/
Автор: Власов В.В. Закиян С.М. Дементьева Е.В.
Теги: общая генетика общая цитогенетика иммуногенетика эволюционное учение видообразование филогенез биология биохимия генетика эпигенетика
ISBN: 978-5-7692-1227-7
Год: 2012
Текст
РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК
СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ
ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ И ГЕНЕТИКИ
ИНСТИТУТ ХИМИЧЕСКОЙ БИОЛОГИИ И ФУНДАМЕНТАЛЬНОЙ МЕДИЦИНЫ
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РФ
НОВОСИБИРСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ПАТОЛОГИИ
КРОВООБРАЩЕНИЯ ИМЕНИ АКАДЕМИКА Е. Н. МЕШАЛКИНА
ЭПИГЕНЕТИКА
Ответственные редакторы
доктор биол. наук, профессор С. М. Закиян
академик, доктор хим. наук, профессор В. В. Власов
канд. биол. наук Е. В. Дементьева
НОВОСИБИРСК
ИЗДАТЕЛЬСТВО СИБИРСКОГО ОТДЕЛЕНИЯ
РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК
2012
УДК 575
ББК 28.04
Э71
Эпигенетика / Отв. ред. С. М. Закиян; В. В. Власов, Е. В. Дементьева; Рос. акад, наук,
Сиб. отд-ние, Ин-т цитологии и генетики [и др.]. — Новосибирск: Изд-во СО РАН,
2012. — 592 с.
Эпигенетика — направление генетики, сравнительно недавно оформившееся в самостоя-
тельную область исследований. В последние годы исследования в этой области развиваются осо-
бенно быстрыми темпами, что в значительной степени связано с появлением новых высокоэффек-
тивных методов анализа. В представленной монографии коллективом авторов с высокой степенью
полноты изложено современное состояние исследований по основным проблемам эпигенетики.
Представленная информация не только суммирует результаты исследований зарубежных ученых, но
и предоставляет информацию об оригинальных работах авторов, большинство из которых является
признанными специалистами в данной области. В монографии подробно описаны новые методы, ко-
торые используются для исследования эпигенетических явлений различной природы. Изложенный в
книге материал представляет интерес для биологов различных специальностей: генетиков, физиоло-
гов, иммунологов, биохимиков и биотехнологов, а также для медицинских генетиков, врачей, студен-
тов и аспирантов.
Утверждено к печати
Ученым советом Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН
Рецензенты.
академик РАН, доктор биол. наук, профессор И. Ф. Жимулёв
член-корр., доктор хим. наук, профессор О. И. Лаврик
доктор биол. наук, профессор К. В. Северинов
доктор биол. наук А. В. Вершинин
Авторы:
Закиян С. М., Артемов Г. Н., Баранов В. С., Белякин С. Н., Брусенцова И. В., Ванюшин Б. Ф., Васько-
ва Е. А., Галкин А. П., Горчаков А. А., Григорьева Е. В., Грин И. Р., Демакова О. В., Дементьева Е. В.,
Елисафенко Е. А., Ефимова О. А., Жарков Д. О., Захарова И. С., Зенкова М. А., Иванкина Е. А., Инге-
Вечтомов С. Г., Кизилова Е. А., Колесников Н. Н., Колесникова Т. Д., Короткова А. М., Коряков Д. Е.,
Кузнецова Т. В., Мазурок Н. А., Малахова А. А., Медведев С. П., Натальин П. Б., Павлова С. В., Пен-
дина А. А., Покушалов Е. А., Рубель А. А., Сопова Ю. В., Сорокин М. А., Стегний В. Н., Трофимова И. Л.,
Усов К. Е., Федорова И. Д., Федорова Н. Б., Чадов Б. Ф., Чадова Е. В., Черноловская Е. Л., Шевченко А. И.
ISBN 978-5-7692-1227-7 © Институт цитологии и генетики СО РАН, 2012
© Институт химической биологии и фундаментальной меди-
цины, 2012
©Новосибирский научно-исследовательский институт пато-
логии кровообращения имени академика Е. Н. Мешалкина,
2012
© Оформление. Издательство СО РАН, 2012
ОГЛАВЛЕНИЕ
Предисловие, 5
Глава 1
Нуклеосомная организация хроматина, 7
Коряков Д. Е.
Глава 2
Механизмы соматического мутагенеза и активного
ДЕМЕТИЛИРОВАНИЯ ДНК В ЭПИГЕНЕТИЧЕСКОЙ РЕГУЛЯ-
ЦИИ, 31
Жарков Д. О., Грин II. Р.
Глава 3
Метилирование ДНК у растений: эпигенетический
КОНТРОЛЬ ЗА ГЕНЕТИЧЕСКИМИ ФУНКЦИЯМИ, 53
Ванюшин Б. Ф.
Глава 4
Механизмы эпигенетического наследования, 89
Колесникова Т. Д.
Глава 5
Пространственно-временная программа репликации
ДНК. Эпигенетические механизмы регуляции в кле-
точном цикле и в развитии, 107
Колесникова Т. Д.
Глава 6
Пространственная организация ядра как механизм
ЭПИГЕНЕТИЧЕСКОЙ РЕГУЛЯЦИИ, 143
Стегний В. И, Артемов Г. Н, Усов К Е.
Глава 7
РНК-интерференция — эволюционно консервативный
МЕХАНИЗМ РЕГУЛЯЦИИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ, 787
Черноловская Е. Л.. Зенкова М. .4.
Глава 8
Генетические и эпигенетические механизмы предым-
плантационного развития мыши, 207
Сорокин М. .4.
Глава 9
Эпигенетические механизмы нормального и патоло-
гического развития человека, 225
Баранов В. С., Кузнецова Т. В., Пендина .4. А.,
Ефимова О. А., Федорова II. Д., Трофимова II. Л.
Глава 10
ЭВОЛЮЦИЯ И ОРГАНИЗАЦИЯ КЛАСТЕРОВ ГЕНОВ С ИМПРИНТИ-
РОВАННОЙ МОНОАЛЛЕЛЬНОЙ ЭКСПРЕССИЕЙ, 267
Короткова .4. М., Захарова II. С.
Глава 11
Стволовые клетки, 283
Григорьева Е. В., Шевченко А. II., Мазурок Н. А.,
Покушалов Е. .4., Закиян С. М.
Глава 12
Эпигенетические механизмы в регуляции самообнов-
ления И ПЛЮРИПОТЕНТНОСТИ КЛЕТОК МЛЕКОПИТАЮ-
ЩИХ, 317
Медведев С. П., Покушалов Е. .4., Закиян С. М.
Глава 13
«Тест на химеризм»: возможности и превратности
метода, 343
Кизилова Е. .4.
Глава 14
ДОЗОВАЯ КОМПЕНСАЦИЯ У ДРОЗОФИЛЫ: МЕХАНИЗМ И ЭПИ-
ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ, 359
Горчаков А. А., Демакова О. В., Брусенцова II. В.
Глава 15
Регуляция экспрессии генов Х-хромосомы у млекопи-
тающих, 385
Дементьева Е. В., Шевченко А. II, Закиян С. М.
Глава 16
Структура и функционирование центра инактивации
Х-хромосомы млекопитающих, 403
Малахова А. А., Елисафенко Е. .4.. Шевченко А. II.
Павлова С. В., Закиян С. М.
Глава 17
Эволюция ПРОЦЕССА ИНАКТИВАЦИИ Х-ХРОМОСОМЫ, 419
Елисафенко Е. А., Колесников Н. Н., Шевченко А. II,
Закиян С. М.
Глава 18
Модификации хроматина в процессе инактивации
Х-хромосомы у самок млекопитающих, 433
Павлова С. В., Дементьева Е. В., Шевченко А. II.
Глава 19
Мейотическая инактивация половых хромосом, 451
Васькова Е. .4.. Павлова С. В.. Шевченко А. II.
Закиян С. М.
Глава 20
Диминуция хроматина с точки зрения эпигенетики.
Механизм РНК-опосредованной перестройки генома
в ХОДЕ элиминации у инфузорий, 465
Иванкина Е. .4.
Глава 21
Прионы, «белковая наследственность» и эпигенети-
ка, 481
Пнге-Вечтомов С. Г, Галкин А. П, Сомова Ю. В.,
Рубель .4. .4.
Глава 22
Эпигенетическая феноменология у условных мутан-
тов Drosophila melanogaster: морфозы и модифика-
ции, 499
Чадов Б. Ф„ Чадова Е. В., Федорова Н. Б.
Глава 23
Современные технологии секвенирования ДНК в эпи-
генетике, 535
Натальин П. Б., Белякин С. Н.
Список СОКРАЩЕНИЙ, 563
Словарь терминов, 567
Благодарности, 587
Контактные данные авторов, 583
ПРЕДИСЛОВИЕ
«Genetics proposes; epigenetics disposes.»
«Генетика предполагает; эпигенетика располагает.»
Р. Medawar*, J. Medawar
История эпигенетики тесно связана с ис-
торией биологии развития и эволюции.
В течение последних 50 лет само значение тер-
мина «эпигенетика» претерпело эволюцию, и
этот процесс шел параллельно развитию нашего
понимания молекулярных механизмов, лежащих
в основе регуляции экспрессии генов у эукариот.
Термин «эпигенетика» был предложен Кон-
радом Уоддингтоном в 1940 г. как производное
от аристотелевского слова «эпигенез» (Waddin-
gton С. Н. 1940. Organisers & Genes. Cambridge:
Cambridge University Press). Когда Уоддингтон
ввел термин «эпигенетика», физическая природа
генов и их роль в наследственности не были до
конца известны, поэтому’ он использовал его для
обозначения модели того, как гены могут взаи-
модействовать со своим окружением при фор-
мировании фенотипа.
До 1950-х гг. под «эпигенетикой» понимали
все события, происходящие в ходе развития от
оплодотворенной яйцеклетки до взрослого орга-
низма, — т. е. все регуляторные процессы, кото-
рые, начиная с генетического материала, форми-
руют конечный продукт (Waddington С. Н. 1953.
Epigenetics and evolution. Svmp. Soc. Exp. Biol.
V. 7. P. 186—199).
Современное использование этого слова яв-
ляется более узким. Префикс «эпи» в термине
«эпигенетика» заимствован из греческого языка
и может переводиться как «на», «над», «сверх»,
«после». К эпигенетическим факторам относят
только те факторы, которые действуют дополни-
тельно или помимо генетических молекулярных
факторов.
Работающее в настоящее время определение
«эпигенетики» содержится в работах А. Риггса
(Riggs A. D.) и понимается как «изучение мито-
тически и/или мейотически наследуемых изме-
нений в функции генов, которые не могут быть
объяснены изменениями в последовательности
ДНК» (Riggs A. D., Martienssen R. F., Russo V. Е. А.
1996. Introduction. In: Epigenetic Mechanisms of
Gene Regulation (ed. Russo V. E. A. et al.). New
York: Cold Spring Harbor Laboratory Press. P. 1—4).
Молеку’лярная основа эпигенетики — моди-
фикация активности генов, не затрагивающая
базовую структуру ДНК. Основные эпигенети-
ческие механизмы регу’ляции активности генов,
известные в настоящее время, — метилирование
ДНК, ацетилирование гистонов, некодируто-
щая РНК, ремоделирование хроматина. Особен-
ностью эпигенетических изменений является то,
что они сохраняются при клеточном делении.
Известно, что большинство эпигенетических
изменений проявляется только в пределах жизни
одного организма. В то же время, если измене-
ние в ДНК произошло в сперматозоиде или яй-
цеклетке, то некоторые эпигенетические прояв-
ления могут передаваться от одного поколения
* Peter Brian Medawar, лауреат Нобелевской премии по ме-
дицине и физиологии.
6 ЭПИГЕНЕТИКА
к другому. Это свидетельствует о возможности
наследования приобретенных признаков, что до
последнего времени считалось абсолютно не-
возможным.
Разница между’ эпигенетическими и генетиче-
скими механизмами наследования — в их ста-
бильности, воспроизводимости эффектов. Гене-
тически обусловленные признаки могут переда-
ваться неограниченно долго. Индуцированные
определенными стимулами эпигенетические из-
менения обычно воспроизводятся в ряду’ клеточ-
ных поколений в пределах жизни одного орга-
низма. Когда они передаются потомкам, то мо-
гут воспроизводиться не более трех—четырех
поколений, а потом, если индуцировавший их
стимул исчезает, постепенно сходят на нет.
К специфическим эпигенетическим процес-
сам относятся такие явления, как импринтинг,
инактивация Х-хромосомы, эффект положе-
ния, материнские эффекты, репрограммирова-
ние, трансфекция, молчание генов, карциноге-
нез, модификации гистонов, гетерохроматиниза-
ция, партеногенез, старение, клонирование и др.
Первый яркий эксперимент, демонстрирую-
щий возможность эпигенетического наследова-
ния между’ поколениями, был проведен в 2003 г.
американскими учеными Рэнди Джиртлом (Ran-
dy L. Jirtle) и Робертом Уотерлендом (Robert
Waterland) из университета Дьюка в США на
мышах с мутантным геном окраски агути
(agouti). Была показана возможность длительной
модификации экспрессии мутантного гена под
воздействием специальной диеты до и во время
беременности. Рэнди Джиртл так прокомменти-
ровал свое открытие в журнале Discovery’ в ста-
тье «ДНК — это не судьба»: «...эпигенетика до-
казывает, что мы ответственны за целостность
нашего генома. Раньше мы думали, что только
гены предопределяют, кто мы. Сегодня мы точ-
но знаем: все, что мы делаем, все, что мы едим,
пьем или курим, оказывает воздействие на экс-
прессию наших генов и генов будущих генера-
ций. Эпигенетика предлагает нам новую кон-
цепцию свободного выбора».
Центральная эпигенетическая гипотеза о том,
что активность многих генов подвержена влия-
нию извне, сейчас находит подтверждение
во множестве экспериментов на модельных жи-
вотных.
В перспективе расшифровка эпигенетических
механизмов контроля развития и жизнедеятель-
ности организма приведет к революции в биоло-
гии и медицине. Именно за эпигенетической те-
рапией будущее в разработке лекарственных
препаратов следующего поколения для лечения
самых тяжелых болезней, и фармацевтические
компании уже сейчас затрачивают на исследова-
ния сотни миллионов долларов.
Благодаря трудам Ч. Дарвина и Г. Менделя
XIX в. в биологии называют эрой Эволюции
и Генетики, открытие структуры молекулы ДНК
Дж. Уотсоном и Ф. Криком и расшифровка
ее первичной последовательности предопреде-
лили XX веку быть эрой Геномики, а насту-
пившему XXI в. предрекают стать эрой Эпигене-
тики.
ГЛАВА
1
НУКЛЕОСОМНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ХРОМАТИНА
СОДЕРЖАНИЕ
1.1. Уровни упаковки ДНК
в хромосомах, 8
1.2. Структура нуклеосомы, 9
1.3. Варианты гистонов, 10
1.4. Модификации гистонов, 11
1.5. Метилирование ДНК, 15
1.6. Сборка и ремоделирование
нуклеосом, 16
1.7. Наследование модификаций
гистонов и ДНК, 18
1.8. «Гистоновый» код, 19
1.9. «Нуклеосомный» код, 21
1.10. Особые типы хроматина, 22
Список литературы, 24
8 ЭПИГЕНЕТИКА
Рост, развитие, деление, активность каждой
клетки организма и, как следствие, нормальная
жизнь организма в целом зависят от правильной
реализации генетических программ, заложенных
в ядерной ДНК. Программы должны быть запу-
щены и остановлены в определенное время и
только в нужном типе клеток. Это становится
возможным благодаря тому’, что ДНК находится
не в свободном виде, а связана с РНК и многими
типами белков. Такой сложный и, в то же время,
динамичный комплекс, обладающий многоуров-
невой укладкой, называется хроматином. В его
основе лежат нуклеосомы, несущие на себе эпи-
генетические метки, роль которых выполняют
модификации гистонов и метилирование ДНК.
Комбинации меток образуют так называемый
гистоновый код, а взаиморасположение нуклео-
сом, упорядоченное относительно последова-
тельностей ДНК, формирует «нуклеосомный
код». Таким образом, если в /ТНК заложена ге-
нетическая программа, то в гистоновом и нук-
леосомном кодах заложена эпигенетическая
программа, т. е. «расписание работы» ДНК.
Рис. 1.1. Иерархия упаковок ДНК и хроматина в мета-
фазной хромосоме, от двойной спирали ДНК (а), через
нуклеосомы (б), 30-нанометровые фибриллы (в), пет-
ли хроматина, прикрепленные к скэффолду (г), и до
метафазной хромосомы (б). Справа указаны прибли-
зительные размеры каждой из этих структур.
1.1. Уровни упаковки ДНК в хромосомах
Известно, что суммарная длина ДНК, прихо-
дящаяся на одну’ клетку’ человека, составляет
около полутора—двух метров. После нескольких
последовательных этапов упаковки ДНК умеща-
ется в ядре диаметром всего нескольких микро-
метров. На первом этапе двойная спираль ДНК
(рис. оборачивается вокруг белковой гло-
булы, образу’я нуклеосому. Несколько нуклео-
сом, соединенных вместе, формирутот цепочку’
шириной ~11 нм, называему’Ю «бу'сины на нити»
(beads-on-a-string structure) (рис. 1.1,6). Далее
эта цепочка образует фибриллу толщиной по-
рядка 30 нм (рис. 1.1, в), которая затем уклады-
вается в петли, прикрепленные к скэффолду’
(scaffold) (рис. 1.1, г), специфической белковой
структуре, составляющей остов метафазной хро-
мосомы (рис. 1.1, Э).
Из перечисленных уровней упаковки подроб-
нее всего изу’чены ну'клеосомы. Следу'ющий
уровень — 30-нанометровую фибриллу’ исследо-
вали самыми разнообразными физико-химичес-
кими методами in vitro в течение многих лет и
продолжают это делать, однако же, ее структура
до сих пор остается до конца неясной. Кроме
того, результаты некоторых экспериментов ста-
вят под сомнение существование 30-нанометро-
вых фибрилл in vivo [Eltzov et al., 2008], и, воз-
можно, что лишь часть хроматина in vivo орга-
низована в такуто структуру. Типичная фибрилла
имеет диаметр 30—32 нм, и он не зависит от
длины последовательности ДНК, которая соеди-
няет две нуклеосомы, если эта длина находится в
пределах 30—60 п.н. Плотность нуклеосом мо-
жет варьировать и составляет от 6—7 до 13—
15 штук на 11 нм длины фибриллы [Athey' etal.,
1990; Ghirlando, Felsenfeld, 2008]. Моделей, ко-
торые описывают укладку' нуклеосом в фибрил-
ле, несколько, и их разделяют на два основных
класса. В первом из них (one-start helix) 30-на-
нометровая фибрилла представляет собой про-
стую спираль, в котору'Ю у'ложена цепочка из
нуклеосом. Однако такая структура, общеприня-
тая в первые годы исследований, сейчас считает-
ся маловероятной. По современным представле-
ниям, больше соответству'ют действительности
модели, собранные во втором классе (two-start
helix). В этих случаях 30-нанометровая фибрилла
хоть и называется спиралью (helix), но представ-
ляет собой сложное переплетение нуклсосомной
нити, при котором ДНК соединяет нуклеосомы в
соседних параллельных рядах и на противопо-
ложных сторонах спирали [Dorigo etal., 2004;
ГЛАВА 1 9
Wong et al., 2007]. О петлях в более высоких уров-
нях упаковки известно гораздо меньше.
1.2. Структура нуклеосомы
Нуклеосома представляет собой белковую
глобулу’, называемую нуклсосомным кором или
гистоновым октамером, вокруг которой нить
ДНК делает ~1,67 оборота [Kornberg, 1974;
Oudet et al., 1975; Finch et al., 1977]. Длина фраг-
мента /ТНК, приходящегося на одну’ нуклеосому,
варьирует и составляет в среднем 200 п.н.
[Hewish, Burgoync. 1973; Noll, 1974]. Непосред-
ственно с кором связаны 146—147 пар, а осталь-
ные несколько десятков соединяют две соседние
нуклеосомы [Mirzabekov et al., 1978; Latter, 1979;
Thoma et al., 1979; Klug et al., 1980].
Глобула содержит по две молекулы каждого
из четырех типов коровых гистонов: Н2А, Н2В,
НЗ и Н4, и имеет клиновидную форму’, узкуто
часть ее образует тетрамер (НЗ—Н4)2, а широкая
часть состоит из двух димеров Н2А—Н2В, кото-
рые расположены по бокам тетрамера и не взаи-
модействуют друг с другом [Thomas, Kornberg,
1975; Klug et al., 1980; Arents et al., 1991]. Из всей
ДНК, что намотана на октамер, примерно 80 пар
непосредственно связаны с тетрамером (НЗ—
Н4)2 и около 40 пар с димерами Н2А—Н2В. Од-
на молекула линкерного гистона Н1 связывается
с внешней стороной нужлеосомы в районе тет-
рамера (НЗ—Н4)2, тем самым фиксируй на ней
нить ДНК [Varshavsky et al., 1976; Hayashi et al.,
1978; Simpson, 1978; Sperling, Sperling, 1978;
Thoma et al., 1979].
Средняя часть всех коровых гистонов имеет
общую пространственную структуру, называе-
мую гистоновой складкой (histone fold domain,
HFD). Этот домен состоит из трех а-спиралей
(al, a2 и a3), разделенных двумя петлями (L1 и
L2) [Arents, Moudrianakis, 1995]. HFD гистонов
Н2А и Н2В соединяются друт с другом анти-
параллельно, формируя гетеродимер. Таким же
образом димеризу’ются и гистоны НЗ и Н4. Два
димера НЗ—Н4 формируют тетрамер благодаря
прочному’ соединению спиралей а2 и аЗ гистона
НЗ из одного димера с такими же спиралями НЗ
из другого димера. Это соединение называется
4-спиральным узлом (4-helix bundle, 4НВ). Диме-
ры Н2А—Н2В присоединяются к тетрамеру
(НЗ—Н4)2 благодаря слабому 4НВ между спира-
лями а2 и аЗ гистонов Н2В и Н4. N-концевые
(N-terminal domains, NTD, или N-хвосты, N-tails)
и короткие С-концевые (С-terminal domains,
CTD) части гистоновых молекул не имеют опре-
деленной структуры и свободно расходятся
в стороны [Lilley et al., 1977; Hacques et al., 1990;
Luger et al., 1997] (рис. 1.2).
Рис. 1.2. Схема структуры отдельной молекулы гистона и целой нуклеосомы
Поясн. см. в тексте.
10 ЭПИГЕНЕТИКА
1.3. Варианты гистонов
Каждый тип гистонов (кроме, по-видимому,
Н4) не является однородным, а представляет со-
бой группу, состоящую из канонических гисто-
нов и гистоновых вариантов. Гены всех канони-
ческих гистонов лишены интронов, собраны в
единый тандемно повторенный кластер, их РНК
не полиаденилируется, а транскрипция тесно
привязана ко времени репликации ДНК. Гены же
гистоновых вариантов, напротив, обычно уни-
кальны. разбросаны по всему’ геному’, зачастую
содержат интроны, транскрибируются постоян-
но, а их РНК полиаденилируется. Роль гистоно-
вых вариантов состоит в том, чтобы, сохраняя
нуклеосомную укладку’, увеличивать или умень-
шать ее устойчивость, создавать особый кон-
текст в каждом конкретном участке хроматина и,
тем самым, управлять процессами реализации,
защиты или передачи генетической информации.
Для гистона НЗ известны как минимум три
варианта у Т. thermophila. D. melanogaster и
X. laevis (Н3.2, НЗ.З и СепНЗ), пять vM musculus
(Н3.1, Н3.2, НЗ.З, H3t и СепНЗ) и семь v
Н. sapiens (Н3.1, Н3.2, НЗ.З, H3t, НЗ.Х, H3.Y и
СепНЗ). Два из них являются каноническими —
Н3.1 и Н3.2, и различаются всего одной амино-
кислотой [Szenker etal., 2011]. Центромерный
вариант НЗ (СепНЗ) у человека известен как
CENP-A, у дрожжей X cerevisiae как Cse4 и у
дрозофилы как CID. Они имеют низкую гомоло-
гию друг с другом и, ио-видимому, происходят
от разных предшественников. Несмотря на это,
их объединяют в одну' группу’, поскольку’ они
выполняют единую функцию по формированию
центромеры и сборке кинетохора. СепНЗ лишь
на 50—60 % гомологичен каноническому' НЗ в
районе HFD и не имеет гомологии с НЗ в N-koh-
цевой части. Нуклеосомы, содержащие СепНЗ.
также отличаются от канонических. Считается,
что у' дрозофилы центромерные нуклеосомы со-
держат не восемь, а всего четыре молекулы гис-
тонов — CID, Н4, Н2А и Н2В, и длина ДНК,
обернутая вокруг них, примерно в 2 раза меньше
обычной [Dalal et al., 2007]. У дрожжей 5. cerevi-
siae центромерные нуклеосомы предположи-
тельно представляют собой гексамер из двух
молекул трех типов: Cse4, Н4 и Scm3, и при этом
лишены Н2А и Н2В [Mizuguchi et al., 2007]. Од-
нако данный вопрос пока открыт, поскольку'
другие исследования показали, что эти нуклео-
сомы имеют октамернуто структуру, a Smc3 не
входят в состав С8е4-содержащих нуклеосом
[Westermann et al., 2003; Camahort et al., 2009].
Вариант НЗ.З у большинства организмов от-
личается от канонического гистона Н3.2 всего
четырьмя заменами в положениях 31, 87, 89 и 90.
Остаток 31 расположен на N-конце молекулы,
остальные три положения находятся в спирали
0.2, и от них зависит специфичность встраивания
этого варианта в хроматин. Если НЗ встраивает-
ся во время репликации, то НЗ.З замещает его в
нуклеосомах независимо от репликации [Tagami
et al., 2004]. Как у дрозофилы, так и у человека
НЗ.З встраивается преимущественно в хроматин
активных генов, промоторов и регуляторных
областей генов [Henikoff. 2008]. Также, по срав-
нению с нуклеосомами, содержащими канониче-
ский вариант НЗ, НЗ.З обогащен модификация-
ми, характерными для активного хроматина
[Loyola et al., 2006]. Распределение НЗ.З обратно
коррелирует с распределением Н1, и НЗ.З, no-
видимому, участвует в удалении Н1 из хромати-
на [Braunschweig et al., 2009].
Семейство Н2А образует основной гистон
Н2А и варианты H2A.Z. Н2А.Х, макроН2А
(тН2А) и H2A-Bbd, которые значительно отли-
чаются от канонического гистона. Очень консер-
вативным является вариант H2A.Z. Он участвует
в регулировании как активации транскрипции,
так и ее подавления, в репарации ДНК, высоко-
у'ровневой укладке хроматина, метилировании
ДНК у растений и других процессах. Наиболее
исследовано участие варианта H2A.Z в организа-
ции премоторных областей генов, где он входит в
состав нуклеосом, ограничивающих безнуклео-
сомную область перед точкой начала транскрип-
ции (подробнее см. 1.9). Если у дрожжей этот ва-
риант закодирован единственным геном, который
не является жизненно важным, у позвоночных
найдены два гена, кодирующие разные, невзаимо-
заменяемые формы — H2A.Z1 и H2A.Z2 [Faast
et al.. 2001: Eirin-Lopez et al., 2009].
H2A.X схож с каноническим H2A в глобу-
лярной части, но отличается от него в С-конце,
где содержит остаток серина, способный фосфо-
рилироваться с образованием формы уН2А.Х.
Эта модификация возникает в ответ на появле-
ние двунитевых разрывов ДНК и привлекает в
данный район белки репарации и комплексы ре-
моделирования хроматина [Altaf et al.. 2009; van
Attikum, Gasser, 2009]. уН2А.Х также необходим
для ремоделирования и инактивации половых
хромосом в мейозе у мышей или, в более широ-
ком смысле, для инактивации неспаренного
хроматина в мейозе [Turner et al., 2005].
mH2A характерен для позвоночных, и перво-
начально предполагалось, что он необходим для
ГЛАВА 1 11
инактивации Х-хромосомы. Однако позднее ока-
залось, что его роль в регулировании экспрессии
гораздо сложнее. В зависимости от конкретных
обстоятельств, шН2А может участвовать как в
подавлении, так и в активации транскрипции.
Кроме того, он связан с контролем клеточного
цикла [Chadwick, Willard, 2002; Gamble, Kraus,
2010]. mH2A содержит большой не гистоновый
macro-домен на С-конце молекулы, из-за чего
размер этого варианта в три раза больше, чем
размер канонического. N-конец молекулы на
64 % гомологичен Н2А. У млекопитающих су-
ществуют две разновидности, кодируемые раз-
ными генами: тН2А1 и тН2А2, первая из кото-
рых в результате альтернативного сплайсинга
дает еще два подтипа: шН2А1.1 и тН2А1.2
[Pehrson, Fired, 1992; Chakravarthy et al., 2005].
Вариант H2A-Bbd (Barr body deficient) харак-
терен только для млекопитающих, он гомологи-
чен основному’ варианту’ на 48 % и отсутствует в
инактивированной Х-хромосоме [Chadwick, Wil-
lard, 2001]. Считается, что H2A-Bbd участвует
в активации генов, так как наличие данного ва-
рианта повышает эффективность ацетилирова-
ния нуклеосомы, а также ослабляет связывание
с ней ДНК и, тем самым, увеличивает доступ-
ность для факторов транскрипции [Gonzalez-Ro-
mero et al., 2008].
Линкерный гистон Hl у млекопитающих
представлен не менее, чем 11 вариантами, и это
больше, чем уг любого другого гистона. Их мож-
но разделить на две группы: повсеместно пред-
ставленные в соматических клетках (Н1°, Н1а,
Hlc, Hid, Hie, Hlb и Hix, они также известны
под названиями Н1.0, Hl.l, Н1.2, Н1.3, Н1.4,
Н1.5 и Н1.Х соответственно), и тканеспецифич-
ные Hit, Hlt2, HILS (найдены в семенниках) и
Н1°° (обнаружен в яичниках) [Godde, Ura, 2008].
Варианты отличаются друг от друга по разме-
ру и составу. Так, соматические варианты
Н1.1—Н1.5 имеют длину* порядка 220 а.к. и со-
отношение лизин/аргинин составляет 16, семен-
никспецифичный Hit состоит из 209 аминокис-
лот, а соотношение равно 2,9, длина варианта
Н1°° составляет 304 остатка, а соотношение 2,3
[Godde, Ura, 2009].
Не все варианты Н1 жизненно необходимы,
поскольку' они, возможно, взаимозаменяемы.
Так, отсутствие Н1 у инфузорий и низших гри-
бов не сказывается на их жизнеспособности.
Удаление Н1° либо Hit у мышей также не вызы-
вает заметных изменений. Однако удаление сра-
зу трех вариантов Н1.2, Н1.3 и Н1.4 приводит к
нарушению развития [Godde, Ura, 2008]. Разные
семенникспецифичные формы Н1 работают на
разных этапах сперматогенеза. По ходу этого
процесса степень упаковки хроматина возраста-
ет, и происходит смена менее основных лизин-
богатых гистонов на более основные аргининбо-
гатые. Так, в сперматогониях хроматин содер-
жит Н1, на стадии пахите ны его замещает вари-
ант Hit, в сперматидах ему’ на смену' приходят
варианты Hlt2 и HIUS [Godde, Ura, 2009], а за-
тем все гистоны замещаются на протамины
(о них подробнее см. 1.10.1).
1.4. Модификации гистонов
Чтобы обеспечить запуск процессов в хрома-
тине только в определенное время и в опреде-
ленном месте, для управления процессами,
а также для их временной и пространственной
координации в хроматине должны быть эпигене-
тические метки. Они необходимы также для
«запоминания» текущего состояния хроматина
и передачи этого состояния в следующее кле-
точное поколение. Роль таких эпигенетических
меток выполняют посттрансляционные кова-
лентные модификации гистонов и метилирова-
ние ДНК.
Модификациям подвергаются в основном
N-хвосты и в меньшей степени глобулярная и
С-концевая части молекул гистонов. Модифици-
роваться могут лишь некоторые аминокислот-
ные остатки, и при этом каждый по-своему.
К ним могут быть присоединены небольшие хи-
мические группы, таковыми являются метиль-
ные, ацетильные и фосфатные либо достаточно
крупные белковые молекулы, такие как убикви-
тин, биотин, SUMO и цепочки АДФ-рибозы. Ос-
татки пролина же могут быть изомеризованы. Для
обозначения разнообразных модификаций в боль-
шинстве случаев используют такую систему’: ука-
зывают название гистона, название аминокисло-
ты по однобуквенной номенклатуре, номер ос-
татка от N-конца и тип модификации. Например,
Н4К16ас означает, что это ацетилированный 16-й
по счету’ остаток лизина в гистоне Н4.
Все модификации являются обратимыми, и
для каждой существуют ферменты, которые ее
устанавливают или удаляют. Общее число фер-
ментов велико, и оно постоянно увеличивается,
но единая номенклатура для них пока отсутству-
ет. Например, НЗК4-специфичная деметилаза
у человека называется USD1, а у дрозофилы
SU(VAR)3-3; НЗК4-специфичная метилтрансфе-
раза у человека называется MLU, а у дрозофилы
Тгх. Для упрощения громоздких бессистемных
12 ЭПИГЕНЕТИКА
названий был предложен вариант единой но-
менклатуры для ферментов, связанных с ацети-
лированием и метилированием [Allis et al., 2007].
По ней все лизиновые деметилазы обозначены
KDM (K-demethylases), ацетилтрансферазы —
КАТ (K-acctyltransfcrascs), лизиновые метил-
трансферазы — KMT (K-methyltransferases). Со-
ответствующий лизиновый остаток обозначается
цифрой или комбинацией цифры и буквы. На-
пример, деметилазы LSD1 и SU(VAR)3-3 обо-
значены как KMD1, а НЗК9-специфичная деме-
тилаза человека JMJD2D согласно новой но-
менклатуре стала KMD4D.
1.4.1. Метилирование
Метилирование является модификацией, для
которой существуют разные варианты. К лизи-
новому остатку могут быть присоединены одна,
две или три метильные группы, соответственно
он может быть моно- (mel), ди- (тс2) или три-
метилированным (теЗ). Аргинин может быть
моно- или диметилирован, причем атомы азота
на конце боковой цепи аргинина неодинаковы:
один из них входит в состав амино-, а другой —
иминогруппы. Таким образом, диметилирован-
ный остаток аргинина может нести обе метиль-
ные группы на атоме азота из аминогруппы (это
асимметричное метилирование, тс2а) либо по
одной группе у двух разных атомов азота (это
симметричное метилирование, me2s).
Каждый из этих вариантов выполняет свою
биологичсскую функцию в самых разных хрома-
тиновых процессах. Например, метилирование
НЗК4, H3K36 и НЗК79 связано с транскрипцией,
тогда как метилирование остатков НЗК9, НЗК27
и Н4К20 играет ключевую роль в инактивации.
В разных процессах могут участвовать и разные
формы одного остатка. Показано, что диметили-
рованный аргининовый остаток H3R2me2a пре-
пятствует активации транскрипции путем инги-
бирования образования НЗК4теЗ. Монометили-
рованная же форма H3R2mel не влияет на
НЗК4теЗ и коррелирует с активной транскрип-
цией [Kirmizis et al., 2009].
Присоединение метильных групп осуществ-
ляет группа ферментов, называемых гистон-ме-
тилтрансферазы, а их удаление — гистон-деме-
тилазы. Большинство лизиновых метилтрансфе-
раз обладает каталитическим SET-доменом и
подразделяется на пять семейств (SUV39, SET1,
SET2, RIZ и SMYD3), которые различаются по-
ложением SET-домена, специфичностью к кон-
кретному' остатку’ и наличием других доменов
в молекуле |Fryc et al., 2010]. Лишь небольшая
группа ферментов, специфичных для НЗК79,
вместо SET использует другой каталитический
домен [Feng et al., 2002; Martin, Zhang, 2005].
Аргининспецифичные метилтрансферазы под-
разделяют на два класса, оба из которых способ-
ны производить монометилирование, но фер-
менты класса I производят асимметричное диме-
тилирование, а класса II — симметричное [Zhang,
Reinberg, 2001; McBride, Silver, 2001]. Донором
метильной группы выступает S-аденозин-Е-ме-
тионин [Schluckebier etal., 1995]. Данное соеди-
нение является универсальным и для ДНК-, и
для белокспецифичных метилтрансфераз. Соот-
ветственно, все эти ферменты содержат консер-
вативный мотив, связывающий S-аденозил-Е-
метионин, независимо от того, на какой субстрат
они переносят метильную группу^ [Niewmier-
zycka, Clarke, 1999].
В течение долгого времени метилирование
гистонов считали очень устойчивым и полагали,
что его удаление происходит путем замены всей
гистоновой молекулы либо отрезания N-хвоста.
Подтверждением тому’ является замена Н3.1 ва-
риантом НЗ.З в активно транскрибируемых рай-
онах [Ahmad, Henikoff, 2002], а также удаление
гистоновых хвостов в микронуклеусе у Tetrahy-
mena [Allis et al., 1980]. Однако потом стало оче-
видно, что такой способ не может быть основ-
ным хотя бы потому', что при этом теряются
все остальные модификации в той же молекуле
гистона.
Активные поиски привели к обнаружению
лизиновых деметилаз, которые способны уда-
лять метильные группы и давать немодифициро-
ванный остаток с помощью двух разных хими-
ческих реакций. Первым был обнаружен фер-
мент LSD1 [Shi etal., 2004]. Он способен деме-
тилировать только остатки mel и те2 с помо-
щью амино-оксидазной реакции с образованием
формальдегида, перекиси водорода и немодифи-
цированного остатка, используя FAD в качестве
кофактора. Позднее было выявлено семейство
ферментов, несущих каталитический JmjC-до-
мен [Tsukada et al., 2006]. Эти ферменты исполь-
зуют в качестве кофакторов ионы Fe2+ и а-кето-
глутарат и удаляют метильные группы с образо-
ванием сукцината, формальдегида и СО2. Разные
белки данного семейства способны деметилиро-
вать любые остатки: mel, mc2 и теЗ [Klose,
Zhang, 2007].
Деметилирование аргинина в гистонах на
данный момент исследовано еще очень мало. Из-
вестно семейство ферментов PADI, которое
ГЛАВА 1 13
при участии ионов Са' удаляет монометили-
рование с помощью реакции деиминирования
[Cuthbert etal., 2004; WangH. etal., 2004]. При
этом данную реакцию нельзя назвать истин-
ным деметилированием, поскольку’ в результате
нее образуются формальдегид и производное
аргинина цитруллин вместо немодифицирован-
ного остатка.
1.4.2. Ацетилирование
В отличие от метильной, ацетильная группа
на остатке лизина может быть только одна. Эта
молскулярная метка связана прсимущественно с
активацией транскрипции и является очень мо-
бильной, что обеспечивают многочисленные гис-
тон-ацетилтрансферазы и гистон-деацетилазы.
Все ацетилтрансферазы делят на два больших
класса в зависимости от того, в какой части
клетки они работают. Ферменты типа В работа-
ют в цитоплазме, а трансферазы типа А являют-
ся ядерными. Кроме этого, среди них выделяют
несколько семейств и суперсемейств по наличию
в их составе консервативных доменов и участию
в работе разных белковых комплексов (GNAT,
MYST, рЗОО/СВР, коактиваторы ядерных рецеп-
торов, TAFII250 и TFIIIC) [Sterner, Berger, 2000;
Roth etal., 2001]. Все ацетилтрансферазы объе-
диняет гомология каталитического домена. Его
детальная пространственная организация и ме-
ханизм работы изучены для ферментов PCAF и
GCN5. Этот домен содержит несколько мотивов,
самым консервативным из которых является мо-
тив A (R/G-x-x-G-x-G/A), узнающий и связы-
вающий донора ацетильной группы Ас-СоА
[Dutnall etal., 1998; Wolf etal., 1998; Clements
et al., 1999; Lin et al., 1999; Rojas et al., 1999;
Trievel et al., 1999].
Среди многочисленных гистон-деацетилаз
различают четыре класса, исходя из их гомоло-
гии между’ собой и локализации в ядре или ци-
топлазме [de Ruijter etal., 2003; Verdin etal.,
2003; Blander, Guarente, 2004; Hisahara etal.,
2005; Yang, Gregoire, 2005]. По гомологии к бел-
кам RPD3, HDA1 и Sir2 из 5. cerevisiae деацети-
лазы разделяют на классы I, П и III соответ-
ственно [Imai et al., 2000; Bjerling et al., 2002].
Деацетилазу HDAC11, близкую к белкам класса
I, выделяют в отдельный класс IV [Gao et al.,
2002; Yang, Gregoire, 2005]. Деацетилазы обла-
дают низкой специфичностью к су’бстратам, вхо-
дят в состав больших белковых комплексов, и
зачастую в одном комплексе одновременно при-
сутствуют ферменты из разных классов.
1.4.3. Фосфорилирование
Суммарно во всех коровых гистонах фосфо-
рилированию подвергаются около дву’х десятков
остатков серина и треонина, а также не менее
дву’х остатков тирозина и дву’х гистидина. При-
соединение фосфатных групп, донором которых
является АТФ, осуществляют киназы, а их уда-
ление — фосфатазы. Данная модификация за-
действована в регулировании таких процессов,
как митоз, мейоз, апоптоз и транскрипция, и яв-
ляется либо этапом сигнального пути по переда-
че в ядро внеклеточного сигнала, либо ответом
на стадию клеточного цикла [Baek, 2011: Ва-
neijee, Chakravarti, 2011].
В качестве примера активации гена внекле-
точным сигналом при участии H3S10ph можно
привести следу’ющий. У человека одним из ге-
нов, активиру’смых эстрогеном, является TFFI.
Данный гормон действует только на клетки, в
которых экспрессируется ядерный эстрогеновый
рецептор (Estrogen receptor. ERa). При отсутст-
вии гормона ERa находится в неактивном со-
стоянии, а воздействие эстрогена приводит к из-
менению его конформации и связыванию с ре-
гуляторной областью гена-мишени, например,
TFF1. После этого ERa активирует МАРК-путь
(МАРК pathway), вследствие чего киназа MSK1
фосфорилирует H3S10 в премоторной области
гена TFF1. С этим модифицированным остатком
связывается комплекс, содержащий гистон-ме-
тилтрансферазу SMYD3, которая производит
триметилирование НЗК4. Следствием этого со-
бытия является активация транскрипции гена-
мишени [Li et al., 2011].
1.4.4. Убиквитинирование, сумоилирова-
ние, биотинилирование, АДФ-рибо-
зилирование
Убиквитин — это полипептид длиной 76 ами-
нокислотных остатков. Его присоединение к гис-
тону’ происходит в три этапа при помощи боль-
ших комплексов, содержащих три класса белков.
Вначале имеет место АТФ-зависимая активация
убиквитина ферментами El (ubiquitin activating
enzyme), затем он присоединяется к ферменту’ Е2
(ubiquitin conjugating enzyme), после чего пере-
носится с Е2 на остаток лизина в гистоне при
помощи ферментов убиквитин-лигаз ЕЗ [Pickart,
2001]. Вообще, к белку’ могут быть присоедине-
ны одна молекула убиквитина или цепочка из
нескольких молекул. К гистонам присоединяется
одна молекула, и, в отличие от большинства дру-
14 ЭПИГЕНЕТИКА
гих модификаций, это происходит преимущест-
венно в С-концевой части гистонов. Удаление
убиквитинов производят убиквитин-протеазы
(Ubp).
Наиболее хорошо изучены модификации
H2AK119ub и H2BK123ub. Первая из них вовле-
чена в процесс инактивации, а вторая участвует
в инициации и элонгации транскрипции [Wang Н.
etal., 2004; Lee etal., 2007; Kim etal., 2009а].
Точные механизмы этих процессов пока до кон-
ца неясны, а некоторые факты противоречивы.
Предполагается, что H2BK123ub повышает ус-
тойчивость нуклеосомы и создает возможность
для связывания с ней ферментов, метилирующих
НЗК4, что необходимо для инициации транс-
крипции [Chandrasekharan et al., 2010]. Н2АК119ub
же ингибирует метилирование НЗК4 и, тем са-
мым, подавляет инициацию транскрипции [Na-
kagawa et al., 2008].
Белки семейства SUMO (small ubiquitin-rela-
ted modifier) лишь на 18 % сходны с убиквити-
ном. состоят из порядка ста аминокислот, что
больше, чем у убиквитина, но имеют схожую
с ним пространственную организацию. Процесс
присоединения SUMO к лизину аналогичен при-
соединению убиквитина, а ферменты близкород-
ственны убиквитиновым. Удаление SUMO про-
исходит посредством SUMO-специфичных про-
теаз (SENP) [Gill, 2004]. Эта модификация (как
и убиквитинирование) широко распространена
у множества белков, но для гистонов исследова-
на еще недостаточно. Показано, что у млекопи-
тающих сумоилироваться может гистон Н4,
у дрожжей 5. cerevisiae этой модификации под-
вергаются все коровые гистоны. Во всех случаях
сумоилирование вызывает инактивацию транс-
крипции путем привлечения в данный район де-
ацетилаз и инактивирующих белков [Shiio,
Eisenman, 2003; Nathan et al.. 2006].
Присоединение биотина к остатку лизина
в гистонах обнаружено у человека, дрозофилы и
других организмов. Показано, что биотинилиро-
ваться могут более десятка положений в гисто-
нах НЗ, Н4 и Н2А. Однако эта модификация яв-
ляется очень редкой и трудно выявляемой, по-
скольку ее несут лишь сотые доли процента от
всех гистонов человека в культуре клеток. Био-
логическая функция биотинилирования мало по-
нятна, но предполагается, что она связана с
инактивацией. Известно, что H4K12bio в хромо-
сомах человека присутствует в прицентромер-
ном гетерохроматине, мобильных элементах и
теломерных повторах [Hassan, Zempleni, 2008;
Toshinobu et al., 2011]. При этом длина фрагмен-
та ДНК, обернутого вокруг нуклеосомы, содер-
жащей H4K12bio, больше примерно на 20 пар
нуклеотидов, чем в обычной нуклеосоме. Воз-
можно, это следствие более прочной связи ДНК
и гистонов, что стабилизирует нуклеосому, пре-
пятствует ее разрушению и, как следствие, акти-
вации данного района [Filenko et al., 2011].
АДФ-рибозилирование белков является рас-
пространенной модификацией, но в отношении
гистонов она опять-таки еще мало исследована.
Источником АДФ-рибозы является NAD+, а в
качестве субстрата в гистонах выявлены глута-
мат и лизин. Ферменты, переносящие АДФ-
рибозу с донора на акцептор, относятся к боль-
шому семейству АДФ-рибозилтрансфераз (ART).
Причем они способны присоединять одну’ моле-
кулу’ АДФ-рибозы к остатку’ аминокислоты либо
несколько молекул одну’ к другой. Гистоны мо-
гут быть моно- или олиго-АДФ-рибозилирова-
ны. В наибольшей степени модифицируется Н1,
в меньшей Н2В и совсем слабо Н2А, НЗ и Н4.
Биологическая функция АДФ-рибозилирования
еще неясна. Вероятно, оно участвует в высоко-
уровневой укладке хроматина, ремоделировании
нуклеосом, репарации ДНК, репликации и транс-
крипции. Возможно, эта модификация ослабляет
связь ДНК с гистонами, делает ДНК более дос-
тупной для белков транскрипции и репликации,
способствует привлечению комплексов ремоде-
линга и репарации [Messner, Hottiger, 2011].
1.4.5. Изомеризация пролина
Остаток пролина в составе белков может при-
сутствовать в двух конформационных формах —
цис и транс. При этом утлы, под которыми оста-
ток пролина соединяется с предшествующей
аминокислотой в полипептидной цепи, различа-
ются на 180° [Ramachandran. Sasisekharan, 1968].
Изомеризация не является истинной модифика-
цией, так как молекула остается химически не-
изменной. 7/хшс-конформация обладает мень-
шей энергией, и поэтому’ 93—95 % остатков про-
лина в белках, чья пространственная укладка оп-
ределена, присутствуют в /и/А7//с-формс [Stewart
et al., 1990; Weiss et al., 1998; Jabs et al., 1999].
Переход между’ цис- и /и/х///с-формами может
происходить спонтанно, но т vivo изменением
конформации пролина и правильным складыва-
нием полипептида управляют ферменты пролин-
изомеразы. Их можно разделить на три семей-
ства: Pinl, циклофилины и ЕК506-связывающие
белки (FKBP) [Gothel, Marahiel, 1999]. Эти фер-
менты задействованы в самых разных клеточных
ГЛАВА 1 15
процессах: транскрипция, сплайсинг, иммунный
ответ, регуляция клеточного цикла и др. Кроме
того, пролинизомеразы входят в состав белко-
вых комплексов, модифицирующих гистоны.
Так что изомеризация пролина участвует и в
хроматиновых процессах тоже, путем изменения
конформации N-хвостов. Например, у 5. cerevi-
siae фермент Fpr4 из семейства FKBP способен
изомеризовать пролиновый остаток H3P38, что
меняет доступность находящегося рядом остатка
H3K36 для гистон-метилтрансферазы Set2 [Nel-
son et al., 2006].
1.5. Метилирование ДНК
Данная модификация очень неравномерно
представлена у разных таксонов. Если у позво-
ночных и растений ДНК метилирована значи-
тельно, то у большинства беспозвоночных ме-
тилирования мало либо нет вовсе. У нематоды
С. elegans ДНК не содержит метилированных
нуклеотидов на всех стадиях развития [Simpson
et al., 1986], у дрозофилы небольшое количество
метилированной ДНК есть у ранних эмбрионов,
но по мере роста ее доля быстро убывает прак-
тически до нуля [Lyko et al., 2000]. У пчелы
A. melifera метилирование ДНК есть и играет
ключевую роль в организации социальной струк-
туры популяции [Wang etal., 2006; Kucharski
et al., 2008]. Среди грибов у 5. pombe и 5. cerevi-
siae ДНК не метилирована, ay N. crassa метили-
рована [Antequera et al., 1984; Selker, 2004]. Та-
ким образом, эпигенетическая роль данной мо-
дификации варьирует в очень широких преде-
лах. Если у дрозофилы его отсутствие не влияет
на фертильность и жизнеспособность, то у мле-
копитающих ведет к эмбриональной летально-
сти. У тех организмов, у кого метилирование
ДНК есть, оно всегда связано с процессами
инактивации.
У эукариот метильная группа присоединяется
к цитозину’ в положении 5 с образованием 5-ме-
тилцитозина (т5С). У млекопитающих подав-
ляющее большинство модифицированных цито-
зинов входит в состав динуклеотидов CpG, и до-
ля m5CpG среди всех CpG составляет 70—80 %
[Ehrlich etal., 1982]. Большинство оставшихся
динуклеотидов образуют перед промоторами
многих генов (у человека —60 %) CpG-островки,
т. е. участки ДНК размером от 200 п.н. с плот-
ностью CpG выше, чем в среднем по геному’, и
отсутствием метилирования [Illingyvorth, Bird,
2009]. В отличие от клеток взрослого организма,
в эмбриональных стволовых клетках человека
почти четверть метилированных цитозинов вхо-
дит в состав не CpG, a CpHpG и СрНрН (где
Н — это А, С или Т) [Ramsahoye et al., 2000;
Lister etal., 2009]. У растений цитозин может
быть метилирован в любом окружении, и. в от-
личие от млекопитающих, у растений метилиро-
ваны преимущественно мобильные элементы и
другие повторенные последовательности [Zhang
et al., 2006]. У дрозофилы цитозины метилиру-
ются почти исключительно в составе динуклео-
тидов СрТ и СрА [Lyko et al., 2000].
У животных ферменты, способные метилиро-
вать ДНК, объединяют в семейство ДНК-метил-
трансфераз (DNMT): DNMT1, DNMT2, DNMT3A,
DNMT3B и DNMT3L. У позвоночных установ-
ление модификации, т. е. метилирование de novo,
осуществляют ферменты DNMT3A и DNMT3B
[Jeltsch, 2006]. Белок DNMT3L гомологичен
DNMT3A и DNMT3B, но не имеет каталитичес-
кой способности. Он связывается с немодифи-
цированным остатком НЗК4 и привлекает в дан-
ный район DNMT3A [Ooi etal., 2007]. Поддер-
жание метилированного состояния путем моди-
фикации полуметилированной ДНК в процессе
репликации осуществляет DNMT1 [Jeltsch, 2006].
Однако существуют данные, согласно которым
все три фермента являются универсальными,
и DNMT1 может метилировать de novo, а
DNMT3A и DNMT3B участвуют в поддержании
метилированного состояния [Riggs, Xiong, 2004;
Egger et al.. 2006].
DNMT2 — это фермент, для которого у по-
звоночных метилтрансферазная активность в
отношении ДНК не выявлена либо она очень
низкая, но есть активность в отношении РНК.
Он модифицирует цитозин-38 в антикодоновой
петле тРНК аспарагиновой кислоты [Goll et al.,
2006], а возможно, и другие тРНК [Schaefer,
Lyko. 2010]. Однако, у дрозофилы данный фер-
мент, по-видимому, способен метилировать
ДНК, так как dNmt2 — это единственный ген
в геноме дрозофилы, обладающий гомологией
к генам ДНК-метилтрансфераз. Его удаление
ведет к отсутствию метилирования СрА и СрТ,
а оверэкспрессия — к гиперметилированию этих
динуклеотидов [Kunert etal., 2003]. У растений
метилирование de novo производит DRM2 (го-
молог DNMT3), а поддерживают метилирован-
ное состояние в динуклеотидах CpG фермент
DMT1 (или МЕТ1, гомолог DNMT1), в сочета-
нии CpHpG — СМТЗ, а в составе СрНрН —
DRM2 [Meyer, 2011].
У млекопитающих метилирование ДНК явля-
ется в основном стабильным и наследуемым
16 ЭПИГЕНЕТИКА
в соматических клетках. Однако под действием
внешних сигналов либо на определенных стади-
ях жизненного цикла имеет место деметилиро-
вание [Morgan etal., 2005]. Оно может быть ак-
тивным или пассивным. Активное деметилиро-
вание является ферментативным процессом.
Пассивное же деметилирование — это, по сути,
разбавление, которое происходит при реплика-
ции ДНК и отсутствии метилирования вновь
синтезированной цепи.
В момент оплодотворения ДНК и мужского, и
женского про нуклеусов метилирована. В тече-
ние 4—8 ч после оплодотворения в мужском
пронуклсусс происходит активное деметилиро-
вание, которое завершается уже к началу перво-
го зиготического деления. Удаление метильных
групп начинается с интронов, межгенных рай-
онов и повторенных последовательностей, затем
происходит в экзонах и, наконец, в промоторах
[Popp etal., 2010]. При этом метилирование со-
храняется в импринтированных генах (imprinting
control regions), ретротранспозонах и прицент-
ромерном гетерохроматине. Деметилирование
женского генома происходит пассивно до стадии
бластоцисты. Однако, и в этом случае данный
процесс касается не всего генома, и ряд имприн-
тированных генов продолжает поддерживать
свой статус с помощью DNMT1. К стадии блас-
тоцисты количество метилирования, пришед-
шего в зиготу’ из гамет, достигает минимума,
после чего в ядрах внутренней клеточной массы
бластоцисты начинается метилирование de novo
с помощью DNMT3A и DNMT3B. Еще одна
волна деметилирования происходит в форми-
рующихся зародышевых клетках полового пути
эмбриона (primordial germ cells, PGC). В них
происходит активное удаление всех эпигенети-
ческих меток, в том числе и метилирования
ДНК, для их дальнейшей переустановки [Wu,
Zhang, 2010].
Возможных механизмов активного деметили-
рования существует несколько. Прямое удаление
метильной группы у т5С путем разрушения уг-
лерод-углеродной связи считается маловеро-
ятным, и до сих пор не найдены достоверные
факты, подтверждающие существование этого
механизма. Среди других способов существуют
деметилирование путем удаления азотистого ос-
нования т5С с сохранением сахаро-фосфатного
остова, образования однонуклеотидной бреши и
ее восстановление; деаминирование т5С с об-
разованием Т и его последующей репарацией на
немодифицированный С; удаление нескольких
нуклеотидов с последующим восстановлением
бреши как при репарации мутаций; окислитель-
ное деметилирование, при котором происходит
превращение метильной группы -СН3 в оксиме-
тильную -СН2ОН и ее последующее удаление в
несколько этапов. Так или иначе, проблема ак-
тивного деметилирования еще далека от пони-
мания. Некоторые из перечисленных механиз-
мов только предполагаемые, и неясно, как раз-
ные механизмы представлены у разных таксонов
[Wu, Zhang, 2010].
1.6. Сборка и ремоделирование нуклеосом
Нуклеосомная укладка не является статичной,
и в ней происходят несколько типов изменений.
Нуклеосомы препятствуют прохождению вилки
репликации, поэтому’ их необходимо временно
удалить перед вилкой, а сразу после ее прохож-
дения восстановить. Этот процесс называется ре-
пликационно-зависимой сборкой нуклеосом (rep-
lication-coupled). В интерфазном ядре для управ-
ления активностью хроматина необходимо заме-
нять гистоны, которые были встроены в хроматин
во время репликации, на другие варианты, и эта
замена называется репликационно-независимой
вставкой гистонов (replication-independent). Кроме
того, для правильной работы хроматина также
требуется перемещение нуклеосом относительно
последовательности ДНК, и такое перемещение
называется АТФ-зависимым ремоделированием
(nucleosome remodeling). Хотя в широком смысле
под ремоделированием понимают любое измене-
ние связывания ДНК и гистонов, включающее не
только перемещение нуклеосом, но и их сборку',
разборку- и замену- гистонов.
Во время репликации ДНК становится в два
раза больше, и это требует в два раза больше
гистонов, поэтому в укладке новых цепей участ-
вуют как старые гистоны, так и вновь синтези-
рованные. Вопрос о том, как новые и старые
гистоны соотносятся между’ собой, долгое время
был открыт, поскольку’ разные эксперименты
давали противоречивые результаты. По одной
точке зрения старый октамер распадается на две
пары димеров НЗ—Н4 и две пары Н2А—Н2В, а
при сборке новых нуклеосом эти димеры произ-
вольно комбинируются между- собой и новыми
димерами. По другой же точке зрения, которая
сейчас преобладает, старый октамер распадается
на устойчивый тетрамер (НЗ—Н4)2 и два димера
Н2А—Н2В. Вследствие этого каждая нуклеосо-
ма содержит либо только старые НЗ и Н4, либо
только новые, но димеры Н2А—Н2В могут быть
в любой комбинации [Xu et al., 2010].
ГЛАВА 1 17
П равил ьну ю укладку’ молоку л белков вообще
и гистонов в частности, а также сборку7 белковых
комплексов контролирует особая группа бел-
ков— шапероны [De Koning etal., 2007]. Для
транспорта вновь синтезированных гистонов НЗ
и Н4 в ядро в виде димеров необходим шаперон
Asf 1. Он также важен для ацетилирования остат-
ка НЗК56, что является ключевым событием для
встраивания новых гистонов в хроматин. У че-
ловека и дрозофилы модификацию производит
комплекс рЗОО/СВР, а у 5. cerevisae и X pombe —
фермент Rttl09, и он способен это делать только
в комплексе с Asfl [Recht et al., 2006; Xhemalce
et al., 2007: Chen et al., 2008: Li et al., 2008: Das
et al., 2009; Campos et al., 2010]. Далее с димера-
ми связывается друтой шаперон CAF-1, который
соединяет новые молекулы НЗ—Н4 с ДНК
[Smith, Stillman, 1989; Kaufman et al., 1995]. Не-
обходим ли он для связывания старых гистонов,
пока не известно. Возможно, эту7 функцию мо-
жет выполнять Asfl [Groth etal., 2007]. У X ce-
revisiae существует еще один НЗ—Н4-гистоно-
вый шаперон Rttl06, который работает парал-
лельно с CAF-1. Как происходит разделение
футгкций между7 CAF-1 и Rttl06, пока точно не-
известно [Li et al., 2008]. И Asfl, и CAF-1 непо-
средственно взаимодействутот с белками репли-
кационного комплекса, тем самым обеспечивая
сборку7 нужлеосом прямо во время прохождения
вилки репликации. Пока еще не ясно, когда про-
исходит формирование тетрамера (НЗ—Н4)2.
Возможны два варианта: либо вначале с ДНК
связывается один димер, а затем друтой, либо ди-
меры соединяются, и после этого с ДНК связы-
вается у7же готовый тетрамер. На последнем
этапе с помощью шаперона Napl к комплексу7
(НЗ—Н4)2—ДНК присоединяются два димера
Н2А—Н2В [Ito et al., 1996], а с помощью шапе-
рона NASP — линкерный гистон Hl [Alekseev
et al., 2003].
Для правильной работы хроматина после ре-
пликации требуется замена одних вариантов
гистона на другие. Вариант НЗ.З обнаружен
преимущественно в транскрипционно активных
районах хромосом, но помимо этого присутству-
ет в теломерах и гетерохроматине, что говорит о
его вовлеченности в широкий спектр процессов.
Как и канонический вариант, НЗ.З попадает в
ядро в виде димера с Н4 при помощи шаперона
Asfl, но если НЗ—Н4 далее переходит к CAF-1,
то НЗ.З—Н4 — к одному7 из дву7х шаперонных
комплексов — HIRA или DAXX. Они осу ществ-
ляют замену7 НЗ на НЗ.З в разных доменах хро-
мосом — HIRA в промоторах активных генов, а
DAXX в теломерах [Tagami et al., 2004; Drane
etal., 2010; Goldberg etal., 2010]. При этом
DAXX специфически взаимодействует с теми
аминокислотными остатками в НЗ.З, которые от-
личают его от канонического гистона [Lewis
et al., 2010]. При связывании димера НЗ.З—Н4 с
HIRA важную роль играет фосфорилирование
остатка H4S47. Оно усиливает связывание НЗ.З-
содержащих димеров с HIRA и способствует их
встраиванию в хроматин [Kang et al., 2011].
Замену7 Н2А на вариант H2A.Z производит
комплекс SWR1 с использованием энергии АТФ.
По-видимому, данный комплекс связывается с
той частью нуклеосомы, где ДНК заходит и схо-
дит с нее, и разматывает фрагмент ДНК, который
контактирует с димерами Н2А—Н2В. Это вызы-
вает либо самостоятельное удаление одного ди-
мера Н2А—Н2В, либо это делает SWR1, а затем
присоединяет новый димер H2A.Z—Н2В. Наличие
двух разных вариантов Н2А в одной нуклеосоме
нарушает ее уетойчивость и облегчает для SWRI
замену7 второго димера Н2А—Н2В на H2A.Z—
Н2В [Mizuguchi et al., 2004]. Замену каноническо-
го Н2А на вариант Н2А.Х осуществляет комплекс
FACT, но, в отличие от других подобных ком-
плексов, без участия АТФ. FACT способен как
удалять димер Н2А—Н2В из нуклеосомы и за-
мещать его димером Н2А.Х—Н2В, так и произ-
водить обратную замену7 [Нео et al., 2008].
При ремоделировании нужлеосом не изменя-
ется ее состав, но изменяется взаимодействие
между7 гистонами и ДНК, что приводит к пере-
мещению нужлеосомы относительно последова-
тельности ДНК. Это происходит благодаря ак-
тивности ремоделирутощих комплексов, которые
разделяют на четыре семейства: SWI/SNF, ISWI,
CHD и INO80. Все их объединяет наличие субъ-
единицы, несущей АТФ-азный домен, актив-
ность которого и приводит к ремоделированию.
Различаются же семейства тем, что АТФ-азы
несу7т разные домены, необходимые для контек-
стнозависимого связывания с хроматином, а так-
же друтие су7бъединицы. Ферменты из семейства
SWI/SNF помимо АТФ-азного домена содержат
bromo-домен, необходимый для узнавания аце-
тилированных лизинов. Друтие су7бъединицы
данного комплекса также содержат Ьгошо-доме-
ны. В комплексе ISWI bromo-домен отсутствует
на АТФ-азной субъединице, но другие субъеди-
ницы имеют в своем составе PHD finger-bromo-
домен. CHD несут тандемный chromo-домен,
которым могут связываться с метилированными
лизинами. Кроме этого разные комплексы раз-
личаются и тем, что именно они делают с нуж-
18 ЭПИГЕНЕТИКА
леосомной укладкой. Например, ISWI способны
равномерно распределять нуклссомы, выравни-
вая длин\г фрагмента ДНК между' ними, a SWI/
SNF, наоборот, нарушают равномерность уклад-
ки [Clapier, Cairns. 2009; Glatt et al.. 2011].
За время исследования ремоделирующих
комплексов были выдвинуты несколько моде-
лей, объясняющих, как происходит перемещение
нуклеосомы относительно последовательности
ДНК. Сейчас наиболее предпочтительной счита-
ется следующая модель (рис. 1.3). Ремодели-
рующий комплекс закрепляется в двух точках
нуклеосомы: DBD-доменом (DNA-binding do-
main) рядом с местом, где ДНК заходит на гис-
тоновый октамер, и транслоказным доменом,
рядом со средней частью фрагмента ДНК, намо-
танного на октамер. DBD-домен перемещается
вместе с нитью ДНК, образуя на поверхности
октамера петлю (см. рис. 1.3, прямая красная
стрелка и шаг 1), которая движется в направле-
нии транслоказного домена, а он, в свою оче-
редь, тянет нить /ТНК, помогая петле двигаться
(см. рис. 1.3, шаг 2). После транслоказного до-
мена петля продолжает двигаться дальше, а ко-
гда достигает места, где ДНК сходит с октамера,
вся нуклеосома оказывается сдвинутой относи-
тельно последовательности ДНК (см. рис. 1.3,
шаг 3). После этого DBD-домен отсоединяется
от ДНК, перемещается назад, и цикл повторяется
(см. рис. 1.3, изогнутая красная стрелка и шаг 4)
[Clapier. Cairns, 2009].
Рис. 1.3. Схема работы ремоделирующего комплекса.
Красно-оранжевая линия вокруг серого круга изображает
ДНК вокруг гистонового октамера. DBD — DBD-домен, Тг —
транслоказный домен, Hinge — «шарнирный» домен. Пере-
мещение звездочки иллюстрирует перемещение участка ДНК
относительно гистонового октамера.
1.7. Наследование модификаций гистонов
и ДНК
После прохождения вилки репликации хро-
матин. образованный новыми цепями ДНК.
должен сохранить свои свойства. Поскольку во
время этого процесса нуклеосомная укладка раз-
рушается, а затем восстанавливается, то возни-
кает вопрос: каким образом происходит насле-
дование модификаций хроматина? Сейчас из-
вестны несколько механизмов, которые участ-
вуют в данном процессе.
Поддержание метилированного состояния
ДНК осуществляет фермент DNMT1 [Jeltsch,
2006]. Ключевую роль в этом процессе играет
белок NP95, который связывается с метильной
группой у т5С с помощью домена SRA (SET-
and Ring-associated domain). Связывание проис-
ходит только в полу'метилированных, но не в
симметрично метилированных цепях ДНК. NP95
привлекает в этот локус фермент DNMT1, кото-
рый и метилирует вновь синтезированную цепь
[Sharif et al., 2007].
Метилирование родительской цепи ДНК мо-
жет служить маркером, благодаря которому'
происходит восстановление не только метилиро-
вания дочерней цепи ДНК, но и модификаций
гистонов. Белок NP95 помимо DNMT1 также
способен привлекать гистон-деацетилазу HDAC1,
которая удаляет ацетильные группы, и метил-
трансферазу' G9a, которая метилирует остаток
НЗК9 [Unoki et al., 2004; Kim et al., 2009b], Кро-
ме NP95 c m5C способны связываться белки,
имеющие специфический домен и объединяемые
в семейство MBD (methyl-CpG-binding domain).
Разные представители семейства также способ-
ны привлекать ферменты, обладающие модифи-
цирующей активностью в отношении гистонов.
Например. МеСР2 и MBD4 взаимодействуют с
деацетилазным комплексом Sin3A/HDAC [Jones
et al., 1998; Kondo et al., 2005], а белок MBD1 свя-
зывается с гистон-метилтрансферазами SETDB1
и SUV39H1 [Fujita et al., 2003; Sarraf, Stancheva,
2004]. Таким образом, модификация ДНК, ха-
рактерная для неактивного хроматина, поддер-
живает набор модификаций гистонов, также ха-
рактерных для неактивного хроматина. Однако,
все это возможно только у тех организмов, у ко-
торых есть метилирование ДНК, а, например, у
дрозофилы наследование модификаций должно
происходить по-другому. И даже у млекопитаю-
щих наследование модификаций гистонов через
метилирование ДНК — это не единственный
способ.
ГЛАВА 1 19
Одна из первых моделей предполагала, что
происходит полуконссрвативнос наследование
модификаций гистонов. Во время репликации
тетрамеры (НЗ—Н4)2 распадаются на два диме-
ра. каждый из которых снова формирует тетра-
мер с вновь синтезированными молскулами НЗ и
Н4. В таких гибридных тетрамерах на новых
гистонах устанавливаются модификации на ос-
нове тех, что пришли в составе старого димера
НЗ—Н4. Однако же, сейчас преобладает мнение,
что тетрамеры (НЗ—Н4)2 сохраняют свою целост-
ность, не распадаются на димеры и распреде-
ляются между' дочерними цепями ДНК случай-
но. Следовательно, после репликации вперемеж-
ку возникают нуклеосомы, которые несут ста-
рый набор модификаций, и нуклеосомы без него,
и старые нуклеосомы служат матрицами, по ко-
торым устанавливается набор модификаций в
новых нуклеосомах. Например, один из возмож-
ных механизмов установки в новых нуклеосомах
меток, определяющих гетерохроматиновое со-
стояние, связан с белком НР1. С помощью chro-
mo-домена он связывается с ди- и триметилиро-
ванным НЗК9 в нуклеосоме, несущей старые
гистоны [Fischle et al., 2003]. Кроме этого, он
взаимодействует с шапероном CAF-1, а он, бу-
дучи связанным с НР1, привлекает SETDB1 —
фермент, обеспечивающий монометилирование
НЗК9 в нуклеосоме, состоящей из новых гисто-
нов [Quivy etal.. 2008; Loyola etal.. 2009]. Дан-
ная модификация является субстратом для ди- и
триметилирования, которые производят фермен-
ты SUV39H1/2 и G9a, привлекаемые в данный
район белком НР1 [Aagaard etal., 1999; Fritsch
et al., 2010]. Таким образом, при случайном рас-
пределении старых гистонов между' новыми ну-
клеосомами во время репликации /ТНК НР1 спо-
собен узнавать маркеры, характерные для гете-
рохроматина. и заново устанавливать их совме-
стно с другими белками в новых нуклеосомах.
1.8. «Гметоновый» код
Огромная и постоянно растущая масса фактов
о модификациях гистонов неизменно приводит к
вопросу о том, как работает вся эта сложная ма-
шина. Существуют как минимум два варианта
ответа. Например, добавление или удаление хи-
мических групп к молекулам гистонов изменяет
их общий электрический заряд. Это изменит
конформацию нуклеосомы и, как следствие, из-
менит доступность ДНК для белков. Согласно
другой точке зрения, ключевую роль играет не
общий электрический заряд, а конкретная ком-
бинация модификаций, которая присутствует
на данной нуклеосоме. Эта точка зрения лежит
в основе теории «гистонового кода».
Идея теории состоит в следующем. Если в ге-
нетическом коде аминокислота закодирована
триплетом нуклеотидов, то в гистоновом коде
процесс, который должен быть в данном участке
хромосомы, закодирован набором модификаций.
Какой-либо сигнал — внешний, приходящий из
цитоплазмы, или внутренний, закодированный в
последовательности ДНК, активирует фермен-
ты-модификаторы гистонов. Эти ферменты либо
сами обладают специфичностью к конкретным
аминокислотным остаткам, либо входят в состав
белковых комплексов, субъединицы которых оп-
ределяют такую специфичность. Далее фермент
модифицирует остаток аминокислоты, и эта мо-
дификация является сайтом связывания для вос-
принимающего белка или комплекса белков, и
уже этот белок или комплекс запускает какой-то
конкретный хроматиновый процесс [Strahl, Allis,
2000; Jenuwein. Allis. 2001]. Однако, вероятно,
что и общий заряд молекулы, и комбинация мо-
дификаций не исключают друг друга, а работают
параллельно.
Хроматиновые процессы могут конкуриро-
вать друг с другом, а могут быть следствием
один другого. Поэтому' модификации и их ком-
бинации не существуют сами по себе, а участ-
вуют в сложных перекрестных взаимодействиях,
называемых англоязычным термином modifica-
tions cross-talk. Суть взаимодействий сводится к
тому', что для появления одной модификации
необходимо наличие другой, либо наоборот, на-
личие одной препятствует возникновению дру-
гой [Мшт, 2010].
Все взаимодействия можно разделить на три
группы: in situ, in cis и in trans. К первой группе
относятся взаимодействия между' разными мо-
дификациями одного и того же аминокислотного
остатка, и наличие одного типа модификаций
исключает другой. Хорошо известным примером
этого служат ацетилирование и метилирование
НЗК9. Наличие ацетильной группы характерно
для активного хроматина и препятствует мети-
лированию — маркеру неактивного хроматина,
и наоборот. Взаимодействие in cis подразумевает
влияние одной модификации на другие, находя-
щиеся по соседству в том же гистоне. Например,
активирование киназы Ras-MAPK приводит к
фосфорилированию H3S10, а это в 10 раз повы-
шает эффективность ацетилирования НЗК14
[Cheung et al., 2000]. В то же время H3S10ph бло-
кирует метилирование соседнего остатка НЗК9.
20 ЭПИГЕНЕТИКА
А диметилирование НЗК9 в свою очередь пре-
пятствует фосфорилированию H3S10 [Rea etal.,
2000]. В систему' взаимодействий in trans входят
взаимодействия между' модификациями в разных
гистоновых молекулах. Так. у дрозофилы и мле-
копитающих триметилирование Н4К20 зависит
от метилирования НЗК9 [Schotta et al., 2004].
Модификации гистонов взаимодействуют так-
же и с метилированием /ТНК У млекопитающих
в раннем эмбриогенезе происходит метилирова-
ние ДНК, но этот процесс не затрагивает CpG-
островки, и, как считается, ключевым игроком в
данном процессе является остаток НЗК4. Связы-
вание РНК-полимеразы с премоторными облас-
тями генов опосредованно вызывает локальное
метилирование НЗК4, что препятствует связы-
ванию с нуклеосомой белка DNMT3L и привле-
чению ДНК-метилтрансферазы DNMT3A [Ooi
et al., 2007]. Таким образом, метилирование ДНК
появляется в геноме там, где нет метилирования
НЗК4, но отсутствует в CpG-островках, где та-
кое метилирование есть. В отличие от НЗК4 три-
метилирование НЗК9 необходимо для привлече-
ния фермента DNMT3B, который метилирует
ДНК в прицентромерном гетерохроматине у
млекопитающих [Lehnertz etal., 2003]. В приве-
денных примерах метилирование ДНК является
следствием определенных модификаций гисто-
нов, но и модификации могут быть следствием
метилирования ДНК. Например, у млекопитаю-
щих белок ICB90 связывается с пт’С и привле-
кает комплекс HDAC1, который удаляет аце-
тильные группы у лизиновых остатков в гисто-
нах [Unoki et al., 2004].
Для того чтобы воспринимающий белок свя-
зался с модифицированным гистоном и далее
стимулировал реализацию хроматинового про-
цесса, он должен обладать доменом, специфиче-
ски узнающим эту' модификацию. Сейчас из-
вестны уже довольно много доменов и их вари-
антов, для которых определены их точные струк-
тура и функция [Tavema et al., 2007]. Для связы-
вания с ацетилированным лизином необходим
bromo-домен. Первый такой домен, узнающий
Н4К16ас, был подробно охарактеризован у акти-
ватора транскрипции PCAF [Dhalluin et al.,
1999]. Позднее у другого белка — TAF1, был
описан двойной bromo-домен, который наиболее
эффективно связывался с N-концом Н4, ацети-
лированного одновременно в двух положени-
ях— К5 и К12 [Jacobson etal., 2000]. Еще один
вариант — это тандемный bromo-домен белка
Rsc4p. В отличие от двойного, в котором доме-
ны достаточно независимы, тандемный является
единой структурой. Один из Ьгото-доменов
Rsc4p может связываться с Н4К14ас, а друтой
служит для его регуляции, поскольку' может свя-
зываться с ацетилированным остатком К25 в
самом белке Rsc4p. а это препятствует узнава-
нию Н4К14ас [VanDemark et al., 2007].
С метилированными остатками лизина и ар-
гинина связываются белки, обладающие доме-
ном из суперсемейства Royal, которое составля-
ют домены chromo, Tudor, PWWP, plant Agenet и
МВТ [Maurer-Stroh et al., 2003]. Tudor- и chromo-
домены связываются с ди- и триметилирован-
ными лизинами, а МВТ-домены — преимущест-
венно с моно- и диметилированными. Tudor-до-
мены являются пока единственными структура-
ми, которые опознают симметрично диметили-
рованный аргинин [Tavema et al., 2007; Chen
etal., 2011]. С модифицированными и немоди-
фицированными остатками НЗК4 связываются
белки, несущие домен из семейства PHD finger
[Li et al., 2006; Tavema et al., 2007].
В течение продолжительного времени пола-
гали, что фосфорилирование влияет на работу
хроматина, изменяя конформацию молекул за
счет изменения ее заряда. Однако эта модифика-
ция может активировать процесс благодаря свя-
зыванию белков, несущих определенные доме-
ны. Таких доменов известно несколько, но све-
дений о тех, которые узнают фосфорилирован-
ные гистоны, пока мало. Фосфорилированный
H3S10 является сайтом связывания для белков
с 14-3-3-доменом, а остаток H2A.XS139ph — до-
меном BRCT [Tavema et al., 2007].
Домен образует сложную систему' электриче-
ских взаимодействий и водородных связей как с
самим модифицированным остатком, так и с его
соседями. Поэтом}' прочность и сама возмож-
ность связи определяются не только модифициро-
ванным остатком, но и его окружением. Благода-
ря этому' одна и та же модификация, но в разном
контексте, будет узнана разными воспринимаю-
щими белками и даст начало разным процессам.
Так, исследование взаимодействия между' chro-
то-доменом белка НР1 и НЗК9те показало, что
помимо самого лизина в связывании участвуют
остатки от -1 до -4, но наибольшую роль играет
аланин в положении -2. Chromo-домен НР1 не
способен связываться с НЗК4 и Н4К20. посколь-
ку' в положениях -2 от них находятся аргинин и
гистидин соответственно. У остатка НЗК27 в по-
ложении -2 находится подходящий аланин, но
НР1 имеет очень низкую эффективность связыва-
ния с К27, так как в позиции -4 расположен лизин
вместо глутамина [Nielsen et al., 2002].
ГЛАВА 1 21
1.9. «Нуклеосомный» код
Любая последовательность ДНК теоретиче-
ски способна формировать нуклеосомную ук-
ладку. Однако же нуклеосомы распределены в
хроматине неравномерно, и существуют районы,
лишенные нуклеосомной укладки. Для того что-
бы двойная спираль ДНК обернулась вокруг
гистонового октамера, она должна изогнуться в
нескольких местах, но разные комбинации нук-
леотидов различаются по своей способности к
изгибанию. К наиболее жестким комбинациям
относятся АТ, АА, ААТ и АТТ, а к наиболее
гибким CG, GC, CAG и CTG [Richmond, Davey,
2003; Segal et al., 2006]. Сравнение состава ДНК-
фрагментов хромосом 5. cerevisiae, в которых
нуклеосомы почти всегда есть, с теми, где их
почти всегда нет, показало, что нуклеосомы ча-
ще формируются в GC-богатых районах, а реже
в АТ-богатых [Yuan et al., 2005; Peckham et al.,
2007]. Исследование, проведенное на C. elegans,
выявило, что ДНК между’ нуклеосомами обога-
щена нуклеотидами А и Т, а ДНК, которая намо-
тана на гистоновый кор, наоборот, обогащена G
и С [Kaplan et al., 2009].
Разная способность последовательностей ДНК
к формированию нуклеосом является пред-
посылкой своеобразного «нуклсосомного кода».
С помощью локальных изменений общего AT/GC-
состава и наличия повторяющихся комбинаций
нуклеотидов геном «кодирует» положение «от-
крытых» и «закрытых» участков ДНК и, как
следствие, сайтов связывания транскрипцион-
ных факторов, сайтов инициации транскрипции
и т. п. Однако анализ распределения нуклеосом
in vivo показал, что районов, лишенных нуклео-
сомной укладки, больше, чем это предсказано
исходя только из состава ДНК. Кроме этого,
теоретическое предсказание нуклеосомной ук-
ладки далеко не всегда соответствует реальному’
распределению in vivo. Следовательно, комбина-
ция нуклеотидов — это не единственный меха-
низм, управляющий распределением нуклеосом
в хроматине.
Метилирование ДНК отрицательно влияет на
гибкость молекулы ДНК и препятствует форми-
рованию нуклеосомы [Tippin, Sundaralingam.
1997; Nathan, Crothers, 2002; Pennings et al., 2005].
При элонгации транскрипции происходят удале-
ние нуклеосом и обратное их восстановление
после завершения процесса. При этом, чем выше
транскрипционная активность, тем ниже вероят-
ность нуклеосомной укладки. Молекулы гисто-
нов могут нести на себе посттрансляционнные
модификации, которые привлекают комплексы
АТФ-зависимого ремоделирования, а их актив-
ность приводит к разрушению нуклеосомной ук-
ладки. Важную роль в этом играют и транскрип-
ционные факторы, которые при связывании с по-
следовательностью ДНК конкурируют с гистона-
ми [Segal, Widom, 2009; Zhang et al., 2009]. Таким
образом, неравномерность распределения нук-
леосом в хроматине продемонстрирована многи-
ми исследованиями на разных организмах, но все
механизмы, управляющие таким распределением,
еще до конца не ясны. Вероятнее всего, последо-
вательность нуклеотидов хоть и играет ключевую
роль, но этот фактор не единственный. Совмест-
ное или конкурентное действие разных факторов
и определяет нуклеосомную укладку.
Детальное сравнение положения нуклеосом в
хроматине и генов в ДНК у дрожжей 5. cerevi-
siae выявило закономерность распределения нук-
леосом в премоторных областях активных генов
(рис. 1.4). Промежуток от нуклеотида -150 до
точки начала транскрипции (transcription start
site, TSS) лишен нуклеосом и образует 5'-безну-
клсосомную область (nucleosome-free region,
NFR). В районе от -300 до -150 расположена так
называемая нуклеосома -1. Она является фази-
рованной. т. е. она всегда занимает положение
в данном месте ДНК либо точно, либо с неболь-
шим разбросом (порядка ±30 нуклеотидов). Нук-
леосома -1 содержит вариант H2A.Z, регулирует
TSS
С------------------------------------------------►
-1 +1
5-NFR З'-NFR
Рис. 1.4. Схема нуклеосомной укладки внутри и вокруг гена у S. cerevisiae.
Ген обозначен серой стрелкой, TSS —точка начала транскрипции (а). Расположение фазированных
и нефазированных нуклеосом, а также 5'- и З'-безнуклеосомных областей (б). Черные овалы обо-
значают фазированные нуклеосомы. Серые овалы, наложенные друг на друга, обозначают «слу-
чайно» распределенные нуклеосомы внутри гена.
22 ЭПИГЕНЕТИКА
связывание с промотором транскрипционных
факторов и сборку комплекса РНК-полимеразы.
Сразу за TSS находится нуклеосома +1. Из всех
нуклеосом, расположенных внутри или вокруг
гена, она является самой фазированной, кроме
этого содержит вариант гистона H2A.Z, а также
специфический набор модификаций, таких, на-
пример, как H3K4me3. С началом транскрипции
эта нуклеосома удаляется, но очень быстро вос-
станавливается после того, как РНК-полимераза
продвигается дальше [Mavrich etal., 2008а]. По-
добная нуклсосомная организация выявлена у
других эукариот, хотя и с отличиями. Например,
у дрожжей S. pombe нуклеосома -1 практически
не фазирована [Lantermann et al., 2010]. У дрозо-
филы нуклеосома +1 расположена не сразу за
TSS, а в положении +135, а нуклеосома -1 не
содержит вариант гистона H2A.Z [Mavrich et al.,
2008b]. У человека данный вариант присутствует
в нуклеосомах от -3 до +3 [Schones et al., 2008].
Консервативная нуклсосомная организация
премоторного района у У cerevisiae. а именно
наличие NFR и варианта гистона H2A.Z во флан-
кирующих его нуклеосомах -1 и +1, является
следствием нескольких причин. Во-первых, NFR
содержит поли-А/Т-тракты, которые препятст-
вуют формированию нуклсосомной укладки. Так-
же этому' препятству’ют факторы транскрипции,
которые связываются с данным районом. Более
того, они могут определять общую структуру
района. Например, в промоторе гена SNT1 у У ce-
revisiae есть мотив для связывания транскрипци-
онного фактора Rebl. Данный мотив был встро-
ен в кодирующую область молчащего гена
PRM1, и это привело к образованию в данном
месте NFR, окруженного нуклеосомами, содер-
жащими H2A.Z [Hartley, Madhani, 2009].
Другое исследование показало, что в клетках
человека HeLa в NFR-активных генах находится
нуклеосома, содержащая сразу два варианта гис-
тонов: НЗ.З и H2A.Z. Такая комбинация является
нестабильной, и в тех условиях, в которых друтие
нуклеосомы устойчивы, эта относительно легко
распадается, что объясняет, почему’ в друтих ис-
следованиях в районе перед TSS нуклеосомы не
были обнару’жены. Предполагается, что функция
этой нуклеосомы состоит в том, чтобы «держать
место», т. е. защищать его от неспецифических
факторов или образования стабильной нуклеосо-
мы. А неустойчивость дает возможность транс-
крипционным факторам, например CTCF, отно-
сительно легко заместить ее [Jin et al., 2009].
Сразу за +1 расположена нуклеосома +2, и
она обладает теми же свойствами, но менее вы-
раженными. Степень проявления свойств быстро
убывает у +3 и всех последутощих нуклеосом, а
на расстоянии порядка 1 т.п.н. от TSS нуклео-
сомы расположены уже не фазирование, а слу-
чайно, не содержат H2A.Z и несут друтие моди-
фикации гистонов. Сразуг после окончания гена
находится З'-NFR [Mavrich etal., 2008а]. Однако
же, внутри кодирующей части гена нуклеосомы
распределены случайно только на первый взгляд.
Сопоставление их укладки с экзон-интронной
структурой генов у человека, D. melanogaster и
С. elegans выявляет то, что нуклеосомы преиму-
щественно находятся в экзонах, а не интронах, и
эти нуклеосомы несут модификацию НЗКЗбтеЗ
[Schwartz et al., 2009; Tilgner et al., 2009].
Таким образом, нуклсосомная укладка играет
ключевую роль в регуляции транскрипции. Стро-
гое положение нуклеосом и безнуклеосомной об-
ласти относительно TSS и наличие H2A.Z тесно
связаны с привлечением факторов транскрипции
и РНК-полимеразы. Позиционирование нуклео-
сом внутри гена сопряжено с интрон-экзонной
структурой и играет роль в сплайсинге РНК.
1.10. Особые типы хроматина
1.10.1. Хроматин в ядрах сперматозоидов
При созревании сперматозоидов возникает не-
обходимость очень плотной упаковки гаплоидно-
го генома в объеме ядра, составляющего пример-
но 5 % от объема ядра соматической клетки. По-
этому на стадии спермиогенеза происходит ре-
организация хроматина, которая включает в себя
изменение в составе основных белков. Если
сравнить этот процесс у представителей разных
таксонов, то можно выделить три варианта раз-
вития событий. У иглокожих изменений относи-
тельно мало, у’ них сохраняются гистоны, харак-
терные для соматических клеток, и/или появля-
ются варианты, характерные для сперматозои-
дов. У костистых рыб и птиц происходит непо-
средственная замена гистонов другими белками
меньшего размера, называемыми протаминами
(protamines, Р). У головоногих моллюсков, хря-
щевых рыб и млекопитающих замена гистонов
идет в два этапа, вначале на переходные белки
(transition proteins, ТР), а только затем на прота-
мины. После оплодотворения хроматин из ядра
сперматозоида снова приобретает нуклеосомную
укладку-.
Переходные белки значительно варьируют у
разных видов по массе и аминокислотному’ со-
ставу, и в целом они более основные, чем гисто-
ГЛАВА 1 23
ны, но менее, чем протамины. У каракатицы и
кальмара единственный ТР является предшест-
венником протамина, тогда как у акул переход-
ные белки не родственны ни гистонам, ни про-
таминам. У млекопитающих известны четыре
переходных белка, наиболее изучены из которых
ТР1 и ТР2, составляющие большинство (до 90 %)
переходных белков в ядре. ТР1 высоко консер-
вативен, он имеет размер 54 аминокислотных
остатка, из которых 20 % приходятся на аргинин
и 19 % на лизин. ТР1 у быка и барана содержит
цистеин, тогда как ТР1 человека, мыши и крысы
нет. ТР2 содержит больше основных остатков
(32 %), сосредоточенных в основном на С-конце
молскулы, а на N-конце находятся два предпола-
гаемых домена «цинковый палец», необходимых
для связывания с ДНК [Woutcrs-Tyrou et al., 1998;
Meistrich et al., 2003].
Протамины образуют разнородное семейство
небольших белков массой 4—12 кДа, которое,
как считается, имеет общего предшественника
с гистоном Hl [Lewis etal., 2004]. У рыб прота-
мины самые короткие среди позвоночных —
у лосося 32 аминокислотных остатка, у трито-
на— 42—48, у аллигатора — 56—62, у утконо-
са— 60, у человека — 50—57 [Lewis et al., 2003].
У млекопитающих обнаружены два протамино-
вых гена: Р1, который кодирует белок Р1, и Р2.
кодирующий семейство белков Р2 (Р2, РЗ и Р4).
Если ген Р2 есть у всех плацентарных млекопи-
тающих, то белки Р2 есть только у приматов,
многих грызунов и еще некоторых видов. Но у
одних (бык, хряк) белки Р2 отсутствуют из-за
мутации в гене, а у других (крыса) отсутствие
Р2 — это результат подавления транскрипции и
трансляции [Hecht, 1989; Maier etal., 1990].
У тех видов, у которых Р2 есть, их доля в ядре
варьирует и составляет 67, 34 и 43 % у человека,
мыши и хомяка соответственно [Bench et al.,
1996]. Семейство Р2 от Pl отличает низкая го-
мология, а также то, что Р1 сразу образуется
в виде зрелого белка, Р2—Р4 же формируются из
предшественника. Так, например, у мыши с гена
Р2 синтезируется белок длиной 106 остатков, из
которого путем отрезания фрагментов образуют-
ся шесть промежуточных форм, которые дают
зрелые белки [Chauviere etal., 1992]. Гены Pl и
Р2 не взаимозаменяемы, и оба необходимы для
фертильности [Cho et al., 2001].
Характерной особенностью всех протаминов
является значительная обогащенность остатками
аргинина. У Р1 человека они составляют 48 %,
у Р1 мыши и у хряка— 52 %, у барана— 54 %.
Эта аминокислота является ключевой для связы-
вания с ДНК благодаря положительному' заряду'.
Друтой важной аминокислотой является цисте-
ин, большое число остатков которого нехарак-
терно для хроматиновых белков. Остатки цис-
теина способны образовывать дисульфидные
мосты, тем самым скрепляя вместе разные моле-
кулы. Но их доля значительно варьирует от пол-
ного отсутствия у' птиц и костистых рыб до 12 %
в Р1 человека или 20 % у хряка. Даже у доста-
точно близких видов разница может быть значи-
тельной. Так, в протамине кальмара цистеины
отсутствуют, а у осьминога составляют 19 из 84
аминокислот [Lewis etal., 2003]. Большинство
остатков аргинина расположены в средней части
молекулы, тогда как остатки цистеина находятся
на ее концах. Еще одной аминокислотой, важной
для связывания с ДНК, является серин, который
после трансляции фосфорилируется, но после
присоединения к ДНК большинство фосфатных
групп удаляется. Доля серинов в Р1 составляет
10 % [McKay et al., 1985].
Пространственная организация молекул про-
таминов пока недостаточно исследована, и на
этот счет существуют две основные модели. Со-
гласно одной из них, молекулы протаминов ли-
шены вторичной структу'ры. Другая же модель
предполагает, что вторичная структура отсутст-
вует лишь у' свободных молекул, но при связы-
вании с ДНК внутри протаминов возникают во-
дородные связи и формируется вторичная струк-
тура. На этот предмет подробно были исследо-
ваны белки лосося и кальмара. Оказалось, что
—20 % от длины молекулы у лосося и —40 % у
кальмара состоят из а-спирали и —40 % в обоих
случаях приходится на p-изгиб (P-tum). В моле-
кулах не обнаружены р-складки (P-sheet) [Roque
etal., 2011].
Структу'ра ДНК-протаминового комплекса
также пока недостаточно ясна. По одной точке
зрения, протамины уложены в малую борозду'
двойной спирали ДНК, при этом положительно
заряженные боковые цепи аргинина нейтрали-
зуют отрицательный заряд фосфатных групп
ДНК [Feughelman etal., 1955]. Другая модель
предполагает, что аргинины расположены в
большой борозде, а остатки нейтральных амино-
кислот внедряются в малую борозду' соседних
молекул ДНК [Puigjaner et al., 1986: Roque et al.,
2004]. Обе эти модели исходят из того, что у
протаминов отсутствуют внутримолекулярные
водородные связи и, как следствие, вторичная
структу'ра. Другая группа моделей учитывает то,
что протамины, как минимум частично, имеют
конформацию а-спиралей, которые либо окру-
24 ЭПИГЕНЕТИКА
жают большую борозду’ молекулы ДНК, либо за-
полняют пространство между’ соседними молеку-
лами ДНК [Warrant, Kim, 1978; Verdaguer etal.,
1993; Raukas, Mikelsaar, 1999]. Считается, что
в отличие от нуклеосомной укладки, при которой
ДНК оборачивается вокрут белковой глобу’лы,
в ядрах сперматозоидов она сохраняет линейную
структуру. Благодаря связыванию с протаминами
происходит нейтрализация отрицательного заряда
двойных спиралей, что позволяет им латерально
соединяться в фибриллы диаметром 30—50 нм
[Eirin-Lopez, Ausio, 2009]. Фрагменты длиной
50—60 т.п.н формируют тороидальные петли,
закрепленные в ядерном матриксе. Дисульфид-
ные мосты между’ остатками цистеина увеличи-
вают прочность и стабильность такой структуры
[Balhom, 2007]. Центромерные районы хромосом
сосредоточены в центральной части ядра, а тело-
мерные районы на периферии.
Исследование хроматина из сперматозоидов
человека, хряка и мыши показало, что гистоны
замещены протаминами не полностью. У человека
это происходит на 85 %, а остальные 15 % ДНК
сохраняют нуклеосомную укладку- [Tanphaichitr
etal., 1978; Gatewood etal., 1990; Andrabi, 2007].
При этом нуклеосомы сохраняются не случайно,
а в основном в кластерах импринтированных
генов, микроРНК, НОХ-генов, а также в промо-
торах генов, кодирующих факторы транскрип-
ции и белки, которые работают в эмбриональном
развитии [Hammond etal., 2009]. Например, спе-
цифические для эмбрионов 8- и у-глобиновые ге-
ны обогащены гистонами, а специфический для
взрослых особей ген р-глобина обогащен прота-
минами [Gardiner-Garden etal., 1998]. Но нали-
чие нуклеосом не исключает наличия в данном
районе протаминов, при этом средняя длина ДНК,
связанной с протаминами, оставляет 750 п.н.,
а нуклесомная укладка распространяется на рай-
оны около 2 т.п.н. Наличие нуклеосом коррели-
рует с отсутствием метилирования ДНК [Ham-
mond etal., 2009]. Важно отметить, что хрома-
тин, сохраняющий в ядрах сперматозоидов нук-
леосомную укладку-, расположен на периферии
ядра, что может иметь значение для быстрого
ответа на сигналы, поступающие из ооцита по-
сле оплодотворения [Gineitis et al., 2000].
1.10.2. Хроматин в хромосомах
динофлагеллят
Особое место среди эукариот занимают одно-
клеточные организмы, объединяемые в тип Di-
noflagellata [Wong, Kwok, 2005]. Это связано с
тем, что соотношение количества белков и ДНК в
хроматине эукариот составляет примерно 1:1,
тогда как у динофлагеллят это значение соответ-
ствует 1 : 10 [Rizzo et al., 1982]. Кроме того, у
этих организмов отсутствуют гистоны и ну’клео-
сомная укладка [Bodansky et al., 1979; Vemet et al.,
1990]. Вместо гистонов хромосомы содержат гис-
тоноподобные белки (НСс), родственные прока-
риотическим HU-белкам [Wong et al., 2003].
Отсутствие гистонов и нуклеосом говорит о
том, что описанная выше система организации и
управления хроматином, присущая большинству’
эукариот, не является единственно возможной.
Динофлагелляты имеют свою собственную сис-
тему', основанную на других механизмах, кото-
рые пока еще не исследованы.
Исследования по данной главе поддержаны
грантом РФФИ № 12-04-00160.
Список ЛИТЕРАТУРЫ
AagaardL.. LaibleG., SelenkoР.. SchmidAL. Dorn R. Schot-
ta G., KuhfittigS., Wolf A., Lebersorger A., Singh P. B.,
Reuter G., Jenuwein T. Functional mammalian homo-
logues of the Drosophila PEV-modifier Sti(var)3—9 en-
code centromere-associated proteins which complex with
the heterochromatin component M31 H EMBO J. 1999.
Vol. 18. P. 1923—1938.
Ahmad K., HenikoffS. The histone variant H3.3 marks active
chromatin by replication-independent nucleosome assem-
bly // Mol. Cell. 2002. Vol. 9. P. 1191—1200.
Alekseev O. AL, Bencic D. C, Richardson R T., U idgren E. E.,
О Rand AL G. Overexpression of the linker histone-bin-
ding protein tNASP affects progression through the cell
cycle // J. Biol. Chem. 2003. Vol. 278. P. 8846—8852.
Allis C. D., Bowen J. K., Abraham G.N., Glover С. K, Gorov-
sly Л/. .4. Proteolytic processing of histone H3 in chroma-
tin: a physiologically regulated event in Tetrahvmena mi-
cronuclei // Cell. 1980. Vol. 20. P. 55—64.
Allis C. D., BergerS. L., Cote J.. DentS., JenuwienT., Kouzari-
desT., PillusL., ReinbergD., ShiY., ShiekhattarR, Shi-
latifardA., Workman J., Zhang Y. New nomenclature for
chromatin-modifying enzymes // Cell. 2007. Vol. 131.
P. 633—636.
AltafAL, Auger A., Covic Al., Cote J. Connection between his-
tone H2A variants and chromatin remodeling complexes //
Biochem. Cell Biol. 2009. Vol. 87. P. 35—50.
Andrabi S. AL H. Mammalian sperm chromatin structure and
assessment of DNA fragmentation // J. Assist. Reprod.
Genet. 2007. Vol. 24. P. 561—569.
Antequera F, TamameAL., Villanueva J. R, SantosT. DNA
methylation in the fungi // J. Biol. Chem. 1984. Vol. 259.
P. 8033—8036.
Arents G., ALoudrianakis E. N. The histone fold: a ubiquitous
architectural motif utilized in DNA compaction and pro-
tein dimerization // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1995.
Vol. 92. P. 11170—11174.
Arents G., Burlingame R W., H angB. C, Love ГГ. E„ ALoudri-
anakis E. N. The nucleosomal core histone octamer at
3.1 A resolution: a tripartite protein assembly and a left-
handed superhelix// Ibid. 199 E Vol. 88.’ P. 10148—
10152.
ГЛАВА 1 25
Athey В. D., Smith М. F.. RankertD.A., Williams S. P.. Lang-
more J. P. The diameters of frozen-hydrated chromatin fi-
bers increase with DNA linker length: evidence in support
of variable diameter models for chromatin И J. Cell. Biol.
1990. Vol. 1 11. P. 795—806.
BaekS. H. When signaling kinases meet histones and histone
modifiers in the nucleus// Mol. Cell. 2011. Vol. 42.
P. 274—284.
Balhom R. The protamine family of sperm nuclear proteins //
Genome Biol. 2007. Vol. 8. P. 227.
Banerjee T., Chakravarti D. A peek into the complex realm of
histone phosphorylation // Mol. Cell. Biol. 2011. Vol. 31.
P. 4858 4873.
Bench G., Friz A., CorzettAL, Morse D., Balhom R. DNA and to-
tal protamine masses in individual sperm from fertile mam-
malian subjects // Cytometry. 1996. Vol. 23. P. 263 -271.
BjerlingP., Silverstein R A., Thon G.. Caudy A., Grewal S.. Ek-
wall K. Functional divergence between histone deace-
tylases in fission yeast by distinct cellular localization and
in vivo specificity// Mol. Cell. Biol. 2002. Vol. 22.
P. 2170—2181.
Blander G., Guarente L. The Sir2 family of protein deacety-
lases //Annu. Rev. Biochem. 2004. Vol. 73. P. 417—435.
BodanskyS., Mintz L. B., Holmes D. S. The mesokaryote Gy-
rodinium cohnii lacks nucleosomes // Biochem. Biophys.
Res. Commun. 1979. Vol. 88. P. 1329—1336.
Braunschweig U, Hogati G. J., Pagie L., van Steensel B. His-
tone Hl binding is inhibited by histone variant НЗ.З //
EMBO J. 2009. Vol. 28. P. 3635—3645.
CamahortR, ShivarajuM., MattinglyAL, LiB., Nakanishi S.,
Zhu D., ShilatifardA., Workman J. L., Gerton J. L. Cse4 is
part of an octameric nucleosome in budding yeast // Mol.
Cell. 2009. Vol. 35. P. 794—805.
CamposE. L, Dillingham J., Li G., Zheng H, J'oigtP., Kuo W. H,
Seepany H. Gao Z.. Day L. A.. Greenblatt J. F. Rein-
berg D. The program for processing newly synthesized
histones H3.1 and H4// Nat. Struct. Mol. Biol. 2010.
Vol. 17. P. 1343—1351.
Chadwick В. P., Willard H. F. A novel chromatin protein, dis-
tantly related to histone H2A, is largely excluded from the
inactive X chromosome// J. Cell Biol. 2001. Vol. 152.
P. 375—384.
Chadwick В. P., Willard H. F. Cell cycle-dependent localization
of macroH2A in chromatin of the inactive X chromo-
some // J. Cell Biol. 2002. Vol. 157. P. 1113—1123.
Chakravarthy S., Gundimella S. К. 1., Caron C, Perche P.-Y.,
Pehrson J. R., Khochbin S., Luger K. Structural charac-
terization of the histone variant macroH2A// Mol. Cell.
Biol. 2005. Vol. 25. P. 7616—7624.
ChandrasekharanAL. B., HuangF, Sun Z.-W. Histone H2B
ubiquitination and beyond. Regulation of nucleosome sta-
bility', chromatin dynamics and the trans-histone H3 me-
thylation // Epigenetics. 2010. Vol. 5. P. 460—468.
ChauviereM., Martinage A., Debarle AL, SautibreP., Che-
vaillierP. Molecular characterization of six intermediate
proteins in the processing of mouse protamine P2 precur-
sor // Eur. J. Biochem. 1992. Vol. 204. P. 759—765.
Chen С. C„ Carscai J. J., FeserJ., Tamburini B., ZabaronickS.,
Linger J., Tyler J. K. Acetylated lysine 56 on histone H3
drives chromatin assembly after repair and signals for the
completion of repair 11 Cell. 2008. Vol. 134. P. 231—243.
ChenC, Nott T. J., Jin J., PawsonT. Deciphering arginine
methylation: Tudor tells the tale // Nat. Rev. Mol. Cell
Biol. 201 1. Vol. 12. P. 629—642.
Cheung P., Tanner K.G., Cheung W.L., Sassone-Corsi P.,
Denu J. AL., Allis C. D. Synergistic coupling of histone H3
phosphorylation and acetylation in response to epidermal
growth factor stimulation// Mol. Cell. 2000. Vol. 5.
P. 905—915.
ChoC, Willis W. D., GouldingE. H.. Jung-HaH, ChoiY.-C,
Hecht N. B. Eddy E. AL. Haploinsufficiency of protamine
-1 or -2 causes infertility in mice// Nat. Genet. 2001.
Vol. 28. P. 82—86.
ClapierC. R., Cairns B. R. The biology' of chromatin remodel-
ing complexes /7 Annu. Rev. Biochem. 2009. Vol. 78.
P. 273- 304.
Clements A.. Rojas J. R. TrievelRC.. WangL., BergerS. L..
Marniorstein R. Crystal structure of the histone acetyl-
transferase domain of the human PCAF transcriptional
regulator bound to coenzyme A // EMBO J. 1999. Vol. 18.
P. 3521—3532.
Cuthbert G. L., DaujatS., Snowden A. W, Erdjument-Bro-
mage H, Hagiwara T, Yamada M, Schneider R, Greg-
ory P.D., TempstP., Bannister A. J., KouzaridesT. His-
tone deimination antagonizes arginine methylation // Cell.
2004. Vol. 118. P. 545—553.
Dalal Y., WangH, Lindsay’S., HenikoffS. Tetrameric structure
of centromeric nucleosomes in interphase Drosophila
cells // PLoS Biol. 2007. Vol. 5. e218.
Das C, Lucia AL S., Hansen КС, Tyler J. К. CBP/p300—
mediated acetylation of histone H3 on lysine 56 H Nature.
2009. Vol. 459. P. 113—117.
De KoningL., Corpet A., Haber J. E., Almouzni G. Histone cha-
perones: an escort network regulating histone traffic //
Nat. Struct. Mol. Biol. 2007. Vol. 14. P. 997—1007.
de Ruijter A. J., van Gennip .1. H, Caron H. M, KempS., van
KuilenburgA. B. Histone deacetylases (HDACs): Charac-
terization of the classical HDAC family // Biochem. J.
2003. Vol. 370. P. 737—749.
DhalluinC., Carlson J. E., ZengL., HeC, Aggarwal A. K,
Zhou Al. AL Structure and ligand of a histone acetyltrans-
ferase bromodomain// Nature. 1999. Vol. 399. P. 491—
496.
DorigoB., Schalch T, KulangaraA.. DudaS., Schroeder R R.
Richmond T. J. Nucleosome arrays reveal the two-start or-
ganization of the chromatin fiber // Science. 2004.
Vol. 306. P. 1571—1573.
DraneP., Ouararhni K., DepauxA., ShuaibAL., HamicheA.
The death-associated protein DAXX is a novel histone
chaperone involved in the replication-independent deposi-
tion of НЗ.З // Genes Dev. 2010. Vol. 24. P. 1253—1265.
DutnallR N., Tafrov S. T, SternglanzR, Ramakrishnan V.
Structure of the histone acetyltransferase Hatl: A para-
digm for the GCN5—related N-acetyltransfcrase super-
family 11 Cell. 1998. Vol. 94. P. 427 438.
Egger G., JeongS., EscobarS. G., Cortez С. C, Li T. W.,
Saito E, Yoo С. B., Jones P. A., Liang G. Identification of
DNMT1 (DNA methyltransferase 1) hypomorphs in so-
matic knockouts suggests an essential role for DNMT1 in
cell survival // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2006.
Vol. 103. P. 14080—14085.
Ehrlich AL, Gama-Sosa AL. A., HuangL.H, ALidgettRAL,
Kuo К. C, ALcCune R. A., Gehrke C. Amount and distribu-
tion of 5-methylcytosine in human DNA from different
types of tissues of cells // Nucleic Acids Res. 1982.
Vol. 10. P. 2709—272E
Eirin-Lopez J. AL., AusioJ. Origin and evolution of chromoso-
mal sperm proteins // BioEssays. 2009. Vol. ЗЕ P. 1062-
1070.
Eirin-Lopez J. AL, Gonzalez-RomeroR, Dryhurst D., Lshiba-
shi T, AusioJ. The evolutionary differentiation of two his-
tone H2A.Z variants in chordates (H2A.Z-1 and H2A.Z-2)
is mediated by' a stepwise mutation process that affects
three amino acid residues H BMC Evol. Biol. 2009. Vol. 9.
P. 3E
EltzovAL., ALacLellanAL. C, ALaeshima AL, FragakisA. S., Du-
bochetJ. Analysis of cryo-electron microscopy' images
does not support the existence of 30—nm chromatin fibres
26 ЭПИГЕНЕТИКА
in mitotic chromosomes in situ 11 Proc. Natl. Acad. Sci.
USA. 2008. Vol. 105. P. 19732—19737.
FaastR., Thonglairoam Г., Schulz T.C., Beall J., Wells J. R,
Taylor H., ALatthaei K, Rathjen P. D., TremethickD. J.,
Lyons I. Histone variant H2A.Z is required for early
mammalian development// Curr. Biol. 2001. Vol. 11.
P. 1183 1187.
FengQ.. WangH, NgH H. Erdjument-Bromage H, TempstP..
StruhlK, Zhang Y. Methylation of H3-lysine 79 is medi-
ated by a new family of HMTases without a SET do-
main ii Curr. Biol. 2002. Vol. 12. P. 1052—1058.
FeughelmanAL, Langridge R, Seed II. E, Stokes A. R, 177/-
son H. R, Hooper С. W, Wilkins AL H. F, BarcleyR. K, Ha-
milton L. D. Molecular structure of deoxyribose nucleic acid
and nucleoprotein 11 Nature. 1955. Vol. 175. P. 834—838.
FilenkoN.A., Kolar C, West J. T, Smith S. A., Hassan Y. L,
BorgstahlG. E. O., Zempleni J.. Lyubchenko 1. L. The
role of histone H4 biotinylation in the structure of nu-
cleosomes // PLoS ONE. 2011. Vol. 6. el6299.
Finch J. T., Lutter L. C, Rhodes D., Brown R S., Rushton B.,
Levitt AL, KlugA. Structure of nucleosome core particles
of chromatin 11 Nature. 1977. Vol. 269. P. 29—36.
FischleW, Wang Y., Jacobs S. A., KimY., Allis C. D., Khora-
sanizadeh S. Molecular basis for the discrimination of re-
pressive methyl-lysine marks in histone H3 by Polycomb
and HP1 chromodomains И Genes Dev. 2003. Vol. 17.
P. 1870—1881.
Fritsch L„ Robin P., Mathieu J. R, SouidiM., HinauxH,
Rougeulle C, Harel-Bellan A., Ameyar-Zazoua AL, Ait-Si-
Ali S. A subset of the histone H3 lysine 9 methyltrans-
ferases Suv39hl, G9a, GLP, and SETDB1 participate in a
multimeric complex // Mol. Cell. 2010. Vol. 37. P. 46—56.
Frve S. Г., Heightman T, Jin J. Targeting methyl lysine '/
Anna Rep. Med. Chem. 2010. Vol. 45. P. 329—343.
Fujita N., WatanabeS., LchimuraT.. TsuruzoeS., Shinkai Y..
Tachibana AL, Chiba T., NakaoAL. Methyl-CpG binding
domain 1 (MBD1) interacts with the Suv39hl—IIP! het-
erochromatic complex for DNA methylation-based tran-
scriptional repression// J. Biol. Chem. 2003. Vol. 278.
P. 24132—24138.
Gamble AL. J., Kraus W. L. Multiple facets of the unique histone
variant macroH2A // Cell Cvcle. 2010. Vol. 9. P. 2568—
2574.
GaoL., Cueto AL. A.. Asselbergs F, Atadja P. Cloning and
functional characterization of HDAC11, a novel member
of the human histone deacetylase family // J. Biol. Chem.
2002. Vol. 277. P. 25748—25755.
Gardiner-Garden AL, Ballesteros AL, Gordon AL, TamP. His-
tone- and protamine-DNA association: conservation of
different patterns within the beta-globin domain in human
sperm // Mol. Cell. Biol. 1998. Vol. 18. P. 3350—3356.
Gatewood J., CookG., Balhom R, Schmid C., Bradbury E. Iso-
lation of four core histones from human sperm chromatin
representing a minor subset of somatic histones // J. Biol.
Chem. 1990. Vol. 256. P. 20662—20666.
GhirlandoR, Felsenfeld G. Hydrodynamic studies on defined
heterochromatin fragments support a 30-nm fiber having
six nucleosomes per turn// J. Mol. Biol. 2008. Vol. 376.
P. 1417 1425.
Gill G. SUMO and ubiquitin in the nucleus: different functions,
similar mechanisms? // Genes Dev. 2004. Vol. 18.
P. 2046—2059.
Gineitis A. A., Zalenskaya L. A., Yau P. AL, ALorton В. E., Zalen-
sky A. O. Human sperm telomere-binding complex in-
volves histone H2B and secures telomere membrane at-
tachment // J. Cell. Biol. 2000. Vol. 51. P. 1591—1598.
GlattS., AlfieriC, ALullerC. W. Recognizing and remodeling
the nucleosome 11 Curr. Opin. Struct. Biol. 2011. Vol. 21.
P. 335—341.
Godde J. S., Ura K. Cracking the enigmatic linker histone
code // J. Biochem. 2008. Vol. 143. P. 287—293.
Godde J. S., Ura K. Dynamic alterations of linker histone vari-
ants during development // Int. J. Dev. Biol. 2009. Vol. 53.
P. 215—229.
Goldberg A. D., BanaszynskiL. A., Noh К AL, Lewis P. W, El-
saesserS.J., Stadler S., Dewell S., Law AL, GuoX., LiX.,
WenD.. Chapgier A.. DeKelver R C. ALillerJ. C. Lee 1. L.
Boydston E. A., Holmes AL. C., Gregory P.D., Greatly J. AL,
RafiiS., YangC, ScambierP. J., GarrickD., GibbonsR J.,
Higgs D. R, CristeaL. AL, UmovF. D., ZhengD., Allis C. D.
Distinct factors control histone valiant НЗ.З localization at spe-
cific genomic regions // Cell. 2010. Vol. 140. P. 678—691.
Goll AL. G., KirpekarF, ALaggert K. A., Yoder J. A., Hsieh C. L.,
ZhangX., Golic K. G., Jacobsen S. E., Bestor T. H. Methy-
lation of tRNA Asp by the DNA methyltransferase ho-
molog Dnmt2 7 Science. 2006. Vol. 311. P. 395—398.
Gonzalez-Romero R, ALendezJ., AusioJ., Eirin-Lopez J. AL.
Quickly evolving histones, nucleosome stability and
chromatin folding: All about histone H2A.Bbd // Gene.
2008. Vol. 413. P. 1—7.
GothelS.F, ALarahielAL. A. Peptidyl-prolyl cis-trans isom-
erases, a superfamily of ubiquitous folding catalysts //
Cell. Mol. Life Sci. 1999. Vol. 55. P. 423 436.
Groth A., Corpet A., Cook A. J, Roche D., BartekJ., Lukas J.,
Almouzni G. Regulation of replication fork progression
through histone supply and demand // Science. 2007.
Vol. 318. P. 1928—1931.
HacquesALF., ALullerS., DeALurcia G., Fan RegenmortelAL. H,
ALarion C. Use of an immobilized enzyme and specific an-
tibodies to analyze the accessibility and role of histone
tails in chromatin structure // Biochem. Biophys. Res.
Commun. 1990. Vol. 168. P. 637—643.
Hammoud S. S., NixD.A., Zhang H, Purwar J., Carrell D. T,
Cairns B. R. Distinctive chromatin in human sperm pack-
ages genes for embryo development // Nature. 2009.
Vol. 460. P. 473 479/
Hartley P.D., ALadhani H. D. Mechanisms that specify pro-
moter nucleosome location and identity // Cell. 2009.
Vol. 137. P. 445 458.
Hassan Y. L., Zempleni J. A novel, enigmatic histone modifica-
tion: biotinylation of histones by holocarboxylase syn-
thetase 11 Nutrition Rev. 2008. Vol. 66. P. 721—725.
Hayashi K, Hofstaetter T., Yakuwa N. Asymmetry of chromatin
subunits probed with histone Hl in an Hl—DNA com-
plex//Biochemistry. 1978. Vol. 17. P. 1880—1883.
Hecht N. B. Mammalian protamines and their expression // His-
tones and other basic nuclear proteins / Hnilica H. S. (ed.).
Boca Raton: CRC Press, 1989. P. 347—373.
HenikoffS. Nucleosome destabilization in the epigenetic regula-
tion of gene expression // Nat. Rev. Genet. 2008. Vol. 9.
P. 15—26.
HeoK, KimH, ChoiS. H, Choi J., Kim K, GuJ., Lieber AL. R,
Yang A. S., An W. FACT-mediated exchange of histone
variant H2AX regulated by phosphorylation of H2AX and
ADP-ribosylation of Spti6 // Mol. Cell. 2008. Vol. 30.
P. 86—97.
Hewish D. R., Burgoyne L. .1. Chromatin sub-structure. The di-
gestion of chromatin DNA at regularly spaced sites by a
nuclear deoxyribonuclease 7 Biochem. Biophys. Res.
Commun. 1973. Vol. 52. P. 504—510.
HisaharaS., Chiba S., ALatsumoto H, HorioY. Transcriptional
regulation of neuronal genes and its effect on neural func-
tions: NAD-dependent histone deacetylase SIRT1
(Sir2a) // J. Pharmacol. Sci. 2005. Vol. 98. P. 200—204.
Lllingworth R. S., Bird A. P. CpG islands — ‘A rough guide’ //
FEBS Let. 2009. Vol. 583. P. 1713—1720.
Lmai S., Armstrong C. AL, KaeberleinAL., Guarente L. Tran-
scriptional silencing and longevity protein Sir2 is an
ГЛАВА 1 27
NAD-dependent histone deacetylase 11 Nature. 2000.
Vol. 403. P. 795—800.
ItoT., Bulger AL, Kobayashi R., Kadonaga J. T. Drosophila
NAP-1 is a core histone chaperone that functions in ATP-
facilitated assembly of regularly spaced nucleosomal ar-
rays // Mol. Cell. Biol. 1996. Vol. 16. P. 3112—3124.
JabsЛ., Weiss AL. S, HilgenfeldR. Non-proline cis peptide bonds
in proteins // J. Mol. Biol. 1999. Vol. 286. P. 291—304.
Jacobson RH., Ladurner A. G., KingD. S., Tjian R Structure
and function of a human TAFII250 double bromodomain
module // Science. 2000. Vol. 288. P. 1422—1425.
Jeltsch A. Molecular enzymology of mammalian DNA methyl-
transferases// Curr. Top. Microbiol. Immunol. 2006.
Vol. 301. P. 203—225.
Jenuwein T, Allis C. D. Translating the histone code // Science.
2001. Vol. 293. P. 1074 -1080.
JinC., ZangC., Wei G., Cui K. PengW.. ZhaoK, FelsenfeldG.
H3.3T12A.Z double variant-containing nucleosomes mark
‘nucleosome-free regions’ of active promoters and other
regulatory regions// Nat. Genet. 2009. Vol. 41. P. 941—
945.
Jones P. L., Veenstra G. J., Wade P. A., CemiaakD., Kass S. U.,
LandsbergerN., StrouboulisJ., Wolffe A. P. Methylated
DNA and MeCP2 recruit histone deacetylase to repress
transcription//Nat. Genet. 1998. Vol. 19. P. 187—191.
KangB.. PuAL, HuG.. Wen П’.. DongZ. ZhaoK. StillmanB..
Zhang Z. Phosphorylation of H4 Ser 47 promotes HIRA-
mediated nucleosome assembly// Genes Dev. 2011.
Vol. 25. P. 1359—1364.
Kaplan N., ALoorel.K, Fondufe-ALittendorfY., Gossett A. J.,
TilloD., Field 1., LeProust E. AL, Hughes T. R, Lieb J. D.,
WidomJ., Segal E. The DNA-encoded nucleosome organi-
zation of a eukaryotic genome // Nature. 2009. Vol. 458.
P. 362—366.
Kaufman P. D.. KobayashiR. Kessler N.. Stillman B. The pl50
and p60 subunits of chromatin assembly factor I: a mo-
lecular link between newly synthesized histones and DNA
replication // Cell. 1995. Vol.’ 81. P. 1105—1114.
Kim J., GuermahAL, ALcGinly R. K, LeeJ.S., TangZ., A Hi-
ne T. A., ShilatifardA., ALuirT.W., Roeder R. G. RAD6-
mediated transcription-coupled H2B ubiquitylation directly
stimulates H3K4 methylation in human cells // Cell. 2009a.
Vol. 137. P. 459—471.
KimJ.K, Esteve P.O.. Jacobsen S. E.. Pradhan S. UHRTT
binds G9a and participates in p21 transcriptional regula-
tion in mammalian cells // Nucleic Acids Res. 2009b.
Vol. 37. P. 493—505.
KirmizisA., Santos-Rosa H., PenkettC.J., Singer AL A., Gre-
en R. D., KouzaridesT. Distinct transcriptional outputs as-
sociated with mono- and dimethylated histone H3 arginine
2 7 Nat. Struct. Mol. Biol. 2009. Vol. 16. P. 449-Л51.
Klose R. J., Zhang Y. Regulation of histone methylation by de-
methylimination and demethylation// Nat. Rev. Mol. Cell
Biol. 2007. Vol. 8. P. 307—318.
Klug A., Rhodes D., Smith J., Finch J. T, Thomas J. O. A low
resolution structure for the histone core of the nu-
cleosome //Nature. 1980. Vol. 287. P. 509—516.
KondoE., GuZ., HoriiA., Fukushige S. The thymine DNA
glycosylase MBD4 represses transcription and is associ-
ated with methylated p!6 (LNK4a) and hALLHl genes //
Mol. Cell. Biol.’2005. Vol. 25. P. 4388 4396.
KombergR D. Chromatin structure: a repeating unit of his-
tones and DNA // Science. 1974. Vol. 184. P. 868—871.
KucharskiR., ALaleszka J., ForetS., ALaleszkaR Nutritional
control of reproductive status in honeybees via DNA me-
thylation // Science. 2008. Vol. 319. P’ 1827—1830.
KunertN., ALarholdJ., StankeJ., StachD., LykoF. A Dnmt2-
like protein mediates DNA methylation in Drosophila 11
Development. 2003. Vol. 130. P. 5083—5090.
Lantermawi A. B.. Straub T.. StralforsA.. Yuan G. C.. Ek-
wall K, Korber P. Schizosaccharomyces pombe genome-
wide nucleosome mapping reveals positioning mecha-
nisms distinct from those of Saccharomyces cerevisiae 11
Nat. Struct. Mol. Biol. 2010. Vol. 17. P. 251—257.
LeeJ.S., ShuklaA., Schneider J., SwansonS. K, Washburn AL. P.,
FlorensL., BhaumikS. R, ShilatifardA. Histone crosstalk
between H2B monoubiquitination and H3 methylation medi-
ated by COMPASS // Cell. 2007. Vol. 131. P. 1084—1096.
LehnertzB., UedaY., DerijckA.A., Braunschweig U., Perez-
Burgos L, KubicekS., ChenT., Li E., Jenuwein T, Pe-
ters A. H. Suv39h-mediated histone H3 lysine 9 methyla-
tion directs DNA methylation to major satellite repeats at
pericentric heterochromatin// Curr. Biol. 2003. Vol. 13.
P. 1192—1200.
Lewis J. D., SongY., deJongALE., BaghaS.AL, AusioJ. A
walk though vertebrate and invertebrate protamines //
Chromosoma. 2003. Vol. 111. P. 473 482.
Lewis J. D., Saperas N., SongY., Zamora AL J., ChivaAL, Au-
sioJ. Histone Hl and the origin of protamines/7 Proc.
Natl. Acad. Sei. USA. 2004. Vol. 101. P. 4148 4152.
Lewis P. W., Elsaesser S. J., Noh K-AL, Stadler S. C., Allis C. D.
Daxx is an НЗ.З-specific histone chaperone and cooperates
with ATRX in replication-independent chromatin assembly
at telomeres // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2010. Vol. 107.
P. 14075—14080.
Li H., Llin S., WangW., Duncan E. AL., WysockaJ, Allis C. D.,
Patel D. J. Molecular basis for site-specific read-out of
histone H3K4me3 by the BPTF PHD finger of NURF /7
Nature. 2006. Vol. 442. P. 91—95.
Li Q., Zhou H., Wurtele H., Davies B., Horazdovsky B., Per-
reault A., Zhang Z. Acetylation of histone H3 lysine 56
regulates replication-coupled nucleosome assemblv // Cell.
2008. Vol. 134. P. 244—255.
Li Y„ SunL., Zhang Y.. WaiigD., WangF. Liang J., Gui B..
ShangY. The histone modifications governing TFF1 tran-
scription mediated by Estrogen receptor // J. Biol. Chem.
2011. Vol. 286. P. 13925—13936.
Lilley D. AL. J., Pardon J. F, Richards B. AL. Structural investi-
gations of chromatin core protein by nuclear magnetic
resonance И Biochemistry. 1977. Vol. 16. P. 2853—2860.
Lin E, Fletcher C. AL., Zhou J., Allis C. D., Wagner G. Solution
structure of the catalytic domain of GCN5 histone acetyl-
transferase bound to coenzyme A // Nature. 1999.
Vol. 400. P. 86—89.
Lister R, PelizzolaAL, Dowen R H, Hawkins RD., HonG.,
Tonti-Filippini J., NeryJ.R, LeeL, YeZ., NgoQ. AL, Ed-
sallL., Antosiewicz-Bourget J., StewartR, Ruotti Г., ALil-
larA.H, Thomson J. A., RenB., Ecker J. R. Human DNA
methylomes at base resolution show widespread epigenomic
differences Nature. 2009. Vol. 462. P. 315—322.
Loyola A., BonaldiT., Roche D., LmhofA., Almouzni G. PTMs
on H3 variants before chromatin assembly potentiate their
final epigenetic state // Mol. Cell. 2006. Vol. 24. P. 309—
316.
Loyola A., Tagami H, BonaldiT., Roche D., QtrivyJ.P., Lm-
hofA., Nakatani E, DentS. Y. R, Almouzni G. The HP1
CAFl-Set-DBl-containing complex provides H3K9mel
for Suv39-mediated K9me3 in pericentric heterochro-
matin 7 EMBO Rep. 2009. Vol. 10. P. 769—775.
Luger K, ALaderA. W, RichmondR. K, Sargent D. R, Rich-
mond T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle
at 2.8 A resolution // Nature. 1997. Vol. 389. P. 251—260.
LutterL. C. Precise location of DNase I cutting sites in the nu-
cleosome core determined by high resolution gel electro-
phoresis // Nucleic Acids Res. 1979. Vol. 6. P. 41—56.
LykoF., Ramsahoye В. H, Jaenisch R. DNA methylation in
Drosophila melanogaster!! Nature. 2000. Vol. 408.
P. 538—540.
28 ЭПИГЕНЕТИКА
Maier W.hL, Nussbaum G.. DomenjoudL.. KlemmU., Engel W.
The lack of protamine 2 (P2) in boar and bull spermatozoa
is due to mutations within the P2 gene // Nucleic Acids
Res. 1990. Vol. 18. P. 1249—1254.
Martin C, Zhang Y. The diverse functions of histone lysine
methylation 11 Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2005. Vol. 6.
P. 838 849.
Maurer-Stroh S.. DickensN. J., Hughes-Davies L.. Kouzarides T,
Eisenhaber F, Ponting С. P. The Tudor domain ‘Royal
Family’: Tudor, plant Agenet, Chromo. PWWP and
МВТ domains '/ Trends Biochem. Sei. 2003. Vol. 28.
P. 69—74.
Mavrich T. N., loshikhes I. P., VentersB. J., Jiang C., Tom-
sha L. P., Qi J., Schuster S. C, Alberti., Pugh B. F. A bar-
rier nucleosome model for statistical positioning of nu-
cleosomes throughout the yeast genome // Genome Res.
2008a. Vol. 18. P. 1073—1083.
Mavrich T. N., JiangC., loshikhesI. P., Li X., VentersB.J.,
ZantonS.J., TomshoL.P., Qi J., Glaser EL., Schus-
ter S. C, Gilmour D. S., Alberti., PughB. F. Nucleosome
organization in the Drosophila genome // Nature. 2008b.
Vol. 453. P. 358—362.
McBride A. E., Silver P. .1. State of the Arg: Protein methylation
at arginine comes of age // Cell. 2001. Vol. 106. P. 5—8.
McKay D. J., RenauxB. S., Dixon G. H. The amino acid se-
quence of human sperm protamine Pl // Biosci. Rpts.
1985. Vol. 5. P. 383—391.
Meistrichhl L., MohapatraB„ Shirley C. R, ZhaoM. Roles of
transition nuclear proteins in spermiogenesis // Chromo-
soma. 2003. Vol. 111. P. 483 488.
Messner S., Hottiger M. O. Histone ADP-ribosylation in DNA
repair, replication and transcription // Trends Cell Biol.
2011. Vol. 21. P. 534—542.
MeyerP. DNA methylation systems and targets in plants//
FEBS Let. 201L Vol. 585. P. 2008—2015.
Mirzabekov A. D., ShickV.V., Belyavsky A. V., Bavykin S. G.
Primary organization of nucleosome core particle of chro-
matin: Sequence of histone arrangement along DNA // Proc.
Natl. Acad. Sei. USA. 1978. Vol. 75. P. 4184-^1188.
Mizuguchi G., ShenX., Landry J., Wu IF. H., Sen S., Wu C.
ATP-driven exchange of histone H2AZ variant catalyzed
by SWR1 chromatin remodeling complex // Science.
2004. Vol. 303. P. 343—348.
Mizuguchi G.. XiaoH., Wisniewski J.. Smith hl. hl.. Wu C.
Nonhistone Scm3 and histones СепНЗ—H4 assemble the
core of centromere-specific nucleosomes // Cell. 2007.
Vol. 129. P. 1153—1164.
Morgan H. D., Santos F, Green K., Dean W., ReikW. Epige-
netic reprogramming in mammals// Hum. Mol. Genet.
2005. Vol. 14. P. R47- -R58.
MurrR. Interplay between different epigenetic modifications
and mechanisms// Adv. Genet. 2010. Vol. 70. P. 101—
141.
Nakagawa T., Kajitani T., TogoS., hlasukoN., Ohdan H., Hi-
shikawa 1., Koji T, Matsuyama T, Ikura T, Muramat-
su hl., Ito T. Deubiquitylation of histone H2A activates
transcriptional initiation via trans-histone cross-talk with
H3K4 di- and trimethylation // Genes Dev. 2008. Vol. 22.
P. 37- 49.
Nathan D., Ingvarsdottir K, Sterner D.E., Byleby G. R. Dok-
manovicM, Dorsey J. A., Whelan K. A., Krsmanovic hl.,
Lane W. S., hleluhP. B., Johnson E. S„ Berger S. L. His-
tone sumoylation is a negative regulator in Saccharomyces
cerevisiae and shows dynamic interplay with positive-
acting histone modifications // Genes Dev. 2006. Vol. 20.
P. 966—976.
Nathan D., Crothers D. hl. Bending and flexibility of methy-
lated and unmethylated EcoRI DNA // J. Mol. Biol. 2002.
Vol. 316. P. 7—17.
Nelson C. J., Santos-Rosa H., KouzaridesT. Proline isomeriza-
tion of histone H3 regulates lysine methylation and gene
expression // Cell. 2006. Vol. 126. P. 905—916.
Nielsen P. R, Nietlispach D., MottH.R, Callaghan J., Ban-
nister A., KouzaridesT., Murzin A. G., Murzina N. V.,
Laue E. D. Structure of the HP1 chromodomain bound to
histone H3 methylated at lysine 9 // Nature. 2002.
Vol. 416. P. 103—107.
Niewmierzycka A., Clarke S. S-adenosyhnethionine-dependent
methylation in Saccharomyces cerevisiae. Identification of
a novel protein arginine methyltransferase // J. Biol.
Chem. 1999. Vol. 274. P. 814—824.
Noll hl. Internal structure of the chromatin subunit // Nucleic
Acids Res. 1974. Vol. l.P. 1573—1578.
Ooi S. K, Qiu C, Bernstein E., Li K, Jia D., YangZ., Erdjument-
Bromage H, TempstP., Lin S. P., Allis C. D., ChengX, Be-
stor T. H. DNMT3L connects unmethylated lysine 4 of his-
tone H3 to de novo methylation of DNA // Nature. 2007.
Vol. 448. P. 714—717.
OudetP., Gross-Bellardhl., Chambon P. Electron microscopic
and biochemical evidence that chromatin structure is a re-
peating unit // Cell. 1975. Vol. 4. P. 281—300.
Peckham H.E., Thurman RE., FuY., StamatoyannopoulosJ. A.,
Noble W. S., Struhl K, WengZ. Nucleosome positioning
signals in genomic DNA // Genome Res. 2007. Vol. 17.
P. 1170—1177.
Pehrson J. R., Fried Г. .1. MacroH2A, a core histone containing
a large nonhistone region " Science. 1992. Vol. 257.
P. 1398—1400.
Pemiings S., Allan J., Davey C. S. DNA methylation, nucleo-
some formation and positioning // Brief. Funct. Genomic
Proteomic. 2005. Vol. 3. P. 351—361.
Pickart С. hl. Mechanisms underlying ubiquitination // Annu.
Rev. Biochem. 2001. Vol. 70. P. 503—533.
PoppC, Dean W., FengS., CokusS.J, Andrews S.. Pellegri-
ni hl., Jacobsen S. E., ReikW. Genome-wide erasure of
DNA methylation in mouse primordial germ cells is af-
fected by AID deficiency // Nature. 2010. Vol. 463.
P. 1101—1105.
Puigjaner L. C., FitaL, Arnott A., Chandrasekaran R, Subi-
ranaJ. .1. Modeling and refinement of the crystal structure
of nucleoprotamine from Gibbula divaricataJ. Biomol.
Struct. Dyn. 1986. Vol. 3. P. 1067—1068.
QuivyJ.P., Gerard A., Cook A. J. L., Roche D.. Almouzni G.
The HP1—p!50/CAF-l interaction is required for pericen-
tric heterochromatin replication and S-phase progression
in mouse cells// Nat. Struct. Mol. Biol. 2008. Vol. 15.
P. 792—797.
Ramachandran G. N, Sasisekharan 1’ Conformation of poly-
peptides and proteins // Adv. Protein Chem. 1968. Vol. 23.
P. 283 438.
Ramsahoye В. H, Biniszkiewicz D., LykoF, Clark V., Bird A. P.,
JaenischR. Non-CpG methylation is prevalent in embry-
onic stem cells and may be mediated by DNA methyltrans-
ferase 3a " Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2000. Vol. 97.
P. 5237—5242.
RaukasE., Mikel soar R. H. Are there molecules of nucleopro-
tamine? / BioEssays. 1999. Vol. 2. P. 440—448.
ReaS., EisenhaberF, O’CarrollD., StrahlB.D., Sun Z W.,
Schmid hl., Opravil S., Mechtler K, PontingC.P.. Al-
lis C. D., Jenuwein T. Regulation of chromatin structure by
site-specific histone H3 methyltransferases // Nature. 2000.
Vol. 406. P. 593—599.
