концентрации АБК.
В конце стадии созревания уровень АБК в зародыше и эндосперме
снова снижается, причиной чему является повышение уровней экс-
прессии генов CYP707A, контролирующих инактивацию АБК
Промесс созоевания зародыша достаточно четко делится на два
этапа, которые различаются по набору экспрессирующихся в них ге-
нов. На первом этапе (который также называют стадией МАТ — от
maturation) имеет место накопление питательных веществ. На втором
этапе (стадии LEA — от LEA-бслков, с накоплением которых связан
этот период) происходит подготовка зародыша к периоду покоя, он
приобретает устойчивость к высыханию. АБК является ключевым
регулятором обеих стадий созревания зародыша, при этом в обеспе-
чении МАТ- и LEA-стадий принимают участие две разные группы
АБК-зависимых транскрипционных факторов.

Основной характеристикой стадии МАТ является экспрессия ге-
нов запасных белков (например, генов олеозина и круциферина ара-
бидопсис), которые необходимы для обеспечения будущего пророст-
ка питательными веществами. В промоторах всех генов запасных
белков имеются последовательности RY для связывания транскрип-
ционных факторов ABI3, LEC2 и FUS3, а также иногда последова-
тельности ABRE для связывания транскрипционных факторов АВЕ
Функция АБК как ключевого регулятора МАТ-стадии созревания
зародыша осуществляется через транскрипционные факторы ABI3,
LEC2 и FUS3 Кроме того, в контроле экспрессии некоторых генов за-
пасных белков имеет место взаимодействие ABI3-ABF (см. выше).

Поздняя стадия созревания зародыша — стадия LEA — связана
с накоплением ЕЕА-бетжовДБелки LEA (Late Embryogenesis Abun-
dant), которые вст речаются практически у всех про- и эукариот, у рас-
тений являются основными регуляторами устойчивости клетки к вы-
сыханию и низкой температуре, тем не менее механизм их действия
остается непонятным. Это небольшие (100-250 аминокислот) пепти-
ды, особенностью которых является высокая гидрофильность и ста
бильность при разных температурах. В геноме арабидопсис иденти-
фицированы более 50 генов LEA, которые экспрессируются в разных
органах и на разных стадиях развития, причем максимум их экспрес-
сии наблюдается в созревающих семенах/Накопление LEA-белков
на поздней стадии созревания играет центральную роль в предохра-
нении покоящегося зародыша от высыхания. Б постэмбриональном
развитии растений LEA-белки выполняют ту же функцию: защища-
ют ткани растения от дегидратации; уровень экспрессии генов LEA
в вегетативных тканях резко возрастает в условиях стресса. В промо-
торах большинства LEA-генов отсутствуют RY-последовательности,
при этом имеются две-три последовательности ABRE для связывания
транскрипционных факторов ABF, а также в ряде случаев последова-
тельности СЕ для связывания транскрипционного фактора ABI4 ,
Рис. 7.8 Регуляция экспрессии генов нг МАТ- и LEA-стадигх созревания зародыша
Вверху — экспрессия генов запасных белков (CRC — ген круциферина). в промото-
рах которых содержатся РУ-поспедсватепьноыи На стадии МАГ с их промоторами
связывается транскрипционный фактор АВ13, запуская транскрипцию. При переходе
к стадии L.EA протеинфосфатазы РР2С дефосфорилируют и инактивируют ABI3,
к промоторам генов запасных белков присоединяется белок VAL1, который подавляет
их транскрипцию за счет деацетилирования гистонов комплексом HDAC
Внизу — экспрессия генов LEA-бслков, в промоторах которых содержатся ABRE-
послсдовательнссти. На стадии МАТ гены LEA экспрессируются на низком уровне.
На стадии LFA активируется присоединение транскрипционных факторов ABF к их
промоторам — возможно, за счет взаимодействия ABI3-ABF

Итак, МАГ-стадия созревания зародыша регулируется транс-
крипционными факторами ABI3, LEA-стадня — транскрипцион-
ными факторами АВЕ*Ключевым событием при переходе от стадии
МАТ к стадии LEA является подавление экспрессии генов запасных
белков и запуск экспрессии LEA-геновфрис. 7.8).

' Основную роль в «выключении» генов запасных белков при
переходе к стадии LEA играет инактивация транскрипционного
фактора ABI3 за счет его дефосфорилирования протеинфосфатаза-
ми РР2С. Действительно, в начале LEA-стадии имеет место акти-
вация РР2С.дПо-видимому, основную роль в этом процессе играет
фосфатаза AHG1, поскольку только у мутанта арабидопсис с поте-
рей функции ahgl экспрессия генов запасных белков продолжает-
ся вплоть до стадии прорастанияфПосле диссоциации ABI3 с RY-
последовательностей в промоторах генов запасных белков с ними
связывается транскрипционный репрессор VAL, который подавляет
транскрипцию этих генов за счет деацетилирования гистонов.
Одновременно с подавлением экспрессии генов запасных бел-
ков происходит активация экспрессии LEA-генов за счет взаи-
модействия димеров транскрипционных факторов ABF с ABRE-
последовательностями в их промоторах. Вышележащие механизмы,
запускающие экспрессию 2£Л-генов именно на этой стадии, в на-
стоящее время неизвестны. Согласно одному из предположений,
для активации экспрессии LEA-генов необходимо взаимодействие
транскрипционных факторов ABF с АВ13, который являетря коакти-
валором их присоединения к ABRE-последовательностям^

Стимуляция периода покоя семян

Ijlocne LEA-стадии созревания зародыша наступает период покоя
семян, Период покоя включает в себя три основных момента: 1) пре-
кращение влаго- и газообмена зародыша с окружающей средой, что
достигается за счет семенной кожуры, 2) ингибирование метаболи-
ческих процессов и экспрессии генов зародыша и 3) ингибирование
прорастания.

Два последних процесса являются АБК-зависимыми и связаны
с активностью транскрипционного фактора ABI3 (рис. 7.9). Несмотря
на то что уровень АБК в самом зародыше снижается к концу LEA-
стадии созревания, в течение периода покоя АБК синтезируется в се-
менной кожуре и перикарпе; у зародышей некоторых видов растений
в течение периода покоя продолжается синтез АБК в семядолях.

Прекращение экспрессии генов зародыша контролируется на
уровне репрессии транскрипции и пост-транскрипционных мо-
дификаций РНК. У разных видов растений выявлен ряд мутаций,
приводящих к сверхчувствительности к АБК и длительному перио-
ду покоя семян и получивших общее название Jog-мутации (delay
of germination), 3 дальнейшем установлено, что фенотипы dog-
мутавтов арабидопсис связаны с потерей или усилением функции
генов, участвующих в контроле транскрипции и посттранскрипци-
онных модификаций РНЮ

Например, один из генов-регуляторов периода покоя — RDO2
(REDUCED DORMANCY 2) кодирует фактор элонгации транскрип-
ции S-II (TF11S), гомологи которого хорошо изучены у дрожжей
и животных. Репрессия транскрипции генов зародыша в период по-
коя осуществляется также за счет изменения структуры хроматина:
например, ген RDO4 кодирует убиквитин-лигазу. осуществляющую
моноубиквитинирование гистона Н2В?Крометсго, в АБК-зависимом
контроле периода покоя семян действуют механизмы, связанные
с процессингом мРНК. У арабидопсис был выявлен ряд Jog-мутаций
Рис. 7 9 Центральная рстгь АБК в контроле периода покоя семян

АБК репрессирует транскрипцию генов зародыша за счет подавления центральных
регуляторов транскрипции и созревания РНК (путь DOG — Delay 01 Germination). АЬК
подавляет гиббсреллин-зависимый процесс прорастания за счет активации генов
катаболизма гиббереллинов, стабилизации DELLA-белков, регрессии транскрипцион-
ных факторов GAMYB с помощью miR 159 и подавления экспрессии генсв а-амилаз
с помощью транскрипционных факторов WRKY

с потерей функции генов, контролирующих копирование мРНК
(АВА-hypersensitive (abh)), синтез miPHK (hyponastic leaves (hyl)),
сплайсинг мРНК (supersensitive to ABA and drought l(sadl)) и поли-
аденилирование мРНК (ABA hypersensitive germination 2 (ahg2)). Bee
перечисленные мутанты характ еризуюгся сверхчувствительностью
к АБК и длительным периодом покоя семян таким образом, со-
ответствующие гены являются негативными регуляторами периода
покоя.

Изменение чувствительности к АБК у мутантов по периоду по-
коя позволяет предположить, что экспрессия перечисленных DOG-
генов контролируется АБК или же их функции связаны с передачей
сигнала АБК. Тем не менее вышележащие АБК-зависимые м.еханиз-
мы контроля периода покоя семян остаются неизвестными. L
Ингибирование прсрастания семян

Прорастание семян включает в себя два основных этапа: пре-
кращение периода покоя и начало вегетативного развития зрело-
го зародыша с превращением его в проросток. АБК-зависимое за-
медление или прекращение прорастания является необходимым
условием выживания семян в стрессовых условиях, при которых
усиливается синтез АБК в материнском растении и семенной ко-
журе.

Наиболее раннее событие при прорастании, которое является
индуктором прекращения периода покоя и начала развития про-
ростка, — секреция а-амилаз алейроновым слоем эндосперма. Этот
процесс позитивно регулируется гиббереллинами путем прямой ак-
тивации генов а-амилаз гиббереллин-зависимыми транскрипцион-
ными факторами GAMYB (см. главу «Гиббереллины»).

АБК является антагонистом гиббереллинов в контроле прорас-
тания семян (рис. 7.9). Во-первых, АБК стимулирует экспрессию
генов, связанных с инактивацией гиббереллинов (гены Ga2Ox) и ре-
прессией передачи их сигнала (гены DELLA-белков), а также нега-
тивно регулирует экспрессию генов GAMYB. АБК-зависимое пода-
вление экспрессии генов GAMYB осуществляется через деградацию
их транскриптов с помощью микроРНК гшК159. АБК стимулирует
накопление этой микроРНК в покоящихся семенах, поскольку ген
miR159 является прямой мишенью транскрипционного фактора
ABI3.

Во-вторых, АБК репрессирует передачу сигнала гиббереллинов за
счет стабилизации DELLA-белка RGL, основной функцией которо-
го является репрессия прорастания (механизмы его АБК-зависимой
стабилизации неизвестны).

Наконец, АБК может напрямую, без участия гиббереллинов,
подавлять экспрессию генов а-амилаз. Непосредственное уча-
стие в АБК-зависимом подавлении генов а-амилаз играют АБК-
зависимые транскрипционные факторы WRKY WRKY — большая
группа специфичных для растений транскрипционных факторов (у
арабидопсис семейство WRKY включает в себя более 70 белков),
которые активируются некоторыми группами фитогормонов (АБК,
этиленом, салициловой кислотой) и играют роль, главным образом,
в отвез е на биотический и абиотический стресс, а также в процессах
старения. Многие гены WRKYявляются мишенями транскрипцион-
ных факторов ABI3 и ABF. В покоящихся семенах транскрипцион-
ные факторы WRKY напрямую связываются с промоторами генов
а-амилаз, ингибируя их активность,. /
Итак, абсцизовая кислота — фито гормон, отвечающий за созре-
вание и период покоя семян, а также принимающий участие в ответе
на высыхание и другие абиотические стрессы. Уникальной особен-
ностью передачи сигнала АБК является наличие четырех незави-
симых групп рецепторов, совершенно разных по строению и лока-
лизации в клетке, которые принимают участие в контроле разных
АБК-регулируемых процессов.

Источники рисунков, использованных в главе

I.	Marten Н., Konrad К. R., Dietrich Р, Roelfsema М. R. G., Hedrich R. Са21-
dependent and -independent abscisic acid activation of plasma membrane anion
channels in guard cells of Nicotiana tabacum // Plant Physiology. 2007. Vol. 143.

P. 28-37.

2.	Nambara E., Marion-Poll A. Abscisic acid biosynthesis and catabolism // Annual
Review of Plant Biology. 2005. Vol. 56. P. 165-185

Рекомендованная литература

1.	Новикова Г. В., Степанченко Н. С., Носов А. В. и др. В начале пути: восприятие
АБК и передача ее сигнала у растений. Физиология растений. 2009 Т. 56. №6.
С.806-823.

2.	Finkelstein R, Reeves W., Ariizumi T. et al. Molecular A spects of Seed Dormancy //
Annual Reviews of Plant Biology. 2008. Vol 59 P. 387 -415.

3.	Guerriero G., Martin N., Golovko A. et al. The RY/Sph element mediates
transcriptional repression of maturation genes from late maturation to early seedling
growth // New Phytologist 2009. Vol. 184. P. 552-565.

4.	McCourt R, Creelman R. The ABA receptors — we report you decide // Current
Opinion in Plant Biology. 2008. Vol. 11. P. 474-478.

5	Nambara E., Marion-Poll A. Abscisic acid biosynthesis and catabolism // Annual
Review of Plant Biology. 2005. Vol. 56. P. 165-185.

6.	Nishimura N., Sarkeshik A., Nito К et al PYR'?Yd/RCAR family members are
major in-vivo ABI1 protein phosphatase 2C-interacting proteins in Arabidopsis //
Plant Journal. 2009.

7.	Umezawa T. Sugiyama N., Mizoguchi M. et al. Type 2C protein phosphatases
directly regulate abscisic acid-activated protein kinases in Arabidopsis // PNAS.
2009. Vol 106. P 17588-17593.
Раздел III

Генетический контроль
морфогенеза растений

В третьем разделе учебника мы рассмотрим регуляцию развития
основных органов растения: апикальных меристем побега и корня,
листьев и цветков, а также ознакомимся с регуляцией эмбриональ-
ного развития растений и контролем перехода от вегетативного раз-
вития к цветению.

Значительная часть морфогенетических событий у растений
происходит в период эмбрионального развития: например, на
самых ранних этапах эмбриогенеза определяются апикально-
базальная полярность и радиальная симметрия растительного
организма, происходит первичная разметка зачатков органов
и тканей вдоль апикально-базальной и радиальной осей. При этом
органогенез у растений продолжается в течение всего периода
жизни в связи с наличием меристем, на периферии которых про-
исходит дифференцировка тканей и закладка органов. В главах
этого раздела мы рассмотрим генетический контроль поддержа-
ния и развития двух основных первичных меристем растений
апикальных меристем побега и корня (ПАМ и КАМ), которые
закладываются в эмбриогенезе и продолжают функционировать
в течение постэмбрионалыюго периода. Латеральные органы
побега и корня, которые закладываются благодаря координиро-
ванной дифференцировке клеток на периферии ПАМ и КАМ,
также характеризуются сложным контролем развития, которое
включает в себя определение симметрии и апикально-базальной
полярности, а также разметку на домены с разным характером
экспрессии генов. Особое место в жизни высших растений за-
нимает переход к генеративному развитию, который включает
в себя инициацию цветения, детерминацию флоральной мери-
стемы и формирование органов цветка

Одной из особенностей растений является сильная зависимость
морфогенеза от внешних условий: например, переход к цветению
может зависеть от длины дня и продолжительности низкотемпера-
турного периода. Внутренними факторами, регулирующими про-
граммы развития различных органов растения в зависимости от
внешних условий, являются фитогормоны. Многие морфогенети-
ческие программы находятся под контролем определенной груп-
пы фитогормонов (например, формирование апикального крючка
у проростка в темноте зависит от этилена) или регулируются ба-
лансом двух групп гормонов-антагонистов (например, пролифера-
ция клеток побеговой и корневой апикальных меристем и закладка
латеральных органов побега и корня зависит от баланса цитокини-
нов и ауксинов).

В настоящее время при изучении мутантов с нарушениями раз-
вития различных органов выявлены основные регуляторы морфоге-
неза растений: как правило, это гены, кодирующие транскрипцион-
ные факторы или факторы ремоделинга хроматина. В ряде случаев
показана взаимная репрессия генов-регуляторов противоположных
программ развития, установлена связь центральных регуляторов
морфогенеза с метаболизмом, транспортом или передачей сигнала
фитогормонов. Вместе с тем мишени этих master-генов, непосред-
ственно контролирующие развитие тех или иных тканей, в большин-
стве случаев еще только предстоит выявить.

На примерах, приведенных в главах этого раздела, вы убедитесь,
что каждая морфогенетическая программа растительного организма
находится под контролем большого количества взаимодействующих
генов, определяющих координацию разных программ развития и со-
ставляющих регуляторную генную сеть.
Глава 8

Эмбриогенез

Эмбриогенез семенных растений можно условно разделить на два
этапа — морфогенез и созревание, которые контролируются разными
наборами генов. В процессе морфогенеза идет определение плана тела
зародыша, закладываются ткани и органы будущего растения. Про-
цесс созревания включает в себя рост сформировавшегося зародыша,
накопление питательных веществ и ингибирование прорастания.

Основные стадии морфогенеза зародыша представлены на ри-
сунке 8.1. В основе процессов морфогенеза зародыша лежит опре-
деление доменов зародыша с разным характером транскрипции
генов-регуляторов развития (эмбриональный паттернинг), которое
начинается с первых делений зиготы.

Первое деление зиготы полярно, в результате него образуются
апикальная и базальная клетки, которые различаются по набору экс-
прессирующихся в них генов и впоследствии дают начало разным
органам: из апикальной клетки развивается большая часть зароды-
ша, базальная клетка дает начало гипофизу и суспензору.

После нескольких упорядоченных делений апикальной клетки зи-
готы формируется зародыш сферической формы; эта стадия развития
получила название стадии глобулы (globular stage). Началом стадии
глобулы можно считать формирование 8-клеточною зародыша.

Следующая стадия эмбриогенеза — стадия сердца (heart stage) — ха-
рактеризуется неравномерной пролиферацией клеток, которая приводит
к закладке зачатков семядолей, апикальной меристемы побега и первич-
ного корня. На стадии сердца впервые определяется билатеральная сим-
метрия развивающеюся зародыша. Иногда выделяют стадию перехода
между глобулярной стадией и стадией сердца (transition stage).
Рис. 8.1. Стадии эмбриогенеза семенного растения на примере зародыша арабидопсис
(модифицировано но Taiz, Zeiger, 2С03)

А — апикальная и базальная клетки, Б — >-етырехкг.еточный зародыш. В — вось-
миклеточныи зародыш (стадия октантов), Г — стадия глсбулы, Д — ранняя стадия
сердца (стадия перехода), Е — поздняя стадия сердца. Ж — стадия Торпедо, 3 — по-
коящийся зародыш.

Стрелками показаны зачатки некоторых органов и тканей

На стадии Торпедо (torpedo stage) усиливается рост клеток рас-
тяжением и происходит дальнейшее развитие зачатков органов, на-
чинается накопление в тканях зародыша питательных веществ. Эта
стадия завершает морфогенез зародыша, после нее начинается его
созревание и в дальнейшем наступает период покоя, сопровождаю-
щийся остановкой метаболизма.

Наиболее важными моментами морфогенеза зародыша являются:

I)	формирование апикально-ба зальной оси;

2)	развитие радиальной и билатеральной симметрии.

8.1.	Формиро ание апикально базальной оси зародыша

Формирование апикально-базальной оси зародыша начинается еще
до делений зиготы, так как зигота уже имеег полярное строение (рис.
8.2). Базальная и терминальная части зиготы легко различимы визуаль-
но: в герминальной части находится ядро, и цитоплазма там имеет более
плотную консистенцию, в базальной части размещена большая вакуоль.
На стадии 8 клеток начинается
обособление доменов зародыша
вдоль апикально-базальной оси
(рис. 8.3). На этой стадии у заро-
дыша можно выделить:

1.	Производные апикальной
клетки:

•	четыре «верхних» клетки,
которые в дальнейшем дают
начало апикальному домену
зародыша (его производными
являются семядоли и апикаль-
ная меристема побега);

•	четыре «нижних» клетки, ко-
торые в дальнейшем дают на-

Рис. 8 2 строение зародышевого мешха
арабидопсис (модифицировано пс Tail,
Ze>ger, 2003). На рисунке отражено по-

чало центральному домену за- пярное строение зиготы
родыша (из него развивается

гипокотиль проростка).

2.	Производные базальной клетки:

• две «верхних» клетки, которые в дальнейшем дают начало ба-
зальному домену зародыша или гипофизу (его производные
апикальная меристема корня и корневой чехлик);

 -апикальный
домен

- центральный
домен

 -баеальныъ
домен

О - суспензор

Рис. 8.3 Формирование апииагьнс-базальной оси зародыша (модифицировано по

Laux et al 2004)
• клетки суспензора. Функцией суспензора является связь зароды-
ша с эндоспермом.

Формирование радиальной симметрии зародыша имеет перво-
степенное значение для закладки и развития многообразных тканей
растения. Слои клеток — предшественники разных тканей начина-
ют дифференцироваться у зародыша со стадии 16 клеток.

Клетки разных доменов зародыша четко различаются гистологи-
чески, а также по набору экспрессирующихся в них генов. Клональ-
ный анализ показал, что вклад каждой клетки в план тела зародыша
предсказуем, и каждая из них дифференцируется в соответствии со
своей финальной программой.

В настоящее время у разных видов растений получено множество
мутантов с нарушением морфогенеза зародыша (рис. 8.8). Их можно
разбить на две группы:

1.	Мутанты с нарушением общего плана деления клеток.

2.	Мутанты с нарушением развития отдельных доменов зароды-
ша— апикального, цент рального или базального

Примерами мутантов первой группы у арабидопсис являются
мутант gnom с дефектом полярного транспорта ауксинов и му-
танты knolle и keule, имеющие нарушения цитокинеза. У мутан-
тов этой группы не происходит обособления доменов зародыша
и нормального органогенеза, проростки не имеют основных орга-
нов (апекса, первичного корня, семядолей, гипокотиля) и погиба-
ют вскоре после прорастания. Примерами представителей второй
группы являются мутанты gurke с редукцией апикального доме-
на, fackel с нарушением развития центрального домена, а также
monopteros и bodenlos, у которых отсутствует базальный домен
зародыша. Изучение таких мутантов позволило выявить ряд ме-
ханизмов, участвующих в контроле морфогенеза зародыша у выс-
ших растений.

Дифференциальная экспрессия генов будущего зародыша
(рис. 8.4) начинается еше на стадии зиготы и лежит в основе ее асим-
метричного деления. Гены, экспрессирующиеся на самых ранних
этапах эмбриогенеза, контролируют асимметричность первых деле-
ний зиготы и определяют первичную разметку доменов зародыша.

В яйцеклетке и зиготе арабидопсис выявлена экспрессия трех
генов, важных для ранних этапов эмбриогенеза. Во-первых, это ген
P1N7, продуктом которого является один из PIN-белков, составляю
ших основу выходного канала для полярного транспорта ауксинов
(ПАТ). Создание определенного направления ПАТ является одним
из ключевых моментов в обеспечении нормального органогенеза
AtMLI

PIN1

MP BDL

PIN7

PIN4

WUS

W0X2

WCX8

WOX9

A NT

BEV

PHV

WOXS

Рис. 8.4 Зоны экспрессии различных генов t эмбриогенезе арабидопсис (модифици-
рсвано по We'jers, Jurgens, 2005). Представлены стадии зитоты, двух клеток, восьми
клеток, глобулы, начало стадии сердца

у растений. Во-вторых, это гены WOX2 и №0X8, которые в даль-
нейшем контролируют идентичность клеток зародыша (№0X2)
и клеток суспензора (№0X8) на самых ранних стадиях развития
(до глобулы).

Транскрипты PJN7, №0X2 и WOX8 асимметрично распределены
в зиготе (механизм такого распределения неизвестен); после перво-
го деления зиготы сохраняется асимметричный характер экспрессии
этих трех генов в апикальной и базальной клетках.
Полярный транспорт ауксинов и формирование
апикально-базальной оси зародыша

11ЛТ играет основополагающую роль в обеспечении полярности
развития растения на всех стадиях. Именно ПАТ определяет фор-
мирование апикально-базальной оси зародыша. Направление ПАТ
зависит главным образом от пространственной локализации белков
выходного канала PIN (подробнее см. главу «Ауксины») Таким об-
разом, важнейшее значение для морфогенеза зародыша имеет:

•	асимметричный характер экспрессии Р/А-генов в первых клетках
зародыша;

•	асимметричный характер распределения PIN-белков на разных
полюсах клеток.

В недавних исследованиях установлено, что между PIN белками
существует «разделение функций» в обеспечении полярности раз-
вития зародыша: разные PIN-белки работают на разных стадиях раз
вития зародыша и в разных его доменах.

Самым «ранним» из РЖ-генов арабидопсис является PIN7, экс-
прессия которою начинается еше в материнском гаметофите. Транс-
крипты PIN7 неравномерно распределены в зиготе — сосредоточены
в се базальной части. После первого деления зиготы экспрессия гена
PIN7 продолжается в базальной клетке; белок PIN7 локализуется на
апикальной ее стороне, обращенной к апикальной клетке (рис. 8.5).
Следствием такой локализации белка PIN7 является приток аукси-
нов в апикальную клетку, производными которой являются зачатки
практически всех органов растения.

Начиная со стадии двух клеток, в апикальной клетке начинает
экспрессироваться ген PINJ, который является основным Р/А-геном
в растении и обеспечивает полярность развития практически всех
его органов.

В дальнейшем гены PIN7 и PIN1 сохраняют комплементарный про-
странственный характер экспрессии: P1N7 экспрессируется во всех про-
изводных базальной клетки (клетках суспензора), тогда как экспрессия
PIN1 до стадии глобулы наблюдается во всех производных апикальной
клетки. На более поздних стадиях экспрессия PIN1 сохраняется в клет-
ках, дающих начало семядолям, ПАМ и гипокотилю. Аномалии морфо
генеза у мутантов с потерей функцииpin7 иpinl связаны с нарушением
плана деления клеток на ранних стадиях эмбрионального развития.

На стадии глобулы в зародыше начинает работать еще один PIN-
ген — PIN4, который экспрессируется в клетках базального домена
зародыша.
По-видимому, регуляция экспрессии генов PIN в эмбриогене-
зе связана с ауксин-зависимым транскрипционным фактором МР/
ARF5 и репрессором транскрипции BDL/IAA12, для которых дав-
но известна роль в поддержании определенного уровня транскрип-
тов Р/А-генов (см. главу «Ауксины»). Гены MP (MONOPTEROS)
и BDL (BODENLOS) начинают экспрессироваться на стадии двух
клеток в апикальной клетке зародыша, в дальнейшем характер их
экспрессии совпадает с зоной экспрессии гена PIN1. В эмбриоге-
незе гены МР и BDL имеют наибольшее значение в спецификации
базального домена зародыша, аномалии у мутантов тр и bdl связа-
ны с его редукцией.

Помимо экспрессии Р/А-генов, большое значение па ранних ста-
диях эмбриогенеза имеет распределение PIN-белков на по-разному
ориентированных поверхностях клеток. На стадиях 4, 8 и 16 клеток
белок PIN1 равномерно распределен по всем поверхностям клеток
зародыша; белок PIN7 расположен на апикальных сторонах клеток
суспензора. Таким образом, на этих стадиях имеет место направлен-
ный транспорт ауксина из суспензора в зародыш, но в самом заро-
дыше направления ПАТ еще не определены. На стадии глобулы ло-
кализация белка PIN1 становится полярной — он сосредоточивается
на базальных сторонах клеток зародыша, обеспечивая транспорт
ауксинов к базальному домену. В это же время белок PIN7 также
меняет свою полярную локализацию и перемещается с апикальной
стороны клеток суспензора па базальную (рис. 8.5). Такой поворот
ПАТ в зародыше на стадии глобулы необходим для развития базаль-
ного домена зародыша и создания максимума концентрации ауксина
в месте закладки будущего корня.

Вероятно, основополагающую роль в изменении локализации
PIN-белков на поверхности клеток при переходе к стадии глобу-
лы играет белок GNOM, опосредующий их ГТФ-зависимый вези-
кулярный транспорт (см. главу «Ауксины»), Ген GNOM начинает
экспрессироваться на ранних стадиях эмбрионального развития
(до глобулы). Мутанты с потерей функции gnom имеют серьезные
аномалии, связанные с нарушением развития всех доменов заро-
дыша.

Итогом дифференциальной экспрессии генов PIN и различной
полярной локализации PIN белков на ранних стадиях эмбриогенеза
является создание максимумов концентрации ауксина у зародыша на
стадии сердца, которые совпадают с местами закладки семядолей
и первичного корня (см. характер экспрессии конструкции DR5.. GFP
па рис. 8.4).
о PIN7

базальная
клетка

Рис 8.5. Схема локализации PlN-бепков на ранних этапах развития зародыша (кгоди

Лидировало по Weijers and Jurgens, 2005)

Гены WOX и первичная спецификация доменов зародыша

Помимо генов, контролирующих ПЛТ, к числу наиболее «ран-
них» регуляторов эмбриогенеза у высших растений относятся
также гены WOX2 и WOX8. Продуктами этих генов, как и про-
чих генов подсемейства WOX, являются гомеодомен-содержащие
транскрипционные факторы. Наиболее известными представите-
лями подсемейства WOX являются гены WUS и WOX5, которые
играют основополагающую роль в поддержании пулов стволовых
клеток в апикальной меристеме побега (WUS) и корня (Я'ОХ5) (бо-
лее подробно см. в главах «Апикальная меристема побега» и «Раз-
витие керн я»).

Экспрессия генов WOX2 и WOX8 начинается в материнском гаме-
тофите и продолжается у зародыша со стадии зиготы до прорастания.
Транскрипты WOX2 и WOX8 асимметрично распределены в зиготе;
после первого ес деления мРНК WOX2 оказывается в апикальной
клетке, а мРНК WOX8 — в базальной (рис. 8.4, 8.6). На более позд-
них стадиях развития ген WOX2 экспрессируется в производных
апикальной клетки (апикальном и центральном доменах зародыша),
а ген WOX8 — в производных базальной клетки (гипофизе и суспен-
зоре) Считается, что ген WOX2 является регулятором идентичности
клеток зародыша, а ген WOX8 клеток суспензора. Действительно,
зигота 1 клетка 4 клетки 8 клеток глобула сердце

Рис. 8.6. Локализация зон экспрессии ;енов W0X2 (верхний ряд), W0X9 (средний
ряд) и W0X8 (нижний ряд) на разных стадиях эмбриогенеза арабидопсис с помощью
гибридизации /л situ (модифицирсвгно но Hatkeг et al., 2603)

z — зигота, a — апикальная клетка, Ь — базальная клетка, ad — апикальный домен,
cd — центральный домен, hy — гипофиз, so — суспензор, еп — эндосперм

мутанты с потерей функции wox2 и юах8 имеют нарушения в разви-
тии зародыша и суспензора соответственно. В частности, у мутант а
wox2 нарушено направление и время деления клеток зародыша на
ранних стадиях развития (до глобулы).

На стадии четырех клеток к генам WOX2 и WOX8 присоеди-
няется ген WOX9. который начинает экспрессироваться в клетке-
предшественнице базального домена зародыша.

Начиная со стадии восьми клеток зоны экспрессии генов WOX2,
WOX8 и WOX9 совпадают с первичной разметкой зародыша на до-
мены: в клетках-предшественнииах апикального домена экспресси-
руется ген WOX2, в клетках-предшественницах центрального до-
мена — WOX9, базального WOX8 и WOX9, суспензора WOX8
(рис. 8.6, 8.7). Таким образом, функция генов WOX в эмбриогенезе
растений аналогична функции НОХ-генов животных, которые экс-
Рис. 8 7 Зоны экспрессии генов WUX2, W0X3 и W0X9 на ранних стадиях эмбриогенеза
и первичная размены зародыша на домены (модифицировано по Hanker et al., 2003)

премируются в определенных сегментах зародыша в сорогой после-
довательности и определяют позиционную информацию.

Со стадии глобулы у зародыша начинается экспрессия генов IJ'T'S
и WOX5 в клетках-предшественницах апикальной меристемы побе-
га и апикальной меристемы корня соответственно. Зоны экспрессии
генов WOX2, WOX8 и WOX9 при этом сужаются: например, на ста-
дии сердца гены WOX2 и WOX9 экспрессируются на низком уровне
в эпидермальном слое клеток апикального (WOX2) и центрального
(WOX9) доменов; экспрессия гена WOX8 сохраняется на суспензоре
и прилежащих к нему клетках эндосперма.

Точные механизмы влияния генов WOX на раннее развитие заро-
дыша в настоящее время неизвестны. Вместе с тем предполагается,
что «ранние» гены WOX действуют позже, чем ауксины. Действи-
тельно, у мутантов с потерей функции тр и усилением функции bdl
нс происходит активации экспрессии гена WOX9 на ранних стадиях
развития, результатом чею является нарушение закладки базального
домена зародыша. При этом ген WOX9 не является прямой мишенью
транскрипционного фактора MP/ARF5 и репрессора транскрипции
BDL/IAA12, то есть имеет место опосредованный ауксин-зависимый
контроль экспрессии WOX9 в эмбриогенезе.

8.2.	Контроль развития разных доменов зародыша

Основные успехи в изучении морфогенеза зародыша у высших
растений были достигнуты при изучении многочисленных мутан-
тов арабидопсис с различными нарушениями этого процесса. Му-
тантов по морфогенезу зародыша можно разделить на две группы
(рис. 8.8).

1.	Мутант ы с нарушением развития всех доменов зародыша. Ано-
малии развития у этой группы мутантов связаны с нарушением
упорядоченного деления клеток начиная с самых ранних этапов
эмбриогенеза, в результате чего нарушается закладка и развитие
Рис 8 8. Фенотипы некоторых му (антов арабидопсис с нарушением морфогенеза
зародыша

Спееа — проросток диксго типа (wi). Вверху — пророст мутантов с нарушени-
ем развития отдельных доменов зародыша: апикального (gurkc, gk), центрального
(fackel, fk), базального (tnonopteros, тр). Внизу — пророст мутантов с нарушением
упорядоченного деления клеток: knolle (ku), keule (ken), gnom (gn)

всех зародышевых доменов. К этой сборной группе относятся
мутанты с самыми разными дефектами: нарушением распределе-
ния PIN-белков на полюсах клетки (gnom), везикулярного транс-
порта (hinkel) и экзоцигоза (knolle, keule), биосинтеза целлюлозы
и пектина (tumorous shoot development).

2.	Мутанты с редукцией или нарушением развития отдельных доме-
нов зародыша: апикального (shoot meristemless, сир shapes cotyle-
dons, zwille, gurke, topless), центрального (fackel, hydra, cephalo-
pod) и базального (monopteros, bodenlos). Благодаря изучению
мутантоз этой группы были выявлены основные пути регуляции
развития отдельных доменов.

Гены — регуляторы упорядоченного деления клеток в эмбриогенезе

Необходимым условием нормального развития зародыша являет-
ся поддержание определенного плана деления клеток начиная с ран-
них стадий эмбриогенеза.
Упомянутый выше механизм обеспечения упорядоченного деле-
ния клеток связан с контролем направления ПАТ, опосредованного
белками PIN. Главную роль в определении его направления играет
распределение PTN-белков на разных полюсах клетки — нарушение
их расположения приводит к невозможности закладки и формирова-
ния основных доменов зародыша. Примером таких нарушений явля-
ется фенотип вышеупомянутого мутанта gnom (рис. 8.8) с потерей
функции гена, участвующего в контроле ГТФ-зависимого везикуляр-
ного транспорта PIN-белков из аппарата Гольджи на плазмалемму.

Нарушение закладки и развития всех доменов зародыша харак-
терно также для мутантов арабидопсис с потерей функции генов,
контролирующих формирование плазмалеммы и клеточной стенки
у дочерних клеток при завершении процессов цитокинеза Этот про-
цесс нарушен у многочисленной группы так называемых мутантов
по цитокинезу, knolle, keule, korrigan, hinkel, tumorous shoot develop-
ment и т. д., для которых характерны такие дефекты в эмбриональном
и постэмбриональном делении клеток, как нарушение направления
клеточных делений, формирование многоядерных клеток с непол-
ной клеточной стенкой и накопление экзоцигозных везикул внутри
клетки (рис. 8.9 Д). В результате у мутантов по цитокинезу в той или
иной степени нарушено развитие всех доменов зародыша, или даже
не происходит первичной закладки доменов. Это приводит к сниже-
нию жизнеспособности и аномалиям постэмбрионального развития.
Например, косупрессия гена KEULE в отдельных органах растения
приводит к нарушению упорядоченного деления клеток и формиро-
ванию каллусоподобных структур (рис. 8.9 Е).

Продукты генов KNOLLE и KEULE (KN и KEU) участвуют в кон-
троле экзоцитоза. Процесс экзоцитоза необходим для формирования
перегородки между делящимися клетками, в результате сбоя его рабо-
ты мутанты knolle и keule имеют нарушения цитокинеза и не способны
к упорядоченному делению клеток. Геи KNOLLE кодирует плазмалем-
ный белок из семейства синтаксинов, продуктом гена KEULE является
взаимодействующий с KNOLLE белок семейства Seel. Белки синтак-
сины являются необходимым компонентом везикулярного транспор-
та и обеспечивают присоединение мембранных пузырьков к плазма-
лемме в процессе экзоцитоза. Двумя другими необходимыми частями
этого процесса являются белки синаптобревины, локализованные на
мембранах везикул, и растворимые белки комплекса SNARE, которые
осуществляют взаимодействие между сингаксинами и синаптобреви-
нами (рис. 8.10). В частности, в комплекс SNARE входят белки Seel,
к которым относится продукт гена KEULE.
Рис 8 5. Фенотипы мутантов арабидопсис с нарушением упорядоченного деления
клеток

А — прсросгск дикого типа (wt), Б — мутант knolle (по Assaad ei al., 2001), В — му-
тант keule (по Soliner et al., 2002), Г — мутант tsd 1 (пи Kiupkova and Schmiilling,
20C9), Д — зародыш дикого типа и зародыш keule на стадии сердца (по Assaad et
al., 2001). Видны беспорядочно расположенные увеличенные мнсгоядерные клетки
у мутанта Е — цветок дикого типа и цветок траксгеннсго растения с косуг рессией
гена KEULE (по Assaad et al., 2001) Квадратом отмечены каллусоподобные структуры,
возникшие з результате неупорядоченного деления клеток

Ген KEIJLE экспрессируется но всех клетках растения, тогда как
экспрессия гена KNOLLE характерна только для активно пролифери-
рующих клеток. Кроме того, динамика синтеза и деградации белка
KNOLLE строго зависит от стадии клеточного никла; в начале ми-
тоза белок KNOLLE накапливается в аппарате Гольджи, в телофазе
локализуется на формирующейся перегородке между клетками и ис-
чезает к концу цитокинеза (рис. 8.10). Механизмы, контролирующие
накопление и деградацию белка KNOLLE в зависимости от фазы
митоза, в настоящее время не выяснены. Интересно, что такую же
МЕМБРАНА ВЕЗИКУЛЫ

ОИНАПТОБРЕВИН

ЯЛАЗМАЛЕММА

сингаксин
(KNOLLE)

SNARE комплекс
(в том числе
белок Sec1 - KEULE)

Рис 8 10 Белки везикулярного транспорта KNOLLE и KEULE

Слева — схема взаимодействия белков KNOLLE и KEULE в процессе экзодитоза (по
Assaad et al., 1996). Справа — иммунолокализациг белка KNOLLE в разных фазах
митоза (по Volkei et al., 2001) В профазе (А) белок KNOLLE сосредоточен в аппарате
Гольджи, в телофазе (Б) и цитокинезе (В) приурочен к формирующейся перегородке
между клетками

динамику концентрации белка в зависимости от фаз митоза у рас-
тений демонстрируют циклины класса В, контролирующие прохож-
дение М-фазы клеточного цикла Возможно, в регуляции динамики
этих белков задействованы одни и те же механизмы.

Еще один необходимый участник везикулярного транспорт а у рас-
тений — продукт гена HINKEL (HIK) — это кинезин-подобный белок
из специфичного для растений подсемейства. Кинезины — группа
белков, взаимодействующих с микротрубочками и содержащих мо-
торный N-концевой домен; одной из их многочисленных функций
является обеспечение перемещения везикул вдоль микротрубочек.
Фенотип мутанта с потерей функции hik напоминает фенотип му-
танта keule (рис. 8 9).
Изменения плана деления клеюк в эмбриогенезе характерны
и для мутантов, у которых формирование клеточной стенки при ци-
токинезе нарушено вследствие дефектов в синтезе ее основных ком-
понентов — целлюлозы и пектинов. К этой группе у арабидопсис
относятся мутанты 1руппы tumorous shoot development (tsdy. tsdl/ko-
rrigan и tsd2, характерной чертой которых являются нарушения пла-
на деления клеток во всех доменах зародыша, а также формирова-
ние неупорядоченного, быстро пролиферирующего каллуса на месте
апикальной меристемы побега у проростков (рис. 8.9 Г). Продуктом
гена TSD1 является мембрано-ассоциированный фермент эндо-1,4-
/?-О-глюкаказа, участвующий в биосинтезе целлюлозы; ген TSD2
кодирует трансмембранный белок с пектин-метилтраксферазкой ак
тивностью, который принимает участие в биосинтезе пектина.

Развитие апикального домена зародыша

Апикальный домен зародыша дает начало апикальной меристеме
побега (ПАМ) и семядолям — соответственно, мутанты с наруше-
нием развития апикального домена имеют дефекты в развитии этих
органов (рис. 8.11). Закладка и дифференцировка апикального доме-
на зародыша зависит от регуляции пространственного и временного
характера экспрессии определенного набора генов (рис. 8.12).

Основную роль в развитии ПАМ играют гены STM, WUS, CLV
(более подробно см. в главе «Апикальная меристема побега»). Ген
SHOOT MERISTEMLESS (STM) необходим для пролиферации кле-
ток ПАМ и закладки НАМ в эмбриогенезе, потеря функции этого
гена у мутантов stm приводит к отсутствию ПАМ при нормальном
развитии семядолей (рис. 8.11 Б). Функцией гена WOSHEL (WUS)
является закладка ПАМ в эмбриогенезе, а также поддержание ниши
стволовых клеток ПАМ на ностэмбриональной стадии развития. Ак-
тивность генов CLAVATA (CLV) необходима для ограничения зоны
экспрессии гена WUS, что имеет большое значение в обеспечении
нормальной функции IIАМ.

Развитие семядолей у зародыша также связано с активностью
большого количества генов. Семядоли являются первыми листья-
ми растения — следовательно, механизмы их инициации и разви-
тия сходны с таковыми при инициации и развитии листа (подроб-
нее см. главу «Развитие листа»). Важнейшее значение в закладке
семядолей играет появление двух зон высокой концентрации аук-
синов на периферии апикального домена зародыша. Создание ло-
кальных максимумов концентрации ауксинов достигается за счет
определенной ориентации ПАТ и зависит от локализации белков
Рис. 8.1 1. Фенотипы мутантных проростков арабидопсис с нарушением развития
апикального домена (пс Lynn ct al, 1999; Kumaran et al. 2002; Kajiwara el al, 2004;
Hibara et al., 2006; Long et al., 2002)

A — дикий тип, Б — stm (отсутствие FAM), 3 — cud cuc2 (слитке семядоли и от-
сутствие ПЛМ), Г — дк (редукция семядолей), Д—zll (листоподобная структура на
месте ПАМ), Е — tpl (кооень на месте ПАМ и семядолей)

PIN на поверхности клеток. Основную роль в дальнейшем разви-
тии семядолей играют ген AINTEGUMENTA (ANT), стимулирую-
щий пролиферацию клеток в примордиях семядолей, гены CUP-
SHAPED COTYLEDON (CUCI, CUC2 и CUC3), определяющие
границу между семядолями, а также гены, кодирующие транс-
крипционные факторы семейств HD-Z1P1II, KANADY и YABBY,
которые контролируют адаксиально-абаксиальную полярность
семядолей и листьев. Мутанты с потерей функции соответствую-
щих генов имеют нарушения формирования апикального домена
зародыша: например, у двойного мутанта сис! сис2 происходит
слияние семядолей с потерей ПАМ (рис. 8.11 В); у множественных
мутантов по генам HD Z1P1I1 (phbphv rev) развивается единствен-
ная нитевидная семядоля.

Формирование апикального домена зародыша включает в себя
три основных этапа:

•	спецификация апикального домена;

•	закладка ниши стволовых клеток ПАМ;

•	закладка примордиев семядолей.

Первичная спецификация апикального домена происходит на
стадии 8 клеток и зависит от экспрессии гена WOX2, который кон-
тролирует идентичность апикальной части зародыша (см. выше). За-
кладка ПАМ и примордиев семядолей начинается на стадии глобулы
и продолжается на стадии сердца.

На стадии глобулы в апикальном домене зародыша можно впер-
вые выделить четыре субэпидсрмальные клетки-предшественницы
ПАМ, в которых начинает экспрессироваться ген WUS — основной
маркер ниши стволозых клеток ПАМ. На этой же стадии в апикаль-
ном домене зародыша начинается экспрессия гена ANT— он экс-
прессируется во всех клетках апикального домена, кроме клеток-
предшественниц ПАМ.

В конце стадии глобулы у зародыша происходит также заклад-
ка примордиев семядолей, которая связана с экспрессией генов
CUCl, CUC2 и STM на периферии апикального домена. Зона экс-
прессии CUC1, CUC2 и STM разделяет сплошное «кольцо» экс-
прессии гена ANT на две части, которые соответствуют зачаткам
семядолей. Таким образом, к концу стадии глобулы на периферии
зародыша имеются две зоны экспрессии гена ANT, соответствую-
щие примордиям семядолей; между ними лежит зона экспрессии
генов STM и CUC, соответствующая будущей ПАМ, и в центре
этой зоны находится ниша стволовых клеток, где экспрессируется
ген WUS (рис. 8.12).

На стадии сердца у зародыша морфологически выделяется ПАМ,
имеющая типичную трехслойную структуру, а также примордии се-
мядолей. На этой стадии происходит разграничение зон экспрессии
генов CUC и STM. Также на стадии сердца в двух верхних слоях
ПАМ начинают экспрессироваться гены CLV.

О вышележащих регуляторах экспрессии генов, контролирующих
закладку ПАМ и семядолей в эмбриогенезе, в настоящее время прак-
тически ничего не известно. Одним из таких регуляторов может быть
ген GIJRKE (СК), потеря функции которого у мутанта gk приводит
к редукции семядолей и аномалиям в развитии ПАМ. Показано, что
редукция семядолей у мутанта gk связана с аномальным характером
16 клеток Начало

Начало
стадии

Конец
садим сердца

ПАМ пророста

 ANT

стадии
глобулы

Начало
стадии глобулы

сердца

О W

Конец Начало Конец
стадии глобулы стадии стадии сердца
сердца

 WIJS

□ CUC2/STM

О CUC2

□ STM

 С1УЗ

 адаксиальная сторона

С6МЯДОЯИ

 абаксиальная сторона
семядоли

Рис. 8.12. Развитие апикального домена зародыша (no Laux et al., 2011)

Эвсрху — формирование апикальной меристемы побега (ПАМ): CZ — центральная
зона. PZ — гериферрческая зона, RZ — риб зона. Внизу — зоны экспрессии различ-
ных генов на разных стадиях развития апикального домена зародыша

экспрессии генов ANJ’ CVC1 и CUC2: у зародышей gk зона экспрес-
сии этих генов перекрывается с зоной экспрессии гена STM. Таким
образом, функцией гена GK является онраничение экспрессии генов
ANT, CIJC1 и CUC2 в апикальном домене зародыша Продукт гена
GK — фермент апетил-СоА-карбоксилаза-1 (АСС1), который ката-
лизирует синтез малонил-СоА. Таким образом, малонил-СоА играет
центральную, но в настоящее время неизученную роль в контроле
развития апикального дсмепа зародыша. Ген GK экспрессируется во
всех органах растений арабидопсис как на эмбриональной, так и на
постэмбриональной стадии развития, что свидетельствует о важной
роли продукта этого гена в развитии растений.

Еще один регулятор развития апикального домена зародыша —
ген ZWILLE/PINHEAD/ARGONAUTE 10 (ZLL/PNH/AGO10), кото-
рый участвует в контроле развития ПАМ и, по-видимому, действу-
ет раньше гена STM. У зародышей zll наблюдается аберрантный
характер экспрессии гена STM, в результате чего на месте ПАМ
дифференцируются листоподобные структуры. Напротив, эктопи-
ческая экспрессия гена ZLL приводит к трансформации семядолей
в апексы побегов. Ген ZLL в зародыше начинает экспрессировать-
ся со стадии октантов, на ранних стадиях эмбриогенеза его экс-
прессия выявляется во всех клетках зародыша, в зрелом зароды-
ше и в пост эмбриональном развитии ZLL экспрессируется в ПАМ,
проводящей системе, а также в адаксиальной части листьев и се-
мядолей. Продуктом гена ZLL является белок, относящийся к кон-
сервативному для высших эукариот семейству PAZ (PIWI-ARGO
NAUTE-ZWILLE), представители которого выполняют разные
функции в процессах, связанных с РНК-интерференцией (созрева-
нии miPHK и siPHK, метилировании ДНК и т. д.) Недавно было
показано, что функцией гена ZLL является негативный контроль
уровня микроРНК miR165/166 в развивающейся ПАМ, семядо-
лях и листьях. Функция miR165/166 хорошо изучена на примере
определения адаксиально-абаксиальной полярности листовой
пластинки и связана с негативной регуляцией уровня транскрип-
тов генов PHABULOSA (РНВ), PHAVOLUTA (PHV) и REVOLUTA
(REV), кодирующих транскрипционные факторы HD-Z1PIII (более
подробно см. главу «Развитие листа»). За счет снижения количе-
ства транскриптов miR165/l 66 у мутанта zll, его семядоли, листья,
а также листоподобные структуры, замещающие ПАМ у гомози-
гот по «сильным» аллелям zll, имеют радиальную структуру и ли-
шены абаксиальной стороны. На мутантах zll было показано, что.
помимо контроля развития адаксиальной стороны листа, продукты
генов РНВ, PHV и REV, по-видимому, также участвуют в контро-
ле развития ПАМ. Действительно, восстановление нормального
фенотипа у растений zll происходит как при снижении концентра-
ции miRl 65/166, так и при повышении концентрации транскриптов
PHB.PHVw REV

К гомеозисным заменам производных апикального домена при-
водит также потеря функции гена TOPLESS (ТРЕ). Это мутация
с условным проявлением: при повышенной температуре (29°C)
у мутантов tpl на месте ПАМ и семядолей развивается корень,
анатомически сходный с первичным корнем зародыша, при более
низкой температуре у этих мутантов наблюдаются разнообразные
дефекты, связанные с подавлением развития ПАМ и семядолей.
Продукт гена TPL — белок из семейства транскрипционных коре-
прессоров TUP 1/GROUCHO, которые играют роль в развитии всех
эукариот. Недавно было показано, что белок TPL взаимодейству-
ет с репрессором транскрипции ауксин-регулируемых генов BDL/
[АА12 и необходим для BDL-зависимого подавления активности
транскрипционного фактора MP/ARF5 (подробнее см. в главе
«Ауксины»), Поскольку транскрипционный фактор МР является
ключевым регулятором спецификации и развития базального до-
мена зародыша (см. ниже), его эктопическая активация у мутанта
tpl приводит к дифференцировке клеток апикального домена по
«базальному» пути.
Развитие центральною домена зародыша

Производными центрального домена зародыша являются гипо-
котиль, основания семядолей, первичный корень и проксимальная
часть апикальной меристемы корня. В результате мутанты с нару-
шением развития центрального домена имеют редуцированный ги-
покотиль и укороченный главный корень.

Наиболее выраженные аномалии в развитии центрального до-
мена зародыша отмечены у мутантов арабидопсис fackel (fk), hy-
dra 1 (hydl) и cephalopod (cph). Интересно, что все перечисленные
мутанты дефектны по биосинтезу стеролов, что свидетельствует
о ключевой роли стеролов в развитии центрального домена зароды-
ша. Продуктом гена FACKEL (FK) является С14-стеролредуктаза,
ген HYDRA 1 {HYDL) кодирует С7,8-изомеразу, продуктом гена CE-
PHALOPOD (CPH/SM’ri) является стеролметилтрансфераза. Анализ
спектра стеролов у мутантов с потерей функции fk, hydl и cph, а так-
же двойных мутантов позволил установить, что ген FK действует
в контроле биосинтеза стеролов выше, чем ген HYD1. Экспрессия
генов, связанных с метаболизмом стеролов, начинается в эмбриоге-
незе со стадии глобулы и приурочена в основном к центральному
и апикальному доменам зародыша. Редукция центрального домена
зародыша у мутантов fk, hydl и cph связана с потерей способности
клеток центрального домена, в частности инициалей проводящей
системы, к росту удлинением и асимметричным делением. На более
поздних стадиях развития мутанты по синтезу стеролов демонстри-
руют также дефекты развития апикального домена.

У всех высших эукариот стеролы играют важную роль в эмбрио-
нальном и постэмбриопалыюм развитии: например, у позвоночных хо-
лестерол является компонентом клеточных мембран, а его производные
стероидные гормоны необходимы для нормального развития организ-
ма. Похоже, что у растений роль стеролов в эмбриогенезе также связана
с их двоякой функцией: с одной стороны, они являются необходимым
структурным компонентом клеточных мембран, с другой — сигналь-
ными молекулами. Производными одного из основных растительных
стеролов — кампестерола — являются брассиносгероиды группа
стероидных юрмонов растений, которые играют роль в ответе на свет
в постэмбриопалыюм развитии. Кроме того, по последним данным,
стерольная композиция мембраны влияет на локализацию белков PIN
на поверхности клеток, таким образом, фенотипы мутантов Д hydl
и cph могут быть отчасти связаны с нарушением ПАТ.

Помимо измененной стерольной композиции мембран, характер-
ной особенностью клеток мутантов fk, hydl и cph являются неполные
и утонченные клеточные стенки. Причиной этого является дефицит
синтеза целлюлозы. Интересно, что ингибитор биосинтеза стеро-
лов 15-азастсрол вызывает такие же аномалии развития клеточной
стенки. Таким образом, стеролы необходимы для синтеза целлюлозы
в растительных клетках и формирования клеточной стенки.

О связи продуктов генов ГК, HYD1 и CPH/SMT1 с брассино-
стероидами имеются противоречивые данные. С одной стороны,
продукты всех трех генов действуют на начальных этапах синтеза
кампестерола, который является предшественником брассиносте-
роидов. Более того, обнаружено, что рецептор к брассипостероидам
BRI 1 действует ниже продукта гена ГК в контроле развития произ-
водных центрального домена. С другой стороны, дефекты развития
у мутанта с потерей функции fk не компенсируются при увеличении
концентрации брассиностероидов.

Развитие базального домена зародыша

Производной базального домена зародыша, или гипофиза, явля-
ется дистальная часть апикальной меристемы корня (КАМ), в том
числе покоящийся центр (ПЦ) — ниша стволовых клеток КАМ (бо-
лее подробно см. в главе «Развитие корня»). При этом проксималь-
ная часть КАМ развивается из центрального домена зародыша.