RechtJ., TsubotaT., Тонну J. C, DiazRL, Berger J. hl,
ZhangX, Garcia B. A., ShabanowitzJ., Burlingame A. L.,
HuntD.F, Kaufman P.D., Allis C. D. Histone chaperone
Asfl is required for histone H3 lysine 56 acetylation, a modi-
fication associated with S phase in mitosis and meiosis //
Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. Vol. 103. P. 6988—6993.
ГЛАВА 1 29
Richmond Т. J.. Davey C. A. The structure of DNA in the nu-
cleosome core // Nature. 2003. Vol. 423. P. 145—150.
Riggs A. D., Xiong Z. Methylation and epigenetic fidelity//
Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. Vol. 101. P. 4—5.
Rizzo P. J., Jones AL, Ray S. AL. Isolation and properties of iso-
lated nuclei from the florida red tide dinoflagellate Gym-
nodinium breve (davis)// J. Protozool. 1982. Vol. 29.
P. 217—222.
Rojas J. R, TrievelRC., Zhou J., ALoY., LiX., BergerS. L.,
Allis C. D., ALarmorstein R Structure of Tetrahymena
GCN5 bound to coenzyme A and a histone H3 peptide //
Nature. 1999. Vol. 401’ P. 93—98.
Roque A., OrregoAL., Ponte L., Suau P. The preferential binding
of histone Hl to DNA scaffold-associated regions is de-
termined by its C-terminal domain // Nucleic Acids Res.
2004. Vol. 32. P. 6111 15119.
Roque A.. Ponte L., Suau P. Secondary structure of protamine in
sperm nuclei: an infrared spectroscopy study // BMC
Struct. Biol. 2011. Vol. 1 1. P. 14.
RothS. E, Demi J. AL., Allis C. D. Histone acetyltransferases //
Annu. Rev. Biochem. 2001. Vol. 70. P. 81—120.
SarrafS. A., Stancheva L. Methyl-CpG binding protein MBD1
couples histone H3 methylation at lysine 9 by SETDB1 to
DNA replication and chromatin assembly // Mol. Cell.
2004. Vol. 15. P. 595—605.
Schaefer AL., LykoF. Solving the Dnmt2 enigma// Chromo-
soma. 2010. Vol. 119. P. 35 40.
Schluckebier G., O’Gara AL, Saenger П’., Cheng X. Universal
catalytic domain structure of AdoMet-dependent methyl-
transferases // J. Mol. Biol. 1995. Vol. 247. P. 16—20. ’
Schones D. E., Cui K, CuddapahS., RohT.Y., Barski A.,
WangZ., TTeiG., ZhaoK. Dynamic regulation of nu-
cleosome positioning in the human genome // Cell. 2008.
Vol. 132. P. 887—898.
Schotta G.. LachnerAL. Sarnia K. Ebert A.. SenguptaR,
Reuter G., ReinbergD., Jenuwein T. A silencing pathway
to induce H3—K9 and H4—K20 trimethylation at consti-
tutive heterochromatin// Genes Dev. 2004. Vol. 18.
P. 1251—1262.
Schwartz S., ALeshorer E., AstG. Chromatin organization marks
exon-intron structure// Nat. Struct. Mol. Biol. 2009.
Vol. 16. P. 990—995.
SegalE., Fondufe-ALittendorfY., ChenL., ThastromA., FieldY.,
ALooreL. K. Wang J. Z., WidomJ. A genomic code for nu-
cleosome positioning // Nature. 2006. Vol. 442. P. 772—
778.
SegalE., WidomJ. What controls nucleosome positions?//
Trends Genet. 2009. Vol. 25. P. 335—343.
Selker E. U. Genome defense and DNA methylation in Neuro-
spora // Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 2004.
Vol. 69. P. 119—124.
SharifJ., ALutoAL., TakebayashiS., SuetakeL., LwamatsuA.,
Endo T. A., ShingaJ., ALizutani-Koseki Y., ToyodaT.,
Okamura K., Tajima S., ALitsuya K, OkanoAL, Koseki H.
The SRA protein Np95 mediates epigenetic inheritance by'
recruiting Dnmtl to methylated DNA // Nature. 2007.
Vol. 450. P. 908—912.
Shi Y., Lan F, ALatsonC, ALulliganP., Wherstine J. R, Co-
le P. A., CaseroR. A., Shi Y. Histone demethylation medi-
ated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1 // Cell.
2004. Vol. 119. P. 941—953.
Shiio E, Eisenman R. N. Histone sumoylation is associated with
transcriptional repression // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.
2003. Vol. 100. P. 13225—13230.
Simpson R. T. Structure of the chromatosome, a chromatin par-
ticle containing 160 base pairs of DNA and all the his-
tones /' Biochemistry. 1978. Vol. 17. P. 5524—5531.
Simpson Г. J., Johnson T. E., Hammen R F. Caenorhabditis ele-
gans DNA does not contain 5-methylcytosine at any' time
during development or aging // Nucleic Acids Res. 1986.
Vol. 14. P. 6711- -6719.
Smith S., Stillman B. Purification and characterization of CAP-I,
a human cell factor required for chromatin assembly' dur-
ing DNA replication in vitro 11 Cell. 1989. Vol. 58.
P. 15—25.
Sperling J., SperlingR. Photochemical cross-linking of histones
to DNA nucleosomes // Nucleic Acids Res. 1978. Vol. 5.
P. 2755—2773.
Sterner D. E., BergerS. L. Acety'lation of histones and transcrip-
tion-related factors // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2000.
Vol. 64. P. 435 459.
Stewart D. E., SarkarA., Wampler J. E. Occurrence and role of
cis peptide bonds in protein structures // J. Mol. Biol.
1990. Vol. 214. P. 253—260.
StrahlB.D., Allis C. D. The language of covalent histone
modifcations /'Nature. 2000. Vol. 403. P. 41—45.
SzenkerE., Rav-GalletD., Almouzni G. The double face of the
histone variant НЗ.З// Cell Res. 2011. Vol. 21. P. 421—
434.
Tagami H., Ray-Gallet D., Almouzni G., Nakatani Y. Histone
H3.1 and НЗ.З complexes mediate nucleosome assembly
pathways dependent or independent of DNA synthesis //
Cell. 2004. Vol. 116. P. 51—61.
Tanphaichitr N., Sobhon P., Taluppeth N., ChalermisarachaiP.
Basic nuclear proteins in testicular cells and ejaculated
spermatozoa in man// Exp. Cell Res. 1978. Vol. 117.
P. 347—356.
Tavema S. D., Li H., Ruthenburg A. J., Allis CD., Patel D. J.
I low chromatin-binding modules interpret histone modifi-
cations: lessons from professional pocket pickers // Nat.
Struct. Mol. Biol. 2007. Vol. 14. P. 1025—1040.
Thoma F, Koller Т.Н., Klug A. Involvement of histone Hl in
the organization of the nucleosome and of the salt-de-
pendent superstructures of chromatin // J. Cell Biol. 1979.
Vol. 83. P. 403 427.
Thomas J. O., KornbergR D. An octamer of histones in chro-
matin and free in solution // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.
1975. Vol. 72. P. 2626—2630.
Tilgner H, Nikolaou C, Althammer S., Sammeth AL, BeatoAL,
I'alcarcelJ., GuigoR. Nucleosome positioning as a de-
terminant of exon recognition 7 Nat. Struct. Mol. Biol.
2009. Vol. 16. P. 996—1001.
Tippin D.B.. Sundaralingam AL. Nine polymorphic crystal
structures of d(CCGGGCCCGG), d(CCGGGCCm5CGG),
d(Cm5CGGGCCm5CGG) and d(CCGGGCC(Br)5CGG)
in three different conformations: effects of spermine bind-
ing and methylation on the bending and condensation of
A-DNA // J. Mol. Biol. 1997. Vol. 267. P. 1171—1185.
Toshinobu K, Rios-Avila L., Pestinger K, Wijeratne S. S. K,
Zempleni J. Biotinylation is a natural, albeit rare, modifi-
cation of human histones// Mol. Genet. Metabol. 2011.
Vol. 104. P. 537—545.
TrievelRC., Rojas J. R, Sterner D. E., T'enkataramani R N.,
WangL., Zhou J., Allis C. D., BergerS. L, ALarmorstein R.
Crystal structure and mechanism of histone acety'lation of
the yeast GCN5 transcriptional coactivator// Proc. Natl.
Acad. Sci. USA. 1999. Vol. 96. P. 8931—8936.
Tsukada Y., Fang J., Erdjument-Bromage H, Warren ALE.,
Borchers С. H., TempstP., Zhang Y. Histone demethyla-
tion by a family of JmjC domain-containing proteins //
Nature. 2006. Vol. 439. P. 811—816.
Turner J. AL, ALahadevaiah S. K, Fernandez-Capetillo O., Nus-
senzweigA., Xu X., DengC.X., Burgoyne P. S. Silencing
of unsynapsed meiotic chromosomes in the mouse 11 Nat.
Genet.’2005. Vol. 37. P. 41^17.
UnokiAL, Nishidate T., Nakamura Y. ICBP90, an E2F-1 target,
recruits HDAC1 and binds to methyl-CpG through its
SRA domain // Oncogene. 2004. Vol. 23. P. 7601—7610.
30 ЭПИГЕНЕТИКА
van Attikum Н.. Gasser S. AL Crosstalk between histone modi-
fications during the DNA damage response // Trends Cell
Biol. 2009. Vol. 19. P. 207—217.
VanDemark А. P., Kasten Al. AL, Ferris E., Heroux A., Hill С. P.,
Cairns B.R. Autoregulation of the rsc4 tandem bromodo-
main bv gcn5 acetylation // Mol. Cell. 2007. Vol. 27.
P. 817- 828.
Varshavsky A. J, Bakayev V. V. Georgiev G. P. Heterogeneity
of chromatin subunits in vitro and location of histone Hl //
Nucleic Acids Res. 1976. Vol. 3. P. 477 492.
Verdaguer N., PerelloAL, Palau J., Subirana J. A. Helical
structure of basic proteins from spermatozoa. Comparison
with model peptides// Eur. J. Biochem. 1993. Vol. 214.
P. 879—887.
Verdin E., Dequiedt F., Easier H. G. Class II histone deacety-
lases: Versatile regulator // Trends Genet. 2003. Vol. 19.
P. 286—293.
VernelG., Sala-RoviraAl., AlaederAL, JacquesF, HerzogAl.
Basic nuclear proteins of the histone-less eukaryote Cryp-
thecodinium cohnii (Pyrrhophyta): two-dimensional elec-
trophoresis and DNA-binding properties 11 Biochim. Bio-
phys. Acta. 1990. Vol. 1048. P. 281—289.
WangY., WysockaJ, SaveghJ., Lee Y. H, Perlin J. R, Leo-
nelli L., Sonbuchner L. S., McDonald С. H., CookRG.,
Doti 1., Roeder R. G, Clarke S., Stallcup Al. R, Allis C. D.,
CoonrodS. A. Human PAD4 regulates histone arginine me-
thylation levels via demethylimination // Science. 2004a.
Vol. 306. P. 279—283.
WangH, WangL., Erdjument-Bromage H, Vidal AL, TempstP.,
Jones R. S, Zhang Y. Role of histone H2A ubiquitination in
Polycomb silencing// Nature. 2004b. Vol. 431. P. 873—
878.
WangY., JordaAL, Jones P. L., Alaleszka R, LingX., Robert-
son H. Al., AlizzenC.A., PeinadoALA., Robinson G. E.
Functional CpG methylation svstem in a social insect 7
Science. 2006. Vol. 314. P. 645' 647.
Warrant R. W, Kim S. H. a-Helix-double helix interaction
shown in the structure of a protamine-transfer RNA com-
plex and a nucleoprotamine model // Nature. 1978. Vol. 27
P. 130—135.
Weiss Al. S., Jabs A., Hilgenfeld R. Peptide bonds revisited 7
Nat. Struct. Biol. 1998. Vol. 5. P. 676.
Westermann S., Cheeseman I. AL, Anderson S., Yates J. R 3rd,
Drubin D. G.. Barnes G. Architecture of the budding yeast
kinetochore reveals a conserved molecular core // J. Cell
Biol. 2003. Vol. 163. P. 215—222.
WolfE., VassilevA., Alakino Y., Sali A., NakataniY., Bur-
ley S. K. Crystal structure of a GCN5-related N-acetyl-
transferase: Serratia marcescens aminoglycoside 3-N-ace-
tyltransferase // Cell. 1998. Vol. 94 P. 439 449.
Wong J. T., New D. C, Wong J. C, HungV.K Histone-like
proteins of the dinoflagellate Crypthecodinium cohnii have
homologies to bacterial DNA-binding proteins // Eu-
karyot. Cell. 2003. Vol. 2. P. 646—650.
WongH, Victor J.-AL, Alozziconacci J. An all-atom model of
the chromatin fiber containing linker histones reveals a
versatile structure tuned by the nucleosomal repeat
length " PLoS ONE. 2007. Vol. 2. e877.
Wong J. T. I'., Kwok A. C. AL Proliferation of dinoflagellates:
blooming or bleaching // BioEssays. 2005. Vol. 27.
P. 730—740.
Wouters-Tyrou D., Alartinage A., Chevaillier P., SautiereP.
Nuclear basic proteins in spermiogenesis // Biochimie.
1998. Vol. 80. P. 117 128.
JTwS. C. Zhang Y. Active DNA demethylation: many roads
lead to Rome// Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2010. Vol. IE
P. 607—620.
XhemalceB., Aliller K. AL, Driscoll R, Alasumoto H, Jack-
son S. P., Kouzarides T., Perreault A., Arcangioli B. Re-
gulation of histone H3 lysine 56 acetylation in Schizosac-
charomyces pombeH j. Biol. Chem. 2007. Vol. 282.
P. 15040—15047.
Xu AL, LongC, ChenX., Huang C, ChenS., Zhu B. Partition-
ing of histone H3—H4 tetramers during DNA replication-
dependent chromatin assembly // Science. 2010. Vol. 328.
P. 94—98.
YangX, Gregoire S. Class II histone deacetylases: from se-
quence to function, regulation, and clinical implication //
Mol. Cell. Biol. 2005. Vol. 25. P. 2873—2884.
Yuan G.-C., LiuY.-J., Dion Al. F., SlackAl.D., WuL.F, Alt-
schuler S. J., Rando O. J. Genome-scale identification of
nucleosome positions in 5. cerevisiae // Science. 2005.
Vol. 309. P. 626—630.
ZhangX., Tazaki J., Sundaresan A., CokusS., ChanS. W, Chen H,
Henderson 1. R, ShinnP., Pellegrini AL, Jacobsen S. E.,
Ecker J. R. Genome-wide high-resolution mapping and
functional analysis of DNA methylation in Arabidopsis /
Cell. 2006. Vol' 126. P. 1189- -1201.
Zhang Y., Aloqtaderi Z., Rattner В. P., Euskirchen G., Sny-
derAI., KadonagaJ. T., LiuXS., StruhlK. Intrinsic his-
tone-DNA interactions are not the major determinant of
nucleosome positions in vivo II Nat. Struct. Mol. Biol.
2009. Vol. 16. P. 847—853.
ZhangY., ReinbergD. Transcription regulation by histone me-
thylation: Interplay between different covalent modifica-
tions of the core histone tails и Genes Dev. 2001. Vol. 15.
P. 2343—2360.
ГЛАВА
2
МЕХАНИЗМЫ СОМАТИЧЕСКОГО МУТАГЕНЕЗА
И АКТИВНОГО ДЕМЕТИЛИРОВАНИЯ ДНК
В ЭПИГЕНЕТИЧЕСКОЙ РЕГУЛЯЦИИ
СОДЕРЖАНИЕ
2.1. Активное изменение химической
структуры ДНК как способ эпигене-
тической регуляции. Метилирова-
ние ДНК эукариот, 32
2.2. Деметилирование ДНК по механиз-
му эксцизионной репарации осно-
ваний ДНК, 33
2.3. Редактирование ДНК: направлен-
ное повреждение ДНК и соматиче-
ский мутагенез как способ контро-
ля активности генов, 43
2.4. Динамическая химическая структу-
ра ДНК и регуляция активности ге-
нов: проблемы и перспективы, 45
Список литературы, 46
32 ЭПИГЕНЕТИКА
Метилирование оснований цитозина в CpG-
динуклсотидах ДНК представляет собой хорошо
изученный способ регуляции активности генов на
уровне транскрипции и лежит в основе многих
примеров эпигенетической наследственности —
передачи информации об активности гена от ро-
дительских клеток или организмов к потомкам.
Несмотря на огромное число работ, посвященных
возникновению эпигенетического метилирования
в химической структуре ДНК, очень немногое из-
вестно о снятии таких модификаций. За послед-
ние годы у животных и растений были выявлены
несколько механизмов активного деметилирова-
ния ДНК, основанные на процессе эксцизионной
репарации оснований ДНК, рассматриваемые ни-
же. Помимо этого, накапливается все больше све-
дений о том, что репарация ДНК участвует в про-
цессе направленного соматического мутагене-
за— необратимого изменения последовательно-
сти ДНК, также играющем важную роль в неко-
торых ветвях клеточной дифференцировки в ходе
развития организма.
2.1. Активное изменение химической
структуры ДНК КАК СПОСОБ
ЭПИГЕНЕТИЧЕСКОЙ РЕГУЛЯЦИИ.
Метилирование ДНК эукариот
Классические работы молскулярной генетики
середины XX в. заложили фундамент понимания
механизмов наследования генов и определения
ими фенотипических признаков. Однако уже в
то время стало ясно, что даже наследуемый ком-
понент фенотипической изменчивости не всегда
полностью определяется последовательностью
нуклеотидов ДНК в геноме клетки или организ-
ма [Holliday, 2006]. В ходе изучения процессов
развития организмов на молскулярно-генетичес-
ком уровне возникло понятие о существовании
двух параллельных и взаимодополняющих сис-
тем наследственности: генетической, которая
основана на последовательности нуклеотидов
ДНК, и эпигенетической, которая основана на
стабильной активации и инактивации экспрес-
сии генов [Maynard Smith, 1990].
Несмотря на то, что число исследований, по-
зиционирующихся как эпигенетические, в по-
следние годы растет лавинообразно, единое оп-
ределение понятия «эпигенетика» парадоксаль-
ным образом отсутствует. Ряд исследователей
вслед за К. Уоддингтоном понимают под эпиге-
нетикой закономерности реализации генотипа и
его взаимодействия со средой в фенотипе (в том
числе с возможным изменением последователь-
ности ДНК), в то время как другое определение,
берущее начало из работ А. Риггса, Р. Холлидея
и Дж. Мэйнард-Смита, более узко трактует эпи-
генетику как наследование, не связанное с изме-
нением последовательности ДНК [Maynard Smith,
1990; Holliday, 2006; Bird, 2007]. В любом случае
считается достаточно общепринятым то, что эпи-
генетические механизмы отвечают за передачу’
информации о состоянии клетки при ее делении
(как для одноклеточных организмов, так и для
отдельных клеток многоклеточных), но лишь
в исключительных случаях принимают участие
в передаче этой информации из поколения в по-
коление у многоклеточных организмов, размно-
жающихся половым путем.
Из эпигенетических механизмов в узком
смысле этого слова (т. е. не затрагивающих по-
следовательность ДНК) на сегодня лучше всего
изучены два способа стабильной активации и
инактивации генов. Первый из них связан с изме-
нением состояния конденсации хроматина за счет
ковалентной модификации гистонов или других
белков, отвечающих за упаковку ДНК, второй —
с ковалентной модификацией самой ДНК, что ве-
дет к изменению сродства к ней разнообразных
ДНК-связывающих белков [Bird, 2007].
В живой природе направленная ковалентная
модификация ДНК, в основном затрагивающая
азотистые основания, достаточно широко рас-
пространена у прокариот, их вирусов и одно-
клеточных эукариот. Например. А6-метиладенин
в ДНК бактерий выполняет важные функции
в регуляции инициации репликации и маркирует
родительские цепи ДНК при мисматч-репарации
[Ratel et al., 2006], а модификация пиримидино-
вых оснований по положению С5, характерная
для многих бактериофагов (например, замена
Cyl глюкозилированным 5-гидроксиметилцито-
зином у Т-четных фагов), защищает их от дейст-
вия клеточных систем рестрикции [Warren, 1980].
Всего в геномах прокариот и низших эукариот
насчитывается более десятка функциональных
модификаций оснований ДНК [Gommers-Ampt,
Borst, 1995]. Однако у высших эукариот единст-
венным модифицированным основанием ДНК,
для которого надежно показано участие в регу-
ляции экспрессии генов, до недавних пор являл-
ся 5-метилцитозин (ш5С).
Метилирование Cyl часто приводит к подав-
лению транскрипции и играет важную роль в
дифференцировке клеток и сохранении аллель-
специфичной экспрессии импринтированых ге-
нов. У млекопитающих три ДНК-(цитозин-5)-
метилтрансферазы (DNMT1, DNMT3a и DNMT3b)
ГЛАВА 2 33
катализируют перенос метильной группы с
8-аденозил-Ь-метионина на цитозин в динуклсо-
тидах CpG [Jeltsch, 2006; Jurkowska etal., 2011].
DNMT3a и DNMT3b обычно рассматриваются
как метилазы de novo, поскольку их активность
одинакова при использовании неметилирован-
ных и полумстилированных CpG-субстратов, а
DNMT1 — как фермент, поддерживающий ста-
тус метилирования, поскольку его активность на
1—2 порядка выше на полумстилированных
CpG-сайтах, чем на неметилированных. Иссле-
дования на трансгенных мышах выявили эм-
бриональную летальность животных при инак-
тивации любой из этих ДНК-метилтрансфераз
[Li et al., 1992; Okano et al., 1999].
Метилирование ДНК может репрессировать
экспрессию генов по двум механизмам: за счет
непосредственного ингибирования взаимодейст-
вия транскрипционных факторов с их сайтами
связывания [Watt, Molloy, 1988] и за счет узна-
вания метил-CpG специфическими метил-CpG-
связывающими белками, которые далее взаимо-
действуют с гистон-модифицирующими фермен-
тами, приводя к конденсации и инактивации
хроматина [Jones et al., 1998; Nan et al., 1998; Ng
et al., 1999; Sarraf, Stancheva, 2004]. Неправиль-
ная регуляция паттернов метилирования ДНК, в
частности глобальное деметилирование ДНК и
гиперметилирование генов-онкосупрессоров, яв-
ляется маркером онкозаболеваний [Jones, Baylin,
2007]. Показано, что гипометилирование генома
у мышей со сниженной экспрессией DNMT1 вы-
зывает развитие агрессивных Т-клеточных лим-
фом с высокой частотой хромосомных пере-
строек [Gaudet etal., 2003]. Инактивация гена
DNMT3b в эмбриональных фибробластах мыши
ведет к их преждевременному' старению либо
спонтанной иммортализации [Dodge et al., 2005].
Как видно, изменения в содержании и распреде-
лении ш5С в ДНК млекопитающих ведут к ге-
номной нестабильности, которая может давать
толчок онкозаболеваниям.
Механизмам и роли метилирования цитозина
в геноме высших эукариот посвящено большое
число работ. Напротив, о механизмах деметили-
рования до недавнего времени было известно
очень немногое. Достаточно очевидна модель
пассивного деметилирования: после репликации
ш5С в полностью метилированном CpG-сайте
исчезает из дочерней цепи, и если не происходит
его восстановления за счет активности DNMT,
то через несколько клеточных циклов в большей
части потомства исходной клетки данный CpG-
сайт окажется деметилированным. С другой сто-
роны, довольно давно обсуждалась возможность
активного деметилирования ш5С, которая по-
зволяла бы регулировать статус метилирования
отдельных генов вне зависимости от клеточного
деления. Однако механизм этого процесса оста-
вался неизвестным, и только работы последних
лет показали, что он основан на системе репара-
ции ДНК, основная функция которой — поддер-
жание генетической стабильности. Одновремен-
но было выяснено, что та же самая система ре-
парации ДНК отвечает и за некоторые события,
лежащие в основе клеточной дифференцировки,
в частности, в ходе развития иммунной системы.
2.2. Деметилирование ДНК по механизму
ЭКСЦИЗИОННОЙ РЕПАРАЦИИ ОСНОВАНИЙ
ДНК
2.2.1. Эксцизионная репарация
оснований ДНК
Направленная эпигенетическая модификация
оснований ДНК — далеко не единственный слу-
чай появления неканонических оснований в кле-
точном геноме. Гораздо чаще они возникают под
действием разнообразных эндогенных и экзо-
генных факторов, повреждающих генетический
материал клетки. Основания ДНК могут подвер-
гаться окислению, восстановлению, дезамини-
рованию, электрофильному’ присоединению за-
местителей разного рода (например, метилиро-
ванию), могут вступать в фотохимические реак-
ции и теряться при спонтанном гидролизе TV-гли-
козидной связи [Friedberg etal., 2006; von Son-
ntag, 2006; Halliyvell, Gutteridge, 2007]. Кроме ос-
нований, повреждаться может и фосфодиэфир-
ный остов ДНК. Для предотвращения мутаген-
ных и цитотоксических последствий поврежде-
ния ДНК в клетке существует несколько взаимо-
дополняющих ферментативных систем, которые
поддерживают процессы, носящие общее назва-
ние «репарация ДНК». Главная цель всех этих
систем — восстановление последовательности
ДНК, существовавшей до ее повреждения.
На текущий момент выделяют шесть глав-
ных систем репарации, которые отличаются друг
от друга используемыми субстратами, фермента-
ми и механизмами устранения поврежденных
звеньев. В ходе нескольких не связанных друг с
другом процессов, объединяемых под общим на-
званием реактивации, поврежденные основания
ДНК непосредственно превращаются в нормаль-
ные без расщепления ДНК и последующего ее
синтеза. Например, образующиеся под действи-
34 ЭПИГЕНЕТИКА
ем ультрафиолетового излучения циклобутано-
вые пиримидиновые димеры превращаются в
два исходных пиримидиновых основания фер-
ментом фотолиазой при облучении светом ви-
димого спектра. Все остальные системы репара-
ции действуют с деградацией и повторным син-
тезом поврежденной части ДНК. В случае силь-
ного повреждения ДНК — образования двуце-
почечных разрывов, обширных однонитевых
брешей, сшивок между’ цепочками — функцио-
нирует система рекомбинационной репарации,
при которой поврежденная ДНК исправляется за
счет рекомбинации с полноценной копией гене-
тического материала, если та присутствует в
клетке. Двуцепочечные разрывы также могут
устраняться в процессе воссоединения негомоло-
гичных концов, что, однако, ведет к потере части
генетического материала. Неканонические пары
оснований и короткие петли в ДНК узнаются
системой мисматч-репарации, которая удаляет
фрагмент ДНК, включающий неканонический
элемент, и застраивает образовавшуюся брешь.
Для эксцизионной репарации нукчеотидов, суб-
стратами которой являются объемные аддукты в
ДНК, также характерно вырезание участка ДНК
с последующим синтезом.
В большинстве случаев повреждение основа-
ний ДНК устраняется в процессе эксцизионной
репарации оснований (ЭРО). По количеству ис-
правляемых повреждений ЭРО представляет со-
бой главный способ репарации ДНК в живой
клетке. Этот путь репарации инициируется выще-
плением поврежденного азотистого основания од-
ним из ферментов, принадлежащих к классу ДНК-
гликозилаз [Королев, 2005: Friedberg etal., 2006:
Жарков, 2007; Zharkov, 2008; Сидоренко, Жарков,
2008], которые катализируют гидролиз TV-глико-
зидной связи (рис. 2.1, табл. 2.1). Выщепление по-
врежденного элемента ДНК в виде основания от-
личает ЭРО от всех других типов репарации, в ко-
торых он удаляется в составе дезоксирибонуклео-
тидов или коротких олигонуклеотидов.
-ЧЁ)-ЧЁ)-к®-ЧЁ)-Ч©-Ч©-Ч©^ -к®-ЧЕ>-Ч₽)-Ч₽)-ЧЁ)-ЧЁ)-Ч^ -Ч©-ЧЕ>Дё)-Ч©-Ч©-Ч©-ЧЁ)-1-
Lig I
Lig III/XRCC1
Рис. 2.1. Общий механизм эксцизионной репарации оснований (ЭРО). Описание основных путей ЭРО дано в тек-
сте. Черным ромбом обозначено поврежденное основание, двойной линией — 4,5-дигидроксипентеналь-2 (нена-
сыщенный альдозный фрагмент, продукт p-элиминирования З'-фосфатной группы), стрелкой в ДНК—свобод-
ный З'-ОН-конец.
ГЛАВА 2 35
ДНК-гликозилазы делятся на несколько ти-
пов. В результате действия монофункциональных
ДНК-гликозилаз в ДНК образуется первый про-
межуточный продукт ЭРО — апурин-апирими-
диновый сайт (АР-сайт). АР-сайты также могут
возникать за счет спонтанной апуринизации де-
зоксирибонуклеотидов в составе ДНК. Другие
ДНК-гликозилазы, называемые бифункциональ-
ными, могут после удаления поврежденного ос-
нования вносить разрыв с 3'-стороны от образо-
вавшегося АР-сайта по механизму’ р-элиминиро-
вания. Такая активность называется АР-лиазной.
Продукты p-элиминирования не могут служить
субстратами для последующих шагов ЭРО и
должны удаляться из ДНК (см. рис. 2.1). Некото-
рые бифункциональные ДНК-гликозилазы спо-
собны катализировать две последовательных ре-
акции элиминирования межнуклеозидных фос-
фатов (р,5-элиминирование), в результате чего
на месте поврежденного звена образуется одно-
нуклеозидная брешь, обрамленная фосфатными
группами, которая тоже должна подвергаться
процессингу перед продолжением ЭРО. Эти раз-
личия в механизме реакции приводят к разделе-
нию ЭРО на несколько путей на самом первом
этапе (см. рис. 2.1).
АР-сайты, образовавшиеся при повреждении
ДНК или под действием монофункциональных
ДНК-гликозилаз, служат субстратами для фер-
ментов АР-эндонуклеаз. которые гидролизуют
фосфодиэфирную связь непосредственно с 5'-сто-
роны от АР-сайта и вносят таким образом одно-
цепочечный разрыв в ДНК (см. рис. 2.1) [Demp-
le, Harrison, 1994; Королев, 2005; Friedberg et al.,
2006; Zharkov, 2008]. Ненасыщенные альдозные
фрагменты — продукты р-элиминирования —
удаляются из ДНК фосфодиэстеразной активно-
стью, обычно также ассоциированной с АР-эндо-
нуклеазами [Demple, Harrison, 1994]. Возникаю-
щие при р,5-элиминировании 3'-фосфатные
группы выщепляются из ДНК фосфатазной ак-
тивностью, которая у Е. coli принадлежит опять
же АР-эндонуклеазам, а в клетках человека —
полинуклеотидкиназе [Demple, Harrison, 1994;
Wiederhold etal., 2004]. Наконец, в недавно от-
крытом пути инцизионной репарации АР-эндо-
нуклсазы расщепляют ДНК с 5'-стороны от не-
которых дезоксирибонуклеотидов с поврежден-
ным основанием без его предварительного уда-
ления ДНК-гликозилазой [Ischenko, Saparbaev,
2002] (см. рис. 2.1).
Гидролиз ДНК по АР-сайту АР-эндонуклса-
зами приводит к появлению еще одного проме-
жуточного продукта ЭРО — одноцепочечного
Таблица 2.1
Известные ДНК-гликозилазы Е. coli и человека
Е. coli Человек Субстратная специфичность
Ung UNG Ura в любом контексте
Mug TDG Thy, Ura, hmUra, fCyt, caCyt в nape c Gua, eCyt
SMUG1 Ura в любом контексте, hmUra, fUra, caUra
MBD4 Thy, Ura, hmUra в паре c Gua в CpG-динуклеотидах
Al kA Алкилированные пурины, этеноаде- нин, гипоксантин
Tag MPG Алкилированные пурины Алкилированные пурины, этеноаде- нин, гипоксантин
Nth NTHL1 Окисленные пиримидины
OGG1 Окисленные пурины
MutY MUTYH Ade в паре с Gua или oxoGua; 2-OH-Ade
Fpg Окисленные пурины
Nei NEIL1 Окисленные пиримидины Окисленные пурины и пиримидины
NEIL2 Окисленные пурины и пиримидины
NEIL3 Окисленные пурины и пиримидины
разрыва с 3'-концевой ОН-группой, служащей
субстратом для ДНК-полимераз, и 5'-концевым
фрагментом 2'-дезоксирибозо-5'-фосфата (dRP).
Для завершения репарации необходим репара-
тивный синтез ДНК (заполнение бреши) и по-
следующее лигирование разрыва (см. рис. 2.1).
На этой стадии происходит еще одно разделение
процесса ЭРО на пути с участием разных фер-
ментов, называемые «короткозаплаточной» и
«длиннозаплаточной» ЭРО. В первом из этих
случаев ДНК-полимераза (ДНК-полимераза р в
клетках высших эукариот) включает один dNMP
на место поврежденного звена. Фрагмент dRP
удаляется из ДНК с участием 5'—>3'-экзонуклеаз
или 2'-дезоксирибозо-5'-фосфатлиаз (dRP-лиаз),
которые выщепляют dRP по гидролитическому’
или лиазному’ механизму’ соответственно (см.
рис. 2.1); в клетках высших эукариот функцию
удаления dRP выполняет в основном dRP-лиаз-
ная активность ДНК-полимеразы р. Затем осу-
ществляется лигирование, которое в клетках
высших эукариот катализирует ДНК-лигаза Ша
в комплексе с вспомогательным белком XRCC1.
При длиннозаплаточной ЭРО после включения
первого dNMP репаративный синтез продолжа-
ется с заменой двух—пяти нуклеотидов и вытес-
нением или деградацией впереди лежащей цепи
ДНК; в клетках высших эукариот этот синтез ве-
дется ДНК-полимеразами 5 или 8 с привлечени-
36 ЭПИГЕНЕТИКА
ем вспомогательных факторов (PCNA, RFC, RPA).
Вытесненный участок ДНК удаляется флэп-эн-
донуклсазой (FEN1 в случае высших эукариот),
и одноцепочечный разрыв лигируется (у высших
эукариот — ДНК-лигазой I) [Fortini, Dogliotti.
2007]. Недавно открыты ветви ЭРО, не зависи-
мые от ДНК-гликозилаз (инцизионная репара-
ция) или АР-эндонуклеаз (см. рис. 2.1), однако
непонятно, насколько важны эти процессы для
репарации in vivo.
2.2.2. Деметилирование, инициированное
дезаминированием 5-метилцитозина
Из описанного выше механизма ЭРО очевид-
но, что удаление ш5С из ДНК могло бы осуще-
ствляться под действием специфичной 5-метил-
цитозин-ДНК-гликозилазы с последующей репа-
рацией. ДНК-гликозилазная активность, удаляю-
щая основания т5С, была описана в экстрактах
клеток млекопитающих и птиц [Jost, 1993; Jost,
Jost, 1994] и выделена в высокоочищенном со-
стоянии из куриных эмбрионов [Jost et al., 1995].
Однако эта активность представляла собой не
один полипептид, а рибонуклсопротсин, в соста-
ве которого были идентифицированы ДНК-гли-
козилаза TDG, РНК-геликаза и РНК длиной 300—
500 нуклеотидов, необходимые для проявления
активности [Fremont etal., 1997; Jost etal., 1999;
Zhu et al., 2000b|. Группой Ж.-П. Жоста сообща-
лось о том, что рекомбинантные ДНК-гликози-
лазы TDG и MBD4 курицы и человека с невысо-
кой эффективностью удаляют основания т5С из
ДНК [Zhu et al., 2000а, Ь], однако другие иссле-
дователи не обнаружили у этих ферментов 5-ме-
ти лцитозин-ДНК-гликозилазной активности [Неп-
drich etal., 1999; Hardeland etal., 2003; Metivier
etal., 2008]. Учитывая повышенную склонность
m5C к дезаминированию, возможно, что описан-
ная активность TDG и MBD4 на самом деле от-
ражает их способность эффективно удалять Thy
из пар Thy: Gua (см. ниже). В настоящее время,
по-видимому, нельзя считать доказанным суще-
ствование 5-метилцитозин-ДНК-гликозилаз у
позвоночных животных, в отличие от анало-
гичных активностей у растений (см. разд. 2.2.4).
Более убедительные доказательства сущест-
вуют в пользу активного деметилирования ДНК,
основанного на хорошо изученном механизме
репарации неправильных пар Thy:Gua, которые
образуются в результате дезаминирования ш5С
в парах m5C:Gua. Такие предмутагенные повреж-
дения очень часто возникают в CpG-сайтах
в клетках высших эукариот, поэтому’ их репара-
ция исключительно важна. Из клеток млекопи-
тающих была выделена ферментативная актив-
ность, способная связываться с двуцепочечными
олигонуклеотидами, содержащими пары Thy:Gua
и Ura:Gua, и удалять из них основания Thy и Ura
[Neddermann, Jiricny, 1994]. Выделение белка ти-
мин-ДНК-гликозилазы (thyminc-DNA glycosylase,
TDG) в чистом виде из клеток HeLa позволило
клонировать его кДНК [Neddermann etal., 1996].
Ген TDG человека расположен на хромосоме 12
в районе 12q24.1 [Schmutte etal., 1997]. Синтези-
руется единственная изоформа мРНК и белка —
полипептид длиной 410 а.к.о.
Фермент TDG проявляет активность по от-
ношению к очень ограниченному’ ряду’ субстра-
тов, и к тому’ же строго специфичен к неканони-
ческим парам, не выщепляя Thy или Ura из од-
ноцепочечной ДНК. На активность фермента до
некоторой степени влияет контекст [Sibghat-Ullah,
Day, 1995; Sibghat-Ullah etal., 1996]. В частности,
оказалось, что значение имеет природа основа-
ния с 5'-стороны от звена G в комплементарной
цепи: Thy выщепляется из пар Thy:Gua почти на
порядок быстрее, если в комплементарной цепи
присутствует последовательность CpG по срав-
нению с TpG, GpG и ApG, чего и следовало ожи-
дать для специфичной репарации продуктов дез-
аминирования в CG-островках. Еще эффектив-
нее, чем основания Thy, фермент TDG выщепля-
ет основания Ura из пар Ura:Gua, которые обра-
зуются при дезаминировании неметилированно-
го Cyt в ДНК [Neddermann, Jiricny, 1994]. Фер-
мент достаточно толерантен к модификациям ос-
нования Gua в паре [Sibghat-Ullah, Day, 1995;
Sibghat-Ullah et al., 1996]. Помимо Thy и Ura, фер-
мент TDG эффективно выщепляет из пар с Gua
3,/V4-этеноцитозин (sCyt) — основание, образую-
щееся при повреждении ДНК продуктами пере-
кисного окисления липидов [Saparbaev, Laval,
1998]. Фермент TDG очень сильно ингибируется
АР-продуктом реакции и стиму’лируется АР-эн-
донуклеазой [Waters et al., 1999; Hardeland et al.,
2002] и ферментом DNMT3a [Li et al., 2007].
Вторая ДНК-гликозилаза, участвующая в ре-
парации пар Thy:Gua, MBD4, была идентифици-
рована в ходе поиска полипептидов, содержа-
щих метилсвязывающий домен (methyl-binding
domain, MBD) и способных связывать ДНК с
большим количеством метилированных CpG-
сайтов [Hendrich, Bird, 1998]. Независимо от это-
го, она была обнару’жена (под названием MED1)
при поиске белков человека, связывающихся с
фактором мисматч-репарации MLH1 в дрожже-
вой двухгибридной системе [Bellacosa et al.,
ГЛАВА 2 37
1999]. Белок встречается, по всей вероятности,
только у позвоночных. Ген MBD4 человека рас-
положен на хромосоме 3 в районе 3q21—q22
[Hendrich et al., 1999]. В состав гена входят во-
семь экзонов, синтезируются единственная мРНК
и полипептид длиной 580 а.к.о. Белок связыва-
ется с метилированной ДНК за счет MBD-до-
мена в N-концевой части. C-Конец белка содер-
жит отдельный домен, обладающий каталитиче-
ской активностью по отношению к Thy или Ura
напротив Gua и наиболее (хотя не абсолютно)
специфичный к этим неканоническим парам в
составе CpG-сайтов [Petronzelli etal., 2000].
MBD-Домен не требуется для катализа [Ibid].
Помимо своей основной активности, MBD4
удаляет Thy из пар с Об-метилгуанином [Cortelli-
по et al., 2003], тимингликоль из пар с Gua [Yoon
et al., 2003], 5-галогенопиримидины [Turner et al.,
2006] и проявляет слабую активность по отно-
шению к sCyt [Petronzelli et al., 2000]. Как и для
TDG. кинетика реакции, катализируемой фер-
ментом MBD4, отражает тесное связывание с
АР-продуктом [Petronzelli et al., 2000].
На возможное участие TDG в процессах ре-
гуляции экспрессии генов указывает то, что этот
белок был идентифицирован при поиске поли-
пептидов, взаимодействующих с рецептором ре-
тиноевой кислоты RAR и его гомологом RXR —
факторами транскрипции, которые связывают
различные изомеры ретиноевой кислоты и активи-
руют транскрипцию ряда генов [Um etal., 1998].
Дальнейшие исследования показали, что TDG
действительно связывается с этими рецепторами,
а также с эстрогеновым рецептором ERoc, и дейст-
вует при этом как коактиватор транскрипции [Um
et al., 1998; Chen et al., 2003]. Участие TOG в регу-
ляции экспрессии на уровне метилирования/деме-
тилирования ДНК и упаковки хроматина также
можно предположить из его физической ассоциа-
ции с гистонацетилазой СВР/рЗОО [Tini et al.,
2002] и метилтрансферазой DNMT3a [Ei etal.,
2007]. В эмбриональных мышиных фибробластах
TDG7 нарушены транскрипция, активируемая ре-
тиноевой кислотой, и привлечение СВР/рЗОО к
областям активной транскрипции [Cortellino et al.,
2011]. Белок MBD4 также задействован в регуля-
ции транскрипции: показано, что его комплекс
с корепрессором Sin3A и гистондеацетилазой
HDAC1 репрессирует транскрипцию, связываясь
с гиперметилированными участками в промоторах
гснов-онкосупрсссоров pie1141"40 и MLH1 [Kondo
etal., 2005].
Как видно, для того, чтобы ЭРО с участием
TOG или MBD4 могла служить эффективным
способом активного деметилирования, необхо-
димо наличие механизма активного дезаминиро-
вания т5С в составе CpG-сайтов. Сообщалось,
что в отсутствие доноров метильной группы дез-
аминирование может катализироваться самими
метилтрансферазами DNMT3a и DNMT3b [Meti-
vier et al., 2008], вероятно, по механизму с обра-
зованием ковалентного интермедиата фермент—
дигидропиримидин, который был показан для
бактериальной метилтрансферазы М.Л/рс/П [Shen
et al., 1992]. Однако данные последних лет одно-
значно указывают на то, что главным способом
активного дезаминирования ДНК в клетках выс-
ших эукариот служит действие ферментов-дез-
аминаз AID и АРОВЕС.
Основной функцией цитидиндезаминазы,
индуцируемой активацией (activation-induced
cytidine deaminase, AID), является инициация
процессов рекомбинации с переключением клас-
са и соматического гипсрмутагснсза в генах им-
муноглобулинов в В-лимфоцитах, стимулиро-
ванных в присутствии антигена [Petersen et al.,
2001; Yoshikawa etal., 2002] (см. разд. 2.3). AID
преимущественно дезаминирует Cyt до Ura в
консенсусном мотиве WRC (W = А или Т, R =
= пурин) in vitro, что совпадает со спектром ги-
пермутагенеза в генах иммуноглобулинов in vivo
[Pham et al., 2003]. Фермент AID также способен
превращать основания m5C в Thy [Morgan et al.,
2004].
Дезаминазы семейства APOBEC (apolipoprotein
В mRNA editing enzyme, catalytic polypeptide-
like) используют в качестве субстрата основания
Cyt как в ДНК, так и в РНК [Conticello, 2008;
Bransteitter etal., 2009]. На сегодня известно де-
вять ферментов АРОВЕС человека, большинство
из которых принимают участие в редактирова-
нии РНК и в защите клеток от вирусов. Практи-
чески все они могут дезаминировать Cyt до Ura в
ДНК in vitro, но пока только для АРОВЕС 1 по-
казана способность превращать основания т5С
в Thy [Morgan et al., 2004].
Существование полной системы деметилиро-
вания, состоящей из дезаминазы, Thy:Gua-rnn-
козилазы и аппарата репарации ДНК (рис. 2.2),
подтверждается рядом свидетельств. Помимо ро-
ли AID в генетических процессах в клетках им-
мунной системы, этот фермент важен для эпиге-
нетического репрограммирования. Так, AID тре-
буется в индуцированных плюрипотентных ство-
ловых клетках для деметилирования промоторов
и активации транскрипции генов oct 4 и ncinog,
необходимых для индукции плюрипотентного
состояния [Bhutani etal., 2010]. В мышиных эм-
38 ЭПИГЕНЕТИКА
Рис. 2.2. Схема возможных путей активного деметилирования ДНК с уча-
стием аппарата ЭРО.
Под действием дезаминаз AID или АРОВЕС основания т5С (1) переводятся в Thy (2)
в составе неканонических пар Thy:Gua. Под действием оксигеназ ТЕТ1, ТЕТ2 или
ТЕТЗ основания т5С могут окисляться по экзоциклической метильной группе до про-
изводных цитозиновой серии: hmCyt (3), fCyt (4) или caCyt (5). Эти производные в
свою очередь могут служить субстратами для дезаминаз AID или АРОВЕС, что при-
водит к появлению соответствующих им окисленных форм тиминовой серии: hmUra
(6), fUra (7) или caUra (8). При удалении ДНК-гликозилазами TDG, MBD4, SMUG1 или
NEIL1 оснований Thy, окисленных производных т5С или окисленных—дезаминиро-
ванных производных т5С в ДНК возникает АР-сайт (9), который далее процессиру-
ется по пути ЭРО.
брионах (Е)13.5 спсГ уровень метилирования
в геноме в целом примерно в 3 раза выше, чем
в эмбрионах этой же стадии мышей дикого типа
[Popp et al., 2010]. Интересно, что у мышей гены
aid и apobecl располагаются в так называемом
кластере плюрипотентности — участке хромо-
сомы VI размером в 200 т.п.н., в котором нахо-
дятся гены nanog, dppa3 и gdf3, участвующие
в поддержании клеток в плюрипотентном или
стволовом состоянии, при этом регуляция всех
этих пяти генов осуществляется синхронно
[Morgan et al., 2004].
В ходе скрининга дефектов эмбрионального
развития, вызванных малыми интерферирую-
щими РНК, было выяснено, что деметилирова-
ние генома Darrio rerio требует участия дезами-
наз AID или АРОВЕС2, ДНК-гликозилазы MBD4
и вспомогательного белка репарации GADD45,
причем непосредственно показано образование
пар Thy:Gua в этом процессе [Rai etal.. 2008].
Наиболее убедительные доказательства функ-
ционального взаимодействия AID и Thy:Gua-гли-
козилазы были получены при попытке выведе-
ния мышей-нокаутов по гену tdg. У гомозигот
tdg~'~ наблюдалась эмбриональная летальность
на стадии (Е)11.5 с множественными дефектами
органогенеза и гиперметилированием CpG-сай-
тов [Cortellino et al., 2011]. Введение в геном tdg4 -
ГЛАВА 2 39
конструкции, кодирующей каталитически неак-
тивный фермент TDG, не устраняет этот фено-
тип. Более того, показано, что AID, TDG и
GADD45 образуют комплекс, детектируемый
коиммунопрсципитацисй [Ibid]. Белок MBD4
у млекопитающих, скорее всего, играет второ-
степенную роль в активном деметилировании,
поскольку мыши с инактивированным геном
mbd4 жизнеспособны, фертильны и не содержат
аномальных паттернов метилирования, хотя и
склонны к развитию опухолей [Millar et al., 2002;
Wong et al., 2002].
Безусловно, в предлагаемом механизме ак-
тивного деметилирования путем дезаминирова-
ния ферментом AID и репарации ферментами
TDG/MBD4 остаются неясные места, связанные
прежде всего с неоптимальностью CpG-сайтов
как субстратов для дезаминаз. Во-первых, CpG-
мотив не совпадает с консенсусным WRC-moth-
вом AID. Во-вторых, AID преимущественно дез-
аминирует одноцепочечную ДНК и эффективно
функционирует только в активно транскриби-
руемых генах, где она временно образуется в
комплексе с РНК-полимеразой [Chaudhuri etal.,
2003], в то время как т5С ассоциирован со сни-
женным уровнем транскрипции. В-третьих, эф-
фективность ферментативного дезаминирования
пГС гораздо ниже, чем эффективность дезамини-
рования Cyt. Однако вполне возможно, что взаи-
модействие с другими клеточными белками мо-
жет приводить к значительному повышению эф-
фективности действия AID и АРОВЕС.
2.2.3. Деметилирование, инициированное
окислением 5-метилцитозина
Помимо дезаминирования, удаление ш5С из
ДНК, как для поддержки стабильности генома,
так и в целях регуляции метилирования, может
инициироваться и другими химическими пре-
вращениями этого основания. В частности, 5-ме-
тильная группа тэС может подвергаться окис-
лению в реакциях, аналогичных реакциям окис-
ления 5-метильной группы Thy, которые дают
ряд хорошо изученных продуктов: 5-гидрокси-
мстилурацил (hmUra), 5-формилурацил (fUra) и
5-карбоксиурацил (caUra) [von Sonntag, 2006].
В случае окисления ш5С этой серии соответст-
вуют 5-гидроксиметилцитозин (hmCyt), 5-фор-
милцитозин (fC y t) и 5-карбоксицитозин (caCyt)
(см. рис. 2.2). Параллельно с окислением 5-ме-
тильной группы т5С может подвергаться дез-
аминированию, приводящему' к продуктам серии
Ura. Все эти реакции достаточно эффективно
протекают при повреждении ДНК активными
формами кислорода, образующимися при радио-
лизе воды [von Sonntag, Schuchmann, 1986; von
Sonntag, 2006].
В последние годы были открыты ферменты,
катализирующие окисление т5С в ДНК по 5-ме-
тильной группе. Первым из них стал белок ТЕТ1
(ten-eleven translocation partner 1), изначально
описанный как продукт гена, с которым сливает-
ся ген MLL при транслокации t(10;ll)(q22;q23),
обнаруживаемой у некоторых пациентов с ост-
рой миелоидной лейкемией [Ono etal., 2002].
Гомология ТЕТ1 с белками трипаносом, окис-
ляющими 5-метильную группу Thy, привела к
открытию того, что ТЕТ1 млекопитающих явля-
ется 2-кетоглутарат/Ее(П)-зависимой оксигена-
зой, способной катализировать превращение ш5С
в hmCyt [Tahiliani et al., 2009; Ito et al., 2010]. Эта
же активность была показана для гомологичных
ТЕТ1 белков ТЕТ2 и ТЕТЗ [Ito et al., 2010]. Реак-
ция может не останавливаться на стадии гидро-
ксиметильного производного: все белки ТЕТ спо-
собны окислять ш5С до fCyt и caCyt [Ito et al.,
2011; He etal., 2011]. Более того, было показа-
но, что дезаминазы AID, АРОВЕС 1, АРОВЕС2,
АРОВЕСЗА, АРОВЕСЗС и АРОВЕСЗЕ способны
in vivo катализировать дезаминирование hmCyt до
hmUra [Guo et al., 2011]. Таким образом, при су-
ществовании ДНК-гликозилаз, удаляющих осно-
вания hmCyt. hmUra и другие продукты окисле-
ния т5С или Thy по 5-метильной группе, воз-
можна инициация активного деметилирования
ферментами ТЕТ либо самостоятельно, либо с
привлечением дезаминаз (см. рис. 2.2).
Монофункциональная ДНК-гликозилаза, уда-
ляющая основания hmUra, была описана в клет-
ках плазмацитомы мышей, а ДНК-гликозилаза,
удаляющая hmCyt, — в тимусе теленка еще в
1980-хгг. [Hollstein etal.. 1984; Cannon etal..
1988; Cannon-Carlson etal., 1989], однако иден-
тификация этих активностей до сих пор неодно-
значна. Вскоре после этого Дж. Тибор с соавто-
рами на основании сравнения распространенно-
сти hmUra-ДНК-гликозилазы и систем метили-
рования ДНК в живой природе выдвину’л пред-
положение, что этот фермент может выполнять
какие-то специфические для клеток высших эу-
кариот функции, возможно, связанные не с ре-
парацией повреждений ДНК, возникших под
действием внешних факторов, а с регуляцией
метилирования Cyt [Boorstein et al., 1987; Boors-
tein et al., 1989]. Активность, удаляющая hmUra
из пар c Gua, в клетках человека примерно в
60 раз выше активности, удаляющей hmUra из
40 ЭПИГЕНЕТИКА
пар с Ade, что свидетельствует о более эффек-
тивной репарации hmUra, если это основание
возникает по пути окисления—дезаминирования
т5С, а не по пути окисления Thy [Rusmintratip,
Sowers, 20001. При исследовании высокоочи-
щенных препаратов рекомбинантных ДНК-гли-
козилаз активность, удаляющая hmUra из ДНК,
была описана для SMUG1, NEIU1, TDG и MBD4
[Boorstein etal., 2001; Zhang etal., 2005;
Cortellino etal., 2011]. Известные ДНК-гликози-
лазы человека, по-видимому, не способны вы-
щеплять из ДНК основания hmCyt (И. Грин, не-
опубликованные данные). Что касается продук-
тов более глубокого окисления или окисления—
дезаминирования т5С, то показана способность
TDG удалять из ДНК основания fCyt и саСу t [Не
etal., 2011; Maiti, Drohat, 2011]. Многие ДНК-
гликозилазы способны выщеплять основания
fUra: TDG [Uiu et al., 2003], MBD4 [Ibid], SMUG1
[Matsubara et al., 2003, 2004], NEIU1 [Zhang et al.,
2005], NTHL1 [Miyabe et al., 2002], a caUra явля-
ется одним из субстратов SMUG1 [Darwanto
et al., 2009].
На сегодня остается открытым вопрос, явля-
ются ли hmCyt, hmUra и другие продукты фер-
ментативного процессинга т5С только коротко-
живущими интермедиатами активного демети-
лирования или они представляют собой моди-
фицированные основания, которые играют свою
особую роль в регуляции экспрессии генов. Су-
ществуют многочисленные свидетельства, гово-
рящие в пользу второй из этих возможностей по
крайней мере для hmCyt. В ДНК животных
hmCyt как минорное основание, уровень которо-
го сравним с уровнем т5С, впервые был описан
40 лет назад в препаратах из мозга и печени
крысы [Penn etal., 1972]. С использованием не-
скольких независимых аналитических методов
(тонкослойная хроматография, высокоэффектив-
ная жидкостная хроматография, хромато-масс-
спектрометрия, иммунопреципитация, конъюга-
ция с радиоактивно меченой глюкозой специфи-
ческими глюкозилтрансферазами, высокоспеци-
фические химические реагенты) наличие hmCyt
на уровне 0,2—1 % было подтверждено как в
стволовых клетках разной степени дифференци-
ровки, так и в эмбриональных фибробластах и
дифференцированных клетках головного мозга,
почек, печени и ряда других тканей [Kriaucionis,
Heintz, 2009; Szwagierczak et al., 2010; Iqbal et al.,
2011; Jin et al., 2011; Koh et al., 2011; Pastor et al.,
2011; Song et al., 2011]. Уровень hmCyt в клеточ-
ной ДНК коррелирует с уровнем экспрессии ге-
нов ТЕТ [Ко et al., 2010; Szwagierczak et al., 2010;
Koh et al., 2011]. Наивысший уровень hmCyt ста-
бильно обнаруживается в ЦНС; с другой сторо-
ны, этого основания мало или оно не детектиру-
ется в клеточных линиях ракового происхожде-
ния [Kriaucionis, Heintz, 2009; Ко etal., 2010].
Показано, что 2-гидроксиглутарат, метаболит, ха-
рактерный для многих опухолей с мутациями ге-
нов IDH1 и IDH2, кодирующих соответственно
цитоплазматическую и митохондриальную фор-
мы изоцитратдегидрогеназы, сильно ингибирует
ферменты ТЕТ и приводит к снижению уровня
hmCyt в ДНК [Xu et al., 2011]. При репрограмми-
ровании отцовского генома в мышиной зиготе
после оплодотворения уровень т5С значительно
снижается, а уровень hmCyt, напротив, повыша-
ется [Iqbal et al., 2011; Wossidlo et al., 2011].
В отличие от hmCyt, в образцах ДНК из раз-
ных тканей взрослых мышей практически не об-
наруживается продуктов дальнейшего окисления
или окисления—дезаминирования [Globisch et al.,
2010], хотя сообщалось об обнаружении неболь-
ших количеств fCyt и caCyt в ДНК ранних эмб-
рионов и эмбриональных стволовых клеток мы-
ши [Inoue etal., 2011; Pfaffeneder etal., 2011].
Возможно, в то время как hmCyt является ста-
бильной эпигенетической модификацией ДНК,
продукты его дальнейшего процессинга сущест-
вуют только короткое время в ходе активного
деметилирования и не накапливаются в /ТНК на
детектируемом уровне.
Влияние hmCyt и других окисленных произ-
водных т5С на экспрессию генов в настоящее
время является предметом активного изучения.
В отличие от т5С, который обычно связан с по-
давлением транскрипции, наблюдается положи-
тельная корреляция между’ содержанием hmCyt в
генах и уровнем их экспрессии в эмбриональных
стволовых клетках и в мозге мыши и человека
[Ficz et al., 2011; Jin et al., 2011]. Это согласуется
с тем, что окисление т5С до hmCyt приводит
к ингибированию связывания MBD-домена бел-
ка — регулятора транскрипции МеСР2 с метили-
рованной и полуметилированной ДНК [Valinluck
et al., 2004], а также к ингибированию метилиро-
вания Cyt в противоположной цепи ферментом
DNMT1 [Valinluck, Sowers, 2007]. С другой сто-
роны, белок MBD3 преимущественно связывает
CpG-динуклеотиды, содержащие hmCyt, и регу-
лирует активность некоторых факторов ремоде-
лирования хроматина [Yildirim etal., 2011]. Ме-
тилирование Cyt стабилизирует спираль ДНК, а
окисление т5С до hmCyt, напротив, снижает ее
стабильность, что может способствовать более
легкому’ раскрытию /ТНК в комплексах актива-
ГЛАВА 2 41
ции транскрипции [Thalhammer et al., 2011]. Од-
нако для генов, репрессируемых белками группы
Polycomb, присутствие hmCyt, напротив, корре-
лирует с пониженным уровнем экспрессии [Wu
et al., 2011а. bj.
Структур ДНК с hmCyt на сегодня не извест-
но. hmUra образует канонические уотсон-кри-
ковские связи с Ade и связи уоббл-типа с Gua
[Mellac etal., 1993]. рК, атома N3 основания
hmUra снижено по сравнению с Thy, что приво-
дит к наличию минорного С4-енольного тауто-
мера, образующего связи уотсон-криковского
типа с Gua. С 5-Гидроксильная группа hmUra
служит донором водородной связи и может об-
разовывать ее с атомом N7 пуриновых основа-
ний, соседних с поврежденным звеном, искажая
таким образом картину’ водородных связей в
большой бороздке и потенциально влияя на уз-
навание последовательностей ДНК белками [Mel-
lac etal., 1993; Pastemack etal., 1996]; такой пат-
терн образования водородных связей может
ожидаться и для hmCyt. Из продуктов дальней-
шего окисления т5С известны структуры ДНК,
содержащей пары fCyt:Gua (К. Kimura et al., не-
опубликованные данные, номер 1VE8 в базе дан-
ных PDB) и fUra:Ade [Tsunoda etal., 2001]. Ос-
нование fUra образует каноническую уотсон-
криковскую пару с Ade и привносит в большую
бороздку- акцептор водородной связи; fCyt, по-
мимо этого, обладает потенциалом к образова-
нию водородной связи между’ N4 и кислородом
формильной группы.
Необходимость поддержания продуктов окис-
ления—дезаминирования т5С на низком уровне
связана с их мутагенным потенциалом, как и для
любых продуктов дезаминирования оснований.
Основания hmUra и fUra в ДНК-матрице не бло-
кируют действие ДНК- и РНК-полимераз, и
hmUra может даже заменять Thy в геноме неко-
торых бактериофагов [Herrala, Vilpo, 1989; Zhang
et al., 1997, 1999], однако, напротив, fUra с низ-
кой эффективностью может включаться не толь-
ко dAMP, но и dGMP [Masaoka et al., 2001]. Ток-
сичность и мутагенность hmUra в клетках мле-
копитающих низка [Kaufman, 1986; Boorstein,
Teebor, 1988], однако его присутствие ведет к
индукции сестринских хроматидных обменов
[Kaufman, 1989], что свидетельствует о наруше-
нии механизмов поддержки стабильности генома.
На сегодня остается открытым вопрос, какие
функции выполняют отдельные белки ТЕТ в
функционировании системы активного демети-
лирования, инициируемого окислением. Мыши-
нокауты tet I жизнеспособны, фертильны и не
имеют ярко выраженного фенотипа [Dayvlaty
etal., 2011]. У мышей tet2 1 нарушена только
дифференцировка клеток кроветворной линии
[Ко etal., 2011; Li etal., 2011]. Пока наиболее
важным представляется белок ТЕТЗ: его дефи-
цит приводит к неспособности зиготы деметили-
ровать отцовский геном, что замедляет актива-
цию отцовских генов Oct4 и Nanog и приводит
к дефектам развития [Gu et al., 2011].
2.2.4. Специфичные 5-метилцитозин-
ДНК-гликозилазы растений
У растений обнаружен достаточно представи-
тельный набор ДНК-гликозилаз, встречающихся
в других царствах живого мира. Например, ге-
ном Arcibidopsis thaliana содержит последова-
тельности, гомологичные Ung, AlkA, Tag, Nth,
MutY, Fpg, MBD4, AAG и OGGI [The Arabidop-
sis..., 2000].
Помимо этих широко распространенных
ДНК-гликозилаз, в A. thaliana присутствуют два
фермента с ДНК-гликозилазными активностя-
ми, которые не имеют известных аналогов у жи-
вотных, грибов и прокариот. Эти ферменты,
DEMETER (DME) и REPRESSOR OF SILENCING 1
(ROS1), принимают участие в регуляции статуса
метилирования отдельных участков ДНК расте-
ний, от которого зависит импринтинг генов при
наследовании по отцовской или материнской
линии и сайленсинг или активация промоторов
отдельных генов в жизненном цикле растений
[Autran et al., 2005; Chan et al., 2005; Kapoor et al.,
2005]. Анализ метилирования ДНК в разных ор-
ганах и тканях A. thaliana показывает, что геном
в эндосперме практически полностью гипомети-
лирован, за исключением гиперметилирования
последовательностей 5'-СНН-3' (Н = А, С или Т)
в составе транспозонов [Hsieh et al., 20091.
Ген DME был изолирован в ходе скрининга
мутаций A. thaliana, влияющих на жизнеспособ-
ность семян при передаче по материнской, но не
по отцовской линии и эпистатических с генами
группы Polycomb (MEDEA (МЕА), FERTILIZATION
INDEPENDENT ENDOSPERM и FERTILIZATION
INDEPENDENT SEED 2) [Choi et al., 2002]. Жиз-
неспособность семян зависит от передачи аллеля
DME дикого типа по материнской линии. Ген
DME экспрессируется преимущественно в цент-
ральной клетке женского гаметофита, которая
дает начало эндосперму’. От наличия продукта
гена DME зависит экспрессия импринтирован-
ной материнской копии МЕА в центральной
клетке и в эндосперме, а эктопическая экспрес-
42 ЭПИГЕНЕТИКА
сия DME активирует экспрессию в норме ре-
прессированной отцовской копии МЕА [Choi
etal., 2002]. Помимо этого, продукт гена DME
регулирует в эндосперме активность промоторов
материнских копий таких генов, как ELOWERING
WAGENINGEN (FWA), необходимого для нор-
мального развития цветков [Kinoshita et al., 2004],
MATERNALLY EXPRESSED РАВ C-TERMINAL
(MPC), кодирующего ро1у(А)-связывающий бе-
лок [Tiwari et al., 2008], и AGAMOUS-LIKE 36
(AGL36), отвечающего за поддержку экспрессии
многих генов при наличии отцовского генома
[Shirzadi et al., 2011]. Анализ транскриптома рас-
тений дикого типа и мутантов dme показывает,
что всего под контролем ДНК-гликозилазы DME
находится -100 генов [Ohr et al., 2007]. Ген DME
экспрессируется также в вегетативных, но не в
половых клетках мужского гаметофита, где он
регулирует метилирование МЕА, FWA и транс-
позонов (в частности, Mula) и необходим для
нормального прорастания пыльцы [Schoft et al.,
2011].
Ген DME кодирует полипептидный продукт
размером 1729а.к.о., несущий сигнал ядерной
локализации и участок гомологии с гистоном Н1
и содержащий несколько элементов, характер-
ных для ДНК-гликозилаз семейства Nth, в том
числе мотив HhH, GPD-петлю с каталитической
диадой Lys—Asp, и FeS-кластер. Эктопическая
экспрессия DME в листьях приводит к активации
в них гена МЕА и к появлению одноцепочечных
разрывов в премоторной области этого гена
[Choi et al., 2002]. При эктопической экспрессии
ген DME дикого типа супрессирует мутантный
материнский аллель и активирует экспрессию
материнской копии МЕА, в то время как ген
DME с мутацией D1304N, приводящей к замене
остатка Asp каталитической диады, этого делать
не способен [Choi et al., 2004]. Поиск мутаций-
супрессоров dme выявил, что импринтинг гена
МЕА индуцируется продуктом гена МЕТ1, обла-
дающим ДНК-метилтрансферазной активностью,
и снимается продуктом гена DME [Xiao etal.,
2003]. Мутации в гене DME увеличивают гло-
бальное метилирование генома эндосперма по
динуклсотидам 5'-CG-3' до уровня остальных
тканей [Hsieh et al., 2009].
Клонирован в Е. coli и выделен рекомбинант-
ный полноразмерный белок DME с гексагисти-
диновым пептидом [Morales-Ruiz et al., 2006], а
также химерный белок, в котором С-концевой
участок DME слит с мальтозосвязывающим бел-
ком (maltose-binding jjrotein, МБР) [Gehring et al.,
2006]. Оба они выщепляют из дцОДН-субст-
ратов основания т5С и Thy (но не Ura), находя-
щиеся напротив Gua, обладают АР-лиазной ак-
тивностью по механизму’ Р- и отчасти р,6-эли-
минирования и способны пришиваться к субст-
рату под действием NaBH4 [Gehring et al., 2006;
Morales-Ruiz et al., 2006]. При этом после расще-
пления одной цепи ДНК активность фермента по
отношению к остатку ш5С в противоположной
цепи подавляется [Gehring etal., 2006]. С ис-
пользованием сайт-направленного мутагенеза
показано, что для проявления пГС-гликозилаз-
ной активности необходимо наличие функцио-
нальных мотивов HhH и FeS-кластера, а также
двух консервативных доменов вне участка гомо-
логии с ДНК-гликозилазами суперсемейства Nth
[Mok etal., 2010]. Экспрессия химерного гена
МВР—DME токсична для Е. coli дикого типа, но
не для изогенных штаммов dem, в ДНК которых
нет оснований m5C [Gehring et al., 2006].
В геноме A. thaliana также присутствуют два
гомолога гена DME — DME-like (DML) 2 и DML3,
которые, в отличие от DME. широко экспресси-
руются в разных органах и тканях. ДНК-глико-
зилазный домен в них сохраняется, и для белков
DML2 и DML3 была показана способность уда-
лять из олигонуклеотидных субстратов основа-
ния ш5С и Thy (из пар Т: G) [Penterman et al.,
2007; Ortega-Galisteo etal., 2008]. Мутации по
генам DML2 и DML3 ведут к изменению уровня
метилирования многих сайтов в геноме A. tha-
liana, однако это изменение разнонаправлено:
некоторые гипометилированные сайты в расте-
ниях dml2 и dml3 становятся гиперметилирован-
ными, а некоторые гиперметилированные сай-
ты — гипометилированными [Ibid].
Ген ROS1 был выявлен в ходе поиска мута-
ций A. thaliana, способных индуцировать транс-
крипционный сайленсинг трансгенов под управ-
лением промотора RD29A. который в норме конт-
ролирует ответ растений на некоторые гормоны
и стресс, связанный с засухой, соленостью и
низкой температурой [Gong etal., 2002]. В му-
тантных растениях rosl инактивированы и эндо-
генные промоторы RD29A, а также некоторые
друтие промоторы, в частности, промотор 35S
вируса мозаики цветной капусты. Сайленсинг
связан с индуцированным малыми РНК гипер-
метилированием премоторных участков и сни-
мается как при использовании ингибитора мети-
лирования 5-аза-2'-дезоксицитидина, так и в рас-
тениях с мутированным геном DECREASED
DNA METHYLATION 1 (DDM1), продукт которо-
го активирует метилирование ДНК. Бисульфит-
нос секвенирование показывает, что в растениях
ГЛАВА 2 43
rosl сохраняется нормальное метилирование по-
следовательностей 5'-CG-3', но резко повышено
метилирование последовательностей 5'-CHG-3'
и 5'-СНН-3' в премоторных областях, что ин-
дуцирует транскрипционный сайленсинг [Zhu
et al., 2007].
Ген ROS1 был клонирован [Gong et al., 2002].
Оказалось, что, подобно гену’ DME, он коди-
рует полипептидный продукт большого размера
(1393 а.к.о.) с доменом, гомологичным ДНК-
гликозилазам семейства Nth. Химерный белок
MBP-ROS1 способен расщеплять суперскручен-
ную плазмидную ДНК, метилированную мети-
лазой Mspi., которая модифицирует 5'-концевые
остатки С в последовательности 5'-CCGG-3', но
не расщеплял неметилированную плазмиду’ или
плазмиду, метилированную метилазой &у1, пе-
реносящей метильные группы на остатки С в по-
следовательности 5'-CG-3' [Gong etal., 2002].
При анализе с использованием дцОДН-субстра-
тов специфичность и механизм действия химер-
ного белка |Agius et al.. 2006] и рекомбинантного
полноразмерного ROS1 практически совпадает
с упомянутой выше специфичностью фермента
DME [Morales-Ruiz et al., 2006], однако при этом,
в отличие от плазмидных субстратов, пред-
почтительным является субстрат 5'-meCG-3', а не
5'-meCCGG-3'. Мутантные растения rosl облада-
ют повышенной чувствительностью к MMS
и Н2О2 [Gong et al., 2002], что свидетельствует
о возможной роли фермента ROS1 не только в
регуляции транскрипции, но и в репарации ДНК.
Показано также, что белок ROS 1 взаимодейству-
ет in vitro и in vivo с субъединицей фактора реп-
ликации A RPA2 [Kapoor et al., 2005], который
связывает одноцепочечную ДНК и участвует в
репликации и репарации. Мутации в гене RPA2
снимают сайленсинг промотора 35S (но не про-
мотора RD29A) в растениях rosl. не изменяя при
этом статуса его метилирования, а также сооб-
щают растениям повышенную чувствительность
KMMS[Ibid].
В целом, существующие данные указывают
на то, что ДНК-гликозилазы DME и ROS 1 мож-
но рассматривать как аналоги ДНК-гликозилазы
животных MBD4, которые приобрели дополни-
тельную важную функцию — способность уда-
лять из ДНК остатки ш5С и таким образом при-
нимать непосредственное участие в регуляции
активности некоторых генов растений.
Помимо генов ДНК-гликозилаз, материнский
эффект в эндосперме A. thalicinci наблюдается
для гена DNA LIGASE I (LIG1), белковый про-
дукт которого действует на завершающей стадии
пути ЭРО у растений [Andreuzza et al., 2010]. Не-
смотря на то, что LIG1 экспрессируется во всех
органах растения, материнский эффект ограни-
чен только теми тканями, в которых наблюдает-
ся экспрессия DME. Это свидетельствует о том.
что для корректного деметилирования ДНК у
растений необходим полностью функциональ-
ный процесс ЭРО.
2.3. Редактирование ДНК: направленное
ПОВРЕЖДЕНИЕ ДНК И СОМАТИЧЕСКИЙ
МУТАГЕНЕЗ КАК СПОСОБ КОНТРОЛЯ
АКТИВНОСТИ ГЕНОВ
Считается, что геном подавляющего большин-
ства соматических клеток многоклеточных орга-
низмов идентичен геному оплодотворенной зиго-
ты, из которой этот организм развился. Однако
есть ряд важных исключений, объединенных под
общим названием соматического мутагенеза, ко-
гда на пути от зиготы к соматической клетке в ге-
номе происходят изменения. На сегодня накоплен
огромный массив данных по соматическому’ му-
тагенезу в патологических процессах, связанных
прежде всего с канцерогенезом. Гораздо меньше
известно о соматическом мутагенезе как процес-
се, необходимом для нормального развития орга-
низма. У человека главный пример такого нор-
мального соматического мутагенеза дают собы-
тия, происходящие в клетках иммунной системы
при генерации разнообразия генов иммуноглобу-
линов и Т-клеточных рецепторов.
Недавно была открыта новая роль фермента
UNG в функционировании иммунной системы
позвоночных. В процессе генерации широкого
репертуара антител в генах иммуноглобулинов
(Ig) происходят генная конверсия, рекомбинация
с переключением класса (РПК) и соматический
гипермутагенез (СГМ). которые направлены на
повышение разнообразия антител. Все эти про-
цессы зависят от фермента AID [Neuberger et al.,
2003], который превращает основания Cyl в ге-
нах Ig в Ura. Считается, что UNG выщепляет эти
основания Ura; получающиеся АР-сайты, не об-
разующие комплементарных пар, инициируют
СГМ, а дальнейшие репарационные процессы,
зависимые от нуклеазы MRE1I/RAD50 [Larson
et al., 2005], превращают АР-сайты в одноцепо-
чечные разрывы, которые инициируют рекомби-
нацию в процессах конверсии и РПК. Такая схе-
ма предложена на основе ряда свидетельств. У
мышей UNG - резко снижается РПК и изменяет-
ся спектр СГМ по парам Gua: Cyt, но не по парам
Ade:Thy [Rada et al., 2002]. Пациенты с инакти-
44 ЭПИГЕНЕТИКА
вирующими мутациями гена UNG страдают от
гипсриммуноглобулинсмии М и обнаруживают
дефекты в РПК и СГМ [Imai etal., 2003]. При
направленной инактивации гена UNG в клетках
Gallus gallus DT40 в них прекращается РПК и
изменяется спектр СГМ [Saribasak et al., 2006].
Гетерологичная экспрессия гена AID в клетках
дрожжей придает им гиперрекомбиногенный и
мутаторный фенотип, при этом спектр мутаций
зависит от наличия функционального дрожжево-
го белка Unglp [Poltoratsky etal., 2004; Mayorov
et al., 2005]. Мутагенный спектр, обусловленный
воздействием на ДНК чистого фермента AID in
vitro, воспроизводится in vivo при отсутствии
UNG [Larijani et al., 2005]. Мутации и одноцепо-
чечные разрывы в генах 1g совпадают с последо-
вательностями, предпочитаемыми ферментом
AID in vitro [Pham et al., 2003; Beale et al., 2004;
Schrader etal., 2005]. Экспрессия гена ugi бакте-
риофага PBS1, кодирующего ингибитор урацил-
ДНК-гликозилазы, в клеточной линии лимфомы
мышей подавляет РПК [Begum etal.. 2004]. Со-
вместная экспрессия генов AID и UNG индуци-
рует хромосомные транслокации, инициирован-
ные двуцепочечными разрывами [Ramiro et al.,
2006]. Наконец, Pol p-зависимая ЭРО в генах 1g
снижает уровень СГМ [Wu, Stavnezer, 2007].
Урацил-ДНК-гликозилазная активность в AID-
зависимом пути, вероятно, определяется только
от UNG. поскольку РПК и СГМ у мышей MBD4
не затронут [Bardwell et al., 2003], а белок
SMUG1 в В-лимфоцитах синтезируется слабо и
инициирует корректную, а не мутагенную или
рекомбиногенную репарацию [Kavli et al., 2005;
Di Noia et al., 2006]. Однако AID-индуцирован-
ный СГМ не полностью зависит от UNG: мута-
ции также происходят в парах Ade:Thy по пути,
зависящему' от узнавания соседних с ними нека-
нонических пар Ura: Gua белками мисматч-репа-
рации MSH2 и MSH6 с последующей ошибоч-
ной репарацией с участием Pol г] [Lee et al., 2004;
Kavli etal., 2007]. У мышей UNG^ с возрастом
развиваются спонтанные В-клеточные лимфомы,
что указывает на особую роль UNG в иммунной
системе [Nilsen et al., 2003, 2005; Andersen et al.,
2005].
Следует указать, что помимо описанного ме-
ханизма существует альтернативная модель,
объясняющая роль AID в РПК и СГМ. Она осно-
вана на способности AID дезаминировать РНК и
постулирует редактирование ферментом AID по-
ка неизвестных мРНК, от продуктов которых за-
висит созревание генов Ig [Honjo etal., 2004].
Хотя приведенные выше свидетельства согласу-
ются с механизмом дезаминирования ДНК, а не
РНК, в литературе есть данные, не вписываю-
щиеся в модель дезаминирования ДНК. Напри-
мер, для протекания AID-зависимой РПК нужен
синтез белка de novo [Begum etal., 2004]. Зави-
симость от каталитически активного UNG также
неоднозначна: восстановление РПК в клетках
UNG^ ферментом UNG с инактивирующими
мутациями позволило предположить, что UNG
скорее играет в РПК роль структурного белка
[Ibid], хотя в этом случае низкая остаточная ак-
тивность мутантных форм UNG могла оказаться
достаточной для протекания РПК [Stivers, 2004].
Двуцепочечные разрывы при РПК могут возни-
кать в процессах, не требующих участия AID и
UNG, поскольку’ их спектр не изменяется при
нокаутировании AID [Bross, Jacobs, 2003] и UNG
[Begum et al., 2007] или при экспрессии гена tigi
[Begum etal., 2004]. Таким образом, вопрос о
роли UNG в генерации иммунного разнообразия
пока нельзя считать закрытым.
В принципе, не исключена возможность уча-
стия в РПК и СГМ и других ДНК-гликозилаз.
Например, гены OGG1 и MPG активно экспрес-
сируются в созревающих В-лимфоцитах, и соот-
ветствующие ДНК-гликозилазы могли бы участ-
вовать в инициации этих процессов [Kuo, Sklar,
1997; Longerich et al., 2007]. Однако изменений
спектра РПК и СГМ у мышей oggU и mpg -
обнаружено не было [Winter et al., 2003; Lon-
gerich et al., 2007].
Учитывая то, что РПК и СГМ инициируются
дезаминированием, интересным представляется
вопрос, как именно эти процессы ограничивают-
ся лишь соответствующими областями генов им-
муноглобулинов и насколько они могут влиять
на состояние метилирования генома В-лимфо-
цитов. При созревании В-лимфоцитов в герми-
нальных центрах происходит значительное из-
менение паттерна метилирования ДНК, затраги-
вающее несколько сотен генов. При этом снижа-
ется метилирование в целом и в особенности ме-
тилирование по консенсусным сайтам связыва-
ния AID [Shaknovich et al., 2011]. Для локуса, ко-
дирующего легкие цепи к-типа, показано, что
гипометилирование ассоциируется с повышен-
ным уровнем СГМ [Fraenkel et al., 2007]. Экс-
прессия гена DNMT1 в созревающих В-лимфо-
цитах повышена, а ее искусственное снижение
или ингибирование фермента DNMT1 децитаби-
ном приводит к подавлению образования герми-
нальных центров и накоплению разрывов в ДНК
В-лимфоцитов [Shaknovich etal., 20111. Показа-
но, что в ходе РПК AID образует комплексы
ГЛАВА 2 45
с белками КАР1 и НР1, которые, в свою очередь,
узнают триметилированный вариант гистона
НЗК9теЗ, связанный с донорным участком
рекомбинации, где должен произойти разрыв
[Jeevan-Raj etal., 2011]. Однако в случае СГМ
этот механизм не действует.
Соматический гипсрмутагснсз в В-лимфоци-
тах — наиболее изученный, но не единственный
пример соматического мутагенеза, который мо-
жет действовать при дифференцировке клеток.
Например, полногеномный скрининг мобильных
элементов LI, Alu и SVA выявил, что при разви-
тии мозга человека происходит мобилизация
ретротранспозонов, которые преимущественно
встраиваются в области, богатые генами, по-раз-
ному экспрессирующимися в разных отделах
мозга [Baillie etal., 2011]. Подобные события
могут влиять на активность генов как за счет
внедрения регуляторных элементов поблизости
от них, так и за счет изменения организации
хроматина [Foerster etal., 2011]. Хорошо извес-
тен феномен диминуции хроматина — утери
части генетического материала в ходе развития,
характерный для некоторых беспозвоночных
(напр., циклопы и нематоды) и примитивных по-
звоночных (миксины), но у человека не наблю-
дающийся [Kloc, Zagrodzinska, 2001; Гришанин
et al., 2006].
2.4. Динамическая химическая структура
ДНК и регуляция активности генов:
ПРОБЛЕМЫ И ПЕРСПЕКТИВЫ
В последние несколько десятков лет первона-
чальные представления о ДНК как о стабильной
структуре, состоящей исключительно из четырех
канонических нуклеотидов, претерпело значи-
тельные изменения. Оценки скорости спонтан-
ного повреждения ДНК показали, что в ней по-
стоянно возникают поврежденные звенья разных
типов, которые активно удаляются в процессе
репарации. Открытие модифицированных осно-
ваний, принимающих участие в регуляции экс-
прессии генов, и того факта, что некоторые из
них идентичны основаниям, которые обычно
рассматриваются как поврежденные и нуждаю-
щиеся в репарации, привело к возникновению
взгляда на ДНК как на химически лабильную
структуру, находящуюся в динамически ста-
бильном состоянии, когда ее звенья постоянно
модифицируются и вновь возвращаются к обыч-
ному’ виду’. Возможность взаимодействия моди-
фицированной ДНК с разными белками, а также
стабилизации или дестабилизации отклонений
от канонической химической структуры ДНК
при таком взаимодействии потенциально дает
мощный и гибкий способ регуляции многих ас-
пектов функционирования ДНК, в том числе
экспрессии генов.
Один из наиболее интересных и малоизучен-
ных вопросов, касающихся регуляции активно-
сти генов за счет ковалентной модификации
ДНК, связан с возможностью существования
других, не известных еще эпигенетических мо-
дификаций или участия известных типов повре-
жденных звеньев ДНК в эпигенетической регу-
ляции. Например, недавно было достаточно не-
ожиданно обнаружено, что 8-оксогуанин, одно
из самых распространенных окисленных осно-
ваний ДНК, служит ключевым элементом акти-
вации генов факторами транскрипции ERoc [Ре-
rillo etal., 2008] и с-Мус [Amente etal., 2010].
В обоих случаях факторы транскрипции связы-
ваются с сайтами-мишенями и привлекают де-
метилазу’ гистонов LSD1, которая в ходе окис-
лительного деметилирования форм гистонов
НЗК4ше2 и НЗК9ше2 производит Н2О2 в качест-
ве одного из продуктов. Н2О2 немедленно окис-
ляет основания Gua в непосредственной близо-
сти от места своего возникновения. Получив-
шиеся основания 8-оксогуанина удаляются из
ДНК с участием гликозилазы OGG1 и АР-эндо-
нуклеазы АРЕХ1, и в ДНК возникают разрывы,
что в конечном итоге приводит, по не выяснен-
ному до конца механизму’, к локальной декон-
денсации хроматина и активации транскрипции.
Взаимосвязь между; репарацией ДНК и ее
эпигенетическим метилированием может прояв-
ляться и на другом уровне: при репарации по-
вреждений, соседствующих с CpG-сайтом, по
длиннозаплаточному' пути, т5С может удаляться
из ДНК. Насколько эффективно может затем
восстанавливаться статус метилирования CpG-
сайтов в отсутствие репликации и при наличии
репаративного синтеза ДНК, пока неизвестно.
Модификация химической структуры ДНК
обратима, пока работа систем репарации или ре-
пликации ДНК не привела к появлению на этом
месте канонической пары оснований, отличной от
первоначальной пары (например, к возникнове-
нию пары Т: А вместо С : G из-за дезаминирова-
ния 5-метилцитозина с после дующей репликаци-
ей). После этого можно говорить о возникнове-
нии соматической мутации. Имеющиеся данные
говорят о том, что такая необратимая модифика-
ция последовательности ДНК — составная часть
эпигенетической модификации в трактовке Уод-
дингтона— может, наряду' с обратимым измене-
46 ЭПИГЕНЕТИКА
нием химической структуры ДНК, играть важную
роль в процессах развития и дифференцировки.
Вполне возможно, что современные высокопро-
изводительные методы секвенирования, позво-
ляющие анализировать гетерогенность генома в
пределах одного организма и активно приме-
няющиеся сейчас в исследованиях канцерогенеза
[Meyerson etal., 2010], позволят выявить новые
процессы, в которых соматический мутагенез иг-
рает не патологическую, а нормальную роль.
Работа поддержана программой «Молекуляр-
ная и клеточная биология» Президиума РАН
(грант 6.14), Российским фондом фундаменталь-
ных исследований (11-04-00807-а) и грантом Пре-
зидента РФ для молодых кандидатов наук (МК-
2703.2011.4, И. Р. Грин).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Гришанин А. К., Шеховцов А. К., Бойкова Т. В., Акифьев А. Н,
Жимулев 11. Ф. Проблема диминуции хроматина на
рубеже XX и XXI веков И Цитология. 2006. Т. 48.
С. 379—397.
ЖарковД. О. Структура и конформационная динамика глико-
зилаз эксцизионной репарации оснований ДНК// Моле-
ку.ияр. биология. 2007. Т. 41. С. 772—786.
Королев В. Г. Эксцизионная репарация поврежденных ос-
нований ДНК: АП-эндонуклеазы и ДНК-полимеразы //
Генетика. 2005а. Т. 41. С’ 1301—1309.
Королев В. Г. Эксцизионная репарация поврежденных ос-
нований ДНК: ДНК-гликозилазы // Генетика. 20056.
Т. 41. С. 725—735.
Сидоренко В. С., Жарков Д. О. Роль гликозилаз эксцизион-
ной репарации оснований ДНК в патогенезе наследст-
венных и инфекционных заболеваний человека И Мо-
лекуляр. биология. 2008. Т. 42. С. 891—903.
AgiusF, Kapoor A., ZhuJ.-K Role of the Arabidopsis DNA
glycosylase/lyase ROS1 in active DNA demethylation 11
Proc. Natl Acad. Sei. USA. 2006. Vol. 103. P. 11796—
11801.
Amente S., Bertoui A., Morano A., Lania L., Awedimento E. J’.,
Alajello B. LSDl-mediated demethylation of histone H3
lysine 4 triggers Myc-induced transcription // Oncogene.
2010. Vol. 29. P. 3691—3702.
Andersen S., Ericsson AL, DaiH.Y., Bena-Diaz J., Sluppha-
ugG., Nilsen H, AarsetH, Krokan H. E. Monoclonal
В-cell hyperplasia and leukocyte imbalance precede de-
velopment of В-cell malignancies in uracil-DNA gly-
cosylase deficient mice // DNA Repair. 2005. Vol. 4.
P. 1432 1441.
Andreuzza S., Li J.. Guitton A.-E.. Faure J.-E., CasanovaS.,
Park J.-S., ChoiY., ChenZ., Berger F. DNA LIGASE I
exerts a maternal effect on seed development in Arabidop-
sis thaliana 11 Development. 2010. Vol. 137. P. 73—81.
AutranD., Huanca-AIamani IE, J’ielle-Calzada J.-P. Genomic
imprinting in plants: The epigenetic version of an Oedipus
complex // Curr. Opin. Plant Biol. 2005. Vol. 8. P. 19—25.
Baillie J. K., Barnett AL JJ’., Upton K. R., Gerhardt D. J., Rich-
mond T. A., De SapioF., Brennan P. AL, RizzuP., SmithS.,
Fell AL., Talbot R. T, Gustincich S.. Freeman T. C, ALat-
tickJ.S., HumeD. A., HeutinkP., CarninciP., Jedde-
lohJ.A., Faulkner G. J. Somatic retrotransposition alters
the genetic landscape of the human brain 7 Nature. 2011.
Vol. 479. P. 534—537.
Bardwell P. D., ALartinA., JJ’ongE., Li Z., Edelmann JJ’.,
Scharff Al. D. The G-U mismatch glycosylase methyl-CpG
binding domain 4 is dispensable for somatic hypermuta-
tion and class switch recombination // J. Immunol. 2003.
Vol. 170. P. 1620- 1624.
BealeR.C.L., Petersen-AIahrtS. K.. JJ’attl.N., HarrisRS.,
Rada C, Neuberger Al. S. Comparison of the differential
context-dependence of DNA deamination by АРОВЕС en-
zymes: Correlation with mutation spectra in vivo 11 J. Mol.
Biol. 2004. Vol. 337. P. 585—596.
Begum N. A., Kinoshita K., Kakazu N, Aluramatsu AL, Na-
gaoka H., Shinkura R, Biniszkiewicz D., Boyer L. A., Jae-
nisch R, Honjo T. Uracil DNA glycosylase activity is dis-
pensable for immunoglobulin class switch " Science.
2004a. Vol. 305. P. 1160—1163.
Begum N. A., Kinoshita K., Aluramatsu AL, Nagaoka H., Shin-
kura R., Honjo T. De novo protein synthesis is required for
activation-induced cytidine deaminase-dependent DNA
cleavage in immunoglobulin class switch recombination //
Proc. Natl Acad. Sei. USA. 2004b. Vol. 101. P. 13003—
13007.
Begum N. A., Lzumi N., Nishikori AL, Nagaoka H, Shinkura R,
Honjo T. Requirement of non-canonical activity' of uracil
DNA glycosylase for class switch recombination // J. Biol.
Chem. 2007.’Vol. 282. P. 731—742.
BellacosaA., CicchillittiL., SchepisF, RiccioA., YeungA. T,
Matsumoto Y., GolemisE.A., GenuardiAL, Neri G. MED1,
a novel human methyl-CpG-binding endonuclease, inte-
racts with DNA mismatch repair protein MLH1 // Proc.
Natl Acad. Sei. USA. 1999. Vol. 96. P. 3969—3974.
BhutaniN, Brady J. J., DamianAL, Sacco A., Corbel S. Y.,
Blau H. Al. Reprogramming towards pluripotency requi-
res AID-dependent DNA demethylation// Nature. 2010.
Vol. 463. P. 1042—1047.
Bird A. Perceptions of epigenetics // Nature. 2007. Vol. 447.
P. 396—398.
Boorstein R. J., Teebor G. IE Mutagenicity' of 5-hydroxyme-
thyl-2'-deoxyuridine to Chinese hamster cells // Cancer
Res. 1988. Vol. 48. P. 5466—5470.
Boorstein R. J., Levy D. D., Teebor G. IE 5-Hydroxymethylu-
racil-DNA glycosylase activity' may be a differenti-
ated mammalian function// Mutat. Res. 1987. Vol. 183.
P. 257—263.
Boorstein R. J., ChiuL.-N, Teebor G. JJ’. Phylogenetic evi-
dence of a role for 5-hydroxymethyluracil-DNA glycosy-
lase in the maintenance of 5-methylcytosine in DNA // Nu-
cleic Acids Res. 1989. Vol. 17. P.’ 7653—7661.
Boorstein R J., Cummings A. Jr., Alarenstein D. R, Chan AL K.,
Ala Y., NeubertT.A., Brown S. Al., Teebor G. IE Defini-
tive identification of mammalian 5-hydroxymethyluracil
DNA V-glycosylase activity' as SMUG1 // J. Biol. Chem.
2001. Vol. 276. P. 41991—41997.
Bransteitter R., Prochnow C, ChenX. S. The current structural
and functional understanding of АРОВЕС deaminases //
Cell. Mol. Life Sei. 2009. Vol. 66. P. 3137—3147.
BrossL., Jacobs H. DNA double strand breaks occur independ-
ent of AID in hypermutating Ig genes // Clin. Dev. Immu-
nol. 2003. Vol. 10. P. 83—89.
Camion S. J’., Cummings A., Teebor G. JJ’. 5-Hydroxymethy-
leytosine DNA glycosylase activity' in mammalian tissue //
Biochem. Biophys. Res. Commun. 1988. Vol. 151.
P. 1173—1179.
Cannon-Carlson S. J’., Gokhale H, Teebor G. JJ’. Purification
and characterization of 5-hydroxymethyluracil-DNA gly-
cosylase from calf thymus: Its possible role in the mainte-
nance of methylated cytosine residues // J. Biol. Chem.
1989. Vol. 264.’P. 13306—13312.
ГЛАВА 2 47
Chan S. I Г.-I... Henderson I. R. JacobsenS. E. Gardening the
genome: DNA methylation in Arabidopsis thaliana 11 Nat.
Rev. Genet. 2005. Vol. 6. P. 351—360.
Chaudhuri J., Tian XL, KhuongC, Chua К, PinaudE., Alt F. IE.
Transcription-targeted DNA deamination by the AID anti-
body diversification enzyme // Nature. 2003. Vol. 422.
P. 726 730.
Chen D.. Lucey XL. J., PhoenixF., Lopez-Garcia J., Hart S. XL.
Losson R., BuluwelaL., CoombesRC., ChambonP.,
ScharP., AU S. T:G mismatch-specific thymine-DNA gly-
cosylase potentiates transcription of estrogen-regulated
genes through direct interaction with estrogen receptor a '/
J. Biol. Chem. 2003. Vol. 278. P. 38586—38592.
ChoiY., GehringXL, Johnson L, Hannon XL, Harada J. J.,
GoldbergR. B., Jacobsen S. E., Fischer R. L. DEMETER, a
DNA glycosylase domain protein, is required for en-
dosperm gene imprinting and seed viability in Arabidop-
sis // Cell. 2002. Vol. 110. P. 33—42.
Choi E, Harada J. J., GoldbergR. B., Fischer R. L. An invari-
ant aspartic acid in the DNA glycosylase domain of
DEALETER is necessary for transcriptional activation of
the imprinted XLEDEA gene U Proc. Natl Acad. Sei. USA.
2004. Vol. 101. P. 7481—7486.
Conticello S. G. The AID/АРОВЕС family of nucleic acid mu-
tators II Genome Biol. 2008. Vol. 9. P. 229.
CortellinoS., Turner D., XLasciulloV., SchepisF, AlbinoD..
DanielR., SkalkaA.XL, XLeropolN. J., Alberti C., Larue L.,
BellacosaA. The base excision repair enzyme MED1 medi-
ates DNA damage response to antitumor drugs and is associ-
ated with mismatch repair system integrity // Proc. Natl
Acad. Sei. USA. 2003. Vol. 100. P. 15071—15076.
Cortellino S., Xu J., Sannai XL, XLoore R., Caretti E., Cigli-
anoA.. Le CozXL. Devarajan K, ITesselsA., Soprano D.,
Abramowitz L. K, Bartolomei XL. S., Rambow F, Bas-
siXLR. BrtmoT.. FanciulliXL. Renner C., Klein-Szan-
toA.J., XLatsumoto Y., Kobi D., Davidson L., Alberti C.,
LarueL, BellacosaA. Thymine DNA glycosylase is es-
sential for active DNA demethylation by linked deamina-
tion-base excision repair // Cell. 2011. Vol. 146. P. 67—79.
DarwantoA., Theruvathu J. A., Sowers J. L., RogstadD.K.,
Pascal T, Goddard П’., Sowers L. C. Mechanisms of base
selection by human single-stranded selective monofunc-
tional uracil-DNA glycosylase // J. Biol. Chem. 2009.
Vol. 284. P. 15835—15846.
Dawlaty XL. XL, Ganz K, Powell В. E., Hu Y.-C, XLarkaulaki S.,
Cheng А. 1Г., GaoQ., Kim J., Choi S.-П., PageD.C.,
Jaenischs R. Tetl is dispensable for maintaining pluripo-
tency and its loss is compatible with embryonic and post-
natal development// Cell Stem Cell. 2011. Vol. 9.
P. 166 175.
DempleB.. Harrison L. Repair of oxidative damage to DNA:
Enzymology' and biology // Annu. Rev. Biochem. 1994.
Vol’63. P. 915—948.
Di NoiaJ. XL, Rada C, Neuberger XL. S. SMUG1 is able to ex-
cise uracil from immunoglobulin genes: Insight into muta-
tion versus repair // EMBO J. 2006. Vol. 25. P. 585—595.
Dodge J. E., OkanoXL., DickF, TsujimotoN, ChenT., Il’angS.,
Ueda E, Dyson N., Li E. Inactivation of Dimt3b in mouse
embryonic fibroblasts results in DNA hypomethylation,
chromosomal instability, and spontaneous immortalization /'
J. Biol. Chem. 2005. Vol. 280. P. 17986- -17991.
FiczG., Branco XL. R, Seisenberger S., Santos F, Krueger F,
Ноге T. A., XLarques C. J., Andrews S., Reik IE Dynamic
regulation of 5-hydroxymethylcytosine in mouse ES cells
and during differentiation // Nature. 2011. Vol. 473.
P. 398—402.
Foerster A. XL., Dinh H. Q., SedmanL., H’ohlrab B., Sche-
id О. XL. Genetic rearrangements can modify chromatin fea-
tures at epialleles // PLoS Genet. 2011. Vol. 7. el002331.
FortiniP., DogliottiE. Base damage and single-strand break
repair: Mechanisms and functional significance of short-
and long-patch repair subpathways // DNA Repair. 2007.
Vol. 6. P. 398—409.
FraenkelS., XLostoslavsky R., Novobrantseva T. L., PelandaR,
Chaudhuri J., Esposito G., JungS., AltF. IE, Rajew-
skyK, Cedar H., Bergman Y. Allelic ’choice' governs so-
matic hypermutation in vivo at the immunoglobulin
к-chain locus 11 Nat. Immunol. 2007. Vol. 8. P. 715—722.
FremontXL, SiegmannXL, GaulisS., XLatthiesR., HessD.,
Jost J.-P. Demethylation of DNA by purified chick em-
bryo 5-methylcytosine-DNA glycosylase requires both
protein and RNA // Nucleic Acids Res. 1997. Vol. 25.
P. 2375—2380.
Friedberg E. C., Walker G.C, Siede IE, IEoodR.D., Schul-
tz R. A., Ellenberger T. DNA Repair and Mutagenesis.
Washington. D.C.: ASM Press. 2006. 1 118 p.
Gaudet F, Hodgson J. G., Eden A., Jackson-Grusby L., Dous-
man J., Gray J. W., Leonhardt H, Jaenisch R. Induction
of tumors in mice by genomic hypomethylation // Science.
2003. Vol. 300. P. 489—492.
GehringXL, Huh J. H, Hsieh T.-F, Penterman J., Choi E, Ha-
rada J. J., GoldbergR. B., Fischer R. L. DEMETER DNA
glycosylase establishes MEDEA polycomb gene self-im-
printing by allele-specific demethylation // Cell. 2006.
Vol. 124. P. 495—506.
Globisch D., XLunzel XL, XLiiller XL, XLichalakis S., Wagner XL,
Koch S., Briickl T, Biel XL, CarellT. Tissue distribution
of 5-hydroxymethylcytosine and search for active de-
methylation intermediates // PLoS ONE. 2010. Vol. 5.
el 5367.
Gommers-AmptJ. H., BorstP. Hypermodified bases in DNA//
FASEB J. 1995. Vol. 9. P. 1034—1042.
Gong Z., XLorales-Ruiz T, Ariza R. R., Roldan-Arjona T, Da-
vid L., ZhuJ.-K. ROSE a repressor of transcriptional gene
silencing in Arabidopsis, encodes a DNA glvcosvlase.
lyase II Cell. 2002. Vol. 111. P. 803—814.
Gu Т.-P., GuoF, YangH, Wu H.-Р., Xu G.-F, Liu IE, Xie Z-G,
ShiL., HeX., JinS.-G., IqbalK, Shi Y. G., Deng Z.,
SzabyP. E., Pfeifer G. P., Li J., Xu G.-L. The role of Tet3
DNA dioxygenase in epigenetic reprogramming bv oocy-
tes 11 Nature. 2011. Vol. 477. P. 606—610.
GuoJ. U., Su E, ZhongC., XLing G.-L., SongH. Hydroxylation
of 5-methylcytosine by' TET1 promotes active DNA de-
methylation in the adult brain// Cell. 2011. Vol. 145.
P. 423—434.
Halliwell B., Gutteridge J. XL. C. Free Radicals in Biology' and
Medicine. Oxford: Oxford Universify Press, 2007. 704 p.
Hardeland U, SteinacherR, Jiricny J., ScharP. Modification
of the human thymine-DNA glycosylase by' ubiquitin-like
proteins facilitates enzymatic turnover // EMBO J. 2002.
Vol. 21. P. 1456—1464.
Hardeland U., BenteleXL, Jiricny J., Schdr P. The versatile
thymine DNA-glycosylase: A comparative characteriza-
tion of the human, Drosophila and fission yeast ortho-
logs // Nucleic Acids Res. 2003. Vol. ЗЕ P. 2261—
2271.
HeY.-F., LiB.-Z., LiZ., LiuP., WangY., TangO., Ding J.,
Jia E, ChenZ., LiL., Sun E, LiX., Dai Q., SongC.-X.,
ZhangK. HeC.. Xu G.-L. Tet-mediated formation of 5-
carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian
DNA // Science. 2011. Vol. 333. P. 1303—1307.
HendrichB., AbbottC., XLcQueenH., ChambersD., CrossS.,
Bird A. Genomic structure and chromosomal mapping of
the murine and human XLbdl, XLbd2, XLbd3, and XLbd4
genes // Mamm. Genome. 1999. Vol. 10. P. 906—912.
Hendrich B.. Bird A. Identification and characterization of a
family of mammalian methyl-CpG binding proteins //
Mol. Cell. Biol. 1998. Vol. 18.’P. 6538—6547.
48 ЭПИГЕНЕТИКА
Hendrick В.. Hardeland U., NgH.-H.. Jiricny J., Bird A. The
thymine glycosylase MBD4 can bind to the product of
deamination at methylated CpG sites // Nature. 1999.
Vol. 401. P. 301—304.
HerralaA. AL, VilpoJ.A. Template-primer activity of 5-(hyd-
roxymethyl)uracil-containing DNA for prokaryotic and
eukaryotic DNA and RNA polymerases // Biochemistry.
1989.’Vol. 28. P. 8274—8277.
HollidayR. Epigenetics: A historical overview// Epigenetics.
2006. Vol. 1. P. 76—80.
Hollstein Al. C, Brooks P., LinnS., AmesB. N. Hydroxymethy-
luracil DNA glycosylase in mammalian cells // Proc. Natl
Acad. Sci. USA. 1984. Vol. 81. P. 4003—4007.
HonjoT., AIuramatsuAL, Fagarasan S. AID: How does it aid
antibody diversity? // Immunity. 2004. Vol. 20. P. 659—
668.
Hsieh T.-F., Ibarra C. A.. SilvaP.. ZemachA.. Eshed-Wil-
UamsL., Fischer R. L, Zilberman D. Genome-wide de-
methylation of Arabidopsis endosperm // Science. 2009.
Vol. 324. P. 1451—1454.
Imai K, SlupphaugG., Lee ГГ.-L, ReyyP., Nonoyama S., Cata-
lan Al., YelL., Forveille AL, Kavli В., Krokan H. E.,
Ochs H. D., Fischer A., DurandyA. Human uracil-DNA
glycosylase deficiency associated with profoundly im-
paired immunoglobulin class-switch recombination 11 Nat.
Immunol. 2003. Vol. 4. P. 1023—1028.
Inoue A., ShenL., Dai О., He C, Zhang Y. Generation and rep-
lication-dependent dilution of 5fC and 5caC during mouse
preimplantation development// Cell Res. 2011. Vol. 21.
P. 1670—1676.
Iqbal K, Jin S.-G., Pfeifer G. P., Szaby P. E. Reprogramming of
the paternal genome upon fertilization involves genome-
wide oxidation of 5-methylcytosine '/ Proc. Natl Acad.
Sci. USA. 2011. Vol. 108. P. 3642—3647.
Ischenko A. A.. Saparbaev AL K. Alternative nucleotide incision
repair pathway for oxidative DNA damage // Nature.
2002. Vol. 415. P. 183—187.
ItoS., D'AlessioA. C, Taranova О. I'., HongK., SowersL. C,
Zhang Y. Role of Tet proteins in 5mC to 5hmC conver-
sion, ES-cell self-renewal and inner cell mass specifica-
tion "Nature. 2010. Vol. 466. P. 1129-1133.
ItoS., ShenL., Dai Q., П и S. C, CollinsL. B., SwenbergJ. A.,
He C, Zhang Y. Tet proteins can convert 5-methylcytosine
to 5-formvlcytosine and 5-carboxvlcvtosine // Science.
2011. Vol.’333. P. 1300—1303.
Jeevan-Raj В. P., Robert I., Heyer V., Page A., iVangJ.H.,
CommasF, AltF. IT., Losson R, Reina-San-AIartin B.
Epigenetic tethering of AID to the donor switch region
during immunoglobulin class switch recombination // J.
Exp. Med. 2011. Vol. 208. P. 1649 1660.
JeltschA. Molecular enzymology of mammalian DNA methyl-
transferases // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 2006.
Vol. ЗОЕ P. 203—225.
Jin S.-G., П’иХ, LiA.X., Pfeifer G. P. Genomic mapping of
5-hydroxymethylcytosine in the human brain // Nucleic
Acids Res. 2011. Vol. 39. P. 5015—5024.
Jones P. A., BaylinS.B. The epigenomics of cancer// Cell.
2007. Vol. 128. P. 683—692.
Jones P. L., Veenstra G. C. J., WadeP.A., VermaakD.,
KassS. U.. LandsbergerN., Strouboulis J.. Holf
fe A. P. Methylated DNA and MeCP2 recruit histone deace-
tylase to repress transcription " Nat. Genet. 1998. Vol. 19.
P. 187—191.
Jost J.-P. Nuclear extracts of chicken embryos promote an ac-
tive demethylation of DNA by excision repair of 5-methy-
Ideoxvcytidine // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1993.
Vol. 90. P. 4684—4688.
JostJ.-P., Jost Y.-C. Transient DNA demethylation in differen-
tiating mouse myoblasts correlates with higher activity of
5-methvldeoxvcvtidine excision repair // J. Biol. Chem.
1994. Vol. 269. P. 10040—10043.
JostJ.-P., SiegniannAL., SunL., LeungR. Mechanisms ofDNA
demethylation in chicken embryos. Purification and prop-
erties of a 5-methylcytosine-DNA glycosylase // J. Biol.
Chem. 1995. Vol. 270. P. 9734—9739.
JostJ.-P., Schwarz S., HessD., Angliker H, Fuller-Pace F. Г.,
StahlH. ThiryS.. SiegniannAL A chicken embryo protein
related to the mammalian DEAD box protein p68 is tightly
associated with the highly purified protein-RNA complex
of 5-MeC-DNA glycosyiase// Nucleic Acids Res. 1999.
Vol. 27. P. 3245—3252’
Jurkowska R. Z., Jurkowski T. P., JeltschA. Structure and func-
tion of mammalian DNA methyltransferases // Chembio-
chem. 2011. Vol. 12. P. 206—222.
Kapoor A., Agarwal AL, Andreucci A., ZhengX., GongZ., Ha-
segawa P. AL, Bresson R. A.. ZhuJ.-K. Mutations in a
conserved replication protein suppress transcriptional gene
silencing in a DNA-methylation-independent manner in
Arabidopsis /7 Curr. Biol. 2005. Vol. 15. P. 1912—1918.
Kapoor A., AgiusF, ZhuJ.-K. Preventing transcriptional gene
silencing bv active DNA demethylation // FEBS Lett.
2005. Vol. 579. P. 5889—5898.
Kaufman E. R. Biochemical analysis of toxic effects of 5-hydro-
xymethyl-2'-deoxyuridine in mammalian cells // Somat.
Cell Mol. Genet. 1986. Vol. 12. P. 501—512.
Kaufman E. R. Induction of sister chromatid exchanges by the
thymidine analog 5-hvdroxvmethvl-2'-deoxvuridine // So-
mat. Cell Mol. Genet. 1989’Vol. 15. P. 563—568.
Kavli B., AndersenS., Otterlei AL, LiabakkN.B., Imai K,
Fischer A., DurandyA., Krokan H. E., SlupphaugG. В
cells from hyper-IgM patients carrying UNG mutations
lack ability' to remove uracil from ssDNA and have ele-
vated genomic uracil // J. Exp. Med. 2005. Vol. 201.
P. 2011—2021.
Kavli B., Otterlei AL., SlupphaugG., Krokan H. E. Uracil in
DNA—General mutagen, but normal intermediate in ac-
quired immunity' // DNA Repair. 2007. Vol. 6. P. 505—
516.
KinoshitaT., AliuraA., Choi Y., KinoshitaY., CaoX., Jacob-
sen S. E., Fischer R. L., Kakutani T. One-way control of
ETTA imprinting in Arabidopsis endosperm by DNA me-
thylation // Science. 2004. Vol. 303. P. 521—523.
KlocAI.. Zagrodzinska B. Chromatin elimination — an oddity
or a common mechanism in differentiation and develop-
ment? h Differentiation. 2001. Vol. 68. P. 84—91.
Ko AL, HuangY., Jankowska A. AL, Pape U. J., Tahiliani AL,
Bandukwala H. S., An J., Lamperti E. D., Koh К. P., Ga-
netzkyR, LiuX. S., AravindL., AgarwalS., Alacie-
jewski J. P., Rao A. Impaired hydroxylation of 5-methy-
ley'tosine in myeloid cancers with mutant TET211 Nature.
2010. Vol. 468. P. 839—843.
Ko AL, Bandukwala H. S., An J., Lamperti E. D., Thomp-
son E. C, Hastie R, Tsangaratou A., Rajewsky K, Ko-
ralovS.B, Rao A. Ten-Eleven-Translocation 2 (TET2)
negatively regulates homeostasis and differentiation of he-
matopoietic stem cells in mice // Proc. Natl Acad. Sci.
USA. 2011. Vol. 108. P. 14566—14571.
KohKP., YabuuchiA., RaoS., HuangY., CuimiffK, Nardo-
ne J., LaihoA.. Tahiliani AL, Sommer C. A.. Alostoslav-
sky G., Lahesmaa R, Orkin S. H, RodigS. J., Daley G. Q.,
RaoA. Tetl and Tet2 regulate 5-hydroxymethylcytosine
production and cell lineage specification in mouse em-
bryonic stem cells// Cell Stem Cell. 2011. Vol. 8.
P. 200—213.
Kondo E., Gu Z., Horii A., Fukushige S. The thymine DNA gly-
cosylase MBD4 represses transcription and is associated
with methylated р16ШК4а and hAILHl genes // Mol. Cell.
Biol. 2005. Vol. 25. P. 4388—4396.
ГЛАВА 2 49
Kriaucionis S.. Heintz N. The nuclear DNA base 5-hydroxy-
methvlcytosine is present in Purkinje neurons and the
brain// Science. 2009. Vol. 324. P. 929—930.
KuoF. C, Sklar J. Augmented expression of a human gene for
8-oxoguanine DNA glycosylase (MutM) in В lymphocytes
of the dark zone in lymph node germinal centers // J. Exp.
Med. 1997. Vol. 186. P. 1547 1556.
Larijani AL.. FriederD., Basit JJ’., Martin A. The mutation spec-
trum of purified AID is similar to the mutability' index in
Ramos cells and in ung"1- mshZ4- mice // Immunogenetics.
2005. Vol. 56. P. 840—845.
Larson E. D., Cummings JJ'. J., BednarskiD. JJ’., MaizelsN.
MRE11 RAD50 cleaves DNA in the AID/UNG-dependent
pathway of immunoglobulin gene diversification // Mol.
Cell. 2005. Vol. 20. P. 367—375.
Lee G. S, Brandt J’. L., Roth D. В. В cell development leads off
with a base hit: dU:dG mismatches in class switching and
hypermutation " Mol. Cell. 2004. Vol. 16. P. 505—508.
LiE., Bestor T. H., Jaenisch R. Targeted mutation of the DNA
methyltransferase gene results in embryonic lethality //
Cell.1992. Vol. 69. P. 915—926.
LiY.-Q., ZhouP.-Z., ZhengX.-D., JJ'alsh С. P., Xu G.-L. Asso-
ciation of Dnmt3a and thymine DNA glycosylase links
DNA methylation with base-excision repair /7 Nucleic Ac-
ids Res. 2007. Vol. 35. P. 390 400.
Li Z., CaiX., Cai C.-L., JJ’angJ.. Zhang JJ'., Petersen В. E..
YangF-C, Xu AL. Deletion of Tet2 in mice leads to dys-
regulated hematopoietic stem cells and subsequent deve-
lopment of myeloid malignancies// Blood. 2011.
Vol. 118. P. 4509-4518.
LiuP., BurdzyA., Sowers L. C. Repair of the mutagenic DNA
oxidation product, 5-formvluracil " DNA Repair. 2003.
Vol. 2. P. 199—210.
Longerich S., MeiraL., ShahD., Samson L. D., StorbU. Alky-
ladenine DNA glycosylase (Aag) in somatic hypermuta-
tion and class switch recombination // DNA Repair. 2007.
Vol. 6. P. 1764—1773.
Maiti A., DrohatA. C. Thymine DNA glycosylase can rapidly
excise 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine: Potential
implications for active demethylation of CpG sites // J.
Biol. Chem. 2011. Vol. 286. P. 35334—35338.
ALasaoka A., TeratoH., Kobayashi AL, OhyamaY., Ide H. Oxi-
dation of thymine to 5-formyluracil in DNA promotes
misincorporation of dGMP and subsequent elongation of a
mismatched primer terminus by DNA polymerase // J.
Biol. Chem. 2001. Vol. 276. P. 16501—16510.
ALatsubaraAL, ALasaokaA., Tanaka T., ALiyanoT., KatoN.,
TeratoH., OhyamaY., LwaiS., Lde H. Mammalian 5-for-
myluracil-DNA glycosylase. 1. Identification and char-
acterization of a novel activity that releases 5-formvluracil
from DNA 7 Biochemistry. 2003. Vol. 42. P. 4993—5002.
ALatsubaraAL, Tanaka T, TeratoH., OhmaeE., LzumiS., Kata-
yanagi K., Lde H. Mutational analysis of the damage-re-
cognition and catalytic mechanism of human SMUG1
DNA glycosylase // Nucleic Acids Res. 2004. Vol. 32.
P. 5291—5302.
ALaynardSmith J. Models of a dual inheritance system // J.
Theor. Biol. 1990. Vol. 143. P. 41—53.
ALayorov J'. L., Rogozin L.B., Adkison L. R, Frahm C., Kun-
kel T. .1.. Pavlov Y. L. Expression of human AID in yeast
induces mutations in context similar to the context of so-
matic hypermutation at G-C pairs in immunoglobulin
genes // 13MC Immunol. 2005. Vol. 6. P. 10.
ALellac S., Fazakerley G. J'., Sowers L.C. Structures of base
pairs with 5-(hydroxymethyl)-2'-deoxyuridine in DNA de-
termined by NMR spectroscopy // Biochemistry. 1993.
Vol. 32. P. 7779—7786.
ALetivierR, GallaisR, Tiffoche C., Le PeronC, Jurkows-
kaRZ., Carmouche R P., Lbberson D., Barath P., De-
may F. ReidG., Benes J'., JeltschA., GannonF. Sal-
bert G. Cyclical DNA methylation of a transcriptionally
active promoter //Nature. 2008. Vol. 452. P. 45—50.
ALeyersonAL, Gabriel S., Getz G. Advances in understanding
cancer genomes through second-generation sequencing //
Nat. Rev. Genet. 2010. Vol. 11. P. 685—696.
ALillarC. B., Guy J., Sansom O. J., Selfridge J., ALacDougall E.,
HendrichB.. Keightley P. D.. BishopS. AL. Clarke A. R.
Bird A. Enhanced CpG mutability' and tumorigenesis in
MBD4—deficient mice // Science. 2002. Vol. 297.
p. 403—405.
ALiyabeL., ZhangQ.-AL., Kino K., Sugiyama H, TakaoAL, Ya-
suiA., Yonei S. Identification of 5-formyluracil DNA gly-
cosvlase activity of human hNTHl protein // Nucleic Ac-
ids Res. 2002. Vol. 30. P. 3443—3448.
ALokY.G., Uzawa R, Lee J., JJ'einer G. AL, Eichman B.F.,
Fischer R. L.. HuhJ.H. Domain structure of the
DEMETER 5-methylcytosine DNA glycosylase // Proc.
Natl Acad. Sei. USA. 2010. Vol. 107. P.19225—19230.
ALorales-Ruiz T, Ortega-Galisteo A. P., Ponferrada-ALarin AL. L.,
ALartinez-ALaciasALL., Ariza RR, Roldan-Arjona T.
DEMETER and REPRESSOR OF SILENCING 1 encode
5-methylcytosine DNA glycosylases // Ibid. USA. 2006.
Vol. 103. P. 6853—6858.
ALorgan H. D., Dean JJ’., Coker H. A., Reik JJ’., Petersen-
ALahrtS. K. Activation-induced cytidine deaminase deami-
nates 5-methylcytosine in DNA and is expressed in pluripo-
tent tissues: Implications for epigenetic reprogramming // J.
Biol. Chem. 2004. Vol. 279. P. 52353—52360.
NanX., NgH-H, Johnson C. A., LahertyC.D., Turner B. AL,
Eisenman R. N., Bird A. Transcriptional repression by' the
methyl-CpG-binding protein MeCP2 involves a histone
deacetvlase complex // Nature. 1998. Vol. 393. P. 386—
389.
Neddermann P.. JiricnyJ. Efficient removal of uracil from G*U
mispairs by' the mismatch-specific thymine DNA glycosy-
lase from HeLa cells // Proc. Natl Acad. Sei. USA. 1994.
Vol. 91. P. 1642—1646.
Neddermann P., Gallinari P., LettieriT., Schmid D., Truong O.,
Hsuan J. J., JJ’iebauerK, JiricnyJ. Cloning and expres-
sion of human G/T mismatch-specific thymine-DNA gly-
cosylase// J. Biol. Chem. 1996. Vol. 271. P. 12767—
12774.
Neuberger AL. S., Harris R S., Di Noia J.. Petersen-ALahrt S. K.
Immunity through DNA deamination // Trends Biochem.
Sei. 2003. Vol. 28. P. 305—312.
NgH-H, ZhangY., Hendrich B., Johnson C. A., Turner B. AL,
Erdjument-Bromage H, TempstP., ReinbergD., Bird A.
MBD2 is a transcriptional repressor belonging to the
MeCPl histone deacetylase complex// Nat. Genet. 1999.
Vol. 23. P. 58—61.
Nilsen H, Stamp G., Andersen S., HrivnakG., Krokan H. E.,
Lindahl T, Barnes I). E. Gene-targeted mice lacking the
Ung uracil-DNA glycosylase develop В-cell lymphomas /7
Oncogene. 2003. Vol. 22. P. 5381—5386.
Nilsen H, An Q., Lindahl T. Mutation frequencies and AID ac-
tivation state in В-cell lymphomas from Ung-deficient
mice // Ibid. 2005. Vol. 24. P. 3063—3066.
OltrH, Bui A. Q., LeB. H, Fischer R. L., Choi F. Identification
of putative Arabidopsis DEMETER target genes by Ge-
neChip analysis,'! Biochem. Biophys. Res. Commun.
2007. Vol. 364. P. 856—860.
OkanoAL., BellD. JJ’., Haber D. A., LiE. DNA methyltrans-
ferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo me-
thylation and mammalian development// Cell. 1999.
Vol. 99. P. 247—257.
OnoR, TakiT., TaketaniT., TaniwakiAL, Kobayashi H, Ha-
yashi Y. LCX, leukemia-associated protein with a CXXC
domain, is fused to ALEE in acute myeloid leukemia with
50 ЭПИГЕНЕТИКА
trilineage dysplasia having t(10;ll)(q22;q23)/7 Cancer
Res. 2002. Vol. 62. P. 4075—4080.
Ortega-Galisteo A. P., ALorales-RuizT., Ariza R. R., Roldan-
Arjona T. Arabidopsis DEMETER-LIKE proteins DML2
and DML3 are required for appropriate distribution of
DNA methylation marks // Plant Mol. Biol. 2008. Vol. 67.
P. 671 681.
Pasternack L. B., BramhamJ.. MayolL.. GaleoneA.. JiaX..
Kearns D. R. 'll NMR studies of the 5-(hydroxymethyl)-
2'-deoxyuridine containing TF1 binding site // Nucleic Ac-
ids Res' 1996. Vol. 24. P. 2740—2745.
Pastor W. A., Pape U. J., Huang 17, Henderson H. R, Lister R,
Ko AL, McLoughlin E. AL, Brudno 17, ALahapatra S., Kap-
ranov P., Tahiliani AL, Daley G. Q., LiuX. S., Ecker J. R.,
ALilos P. AL., Agarwal S., Rao A. Genome-wide mapping
of 5-hydroxymethylcytosine in embryonic stem cells //
Nature' 2011. Vol. 473. P. 394—397.
Penn N. W., SuwalskiR, O'Riley C., Bojanowski K, Yura R.
The presence of 5-hydroxymethylcytosine in animal de-
oxyribonucleic acid // Biochem. J. 1972. Vol. 126. P. 781—
790.
Penterman J., Zilberman D., Huh J. H, Ballinger T, Heni-
koffS., Fischer R. L. DNA demethylation in the Arabidop-
sis genome 11 Proc. Natl Acad. Sei. USA. 2007. Vol. 104.
P. 6752—6757.
PerilloB.. OmbraALN., BertoniA., CuozzoC. SacchettiS..
Sasso A., Chiariotti L., ALalorni A., Abbondanza C., .11-
vedimentoE. Г. DNA oxidation as triggered by H3K9me2
demethylation drives estrogen-induced gene expression //
Science. 2008. Vol. 319. P. 202—206.
Petersen S., Casellas R, Reina-San-ALartin B., Chen H. T., Di-
filippantonioAL. J., Wilson P.C., HanitschL., Celeste A.,
ALuramatsu AL., Pilch D. R.. Redon C., RiedT., Bon-
ner W. AL., Honjo T, Nussenzweig AL. C, Nussenzweig A.
AID is required to initiate Nbsl g-H2AX focus formation
and mutations at sites of class switching// Nature. 200L
Vol. 414. P. 660—665.
Petronzelli F., Riccio A., ALarkham G. D., Seeholzer S. H,
GenuardiAL, KarbowskiAL, Yeung A. T., ALatsumoto Y.,
Bellacosa A. Investigation of the substrate spectrum of the
human mismatch-specific DNA V-glycosylase MED1
(MBD4): Fundamental role of the catalytic domain // J.
Cell. Physiol. 2000a. Vol. 185. P. 473—480.
Petronzelli F. Riccio A., ALarkham G.D., Seeholzer S. H. Sto-
erkerJ, GenuardiAL, Yeung A. T, ALatsumoto Y., Bella-
cosa A. Biphasic kinetics of the human DNA repair protein
MED1 (MBD4), a mismatch-specific DNA V-glycosylase //
J. Biol. Chem. 2000b. Vol. 275. P. 32422—32429.
Pfaffeneder T., HacknerB., TrufiAL., ALunzelAL., ALilllerAL.,
Deiml C. A., Hagemeier C, Carell T. The discovery of
5-formylcytosine in embryonic stem cell DNA // Angew.
Chem. Ink Ed. 2011. Vol. 50. P. 7008—7012.
PhamP., Bransteitter R, Petruska J., Goodman AL. F. Proces-
sive AID-catalysed cytosine deamination on single-stran-
ded DNA simulates somatic hypermutation // Nature.
2003. Vol. 424. P. 103—107.
Poltoratsky 17 P., Wilson S. H., Kunkel T. A., Pavlov 17 L. Re-
combinogenic phenotype of human activation-induced cy-
tosine deaminase // J. Immunol. 2004. Vol. 172. P. 4308
4313.
Popp C., Dean W, FengS., CokusS.J., Andrews S., Pelle-
grini AL., Jacobsen S. E., Reik W. Genome-wide erasure of
DNA methylation in mouse primordial germ cells is af-
fected by AID deficiency // Nature. 2010. Vol. 463.
P. 1101—1105.
Rada C., Williams G. T, Nilsen H, Barnes D. E., Lindahl T.,
Neuberger AL. S. Immunoglobulin isotype switching is in-
hibited and somatic hypermutation perturbed in UNG-
deficient mice // Curr. Biol. 2002. Vol. 12. P. 1748—1755.
Rai K, Huggins L. J., James S. R, Karpf A. R, Jones D. A..
Cairns B. R. DNA demethylation in zebrafish involves the
coupling of a deaminase, a glycosylase, and Gadd45 //
Cell. 2008. Vol. 135. P. 1201—1212.'
Ramiro A. R, JankovicAL, Callen E., Difilippantonio S.,
Chen H.-T, ALcBride K. AL, Eisenreich T. R, Chen J.,
Dickins R A., Lowe S. W., Nussenzweig A., Nussenz-
weigAL. C. Role of genomic instability and p53 in AID-
induced c-myc—Lgh translocations // Nature. 2006. Vol. 440.
P. 105—109.
RatelD., Ravanat J.-L., Berger F, Wion D. N6-methyladenine:
The other methylated base of DNA " Bioessays. 2006.
Vol. 28. P. 309-315.
Rusmintratip 17, Sowers L. C. An unexpectedly high excision
capacity for mispaired 5-hydroxymethyluracil in human
cell extracts 11 Proc. Natl Acad. Sei. USA. 2000. Vol. 97.
P. 14183—14187.
Saparbaev AL, Laval J. S^-ethenocytosine, a highly mutagenic
adduct, is a primary substrate for Escherichia coli double-
stranded uracil-DNA glycosylase and human mismatch-
specific thymine-DNA glvcosvlase 7 Ibid. 1998. Vol. 95.
P. 8508—8513.
SaribasakH, SaribasakN. N, IpekF. AL, EllwartJ. W., Ara-
kawa H, Buerstedde J.-AI. Uracil DNA glycosylase dis-
ruption blocks Ig gene conversion and induces transition
mutations И J. Immunol. 2006. Vol. 176. P. 365—371.
SarrafS. A., Stancheva L. Methyl-CpG binding protein MBD1
couples histone H3 methylation at lysine 9 by SETDB1 to
DNA replication and chromatin assembly // Mol. Cell.
2004. Vol. 15. P. 595—605.
Schmutte C., BaffaR, Feronese L. AL, ALurakumoY., FishelR
Human thymine-DNA glycosylase maps at chromosome
12q22—q24.1: A region of high loss of heterozygosity in
gastric cancer // Cancer Res. 1997. Vol. 57. P. 3010—3015.
SchoftV. K, Chumak N. ChoiY., Hannon AL, Garcia-Aguilar AL.
ALachlicova A., SlusarzL., ALosiolekAL., ParkJ.-S.,
ParkG.T., Fischer R. L., Tamaru H. Function of the
DEMETER DNA glycosylase in the Arabidopsis thaliana
male gametophyte // Proc. Natl Acad. Sei. USA. 2011.
Vol. 108. P. 8042—8047.
Schrader С. E., Linehan E. K, ALochegova S. N, Wood-
land R. T.. Stavnezer J. Inducible DNA breaks in Ig S re-
gions are dependent on AID and UNG // J. Exp. Med.
2005. Vol. 202. P. 561—568.
Shaknovich R, Cerchietti L., Tsikitas L, Kormaksson AL, De S.,
Figueroa AL. E., Ballon G., YangS.N., Weinhold N,
Reimers AL, Clozel T, Luttrop K, Ekstrom T. J., Frank J.,
Vasanthakumar A., Godley L. A., ALichor F, Elemento O.,
ALelnickA. DNA methyltransferase 1 and DNA methyla-
tion patterning contribute to germinal center В-cell differ-
entiation Г Blood. 2011. Vol. 118. P. 3559—3569.
ShenJ.-C, Rideout W. AL. 3rd, Jones P. A. High frequency
mutagenesis by a DNA methyltransferase // Cell. 1992.
Vol. 71. P. 1073—1080.
ShirzadiR, Andersen E. D., Bjerkan K. N., Gloeckle B. AL.,
HeeseAL, UngruA., Winge P., KonczC, Aalen R B.,
Schnittger A., Grini P. E. Genome-wide transcript profil-
ing of endosperm without paternal contribution identifies
parent-of-origin-dependent regulation of AGAALOUS-
LLKE36 7 PLoS Genet. 2011. Vol. 7. 61001303.
Sibghat-l llah, DayR. S. 3rd. Site specificity of incisions at G:T
and O6-methylguanine:T base mismatches in DNA by
human cell-free extractst // Biochemistry. 1995. Vol. 34.
P. 6869-6875.
Sibghat-LTlah, Gallinari P., XuY.-Z., Goodman AL. F, Blo-
om L. B., Jiricny J., DayR. S. 3rd. Base analog and neigh-
boring base effects on substrate specificity of recombinant
human G:T mismatch-specific thymine DNA-glyco-
sylase // Ibid. 1996. Vol. 35. P. 12926—12932.
ГЛАВА 2 51
Song С.-Х., Szulwach К. Е., Fit Y.. Dai О.. YiC, LiX., Li Y..
ChenC.-H, Zhang W., JianX., Wang J., ZhangL., Lo-
oney T. J., Zhang B., GodleyLA., FlicksL. Al., LahnB. T,
JinP., HeC. Selective chemical labeling reveals the ge-
nome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine //
Nat. Biotechnol. 2011. Vol. 29. P. 68 72.
Stivers J. T. Comment on «Uracil DNA glycosylase activity is
dispensable for immunoglobulin class switch» // Science.
2004. Vol. 306. P. 2042b.
Szwagierczak A., Bultmann S., Schmidt C. S., SpadaF, Leon-
hardt H. Sensitive enzymatic quantification of 5-hydroxy-
methylcytosine in genomic DNA // Nucleic Acids Res.
2010’ Vol. 38. e!81.
Tahiliani AL, Koh К. P., Shen I., Pastor IF. A., Bandukwala H,
BrudnoY., Agarwal S., Iyer L. AL, I.iulj.R., AravindL.,
Rao A. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymet-
hylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1 //
Science. 2009. Vol. 324. P. 930—935.
Thalhammer A., Hansen A. S., El-Sagheer A. H, Brown T,
Schofield C. J. Hydroxylation of methylated CpG dinu-
cleotides reverses stabilisation of DNA duplexes by cyto-
sine 5-methylation// Chem. Commun. 2011. Vol. 47.
P. 5325—5327.
The Arabidopsis Genome Initiative Analysis of the genome se-
quence of the flowering plant Arabidopsis thaliana 11 Na-
ture. 2000. Vol. 408. P. 796—815.
TiniAL, Benecke A., UmS.-J, TorchiaJ., EvansR. AL, Cham-
bon P. Association of СВР'рЗОО acetylase and thymine
DNA glycosylase links DNA repair and transcription //
Mol. Cell. 2002. Vol. 9. P. 265—277.
TiwariS., Schulz R, Ikeda I., Dytham L., Bravo J., Alathers L,
Spielman AL, Guzman P., OakeyRJ, KinoshitaT.,
Scott R. J. AL4TERNALLYEXPRESSED РАВ ('-TERMINAL.
a novel imprinted gene in Arabidopsis, encodes the con-
served C-terminal domain of polyadenylate binding pro-
teins // Plant Cell. 2008. Vol. 20. P. 2387—2398.
TsunodaAL, KarinoN, Ueno Y., AlatsudaA., TakenakaA.
Crystallization and preliminary X-ray analysis of a DNA
dodecamer containing 2'-deoxy-5-forniyluridine: What is
the role of magnesium cation in crystallization of
Dickerson-type DNA dodecamers? // Acta Crystallogr. D.
Biol. Crystallogr. 2001. Vol. 57. P. 345—348.’
Turner D. P., Cortellino S., SchuppJ.E., Caretti E., Loh T,
Kinsella T. J., BellacosaA. The DNA V-glycosylase
MED1 exhibits preference for halogenated pyrimidines
and is involved in the cytotoxicity of 5-iodode-
oxyuridine // Cancer Res. 2006. Vol. 66. P. 7686—7693.
UmS., Harbers AL., Benecke A., Pierrat B., Losson R, Cham-
bon P. Retinoic acid receptors interact physically and
functionally with the T:G mismatch-specific thymine-
DNA glycosylase// J. Biol. Chem. 1998. Vol. 273.
P. 20728’ 20736.
I'alinluck I'., SowersL. C. Endogenous cytosine damage prod-
ucts alter the site selectivity of human DNA maintenance
methyltransferase DNMT1 // Cancer Res. 2007. Vol. 67.
P. 946—950.
I'alinluck Г., Tsai H.-H, RogstadD.K, Burdzy A., Bird A.,
SowersL. C. Oxidative damage to methyl-CpG sequences
inhibits the binding of the methyl-CpG binding domain
(MBD) of methyl-CpG binding protein 2 (MeCP2) 11 Nuc-
leic Acids Res. 2004. Vol. 32. P. 4100—4108.
von Sonntag C. Free-Radical-Induced DNA Damage and Its
Repair: A Chemical Perspective. Berlin; Heidelberg:
Springer, 2006. 523 p.
von Sonntag C., Schuchmann H.-P. The radiolysis of pyrimidi-
nes in aqueous solutions: An updating review // Int. J. Ra-
diat. Biol. 1986. Vol. 49. P. 1—34.
Warren R. ,4. J. Modified bases in bacteriophage DNAs // Annu.
Rev. Microbiol. 1980. Vol. 34. P. 137—158.
Waters T. R. Gallinari P.. Jiricny J.. Swann P. F. Human
thymine DNA glycosylase binds to apurinic sites in DNA
but is displaced by human apurinic endonuclease 1 // J.
Biol. Chem. 1999. Vol. 274. P. 67—74.
WattF., AlolloyP. L. Cytosine methylation prevents binding to
DNA of a HeLa cell transcription factor required for opti-
mal expression of the adenovirus major late promoter //
Genes Dev. 1988. Vol. 2. P. 1136—1143.
Wiederhold L., Leppard J. B., KedarP., Karimi-Busheri F, Ra-
souli-NiaA., WeinfeldAL, Tomkinson A. E., IzumiT.,
PrasadR, Wilson S.H., AlitraS., Hazra T. К. AP en-
donuclease-independent DNA base excision repair in hu-
man cells // Mol. Cell. 2004. Vol. 15. P. 209-220.
WinterD. B., PhungQ. H, ZengX., SeebergE., BarnesD.E.,
Lindahl T, Gearhart P. J. Normal somatic hypermutation
of Ig genes in the absence of 8-hydroxvgLiaiiiiic-l )NA gly-
cosylase // J. Immunol. 2003. Vol. 170’. P. 5558—5562. ’
WongE., YangK, Kuraguchi AL., WerliiigU., Avdievich E.,
Fan K, FazzariAL, JinB., Brown A. AL C., Lipkin AL,
Edelmann W. Mbd4 inactivation increases СвТ transition
mutations and promotes gastrointestinal tumor formation //
Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2002. Vol. 99. P. 14937—
14942.
WossidloAL, Nakamura T, Lepikhov K, Alarques C. J., Zak-
hartchenko V., BoianiAL, ArandJ., Nakano T, Reik W,
Walter J. 5-Hydroxymethylcytosine in the mammalian zy-
gote is linked with epigenetic reprogramming // Nat.
Commun. 2011. Vol. 2. 241.
WuH, D'AlessioA. C., ItoS., WangZ., Cui K, ZhaoK,
Sim F. E., Zhang F. Genome-wide analysis of 5-hydro-
xymethylcytosine distribution reveals its dual function in
transcriptional regulation in mouse embryonic stem cells //
Genes Dev. 2011a. Vol. 25. P. 679—684.
Wu H, D'Alessio .4. C, Ito S., Xia K, Wang Z., Cui K, Zhao K,
Sun YE.. ZhangY. Dual functions of Tetl in transcrip-
tional regulation in mouse embryonic stem cells // Nature.
201 lb. Vol. 473. P. 389—393.
ГГ;;Д'., Stavnezer J. DNA polymerase b is able to repair breaks
in switch regions and plays an inhibitory role during im-
munoglobulin class switch recombination // J. Exp. Med.
2007. Vol. 204. P. 1677—1689.
Xiao W, Gehring AL, Choi Y., Alargossian L.. Pit H, Ha-
rada J. J., GoldbergR B., Pennell R I., Fischer R L. Im-
printing of the МЕЛ Polycomb gene is controlled by an-
tagonism between MET1 methyltransferase and DME gly-
cosylase // Dev. Cell. 2003. Vol. 5. P. 891—901.
Xu W, YangH, LiuY., YangY., WangP., KimS.-H, ItoS.,
YangC, WangP., XiaoAI.-T., LiuL.-X., Jiang W.-O.,
Liu J., Zhang J.-Y., WangB., FryeS., ZhangY., Xu Y.-H,
LeiQ.-Y., Guan K.-L., Zhao S.-AL, Xiong Y. Oncometabo-
lite 2-hydroxyglutarate is a competitive inhibitor of a-ke-
toglutarate-dependent dioxygenases// Cancer Cell. 2011.
Vol. 19. P. 17—30.
Yildirim O., LiR, HungJ.-H, Chen P. B., DongX., Ее L.-S.,
WengZ., Rando O. J., Fazzio T. G. Mbd3/NURD complex
regulates expression of 5-hydroxymethylcytosine marked
genes in embryonic stem cells// Cell. 2011. Vol. 147.
P. 1498—1510.’
Yoon J.-H, Iwai S., O'Connor T. R, Pfeifer G. P. Human thy-
mine DNA glycosylase (TDG) and methyl-CpG-binding
protein 4 (MBD4) excise thymine glycol (Tg) from a Tg:G
mispair// Nucleic Acids Res. 2003. Vol. 31. P. 5399—
5404.
Yoshikawa K, OkazakiI.-AI., EtoT., Kinoshita K, AIura-
matsuAL., Nagaoka H, Honjo T. AID enzyme-induced hy-
permutation in an actively transcribed gene in fibroblasts //
Science. 2002. Vol. 296. P. 2033—2036.
ZhangQ.-AL, Sugiyama H, Aliyabel., Alatsuda S., Saitol., Io-
ne; S. Replication of DNA templates containing 5-formy-
52 ЭПИГЕНЕТИКА
luracil. a major oxidative lesion of thymine in DNA 11 Nu-
cleic Acids Res. 1997. Vol. 25. P. 3969-3973.
Zhang O.-M., Yonekttra S.-L, TakaoM., Yasui A., Sugiyama PL,
Yonei S. DNA glycosylase activities for thymine residues
oxidized in the methyl group are functions of the hNEILl
and hNTHl enzymes in human cells // DNA Repair. 2005.
Vol. 4. P. 71 79.
ZhangQ.M.. Sugiyama H., Miyabel., klatsudaS.. KinoK..
Saito 1., Yonei S. Replication in vitro and cleavage by re-
striction endonuclease of 5-formyluracil- and 5-hydroxy-
methvluracil-containing oligonucleotides // Int. J. Radiat.
Biol.'1999. Vol. 75. P. 59—65.
Zharkov D. O. Base excision DNA repair // Cell. Mol. Life Sei.
2008. Vol. 65. P. 1544—1565.
Zhu B.. Zheng Y., Angliker H., SchwarzS., ThiryS.. Sieg-
mannM., Jost J.-P. 5-Methylcytosine DNA glycosylase
activity is also present in the human MBD4 (G/T mis-
match glycosylase) and in a related avian sequence // Nu-
cleic Acids Res. 2000a. Vol. 28. P. 4157 4165.
ZhuB., Zheng Y., PLessD., Angliker H., SchwarzS., Sieg-
mannM., ThiryS., Jost J.-P. 5-Methylcytosine-DNA gly-
cosylase activity is present in a cloned G/T mismatch
DNA glycosylase associated with the chicken embryo
DNA emethyiation complex // Proc. Natl Acad. Sei. USA.
2000b. Vol.'97. P. 5135—5139.
Zhu J., Kapoor A., Sridhar К J~, AgitisF., ZhuJ.-K. The DNA
glycosylase/lyase ROS1 functions in pruning DNA methy-
lation patterns in Arabidopsis 17 Curr. Biol. 2007. Vol. 17.
P. 54—59.
ГЛАВА
3
МЕТИЛИРОВАНИЕ ДНК У РАСТЕНИЙ:
ЭПИГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ
ЗА ГЕНЕТИЧЕСКИМИ ФУНКЦИЯМИ
СОДЕРЖАНИЕ
3.1. Метилирование и его влияние на
структуру ДНК и взаимодействие
с белками, 55
3.2. ДНК-метилтрансферазы, 58
3.3. Хромометилазы, 62
3.4. 5-аденозил-/_-метионин-зависимые
и чувствительные к статусу мети-
лирования ДНК эндонуклеазы рас-
тений, 72
3.5. Метилирование адениновых остат-
ков в ДНК у растений, 79
3.6. Метилирование ДНК и другие эпи-
генетические сигналы, 80
3.7. Направляемое РНК-метилирова-
ние ДНК и замалчивание генов,
Список литературы, 83
54 ЭПИГЕНЕТИКА
Более полувека назад профессор Андрей Ни-
колаевич Белозерский пригласил автора этой гла-
вы заниматься нуклеиновыми кислотами. Следо-
вало изучить нуклеотидный состав ДНК и РНК у
нескольких бактерий. Анализ состава этих ДНК
в то незабываемое время четко показал, что GC-
содержание в ДНК видоспецифично, и оно мо-
жет служить важным таксономическим призна-
ком у бактерий [Спирин и др., 1957]. По сути де-
ла, эта работа была одной из тех, которые зало-
жили основы геносистематики. Мир ДНК эука-
риот в то время был практически не затронутым.
Так, например, сведения о составе ДНК у пред-
ставителей всего растительного царства ограни-
Таблица 3.1
Минорные метилированные основания в ДНК*
Организмы Мол. %
т5С т6А
Бактерии 0,01—1,53 0,02—0,70
Водоросли 0,20—3,50 0,10—0,60
Г рибы + 0—0,5
Простейшие 0,3—1,0
Растения 2,0—10,0 0,5—1,0
Беспозвоночные 0,1—2,5 ?
Позвоночные 0,7—3,5 +
По [Ванюшин, Белозерский, 1959; Vanyushin etal., 1968,
1970].
Рис. 3.1. Канонические WC-пары оснований в ДНК
(стрелками показаны места метилирования оснований).
чивались тогда лишь данными по ДНК зароды-
шей пшеницы. Одной из наших задач тогда было
хотя бы отчасти ответить на вопрос — каковы
же ДНК у этих эукариот. Первые системные ис-
следования состава ДНК у высших растений бы-
ли выполнены в России, они касались ДНК архе-
гониальных (мхи, плауны, хвощи, папоротники,
голосеменные) и цветковых (покрытосеменные,
как одно-, так и двудольные) растений [Ваню-
шин, Белозерский, 1959].
Уже тогда было установлено, что отличи-
тельной особенностью ДНК всех высших расте-
ний является относительно высокое содержание
в них дополнительного основания — 5-метилци-
тозина (т5С) (табл. 3.1) [Ванюшин, Белозерский,
1959; Ванюшин, 1965, 1972, 2007]. Затем в рас-
тительных ДНК, как у бактерий [ Vanyushin et al.,
1968], был найден М-метиладенин (шбА) [Ва-
нюшин и др., 1971].
Долгое время происхождение этих оснований
в ДНК оставалось неизвестным. Лишь в 1963 г.
были обнаружены изначально у бактерий, а поз-
же и у эукариот ферменты, которые в присутст-
вии донора метильных групп S-аденозилметио-
нина избирательно метилировали отдельные ос-
татки цитозина и аденина в цепях ДНК. Стало
ясно, что обнаруживаемые в молекуле ДНК «ми-
норные» основания (ш5С и шбА) не встраиваются
в них в готовом виде [Сулимова и др., 1978а], а
возникают в результате энзиматической модифи-
кации (метилирования) соответствующих обыч-
ных оснований (рис. 3.1) в сформированных или
формирующихся цепях ДНК. При этом фермент
ДНК-метилтрансфераза «ловко расправляется» с
ДНК, он образует с ней ковалентно связанный
комплекс с выворачиванием наружу из двуцепо-
чечной спирали ДНК модифицируемого основа-
ния и метилирует это основание (рис. 3.2). После
этого акта ковалентная связь между' ферментом и
ДНК рвется, комплекс распадается, а метилиро-
ванное основание (ш5С) возвращается на свое
прежнее место в структуре ДНК.
Специфичность и функциональное значение
энзиматического метилирования ДНК очень
многие годы оставались неизвестными. Более
того, очень распространено было представление
о том, что эти «минорные» основания вообще не
играют никакой роли ни в структуре самой ДНК,
ни в ее функционировании. В качестве «неотра-
зимого» аргумента для таких представлений час-
то использовался излюбленный объект класси-
ческой генетики — дрозофила. В геноме этого
насекомого долго никому’ не удавалось найти
минорные основания, в том числе т5С. Это да-
ГЛАВА 3 55
вале многим, в том числе и нобелевскому’ лау-
реату’ У. Гилберту’, повод утверждать, что по-
скольку' дрозофила живет без метилирования
ДНК, то эта модификация генома вообще не
имеет существенного значения в жизнедеятель-
ности эукариотических организмов. Это на дол-
гие годы сильно охлаждало интерес к изучению
метилирования ДНК у многих биохимиков и мо-
лекулярных биологов мира и позволило нам в
течение многих лет в более или менее спокойной
обстановке шаг за шагом идти по пути исследо-
вания метилирования ДНК у разных организмов.
Кстати, мы давно заметили, что геном дрозофи-
лы характеризуется значительным дефицитом
CpG-последовательностей, служащих обычно ос-
новным сайтом при in vivo метилировании ДНК
у эукариот; по нашему’ мнению, такая выражен-
ная CpG-супрессия в геноме дрозофилы могла
быть обусловлена только метилированием в ней
цитозиновых остатков [Мазин, Ванюшин, 1988а].
Поскольку’ обнаружить собственно ДНК-метил-
трансферазную активность у дрозофилы в то вре-
мя нам не удавалось, мы назвали такую возмож-
ную модификацию ДНК у этого насекого «иско-
паемым» метилированием ДНК [Мазин, Ваню-
шин, 1988а]. Сейчас утке четко доказано, что у
дрозофилы ДНК метилирована, и эта модифика-
ция генома важна для развития насекомого, а
ДНК-метилтрансферазная активность выявляется
на ранних стадиях развития насекомого [Lyko
et al., 2000]. Мы всегда были убеждены в том, что
минорные основания в ДНК и сама энзиматиче-
ская модификация генома не могут быть бесслед-
ными в структуре генома и обязательно должны
сказываться на его биологических функциях.
3.1. Метилирование и его влияние
НА СТРУКТУРУ ДНК И ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ
С БЕЛКАМИ
Нам удалось найти такую необычную при-
родную двутяжевую ДНК (ДНК бактериофага
AR9 Вас. brevis), у которой вместо обычного для
ДНК тимина присутствует характерное для РНК
основание урацил. Так что в принципе урацил
прекратил свое существование в качестве отли-
чительного признака РНК. Грубо говоря, ура-
цил — это тот же тимин, но без метильной груп-
пы. Урацилсодержащая ДНК бактериофага AR9
плавилась (денатурировала) при гораздо более
низкой температуре, чем эквивалентная ей по
составу нормальная тиминсодержащая ДНК [Ва-
нюшин и др., 1970]. Стало ясно, что метилиро-
вание остатков цитозина небезразлично для са-
Рис. 3.2. Комплекс цитозиновой ДНК-метилтрансфе-
разы с ДНК.
мой структуры ДНК. Это было первым надеж-
ным указанием на то, что метильные группы пи-
римидиновых оснований в ДНК стабилизируют
ее вторичную структуру. Еще более привлека-
тельным оказалось то, что метилирование ДНК
ощутимо сказывается на ее взаимодействии (свя-
зывании) с различными белками. В частности,
нами в ядрах растений выявлены белки, специ-
фически связывающиеся с регуляторными эле-
ментами генов рРНК (135 bp subrepeat element),
и продемонстрировано, что связывание некото-
рых из этих ядерных белков модулируется мети-
лированием in vitro цитозиновых остатков [Ashap-
kin etal., 1993]. Во многих случаях метилирова-
ние ДНК по цитозиновым остаткам препятствует
связыванию со специфично реагирующими с
ДНК ядерными белками (факторами), которые
осуществляют разные генетические процессы,
в том числе транскрипцию, репликацию и репа-
рацию ДНК. Так, например, предварительное
метилирование второго цитозинового остатка в
сайте CCGG во фрагменте гена рибосомной РНК
пшеницы лишало его способности связывать
один из ядерных пшеничных белков (рис. 3.3).
С другой стороны, известны и так называемые
m5CpG ДНК-связывающие белки, которые спе-
цифично аранжируют на ДНК весь ансамбль
сложных белковых комплексов, контролирующих
и осуществляющих экспресссию генов [Defossez,
Stancheva, 2011].
Неэнзиматическое метилирование ДНК.
Если ДНК без всяких белков проинкубировать с
меченым по метильной группе S-аденозил-Т-ме-
тионином, то через некоторое время его радио-
активность обнаруживается уже в составе ДНК в
56 ЭПИГЕНЕТИКА
1 2 3
ДНК-белковый комплекс
Рис. 3.3. Связывание ядерного белка пшеницы с DCR-
фрагментом (174 пар оснований) гена пшеничной рРНК
блокируется метилированием in vitro сайта CCGG ДНК-
метилтрансферазой Hpall.
1 —фрагмент рРНК предварительно метилирован с помо-
щью Нра1Г, 2, 3 — комплекс фрагмента гена рРНК с белком
[Ashapkin et al., 1995].
виде вновь возникших в ней остатков 5-метилци-
тозина и тимина. Так было открыто неэнзимати-
ческое метилирование ДНК (рис. 3.4) [Мазин и
др.. 1985]. Интересно, что при этом меченый ти-
мин в ДНК обнаруживался в гораздо более за-
метных количествах, чем т5С. Тем самым было
выявлено, что неэнзиматическое метилирование
ДНК в водном растворе сопровождается быст-
рым окислительным дезаминированием возник-
ших остатков т5С с превращением их в остатки
тимина. Это явилось доказательством того, что
метилирование остатков цитозина в ДНК может
приводить к С —> Т-транзиции (GC-napa основа-
ний заменяется АТ-парой), а остатки т5С служат
«горячими» мутационными точками. Само это
явление лежит в основе заметного частичного
исчезновения (супрессии) некоторых CpG-no-
следовательностей из генов и геномов разнообраз-
ных организмов и является одним из магистраль-
ных путей природного мутагенеза и эволюции.
Специфичность энзиматического метили-
рования ДНК. Существование в природе потен-
циальной возможности метилирования ДНК, по-
видимому, и было использовано появившимися
ДНК + метил* - SAM > метил*-ДНК + SAH
метилирование дезаминирование
Цитозин 5-метИЛЦИТОЗИН (5-метилурацил) ТИМИН
С G —> m5C ¥ G —> Т ♦ G
ТА GC
GO -л АТ (транзиция)
Рис. 3.4. Неэнзиматическое метилирование ДНК [Ма-
зин и др., 1985].
в эволюции особыми белками ферментами ДНК-
метилтрансферазами, которые, в отличие от хао-
тичного неэнзиматического метилирования ДНК,
модифицируют цитозиновые или адениновые ос-
татки в строго определенных нуклеотидных по-
следовательностях [Мазин, Ванюшин, 1990]. Мы
расшифровали одну из самых первых таких ме-
тилируемых нуклеотидных последовательностей
в ДНК у бактерий [Vanyushin, Dobritsa, 1975].
В клетках бацилл Вас. brevis цитозиновая ДНК-
метилтрансфераза метилирует цитозиновые ос-
татки (подчеркнуто) в последовательности (5')
GCTGC (3'). Позднее это было подтверждено в
работах нобелевского лауреата Р. Робертса. Ока-
залось, что метилирование ДНК у бактерий ле-
жит в основе явления так называемой хозяйской
рестрикции-модификации. Это явление в част-
ности означает, что выращенный в клетках того
или иного бактериального штамма бактериофаг
приобретает хозяйскую специфичность и спосо-
бен заражать только клетки этого хозяина (рест-
рикция — ограничение круга хозяев), поскольку
ДНК бактериофага метилирована хозяйскими
бактериальными ДНК-метилтрансферазами и тем
самым защищена от гидролиза чувствительными
к такому метилированию ДНК хозяйскими фер-
ментами эндонуклеазами. В частности, мы уста-
новили, что специфичность метилирования ДНК
по адениновым остаткам у бактериофага Т2 и его
хозяина Е. coli действительно одинакова [Vanyu-
shin etal., 1971]. В известной мере эти данные
наряду’ с другими послужили обоснованием хи-
мической природы явления хозяйской рестрик-
ции-модификации у бактерий. До этого мы убе-
дились в том, что ДНК у разных бактерий мети-
лирована по-разному и была установлена штам-
мовая и видовая специфичность метилирования
генома у микроорганизмов [Vanyushin et al.,
1968]. Более того, было показано, что характер
метилирования ДНК у бактерий изменяется при
диссоциации (R, S-формы) [Vanyushin et al., 1968]
и спорообразовании [Ванюшин и др., 1972]. По-
жалуй, эти данные явились одними из самых
первых указаний на то, что метилирование ДНК
связано с клеточной дифференцировкой у мик-
роорганизмов.
Предстояло еще выяснить, какова химическая
и биологическая специфичность метилирования
ДНК у эукариотических организмов, в том числе
у растений и животных. Еще до появления мето-
дов секвенирования ДНК, при анализе выщеп-
ляемых из ДНК пиримидиновых последователь-
ностей, нам удалось показать, что в геноме рас-
тений 5-метилцитозин содержится в пос ледова-
ГЛАВА 3 57
тельностях Ри-т5С-Ри, Ри-т5С-Т-Ри, Ри-т5С-С-Рп
и Ри-т5С-т5С-Рп [Кирнос и др., 1981]. Это сов-
пало с появившимися позднее данными группы
А. Разина (Израиль) о метилировании остатков
цитозина в сайтах CG и CNG в растительных и
животных ДНК [Gruenbaum etal., 1982]. По на-
шим данным, в геноме растений значительная
доля (около 30 %) 5-метилцитозина содержится
именно в последовательностях m5CNG [Кирнос
и др., 1981]. Существование ш5С в CNG-сайтах,
в особенности у животных, долгое время вообще
не признавалось, и первые сообщения об этом
даже вызывали резкое недоверие и неприятие.
Между’ тем, такое метилирование ДНК действи-
тельно осуществляется и в животных клетках, и
оно имеет существенное биологическое значе-
ние. Метилирование цитозиновых остатков в этих
и асимметричных последовательностях в основ-
ном и наблюдается при индуцированном малы-
ми двутяжевыми РНК метилировании ДНК, со-
пряженном с инактивацией генов [Wassenegger
etal., 1994]. У растений выявлен фермент, кото-
рый метилирует цитозиновые остатки в любом
контексте за исключением CpG [Wada et al.,
2003]. Таким образом, в принципе, природа хи-
мической специфичности метилирования ДНК
у растений и животных установлена.
У растений арабидопсиса довольно сильно
метилирована ДНК центромерной и перицен-
тромерной областей гетерохроматина, в особен-
ности это касается транспозонов и других по-
вторяющихся последовательностей. ДНК эухро-
матина метилирована гораздо меньше, т5С най-
ден как в межгенных областях, так и в отдель-
ных генах. Около 55 % т5С содержится в CG-,
23 % — в CNG и 22 % — в CNN-последователь-
ностях | Vanyushin, Ashapkin, 2011]. Все три типа
метилированных последовательностей найдены
в повторах центромерных областей хроматина, а
тела генов почти исключительно метилированы
по CG-сайтам. Соответствующие кодирующие
siRNA области генома содержали значительное
количество остатков 5-метилцитозина в CG-,
CNG- и CNN-сайтах. Более 60 % экспрессируе-
мых генов неметилированы вовсе. 5'- и З'-конце-
вые проксимальные части метилированных ге-
нов относительно гипометилированы. Неметили-
рованные гены обычно транскрибируются весь-
ма умеренно, и они значительно обогащены ге-
нами, кодирующими факторы транскрипции. Ге-
ны с метилированным промотором транскриби-
руются относительно слабо и тканеспецифично.
При всех обстоятельствах метилирование про-
мотора имеет большее значение для инактива-
ции (сайлесинга) генов, чем метилирование соб-
ственно тела гена [Vanyushin, Ashapkin, 2009,
2011]. К удивлению, профиль метилирования
ДНК у тройных б//7и/-б//77?2-с7и/3-мутантов не
отличался сильно от такового у растений дикого
типа и более 90 % метилируемых сайтов оказа-
лись метилированными. Таким образом, у рас-
тений арабидопсиса существует мощная ком-
пенсаторная система защиты статуса метилиро-
вания от генома выпадения функций отдельных
генов ДНК-метилтрансфераз.
Что касается биологической специфичности
метилирования ДНК у эукариот, мы уже давно
знали, что оно видоспецифично: у многих беспо-
звоночных степень метилирования генома очень
мала; как уже упоминалось, в ДНК дрозофилы
долгое время пгС вообще не могли обнаружить,
а у позвоночных в ДНК т5С всегда обнаружива-
ется в ощутимых количествах, в ДНК растений
его уже вовсе нельзя назвать «минорным» осно-
ванием: часто в этих ДНК т5С по количеству
вполне сопоставим с цитозином. Например, в
сателлитной ДНК у пролески почти весь цитозин
представлен его метилированным производным
(ш5С).
Мы установили, что наряду’ с видовой суще-
ствуют также тканевая (клеточная) [Vanyushin
et al., 1970, 1973], субклеточная (органоидная) и
возрастная [Бердышев и др., 1967; Ванюшин,
Бердышев, 1977] разнокачественность (специ-
фичность) метилирования ДНК у животных и
растений. Здесь уместно привести признание
одного из наших американских коллег, Крейга
Куни [Cooney, 1999]: «...Русские показали, что
метилирование ДНК у животных уменьшается с
возрастом. Это было интригующим указанием
на то, что старение и уменьшение метилирова-
ния ДНК идут рука об руку. Означает ли это, что
существует связь между старением клеток и
уменьшением уровня метилирования ДНК? Ско-
рее всего, да. Борис Ванюшин и его сотрудники
в Москве первыми показали еще в 1960 годах и
опубликовали в 1967 году’, что у горбуши уро-
вень метилирования ДНК уменьшается с возрас-
том. Они же показали, что это происходит также
и в большинстве органов у стареющих коров и
крыс. Позднее несколько групп ученых в США и
Японии обнаружили, что и у мышей при старе-
нии уменьшается метилирование ДНК». Теперь
возрастное падение уровня метилирования ДНК
стало вполне очевидным, и некоторые исследо-
ватели даже склонны считать, что степень мети-
лирования ДНК может служить некими биоло-
гическими часами, по которым можно судить
58 ЭПИГЕНЕТИКА
о возрасте и прогнозировать продолжительность
жизни. Искажение метилирования ДНК может
приводить к преждевременному’ старению.
Мы нашли существенные возрастные изме-
нения в характере метилирования ДНК и у рас-
тений [Дрожденюк и др., 1975, 1976, 1977; Са-
вельев и др., 1990]. Метилировние ДНК у расте-
ний изменяется в течение всего онтогенеза, на-
чиная с прорастания семян вплоть до конечных
стадий развития растения, в том числе и при
апоптозе [Ванюшин, 2001] и феноптозе (термин
предложен В. П. Скулачсвым) — запрограмми-
рованной гибели организма, которая особенно
ярко и иногда даже «драматично» выражена у
монокарпических растений. (Нам довелось са-
мим много лет назад видеть в Батумском бота-
ническом саду’ очень грустную картину’ — боль-
шую многолетнюю «плантацию» бамбука, вы-
мершую в одночасье вскоре после цветения. Как
и у нерестующей горбуши [Бердышев и др.,
1967], запрограммированная гибель растений
бамбука сопровождалась глобальным уменьше-
нием степени метилирования ДНК (неопублико-
ванные данные) во всех органах). Скорее всего,
это — общебиологическое явление, и, по-види-
мому, оно определяется гормональным контро-
лем как у животных, так и у растений. Так что
«флориген» М. X. Чайлахяна может быть ответ-
ственным не только за индукцию цветения, но и
за феноптоз в результате модуляции гормонами
метилирования генома [Башките и др.. 1978,
1979, 1980а, б; Артюховская и др., 1986; Ваню-
шин и др., 2002; Кирнос и др., 1986, 1987].
Мы обнаружили, что в разных клетках одного
и того же организма ДНК метилирована по-
разному, и, стало быть, метилирование генома
связано с клеточной дифференцировкой. Это
позволило нам первыми заявить, что метилиро-
вание ДНК — механизм регуляции экспрессии
генов и клеточной дифференцировки [Vanyushin
et al., 1970]. Эта и другие наши работы привлек-
ли очень большое внимание многих исследова-
телей у нас и за рубежом и послужили толчком к
интенсивному исследованию метилирования ДНК
во всем мире. Тканевая разнокачественность ме-
тилирования суммарной ДНК или отдельных
генов свойственна также и растениям.
Установлено, что в митохондриях и ядре од-
ной и той же клетки ДНК метилированы по-раз-
ному. В митохондриальной ДНК сердца быка
обнаружен 5-метилцитозин [Vanyushin, Kimos,
1974]. Характер распределения 5-метилцитозина
по пиримидиновым изоплитам в митохондриаль-
ной и ядерной ДНК различен. Наряду’ с этим,
нами была выделена цитозиновая ДНК-метил-
трансфераза из митохондрий животных и пока-
зано, что этот фермент обладает иной сайтовой
специфичностью действия по сравнению с ядер-
ной ДНК-метилтрансферазой [Кудряшова и др..
1976]. Так, была открыта субклеточная (орга-
нелльная) специфичность метилирования ДНК.
В отличие от животных у растений мы не нашли
5-метилцитозин в ДНК митохондрий, зато в них
обнаружен/'/-мстиладснин | Vanyushin et al., 1988].
В отличие от сильно метилированных ядерных
ДНК высших растений, их хлоропластные ДНК
неметилированы [Ванюшин, Огаркова. 1990].
Имеются единичные сведения о том, что ДНК
иных пластид (лейкопласты, хромопласты, ами-
лопласты) высших растений могут содержать
разные минорные метилированные основания, и
предполагается, что метилирование ДНК может
участвовать в дифференцировке пластид [Ngem-
prasirtsiri et al., 1988], однако эти данные и пред-
положения пока еще никем не подтверждены.
3.2. ДНК-МЕТИЛТРАНСФЕРАЗЫ
У растений обнаружено как минимум три
класса цитозиновых ДНК-метилтрансфераз и
более дюжины генов, кодирующих ДНК-метил-
трансферазы (табл. 3.2, рис. 3.5) [Finnegan, Ko-
vac, 2000; Vanyushin, Ashapkin, 2007, 2009]. Это
гораздо больше, чем у всех известных эукариот.
Цитозиновые ДНК-метилтрансферазы клас-
са METI. Эти ферменты осуществляют так на-
зываемое поддерживающее метилирование CpG-
сайтов при репликации ДНК, в целом обеспечи-
вая сохранение и передачу- по наследству общей
картины (pattern) метилирования этих сайтов в
геноме. Поэтому- не удивительно, что МЕТ1 гены
экспрессируются во всех органах (рис. 3.6), а
собственно само тело этих генов как у растений
дикого типа, так и у разных полученных нами
трансгенных растений арабидопсиса практиче-
ски неметилировано (рис. 3.7). Это же свойст-
венно и гену’ главной поддерживающей метили-
рование CpNpG-сайтов ДНК-метилтрансферазы
СМТЗ (рис. 3.8). Экспрессия этого гена весьма
консервативна: у трансгенных линий арабидоп-
сиса с антисмысловой конструкцией МЕТ1 под
индуцибельным промотором экспрессия этого
гена значительно не изменяется в зависимости
от индукции конструкта (рис. 3.9).
Гены семейства МЕТ1 имеют общую струк-
туру’ в виде 10 консервативных мотивов, кото-
рые в большинстве случаев расположены в од-
ном и том же порядке и разделены последова-
ГЛАВА 3 59
Таблица 3.2
Цитозиновые ДНК-метилтрансферазы растений
Семейство Сокра- щенное наимено- вание Синонимы Локус, координаты, nts Наличие доменов Экспрессия Функция
MET1 METI, DMT1, DDM2 AT5G49160, 19949456- 19955595 BAH (2) m5C-DNA- methyltransferase Во всех органах, особенно активно делящихся Главная поддерживающая CpG-метилаза
MET MET2a METH, MET2, DMT2 AT4G14140, 8146340- 8152126 BAH (2) m5C-DNA- methyltransferase Аналогично МЕТ1, но в 10 000 раз слабее Не установлена
MET2b DMT8, METIIb AT4G08990, 5764778- 5770493 BAH (2) m5C-DNA- methyltransferase Не изучена Не установлена
MET3 DMT3, METIII AT4G13610, 7915018- 7921227 BAH (2) m5C-DNA- methyltransferase Не изучена Неизвестна, у экотипа Columbia поврежден
CMT1 DMT4 AT1G80740, 30347286- 30351940 BAH, Chromo, m5C-DNA- methyltransferase Не обнаружена Неизвестна, у экотипа Columbia поврежден
CMT CMT2 DMT5 AT4G19020, 10414537- 10421211 BAH, Chromo, m5C-DNA- methyltransferase Аналогично МЕТ1, но в ~10 раз слабее Вторая поддерживающая CpNpG-метилаза
CMT3 DMT6 AT1G69770, 26251990- 26257248 BAH, Chromo, m5C-DNA- methyltransferase Во всех органах, особенно в частях цветка Главная поддерживающая CpNpG-метилаза
DRM1 DMT9 AT5G15380, 4991350- 4994829 UBA (2) m5C-DNA- methyltransferase Не обнаружена Вторая de novo ДНК-метилаза?
DRM DRM2 DMT7 AT5G14620, 4715256- 4718707 UBA (2) m5C-DNA- methyltransferase Во всех органах Главная de novo ДНК-метилаза
DRM3 DMT10 AT3G17310, 5909007- 5913248 m5C-DNA- methyltransferase Не обнаружена Не установлена
те леностями варьирующих структуры и длины.
Мотивы I и X участвуют в связывании с S-адено-
зилметионином, мотив IV содержит консерва-
тивный дублет Pro-Cys, образующий активный
сайт переноса метильной группы, вариабельная
область между мотивами VIII и IX содержит уз-
нающий домен (TRD — target recognition domain),
обеспечивающий узнавание специфического сай-
та метилирования. Большой домен, содержащий
каталитический центр, включает мотивы I—VIII
и большую часть X, в то время как малый состо-
ит из TRD и мотива IX. При взаимодействии со
специфическим сайтом метилируемый остаток
цитозина «выворачивается» из двойной спирали
МЕТ1 Е
МЕТ2а С
МЕТ2Ь [
МЕТЗ
СМТ1
СМТ2
СМТЗ
DRM1
DRM2
DNMT2
Рис. 3.5. Семейство цитозиновых ДНК-метилтрансфе-
раз Arabidopsis thaliana [Vanyushin, Ashapkin, 2009].
ЮОаа
Dornin
BAH
^] DNA-methyltransferase
I I Chromo
UBA
60 ЭПИГЕНЕТИКА
Цветок Стебель Лист Корень
Рис. 3.6. Транскрипция гена МЕТ1 у Arabidopsis thaliana [Ашапкин и др.,
2011].
1 —дикий тип; 2 — трансгенное растение без индукции антисмысловой /ИЕП-конст-
рукции; 3 — то же растение после обработки Си.
pMat4 probe _
pYc2 DMA probe
MET1 probe pYc8 DMA probe
WT, 34-7066-3 + Си, pYc2-768-5,
1 kbr
Рис. 3.7. Характер цитозинового метилирования гена МЕТ1 у Arabidopsis thaliana [Ашапкин и др., 2011].
WT — растения дикого типа. Остальные — наши трасгенные растения (мутанты) с антисмысловой конструкцией гена ДНК-ме-
тилтрасферазы МЕТ 1 под индуцибельным промотором. +Си — растения обработаны индуктором (Си). Черные кружки — най-
денные метилированные сайты, серые кружки — частично метилированные сайты, пустые кружки — неметилированные сайты.
ДНК в активный центр фермента. Образующаяся
при этом структура стабилизируется в результа-
те взаимодействия боковых аминокислотных
цепей из обоих доменов ДНК-метилтрансферазы
с распаренным остатком гуанина.
Первая секвенированная цитозиновая ДНК-
метилтрансфераза эукариот (мышиная) содержа-
ла 8 из 10 консервативных мотивов. Для клони-
рования аналогичной метилазы растений исполь-
зовали ПЦР с вырожденными праймерами, соот-
ветствующими двум наиболее консервативным
из них. Полученная в результате последователь-
ность. METI. кодировала белок, сходный с мы-
шиной метилтрансферазой Dnmtl. Оба фермента
существенно больше прокариотических цитози-
новых ДНК-метилтрансфераз за счет присут-
ствия большого неконсервативного N-концевого
домена, связанного с консервативным С-конце-
ГЛАВА 3 61
WT, 34-7066-3 + Cu,
pYc2_7066-4 + Cu-5,
pYc8-7066-1 + Cu
Н(—0,29) 1-1(0,03)
GCGC-сайты
34-7066-3
H(—0,29) H(0,03)
Mill lllliBIIIIIIIII
pYc8-7066-1,
pYc2-7066-4
Н(—0,29) Н(0,03)
__Lfea iinif ин ни i
MillIflliwi Itl Illi
Рис. 3.8. Характер цитозинового метилирования и транскрипции гена СМТЗ в листьях растений дикого типа и
трансгенных растений арабидопсиса [Ашапкин и др., 2011].
1 — растения дикого типа; 2—5 — трансгенные растения разных линий с индуцированной или неиндуцированной антисмысло-
вой конструкцией МЕТ1. Обозн. см. рис. 3.7.
WT
34-7066-3
CCGG-сайты
DRM2Str probe
DRM2Pro probe
1 kb
pYc8-7066-1
P(+3,6)
pYc2-768-5
pYc2-768-5 + Cu
P(—1,7)
H(—0,48) H(+0,02)
H(+2,1)
Корень Цветок Стебель
Лист
-3,4 kb
Nothem’s blots (DRJW2mRNA)
Рис.3.9. Характер метилирования CCGG-сайтов и транскрипции гена DRM2 у Arabidopsis thaliana [Ашапкин и др.,
2011].
62 ЭПИГЕНЕТИКА
вым доменом последовательностью повторяю-
щихся остатков Gly и Lys. Степень гомологии
между METI и Dnmtl по аминокислотной после-
довательности составляет около 50 % для С-кон-
цевого домена и лишь 24 % — для N-концевого.
В геноме арабидопсиса ген METI является
членом небольшого мультигснного семейства,
содержащего не более пяти генов, из которых
четыре частично изучены. Два из них, МЕТПа и
МЕТШ, тесно сцеплены, а два других, METI и
МЕТПЬ, находятся в разных локусах. Эти гены
являются результатом серии дупликаций одного
предкового гена. На это указывает консерватив-
ность их структуры, в том числе положения 1 1
интронов. Наиболее сходны несцепленные гены
МЕТПа и МЕТПЬ, которые, по-видимому, воз-
никли в результате самой недавней дупликации,
захватившей помимо кодирующей последова-
тельности также около 1700 пар оснований (Ьр)
5'- и около 1800 Ьр З'-флангов.
METI кодирует доминирующую по уровню
транскрипции метилтрансферазу. экспрессирую-
щуюся в вегетативных и цветочных тканях, при-
чем наиболее активно в меристематических клет-
ках. МЕТПа Ъ также экспрессируются во всех
тканях, но примерно в 10000 раз слабее, чем
METI. Экспрессия МЕТШ пока не изучена. У эко-
типа арабидопсиса Columbia (Col) этот ген содер-
жит два стоп-кодона внутри открытой рамки
считывания (ORF). поэтому’ его роль в метили-
ровании ДНК у арабидопсиса сомнительна. Прав-
да, у экотипа Landsberg erecta этот ген содержит
неповрежденную ORF.
Гомологи METI идентифицированы у расте-
ний моркови, гороха, томата и кукурузы, причем
у моркови и кукурузы найдено по два гена этого
класса. У моркови эти два гена гомологичны на
85 %, основное различие между’ ними связано с
присутствием повторяющейся последовательно-
сти 171 Ьр — пять копий в одном из генов и
лишь одна в другом. Характер экспрессии этих
генов в тканях моркови, по данным гибридиза-
ции in situ, несколько различается. Два иденти-
фицированных у кукурузы гена, возможно, яв-
ляются ортологами. У гороха пока удалось найти
только один ген этого класса.
От аналогичных ферментов млекопитающих
растительные ДНК-метилазы METI-класса отли-
чаются отсутствием характерного для первых
Cys-богатого Zn-связывающего участка в N-koh-
цевом домене и присутствием в нем так назы-
ваемой кислой области, содержащей не менее
50 % остатков глутаминовой и аспарагиновой
аминокислот, не найденной в Dnmtl-подобных
ДНК-метилазах у млекопитающих. По сравне-
нию с млекопитающими TRD-последователь-
ность в растительных ДНК-метилтрансферазах
этого класса имеет делению 40—41 а.к.о., и в
целом она менее консервативна, чем оставшаяся
часть метилтрансферазного домена. Это может
быть связано с различиями в субстратной спе-
цифичности, но возможно также и то, что вариа-
бельные аминокислоты просто несущественны
для узнавания. Для N-концевого домена мыши-
ной Dnmtl установлены три функции: 1) транс-
порт белка в ядро; 2) ассоциация с репликатив-
ными комплексами во время S-фазы; 3) дискри-
минация между’ полуметилированным и немети-
лированным ДНК субстратами, обеспечивающая
сильную избирательность действия фермента
в пользу’ полумстилированных сайтов.
3.3. Хромометилазы
Второй класс цитозиновых ДНК-метилтранс-
фераз у растений был обнаружен в 1998 г. прак-
тически случайно при анализе банков генов для
белков, содержащих так называемый хромодо-
мен, играющий существенную роль в белок-бел-
ковых взаимодействиях на уровне хроматина.
У арабидопсиса обнаружено небольшое мульти-
генное семейство (не менее трех генов) хромо-
метилаз (СМТ). Для генов этого семейства ха-
рактерна инсерция хромодомена между’ II и IV
консервативными мотивами метилтрансфераз-
ной последовательности. Хромодомен был впер-
вые обнаружен в белках дрозофилы Polycomb и
Heterochromatin 1, где он играет важную роль в
ассоциации с гетерохроматином. Хромодомен
этих белков обеспечивает ассоциацию с гетеро-
хроматином репортерного GFP-белка и в клетках
трансгенных растений. Отсюда следует очевид-
ное предположение о возможном участии хромо-
метилаз в метилировании ДНК гетерохроматина.
Как и ДНК-метилазы первого класса, хромоме-
тилазы содержат восемь консервативных моти-
вов; степень гомологии с ДНК-метилазами пер-
вого класса внутри этих мотивов составляет око-
ло 30—70 %, т. е. существенно ниже, чем степень
гомологии в пределах класса (65—100 %). N-Koh-
цевой домен у ДНК-метилтрансфераз СМТ-клас-
са варьирует по длине и не имеет сходства с ана-
логичным доменом метилтрансферазы METI-
класса. Интересно, что у’ некоторых экотипов
арабидопсиса первый обнаруженный ген этого
семейства (СМТ1) поврежден инсерцией транс-
позона. У экотипа Col он содержит мутацию,
приводящую к преждевременной терминации
ГЛАВА 3 63
трансляции. Тем не менее его транскрипты об-
наружены в вегетативных и цветочных тканях.
11о-видимому, у тех экотипов, где он не повреж-
ден, этот ген может играть какую-то функцио-
нальную роль. Гены СМТ2 и СМТЗ транскриби-
руются, причем СМТ2 — активнее, чем СМТ1 и
СМТЗ. Гены этого класса найдены также в гено-
мах Brassica и кукурузы (по Idf гена). У Brassica
они, по-видимому, гомологичны СМТ1 и СМТ2,
а у кукурузы они, скорее всего, ортологичны.
У животных ДНК-метилтрансферазы этого клас-
са пока вообще не найдены.
При анализе мутантов с полностью инактиви-
рованным геном СМТЗ оказалось, что наиболее
очевидным и выраженным последствием такой
инактивации является почти полное исчезнове-
ние метилирования ДНК по сайтам CpNpG. По-
скольку' такие сайты в ДНК растений представ-
ляют собой второй тип симметричных сайтов-
мишеней метилирования ДНК, логичен вывод,
что хромометилазы есть не что иное, как второй,
специфичный для высших растений тип поддер-
живающих цитозиновых ДНК-метилтрансфераз.
ДНК-метилтрансферазы семейства DRM
(domains rearranged methyltransferases). У жи-
вотных главную роль в метилировании ДНК de
novo выполняют метилтрансферазы Dnmt3a,b.
Они обладают соответствующей энзиматической
активностью in vivo и in vitro, и с нарушением их
активности связаны некоторые наследственные
заболевания человека. Гены, кодирующие гомо-
логичные этим метилазам полипептиды, обна-
ружены в геномах кукурузы и арабидопсиса. Со-
ответствующие белки у арабидопсиса и кукуру-
зы довольно сходны по всей длине (28 % иден-
тичных аминокислот в N-концевом домене и
66 % — в С-концевом). По последовательности
аминокислот в каталитическом домене эти белки
наиболее близки ВппйЗ-метилтрансферазам жи-
вотных (28 % идентичности). В то же время по
N-концсвому домену’ никакой гомологии с фер-
ментами животных у них не обнаружено.
Эти растительные ДНК-метилтрансферазы
лишены характерных для N-концевого домена
Dnmt3 -элементов в виде PWWP и Су s-богатого
мотивов. Расположение консервативных моти-
вов каталитического домена в найденных белках
отличается от обычного: вместо I, II, III. IV, V,
VI, IX, X (мотивы VII—VIII малоконсервативны
и у эукариот трудно различимы) у них — VI, IX,
X, I, II, III, IV, V. Точку- перестройки можно ло-
кализовать в области нескольких остатков ами-
нокислот междул мотивами X и I. Именно это об-
стоятельство послужило основанием для обозна-
чения найденных белков у арабидопсиса как
DRMs (domains rearranged methyltransferases). У
кукурузы гомолог обозначен как ZMET3, так как
это — третий обнаруженный у нее класс ДНК-
метилтрансфераз. С помощью этих последова-
тельностей гомологичная 3'-концевая кДНК-по-
следовательность найдена и в EST-банке сои
(#А1736568). Она кодирует полипсптидную цепь,
содержащую все консервативные мотивы в том
же порядке, как и в DRM и ZMET3. В трехмер-
ной структуре бактериальной цитозиновой ДНК-
метилтрансферазы M.Hhal начало мотива I со-
седствует с концом мотива X. Поскольку' в DRM
и ZMET3 они непосредственно соседствуют
в полипептидной цепи, можно предположить,
что, несмотря на перестройку' первичной струк-
туры в этих ДНК-метилтрансферазах, трехмер-
ная структура в целом не нарушена.
Построение филогенетического древа для
всех известных эукариотических ДНК-метил-
трансфераз на основании сходства аминокислот-
ных последовательностей каталитических моти-
вов I—IV показало, что DRM1, DRM2, ZMET3
и гомологичная последовательность сои явно
попадают в одну' группу' с Dnmt3 мыши и чело-
века и аналогичной метилазой рыбки полосатый
данио (zebrafish). Они являются ядерными бел-
ками (сигнальная последовательность типа Т ан-
тигена SV40), содержащими N-концевые UBA
(убиквитинсвязывающие) домены, характерные
для белков эксцизионной репарации ДНК.
Судя по результатам блот-гибридизации,
у' арабидопсиса и кукурузы эти белки являются
членами небольших мультигенных семейств.
У арабидопсиса гены DRM1 и DRM2 картирова-
ны в верхней части хромосомы V между' марке-
рами mi 174 и mi322 примерно на расстоянии
230 т.н. (1 сМ) друг от друга. В банке генов это-
го растения обнаружены еще три гомолога, но.
судя по последовательностям, все они представ-
ляют собой псевдогены. У кукурузы помимо
ZMET3 обнаружен еще один гомолог, содержа-
щий нарушенную консервативную последова-
тельность каталитического мотива IV; очевидно,
он тоже является псевдогеном. С помощью блот-
гибридизации показано, что транскрипт DRM2
(2,5 т.н.) легко обнаруживается во всех исследо-
ванных органах растения (корень, лист, цветок),
а транскриптов DRM1 не найдено.
Мы установили, что у растений арабидопсиса
ген DRM2 экспрессируется во всех органах, при-
чем особенно интенсивно в цветке (см. рис. 3.9).
Любопытно, что в теле гена один из CCGG-сай-
тов у' растений дикого типа и у трансгенных му-
64 ЭПИГЕНЕТИКА
тантов практически всегда метилирован (см.
рис. 3.9). Функциональная роль ДНК-метил-
трансфераз этого класса до последнего времени
оставалась загадочной. Эти ДНК-метилтрансфе-
разы у растений являются главными фермента-
ми, осуществляющими метилирование остатков
цитозина в ДНК de novo, т. е. в отсутствие мети-
лированного остатка в комплементарной цепи
ДНК. Больше того, выяснилось, что метилазы
этого класса «охотно» метилируют остатки ци-
тозина и в асимметричных последовательностях.
К тому’ же именно эти ДНК-метилтрансферазы
вовлечены в индуцированное малыми РНК ме-
тилирование ДНК и инактивацию генов (gene
silencing).
Функциональная роль ДНК-метилтранс-
фераз разных классов. Хотя вопрос об участии
отдельных метилаз в осуществлении метилиро-
вания ДНК того или иного типа в последние го-
ды в значительной мере прояснился, однако во
многом не изученным остается значение самого
существования различных типов метилирования
ДНК. В меньшей степени это относится к мети-
лированию CpG-типа и, соответственно, к фер-
ментам класса METI. Сама МЕТ1 без сомнения
является главной поддерживающей ДНК-метил-
трансферазой у растений. Это подтверждается не
только ее высокой гомологией с поддерживаю-
щей метилтрансферазой животных Dnmtl, но и
характером экспрессии: она преимущественно
экспрессируется в делящихся клетках меристе-
матических зон. Трансгенные растения, содер-
жащие антисенс-конструкции к METI, как и рас-
тения с мутацией в консервативном мотиве I
МЕТ1, имеют сниженный уровень метилирова-
ния уникальных и повторяющихся последова-
тельностей ДНК. При этом уменьшение метили-
рования касается в основном сайтов CpG, но оно
затрагивает, хотя и в меньшей степени, и мети-
лирование сайтов CpNpG.
Основной, если не единственной, мишенью
метилирования ДНК-метилтрансферазой METI
является симметричная последовательность CpG.
Уменьшение степени метилирования последова-
тельностей CpNpG при введении в растения ан-
тисенс-конструктов METI может быть не пря-
мым эффектом, а опосредованным другими ме-
тилтрансферазами. У гомозиготных самоопы-
ляющихся линий растений, дефектных по МЕТ1
и, соответственно, метилированию CpG-типа,
наблюдаются прогрессивные нарушения морфо-
генеза. Это представляется вполне логичным
следствием постепенно накапливающихся ано-
малий в регуляции тканеспецифической транс-
крипции генов в результате утраты метилиро-
ванных сайтов в их регуляторных последова-
тельностях. Однако в действительности все об-
стоит несколько сложнее. В клетках таких рас-
тений на фоне общего снижения степени мети-
лирования ДНК часто наблюдается локальное
гиперметилирование некоторых генов (напри-
мер, гена Superman), сопровождающееся харак-
терными фенотипическими проявлениями (го-
мейотические трансформации цветка). Мишенью
гиперметилирования в таких растениях служат
остатки цитозина в асимметричных CpNpN
и симметричных сайтах CpA/TpG, но никогда —
в симметричных сайтах CpG.
При спонтанных эпимутациях гена Superman
в растениях с активной ДНК-метилтрансферазой
METI (так называемые dark kent аллели) наблю-
дается гиперметилирование ДНК по сайтам всех
типов. Исследование растений, у которых актив-
ность метилтрансферазы METI существенно сни-
жена с помощью трансгенных антисенс-кон-
структов или мутаций по самому’ гену’ МЕТЕ в
течение ряда последовательных поколений об-
наружило постепенное накопление все более
выраженных аномалий развития, которые посте-
пенно исчезали при восстановлении активности
METI путем возвратного скрещивания с расте-
ниями дикого типа. Значит, причиной аномалий
является не собственно подавление активности
ДНК-метилтрансферазы, а постепенное накоп-
ление аномального недометилирования в генах,
регулирующих развитие.
Подытоживая, можно считать установлен-
ным, что METI является главной поддерживаю-
щей CpG ДНК-метилтрансферазой, прямо или
косвенно участвующей в регуляции транскрип-
ции многих генов. Влияние этой ДНК-метил-
трансферазы на метилирование других сайтов,
скорее всего, не является прямым эффектом,
а опосредовано другими метилтрансферазами.
Функции метилтрансфераз МЕТПа,Ь и МЕТШ
пока неизвестны. Транскрипция генов МЕТПа и
МЕТНЬ не меняется при введении в растения
трансгенных антисенс-конструктов МЕТЕ Анти-
сенс-конструкты к гену’ МЕТПа не влияют на
общий уровень метилирования ДНК и на разви-
тие растений.
Анализ ряда ноль-мутантов арабидопсиса по
гену СМТЗ (получены как супрессоры эпимута-
ций гена Superman) показал, что в них практиче-
ски полностью утрачено метилирование геном-
ной ДНК по симметричным сайтам CpNpG, но
практически не затронуто метилирование по
сайтам CpG. Аналогичную картину- наблюдали и
ГЛАВА 3 65
при анализе метилирования ДНК у мутантов ку-
курузы по гену’ 7.mel2. являющемуся гомологом
генов СМТ1 и СМТ 3 арабидопсиса. По-видимо-
му, СМТЗ является поддерживающей CpNpG-
метилтрансферазой. Степень уменьшения мети-
лирования асимметричных сайтов варьирует у
разных линий мутантных растений в широких
пределах и, по-видимому, является непрямым
эффектом. При сравнении фенотипа ноль-мутан-
тов по генам метилтрансфераз METI и СМТЗ,
а также характера экспрессии и метилирования
ряда генов оказалось, что для супрессии актив-
ности гена Superman существенно метилирова-
ние по сайтам CpNpG, но не CpG, в то время
как для гена fwa картина прямо противополож-
ная. Иными словами, экспрессия каждого кон-
кретного гена у растений может зависеть от ме-
тилирования любой из двух поддерживающих
ДНК-метилтрансфераз. Заметим, однако, что в
целом фенотипические последствия инактива-
ции METI существенно более выражены, чем
эффекты инактивации СМТЗ [Vanyushin. Ashap-
kin, 2009].
Очевидными кандидатами на роль фермен-
тов, ответственных за метилирование асиммет-
ричных последовательностей в ДНК растений,
являются метилтрансферазы семейства DRM.
Действительно, сохранение метилирования сай-
тов этого типа предполагает постоянное их ме-
тилирование de novo, а именно DRM-метил-
трансферазы являются гомологами de novo ме-
тилтрансфераз животных. Кроме того, метили-
рование асимметричных сайтов практически не
затронуто у многих линий растений с ноль-му-
тациями по генам METI и СМТЗ. У двойных
ноль-мутантов drml и drm2 арабидопсиса пол-
ностью отсутствует de novo ДНК-метилазная ак-
тивность, необходимая для инактивации транс-
генов. Однако прямой анализ метилирования
ряда индивидуальных последовательностей ДНК
у таких мутантов обнаружил, что метилирование
асимметричных сайтов полностью элиминиро-
вано в одних локусах, но лишь частично — в
других. С другой стороны, в некоторых локусах
частично элиминировано также метилирование
по сайтам CpNpG. У тройных мутантов drml-
drm2-cmt3 полностью элиминировано метилиро-
вание по асимметричным сайтам и сайтам CpNpG
и практически не затронуто метилирование по
сайтам CpG. Добавим также, что ни у двойных
б//ти/-б//ти2-мутантов, ни у одинарных cmt3-vi\-
тантов не наблюдалось заметных морфологичес-
ких аномалий, в то время как у тройных drml-
drm2-cml З-мутатов таких аномалий множество.
Это доказывает то, что функции DRM и СМТЗ
взаимозависимы и локусспсцифичны.
DRM-метилтрансфераза табака (NtDRMl)
действительно обладает активностью de novo ме-
тилтрансферазы. которая неизбирательно мети-
лирует остатки цитозина во всех сайтах, кроме
CpG [Wada et al., 2003]. Транскрипты генаNtDRMl
присутствуют во всех тканях растения. По-види-
мому, DRM действительно являются de novo ме-
тилтрансферазами, неизбирательно метилирую-
щими остатки цитозина во всех последователь-
ностях, кроме CpG.
Изучение биологической роли разных ДНК-
метилтрансфераз до сих пор практически не
учитывало их взаимных влияний как на уровне
транскрипции кодирующих их генов, так и на
уровне самих реакций метилирования ДНК. Ме-
жду’ тем, существование таких влияний не вызы-
вает сомнений: во-первых, от метилирования
ДНК зависит транскрипция многих генов, в том
числе и генов самих ДНК-метилтрансфераз, во-
вторых. все реакции энзиматического метилиро-
вания ДНК зависят от ее метилированности по
тем или иным сайтам, т. е. метилирование ДНК
одной метилтрансферазой может и должно вли-
ять на ее последующее метилирование другими
метилтрансферазами. Более того, в клетках выс-
ших растений (и других эукариот), по-видимому,
существует единая сложно организованная целая
система эпигенетической регуляции активности
генов. Все три типа метилирования ДНК тесно
«увязаны» не только друг с другом, но и с двумя
другими глобальными эпигенетическими систе-
мами, а именно системой модификации гистонов
и системой регуляции экспрессии генов малыми
РНК. Так, например, активность Lys-9-метилазы
гистона НЗ необходима для метилирования сай-
тов CpNpG метилтрансферазой СМТЗ, а само
метилирование гистона НЗ по остатку’ Lys-9 за-
висит от метилирования ДНК по сайтам CpG
метилтрансферазой METI. Показано также, что
именно малые РНК являются тем самым давно
искомым элементом сайт-специфического узна-
вания, который обеспечивает точное «наведе-
ние» цитозиновой de novo ДНК-метилтрансфера-
зы на определенные последовательности ДНК
[Wassenegger et al.. 1994].
Для углубленного изучения роли ДНК-ме-
тилтрансфераз и метилирования генома у расте-
ний мы задались целью получить трансгенные
растения арабидопсиса, которые содержат в ге-
номе экспрессируемые под разными индуци-
бельными промоторами (медь-, этанол- и стеро-
идзависимый) антисмысловые конструкции для
66 ЭПИГЕНЕТИКА
всех известных генов растительных ДНК-метил-
трансфераз. В принципе это могло дать нам дей-
ствительно уникальную возможность выключать
каждый из этих генов в любой последовательно-
сти и любой комбинации практически на любом
этапе развития растения по нашему’ выбору.
В результате мы получили целую коллекцию
таких трансгенных растений арабидопсиса. Дей-
ствительно, под воздействием индукторов нам
удалось избирательно инактивировать гены со-
ответствующих ДНК-метилтрансфераз, в том
числе и МЕТ] (см. рис. 3.6). Оказалось, что раз-
ные типы метилирования ДНК влияют друг на
друга. Так, наличие метилированного CG-сайта
увеличивает вероятность метилирования близ-
лежащих сайтов CNG, а наличие метилирован-
ного CNG-сайта увеличивает вероятность мети-
лирования близлежащих сайтов CNN. У ноль-
мутантов metl на фоне общего снижения уровня
метилирования ДНК часто гиперметилированы
промоторы некоторых генов по сайтам CNG и
CNN.
У комбинированных мутантов metl-drml-
drm2 заметно увеличено метилирование CNG в
структурной части многих генов, как бы отчасти
«заменяя» исчезнувшее CpG-метилирование. Та-
ким образом, множество ДНК-метилтрансфераз
и их генов у растений, по-видимому, имеет вза-
имный компенсаторный смысл, обеспечивая на-
дежную модификацию генома при различных, в
том числе и неблагоприятных, условиях внеш-
ней среды и при возможной инактивации от-
дельных элементов энзиматического эпигенети-
ческого контроля.
При изучении полученных нами трансгенных
растений арабидопсиса мы столкнулись с рядом
непредвиденных обстоятельств и проблем. Так,
у трансгенных растений с активными антисмыс-
ловыми конструктами генов цитозиновых ДНК-
метилтрансфераз морфологических изменений
может сразу и не быть или же они появляются в
последующих поколениях. В ходе селекции ус-
тойчивых гомозиготных трансгенных линий ара-
бидопсиса их фенотипические характеристики
могут заметно изменяться. Нередко селекция
таких растений невозможна из-за нарушений
формирования и созревания семян. Вопреки на-
шим ожиданиям, инактивация генов-мишеней
антисенсами может быть необратимой, т. е. со-
храняться и в отсутствие индуктора. Наконец,
эффекты выключения генов могут быть не след-
ствием отсутствия собственно той или иной
ДНК-метилтрансферазы, а результатом действия
на другие эпигенетические механизмы.
К сожалению, нам пока не удалось получить
трансгенные растения арабидопсиса с антисмыс-
ловыми конструкциями гена адениновой ДНК-
метилтрансферазы. Не исключено, что встраива-
ние таких конструкций в геном растения может
приводить к летальному’ исходу и такие мутанты
нежизнеспособны. Это в принципе может наво-
дить на мысль о том, что адениновое метилиро-
вание ДНК у растений, по крайней мере, функ-
ционально.
Функциональное значение метилирования
днк. Поскольку’ мы волей судеб оказались од-
ними из первых, кто задался вопросом о биоло-
гической роли метилирования ДНК на фоне об-
щего скепсиса относительно значения этой мо-
дификации генома, нам пришлось выбирать и
использовать самые разные биологические мо-
дели для доказательства исключительной роли
метилирования ДНК в жизнедеятельности орга-
низмов. Изначально мы исходили из принципа,
что если метилирование ДНК имеет какие-либо
биологические функции, то оно само, скорее все-
го, не может оставаться «равнодушным» к этим
функциям и, по крайней мере, должно более или
менее специфично изменяться при их индукции.
Так мы пришли к таким индуцируемым моде-
лям, как гидрокортизон—печень и обучение (па-
мять)—нейрон. И, действительно, оказалось, что
после введения животному’ гидрокортизона в его
печени сильно изменяется характер метилирова-
ния ДНК и это сопряжено с индукцией в ней
разных генов [Vanyushin et al., 1973]. Нами уста-
новлено, что при обучении в нейронах, а не дру-
гих клетках мозга изменяется характер метили-
рования ДНК. Найденные изменения в ДНК при
обучении — одно из первых указаний на участие
генома в формировании памяти [Ванюшин и др.,
1974].
У растений метилирование ДНК сильно из-
меняется при прорастании семян [Дрожденюк и
др., 1974, 1975, 1976; Сулимова и др., 19786],
переходе к цветению [Сулимова и др., 1978а;
Хвойка и др., 1978], после заражения разными
грибами и вирусами [Guseinov, Vanyushin, 1975;
Guseinov et al., 1975] и при поражении растения-
ми-паразитами [Ванюшин и др., 1979]. Стало по-
нятно, что инфекционные агенты могут тонко
воздействовать на организм растения, подчиняя
его своим «прихотям» путем модуляции метили-
рования хозяйской ДНК.
«Еще в 1977 г. русские сравнили характер ме-
тилирования ДНК в клетках крови у нормальных
и больных лимфолейкозом коров. В целом, уро-
вень метилирования ДНК у больных этим видом
ГЛАВА 3 67
рака крови животных оказался ниже. Это было
одним из самых первых свидетельств того, что
метилирование ДНК, по крайней мере, как-то
участвует в этой болезни либо в качестве ее при-
чины, либо в качестве следствия» [Cooney. 1999].
Действительно, в лимфоцитах крови крупного
рогатого скота при хроническом лимфолейкозе
характер метилирования генома резко изменяет-
ся [Бурцева и др., 1977]. На фоне очень высокой
ДНК-метилтрансферазной активности степень
тотального метилирования ДНК в раковых (лей-
козных) клетках животных существенно ниже, а
палиндромных последовательностей, наоборот,
гораздо выше, чем в нормальных клетках [Ro-
manov, Vanyushin, 1981]. В ядрах лимфоцитов
крови лейкозных коров были обнаружены, по
крайней мере, две ДНК-метилазные активности,
одна из которых резко отличалась по сайтовой
специфичности действия от ДНК-метилазной ак-
тивности из клеток здоровых коров. Все это и
позволило нам в числе первых обоснованно зая-
вить, что нарушение метилирования ДНК —
путь к раку. Теперь это стало истиной и получи-
ло подтверждение и развитие в работах С. Бей-
лина, Р. Ениша, П. Джонса, П. Пфайфера, М. Эр-
лих (все из США), Я. И. Бурьянова, Ф. Л. Кисе-
лева и многих других, а сведения о характере ме-
тилирования генов — ранний диагностический
признак рака. В известной мере сходные изме-
нения в характере метилирования ДНК и наборе
ДНК-метилтрансферазных активностей проис-
ходят и при «раковой» трансформации расти-
тельных клеток, в том числе и при агробактери-
альной трансформации и под воздействием раз-
ных инфекционных агентов.
У растений метилирование ДНК контролиру-
ется разными фитогормонами и специфическими
регуляторами роста и развития растений [Баш-
ките и др., 1978, 1979, 1980; Ашапкин и др.,
1986; Артюховская и др., 1986; Ковальская и др.,
1986; Ванюшин и др., 2002]. Под действием раз-
ных фитогормонов у растений заметно уменьша-
ется глобальное метилирование ДНК в клеточ-
ном цикле [Ванюшин и др., 1981; Кирнос и др.,
1986, 1987]. Кроме того, фитогормоны подавля-
ют метилирование вновь синтезируемых цепей
ДНК, не влияя на метилирование фрагментов
Оказаки (табл. 3.3) [Башките и др., 1980: Vanyu-
shin, 1984]. Так, впервые было установлено, что
фитогормоны действуют на геном растений пу-
тем модуляции его метилирования. Более того,
мы считаем, что именно модуляция метилирова-
ния ДНК является одной из ведущих сторон дей-
ствия гормонов у растений и животных. Не ис-
ключено, что гормон-рецепторные комплексы
могут конкурировать за места связывания и ме-
тилирования генома соответствующими ДНК-
метилтрансферазами.
Мы всегда рассматривали метилирование
ДНК как способ негативного или позитивного
контроля за активностью генов. В большинстве
случаев метилирование ДНК инактивирует гены,
однако уже имеются примеры того, что метили-
рование отдельных генов индуцирует их актив-
ность как у микробов (ген тот), так и у расте-
ний. Так, метилирование гена pMADS3 у петунии
стимулирует его экспрессию [Shibuya et al., 2009].
Механизмы этой стимуляции экспрессии гена
неизвестны. Предполагается, что метилирование
CG-сайта, по-видимому, препятствует сайт-спе-
цифичсскому связыванию некого репрессора с
сайлесерным элементом и таким образом стиму-
лирует экспрессию гена. Метилирование двена-
дцати CG-сайтов в тройном тандемном повторе
у гена PHERES1 арабидопсиса является обяза-
тельным условием экспрессии отцовского алле-
ля [Makarevich etal., 2008]. Предполагается,
что замалчивание материнского аллеля с геном
PHERES1 в центральной клетке женского гаме-
тофита осуществляется деметилированием с по-
мощью гликозидазы DME. Пока это лишь два
примера того, что метилирование ДНК позитив-
но влияет на транскрипцию генов у растений.
Как правило, подавление метилирования ДНК у
мутантов с дефектами метилирования генома
или у растений под влиянием ингибиторов ДНК-
метилтрансфераз сопровождается наследуемы-
ми фенотипическими изменениями, вызванными
эктопической реактивацией разных молчащих
генов.
Метилирование цитозиновых остатков в ДНК
растений вовлечено в замалчивание повторяю-
щихся трансгенов [Matzke, Matzke, 1995] и раз-
Таблица 3.3
Степень метилирования вновь синтезированной
ДНК в суспензионной культуре клеток табака и
/.-клетках мыши [Кирнос и др., 1988а, б; Vanyushin,
Kirnos, 1988]
Клетки и условия выращивания 100 х т5С/С + т5С
Репликативные фрагменты ДНК
< 5S > 5S
Клетки табака 17,0 ± 0,4 40,2 ± 0,3
Клетки табака + 2,4-Д (5 мг/л) 20,2 ± 0,6 20,1 ± 0,5
L-клетки мыши 2,8 ± 0,2 4,2 ± 0,1
68 ЭПИГЕНЕТИКА
личных мобильных элементов [Brutnell, Della-
porta, 1994; Martienssen, Baron, 1994; Schlappi
etal., 1994]. Это позволяет рассматривать такое
метилирование ДНК как механизм избиратель-
ной инактивации встроенных в геном чужерод-
ных генов, в том числе и разных элементов ви-
русной природы.
Ингибитор метилирования ДНК 5-азацитидин
подавляет образование адвентивных побегов у
петунии, а метилирование цитозиновых остатков
в CCGG- и CGCG-сайтах в генах MADS-box и
CDC48 позитивно коррелирует с индукцией об-
разования адвентивных побегов [Prakash et al.,
2003]. Обработка растений 5-азацитидином при-
водит к наслсдуемым карликовости у риса [Sano,
2002] и увеличению белковости зерновок у пше-
ниц [Ванюшин и др., 1990]. У трансгенных рас-
тений риса индуцированная 5-азацитидином экс-
прессия гена bar исчезает примерно через 50 дней
[Kumpatla, Hall, 1998]. Это означает, что расте-
ния обладают способностью со временем более
или менее восстанавливать исходный статус ме-
тилирования их генома, нарушенный этим хи-
мическим деметилирующим ДНК агентом. Ана-
логичную картину мы наблюдали у пшениц, у
них индуцированное 5-азацитидином увеличе-
ние белковости зерновок сохранялось лишь в не-
скольких поколениях [Ванюшин и др., 1990].
Метилирование ДНК контролирует цветение
растений [Finnegan etal., 1996]. Так, например,
обработка 5-азацитидином, как и антисмысловая
инактивация гена МЕТ1, делают ненужной яро-
визацию у холодозависимых растений арабидоп-
сиса [Bum et al., 1993; Finnegan et al., 1998]. Ме-
тилирование ДНК регулирует экспрессию ре-
прессора цветения FLC [Finnegan etal., 1998,
2004]. На самом деле, холодовая обработка
(стресс) приводит к частичному деметилирова-
нию ДНК у многих растений, что, скорее всего,
сопряжено с холодовой индукцией неких особых
белков. ДНК озимых сортов пшениц метилиро-
ваны в большей степени, чем яровых [Sherman,
Talbert, 2002].
Метилирование ДНК — один из механизмов
геномного импринтинга и регуляции всей про-
граммы развития. В эндосперме особые области
ДНК при материнском типе наследования оказа-
лись гипометилированными, а при мужском ти-
пе наследования они по метилированию были
такими же, как в зародыше или листе [Lauria
etal., 2004]. Широко известная сомаклональная
изменчивость в культурс растительных клеток и
тканей обусловлена не только мутациями, но и
эпимутациями, в том числе и существенным из-
менением профиля метилирования ДНК [Miguel,
Магат, 2011].
Метилирование ДНК может существенно мо-
дулироваться различными биологическими (ви-
русы. бактерии, грибы, паразитические расте-
ния) и абиотическими факторами (стрессами),
влияющими на рост и развитие растений. Любо-
пытно, что повышенный уровень радиации в ре-
зультате Чернобыльской катастрофы привел к
сильному' увеличению глобального метилирова-
ния генома у многих растений [Kovalchuk et al.,
2003]. Профиль метилирования ДНК может за-
метно изменяться под воздействием среды, обыч-
но у стресс-толерантных и неустойчивых к тому’
же стрессу растений он различен. Так, например,
ДНК солеустойчивых мангровых деревьев, рас-
тущих в соленых болотах, оказались гипомети-
лированными по сравнению с ДНК этих деревь-
ев, растущих на речных пресноводных участках
[Lira-Medeiros etal., 2010]. Таким образом, эпи-
генетическая вариабельность в естественных рас-
тительных популяциях, по-видимому, важна для
адаптации растений к условиям среды.
Поражение растений хлопчатника вилтом со-
провождается искажением метилирования по-
вторяющихся, но не уникальных последователь-
ностей в геноме растения [Guseinov, Vany ushin,
1975]. Существено изменяется характер метили-
рования суммарной ДНК у растения-хозяина
(люцерна) при развитии на нем растения-пара-
зита (Cuscuta sp.) [Ванюшин и др., 1979]. Таким
образом, грибы, вирусы и друтие инфекционные
агенты путем модуляции метилирования ДНК
могут переключать программу’ работы генов хо-
зяина в свою пользу. С друтой стороны, расте-
ния способны на свой лад модифицировать ви-
русные ДНК, которые не встроены в хозяйский
геном. Так, неинкапсулированная ДНК вируса
мозаики цветной капусты быстро становится ме-
тилированной в листьях турнепса по всем сай-
там Hpall/MspI [Tang, Leisner, 1998].
«Правильное» метилирование может стаби-
лизировать свободную чужеродную ДНК в клет-
ках растения-хозяина [Rogers, Rogers, 1992]. При
трансформации клеток ячменя наиболее ста-
бильной оказалась вирусная ДНК с полностью
метилированными CG-сайтами, а та же ДНК, ме-
тилированная только по адениновым остаткам,
быстро деградировала. Таким образом, в клетках
ячменя определенно имеется некая система рас-
познавания неправильно метилированных ДНК,
обеспечивающая их быстрое удаление из деля-
щихся клеток [Ibid]. Эти интригующие сведения
могут указывать на существование системы хо-
ГЛАВА 3 69
зяйской рестрикции-модификации у растений,
что хорошо согласуется с нашими данными о вы-
явлении у растений специфических эндонуклеаз,
распознающих статус метилирования ДНК [Fedo-
reyeva et al., 2007; Александрушкина и др., 2009].
Таким образом, на самом деле цитозиновое
метилирование ДНК контролирует рост и разви-
тие растений. Как и у животных [Holliday, Pugh,
1975; Razin, Riggs, 1980; Bird, 1992; Razin, 1998],
оно участвует в регуляции всех генетических
процессов, в том числе транскрипции, реплика-
ции, репарации ДНК, клеточной дифференциров-
ке, геномном импринтинге и транспозиции генов.
Репликативное метилирование ДНК и на-
следование характера метилирования генома.
Нас давно интересовал вопрос о том, когда и в
какой степени метилируются ДНК в клеточном
цикле у растений и животных. Известно, что
синтез одной из цепей ДНК при репликации дву-
тяжевых ДНК происходит непрерывно, а другой
прерывисто с образованием относительно ко-
ротких фрагментов (фрагменты Оказаки), кото-
рые затем сшиваются в одну непрерывную цепь
(рис. 3.10). Мы задались целью выделить эти
фрагменты по мере синтеза (репликации) ДНК и
выяснить, метилированы ли они или нет. Оказа-
лось, что при выращивании клеток растений и
животных в среде при высокой концентрации
клеток синтез ДНК в них ограничивается обра-
зованием коротких интактных фрагментов без
их лигирования [Башките и др., 1980: Kiryanov
etal., 1980; Ванюшин и др., 1981; Кирьянов
и др., 1982; Vanyushin, 1984; Vanyushin, Kimos,
1988]. Эти фрагменты нам удалось получить в
ощутимых количествах и изучить их метилиро-
вание. Они на самом деле представляли собой
фрагменты Оказаки, которые в условиях чейз-
эксперимента сшивались с образованием нормаль-
ных длинных тяжей ДНК. Оказалось, что фраг-
менты Оказаки метилированы (см. табл. 3.3,
рис. 3.10) | Vanyushin, 1984; Vanyushin, Kimos,
1988; Кирнос и др., 1988а—в]. Так было открыто
и документировано собственно репликативное
метилирование ДНК у растений и животных, и
предполагалось, что ДНК-метилтрансферазы мо-
гут входить в состав репликативного комплекса
| Vanyushin. Kimos. 1988; Александрушкина и др.,
1991; Кирнос и др.. 1993. 1986].
Нам удалось выделить и частично очистить
белковую фракцию с цитозиновой ДНК-метил-
трансферазной активностью из хроматина про-
ростков пшеницы, выращенных в присутствии
5-азацитидина [Власова и др., 1992]. Скорее все-
го, это была в основном именно репликативная
ДНК-метилтрансфераза, прочно связанная с
вновь сформированным хроматином. Пшенич-
ная цитозиновая ДНК-метилтрансферазная ак-
тивность модулировалась фитогормонами [Вла-
сова и др., 1994, 1996].
По степени и специфичности метилирования
сформированные in vivo в проростках пшеницы
фрагменты Оказаки отличались от лигирован-
ных интермедиатов репликации и зрелой ДНК
(см. табл. 3.3). В отличие от метилирования ли-
гированной ДНК метилирование фрагментов
Оказаки устойчиво к действию различных инги-
биторов реакции метилирования (S-изобутиладе-
нозин и другие) и не подавляется гормонами
(ауксины у растений) [Кирнос и др., 1984, 1988а,
б]. Мы пришли к выводу’, что в ядре имеется не-
сколько ДНК-метилтрансфераз [Кирьянов и др.,
1982], и метилирование ДНК на разных стадиях
репликации может осуществляться разными по
специфичности действия ферментами. Это пол-
ностью согласуется с современными сведениями
о множественности ядерных ДНК-метилтранс-
фераз у животных и растений. Затем нам удалось
дискриминировать репликативное и постреплика-
тивное метилирования ДНК у растений [Кирнос
и др., 1984, 1986, 1987, 1988а—в]. Эти процессы
различаются по специфичности метилируемых
Рис. 3.10. Репликативное метилирование ДНК.
70 ЭПИГЕНЕТИКА
Рис. 3.11. Регуляция метилированием репликации ДНК в клеточном цикле [Vanyushin, Kirnos, 1988].
последовательностей в ДНК и по чувствительнос-
ти к разным гормонам и ингибиторам.
Мы предложили и описали [Кирнос и др.,
1983; Vanyushin, Kirnos, 1988] механизм при-
родной регуляции репликации ДНК метилиро-
ванием (рис. 3.11). Это удалось нам сделать бла-
годаря удивительному' подарку' природы — су-
ществованию синхронного развития злаков. Ока-
залось, что при развитии проростков пшеницы в
стандартизированных условиях в их первом лис-
те и колеоптиле происходит природный выра-
женный синхронный и периодичный синтез (ре-
пликация) ДНК (рис. 3.12) [Кирнос и др., 1983].
Такой степени синхронизации деления клеток не
удается получить даже у бактерий, не говоря
у'же о ку'льту'рах клеток животных и растений, в
том числе и с применением самых ухищренных
современных способов синхронизации. В листе
мы выявили по крайней мере пять четких пиков
синтеза (репликации) ядерной ДНК (см. рис. 3.12).
Тем самым, в терминах ДНК целый интактный
орган растения (лист) можно рассматривать как
одну' клетку'. Причем, в отличие от искусствен-
ных суспензионных культу'р клеток в этом ин-
тактном органе на растении функционируют все
сигнальные системы организма. Нам оставалось
лишь выделить из первых листьев ДНК в начале,
середине и после репликации и установить как
метилированы их отдельные цепи. Для этой цели
мы выращивали проростки в присутствии 5-бром-
у'рацила, чтобы вновь синтезируемые цепи ДНК
были утяжеленными, выделяли ДНК и с помо-
щью центрифугирования в градиенте плотности
CsCl разделяли цепи исходной материнской (лег-
кой) ДНК и заново синтезированной в клеточ-
ном цикле (тяжелой) ДНК. Перво-наперво было
Возраст проростка, ч
Рис. 3.12. Природный синхронный синтез ДНК в колеоптиле (а) и первом листе (б) этиолированных проростков
пшеницы.
1 — радиоактивность ДНК, 2 — содержание ДНК в листе [Кирнос и др., 1983].
ГЛАВА 3 71
установлено, что в результате репликации у рас-
тений образуются полумстилированныс дуплек-
сы ДНК и молскулы /ТНК сильно асимметричны
по степени метилирования комплементарных
цепей. Эта асимметрия цепей уменьшается к
концу клеточного цикла, и перед новой реплика-
цией полумстилированныс сайты становятся
вновь полностью метилированными. Репликация
полумстилированных ДНК в клетке, по-видимо-
му, запрещена, так как она приведет к утрате
эпигенетического сигнала [Кирнос и др., 1988а, б;
Vanyushin, Kimos, 1988]. Много позже нас было
показано, что такая регуляция репликации реа-
лизуется б/<7/и-мстилированисм у бактерий. Те-
перь стало более или менее понятным, как про-
исходит передача этого сигнала (характера ме-
тилирования) ДНК по наследству.
Как уже отмечалось, при репликации возни-
кают полумстилированныс ДНК, в таком со-
стоянии, по-видимому, и работает большинство
генов в интерфазном ядре. Перед очередным ра-
ундом репликации генома и делением клетки
ДНК-метилтрансферазы поддерживающего типа,
в частности dmtl (они поддерживают наследст-
венный статус метилирования генома), метили-
руют полумстилированныс сайты с образовани-
ем полностью метилированных сайтов. Метили-
рованный цитозин в одной цепи служит сигна-
лом для метилирования этим ферментом цито-
зинового остатка в оппозитной комплементар-
ной цепи. При этом гены инактивируются
(транскрипция — стоп!), и они в принципе гото-
вы к репликации (она разрешена), когда клетка
завершает свой цикл (см. рис. 3.11). Таким обра-
зом, характер метилирования ДНК наследуется!
Например, установлено, что обработка растений
пшеницы ингибитором метилирования ДНК —
5-азацитидином — приводит к наследуемому в
нескольких поколениях сильному’ (иногда более
чем на 30 %) увеличению белковости зерна
(рис. 3.13) [Ванюшин и др., 1990]. Такое и не
снилось генетикам и селекционерам. Обычно
гены запасных белков довольно сильно заре-
прессированы; для прорастания и начального
развития растения вполне достаточно запасного
белка, который имеется в зерновке и избыток его
не нужен. В присутствии 5-азацитидина в расте-
нии ДНК сильно деметилируется, и экспрессия
генов запасных белков в зерновке увеличивает-
ся. Растению в принципе это и не нужно, а в
биотехнологии даже очень может пригодиться.
Значит, целенаправленная регуляция экспрес-
сии генов у растений может служить весьма эф-
фективным биотехнологическим приемом.
Рис. 3.13. Увеличение белковости зерно-
вок пшеницы под влиянием 5-азацити-
дина — ингибитора метилирования ДНК
[Ванюшин и др., 1990].
К — контроль. Остальные дорожки — белок из
зерновок растений, обработанных 5-азацити-
дином разными способами.
Деметилирование генома. Мы уже отметили,
что репликация ДНК сопровождается возникно-
вением неметилированных сайтов во вновь обра-
зованной цепи дуплекса ДНК. Часто это называ-
ют пассивный деметилированием ДНК. На самом
деле это никакое собственно не деметилирование
ДНК, а всего лишь неметилирование или недоме-
тилирование ДНК при репликации в результате
некой блокады действия поддерживающей ДНК-
метилтрансферазы DMT1. Вопрос о деметилиро-
вании ДНК долгое время оставался спорным, хо-
тя все время появлялись неопровержимые сведе-
ния о том, что оно существует и в частности при
эмбриогенезе. В принципе остатки 5-метилцито-
зина могут выщепляться из ДНК и замещаться за-
тем при последу’ющей репарации остатками цито-
зина. Возможно и прямое отщепление метильной
группы от остатков 5-метилцитозина с окислени-
ем ее в метанол [Ramchandani et al., 1999].
У растений имеется ген DEMETER (DME},
экспрессирующийся у женского гаметофита с ин-
72 ЭПИГЕНЕТИКА
дуцированисм материнских аллелей с импринти-
рованным геном MEDEA [Choi et al., 2002]. DME
кодирует ДНК-гликозидазу-лиазу, которая акти-
вирует ген МЕА путем вырезания некоторых ос-
татков 5-метилцитозина у МЕА в двух компакт-
ных областях соответственно выше и ниже ко-
дирующей последовательности [Gehring et al.,
2006]. Отцовская аллель при этом не затрагива-
ется, поскольку DME экспрессируется в цент-
ральной клетке только перед оплодотворе-
нием. Другая т5С-специфическая ДНК-гликози-
даза ROS1 (repressor of silencing 1) была выявле-
на у трансгенных растений арабидопсиса с му-
тацией по ROS1 [Gong et al., 2002]. DME и ROS1
гликозидазы преимущественно вырезают остат-
ки 5-метилцитозина из ш5СО-сайтов. Они спо-
собны выстригать также остатки тимина из T-G-
мисматчей. Два другие белка из семейства
DME — DEMETER-LIKE 2 и 3 (DML2, DML3)
также являются ш5С-специфическими ДНК-гли-
козидазами, которые необходимы для контроля
за правильным метилированием различных ге-
нов [Penterman etal., 2007; Ortega-Galisteo etal.,
2008]. При оплодотворении один спермий опло-
дотворяет гаплоидную яйцеклетку с образовани-
ем диплоидного зародыша, а другой попадает в
диплоидную центральную клетку, которая дает
начало триплоидному эндосперму’. Перед опло-
дотворением или на ранних стадиях развития
эндосперма ДНК в нем подвержена сильному’
деметилированию по многим и самым разным
сайтам [Hsieh etal., 2009; Gehring etal., 2009].
Большинство ш5СО-сайтов деметилиру'ется ма-
теринскими DME. Одновременное выстригание
обоих остатков ш5С из симметрично метилиро-
ванного сайта может приводить к фатальному’
разрыву' двутяжевой спирали ДНК. На терми-
нальных стадиях развития женского гаметофита
экспрессия гена МЕТ1 сильно подавлена перед
последним синтициальным делением, она очень
слаба и в центральной клетке. Может быть
это — изящное благоприятное эволюционное при-
способление у растений. Последний раунд реп-
ликации ДНК в отсутствие МЕТ1-активности
должен приводить к возникновению ДНК с по-
луметилированными сайтами, которые затем мо-
гут деметилироваться с помощью DME без ро-
ковых двутяжевых разрывов ДНК.
Часто спрашивают, что лучше — когда ДНК
сильно или слабо метилирована? Наш ответ —
ни то и ни другое. Она должна быть метилиро-
вана нормально, как это умеет делать и поддер-
живать всеми силами и возможностями нор-
мальная клетка, следуя принципу' поддержания
гомеостаза. Действительно, когда наш коллега из
Национального токсикологического центра США
Лайонел Пуарье исключает из рациона амино-
кислоту' метионин (источник метильных групп),
у всех подопытных крыс через две недели неот-
вратимо развивается рак (гепатома) печени. Рак
развивается и в том слу'чае, когда у трансгенных
мышей активирован ген фермента человеческой
ДНК-метилтрансферазы, что приводит к супер-
метилированию у них генома. В результате но-
каута только одного из генов ДНК-метилтранс-
фераз у' животных останавливается развитие эм-
брионов и включается запрограммированная ги-
бель клеток (апоптоз). Как ни крути, а к измене-
нию метилирования ДНК нужно относиться с
большим уважением и осторожностью.
Как бы то ни было, скептики, о которых упо-
миналось в самом начале, повержены, и сегодня
доподлинно известно, что метилирование ДНК в
клетке — не пустяк: оно контролирует все! гене-
тические процессы, в том числе и такие как
транскрипция, репликация, рекомбинация, транс-
позиция генов, репарация, инактивация Х-хро-
мосомы (половая дифференцировка). Не удиви-
тельно, что к изучению этой относительно не-
большой энзиматической модификации генома
сейчас прикован очень большой интерес многих
исследователей мира.
3.4. З-аденозил-Е-метионин-
ЗАВИСИМЫЕ И ЧУВСТВИТЕЛЬНЫЕ К СТАТУСУ
МЕТИЛИРОВАНИЯ ДНК ЭНДОНУКЛЕАЗЫ
РАСТЕНИЙ
Из везикулярной фракции клеток стареющих,
подверженных апоптозу' колеоптилей 8-дневных
этиолированных проростков пшеницы выделены
и охарактеризованы эндонуклеазы WEN 1 и
WEN2 [Fedoreyeva et al., 2007; Федореева и др..
2008]. Эти ферменты являются нейтральными
Са2+-, Mg2+-, Мп2+-зависимыми эндонуклеазами.
Обе эти ферментативные активности найдены и
в ядре претерпевающих запрограммированную
гибель клеток (ЗГК) колеоптиля. Высокая ион-
ная сила, Zn2+ и ЭДТА полностью ингибируют
эти ферменты. В присутствии Mg2+ фермент
WEN2 наиболее активен при pH от 5,5 до 7,7 и
37 °C, а без добавления Mg2+ в более узком ин-
тервале значений pH (от 6,8 до 7,7). Ферменты
сохраняют активность при высокой температу'ре
(65 °C). WEN2 предпочтительно расщепляет не-
метилированну'ю, a WEN 1 — метилированную
ДНК Z-фага. В качестве субстрата эндонуклеаза
WEN2 предпочитает двуцепочечную ДНК. SAM
ГЛАВА 3 73
и SiBA значительно увеличивают активность эн-
донуклеазы WEN2 (оптимальная концентрация
SAM 0,3 мМ). В отличие от сильного стимули-
рующего действия на WEN1 конкурентные ин-
гибиторы реакции метилирования ДНК (аналоги
SAM) SAH и SiBA при концентрации 0,3 мМ
гораздо слабее стимулируют гидролиз немети-
лированной ДНК ферментом WEN2. Предпола-
гается, что WEN 1 и WEN2 участвуют в апоптоз-
ной деградации ДНК. При обработке ими выде-
ленных растительных ядер происходит выра-
женная мсжнуклеосомная фрагментация ядерной
ДНК (рис. 3.14). Эндонуклеаза WEN1 обладает
сайтовой специфичностью действия: двутяжевые
ДНК она гидролизует по CNG-сайтам, расщеп-
ляя фосфодиэфирную связь между- остатками С
и N, предпочтительно когда остаток С метили-
рован [Федореева, Ванюшин, 2011].
Mg2+-, Са2+-, S-адснозил-Л-мстионин-зависи-
мые, чувствительные к статусу метилирования
субстратных ДНК эндонуклеазы WEN 1 и WEN2
из проростков пшеницы обладают выраженным
процессивным действием [Федореева, Ванюшин,
2012]. Гидролиз ими ДНК происходит в не-
сколько последовательных этапов: сначала фер-
менты сайт-специфично гидролизуют ДНК 7-фа-
га (по CNG-сайтам, фермент WEN1) с высвобо-
ждением крупных фрагментов, потом эти фраг-
менты гидролизуются до олигонуклеотидов дли-
ной 120—140 п.н., которые при последующем
гидролизе расщепляются до более коротких
фрагментов и мононуклеотидов. Начальные эта-
пы гидролиза ДНК могут происходить в отсутст-
вие Mg2+, а последующий гидролиз ДНК стиму-
лируется Mg2+ [Там же]. Модуляция действия
ферментов Mg2+ и, по-видимому, образовавшими-
ся фрагментами ДНК сопровождается реорга-
низацией структуры эукариотических (пшенич-
ных) эндонуклеаз с изменением их каталитичес-
ких свойств и сайтовой специфичности действия.
Сродство фермента к метилированной ДНК, со-
держащей сайты Cm5CWGG и Gm6ATC, гораздо
выше, чем к неметилированной. В присутствии
SAM константы Михаэлиса для WEN2 на стадии
гидролиза с образованием фрагментов ДНК дли-
ной 120—140 п.н. меньше, чем без SAM, а для
WEN1 они больше в 1,5-2 раза. Этим подтвер-
ждено, что SAM ингибирует фермент WEN1 и
стимулирует WEN2. Таким образом, пшеничные
эндонуклеазы WEN1 и WEN2 существенно раз-
личаются по сродству к субстратным ДНК с раз-
ным статусом метилирования, по скоростям гид-
ролиза ДНК и временам образования сходных по
длине фрагментов ДНК. По-видимому, эти изу-
ченные эндонуклеазы могут гидролизовать ДНК
и в клеточном ядре не только до крупных, но и до
очень небольших фрагментов, в том числе моно-
нуклеотидов, участвуя, например, в утилизации
нуклеинового материала при апоптозе.
Набор, активности и субстратная специфич-
ность действия эндонуклеаз в растении сущест-
венно изменяются при старении (рис. 3.15) и,
по-видимому, контролируются фитогормонами
[Александрушкина и др., 2008, 2009; Александ-
Рис. 3.14. Гистон Н1 модулирует активность эндонуклеаз растений [Смирнова и др., 2004; Федореева и др.,
2009].
1 — ДНК, 2— ДНК + WENI, 3 —ДНК + WENI + Н1 пшеницы, 4 —ДНК + WENI + Н1 крысы, 5 —ДНК + WENI + фракция I гис-
тона Н1 пшеницы, 6 — ДНК + WEN1 + фракция II гистона Н1 пшеницы.
74 ЭПИГЕНЕТИКА
Первый лист
Возраст проростка, дни
Рис. 3.15. Эндонуклеазные активности (in gel), найденные в экстрактах из разных органов
проростков пшеницы различного возраста [Александрушкина и др., 2009].
рушкина, Ванюшин, 2009]. Это и может во мно-
гом определять характер востребованной целе-
направленной деградации ДНК в клетках расте-
ния на разных, в том числе и терминальных, эта-
пах онтогенеза.
Мы установили, что суммарный гистон Н1 из
проростков пшеницы или печени крысы моду-
лирует гидролиз ДНК фага X растительными эн-
донуклеазами WEN1 и WEN2 [Федореева и др.,
2009]. Действие фракций I и IV пшеничного гис-
тона Н1 на гидролиз ДНК ферментами WEN1 и
WEN2 зависит от статуса метилирования суб-
стратной ДНК. Фракция IV гистона Н1 пшеницы
усиливает гидролиз неметилированной ДНК фа-
га X ферментами WEN 1 и WEN2, в то время как
гидролиз метилированной ДНК фага X (она со-
держит 5-метилцитозин в Ст5С \¥СС-послсдова-
тельностях и А6-метиладенин в Gm6АТС-сайтах)
ферментом WEN1 ингибируется фракциями 1 и
IV гистона Н1 пшеницы. Как уже отмечалось,
SAM модулирует активность растительных эн-
донуклеаз. Однако в присутствии гистона Н1
SAM не обладает дополнительной к действию
гистона Н1 способностью усиливать гидролиз
ДНК. Тем самым, модулирующее действие Н1-
гистона и SAM на гидролиз ДНК в известной
мере сходно. Возможно, SAM и гистон Н1 инду-
цируют аналогичные аллостерические превра-
щения в структуре изученных растительных эн-
донуклеаз.
Таким образом, гидролиз ДНК растительны-
ми эндонуклеазами модулируется как суммар-
ным гистоном Н1, так и его фракциями. Отдель-
ные фракции гистона Н1 пшеницы влияют на
гидролиз ДНК по-разному; они стимулируют
или, напротив, ингибируют гидролиз, в том чис-
ле и в зависимости от статуса метилирования
ДНК. Предполагается, что под влиянием гистона
Н1 может изменяться сайтовая специфичность
действия эндонуклеаз либо в структуре ДНК
возникают новые или маскируются сайты, дос-
тупные для действия этих ферментов. Обнару-
жение модулирующего действия гистона Н1 на
действие эндонуклеаз важно в частности для по-
нимания молскулярных механизмов апоптозной
фрагментации ДНК, поскольку’ этот белок в ос-
новном локализован в межнуклеосомных участ-
ках хроматина, т. е. в наиболее уязвимых местах
для первичной атаки эндонуклеаз на ядерную
ДНК при апоптозе.
У становлено, что короткие (состоящие из 2—
4 а.к.о.) биологически активные пептиды могут
ингибировать гидролиз ДНК CNG-сайтспеци-
фическими пшеничными эндонуклеазами в зави-
симости от стату са метилирования ДНК [Хавин-
сон и др., 2011]. Короткие пептиды в качестве
сигнальных молекул могут запускать или инги-
бировать самые различные процессы и реакции в
клетке. Под влиянием коротких пептидов сред-
няя продолжительность жизни эксперименталь-
ГЛАВА 3 75
ных животных увеличивается на 30—40 %; об-
работка пептидом Ala-Glu-Asp-Gly фиброблас-
тов человека способствует индукции теломе-
разной активности и удлиняет теломеры в 2,5
раза, это сопровождается увеличением на 42,5 %
числа делений клеток, т. е. преодолевается ли-
мит Хейфлика [Khavinson, 2005]. После введе-
ния мышам /и vivo пептидов Glu-Trp, Lys-Glu,
Ala-Glu-Asp-Gly, Ala-Glu-Asp-Pro у животных из-
меняется экспрессия генов в миокарде и голов-
ном мозге [Khavinson, 2005].
Выявленная нами моду’ляция пептидами дей-
ствия растительных эндонуклсз скорее всего
происходит в результате их связывания с ДНК.
Пептиды не только дискриминируют («распозна-
ют») определенные последовательности в ДНК,
но и различают их по статусу метилирования. На-
ряду с интактными ДНК испытанные пептиды
(эпиталон и другие) связываются и с однотяже-
выми структурами /ТНК (олигонуклеотидами),
содержащими метилируемые у эукариот CNG- и
CG-сайты |Федореева и др.. 2011].
Мы открыли тканевую, субклеточную и воз-
растную специфичность метилирования ДНК
[Vanyushin et al., 1970] и впервые показали, что
характер метилирования ДНК в раковых клетках
иной, чем в нормальных [Romanov, Vanyushin,
1981]. Поскольку’ короткие пептиды «распозна-
ют» не только отдельные последовательности в
ДНК, но и статус их метилирования, мы посту-
лируем. что один и тот же биологически актив-
ный короткий пептид будет связываться с ДНК и
воздействовать на функции генов по-разному: в
различных тканях (клетках); в ядре и митохонд-
риях; в молодых и старых клетках; в нормаль-
ных и злокачественных клетках. Почти все эти
постулаты уже подтверждены экспериментально
[Khavinson, 2005].
Обнаруженный нами феномен модуляции
действия эндонуклеаз короткими биологически
активными пептидами может быть лишь частью
глобального биологического закона: сайт-специ-
фично связывающиеся с ДНК (особенно с регу-
ляторными элементами генома) пептиды долж-
ны модулировать функции многих взаимодейст-
вующих с ДНК белков (ДНК-метилтрансферазы,
РНК- и ДНК-полимеразы и многие регуляторные
факторы). Так. например, определенные гекса-
пептиды являются строго селективными лиган-
дами для свободных от белка Holliday junctions и
блокируют рекомбинацию [Ranjit et al., 2010].
Мы предложили один из наиболее вероятных
механизмов активации генов короткими пепти-
дами [Хавинсон и др., 2011]: пептиды селектив-
но связываются с премоторными CNG- или CG-
сайтами, что делает эти сайты недоступными для
ДНК-метилтрансфераз, и в результате промотор
остается неметилированным. а это — решающий
элемент активации многих генов. Таким обра-
зом, специфические (комплементарные или ал-
лостерические) пептид—ДНК-взаимодействия
могут эпигенетически контролировать генетиче-
ские функции клетки, и, вероятно, они играли
очень важную роль уже на самых ранних этапах
зарождения жизни и в эволюции.
Итак, у растений существуют эндонуклеазы,
которые распознают субстратные ДНК по стату-
су метилирования и по-разному модулируются
донором метильных групп — SAM и его анало-
гами. Это может указывать на существование у
высших растений системы рестрикции — моди-
фикации генома (R-М) или, по крайней мере, ее
отдельных элементов.
В целом, многие стороны проблемы органи-
зации и роли цитозинового метилирования ДНК
в клетке, в том числе и у высших растений, уже
довольно успешно изучены. Тем не менее эта
область науки продолжает радовать и даже по-
ражать нас новыми успехами и сюрпризами.
В частности, относительно недавно расшифро-
ван первый эукариотический метилом: описана
полная картина цитозинового метилирования
генома арабидопсиса. Сначала это было сделано
большими коллективами авторов с использова-
нием соответствующих ДНК-микрочипов [Zhang
et al., 2006] и вслед за этим осуществлено би-
сульфитное секвенирование ДНК, которое по-
зволило получить полную, наиболее точную и
исчерпывающую картину (pattern) метилирова-
ния цитозиновых остатков в геноме арабидопси-
са [Cokus et al., 2008; Lister et al., 2008]. Безус-
ловно. это — грандиозный успех современной
молекулярной биологии. Делается вполне оп-
равданный вывод о том, что информация о ме-
тилировании ДНК может осуществить в буду-
щем настоящий переворот в сельском хозяйстве
и медицине. Как бы то ни было, на мой взгляд,
страница о цитозиновом метилировании ДНК в
основном уже перевернута. Давайте откроем с
Вами новую. Далее речь пойдет об открытии и
характеристике аденинового метилирования ДНК
у растений. Тем самым, сегодня на основании
только лишь сведений о цитозиновом метилиро-
вании ДНК утверждать, что метилом растений
уже расшифрован полностью, пока еще прежде-
временно.
76 ЭПИГЕНЕТИКА
3.5. Метилирование адениновых остатков
в ДНК У РАСТЕНИЙ
В ДНК эукариот уже давно обнаружен А6-ме-
тиладенин. Он встречается в ДНК водорослей
[Пахомова и др., 1968] и их вирусов [Nelson et al.,
1998], грибов [Бурьянов и др., 1970; Rogers et al.,
1986], простейших [Зайцева и др., 1974; Cum-
mings etal., 1974; Rae, Spear, 1978; Кирнос и др.,
1980; Pratt, Hattman, 1981] и растений [Ванюшин
и др., 1971; Бурьянов и др., 1972]. Это означало,
что у эукариот геном может метилироваться как
по цитозиновым, так и по адениновым остаткам.
Мы нашли 7V6-метиладенин в суммарной ДНК у
многих высших растений (табл. 3.4) [Ванюшин
и др., 1971] и в митохондриальной ДНК пророст-
ков пшеницы [Кирнос и др., 1988г; Vanyushin
etal., 1988; Александрушкина и др., 1990] и по-
казали, что, в отличие от животных, митохонд-
рии растений (пшеница) располагают адени-
новыми ДНК-метилтрансферазами, но не имеют
цитозиновых ДНК-метилтрансфераз [Кирнос
и др., 19976].
У растений мы обнаружили новый класс ге-
терогенных по размеру миникольцевых тяже-
лых митохондриальных ДНК, которые содержат
А^-метиладенин, а не 5-метилцитозин [Kirnos
etal., 1992]. Эти ДНК выявлены у всех изучен-
ных архегониальных и цветковых растений
[Кирнос и др., 1992]; синтез таких ДНК наиболее
сильно выражен в стареющих органах (колеоп-
тиль) растений. Интенсивная репликация таких
мтДНК является одним из характерных призна-
ков апоптоза у растений [Кирнос и др., 1983;
Bakeeva et al., 1999; Ванюшин, 2001].
С помощью компьютерного анализа баз дан-
ных установлено, что в геномах Leishmania ma-
jor, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomy-
ces pombe. Arabidopsis thaliana. Drosophila mela-
nogaster, Caenorhabditis elegans и Homo sapiens
Tаблица 3.4
Содержание А^-метиладенина (m6A) в суммарной
ДНК проростков растений [Ванюшин и др., 1971]
Источник ДНК т6А, % от аденина
Пшеница 0,10
Кукуруза 0,19
Ячмень 0,23
Редис 0,06
Горох 0,17
Огурец 0,09
Хлопчатник 0,04
Подсолнечник 0,14
имеются открытые рамки считывания, коди-
рующие белки, которые обладают высокой сте-
пенью гомологии с ДНК-(амино)метилтрансфе-
разами прокариот [Шорнинг, Ванюшин, 2001].
В аминокислотных последовательностях этих
белков выявлены типичные для бактериальных
ДНК-(амино)метилтрансфераз консервативные
мотивы. Найденные открытые рамки считывания
вероятных ДНК-(амино)метилтрансфераз эука-
риот закодированы в ядре. В митохондриальных
геномах, в том числе и некоторых полностью
секвенированных мтДНК растений, нуклеотид-
ные последовательности, имеющие значитель-
ную гомологию с генами прокариотических
ДНК-(амино)метилтрансфераз, не выявлены. Та-
ким образом, в ядрах простейших, дрожжей,
высших растений, насекомых, нематод и позво-
ночных имеются гомологичные бактериальным
адениновым ДНК-метилтрансферазам открытые
рамки считывания [Там же]. Поэтому метили-
рование адениновых остатков в ДНК может быть
широко распространено у эукариот, и поиск со-
ответствующих белков (адениновых ДНК-метил-
трансфераз) у этих организмов с выяснением их
функций является весьма перспективным.
Предварительно обобщая полученные нами
ранее сведения об адениновом метилировании
/ТНК у растений, следует отметить, что тбА най-
ден как в ядерной, так и в митохондрильной
ДНК, в ядерной ДНК он локализован в последо-
вательности Gm6АТС: установлено, что один и
тот же ген (DRM2) метилирован как по аденино-
вым, так и по цитозиновым остаткам [Ashapkin
etal., 2002]. На рис. 3.16 показан характер аде-
нинового метилирования этого гена у растений
арабидопсиса. Видно, что в теле этого гена есть
частично метилированные по адениновым ос-
таткам сайты.
Анализируя имеющиеся сведения о полном
геномном секвенировании ДНК арабидопсиса,
мы нашли у него некую нуклеотидную последо-
вательность, в известной мере гомологичную бак-
териальному’ гену’ dam, которая может рассмат-
риваться в качестве гена «кажущейся» аденино-
вой ДНК-метилтрансферазы. Этот ген активно
транскрибируется во всех изученных тканях рас-
тений арабидопсиса и особенно интенсивно в
корнях и молодых листьях (рис. 3.17). Не ис-
ключено, что интенсивная экспрессия этого гена
именно в корнях как-то связана с синтезом в них
цитокининов, которые в принципе могут подав-
лять адениновое метилирование ДНК. Мы не
знаем, метилирован ли этот ген собственно по
адениновым остаткам ДНК, зато опреленно ус-
ГЛАВА 3 77
DRM2Pro probe
DRM2Str probe
1 kb
Рис. 3.16. Характер аденинового метилирования (Ст6АТС-сайты) в гене ДНК-метилтрансферазы DRM2 у Arabi-
dopsis thaliana [Ashapkin et al., 2002].
тановили, что он явно метилирован по цитози-
новым (рис. 3.18). Картина метилирования цито-
зиновых остатков в этом гене адениновой ДНК-
метилтрансферазы у арабидопсиса весьма харак-
терна для генов, активно транскрибирующихся
во многих растительных тканях. В листьях его
промотор и 5'-проксимальные экзоны неметили-
рованы, а 3'-проксимальные экзоны метилирова-
ны за исключением 3'-концевой половины по-
следнего экзона. Любопытно, что у трансгенных
растений арабидопсиса с индуцируемой анти-
смысловой конструкцией МЕТ1 после ее индук-
ции большинство частично метилированных по
второму’ цитозину’ в CCGG-сайтах становится
полностью метилированными (см. рис. 3.18). Зна-
чит, у этих растений существует некая любопыт-
ная, утонченная взаимозависимая регуляция ци-
тозиновых метилирований ДНК. Казалось бы,
инактивация МЕТ1 антисенсом должна сопро-
вождаться уменьшением степени метилирования
CG-сайтов, а на деле в данном случае она приво-
дит к увеличению метилирования этих сайтов,
правда, в последовательности CCGG; к сожале-
нию, мы не знаем, как эта индукция антисмы-
словой конструкции МЕТ1 сказывается на мети-
лировании CpG во всех других последоватеьно-
стях (сайтах), хотя в GCGC-сайтах оно не изме-
няется. Тем не менее, можно видеть, что CpG-
метилирование вне тела гена при этом все же су-
щественно уменьшается: бывшие частично ме-
тилированными CCGG-сайты в премоторной зо-
не становятся полностью неметилированными
(см. рис. 3.18).
У пшеницы с помощью ПЦР с использовани-
ем специфических промоторов риса мы нашли и
секвенировали очень близкий гомолог уникаль-
ного AT3G264 гена арабидопсиса, содержащий
InterPro домен //-адениновой ДНК-метилтранс-
феразы (IPR002052) и РНК-метилтрансфераз
(IPR000241, IPR016691). Может быть, этот ген ко-
дирует белок, обладающий как ДНК-, так и РНК-
метилазной активностями. Это свойство такого
белка не могло бы быть особенно удивительным:
существуют же, например, ферменты эндонуклеа-
зы, которые атакуют как ДНК, так и РНК.
А как обстоят дела собственно с самим фер-
ментом, осуществляющим адениновое метили-
рование ДНК у растений?
Пока мы располагаем лишь одним из эукарио-
тических (растительных) ферментов, который
умеет так модифицировать ДНК [Fedoreyeva,
Vanyushin, 2002]. Изучая апоптоз у растений, мы
впервые обнаружили, выделили и охарактеризо-
вали особые субклеточные структуры (везикулы),
характерные для апоптозных растительных кле-
ток [Bakeeva etal., 1999; Ванюшин, 2001]. Имен-
Транскрипция гена N6AMT в разных органах
Лист Лист Стебель Корень Цветок
(молодой) (старый)
Транскрипция гена N6AMT в листьях
разных линий трансгенных растений
1 2 3 4 5
Nothem’s blots (A/6AMTmRNA)
Рис. 3.17. Найден ген (t/AMT) адениновой
ДНК-метилтрансферазы у A. thaliana [Ашапкин
и др., 2012].
1 —дикий тип (Columbia), 2—5 — линии разных
трансгенных растений, выращенных при различных
условиях индукции.
78 ЭПИГЕНЕТИКА
N6AMtase probe
1 kbp
N6AMtase promoter probe
pYc2-768-5 + Cu,
pYc2-7066-4 + Cu
M(—3,2)
M(-3,3)
M(—4,1) M(-3,6)M(-3,1)
M(—0,7)
M(—1,7)
т т ш
11
H(-1,7)
H(—0,5)
H(—0,4)
M(1,3)
M(1,1) M(1,5)
H(0,8)
Рис. 3.18. Характер цитозинового метилирования гена адениновой ДНК-метилтрансферазы у Arabidopsis
thaliana [Ашапкин и др., 2012].
но из таких везикул (рис. 3.19) с интенсивным
синтезом митохондриальных ДНК [Кирнос и др.,
1997а, б] нам и удалось извлечь этот фермент. Он
метилирует внутренний адениновый остаток в
последовательности TGATCA предпочтительно у
однотяжевых ДНК и, по-видимому, участвует в
контроле за репликацией митохондриальных
ДНК [Fedoreyeva. Vanyushin, 2002]. До сих пор
Рис. 3.19. Апоптозная клетка (а) (на срезе колеоптиля)
и фракция везикул (б), выделенных из колеоптилей
8-дневных этиолированных проростков пшеницы [Ba-
keeva et al., 1999]. М — митохондрии.
мы не знаем, участвует ли именно этот фермент в
модификации адениновых остатков в ДНК ядра
или же ядерная ДНК модифицируется иной аде-
ниновой ДНК-метилтрансферазой.
Итак, в целом, метилирование ДНК у расте-
ний значительно богаче и сложнее, чем у живот-
ных. Растения обладают гораздо большим набо-
ром ДНК-метилтрансфераз, некоторые из кото-
рых уникальны для этих организмов и имеют
убиквитинсвязывающий домен [Finnegan, Kovac,
2000; Finnegan et al., 2000]. В отличие от живот-
ных нокаут гена МЕТ1, гомологичного живот-
ному dmtl, у растений не является летальным и,
по-видимому, компенсируется другими ДНК-
метилтрансферазами в растительной клетке. По-
скольку у растений ген может быть одновременно
метилирован как по адениновым, так и по цито-
зиновым остаткам [Ashapkin etal., 2002], речь
может идти о существовании у них системы обо-
юдного контроля за этими модификациями гено-
ма. По-видимому, метилирование аденина может
влиять на метилирование цитозина и наоборот.
Так, например, метилирование аденина в GATC-
сайтах гена DRM2 у растений арабидопсиса силь-
но уменьшено в присутствии индуцированных
антисмысловых конструкций METI трансгена ци-
тозиновой ДНК-метилтрансферазы [Ibid],
ГЛАВА 3 79
К сожалению, функциональная роль аденино-
вого метилирования /ТНК у высших эукариот все
еще неизвестна. Мы предполагаем, что, как и
метилирование остатков цитозина, оно может
контролировать репликацию ДНК и экспрессию
генов [Ванюшин, 2005]. В частности, контроль
за метилированием адениновых остатков в ДНК
цитокининами (А6-производные аденина) путем
их включения в ДНК может служить одним из
механизмов регуляции экспрессии генов и кле-
точной дифференцировки у растений (рис. 3.20)
[Vanyushin, 1984]. Действительно, цитокинин
6-бензиламинопурин подавляет метилирование
ДНК в пластидах культуры клеток клена белого
(явор) и индуцирует в них экспрессию генов,
кодирующих ферменты фотосинтеза [Ngempra-
sirtsiri et al., 1988].
Мы доказали, что фитогормоны цитокини-
ны — природные производные аденина — моту’т
непосредственно включаться в ДНК растений
[Кудряшова, Ванюшин, 1986] и простейших Tet-
rahyrnena pyriformis [Мазин, Ванюшин, 1986] —
организмов, у которых нами выявлены А6-ме-
тиладенин в ДНК или метилирование ДНК по
остаткам аденина. Природное включение цито-
кининов вместо аденина в узнаваемые ДНК-ме-
тилтрансферазами сайты ДНК должно препятст-
вовать метилированию ДНК по соответствую-
щим адениновым остаткам в таких сайтах. Та-
ким путем в клетке могут возникать недомети-
лированные по адениновым остаткам ДНК, что
должно существенно сказываться на экспрессии
генов и репликации ДНК.
3.6. Метилирование ДНК и другие
ЭПИГЕНЕТИЧЕСКИЕ СИГНАЛЫ
Помимо энзиматической модификации (ме-
тилирования) самой генетической матрицы [Ва-
нюшин, 2006] в клетке есть и другие системы
эпигенетических сигналов, их много и они весь-
ма разнообразны. У некоторых из них реши-
тельная роль принадлежит не ДНК, а белкам, в
том числе белкам хроматина. Сегодня говорят о
гистоновом «коде». Этот код существенно рас-
ширяет потенциал собственно генетического ко-
да ДНК. Вследствие той или иной модификации
гистонов изменяется структура хроматина, что
приводит к наследуемым изменениям в транс-
крипции генов. Модификация гистонов «туда и
обратно» (метилирование, фосфорилирование,
ацетилирование, убиквитинирование без или с
приставкой де-) часто определяет, будут ли гены
активными или нет. К этому’ примыкают еще и
Рис. 3.20. Возможное ингибирование образования
метилированных адениновых сайтов в ДНК в резуль-
тате включения в нее цитокининов (СК) [Vanyushin,
Kirnos, 1988].
множественные специальные негистоновые регу-
ляторные белки, формирующие затейливые ком-
плексы на ДНК, которые замалчивают гены или,
напротив, запускают их в работу’. Мы — на пороге
расшифровки и этих любопытных сигналов.
Имеется уже много данных о том, что суще-
ствует взаимозависимость между’ метилировани-
ем ДНК и модификацией гистонов. У Neurospora
метилирование лизина 9 в гистоне НЗ критично
для цитозинового метилирования ДНК и нор-
мального развития гриба [Tamaru, Selker, 2001;
Tamaru et al., 2003]. Иначе говоря, гистоны мо-
гут выступать в качестве переносчика сигналов
для метилирования генома. С другой стороны, у
арабидопсиса метилирование CpG в ДНК пред-
шествует и направляет метилирование лизина 9
в гистоне НЗ [Soppe et al., 2002]. Интересно, что
неметилированный по лизину’ 4 (К4) хвост гис-
тона НЗ служит аллостерическим активатором
ДНК-метилтрансферазы Dnmt3a. Этап взаимо-
действия неметилированного хвоста гистона яв-
ляется своеобразным checkpoint для метилиро-
вания ДНК этим ферментом.
У животных и растений существует связь
между’ метилированием ДНК и деацетилирова-
нием гистонов [Aufsatz etal., 2002]. Например,
ген гистоновой деацетилазы необходим для ме-
тилирования ДНК, индуцированного малыми
80 ЭПИГЕНЕТИКА
РНК (dsRNA) [Aufsatz etal., 2002]. Поистине,
«метилирование встречается с ацетилированием».
3.7. Направляемое РНК-метилирование
ДНК И ЗАМАЛЧИВАНИЕ ГЕНОВ
Особый интерес привлекает сегодня изучение
механизмов и биологической роли метилирова-
ния ДНК, направляемого малыми РНК (RNA-
directed DNA methylation), которые осуществля-
ют специфическое выключение генов (gene si-
lencing) [Matzke, Matzke, 1995]. Считается, что
сайт-специфичные ДНК-метилтрансферазы в
присутствии маленькой сигнальной РНК осуще-
ствляют de novo метилирование ДНК по CNG и
другим сайтам в нуклеотидной последователь-
ности ДНК, узнаваемой малой РНК; это метили-
рование мобилизует соответствующие фермен-
ты, которые в частности и модифицируют гис-
тоны [Matzke et al., 2004].
Модификация гистонов приводит к индукции
или усилению метилирования CNG-сайтов, ко-
торое затем поддерживается без участия РНК-
триггера. В цепи этих событий метилирование
ДНК может быть как причиной, так и следстви-
ем «замалчивания» генов [Matzke et al., 2004]. Не
удивительно, что особый прогресс в области на-
правленного РНК-метилирования генов достиг-
нут благодаря изучению метилирования ДНК
именно у растений, а не животных. Это. по-ви-
димому, во многом объясняется тем, что именно
растения обладают выраженным метилировани-
ем CNG и несимметричных сайтов в ДНК [Кир-
нос и др., 1981], которое в основном и вовлечено
в РНК-направляемое метилирование генома. В
последнее время появилось много указаний на
то, что такое наведенное РНК-метилирование
ДНК в триплексе РНК—ДНК играет решающую
роль в замалчивании генов малыми РНК; у орга-
низмов или мутантов с дефектным цитозиновым
метилированием ДНК это РНК-замалчивание
генов неэффективно.
* * *
У высших растений ДНК сильно метилирова-
ны по остаткам цитозина; 5-метилцитозин лока-
лизован преимущественно в CG- и CNG-после-
довательностях. Глобальное метилирование ДНК
виде-, ткане-, органоидспецифично, оно изменя-
ется при прорастании семян, переходе растений
к цветению, различных вирусных и грибных ин-
фекциях и уменьшается с возрастом [Ванюшин,
2009]. Как правило, /ТНК архегониальных менее
метилированы, чем ДНК цветковых растений
[Ванюшин, Белозерский, 1959; Vanyushin et al.,
1971]. Найдены видовые различия филогенети-
ческого значения по встречаемости метилиро-
ванных CNG-последовательностей в геномах
растений [Kovarik etal., 1997; Fulnecek etal.,
2002]. Тканевая специфичность метилирования
ДНК, выявленная изначально у животных [Va-
nyushin et al., 1970], затем обнаружена у расте-
ний [Ванюшин и др., 1979]. Отдельные гены в
разных тканях одного и того же растения мети-
лированы по-разному [Bianchi, Viotti, 1988; Lo
Schiavo et al.. 1989; Palmgren et al.. 1991; Kutueva
et al., 1996; Rossi et al., 1997; Riggs, Chrispeels,
1999; Ashapkin etal., 2002; Chopra etal., 2003].
Содержание m5C в ДНК разных тканей связано и
с так называемым градиентом цветения [Хвойка
и др., 1978]. Первое же картирование характера
метилирования целого генома (метилом) Arabi-
dopsis thaliana показало, что ДНК перицентро-
мерного гетерохроматина, повторяющиеся по-
следовательности и зоны образования малых ин-
терферирующих РНК сильно метилированы,
примерно треть генов метилированы в транскри-
бируемых областях и только около 5 % генов —
в премоторной области.
Метилированные в транскрибируемых облас-
тях гены конститутивно транскрипционно ак-
тивны, в то время как у метилируемых по про-
моторной области генов существует сильно вы-
раженная тканевая специфичность экспрессии
[Zhang et al., 2006]. Так, например, мы установи-
ли, что степень метилирования промотора пата-
тинового гена в разных тканях картофеля обрат-
но коррелирует со степенью экспрессии этого
гена, он заметно недометилирован в клубнях
картофеля [Романов и др., 2007], где и осущест-
вляется в основном синтез этого белка.
Специфические изменения в характере мети-
лирования ДНК происходят на протяжении всей
жизни растения, начиная от прорастания семян и
вплоть до его гибели, запрограммированной или
вызванной разными агентами и факторами био-
логической и абиотической природы. Думается,
онтогенез растения вообще невозможен без ме-
тилирования генома, потому’ что у растений, как
и у животных, метилирование ДНК участвует в
контроле за всеми генетическими функциями,
включая транскрипцию, репликацию, репарацию
ДНК, транспозицию генов, геномный имприн-
тинг и клсточную дифференцировку’ [Ванюшин,
Кирнос, 1988; Ванюшин, 2006, 2009]. Индуци-
руемое холодом цветение регулируется метили-
рованием ДНК. При холодовой обработке (яро-
ГЛАВА 3 81
визация) ДНК частично деметилируется, и в ре-
зультате активируются гены, отвечающие за ин-
дукцию цветения.
Метилирование ДНК контролирует рост и
развитие растений [Ванюшин. Кирнос. 1988].
Метилирование генома вовлечено в замалчива-
ние генов маленькими РНК (siRNA). Нокаут и
нокдаун генов соответствующих ДНК-метил-
трансфераз сопровождаются серьезными изме-
нениями фенотипических свойств, нарушением
роста и развития растений. Индуцированное
5-азацитидином деметилирование ДНК при фор-
мировании зерновки приводит к наследуемому
увеличению белковости пшениц. Тем самым, из-
бирательная регуляция метилирования ДНК —
новое эффективное средство биотехнологическо-
го контроля за продуктивностью растений.
Метилирование ДНК у растений и животных
имеет много общего, однако у растений оно име-
ет целый ряд специфичных особенностей. Так,
например, доля метилированных CNG и асим-
метричных последовательностей ДНК в расти-
тельных геномах гораздо выше, чем у животных.
В целом, растения имеют существенно более
сложную систему’ метилирования геномов по
сравнению с животными. Прежде всего, следует
отметить, что растения обладают гораздо боль-
шим арсеналом ДНК-метилтрансфераз (более
12). Это, возможно, обеспечивает им более на-
дежную систему’ модификации генома, чем у
животных. У растений выживают даже тройные
0-мутанты (по генам трех разных ДНК-метил-
трансфераз), тогда как у животных нокаут гена
всего лишь одной ДНК-метилтрансферазы явля-
ется летальным. Некоторые растительные ДНК-
метилтрансферазы вообще не имеют аналогов в
животном мире. Они уникальны и, в отличие от
животных ДНК-метилтрансфераз, содержат кон-
сервативный убиквитинсвязывающий домен, а
их убиквитинизация может влиять на локализа-
цию фермента в клетке в зависимости от тех или
иных внеклеточных сигналов, клеточного цикла
и транспозонной или ретровирусной активно-
стей. Интересно, что активность растительных
ДНК-метилтрансфераз может напрямую зави-
сеть от регуляторов роста растений. Кроме того,
в отличие от животных растения обладают спе-
цифическими органеллами — пластидами (хло-
ропласты, хромопласты, амилопласты, лейко-
пласты), которые имеют собственные отличные
от ядерных системы модификации (метилирова-
ния) ДНК. Эти системы могут играть важную
роль в дифференцировке и функционировании
пластид. Метилирование ДНК в растительных
митохондриях иное, чем в ядре. В растительных
мтДНК найден А^-метиладенин, но не 5-метил-
цитозин, который свойствен животным мтДНК.
Поэтому’ в целом системы модификации ДНК в
цитоплазматических органеллах в животной и
растительной клетках весьма различны. В отли-
чие от животных у растений, по-видимому, име-
ется система рестрикции-модификации генома;
во всяком случае, мы установили, что у растений
имеются А-аденозилметионинзависимые эндо-
нуклеазы, чувствительные к статусу метилиро-
вания ДНК. Судя по этим признакам, найденные
и изученные нами растительные эндонуклеазы в
известной мере аналогичны типичным бактери-
альным рестрикционным эндонуклеазам.
Мы обнаружили, что репликация генома со-
провождается появлением полумстилированных
сайтов в ДНК; возникшая при этом асимметрия
метилирования цепей ДНК значительно уменьша-
ется или вовсе исчезает к концу’ клеточного цикла.
На этом основании нами предложена модель ре-
гуляции репликации ДНК метилированием.
Мы установили, что первичные репликатив-
ные элементы генома (фрагменты Оказаки) ме-
тилированы. Так было открыто и документиро-
вано собственно репликативное метилирование
ДНК у растений и животных и показано, что
ДНК-метилтрансферазы могут входить в состав
репликативного комплекса. Мы пришли к выво-
ду’, что в ядре имеется несколько ДНК-метил-
трансфераз и метилирование ДНК на разных
стадиях репликации может осуществляться раз-
ными по специфичности действия ферментами.
Это подтвердилось современными сведениями о
множественности ядерных ДНК-метилтрансфе-
раз. Нам удалось дискриминировать репликатив-
ное и пострепликативное метилирования ДНК у
растений. Эти процессы различаются по специ-
фичности метилируемых сайтов в ДНК и по чув-
ствительности к разным гормонам и ингибито-
рам метилирования.
Найдено, что фитогормоны контролируют
метилирование ДНК. Под действием фитогор-
монов заметно уменьшается глобальное метили-
рование ДНК Кроме того, они подавляют мети-
лирование вновь синтезируемых цепей ДНК, не
влияя на метилирование фрагментов Оказаки.
Так впервые было обнаружено, что фитогормо-
ны воздействуют собственно на геном путем мо-
ду’ ляции его метилирования. Мы считаем, что
именно модуляция метилирования ДНК является
одним из ведущих механизмов действия гормо-
нов у растений и животных. Не исключено, что
гормон-рецепторные комплексы конкурируют за
82 ЭПИГЕНЕТИКА
места связывания и метилирования генома соот-
ветствующими ДНК-метилтрансферазами.
Говоря об этой модификации генома, мы
должны отдавать себе отчет в том, что, по сути,
мы имеем дело, по крайней мере, с тремя ком-
понентами этой сложной реакции или даже сис-
темы: собственно субстрат реакции — ДНК,
фермент (ДНК-метилтрансфераза) и донор ме-
тильных групп (S-аденозил метионин). Разумеет-
ся, контроль за модификацией ДНК и эффектив-
ностью этого процесса осуществляется на уров-
не всех этих компонентов, да еще и с участием
иных самых разнообразных составляющих кле-
точного метаболизма. Наряду с этим, статус
метилирования генома в дифференцированной
клетке на определенной стадии онтогенеза зави-
сит также и от активности деметилирующих
ДНК ферментов. Одна из таких животных деме-
тилаз ДНК, отщепляющая непосредственно ме-
тильную групп}' от остатков 5-метилцитозина
ДНК, открыта недавно, она выделена в виде ин-
дивидуального белка и ее ген проклонирован.
Так что степень и характер метилирования гено-
ма на самом деле могут быть некими динамич-
ными признаками, которые в каждый момент во
многом определяются соотношением активно-
стей метилирующих и деметилирующих ДНК
ферментов.
Однако часто даже в присутствии этих актив-
ных ферментов, достаточного количества S-аде-
нозилметионина (донора метильных групп и мо-
дулятора активностей ферментов) и в отсутствие
соответствующих ингибиторов эти реакции в
ядре невозможны просто из-за недоступности
субстрата — ДНК в хроматине для ферментов.
Здесь на первое место выходит организация соб-
ственно хроматина. Кроме упомянутых уже
множественных модификаций гистонов, заметно
модулирующих организацию хроматина и дос-
тупность ДНК для ферментов, за связывание и
взаимодействие ДНК-метилтрансфераз с ДНК
конкурируют многие иные белки. В частности, к
ним могут относиться и белки гормон-рецептор-
ных комплексов. Этим, по-видимому, во многом
объясняются выявленная нами регуляция мети-
лирования ДНК гормонами у растений и живот-
ных и действие гормонов в клетке. Как бы то ни
было, дальнейший прогресс в исследовании ме-
тилирования генома сильно зависит от детально-
го изучения тонкой структуры хроматина и ее
разнообразных функциональных флуктуаций в
ядре.
Открыто адениновое метилирование ДНК у
растений; А^-метиладенин (тбА) найден в мито-
хондриальной и ядерной ДНК. У Arabidopsis
thaliana ген цитозиновой ДНК-метилтрансфе-
разы DRM2 метилирован как по цитозиновым
(CCGG), так и адениновым (GATC) остаткам.
Индукция антисмысловых конструкций цитози-
новой ДНК-метилтрансферазы (METI) у транс-
генных растений арабидопсиса приводит к изме-
нению характера метилирования адениновых
остатков в гене DRM2. Значит, у растений суще-
ствует взаимозависимый контроль между' адени-
новым и цитозиновым метилированиями ДНК.
Это — новый механизм утонченного эпигенети-
ческого контроля сопряженными метилирова-
ниями ДНК за функциями генома у эукариот.
Из богатой митохондриями фракции вакуо-
лярных везикул, возникающих при апоптозе у
стареющих колеоптилей пшеницы, выделена пер-
вая адениновая ДНК-метилтрансфераза высших
эукариот. В присутствии .S-адснозил-/,-метио-
нина этот Са2+/ Mg21 -зависимый фермент (wadm-
tase) метилирует de novo остаток аденина в сере-
дине последовательности TGATCA у одно- и
двутяжевых ДНК, предпочитая однотяжевые
структуры. По-видимому, wadmtase модифици-
рует мтДНК и участвует в регуляции реплика-
ции митохондрий; не исключено, что она же ме-
тилирует и яДНК.
Цитокинины — производные аденина — мо-
гут непосредственно включаться в ДНК расте-
ний и простейших. Природное включение цито-
кининов вместо аденина в узнаваемые ДНК-
метилтрансферазами сайты ДНК должно пре-
пятствовать метилированию ДНК по соответст-
вующим адениновым остаткам. Таким путем в
клетке могут возникать недометилированные по
адениновым остаткам ДНК. Контроль за мети-
лированием адениновых остатков в ДНК цито-
кининами путем их включения в ДНК может
служить одним из механизмов регуляции экс-
прессии генов и клеточной дифференцировки у
растений.
Из колеоптилей пшеницы выделены SAM-
зависимые эндонуклеазы WEN 1 и WEN2, чувст-
вительные к статусу метилирования ДНК. Эти
свойства не были известны для эндонуклеаз
высших эукариот, а характерны лишь для неко-
торых бактериальных рестрикционных эндонук-
леаз, что указывает на возможное существование
системы рестрикции-модификации генома у рас-
тений. Конкурентные ингибиторы метилирова-
ния /ТНК Л-адснозил-Л-гомоцистсин и Л-изобу-
тиладенозин также модулируют гидролиз ДНК
этим ферментом. Таким образом, открыт новый
тип регуляции активности эукариотических (рас-
ГЛАВА 3 83
тигельных) эндонуклеаз, основанный на их мо-
дуляции донором метильных групп SAM и его
аналогами ингибиторами реакции метилирова-
ния. По-видимому, ферменты WEN1 и WEN2
участвуют в деградации ядерной ДНК при запро-
граммированной гибели растительной клетки. По
некоторым свойствам эндонуклеаза WEN1 напо-
минает животную эндонуклеазу G, которая фраг-
ментирует ДНК при апоптозе. Другая выделенная
из колеоптилей пшеницы уникальная эндонуклеа-
за WEN2, как и WEN1, также чувствительна
к статусу метилирования /ТНК и моду лируется
SAM. У растений существует система сопряжен-
ной регуляции SAM-зависимых (в том числе и
чувствительных к статусу метилирования ДНК)
эндонуклсазных активностей с разнонаправлен-
ным действием на них эффектора (модулятора)
SAM. К тому же действие этих эндонуклеаз мо-
дулируется гистоном Н1, это может существенно
влиять на мсжнуклсосомную фрагментацию
яДНК этими ферментами при апоптозе.
Растения — уникальные системы или модели
организмов, которые представляют нам необыч-
ные и разнообразные возможности для расшиф-
ровки и понимания интимных механизмов и
функциональной роли метилирования ДНК и
функционирования геномов у эукариот. Каждый
раз, глядя на уровень и характер метилирования
генома, включая метилом, нужно отдавать себе
отчет, что это, как правило, всего лишь момен-
тальный снимок, а не полная целостная картина
состояния модификации генома в онтогенезе. На
самом деле это очень динамичный процесс, ре-
зультирующий метилирование и деметилирова-
ние ДНК.
Нет сомнений в том, что метилирование ДНК
связано с эволюцией и таксономией растений.
Мы уже давно заметили, что в целом ДНК архе-
гониальных и голосеменных метилированы в
меньшей степени, чем ДНК покрытосеменных
растений [Ванюшин, Белозерский, 1959; Vany-
ushin etal., 1971]. При анализе профилей мети-
лирования геномов у 30 поколений 10 линий
A. thaliana, полученных из одного и того же
предшественника, установлено, что примерно
30000 цитозиновых остатков в ДНК этих штам-
мов (линий) растений метилированы по-разному,
т. е. эпигеномы у этих растений весьма различны
и своеобразны. В особенности это касается ха-
рактера метилирования транспозонов и коди-
рующих малые интерферирующие РНК элемен-
тов [Becker et al., 2011].
Описанные здесь метилирования ДНК —
очень деликатный и эффективный природный
механизм регуляции активности генов, состоя-
ния и репликации генома в клетке. Эти модифи-
кации генома тесно связаны с другими утончен-
ными эпигенетическими сигналами, превраще-
ниями в структурной и функциональной органи-
зации генома и клетки, которые в совокупности
и определяют жизнь, ее сущность и качество,
иными словами «быть или не быть». Принципи-
ально важно отметить, что существующие в клет-
ке множественные эпигенетические системы и
сигналы тесно связаны между собой, взаимоза-
висимы и в большинстве, по-видимому, взаимо-
заменяемы. Во многом это имеет некий подстра-
ховочный смысл, для того чтобы гарантирован-
но обеспечить надежность сигнала. Конкретные
цепочки, отдельные связи и изощренная паутина
этих взаимозависимых сигналов еще очень дале-
ки от полного понимания. Однако нет никакого
сомнения в том, что метилирования ДНК играют
очень важную роль в жизни клетки и организма
и поэтому дальнейшие исчерпывающие иссле-
дования в этой захватывающей области зна-
ний — очень важная и плодотворная задача на-
шего века, который по праву называют эрой эпи-
генетики.
* * *
Автор главы приносит глубокую благодар-
ность всем своим сотрудникам, многочисленным
аспирантам и студентам, с которыми ему' дове-
лось работать на протяжении долгих лет в этой
захватывающей области научного знания. Среди
них особо хочу- выделить и сердечно поблагода-
рить Н. И. Александрушкину и В. В. Ашапкина;
многие описанные приоритетные данные неот-
рывно связаны с именем моего блестящего уче-
ника светлой памяти М. Д. Кирноса.
Исследования по данной главе поддержаны
грантом РФФИ 11-04-00026-а.
Список ЛИТЕРАТУРЫ
Апександрушкина Н. II, Ванюшин Б. Ф. Эндонуклеазы и их
участие в апоптозе растений И Физиология растений.
2009. Т. 56. С. 1—17.
Апександрушкина Н. II, Кудряшова II. Б., Кирнос А/. Д.,
Ванюшин Б. Ф. Синтез и метилирование по аденино-
вым остаткам тяжелых миниплазмид митохондриаль-
ной ДНК в колеоптиле и листе проростков пшеницы:
влияние фитогормонов И Биохимия. 1990. Т. 55.
С. 2038—2045.
Апександрушкина Н. II, Ротаенко Е. П., Никифорова II. Д.,
Чернов В. А., Бубенщикова С. Н, Бойко Л. М, Кир-
нос М. Д., Ванюшин Б. Ф. Двухэтапное метилирование
генома пшеницы в культуре клеток и в проростке //
Там же. 1991. Т. 56. С. 361—368.
84 ЭПИГЕНЕТИКА
Александрушкина И. II. КофЭ.М.. Середина А. В.. Бор-
зов А. А., Ванюшин Б. Ф. Связанные со старением де-
градация ДНК и эндонуклеазная активность в листьях
гороха нормального и афильного генотипов И Физио-
логия растений. 2008. Т. 55. С. 1—10.
Александрушкина Н. II, Середина А. В., Ванюшин Б. Ф.
Активность эндонуклеаз в колеоптиле и первом листе
развивающихся этиолированных проростков пшени-
цы // Там же. 2009. Т. 56. С. 1—11.
Артюховская И. .1., Александрушкина Н. II, Ашапкин В. В.,
Кирнос М Д., Ванюшин Б. Ф. Влияние различных фи-
тогормонов на репликативный синтез ядерной ДНК в
S-фазе клеток первого листа этиолированных пророст-
ков пшеницы // Биохимия. 1986. Т. 51. С. 1868—1874.
Ашапкин В. В., Александрушкина Н. II, Кирнос М. Д., Ва-
нюшин Б. Ф. Подавление репликативного синтеза ДНК
нуклеозидами, их синтетическими аналогами и инги-
биторами метилирования ДНК в первом листе этиоли-
рованных проростков пшеницы И Биохимия. 1986.
Т. 51. С. 1587—1594.
Ашапкин В. В., Кутуева Л. II, Ванюшин Б. Ф. Регулируется
ли метилированием транскрипция гена цитозиновой
ДНК-метилтрансферазы МЕТ1 у растения Arabidopsis
thaliana? И Генетика. 2011. Т. 47. С. 320—331.
Башките Е. А., Славенас II. Ю., Ванюшин Б. Ф. Содержа-
ние 5-метилцитозина в ДНК салата при воздействии
гиббереллином на ранних стадиях онтогенеза И Вести.