Первичная закладка базального домена зародыша происходит на
стадии 8 клеток. На этой стадии происходит асимметричное деление
первой клетки базального домена, в результате которое образуются
две дочерние клетки, различающиеся по набору экпрессирующихся
в них генов, а также судьбе их дальнейших производных. Верхняя
линзообразная клетка гипофиза дает начало покоящемуся центру
КАМ, тогда как нижняя клетка дает начало инициалям корневого
чехлика. В первой клетке гипофиза экспрессируются гены WOX5
и SCARECROW (SCR), функции которых необходимы для развития
ПЦ; после асимметричного деления первой клезки гипофиза экс-
прессия этих генов сохраняется только в верхней линзообразной
клетке. Предполагается, что уже на этой стадии происходит опре-
деление идентичности покоящеюся центра КАМ. Кроме того, от
ранних сигналов ПЦ, по-видимому, зависит дифференцировка всех
стволовых клеток зародыша: действительно, дефекты в раннем раз-
витии ПЦ часто приводят к аномальной дифференцировке произво-
дных соседних стволовых клеток.

Одним из наиболее ранних событий в инициации КАМ является
возникновение максимума концентрации ауксинов в нижней части ба-
зального домена зародыша. Это событие имеет место в конце стадии
глобулы и связано с определенной ориентацией полярного транспорта
ауксинов, опосредованного PIN-бслками. Экспрессия генов PIN в эм-
бриогенезе зависит от активности ауксин-зависимого транскрипцион-
ного фактора MP/ARF5 и репрессора транскрипции BDL/1AA12, а так-
же взаимодействующего с ними транскрипционного корспрсссора TPL.
В результате мутант арабидопсис с потерей функции тр и мутант с уси-
лением функции bdl имеют сходный фенотип, связанный с редукцией
базального домена зародыша. Ранние дефекты развития у мутантов тр
и bdl начинают проявляться со стадии двух клеток: апикальная дочерняя
клсгка зиготы у них делится не вертикально, а горизонтально. В даль-
нейшем, начиная со стадии восьми клеток, у этих мутантов наблюдает
ся аномальный характер делений клеток центрального домена, а первая
клетка базального домена не способна к асимметричному делению и не
дает начало линзообразной клетке, производной которой является ПЦ
КАМ. Кроме того, мутантные зародыши демонстрирую! аберрантный
характер экспрессии гена W0X9, что свидетельствует о роли белков
MP/ARF5 и BDL/IAA12 в регуляции его экспрессии. Результатом все-
го этого является отсутствие первичного корня у проростков тр и bdl.
У мутанта с потерей функции tpl происходит замещение апикального
домена на базальный и развитие корня на месте ПАМ и семядолей (см.
выше), что свидетельствует о роли гена TPL как основного негативного
регулятора развития базального домена зародыша, который действует
выше МР и BDL (рис. 8 13). Функция TPL как корепрессора транскрип-
ции включает в себя взаимодействие с гистон-деацетилазами (HDAC),
которые деацетилируют гистоны в промоторах генов-мишеней — в свя-
зи с этим мутации с потерей функции генов гистон-деацетилаз супрес-
сируюз прояаление мутации tpl.

Редукция базального домена также харакзерна для зародышей му
танта ахгб (auxin-resistant 6), дефекты развития у которого связаны
с аномальной ориентацией клеточных делений производных первой
клетки гипофиза. Продукт гена AXR6 — одна из субъединиц убиквитин-
лигазного комплекса SCFTIR:, который действует на последних этапах
передачи сигнала ауксинов и опосредует убиквитин-зависимую дегра-
дацию белков Aux/IAA (более подробно см. в главе «Ауксины»),

Еще один мутант арабидопсис с редукцией базального домена за-
родыша — мутайт hobbit (hbt) также характеризуется аномальной
ориентацией клеточных делений в базальном домене и репрессией от-
вета на ауксины в результате накопления Aux/IAA-белков. Продуктом
гена НВТявляется белок АРСЗ — одна из многочисленных субъединиц
убиквитин лигазного комплекса АРС (Anaphase Promoting Complex),
контролирующего нормальный ход митоза Основной мишенью ком-
Рис. 8.13. Центральная роль генов МР, BDL и TPL в спецификации базального домена
зародыша (мо дифицировано по Moller and iNeijers, 2009)

Для спецификации гипофиза (ризоеый цвет) необходима активация транскрипци-
онного Фактора МР в превгекулярных клетках центрального дсмена (голубой цвет),
прилегающих к гипофизу. Активность МР подавляют транскрипционный репрессор
BDL и взаимодействующий с ним корспрессор IPL. При повышении концентрации
ауксинов МР высвобождается из комплекса с BDI. и IPL и активирует экспрессию
гена P>N1, контролирующего транспорт ауксинов в клетки гипофиза Возможной
мишенью МР является также гипотетический сигнал спецификации гипофиза (S)

плекса АРС являются молекулы циклинов. Кроме того, недавно было
показано, что комплексы АРС также могут взаимодействовать с белка-
ми Aux/IAA, играя роль в их убиквитин-зависимом протеолизе.

8,3.	Контроль созревания зародыша

Как уже было сказано выше, эмбриональное развитие семенных
растений можно подразделить на две основные фазы: фаза морфоге-
неза, в течение которой происходит формирование зачатков основ-
ных органов проростка, и фаза созревания, основными характери-
стиками которой являются:
fCu/RNA

LEC2 RNA



J?-> RNA

Ъ HNA

OLtOSIN RNi

Рис. 8 14 Фазы морфогенеза и созревания зародыша в эмбриогенезе семенных
растений (по Braybrook and Harada, 2!1 С8)

Внизу — фазы морфогенеза и созревгния в развитии зародыша арабидопсис. По-
середине — изменения уровней гиббереллинов (ГК) и абсцизсвсй кислотв' (АБК) при
созревании. Вверху — изменение уровней экспрессии генов-регуляторов созревания
(красный цвет) и генов запасных балков (коричневый цвет) в процессе эмбриогенеза

•	пост зародыша;

•	накопление питательных веществ (запасных белков, крахмала
и липидов);

•	защита от высыхания (накопление LEA-белков, защищающих
ткани от дегидратации);

•	ингибирование прорастания.

После окончания фазы созревания зародыш высыхает и перехо-
дит к периоду покоя.

Фазы морфогенеза и созревания не разделены во времени: про-
цессы, связанные с созреванием зародыша, начинаются на морфоге-
нетической стадии сердца (рис. 8.14).

Гены LEC — ключевые регуляторы созревания зародыша

Ключевую роль в регуляции созревания зародыша играют гены
группы LEAFY COTYLEDON (LECy. их экспрессия стимулирует на-
копление запасных белков, а также ингибирует прорастание; кроме
того, эти гены играют важную, но невыясненную роль в контроле
морфогенеза зародыша.

Гены LEC начинают экспрессироваться в зародыше на стадии
глобулы; их уровень экспрессии достигает максимума в начале фазы
созревания. Продуктами этих генов являются транскрипционные
факторы, которые напрямую регулируют экспрессию генов, связан-
ных с созреванием и, предположительно, некоторых генов, участву-
ющих в контроле морфогенеза зародыша. ГГС гены арабидопсис
можно разделить на два класса, поскольку они кодируют два разных
типа транскрипционных факторов. Белок LEC1 представляет со-
бой ПАРЗ-субъединицу ССААТ-связывающего транскрипционного
фактора (уникальное семейство транскрипционных факторов выс-
ших растений), тогда как белки LEC2 и FUSCA 3 (FUS3) являются
транскрипционными факторами с ВЗ-доменом. К последней группе
относится также АБК-зависимый транскрипционный фактор АВА-
JNSF.NS1TIVE 3 (ABI3), который также является регулятором созре-
вания зародыша.

Центральная роль генов LEC в эмбриогенезе была установле-
на блаюдаря фенотипу мутантов с потерей и усилением функций
этих генов (рис. 8.15) Характерными чергами мутантов с потерей
функции led, 1ес2, аЫЗ и fus3 являются вивипария, неустойчивость
к высыханию, снижение количества запасных питательных веществ
в тканях, а также эктопическое деление клеток (пролиферация кле-
ток суспензора, активация П АМ, трихомы на семядолях). Напротив,
для мутантов и трансгенных растений с усилением функций генов
LEC1, LEC2, ABI3 и FUS3 характерен ювенильный фенотип, при ко-
тором проростки и взрослые растения приобретают черты зароды-
шей, а также усиленное накопление питательных веществ.

При изучении эпистатического взаимодействия мутаций led,
1ес2, аЫЗ и fus3 было показано, что в контроле эмбриогенеза рас-
тений ген LEC1 действует раньше генов LEC2, FUS3 и АВ13. Кроме
того, экспрессия гена LEC1 в тканях зародыша начинается раньше
остальных /.ЕС-генов (рис. 8.14). В дальнейшем было показано, что
гены LEC2, FUS3 и АВ!3 являются прямыми мишенями транскрип-
ционного фактора LEC1, который позитивно регулирует экспрессию
этих генов, связываясь с последовательностями в их промоторах.

Кроме того, продукт гена LEC2 также может позитивно регули-
ровать экспрессию генов FUS3, ABI3 и LEC1. Транскрипты этих ге-
нов накапливаются у трансгенных растений с повышенным уровнем
экспрессии LEC2, в то же время транскрипционный фактор LEC2
не может напрямую связываться с промоторами генов FUS3, ABJ3
Рис. 815 Фенотипы растений арабидопсис с измененным уровнем экспрессии генов 1ЕС
А — фенотип мутанта с потерей функции led (по Melnke et al., 1994): вверху —
мутантный проросток, внизу — листоподобчая семядоля с трихомом Б — сравнение
фенотипов трансгенных проростков 35S::LEC1 с конститутивно повышенным уровнем
экспрессии гена LEC1 (справа) и проростков дикого типа (слева) (по Lctan et al., 1998).
В — взрослое трансгенное растение ML::FUS3 с индуцированной повышенной экс-
прессией гена FUS3 (по Cazzarrrni et al. 2004). Г — листья растения дикого типа (слева)
и трансгенного растения ML::FUS3 (справа) (по Gazzarrini el aL, 2004): вверху — общи й
вид (у семядолспсдобпь'х листьев чтапегенного растения отсутствует трихом), внизу —
поперечный срез (в клетках листа трансгенного растения накапливаются гранулы
крахмала)

и LEC1 — вероятно, имеет место опосредованная регуляция их экс-
прессии.

Мишенями транскрипционных факторов LEC2, FUS3 и АВ13
являются гены, кодирующие запасные белки семян (у арабидопсис
к ним относятся олеозин, глобулин 12S (круциферин), альбумин
2S). Характерной чертой генов, кодирующих эти белки, является
наличие консервативного RY-мотива, с которым связываются ДНК-
связывающие ВЗ-домены транскрипционных факторов LEC2, АВ13
и FUS3. Таким образом, одной из установленных функций генов
LEC является позитивная регуляция накопления запасных белков
при созревании зародыша.

Ген PICKLE (РКЕ) — антагонист LEC-генов в контроле созрева
ния зародыша, основной его функцией является репрессия транс-
крипции LEC-генов па ноегэмбриональной стадии развития расте-
ний. В результате конститутивной экспрессии LEC-генов у мутанта
с потерей функции pkl развивается характерный фенотип, связанный
с ювенилизацией растений и повышенным накоплением питатель-
ных веществ; характерной особенностью мутанта pkl является на-
копление большого количества липидов в первичном корне, на ко-
тором формируется вздутие. Кроме того, потеря функции гена PKL
стимулирует соматический эмбриогенез в культуре тканей и органов
растений — опять же за счет повышения уровней экспрессии LEC-
гснов, которые являются регуляторами соматического эмбриогенеза
(см. ниже). Продуктом гена PKL является фактор ремоделинга хро-
матина, относящийся к семейству белков CHD3 За счет изменения
структуры хроматина белок PKL напрямую репрессирует экспрессию
гена LEC1, следствием чего является подавление остальных LEC-
генов. Другой мишенью белка PKI. являются гены DELLA-белков,
функцией которых является репрессия передачи сигнала гибберел-
линов (подробнее см. главу «Гиббереллины») — таким образом,
белок PKL стимулирует передачу сигнала этих гормонов. Функция
гена PKL как негативного регулятора отпета на АБК и позитивного
регулятора ответа на гиббереллины крайне важна для контроля дли-
тельности периода покоя семян.

Роль АБК и гиббереллинов в созревании зародыша

Гиббереллины и абсцизовая кислота (АБК) — две группы фито-
гормонов, играющих ключевую роль в контроле созревания зароды-
ша. В обеспечении различных процессов, связанных с созреванием,
эти гормоны действуют как антагонисты: АБК — «гормон периода
покоя» — стимулирует накопление запасных веществ в зародыше
и ингибирует дальнейшее вегетативное развитие, тогца как гибберел-
лины — «гормоны прорастания» — ингибируют процессы, связанные
с созреванием зародыша, и стимулируют прорастание. Действитель-
но, одной из характерных черт АБК-дефицитных мутантов является
вивипария (прорастание семян внутри плода без периода покоя), а де-
фицит гиббереллинов приводит к увеличению периода покоя семян.
Гиббереллины и АБК имеют противоположный характ ер изменения
концентрации при созревании зародыша и прорастании (см. графики
на рис. 8.14). Регулировка созревания зародыша двумя гормоками-
ангагонистами дает возможность для тонкого контроля длительности
периода покоя семян в зависимости от их баланса.

Установлено, что между АБК, гиббереллинами и генами LEC су •
ществует тесное взаимодействие в контроле эмбриогенеза. При этом
АБК действует в одном направлении с генами LEC — в частности,
стимулирует LEC-зависимое накопление запасных белков (у мутан-
тов по синтезу и передаче сигналов АБК количество запасных белков
резко снижено). Гиббереллины, напротив, являются антагонистами
АБК и ГЕС-генов.

Транскрипционные факторы ABI3, LEC2 и FUS3 интегрированы
в систему ответа на АБК — они активируются при связывании фос-
фагидных кислог, с синтезом которых сопряжен один из основных
путей передачи сигнала этого гормона. Кроме того, эктопическая
экспрессия гена FUS3 повышает уровень АБК в тканях зародыша,
но механизм этой позитивной регуляции неизвестен.

В то же время известно, что гены LEC негативно регулируют
уровень гиббереллинов через позитивную регуляцию экспрессии
гена GA2ox6, который кодирует белок, участвующий в катаболизме
активных гиббереллинов. Эта регуляция осуществляется опосредо-
ванно: установлено, что транскрипционный фактор LEC2 напрямую
активирует ген AGL15, продуктом которого является транскрипци-
онный фактор с MADS-боксом В свою очередь, транскрипционный
фактор AGL15 напрямую активирует экспрессию GA2ox6.

В LEC-зависимом контроле концентрации АБК и гиббереллинов
существует и обратная связь: было показано, что стабильность белка
FUS3 позитивно регулируется АБК и негативно — гиббереллинами.
Механизмы этой регуляции неизвестны.

Таким образом, АБК может влиять на процессы созревания заро-
дыша через взаимодействие с LLC-генами. Действительно, у АБК-
дефицитных мутантов снижен как уровень запасных белков, так
и уровень белков LEC. С другой стороны, вероятно, существуют
LEC-независимые пути влияния АБК на созревание зародыша. На-
пример, было показано, что накопление липидов в тканях зародыша
контролируется А Р2-подобным АБК-зависимым транскрипционным
фактором АВ14 (подробнее см. главу «Абсцизовая кислота»).

Гены LEC и контроль соматического эмбриогенеза

Помимо регуляции процессов созревания зародыша, активность
LLC-генов необходима для его нормального морфогенеза, при этом
действие LLC-генов в морфогенезе гораздо менее изучено.

Давно известно, что эктопическая экспрессия генов LEC стиму-
лирует соматический эмбриогенез в культуре тканей и органов раз-
личных растений. Соматический эмбриогенез представляет собой
развитие зародыша из вегетативной клетки, он возможен благода-
ря тотипотентности любой растительной клетки. По механизмам
развития зародыша он сходен с зиготическим — по крайней мерс,
характеризуется таким же характером экспрессии основных генов-
регуляторов морфогенеза зародыша. В качестве индуктора сома-
тического эмбриогенеза часто используют ауксины, в особенности
синтетический ауксин 2,4-Д, или цитокинины. Это связано с тем, что
для соматического эмбриогенеза в культуре изолировав ных органов
растений необходима пролиферация клеток, приводящая к возник-
новению каллуса, из клеток которого в дальнейшем дифференциру-
ются зародыши. Таким образом, соматический эмбриогенез включа-
ет в себя два шага: 1) пролиферацию и дедифференцировку клеток
(приобретение ими статуса стволовых клеток) — индуктором этого
процесса являются ауксины и цитокинины, и 2) собственно сомати-
ческий эмбриогенез, сопровождающийся организованным делением
и дифференцировкой клеток зародыша.

Похоже, EEC-гены участвуют в контроле обеих стадий соматиче-
ского эмбриогенеза. С одной стороны, мишенями транскрипцион-
ного фактора LEC2 являются гены YUC2 и YUC4, контролирующие
один из путей биосинтеза ауксинов; таким образом, активность LEC-
генов, вероятно, может индуцировать первичную дедифференциров-
ку клеток за счет повышения концентрации эндогенных ауксинов.

С другой стороны, потеря функции одного или нескольких LEC-
генов у мутантов приводила соответственно к снижению и полной
репрессии способности к соматическому эмбриогенезу в каллусе,
индуцированном 2,4-Д, при том что концентрация и распределение
ауксинов в каллусе были одинаковы у дикого типа и у мутантов.
Следовательно, в контроле соматического эмбриогенеза EEC-гены
действуют позже ауксинов и необходимы для индукции дифферен-
цировки зародышей из клеток каллуса.

Поскольку соматический и зиготический эмбриогенез имеют
сходные механизмы морфогенеза зародыша, для EEC-генов предпо-
лагается важная роль как первичного индуктора развития зародыша
из зиготы. В то же время они могут быть не единственными регуля-
торами т акого плана, так как тройные мутанты led 1ес2 fiis3 все же
жизнеспособны.

Возможно, роль LЕС-генов в морфогенезе зародыша связана с их
участием в негативном контроле пролиферации клеток. Эта функция
EEC-генов осуществляется за счет негативной регуляции экспрессии
некоторых генов циклинов, которые необходимы для обеспечения
клеточною цикла. Транскрипционные факторы LEC не связывают-
ся напрямую с громоторами циклиновых генов — вероятно, в этом
случае имеет место опосредованная регуляция их экспрессии. Было
показано, что LEC-зависимая репрессия транскрипции циклино-
вых генов снимается при увеличении концентрации гиббереллинов.
Следствием LEC-зависимой негативной регуляции генов циклинов,
возможно, является пролиферация клеток суспензора у двойных
мутантов по £ЕС-генам — в результате у определенного процента
мутантных зародышей развиваются зародыши-«близнецы», один из
которых формируется из клеток суспензора.
8.4.	Контроль развития эндосперма

Помимо оплодотворения яйцеклетки с образованием зиготы,
важным компонентом двойного оплодотворения является слияние
второго спермия с диплоидной центральной клеткой, которое при-
водит к образованию гриплоидного эндосперма, содержащего запас
питательных веществ.

Основную роль в развитии эндосперма играют гены группы FIS'.
MEDEA (МЕА), FERTILIZATION INDEPENDENT ENDOSPERM(FIE)
и FERTILIZATION INDEPENDENTSEED2 (FIS2), которые контроли-
руют пролиферацию клеток эндосперма и зародыша. Мутанты ара-
бидопсис с потерей функций этих генов были идентифицированы по
способности к развитию семян без оплодотворения. В эндоспеоме
мутантов, развивающемся независимо от оплодотворения, наблюда-
ется усиленная пролиферация клеток, что свидетельствует о функ-
ции /"75-генов как негативных регуляторов клеточного цикла.

Кроме того, все три рецессивные мутации классаfis демонстриру-
ют материнский эффект в гетерозиготе: 50% семян, полученных от
гетерозиготного материнского растения, абортируются независимо
от отцовской аллели FIS-гена (рис. 8.16 А). Этот эффек! обусловлен
тем, что половина яйцеклеток гетерозиготного материнского родите-
ля содержит мутантную аллель. Ранние стадии развития зародыша
у гетерозигот поfis морфологически не отличаются от таковых у ди-
кого типа, но после стадии глобулы развитие мутантных зародышей
останавливается (рис 8 16 Б).

Продуктами генов МЕА, FIE и F1S2 являются белки группы Poly-
comb (PcG), имеющие высокий процент гомологии с Poiycomb белка-
ми дрозофилы Suppressor of variegation, Enhancer of Zeste и Trithorax,
которые являются регуляторами экспрессии гомеобокс-содержащих
генов в развитии дрозофилы. Гомологами FIS-белков у растений
являются Polycomb белки CURLY LEAF (CLF), которые регулиру-
ют экспрессию одного из генов идентичности флоральных органов
AGAMOUS (AG) и VERNALIZATION 2 (VRN2), который репресси-
руют экспрессию гена FLOWERING LOCUS С (FLC), участвующего
в контроле инициации цветения.

Как и другие белки группы Poiycomb, FIS-белки растений взаи-
модействуют между собой с образование.м Poiycomb-комплекса,
который участвует в эпигенетической регуляции экспрессии генов.
К сожалению, о мишенях Poiycomb-комплекса FIS в настоящее вре-
мя практически ничего не известно. Единственный ген, для которого
показана прямая регуляция экспрессии Poiycomb-комплексом F1S —
А

Рис. 8.16. Влияние мутации теа на развитие эндосперма и зародыша арабидопсис

(по Grossniklaus et al., 1998)

А — материнский эффект гетерозиготности по мутации теа: у гетерозиготного
материнскою растения наблюдается 50% абортивных семян (сг.еса), тсгдэ как при
опылении растения дикого типа пыльцой гетерозигстнсгс родителя сходный эффект
отсутствует. Б — развитие зародыша дикого типа (вверху) и мутанта теа (внизу) на
стадии глобулы: у мутантного зародыша видна аномальная прот ифсрация кгеток

Б

ген PHERES1 (РНЕ Г), продуктом которого является транскрипци-
онный фактор с MADS-боксом. Гены-мишени транскрипционного
фактора РИЕ1 также не выявлены.

Экспрессия гена РНЕ1 наблюдается как в эндосперме, так
и в зародыше, и начинается сразу после оплодотворения. У му-
тантов группы fis наблюдается значительное повышение уровня
экспрессии гена РНЕ1, что свидетельствует о роли белков PcG
как основных негативных регуляторов регуляции его экспрессии.
Более того, искусственное снижение уровня транскриптов РНЕ1
у мутанта теа снижает процент абортивных семян — таким об-
разом, по-видимому, ген РНЕ1 является негативным регулятором
развития эндосперма, и его репрессия белками PcG является усло-
вием нормального развития этого органа. Вообще, транскрипци-
онные факторы с MADS-боксом играют важную роль в различ-
ных аспектах постэмбрионального развития высших растений,
что позволяет предположить роль гена РНЕ1 как ключевого нега-
тивного регулятора развития эндосперма и, возможно, зародыша.

Источники рисунков, использованных в главе

1.	Assaad F. Е, Mayer U., Wanner G. et al. The KEULE gene is involved in
cytokinesis in Arabidopsis // Molecular and Geneial Genetics. 1996 Vol.253.
P. 267-277.

2.	AssaadE E, Huet Y, Mayer U. et al. The cytokinesis gene KEULE encodes a Seel
protein that binds the syntaxin KNOLLE // Cell Biology 20111. Vol 152. P 531-543.

3.	В ray brook S. A., Harada J. J. LECs go crazy in embryo development // Trends
in Plant Science 2008. Vol. 13 . P 624-630

4.	Gazzarrini S.. Tsuchiya Lumba S. ct al. The transcription factor FU6CA3 controls
developmental timing in Arabidopsis through the hoimones gibberellin and abscisic
acid // Development and Cell. 2004. Vol. 7. P. 373-385.

5.	Grossniklaus U., Vlelle-Calzada J., Hoeppner M. A. et al. Matemat control of
embryogenesis by MEDEA, a PolycombGroup gene in Arabidopsis II Science, 1998.
Vol. 280. P. 446-450.

6.	Haecker A., Grofi-Hardt R, Geiges B. et al. Expression dynamics of WOX genes
mark cell fate decisions during early embryonic patterning in Arabidopsis thaliaua //
Development. 2003 Vol. 131. P. 657 668

7.	Hibara K., Karim M. R., Takada S et al Arabidopsis CUP-SHAPED
COTYLEDON3 regulates postembryonic shoot meristem and organ boundary
formation // Plant Cell. 2006. Vol. 18. P 2946-2957.

8.	Kajiwara T, Furutani M.. Hibara K. et al. The GURKE gene encoding an
Acetyl CoA carboxylase is required for partitioning the embryo apex into three
subregions in Arabidopsi // Plant Cell and Physiology 2004. Vol. 45. P. 1122—
1128

9.	Krupkovd E., Schmiilling T. Developmental consequences of the tumorous shoot
development! mutation, a novel allele of the cellulose-syntliesizing KORR1GAN1
gene // Plant Molecular Biology. 2009.

10.	Kumaran M. K., Bowman J. L., Sundaresun V. YABBY polarity genes mediate the
repression of KNOX homecbox genes in Arabidopsis // Plant Cell. 2002. Vcl. 14.
P. 2761-2770.

11.	Laux T, Wurst hum T, Breuninger H. Genetic regulation of embryonic pattern
formation // Plant Cefi. 2004. Vol. 16. P. 190-202.

12.	Long J A., Woody S'.. Poethig S. et at. Transformation of shoots into roots in
Arabidopsis embryos mutant at the TOPLESS locus // Development. 2002. Vol. 129.
P 2297-2306.

13.	l.otan T, Ohto M., Yee К. M. et al. Arabidopsis LEAFY COTY) EDON1 is sufficient
to induce embryo development in vegetative cells// Cell. 1998. Vol.93. P. 1195—
1205.

14.	Lynn K., Fernandez A., Aida M. et al. The PIN1IEAD/ZW1LLE gene acts
pleiotropically in Arabidopsis development and has overlapping functions with the
ARGONAUTE1 gene // Development 1999. Vol. 126. P.469-481.
15.	Meinke D. W, Franzmqnn L. И., Nickle Т. С. et al. Leafy Cotyledon Mutants of
Arabidopsis // Plant Cell. 1994. Vol.6. P. 1049-1064.

16.	Moller B., Weijers D. Auxin control of embryo patterning // Cold Spring Harbor
perspectives in biology. 2009. Vol. 1. P. 1-12.

17.	Sollner R., Glasser G., Wanner G. et al. Cytokinesis defective mutants
of Arabidopsis // Plant Physiology 2002. Vol. 129, P 678-690.

18.	Taiz L., Zeiger E. Plant Physiology. 2002. Hardcover Publisher: Sinauer Associates;
3 edition 690 pages. ISBN: 0878938230.

19.	Volker A., StierhofY. -D., Jurgens G. Cell cycle-independent expression of the
Arabidopsis cytokinesis specific syntaxin KNOLLE results in mistargeting to
the plasma membrane and is not sufficient for cytokinesis // Cell Science. 2001.
Vol. 114. P. 3001-3012.

20.	Weijers D., Jurgens G. Auxin and embryo axis formation: the ends in sight? //
Current Opinion in Plant Biology. 2005. Vol. 8 P. 32-37.

Рекомендованная литература

1.	Chandler J., Nardmann J., Werr W Plant development revolves around axes //
Trends in Plant Science. 2008. Vol. 13. P. 78-84

2.	Lau S, Ehrismann J. S., Schlereth A. et al. Cell-cell communication in Arabidopsis
early embryogenesis // European journal of cell biology. 2009.

3.	Park S., Harada J. J. Arabidopsis embryogenesis // Methods in molecular biology.
2008. Vol. 427. P. 3-16.

4.	Ten Hove C. A., Heidslra R Who begets whom? Plant cell fate determination
by asymmetric cell division // Current Opmion in Plant Biology. 2008. Vol. 11.
P. 34-41.
Глава 9

Развитие апикальной меристемы
побега

9.1	Меристемы растений, стволавые клетки и принцип
организации ниши стволовых клеток

В ходе развития способность к клеточным делениям сохраняется
почти у всех живых зрелых тканей растений, которые, будучи тоти-
потентными, способны дать начало отдельному растению. Но при
этом активная пролиферация характерна для особой популяции кле-
ток растений — меристем (от греч. meristos — делимый). У расте-
ний выделяют несколько типов меристем — апикальные, латераль-
ные (боковые), вставочные меристемы. Первичными меристемами,
закладывающимися в ходе эмбриогенеза, являются апикальная ме-
ристема корня и побега. Из апикальной меристемы побега форми-
руются надземные органы растений — листья, стебель. Затем, по
мере развития растений, апикальная меристема побега дает начало
меристеме соцветия и цветка.

Для того чтобы АМ могла постоянно продуцировать новые орга-
ны, она должна обладать двумя основными свойствами:

•	быть способной постоянно поддерживать недифференцирован-
ное состояние и обеспечивать постоянство развития;

•	быть способной продуцировать клетки, способные к дифферен-
цировке и формированию новых органов.

В меристеме выделяют особую популяцию клеток, которые
и определяют такие свойства меристемы. Этими клетками являют-
ся стволовые клетки. Стволовые клетки представляют собой группу
недифференцированных клеток, способных поддерживать собствен-
ную популяцию и в то же время способных продуцировать клетки,
претерпевающие дифференцировку и дающие начало новым орга-
нам и тканям

Наличие тотипотентных стволовых клеток, способных к собствен-
ному возобновлению, позволяет растениям расти и формировать
новые органы в т ечение многих лет. Это отличает их от животных.
У животных же тотипотентными являются клетки, возникающие по-
сле первых делений дробления, далее в процессе эмбрионального
развития формируется бластоциста, и клетки бластоцисты уже не
равноценны, из отдельной клетки бластоцисты не может сформиро-
ваться нормальный зародыш. Клетки бласт оцисты дают начало всем
типам клеток организма, их называют плюрипотентными. А затем
но мере развития организма стволовые клетки специализируются
и становятся способными участ вовать в образовании только опреде-
ленного типа клеток (такие клетки называют мультиногентными).

Но, несмотря на существующие различия свойств и регуляции
стволовых клеток, у растений и животных можно выделить общие
принципы организации стволовых клеток. Стволовые клетки ло-
кализуются в так называемой «нише стволовых клеток» (stem cell
niche): локальном микроокружении, поставляющем факторы, необ-
ходимые для поддержания стволовых клеток.

Дифференцировка стволовых клеток в нише подавляется в резуль-
тате действия факторов, продуцируемых клетками «организующего
центра». Как 1 гравило, клетки организующего центра характеризу-
готся большей длительностью клеточного цикла, то есть эти клет-
ки делятся с меньшей скоростью. По мере деления дочерние клетки
удаляются от организующего центра, оказываясь вне зоны действия
сигналов, продуцируемых организующим центром, и претерпевают
дифференцировку (рис. 9.1).

Таким образом, принцип организации стволовых клеток является
общим у растений и животных. Однако молекулярные механизмы
поддержания стволовых клеток у растений и животных принципи-
ально различны. В этой главе мы рассмотрим, как осуществляется
регуляция стволовых клеток у растений.

У растений стволовые клетки локализуются в меристемах. В апи-
кальной меристеме побега стволовые клетки локализованы в цен-
тральной зоне, а клетки нижних слоев (подлежащей зоны) пред-
ставляют собой так называемый «организующий центр», который
продуцирует сигналы, регулирующие поддержание свойств ствол о-
гчутриклеточный
сигнал

Рис. 9.1. Общий принцип организации «ниши ствслсвых клеток»

вых клегок. В меристеме корня аналогичный по функции органи-
зующий центр меристемы называют «покоящимся центром», вокруг
которого располагаются стволовые клетки-инициали.

9.2	. Строение апикальной меристемы побега

Апикальная меристема побега (ПАМ) расположена на верхушке
побега и прикрыта зачатками молодых листьев. ПАМ дает начало
наземным органам растения, которые формируются по модульному
принципу, элемент побега включает лист, междоузлие и пазушную
почку. В меристеме также выделяют различные морфофункциональ-
ные зоны (рис. 9.2). Клетки центральной зоны, относительно круп-
ные вакуолизированные клетки, делятся медленно и с постоянной
скоростью, обеспечивая постоянство развития. Именно в этой зоне
меристемы и сосредоточены стволовые клетки растений. Централь-
ная зона окружена клетками периферической зоны, способными
к дифференцировке: в результате делений клеток периферической
зоны в меристеме формируется примордий листа и пазушные почки.
Клетки подстилающей (nb) зоны дают начало внутренним тканям
побега.

Кроме того, в апикальной меристеме выделяют различные слои
клеток, обозначаемые как L,, Ь2 и L3. Клетки двух внешних слоев
L] и Ь2 делятся антиклинально, то есть плоскость деления клеток
ориентирована перпендикулярно поверхности меристемы. Эти два
слоя клеток объединяют под общим названием «туника». Клетки
При^ордий листа

Рис. 9 2. Строение апикальной меристемы побега

внутреннего слоя L3 (который также называют «корпус») характери-
зуются различным направлением деления. Такая организация ПАМ
характерна т ля арабидопсис и многих двудольных растений. В отли-
чие от них, у однодольных растений «туника», как правило, состоит
только из одною слоя клеток — Ц, тогда как слой L2 соответствует
«корпусу».

С помощью клонального анализа с использованием периклиналь-
ных химер (то есть растений, у которых клетки разных слоев ПАМ
имеют разный генотип) было покатано, что из клеток внешнего слоя
L, образуется эпидермис побега, то; да как клетки слоев L2 и L3 обе-
спечивают формирование внутренних тканей листа и стебля (мезо-
филл. проводящие ткани).

Для правильного развития побега рост и пролиферация клеток
периферической зоны ПАМ должны быть четко скоординированы
с пролиферацией клеток в центральной зоне и постоянным возоб-
новлением стволовых клеток НАМ. Кроме того, особенностью ПАМ
является ее высокая способность к регенерации и восстановлению
собственной функции. Так, при разрушении клеток центральной
зоны ПАМ их замещают клетки периферической зоны, и функция
ПАМ восстанавливается. При «рассечении» ПАМ на две части она
регенерирует с образованием двух новых меристем нормального
размера. Периферическая и центральная зоны, а также боковые ор-
ганы, образующиеся из НАМ, содержат клет ки трех различных сло-
ев, имеющих различное клональное происхождение. Таким образом,
меристема представляет собой сложно организованную структуру,
работа которой обеспечивается скоординированными взаимодей-
ствиями между клетками различных слоев и зон ПАМ.

Клетки ПАМ соединены через плазмодесмы, через которые про-
исходит обмен различными регуляторными молекулами. Экспери-
менты по изучению транспорта и анализу перемещения раствори-
мых флуоресцентных белков по клеткам ПАМ позволили выявить
компартментализапию ПАМ: центральная и периферическая зоны
меристемы соответствуют двум «симпластическим полям», зонам,
в пределах которых осуществляется диффузия флуоресцентного
белка через плазмодесмы. Таким образом, можно предположить,
что транспорт различных регуляторных молекул через плазмодесмы
также может осуществляться в пределах этих зон, аналогично транс-
порту флуоресцентного белка. Интересно отмстить, что переход ме-
ристемы в состояние покоя сопровождается нарушением единых
симпластичсских полей в ПАМ и изоляцией клеток. Таким образом,
активность меристемы может регулироваться, в том числе за счет
изменения ее физиологического состояния, а именно функциональ-
ного состоянии плазмодесм, соединяющих клетки ПАМ.

8.3. Мутанты с нарушением развития апикальной
меристемы побега

Ключевые гены, контролирующие активность апикальной мери-
стемы растений, были выявлены у арабидопсис с помощью методов
классической генетики при исследовании мутантов с нарушением
развития меристемы. Такие мутанты арабидопсис включают мутан-
тов с недоразвитием ПАМ: sim, wus, zll и др.; а также мутантов с уве-
личением размера AM: clvl, clv2, clv3, fasl, fas2 и др Рассмотрим
более подробно фенотип таких мутантов.

Мутанты с недоразвитием ПАМ

У мутанта was (wusehel) в ходе эмбриогенеза формируется ПАМ,
но она характеризуется уменьшенными размерами и состоит из круп-
ных вакуолизированных клеток ПАМ побега формирует несколько
листьев и прекращает свое развитие. На придан очных побегах мутан-
та wus могут закладываться цветки с нормальным числом чашели-
стиков и лепестков, прекращающих свое развитие с формированием
единственной тычинки. На основании фенотипических особенно-
стей мутанта wus можно предположить, что ген WUS (WUSCHEI.)
необходим для формирования нормальной ПАМ в эмбриогенезе
и для поддержания клеток ЦЗ апикальной меристемы в стволовом
состоянии в процессе вегетативного и репродуктивного развития.

Паралог гена WUS, ген W0X9 арабидопсис (также известный как
S1IMPY (STIP)), также участвует в функционировании ПАМ. По-
скольку у мутантов stip наблюдается нарушение развития апикаль-
ной меристемы и отсутствие экспрессии генов IVUS в апикальной
меристеме побега, предполагают, что в норме ген IVOX9 прямо или
косвенно влияет на активность гена WUS. У мутантов по гену WOX9
происходит дифференцировка клеток ПАМ и остановка ее развития.
Однако такой мутантный фенотип может быть полностью восстанов-
лен добавлением сахарозы в среду для культивирования растений.

У мутантов stm (shoot meristemless) с полной утратой функции
гена («жес ткие» аллели stm-1, stm -5) ПАМ не закладывается в ходе
эмбриогенеза, и на месте меристемы между семядолями располага-
ются крупные вакуолизированные клетки. При этом семядоли могут
сливаться. У мутантов stm-2 («мягкая, слабая» аллель) ПАМ харак-
теризуется небольшим числом клеток и способна давать начало 1-3
листьям и нескольким пазушным побегам. Мутанты stm-б с еще бо-
лее слабым проявлением мутантного фенотипа ПАМ развиваются до
стадии цветения, но число органов цветка значительно меньше, чем
в цветках дикого типа. Фенотипические характеристики мутантов
stm позволяют предположить, что ген STM необходим для закладки
ПАМ в эмбриогенезе и для предотвращения дифференцировки кле-
ток ЦЗ апикальной меристемы в процессе вегетативного и репродук-
тивного развития.

Мутанты с увеличенной ПАМ

У арабидопсис известны несколько мутантов с увеличением раз-
мера ПАМ, которых можно разделить на две группы. Группа му-
тантов clavata (clvl, 2, 3) характеризуется увеличением количества
клеток центральной зоны. Морфологическими особенностями таких
мутантов являются многолистная розетка, фасциация стебля, увели-
чение числа органов в цветке, увеличение числа плодолистиков, об-
разование плода «матрешка». Гены CLAVATA (CLV1, 2, 3) необходи-
мы для ограничения размера ПАМ в эмбриогенезе и на всех стадиях
постэмбрионального развития, а также для ограничения пролифера-
ции в цветочной меристеме.

Мутанты mgo (mgoun) (mgol и 2) также характеризуются уве-
личенной ПАМ, но в отличие от мутантов civ у них наблюдается
увеличение не центральной, а периферической зоны меристемы
У мутантов mgo уменьшено количество листьев и органов цветка.
Предполагается, что гены MGO регулируют закладку листового при-
мордия в периферической зоне ПАМ.

9.4.	Роль транскрипционных факторов в регуляции
акгивности меристемы побега

Многие мутанты арабидопсис с нарушением активности ПАМ
несут мутации в генах, кодирующих ТФ. ТФ представляют собой
ключевые регуляторы развития и поддержания активности ПАМ.
Рассмотрим основные ТФ, необходимые для функционирования
ПАМ.

Ген STM арабидопсис кодирует гомсодомен-содержащий ТФ груп-
пы KNOX I из семейства TALE (Three Amino Acid Loop Extension).
ТФ STM необходим для правильного развития и функционирования
апикальной меристемы побега, для поддержания клеток ПАМ в не-
дифференцированном состоянии. Ген STM начинает экспрессировать-
ся еще в апексе зародыша на стадии поздней глобулы (рис. 9.4). На
последующих этапах развития ген STM экспрессируется в вегетатив-
ной ПАМ, в меристеме соцветия и меристеме цветка. В апексе побега
ген STM экспрессируется в недифференцированных клетках ПАМ, а
в клетках формирующегося листового примордия экспрессия STMпо-
давляется. После закладки плодолистиков в меристеме цветка (и, со-
ответственно, прекращения функционирования меристемы цветка, ее
«терминации») STM перестает экспрессироваться.

Другие представители генов KNOX /, паралоги гена STM у араби-
допсис, а именно KNAT1 (также известный как BP (BREVIPEDICEL-
LUS)) и KNAT2, также функционируют в ПАМ. Их экспрессия также
наблюдается в клетках ПАМ и подавляется в сайтах закладки ли-
стовых примордиев. Показано, что за подавление экспрессии генов
KNAT1 и KNAT2 в листовом примордии ответственны транскрипци-
онные факторы группы MYB AS1 и AS2 (ASYMMETRIC LEAVES
1,2), контролирующие переход клеток в дифференцированное со-
стояние. Предполагают, что репрессия акгивност и генов KNOX в ли-
стовом примордии может осуществляться за счет эпигенетических
механизмов с участием белков Polycomb: согласно одной из моделей
белки AS 1 и AS2 связываются с промоторами генов KNOX и рекру-
тируют факторы ремоделирования хроматина в область промоторов,
что приводит к подавлению транскрипции генов KNOX. В то же
время для правильного функционирования меристемы необходимо
подавление акгивности генов AS1 и AS2 в клетках меристемы. Эту
функцию и осуществляет транскрипционный фактор STM. В част-
Рис. 9.3. Схема взаимодействия ТФ KNOX I и AS в меристеме побега

ности, у мутантов по гену STM экспрессия гена AS1 не подавляется
и наблюдается в области меристемы (рис. 9.3).

Интересно отметить, что подавление экспрессии KNOX-генов
I класса в листовом примордии характерно для арабидопсис, рас-
тения, имеющего простые листья. Однако у растений со сложными
листьями, нанримср у томага, экспрессия КМ2¥-генов I класса на-
блюдается и в области листовых примордиев. Так, ген LeT6 тома-
та, гомолог гена SI М арабидопсис, экспрессируется как в листовом
примордии, так и в апикальной меристеме. Показано, что изменение
морфологии листа в ходе эволюции растений связано с изменением
характера экспрессии AAZZY-генов в апексе побега.

Ген WUSCHEL (WUS), который впервые обнаружен у арабидопсис,
кодирует гомеодомсн-содержаший транскрипционный фактор с ати-
пичным гомеодоменом, состоящим из 66 аминокислотных остатков.
У арабидопсис описано целое семейство генов — гомологов WUS, по-
лучивших название WOX(WUSCHEL related homeobox). Ген WUS на-
чинает экспрессироваться в апексе эмбриона на стадии 16-клетсчногс
зародыша (стадия ранней глобулы). В ПАМ ген WUS экспрессируется
в центральной зоне апикальной меристемы в небольшой группе кле-
ток, образующих так называемый «организующий центр» меристемы
(рис. 9.4). Клетки организующего центра митотически менее активны,
чем остальные клетки меристемы. Считается, что клетки организую-
щего центра «побуждают» к активным делениям прилежащие стволо-
вые клетки меристемы. Основная функция гена WUS— поддержание
пула стволовых клеток в апикальной меристеме побега. Так же как
и ген STM, ген JVUS экспрессируется в вегетативной ПАМ, в меристе-
ме соцветия и меристеме цветка. В ходе развития цветка транскрипци-
онный фактор WUS активирует экспрессию гена A GAMOUS (AG). Ген
Рис. 9.4. Экспрессия генов S1M и WUS ь апикальной меристеме побега

A(j экспрессируется в третьем и четвергом кругах формирующегося
цветка, его активность необходима для развития генеративных орга-
нов. 11родукт гена A G — транскрипционный фактор, который репрес-
сирует активность гена WUS в меристеме цветка, после чего меристе-
ма становится детерминированной и оказывается более не способной
поддерживать свою митотическую активность.

9.5.	Система WUS-CLV и ее роль в поддержании ст Беловых
клеток растений

Мутанты clavata (clvl, 2, 3) характеризуются увеличением коли-
чества клеток центральной зоны ПАМ, вместе с этим у таких мутан-
тов увеличена зона экспрессии гена WUS в ПАМ. На основании это-
го было высказано предположение, что гены CLAVATA (CLV1, CLV2,
CLV3) негативно регулируют экспрессию гена WUS, ограничивая
область его экспрессии в ПАМ

Ген СЫЧ кодирует трансмембранную рецепторную киназу. Этог ген
экспрессируется в клетках центральной зоны слоя L3 ПАМ (центральная
Рис 9.5. Экспрессия генов CLV1, CLV3 и WUS в апикальной меристеме побега
зона «корпуса» НАМ). Ген CLV2 кодирует рецсптор-подобный белок,
имеющий значительное сходство с CLV1, ко без цитоплазматическо-
го киназного домена. Предполагают, что продукты генов CLK1 и CLV2
образуют гетеродимерный рецепторный комплекс CLV1/CLV2. Оказа-
лось, что ген CLV3 кодирует небольшой секреторный пептид из 96 ами-
нокислот. CLV3 экспрессируется в центральной зоне НАМ в клегках
слоя L, и Ь2 (центральная зона «туники» ПАМ) (рис. 9.5)

Область экспрессии CLV3 располагается над клетками, экспрес-
сирующими и совпадает с предполагаемым доменом стволо-
вых клеток в ПАМ. Экспрессию гена CLV3 используют в качестве
маркера стволовых клеток ПАМ.

CLV3 представляет собой лиганд, который связывается с ре-
цепторным комплексом CLV1/CLV2, что приводит к запуску сиг-
нального каскада, негативно регулирующего экспрессию гена
ITUS (рис. 9.6).

Показано, что ген IVUS, в свою очередь, оказывает влияние на экс-
прессию генов CLV Эктопическая экспрессия H 'L'S в развивающемся
листовом примордии вызывает подавление дифференцировки клеток
примордии и остановку его развития, и вместе с этим вызывает экто-
пическую экспрессию гена CLV3. Таким образом, Тф WIJS взаимо-
действует с компонентами системы CLV по принципу отрицательной
обрат ной связи: экспрессия WUS в организующем центре ПАМ сти-
мулирует поддержание стволовых клеток в верхних слоях меристемы
и активирует экспрессию CLH3 в зоне стволовых клеток; в свою оче-
редь, продукт CLV3, секреторный пептид, перемещается в нижележа-
щие слои меристемы, где он связывается с рецепторным комплексом
Рис. 9.6. Регуляция экспрессии ген? WUS
с участием системы CLV

CLV3

CLV1/CLV2 и запускает каскад,
подавляющий экспрессию WUS
(рис. 9.7).

Было показано, что переме-
щение гибридного белка CLV3-
GFP в ПАМ ограничивается при
сверхэкспрессии гена CLV1. На
основании этою предполагают,
что рецептор CLV1 обладает до-
полнительной функцией: помимо
его участия в рецепции CLV3, он
также ограничивает перемещение
CLV3 и, таким образом, сохраня-
ет небольшую область клеток,
экспрессирующих WUS в ПАМ,
«предохраняя» ее от не» ативного
действия CLV3.

Ген WUS экспрессируется
в организующем центре мери-
стемы, который согласно модели
«ниш стволовых клеток» являет-
ся источником некоею сигнала,
подавляв >1 него дифференцировку
и стимулирующего деления ство-
ловых клеток. Какова же природа

этого гипотетического сигнала,
Рис. 9.7. Схема взаимодействия WUS поступающего из организующе-
и системы CLV в ПАМ	го центра? Не является ли им

продукт гена самою WUS? Экс-
перименты по изучению локализации белкового продукта с исполь-
зованием гибридного белка WUS-GUS, показали, что белок WUS,
как и мРНК WUS, локализован в организующем центре ПАМ, но не
в зоне стволовых клеток. Таким образом, сам WUS не является тем
сигналом, который перемещается из организующего центра и peiy-
лирует активность стволовых клеток в ПАМ. Природу сигнала, регу-

лирующего активность стволовых клеток, еще предстоит выяснить.

Дополнительная информации

Пептид CLV3 относится к большому семейству секретируемых CLE-пептидов
(CLV3/ESR-related), имеющих консервативный CLE-домен из 12 аминокислот на
С-концевом участке пептида. В геноме арабидопсис идентифицировано более 30 гс-
нов, предположительно 'кодирующих различные CLE-пептиды. Такие гены кодиру-
ют белки из 80 120 аминокислот. Установлено, что активной формой CLE-пептидов
является пептид из 12 аминокислот, соответствующих CLE-домену, образующийся
в результате процессинга исходного белка. В целом ряде экспериментов химически
синтезированные CLE-псптиды из 12 аминокислот демонстрировали физиологиче-
скую активность при обработке ими растений.

Помимо CLV3, другие CLE пептиды также являются важными сигнальными
молекулами, регулирующими развитие растений. Так, например, CLE-пептид TD1F
(tracheary element differentiation inhibitory factor) регулирует развитие проводящих
тканей. Открыты CLE-пептиды, регулирующие активность апикальной меристемы
корпя (см. главу «Развитие корня»). Кроме того, совсем недавно у бобовых расте-
ний. вступающих в симбиотические взаимодействия с почвенными бактериями ри-
зобиями, были идентифицированы CLE-псптиды, специфично регулирующие раз
витие клубенькоь. Таким образом, CLE-пептиды представляют собой новый класс
регуляторных молекул (их относят к пептидным гормонам растений), играющих
важную роль в развитии растений.

9.6.	Взаимодействие гормонов и транскрипционных
факторов в апикальной меристеме побега

Взаимодействие генов KNOX с цитокининами

Известно, что фенотип растений со сверхэкспрессией /СУОХ-генов
напоминает фенотип растений с повышенным содержанием цито-
кининов. Так, у трансгенных растений табака со сверхэкспрессией
гена кукурузы KN1 наблюдалось снятие апикального доминирова-
ния, у растений арабидопсис со сверхэкспрессией гена KNAT1 про-
исходило формирование «дольчатых» листьев с многочисленными
эктопическими меристемами в пазухах таких листьев, ингибирование
роста корней растяжением. Подобные фенотипические проявления
наблюдались и у трансгенных растений со сверхэкспрессией бактери-
ального zpf-гена, контролирующего синтез цитокинина. Такого рода
наблюдения свидетельствуют о том, что цитокинины и £Д/СЛ¥-гены,
возможно, задействованы в общих регуляторных механизмах.

У трансгенных растений со сверхэкспрессией KNAT1 наблюда-
лось увеличение содержания цитокининов изопснтенилового типа
(изопентениладенина и изопентениладенозина), кроме того, такие
растения характеризовались изменением формы листа, нарушением
характера жилкования, редукцией или полным отсутствием клеток
палисадной паренхимы, устьиц. По краю листовой пластинки фор-
мировались меристемоподобныс структуры. Подобного рода фено-
типические проявления сверхэкспрессии KNAT1 подтверждают роль
пою гена как антагониста клеточной дифференцировки. Накопле-
ние цитокининов изолептенилового типа происходило локально
в тех тканях, которые демонстрировали наиболее значительные фе-
но типические изменения, в областях, где закладывались меристемо-
подобные структуры.

За последнее время в ряде работ получены данные, свидетель-
ствующие о влиянии ХАОХ-генов на биосинтез цитокининов. Для
изучения генов-мишеней транскрипционного фактора STM авторы
работ использовали гибридную конструкцию (35S STM-GR), со-
держащую ген STM, «сшитый» с частью гена глюкокортикоидного
рецептора (glucocorticoid receptor, GR). При добавлении гормона
дексаметазона происходил перенос гибридного продукта из цито-
плазмы в ядро и, как следствие, активация генов-мишеней. Авторы
показали, что активация STM приводит к увеличению экспрессии
цигокинин-регулируемого гена ARR-5 (Arabidopsis response regula-
tor 5) и генов А11РТ5 и AtiPT?, участвующих в биосинтезе цитоки-
нина. При этом усиление экспрессии AtIPT5 наблюдали нс во всех
экспериментах. В работе других исследователей с использованием
аналогичной системы для активации KNAT2 также наблюдалось
увеличение экспрессии гена AtiPT?. В биосинтез цитокининов во-
влечена целая группа Яг/ЛТ-генсв {AtIPTI — AtiPT 9). Поскольку
в экспериментах по изучению влияния ХАОА-генов (STM, KNAT1,
К NAT2) было выявлено изменение экспрессии только двух AtlPT-
генов, авторы предположили, что существует два пути биосин теза
цитокинина: А'А’ОХ-завлсимый и XAGX-независимый.

В экспериментах по выявлению генов-мишеней STM было по-
казано, что STM активирует экспрессию гена GA2ox, вовлеченного
в дезактивацию гиббереллинов. Негативное влияние генов KNOX на
метаболизм гиббереллинов в НАМ было подтверждено и другими дан-
ными. Гак, например, было показано, что эктопическая экспрессия гена
STM подавляет транскрипцию гена GA20oxl, кодирующего фермент
гиббереллин-20-оксидазу. вовлеченный в биосинтез гиббереллина.

Таким образом, действие транскрипционных факторов KNOX
регулирует содержание гормонов в ПАМ: приводит к увеличению
содержания цитокинина и снижению содержания гиббереллина
ь ПАМ.

Известно, что в области инициации листовою примордия про-
исходит локальное увеличение содержания ауксина, что совпадает
с местом подавления экспрессии STM. Предполагается, что ауксин
подавляет экспрессию STM в зачатке развивающегося листа. Экспери-
менты с использованием ингибиторов транспорта ауксина показали,
чго при культивировании апексов кукурузы на среде с ингибитором
полярного транспорта ауксина нафтилфталамовой кислогой (НФК)
происходило нарушение формирования листьев, связанное с сохране-
нием экспрессии АТ/ОАгенов в области закладки примордия.

Взаимодействие генов WOX с цитокининами

Взаимодействие между гормонами и транскрипционным факто-
ром WUS также было исследовано. Известно, что Л/?/?-гены А-типа
являются генами первичного ответа на цитокинины (см. главу «Ци-
токинины»), При этом активация транскрипции Л/?Л-генов А-типа
осуществляется белками-регуляторами другой подгруппы ARR бел-
ков, относящихся к В-типу. Известно, что активация ARR белков
В-типа происходит при их фосфорилировании в результате передачи
сигнала от цитокининового рецептора. ARR-белки В-типа играют
важную роль в цитокининовом ответе, запуская экспрессию генов-
мишеней. Белки, кодируемые ЛЛЯ-генэми А-типа, являются нега-
тивными регуляторами цитокининового отзета, антагонистами ARR
белков В-типа. Таким образом, ARR гены А-типа участвуют в авто-
регуляции цитокининового ответа по механизму отрицательной об-
ратной связи.