МГУ. Сер. 16. Биология. 1978. № 1. С. 45—50.
Башките Е. А., Хвойка Л. А., Фридрих А., Ванюшин Б. Ф.
Изменение содержания 5-метилцитозина в ДНК рас-
тений гороха под влиянием фитогормонов И Биол.
науки. 1979. № 7. С. 23—28.
Башките Е. А., Александрушкина Н. II, Кирнос М. Д., Кирь-
янов Г. II, Ванюшин Б. Ф. Метилирование ДНК в сус-
пензионной культуре клеток табака при обработке фи-
тогормонами 7/ Там же. 1980а. №4. С. 103—НО.
Башките Е. А., Кирнос М. Д., Кирьянов Г. II, Александруш-
кина И. II, Ванюшин Б. Ф. Репликация и метилирование
ДНК в клетках суспензионной культуры табака и влия-
ние ауксина // Биохимия. 19806. Т. 45. С. 1448—1456.
Бердышев Г. Д., Коротаев Г. К, Боярских Г. В., Ваню-
шин Б. Ф. Нуклеотидный состав ДНК и РНК сомати-
ческих тканей горбуши и его изменение в течение не-
реста // Биохимия. 1967. Т. 32. С. 988—993.
Бурцева Н. И., Азизов Ю. М., Иткин Б. 3., Ванюшин Б. Ф.
Изменение метилирования ДНК лимфоцитов крупного
рогатого скота при хроническом лимфолейкозе И Био-
химия. 1977. Т. 42. С. 1690—1696.
Бурьянов Я. II, Ильин А. В., Скрябин Г. К. О нахождении 6-
метиламинопурина в ДНК гриба Mucor hiemalis //
Докл. АН СССР. 1970. Т. 195. С. 728—730.
Бурьянов Я. II., Ерошина Н. В., Вагабова Л. М, Ильин А. В.
О нахождении 6-метиламинопурина в ДНК пыльцы
растений // Докл. АН СССР. '1972. Т. 206. С. 992—
994.
Ванюшин Б. Ф. Нуклеиновые кислоты и систематика расте-
ний И Проблемы филогении растений. М.: Наука,
1965. С. 14—24. (Тр. МОИН. Секция ботаники,
Т. 13).
Ванюшин Б. Ф. Метилирование ДНК и его значение в диф-
ференцировке видов и эволюции организмов // Строе-
ние ДНК и положение организмов в системе / Ред.
А. Н. Белозерский, А. С. Антонов. М.: Изд-во МГУ,
1972. С. 279—319.
Ванюшин Б. Ф. Апоптоз у растений И Успехи биол. химии.
2001. Т. 41. С. 3—38.
Ванюшин Б. Ф. Метилирование адениновых остатков в
ДНК эукариот// Молскуляр. биология. 2005. Т. 39.
С. 557—566.
Ванюшин Б. Ф. Энзиматическое метилирование ДНК —
эпигенетический контроль за генетическими функ-
циями клетки // Биохимия. 2005. Т. 70. С. 598—611.
Ванюшин Б. Ф. Метилирование ДНК и эпигенетика И Гене-
тика. 2006. Т. 42. С. 1— 14.
Ванюшин Б. Ф. Пристальный взгляд стихийного натурали-
ста на мир ДНК: (Нуклеотидный состав, последова-
тельности, метилирование) И Биохимия. 2007. Т. 72.
С. 1598—1608.
Ванюшин Б. Ф. Метилирование ДНК у растений: механиз-
мы и биологическая роль И Тимирязевские чтения /
Ред. В. В. Кузнецов. М.: Наука, 2009. Вып. 69. 77 с.
Ванюшин Б. Ф., Белозерский .4. И. Нуклеотидный состав
дезоксирибонуклеиновых кислот высших растений //
Докл. АН СССР. 1959. Т. 129. С. 944—946.
Ванюшин Б. Ф., Бердышев Г. Д. Молекулярно-генетические
механизмы старения. М.: Медицина. 1977. 285 с.
Ванюшин Б. Ф., Кирнос М. Д. Метилирование ДНК выс-
ших растений и клеточная дифференцировка И Геном
растений Ред. К. М. Ситник. Киев: Наук, думка, 1988.
С. 105—130.
Ванюшин Б. Ф., Огаркова О. .4. Отсутствие содержащих
метилированный аденин СтбАТС-последовательнос-
гей в хлоропластных и ядерных ДНК бобовых расте-
ний и Биохимия. 1990. Т. 55. С. 946—951.
Ванюшин Б. Ф.. Беляева И. И., Кокурина И. А.. Стельма-
щукВ.Я., Тихоненко А. С. Характеристика урацил со-
держащей ДНК фага AR 9 Bacillus subtilis // Молекул,
биология. 1970. Т. 4. С. 724—729.
Ванюшин Б. Ф., Кадырова Д. X., Каримов X. X., Белозер-
ский .4. И. Минорные основания в ДНК высших расте-
ний "Биохимия. 1971. Т. 36. С. 1251—1258.
Ванюшин Б. Ф., Дуда В. II, Добрица С. В. Различия в соста-
ве ДНК вегетативных клеток и спор анаэробных бак-
терий // Докл. АН СССР. 1972. Т. 206. С. 1226—1229.
Ванюшин Б. Ф., Тушмалова И. А., Гуськова Л. В. Метилиро-
вание ДНК мозга как показатель участия генома в ме-
ханизмах индивидуально приобретенной памяти И
Докл. АН СССР. 1974. Т. 219. С. 742—744.
Ванюшин Б. Ф., Сингх С. С., Сонвол Г. Изменение метили-
рования ДНК люцерны при заражении куску!ой и тка-
невые различия в ДНК паразитического растения И
Биохимия. 1979. Т. 44. С. 864—867.
Ванюшин Б. Ф.. Башките Е. А.. Хвойка Л. А. Метилирова-
ние ДНК в проростках пшеницы и влияние фитогор-
монов // Биохимия. 1981. Т. 4. С. 47—54.
Ванюшин Б. Ф., Севостьянова С. С., Кирнос А/. Д., Саидо-
ва И С. Увеличение белковости зерновок пшениц под
влиянием 5-азацитидина — ингибитора метилирования
ДНК // Изв. АН СССР. Сер. биол. 1990. № 1. С. 75 83.
Ванюшин Б. Ф., ЕИорнинг Б. Ю.. Середина А. В.. Александ-
рушкина И. И. Влияние фитогормонов и 5-азацитиди-
на на апоптоз у этиолированных проростков пшени-
цы " Физиология растений. 2002. Т. 49. С. 558—564.
Власова Т. И., Демиденко 3. И., Кирнос М. Д, Ванюшин Б. Ф.
Репликативная цитозиновая ДНК-метилтрансфераза из
образованного в присутствии 5-азацитидина хрома-
тина проростков пшеницы И Биохимия. 1992. Т. 57.
С. 1049 1056.
Власова Т. И.. Кирнос М. Д.. Демиденко 3. И.. Ванюшин Б. Ф.
Модуляция фитогормонами метилирования in vitro
пшеничной ядерной ДНК цитозиновой ДНК-метил-
грансферазой пшеницы И Биохимия. 1994. Т. 59.
С. 1872—1881.
Власова Т. И., Кирнос А/. Д., Ванюшин Б. Ф. Цитозиновая
ДНК-метилтрансфераза из проростков пшеницы И
Биохимия. 1996. Т. 61. С. 1078—1087.
Дрожденюк А. И., Сулимова Г. Е., Ванюшин Б. Ф. Содержа-
ние 5-метилцитозина в ДНК пшеницы на ранних ста-
ГЛАВА 3 85
днях онтогенеза И Вести. МГУ. Сер. 16. Биология,
почвоведение. 1975. Т. 4. С. 76—79.
Дрожденюк А. П., Сулимова Г. Е., Ванюшин Б. Ф. Измене-
ние нуклеотидного состава и молекулярной популяции
ДНК пшеницы при прорастании ' Молекул, биология.
1976. Т. 10. С. 1378—1386.
Дрожденюк А. И, Сулимова Г. Е., Ванюшин Б. Ф. Содержа-
ние 5-метилцитозина в разных классах повторяю-
щихся последовательностей ДНК некоторых высших
растений И Биохимия. 1977. Т. 42. С. 1439—1444.
Зайцева Г. Н., Колесников А. А., Яценко II Я., Кирнос М. Д.,
Ванюшин Б. Ф. О первичной структуре ДНК кинето-
пласта Crithidia oncopelti И Докл. АН СССР. 1974.
Т. 219. С. 243—245.
Кирнос М. Д., Меркулова Н. А., Борхсениус С. И, Ваню-
шин Б. Ф. Характер метилирования ДНК макронукле-
уса у простейшего Tetrahvmena pvriformis // Докл. АН
СССР. 1980. Т. 255. С. 225—227. '
Кирнос М. Д„ Александрушкина Н. II, Ванюшин Б. Ф. 5-Ме-
тилцитозин в пиримидиновых последовательностях
ДНК растений и животных: Специфичность метили-
рования И Биохимия. 1981. Т. 46. С. 1458—1474.
Кирнос М. Д., Бакеева Л. Е., Волкова С. А., Ганичева Н. II.,
Ванюшин Б. Ф. Митохондриальная природа новообра-
зованной ДНК в стареющих колеоптилях этиолиро-
ванных проростков пшеницы // Биохимия. 1983а.
Т. 48. С. 1505—1512.
Кирнос М. Д„ Волкова С. А., Ганичева Н. II, Кудряшо-
ва II. Б., Ванюшин Б. Ф. Синхронный синтез ДНК в
колеоптиле и первом листе развивающихся этиолиро-
ванных проростков пшеницы: природа и соотношение
синтезов ядерной и митохондриальной ДНК// Биохи-
мия. 19836. Т. 48. С. 1587—1595.
Кирнос М. Д., Ганичева Н. II, Кутуева Л. II, Ванюшин Б. Ф.
Нерепликативные синтез и метилирование ДНК в кле-
точном цикле клеток первого листа этиолированных
проростков пшеницы " Биохимия. 1984. Т. 49. С. 1690—
1702.
Кирнос М. Д., Кутуева Л. II, Ганичева Н. II, Ванюшин Б. Ф.
Неполуконсервативный характер репликативного ме-
тилирования ДНК в меристеме листа проростков пше-
ницы: образование недометилированных участков и
разная специфичность метилирования промежуточных
репликативных фрагментов И Биохимия. 1984. Т. 49.
С. 1357—1366.
Кирнос МД, Артюховская Н. А., Александрушкина Н. II,
Ашанкин В. В., Ванюшин Б. Ф. Влияние фитогормонов
на репликативное и пострепликативное метилирова-
ние ядерной ДНК в S-фазе клеточного цикла клеток
первого листа этиолированных проростков пшеницы И
Биохимия. 1986. Т. 51. С. 1875—1885.
Кирнос М. Д., Александрушкина Н. II, Кутуева Л. II, Ар-
тюховская Н. А., Ванюшин Б. Ф. Пострепликативное
метилирование — дискретный этап метилирования
ядерной ДНК в клеточном цикле клеток первого листа
проростков пшеницы. Влияние температуры, фитогор-
монов, ингибиторов трансляции, транскрипции и ме-
тилирования ДНК // Биохимия. 1987. Т. 52. С. 625—637.
Кирнос М. Д, Александрушкина Н. II, Кутуева Л. II, Ва-
нюшин Б. Ф. Репликативное и пострепликативное ме-
тилирование ядерной ДНК модулируют асимметрию
ее комплементарных цепей по содержанию остатков
5-метилцитозина в нескольких последовательных кле-
точных циклах клеток первого листа проростков пше-
ницы // Биохимия. 1988а. Т. 53. С. 355—367.
Кирнос М. Д., Александрушкина Н. II, Кутуева Л. II, Ва-
нюшин Б. Ф. Репликативное метилирование — дис-
кретный этап модификации ДНК у растений. Крите-
рии дискретности — уровень и специфичность мети-
лирования фрагментов Оказаки И Биохимия. 19886.
Т. 53. С. 1397—1406.
Кирнос М. Д., Александрушкина Н. II, Ванюшин Б. Ф. Ин-
гибирование и изменение специфичности метилирова-
ния фрагментов Оказаки в проростках пшеницы под
влиянием 5-азацитидина и S-изобутиладенозина И
Биохимия. 1988в. Т. 53. С. 1667- 1678.
Кирнос М. Д.. Александрушкина Н. II. Ванюшин Б. Ф.
Ы^-Метиладенин в митохондриальной ДНК высших
растений // Биохимия. 1988г. Т. 53. С. 1791—1796.
Кирнос М. Д., Александрушкина Н. II, Ванюшин Б. Ф. Вы-
раженная природная модуляция уровня метилирова-
ния ядерной ДНК в неделящихся клетках и ее скоор-
динированность с S-фазами в меристематических
клетках формирующегося листа проростков пшени-
цы " Биохимия. i989. Т. 54. С. 313- -322.
Кирнос М. Д.. Александрушкина Н. II, Горемыкин В. В..
Кудряшова II. Б., Ванюшин Б. Ф. Тяжелая митохонд-
риальная ДНК у высших растений 7 Биохимия. 1992.
Т. 57. С. 1566—1573.
Кирнос М. Д., Александрушкина Н. II, Ванюшин Б. Ф. Двух-
этапное метилирование реплицирующегося генома в
клетках высших растений " Успехи биол. химии. 1993.
Т. 33. С. 148—172.
Кирнос М. Д., Александрушкина Н. II, Власова Т. II, Ваню-
шин Б. Ф. Структурная и функциональная организация
метилирования реплицирующегося генома растений И
Молекул, биология. 1995. Т. 29. С. 1242—1257.
Кирнос М. Д, Александрушкина Н. II, Ванюшин Б. Ф. Апо-
птоз в клетках первого листа и колеоптиля проростков
пшеницы: Межнуклеосомная фрагментация генома и
синтез тяжелых олигонуклеосомного размера фрагмен-
тов ДНК 7 Биохимия. 1997а. Т. 62. С. 1008—1014.
Кирнос М. Д., Александрушкина Н. II, Шорнинг Б. Ю., Бу-
бетцикова С. Н.. Ванюшин Б. Ф. Суперпродукция тя-
желой ДНК в неделящихся клетках стареющего коле-
оптиля проростков пшеницы при апоптозе И Биохи-
мия. 19976. Т. 62. С. 1587—1597.
Кирьянов Г. II, Исаева Л. В., Кирнос М. Д., Ганичева Н. II,
Ванюшин Б. Ф. Репликативное метилирование ДНК в
L-клетках: действие S-изобутиладенозина и циклогек-
симида и возможное существование двух ДНК-ме-
гилаз И Биохимия. 1982. Т. 47. С. 153—161.
Ковальская В. С.. Кудряшова II. Б.. Ванюшин Б. Ф. Влияние
цитокининов на метилирование ДНК в первом листе
проростков пшеницы И Биол. науки. 1986. № 10.
С. 19—24.
Кудряшова II. Б., Ванюшин Б. Ф. Включение цитокининов в
ДНК проростков пшеницы// Биохимия. 1986. Т. 51.
С. 321 327.
Кудряшова II. Б.. Кирнос М. Д.. Ванюшин Б. Ф. ДНК-мети-
лазные активности из митохондрий и ядер животных.
Различная специфичность метилирования ДНК И Био-
химия. 1976. Т. 41. С. 1968—1977.
Мазин А. Л., Ванюшин Б. Ф. Включение цитокинина (6-бен-
зиламинопурина) в ДНК простейшего Tetrahymena
pvriformis // Изв. АН СССР. Сер. биол. 1986. № 1.
С. 122—124.
Мазин .1. Л., Ванюшин Б. Ф. Потеря динуклеотидов CpG из
ДНК. 5. Следы ископаемого метилирования в геноме
дрозофилы И Молекул, биология. 1988а. Т. 22.
С. 1399—1404.
Мазин .1. Л., Ванюшин Б. Ф. Потеря динуклеотидов CpG из
ДНК. 6. Метилирование митохондриальных и хлоро-
пластных генов у животных и растений // Там же.
19886. Т. 22. С. 1688—1696.
Мазин А. Л.. Ванюшин Б. Ф. О возможном происхождении и
эволюции энзиматического метилирования ДНК эука-
риот. Метилирование цитозиновых остатков в трех се-
86 ЭПИГЕНЕТИКА
мействах палиндромов: RYRY, YYRR и YYRYRR 7
Там же. 1990. Т. 24. С. 23 43.
Мазин А. Л, Гимадутдинов О. А., Туркин С. II., Бурце-
ва Н. Н, Ванюшин Б. Ф. Неэнзиматическое метилиро-
вание ДНК под действием 5-аденозилметионина с об-
разованием из цитозина остатков минорного тимина и
5-метилцитозина И Там же. 1985. Т. 19. С. 903 914.
Пахомова hl. В.. Зайцева Г. Н.. Белозерский А. Н. Наличие
5-метилцитозина и 6-метиламинопурина в ДНК неко-
торых водоростей И Докл. АН СССР. 1968. Т. 182.
С. 712—714.
Райанов Г. А., Наумкина Е. hl, Ашапкин В. В., Ваню-
шин Б. Ф. Метилирование GCGG-сайтов пататинового
промотора органоспецифично и обратно коррелирует с
его активностью// Докл. РАН. 2007. Т. 47. С. 410—
413.
Савельев С. В.. Ашапкин В. В.. Ванюшин Б. Ф. Рибосомная
ДНК гексаплоидной пшеницы: характер метилирова-
ния и временная организация репликации в разви-
вающихся проростках// Молекул, биология. 1990.
Т. 24. С. 1042—1056.
Смирнова Т. А., Прусов .1. И, Коломийцева Г. Я., Ваню-
шин Б. Ф. Гистон Н1 в развивающемся и стареющем
колеоптиле у этиолированных проростков пшеницы И
Биохимия. 2004. Т. 69. С. 1387—1395.
Спирин А. С.. Белозерский А. И, Шугаева Н. В.. Ваню-
шин Б. Ф. Изучение видовой специфичности нуклеи-
новых кислот у бактерий '' Биохимия. 1957. Т. 22.
С. 744—754.
Сулимова Г. Е., Мазин А. Л., Ванюшин Б. Ф., Белозер-
ский .4. Н. Содержание 5-метилцитозина в различных
по составу фракциях ДНК высших растений " Докл.
АН СССР. 1970. Т. 193. С. 1422—1425.
Сулимова Г. Е., Ванюшин Б. Ф., Хвойка Л. А., Фридрих А.,
Булгаков Р.. Черны Б. О невозможности включения
5-метилцитозина и его нуклеозидов в ДНК высших
растений // Биохимия. 1978а. Т. 43. С. 240—245.
Сулимова Г. Е., Дрожденюк А. П., Ванюшин Б. Ф. Измене-
ние метилируемых последовательностей и молекуляр-
ной популяции ДНК пшеницы при прорастании И Мо-
лекул. биология. 19786. Т. 12. С. 496—504.
Федореева Л. II, Ванюшин Б. Ф. CNG сайт-специфичная
метил-чувствительная эндонуклеаза WEN1 из про-
ростков пшеницы // Биохимия. 2011. Т. 76. С. 799—806.
Федореева Л. II, Ванюшин Б. Ф. Процессивный характер
действия пшеничных эндонуклеаз WEN1 и WEN2. Ки-
нетические параметры // Там же. 2012. Т. 77. С. 603—610.
Федореева Л. II, Смирнова Т. А., Коломийцева Г. Я., Ваню-
шин Б. Ф. Гистон Н1 модулирует гидролиз ДНК эндо-
нуклеазами WEN1 и WEN2 из колеоптилей пшени-
цы // Биохимия. 2009. Т. 74. С. 181—189.
Федореева Л. II., Соболев Д. Е., Ванюшин Б. Ф. S-аденозил-
Е-метионинзависимая и чувствительная к ciaiycy ме-
тилирования ДНК эндонуклеаза WEN2 из колеоптилей
пшеницы // Биохимия. 2008. Т. 73. С. 1243—1251.
Федореева Л. II, Киреев II. II, Хавинсон В. X., Ваню-
шин Б. Ф. Проникновение коротких флуоресцентно-
меченых пептидов в ядро в клетках НеЕа и специфи-
ческое взаимодействие пептидов с дезоксирибоолиго-
нуклеотидами и ДНК in vitro И Там же. 2011. Т. 76.
С. 1505—1516.
Хавинсон В. X., Федореева Л. II, Ванюшин Б. Ф. Короткие
пептиды модулируют действие эукариотических эн-
донуклеаз из проростков пшеницы // Докл. РАН. 2011.
Т. 437. С. 124—127.
Хвойка Л., Сулимова Г. Е., Булгаков Р., Башкшпе Е. А., Ва-
нюшин Б. Ф. Изменение содержания 5-метилцитозина
в ДНК растений по мере градиента цветения 11 Биохи-
мия. 1978. Т. 43. С. 996—1000.
ШорнингБ.Ю., Ванюшин Б. Ф. Предполагаемые ДНК-
(амино)метилтрансферазы у эукариот // Биохимия.
2001. Т. 66. С. 929—939.
Ashapkin V. V., Antoniv Т. Т, Vanyushin В. F. Multiple nuclear
protein binding to 135bp subrepeat element of wheat ribo-
somal intergenic spacer // Biochem. Mol. Biol. Int. 1993.
Vol. 30. P. 755 761.
Ashapkin V. V., Antoniv T. T. Vanyushin B. F. Methylation-de-
pendent binding of wheat nuclear proteins to promoter re-
gion of ribosomal RNA genes// Gene. 1995. Vol. 157.
P. 273—277.
Ashapkin V. V., KutuevaL.I, Vanyushin B. F. The gene for do-
mains rearranged methyltransferase (DRM2) in Arabidopsis
thaliana plants is methylated at both cytosine and adenine
residues // FEBS Eett. 2002. Vol. 532. R 367—372.
Aufsatz IV., MetteM. F, Van der IVinden J., MatzkeM, Matz-
ke A. J. HDA6. a putative histone deacetylase needed to
enhance DNA methylation induced by double-stranded
RNA // EMBO J. 2002. Vol. 21. P. 6832—6841.
Bakeeva L. E., Kimoshl. D., Aleksandrushkina N. I, Kazimir-
chyukS. B., ShoniingB. Yu., Zamyatnina V. A., Yaguzhin-
skyL.S., Vanyushin B. F. Subcellular reorganization of
mitochondria producing heavy DNA in aging wheat col-
eoptiles // FEBS Eett. 1999. Vol. 457. P. 122—125.
Becker C., HagmannJ., Midler J., Koenig D., Stegle O., Borg-
ward! K.. Weigel D. Spontaneous epigenetic variation in
the Arabidopsis thaliana methylome // Nature. 2011.
Vol. 480. P. 245—249.
Bianchi hl. W, Fiotti A. DNA methylation and tissue specific
transcription of storage protein genes of maize // Plant
Mol. Biol. 1988. Vol. 11. P. 203—214.
Bird A. The essentials of DNA methylation // Cell. 1992.
Vol. 70. P. 5—8.
BrutnellT. P., Dellaporta S. L. Somatic inactivation and reacti-
vation of Ac associated with changes in cytosine methyla-
tion and transposase expression// Genetics. 1994. Vol. 138.
P. 213—225.
Burn J. E., Smyth D.R., Peacock W. J., Dennis E. S. Genes
conferring late fl owering in Arabidopsis thaliana " Ge-
netica. 1993. Vol. 90. P. 147—155.
ChoiY., GehringhI, Johnson L., HamonM., Harada J. J.,
Goldberg R. B.. Jacobsen S. E„ Fischer R. L. DEMETER,
a DNA glycosylase domain protein, is required for en-
dosperm gene imprinting and seed viability in Arabidop-
sis 11 Cell. 2002. Vol. 110. P. 33 42.
ChopraS., Cocciolone S. hl, BushmanS., Sangar V., McMul-
len hl. D., Peterson T. The maize unstable factor for oran-
gel is a dominant epigenetic modifier of a tissue specifi
cally silent allele of pericarp colorl // Genetics. 2003.
Vol’. 163. P. 1135 1146.
CokusS. J., FengS.. ZhangX., Chen Z.. Merriman B., Hauden-
schildC.D., PradhanS., Nelson S. F, Pellegrini M,
Jacobsen S. E. Shotgun bisulphate sequencing of the
Arabidopsis genome reveals DNA methylation pattern-
ing // Nature. 2008. Vol. 452. P. 215—219’
Cooney C. Methyl Magic. Kansas City: McMeel, 1999. P. 253.
Cummings D. J., Tait A., Godard J. hl. Methylated bases in
DNA from Paramecium aurelia // Biochim. Biophys.
Acta. 1974. Vol. 374. P. 1 11.
Defbssez P. A., Stancheva I. Biological functions of methyl-
CpG-binding proteins// Prog. Mol. Biol. Transl. Sei. 2011.
Vol. 101. P. 377—398.
Fedoreyeva L. I., Sobolev D.E., Vanyushin B. F. Wheat en-
donuclease WEN1 dependent on S-adenosyl-L-methionine
and sensitive to DNA methylation status // Epigenetics.
2007. Vol. 2. P. 50—53.
Fedoreyeva L. I., Vanyushin B. F. N6-Adenine DNA-methyl-
transferase in wheat seedlings // FEBS Eett. 2002. Vol. 514.
P. 305—308.
ГЛАВА 3 87
Finnegan Е. J., Kovac К. A. Plant DNA methyltransferases //
Plant Mol. Biol. 2000. Vol. 43. P. 189—210.
Finnegan E. J., Genger R. K, Kovac K, Peacock JJ. J., Den-
nis E. S. DNA methylation and the promotion of flowering
by vernalization // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1998.
Vol. 95. P. 5824—5829.
Finnegan E. J., Peacock JJ’. J., Dennis E. S. Reduced DNA
methylation in Arabidopsis thaliana results in abnormal
plant development // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1996.
Vol. 93. P. 8449—8454.
Finnegan E. J., Sheldon С. C, JardinaudF, Peacock JJ . J.,
Dennis E. S. A cluster of Arabidopsis genes with a coordi-
nate response to an environmental stimulus // Curr. Biol.
2004. Vol. 14. P. 911—916.
Fulnecek J., MatyasekR., KovarikA. Distribution of 5-methyl-
cytosine residues in 5S rRNA genes in Arabidopsis thalia-
na and Secale cereale 11 Mol. Genet. Genomics. 2002.
Vol. 268. P. 510—517.
GehringAl., HuhJ.H, Hsieh T.-F., Penterman J., ChoiY.,
Harada J. J., GoldbergR. B., Fischer R L. DEMETER
DNA glycosylase establishes MEDEA Polycomb gene sel-
fimprinting by allele-specific demethylation H Cell. 2006.
Vol. 124. P. 495—506.
GehringM., Bubb K. L., HenikoffS. Extensive demethylation of
repetitive elements during seed development underlies
gene imprinting // Science. 2009. Vol. 324. P. 1447—
1451.
GongZh., Morales-Ruiz T, ArizaR R, Roldan-Arjona T,
DavidL., ZhuJ.-K. ROS1, a repressor of transcriptional
gene silencing in Arabidopsis, encodes a DNA glycosy-
lase/lyase // Cell. 2002. Vol. 111. P. 803—814.
Gruenbattm Г., Cedar H., Razin. 1. Substrate and sequence
specificity of a eukaryotic DNA methvlase // Nature.
1982. Vol. 295. P. 620 ' 622.
Guseinov J’. A.. J’anyushin B. F. Content and localization of
5-methylcytosine in DNA of healthy and wilt-infected cot-
ton plants // Biochim. Biophys. Acta. 1975. Vol. 395.
P. 229—238.
Guseinov J’. A., Kiryanov G. I., J’anyushin B. F. Intragenome
distribution of 5-methylcytosine in DNA of healthy and
wilt-infected cotton plants Gossvpium hirsutum L. // Mol.
Biol. Rep. 1975. Vol. 2. P. 59—63.
Holliday R., Pugh J. E. DNA modification mechanisms and
gene activity during development// Science. 1975. Vol. 187.
P. 226—232.
Hsieh T.-F., Ibarra C. A., Silva P., Zemach A., Eshed-JJ’il-
HamsL., Fischer R. L., Zilberman D. Genome-wide de-
methylation of Arabidopsis endosperm // Science. 2009.
Vol. 324. P. 1451—1454.
Khavinson J’. Kh. Gerontological Aspects of Genome Peptide
Regulation. Basel: Karger AG, 2005. 104 p.
Kirnos AL D., Alexandrushkina N. I., Zagorskaya G. Ya., Ki-
reev 1.1., J’anyushin B. F. Superproduction of heavy'
minicircular mitochondrial DNA in aging wheat coleop-
tiles // FEBS Lett. 1992. Vol. 298. P. 109—112.
Kiryanov G. L, KirnosAl. D., Demidkina N. P., Alexandrush-
kina N. I., J’anvushin B. F. Methylation of DNA in L cells
on replication 7 FEBS Lett. 1980. Vol. 112. P. 225—228.
Kovalchuk O., Burke P., Arkhipov A., Kuchma N., James S. J.,
Kovalchuk I.. Pogribny I. Genome hypermethylation in
Pinus silvestris of Chernobyl — a mechanism for radiation
adaptation? // Mutat. Res. 2003. Vol. 529. P. 13—20.
Kovarik A., MatyasekR, Leitch A., Gazdova B., Fulnecek J.,
BezdekAl. Variability' in CpNpG methylation in higher
plant genomes 11 Gene. 1997. Vol. 204. P. 25—33.
Kumpatla S. P., Hall T. C. Longevity' of 5-azacytidine-mediated
gene expression and reestablishment of silencing in trans-
genic rice// Plant Mol. Biol. 1998. Vol. 38. P. 1113—
1122.
Kutueva L. I.. Ashapkin J’. J’., J’anyushin B. F. The methylation
pattern of a cytosine DNA-methyltransferase gene in Ara-
bidopsis thaliana plants // Biochem. Mol. Biol. Int. 1996.
Vol. 40. P. 347—353.
Lauria AL, RupeAL, GuoAL, KranzE., PironaR, J’iottiA.,
Lund G. Extensive maternal DNA hypomethylation in the
endosperm of Zea mays // Plant Cell. 2004. Vol. 16.
P. 510—522.
Lira-Medeiros C. F, ParisodC, Fernandes R A., Mata C. S.,
Cardoso M. A., Ferreira P. C. G. Epigenetic variation in
mangrove plants occurring in contrasting natural environ-
ment II PLoS One. 2010. Vol. 5. e!0326.
Lister R, О Malley RC, Tonti-Filippini J., Gregory B. D.,
Berry C.C., Millar A. H, Ecker J. R. Highly integrated
single-base resolution maps of the epigenome in Arabi-
dopsis // Cell. 2008. Vol. 133. P. 523- -536.
Lo SchiavoF, PittoL.. Giuliano G., Torti G., NuttiRonchi J’..
AlarazzitiD., J’ergaraM. R., OrselliS., TerziM. DNA
methylation of embryonic carrot cell culture and its varia-
tions as caused by mutation, differentiation, hormones and
hypomethylating drugs // Theor. Appl. Genet. 1989.
Vol. 77. P. 325—331.
LykoF., RamsahqyeВ. H, JaenischR. DNA methylation in Dro-
sophila melanogaster 11 Nature. 2000. Vol. 408. P. 538—540.
Makarevich G., J’illar С. B. R, Erilova A., Koehler C. Mecha-
nism of PHERES1 imprinting in Arabidopsis // J. Cell Sei.
2008. Vol. 121. P. 906—912.
MartienssenR, BaronA. Coordinate suppression of mutations
caused by' Robertson’s mutator transposons in maize /7
Genetics. 1994. Vol. 136. P. 1157—1170.
Matzke AL, Aufsatz JJ’., KatmoT., DaxingerL., Papp I., Alet-
te Al. F, Matzke .4. J. Al. Genetic analysis of RNA-me-
diated transcriptional gene silencing // Biochim. Biophys.
Acta. 2004. Vol. 167. P. 129—141.
Alatzke Al. A., Alatzke A. J. AL. Homology-dependent gene si-
lencing in transgenic plants: What does it really' tell us? /7
Trends Genet. 1995. Vol. 11. P. 1—3.
Miguel C., Alarum L. An epigenetic view of plant cells cultured
in vitro: somaclonal variation and beyond " J. Exp. Bot.
2011. Vol. 62. P. 3713—3725.
Nelson Al., BurbankD. E., J’an Etten J. L. Chlorella viruses
encode multiple DNA methyltransferases // Biol. Chem.
1998. Vol. 379. P. 423 428/
Ngernprasirtsiri J., Kobayashi H. Akazawa T. DNA methyla-
tion as a mechanism of transcriptional regulation in non-
photosynthetic plastids in plant cells // Proc. Natl. Acad.
Sei. USA. 1988. Vol. 85. P. 4750 4754.
Ortega-Galisteo A. P., Alorales-RuizT., Ariza R R., Roldan-
Arjona T. Arabidopsis DEMETER-LIKE proteins DML2
and DML3 are required for appropriate distribution of
DNA methylation marks // Plant Mol. Biol. 2008. Vol. 67.
P. 671—681.
Palmgren G, AlattsonO., OkkelsF. T. Specific levels of DNA
methylations in various tissues, cell lines, and cell types of
Daucus carota ' Plant Physiol. 1991. Vol. 95. P. 174—178.
Penterman J., Zilberman D., Huh J. H, Ballinger T, Heni-
koffS., Fischer R. L. DNA demethylation in the Arabidop-
sis genome " Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2007. Vol. 104.
P. 6752 6757.
Prakash A. P.. Kush A.. Lakshmanan P.. Kumar P.P. Cytosine
methylation occurs in a CDC48 homologue and a MADS-
box gene during adventitious shoot induction in Petunia
leaf explants И J. Exp. Bot. 2003. Vol. 54. P. 1361—1371.
Pratt K, Hattman S. Deoxyribonucleic acid methylation and
chromatin organization in Tetrahvmena thermophila //
Mol. Cell. Biol. 1981. Vol. 1. P. 600—608.
Rae P. AL. Spear В. B. Macronuclear DNA of the hypotrichous
ciliate Oxvtricha fallax // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1978.
Vol. 75. P. 4992 4996.
88 ЭПИГЕНЕТИКА
Ranjit D. К.. Rideout AL. C. Nefzi A., Ostresh J. AL, Pinilla C..
Segall A. AL. Small molecule functional analogs of pep-
tides that inhibit lambda site-specific recombination and
bind Holliday junctions H Bioorg. Med. Chem. Lett. 2010.
Vol. 20. P. 4531—4534.
Razin A. CpG methylation, chromatin structure and gene silenc-
ing a threeway connection // EMBO J. 1998. Vol. 17.
P. 4905 4908.
Razin A., Riggs A. D. DNA methylation and gene function//
Science. 1980. Vol. 210. P. 604—610.
Riggs C. D., Chrispeels AL. J. The expression of phytohemag-
glutinin genes in Phaseolus vulgaris is associated with or-
gan-specific DNA methylation patterns // Plant Mol. Biol.
1999. Vol. 14. P. 629—532.
Rogers J., Rogers S. II. Comparison of the effects of №-me-
thyldeoxyadenosine and C5-methyldeoxycytosine on tran-
scription from nuclear gene promoters in barlev 11 Plant J.
1995. Vol. 7. P. 221—233.
Rogers S.D., Rogers AL. E., Saunders (i.. HoltG. Isolation of
mutants sensitive to 2-aminopurine and alkylating agents
and evidence for the role of DNA methylation in Penicil-
lium chrvsogemmi // Curr. Genet. 1986. Vol. 10. P. 557—
560.
Rogers S. IE, Rogers J. C. The importance of DNA methylation
for stabi 1 itv of foreign DNA in barley // Plant Mol. Biol.
1992. Vol. 18. P. 945—961.
Romanov G. A., Fanyushin B. F. Methylation of reiterated se-
quences in mammalian DNAs. Effects of the tissue type,
age, malignancy and hormonal induction // Biochim. Bio-
phys. Acta. 1981. Vol. 653. P. 204—218.
Rossi Г., ALottoAL, Pellegrini L. Analysis of the methylation
pattern of the maize Opaque-2(02) promoter and in vitro
binding studies indicate that the 02 В-Zip protein and
other endosperm factors can bind to methylated target se-
quences // J. Biol. Chem. 1997. Vol. 272. P. 13758—
13765.
Sono H. DNA methylation and Lamarckian inheritance // Proc.
Jap. Acad. 2002. Vol. 78. P. 293—298.
SchlappiAL., Raina R., FedoroffN. Epigenetic regulation of the
maize Spin transposable element: Novel activation of a
methylated promoter by TnpA// Cell. 1994. Vol. 77.
P. 427—437.
Sherman J. D., Talbert L. E. Vernalization-induced changes of
the DNA methylation pattern in winter wheat // Genome.
2002. Vol. 45. P. 253—260.
Shibuya K, Fukushima S., TakatsujiH. RNA-directed DNA
methylation induces transcriptional activation in plants '/
Proc.’ Natl. Acad. Sci. USA. 2009. Vol. 106. P. 1660—
1665.
Soppe IF J. J., Jasencakova Z., Houben A., Kakutani T, ALeis-
terA.. Huang AL. S.. Jacobsen S. E.. Schubert L.. FranszP. F.
DNA methylation controls histone H3 lysine 9 methyla-
tion and heterochromatin assembly in Arabidopsis '/
EMBO J. 2002. Vol. 21. P. 6549—6559.
Tamaru H., Selker E. U. A histone H3 methyltransferase con-
trols DNA methylation in Neurospora crassa // Nature.
2001. Vol. 414. P. 277—283.
Tamaru H., ZhangX., ALcALillen D., Singh P. B., Nakayama J.,
Grewal S. L, Allis C. D., ChengX., Selker E. U. Trimethy-
lated lysine 9 of histone H3 is a mark for DNA methyla-
tion in Neurospora crassa // Nat. Genet. 2003. Vol. 34.
P. 75—79.
Tang IE, Leisner S. Methylation of nonintegrated multiple copy
DNA in plants // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998.
Vol. 245. P. 403 406.
Fanyushin B. F. Replicative DNA methylation in animals and
higher plants // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1984.
Vol. 108. P. 99—114.
Fanyushin B. F. DNA methylation in plants// Curr. Top. Mi-
crobiol. Immunol. 2006. Vol. 301. P. 67—122.
Fanyushin B. F, Alexandrushkina N. L, KirnosALD. Nf’-Met-
hyladenine in mitochondrial DNA of higher plants //
FEBS Lett. 1988. Vol. 233. P. 397—399.
Fanyushin B. F, AshapkinF. F Peculiarities of DNA methyla-
tion in plants // Progress in DNA methylation research I
H. P. Neumann (edr). N.Y.: Nova Science, 2007. P. 1—90.
Fanyushin B. F, Ashapkin F. F. DNA methylation in plants.
N.Y.: Nova Biomedical Books: Nova Science, 2009. 152 p.
Fanyushin B. F, AshapkinF. F. DNA methylation in higher
plants: past, present and future // Biochim. Biophys. Acta.
2011. Vol. 1809. P. 360 368.
Fanyushin B. F, Dobritsa .1. P. On the nature of cytosine-
methylated sequence in DNA of Bacillus brevis var. G.-
B. // Ibid. 1975. Vol. 407. P. 61—72.
Fanyushin B. F, KirnosAL. D. The nucleotide composition and
pyrimidine clusters in DNA from beef heart mitochon-
dria // FEBS Lett. 1974. Vol. 39. P. 195—199.
Fanvushin B. F, KirnosAL. D. DNA methylation in plants//
" Gene. 1988. Vol. 74. P. 117—121.
Fanyushin В. F, Belozersky A. N., Kokurina N. A., Kadiro-
va D. X. 5-Methylcvtosine and 6-methylaminopurine in
bacterial DNA // Nature. 1968. Vol. 218.’P. 1066—1067.
Fanvushin B. F, Tkacheva S. G., Belozersky A. N. Rare bases in
’ animal DNA //Nature. 1970. Vol. 225. P. 948—949.
Fanyushin B. F, Buryanov Ya. L., Belozersky A. N. Distribution
of V6-methyladenine in DNA of T2 phage and its host
E. coli B. // Nat. New Biol. 1971. Vol. 230. P. 25—27.
Fanyushin B. F., ALazin A. L., Fasiliev F. K, Belozersky A. N.
The content of 5-methylcytosine in animal DNA: The spe-
cies and tissue specificity // Biochim. Biophys. Acta.
1973a. Vol. 299. P. 397^103.
Fanyushin В. F, Nemirovsky L. E., Klimenko FF, Fasi-
liev F. K, Belozersky A. N. The 5-methylcytosine in DNA
of rats. Tissue and age specifi city and the changes in-
duced by hydrocortisone and other agents // Gerontologia.
1973b. Vol’ 19. P. 138—152.
Fanyushin B. F., Bakeeva L. E., Zamyatnina F A., Aleksan-
drushkina N. 1. Apoptosis in plants: Specific features of
plant apoptotic cells and effect of various factors and
agents // Int. Rev. Cytol. 2004. Vol. 233. P. 135—179.
llasova T. L., Demidenko T. L., KirnosALD., Fanyushin B. F.
In vitro DNA methylation by wheat nuclear cytosine
DNA-methvltransferase: effect of phytohormones // Gene.
1995. Vol. 157. P. 279—281.
llasova T. L., Fanyushin B. F. DNA methylation by wheat cyto-
sine DNA methyltransferase: Modulation by protease in-
hibitor E-64 // Biochem. Mol. Biol. Int. 1998. Vol. 45.
P. 145—153.
IFada 1., Ohya H., Yamaguchi Y., Koizumi N, SanoH. Prefer-
ential de novo methylation of cytosine residues in non-
CpG sequences by a domains rearranged DNA methyl-
transferase from tobacco plants // J. Biol. Chem. 2003.
Vol. 278. P. 42386—42393.
WasseneggerAL, HeimesS., Riedel L., Sanger H. L. RNA di-
rected de novo methylation of genomic sequences in
plants // Cell. 1994. Vol. 76. P. 567—576.
ZhangX., YazakiJ., Sundaresan A., CokusS., ChanS. IF.,
Chen H., Henderson L. R, Shinn P., Pellegrini AL., Jacob-
sen S.E., Ecker J. R. Genome-wide high-resolution map-
ping and functional analysis of DNA methylation in Ara-
bidopsis // Cell. 2006. Vol. 126. P. 1189—1201.
ГЛАВА
4
МЕХАНИЗМЫ
ЭПИГЕНЕТИЧЕСКОГО НАСЛЕДОВАНИЯ
СОДЕ РЖАН И Е
4.1. Стабильность эпигенетических ме-
ток во времени, 92
4.2. Поддержание эпигенетических ме-
ток во время репликации ДНК, 93
4.3. Поведение хроматиновых меток во
время митоза, 101
4.4. Наследование уровней упаковки
хроматина более высокого порядка
и пространственной организации
ядра, 102
Список литературы, 105
90 ЭПИГЕНЕТИКА
В многоклеточном организме присутствуют
различные типы клеток, обладающие одинако-
вой последовательностью ДНК. Следовательно,
характеристики, отличающие клетки одну от дру-
гой, могут быть записаны «над» последователь-
ностью /ТНК Некоторые из них обладают спо-
собностью стабильно наследоваться в клеточных
поколениях. Именно такие характеристики мы
относим к эпигенетическим. Это, прежде всего,
паттерн экспрессии генов. Но сюда же можно
отнести и пространственно-временную органи-
зацию репликации ДНК, становление и поддер-
жание пространственной архитектуры ядра и
таких специфических хроматиновых доменов, как
центромеры и теломеры, а также поддержание
доменной организации хроматина в целом. В на-
стоящей главе мы обсудим именно механизмы
стабильного поддержания эпигенетических ха-
рактеристик в клеточных поколениях.
В самом простом случае для наследования ак-
тивного или, наоборот, неактивного состояния
гена достаточно механизма положительной об-
ратной связи. Предположим, что ген А должен
постоянно экспрессироваться в клеточных поко-
лениях после разового воздействия определенного
внешнего сигнала. Для постоянного поддержания
гена А во включенном состоянии достаточно, что-
бы продукт гена А активировал его экспрессию
(рис. 4.1). Можно предположить также, что этот
продукт будет со временем разрушаться и в клет-
ке будет определенная равновесная концентрация.
Деление клетки должно привести к разбавлению
концентрации продукта А в клетке, но оно будет
через некоторое время компенсировано синтезом
дополнительного продукта. Если продукт гена А
будет выступать как репрессор гена В, то посто-
янное активное состояние А будет обеспечивать
выключенное состояние гена В.
Еще в 1961 г. Ф. Жакоб и Ж. Моно предложи-
ли схему наследственной передачи информации
об активности генов, основанной на так называе-
мом генетическом триггере. Отрицательные об-
ратные связи между двумя оперонами создают
двухопсронный триггер — систему’ с двумя насле-
дуемыми устойчивыми функциональными состоя-
ниями (рис. 4.2). Примерами реальных триггеров
являются система управления репликацией у фага
лямбда [Ратнер, 1975; Ratner, Tchuraev 1978], а на-
следуемого состояния — лизогения. Выбор режи-
ма функционирования (в простейшем случае —
есть или нет активность гена) зависит от регуля-
торных молекул, циркулирующих в клетке.
Роль подобных триггеров в развитии и диф-
ференцировке клеток эукариотических организ-
мов можно продемонстрировать на примере ло-
гической схемы, связанной с выбором между’ со-
стоянием плюрипотентности, характерным для
стволовых клеток, или же состоянием, связанным
с дифференцировкой. В стволовых клетках при-
сутствуют факторы транскрипции, в частности
Oct4, которые являются активаторами для целого
набора генов, необходимых клетке для поддер-
жания ее в плюрипотентном состоянии. Эти фак-
торы одновременно подавляют экспрессию мно-
жества генов, работающих в дифференцирован-
ных клетках. В геноме закодированы и факторы
транскрипции, оказывающие противоположное
действие на тот же набор генов (рис. 4.3). В каком
состоянии будет находиться система? Вероятно,
это зависит от того, действие какого фактора
окажется сильнее. Добавим положительную об-
ратную связь самим факторам транскрипции и
подавление ими транскрипции друг друга. В та-
кой системе каждое из двух возможных состоя-
ний системы становится устойчивым. Тот транс-
крипционный фактор, который «победил», будет
наследовать собственное включенное состояние
и постоянно подавлять экспрессию «конкурен-
та». Переключить систему’ из одного состояния в
другое можно при помощи внешнего фактора,
который мог бы пересилить действие «победи-
теля» и активировать фактор с противоположной
активностью. Тогда экспрессия первого фактора
начнет падать, и, в результате, вся система ока-
жется «перепрограммированной». Именно с ис-
пользованием такого подхода впервые получены
индуцированные плюрипотентные клетки [Taka-
hashi, Yamanaka 2006; Wemig et al., 2007].
Ген «выключен»
Кратковременный внешний
сигнал активирует транскрипцию
Ген остается включенным
за счет положительной обратной связи
Рис. 4.1. Петля положительной обратной связи позволяет поддерживать ген в активном состоянии.
ГЛАВА 4 91
Рис. 4.2. Двухоперонный триггер — система с двумя
устойчивыми функциональными состояниями.
Гены, препятствующие
Рис. 4.3. Логическая схема экспериментального перепрограммирования соматической
клетки в стволовую.
Но, вероятно, для стабильного существования
многоклеточного организма этого оказалось не-
достаточно. У высших эукариот важнейшую роль
в поддержании и наследовании состояния экс-
прессии генов берет на себя хроматин. Транс-
крипционные факторы работают в определенном
хроматиновом ландшафте, который не так-то
просто «перепрограммировать». Именно поэто-
му’ репрограммирование клеток — процесс очень
низкоэффективный (около 1 % клеток достигают
плюрипотентности) и постепенный, требующий
множества клеточных поколений и последова-
тельных почти стохастических промежуточных
шагов [Hiratani, Gilbert, 2009]. Хроматин выпол-
няет и другие важные функции, в частности, под-
держание структурных элементов хромосом —
центромер и теломер.
В хроматине можно выделить два типа меток:
кратковременные инструкции, которые могуч быть
быстро изменены в ответ на полученные сигналы
(например, тепловой шок или повреждения в
ДНК), и долговременные инструкции, способные
поддерживаться длительное время, уже без уча-
стия первоначального индуктора. Как правило,
долговременные инструкции, записанные в хрома-
тине, работают на уровне относительно протяжен-
ных доменов. Такие домены характеризуются оп-
ределенным набором модификаций гистонов, ва-
риантов гистонов, набором негистоновых белков,
положением в ядре, временем репликации в S-фа-
зе, плотностью активных генов. Все эти характе-
ристики являются взаимосвязанными, они уста-
навливаются в данном типе клеток на опреде-
ленном этапе дифференцировки и могут ста-
бильно поддерживаться. Проблему’ механизмов
такого поддержания можно разделить на две:
• стабильность эпигенетических меток во
времени;
• поддержание эпигенетических меток в
ходе последовательных клеточных деле-
ний. В частности, способность сохранения
или точного воспроизведения эпигенети-
ческих меток во время таких серьезных
событий, как сборка-разборка хроматина
при репликации и глобальная реорганиза-
ция ядра в митозе.
92 ЭПИГЕНЕТИКА
4.1. Стабильность эпигенетических меток
во ВРЕМЕНИ
Круговорот гистонов и стабильность эпи-
генетических меток. Вопрос о стабильности
эпигенетических меток в течение длительного
времени возникал, в первую очередь, в связи с
вопросом о стабильности эпигенетического ста-
туса долгоживущих клеток, в частности, нейро-
нов. Но он стал еще более актуальным, когда
стало выясняться, что многие характеристики
хроматина гораздо более динамичны, чем о них
думали раньше. Оказалось, например, что в хро-
матине очень быстро происходит круговорот
гистонов (histone tumower). Исследования на
культурс клеток дрозофилы показали, что в рай-
онах сайтов инициации транскрипции (transcrip-
tion start site TSS) активно работающих генов
полный обмен нуклеосом происходит очень бы-
стро — всего за 1 ч. Время одного клеточного
цикла в этой культурс клеток составляет около
15 ч. и за это время нуклеосомы должны обно-
виться около 15 раз. Более того, в сайтах посад-
ки таких белков, как EZ и PSC — важнейших
участников эпигенетического наследования, —
время обмена гистонов составляло в этих клет-
ках всего полтора часа [Deal et al., 2010].
Интересно, что круговорот димеров Н2А—
Н2В происходит значительно быстрее, чем кру-
говорот НЗ—Н4. Предполагается, что именно
поэтому большинство меток, определяющих дли-
тельное поддержание эпигенетического состоя-
ния, связано именно с модификациями гистона
НЗ [Kimura, Cook, 2001; Probst et al., 2009]. Кроме
того, метилирование гистонов считается более
стабильной меткой, чем ацетилирование. Ацети-
лирование гистонов динамично в клеточном цик-
Рис. 4.4. Структура белка НР1 (а) и механизм поддер-
жания НР1-зависимого хроматина (б).
ле и регулируется равновесием между- аце-
тилтрансферазами и деацетилазами. Например,
НЗК9/14ас удаляется из хроматина в проме-
тафазе митоза и восстанавливается лишь в тело-
фазе [Kruhlak etal., 2001]. Общий уровень аце-
тилирования может значительно меняться и в
ответ на другие сигналы клеточного цикла, на-
пример, во время О2/М-чекпойнта [Bonenfant
et al., 2007].
Становится очевидным, что любое длитель-
ное поддержание в домене определенных харак-
теристик нуклеосом обеспечивается динамиче-
скими процессами.
Механизм положительной обратной связи
обеспечивает стабильность гетерохроматино-
вых доменов. Поскольку все компоненты хро-
матина связаны с ним динамично, общий меха-
низм сохранения локальных особенностей хро-
матина— это механизм положительной обрат-
ной связи. Рассмотрим его действие на примере
HP 1-зависимого гетерохроматина. HP 1-зависи-
мый гетерохроматин присутствует у всех иссле-
дованных эукариот за исключением дрожжей
5. cerevisiae. Как правило, он связан с прицент-
ромерными районами, обогащенными повторен-
ными последовательностями. Его главной харак-
теристикой является ди- и триметилирова-
ние гистона НЗ по девятому- лизину (НЗК9ше2,
НЗК9шеЗ). Это метилирование осуществляет
гистонметилтрансфераза, которая у дрозифилы
носит название SU(VAR)3-9 (Suv39hl,2 —у чело-
века, Сг14 — у S. pombe).
Белок НР1 имеет хромодомен (chromodomain),
который позволяет ему- связываться с метилиро-
ванными НЗК9. Кроме того, в белке НР1 есть так
называемый хромотеневой домен (chromoshadoyv
domain), который отвечает за белок-белковые
взаимодействия. Этот домен обеспечивает, в част-
ности. взаимодействие молекул НР1 друг с дру-
гом и с SU(VAR)3-9. Привлекая в хроматин
SU(VAR)3-9, НР1 обеспечивает новое метилиро-
вание НЗК9 в той же или в соседних нуклеосо-
мах. Новые сайты метилирования будут снова
привлекать НР1 и так далее (рис. 4.4). Таким об-
разом, формируется петля положительной обрат-
ной связи (самоподдерживающаяся петля) [Lach-
ner et al.. 2001].
У млекопитающих с НР1 может связываться
и ДНК-метилтрансфераза DNMT1, которая вно-
сит метилильную метку2 в ДНК. С метилирован-
ной ДНК, в свою очередь, взаимодействует бе-
лок МБР, способный привлекать в хроматин де-
ацетилазу гистонов и гистонметилтрансферазу.
Получается, что присутствие в хроматине мети-
ГЛАВА 4 93
лирования ДНК будет способствовать дальней-
шему’ метилированию ДНК, деацетилированию
гистонов, метилированию гистонов по НЗК9 и
привлечению НР1. Все эти модификации будут
также поддерживать метилирование ДНК и друг
друга. Такой хроматин может стабильно сохра-
нять свой характерный набор модификаций дли-
тельное время, несмотря на динамическую при-
роду’ связывания отдельных его компонентов —
гистонов и негистоновых белков.
Так ли стабильны эпигенетические метки?
Динамическое равновесие между’ различными
компонентами хроматина во времени и в про-
странстве ядра позволяет стабильно поддержи-
вать определенный статус экспрессии генов, но
оставляет возможность на определенных этапах
жизненного цикла изменить ситуацию. При оп-
ределенных условиях можно сдвинуть равнове-
сие, обеспечить доступ к хроматину^ новым регу-
ляторным белкам и перепрограммировать хро-
матиновый домен, переведя его в новое состоя-
ние динамического равновесия.
Интересно отметить, что для полного сохра-
нения хроматиновым доменом своих свойств не-
обходимо, чтобы все соответствующие структур-
ные белки и ферментативные активности присут-
ствовали в ядре. Оказалось, что многие компонен-
ты хроматина экспрессируются не постоянно, но
лишь на определенных стадиях клеточного цикла.
Складывается впечатление, что можно говорить о
значительной динамике свойств хроматиновых
доменов в целом в ходе клеточного цикла [Вопеп-
fant et al., 2007; Scharf et al., 2009a, b],
4.2. Поддержание эпигенетических меток
во время репликации ДНК
В ходе репликации происходит точное вос-
произведение последовательности нуклеотидов в
молекуле ДНК. А что происходит во время реп-
ликации с эпигенетическими маркерами? Оказы-
вается, в репликационной вилке идут процессы,
обеспечивающие точное воспроизведение пат-
терна многих хроматиновых меток. Это касается
метилирования ДНК, некоторых модификаций
гистонов и некоторых структурных белков хро-
матина. Мы говорим, только некоторых? Да.
именно так. Некоторые компоненты хроматина
во время репликации снижают концентрацию
или вовсе покидают хроматин, и для их полного
восстановления требуется время, иногда — боль-
шая часть клеточного цикла.
Ниже мы обсудим несколько взаимосвязан-
ных механизмов, работающих в репликационной
вилке и необходимых для эпигенетического на-
следования.
Наследование паттерна метилирования
ДНК. Среди всех механизмов наследования эпи-
генетических меток через репликационную вил-
ку’ первым был открыт механизм наследования
метилирования ДНК у млекопитающих. Здесь
клетки используют полуконсервативность реп-
ликации. Во вновь синтезированной ДНК одна
из цепей сохраняет все метильные метки. Сразу’
после синтеза ДНК с метильными группами в
полуметилированных дочерних цепях связыва-
ется белок NP95. С ним связывается поддержи-
вающая ДНК-метилтрансфераза DNMT1 и обес-
печивает точное воспроизведение паттерна ме-
тилирования ДНК.
Казалось бы, эффективность такого наследо-
вания может быть абсолютной. На самом деле,
ситуация немного сложнее. Оказалось, что под-
держивающие метилазы обеспечивают не пол-
ное воспроизведение паттерна. Пропущенные
метки затем восстанавливаются учреждающими
ДНК-метилтрансферазами. Таким образом, для
поддержания метилирования ДНК также необ-
ходимо взаимодействие с другими компонента-
ми хроматина и принцип положительной обрат-
ной связи (см. обзор [Blomen, Boonstra, 2011]).
Сборка-разборка нуклеосом в репликаци-
онной вилке. Во время репликации молекула
ДНК, находящаяся в репликационной вилке, в
какой-то момент должна быть полностью осво-
бождена от нуклеосом. Но если нуклеосомы ухо-
дят, каким образом можно сохранить модифи-
кации гистонов и связанные с ними свойства
хроматина?
Чтобы разобраться в этом вопросе, необходи-
мо остановиться на механизмах сборки и раз-
борки хроматина.
Нуклеосома является стабильной структурой
только тогда, когда на нее намотана молекула
ДНК. В растворе гистоны могут присутствовать
в виде димеров НЗ—Н4, Н2А—Н2В. НЗ—Н4
формирует стабильный в отсутствие ДНК тетра-
мер. При сборке нуклеосомы с ДНК в первую
очередь связываются димеры НЗ—Н4, формируя
тетрамер, затем присоединяются димеры Н2А и
Н2В. Разборка происходит в обратном порядке
[Henikoff. 2008].
Для правильной сборки хроматина в нуклео-
сомы необходимо как минимум два класса бел-
ков-помощников: так называемые гистоновые
шапероны и белки АТФ-зависимого ремоделин-
та хроматина. Поскольку’ гистоны имеют значи-
тельный положительный заряд, простое добав-
94 ЭПИГЕНЕТИКА
ление гистонов к молскуле ДНК в растворе при-
водит к образованию нерастворимого комплекса.
Гистоновые шапероны всегда сопровождают
гистоны на пути в ядро и управляют сборкой
нуклеосом. Эти белки, в частности, временно
экранируют заряд гистонов. Белки ремоделинга
хроматина обеспечивают упорядоченное рас-
пределение нуклеосом по ДНК [Haushalter, Ka-
donaga, 2003].
Во время репликации гистоновые шапероны
локализуются непосредственно в репликационной
вилке. В частности, CAFl связан с PCNA, ASF1 —
с МСМ. Эти белки участвуют как в разборке, так
и в сборке хроматина. По-видимому, при сборке
хроматина нуклеосома разбирается на димеры
(только димеры создают устойчивый комплекс с
шаперонами CAF1 и ASF1 in vitro), и эти димеры
не «уплывают» из репликационной вилки, но
встраиваются тут же, во вновь синтезированные
молекулы ДНК. Таким образом, гистоны, несущие
определенные метки, встраиваются в хроматин в
непосредственной близости от того места, где они
были до прихода репликационной вилки.
В литературе активно обсуждался вопрос,
происходит ли сборка нуклеосом по полуконсер-
вативному принципу’ (т. е. каждая нуклеосома
должна включать ровно половину’ старых гисто-
нов и половину’ новых) или же происходит «слу-
чайно» (т. е. новая нуклеосома может состоять
как из комбинации старых и новых гистоновых
димеров, так и только из старых или только
вновь синтезированных гистонов). Большинство
фактов говорит в пользу’ второго варианта. На-
пример, известно, что вариант гистона НЗ—НЗ.З
не синтезируется во время S-фазы и встраивает-
ся в хроматин на других этапах клеточного цик-
ла. В случае полуконсервативного механизма во
время S-фазы должны возникать «смешанные»
нуклеосомы НЗ/НЗ.З, однако экспериментально
обнаружить такие нуклеосомы не удалось [Loyo-
la et al., 2006]. Нередко высказывается точка зре-
ния, что старые НЗ—Н4 переносятся из старого
хроматина в новый в виде тетрамера. В под-
тверждение, недавно было обнаружено, что гис-
тоновые шапероны из класса Nap-белков (Nuc-
leosome assembly proteins, в частности Napl и
Vps75 дрожжей 5. cerevisiae) связываются с гис-
тонами НЗ и Н4 именно в форме тетрамера
[Bowman et al., 2011]. Однако, даже если «истин-
но полуконсервативный» принцип при сборке
нуклеосом не работает, мы знаем, что хромати-
новые метки, связанные с эпигенетической регу-
ляцией, как правило, организованы в протяжен-
ные домены. Для воспроизведения хроматино-
вых меток на уровне однородного протяженного
домена точного полуконсервативного принципа и
не требуется — ферменты, вносящие метки в хро-
матин, будучи связанными с одной нуклеосомой,
могут вносить метки в соседние нуклеосомы.
Механизм прямого переноса белков из старо-
го хроматина в новый работает не только для
гистонов. Так, например, шаперон CAF1 облада-
ет функцией связываться с молекулой НР1 перед
репликационной вилкой и переносить его во
вновь собирающийся за вилкой хроматин [Loyo-
la et al., 2009].
Проблема снижения концентрации эпиге-
нетических маркеров в хроматине после реп-
ликации. Описанный выше механизм приводит
к тому’, что все гистоны, вместе со своими моди-
фикациями, будут сохранять свое положение в
пределах хроматиновых доменов после прохож-
дения репликационной вилки. В то же время, по-
сле репликации ДНК становится в два раза
больше и для упаковки всей этой ДНК требуется
в два раза больше гистонов.
Синтез гистонов в клетке приурочен к S-фазе
клеточного цикла. Вновь синтезированные гис-
тоны получают в цитоплазме специфический на-
бор модификаций, которые будут «переписаны»
во время встраивания этих гистонов в хроматин
или во время дозревания хроматина после реп-
ликации.
Важно отметить, что во время S-фазы в клет-
ке синтезируются только основные варианты
гистонов. Такие специфические варианты, как
НЗ.З или центромерный вариант НЗ, синтези-
руются на других этапах клеточного цикла.
Таким образом, гистоны, которые были в хро-
матине до репликации и несли эпигенетические
метки, будут «разбавлены» вновь синтезирован-
ными гистонами, этих меток не имеющими.
Однако если в хроматине сохраняется хотя
бы половина модификаций, то, как мы уже упо-
минали, остальные могут быть восстановлены по
механизму’ обратной связи, в частности, за счет
взаимодействия между’ модификациями. Такое
восстановление действительно происходит. При
этом некоторые модификации восстанавливаются
очень быстро, непосредственно в репликацион-
ной вилке. Другие же могуч вноситься позднее, во
время пострепликационного «дозревания» хрома-
тина, или даже на гораздо более поздних этапах
клеточного цикла, например, в метафазе или G1.
Восстановление хроматиновых меток не-
посредственно в репликационной вилке. Мно-
жество ферментов-модификаторов хроматина
сидят непосредственно в репликационной вилке.
ГЛАВА 4 95
Димеры
Н2А—Н2В
Г метоновые
шапероны
ASF1, CAF1,
HIRA
тетрамер
НЗ—Н4
Димеры
НЗ—Н4
Г метоновые шапероны
NAP1, FACT
б Родительские гистоны
Вновь синтезированные гистоны
Рис. 4.5. Сборка (а) и разборка (б) нуклеосом.
При сборке нуклеосомы сначала на ДНК собирается тетрамер (НЗ—Н4)2, затем присоединяются димеры Н2А и Н2В. Димеры
НЗ—Н4 поставляются гистоновыми шаперонами CAF1 и ASF1, HIRA участвует в транспортировке димеров, содержащих вари-
ант НЗ.З. Димеры Н2А—Н2В связаны с шаперонами NAP1 и FACT. Разборка нуклеосом происходит в обратном порядке. Во
время репликации нуклеосомы снимаются с ДНК, при этом они распадаются на родительский тетрамер НЗ—Н4, который затем
может быть разобран на димеры гистоновыми шаперонами, и димеры Н2А—Н2В. Родительские гистоны сохраняют все моди-
фикации гистонов неизменными. При сборке новых нуклеосом возможны различные комбинации старых и новых гистонов.
Новые гистоны несут специфические для них модификации, которые будут заменены во время или после встраивания гистона
в хроматин (по [Probst et al., 2009]).
96 ЭПИГЕНЕТИКА
Главной посадочной площадкой для них служит
PCNA. Этот гомотример, с одной стороны, ста-
билизирует взаимодействие ДНК-полимеразы с
ДНК, а с другой, взаимодействует с огромным
количеством белков, привлекая их к месту’ син-
теза ДНК (рис. 4.6) [Moldovan et al., 2007; Probst
et al., 2009]. В частности, у млекопитающих не-
посредственно с PCNA взаимодейству’ют деаце-
тилазы гистонов и метилтрансферазы, вовлечен-
ные в монометилирование Н4К20 (H4K20mel),
ДНК-метилтрансфераза DNMT1, а также белки
ремоделинга хроматина (Williams syndrome tran-
scription factor (WSTF)—(SNF2H)). Кроме того, с
PCNA в вилке репликации связан гистоновый
шаперон CAF1, который не только участвует в
сборке—разборке нужлеосом, но тоже является
посадочной площадкой для ряда белков. Он мо-
жет взаимодействовать с метил-СрО-связыва-
ющим белком MBD1 НЗК9-гистонметилтранс-
феразой SetDBl (обеспечивающей монометили-
рование НЗК9 (H3K9mel)) и белком НР1. Пред-
полагается, что именно CAF1 переносит молеку-
лы НР1 из хроматина перед репликационной
вилкой во вновь формирующийся хроматин. При
мутации в HP 1-связывающем сайте белка CAF1
S-фаз доходит до середины и останавливается
(для обзора см. [Probst et al., 2009]).
Некоторые модификаторы гистонов привле-
каются в репликационную вилку’ машиной мети-
лирования ДНК, используя ее одновременно в
Рис. 4.6. PCNA является посадочной площадкой для множества белков, обеспечивая
координацию между синтезом ДНК и пострепликационной сборкой хроматина.
При репликации ДНК в клетках млекопитающих PCNA привлекает в репликационную вилку chroma-
tin assembly factor 1 (CAF1) модификаторы гистонов: деацетилазы гистонов (HDAC), гистон-
метилтрансферазу SET8, белки ремоделинга хроматина (WSTF—SNF2H). В зависимости от при-
сутствия метилирования ДНК, PCNA вместе с NP95 привлекает ДНК-метилтрансферазу (DNMT1),
которая метилирует полуметилированные CpG-сайты на дочерних цепях (по [Probst et al., 2009]).
ГЛАВА 4 97
качестве посадочной площадки и в качестве мар-
кера соответствующего типа хроматина. Напри-
мер, DNMT1 и NP95 привлекают в репликацион-
ную вилку деацетилазы гистонов. Кроме того,
DNMT1 взаимодействует с гистонметилтрансфе-
разой G9a. NP95 имеет сродство как к полумсти-
лированной ДНК, так и к гистонам, метилиро-
ванным по НЗК9. Следовательно, этот белок
может связываться с полумстилированной ДНК,
интерпретировать гистоновое окружение и осу-
ществлять петлю обратной связи, обеспечиваю-
щую взаимное усиление метилирования ДНК и
меток в гистонах.
Не только PCNA. но и некоторые другие белки
репликации принимают участие в эпигенетичес-
ком наследовании. Например, комплекс МСМ2-7
взаимодействует с гистоновым шапероном ASF1,
который, так же как и CAF1, участвует в коорди-
нации потока гистонов между родительскими и
дочерними цепями ДНК.
Одновременное привлечение всех этих бел-
ков в рспликационную вилку’, вероятно, обеспе-
чивает координацию между’ всеми метками, вно-
симыми в ДНК и гистоны. После репликации
PCNA, вместе с CAF1, сохраняются на отрепли-
цированной ДНК еще около 20 мин, что позво-
ляет закончить все необходимые модификации
хроматина. Кроме того, соседство гистоновых
шаперонов и модификаторов хроматина позво-
ляет вносить некоторые модификации в гистоны
еще до сборки нуклеосомы. Это относится к аце-
тилированию [Lande-Diner et al., 2009] и H3K9mel
[Loyola et al., 2006].
Пострепликационное дозревание хромати-
на. Несмотря на то, что, казалось бы, в вилке со-
средоточены все возможные ферментативные ак-
тивности, связанные с модификациями гистонов,
далеко не все события непосредственно сопрово-
ждают репликацию. Исследования модификаций
гистонов в клеточном цикле методами масс-
спектрометрии показали, что если ацетилирова-
ние и монометилирование происходят достаточно
быстро, то ди- и триметилирование происходят
медленно и постепенно. Такое постепенное вос-
становление хроматиновых маркеров после реп-
ликации назвали «дозревание хроматина».
В работе, сделанной на клетках HeLa, было
показано, что монометилирование происходит
во время или сразу после сборки нуклеосом. Ве-
роятно, те гистонметилтрансферазы, которые
присутствуют в репликационной вилке, отвеча-
ют именно за монометилирование. За этим рез-
ким всплеском метилирования следует относи-
тельно медленное повышение более высоких
уровней метилирования [Scharf et al., 2009]. Это
согласуется с более ранними результатами, полу-
ченными на дрозофиле, что монометилирование
может предшествовать и быть необходимым для
дальнейшего метилирования [Schotta et al., 2004].
Последовательное метилирование указывает
на дополнительный уровень регуляции перехода
между’ менее и более метилированными форма-
ми. Триметилированные формы намного лучше
связывают структурные белки, такие как НР1
или Polycomb, которые конденсируют хроматин
посредством предотвращения ремоделинга хро-
матина. Можно спекулировать, что медленное
триметилирование предотвращает преждевре-
менную конденсацию хроматина, в результате
чего ДНК на время остается более доступной
для внешних сигналов. Эта уникальная возмож-
ность (yvindoyv of opportunity’) может позволить
клеткам изменить профиль экспрессии генов в
случае получения соответствующих внешних
сигналов [Scharf et al., 2009].
Возможно, в пострепликационном дозрева-
нии хроматина могут участвовать дополнитель-
ные сайт-специфические факторы, например,
ДНК-связывающие белки. В результате одни и
те же свойства, создаваемые в хроматине во вре-
мя репликации ДНК, могут затем использоваться
по-разному в разных доменах.
Динамика метилирования НЗК27 в клеточ-
ном цикле. Выше мы обсудили HPl/SU(VAR)3-9/
H3K9me2 хроматин. Еще один важный класс
хроматиновых доменов, связанный с репрессией
генов, необходимых на ранних этапах развития
многоклеточных, связан с белками группы Poly-
comb. Характерной для таких доменов гистоно-
вой модификацией является триметилирование
НЗК27 (НЗК27теЗ).
Белки группы Polycomb впервые были откры-
ты у дрозофилы, поэтому’ при описании мы бу-
дем использовать названия белков, принятые
для дрозофилы. Эти белки формируют несколь-
ко комплексов, наиболее консервативными сре-
ди которых являются PRC1 и PRC2 (Polycomb
repressive complex 1, 2). Enhancer of zeste (E(Z))
(у млекопитающих EZH2) — субъединица комп-
лекса PRC2. Это гистон-метилтрансфераза, ме-
тилирующая лизин 27 гистона НЗ. Эта хромати-
новая метка специфически узнается хромодоме-
ном белка Polycomb (PC), входящего в комплекс
PRC1. Комплекс PRC1 обладает рядом катали-
тических активностей, необходимых для репрес-
сии транскрипции, и формирует транскрипцион-
но-неактивный хроматин. Комплекс PRC2 тоже
может узнавать НЗК27теЗ.
98 ЭПИГЕНЕТИКА
Поддержание во времени и эпигенетическое
наследование хроматина, связанного с Polycomb-
сайленсингом, в общих чертах сходно с под-
держанием прицентромерного гетерохроматина.
В то же время. Polycomb-регуляция значительно
более динамична в ходе развития организма и,
вероятно, требует более тонкой регуляции.
Долгое время считалось, что, как только
в хроматине устанавливается метилирование
НЗК27теЗ, оно привлекает комплекс PRC2, что
приводит к новому’ метилированию. В пользу
быстрого восстановления статуса метилирования
НЗК27 во время репликации говорили и данные
о том, что PRC2 локализован в репликационной
вилке и солокализуется с PCNA [Hansen et al.,
2008].
Однако множество фактов указывает на то,
что гистон-метилтрансферазы, локализованные
в репликационной вилке, катализируют только
монометилирование. Это относится и к EZH2,
которая в целом отвечает за все уровни метили-
рования [Scharf etal.. 2009]. В результате пос-
ле репликации происходит заметное снижение
уровня НЗК27шеЗ. Кроме того, на клетках HeLa
было показано, что количество НЗК27шеЗ сни-
жается примерно в два раза и во время митоза,
после чего в ходе поздней G1- и S-фазы проис-
ходит восстановление уровня метилирования
[Aoto et al., 2008]. На каком же этапе клеточного
цикла происходит восстановление НЗК27шеЗ?
Совсем недавно в исследованиях на клетках
дрозофилы и клетках млекопитающих было по-
казано, что в клеточном цикле на стадии, пред-
шествующей репликации, происходит значи-
тельный подъем уровня экспрессии компонентов
всех комплексов, участвующих в Polycomb-еай-
ленсинге. Одновременно в хроматине наблюда-
ется значительное повышение общего уровня
НЗК27шеЗ. Эти события происходят в ранней
S-фазе, предшествуя репликации генов — мише-
ней Polycomb сайленсинга. На стадии поздней
S-фазы, когда происходит репликация соответ-
ствующих локусов, уровень НЗК27теЗ снижает-
ся [Lanzuolo etal., 2011]. Для сравнения инте-
ресно отметить, что уровень НЗК9те2 в ходе
всего клеточного цикла претерпевает лишь не-
значительные колебания [Aoto et al.. 2008], что
еще раз подчеркивает различия в поведении
НР1- и Polycomb-завиеимого хроматина в кле-
точном цикле.
Этот пример показывает, что дозревание
хроматина может происходить на самых разных
этапах клеточного цикла и даже непосредствен-
но перед очередным раундом репликации. Глав-
ное, что для поддержания «информации» о со-
стоянии хроматина в ряду клеточных поколений
достаточно восстановить некий базовый уровень
соответствующих меток хотя бы один раз в кле-
точном цикле.
Динамика вариантов гистонов в клеточном
цикле. В ходе репликации в хроматин встраива-
ются только основные варианты гистона НЗ. Дру-
гие варианты, такие как НЗ.З и CENPA, транс-
крибируются на других этапах клеточного цикла
и встраиваются в хроматин независимо от репли-
кации при помощи специальных гистоновых ша-
перонов.
Вариант НЗ.З встраивается в такие участки
хроматина, где происходит наиболее быстрый
обмен гистонов. Как правило, это транскрипци-
онно активный хроматин. Во время сборки хро-
матина в репликационной вилке все гистоны
НЗ.З будут приходить только из родительских
нуклеосом т. е. будет происходить разбавление
метки НЗ.З.
Однако, судя по всему’, разбавление НЗ.З и
его модификаций в два раза в ходе репликации
не влияет на транскрипционный статус соответ-
ствующего района. Если же ген продолжает ак-
тивно экспрессироваться, будет происходить
быстрая замена Н3.1 на НЗ.З. Модификации гис-
тонов, связанные с унаследованными молекула-
ми НЗ.З, могут привлекать факторы, которые
модифицируют вновь встроенные НЗ.З, а также
создают метки активного хроматина в Н3.1. По-
казано, что, будучи в соседстве с нуклеосомами,
несущими НЗ.З, нуклеосомы с вариантом Н3.1
накапливают метки активного хроматина [Loyola
et al., 2006] (рис. 4.7).
Вариант гистона НЗ — CENPA определяет
положение центромеры. Связывание CENPA с
центромерами является исключительно стабиль-
ным и практически не подвержено динамике в
ходе клеточного цикла. Исследования, прове-
денные на клетках млекопитающих, показали,
что включение новых CENPA в центромеры про-
исходит в очень коротком промежутке клеточ-
ного цикла — поздней телофазе — ранней G1
[Jansen et al., 2007].
Центромерная ДНК реплицируется в S-фазе,
при этом родительские CENPA-нуклеосомы рас-
пределяются между дочерними цепями. Следо-
вательно, после репликации хроматин в центро-
мерах несет только половину’ соответствующей
метки до окончания S-фазы, всю последующую
фазу G2 и большую часть фазы М. До конца не
ясно, в каком виде центромерный хроматин «до-
жидается» встройки вновь синтезированных цент-
ГЛАВА 4 99
Замена на вариант НЗ.З
во время транскрипции
НЗ.З—Н4
Новый Н3.1—I
Н2А—Н2В
Активная метка
«Нестабильная»
нуклеосома
с НЗ.З—Н4
Более
стабильная
нуклеосома
с Н3.1—Н4
Рис. 4.7. Динамика хроматина, содержащего гистоновый вариант НЗ.З, в клеточном цикле.
«Разбавление» во время S-фазы и постепенное восстановление концентрации во время транскрипции. В этом
восстановлении участвует гистоновый шаперон HIRA (по [Probst et al., 2009]).
ромерных нуклеосом. Наиболее вероятно, что в
ходе репликации центромерный хроматин час-
тично упаковывается в нуклеосомы, несущие
Н3.1, которые затем будут заменены на другие,
содержащие CENPA. Можно предположить, что
в хроматине временно будет пониженная кон-
центрация нужлеосом.
Однако есть еще один возможный сценарий.
Недавно было показано, что CENPA-содержа-
щие нуклеосомы могут иметь необычную струк-
туру. Так, у 5. cerevisiae специализированная
нуклеосома, несущая cse4 (дрожжевой вариант
центромерного гистона НЗ), существует в фор-
ме. где гистоны Н2А и Н2В заменены на негис-
тоновый белок suppressor of chromosome misseg-
regation 3 (Scm3) [Mizuguchi et al., 2007]. У D. me-
lanogaster обнаружены «полунуклсосомы», кото-
рые состоят из гистонов сепНЗ (центромерный
вариант НЗ), Н4, Н2А и Н2В в одном экземпля-
ре [Dalal etal., 2007]. Можно считать, что «не-
обычные» нуклеосомы, содержащие CENPA, со-
ответствуют центромерному' хроматину’ на про-
межуточном этапе сборки, несущему' половину'
CENPA, до того, как вновь синтезированные мо-
леку'лы CENPA восстановятся в прежнем коли-
честве на более поздних этапах клеточного цик-
ла (рис. 4.8).
Роль времени репликации хроматиновых
доменов в эпигенетическом наследовании.
Еще один важный механизм, участвующий в
эпигенетическом наследовании различных типов
хроматина, — пространственно-временная регу-
ляция репликации генома. В целом можно ска-
зать, что активный хроматин реплициру'ется на
ранних этапах S-фазы, в то время как хроматин,
соответствующий генам в состоянии сайленсин-
га, реплицируется в середине S-фазы, и послед-
ней реплициру'ется большая часть конститутив-
ного гетерохроматина.
Само по себе разделение во времени и в про-
странстве репликации и, соответственно, сборки
разных типов хроматина кажется очень разум-
ным решением, поскольку' обеспечивает допол-
нительную защиту' от случайного перераспреде-
ления хроматиновых меток. Так, например,
очень важно, чтобы центромерный вариант гис-
тона НЗ собрался вновь только на центромерной
ДНК. Появление этого гистона в других районах
хромосомы может привести к возникновению
эктопической центромеры. Предполагается, что
у всех эужариот центромерный хроматин являет-
ся независимым репликационным доменом, хотя
время репликации центромерной ДНК может
значительно различаться. Так, у дрожжей Candi-
da albicans, S. cerevisiae и 5. pombe центромер-
ный хроматин реплициру'ется в самом начале
S-фазы [Kim etal., 2003; Koren etal., 2010]. Для
Candida albicans показано, что ориджин репли-
кации, связанный с центромерой, является наи-
более рано активиру'ющимся ориджином в хро-
100 ЭПИГЕНЕТИКА
S-фаза, снижение концентрации CENP-A в хроматине
Рис. 4.8. Три гипотетических модели «поведения» центромерных нуклеосом в клеточном цикле (см. текст)
(по: [Probst et al., 2009]).
мосоме, при этом перенос центромерных детер-
минант в эктопический сайт также приводит к
очень ранней репликации [Koren etal., 2010].
У высших эукариот центромерная ДНК может
реплицироваться на самых разных этапах S-фа-
зы, однако всегда асинхронно с соседним при-
центромерным гетерохроматином [Weidtkamp-
Peters et al., 2006].
Кроме такого пассивного влияния на упаков-
ку хроматина, пространственно-временная орга-
низация репликации позволяет обеспечить ак-
тивный механизм эпигенетического наследова-
ния. Оказывается, что набор белков, участвую-
щих в упаковке и модификациях хроматина, мо-
жет значительно различаться в репликационных
вилках, работающих на разных этапах S-фазы.
Пожалуй, наиболее яркой иллюстрацией диф-
ференциальной сборки хроматина на разных
этапах S-фазы является ситуация с ацетилирова-
нием гистонов [Lande-Diner etal., 2009]. Оказа-
лось, ацетилирование гистонов НЗ и Н4, сопро-
вождающее сборку хроматина в репликационной
вилке, определяется именно временем реплика-
ции соответствующего района. Вновь синтези-
рованные димеры НЗ/Н4, прежде чем попасть в
нуклеосому, подвергаются следующим модифи-
кациям: на этапе ранней S-фазы изначально не
ацетилированный гистон НЗ активно ацетилиру-
ется. Для этого с репликационной вилкой связы-
ваются ацетилазы гистонов. На этапе поздней
S-фазы, наоборот, с репликационной вилкой свя-
заны деацетилазы гистонов, они деацетилируют
гистон Н4, который приходит в ядро в преацети-
лированном состоянии.
Получается, что ДНК, запрограммированная
реплицироваться в ходе первой половины S-фа-
зы, автоматически переупаковывается в ацети-
лированные коровые гистоны, в то время как рай-
оны генома, лежащие в поздно реплицирующихся
участках, получат деацетилированные гистоны.
Если заставить последовательности ДНК, изна-
чально упакованные в нуклеосомы с деацетили-
рованными гистонами, реплицироваться в ран-
ней S-фазе, происходит «переупаковка» хрома-
тина в ацетилированные гистоны. Наоборот, из-
менение репликации от ранней к поздней сопро-
вождается упаковкой хроматина в деацетилиро-
ванные гистоны [Lande-Diner et al., 2009].
Поскольку время репликации ДНК у высших
эукариот регулируется на уровне протяженных
(около 1 м.п.н.) доменов, получается, что во
время репликации геном будет подразделяться
на два дискретных типа доменов — гипо- или
гиперацетилированные. Это очень хорошо со-
гласуется с организацией хромосом млекопи-
тающих, где выделяются гиперацетилированные
ГЛАВА 4 101
рано реплицирующиеся R-диски и гипоацети-
лированные и реплицирующиеся позднее G-дис-
ки (рис. 4.9).
Метилирование НЗК4 осуществляется как в
ранней, так и в поздней S-фазе.
ДНК- и НЗК9-метилтрансферазы обнаружи-
ваются в вилках репликации на стадии поздней
S-фазы, что обеспечивает упаковку всех поздно
реплицирующихся последовательностей в гете-
рохроматин.
Получается, что мы опять имеем дело с пет-
лей обратной связи. Тип хроматинового домена
определяет время репликации, а время реплика-
ции, в свою очередь, определяет тип хроматина,
в который будет упаковываться домен.
Вероятно, таким образом поддерживается
«грубое» разделение доменов на отрытый и за-
крытый типы хроматина, которое осуществляет-
ся непосредственно в репликационной вилке.
После репликации постепенно происходит по-
следовательное дозревание хроматина, в кото-
ром могут участвовать дополнительные район-
специфические факторы, в частности, ДНК-свя-
зывающие белки, узнающие определенные сай-
ты-мишени или некодирующие РНК, сиквенс-
специфически привлекаемые к определенным
участкам генома.
Важно, что, регулируя время репликации
района, можно не только воспроизводить хрома-
тиновые метки в клеточных поколениях, но и пе-
репрограммировать состояния района. Так, в
культуре клеток млекопитающих при инъекции
плазмиды, несущей репортерный ген, на стадии
поздней S-фазы репортерный ген запаковывает-
ся в закрытый хроматин и не транскрибируется.
Это состояние затем наследуется в клеточных
поколениях. Если же инъекция происходит на
более ранних этапах S-фазы, репортерный ген
стабильно транскрибируется в клеточных поко-
лениях [Zhang et al., 2002: Lande-Diner et al.,
2009]. Вероятно, такое перепрограммирование
играет большую роль при дифференцировке кле-
ток [Hiratani et al., 2010].
4.3. Поведение хроматиновых меток
ВО ВРЕМЯ МИТОЗА
Во время митоза многие белки покидают
хромосомы. Это и факторы транскрипции, и бел-
ки, связанные с энхансерами, и, собственно РНК-
полимеразы (для обзора см. [Burke et al., 2005]).
Значительно снижается концентрация НР1, Ре,
DNMT1, HDAC1 и некоторых других белков,
участвующих в поддержании эпигенетического
Рис. 4.9. Бимодальная система ацетилирования диме-
ров НЗ—Н4 в репликационной вилке. В ранней S-фазе
гистон НЗ активно ацетилируется посредством гистон-
ацетилтрансфераз. Это происходит в репликационной
вилке, но еще до формирования нуклеосомы. Гистон
Н4 приходит в ядро в преацетилированном состоянии.
В поздней S-фазе в репликационной вилке гистонаце-
тилтрансферазы отсутствуют, зато присутствуют де-
ацетилазы, которые активно удаляют ацетильные мет-
ки с гистона Н4 (по [Lande-Diner et al., 2009]).
состояния хроматина [Aoto etal., 2008]. Уход из
хроматина ферментов — модификаторов гисто-
нов и таких важных игроков на поле эпигенети-
ки, как НР1 и PC, показывает, что поддержание
хроматина во время митоза — еще один важный
вопрос, требующий обсуждения.
НР1-зависимый хроматин во время мито-
за. Во время митоза киназа Aurora В фосфори-
лирует соседние с H3K9me H3S10, что приво-
дит к уходу из хроматина НР1. Однако уровень
НЗК9те2 остается практически неизменным.
После митоза фосфатаза РР1 дефосфорилирует
H3S10, после чего НР1 может снова связаться
с метилированными НЗК9 и восстановить свою
роль гетерохроматинового регулятора [Blomen,
Boonstra, 2011].
Итак, мы снова имеем дело с петлей обратной
связи между’ метилированием НЗК9 и НР1. Ка-
залось бы, никаких дополнительных механизмов
и не требуется. Однако, у 5. pombe поддержание
хроматина, связанного с метилированным НЗК9
и дрожжевым гомологом НР1—SWI6 в ряду’
клеточных поколений, требует дополнительного
участия системы РНК-интерференции.
Дрожжи 5. pombe проводят значительную
часть времени в фазе G2, во время которой при-
центромерные повторы упакованы в нуклеосо-
мы, обогащенные НЗК9ше2, с которыми связан
SWI6. Когда клетки входят в митоз, гистон НЗ
фосфорилируется по основанию S10, что приво-
дит к снижению связывания SWI6 и облегчает
сегрегацию хромосом. Центромеры вступают
в репликацию очень рано, еще до начала цито-
102 ЭПИГЕНЕТИКА
кинеза. Связанное с репликацией разбавление
гистонов НЗК9те2 приводит к дальнейшему’
снижению концентрации SWI6. Это делает соот-
ветствующий участок ДНК доступным для РНК-
полимеразы II. и начинается двунаправленная
транскрипция прицентромерных повторов. Транс-
крипты подвергаются процессингу до малых ин-
терферирующих РНК (siRNA), которые накап-
ливаются во время S-фазы. Затем по механизму’
связанного с РНК-интерференцией транскрип-
ционного сайленсинга происходит привлечение
в соответствующие районы НЗК9 гистон-метил-
трансферазы и деацетилазы гистонов, восстанав-
ливающих гетерохроматиновые характеристики
[Chen etal., 2008; Kloc etal., 2008; Probst etal.,
2009]. Получается, что у 5. pombe в каждом
клеточном цикле гетерохроматин формируется
de novo.
Считается, что у высших эукариот подобный
механизм принимает участие в становлении НР1-
зависимого хроматина на этапах раннего разви-
тия, в то время как при дальнейшем наследова-
нии его в клеточных поколениях достаточно
взаимодействия между’ хроматиновыми метками.
H3K9me2/3 сохраняются на всех этапах клеточ-
ного цикла, кроме того, не все молекулы НР1
уходят из хроматина во время митоза. Однако
показано, что в клетках мышей в конце митоза, в
G1- и в ранней S-фазе также идет накопление
центромерных РНК. Их роль в эпигенетическом
наследовании не известна [Lu, Gilbert. 2007].
Интересно, что в клетках человека в течение
всего митоза НР1, ассоциированный собственно
с центромерой, остается связанным с хромати-
ном, и это связывание не зависит от метилиро-
вания НЗК9 [Hayakawa et al., 2003]. Это застав-
ляет задуматься о том, что, когда мы говорим
«прицентромерный гетерохроматин упакован в
HP 1-зависимый хроматин», мы не должны забы-
вать, что реально прицентромерный гетерохро-
матин не однороден, в нем можно выделить раз-
личные типы хроматина, связанные и не связан-
ные с НР1 [Demakova et al., 2007]. Вероятно, для
поддержания разных типов доменов могут ис-
пользоваться различные дополнительные меха-
низмы эпигенетического наследования.
Polycomb-зависимый хроматин во время ми-
тоза. Во время митоза концентрация НЗК27теЗ
в хроматине снижается [Aoto et al., 2008], однако
около половины этой метки все-таки сохраняет-
ся. Большая часть комплексов PRC2 также про-
должает выявляться в районах хромосом, марки-
рованных НЗК27теЗ. Во время митоза из хро-
матина уходят комплексы PRC1, и возвращаются
они в PRC2-3aBncnMbie НЗК27теЗ-районы после
окончания клеточного деления. Приход PRC1
обеспечивает формирование структуры хромати-
на более высокого порядка. Интересно, что гло-
бальное восстановление статута метилирования
этих доменов происходит только по окончании
стадии G1.
4.4. Наследование уровней упаковки
ХРОМАТИНА БОЛЕЕ ВЫСОКОГО ПОРЯДКА
И ПРОСТРАНСТВЕННОЙ ОРГАНИЗАЦИИ ЯДРА
Обратим внимание, что во время митоза из
хроматина уходят именно те компоненты систе-
мы Polycomb-сайленеинга, которые формируют
структуры хроматина высокого порядка. Белок
НР1 тоже участвует в глобальной упаковке хро-
матина в ядре, например, в формировании хро-
моцентров. Можно предположить, что сохране-
ние подобных структур помешало бы упаковке
хроматина, необходимой для сегрегации хромо-
сом. Возникает вопрос, каким образом эти струк-
туры высшего порядка восстанавливаются после
митоза. Вероятно, здесь работает несколько фак-
торов. Во-первых, в хроматине сохраняются мет-
ки, которые будут узнаваться возвращающимися
белками и позволят им вновь связаться со свои-
ми районами. Во-вторых, архитектура хроматина
(т. е. взаимное расположение отдельных участ-
ков генома, петлевая организация) разрушается
не полностью. Она должна сохраняться на таком
уровне, чтобы вернувшиеся в хроматин белки,
начав взаимодействовать друг с другом, могли
обеспечить ее дальнейшую самосборку’, причем
единственно правильным образом.
Ядерный матрикс и поддержание прост-
ранственной организации ядра. Одним из важ-
ных механизмов поддержания петлевой органи-
зации хроматина является сохранение во время
митоза контактов ДНК с ядерным матриксом
[larovaia et al., 2004, 2005]. Участки генома, взаи-
модействующие с ядерным матриксом, называ-
ются MAR (matrix associated regions). MAR-рай-
оны являются важной эпигенетической характе-
ристикой клеток. Они принимают непосредст-
венное участие в регуляции репликации ДНК
(эффективные ориджины репликации обязатель-
но должны быть прикреплены к матриксу) и тка-
неспецифической транскрипции. Контакты ДНК/
матрикс приводят к образованию хроматиновых
петель размерами от 20 до 200 т.п.н., которые
могут значительно меняться в ходе дифферен-
цировки клеток [Разин, 2006].
ГЛАВА 4 103
Однако прикрепления ДНК к ядсрному мат-
риксу неоднородны по своей природе. Они мо-
гут быть разделены на две большие группы: (1)
перманентные участки прикрепления, и (2) вре-
менные участки прикрепления, возникающие в
связи с осуществлением различных функцио-
нальных процессов [Там же]. Судя по всему’,
взаимодействия между энхансерами и промото-
рами относятся к временным взаимодействиям.
Именно постоянно взаимодействующие участки,
вероятно, являются каркасом для дальнейшей
сборки пространственной организации ядра.
Одним из кандидатов на главную роль в под-
держании этих постоянных тканеспецифических
взаимодействий является CTCF. Этот белок, пер-
воначально описанный как инсуляторный, вы-
полняет в ядре множество функций. Накаплива-
ются факты о глобальной роли CTCF в форми-
ровании хроматиновых петель и контактов меж-
ду различными районами хромосом. В частно-
сти, он обеспечивает взаимодействия между' эн-
хансерами и промоторами. В клетках млекопи-
тающих CTCF обнаруживается на границах до-
менов активного и неактивного хроматина. Счи-
тается, что здесь он играет важную роль в раз-
граничении доменов [Barski et al., 2007; Guelen
et al., 2008; Cuddapah et al., 2009]. Согласно дру-
гим исследованиям, CTCF часто маркирует гра-
ницы гетерохроматиновых доменов, связанных
с ядерной ламиной |Guelen etal., 2008]. Все это
указывает на его важную роль в пространствен-
ной организации хроматина в ядре.
Оказалось, что как связывание CTCF с хрома-
тином, так и пространственное взаимодействие
удаленных участков хроматина, обусловленное
CTCF, может сохраняться в митотических хро-
мосомах [Burke et al., 2005; Rubio et al., 2008;
Phillips, Corces, 2009]. Предполагается, что взаи-
модействие связанных с удаленными участками
хроматина молекул CTCF друг с другом, а также
с другими белками может обеспечивать стабили-
зацию определенного уровня организации хро-
матина. Можно полагать, что сохранение струк-
туры доменов в целом позволяет затем восстано-
вить более тонкие пространственные взаимодей-
ствия, в частности, взаимодействие энхансеров
с промоторами.
Чтобы лучше понять, как это происходит,
рассмотрим, как CTCF участвует в пространст-
венной организации бета-глобинового локуса
мыши (рис. 4.10). Этот локус включает несколь-
ко генов, расположенных тандемно. Их экспрес-
сия происходит последовательно и только в клет-
ках эритроидного ряда. Для того чтобы экспрес-
сироваться, каждый ген должен быть пространст-
венно приближен к локус-контролирующему’
элементу' (locus control region, LCR), в состав ко-
торого входит энхансер. В окрестностях класте-
ра есть четыре потенциальных сайта связывания
для белка CTCF, один из которых находится в
LCR. В неэритроидных клетках CTCF не связы-
вается со своим потенциальным сайтом в LCR
бета-глобинового локуса. В этой ситуации эн-
хансер в принципе не может взаимодействовать с
промотором — хроматин организован так, что они
расположены очень далеко друг от друта. В клет-
ках эритроидного ряда CTCF сидит во всех четы-
рех сайтах, в результате чего сайты взаимодейст-
вуют друг с друтом, образуя розетку петель хро-
матина. Глобиновые гены оказываются в одной
петле, пространственная организация которой по-
зволяет энхансеру7 взаимодействовать с промото-
рами при наличии соответствующих транскрип-
ционных факторов. Как только эти транскрипци-
онные факторы появятся в клетке — это происхо-
дит на определенном этапе развития, — автомати-
чески формируется новая петля между' энхансе-
ром и промотором. Точно так же, если во время
митоза транскрипционные факторы покинут хро-
мосому', но сохранится петлевая организация, ос-
нованная на взаимодействиях с CTCF-сайтами, то
после возвращения транскрипционных факторов
петли быстро восстановятся [Phillips, Corces,
2009].
Итак, если взаимодействие энхансер—промо-
тор достаточно динамично, то структура, созда-
ваемая с участием CTCF, стабильна и способна
сохраняться при прохождении через митоз. Воз-
вращение в хроматин энхансер-связывающих
белков после митоза автоматически восстановит
энхансер-промоторное взаимодействие, так как
эти структу'ры поддерживаются пространственно
сближенными.
7]рянс-факторы и наследование простран-
ственной организации ядра. Кроме гщс-факто-
ров, остающихся в хроматине во время митоза,
важную роль должны играть и шрс/нс-факторы,
распределяющиеся по дочерним клеткам и вре-
менно не связанные с хроматином. Если помес-
тить дифференцированные ядра Xenopus в экс-
тракт яиц Xenopus. компетентных к митозу, в них
происходят глобальные изменения хромосомной
архитектуры. В частности, значительно меняется
характерный размер петель хроматина, заякорен-
ных на ядер ном матриксе. Следовательно, в экс-
тракте присутствуют какие-то шрс/нс-факторы,
которые позволяют наследовать и перепрограм-
мировать упаковку' хроматина в петли.
104 ЭПИГЕНЕТИКА
Рис. 4.10. Специфические для разных клеточных типов внутрихромосомные взаимодействия в бе-
та-глобиновом локусе мыши, обусловленные CTCF.
а — схематически представлен мышиный р-глобиновый локус. Четыре гена глобинов (sy и phi активны в прими-
тивных эритроидных клетках, p-major и p-minor — в дефинитивных эритроидных клетках) оказались внутри клас-
тера генов обонятельных рецепторов (OR). Локус-контролирующий район (LCR) содержит несколько сайтов,
гиперчувствительных к обработке ДНКазой I (HS, черные стрелки), соответствующих различным регуляторным
элементам. Розовые прямоугольники обозначают потенциальные сайты связывания CTCF. е—г — специфи-
ческий паттерн связывания CTCF в предшественниках эритроидных клеток, дефинитивных эритроидных клетках
и неэритроидных (нервных) клетках определяет пространственную организацию локуса. Хотя петли изображены
так, как будто молекулы CTCF взаимодействуют непосредственно друг с другом, вероятно, на самом деле они
взаимодействуют через посредников, которые пока не известны (по [Phillips, Corces, 2009]).
Среди таких транс-факторов, управляющих
сборкой петлевой структуры, можно отметить
базовые компоненты пререпликационного комп-
лекса— ORC. Показано, что выбор сайтов, с ко-
торыми в данном клеточном цикле будет связан
ORC, происходит в конце митоза—начале G1,
как раз в то время, когда начинается восстанов-
ление ядерной организации. Существует очень
хорошая корреляция между размером петель
и размером репликонов [Courbet etal., 2008].
И ремоделинг размера петель, и распределение
ориджинов репликации, и привлечение в хрома-
тин ORC находятся в зависимости от топоизоме-
разы II [Lemaitre et al., 2005]. Различия в концент-
рации ORC и локальных условиях хроматина,
влияющих на связывание ORC, могут быть фак-
тором, управляющим петлевой организацией
хроматина.
* * *
Мы рассмотрели некоторые общие законо-
мерности, которые могут обеспечить стабильное
поддержание в клеточных поколениях различ-
ных эпигенетических характеристик. Мы косну-
лись только наиболее изученных вопросов, по-
этому’ из нашего рассмотрения выпали некото-
рые важные направления, например, роль неко-
ГЛАВА 4 105
дирующих РНК (интересный пример, касаю-
щийся механизмов участия некодирующих РНК
и РНК-интерференции в эпигенетическом насле-
довании, можно найти в главе 20 про димину-
цию хроматина у инфузорий).
В качестве примера мы использовали самые
известные типы хроматиновых доменов. На са-
мом деле, в хроматине можно выделить значи-
тельно больше типов доменов. Для многих из
них механизмы наследования до сих пор не из-
вестны. Важно подчеркнуть, что локальные эпи-
генетические характеристики относительно лег-
ко изменяются, если появляется соответствую-
щий сигнал. Например, ковалентные модифика-
ции гистонов, каждая в отдельности, находятся в
динамическом равновесии и достаточно обрати-
мы. Напротив, организация хромосом на уровне
протяженных доменов, пространственная орга-
низация этих доменов в ядре, по-видимому, яв-
ляются гораздо менее обратимыми. К такого рода
явлениям относятся, например, изменения, наб-
людаемые при инактивации Х-хромосомы. Мож-
но отметить следующую тенденцию: чем выше
уровень организации хроматина, тем стабильнее
его эпигенетическое состояние. Вероятно, здесь
сказывается одновременная работа большого ко-
личества взаимосвязанных механизмов, обеспе-
чивающая в целом очень стабильное воспроизве-
дение всех эпигенетических меток.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Разин С. В. Пространственная организация эукариотическо-
го генома и работа эпигенетических механизмов 7 Ге-
нетика. 2006. Т. 42. С. 1605 1614.
Ратнер В. .1. Молекулярно-генетические системы управ-
ления. Новосибирск: Наука, 1975. 287 с.
AotoT., Saitoh N., Sakamoto Y., WatanabeS., NakaoM. Poly-
comb group protein-associated chromatin is reproduced in
post-mitotic G1 phase and is required for S phase progres-
sion // J. Biol. Chem. 2008. Vol. 283. P. 18905—18915.
BarskiЛ., CtiddapahS., Cui K, RohT.Y., Schones D. E.,
WangZ., Wei G., Chepelevl., Zhao K. High-resolution
profiling of histone methylations in the human genome //
Cell. 2007. Vol. 129. P. 823—837.
Blomen E A., Boonstra J. Stable transmission of reversible mo-
difications: maintenance of epigenetic information through
the cell cycle // Cell. Mol. Life Sci. 2011. Vol. 68. P. 27—
44.
BonenfantD., Towbin H, Couloti\L, Schindler P., Muel-
ler D. R., van Oostrum J. Analysis of dynamic changes in
post-translational modifications of human histones during
cell cycle by mass spectrometry // Mol. Cell. Proteomics.
2007.’Vol. 6. P. 1917—1932.
Bowman A., WardR, WiechensN., Singh E, El-Mkami H,
Norman D. G., Owen-Hughes T. The histone chaperones
Napl and Vps75 bind histones H3 and H4 in a tetrameric
conformation "Mol. Cell. 2011. V. 41. P. 398 408.
Burke L. J., ZhangR, BartkulmM., Tiwari Г. K., Tavoosi-
danaG., Kurukuti S., Weth C., Leers J., GaljartN., Ohls-
sonR., RenkawitzR. CTCF binding and higher order
chromatin structure of the Hl 9 locus are maintained in mi-
totic chromatin // EMBO J. 2005. Vol. 24. P. 3291—3300.
Chen E. S., ZhangK., Nicolas E., Cam HP., ZofallM., Gre-
wal S. I. Cell cycle control of centromeric repeat transcrip-
tion and heterochromatin assembly H Nature. 2008.
Vol. 451. P. 734 737.
CourbetS., GayS.. AmoultN.. WronkaG.. AnglanaM.. Bri-
son O., DebatisseM. Replication fork movement sets
chromatin loop size and origin choice in mammalian
cells //Nature. 2008. Vol. 455. P. 557—560.
CtiddapahS., Jothi R, Schones D.E., RohT.Y., Cui K.,
Zhao K. Global analysis of the insulator binding protein
CTCF in chromatin barrier regions reveals demarcation of
active and repressive domains // Genome Res. 2009.
Vol. 19. P. 24 32.
Dalal Y.. WangH, LindsayS.. HenikoffS. Tetrameric structure
of centromeric nucleosomes in interphase Drosophila
cells // PLoS Biol. 2007. Vol. 5. P. e218.
DealR. B., HenikoffJ. G., HenikoffS. Genome-wide kinetics of
nucleosome turnover determined bv metabolic labeling of
histones // Science. 2010. Vol. 328. P. 1161—1164.
Demakova О. E, Pokholkova G. E, Kolesnikova T. D., Dema-
kov S. A., Andreyeva E. N., Belyaeva E. S., ZhimulevI. F.
The SU(VAR)3—9/HP1 complex differentially regulates
the compaction state and degree of underreplication of X
chromosome pericentric heterochromatin in Drosophila
melanogaster // Genetics. 2007. Vol. 175. P. 609—620.
GuelenL., PagieL., BrassetE., Meuleman W., FazaM.B.,
TalhoutW., EussenB.H, de Klein A., Wessels L, de La-
ar W., van Steensel B. Domain organization of human
chromosomes revealed by mapping of nuclear lamina in-
teractions // Nature. 2008. Vol. 453. P. 948—951.
Hansen К. H., Bracken .4. P., Pasini D., Dietrich N, Geha-
ni S. S.. Monrad A., Rappsilber J.. Lerdrup M., Helin K. A
model for transmission of the H3K27me3 epigenetic
mark 11 Nat. Cell Biol. 2008. Vol. 10. P. 1291—1300.
Haushalter K. A., KadonagaJ.T. Chromatin assembly by
DNA-translocating motors // Nat. Rev. Mol. Cell Biol.
2003. Vol. 4. P. 613—620.
HayakawaT., Haraguchi T, Masumoto H, HiraokaY. Cell
cycle behavior of human HP1 subtypes: distinct molecular
domains of HP1 are required for their centromeric local-
ization during interphase and metaphase /7 J. Cell Sci.
2003. Vol. 116. P. 3327—3338.
Henikoff S. Nucleosome destabilization in the epigenetic regula-
tion of gene expression // Nat. Rev. Genet. 2008. Vol. 9.
P. 15—26.
HirataniL, GilbertD. M. Replication timing as an epigenetic
mark // Epigenetics. 2009. Vol. 4. P. 93 97.
HirataniL. RybaT.. ItohM.. RathjenJ., KulikM.. PappB..
Fussner E., Bazett-Jones D. P., Plath K, Dalton S., Rath-
jen P. D., Gilbert D. M. Genome-wide dynamics of repli-
cation timing revealed by in vitro models of mouse em-
bryogenesis // Genome Res. 2010. Vol. 20. P. 155—169.
larovaia О. V., AkopovS. B., Nikolaev L. G., Sverdlov E. D.,
Razin S. V. Induction of transcription within chromosomal
DNA loops flanked by' MAR elements causes an associa-
tion of loop DNA with the nuclear matrix // Nucleic Acids
Res. 2005. Vol. 33. P. 4157 4163.
Larovaia О. E, Bystritskiy A., RavcheevD., HancockR, Ra-
zin S. E Visualization of individual DNA loops and a map
of loop domains in the human dystrophin gene // Nucleic
Acids Res. 2004. Vol. 32. P. 2079—2086.
Jansen L. E., Black В. E., Foltz D. R., Cleveland D. W. Propaga-
tion of centromeric chromatin requires exit from mitosis //
J. Cell Biol. 2007. Vol. 176. P. 795—805.
Kim S. AL, DubeyD.D., HubermanJ.A. Early-replicating het-
erochromatin // Genes Dev. 2003. Vol. 17. P. 330—335.
106 ЭПИГЕНЕТИКА
Kimura Н., CookP.R. Kinetics of core histones in living hu-
man cells: little exchange of H3 and H4 and some ra-
pid exchange of H2B// J. Cell Biol. 2001. Vol. 153.
P. 1341—1353.
Kloc A., Zaratiegui AL, NoraE., ALartienssen R. RNA interfer-
ence guides histone modification during the S phase of
chromosomal replication// Curr. Biol. 2008. Vol. 18.
p. 490 495.
Koren A., Tsai H. J., Tirosh BurrackL. S., Barkai N, Ber-
man J. Epigenetically-inherited centromere and neocen-
tromere DNA replicates earliest in S-phase 11 PLoS Genet.
2010. Vol. 6. P. 61001068.
KnihlakAL. J., Hendzel AL J., Fischle IE, Benos N. R, Ha-
meed S., YangX. J., Verdin E., Bazett-Jones D. P. Regula-
tion of global acetylation in mitosis through loss of histone
acetyltransferases and deacetylases from chromatin " J.
Biol. Chem. 2001. Vol. 276. P. 38307—38319.
Bachner AL, O'Carroll D., ReaS., ALechtler K, Jenuwein T.
Methylation of histone H3 lysine 9 creates a binding site
forHPl proteins //Nature. 2001. Vol. 410. P. 116—120.
Lande-Diner L., Zhang J., Cedar H. Shifts in replication timing
actively affect histone acetylation during nucleosome reas-
sembly // Mol. Cell. 2009. Vol. 34. P. 767—774.
Lanzuolo C., Lo Sardo F., Diamantini A., Orlando К PcG com-
plexes set the stage for epigenetic inheritance of gene si-
lencing in early S phase before replication // PLoS Genet.
2011. Vol. 7. P. 61002370.
Lemaitre J. AL, DanisE„ PaseroP., VassetzkyY., ALechaliAL.
Mitotic remodeling of the replicon and chromosome struc-
ture 11 Cell. 2005. Vol. 123. P. 787—801.
Loyola A., Bonaldi T, Roche D., LmhofA., Almouzni G. PTMs on
H3 variants before chromatin assembly potentiate their final
epigenetic state // Mol. Cell. 2006. Vol. 24. P. 309—316.
Loyola A., Tagami H., BonaldiT., Roche D., QurvyJ.P., Im-
hof A.. Nakatani E. DentS. E. Almouzni G. The HPlalpha-
CAFl-SetDBl-containing complex provides H3K9mel for
Suv39-mediated K9me3 in pericentric heterochromatin//
EMBOReP. 2009. Vol. 10. P. 769—775.
Lu J., Gilbert D. AL. Proliferation-dependent and cell cycle regu-
lated transcription of mouse pericentric heterochromatin //
J. Cell Biol. 2007. Vol. 179. P. 411—421.
ALizuguchi G., Xiao H.. Wisniewski J., Smith AL. AL. Wu C. Non-
histone Scm3 and histones СепНЗ—H4 assemble the core
of centromere-specific nucleosomes // Cell. 2007. Vol. 129.
P. 1153—1164.
ALoldovan G. L., Pfander B., Jentsch S. PCNA, the maestro of
the replication fork // Cell. 2007. Vol. 129. P. 665—679.
Phillips J. E, Corces V. G. CTCF: master weaver of the ge-
nome 11 Cell. 2009. Vol. 137. P. 1194—1211.
Probst A. V, DunleavyE., Almouzni G. Epigenetic inheritance
during the cell cycle // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2009.
Vol. 10. P. 192—206.
Ratner Г. A., Tchuraev R. N. Simplest genetic systems control-
ling ontogenesis: organization principles and models of
their function // Progr. Theor. Biol. N.Y.: Acad. Press,
1978. V. 5. P. 82—127.
Rubio E. D., Reiss D. J., WelcshP.L., Disteche C. AL, Filippo-
va G. N, BaligaN. S., AebersoldR. RanishJ. A., KrummA.
CTCF physically links cohesin to chromatin// Proc. Natl.
Acad. Sci. USA. 2008. Vol. 105. P. 8309—8314.
Scharf A. N., Barth T. K, LmhofA. Establishment of histone
modifications after chromatin assembly // Nucleic Acids
Res. 2009. Vol. 37. P. 5032—5040.
Schotta G., LachnerAL, Sarma K, Ebert A., Sengupta R,
Reuter G., ReinbergD., Jenuwein T. A silencing pathway
to induce H3—K9 and H4—K20 trimethylation at consti-
tutive heterochromatin '/ Genes Dev. 2004. Vol. 18.
P. 1251—1262.
Takahashi K, Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells
from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by de-
fined factors // Cell. 2006. Vol. 126. P. 663—676.
Weidtkamp-Peters S., RahnH.P., Cardoso AL C., Hemme-
rich P. Replication of centromeric heterochromatin in
mouse fibroblasts takes place in early, middle, and late S
phase // Histochem. Cell Biol. 2006. Vol. 125. P. 91—102.
WenhgAL, ALeissnerA., ForemanR, BrambrinkT., KuAL.
Hochedlinger K, Bernstein В. E., Jaenisch R In vitro re-
programming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like
state // Nature. 2007. Vol. 448. P. 318—324.
Zhang J., Xu F, Hashimshony T, Keshet L., Cedar H. Estab-
lishment of transcriptional competence in early and late S
phase // Nature. 2002. Vol. 420. P. 198—202. ’
ГЛАВА
5
ПРОСТРАНСТВЕННО-ВРЕМЕННАЯ
ПРОГРАММА РЕПЛИКАЦИИ ДНК.
ЭПИГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ
В КЛЕТОЧНОМ ЦИКЛЕ И В РАЗВИТИИ
СОДЕ РЖАН И Е
5.1. Основные понятия, связанные
с инициацией репликации, 108
5.2. Чем определяется локализация
ориджинов?, 112
5.3. Программирование ориджинов
в клеточном цикле, 115
5.4. Протяженные репликационные
домены,129
5.5. Значение пространственно-вре-
менной регуляции репликации, 134
Список литературы, 136
108 ЭПИГЕНЕТИКА
В каждом клеточном цикле геномная ДНК
должна быть удвоена, чтобы обеспечить наслед-
ственным материалом дочерние клетки. Очень
важно, чтобы каждая последовательность была
копирована при этом ровно один раз. Для этого
процесс репликации должен жестко регулиро-
ваться в клеточном цикле.
Участок генома, на котором происходит ини-
циация репликации (синтеза лидирующей цепи
ДНК), называется ориджином репликации. Орид-
жин также можно определить как последова-
тельность ДНК, связывающую белки инициации
репликации. У эукариот в каждом клеточном
цикле репликация инициируется на множестве
ориджинов. Белки, участвующие в этом процес-
се, достаточно консервативны. Однако консен-
сусные последовательности ДНК, маркирую-
щие ориджины, обнаружены только у дрожжей
5. cerevisiae. Считается, что у метазоа сайты
инициации репликации определяются эпигене-
тически, что позволяет осуществлять более гиб-
кую регуляцию репликации генома, оптималь-
ную для разных типов клеток. Размер реплико-
нов и расположение ориджинов в значительной
степени определяются хроматиновым контек-
стом, регулируются в процессе онтогенеза и ме-
няются в ходе дифференцировки клеток. Распре-
деление активных ориджинов также меняется
в ответ на генотоксический стресс.
Время в S-фазе, когда включается каждый
конкретный ориджин, — еще один важный пара-
метр инициации репликации, находящийся под
эпигенетическим контролем. Регуляция времени
репликации осуществляется на уровне протя-
женных хроматиновых доменов. Районы генома,
маркированные модификациями гистонов, ха-
рактерными для активных генов, как правило,
имеют ранние ориджины, в то время как орид-
жины в районах с модификациями, характерны-
ми для молчащего хроматина, как правило, ак-
тивируются поздно в S-фазе. В то же время на-
капливаются данные о том, что само время реп-
ликации в S-фазе является определяющим фак-
тором для поддержания эпигенетического со-
стояния разных типов хроматиновых доменов.
Таким образом, эпигенетическое состояние хро-
матина и время его репликации тесно взаимосвя-
заны. В ходе дифференцировки клеток в про-
грамме репликации генома происходят значи-
тельные изменения, которые связаны с измене-
ниями в транскрипционной активности генов и
организации ядра.
В настоящей главе обсуждаются молекуляр-
ные механизмы пространственно-временной ре-
гуляции репликации как на уровне отдельных
ориджинов репликации, так и на уровне протя-
женных хроматиновых доменов.
5.1. Основные понятия, связанные
С ИНИЦИАЦИЕЙ РЕПЛИКАЦИИ
5.1.1. Последовательность событий,
предшествующих инициации
репликации
Инициация репликации на отдельном орид-
жине представляет собой сложный процесс, про-
ходящий в несколько этапов и требующий свя-
зывания с ориджином множества белков. Не-
смотря на то, что консервативной последова-
тельности ДНК, необходимой для инициации
репликации, у высших эукариот не обнаружено,
этапы инициации этого процесса и связанные с
ним белки в большой степени консервативны
[DePamphilis, 1999; Bell, Dutta, 2002; Weinreich
et al., 2004; Sclafani, Holzen, 2007; Borowiec,
Schildkraut, 2011].
На первом этапе на ориджине происходит
сборка шестисубъединичного комплекса ORC
(origin recognition complex). ORC остается свя-
занным с ориджином в течение почти всего кле-
точного цикла, и, следовательно, одной из его
функций может быть маркирование сайтов ини-
циации репликации. У позвоночных и D. melano-
gaster синтез и связывание ORC с хромосомами
регулируется в клеточном цикле [Asano, Whar-
ton, 1999; DePamphilis, 2003]. У 5. cerevisiae ORC
связан с хроматином постоянно.
На втором этапе ORC затекает сборку на
ориджине мультибелкового комплекса, называе-
мого пререпликационным комплексом (pre-RC).
Для формирования pre-RC необходимы как ми-
нимум ORC, Cdc6, Cdtl, МСМ9 и гетерогекса-
мерный комплекс МСМ2-7 (рис. 5.1). Cdc6 непо-
средственно взаимодействует с ORC, и вместе с
Cdtl эти белки необходимы для посадки МСМ.
Сборка pre-RC происходит в фазе G1 [Raghu-
raman et al., 1997; Dimitrova, Gilbert, 1999].
На третьем этапе, непосредственно перед
инициацией репликации на данном ориджине,
происходит его активация. Pre-RC последова-
тельно присоединяет дополнительные белки и
превращается в преинициаторный комплекс (рге-
IC). К таким белкам относятся Cdc45, RPA и
участвующие в репликации ДНК-полимеразы.
В отличие от предыдущих этапов, этот этап
происходит не одновременно на разных орид-
жинах и находится под контролем регуляторных
ГЛАВА 5 109
МстЭДД Cdc6
Cdc6
Cdtl
Мстэ) QRC
Пререпликационный комплекс
Инициация репликации
другие факторы репликации
(ДНК-полимеразы, киназы и др.)
Рис. 5.1. Последовательность событий при формировании пререпликационного комплекса и
активации ориджина репликации у млекопитающих (по: [Borowiec, Schildkraut, 2011]).
киназ. Это позитивный контроль киназами груп-
пы CDK (CDK1 и CDK2. циклин-зависимые ки-
назы, работают в комплексе с циклинами) и ки-
назой Cdc7 в комплексе с регуляторной субъ-
единицей Dbf4, а также негативный контроль ки-
назами, участвующими в клеточном ответе на
повреждение ДНК (intra-S-phase checkpoint).
Считается, что гетерогексамерный комплекс
МСМ2-7 вместе с Cdc45 и комплексом GINS яв-
ляются основной геликазой в процессе реплика-
ции [Ilves etal., 2010] (см. рис. 5.1). Связывание
Cdc45 и GINS приводят к активации геликазной
активности. Cdc45 необходим как для инициа-
ции репликации, так и для дальнейшего движе-
ния репликационной вилки. Предполагается, что
Cdc45 привлекает CDK2, что приводит к фосфо-
рилированию гистона Н1 и деконденсации хро-
матина. Это делает возможным инициацию и об-
легчает продвижение репликационной вилки
[Alexandrow, Hamlin, 2005].
Лицензирование ориджинов репликации.
Cdc6, Cdtl, МСМ9, и МСМ2-7 являются так на-
зываемыми лицензионными факторами репли-
кации, а механизм, обеспечивающий однократ-
ную активацию ориджинов в каждом клеточном
цикле, называется лицензированием. Этот меха-
низм основан на том. что сборка pre-RC возмож-
на только на определенном этапе клеточного
цикла, на этапе отсутствия или низкой концент-
рации циклин-зависимых киназ. Этот этап соот-
ветствует фазе G1, т. е. непосредственно пред-
шествует репликации. Перед началом S-фазы
происходит активация циклин-зависимых киназ,
что делает возможным инициацию репликации.
После инициации репликации данный ориджин
переходит в нелицензированное состояние, а
CDK-зависимое фосфорилирование лицензион-
ных факторов предотвращает новое лицензиро-
вание. В результате такого фосфорилирования
происходят ингибирование хроматин-связываю-
щей активности лицензионных факторов, ини-
циация их протеолиза или их транспортировка
из ядра в цитоплазму’. Кроме того, в клеточном
цикле у метазоа от начала S-фазы до конца ми-
тоза присутствует белок Geminin, который свя-
зывается с Cdtl и тем самым предотвращает ли-
цензирование. Когда репликация ДНК и сегрега-
ция хромосом успешно завершены, CDK инак-
тивируются и Geminin деградирует.
110 ЭПИГЕНЕТИКА
5.1.2. Пластичность
инициации репликации
Доля клеточных циклов, в которой данный
ориджин активируется, называется эффектив-
ностью ориджина. Каждый ориджин имеет оп-
ределенные эффективность и характерное время
активации: оба эти параметра программируются
в каждом клеточном цикле и, в то же время, яв-
ляются стабильными характеристиками ориджи-
на, наследуемыми эпигенетически. Время акти-
вации ориджина и его эффективность напрямую
не связаны — некоторые поздние ориджины эф-
фективны, некоторые — нет. Некоторые орид-
жины неэффективны из-за соседства с более ран-
ними ориджинами, другие — сами по себе [Rag-
huraman etal., 2001; Weinreich etal., 2004]. Эф-
фективность ориджинов у дрожжей варьирует в
широких пределах и может достигать 90 %
[Raghuraman etal., 2001; Heichinger etal., 2006].
У метазоа эффективность ориджинов значитель-
но ниже. Для тех ориджинов. которые достаточ-
но хорошо охарактеризованы, она колеблется в
пределах 5—20 % [Lebofsky et al., 2006; Hamlin
etal., 2008]. Такая низкая эффективность орид-
жинов означает, что в каждом конкретном рай-
оне события инициации репликации носят веро-
ятностный характер, и их распределение может
отличаться как между клетками одного типа, так
и в последующих клеточных циклах [Herrick,
2010: Mechali, 2010: Rhind et al., 2010].
Ориджины репликации, как правило, органи-
зованы в кластеры, образующие так называемые
зоны инициации репликации [Borowiec, Schild-
kraut, 2011; Mesner et al., 2011]. В пределах каж-
дой зоны инициации присутствует множество
ориджинов, но поскольку’ эффективность каждо-
го из них очень низка, локализация отдельных
событий инициации будет различаться между’
клетками. Когда в пределах кластера происходит
активация первого ориджина, соседние ориджи-
ны инактивируются вследствие «интерферен-
ции» [Lebofsky- et al., 2006].
У эукариот выделяют также «спящие», или дор-
мантные (dormant), ориджины, которые в нор-
мальном клеточном цикле никогда не иницииру-
ют репликацию, но активируются только в опре-
деленных условиях, в частности, в ответ на репли-
кационный стресс [Borowiec, Schildkraut, 2011].
Локализация ориджинов репликации, их эф-
фективность и последовательность активации
подвержены эпигенетической регуляции и в
большой степени определяют пространственно-
временные закономерности репликации генома.
На самых ранних этапах эмбрионального разви-
тия репликация осуществляется на ориджинах,
распределенных относительно случайно и акти-
вирующихся достаточно синхронно. Переход от
случайной к сайт-специфической инициации ре-
пликации происходит в развитии одновременно
с началом зиготической транскрипции [Wong
etal., 2011].
5.1.3. Кластеры совместно
регулируемых репликонов
Фокусы репликации. Репликация групп ре-
пликонов осуществляется в составе «фабрик»,
которые выявляются как точечные пятна (так
называемые фокусы) при импульсном включе-
нии в /ТНК предшественников нуклеотидов (на-
пример, BrdU) или при иммуноокрашивании на
белки репликации (рис. 5.2, а). Расположение в
ядре и размер фокусов репликации формируют
специфический паттерн на разных этапах S-фазы
(рис. 5.2, б). В ходе S-фазы количество актив-
ных фокусов, соответствующих эухроматино-
вым районам, в нуклеоплазме постепенно падает
до нуля, а количество активных фокусов, ассо-
циированных с гетерохроматиновыми районами,
в нуклеоплазме, вокруг ядрышек и около ядер-
ной мембраны возрастает. Количество наблю-
даемых фокусов в средней и поздней S-фазах
значительно меньше, чем в ранней S-фазе, в то
же время, средний размер этих фокусов больше.
Вероятно, эти дискретные репликационные до-
мены соответствуют так называемым реплика-
ционным дискам метафазных хромосом млеко-
питающих, совпадающим с гимза-положитель-
ными (G, реплицируются поздно) и гимза-отри-
цательными (R, реплицируются рано) дисками
метафазных хромосом [Holmquist, 1992; Drouin
et al., 1994; Strehl et al., 1997; Costantini, Bernardi,
2008]. У D. melanogaster существование фокусов
репликации в митотически делящихся клетках
на цитологическом уровне не показано, однако
есть данные о районах, протяженностью в не-
сколько сотен т.п.н., которые имеют тенденцию
реплицироваться в S-фазе одновременно, что
указывает на скоординированную регуляцию
репликации в пределах групп смежных реплико-
нов [Schubeler et al., 2002].
Наличие фокусов репликации считается уни-
версальным свойством репликации ДНК эукари-
от и характерным признаком архитектуры их
ядра [Berezney etal., 2000; Sadoni etal., 2004].
Фокусы репликации являются отражением ско-
ординированной активации репликации ДНК на
ГЛАВА 5 111
Рис. 5.2. Фокусы репликации.
а — слева — визуализация фокусов репликации в одном ядре после импульсного включения меченного биотином dUTP. Счита-
ется, что фокусы репликации соответствуют кластерам репликонов, организованным в петли. Во время инициации репликации
в данном фокусе основания петель соответствуют ориджинам репликации, фиксированным на центральной структуре, относя-
щейся к ядерному матриксу. Белки, осуществляющие репликацию, также зафиксированы на этой центральной структуре и фор-
мируют репликационную фабрику. Во время синтеза реплицирующиеся в данный момент фрагменты ДНК «протаскиваются»
через машину репликации (по [Cayrou et al., 2010]). б— распределение фокусов репликации на разных этапах S-фазы. Клетки
яичников китайского хомячка предварительно синхронизованы на границе G1/S, а затем синхронно стимулированы на начало
S-фазы. Через разные промежутки времени от начала S-фазы пробы клеток были импульсно помечены BrdU в течение 5 мин,
фиксированы и окрашены антителами к BrdU. Приведены примеры пяти наиболее типичных вариантов мечения, наблюдаемых
в клетках китайского хомячка (типы I—V) (по [Dimitrova, Gilbert, 1999]). Такая динамика фокусов репликации во время S-фазы
характерна для большинства типов клеток млекопитающих.
соседних ориджинах. Считается, что фокусы
репликации — это дискретные сайты интерфаз-
ных ядер, в которых собираются ферменты реп-
ликации ДНК для одновременной элонгации ре-
пликационных вилок на соседних репликонах.
Размеры фокусов варьируют в широких преде-
лах. Принято считать, что в среднем один фокус
соответствует около 1000 т.п.н. (см. ссылки в
[Berezney etal., 2000]), однако анализ реплици-
рующихся ядер при помощи нового поколения
микроскопов высокого разрешения 3D-SIM (su-
per-resolution 3D-structured illumination microsco-
py) показывает, что структуры, которые ранее
считались индивидуальными фокусами, имеют
более сложную пространственную организацию
и, вероятно, состоят из нескольких более мелких
фокусов [Chagin et al., 2010]. Таким образом, во-
прос о точном соответствии фокусов реплика-
ции, цитологически видимых в целых ядрах,
кластерам синхронно активирующихся ориджи-
нов, выявляемых на распластанных нитях ДНК,
и репликационным доменам в геноме остается
открытым.
Фокусы репликации являются стабильными
структурами, сохраняющими хромосомную ло-
кализацию в течение клеточного цикла и в кле-
точных поколениях. Полагают, что они пред-
ставляют собой фундаментальные единицы хро-
мосомной организации [Jackson, Pombo, 1998;
Sadoni etal., 2004]. Эта стабильность, судя по
всему’, проистекает из взаимодействия с ядер-
ным матриксом. Сами по себе ориджины репли-
кации являются MAR-последовательностями, и
связывание комплекса ORC с ориджинами уча-
ствует в заякоривании их на ядерном матриксе
(см. ниже).
Пространственная организация ориджинов в
репликационные фабрики позволяет координи-
ровать не только события инициации на сосед-
них ориджинах, но и весь дальнейший процесс
репликации в локусе. Показано, что скорость
движения репликационных вилок, инициирован-
ных от одного ориджина в разных направлениях,
а также скорость движения вилок, инициирован-
ных ориджинами из одного кластера, регулиру-
ется координированно [Conti etal., 2007]. Оста-
новка или торможение вилки приводит к актива-
ции дополнительных ориджинов в пределах кла-
стера. Получается, что в пределах репликацион-
ной фабрики соседние репликоны «владеют ин-
112 ЭПИГЕНЕТИКА
Рис. 5.3. Модель последовательной инициации репликации ДНК в соседних фокусах репликации.
На схеме изображены два соседних фокуса репликации, соединенных половиной двунаправленного реплико-
на. Основания петель соответствуют ориджинам репликации (красный цвет), фиксированных на центральной
структуре, относящейся к ядерному матриксу (синий цвет). 1 — начинается репликация более раннего фокуса
(левого). Удвоенная ДНК обозначена зеленым цветом, направления репликационных вилок указаны зелеными
стрелками. Нереплицированная ДНК показана черным. 2 — репликация более раннего фокуса закончилась,
вилка репликации, пришедшая из этого фокуса, активирует репликацию в соседнем, более позднем, фокусе.
Синхронная активация ориджинов во всем кластере репликонов (иллюстрируется оранжевой звездой) облег-
чается их пространственной организацией. 3 — начинается репликация более позднего фокуса (по [Sadoni
et al., 2004]).
формацией» о расстоянии до соседних ориджи-
нов и о скорости репликации на них.
Последовательная инициация репликации
в соседних фокусах. Для инициации реплика-
ции в каждом новом фокусе сборка на ДНК всей
репликационной машинерии происходит de novo.
В то же время, для расположенных рядом фоку -
сов обнаружена интересная тенденция — акти-
вироваться последовательно, т. е. окончание ре-
пликации в одном фокусе стимулирует инициа-
цию в соседнем [Sporbert etal.. 2002; Sadoni
et al., 2004; обзор Chagin et al., 2010]. Так, в клет-
ках HeLa, после того, как процесс синтеза ДНК
начался (активировались первые, наиболее ран-
ние ориджины репликации), лишь 10 % событий
инициации репликации de novo происходит в
сайтах, не являющихся соседними тем сайтам,
где только что закончилась репликация. Этот
регуляторный механизм действует на уровне фо-
кусов ДНК — репликационных фабрик [Maya-
Mendoza et al., 2010].
Предполагается, что именно приближение
вилки репликации к кластеру пространственно-
сближенных ориджинов может запускать их ак-
тивацию (рис. 5.3). Так, исследования реплика-
ции в локусе IgH тяжелой цепи иммуноглобули-
на в лимфобластах мыши показали, что единст-
венная вилка репликации отвечает за реплика-
цию около 400 т.п.н. [Ermakova et al., 1999]. Эта
вилка берет начало в кластере ранних ориджи-
нов и доходит до кластера поздних ориджинов.
Можно предположить, что именно входящая ре-
пликационная вилка активирует репликацию в
кластере поздних ориджинов. У дрожжей У. се-
revisiae ориджины не организованы в кластеры.
Тем не менее, исследование последовательности
инициации репликации на всех (девяти) ориджи-
нах хромосомы VI у У. cerevisiae показало, что
инициация репликации на каждом ориджине (за
исключением самого первого) происходит толь-
ко после того, как к нему' приблизится вилка ре-
пликации, инициированная более ранним орид-
жином [Yamashita et al., 1997].
Таким образом, регуляция репликации у выс-
ших эукариот происходит на нескольких уров-
нях. Во-первых, она может осуществляться на
уровне отдельных ориджинов. Во-вторых, на
уровне фокусов репликации, организованных по
принципу группировки нескольких петлевых до-
менов-репликонов, заякоренных на ядерном мат-
риксе. И наконец, существует временная регуля-
ция репликации генома, оперирующая на уровне
протяженных хроматиновых доменов и различ-
ных компартментов ядра.
5.2. Чем определяется локализация
ориджинов?
Поскольку' уг высших эукариот отсутствуют
консенсусные последовательности для инициа-
ции репликации, картирование ориджинов реп-
ликации представляет определенные трудности.
Поэтому' до недавнего времени исследования
инициации репликации ограничивались в значи-
тельной степени характеризацией индивиду'аль-
ных «модельных» ориджинов, связанных с опре-
деленными локусами [Aladjem et al., 2007; Ham-
lin et al., 2010]. В последние годы появляется все
больше публикаций, посвященных картирова-
нию ориджинов репликации на геномном у'ров-
не. В частности, доступны результаты для от-
дельных хромосом в культу'рах клеток мыши и
человека [Cadoret etal., 2008; Sequeira-Mendes
etal., 2009; Kamani etal., 2010; Mesner etal.,
ГЛАВА 5 113
2011], прокартированы ориджины по всему ге-
ному’ в различных культурах клеток и тканях
дрозофилы [MacAlpine etal., 2010; Sher etal.,
2012], в клетках мыши [Cayrou et al., 2011]. Поя-
вились данные по полногеномному' картирова-
нию ориджинов репликации у растения Arabi-
dopsis thaliana [Costas et al., 2011]. Сравнение ло-
кализации ориджинов репликации между’ раз-
личными клеточными типами одного организма
показало, что как у дрозофилы, так и у млекопи-
тающих распределение ориджинов тканеспеци-
фично [Eaton et al., 2011; Mesner et al., 2011].
Все полученные данные еще раз подтвердили
отсутствие определенных последовательностей
ДНК, специфических для инициации реплика-
ции и, в то же время, позволили сделать выводы
о свойствах хроматина, которые являются опре-
деляющими для локализации ориджинов репли-
кации у высших эукариот.
К вопросу об определении понятия «орид-
жин». В самом начале мы назвали ориджином
репликации участок генома, на котором проис-
ходит инициация репликации (синтез лидирую-
щей цепи ДНК). Однако, что конкретно понима-
ется под ориджинами, когда речь идет об их кар-
тировании или о количестве ориджинов? Вопрос
упирается в методику' поиска ориджина.
Мы не будем сейчас подробно останавли-
ваться на деталях различных методик картиро-
вания ориджинов репликации, однако рекомен-
дуем читателю замечательный обзор Дэвида
Гилберта [Gilbert, 2010; см. также Desprat etal.,
2009; Cadoret, Prioleau, 2010; Borowiec, Schild-
kraut, 2011]. Важно отметить, что практически
все методы картирования на геномном уровне
основаны на усреднении результатов, получен-
ных при анализе множества клеток.
Картирование коротких вновь синтезирован-
ных лидирующих цепей ДНК позволяет опреде-
лить участки генома, в которых хотя бы в неко-
торых клетках произошла инициация реплика-
ции. Но мы знаем, что большинство ориджинов
высших эукариот характеризуются низкой эф-
фективностью. Поэтому’ число ориджинов, полу-
ченных в таком анализе, будет значительно от-
личаться от числа ориджинов, активирующихся
в каждом конкретном клеточном цикле.