При анализе экспрессии участвующих в цитокининовом ответе
Я/?А-генов А-типа (Arabidopsis Response Regulators А-type) ARR5,
ARR6, ARR7, ARR]5 — было установлено, что WUS является репрес-
сором их транскрипции. Таким образом, транскрипционный фактор
WUS контролирует цитокинин-зависимые реакции в меристеме.

Связь с цитокининовым ответом была показана и для паралога
WUS — транскрипционного фактора WOX9/STIP. Совсем недавно
в экспериментах по крупномасштабному изучению экспрессии ге-
нов было обнаружено, что среди генов, экспрессия которых регули-
руется ТФ W0X9, находятся многие цитокинин-регулируемые гены,
в том числе гены ARR А-типа и В-типа, а также гены, кодирующие
CRF. Предполагаю!, что W0X9 участвует в активации цитокинин-
регулируемых генов параллельно с ранее охарактеризованными ре-
гуляторами цитокининового ответа — транскрипционными факто-
рами ARR В-типа. На основании того, что экспрессия гена W0X9
значительно снижена у мутантов по генам цитокининовых рецепто-
ров и у мутантов по генам ARR В-типа, предполагают, что экспрес-
сия самого гена W0X9 также регулируется цитокинином.

Таким образом, действие транскрипционных фактооов и гормо-
нов, в первую очередь цитокинина, тесно взаимосвязано. Действие
АТУОЛ'-генов осуществляется через прямую локальную активацию
Рис. 9.8. Общая схема взаимодействия гормонов и ТФ в меристеме побега

биосинтеза цитокининов, активирующих клеточные деления в апи-
кальной меристеме, тогда как гены WOX оказывают влияние на рас-
пространение цитокининового ответа (рис. 9 8).

97. Регуляция клеточного цикла в апикальной меристеме
побега

Пролиферация клеток в меристемах контролируется различны-
ми факторами, в том числе транскрипционными факторами и гор-
монами. В конечном счете мишенью действия этих факторов явля-
ются непосредственные регуляторы клеточного цикла — циклины
и циклин-зависимые киназы. У растений, как и у других эукариот,
клеточный цикл контролируется белковыми комплексами циклинов
Сус-групп А, В, D и циклин-зависимых киназ С1Ж (Cyclin-Depen-
dent Kinases). У растений обнаружены циклин-зависимые киназы
CDKA, гомологи CDK1, характерные и для всех других эукариот,
а также и специфичные для растений циклин-зависимые киназы
CDKB. В клеточном цикле выделяют четыре основных стадии: ста-
дию G1 (от англ, gap — промежуток), во время которой идет синтез
мРНК, белков, других клеточных компонентов; стадию S (от англ,
synthesis — синтез), во время которой идет репликация ДНК; ста-
дию G2, во время которой идет подготовка к следующей стадии —
митозу (стадия М). Клетки могут выходить из цикла на стадии G1
в стадию покоя GO, что, как правило, характерно для дифференци-
рованных клеток. Клетки также могут покидать цикл на стадии G2,
сохраняя эндоредуплицированное состояние. Переход из стадии G1
Стадия покоя
gQ Дифференцировка

CytB Cd к А/В

Cdc?5

60

АЛ

G1

Пролиферация

CycD CdкА

$

СусА CdkA/B

САК

ICK

Стадия покоя
Дифференцировка
Эндоредупликаци я

Рис. 9.9 Регуляция клеточного цикла у растений

в стадию синтеза (S) контролируется циклинами группы D (CycD)
в комплексе с CdkA (см. рисунок 9). Фосфорилирование комплексом
CycD/CdkA рстинобласт ома-под обного белка (retinoblastoma-related
protein (RBR), вызывающее диссоциацию этого белка от комплекса
транскрипционных факторов, приводит к активации ряда генов, от-
ветственных за инициацию репликации.

Экспрессия циклинов А-гипа (СусА) наблюдается при переходе
из стадии G1 в ст адию S и в течение стадии S клеточного цикла.
Циклины группы В (СусВ) в комплексе с CDKA или с CDKB регу-
лируют переход из стадии G2 в стадию митоза (М). Существует по-
зитивный и негативный контроль активности комплексов циклинов
с CDK. В частности, у арабидопсис фосфатаза Cdc25 дефосфори-
лируст циклин-зависимую киназу CDK, активируя ее, киназы САК
(Cdk-activating kinases) позитивно, a ICK (Inhibitors of CDK) негатив-
но регулируют CDK (рис. 9.9).

Переход G1-S является ключевым этапом в регуляции клеточ-
ного цикла. У растений циклины группы D, регулирующие пере-
ход G1-S, являются мишенями действия различных регуляторных
фактороч. Так, было показано, что у арабидопсис экспрессия генов
CycD3 и CycD2 активируется сахарозой. Посредством такого взаи-
модействия осуществляется связь пролиферации клеток с доступно-
стью питательных веществ. На экспрессию гена CycD3 оказывают
воздействие цитокинины и брассиностероиды. Ауксин также за-
дейртвован в активации циклин-зависимых киназ CDK., он контро-
лирует убиквитин-зависимую деградацию белков, регулирующих
клеточный цикл. Абсцизовая кислота активирует экспрессию ICK,
тем самым ингибируя деления клеток. Гиббереллин также оказывает
влияние на клеточный цикл, стимулируя переход клегок из фазы G1
б фазу S.

9.8 Саязь процессов пролиферации и дифференцировки
в меристеме побега: регуляция функции меристемы
листовым примордием

Влияние сигналов, поступающих из закладывающихся прпмор-
диев листа, было показано при анализе различных мутантов расте-
ний. Так, у мутантов львиного зева phamastica (phan) наблюдается
формирование радиальных листьев (состоящих преимущественно
из клеток адаксиального типа) и, кроме того, происходит останов-
ка развития ПАМ. В норме ген PHAN, кодирующий ТФ семейства
MYB, экспрессируется в листовом примордии, при этом его продукт
необходим для поддержания активности ПАМ. Предпола] ается, что
сигналы, поступающие из клеток листовых примордиев, стимулиру-
ют ПАМ к «пополнению» клеток периферической зоны, необходи-
мых для формирования листовых примордиев.

Другим геном, вероятно, опосредующим взаимодействие между
клетками листового примордия и клетками меристемы, является ген
НАМ (HAIRY MERISTEM), идентифицированный у петуньи. Предпо-
лагают, что ген НАМ, кодирующий ТФ семейства GRAS, опосредует
сигнал, поступающий из примордиев боковых органов и дифферен-
цирующихся клеток проводящей системы, необходимый для поддер-
жания активности ПАМ У мутантов ham в вегетативном развитии
происходит ранняя остановка (терминация) развития апикальной
меристемы побега, при этом меристематические клетки претерпе-
вают дифференцировку: происходит дифференцировка клеток слоя
L, в клетки эпидермиса (с образованием выростов-трихом), ниже-
лежащих слоев клеток — в клетки коры и проводящие ткани; та-
кое гистологическое строение характерно для тканей стебля. НАМ
экспрессируется в нижних слоях меристемы - в клетках слоя L3 —
в месте инициации листового примордия, а также в развивающихся
проводящих тканях стебля. Предполагается, что ТФ НАМ опосре-
дует некий сигнал, поступающий из дифференцированных клеток,
функция которого заключается в поддержании недифференцирован-
ного состояния клеток меристемы.
Один из сигналов для закладки листового примордия представ-
ляет собой ауксин: области концентрационного максимума аукси-
на в ПАМ определяют сайты закладки листового примордия. При-
ток ауксина в развивающийся примордии приводит к снижению
концентрации ауксина в окружающих клетках ПАМ. Следующий
листовой примордий формируется на удалении от уже образовав-
шегося примордия, в области, где возможно накопление ауксина. Та-
кой механизм определяет «близость» закладки соседних листовых
примордиев и объясняет формирование спирального филлотаксиса
у арабидопсис. Было показано, что накопление ауксина необходимо
для подавления экспрессии генов KNOX I в развивающемся листо-
вом примордии. Так же как и ауксин, гиббереллин подавляет экс-
прессию генов KNOX в области закладки примордия и ст имулирует
дифференцировку. В совокупности все эти данные демонстрируют
четкую согласованность и взаимную регуляцию процессов проли-
ферации в ПАМ и дифференцировки в развивающемся примордии
листа.

Источники рисунков, использованных в главе

1.	Bowman J., Yuval Е. Formation and maintenance of the shoot apical meristem //
Trends in Plant Science 2000. Vol. 5. N3. P. 110-115.

2.	Sablowskt R Plant and animal stem cells: conceptually similar, molecularly
distinct? // Trends in Ceil Biology. 2004. Vol. 14.1. 11. P. 605-611.

3.	Taiz L. andZeiger E. Plant Physiology, Pub’ Sinauer Associates. 3 ed. 2002. 690 p.

Рекомендованная литература

1.	Bowman J, Yuval E. Formation and maintenance of the shoot apical meristem //
Trends in Plant Science. 2000. Vol. 5. N 3. P. 110-115.

2.	Jasinski S. KNOX action in Arabidopsis is mediated by coordinate regulation of
cytokinin and gibberellin activities // Current Biology. 2005. Vol. 15. P. 1560-1565.

3.	Leibfried A., To J. P., Busch W. et al. WUSCHEL controls meristem function
by direct regulation of cytokinin-inducible response regulators // Nature. 2005.
Vol. 438. I. 7071. P. 1172-1175.

4.	Sablowski R. Plant and animal stem cells: conceptually similar, molecularly
distinct?//Trends Cell Biology. 2004 Vol.14.1. 11. P.605-611.

5.	Sarkar A. K., Luijten M., Miyashima S et al. Conserved factors regulate signalling
in Arabidopsis thaliana shoot and root stem cell organizers // Nature. 2007. Vol. 446.
I. 7137. P. 811-814.

6.	Tucker M. R., Laux T Connecting the paths in plant stem cell regulation // Trends
Cell Biol. 2007. Vol. 8. P.403-410.
Глава 10

Развитие листа

Лист — латеральный надземный орган растения, происходя-
щий от популяции плюрипотентных клеток в периферической
зоне апикальной меристемы побега (ПАМ). Начальным событием
в развитии листа следует считать спецификацию клеток листового
зачатка. Координированная активация клеточных делений вызыва-
ет дальнейший рост листового примордия за пределы периферии
ПАМ. Параллельно с ростом начинается процесс дифференциров-
ки, приводящий к появлению специфических типов клеток листа.
Одним из ключевых событий дифференцировки является детер-
минация адаксиальной и абаксиальной («верхней» и «нижней»)
сторон листовой пластинки, которая происходит на самых ранних
этапах развития примордия.

10.1.	Инициация листового примордия

Инициация всех латеральных органов побега, в том числе ли-
стьев, происходит на периферии ПАМ. Ключевую роль в инициа-
ции листовых примордиев играет баланс двух противоположных
процессов: пролиферации клеток и дифференцировки клеток (рис.
10.1). Клетки, вовлеченные в инициацию листового примордия (leaf
founder cells), отличаются от остальных клеток периферии ПАМ
по спектру экспрессирующихся в них генов, которые обусловли-
вают переход клеток в детерминированное состояние. Интересно,
что ряд механизмов, играющих роль в инициации листовых при-
мордиев в ПАМ, сходен с механизмами закладки первых листьев
зародыша — семядолей — в эмбриогенезе.
Первичная спецификация клеток листового примордия

Сигналом начала спецификации клеток в сайте инициации листа
является прекращение экспрессии меристем-слецифических генов
KNOX. Гены KNOX класса I никогда не экспрессируются на началь-
ных этапах инициации листового примордия. хотя на более поздних
стадиях развития листа может происходить возобновление их экс-
прессии. которое необходимо для развития рассеченных и сложных
листьев.

Детерминированные клетки листового примордия. в отличие
от клеток ПАМ, характеризуются ограниченным числом делений.
С другой стороны, определенный уровень пролиферации клеток не-
обходим для роста листового примордия; снижение количества кле-
точных делений и переход к росту растяжением происходит па бо-
лее поздних стадиях развития листа, после определения его формы.
Основную роль в пролиферации клегок листового примордия играет
экспрессия гена AINTEGUMENTA (ANT).

Прекращение экспрессии генов KNOX и начало экспрессии гена
AN'l — наиболее ранние маркеры клеток, вышедших из ниши мери-
стематических клеток ПАМ для образования латеральных органов
побега.

Репрессия генов KNOX при инициации листа осуществляется за
счет двух независимых событий:

•	прямой репрессии транскрипции генов KNOX с помощью систе-
мы AS1-AS2-HIRA, которая включает в себя взаимодействую-
щие транскрипционные факторы ASYMMETRIC LEAF 1 (ASI)
и ASYMMETRIC LEAF 1 (AS2), а также фактор ремоделинга хро-
матина II1RA;

•	возникновения локусов высокой концентрации ауксинов на пери-
ферии ПАМ.

Гены, подавляющие экспрессию генов KNOX, были впервые вы-
явлены при изучении мутаций asl и as2 {asymmetric leaf 1 и 2) ара-
бидопсис, rs2 {rough sheath 2) кукурузы и phan {phantastica) львиного
зева, в дальнейшем их ортологи были обнаружены у всех изученных
видов растений. Специфические фенотипы перечисленных мутантов
связаны с экгопической экспрессией генов KNOX в листовых пластин-
ках и черешках: эго лотосовидные листья (lotus leaves) у asl и as2,
узелки на границе листа и листовою влагалища у rs2, радиально-
симметричные листья без выраженных листовых пластинок у phan
(рис. 10.2). Кроме того, у всех мутантов этой группы наблюдается
нарушение адаксиально-абаксиальной полярности листовых пласти-
рост клеток
растяжением

ПАТ

PN1

ПАМ

эуксин

AS1 AS2

экспансии^

МР

дифференци-
ровка
специфических /
типов клеток/

UO I
Pib

ауксин

AS1,
AS2

HIRA

, KNOX

примордии
листа

PHv,
EV

CycD

У

УАВЙ,
.FIL

пролиферация
клеток
примордия

ANT "* м

Рис. 10.1. Основные факторы, участвующие в инициации листового примордия
у араоидэпзис

Локальный максимум концентрации ауксинов (зеленый круг) возникает за счет
изменения направления ПАТ, которое зависит от белков PIN, РЮ и CN0M. Ауксины
влияют на экспрессию Р/Л/-генов через ауксин-зависимый транскрипционный фактср
МР и репрессор ответа на ауксин BDL. Экспрессия генов KNOX подавляется взаимо
действующими транскрипционными факторами AS1 и AS2 и фактором ремоделинга
хроматина HIRA. Транскрипционный фактор АМТ стимулирует пролиферацию клеток
листового зачатка за счет активации экспрессии генов CycDS Растяжение клеток
листового примордия происходит за счет ауксин-зависимой активации экспанспюп.
[ранскрипционные факторы РНВ, PhV, REV, KAN, yABS и FIL1 регулируют распреде-
ление белка PIN1 и контролируют дифференцировку специфических типов клеток.
Ауксины также ограничивают зону экспрессии генов AS1, AS2 и ANTдо места инициа
ции примордия (механизм неизвестен)

нок, что особенно сильно выражено у мутанта phan львиного зева.
Развитие такого специфического фенотипа связано с функцией транс-
крипционных факторов AS 1/RS2/PHAN и AS2 в контроле полярности
листовой пластинки, о чем будет сказано ниже.

Транскрипционные факторы AS1/RS2/P11AN относятся к семей-
ству MYB. В состав его молекулы входят N-концевой MYB-домен,
Рис. 10.2 Фенотипы мутантов с потерей функции генов ASI/RS2/ PHAN

А — мутация as1 (asymmetric leaf 1) арабидопсис. Стрелками отмечены чашеобраз-
ные листья.

Б — мутация rs2 (rougn sheatn 2) кукурузы. Стрелкой отмечены узолки на листовом
влагалище

В — мутация phan (phantastica) львиного зева. Стрелкой отмечен радиально-
симметричный лист с редуцированной листовой пластинкой

Рис. 10.3 Модель взаимодействия комплексов AS1-AS2 с промоторами генов KNOX
(по Guo et al. 20U8).

Комплексы AS1-AS2 связываются с сайтами X и Y в промоторах KNOX генов, что
приводит к образованию гетли. Белок HIRA через связывание с AS1 взаимодействует
с участком прсмстсра гена KNOX, результатом чего является его стабильный сайлен
синг в развивающихся листьях

UTR

KNOX

необходимый для связывания с ДНК, и С-концсвой домен, обеспечи-
вающий белок-белковые взаимодействия.

Транскрипционный фактор AS2 является членом специфичного
для растений семейства LBD. Для этих транскрипционных факторов
характерно наличие консервативного N-концевого LOB-домена, ко-
торый обеспечивает как ДНК-белковые, так и белок-белковые взаи-
модействия

На арабидопсис было показано, что белки AS1 и AS2 формируют
гетеродимер, который напрямую связывается с двумя консервативны-
ми сайтами X и Y в промоторах КФ!ОХ- генов (рис. 10.3). Белок AS1
выполняет функцию транскрипционного репрессора, но сам по себе
Рис. 10.4 Роль X- м Y-сайтов связывания комплексов AS1-AS2 в репрессии транс-
крипции гена KNAT1 в листьях (по Guo et al. 2008)

Экспрессия конструкции P-KNAT1::GUS у растений арабидопсис:

У растений диксго типа экспрессия KNAU ограничена зоной НАМ (А), у мутантов asl
и as2 наблюдается его эктопическая экспрессия в листьях (Ь и В). Делеция X (Г) или
Y (Д) сайтов в промоторе, а также делеция обоих сайтов (Е) приводит к эктопической
экспрессии KNAT1

не способен к взаимодействию с промотором гена-мишени по при-
чине отсутствия в его MYB-домене нескольких консервативных ами-
нокислот, критичных для связывания с ДНК. Связывание комплексов
AS1-AS2 с промоторами ААОХ-генов обеспечивает белек AS2.

С помощью делеционного анализа промотора гена KNATI араби-
допсис было установлено, что для репрессии этого гена в листовом
примордии абсолютно необходимы оба сайта связывания комплек-
сов AS1-AS2, так как делеция любого из сайтов X или Y приводит
к эктопической экспрессии KNAT1 в листьях (рис. 10 4). В дальней-
шем было установлено, что для репрессии генов KNOXнеобходимо
взаимодействие между двумя гетеродимерами AS1-AS2, связавши-
мися с сайтами X и Y, в результате чего участок промотора регули-
руемого гена образует петлю.

Важную роль в репрессии транскрипции генов KNOX на ранних
стадиях развития листа играют эпигенетические механизмы, за счет
которых неактивное состояние генов KNOX может передаваться от
материнских клеток к дочерним через митотические деления. Уста-
новлено, что для репрессии транскрипции генов KNOX в листовом
примордии абсолютно необходим фактор ремоделинга хроматина
HIRA, относящийся к группе гистоновых шаперонов, который взаи-
модействует с белком AS1. У трансгенных растений с косупрессией
гена HIRA наблюдается эктопическая экспрессия генов KNOX и раз-
вивается фенотип, сходный с фенотипом мутантов as! и as2. Белки
H1RA обнаружены у всех эукариот и играют роль в образовании гете-
рохроматина, регулируя таким образом уровень экспрессии большого
ряда генов например, у млекопитающих белок HIRA взаимодействует
с гистон-деацетилазами и вызывает деацетилирование гистона НЗ.З,
который обычно ассоциирован с транскрипционно активными райо-
нами генома. Мутанты арабидопсис с полной потерей функции гена
HIRA погибают на ранних стадиях эмбриогенеза, что свидетельствует
о чрезвычайно важной роли этого белка в развитии растений.

Роль ауксинов в инициации листа

Известно, что фитогормоны ауксины негативно регулируют про 
лиферацию стволовых клеток ПАМ и стимулируют инициацию
латеральных органов, в частности, листьев. Ауксин-зависимая сти-
муляция закладки листьев связана с тремя важными функциями аук-
синов.

1.	Стимуляция растяжения клеток с помощью механизма «кислого
роста».

Ауксин активирует работу протонных помп плазмалеммы, в ре-
зультате чего происходит закисление пространства между плаз-
малеммой и клеточной стенкой. Снижение pH, в свою очередь,
приводит к активации экспансинов — белков, ассоциированных
с клеточной стенкой, которые способствуют разрушению водород-
ных связей между целлюлозными фибриллами и растяжению кле-
ток. Первичной мишенью действия экспансинов при инициации ли-
ста являются клетки субпротодермального слоя, которые благодаря
растяжению изменяют антиклинальное направление делений на пе-
риклинальное, что приводит к формированию бугорка на периферии
ПАМ — листового примордия. Действительно, в опытах с исполь-
зованием локальных аппликаций экзогенного экспансина, а также на
трансгенных растениях табака, содержащих индуцибельную версию
одного из генов ЕХР, показано, что повышение уровня экспансинов
в нескольких слоях клеток на локальных участках ) JAM само по себе
приводит к инициации листовых примордиев и в дальнейшем к раз-
витию нормальных листьев.

2.	Негативная регуляция экспрессии генов KNOX.

Механизмы негативной регуляции экспрессии Л'АОА'-генов аук-
синами нс выяснены, тем не менее у мутантов с потерей функции
генов, контролирующих транспорт и передачу сигнала ауксинов, на-
блюдается эктопическая экспрессия некоторых XTvYTY-генов (напри-
мер, KNAU) в листьях. По-видимому, ауксин-зависимая регуляция
экспрессии ХЛОТ-генов осуществляется независимо от системы
AS1-AS2-HIRA.

3.	Ограничение зоны экспрессии генов ASI, AS2 и ANT.

Как уже было сказано выше, гены ASI, AS2 и ANT являются
наиболее ранними маркерами листовых примордиев и играют
ключевую роль в инициации и развитии листа. При сравнении
пространственного характера экспрессии генов ASI, AS2 и ANT
у растений дикого типа и мутантов, полностью неспособных к за-
кладке листовых примордиев (например, мутантов арабидопсис
тр pinl с нарушением ПАТ и передачи сигнала ауксинов) было
показано, что у растений дикого типа зона экспрессии этих генов
ограничена местами инициации примордиев, тогда как у мутан-
тов тр pinl она образует сплошное кольцо на периферии ПАМ.
Как бы то ни было, в настоящее время данных, подтверждающих
ауксин-зависимую регуляцию экспрессии генов AS1 и ANT, полу-
чено не было В то же время для гена AS2 было продемонстриро-
вано связывание с его промотором ауксин-зависимого транскрип-
ционного фактора ARF7.

Одним из наиболее ранних событий в инициации листовых при-
мордиев является пиявлепие локальных максимумов концентра-
ции ауксина в определенных участках на периферии ПАМ (рис.
10.5 Б). Их появление является следствием изменения ориентировки
полярного транспорта ауксина (ПАТ) и зависит главным образом от
изменения локализации на поверхности клеток белка PIN1. У .му-
тантов pinl, а также у растений, обработанных ингибиторами ПАТ,
не возникают локальные максимумы концентрации ауксинов на пе-
риферии ПАМ, следствием чего является нарушение филлотаксиса
и аномалии развития латеральных органов побега.

Белок PIN1 в ПАМ присутствует исключительно в клетках слоев
L, и L, и локализован на апикальной их стороне. Благодаря такому
Рис. 10.5. Распределение белка PIN1 в ПАМ и листовых примэрдиях арабидопсис.

А, Б — экспрессия репсртерных конструкций PlN1:GFP (зеленый цвет)
и DR5..3XVFNUS N7 (красный цвет) в ПАМ арабидопсис (представлены поперечные
срезы субэпидермального слоя ПАМ). Максимумы экспрессии гена PIN1 совгадают
с максимумами концентрации ауксина в сайтах инициации листсвых примордиев (по
Heisler et al., 2005).

В — продольный срез ПАМ. Стрелками отмечена локализация белка PIM1 в слое кле
ток L, НАМ, проводящей системе развивающихся примордиев (Р) и сайте инициации
нсвсго примордия (Im) (по Reinhardt et al., 2003).

Г — продольный срез листового примордия Стрелками отмечена локализация белка
PIN1 в центральном домене примордия, соответствующем будущему сосудистому
пучку (по Reinhardt et al.. 2003).

Д — схема полярного транспорта ауксина с ПАМ (по Reinhardt et al, 2003)

ею расположению, полярный т ранспорт ауксина в НАМ идет акропе-
тально по клеткам эпидермиса. В сайт ах инициации листа белок PIN 1
начинает накапливаться вс внутренних слоях клеток, соответствую-
щих центральной части будущего примордия В дальнейшем зона его
накопления ограничивается узким (2-3 клетки в ширину) участком,
соответствующим месту закладки сосудистого пучка (рис. 10.5 В, Г).

1бчные механизмы, вызывающие изменение локализации белка
P1N1 в месте инициации латеральных органов побега в настоящее вре-
мя неизвестны. По-видимому, имеет место регуляция на уровне экс-
прессии гена PIN1, так как пространственный характер распределения
мРНК PIN] совпадает с распределением соответствующего белка. Во-
обще, разграничение зон экспрессии гена PIN] и КАСЛУ генов является
одним из наиболее ранних событий в спецификации латеральных орга-
нов НАМ. Установлено, что на экспрессию гена PIN1 в ПАМ арабидоп-
сис влияет несколько групп транскрипционных факторов.
Во-первых, эго ауксин-зависимый транскрипционный фактор
MP/ARF5 и его антагонист — транскрипционный репрессор BDL/
 АА12, которые играют ключевую роль в регуляции экспрессии P1N-
генов. У муз антов с потерей функции тр, так же, как у муз антов
pin, снижена способность к образованию латеральных органов по-
бега, двойные мутанты тр pinl имеют серьезные аномалии разви-
тия, связанные с редукцией полярного транспорта ауксина в ПАМ:
у них развивается сильно увеличенная ПАМ с расширенной зоной
экспрессии генов CLV3 и STM и полностью отсутствуют латераль-
ные органы побега.

Кроме того, позитивными регуляторами экспрессии PIN! в ли-
стовом примордии являются транскрипционные факторы HD-ZIP1II
и KANADY, которые регулируют адаксиально-абаксиальную по-
лярность листовой пластинки. Возможно, функции этих транскрип-
ционных факторов в контроле дифференцировки специфических
типов клеток на разных сторонах листа связаны с их влиянием на
пространственный характер экспрессии гена PIN1. Анализ распре-
деления белка PIN 1 у множественных мутантов с потерей функции
генов HD-ZIP1II и KANADY показал, что экспрессия генов KANADY
сужает зону эспрессии гена PIN1, тогда как экспрессия генов HD-
ZIPIH — расширяет ее (см. ниже).

Пролиферация клеток листового примордия

Нормальное развитие всех производных ПАМ, в том числе ли-
стьев, зависит от гена AINTEGEMENTA (ANT), который стимулирует
пролиферацию клеток примордия. Наряду с геном AS1, экспрессию
гена ANT считают наиболее ранним молекулярным маркером ини-
циации латеральных органов побега. Продуктом гена ANT являет-
ся транскрипционный фактор семейства APETAL A2. Долгое время
считалось, что функцией генаЛА'/'является контроль деления клеток
в интегументах при развитии завязи, в настоящее время для этого
гена установлена более широкая функция, связанная с контролем ко-
личества клеток во всех латеральных органах побега. Мутации с по-
терей функции ant приводят к уменьшению размера листовых пла-
стинок и флоральных органов за счет снижения количества клеток
в них, повышение уровня его экспрессии у растений 35S:ANT уве-
личивает размеры всех латеральных органов без изменения их мор-
фологии за счет поддержания меристематической активности клеток
и продления времени их пролиферации. Этот эффект достигается
продлением времени экспрессии генов группы CycD3 в полностью
сформировавшихся, зрелых листьях растений, при этомАМТ не вза-
имодействует напрямую с промогорами генов CycD3. Прямой ми-
шенью транскрипционного фактора ANT являются гены F1L и YAB3,
продуктами которых являются транскрипционные факторы семей-
ства YABBY, участвующие в контроле адаксиально-абаксиальной
полярности латеральных органов и пролиферации клеток листовой
пластинки.

10.2.	Определение границ листового примордия

Одним из ключевых моментов в развитии латеральных органов
побега является определение границ, отделяющих развивающийся
примордий от ПАМ и других примордиев.

В определении границ производных ПАМ участвуют две группы
генов: гены LATERAL ORGAN BOVE DARY DOMAIN (LBD) и гены
CUB-SHAPED COTYLEDON (CUC). Продуктами генов LBD —
JAGGED LATERAL ORGANS (JLO) и LATERAL ORGAN BOUNDARY
(LOB) является специфичная для растений группа транскрипци-
онных факторов, продуктами генов CUC— CUC1. CUC2 и CUC3 —
транскрипционные факторы с NAC-доменом. Обе группы генов
играют важную, но не совсем понятную роль в определении границ
между органами растения.

Экспрессия генов LBD и CUC в эмбриогенезе арабидопсис начи-
нается на стадии глобулы; на более поздних стадиях развития зоны
их экспрессии совпадают с границами примордиев семядолей. По-
видимому, эти гены играют очень важную роль в эмбриогенезе, так
как потеря их функции приводит к остановке развития зародыша
на стадии глобулы ввиду полной неспособности к нормальному ор-
ганогенезу («сильные» аллели jlo) или серьезным аномалиям раз-
вития апикального домена зародыша (двойные и тройные мутанты
сис). В постэмбриональном развитии растений основным местом
экспрессии генов LBD и CUC являются примордии латеральных
органов побега.

Предполагаемыми мишенями транскрипционных факторов LBD
и CUC являются гены KNOX класса I (STM, KNAT1), для экспрессии
которых в эмбриональной ПАМ требуется активность CUC и JLO.
Напротив, экспрессия генов PIN негативно регулируется транс-
крипционными факторами LBD и CUC: благодаря их активности на
границах примордиев латеральных органов происходит подавление
экспрессии гена PIN1 при одновременной активации его экспрессии
в верхней части примордия.

Таким образом, гены LBD и CUC участвуют, с одной стороны,
в контроле меристематической активности клеток и, с другой сто-
ПАМ адаксиальный

Рис. Ю.6. Гены, регулирующие идентичность доменов листового примордия

Идентичность проксимального домена регулирую! гены ВОР, дистального доме-
на — гены JAG. Гены NS/PHS контролируют развитие латеральных доменов Гены
HD-/IPHI и взаимодействующие гены KA1JADY(КАК) и YABBY(YAB) контролируют
адаксиально-абаксиальную полярность примордия Гены CUC1-3 и JLO определяют
границу листового примордии, ограничивая зону экспрессии генов KNOX

роны, в регуляции полярного транспорта ауксинов. По-видимому,
обе эти функции важны для отделения примордиев от ПАМ, так как
в формировании примордия большое значение имеет изменение на-
правления клеточных делений.

Ю.З. Контроль идентичности доменов листа

Начиная с самых ранних этапов развития, листовой примордий
достаточно четко разделяется на несколько доменов. В зависимости
от расположения можно выделить центральный и два латеральных
домена, адаксиальный и абаксиальный, проксимальный и дисталь-
ный (рис. 10 6). Домены листового примордия различают ся по на-
бору экспрессирующихся в них генов и вносят разный вклад в раз-
витие листовой пластинки. Анализ мутантов с нарушением развития
отдельных доменов листовой пластинки позволил выявить гены, от-
вечающие за идентичность разных доменов.
Идентичность проксимального и дистального доменов листа

В развивающемся листе можно условно выделить проксималь-
ный (прилегающий к черешку) и дистальный («кончик» листа) до-
мены. Для дистальной части листовой пластинки характерны более
активные процессы деления, роста и дифференцировки клеток по
сравнению с проксимальной.

Развитие проксимального и дистального доменов листа на-
ходится под контролем двух групп генов-антагонистов: гены
BLADE ON PETIOLE 1 и 2 (ВОР1 и ВОР2) контролируют.идентич-
ность проксимального домена, гены JAGGED (JAG) и JAGGED-
LIKE (JGL) — идентичность дистального домена. Продуктами
генов JAG и JGL являются транскрипционные факторы, содер-
жащие «цинковые пальцы», продуктами генов ВОР — белки
с неизвестной функцией, содержащие BTB/POZ-домены. Доме-
ны BTB/POZ, участвующие в белок-белковых взаимодействиях,
широко распространены среди белков-репрессоров транскрип-
ции, действующих в составе гистон-деацетилазных комплексов,
таким образом, белки ВОР могут выполнять функцию транс-
крипционных репрессоров. Гены ВОР1 nJAG негативно регули-
руют экспрессию друг друга; кроме того, гены ВОР участвуют
в подавлении транскрипции генов KNOX в листовых приморди-
ях. Мутации с потерей функции bop приводят к эктопической
экспрессии генов KNOX и JAG в проксимальном домене лист а,
результатом которой является развитие увеличенных листьев
с дополнительными листовыми пластинками на черешках и ин-
тенсивным ростом проксимального домена. Напротив, у мутан-
тов jag замедлена пролиферация клеток и рост дистальной части
листовой пластинки.

Таким образом, роль генов ВОР в развитии листа заключается
в репрессии меристематической активности клеток в проксималь-
ном домене листа, а роль генов JAG — в стимуляции пролиферации
клеток дистального домена.

Идентичность латеральных дзменов листа

В пределах проксимального домена листового примордия можно
выделить два краевых латеральных домена и центральную жилку
(рис. 10.7). Основными регуляторами развития латеральных доме-
нов листа являются гены NARROW SHEATH I и 2 (NS1 и NS2) куку-
рузы и PRESSED FLOWER (PRS) арабидопсис, продуктами которых
являются транскрипционные факторы семейства WOX. Гены куку-
рузы NS1 и NS2 представляют собой результат дупликации одного
А

Двудольные

Дисталь

НЫЙ 1
домен

Прокси
маль L

домен

Рис. 10.7. Роль генэв NS/PRS в развитии краевых доменов латеральных органов
побега

А — разные схемы формирования листовой пластинки у однодольных и двудсгьных
растений (модифицировано по Nardmann et al., 2004): у двудольных большая часть
листа является производной дистального домена примсрдия, у однодольных — прок-
симального. Б — фенотип двойного мутанта кукурузы ns1 r,s2 редукция краевых
дсменов листовой пластинки (по Nardmann et al., 20С4). В — фенотип мутанта араби-
допсис prs. редукция краевых доменов чашелистиков (по Matsumoto Okada, 2001)

гена, op гологом которою у арабидопсис является ген PRS. Экспрес-
сия генов NS1 и NS2 начинается вскоре после инициации листово-
го примордия в двух фокусах на его периферии, соответствующих
краям будущего листа. У двойных мутантов nsl ns'2 полностью от-
сутствуют краевые домены листа — фактически от листа остается
только центральная жилка. В то же время у мутантов prs не выявле-
но серьезных нарушений развития листовых пластинок, но харак-
терно образование очень узких чашелистиков и тычинок. Эти разли-
чия мутан тов ns и prs связаны с разным механизмом закладки листа
у однодольных и двудольных: большая часть листа кукурузы являет-
ся производной проксимального домена листового примордия, тогда
как у арабидопсис проксимальный домен дает начало только краям
черешка. В то же время чашелистики и тычинки у арабидопсис раз-
виваются в значительной мерс из проксимального домена примор-
диев — в результате этого у мутантов prs бутоны выглядят сдавлен-
ными (pressed flower); лепестки выглядывают наружу из-под узких
чашелистиков.

Адаксиально-абаксиальная полярность листовой пластинки за-
висит от антагонистического взаимодействия двух групп транс-
крипционных факторов (рис. 10.8): идентичность адаксиального
домена листа контролируют транскрипционные факторы семей-
ства HD-ZIPIII, идентичность абаксиального домена — транскрип-
Рис. 1 С.8 Определение адаксиально-абаксиальной полярности листовок пластикки
арабидопсис (модифицировано no Barkoulas et aL, 2007)

Регуляторы идентичное™ адаксиального домена — транскрипционные факторы HD-
ZIPIII, регуляторы идентичности абаксиального дсмена — транскрипционные фак-
торы KANADY и УЛОВУ. KANADY действуют раньше YABBY. Гены KANADYи HD-ZIPIII
взаимно регрессируют друг друга. Системы KANADY/YABBY и HD-ZIPIII оказывают
противоположное действие на полярный транспорт ауксина через контроль экспрес-
сии гена PIN1. Экспрессия генов HD-ZIPIII находится под влиянием определенных
микроРНК 165/166, экспрессия генов YABBYрегулируется эуксин-зависимыми транс-
крипционными факторами ARF3 и AF.F4. Тоанскрипционные Факторы YABBY взаи-
модействую! с ко реп рессорами STY/LUG, транскрипционные факторы HD-ZIPIII —
с транскрипционными факторами DRN

ционные факторы KANADY и YABBY. Гены HD-ZIPIII экспрес-
сируются только на адаксиальной стороне листа, гены KANADY
и YABBY — только на абаксиальной. Кроме того, чго «адаксиаль
ные» и «абаксиальные» гены взаимно репрессируют друг друга,
в ограничении зоны их экспрессии участвуют также и другие регу-
ляторы — наг.ример, микроРНК. По-видимому, противоположное
влияние транскрипционных факторов семейства HD-ZIPI1I и KA-
NADY на развитие адаксиального и абаксиального доменов листа
в значительной степени определяется их антагонизмом в контро-
ле экспрессии гена P1NI: HD-ZIPIII расширяют зону экспрессии
PINI, KANADY — сужают.
Идентичность адаксиального дпмена листа

Транскрипционные факторы HD-ZIPIII (Class III homeodomain
Leu zipper), которые наряду с транскрипционными факторами
KNOX и WOX относятся к семейству TALE, принимают участие
в различных аспектах развития растений. Характерной особенно-
стью белков HD-ZIPIII является наличие ДНК-связывающего го-
меодомена и последовательности «лейциновой молнии», которая
важна для образования димеров. Кроме того, их молекулы содержат
N-концевой START-домен, предположительно, обладающий липид-
и стерол-связывающей активностью, и С-конпевой MEK.HLA-домен,
по-видимому, участвующий в белок-белковых взаимодействиях.
В геноме арабидопсис присутствуют пять генов, кодирующих транс-
крипционные факторы HD-ZIPIII: REVOLUTA (REV). PHABULOSA
(РНВ), PHAVOLUTA (PHV), CORONA (СШ) и ATHB8. гомологи их
обнаружены у кукурузы и риса. Все эти гены различаются по функ-
циям. которые они выполняют в развитии растений.

Гены PHV, РНВ_ hl-REV.— основные регуляторы идентичности
адаксиального домена листа, а также других латеральных органов
побега. У мутантов phb, phv и rev развиваются листья с нарушени-
ем адаксиально-абаксиальной симметрии, в частности, для множе-
ственных мутантов характерны радиально-симметричные листья,
содержащие ткани, характерные для абаксиальной стороны, а также
радиальные сосудистые пучки, в которых ксилема окружает флоэму.
Кроме того, гены PHV, РНВ и ЛЛ’Кучаствуют в поддержании ПАМ:
у тройных музанзов phb phv rev на месте ПАМ развивается един-
ственная радиально-симмез ричная семядоля.

По контрасту с PHVи РНВ гены CNA и АТНВ8 являются антаго-
нистами REV, так как мутации с потерей функции этих генов супрес-
сируют дефекты развития латеральных органов no6ei а у мутантов
с потерей функции rev.

Роль генов HD-ZIPIII в определении полярности латеральных ор-
ганов зависит от пространственной регуляции их экспрессии, в ко-
торой принимают участие белки, микроРНК и фитогормоны.

Один из механизмов регуляции генов HD-Z1P1I1 осуществляет-
ся на посттранскрипционном уровне с помощью микрсРНК1б5/166
(miR165/iniR166), которые расщепляют транскрипты этих генов
в тканях абаксиального домена листа. miR165/miR 166-зависимая
регуляция экспрессии генов PHV и РНВ была первым обнаружен-
ным примером регуляции генов растений с помощью микроРНК.
По-видимому, это основной механизм регуляции экспрессии генов
HD-ZIPIII, гак как повышение уровня экспрессии гена miR165 вы-
зывает резкое снижение уровня экспрессии всех пяти генов HD-
ZIPIU. МикроРНК miRI65 и miRl66 отличаются друг от друга по
одному нуклеотиду и обнаруживают комплемент арность с участком
последовательности, кодирующей START-домен белков HD-ZIPIII.
Показано, что доминантные мутации с усилением функции генов
HD-ZIPI1I арабидопсис приводят к замене одного нуклеотида в по-
следовательности, которую узнают miR165/166, результатом чего
является эктопическая экспрессия генов PHV, РНВ, REV и CNA
в тканях абаксиальной стороны листа. Таким образом, для контроля
адаксиально-абаксиальной полярности листа важна пространствен-
ная регуляция экспрессии генов mlR165 и miR166., механизмы кото-
рой в настоящее время неизвестны.

Во-вторых, экспрессию генов HD-ZIPIII негативно регулируют
транскрипционные факторы KANADY, которые являются антагони-
стами HD-ZIPIII и контролируют идентичность абаксиального до-
мена листа.

Кроме того, имеются данные об ауксин-зависимой регуляции по
крайней мере некоторых генов HD-ZIPHI. Например, обработка про-
ростков риса ауксином вызывает эктопическую экспрессию одного
из HD-ZIP111 генов — OSHB3 (гомолог генов РНВ и PHV) в цен-
тральном районе НАМ, что коррелирует с нарушениями процесса
инициации листовых примордиев.

Взаимодействие с транскрипционными факторами HD-ZIPIII
установлено для белков DORNROSCHEN (DRN) и DORNRO-
SCHEN-LIKE (DRNL) арабидопсис, которые относятся к семейству
АР2-подобных транскрипционных факторов. Повышение уровня
экспрессии генов DRN и DRNL у трансгенных растений вызывает
дефекты развития, сходные с теми, что наблюдаются у множествен-
ных мутантов с потерей функции генов HD-ZIPIII. Было показано,
что белки DRN и DRNL образуют гетеродимеры с продуктами генов
РНВ, REV, CNA и АТНВ8, причем в этом взаимодействии участвуют
АР2 домены белков DRN и DRNL и MEKHLA домены белков HD-
ZIPIII. По видимому, образование гетеродимеров приводит к пода-
влению экспрессии генов-мишеней.

Одной из функций транскрипционных факторов HD-ZIPIII яв-
ляется репрессия генов, кодирующих транскрипционные факторы
семейства KANADY, в гканях адаксиальной стороны листовых при-
мордиев.

Вторая важная функция транскрипционных факторов HD-
ZIPIII — контроль распределения белка полярного транспорта аук-
сина PINI (механизмы неизвестны). У множественных мутантов
арабидопсис с потерей функции phb phv rev нормальный характер
экспрессии гена PIN1 меняется в эмбриогенезе, начиная со стадии
сердца (рис. 10.9). Вместо билатерального характера экспрессии
PIN1, характерного для дикого типа, у мутантов phb phv rev этот
ген экспрессируется по всей площади апикальной части зароды-
ша. Благодаря аномальному распределению белка PIN1, полярный
транспорт ауксина у зародышейphbphv rev направлен к небольшому
участку в центре апикального домена — в результате на месте ПАМ
создастся максимум концентрации ауксина и происходит закладка
семядоли.

Идентичность абаксиального домена листа

Контроль идентичности абаксиальных доменов латеральных ор-
ганов побега осуществляют взаимодействующие транскрипционные
факторы KANADY и YABBY. У арабидопсис выделено четыре гена
KANADY(KANI -KAN4) и три гена YABBY (FIL, YAB2 и YAB3), их го-
мологи обнаружены у других видов растений: например, гены груп-
пы YABBYZYB кукурузы, GRAMIN1FOLIA (GRAM) и PROLONGATA
(PROL) львиного зева.

Гены KANADY кодируют транскрипционные факторы с GARP-
ломеном и экспрессируются только на абаксиальной стороне листо-
вою примордия — то есть характеризуются паттерном экспрессии,
комплементарным таковому у генов HDZipIII.

Для мутантов с потерей функции кап характерен аномальный фе-
нотип, связанный с потерей абаксиального домена и радиализацией
сосудистых пучков Кроме того, у множественных мутантов на гипо-
котиле и абаксиальной стороне семядолей образуются эктопические
листоподобные выросты с радиальной симметрией. Анатомические
отличия от дикого типа начинают проявляться у множественных
мутантов кап начинал со стадии сердца: у них наблюдаются пери-
клинальные (вместо антиклинальных) деления в субэпидермальном
слое клеток, результатом чего являются выросты на семядолях и ги-
покотиле, с точки зрения анатомии представляющие собой эктопи-
ческие листовые пластинки.

Одной из установленных функций транскрипционных факторов
KANADY является позитивная регуляция экспрессии генов YABBY,
которые являют ся их прямой мишенью Также транскрипционные
факторы KANADY подавляют экспрессию генов HD-ZIPIII в абак-
сиальном домене листового примордия.

Кроме того, транскрипционные факторы KANADY могут влиять
на полярность латеральных органов побега через контроль экспрес-
Дикий тип

phb phv rev

karri kan2 kan4

i 1

Рис. 10 9. Влияние генов HD-ZIPIH и KANADYна направление полярного транспор-
та ауксина (ПАТ) и развитие семядолей у зародышей арабидопсис (по Izhaki and
Bowman, 2.007)

Представлены зародыши дика о типа, мутанть с посерей функции сенов HD-ZIPIII (phb
phv rev) и мутанты с потерей функции генов KANADY(kan1 kan2kan4). А —схема на-
граблений ПАТ у зародышей на стадии сердца, Е>— экспрессия репсртерной конструкции
PIN1: 'GFP; у зародышей kan I кзп2 kan4 зона экспрессии PIN1 расширена, у за родышай
phb phv rev — сужена/В — экспресс ля репортерной хонструкци и DR5 GFP. у зародышей
кап1 кап2кап4 псявляются дополнительные максимумы концентрации ауксинов, у за-
родышей phbphvrev— единственный максимум их концентрации на месте ПАМ
сии гена P/А/, Действительно, у множественных мутантов арабидоп-
сис кап! кап2 кап4 отмечен аномальный пространственный характер
экспрессии гена PIN1: в частности, наблюдается высокий уровень
его экспрессии в эпидермальных и субэпидермальных клетках ги-
покотиля, тогда как у зародышей дикого типа экспрессия гена PIN]
в этой зоне прекращается на стадии сердца. В результате нарушения
распределения белка PJN1, у мутантов кап! кап2 кап4 появляются
локальные максимумы концентрации ауксина в гипокотиле и семя-
долях, на месте которых происходит инициация листоподобных вы-
ростов.

Интересным фактом является комплементация фенотипов мно-
жественных мутантов по генам HD-ZIPIII и KANADY: у мутанта
с лотерей функции генов обеих групп кап! кап2 кап4 phbphv rev на-
блюдается, с одной стороны, формирование единственной семядоли
па месте ПАМ (как у мутан тов phb phv rev) и, с другой стороны —
листоподобных выростов на семядоле и гипокотиле (как у мутан-
юв кап! кап2 кап4). Поскольку ранее было показано, что фенотипы
множественных мутантов с потерей функции генов HD-ZIPIII и KA-
NADY зависят от аномального характера экспрессии гена PIN1, весь-
ма вероятно, что транскрипционные факторы HD-ZIPIII и KANADY
действуют в разных путях контроля его экспрессии.

К основным регуляторам идентичности адаксиального домена
листового примордия откосятся также гены семейства YARRY, ко-
торые являются мишенью транскрипционных факторов KANADY
и AN Г У арабидопсис к этому семейству относятся гены FIL (FILA-
MENTOUS LEAP'), YAB2 и YAB3 (YABBY 2 и 3). У множественных
мутантов с потерей функции генов YABBY fil уаЬЗ и fil уаЬ2 уаЬЗ
развиваются узкие радиальные листья, состоящие только из клеток,
характерных для адаксиальной стороны листовой пластинки. Экс-
прессия этих генов наблюдается строго на абаксиальной стороне
листа, более того, граница зоны экспрессии генов YABBY является
маркером границы между абаксиальным и адаксиальным доменами
листовой пластинки. Исходя из этого, предполагается, что одной из
функций генов YABBY является коммуникация между адаксиальной
и абаксиальной частями в процессе развития листа. Продуктами
генов YABBY является специфичное для растений семейство транс-
крипционных факторов.

Установлено, что по крайней мере некоторые транскрипционные
факторы YABBY являются негативными регуляторами экспрессии
генов KNOX. Действительно, у мутантов арабидопсис с потерей
функции fil и уаЬЗ наблюдает ся эктопическая экспрессия генов STM,
KNAT1 и KNAT2 в листьях, для двойных мутантов характерно об-
разование эктопических нобеговых меристем и меристем соцветий
на адаксиальной стороне семядолей и листовых пластинок. Кроме
того, показано, что мутации с потерей функции /£/ и уаЬЗ частич-
но восстанавливают фенотип мутантов stm, тогда как у трансгенных
растений с повышенным уровнем экспрессии этих генов помимо
абаксиализации листовых пластинок наблюдается арест побеговых
меристем. При этом уровень экспрессии гена AS1 в листьях мутан-
тов fit уаЬЗ не меняется по сравнению с диким типом — таким об-
разом, транскрипционные факторы YABBY негативно регулируют
гены KNOX независимо от AS1. В то же время, согласно целому ряду
фактов, сами гены AS1/PHAN и AS2 также принимают участие в кон-
троле адаксиально-абаксиальной полярности латеральных органов.
Для мутанта phan львиного зева характерно развитие радиальных
листьев без адаксиальной стороны; у мутантов с потерей функции
asl и as 2 также отмечена частичная абаксиализация латеральных
ор1анов побега. При росте в условиях повышенной температуры
у мутантов asl и as2 наблюдается накопление miPHK 165/166 та-
ким образом, вероятно, что транскрипционные факторы AS1 и AS2
участвуют в репрессии развития адаксиального домена листа через
регуляцию экспрессии генов miR 165 и miR166.

Еще одна функция транскрипционных факторов YABBY — сти-
муляция пролиферации клеток абаксиального домена. Экспрессия
генов YA В BYв зрелом листе отмечена только в клетках, сохранивших
способность к делению, которые располагаются преимущественно
по краям листовой пластинки, а также на границе адаксиального
и абаксиального доменов листа. Потеря функции нескольких генов
YABBY у множественных мутантов сужает зону пролиферации кле-
ток, в результате чего образуются очень узкие листья; напротив, экто-
пическая экспрессия генов YABBYвызывает усиление пролиферации
клеток абаксиального домена листа. Установлено, что образование
эктопических листовых пластинок у множественных мутантов с по-
терей функции генов KANADY связано с активностью генов YABBY-.
при том, что гены YABBY у мутантов kanl kan2 кап4 экспрессируют-
ся на низком уровне, максимумы их экспрессии отмечены в листо-
подобных органах. У мутантов с потерей функции нескольких генов
KANADYи YABBYлистоподобные органы не образуются.

Среди мишеней транскрипционных факторов YABBY были
идентифицированы только гены GA2Ox и Ga3Ox, участвующие
в метаболизме гиббереллинов: по-видимому, снижение концентра-
ции этих гормонов необходимо для пролиферации клеток абакси-
ального домена. Вероятно, основная функция транскрипционных
факторов YABBY заключается в репрессии неидентифицированных
генов-регуляторов развития адаксиальною домена листа, при этом
большое значение имеет взаимодействие белков YABBY с одной
из групп белков-корепрессоров транскрипции. Было установлено,
что продукт гена GRAM1NIFOLIA (GRAM) львиного зева, который
относится к семейству белков YABBY, физически взаимодействует
с продуктом гена STYLOSA (STY), ортологом которого у арабидоп-
сис является ген LEUGNIG (LUG). Белки STY и LUG относятся
к группе корспрессоров транскрипции, которые взаимодействуют
с транскрипционными факторами и принимают участие в контроле
разнообразных процессов развития (например, к этому же семейству
у арабидопсис относится белок TOPLESS, играющий важную роль
в определении идентичности апикального домена зародыша). Двой-
ные мутанты с потерей функции sty gram имеют серьезные нару-
шения в развитии, связанные с редукцией числа клеточных делений
в латеральных органах и нарушением адаксиально-абаксиальной
специализации клеток. Интересно, что зоны экспрессии генов GRAM
и STY перекрываются в течение достаточного короткого периода -
на стадии инициации примордиев латеральных органов, на более
поздних стадиях мРНК STY обнаруживайся в адаксиальном домене
листа, а мРНК GRAM— в абаксиальном

10.4. Развитие рассеченного и сложном листа

Исследования показали, что большое разнообразие типов листа
(цельнокрайный, зубчатый, рассеченный, сложный лист) опреде-
ляется изменениями структуры края листовой пластинки, которые
имеют в своей основе один и тот же механизм, во многом сходный
с механизмом инициации листа на периферии ПАМ (рис. 10.10).
Ключевую роль в формировании любых выростов на краях листовой
пластинки играют два процесса; 1) возобновление экспрессии генов
KNOX и нескольких участках по краю листовой пластинки и 2) соз-
дание в этих участках локальных максимумов концентрации аукси-
нов за счет изменения ориентировки ПАТ.

На растениях с эктопической экспрессией гена KNAT1 под инду-
цибельным промотором было показано, что максимальное количе-
ство белка PINI и максимальная концентрация ИУК выявляется на
кончиках лопастей рассеченных листьев. Таким образом, экспрессия
генов KNOX способствует накоплению белка PIN1. Предполагается,
что активность генов KNOX в листьях препятствует нормальному
базипетальному распределению белка PIN 1 на поверхности клеток,
что приводит к появлению локальных максимумов ауксина на краях
листовой пластинки. Накопление ауксина способствует пролифера-
ции клеток листа за счет повышения уровня экспрессии гена ANT,
росту клеток растяжением и дифференцировке клеток в лопасти
листа, в частности — развитию сосудов. Кроме того, важную роль
в развитии зубчиков по краю листа играет баланс между микроРНК
miR 164А и его мишенью, транскриптом гена CUP SHAPED COTYLE-
DON2 (CUC2), который отвечает за определение границы листового
примордия, а также границы лопастей в пределах сложного листа.

Основными позитивными регуляторами развития рассеченных
и сложных листьев являются ALVClY-гены: повышение уровней их
экспрессии приводит к появлению зубчатых листьев у арабидопсис
и суперсложных листьев, состоящих из огромного множества мел-
ких листочков, у томата. Негативным регулятором «усложнения»
листа является ген CUC3: повышение уровня его экспрессии вы-
зывает слияние лопастей сложной листовой пластинки. Предпола-
гаемый механизм этого явления связан с расширением пограничных
доменов, которое препятствует росту лопастей. У Cardamine hirsuta,
близкого родственника арабидопсис, имеющего сложные листья,
снижение уровня экспрессии гена STM или повышение уровня экс-
прессии гена CUC3 приводит к развитию нерассеченных листовых
пластинок.

Развитие сложных листьев, состоящих из нескольких листовых
пластинок на одном черешке, зависит от» работы нескольких групп
генов (рис. 10.10). Во-первых, это гены KNOX. Особенностью раз-
вития сложного листа является ранняя реактивация генов KNOX
в развивающемся примордии, усиление их экспрессии (например,
у доминантных мутантов томата Mouse Ears (Me) и Curl (Си) с уси-
лением функции KNOX генов LeT6 и TKN1) вызывает развитие су-
персложного листа. В то же время существует несколько разных
механизмов развития сложного листа: например, у бобовых не про-
исходит возобновления экспрессии генов KNOX в развивающихся
листовых примордиях, но формируются сложные листья.

Во-вторых, развитие сложного листа регулируется некоторыми ге-
нами идентичности флоралыюй меристемы. На примере бобовых —
гороха (Pisum sativum), люцерны (Medicago truncatula) и лядвенца
(Lotus japonicus) — была продемонстрирована роль в этом процессе
ортологов генов LFYfFLO, которые являются ключевыми регулято-
рами развития флоральных органов, а также их корегуляторов UEO/
FIM(см. главу «Развитие цветка»). Например, мутации, приводящие
к развитию простого листа наряду с нарушениями развития цвет-
Рис. 10.10. Механизмы формирования зубчатого и рассеченного листа (модифици-
ровано по Barkoulas et aL, 2007)

А — максимуме концентрации ауксина в месте возникновения зубчиков у оозегонно-
го листа арабидопсис.

Б — модель контроля инициации зубчика/лопасти по краю листа: экспрессия генов
KNOX способствует накоплению бет ка PI3M1 и возникновению локального максимума
концентрации ауксинов. Ауксины стимулирую* экспрессию генов ЕХР и ANT, неебхо
димых для роста лопасти. Гены CUC определяют границу лопасти, экспрессия гена
CUC2 регулируется miPNA164

ков — unifoliata (uni) гороха, single leafletl (sgll) люцерны и prolifer-
ating floral meristem (pfin) лядвенца — представляют собой результат
потери функции генов группы LFY/FLO', мутация stamina pistilloida
(sip) гороха связана с потерей функции ортолога гена UFO.

В-третьих, на морфологию сложного листа оказывают влияние
гены, контролирующие адаксиально-абаксиальную полярность ли-
стовой пластинки — например, ген PHANTASTICA (PHAN), стимули-
рующий инициацию листа и дифференцировку клеток адаксиальной
стороны. Известны два основных типа сложного листа- перистый
и пальчатый, причем основное отличие второго от первого заключа-
ется в редукции черешка между листовыми пластинками. У транс-
генных растений томата, экспрессирующих антисенс-конструкцию
Рис 10.11 Гены, влияющие на структуру сложного листа томата (модифицировано
по Kim et al, 2003; Blein et al 2008)

Повышение уровней экспрессии генов KNOX приводит к развитию сложного и су-
персложнсго листа снижение уровня эксгрессии гена PHAN—к изменению перистой
формы листа на пальчатую, повышение уровня экспрессии гена CUC3 — к слиянию
лопастей сложного листа. В качестве примера приведены листья мутантов и трансген-
ных растений томата с измененными уровнями экспрессии соответствующих гоысв

гена LePIIAN, форма сложною лист а меняется с перистой на паль-
чатую; такой же пространственный характер экспрессии ортологов
гена PHAN наблюдается у всех изученных видов растений с паль-
чатосложными листьями. Все дело в том, что черешок сложного
листа является производным адаксиального домена листового при-
мордия таким образом, ограничение зоны экспрессии гена, уча-
сгвующего в контроле развития адаксиальной стороны, приводит
к редукции черешка и формированию пальчатого листа вместо пе-
ристого.

Источники рисунков, использгпанных в главе

I.	Barkoulas М., Galinha С., Grigg S. Р. et al. From genes to shape: regulatory
interactions in leaf development// Current Opinion in Plant Biology. 200”. Vol. 10
P. 660-666.

2.	Blein T, Pulido A., Vialette-Guiraud A. et al \ conserved molecular framework
for compound leaf development // Science. 2008 Vol. 322. P. 1835-1839

L Guo M., Thomas J., Collins G. et al. Direct repression of KNOX loci by the
ASYMMETRIC LEAVES! complex of Arab.dopsis // Plant Cell. 2008. Vol.20.
F. 48-58.

4.	Heisler M. G., Ohno C, Das P. et al. Patterns of auxin transport and gene expression
during primordium development revealed by live imaging of the Arabidopsis
inflorescence meristem // Current Biology. 2005. Vol. 15. N 21. P. 1899 -1911.

5.	Kim M.. McCormick S., Timmermans M. et al. The expression domain

of PHANTASTICA determines leaflet placemer.l in compound leaves // Nature.

2003. Vol. 424. P.438^443.

6.	Matsumoto N., Okada К \ homeobox gene, PRESSED FLOWER, regulates lateral
axis-dependent development of Arabidopsis flowers // Genes and Development.

2001. Vol. 15. P.3355-3364.

7.	Nardmann J., Ji J, Were W., Scanlon M. J. The maize duplicate genes narrow
sheath I and narrow shcath2 encode a conserved homeobox gene function in a lateral
domain of shoot apical meristems // Development. 2004. Vol. 131. P. 2827-2839.

8.	Reinhardt et al. Regulation of phyllotaxis by polar auxin transport // Nature. 2003.
Vol. 426. N20 P. 255-260.

Рекомендованная литература

1.	Barkoulas M., Galinha C., GnggS. P. et al. From genes to shape: regulatory
interactions in leaf development // Current Opinion in Plant Biology 2007. Vol. 10.
P 660-666.

2.	Pulido A. Laufs P Coordination of developmental processes by small RNAs during
leaf development // Experimental Botany. 2010.

3.	Micol J. L. Leaf development: time to turn over a new leaf? // Current Opinion in
Plant Biology. 2009. Vol. 12. P. 9-16.
Глава 11

Развитие корня

11.1.	Организация меристемы корня. Покоящийся центр
и стволовые клетки в меристеме корня

Корень приспособлен для роста в почве и поглощения воды и ми-
неральных веществ. Структура корня отвечает выполняемым этим
органом функциям. В корне выделяют следующие основные зоны:
зона деления (меристема), зона растяжения (элонгации), зона корне-
вых волосков, зона проведения.

Рост корня осуществляется за счет активности корневой апи-
кальной меристемы (КАМ), располагающейся на его верхушке
и прикрытой корневым чехликом. КЛМ представлена медленно
делящимися (имеющими длительный клеточный цикл) клетка-
ми так называемого покоящегося центра (ГЩ) и клетками прок-
симальной меристемы — инициалами, которые делятся с боль-
шей скоростью (имеют меньшую продолжительность клеточного
цикла). Так, например, у кукурузы клетки ПЦ делятся в среднем
1 раз в 180-200 часов, тогда как окружающие ПЦ клетки прокси-
мальной меристемы (инициали) делятся в среднем каждые 20 ча-
сов. У арабидопсис, как и у других растений с «закрытым» типом
меристемы корня, имеются клетки-инициали для разных тканей.
В результате их последовательных делений образуются линейные
ряды клеток (их также называют «файлы» клеток), составляющие
основные ткани корня: эпидерму, проводящие ткани, клетки пер-
вичной коры (эту ткань также называют «кортекс» (от англ, cor-
tex — кора), в русскоязычной литературе для обозначения этой
А

О Латеральный чехлик
 Центральный чехлик (колумелла)
I Эпидерма

Первичная кора

Эндодерма

Перицикл

Проводящие ткани
□ Покоящийся центр

Рис. 11.1. Строение кончика корня арабидопсис

А — общая схема строения кончика корня. Б — инициальные клетки в меристеме
корня (цифрами указано количество соответствующих инициальных клеток в мери-
стеме арабидопсис)

ткани ранее использовали термин «мезодерма») и эндодерму, а
также корневой чехлик (рис. 11.1). У арабидопсис выделяют сле-
дующие группы клеток-инициалей (см. рис J 1.1Б):

•	инициали эпидермы,

•	инициали псрицикла/проводящих тканей;

•	инициали первичной коры/эндодермы;

•	инициали колумеллы.

Клетки покоящеюся центра представляют собой «организующий
центр» меристемы, который стимулирует клеточные деления приле-
жащих клеток-инициалей и блокирует их дифференцировку. А сами
клетки-инициали, таким образом, представляют собой стволовые
клетки в меристеме корня.

Дополнительная информация

У растений выделяют два типа организации меристемы корня: «открытый»
и «закрытый». Один из критериев такого деления — характер развития корне-
вого чехлика, У растений с «закрытой» меристемой, к которым относится ара-
бидопсис, чехлик развивается отдельно от остальных тканей корня, а у растений
с «открытой» КАМ (например, подсолнечника) между клетками чехлика и коры
нет четких границ. Гистогенез корня в большей степени изучен у растений с «за-
крытой» КАМ: у них имеются различные типы клеток-инициалей, дающих начало
различным тканям корня. У растений с «открытой» КАМ механизмы гистогенеза
корня менее ясны у таких растений разные ткани корня могут образовываться из
общих клеток-инициалей. Оба типа меристем встречаются как у однодольных, так
и у двудольных растений.
11.2.	Регуляция активности покоящегося центра
меристемы корня

На роль покоящегося центра корня как «организатора» КАМ
указывает целый ряд данных. При удалении (выжигании лазером)
клеток ПЦ прилежащие к нему клетки-инициали претерпевают диф-
ференцировку. Так, например, маркером дифференцировки клеток
колумеллы (центральная часть чехлика) являются гранулы крахмала
(их легко выявить окрашиванием люголем), отсутствующие з не-
дифференцированных клетках-инициалях колумеллы. При удалении
лазером ПЦ в прилежащих клетках-инициалях колумеллы наблюда-
ются признаки дифференцировки — накопление гранул крахмала.

Какие же факторы отвечают за формирование ПЦ и поддержание
стволовых клеток в меристеме корня? В последнее время появляется
все больше данных, свидетельствующих о том, что механизмы под-
держания меристематической активности в корневой апикальной
меристеме и в гюбеговой апикальной меристеме включают общие
компоненты. Как вы помните, в побеговой апикальной меристеме
действует система генов С/.А РАТА и WUSCHEL, которые регулиру-
ют меристематическую активность клеток. В покоящемся центре
меристемы корня обнаружена экспрессия гомолога гена WUSCHEL,
названного WOX5 (WOX -WUS -related homeobox 5). У мутантов по
гену WOX5 корень укорочен и характеризуется увеличением разме-
ров клеток в области ПЦ и инициалей колумеллы. Ряд экспериментов
указывает на го, что экспрессия гена WOX5 регулируется ауксином.
Какова же функция этого гена? Экспериментально было показано,
что сверхэкспрсссия гена WOX5 в покоящемся центре достаточна
для подавления дифференцировки клеток колумеллы. Такие данные
позволяют предположить, что активность гена WOX5 предотвраща-
ет дифференцировку стволовых клеток-инициачей и стимулирует их
деления. Как и ген WUS, ген WOX5 экспрессируется в «организую-
щем центре» меристемы, а именно в покоящемся центре меристемы
корня. В связи с этим было высказано предположение, что продук-
ты генов WUS и WOX5 могут выполнять эквивалентные функции
в апикальных меристемах. Эксперименты по комплементации под-
тверждают это предположение: экспрессия WUS под промотором
гена WOX5 (pWOX5::WUS) восстанавливает нормальный фенотип
у мутантов wox5, тогда как экспрессия WOX5 под промотором гена
WUS (pWUS::WOX5) предотвращает преждевременную остановку
развития меристемы соцветия и цветка у мутантов wus (восстанов-
ление нормального фенотипа).
Факторы, регулирующие поддержание активности КАМ и ПАМ

Таблица 11.1

Компонент	Апикальная меристема побега	Апикальная меристема корня
Транскрипционный фактор семейства WOX	WUS	WOX5
CLE-пептид	CLV3	CLE40, CLE19
Рецепторные серин-треониновые протеинкиназы	CLV1/CLV2, CRN/CLV2	ACR4, CRN/CLV2 ?

Кроме того, в КАМ методом обратной генетики выявлена экс
нрессия CL ИЗ-подобных генов: CLE19, CLE40, кодирующих CLE-
пептиды. Экспериментально показано, что сверхэкспрессия этих
генов под ткансспецифичным промотором нарушает функциониро-
вание апикальной меристемы корня В частности, сверхэкспрессия
CLE19 в керне арабидопсис приводит к уменьшению размера КАМ.
Обработка растений арабидопсиса экзогенными CLE-пептидами
(CLV3, CLE40, CLE19) приводит к значительному уменьшению чис-
ла клеток в КАМ и его укорочению. При обработке CLE-пептидами
растений, мутантных по гену CLV2, такого эффекта не наблюдали,
что свидетельствует о том. что действие CLE-пептидов на растение
может осуществляться через рецепторный белок CLV2. Для пептида
CLE40 был обнаружен его предположительный рецептор — ACR4
(Arabidopsis Crinkly 4). Мутант по гену ACR4 характеризуется нали-
чием дополнительных слоев клсток-инициалей колумеллы. Такой же
фенотип характерен и для мутанта Ые40, что свидетельствует о том,
что в норме продукты генов ACR4 и CLE40 ограничивают число
клеток-инициалей колумеллы в меристеме корня. Кроме того, у му-
тантов Ые40 и асг4 в меристеме корня увеличена область экспрессии
гена WOX5. На основании таких данных предполагается, что CLE40
может ограничивать область экспрессии WOX5 в меристеме корня
таким же образом, как CLE-пептид CLV3 ограничивает область экс-
прессии гена WUS в мерис теме побега (рис 11.2).

Таким образом, системы, поддерживающие пул стволовых кле-
ток в меристеме корня и в меристеме побега, включают следую-
щие общие компоненты: лиганд CLE-пептид, связывающийся с ре-
цепторными протеинкиназами (которые могут функционировать
в виде гетеродимерных комплексов), активирующие сигнальный
каскад, приводящий к подавлению экспрессии гена семейства WOX
(табл. 11.1).
Рель ауксина в развитии меристемы корня

Ауксин играет ключевую роль в развитии корня на всех этапах,
начиная с момента закладки корня в эмбриогенезе. Ауксин определя-
ет положение и формирование ниши стволовых клеток и покоящего-
ся центра в меристеме корня, регулирует митотическую активность
меристемы корня, кроме того, ауксин вовлечен в развитие бокового
корня. В связи с этим распределение ауксина в тканях корня имеет
важное значение для его правилвного развития. Направление по-
лярного транспорта ауксина в корне определяется характером рас-
положения в плазматической мембране белков-переносчиков PIN,
обеспечивающих «отток» ауксинов из клетки.

Роль генов PLETHORA (PLT) 1 и 2 в фермировании ПЦ

и поддержании стволовых клеток

У арабидопсис было показано, что в поддержании активности
стволовых клеток растений также принимают участие гены PLETHO-
RA (PLT), кодирующие транскрипционные факторы с АР2-домеиом.
У арабидопсис выявлено4 гена PLT(PLT1, PLT2, PLT3 и ВВМ (ВАВТ
BOOM)). Эти гены экспрессируются преимущественно в покоящем-
ся центре и в клетках-инициалях колумеллы. Область экспрессии
этих генов соответствует зоне с максимальным содержанием аукси-
на в кончике корня. Предполагается, что белковые продукты генов
PLT формируют концентрационный градиент, максимум которого
соответствует нише стволовых клеток в корне. Показано, что ауксин
регулирует экспрессию генов PLT В свою очередь, продукты генов
PLTнеобходимы для поддержания градиента ауксина в кончике кор-
ня. Вероятно, их действие осуществляется через регуляцию экспрес-
сии генов PIN, кодирующих белки-переносчики ауксина, поскольку
у мутантов по генам PLT в кончике корня практически отсутствует
экспрессия некоторых генов P1N (в частности, PIN 3, 4, 7) или имеет
аномальное распределение.

Роль генов SHORTROOT (SHR) и SCARECROW (SCR)

в формировании ПЦ и в поддержании стволовых клеток

Мутанты по гену SCARECROW (SCR) и SHORTROQT (SHR) ха-
рактеризуются нарушением структуры и функции ПЦ и, как след-
ствие, укорочением и недоразвитием корня. Кроме того, мутации
по гену SCR и SHR также приводят к изменению радиальной струк-
туры корня (см. раздел «Генетический контроль дифференцировки
клеток эндодермы и коры»), SCR
экспрессируется в покоящем-
ся центре, а также в эндодерме,
в инициалях эндодермы/коры.
При восстановлении экспрес-
сии гена SCR только в ПЦ с по-
мощью системы трансактивации
UAS-GAL4 (см. главу «Методы
в ГРР») у мутантов scr наблю-
дали восстановление структуры
и функции ПЦ. Таким образом,
экспрессия гена SCR в ПЦ необ-
ходима для функционирования
11Ц и поддержания активности

CLE4C	прилежащих стволовых клеток

в меристеме корня.

Рис. 11.2. Регуляторная сеть, контроля-	На рисунке 11.2 представлена

рующая функционирование меристемы общая схема регуляции активно-
корня	сти ПЦ и функционирования ме-

ристемы корня с участием гормо-
на ауксина, транскрипционных факторов различных групп (WOX5,
PLT, SHR, SCR), а также сигнального пептида CLE40 и его предпо-
лагаемого рецептора ACR4.

11.3.	Генетический контроль дифференцировки клеток
эндодермы и первичной коры

Формирование двух клеточных типов — клеток эндодермы и кле-
ток первичной коры корня — происходит в результате асимметрич-
ного периклинального деления клеток-инициалей, общих для этих
двух типов клеток (иницнали коры/эндодермы). На примере диф-
ференцировки клеток коры и эндодермы можно проследить, как
асимметричное клеточное деление исходной инициальной клетки
приводит к появлению двух разных клеточных типов. Что именно
определяет различную судьбу дочерних клеток? Получают ли до-
черние клетки различный набор «клеточных детерминант», регуля-
торных молекул, определяющих их дальнейший путь развития, или
же различия в судьбе дочерних клеток определяются их «клеточным
окружением» — влиянием внешних стимулов? На эти вопросы по-
стараемся ответить, рассмотрев известные молекулярные механиз-
мы, лежащие в основе развития клеток коры и эндодермы корня
Ключевыми генами, ответственными за формирование клеток эн-
додермы и коры, являются гены SCARECROW (SCR) и SHORTROOT
(SHRj. Оба эти гена кодируют транскрипционные факторы семей-
ства GRAS.

У мутантов ио гену SHR отсутствует слой клеток эндодермы
в корне. При этом эктопическая экспрессия SHR (pSCR::SHR) приво-
дит к формированию дополнительных слоев клеток эндодермы. Ло-
кализацию экспрессии гена SHR изучали с помощью генетических
конструкций, включающих реиортерный ген GFP. С использовани-
ем конструкции, включающей промотор SHR, соединенный с геном
GFP (pSIlR :GFP), было показано, что мРНК SHR синтезируется
в клетках стелы. Однако при использовании другой конструкции,
включающей кодирующую последовательность SHR, слитую с по-
следовательностью GFP (pSHR::SHR-GFP), позволяющей исследо-
вать локализацию белка SHR, свечение гибридного белка, помимо
клеток стелы, также наблюдали в клетках эндодермы, в инициалах
ксры/эндодермы и в клетках покоящегося центра. То есть ген SHR
экспрессируется в клетках стелы, а затем его белковый продукт пе-
ремещается в соседние слои клеток (рис. 11.3).

У мугантов5сгтакже нарушена радиальная структура корня: вме-
сто слоев клеток эндодермы и коры формируется единый слой кле-
ток (так называемый «мутантный слой»), сочетающих свойства кле-
ток эндодермы и коры (экспрессирующих как маркеры эндодермы,
так и коры). Такое фенотипическое проявление мутации scr свиде-
тельствует о том, что ген SCR контролирует асимметричное деление
клеток-инициалей. SCR экспрессируется в эндодерме, в инициалях
коры/эндодермы и в покоящемся центре.

У мутантов scr белок SHR. может перемещаться из стелы в клетки
«мутантного слоя», что указывает на то, что перемещение SHR из
стелы не зависит от работы гена SCR. Однако при эктопической экс-
прессии SHR-GFP в клетках эпидермы у мутантов scr гибридный бе-
лок SIIR-GFP перемещается из клеток эпидермы во внутренний слой
клеток, что не наблюдается у дикого типа. Это указывает на то, что
SCR все-таки вовлечен в перемещение белка SHR. Предполагают,
что SCR ограничивает миграцию белка SHR в соседние слои клеток
корня, таким образом предотвращая дополни тельные периклиналь-
ные клеточные деления, которые могли бы привести к формирова-
нию дополнительных слоев клеток эндодермы, как это наблюдается
при эктопической экспрессии SHR (pSCR::SHR).

Согласно одной из моделей клеточным детерминантом, опреде-
ляющим дифференцировку эндодермы, является белок SHR. SHR
инициали первичной кэрь /эндодеомь.

Рис. 11.3. Участие бе лков SHR и SCI I в диф-
ференцировке клеток эндодермы и коры

активирует экспрессию гена
SCR, который, в свою очередь,
препятствует распространению
белка SHR в слои клеток коры
и таким образом регулирует его
действие. Мишени гена SCR, по-
видимому, регулируют направле-
ние деления клеток-инициалей
и регулируют активность других
факторов, определяющих асим-
метричный характер их деления.

При асимметричном деле-
нии клетки-инициали дочерние
клетки получают различный на-
бор регуляторных молекул (в том
числе SHR, SCR), на распределе-
ние которых оказывают влияние
прилежащие слои клеток (в дан-
ном случае миграция белка SHR

из клеток стелы в клетки эндо-
дермы). Таким образом, на диф-
ференцировку клеток эндодермы

и первичной коры оказывает влияние как распределение «клеточных

детерминант» в дочерних клетках, так и «клеточное окружение».

11.4.	Генетический контроль дифференцирьвки клеток
эпидермы

Дифференцировка клеток эпидермы представляет собой другую мо-
дель, позволяющую проследить роль клеточного окружения в опреде-
лении судьбы клетки. Слой эпидермы состоит из двух типов клеток:
• клетки, формирующие корневые волоски (трихобласты, «воло-
сковые» клетки);

• клетки, не формирующие корневые волоски (агрихобласты, «не-
волосковые» клетки).

Корневые волоски представляют собой т рубчатые выросты не-
которых клеток эпидермиса, формирующиеся на определенном рас-
стоянии от кончика корня в зоне дифференцировки (зоне корневых
волосков), наличие которых увеличивает площадь поверхности кор-
ня, что способствует усилению всасывания воды и минеральных ве-
ществ из почвы.
Поперечный
срез корня

1ЛГ

Рис. 11.4 Фенотипы мутаций пс генам, определяющим дифференцировку клеток
эпидермиса

В распределении волосковых и неволосковых клеток в эпидер-
мальном слое была отмечена следующая закономерность: клетка
эпидермы, располагающаяся между двумя клетками коры, развива-
ется по «волосковому» пути, а клетка эпидермы, контактирующая
с одной клеткой коры, развивается как «неволосковая» В связи
с этим было высказано предположение, что на судьбу клетки эпи-
дермы оказывает влияние позиционный сигнал, поступающий из
клеток коры.

У арабидопсис были выявлены мутанты с нарушением характе-
ра распределения корневых волосков: так, у мутанта caprice (срс)
корневые волоски практически отсутствуют, тогда как для мутантов
gt2, ttg, wer характерно повышенное количество корневых волосков
в корне по сравнению с диким типом (рис. 11.4).

Ген GLABRA2 (GL2), выявленный в результате анализа мутантов,
кодирует транскрипционный фактор HD-Zip (homcodomam-leucine
zipper). Ген CL2 экспрессируется исключительно в «неволосковых»
клетках и является ключевым регулятором развития клеток эпидер-
мы по «неволосковому» пути. Ген CAPRICE (СРС) кодирует транс-
крипционный фактор с ДНК-связывающим Myb-доменом и опре-
деляет развитие клеток эпидермиса по «волосковому» пути и, как
предполагается, является негативным регулятором экспрессии GL2.
Рис. 11.5. Взаимодействие Т<ь в регуляции дифференцировки клеток эпидермиса

Ген WEREWOLF (WER), кодирующий транскрипционный фактор
с ДНК-связывающим Myb-доменом, и ген TRANSPARENT TESTA
GLABRA 1 (TTG), кодирующий белок, с WD40-noBTopaMH, участвую-
щий в белок-белковых взаимодействиях, являются другими важными
регуляторами дифференцировки клетки эпидермы по «волосковому»
пути. Согласно одной из моделей позиционный сигнал из клеток коры
действует на комплекс транскрипционных факторов, регулирующих
экспрессию GL2. Предполагается, что позиционный сигнал влияет на
экспрессию гена IVER: в одних клетках ингибирует экспрессию WER
(«волосковые клетки»), а в других усиливает («неволосковые клет-
ки»). В будущих «неволосковых» клетках наблюдается более высокий
уровень экспрессии WER по сравнению с экспрессией СРС. ТФ WER
в комплексе с другими ТФ активирует экспрессию GL2, ингибирую-
щего развитие корневых волосков. В результате такая клетка разви-
вается как «неволосковая». В противоположность этому, в «волоско-
вых» клетках наблюдается низкий уровень экспрессии IVER. В таких
клетках, в отсутствие ТФ WER, его место в комплексе, регулирую-
щем экспрессию гена GL2, занимает ТФ. СРС в комплексе с другими
ТФ ингибирует экспрессию гена GL2, в результате чего клетка раз-
вивается как «волосковая». Согласно этой модели наличие продукта
гена GL2 является ключевым фактором в определении судьбы клетки
эпидермы, при этом GL2 подавляет развитие корневою волоска (рис.
11.5). Регуляция развития корневого волоска осуществляется через
воздействие на аппарат микротрубочек. Известно, что ТФ GL2 связы-
вается с промотором тепа фосфолипазы D и подавляет его экспрессию
в «неволосковых» клетках. В свою очередь, фосфолипаза D участвует
в сигнальном каскаде, регулирующем реорганизацию микротрубочек,
необходимую для роста корневого волоска. Таким образом GL2 по-
давляет развитие корневого волоска.

11.5. Регуляция развития бокового корня

Считается, что, в отличие от меристемы побега, корневая апи-
кальная меристема не участвует в образовании боковых органов: как
правило, закладка примордиев боковых корней происходит вне зоны
меристемы в результате делений клеток перицикла. Однако, как мы
с вами увидим, данные, накопленные за последние годы, заставляют
пересмотреть устоявшиеся представления о природе корневой мери-
стемы и возникновении бокового корня.

У арабидопсис, как и многих других видов, боковой корень (БК)
образуется из клеток перицикла, расположенных напротив ксилемы.
Такую закономерность можно объяснить гем, что контакт развиваю-
щегося примордия с ксилемой обеспечивает быстрое поступление
необходимых для его развития воды и минеральных веществ. Одна-
ко эта закономерность характерна не для всех видов растений: на-
пример, у пшеницы, кукурузы, риса и моркови БК образуется из кле-
ток перицикла, расположенных напротив флоэмы. Таким образом,
в инициацию развития БК вовлечены клетки перицикла, занимаю-
щие определенное положение относительно флоэмы и ксилемы, что
позволяет предположить роль позиционной информации в опреде-
лении сайта закладки БК.

Как и у многих других видов растений, у арабидопсис БК форми-
руются вне зоны меристемы на удалении от кончика корня. Однако
закладка БК может также происходить как в непосредственной бли-
зости от кончика корня, так и в самой меристеме корня, как это про-
исходит, например, у тыквы. Ранее считалось, что клетки перицикла,
покидая меристему, выходят из цикла (на стадии G2) и становятся
митотически неактивными, и затем при инициации развития при-
мордия БК в клетках перицикла происходит реактивация клеточных
делений. Данные, накопленные в последнее время, опровергают эту
гипотезу. Клетки перицикла гезерогенны по своей природе: клетки
перицикла, расположенные напротив ксилемы, отличаются от кле-
ток перицикла, расположенных напротив флоэмы. Так, у арабидоп-
сис расположенные напротив ксилемы клетки перицикла способны
давать начало БК, их называю! клетки-основательницы. Было пока-
зано, что, в отличие о г других типов клеток, образующихся из мери-
стемы корня, клегки-основательницы сохраняют митотическую ак-
тивность (не выходят из цикла). У арабидопсис и люцерны в клетках
Рис. 11.6. Стации развития боковою корни (модифицировано по Malamy and Beiifey, 1997)

перицикла наблюдается конститутивная экспрессия генов, контро-
лирующих клеточный цикл, в частности гена циклин-зависимой ки-
назы CDKA1 и циклина СусА2;1. У арабидопсис клетки перицикла,
расположенные напротив ксилемы, характеризуются цито логически-
ми особенностями, характерными для меристематических клеток'
наличием плотной цитоплазмы, крупного ядра и мелких вакуолей.
В связи с этим в настоящее время складывается представление о пе-
рицикле как о некой «расширенной» меристеме корня, активность
которой приводит к закладке примордиев ]>К.

У арабидопсис развитие БК начинается с антиклинальных деле-
ний клеток перицик ла с последующими периклинальными деления-
ми. В результате определенным образом ориентированных и асим-
метричных клегочных делений происходит формирование основных
т каней и типов клеток, и образующийся БК «прорастает» сквозь кору
материнского корня. К моменту выхода зачатка БК на поверхность
в нем уже полностью сформирована тканевая структура и начинает
функционировать меристема. Стадии развития бокового корня пред-
ставлены на рисунке 11.6.

Регуляция закладки боковых корней

Известно, что ауксин играет ключевую роль в формировании
БК. Воздействие экзогенного ауксина приводит к увеличению чис-
ла БК. При подавлении полярного транспорта ауксина формирова-
ние БК также подавляется. С помощью репортерной конструкции,
чувствительной к действию ауксина DR5::CUS (DR5 ауксин-
чувегвительный элемент, содержащий повторы последовательности
TGTCTC), было показано, что концентрация ауксина увеличивается
в клетках перицикла на самых ранних этапах развития БК. Како-
вы же механизмы действия ауксина при формировании примордия
БК? Считается, что ауксин опосредует переход клеток перипикла из
стадии G1 в S, предположительно воздействуя на белки-регуляторы
клеточного цикла циклины типа D или циклин-зависимые киназы
CDKB1;!. Также существуют данные о том, что ауксин может по-
давлять экспрессию белков-инг ибиторов клеточного цикла (таких
как KRP, Kip-related proteins), таким образом стимулируя клеточные
деления клеток перицикла.

Значительный процент мутантов с нарушением образования БК
содержит мутации в генах, вовлеченных в метаболизм или действие
ауксина. Среди мутантов, не образующих БК, особый интерес пред-
ставляет мутант alf4 (aberrant lateral root formation 4) с нарушением
митотической акт ивности клеток перицикла. У мутантов alf4 в клет-
ках перицикла не обнаружена экспрессия циклина CycBljl, регу-
лирующего переход G2-M (необходимый для активации клеточных
делений при развитии примордия). Ген ALF4 был клонирован — он
кодирует уникальный для растений белок, предположительно ядер-
ной локализации, не имеющий сходства с какими-либо ранее извест-
ными белками. Предполагается, что ALF4 действует независимо от
ауксинового сигналинга, но конкретные механизмы его действия
остаются неизвестными.

Все клетки перицикла, расположенные напротив ксилемы, спо-
собны переходить к клеточным делениям при усилении концентра-
ции ауксина. Однако далеко не из всех таких клеток перицикла обра-
зуются БК. Какие же дополнительные факторы регулируют закладку
и распределение БК, что вызывае-локальное увеличение концентра-
ции ауксина в клетках корня?

Для арабидопсис показано, что в клетках ксилемы, прилежащих
к клеткам перицикла, наблюдается периодическое изменение кон-
центрации ауксина с интервалом около 15 часов. Локальное усиле-
ние концентрации ауксина запускает в соседних клетках перицик-
ла ответные реакции, приводящие к активации клеточных делений
и формированию примордия. Таким образом, периодичность заклад-
ки БК обусловлена периодическим локальным усилением концен-
трации ауксина в клетках корня. Кроме того, локальное увеличение
концентрации ауксина в корне может быть вызвано механическими
стимулами и гравитропизмом. Было показано, что механическое из-
гибание корня вызывает перераспределение белков-переносчиков
ауксина (в частности, PIN1) в клетках ксилемы, следствием чего
является локальное усиление ауксинового сигнального ответа, при-
водящего к закладке примордия БК. Таким образом, закладку БК на-
ряду с эндогенными факторами (колебания концентрации ауксина)
также регулируют внешние стимулы.
В отличие от ауксина, индуктора образования БК, гормон цитоки-
нин подавляет образование БК. Локальное усиление концентрации
цитокинина в клетках перицикла, вызванное сверхэкспрессией гена
биосинтеза цитокинина изопентинилтрансферазы IPT (ISOPENTE-
NYL TRANSFERASE), нарушает закладку примордиев БК. Предпола
гается, что цитокинин оказывает влияние на экспрессию генов PIN,
таким образом нарушает формирование градиента ауксина. Экзоген-
ное добавление цитокинина вызывает изменение направлений клеточ-
ных делений в формирующемся примордии, нарушая его структуру,
что приводит к формированию «плоскою» примордия БК.

Гены, отвечающие за поддержание меристемы корня, такие как
WOX5, ACR4, начинают экспрессироваться на самых ранних этапах
развития примордия БК. Было показано, что ген JVOX5 экспрессиру-
ется в перицикле, в клетках-основательницах примордия. Ген ACR4
также начинает экспрессироваться в клетках перицикла после пер-
вого асимметричного деления Интересно отметить, что ген ACR4
необходим для подавления клеточных делений в соседних клетках
перицикла: у мутантов асг4 примордии БК закладываются на близ-
ком расстоянии друг от друга. Таким образом, ген ACR4 регулирует
пролиферацию клеток не только локально, предположительно, огра-
ничивая экспрессию W0X5 в меристеме корня, но также вовлечен
и в системный контроль пролиферации клеток, регулируя количе-
ство закладываемых примордиев БК.

Для выхода БК на поверхность материнского корня примордию
БК необходимо «преодолеть» несколько слоев клеток: эндодерму,
кору и эпидерму материнского корня, при этом растущий примор-
дий не должен «повредить» ткани материнского корня. Было пока-
зано, что в клетках корня, окружающих примордии, экспрессируют-
ся ферменты, осуществляющие перестройку («ремоделирование»)
клеточных стенок, что обеспечивает разделение клеточных стенок
соседних клеток. К таким ферментам (CWR, cell wall remodelling
enzymes) относятся пектатлиэза, полигалактуроназа и другие. Пред-
полагается, что гены, кодирующие эти ферменты, регулируются ком-
понентами ауксинового сигнального каскада. Таким образом, ауксин
играет ключевую роль в формировании БК на всех этапах его раз-
вития: от инициации примордия БК до его выхода на поверхность
материнского корня (рис. 11.7).

Дополнительная информация

У животных в развитии важную роль играют так называемые морфогены — ве-
щества, определяющие путь дифференцировки клеток-мишеней, которые находятся
* Покоящийся центр
О Инициалы колумеллы

Колумелла

* Инициалы коры/эндодерлш

О Эндодерма

С_ Кора

I Инициалы эпидермы

* Эпидерма

О Латеральный чехлик
Направление развития

* проводящих тканей

 Преобладающее наставление
плоскости деления клеток

I Дифферент гирогмннь». тяжи
котлемы

Концентрационный
максимум ауксина

 Покоящийся центр
Ориентация плоскостей
деления клеток
Направление
транспорта ауксина

Рис. 117. Влияние ингибитора транспорта ауксина на структуру корня

в зоне градиента их эффективных концентраций, при этом клетки-мишени способ-
ны воспринимать разные концентрации морфогена как различные информацион-
ные сигналы. В развитии живогных в качестве морфогенов выступают вещества
различной природы: как правило, это способные к диффузии секреторные белки,
морфогенами могут являться транскрипционные факторы (например, транскрип-
ционные факторы Bicoid, Hunchback и Caudal, градиент которых шрает ключевую
роль в определении переднезадней оси зародыша дрозофилы), а также молекулы
более простой химической природы, например ретиноевая кислота, градиент кото-
рой играет ключевую роль в развитии конечностей позвоночных

В настоящее время в литературе обсуждается вопрос, можно ли называть «аук-
син» растительным морфог еном? Соответствует ли механизм действия этого гор-
мона определению морфогена? Важной особенностью действия ауксина является
формирование концентрационного градиента. Ауксин синтезируется преимуще-
ственно в листовых примордиях и молодых листьях и транспортируется из апекса
побега в кончик корня путем полярного транспорта. Таким образом, посредством
апикально-базального транспорта ауксин опосредует системный контроль развития
растения, «информируя» корень об активности и жизнедеятельности побеговой ча-
сти растения. Помимо роли ауксина в координации развития его отдельных частей,
концентрационный градиент ауксина предопределяет структуру и позицию органов
и тканей растений, что четко прослеживается на примере развития корня. Прежде
всего, наличие градиента ауксина важно для определения апикально-базальной оси
зародыша в эмбриогенезе и формирования КАМ. Концентрационный максимум
ауксина определяет место закладки примордия БК. Кроме того, концентрационный
градиент ауксина играет важную роль в определении судьбы клеток.

Показано, что в норме концентрационный максимум ауксина наблюдается
в клетках колумеллы и их инициалах Обработка ингибиторами транспорта ауксина
(фиготооиинами) приводит к сдвигу концентрационного максимума ауксина и как
i ледствие — к изменению дифференцировки клеток и изменению пространствен-
ной структуры корпя (рис. 11.7). Так, в результате смещения максимума ауксина
н копчике корня клетки эндодермы, оказавшись в зоне действия новых значений
концентрационною градиента ауксина, приобрели свойства клеток покоящегося
Петра, прилежащие клетки коры и эпидермы — свойства клеток-инициалей колу-
меллы и клеток колумеллы соответственно. Такие эксперименты доказывают, что
концентрация ауксина является своего рода информационным сигналом, опреде-
Ппощим судьбу клеток. Но все-лаки, можем ли мы назвать ауксин морфогеном?
большинство авторов сходится во мнении, что в строгом смысле ауксин не явля-
йся морфогеном, поскольку в действии ауксина на клетки-мишени важно превы-
шение некоего пороговою значения концентрации ауксина (концентрационный
максимум), а не сам концентрационный градиент как таковой. Тогда как з случае
классическою морфогена различные значения его концентрации воспринимаются
клегками-мишенями как различные информационные сигналы. Кроме того, сам по
себе ауксин необходим, чо нс достаточен для изменения плана развития растений:
ci о действие дополняют присутствующие в клетках-мишенях другие регуляторные
молекулы и позиционные сигналы, поступающие от окружающих клеток.

Источники рисунков, использованных в главе

I.	Barton К. М. Giving Meaning to Movement Cell. 2001. Vol. 107. P. 129-132.

2.	Doerner P. Root patterning: does auxin provide positional cues? // Curr Biol. 2000.
Vol. 10. I. 5. ?. R201-R203.

1. Griersona C. Schiefelbeinb J Root Hairs in The Arabidopsis book. / The American
Society of Plant Biologists. 2002.

I. Taiz L. andZeiger E. Plant Physiology I Sinauer Associates; 3 ed. 2002. 690 p.

Рекомендованная литература

I.	Casson S. A , Keith L. Genes and signalling in root development // New Phvtologist.
2003. Vol. 158. Nl.P. 11-38.

2.	De Smet /.. Vanneste S, Inze D. et al. Lateral root initiation or the birth of a new
meristem // Plant Mol Biol. 2006. Vol.60. N6. P.871-887.

.3. Jiang К , Feldman L. J. Regulation of root apical meristem development // Annu
Rev Cell Dev Biol. 2005. Vol.21. P.485-509.

4.	Peret B., De Ryhel B., Casimiro I. et al. Arabidopsis lateral root development: an
emerging story // Trends Plant Sci. 2009. Vol. 14 P. 399-408

5.	Pesch M.. Hiilskamp M. Creating a two-dimensional pattern de novo during
Arabidopsis trichome and root hair initiation // Current Opinion in Genetics &
Development 2004. Vol. 14. P. 422^127.

6	Sabatini S., Heidstra R , IVildwarer M. et al. SCARECROW is involved in
positioning the stem cell niche in the Arabidopsis root meristem // Genes De V.
2003. Vol. 17. N3 P. 354-358.

7.	Sarkar A. К Luijten M„ Miyashima S. et al. Conserved factors regulate signalling
in Arabidopsis thaliana shoot and root stem cell organizers // Nature. 2007. Vol 446.
1.7137. P.8U-814.
8.	Scheres В , Benfey Р, Dolan L. Root Development. The Arabidopsis Book.
American Society of Plant Biologists Press. 2002. P. 1-19.

9.	Schiefelbein J. Cell-fate specification in the epidermis: a common patterning
mechanism in the root and shoot // Current Opinion in Plant Biology. 2003. Vol. 6.
I. I P. 74-78.

10.	Stahl У, Simon R. Is the Arabidopsis root niche protected by sequestration of the
CLE40 signal by its putative receptor ACR4? // Plant Signal Beha Vol. 2009. Vol. 4.
N 7. P. 634-635.

11.	Ueda M., Koshino-Kimura Y, Okada K. Stepwise understanding of root
development // Curr Opin Plant Biol. 2005. Vol. 1. P. 71-76.

12.	van den Berg C„ Willemsen V, Hendriks G. et al. Short-range control of cell
differentiation in the Arabidopsis root meristem // Nature. 1997. Vol. 390.1. 6657.
P. 287-289.
Глава 12

Инициация цветения

; Переход к цветению (инициация, или индукция, цветения) пред-
ставляет собой запуск одной из наиболее важных генетических про
грамм развития растений, определяющей успешное репродуктивное
размножение. Этот этап предшествует двум последующим — этапу де-
терминации флоралыюй меристемы и этапу дет ерминации и развит ия
органов цветка, которым посвяшена следующая паза. Этап инициации
цветения (в отличие от следующих за ним) не проявляется на морфо-
логическом уровне, однако в это время в растении происходят важ-
нейшие физиологические процессы, в основе которых лежат сложные
молекулярно-генетические преобразования. На этом этапе в клетках
растения осуществляется сбор и анализ информации, поступающей из
окружающей среды, оценка готовности самого растения к оставлению
। юлноценного потомства. Именно на этом этапе особенно ярко проявля-
ется зависимость онтогенеза растения от условий окружающей среды.

Гены, контролирующие переход к цветению, лучше всего иссле-
дованы у A. thaliana — факультативного длиннодневного растения,
зацветающего раньше в условиях длинного дня (ДД, 16 ч светового
периода), чем короткого дня (КД, 8-10 ч светового периода) Гермин
«факультативное» в данном случае означает, что растения могут за-
цвести и в условиях КД. На время зацветания A. thaliana оказывают
влияние также интенсивность света (более яркий свет частично ком-
пенсирует эффект КД), температурные условия (точнее, холодовое воз-
действие), стрессовые воздействия. Эндогенные факторы — возраст
растения, вегетативная масса (она отражает статус питания, в первую
очередь, содержание сахаров), содержание гормонов (особенно гиббе-
реллинов) также важны для индукции цветения. Перечисленные фак-
Этап1
Индукций
цветения

Этап 2
Детерминация
меристемы
цветка

ЗтапЗ
Детерминация
эрганов
цветка

Индукция

Цвв1ение

Рис. 12.1. Последовательные этапы развития цвета Arabidopsis thaliana и основные
гены, кх контролирующие

На 1-м этапе гены определяют еремя цветения и переход растений на репродуктив-
ную фазу развития, контролируя восприятие сигналов внешней и внутренней среды.

На 2 м этапе начинают действовать гены, детерминирующие фпорэльную меристему.

На 3-м осуществляется спецификация флорагьной меристемы генами, детермини-
рующими тип органов цветка

торы важны для индукции цветения и у других видов растений, поэто-
му A. thaliana является удобной моделью для изучения генетической
регуляции всех основных путей индукции цветения.

Сегодня у A. thaliana известно более 80 генов, вовлеченных
в контроль времени зацветания. Лучше всего изучен генетический
контроль четырех основных сигнальных путей индукции цветения:
холодового, фотопериодического,^гиббереллинового и так называе-
мого автономного пути (рис. 12.1).

12.1.	Фотопериодическая регуляция перехода к цветению

Изменение длины светового дня коррелирует с комплексом се-
зонных изменений, происходящих в природе, и сигнализирует рас-
юниям о приближении неблагоприятного для роста периода и изме-
нении температурных условий. Длина светового дня (фотопериод)
является важным фактором развития растений и регулирует процес-
сы, связанные с сезонными изменениями растений, такие как цвете-
ние, образование запасающих органов, закладка почек, подготовка
к периоду покоя.

В зависимости от реакции на изменение длины светового дня
растения разделяют на две основные группы: растения короткого
дня и растения длинного дня. У растений короткого дня цветение
наступает при КД (например, кукуруза, рис и др.), а растения длин-
ного дня цветут при ДД (например, арабидопсис, пшеница, овес,
рожь и др.). Также выделяют нейтральнодневные растения, на ко-
торые длина дня не оказывает заметного влияния. Принадлежность
растений к той или иной группе определяется их географическим
происхождением и распространением: как правило, растения ко-
роткого дня произрастают в тропических и субтропических об-
ластях, растения длинного дня — главным образом в умеренных
и северных широтах.

Перед тем, как перейти к рассмотрению молекулярных механиз-
мов фотопериодической индукции цветения, постараемся ответить
на вопрос, каким же образом растение воспринимает изменение
длины светового дня? Прежде всего, необходимо понять, каким об-
разом растения «ощущают» время. Какие механизмы лежат в основе
«биологических часов» растений, позволяющих растениям уловить
изменение длины светового дня?

Дополнительная информация

Впервые концепцию о регуляции цветения продолжительностью светового дня
сформулировали в 1920 г. американские ученые У. Гарнер и Г. Аллард. Для обо-
значения влияния от крытого ими явления — влияние длины светового дня на время
цветения — эти исследователи предложили использовать термин «фотопериодизм».
Гарнер и Аллард исследовали регуляцию цветения у сои и табака. В частности, ими
была обнаружена необычная мутантная форма табака (названная ими «Maryland
Mammoth»), отличающаяся от исходного сорта более крупными размерами и ши-
рокими листьями. В отличие от исходного сорта выявленная форма в полевых
условиях не зацветала в течение лета, и исследователи вынуждены были перенести
растения в теплицу, чтобы уберечь их от заморозков. К их удивлению в условиях
1сплицы табак зацвел! Как выяснили Гарнер и Аллард, фактором, вызвавшим цве-
1сние у габака, было уменьшение длины светового дня в теплице. В последующих
жспсриментах Гарнер и Аллард изучали влияние продолжительности светового
дня и ночи па время цветения и показали, что прерывание ночи вспышками света
препятствовало зацветанию растений (объектом их исследования были растения,
зацветающие при КД).
Изучая фотопериодическую регуляцию цветения у растений, физиолог расте-
ний М. X. Чайлахян в 1936 г. сформулировал концепцию о существовании фло-
ригена — гипотетическою гормона цветения В опытах с дурнушником (Xanthium
strumarium), растением короткого дня, М. X. Чайлахян показал, что для индукции
цветения достаточно поместить л условия короткого светового дня лишь один лист
растения На основании полученных результатов М. X. Чайлахян предположил, что
при изменении длины светового дня в листьях образуется некое физиологически
активное вещество, названное им флоригеном, которое транспортируется по флоэ
ме в меристему побега, где и запускает преобразование вегетативной меристемы
в меристему цветка. С использованием прививок было показано, что флориген не
имеет видовой специфики и способен индуцировать цветение у растений разных
видов. Однако механизм образования флоригена и его химическая природа долгое
время оставались загадкой. Неоднократные попытки выявить во флоэме химиче-
ское вещество, стимулирующее цветение, не были успешными. Предполагалось
также, что флориген может представлять собой не какое-то конкретное вещество,
а совокупность гормонов растений, включающую гиббереллины и гипотетические
антезины (от греч. anthesis — цветение). Загадку о природе флоригена удалось раз-
решить генетикам спустя семьдесят лет.

Фоторецепторы

У растений восприятие света осуществляется фоторецепторами,
среди которых выделяют две основные группы: фитохромы, погло-
щающие красный и дальний красный свет, и криптохромы — ре-
цепторы синего света.

Фоторецепторы оказывают влияние:

1)	на функционирование циркадных часов — они поставляют «вход-
ную» информацию, необходимую для правильного поддержания
ритмов; это возможно благодаря тому, что фитохромы могут свя-
зываться с транскрипционными факторами (ТФ) и регулировать
уровень транскрипции генов, являющихся основными компонен-
тами циркадного осциллятора;

2)	па уровень транскрипции ключевою гена фотопериодической
индукции цветения CONSTANS (СО), который функционирует
«на выходе» из циркадного осциллятора (действие фитохромов
на транскрипцию СО также опосредовано взаимодействием
с другими белками); отмстим, что фитохромы управляют транс-
крипцией СО как через воздействие на циркадный осциллятор,
так и минуя его;

3)	на стабильность самого белка СО.

Молекулярные компоненты циркадных часто у растений

«Биологические часы» у живых организмов называют циркад-
ными ритмами. Эти ритмы относятся к циклическим процессам,
происходящим в организме. У растений примерами таких суточных
изменений является открытие-закрытие устьиц, «движения» ли-
стьев - поднимание и опускание листьев в зависимости от времени
суток. Ритмичность характерна и для метаболических процессов,
таких как фотосинтез и дыхание. Такие процессы можно назвать
осциллирующими, т. е. характеризующимися суточным изменением
активности. Ритмы (периоды) таких процессов в целом совпадают
С ритмами внещней среды, главным образом со сменой дня и ночи. Но
лри этом циркадные ритмы не являются прямым ответом организма
па присутствие или отсутствие света: им свойственна автономность,
поскольку циркадные ритмы сохраняются и при отсутствии изме-
нений в действии факторов внешней среды. «Ритмичность» прояв-
ляется на различных уровнях: она проявляется как в изменениях на
уровне целого организма, в активности метаболических процессов
и соответствующей активности белков, гак и в экспрессии генов. Со-
гласно концепции «молекулярных биологических часов» именно из-
менения в уровне экспрессии генов-регуляторов лежат в основе всех
суточных изменений, происходящих в организме.

Дополнительная информация

Фитохромы существуют в двух взаимоиревращающихся формах. Одна погло-
щает красный свет (650-680 нм), другая — дальний красный (710-740 нм). По-
глотив свет, фитохром переходит из одной фермы в другую. Фитохромы для де-
текции света используют ковалентно связываемые тетрапирольныс хромофоры.
У A. thaliana исследовано 5 генов фитохромов — PHYA, PHYB, PHYC, PHYD, PHYE.
Основная роль в восприятии фотопериода принадлежит генам PHYA и PHYB, при
чем продукт PHYA функционирует главным образом при красном и синем свете низ-
кой интенсивности, а фитохром PHYB работает при интенсивном красном свете.
Криптохромы для поглощения синего света (450 -495 нм) используют сцепленные
флавиновые и птериновые хромофоры и кодируются несколькими генами — CRY1,
CR Y2 и CR Y3, а также генами ZE1TL UPE (ZTL) и FLA VIN-BINDING KELCH REPEA Т
FBOX1 (FKF'I). кодирующими дополнительные рецепторы синего света. Гены, ко-
дирующие разные фоторецепторы, могут взаимодействовать — модулировать экс-
прессию друг друга, вовлекая в эти взаимодействия транскрипционные регуляторы.
Сами фоторецепторы также взаимодействуют друг с другом, например, PHYA —
CRY1 и PHYB —CRY2.

У арабидопсис выявлены три основных компонента циркадных
часов: гены LATE ELONGATED HYPOCOTYL (LIIY), CIRCADIAN
CLOCK ASSOCIATED (CCA I) и TIMING OF CARI (TOC1). Про-
дуктами этих генов являются регуляторные белки. Экспрессия ге-
нов LHY и ССА1 осциллирует в соответствии с циркадными рит-
мами. Основным сигналом, синхронизирующим циркадные часы
Рис. 12 2. Принцип функционирования циркадных s асов

Свет, воспринимаемый системой фоторецепторов, синхронизирует циркадные часы
с сезонными изменениями е длине дня. Возникающие в результате функционирования
часов циркадные ритмы контролирую: экспрессию многих генов, е том числе и гена СО,
который контролирует образование флоригена — продукта гена F1 (см. ниже)

с сезонными изменениями в длине дня, служит свет. Установлено,
что активированный красным светом PHYB перемещается из ци-
топлазмы в ядро клеток, где связывается с ТФ PHYTOCHROME
INTERACTING FACTOR 3 (PIF3) семейства HLH. Этот комплекс
может регулировать транскрипцию генов CCA 1 и LHY, являющих-
ся основными компонентами циркадного осциллятора у A. thaliana
(рис. 12.2), связываясь с цис-элементами (G-box) в их промоторной
облает и. Другим важнейшим активатором транскрипции этих генов
в начале светового дня (утром) является ген ТОС1.

Гены LHY и ССА1 кодируют ТФ MYB-семейства, которые пода-
вляют экспрессию гена ТОС1. Снижение активности ТОС1, в свою
очередь, приводит к снижению уровня экспрессии генов LHYи ССА1,
поскольку ТОС1 является положительным регулятором экспрессии
этих двух генов. Минимум экспрессии генов LHY и ССА1 наблю-
дается в конце светового дня. Поскольку LHY и ССА1 являются не-
гативными регуляторами ТОС1, снижение активности LHY и ССА1
соответствующим образом приводит к увеличению экспрессии гена
ТОС1, максимум экспрессии которою совпадает с минимумом экс-
прессии LHY и ССЛ1. Таким образом, данная система, основанная на
регуляции транскрипции по механизму отрицательной обратной свя-
зи, представляет собой молекулярный механизм циркадных часов.

Циркадными ритмами контролируется работа многих генов, в'том
числе генов фотопериодической индукции цветения, основным из
которых является ген СО.
Ген CONSTANS (СО) — ключевой ген фотопериодической индукции
цветения

Ген СО, как и другие компоненты системы фотопериодической
регуляции цветения, был выявлен при анализе мутантов арабидоп-
сис. В норме у арабидопсис увеличение длины светового дня стиму-
пирует цветение, тогда как при коротком дне цветение подавляется.
Мутант по гену СО характеризуется поздним цветением только при
длинном дне. Трансгенные растения арабидопсис со сверхэкспрес-
сией СО переходят к цветению рано как при коротком, так и при
длинном дне. СО кодирует предполагаемый ТФ с доменами «цин-
ковые пальцы» Ген СО экспрессируется в проводящих тканях в ли-
стьях, что было показано с помощью анализа активности промотора
। ена СО, соединенного с репортерным геном p-глюкуропидазы GUS
(CO::GUS). Уровень мРНК изменяется в течение суток и регулирует
ся компонентами циркадных часов: в начале дня уровень экспрессии
минимален, ко второй половине дня экспрессия гена СО постепенно
увеличивается и достигает максимума к вечеру.