Если мы пытаемся искать ориджины по ха-
рактерному’ набору связанных с ними белков —
мы картируем лишь потенциальные ориджины,
но ничего не знаем, реально ли они инициируют
репликацию. Во-первых, лишь небольшая фрак-
ция собранных pre-RC активируется в каждом
клеточном цикле. Во-вторых, некоторые компо-
ненты пререпликационных комплексов (напри-
мер, МСМ2-7) присутствуют в хроматине в
большом избытке, а другие (например, ORC) мо-
гут иметь дополнительные функции, не связан-
ные с инициацией репликации.
Многие подходы включают этап синхрониза-
ции клеток, например, при помощи гидроксимо-
чевины (HU). Но любые манипуляции с клеточ-
ным циклом и активацией каскада ATR/CHK1
(см. ниже) могут приводить к значительным из-
менениям паттерна активных ориджинов. На-
пример, воздействие HU приводит к запуску’
дормантных ориджинов.
Таким образом, говоря о понятии ориджин,
необходимо выбрать некий критерий, по кото-
рому’ он будет определен. Например, это может
быть район генома, с которым связывается ком-
плекс ORC.
ORC связывается с участками ДНК, сво-
бодными от нуклеосом. В целом, для метозоа
показано, что ORC не проявляет in vitro никакой
специфичности к последовательности ДНК. но
при этом он обладает повышенным сродством к
супсрскручснной ДНК [Vashee et al., 2003; Re-
mus et al., 2004]. На этом основании было сдела-
но предположение, что изменение топологии
ДНК, например вследствие удаления нужлеосом,
может определить место потенциального орид-
жина. Пионерные эксперименты на A cerevisiae
показали, что наличие нуклеосомы в положении
ориджина ингибирует инициацию репликации
на этом ориджине [Simpson, 1990]. Аналогично,
деацетилаза гистонов Sir2 A. cerevisiae ингиби-
рует активность ориджинов посредством стаби-
лизации положения нужлеосом, которые в ее от-
сутствие менее стабильно связаны с ДНК [Cram-
pton etal., 2008]. Результаты картирования ORC
на геномном уровне в клетках A cerevisiae и
D. melanogaster показали, что он связывается с
участками ДНК, свободными от нужлеосом или
же содержащими нуклеосомы, которые легко
могут быть удалены [Field et al., 2008; Berbenetz
etal., 2010; Deal etal., 2010; Roy etal., 2010;
Eaton etal., 2011]. Показано, что в распределе-
нии ориджинов репликации важную роль играют
комплексы АТФ-зависимого ремоделинга хро-
матина [Cayrou etal., 2010; Eaton etal., 2011].
Эти комплексы участвуют в изменении положе-
ния нужлеосом относительно последовательно-
сти ДНК и удалении нужлеосом с ДНК. Все эти
результаты указывают на то, что организация
ДНК в нуклеосомы может быть определяющим
свойством ориджинов у всех эукариотических
организмов.
114 ЭПИГЕНЕТИКА
Однако и сам по себе комплекс ORC спосо-
бен влиять на расположение нуклеосом [Lipford,
Bell, 2001; Ghosh et al., 2006]. Формирование pre-
RC требует посадки еще целого комплекса бел-
ков, часть из которых тоже должна связываться с
ДНК. Маловероятно, что такая структура может
собраться на ORC, окруженном фиксированны-
ми, прочно связанными с ДНК нуклеосомами
[Lipford, Bell, 2001]. Есть предположение, что
ORC привлекает на место своей посадки новые
комплексы ремоделинга хроматина, что приво-
дит к формированию более открытой нуклсо-
сомной укладки и позволяет связаться с ДНК
остальным компонентам pre-RC (рис. 5.4).
Ориджины репликации часто локализуют-
ся в премоторных областях генов. Эукариоти-
ческие гены имеют характерную нуклеосомную
организацию: как правило, в промоторах есть
участок, свободный от нуклеосом, расположен-
ный на фиксированном расстоянии от сайта ини-
циации транскрипции (transcription start site, TSS).
Первая нуклеосома, перекрывающая тело гена,
соответственно, тоже находится на фиксирован-
ном расстоянии от TSS. Далее нуклеосомы рас-
полагаются упорядоченно, через фиксированный
интервал [Lee etal., 2007]. Поскольку в промо-
торах всегда присутствует участок, свободный
от нуклеосом, именно промоторы часто высту-
пают в роли ориджинов репликации у эукариот.
У 5. cerevisiae ориджины репликации содер-
жат сайты посадки для транскрипционного фак-
тора Abfl, который может участвовать в актива-
Рис. 5.4. Модель, объясняющая наблюдаемое распре-
деление нуклеосом в районах ориджинов репликации.
а, б—комплекс ORC связывается с ДНК в участках, сво-
бодных от нуклеосом. Такие участки могут возникать в ре-
зультате работы комплексов ремоделинга хроматина, свя-
занных транскрипцией. Однако предполагается, что большую
роль играет и подлежащая последовательность ДНК, спо-
собствующая нестабильному связыванию нуклеосом, е —
ORC привлекает новые комплексы ремоделинга хроматина,
что приводит к формированию более открытой нуклеосомной
укладки и позволяет связаться с ДНК остальным компонен-
там pre-RC.
ции ориджина [Diffley, Stillman, 1989]. У 5. pom-
be, а также у высших эукариот ориджины репли-
кации часто расположены в промоторах генов
[Dai et al., 2005; Cadoret et al., 2008; Sequeira-
Mendes etal.. 2009; MacAlpine etal.. 2010; Eaton
etal., 2011]. Известно множество примеров, ко-
гда факторы транскрипции влияют на локализа-
цию или активацию ориджинов [Cayrou et al.,
2010]. Это может достигаться привлечением ма-
шины ремоделинга хроматина, комплексов, вно-
сящих ковалентные модификации гистонов, или
через прямое взаимодействие факторов транс-
крипции с компонентами pre-RC [Kohzaki, Mu-
rakami, 2005]. Однако, вероятно, важнее всего
то, что транскрипционно активные промоторы
генов гиперацетилированы по гистонам НЗ и
Н4 и, как следствие, поддерживают открытую
структуру хроматина, которая является пред-
почтительным субстратом для инициации реп-
ликации.
Наиболее полные данные о значении хрома-
тинового ландшафта для локализации ORC по-
лучены для D. melanogaster в рамках проекта
modENCODE (model organism encyclopedia of
DNA elements) [Roy etal., 2010; Eaton etal.,
2011]. Цель этого проекта—поиск всевозмож-
ных функциональных последовательностей ДНК
в геноме модельных организмов — D. melano-
gaster и С. elegans. У дрозофилы, так же как и у
всех исследованных эукариот, многие ориджины
совпадают с сайтами инициации транскрипции
или лежат в непосредственной близости от них.
Чтобы понять, какие из элементов, окружающих
ориджин, необходимы для связывания ORC, а
какие являются следствием локализации орид-
жинов в TSS, авторы работы [Eaton etal., 2011]
проанализировали различия между’ сайтами свя-
зывания ORC, лежащими в пределах 1 т.п.н. от
TSS. и сайтами, удаленными от TSS на большие
расстояния.
Оказалось, что все сайты связывания ORC,
независимо от локализации ближайшего TSS,
обогащены белками ремоделинга хроматина,
например, компонентами комплекса NURF
(NURF301, ISWI). В полном соответствии с
представлением о связывании ORC с динамич-
ным, активным хроматином было показано, что
все сайты связывания ORC характеризуются бы-
стрым обменом нуклеосом и гистоновым вари-
антом НЗ.З. Многие модификации гистонов
одинаково характерны как для тех сайтов связы-
вания ORC, которые попадают в область промо-
торов, так и для тех, которые от промоторов
удалены. Однако наблюдались и некоторые раз-
ГЛАВА 5 115
личия. Так, сайты связывания ORC первой груп-
пы обогащены такими характерными для промо-
торов модификациями гистонов, как НЗК9ас,
НЗК27ас, НЗК4те2 и НЗК4теЗ. В удаленных
же ORC-сайтах выявлялось меньше НЗК4теЗ,
но больше НЗК18ас и НЗК4те1. Кроме того,
показано, что районы ориджинов не обогащены
метками хроматина, характерными для тела генов
(например, H3K79mel, НЗКЗбше! и НЗКЗбшеЗ).
В то же время в ORC-сайтах, удаленных от TSS,
обнаруживается специфическое обогащение
НЗКЗбше!.
Чтобы понять, какие свойства промоторов
особенно важны для функционирования их в
качестве ориджинов, важно понять, чем разли-
чаются промоторы, связывающие и не связы-
вающие комплекс ORC. Оказалось, что промо-
торы, являющиеся ориджинами, в среднем свя-
заны с большим количеством белков ремоделин-
га хроматина, и обмен нуклеосом происходит в
этих участках с большей скоростью. Все это еще
раз подтверждает, что для связывания ORC важ-
нее всего способность хроматина легко освобо-
ждаться от нуклеосом [Eaton et al., 2011].
5.3. Программирование ориджинов
В КЛЕТОЧНОМ ЦИКЛЕ
5.3.1. Этапы программирования
ориджинов в клеточном цикле
Согласно модели лицензирования ориджинов,
для того чтобы избежать ре-репликации генома,
сборка пререпликационного комплекса и его ак-
тивация должны происходить на разных этапах
клеточного цикла, при этом сборка pre-RC не
может происходить в S-фазе. Поэтому’ все орид-
жины, будь то ранние или поздние, должны быть
«заряжены» до начала S-фазы. Связывание ORC
с ДНК начинается еще в конце фазы митоза и
продолжается в начале G1. В G1 происходит по-
степенная сборка пререпликационных комплек-
сов. Количество полностью собранных к началу’
S-фазы pre-RC значительно превышает число
событий инициации репликации в одном кле-
точном цикле [Mechali, 2010]. Оказывается, к
началу S-фазы клетка уже «знает», какие орид-
жины будут активироваться (если не наступит
репликационный стресс) и на каком этапе S-фа-
зы должен активироваться каждый ориджин.
Элегантные эксперименты на изолированных
ядрах млекопитающих, реплицирующихся в экс-
тракте яиц ксенопуса, показали, что во время
фазы G1 можно выделить так называемый мо-
мент выбора ориджинов (origin decision point) —
временной интервал, который является опреде-
ляющим для отбора тех ориджинов, которые бу-
дут активироваться в ближайшей S-фазе, среди
всех, на которых уже собраны пререпликацион-
ные комплексы [Wu, Gilbert, 1996]. По времени
этот интервал совпадает с завершением процес-
сов постмитотической реорганизации ядра и
фиксацией ядерной архитектуры до следующего
митоза. Еще одним важным этапом, необходи-
мым для установки паттерна активных ориджи-
нов в ближайшей S-фазе, является митоз. Имен-
но с митозом связана глобальная реорганизация
ядра, которая завершается в начале G1 (рис. 5.5).
Яркой иллюстрацией важности для организа-
ции репликации прохождения через митоз явля-
ются эксперименты по репрограммированию диф-
ференцированных ядер млекопитающих в эмб-
риональные стволовые клетки после инкубации
их в экстрактах яиц ксенопуса, специально под-
готовленных для остановки клеточного цикла на
стадии митоза («митотически компетентный экс-
тракт») [Ganier etal., 2011]. Дело в том, что для
полного перепрограммирования клетки должны
перейти к быстрым эмбриональным делениям,
т. е. им необходимо перейти к значительно боль-
шемуг числу’ активных ориджинов — это соот-
ветствует особенностям репликации на эмбрио-
нальных стадиях. Вероятно, дополнительное вы-
держивание ядер в клеточных экстрактах, соот-
ветствующих по составу’ стадии митоза, позво-
ляет ядрам лучше справиться с такой задачей.
Кроме того, было показано, что сам по себе пе-
ренос мышиных соматических ядер в зиготы
именно на стадии митоза повышает эффектив-
ность репрограммирования [Lemaitre et al., 2005;
Abdurashidoya et al., 2007; Egli et al., 2007].
Относительно независимо от выбора ориджи-
нов происходит программирование времени акти-
вации ориджинов (timing decision point). Оно про-
исходит на более раннем этапе клеточного цикла
(см. рис. 5.5) и уже не на уровне индивидуальных
ориджинов, а на уровне более протяженных доме-
нов [Wu, Gilbert, 1996; Dimitroya, Gilbert, 1999;
Hiratani etal., 2008; Schwaiger etal., 2009; Gay
etal., 2010]. Интересно, что «запрограммирован-
ное состояние» сохраняется лишь до тех пор, пока
в районе не прошла репликация. В фазе G2 кле-
точного цикла районы хромосом не несут марке-
ров репликационного тайминга, они восстанавли-
ваются вновь в ранней G1 после необходимого
прохождения через митоз [Lu et al., 2010].
Рассуждая в рамках модели фокусов репли-
кации, можно сказать, что «выбор ориджинов»
116 ЭПИГЕНЕТИКА
Реализация программы репликации
Лицензирование
ориджинов
(связывание МСМ2-7)
Рис. 5.5. Становление и реализация программы репликации в клеточном цикле.
Внутренний круг маркирует фазы клеточного цикла. На внешнем круге желтой и красной стрелками показаны периоды в кле-
точном цикле, когда лицензирование репликации возможно и когда оно ингибировано соответственно. Зеленой стрелкой отме-
чена часть клеточного цикла, соответствующая S-фазе. В центре схематично показаны ключевые события, происходящие в
ядре на соответствующих этапах клеточного цикла. В ходе митоза спаренные сестринские хроматиды выравниваются на ме-
тафазной пластинке и расходятся к противоположным полюсам делящейся клетки во время анафазы. Затем происходит де-
конденсация митотических хромосом, подготавливающая хромосомы к вступлению в фазу G1. В ранней G1, после восстанов-
ления ядерной оболочки (непрерывная черная линия), районы эухроматина (красные точки) и районы гетерохроматина (синие
точки) сначала распределены в ядре случайным образом. Затем они перемещаются, занимают определенное положение в
ядре, которое остается стабильным до начала нового митоза. Во время S-фазы фокусы репликации, показанные зеленым,
активируются в соответствии с программой репликации. Пострепликационные ядра проходят через G2 в митоз, в котором про-
исходят конденсация хромосом и разрушение ядерной оболочки. Фиолетовыми стрелками отмечены «timing decision point» и
«origin decision point» (no [Gillespie, Blow, 2010]).
подразумевает определение того, какие ориджи-
ны окажутся в основаниях петель и будут акти-
вироваться в составе одного фокуса в данном
клеточном цикле. А программирование «репли-
кационного тайминга» будет определять, в ка-
ком порядке и на каких этапах клеточного цикла
активировать кластеры ориджинов, внутри кото-
рых инициация репликации происходит син-
хронно.
5.3.2. Чем определяется эффективность
ориджинов
Какие различия на молекулярном уровне мо-
гут приводить к различной способности орид-
жинов активировать репликацию? Почему’ неко-
торые активируют репликацию очень редко,
другие тканеспецифично, третьи только в ответ
на репликационный стресс? Далее мы поговорим
о молскулярных механизмах, отвечающих за эти
различия.
Зависимость эффективности ориджинов от
времени связывания ORC. В некоторых случа-
ях эффективность ориджинов зависит от сродст-
ва соответствующих хромосомных сегментов к
комплексам ORC. Связывание ORC зависит от
локальных условий хроматина и транскрипци-
онной активности, поэтому’ неудивительно, что
оно может иметь особенности в разных тканях.
Для дрожжей A. pombe показано, что эффектив-
ность ориджинов зависит от того, когда в кле-
точном цикле ORC связывается с хроматином.
ГЛАВА 5 117
ORC-комплексы, собравшиеся в хроматине рано,
в фазе М, имеют тенденцию быть более эффек-
тивными, чем те, что сообрались позднее, в G1
[Wu, Nurse, 2009]. Связывание ORC с хромати-
ном у S. pombe периодично в клеточном цикле,
возрастает в ходе митоза и достигает максимума
во время перехода M/G1. Формирование пререп-
ликационных комплексов тоже периодично в
клеточном цикле, оно начинается и достигает
максимума в G1. Задержка клеток на стадии ми-
тоза позволяет комплексам ORC связаться с
ориджинами более единообразно, что приводит
к изменениям активности ориджинов по всему’
геному’, так что ориджины становятся более од-
нородными по свойствам. При этом избыток
компонентов рге-IC усиливает репликацию как
на ранее эффективных, так и на не эффективных
ориджинах [Ibid].
Зависимость от различной загрузки МСМ2-7.
Еще один фактор, который может влиять на ве-
роятность активации ориджина, — количество
комплексов МСМ2-7, загруженных на данный
ориджин. Показано, что к началу S-фазы ком-
плексы МСМ2-7 присутствуют в хроматине в
большом избытке по сравнению с числом собы-
тий инициации репликации, числом комплексов
ORC, а также по сравнению с их минимально
необходимым количеством для репликации ге-
нома в нормальных условиях [Borowiec, Schild-
kraut, 2011]. Роль такого избытка двояка.
Во-первых, избыток МСМ2-7 на каждом ин-
дивидуальном ориджине может повышать его эф-
фективность [Edwards etal., 2002; Bowers etal.,
2004]. Если каждый комплекс МСМ2-7 может са-
мостоятельно инициировать репликацию, орид-
жин, на котором загружено десять пар комплек-
сов МСМ2-7, должен активироваться с вероят-
ностью, в десять раз большей, чем ориджин с
одной парой МСМ2-7. Таким образом, эффек-
тивность, с которой ORC загружает МСМ2-7 на
данном ориджине, или количество времени, ко-
торое ORC связан с ориджином и может загру-
жать МСМ2-7, может определять вероятность
активации ориджина [Borowiec, Schildkraut, 2011].
Как только активируется геликазная активность
одного из комплексов МСМ2-7, связанных с
данным ORC, и начинается плавление ДНК, сра-
батывает механизм интерференции ориджинов и
активация репликации с соседних МСМ2-7 ин-
гибируется [Woodward et al., 2006].
Во-вторых, как было показано в эксперимен-
тах на клетках млекопитающих, сайты связыва-
ния избыточного МСМ, не связанного с ORC,
соответствуют дормантным ориджинам, которые
активируются только в условиях репликационно-
го стресса [Woodward etal., 2006; Ibarra etal.,
2008]. Считается, что часть МСМ2-7 после за-
грузки в хроматин в местах локализации комп-
лексов ORC способны двигаться вдоль хромати-
новой фибриллы на достаточно большие расстоя-
ния, и этот избыток комплексов МСМ2-7 облада-
ет потенциалом активировать инициацию репли-
кации в условиях стресса (для обзора см. [Wong
etal., 2011]). Полногеномный анализ распределе-
ния сайтов инициации репликации в клеточных
культурах D. melanogaster показал, что среди сай-
тов инициации репликации, выявляемых в клет-
ках после обработки их гидроксимочевиной, толь-
ко 82 % сайтов инициации соответствуют сайтам
связывания ORC [Eaton et al., 2011].
Лимитирующие факторы, определяющие
число одновременно активных репликонов.
Роль количества и стехиометрического соотно-
шения компонентов, необходимых для инициа-
ции репликации, можно продемонстрировать на
примере инициации репликации в соматических
и эмбриональных клетках млекопитающих.
Считается, что высокая плотность ориджинов
и их высокая эффективность в эмбриональном
хроматине в значительной степени связаны с
избытком на данном этапе развития всех компо-
нентов pre-RC, а также Cdc45. В соматических
клетках млекопитающих в среднем присутствует
приблизительно один гексамер ORC, две моле-
кулы Cdc6 и четыре—пять гексамеров МСМ из
расчета на каждые 100 т.п.н., что примерно в
десять раз ниже, чем в эмбриональных клетках.
Кроме того и, вероятно, важнее всего, что pre-
RC в соматических клетках вынуждены конку-
рировать за лимитирующий фактор — Cdc45
[Wong etal., 2011]. Cdc45, одновременно при-
сутствующего в клетках, достаточно лишь для
активации определенной доли ориджинов. по-
этому для активации новых репликонов прихо-
дится ждать, когда он освободится. Поскольку’
Cdc45 принимает участие не только в инициа-
ции, но и в элонгации репликации, являясь ком-
понентом геликазного комплекса, для его вы-
свобождения требуется время. Поэтому^ концент-
рация Cdc45 существенно влияет и на времен-
ные особенности S-фазы. Микроинъекция из-
бытка очищенного Cdc45 в S-фазные ядра акти-
вирует дополнительные сайты инициации реп-
ликации, что еще раз подтверждает, что в клет-
ках млекопитающих Cdc45 является фактором,
определяющим количество репликонов, которые
могут одновременно использоваться клеткой
[Ibid],
118 ЭПИГЕНЕТИКА
В активации ориджинов участвуют множест-
во факторов. Кроме Cdc45, роль которого в ка-
честве лимитирующего фактора показана в клет-
ках млекопитающих и у 5. pombe [Patel et al., 2008;
Wu, Nurse, 2009J, на роль лимитирующих факто-
ров также претендуют киназы клеточного цик-
ла DDK (S. pombe), CDK1 и CDK2 (позвоноч-
ные) [Krasinska et al., 2008; Katsuno et al., 2009] и
Cdc28/Clb5 (S. cerevisiae) [Donaldson etal., 1998;
McCune et al., 2008].
Важную роль в активации ориджинов иг-
рает прикрепление ДНК к ядерному матрик-
су. После обработки ядер солями в высоких кон-
центрациях происходит удаление значительной
части хроматиновых белков. Оставшиеся ядер-
ные структуры состоят из петлевых доменов, за-
якоренных на ядерном матриксе, которые можно
видеть в микроскоп и проводить измерения. Су-
ществует тесная связь между’ такими петлями,
репликонами и ориджинами репликации ДНК.
Так, например, для многих видов животных и
растений показано, что размер хроматиновых пе-
тель совпадает с размерами репликонов [Buongi-
omo-Nardelli et al., 1982; Cayrou et al., 2010]. При
инкубации дифференцированных ядер Xenopus в
экстракте яиц Xenopus, соответствующем стадии
митоза, происходят глобальные изменения хро-
мосомной архитектуры. В частности, когда в та-
кой экстракт поместили ядра эритроцитов, сред-
ний размер петель ДНК изменялся от 97 до
15 т.п.н., что коррелировало с размерами реп-
ликонов [Cayrou et al., 2010] (рис. 5.6).
Сходная корреляция между- размером репли-
конов и размером петель наблюдалась в клетках
млекопитающих [Courbet etal., 2008]. Показано,
что распределение активных ориджинов в клет-
ках китайского хомячка зависит не только от
скорости движения репликационных вилок, но и
от организации петель хроматина. В экспери-
ментах по изменению скорости движения репли-
кационных вилок при помощи воздействия на
клетки различных химических агентов была об-
наружена четкая корреляция между- скоростью
репликации в данной S-фазе и размером петель
хроматина в последующей фазе G1. Было пока-
зано, что в S-фазе активировались преимущест-
венно те ориджины, которые соответствовали
местам заякоривания петель в G1. Эти данные
указывают на существование механизма про-
граммирования ориджинов, в котором скорость
репликации контролирует распределение петель
хроматина, а оно, в свою очередь, — выбор
ориджинов в после дующем цикле [Ibid].
При амплификации повторенного локуса
DHFR (локус дигидрофолатредуктазы) в культу-
ре клеток китайского хомячка СНОС 400 в каж-
дом клеточном цикле активируется лишь 15 %
ориджинов, остальные повторенные единицы
реплицируются пассивно вилками, пришедшими
с активных ориджинов фланкирующих повторов
[Dijkyvel etal., 1994]. Показано, что изменения
чувствительности к микрококковой нуклеазе
(которые отражают изменения структуры хрома-
тина) во время прохождения клеткой границы
G1/S происходят только в тех повторенных еди-
ницах, которые связаны с ядерным матриксом
[Pemov et al., 1998].
TopoIl
Петли
Дифференцированные ядра
Репрограммированные ядра
Рис. 5.6. Перепрограммирование ориджинов репликации ДНК во время митоза.
Митоз позволяет адаптировать репликацию хромосом к новой клеточной программе. Организация петель
хроматина и плотность ориджинов репликации в дифференцированном ядре могут быть подвергнуты полной
реорганизации во время прохождения через митоз в экстракте яиц ксенопуса. Этот процесс требует участия
топоизомеразы II. Если в соматических клетках ориджины располагались на расстоянии 50—300 т.п.н., то
после реорганизации среднее расстояние между ориджинами становится 10—15 т.п.н., что необходимо для
быстрых репликационных циклов на ранних эмбриональных стадиях (по [Cayrou et al., 2010]).
ГЛАВА 5 119
У млекопитающих концентрация в клетке
ORC2—5 постоянна в клеточном цикле, а уро-
вень субъединицы ORC1 осциллирует в клеточ-
ном цикле. Этот феномен называется «ORC
cycle» [DePamphilis. 2003]. Уровень ORC1 на-
чинает нарастать в середине фазы G1, достигает
максимума во время перехода G1/S, когда он
обнаруживается в составе ядерного матрикса, и
снижается до базального уровня в S-фазе. Одно-
временно с увеличением концентрации ORC1 в
ядре появляется фракция ORC2—5, связанного с
ядерным матриксом [Tatsumi etal., 2003]. Таким
образом, ORC1 в клетках млекопитающих регу-
лирует статус комплекса ORC посредством при-
влечения его к ядер но му матриксу (см. обзор
[Anachkova et al., 2005]).
Каким образом прикрепление к матриксу ре-
гулирует инициацию репликации? У Xenopus
распределение ориджинов репликации и ремо-
делинг размера петель находятся в зависимости
от топоизомеразы II [Lemaitre et al., 2005]. То-
поизомераза Il — фермент, ассоциированный с
матриксом [Earnshaw, Heck, 1985]. Репрограм-
мирование распределения ориджинов реплика-
ции коррелирует с привлечением в хроматин
ORC, которое тоже зависит от топоизомеразы II
[Lemaitre etal., 2005]. Причинно-следственные
связи здесь пока до конца не ясны, однако мож-
но предположить, что петлевая организация
хроматина может иметь значение как в локали-
зации ORC, так и в регуляции эффективности
ориджинов на этапах активации. И наоборот,
связывание ORC может определять создание пе-
тель, заякоривая ориджины на матриксе. Кроме
того, присоединение к матриксу помогает объе-
динять несколько ориджинов репликации вме-
сте, организовывая репликационные фабрики,
что облегчает их скоординированную регуляцию
[Eivazova et al.. 20091.
Особенности хроматина, влияющие на эф-
фективность ориджинов. Активация ориджи-
нов зависит от ацетилирования гистоновых
«хвостов». У мутантов по гену деацетилазы гис-
тонов Sir2 S. cerevisiae все ориджины в районе
локуса повторов рДНК включаются почти в ка-
ждом клеточном цикле, в то время как в норме
инициация происходит лишь на 20 % ориджинов
[Pasero etal., 2002]. В бета-глобиновом локусе
млекопитающих именно различия в локальном
ацетилировании гистонов отвечают за актив-
ность ориджина репликации в клетках эритро-
идного ряда и ее отсутствие в неэритроидных
клетках [Goren et al., 2008]. И у млекопитающих,
и у D. melanogaster белки pre-RC связаны с аце-
тилтрансферазами гистонов (см. ссылки в [Ag-
garwal, Calvi, 2004]).
Направленное связывание гистонацетилтранс-
феразы Chameau с хорионовым ориджином дро-
зофилы. встроенным в искусственную конструк-
цию, локально стимулировало активность орид-
жина, тогда как связывание с Rpd3 или Ре инги-
бировало ее (Ре — часть мультибелковых ком-
плексов, необходимых для поддержания хромати-
новых доменов с репрессированной транскрип-
цией). Следовательно, направленное привлече-
ние ацетилаз и деацетилаз в район ориджина
может программировать паттерн его активности
в развитии и клеточном цикле. Одним из пре-
тендентов на роль направляющего агента счита-
ется белок Rb. Известно, что деацетилазы гисто-
нов млекопитающих, подобные Rpd3, связыва-
ются с Rb и обеспечивают транскрипционную
репрессию. У D. melanogaster dE2Fl и Rbf (гомо-
лог Rb у D. melanogaster) работают в комплексе
при репрессии транскрипции и способны взаи-
модействовать с DmORC. В клетках млекопи-
тающих E2F и Rb связываются с фокусами реп-
ликации и ориджинами [Aggarwal, Calvi, 2004].
Интересно, что гомолог Chameau у млекопи-
тающих — гистонацетилтрансфераза НВО1 тоже
связывается с ориджинами репликации и являет-
ся важным регулятором лицензирования орид-
жинов. По последним данным, НВО1 взаимо-
действует с Cdtl и регулирует посадку комплек-
са МСМ2-7. В фибробластах человека НВО1 на-
ходится практически в эквимолярной концен-
трации с числом активных ориджинов реплика-
ции, что указывает на основную роль этого фер-
мента в регуляции инициации репликации [Miot-
to, Struhl, 2008; lizuka et al., 2009].
В то же время, ацетилирование не является
универсальным свойством ориджинов реплика-
ции. Вероятно, оно используется для выбора не-
которых ориджинов, однако гораздо теснее оно
связано с регуляцией времени инициации репли-
кации, чем с эффективностью ориджинов [Ме-
chali, 2010].
В тех случаях, когда инициация происходит в
доменах закрытого хроматина с низким уровнем
ацетилаз гистонов, возможно, используются аль-
тернативные механизмы привлечения компонен-
тов pre-RC в хроматин. Показано, что у 5. pombe
в активации ориджинов репликации в гетеро-
хроматиновых районах принимает участие го-
молог НР1 — белок SWI6, который направленно
привлекает в эти районы комплекс DDK/Cdc7
[Hayashi et al., 2009]. У D. melanogaster показано
взаимодействие между’ ORC и НР1 [Рак etal.,
120 ЭПИГЕНЕТИКА
1997]. Несмотря на то, что предполагается неза-
висимая от репликации функция ORC в процессе
становления гетерохроматиновых доменов, мож-
но полагать, что взаимодействие ORC и НР1 мо-
жет облегчать формирование пререпликацион-
ных комплексов в гетерохроматиновых районах.
5.3.3. Инициация репликации
и регуляторы клеточного цикла.
Понятие «ранних» и «поздних»
ориджинов
Ранние и поздние ориджины по-разному
реагируют на «intra-S-phase checkpoint». В те-
чение всей S-фазы клеточного цикла включают-
ся все новые ориджины (см., например, [Rag-
huraman et al., 2001]). Тем не менее, принято го-
ворить о «ранних» и «поздних» ориджинах. Дело
в том, что все ориджины можно разделить на два
класса в зависимости от того, влияет ли на ини-
циацию репликации на данном ориджине систе-
ма контроля повреждений ДНК в S-фазе — так
называемый «intra-S-phase checkpoint» [Shirahige
et al., 1998].
Несмотря на термин «checkpoint», контроль
целостности ДНК, осуществляющийся во время
S-фазы, отличается от других точек контроля,
существующих в клеточном цикле. Вместо пре-
дотвращения перехода к следующей стадии кле-
точного цикла, остановки цикла на определен-
ном его этапе, здесь происходит лишь замедле-
ние синтеза ДНК [Willis, Rhind, 2009].
Значительные повреждения ДНК и остановив-
шиеся репликационные вилки запускают каскад
событий, которые приводят к замедлению или
полной остановке движения всех репликацион-
ных вилок и блокированию инициации реплика-
ции на поздних ориджинах. Ранние ориджины
сохраняют способность инициировать реплика-
цию, при этом активируется множество «спящих»
(дормантных, dormant) ориджинов, не активирую-
щихся в нормальных условиях. Активация чек-
пойнта в S-фазе обеспечивает также стабилиза-
цию остановившихся вилок репликации, в ре-
зультате чего в таких вилках сохраняется поли-
меразный комплекс. Без такой стабилизации с
большой вероятностью происходит коллапс вил-
ки. сопровождающийся двунитсвыми разрывами
ДНК [Paulsen, Cimprich, 2007]. В случае значи-
тельных повреждений клетка вступает в апоптоз.
Для искусственной инициации остановки
клеточного цикла в этой контрольной точке на
клетки воздействуют гидроксимочевиной (HU).
Считается, что HU блокирует фермент рибонук-
лсотидрсдуктазу, что приводит к исчерпанию
пула нуклеотидов в клетке и, как следствие, за-
медлению или полной остановке движения ви-
лок репликации ДНК [Hendriks, Mathews, 1998].
И. в итоге, клетки, находившиеся в S-фазе, «за-
мирают» на соответствующей стадии, а клетки,
бывшие на других этапах цикла, вступают в
S-фазу и останавливаются на ранних ее этапах.
Система ответа на повреждение ДНК консер-
вативна у эукариот. Блокирование инициации
репликации на поздних ориджинах в присутст-
вии HU наблюдали у 5. cerevisiae [Shirahige et al.,
1998], млекопитающих [Dimitrova, Gilbert, 2000],
в экстракте ооцитов Xenopus [Marheineke, Hy-
rien, 2001] и у D. melanogaster [MacAlpine etal.,
2004]. Так, например, геномное исследование
5. cerevisiae показало, что из 260 ориджинов ре-
пликации 143 (ранние) включались в присутст-
вии HU, в то время как 104 ориджина в тех же
условиях не включались [Yabuki etal., 2002].
У D. melanogaster 30 % ориджинов способны к
инициации репликации в присутствии HU
[MacAlpine et al., 2004, 2010].
Стоит заметить, что у млекопитающих, не-
смотря на то, что стабильно ранние и стабильно
поздние ориджины составляют значительную
фракцию генома, почти половина ориджинов
активируется с равной вероятностью в ранней
или поздней S-фазе [Jeon et al., 2005]. У 5. pombe
воздействие HU оказывает слабый эффект на
активацию ориджинов [Heichinger et al., 2006;
Hayashi et al., 2007]. Интересно, что у 5. pombe
также почти нет постоянно поздних ориджи-
нов — ориджины активируются стохастически
относительно времени в S-фазе [Dai et al., 2005;
Patel et al., 2006].
ATR/CHKl-каскад управляет активацией
ориджинов. Оказалось, что в ходе нормальной
S-фазы последовательностью активации орид-
жинов репликации управляет регуляторный кас-
кад, который участвует в клеточном ответе на
репликационный стресс [Shechter, Gautier, 2005;
Borowiec, Schildkraut, 2011]. Под репликацион-
ным стрессом подразумеваются такие условия,
которые приводят к остановке репликационных
вилок, в частности, из-за большого количества
повреждений в ДНК или из-за химических аген-
тов. блокирующих ферменты, связанные с реп-
ликацией, — HU (блокируется рибонуклсотид-
редуктаза), афидиколин (блокируются ДНК-по-
лимеразы).
Перечислим ключевых участников этого кас-
када. Главным сенсором повреждений в ДНК
является киназа ATM (ataxia telangiectasia muta-
ГЛАВА 5 121
ted). Остановившиеся вилки репликации активи-
руют другую киназу — ATR (ATM and Rad3-
related). Киназы ATM и ATR имеют множество
мишеней, фосфорилирование которых необхо-
димо в регуляции нормального клеточного цик-
ла, клеточного ответа на повреждения ДНК и
апоптоза. Роль этих киназ в регуляции ориджи-
нов репликации главным образом связана с ак-
тивирующим фосфорилированием чекпойнт-ки-
назы СНК1 (checkpoint kinase 1) [Zegerman, Dif-
fley, 2009]. Активация CHK1 приводит к фосфо-
рилированию фосфатазы Cdc25A, что запускает
ее же деградацию. Cdc25A, в свою очередь, ре-
гулирует активность циклин-зависимых киназ.
СНК1-зависимая деградация фосфатазы Cdc25A
предотвращает дефосфорилирование CDK1 и
CDK2. Это предотвращает связывание с ориджи-
нами Cdc45, необходимого для активации орид-
жинов (рис. 5.7) (для обзора см. [Willis, Rhind,
2009; Nakanishi et al., 2010]).
В нормальном клеточном цикле именно ATR-
зависимый каскад ингибирует преждевременное
включение поздних ориджинов и ограничивает
использование ориджинов в кластерах ранних
ориджинов (латеральное ингибирование). Бло-
кирование активности ATM и ATR при помощи
кофеина или специфических антител приводит к
значительному’ увеличению числа ориджинов
репликации в нормальных клетках [Marheineke,
Hyrien, 2004; Shechter et al., 2004].
Каким образом каскад, активирующийся в от-
вет на репликационный стресс, работает в нор-
мальной S-фазе, в отсутствие остановившихся
вилок и повреждений ДНК?
Оказалось, что активатором ATR является
интермедиат репликации — комплекс одноцепо-
чечной ДНК с белками RPA (белки, связываю-
щие одноцепочечную ДНК) [Sorensen et al.,
2004]. Так. частичное удаление RPA из экстракта
ооцитов Xenopus предотвращает увеличение
числа активных ориджинов в ответ на воздейст-
вие кофеина.
Сразу можно упомянуть несколько любопыт-
ных следствий такого механизма активации
ATR. Во-первых, чем медленнее происходит
синтез ДНК, тем больше в репликационной вил-
ке накапливается одноцепочечной ДНК, тем вы-
ше уровень индукции ATR. Во-вторых, индук-
ция ATR происходит локально, сразу’ после на-
чала синтеза ДНК, что может объяснить быст-
рую «чувствительность» окружающих последо-
вательностей к активации ориджинов и обеспе-
чивать интерференцию между’ ориджинами [Na-
kanishi et al., 2010] (рис. 5.8).
Рис. 5.7. Основные компоненты ATR-каскада, участ-
вующие в регуляции активации ориджинов.
Кроме того, предполагается, что движение
репликационных вилок также может тормозить-
ся физиологическими ограничениями генома.
Во-первых, некоторые последовательности ДНК
могут реплицироваться с большим трудом, чем
друтие. Во-вторых, факторы, связанные с хрома-
тином, инсуляторные элементы и специфические
ядерные структуры могут замедлять или оста-
навливать репликационную вилку’ в отсутствие
репликационного стресса, что будет также акти-
вировать ATR-каскад.
Эффект ATR на интерференцию ориджинов и
супрессию поздних ориджинов в ходе нормаль-
ATM/ATR? -> СНК1-р ATM/ATRt -> СНК1-р
инициировавшие репликацию
«спящие»
пассивно инициировавшие репликацию
Комплексы
МСМ2-7
Рис. 5.8. Модель, иллюстрирующая, как ATR/CHK1-
каскад участвует в регуляции последовательной акти-
вации кластеров ориджинов, а также выбора ориджи-
нов в пределах одной репликационной фабрики.
Как только произошла инициация репликации, т. е. активиро-
валась геликазная активность одного из комплексов МСМ2-7
в локусе, началось плавление ДНК и появились комплексы
одноцепочечной ДНК с белками RPA, локально активируется
ATR-каскад и ингибируется активация новых МСМ2-7 (по
[Nakanishi et al., 2010]).
122 ЭПИГЕНЕТИКА
ной репликации, а также супрессию активации
поздних ориджинов в ответ на репликационный
стресс опосредуется именно СНК1 [Miao etal.,
2003; Shechter et al., 2004; Syljuasen et al., 2005].
Точно так же, как при ингибировании ATR. при
ингибировании или удалении СНК1 наблюдают-
ся увеличение количества активных ориджинов,
замедление скорости репликационных вилок и
нарушение временной последовательности реп-
ликации генома. Важно, что в отсутствие СНК1
ориджины, в норме инициирующие репликацию
поздно, активировались в ранней S-фазе [Peter-
mann, Caldecott, 2006; Petermann et al., 2006; Maya-
Mendoza etal., 2007]. Кроме того, на фоне сни-
жения количества СНК1 супрессируется интер-
ференция ориджинов, что приводит к более ко-
роткому’ расстоянию между’ ориджинами [Маг-
heineke, Hyrien, 2004].
У <$. cerevisiae и метазоа RAD53 и СНК1 со-
ответственно предотвращают активацию позд-
них ориджинов до тех пор, пока около половины
генома не закончит репликацию [Santocanale,
Diffley, 1998; Shechter etal., 2004]. Для перехода
к репликации второй половины генома фор-
мально требуется «восстановление от чекпойн-
та», т. е. нейтрализация СНК1. И, действитель-
но, показано, что СНК1 разрушается через убик-
витинирование и протеосомную деградацию в
средней и поздней S-фазе [Whitcomb, Tavlor,
2009].
Роль СНК1 в регу’ляции S-фазы не ограничи-
вается влиянием на инициацию ориджинов реп-
ликации посредством регуляции активности цик-
лин-зависимых киназ. СНК1 также играет важ-
ную роль в регуляции транскрипции генов, не-
обходимых для нормального течения S-фазы
При остановке
репликационной вилки
активируются «спящие»
ориджины
При остановке
репликационной вилки
«спящие» ориджины
не активируются
нация
Рис. 5.9. Активация дормантного ориджина помогает
быстро решить проблему репликации фрагмента ДНК
между двумя остановившимися вилками репликации
(по [Ge, Blow, 2010]).
[Shimada etal., 2008]. Так, например, активация
СНК1 приводит к репрессии гена, кодирующего
ацетилтрансферазу GCN5, которая может участ-
вовать в остановке клеточного цикла в ответ на
репликационный стресс.
Особый интерес представляет роль СНК1 в
регу’ляции экспрессии рибону’клеотидреду’ктазы
RNR2 [Zhang et al., 2009]. Уровень экспрессии
RNR2 определяет количество ДНК-предшест-
венников и, таким образом, скорость синтеза
ДНК. Показано, что скорость репликации и чис-
ло активных ориджинов репликации находятся в
прямой зависимости [Courbet et al., 2008]. Веро-
ятно, именно СНК1 координирует плотность
ориджинов и скорость репликационных вилок
как в нормальной S-фазе, так и в условиях реп-
ликационного стресса [Herrick, Bensimon, 2008;
Naruyama et al., 2008; Zhang et al., 2009].
Активация дормантных ориджинов в ус-
ловиях репликационного стресса. В ответ на
повреждения ДНК и остановившиеся вилки реп-
ликации происходит несколько событий, кото-
рые, на первый взгляд, противоречат друг другу-.
С одной стороны, когда останавливается реп-
ликационная вилка, инициирутотся дормантные
ориджины [Branzei, Foiani, 2005], расположен-
ные в непосредственной близости [Ge et al.,
2007; Ibarra et al., 2008]. Показано, что аналогич-
ным образом дву’цепочечные разрывы в ДНК
приводят к у’силению использования ориджинов,
расположенных поблизости от разрыва [Doksani
et al., 2009]. Таким образом, чекпойнт не только
отвечает за предотвращение продолжения S-фа-
зы в условиях затруднения клеточного цикла, но
делает более вероятной активацию неэффектив-
ных ориджинов и активирует дормантные орид-
жины. Вероятно, это необходимо для предот-
вращения недорепликации. Репарация ДНК —
процесс достатчно длительный, и такое продол-
жение репликации позволит как можно меньше
задерживать репликацию всего генома в ответ на
случайные события, происходящие по ходу’ дви-
жения индивиду’альных репликационных вилок
(рис. 5.9).
С друтой стороны, репликационный стресс
должен активировать ATR и ее прямую ми-
шень — СНК1, что должно приводить к ингиби-
рованию активации ориджинов репликации. Ка-
ким образом одни ориджины супрессиру’ются, в
то время как друтие, наоборот, активирутотся?
Одна из моделей основана на том, что
ATM/ATR оказывает двоякий эффект: на фоне
репликационного стресса запускается еще один
регу’ляторный каскад, который на дормантных
ГЛАВА 5 123
I
ATR
Репликационный стресс
• Истощение пула нуклеотидов
•Повреждение ДНК
•Замедление или остановка репликационных вилок
Поздние ориджины
PreRC Ранние ориджины
на ориджине
Рис. 5.10. Модель, объясняющая различный эффект ATR-каскада на
поздние и ранние дормантные ориджины в условиях репликационного
стресса (по [Mechali, 2010]).
ориджинах перекрывает эффект ингибирования
(рис. 5.10).
Кроме того, различный эффект ATR-каскада
связан с регуляцией инициации репликации на
уровне кластеров ориджинов, организованных в
репликационные фабрики [Ge, Blow, 2010]. При
низком уровне репликационного стресса ATR/
СНК1 преимущественно супрессирует инициа-
цию ориджинов так: ингибируется активация
новых репликационных фабрик, в результате
чего наблюдается снижение общего числа ак-
тивных кластеров ориджинов и репликационных
фабрик. В это время происходит замедление
скорости репликации в уже активированных ре-
пликонах. Замедление скорости репликации, как
показано в работе [Courbet et al., 2008], приводит
к активации дормантных ориджинов в пределах
тех фокусов репликации, которые уже были ак-
тивны. Ингибирование новых фабрик посредст-
вом ATR/CHK1, таким образом, перераспреде-
ляет ресурсы в сторону уже активных фабрик
(рис. 5.11). Такой расклад позволяет минимизи-
ровать разрушительный эффект от появления
остановившихся вилок и предотвратить пробле-
му тех районов между’ остановившимися вилка-
ми, которые не успевают закончить репликацию
до конца S-фазы.
Эти результаты показывают, что в условиях
репликационного стресса чувствительными к ин-
гибированию посредством СНК1 являются все
ориджины, локализованные в репликационных
фабриках, еще не активированных в данной
S-фазе. Возникает вопрос: так существует ли в
действительности разделение на РАННИЕ и
ПОЗДНИЕ ориджины? Или же в эксперимен-
тальных условиях, когда на клетки воздействуют
HU, происходит синхронизация клеток на той
стадии, когда успели активироваться только са-
мые первые репликационные фабрики, соответ-
ствующие самому началу S-фазы?
Как оказалось, ранние и поздние ориджины
не только различаются по чувствительности к
регуляции ATR/CHK1, но и могут активировать-
ся различными циклин-зависимыми киназами.
Нормальная S-фаза
Репликационный стресс
кластеров ориджинов
(новых репликационных фабрик)
Рис. 5.11. Модель, показывающая, как репликационные фабрики реаги-
руют на не очень высокий уровень репликационного стресса [Ge, Blow,
2010].
124 ЭПИГЕНЕТИКА
Ранние и поздние ориджины активируются
разными циклин-зависимыми киназами. Пред-
положение о том, что ранние и поздние ориджи-
ны могут активироваться разными комплексами
циклинов с циклин-зависимыми киназами, воз-
никло после исследований репликации у 5. ce-
revisiae. У 5. cerevisiae в активации ранних орид-
жинов главную роль играет Cdkl/Clb6. В ходе
/S-фазы С1Ь6 подвержен деградации, а для акти-
вации поздних ориджинов требуется циклин
Clb5 [Donaldson etal., 1998; Jackson etal., 2006].
При мутации по гену циклина С1Ь5р весь геном
реплицируется, используя лишь ранние ориджи-
ны [Donaldson etal., 1998]. Оказалось, что в
клетках млекопитающих ранние и поздние орид-
жины также активируются разными комплекса-
ми Cyc/CDK.
В нормальных соматических клетках млеко-
питающих инициация репликации на ранних
ориджинах регулируется циклинами Cyclin А и
Cyclin Е, связанными с циклин-зависимой кина-
зой CDK2. Кроме того, в регуляции участуст ки-
наза Cdc7 в комплексе с регуляторной субъеди-
ницей Dbf4. Эти две киназы фосфорилируют
субъединицы комплекса МСМ2-7, что позволяет
ориджину связывать Cdc45 [Machida et al., 2005].
В активации поздних ориджинов в клетках мле-
копитающих важную роль играет другой ком-
плекс CDKl/Cyclin А2 [Katsuno et al., 2009].
В мышиных эмбриональных фибробластах, в
ранней S-фазе активен комплекс Cyclin А2/
CDK2. После того, как к середине S-фазы фор-
мирование комплексов с CDK2 достигает плато,
появляется и постепено возрастает активность
Cyclin A2/CDK1 [Idid], Интересно, что такая
дифференциальная активность в значительной
степени связана с СНК1. В клетках, мутантных
по СНК1, активность Cyclin A2/CDK1 прояв-
лялась раньше и усиливалась, а активность Cyc-
lin A2/CDK2 не претерпела значительных из-
менений. При этом CDK2 может связываться с
ранними, но не с поздними ориджинами репли-
кации, в то время как CDK1 способна связывать-
ся со всеми [Ibid].
Таким образом, можно говорить о том, что в
середине S-фазы происходит качественный пе-
реход между’ СОК2-опосредованной активацией
«ранних» ориджинов и CDKl-опосредованной
активацией, «менее разборчивой» по отношению
к ориджинам. Для этого перехода требуется ней-
трализация активности СНК1.
Роль СНК1 в управлении активностью
CyclinA2/CDKl, но не CyclinA2/CDK2, связана
с регуляцией уровня CDC25A. Удаление СНК1
приводит к значительному повышению уровня
Cdc25A и гиперактивации CyclinA2/CDKl. При
этом почти в три раза повышается плотность
ориджинов репликации [Ibid]. Оверэкспрессия
CyclinA2/CDKl имеет аналогичный эффект. По-
этому вероятно, что именно уровень CDK1 мо-
дулирует эффективность ориджинов и время их
активации [Shechter etal., 2004; Svljuascn etal.,
2005].
Почему все-таки CDK1 имеет такой специфи-
ческий эффект на поздние ориджины? CDK1
преимущественно связывается с поздними орид-
жинами, хотя и CDK1, и CDK2 могут связывать-
ся с ранними. У дрожжей и в системе экстрактов
ооцитов Xenopus CDK1 в комплексе с циклина-
ми может специфически взаимодействовать с
ORC [Romanoyvski et al., 2000; Wuarin et al., 2002].
Судя по всему’, циклин-зависимые киназы могут
каким-то образом дифференциально распозна-
вать те самые гщс-факторы, которые определяют
активацию ориджинов. А поскольку’ известно,
что время активации ориджинов программиру-
ется на уровне протяженных хроматиновых до-
менов, в таком узнавании важную роль должно
играть состояние хроматина.
Постепенная последовательная активация
ориджинов необходима для поддержания балан-
са между’ числом активных репликационных ви-
лок и скоростью, с которой происходит синтез
ДНК. Плотность активных ориджинов (частота
событий инициации) и движение репликацион-
ных вилок (скорость элонгации) должны корегу-
лироваться, чтобы гарантированно обеспечить
эффективную и полную дупликацию каждого
хромосомного домена. Факты подтверждают эту’
гипотезу и указывают на то, что ATR/CHK1-кас-
кад играет важную роль в корегуляции частоты
инициаций и скорости элонгации [Herrick, Веп-
simon. 20081.
5.3.4. Механизмы программирования
времени активации ориджинов
Если ранние и поздние ориджины могут по-
разному реагировать на сигналы клеточного
цикла, то это означает, что к началу’ S-фазы они
должны быть каким-то образом маркированы
как «ранние» и «поздние». Далее мы рассмот-
рим, как и на каком этапе клеточного цикла про-
исходит такое «программирование».
Практически во всех случаях сами по себе
ориджины, клонированные как автономные реп-
лицирующиеся плазмиды, инициируют реплика-
цию рано, независимо от времени их репликации
ГЛАВА 5 125
в нативном положении (см. обзор [Diffley, Labib,
2002]). Следовательно, время репликации орид-
жинов должно определяться окружающими по-
следовательностями ДНК или состоянием при-
лежащего хроматина. Существуют специфичес-
кие последовательности ДНК, связывающие фак-
торы поздней инициации репликации. Такие
специфические консервативные последователь-
ности ДНК были обнаружены у дрожжей 5. рот-
Ье. Эти последовательности встречаются вблизи
всех известных у этого организма поздних орид-
жинов и влияют на время их репликации [Yom-
pakdee, Huberman, 2004]. У высших эукариот
исследовано несколько г/г/с-регуляторных эле-
ментов ДНК, определяющих время включения
расположенных поблизости ориджинов, однако
эти последовательности специфичны только для
этих ориджинов [Aladjem et al., 1998; Lu et al.,
2001; Umov et al., 2002].
Положение в ядре играет важную роль в
программировании ориджинов. Программиро-
вание временной последовательности реплика-
ции в клетках млекопитающих происходит в на-
чале фазы G1. Как раз в это время в клетке за-
канчивается постмитотическое перемещение
хромосом. Это косвенно указывает на возмож-
ную связь между’ установкой времени реплика-
ции районов хромосом и их положением в ядре
[Gilbert, 2001, 2010].
Недавно были прокартированы на геномном
уровне изменения временного профиля реплика-
ции в ходе развития млекопитающих. Оказалось,
что эти изменения значительно коррелируют с
картами пространственных взаимодействий меж-
ду районами [Ryba etal., 2010]. В результате
возникла модель (рис. 5.12), согласно которой
пространственная реорганизация ядра (она про-
исходит как раз одновременно с «программиро-
ванием» репликационных доменов) приводит к
формированию ядерных компартментов, кото-
рые создают различные условия для инициа-
ции репликации. Протяженные домены ранней и
поздней репликации соответствуют участкам
генома, попавшим в различные компартменты.
Свойство этих доменов быть «запрограммиро-
ванными» на определенное время инициации
Ранняя
Поздняя
репликация
Рис. 5.12. Исследования временной последовательности репликации на уровне геномов по-
казали тесную связь между временной организацией репликации и пространственной органи-
зацией ядра.
а — согласно модели, разработанной на основании геномного анализа пространственных взаимодейст-
вий районов генома (Hi-C-анализ), хромосомы состоят из последовательных фрактальных глобул, струк-
тура которых задается этими пространственными взаимодействиями. Хроматин может взаимодейство-
вать с другими глобулами в пределах одного и того же ядерного компартмента, но районы, лежащие в
разных компартментах, взаимодействовать не могут, б—фокусы репликации, меченные зеленым (ран-
ние) и красным (поздние), соответствуют фрактальным глобулам из разных компартментов. В красном —
поздней глобуле больше хроматиновых взаимодействий, хроматин упакован более плотно, что делает
ориджины репликации менее доступными для факторов инициации репликации (а, из [Lieberman-Aiden
et al., 2009] с изменениями; б— из [Ryba et al., 2010; Gilbert et al., 2010] с изменениями).
126 ЭПИГЕНЕТИКА
репликации в S-фазе сохраняется до тех пор, по-
ка они не пройдут через репликацию [Lu et al.,
2010; Gilbertetal'., 2010].
Если клетки выходят из клеточного цикла в
G0, пространственная организация ядра может
претерпевать значительные изменения, однако
после возвращения клеток в клеточный цикл ре-
пликация происходит по тому' же самому’ сцена-
рию — «запрограммированное состояние» доме-
нов сохраняется, несмотря на видимые измене-
ния в распределении рано и поздно реплици-
рующихся доменов в ядре.
Поздно реплицирующиеся дрожжевые орид-
жины имеют тенденцию располагаться близко к
периферии ядра в определенное время фазы G1, в
то время как ориджины, реплицирующиеся рано,
локализуются в ядре более случайным образом.
Важно отметить, что локализация в ядре оп-
ределяет установление репликационной про-
граммы в фазе G1, но не дальнейшее ее поддер-
жание. Эксцизия позднего ориджина ARS501 у
5. cerevisiae, независимо от ее времени в клеточ-
ном цикле, сопровождается перемещением эпи-
сомы от периферии ядра, но не сопровождается
перепрограммированием ориджина [Heun et al.,
2001; Gilbert, 2001]. Периферическая локализа-
ция реплицирующейся в значительной степени
поздно хромосомы 18 человека теряется, когда
клетка выходит из клеточного цикла. Если такую
клетку’ стимулировать вступить в S-фазу, хромо-
сома 18 сохраняет свойство поздней репликации,
не возвращаясь к периферической локализации
до следующего митоза [Bridger et al., 2000]. Сле-
довательно, положение на периферии ядра тре-
буется именно для программирования, но не для
поддержания программы поздней репликации.
Каким образом положение в ядре может уча-
ствовать в программировании репликации?
В ранней Gl-фазе одновременно с постмито-
тическим перераспределением хромосом проис-
ходит связывание с хромосомами структурных
белков хроматина, которые были удалены из
хроматина во время митоза. Реассоциация бел-
ков, определяющих архитектуру хроматина, в зо-
не периферии ядра может приводить к увеличе-
нию локальной концентрации этих белков, тем
самым создавая микроусловия для формирова-
ния определенной хромосомной архитектуры.
Эта архитектура хроматина может оставаться до-
статочно стабильной в течение оставшегося кле-
точного цикла, независимо от положения в ядре,
и определять время включения ориджинов.
Поскольку и временная последовательность
репликации генома, и пространственная архи-
тектура ядра поддерживаются в клеточных поко-
лениях, должны быть механизмы наследования
этой программы через митоз, чтобы каждый раз
в соответствующий период клеточного цикла
происходило восстановление детерминант реп-
ликационного тайминга в точном соответствии с
эпигенетическим состоянием данного типа кле-
ток. Однако разборка и последующее восстанов-
ление в каждом клеточном цикле обеспечивают
временное окно («yvindoyv of opportunity»}), по-
зволяющее перепрограммировать как ЗВ-органи-
зацию ядра, так и программу- репликации гено-
ма, что, возможно, является первым и решаю-
щим шагом перехода клетки к новому- этапу
дифференцировки.
Статус ацетилирования гистонов ориджи-
нов определяет время инициации реплика-
ции. Выше мы обсудили, что в начале фазы G1
на периферии ядра ориджины каким-то образом
маркируются и эти метки затем во время S-фазы
узнаются киназами клеточного цикла. Что же
является меткой?
Исследования на геномном уровне показыва-
ют, что именно локальные свойства хроматина
определяют, какие ориджины будут активиро-
ваться преимущественно в начале S-фазы [Cadoret
et al., 2008; Farkash-Amar et al., 2008; Desprat et al.,
2009; Sequeira-Mendes etal., 2009; Hansen etal.,
2010; Hiratani etal., 2010]. Районы, маркирован-
ные модификациями гистонов, характерными
для активных генов, как правило, имеют ранние
ориджины, в то время как ориджины в районах
с репрессивными модификациями, соответствую-
щими ГХ, как правило, активируются поздно в
S-фазе [Pope et al., 2010]. Это согласуется с иссле-
дованиями, показавшими, что ранняя репликация
значительно коррелирует с транскрипционной ак-
тивностью [Schyvaiger etal., 2009; Hansen etal.,
2010]. Ранние ориджины локализуются преиму-
щественно около активно экспрессирующихся ге-
нов, ориджины, активирующиеся в середине S-фа-
зы, — около умеренно экспрессирующихся генов,
а поздние ориджины лежат далеко от транскриби-
руемых генов [Desprat et al., 2009]. Районы генома,
реплицирующиеся рано, характеризуются высо-
кой чувствительностью к обработке ДНКазой I
[Kerem et al., 1984], упаковкой в ацетилированные
гистоны [Roy etal., 2010]. Поздно реплицирую-
щиеся районы характеризуются закрытой конфор-
мацией хроматина и содержат преимуществен-
но не транскрибирующиеся последовательности
ДНК [Schubeler et al., 2002; MacAlpine et al., 2004;
Woodfine etal., 2004; Jeon etal., 2005; Farkash-
Amar et al., 2008].
ГЛАВА 5 127
Поскольку ориджины репликации располага-
ются вблизи активно транскрибирующихся ге-
нов и нередко совпадают с промоторами или
иными регуляторными элементами транскрип-
ции. как правило, в районах ориджинов можно
обнаружить огромное количество самых разно-
образных хроматиновых меток. Из-за этого ока-
зывается достаточно трудно определить роль
отдельных компонентов хроматина именно в
инициации репликации. Даже соседние ориджи-
ны, активирующиеся синхронно, могут иметь
различный набор модификаций [Norio, 2006].
В табл. 5.1 приведен общий обзор модифи-
каций хроматина, которые могут участвовать во
временной регуляции активации ориджинов.
Считается, что главным маркером времени
репликации является статус ацетилирования гис-
тонов. Так, отсутствие деацетилазы гистонов
Rpd3 или взаимодействующего с ней партнера
Sin3 привело к тому’, что поздние ориджины во
внутрихромосомных локусах 5. cerevisiae стали
раньше связывать фактор репликации Cdc45p и,
в результате, раньше инициировать репликацию
[Vogelauer etal., 2002]. Кроме того, отсутствие
Rpd3 компенсировало эффект мутации по гену
циклина с1Ь5 (у мутантов включаются только
ранние ориджины), а это указывает на то, что без
Rpd3 поздние ориджины приобрели способность
активироваться по сигнальному’ пути, в норме
активирующему’ только ранние ориджины [Apa-
ricio etal., 2004]. Усиление ацетилирования гис-
тонов вблизи позднего ориджина ARS1412 5. ce-
revisiae посредством рекрутирования гистонаце-
тилтрансферазы Gcn5p также привело к раннему’
включению ориджина [Vogelauer etal., 2002].
Направленное привлечение HAT/HDAC к орид-
жину репликации локуса [(-глобиновых генов
человека привело к изменению времени репли-
кации примерно на 20 % от общей длины S-фазы
[Goren et al., 2008]. Ингибиторы деацетилаз гис-
Таблица 5.1
Обзор посттрансляционных модификаций гистонов, которые могут участвовать в регуляции ориджинов
[Dorn, Cook, 2011]
Хроматиновая метка Локализация Предполагаемая функция
НЗКЗбтеЗ Ранние ориджины 4 Поздние ориджины? В S-фазе удаляется Ингибирование активации ориджинов
НЗК4теЗ Ранние ориджины 4 Поздние ориджины 4 Во время активации временно ?, затем удаляется в S-фазе Ингибирование повторной активации ориджинов, поддержание «полуоткрытого» состояния
Н4К20те2(3) Ранние ориджины: аккумулируется в S, удаляется в G1 Ингибирование повторной активации ориджинов, поддержание «полуоткрытого» состояния
H2BK123ub Ориджины: 4G1 и S Остальные районы: 4G1 Обеспечивает стабильность нуклеосом
Н2ВК111те Отсутствует в ориджинах, в остальных районах 4G1 Неизвестно
Н4К79ас Обогащение в районах ориджинов. Отсутствует в G1 Неизвестно
Н4К16ас Ранние ориджины: ? Ограничивает распространение гетерохроматина в районы ориджинов
H2AS1P Обогащение в районах ориджинов. Отсутствует в G1 Неизвестно
H2AS15P Обогащение в районах ориджинов. Присутствует в G2/M Неизвестно
НЗК37те1 Обогащение в районах ориджинов. В S-фазе отсутствует Неизвестно
Н4К20те1 Ориджины: 4 в М-фазе Участвует в лицензировании
НЗКЗбте1 Ориджины: 4 в S-фазе Участвует в активации ориджинов
Ацетилирование (НЗК9/14, Н4К5,8,12) Активные ориджины: ? Участвует в активации ориджинов
128 ЭПИГЕНЕТИКА
тонов изменяют временную картину репликации
в клетках млекопитающих [Bickmore, Carothers,
1995]. Все эти эксперименты указывают на кон-
сервативность регуляции инициации репликации
через деацетилирование гистонов у эукариот.
И у млекопитающих, и у D. melanogaster белки
pre-RC связаны с ацетилтрансферазами гистонов
(см. ссылки в [Aggarwal, Calvi, 2004]).
Инициация репликации продолжается в тече-
ние всей S-фазы и может быть скоординирована
с другими процессами, например, с транскрип-
цией определенных генов. В течение S-фазы по-
стоянно происходит снятие блока с определен-
ной группы ориджинов, и они получают воз-
можность включиться. Так, например, при пере-
ходе фолликулярных клеток D. melanogaster от
эндорепликации генома к амплификации хорио-
новых генов необходима активность деацетилаз
гистонов, которая препятствует инициации реп-
ликации на всех ориджинах генома. В районах
ориджинов хорионовых генов с деацетилазами
гистонов конкурируют специфические гистон-
ацетилтрансферазы, причем инициации репли-
кации предшествует 25-кратное повышение аце-
тилирования гистонов в районе ориджина. При
ингибировании активности деацетилаз гистонов
вместо перехода к амплификации эти клетки
продолжили эндорепликацию, при этом гетеро-
хроматин реплицировался одновременно с эу-
хроматином [Aggarwal, Calvi, 2004].
Для D. melanogaster на геномном уровне по-
казано, что рано реплицирующиеся районы хро-
мосом маркированы ацетилированными Н4К16
гистонами, при этом обогащение Н4К16ас на-
блюдалось даже в отсутствие транскрипции. Та-
кое обогащение особенно значительно в зонах
инициации репликации. Интересно, что у самцов
дрозофилы в дозово-компенсированной, обога-
щенной Н4К16ас Х-хромосоме отсутствует позд-
няя репликация [Schwaiger et al., 2009].
Другие компоненты хроматина могут осу-
ществлять «тонкую регулировку» временной
программы репликации. Считается, что другие
компоненты и модификации хроматина тоже
могут оказывать прямое воздействие на времен-
ную программу’ репликации, однако вклад каж-
дого фактора в отдельности оказывается относи-
тельно небольшим [Hiratani etal., 2009]. Напри-
мер, в эмбриональных стволовых клетках мыши,
мутантных по генам, кодирующим такие хро-
матиновые белки, как ДНК-метилтрансфераза
Dnmtl, гистонметилтрансфераза G9a, Eed — бе-
лок группы Polycomb или гистонметилтрансфе-
разы Suv39hl/h2, были обнаружены лишь уме-
ренные изменения во времени репликации от-
дельных последовательностей прицентромерно-
го гетерохроматина. Однако время репликации
двадцати генов, попавших в анализ, не измени-
лось [Jorgensen etal.. 2007]. Определенный эф-
фект метилтрансферазы Suv39hl/h2 на время реп-
ликации гетерохроматиновых последовательнос-
тей наблюдали в человеческих эмбриональных
фибробластах [Wu et al., 2006]. У дрожжей S. pom-
be на фоне мутаций в генах, кодирующих орто-
логи НР1 и SU(VAR)3-9 (Swi6 и С1г4 соответст-
венно). наблюдалось замедление репликации
в гетерохроматиновых районах [Hayashi et al..
2009]. У дрозофилы показано, что НР1 имеет две
различные функции в регу’ляции временных осо-
бенностей репликации: он контролирует очень
позднюю репликацию центромерной ДНК, в то
время как в эухроматиновых районах, характе-
ризующихся высоким уровнем повторенных по-
следовательностей, он необходим для более ран-
ней репликации [Schyvaiger etal., 2010]. Эти ис-
следования показывают, что многие хроматино-
вые факторы, судя по всему’, работают дополни-
тельно к глобальным механизмам управления
временной программой репликации, обеспечивая
тонкую сайт-специфическую регулировку’ («fine-
tuning») этой программы [Wu et al., 2006; Schyvai-
ger etal., 2010].
Важно подчеркнуть, что ни одна эпигенети-
ческая метка не коррелирует с репликационным
таймингом сильнее, чем сама по себе транскрип-
ция (см. обзор [Hayashi et al., 2009]).
Каким образом особенности хроматина
управляют временем активации ориджинов?
Говоря об эффективности ориджинов, мы уже
обсуждали тот факт, что концентрация в ядре
Cdc45 может являться лимитирующим факто-
ром, определяющим количество ориджинов, ко-
торое одновременно может активироваться в
клетке. Cdc45 связывается с ориджинами репли-
кации непосредственно в момент их активации,
при этом сродство ориджинов к Cdc45 определя-
ется статусом их ацетилирования [Alexandroyv,
Hamlin, 2005], а также, возможно, другими хро-
матиновыми метками, например, статусом мети-
лирования H3K36 [Pryde et al., 2009].
С друтой стороны, связыванию ориджином
Cdc45 предшествует фосфорилирование МСМ2-7
циклин-зависимыми киназами. Это фосфорили-
рование ингибируется при помощи ATR/CHK1-
каскада, причем, вероятно, уже активировавшие-
ся ориджины или репликационные фабрики мо-
гут локально вызывать ингибирование инициа-
ции в окружающих участках хроматина (см. вы-
ГЛАВА 5 129
ше). При этом ранние эффективные ориджи-
ны — те самые, которые несут метки наиболее
открытого хроматина, — являются не чувстви-
тельными к ATR/CHK1-опосредованному инги-
бированию. Судя по всему’, фосфорилирование
ориджина комплексами циклинов с циклин-за-
висимыми киназами тоже должно быть чу встви-
тельно к особенностям хроматина.
Можно предположить и более простое объяс-
нение, основанное на том, что в закрытом хрома-
тине последовательности, связывающие pre-RC, а
затем и сами pre-RC физически менее доступны
для связывания факторов, обеспечивающих сле-
дующие этапы программирования и активации
ориджинов, в результате чего они связывают все
лимитирующие факторы только после того, когда
конкуренция за них уже закончилась.
Каскадная активация репликационных
доменов. Модель домино. Как уже обсуждалось
в главе про фокусы репликации, при репликации
геномов млекопитающих имеет место тенденция
последовательной активации соседних реплика-
ционных кластеров. Можно предположить, что
репликация определенного района генома облег-
чается последовательным связыванием факторов
репликации в соседних сайтах инициации. Веро-
ятно, акт репликации вызывает локальные изме-
нения в конденсации хроматина, которые в свою
очередь обеспечивают доступ/привлечение фак-
торов репликации и новые события инициации.
Репликация, согласно такой модели, должна на-
чинаться в сайтах с «открытой» конформацией
хроматина. Результатом события инициации бу-
дет деконденсация хроматина в соседних рай-
онах, что сделает его доступным для факторов
инициации репликации. Такая модель, подразу-
мевающая каскадный механизм подготовки хро-
матина к инициации репликации, была названа
«модель домино» (см. обзор [Chagin et al., 2010]).
По некоторым косвенным данным, в таком
постепенном создании хроматина, компетентно-
го к инициации репликации, могут принимать
участие компоненты геликазного комплекса, в
частности МСМ2-7 или Cdc45. Cdc45 участвует
в специфическом фосфорилировании гистона Н1
и связанной с этим фосфорилированием декон-
денсации хроматина, необходимой для инициа-
ции репликации. Кроме того, показано, что на
цитологических препаратах реплицирующихся
клеток распределение этих белков отражает об-
щий ход S-фазы, однако они появляются в фоку-
сах репликации раньше, чем происходит ини-
циация репликации [Alexandrow, Hamlin, 2005].
5.4. Протяженные репликационные
домены
Получение полногеномных профилей репли-
кации из самых разнообразных клеток высших
эукариот (исключением являются только эм-
бриональные клетки на стадии быстрых делений
дробления) показало, что в каждом типе клеток в
геноме выделяются четкие домены ранней и
поздней репликации [Hiratani et al., 2008; Pope
etal., 2010]. Эти домены в целом очень хорошо
отражают организацию генома в хроматиновые
домены (рис. 5.13). Можно полагать, что относи-
тельно однородные свойства хроматина в преде-
Lymph RT
CTCF
H3K4me1
H3K4me2
H3K4me3
НЗКЭас
H3K27ac
НЗКЗбтеЗ
НЗК27теЗ
Н4К20те1
*НЗК9те2
*НЗК9теЗ
Control
60
Максимум □ Минимум
70
100
80
90
110
Рис. 5.13. Профиль репликации (верхний ряд) и особенности хроматина в участке
хромосомы 10 из лимфобластов человека размером 50 м.п.н. (по [Ryba et al., 2010]).
130 ЭПИГЕНЕТИКА
лах домена и определяют относительно син-
хронную инициацию репликации в его пределах.
Что происходит на границах репликаци-
онных доменов? Чем определяется время реп-
ликации на границах дискретных доменов реп-
ликации? В случае присутствия на границе доме-
нов каких-то физических барьеров можно ожи-
дать остановки репликационной вилки и скачко-
образного профиля репликации между соседни-
ми доменами. В других случаях профиль репли-
кации должен выглядеть более плавным.
Действительно, профиль репликации на гра-
ницах репликационных доменов высших эука-
риот может изменяться скачкообразно. Значи-
тельная разница во времени репликации между
относительно близко расположенными районами
(менее 100 т.п.н.) известна для нескольких по-
граничных зон между’ R- и G-дисками млекопи-
тающих [Tenzen et al., 1997; Watanabe et al., 2000].
Например, в районе локуса МНС (major histo-
compatibility complex) человека обнаружена раз-
ница во времени репликации 1 ч между последо-
вательностями, расположенными на расстоянии
всего 16 т.п.н. [Watanabe et al., 2000], что может
указывать на наличие барьеров, на которых вил-
ка репликации либо останавливается, либо зна-
чительно снижает скорость. Последовательности
ДНК в таких районах характеризуются общими
свойствами, а именно: высокой плотностью Alu-
и LINE-повторов, наличием полипурин/полипи-
римидиновых трактов, ди-, три- и тетрануклео-
тидных повторов, SAR-районов [Tenzen et al.,
1997; Watanabe et al., 2000].
Однако время вступления районов в реплика-
цию вдоль по хромосоме на границе G- и R-дис-
ков может изменяться и постепенно. Такую кар-
тину’ наблюдали между’ реплицирующимся рано
R-диском 13ql4.3 и реплицирующимся поздно
G-диском 13q21.1 человеческой хромосомы 13
[Strehl etal., 1997]. Интересно, что переход про-
исходит ступенчато: группы репликонов при-
мерно 1 м.п.н. (что соответствует среднему' раз-
меру фокуса репликации) реплицируются скоор-
динированно.
Известны примеры и градиента времени реп-
ликации. Так, например, в эмбриональных ство-
ловых клетках мыши район тяжелой цепи имму-
ноглобина (IgH) размером в 400 т.п.н. граничит с
одной стороны с районом, который всегда реп-
лицируется очень рано в S-фазе, а с другой сто-
роны — с районом, который всегда реплициру-
ется поздно. Сам по себе район IgH реплициру-
ется единственной вилкой, приходящей от рано
реплицирующегося района в направлении позд-
но реплицирующегося. Получается, что прокси-
мальный ранний ориджин направляет вилку’ ре-
пликации через район IgH, и эта вилка движется
до тех пор, пока не встретится с вилкой, идущей
от ориджина. который включается позднее [Er-
makova et al., 1999; Norio et al., 2005]. Таким об-
разом, между кластерами синхронно включаю-
щихся ориджинов расстояние может быть суще-
ственно больше, чем между ориджинами внутри
кластеров, и границы доменов поздней реплика-
ции могут определяться скоростью движения
вилок репликации от ранних ориджинов.
Когда были получены геномные профили ре-
пликации для различных типов клеток млекопи-
тающих, стало ясно, что на границах многих ре-
пликационных доменов существуют зоны, про-
тяженностью вплоть до полутора м.п.н., в кото-
рых отсутствуют события инициации реплика-
ции [Farkash-Amar etal., 2008; Hiratani etal.,
2008; Desprat et al., 2009; Guan et al., 2009; Ryba
etal., 2010]. Такие зоны были названы temporal
transition region (TTR). Важно, что TTR не прос-
то не содержат ориджины репликации, но для
них, вероятно, характерно активное ингибирова-
ние активности ориджинов. Направленно встро-
енные в TTR локуса IgH мыши ориджины реп-
ликации (фрагменты ДНК, способные к эффек-
тивной инициации репликации в других районах
генома) не инициировали репликацию [Guan
et al., 2009].
Совсем недавно вышла работа, вступающая в
противоречие с представлением о широком рас-
пространении протяженных репликонов в TTR в
клетках млекопитающих [Guilbaud etal., 2011].
Согласно данным этой работы, такие репликоны
характерны лишь для эмбриональных стволовых
клеток, в то время как в дифференцированных и
раковых клетках авторы не обнаружили репли-
конов протяженностью более 100 т.п.н. Авторы
предполагают, что наблюдающийся в TTR гра-
диент репликации обеспечивается последова-
тельной каскадной активацией ориджинов в со-
ответствующих районах. В частности, авторы
продемонстрировали, что в клетках HeLa локус
IgH реплицируется при помощи множества по-
следовательно активирующихся ориджинов.
Изменения репликации при дифференци-
ровке происходят на уровне протяженных
доменов. Репликационные домены, в пределах
которых репликация происходит координиро-
ванно, представляют собой дискретные единицы
хромосомной структуры и функции, которые
могут менять свои свойства в ходе дифференци-
ровки клеток [Hiratani, Gilbert, 2009]. В настоя-
ГЛАВА 5 131
щее время можно с уверенностью говорить о
том, что значительная часть генома является объ-
ектом временной регу’ляции репликации в ходе
развития, и для каждого клеточного типа уста-
навливается своя, характерная для него, прог-
рамма репликации [Hiratani etal., 2008, 2010;
Pope etal., 2009; Schwaiger etal., 2009]. Так, в
ходе дифференцировки мышиных эмбриональ-
ных стволовых клеток в клетки — предшествен-
ники нервных клеток, время репликации меняют
около 20 % генома. В целом, около половины
генома млекопитающих изменяет время репли-
кации на тех или иных стадиях развития.
При исследовании динамики геномных про-
филей репликации в ходе дифференцировки кле-
ток млекопитающих был замечен любопытный
факт. Несмотря на то, что репликационные до-
мены в каждом определенном типе мышиных
или человеческих клеток могут быть очень раз-
ными по своему’ размеру, вплоть до нескольких
м.п.н., фрагменты генома, которые в ходе диф-
ференцировки меняли время репликации, были
приблизительно одного размера — порядка 400—
800 т.п.н. Можно предполагать, что это свойст-
во отражает существование минимального раз-
мера домена координированной регуляции вре-
мени репликации [Woodfine et al., 2005; Hiratani
etal., 2008, 2010; Gilbert etal., 2010; Rvba etal.,
2010;].
Подобные исследования были проведены и на
D. melcmogaster [Schwaiger et al., 2009; MacAlpi-
ne etal., 2010|. Они также продемонстрировали
разницу’ в 20 % при сравнении профилей репли-
кации между* двумя типами клеток: клетками
эмбрионального происхождения Кс и клетками
С18, полученными из крылового имагинального
диска. Важно, что у дрозофилы районы диффе-
ренциальной репликации также достаточно про-
тяженные, в среднем около 100 т.п.н. В то же
время, у дрозофилы изменения времени реплика-
ции участков генома могут происходить и в пре-
делах небольших участков генома, около не-
скольких т.п.н. [Belyaeva et al., 2012].
Удивительно, но общий временной порядок
репликации, характерный для каждого типа кле-
ток, является очень консервативным. Так, при
сравнении профилей репликации в клетках мы-
ши и человека одного клеточного типа, в протя-
женных районах, демонстрирующих синтению,
профили репликации были очень похожими
(рис. 5.14) [Yaffe etal., 2010]. Тканеспецифиче-
ские профили репликации оказались более кон-
сервативными, чем многие друтие свойства тех
же участков генома, в частности, чем GC-состав.
/ /V'-VN'T" ’У'//*
0,0е+00 5,0е+07 1,0е+08 1,5е+08 2,0е+08 2,5е+08
iP III Illi HUH Г III Illi II Jl
i ni mi иiiMin h i ил
~ -X ‘ X
wV-' „..Wa ’ lA v-i
—I---------------1--— ---------—I-------------1------
0,0e+00 5,0e+07 1,0e+08 1,5e+08
III, ч lilPIHQM I I I’iML
2,0e+07 4,0e+07 6,0e+07 8,0e+07 1,0e+08
11 11
U2 П12
Д]3 IJ13
I 4 □14
5 П15
□ 6 H16
H7 17
□ 8 □ 18
| 9 19
□ Ю @X
пстлти ыд1 aiMiiiiiramra
50 м.п.н.
Рис. 5.14. Консервативность временного профиля репликации.
Сравнение профилей репликации в зонах синтении хромосом мыши и человека. Показаны профили для
хромосом 1,6, 15 и 21 фибробластов человека (голубой профиль), лимфобластов человека (синий про-
филь) и профиль репликации для ортологичных районов в мышиных эмбриональных фибробластах
(светло-зеленый профиль) и мышиных лимфобластах (темно-зеленый профиль). Под каждой хромосо-
мой — карта синтении мышь—человек, цветами закодированы соответствующие хромосомы мыши
[Yaffe et al., 2010].
132 ЭПИГЕНЕТИКА
Это указывает на то, что поддержание точной
временной программы репликации — очень важ-
ная характеристика эпигенетического состояния
клеток, хотя точное значение этой программы
пока до конца не ясно.
Репликационные домены — очень стабиль-
ная и информативная эпигенетическая ха-
рактеристика типа клеток и стадий диффе-
ренцировки. В биологии стволовых клеток су-
ществуют задачи, связанные с проверкой качест-
ва индуцированных плюрипотентных клеток, с
выяснением потенциала клеток к дифференци-
ровке и определением клеточной идентичнос-
ти — на ранних этапах эмбриогенеза клетки бы-
стро меняют свойства и эпигенетический статус.
Недавно было показано, что временные особен-
ности репликации являются очень удобной ха-
рактеристикой для решения этих задач [Ryba
etal., 2011]. Как оказалось, профиль реплика-
ции — характеристика менее динамичная, чем
особенности транскрипции или состава хрома-
тина. Организация репликационных доменов
специфична для каждого клеточного типа. При
этом изменения в профиле репликации в ходе
ESC/iPSC
Ранний эпибласт
Поздний эпибласт
Эктодерма
Мезодерма/энтодерма
Частичная iPSC
Поздняя мезодерма
Рис. 5.15. Дендрограмма изменений профиля репли-
кации в ходе эмбриогенеза мыши. Представлены ре-
зультаты сравнения и иерархической кластеризации
клеток на основании сравнения профилей реплика-
ции. В анализ взяты двадцать две клеточных линии,
представляющие семь стадий эмбриогенеза (отмече-
ны разными цветами) (по [Hiratani et al., 2010]).
диффренцировки клеток происходят в строго
определенном порядке и на уровне достаточно
протяженных участков генома.
Группе Дэвида Гилберта удалось протестиро-
вать несколько десятков клеточных типов, соот-
ветствующих разным этапам раннего эмбриональ-
ного развития и построить дендрограмму, которая
отражает последовательность дифференцировки и
«родственные связи» клеток (рис. 5.15).
Замечательно, что профили репликации и для
человеческих, и для мышиных индуцированных
плюрипотентных клеток, репрограммированных
из фибробластов, практически не отличаются от
такового в эмбриональных стволовых клетках.
Более того, как только происходит потеря плю-
рипотентности, профиль репликации значительно
меняется [Hiratani, Gilbert, 2009]. Таким образом,
профиль репликации может служить прекрасным
маркером плюрипотентности. Более того, оказа-
лось, что для характеристики состояния клеток не
обязательно каждый раз получать полногеном-
ный профиль. Можно выделить определенные
маркерные районы, которые позволяют по отно-
сительно небольшом),’ объем\' данных проводить
классификацию эмбриональных клеток мыши
или человека (рис. 5.16). Эти районы были назва-
ны «репликационными фингерпринтами» (replica-
tion fingerprints) [Ryba et al., 2011].
Репликационные фингерпринты дают широ-
кие возможности для характеризации типов кле-
ток. Так, зная маркерные районы для каждого
клеточного типа, можно создать наборы для оп-
ределения типа клеток или степени дифферен-
цировки, основанные на ПЦР. Метод подразуме-
вает анализ обогащенности новосинтезирован-
ными молекулами ДНК на этапе ранней S-фазы
для нескольких характеристических районов
[Rybaetal., 2011].
Репликационные домены и регуляция
транскрипции генов. Итак, в ходе дифферен-
цировки клеток происходят значительные изме-
нения времени репликации протяженных хрома-
тиновых доменов. Но как это соотносится с ре-
гуляцией экспрессии генов?
Тотальные исследования профилей реплика-
ции и транскрипции D. melanogaster показали,
что чем позднее ген реплицируется в S-фазе кле-
точного цикла, тем меньше вероятность его
транскрипционной активности в данном типе
клеток. В то же время есть активные гены, кото-
рые локализуются в поздно реплицирующихся
районах, и, напротив, есть неактивные гены, ко-
торые реплицируются рано в S-фазе [Schubeler
et al., 2002; Schwaiger et al., 2009]. Однако корре-
ГЛАВА 5 133
Рис. 5.16. Профили репликации хромосомы 7 человека в двух клеточных типах (две линии эмб-
риональных стволовых клеток — голубой и синий профили — и две линии предшественников
нервных клеток — темно- и светло-зеленый профили).
Серым цветом отмечены четыре участка генома размером 200 т.п.н., которые могут служить маркерными рай-
онами. позволяющими различить эти два типа клеток (по [Ryba et al., 2011 ]).
ляции между временем репликации гена и уров-
нем его транскрипции у D. rnelcinogaster обнару-
жено не было. Большинство активных генов с
различными уровнями экспрессии реплициру-
ются рано, в то время как меньшая группа генов,
среди которых есть и активно транскрибируе-
мые, реплицируются поздно [Schubeler etal.,
2004]. При этом уровень транскрипции генов кор-
релирует с уровнем специфичных для эухрома-
тина гистоновых модификаций. Оказалось, что
домены ранней и поздней репликации D. melano-
gaster очень четко различаются по плотности
транскрипции вдоль хромосомы. Плотность сай-
тов связывания РНК-полимеразы II значительно
больше в районах наиболее ранней репликации
по сравнению с районами, вступающими в реп-
ликацию позже. Эти данные указывают на то,
что транскрипционный статус влияет на про-
филь репликации на уровне крупных доменов
(>100 т.п.н.), а не на уровне отдельных генов
[MacAlpine et al., 2004].
К подобным же выводам привели исследова-
ния репликации у млекопитающих [Hiratani
et al., 2008, 2010; Ryba et al., 2010]. Значительная
корреляция наблюдается между временем реп-
ликации и транскрипцией для тех генов, которые
реплицируются в средней и поздней S-фазе. В то
же время для генов, которые реплицируются во
время первой трети S-фазы, такой корреляции не
было найдено, т. е. эти гены могут приблизи-
тельно с одинаковой вероятностью экспрессиро-
ваться или нет (рис. 5.17).
Важно учитывать еще и то, что последова-
тельности /ТНК, соответствующие генам, имеют
тенденцию реплицироваться в ранней S-фазе
независимо от уровня их экспрессии. Полноге-
номный анализ профилей репликации у млеко-
питающих показал, что около 75 % генов репли-
цируются в первой половине S-фазы, в то время
как большая часть негенной ДНК реплицируется
в поздней S-фазе во всех исследованных клеточ-
ных типах [Hiratani et al., 2008].
Какие же гены попадают в домены, изме-
няющие время репликации в ходе развития?
Судя по всему, это зависит не от функции гена, а
от его хроматинового контекста и, как следст-
вие, его молекулярной организации. В качестве
примера можно привести бета- и альфа-глоби-
новые гены млекопитающих, которые являются
паралогичными и экспрессируются только в
клетках эритроидного ряда.
Бета-глобиновый локус расположен в хро-
матиновом домене размером более 1 м.п.н., ко-
торый в эритроидных клетках становится чувст-
вительным к расщеплению ДНКазой I («откры-
тая» конформация хроматина), характеризуется
повышенным уровнем ацетилирования гистонов
НЗ и Н4, расположен далеко от прицентромер-
ного гетерохроматина и реплицируется рано в
Нет корреляции Сильная корреляция
Ранняя S Средняя S Поздняя S
Время репликации
Рис. 5.17. Корреляция между временем репликации и
транскрипционным статусом наблюдается только для
генов, реплицирующихся во второй половине S-фазы
(по [Hiratani et al., 2009]).
134 ЭПИГЕНЕТИКА
S-фазе. В неэритроидных клетках р-глобиновые
гены подвержены сайленсингу, локус нечувст-
вителен к расщеплению эндонуклеазами («за-
крытый» хроматин), гипоацетилирован, перено-
сится к прицентромерному гетерохроматину и
реплицируется поздно в S-фазе [Smith, Higgs,
1999; Schubeler etal., 2000]. Регуляция таких
тканеспецифичных изменений осуществляется с
помощью специфических г/г/с-последовательнос-
тей, которые локализованы в пределах 40 т.п.н.,
окружающих LCR (элемент, необходимый для
регуляции тканеспецифичной экспрессии бета-
глобинового локуса), и ли/А7//с-факторов, способ-
ных переключить программу’ репликации в клет-
ках эритроидного ряда. Анализ делеций позво-
лил разделить последовательности ДНК, отве-
чающие за временную регуляцию экспрессии и
репликации в данном локусе, а также показать,
что время репликации локуса коррелирует с чув-
ствительностью его к нуклеазам (т. е. структурой
хроматина), но не с экспрессией глобиновых ге-
нов [Cimbora et al., 2000].
В то же время альфа-глобиновый локус
расположен в хроматиновом домене, для которо-
го характерны «открытая» конформация и ран-
няя репликация в S-фазе независимо от статуса
транскрипции глобиновых генов. Локус характе-
ризуется большим количеством активных генов
и CpG-островков [Smith, Higgs, 1999]. В этом
районе не было обнаружено ориджина или зоны,
которая бы определяла время репликации рай-
она. Здесь, видимо, паттерн репликации связан
со структурой хроматина во всем локусе, кото-
рая облегчает доступ к множественным ориджи-
нам репликации. Вероятно, для ранней инициа-
ции репликации не требуется специального про-
граммирования. Известно, что CpG-островки
(G + С-богатые районы длиной около 1 т.п.н. и
свободные от метилирования) содержат промо-
торы многих генов млекопитающих. Эти остров-
ки также составляют значительную фракцию
ориджинов репликации млекопитающих. Для
этих ориджинов характерна скоординированная
ранняя инициация репликации в S-фазе [Delgado
et al., 1998].
Изменение времени репликации района в S-
фазе может быть одним из механизмов перепро-
граммирования его состояния в следующих кле-
точных поколениях. Действительно, переключе-
ние программы репликации на «позднюю» мо-
жет определить дальнейшее репрессивное, «мол-
чащее», состояние района. Активное же состоя-
ние хроматина, сопряженное с ранней реплика-
цией, не обязательно приводит к повышению
активности генов, так как для активации транс-
крипции могут требоваться специфические регу-
ляторные факторы. В то же время активное со-
стояние хроматина может облегчить связывание
промоторов с этими факторами. В свою очередь,
способность регуляторов транскрипции рекру-
тировать ферменты, которые модифицируют и
перестраивают хроматин, может быть одним из
факторов, определяющих, где и когда начнется
репликация в хромосомах высших эукариот.
5.5. Значение пространственно-временной
РЕГУЛЯЦИИ РЕПЛИКАЦИИ
Мы обсудили особенности и механизмы ре-
гуляции пространственно-временной организа-
ции репликации эукариотических геномов и вы-
яснили, что программа репликации — стабиль-
ная эпигенетическая характеристика клеток, ко-
торая жестко регулируется в клеточном цикле и
в развитии. Нам осталось ответить на самый
главный вопрос — почему’ регуляция реплика-
ции подвержена такому' жесткому’ контролю,
какова ее роль в клеточном цикле, в развитии
многоклеточного организма, а также в эволюции
геномов.
Роль в поддержании стабильности гено-
мов. Судя по всемуг, первоначальная роль пла-
стичной инициации репликации связана с под-
держанием стабильности эукариотического ге-
нома. Управление эффективностью потенциаль-
ных ориджинов позволяет добиться заданной
протяженности S-фазы независимо от скоростей
движения отдельных репликационных вилок и
от наличия некоторого количества повреждений
в молекуле ДНК. Это позволяет четко придер-
живаться определенного времени клеточного
цикла, что очень важно для согласованного раз-
вития многоклеточного организма. Нарушение
регуляции временной последовательности реп-
ликации у высших эукариот приводит к не-
стабильности генома, нарушениям в конденса-
ции хромосом в митозе, нарушению когезии се-
стринских хроматид и даже злокачественной
трансформации клеток (для обзора см. [Hiratani,
Gilbert, 2009]).
Роль в регуляции экспрессии генов и под-
держании хроматиновых доменов. У всех изу-
ченных к настоящему’ моменту’ многоклеточных
организмов наблюдается значительная положи-
тельная корреляция между’ ранней репликацией
и транскрипцией, однако нельзя говорить об од-
нозначной связи между временем репликации
гена и уровнем его транскрипции. Считается,
ГЛАВА 5 135
что временная организация репликации важна
именно для поддержания эпигенетического ста-
туса протяженных хроматиновых доменов, кото-
рые, в свою очередь, определяют транскрипци-
онную компетентность индивидуальных генов
в каждом типе клеток.
Более того, дифференциальная репликация
разных типов хроматина в S-фазе является од-
ним из важных механизмов, обеспечивающих
поддержание особенностей хроматиновых доме-
нов в клеточном цикле (подробнее см. в главе
про механизмы эпигенетического наследования).
Оказалось, что на разных этапах S-фазы проис-
ходит сборка различных типов хроматина. Вы-
яснилось, что набор белков, участвующих в упа-
ковке и модификациях хроматина, может значи-
тельно различаться в репликационных вилках,
работающих на разных этапах S-фазы.
Так, ДНК, реплицирующаяся в первой поло-
вине S-фазы, будет автоматически упаковывать-
ся в ацетилированные гистоны, тогда как /ТНК,
реплицирующаяся в поздней S-фазе, — в деаце-
тилированные [Lande-Diner et al., 2009]. По-
скольку время репликации ДНК у высших эука-
риот регулируется на уровне протяженных (око-
ло 1 м.п.н.) доменов, получается, что во время
репликации геном будет подразделяться на два
дискретных типа доменов — гипо- или гипер-
ацетилированные. ДНК- и НЗК9-метилтранс-
феразы обнаруживаются в вилках репликации на
стадии поздней S-фазы, что обеспечивает упа-
ковку всех поздно реплицирующихся последова-
тельностей в гетерохроматин.
Предполагается, что изменение времени реп-
ликации хроматинового домена в онтогенезе
может быть важным механизмом его инактива-
ции, т. е. программирования молчащего состоя-
ния района для последующих клеточных поко-
лений. Так, например, при инактивации Х-хро-
мосомы млекопитающих переключение времени
репликации является одним из первых эпигене-
тических событий. Для большинства генов выс-
ших эукариот характерно, что оба аллеля экс-
прессируются одинаково и реплицируются ско-
ординированно. Однако имеется небольшой класс
генов, которые транскрибируются преимущест-
венно с одного аллеля в каждой клетке (явление
импринтинга). В большинстве случаев инакти-
вированный аллель реплицируется поздно. При
этом как поздняя репликация, так и инактивация
программируются в мейозе и поддерживаются в
течение остального развития, и эта программа
стирается во время следующего раунда гамето-
генеза. Считается, что временной сдвиг к позд-
ней репликации может использоваться как меха-
низм для выбора активного аллеля [Kitsberg et al.,
1993; Simon et al., 1999; Shufaro et al., 2010].
В качестве прямого доказательства возможно-
сти программирования транскрипционного стату-
са гена при помощи изменения времени его реп-
ликации можно привести эксперименты по инъ-
екции плазмид в клетки, находящиеся на разных
этапах S-фазы. В культуре клеток млекопитаю-
щих при инъекции плазмиды, несущей репортер-
ный ген, на стадии поздней S-фазы репортерный
ген запаковывается в закрытый хроматин и не
транскрибируется. Это состояние затем наследу-
ется в клеточных поколениях. Если же инъекция
происходит на более ранних этапах S-фазы, ре-
портерный ген стабильно транскрибируется в
клеточных поколениях [Zhang et al., 2002; Lande-
Diner et al., 2009].
Роль пространственно-временной органи-
зации репликации в эволюции геномов. Про-
странственно-временная организация реплика-
ции также отражает сложную организацию эука-
риотического генома. Показано, что есть четкая
корреляция между размером генома и «степенью
асинхронности репликации», т. е. по сути дела,
с протяженностью S-фазы (см. обзор [Herrick,
2011]). Во время эмбрионального развития асин-
хронность репликации возникает одновременно
со становлением гетерохроматиновых доменов
[Shermoen et al., 2010].
У млекопитающих подразделение генома на
рано и поздно реплицирующиеся домены соот-
ветствует организации генома в R/G-диски
[Hiratani, Gilbert, 2009]. Кроме того, у млекопи-
тающих обнаруживается четкая корреляция меж-
ду доменами репликации и изохорами — участ-
ками генома, характеризующимися относитель-
но однородным GC-составом [Costantini, Bernar-
di, 2008]. Еще в одной из первых работ по по-
строению хромосомного профиля репликации в
клетках млекопитающих было замечено, что пе-
реход от ранней репликации к поздней соответ-
ствовал скачку в GC-составе. При этом, как пра-
вило, рано реплицирующиеся зоны являются
GC-богатыми, а поздно реплицирующиеся —
нет [Watanabe etal., 2000]. Таким образом, уже
по особенностям организации генома можно
предсказать многие временные закономерности
его репликации.
У дрозофилы также было показано, что доме-
ны поздней репликации обладают особыми
свойствами на геномном уровне, которые позво-
ляют предсказывать такие домены, основываясь
на анализе первичной последовательности ДНК
136 ЭПИГЕНЕТИКА
[Belyakin etal., 2010]. Закономерность заключа-
ется в том, что по краям зон поздней реплика-
ции, как правило, располагаются области повы-
шенной плотности генов, в которых находятся
короткие и часто перекрывающиеся гены. Внут-
ри этих зон располагаются длинные гены с
большими интронами, перемежающиеся длин-
ными межгенными промежутками. Кроме того,
внутри содержатся очень короткие гены, и зна-
чительная их часть представляет собой гены,
экспрессирующиеся в семенниках самцов.
Временной профиль репликации отражает
неоднородную организацию хроматина, которая,
в свою очередь, связана с неоднородной органи-
зацей генома. Возможно, именно неодновремен-
ная репликация разных районов хромосом явля-
ется важной движущей силой дивергенции орга-
низации хроматиновых доменов. Дело в том, что
и у млекопитающих, и у дрозофил скорость ней-
тральной эволюции участков генома, реплици-
рующихся на разных этапах S-фазы, значительно
различается [Chen et al.. 2010; Herrick, 2011; We-
ber et al., 2012]. Описано несколько независимых
механизмов, которые могут приводить к такому’
результату’. Основной механизм накопления му-
таций в поздно реплицирующихся динуклеоти-
дах CpG — накопление замен С > Т увеличива-
ется из-за высокой концентрации метилирования
этих динуклеотидов именно в позднореплици-
рующихся районах генома (метилирование CpG
значительно повышает вероятность замены С >
> Т). Это актуально для тех видов, у которых
большое значение имеет метилирование /ТНК,
например, для млекопитающих. Кроме того, по-
ложительная корреляция между’ скоростью од-
нонуклеотидных замен и временем репликации
района была обнаружена и вне CpG-участков.
Главным механизмом здесь считается снижение
эффективности систем репарации в ходе S-фазы.
Можно, например, вспомнить, что для активации
поздних ориджинов во второй половине S-фазы
требуется нейтрализация СНК1-зависимой сис-
темы контроля повреждений ДНК Судя по все-
му’, в поздней S-фазе снижается активность мис-
матч-репарации (mismatch repair) и, возможно,
некоторых других систем репарации. Кроме то-
го, есть факты, что и вероятность возникновения
мутаций в ходе собственно синтеза ДНК также
не одинакова на разных этапах клеточного цикла
[Chen et al., 2010; Herrick, 2011]. Таким образом,
пространственно-временная организация репли-
кации генома является важным фактором, управ-
ляющим скоростью эволюции геномов у млеко-
питающих.
* * *
Давно известно, что разные типы хроматина
реплицируются в разное время в S-фазе, однако
лишь в последние годы регуляция репликации
стала рассматриваться как эпигенетическое явле-
ние. Стало ясно, что в ходе дифференцировки
происходят значительные изменения в программе
репликации генома, которые тесно связаны с из-
менениями в транскрипционной активности и ор-
ганизации ядра. Домены временно скоординиро-
ванной репликации представляют собой дискрет-
ные единицы хромосомной структуры и функции.
И хотя функциональное значение такой жесткой
регуляции репликации еще до конца не известно,
можно с уверенностью говорить, что программа
репликации — еще одна эпигенетическая харак-
теристика каждого клеточного типа.
Исследования пространственно-временной ор-
ганизации репликации бурно развиваются и, ве-
роятно, преподнесут нам в ближайшие годы еще
немало сюрпризов. Постоянно публикуются но-
вые и новые данные, полученные в различных
организмах, в разных типах клеток и тканей. Это,
с одной стороны, новые полногеномные профили
репликации, а также данные о связи этих профи-
лей с организацией хроматина и распределением
хромосомных белков. С друтой стороны, это но-
вые данные о молекулярных механизмах эпигене-
тической регуляции репликации. Мы попытались
проследить все ступени регуляции репликации,
чтобы помочь читателю сориентироваться в этом
огромном потоке информации.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Abdurashidova G., Radulescu S., Sandoval О., Zahariev S.,
DanailovM. В., Demidovich A., Santamaria L., Biamon-
ti G., Riva S., Falaschi A. Functional interactions of DNA
topoisomerases with a human replication origin // EMBO
J. 2007. Vol. 26. P. 998—1009.
AggarwalB. D.. CalviB. R. Chromatin regulates origin activity
in Drosophila follicle cells // Nature. 2004. Vol. 430.
P. 372—376.
AladjemM. I. Replication in context: dynamic regulation of
DNA replication patterns in metazoans H Nat. Rev. Genet.
2007. Vol. 8. P. 588—600.
AladjemM. I., RodewaldL. IF., KolmanJ.L., ITahlG.M. Ge-
netic dissection of a mammalian replicator in the human
beta-globin locus// Science. 1998. Vol. 281. P. 1005—
1009.
Alexandrow M. G., Hamlin J. L. Chromatin decondensation in
S-phase involves recruitment of Cdk2 by Cdc45 and his-
tone Hl phosphorylation // J. Cell Biol. 2005. Vol. 168.
P. 875—886.
Anachkova B., Djeliova Г., Russey’ G. Nuclear matrix support of
DNA replication // J. Cell. Biochem. 2005. Vol. 96.
P. 951—961.
ГЛАВА 5 137
Aparicio J. G., 1'iggiani C. J. GibsonD. G.. Aparicio O. AL. The
Rpd3—Sin3 histone deacetylase regulates replication timing
and enables intra-S origin control in Saccharomyces cere-
visiae // Mol. Cell. Biol. 2004. Vol. 24. P. 4769 4780.
Asano AL, THiartonR. P. E2F mediates developmental and cell
cycle regulation of ORC1 in Drosophila // EMBO J. 1999.
Vol. 18. P. 2435 2448.
Bell S. P.. DuttaA. DNA replication in eukaryotic cells // Annu.
Rev. Biochem. 2002. Vol. 71. P. 333—374.
Belyaeva E. S., Goncharov F. P., Demakova О. V., Kolesni-
kova T. D., Boldyreva L. J’., Semeshin J’. F, Zhimulev I. F.
Late replication domains in polytene and non-polytene
cells of Drosophila melanogaster 11 PLoS One. 2012.
Vol. 7. P. c30035.
Belyakin S. N., Babenko I’ N., ALaksimovD. A., ShlomaV.V.,
Kvon E. Z., Belyaeva E. S., Zhimulev I. F. Gene density
profile reveals the marking of late replicated domains in
the Drosophila melanogaster genome // Chromosoma.
2010. Vol. 1 19. P. 589—600.
Berbenetz N. Al., Ki slow C, Brown G. JJ’. Diversity of eukary-
otic DNA replication origins revealed by genome-wide
analysis of chromatin structure П PLoS Genet. 2010.
Vol.’6. P. 61001092.
BerezneyR, DuheyD.D., Huberman J. A. Heterogeneity of
eukaryotic replicons, replicon clusters, and replication
foci ' Chromosoma. 2000. Vol. 108. P. 471—484.
Bickmore JJ. A., Carothers A. D. Factors affecting the timing
and imprinting of replication on a mammalian chromo-
some // J. Cell Sei. 1995. Vol. 108 (Pt. 8). P. 2801—2809.
Borowiec J. A., Schildkraut C. L. Open sesame: activating dor-
mant replication origins in the mouse immunoglobulin
heavy chain (Igh) locus" Curr. Opin. Cell Biol. 2011.
Vol. 23. P. 284—292.
Bowers J. L., RandellJ. C, ChenS., Bell S. P. ATP hydrolysis
by ORC catalyzes reiterative Mcm2-7 assembly at a de-
fined origin of replication // Mol. Cell. 2004. Vol. 16.
P. 967—978.
BranzeiD., FoianiAL. The DNA damage response during DNA
replication " Curr. Opin. Cell Biol. 2005. Vol. 17. P. 568—
575.
Bridger J. AL, Boyle S., Kill L. R., Bickmore JJ’. .1. Re-modelling
of nuclear architecture in quiescent and senescent human
fibroblasts // Curr. Biol. 2000. Vol. 10. P. 149—152.
Buongiorno-Nardelli AL. ALicheli G., CarriAL. T. ALarilleyAL. A
relationship between replicon size and supercoiled loop do-
mains in the eukaryotic genome // Nature. 1982. Vol. 298.
P. 100—102.
CadoretJ.C., ALeischF, Hassan-Zadeh J’., Luyten L., Guil-
letC., DuretL., Quesneville EL, PrioleauAL N. Genome-
wide studies highlight indirect links between human repli-
cation origins and gene regulation " Proc. Natl. Acad. Sei.
USA. 2008. Vol. 105. P. 15837—15842.
CadoretJ. C, Prioleau AL. N. Genome-wide approaches to de-
termining origin distribution // Chromosome Res. 2010.
Vol. 18. P. 79—89.
Cayrou C, Coulombe P., ALechali AL. Programming DNA repli-
cation origins and chromosome organization // Chromo-
some Res. 2010. Vol. 18. P. 137—145.
Cayrou C, Coulombe P., J’igneron A., Stanojcic S., Gather O.,
PeifferL.. RivalsE., PuyA.. Laurent-ChabalierS.. De-
sprat R., ALechali AL. Genome-scale analysis of metazoan
replication origins reveals their organization in specific
but flexible sites defined by conserved features // Genome
Res. 2011. Vol. 21. P. 1438—1449.
Chagin J’. O., StearJ. H., Cardoso AL. C. Organization of DNA
replication // Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2010.
Vol. 2. P. a000737.
ChenC.L., RappaillesA., DuquenneL., HuvetAL, Guilba-
udG., Farinelli L., Audit B., dAubenton-Carafa Y., Arne-
odoA.. HyrienO., Thermes C. Impact of replication ti-
ming on поп-CpG and CpG substitution rates in mam-
malian genomes// Genome Res. 2010. Vol. 20. P. 447—
457.
Cimbora D. AL., Schubeler D., ReikA., Hamilton J., Francas-
telC, Epner E. AL., Groudine AL. Long-distance control of
origin choice and replication timing in the human beta-
globin locus are independent of the locus control region //
Mol. Cell. Biol. 2000. Vol. 20. P. 5581—5591.
Conti C., SaccaB., Herrick J., LalouC, PommierY., Bensi-
monA. Replication fork velocities at adjacent replication
origins are coordinately modified during DNA replication
in human cells // Mol. Biol. Cell. 2007. Vol. 18. P. 3059—
3067.
Cortez D., Glick G., Elledge S. J. Minichromosome mainte-
nance proteins are direct targets of the ATM and ATR
checkpoint kinases // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2004.
Vol. 101. P. 10078—10083.
Costantini AL., Bernardi G. Replication timing, chromosomal
bands, and isochores // Ibid. 2008. Vol. 105. P. 3433—
3437.
Costas C, de la Paz Sanchez AL, Stroud H, Yu Y., Olive-
ros J. C, FengS., BenguriaA., Lopez-J’idriero L., ZhangX.,
Solano R, Jacobsen S. E., Gutierrez C. Genome-wide
mapping of Arabidopsis thaliana origins of DNA replica-
tion and their associated epigenetic marks // Nat. Struct.
Mol. Biol. 2011. Vol. 18. P. 395 400.
CourbetS., GayS„ AmoultN., JJ’ronkaG., AnglanaAL., Bri-
sonO., Debatisse AL. Replication fork movement sets
chromatin loop size and origin choice in mammalian
cells //Nature. 2008. Vol. 455. P. 557—560.
Crampton A., ChangF, Pappas D. L., Jr., Frisch R L., JJ’ein-
reichAL. An ARS element inhibits DNA replication
through a SIR2-dependent mechanism " Mol. Cell. 2008.
Vol. 30. P. 156—166.
Dai J., ChuangR. Г., Kelly T. J. DNA replication origins in the
Schizosaccharomyces pombe genome // Proc. Natl. Acad.
Sei. USA. 2005. Vol. 102. P. 337—342.
DealR. B., HenikoffJ. G., HenikqffS. Genome-wide kinetics of
nucleosome turnover determined bv metabolic labeling of
histones 11 Science. 2010. Vol. 328.P. 1161—1164.
Delgado S., Gomez AL, Bird A., Antequera F. Initiation of DNA
replication at CpG islands in mammalian chromosomes //
EMBO J. 1998. Vol. 17. P. 2426—2435.
DePamphilis AL. L. Replication origins in metazoan chromo-
somes: fact or fiction? // Bioessays. 1999. Vol. 21. P. 5—16.
DePamphilis AL. L. The 'ORC cycle': a novel pathway for regu-
lating eukaryotic DNA replication // Gene. 2003. Vol. 310.
P. 1—15.
Desprat R, Thierry-ALiegD., LaillerN., LajugieJ., Schild-
kraut C.. Thierry-ALiegJ.. Bouhassira E. E. Predictable
dynamic program of timing of DNA replication in human
cells // Genome Res. 2009. Vol. 19. P. 2288—2299.
Difflev J. F, Labib K. The chromosome replication cycle// J.
Cell Sei. 2002. Vol. 115. P. 869—872.
Diffley J. F, Stillman B. Similarity between the transcriptional
silencer binding proteins ABF1 and RAP1 // Science.
1989. Vol. 246. P. 1034—1038.
DijkwelP. A., J’aughn J. P., Hamlin J. L. Replication initiation
sites are distributed widely in the amplified CHO dihydro-
folate reductase domain // Nucleic Acids Res. 1994.
Vol. 22. P. 4989 4996.
Dimitrova D. S., Gilbert D. AL. The spatial position and replica-
tion timing of chromosomal domains are both established
in early G1 phase // Mol. Cell. 1999. Vol. 4. P. 983—993.
Dimitrova D. S., Gilbert D. AL. Temporally coordinated assem-
bly and disassembly of replication factories in the absence
of DNA synthesis /7 Nat. Cell Biol. 2000. Vol. 2. P. 686—
694.
138 ЭПИГЕНЕТИКА
Doksani 1.. Bemiejo R., Fiorani S.. Haber J. E.. FoianiAL Rep-
licon dynamics, dormant origin firing, and terminal fork
integrity after double-strand break formation // Cell. 2009.
Vol. 137. P. 247—258.
Donaldson A. D., Fangman ГГ. I.., Brewer B. J. Cdc7 is required
throughout the yeast S phase to activate replication ori-
gins // Genes Dev. 1998. Vol. 12. P. 491 501.
Donaldson A. D.. Raghuraman AL K, Friedman K. L.. Cross F.R,
Brewer B. J., Fangman H~. L. CLB5-dependent activation of
late replication origins in S. cerevisiae " Mol. Cell. 1998.
Vol. 2. P. 173—182.
DomE. S., Cook J. G. Nucleosomes in the neighborhood: new
roles for chromatin modifications in replication origin
control 1 Epigenetics. 201 I. Vol. 6. P. 552—559.
Drouin R, Holmquist G. P., Richer C. L. High-resolution repli-
cation bands compared with morphologic G- and R-ban-
ds //Adv. Hum. Genet. 1994. Vol. 22. P. 47—115.
Earnshaw ГГ. C, Heck Al. AL Localization of topoisomerase II
in mitotic chromosomes // J. Cell Biol. 1985. Vol. 100.
P. 1716—1725.
Eaton Al L., Prinz J. A., AlacAlpine H. K, Tretyakov G., Khar-
chenko P. Г, AlacAlpine D. Al Chromatin signatures of
the Drosophila replication program " Genome Res. 2011.
Vol. 21. P. 164—174.
Edwards Al. C, Tutter А. Г., CveticC, GilbertC. H, Prokho-
rova T. A.. H’alterJ.C. MCM2-7 complexes bind chro-
matin in a distributed pattern surrounding the origin recog-
nition complex in Xenopus egg extracts // J. Biol. Chem.
2002. Vol. 277. P. 33049—33057.
Egli D., RosainsJ., BirkhoffG., Eggan K. Developmental re-
programming after chromosome transfer into mitotic
mouse zygotes // Nature. 2007. Vol. 447. P. 679—685.
Eivazova E. R, Gavrilov A., Pirozhkova I., Petrov A., laro-
vctiaO.V., Razin S.V., Lipinski Al, Fosse tzky Y. S. In-
teraction in vivo between the two matrix attachment re-
gions flanking a single chromatin loop // J. Mol. Biol.
2009. Vol. 386. P. 929—937.
Ermakova О. E, Nguyen L. H, Little R D., Chevillard C, Rib-
let R, Ashouian N, Birshtein В. K., Schildkraut C. L. Evi-
dence that a single replication fork proceeds from early to
late replicating domains in the IgH locus in a non-B cell
line // Mol. Cell. 1999. Vol. 3. P. 321—330.
Farkash-Amar S., Lipson D., PoltenA., Goren A., Helmstet-
terC. YakhiniZ.. Simon I. Global organization of rep-
lication time zones of the mouse genome // Genome Res.
2008. Vol. 18. P. 1562—1570.
Field Y., Kaplan N., Fondufe-AlitiendorfY., AlooreL.K, Sha-
ron E., LublingY., ITidomJ., Segal E. Distinct modes of
regulation by chromatin encoded through nucleosome po-
sitioning signals // PLoS Comput. Biol. 2008. Vol. 4.
P. 61000216.
Gather O., Bocquet S., Peiffer!., Brochard V., Arnaud P.,
PuyA., JouneauA., Fed R, Renard J.P., AlechaliAl.
Synergic reprogramming of mammalian cells by combined
exposure to mitotic Xenopus egg extracts and transcription
factors'/ Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2011. Vol. 108.
P. 17331— 17336.
Gay S., Packages A. AL, AlillotG.A., CourbetS., LetessierA.,
Debatisse Al., Brison O. Nucleotide supply, not local his-
tone acetylation, sets replication origin usage in trans-
cribed regions // EMBO Rep. 2010. Vol. 11. P. 698—704.
GeX. Q., Blow J. J. Chkl inhibits replication factory activation
but allows dormant origin firing in existing factories // J.
Cell Biol. 2010. Vol. 191. P. 1285—1297.
GeX. Q., Jackson D. A., Blow J. J. Dormant origins licensed by
excess Mcm2-7 are required for human cells to survive rep-
licative stress // Genes Dev. 2007. Vol. 21. P. 3331—3341.
Ghosh AL, Kemp AL, LiuG., RitziAL, Schepers A., LeffakAL
Differential binding of replication proteins across the hu-
man c-myc replicator// Mol. Cell Biol. 2006. Vol. 26.
P. 5270—5283.
Gilbert D. AL Nuclear position leaves its mark on replication
timing // J. Cell Biol. 2001. Vol. 152. P. Ell—F15.
Gilbert D. AL Evaluating genome-scale approaches to eukary-
otic DNA replication// Nat. Rev. Genet. 2010. Vol. 11.
P. 673- 684.
Gilbert D. AL, Takebayashi S. I., RybaT.. Lu J.. PopeB.D..
H’ilson K. A., HirataniL. Space and time in the nucleus:
developmental control of replication timing and chromo-
some architecture // Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol.
2010. Vol. 75. P. 143—153.
Gillespie P. J., Blow J. J. Clusters, factories and domains: The
complex structure of S-phase comes into focus '/ Cell Cy-
cle. 2010. Vol. 9. P. 3218—3226.
GorenA., TabibA., HechtAL, CedarH. DNA replication tim-
ing of the human beta-globin domain is controlled by his-
tone modification at the origin" Genes Dev. 2008.
Vol. 22. P. 1319—1324.
Guan Z., Hughes C. AL, KosiyatrakulS., NorioP., Sen R, Fier-
ingS., Allis C. D., Bouhassira E. E., Schildkraut C. L. De-
creased replication origin activity in temporal transition
regions // J. Cell Biol. 2009. Vol. 187. P. 623—635.
Guilbaud G., Rappailles A., Baker A., Chen C. L., ArneodoA.,
GoldarA., d'Aubenton-Carafa Y., ThermesC, AuditB.,
Hyrien O. Evidence for sequential and increasing activa-
tion of replication origins along replication timing gra-
dients in the human genome // PLoS Comput. Biol. 2011.
Vol. 7. P. 61002322.
Hamlin J. L., AlesnerL.D., LarO., Torres R, Chodaparam-
bilS. E, HangL. A revisionist replicon model for higher
eukaryotic genomes // J. Cell Biochem. 2008. Vol. 105.
P. 32 i—329.
Hamlin J. L., AlesnerL.D., DijkwelP.A. A winding road to
origin discoven'// Chromosome Res. 2010. Vol. 18.
P. 45—61.
Hansen RS., Thomas S., Sandstrom R, Canfield T. K, Thur-
man R E., H eaver AL, DorschnerAL O., GartlerS.AL,
Stamatoyannopoulos J. .1. Sequencing newly replicated
DNA reveals widespread plasticity in human replication
timing // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2010. Vol. 107.
P. 139—144.
Hayashi AL, KatouY., ItohT., Tazttmi A., Yamada Y., Takaha-
shi T. Nakagawa T, Shirahige K. Alasukata H. Genome-
wide localization of pre-RC sites and identification of rep-
lication origins in fission yeast // EMBO J. 2007. Vol. 26.
P. 1327—1339.
Hayashi AL T, Takahashi T. S., Nakagawa T, Nakayama J.,
Alasukata H. The heterochromatin protein Swi6'lIP I acti-
vates replication origins at the pericentromeric region and
silent mating-type locus// Nat. Cell Biol. 2009. Vol. 11.
P. 357—362.
Heichinger C„ Penkett C. J., Balder J., Nurse P. Genome-wide
characterization of fission yeast DNA replication origins /7
EMBO J. 2006. Vol. 25. P.’ 5171— 5179.
Hendricks S. P., Alathews С. K. Differential effects of hydroxy-
urea upon dcoxyribonucleoside triphosphate pools, ana-
lyzed with vaccinia virus ribonucleotide reductase '/ J.
Biol. Chem. 1998. Vol. 273. P. 29519 29523.
Herrick J. The dynamic replicon: adapting to a changing cellu-
lar environment " Bioessays. 2010. Vol. 32. P. 153—164.
Herrick J. Genetic variation and DNA replication timing, or
why is there late replicating DNA? // Evolution. 2011.
Vol. 65. P. 3031—3047.
Herrick J., BensimonA. Global regulation of genome duplica-
tion in eukaryotes: an overview from the epifluorescence
microscope /7 Chromosoma. 2008. Vol. 117. P. 243—260.
HeunP., Laroche T, Raghuraman AL K, Gasser S. AL The
positioning and dynamics of origins of replication in the
ГЛАВА 5 139
budding yeast nucleus// J. Cell Biol. 2001. Vol. 152.
P. 385—400.
Hiratani L., GilbertD. AL Replication timing as an epigenetic
mark // Epigenetics. 2009. Vol. 4. P. 93—97.
Hiratani 1., RybaT., LtohAL, YokochiT., Schwaiger AL,
Chang C. JJ’., LyouY., Townes T. AL., Schuheler D., Gil-
bert D. AL. Global reorganization of replication domains
during embryonic stem cell differentiation // PLoS Biol.
2008. Vol. 6. P. e245.
Hiratanil„ Takebayashi S., Lu J., Gilbert D. AL. Replication
timing and transcriptional control: beyond cause and ef-
fect-part II // Curr. Opin. Genet. Dev. 2009. Vol. 19.
P. 142—149.
Hiratani I., RybaT., LtohAL, RathjenJ., Kulik AL, PappB.,
Fussner E., Bazett-JonesD. P., Plath K., Dalton S., Rath-
jenP.D., Gilbert D. AL. Genome-wide dynamics of repli-
cation timing revealed by in vitro models of mouse em-
bryogenesis // Genome Res. 2010. Vol. 20. P. 155—169.
Holmquist G. P. Chromosome bands, their chromatin flavors,
and their functional features // Am. J. Hum. Genet. 1992.
Vol. 51. P. 17—37.
Ibarra A., Schwob E., ALendezJ. Excess MCM proteins protect
human cells from replicative stress by licensing backup
origins of replication// Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2008.
Vol. 105. P. 8956—8961.
LizukaAL, Takahashi Y. ALizzenC.A., CookRG., Fujita AL,
Allis C. D., Frierson H. F, Jr., Fukusato T, Smith AL. AL.
Histone acetyltransferase Hbol: catalytic activity', cellular
abundance, and links to primary cancers // Gene. 2009.
Vol. 436. P. 108—114.
Lives L., Petojevic T, PesaventoJ. J., BotchanAL.R. Activation
of the MCM2—7 helicase by association with Cdc45
and GINS proteins // Mol. Cell. 2010. Vol. 37. P. 247—
258.
Jackson D. .1.. PomboA. Replicon clusters are stable units of
chromosome structure: evidence that nuclear organization
contributes to the efficient activation and propagation of S
phase in human cells // J. Cell Biol. 1998. Vol. 140.
P. 1285—1295.
Jackson L. P., ReedS. I., Haase S. B. Distinct mechanisms con-
trol the stability' of the related S-phase cyclins Clb5 and
Clb6 11 Mol. Cell. Biol. 2006. Vol. 26. P. 2456—2466.
Jeon 1., BekiranovS., KamaniN., KapranovP., Ghosh S.,
ALacAlpine D.. Lee C., HwangD. S., GingerasT.R. Dut-
taA. Temporal profile of replication of human chro-
mosomes // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2005. Vol. 102.
P. 6419—6424.
Jorgensen H. F, Azuara J’., AmoilsS., Spivakov AL, Terry A.,
Nesterova T, CobbB.S., RamsahoyeB., ALerkenschla-
gerAL., Fisher A. G. The impact of chromatin modifiers on
the timing of locus replication in mouse embryonic stem
cells // Genome Biol. 2007. Vol. 8. P. R169.
Kamani N., Taylor C. AL, ALalhotra A., DuttaA. Genomic study'
of replication initiation in human chromosomes reveals the
influence of transcription regulation and chromatin struc-
ture on origin selection// Mol. Biol. Cell. 2010. Vol. 21.
P. 393 404.
KatsimoY., Suzuki A., Sugimura K, Okumura K, Zinelde-
en D. H, ShimadaAL, Niida H, ALizunoT., Hanaoka E,
NakanishiAL. Cyclin A-Cdk] regulates the origin firing
program in mammalian cells // Proc. Natl. Acad. Sei.
USA. 2009. Vol. 106. P. 3184—3189.
KeremB.S., Goitein R, Diamond G., Cedar H, ALarcusAL.
Mapping of DNAase I sensitive regions on mitotic chro-
mosomes // Cell. 1984. Vol. 38. P. 493 499.
KitsbergD., SeligS., BrandeisAL, Simon L., KeshetL., Dris-
coll D. J., NichollsR. D.. Cedar H. Allele-specific replica-
tion timing of imprinted gene regions// Nature. 1993.
Vol. 364. P. 459 463.
Kohzaki H. ALurakami Y. Transcription factors and DNA repli-
cation origin selection // Bioessays. 2005. Vol. 27.
P. 1107—1116.
Krasinska L., BesnardE., CotE., DohetC, ALechali AL, Lemai-
treJ.AL, Fisher D. Cdkl and Cdk2 activity' levels deter-
mine the efficiency of replication origin firing in
Xenopus // EMBO J. 2008. Vol. 27. P. 758 769.
Lande-Diner L., Zhang J.. Cedar H. Shifts in replication timing
actively affect histone acetylation during nucleosome reas-
sembly // Mol. Cell. 2009. Vol. 34. P. 767—774.
Lebofsky R, HeiligR, SonnleitnerAL, Weissenbach J., Bensi-
monA. DNA replication origin interference increases the
spacing between initiation events in human cells // Mol.
Biol. Cell. 2006. Vol. 17. P. 5337—5345.
Lee JJ’., TilloD., BrayN, A torse R. H, Davis R. JJ’., Hug-
hes T. R., Nislow C. A high-resolution atlas of nucleosome
occupancy in veast // Nat. Genet. 2007. Vol. 39. P. 1235—
1244.
Lemaitre J. AL, DanisE„ PaseroP., J’assetzky Y„ ALechaliAL.
Mitotic remodeling of the replicon and chromosome struc-
ture '/ Cell. 2005. Vol. 123. P. 787—801.
Lieberman-Aiden E., van Berkum N. L., Williams L., Lma-
kaevAL, RagoczyT., Telling A., AmitL., Lajoie B. R, Sa-
boP.J., DorschnerAL O., SandstromR, BernsteinB.,
Bender AL. A., GroudineAL, Gnirke A., Stamatoyannopou-
losJ., ALimyL. .1.. Lander E. S, Dekker J. Comprehensive
mapping of long-range interactions reveals folding princi-
ples of the human genome // Science. 2009. Vol. 326.
P. 289—293.
Lipford J. R., Bell S. P. Nucleosomes positioned by' ORC facili-
tate the initiation of DNA replication// Mol. Cell. 2001.
Vol. 7. P. 21—30.
LuJ., LiF, Alurphy C. S., DavidsonAL. JJ’., GilbertD. AL. G2
phase chromatin lacks determinants of replication timing 11
J. Cell Biol. 2010. Vol. 189. P. 967—980.
LuL., Zhang! I., Tower J. Functionally distinct, sequence-spe-
cific replicator and origin elements are required for Droso-
phila chorion gene amplification// Genes Dev. 2001.
Vol. 15. P. 134—146.
ALacAlpine D. AL, Rodriguez H. K, BellS. P. Coordination of
replication and transcription along a Drosophila chromo-
some // Genes Dev. 2004. Vol. 18. P. 3094—3105.
ALacAlpine H. K, Gordan R, Powell S. K, HarteminkA. J.,
ALacAlpine D. AL. Drosophila ORC localizes to open chro-
matin and marks sites of cohesin complex loading // Ge-
nome Res. 2010. Vol. 20. P. 201—211.
ALachida Y. J., Hamlin J. L., DuttaA. Right place, right time,
and only once: replication initiation in metazoans // Cell.
2005. Vol. 123. P. 13—24.
ALarheineke K, Hyrien O. Aphidicolin triggers a block to repli-
cation origin firing in Xenopus egg extracts // J. Biol.
Chem. 2001. Vol. 276. P. 17092—17100.
ALarheineke K, Hyrien О. Control of replication origin density
and firing time in Xenopus egg extracts: role of a caffeine-
sensitive, ATR-dependent checkpoint " J. Biol. Chem.
2004. Vol. 279. P. 28071—28081.
ALaya-ALendoza A., Olivares-Chauvet P., Shaw A., Jackson D. A.
S phase progression in human cells is dictated by' the ge-
netic continuity' of DNA foci // PLoS Genet. 2010. Vol. 6.
P. C1000900. ’
ALaya-ALendoza A., PetermawiE., Gillespie D. A., Calde-
cott К. 1Г,, Jackson D. .1. Chkl regulates the density' of ac-
tive replication origins during the vertebrate S phase /7
EMBO J. 2007. Vol. 26. P. 2719—2731.
ALcCuneHJ., Danielson L. S., AlvinoG.AL, Collingwood D.,
Delrow J. J., Fangman JJ. L., Brewer B. J., Raghura-
manAL. K. The temporal program of chromosome replica-
tion: genomewide replication in elb5 {Delta} Saccharomy-
ces cerevisiae // Genetics. 2008. Vol. 180. P. 1833—1847.
140 ЭПИГЕНЕТИКА
Mechidi AL Eukaryotic DNA replication origins: many choices
for appropriate answers // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2010.
Vol. 11. P. 728—738.
ALesner L. D., Ealsahmiar V., Karnani N, Dutra A., Ham-
lin J. L., Bekiranov S. Bubble-chip analysis of human ori-
gin distributions demonstrates on a genomic scale signifi-
cant clustering into zones and significant association with
transcription // Genome Res. 2011. Vol. 21. P. 377—389.
ALiaoH, Seiler J. A., Burhans IE C. Regulation of cellular and
SV40 virus origins of replication by Chkl—dependent in-
trinsic and UVC radiation-induced checkpoints // J. Biol.
Chem. 2003. Vol. 278. P. 4295 4304.
MiottoB., Struhl К. HBO1 histone acetylase is a coactivator of
the replication licensing factor Cdtl // Genes Dev. 2008.
Vol. 22. P. 2633—2638.
Nakanishi AL, Katsuno Y., Niida H, ALurakami H, Shimada AL.
Chkl—cyclin A/Cdkl axis regulates origin firing pro-
grams in mammals // Chromosome Res. 2010. Vol. 18.
P. 103—113.
Naniyania H, Shimada AL, Niida H., Zineldeen D. H., Hashi-
moto E, Kohri K., Nakanishi AL. Essential role of Chkl in
S phase progression through regulation of RNR2 expres-
sion // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2008. Vol. 374.
P. 79—83.
Norio P. DNA replication: the unbearable lightness of origins //
EMBO Rep. 2006. Vol. 7. P. 779—781.
NorioP., Kosiyatrakul S., YangQ., Guan Z., Brown N. AL.,
Thomas S., RibletR., Schildkraut C. L. Progressive activa-
tion of DNA replication initiation in large domains of the
immunoglobulin heavy chain locus during В cell devel-
opment // Mol. Cell. 2005. Vol. 20. P. 575—587.
PakD. T, PfhmimAL., Chesnokov I., HuangD. JJ’., KellumR.,
ALarrJ., Romanowski P., Botchan AL. R. Association of the
origin recognition complex with heterochromatin and HP1
in higher eukaryotes // Cell. 1997. Vol. 91. P. 311 -323.
PaseroP., BensimonA., Schwob E. Single-molecule analysis
reveals clustering and epigenetic regulation of replication
origins at the yeast rDNA locus // Genes Dev. 2002.
Vol. 16. P. 2479—2484.
PatelP. K., ArcangioliB., BakerS. P., BensimonA., RhindN.
DNA replication origins fire stochastically in fission
yeast 11 Mol. Biol. Cell. 2006. Vol. 17. P. 308^316.
Patel P. K, Kommajosyula N., Rosebrock A., BensimonA.,
Leatherwood J.. Bechhoefer J., RhindN. The Hskl(Cdc7)
replication kinase regulates origin efficiency // Ibid. 2008.
Vol. 19. P. 5550—5558.
Paulsen RD., Cimprich K. A. The ATR pathway: fine-tuning
the fork // DNA Repair (Amst). 2007. Vol. 6. P. 953—
966.
PemovA., BavykinS., Hamlin J. L. Attachment to the nuclear
matrix mediates specific alterations in chromatin struc-
ture// Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1998. Vol. 95.
P. 14757—14762.
Petermann E., Caldecott K. JJ’. Evidence that the ATR Chkl
pathway maintains normal replication fork progression
during unperturbed S phase H Cell Cycle. 2006. Vol. 5.
P. 2203—2209.
Petermann E., A laya-A Lendoza A., ZachosG., Gillespie D. A.,
Jackson D. A., Caldecott K. JJ’. Chkl requirement for high
global rates of replication fork progression during normal
vertebrate S phase // Mol. Cell. Biol. 2006. Vol. 26.
P. 3319—3326.
Pope B. D., Hiratani L., GilbertD. AL. Domain-wide regulation
of DNA replication timing during mammalian develop-
ment H Chromosome Res. 2010. Vol. 18. P. 127—136.
Pryde F., JainD., Kerr A., Curley R, ALariotti F. R, J’oge-
lauerAL. H3 k36 methylation helps determine the timing
of cdc45 association with replication origins // PloS One.
2009. Vol. 4. P. e5882.
Raghuraman AL. K. Brewer B. J., Fangman JJ. L. Cell cycle-
dependent establishment of a late replication program //
Science. 1997. Vol. 276. P. 806—809.
Raghuraman AL K, JJ'inzeler E. A., CollingwoodD., HuntS.,
JJ’odickaL., Conway A., Lockhart D. J., Davis R. IE,
Brewer B. J., Fangman JJ’. L. Replication dynamics of the
yeast genome // Science. 2001. Vol. 294. P. 115- 121.
RemusD.. BeallE. L.. Botchan AL. R. DNA topology', not DNA
sequence, is a critical determinant for Drosophila ORC-
DNA binding ' EMBO J. 2004. Vol. 23. P. 897—907.
RhindN., YangS. C, Bechhoefer J. Reconciling stochastic ori-
gin firing with defined replication timing // Chromosome
Res. 2010. Vol. 18. P. 35 43.
Romanowski P., ALarrJ., ALadine AL A., RowlesA., BlowJ.J.,
Gautier J., Laskey R. A. Interaction of Xenopus Cdc2 x
cyclin Al with the origin recognition complex // J. Biol.
Chem. 2000. Vol. 275. P. 4239 4243.
Rosenbloom K. R, Dreszer T. R, Pheasant AL, Barber G. P.,
ALeyerL. R, Pohl A., Raney B. J., JJ’angT., Hinrichs A. S.,
Zweig A. S., Fujita P. A., Learned K, RheadB., Smith К. E.,
KuhnR AL, KarolchikD., HausslerD., Kent JJ’. J. ENCODE
whole-genome data in the UCSC Genome Browser // Nu-
cleic Acids Res. 2010. Vol. 38. P. D620—625.
RoyS., ErnstJ., KharchenkoP. J'., KheradpourP., NegreN.,
Eaton ALL., Landolin J. AL, Bristow C. A., ALaL.,
Lin AL F., JJ’ashietl S.. ArshinoffB. I., AyF. ALeyer P. E..
Robine N., Washington N. L., Di Stefano L, Berezikov E.,
Brown CD., CandeiasR, Carlson J. JJ’., Carr A., Jun-
greisL., ALarbach D., SealfonR, TolstorukovAL. Г.,
1ГШ5., Alekseyenko A. A., Artieri C., Booth B. JJ’., Bro-
oks A. N., Dai Q., Davis C. A., Duff AL. O., FengX., Gorc-
hakov A. A., GuT., HenikoffJ. G., KapranovP., LiR,
MacAlpine H. K, ALaloneJ., ALinodaA., NordmanJ.,
Okamura K, Perry AL, Powell S. K, Riddle N. C, Sa-
kai A., Samsonova A.. Sandler J. E.. Schwartz Y. B..
SherN., SpokonyR, Sturgill D., van Baren AL, WanKH,
YangL., YuC., FeingoldE., GoodP., Guyer AL, Low-
don R, AhmadK, Andrews J., Berger B., Brenner S. E.,
Brent AL. R, CherbasL., Elgin S. C, GingerasT.R,
Grossman R, Hoskins R A., Kaufman T. C, Kent JJ’., Ku-
roda ALL, Orr-JJ'eaver T, PerrintonN., PirrottaJ’.,
Posakony J. IE, RenB., RussellS., CherbasP., Grav-
eley B. R, Lewis S., ALicklemG., Oliver B., ParkP. J.,
CelnikerS.E.. HenikoffS., Karpen G. H, LaiE.C..
ALacAlpine D. AL., Stein L. D., JHiite К. P., Kellis AL. Iden-
tification of functional elements and regulatory circuits by
Drosophila modENCODE // Science. 2010. Vol. 330.
P. 1787—1797.
RybaT., Hiratani L, Lu J., LtohAL, Kulik AL, Zhang J.,
Schulz T. C, Robins A. J., Dalton S., Gilbert D. AL. Evolu-
tionarily conserved replication timing profiles predict long-
range chromatin interactions and distinguish closely related
cell types 11 Genome Res. 2010. Vol. 20. P. 761—770.