Причиной повышения мРНК в конце длинного дня является регу-
лируемая циркадными часами и светом деградация транскрипционно-
го репрессора гена СО — белка CDF1. Последовательность событий
:акова (рис. 12.3): циркадные ритмы контролируют транскрипцию
генов FKF-1 (кодирует белок с LOV-доменом и F-боксом, является ре-
цептором синего света и участвует в запуске программы деградации
белков) и GIGANTEA (GI, кодирует ядерный белок). Их продукты лод
влиянием синего света, который абсорбируется LOV-доменом бел-
ка FK.FI, образуют белковый комплекс. Этот комплекс связывается
с транскрипционным репрессором CDF1 и вызывает его деградацию,
что приводит к активации транскрипции СО к концу длинного дня.

Светом регулируется и стабильность самого белка СО (в темно-
те он нестабилен) Свет активирует рецепторы синего света крип-
тохромы CRY1 и CRY2, которые в активированном состоянии взаи-
модействуют с белком СОР1 и инактивируют его (рис. 12.3). Белок
СОР1 — компонент ЕЗ убикивитин-лигазного комплекса, контроли-
рующий опосредованные действием света реакции, в том числе пе-
реход к цветению. В отсутст вие света СОР1 напрямую связывается
с белком СО и опосредует реакцию его убиквитинирования, что на-
правляет белок СО на путь протеолитической деградации в протеа-
сомах. Таким образом, в отсутствие свега СОР1 связывается с СО,
такое взаимодействие приводит к деградации СО. На свету проис-
ходит активация криптохромов, С-конпевой домен которых связы-
вается с белком СОР1, блокируя его действие. В результате инакти-
фоторецепторы

—> мРНК FKF1 и GI

СИНИЙ СВЕТ

> стабилизация
комплекса

криптохромы

% CRY1, CRY2

Рис. 12.3. Основные механизмы регуляции экспрессии гена CONSTANS у Arabidopsis
thaliana

Свет и контролируемые им циркадные часы осуществляют регуляцию транскрипции
и стабильности белкового продукта гена СО. Рецепторы синего света подчеркнуты
волнистой чертой

вации СОР1 белок СО более не подвергается деградации и способен
осуществлять свою функцию активации транскрипции гена-мишени
FT, который инициирует цветение.

Дополнительная информация

N-концеьой домен белков криптохромов имеет сходство с белками фотолиазами
(PHR, photolyase related domain), флавопротеинами, катализирующими репарацию
вызванных действием УФ повреждений ДНК с использованием энергии солнечною
света С-концевой домен криптохромов нс обнаруживает сходства ни с фотолиаза-
ми, ни с другими известными белками, этот домен необходим для взаимодействия
с белками регуляторами, опосредующими фотоморфогенет ические реакции у расте-
ний, в тем числе белком СОР1. Существуют различные методические подходы для
исследования белок-белковых взаимодействий: двугибридная дрожжевая система,
анализ связывания in vitro, колокализация белков in vivo, FREI' (fluorescence resonance
energy transfer) — резонансный перенос энергии флуоресценции. Все эти подходы
были использованы для доказательства взаимодействия белков СОР1 и СО.

Эти данные не только вскрыли молекулярные механизмы, осущест-
вляющие связь между циркадными ритмами и действием света, но
и полностью подтвердили так называемую модель «совпадения» (coin-
cidence model), которая была создана физиологами для объяснения яв-
ления фотопериодизма еще в первой половине прошлого века. Согласно
Гейл
ре гулиру емые
циркацы."мл
часами

актиьгциксьеюм

Гены
регулирующие
цветение

Рис. 12.4. Схематическое представление модели совпадение

На верхней панели показаны кривые, отражающие суточные ритмы изменения актив-
ности генов (их белковых продуктов), которые рр|улируются циркадными ритмами;

на нижней — активность ibhcb (мРНК и бет ка). которые являются мишенями верхних
и регулируют время зацветания

этой модели регуляторный белок, ретулируемый циркадными ритмами,
является фоточувствитсльным. Характер осцилляции концентрации та-
кого регуляторною белка является таковым, что максимальная концен-
трация белка при коротком дне наблюдается в темное время суток. Как
результат, в отсутствие действия света такой белок не активируется и не
запускает pa6oiy генов, ответственных за цветение (рис. 12.4). Однако
при увеличении длины световою дня происходит совпадение двух фак-
торов: максимальной концентрации белка-регулятора и действия света.
В результате действия света белок-регулятор активируется и запускает
работу генов, регулирующих цветение.

Сегодня можно утверждать, что главную роль в реализации этой
модели играет ген СО, экспрессия которого регулируется на транс-
крипционном и посггрансляционном уровне циркадными ритмами
и светом соответственно, и его мишень — ген FT, регулирующий
зацветание в ответ на фотопериодический сигнал.

Мишень гена СО - ген FLOWERING LOCUS Т (FT),
кодирующий флориген

Для поиска мишеней гена СО, кодирующего ТФ, проводили срав-
нительное изучение экспрессии генов в ответ на изменение длины
светового дня у мутантов со и растений дикого типа. Оказалось, что
при увеличении длины светового дня у растений дикого типа проис-
ходит увеличение экспрессии гена FT, тогда как у мутантов со экс-
прессия этого гена не возрастала. Следовательно, ген СО необходим
для активации экспрессии гена FT.

Фенотипическое проявление мутации в гене FT схоже с мутацией
в гене СО', для мутантов ft характерно позднее цветений при длин-
ном дне. Ген FT кодирует белок размером 20 кДа, который обладает
сходством с Raf-киназным ингибитором или белком, связывающим
фосфазпдплэтаноламин. Ген СО активирует транскрипцию гена FT
локально, в той же области, где экспрессируется сам ген СО, а имен-
но во фпоэме листьев. Таким образом, область экспрессии этих двух
ключевых регуляторов цветения совпадает с местом образования
гипотетического флоригена. Закономерный вопрос, встающий перед
исследователями, заключается в том, каким же образом осущест-
вляется передача сигнала, побуждающего растение к цветению, из
листа в меристему побега? Эктопическая экспрессия гена СО под
контролем промотора, специфичного для меристемы побега, не при-
водила к активации экспрессии FT в апексе побега и не вызывала
перехода к цветению. В противоположность этому эктопическая экс-
прессия FT в меристеме побега оказалась способной индуцировать
цветение! Полученные данные пролили свет на природу флоригена,
позволив предположить, что им является продукт гена FT, кот орый
транспортируется из листа в апекс побега.

Для проверки того, способна ли индукция экспрессии FT без
изменения длины светового дня вызвать цветение, использовали
трансгенные растения A. thaliana, содержащие ген FT под контро-
лем промотора, индуцируемого тепловым шоком (Hsp::FT). Воздей-
ствуя тепловым шоком (нагревание до 37 С°), исследователи могли
локально индуцировать экспрессию FT в отдельном листе трансген-
ного растения. Оказалось, что индукция экспрессии FT в отдельном
листе стимулировала у растений переход к цветению Эксперимен-
ты с использованием гибридизации in situ и иммуногистологиче-
ского подхода показали, что в апекс побега передвигается белок FT
(Jaeger and Wigge, 2007). Таким образом, белок FT и оказался тем
самым флоригеном — передвигающейся из листьев в апекс молеку-
лой, индуцирующей цветение, су шествование которой предположил
М. X. Чайлахян еще в 1936 году!

В целом начальные этапы зависимого от длины светового дня
пути регуляции цветения A. thaliana выглядя! следующим образом.
В результате удлинения длины светового дня происходит стабилиза-
ция белка СО. Белок СО, накапливающийся в листьях, локально ак-
тивирует экспрессию гена FT. Белок FT перемещается из листьев по
флоэме в апекс побега, где запускает каскад событий, приводящих
к цветению Каковы же последующие события этого пути?

Мишени гена FT

Эктопическая экспрессия FT под контролем промотора 35S
[35S::FT) вызывает преждевременное цветение. Для выявления ми-
шеней действия FT выясняли, мутации в каких других известных
генах, приводящих к позднему цветению, способны подавлять эф-
фект свсрхэкспрессии гена FT. Оказалось, что такими свойствами
обладает мутация в гене FD (FLOWERING LOCUS D): при сверх-
жспрессии FT у мутантов по гену FD (35S::FT fd-1) не наблюда-
лось преждевременного цветения. Ген FD экспрессируется преиму-
щественно в апексе побега, и уровень его экспрессии не зависит от
времени суток (хотя зависит от холодового воздействия, см. ниже).
Анализ локализации гибридного белка FD-GFP показал, что белок
локализуется в ядре, что согласуется с предполагаемой функцией
FD: ген FD кодирует ТФ с доменом лейциновая молния (bZIP). В не-
индуктивных условиях (на коротком дне, когда ген FT не экспресси-
руется) белок FD связывается белком TFL1 (см. следующую главу),
который блокирует транскрипционную активност ь FD. В индуктив-
ных условиях поступающий в апекс белок FT вытесняет очень по-
хожий на него белок TFL1 и сам непосредственно взаимодействует
с FD. Таким образом, согласно современным представлениям белок
FT, перемещаясь из листа в апекс побега, взаимодействует с транс-
крипционным регулятором FD, и гетеродимер FT/FD активирует экс-
прессию генов, ответственных за развитие меристемы цвет ка (генов
идентичности цветковых меристем, см. следующую главу).

Одной из основных мишеней гетеродимера FT/FD является ген
SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CO I (SOC1). Как можно
догадаться по названию гена («супрессор сверхэкспрессии СО»),
мутация sod была выявлена как мутация, подавляющая эффект
сверхэкспрессии гена СО. На основании этого предположили, что
SOC1 участвует в фотопериодической регуляции цветения, опосре-
дованной СО, и может являться мишенью СО. Изменение уровня
экспрессии гена SOC1 у мутантов ft и у трансгенных растений со
сверхэкспрессией FT свидетельствует о том, что FT является поло-
жительным регулятором SOC1. Помимо SOCI ген FT активирует
транскрипции генов API и FUL, которые, как и SOC1, принадлежат
к семейству регуляторных генов MADS-семейства и вместе с SOC1
активируют транскрипцию гена LFY. Гены LFY и API контролируют
следующий за индукцией цветения этап детерминации флоральной
меристемы, и их функция будет рассмотрена в следующей главе.

Эволюционная ионсервативнссть взаимодействующих генов CO-FT

Консервативность функции флоригена была продемонстрирована
еще в прошлом веке задолго до открытия его молекулярной приро-
ды. Доказательства универсальности флоригена были основаны на
экспериментах с использованием прививок между длиннодневными
(ДД) и короткодневными (КД) растениями разных видов. Было про-
демонстрировано, что индуцированные к цветению подвои КД рас-
тений могли вызывать цветение у неиндуцированных ДД привоев
(например, прививки между КД растением КаФтсЬоё blossfeidiana
в качестве донора флоригена и ДД растением реципиентом Sedum
spectabile), и наоборот.

Сегодня, когда идентифицированы кодирующий флориген ген FT
и его индуктор СО и их ортологи выделены у разных видов растений,
доказательством универсальности служат эксперименты с трансген-
ными растениями. Так, например, установлено, что ортолог СО из
КД растения ипомеи Pharbitis nil может компенсировать неспособ-
ность к цветению на КД мутанта со A. thaliana. Точно так же ортолог
этого же гена ДД растений пшеницы (его назвали геном Hdl) может
компенсировать мутацию в гене Hdl у КД растений риса. Суперэк-
спрессия ортолога FT из нейтрального к длине дня растений томат а
Solanum lycopersicum (ген назвали SFT) в КД растениях табака сорта
Maryland Mammoth вызывала его зацветание на ДД. Трансгенные
растения A. thaliana с эктопической экспрессией гена томата. SFT за-
цветали на КД. Точно так же прививки в качестве донора частей рас-
тений томата с суперэкспрессией гена SFT вызвали цветение у реци-
пиентов — КД растений табака Maryland Mammoth на ДД.

Ортолог FT выделен и у древесных растений тополя (Populus
spp). Было показано, что у многолетних растений уровень экспрес-
сии этого гена постепенно увеличивается с возрастом, и зацветание
становится возможным при достижении некою критического уровня
экспрессии этого гена. Суперэкспрессия собственного гена FT при-
водила к раннему зацветанию растений тополя, что говорит о том,
что универсальность флоригена не ограничивается видами травяни-
стых растений.

В геноме риса найдены все упомянутые выше компоненты фото-
периодической индукции цветения. Интересно, что гены выявляли
не по гомологии, а путем анализа мутантов с изменением времени
А

длинный

Рис 12 5. Основные гены, контролирующие фотопериодическую индукцию цветения
у длиннадневного растения Arabidopsis thaliana (А) и короткодневного растения Oryza
sativa (Б) (модифицировано по Greenup et al., 2009)

Гены-ортолеги выделены одинаковыми фигурами (прямоугольником и овалом)

зацветания. Ортолог СО — Heading date 1 (Hdl) регулируется ри-
совым ортологом GI — OsGl, транскрипция которого подчиняется
циркадным ритмам. Ген Heading date За (Hd3a) оказался ортологом
FT A. thaliana. Как и FT, он экспрессируется в листьях, а его про 
дукт поступает в апекс и инициирует цветение. На КД ген Hdl уско-
ряет цветение, активируя транскрипцию Hd3a, но на ДД этого не
происходит. Это объясняется тем, что у риса есть дополнительный
регулятор транскрипции Hd3a — регуляторный ген Ghd7, который
в условиях ДД подавляв) транскрипцию продуцирующего флориген
гена Hd3a (рис. 12.5). Поэтому ген Hd3a экспрессируется не на ДД,
как FT, а на КД. При делеции репрессора Ghd7 ген Hd3a экспресси-
руется и на ДД. Кроме того, у риса выявлен еще один активатор гена
Hd3a на КД — ген Early heading date I (Ehdl), действующий неза-
висимо от Hdl.

Таким образом, в процессе эволюции сохранялась консерватив-
ность функции главных генов фотопериодической индукции цве-
тения (прежде всего, взаимодействующих ортологов СО — FT), но
изменялась их регуляция за счет появления новых регуляторных
компонентов — активаторов и репрессоров.

12.2.	Индукция цветения холодом

Растения способны оценивать не только фотопериод, но и сезон,
наиболее благоприятный для цветения. В условиях чередования
благоприятных (теплых) и неблагоприятных (холодных) сезонов для
оставления полноценного потомства важно начать цветение не в кон-
це теплого сезона, а в его начале. О начале теплого сезона сигнали-
зируют предшествующие ему холода. Поэтому в процессе эволюции
у многих видов растений выработались специальные генетические
механизмы, обеспечивающие потребность к продолжительному воз-
действию низких температур (как правило, 1-7 °C в течение 1-3 ме-
сяцев) для индукции цветения. Этот процесс называют яровизацией
(вернализацией).

Дополнительная информация

Воздействие низких температур для индукции цветения может требоваться на
различных этапах жизненного цикла. Так, многие озимые формы однолетних рас-
тений реагируют на воздействие низких температур еще до прорастания семян, дру-
гие виды растений становятся восприимчивыми к яровизации на поздних этапах
вегетативного развития. Некоторые виды не переходят к цветению без яровизации,
у других видов воздействие низких температур ускоряет переход к цветению, но
нс является обязательным для его индукции. Важно отмстить, что при яровизации
действие оказывают низкие температуры (1-7 °C), при которых растения способны
сохранять метаболическую активность, тогда как отрицательные температуры, при
которых метаболическая активность в растениях подавляется, не приводят к яэо-
визации.

Воздействие холодом, по данным физиологов, делает апикальную
меристему компетентной к восприятию фотопериодического сигна-
ла. При яровизации происходят эпигенетические изменения в мери-
стематических тканях растений, приводящие к изменению экспрес-
сии генов, отвечающих за индукцию цветения. Прежде чем перейти
к рассмотрению молекулярных механизмов яровизации у растений,
вспомним, какие процессы могут лежать в основе эпигенетических
изменений у эукариот.

Молекулярные механизмы эпигенетических изменений

К эпигенетическим изменениям относят изменение активности
(подавление экспрессии) гена, не связанное с изменением его ну-
клеотидной последовательности, которое может сохраняться в те-
чение ряда клеточных поколений. Основными эпигенетическими
механизмами являются метилирование ДНК и изменение структу-
ры хроматина. Для растений характерно метилирование цитозина
в контексте CpG, CpNpG и CpNpN (N — отличный от гуанина ну-
клеотид). Метилирование ДНК осуществляется ферментами ДНК-
метилтрансферазами. У эукариот известно два типа метилирования.
К первому типу относят метилирование de novo, происходящее, как
правило, во время эмбриогенеза и обуславливающее клеточную
чифференцировку. Второй тип представляет собой поддерживаю-
щее метилирование, обеспечивающее сохранение уже имеющегося
паттерна метилирования ДНК после репликации. Благодаря этому
метилированное состояние может наследоваться в ряду клеточных
поколений. Метилирование ДНК является одним из вариантов за-
молкания (сайленсинга) гена и может быть опосредовано действием
малых двухцепочечных РНК (это особенно важно при метилирова-
нии de novo). Такие РНК (малые интерферирующие РНК — siRNA
пли микроРНК — miRNA) в комплексе с другими белками опосре-
1уют посадку ДНК-метилтрансфераз на участки ДНК, нуклеотидная
последовательность которых комплементарна последовательности
самих малых РНК. таким образом определяя специфичность мети-
лирования. Метилирование ДНК играет важную роль в регуляции
активности генов. Метилирование ДНК тесно связано со структу-
рой хроматина и активностью соответствующих генов и опосредует
большую степень «гстсрохроматизации» хроматина, модификацию
гистонов. В частности, метилирование ДНК в промоторном участке
гена и сопутствующие изменения структуры хроматина могут созда-
вать препятствия для посадки ТФ и, как следствие, снижают актив-
ность соответствующего гена. Кроме того, у эукариот существует
особый класс регуляторных белков с метил-связывающим доменом
(methyl domain binding proteins, MDBP). Чаще всего связывание
с метилированным цитозином этого белка и является основной при-
чиной нарушения связывания ТФ с регуляторными участками ДНК
и подавления транскрипции генов.

Изменение структуры хроматина, обуславливающее подавле-
ние транскрипции генов, может также происходить вследствие из-
менения уровня метилирования и ацетилирования гистонов. Как
правило, ацетилированное состояние гистонов облегчает доступ
регуляторных белков к ДНК, и оно характерно для транскрипцион-
но активных участков хроматина, тогда как деацетилированное со-
стояние гистонов ассоциировано с тракскрипционно неактивным
хроматином. Процессы ацегилирования/деацетилирования гистонов
осуществляю! временную активацию/лодавление экспрессии генов,
модифицируя гистоны на локальных участках хроматина, обычно
соответствующих премоторным районам гена. Более длительное за-
молкание генов, наследуемое при митотических и даже мейотиче-
ских делениях клеток, связано с процессом метилирования гистонов
по определенным остаткам лизина, что обуславливает гетерохрома-
тизацию, то есть подавление транскрипционной активности иротя-
женных участков хроматина. Кроме того, у эукариот существует осо-
бая группа белков, способных изменять (ремоделировать) структуру
хроматина. Эти белки относятся к группе Poiycomb (Po!ycomb-group
proteins, PcG). Белки Poiycomb были впервые идентифицированы
у дрозофилы как регуляторы активности гомеозисных генов, играю-
щих ключевую роль в развитии дрозофилы. Polycomb-белки входят
в состав ДНК-белкового комплекса (но сами Poiycomb-белки напря-
мую не связываются с ДНК) и опосредуют метилирование и деаце-
тилирование гистонов, что приводит к компакт изации хроматина.
В результате таких изменений ДНК становится недоступной для
посадки регуляторных белков, активаторов транскрипции, и проис-
ходит подавление транскрипционной активности хроматина.

Эпигенетические механизмы, вовлеченные в процесс яровизации

Ключевым геном, контролирующим индуцированную холодом
инициацию цветения, является ген FLOWER LOCUS С (FLC), ко-
торый экспрессируется в основном в апикальных участках побега
и корня. Именно этот ген определяет потребность растений A. thali-
ana к яровизации.

Продукт гена FLC, ТФ семейства MADS, представляет собой
основной репрессор цветения. У растений A. thaliana со сверхэк-
спрессией FLC наблюдае~ся снижение содержания мРНК SOC1, FT
и FD, поскольку ТФ FLC подавляет экспрессию этих генов (рис. 12.6),
связываясь с регуляторными последовательностями этих генов (с
регуляторным цис-элементом CArG-боксом). Подавление транс-
крипции гена FT наблюдается главным образом в листе, где этот ген
транскрибируется в ответ на индуктивный фотопериод, а подавление
транскрипции SOC1 и FD наблюдается в апексе побега. В ответ на
яровизацию наблюдается снижение мРНК и белка FLC, что приво-
дит к образованию флоригена FT, который по флоэме перемешается
в апекс побега. Там благодаря «выключению» FLC начинают более
акгивно экспрессирова! вся мишени FT — гены SOCI и FD, что обе-
спечивает компетентность апикальной меристемы к действию по-
ступающего в нее белка FT, который запускает процесс цветения.

Подавление экспрессии FLC при яровизации обусловлено эпи-
генетической регуляцией: в результате действия низких температур
происходит ремоделирование хроматина в области гена FLC, при
этом такое измененное состояние хроматина сохраняется в ряду кле-
точных поколений.

Основную роль в эпигенетическом замолкании гена FLC игра-
ет ген VERNALIZATION INSENSITIVE 3 (VIN3), кодирующий белок
ХОЛОД

цветение

Рис. 12.6 Эпигенетическая регуляция
экспрессии гена FlC тремя группами
генов

Гены, индуцирующие зацветание в ответ
на действие холода (вверху), и гены
автономного пути инициации цветения
(справа) приводят к компактизации хро-
матина г згмелканию гена FLC. Ген FRI
вовлечен в поддержание активирование
го состояния хроматина гена FLC

с гомеодоменом. У мутантов vin3
при яровизации не происходит
наблюдающегося у растений ди-
кого типа деацетилирования и ме-
тилирования гистонов, и ген FJ.C
остается функционально актив-
ным. Экспрессия гена VTN3 инду-
цируется длительным холодовым
воздействием и вызывает деаце-
тилирование гистонов, связан-
ных с ДНК гена FI.C. Однако экс-
прессия VIN3 является временной
(транзитной) и прекращается при
переносе растений в теплое поме-
щение. Для стабильного замолка-
ния FLC необходима функция ге-
нов VERNALIZATION 1, 2 (VRN1
и VRN2), кодирующих соответ-
ственно Myb-подобный ДНК-
связывающий белок и белок груп-
пы PolyComb (PcG), обладающий
гистон-метилтрансферазиой ак-
тивностью. После метилирования
гистонов ген FLC сохраняет эпи-
генетическое «молчание» и после
наступления теплого сезона, по-
зволяя растениям зацветать.

Дополнительная информация

Обнаружение гена FLC стало возможным благодаря тому, что у арабидопсис
есть как расы с коротким жизненным циклом, которые не требуют яровизации для
цветения (яровые), так и расы, требующие яровизации (растения ведут себя как ози-
мые и зацветают на второй год). Различия между этими расами связаны с разным
аллельным состоянием гена FLC: доминантные функционально активные аллели
обуславливают потребность в яровизации, а рецессивные нефункциональные алле-
ли или аллели с пониженной функцией обуславливают раннее цветение в условиях
отсутствия яровизации.

Анализ хроматина в области локуса FLC методом иммунопреципитации с ис-
пользованием ряда антител, специфичных к метилированным по определенным по-
ложениям гистонам, показал, что в подвер. нутых яровизации тканях, в частности,
повышено содержание триметипироваиного по Lys9 гистона НЗ. Как известно, дзя
животных гриметилированный гистон НЗ по Lys9 также является маркером гете-
рохроматииа. Кроме того, при яровизации происходит деацетилирование гистона
НЗ в области локуса FLC.

При переходе к неблагоприятному для цветения периоду белок FRI привлека-
ет комплекс белков, осуществляющих метилирование Lys4 гистона НЗ (НЗК4тсЗ)
в области локуса FLC, что приводит к активации транскрипции FLC.

Ген FLC является мишенью не только генов* контролируемых
холодом, но и генов, которые функционируют в других системах
инициации цветения (рис. 12.6). Так, гены FLD, FVE из автономного
пути инициации цветения (см. далее), работ ающие в комплексе с ги-
стоновыми деацетилазами, также заставляют замолчать ген FLC.

Кроме генов, подавляющих транскрипцию FLC. в геноме A. thali-
ana найдены и его активаторы, среди которых основным является
ген FRIGIDA (FRI).

Таким образом, исследования генетического контроля потреб-
ности к яровизации вскрыли молекулярные механизмы взаимодей-
ствия фотопериодического и холодового путей индукции цветения,
которое было установлено физиологами еще в первой половине про-
шлого века. Экспрессия гена FLC в растениях, не подвергнувшихся
яровизации, делает апекс растения нечувствительным к действию
фотопериодического сигнала, где белок FLC подавляет экспрессию
генов FD и SOC). Переход к цветению происходит тогда, когда яро-
визация и гены автономного пути снижают уровень экспрессии FLC,
а накопление продукта транскрипции СО активирует экспрессию
FT, продукт которого по флоэме поступает в компетентный апекс,
где связывается с белком FD и активирует транскрипцию гена SOC1
и других генов, запуская механизм перехода к цветению.

Эволюция признака озимости/яровости

Знание основных генов, контролирующих индукцию цветения
холодом, позволило исследовать генетические основы природного
полиморфизма по потребности к яровизации у разных рас A. thali-
ana. Оказалось, что яровость, т. е. способность зацветать без холо-
дового воздействия (отсутствие потребности к яровизации), которая
свойственна расам, произрастающим в теплых регионах, связана
либо с мутациями его активатора — гена FRI, либо с мутационными
изменениями гена FLC. Анализ полиморфизма этих генов у почти
200 рас A. thaliana позволил сделать вывод о том, что яровые формы
возникали из озимых в процессе эволюции неоднократно в результа-
те отбора разных мутаций в локусах FR1 и FLC. Потребность к яро-
визации, наличие озимых и яровых форм характерно и для других
ДПич шй день	яроеиз^я

цветение

Рис. 12.7. Взаимодействие генов инлткиии цветения холодам и фотоперисдем у длин-
нодневных двудольных (A, Arabidopsis thaliana) к однодольных (Б, пшеница и ячмень)
растений (модифицировано пс ftlexandre and Hennig, >008; Cieenup et al., 2009)
Гены ертологи выделены одинаковыми фигурами (прямоугольником и овалом)

видов растений. Получены данные, что у других видов двудольных
(репы Brassica гара и свеклы Beta vulgaris ssp. vulgaris) в контроле
потребности к яровизации участвуют орт ологи гена FLC. В то же
время у однодольных растений, пшеницы и ячменя потребность
к яровизации связана с работой других генетических систем. У пше-
ницы и ячменя функцию FLC выполняет ген VRN2 (рис. 12.7), кото-
рый относится к другому семейству транскрипционных регуляторов
(белок содержит не MADS-домен, как FLC, а ССТ-домен).

Несмотря на различия молекулярной структуры, ген VRN2, как
и FLC, блокирует образование флоригена. Он подавляет транс-
крипцию гена VRN3, ортологичного гену FT (рис. 12.7). Кроме того,
VRN2 подавляет транскрипцию гена VRNI, который, как и ген SOC1,
содержит MADS-бокс, хотя по структуре больше напоминает ген
APETALA1 A. thaliana. Экспрессия гена VRN2 (в отличие от FLC)
подавляется также условиями короткого дня. Таким образом, при-
обретение потребности к яровизации у однодольных и двудольных
растений основано на использовании иегомологичных генов. Эти ге-
нетические данные свидетельствуют о важной роли конвергентной
эволюции в регуляции времени зацветания.

12.3.	Автономный путь индукции цветения

К автономному пути (АП) относят гены FCA, FY, FLD, FPA, FEE,
FLK, LD, мутации в которых вызывают существенную задержку
цветения как в условиях ДД, так и в условиях КД (независимо от
фотопериода — отсюда и название пути) Гены автономного пути
в растениях A. thaliana дикого типа ускоряют зацветание, подавляя
экспрессию гена FLC, играющего главную роль в холодовой индук-
ции цветения (рис. 12.6). Мутации, нарушающие функцию любого из
генов автономного пути, приводят к усилению экспрессии их мише-
ни FLC и задержке цветения. Показано, что белки FCA, FPA и FLK
содержат РНК-связывающие домены, что говорит об их возможном
участии в посттранскрипционной регуляции экспрессии FLC. Белок
FY контролирует процессинг РНК, а белки FVE, FLD — состояние
хроматина гена FLC, вступая в комплекс с гистон-деацетилазами.

Дополнительная информация

Анализ природного полиморфизма гена FLC показал, что з результате точковых
мутаций, а также инсерций разных по протяженности фрагментов ДНК (инсерции
обнаружены в основном в 1-м интроне 1ена FLC) возникали либо нефункциональ-
ные нуль-аллели, либо слабо экспрессирующиеся аллели, транскрипция которых
лишь незначительно увеличивалась под воздействием активатора FRI. У рас с са-
мым коротким жизненным циклом выявлены нарушения функции сразу обоих ге-
нов FR1 и FLC.

12.4.	Гормональная индукция цветения

Важнейшим индуктором цветения у A. thaliana является гиббе
реллин (ГА) В условиях КД, когда не активен длиннодневный путь
индукции цветения, ГА-зависимый путь у A. thaliana становится
основным Мутация gal-З, блокирующая синтез ГА, предотвращает
зацветание растений. В условиях КД мутанты остаются на вегета-
тивной стадии развития даже в возрасте 6 месяцев. При экзогенной
обработке активным гиббереллином мутанты в условиях КД могут
зацветать уже на 26-й день. В условиях ДД мутации, нарушающие
передачу ГА-сигнала, лишь задерживают цветение, поскольку акти-
вен длиннодневный (фотопериодический) путь индукции цветения.

Гиббереллин индуцирует цветение, повышая уровень транскрип-
ции гена LFY, который действует на втором этапе развития цвет-
ка — этапе детерминации флоральной меристемы (рис. 12.1 и см.
следующую главу). Действие ГА опосредовано транскрипционным
регулятором М YB -семейства A1MYB33, продукт которого взаимодей-
ствует с промотором LFY, осуществляя регуляцию экспрессии LFY.

Кроме то1 о, ГА может активировать в меристеме соцветия экспрес-
сию гена SOC1 — транскрипционного активатора LFY. У A. thaliana
под действием света в листьях повышается содержание ГА. который
вместе с белком FT (флоригеном) по флоэме поступает в апекс, где
активирует уровень транскрипции генов SOC1 и LFY. По некоторым
данным, мишенью ГА может служить и ген FT.

Зацветание A. thaliana, индуцированное ГА, также связано с хо-
подовым путем индукции цветения. По данным физиологов, яро-
визация делает меристему побега компетентной к действию ГА.
I Io-видимому, это объясняется тем, что белок FLC репрессирует
транскрипцию гена SOC1, который является одной из мишеней дей-
ствия ГА. Яровизация устраняет этот эффект путем уменьшения
уровня экспрессии FLC. В условиях яровизации и ДД зависимость
от ГА-пути незначительна.

ГА стимулирует цветение у большинства длиннодневных рас-
тений, которые выращивают при КД, однако есть и исключения из
этого правила. Например, растения озимой пшеницы не ускоряют
зацветания после обработки гиббереллином. Действие ГА на корот-
кодневные растения, выращиваемые в неиндуктивных условиях ДД,
не приводит к их зацветанию. Более того, для некоторых из них (на-
пример, злаков — Peapratensis и Bromus inermts) обработка ГА бло-
кирует зацветание, индуцированное коротким днем. Таким образом,
ГА-путь индукции цветения не является универсальным. Есть дан-
ные, что в регуляции цветения у других видов растений (например,
Sinapis alba) вместо ГА могут участвовать цитокинины.

Дополнительная информация.

Уровень экспрессии репортерного гена p-глюкуронидазы под контролем ре
гуляторной и промоторной области гена LFY (LFY:GUS) существенно снижается
в мутантах, дефектных по генам биосинтеза ГА, например gal-З, и увеличивается
в мутантах с конститутивной передачей ГА-сигнала, таких как spy. В то же время
неспособность мутантов gal-З к цветению при коротком дне можно преодолеть,
вызвав эктопическую экспрессию гена LFY (35S. .LFY). Поскольку транскрипция
LFY активируется гиббсрелтинами, 35S::LFY gal-З растения формируют больше
листьев, чем 35S::LFY. Следовательно, ГА-путь играет дополнительную роль в ре-
гуляции времени зацветания.

12.5.	Онтогенетическая регуляция цветения

Возраст растения — еще один важнейший фактор инициации
цветения. Растения на ювенильной стадии развития даже в усло-
виях индуктивного фотопериода и после воздействия холода не за-
цветают. О существовании зависимого от возраста пути инициации
цветения свидетельствовали и исследования мутантов A. thaliana с
нарушением функции гена FT, а также двойных мутантов с инак-
тивированными геном FT и его паралогом TSF {TWIN SISTER OF
FT), который частично дублирует функцию первого гена. Несмотря
на существенную задержку времени зацветания у этих мутантов,
в конце концов растения все же зацветали, хотя, по описанным
выше данным, ген FT играет ключевую роль в индукции цветения.
Причины этого явления стали понятны совсем недавно. У A. thali-
ana найден способ оценки состояния онтогенеза, связанный с функ-
ционированием микроРНК miRl 56. Этот путь играет второстепен-
ную роль при нормальном функционировании гена FT, однако при
нарушении его функции, а также в неиндуктивных условиях КД,
когда FT не экспрессируется, этот путь (как и гиббереллиновый)
становится первостепенным.

Мишенями miR156 являются регуляторные гены со сложным на-
званием SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN-LIKE (SPL).
У A. thaliana таких генов несколько, и они являются важнейшими
регуляторами MADS-бокс-содержащих генов APETALA1, SOC1,
FUL, которые активируют транскрипцию гена LFY. При эктопиче-
ской экспрессии miRl56 под промотором 35S трансгенные растения
A. thaliana зацветали позже, чем растения дикого типа, и для перехо-
да к цветению им требовалось более длительное воздействие фото-
периодического сигнала (не 2, а 5 длинных дней).

В ювенильных проростках наблюдается высокое содержание
miRl56, что приводит к снижению уровня экспрессии SPL. С возрас-
том содержание tniR]56 начинает снижаться, a SPL — повышается.
Это приводит к активации экспрессии APETALA 1, SOC1, FUL и их
мишени  гена LFY. В результате растения зацветают даже при от-
сутствии экспрессии гена FT, продукт которого в растениях дикого
типа при индуктивных условиях, вступая з комплекс с белком FD,
активирует те же гены-мишени.

Кроме микроРНК существуют и другие пути оценки возраста, од-
нако их молекулярные механизмы исследованы недостаточно.

12.6.	Интеграция путей инициации цветения и переход
на последующие этапы развития цветка

Информация от разных индуктивных путей поступает на не-
многочисленные гены-интеграторы. Это гены FT, SOC1, а также
гены LFY и API, о которых речь пойдет в следующей главе. Если
суммарный сигнал достаточен для достижения этими генами опре-
деленного порогового уровня экспрессии, растение переходит на
следующий этап репродуктивного развития (этап 2, рис. 12.1) —
приступает к формированию нового типа меристемы — меристемы
цветка. У растений с закрытым типом соцветия флоральная мери-
стема (ФМ) образуется прямо из вегетативной. В процессе этого
преобразования ФМ теряет зональное строение, характерное для
вегетативной меристемы, и митотическая активность, необходимая
для формирования примордиев органов цветка (этап 3, рис. 12.1),
сосредотачивается в клетках мантии В процессе развития органов
цветка расходуется весь запас стволовых клеток, меристема утра-
чивает способность поддерживать собственную меристематиче-
скую активность, и клетки вступают на путь конечной дифферен-
цировки. Утрата меристематической активности идет от периферии
к центру - позже всего деления прекращаются в центральной ча-
сти, где развивается гинецей. У растений с открытым соцветием
апикальная меристема побега (ПАМ) сохраняет свою недетермини-
рованность на протяжении всего жизненного цикла, а ФМ образу-
ются на периферии ПАМ.

Дополнительная информация

Еще в 1918 г. немецким физиологом растений Г. Клебсом сформулирована тро-
фическая теория регуляции цветения, в соотьетстьии с кот орой соотношение угле-
рода и азота (C N) в тканях растений является ключевым фактором, регулирующим
время цветения: цветению способствует низкое содержание азота и высокое содер-
жание сахаров. Сегодня установлено, что сахароза, образующаяся в активно фото
синтезирующих листьях, поступает вместе с ГА в апекс растений A. thaliana, где
эти регуляторные молекулы вызывают усиление транскрипции генов LFY и SOC1,
действуя комплементарно. Кроме того, вместе с ГА сахароза может принимать уча-
стие в активации гена FT. Очевидно, что сахароза, содержание которой с возрастом
в растении увеличивается, может служить одним из сигналов об онтогенетическом
состоянии растения, его готовности к оставлению потомства. Ассимилированные
формы азота (глютамин и мютамат) также влияют на экспрессию многих генов,
однако, как и в случае с сахарозой, молекулярные механизмы не ясны. Показано
только, что органический азот влияет на уровень экспрессии гена ССА1 — одного
из основных генов циркадного осциллятора

Вопрос о том, каким образом регулируется время цветения у рас
тений, представляет как практический, гак и теоретический интерес,
и интересует исследователей уже очень давно. С начала двадцатого
века физиологами предлагались различные концепции, объясняю-
щие, какие факторы важны в регуляции цветения. В конце прошло-
го века благодаря созданию представительных коллекций мутантов
с изменением времени зацветания у модельного растения A. thali-
ana, изучению их чувствительности к выявленным физиологами
факторам индукции цветения (фотопериод, яровизация, гиббс-рел
лин) генетикам удалось выявить основные гены, контролирующие
разные индуктивные пути, и исследовать их взаимодействие. Сегод-
ня исследована и молекулярная функция основных генов, вскрыты
молекулярные механизмы генных взаимодействий. Более того, ге-
нетикам удалось найти тот самый неуловимый флориген, существо-
вание которого предсказано физиологами более 70 лет тому назад.
Доказательство того, что продукт гена FT является тем самым сигна-
лом к цветению, который образуется при индуктивном фотопериоде
в листьях и затем поступает в алекс, было признано одним из наи-
более значимых открытий 2005 года.

Все пути индукции цветения взаимозависимы, и ни один путь
не" является полностью автономным. Взаимодействие разных путей
позволяет растению переходить к цветению в наиболее благопри-
ятный со всех точек зрения период (собственная физиологическая
готовность, подходящие условия среды). Однако при неблагоприят-
ных условиях (климатические катаклизмы, невозможность набрать
нормальную вегетативную массу и пр.), т. с. при нарушении работы
одного пути, растение использует другие для того, чтобы оставить
хотя бы немногочисленное потомство,

Рекомендованная литература

1.	Bdurle I., Dean С. The Timing of Developmental Transitions in Plants // Cell. 2006.
Vol. 125. P. 655 -664.

2.	Corbesier L., Coupland G. Photoperiodic flowering of Arabidopsis: integrating
genetic and physiological approaches to characterization of the floral stimulus //
Plant, Cell and Environment. 2005. Vol. 28. P. 54-66.

3.	Henderson I. R., Dean C. Control of Arabidopsis flowering: the chill before the
bloom // Development. 2004 . Vol. 131. P 3829-3838.

4.	Kobayashi Y., Weigel D. Move on up, it’s time for change — mobile signals
controlling photopcriod dependent flowering // Genes DeVol. 2007 Vol. 21.
P. 2371-2384.

5.	Koornneef M., Alonso-Blanco C., Blankestijn-de Vries H., Hanhart C. J.,
Peeters A. J. M. Genetic Interactions Among Late-Flowering Mutants
of Arabidopsis // Genetics. 1998. Vol. 148. P. 885-892.

6	Mouradov A., Cremer E, Coupland G. Control of Flowering Time: Interacting
Pathways as a Basis for Diversity // The Plant Cell. 2002. S111-S130.

7.	Pineiro M., Coupland G. The Control of Flowering Time and Floral Identity in
Arabidopsis // Plant Physiology. 1998. Vol. 117. N 1. P. 1-8.

8.	Sung S., Amasino R. M. Vernalization and eplgcnetics: how plants remember
winter// Current Opinion in Plant Biology. 2004 Vol. 7. P.4-10.
Глава 13

Развитие меристемы цветка

_ После того, как апикальная меристема побега получила сигналы,
индуцирующие переход на репродуктивную стадию, в растении на-
чинает работать генетическая программа развития цветка. На первом
этапе инициируется появление нового типа меристемы — флораль-
ной меристемы (ФМ). На втором этапе наблюдается детерминация
разных типов флоральных ораганов (чашелистиков, лепестков, ты-
чинок и плодолистиков). На третьем (у растений с зигоморфным ти-
пом цветка) формируется радиальная асимметрия цветка.

Цветок, развивающийся из нового типа меристемы, имеет не-
сколько принципиальных струкгурных отличий от вегетативных по-
бегов: (1) органы цветка расположены в виде мутовок (кругов), а не
спирально; их число постоянно и видоспецифично; (2) боковые ме-
ристемы в пазухах флоральных органов не формируются; (3) мери-
стематическая активность ФМ исчезает после формирования органов
4-й мутовки. По сути, цветок представляет собой видоизмененный
побег, метаморфоз которого в цветок контролируется многими взаи-
модействующими генами. Основными генами, контролирующими
появление ФМ у A. thaliana являются гены LEAFY (LEY), UNUSUAL
FLORAL ORGANS (UFO), APETALA1 >APl) и APETALA2 (AP2). Рас-
смотрим более подробно их функцию. ]

13.1.	Ген LEAFY(LFY) - интегратор информации, инициирующей
переход растений на репродуктивную стадию развития

Ген LFYиграет ключевую роль в формировании ФМ у Л. thaliana,
являясь основным геном — интегратором информации, поступаю-
щей от разных путей инициации цветения (рис. 13.1). Во-первых,
его работа контролируется системой фотопериодической индукции
цветения — транскрипция LFYактивируется на длинном дне (ДД).
Это происходит следующим образом: образующийся на ДД белок
FT поступает в апекс из листьев и, образуя гетеродимер с белком
FD (предыдущая глава), активирует транскрипцию MADS-бокс
гена SOC1 Белок SOC1, образуя гетеродимер с белком AGL24 (так-
же содержит MADS-домен), непосредственно активирует транс-
крипцию гена LFY Есть указания на то, что ген LFY может быть
и прямой мишенью FT, однако молекулярные механизмы пока не
исследованы. Кроме того, гегеродимер FT/FD может активировать
транскрипцию LFYопосредованно, через активацию транскрипции
генов API и FUL, которые гоже являются регуляторами транскрип-
ции гена LFY.

уЪо-вторых, транскрипция LFYактивируется гиббереллином (ГА),
который, вызывая разрушение негативных регуляторов I Л-сигнала—
белков с DELLA-доменами (GAI, RGA, см. главу «Гиббереллины»),
активирует экспрессию транскрипционного регулятора — гена
MYB33 Последний прямо или опосредованно активирует транс-
крипцию LFY, связываясь с консервативными цис-регуляторными
элементами CAACTGTC в премоторной области гена LFY. Сахароза,
концентрация которой в тканях растения прямо связана с активно-
стью фотосинтетических процессов и отражает статус питания и го-
товность растения к успешному оставлению потомства, усиливает
действие гиббереллина на уровень экспрессии гена LFY. Предпола-
гается, что гиббереллин и сахароза, гак же как и белок FT, могут
перемещаться по флоэме из листьев в апекс растения, являясь со-
ставной частью комплексного флоригена.

В-третьих, для определения места транскрипции гена LFY важен
гормон ауксин. Ауксин размечает участки формирования всех лате-
ральных органов (см. кцавьк«Ауксины», «Развитие листа»), и его на-
копление в местах, где в дальнейшем будут развиваться флоральные
примордии, предшествует активной транскрипции LFY в этих участ-
ках^! Тред полагается, что такая связь обусловлена тем, что для по-
ступления белка FT в участку формирующейся ФМ должна сформи-
роваться проводящая системаДРТ перемешается из листьев в апекс
пофлоэме).	

SB-четвсргых, транскрипция LFY опосредованно зависит от холо-
дового воздейсгвия. Ген FLC до яровизации блокирует цветение, по-
давляя транскрипцию сразу нескольких генов-мишеней — FD, FT, а
также гена SOCI, который регулирует транскрипцию LFY. \
Рис. 13.1. Интеграции разных индуктивных сигналов цветенияichom LFY(модифици-

ровано по Blazquez, 2000)

Зеленым цветом показаны основные гены, контролирующие развитие флоральной
меристемы и органов цветка. Другими цветами обозначены гены, инициирующие цве-
тение в ответ на индукцию светом (фотоперисдом), холодом гормонами и сахарами

На стебле мутантов IJy вместо цветов формируются боковые по-
беги в пазухах стеблевых листьев (рис. 13.2). Только на верхних яру-
сах соцветия в условиях длинного дня могут формироваться зеленые
безлепестковые цветки, особенно у «мягких» аллелей, т. е. аллелей,
имеющих остаточную активность и проявляющих низкую экспрес-
сивность. Морфоло! ия цветков, как правило, аномальная: органы
расположены не в виде мутовок, а спирально, число органов цветка
редуцировано, а из пазух спирально расположенных органов могут
развиват ься новые иобегоподибные цветки. Цветки, расположенные
на верхних участках стебля, фертильны, однако у них образуется
меньше тычинок и лепестков, что объясняется тем, что LFY является
важнейшим активатором генов В-класса, отвечающим за развитие
ли’КИ’ЛТил laafy дикий туп floricaula

Aiabidopsis thaliana Antirrhinum majus

дикий тип falsiflora

Solanum iycopersicum

Рис 13.2. Мутации, нарушающие активность гена LFY у Arabidupsis thaliana и его
ортологов из других видов растений, нарушают метам трфоз побегов в цветки. По
бегоподобные зеленые цветки мутантов Ну показаны темным цветом

этих органов (см. далее). Ген LFY играет т акже важную роль в регу-
ляции экспрессии гомеозисных генов API и AG (см. ниже).

Ген LFY клонирован по гомологии с ортологсм из A. majus
FLORICAULA (FLO). мутации которого также нарушают метамор-
фоз побега в цветок и приводят к развитию вегетативных побегов
вместо цветков. Ген кодирует ядерный белок, не имеющий суще-
ственной гомологии с другими известными белками, кроме белка
FLORICAULA. Несмотря на это, анализ кристаллической структуры
белка показал его сходство с регуляторными белками HLH (hehx-
turn-helix), к которым относятся гомеобоксные белки растений
и животных. Образуя гомодимеры, белки LFY связываются с ДНК
генов-мишеней.

Экспрессия гена I.FY наблюдается в ПАМ при формировании
листовых примордиев и усиливается с возрастом растений. Дости-
жение порогового уровня экспрессии гена LFY является тем крити-
ческим фактором, который обеспечивав! переключение ПАМ рас-
тений с процесса формирования примордиев листьев на процесс
формирования флоральных примордиев. В верхушке цветоноса ген
LFYэкспрессируется только по бокам ПАМ (в участках, формирую-
щих ФМ), а не в ее центральной зоне. Эго связано с присутствием
в центральной зоне продукта гена TFL1 (см ниже).

Важная роль гена LFY в образовании флоральных примордиев
была подтверждена и в экспериментах с трансгенными растениями
A. thaliana, в которых ген LFY конститутивно экспрессируется под
контролем активного промотора гена 35S вируса мозаики цветной
капусты. Формирование цветков у трансгенных растений наблю-
дали значительно раньше, и в тех участках, где у растений дикого
шпа обычно формировались стеблевые листья с пазушными почка-
ми. Интересно, что эктопическая экспрессия гена LFY из A. thali-
ana в трансгенных (358::£?’У) растениях осины (Populus tremula х
tremuloides) также вызывала значительное ускорение цветения (у
'-месячных трансгенных растений), в то время как в норме цветение
начинается только в возрасте 8 лет. Эти результаты говорят о консер-
вативное! и функции гена LFY

13.2.	Ген TERMINAL FLOWER1 (TFL1) - антагонист LFY

] _Ген TFL1 является генсм-антагонистом LFY. У мутантов tfll цве-
тение наступает значительно раньше, чем у растений дикого типа,
и вскоре после индукции цветения наблюдается превращение апи-
кальной меристемы побега во флоральную. В результате у мутантов
tfll образуется терминальный цветок, то есть соцветие открытого
типа, характерное для A. thaliana, превращается в соцветие закрыто-
i о типа. Таким образом, главная функция гена TFL1 — поддержание
недетерминированности и меристематическоща*стивнести ПАМ на
протяжении всего жизненного цикла растениддй-юрмирование тер •
минального цветка у мутантов tfll связано с тем; что при отсутствии
нормального продукта гена TFL1 мРНК гена LFY, отвечающего за
формирование флоральной меристемы, обнаруживается не только
в периферических участках ПАМ (как у растений дикого типа), но
также и в центральной зоне ПАМ. Следовательно, ген TFL1 являет-
ся негативным регулятором гена ЛлТ^Эта регуляция, по-видимому,
является опосредованной. В растениях дикого типа ген TFL1 транс-
крибируется в центральной зоне ПАМ, в нижней ее части, а его про-
дукт — небольшой сигнальный белок TFL1, напоминающий инги-
биторы Raf-l киназ и фосфатидил-этаноламинсвязывающие белки
животных, перемешается вверх и занимает всю центральную зону
меристемы. Здесь он блокирует активность белка FD, образуя с ним
комплекс. Поскольку FD является транскрипционным активатором
генов SOC1, FUL и API, а через них — и гена LFY, в центральной
зоне уровень экспрессии гена LFY существенно ниже, чем на пе-
риферии ПАМ, где закладываются флоральные примордии. Ин-
тересно, что сам ген LFY поддерживает перемещения белка TFL1
в верхнюю часть центральной зоны ПАМ цветоноса. Это позволяет
сохранить пролиферативную активность ПАМ на всем протяжении
жизненного цикла A. thaliana и обуславливает развитие открытого
типа соцветия.
Ген LFY (вместе с геном API} является негативным регулято-
ром транскрипции гена TFL1 на переферии ПАМ, где развивают-
ся флоральные примордии. Об этом свидетельствует формирование
терминального цветка у трансформантов A. thaliana с эктопической
экспрессией гена LFY и отсутствие или низкий уровень мРНК TFLI
в ПАМ таких трансгенных растений.

У A. majus также имеются мутанты centroradialis (сеп) с закрытым
типом соцветия. Гены TFL1 и CEN кодируют гомологичные белки
(70% сходства). Как и TFL1, ген СЕМ экспрессируется в централь-
ной зоне ПАМ главного и боковых побегов и препятствует экспрес-
сии в ней генов, отвечающих за формирование ФМ. У A. thaliana
идентифицирован еще один ген TFL2, который так же, как ген TFL1,
участвует в поддержании нормального функционирования ПАМ.
Таким образом, для нормальной дифференцировки соцветия у рас-
тений A. thaliana важна функция как генов, отвечающих за сохране-
ние меристематической активности ПАМ, так и генов, отвечающих
за формирование ФМ.

Дополнительная информация

Ген ТГЫ является гомологом гена FT, кодирующим флориген (см. преды-
дущую главу). Эти гены возникли в результате дупликации одной предковой
копии, однако первый задерживает цветение, а второй — ускоряет. Продук-
ты обоих генов могут взаимодействовать с белком FD — транскрипционным
активатором цветения. Связывание FD с TFL1 блокирует активаторную ак-
тивность FD, а связывание с FT не препятствует этой функции FD. В индук-
тивных условиях FT, поступающий из листьев в апекс, вытесняет TFL1 из
комплекса TFL1/FD. Новый белковый комплекс активирует цветение. Хотя
продукты TFL1 и FT показывают всего 59% идентичности, специальные ис-
следования показали, что изменение функции паралогов связано с заменой
всего одной аминокислоты в белке (гистидин или тирозин в положении 85
белка) С помощью создания и изучения трансгенных растений арабидоп-
сис, эктопически экспрессирующих под 358-промотором мутантные версии
генов TFL1 и FT (их получали путем мутагенеза in vitro), было показано, что
именно эта замена меняет функцию белков на противоположную: в отличие
от растений 35S::TFL1, характеризующихся существенной задержкой цвете-
ния, растения, экспрессирующие мутантную версию TFL1 с одной амино-
кислотной заменой, зацветали раньше, чем дикий тип (практически так же,
как растения 35S::FT), а растения, экспрессирующие мутантную версию
FT зацветали очень поздно, как 35S::TFL1 (Hanzawa Y., Money T., Bradley D.
A single amino acid converts a repressor to an activator of flowering. PNAS. 2005.
V. 102 (21). P. 7748-7753). Этот удивительный пример наглядно демонстриру-
ет, что даже единичные мутации могут играть важнейшую роль в эволюции
функции генов.
—-------------------------/у U О ’ Н’ {'J '<---------Z

13.Зд	Ортологи генов LFY и TFL1i& других видов растений,
их рояь^ццределении структуры соцветия /yQif-

/ ’

Ортологи генов LFY и FLO A. thaliana и львиного зева (расте-
ний из семейств крестоцветных и норичниковых соответствен-
но) идентифицированы у многих растений. Гены AFZJ и NFL2
(Nicotiana FLO/LFY) табака Мсоиапа tabacum (семейство пасле
новых), имеющего закрытый тип соцветия, в отличие от генов
LFY/FLO, экспрессируются не только на периферии ПАМ, но
н в центральной зоне ПАМ соцветия, что приводит к формиро-
ванию терминального цветка. Ортолог генов LFY/FLO, ген ALF,
найден и у другого представителя семейства пасленовых — пе-
। унии Petunia hybrida, также имеющей закрытый тип соцветия.
Мутация alf приводит к трансформации терминального цветка
в побег. Превращение цветков в побеги характерно и для мутанта
falsiflora томата Solanum Iycopersicum (рис. 13.2). Белок, кодируе-
мый геном FALSIFlORA (FA), имеет 90 %-ное сходство с белками
NFL1 табака и ALF петунии и 80 и 70 %-ное — с FLO и LFY, со-
ответственно. У томата так же, как у табака и петунии, соцветия
закрытые, и экспрессия гена FA в растениях дикого типа наблю-
дается не только во ФМ, но и в ПАМ.

Гены UNIFOLIATA (.(2ДХ_ДРугое его название — PEAFLO) горо-
ха Pisum sativum и SINGLE LEAFLET! (SGL1)люцерны Medicago
truncatula также отвечают за формирование ФМ и являются гомоло-
гами генов LFY/FLO, однако в отличие от них они имеют еще одну
функцию — участвуют в контроле морфогенеза сложного листа го-
роха. Это видно из фенотипа мутантов uni и sglF. у них нарушается
формирование цветков (вместо них формируются побегоподобные
структуры) и одновременно сложный лист превращается в простой.
Ортолог LFY/FLO обнаружен у Eucalyptus globules. Ген ELF1 эвка-
липта имеет такой же характер экспрессии, что и ген LFY. Транс-
генные растения арабидопсис, несущие ген ELF1 под промотором
35S. так же, как растения 35S. LFY, формируют цветки на месте по-
6ei ов.

В геноме кукурузы нашли 2 гомолога LFY — гены ZFLI и ZFL2.
Белки ZFL1 и ZFL2 показывают 67 и 65 %-ное сходство с FLO льви-
ного зева, 65 и 66%-ное сходство с LFY A. thaliana. Так же, как у дву-
дольных, эти гены важны для перехода на репродуктивную фазу
развития и формирования ФМ, для регуляции генов, контролирую-
щих развитие органов цветка, а также для определения структуры
соцветия.
Дополнительная информация

У риса Oryza sativa выделен ген RFL, имеющий то же число и положе-
ние интронов, что и гены LFY и FLO, а его продукт имеет 44 и 48%-ное
сходство с продуктами соответствующих генов. Ген RFL экспрессировался
в апикальных участках молодых метелок, но не во ФМ. Предполагается, что
этот ген участвует в процессе развития метелок и их ветвлении, но не в фор-
мировании ФМ, то есть не является ортологом генов LFY и FLO. Об этом
свидетельствовал и фенотип растений A. thaliana, конститутивно экспресси-
рующих ген RFL под промотором 35S. Только 2 из 100 трансгенных растений
формировали терминальный цветок, у всех растений наблюдались аномалии
развития семядолей, листьев, лепестков и тычинок. В то же время при экс-
прессии в растениях мутанта Ify A. thaliana гена RFL под промотором гена
LFY (LFl.RFL) наблюдали частичную комплементацию мутангногб фено-
типа. Полученные данные свидетельствуют о том, что ген RFL лишь частич-
но сохранил свою функцию, и что генетические механизмы формирования
ФМ у некоторых злаков могут быть иными, чем у двудольных растений. По-
видимому, гены FI О/LFY и RFL (так же, как и гены ZFLI и ZFL2 кукурузы)
произошли от одного предкового гена, но в процессе эволюции произошло
расхождение их функций. Несмотря на высокое сходство последовательно-
стей генов кукурузы ZFL1 и ZFL2 с рисовым геном RFL (80 и 83 %-ное сход-
ство по белку соответственно), их функция больше похожа на функцию гена
LFY, чем на функцию гена риса RFL.

Продукты генов сосны NEEDLY (NLY) и PfFLL имеют значительные отличия
от продуктов генов LFY и FLO: у них отсутствуют богатый пролином домен на
yV-конце и кислый район в середине белка, которые предположительно важны для
функционирования белка как транскрипционного фактора. Ген сосны PrFLL, по-
видимому, участвует в формировании мужских репродуктивных структур, так как
экспрессируется в молодых мужских, но не в женских стробилах.

сосны Pinus radiata выявлены два гомолога генов LFY/FLO:
гены NEEDLY (NLY) и PrFLL. Изучение гена NLY показало, что он
экспрессируется в участках закладки женских и мужских строби-
лов и на начальных этапах их развития. Трансформация растений
A. thaliana геном УАУ под контролем промотора 35S (35S::NLY) при-
водила к раннему цветению, метаморфозу побегов в цветки и форми-
рованию терминального цветка. Более того, ген NLYпод контролем
промогора гена LFY был способен супрессировать фенотип мутанта
lfy-26. Эти эксперименты доказывают, что, несмотря на выявленные
структурные отличия от генов LFY и FLG. ген NLY является истин-
ным их ортологом.

Гомологи генов LFY/FLO найдены и у представителей класса
гпеговых Gnetum gnemon и Welwitschia mirabilis, однако анализ их
функций не проводился. Наличие ортологов генов LFY/FLO у голо-
семенных и покрытосеменных растений позволяет предполагать,
что эти гены участвовали в возникновении репродуктивных органов
у предковых форм семенных растений.

Особенности экспрессии ортологов LFY/FLO у видов покрытосе-
менных с открытым и закрытым типом соцветий свидетельствуют
о возможном участии этих генов в эволюции структуры соцветий.
Гак, у растений с открытыми соцветиями — A. thaliana, A. majus —
гены LFY и FLO экспрессировались только в латеральных, но не
в центральной зоне апикальной меристемы соцветий (рис. 13.3).
У растений с закрытыми соцветиями — у табака, томатов, Impatiens
hahamina, петунии — значительный уровень экспрессии этих генов
наблюдали и в центральной зоне ПАМ, что приводило к формирова-
нию терминального цветка (рис. 13.3).

Гены, взаимодействующие с ортологами LFY/FLO, также могли
вносить важный вклад в эволюцию структуры соцветия. В первую
очередь это относится к ортологам генов A. thaliana и A. majus TFL1
и CEN, которые являются антагонистами LFY/FLO Ортологи генов
TFL1 и CEN выделены у табака Nicotiana tabacum. Эти гены_СЕТ2
и СЕТ4 имеют 97 %-ное сходство нуклеотидной последовательности
кодирующей части гена, что, очевидно, связано с удвоением одного
предкового гена у аллотетраплоидного табака. Кодируемые ими бел-
ки имеют 83 %-ное сходство с продуктом гена CEN. Гены экспрес-
сируются в апикальной меристеме боковых побегов на начальных
этапах ее развития, но не в ПАМ главного побега. При переходе бо-
ковых побегов к цветению их экспрессия прекращается. Отсутствие
экспрессии генов СЕТ2 и СЕТ4 в ПАМ главного побега и связанная
с этим экспрессия генов NFL1 и NFL2 в этом районе приводит к фор-
мированию терминального цветка и закрытию соцветия.

Ген DET гороха — ортолог TFL1/CEN— начинает экспрессиро-
ваться в ПАМ после перехода растений на репродуктивную стадию
развития. Он не экспрессируется в участках развивающихся примор-
диев и так же, как гены TFL1/CEN, поддерживает недетерминиро-
ванность побега гороха. Мутации det, как и мутация tfll у A. thaliana
(рис. 13.3), приводят к развитию дегерминантною типа соцветия из-
за экспрессии у мутантов в центре апикальной меристемы соцветия
генов LFY и UFO.

Таким образом, сравнительный анализ структуры соцветий рас-
тений разных видов и характера экспрессии в них ортологов генов
LFY/FLO, вызывающих формирование ФМ, и TFL1/CEN, поддержи-
вающих недифференцированное состояние ПАМ, свидетельствует
о том, что место экспрессии этих генов определяет формирование
открытого или закрытого типов соцветия.
Рис. 13 3. Связь между структурой побега (открытое/закрытое) и особенностями
экспрессии ненов антагонистов - ортологии LFY и TFL1 в апикальной меристеме
соцветия

Б растениях с открытым тигом ссцветия ортсгоги LFY не экспрессируются в центре
апикальной меристемы, поскольку там мобильный белок TFL1 (показан звездочками)
препятствует экспрессии LFY. У растений с закрытым соцветием, а также у мутантов
по ортогогам TFL1 ген LFY начинает экспрессироваться по всей апикальной меристе-
ме (серый цвет) и превращав! ее во флоральную меристему

Дополнительная информация

Хотя у большинства исследованных растений связь между структурой по-
бега и особенностями эспрессии ортологов LFY/FLO и TFL1/CEN подтвержде-
на, обнаружены и отклонения от выявленных закономерностей. Так, гомолог
гена CEN и TFL1 томата — ген SELF-PRUNING (SP) экспрессируется во всех
участках ПАМ, что, однако, не препятствует экспрессии в пей ортолога генов
LFY/FLO и формированию закрытого соцветия. Получены данные, что на-
блюдающееся у некоторых видов рода Jonopsidium формирование единичных
цветков прямо из пазух розеточных листьев, отличающее Эти виды от боль-
шинства видов крестоцветных, развивающих цветонос, связано с более вы-
соким уровнем экспрессии ортологов LFY. Это может быть не только резуль
татом изменения регуляторных участков этих генов, но и изменением уровня
экспрессии актизагорсв генов LFY (например, СО) или изменением уровня
или паттерна экспрессии ортологов генов-антагонистов TFLI.
13.43Ген UNUSUAL FLORAL ORGANS (UFO) -	<( /

корегулято^гена LFY^J

Мутанты по гену UFO похожи на мутантов A. thaliana по мягким
аллелям гена LFY, хотя вызывают более существенное нарушение
в структуре цветков, особенно во 2-й и 3-й мутовках Ген UFO ко-
дирует белок, содержащий F-бокс, найденный у ряда белков, свя-
занных к регуляцией клеточного цикла. Такие белки обычно входят
в состав белкового SCF комплекса, который участвует в деградации
белков. Поскольку мутации Ify показывают эпистатичность по от-
ношению к мутациям ufo, гены могут принимать последовательное
участие в процессе, ведущем к формированию флоральной меристе-
MbiJJjaK же, как LFY, ген UFO отвечает не только за формирование
флоральных примордиев, но и регулирует экспрессию г^^иЗпсттих
генов класса В — АРЗ и PI. В экспериментах с трансгенными расте-
ниями (35S::UFO) A. thaliana показано, что эктопическая экспрессия
гена UFO в мутантах Ify не приводила к формированию лепестков
и тычинок. Следовательно^ ген UFO способен нормально функцио-
нировать только при наличии активности гена LFY. Предполагает-
ся, что UFO является корегуля тором, действующим вместе с геном
LFY. Совместное участие генов LFY и UFO в регуляции экспрессии
гена АРЗ было подтверждено при изучении растений A. thaliana, со-
держащих реиортерный ген GUS (ген Р-глюкуроиидазы) под контро-
лем промотора гена АРЗ. Активность Р-глюкуронидазы наблюдали
у этих растений даже в вегетативных органах после их трансфор-
мации одновременно генами 35&..LFY и 35S::UFO, но не каждым
из генов в отдельности.'Ортологи UFO найдены у львиного зева,
лядвенца Lotus japonicus — соответственно шты FJMBRIA'TaAFIM)
и PROLIFERATINGFLORAL ORGANS (/3/,’(9)^Мутации в этих генах
приводят к фенотипу, похожему на фенотип мутантов ufo A. thaliana,
что свидетельствует о консервативности выполняемой этими генами
функции. 

В то же время функция этих генов у петунии DOUBLE ТОР
(DOT) несколько иная. Как у A. thaliana, белки DOT (гомолог UFO)
и ALF (гомолог LFY) взаимодействуют между собой, и мутации
dotl и alf вызывают похожие замены цветков на побеги. Эктопиче-
ская экспрессия обоих генов ALF и DOT, а также одного гена DOT
(35S..DOT), приводит к необычайно раннему зацветанию растений
и прекращению развития соцветия после формирования единствен-
ною терминального цветка. Однако экспрессия одного ALF или его
гомолога LFY из растений A. thaliana не вызывает раннею цвете-
ния (как это было показано для трансгенных растений A. thaliana
и тополя, экспрессирующих химерный ген 35S::LFY). Следователь-
но, главную роль в переходе растений к образованию ФМ у петунии
играет транскрипционная активация гена DOT, а не гена ALF. Если
у Л. thaliana ген UFO экспрессируется в НАМ на всех стадиях разви-
тия растений (и на вегетативной), а уровень транскрипции LFY до-
стигает порогового только при переходе на репродуктивную стадию,
то у петунии картина прямо противоположная. Лимитирующим фак-
тором является уровень транскрипции DOT (он начинает транскри-
бироваться только после индукции цветения), а нс гена ALF, который
активно транскрибируется уже на вегетативной стадии развития.
Предполагается, что белок DOT посттрансляционно модифицирует
и активирует транскрипционный факюр ALF, после чего он запуска-
ет программу развития ФМ.

13.5. Ген APETALA1 (АР1) и его пгралог ген CAULIFLOWER (CAL)

Об участии гена API в формировании флоральных примордиев
свидетельствуют особенности морфологии цветка одиночных му-
тантов apl: в пазухах органов первого круга, которые представлены
не чашелистиками, а листьями (бракгеями), у них формируются до
полнительные цветы, которые могут образовывать новые цветки той
же морфологии. Такие соцветия из «ветвящихся» цветков больше
напоминают тирс, а не кисть (рис. 13.4). У самых «суровых» мутан-
тов на одной цветоножке, отходящей от стебля, могут развиваться
более 10 цветков.

Об участии гена API в детерминации ФМ говорит не только по-
бегоподобная структура цветков, но и фенот ип двойных мутантов Ify
apl. В отличие от одиночных мутантов Ify, которые время от време-
ни формировали цветы на верхних ярусах побега, двойные мутан-
ты Ify apl не способны формировать цветы Важная роль гена API
в формировании ФМ была показана при анализе трансформантов
A. thaliana (35S::AP1) с эктопической экспрессией этого гена^Фено-
тип таких трансформантов был похож на фенотип трансформантов
35S..LFY, о которых сказало выше: растения зацветали рано и фор-
мирование цветов наблюдалось даже в пазухах стеблевых листьев,
где у не трансформированных растений обычно развиваются боко-
вые побеги£Эки}пическ5я эт&лрессия гена 35S:;AP1 в мутантах Ify
не приводила к нормализации морфологии цветков — они имели
множественные нарушения, типичные для мутантов Ify. Следова-
тельно, ген API оказываем вдияпие на более поздние стадии форми-
рования ФМ, чем ген LFY.
Рис. 13.4. Оспбенности морфологии мутантов apt и cal Arabidopsis thaliana

' Особенности экспрессии гена API отражают его двоякую функ-
цию. Он начинает транскрибироваться в апексе индуцированных
к цветению растений под непосредственным действием белкового
комплекса FD/FT. Ген LFY является еще одним активатором гена
API. В свою очередь, API может активировать транскрипцию гена
LFY в периферических районах ПАМ, где будут закладываться
ФМ. Позже, в развивающихся цветках, мРНК гена API сосредото-
чена в формирующихся органах околоцветника, что отражает его
роль в детерминации чашелистиков и лепестков (функцию генов
A-класса, см. дальше). /

у 'Ген API является регуляторным и кодирует белок с ДНК-
связывающим MADS-доменом. Его мишенями являются гены двух
групп. Во-первых, гены, контролирующие индукцию цветения SOC1,
SIP, AGL24 и поддерживающий пролиферацию клеток ПАМ ген TFL1
(API выступает как их репрессор). Во-вторых, мишенями гена API яв-
ляются отвечающие за развитие органов цветка гены В-класса, транс-
крипцию которых он активирует вместе с генами LFYи UFO.

1 В геноме A. thaliana есть паралог API, дублирующий его "функ-
цию — ген CAL. Одиночные мутанты cal не имеют фенотипического
проявления. В то же время двойные мутанты cal apl вместо цвет-
ков, характерных для мутантов apl, формируют многочисленные
меристемы соцветия, которые собраны в кластеры, как у цветной
капусты (рис 13.4). Этот фенотип говорит об участии CAL в детер-
минации ФМГ^Интересно, что у цветной капусты (Brassica oleracea
var. Ьопу4ы)'бртологичный ген оказался нефункциональным (в нем
обнаружена мутация сдвига рамки считывания). По-видимому, не-
Рис. 13.5. Генные взаимодействия, поддерживающие формирование открытого типа
соцветия

функциональная аллель CAL была отобрана в процессе селекции
цветной капусты.

Г Гены API и CAL в растениях дикого типа функционируют вме-
сте (рис. 13.5). Они, так же как LFY, подавляют транскрипцию гена
TFL1 на периферии ПАМ и поддерживают в этих участках уровень
транскрипции LFY, который, в свою очередь, является активатором
паралогов API и CAL.

В центре ПАМ экспрессия всех трех генов, контролирующих
образование ФМ, подавляется белком TFL1, блокирующим актива-
тор транскрипции FD. В результате клетки апикальной меристемы
цветоноса продолжают пролиферировать и образовывать все новый
материал для развития флоральчых меристем. Этот процесс у рас-
тений с открытым типом^оцветия прекращается вместе с заверше-
нием жизненного циклаГ ,_\

Рекомендованная литература

1.	Hempel Е D, Welch. D. R , Feldman L. J. Floral induction and determination: where

is flowering control'ed7 // Trends in Plant Science. 2000. Vol. 5. N. 1. P. 17-21.

2.	Liljegren S. J., Gustafson-Brown C., Pinyopich A. et al. Interactions among
APETALA1, LEAFY, and TERMINAL FLOWF.R1 Specify Meristem Fate. Plant
Cell. 1999. Vol. 11.N6.P 1007-1018.

3.	Parcy F, Bomblies K„ Weigel D. Interaction of LEAFY, AGAMOUS and TERMINAL
FLOWER I in maintaining floral meristem identity in Arabidopsis. Development.

2002. Vol. 129. P. 2519-2527.

4.	Prusinkiewiez P, Erasmus Y, Lane B. et al. Evolution and Development of

Inflorescence Architectures// Science. 2007. Vol.316, P. 1452- 1456.

5	Yoon H-S., Зант D. A. Transgenic study of parallelism in plant morphological

evolution П PNAS. 2004 Vol. 101. N 17 P.6525-6529
Глава 14

Развитие органов цветка

Ген LFY, играющий центральную роль в инициации
формирования ФМ, инициирует и образование органов цветка,
активируя транскрипцию генов, детерминирующих тип органа.
I енетическая схема, описывающая детерминацию опганов
в радиально расположенных мутовках цветка тремя группами генов
(А, В и С), напоминает схему, описывающую регионализацию
эмбриона дрозофилы вдоль переднезадней оси. Основной вклад
в разработку этой схемы, получившей название АВС-модели,
внесли исследования гомеозисных мутантов Arabidopsis thaliana
и Antirrhinum majus, у которых, как и у гомеозисных мутантов
плодовой мушки, наблюдаются замены одних органов на другие.

14.1.	АВС-модель

Рассмотрим логику создания и основные положения АВС-модели
на примере/!, thaliana. Цветокэтого крестоцветного растения состоит
из органов, расположенных в четырех мутовках: в наружной 1-й
мутовке находятся четыре чашелистика, во 2-й четыре лепестка,
в 3-й — от четырех до шести тычинок, в 4-й — пестик, состоящий
из двух плодолистиков.

У гомеозисных мутантов apetala2 (ap2) с высокой
экспрессивностью наблюдаются замены органов двух наружных
мутовок: в 1-й мутовке чашелистики заменяются на плодолистики,
а во 2-й лепестки — на тычинки, а органы 4-й и 5-й мутовок не
изменены. У мутантов apetala3 (арЗ) 3 и pistillata (pi) органы 2-й
(лепестки) и 3-й мутовки (тычинки) заменены чашелистиками
и плодолистиками соответственно. У мутантов agamous (ag)
Рис. 14.1 С (роение цветка у двойных и тройных гимесзисных ы^атов Arabidopsis
thaliana

генеративные органы 3-й и 4-й мутовок (тычинки и плодолистики)
заменены на органы околоцветника. Кроме того, у мутантов ag
центральная зона ФМ продолжает пролиферировать и образовывать
все новые и новые органы околоцветника, превращая цветок
в «махровый» (рис. 14.1).

Основываясь на формальной генетической логике, исследователи
предположили, что гомеозисные гены в растениях дикого типа
экспрессируются в мутовках, затронутых мутацией, т. е ген
АР2 — в 1—2-й мутовках, АРЗ/Р1 — во 2-3-й, а AG — в 3-й и 4-й
мутовках, что схематически представлено на рисунке 14.2.
Перекрывание доменов экспрессии приводит к тому, что в каждой
мутовке экспрессируется уникальный набор генов, что и приводит
к формированию определенных специфических для каждой мутовки
органов. Т. е. в 1-й мутовке — чашелистиков под влиянием гена АР2,
во 2-й — лепестков при совместном действии генов АР2 и AP3/PI,
в 3-й — тычинок — под влиянием совместного действия генов АРЗ/
PI и 4G, а в 4-й — плодолистиков — геном AG

Основываясь на особенностях фенотипа мутантов ар2 и ag, сделаны
и другие предположения: (1) гены АР2 и AG негативно регулируют
экспрессию друг друга: генЛЛ?не позволяет генуЛ(7экспрессироваться
в 1-м и 2-м кру| е, а ген AG не позволяет экспрессироваться гену АР2
в 3-м и 4-м круге; (2) помимо детерминации генеративных органов, ген
AG подавляет пролиферацию центральной зоны ФМ. "Эти допущения
позволяют обьяснигь все основные особенности структуры цветка
Рис. 14.2 Генетическая модель дифференцировки органов цветка Arabidopsis thaliana
Слева— схема половинки цветка (вид сбоку): сверху указан номер мутовки; снизу
обозначен тип органов, который будет сформирован в мутовке (Ч — чашелистик,
Лп — лепесток, Г — тычинка, П — плодолистик, Л — лист) Справа — схема цветка
(вид сверху); перекоывание доменов экспрессии обозначено цветовой гаммой (зеленый
цвет 2-й мутовки — резул ьтат совместной экспрессии АР2 и AP3/PI, оранжевый в 3-й
му совке — результат совмест ной экспрессии АРЗ/FI и /1С)

мутовка 1234
дикий тип AP3/PI.

АР2[—fAG
орган Ч Л Т П

AP3/PI

AP3/PI
ад	0?

ч л Л ч*

арЗ/pi	ар2|—ia<

ч ч Л п

П Т Т П

мутовка 1	234

ар2 арЗ
П П П Г

арЗ ад
ч ч ч ч*

AP3/PI

ар2ад
Лист Л/Т ЛЯ Лист*

ар2 ад арЗ

Лист Лист Лист Лист*

Рис. 14 3. Схематическое изображение гомеозисных превращений в цветках одиноч-
ных и двойных мутантов Arabidopsis thaliana и их объяснение с mакции генетической
модели развития цветка

Звездочкой отмечено наличие дополнительных мутовок; знаком обозначено наличие
негативного взаимодействия между генами Остальные обозначения как на рис 14.1
одиночных гомеозисных мутанов и предсказать фенотип двойных
мутантов (рис. 14.3).

Экспериментальное изучение морфологии цветка двойных
мутантов A. thaliana (рис. 14.1) подтвердило предсказания АВС-
модели, а значит, и ее правильность. Цветки двойных мутантов ар2
арЗ и ар2 pi состояли из одних плодолистиков, а арЗ ag и pi ag — из
одних чашелистиков, причем из-за нарушения гена A G пролиферация
ФМ не прекращалась после формирования 4 мутовок, и цветок
состоял из многочисленных чашелистиков. У двойных мутантов
ар2 ag органы цветка наружной мутовки представлены листьями,
т. к. в этой мутовке по предсказанию ABC-модели нет экспрессии
генов, детерминирующих флоральные органы. Остальные органы
представляют нечто неопределенное. Тройные мутанты A. thaliana,
ар2 ag pi и ар2 ag арЗ формируют во всех мутовках только
листья или листоподобные органы (рис. 14.1). Этот факт явился
четким свидетельством в пользу фолиарной теории морфогенеза
цветка, разработанной еще в 1790 г. всемирно известным поэтом
и естествоиспытателем Иоганном Вольфгангом Гёте. Согласно
этой классической теории морфогенеза цветок представляет собой
видоизмененный побег, а органы цветка — видоизмененные листья
Изучение двойных и тройных мутантов A. thaliana показало, что
видоизменение листовых органов в органы цветка осуществляется
под влиянием продуктов генов А, В и С-классов.

У львиного зева Antirrhinum majus также есть мутанты
с гомеозисными заменами органов цветка. Их изучение
проводилось одновременно с мутантами A. thaliana и привело
к гем же заключениям. Объединенную модель детерминации типа
органов цветка тремя классами генов, действующих в двух рядом
расположенных мутовках, назвали ABC-моделью Гены класса А
детерминируют развитие чашелистиков в 1-й мутовке и, действуя
вместе с генами класса В во 2-ой мутовке, лепестков. В 3-й мутовке
гены класса В вместе с генами класса С детерминируют развитие
тычинок, а в 4-й гены класса С — плодолистиков. Название генов А.
В и С-классов A. thaliana, львиного зева и некоторых других видов
приведены в таблице 14.1.

Дополнительная информация

У львиного зева есть 2 гомолога гена АР2 A. thaliana — гены LIP1 и LIP2,
которые функционально дублируют друг друга, поэтому единичные мутации
не приводят к фенотипическим изменениям. Поскольку у двойного мутанта
вместо чашелистиков развиваются брактеи, а лепестки существенно умень-
Таблица 14.1

Гены АВС класспн Antirrhinum majus и Arabidopsis thaliana

Гены	Antirrhinum majus	Arabidopsis thaliana
А-класс	SQUAMOSA (SQUA)  1.1PLESS1 (L1P1)  LIPLESS2 (L1P2)	A PETALA 1 (API)  APETALA2 (AP2)
В-класс	DEFICIENS (DEF) GlOEOSA (GLO)	APETALA3 (AP3) PI STILL ATA (Pl)
С-класс	PLENA (PLE)	AG AMOUS (AG)

шены в размере, предполагают, что, как и АР2, гены LIP отвечают за развитие
органов околоцветника. Однако они отличаются от АР2 тем, что не подавляют
। ранскрипцию гена С-класса PLE. Этот вывод сделан на основе анализа двой-
ного мутанта lipl Iip2: у него, в отличие от ар2, органы околоцветника не заме-
няются на репродуктивные органы и эктопической экспрессии генов С-класса
в наружных мутовках не наблюдается. Функция гена С-класса PLE наиболее
консервативна. Рецессивные мутации гена PLE, приводящие к нарушению его
функции, вызывают развитие махрового цветка, состоящего только из органов
околоцветника. Кроме того, как у мутанта ag, у мутантов pie наблюдается дли-
 ельная пролиферация ФМ. Доминантные мутации того же гена, связанные
с повышенной экспрессией PLE, приводят в зеркальному фенотипу — во всех
мутовках развиваются генеративные органы (как у мутантов ар2 и трансген-
ных растений A. thaliana с эктопической экспрессией гена AG под контролем
555-промотора).

К генам класса А относят и ген A. thaliana APETALA1 (API),
о котором речь шла в предыдущем разделе. Мутация в этом
гене не только задерживает детерминацию ФМ, но и нарушает
развитие органов 1-го и 2-го круга (лепестки не развиваются, а
вместо чашелистиков развиваются листья с активными пазушными
меристемами, из которых появляются цветки второго порядка и
с теми же морфологическими особенностями). Похожую функцию
осуществляет ген SQUA львиного зева.

14.2.	Особенности структуры
и экспрессии генов АВС-классов

В настоящее время гены АВС-классов клонированы. Установлено,
что гены API, АРЗ, PI и AG кодируют транскрипционные факторы,
содержащие высококонсервативный ДНК-связывающий домен
(MADS-бокс), получивший название MADS-домен (аббревиатура из
первых букв нескольких транскрипционных белков — регулятора
транскрипции дрожжей МСМ1, продукта гомеозисных генов
N—(	| MADS | 1

ЛийггЬлим IM fit «-.NS)

AtuWwpm (АСЛ /5)
Гапмт&иА (PlanKI

MVRRKIK IKRIEHATTR
MZRGKIO IKRIENQINR
MGRGAIE iKRIEHANSR
MGRGKIt IKRIEN-TNR

QVTFSKRRGG ELKRAHGLSV ICDAEVAVII
QVTVSKRRAG LFKKAHEtSV LCDAKVSItM
QVFFSKRHAG LIKXAHFISif LCDAEVAV1V
QVTFSARRNG LEKKAHEESV LCDAEVALII

FSSKGKLFQF
I1S13RLHEV
FRAlGHLFEr
FSSRGKIEEF

Рис. 14.4. Доменная организация белков, кодируемых гомеозисными генами рас-
тений

A. thaliana AG и львиного зева DEF, регулятора транскрипции
человека SRF). Этот домен, состоящий из -60 аминокислот, способен
связываться с регуляторными последовательностями CC(A/T)6GG
генов-мишеней, которые получили название CArG-боксов. Кроме
того, MADS-домен участвует в димеризации белков. В геноме
A. thaliana обнаружено более 80 генов, содержащих MADS-бокс.
Эти регуляторные гены не только контролируют развитие цветка,
но и принимают участие в инициации цветения, в развитии корня,
в контроле дифференцировки клеток при развитии плодов и пр.
Гомеозисные замены органов описаны только при нарушениях
работы генов ЛВС-классов, отвечающих за развитие цветка, поэтому
не все MADS-гены можно называть гомеозисными.

Различают несколько типов генов, содержащих MADS-бокс. МА DS-
гены тина I кодируют белки, которые не содержат в своем составе
других известных доменов, кроме MADS, а белки MADS-генов типа
II кроме MADS-доменов содержат также 1, К и С-домены и поэтому
называются MIKC-генами (рис. 14.4) Среди 82 MADS-генов А.
thaliana 32 относятся к этому типу, в том числе гомеозисные гены API,
АРЗ, PI и AG Консервативный К-домсн (кератин-подобный домен)
MlKC-генов обуславливает формирование спиральных участков
белка, обеспечивающих взаимодействие с дру] ими белками. Домены
I и С менее консервативны. Показано, что домен I вместе с MADS
участвует в димеризации MADS белков, определяя специфичность
взаимодействия с теми или иными MADS-белками (сами MADS-
домены разных белков очень похожи друг на друга и поэтому не могут
обеспечить такой специфичности взаимодействий). Домен С может
принимать участие в регуляции транскрипции других генов, а также
во взаимодействии с другими белками (не содержащими MADS-
домен) при образовании мультимерных белковых комплексов.

Таким образом, гомеозисные гены растений отличаются по
структуре от гомеозисных генов животных — они содержат не
Рис. 14 5. Характер транскрипции гомеозисных генов АВС классов в онтогенезе
цветка Arabidopsis, thaliana (модифицировано по Irish, 1999 Krizek and Fletcher, 2C05)
Цифрами обозначены последовательные стадии развития цветка

гомеобокс (общая для гомеозисных генов животных структурная
единица, кодирующая ДИК связывающий домен типа HLH), а
MADS-бокс. Кроме тою, гомеозисные гены растений не собраны
в кластеры, а разбросаны случайно по разным хромосомам. Ген АР2
кодирует транскрипционный фактор, имеющий иное строение.

Методом in situ гибридизации показано, что все гены, содержащие
MADS-бокс, экспрессируются в определенных участках флоральной
меристемы в соответствии с их функцией, предсказанной АВС-
модслью и в определенной последовательности. Экспрессия гена API
начинается раньше всех других генов — сразу как только намечается
флоральный примордий (это отражает его роль в детерминации
ФМ), но вскоре, по мере развития примордия цветка, ограничивается
участками флоральной меристемы, из которых образуются
чашелистики и лепестки. Второй ген класса А — АР2 не показывает
специфичности транскрипции на всех стадиях развития цветка (мРНК
присутствует во всех мутовках и в вегетативных тканях растений),
однако за счет посттранскрипционной регуляции в цветке (см. ниже)
белок АР2 обнаруживается только в околоцветнике, что соответствует
особенностям фенотипа. После формирования примордиев
чашелистиков начинается экспрессия генов В-класса АРЗ и PI
в участках формирования лепестков и тычинок. Невысокий уровень
мРНК гена Р/ выявляется и во внутренней мутовке, однако совместная
экспрессия обоих генов В-класса, необходимая для осуществления
функции В (см. ниже), наблюдается только во 2-й и 3-й мутовке
в соответствии с предсказаниями ABC-модели. Экспрессия гена
С-класса AG наблюдается в центральной части флоральной меристе-
мы, из которой разовьются генеративные органы цветка (рис. 14.5).

Изучение характера экспрессии гена AG в формирующихся
цветках мутантов ар2 подтвердили также наличие негативной
регуляции гена AG со стороны гена АР2\ экспрессия гена AG
у мутантов ар2 обнаруживалась во всех мутовках. Подтверждено
и предположение об участии гена AG в контроле пролиферации
клеток ФМ (молекулярные механизмы этого процесса рассмотрены
ниже). Для гомеозисных генов львиного зева выявлены те же
особенности экспрессии, что и для генов A. thaliana

Таким образом, молекулярно-генетические исслсдозачия генов
ЛВС-классов подтвердили правильность всех предположений,
выдвинутых на основании изучения структуры цветка у мутантов
Эго свидетельствует о высокой эффективности формальной
генетической логики при построении моделей даже таких сложных
признаков, как морфогенез. На примере ABC-модели можно видеть,
что детальный анализ фенотипа мутантов позволяет не только
формулировать гипотезы о функции генов на уровне организма, но
и может правильно предсказывать временные и пространственные
особенности генной экспрессии. Отсутствие специфичности
экспрессии на одном уровне не отвергает правильности формальных
логических суждений, а лишь указывает на то, что регуляция
экспрессии может осуществляться на каком-то другом уровне.

14.3.	Подтверждение АБС-модели путем исследования
трансгенных растений

Клонирование ЛВС-генов открыло возможности для направленной
модификации структуры цветка путем создания трансгенных
растений. Эти исследования еще раз подтвердили правильность
ЛВС-модели, поскольку фенотип трансгенных растений полностью
совпадает с ее предсказаниями. Так, например, при одновременной
эктопической экспрессии генов В-класса под контролем 35S-
промотора в растениях A. thaliana (35S::AP3 35S::PI, рис. 14.6) в 1-й
мутовке развиваются не чашелистики, а лепестки (к генам А-класса
присоединяются эктопически экспрессирующиеся гены В-класса).
В 4-й мутовке вместо плодолистиков развиваются тычинки (к гену
С-класса присоединяются гены В-класса).
л л т т

л л л л

т т т т

Рис. 14.6 Строение цветка у трансгенных растений Arabidopsis tltahana (слева) и егэ
объяснение с позиций АЗС-модели (справа). А - 35S:AP3 35S:PI, Б-ag 35S::AP3
35S::PI:B- 35S::AP3 35S::PI 35S..AG 'модифицировано no Honma ar.d Goto, 2001;

Krizek and Meyerowitz, 1996) Обозначения как на рис. 14 2

Если гены В-класса экспрессируются в растениях мутанта cig, то
все органы цветка представлены лепеегками. При одновременной
эктопической экспрессии генов В- и С-классов (35S::AP3 35S..PI
35S::AG) все органы цветка представлены тычинками (рис. 14.6).
Похожая структура цвегка и у растений муганга ар2, эктопически
экспрессирующих гены В класса, поскольку и в этом случае из за ci гятия
Hei ативной регуляции со стороны гена АР2 наблюдается эктопическая
экспрессия гена С-класса АС в наружных мутовках. Поскольку гены
В-класса действуют сообща (см. ниже) эктопическая экспрессия одного
из них не приводила к вышеуказанным замещениям органов. Таким
образом, изучение мутантов и трансгенных растений показывает, что
в 11аружной мутовке под влиянием генов ЛВС- классов може г развиваться
любой тип органон цветка: чашелистики (у дикого типа), лепестки
(35S-P1 и 35S-AP3), тычинки (у мутанта ар 2 экспрессирующего 35S-PI
и 35SAP3), плодолистики (у мутантаар2-2).
14.4.	Генетические механизмы, определяющие время и ме-
сто экспрессии гсмеозисных генов

Особенности экспрессии гомеозисных генов — результат
сложных генных взаимодействий, которые осуществляются на
разных уровнях.

LFY - основной транскрипционный активатор генов АВС-классов

Белок LFY распознает цис-элементы в регуляторном участке гена
API и активирует транскрипцию API в молодых ФМ. Сначала мРНК
API обнаруживается во всей меристеме, однако после включения
гена AG (он начинает экспрессироваться позже, чем гены классов
А и В), мРНК во внутренних мутовках уже не обнаруживается. Это
объясняется тем, что ген AG выступает в качестве транскрипционного
репрессора API на своей территории — в 3-й и 4-й мутовках. При
нарушении функции AG (у мутантов ag) ген API транскрибируется
и во внутренних мутовках, где под его действием развиваются
органы околоцветника.

Ген LFY вместе с корегулятором — геном UFO, а з акже ген API
активиру юттранскрип цию генов В-класса. Продукты генов/1 РЗ и Р1
формируют гетеродимеры (белки связываются в районе К-домена).
Димеризация транскрипционных факторов, кодируемых генами
АРЗ и РЦ является непременным условием для их связывания
с ДНК и нормального функционирования. Несмотря на то что ген
PIтранскрибируется и в 4-й мутовке, совместная экспрессия обоих
генов, необходимая для формирования гетеродимерного белка
и осуществления функции В, наблюдается только во 2-й и 3-й
мутовках. Формирование гетеродимеров стабилизирует белки АРЗ/
PI, способствует их проникновению в ядро и связыванию MADS-
доменов с участком ДНК (CarG-боксом) в генах-мишенях. Такими
генами-мишенями являются гены, отвечающие за дальнейшую
дифференцировку лепестков и тычинок, а также сами гены АРЗ
и PI. Способность к такой позитивной авторегуляции (усиление
транскрипции гена под действием собственного продукта)
приводит к тому, что при утрате функции одного из генов (у
одиночных мутантов арЗ и pi) формирование мРНК гена-партнера
быстро прекращается. Это объясняет, почему мутации любого
гена класса В вызывают одинаковое фенотипическое проявление.
Формирование гетеродимеров и способность к авторегуляции
показана также для ортологов АРЗ и PI из львиного зева —
DEFICIENS (DEF) и GLOBOSA (GLO). также относящихся к классу
В (табл 14 1). Мутанты львиного зева def и gio имеют практически
такой же фенотип, как и мутанты арЗ и pi. Гомология генов класса
В A. thaliana и A. majus (61,2% идентичности аминокислотной
последовательности белков АРЗ и DEF, и 58,4% идентичности PI
и GL О), сходство функций и молекулярных механизмов их действия
свидетельствуют о том, что у общих для A. thaliana и A. majus
предшественников должны были присутствовать предковые гены
)той пэры ортологов. Способность к позитивной авторегуляции
показана и для гена AG.

Ген LFY вместе с геном WUS активирует также транскрипцию гена
AG во внутренних мутовках цветка. Как отмечалось выше, ген Л-класса
АР2 ограничивает транскрипцию AG в развивающемся околоцветнике.
У мутантов ген AG транскрибируется по всей ФМ, что приводит
к развитию репродуктивных органов в наружных мутовках. Установлено,
что во 2-м интроне гена AG есть цис-элементы (С А<}-бокс), с которыми
связываются белки с доменом MADS, и цис-элементы, с которыми
связывается белок LFY. Более того, одни элементы обуславливают
транскрипцию гена A G в 3-й, а другие — в 4-й мутовке.

Кгдастральные гены

Так называю! гены, определяющие пространственные границы
экспрессии других генов. Ген SUPERMAN (SUP), кодирующий
транскрипционный белок с доменом «цинковые пальцы» типа Cys2
His2 и экспрессирующийся по границе между 3-й и 4-й мутовками,
важен для определения места экспрессии гена АРЗ В-класса.
У мутантов sup в результате экспрессии гена АРЗ в центре ФМ
появляются дополнительные тычинки в расширенной 4-й мутовке.
Считается, что ген SUP поддерживает границу между 3-й и 4-й
мутовками, что определяет правильную границу экспрессии гена
АРЗ, хотя молекулярные механизмы этого процесса не совсем
ясны. Ген RABBIT EARS (RBE), похожий на SUP, препятствует
экспрессии гена A G во 2-й мутовке. Другим негативным регулятором
AG является кадастральный ген LEUN1G (LUG). Белок LUG
в составе мультибелкового комплекса, включающего гистоновые
деацетилазы HDAC (ферменты, которые деацетилируют гистоны
и делают хроматин более компактным и менее доступным для
транскрипционных факторов) подавляет транскрипцию AG в 1 и 2-й
мутовках. Недавно установлено, что в состав этого мультибелкового
комплекса обязательно входит и белок API. Следовательно, не только
ген АР2, но и второй ген A-класса API оганичивает экспрессию гена
С-класса в наружных мутовках.
Регуляция транскрипции геиос 3 и С-классов белками группы

Poiycomb (PcG)

Описанные выше механизмы транскрипционной регуляции вызывают,
кратковременное изменение уровня транскрипции генов, которое зависит
ог присутствия в клетке транскрипционных белков и их корегуляторов.
Однако, кроме этих механизмов, в регуляции транскрипции генов,
контролирующих тип органов цветка, используются и эпигенетические
механизмы, вызывающие долговременное «замолкание» генов. В главах
2 и 8 описано участие белков PcG в эпигенетическом подавлении
транскрипции MADS-генов, участвующих в контроле развития
эндосперма и потребности в яровизации. MADS-бокс содержащие гены
API, АРЗ, PI и AG также являются мишенями белкового комплекса
PcG (рис. 14.7), в cociae которых обязательно входят гистоновые
метилтрансферазы. Стабильное эпигенетическое подавление экспрессии
АНС-генов важно для предотвращения их активности на ювенильной
стадии развития растений. Мутации в генах EMBRYONIC FLOWER
(EMF2) и CURLY LEAF (CLF), кодирующие белки PcG, приводили
к раннему переходу растений на репродуктивную стадию развития и к
эктопической экспрессии всех MADS-гепов ABC-классов. Так, например,
ген AG у таких мутантов начинает экспрессироваться прямо в листьях
молодых проростков, а не только в репродуктивных органах цветка, как
в растениях дикою типа.

Таким образом, у растений, как и у животных, PcG-белки
вызывают метилирование гистонов и подавление транскрипции

комплекс FIS

комплекс EMF

комплекс VRN

MSI1

F-S2

РНЕ1

Ген РНЕ1 (тип MADS h
участвует ь инициации
развития эндосперма

MSi-t	EMF2

AG, АРЗ etc

MSI1" VRN2

FLC

Ген FLC (тип MADS II)
контролирует потребность
к яровизации

Гены AG, АРЗ (тип MADS II)
участвуют в определении
типа органов цветка

Рис 14 7 Белковые комплексы группы Poiycomb Arabidopsis thaliana подавляют транс-
крипцию AMDS-генов, контролирующих мны ие процессы орогенеза. Показано строение
разных клиплексов и их мишени (модифицировано по Chanvivattana et al, 2004)
генов-мишеней. Только у растений такими мишенями являются не
гомеобокс-содержащие, а MADS-бокс-содержащие гены.

Посттранскрипционный уровень регуляции

Посттракскрипционный уровень регуляции также важен
для правильной локализации экспрессии генов. Как отмечалось
выше, ген A-класса АР2 транскрибируется по всей ФМ и во всех
вегетативных тканях растений дикого тина Однако в цветке его
активность проявляется только в 1-й и 2-й мутовках. Это связано
с наличием в 3—d-й мутовках микроРНК (miPHK), которые блокируют
т рансляцию мРНКЛР2. В геноме A thaliana найдены 4 похожих гена
микроРНК — miR172a-l. 172а-2, I72b-1, 172Ь-2, имеющих участки
гомологии с мРНК АР2. Эти маленькие гены экспрессируются в 3-й
и 4-й мутовках и блокируют там экспрессию АР2. Растения 35S::
miRl72 имели фенотип мутантов ар2, что связано не со снижением
уровня мРНК АР2, а с уменьшением уровня белка АР2. Это позволяет
объяснить и тог факт, что растения 35S::AP2 имели фенотип, близкий
к дикому типу. В таких растениях есть высокий уровень мРНК АР2,
но лишнего белка нет из-за нарушения трансляции. Трансгенные
растения 35S::AP2 ml экспрессирующие под промотором 35S
дополнительную копию гена АР2 с мутациями в области гомологии
с miR 172, имели фенотип мутантов ag (рис. 14.8). Следовательно,
белок АР2, который не разрушается из-за снижения гомологии
с miR 172, подавляет экспрессию AG, что подтверждает негативную
регуляцию генов В классов генами А-класса.

Гиббереллин также участвует в регуляции генов, детерминиру-
ющих органы цветка: он усиливает транскрипцию генов В-и С-класса,
подавляя активность белков RG А и RGI .2 с DF.LLA-доменом, которые
являются негативными регуляторами гиббереллинового ответа.

14.5.	Определение границ между органами цветка

Местоположение ФМ и положение органов цветка в мутовке
определяется тремя основными группами факторов. Во-первых, так
же как и в определении положения примордиев листа, важную роль
играют локальные градиенты ауксина. У мутантов с нарушением
функции одновременно в нескольких генах, контролирующих синтез
ауксина (например, у двойных и тройных мутантов A. thaliana по
генам флавин-монооксигсназы yucl уис4 и yucl уис2 уисб), а также
у мутантов с нарушением полярного транспорта этого гормона pin
и pid наблюдаются похожие аномалии развития: ФМ либо вообще
нс развиваются, и цветонос похож на булавку (у мутантов с высокой
ч л т л

Рис. 14 8 МикрпРНК - новый компонент АВСЕ модели (модифицировано по Chen, 2004;

Jack 2064)

А, Б, В, Г—цветки растений дикого тина, мутанта ар2, трансгенного растения 35S:. miR172
и 35S. АР2 ml соответственно; Д—модифицированнаг АВСЕ-моцель; Е — экспрессия
мРНК miR172 в тычинках и плодолистиках развивающегося цветка (in situ гибридизация)

экспрессивностью), либо на цветоносе образуются несколько
цветков с аномалиями развития всех органов. Во-вторых, для
нормального развития органов цветка необходима функция генов,
определяющих границы между мутовками, а также границы между
самими органами. Главную роль вустановлении границ играют гены
CUC1,2,3, пространственно разграничивающие все органы—листья
(см. главу 10), ФМ, органы цветка. Подавляя клеточные деления
вокруг примордиев органов и между ними, эти регуляторные гены
обеспечивают нормальное развитие самих органов. Нарушение
функции генов CUC приводит к слиянию органов, особенно
чашелистиков, к нарушению органотаксиса. Похожий фенотип
и у мутантов с нарушением функции регуляторного гена PETAL
LOSS {РТЕ), который отличается от генов CUC тем, что проявляет
свое действие только в цветке, пространственно разграничивая
чашелистики

Пространственные особенности и уровень экспрессии генов CUC
и PTL зависят от распределения ауксина, который, накапливаясь
в участках развития будущих органов, подавляет экспрессию
генов-«пограничников» в самих примордиях, заставляя их
экспрессироваться только на узких пограничны! участках.
В-третьих, функция генов AS/, AS2 и JA G-экспрессирующихся
в примордиях развивающихся органов (в том числе, и листьев, см.
главу 10), также необходима для ограничения доменов экспрессии
генов CUC и PTL. В цветках двойных мутантов asl jag и as2 jag из-
за распространения доменов экспрессии, подавляющих клеточные
деления генов CUC и PTL, чашелистики и лепестки недоразвизы
или превращаются в маленькие филаментоподобные струкгуры.

14.6.	Роль гена AG в подавлении пула стволовых клеток
в меристеме цветка

ФМ, как и НАМ, содержит пул стволовых клеток, который
необходим для развития полноценного цветка. Поддержание пула
стволовых клеток осуществляется с участ ием тех же генов, что и в П АМ
(см. главу 9). Тем не менее после развития примордиевтычинок и пестика
пул меристематических клеток в цветке исчерпывается, и клетки
вступают на путь конечной дифференцировки. Это объясняется
тем, что гомеозисный ген AG, отвечающий за детерминацию
репродуктивных органов цветка, обладает еще одной функцией —
подавляет транскрипцию гена WUS, поддерживающего в центре ФМ
пул стволовых клеток. Транскрипция гена AG в центральной зоне
ФМ активируется двумя транскрипционными факторами — LFY
и WUS, которые связываются с регуляторными цис-элементами,
расположенными во 2-м интроне гена AG (рис 14.9)

В отличие от гена CLV3, экспрессия которого должна постоянно
поддерживаться геном WUS, ген A G зависите! гена ИГЛ'только на самых
начальных этапах, после чего его экспрессия становится независимой
от WUS. Сразу после появления примордиев тычинок и пестика ген
AG подавляет транскрипцию WUS, что приводит к исчезновению пула
стволовых клеток и терминации развития цветка. У мутантов agген WUS
поодолжаст работать, ФМ продолжает функционировать, и поэтому
в цветке развиваются многочисленные органы. Если растения мутанта
ag выращивать в условиях сниженного уровня гена LFY (на фоне
гетерозиготности по мутации Ify и в условиях КД), то из центральной
части махровых цветков мутанта могут вырастагь новые побеги, т. е.
наблюдаются реверсии ФМ в ПАМ.

14 7. ДВОЕ модель

Хотя АВС-модель позволила объяснить изменения морфологии
цветка одиночных, двойных и тройных мутантов, одновременная
эктопическая экспрессия генов ABC-класса не превращает листья
Рис 14.9. Ген AG - регулятор транскрипции гена WUS вс флоральной меристеме (ФМ}

(модифицировано по Lenhard et al.. 2001, Shanna et al. 2003)

В ПЛМ поддерживается постоянство пула ствсловых клеток благодаря взаимодействию
генов WUS и GLV (слева вверху). Во ФМ активируетсг ген AG которой регрессирует ген
WUS У мутантов ag ген MS продолжав’ экспрессироватося в центре ФМ (справа внизу)

в органы цветка. Это объясняется тем, что продукты генов АВС-
классов для осуществления функции регуляции транскрипции
нижестоящих генов-мишеней должны образовать белковый
комплекс с продуктами еще одной группы генов, названной
классом Е. У A. thaliana этот класс включает 4 гена с MADS-
боксами: SEPALLATA1 (SEP1), SEPALLATA2 (SEP2), SEPALLATA3
(SEP3) и SEPALLATA4 (SEP4). Гены SEP частично дублируют
функцию друг друга, поэтому мутации единичных генов не приводят
к гомеозисным превращениям. Это объясняет причину того, почему
их нашли позже, чем ABC-гены. У тройных мутантов sepl sep2
sep3 меристема цветка становится недетерминированной, и органы
цветка представлены одними чашелистиками (sepal — чашелистик;
отсюда— название генов), что похоже на фенотип двойного мутанта
по генам класса В и С (арЗ ag и pi ag). У четверного мутанта sepl
sep2 sep3 sep4 вместо чашелистиков развиваются листоподобные
структуры, т. е. происходит нарушение программы метаморфоза
листьев в органы цветка Похожий фенотип описан у петунии Petunia
hybrida, у которой в результате явления косупрессии перестают
экспрессироваться гены FBP2 и FBP5, которые также относятся
к Е-классу. Гены Е-класса найдены и у других видов растений.

У трансгенных растений A.thaliana, эктопически экспрессирующих
1ены А и В классов вмест е с одним из генов SEP (например, 3.5S::SEP3),
Рис. 14.10. Превращение листьев растений Arabidopsis thaliana в лепестки у трансгенных
растений эктопически экспрессирующих гены А, В и Е-классов (по PeLz et al., 2001).

листья розетки начинают превращаться в лепестки, а при экспрессии
вместе с генами А- и В-классов двух генов SEP (35S::SEP2 и 35S::SEP3,
рис. 14 10) это превращение становится полным.

Путем анализа взаимодействий между генами АВС и Е-классов,
изучения фенотипа разных трансгенных растений A. thaliana, а
также анализа взаимодействия между белками установлено, что
продукты генов А ВСЕ-классов—белкисМАОБ-доменамиработают
в составе белковых «квартетов» (рис 14.11), в которых продукты
генов Е-клаеса выполняют функцию стабилизации и скрепления
(склеивания) белков Состав таких белковых комплексов определяет
специфичность связывания с цис-элементами (САт( 1-бокс) тех генов-
мишеней, которые будут участвовать в регуляции дальнейшей
дифференцировки клеток по пути, детерминированному генами
АВСЕ-классов.

Авторегуляция транскрипции генов В- и С-классов, а также
взаимная регуляция генов ABC-классов также осуществляется
белковыми комплексами, в состав которых обязательно входят белки
SEP. Белки SEP могут участвовать также в образовании белковых
комплексов, контролирующих инициацию цветения.

Таким образом, гены Е-класса необходимы для образования
функционально активных белковых комплексов. Эти комплексы
определяют тип органа цветка в соответствии с присутствием
в них белков, которые кодируются ABC-генами: в 1-й мутовке
под влиянием продуктов генов A-класса включается программа
развития чашелистиков, во 2-й (белки А и В) — лепестков, в 3-й
(белки В и С) и 4-й (С) — тычинок и плодолистиков соответственно.
Следовательно, обнаружение нового класса генов не изменило
основных положений ABC-модели, но позволило детализировать се
молекулярные механизмы. Кроме того, эта информация позволяет
Рис. 14.11. Тетрамерные регуляторные белковые комплексы, определяющие тип органов
цветка в соответствии с моделью АВСЬ (модифицировано ио Kiizek, Fletcher, 2005)

сегодня получать цветки с любым типом органов в любой мутовке,
создавая разные функционально активные сочетания работающих
генов на основе использования мутантов и трансгенных растений.

У петунии путем анализа мутантов были идентифицированы М ADS-
гены, которые участвуют в развитии семяпочек FBP7 и FBP11. Эти гены
экспрессируются в семяпочках, и нарушение их функции приводит
к превращению семяпочек в плодолистикоподобные структуры. При
супсрэкспрсссии этих генов на чашелистиках, а иншда и на лепестках
развиваются семяпочки. Гены предпожено относись к генам D-класса.
Однако пока не ясно, консервативна ли функция этих генов.

14.8.	Мишени гензв АВС-классов

Регуляторные гены АВС-классов запускают программы дифферен-
цировки разных органов цветка, активируя транскрипцию генов-
мишеней. Глобальный анализ транскрипции генов, которые работают
в разных органах цветка дикого типа и гомеозисных мутантов А.
thaliana, позволил выявить гены, специфически экспрессирующиеся
в разных типах органов. В чашелистиках и лепестках таких генов
оказалось немного — 13 и 18, ав более сложно устроенных
репродуктивных органах — тычинках и пестике — более 1100
и более 260 соответственно. Функция большинства из этих генов
пока не определена, и остается не понятно, являются ли они
непосредственными мишенями MADS-белков АВСЕ-классов или
индуцируются какими-то пока нс установленными посредниками.
К непосредственно регулируемым генами В-класса (белковым
«квартетам», в состав которых входят белки АРЗ и PI), относится
ген NAC-LIKE, ACTIVATED BY АРЗ/Р1 (NAP) Этог ген также
регуляторный; кодирует транскрипционный фактор семейства NAC,
специфичный для растений (к этому семейству относится ген CUC2),
и контролирует переход клеток от делений к растяжениям при развитии
лепестков и тычинок.

Мишенью гена AG является ген SPOROCYTELESS (SPL),
который называют также NOZZLE. Ген кодирует транскрипционный
фактор, необходимый для развития семяпочек и ранних этапов
микроспорогенеза. На более поздней стадии развития пыльников
мишенью AG является другой ген — ген DEFECTIVE IN ANTHER
DEHISCENCE] (DADI), контролирующий начальный этап
синтеза жасмо.човой кислоты. Именно этот фжогормон важен для
заключительных этапов формирования фертильных тычинок —
созревания пыльцы, роста тычиночной нити и, наконец, раскрытия
пыльника. Ген AG активирует транскрипцию DAD1, связываясь
с CArG-боксом. Интересно, что в гене DAD1, как и в гене SUR этот
цис-элемент располагается не в регуляторной области и не в интроне
(как у большинства генов), а в кодирующей части. Регуляция геном
AG генаDAD1 осуществляется, по-видимому, независимо от наличия
продуктов генов В-класса, вместе с которыми AG контролирует
ранние этапы детерминации развития этих органов.