Ryba T, Hiratani L., Sasaki T., Battaglia D., Kulik AL, Zhang J.,
Dalton S, GilbertD. AL. Replication timing: a fingerprint
for cell identity and pluripotency // PLoS Comput. Biol.
2011. Vol. 7. P. 61002225.
Sadoni N, Cardoso Al. C, Stelzer E. H, Leonhardt H, ZinkD.
Stable chromosomal units determine the spatial and tem-
poral organization of DNA replication // J. Cell Sei. 2004.
Vol. 1 17. P. 5353—5365.
Santocanale C., DiffleyJ.F. A Mecl- and Rad53-dependent
checkpoint controls late-firing origins of DNA replica-
tion. Nature. 1998. Vol. 395. P. 615—618.
Schubeler D., Francastel C., CimboraD.AL, ReikA., ALar-
tinD.l., GroudineAL. Nuclear localization and histone
acetylation: a pathway for chromatin opening and tran-
scriptional activation of the human beta-globin locus //
Genes Dev. 2000. Vol. 14. P. 940—950.
ГЛАВА 5 141
Schubeler D.. Scalzo D., KooperbergC., van Steeiisel B.. Del-
row J., Groudine AL. Genome-wide DNA replication pro-
file for Drosophila melanogaster. a link between tran-
scription and replication timing // Nat. Genet. 2002.
Vol. 32. P. 438 442.
Schwaiger AL, Kohler H., Oakeley E. J., Stadler AL B., Sclni-
belerD. Heterochromatin protein 1 (HP1) modulates rep-
lication timing of the Drosophila genome // Genome Res.
2010. Vol. 20. P. 771—780.
Schwaiger M, Stadler M B., Bell O., Kohler H, Oakeley E. J.,
Schubeler D. Chromatin state marks cell-type- and gender-
specific replication of the Drosophila genome // Genes
Dev. 2009. Vol. 23. P. 589—601.
Sclafani R. A., Holzen T. AL Cell cycle regulation of DNA repli-
cation // Annu. Rev. Genet. 2007. Vol. 41. P. 237—280.
Sequeira-Mendes J., Diaz-Uriarte R, Apedaile A., Huntley D.,
BrockdorffN.. GoruezAI. Transcription initiation activity
sets replication origin efficiency in mammalian cells //
PLoS Genet. 2009. Vol. 5. P. C1000446.
Shechter D., Costanzo Г., Gautier J. ATR and ATM regulate
the timing of DNA replication origin firing // Nat. Cell
Biol. 2004. Vol. 6. P. 648—655.
Shechter D., Gautier J. ATM and ATR check in on origins: a
dynamic model for origin selection and activation // Cell
Cycle. 2005. Vol. 4. P. 235—238.
SherN., Bell G. W., Li S., NordmanJ. EngT.. Eaton ALL..
ALacalpine D. AL., Orr-Weaver T. L. Developmental con-
trol of gene copy number by repression of replication ini-
tiation and fork progression // Genome Res. 2012. Vol. 22.
P. 64—75.
ShermoenA. ГГ., ALcClelandAL L., O'FarrellP. H. Develop-
mental control of late replication and S phase length //
Curr. Biol. 2010. Vol. 20. P. 2067—2077.
Shimada AL., Niida H., Zineldeen D. H., Tagami H., Tanaka AL,
Saito H., Nakanishi AL. Chkl is a histone H3 threonine 11
kinase that regulates DNA damage-induced transcriptional
repression // Cell. 2008. Vol. 132. P. 221—232.
Shirahige K, Hori Y., Shiraishi K, Yamashira AL., Takaha-
shi K, Obuse C., Tsurimoto T, Yoshikawa H. Regulation
of DNA-replieation origins during cell-cycle progression //
Nature. 1998. Vol. 395. P. 618—621.
Shufaro E, Lacham-Kaplan O., TzuberiB. Z., ALcLaughlin J.,
TrounsonA., Cedar H., ReubinoffB. E. Reprogramming
of DNA replication timing // Stem Cells. 2010. Vol. 28.
p. 443 449.
Simon L., TenzenT., ReubinoffB.E., Hillman D., ALcCar-
rey J. R., Cedar H. Asynchronous replication of imprinted
genes is established in the gametes and maintained during
development '/Nature. 1999. Vol. 401. P. 929—932.
Simpson R. T. Nucleosome positioning can affect the function
of a eis-aeting DNA element in vivo // Nature. 1990.
Vol. 343. P. 387—389.
Smith Z. E., Higgs D. R. The pattern of replication at a human
telomeric region (16pl3.3): its relationship to chromo-
some structure and gene expression " Hum. Mol. Genet.
1999. Vol. 8. P. 1373—1386.
Sorensen C. S., Syljuasen R G., Lukas J., BartekJ. ATR,
Claspin and the Rad9-Radl-Husl complex regulate Chkl
and Cde25A in the absence of DNA damage // Cell Cycle.
2004. Vol. 3. P. 941—945.
Sporbert A., Gahl A., Ankerhold R, Leonhardt H, Cardo-
so AL. C. DNA polymerase clamp shows little turnover at
established replication sites but sequential de novo as-
sembly at adjacent origin clusters // Mol. Cell. 2002.
Vol. 10. P. 1355—1365.
Strehl S., LaSalle J. AL., Lalande AL. High-resolution analysis of
DNA replication domain organization across an R/G-band
boundary // Mol. Cell. Biol. 1997. Vol. 17. P. 6157—
6166.
Syljuasen R G., Sorensen C. S., Hansen L.T., FuggerK.
Lundin C., JohanssonF., HelledayT., SehestedAL, Lu-
kas J., BartekJ. Inhibition of human Chkl causes in-
creased initiation of DNA replication, phosphorylation of
ATR targets, and DNA breakage // Mol. Cell. Biol. 2005.
Vol. 25. P. 3553—3562.
Tatsumi E, Ohta S., Kimura H, Tsurimoto T, Obuse C. The
ORC1 cycle in human cells: I. cell cycle-regulated oscilla-
tion of human ORC1// J. Biol. Chem. 2003. Vol. 278.
P. 41528 41534.
TenzenT., YamagataT., FukagawaT., Sugaya K, Ando A.,
LnokoH., GojoboriT., Fujiyama A., Okumura K, Lke-
mura T. Precise switching of DNA replication timing in
the GC content transition area in the human major histo-
compatibility complex 7 Mol. Cell. Biol. 1997. Vol. 17.
p. 4043 4050.
VrnovF.D.. Liang C.. BlitzblauH. G., Smith H. S.. Gerbi S. A.
A DNase I hypersensitive site flanks an origin of DNA
replication and amplification in Seiara // Chromosoma.
2002. Vol. lll.P. 291—303.
VasheeS., CveticC., LtiW, SimancekP., Kelly T. J., Wal-
ter J. C. Sequence-independent DNA binding and replica-
tion initiation by the human origin recognition complex //
Genes Dev. 2003. Vol. 17. P. 1894—1908.
VogelauerAL, RubbiL., LucasL, Brewer B. J., GrunsteinAL.
Histone acetylation regulates the time of replication origin
firing 11 Mol’ Cell. 2002. Vol. 10. P. 1223—1233.
Watanabe Y„ TenzenT., NagasakaY., LnokoH., LkemuraT.
Replication timing of the human X-inaetivation center
(XIC) region: correlation with chromosome bands // Gene.
2000. Vol. 252. P. 163—172.
Weber С. C., Pink C. J., HurstLD. Late replicating domains
have higher divergence and diversity in Drosophila
melanogaster // Mol. Biol. Evol. 2012. Vol. 29. P. 873—
882.
Weinreich AL, Palacios DeBeer AL. A., FoxC.A. The activities
of eukaryotic replication origins in chromatin " Biochim.
Biophys.’Acta. 2004. Vol. 1677. P. 142—157.
Whitcomb E. A., Taylor A. Ubiquitin control of S phase: a new
role for the ubiquitin conjugating enzyme, UbeH7 // Cell
Div. 2009. Vol. 4. P. 17.
Willis N., RhindN. Regulation of DNA replication by the S-
phase DNA damage checkpoint // Cell Div. 2009. Vol. 4.
P. 13.
WongP. G., Winter S. L., Zaika E., CaoT.V., OguzU.,
KoomenJ.AL, Hamlin J. L., Alexandrow AL G. Cde45
limits replicon usage from a low density of preRCs in
mammalian cells 11 PLoS One. 2011. Vol. 6. P. e!7533.
Woodfine K, Beare D. AL, Lchimura K, Debernardi S., ALun-
gallA.J., Fiegler H, Collins V.P., Carter N. P., Dun-
ham L. Replication timing of human chromosome 6 // Cell
Cycle. 2005. Vol. 4. P. 172—176.
Woodfine K, Fiegler H, Beare D. AL, CollinsJ.E., ALcCaim О. T,
YoungB.D., Debernardi S., ALottR, Dunham L, Car-
ter N. P. Replication timing of the human genome // Hum.
Mol. Genet. 2004. Vol. 13. P. 191—202.
Woodward A. AL, GohlerT., Luciani AL. G., OehlmannAL,
GeX., Gartner A., Jackson D. A., Blow J. J. Excess
Mem2-7 license dormant origins of replication that can be
used under conditions of replicative stress // J. Cell Biol.
2006. Vol. 173. P. 673—683.
WuJ.R, Gilbert D. AL. A distinct G1 step required to specify
the Chinese hamster DHFR replication origin H Science.
1996. Vol. 271. P. 1270—1272.
Wu P. E, Xurse P. Establishing the program of origin firing
during S phase in fission Yeast'/ Cell. 2009. Vol. 136.
P. 852—864.
WuR, Singh P. B., Gilbert D. AL. Uncoupling global and fine-
tuning replication timing determinants for mouse perieen-
142 ЭПИГЕНЕТИКА
trie heterochromatin/7 J. Cell Biol. 2006. Vol. 174.
P. 185—194.
irtiarmJ., BtickV., Nurse P., Millar J. B. Stable association of
mitotic cyclin B/Cdc2 to replication origins prevents endo-
reduplication // Cell. 2002. Vol. 111. P. 419—431.
YahukiN., Terashima H., Kitada K. Mapping of early firing
origins on a replication profile of budding yeast'' Genes
Cells. 2002. Vol. 7. P. 781—789.
YaffeE., Farkash-Amar S., Pollen A., Yakhini Z., TanayA.,
Simon 1. Comparative analysis of DNA replication timing
reveals conserved large-scale chromosomal architecture //
PLoS Genet. 2010. Vol. 6. P. elOOlOll.
Yamashita M, HoriY., ShinomiyaT., OhuseC., Tsurimoto T,
Yoshikawa H., Shirahige K. The efficiency and timing of
initiation of replication of multiple replicons of Saccharo-
myces cerevisiae chromosome VI /7 Genes Cells. 1997.
Vol. 2. P. 655—665.
Yompakdee C., Huberman J. A. Enforcement of late replication
origin firing by clusters of short G-rich DNA sequences //
J. Biol. Chem.’2004. Vol. 279. P. 42337—42344.
Zegerman P., DiffleyJ.F. DNA replication as a target of the
DNA damage checkpoint 11 DNA Repair. 2009. Vol. 8.
P. 1077—1088.
Zhang Y.ir, Jones T. L„ Martin S. E„ CaplenN.J., Pom-
mier Г. Implication of checkpoint kinase-dependent up-
regulation of ribonucleotide reductase R2 in DNA damage
response 11 J. Biol. Chem. 2009. Vol. 284. P. 18085—
18095.
ГЛАВА
6
ПРОСТРАНСТВЕННАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ЯДРА
КАК МЕХАНИЗМ ЭПИГЕНЕТИЧЕСКОЙ РЕГУЛЯЦИИ
СОДЕРЖАНИЕ
6.1. Пространственная организация
хромосом в ядре, 145
6.2. Роль гетерохроматина в образова-
нии пространственной структуры
ядра, 154
6.3. Пространственная организация
ядер клеток двукрылых насеко-
мых, 156
6.4. Молекулярно-генетическая органи-
зация районов прикрепления хро-
мосом к ядерной оболочке маля-
рийных комаров, 160
6.5. Молекулярно-цитогенетическая
характеристика прицентромерного
гетерохроматина у близкород-
ственных видов подгруппы
melanogaster рода Drosophila, 166
Список литературы, 175
144 ЭПИГЕНЕТИКА
Регуляция работы генетического аппарата
может осуществляться, по крайней мере, на трех
уровнях. Первый уровень регуляции известен
широко и довольно подробно изучен — это нук-
леотидная последовательность ДНК. Вторым
уровнем являются метилирование ДНК, пост-
трансляционные модификации гистонов и ре-
моделинг хроматина — эпигенетические метки,
напрямую не зависящие от нуклеотидной после-
довательности ДНК. Сочетание этих эпигенети-
ческих меток образует гистоновый код, который
записан «поверх» генетического кода на белках
хроматина. Таким образом, если совокупность
последовательности нуклеотидов всей ДНК од-
ного организма называют геномом, то совокуп-
ность всех эпигенетических меток можно на-
звать эпигеномом. Эпигенетический уровень ре-
гуляции в настоящее время интенсивно изучает-
ся [Jiang, Pugh, 2009]. Третьим уровнем регуля-
ции генетической экспрессии является трехмер-
ная организация хроматина в пространстве ин-
терфазного ядра. Пространство ядра подразде-
лено на зоны активного и неактивного хромати-
на — соответственно эухроматина и гетерохро-
матина [Misteli, 2007]. Положение хроматина в
тех или иных доменах определяет его возможно-
сти для экспрессии генов. Так, известно, что ге-
нетический материал, пространственно переме-
щенный в соседство с гетерохроматином, стано-
вится неактивным [Croft et al., 1999; Sexton et al.,
2009]. Механизмы регуляции функционирования
генома на уровне пространственной организации
ядра остаются нераскрытыми и представляют
собой одну из главных проблем современной
клеточной биологии [Cremer et al., 2006; Cremer,
Cremer, 2010].
Исследование пространственной организации
начало развиваться, когда стало ясно, что для
понимания функционирования генетического ап-
парата недостаточно знаний лишь о нуклеотид-
ной последовательности ДНК, которую дают
проекты по секвенированию геномов. Оказалось,
что до 99 % геномов многих организмов занима-
ет ДНК, которая не участвует в кодировании
белков. Поэтому’ возникает вопрос о роли неко-
дирующих последовательностей в выполнении
клеточных функций. Бытовавшее мнение о не-
кодирующей части генома как о мусорной, бал-
ластной ДНК в настоящее время теряет свои по-
зиции. Становится ясно, что эти последователь-
ности играют большую роль в надгенетических
уровнях регуляции работы генов. Можно выде-
лить, по крайней мере, два таких надгенетиче-
ских уровня:
1) посттрансляционные модификации гисто-
нов, ремоделинг хроматина и метилирование
ДНК [Schoenherr, Tilghman, 2000; Grewal, Elgin,
2002; Elgin, Grewal, 2003];
2) пространственная организация ДНК в ядре
[Cremer, Cremer, 2010].
Оба уровня в большей или меньшей степени
функционируют опосредованно — через после-
довательность ДНК и связаны с гетерохромати-
ном [Manuelidis, Borden, 1988; Haaf, Schmid,
1989]. Гетерохроматин образует области, репрес-
сирующие транскрипцию, и состоит, как прави-
ло, из повторенных последовательностей ДНК и
специфического набора посттрансляционных
модификаций гистонов и характерных белков
[Trojer, Reinberg, 2007]. Ген, линейно или про-
странственно перенесенный в соседство с гете-
рохроматином, становится транскрипционно не-
активным. Транскрипционно неактивное состоя-
ние хроматина поддерживается за счет модифи-
каций гистонов.
В ядерном пространстве хромосомы всегда
занимают дискретные области — хромосомные
территории [Zorn etal., 1979; Visser etal., 2000].
Занимая отдельную область в ядре, гетерохрома-
тические районы хромосом расположены у пе-
риферии ядра [Schneider, Grosschedl, 2007]. По-
казано также, что хромосомы с высокой плотно-
стью генов располагаются ближе к центру ядра,
а с низкой — у периферии [Croft etal., 1999;
Habermann etal.. 2001; Alexandrova etal.. 2003].
Таким образом, хромосомы в пространстве упо-
рядочены и расположены не случайно. Близость
гетерохроматина к ядерной оболочке свидетель-
ствует о существовании специфической связи
гетерохроматин—ядерная оболочка [Marshall,
2003]. За контакт ДНК с ядерными структурами
в геноме эукариот отвечают специфические по-
следовательности ДНК — SAR/MAR [Wang et al..
2010]. С этими последовательностями непосред-
ственно или через специальные белки контакти-
руют белки ядерной ламины и прочие ламинас-
социированные белки [Hakes, Berezney, 1991;
Gruenbaum et al., 2000; Goldman et al., 2002; Bur-
ke, Ellenberg, 2002; Mattout-Drubezki, Gruenbaum,
2003]. Повторы ДНК, модифицированные гисто-
ны, как и ассоциированные с ними специфичес-
кие белки, характерные для гетерохроматина,
могут также взаимодействовать с ядерной обо-
лочкой [Wagner etal., 2004; Guarda etal., 2009].
Однако очень немного работ посвящено тонким
механизмам взаимодействия ДНК и хроматина
со скелетными структурами ядерного матрикса
[Wang et al., 2010].
ГЛАВА 6 145
Пространственная организация ядра различа-
ется в клетках зародышевого пути и дифферен-
цированных клетках [Marshall, 2003]. Таким об-
разом, процесс дифференцировки связан с реор-
ганизацией хромосомомембранных отношений.
Подробно это явление не изучено и не ясно, яв-
ляется ли сама дифференцировка причиной транс-
формации внутриядерной архитектуры или из-
менение ядерной архитектуры определяет спе-
циализацию клетки.
Существует чрезвычайно мало данных об осо-
бенностях пространственной организации клеток
с политенными хромосомами. Клетки, в которых
формируются такие хромосомы, можно исполь-
зовать как удобную модель интерфазного ядра и
экстраполировать результаты на клетки с дипло-
идным набором хромосом. В работе Хохштрас-
сера и Седата [Hochstrasser, Sedat, 1987] прове-
ден подробный анализ различий архитектуры
ядер с политенными хромосомами из четырех
тканей Drosophila. Данный анализ показал, что
архитектура хромосом довольно стабильна в
клетках одной ткани и реорганизуется при изме-
нении транскрипционного паттерна. Эти данные
согласуются с концепцией хромосомных терри-
торий. Однако тонких механизмов формирова-
ния пространственной организации политенных
хромосом не выявлено, так как эти работы были
выполнены с использованием рутинной световой
и электронной микроскопии и без применения
современных молекулярно-цитогенетических под-
ходов. Анализ литературных источников позво-
ляет выделить проблемы пространственной ор-
ганизации ядра, требующие разрешения в на-
стоящее время:
1) ультратонкая организация хромосомных
территорий;
2) архитектура ядер с политенными хромосо-
мами;
3) различия в линейной и пространственной
организации хромосом клеток с разным транс-
крипционным профилем.
6.1. Пространственная организация
хромосом в ЯДРЕ
Идея упорядоченности хромосом в ядрах эу-
кариотических организмов высказывалась еще в
конце XIX в. Раблем [Rabi, 1885]. Затем стали
появляться предположения об общности органи-
зации структуры интерфазных ядер. Камингсом
[Comings, 1968] было выдвинуто предположение
о том, что основой упорядоченности хромосом в
ядре является жесткое прикрепление хроматина
к ядерной мембране. Ученым были представлены
следующие аргументы в подтверждение своих
взглядов: 1) ассоциация ядрышковых организато-
ров между' собой и их периферийная локализация
в ядре; 2) парная ориентация гомологичных хро-
мосом в соматических и половых клетках дву-
крылых насекомых и других организмов в про-
цессе митоза и мейоза; 3) поляризованное и фик-
сированное положение хромосом в интерфазе;
4) неслучайное распределение радиационно ин-
дуцированных хромосомных аберраций; 5) упоря-
доченное расположение хромосом разных видов
на метафазной пластинке в гибридных клетках.
В настоящее время проблема пространствен-
ной организации ядра стоит наиболее остро, так
как ее рассматривают в качестве одного из меха-
низмов негенетической регуляции функциони-
рования ядра. Существует два основных взгляда
на принцип формирования пространственной
организации клеточного ядра. В основе первого
взгляда лежат представления о детерминирован-
ности организации этой системы, в которой
структура обусловливает функцию. Против этой
гипотезы свидетельствует то, что потеря пер-
вичных структурных компонентов ядра в экспе-
рименте не сопровождается изменением функ-
ционирования генома. Второй взгляд основыва-
ется на представлении о ядре как о самооргани-
зующейся системе, в которой происходит дина-
мичное взаимодействие между’ структурой и
функцией, когда процессы, происходящие в ядре,
способны изменять ядерную архитектуру. Так,
аппарат транскрипции способен работать как мо-
лекулярный комплекс, стабилизирующий хрома-
тиновые петли и детерминирующий генетиче-
скую активность [Gaudin et al., 2009].
6.1.1. Модели пространственной
организации ядра
Эксперименты по облучению отдельных об-
ластей ядра ультрафиолетом показали, что раз-
ные хромосомы в интерфазном ядре как у жи-
вотных, так и у растений занимают дискретные
области [Zorn et al., 1979] — хромосомные тер-
ритории (CTs; chromosome territories). Границы
хромосомной территории можно определить в
результате эксперимента FISH по локализации
хромосомспецифичной ДНК в пространстве ядра
(рис. 6.1).
Локализация зондов в пространстве ядра бу-
дет соответствовать локализации хромосомных
территорий всех хромосом кариотипа [Cremer,
Cremer, etal., 2006]. Однако отдельные петли,
146 ЭПИГЕНЕТИКА
Рис. 6.1. Локализация хромосомных
территорий в ядре фибробласта
человека [Bolzer et al., 2005].
образованные отдельными 30-нанометровыми
фибриллами, могут не детектироваться в резуль-
тате FISH. Таким образом, FISH не всегда по-
зволяет достоверно определить границы хромо-
сомной территории [Mahy et al.. 2002].
Исследования показали, что хромосомные
территории неслучайным образом расположены
Рис. 6.2. Модель CT-IC.
Красным цветом обозначены хромосомные территории/до-
мены с транскрипционно активными (белые точки) и неактив-
ными (черные точки) генами; зеленым цветом обозначено
интерхроматиновое пространство с ферментативными комп-
лексами (желтые точки) [Branco, Pombo, 2006].
в пространстве ядра. В эволюции сохраняется
общий принцип их локализации — богатые гена-
ми хромосомы расположены ближе к централь-
ной части ядра, а хромосомы с небольшим чис-
лом генов — ближе к периферии. Такая законо-
мерность выявлена у человека [Croft et al., 1999],
курицы [Habermann etal., 2001] и гидры [Alex-
androva etal., 2003]. По указанному’ принципу’ в
пределах одной хромосомной территории распо-
лагаются субхромосомные домены [Kupper et al.,
2007]. Этот феномен объясняется тем, что гете-
рохроматин, локализованный преимущественно
у ядерной оболочки, создает репрессионную сре-
ду для транскрипции [Schneider, Grosschedl, 2007].
Однако, не всегда гены, расположенные у пери-
ферии, являются транскрипционно неактивны-
ми. У дрожжей ассоциированные с белками
ядерных пор участки хроматина активно экс-
прессируются [Casolari et al., 2004].
Су’ществу’ет несколько моделей, описываю-
щих пространственную организацию ядра.
Модель CT-IC (Chromosome territories —
Interchromatin compartment model). Согласно
этой модели хромосомные территории разных
хромосом в ядре не перекрываются друг с дру-
гом (рис. 6.2) [Visser et al., 2000]. Хромосомная
территория представляет собой фибриллу диа-
метром 30 нм, которая структурно и функцио-
нально разбита на хроматиновые домены, со-
держащие ДНК длиной до 1 м.п.н. Домены ор-
ганизованы в виде розеток петель длиной до
100 т.п.н. [Cremer etal., 2006]. Хромосомные
территории отделены друг от друга интерхрома-
тиновым компартментом (IC; interchromatin com-
partment), который не содержит хроматина.
Он представляет собой сеть каналов, прони-
кающих между’ хроматиновыми доменами и вы-
полняющих функцию переноса транкрипцион-
ных факторов и проду’ктов транскрипции. Транс-
крипционно активные последовательности ДНК
расположены на вершинах петель хроматиновых
доменов. Эти участки петель обращены в интер-
хроматиновое пространство, где они становятся
более доступными для агентов транскрипции и
сплайсинга. Иногда в пределах хромосомного
домена происходит образование гигантской пет-
ли длиной до 3 м.п.н., которая способна пере-
носить гены, расположенные на ней, в пределы
других хромосомных территорий [Volpi et al.,
2000]. Таким образом, транскрипционно актив-
ные участки хроматина должны быть обращены
в интерхроматиновое пространство, а неактив-
ные локализованы в глу’бине хромосомной тер-
ритории (см. рис. 6.2). Однако строгой корреля-
ГЛАВА 6 147
Интерфазная клетка
Пространство внутри
территории
Перемешивание фибрилл
двух соседних
хромосомных территорий
Фибрилла 30 нм
Нуклеосома
Фибрилла 10 нм
Хроматиновая «решетка»
Рис. 6.3. Модель решетки.
Синим и желтым цветом обозначены территории разных хромосом; тонкие нити — нукпеосомные нити; толстые нити —
30-нанометровые фибриллы [Branco, Pombo, 2006].
ции между’ транскрипционным статутом гена и
его положением в пределах хромосомной тер-
ритории не обнаружено, и часто активные гены
локализуются внутри хромосомной территории.
Недостатком модели CT-IC является то, что она
не рассматривает функциональное взаимодейст-
вие периферийных хроматиновых сегментов
между’ собой и с внутриядерными структурами
[Branco, Pombo et al., 2006].
Модель решетки (lattice model). Модель ре-
шетки основывается на электронно-микроскопи-
ческих данных [Dehghani et al., 2005]. С помощью
электронной микроскопии показано, что хроматин
в ядре образует фибриллы 10 нм и 30 нм в диа-
метре и концентрация их в ядре неоднородна.
Хроматиновых доменов с помощью электронного
микроскопа обнаружить не удалось, поэтому’ счи-
тается, что их не существует. Таким образом, хро-
матиновые фибриллы образуют решетку’ (рис. 6.3).
Модель решетки объясняет высокую диффузион-
ную способность макромолекул в ядре.
Хромосомные территории взаимодействуют
друг с другом, так что интерхроматинового про-
странства, организованного в виде каналов, не
существует и хроматин образует непрерывную
сеть, заполняющую весь объем ядра. Однако не
исключено, что молекулы РНК, заполняющие
интерхроматиновое пространство, на электрон-
ных фотографиях можно принять за нити хрома-
тина, образующие непрерывную структуру в ви-
де решетки. В этом случае модель решетки не
имеет оснований [Branco, Pombo, 2006].
Модель ICN (inter chromosome network
model). Согласно этой модели (рис. 6.4), хромо-
1. Структурное прикрепление
(например, ядерная ламина, ядрышки)
2. Внутрихромосомные контакты
3. Внутрихромосомная диффузия
4. Межхромосомные контакты
5. Межхромосомная диффузия
6. Проникновение петли хроматина
внутрь другой хромосомной
территории
Рис. 6.4. Модель ICN.
Красным и зеленым цветами обозначены территории разных хромосом, синим — места, где аккумулируются ферментативные
комплексы и образуются внутрихромосомные и межхромосомные контакты [Branco, Pombo, 2006].
148 ЭПИГЕНЕТИКА
сомные территории могут изменять положение в
зависимости от функционального статуса —
обычно их флуктуации составляют до 0,4 мкм,
но могут достигать и 1,5 мкм. Такие изменения в
локализации хромосомных территорий не могут
происходить без частичного перекрывания со-
седних территорий, к тому’ же, как показывают
некоторые исследования, транслокации способ-
ны возникать лишь в случае, если межхромо-
сомные расстояния в ядре незначительны [Holley
et al., 2002]. Выявлено, что около 20 % ядра со-
ставляют области, где хромосомные территории
перекрываются. В области перекрывания хромо-
сомных территорий можно обнаружить большое
количество факторов транскрипции и соответст-
вующую транскрипционно активному’ хромати-
ну’ конформацию. Ингибирование транскрипции
вызывает изменение конформации этих пере-
крывающихся участков.
Следовательно, сам транскрипционный меха-
низм способен определять пространственную
организацию хромосом, что объясняет различие
в распределении хромосом в пространстве ядра в
разных тканях, консервативное в эволюции [Mo-
ra etal., 2006]. Модель ICN предполагает, что
баланс между’ тканеспецифичными внутри- и
межхромосомными взаимодействиями, наряду с
функциональными связями хромосом с ядерной
ламиной и ядрышками, обосновывает позицию
хромосом и их конформацию.
6.1.2. Молекулярные особенности
внутриядерной организации
хроматина
В условиях in vivo наблюдают изменение рас-
положения хромосом в ядре в течение коротких
временных промежутков, в то время как при дли-
Рис. 6.5. Организация 30-нанометровой нити хрома-
тина в петли [Sexton et al., 2009].
тельном наблюдении хромосома расположена
примерно в пределах своей территории [Vazquez
et al., 2001]. Структурные элементы ядра, и пре-
жде всего ядерная оболочка, ограничивают ми-
грацию хромосомы в объеме ядра. Локусы, на-
ходящиеся вблизи ядерной оболочки, изменяют
свое положение в меньшей степени, чем друтие
участки хромосом, расположенные дальше от
периферии ядра [Chubb et al., 2002]. Положение
хромосом в ядре определяется системой взаимо-
действия хроматина/ДНК с белками ядерной ла-
мины и белками ядерного матрикса [Marshall,
2003].
6.1.2.1. Взаимодействие хроматина
с белками ядерного матрикса
Нуклеосомная нить — функциональный ком-
плекс ДНК и гистоновых белков — организо-
вана в клетке в виде 30-нанометровой фибриллы.
Эта фибрилла в интерфазном ядре образует пет-
ли. основания которых контактируют друг с дру-
гом и формируют розеткоподобные структуры.
Основания петель вступают во взаимодействие
с белками ядерного матрикса (рис. 6.5).
Ядсрный матрикс представляет собой фибрил-
лярно-гранулярный каркас, состоящий из бел-
ков, устойчивых к экстракции растворами солей
высоких концентраций и детергентов [Hakes,
Berezney, 1991]. В местах взаимодействия осно-
ваний петель розеток с белками ядерного мат-
рикса обнаруживают специфические последова-
тельности ДНК — SAR/MAR (scaffold associated
region/matrix attachment region). Значение MAR в
клеточных процессах обусловлено взаимодейст-
вием с множеством белков. Большинство из них
являются компонентами ядерного матрикса.
Около двенадцати основных белков ядерного
матрикса выделено из клеток печени крыс [Wang
etal., 2010]. Семь из них непосредственно свя-
зывают ДНК — ламины класса А, матрины D, Е,
F, G и 4 [Hakes, Berezney, 1991]. Существуют два
типа взаимодействия белков и MAR-последова-
тельностей ДНК — первый с участием малой
борозды двойной спирали ДНК, второй — с уча-
стием одноцепочечных участков ДНК [Luderus
etal., 1994]. Наиболее изучены белки — HMGI(Y),
NMP-1, NMP-2, ARBP, HnRNP-U/SAF-A, pl 14,
SATB1, SATB2, SMAR1, SAF-B.
HMGI(Y) In vitro этот белок связывает ДНК
с нарушенной вторичной структурой, содержа-
щей «расплетенные» и су перекрученные участ-
ки. HMGI(Y) связывает транскрипционные фак-
торы [Reeves, Beckerbauer, 2001].
ГЛАВА 6 149
NMP-1 и NMP-2. Эти белки специфично
взаимодействуют с промотором гена остеокаль-
цина в остеобластах. NMP-1 присутствует во
всех клетках, регулирует клеточный рост и
обычно связан с белками ядерного матрикса.
NMP-2 встречается только в остеобластах и рас-
познает мотив СААТ подобно белку С/ЕВР, ко-
торый локализован исключительно на ядерном
матриксе [Bidwell et al., 1993].
ARBP. Белок выделен у курицы и избира-
тельно связывает MAR в лизозимном локусе и
MAR дрозофилы, мыши и человека. ARBP явля-
ется компонентом внутриядерной сети. Его вы-
сокие связывающие характеристики минималь-
ного фрагмента MAR свидетельствуют о значе-
нии ARBP в образовании хроматиновых петель
[Van Kries et al., 1991].
HnRNP-U/SAF-A. У позвоночных этот белок
специфично связывает SAR и, по-видимому, во-
влечен в процесс упаковки РНК. In vitro HnRNP-
U/SAF-A формирует строго упорядоченный комп-
лекс с дву- или одноцепочечной молскулой ДНК
[Fackelmayer et al., 1994].
SAF-B. Белок специфически связывает MAR
и SAR последовательности. Большое количество
молекул SAF-B можно обнаружить в хроматине,
однако в ядерном матриксе они не найдены
[Renz, Fackelmayer, 1996].
SATB1. Белок экспрессируется преимущест-
венно в тимусе. SATB1 селективно взаимодейст-
вует с малой бороздкой ДНК SAR/MAR, но
не связывает одноцепочечную ДНК [Dickinson
et al., 1997].
SATB2. Специфичный для В-клеток белок,
который связывает MAR близ локуса, кодирую-
щего иммуноглобулин, и усиливает экспрессию
этого гена [Dobreva et al., 2003].
SMAR1. Белок, связывающий MAR, является
продуктом альтернативного сплайсинга гена
smart. который экспрессируется в клетках тиму-
са [Chattopadhvav et al., 2000].
р114. Белок связывает «расплетенные» АТ-
богатые участки MAR последовательностей
ДНК и обнаружен только в клетках опухоли
больных раком молочной железы [Yanagisawa
et al., 1996].
Белки, связывающие MAR, за счет этого вза-
имодействия выполняют ряд функций. Они спо-
собны определять архитектуру розетки, за счет
изменения точек взаимодействия хроматиновых
петель [Liebich et al., 2002]. Белки MAR способ-
ны влиять на экспрессию генов — усиливать,
как белок Bright, либо репрессировать, как
SATB1. SATB1 действует через связывание бел-
ков репрессоров транскрипции путем поддержа-
ния ацетилированного состояния гистонов на
низком уровне, а также посредством модифика-
ции структуры хроматина [Gong et al., 2009]. Та-
ким образом, действуя как регуляторы транс-
крипции, белки MAR и MAR-связывающие бел-
ки имеют большое значение в процессах ткане-
вой дифференцировки и органогенза. В этом от-
ношении наиболее изучен SATB1. Мыши, у ко-
торых не экспрессируется ген satbl, развиваются
с аномальными тимоцитами [Alvarez et al., 2000].
SATB1 участвует также в апоптозе — в ходе
этого процесса происходит разрушение связи
SATB1 с ДНК [Galande et al., 2001]'.
6.1.2.2. Взаимодействие хроматина
с белками ядерной оболочки
Существование механизма специфического
взаимодействия хроматина и ядерной оболочки
доказывает факт расположения вблизи нее гете-
рохроматина [van DrieL Fransz, 2004].
Клеточное ядро отделено от цитоплазмы
ядерной оболочкой, образованной наружной и
внутренней мембраной, комплексами ядерных
пор (NPCs; nuclear pore complexes) и ядерной
ламины. Наружная мембрана оболочки ядра
контактирует с эндоплазматическим ретикулу-
мом (ЭПР) и образует с ним непрерывную
структуру. Внутренняя мембрана включает в
себя специфические белки, которые не встреча-
ются в наружной мембране. Ядсрная ламина
расположена между’ внутренней мембраной и
хроматином [Mattout-Drubezki, Gruenbaum, 2003].
Взаимодействие хроматина с ядерной обо-
лочкой происходит посредством контакта с ла-
минами и белками внутренней мембраны, вхо-
дящими в состав ядерной ламины. Основным
компонентом ядерной ламины являются белки,
относящиеся к классу промежуточных филамен-
тов,— ламины [Stuurman etal., 1998]. Также в
состав ядерной ламины входят белки, связанные
с ламинами, такие как рецептор ламина В (LBR),
ламинассоциированные полипептиды 1 и 2 (LAP1,
LAP2), имерин, несприн-1, MAN1, отефин и бе-
лок YA [Gruenbaum etal., 2000; Goldman etal.,
2002], UNC-84. UNC-83. нурин и белок RFBP
[Burke, Ellenberg, 2002]. Некоторые из этих
трансмембранных полипептидов также связыва-
ют белки хроматина или ДНК.
Ламины. Ламины разделяют на два класса —
А и В. В-тип ламина присутствует во всех клет-
ках у многоклеточных животных, в то время как
А-тип — только в дифференцированных [Gru-
150 ЭПИГЕНЕТИКА
enbaum etal., 2005]. Ламины всех типов состоят
из консервативной а-спирали, которая располо-
жена в центральной части молскулы (стержнево-
го домена), и двух неконсервативных глобуляр-
ных доменов — хвостового домена, находящего-
ся у карбоксильного конца, и головного домена
на N-конце молекулы. С-конец ламина (СааХ
box) подвергается посттрансляционным моди-
фикациям (рис. 6.6).
В ядре ламины представлены димерами —
две молекулы соединяются стержневыми доме-
нами. Димеры молскул ламина связываются друг
с другом посредством взаимодействия головных
доменов одной пары с хвостовыми доменами
другой и образуют полимер, диаметр которого
составляет 10 нм [Heitlinger et al., 1992]. Количе-
ство генов ламинов увеличивается в эволюции.
У Drosophila имеется один ген А-ламина и
один — В-ламина, а у млекопитающих — три
гена А- и В-типов ламина, с которых в результа-
те сплайсинга синтезируются семь разных моле-
кул [Furukawa et al., 1994].
Ламины способны связывать ДНК непосред-
ственно in vivo. На Drosophila показано, что в
живой клетке только на стадии интерфазы ламин
способен связываться с молекулами ДНК [Rze-
pecki, 1998]. In vitro ламин связывает районы,
ассоциированные с матриксом или хромосомным
скэффолдом (SAR/MAR) [Luderus etal., 1992], а
также последовательности центромер и теломер
[Baricheva etal., 1996]. Ламины могут взаимо-
действовать с одноцепочечной ДНК, однако с
более низкой аффинностью, чем с SAR/MAR. Во
взаимодействии ДНК и ламинов существенную
роль играют состояние полимеризации ламинов
и стержневой домен [Zhao et al., 1996]. Ламины
могут связываться с белками хроматина, причем
в этом взаимодействии участвует также хвосто-
вой домен ламина [Ulitzur et al., 1992].
Ламины в ядре выполняют ряд функций. Они
необходимы для пространственной организации
комплексов ядерных пор, они вовлечены в про-
цессы конденсации хроматина и репрессии генов
близ ядерной периферии; ламины В-типа участ-
вуют в процессе роста ядерной оболочки [Melcer
et al., 2007].
Рис. 6.6. Молекула ламина.
Head — головной домен, Rod — стержневой домен, Tail —
хвостовой домен [Melcer et al., 2007].
У Drosophila есть только один ламин типа
А — ламин С, и один ламин типа В — DmO.
У этого насекомого оба ламина выполняют раз-
личные и взаимодополняющие функции. Мухи,
гомозиготные по мутантному аллелю гена лами-
на С, погибают на стадии предкуколки, что оз-
начает неполное замещение ламином DmO
функции ламина С. В то же время мутации в ге-
не DmO являются летальными [Osouda et al.,
2005]. Ламин DmO фосфорилирован в интерфаз-
ном ядре, и эта модификация имеет значение для
взаимодействия этого ламина с хроматином [Stu-
urman et al., 1995].
Рецептор ламина В (LBR; lamin В receptor).
LBR представляет собой белок массой 58 кДа,
который имеет восемь трансмембранных сег-
ментов и обращенный в нуклеоплазму N-конец.
LBR взаимодействует с ламинами В-типа и об-
ладает стеринредуктазной активностью [Holmer
etal., 1998]. LBR способен связывать двуцепо-
чечную ДНК линкера нуклеосом, подобно гис-
тону Н1 или белку HMG1/2 [Duband-Goulet, Cour-
valin, 2000]. LBR также способен взаимодейст-
вовать с белком НР1 (heterochromatin protein 1),
который является ключевым белком при форми-
ровании гетерохроматина. Показано, что in vivo
LBR связывает комплекс белка НР1 и тетрамера
гистонов НЗ/Н4 [Wagner et al., 2004]. Ассоциа-
ция LBR и белка MeCPl приводит к образова-
нию контакта с ядерной оболочкой также мети-
лированной ДНК [Guarda et al.. 2009]. Таким об-
разом, LBR имеет большое значение для про-
странственной организации хроматина в ядре.
Возможно, что именно LBR является ответст-
венным за локализацию гетерохроматина пре-
имущественно в области периферии ядра [Hol-
mer, Worman, 2001].
Во время интерфазы вновь синтезированный
LBR посредством латеральной диффузии пере-
мещается по мембранам ЭПР на внешнюю ядер-
ную мембрану, а далее через ядерные поры — на
внутреннюю ядерную мембрану’, где молекулы
этого белка иммобилизируются хроматином и
ламинами. В раннем митозе эти взаимодействия
разрушаются, и количество молекул LBR на
мембранах ЭПР и ядерной оболочки выравнива-
ется. В метафазе, когда оболочка ядра разруше-
на, LBR равномерно распределен по мембранам
ЭПР, который окружает аппарат веретена деле-
ния и конденсированный хроматин. Сайты взаи-
модействия хроматина с LBR появляются снова
только в анафазе, когда находящийся в ЭПР LBR
связывает его. На стадии формирования новой
ядерной оболочки происходят направленная диф-
ГЛАВА 6 151
фузия LBR к формирующимся мембранам и об-
разование новых контактов, пока в интерфазе
весь LBR не будет сосредоточен на внутренней
мембране оболочки ядра [Ellenberg et al., 1997].
Ламинассоциированные полипептиды
LAP 1 и LAP 2. У млекопитающих выявлено три
типа LAP 1 (LAP 1А, LAP IB, LAP 1 С), которые
кодируются одним геном и являются продукта-
ми альтернативного сплайсинга РНК. Ламины
связывает каждый тип, но с разной аффинностью.
У млекопитающих продукты транскрипции
гена, кодирующего LAP 2, в результате сплай-
синга формируют шесть вариантов белка LAP 2
(LAP 2а, LAP 2|3, LAP 2у. LAP 25, LAP 2е, LAP
2Q. Четыре из них — LAP 2р, LAP 2у, LAP 25,
LAP 2е — интегральные белки внутренней ядер-
ной оболочки, a LAP 2а и LAP 2£ не связаны с
мембранами ядерной оболочки, а растворены в
нуклеоплазме [Berger etal., 1996]. N-концевой
домен у всех изомеров консервативен и включа-
ет LEM-домен. LEM-домен LAP 2р может свя-
зывать белок BAF (barrier to autointegration
factor), но более прочное взаимодействие обра-
зует с комплексом BAF-ДНК [Mattout-Drubezki,
Gruenbaum, 2003]. Показано, что взаимодействие
LAP 2р с ламинами и хроматином имеет боль-
шое значение в процессах формирования и раз-
рушения ядерной оболочки [Holmer et al., 2001].
Имерин. 40 аминокислотных остатков N-koh-
цевого домена имерина гомологичны N-концево-
му’ домену’ LAP 2|3 (LEM-домену). Этот белок
способен взаимодействовать с ламинами всех
типов за счет LEM-домена — выявлено по край-
ней мере два сайта связывания ламина. Кроме
того, имерин связывает транскрипционные фак-
торы GCL (germ cell-less), BTF (BCL2-associated
transcription factor) и способен связываться c BAF
[Holaska etal., 2003; Bengtsson, Wilson, 2004].
Имерин в ранней анафазе связывается с хрома-
тином в сайтах, отличных от мест локализации
LBR [Haraguchi et al., 2000].
Имерин способен образовывать контакт с ак-
тином. Внутриядерный актин выполняет ряд
функций — ремоделинг хроматина, формиро-
вание гетерогенных ядерных РНК, участвует в
ядерном экспорте и транскрипции [Pederson,
Aebi, 2002]. Вероятно, имерин участвует в обра-
зовании белкового комплекса ламин—актин—
спектрин, выполняющего структурную функцию
в ядре.
Другие белки. Молекула белка MAN1, так
же как и LAP 2 и имерин, имеет LEM-домен.
MAN1 локализован исключительно на внутрен-
ней ядерной мембране [Holmer etal., 2001].
У позвоночных MAN1 связывает транскрипци-
онные факторы и блокирует некоторые сигналь-
ные пути, например SMAD-опосредованный сиг-
нальный путь, который имеет значение для диф-
ференцировки тканей и поддержания гомеостаза
[Dijke, Hill, 2004]. У дрозофилы MAN1 образует
комплексы с ламинами DmO и С [Wagner et al.,
2006].
Интегральный белок внутриядерной мембра-
ны оферин найден только у Drosophila. Он обра-
зует контакт с ядерной ламиной и необходим для
стабилизации ядерной оболочки [Ashcry-Padan
et al., 1997]. Также у Drosophila найден транс-
мембранный белок Bocksbeutel-a, который, так
же как и оферин, вовлечен в процесс локализа-
ции других белков внутриядерной мембраны
[Wagner et al., 2004].
Белки LAP 2, имерин, MAN 1, оферин и Bock-
sbeutel объединяет присутствие в их молскулах
LEM-домена. Структура LEM-домена представ-
ляет собой две коротких а-спирали, соединен-
ные петлей. LEM-домен отвечает за взаимодей-
ствие с белком BAF, который в свою очередь
связывает хроматин [Cai et al., 2001].
Белок UNC-84 необходим для процессов по-
ляризации и миграции клеточного ядра и его по-
зиционирования в клетке [Malone et al., 1999].
Кроме белков ядерной ламины и прочих бел-
ков ядерного матрикса в ассоциации хроматина
с ядерной оболочкой принимают участие белки
ядерных пор (NPCs). Известно, что с белками
этого комплекса взаимодействуют специфиче-
ские белки теломер, например у Ки70 теломеры
связываются с нуклеопорином Nupl45 через тре-
тий белок, М1р2 [Galy et al., 2000].
Как описано выше, контакт хроматина с обо-
лочкой ядра обеспечивается несколькими белка-
ми. Ламины способны образовывать непосредст-
венный контакт с ДНК. в то время как большин-
ство белков ядерной ламины взаимодействуют с
белками хроматина, но чаще через белки-посред-
ники (например, BAF). Вероятно, что взаимодей-
ствие хроматина с ядерной оболочкой связано с
процессами ремоделинга и формирования ге-
терохроматина (рис. 6.7), что отражается на его
транскрипционной активности. Связи хроматина
со структурными элементами ядра динамичны и
изменяются в ходе клеточной дифференцировки.
Реорганизация архитектуры ядра в ходе процес-
сов дифференцировки связана со сменой экспрес-
сионного профиля и, прежде всего, с пространст-
венной организацией гетерохроматина.
В раннем эмбриогенезе гетерохроматические
районы хромосом не выявляются, однако гете-
152 ЭПИГЕНЕТИКА
Архитектура ядерной оболочки/Ядерно-цитоплазматическое взаимодействие
Актин
Плектин промежуточные
Несприны
S SUN1/2 =
ЦИТОПЛАЗМА
Наружная мембрана
LAP2P
Рецептор ламина В
RW10 I
Ламин В
Внутренняя мембрана
HDAC3
Ламин
ш BAF
Нуклеосома
Организация хроматина
BAF
I BAF
Мемп меме
le не,'
Регуляция гетерохроматина
t । ।
р-катенин Smad
Экспрессия генов, сигнальные пути
BAF Ламин А/С
LEM
LAP2a
Активность р-катенина Сигнальный путь TGFp/BMP Сигнальные пути E2F/R6 и Rb/MyoD
Рис. 6.7. Схема функционального взаимодействия основных белков ядерной ламины и
хроматина [Schirmer, Foisner, 2007].
рохроматин можно наблюдать, когда клетка на-
чинает дифференцировку. Причем в миобластах
крысы начало дифференцировки сопровождает-
ся перемещением хромоцентров к ядерной пе-
риферии [Chaly, Munro, 1996]. Отмечено также,
что в разных клетках одного организма можно
наблюдать разную архитектуру хромосом [Cre-
mer, Cremer, 2010]. Таким образом, пространст-
венная организация ядра различается в клетках
зародышевого пути и дифференцированных клет-
ках [Marshall, 2003], а процесс дифференцировки
связан с реорганизацией хромосомомембранных
отношений.
6.1.2. Организация районов прикрепления
хромосом к ядерному каркасу
6.1.3.1. SAR/MAR-элементы
Каждая хроматиновая петля крепится к ядер-
ному’ каркасу двумя SAR/MAR-районами. Длина
последовательностей SAR/MAR составляет от
200 до 3000 п.н. Кроме стабилизации хроматино-
вых петель, эти последовательности участвуют в
процессах инициации репликации, транскрипции,
репарации и сплайсинга [Girod et al., 2007].
У человека порядка ста тысяч сайтов взаимо-
действия хромосом с белками ядерного матрикса
[Bode etal., 2006]. Считается, что SAR/MAR
представляют собой АТ-богатые повторы [Hart.
Laemmli, 1998], однако показано, что это могут
быть последовательности, содержащие значи-
тельную часть GA- и СТ-мотивов [Boulicas,
1993; Liebich et al., 2002]. MAR обладают сле-
дующими характеристиками: они обогащены
инвертированными повторами, часто их ДНК не
образует канонической спирали и «расплетена»,
присутствуют свободные от нужлеосом участки
ДНК, полипуриновыс мотивы, участки левоза-
кру’ченной либо трехцепочечной молекулы ДНК.
MAR чрезвычайно полиморфны по нуклеотид-
ной последовательности, но фу’нкционально они
ГЛАВА 6 153
консервативны — MAR животных способны свя-
зывать ядерный скэффолд растений и наоборот
[Fukuda, 1997; Wang et al., 2004].
Был проведен поиск в базе данных SAR/
MARt DB (http//transfac.gbf.de/SMARtDB/ rel. 2.0)
наиболее часто встречающихся гексамеров нук-
леотидов в SAR/MAR-последовательностях [Lie-
bich etal., 2002]. В табл. 6.1 представлены моти-
вы, которые встречаются в составе SAR/MAR
более чем в 4 раза чаще, чем статистически ожи-
даемые. Несмотря на большую частоту’ встречае-
мости этих мотивов, ни один из них не представ-
лен во всех элементах. Две трети из этих мотивов
составляют А- или/и Т-нуклеотиды, и ни в одном
мотиве не обнаружено более одного нуклеотида
С или G. Среди найденных мотивов в SAR/MAR
более всего распространены тракты поли-Т и по-
ли-А, а также мотивы АТ5 и ТА5.
Высокая частота гексануклеотидов АТАТТТ
и АТАТАТ в окружении мотивов АТС коррели-
рует со свойством этих последовательностей об-
разовывать неспаренные участки [Liebich et al.,
2002]. Некоторые мотивы содержат последова-
тельности АТТА и ТААТ, которые служат сай-
тами посадки транскрипционных факторов. Это
свидетельствует об участии SAR/MAR в процес-
се транскрипции. Существуют данные о способ-
ности SAR/MAR усиливать транскрипцию [Allen
et al., 1996]. Они участвуют и в процессе конден-
сации хроматина, так как в метафазных хромо-
сомах обращены в сторону’ хромосомного скэф-
фолда [Hart, Laemmli, 1998].
Кроме того, SAR/MAR содержат сайты по-
садки фермента топоизомеразы II, необходимого
для супсрскручивания и релаксации спирали
ДНК. Как описывалось выше, SAR/MAR функ-
ционируют через взаимодействие с белками ядер-
ного матрикса, в том числе и ламинами, которые
являются компонентом оболочки ядра, а также
специфическими ферментами и факторами транс-
крипции. Таким образом, SAR/MAR-последова-
тельности являются, вероятно, единственными
элементами, которые обеспечивают непосредст-
венное взаимодействие ДНК со структурными
элементами ядра.
Несмотря на вариабельность последователь-
ности SAR/MAR среди них существуют эволю-
ционно консервативные. Из ядерных оболочек
гепатоцитов мыши была выделена и клонирова-
на ДНК. Последовательность клона EnvM4 при-
сутствовала в 50 % клонотеки и имела консерва-
тивный участок с мотивом AAAAG, который
был найден в геномах различных организмов, от
бактерий до человека [Шабарина и др., 2006].
У Drosophila последовательности ДНК, кон-
тактирующие с ядерной ламиной, локализуют-
ся в районах хромосом, контактирующих в ин-
терфазе с ядерной оболочкой [Шарахов и др.,
1993]. Эта ДНК содержит мотивы GT/CA, АТ/ТА,
ССАА, TGGCA, GCCGCC, CCGCCC, которые
являются сайтами связывания белков ядерного
матрикса. Показано, что эта ДНК, взаимодейст-
вующая с ядерной ламиной дрозофилы, локали-
зована в проксимальном Р-гетерохроматине
хромосом слюнных желез.
Последовательность рибосомальной ДНК
также способна образовывать контакт с ядерной
оболочкой. Так. у дрожжей рДНК взаимодейст-
Таблица 6.1
Мотивы, встречающиеся с наибольшей частотой в
SAR/MAR [Liebich et al., 2002, с модификациями]
Ранг Мотив Количество сравнений
1 АААААА/1 I I I I I 4682
2 AAAAAI/AI I I I I 1989
3 AAAAIA/TAI I I I 1830
4 ТААААА/ТТТТТА 1653
5 АААТАА/ТТАТТТ 1651
6 АААТАТ/АТАТТТ 1609
7 ААТААА/ТТТАТТ 1564
8 ТТАААА/ТТТТАА 1512
9 АТАААА/ТТТТАТ 1444
10 СААААА/I I I I IG 1390
11 AAAAI l/AAl I I I 1382
12 АТАААТ/АТТТАТ 1335
13 Al I I IA/TAAAAI 1319
14 ТАААТА/ТАТТТА 1244
15 ААТТАА/ТТААТТ 1233
16 GAAAAA/1 I I I IС 1210
17 AAACAA/TTGTTT 1210
18 AACAAA/TTTGTT 1208
19 АААТТА/ТААТТТ 1207
20 АТТААА/ТТТААТ 1181
21 ACAAAA/TTTTGT 1177
22 AAAAAC/GI I I I I 1144
23 ААТААТ/АТТАТТ 1143
24 АТТТАА/ТТАААТ 1131
25 AAAAIG/CAI I I I 1124
26 AAAAAG/CI I I I I 1122
27 AAAACA/TGI I I I 1119
28 ААТАТА/ТАТАТТ 1110
29 AGAAAA/1 I I IСI 1087
30 AAGAAA/TTTCTT 1075
31 ТАТААА/ТТТАТА 1072
32 АТАТАТ 1057
33 ТАААТТ/ААТТТА 1033
34 АТААТТ/ААТТАТ 1006
154 ЭПИГЕНЕТИКА
вует со специфическими белками внутриядерной
мембраны. Это взаимодействие необходимо для
стабилизации рДНК и является доказательством
существования древнего механизма внутриядер-
ной организации генома [Mekhail et al.. 2008].
Таким образом, функцию пространственной
организации генома выполняют преимущест-
венно SAR/MAR, контактируя с белками ядер-
ного матрикса и, в том числе, с белками ядерной
ламины.
6.2. РОЛЬ ГЕТЕРОХРОМАТИНА В ОБРАЗОВАНИИ
ПРОСТРАНСТВЕННОЙ СТРУКТУРЫ ЯДРА
Хотя механизм, с помощью которого под-
держивается определенная архитектоника ядра,
не ясен окончательно, очевидно, что важную
роль в нем играет взаимодействие гетерохрома-
тиновых районов хромосом с мембраной ядра и
между собой [Онищенко, Ченцов, 1973].
Из семи факторов, ответственных за неслу-
чайность расположения хромосом в ядре, выде-
ленных Камингсом, пять относится к гетерохро-
матину [Comings, 1980].
Роль межхромосомных, или эктопических,
связей в организации трехмерной структуры яд-
ра не изучена до конца, однако, по всей видимо-
сти, очень важна. На давленых препаратах такие
связи выявляются как тяжи хроматина между’
районами интеркалярного гетерохроматина. По-
добные межхромосомные тяжи были описаны в
нераздавленных ядрах хирономусов [Прокофье-
ва-Бе льговская, 1986].
Кроме эктопических связей в организации
трехмерной структуры ядра исключительно боль-
шую роль играют контакты хромосом с ядерной
мембраной. Хромосомы чаще всего удержива-
ются вблизи ядерной оболочки либо вплотную
прилегают к ней. Почти всегда с внутренней
мембраной ядра контактирует прицентромерный
гетерохроматин. Связь гетерохроматина с ядер-
ной оболочкой и его расположение на перифе-
рии ядра в течение интерфазы отмечается в ряде
обзоров как одно из обычных свойств гетеро-
хроматина [Paddy et al., 1990; Belmont et al.,
1993; Marshall etal., 1996; Carvalho etal., 2001;
Sage, Csink, 2003]. Так, у личинок дрозофилы в
клетках слюнных желез хромоцентры всегда на
мембране [Фролова, 1938], так же как и у кома-
ров рода Chironomus в слюнных железах [Груз-
дев, Кикнадзе, 1970], мальпигиевых сосудах и
питающих клетках ооцитов. Среди двукрылых
насекомых фактически у всех видов теломеры
расположены на мембране ядра. В клетках анти-
под Triticale гетерохроматиновые районы поли-
тенных хромосом расположены по периферии
ядра в тесном контакте с ядерной оболочкой
[Жиму-лев, 1992].
Таким образом, в результате осуществления
этих двух типов связей (межхромосомные связи и
связь хромосом с ядерной оболочкой) достигается
довольно жесткая пространственная упорядочен-
ность ядра. Например, ядра клеток средней киш-
ки дрозофилы во время пульсации кишечни-
ка испытывают большие деформации — меняют
обычную для них дисковидную форму’ на шаро-
образную. Во время деформации резко меняется
расположение хромосом в пространстве ядра.
Однако когда ядро вновь принимает форму’ диска,
хромосомы занимают точно такое же положение,
что и до пульсации [Hochstrasser, Sedat, 1987].
Поскольку’ было установлено, что гетерохро-
матин в теломерных и центромерных районах
обогащен тандемноорганизованными повторен-
ными последовательностями [Brutlag, 1980], ко-
торые могут ассоциировать между’ собой, суще-
ствует мнение, что межхромосомные ассоциации
гетерохроматических районов образуются на ос-
нове гомологии последовательностей тандемных
повторов, содержащихся в разных районах хро-
мосом или в разных хромосомах. Однако есть
данные, подтверждающие обратную точку- зре-
ния. Так, Сейдж и Синк показали на D. mela-
nogaster и на D. sinndans. что внутриядерная ас-
социация разных блоков гетерохроматина не
требует гомологии последовательностей. Они
предположили, что подобная ассоциация осуще-
ствляется благодаря белкам, которые «узнают»
гетерохроматин по таким признакам, как богат-
ство повторами, низкая транскрипционная ак-
тивность, поздняя репликация и друтим [Sage,
Csink, 2003].
Карвальо с соавторами установили, что фа-
культативный гетерохроматин и позднорепли-
цирующиеся хроматиновые районы ведут себя
как сайты контактирования с ядерной оболоч-
кой, следовательно, определяют пространствен-
ное расположение хромосом в интерфазном яд-
ре. Прочность взаимодействия прямо пропор-
циональна количеству гетерохроматина [Car-
valho etal.. 2001]. Непосредственно с прикреп-
лением хромосом к ядерной оболочке связан
[З-гетерохроматин — его тяжи внедряются в ядер-
ну’ю мембрану- [Стегний, Шарахова, 1991].
В архитектуре ядра ключевым моментом яв-
ляется разделение его на территории, соответст-
вующие индивидуальным хромосомам. Хромо-
сомная территория представляет собой аморф-
ГЛАВА 6 155
ную, но вместе с тем компактную массу, зани-
мающую часть объема интерфазного ядра. Эта
часть приблизительно соответствует той части
генома, которую составляет эта хромосома [Zink,
Cremer, 1998; Cremer, Cremer, 20011. Простей-
шей моделью образования хромосомных терри-
торий является деконденсация хромосом во вре-
мя интерфазы лишь до определенного предела.
Только некоторые сильно деконденсированные
хромосомные тяжи могут выпетливаться и вне-
дряться внутрь других хромосомных террито-
рий. С этой моделью вполне согласуется утвер-
ждение, что интерфазный гетерохроматин лишь
в пять раз менее конденсирован, чем в метафаз-
ных хромосомах, определяя, таким образом, об-
разование определенного числа хромосомных
территорий.
На биохимическом уровне пространственная
упорядоченность хроматина выражается в виде
специфического связывания особых некоди-
рующих последовательностей ДНК с различны-
ми ядерными белковыми структурами, такими
как ядерный матрикс (скэффолд) и ядерная ла-
мина [Глазков, 1988, 1995; Getzenberg etal.,
1991], которая, в свою очередь, представляет
собой фибриллярную сеть, состоящую в основ-
ном из фибрилл белка ламина, изнутри высти-
лающую ядерную оболочку- и связанную с поро-
выми комплексами и с внутренней ядерной мем-
браной. При выделении этих структур из натив-
ных ядер в их составе обнаруживаются фрагмен-
ты геномной ДНК, связанные с ними с высокой
степенью аффинности [Глазков, 1988]. Таким
образом, в соответствии с ядерными структура-
ми, в составе которых были выделены фрагмен-
ты ДНК, принято называть их ДНК ядерного
матрикса, ДНК ядерной ламины. Предполагает-
ся, что в нативном ядре эти последовательности
ДНК, «заякоренные» белками различных струк-
тур, являются основой пространственной упоря-
доченности хроматина. Протяженные гомологии
отсутствуют даже между ДНК ядерных белко-
вых структур не только у близкородственных
видов (например, ДНК ядерной ламины цыплен-
ка не имеет гомологичных последовательностей
в геномах видов того же семейства — индюка и
перепела [Matzke et al.. 1990]), но даже в геноме
одного организма [Глазков. 1995]. Это свиде-
тельствует о том, что для специфичности связы-
вания со структурными белками не важна пер-
вичная последовательность нуклеотидов. Пока-
зано, что для специфичности связывания имеет
значение вторичная структура фрагмента ДНК,
приобретаемая за счет общей композиции, по
которой ДНК ядерных белковых структур раз-
личных организмов сходны между’ собой. Все
они являются АТ-богатыми последовательно-
стями; имеют в своем составе поли(А)- и по-
ли(Т)-блоки; содержат чередующиеся пурин-
пиримидиновые гомополимерные блоки, даю-
щие изгибы молекулы ДНК, что может обеспе-
чивать существование петельных структур; со-
держат палиндромные мотивы, формирующие
шпильки; а также обогащены сайтами связыва-
ния топоизомеразы II [Глазков, 1995].
Существует мнение, что наблюдаемая на ци-
тологическом уровне связь гетерохроматина с
белками ядерной периферии (с ламином [Bel-
mont et al., 1993] или с интегральными мембран-
ными белками, в частности, с ламин-В-рецеп-
тором [Pyrpasopoulou etal., 1996]) обусловлена
биохимическими взаимодействиями белков обо-
лочки с последовательностями ДНК гетерохро-
матина, обладающих описанными выше чертами
ДНК ядерных белковых структур [Luderus et al.,
1992; Baiborodin et al.. 1993; Baricheva et al..
1996]. Это мнение подтверждается целым рядом
фактов. Во-первых, высокая плотность ДНК
ядерного матрикса отмечалась в ряде исследова-
ний как характерная особенность состава ДНК
прицентромерных гетерохроматиновых районов
[Strausbaugh, Williams, 1996; Донев, Джонджу-
ров, 2000]. Показано, что многие типичные для
прицентромерного гетерохроматина последова-
тельности. сателлиты и мобильные элементы
обладают свойствами, необходимыми для спе-
цифического взаимодействия с белками ядерной
ламины. Мобильные элементы, например рет-
ротранспозоны gypsy, найденные у’ Drosophila,
содержат фрагмент, который вызывает ассоциа-
цию сайтов инсерций на ядерной периферии in
vivo [Gerasimova et al., 2000] и по своим молеку-
лярным характеристикам является типичной ДНК
ядерного матрикса, связывает ядерные матриксы
человека и дрозофилы in vitro [Nabirochkin et al.,
1998]. Сателлиты часто бывают АТ-богатыми,
часто образуют олиго(А)-блоки, за счет которых
образуется изогнутая конфигурация молекулы.
Таковы мажорные сателлиты мартышки, крысы,
лебедя, курицы, фазана, индюка, креветки, сала-
мандры, жуков и дрозофилы [Лобов, Подгорная,
1999]. Действительно, способность мажорных и
минорных сателлитов мыши и альфоидных са-
теллитов человека из прицентромерного гетеро-
хроматина к специфическому’ связыванию с ла-
мином Вис белком ядерного скэффолда SAF-A
(Scaffold Attachment Factor А) была продемонст-
рирована экспериментально [Lobov et al., 2001].
156 ЭПИГЕНЕТИКА
Во-вторых, подобные последовательности бы-
ли найдены при их целенаправленном поиске в
составе прицентромерного гетерохроматина D. те-
lanogaster [Baiborodin et al., 1993; Богачев и др.,
1996; Baricheva etal., 1996]. Клон Х20р1.4 связы-
вался с ламином in vitro и обнаруживался в со-
вместной локализации с ламином in vivo в поли-
тенных ядрах слюнных желез личинок D. mela-
nogaster [Baricheva etal., 1996]. Фрагмент X20pl.4
не содержит открытых рамок считывания, отно-
сится к АТ-богатым (62,6 %) повторам генома
D. melanogaster (120 копий) и представлен мо-
номерами длиной 1,4 и 1,6 т.п.н. Фрагмент ДНК
Х20р1.4 высокоспецифично связывался с лами-
ном in vitro при концентрации конкурентной
ДНК, в 200 раз превышающей концентрацию
экспериментальной ДНК [Baiborodin etal., 1993;
Baricheva et al., 1996]. Район взаимодействия
с ламином (между’ 595 и 919 п.н.) включает че-
тыре тандемных повтора, состоящих из кон-
стантной и вариабельной части. Каждый пов-
тор содержит АТАТТТ/С-бокс и последователь-
ность, гомологичную консенсусу связывания
топоизомеразы II. В вариабельной части повто-
ров встречаются поли(А)-поли(Т)-тракты. Таким
образом, в состав прицентромерного |3-гетеро-
хроматина D. melanogaster, связанного с ядерной
оболочкой, входят повторы, способные к прямым
взаимодействиям с белком оболочки ламином.
6.3. Пространственная организация ядер
КЛЕТОК ДВУКРЫЛЫХ НАСЕКОМЫХ
6.3.1. Внутриядерная архитектура
трофоцитов яичников малярийных
комаров Anopheles
Значение пространственной организации хро-
мосом в процессе видообразования и макроэво-
люционных событиях до сих пор не определено.
Однако существуют свидетельства о том, что
положение хромосом в ядрах трофоцитов яич-
ников у малярийных комаров Anopheles ком-
плекса «.maculipennis» имеет видоспецифичный
характер [Стегний, 1979]. На Calliphora erithro-
cephala показано, что характерное для данного
вида пространственное распределение хромосом
в трофоцитах яичников сохраняется на всех ста-
диях развития фолликула [Ананьина и др., 2005].
Эти данные позволяют предположить, что в
клетках зародышевого пути архитектура хромо-
сом статична и является наследственным при-
знаком. У малярийных комаров видоспецифич-
ный характер организации архитектуры ядра
имеет место только для трофоцитов, в то время
как в клетках слюнных желез и мальпигиевых
сосудов хромосомы, объединенные в хромоцентр
у всех близкородственных видов комаров, не де-
монстрируют такой особенности |Стегний. 1979].
Существуют следующие видовые критерии,
касающиеся пространственной организации тро-
фоцитов малярийных комаров: 1) наличие либо
отсутствие связей хромосом с ядерной оболоч-
кой и локализация мест контактов на хромосо-
мах; 2) морфология хромосомных участков при-
крепления; 3) разобщенность локусов прикреп-
ления гомологичных хромосом у близких видов
на ядерной оболочке: 4) наличие—отсутствие
локального или диффузного хромоцентра. Гомо-
секвентные виды малярийных комаров дискрет-
но различаются по вышеперечисленным крите-
риям. Согласно предположению В. Н. Стегния
11993], перестройка архитектуры интерфазного
ядра клеток генеративной системы является од-
ним из условий видообразования.
Малярийные комары рода Anopheles (от-
ряд Diptera; семейство Culicidae, подсемейство
Anophelinae) являются удобным объектом для
изучения механизмов видообразования. Род
Anopheles, представители которого обитают по-
всеместно, за исключением пустынь и крайних
широт, представляет собой разветвленную сис-
тему' подродов, видовых подгрупп и комплексов.
К настоящему’ моменту насчитывается 474 вида,
входящих в состав шести подродов (Anopheles,
Cellia, Kerteszia, Lophopodomyia, Nyssorhynchus и
Stethomyia) [Knight, Stone, 1977].
Наличие у малярийных комаров рода Anop-
heles в ядрах трофоцитов яичников имаго и в
ядрах слюнных желез личинок хорошо структу-
рированных политенных хромосом позволяет
легко картировать последовательности ДНК с
помощью in situ гибридизации. Дисковый рису-
нок политенных хромосом является хорошим
маркером для установления видового статуса не
различимых по морфологии видов-двойников в
комплексах «.gambiae», «pseudopunctipennis» и
«maculipenrris».
В ядрах соматических клеток гетерохромати-
ческие области политенных хромосом контакти-
руют между собой, образуя единый хромоцентр.
В клетках генеративной системы гетерохрома-
тические районы отличаются большей степенью
политении и не образуют хромоцентр [Стегний,
1987]. Различия в прикреплении гетерохромати-
на к ядерной оболочке обусловливают уникаль-
ность пространственной организации ядра у ка-
ждого из видов малярийных комаров [Стегний,
ГЛАВА 6 157
1979]. Как и у Drosophila, в политенных хромо-
сомах трофоцитов Anopheles выделяют а- и [>-
гетерохроматин. а-Гетерохроматин имеет блоч-
ную организацию, а Р-гетерохроматин имеет на-
рушенную дисковую исчерченность [Шарахова
и др., 1997].
Комплекс «maculipennis» включает в себя че-
тырнадцать видов малярийных комаров. Все ви-
ды этого комплекса имеют сходные по дисково-
му’ рисунку' хромосомы, однако пространствен-
ная организация хромосом в ядре четко различа-
ется. Рассмотрим пять видов этого комплекса —
An. messeae. An. atroparvus, An. heklemishevi.
An. maculipennis и An. melanoon.
Х-хромосома Ал. messeae (рис. 6.8) жестко свя-
зана с ядерной оболочкой районом 2Ь—с. Мор-
фологически этот район соответствует |3-гете-
рохроматину [Стегний, 1991], также в нем найде-
ны повторенные последовательности ДНК [Стег-
ний, Шарахова, 1990].
В прицентромерном районе 5Ь, так же как и у
An. heklemishevi, формируется а-гетерохромати-
новый блок, но он значительно крупнее, чем у
последнего. Хромосома 2 не имеет облигатных
связей с ядерной оболочкой и свободно распо-
ложена в пространстве ядра. В прицентромерном
районе этой хромосомы отмечаются асинапсис го-
мологов и крупный а-гетерохроматиновый блок,
размеры которого варьируют в популяциях
An. messeae. Хромосома 3 жестко крепится к
ядерной оболочке — при этом наблюдается рас-
хождение гомологов обоих плеч, а также их раз-
общение в пространстве ядра [Стегний, 1979].
Х-хромосома An. atroparvus (рис. 6.9) крепит-
ся к ядерной оболочке прицентромерной обла-
стью, которая имеет морфологию |3-гетерохрома-
тина. Часто при этом гомологи в данном районе
разобщены [Стегний, 1993].
Хромосома 2 не имеет облигатного прикреп-
ления к оболочке ядра и свободно расположена в
его пространстве. Хромосома 3, как и у преды-
дущих двух видов, имеет жесткое крепление к
ядерной оболочке прицентромерным районом
[Стегний, 1993; Шарахова и др., 1997].
Х-хромосома Ли. heklemishevi (рис. 6.10) име-
ет локальную эктопическую связь с ядерной обо-
лочкой блоком интеркалярного гетерохроматина
в участке 2Ь. В прицентромерном районе 5Ь этой
хромосомы расположен крупный гетерохрома-
тиновый блок, который всегда связан с ядрыш-
ком. Хромосома 2 жестко крепится к ядерной
оболочке прицентромерными участками левого
и правого плечей, при этом гомологи в про-
странстве разобщены. В прицентромерном рай-
оне 15d левого плеча наблюдаются блоки а-гете-
рохроматина. Хромосома 3 также облигатно кре-
пится к оболочке прицентромерным районом,
причем левое плечо асинаптирует, а правое име-
ет более локальную область контакта с ядерной
оболочкой. В правом плече в участке 32d, как и
у всех видов комплекса, расположен блок а-гете-
рохроматина [Стегний, 1993].
Хромосома X An. maculipennis (рис. 6.11)
имеет жесткое крепление к ядерной оболочке в
Рис. 6.8. Хромосомы трофоцитов An. messeae.
С — центромера; стрелкой указаны районы прикрепления хро-
мосом к ядерной оболочке [Стегний, 1993 с модификациями].
Рис. 6.9. Хромосомы трофоцитов An. atroparvus.
С — центромера; стрелкой указаны районы прикрепления хро-
мосом к ядерной оболочке [Стегний, 1993 с модификациями].
158 ЭПИГЕНЕТИКА
Рис. 6.10. Хромосомы трофоцитов An. beklemishevi.
С — центромера; стрелкой указаны районы прикрепления хро-
мосом к ядерной оболочке [Стегний, 1993 с модификациями].
прицентромерном районе. В месте крепления
конъюгация гомологов исчезает, в отличие от
XL-хромосомы An. atroparvus. Район прикрепле-
ния этой хромосомы у An. maculipennis отлича-
ется от An. atroparvus, так как в прицентромер-
ном районе первого можно наблюдать а-гете-
рохроматические блоки.
Хромосома 2 подобна An. messeae с a-гетеро-
хроматическими блоками в центромере. Хромо-
сома 3 жестко крепится к ядерной оболочке
[Стегний, 1993].
У An. melanoon XL-хромосома (рис. 6.12) во-
все не имеет жесткого контакта с оболочкой яд-
ра, а в прицентромерном районе находится а-ге-
терохроматиновый блок. Хромосома 2 сходна с
таковыми у An. maculipennis и An. messeae. но
выраженного a-гетерохроматического блока в
прицентромерном районе у An. melanoon нет.
Хромосома 3 жестко крепится к ядерной обо-
лочке [Стегний, 1993].
Области крепления хромосом к ядерной обо-
лочке имеют морфологию [З-гетерохроматина.
С изменениями в структуре этих районов связы-
вают эволюционные преобразования в комплек-
се «maculipennis» [Шарахова и др., 1997].
Оказалось, что наибольшее количество высо-
коповторяющихся последовательностей локали-
зовано в прицентромерных районах хромосом
An. messeae (5b, 14b—с, 15d, 32с—d, 33b—с),
меньшее количество — в теломерных участках
(1а, 6а—Ь, 21а—Ь, 22а, 39а), но преимуществен-
но в хромосомах X и 3R. Небольшое количество
Рис. 6.11. Хромосомы трофоцитов An. maculipennis.
С — центромера; стрелкой указаны районы прикрепления хро-
мосом к ядерной оболочке [Стегний, 1993 с модификациями].
сайтов локализации повторов находятся в ука-
занных районах: XL — 2а—b, ЗЬ, 4а, 5а; 2R —
7Ь—с, 10а—b, 11b—с, 12с, 13b, 14b; 2L —21с,
20с, 19а, 18b, 15а; 3R — 23а, 23с, 26а—с, 30с,
31b—с; 3L — 39d, 39е, 38с, 37b, 35а—с, 34а, 34b.
Исследование молекулярно-генетической ор-
ганизации гетерохроматина малярийных кома-
ров комплекса «maculipennis» было проведено
О. L. Грушко с соавторами [Грушко и др., 2004;
Grushko et al.. 2009]. В работе анализировали
первичную последовательность прицентромер-
ного района хромосомы 2 An. atroparvus [Груш-
ко и др., 2004]. Показано, что ДНК An. atro-
parvus прицентромерного гетерохроматина хро-
ГЛАВА 6 159
мосомы 2 является АТ-богатой (содержание пар
А-Т превышает 50 %). Повторы, содержащиеся в
этом участке ДНК, различаются как по последо-
вательности, так и по копийности. Кроме того,
немаловажно, что ДНК этого района содержит
последовательности, взаимодействующие с бел-
ками ядерного матрикса. Известно, что хромо-
сома 2 не крепится к оболочке ядра, однако об-
наружены последовательности, имеющие срод-
ство к белкам ядерной ламины. Анализ резуль-
татов FISH отдельных клонов из прицентромер-
ного района хромосомы 2 с хромосомами видов
комплекса показал сложность организации гете-
рохроматических районов, имеющих морфоло-
гию Р-гетерохроматина.
Авторами сделано предположение о том, что
гетерохроматин в таких районах состоит из по-
следовательностей, универсальных для прицен-
тромерных районов всех хромосом вида, хромо-
сомспецифичных последовательностей, обнару-
живаемых только в отдельных хромосомах, и
последовательностей, локализованных только в
отдельных сайтах некоторых хромосом, но не во
всех хромосомах [Grushko et al., 2009].
6.3.2. Межвидовые различия взаимного
расположения политенных
хромосом трофоцитов яичников
Drosophila в подгруппе melanogaster
Подгруппа melanogaster включает девять ви-
дов Drosophila'. D. orena, D. erecta, D. teissieri,
D. yakiiba, D. santomea, D. melanogaster, D. simu-
lans, D. sechellia, D. mauritiana. В свою очередь
эти девять видов подгруппы melanogaster были
сгруппированы в два комплекса: комплекс «me-
lanogaster», включающий D. melanogaster, D. si-
mulans, D. sechellia, D. mauritiana, и комплекс
«yakiiba». включающий D. orena. D. erecta. D. teis-
sieri, D. yakiiba, D. santomea [Ashbumer, 1989;
Lachaise, Benassi, 2000].
Комплекс «melanogaster». Анализ простран-
ственного расположения первичных политенных
хромосом трофоцитов яичников D. melanogaster,
D. simulans, D. mauritiana показал, что ни у од-
ного из видов нет локального хромоцентра, по-
добного хромоцентру хромосом слюнных желез,
и отдельные хромосомы рассредоточены в про-
странстве ядра. Вместе с тем каждый из видов
имеет характерные видоспецифичные особенно-
сти архитектоники хромосом трофоцитов.
Наиболее резко отличается от других видов
D. mauritiana тем, что хромосома 3 имеет жестко
объединенные в центромерном районе плечи
Рис. 6.12. Хромосомы трофоцитов An. те/апооп.
С — центромера; стрелкой указаны районы прикрепления хро-
мосом к ядерной оболочке [Стегний, 1993 с модификациями].
и яркий блок центромерного гетерохроматина.
У D. simulans, D. sechellia и D. melanogaster хро-
мосома 3 имеет разобщенные плечи. Локального
хромоцентра нет ни у одного вида, однако D. si-
mulans и D. sechellia имеют растянутый по ядер-
ной оболочке «мостик», объединяющий все
хромосомные плечи по центромерным участкам.
У D. melanogaster все хромосомные плечи связа-
ны с оболочкой ядра центромерными участками,
однако видимой связи их между собой не обна-
ружено [Стегний, Вассерлауф, 1994].
Анализ межвидовых гибридов показал, что
спаривание гомеологов сильно нарушается и не-
сконъюгированными могут быть центромерные
районы или же целиком хромосомные плечи.
У гибрида, полученного от скрещивания D. mau-
ritiana и D. simulans, наблюдается объединение
центромерных участков гомеологов simulans в
центромерный «мостик», характерный для дан-
ного вида. Гомеологи mauritiana в центромерной
части не обнаруживают объединения.
Таким образом, в гибридной конфигурации
сохраняются видоспецифичные позиции хромо-
сомных плеч. Гибрид, полученный от скрещива-
ния D. simulans и D. melanogaster, показывает
отсутствие коньюгации между’ гомеологами и их
рассредоточенность в пространстве ядра.
Таким образом, анализ первичных политен-
ных хромосом трофоцитов у видов и ряда меж-
видовых гибридов в комплексе «melanogaster»
160 ЭПИГЕНЕТИКА
показал, что пространственная организация хро-
мосом является видоспецифичным признаком.
Основные показатели видоспецифичности
архитектоники хромосом связаны:
1) с наличием или отсутствием связи опреде-
ленных хромосом с ядерной оболочкой;
2) с разобщенностью мест прикрепления го-
меологичных хромосом на ядерной оболочке у
межвидовых гибридов;
3) с наличием или отсутствием локального
хромоцентра. [Стегний, 1993].
Комплекс «уакиЪа». Детальный анализ взаи-
морасположения первичных политенных хромо-
сом трофоцитов яичников D. arena. D. erecta,
D. teissieri, D. yakuba, D. santomea показал рез-
кие межвидовые различия [Вассерлауф, Стег-
ний, 1992; Усов и др., 2007].
D. огепа имеет типичную хромоцентральную
организацию хромосом с большим гетерохрома-
тическим блоком в центре, очевидно, представ-
ляющим собой XR-хромосому. Подобная ор-
ганизация первичных политенных хромосом
D. огепа резко выделяет этот вид как среди дру-
гих видов данного комплекса, так и среди ос-
тальных членов подгруппы melanogaster [Вас-
серлауф, Стегний, 1992].
У D. erecta центромерные районы хромосом
разобщены между собой в отличие от D. огепа, но
объединены тонким хроматиновым «мостиком».
В отличие от D. erecta у D. teissieri плечи
хромосомы 3 объединены в центромерном рай-
оне, так же как и плечи хромосомы 2. У D. уа-
киЬа и D. santomea плечи хромосом 2 и 3 плотно
объединены в центромерах и отсутствует явная
связь хромосом между собой [Вассерлауф, Стег-
ний, 1992; Усов и др., 2007].
6.4. Молекулярно-генетическая организация
РАЙОНОВ ПРИКРЕПЛЕНИЯ ХРОМОСОМ
К ЯДЕРНОЙ ОБОЛОЧКЕ МАЛЯРИЙНЫХ
КОМАРОВ
6.4.1. Исследование локализации
последовательностей ДНК района
2Ь—с An. messeae на хромосомах
малярийных комаров Anopheles
комплекса «maculipennis»
Была поставлена задача — выявить, имеет ли
район прикрепления XL-хромосомы An. messeae
общие последовательности с районами прикреп-
ления хромосом.
В трофоцитах XL-хромосома An. messeae об-
разует контакт с ядерной оболочкой участком,
расположенным в районе 2Ь—с, который нахо-
дится в середине плеча, что отличает вид An. mes-
seae от других видов комплекса «maculipennis»
[Стегний, 1979]. Поиск гомологичных последо-
вательностей ДНК района 2Ь—с интересен тем,
что этот район прикрепления хромосомы распо-
лагается не в прицентромерной области, а зна-
чит, позволит провести анализ района, ответст-
венного за контакт с ядерной оболочкой «в чис-
том виде», исключив последовательности, ха-
рактерные для центромер.
Результаты FISH показали, что ДНК района
2Ь—с XL-хромосомы An. messeae локализова-
лась не только в районе 2Ь—с, но и в прицент-
ромерном районе хромосомы XL An. messeae
(рис. 6.13). Подобная ситуация наблюдалась при
гибридизации этой ДНК с XL-хромосомой дру-
гих видов комплекса «.maculipennis». Сигнал
был обнаружен в районе, гомеологичном району
2Ь—с, а также прицентромерном районе хромо-
сомы XL. В прицентромерном районе у An. bek-
lemishevi. An. atroparvus и An. melanoon сигнал
находился только в [(-гетерохроматине, а у An. ma-
culipennis и An. messeae — в [3- и а-гетерохро-
матине.
Интенсивный сигнал в гомеологичном району
2Ь—с An. messeae районе XL-хромосомы видов
комплекса «.maculipennis» позволяет провести
оценку происхождения района прикрепления
XL-хромосомы у An. messeae. Вероятно, об-
разование района прикрепления в середине пле-
ча хромосомы было обеспечено не переносом
инверсией из прицентромерной области, а воз-
никло в результате реорганизации последова-
тельности ДНК этого района.
Хромосома 2. У большинства изучаемых ви-
дов хромосома 2 не имеет связи с ядерной обо-
лочкой, но у An. heklemishevi она образует кон-
такт с оболочкой ядра в прицентромерной об-
ласти [Стегний, 1993]. Гомология ДНК 2Ь—с
Ал. messeae обнаружена с прицентромерным рай-
оном хромосомы 2 у всех видов (рис. 6.14). При
этом происходило мечение как |3-гетерохрома-
тина у An. heklemishevi, An. atroparvus и An. me-
lanoon, так и а- и [(-гетерохроматина у An. ma-
culipennis и An. messeae. Сигналы были обнару-
жены также в середине обоих плеч хромосомы 2
у всех видов.
Хромосома 3. В трофоцитах самок всех изу-
ченных видов хромосома 3 крепится к оболочке
ядра прицентромерными участками, и на препа-
ратах плечи этой хромосомы лежат отдельно
друг от друга [Стегний, 1993]. В прицентромер-
ном районе правого плеча хромосомы 3 помети-
ГЛАВА 6 161
TAMRA
DAPI
TAMRA
DAPI
TAMRA
DAPI
2 b—с
5 а—b
С
5Ь
5b
20 мкм
20 мкм
20 мкм
5Ь
TAMRA
DAPI
TAMRA
DAPI
20 мкм
4 *
С
Ь—с
20 мкм
Рис. 6.13. Локализация ДНК рай-
она 2b—с XL-хромосомы An. me-
sseae на XL-хромосоме трофоци-
тов комаров комплекса «maculi-
pennis».
а — An. messeae', б—An. atroparvus',
в — An. beklemishevi; г — An. maculi-
pennis', д — An. melanoon', С — цент-
ромера; стрелка синего цвета указы-
вает на сигнал в районе прикрепле-
ния хромосомы; * — на сигнал в а-ге-
терохроматине.
20 мкм
14d
Рис. 6.14. Локализация ДНК рай-
она 2Ь—с XL-хромосомы An. mes-
seae на хромосоме 2 трофоцитов
комаров комплекса «maculipennis».
а — An. messeae; б — An. atroparvus;
в — An. beklemishevi; г — An. maculi-
pennis; д — An. melanoon; С — цент-
ромера; стрелка синего цвета указы-
вает на сигнал в районе прикрепле-
ния хромосомы; * — на сигнал в а-ге-
терохроматине.
TAMRA
DAPI
2R
162 ЭПИГЕНЕТИКА
лись тяжи района 32d (район прикрепления хро-
мосомы 3R к оболочке ядра у всех видов кома-
ров комплекса «maculipennis»). У An. melanoon.
An. atroparvus и An. beklemishevi был также об-
наружен сигнал в районе 32d дистальнее а-гете-
рохроматического блока (рис. 6.15). У Ап. таси-
liennis и An. messeae таких сигналов обнаружено
не было. Однако лишь у этих двух видов проис-
ходила гибридизация с а-гетерохроматическим
блоком района 32d.
В левом плече хромосомы 3 был обнаружен
сигнал в прицентромерном районе 33а—с, кото-
рым плечо крепится к ядерной оболочке
(рис. 6.16). Сигналы можно было наблюдать в
районах интеркалярного а-гетерохроматина у
An. beklemishevi (35b), An. atroparvus (35b), An.
melanoon (34b) nAn. maculipennis (34b).
Флуоресцентная in situ гибридизация ДНК
района прикрепления XL-хромосомы An. mes-
seae с хромосомами того же вида и видов ком-
плекса «maculipennis» показала, что этот район
характеризуют последовательности, не являю-
щиеся универсальными в определении способ-
ности хромосомы XL или прочих хромосом ка-
риотипа образовывать контакт с ядерной обо-
лочкой в трофоцитах. Доказательством этому’
утверждению служат: 1) отсутствие сигнала в
районах прикрепления XL-хромосомы An. bek-
lemishevi и 3L-xpoMoeoM An. maculipennis и
An. melanoon', 2) наличие сигнала в инертных по
отношению к ядерной оболочке XL-хромосоме
An. maculipennis и хромосомах 2 An. atroparvus
An. messeae, An. melanoon и An. maculipennis.
FISH ДНК района 2Ь—с An. messeae с хромо-
сомами трофоцитов видов комплекса «maculi-
pennis» позволил провести сравнительный ана-
лиз, иллюстрирующий различие в распределе-
нии повторенных последовательностей ДНК на
хромосомах близкородственных видов малярий-
ных комаров. Анализ нуклеотидной последова-
тельности ДНК этого района показал высокое
содержание в нем мобильных генетических эле-
ментов (МГЭ). СатДНК и генов было выявлено
небольшое количество. Характерное для маля-
рийных комаров высокое содержание МГЭ в ге-
терохроматине, их локализация преимуществен-
но в P-гетерохроматине [Holt et al., 2002], а так-
же большое количество МГЭ в библиотеке кло-
нов района 2Ь—с An. messeae позволяет предпо-
ложить, что в эксперименте FISH главным обра-
зом наблюдали локализацию МГЭ. Таким обра-
зом, можно утверждать о тенденции к аккумуля-
ции МГЭ в прицентромерных районах. Так, у эво-
люционно исходного вида An. atroparvus МГЭ
32d
20 мкм
TAMRA
DAPI
TAMRA
DAPI
TAMRA
DAPI
32d
32d
20 мкм
20 мкм
32d
20 мкм
20 мкм
TAMRA
DAPI
ф TAMRA
DAPI
Рис. 6.15. Локализация ДНК рай-
она 2b—с XL-хромосомы An. mes-
seae на 3R хромосоме трофоци-
тов комаров комплекса «maculi-
pennis».
a — An. messeae', б—An. atroparvus',
в — An. beklemishevi', г — An. maculi-
pennis', d — An. melanoon', C — цент-
ромера; стрелка синего цвета указы-
вает на сигнал в районе прикрепле-
ния хромосомы; * — на сигнал в а-ге-
терохроматине.
32d
ГЛАВА 6 163
TAMRA
DAPI
С
33c
sZ.
33с
35b
*
TAMRA
DAPI
20 мкм
* 35b
TAMRA
DAPI
20 мкм
20 мкм
TAMRA
DAPI
34b
20 мкм
20 мкм
TAMRA
DAPI
Рис. 6.16. Локализация ДНК рай-
она 2b—с XL-хромосомы An. mes-
seae на ЗЬ-хромосоме трофоци-
тов комаров комплекса «maculi-
pennis».
а — An. messeae; б — An. atroparvus;
в — An. beklemishevi; г — An. maculi-
pennis; д — An. melanoon; С — цент-
ромера; стрелка синего цвета указы-
вает на сигнал в районе прикрепле-
ния хромосомы; * — на сигнал в а-ге-
терохроматине.
можно было обнаружить в середине плеч, преж-
де всего хромосом 3 и XL, у An. melanoon коли-
чество идентифицированных встроек вдоль пле-
чей было меньше, и, наконец, у «молодого» вида
An. messeae такие повторы локализовались, пре-
жде всего, в а-гетерохроматине хромосом XL,
2 и 3R. Возможно, что возникновение в филоге-
незе «новых» а-гетерохроматиновых блоков свя-
зано с перемещением МГЭ в прицентромерные
районы.
6.4.2. Анализ нуклеотидной
последовательности ДНК
района прикрепления хромосомы
XL к оболочке ядра в трофоцитах
Ап. messeae
Общая протяженность области, первичная по-
следовательность которой была определена, со-
ставляет около 72 т.п.н. Обнаружено, что район
2Ь—с представляют АТ-богатые последователь-
ности (содержание АТ-пар — 58 %). Последова-
тельность ДНК этого района анализировали
на предмет умеренных повторов, сатДНК, ге-
нов, SAR/MAR-элементов и последовательно-
стей, способных связываться с белками ядерных
структур.
В изучаемом районе были выявлены все клас-
сы нуклеотидных последовательностей. Тандем-
ных повторов обнаружено мало (табл. 6.2). Сре-
ди них выявлены микросаттелиты (Mes2b—
с_273, Mes2b—с_426, Mes2b—с_430) и миниса-
теллиты (Mes2b—с_2, Mes2b—с_157, Mes2b—
с_229, Mes2b—с_273, Mes2b—с_353).
Сателлитов обнаружить не удалось, видимо,
по той причине, что анализу подвергались фраг-
менты, по длине не превышающие в среднем
250 т.п.н. Следует обратить внимание, что тан-
демные повторы, входящие в состав клонов
Mes2b—с_2, Mes2b—с_157, Mes2b—с_175,
Mes2b—с_229 и Mes2b—с_273, имеют мотивы
AAG/AAAG/ AAAAG/AAAAAG, которые по-
добны описанному’ консенсусу для ДНК ядерной
ламины гепатоцитов мыши — AAAAG [Шаба-
ринаи др., 2006].
Анализ показал высокое разнообразие МГЭ
(табл. 6.3). Были обнаружены LTR-ретротранс-
позоны и LINE-элементы, а также транспозо-
ны, перемещающиеся по принципу «вырезания-
встройки». Однако SINE, MITE и гелитроны
в районе 2Ь—с не найдены.
Были выявлены характерные для An. gambiae
LINE-элемент CR1-4 AG (семейство CR1), рет-
ротранспозон Outcast из той же группы, LTR-
164 ЭПИГЕНЕТИКА
Таблица 6.2
Тандемные повторы района 2Ь—с An. messeae
Клон 2Ь—с An. messeae Последовательность консенсуса Длина консенсуса Число повторов
Mes2b—с_2 AGGAAGAAAACAG 13 2
GAAAGGAGAAA 11 2,6
Mes2b—с_157 TTATGATGAAAAAG 14 1,9
Mes2b—с_229 GAAGTATGAAAGA 13 3,8
Mes2b—с_273 AAAG 4 8,8
AAAGAAAGAACGAAAG 16 2,2
Mes2b—c_353 TTTTGTTTTGTTTGG 15 1,9
Mes2b—c_426 TAC 3 40,7
Mes2b—c_430 TO 2 13,5
ретротранспозоны Gypsy43-I AG-int (семейство
Gypsy). BEL13-IAG (семейство BEL) и AGML
Среди транспозонов, типичных для An. gambiae,
выявлен транспозон P1AG. Найдено также боль-
шое разнообразие МГЭ, описанных у представи-
телей одноклеточных, позвоночных, растений и
других таксонов. Характерными для района 2Ь—
с An. messeae оказались типичные для позвоноч-
ных животных, в том числе Homo sapiens, рет-
ротранспозоны L1 и L2A. В районе 2Ь—с были
обнаружены также ретротранспозон TONT1LE I
и транспозоны EnSpm-3_HV, EnSpm-6_VV,
MUDSOLT1, описанные у растений. Представ-
ленные МГЭ имеют довольно низкую степень
дивергенции с обнаруженными у An. messeae,
даже по сравнению с мобильными элементами
семейства Gypsy An. gambiae. Возможно, что
присутствие в изучаемом районе данных МГЭ
связано с явлением «горизонтального переноса».
Поиск уникальных последовательностей в
районе 2Ь—с An. messeae показал крайнюю
обедненность его генами (табл. 6.4). Найденные
уникальные последовательности оказались го-
мологичны генам An. gambiae, функция которых
Таблица 6.3
Мобильные элементы района 2Ь—с XL-хромосомы An. messeae
Семейство МГЭ МГЭ/организм Гомология, %
L1 L1_SS, L1MC4_5end, L1_Mur2_orf2, L1MA6, L1MB3_EC, L1MB, L1MEC_5, L1HS, L1-2_Ttr, L1MEf_5end/Eutheria 75—91
CR1 L2A/Eutheria 66
ш CR1-4_AG/Anopheles gambiae 66—71
—1 RTE RTE-9_SP/Strongylocentrotus purpuratus 88; 91
Penelope Penelope-13_HMI Hydra magnipapillata 91
R4 Outcast EhRLE2/Entamoet>a histolytica Outcast/Anopheles gambiae 72
LTR/Gypsy Gypsy43-l_AG-int/Anopfte/es gambiae 70
££ LTR/BEL BEL13-l_AG/Anop/ie/es gambiae 65; 71
1— —1 LTR TONT1_LE_l/So/anum lycopersicum AGMtIAnopheles gambiae 79; 67
ERV/ERV1 HARLEQUIN, ZFERV-2-l_DR/Chordata 72; 80
EnSpm ENSPM-6_DR, EnSpm-3_HV, EnSpm-6_VV/Dan/o rerio, Triticeae, V7t/s vinifera 67—83
Z DNA/P P1_AG/Anopheles gambiae 89—94
о со Sola Sola1-7_AP, Sola1-9_AP lAcyrthosiphon pisum 91; 72
О с о Polinton Polinton-2_NV//\/ematoste//a vectensis 72
X 05 MuDR MUDSOLT1/So/anum tuberosum 76
Q. 1- hAT CHARLIE3/Eutheria 86
Chapaev Chapaev3-2_AC/O/yz/as latipes 69
piggyBac/Looper LOOPERN2_DR/Dan/o rerio 72
ГЛАВА 6 165
Таблица 6.4
Генетический состав района 2Ь—с An. messeae
Клон 2Ь—с An. messeae Г омолог у An. gambiae Ортолог у D. melanogaster
Ген E-value Хр-ма/район
Mes2b—с_144 AAGAP000357 5,5е-07 XL/3B —
Mes2b—с_198 AAGAP006662 2е-10 2L/25D CG3165
Mes2b—с_255 AAGAP001531 3е-23 2R/8B CG6125
М es2 b—с 26 3 AAGAP005897 Зе-04 2L/23C CG5087
Mes2b—с_425 AAGAP000621 2е-47 Х/1С, X/5D CG3108
неизвестна. Однако, для большинства генов бы-
ли определены ортологи у D. melanogaster.
Подводя итог оценки состава ДНК района
прикрепления XL-хромосомы An. messeae. сле-
дует отметить, что тандемные повторы и гены
образуют незначительную часть района 2Ь—с.
Наиболее значительную фракцию анализируе-
мого района составляют МГЭ всех классов за
исключением MITE, SINE и гелитронов.
6.4.3. Поиск общих последовательностей
ДНК в районах прикрепления XL-
и 3R-хромос ом An. messeae
Последовательность ДНК районов прикреп-
ления хромосом трофоцитов малярийных кома-
ров имеет сложную организацию. Вероятно, та-
кие районы образуют последовательности, ти-
пичные для гетерохроматина, и последователь-
ности, определяющие функцию контакта хромо-
сомы с ядерной оболочкой. Для выявления по-
следовательностей, принадлежащих ко второй
группе, был использован подход, позволяющий
провести скрининг библиотеки клонов района
2Ь—с An. messeae с использованием ДНК района
прикрепления хромосомы 3R An. messeae (район
32d). В результате эксперимента было показа-
но, что общими для районов 2Ь—с и 32d An. mes-
seae являются последовательности МГЭ типа
DOC6 DM, ретротранспозоны семейств L1 и Erv
(табл. 6.5). Последовательность клона Mes2b—
с_403. которая представлена в прицентромерных
районах хромосом X, 2L, 2R и некартированных
сайтах An. gambiae, имеет свойство образовы-
вать контакт с ядерной ламиной. Однако с боль-
шей достоверностью ДНК ядерной ламины вы-
Таблица 6.5
Характеристика гомологичных последовательностей районов прикрепления хромосом XL и 3R
An. messeae
Клон 2Ь—с An. messeae МГЭ Взаимодействие с белками или SAR/MAR
Название Гомология, %
Mes2b—с_18 DOC6_DM 44 СК, SAR/MAR
Mes2b—с_346 L1MC4_5end 85 Ядерная ламина
М es2 b—с 3 8 3 HARLEQUIN 72 Ядерный матрикс, ядерная ламина
Mes2b—с_390 L1HS 91 Ядерный матрикс
Mes2b—с_417 L1MEf_5end 75 -
Mes2b—с_431 Тандемные n Консенсус AAAACACATT овторы Период/Score 2,2/35 Ядерный матрикс
Mes2b—с_204 Mes2b—с_277 Mes2b—c_395 Mes2b—c_432 Mes2b—c_403 Mes2b—c_455 Другие последов ательности Ядерный матрикс, SAR/MAR СК Ядерный матрикс SAR/MAR Ядерная ламина Ядерный матрикс
Примечание. СК — синаптонемальный комплекс
166 ЭПИГЕНЕТИКА
являлась в клонах, содержащих МГЭ LlMC4_5end
и HARLEQUIN. Все клоны, кроме Mes2b—с_417,
обладают свойствами потенциального взаимо-
действия с ядерными и хромосомными структу-
рами.
Таким образом, удалось выявить двенадцать
клонов, общих для районов прикрепления хро-
мосом XL и 3R An. messeae. Они представляли
собой МГЭ и тандемные повторы. 90 % получен-
ных клонов способны взаимодействовать с бел-
ками внутриядерных структур.
6.4.4. Поиск хромосомспецифичных
последовательностей ДНК
в районах прикрепления
XL-хромосомы у An. messeae
и An. atroparvus
Для поиска эволюционно консервативных
элементов, которые характеризуют районы при-
крепления XL-хромосом, был проведен скри-
нинг библиотеки клонов 2Ь—с An. messeae с по-
мощью ДНК-пробы района прикрепления XL-
хромосомы An. atroparvus (район 5а). LISH ДНК
района 2Ь—с An. messeae с хромосомами An. at-
roparvus показал его гомологию с районом 5а.
В результате скрининга выявлено одиннадцать
последовательностей, среди которых отсутст-
вовали кодирующие белки (табл. 6.6). Около по-
ловины выявленных клонов представляли со-
бой ретротранспозоны и лишь в одном клоне
(Mes2b—с_199) был найден тандемный повтор.
Большинство фрагментов после анализа в про-
грамме ChrClass было отнесено к классу взаимо-
действующих с белками розеткоподобных струк-
тур и внутриядерным матриксом фибриллярно-
гранулярной сети. В ходе анализа были найдены
клоны, характерные для 2Ь—с An. messeae, 32d
An. messeae и 5a An. atroparvus — Mes2b—c_390,
Mes2b—c_395 и Mes2b—c_417. Mes2b—c_390 и
Mes2b—c_417 представляют собой LINE-рет-
ротранспозоны, а последовательность Mes2b—
c_395 способна потенциально взаимодейство-
вать с белками ядерного матрикса.
6.5. Молекулярно-цитогенетическая
ХАРАКТЕРИСТИКА ПРИЦЕНТРОМЕРНОГО
ГЕТЕРОХРОМАТИНА У БЛИЗКОРОДСТВЕННЫХ
ВИДОВ ПОДГРУППЫ «MELANOGASTER» РОДА
Drosophila
6.5.1. Получение районоспецифичной
библиотеки ДНК хромоцентра
первичных политенных хромосом
трофоцитов яичников D. огепа
С использованием метода микродиссекции
политенных хромосом [Рубцов и др., 1999] было
вырезано четыре хромоцентра с двух препара-
тов политенных хромосом трофоцитов яичников
D. огепа. Диссектированный район представлен
на рис. 6.17. Затем диссектированный материал
амплифицировали с помощью ПЦР с частично
вырожденным праймером (DOP-ПЦР) и получи-
Таблица 6.6
Характеристика последовательностей, общих для районов прикрепления хромосомы XL An. messeae и
An. atroparvus
Клон 2Ь—с An. messeae МГЭ Взаимодействие с белками или SAR/MAR
Название Гомология, %
Mes2b—с_3 Gypsy43-l_AG-int 70,79 Ядерная ламина
Mes2b—с_243 ERV3 90,62 —
Mes2b—с_390 L1HS 91,20 Ядерный матрикс
Mes2b—с_417 L1MEf_5end 75,00 —
Mes2b—c_199 Тандемнь Консенсус TTTTTTC е повторы Период/Score 2,9/33
Mes2b—c_153 Mes2b—c_158 Mes2b—c_195 Mes2b—c 337 Mes2b—c_395 Mes2b—c_418 Другие после/ довательности Ядерная ламина Ядерный матрикс Ядерный матрикс Ядерный матрикс Ядерный матрикс Ядерный матрикс
ГЛАВА 6 167
ли смесь фрагментов (районоспецифичную биб-
лиотеку’ ДНК) длиной от 200 до 1000 п.н., кото-
рой было присвоено имя «Dorel».
6.5.2. Анализ состава ДНК хромоцентра
первичных политенных хромосом
трофоцитов D. огепа
В результате клонирования в плазмидном
векторе фрагментов районоспецифичной биб-
лиотеки ДНК хромоцентра политенных хромо-
сом трофоцитов D. огепа было получено 133
клона. Далее было отобрано 76 клонов и прове-
дено их секвенирование. Общая длина просекве-
нированных фрагментов составила 23940 п.н.
Нуклеотидные последовательности фрагментов
библиотеки были опубликованы в базе данных
«GenBank» (режим доступа: http://www.ncbi.nlm.
nih.gov; индексы доступа с НМ594089 по
НМ594162). Затем эти фрагменты подверглись
анализу при помощи различных пакетов компь-
ютерных программ.
6.5.3. Анализ фрагментов библиотеки
на наличие внутренних тандемных
повторов
Известно, что короткие тандемные повторы
являются одним из основных составляющих
компонентов гетерохроматина [Plohl et al., 2008].
Поэтому’ все фрагменты библиотеки были про-
анализированы на наличие тандемных повторов
при помощи программы «Tandem Repeats Fin-
der» Program Version 4.00 [Benson, 1999]. В ре-
зультате внутри четырех фрагментов (1R, 6R,
P36F, P97F) были найдены тандемно повторен-
ные последовательности длиной от 14 до 38 п.н.,
причем фрагмент 6R содержал в себе два повто-
ра, вложенных один в другой. Консенсусная по-
следовательность и другие характеристики по-
второв представлены в табл. 6.7.
Рис. 6.17. Политенные хромосомы трофоцитов яични-
ков D. огепа.
Рамкой выделен микродиссектированный хромоцентр; XL, 2,
3 — политенные хромосомы.
Обнаруженные в составе фрагментов библио-
теки тандемные повторы относятся к минисател-
литам, согласно классификации тандемных по-
второв, приведенной в работе S. Wang с соавто-
рами [2008]. В результате анализа генома D. me-
lanogaster при помощи программы «Tandem Re-
peats Finder» были выявлены в довольно боль-
шом количестве различные микросателлиты,
минисателлиты и сателлиты [Ibid], в то время
как в составе библиотеки D. огепа при помощи
данной программы микросателлиты и сателлиты
обнаружить не удалось.
В целом, надо сказать, что тандемные повто-
ры могут составлять огромные по протяженно-
сти участки хромосом и гетерохроматина, но,
тем не менее, они были обнаружены только
внутри четырех из 76 проанализированных фраг-
ментов библиотеки ДНК «Dorel» (см. табл. 6.7).
Возможно, это связано с тем, что у D. огепа ко-
роткие тандемные повторы не занимают таких об-
ширных участков гетерохроматина, как у D. me-
lanogaster. Кроме того, гетерохроматин D. огепа
Таблица 6.7
Тандемные повторы в составе фрагментов библиотеки ДНК «Dorel»
Название фрагмента и его размер Размер повтора Количество копий повтора во фрагменте Консенсусная последовательность повтора
6R(193 п.н.) 19 3,5 TTTTGGATTAAATTTCAAA
6R 23 3,5 AGTTTTGGATTGAAATGTCTACA
P36F (283 п.н.) 38 2,1 TACGCTTTTTATGAAACAATATAGAAAAGTAGCAGAAGG
P97F (406 п.н.) 14 2,2 AATATTGACTACAG
1R (190 п.н.) 22 3,5 AGTTTTGGATTGAGATGTCACA
168 ЭПИГЕНЕТИКА
может содержать большое количество длинных
тандемных повторов, тогда как фрагменты биб-
лиотеки относительно небольшие по размеру
(в среднем 200—250 п.н.).
6.5.4. Анализ фрагментов библиотеки
ДНК «Dorel» на наличие гомологии
с известными повторенными
последовательностями из геномов
различных видов Drosophila
С использованием базы данных программы
«Repeat Masker» была найдена гомология 36
фрагментов библиотеки с различными классами
повторов (табл. 6.8). Среди найденных повторов:
один простой повтор — (TATATG)n; один фраг-
мент библиотеки имеет значимую гомологию с
сателлитом (SAR) D. melanogaster, один Т-бога-
тый повтор низкой сложности. Большинство
фрагментов библиотеки ДНК «Dorel» (33 фраг-
мента) показало значимую гомологию с фрагмен-
Таблица 6.8
Повторы в составе ДНК хромоцентра трофоцитов
D. огепа
Мобильные генетические элементы
LTR- ретротранспозон ы LINE ДНК- транспозоны
Семейство Gypsy. Gypsy 3_i; Gypsy 9_i; Gypsy4_l Gypsy 10_i; Gypsy J; IDEFIXJ; DM297J; STALKER 4_l; Quasimodo_l, ZAM_I; HMSBEAGLEJ; TV1J; QUASIMODO 2-IJDM Семейство Jockey. G3_DM; HELENA_RT Гелитроны: DNAREP1JDM; Helitron1_DYak
Семейство /: l_DM
Полинтоны: Polinton-1_DY
Семейство Roo: ROO_I Семейство Copia'. Copia_l Семейство Circe'. Circe Семейство CRT. DMCR1A
Повторы
Сателлит Простой повтор Т-богатый
SARJDM (TATATG)n повтор низкой сложности
тами известных мобильных элементов из геномов
других видов подгруппы «melanogaster».
Среди 33 фрагментов гомологичных участкам
различных МГЭ: 25 фрагментов были гомоло-
гичны участкам LTR-ретротранспозонов. 5 —
участкам LINE-элементов.
Для остальных показана значимая гомология
с участками ДНК-транспозонов, полинтонов и
гелитронов {Polintons и Helitrons) D. melanogas-
ter и других видов: DNAREPl DM, Polinton-lDY,
Helitron-1 DYak.
Известно, что среди основных классов МГЭ
как в эухроматинс. так и в гетерохроматине
D. melanogaster наиболее богато представлен
класс LTR-ретротранспозонов, в меньшей степе-
ни представлены LINE-элементы и менее всего
ДНК-транспозоны [Kaminker et al., 2002; Smith
etal., 2007]. Аналогичное соотношение классов
МГЭ характерно и для библиотеки ДНК хро-
моцентра D. orena.
Среди LTR-ретротранспозонов были обнару-
жены: gypsy (девять фрагментов). Ide fix (четыре
фрагмента), ZAM (три фрагмента), гоо (три фраг-
мента), Quasimodo (два фрагмента), Stalker 4 (два
фрагмента), HMSBeagle (один фрагмент), copia
(1 фрагмент), tvl (один фрагмент), circe (один
фрагмент). Пять фрагментов гомологичны участ-
кам He-LTR-ретротранспозонов (LlNE-элемен-
тов): crl (два фрагмента), G3, Helena, I (по од-
ному’ фрагменту’). Таким образом, библиотека
хромоцентра D. orena содержит значительное
количество различных представителей семейства
Gy/zsy, в то время как представители других се-
мейств МГЭ встречались в меньшей степени.
Кроме того, была найдена значимая гомоло-
гия фрагмента библиотеки «Dorel» с участком
одного из представителей недавно открытого
подкласса ДНК-транспозонов, названных полин-
тонами {Polintons) [Kapitonov, Jurka, 2006; Fes-
chotte et al., 2009]: Polinton-l DY D. yakiiba. По-
линтоны являются самыми сложными ДНК-
транспозонами эукариот, так, например, Polin-
ton-1 DY D. yakiiba имеет длину- 14782 п.н.
Также была найдена значимая гомология трех
фрагментов библиотеки с участками сравнитель-
но недавно открытых транспозонов, гелитронов
{Helitrons), которые даже предложили выделить
в отдельный подкласс ДНК-транспозонов [Fes-
chotte etal., 2009]: DNAREPl D. melanogaster
(два фрагмента) и Helitron-1 D. yakiiba (один
фрагмент). Присутствие элемента DNAREPl,
свойственного геному- D. melanogaster, в геноме
D. orena не является необычным, так как этот
элемент найден в геномах многих видов Dro-
ГЛАВА 6 169
sophila, геномы которых были частично или
полностью секвенированы. Но в то же время
DNAREP1 не был обнаружен за пределами отря-
да Diptera [Kapitonov, Jurka, 2007]. Известно, что
геном D. melanogaster содержит огромное коли-
чество копий DNAREPI — до нескольких ты-
сяч [Kapitonov, Jurka, 2003], однако подобной
обогащенности ДНК-библиотеки хромоцентра
D. огепа этим элементом найдено не было.
Интересно, что степень дивергенции консен-
сусных последовательностей элементов Polinton-
I DY и Helitron-1 D. yaknba и последовательно-
стей, найденных у D. огепа. очень низка (8,7 и
10,5 % соответственно), что, очевидно, связано с
филогенетической близостью D. огепа и D. ya-
knba.
6.5.5. Анализ фрагментов библиотеки
ДНК хромоцентра D. огепа на
наличие гомологии с известными
уникальными последовательно-
стями из геномов различных
видов Drosophila
Был осуществлен поиск гомологии фрагмен-
тов библиотеки D. огепа с уникальными после-
довательностями из полностью или частично
аннотированных геномов других видов Droso-
phila подгруппы «melanogaster» в базе данных
«FlyBase» при помощи программы «BLAST».
В результате было показано, что четыре фраг-
мента (P13F, P70F, P71F, P84F) имеют значимую
гомологию с аннотированными генами из гено-
мов видов подгруппы «melanogaster» (табл. 6.9).
Так как из всех видов подгруппы «melano-
gaster» полная нуклеотидная последователь-
ность генома была определена только у D. mela-
nogaster [Adams et al., 2000; Clark et al., 2007],
локализация генов до хромосомы (иногда до
района) возможна только для этого вида. В слу -
чае других видов гомологичный фрагменту’ уча-
сток удавалось локализовать в лучшем случае
до хромосомы, но чаще всего только до скэф-
фолда.
Фрагмент P70F гомологичен участкам ге-
нов D. melanogaster (CG41042-RA), D. yaknba
(GE22700-RA), D. erecta (GG23072-RA). Эти ге-
ны не имеют названия и занесены в базу’ данных
под номерами. Процессы и функции, за которые
отвечают эти гены, неизвестны, локализация из-
вестна только для гена D. yaknba (гетерохрома-
тин хромосомы 3).
Фрагмент P84F обнаружил значимую гомоло-
гию (E-valuc=3.4c 23) с участком гена GG23098
D. erecta. Локализация в геноме и функции этого
гена неизвестны.
Фрагмент P13F гомологичен участку гена
DIP1 {Disco Interacting Protein /). локализован-
ному у D. melanogaster в [З-гетерохроматине
Х-хромосомы (район 20А4—20А5). Было пока-
зано, что этот ген выполняет несколько функ-
ций. Так, например, продукт гена DIP1 участву-
ет в регуляции экспрессии гена Disco.
В свою очередь ген Disco кодирует белок, ко-
торый является фактором транскрипции [De-
Sousa et al., 2003]. Кроме того, установлено, что
белок DIP1 является компонентом ядерной обо-
лочки и прочно связан с додекасателлитом из при-
центромерного гетерохроматина хромосомы 3 D.
melanogaster [Felice et al., 2003]. Ортолог гена. DIP 1
был найден у A. gambiae (ENSANGG00000013542)
и£>. erecta (GG17525).
Таблица 6.9
Гомология фрагментов библиотеки ДНК «Dorel» с участками генов видов подгруппы melanogaster
Название фрагмента и его размер Ген Вид E-value Локализация
P13F (468 п.н.) DIP1-RA D. melanogaster 9.6 e-26 Х-хромосома, район 20A4-20A5
GE20549-RA D. yakuba 4.2 e-70 2L
GM16518-RA D. sechellia 6.9 e-72 Scaffold_26
P71F (227 п.н.) GD10382-RA D. simulans 2.8 e-74 2R
GG23178-RA D. erecta 3.9 e-101 Scaffold_4929
vlc-RA (vulcan) D. melanogaster 4.7 e-79 2Р-хромосома, район 41F8
CG41042-RA D. melanogaster 2.3 e-10 Неизвестна
P70F (241 п.н.) GG23072-RA D. erecta 1.9 e-32 Scaffold_4929
GE22700-RA D. yakuba 5.0 e-82 Гетерохроматин хромосомы 3
P84F (384 п.н.) GG23098 D. erecta 3.4 e-23 Scaffold_4929
Примечание. E-value — вероятность случайной гомологии.
170 ЭПИГЕНЕТИКА
Была также обнаружена значимая гомология
фрагмента P71F с участками генов D. melanogas-
ter (vulcari), D. erecta (GG23178-RA), D. sinrulans
(GD10382-RA), D. sechellia (GM16518-RA) и
D. yakuba (GE20549-RA) (см. табл. 6.9). Ген Vul-
can (vic) D. melanogaster расположен на пра-
вом плече хромосомы 2 (район 41F8) и участ-
вует в развитии конечностей из имагинальных
дисков и межклеточной сигнализации. Осо-
би, мутантные по этому гену, имеют дефор-
мированные конечности и гибнут на ранних
стадиях развития [Gates, Thummel, 2000]. Орто-
логи этого гена были найдены v A. gambiae
(ENSANGG00000004932.3), С. elegans (W03A5),
G. gallus (ENSGALG00000014796.2).
Интересно, что среди фрагментов библиотеки
хромоцентра D. огепа, представленных в табл. 6.8,
наиболее высокую степень гомологии (самое
низкое значение E-value) имеют фрагменты, го-
мологичные участкам генов D. erecta. Так, гомо-
логия фрагмента P70F с геном GG23072-RA бы-
ла 100 %, а в случае с геном GG23178-RA E-va-
lue была очень низкой — 3.9е 101. Этот факт
вполне объясним — согласно большинству схем
филогении подгруппы «melanogaster», D. erecta
является самым близким в филогенетическом
отношении видом к D. огепа [Lachaise et al.,
1988; Стегний, Вассерлауф, 1994; O'Grady et al.,
2001; Thomopoulos, 2004].
6.5.6. Распределение
последовательностей ДНК
из хромоцентра трофоцитов
D. огепа на первичных политенных
хромосомах трофоцитов
у близкородственных видов
подгруппы «melanogaster»
Материал «Dorel» был помечен Tamra-5'-
dUTP и использован в качестве ДНК-пробы для
гибридизации с политенными хромосомами тро-
фоцитов яичников видов подгруппы melanogas-
ter. D. orena, D. teissieri, D. yakuba, D. santomea,
D. erecta, D. melanogaster (линия Canton S), D. si-
mulans, D. mauritiana, D. sechellia. Изучение ло-
кализации пробы на хромосомах питающих кле-
ток яичников девяти видов подгруппы melano-
gaster показало следующее:
Комплекс «yakuba». У D. огепа последова-
тельности, гомологичные последовательностям
районоспецифичной пробы, помимо хромоцен-
тра были обнаружены в составе проксимальных
районов всех хромосомных плеч (рис. 6.18, г?).
Рис. 6.18. FISH ДНК-пробы из
хромоцентра D. огепа на поли-
тенные хромосомы трофоцитов
видов комплекса «уакиЬа».
а — D. огепа, б — D. erecta, в — D.
teissieri, г — D. yakuba, д — D. san-
tomea', XL, 2, 3 — политенные хромо-
сомы; С — центромерные районы;
Ch — хромоцентр; стрелкой указана
локализация пробы в субтеломерном
районе хромосомы 3.
ГЛАВА 6 171
У D. erecta кроме прицентромерных районов
последовательности хромоцентра присутствуют
в субтеломерном районе хромосомы 3. Степень
мечения прицентромерного района хромосомы 3
значительно выше, чем на других хромосомах.
Менее всего помстился прицентромерный район
Х-хромосомы (рис. 6.18, б).
D. teissieri, D. yakiiba, D. santomea имеют
сходную морфологию хромосом трофоцитов, у
всех этих видов сигнал обнаружен в прицентро-
мерном районе Х-хромосомы, в районах, приле-
гающих к плотным, ярко окрашивающимся
DAPI блокам прицентромерного гетерохромати-
на хромосом 2 и 3, причем на хромосоме 3 обна-
ружены два участка интенсивного мечения —
с каждой стороны от блока, а на хромосоме 2 —
один такой участок (рис. 6.18, в—д). У всех трех
видов в большей степени помстился прицентро-
мерный район хромосомы 3, а в меньшей — при-
центромерный район Х-хромосомы.
Комплекс «melanogaster». У D. melanogaster,
D. simulans. D. mauritiana. D. sechellia последо-
вательности хромоцентра D. orena были обна-
ружены в составе прицентромерных районов
всех хромосом (рис. 6.19, а—г). Однако наблю-
дались некоторые различия в локализации пробы
и в степени мечения прицентромерных районов
разных хромосом. Так у D. simulans и D. sechel-
lia самая высокая степень мечения характерна
для хромосомы 3. Кроме того, у D. simulans сиг-
нал не был обнаружен на одном из плеч хромо-
сомы 2 (см. рис. 6.19, а). У D. mauritiana степень
мечения прицентромерных районов хромосом 2
и 3 не отличается друг от друга, но заметно ниже
у Х-хромосомы (см. рис. 6.19, г). У D. melano-
gaster в целом прицентромерные районы всех
хромосом помстились в меньшей степени по
сравнению с остальными видами подгруппы
«melanogaster».
Кроме того, было изучено распределение
районоспецифичной ДНК-пробы из хромоцентра
D. огепа в пространстве ядер с ретикулярной
структурой у всех видов подгруппы «melanoga-
ster». В результате, у всех изученных видов,
кроме D. огепа, было отмечено диффузное рас-
пределение пробы в пространстве ядра с рстику-
лярной структурой (рис. 6.20, а). В качестве
примера приведено ядро трофоцита D. mauri-
tiana). У D. огепа, в отличие от всех остальных
видов, в ядрах с рстикулярной структурой мече-
ный хроматин выявлялся преимущественно в
пределах локальной территории (рис. 6.20, б).
Последовательности ДНК гетерохроматина
эволюционно лабильны и являются быстро изме-
няющейся частью генома эукариот, так как пред-
ставлены главным образом тандемными и дис-
пергированными повторами. Различия по количе-
ству гетерохроматина, а также по его распределе-
нию на хромосомах у близкородственных видов
встречаются довольно часто [Lohe, Roberts, 2000].
Размер генома у всех видов подгруппы
«melanogaster», за исключением D. огепа. разли-
Рис. 6.19. FISH ДНК-пробы из хро-
моцентра D. огепа на политенные
хромосомы трофоцитов видов ком-
плекса «melanogaster».
а — D. simulans, б — D. melanogaster, в —
D. sechellia, г — D. mauritiana', XL, 2, 3 —
политенные хромосомы; С — цент-
ромерные районы; стрелкой указано от-
сутствие сигнала на одном из плеч хро-
мосомы 2 D. simulans.
172 ЭПИГЕНЕТИКА
Рис. 6.20. FISH ДНК-пробы из хро-
моцентра D. огепа на хроматин ядер
трофоцитов с ретикулярной структу-
рой у видов D. mauritiana (а) и D.
огепа (б).
Ch — хромоцентр.
чается незначительно, нуклеотидные последо-
вательности, ассоциированные с гетерохрома-
тином, занимают около трети генома этих видов
и находятся в основном в прицентромерных и
теломерных районах хромосом [Schulze et al.,
2006]. Геном D. огепа приблизительно в 1,6 раза
больше по размеру, чем у всех остальных видов
подгруппы, что обусловлено высоким содержа-
нием повторенных последовательностей ДНК
гетерохроматина [Boulesteix et al., 2006].
In situ гибридизация районоспецифичной
ДНК-пробы на политенные хромосомы трофо-
цитов D. огепа, D. erecta, D. teissieri, D. yakuba,
D. santomea, D. simulans, D. melanogaster, D. se-
chellia, D. mauritiana показала, что у D. огепа она
локализуется в хромоцентре и в проксимальных
районах хромосомных плеч (см. рис. 6.20, а), у
остальных видов — в основном в прицентро-
мерных районах. И хотя различия по этому' па-
раметру между видами существуют (отсутствие
сигнала на одном из плеч хромосомы 2 D. simu-
lans (см. рис. 6.19, а) и локализация сигнала в
субтеломерном районе хромосомы 3 D. erecta
(см. рис. 6.20. 6)), однако в целом они незначи-
тельны. Таким образом, полученные данные
свидетельствуют о том, что межвидовые разли-
чия во взаиморасположении хромосом трофоци-
тов яичников незначительно отражаются на рас-
пределении пробы ДНК.
В отличие от всех остальных видов, у D.
огепа существует территориальность распреде-
ления пробы в ядрах трофоцитов с рстикулярной
структурой (см. рис. 6.20, б), когда хромосомы
полностью декомпактизованы. Таким образом,
хромоцентр D. огепа не подвергается деконден-
сации в ядрах с ретикулярной структурой, со-
храняясь в компактизированном состоянии, в
то время когда происходит дезинтеграция пер-
вичных политенных хромосом, в результате че-
го ядро переходит на стадию «скрытой» поли-
тении.
Необходимо отметить, что отсутствие мече-
ния района прицентромерного гетерохроматина
одного из плеч хромосомы 2 D. simulans (см.
рис. 6.19, а) говорит об отсутствии в его составе
последовательностей, гомологичных последова-
тельностям ДНК-пробы из хромоцентра D. огепа
и. следовательно, о возможности формирования
типичных гетерохроматиновых структур на осно-
ве совершенно разных последовательностей ДНК.
С районами интеркалярного гетерохроматина
хромосом трофоцитов видов подгруппы «mela-
nogaster» гибридизации районоспецифичной про-
бы не наблюдалось. Однако в ходе in situ гибри-
дизации обнаружилось, что субтеломерный рай-
он одного из плеч хромосомы 3 D. erecta содер-
жит последовательности, гомологичные последо-
вательностям ДНК-пробы из хромоцентра D. оге-
па (см. рис. 6.20, б). То есть эти результаты ука-
зывают на гетерохроматиновую природу данно-
го субтеломерного района одного из плеч хро-
мосомы 3 D. erecta, имеющего сходство с хро-
моцентром D. огепа на уровне состава ДНК.
Таким образом, у’ восьми видов подгруппы
«melanogaster» — D. erecta, D. teissieri, D. yaku-
ba, D. santomea, D. simulans, D. melanogaster,
D. sechellia, D. mauritiana — прицентромер-
ный гетерохроматин характеризуется частичным
сходством состава ДНК с составом ДНК хромо-
центра D. огепа. Общим компонентом хромо-
центра трофоцитов D. огепа и прицентромерного
гетерохроматина всех хромосом у видов D. erec-
ta, D. teissieri, D. yakuba, D. santomea, D. simu-
lans, D. melanogaster. D. sechellia, D. mauritiana
являются разнообразные повторенные последо-
вательности ДНК, а также последовательности,
гомологичные генам, фрагменты которых были
клонированы, секвенированы и охарактеризова-
ны в ходе данной работы.
В целом хромосомы X, 2 и 3 у каждого вида
подгруппы «melanogaster» отличались по степе-
ни мечения прицентромерных районов. Причем
ГЛАВА 6 173
для видов комплекса «уакиЬа» была выявлена
следующая закономерность — в большей степе-
ни помстился прицентромерный район хромосо-
мы 3, а в меньшей степени — прицентромерный
район Х-хромосомы. В то время как у видов
комплекса «melanogaster» подобной тенденции
выявлено не было, а степень мечения прицен-
тромерных районов хромосом значительно варь-
ировала у разных видов данного комплекса без
соблюдения какой-либо общей закономерности.
Таким образом, районы прицентромерного гете-
рохроматина разных хромосом у восьми ви-
дов подгруппы «melanogaster» содержат общие с
хромоцентром трофоцитов D. огепа повторяю-
щиеся последовательности ДНК, но при этом,
вероятно, различаются между собой по их пред-
ставленности.
Консерватизм распределения пробы (преиму-
щественно в прицентромерных районах хромо-
сом) и наличие гомологии последовательностей в
геномах всех видов подгруппы «melanogaster»
свидетельствует, вероятно, о том. что эволюцион-
ные преобразования генома, давшие начало ви-
дам данной подгруппы, не привели к кардиналь-
ному перераспределению ДНК гетерохроматина
по геному. Таким образом, можно предположить,
что видоспецифичность взаиморасположения
хромосом в ядрах трофоцитов генеративной тка-
ни во многом определяется количеством, соста-
вом и сочетанием повторенных последовательно-
стей гетерохроматина, но, вероятно, не только эти
характеристики гетерохроматина вносят вклад
в формирование архитектуры ядра.
* * *
Итак, проведен сравнительный анализ после-
довательности ДНК района прикрепления XL-
хромосомы An. messeae к оболочке ядра. Выяв-
лена локализация этой ДНК на хромосомах близ-
кородственных видов, проведен анализ ее нук-
леотидной последовательности, найдены эле-
менты, характерные для районов прикрепления
хромосом.
Район прикрепления хромосомы XL An. mes-
seae к ядерной оболочке, вероятно, является ге-
терохроматическим. Такой вывод можно сделать
на основании проведенной FISH ДНК этого рай-
она с хромосомами близкородственных видов,
а также сходной картины гибридизации ДНК
из прицентромерных районов хромосом видов
An. heklemishevi и An. atroparvus. Анализ пер-
вичной последовательности ДНК района при-
крепления XL-хромосомы Ал. messeae показал
большое разнообразие МГЭ и небольшое содер-
жание кодирующих последовательностей, что
также является косвенным свидетельством гете-
рохроматической природы района прикрепления
XL-хромосомы An. messeae. Большое количество
МГЭ не вызывает удивление, так как известно,
что Р-гетерохроматин представляют, как правило,
умеренные повторы. В гетерохроматине An. gam-
biae тандемные повторы занимают незначитель-
ную часть | Koryakov et al., 1996], что и было от-
мечено в данной работе для района 2Ь—с Ап.
messeae. Таким образом, последовательность
ДНК района 2Ь—с не является принципиально
отличной от других районов, имеющих морфо-
логию Р-гетерохроматина, в том числе хромо-
сом, не имеющих контактов с оболочкой ядра.
Морфологическое сходство этого района с |3-ге-
терохроматином политенных хромосом являлось
основой гипотезы происхождения этого района
[Стегний, 1991; Шарахова и др., 1997]. Ранее
предполагалось, что эволюционно исходным
инверсионным вариантом является тот, у кото-
рого район 2Ь—с расположен в прицентромер-
ной области. Однако эксперименты FISH ДНК
района прикрепления XL-хромосомы An. mes-
seae с хромосомами близкородственных видов
показывают, что у предковых видов и даже
представителя неарктической ветви комплекса
An. heklemishevi гомеологичный району 2Ь—с
район всегда находится в середине плеча XL-
хромосомы. Таким образом, возникновение у Ап.
messeae хромосомы с районом прикрепления,
расположенным в центральной части плеча, бы-
ло вызвано реорганизацией самой последова-
тельности ДНК и не связано с хромосомными
перестройками. Различия в организации после-
довательностей ДНК районов прикрепления
хромосом у малярийных комаров комплекса
«maculipennis». таким образом, могут быть вы-
званы перемещением МГЭ, содержащих SAR/
MAR-элементы. Этот процесс мог сопровож-
даться изменением концентрации последова-
тельностей, содержащих SAR/MAR, согласно
концепции «библиотек» [Ugarkovic, Plohl, 2002].
Согласно модели библиотек, реорганизация по-
второв гетерохроматина происходит за счет ам-
плификации одних повторов и элиминации дру-
гих. Совокупность указанных процессов могла
привести к формированию характерной морфо-
логии района прикрепления XL-хромосомы и
его локализации в центральной части плеча этой
хромосомы у Ли. messeae.
Результаты исследования пространственной
организации ядра у малярийных комаров под-
174 ЭПИГЕНЕТИКА
тверждают существование в геноме специфиче-
ских сайтов, обогащенных элементами, обеспе-
чивающими взаимодействие хромосом с ядерной
оболочкой. Впервые проведенный анализ района
прикрепления, расположенного в середине плеча
хромосомы, показал, что такие районы являются
гетерохроматическими и могут локализоваться
не только в прицентромерных районах хромо-
сом, но и в середине плеч. Настоящая работа по-
казала многокомпонентность молекулярно-гене-
тического состава гетерохроматина в отношении
его взаимодействия со структурными элемента-
ми ядра. Это свойство гетерохроматина проявля-
ется в существовании двух компонентов, кото-
рые входят в его состав, — консервативных эле-
ментов, характерных как для прицентромерного,
так и интеркалярного гетерохроматина всех
хромосом, а также вариабельного компонента —
видоспецифичных и районспецифичных после-
довательностей ДНК. За счет реорганизации эле-
ментов вариабельного компонента гетерохрома-
тина происходит изменение взаимодействия
хромосом с ядерной оболочкой. Реорганизация
последовательностей гетерохроматина районов
прикрепления хромосом может являться ключе-
вым процессом, который сопровождает видооб-
разовательные события у малярийных комаров.
В результате настоящего исследования уста-
новлено, что локальный хромоцентр первич-
ных политенных хромосом трофоцитов яични-
ков D. огепа имеет типичный для гетерохрома-
тина состав ДНК — повторенные последова-
тельности:
а. Диспергированные повторы (МГЭ). Среди
обнаруженных МГЭ в составе библиотеки «Do-
re 1» преобладали представители различных се-
мейств LTR-ретротранспозонов. Также были вы-
явлены МГЭ, которые принадлежат к группе
LINE-элементов. Кроме того, были обнаружены
такие представители ДНК-транспозонов, как ге-
литроны (Helitrons) и полинтоны (Polintons). Не-
обходимо отметить, что в результате настоящей
работы для генома D. огепа впервые описано
разнообразие МГЭ.
б. Тандемные повторы. В составе библиотеки
ДНК хромоцентра D. огепа при помощи про-
граммы «Tandem Repeats Finder» найдено четыре
минисателлита, а с помощью программы «Re-
peatMasker» обнаружены сателлит (SAR), про-
стой повтор (TATATG)n и Т-богатый повтор
низкой сложности. Кроме того, четыре фрагмен-
та библиотеки «Dorel» оказались гомологичны
нескольким аннотированным генам, принадле-
жащим разным видам подгруппы «melanogas-
ter». Среди этих генов наиболее изученными яв-
ляются DIP1 и Vulcan, которые первоначально
были обнаружены в геноме D. melanogaster. Впо-
следствии ортологи DIP1 и Vulcan были найдены
у позвоночных и беспозвоночных животных.
Показано, что у восьми видов подгруппы
«melanogaster» — D. erecta, D. teissieri, D. yaku-
ba, D. santomea, D. simulans, D. melanogaster,
D. sechellia, D. mauritiana — прицентромерный
гетерохроматин характеризуется частичным
сходством состава ДНК с составом ДНК хромо-
центра D. огепа. Общим компонентом хромо-
центра трофоцитов D. огепа и прицентромерного
гетерохроматина всех хромосом у видов D. erec-
ta, D. teissieri, D. yakiiba, D. santomea, D. simu-
lans, D. melanogaster, D. sechellia, D. mauritiana
являются повторенные последовательности ДНК
и последовательности, гомологичные генам.
Показано, что только у D. огепа в ядрах тро-
фоцитов с ретикулярной структурой районоспе-
цифичная ДНК распределялась в пределах ло-
кальной территории в пространстве ядра, для
остальных же видов было характерно диффузное
распределение по всему ядру. Это указывает на
то, что хромоцентр трофоцитов D. огепа не под-
вергается деконденсации в ядрах с рстикулярной
структурой.
Установлено, что ДНК из хромоцентра тро-
фоцитов D. огепа консервативна в плане своего
распределения преимущественно в прицентро-
мерных районах политенных хромосом трофо-
цитов у всех видов подгруппы melanogaster.
Существует гипотеза, согласно которой пере-
распределение последовательностей ДНК гете-
рохроматина по геному может вызвать реорга-
низацию архитектуры ядер клеток генеративной
системы, что. вероятно, сопровождает видообра-
зование. Консерватизм распределения районо-
специфичной ДНК (преимущественно в прицент-
ромерных районах хромосом) и наличие гомоло-
гии последовательностей в геномах всех видов
подгруппы melanogaster свидетельствуют, веро-
ятно, о том, что эволюционные преобразования
генома, давшие начало видам данной подгруп-
пы, не привели к кардинальному’ перераспреде-
лению ДНК гетерохроматина по геному’. Воз-
можно, что видоспецифичность архитектуры
ядер клеток генеративной системы у’ разных ви-
дов определяется тонкими различиями в струк-
туре гетерохроматина.
ГЛАВА 6 175
Список ЛИТЕРАТУРЫ
Ананьина Т. В., Ведерников А. Е., Вассерлауф II. Э., Кара-
мышева Т. В., Рубцов Н. Б., Стегний В. Н. Визуализа-
ция хромосомных территорий в интерфазных ядрах
трофоцитов яичников Calliphora erithrocephala Mg.
(Diptera: Calliphoridae)// Генетика. 2005. T. 41, №10.
С. 1350- -1357.
Богачев С. С., Борисевич II. В., Фишер П. А., Штурман Н.,
Шарахов II. В. f-Гетерохроматин Drosophila: Моле-
кулярная организация и функционирование. Молску-
лярно-биологический анализ MAR/SAR последова-
тельности ДНК из центромерного гетерохроматина
Drosophila melanogaster И Там же. 1996. Т. 32. № 2.
С. 240—251.
Вассерлауф II. Э., Стегний В. Н. Видоспецифичные осо-
бенности архитектоники первично политенных хромо-
сом трофоцитов у Drosophila огепа, Drosophila erecta,
Drosophila teissieri, Drosophila yakuba 11 Там же. 1992.
T. 28, № 3. С. 198- -200.
Глазков AI. В. Структурно-функциональная организация
ДНК в интерфазном ядре. Структурный аспект И Мо-
лекулярная биология. 1988. Т. 22, № 1. С. 10—16.
Глазков AL В. Петельно-доменная организация генов в эу-
кариотических хромосомах И Там же. 1995. Т. 29, № 5.
С. 965—982.
Груздев А. Д., Кикнадзе II. II. О связи политенных хромо-
сом с мембраной ядра И Цитология. 1970. Т. 12, № 7.
С. 919—921.
Грушко О. Г., Шарахова М. В., Шевченко А. II. Караго-
дин Д. А., Карамышева Т. В., Рубцов Н. Б., Стегний В. Н.
Характеристика и сравнительный анализ ДНК из при-
центромерного гетерохроматина хромосомы 2 Anophe-
les atroparvus V. Tiel (Culicidae, Diptera) // Генетика.
2004. T. 40, № 10. С. 1325—1335.
ДоневР.А!, Джонджуров Л. П. Прочно связанная с мат-
риксом ДНК. вероятно, играет важную роль в органи-
зации центромер хромосом И Молекулярная биология.
2000. Т. 34, № 1. С. 137—142.
Жимулев II. Ф. Политенные хромосомы: морфология и
структура. Новосибирск: Наука, 1992. 480 с.
Лобов II. Б., Подгорная О. II. Роль белков ядерного матрик-
са в формировании гетерохроматина И Цитология.
1999. Т. 41, № 7. С. 562—573.
Оншценко Г. Е., Ченцов Ю. С. Расположение и ультра-
структура теломерных участков хромосом в интерфаз-
ных ядрах клеток Allium fistulosum 11 Там же. 1973.
Т. 15. С. 643—649.
Прокофьева-Бельговская .1. .1. Гетерохроматические рай-
оны хромосом. М.: Наука, 1986. 430 с.
Рубцов Н. Б., Алексеенко А. .4., Беляева Е. С., Волкова Е. II,
КокозаЕ.Б., Акакунин LL. В., АЕошкин Ю. AL, Шесто-
пал С. А., Жимулев II. Ф. Микроклонирование и харак-
теристика ДНК из районов прицентромерного гетеро-
хроматина политенных хромосом Drosophila melano-
gaster // Генетика. 1999. Т. 35, № 1. С. 55—61.
Стегний В. Н. Реорганизация структуры интерфазных ядер
в онто- и филогенезе малярийных комаров И Докл. АН
СССР. 1979. Т. 249, № 5. С. 1231.
Стегний В. Н. Системная реорганизация архитектоники
политенных хромосом в онто- и филогенезе малярий-
ных комаров. Сообщение 1. Различия структуры ядер
соматических и генеративной тканей И Генетика. 1987.
Т. 23, № 5. С. 821—827.
Стегний В. Н. Популяционная генетика и эволюция маля-
рийных комаров. Томск: Изд-во ТГУ, 1991. 137 с.
Стегний В. Н. Архитектоника генома, системные мутации и
эволюция. Новосибирск: Изд-во НГУ, 1993. 111 с.
Стегний В. И. Вассерлауф II. Э. Видовая архитектоника
хромосом генеративной ткани и проблема филогене-
тических отношений в подгруппе «melanogaster» рода
Drosophila (Sophophora)!I Генетика. 1994. Т. 30, №4.
С. 478—483.
Стегний В. Н., Шарахова AI. В. Повторяющиеся последова-
тельности ДНК малярийных комаров. Особенности
локализации высокоповторяющейся ДНК у Anopheles
messeae // Там же. 1990. Т. 26, № 7. С. 1187—1194.
Стегний В. И, Шарахова AI. В. Системная реорганизация
архитектоники политенных хромосом в онто- и фило-
генезе малярийных комаров. Структурные особеннос-
ти зон прикрепления хромосом к ядерной оболочке И
Там же. 1991. Т. 27, № 5. С. 828—835.
Усов К. Е., Вассерлауф II. Э., Стегний В. Н. Архитектура
ядер трофоцитов яичников Drosophila santomea и
D. yakuba на разных стадиях эндорепликации И Вест-
ник ТГУ. 2007. № 299. С. 212—216.
Фролова С. Л. Структура ядер в слюнных железах некото-
рых видов Drosophila И Биол. журнал. 1938. Т. 7.
С. 703—736.
Шабарина А. Н., Прилепа Е. II, Глазков А! В. Необычная
нуклеотидная последовательность фрагмента ДНК,
выделенного из ядерных оболочек гепатоцитов мы-
ши // Генетика. 2006. Т. 42, № 7. С. 879—886.
Шарахов II. В., Баричева Э. А!.. Богачев С. С., Фишер П. А..
Лапик Е. Р., Рогачев В. А., Себелева Т. Е. Специфичес-
кие последовательности ДНК ассоциированы с ядер-
ной оболочкой в ядрах псевдопитающих клеток ова-
риев Drosophila melanogaster линии otu 11 И Цитоло-
гия. 1993. Т. 47, № 3. С. 243—248.
Шарахова АI. В., Стегний В. Н., Тимофеева О. В. Полимор-
физм прицентромерного гетерохроматина политенных
хромосом трофоцитов яичников в природных популя-
циях малярийного комара Anopheles messeae Fall /7 Ге-
нетика. 1997. Т. 33, № 2. С. 281—283.
AdamsAI.D., Celniker S. Е., HoltR A., Evans C. A., Gocay-
ne J. D. et al. The genome sequence of Drosophila mela-
nogaster / Science. 2000. Vol. 287. P. 2185—2195.
Alexandrova O., Solovei L., Cremer T., David C. N. Replication
labeling patterns and chromosome territories typical of
mammalian nuclei are conserved in the early metazoan
Hydra 11 Chromosoma. 2003. Vol. 112. P. 190—200.
Allen G. C, Hall G. J.. ALichalowski S., Newman IE, SpikerS.,
H’eissinger A. K, Thompson IE. F. High-level transgene
expression in plant cells: effects of a strong scaffold at-
tachment region from tobacco H Plant Cell. 1996. Vol. 8,
N 5. P. 899—913.
Alvarez J. D., YasuiD. H, Niida H, Joh T, LohD. 1., Kohwi-
Shigematsu T. The MAR-binding protein SATB1 orches-
trates temporal and spatial expression of multiple genes
during T-cell development11 Genes Dev. 2000. Vol. 14,
N 5. P. 521—535.
Ashburner A I. Drosophila : A Laboratory' Handbook. N. Y.: Cold
Spring Harbor Laboratory Press, 1989. P. 1167—1190.
Ashery-Padan R., H eiss A. AL, Feinstein N., Gruenbaum Y.
Distinct regions specify the targeting of otefin to the nu-
cleoplasmic side of the nuclear envelope // J. Biol. Chem.
1997. Vol. 272. P. 2493 2499.
Baiborodin S. I., Boricheva E. A I. Bogachev S. S.. Borisevich I. E,
Strotz О. Г., Filippova AI. A., Sharakhov 1. Г., Shilov A. G.
A molecular and cytogenetic analysis of 20p7 fragment
DNA from the proximal-heterochromatin of Drosophila
melanogaster // Gene. 1993. Vol. 134, N2. P. 175—181.
Boricheva E., Berrios AL, Bogachev S. S., Borisevich L. Г, La-
pikE. R, Sharakhov L. Г, Stuurman N., Fisher P. .1. DNA
from Drosophila melanogaster f-heterochromatin binds
specifically to nuclear lamins in vitro and the nuclear en-
velope in situ // Ibid. 1996. Vol. 171. P. 171—176.
176 ЭПИГЕНЕТИКА
Belmont A. S., ZhaiY.. ThileniusA. Lamin В distribution and
association with peripheral chromatin revealed by optical
sectioning and electron microscopy tomography // J. Cell
Biol. 1993. Vol. 123. P. 1671—1685.
Bengtsson L., Wilson K. L. Multiple and surprising new func-
tions for emerin, a nuclear membrane protein // Curr.
Opin. Cell Biol. 2004. Vol. 16. P. 73- -79.
Benson G. Tandem Repeats Finder: a programme to analyze
DNA sequences // Nucleic Acids Res. 1999. Vol. 27, N 2.
P. 573—580.
BergerR., Theodor L., ShohamJ, GokkelE., Brok-SimoniF,
Avraham KB., Copeland N. G., Jenkins N. A., Recha-
vi G., Simon .4. J. The characterization and localization of
the mouse thymopoietin/lamina-associated polypeptide 2
gene and its alternatively spliced products // Genome Res.
1996. Vol. 6. P. 361 370.
Bidwell J. P.. van Wijnen A. J., Fey E. G., Dworetzky S.. Pen-
man S., Stein J. L., Lian J. B., Stein G. S. Osteocalcin gene
promoter-binding factors are tissue-specific nuclear matrix
components // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1993. Vol. 90,
N8. P. 3162—3166.
Bode J., Winkelmann S., Gotze S., SpikerS., Tsutsui K, Bi C.,
Prashanth A. K, Benham C. Correlations between scaf-
fold/matrix attachment region (S/MAR) binding activity
and DNA duplex destabilization energy 7 J. Mol. Biol.
2006. Vol. 358. N 2. P. 597—613.
Bolzer A., KrethG., SoloveiL, Koehler D., Saracoglu K,
Fauth C., MiiHerS.. EilsR, Cremer C, SpeicherAL.R.,
Cremer T. Three-dimensional maps of all chromosomes in
human male fibroblast nuclei and prometaphase rosettes '/
PLoS Biol. 2005. Vol. 3, N 5. P. el57.
BoulesteixAL, Weiss AL, Biemont C. Differences in genome size
between closely related species: the Drosophila melano-
gaster species subgroup // Mol. Biol. Evol. 2006. Vol. 23,
N 1. P. 162—167.
Boulikas T. Homeodomain protein binding sites, inverted re-
peats, and nuclear matrix attachment regions along the
human beta-globin gene complex П J. Cell Biochem. 1993.
Vol. 52, NLP. 23—36.
Branco AL. R., PomboA. Intermingling of chromosome territo-
ries in interphase suggests role in translocations and tran-
scription-dependent associations // PLoS Biol. 2006.
Vol. 4. P. el38.
Brutlag D. L. Molecular arrangement and evolution of heterochro-
matic DNA // Annu. Rev. Genet. 1980. Vol. 14. P. 121—144.
Burke B., EllenbergJ. Remodelling the walls of thenucleus '/
Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2002. Vol. 3. P. 487—497.
Cai AL, Huang Y., GhirlandoR, Wilson K. L., CraigieR,
Clore G. A I. Solution structure of the constant region of
nuclear envelope protein LAP2 reveals two LEM-domain
structures: one binds BAF and the other binds DNA //
EMBO J. 2001. Vol. 20. P. 4399—4407.
Carvalho C., Pereira H. AL, Ferreira J., Pina C„ ALendonga D.,
Rosa A. C, Carmo-FonsecaAL Chromosomal G-dark
bands determine the spatial organization of centromeric
heterochromatin in the nucleus// Mol. Biol. Cell. 2001.
Vol. 12, N 1 1. P. 3653—3572.
Casolari J. AL., Brown C. R, Komili S., West J, Hieronymus H,
Silver P. .1. Genome-wide localization of the nuclear
transport machinery' couples transcriptional status and nuc-
lear organization // Cell. 2004. Vol. 117. P. 427—439.
Chaly N., ALunroS.B. Centromeres reposition to the nuclear
periphery' during L6E9 myogenesis in vitro // Exp. Cell
Res. 1996. Vol. 223. P. 274—278.
Chaly N., ALunroS.B. Centromeres reposition to the nuclear
periphery' during L6E9 myogenesis in vitro // Exp. Cell
Res. 1996. Vol. 223. P. 274—278.
Chattopadhyay S., Kaul R, Charest A., Housman D., Chen J.
SMAR1, a novel, alternatively spliced gene product, binds
the Scaffold Matrix-associated region at the T cell recep-
tor beta locus // Genomics. 2000. Vol. 68, NLP. 93—96.
Chubb J. R., Boyle S., Perry P., Bickmore W. A. Chromatin
motion is constrained by association with nuclear com-
partments in human cells // Curr. Biol. 2002. Vol. 12.
p. 439—445.
Clark A. G., Eisen AL. B., Smith D. R, Bergman C. AL, Oliver В.
et al. Evolution of genes and genomes on the Drosophila
phylogeny 11 Nature. 2007. Vol. 450, N 8. P. 203—218.
Comings D. E. The rationale for an ordered arrangement of
chromatin in the interphase nucleus // Am. J. Hum. Genet.
1968. Vol. 20, N 5. P. 440—460.
Comings D. E. Arrangement of chromatin in the nuc-
leus // Hum. Genet. 1980. Vol. 53, N 2. P. 131—143.
Cremer T, Cremer C. Chromosome territories, nuclear architec-
ture and gene regulation in mammalian cells П Nat. Rev.
Genet. 2001. Vol. 2,N4. P. 292—301.
Cremer T, Cremer AL. Chromosome territories// Cold Spring
Harb. Perspect. Biol. 2010. Vol. 2, N 3. P. a003889.
Cremer T, Cremer AL, Dietzel S., ALiiller S., Solovei L, Fakan S.
Chromosome territories — a functional nuclear land-sca-
pe // Curr. Opin. Cell Biol. 2006. Vol. 18. P. 307—316.
Croft J. A., Bridger J. AL., Boyle S., PerryP., Teague P., Bick-
more W. .1. Differences in the localization and morphol-
ogy' of chromosomes in the human nucleus // J. Cell Biol.
1999. Vol. 145. P. 1119—1131.
DehghaniH, DellaireG., Bazett-Jones D. P. Organization of
chromatin in the interphase mammalian cell 7 Micron.
2005. Vol. 36. P. 95—108.
DeSousa D., ALukhopadhyay AL, PelkaP., ZhaoX., Dey В. K,
Robert K, Pelisson A., Bucheton A., Campos A. R A no-
vel double-stranded RNA-binding protein, Disco Interact-
ing Protein 1 (DIP1). contributes to cell fate decisions dur-
ing Drosophila development // J. Biol. Chem. 2003.
Vol. 278, N 39. P. 38040—38050.
Dickinson L. A., Dickinson C. D., Kohwi-Shigematsu T. An
atypical homeodomain in SATB1 promotes specific rec-
ognition of the key' structural element in a matrix attach-
ment region// Ibid. 1997. Vol. 272, NIL P. 11463—
11470.
DijkeP., Hill C. S. New insights into TGF-P-Smad signaling//
Trends Biochem. Sei. 2004. Vol. 29. P. 265—273.
Dobreva G., Dambacher J., Grosschedl R. SUMO modification
of a novel MAR-binding protein, SATB2, modulates im-
munoglobulin mu gene expression // Genes Dev. 2003.
Vol. 17,N24. P. 3048—3061.
Duband-Goulet L., CourvalmJ. -C. Inner nuclear membrane
protein LBR preferentially interacts with DNA secondary
structures and nucleosomal linker // Biochemistry. 2000.
Vol. 39. P. 6483 6488.
Elgin S.C.. Grewal S. 1. Heterochromatin: silence is golden//
Curr. Biol. 2003. Vol. 13, N 23. P. R895—R898.
EllenbergJ., Siggia E. D., ALoreira J. E„ Smith C. L., Pres-
ley J. F, Worman H. J., Lippincott-Schwartz J. Nuclear
membrane dynamics and reassembly in living cells: target-
ing of an inner nuclear membrane protein in interphase
and mitosis " J. Cell Biol. 1997. Vol. 138, N 6. P. 1193—
1206.
Fackelmayer F. O., DahmK, Renz A., Ramsperger U., Rich-
ter A. Nucleic-acid-binding properties of hnRNP-U/SAF-
A, a nuclear-matrix protein which binds DNA and RNA in
vivo and in vitro // Eur. J. Biochem. 1994. Vol. 221, N 2.
P. 749—757.
FeliceB. D., WilsonRR, ALondolaP., ALatroneG., DamianoS.,
Garbi C., NeziL, Su T. T. Characterization of DIP1, a novel
nuclear protein in Drosophila melanogaster II Biochem.
Biophys. Res. Commun. 2003. Vol. 307. P. 224—228.
FeschotteC, Keswani U., Ranganathan N., Guibotsy AL. L.,
Levine D. Exploring repetetive DNA landscapes using
ГЛАВА 6 177
REPCLASS, a tool that automates the classification of
transposable elements in eukaryotic genomes 11 Genome
Biol. Evol. 2009. Vol. 1. P. 205—220.
Fukuda Y. J. Characterization of matrix attachment sites in the
upstream regions of a tobacco chitinase gene // Plant Mol.
Biol. 1997. Vol. 39, N 5. P. 1051—1062.
Furukawa K., Lnagaki H., Hotta E Identification and cloning of
an mRNA coding for a germ cell-specific А-type lamin in
mice // Exp. Cell Res. 1994. Vol. 212. P. 426—430.
GalandeS., Dickinson L. .1., Micml.S., Sikorska M„ Kohwi-
Shigematsu T. SATB1 cleavage by caspase 6 disrupts PDZ
domain-mediated dimerization, causing detachment from
chromatin earlv in T-cell apoptosis // Mol. Cell Biol. 2001.
Vol. 21, N 16. P. 5591—5604.
GalyJ., Olivo-Marin J. C, Scherthan H, Dove I'., Rasca-
lou N., Nehrbass U. Nuclear pore complex in the organiza-
tion of silent telomeric chromatin // Nature. 2000.
Vol. 403. P. 108—112.
Gates J., Thummel C. S. An enhancer trap screen for ecdysone-
inducible genes required for Drosophila adult leg morpho-
genesis // Genetics. 2000. Vol. 156. P. 1765—1776.
GaudinJ’., Andrey P., Devinoy E., Kress C., Kieu K., Beau-
jean N, Л laurin Г., Debey P. Modeling the 3D functional
architecture of the nucleus in animal and plant kingdoms //
C. R. Biol. 2009. Vol. 332. P. 937—946.
Gerasimova T. I.. ByrdK.. Corces J’. G. A chromatin insulator
determines the nuclear localization of DNA // Mol. Cell.
2000. Vol. 6,N 5. P. 1025—1035.
GetzenbergR. H., PientaK.J, H ard JJ’. S., Coffey D. S. Nuc-
lear structure and the three-dimensional organization of
DNA // J. Cell Biochem. 1991. Vol. 47, N 4. P. 289—299.
GirodP. A., Nguyen D. Q., Calabrese D., Puttini S., Grandje-
anM., Martinet D., Regamey A., SaugyD., Beckmann J. S.,
Bucher P., MerniodN. Genome-wide prediction of matrix
attachment regions that increase gene expression in mam-
malian cells // Nat. Methods. 2007. Vol. 4, N 9. P. 747—
753.
Goldman R D., GruenbaumY., Moir R D., Shumaker D. K.,
Spann T. P. Nuclear lamins: building blocks of nuclear ar-
chitecture /7 Genes Dev. 2002. Vol. 16. P. 533—547.
GongH., JJ'angZ., ZhaoG.JJ'., LvX., JJ'ei G. H, JJ’angL.,
LiuD.P., Liang C.C. SATB1 regulates beta-like globin
genes through matrix related nuclear relocation of the clus-
ter // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2009. Vol. 383,
NLP. 11—15.
GrewalS. I., Elgin S. C. Heterochromatin: new possibilities for
the inheritance of structure // Curr. Opin. Genet. Dev.
2002. Vol. 12. P. 178—187.
GruenbaumY., Wilson К. L., HarelA., GoldbergM, CohenM.
Nuclear lamins-structural proteins with fundamental func-
tions // J. Struct. Biol. 2000. Vol. 129. P. 313—323.
GruenbaumY., Margalit A., Shumaker D. K., Wilson KL. The
nuclear lamina comes of age // Nat. Rev. Mol. Cell Biol.
2005. Vol. 6. P. 21—31.
Grushko O. G., Sharakhova M. J'., Steguii J . N., Sharak-
hovl. J'. Molecular organization of heterochromatin in
malaria mosquitoes of the Anopheles maculipennis sub-
group 11 Gene. 2009. N 448. P. 192—197.
Guarda A., Bolognese F, Bonopace I. M., BadaraccoG. Interac-
tion between the inner nuclear membrane lamin В receptor
and the heterochromatic methyl binding protein, MeCP2 //
Exp. Cell Res. 2009. Vol. 315,N 11. P. 1895—1903.
HaafT., Schmidt M. Centromeric association and non-random
distribution of centromeres in human tumour cells // Hum.
Genet. 1989. Vol. 81. P. 137—143.
Habermann F. A., Cremer M., JJ’alterJ, KrethG., von Hase J.,
Bauer K, WienbergJ., Cremer C, Cremer T, SoloveiI. Ar-
rangements of macro- and microchromosomes in chicken
cells // Chromosome Res. 2001. Vol. 9. P. 569—584.
Hakes D. J.. Berezney R. DNA binding properties of the nuclear
matrix and individual nuclear matrix proteins. Evidence
for salt-resistant DNA binding sites // J. Biol. Chem. 1991.
Vol. 266, N 17. P. 11131—11140.
Haraguchi T, Koujin T, Hayakawa T, Kaneda T, Tsutsumi C,
ImamotoN., AkazawaC., SukegawaJ., YonedaY., Hira-
oka Y. Live fluorescence imaging reveals early recruitment
of emerin, LBR. RanBP2, and Nupl53 to reforming func-
tional nuclear envelopes// J. Cell Sei. 2000. Vol. 113.
P. 779—794.
Hart С. M, Laemmli U. K. Facilitation of chromatin dynamics
by SARs // Curr. Opin. Genet. Dev. 1998. Vol.’ 8, N 5.
P. 519—525.
Heitlinger E., Peter AL, Lustig A., J’illiger JJ’., NiggE.A.,
Aehi U. The role of the head and tail domain in lamin
structure and assembly: analysis of bacterially expressed
chicken lamin A and truncated B2 lamins // J. Struct. Biol.
1992. Vol. 108. P. 74—89.
HochstrasserM., Sedat J. JJ’. Three-dimensional organization of
Drosophila melanogaster interphase nuclei. I. Tissue-spe-
cific aspects of polytene nuclear architecture // J. Cell
Biol. 1987. Vol. 104. P. 1455—1470.
HolaskaJ. AL, Lee К. K, Kowalski A. K, JJ’ilson K. L. Tran-
scriptional repressor germ cell-less (GCL) and barrier-to-
autointegration factor (BAF) compete for binding to emerin
in vitro // J. Biol. Chem. 2003. Vol. 278. P. 6969—6975.
Holley JJ'. R, ALianl. S., ParkS. J., RydbergB., Chatterjee A. A
model for interphase chromosomes and evaluation of ra-
diation-induced aberrations // Radiat. Res. 2002. Vol. 158.
P. 568—580.
HolmerL., PezhmanA., JJ’orman H. J. The human lamin В
receptor'sterol reductase multigene family // Genomics.
1998. Vol. 54. P. 469—476.
Holmer L., JJ’orman H. J. Inner nuclear membrane proteins: func-
tions and targeting// Cell Mol. Life Sei. 2001. Vol. 58,
N 12—13. P. 1741—1747.
Holt R A., Subramanian G. M., Halpern A., Sutton G. G., Char-
lab R. et al. The genome sequence of the malaria mosquito
Anopheles gambiae 11 Science. 2002. Vol. 298. P. 129—149.
JiangC, Pugh B. F. Nucleosome positioning and gene regula-
tion: advances through genomics // Nat. Rev. Genet. 2009.
Vol. 10, N3. P. 72—161.
Kaminker J. S., Bergman С. AL, Kronmiller B., Carlson J., Svir-
skasR, PatelS., FriseE.. JJlieelerD. A., LewisS. E.. Ru-
bin G. M., Ashburner AL, Celniker S. E. The transposable
elements of the Drosophila melanogaster euchromatin: a
genomics perspective // Genome Biol. 2002. Vol. 3, N 12.
R0084.
Kapitonov J’. J’., JurkaJ. Molecular paleontology' of transpos-
able elements in the Drosophila melanogaster genome //
Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2003. Vol. 100. NIL
P. 6569—6574.
Kapitonov J’. I’., JurkaJ. Self-synthesizing DNA transposons in
eukaryotes // Ibid. 2006. Vol. 103, N 12. P. 4540 4545.
Kapitonov J’. J’., JurkaJ. Helitrons on a roll: eukaryotic rolling-
circle transposons // Trends Genet. 2007. Vol. 23, N 10.
P. 521—529.
Knight K. L., Stone A. A catalog of the mosquitoes of the world
(Diptera: Culicidae). Thomas Say' Found. J. Ent. Soc. Am.
1977. 612 p.
Koryakov D. E., Belyaeva E. S., Alekseyenko A. A., Zhimulev I. F.
Alpha and beta heterochromatin in polytene chromosome 2
of Drosophila melanogaster ,7 Chromosoma. 1996. Vol. 105.
P. 310—319.
Kupper K., Kolbl A., BienerD., Dittrich S., von Hase J., Thor-
meyerT., Fiegler H, Carter N. P., Speicher AL R., Cre-
mer T, Cremer M. Radial chromatin positioning is shaped
by' local gene density', not by' gene expression // Chromo-
soma. 2007. Vol. 116. P. 285—306.
178 ЭПИГЕНЕТИКА
Lachaise D.. Benassi Г. Evolutionary novelties in islands: Dro-
sophila santomea, a new melanogaster sister species from
Sao Tome // Evolution. 2000. P. 1487—1495.
Lachaise D., CariouM. L., David J. R. Historical biogeography
of the Drosophila melanogaster species subgroup " Evol.
Biol. 1988. Vol. 22. P. 159—225.
LiebichL, Bode J., Reuter I., Wingender E. Evaluation of se-
quence motifs found in scaffold/matrix attached regions
(S/MARs)// Nucleic Acids Res. 2002. Vol. 30, N15.
P. 3433—3442.
Lobov I. B., Tsutsui K., Mitchell .1. R, Podgornaya О. I. Speci-
ficity of SAP-A and lamin В binding in vitro correlates
with the satellite DNA bending state H J. Cell. Biochem.
2001. Vol. 83, N 2. P. 218—229.
Lohe A. R., Roberts P. .1. Evolution of DNA in heterochromatin:
the Drosophila melanogaster sibling species subgroup as a
resource // Genetica. 2000. Vol. 109. P. 125—130.
LuderusM. E., den Blaauwen J. L., de Smit O. J., Comp-
ton D. A., vanDrielR. Binding of matrix attachment re-
gions to lamin polymers involves single-stranded regions
and the minor groove // Mol. Cell Biol. 1994. Vol. 14,
N 9. P. 6297—6305.
LuderusM. E., de Graaf A., Mattia E., den Blaauwen J. L, Gran-
dehl.A., deJongL., vanDrielR. Binding of matrix at-
tachment regions to lamin Bl И Cell. 1992. Vol. 70.
P. 949—959.
MahyN. L., Perry P. E., Bickmore W. .4. Gene density and tran-
scription influence the localization of chromatin outside of
chromosome territories detectable by FISH /7 J. Cell Biol.
2002. Vol. 159, N 5. P. 753—763.
Malone C. J., Fixsen W. D., Horvitz H. R., Han hl UNC-84
localizes to the nuclear envelope and is required for nu-
clear migration and anchoring during C. elegans develop-
ment " Development. 1999. Vol. 126. P. 3171—3181.
Manuelidis L.. Borden J. Reproducible compartmentalization of
individual chromosome domains in human CNS cells re-
vealed by in situ hybridization and three-dimensional re-
construction // Chromosoma. 1988. Vol. 96, N 6. P. 397—
410.
Marshall W. F. Gene expression and nuclear architecture during
development and differentiation // Meeh. Dev. 2003.
Vol. 120. P. 1217—1230.
Marshall W. F., Demburg .1. F, Harmon B., AgardD. A., Se-
datJ. W. Specific interactions of chromatin with the nu-
clear envelope: positional determination within the nu-
cleus in Drosophila melanogaster 11 Mol. Biol. Cell. 1996.
Vol. 7, N 5. P. 825—842.
Mattcrut-Drubezki A., Gruenbaum Y. Dynamic interactions of nuc-
lear lamina proteins with chromatin and transcriptional ma-
chinery // Cell. Mol. Life Sci. 2003. Vol. 60. P. 2053 2063.
Matzke M. .1.. Varga F. Berger H.. Schemthaner J.. Schwei-
zer D., MayrB., Matzke A. J. A 41—42 bp tandemly re-
peated sequence isolated from nuclear envelopes of chicken
erytrocytes is located predominantly on microchromo-
somes // Chromosoma. 1990. Vol. 99. P. 131—137.
MekhailK., Seebacher J., Gygi S. P., MoazedD. Role for peri-
nuclear chromosome tethering in maintenance of genome
stability // Nature. 2008. Vol. 456. P. 667—671.
MelcerS., Gruenbaum Y., Krohneb G. Invertebrate lamins//
Exp. Cell Res. 2007. Vol. 313. P. 2157—2166.
Misteli T. Beyond the sequence: cellular organization of ge-
nome function " Cell. 2007. Vol. 128, N 4. P. 787—800.
hloraL., Sanchez 1., GarciaM., Ponsahi. Chromosome terri-
tory positioning of conserved homologous chromosomes
in different primate species // Chromosoma. 2006.
Vol. 115. P. 367—375.
Nabirochkin S., Ossokina hl, Heidmann T. Scaffold attachment
region co-localizes with the gypsy retrotransposon insula-
tor sequense h J. Biol. Chem. 1998. Vol. 23. P. 247—273.
O'Grady P. hl, Baker R. H.. DurandoC.hl. Etges W. J. De-
Salle R. Polytene chromosomes as indicators of phylogeny
in several species groups of Drosophila // BMC Evol.
Biol. 2001. Vol. l.P. 6.
Osouda S., Nakamura Y., de Saint Phalle B., McConnell hl.,
Horigome T, Suffyama S., Fisher P. A., Furukawa K. Null
mutants of Drosophila В-type lamin Dm(0) show aberrant
tissue differentiation rather than obvious nuclear shape
distortion or specific defects during cell proliferation //
Dev. Biol. 2005. Vol. 284. P. 219—232.
Paddy hl. R, Belmont A. S., Saumweber H., AgardD. A., Se-
datJ. W. Interphase nuclear envelope lamins form a dis-
continuous network that interacts with only a fraction of
the chromatin in the nuclear periphery // Cell. 1990.
Vol. 62,N l.P. 89—106.
Pederson T., Aebi U. Actin in the nucleus: what form and what
for? // J. Struct. Biol. 2002. Vol. 140. P. 3—9.
Plohlhl, Luchetti A., Mestrovic N., hlantovani B. Satellite
DNAs between selfishness and functionality: Structure,
genomics and evolution of tandem repeats in centromeric
(hetero)chromatin // Gene. 2008. Vol. 409. P. 72—82.
Pyrpasopoulou A., Meier J., Maison C., SimosG., Georga-
tos S. D. The lamin В receptor (LBR) provides essential
chromatin docking sites at the nuclear envelope // EMBO
J. 1996. Vol. 15,N24. P. 7108—7119.
Rabi C. Uber Zellteilung// Morphologisches Jahrbuch. 1885.
Vol. 10. P. 214.
Reeves R., Beckerbauer L. HMGI'Y proteins: flexible regulators
of transcription and chromatin structure // Biochim. Bio-
phys. Acta. 2001. Vol. 1519, N 1—2. P. 13—29.
Renz A., Fackelmayer F. O. Purification and molecular cloning of
the scaffold attachment factor В (SAF-B), a novel human
nuclear protein that specifically binds to SAR/MAR-DNA //
Nucleic Acids Res. 1996. Vol. 24, N 5. P. 843—849.
RzepeckiR. Bogachev S. S.. Kokoza E., StuurmanN., Fis-
her P. .4. In vivo association of lamins with nucleic acids
in Drosophila melanogaster!! J. Cell Sci. 1998. Vol. 111.
P. 121—129.
Sage В. T., CsinkA. K. Heterochromatic self-association, a de-
terminant of nuclear organization, does not require se-
quence homology in Drosophila // Genetics. 2003.
Vol. 165. P. 1183—1193.
Schirmer E. C, FoisnerR. Proteins that associate with lamins:
many faces, many functions // Exp. Cell Res. 2007.
Vol. 313. P. 2167—2179.
Schneider R., Grosschedl R. Dynamics and interplay of nuclear
architecture, genome organization, and gene expression //
Genes Dev. 2007. Vol. 21. P. 3027—3043.
Schoenherr C. J., Tilghman S. hl. Epigenetics in mammals/7
Chromatin Structure and Gene Expression. Oxford, UK:
Oxford University Press. 2000. P. 252—277.
Schulze S. R, McAllister B. F, Sinclair D. A., FitzpatrickK. A.,
Marchetti hl, Pimpinelli S., Honda B. hl. Heterochromatic
genes in Drosophila: a comparative analysis of two
genes // Genetics. 2006. Vol. 173. P. 1433—1445.
Sexton T, Bantiguies F, Cavalli G. Genomic interactions: Chro-
matin loops and gene meeting points in transcriptional regu-
lation // Semin. Cell Dev. Biol. 2009. Vol. 20. P. 849—855.
Smith CD., Shu S., hlungall C. J., KarpenG.H. The Release
5.1 annotation of Drosophila melanogaster heterochro-
matin // Science. 2007. Vol. 316. P. 1586—1591.
StrausbaughL. D., WilliamsS. hl High density of an SAR-as-
sociated motif differentiates heterochromatin from euchro-
matin // J. Theor. Biol. 1996. Vol. 183, N 2. P. 159—167.
Stuurman N., Heins S., Aebi U. Nuclear lamins: their structure,
assembly and interactions // J. Struct. Biol. 1998.
Thomopoulos G. N. Phylogenetic relationships in the Droso-
phila melanogaster species subgroup: An ultrastructural
histochemical study of the secretory granules in the larval
ГЛАВА 6 179
salivary gland cells ofD. arena and D. sechellia 11 J. Biol.
Res. 2004. N l.P. 81—90.
TrojerP., ReinbergD. Facultative heterochromatin: is there a
distinctive molecular signature? и Mol. Cell. 2007. Vol. 28.
P. 1—13.
UgarkovicD., PlohlAL. Variation in satellite DNA profiles
causes and effects// EMBO J. 2002. Vol. 21. P. 5955
5959.
Utitzur N., Harel A., Feinstein N., Grtienbaum Y. Lamin activity'
is essential for nuclear envelope assembly in a Drosophila
embryo cell-free extract// J. Cell Biol. 1992. Vol. 119.
P. 17—25.
van Driel R., FranszP. Nuclear architecture and genome func-
tioning in plants and animals: what can we learn from
both? 11 Exp. Cell Res. 2004. Vol. 296. P. 86—90.
Vazquez J., Belmont A. S., SedatJ. IV. Multiple regimes of con-
strained chromosome motion are regulated in the inter-
phase Drosophila nucleus// Curr. Biol. 2001. Vol. 11.
P. 1227—1239.
Visser A. E., JauninF., FakanS., Aten J. A. High resolution
analysis of interphase chromosome domains // J. Cell Sei.
2000. Vol. 113. P. 2585—2593.
VolpiE.V, Chevret E., Jones T., Vatcheva R, Williamson J.,
BeckS., CampbellR. D., Goldsworthy AL, PowisS.H.,
Ragoussis J., Trowsdale J., Sheer D. Large-scale chroma-
tin organization of the major histocompatibility' complex
and other regions of human chromosome 6 and its re-
sponse to interferon in interphase nuclei " J. Cell Sei.
2000. Vol. 113. P. 1565—1576.
von Fries J. P., Buhrmester H., Strutting W. H. A matrix/scaf-
fold attachment region binding protein: identification, pu-
rification, and mode of binding // Cell. 1991. Vol. 64, N 1.
P. 123—135.
Wagner N., Weber D., Seitz S., Krohne G. The lamin В receptor
of Drosophila melanogaster 11 J. Cell Sei. 2004. Vol. 117.
P. 2015 2028.
WangS.. Lorenzen hi. D.. BeemanR W. Brown S. J. Analysis of
repetitive DNA distribution patterns in the Tribotium casta-
neum genome // Genome Biol. 2008. Vol. 9, N 3. R61.
WangT. -Г., Han Z. -AL, ChaiY. -R, Zhang J. -H. A mini re-
view of MAR-binding proteins // Mol. Biol. Rep. 2010.
Vol. 37. P. 3553—3560.
Yanagisawa J., Ando J., Nakayama J., Kohwi Y., Kohwi-Shige-
matsu T. A matrix attachment region (MAR)-bindin-
gactivity due to a pl 14 kilodalton protein is found only in
human breast carcinomas and not in normal and benign
breast disease tissues // Cancer Res. 1996. Vol. 56, N 3.
p. 457—462.
Zhao F, HarelA., StuurmanN, GuedatiaD., GruenbattmY.
Binding of matrix attachment regions to nuclear lamin is
mediated by the rod domain and depends on the lamin poly-
merization state // FEBS Lett. 1996. Vol. 380. P. 161—1б4.
ZinkD., Cremer T. Chromosome dynamics in nuclei of living
cells // Curr. Biol. 1998. Vol. 8. P. 321—324.
Zorn C. Cremer C. Cremer T, Zimmer J. Unscheduled DNA
synthesis after partial UV irradiation of the cell nucleus:
distribution in interphase and metaphase // Exp. Cell Res.
1979. Vol. 124,NLP. 111—119.
ГЛАВА
7
РНК-ИНТЕРФЕРЕНЦИЯ —
ЭВОЛЮЦИОННО КОНСЕРВАТИВНЫЙ МЕХАНИЗМ
РЕГУЛЯЦИИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ
СОДЕРЖАНИЕ
7.1. Механизм РНК-интерференции,
182
7.2. Особенности механизма РНК-ин-
терференции у разных организмов,
184
7.3. Конструирование интерферирую-
щих РНК для биомедицинских це-
лей, 185
7.4. Перспективы использования ин-
терферирующих РНК в медицине
196
Список литературы, 199
182 ЭПИГЕНЕТИКА
РНК-интерференция представляет собой эво-
люционно консервативный механизм, обеспечи-
вающий разрушение в клетке определенных мРНК
под действием двуцепочечных РНК определен-
ной структуры, последовательность которых го-
мологична последовательности мРНК мишени.
Эти двуцепочечные РНК могут быть внесены в
клетку извне (вирусы и синтезированные иссле-
дователями молекулы) или образовываться в
клетке, будучи закодированными в ее геноме.
Малые интерферирующие РНК (siPHK) в на-
стоящее время широко используются для инги-
бирования экспрессии генов в молскулярной био-
логии и экспериментальной фармакологии. Они
являются наиболее эффективными и специфич-
ными ингибиторами экспрессии генов, дейст-
вующими в наномолярных и субнаномолярных
концентрациях. В данной главе будет рассмот-
рен механизм РНК-интерференции, его особен-
ности у разных организмов, а также участие эн-
догенных микроРНК (miPHK) в регуляции про-
цессов в клетке. Основное внимание будет уде-
лено современным подходам к конструированию
интерферирующих РНК для селективного по-
давления экспрессии терапевтически значимых
генов и обсуждению проблем их биомедицин-
ского применения.
7.1. Механизм РНК-интерференции
РНК-интерференция (RNA interference) — ме-
ханизм подавления экспрессии генов под дейст-
вием двуцепочечной РНК (дцРНК) — была от-
крыта Fire и Mello у С. elegans [Fire et al., 1998],
позднее было обнаружено, что механизм РНК-
интерференции (РНКи) функционирует практи-
чески у всех эукариот. Впервые на процесс, поз-
же названный РНК-интерференцией, ученые об-
ратили внимание при исследовании ингибирова-
ния экспрессии генов под действием антисмы-
словой РНК. Используя в качестве отрицатель-
ного контроля смысловую РНК, полученную пу-
тем in vitro транскрипции с плазмидных матриц,
ученые обнаружили, что и смысловая, и анти-
смысловая РНК одинаково эффективно ингиби-
руют экспрессию исследуемых генов. При выяс-
нении причины такого явления было установле-
но, что такой эффект вызывают только неочи-
щенные препараты РНК, в составе которых были
обнаружены примеси двуцепочечны.х молекул,
образующихся в результате неспецифичной транс-
крипции с промотора другой РНК-полимеразы,
которые часто фланкируют кДНК в составе
плазмиды с двух сторон. Эксперименты показа-
ли, что агентом, вызывающим эффективное ин-
гибирование экспрессии генов, является именно
двуцепочечная РНК. На сегодня уже выяснены
многие детали механизма действия этого агента
(рис. 7.1). На первом этапе — фаза инициации —
длинная двуцепочечная РНК распознается кле-
точной рибонуклеазой Дайсер (Dicer), которая
содержит в своем составе N-концевой геликаз-
ный домен, РНК-связывающий PAZ (Piwi-AGO-
Zwille) домен, два РНКаза Ш-подобных домена
и домен связывания двуцепочечной РНК (dsRBD)
[Collins, Cheng, 2005]). У человека обнаружена
только одна форма фермента Дайсер, в то время
как некоторые организмы экспрессируют не-
сколько видов этой рибонуклеазы, имеющих
различную субстратную специфичность [Meister,
Tuschl, 2004]. Так, у Drosophila melanogaster об-
наружено два вида Дайсера: dcr-1 (необходим
для созревания микроРНК) и dcr-2 (участвует в
продукции siPHK), у Arabidopsis thaliana — че-
тыре [Schauer et al., 2002; Lee et al., 2004]. Дайсер
разрезает дцРНК на короткие дуплексы длиной
21—25 п.н. с двумя—тремя выступающими нук-
леотидами на 3'-концах обеих цепей. Эти ду-
плексы были названы малыми интерферирую-
щими РНК, или siPHK (small interfering RNA,
siRNA). На втором этапе — эффекторная фаза —
получившиеся в результате ферментативного
процессинга siPHK взаимодействуют с клеточ-
ными белками, образуя RLC (RISC-loading comp-
lex), компонентами которого являются Дайсер и
TRPB (у Drosophila R2D2). Затем происходит
замещение димера Дайсер/TRPB белком AGO2,
и таким образом формируется комплекс RISC
(RNA-induced silencing complex).
Белки семейства AGO отличаются высокой
консервативностью (см. обзор [Gagnon, Corey,
2012]). У человека известно восемь белков этого
семейства: четыре белка подсемейства AGO
(AGO1—4) и четыре белка подсемейства PIWI
(AGO5—8) [Sasaki etal., 2003]. Белки AGO со-
держат в своем составе характерные PAZ-домен,
PIWI-домен и Mid-домен. PAZ-домен узнает и
связывает 3'-конец малых РНК [Lingel etal.,
2004], PIWI обладает РНКаза Н-подобной актив-
ностью и разрезает РНК-мишень [Wang etal.,
2008], Mid-домен специфически связывает 5'-
концевой фосфат «направляющей» цепи [Frank
et al., 2010]. Цепь siPHK укладывается вдоль по-
ложительно заряженного «желоба», образован-
ного N-концевым, PAZ- и Mid-доменами, обес-
печивая возможность комплементарного взаи-
модействия с мишенью и доступ PIWI-домена к
сайту7 разрезания [Wang et al., 2008]. Не все бел-
ГЛАВА 7 183
ки семейства AGO способны разрезать мРНК:
например, у человека этой активностью обладает
только белок AGO2, a AGO3, несмотря на нали-
чие сходного каталитического домена, лишен
этой активности [Hock. Meister. 2008].
В процессе активации комплекса RISC одна
из цепей siPHK, «пассажирская», разрезается
примерно посередине и диссоциирует из ком-
плекса, для эффективного удаления этой цепи у
позвоночных требуется участие комплекса СЗРО
[Liu et al., 2009], а у человека присутствие этого
комплекса и AGO2 является достаточным для
сборки активированного RISC (далее — RISC*)
[Ye etal., 2011].
Комплекс RISC , который включает в себя
одну из цепей siPHK, белок AGO2, а иногда и
некоторые другие белки, способен связываться с
комплементарными последовательностями в со-
ставе мРНК и разрезать ее (рассмотрено в обзоре
[Kim, Rossi, 2008], после чего вся молекула
мРНК быстро деградирует под действием кле-
точных рибонуклеаз, а высвободившийся RISC
может взаимодействовать со следующей мише-
нью, действуя в каталитическом режиме.
При исследовании механизма РНК-интерфе-
ренции был обнаружен также другой путь акти-
вации RISC («обходной» путь), при котором дис-
социация цепей siPHK происходит без предвари-
тельного расщепления смысловой цепи AGO2
[Matranga etal., 2005]. Данный путь активации
характерен для miPHK (microPHK — микроРНК,
малые регуляторные РНК), содержащих неспа-
ренные основания в центральной части, которые
блокируют действие эндорибонуклеазы AGO2, а
также для siPHK, содержащих в центральной
части дуплекса (вокруг сайта расщепления: меж-
ду 9 и Юн. «пассажирской» цепи [Elbashir
et al., 2001]) химически модифицированные ана-
логи нуклеотидов, также блокирующие рибо-
нуклеазную активность AGO2 [Matranga etal.,
2005; Leuschner, 2006]. При таком пути актива-
ции RISC связывается с мРНК-мишенью, и в
комплексе с белками-супрессорами трансляции,
одним из которых является RCK/p54 (геликаза
семейства DEAD box), ингибирует трансляцию
мРНК [Chu, Rana, 2006]. В дальнейшем, мРНК в
комплексе с белками депонируется в «Р-тель-
цах» (P-body), цитоплазматических образовани-
ях, участвующих в регуляции экспрессии генов
эукариот [Chu, Rana, 2006]. В процессе депони-
рования принимает участие белок GW182, со-
держащий в своем составе глицин/триптофан-
богатый мотив (GW), который напрямую взаи-
модействует с MID—PIWI-доменами белка AGO
Длинная дцРНК
е
жж
жж
siPHK
RLC
Дайсер
Дайсер
RISC
siPHK атф
мРНК-мишень
Расщепление мРНК
Рис. 7.1. Механизм РНК-интерференции.
Схема составлена по данным [Meister, Tuschl, 2004].
[Till etal., 2007]. мРНК могут находиться в
«Р-тельцах» длительное время, оставаясь интакт-
ными, и впоследствии снова участвовать в транс-
ляции, освобождаясь из «Р-телец», либо подвер-
гаются деградации после «декепирования» [Till
et al.. 2007].
«Обходной» путь активации является менее
эффективным по сравнению с «классическим»,
поскольку в этом случае RISC не действует в
каталитическом режиме, ингибируя экспрессию
генов по механизму’ блокирования трансляции
без расщепления мРНК-мишени. Кроме того, эф-
фективность сборки активированного RISC лими-
тирована низкой скоростью диссоциации интакт-
ных цепей siPHK [Matranga et al., 2005], требую-
щей затрат энергии АТФ [Nykanen et al., 2001].
Теоретически любая из двух цепей, состав-
ляющих siPHK, может войти в состав комплекса
RISC и стать «направляющей» цепью («guide»
strand), но только комплексы, содержащие в сво-
184 ЭПИГЕНЕТИКА
ем составе антисмысловую цепь siPHK, которая
комплементарна мРНК-мишени, могут распозна-
вать эту’ мРНК и индуцировать ее расщепление
или блокировать трансляцию. Комплексы, в со-
став которых входит смысловая цепь, не оказы-
вают биологического эффекта ввиду отсутствия
в клетке комплементарных мишеней либо могут
вызывать неспецифические побочные эффекты
за счет узнавания частично комплементарных им
последовательностей в составе других клеточ-
ных мРНК. Экспериментально доказано, что
равная вероятность включения смысловой либо
антисмысловой цепи в состав активированного
RISC реализуется далеко не для всех siPHK: для
большинства siPHK одна из цепей включается в
состав активированного RISC-комплекса более
эффективно и, таким образом, определяет актив-
ность данной siPHK. Механизм выбора «направ-
ляющей» цепи подробно изучен в большом ко-
личестве экспериментальных и теоретических
исследований, которые показали, что специфич-
ность сборки RISC-комплекса определяется от-
носительной термодинамической стабильностью
различных частей siPHK-дуплекса (рассмотрено
в обзорах [Aronin, 2006; Kim, Rossi, 2008]). На-
копленные к настоящему' времени данные пока-
зывают, что наиболее активными ингибиторами
экспрессии генов являются siPHK, в которых ду-
плекс со стороны 5'-конца антисмысловой цепи
является более термодинамически стабильным,
чем со стороны З'-конца [Khvorova etal., 2003].
Влияние такой термодинамической асимметрии
является определяющим на первом этапе сборки
комплекса RISC, когда siPHK взаимодействует с
гетеродимером Danccp/TRBP: при этом TRBP
связывается с 5'-концом более термостабильной
части дуплекса и направляет Дайсер к 5'-концу
противоположной цепи, образуя RLC. На втором
этапе сборки, когда рибонуклеаза Ago2 взаимо-
действует с комплексом RLC, PIWI-домен белка
Ago2 связывается с той частью комплекса, кото-
рая была занята Дайсером и постепенно замеща-
ет его. Конфигурация образовавшегося комплек-
са RISC однозначно определяет, какая цепь ос-
танется в комплексе при его активации и будет
играть роль направляющей цепи, а какая цепь
будет разрезана и диссоциирует из комплекса.
7.2. Особенности механизма РНК-
интерференции У РАЗНЫХ ОРГАНИЗМОВ
У С. elegans, а также у таких организмов, как
Arabidopsis и Neurospora crassa, в отличие от
Drosophila и позвоночных, интерферирующее
действие двуцепочечной РНК (дцРНК) сохраня-
ется на протяжении нескольких поколений. Это
происходит благодаря содержащейся в этих ор-
ганизмах РНК-зависимой РНК-полимеразе (RdRp),
которая достраивает мРНК-мишень до дцРНК,
используя антисмысловую цепь siPHK в качестве
праймера. Получившиеся таким образом длинные
дцРНК, гомологичные протяженному2 участку
мРНК, нарезаются, в свою очередь, белком Дай-
сер с образованием siPHK, усиливая тем самым
эффект интерференции и увеличивая его дли-
тельность [Sijen et al., 2001]. В дальнейшем siPHK
выступают либо в качестве праймеров для син-
теза длинной антисмысловой РНК, либо могут
индуцировать расщепление мРНК-мишени в
районе ее гомологии с siPHK.
Синтез вновь образующейся цепи РНК у
С. elegans протекает в строго определенном на-
правлении от 5'- к 3'-концу’, в то время как у рас-
тений в качестве затравки могут выступать как
5'-, так и З'-концы [Vaistij et al., 2002]. Таким об-
разом. расщепление мРНК способствует увели-
чению концентрации siPHK. Функцию эндонук-
леазы у С. elegans, так же как и у Drosophila, вы-
полняет белок семейства Argonaute — RDE-I
[Tabara et al., 2002]. Под действием RdRp обра-
зуются относительно короткие фрагменты, по-
этому вторичный siPHK-сигнал фиксируется на
расстоянии не более, чем несколько сотен пар
оснований от сайта исходной гомологии. RdRp,
участвующие в процессе РНКи, были также об-
наружены у грибов, растений и беспозвоночных
[Cogoni, Macino, 1999; Dalmay et al., 2000; Mour-
rain etal., 2000; Smardon etal., 2000; Matrens
et al., 2002; Vaistij et al., 2002]. К сожалению, у
млекопитающих этот фермент отсутствует, и
siPHK вызывают только кратковременное подав-
ление экспрессии генов. Следует также отме-
тить, что RdRp играет важную роль в биогенезе
ряда эндогенных регуляторных некодирующих
РНК, которые будут подробно рассмотрены в
следующем разделе.
Другой особенностью протекания РНКи у
С. elegans и растений является способность рас-
пространения эффекта подавления экспрессии
генов между’ тканями целого организма [Palauqui
et al., 1997; Fire, 1998; Voinnet et al., 1998; Wins-
ton et al., 2002], тогда как у Drosophila и H. sa-
piens процесс РНКи протекает в локализованном
районе, на который воздействует дцРНК, и не
распространяется на другие ткани и органы
[Roignant etal., 2003]. Проявление соматическо-
го характера распространения siPHK было про-
демонстрировано в эксперименте с нематода-
ГЛАВА 7 185
ми — кормление червей бактериями, экспресси-
рующими дцРНК, индуцирует внутри червя
процесс РНКи [Timmons, Fire, 1998]. Такая сома-
тическая передача РНКи требует наличия меха-
низмов амплификации и транспорта, передаю-
щего сигнал между’ клетками. В числе генов,
обеспечивающих возможность передачи инги-
бирующего сигнала между клетками и даже по-
колениями у С. elegans, были идентифицирова-
ны sid-1, sid-2 и sid-3 (SID — Systemic RNA inter-
ference defective) [Feinberg, Hunter, 2003]. Гомо-
логи белка SID-1 были найдены у большинства
млекопитающих, включая человека [Winston
et al., 2002: Wolfrum et al., 2008], что указывает
на возможность существования системной РНКи
и у других организмов. Однако в случае млеко-
питающих, из-за отсутствия системы амплифи-
кации сигнала, трудно ожидать значимых биоло-
гических эффектов передачи РНКи между’ клет-
ками и тканями организма.
У растений, дрожжей и мух siPHK кроме РНКи
участвуют в РНК-зависимом метилировании
ДНК (RdMD, RNA-directed DNA methylation)
[Matzke etal., 2009a,b]. siPHK в комплексе с
AGO4 взаимодействует с комплементарными ей
псРНК (non-coding RNA, некодирующими РНК),
которые синтезируются в ядре под действием
Pol V или Pol II [Wierzbicki et al., 2008, 2009; He
et al., 2009а]. В свою очередь AGO4 так же взаи-
модействует с указанными полимеразами [Не
et al., 2009b]. Образовавшийся комплекс рекру-
тирует de novo ДНК-метилтрансферазу комплекс
DRM2 и DDR, содержащий белки, ремодели-
рующие хроматин (DDR1 и DMS3), и белок, свя-
зывающий одноцепочечну’ю метилированную
ДНК (RDM1) [Gao et al., 2010]. Несмотря на ряд
публикаций, описывающих ингибирование транс-
крипции под действием siPHK, направленных на
премоторные участки генов млекопитающих
[Morris et al., 2004; Castanotto et al., 2005; Janowski
et al., 2005; Kim et al., 2007], существование ана-
логичного механизма ремоделирования и моди-
фикации хроматина у высших организмов пока не
считается доказанным.
У дрожжей обнару’жен интересный механизм
подавления активности прицентромерных по-
второв, ключеву’ю роль в котором играют ком-
плексы siPHK с AGO1. Этот механизм был на-
зван RITS (RNA-induced transcriptional silencing)
[Volpe etal., 2002; Verdel etal., 2004]. Источни-
ком интерфериру’ющих РНК в этом случае яв-
ляются некодиру’ющие РНК, транскрибируемые
с этих повторов, образуя комплекс с AGO1, они
взаимодейству’ют с вновь синтезированными ис-
ке дтру’ющими РНК и рекрутируют гистон-НЗ-
лизин9 метилазу (НЗК9те) и метилтрансферазу’
С1г4, которые модифицируют соответствутощий
гистон и способствуют формированию и под-
держанию гетерохроматина [Nakayama et al.,
2001; Volpe et al., 2002]. В образовании комплек-
са также участвуют Tas3, содержащий AGO-свя-
зывающий домен, и Chpl, связывающийся с хро-
матином [Sadialie etal., 2004; Till etal., 2007].
Эти белки слу’жат своеобразным «мостиком» и
обеспечивают специфичность метилирования.
К настоящему’ времени подробно изу’чен це-
лый ряд процессов в различных организмах, где
интерферирующие РНК ингибируют транскрип-
цию генов. В большинстве случаев эти процессы
имеют много общих черт с RdMD и RITS: зави-
симость от транскрипции некодирутощих РНК,
действие siPHK или ее аналогов в комплексе с
белками семейств AGO или PIWI, образование
комплекса, ремоделирующего и модифицирую-
щего хроматин. Отличаются, как правило, уча-
ствующие в процессе белки и типы некодируто-
щих РНК. Среди наиболее изученных примеров
таких процессов следует упомянуть подавление
активности транспозонов у Drosophila [Pal-Bhad-
ra et al., 2004; Brower-Toland et al., 2007], подав-
ление локуса импринтинга в половых клетках
мыши [Kuramochi-Miyagawa et al., 2008; Watana-
be et al., 2011] и элиминацию ДНК транспозонов
у Tetrahymena [Aronica et al., 2008; Kataoka,
Mochizuki, 2011].
7.3. Конструирование интерферирующих
РНК ДЛЯ БИОМЕДИЦИНСКИХ ЦЕЛЕЙ
7.3.1. Молекулярные мишени
Многие заболевания и патологические со-
стояния человека и животных связаны с нару-
шением регуляции экспрессии генов, экспресси-
ей чужеродных генов или химерных и мутант-
ных вариантов генов собственного организма.
В последнее время достигнут большой прогресс
в конструировании и применении интерфери-
рующих РНК на различных моделях заболева-
ний человека.
Генетические заболевания. Заболевания, вы-
званные экспрессией мутантных аллелей генов,
представляют особый интерес в качестве моде-
лей для испытания интерфериру’ющих РНК. Во
многих случаях экспрессия аллеля дикого типа
необходима для нормального развития и функ-
ционирования организма, поэтому' основным тре-
бованием к интерфериру’ющим РНК, предназна-
186 ЭПИГЕНЕТИКА
ченным для подавления экспрессии химерного
или мутантного варианта гена, является селек-
тивность действия ингибитора. Многообещаю-
щие результаты получены при использовании
siPHK для селективного подавления аллелей, со-
держащих однонуклеотидные полиморфизмы
[Miller et al., 2003, 2004]. При ряде неврологиче-
ских заболеваний патогеном являются полиглю-
таминовые белки, которые кодируются транс-
криптами, содержащими CAG-повторы. Такие
же повторы входят в состав многих нормальных
транскриптов, что не позволяет использовать
направленные на них siPHK. Для решения дан-
ной проблемы было предложено выявлять одно-
нуклеотидные полиморфизмы в составе мутант-
ных транскриптов и использовать siPHK, цент-
ральные районы которых содержат полиморф-
ные нуклеотиды. Удалось подобрать исключи-
тельно селективные комбинации siPHK/SNP, ко-
торые позволили ингибировать экспрессию му-
тантного транскрипта с сохранением экспрессии
аллеля дикого типа [Miller et al., 2003. 2004].
На примере siPHK, направленных на одно-
нуклеотидные мутации в гене супероксид дис-
мутазы (SOD1) [Ding etal., 2003], вызывающие
развитие бокового амиотрофического склероза
(ALS), и мутации в гене хантингтине (НТТ)
[Schwarz et al., 2006], вызывающие болезнь Ханг-
тингтона, была подтверждена принципиальная
возможность селективного подавления экспрес-
сии мутантных аллелей. Обнаружено, что наи-
лучшая дискриминация аллелей достигается при
пурин-пуриновых мисматчах, расположенных в
позициях 10 и 16 со стороны 5'-конца направ-
ляющей цепи siPHK [Schwarz et al., 2006].
Вирусные заболевания. Вирусы являются дос-
таточно трудными мишенями для воздействия
siPHK, поскольку’ многие из них в процессе эво-
люции выработали сложные механизмы ухода от
противовирусной защиты высших организмов,
частью которой является механизм РНК-интерфе-
ренции. Тем не менее, для целого ряда вирусов
были подобраны эффективные молекулярные
мишени, ингибирование которых блокирует их
репликацию или предотвращает заражение клет-
ки. Первые успешные результаты были получе-
ны на мышиной модели гепатита В (HBV): пока-
зано, что при введении репликона гепатита В
вместе с конструкцией, экспрессирующей shPHK
(шпилечную РНК), направленную на коровый
антиген HBV, происходит значительное (на два
порядка) снижение экспрессии вирусного гена-
мишени в печени животных [McCaffrey’ et al.,
2003]. Несколько групп исследователей, исполь-
зуя модельную систему’ с минирепликоном, до-
бились ингибирования репликации вируса в
культуре клеток [Kapadia et al., 2003; Randall
et al., 2003; Wilson et al., 2003], в этих исследова-
ниях в качестве мишеней для интерферирующих
РНК были использованы внутренний сайт посад-
ки рибосомы (internal ribosome entry’ site (IRES) и
участки РНК, кодирующие неструкту’рные белки
NS3 и NS5b. Особый интерес к вирусу гепатита
В вызван не только недостаточной эффективно-
стью лечения вызываемого им заболевания тра-
диционными лекарственными средствами, но и
тем, что вирус поражает преимущественно клет-
ки печени, доставка терапевтических нуклеино-
вых кислот в которые происходит наиболее эф-
фективно при системном введении. Несмотря на
обнадеживающие результаты, полученные на
животных моделях, возможность получения те-
рапевтически значимых эффектов при использо-
вании siPHK на человеке еще не доказана.
Еще одной интересной мишенью для интер-
ферирующих РНК является вирус иммунодефи-
цита человека (HIV). В ряде исследований для
подавления HIV были использованы синтетиче-
ские siPHK и кассеты, экспрессирующие shPHK,
направленные на различные ранние и поздние
вирусные РНК: TAR элемент, tat, rev, gag, env,
vif и nef (рассмотрено в обзоре [Zeller, Kumar,
2011]). Несмотря на успешное подавление реп-
ликации вируса под действием интерферирую-
щих РНК, клиническое применение siPHK за-
труднено ввиду высокой скорости мутации этого
вируса и формирования мутантных клонов, ус-
тойчивых к siPHK [Boden etal., 2003]. Поэтому’
более эффективной стратегией для борьбы с HIV
представляется подавление экспрессии клеточ-
ных факторов, необходимых для его репликации
и инфицирования, таких как NFk|3 [Surabhi, Gay-
nor, 2002], рецептор CD4 [Novina et al.. 2002] и
ко-рецепторы CXCR4 и CCR5 [An et al., 2007;
Kim etal., 2010]. Особенный интерес представ-
ляет в качестве мишени ко-рецептор CCR5, экс-
прессирующийся макрофагами: он не является
необходимым для нормального функционирова-
ния иммунной системы. Показано, что гомозиго-
ты, несущие 32-нуклеотидную делецию в этом
гене, не чувствительны к заражению HIV. а гете-
розиготы — носители этого аллеля демонстри-
руют замедленную прогрессию заболевания [Sam-
son et al., 1996].
Онкологические заболевания. Важную роль в
процессе злокачественной трансформации кле-
ток играют гены, гиперэкспрессия которых при-
водит к неконтролируемой пролиферации (бел-
ГЛАВА 7 187
ки-рсгуляторы клеточного цикла) [Bishop, 1982],
блокированию апоптоза [Dive, 1997], нарушению
процессов дифференцировки [Campbell et al.,
1998], повышению уровня генетической неста-
бильности [Albertson et al., 2003], а также к уси-
лению инвазивных свойств опухолевой клетки
[Bernhard etal., 1990; Dvorak etal., 1995]. Наибо-
лее часто в опухолевых клетках наблюдается экс-
прессия мутантных форм или гиперэкспрессия
нормальных клеточных генов, кодирующих ре-
цепторы, транскрипционные факторы, тирозин-
киназы и другие регуляторные белки.
Пути передачи сигналов в клетке включают
множество дублирующих друг друга элементов,
поэтому’ при подавлении экспрессии одного кле-
точного фактора, участвующего в передаче сиг-
нала, возможна компенсация его функции путем
активации альтернативного сигнального пути
[Sulic et al., 2005]. Проблема поиска молекуляр-
ных мишеней для направленного действия про-
тивоопухолевых терапевтических агентов ос-
ложняется тем, что опухолевый процесс разви-
вается в результате накопления комплекса гене-
тических и эпигенетических аномалий и выявить
его причину’ не всегда удается. Более того, гены,
нарушения которых явились инициаторами раз-
вития заболевания, не всегда могут служить хо-
рошей мишенью для агентов, предназначенных
для обращения опухолевого фенотипа или для
активации механизмов гибели опухолевой клет-
ки. Благодаря большому интересу научного со-
общества к поиску’ молекулярных мишеней для
терапии опухолевых заболеваний, на сегодня
имеется целый ряд успешных примеров экспе-
риментального применения siPHK в модельных
системах на животных. Так, была показана эф-
фективность адено- и ретровирусов, экспресси-
рующих shPHK, направленные против мРНК ге-
на Heel, на модели индуцированной аденокарци-
номы [Gurzov, Izquierdo, 2006], специфическая
аптамер-опосредованная доставка siPHK в клет-
ки опухоли, экспрессирующие простат-специфи-
ческий антиген (PSMA) [McNamara et al., 2006],
эффективное подавление экспрессии фактора
роста васкулярного эндотелия (VEGF) под дей-
ствием siPHK, приводящее к ингибированию ан-
гиогенеза и торможению роста опухоли [Takei
et al., 2004], блокирование распространения ме-
тастазов саркомы Эвинга под действием анти-
Eyvs-Flil siPHK [Hu-Lieskovan et al., 2005].
Особый интерес в качестве мишеней для ин-
терферирующих РНК представляют собой гены,
ответственные за устойчивость опухолей к хи-
мио- [Nieth et al., 2003] и радиотерапии [Collis
etal., 2003]. Их преимуществом является то, что
подавление экспрессии этих генов в здоровых ор-
ганах и тканях организма, как правило, не приво-
дит к патологическим последствиям и, таким об-
разом. снимается проблема высокоселективной
доставки siPHK в опухоль. Уже получены поло-
жительные результаты при совместном действии
традиционного химиотерапевтического препарата
доксорубицина и siPHK, направленных на подав-
ление экспрессии генов MDR1 (Multiple Drug
Resistance) и BCL2 на лекарственно устойчивые
клетки рака легких [Saad et al., 2008].
В Институте химической биологии и фунда-
ментальной медицины СО РАН получены высо-
коэффективные ингибиторы экспрессии гена
MDR1 [Логашенко и др., 2002, 2005, 2006; Loga-
shenko etal., 2004]. После «выключения» этого
гена гибель опухолевых клеток эффективно про-
исходит при ранее переносимых дозах цитоста-
тика. Показано, что опухоли мыши, образован-
ные лекарственно-устойчивыми клетками, транс-
фецированными анти-mdrlb siPHK, более чем в
2 раза эффективнее регрессируют под действием
циклофосфамида, чем контрольные опухоли
[Patutina et al., 2010].
Для совместной доставки в опухоль цитоста-
тиков и интерферирующих РНК используют ли-
посомы [Saad et al., 2008], носители на основе
дендримеров [Kaneshiro, Lu, 2009], пористых на-
ночастиц [Meng etal., 2010] и модифицирован-
ных квантовых точек [Jin-Ming Li et al., 2012].
7.3.2. Способы получения
интерферирующих РНК
В настоящее время используют три основные
стратегии получения siPHK: а) создание плаз-
мидных или вирусных конструкций, экспресси-
рующих siPHK или шпилечные shPHK в клетках;
б) химический синтез siPHK; в) ферментатив-
ный синтез siPHK с помощью Т7-транскрипции
in vitro.
Экспрессирующие конструкции. Использова-
ние плазмидных конструкций, кодирующих siPHK
или shPHK, обеспечивает стабильную внутри-
клеточную экспрессию интерферирующих РНК,
вызывающую более продолжительное ингиби-
рование экспрессии РНК-мишени по сравнению
с экзогенными siPHK [Amarzguioui, 2005]. При-
менение вирусных векторов, например лентиви-
русных или аденовирусных, позволяет эффек-
тивно доставлять конструкции в клетки [Poliseno
et al., 2004], однако вопросы безопасности их
применения еще не решены [Stevenson, 2004].
188 ЭПИГЕНЕТИКА
В настоящее время используются два основ-
ных типа векторов для экспрессии siPHK внутри
клетки: первый тип представляет собой тандем-
ный вектор, который транскрибирует смысло-
вую и антисмысловую последовательности, на-
ходящиеся под контролем разных промоторов,
второй тип вектора транскрибирует единствен-
ную цепь РНК, сворачивающуюся в шпилечную
структуру, так называемую короткую шпилеч-
ную РНК (shPHK), из которой после расщепле-
ния Дайсером образуются siPHK [Tuschl, 2002].
shPHK-экспрессирующий вектор более удобен
для конструирования, чем векторы тандемного
типа, кроме того, показано, что ингибирование
экспрессии гена-мишени под действием интер-
ферирующей РНК, экспрессируемой таким век-
тором, происходит более эффективно [Kobayashi
et al., 2004], поэтому’ shPHK-экспрессирующие
векторы используются значительно чаще.
Вектор, экспрессирующий shPHK, состоит
из промотора, последовательности, кодирующей
смысловую цепь, петли, последовательности, ко-
дирующей антисмысловую цепь, и терминатора
транскрипции. Промоторы РНК-полимеразы III
(pol III), малых ядерных РНК U6 (U6) и РНКазы
Р человека Hl (Н1) часто используются для экс-
прессии shPHK, поскольку’ они обеспечивают ста-
бильную транскрипцию коротких РНК в боль-
ших количествах, кроме того, их сайты инициа-
ции и терминации транскрипции точно опреде-
лены. Показано, что эффективность подавления
экспрессии гена-мишени под действием shPHK-
экспрессирующих векторов зависит от типа про-
мотора [Boden et al., 2003; Papadakis et al., 2004;
Takahashi et al., 2009], причем эффективность его
действия может зависить от типа клеточной ли-
нии [Choy' et al., 2008]. Промоторы pol II также
могут быть использованы для контроля транс-
крипции shPHK в составе векторов [Zhou et al..
2005]. Некоторые промоторы pol II способны
обеспечить клеточную и тканевую специфичность
экспрессии shPHK: например, промотор теломера-
зы, повышенная экспрессия которой наблюдается
в опухолевых клетках [Xing et al., 2008], промотор
al-антитрипсина человека (hAAT) — экспрессия в
гепатоцитах [Giering etal., 2008]. Д. Гримм и др.
сообщали об успешном подавлении экспрессии
гена оболочки поверхностного антигена (sAg)
вируса гепатита В (HBV) в печени HBV-транс-
генных мышей под действием shPHK, экспрес-
сиру'ющейся под управлением промотора U6.
Однако, было обнаружено, что повсеместная
экспрессия shPHK, при которой нарабатывается
ее избыточное количество, является токсичной
для мышей [Grimm etal., 2006]. Токсичность
shPHK, как оказалось, вызвана ограниченным
количеством в клетках Экспортина 5, который
осуществляет перенос РНК из ядра в цитоплаз-
му': в условиях избытка shPHK он не справляется
со своей функцией, что затру'дняет перемещение
эндогенных miPHK из ядра в цитоплазму' и на-
рушает регуляцию экспрессии целого ряда ге-
нов. Недавно Дж. С. Гиерин и др. предложили
решение этой проблемы, они использовали гепа-
тоцит-специфичный промотор (hAAT) для экс-
прессии shPHK [Giering et al., 2008]. Этот подход
оказался эффективным не только для подавления
репликации HBV в HBV-трансгенных мышах, но
также устранил токсичность, связанную с избы-
точной наработкой shPHK.
Химический синтез. С помощью химического
синтеза можно получить siPHK любой последо-
вательности и в больших количествах, в том чис-
ле siPHK, содержащие различные химичес-
кие модификации, повышающие устойчивость
siPHK к рибонуклеазам и увеличивающие эф-
фективность и длительность ее действия. Кано-
нические малые интерферирующие РНК пред-
ставляют собой дуплексы длиной 21 пара осно-
ваний с 3'-выступающими динуклеотидами. Тем
не менее, в последнее время стало известно, что
интерферирующие РНК другой структуры также
могут подавлять экспрессию генов-мишеней, дей-
ствуя по механизму' РНК-интерференции. Новый
дизайн малых интерферирующих РНК. пред-
ставляющих собой дуплекс, образованный анти-
смысловой цепью и смысловой цепью, состоя-
щей из двух коротких олигорибону'клеотидов
длиной 10—12 нуклеотидов, содержащих LNA-
модифицированные звенья, был предложен в
[Bramsen etal., 2007]. В составе таких молекул,
названных малыми вну'тренне-сегментирован-
ными интерферирующими РНК, или sisiPHK
(small internally segmented interfering RNA,
sisiRNA), функциональной является только анти-
смысловая цепь, тогда как смысловая цепь сег-
ментирована и не может играть роль ведущей
цепи и входить в состав активированного RISC.
Такая функциональная асимметрия дуплекса
обеспечивает его высокую активность и специ-
фичность. Дизайн sisiPHK позволяет вводить та-
кие количество и типы химических модифика-
ций в состав антисмысловой цепи, которые сде-
лали бы ее нефункциональной в рамках siPHK
классической структуры.
Синтетические дуплексы длиной 25—27 п.н.
специфической структуры, так называемые суб-
страты Дайсера, или DsiPHK (Dicer-substrate
ГЛАВА 7 189
RNA, DsiRNA), недавно были предложены в ка-
честве эффекторов РНК-интерференции. Пока-
зано, что они проявляют более высокую актив-
ность по сравнению с 21 п.н. siPHK, направлен-
ными к той же последовательности мишени в
составе мРНК за счет облегчения эффективной
сборки комплекса RLC после процессинга дуп-
лекса Дайсером [Kim et al., 2005]. Использование
асимметричных дуплексов, состоящих из 25-звен-
ной смысловой цепи и 27-звенной смысловой
цепи, имеющих только один динуклеотидный
выступ на 3'-конце антисмысловой цепи и два
дезокси нуклеотида на 3'-конце смысловой цепи,
обеспечивает правильный процессинг и включе-
ние антисмысловой цепи в RISC в качестве ве-
дущей цепи [Bramsen et al., 2009].
Недавно показано, что минимальный дуплекс
РНК, способный входить в состав каталитически
активного RISC-комплекса, имеет длину’ всего
16 п.н. [Chu, Rana, 2008], а в случае если интер-
ферирующая РНК содержит химические мо-
дификации, может иметь длину’ всего 15 п.н.
(rxRNA) или даже состоять только из одной ан-
тисмысловой цепи (rxRNAsolo) [Samarsky, 2009].
Тип и расположение модификаций в составе
двух последних упомянутых структур, разрабо-
танных компанией RXi Pharmaceuticals, не рас-
крываются авторами до публикации патента.
Ферментативный синтез. Ферментативный
синтез с помощью in vitro транскрипции с Т7
РНК-полимеразой на коротких ДНК-матрицах
[Donze, Picard, 2002; Sohail et al., 2003] позволяет
быстро получить в условиях любой лаборатории
препарат siPHK стандартного качества. Альтер-
нативным способом ферментативного получения
siPHK является ферментативный синтез длин-
ных двуцепочечных РНК с последующей нарез-
кой рекомбинантным Дайсером in vitro [Myers
etal., 2003; Buchholz etal., 2006]. Этот способ
имеет два основных преимущества: во-первых,
нет необходимости выбирать последователь-
ность активных siPHK и перебирать варианты,
так как среди образовавшихся в результате про-
цессинга молекул такие наверняка есть и биоло-
гический эффект действия такой смеси siPHK
практически обеспечен, во-вторых, каждая siPHK
присутствует в смеси в невысокой концентра-
ции, что снижает риск возникновения побочных
эффектов (этот вопрос будет рассмотрен более
подробно в разделе 7.3.4). Недостатком фермен-
тативных методов является невозможность вве-
дения в состав siPHK химических модификаций
для улучшения ее свойств.
7.3.3. Химические модификации
в составе интерферирующих РНК
Широкий спектр химических модификаций
был испытан для улучшения различных свойств
siPHK. Предыдущие достижения в этой области
рассмотрены в обзорах [Chiu, Rana, 2003; Mano-
haran, 2004; Behlke, 2008; Watts etal., 2008]. Ос-
новные типы модификаций включают модифи-
кации азотистых оснований, межнуклеотидных и
концевых фосфатных групп, 2'-положения ри-
бозного кольца и замен}7 самой рибозы на другие
молекулы (рис. 7.2).
Компактные модификации азотистых основа-
ний, не меняющие заряд молекулы, обычно со-
вместимы с функционированием такого моди-
фицированного дуплекса как интерференцион-
ного агента. Тем не менее, такие модифициро-
ванные siPHK обычно не обладают какими либо
улучшенными или полезными свойствами по
сравнению со своими не модифицированными
аналогами. 5-метил- и 5-пропинил-аналоги пи-
римидиновых нуклеотидов вводили в siPHK для
исследования влияния стерических эффектов в
большой бороздке siPHK на интерференционную
активность RISC-комплекса [Terrazas, Kool, 2009].
Введение громоздкой 5-пропинильной модифи-
кации ингибировало РНКи-активность, причем
наиболее сильно влияние модификации прояв-
лялось в тех случаях, когда она была введена в
5'-район антисмысловой цепи. Замена такой мо-
дификации на меныпую по размеру 5-метиль-
ную группу’ не влияла на интерферирующую ак-
тивность, и активности модифицированной и
немодифицированной siPHK были сходны. Тем
не менее, данные, полученные ранее, о том, что
введение в siPHK компактных 5-бром- и 5-йод-
замещенных аналогов приводило к снижению
интерферирующей активности, указывают — не
только размер, но и природа группы, модифици-
рующей азотистое основание, влияют на актив-
ность siPHK [Chiu, Rana, 2003].
Исследования по химической модификации
концевых групп в siPHK показали, что 5'-конец
антисмысловой цепи должен сохранять способ-
ность к фосфорилированию либо уже содержать
фосфатную группу’ до попадания в клетку’ [Czau-
dema etal., 2003]. В то же время, 5'-конец смы-
словой цепи может быть использован для введе-
ния химических модификаций, предназначенных
для защиты от действия экзонуклеаз, улучшения
доставки siPHK в клетку’, или для введения раз-
личных флуоресцентных красителей (рассмот-
190 ЭПИГЕНЕТИКА
2'-ОН 2-О-Ме 2-F 2-FANA 2'-Н
2'-O-allyl 2-О-МОЕ 2-O-DNP
Рис. 7.2. Аналоги нуклеозидов и нуклеотидов, используемые для модификации siPHK.
а — введение заместителей в фуранозу; б — структурные модификации фуранозного цикла; е — модификации фосфатного
остова; г — модификации азотистых оснований. «В» — азотистые основания; «R» — остаток рибозы.
рено в обзорах [Manoharan, 2004; De Paula et al.,
2007]). Присоединение различных молекул (на-
пример, аминогруппы или остатка холестерина)
может быть также использовано для блокирова-
ния взаимодействия 5'-конца смысловой цепи и
предотвращения ее включения в качестве «ве-
дущей» цепи в RISC-комплекс [Kubo et al..
2008].
Фосфоротиоатные (PS), боранофосфатные
(BP), амидные и 2',5'-фосфодиэфирные связи
могут быть использованы в siPHK вместо кано-
нических 3'—5'-фосфодиэфирных (рассмотрено
в обзоре [Watts et al., 2008]). Однако только вве-
дение боранофосфатных модификаций не сни-
жает, а в некоторых случаях даже повышает ин-
терферирующую активность siPHK [Hall etal.,
2004]. Остальные перечисленные выше модифи-
кации могут быть использованы в некоторых (не
во всех) положениях siPHK для защиты от дей-
ствия рибонуклеаз, однако активность модифи-
цированных дуплексов, как правило, не превы-
шает, а чаще всего оказывается ниже, чем актив-
ность немодифицированных siPHK той же по-
следовательности .
ГЛАВА 7 191
Ввиду’ особой важности защиты 2'-положения
рибозы от действия эндорибонуклеаз в литера-
туре описано большое количество химичес-
ких модификаций, затрагивающих эту’ позицию:
2'-О-метил-(2'-ОМе). 2'-фтор-(2'-Р), ДНК. 2'-
аминоэтоксиметил-(2'-АЕМ), 2'-аминопропокси-
метил-(2'-АРМ), 2'-аминоэтил-(2'-ЕА), 2'-амино-
пропил-(2'-АР), 2'-цианоэтил-(2'-СЕ), 2'-гуани-
диноэтил-(2 '-GE), 2'-О-метоксиэтил-(2 '-О-МОЕ),
2'-О-2,4-динитрофенил-(2'-О-ОНР) и другие.
Структуры перечисленных модифицированных
аналогов приведены на рис. 7.2. Как правило,
замена большого количества или всех нуклеоти-
дов на 2'-модифицированные аналоги приводит
к снижению или даже полному блокированию
интерферирующей активности siPHK, однако
частичная модификация 2'-положений рибозы
широко используется для создания высокоэф-
фективных siPHK. Наиболее удачными оказа-
лись 2'-F [Layzer et al., 2004] и 2'-дезокси-2'-
флуюро-бета-В-арабино-(2'-ЕАНА) [Dowler et al.,
2006] аналоги рибонуклеотидов, введение кото-
рых практически не приводит к снижению ин-
терферирующей активности siPHK даже при за-
мене на аналоги всех нуклеотидов в ее составе.
Основные усилия исследователей в этой области
направлены на создание новых аналогов нуклео-
тидов и специфических паттернов расположения
модифицированных аналогов в составе siPHK,
позволяющих улучшить ее интерферирующие
свойства.
В Институте химической биологии и фунда-
ментальной медицины СО РАН предложен экс-
периментальный алгоритм селективной модифи-
кации нуклсазочувствитсльных сайтов в составе
siPHK, который позволяет сохранить биологиче-
скую активность и увеличить длительность ин-
гибирующего действия siPHK [Volkov et al.,
2009; Petrova et al.. 2010, 2011].
Недавние публикации описывают успешные
примеры использования siPHK, содержащих раз-
личные типы модификаций в составе одной мо-
лекулы [Morrissey et al., 2005; Collingwood et al.,
2008; Lively etal., 2008; Barik, 2009]. Так, чере-
дующиеся специфическим образом 2'-ОМе- и 2'-
F-модификации в составе смысловой цепи были
успешно использованы для конструирования
siPHK, направленной на РНК, кодирующую боль-
шую субъединицу полимеразы респираторного
синцитиального вируса (RSV) [Barik, 2009]. Ин-
траназальное введение этой siPHK лаборатор-
ным животным (мыши) ингибировало репродук-
цию вируса и развитие вирусной инфекции. Пат-
терн модификации с использованием 2'-ОМе-
модифицированных аналогов был предложен и
для 27 п.н. dsiPHK [Collingwood et al., 2008]. По-
казано, что частичная модификация dsiPHK, не
затрагивающая сайт разрезания Дайсера, не пре-
пятствует правильному’ процессингу dsiPHK в
siPHK. Недавно путем скрининга была иденти-
фицирована высокоэффективная химически мо-
дифицированная анти-1Е-13 siPHK с паттерном
модификации, сходным с модификациями, пред-
ложенными в работе Morrissey [Morrissey et al.,
2005]. Эффективное подавление экспрессии ге-
на-мишени под действием этой siPHK было про-
демонстрировано в экспериментах на мышах
[Lively et al., 2008]. В этой siPHK все кроме трех
2'-гидроксилов были заменены на 2'-F-, 2'-ОМе-
или 2'-Н-группы и по концам смысловой цепи
были введены инвертированные апуриновыс
нуклеотиды.
Многочисленные исследования показали, что
для сохранения интерферирующей активности мо-
дифицированный дуплекс должен иметь А-форму
спирали [Chiu. Rana. 20031, однако некоторые
позиции в составе структуры siPHK более или
менее толерантны к модификациям, искажаю-
щим каноническую A-форму дуплекса. ДНК-дуп-
лексы, образующие спираль В-формы, неактив-
ны в качестве интерферирующих агентов. Для
выявления позиций в составе siPHK, в которых
должны находиться только рибонуклеотиды, ис-
пользовали замены рибонуклеотидов на дезок-
сирибонуклеотиды и исследовали влияние таких
замен на интерферирующую активность полу-
ченных siPHK [Ui-Tei et al., 2008]. Оказалось,
что следующие позиции в составе siPHK могут
быть заменены на дезоксинуклеотиды без суще-
ственного снижения биологической активности:
район «ядра» («seed» region) 2—8 н. от 5'-конца
антисмысловой цепи, комплементарная ему по-
следовательность в составе смысловой цепи,
5'-конец антисмысловой цепи и 3'-выступающий
конец смысловой цепи. Остальные позиции
должны быть заняты рибонуклеотидами или
РНК-подобными аналогами нуклеотидов для
обеспечения правильного узнавания siPHK РНК-
связывающими белками TRBP2 и Ago2, которое
необходимо для сборки RISC-комплекса.
Другие модификации рибозы включают це-
лый ряд «замкнутых» аналогов РНК, в которых
3'-эндоконформация рибозного кольца ковалент-
но закреплена метиленовым или этиленовым
мостиком (LNA, ENA, их производные и изоме-
ры [Bramsen etal., 2009; Zhou etal., 2009]), и
РНК, в которой рибозное кольцо заменено на
структурно не схожую молекулу: «разомкнутые»
192 ЭПИГЕНЕТИКА
нуклеиновые кислоты, в которых отсутствует
связь между’ 2'- и 3'-положениями (UNA) [Jensen
et al., 2008], содержащие D-альтритол нуклеи-
новые кислоты (ANA) [Fisher et al., 2007], гекси-
тол-нуклсиновыс кислоты (HNA) и псптид-нук-
леиновые кислоты, в которых сахарофосфатный
остов заменен на полипептидный (PNA). Гео-
метрия дуплексов, образуемых олигорибонуклс-
отидами с модифицированным остовом, совмес-
тима с РНК-интерференцией, однако решающее
влияние на интерферирующую активность мо-
дифицированных siPHK оказывает термодина-
мическая стабилизация или дестабилизация раз-
ных участков дуплекса в результате введения та-
ких модификаций. Этот аспект влияния модифи-
каций требует более подробного рассмотрения.
Введение химических модификаций в состав
siPHK может существенно влиять на ее интерфе-
рирующую активность как за счет изменения
термодинамической асимметрии дуплекса, так и
за счет общего увеличения его термостабильно-
сти. Кроме этого, химические модификации мо-
гут увеличивать или уменьшать сродство дуп-
лекса к белковым компонентам, участвующим в
процессе РНК-интерференции. С точки зрения
термодинамики, введение химических модифи-
каций в состав siPHK может как стабилизировать
(2'-ОМе, 2'-F/2'-OMe, HNA, ANA, ALN, LNA и
другие), так и дестабилизировать (DNA, 2'-АЕМ,
2'-АРМ, OX, 2'-ЕА. 2'-АР. 2'-СЕ. UNA) дуплекс.
В комплексном исследовании, описанном в
[Bramsen etal., 2007], было проведено прямое
сравнение влияния 21 типа химических модифи-
каций на интерферирующую активность siPHK и
жизнеспособность клеток, трансфецированных
этими siPHK. Всего в этом исследовании, на-
правленном на получение siPHK с улучшенными
свойствами, было использовано 2160 siPHK, со-
держащих различные комбинации химических
модификаций. Полученные данные показали,
что механизм РНК-интерференции более толе-
рантен к модификациям в составе смысловой
цепи: более активные siPHK содержали меньшее
суммарное количество модификаций в составе
дуплекса и меньшее количество модификаций в
составе антисмысловой цепи. Наибольший по-
ложительный эффект на активность siPHK ока-
зали химические модификации, обеспечившие
предпочтительное включение в RISC антисмы-
словой цепи путем создания благоприятной тер-
модинамической асимметрии дуплекса. Тем не
менее, введение большого количества модифи-
цированных звеньев, приводящее к существен-
ному’ увеличению общей термодинамической
стабильности дуплекса, снижает интерферирую-
щую активность. Этот факт указывает на важ-
ную роль дестабилизирующих модификаций
(например, таких как UNA [Jensen et al., 2008]) в
создании благоприятной термоасимметрии ду-
плекса [Bramsen et al., 2007].
Структура выступающих 3'-концов siPHK яв-
ляется еще одним важным параметром, влияю-
щим на выбор направляющей цепи и на ее ин-
терферирующую активность. Ранее считалось,
что выступающие концы длиной два—три нук-
леотида могут иметь любую последователь-
ность, даже состоять из дезоксирибонуклеоти-
дов. что упрощает и удешевляет синтез siPHK,
однако последние данные показали, что они мо-
гут влиять на активность siPHK [O'Toole et al.,
2005, 2006]. Доказано, что химические модифи-
кации, введенные в состав 3'-выступающих кон-
цов siPHK, осуществляют воздействие на их ак-
тивность как путем стабилизации/дестабилиза-
ции дуплекса, так и через взаимодействие с бел-
ковыми компонентами, участвующими в РНК-
интерференции, или защищая siPHK от деграда-
ции рибонуклеазами (проблема нуклеазоустой-
чивости будет позже рассмотрена в этом обзоре
более подробно).
Н4-фенилкарбамоил-цитозин (N4-CPP) — мо-
дифицированное азотистое основание, при вве-
дении которого в выступающие концы ДНК-
дуплексов наблюдается их стабилизация за счет
стэкинг-взаимодействий [Nakano etal., 2005].
Недавно было предложено использовать эту’ мо-
дификацию для получения химически модифи-
цированных siPHK, предназначенных для подав-
ления экспрессии химерного гена bcr-abl в клет-
ках линии К-562 [Murao etal., 2008]. Показано,
что введение такого модифицированного осно-
вания в выступающий 3'-конец смысловой цепи
siPHK увеличивает ее интерферирующую актив-
ность по сравнению с активностью немодифи-
цированной siPHK. Аналогичная модификация в
составе антисмысловой цепи, напротив, снижает
интерферирующее действие такой siPHK.
Интерферирующая активность siPHK, содер-
жащих морфолино-аналоги нуклеотидов, зави-
сит от положения модификации в структуре ду-
плекса [Zhang etal., 2009]. Исследование кон-
центрационной зависимости и кинетики дейст-
вия siPHK, 3'-конец которой содержал такую
модификацию, показало, что эффективное инги-
бирующее действие наблюдается при более низ-
ких концентрациях и детектируется в течение
более продолжительного времени, чем при ис-
пользовании немодифицированной siPHK. Не-
ГЛАВА 7 193
давно было показано, что добавление дополни-
тельного рибонуклеотида на 3'-конец антисмы-
словой цепи с образованием 3-нуклсотидного вы-
ступа способствует правильном}7 выбору этой це-
пи в качестве направляющей [Bramsen et al.,
2007]. Брамсен с соавторами идентифицировали
несколько паттернов модификации выступающих
3'-концевых тринуклеотидов, которые способст-
вуют (5'-LNA-LNA-PHK-3') или, наоборот, пре-
пятствуют (5'-РНК-НМ-3' и 5'-PHK-UNA-PHK-3')
проявлению высокой интерферирующей активно-
сти siPHK, содержащими такие модификации.
В другом исследовании была показана высо-
кая интерферирующая активность РНК-3'-PNA-
химер, в которых 3'-выступающий динуклсотид
смысловой цепи был заменен на PNA-аналог
[Potenza et al., 2008], причем аналогичная моди-
фикация в составе антисмысловой цепи не сни-
жает активности модифицированной siPHK.
7.3.4. Эффекты «off-target» и способы
их предотвращения
В организме высших позвоночных введение
длинной дцРНК вызывает активацию системы
врожденного иммунитета и приводит к индук-
ции синтеза интерферонов и цитокинов [Good-
boum et al., 2000]. Этот ответ представляет собой
защитную реакцию клеток организма на вирус-
ные и бактериальные инфекции и заключается в
запуске регуляторных каскадов, которые приво-
дят к гибели зараженной клетки и прекращению
развития патогена, не позволяя ему7 распростра-
ниться на соседние клетки [Samuel, 2001; Sen,
2001].
Длинная дцРНК связывается с клеточными
Toll-подобными рецепторами 3 типа (TLR3), ко-
торые через сложную сеть регуляторных каска-
дов передают сигнал и активируют экспрессию
генов интерферонов (IFNa, IFNp, IFNy). Интер-
фероны секретируются в межклеточное про-
странство и кровоток и, специфически связыва-
ясь с клеточными рецепторами клеток, активи-
руют транскрипцию генов (PKR, OAS, RNASEL,
р56, р54, р58, рбО), ответственных за противови-
русный и противобактериальный ответ. Таким
образом, запущенная цепь событий приводит к
остановке деления и, зачастую, к гибели зара-
женной клетки [Stark et al., 1998].
В ответ на попадание в клетку7 дцРНК акти-
вируются три независимые сигнальные системы:
2'—5'-олигоаденилатсинтетаза (OAS), дцРНК-
зависимая протеинкиназа R (PKR) и система ре-
гуляции экспрессии генов, опосредованная TLR3
(рис. 7.3) [Castelli et al., 1997; Clemens, 1997;
Matsumoto et al., 2004; Sen, Sarkar, 2005]. Две по-
следние системы принимают непосредственное
участие в индукции синтеза интерферонов. Пос-
ле проникновения в клетку7 или образования в
цитоплазме дцРНК связывается с PKR, индуци-
рует ее димеризацию и последующую актива-
цию путем аутофосфорилирования [Meurs et al.,
1990]. Активированный PKR фосфорилирует та-
кие субстраты, как eIF-2, IkB, протеинфосфатаза
2А (РР2А), ядерный фактор NF-90 в Т-лимфо-
цитах, NFAT-90 и ATF-2 [Clemens, 1997; Zama-
nian-Daryoush et al., 2000]. В результе этих собы-
тий происходят блокирование трансляции в
клетке и индукция апоптоза [Gil, Esteban, 2000].
OAS при связывании с длинной дцРНК изменяет
свою конформацию, что приводит к ее акти-
вации [Hartmann etal., 2003]. После этого OAS
способна олигомеризовать АТР и другие ри-
бонуклеозидтрифосфаты с образованием про-
дуктов с 2'—5'-фосфодиэфирными связями, ко-
торые индуцируют димеризацию и активацию
цитоплазматической эндорибонуклеазы РНКаза
L [Dong, Silverman, 1995]. Активированная
РНКаза L неспецифически гидролизует одноце-
почечные вирусные и клеточные РНК, включая
рибосомные РНК, что приводит к полной оста-
новке трансляции в клетке [Li et al., 1998]. Свя-
зывание дцРНК с рецептором TLR3 приводит к
специфическому7 фосфорилированию его цито-
плазматического домена киназой PI3K по тиро-
зину7. Затем ассоциированный с TLR3 адаптер-
ный белок TRIF изменяет свою конформацию,
что дает ему7 возможность взаимодействовать с
другими участниками этого сигнального каска-
да. Киназа ТВК1 после взаимодействия с факто-
ром TRIF способна специфически фосфорилиро-
вать по серину7 находящийся в цитоплазме транс-
крипционный фактор IRF3. после чего тот диме-
ризуется и проникает в ядро клетки, где активи-
рует транскрипцию гена IFN|3. TRIF через белок
RIP1 (receptor-interacting protein) воздействует на
белковый комплекс IKK, фосфорилирутощий ин-
гибитор IkB, который затем высвобождает свя-
занный с ним ядерный фактор NF-kB, последний
транслоцируется в ядро и активирует экспрес-
сию цитокиновых генов [Takeda etal., 2003].
TRAF6 способен передавать сигнал от TRIF на
киназу7 ТАК1, которая затем может фосфорили-
ровать IKK-комплекс, а также киназы р38 и JNK,
а те в свою очередь фосфорилируют транскрип-
ционные факторы ATF-2 и с-Jun, запускающие
экспрессию генов цитокинов [Alexopoulou et al.,
2001]. Таким образом, длинная дцРНК при про-
194 ЭПИГЕНЕТИКА
Длинная дцРНК
РНКаза L
Белок в клетке
не синтезируется
2’-5’-олигоаденилаты
Деградация РНК
Синтез интерферонов и цитокинов, апоптоз
Рис. 7.3. Сигнальные системы, которые активируются под действием дцРНК: OAS (a), PKR (б) и TLR3 (е).
Схема составлена по данным [Castelli et al., 1997; Clemens, 1997; Matsumoto et al., 2004; Sen, Sarkar, 2005].
никновении в клетку млекопитающего активи-
рует систему' интерферонового ответа и приво-
дит к неспецифическому подавлению экспрессии
генов, поэтому' использовать длинные дцРНК
в качестве индукторов РНК интерференции в
клетках млекопитающих, за исключением ооци-
тов и малодифференцированных клеток эмбрио-
на на ранних этапах развития, не представляется
возможным.
Для специфического выключения экспрессии
определенных генов в клетках млекопитающих
успешно используют не протяженные двуцепо-
ГЛАВА 7 195
чечные РНК, а короткие синтетические дуплек-
сы, имитирующие фрагменты РНК, получаю-
щиеся в результате фрагментации дцРНК Дайсе-
ром — siPHK. Обнаружено, что некоторые siPHK
способны, в зависимости от последовательности,
вызывать неспецифический ответ, т. е. являются
индукторами интерферонов [Judge etal., 2005;
Sioud, 2005]. Неспецифические эффекты, кото-
рые возникают в результате взаимодействия
siPHK с клетками млекопитающих, могут быть
разделены на три основные группы: активация
системы врожденного иммунитета, включение
смысловой цепи в комплекс RISC, действие
смысловой или антисмысловой цепи siPHK по
механизму miPHK [Zeng et al., 2003; Doench et al.,
2003], что приводит к подавлению экспрессии
отличных от мишени генов, мРНК которых час-
тично комплементарна «sccdw-району siPHK
[Lim et al., 2005].
Известно, что дцРНК длиной больше, чем
30 пар оснований, являются мощными активато-
рами системы врожденного иммунитета у мле-
копитающих [Minks etal., 1979]. Однако имму-
ногенная активность коротких РНК-дуплексов
была обнаружена только в ряде недавних иссле-
дований (например, [Kim et al., 2004; Hornung
et al., 2005, 2006; Judge et al., 2005; Marques,
Williams, 2005; Morrissey etal., 2005; Reynolds
et al., 2006; Schlee et al., 2006; Robinson et al.,
2009]). Активация иммунного ответа короткими
дцРНК является довольно сложным процес-
сом [Marques, Williams, 2005; Schlee et al., 2006]:
siPHK распознаются тремя основными типами
Toll-подобных рецепторов (TLR3, TLR7 и TLR8),
а также рядом TLR-независимых белков (OAS,
PKR, RIG-1, Mda 5). Распознавание этими ре-
цепторами приводит к секреции цитокинов и
глобальным изменениям в профиле экспрессии
генов [Schlee etal., 2006; Robinson etal., 2009].
Интенсивность и тип клеточного ответа сущест-
венно зависят от длины и последовательности
дцРНК, а также от способа ее доставки в клетку’
[Reynolds etal., 2006]. Зависимость иммунного
ответа от последовательности siPHK до сих пор
до конца не изупена, однако выяснено, что Н-бо-
гатые и/или UG(GU)-6orarbie мотивы наиболее
часто обнаруживаются в составе иммуностиму-
лирующих последовательностей in vivo и in vitro
[Hornung etal., 2005; Judge etal., 2005; Diebold
et al., 2006].
Химические модификации могут быть с ус-
пехом использованы для блокирования иммуно-
стимулирующих свойств siPHK [Judge et al.,
2006; Cekaite etal., 2007; Judge, MacLachlan,
2008]. siPHK, в которых >90 % нуклеотидов за-
менены на 2'-F-, 2'-ОМе- и 2'-дезокси аналоги,
проявляют только минимальную иммуности-
мулирующую активность по сравнению с немо-
дифицированными дуплексами или вообще не
проявляют такой активности при введении мы-
шам [Morrissey etal., 2005а,Ь]. Эти данные, ве-
роятно, указывают на то, что рибоза играет ос-
новную роль при распознавании дцРНК соответ-
ствующими рецепторами [Diebold etal., 2006].
Недавно было показано, что присутствия только
двух 2'-ОМе-модификаций в составе смысловой
цепи иммупостиму’лиру’ющей последовательно-
сти siPHK достаточно для полного блокирования
ее иммупостиму’лиру’ющей активности [Kariky
et al., 2005; Judge et al., 2006]. К удивлению, бы-
ло обнару’жено, что даже присутствие 2'-ОМе-
модифицированного некомплементарного оли-
гонуклеотида блокирует ТкК7-зависимую акти-
вацию иммунной системы под действием немо-
дифицированной siPHK, что указывает на то, что
2'-ОМе-РНК сама по себе является антагонистом
TLR7 [Robinson etal., 2009]. Доказано, что 2'-F-
или 2'-ОМе-модификация уридинов предотвра-
щает развитие как TLR-зависимых, так и TLR-
независимых побочных имму’ностиму’лирующих
эффектов [Cekaite et al., 2007; Robinson et al.,
2009].
Известно, что более длинные, чем siPHK,
двуцепочечные РНК (такие как DsiPHK [Colling-
wood et al., 2008]) могут активировать систему’
врожденного иммупитета в некоторых клеточ-
ных линиях, в которых siPHK таких эффектов не
вызывают [Reynolds etal., 2006]. Химические мо-
дификации, предотвращающие распознавание
иммунной системой 21-звенных siPHK [Kariky’
et al., 2005; Morrissey et al., 2005a, b; Judge et al.,
2006; Cekaite et al., 2007; Robbins et al., 2007],
эффективно блокируют и иммупостиму’лиру’ю-
щее действие DsiPHK. Тем не менее, показано,
что если в культуре клеток РВМС человека и 2'-
ОМе-, и 2'-Р-модификации блокирутот секрецию
IFN-a и TNF-a, то в культуре RIG-1-зависимых
клеток T98G только дву’цепочечные РНК, содер-
жащие 2'-ОМе-модификацию, не вызывают им-
мунный ответ [Collingwood et al., 2008].
Ряд других модификаций также может быть
использован для блокирования иммупостиму’ли-
рующей активности siPHK. LNA-модификации,
включенные по концам смысловой цепи имму-
ностимулирующей siPHK, эффективно блоки-
руют секрецию IFN-a, не влияя на интерфери-
рующую активность [Hornung etal., 2005]. Опи-
саны модификации азотистых оснований, кото-
196 ЭПИГЕНЕТИКА
рые снижают иммунный ответ: включение псев-
доурацила или 2-тиоурацила в состав siPHK пре-
дотвращает RIG-1-зависимую иммуностимуля-
цию [Hornung et al., 2006], ряд модификаций ос-
нований предотвращают иммунные эффекты,
опосредованные TLR3, TLR7 и TLR8 [Kariky
etal., 2005; Robbins etal., 2007]. Сравнение про-
филей индукции цитокинов под действием не-
модифицированной, 2'-ОМе-модифицированной
и 2'-F-модифицированной siPHK выявило суще-
ственные различия между ними [Zamanian-Da-
iyoush et al., 2008].
Накопленные к настоящему’ времени экспе-
риментальные данные позволяют заключить, что
доступный набор химических модификаций по-
зволяет эффективно блокировать нежелательные
эффекты, связанные с активацией иммунной
системы. Часто иммунный ответ является неже-
лательным побочным эффектом, так как вызыва-
ет изменение экспрессии большого числа генов.
Однако, известны примеры удачного совмеще-
ния индукции иммунного ответа и ингибиро-
вания протоонкогенов препаратом на основе
siPHK. Kortylcwski и Poeck с соавторами показа-
ли, что можно повысить противоопухолевые
свойства препаратов на основе siPHK благодаря
активации неспецифического иммунного ответа
[Poeck et al., 2008; Korty lcwski et al., 2009].
Другой тип побочных эффектов siPHK связан
с образованием несовершенных комплексов
siPHK с отличными от мишени мРНК [Jackson
et al., 2003], при этом siPHK может действовать
как miPHK [Birmingham et al., 2006; Jackson
et al., 2006] или ее смысловая цепь может вклю-
чаться в состав комплекса RISC и взаимодейст-
вовать с комплементарными или частично-комп-
лементарными ей мРНК. Подходы, направлен-
ные на повышение специфичности действия
siPHK и снижение побочных эффектов такого
рода, обычно ориентированы на предотвраще-
ние включения смысловой цепи RISC и сниже-
ние эффективности образования несовершенных
комплексов с участием «sccdw-района антисмы-
словой цепи.
Первая цель достигается с помощью сниже-
ния термостабильности дуплекса со стороны 3'-
конца антисмысловой цепи, как описано в разде-
ле «Выбор цепи в модифицированных дуплек-
сах». В дополнение к этому’, для предотвращения
участия смысловой цепи в развитии побочных
эффектов, можно использовать ее модификацию.
Наиболее успешным примером реализации тако-
го подхода является sisiPHK, которая содержит
смысловую цепь с разрывом (т. е. состоящую из
двух рибонуклеотидов), что предотвращает ее
включение в RISC [Bramsen et al., 2007, 2009].
Для обеспечения стабильности дуплекса требу-
ется введение в состав каждого из фрагментов
смысловой цепи по одной LNA-модификации.
поскольку’ 10—12 п.н. дуплексы, образован-
ные немодифицированной РНК, недостаточно
стабильны для индукции РНК-интерференции.
В качестве альтернативного подхода для предот-
вращения включения смысловой цепи в RISC
может быть использована модификация 5'-конца
смысловой цепи, блокирующая его фосфорили-
рование, например, метилирование [Chen et al.,
2008]. Введение восьми дезоксирибонуклеоти-
дов с З'-конца смысловой цепи также сущест-
венно снижает вызываемые ею побочные эффек-
ты [Ui-Tei et al., 2008].
Химические модификации могут существен-
но снизить miPHK-подобную активность цепей
siPHK и улучшить специфичность ее действия:
было показано, что единичная 2'-ОМе-модифи-
кация в позиции 2 антисмысловой цепи сни-
жает влияние на уровень транскриптов, частично
комплементарных «sccdw-району, без изменения
эффективности снижения уровня мРНК-мишени
[Jackson et al., 2006]. Тот факт, что наиболее эф-
фективное подавление неспецифических эффек-
тов происходит при модификации именно поло-
жения 2, а не других позиций антисмысловой
цепи, должен усчитываться при конструировании
химичски модифицированных siPHK [Jackson
et al., 2006]. Замена нуклеотидов в составе «seed»-
района на дезокси аналоги также существенно
снижает miPHK-подобные неспецифические эф-
фекты [Ui-Tei et al., 2008].
Другая стратегия для снижения неспецифиче-
ского действия siPHK была разработана компа-
нией Dharmacon RNA Technologies (http://www.
dharmacon.com/), которая предложила использо-
вать одновременно четыре разных siPHK-дуп-
лекса, направленных на один ген. В этом случае,
как утверждают разработчики, происходит «раз-
бавление» неспецифических эффектов, которые
различаются для разных дуплексов. Эта страте-
гия может использоваться вместе с химическими
модификациями, описанными выше.
7.4. Перспективы использования
ИНТЕРФЕРИРУЮЩИХ РНК В МЕДИЦИНЕ
Технология РНК-интерференции активно ис-
пользуется для создания прототипов лекарствен-
ных средств, целый ряд которых проходит в на-
стоящее время клинические испытания (табл. 7.1).
ГЛАВА 7 197
Таблица 7.1
siPHK, проходящие клинические испытания
siPHK Мишень Производитель Заболевание Фаза испытаний
Bevasiranib (Cand5) VEGF-A Acuity Pharmaceuticals (Opko Health) Возрастная макулярная дегенерация III [Shen et al., 2006; Dejneka et al., 2008; Castanotto, Rossi, 2009; Keller, 2009; Oh, Park, 2009; Kaufmann et al., 2010; Lares et aL, 2010; Lam et aL, 2012]
Отек желтого пятна при диабете II [Shen et aL, 2006; Dannull et aL, 2007; Dejneka et aL, 2008; Hickerson et aL, 2008; Castanotto, Rossi, 2009; Kaufmann et aL, 2010; Lares et aL, 2010; Leachman et aL, 2010]
Sirna-027 VEGFR1 Sirna Therapeutics Возрастная макулярная дегенерация II [Keller, 2009; Oh, Park, 2009; Kaiser et aL, 2010; Kaufmann et aL, 2010; Lam etaL, 2012]
RTP801i-14 (REDD14NP) RTP801 Quark Pharmaceuticals, Silence Therapeutics (Pfizer)
ALN-RSV01 Ген N респираторно- го синцитиального вируса (RSV) Alnylam Pharmaceuticals Респираторная синцитиальная вирусная инфекция II [DeVincenzo et aL, 2008, 2010; Oh, Park, 2009; Lam et aL, 2012]
QPI-1007 Проформа NGF Quark Pharmaceuticals Хроническая атрофия зрительного нерва I [Lares et aL, 2010; Lam et aL, 2012]
TD1010 мРНК KRT6A Pachyonychia Congenita Project (TransDerm) Врожденный кератоз I [Hickerson et aL, 2008; Leachman et aL, 2010]
C ALAA-01 RRM2 Calando Pharmaceuticals Солидные опухоли I [Aleku et aL, 2008; Davis et aL, 2010]
Atu027 PKN3 Silence Therapeutics
ALN-VSP02 KSP (Eg5), VEGF Alnylam Pharmaceuticals
I5NP (QPI-1002) TP53 Quark Pharmaceuticals Острая почечная н ед остаточ н ость II [Gaber et aL, 2010]
PRO-040201 ApoB Pharmaceuticals Г иперхолестерине- МИЯ I [Keller, 2009; Oh, Park, 2009; Lam et aL, 2012]
ApoB SNALP ApoB Tekmira Pharmaceuticals
NUC B1000 Вирус гепатита В (HBV) Nucleonics Гепатит В I [Oh, Park, 2009]
AKIi-5 TP53 Quark Pharmaceuticals Острая почечная н ед остаточ н ость I [Oh, Park, 2009; Gaber etaL, 2010]
Самой первой siPHK, которая была включена
в клинические испытания на человеке, стала
siPHK Bevasiranib («Acuity Pharmaceuticals»), на-
правленная на мРНК гена VEGF-A, который ко-
дирует фактор роста эндотелия сосудов, и пред-
назначенная для лечения возрастной макулярной
198 ЭПИГЕНЕТИКА
дегенерации [Castanotto, Rossi, 2009; Kaufmann
etal., 2010; Lares etal., 2010]. Это заболевание
ведет к потере зрения, вызванной разрастанием
сосудов за ретиной глаза, которое стимулируется
этим фактором. В данном подходе делается ак-
цент на подавление разрастания сосудов в глазу.
Лечение проводят прямыми инъекциями siPHK в
глаз человека. Одной из причин успешного ис-
пытания препарата Bevasiranib является отсутст-
вие нежелательного побочного иммунного отве-
та (что вызвало бы воспаление и повысило бы
токсичность препарата siPHK), поскольку’ чело-
веческий глаз является единственным органом,
где отсутствуют клетки, способные запускать
иммунный ответ. Доклинические исследования
Bevasiranib показали эффективное снижение нео-
васкуляризации при ингибировании экспрессии
гена VEGF-A после введения siPHK [Shen et al.,
2006; Dejneka etal., 2008]. На данный момент
успешно завершена III фаза клинических испы-
таний этой siPHK. Проходит II фаза клинических
испытаний Bevasiranib в качестве препарата для
лечения отека желтого пятна у пациентов, боль-
ных диабетом (см. табл. 7.1). Кроме того, для ле-
чения возрастной макулярной дегенерации было
предложено использовать в качестве мишеней
для siPHK ген VEGFR1, кодирующий рецептор
фактора роста эндотелия сосудов, и индуцируе-
мый гипоксией ген RTF807, который участвует в
прогрессии этого заболевания, через опосредо-
ванное усиление эффекта VEGF-A (см. табл. 7.1).
Успешно проведена II фаза клинических испы-
таний соответствующих siPHK [Kaiser et al.,
2010; Kaufmann et al., 2010].
Для лечения хронической атрофии зрительно-
го нерва предложено подавлять с помощью siPHK
экспрессию гена, кодирующего мутантную про-
форм}’ фактора роста нервов (NGF), которая на-
рушает нейротрофиновые сигнальные пути, что
приводит к атрофии зрительного нерва.
Одной из причин развития острой почечной
недостаточности является мутация в гене ТР53, в
результате чего в клетке образуется мутантная
форма белка р53, не способная связываться с ка-
ноническими для этого фактора сайтами в ДНК.
Из-за этого в клетке нарушаются процессы регу-
ляции апоптоза, репарации ДНК и метаболизма.
Для лечения этого заболевания предложено ис-
пользовать siPHK, направленные на мРНК этого
мутантного гена. Соответствующие siPHK (QPI-
1002 и AKIi-5) проходят клинические испытания
(на I и II фазах) [Gaber et al., 2010].
Для лечения солидных опухолей предложены
две siPHK, направленные на подавление экс-
прессии генов RRM2 и PKN3, и одна siPHK, на-
правленная на одновременное подавление экс-
прессии генов VEGF и KSP. RRM2 кодирует М2-
субъединицу рибонуклеотид-редуктазы, которая
необходима для синтеза ДНК. PKN3 кодирует
протеинкиназу, участвующую в передаче регу-
ляторных сигналов, стиму’лирующих клеточную
пролиферацию. KSP (Eg5) кодирует кинезин-по-
добный белок, очень важный для формирования
веретена деления и процесса митоза в целом. Со-
ответственно, ингибирование экспрессии этих ге-
нов должно приводить к остановке синтеза ДНК в
опухолевой клетке, нару’шению формирования
веретена деления, остановке роста и пролифера-
ции опухолевой клетки. Препараты проходят
I фазу’ клинических испытаний [Aleku et al., 2008;
Toudjarska et al., 2009; Davis et al., 2010].
Самой первой противовирусной siPHK, вклю-
ченной в клинические испытания, стала ALN-
RSV0I, направленная против гена N респира-
торного синцитиального виру’са (RSV), коди-
ру’ющего белок нуклеокапсида. существенный
для его репликации; препарат проходит II фазу
испытаний [DeVincenzo et al., 2008, 2010].
Для лечения гепатита В предложена siPHK
NUC В1000, мишень для которой фирма-произ-
водитель («Nucleonics», США) пока не разгла-
шает (I фаза испытаний).
Для лечения врожденного кератоза была пред-
ложена siPHK. направленная на мРНК мутантной
формы гена KRT6A, кодирующего кератин-ба.
Кератины кодируются генами KRT6A, KRT6B,
KRT16 и KRT17 и являются жесткими фибрил-
лярными белками, которые обеспечивают проч-
ность и устойчивость тканей, формирутощих ко-
жу’, волосы и ногти. Сети кератиновых волокон
защищают ткани от повреждения при трении и
друтих физических нагрузках. Идентифицирова-
но более 20 мутаций в гене KRT6A. каждая из ко-
торых приводит к развитию врожденного керато-
за: нарушается нормальная структура кератина-
6а, из-за чего он теряет способность нормально
взаимодействовать с кератином-16, и тем самым
нарушается сборка сети кератиновых филамен-
тов. Вследствие этого клетки кожи становятся
хрушкими и легко повреждаются, что делает кожу’
менее устойчивой к трению и незначительным
физическим воздействиям, травмам. Даже при
ходьбе образу’ются болезненные волдыри и мозо-
ли. Му’тации в гене KRT6A также нарушают рост
и функции клеток ногтей и слизистой оболочки
полости рта. Предложенные препараты siPHK на-
ходятся на I фазе клинических испытаний [Hic-
kerson et al., 2008; Leachman et al., 2010].
ГЛАВА 7 199
Для увеличения эффективности лечения лим-
фомы и меланомы иммунотерапией с использо-
ванием дендритных клеток (ДК) в медицинском
центре университета Дьюка проходят I фазу ис-
пытаний siPHK, направленные на мРНК имму-
нопротеосомных Р-субъединиц LMP2, LMP7 и
МЕСЫ [Bollard etal., 2007; Dannull etal., 2007;
Lares etal., 2010]. Протеосома является мульти-
субъединичным комплексом, ответственным за
деградацию убиквитинилированных белков в
клетке, и генерирует пептиды, которые затем
презентируются на поверхности клетки. Созре-
вание ДК меняет состав протеосом: конститу-
тивные Р-субъединицы X (Р5), Y (pi) и Z (Р2)
заменяются соответственно на индуцируемые
субъединицы LMP2 (P5i), LMP7 (piij и МЕСЫ
(P2i). В результате протеосома уже становится
иммунопротсосомой и производит другой набор
пептидов, которые презентируются на поверх-
ности зрелой ДК, по сравнению с набором пеп-
тидов, генерируемым конститутивной протеосо-
мой незрелых ДК и нормальных клеток. Когда
ДК нагружается антигенами опухоли и созревает
для использования в качестве вакцины, ее про-
теосомы заменяются иммунопротсосомами. Эти
ДК затем будут стимулировать Т-лимфоциты
против набора пептидов, произведенного имму-
нопротсосомами, а не конститутивными протео-
сомами. Такие Т-лимфоциты не смогут опти-
мально распознать опухолевые клетки, которые
презентируют пептиды, сгенерированные кон-
ститутивными протеосомами. Таким образом,
ингибирование экспрессии иммунопротеосом в
зрелых ДК с помощью siPHK, направленных на
мРНК генов трех индуцируемых субъединиц
иммунопротеосом (LMP2, LMP7 и MECL1), мо-
жет решить эту’ проблему’.
Для лечения гиперхолестеринемии было
предложено использовать siPHK, направленные
против мРНК мутантных форм генов ApoB (I фа-
за) и PCSK9 (преклинические испытания). АроВ
кодирует аполипопротеин хиломикронов и ли-
попротеинов малой плотности; мутации в этом
гене или в его регуляторном районе вызывают
развитие гипобеталипопротеинемии и гиперхо-
лестеринемии. PCSK9 кодирует пропротеинкон-
вертазу’ и играет важную роль в гомеостазе холе-
стерина: мутации в этом гене приводят к разви-
тию аутосомально-доминантной гиперхолесте-
ринемии.
Несмотря на определенные успехи клиниче-
ских испытаний siPHK, все же остаются откры-
тыми многие вопросы и нерешенным ряд про-
блем. Это: повышение эффективности доставки
siPHK в клетки, их стабильности in vivo, устра-
нение неспецифических эффектов, токсичности
и т. д. К сожалению, на данный момент ни одна
siPHK пока еще не была введена в клиническую
практику’.
* * *
Разработанные к настоящему’ времени хими-
ческие модификации способны внести сущест-
венный вклад в решение основных проблем при-
менения siPHK: увеличение стабильности, созда-
ние благоприятной термодинамической асиммет-
рии. уменьшение побочных эффектов, обеспе-
чение доставки в клетки и ткани организма и
улучшение биораспределения и биодостутшости.
Оценка вклада всех видов эффектов каждой хи-
мической модификации на процесс РНК-интер-
ференции, позиционной специфичности и специ-
фичности по последовательности наблюдаемых
эффектов необходимы для создания эффективных
паттернов модификации. Комбинация доступных
типов модификаций и минимизация общего ко-
личества модификаций в составе одной молекулы
siPHK являются необходимыми для создания вы-
сокоэффективных siPHK, предназначенных для
специфических областей применения. Поиск но-
вых структур эффекторов РНК-интерференции,
отличных от канонического 21-звенного дуплекса,
также может внести свой вклад в повышение эф-
фективности использования химических модифи-
каций для оптимизации свойств индукторов
РНКи. Впечатляющие успехи в области получе-
ния нуклеазоустойчивых аналогов siPHK, оказы-
вающих длительное ингибирующее действие, вы-
двигают на первый план проблему’ доставки
siPHK в клетки и улучшения ее биодостутшости и
биораспределения. Для решения этой проблемы
требуются совместные усилия специалистов в об-
ласти химической модификации siPHK и разра-
ботчиков новых типов полимерных носителей
нуклеиновых кислот.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Логашенко Е. Б., Черноловская Е. Л., Владимирова А. В.,
Венкова М. Н., Венья.минова .4. Г., Власов В. В. Подав-
ление экспрессии гена множественной лекарственной
устойчивости в опухолевых клетках с помощью корот-
кой двуцепочечной РНК И Докл. АН. Серия химичес-
кая. 2002. Т. 386. С. 274—276.
Логашенко Е. Б., Владимирова А. В., Зенков А. Н, Венко-
ва М. Н., Веньяминова .4. Г., Черноловская Е. Л., Вла-
сов В. В. Обращение фенотипа множественной лекар-
ственной устойчивости с помощью малых интерфери-
рующих РНК И Изв. АН. Серия химическая. 2005.
№ 2. С. 41—44.
200 ЭПИГЕНЕТИКА
Логашенко Е. Б., Владимирова А. В.. Волков А. А, Венко-
ва М. Н, Вельяминова .1. Г., Зенкова AL А., Чернолов-
скаяЕ.Л., Власов В. В. Подавление экспрессии гена
MDR1 с помощью химически модифицированных
аналогов siPHK И Изв. АН. Серия химическая. 2006.
№ 7. С. 1227—1235.
Albertson D. G., Collins С., McCormickF, Gray J. II ’. Chro-
mosome aberrations in solid tumors // Nat. Genet. 2003.
Vol. 34. P. 369—376.
AlekuAL, SchulzP., Keil O., Santel A., Schaeper U., Di-
eckhoffB., Janke O., Endruschat J., DurieuxB., RoderN.,
Loffler K., Lange C, FechtnerAL, ALdpert K, Fisch G.,
Dames S., Arnold II'., Jochims K., Giese K., H'ieden-
mannB., Scholz A., Kaufmann J. Atu027, a liposomal
small interfering RNA formulation targeting protein ki-
nase N3, inhibits cancer progression // Cancer Res. 2008.
Vol. 68. P. 9788—9798.
AlexopoulouL., Holt A. C, Medzhitov R., Flavell R. A. Recog-
nition of double-stranded RNA and activation of NF-
kappa В by Toll-like receptor 3 // Nature. 2001. Vol. 413.
P. 732—738.
Amarzguioui AL, Rossi J. J., KimD. Approaches for chemically
synthesized siRNA and vector-mediated RNAi // FEBS
Lett. 2005. Vol. 579. P. 5974—5981.
An D. S., Donahue RE., KamataAL, PoonB., ALetzgerAL,
ALao S. H.. Bonifacino A.. Krouse A. E.. DarlixJ.L., Bal-
timore D., QinF. X., Chen I. S. Stable reduction of CCR5
by RNAi through hematopoietic stem cell transplant in
non-human primates // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2007.
Vol. 104, N 32. P. 13110—13115.
AronicaL., BednenkoJ., NotoT., Desouza L. I’., SiuKH’.,
LoidlJ., Pearlman BE., GorovoskyAL A., ALochizukiK.
Study of an RNA helicase implicates small RNA-noncoding
RNA interactions in programmed DNA elimination in Tet-
rahymena // Genes Dev. 2008. Vol. 22. P. 2228—2241.
Aronin N. Target selectivity in mRNA silencing // Gene Ther.
2006. Vol. 13. P. 509—516.
BarikS. Treating respiratory viral diseases with chemically
modified, second generation intranasal siRNAs // Methods
Mol. Biol. 2009. Vol. 487. P. 331—341.
BehlkeAI.A. Chemical modification of siRNAs for in vivo
use 7 Oligonucleotides. 2008. Vol. 18. P. 305—320.
BernhardE. J., Aluschel R. J., Hughes E. N. Mr 92,000 gelati-
nase release correlates with the metastatic phenotype in
transformed rat embryo cells // Cancer Res. 1990. Vol. 50.
P. 3872—3877.
Birmingham A., Anderson E. AL, Reynolds A., Ilsleytyree D.,
Leake D., Fedorov Y., Baskerville S., ALaksimova E., Rob-
inson K, Karpilow J., ALarshall IE. S., Khvorova A. 3'
UTR seed matches, but not overall identity', are associated
with RNAi off-targets // Nat. Methods. 2006. Vol. 3.
P. 199—204.
Bishop J. AL Retroviruses and cancer genes // Adv. Cancer Res.
1982. Vol. 37. P. 1—32.
Boden D., Pusch O., LeeF, Tucker L., Ramratnam B. Human
immunodeficiency virus type 1 escape from RNA interfer-
ence // J. Virol. 2003. Vol’. 77. P. 11531—11535.
BodenD., Pusch O., LeeF., Tucker L., ShankP. R., Ramrat-
nam B. Promoter choice affects the potency of HIV-1 spe-
cific RNA interference // Nucleic Acids Res. 2003.
Vol. 31. P. 5033—5038.
BollardC. AL, GottschalkS., LeenA.AL, Heiss H, Straat-
hofKC, Carrum G., Khalil AL, II’uALE, Huis AL. H,
Chang C.C., GresikAL. I’., Gee A. P., Brenner AL K,
Rooney C. AL, Heslop H. E. Complete responses of relap-
sed lymphoma following genetic modification of tumor-
antigen presenting cells and T-lymphocyte transfer //
Blood. 2007. Vol. 110. P. 2838—2345.
Bramsen J. B., LaursenALB., DamgaardC.K, Lena SHF..
BabuB.R., H’engelJ., KjemsJ. Improved silencing prop-
erties using small internally segmented interfering RNAs 11
Nucleic Acids Res. 2007. Vol. 35, N 17. P. 5886—5897.
Bramsen J. B., LaursenALB., Nielsen A. F, Hansen T. B.,
BusC, Langkjer N., BabuB. R., Hojland T, Abramov AL,
FanAerschotA., OdadzicD., SmiciusR., HaasJ., An-
dree C.. Barman J., II’enskaAL. Srivastava P., ZhouC.
Honcharenko D., HessS., ALiillerE., Bobkov G. E, Ahk-
hailov S. N„ Fava E„ ALeyer T. F, Chattopadhyaya J., Ze-
nalAL, Engels J. II'., Herdewijn P., H’engelJ., KjemsJ. A
large-scale chemical modification screen identifies design
rules to generate siRNAs with high activity', high stability'
and low toxicity // Ibid. 2009. Vol. 37, N 9. P. 2867—2881.’
Brower-Toland B., Findley S. D., JiangL., LiuL., Yin H.,
Dus AL., Zhou P., Elgin S. C, LinH. Drosophila PIW1 as-
sociates with chromatin and interacts directly with HPla //
Genes Dev. 2007. Vol. 21. P. 2300—2311.
BuchholzF., KittlerR., SlabickiAL., TheisAL. Enzymatically
prepared RNAi libraries // Nat. Methods. 2006. Vol. 3.
P. 696—700.
Campbell S. L., Khosravi-Far R, Rossman K. L., Clark G. J.,
Der C. J. Increasing complexity' of Ras signaling // Onco-
gene. 1998. Vol. 17. P. 1395—1413.
CastanottoD., Rossi J. J. The promises and pitfalls of RNA-
interference-based therapeutics // Nature. 2009. Vol. 457.
P. 426—433.
CastanottoD., Tommasi S., Li AL, Li H, Yanow S„ Pfei-
fer G. P., Rossi J. J. Short hairpin RNAdirected cytosine
(CpG) methylation of the RASSF1A gene promoter in
HeLa cells // Mol. Ther. 2005. Vol. 12. P. 179—183.
Castelli J. C., Hassel B. A., H oodK. A., Li X. L., AmemiyaK,
Dalakas AL. C, Torrence P. F. YouleRJ. A study of the
interferon antiviral mechanism: Apoptosis activation by' the
2-5A system // J. Exp. Med. 1997. Vol. 186. P. 967—972.
CekaiteL., Furset G., HovigE., SioudAl. Gene expression
analysis in blood cells in response to unmodified and 2'-
modified siRNAs reveals TLR-dependent and independent
effects II J. Mol. Biol. 2007. Vol. 365. P. 90—108.
ChenP.Y., H’einmaimL., GaidatzisD., Pei Y., ZavolanAL,
Tuschl T, ALeister G. Strand-specific 5'-O-methylation of
siRNA duplexes controls guide strand selection and target-
ing specificity' // RNA. 2008. Vol. 14. P. 263—274.
Chiu Y. L., Rana T. AL. siRNA function in RNAi: a chemical
modification analysis // RNA. 2003. Vol. 9. P. 1034—
1048.
ChoyE. I. IF, KokKH, TsaoS. IE, Jin D. Г. Utility' of Ep-
stein-Barr virus-encoded small RNA promoters for driving
the expression of fusion transcripts harboring short hairpin
RNAs // Gene Ther. 2008. Vol. 15. P. 191 -202.
Chu С. E. Rana T. AL. Translation repression in human cells by
microRNA-induced gene silencing requires RCK/p54 //
PLoS Biol. 2006. Vol. 4. P. e210.
Chu С. E, Rana T. AL. Potent RNAi by short RNA triggers //
RNA. 2008. Vol. 14, N 9. P. 1714—1719.
Clemens AL. J. PKR — A protein kinase regulated by double-
stranded RNA // Int. J. Biochem. Cell Biol. 1997. Vol. 29.
P. 945—949.
Cogoni C, ALacino G. Gene silencing in Neurospora crassa re-
quires a protein homologous to RNA-dependent RNA po-
lymerase // Nature. 1999. Vol. 399. P. 166—169.
Collingwood AL. A., Rose S. D., HuangL., Hillier C, Amarzgui-
oui AL., H'iigerAL. T, Soifer H. S., Rossi J. J., Behlke AL. .1.
Chemical modification patterns compatible with high po-
tency' Dicer-substrate small interfering RNAs // Oligonu-
cleotides. 2008. Vol. 18, N 2. P. 187—200.
Collins RE., Cheng X. Structural domains in RNAi// FEBS
Lett. 2005. Vol. 579, N 26. P. 5841—5849.
ГЛАВА 7 201
Collis S.L.. Swartz AL J. Nelson W. G, De Weese T.L. Enhanced
radiation and chemotherapy-mediated cell killing of human
cancer cells by small inhibitory RNA silencing of DNA re-
pair factors // Cancer Res. 2003. Vol. 63. P. 1550—1554.
CzaudernaF, FechtnerAL, DamesS., AygunH., KlippelA.,
PronkG. J., Giese K, Kaufmann J. Structural variations and
stabilising modifications of synthetic siRNAs in mammalian
cells // Nucleic Acids Res. 2003. Vol. 31. P. 2705—2716.
DalmayT., Hamilton A., RuddS., Angell S., Baulcombe D. C.
An RNA-dependent RNA polymerase gene in Arabidopsis
is required for posttranscriptional gene silencing mediated
by a transgene but not by a virus // Cell. 2000. Vol. 101,
N 5. P. 543—553.
Dannull J., Lesher D. T, HolzknechtR, Qi IE, Hanna G., Sei-
gler H, Tyler D. S., Pruitt S. K. Immunoproteasome
down-modulation enhances the ability of dendritic cells to
stimulate antitumor immunity // Blood. 2007. Vol. 110.
p. 4341—4350.
Davis ALE., Zuckerman J. E„ Choi CH, SeligsonD., Tol-
cherA., AlabiC.A., Yen Y., Heidel J. D., Ribas A. Evi-
dence of RNAi in humans from systemically administered
siRNA via targeted nanoparticles // Nature. 2010. Vol. 464.
P. 1067—1070.
De Paula D., Bentley AL. I’., ALahatoR. L. Hydrophobization and
bioconjugation for enhanced siRNA delivery and target-
ing "RNA. 2007. Vol. 13. P. 431—456.
DejnekaN.S., WanS.H, BondO.S., Kornbrust D. J.,
Reich S. J. Ocular biodistribution of bevasiranib following
a single intravitreal injection to rabbit eyes // Mol. Vis.
2008. Vol. 14. P. 997—1005.
DeVincenzo J., Cehelsky J. E., Alvarez R, Elbashir A., El-
bashir S., HarborthJ., Toudjarska L, NechevL., ALuru-
gaiah V., Fan I’liel J., Vaishnaw A. K, ALeyersR Evalua-
tion of the safety', tolerability and pharmacokinetics of
ALN-RSV01, a novel RNAi antiviral therapeutic directed
against respiratory' syncytial virus (RSV) // Antiviral Res.
2008. Vol. 77. P. 225—231.
DeVincenzo J., Lambkin-Williams R, Wilkinson T, Cehelsky J.,
Nochur S., Walsh E., ALeyersR, GollobJ., Vaishnaw A. A
randomized, double-blind, placebo-controlled study of an
RNAi-based therapy directed against respiratory' syncytial
virus // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2010.’ Vol. 107.
P. 8800—8805.
Diebold S. S„ ALassacrier C., AkiraS.. Paturel C.. A Lor el Y..
Reis E., Sousa C. Nucleic acid agonists for Toll-like recep-
tor 7 are defined by' the presence of uridine ribonucleo-
tides // Eur. J. Immunol. 2006. Vol. 36. P. 3256—3267.
DingH, Schwarz D. S., Keene A., AffarelB., FentonL., XiaX.,
Shi E, Zamore P. D., Xu Z. Selective silencing by RNAi
of a dominant allele that causes amyotrophic lateral scle-
rosis // Aging Cell. 2003. Vol. 2. P. 209—217.
Dive C. Avoidance of apoptosis as a mechanism of drug resis-
tance // J. Intern. Med. Suppl. 1997. Vol. 740. P. 139—145.
DoenchJ. G., Petersen С. P., Sharp P. .1. siRNAs can function
as miRNAs // Genes Dev. 2003. Vol. 17. P. 438—442.
DongB., Silverman R. H. 2-5A-dependent RNase molecules
dimerize during activation by 2—5A // J. Biol. Chem.
1995. Vol. 270. P. 4133—4137.
Donze O., PicardD. RNA interference in mammalian cells us-
ing siRNAs synthesized with T7 RNA polymerase // Nu-
cleic Acids Res. 2002. Vol. 30. P. e46.