Среди генов, активируемых геном SEP3,y A. thaliana обнаружены
гены ауксинового ответа (как ARF, так и AUX-IAA гены), а также
гены, регулируемые гиббереллином и брассиностероидами. По-
видимому, MADS-белки могут модулировать фитогормональный
ответ, что необходимо для дифференцировки органов цветка.

14.9.	Консервативность функции АВСЕ-генов и эволюция
структуры цветка

Создание АВ('-модели стимулировало исследования по генетике
развития цветка на разных видах растений. У довольно большого числа
видов клонированы гомологи ABC-генов. Для изучения их функции
анализирую! особенное™ их экспрессии, изучают фенотип мутантов
и трансгенных растений с инактивированными или эктопически
экспрессирующимися генами. В том случае, когда растение трудно
трансформировать или результаты трансформации сложно и долго
изучать (у древесных), анализируют эффекты гетерологичной экспрес-
сии исследуемых генов в растениях A. thaliana (реже — табака). Из
большого числа выполненных работ можно сделать несколько выводов.
1.	У исследованных представителей современных покрытосе-
менных наблюдается соответствие фенотипа мутантов и трансгенных
растений с предсказанными на основе АВС-модели. Это, прежде
всего, касается генов В- и С-классов. Мутанты по этим генам описаны
не только у двудольных (например, у петунии), но и у однодольных
растений (кукуруза, рис). У злаков цветки имеют своеобразное
строение. В центре, как и у всех покрытосеменных, находятся
тычинки и плодолистики. Снаружи они окружены чешуевидными
органами — верхней цветковой чешуйкой (наружная часть цветка)
и лодикулами (между наружной чешуйкой и тычинками), которые не
рассматриваются некоторыми исследователями как элементы цветка,
а считаются прсдлистьями. Другие исследователи считают, что
верхняя цветковая чешуя образовалась в результате срастания двух
листочков околоцветника наружного круга, о чем говорит наличие
у нее двух боковых жилок и отсутствие средней жилки. Лодикулы же
представляют собой редуцированный внутренний круг околоцвет-
ника. Т. е. I щеток злаков рассматривается как производи ый отти личного
цветка однодольных, имеющего околоцветник из 2 кругов. Есть и 3-я
точка зрения: к околоцветнику относятся только лодикулы, а верхняя
цветковая чешуя является предлистом. Исследования на мутантах
кукурузы Zea mays и риса Orisa sativa показали, что нарушения
имеющихся в их геномах ортологов rs\\ouAP3/DEF Arabidopsis thaliana
и Antirrhinum majus, получивших название SILKY 1 и SUPERWOMAN 1
соответственно, приводят к заменам лодикул на чешуи (palea- или
lemma-подобные органы), а тычинок на плодолистики, что очень
похоже на структуру мутантов по генам класса В у модельных видов.
Эти данные с точки зрения АВС-модели указывают на гомологию
верхних цветковых чешуй злаков с чашелистиками двудольных
и гомологию лодикул с лепестками.

Функции выявленных у злаков гомологов генов класса А и С менее
очевидны. У герберы Gerbera hybnda — двудольного растения из
семейства сложноцветных — обнаружено 2 гомолога С-класса —
GAGA1, GAGA2. Экспрессия одного из них в антисмысловой ориента-
ции (у таких трансгенных растений на посттранскрипционном уровне
блокируется экспрессия собственного гена) приводила к превращению
тычинок в лепестковидные структуры и появлению некоторых
признаков чашелистиков у плодолистиков в 4-й мутовке. Кроме того,
как и у мутантов A. thaliana и A. majus ag и pie, у трансгенных растений
герберы продолжалась пролиферация в центре цветка, которая
приводила к развитию дополнительных органов, похожих на органы
1-й и 2-й мутовок.
2.	Наблюдается соответствие между особенностями экспрессии
гомеозисных генов и структурой цветка. Так, например,
в соответствии с предсказаниями ABC-модели, образование
лепестков на месте чашелистиков может произойти, если гены
В-класса будут экспрессироваться не только во 2-й и 3-й мутовках,
но и в 1-й (рис. 14.12 А). Именно такой характер экспрессии
обнаружен в цветках лилейных (у тюльпана Tulipa gesneriana
и лилии Lilium regale), у некоторых представителей гиацинтовых,
агапантовых и орхидных. Интересно, что, как и ген Pl A. thaliana,
его ортолог из генома тюльпана TgGLO экспрессируется шире (даже
в 4-й мутовке), чем гены ортологи АРЗ/DEF (их у тюльпана два —
TgDEFA, TgDEFB). Образование в наружной мутовке некоторых
двудольных лспестковидных органов (у водосбсров Aquilegia alpina
и A. clematiflora, семейство лютиковые) также обусловлено более
широкой экспрессией генов класса В.

В цветках Rumex acetosa экспрессии генов В-класса в околоцветнике
не наблюдали (экспрессия генов класса В была ограничена 3-й
мутовкой — рис. 14 12 Б), что превращало венчик в круг из
чашелистикоподобных органов. При расширении домена экспрессии
генов класса С лепестки могут превращаться в дополнительные
тычинки, что наблюдали у некоторых представителей Macleaya
(Papaveraceae) (рис. 14.12 В). У злаков (например, риса) особенности
экспрессии генов АВС-классов не отличаются от таковых у A. thaliana
и львиного зева (рис. 14.12 Г).

Экспрессия в органах лепестковидного околоцветника
однодольных генов В-класса позволяет говорить о том, что в основе
развития этих органов, традиционно называемых не лепестками,
а лепестковидными органами (tepals), лежит та же генетическая
программа, что и у лепестков двудольных. По-видимому, программа
развития лепестков функционировала уже у общих предков всех
покрытосеменных, а не возникла заново у двудольных. Впрочем,
генетикам еще рано ставить точку в спорах между ботаниками.
Число исследованных представителей современных и базальных
видов покрытосеменных еще очень невелико, и охвачены далеко
не все таксоны. Сюрприз недавно преподнес анализ экспрессии
генов В-класса у аспарагуса Asparagus officinalis — однодольного
растения с двойным лспестковидным околоцветником. В отличие
от лилейных (например тюльпана Tulipa gesneriana), не обнаружено
транскрипции этих генов в наружной мутовке цветков аспарагуса,
т. е развитие околоцветника не связано с функцией генов В-класса,
которые вместе с генами A-класса у лилейных отвечают за развитие
Рис 1412 Различия в строении цветка - результат изменения доменов экспрессии
гомеозисных генов (модифициропано по Theissen, Melzer 2007)

Лп—лепестковидные органы; Вч — верхние чешуи;) to — лодикулы; остальные обо -
значения — как на рис. 141

лепссгковидного околоцветника (рис. 14.13). Это может означать,
что развитие околоцветника у аспарагуса является результатом
конвергентной эволюции, основанной на использовании других
генетических механизмов. Однако эти результаты могут объясняться
и тем, что гены, отвечающие за развит ие околоцвет ника у аспарагуса
еще не найдены. Возможно, что в геноме этого растения, кроме
трех выявленных (AoDEF, похожего млАРЗ/DEF, AoGLOA, AoGLOB,
похожих на P1/GLG"), есть другие гомологи генов В-класса, которые
и выпол н яют функцию В при развитии цветка. Есть и 3-е объяснение.
Выявленные гены являются истинными ортолог ами генов В-класса.
Они транскрибируются только во 2-й и 3-й мутовках, но их продукт
способен перемещаться в наружные мутовки, где вмест е с белками
генов A-класса отвечает за развитие лепестковидных структур.
Пример аспарагуса показывает, как важны для изучения вопросов
эволюции развития исследования мутантов и трансгенных
растений, без которых невозможно исследовать функцию гена на
уровне целого растения.

3.	Образование четких границ между доменами экспрессии
генов ЛВС-классов происходило постепенно в процессе эволюции.
У представителей базальных видов покрытосеменных (Amborella,
Nuphar, Illicium, Magnolia, Asimia) строение цветка показывает
большое разнообразие Часто наблюдается варьирование числа
органов, спиральное расположение, переходные формы между
12	3	4

Лп Лп Т П

12	3	4

• AoGLOAoDFF

Лп

Рис 1413 Строение цветка однодольных Tulips gesnenana и Asparagus officinalis и его
объяснение с позиций АВС-модели (модифицировано по Kanno el al, 2007)
Особенности экспрессии генов В-класса (igDEFA, TgDEFB, fgGLOB) в цветке тюльпана со
отвегс'вует предсказаниям АБС-модели, поскольку совместная зксгрессия трех выявлен
ных взаимодействующих ортологов наблюдается в 1,2 и 3 й мутовках. В цветке аспаоа"у-
са ни один из выявленных предположительных генов В классе не экспрессируемся в 1-й
мутовке что противоречит АВС-модели

разными типами органов. Оказалось, что в цветках этих видов нет
четких траниц между доменами экспрессии генов АВС-классов,
домены экспрессии генов А- и С-классов перекрываются. Не-
видимому, установление четких границ экспрессии — результат
возникновения в процессе эволюции новых регуляторных систем
и генных взаимодейст вий, определяющих домены экспрессии АВС-
генов и границы между ними (см. выше).

4.	Гены В- и С-классов возникли у предков семенных растений
300 -400 мл н леттому назад. Они найдены у голосеменных и гнетовых
Gnetum gnemon. Ортологи генов класса С идентифицированы
также у цикадовых и гинкговых У мхов и папоротников также
были найдены несколько генов MIKC-типа, однако ортологов
генов классов В и С среди них не выявлено. Следовательно,
гомеозисные гены семенных растений возникли в результате
дупликации предковых MlKC-генов споровых и их последующей
дивергенции, после отделения линии папоротников. Особенности
экспрессии в растениях голосеменных генов классов В и С
похожи на таковые у покрытосеменных: гены С-класса работают
в обоих типах репродуктивных органов, а В-класса — только
в мужских репродуктивных органах (стробилах). Более того, гены
голосеменных могут частично компенсировать утрату функции
генов В- и С-классов у мутантов A. thaliana, что свидетельствует
о консервативности их функции. Очевидно, что эти гены являются
древними полоонределяюшими генами всех семенных растений,
причем гены В-класса осуществляют переключение с образования
женских половых органов на мужские. На основании этих данных
выдвинуты гипотезы о генетических механизмах возникновения
предкового цветка покрытосеменных, который предположительно
был обоеполым с удлиненной осью, большим и неопределенным
числом свободных частей. Согласно одной из них бисексуальный
цветок возник из мужской стробилы, у которого в апикальной
части гены В-класса перестали экспрессироваться (‘out-of-male’
сценарий). Согласно другой (‘out-of-female’), бисексуальный
цветок произошел из женской стробилы в результате экспрессии
в ее базальной части генов класса В. Пердполагаемое обеими
гипотезами изменение пространственных особенностей экспрессии
генов В-класса могло происходить под влиянием изменений их
цис-элементов, а также изменений особенностей экспрессии так
называемых транс-действующих факторов, т. с. продуктов генов,
регулирующих транскрипцию генов В-класса.

Околоцветник возник позже, чем репродуктивные органы. Можно
было бы предполагать, что его появление было связано с появлением
генов класса А, однако гены класса А не являются консервативными.
Хотя гомологи генов этого класса обнаружены у многих видов
цветковых растений, до сих пор только для A thaliana доказано их
участие в развитии околоцветника. Для отдельных видов показано,
что гомологи гена API вовлечены в контроль инициации развития
флоралыюй меристемы, однако участие в развитии околоцветника не
подтверждается. Ген API A. thaliana показывает некоторое структур-
ное и функциональное сходство с генами Е-класса (особенно SEP3).
Высказано предположение, что развитие околоцветника у предковых
форм покрытосеменных было связано с появлением новых генов,
которые затем дали начало генам SEP и API, причем у одних видов
главную роль в развитии околоцветника стали играть гены API, а
у других — гены SEP. Эту гипотезу надо еще доказывать, однако уже
сегодня ясно, что гены SEP и API есть только у покрытосеменных,
поскольку их гомологов не удалось выявить у хвойных, цикадовых,
гнетовых, гинкговых. Более того, предполагается, что именно
с появлением генов А- и Е-классов открылись принципиально новые
возможности образования белковых «квартетов», которые позволили
осуществлять более точную спецификацию разных органов и сыг-
рали главную роль в появлении цветка.

14.10.	Генетический контроль симметрии цветка

Симметрия — одна из самых важных характеристик строения
цветка. Цветки делят на актиноморфные (правильные или
радиально симметричные), через которые можно провести
несколько плоскостей симметрии, каждая из которых делит
его на две равные части, и зигоморфные (неправильные или
нерадиально симметричные), через которые можно провести только
одну вертикальную плоскость симметрии. Зигоморфные цветки
чаще всего опыляются насекомыми, следовательно, асимметрия
и энтомофильность эволюционировали вместе. Изменчивость по
признаку симметрии цветка была описана еще Карлом Линнеем,
который описал растения льнянки обыкновенной (Linaria vulgaris)
с актиноморфными цветками (рис. 14.14). Великий систематик
выдвинул очень смелую революционную идею для того времени,
что льнянка является родоначальницей нового таксона, и даже
отнес найденных «монстров» к отдельному виду и роду (Peloria
genistifolia). Сегодня загадка пелорических цветков Линнея начала
приоткрываться благодаря исследованиям на львином зеве A. majus,
который является близким родственником льнянки (норичниковые).

У A. majus цветки билатерально симметричные с ярко выражен-
ными различиями между лепестками (верхние, боковые и нижние
лепестки) и тычинками (развиваются 2 нижних и 2 боковых тычинки,
а развитие 5-й, которая располагается между двумя верхними
лепестками, блокируется). Симметрия контролируется 4 генами,
кодирующими ТФ, относящиеся к двум семействам. Ген CYCLOIDEA
(CYC) и его паралогD1CHOTOMA (DICH) относятся к семейству TCP
и отвечают за детерминацию дорзальной (верхней) части цветка.
Нарушение активности этих генов приводит к формированию
актиноморфного цветка, что особенно ярко проявляется у двойных
мутантов eye dich. Все лепестки мутантов похожи на нижние лепестки
цветков дикого типа. Кроме того, в цветке развиваются не 4, а 5
полноценных тычинок. Т. е. как и у пелорических цветков льнянки,
мутации сус и dich приводят к вентрализации цветка. Транскрипция
гена RADIALIS (RAD) активируется генами CYC и D1CH, которые
экспрессируются в дорзальной части развивающегося цветка.
Небольшой способный к перемещениям между клетками MYB-бе-
лок R AD подавляет в дорзальной и латеральной частях цветка работу
дикий тип

сус

Рис. 14.14. Изменения симметрии цветка у львиного зева и льнянки и генетический
контроль зигаморфноеги (модифицировано по Corley et al, 2005).

Сг.евг показаны зигомирф1 ые цветки растений дикого типа и актиноморфные цветки му-
тан1 а сус львиного зева и пелории льнянки. Справа сверху—схема структуры зигоморф-
ного и актиноморфного цветка, снизу показаны участки экспрессии генов, детермини
руюдих верхнюю и нижнюю части цветка и представлена модель их взаимодействия

гена DIVARICATA (DIV), который выполняет функцию развития
латеральных и нижних лепестков и, как и RAD, относятся к семейству
MYB-генов. Таким образом, формирование зигоморфного цветка —
результат взаимодействия между генами, которые осуществляют
детерминацию развития дорзальной и вентральной частей цветка.
Действие этих генов напоминает работу генов, контролирующих
поляризацию листа у A. thaliana и A majus (см. главу 10), а также
генов, осуществляющих дорзо-вентральную разметку эмбриона
дрозофилы.

Неравномерное развитие лепестков и тычинок в зигоморфных
цветках может объясняться тем, что мишенями генов,
контролирующих дорзо-вентральную разметку цветка, могут быть
гены циклинов. Репрессируя их транскрипцию, гены «асимметрии»
подавляют деления клеток в определенных участках флоральной
меристемы, создавая зигоморфный цветок.

После клонирования гена CYC у львиною зева был клонирован его
гомолог из льнянки. Оказалось, что пелорические формы—результат
эпигенетического замолкания гена CYC льнянки в результате
метилирования ДНК в промоторной области гена и его начале.
Метилирование ДНК затрудняет связывание транскрипционных
факторов с регуляторными участками гена, поэтому уровень его
транскрипции снижается. Эти данные хорошо объясняют причину
нестабильного проявления признака актиноморфпости цветка
льнянки. В литературе описаны растения льнянки, у которых
развивались одновременно зигоморфные и актиноморфные
цветки. Кроме того, среди потомства пелорических растений не
наблюдали четких генетических закономерностей расщепления
по типу симметрии цветка, признак наследовался нестабильно,
что характерно для эпигенетических модификаций. Спонтанно
появляющиеся пелорические формы характерны для многих расте-
ний с зигоморфным цветком (например, губоцветных). Возможно,
что причиной этих изменений также являются эпигенетические
изменения. Отметим, что ген SUP, определяющий границу
экспрессии генов В-класса, также часто эпигенетически замолкает.
Некоторые из эпигенетических гиперметилированных аллелей гена
SUP наследовались чрезвычайно стабильно на протяжении многих
половых поколений как при самоопылении, так и в гибридных
популяциях. Причины того, почему ген SUP является «горячей
точкой» эпигенетических модификаций, пока не выяснены.

Заключение

Развитие цветка — многоэтапный процесс, который следует
за процессом инициации цветения. Если в индукции цветения
определяющую роль играют условия внешней среды, то последующие
этапы значительно меньше зависят от внешних факторов. Как
правило, после индукции цветения растения продолжают программу
развития цветка даже после перенесения их в неиндуктивные усло-
вия. Это объясняется тем, что главную роль в регуляции экспрессии
генов, контролирующих развитие цветка, играют не зависящие
или мало зависящие от условий среды межгенные взаимодействия
и авторегуляторные процессы.

Анализ морфогенеза цветка показываст, что в развитии растений
и животных используются сходные принципы. Радиальная разметка
ФМ на мутовки и разметка тела животных на сегменты/сомиты
осуществляется регуляторными гомеозисными генами, которые
имеют разную молекулярную структуру, но взаимодействуют
по одному и тому же принципу. Они ограничивают эспрессию
друг друга, поэтому нарушение активности одного гена приводит
к тому, что «сосед» начинает экспрессироваться в освободившемся
пространстве, обуславливая явление гомеозиса. У растений,
как и у животных, дифференциальная активность генов может
создаваться градиентами концентраций морфогенов — подвижных
регуляторных или сигнальных белков. К таким белкам, по-видимому,
относятся свободно диффундирующие из клетки в клетку белки LFY,
TFL1 и некоторые другие. Кроме того, у растений, как и у животных,
экспрессия гомеозисных генов регулируется белками группы
PolyComb, а также микроРНК.

Рекомендованная литература

I.	Chatmvattana Y, Bishopp А ., Stock С. et al. Interaction of Polycomb-group proteins
controlling flowering in Arabidopsis // Development. 2004. Vol. 131. P. 5263-5276.

2.	Coen E. C., Meyerowitz E. M. The war of the whorls: genetic interactions controlling
flower development//Nature. '.991. Vol.353. P.31-37.

3	Corley S. B., Carpenter R., Copsey L., Coen E. Floral asymmetry involves an
interplay between TCP and MYB transcription factors in Antirrhinum // PNAS
2005. Vol 102. P. 5068-5073.

4.	Goto K.. Kyozuka J., Bowman J L. Turning floral organs into leaves, leaves into
floral organs // Current Opinion in Genetics & Development. 2001. Vol. 11. P. 449—456.

5.	Jack T Molecular and Genetic Mechanisms of Floral Control // Plant Cell. 2004.

Vol. 16. P S1-S17.

6.	Krizek В A. Arabidopsis: Flower Development and Patterning // Encyclopedia
of Life Sciences. John Wiley & Sons, Ltd: Chichester. 2009 / DOL
10.1002/9780470015902. a0000 734,pub2.

7.	Krizek B. A., Fletcher J. C. Molecular mechanisms of flower development: an
armchair guide // Nature Reviews Genetics. 2005. Vol. 6. P. 688-698

8.	Lenhard M., Bohnert A. Jurgens G. et al. Termination of stem cell maintenance in
Arabidopsis floral meristems by interactions between WUSCHEL and AGAMOUS //
Cell. 2001. Vol. 105. P 805-814.

9.	Pelaz S., Tapia-Lopez R., Alvarez Buylla E. R. et al. Conversion of leaves into petals
in Arabidopsis. Curr. Biol. 2001. Vol. 11. P. 182-184.

10.	Sablowski R. Flowering and Ceterminacy in Arabidopsis. JU Experimental Botany.
2007 Vol. 58. N 5. P. 899-907.

11.	Theissen G., Melzer R. Molecular Mechanisms Underlying Origin and
Diversification of the Angiosperm Flower // Annals of Botany. 2007. Voi. 100.
F. 603-619.
Глава 15

Клональный анализ в изучении
морфогенеза высших растений

151. Основные ппнятия и термины

Органы и ткани растения состоят из многих клеток, имеющих
разное кленовое происхождение. Как оценить вклад разных клонов
в формировании органов и тканей? Когда и каким образом происхо-
дит детерминация клеток меристемы у растения? Руководствуются
ли дифференцирующиеся клетки только заложенной в них генети-
ческой программой или сигналами, поступающими из клеточного
окружения? Какие генетические механизмы определяют поведение
клеток при формировании органов? Отвез на эти вопросы можно
получить с помощью клонального анализа.

Клональный анализ — это совокупность методов, основанных
на генетическом маркировании или удалении отдельных клеточных
клонов, позволяющая изучать взаимодействия клеток (клонов), за
кономерности морфогенеза и выявлять гены, функция которых обе-
спечивает клеточные взаимодействия.

Взаимодействия клезок заключаются в том, что одни клетки
посылают другим (клеткам-мишеням) индуктивные сигналы,
определяющие направление детерминации и дифференцировки,
контролирующие скорость и направление клеточных делений,
изменяющие метаболизм и экспрессию генов. Компетентность
клеток к индуктивному сигналу (способность клеток-мишеней
воспринимать сигнал) зависит от стадии онтогенеза, внешних
(условия окружающей среды) и внутренних (тип ткани, располо-
350 й? Раздел ill. Генетический контроль морфогенеза растений
женис клеток и пр.) условий и определяется наличием на поверх-
ности клеток или внутри нее молекул, способных воспринять или
передать индуктивный сигнал.

Клетки (группы клеток), генерирующие индуктивные сигналы,
выполняют роль организующих центров морфогенеза

Клональный анализ позволяет решать следующие вопросы:

1)	выяснять время и направление генетической детерминации кле-
ток разных клонов, отслеживая судьбу клеток каждого клона
в процессах морфогенеза, т. е. изучать закономерности развития
органов и тканей;

2)	оценивать степень детерминации клеток, экспериментально
воздействуя на клет ку, модифицируя условия среды, меняя кле-
точное окружение;

3)	изучать принципы взаимодействия клеток, принадлежащих
к одному и разным клонам и выявлять те клоны, сигналы кото-
рых определяют поведение клеток других клонов при формиро-
вании тех или иных органов;

4)	анализировать способы передачи индуктивных сигналов клет-
ками и слоями клеток, исследовать природу молекул, которые
выполняют роль индуктивных сигналов и направление их пере-
движений; выявлять участки генов, отвечающие за способность
генных продуктов к перемещениям.

Заметим, что среди всех перечисленных вопросов именно 4-й
является наиболее важным для генетика. Обычно, изучая функ-
цию гена, отдельных доменов кодируемого продукта, исследователь
ограничивается констатацией принадлежности белка (его доменов)
к определенным семействам (т. е к выполнению определенной моле-
кулярной функции) и выявлением локализации белка внутри клетки
(ядро, цитозоль, митохондрии, пластиды, ЭПР) или в апопласте. Од-
нако эта информация не дает возможность отнести белок (и тем бо-
лее небелковый продукт, в образовании которого исследуемый белок
может участвовать) к индуктивным сигнальным молекулам. Ведь
служить индуктивными сигналами и «путешествовать» от клетки
к клетке могут и транскрипционные факторы, а секреторные белки
совсем не обязательно играют роль сигнальных молекул! В настоя-
щее время мы не знаем, какие свойства белка, какие домены застав-
ляют его перемещаться в другие клетки, потому что классификация
белков по их способности к «путешествиям» («автономные» и «не-
автономные» белки) невозможна без исследования мозаиков (химер).
Исследования на химерах позволяют найти тс участки генов (а зна-
чит, и белков), которые необходимы для обеспечения перемещения
белка и обеспечения клеточных коммуникаций.

Без генетических знаний, владения методами генетической инже-
нерии и трансформации нельзя обойтись и при создании мозаичных
или химерных организмов с использованием современных способов
их получения.

15.2.	Генетические химеры, классификация

Химера — термин, пришедший в биологию из древнегреческой
мифологии. Химера — порождение Тифона и Ехидны, чудовище
с головой льва, туловищем козы и хвостом дракона. Немецкий бо-
таник Ганс Винклер в 1907 г. впервые использовал этот термин для
форм растений, полученных им при сращивании (прививке) расте-
ний паслена и томата (Solanum lycopersicum и S.nigrum) Генетиче-
ская химера — организм, состоящий из генетически разнокачествен-
ных клеток, то есть организм мозаичный по генетической структуре
клеток (мозаик).

В биологии развития животных между терминами «химера»
и «мозаик» проводят четкие различия. Мозаиками называют осо-
бей с генетически разнокачественными клетками, возникшими в ре-
зультате спонтанных или индуцированных генетических изменений
(мутаций, перестроек хромосом, потери хромосом), а под химерами
подразумевают лишь организмы, возникшие в результате слияния
клеток двух разных организмов (прививочные или трансплантаци-
онные химеры) У растений принято использовать термин химера
независимо от происхождения генетической разнокачественное™.

Химеризм, связанный с возникновением мутационных наруше-
ний всех типов, называют структурно-генетическим. Судьба му-
тантных клеток зависит от времени возникновения. Рано возник-
шая мутация будет передана большему числу клеток, чем поздно
появившаяся. Нужно учитывать также, что половому потомству
могут быть переданы только мутации, возникшие в клетках генера-
тивного пути, или «генетически эффективных клетках» (рис. 15.1).
Все ткани потомков будут генетически однородными, поэтому ана-
лиз структурно-генетических химер ограничивается одним поло-
вым поколением.

Химеризм по плоидности и числу хромосом наблюдается прак-
тически у всех многоклеточных организмов. Полиплоидные клетки
имеют более крупные размеры, чем клетки меньшей плоидности,
поэтому следить за судьбой таких клеток можно с помощью микро-
скопа.
псрмьлоное
потомстве

Рис. 15.1. Потомство химерных организмов всегда генетически однородно

В природе широко распространены и химеры по мутациям (точ-
ковым, вызванным мобильными элементами или перестройками
хромосом). Выявить структуру химеры и изучать судьбу клеточных
клонов в случае точковых мутаций можно, если они имеют феноти-
пическое проявление — например, изменяют содержание или сост ав
пигментов (хлорофилла и антоциана у растений), что существенно
ограничивает возможности клональною анализа. Если в руках ис-
следователей имеется клонированный ген, то клетки с мутацией, на-
рушающей транскрипцию этого гена, могут быть выявлены по отсут-
ствию мРНК гена методом гибридизации in situ (метод, основанный
на гибридизации мРНК, присутствующей на анатомических срезах
растения, с антисмысловой меченой РНК клонированного гена).

Функционально-генетический химеризм не связан с му-
тационными нарушениями, но вызван различиями клеток (кло-
нов) по уровню экспрессии определенных генов (или трансгенов).
К функционально-генетическому химеризму относятся все случаи
специфической экспрессии генов, лежащие в основе индивидуаль-
ного развития и клеточной дифференцировки. Сейчас у растений
идентифицированы гены, характеризующиеся специфической экс-
прессией в определенных клеточных клонах и отдельных тканях,
начиная с самых ранних этапов их заложения. Поэтому наличие
мРНК таких генов служит хорошим маркером этих тканей и может
использоваться для изучения гистогенеза, влияния на этот процесс
гормональных и других факторов, вопросов взаимодействия генов.
Для выявления мРНК используют метод гибридизации in situ (см.
главу 2), а для выявления продуктов таких специфически экспрес-
сирующихся генов метод иммуноферментного анализа (метод,
основанный на выявлении белков по способности связываться со
м.иксохимерг.

периклинальная

химера

мерьклинапьная
хи мера

Рис. 15.2. Классификация химер растений по характеру распределения мутэятных клеток
в меристеме

Рис 15.3. Миксохимера (слева), возникшая в результате мутации (спонтанной или
инцу ц ированной) или п рививки в клетке меристемы, после нес кэльких делений дает на -
чало мериклинальной химере (в центре). Почка, возникшая из маркированного мутацией
участка, даст начало периклинальной химере (справа)

специфическими антителами; этот метод называют также методом
Вестерн блот гибридизация, или иммуноблоттингом).

Растительные химеры принято классифицировать также по харак-
теру распределения разнокачественных клеток. Как показано в главе
9, апикальная меристема побега (ПАМ) покрытосеменных растений
покрыта несколькими слоями клеток — каждый слой представляет
клоновую популяцию периклинально делящихся клеток. Если раз-
ные слои ПАМ, а следовательно, и их дочерние клетки, имеют раз-
ный генотип, то такие химерные растения называют периклинальны-
ми химерами. Мериклинальные (или секторные) химеры — растения,
у которых генетически отличающиеся клетки захватывают опреде-
ленные секторные участки меристемы и органов. У миксохимер (по
старой терминологии, гиперхимер) генетически разнокачественные
клетки распределены по организму случайным образом (рис. 15.2)

При возникновении миксохимеры в результате мутации (спонтан-
ной или индуцированной, вызванной перемещением транспозона)
из нее также можно получить мериклинальные и периклинальные
химеры (рис. 15.3). Важно лишь, чтобы мугация произошла в мери-
стематической, а не дифференцированной клетке. Тип химерности
растения может изменяться и в ходе индивидуального развития, или
химерное! ь вообще может исчезнуть.

15.3.	Способы получения химер

Существует много разных методов получения химер. Многие
были разработаны и использовались в прошлом веке (1-я группа ме-
тодов), другие появились совсем недавно (2-я группа методов) бла-
годаря развитию методов генетической инженерии и генетической
трансформации растений чужеродной ДНК.

1-я группа методов

•	Объединение генетически разнокачественных тканей (клеток)
путем прививок.

•	Получение структурно-генетических химер на основе спонтан-
ного или индуцированного мутагенеза (отбор соматических ге-
нетических изменений или их индукция с использованием мута-
генов).

•	Получение структурно-генетических химер на основе соматиче-
ской рекомбинации.

2-м группа методов

•	Получение структурно-генетических химер с использованием ин-
дуцированного экспериментатором транспозонного мутагенеза.

•	Получение структурно-генетических химер с использованием
индуцированной соматической рекомбинации, вызывающей уда-
ление трансгена из отдельных клеток.

•	Создание функционального химеризма на основе использования
специфических промоторов для экспрессии трансгена в отдель-
ных тканях.

Прививки — наиболее древний способ экспериментального по-
лучения растительных химер. В античные времена писались целые
тракты о земледелии и садоводстве, излагавшие подробнейшим
образом основные приемы размножения растений отводками, черен-
ками и прививкой. На участке соединения привоя и подвоя клетки
двух генетически различающихся организмов могут смешиваться,
и почки, которые возникают из этих миксохимерных тканей, дают
начало химерному побегу — чаще всего мериклинальной (сектор-
ной) химере. Из мериклинальной химеры можно получить пери-
клинальные химеры (как это показано на рис. 15.3). Еще в 1644 г.
получена химера между померанцем {Citrus aurantium) и цедром
(С. medico), которую назвали апельсином «bizzaria». Исследования
показали, что это периклинальная химера с покровом из померанца
Рис. 154. Различные типы периклинальных химер, которые можно получить при смеше-
нии клеток цвух разных генотипов

и вложением из цедра. /Другая древнейшая и хорошо исследованная
периклинальная химера получена в 1829 г. французским садовником
Адамом при прививке пурпурового ракитника (Cytisuspurpureus) на
желтоцвегный ракитник (Laburnum anagyroides). На месте сраста-
ния выросла ветка с листьями и цветами промежуточного характе-
ра между золотым и пурпуровым ракитником. Цветки на этой ветке
были желто-красного цвета. Вегетативные потомки этой ветки су-
ществуют во многих садах до сих пор и косят название ракитника
Адама (Laburnum adaml).

В общей сложности, имея два генетически различающихся орга-
низма А и В, можно получить 6 типов химер (рис. 15.4). Получив один
тип периклинальной химеры, остальные 5 можно получить, стиму-
лируя процесс разрушения химер, при котором мутантные клетки из
одного слоя могут переместиться в другой или другие слои меристе-
мы. Для этого специально травмируют химерный побег, стимулируя
процесс «инвазии» клеток других слоев и возникновение новых при-
даточных почек и побегов. Применение фитогормонов (например,
ИУК) также может приводить к разрушению химер.

Чтобы следить за судьбой генетически разнокачественных кле-
ток, эксперименты проводят на растениях, которые отличаются по
маркерным визуально легко тестируемым мутациям (пигментация,
опушенность), по экспрессии разных рспортерных генов, по цито-
логическим показа! елям.

Все типы химер и мозаиков могут возникать спонтанно (в ре-
зультате мутаций, перестроек и потерь хромосом, полиплоидии).
Поскольку химерные растения могут поддерживаться вегетативным
размножением и представлять определенный практический интерес,
они издавна привлекают большое внимание. Химеры (спорты) пло-
довых и ягодных культур издавна использовались в селекции. Обще-
известными примерами практического использования «спортивных
уклонений» является сорт яблок «Антоновка-600-граммовая», выве-
денный И. В. Мичуриным, безшипные сорта ежевики (содержат му-
тации в клет ках 1^), сорта персика без опушения (нект арины с мута-
циями в клетках слоя L ), без косточки, со светлой мякотью (мутации
в клетках Ц) и др. Практически все виды вегетативно размножаемых
растений накапливают спонтанные мутации и являются химерами
(плодовые растения, картофель, множество видов декоративных
растений — герань, благородная гвоздика, хризантемы, гиацинты,
тюльпаны и др. луковичные растения). Разнообразие сортов таких
растений часто связано с периклинальным типом химерности.

Первые индуцированные мутагенами химеры получены у рас-
тений Л. Стадлером в 1928 г. При облучении рентгеновскими луча-
ми и радием прорастающих семян ячменя он наблюдал появление
пигментных секторов на побегах. Проще всего получить химеру
или мозаик, если исходный организм является гетерозиготой по
какой-либо видимой мутации. При использовании полудоминант-
ных пигментных мутаций вероятность выявления мозаиков уве-
личивается за счет того, что визуально отличимые сектора можно
получать как в результате прямой, так и обратной мутаций (либо
в результате дслеции любой из аллелей). Например, гетерозигот-
ные растения сои (YU yll), табака {Su su), томата (Ха2 ха2), имею-
щие светло-зеленые или желто-зеленые листья, могут формировать
темно-зеленые и желтые сектора. Хотя мозаики могут быть получе-
ны при использовании разных мутагенов, до сих пор предпочтение
отдается радиационному мутагенезу (Х-лучи, гамма-лучи, быстрые
нейтроны) из-за их способности легко проникать в любую ткань
и отсутствия характерного для ряда химических мутагенов задер-
жанного действия.

Химеры по плоидности (цитохимеры) можно получить, используя
алкалоид безвременника осеннего (Colchicum autumnale) колхицин.
Обработка семян и молодых проростков растений приводит к поли-
плоидизации части клеток, т. е образованию химер, которые успешно
используются в клональном анализе начиная с конца 30-х — начала
40-х годов прошлого века. Полиплоидию можно вызвать (хотя и ме-
нее эффективно) и некоторыми другими агентами (хлоралгидрат),
воздействием низких температур, что использовалось до открытия
колхицина. Спонтанная полиплоидизация — нормальное явление,
имеющее место в онтогенезе растений, однако полиплоидизация
в этом случае затрагивает уже дифференцирующиеся клетки, что де-
лает клональный анализ малоинформативным.

Транспозонный мутагенез также используется для клонально-
го анализа. Мутации, вызванные инсерцией транспозона, характе-
ризуются нестабильностью, что
связано с эксцизией мобильных
элементов и восстановлени-
ем функции генов в отдельных
клетках и их потомках. О вос-
становлении функции гена судят
по фенотипу (например, по по-
явлению пигментированных кле-
ток на фоне лишенных пигмента

Рис 15.5 Возникновение химерное™ в ре- окружающих клеток) или по вос-
зультате соматической рекомбинации становлению транскрипции гена
методом гибридизации in situ.

Соматическая рекомбинация также может приводить к возник-
новению мозаиков. Для получения (выявления) химер путем сомати-
ческой рекомбинации также используют гетерозиготы по видимым
мутациям. Если рецессивной мутацией маркируется только 1 локус,
то рекомбинационное событие трудно отличить от мутационного
(мутация в аллели дикого типа тою же локуса). Если использовать
2 морфологических маркера в отталкивании, то в результате сома-
тического кроссинговера возникают 2 симметричных пятна разною
фенотипа (вероятность возникновения таких двойных пятен в ре-
зультате мутаций ничтожна). Идеальными для выявления мозаиков,
возникших в результате соматической рекомбинации, являются ко-
доминантные видимые маркеры. В этом случае соматическая ре-
комбинация вызывает формирование двойных, а не одиночных (как
мутагенез) пятен (рис. 15.5). Например, растения сои Yll yll, гете-
розиготные по полудоминантной видимой мутации, будут давать
двойные мозаичные участки (желтый и темно-зеленый на светло-
зеленом фоне).

В настоящее время благодаря развитию методов генетической
инженерии и генетической трансформации растений и животных
чужеродной ДНК появился ряд новых высокоэффективных ме-
тодов получения химер, основанных на получении трансгенных
растений и включении в состав чужеродной ДНК репорт ерных ге-
нов, легко детектируемая активность которых может проявляться
в любых клетках. Главное их преимущество перед традиционными
состоит в том, что они снимают основное ограничение вышеука-
занных методов, позволяющих выявлять мутации, транспозиции
мобильных элементов или соматическую рекомбинацию только
при их прохождении в генах, контролирующих легко визуально
тестируемые признаки.
Индуцированный экспериметатором транспозонный мута-
генез основан на получении трансгенных организмов, которые со-
держат генные кассеты, имеющие в своем составе экзогенные транс-
позоны (транспозоны из других видов) и слитые с ними репортерные
гены. Это позволяет получать трансгенные организмы, мозаичные по
наличию в клетках активного репортерного гена — например, гена
и id A (GUS), кодирующего Р глюкуронидазу, или генов GFP, YFP,
кодирующих зеленый и желтый флюоресцирующий белок соответ-
ственно. Последние особенно удобны для наблюдения за динамикой
развития маркированных клоновых популяций репортерных генов,
поскольку их экспрессия тестируется в живых тканях. Хорошо из-
ученные транспозоны растений (кукурузы, львиного зева, петунии)
широко используются в клональном анализе разных видов.

Напомним, что транспозоны бывают автономные (например,
Хс-элеменз кукурузы) и неавтономные (Ds-элемент). Автономные
транспозоны содержат все необходимые для перемещения элемен-
ты — и инвертируемые повторы, которые необходимы для реком-
бинации (вырезания мобильного элемента из генома и встраивания
в новые участки генома), и ген, кодирующий транспозазу. который,
взаимодействуя с инвертированными повторами, обеспечивает пе-
ремещение транспозона. Неавтономные транспозоны содержат му-
тации, которые приводят к нарушению функции гена транспозазы
либо имеют делеции концевых повторов. Для получения химер ис-
пользуются как однокомпонентные системы (на основе одного авто-
номного транспозона), так и двухкомпонентные системы транспозо-
нов (на основе двух транспозонов). Принципы работы этих систем
рассмотрены в главе 2.

В 90-х годах прошлого века разработан новый метод создания
химер (мозаиков), основанный на получении трансгенных растений
и животных, у которых в результате индуцированной соматиче-
ской рекомбинации вызывают удаление трансгена из отдельных
клеток. Метод основан на использовании рекомбиназ дрожжей, бак-
терий и бактериофагов, которые способны узнавать короткие специ-
фические повторы и вырезать фрагменты ДНК. заключенные между
ними. Управлять этим процессом можно, подставив ген рекомбина-
зы под индуцибельный промо гор (например, промотор гена теплово-
го шока). Следить за процессом вырезания удобно с использованием
репортерных генов, встроенных в трансген (см. главу 2).

Та же стратегия может использоваться для получения химеры по
любому изучаемому гену растения. В зависимости от конкретных
задач работы и структуры кассеты трансгенной ДНК. после темпе-
SCR

мРНК

SHR

Рис. 15.6. Специфическая экспрессия гепов A. thaliana в тканях корня
(пс Nakajima, Benfey, 2002)

Транскрипция гена SCR наблюдается в клетках эндодермы (Энд), покоящегося центра
(П ц), инициалах первичной коры и эндодермы (Икэ) и их дочерних клетках (дИкд) Ген SHR
транскрибируется во всех клетках центрального цилиндра (Цц) — в клетках проводящих
тканей, перицикла и его инициалях; его белок обнаруживается ~акже ь слое клеток окру
жающих герицикл и его инициали (в тех клетках, где экспресс!'руетск ген SCR,
ратурного шока можно получать мутантные секторы на фоне тканей
дикого типа или секторы дикого типа на фоне мут антных тканей (см.
главу 2). Это позволяет исследовать роль данного гена в развитии,
способность его продукта к перемещению.

Широкое распространение получили также новые методы по-
лучения функционально-генетической гетерогенности клеток
и тканей у трансгенных организмов В основе индивидуального
развития и клеточной дифференцировки лежит явление дифферен-
циальной активности генов. Гены, характеризующиеся специфиче-
ской экспрессией в определенных клетках и тканях, и их промо го-
ры являются основой для получения функционально-генетического
химеризма. Премоторную и регуляторную часть такого гена можно
слить с кодирующей частью репортерного гена (транскрипционное
слияние) или слить репортерный ген с промотором и кодирующей
последовательностью вышеупомянутых генов (трансляционное
слияние) и передать такой слитый ген в растение с помощью ме-
тодов генетической трансформации. По активности репортерного
гена в клетках трансгенного растения можно следить за мРНК (при
т ранскрипционном слиянии) или белковым продуктом слитою гена
(при трансляционном слиянии), что проще и дешевле, чем при ис-
пользовании метода гибридизации in situ для тестирования мРНК
и иммуноферментного анализа для тестирования белкового продук-
та исследуемого гена. Примеры такого маркирования клеток и тка-
ней приведены на рисунке 15.6.

Все клетки растения, содержащего такой слитый трансгсн, имеют
одинаковый генотип, однако они будут характеризоваться наличием
активности трансгена только в определенных клетках и тканях.
Такие трансгенные растения используют ся для решения тех же во-
просов, что и структурно-генетические химеры. Промоторы специ-
фически экспрессирующихся генов используются и для изучения
способности к передвижению по клеткам мРНК или белкового про-
дукта других генов (пример таких работ показан в этой главе ниже —
в разделе 15.7, см. рис. 15.15). При изучении генов, контролирующих
развитие побега, одним из наиболее популярных является промотор
гена ATML1 (или просто МЫ) A. thaliana, который обеспечивает экс-
прессию слитого гена в слое L . В изучении развития корня исполь-
зуют промоторы, обеспечивающие экспрессию трансгена в проводя-
щей системе, в чехлике, в клетках покоящегося центра и др.

Еще одним способом маркирования отдельных клонов клеток
у растений является кратковременная обработка растений стрепто-
мицином — ингибитором синтеза белков в пластидах. Хлоропласты,
развивающиеся из таких пластид, лишены хлорофилла из-за анома-
лий структуры рибосом. Потомки клеток с аномальными пластида-
ми также являются хлорофилл-дефицитными из-за неспособности
образовывать новую рибосомальную РНК в пластидах даже в отсут-
ствие стрептомицина. Этот цитоплазматический дефект наследуется
по материнской линии (как и описанная еще в начале прошлого века
Э. Бауром и К. Корренсом цитоплазматическая пестролистость), хотя
белые клетки стрептомицин-индуцированных пестролистых расте-
ний не несут мутации в хлоропластном геноме. Этот метод получе-
ния пестролистое™ хорошо зарекомендовал себя ка крестоцветных
и может использоваться для клонального анализа наряду с методами
анализа пестролистых химер, несущих мутации в хлоропластном
или ядерном геномах.

15.4.	Использование химер для изучения явления
детерминации клеток

Детерминация — это процесс, предшествующий дифференци-
ровке, который связан с ограничением потенций клеток. Детерми-
нация не проявляется на уровне фенотипа, но приводит к тому, что
Рис. 15.7. Лист периклинальнш химеры Abim'lon hybndum с мут антными клетками

в слое L, (модифицировано по Golz, Hudson, 2002)

В результате периклинальных делений отдельные клетки слоя L, переместились
в мезофилл (хорошо заметно при большем увеличении этого участка, слева) и пре
вратились в зеленые клетки мезофилла

первоначально плюрипотентная (тотипотентная) клетка становится
коммитированной, т. е. обретает свое предназначение — способ-
ность к дифференцировке по определенному пути. Переход к детер-
минированному состоянию - результат получения клетками индук-
тивных сигналов (или снятия действия других сигналов).

В классических опытах с химерами животных, которые получали
путем пересадки клеток и тканей (в первую очередь, в классических
экспериментах Г. Шпемана на амфибиях, Э. Хадорна на плодовой
мушке) показано, что у животных различия в потенциях клеток про-
являются уже на стадии бластулы, а на стадии поздней гаструды
судьба клеток уже окончательно детерминирована, и все потомки де-
терминированных клет ок ведут себя в соответствии с их клоповым
происхождением, демонстрируя автономность развития. Смена про-
граммы детерминации (явление трансдетерминации. открытое в экс-
периментах на химерных мухах Э. Хадорном) наблюдается с часто-
той, примерно равной частоте спонтанного мутагенеза.

Трансдетерминация клеток растений — обычное явление, кото-
рое можно легко увидеть при изучении химерных растений.

Трансдетерминация клеток побега. Периклинальная химера
Ahutilon hybndum (канатник гибридный) — декоративная разновид-
ность с пигментной мутацией в слое Ц. Мезофилл края листовой
пластинки, образованный клетками Ц, имел светло-желтую лиг-
ментаиию, на фоне которой хорошо заметно вкрапление единичных
зеленых клеток, возникших в результате редких периклинальных
делений клеток эпидермиса, не несущих мутацию. В новом клеточ-
ном окружении потомки эпидермальных клеток, которые обычно
не формируют хлоропластов, превращались в мезофильные клетки
с хлоропластами (рис. 15.7).

Подобных примеров трансдетерминации клеток растений при
смене клеточного окружения в литературе много. Уже в первых
работах, выполненных Э. Бауром на химерах, отмечалось, что
при вегетативном размножении химер могут наблюдаться пере-
стройки их структуры — перемещения клеток из одних слоев
в другие. Чаще всего отмечается выход нижележащих слоев на-
верх. Описана форма петунии с белоокаймленными листьями
(слои L, L, давали начало клеткам без хлорофилла, Ц — зеле-
ным клеткам). Чашелистики этой химеры имели противополож-
ную окраску за счет того, что белые клетки слоя Ц в процессе
онтогенеза замещались зелеными клетками из слоя L . Вытесне-
ние белых тканей зелеными в процессе онтогенеза встречается
достаточно часто и может объясняться замедленным развитием
первых. Благодаря таким замещениям, растения могут сохранять
нормальную структуру органов, характерную для данного вида.
Наиболее полная сводка таких наблюдений приведена в моно-
графии II. П. Кренке (Кренке, 19^7) — выдающегося русского
ботаника, сделавшего морфологию растений могущественным
средством изучения онтогенеза растений.

У некоторых видов растений, например Ligustrum ovalifolium,
выходы клеток внутренних слоев на поверхность достигаются осо-
бенно легко. Отмечено также, что листья химер однодольных расте-
ний характеризуются более высокой частотой замещений, чем у дву-
дольных. В результате чего у однодольных почти не встречаются
чисто периклинальные химеры (как многочисленные константные
формы разнообразных периклинальных химер герани), а скорее
периклинально-секторально-миксохимеры (рис. 15.8).

У растений могут наблюдаться и замещения «генетически эффек-
тивных клеток» — аналогов клеток зародышевого пути животных.
Отмечено, что при их повреждении (напоимср, после воздействия
высокими дозами облучения или в результате удаления лазером) ря-
дом расположенные клетки могут заместить генетически эффектив-
ные клетки и передать потомству свою генетическую информацию.
Следовательно, четкого разделения клеток сомы и половых клеток
у растений нет. У живот ных т акое замещение невозможно, и при по-
Рис. 15 8. Периклинальные химеры (слева направо) герани (двудольное) и традесканции
(однодольные)

Нестабильность г.ериклинальныххимер однодольных проявляется в появгснии на ли-
стьях многочисленных полос (секторов), возникших в результате клеточных замещений

вреждении клеток зародышевого пути животное остается стериль-
ным, несмотря на то, что животные клетки более мобильны и могут
легко передвигаться.

Трансдетерминация клеток корня

Спонтанно возникающие секторные химеры корней по плоид-
ности исследовались начиная с 20 -х годов прошлого века. Эти ис-
следования, так же как и анализ экспериментально полученных
цитохимер (колхицин, хлоралгидрат), возникающих в потомстве
от межвидовых скрещиваний, а также спонтанных и индуциро-
ванных химер по перестройкам хромосом, показали, что в корнях
наблюдаются лишь секторные химеры и миксохимеры. Перикли-
нальных химер в корнях растений не выявлено (см. монографию
Шевченко, Гриних, 1981). По -видимому, в апексе корня нет меха-
низмов для поддержания дискретности клоновых популяций кле-
ток. Аналогичные выводы сделаны и при изучении химерных кор-
ней трансгенных растений A. thaliana, отдельные клетки которых
и их потомки были маркированы наличием активности репортер-
ного гена GUS. Химерность возникала при обработке молодых
проростков высокой температурой, которая индуцировала появ-
ление в клетках транспозазы и эксцизию /^-элемента из нетранс-
лируемой 5’области гена GUS, в результате чего ген GUS попадал
под контроль конститутивного промотора 35S (стратегия этого
метода, но с использованием другого репорт ерного гена, приве-
дена в главе «Методы генетики развития растений» — в разделе
«Двухкомпонентные системы транспозонов», см. рис. 1.9). На-
блюдение на второй день после температурного шока за корнями
A. thaliana. отельные клеточные клоны ко юры* маркированы активное гью репортерны
ю гена GUS (затемнены) (модифицировано по Kid пег et al 2000)

Р — ризодерма; К — кора; Э — эндодерма- П — перицикл; Ц — центральный цилиндр
Если на продольном срезе клон: включал более чем одну клетку на слой, то число марки-
рованных клеток в слое отмечено цифрой. Видно, что потомки едной клетки принимают
участие в формировании разных тканей корня

проростков показало, что потомки маркированных клеток могут
занимать разнообразные позиции в корне (рис 15 9) Обнаруже-
на высокая частота перемещения маркированных клеток из одних
инициальных тканей в другие. Например, подсчитано, что иници-
альные клетки эпидермиса/боковых участков чехлика полностью
замещались каждые 13 дней (обновлялись на 16% за48 ч). Иници-
али коры/эндодермы, столбочка (колонки) показывали большую
стабильность (каждый 31 день). Эти данные подтверждаю т отсут-
ствие в корне механизмов для поддержания дискретности клоно-
вых популяций клеток, несмотря на наличие у A. thaliana хорошо
различимых тканей и их инициалей.

Отмечено, что высокая частота клеточных замещений не вызыва-
ла видимых нарушений гистогенеза корня. По-видимому, большая
пластичность поведения клеток корня, который постоянно испыты-
вает более выраженное повреждающее воздействие окружающей
среды, чем побег, обеспечивает возможность быстрого восстановле-
ния нарушении структуры корня.

Таким образом, анализ химер растений показывает, что детерми-
нация клеток растений, в отличие от животных, носит обратимый
характер. Способность клеток к трансдетерминации при изменении
клеточного окружения — важнейшее свойство растительных клеток,
обеспечивающее способность растений к восстановлению повреж-
денных частей.

15.5.	Изучение закономерностей орфогенеза методами
клонального анализа

Изучение закономерностей морфогенеза растений с использова-
нием химер впервые начато в работах Э. Баура еще в 1909 г. Один
из первооткрывателей цитоплазматической наследственности у ге-
рани, Баур работал с химерами (мозаиками) как по цитоплазматиче-
ским, так и по ядерным мутациям. Именно в его работах выявлены
различия химер по типу распределения разнокачественных клеток,
исследована структура целого ряда химер (в гом числе прививоч-
ной химеры ракитника Адама, химер Винклера) и сделаны первые
наблюдения за распределением клеток — потомков разных слоев
меристемы — при развитии листа химер герани, плода химер Сга
taegomespilus (результат прививки боярышника Crataegus monogyna
и Mespilus germanica) и др.

Наблюдая за потомством периклинальных пластидных химер
герани, Баур (термин «периклинальная химера» предложен имен-
но этим исследователем) показал, что именно слой Ц дает начало
гаметам (1909). Аналогичные данные получены Винклером в 1910
г., Йоргенсеном и Крейном в 1927 г. в исследованиях прививочных
химер томата, а позже и на других объектах.

Важный вклад в развитие методологии клонального анализа
у растений был сделан Софией Сатиной, в работах которой для
получения химер был использован колхицин. Работая с дурманом
(Datura stramonium), Сатина отметила химеризм по уровню пло-
идности клеток меристемы проростков, которые проращивались
в присутствии колхицина, а также легкость идентификации поли-
плоидных клеток по их размерам. В этих исследованиях были вы-
явлены периклинальные химеры разного типа (рис. 15.10) и были
полностью подтверждены положения теории немецкого ботани-
ка А. Шмидта (1924) о строении ПАМ побега, показано кленовое
происхождение клеток растений, образованных слоями туника
Kohi роль 2п, 2л, 2п	4п, 2п, 2п	8л, 2п, 2л

Рис. 15.10 Периклинальные циюхимеры дуриана, полученные в работах Сатиной

(по Satina etal , I940)

Тетрапг.сидные (4п) и октаплоидные (8п) клетки значительно крупнее диплоидных. Раз-
мер клеток служит удобным маркером разных слоев апикальной меристемы побега

и корпуса, и консервативность строения ПАМ побега на протяже-
нии всего жизненного цикла растений.

Изучая анатомические срезы листьев, чашелистиксв, лепестков,
тычинок и пестиков дурмана, С. Сатина (а позже — и другие исследо-
ватели на других растительных объектах) изучила вклад разных кле-
точных клонов — потомков клеток меристемы слоев, обозначенных
Сатикой как Lp Ц, Ц. в формирование этих органов. В настоящее
время благодаря этим работам, а также исследованиям, проведенным
с использованием химер по генным мутациям, по трансгенам (см.
выше) показано, что развитие каждою типа органа имеет свои законо
мерности. Так, например, при развитии листьев дурмана клетки слоя
L образуют эпидермис, клетки слоя Ц — основную часть мезофилла
листа, L3 — сосудисгые ткани и некоторую часть мезофилла.

Начальные этапы формирования чашелистиков и лепестков дур-
мана сходны с морфогенезом листа (рис. 15.11), однако позже вклад
клеток L] за счет периклинальных делений становится значитель-
но большим, особенно при развитии свободных краев этих органов.
Аналогичные наблюдения сделаны и для других видов растений
Pharbitis, Chaenomeles lagenaria, Impatlens, Mirabilis, граната, родо-
дендрона, петунии, львиного зева именно поэтому генотип слоя
L, у многих растений является определяющим при формировании
окраски околоцветника. Отмечено также, что участие клеток Ц
19. 4п4п.2п	20. 2п,2п,4п	21. 2л,41),2n	15b. 2n,8n,2n 17. 2n, 8n,2n	18. 4n,2n,8n

Рис. 15.11. Ранние этапы гистогенеза листа и органов около цветника (А) и гинецея

(Б) дурмана

Под срезами органов периклинальных цитохимер указана плоидность клеток слоев L„ L2,
L3 (по Satina, Blakes iee, 1S41,1943)

микроспоры

внутренний I	проводящий

тапетум /	гучск

наружный \ /
тапетум

эндотерции

стромиум

эпидермис

Рис. 15.12. Гистогенез пыльника "оследовательные этапы морфогенеза пыльника

(модифицировано по Goldberg el al., 1993)

Справа — схема продольного среза флоральной меристемы В центре — схема
поперечного среза примордия тычинки Справа — пыльник, состоящий из тканей,
сформированных разными слоями меристемы

в морфогенезе органов околоцветника еще больше увеличивается
с возрастом растений (на верхних участках побега).

Ткани пыльников затянуты однослойным эпидермисом про-
изводным слоя Lp спорогенные ткани, наружный тапетум и эндо-
теций — производные слоя L, а внутренний тапетум и сосудистые
промотор З'-З Ас-элемен SJS

промотор 35S GUS

корпус туника

эксцизия

, гАс-элемента

Рис. 15.13. Клональный анализ развития органов цветка у трансгенных растений
A. thaliana, содержащих репортерный ген GUS и автономный транспозон Ас кукурузы,
отделяющий ген Gl/Soi промогера 3&S (по Jenin arid hish, 20СС)

Экспрессия GUS наблюдается только в отдельных клетках после выхода Ас-элемента
из состава слитого гена. В результат клеточных делений после перехода растений
на репродуктивную стадию развития лоточки таких клеток могут участвовать
в ооразевании флоральной меристемы (ФМ). Справа представлена схема участия
клеток слоев L, (зеленый), 1_2 (красный) и 1_3 (синий) ПАМ в формировании цветка
Буквами А, В и С показаны поперечные срезы пестика на уровне стонбика (А),
серэдины (В) и основания (С) плодолистиков

ткани — Ц. Эти закономерности характерны и для других видов (на-
пример, табака, рис. 15.12).

Наиболее сложными являются закономерности гистогенеза пе-
стиков. У дурмана основание плодолистиков и перегородки (завязь)
сформировано в основном тканями 13. Верхняя часть стенки плодо-
листика (столбик) и перегородки — формируются слоем L?, а клетки
L, образуют лишь сосудистые ткани. Проводящие ткани столбика
и внутренней обкладки завязи, эпидермис наружной части пестика
сформирован клетками L. В образовании семяпочки участвуют все
слои, однако в каждом из ее компонентов доминируют клетки одного
из слоев. Спорогенная ткань образуется слоем Ь2.

Исследования на химерах показали, что у растений разных си-
стематических групп закономерности морфогенеза органов могут
различаться. Так, например, клональный анализ цветков A. thaliana,
экспрессирующих ген GUS в разных слоях меристемы (рис. 15.13)
показал, что лепестки этого вида, в отличие от дурмана, никогда не
содержали клеток слоя L. Слой Ц образовывал лишь эпидермис ле-
пестков и не доминировал (в отличие от дурмана и других видов)
Глава 15. Клональный анализ в изучении морфогенеза высших растений ^8 409
в верхней части лепестков. При развитии пыльников у A. thaliana та-
петум образуется клетками слоя L (а не Ци Ц, как у табака).

При развитии листа большинства двудольных клетки слоя L об-
разуют эпидермис, клетки слоя Ц — основную часть мезофилла
листа, L — сосудистые ткани и некоторую часть мезофилла (как
описано выше у дурмана). У клюквы в образовании мезофилла ли-
ста и проводящей ткани участвовали оба слоя — L, и Ц, причем на
участках с диплоидным мезофиллом проводящие ткани были дипло-
идными, а на участках с тетраплоидным мезофиллом — тетраплоид-
ными. У кукурузы (однодольное растение) клетки слоя Ц участву-
ют в формировании всех тканей листа, в том числе и мезофильных,
клетки Ц образуют мезофилл и сосудистые ткани листа, а клетки L
почти не участвуют в морфогенезе листа.

15.6.	Выявление организующих центров морфогенеза

Клональный анализ — основной инструмент для выявления ор-
ганизующих центров морфогенеза, которые обеспечивают коорди-
нированное поведение разных клеточных клонов при формировании
органов, посылая сигналы в окружающие клетки. Исследования на
химерах позволяют установить, информация из какого слоя мери-
стемы является определяющей для формирования того или иного
органа или ткани.

Примером таких работ является изучение развития структу-
ры соцветия и плода у межвидовых и внутривидовых перикли-
нальных химер томата. Оказалось, что структура побега, гинецея
и плода определяется генетической информацией клеток слоя Ц.
Структура химеры (принадлежность того или иного слоя ПАМ
подвою или привою) выявлялась с помощью морфологических
маркеров разных слоев (по характеру опушения, который опреде-
ляется генотипом слоя Lp окраске мезофилла листа Ц, окраске
створок плода — L ). В одной серии экспериментов привой и под-
вой различались по числу плодолистиков, в другой — по типу
соцветия. Сравнение полученных периклинальных химер показа-
ло, что эти признаки зависят исключительно от генотипа клеток
слоя L. Клетки туники вели себя в соответствии с генетической
программой клеток слоя Ц, а не с собственной программой, что,
очевидно, связано с получением сигналов от клеток корпуса. В та-
блице 15.1 приведены результаты изучения периклинальных хи-
мер по мутации jointless (j), вызывающей изменение типа соцветия
с закрытого (детерминантного) на открытое (недетерминантное).
Эта мутация оказывала также влияние па развитие цветоножки,
Таблица 15.1

Изменение роли клеток при перестройке структуры внутривидовых химер томата
(модифицировано по Szymkowiak, Irish, 1999)

Исходная структура химеры L,L2L,	Измененная структура L,L2L3	Исходный фенотип	Новый фенотип
j j +	jj j	ДИКИЙ тип	jointless
j+j	j+ +	jointless	дикий тип
+ +j	+ + +	jointless	дикий тип
+ j +	++j	ДИКИЙ тип	jointless

нарушая опадение цветков и плодов. Анализ химер показал, что
фенотип растений (дикий тип/jointless) определяется исключи-
тельно генотипом клеток слоя L (табл. 15.1) Интересно, что при
перемещении клеток слоя L в корпус (Ц) эти клетки начинали
определять структуру побега и плода (табл. 15.1). Эти данные на-
глядно демонстрируют роль клеточных взаимодействий в коор-
динации процессов морфогенеза и показывают, что не генотип, а
положение клетки внутри меристемы определяет ее поведение.

Отметим, что при формировании различных морфологических
структур организующую роль могут играть клетки разных слоев. Так,
у прививочной периклинальной химеры камелии, имеющей слой Ц
or Camellia sasanqua и слои Ц и Ц от C.japonica, координирующую
роль в развитии околоцветника играла информация, поступающая
из клеток слоя Lr Организующая роль клеток того или иного слоя
обьясняется его способностью к образованию индуктивных сигна-
лов, которые moi ут передаваться клеткам других слоев меристемы,
координируя их поведение в процессах морфогенеза.

15.7.	Выявление генов, продукты которых могут играть
роль индуктивных сигналов

Клональный анализ позволяет исследовать способность про-
дуктов конкретных генов к перемещениям в другие клетки. Бел-
ковые продукты, способные к перемещению от одной клетки
к другой, называют неавтономными (non-cell-autonomous), а не-
способные к таковым — автономными (cell-autonomous). В настоя-
щее время для любого клонированного гена можно определить
способность его продукта передвигаться от клеток одного слоя
к клеткам другого или по клеткам одного слоя, получив перикли-
нальную или секторную химеру.
Рис. 15.14. Анализ транскрипции i енов НО и DEF в периклинальных химерах
с восстановленной активностью гена FLO в слое Ц ме~одсм in situ гибридизации
(модифицировано по Hantke et al., 1995)

А, Б — эксгрессия FLO в примордии цветка и молодом бутонр соответственно; В —
экспрессия гена О£Г(ген класса В) в молодей бутоне гсго же растения В отличие ст
мРНК FLO, коте рая выявляется только в клетках стюч Ц, мРНК OFF выявляется во всех
слоях тех областей, где буду формироваться лепестки и тычинки; ч — чашелистик

Одна из первых таких работ посвящена изучению способности
к образованию индуктивного сигнала геном FLORICAULA (FLO)
львиного зева Antirrhinum majus. Этот ген является ортологом гена
LEAFY (LFY) A. thaliana, отвечает за формирование флоральной
меристемы и регулирует экспрессию гомеозисных генов А, В и
С-классов, контролирующих дифференцировку органов цветка
(см. главу 14). Для получения химер львиного зева использована
нестабильная мутация (flo 613), вызванная инсерцией мобильного
элемента ТатЗ (Transposone of Antirrhinum majus) в ген FLO. Ста-
бильные мутации нарушают формирование цветков, и на их месте
развиваются дополнительные побеги. У нестабильного мутанта flo
613 при температуре 15 °C наблюдали соматические реверсии к ди-
кому типу — возникновение отдельных цветков, что связано с вы-
ходом транспозона из клеток и восстановлением активности гена
FI.O. Такие растения представляли по сути миксо- или мерикли-
нальные структурно-генетические химеры. Размножая вегетативно
боковые побеги мутанта, были получены периклинальные химеры,
у которых в отдельных слоях ПАМ наблюдалось восстановление
активности гена FLO. Такие химеры выращивали при 25 °C — тем-
пературе, препятствующей дальнейшим транспозициям. Структу-
ру химер проверяли по наличию транскрипции гена методом in situ
гибридизации (рис. 15.14).

Оказалось, что экспрессия гена FLO в любом слое способна вос-
становить способность растений продуцировать цветки. Даже при
экспрессии гена в одном слое L цветки были фертильны (а значит,
Рис 15.15 Локализация мРНК {А, Б) и белка LFY (В, Г) в верхушках цветоносов
рас । ений A. thaliana дикого типа (А, В) и трансгенной линии, экиирессируюшей  ей LFY
под промотором гена АГМИ (по Sessions et al., 2000)

Видно, что s трансгенном растении ATML1:.IFYмРНК присутствует только в слое L,
а белок — во всех слоях меристемы цветоноса v фгсральных меристем. В растениях
дикого типа мРНК и беле к детектируется во всех слоях флорал-ной меристемы

клетки Ц становились способными формировать генеративные тка-
ни), имели красные лепестки (следовательно, клетки Ц в вакуолях
которых накапливался антоциан, приобретали способность воспри-
нимать сигнал о формировании цветка). Показано также, что экс-
прессия FLO в одном слое способна активировать транскрипцию
гомеозисных генов класса В, отвечающих за формирование лепест -
ков и тычинок во всех слоях фл оральной меристемы (например, гена
DEE, рис. 15.14 В).

Поскольку мРНК гена FLO наблюдали только в тех клетках, где
ген активировался после выхода транспозона (рис. 15.15), включе-
ние нижестоящих генов, отвечающих за морфогенез цветка (регу-
ляторных гомеозисных генов, генов, контролирующих образование
антоциана и др.), связано с передвижением по слоям флоральной
меристемы белкового продукт FLO (или другого соединения, об-
разующегося под влиянием белка FLO). Передвижение FLO между
слоями позже было подтверждено с помощью использования анти-
тел к нему. Интересно, что белок FLO может передвигаться по сло-
ям (по вторичным плазмодесмам), но не может двигаться по слою
(по первичным плазмодесмам, связывающим клетки одного клона),
о чем говорит анализ мериклинальных химер: на лепестках мери-
клинальной химеры граница между секторами зеленой ткани чаще
всего была четкой.

Способность к передвижению между клетками показана и для
белка A. thaliana LEAFY, который кодируется ортологом гена FLO.
Анализ мутантов Ify A. thaliana, экспрессирующих ген LFY в слое
L, под контролем специфического для этого слоя промотора гена
AtMLl (функционально-генетический химеризм трансгенных рас-
тений, рис. 15.15), а также анализ секторных химер, полученных
с использованием гена рекомбиназы FPL из плазмиды дрожжей под
контролем промотора гена теплового шока сои HSP (структурно-
генетический химеризм на основе индуцированной соматической
рекомбинации, см. главу 1.4, рис. 1.11 А), показали, что белок LFY
также способен к передвижениям, однако, в отличие от FLO, белок
LFY способен передвигаться как между слоями, так и вдоль них.

В настоящее время способность к перемещениям от клетки
к клетке показана для продуктов (белков и, в отдельных случаях,
мРНК) целого ряда других регуляторных генов. Интересно, что про-
дукты разных генов различаются по их способности к перемеще-
ниям. Регуляторный белок SHR, принадлежащий к специфическо-
му для растений GRAS-семейству, может передвигаться из тканей
центрального цилиндра корня A. thaliana, где ген транскрибируется,
в окружающий его слой клеток (рис. 15.6) и вызывает экспрессию
в этом слое гена SCR. Продукты гомеозисных генов В-класса льви-
ного зева (DEF, GLO) не способны к передвижению из слоя L( фло-
ральной меристемы в нижележащие слои, а также к перемещениям
вдоль одного слоя, хотя способны к ограниченному передвижению
из внутренних слоев к эпидермальному слою. Теми же свойствами,
по-видимому, обладают и продукты генов В-класса A. thaliana. Бел-
ковые продукты гомеобоксных генов KN1 (KNOTTED!) кукурузы
и генов KNAT1, STM A. thaliana (гены, контролирующие поддержа-
ние пула стволовых клеток меристемы побега) способны к передви-
жениям между слоями ПА М в обоих направлениях. Белок кукурузы
KN 1 перемещается от клетки к клетке по плазмодесмам. Возможно,
что и другие «путешествующие» белки используют плазмодесмы.

В экспериментах на томатах показано, что гомолог KN1 кукуру-
зы — белок томата LeT6 и его мРНК — для передвижения могут
использовать проводящие ткани растений (флоэму), что показано
в экспериментах с прививочными химерами, где в качестве подвоя
служили мутантные растения томата, суперэкспрессирующие этот
ген, а в качестве привоя — растения дикого типа. Более того, под
влиянием этих индуктивных сигналов в листьях привоя начинали
проявляться признаки, характерные для мутантных растений подвоя.
Интересно, что белок KN 1, взаимодействуя с белками плазмодесм,
способен обеспечивать и передвижение по ним собственной мРНК,
что характерно для некоторых вирусных белков, которые для пере-
движения по клеткам растений также используют плазмодесмы.

Эксперименты с прививочными химерами показали, что «путе-
шествует» по флоэме транскрипционный белок, участвующий в ре-
гуляции восприятия гиббереллинового сигнала (белок A. tha/iana
GAJ и его гомологи из других видов растений, см. главу 6) и коди-
рующая его мРНК, а также белок-флориген FT, контролирующий
переход к цветению (см. главу 12). Благодаря таким дальнедистан-
ционным перемещениям транскрипционных факторов и кодирую-
щих их мРНК возможна не только координация поведения распо-
ложенных рядом клеточных клонов при формировании органов, но
и интеграция информации от разных органов. Рансе считалось, что
эта интеграция осуществляется в результате перемещения по расте-
нию небелковых молекул (фитогормонов, сахаров и др.). Сегодня мы
знаем, что по флоэме избирательно перемещаются как регуляторные
белковые молекулы, так и молекулы РНК — мРНК, микроРНК. ма-
лые интерферирующие РНК, способные осуществлять регуляцию
экспрессии генов. Очевидно, что такое передвижение позволяет рас-
тению интегрировать данные о состоянии всех частей, о готовности
к переключению на новый этан онтогенеза, что принципиально важ-
но для оставления потомства.

15.8.	Панек доменов, обуславливающих способность белка
к передвижениям

Некоторые белковые молекулы небольшого размера могут пере-
мещаться из клетки в клетку путем простой диффузии (таким путем,
по-видимому, перемещаются белки LFY и TFL1). Особенности тра-
фика других белков, в том числе и транскрипционных факторов, по-
видимому, связаны с какими-то пока мало исследованными свойс i ва-
ми белковых продуктов, а также с различиями в структуре, свойствах
и распределении плазмодесм на поверхности клеток. Специальные
исследования на функционально-генетических химерах позволяют
проводить поиск генных участков, которые определяют способность
белкового продукта к передвижению. С этой целью с помощью му-
тагенеза in vitro получают делегированные версии исследуемого
гена, которые сливают (трансляционное слияние) с репоргерным ге-
Глава 15. Клональный анализ в изучении морфогенеза высших растений 'Й’ 415
ном и экспрессируют в трансгенных растениях под специфическим
промотором, чаще всего - промотором гена ATML1. мРНК такого
грансгена обнаруживав гея только в слое L , а белковый продукт, ко-
торый тестируется по активности репортерного гена, — во всех сло-
ях меристемы. Делеция, затрагивающая важный для передвижения
белкового продукта участок гена, должна нарушать транспорт сли-
того белка. Такой подход позволил показать, что способность к пере-
мещениям белка кукурузы KN 1 зависит от наличия гомеодомена.

Заканчивая рассмот рение современных данных о перемещениях
транскрипционных факторов и мРНК, следует вспомнить о време-
нах лысенковской биологии, когда химеры были чуть ли не един-
ственным официально разрешенным экспериментальным методом
«мичуринской генетики» — лженаучной школы, которая к И. В. Ми-
чурину имела лишь косвенное отношение. Полученные и задокумен-
тированные в многочисленных публикациях 50-60-х годов прошлого
века факты «воспитания» подвоя привоем, и наоборот, трактовались
в свете теории наследования приобретенных признаков. Инструмен-
ты клонального анализа на современном этапе развития генетики
и биологии развития вскрыли несостоятельность таких интерпрета-
ций, выявив молекулярные механизмы взаимодействия тканей хи-
мерных организмов.

15.9.	Изучение взаимодействия клеток и тканей методами
генетически направленного апоптоза

В последние годы для изучения роли клеточных взаимодействий
в процессах морфогенеза растений наряду с обычными хирургиче-
скими методами используются методы «генетической хирургии»,
позволяющие вызывать гибель (апоптоз) определенных клеток
и тканей у трансгенных растений. Этот метод имеет преимущества
перед микро- и лазерной хирургией, поскольку позволяет удалять
клетки, которые по морфологии не отличаются от окружающих кле-
ток, но генетически детерминированы благодаря экспрессии в них
специфических генов, определяющих их дальнейшую судьбу. Из-
бирательная гибель таких клеток обеспечивается активностью ци-
тотоксичных генов, находящихся под контролем промоторов генов,
специфически экспрессирующихся в этих клетках. Наиболее попу-
лярными генами, кодирующими образование цитотоксических про-
дуктов, являются гены бактерий: ген DT-А дифтерийного токсина
Corynebacterium diphtheriae, ингибирующего синтез белка в клетках,
и гены рибонуклеаз (Т1 рибонуклеазы Aspergillus oryzae и барназы
Bacillus amyloliquefaciens). Продукты генов не перемещаются в со-
седние клетки, вызывая гибель только тех клеток растения, где они
транскрибируются. Наблюдения за процессами морфогенеза после
локального удаления отдельных клеток и тканей (хирургического,
.лазерного или генетически направленного) позволяют выявить на-
личие/отсутствие индуктивных сигналов от этих тканей и выяснить
функцию удаленных клеток и тканей в развитии растений. Так, на-
пример, экспрессия гена дифтерийного токсина под контролем про-
мотора гена A. thaliana LEAFY (контролирует появление флоральной
меристемы) в растениях A. thaliana (LFY::DT-A) приводила к отсут-
ствию цветков (Nilsson et aL, 1998). Вместо цветков на цветоносе
развивались листья (брактеи) и листоподобныс органы. Полученные
результаты подтвердили предположение о том, что у A. thaliana от-
сутствие брактей связано с тем, что флоральная меристема является
источником ингибирующих сигналов, подавляющих развитие брак-
тей у растений дикого типа.

В трансгенных растениях A.thaliana, экспрессирующих ген DT-A
иод контролем промотора гена АРЗ, контролирующего развитие ле-
пестков и тычинок и специфически экспрессирующегося в районах
их закладки, позволило проверить гипотезу о том, что развитие ор-
ганов каждого последующего круга зависит от индуктивных сигна-
лов, поступающих от органов предыдущих кругов. У т рансгенных
растений A. thaliana цветки состояли из чашелистиков и пестика
нормальной морфологии, хотя лепестки и тычинки не развивались.
Следовательно, развитие пестика не связано с индуктивными сигна-
лами от клеток закладывающихся примордиев органов предыдущих
мутовок.

Поскольку далеко не для всех тканей растения сейчас выявлены
специфические промогоры, для достижения специфичности дей-
ствия цитотоксичных продуктов предложены два новых подхода.
Один подход основан на трансформации одного растения одновре-
менно двумя генами — barnase и barstar, находящимися под кон-
тролем разных промоторов. Продукт гена barstar не токсичен, но
образует стабильный комплекс с барназой, ингибируя ее РНКазную
активность (т. е. продукт является антитоксином, или антидотом).
Принцип действия этой «двухкомпонентной системы генетической
хирургии» можно проиллюстрировать следующим образом. Пред-
положим, задачей исследования является удаление клеток области
А, однако специфических для этой пели промоторов нет (рис. 15.16).
В этом случае для контроля экспрессии гена барназы можно исполь-
зовать менее специфический промотор, обеспечивающий экспрес-
Skrstai

Samase

Рис. 15.16. Принцип использования генов bamase и barstar для увеличения точности
генетической хирургии (модифицировгнс по Eeais, Goldberg 1997)

сию токсичного продукта в областях А+В Если ген barstar слить
с промотором, контролирующим его экспрессию в области В-ьС, то
сю продукт защитит клетки участка В от гибели В результате будут
удалеиы лишь клетки участка А.

Второй подход основан на той же логике, однако ген-протсктор не
используется. Растение трансформируют двумя фрагментами одно-
го гена барназы под разными промоторами. Гибель клеток наблюда -
ется только в участках перекрывания экспрессии, где в результате
объединения двух пептидов происходит восстановление активности
рибонуклеазы.

Методы генетической хирургии используются не только для изу-
чения проблем взаимодействия клеток и их функции. Направленное
генетическое удаление клеток и тканей можно использовать для по-
лучения форм с мужской ст ерильностью, удобных для производства
гибридных семян. Это продемонстрировано на растениях табака
и томата, экспрессирующих токсичные гены в тапетуме пыльников.
Кроме того, получение таких форм у трансгенных растений позволя-
ет предотвращать «утечку трансгенов» в популяции дикорастущих
растений.

Заключение

Клональный анализ — мощный инструмент для детального из-
учения взаимодействия между клетками и тканями. Исследования
химер свидетельствуют о чрезвычайной пластичности генетиче-
ской детерминации клеток растений, их способности подчиняться
не собственной генетической информации, а индуктивным сиг-
налам, поступающим из других клеток. Такими межклеточными
сигналами могут служить регуляторные белки и мРНК, которые
способны передвигаться между клетками по определенным, но
пока мало известным правилам. При формировании разных ор-
ганов определяющими могут оказываться сигналы клеток разных
слоев. По сути, такие клетки играют роль организующих центров.
В настоящее время не известно, какие факторы (генетические,
физиологические, структурно-анатомические) лежат в основе «на-
значения» на определяющую роль клеток того или иного слоя. Из-
учение этих факторов, выявление организующих центров, анализ
молекулярно-генетической природы посылаемых ими сигналов,
идентификация кодирующих их генов — задача для будущих ис-
следований. Сегодня только для единичных клонированных генов
исследовалась способность продуцировать индуктивные сигналы,
передвигающиеся по клеткам и тканям растения. Совершенно оче-
видно, что для воссоздания реальной картины регуляции морфо-
генеза должны проводиться исследования всех (или, по крайней
мере, всех ключевых) генов, контролирующих развитие. Картина
реализации генетической информации неизмеримо усложняется
с учетом способности клеток обмениваться сигналами. Мировая
генетическая общественность при выполнении третьего этапа по
изучению генома растений одной из главных задач поставила соз-
дание виртуального растения. Уже сейчас ясно, что мы слишком
мало знаем о клеточных и тканевых взаимодействиях, без кото-
рых создание виртуального растения, адекватно отражающего все
процессы, происходящие на всех уровнях организации живых си-
стем (клеточном, тканевом, организменном), невозможно.

Рекомендованная литература

1.	Кренке Н. П. Химеры растений. М.; Л.: Изд-во АН СССР, 1947. 386 с.

2.	Шевченко В. В., ГоинихЛ. И. Химсрчость у растений. М,: Изд-во Наука, 1981.
212 с.

3.	Beals Т. Р., Goldberg В В. A Novel Cell Ablation Strategy Blocks Tobacco Anther
Dehiscence//Plant Cell. 1997. Vol. 9. P. 1527-1545.

4.	Carpenter R., Coen E. S. Transposon induced chimeras show that floricaula, a
meristem identity gene, acts non-autonomously between cell layers // Development.
1995. Vol. 121. P. 19-26.

5.	Day C. D., Galgoci В F. C, Irish И F. Genetic ablation of petal and stamen
primordia to elucidate cell interactions during flora! development // Development.
1995. Vol. 121. P 2887-2895.

6	Kidner C, Stmdaresan V, Roberts К, Dolan L. Clonal analysis of the Arabidopsis root
confirms that position, not lineage, determines cell fate // Planta. 2000. Vol. 211. P. 191-199.
7.	Kim J. К, Rim У., WangJ., Jackson D. A novel cell-to-cell trafficking assay indicates
that the KNOX homeodomain is necessary and sufficient for intercellular protein
and mRNA trafficking // Genes DeVol.2005. Vol. 19. N 7. P.788-793.

8.	Kim M., Camo W., Kessler S., Sinha N. Developmental changes due to long-distance
movement of a homeobox fusion transcript in tomato // Science. 2001. Vol. 293
P. 287-289.

9.	Nakajima K, Benfey P. N. Signa.ing In and Cut: Control of Cell Division and
Differentiation in the Shoot and Root // Plant Cell. Vol. 2002. P S265-S276.

10.	Sessions A., Yanofsky M. E, Weigel D. Cell -cell signaling and movement by the
floral transcription factors LEAFY and APETALA1 // Science 2000. Vol.289.

P. 779-781.

11.	Szymkovlak E. J., Irish E. E. Interactions between jointless and Wild-Type Tomato
Tissues during Development of the Pedicel Abscission Zone and the Inflorescence
Meristem // Plant Cell. 1999 Vol. 11. P. 159-176.

12	Wu X, Weigel D., Wigge R. A. Signaling in plants by intercellular RNA and protein
movement// Genes DeveL 2002, Vol. 16. P. 151-158.
Заключение

В данном учебнике мы расемотрели основные способы регуля-
ции развития растений, а также основные этапы их онтогенеза и раз-
вития отдельных органов.

Принципы генетики развития были сформулированы основопо-
ложниками этой науки (Т. X Морган, Р. Гольдшмидт, Н. В. Тимофеев-
Ресовский, Н. Н. Медведев, М Е. Лобашев и др ) на примере изуче-
ния эмбрионально! о развития животных. Многие из этих принципов
лежат в основе развития как животных, так и растений. Вместе с тем
растения имеют ряд особенностей, отличающих их от животных, та-
ких как тотипотентность любой клетки и способность к органогене-
зу в течение всего жизненного цикла.

Ниже мы перечислим принципы генетики развития и на приме-
рах, приведенных в учебнике, рассмотрим, какие особенности они
имеют в контроле развития растений

1.	Принцип дифференциальной активности гемов как осно-
вы регионализации организма и клеточной дифференцировки. Суть
принципа заключается в следующем: все многообразие типов кле-
ток — результат дифференциальной экспрессии генов з изна-
чально одинаковых клетках.

В основе этого принципа лежат механизмы, универсальные для
всех высших эукариот, в том числе для растений. У высших расте-
ний дифференциальная экспрессия генов лежит в основе разнообра-
зия типов клеток и гканей. Ключевую роль в регуляции экспрессии
генов играют транскрипционные факторы. Экспрессия генов, коди-
рующих транскрипционные факторы, определяет идентичность кле-
ток, тканей, органов растений. Большой процент мутантных форм
растений, характеризующихся теми или иными аномалиями разви-
тия, имеют нарушения в генах, кодирующих именно транскрипцион-
ные факторы. Яркой иллюстрацией этого универсальною принципа
может служить роль транскрипционных факторов с MADS-боксом
в определении идентичности органов цветка.

2.	Принцип ведущей роли ядерно-цитоплазматических от-
ношений в регионализации зародыша, который также называют
принципом асимметричности клеточных делений.

Этот принцип также универсален и реализуется одинаково в раз-
витии животных и растений. У всех высших эукариот дифференци-
альная активность генов наблюдается уже на стадии двухклеточного
зародыша и является результатом неравномерного распределения
в цитоплазме зиготы транскрипционных белков. Закладка и разви-
тие доменов зародыша связана с продолжением дифференциальной
экспрессии генов в разных клетках и зависит от неранномерного рас-
пределения транскрипционных факторов в цитоплазме материнской
клетки и/или влияния клеточного окружения.

3.	Принцип клеточных взаимодействий (принцип эмбрио-
нальной индукции). Суть принципа состоит в том, что одна ткань
(группа клеток) через индуктор влияет на другую (компетент-
ную ткань), определяя путь ее развития.

Этот универсальный принцип развития постулирует важность
позиционной информации (клеточною окружения) и межклеточных
взаимодействий в определении пути дифференцировки клеток. По
сути, развитие — это цепь эмбриональных индукций, т. е. взаимо-
действий индуктор — компетентная ткань. Рассогласование (напри-
мер, из-за мутаций) во времени созревания индукт ора и компетент-
ной ткани нарушает ход морфогенетического процесса.

У животных процессы межклеточных взаимодействий главным
образом опосредованы секретируемыми сигнальными молекула-
ми, взаимодействующими с рецепторами на поверхности клеток-
мишеней. Как правило, в основе таких взаимодействий лежит пе-
редача сигнала от рецептора в ядро, в результате чего происходит
изменение характера экспрессии генов в клетке-мишени. У растений
примером такого типа индукции является ограничение областей экс-
прессии гена WUS в ПАМ и гена WOX5 в КАМ за счет работы систе-
мы CLAVATA.

Другой способ межклеточных взаимодействий основан на пере-
мещении регуляторных молекул (в том числе транскрипционных
факторов) в клетки-мишени через цитоплазматические мостики,
соединяющие соседние клетки. Пример такой регуляции — поступ-
ление регуляторных молекул из питающих и фолликулярных кле-
ток в ооцит дрозофилы. Но для животных такой тип межклеточных
взаимодействий ограничивается, как правило, ранними стадиями
эмбрионального развития и является скорее исключением, чем пра-
вилом.

В отличие от животных, у растений взаимодействие через цито-
плазматические мостики — плазмодесмы — играет центральную
роль в регуляции развития. Через плазмодесмы соседние клетки спо-
собны обмениваться регуляторными молекулами, мРНК, транскрип-
ционными факторами. Плазмодесмы растений могут формироваться
в ходе цитокинеза («первичные» плазмодесмы), а могут также обра-
зовываться между клетками, не имеющими общею клонального про-
исхождения («вторичные» плазмодесмы). Транспорт регуляторных
молекул через плазмодесмы определяет влияние клеточного окру-
жения на судьбу клетки у растений. Примером влияния клеточною
окружения у растений является дифференцировка клеток эндодермы
и первичной коры корня, ключевое значение для которой имеет ми-
грация белка SHR из клеток стелы в клетки-инициали эндодермы.

4.	Принцип единства процессов активации и инактивации
экспрессии генов, контролирующих детерминацию и дифференци-
ровку. Данный принцип заключается в том, что переход клетки на
каждую последующую ст адию дифференцировки обусловлен со-
гласованным выключением одной группы гепов и одновремен-
но включением нового набора генов.

У растений согласованное «включение» и «выключение» генов
одной группы при дифференцировке клеток является общепринятым
способом регуляции развития и зависит от активации/инактивации
экспрессии генов разными гругпами транскрипционных факторов,
активных на разных стадиях. Примером может служить «выключе
ние» генов запасных белков и «включение» LEA генов в клетках за-
родыша при подготовке к периоду покоя, которое достигается за счет
изменения активности разных групп АБК-зависимых транскрипци-
онных факюров.

Вместе с тем принцип единства активации/инактивации генов
одной группы у растений имеет ряд особенностей.

У животных в его основе лежит принцип класгеризованности
генов — т. е. зачастую гены одной группы расположены на одной
хромосоме и образуют кластер, что облегчает регуляцию их экспрес-
сии. Яркий пример — кластеры НОХ-геион у всех видов животных.

У растений до сих пер не было обнаружено примеров кластери-
зованности генов одной труппы. Их согласованная активация или
инактивация достигается исключительно за счет регуляции экспрес-
сии генов одной группы одними и теми же транскрипционными фак-
торами.

5.	Принцип ведущей роли внешних и внутренних факторов
в реализации генетической информации в индивидуальном раз-
витии (или принцип системной регуляции формирования признаков
Н. В. Тимофеева-Ресовского).

Развитие растений согласовано с действием факторов внешней
среды гораздо в большей степени, чем развитие животных, что
связано с особенностями прикрепленного образа жизни растений.
Факторы внешней среды, такие как температура, влажность, длина
светового дня и другие, играют определяющую роль в запуске раз-
личных программ развития у растений — примером может служить
существование нескольких программ инициации цветения, завися-
щих от разных факторов.

Важнейшими внутренними факторами, контролирующими раз-
витие растений, являются разнообразные группы фитогормонов.
В основе гормональной регуляции развития всех высших эукариот
лежит контроль экспрессии генов транскрипционными факторами,
которые активируются при ответе клетки на гормон. В отличие от
животных, для развития растений большое значение имеет регуля-
ция метаболизма фитогормонов в зависимости от факторов внешней
среды: например, активация биосинтеза цитокининов при усилении
минерального питания или биосинтеза этилена при механических
повреждениях. Регуляция гормональной системы факторами окру-
жающей среды дает возможность адаптировать развитие растения
к внешним условиям, что важно для выживания.

6.	Принцип универсальности генетических механизмов раз-
вития многоклеточных организмов.

Животные и растения используют консервативные семейства
генов, которые, возникнув на заре эволюции многоклеточных, со-
храняют консерватизм в силу эффективности механизмов развития,
которые ими определяются. Сходство регуляторных систем, функ-
ционирующих у растений и животных, в первую очередь касается
регуляции клеточных делений: механизмы контроля клеточного
цикла с участием циклинов и циклин-зависимых киназ являются
общими для растений и животных. Кроме того, растения и живот-
ные имеют целый ряд схожих по структуре транскрипционных фак
торов, играющих ключевую роль в их развитии (например, MADS,
транскрипционные факторы с гомеодоменом и др.). Так, например,
транскрипционные факторы растений KNOX демонстрируют струк-
турное сходство с транскрипционными факторами животных MEIS:
те и другие относятся к классу гсмесдомен-содсржащих транскрип-
ционных факторов TALE. Было показано, что, помимо структурного
сходства, эти транскрипционные факторы ^акже характеризуются
сходством выполняемых ими функций: и те, и другие вовлечены
в регуляцию пролиферации клеток.

В то же время растения и животные имеют различия во многих
существенных деталях: например, одни и те же стадии клеточного
цикла у животных и растений контролируются разными группами
циклинов: у растений к гомеозискым замещениям органов приво-
дят мутации не по гомесбокс-содержащим генам, а по генам MADS
и т. д. Эти отличия, появившиеся на более поздних этапах эволюции
растений, лежат в основе принципиальных различий растений и жи-
вотных.

Итак, изучение развития растений позволило проследить универ-
сальные для всех эукариот принципы регуляции развития, а также
выявить уникальные особенности онтогенеза этих весьма своеобраз-
ных живых сушесзв. Важной стороной изучения генетики развития
растений является ее прикладной аспект, позволяющий создавать
растения с заданными программами развития, оперируя его ключе-
выми регуляторами. Большим подспорьем в этом является высокая
пластичность генома растений, а также их способность переносить
серьезные перестройки генома без существенного изменения жиз-
неспособности.

Подводя итоги, следует подчеркнуть, что с точки зрения биоло-
гии развития, растения относятся к числу организмов с ярко выра-
женным «регуляторным» типом онтогенеза. По сравнению с други-
ми многоклеточными организмами они характеризуются наиболее
высоким адаптивным потенциалом, возможно, именно поэтому рас
тения доминируют в биосфере.
Предметный указатель

АВС-модель 361

АВСЕ-модель 375

Абсцизовая кислота 200, 256

Амилопласты! 20

Апикальный крючок 157

Ауксины 94, 286, 310, 316

полярный транспорт ауксинов 97,

148, 235, 286, 296

G-белки 60, 106, 213

гетеро гримерные 60, 106

мономерные 61

Брассиностероиды 59, 250

Везикулярный транспорт 104, 236, 243

Вернализация 81, 335

Взаимодействие генов 23

Вторичные мессенджеры 52

Генетический анализ 21

Гиббереллины 180, 256, 342

Гипокотиль 157, 249

Гипотеза Холодного -Вента 119

Гомеодомен 73, 237, 244, 269, 308

Гомеозис 363

Детерминация 12, 311,400

Домены

зародыша 232, 239

листового примордия 291

Жасмонаты 175

Замещение гена 26

Зародыш 231

Зигота 232

Индуктивный сигнал 389, 410

Индуцированная системная устойчи 
вость 175

Инициали 232, 306

Ионные каналы 114, 221

Кадастральныс гены 371

Кальмодулин 71

Камбий 147

«Кислый рост» 117

Клеточная стенка 117, 195, 244, 250

Клеточный цикл 116, 146, 195, 277, 289

Клональный анализ 15, 389

Колумелла 308

Конъюгаты 96, 134, 183, 203

Корень 125, 306

первичный 126, 250

латеральный 127, 316

придаточный 127

Корепрессоры 80, 127, 251

Корневой волосок 313

Косупрессия 83,183,241,286,376

Латеральные органы побега 281

Лист 281

инициация 281

границы 290

симметрия 291

сложный 301

Малые РнК 28, 81, 295, 336, 373

Меристема 263

апикальная меристема корня 125,
148, 250

апикальная меристема побета 128,
147, 244, 265
интеркалярная 195
флоральная 348

Мегалло транспортеры 165, 167

Метилирование ДНК 78

Микрочиповый анализ 37

Минеральное питание 151

Модель совпадения 330

Модификации гистонов 79

Мозаицизм 391

Морфоген 320

Морфогенез 228

зародыша 231
цветка 361

Мутагенез

Т-ДНК-инсерционный 30
транспозонный 47, 396
химический 33

Обратная генетика 25

Опадение листьев 178

Организующий центр 265, 308, 390,
409

Первичная кора 311

Период покоя семян 224

Перицикл 316

Плазмодесмы 267, 313

Покоящийся центр 306, 308, 310

Поликомб-комплексы 81, 259, 338, 372

Полярность 124,

Прививка 326, 391

Программируемая клеточная смерть
177,415

Прорастание 193

Протсинкиназы 107
кальций-зависимые 72
МАР киназы 66, 108
рецепторные 54, 136, 161, 272
реценгороподобные 58
циклин-зависимые 116, 195

Протеинфосфатазы 2С 209

Растяжение клеток 117, 195

Регуляторы ответа 56, 140

Репортер 30, 39

Рецепторы 52

абсцизовой кислоты 204, 205, 206.

208,213
ассоциированные с G-белками 58.
106,213

ауксинов 106, 111

гиббереллинов 190

гравирецептор 119

света 57, 122, 326

цитокининов 56, 136

этилена 57, 16

РНК-интерференция 28, 248

Сайленсинг 28

Сверхчувствительность 173

Селекторные гены 11

Семядоли 244

Сигнальная трансдукция 52, 65

Сигнальные пептиды 273, 308

Симметрия

адаксиально-абаксиальная (лист) 245,
293

апикально -базальная (зародыш) 231
радиальная (зародыш) 233
радиальная(цветок) 385

Системная приобретенная устойчивость
174

Созревание

зародыша 221, 252

плодов 175

Сосуды 117, 147

Соцветие 353

Старение 150, 177

Стволовые клетки 263, 271,306, 310

Стресс

абиотический 171,219

биотический 173

Суспензор 233
Тиллинг 33

Тотипотентность 13, 263

Трансдетерминация 401

Транскрипционные факторы 73

Тройной отзет 157

Тропизмы 118

гравитропизм 119

фотогропизм 122

Убиквитинирование белков 62, 106, 111,
159, 169, 191,213, 251

Удлинение стебля 195

Устьица 220

Фактор

обмена гуанозина 61, 105

ремоделинга хроматина 79, 127, 256

Фитсгормоны 89,

Фитотропины 105

Фитохромы 57, 187, 326

Флориген 326, 331

Фосфолипазы 67, 106, 215

Фосфопереносящие белки 56, 139

Фосфореле 136

Фотопериод 324

Химера 45, 391

Хлоропласты 151,206

Цветение 127, 197, 205, 323

Цветок 348, 361

границы между органами 373

идентичность органов 361

Циклины 116, 146, 195, 289

Циркадные часы 326

Цитокинины 130, 275

Цитоскелет 104, 120

Экспансины 117, 196

Экспрессия генов 34

дифференциальная 233

изучение 34

регуляция 73, 76

Эмбриогенез 231

зиготический 231

соматический 256

Эмбриональный паттернинг 230

Эндодерма 311

Эндосперм 193,259

Эпигенетические механизмы 77, 336

Этилен 157
Регуляторы развития растений

A BAR'CHLH (АВА RECEPTOR) 206
ABF (ABA-responsive element Binding

Factors) 2 J1

ABI3 (ABA-INSENSITIVE 3) 216, 218,
254

ABI4 (ABA-INSENSITIVE 4) 212

ABI5 (ABA-INSENSITIVE 5) 211,218

A BP (AUXIN-BINDING PROTEINS)

ABP1 106

ABP57 115

ACS (ACCSYNTASE) 65, 159, 160

AG (AGAMOUS) 271, 361,375

AGL (AGAMOUS-LIKE)

AGL 15 187, 257

AGL 24 199

A GO (ARGONAUT) 84,
ZLL/PNH/AGOK) (ZW1LLE)
PINHEAD/ARGONAUTE 10) 247

AHK2, 3, 4 (ARABIDOPSIS HISTIDINE

KINASE) 136

AHP (ARABIDOPSIS HISTIDINE
PHOSPHOTRANSFER PROTEINS) 139

A MT (A MMONIUM TRANSPORTER) 153

ANT(AINTFGUMFNTA) 245, 289

API (АРЕТАLA 1) 344, 361

AP2 (APETALA 2) 361,

AP3 (APETALA 3) 361

APC (ANAPHASE PROMOTING
COMPLEX) 63.251

ARF(AUXIN RESPONSE FACTOR) 108

MP/ARF5 110 (MONOPTF.ROS) 110
126, 236, 251

NPH4/ARF7 (NON PHOTOTROPHIC
HYPOCOTYLE 4) 110

AS 1 (ASYMMETRIC LEAF I) 269, 283,
375

AS2 (ASYMMETRICLEAF2) 269,283. 375
ARR (AUTHENTIC RESPONSE

REGULATOR) 140

A-type 141,276

B-typc 140

AUX1 /LAX 99

A UX/IAA (A UXININSENSITIVE) 108
BDL/IAAI2 (BODENLOS) 110, 126,
236, 251

MSG2/IAA19 (MASSUGU 2) 110
SLR)/1AA 14 (SOLITARY-ROOT) 126

BOP 1. 2 (BLADE ON PETIOLE 1, 2) 292

CAL (CAULIFLOWER) 358

CCA I (CIRCADIAN CLOCK
ASSOCIATED) 327

CDK (CYCL1N DEPENDENT PROTEIN
KINASE) 116,277

CDPK (CALCIUM DEPENDENT
PROTEIN KINASES) 70

CKI1 (CYTOKININ INSENSITIVE 1) 138
CKX1-9 (CYTOKININ OXIDASE I 9) 134

Cl.E (CLV3/ESR-related) 273

CLE19 309

CLE40 309

CLV3 (CLAVATA 3) 58, 268, 271
CLV1. CLV2 (CLAVATA 1, 2) 58, 244,
268, 271

CO (CONSTANS) 329

COP I 330

CPC (CAPRICE) 3\4

CRY 1-3 (CRYPTOCHROME 1-3) 327
CTRI (CONSTITUTIVE TRIPLE

RESPONSE 1) 166

CUC 1-3 (CUP-SHAPED COTYLEDON
1-3) 245, 290, 302, 374
СусА (CYCLINA) 116, 278

CycD (CYCLIN D) 146,278

DAD 1 (DEFECTIVE IN ANTHER
DEHISCENCE1) 379

DCL 1 (DICER-LIKE I) 84

DELLA 188,348

RGA (REPRESSOR OF gal) 189

GAI (GA-INSENSITIVE) 189

RGL1, 2, 3 (RGA-Like I, 2, 3) 189

DRN (DORNROSCHEN) 296

DREE (Dehydratation Responsive
Elements Binding factors) 172

EBF1.2 (EIN3- BINDING F-BOX 1.2) 64,
169

EIN2 (ETHYLENE INSENSITIVE 2) 168
EIN3/EIL (ETHYLENE! INSENSITIVE 3/
E1N3-LIKE) 168

EIN4 (ETHYLENE INSENSITIVE 4) 56, 161
EIN5 (ETHYLENE INSENSITIVE 5) 169
ENT 1-8 (EQUILIBRATIVE

NIICLEPSIDE TRANSPORTER 1-8) 135
ERF1 (ETHYLENE RESPONSE FACTOR)
168, 170

ETO1 (ETHYLENE OVERPRODUCING 1)
65, 159

F.RSL2 (ETHYLENE RESPONSE 1, 2) 56,
57, 144, 161, 164

ETR1.2 (ETHYLENE RESPONSE 1, 2)
56, 161

EXP (EXPANSIN) 117

FK (FACKEL) 249

FCA (FLOWERING TIME CONTROL
LOCUS A) 205

FD (FLOWERING LOCUS D) 333
FERTILIZATION INDEPENDENT
ENDOSPERM (FIE) 81, 259
FERTILISATION INDEPENDENT

SEED2 (F1S2) 81, 82, 259

FLOWERING LOCUS C (FLC) 338

FLOWERING LOCUS T (FT) J 98

FLO (FLORICA ULA) 353,411

FRI (FRIGIDA) 340

FT (FLOWERING LOCUS T) 198, 331

FUSCA 3 (FUS3) 215

FY (FLOWERING LOCUS Y) 205

GAMYB (GA-DEPENDENT MYB) 191, 198

GAMYB 1 194

GAMYB 33 197, 342, 348

GA-ох (GA-OX1DASE) 183

GA2ox 186

GA3ox 184

GA20ox } 86 J

GH3-19T

G1D1 (Gibberellin Insensitive Dwarf 1)

190

SLY/GID2 191

GEF (GUANOSIN EXCHANGE

FACTOR) 63

GNOM 63, 104, 236

GL 2 (GLABRA 2) 314

GPCR (G-Proteins Coupled Receptors)
62,212

GRAS (GAL RGA, SCR) 77

GTG 1,2 (GPCR Type G-proteins 1,2) 214

HAM (HAIRY MERISTEM) 279

HDAC (HYSTONE DEACETILASE) 80

HD-ZIP HI (HOMEODOMAIN-Leu-RICH

ZIPPER III) 74,

PHB (PHABULOSA) 248

PHV(PHAVOLUTA) 248

REV(REVOLUTA) 248

HEN! (HUA ENHANCER I) 84

HIK (H1NKEL) 243

HIRA 284

HST'HASTY) 84

HYD (HYDRA I) 249

HYL I (HYPONASTIC LEAVES) 84
IPT 1-9 (ISOPENTENYL
TRANSFERASE 1-9) 131,275

JAG (JAGGED) 292, 375

KANADY 1-4 297

KEU (KEULE) 242

KN (KNOLLE) 242

KNOX (KNOTTEDI-LIKE

HOMEOBOX) 75

KN ATI (KNOX of A. thaliana 1) 270,

413

KNAT2 270

STM (SHOOTMERSTEMLESS) 244,
269

LBD (LATERAL ORGAN BOUNDARY

DOMAIN) 290

LEA (LATE EMBRYOGENESIS

ABUNDANT) 172,212,

LEAFY COTYLEDONE (LEC) 253

FUS3 (FUSCA 3) 254

LEC1 254

LEC2 215, 254

LFY (LEAFY) 198, 349, 370, 411

LHY (LA ТЕ El,ONG A TED

HYPOCOTYL) 327

LOG (LONELY GUY) 132

MKK9 (MAPKK9) 167

МРКЗ/6 (МАРК 3/6) 167

miR (microRNA) 85,

miR 162 86,

miR 164 303

miR 165/166 86, 248.

miR 172 86, 373

miR 319a (JAW) 86

NRT (NITRATE TRANSPORTER)
153

NS 1, 2 (NARROW SHEATH 1, 2) 292

ORC/CPH/SMT1 (CEPHALOPOD/
STEROLMETILTRANSFERASE 1) 105,
249

PcG (Polycomb Group Proteins) 81, 336,
372

CLF (CURLYLEAF) 81

EMF 2 (EMBRYONIC FLOWER 2) 81

FIE (FERTILIZATION
INDEPENDENT ENDOSPERM) 81,
259

FIS 2 (FERTILISATION
INDEPENDENT SEED 2) 81, 259
ME A (MEDEA) 81,259

SWN (SWINGER) 81

VRN 2 (VERNALIZATION2) 81,339

PHAN (PHANTASTICA) 279, 284, 303

PHE1 (PHERES1) 260

PHYA. PHYB, PHYC, PHYD, PHYE
(PHYTOCHROME A-E) 57, 327
Pl (PIST1LLATA) 361

PICKLE (PKL) 80, 111, 255

PID (P1NOID) 102

PIF 3 (PHYTOCHROME INTERACTING

FACTOR 3) 328

PIL5 (PHYTOCHROME INTERACTING

FACTOR-LIKE 5) 187

PIN (PINFORMED) 99

P1N1 ;00, 235, 287, 294, 298

PIN2 100

PIN3 100, 120

PIN7 100, 235

PHOT1, 2 (PHOTOTROPIN 1, 2) 122

PHT (PHOSPHA ТЕ TRA NSPOR TER)
153

PLT 1-3 (PLETHORA 1-3) 310

PP2C (PROTEIN PHOSPHATASE 2C)
209

PR (PATHOGENESIS RELATED) 174

PRS (PRESSED FLOWER) 292

PUP 1-3 (PURINE PERMEASE 1-3) 135
RANI (RESPONSIVE ТО

ANTAGONIST 1) 165

RCAR/PYR/PYL (Regulatory Components
of АВА Receptor) 208

RCN (ROOT CURLING IN NPA) 104

RIN (RIPENING INHIBITOR) 173

RISC (RNA-Induced Silencing Complex)
84

RTE1 (REVERSION TO ETHYLENE

SENSITIVITY) 165

SAUR (Small Auxin Up-regulated RNAs)
114

SCARECROW (SCR) 77, 310

SCF (Skpl-CulUn-F-box) 62

SEP 1-4 (SEPALLATA 1-4) 376

SHR (SHORTROOT) 77, 310

SnRK2 (SNF1 -Relatedprotein Kinase 2)
209

SOC1 (SUPPRESSOR OF

OVEREXPRESSION OF CONSTANS 1)

198, 333

SP (SPOROCYTELESS) 379

SPL (SQUAMOSA PROMOTER

BINDING PROTEIN-LIKE) 344

SPY (SPINDLY) 192

SULTR (SULPHATE TRANSPORTER)
153

SUMO (Small Ubiquitin related Modifier)
62,213

TFL 1 (TERMINAL FLOWER 1) 351

T1R1 (TRANSPORT INHIBITOR

RESPONSE) 106

TIR3/BIG (TRANSPORTINHIBITOR

RESPONSE 3) 105

TPL (TOPLESS) 102, 248, 251

TOC1 (TIMING OF CAB 1) 327

TSD (TUMOROUS SHOOT

DEVELOPMENT) 244

TTG (TRANSPARENT TESTA/ GL ABRA I)
315

UFO (UNUSUAL FLORAL ORGANS) 357

VALI (VPl/AB13-Like B3) 217

VIN 3 (VERNALIZATION

INSENSITIVE 3) 338

VRN 1 (VERNALIZATION 1) 339

WER (WEREWOLF) 315

WOX(WUSCHEL RELATED

HOMEOBOX) 1b

WOX2 234

WOX5 236, 308

WOX8 234

WOX9/ST1P 239, 268

WUSHEL 236, 244, 267, 270, 375

WRKY 178, 204

YABBY 299
Научное издание

Лутова Людмила Алексеевна, Ежова Татьяна Анатольевна,
Додуева Ирина Евгеньевна, Осипова Мария Александровна

Под редакцией академика РАН Инге Вечтомова Сергея Георгиевича

ГЕНЕТИКА РАЗВИТИЯ РАСТЕНИЙ

Учебное пособие для студентов
высших учебных заведений

ООО «Издательство Н-Л»
Генеральный директор В Г. Родин
Выпускающий редактор Л. А. Титова
Корректор О. Е. Ларионова
Верстка В. Н. Фролов

Подписано в печать 25.12.2010.

Формат 60«90/16. Бумага офсетная.
Гарнитура Times New Roman.

Печать офсетная. Ус л. печ. л. 27. Тираж 1000 экз.
Заказ № 109

Оригинал-макет изготовлен ООО «Издательство Н-Л».
Отпечатано ООО «ПК “Первоцвет”»,
г. Саякт-Петербург, В.О., 24-линия, д. 1.

Тел/факс-(812) 322-66-80.

По вопросам приобретения издания обращаться
в ООО «Издательство Н-Л»

198152, Санкт-Петербург, ул. Автоьская, д. 17, 1-й этаж
Тел. /факс: (812) 784-97 51; 784 97-50.

E-mail: nl@n-l.ru

ISBN 978-5-94869-104-6