Dowler T, Bergeron D„ Tedeschi A. L., Paquet L., Ferrari N.,
DamhaALJ. Improvements in siRNA properties mediated
by' 2'-deoxy-2'-fluoro-beta-D-arabinonucleic acid (FANA) //
Nucleic Acids Res. 2006. Vol. 34. P. 1669—1675.
Dvorak H. F, Brown L. F, Delmar AL, Dvorak A. AL. Vascular-
permeability factor vascular endothelial groyvth-factor.
microvascular hyperpermeability' and angiogenesis // Am.
J. Pathol. 1995. Vol. 146. P. 1029—1039.
Elbashir S. AL. Lendeckel W., Tuschl T. RNA interference is
mediated by' 21- and 22-nucleotide RNAs // Genes Dev.
2001. Vol. 15. P. 188—200.
Feinberg E. H, Hunter С. P. Transport of dsRNA into cells by
the transmembrane protein SID-1 // Science. 2003.
Vol. 301, N 5639. P. 1545—1547.
Fire A., Xu S., ALontgomery AL. K, Kostas S. A., Driver S. E.,
ALello С. C. Potent and specific genetic interference by
double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans // Na-
ture. 1998. Vol. 391. P. 806—811.
Fisher AL., Abramov AL, Fan AerschotA., Xu D., Juliano RL.,
Herdewijn P. Inhibition of MDR1 expression with altritol-
modified siRNAs H Nucleic Acids Res. 2007. Vol. 35.
p. 41064 41074.
FrankF, Sonenherg N., NagarB. Structural basis for 5'-nucle-
otide base-specific recognition of guide RNA by' human
AGO2 /'Nature. 2010. Vol. 465. P. 818—822.
Gaber A. O., Patel A., Polinsky AL. S., SquiersE. C. Safety and
tolerability of intravenous QPI-1002, a siRNA, for pro-
phylaxis of Delayed Graft Function (DGF) in deceased
donor renal allograft recipients at increased risk of DGF:
initial results from a double-blind, phase I first-in-human
study //Am. J. Transplant. 2010. Vol. 10. P. 132.
Gagnon К. T., Corey D. R. Argonaute and the nuclear RNAs:
new pathways for RNA-mediated control of gene expres-
sion // Nucleic Acid Ther. 2012. Vol. 22. N 1. P. 3—16.
Gao Z., Liu H. L., DaxingerL., Pontes О., He X., Qian W.,
Lin H, Xie AL, Lorkovic Z. J., ZhangS., ALiki D„ Zhan X.,
Pontier D., Lagrange T., Jin H, ALatzke A. J., ALatzke AL,
PikaardC.S., Zhu J. К An RNA polymerase II- and
AGO4-associated protein acts in RNA-directed DNA me-
thylation//Nature. 2010. Vol. 465. P. 106—109.
GieringJ. C, Grimm D., Storm T. A., Kay ALA. Expression of
shRNA from a tissue-specific pol II promoter is an etfec-
tive and safe RNAi therapeutic // Mol. Ther. 2008.
Vol. 16. P. 1630—1636.
GilJ., EstebanAL. Induction of apoptosis by the dsRNA-de-
pendent protein kinase (PKR): mechanism of action //
Apoptosis. 2000. Vol. 5. P. 107—114.
GoodhoumS., DidcockL., Randall R. E. Interferons: cell sig-
nalling, immune modulation, antiviral responses and virus
countermeasures // J. Gen. Virol. 2000. Vol. 81. P. 2341 —
2364.
Grimm D., StreetzК L., JoplingC.L., Storm T. A., Pandey K.
Davis C.R., ALarionP., Salazar F, Kay ALA. Fatality' in
mice due to oversaturation of cellular microRNA/short hair-
pin RNA pathways //Nature. 2006. Vol. 441. P. 537—541.
GurzovE. N., Izquierdo AL. RNA interference against Heel in-
hibits tumor growth in vivo // Gene Ther. 2006. Vol. 13.
P. 1 -7.
Hall A. H. Wan J, Shaughnessy E. E.. Ramsay Shaw B.. Alex-
ander K. .1. RNA interference using boranophosphate
siRNAs: structure-activity' relationships // Nucleic Acids
Res. 2004. Vol. 32. P. 5991- -6000.
Hartmann R, Justesen J., SarkarS.N., SenG.C, YeeVC.
Crystal structure of the 2'-specific and double-stranded
RNA-activated interferon-induced antiviral protein 2'—5'-
oligoadenylate synthetase // Mol. Cell. 2003. Vol. 12.
P. 1173 1185.
He X. J.. Hsu 1. F, Zhu S., Liu H. L.. Pontes O.. Zhu J., CuiX..
WangC. S., Zhu J. K. A conserved transcriptional regula-
tor is required for RNA-directed DNA methylation and
plant development // Genes Dev. 2009a. Vol. 23. P. 2717—
2722.
HeX.J., HsuY.F, ZhuS., Wierzbicki A. T., Pontes O., Pi-
kaard C. S., Liu H. L., Wang C. S., Jin H, Zhu J. K. An ef-
fector of RNA-directed DNA methylation in Arabidopsis
is an ARGONAUTE 4- and RNA-binding protein // Cell.
2009b. Vol. 137. P. 498—508.
202 ЭПИГЕНЕТИКА
Hickerson R. P.. Smith F. J. D.. Reeves R. E.. Contag С. H.
Leake D., Leachman S. A., Milstone L. AL, McLean JJ'. H,
Kaspar R. L. Single-nucleotide-specific siRNA targeting
in a dominant-negative skin model // J. Invest. Dermatol.
2008. Vol. 128. P. 594—605.
Hock J., Meister G. The Argonaute protein family '/ Genome
Biol. 2008. Vol. 9, N 2. P. 210.
Hornung J'.. Guenthner-BillerAL. BottrquinC., AblasserA.,
SchleeAL., Uematsu S., Noronha A., Manoharan AL, Aki-
ra S„ De Fougerolles A., Endres S., Hartmanti G. Se-
quence-specific potent induction of IFN-a by short inter-
fering RNA in plasmacytoid dendritic cells through
TLR7 // Nat. Med. 2005. Vol. 11. P. 263—270.
Hornung J'., EllegastJ., Kim S., Brzozka K, Jung A., Kato H,
RoeckH, AkiraS., Conzelmann К. K, SchleeM., En-
dres S., Hartmann G. 5'-Triphosphate RNA is the ligand
forRIG-I 7 Science. 2006. Vol. 314. P. 994—997.
Hu-Lieskovan S., Heidel J. D., Bartlett D. JJ’., Davis ME.,
Triche T. J. Sequence-specific knockdown of EWS-FLI1 by
targeted, nonviral delivery' of small interfering RNA inhibits
tumor growth in a murine model of metastatic Ewing's sar-
coma // Cancer Res. 2005. Vol. 65. P. 8984—8992.
Jackson A. L., BartzS. R, SchelterJ., Kobayashi S. J’., Bur-
chard J., ALaoAL., LiB., CavetG., LinsleyP.S. Expres-
sion profiling reveals off-target gene regulation by
RNAi // Nat. Biotechnol. 2003. Vol. 21. P. 635—637.
Jackson A. L., Burchard J., Leake D., Reynolds A., SchelterJ.,
Guo J., Johnson J. M. LimL., Karpilow J., Nichols K,
Marshall JJ’., KhvorovaA., LinsleyP.S. Position-specific
chemical modification of siRNAs reduces «oft-target» tran-
script silencing h RNA. 2006a. Vol. 12. P. 1197—1205.
Jackson A. L., Burchard J., SchelterJ., Chau B. N., Cleary hl.,
LimL., LinsleyP. S. Widespread siRNA «off-target» tran-
script silencing mediated by seed region sequence com-
plementarity // RNA. 2006b. Vol. 12. P. 1179—1187.
Janowski B. A., Huffman К. E., Schwartz J. C., Ram R, Har-
dy D., Shames D. S., ALinnaJ.D., Corey D. R. Inhibiting
gene expression at transcription start sites in chromosomal
DNA with antigene RNAs // Nat. Chem. Biol. 2005.
Vol. 1. P. 216—222.
Jensen T. B., Langkjer N., JJ’engelJ. Unlocked nucleic acid
(UNA) and UNA derivatives: thermal denaturation studies
Nucleic Acids Symp. Ser. 2008. Vol. 52. P. 133—134.
Li J. AL, JJ'angY. Y., Zhao AL X. TanC.P., Lil. Q.. LeX. E.
JiL. N., AlaoZ. JJ’. Multifunctional QD-based co-delivery
of siRNA and doxorubicin to HeLa cells for reversal of
multidrug resistance and real-time tracking // Biomate-
rials. 2012. Vol. 33. P. 2780—2790.
Judge A., AlacLachlan L. Overcoming the innate immune re-
sponse to small interfering RNA // Hum. Gene Ther. 2008.
Vol. 19. P. 111—124.
Judge A. D., Sood J’., Shaw J. R, FangD., ALcclintock K, ALac-
lachlan L. Sequence-dependent stimulation of the mamma-
lian innate immune response by synthetic siRNA // Nat.
Biotechnol. 2005. Vol. 23. P. 457-Л62.
Judge A. D., Bola G., Lee A. C, ALaclachlan L. Design of nonin-
flammatory synthetic siRNA mediating potent gene silenc-
ing in vivo// Mol. Ther. 2006. Vol. 13. P. 494—505.
Kaiser P. K, SymonsRC., Shah S. AL, Quinlan E. J., Ta-
bandeh H. DoD. I’. Reisen G., Lockridge J. A.. Short B..
Guerciolini R., Nguyen Q. D. RNAi-based treatment for
neovascular age-related macular degeneration by Sima-
027 //Am. J. Ophthalmol. 2010. Vol. 150. P. 33—39.
Kaneshiro T. L., Lu Z. R. Targeted intracellular codelivery of
chemotherapeutics and nucleic acid with a well-defined
dendrimer-based nanoglobular carrier H Biomaterials.
2009. Vol. 30. P. 5660—5666.
Kapadia S. B., Brideau-Andersen A., ChisariF. J’. Interference
of hepatitis C virus RNA replication by short interfering
RNAs H Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. Vol. 100.
P. 2014—2018.
KarikyK, Buckstein AL, Ni H, JJ’eissman D. Suppression of
RNA recognition by Toll-like receptors: the impact of nu-
cleoside modification and the evolutionary origin of
RNA H Immunity. 2005. Vol. 23. P. 165—175.
Kataoka K, ALochizuki K. Programmed DNA elimination in
Tetrahymena: a small RNA-mediated genome surveillance
mechanism// Adv. Exp. Med. Biol. 2011. Vol. 722.
P. 156—173.
Kaufmann J., Ahrens K, Santel A. RNA interference for therapy
in the vascular endothelium // Microvasc. Res. 2010.
Vol. 80. P. 286—293.
Keller AL. Nanomedicinal delivers' approaches for therapeutic
siRNA // Int. J. Pharm. 2009^ Vol. 379. P. 210—211.
KhvorovaA., Reynolds A., JayasenaS.D. Functional siRNAs
and miRNAs exhibit strand bias// Cell. 2003. Vol. 115.
P. 209—216.
Kim D., Rossi J. RNAi mechanisms and applications H Biotech-
niques. 2008. Vol. 44. P. 613—616.
Kim D. H, Longo AL, Hani., LundbergP., Cantin E., Ros-
si J. J. Interferon induction by siRNAs and ssRNAs syn-
thesized by phage polymerase H Nat. Biotechnol. 2004.
Vol. 22. P. 321—325.
Kim D. H, Behlke AL. A., Rose S. D., Chang Al. S., Choi S.,
Rossi J. J. Synthetic dsRNA Dicer substrates enhance
RNAi potency and efficacy H Nat. Biotechnol. 2005.
Vol. 23, N 2. P. 222—226.
Kim J. JJ’., Zhang Y. H, ZernAL.A., Rossi J. J., JJ'uJ. Short
hairpin RNA causes the methylation of trans transforming
growth factor-beta receptor II promoter and silencing of
the target gene in rat hepatic stellate cells H Biochem.
Biophys. Res. Commun. 2007. Vol. 359. P. 292—297.
Kim S., Peer D., Kumar P., Subramanya S., JJ’uH, Asthana D.,
Habiro K, YangY. G., ALanjunath N. Shimaoka AL. Shan-
kar P. RNAi-mediated CCR5 silencing by LFA-1-targeted
nanoparticles prevents HIV infection in BLT mice H Mol.
Ther. 2010. Vol. 18, N 2. P. 370—376.
Kobayashi N, ALatsui 1., KawaseA., Hirata K, ALiyagishiAL.,
Taira K, NishikawaAL, Takakura E Vector-based in vivo
RNA interference: dose- and time-dependent suppression
of transgene expression 7 J. Pharmacol. Exp. Ther. 2004.
Vol. 308. P. 688—693.
Kortylewski AL, Swiderski P.. Herrmann A.. JJ’angL., Kowo-
HkC, KujawskiAL, LeeH, ScutoA., Liu Y, YangC,
Deng J., Soifer H. S., Raubitschek A., FormanS., Ros-
si J. J., Pardoll D. AL., JoveR., YuH. Ln vivo delivery' of
siRNA to immune cells by conjugation to a TLR9 agonist
enhances antitumor immune responses H Nat. Biotechnol.
2009. Vol. 27, N 10. P. 925- -932.
Kubo T.. ZhelevZ.. OhbaH. Bakalova R. Chemically modified
symmetric and asymmetric duplex RNAs: an enhanced
stability to nuclease degradation and gene silencing ef-
fect H Biochem. Biophys. Res. Commun. 2008. Vol. 365.
P. 54—61.
Kuramochi-ALiyagawa S., JJ’atanabe T., Got oh K, TotokiY.,
Toyoda A., LkawaAL, AsadaN, Kojima K, Yamaguchi E,
Ljiri T. JJ’., Hata K, Li E., ALatsuda E, Kimura T, Oka-
beAL., Sakaki E, Sasaki H, Nakano T. DNA methylation
of retrotransposon genes is regulated by Piwi family
members MILI and MIWI2 in murine fetal testes H Genes
Dev. 2008. Vol. 22. P. 908—917.
Lam J. K, Liang JJ’., Chan H. K. Pulmonary' delivery' of thera-
peutic siRNA // Adv. Drug Deliv. Rev. 2012. Vol. 64.
P. 1—15.
Lares AL. R., Rossi J. J., OuelletD. L. RNAi and small interfer-
ing RNAs in human disease therapeutic applications H
Trends Biotechnol. 2010. Vol. 28. P. 570—579.
ГЛАВА 7 203
LayzerJ. М.. Alccaffrey А. Р., Tanner А. К.. Huang Z.. KayAI. А..
Sullenger В. A. In vivo activity of nuclease-resistant
siRNAs // RNA. 2004. Vol. 10. P. 766—771.
Leachman S. A., Hickerson R. P., Schwartz AL E., Bullough E. E.,
Hutcherson S. L., Boucher К. M., Hansen C. D., Elia-
son AL J., Srivatsa G. S., KombrustD. J., Smith F. J., Ale-
Lean ГГ. I., AlilstoneL. AL, Kaspar R. L. First-in-human mu-
tation-targeted siRNA phase lb trial of an inherited skin dis-
order // Mol. Ther. 2010. Vol. 18. P. 442 446.
Lee Y. S„ Nakahara K., PhamJ.JJ’., Kim K., He Z. Y„ Son-
theimerE. J., Carthew R. JJ’. Distinct roles for Drosophila
Dicer-1 and Dicer-2 in the siRNA miRNA silencing path-
ways II Cell. 2004. Vol. 117. P. 69—81.
Leuschner P. J., AmeresS.L., KuengS., AlartinezJ. Cleavage
of the siRNA passenger strand during RISC assembly in
human cells 11 EMBO Rep. 2006. Vol. 7. P. 314 320.
Li J. AL, JJ’angY. Y., Zhao AL X.. TanC.P., Li 1. Q.. LeX. I..
JiL. N, AlaoZ. JJ'. Multifunctional QD-based co-delivery
of siRNA and doxorubicin to HeLa cells for reversal of
multidrug resistance and real-time tracking // Bioma-
terials. 2012. Vol. 33. P. 2780—2790.
LiX. L., Blackford J. A., Hassel B. A. RNase L mediates the an-
tiviral effect of interferon through a selective reduction in
viral RNA during encephalomyocarditis virus infection //
J. Virol. 1998. Vol. 72. P. 2752—2759.
LimL.P., LauN.C.. Garrett-Engele P.. GrimsonA.. Schel-
terJ.AL, Castle J., BartelD. P., Linsley P. S., John-
son J. Al. Microarray analysis shows that some microR-
NAs downregulate large numbers of target mRNAs // Na-
ture. 2005. Vol. 433. P. 769—773.
Lingel A., Simon B., Lzaurralde E., Sattler Al. Nucleic acid 3'-
end recognition by the Argonaute2 PAZ domain // Nat.
Struct. Mol. Biol. 2004. Vol. 11. P. 576—577.
Liu 1., FeX, LangF., LiangC., Chen D., Peng J., Kinch L. N,
Grishin N. J’., Liu О. C3PO, an endoribonuclease that
promotes RNAi by facilitating RISC activation // Science.
2009. Vol. 325. P.’750—753.
Lively T. N., Kossen K, Balhom A., KoyaT., Zinnen S., Ta-
keda K, Lucas J. J., Polisky B., Richards 1. Al., Gel-
fand E. JJ’. Effect of chemically modified IL-13 short in-
terfering RNA on development of airway hyperrespon-
siveness in mice // J. Allergy Clin. Immunol. 2008.
Vol. 121. P. 88—94.
Alanoharan Al. RNA interference and chemically modified
small interfering RNAs // Curr. Opin. Chem. Biol. 2004.
Vol. 8. P. 570—579.
Alarques J. T, JJ’illiams B. R. Activation of the mammalian
immune system by siRNAs // Nat. Biotechnol. 2005.
Vol. 23. P.1399—1405.
AlartensH, Novotny J., Oberstrass J., Steck T. L., Postle-
thwaitP.. Nellen JJ’. RNAi in Dictyostelium: the role of
RNA-directed RNA polymerases and double-stranded
RNase 11 Mol. Biol. Cell. 2002. Vol. 13, N 2. P. 445 453.
AlatrangaC, Tomari Y., Shin C., Bartel D. P., ZamoreP.D.
Passenger-strand cleavage facilitates assembly of siRNA
into Ago2—containing RNAi enzyme complexes // Cell.
2005. Vol. 123. P. 607—620.
AlatsumotoAL, Funami K, OshiumiH, Seya T. Toll-like recep-
tor 3: a link between toll-like receptor, interferon and vi-
ruses 11 Microbiol. Immunol. 2004. Vol. 48. P. 147—154.
AlatzkeAL, KannoT., Daxinger L., Huettel B., AlatzkeA.J.
RNA-mediated chromatin-based silencing in plants //
Curr. Opin. Cell Biol. 2009. Vol. 21. P. 367—376.
AlcCaffrey A. P., Nakai H, Pandey K, Huang Z., Salazar F. H,
XuH, JJ’ielandS. F, Alarion P. L., Kay AL A. Inhibition
of hepatitis В virus in mice by RNA interference // Nat.
Biotechnol. 2003. Vol. 21. P. 639—644.
AIcNamara J. O., AndrechekE. R, JJ’ang Y., J'ilesKD., Rem-
pel R E., GilboaE., Sullenger B. A.. GiangrandeP. H.
Cell type-specific delivery of siRNAs with aptamer-
siRNA chimeras // Nat. Biotechnol. 2006. Vol. 24.
P. 1005—1015.
Aleister G., Tuschl T. Mechanisms of gene silencing by double-
stranded RNA 11 Nature. 2004. Vol. 431. P. 343—349.
AlengH, LiongAl., XiaT., HZ., Zink J. I., NelA.E. Engi-
neered design of mesoporous silica nanoparticles to de-
liver doxorubicin and P-glycoprotein siRNA to overcome
drug resistance in a cancer cell line // ACS Nano. 2010.
Vol. 4. P. 4539 4550.
AleursE., ChongK, Galabru J., ThomasN. S., Kerri. AL, JJ'il-
UamsB.R., Hovanessian A. G. Molecular-cloning and
characterization of the human double-stranded-RNA acti-
vated protein-kinase induced by interferon , Cell. 1990.
Vol. 62. P. 379—390.
Aliller J'. AL, Xia H, AlarrsG.L., Gouvion C. AL, Lee G.,
Davidson В. L.. Paulson H. L. Allele-specific silencing of
dominant disease genes // Proc. Natl. Acad. Sei. USA.
2003. Vol. 100. P. 7195—7200.
Aliller J . AL, Gouvion C. AL, Davidson B. L., Paulson H. L.
Targeting Alzheimer's disease genes with RNA interfer-
ence: an efficient strategy for silencing mutant alleles H
Nucleic Acids Res. 2004. Vol. 32. P. 661—668.
AlinksAl. A., JJ’estD.K, Benvin S., Baglioni C. Structural re-
quirements of double-stranded RNA for the activation of
2',5'-Oligo(A) polymerase and protein kinase of inter-
feron-treated HeLa-cells // J. Biol. Chem. 1979. Vol. 254.
P.180—183.
Alorris K. J’., ChanS. JJ’., Jacobsen S. E., Looney D. J. Small
interfering RNA-induced transcriptional gene silencing in
human cells // Science. 2004. Vol. 305. P. 1289—1292.
AlorrisseyD. J’., BlanchardK, Shaw L., Jensen K, Lockrid-
ge J. A., Dickinson B., Alcswiggen J. A., J’argeeseC.,
Bowman K, Shaffer C. S., Polisky B. A., Zinnen S. Activ-
ity of stabilized short interfering RNA in a mouse model
of hepatitis В virus infection // Hepatology. 2005. Vol. 41.
P. 1349—1356.
Alorrissey D. J’., Lockridge J. A., ShawL., BlanchardK, Jen-
sen K, Breen JJ’., Hartsough K, ALachemer L., Radka S.,
Jadhav J’., J'aish N., Zinnen S., J’argeeseC., Bowman K,
Shaffer C. S., Jeffs L. B., Judge A., ALacLachlan 1., Polis-
ky B. Potent and persistent in vivo anti-HBV activity of
chemically modified siRNAs // Nat. Biotechnol. 2005.
Vol. 23. P. 1002—1007.
AlourrainP., Beclin C., ElmayanT., Feuerbach F, GodonC.,
Alorel J. B., JouetteD., Lacombe A. Al., Nikic S., Pi-
caultN., Remoue K, SanialAL, J’oT.A., J’aucheret H.
Arabidopsis SGS2 and SGS3 genes are required for post-
transcriptional gene silencing and natural virus resis-
tance // Cell. 2000. Vol. 101, N 5. P. 533 542.
AluraoS.. Diala 1.. FujiiAl. Suppression of bcr-abl mRNA by
chemically modified siRNA // Nucleic Acids Symp. Ser.
2008. Vol. 52. P. 499—500.
AlyersJ. JJ’., Jones J. T., AleyerT., Ferrell J. E. Recombinant
dicer efficiently converts large dsRNAs into siRNAs suit-
able for gene silencing /' Nat. Biotechnol. 2003. Vol. 21.
P. 324—328.
NakanoS. -I., Uotani 1., Uenishi K, Fujii AL, Sugimoto N. Site-
selective RNA cleavage by DNA bearing a base pair-
mimic nucleoside // J. Am. Chem. Soc. 2005. Vol. 127.
P. 518—519.
Nakayama J., Rice J. C., StrahlB.D., Allis CD., Grewal S. I.
Role of histone H3 lysine 9 methylation in epigenetic con-
trol of heterochromatin assembly // Science. 2001.
Vol. 292. P. 110—113.
Nieth C, Priebsch A., Stege A., Lage H. Modulation of the clas-
sical multidrug resistance (MDR) phenotype by RNA in-
erference (RNAi) // FEBS Lett. 2003. Vol. 545. P. 144—
150.
204 ЭПИГЕНЕТИКА
Novina С. D.. Alurray AI. F, DykxhoornD. AL. Beresford P. J..
Riess J, Lee S. K., ( oilman R. G., Lieberman J., Shan-
ar P., Sharp P. Л. siRNA-directed inhibition of HIV-1 in-
fection // Nat. Med. 2002. Vol. 8. P. 681—686.
NykanenA., Haley B., ZamoreP.D. ATP requirements and
small interfering RNA structure in the RNA interference
pathway // Cell. 2001. Vol. 107. P. 309 321.
Oh Y. K, Park T. G. siRNA delivery' systems for cancer treat-
ment 11 Adv. Drug Deliv. Rev. 2009. Vol. 61. P. 850—
862.
O'TooleA. S., Miller S., SerraM. J. Stability of 3' double nu-
cleotide overhangs that model the 3' ends of siRNA //
RNA. 2005. Vol. 11,N4. P. 512—516.
O'Toole .1.5., MiUerS., Haines N., ZinkM.C., Serra AL J.
Comprehensive thermodynamic analysis of 3' double-
nucleotide overhangs neighboring Watson-Crick terminal
base pairs" Nucleic Acids Res. 2006. Vol. 34. Nil.
P. 3338—3344.
Palauqui J. C, ElmayanT., PollienJ.AL, Vaucheret H. Sys-
temic acquired silencing: transgene-specific post-trans-
criptional silencing is transmitted by grafting from si-
lenced stocks to non-silenced scions // EMBO J. 1997.
Vol. 16, N 15. P. 4738 4745.
Pal-Bhadra M., Leibovitch B. A., Gandhi S. G., RaoAI.,
Bhadra U., Birchler J. A., Elgin S. C. Heterochromatic si-
lencing and HP1 localization in Drosophila are dependent
on the RNAi machinery // Science. 2004. Vol. 303.
P. 669—672.
Papadakis E. D., Nicklin S. A., Baker A. H, White S. J. Promot-
ers and control elements: designing expression cassettes for
gene therapy // Curr. Gene Ther. 2004. Vol. 4. P. 89—113.
Patutina O. A., Mironova N. L., Popova N. A., Kaledin L,
NikolinV.P., VlassovVV, Zenkova M. .4. The siRNA
targeted to mdrlb and mdrla mRNAs in vivo sensitizes
murine lymphosarcoma to chemotherapy // BMC Cancer.
2010. Vol. 14. P. 204.
Petrova (Kruglova) N. S., MeschaninovaM. I., Venyamino-
va A. G., ZenkovaM. A., Jlassov V. J~., Chernolovska-
yaE. L. 2'-O-Methyl—Modified Anti-MDRl Fork-siRNA
Duplexes Exhibiting High Nuclease Resistance and
Prolonged Silencing Activity // Oligonucleotides. 2010.
Vol. 20. P. 297—308.
Petrova N., Chernikov L, AleschaninovaAI., DovydenkoL,
Venyaminova A., Zenkova AL. Jlassov V.. Chemolovs-
kaya E. Carrier-free cellular uptake and the gene-silencing
activity of the lipophilic siRNAs is strongly affected by
the length of the linker between siRNA and lipophilic
group // Nucleic Acids Research. 2012. Vol. 40. P. 2330—
2344.
PoeckH, Besch R, Alaihoefer C., RennAI., TormoD., Alor-
skaya S. S.. KirschnekS.. GaffalE.. Landsberg J.. Hell-
muthJ., SchmidtA., AnzD., BscheiderAL, SchwerdT.,
BerkingC., BourquinC., Kalitike U., KremmerE., Ka-
to H, AkiraS., Meyers R, Hacker G., NeuenhahnAL,
Busch D., RulandJ., Rothenfusser S., Prinz AL, Hornu-
ng V., Endres S., Tilting T, Hartmann G. 5'-triphosphate-
siRNA: turning gene silencing and Rig-I activation against
melanoma // Nat. Med. 2008. Vol. 14. P. 1256—1263.
PolisenoL., Mercatanti A., Citti L., Rainaldi G. RNA-based
drugs: from RNA interference to short interfering RNAs '/
Curr. Pharm. Biotechnol. 2004. Vol. 5. P. 361—368.
PotenzaN., MoggioL., AlilanoG., Salvatore DiBlasioB.,
RussoS., MessereA. RNA interference in mammalia cells
by RNA-3’-PNA chimeras 11 Int. J. Mol. Sci. 2008. Vol. 9.
P. 299—315.
Randall G., Grakoui A., RiceC.AI. Clearance of replicating
hepatitis C virus replieon RNAs in cell culture by small in-
terfering RNAs // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003.
Vol. 100. P. 235—240.
Reynolds A.. Anderson E. AL. Vermeulen A.. Fedorov 1.. Robin-
son K, Leake D., Karpilow J, Alarshall JV. S., Khvo-
rovaA. Induction of the interferon response by siRNA is
cell type and duplex length-dependent '/ RNA. 2006.
Vol. 12. P. 988—993.
Robbins AL, Judge A., LiangL., AIcclintock K, Yaworski E.,
AlacLachlan I. 2-O-methylmodified RNAs act as TLR7 an-
tagonists 7 Mol. Ther. 2007. Vol. 15. N 9. P. 1663—1669.
Robinson AI., Judge A., AlacLachlan J. siRNA and innate im-
munity 11 Oligonucleotides. 2009. Vol. 19. P. 89—101.
Poignant J. Y., CarreC., A Lu gat B., Szymczak !)., Lepe-
santJ.A., Antoniewski C. Absence of transitive and sys-
temic pathways allows cell-specific and isoform-specific
RNAi in Drosophila '/ RNA. 2003. Vol. 9, N 3. P. 299—
308.
SaadAI., Garbuzenko О. B., Alinko T. Со-delivery of siRNA
and an anticancer drug for treatment of multidrug-resistant
cancer 11 Nanomedicine. 2008. Vol. 3. P. 761—776.
Sadialie AL, Hda T, Urano T, Nnakayama J. A chromodomain
protein, Chpl, is required for the establishment of hetero-
chromatin in fission yeast7 EMBO J. 2004. Vol. 23.
P. 3825—3835.
Samarsky D. Development of novel RNAi therapeutic com-
pounds and in vivo deliverv approaches // RNAi Europe.
2009.
Samson AL. Libert F, DoranzB.J.. Rucker J.. LiesnardC..
Farber C. AI., Saragosti S., Lapoumeroulie C, Cog-
nauxJ., ForceilleC., Aluyldermans G., Verhofstede C.,
Burtonboy G., Georges AL, ImaiT., RanaS., Yi Y.,
Smyth R. J., Collman R G., DornsR JV, J assart G., Par-
mentierAI. Resistance to HIV-1 infection in Caucasian in-
dividuals bearing mutant alleles of the CCR-5 chemokine
receptor gene // Nature. 1996. Vol. 382. P. 722—725.
Samuel С. E. Antiviral actions of interferons // Clin. Microbiol.
Rev. 2001. Vol. 14. P. 778—809.
Sasaki T, Shiohama A., Alinoshima S., Shimizu V. Identification
of eight members of the Argonaute family in the human
genome small star, filled // Genomics. 2003. Vol. 82.
P. 323—330.
Schauer S. E., Jacobsen S. E., Aleinke D. JV, Ray A. Dicer-
Likel: blind men and elephants in Arabidopsis develop-
ment // Trends Plant Sci. 2002. Vol. 7. P. 487—491.
Schlee AI., Hornung V., Hartmann G. siRNA and isRNA: two
edges of one sword // Mol. Ther. 2006. Vol. 14. P. 463—
470.
Schwarz D. S., DingH., Kennington L., AlooreJ. T, Schelter J.,
Burchard J., Linsley P. S., Aronin N, Xu Z., Zamore P. D.
Designing siRNA that distinguish between genes that dif-
fer by a single nucleotide // PLoS Genet. 2006. Vol. 2,
N 9. P. el40.
Sen G. C. Viruses and interferons // Annu. Rev. Microbiol.
2001. Vol. 55. P. 255—281.
Sen G. C, SarkarS.N. Transcriptional signaling by double-
stranded RNA: role of TLR3 // Cytokine Growth Factor
Rev. 2005. Vol. 16. P. 1—14.
Shen J., SamulR, Silva R L., Akiyama H, Liu H, Saishin Y.,
Hackett S. F, ZinnenS., Kossen K, Fosnaugh K, J ar-
geese C., Gomez A., Bouhana K, Aitchison R, PavcoP.,
Campochiaro P. .1. Suppression of ocular neovasculariza-
tion with siRNA targeting VEGF receptor 1 // Gene Ther.
2006. Vol. 13. P. 225—234.
Sijen T, Fleenor J., Simmer F, Thijssen K. L„ Parrish S.,
Timmons L., PlasterkR. H, Fire A. On the role of RNA
amplification in dsRNA-triggered gene silencing // Cell.
2001. Vol. 107, N 4. P. 465 476.
SioudAI. Induction of inflammatory cytokines and interferon
responses by double-stranded and single-stranded siRNAs
is sequence-dependent and requires endosomal localiza-
tion // J. Mol. Biol. 2005. Vol. 348. P. 1079—1090.
ГЛАВА 7 205
Smardon A.. Spoerke J. AL, StaceyS. C. Klein ALE.. ALac-
kinN., ALaineE.AL. EGO-1 is related to RNA-directed
RNA polymerase and functions in germ-line development
and RNA interference in C. elegans 11 Curr. Biol. 2000.
Vol. 10, N 4. P. 169—178.
SohailAL., Doran G., Riedemann J., Alacaulay V., South-
ern E. AL. A simple and cost-effective method for produc-
ing small interfering RNAs with high efficacv // Nucleic
Acids Res. 2003. Vol. 31. P. e38.
StarkG. R, Kerr I. AL, Williams B. R, Silverman R EL, Schrei-
ber R. D. How cells respond to interferons // Annu. Rev.
Biochem. 1998. Vol. 67. P. 227—264.
Stevenson AL. Therapeutic potential of RNA interference// N.
Engl. J. Med. 2004. Vol. 351. P. 1772—1777.
SulicS., Panic L., Dikicl., Volarevic S. Deregulation of cell
growth and malignant transformation // Croat. Med. J.
2005. Vol. 46. P. 622—638.
SurabhiR. AL., Gaynor R B. RNA interference directed against
viral and cellular targets inhibits human immunodefi-
ciency Virus Type 1 replication // J. Virol. 2002. Vol. 76.
P. 12963—12973.
TabaraH., YigitE., Siomi H., ALelloC. C. The dsRNA binding
protein RDE-4 interacts with RDE-1, DCR-1, and a
DExH-box helicase to direct RNAi in C. elegans 11 Cell.
2002. Vol.109, N7. P. 861—871.
Takahashi 1.. YamaokaK. NishikawaAL.. Takakura Y. Quanti-
tative and temporal analysis of gene silencing in tumor
cells induced by small interfering RNA or short hairpin
RNA expressed from plasmid vectors // J. Pharm. Sei.
2009. Vol. 98. P. 74—80.
Takeda K, Kaisho T., Akira S. Toll-like receptors // Annu. Rev.
Immunol. 2003. Vol. 2E P. 335—376.
Takei 1., Kadomatsu K. Yuzawa 1., Alatsuo S., ALuramatsu T. A
small interfering RNA targeting vascular endothelial
growth factor as cancer therapeutics // Cancer Res. 2004.
Vol. 64. P. 3365—3370.
Terrazas AL, Kool E. T. RNA major groove modifications im-
prove siRNA stability and biological activity // Nucleic
Acids Res. 2009. Vol.’37, N 2. P. 346—353.
THIS., Lejeune E., Thermaim R, BortfeldAL., Hothom AL, En-
derle D., Heinrich C., HentzeAL.W., Ladurner A. G. A
conserved motif in agonaute-interaeting proteins mediates
functional interactions through the Argonaute PIWI do-
main // Nat. Struct. Mol. Biol. 2007. Vol. 14. P. 897—903.
Timmons L., Fire A. Specific interference by ingested dsRNA //
Nature. 1998. Vol. 395, N 6705. P. 854.
Toudjarska L., Judge A., Brodsky J., ALcClintock K, de JongS. D.,
AmbegiaE., BuckT., AkincA., Racie T, JeffsL. B., Yawors-
kiE., GollobJ., ALacEachlan L., Sah D. W., BumcrotD. De-
velopment of Aln-Vsp: an RNAi therapeutic for liver ma-
lignancies /'Hepatology. 2009. Vol. 50. P. 1149A.
Tuschl T. Expanding small RNA interference // Nat. Biotechnol.
2002. Vol. 20. P. 446 448.
Ui-Tei K, NaitoY., ZennoS., Nishi K, Yamato K, Takaha-
shi F., Jimi A., SaigoK. Functional dissection of siRNA
sequence by systematic DNA substitution: modified
siRNA with a DNA seed arm is a powerful tool for mam-
malian gene silencing with significantly reduced off-target
effect // Nucleic Acids Res. 2008. Vol. 36. P. 2136- -2151.
Vaistij F. E.. Jones L., Baulcombe D. C. Spreading of RNA tar-
geting and DNA methylation in RNA silencing requires
transcription of the target gene and a putative RNA-
dependent RNA polymerase // Plant Cell. 2002. Vol. 14,
N 4. P. 857—867.
Verdel A., LaS., GerberS., SugiyamaT., Gygi S., GrewalS. L,
ALoazedD. RNAi-mediated targeting of heterochromatin by
the RITS complex 11 Science. 2004. Vol. 303. P. 672—676.
FoiimetO., FainP., AngellS., BaulcombeD. C. Systemic spread
of sequence-specific transgene RNA degradation in plants is
initiated by localized introduction of ectopic promoterless
DNA // Cell. 1998. Vol. 95, N2. P. 177—187.
Volkov A. A., Kruglova N. S., ALeschaninova AL. L, Venyamino-
va A. G., Zenkova AL. A., Ilassov V. V, Chernolovska-
ya E. L. Selective protection of nuclease-sensitive sites in
siRNA prolongs silencing effect // Oligonucleotides. 2009.
Vol. 19. P. 191 202.
Volpe T. A.. KidnerC. HallL. AL, TengG.. GrewalS. L., Alar-
tienssen R. .1. Regulation of heterochromatic silencing and
histone H3 lysine-9 methylation by RNAi '' Science.
2002. Vol. 297. P. 1833—1837.
WangY., JuranekS., LiH, ShengG., Tuschl T., PatelD. J.
Structure of an argonaute silencing complex with a seed-
containing guide DNA and target RNA duplex // Nature.
2008. Vol. 456. P. 921—926.
WasseneggerAL, HeimesS., RiedelL., Sanger H. L. RNA-di-
rected de novo methylation of genomic sequences in
plants // Cell. 1994. Vol. 76. P. 567—576.
Watanabe T, Tomizawa S„ ALitsuya K, Totoki I., Yamamoto Y.,
Kuramochi-ALiyagawa S., TidaN., Hoki Y., Alurphy P. J.,
ToyodaA., Got oh K, Hiura H, ArimaT., Fujiyama A.,
Sado T, Shibata T, Nakano T, Lin H, Lchiyanagi K, So-
loway P.D., Sasaki H. Role for piRNAs and nonco-
ding RNA in de novo DNA methylation of the imprinted
mouse Rasgrfl locus // Science. 2011. Vol. 332. P. 848—
852.
Watts J. K, Deleavey G. F, DamhaAL. J. Chemically modified
siRNA: tools and applications // Drug Discov. Today.
2008. Vol. 13, N 19/20. P. 842—855.
Wierzbicki A. T., Haag J. R., Pikaard C. S. Noncoding tran-
scription by RNA polymerase Pol IVbPol V mediates
transcriptional silencing of overlapping and adjacent ge-
nes 7 Cell. 2008. Vol. 135. P. 635—648.
Wierzbicki .1. T, ReamT.S., Haag J. R, Pikaard C. S. RNA
polymerase V transcription guides ARGONAUTE4 to
chromatin // Nat. Genet. 2009. Vol. 41. P. 630—634.
Wilson J. A., Jayasena S., Khvorova A., Sabatinos S., Rodrigue-
Gervais L.G., AryaS., Sarangi F, Harris-BrandtsAL,
BeaulieuS., Richardson C. D. RNA interference blocks
gene expression and RNA synthesis from hepatitis C rep-
licons propagated in human liver cells // Proc. Natl. Acad.
Sei. USA. 2003. Vol. 100. P. 2783—2788.
Winston W. AL., ALolodowitch C, Hunter С. P. Systemic RNAi
in C. elegans requires the putative transmembrane protein
SID-1 // Science. 2002. Vol. 295. P. 2456—2459.
Wolfrum C, Shi S., Jayaprakash К N., JayaramanAL, WangG,
Pandey R K, Rajeev K. G., Nakayama T, Charrise K,
NdungoE.AL, Zimmermann T, Koteliansky V, ALanoha-
ranAL, Stoffel AL. Mechanisms and optimization of in vivo
delivery of lipophilic siRNAs // Nat. Biotechnol. 2008.
Vol. 25. P. 1149—1157.
XingY., Liu AL., Du 1., QuF, Li 1., Zhang Q., Xiao 1., Zhao J.,
ZengF, Xiao C. Tumor cell-specific blockade of
CXCR4/SDF-1 interactions in prostate cancer cells by
hTERT promoter induced CXCR4 knockdown: a possible
metastasis preventing and minimizing approach // Cancer
Biol. Ther. 2008. Vol. 7. P. 1840—1849.
YeX., HuangN, LiuY., ParooZ., Huerta C., LiP., Chen S.,
LiuQ., Zhang H. Structure of C3PO and mechanism of
human RISC activation// Nat. Struct. Mol. Biol. 2011.
Vol. 18. P. 650—657.
Zamanian-DaryoushAL., ALogensen T. H, DiDonato J. A., Wil-
liams B. R. NF-kappa В activation by double-stranded-
RNA-activated protein kinase (PKR) is mediated through
NF-kappa В-inducing kinase and I kappa В kinase // Mol.
Cell. Biol. 2000. Vol. 20. P. 1278—1290.
Zamanian-DaryoushAL, ALarquesJ. T, GantierALP., Behl-
keALA., John AL, Rayman P., Finke J., Williams B. R.
Determinants of cytokine induction by small interfering
206 ЭПИГЕНЕТИКА
RNA in human peripheral blood mononuclear cells 11 J. In-
terferon Cytokine Res. 2008. Vol. 28. P. 221—233.
ZengY., Yi R., Cullen B. R. MicroRNAs and small interfering
RNAs can inhibit mRNA expression by similar mecha-
nisms// Proc. Natl. Acad. Sei. USA.’2003. Vol. 100.
P. 9779—9784.
Zeller S. J., Kumar P. RNA-based gene therapy for the treat-
ment and prevention of HiV: from bench to bedside '/
Yale J. Biol. Med. 2011. Vol. 84. P. 301—309.
ZhangN., TanC., CaiP., Zhang P„ ZhaoY., Jiang Y. RNA in-
terference in mammalian cells by siRNAs modified with
morpholino nucleoside analogues // Bioorg. Med. Chem.
2009. Vol. 17. P. 2441—2446.
Zhou C. Liu Y., Andaloussi AL. BadgujarN., Plashkevych O..
Chattopadhyaya J. Fine tuning of electrostatics around the
intemucleotidic phosphate through incorporation of modi-
fied 2',4'-carbocyclic-LNAs and -ENAs leads to signifi-
cant modulation of antisense properties // J. Org. Chem.
2009. Vol. 74. P. 118—134.
Zhou H., XiaX. G., Xu Z. An RNA polymerase II construct syn-
thesizes short-hairpin RNA with a quantitative indicator
and mediates highly efficient RNAi // Nucleic Acids Res.
2005. Vol. 33,N6.P. e62.
ГЛАВА
8
ГЕНЕТИЧЕСКИЕ И ЭПИГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ
ПРЕДЫМПЛАНТАЦИОННОГО РАЗВИТИЯ МЫШИ
СОДЕРЖАНИЕ
8.1. Эпигенетическое репрограммиро-
вание генома зиготы, 208
8.2. Переход от материнского к заро-
дышевому контролю развития, 210
8.3. Возникновение различий между
бластомерами, 211
8.4. Возникновение внутренне-наруж-
ной полярности, 212
8.5. Детерминация трофоэктодермы,
214
8.6. Коммитирование трофоэктодермы,
216
8.7. Детерминация внезародышевой
энтодермы и зародышевой экто-
дермы, 217
8.8. Хроматин плюрипотентных клеток,
219
Список литературы, 220
208 ЭПИГЕНЕТИКА
8.1. Эпигенетическое репрограммирование
ГЕНОМА ЗИГОТЫ
У млекопитающих мужская и женская гаметы
различаются по вкладу в инициацию развития
нового организма. Предымплантационное разви-
тие зародыша осуществляется почти полностью
за счет накопленных в яйцеклетке продуктов ге-
нов материнского эффекта — материнских бел-
ков и мРНК (см. обзор в [Schultz, 1993]). Про-
дукты генов материнского эффекта — факторы
ремоделирования хроматина, ферменты кова-
лентной модификации гистонов, ферменты, уча-
ствующие в деметилировании /ТНК, и другие
белки производят эпигенетические изменения в
хроматине родительских пронуклсусов, перево-
дя его в «открытое» состояние. Идущий парал-
лельно процесс репликации родительских гено-
мов способствует их репрограммированию.
В процессе гаметогенеза геномы яйцеклетки
и сперматозоида метилируются. В оогенезе мы-
ши de novo метилирование ДНК осуществляет
метилтрансфераза ЗА (DNMT3A) [Okano etal.,
1999]. Она действует в комплексе с кофактором
DNMT3L [Bourc'his et al., 2001], который обеспе-
чивает связывание комплекса с N-терминальным
«хвостом» гистона НЗ [Kaneda et al., 2004], после
чего окружающая ДНК метилируется. Закрепле-
ние комплекса DNMT3A—DNMT3L на «хвосте»
гистона НЗ возможно, только если остаток лизи-
на в позиции 4 этого гистона (НЗК4) не метили-
рован [Ooi et al., 2007]. Поэтому’ для de novo ме-
тилирования ДНК необходимо параллельное ак-
тивное деметилирование НЗК4 лизин-деметила-
зой IB (KDM1B) [Ciccone etal., 2009]. Эти про-
цессы вызывают транскрипционную инактива-
цию геномов гамет.
После оплодотворения хроматин отцовского
генома деконденсируется. протамины в нем за-
меняются на материнские гистоны. До начала
первой S-фазы у мыши происходит деметилиро-
вание ДНК отцовского пронуклеуса [Oswald et al.,
2000]. Один из механизмов быстрого деметили-
рования реализуется через окисление 5-метилци-
тозинов ферментом ТЕТЗ с образованием 5-гид-
роксиметилцитозинов [Iqbal etal., 2011]. В отли-
чие от 5-метилцитозина 5-гидроксиметилцито-
зин не связывает ни репрессорные белки [Tahi-
liani et al., 2009], ни ДНК-метилтрансферазу
DNMT1 [Valinluck, Sowers, 2007], поэтому не
подавляет транскрипцию и пассивно элиминиру-
ется при репликации ДНК Материнский геном
защищен от активного деметилирования. После
оплодотворения белок STELLA (ген Dppa3) свя-
зывается с транспортным белком RANBP5 и пе-
ремещается в пронуклсусы, где пока не извест-
ным образом поддерживает паттерн метилиро-
вания импринтированных локусов и защищает
материнский геном от активного деметилирова-
ния [Nakamura et al., 2007]. В результате медлен-
ное деметилирование материнского генома идет
пассивно в процессе полуконссрвативной репли-
кации ДНК [Ibid] (рис. 8.1).
К стадии бластоцисты основная масса ДНК в
бластомерах мыши является деметилированной
(см. рис. 8.1). Исключение составляют только
дифференциально метилированные районы им-
принтированных локусов [Santos etal., 2002].
Моноаллельная экспрессия импринтированных
генов поддерживается материнской ДНК-метил-
трансферазой 1 (DNMT1) [Hirasawa etal., 2008].
Белок ZFP57 необходим для установления мети-
лирования ДНК в клетках полового пути, а так-
же для поддержания отцовского и материнского
паттернов метилирования в предымплантацион-
ном зародыше [Li et al.. 20081.
У мыши слабая транскрипция генов зароды-
ша, так называемая минорная активация, начи-
нается на средней—поздней одноклеточной ста-
дии (см. рис. 8.1), причем только в отцовском
пронуклеусе [Aoki etal., 1997]. Трансляция мРНК,
образованных в процессе минорной активации,
отложена до стадии двух клеток [Alizadeh et al.,
2005]. Пока известно всего несколько белков,
участвующих в минорной активации. Так, белок
TIFla в поздней одноклеточной стадии переме-
щается из цитоплазмы в пронуклсусы, где взаи-
модействует с белком SMARCA5 (синоним
SNF2H, субъединица SWI/SNF-комплекса ремо-
делирования хроматина) и активирует ряд генов
зародыша [Torres-Padilla, Zemicka-Goetz, 2006].
Отцовский пронуклеус на этой стадии отличает-
ся от материнского по ряду’ эпигенетических мо-
дификаций хроматина. К началу S-фазы пер-
вого деления дробления ДНК отцовского гено-
ма уже гипометилирована [Oswald etal., 2000;
Santos etal., 2002]. Белки SMARCC1, SMARCA4
и SMARCB1, являющиеся субъединицами
SWI/SNF-комплекса ремоделирования хромати-
на, обогащены в отцовском пронуклсусс [Sun
etal., 2007]. Гистоны отцовского хроматина ги-
перацетилированы [Adenot et al., 1997]. а гистон
НЗ гипометилирован по лизину 9 (НЗК9) [Santos
et al., 2005] в сравнении с гистонами материн-
ского хроматина. В совокупности эти эпигене-
тические модификации хроматина могут обеспе-
чивать облегченный доступ активаторов транс-
крипции к генам.
ГЛАВА 8 209
Гаметы Оплодотворение Пронуклеусы Сингамия 2-клеточный
зародыш
Транскрипция собственного генома зародыша
100%
0 %
Время
Рис. 8.1. Переход к зародышевому контролю развития (по [Li et aL, 2010]).
Транскрипционно инертные гаметы сливаются при оплодотворении, и все содержимое
сперматозоида попадает в цитоплазму яйцеклетки. Ядро сперматозоида деконденсиру-
ется, и протамины в нем заменяются на гистоны материнского происхождения, в ре-
зультате чего формируется отцовский пронуклеус. Яйцо завершает второе мейотиче-
ское деление, и образуются материнские пронуклеусы. После слияния ядер и объеди-
нения хромосом проходит первое деление дробления. Параллельно с этими событиями
происходит деградация материнских мРНК и белков, а также изменяется статус мети-
лирования отцовского и материнского геномов. После оплодотворения отцовский геном
активно деметилируется еще до начала репликации ДНК и формирования пронуклеуса.
Материнский геном деметилируется пассивно в ходе каждого цикла репликации ДНК,
начиная с первого. После минорной активации транскрипции на стадии пронуклеусов
транскрипция зародышевого генома мощно активируется на стадии двух клеток.
Примерно через 12 ч после оплодотворения у
мыши пронуклсусы вступают в S-фазу. которая
продолжается 6—7 ч [Howlett, Bolton, 1985]. По-
сле завершения синтеза ДНК пронуклсусы сбли-
жаются и геномы объединяются.
В целом наследственный материал зиготы
претерпевает эпигенетические изменения, в ре-
зультате которых две гаплоидных терминально
дифференцированных клетки дают одну дипло-
идную клетку со свойствами тотипотентности —
210 ЭПИГЕНЕТИКА
зиготу’. Под тотипотентостью зиготы и бласто-
меров ранних стадий дробления млекопитающих
понимают способность этих клеток давать три
основные популяции клеток бластоцисты — тро-
фоэктодерму. гипобласт и эпибласт.
8.2. Переход от материнского
К ЗАРОДЫШЕВОМУ КОНТРОЛЮ
РАЗВИТИЯ
Одной из первых функций продуктов генов
материнского эффекта после оплодотворения яв-
ляется ремоделирование хроматина родитель-
ских геномов и передача геному’ зиготы функции
контроля развития.
Транскрипционный фактор плюрипотентных
клеток ОСТ4 экспрессируется в ходе оогенеза, а
материнская мРНК Oct4 сохраняется в зародыше
до стадии двух клеток [Palmieri et al., 1994]. По-
давление трансляции этой мРНК в одноклеточ-
ном зародыше вызывает остановку’ развития при
последующем дроблении [Foygel et al.. 2008]
и сопровождается характерными нарушениями
транскрипции генов. Нокдаун Oct4 не влияет на
уровень транскрипции Cdx2, Nanog и Sox2 в од-
но—двухклсточном зародыше мыши, но зато
влияет на транскрипцию генов Eif3c и Eifob, ко-
дирующих субъединицы эукариотического ком-
плекса инициации трансляции Eif3, что указыва-
ет на участие Oct4 в регуляции трансляции ма-
теринских мРНК [Foygel et al., 2008].
Мажорная активация зародышевого генома у
мыши происходит в две волны — на двухклс-
точной стадии и во время перехода от четырех-
к восьмиклеточной стадии [Carter et al., 2003;
Hamatani et al., 2004; Wang et al., 2004] (рис. 8.2).
Мощная активация транскрипции генов зароды-
ша требует ремоделирования хроматина. В этом
процессе принимают участие несколько се-
мейств АТФ-зависимых белков: SWI/SNF, ISWI,
CHD, INO88 (см. обзор в [Clapier, Cairns, 2009]).
Мутация гена Smarca4 мыши, кодирующего
субъединицу’ SWI/SNF-комплекса ремоделиро-
вания хроматина, вызывает остановку’ развития
при переходе от двухклсточной к четырехкле-
точной стадии. При этом наблюдается снижение
глобального уровня гистоновой модификации
НЗК4те2, характерной для эухроматина, и 30%-е
снижение транскрипции зародышевого генома
[Bultman et al., 2006].
Разделение ВКМ Разделение эпибласта
и трофоэктодермы и гипобласта
Поляризация QТрофоэктодерма QBKM С Гипобласт ©Эпибласт
Рис. 8.2. Транскрипционная регуляция предымплантационного развития мыши (по [Zernicka-Goetz et al., 2009]).
Клетки ВКМ выделяются в результате двух волн асимметричных делений при переходах от 8 к 16 и от 16 к 32 клеткам. Наруж-
ные клетки становятся трофоэктодермой. Затем клетки наружного слоя ВКМ становятся гипобластом, а внутренние —
эпибластом. Одновременно происходят изменения на молекулярном уровне: постепенная деградация запасов материнской
мРНК, минорная и мажорная фазы активации транскрипции собственного генома зародыша, поляризация клеток, волны асим-
метричных делений, а также изменения экспрессии генов, ассоциированных с разделением трофоэктодермы и ВКМ, а затем —
гипобласта и эпибласта.
ГЛАВА 8 211
Изучение транскрипции генов при помощи
микрочипов показало, что транскриптомы пред-
ымплантационных зародышей мыши разделя-
ются на два кластера по сходству наборов мРНК:
первый кластер объединяет транскриптомы зре-
лого ооцита и зародышей до поздней двукле-
точной стадии, а другой кластер — транскрип-
томы зародышей от стадии четырех клеток до
стадии поздней бластоцисты [Hamatani et al.,
2004; Wang etal., 2004]. Таким образом, при пе-
редаче функции контроля развития от генов ма-
теринского эффекта геному зародыша одно-
временно меняется и набор работающих генов.
В частности, после возобновления транскрипции
важную роль в развитии начинают играть транс-
крипционные факторы, как унаследованные из
яйцеклетки, так и образованные в результате ак-
тивации генома зародыша.
Одновременно с активацией транскрипции
происходит деградация запасов материнской
мРНК, в результате чего контроль развития пол-
ностью переходит к зародышевым генам. Мас-
совая деградация материнской мРНК у мыши
начинается уже, когда ооцит, находящийся в фа-
зе МП, возобновляет мейоз (см. рис. 8.1, 8.2).
К поздней одноклеточной стадии количество ма-
теринской мРНК сокращается на 60 %, а к сред-
ней двуклеточной стадии — более чем на 90 %
[Bachvarova et al., 1985; Paynton et al., 1988].
По-видимому, деградация как минимум неко-
торых мРНК происходит избирательно с участи-
ем малых некодирующих РНК [Giraldez et al.,
2006; Lykke-Andersen et al., 2008]. Так, избира-
тельная деградация мРНК Mos, Hlfoo, Plat и
Gdf9 обнаружена в одноклеточном зародыше
мыши [Alizadeh et al., 2005]. Известно, что ма-
лые некодирующие РНК регулируют экспрес-
сию генов, входя в состав РНК-индуцирусмых
комплексов сайленсинга (RNA-induced silencing
complex, RISC), которые связываются с мРНК-
мишенями и вызывают их деградацию либо по-
давляют трансляцию. Мутация материнского бел-
ка DICER1 — эндонуклеазы, разрезающей пред-
шественники малых РНК на зрелые малые ин-
терферирующие РНК и микроРНК, нарушает за-
вершение мейоза в мышиных ооцитах [Murchi-
son etal., 2007; Tang etal.. 2007]. Аналогичный
эффект имеет мутация ARGONAUTE2-PHKa3bi,
входящей в состав RISC [Kaneda et al., 2009].
Семейство белков с тандемными доменами
цинковых пальцев СССН-типа обеспечивают
альтернативный путь деградации РНК. Эти бел-
ки связываются с З'-нетранслируемыми района-
ми мРНК и дестабилизируют их [Lai et al., 2000].
Мутантные зародыши мыши, экспрессирующие
укороченный вариант белка ZFP36L2, останав-
ливаются в развитии в период дробления [Ramos
et al., 2004].
Материнские белки также подвергаются де-
градации в раннем развитии. Часть белков ме-
тятся убиквитином и затем расщепляются в про-
теосомах [Suzumori etal., 2003; Roest etal., 2004].
Другим способом деградации белков является
автофагия, в ходе которой избыточные белки и
органеллы окружаются двойной мембраной, об-
разуя автофагосомы, которые сливаются с лизо-
сомами, и их содержимое деградирует (см. обзор
в [Melendez. Neufeld, 2008]). Комплекс белков
ATG12—ATG5—ATG16 локализуется на наруж-
ной поверхности автофагосом (см. обзор в [Xie,
Klionsky, 2007]). Ооциты с нарушенным меха-
низмом автофагии, мутантные по гену’ Atg5, ос-
танавливаются в развитии на стадии четырех—
восьми клеток [Tsukamoto et al., 2008].
8.3. Возникновение различий между
БЛАСТОМЕРАМИ
У мыши борозда первого деления дробления
в большинстве зигот проходит вблизи (в преде-
лах 30 град.) от анимального полюса зародыша,
маркированного расположенным на нем вторым
полярным тельцем [Gray etal., 2004]. В резуль-
тате цитоплазма как анимального. так и вегета-
тивного полюсов примерно поровну’ распределя-
ется между’ двумя дочерними бластомерами
(рис. 8.3). Плоскость первого деления дробления
в большинстве (70—80 %) случаев определяет
расположение границы между’ зародышевой и
внезародышевой частями будущей бластоцисты,
т. е. задает расположение эмбрионально-абэмб-
риональной оси [Gardner, 2001; Piotrowska etal.,
2001; Piotrowska, Zemicka-Goetz, 2001; Fujimori
et al., 2003].
Уже во втором делении дробления у мыши
наблюдается небольшая асинхронность — один
из бластомеров делится немного раньше. Каж-
дый из двух первых бластомеров с некоторой
вероятностью может делиться либо параллельно
оси первого деления (меридиональное деление),
либо перпендикулярно этой оси (экваториаль-
ное деление) (см. рис. 8.3). Если оба бластомера
двуклеточного зародыша делятся меридиональ-
но, образуется четырехклеточный зародыш пло-
ской конформации (30 % случаев у мыши in
vivo), а если же один из бластомеров делится эк-
ваториально, то четырехклеточный зародыш
имеет форму’ тетраэдра (70 % случаев у мыши
212 ЭПИГЕНЕТИКА
Зигота
(1 клетка)
2-е деление
(4 клетки)
Параллельное Ортогональное
деление
деление
Плоские
зародыши
(~20 %)
Тетраэдрические
зародыши
(-80 %)
Рис. 8.3. Начало дробления (по [Li et al., 2010]).
Первое деление оплодотворенной яйцеклетки приводит к
симметричному 2-клеточному зародышу, в котором бласто-
меры имеют одинаковые потенциалы развития. Плоскость
второго деления дробления может располагаться либо па-
раллельно плоскости первого деления, либо ортогонально
ей. В результате у мыши в 20 % случаев все бластомеры
4-клеточного зародыша располагаются в одной плоскости,
однако чаще (-80 % случаев) они образуют тетраэдр.
in vivo) [Gardner, 2002] (см. рис. 8.3). В некото-
рых случаях оба бластомера делятся экватори-
ально. но такие зародыши не выживают. В ре-
зультате меридионального второго деления дроб-
ления оба дочерних бластомера наследуют и
анимальный, и вегетативный компоненты цито-
плазмы («анимально-вегетативные» бластоме-
ры), тогда как экваториальное деление дает
«анимальный» и «вегетативный» бластомеры.
Установлено, что четырехклеточные зародыши
плоской конформации не имеют заданной эмб-
рионально-абэмбриональной оси, все их бла-
стомеры эквивалентны по потенциалу’ развития
[Piotrowska-Nitsche etal., 2005]. Четырехклеточ-
ные зародыши в форме тетраэдра наследуют эм-
брионально-абэмбриональную ось, установлен-
ную плоскостью первого деления дробления,
только если первым произошло меридиональное
деление, а вторым — экваториальное. В этом
случае «анимально-вегетативные» бластомеры
детерминированы к образованию эмбрионально-
го полюса зародыша. Если же порядок деления
бластомеров двухклеточного зародыша был об-
ратным (сначала экваториальное, а потом мери-
диональное деление), то образованные четыре
бластомера не имеют различий по потенциалу
развития [Ibid],
Таким образом, в некоторых зародышах мы-
ши уже на стадии четырех клеток отдельные
бластомеры могут различаться по потенциалу’
развития. Существование таких различий под-
тверждается и на уровне эпигенетических моди-
фикаций хроматина. Анимально-вегетативные
бластомеры имеют высокий уровень асиммет-
ричного метилирования аргининов в позициях
17 и 26 гистона НЗ (H3R26me2a и H3R17me2a), а
в вегетативном бластомере содержание этих мо-
дификаций понижено [Torres-Padilla et al., 2007].
При этом в вегетативном бластомере повышен
уровень мРНК Cdx2 [Jedrusik et al., 2008], что
коррелирует с его предрасположенностью к раз-
витию в трофобласт [Bischoff etal.. 2008]. Ани-
мально-вегетативные бластомеры плюрипотент-
ны, тогда как вегетативные не способны вклю-
чаться в развитие агрегационных химер [Piot-
rowska-Nitsche etal., 2005]. Высокая плюрипо-
тентность анимально-вегетативных бластомеров
как-то связана с гиперметилированием арги-
нинов 17 и 26 гистона НЗ, поскольку' сверхэкс-
прессия метилтрансферазы CARM1, ответствен-
ной за этуг модификацию [Chen. 1999], вызывает
повышение экспрессии Nanog и Sox2 и повыша-
ет вклад клеток в ВКМ [Piotrowska-Nitsche et al.,
2005].
8.4. Возникновение внутренне-наружной
полярности
Одним из важнейших поверхностных белков
межклеточной адгезии у многоклеточных орга-
низмов является Са2+-зависимый трансмембран-
ный белок Е-кадгерин (см. обзор в [Fleming
etal., 2001]). Синтез РНК и белка Е-кадгерина
начинается у мыши на поздней дву'клеточной
стадии в перву'ю волну' мажорной активации
транскрипции [Vestweber et al., 1987]. На стадии
восьми клеток белок перераспределяется в мемб-
ранах клеток: он удаляется с апикальных мемб-
ран и концентрируется в участках межклеточных
контактов [Vestweber etal., 1987]. В результате
происходит компактизация зародыша. Бластоме-
ры у'площаются, увеличивается площадь их кон-
тактов друг с другом, происходит поляризация
клеток, у' них появляются выраженные апикаль-
ГЛАВА 8 213
ные и базолатеральные мембранные домены.
Наружные поверхности поляризованных бласто-
меров имеют множество микроворсинок, тогда
как внутренние поверхности — гладкие, что оз-
начает поляризацию цитоскелета.
Мембранные и цитоплазматические белки пе-
рераспределяются в процессе поляризации. В бла-
стомерах восьмиклеточного зародыша мыши бел-
ки Par-комплекса, включая JAM1, аРКС и PAR3,
локализуются в апикальной цитоплазме [Thomas
et al., 2004; Plusa et al., 2005], а белок PARI — в ба-
золатеральной цитоплазме [Vinot etal., 2005]. Бе-
лок EZRIN перемещается с периферии бластоме-
ров в апикальную субкортикальную цитоплазму’
[Louvet etal., 1996]. Трансмембранный рецептор
EGF локализуется только в базолатеральном мемб-
ранном домене [Dardik et al., 1992].
В результате двух волн асимметричных деле-
ний наружных клеток компактизованного заро-
дыша в нем образуются попу’ляции внутренних и
наружных клеток. Плоскость каждого деления
при этом ориентирована таким образом, что одна
из дочерних клеток остается на поверхности за-
родыша, а другая уходит внутрь (рис. 8.4). Эти
деления дробления — четвертое и пятое по сче-
ту’ — называются асимметричными, поскольку’
образующиеся дочерние клетки имеют разные
последующие пути развития. В этих делениях
происходит асимметричное распределение белков
и мРНК между’ дочерними клетками [Jedrusik
etal., 2008]. Наружные дочерние клетки сохраня-
ют полярность, а внутренние клетки, наследуя
молекулы латеробазальной цитоплазмы, стано-
вятся неполярными [Johnson, Ziomek, 1983] (см.
рис. 8.4). Плотные контакты между’ клетками на-
ружного слоя отделяют их апикальные мембран-
ные домены от базальных и поддерживают поля-
ризованное состояние [Fleming et al., 2001].
Зародыши мыши, мутантные по Е-кадгерину,
все же способны к компактизации из-за присут-
ствия в них остаточного количества материнско-
го Е-кадгерина [Larue etal., 1994]. Однако такие
мутантные зародыши не формируют наружный
слой клеток, не имплантируются и гибнут. В то
Наружная клетка
наследует больше
мРНК Cdx2, чем
внутренняя
8—16 клеток
Рис. 8.4. Транскрипционный контроль разделения трофоэктодермы и ВКМ мыши (по [Zernicka-Goetz etal.,
2009]).
мРНК транскрипционного фактора Cdx2 асимметрично распределена в поверхностном слое цитоплазмы поляризованных бла-
стомеров. В результате при симметричном делении эта мРНК в равных долях распределяется между дочерними клетками, но
когда клетки делятся асимметрично, то дочерние клетки, остающиеся снаружи, получают больше мРНК Cdx2. Затем молеку-
лярный механизм, отслеживающий наружное положение клетки, поддерживает экспрессию Cdx2. Гены, отвечающие за под-
держание поляризации, и гены, отвечающие за развитие трофоэктодермы, усиливают экспрессию друг друга в симметрично
делящихся наружных клетках зародыша мыши. Экспрессия Cdx2 усиливает поляризацию, которая приводит к асимметричному
распределению мРНК Cdx2. Пониженный уровень Cdx2 во внутренних клетках снимает Сбх2-опосредованную репрессию генов
Nanog и Oct4, задействованных в развитии плюрипотентности.
214 ЭПИГЕНЕТИКА
же время если мутантная по Е-кадгерину яйце-
клетка будет оплодотворена нормальным спер-
мием, то зародыш выживает, но компактизация
происходит на стадии морулы, когда в результа-
те активности отцовского аллеля в бластомерах
накапливается достаточное количество Е-кадге-
рина [De Vries etal., 2004]. Таким образом, у
мыши компактизация сама по себе не нужна для
перехода от восьмиклеточной стадии к 16-кле-
точной, однако она является необходимым ша-
гом к формированию эпителиального слоя на-
ружных клеток, без которого невозможно даль-
нейшее развитие зародыша.
В цитоплазме яйцеклетки и бластомеров мы-
ши обнаружен особый белковый комплекс, ве-
роятно, участвующий в материнском контроле
раннего развития [Ohsugi et al., 2008]. Этот ком-
плекс образован белками MATER (ген Nlrp5)
[Tong, Nelson, 1999], FLOPED (ген Ooep) [Pierre
et al., 2007; Herr et al., 2008; Ohsugi et al., 2008],
TLE6 [Ohsugi et al., 2008], FILIA [Ibid] и PADI6
[Yurttas etal., 2008]. Предполагают, что этот
комплекс участвует в хранении и распределении
в клетке белков и РНК [Herr et al., 2008]. Внеш-
ний вид и внутриклеточная локализация ком-
плекса сильно варьируют в зависимости от спо-
соба фиксации зародыша при подготовке к мик-
роскопическому’ исследованию [Morency et al.,
2011]. Авторы, применявшие слабую фиксацию
параформальдегидом в сочетании с конфокаль-
ной микроскопией, обнаруживали субкортикаль-
ную локализацию комплекса, в связи с чем они
использовали название «субкортикальный мате-
ринский комплекс» [Ohsugi etal., 2008]. Более
сильную фиксацию используют при заливке об-
разца в смолу/парафин для последующего при-
готовления срезов для электронной микроскопии
[Littyvin, Denker, 2011]. В этом случае белковый
комплекс с очень сходным составом белков ло-
кализуется равномерно по всей цитоплазме кле-
ток и имеет вид решетки [Schyvarz etal., 1995;
Kim et al., 2010].
Мутации белков MATER, FLOPED, PADI6
нарушают предымплантационное развитие мы-
ши. Взрослые самцы и самки мыши, мутантные
по Nlrp5 (Mater) и Ooep (lloped), имеют внешне
нормальный фенотип, при этом мутантные сам-
цы фертильны, а самки стерильны. Овулировав-
шие мутантные яйцеклетки оплодотворяются, но
развитие останавливается до имплантации. Му-
тантный фенотип зародыша не исправляется
нормальным отцовским аллелем, так как гены
Nlrp5 (Mater) и Ooep (Floped) не экспрессируют-
ся в зародышевом геноме [Tong et al., 2000;
Ohsugi et al., 2008]. В яйцеклетках мышей, му-
тантных по Padi6, отсутствуют характерные ци-
топлазматические белковые решетки [Yurttas
etal., 2008]. После оплодотворения такой яйце-
клетки развитие зародыша останавливается на
стадии двух клеток [Esposito et al., 2007]. Отсутст-
вие в яйцеклетке материнского FILIA имеет ме-
нее катастрофичные последствия. Яйцеклетки
мутантных по Filia мышей оплодотворяются,
однако клеточный цикл в бластомерах замедлен,
что, возможно, отражает роль FILIA и всего
комплекса в контроле сегрегации хромосом при
дроблении [Zheng, Dean, 2009].
8.5. Детерминация трофоэктодермы
Одна из главных задач предымплантацион-
ного этапа развития плацентарных млекопитаю-
щих — формирование плаценты. Для выполне-
ния этой задачи уже на стадии морулы в заро-
дыше начинает выделяться специальная популя-
ция клеток. В наружных клетках морулы подав-
ляется программа плюрипотентности, появляет-
ся способность к интенсивной пролиферации, а
также способность к дифференцировке во все
типы клеток плаценты — формируется зрелая
трофоэктодерма.
Методом нокаута генов мыши показано, что
ген Tead4 является ключевым для запуска всей
транскрипционной сети развития трофоэктодер-
мы [Yagi et al., 2007: Nishioka et al., 2008: Ralston
etal., 2010]. Зародыши мыши, мутантные по
Tead4, погибают на стадии 32 клеток еще до об-
разования бластоцист, а в их бластомерах нару-
шена экспрессия центральных регуляторов раз-
вития трофоэктодермы, таких как Cdx2, Gata3 и
Eomes [Yagi et al., 2007; Ralston et al., 2010]. При
этом в нормальном зародыше мыши экспрессия
Tead4 наблюдается как в трофоэктодерме, так и
в ВКМ, а также в производных линиях стволо-
вых клеток — ТС- и ЭС-клетках [Nishioka et al.,
2008, 2009]. Следовательно, не дифференциаль-
ная экспрессия, а различия в функционировании
белка TEAD4 определяют детерминацию двух
первых популяций клеток в зародыше мыши.
Действительно, иммунофлуоресцентный анализ
выявляет интенсивную локализацию TEAD4 в
ядрах всех бластомеров четырех- и восьмикле-
точных зародышей мыши, тогда как в компакти-
зованных зародышах стадии морулы ядерная ло-
кализация TEAD4 наблюдается только в на-
ружных клетках [Home etal., 2012]. Во внутрен-
них клетках морул и клетках ВКМ бластоцист
мыши белок TEAD4 обнаруживается только в
ГЛАВА 8 215
цитоплазме. При этом общий уровень экспрес-
сии мРНК Tead4 в трофоэктодерме бластоцисты,
а также в трофобластных стволовых клетках
мыши выше, чем в ВКМ или ЭС-клетках мыши
[Ibid], Дифференциальная локализация TEAD4
наблюдается также в бластоцистах крысы, коро-
вы, макаки и человека [Ibid]. В ядрах клеток
трофоэктодермы TEAD4 связывается с регуля-
торными районами нескольких ключевых генов,
контролирующих развитие трофоэктодермы, та-
ких как Cclx2._ l.lf5. Eornes, Gala3. Tcfctp2c. а так-
же собственного гена Tead4 [Ibid]. Таким обра-
зом, повышенный уровень экспрессии Tead4 в
наружных бластомерах вызывает повышение со-
держания белка TEAD4 и его перемещение в яд-
ро, где TEAD4 усиливает экспрессию собствен-
ного гена и остальных генов транскрипционной
сети трофоэктодермы (см. рис. 8.4). Пока не вы-
ясненными остаются механизмы, вызывающие
повышенную экспрессию Tead4 в наружных
клетках, и механизмы, препятствующие ядерной
локализации TEAD4 во внутренних клетках мо-
рулы и бластоцисты.
Гены Cdx2 и Gata3 являются непосредствен-
ными мишенями TEAD4 в наружных клетках за-
родыша мыши [Nishioka et al., 2008; Ralston
etal., 2010]. Их экспрессия нарушается в заро-
дышах, мутантных по Те ad4 [Yagi et al., 2007;
Nishioka et al., 2008].
В норме экспрессия гена Cdx2 в зародыше
мыши начинается на стадии восьми клеток, при-
чем только в некоторых бластомерах, часто
только в двух из восьми [Dietrich, Hiiragi, 2007;
Yagi etal., 2007; Jedrusik etal., 2008; Ralston,
Rossant, 2008]. В процессе поляризации бласто-
меров восьмиклеточного зародыша мыши мРНК
Cdx2 скапливается в апикальной цитоплазме и
сохраняет апикальное расположение в наружных
клетках 16-клеточного зародыша [Jedrusik et al.,
2008], а при последующих асимметричных деле-
ниях наследуется преимущественно наружными
бластомерами. Показано, что CDX2 может вли-
ять на ориентацию плоскости деления. Инъекция
мРНК Cdx2 в один из бластомеров двуклеточ-
ного зародыша вызывает преимущественно сим-
метричное деление этого бластомера и его по-
томков, в результате чего они формируют на-
ружный слой клеток зародыша [Ibid]. Более того,
экспрессия CDX2 усиливает поляризацию клет-
ки, повышая количество апикально локализован-
ного аРКС [Ibid] (см. рис. 8.4). Снижение уровня
мРНК Cdx2 в части клеток зародыша при помо-
щи РНК-интерференции, наоборот, вызывает их
асимметричное деление и уход потомков в ВКМ
[Ibid]. Аналогичный эффект на ориентацию плос-
кости деления имеет подавление в наружных по-
лярных клетках экспрессии белков PAR3 и аРКС
[Plusa etal., 2005]. Таким образом, существует
петля положительной обратной связи между’ со-
стоянием поляризации клетки и экспрессией
CDX2 (см. рис. 8.4). Эта связь усиливает и за-
крепляет разделение двух первых популяций
клеток зародыша. Пока не решенным вопросом
остается механизм возникновения полярного
распределения мРНК Cdx2 в восьмиклеточном
зародыше.
Нокдаун Gata3 посредством РНК-интерфе-
ренции вызывает остановку развития при пере-
ходе от морулы к бластоцисте [Home et al., 2009].
Индуцированная экспрессия Gata3 в ЭС-клетках
мыши вызывает их трофобластную дифферен-
цировку’, но не образование стабильно пролифе-
рирующих ТС-подобных клеток, как это проис-
ходит при индуцированной экспрессии Cdx2
[Ralston et al., 2010]. Таким образом, Gata3 необ-
ходим для созревания трофобласта, но не доста-
точен для поддержания пролиферации его ство-
ловых клеток.
До имплантации зародыша Cdx2 и Gata3 со-
вместно экспрессируются в наружных клетках
зародыша, где они совместно регулируют экс-
прессию генов развития трофоэктодермы, таких
KaKFgfr2. Wnt7b и Втр4 [Orr-Urtreger et al., 1993;
Coucouvanis, Martin, 1999; Kemp etal., 2005].
Кроме того, Gata3 самостоятельно индуцирует
экспрессию генов Eomes и Ascl2 в трофоэкто-
дерме даже в отсутствие Cdx2 [Ciruna, Rossant,
1999; Russ et al., 2000], усиливая детерминацию
трофоэктодермы. Позднее, в момент начала гаст-
руляции, интенсивная экспрессия Gata3 при от-
сутствии Cdx2 наблюдается в эктоплаце нтарном
конусе, где GATA3 регулирует экспрессию ге-
нов Pparg и Dnmt31 [Barak et al., 1999; Bourc'his
etal., 2001], участвующих в дифференцировке
трофобласта. В сумме Gata3 играет двойную роль,
стимулируя сначала созревание клеток трофоэк-
тодермы, а затем дифференцировку клеток экто-
плацентарного конуса в гигантские клетки тро-
фобласта. Набор активируемых GATA3 мише-
ней, возможно, зависит от присутствия других
факторов, например CDX2, либо от количества
самого GATA3 в клетке.
До образования бластоцисты факторы плю-
рипотентности ОСТ4 и NANOG обнаруживают-
ся как во внутренних, так и в наружных клетках
зародыша мыши вне зависимости от наличия
факторов CDX2 и GATA3 [Dietrich, Hiiragi, 2007;
Ralston etal., 2010]. Однако после завершения
216 ЭПИГЕНЕТИКА
кавитации картина меняется. Экспрессия Cdx2
и совместно экспрессирующегося с ним Gata3
полностью прекращается во внутренних клетках
ранней бластоцисты и возрастает в наружных
[Dietrich. Hiiragi. 2007; Ralston. Rossant. 2008;
Ralston et al., 2010]. Экспрессия Oct4 в наружных
клетках зародыша прекращается, и к стадии позд-
ней бластоцисты ОСТ4 полностью исчезает из
трофоэктодермы [Palmieri etal., 1994; Dietrich,
Hiiragi, 2007]. В результате у мыши при разви-
тии морулы в бластоцисту’ экспрессия генов Oct4
и Cdx2 становится взаимоисключающей. Огра-
ничение экспрессии Cdx2 и Gata3 в наружных
клетках происходит даже в зародышах, мутант-
ных по Oct4 [Ralston etal., 2010], что указывает
на отсутствие прямого репрессирующего влия-
ния ОСТ4 на экспрессию генов Cdx2 и Gata3 на
этой стадии. Молекулярный механизм ограниче-
ния экспрессии Cdx2 и Gata3 наружными клет-
ками ранней бластоцисты пока не выяснен.
8.6. КОММИТИРОВАНИЕ ТРОФОЭКТОДЕРМЫ
Точное время необратимого коммитирования
клеток трофоэктодермы мыши установлено в
экспериментах по созданию химерных зароды-
шей. На стадии 16 клеток у мыши нормальные
бластоцисты можно сформировать in vitro как
исключительно из внутренних, так и исключи-
тельно из наружных клеток зародыша [Suwinska
et al., 2008]. В другом эксперименте изолирован-
ные агрегаты внутренних клеток морулы или
ранней бластоцисты мыши при культивировании
in vitro образуют слой наружных поляризован-
ных клеток, который в дальнейшем развивается
в трофобласт [Handyside, 1978; Spindle, 1978;
Rossant, Lis, 1979]. К стадии поздней бластоци-
сты (—64 клетки) способность клеток ВКМ фор-
мировать трофоэктодерму утрачивается [Handy-
side, 1978; Rossant, Vijh, 1980; Balakier, Pedersen,
1982]. Таким образом, у мыши наружные клетки
ранней (—32 клетки) бластоцисты уже детерми-
нированы к образованию трофобласта, а внут-
ренние — к образованию ВКМ [Dyce et al., 1987;
Fleming, 1987]. Эта детерминация у мыши имеет
функциональное значение, поскольку вскоре, на
стадии средней бластоцисты, обе линии необра-
тимо коммитируются. При этом у других млеко-
питающих время от детерминации до коммити-
рования трофоэктодермы и ВКМ может быть
весьма продолжительным. Коммитирование тро-
фоэктодермы у коровы происходит между’ 7-ми
14-м днем эмбрионального развития, ближе к га-
струляции [Berg et al., 2011].
Коммитирование достигается на завершаю-
щей стадии активации самоподдерживающейся
сети транскрипционных факторов Cdx2, Еотех,
Tcfap2c, Elf5, Est2, Sox2, Gata3, характеризую-
щих трофоэктодерму’ и трофобластные стволо-
вые клетки мыши и препятствующих диффе-
ренцировке в направлении ВКМ. Инактивация
в зародыше мыши любого из этих генов вызы-
вает прекращение пролиферации клеток тро-
фоэктодермы и невозможность получения тро-
фобластных стволовых клеток in vitro [Avi-
lion et al., 2003; Donnison et al., 2005; Strumpf
et al.. 2005; Georgiades, Rossant. 2006; Home
et al., 2009; Kuckenberg et al.. 2010; Ralston et al.,
2010].
На стадии коммитирования трофоэктодермы
транскрипционные сети факторов плюрипотент-
ности и факторов развития трофоэктодермы на-
чинают активно подавлять друг друга. ЭС-клет-
ки мыши, культивируемые in vitro, соответству-
ют продвинутой стадии развития зародыша, на
которой уже произошло коммитирование трофо-
эктодермы [Ralston etal., 2010]. В этих клетках
состояние совместной экспрессии Cdx2 и Oct4
неустойчиво. Индуцированная экспрессия Cdx2
подавляет транскрипцию Oct4 и вызывает диф-
ференцировку’ в клетки с фенотипом трофоэкто-
дермы [Niyva et al., 2005]. Однако CDX2 вызыва-
ет дифференцировку и в случав поддержания
экспрессии ОСТ4 на высоком уровне [Ibid]. При
этом белки ОСТ4 и CDX2 формируют комплекс,
подавляющий активность обоих этих факторов,
в частности, угнетается работа ОСТ4-зависи-
мых и CDX2-зависимых энхансеров [Ibid]. Такая
взаимная репрессия этих двух генов как на уров-
не мРНК, так и на уровне белков наблюдается
только в ЭС-клетках мыши и исчезает при их
дифференцировке. Возможно, для образования
репрессирующего комплекса необходимы какие-
то специфичные для ЭС-клеток факторы.
В норме ОСТ4 репрессирует в ЭС-клетках
мыши ряд генов развития трофоэктодермы [Ibid].
В частности, сайты связывания ОСТ4 обнару-
жены в промоторе и первом интроне Cdx2 мыши
[Loh et al., 2006]. Изредка бластоцисты, мутант-
ные по Oct4, имплантируются, после чего их раз-
витие все же останавливается. В таких зароды-
шах наблюдается экспрессия Cdx2 и Gata3 в
клетках эпибласта и внезародышевой энтодермы
[Ralston et al., 2010], что подтверждает роль Oct4
in vivo в репрессии трофобластной дифференци-
ровки внутренних клеток зародыша после имп-
лантации.
ГЛАВА 8 217
Подобные взаимные превращения между дан-
ными линиями не следует считать неожидан-
ными, учитывая онтогенетическое родство ВКМ
и трофоэктодермы, происходящих от ОСТ4-по-
ложительных бластомеров морулы. Подавление
Oct4 и всей транскрипционной сети плюрипо-
тентности, возможно, является первым необхо-
димым шагом для достижения автономности са-
моподдерживающейся транскрипционной сети
трофоэктодермы. При этом время и механизм
репрессии гена Oct4 в наружных клетках заро-
дыша варьируют между’ млекопитающими.
Простая модель разделения линий трофоэк-
тодермы и ВКМ на основе взаимной репрессии
генов Oct4 и Cdx2 (см. рис. 8.4) не может полно-
стью объяснить динамику’ экспрессии этих генов
в раннем развитии млекопитающих. В бластоци-
стах коровы экспрессия Oct4 не ограничена
только клетками ВКМ и наблюдается устойчи-
вая совместная экспрессия Oct4 и Cdx2 в трофо-
эктодерме бластоцист [Berg et al., 2011]. Сходная
совместная экспрессия этих факторов обнаружи-
вается также у свиньи и человека [Rossant, 2007;
Blomberg et al., 2008]. Даже у мыши экспрессия
Oct4 в течение некоторого времени перекрыва-
ется с экспрессией Cdx2 в наружных клетках и в
ранней бластоцисте и их разграничение проис-
ходит только в полностью сформированной бла-
стоцисте [Strumpf et al., 2005].
Вероятно, на начальном этапе детерминации
трофоэктодермы какие-то другие факторы по-
давляют Oct4. У мыши вероятными репрессора-
ми Oct4 являются белки АР2 (гены Tcfap2ci, 2b и
2с) [Berg et al., 2011]. Позднее, когда количество
Oct4 существенно снижается, а количество Cdx2,
соответственно, повышается, функция дальней-
шего ингибирования системы генов плюрипо-
тентности переходит к Cdx2 и начинает работать
триггер Oct4—Cdx2. В результате происходит
как подавление транскрипции гена Oct4, так и
инактивация сравнительно долгоживущего белка
ОСТ4 в цитоплазме [Niyva etal., 2005]. Таким
образом, у мыши Cdx2 участвует в коммитиро-
вании трофоэктодермы, но не в начальной детер-
минации этой линии. Продолжительность на-
чального Сб7х2-независимого этапа детермина-
ции трофоэктодермы тем больше, чем позднее
происходит имплантация у данного вида. У мы-
ши раннее 0Ух2-зависимое коммитирование тро-
фоэктодермы, по-видимому, объясняется необ-
ходимостью раннего образования зрелой трофо-
эктодермы, необходимой для свойственной это-
му’ виду ранней имплантации (уже через день
после образования бластоцисты).
8.7. Детерминация внезародышевой
ЭНТОДЕРМЫ И ЗАРОДЫШЕВОЙ ЭКТОДЕРМЫ
На 4,5-й день после копуляции бластоцисты
мыши освобождаются от блестящей оболочки,
и начинается их имплантация в стенку’ матки.
В это время в ВКМ обособляются две популяции
клеток — эпибласт (зародышевая эктодерма) и
гипобласт (внезародышевая энтодерма). Как и
при формировании трофобласта, второе событие
дифференцировки в эмбриогенезе мыши харак-
теризуется появлением эпителиальных клеток —
гипобласта (синоним — внезародышевая энто-
дерма). Эти клетки выделяются в виде слоя на
поверхности неполяризованных клеток внутрен-
ней клеточной массы (рис. 8.5). Клетки эпибла-
ста плюрипотентны и впоследствии дают начало
всем типам клеток зародыша и, кроме того, вне-
зародышевой мезодерме. Гипобласт участвует в
Позиционная детерминация
Е4.5
информация
Fgf/MAPK-зависимая детерминация
сигнал клеток и апоптоз
t j СаГаб-позитивная клетка \ ) Wanog-позитивная клетка
у j Сс/х2-позитивная клетка
Рис. 8.5. Модели разделения гипобласта и эпибласта
мыши (по [Cockburn, Rossant, 2010]).
В позиционной модели ВКМ мыши на стадии Е3.5 представ-
ляет собой однородную популяцию бипотентных клеток
Клетки, расположенные на наружной поверхности ВКМ, вос-
принимают некую позиционную информацию и становятся
гипобластом. В модели FGF/MAPK-зависимой детерминации
клетки ВКМ также считаются однородной бипотентной попу-
ляцией. Затем различия в активности сигнального пути
FGF/MAPK определяют развитие этих клеток в Nanog- или
СаГаб-позитивные клетки на стадии Е3.5. Изначально клетки
двух типов распределены в ВКМ случайным образом, а за-
тем, в результате сортировки и апоптоза, формируются слои
гипобласта и эпибласта на стадии Е4.5.
218 ЭПИГЕНЕТИКА
формировании желточного мешка (см. обзор в
[Lu et al., 2001]). Потенциал развития клеток 4,5-
дневной бластоцисты уже ограничен. Если на
этой стадии отдельные клетки эпибласта и ги-
побласта перенести в другую бластоцисту, кото-
рую пересадить в матку суррогатной матери, эта
бластоциста имплантируется и развивается в хи-
мерный организм. При этом перенесенные клет-
ки эпибласта и гипобласта дают вклад в развитие
тканей только своей собственной линии [Gard-
ner, Rossant, 1979]. В экспериментах по получе-
нию инъекционных химер мыши было доказано,
что гипобласт является in vivo предшественни-
ком только внезародышевой париетальной и
висцеральной энтодермы, входящей в состав
желточного мешка [Gardner, 1982, 1983]. Эпи-
бласт дает начало эктодерме, мезодерме и энто-
дерме плода, клеткам полового пути, а также ме-
зодермальным компонентам внезародышевых
мембран и плаценты [Gardner, Rossant, 1979].
Изучение развития мутантных мышей пока-
зало, что для разделения эпибласта и гипобласта
необходима активность транскрипционных фак-
торов NANOG и GATA6. В ходе раннего разви-
тия ген Nanog экспрессируется во всех клетках
морулы, а на стадии ранней бластоцисты —
только в клетках ВКМ [Strumpf et al., 2005]. Од-
нако затем в некоторых клетках ВКМ начинает-
ся экспрессия GATA6, и в этих клетках прекра-
щается экспрессия NANOG [Chazaud et al., 2006]
(см. рис. 8.5). Причины изначально гетерогенной
экспрессии GATA6 в ВКМ неизвестны. Таким
образом, в ВКМ 3,5-дневных зародышей мыши
экспрессия GATA6 и NANOG носит взаимоис-
ключающий характер и, по-видимому, не зави-
сит от пространственной локализации клеток
[Chazaud et al., 2006]. На 4,5 д.п.о. ВКМ разделя-
ется на две популяции клеток: ОАТАб-позитив-
ные клетки формируют слой гипобласта, и в них
прекращается экспрессия ОСТ4, а эпибласт вы-
деляется как популяция клеток, сохраняющих
экспрессию ОСТ4 и NANOG [Chazaud etal.,
2006] (см. рис. 8.5).
Зародыши, мутантные по гену’ Nanog, на ста-
дии бластоцисты морфологически не отличают-
ся от нормальных, содержат ВКМ и трофоэкто-
дерму и способны имплантироваться. Однако у
них не формируется эпибласт, все клетки ВКМ
морфологически и по экспрессии генов сходны с
клетками париетальной энтодермы, вскоре после
имплантации зародыши гибнут [Mitsui, 2003]. У
зародышей, мутантных по Gata6, нарушается раз-
витие гипобласта, однако это происходит позд-
нее, чем можно ожидать, исходя из паттерна
экспрессии Gata6 в периимплантационном заро-
дыше. Возможно, первые этапы развития гипо-
бласта не зависят от GATA6 либо его функция
перекрывается с GATA4. Зародыши, мутантные
по Gata6 погибают на 5,5 д.п.о., у них не фор-
мируется внезародышевая эндотерма и в резуль-
тате нарушается развитие эпибласта [Koutsoura-
kisetal., 1999].
Известно, что ЭС-клетки мыши наиболее
близки по своим свойствам к клеткам ВКМ и
эпибласта [Hayashi etal., 2008]. Изучение транс-
крипционной регуляции ЭС-клеток мыши вы-
явило роль фактора ОСТ4 в разделении линий
эпибласта и гипобласта. Для нормального само-
обновления ЭС-клеток необходимо поддержание
среднего уровня экспрессии ОСТ4. Увеличение
экспрессии ОСТ4 более чем на 50 % вызывает
дифференцировку’ ЭС-клеток во внезародыше-
вую энтодерму’ и мезодерму’, в то время как умень-
шение экспрессии ниже 50 % вызывает диф-
ференцировку в трофоэктодерму [Niyva etal.,
2000]. Действительно, in vivo белок ОСТ4 имеет-
ся в ВКМ ранней бластоцисты и отсутствует в
трофоэктодерме, а первичная внезародышевая
энтодерма поздней бластоцисты экспрессирует
ОСТ4 на повышенном уровне [Palmieri et al.,
1994]. Известно, что ОСТ4 активирует транс-
крипцию многих генов, действуя в паре с транс-
крипционными факторами SOX2 [Корр et al.,
2008] и REXI [Ben-Shushan et al., 1998], а также
EIA-подобным белком [Scholer et al., 1991].
Для самообновления ЭС-клеток необходимо
поддержание уровня экспрессии SOX2 в узких
границах. Снижение экспрессии SOX2 приводит
к дифференцировке ЭС-клеток мыши в клетки,
сходные с трофоэктодермой [Cheyv etal., 2005].
Умеренное, не более чем в 2 раза, повышение
экспрессии SOX2 в ЭС-клетках приводит к их
дифференцировке в клетки, экспрессирующие
маркерные гены нейроэктодермы, мезодермы и
трофоэктодермы, но не энтодермы [Корр etal.,
2008]. По-видимому, высокий уровень SOX2 на-
рушает систему’ поддержания плюрипотентности
ЭС-клеток и одновременно блокирует экспрес-
сию генов, необходимых для формирования эн-
тодермы. Это согласуется с паттерном экспрес-
сии гена Sox2 в предымплантационных зароды-
шах. РНК Sox2 впервые обнаруживается в от-
дельных клетках на стадии морулы, затем в
ВКМ бластоцисты и затем в эпибласте. На 7,0—
7,5-й день после копуляции экспрессия Sox2 во
внезародышевых тканях ограничивается перед-
ней частью будущей нейроэктодермы [Avilion
et al., 2003]. Независимо от внезародышевой ли-
ГЛАВА 8 219
нии экспрессия Sox2 возникает в ЭкЭ (6,5-й день
развития) [Wood, Episkopou, 1999; Avilion et al.,
2003].
Вероятно, строго контролируемый уровень
белков ОСТ4 и SOX2 способствует также под-
держанию популяции плюрипотентных клеток в
зародыше. Считается, что снижение экспрессии
ОСТ4 и SOX2 в эпибласте в ходе раннего разви-
тия является одним из ключевых событий, ини-
циирующих его дальнейшее развитие. Однако,
возможно, что повышение экспрессии ОСТ4 и
SOX2 также является независимым механизмом,
определяющим направление дифференцировки
той или иной клеточной популяции (ОСТ4 — ги-
побласт, SOX2 — нейроэктодерма) [Корр et al.,
2008].
Если стехиометрическое соотношение ОСТ4
с его партнерами действительно контроли-
рует разделение трех основных популяций (см.
рис. 8.5) клеток бластоцисты — трофобласта, ги-
побласта и эпибласта, очевидно, что уровень
ОСТ4 должен быть строго регулируемым. Од-
ним из ключевых регуляторов Oct4 является бе-
лок SALL4. Экспрессия SALL4 начинается в от-
дельных бластомерах 8—16-клеточного заро-
дыша, а в поздней бластоцисте транскрипты и
белок SALL4 наблюдаются только в ВКМ [Eiling
et al., 2006]. Вероятно, на предымплантационных
стадиях SALL4 работает только как активатор
транскрипции гена Oct4 [Zhang et al., 2006] и со-
вместно с ним участвует в разделении линий
трофоэктодермы и ВКМ. Однако затем экспрес-
сия SALL4 продолжается как в эпибласте, так и
в производных гипобласта, причем он необхо-
дим для сохранения и дальнейшего развития
обеих этих линий [Eiling et al., 2006]. Также экс-
прессия SALL4 необходима для поддержания
клеток ЭС- и XEN-линий, наиболее близких по
свойствам к эпибласту и гипобласту зародыша.
В этих клетках SALL4 действует как один из
центральных транскрипционных факторов, регу-
лирует работу- многих генов [Lim etal., 2008].
Возможно, SALL4 направляет первые этапы
дифференцировки гипобласта, активируя экс-
прессию Gata6, Gata4 и других генов, опреде-
ляющих впоследствии свойства данной клеточ-
ной популяции. Подтверждение такой функ-
ции SALL4 объяснило бы, почему мутации
Gata6 или Gata4 не приводят к полной утрате
внезародышевой энтодермы, а нарушают только
формирование висцеральной энтодермы на бо-
лее поздних стадиях развития [Soudais et al.,
1995; Morrisev etal., 1998; Koutsourakis etal.,
1999].
8.8. Хроматин плюрипотентных клеток
Хроматин ЭС-клеток мыши и человека харак-
теризуется сравнительно широким распростра-
нением метилированного НЗК27, ассоциирован-
ного с репрессией генов. В то же время на гло-
бальном уровне хроматин ЭС-клеток находится
в «открытом» состоянии, он содержит меньше ге-
терохроматиновых участков, чем в дифференци-
рованных клетках, и ассоциация белков с ДНК
менее прочная [Meshorer et al., 2006; Bhattacha-
rya etal., 2009]. Распределение модификации
H3K9me2 почти идентично в хроматине ЭС-кле-
ток мыши и в нейронах, полученных дифферен-
цировкой этих ЭС-клеток [Lienert et al., 2011]. В
то же время модификация НЗК9шеЗ и ассоции-
рованный с ней гетерохроматиновый белок НР1
в ЭС-клетках распределены диффузно, а при
нейральной дифференцировке образуют неболь-
шие области обогащения [Meshorer et al., 2006].
Трофобластные стволовые клетки, а также
стволовые клетки внезародышевой энтодермы
почти полностью лишены НЗК27шеЗ-модифика-
ции в сравнении с эмбриональными стволовыми
клетками [Rugg-Gunn et al., 2010]. При этом дан-
ные три линии стволовых клеток имеют одина-
ковое распределение модификации НЗК4шеЗ.
В зародышах наблюдается сходное асиммет-
ричное распределение НЗК27шеЗ между трофо-
эктодермой и ВКМ [Dahl et al., 2010|.
После фракционирования популяции ЭС-кле-
ток человека по экспрессии нейральных или ме-
зодермальных генов часть «бивалентных доме-
нов» переходит в моновалентное состояние в со-
ответствующих субпопуляциях, отражая специ-
фичность потенциала развития этой части клеток
[Hong et al., 2011]. Таким образом, «бивалентные
домены» могут представлять собой эксперимен-
тальный артефакт, вызванный гетерогенностью
популяции плюрипотентных клеток. Разделе-
ние «бивалентных доменов» на моновалентные
НЗК4шеЗ и НЗК27шеЗ домены должно проис-
ходить в клетках на основе известных антаго-
нистических взаимодействий ферментных комп-
лексов. Связывание комплекса PRC2, ответст-
венного за модификацию НЗК27шеЗ, стимули-
руется в присутствии H3K27me3 [Hansen et al.,
2008: Margueron et al.. 2009] и подавляется в при-
сутствии меток активного хроматина, таких как
НЗК4шеЗ и H3K36me2/3 [Schmitges etal., 2011].
Это облегчает поддержание и распространение
репрессивной метки НЗК27шеЗ и в то же время
ограничивает ее распространение в область ак-
тивного хроматина. Кроме того, с комплексом
220 ЭПИГЕНЕТИКА
PRC2 взаимодействует НЗК4-деметилаза Kdm5a
(синонимы — Rbp2, Jaridla), а с MLL НЗК4 ме-
тилтрансферазным комплексом взаимодействует
НЗК27-деметилаза Kdm6a (синоним — Utx) [Lee
et al., 2007; Pasini et al., 2008]. Такое антагони-
стичное взаимодействие двух противоположных
модификаций делает их сосуществование в од-
ном районе хроматина неустойчивым и ускоряет
вытеснение одной из модификаций, что, воз-
можно, имеет место при переключении активно-
сти генов в развитии.
Polycomb-опоередованная репрессия генов
способствует сохранению специфичности кле-
точных линий. Например, делеция Rnf2, гена
субъединицы Ring 1В PRC1-комплекса, дестаби-
лизирует ЭС-клетки млекопитающих, вызывая в
них аберрантную экспрессию маркерных генов
трофобласта, внезародышевой энтодермы и ней-
ральных маркеров [Leeb, Wutz, 2007]. Сходный
эффект вызывает отсутствие EED и SUZ12 —
компонентов PRC'2-комплскса [Montgomery et al.,
2005; Pasini et al., 2007; Chamberlain et al.. 2008].
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Adenot P. G., Mercier 1., Renard J. P., Thompson E. M. Differ-
ential H4 acetylation of paternal and maternal chromatin
precedes DNA replication and differential transcriptional
activity in pronuclei of 1—cell mouse embryos // De-
velopment. 1997. Vol. 124. P. 4615- 4625.
AlizadehZ, Kageyama S., Aoki F. Degradation of maternal
triRNA in mouse embryos: Selective degradation of spe-
cific mRNAs after fertilization // Mol. Reprod. Dev. 2005.
Vol. 72. P. 281—290.
AokiF., WorradD. AL, Schultz R. Al. Regulation of transcrip-
tional activity during the first and second cell cycles in the
preimplantation mouse embryo // Dev. Biol. 1997.
Vol. 181. P. 296—307.
AvilionA.A., Nicolis S. K., PevnyL.H., PerezL., FivianN.,
Lovell-Badge R. Multipotent cell lineages in early mouse
development depend on Sox2 function // Genes Dev.
2003. Vol. 17. P. 126—140.
Bachvarova R, De Leon V., Johnson A., Kaplan G., Payn-
ton В . F. Changes in total RNA, polyadenylated RNA, and
actin mRNA during meiotic maturation of mouse oocy-
tes // Dev. Biol. 1985. Vol. 108. P. 325—331.
Balakier H., Pedersen R. .1. Allocation of cells to inner cell
mass and trophectoderm lineages in preimplantation mou-
se embryos // Ibid. 1982. Vol. 90. P. 352—362.
Barak Y., Nelson AL. C, OngE. S., Jones Y. Z., Ruiz-Lozano P.,
Chien K. R., KoderA., Evans R. Al. PPAR gamma is re-
quired for placental, cardiac, and adipose tissue develop-
ment "Mol. Cell. 1999. Vol. 4. P. 585—595.
Ben-Shushan E., Thompson J. R, GudasL. J., Bergman 1. Rex-1,
a gene encoding a transcription factor expressed in the
early embryo, is regulated via Oct-3/4 and Oct-6 binding
to an octamer site and a novel protein, Rox-1, binding to
an adjacent site// Mol. Cell. Biol. 1998. Vol. 18.
P. 1866—1878.
BergD. K., Smith C. S., PeartonD.J., HellsD. N., Broad-
hurstR, DonnisonAL, Pfeffer P. L. Trophectoderm line-
age determination in cattle// Dev. Cell. 2011. Vol. 20.
P. 244—255.
Bhattacharya D.. TalwarS., Alazumder A.. Shivashankar G. I/
Spatio-temporal plasticity in chromatin organization in
mouse cell differentiation and during drosophila embryo-
genesis // Biophys. J. 2009. Vol. 96. P. 3832—3839.
Bischoff Al., Parfitt D. E., Zernicka-Goetz AL Formation of the
embryonic-abembryonic axis of the mouse blastocyst: re-
lationships between orientation of early cleavage divisions
and pattern of symmetric/asymmetric divisions // Develop-
ment. 2008. Vol. 135. P. 953—962.
BlombergL., Hashizume K, Viebahn C. Blastocyst elongation,
trophoblastic differentiation, and embryonic pattern for-
mation // Reproduction. 2008. Vol. 135. P. 181—195.
Bourc'hisD., XuG.L., LinC.S., Bollman B., BestorT.H.
Dnmt31 and the establishment of maternal genomic im-
prints /" Science. 2001. Vol. 294. P. 2536—2539.
Bultman S. J., Gebuhr T. C, Pan H, Svoboda P., Schultz R. AL,
Alagnuson T. Maternal BRG1 regulates zygotic genome
activation in the mouse // Genes Dev. 2006. Vol. 20.
p. 1744—1754.
Carter AL G., HamataniT., Sharov A. A., CarmackC.E.,
Qian Y., Aiba K, KoN. T, Dudekula D. B., Brzoska P. AL,
HwangS. S, Ko AL S. In situ-synthesized novel microarray
optimized for mouse stem cell and early developmental ex-
pression profiling // Genome Res. 2003. Vol. 13. P. 1011 —
1021.
Chamberlain S. J., YeeD.. Alagnuson T. Polycomb repressive
complex 2 is dispensable for maintenance of embryonic
stem cell pluripotency // Stem Cells. 2008. Vol. 26.
P. 1496—1505.
Chazaud C, Yamanaka 1., Pawson T, Rossant J. Early lineage
segregation between epiblast and primitive endoderm in
mouse blastocysts through the Grb2—mapk pathway //
Dev. Cell. 2006. Vol. 10. P. 615—624.
Chen D. Regulation of transcription by a protein methyltrans-
ferase // Science. 1999. Vol. 284. P. 2174—2177.
Chew J. L., Loh Y. H, Zhang IF, ChenX., Tam IF. L., YeapL. S.,
LiP., AngY.S., LimB., RobsonP., NgH.H. Reciprocal
transcriptional regulation of Pou5fl and Sox2 via the
Oct4/Sox2 complex in embryonic stem cells // Mol. Cell
Biol. 2005. Vol. 25. P. 6031—6046.
Ciccone D. N., Su H., HeviS., GayF, Lei H., BajkoJ., XuG.,
Li E., Chen T. KDM1B is a histone H3K4 demethylase re-
quired to establish maternal genomic imprints // Nature.
2009. Vol. 461. P. 415^118.
Ciruna B. G., Rossant J. Expression of the T-box gene Eomeso-
dermin during early mouse development // Meeh. Dev.
1999. Vol. 81. P. 199—203.
Clapier C. R., Cairns B. R. The biology of chromatin remodel-
ing complexes // Annu. Rev. Biochem. 2009. Vol. 78.
P. 273- 304.
Coucouvanis E.. AlartinG.R. BMP signaling plays a role in
visceral endoderm differentiation and cavitation in the
early mouse embryo // Development. 1999. Vol. 126.
P. 535—546.
Dahl J. A., Reiner A. H., KlunglandA., Wakayama T, Col-
las P. Histone H3 lysine 27 methylation asymmetry on
developmentally-regulated promoters distinguish the first
two lineages in mouse preimplantation embryos // PLoS
One. 2010. Vol. 5. P. e9150.
DardikA.. Smith R. Al., Schultz R. Al. Colocalization of trans-
forming growth factor-alpha and a functional epidermal
growth factor receptor (EGER) to the inner cell mass and
preferential localization of the EGFR on the basolateral
surface of the trophectoderm in the mouse blastocyst //
Dev. Biol. 1992. Vol. 154. P. 396 409.
De Fries IF N, Evsikov A. F, Haac В. E., Fancher K. S., Hol-
brook A. E., KemlerR., SolterD., Knowles В. B. Maternal
beta-catenin and E-cadherin in mouse development // De-
velopment. 2004. Vol. 131. P. 4435 4445.
ГЛАВА 8 221
Dietrich J. E.. Hiiragi T. Stochastic patterning in the mouse pre-
implantation embryo // Ibid. 2007. Vol. 134. P. 4219—4231.
Dormison AL, Beaton A., Davey H. W, Broadhurst R, L'Huil-
UerP., Pfeffer B.L. Loss of the extraembryonic ectoderm
in Elf5 mutants leads to defects in embryonic patterning //
Ibid. 2005. Vol. 132. P. 2299—2308.
DyceJ, George AL, Goodall H, Fleming T. P. Do trophectoderm
and inner cell mass cells in the mouse blastocyst maintain
discrete lineages? 11 Ibid. 1987. Vol. 100. P. 685—698.
EllingU., KlasenC., Eisenberger T, AnlagK, Treier AL. Mur-
ine inner cell mass-derived lineages depend on Sall4 func-
tion " Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. Vol. 103.
P. 16319—16324.
Esposito G., Vitale A. AL, Leijten F. P., StrikA. AL, Koonen-Re-
emstA.AL, YurttasP., Robben T. J., CoonrodS., Gos-
sen J. A. Peptidylarginine deiminase (PAD) 6 is essential
for oocyte cytoskeletal sheet formation and female fer-
tility' 7 Mol. Cell. Endocrinol. 2007. Vol. 273. P. 25—31.
Fleming T. P. A quantitative analysis of cell allocation to tro-
phectoderm and inner cell mass in the mouse blastocyst.'/
Dev. Biol. 1987. Vol. 119. P. 520—531.
Fleming T. P., Sheth B., Fesenko L. Cell adhesion in the preim-
plantation mammalian embryo and its role in trophecto-
derm differentiation and blastocyst morphogenesis //
Front. Biosci. 2001. Vol. 6. P. D1000—1007.
Foygel K.. Choi B.. JimS., Leong D.E., Lee A., WongCC,
ZuoE., EckartAL., ReijoPeraR. A., WbngW.H., YaoAL IE
A novel and critical role for Oct4 as a regulator of the ma-
ternal-embryonic transition // PLoS One. 2008. Vol. 3.
P. e4109.
Fujimori T, Kurotaki 1., ALiyazaki J., Nabeshima 1. Analysis of
cell lineage in two- and four-cell mouse embryos // Develop-
ment. 2003. Vol. 130. P. 5113—5122.
Gardner R. L. Investigation of cell lineage and differentiation in
the extraembryonic endoderm of the mouse embryo // J.
EmbryoL ExP; Morphol. 1982. Vol. 68. P. 175—198.
Gardner R. L. Origin and differentiation of extraembryonic tis-
sues in the mouse// Int. Rev. Exp. Pathol. 1983. Vol. 24.
P. 63—133.
Gardner R. L. Specification of embryonic axes begins before
cleavage in normal mouse development // Development.
2001. Vol. 128. P. 839—847.
Gardner R. L. Experimental analysis of second cleavage in the
mouse // Hum. Reprod. 2002. Vol. 17. P. 3178—3189.
Gardner R. L., Rossant J. Investigation of the fate of 4—5 day
post-coitum mouse inner cell mass cells by blastocyst in-
jection // J. EmbryoL Exp. Morphol. 1979. Vol. 52.
P. 141—152.
Georgiades P., Rossant J. Ets2 is necessary' in trophoblast for
normal embryonic anteroposterior axis development //
Development.’2006. Vol. 133. P. 1059—1068.
GiraldezA. J., ALishima Y., RihelJ., GrocockRJ., Van Don-
gen S, Inoue K, Enright A. J., Seiner A. F. Zebrafish mir-
430 promotes deadenylation and clearance of maternal
mRNAs // Science. 2006. Vol. 312. P. 75—79.
Gray D., Plusa B., Piotrowska K, Na J., Tom B., Glover D. AL,
Zernicka-Goetz AL. First cleavage of the mouse embryo re-
sponds to change in egg shape at fertilization // Curr. Biol.
2004. Vol. 14. P. 397 405.
Hamatani T. Carter AL. G, Sharoy’A. A.. Ko AL. S. Dynamics of
global gene expression changes during mouse preimplan-
tation development n Dev. Cell. 2004. Vol. 6. P. 117—131.
Handyside A. H. Time of commitment of inside cells isolated
from preimplantation mouse embryos // J. EmbryoL Exp.
Morphol. 1978. Vol. 45. P. 37—53.
Hansen К. H, Bracken A. P., Pasini D., Dietrich N., Geha-
ni S. S., ALonrad A., Rappsilber J., Lerdrup AL, Helin K. A
model for transmission of the H3K27me3 epigenetic
mark // Nat. Cell Biol. 2008. Vol. 10. P. 1291—1300.
HayashiK.. LopesS. AL.. TangF, SuraniAL. A. Dynamic equi-
librium and heterogeneity' of mouse pluripotent stem cells
with distinct functional and epigenetic states // Cell Stem
Cell. 2008. Vol. 3. P. 391^101.
Herr J. C, Chertihin O., DigilioL., Jha K. N., Vemuganti S., Flick-
inger C. J. Distribution of RNA binding protein MOEP19 in
the oocyte cortex and early embryo indicates pre-patteming
related to blastomere polarity' and trophectoderm specifica-
tion 11 Dev. Biol. 2008. Vol. 314. P. 300—316.
Hirasawa R, Chiba H, Kaneda AL, TajimaS., Li E., Jae-
nisch R., Sasaki H. Maternal and zygotic Dnmtl are nec-
essary and sufficient for the maintenance of DNA methy-
lation imprints during preimplantation development //
Genes Dev. 2008. Vol. 22. P. 1607—1616.
Home P., RayS., Dutta D., Bronshteyn L., Larson AL, Paul S.
GATA3 is selectively expressed in the trophectoderm of
peri-implantation embryo and directly regulates Cdx2
gene expression // J. Biol. Chem. 2009. Vol. 284.
P. 28729—28737.
HomeP., SahaB., RayS., DuttaD., Gunewardena S., YooB.,
Pal A., Vivian J. L., Larson AL, PetroffAL, Gallagher P. G.,
Schulz V. P., White K. L., Golos T. G., BehrB., Paul S. Al-
tered subcellular localization of transcription factor
TEAD4 regulates first mammalian cell lineage commit-
ment// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2012. Vol. 109.
P. 7362—7367.
HongS. H, Rampalli S., LeeJ.B., ALcNicol J., Collins T,
Draper J. S., Bhatia AL. Cell fate potential of human pluri-
potent stem cells is encoded by' histone modifications /7
Cell Stem Cell. 2011. Vol. 9. P. 24—36.
HowlettS. K, Bolton V. N. Sequence and regulation of morpho-
logical and molecular events during the first cell cycle of
mouse embryogenesis // J. Embrvol. Exp. Morphol. 1985.
Vol. 87. P. 1’75—206.
Lqbal K. Jin S. G.. Pfeifer G. P.. Szabo P. E. Reprogramming of
the paternal genome upon fertilization involves genome-
wide oxidation of 5-methylcytosine // Proc. Natl. Acad.
Sci. USA. 2011. Vol. 108. P. 3642—3647.
JedrusikA., ParfittD. E., Guo G., Skamagki AL, Grabarek J. B.,
Johnson AL. H, Robson P., Zernicka-Goetz A L Role of
Cdx2 and cell polarity' in cell allocation and specification
of trophectoderm and inner cell mass in the mouse em-
bryo // Genes Dev. 2008. Vol. 22. P. 2692—2706.
Johnson AL. H. ZiomekC. A. Cell interactions influence the fate
of mouse blastomeres undergoing the transition from the
16- to the 32-cell stage // Dev. Biol. 1983. Vol. 95.
P. 211—218.
Kaneda AL, OkanoAL, Hata K, SadoT., TsujimotoN, Li E.,
Sasaki H. Essential role for de novo DNA methyltrans-
ferase Dnmt3a in paternal and maternal imprinting // Na-
ture. 2004. Vol. 429. P. 900—903.
Kaneda AL, TangF., O'CarrollD., Lao K, SuraniAL. A. Essen-
tial role for Argonaute2 protein in mouse oogenesis // Epi-
genetics Chromatin. 2009. Vol. 2. P. 9.
KempC, Willems E., AbdoS., LambivL., LeynsL. Expression
of all Wnt genes and their secreted antagonists during
mouse blastocyst and postimplantation development //
Dev. Dyn. 2005. Vol. 233. P. 1064—1075.
Kim B., KanR, Anguish L., Nelson L. AL, CoonrodS. A. Poten-
tial role for mater in cytoplasmic lattice formation in mur-
ine oocytes // PLoS One. 2010. Vol. 5. P. el2587.
Kopp J. L., Ormsbee B. D., DeslerAL., RizzinoA. Small in-
creases in the level of Sox2 trigger the differentiation of
mouse embryonic stem cells // Stem Cells. 2008. Vol. 26.
P. 903—911.
KoutsourakisAL., LangeveldA., Patient R, Beddington R,
GrosveldF. The transcription factor GATA6 is essential
for early' extraembryonic development // Development.
1999. Vol. 126. P. 723—732.
222 ЭПИГЕНЕТИКА
KuckenbergР., Buhl S.. IVoyneckiT., van Burden В., Tolku-
novaE., SeiffeF., Moser M., Tomilin A., Winterhager E.,
Schorle H. The transcription factor TCFAP2C/AP-2gam-
ma cooperates with CDX2 to maintain trophectoderm for-
mation Mol. Cell. Biol. 2010. Vol. 30. P. 3310—3320.
Lai 1Г. S., Carballo E., Thorn J. AL, Kennington E. A., Black-
shear P. J. Interactions of CCCH zinc finger proteins with
triRNA. Binding of tristetraprolin-related zinc finger pro-
teins to Au-rich elements and destabilization of mRNA //
J. Biol. Chem. 2000. Vol. 275. P. 17827—17837.
Larue L., OhsugiAL., Hirchenhain J., KemlerR. E-cadherin null
mutant embryos fail to form a trophectoderm epithelium //
Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1994. Vol. 91. P. 8263—8267.
Lee AL G., Villa R., Trojer P., Norman J., Yan К. P., Rein-
bergD., Di Croce L., Shiekhattar R. Demethylation of
H3K27 regulates polycomb recruitment and H2a ubiq-
uitination // Science. 2007. Vol. 318. P. 447—450.
Leeb Al., IVutzA. RinglB is crucial for the regulation of devel-
opmental control genes and PRC 1 proteins but not X inac-
tivation in embryonic cells // J. Cell Biol. 2007. Vol. 178.
P. 219—229.
LienertE, ALohnF, Tiwari Г’ K, Baubec T, RoloffT. C, Gai-
datzisD., Stadler Al. B., Schubeler D. Genomic prevalence
of heterochromatic H3K9me2 and transcription do not
discriminate pluripotent from terminally differentiated
cells/ PLoS Genet. 2011. Vol. 7. P. e!002090.
LimC. E, TamW.L, Zhang J., AngH.S., Jia H., Lipovich L,
NgH. H, IVei ( . 1... Sung IT K, Robson P., YangH.,
LimB. Sall4 regulates distinct transcription circuitries in
different blastocyst-derived stem cell lineages // Cell Stem
Cell. 2008. Vol. 3. P. 543—554.
Littwin T, Denker H. ГГ. Segregation during cleavage in the
mammalian embryo? A critical comparison of whole-
mount/CLSM and section immunohistochemistry casts
doubts on segregation of axis-relevant leptin domains in
the rabbit 7 Histochem. Cell Biol. 2011. Vol. 135.
P. 553—570.
LohY.H., П’и Q., Chew J. L, FegaV.B., ZhanglV, ChenX,
Bourque G., George J., LeongB., Liu J., IVongK. E,
Sung К ГГ., Lee С. ГГ., ZhaoX.D., Chiu К. P., Lipovich L.,
Kuznetsov V. A., Robson P., Stanton LIT, JTei C. L,
RuanY., LimB.. NgH. FI. The Oct4 and Nanog transc-
ription network regulates pluripotency in mouse embry-
onic stem cells // Nat. Genet. 2006. Vol. 38. P. 431—440.
LouvetS., AghionJ., Santa-ALaria A., Alangeat P., ALaroB. Ez-
rin becomes restricted to outer cells following asym-
metrical division in the preimplantation mouse embryo,"
Dev. Biol. 1996. Vol. 177. P. 568—579.
Lu С. C., Brennan J., Robertson E. J. From fertilization to gas-
trulation: axis formation in the mouse embryo // Curr.
Opin. Genet. Dev. 200E Vol. IE P. 384—392. ’
Lykke-Andersen K, Gilchrist AL J., Grabarek J. B., Das P., ALi-
skaE., Zemicka-Goetz AL. Maternal Argonaute 2 is es-
sential for early mouse development at the maternal-zygo-
tic transition /7 Mol. Biol. Cell. 2008. Vol. 19. P. 4383—
4392.
ALargueron R, Justin N, Ohno K, Sharpe AL. L., Son J.,
Drury IV. J. 3rd, I’oigtP., ALartin S. R, Taylor IV R,
DeAlarco V., Pirrotta V., ReinbergD., Gambint S. J. Role
of the poly comb protein EED in the propagation of repres-
sive histone marks 11 Nature. 2009. Vol. 46E P. 762—767.
ALelendezA., Neufeld T. P. The cell biology of autophagy' in
metazoans: a developing story // Development. 2008.
Vol. 135. P. 2347—2360.
ALeshorerE., Yellajoshula D., George E., Scambier P. J.,
Brown D. T, AListeliT. Hyperdynamic plasticity' of chro-
matin proteins in pluripotent embryonic stem cells // Dev.
Cell. 2006. Vol. 10. P. 105—116. ’
ALitsui K. The homeoprotein Nanog is required for maintenance
of pluripotency' in mouse epiblast and ES cells // Cell.
2003. Vol. 113. P. 631—642.
ALontgomery N. D., Yee D., Chen A., KalantryS., Chamber-
lain S. J., Otte A. P., ALagnusonT. The murine polycomb
group protein Eed is required for global histone H3 lysine-
27 methylation // Curr. Biol. 2005. Vol. 15. P. 942 -947.
ALorency E., Anguish L.. CoonrodS. Subcellular localization of
cytoplasmic lattice-associated proteins is dependent upon
fixation and processing procedures// PLoS One. 201E
Vol. 6. P. C17226.
ALorrisey E. E., TangZ., Sigrist K, Lu AL. AL., JiangF, Lp H. S.,
Parmacek AL. S. GATA6 regulates HNF4 and is required
for differentiation of visceral endoderm in the mouse em-
bryo /7 Genes Dev. 1998. Vol. 12. P. 3579—3590.
ALurchisonE.P., Stein P., XuanZ., PanH., ZhangALQ.,
Schultz R. AL, Hannon G. J. Critical roles for Dicer in the
female germline // Genes Dev. 2007. Vol. 2E P. 682—693.
Nakamura T, Aral Y, Umehara H, ALasuhara AL, Kimura T,
Taniguchi H, SekimotoT., LkawaAL, YonedaY., Oka-
beAL., TanakaS., Shiota K, Nakano T. PGC7/Stella pro-
tects against DNA demethylation in early' embryogene-
sis // Nat. Cell Biol. 2007. Vol. 9. P. 64—71.
Nishioka N., Yamamoto S., Kiyonari H., Sato H, SawadaA.,
Ota AL, Nakao K, Sasaki H. Tead4 is required for specifi-
cation of trophectoderm in pre-implantation mouse em-
bryos 11 Meeh. Dev. 2008. Vol. 125. P. 270—283.
Nishioka N., Inoue K, Adachi K, Kiyonari H, Ota AL, Ral-
ston A., YabutaN, HiraharaS., Stephenson R O., Ogo-
nukiN., ALakitaR, Kurihara H, ALorin-Kensicki E. AL,
Nojima H, Rossant J., Nakao K, Niwa H, Sasaki H. The
Hippo signaling pathway components Lats and Yap pat-
tern Tead4 activity' to distinguish mouse trophectoderm from
inner cell mass // Dev. Cell. 2009. Vol. 16. P. 398—410.
NiwaH., ALiyazaki J., Smith A. G. Quantitative expression of Oct-
3/4 defines differentiation, dedifferentiation or self-renewal
of ES cells // Nat. Genet. 2000. Vol. 24. P. 372—376.
NiwaH., Toyooka Y., ShimosatoD., StrumpfD., TakahashiK,
Yagi R., Rossant J. Interaction between Oet3/4 and Cdx2
determines trophectoderm differentiation // Cell. 2005.
Vol. 123. P. 917—929.
OhsugiAL., ZhengP., BaibakovB., LiL., DeanJ. Maternally
derived FILIA-MATER complex localizes asymmetrically'
in cleavage-stage mouse embryos // Development. 2008.
Vol. 135. P. 259—269.
OkanoAL., BellD. IV, Haber D. A., LiE. DNA methyltrans-
ferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo me-
thylation and mammalian development // Cell. 1999.
Vol. 99. P. 247—257.
Ooi S. K, QiuC., Bernstein E., Li K, Jia D., YangZ., Erd-
jument-Bromage H. TempstP.. Lin S. P.. Allis C. D..
ChengX., Bestor T. H. Dnmt31 connects unmethylated ly-
sine 4 of histone H3 to de novo methylation of DNA // Na-
ture. 2007. Vol. 448. P. 714—717.
Orr-Urtreger A., Bedford ALT., Burakova T, Arman E., Zim-
mer Y., YayonA., GivolD., Lonai P. Developmental lo-
calization of the splicing alternatives of fibroblast growth
factor receptor-2 (FGFR2)// Dev. Biol. 1993. Vol. 158.
P. 475- 486.
Oswald J., EngemannS., Lane N.. ALayerll'.. OlekA.. Funde-
le R., Dean IV, Reik IT., Walter J. Active demethylation of
the paternal genome in the mouse zygote // Curr. Biol.
2000. Vol. 10. P. 475—478.
Palmieri S. L., Peter IT, HessH, ScholerH. R. Oct-4 transcrip-
tion factor is differentially' expressed in the mouse embryo
during establishment of the first two extraembryonie cell
lineages involved in implantation // Dev. Biol. 1994.
Vol. 166. P. 259—267.
ГЛАВА 8 223
Pasini D.. Bracken A. P.. Hansen J. B., Capillo AL, Helin K.
The polycomb group protein Suzl2 is required for embry-
onic stem cell differentiation // Mol. Cell. Biol. 2007.
Vol. 27. P. 3769—3779.
Pasini D., Hansen К. H., Christensen J., Agger K., CloosP.A.,
Helin K. Coordinated regulation of transcriptional repres-
sion by the RBP2 H3K4 demethylase and Polycomb-
Repressive Complex 2 // Genes Dev. 2008. Vol. 22.
P. 1345—1355.
PayntonB. J’., RempelR., BachvarovaR. Changes in state of
adenylation and time course of degradation of maternal
mRNAs during oocyte maturation and early embryonic
development in the mouse // Dev. Biol. 1988. Vol. 129.
P. 304—314.
Pierre A., Gautier AL., Callebaut L., BontouxAL, Jeanpierre E.,
Pontarotti P., ALonget P. Atypical structure and phyloge-
nomic evolution of the new eutherian oocyte- and embryo-
expressed KHDC1/DPPA5/ECAT1/OOEP gene family//
Genomics. 2007. Vol. 90. P. 583—594.
Piotrowska K., Zernicka-Goetz AL. Role for sperm in spatial pat-
terning of the early mouse embryo // Nature. 2001.
Vol. 409. P. 517—521.
Piotrowska K., JJ’iannyF, Pedersen R. A., Zernicka-Goetz AL.
Blastomeres arising from the first cleavage division have
distinguishable fates in normal mouse development // De-
velopment. 2001. Vol. 128. P. 3739—3748.
Piotrowska-Nitsche K, Perea-Gomez A., Haraguchi S., Zer-
nicka-Goetz AL. Four-cell stage mouse blastomeres have
different developmental properties // Development. 2005.
Vol. 132. P. 479—490.
PlusaB., FrankenbergS., Chalmers A., Hadjantonakis A. K.,
ALooreC.A., Papalopulu N., Papaioannou J . E., Glo-
ver D. AL., Zernicka-Goetz AL. Downregulation of Par3 and
aPKC function directs cells towards the ICM in the pre-
implantation mouse embryo // J. Cell Sei. 2005. Vol. 118.
P. 505—515.
Ralston A., Rossant J. Cdx2 acts downstream of cell polariza-
tion to cell-autonomously promote trophectoderm fate in
the early mouse embryo// Dev. Biol. 2008. Vol. 313.
P. 614 '629.
Ralston A., CoxB.J., Nishioka N., Sasaki H, Chea E., Rugg-
GtntnP., GuoG., Robson P., Draper J. S.. Rossant J.
Gata3 regulates trophoblast development downstream of
Tead4 and in parallel to Cdx2 // Development. 2010.
Vol. 137. P. 395—403.
Ramos S. B., StumpoD.J, Kennington E. A., Phillips RS.,
Воск С. B., Ribeiro-Neto F, Blackshear P. J. The CCCH
tandem zine-finger protein Zfp3612 is crucial for female
fertility and early embryonic development // Ibid. 2004.
Vol. 131. P. 4883- -4893.
RoestH.P.. BaarendsW. AL. deJJ'itJ.. van Klaveren J. IE.
JTassenaar E., Hoogerbrugge J. IE, van Cappellen JJ'. A.,
Hoeijmakers J. H, Grootegoed J. A. The ubiquitin-conju-
gating DNA repair enzyme HR6A is a maternal factor es-
sential for early embryonic development in mice // Mol.
Cell. Biol. 2004. Vol. 24. P. 5485—5495.
Rossant J. Stem cells and lineage development in the mammal-
ian blastocyst // Reprod. Fertil. Dev. 2007. Vol. 19.
P. Ill 118.
Rossant J., Lis JJ’. T. Potential of isolated mouse inner cell
masses to form trophectoderm derivatives in vivo // Dev.
Biol. 1979. Vol. 70. P. 255—26E
Rossant J., J’ijh K. AL. Ability of outside cells from preimplanta-
tion mouse embryos to form inner cell mass derivatives //
Ibid. 1980. Vol. 76. P. 475—482.
Rugg-Gumi P. J., CoxB. J., Ralston A., Rossant J. Distinct his-
tone modifications in stem cell lines and tissue lineages
from the early mouse embryo // Proc. Natl. Acad. Sei.
USA. 2010. Vol. 107. P. 10783—10790.
RussA. P., JJ'attler S.. Colledge JJ’. H. Aparicio S. A., Carl-
ton ALB., Pearce J. J., BartonS. C, Surani AL. A., Ry-
an K., NehlsAL. C, JJ’ilson J’., Evans AL. J. Eomesodermin
is required for mouse trophoblast development and meso-
derm formation // Nature. 2000. Vol. 404. P. 95—99.
Santos F, Hendrich B., ReikJJ’., Dean JJ’. Dynamic repro-
gramming of DNA methylation in the early mouse em-
bryo /'Dev. Biol. 2002. Vol. 241. P. 172—182.
Santos F, Peters A. H, Otte A. P., ReikJJ'., Dean JJ’. Dynamic
chromatin modifications characterise the first cell cycle in
mouse embryos // Ibid. 2005. Vol. 280. P. 225—236.
SchmitgesF. JJ'., PrustyA.B., FatyAL, Stutzer A., Linga-
raju G. AL, AiwazianJ., SackR, HessD., LiL., ZhouS.,
Bunker ED., JJ'irth U, BouwmeesterT., Bauer A., Ly-
HartigN, ZhaoK., ChanH, GuJ., GutH, Fischle JJ’.,
ALullerJ., Thoma N. H. Histone methylation by PRC2 is
inhibited by active chromatin marks// Mol. Cell. 2011.
Vol. 42. P. 330—341.
ScholerH.R., CiesiolkaT., Gruss P. A nexus between Oct-4
and E1A: implications for gene regulation in embryonic
stem cells // Cell. 1991. Vol. 66. P. 291—304.
Schultz R. AL. Regulation of zygotic gene activation in the
mouse//Bioessays. 1993. Vol. 15. P. 531—538.
Schwarz S. AL, GallicanoG. I., ALcGaughey R JJ’., CapcoD. G.
A role for intermediate filaments in the establishment of
the primitive epithelia during mammalian embryogene-
sis // Meeh. Dev. 1995. Vol. 53. P. 305—321.
SoudaisC, Bielinska AL, HeikinheimoAL, ALacArthur C. A.,
Narita N, SaffitzJ.E., Simon AL. C, Leiden J. AL., JJ’il-
son D. B. Targeted mutagenesis of the transcription factor
GATA-4 gene in mouse embryonic stem cells disrupts
visceral endoderm differentiation in vitro // Development.
1995. Vol. 121. P. 3877—3888.
Spindle A. L. Trophoblast regeneration by inner cell masses iso-
lated from cultured mouse embryos // J. Exp. Zool. 1978.
Vol. 203. P. 483—489.
StrumpfD., ALao C. A., Yamanaka Y., Ralston A., Chawengsak-
sophakK, BeckF, Rossant J. Cdx2 is required for correct
cell fate specification and differentiation of trophectoderm
in the mouse blastocyst // Development. 2005. Vol. 132.
P. 2093—2102.
SunF, TangE, YanA. E, FangH. E, ShengH. Z. Expression
of SRG3, a chromatin-remodelling factor, in the mouse
oocyte and early preimplantation embryos // Zygote. 2007.
Vol’. 15. P. 129—138.
SuwinskaA., CzolowskaR, Ozdzenski JJ’., TarkowskiA. K.
Blastomeres of the mouse embryo lose totipotency after
the fifth cleavage division: expression of Cdx2 and Oct4
and developmental potential of inner and outer blas-
tomeres of 16 and 32 cell embryos // Dev. Biol. 2008.
Vol. 322. P. 133—144.
Suzumori N., Burns К. H, Yan JJ'., ALatzukAL. AL. RFPL4 inter-
acts with oocyte proteins of the ubiquitin-proteasome deg-
radation pathway // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2003.
Vol. 100. P. 550—555.
Tahiliani AL, Koh К. P., Shen E., Pastor JJ’. A., Bandukwala H,
Brudno E, AgarwalS., LyerL.AL, LiuD.R, AravindL.,
Rao A. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymet-
hylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1 //
Science. 2009. Vol. 324. P. 930—935.
TangF, KanedaAL, O'CarrollD., HajkovaP., BartonS. C,
Sun E .1., LeeC., Tarakhovsky A., Lao K., Surani AL. .1.
Maternal microRNAs are essential for mouse zygotic de-
velopment 11 Genes Dev. 2007. Vol. 21. P. 644—648.
Thomas F. C, Sheth B., Eckert J. J., BazzoniG., Dejana E.,
Fleming T. P. Contribution of JAM-] to epithelial differ-
entiation and fight-junction biogenesis in the mouse pre-
implantation embryo // J. Cell Sei. 2004. Vol. 117.
P. 5599—5608.
224 ЭПИГЕНЕТИКА
TongZ. В.. Nelson L. AL A mouse gene encoding an oocyte an-
tigen associated with autoimmune premature ovarian fail-
ure // Endocrinology. 1999. Vol. 140. P. 3720—3726.
Tong Z. B, GoldL., Pfeifer К. E., DorwardH., LeeE.,
Bondy C. A., Dean J., Nelson L. Al. Mater, a maternal ef-
fect gene required for early embrvonic development in
mice 11 Nat. Genet. 2000. Vol. 26. R 267- -268.
Torres-Padilla AL E.. Parfitt D. E.. Kottzarides T. Zernicka-
Goetz AL. Histone arginine methylation regulates pluripo-
tency in the early mouse embryo ' Nature. 2007. Vol. 445.
P. 214—218.
Torres-Padilla AL. E., Zernicka-Goetz AL Role of TIF1 alpha as
a modulator of embryonic transcription in the mouse zy-
gote // J. Cell Biol. 2006. Vol. 174. P. 329—338.
TsukamotoS., Кита A., ALurakami AL, Kishi C., Yamamoto A.,
ALizushima N. Autophagy' is essential for preimplantation
development of mouse embryos // Science. 2008. Vol. 321.
P. 117—120.
I'alinluck Г, SowersL. C. Endogenous cytosine damage prod-
ucts alter the site selectivity' of human DNA maintenance
methyltransferase DNMT1 // Cancer Res. 2007. Vol. 67.
P. 946—950.
Vestweber D., Gossler A., Boiler K., KemlerR. Expression and
distribution of cell adhesion molecule uvomorulin in
mouse preimplantation embryos // Dev. Biol. 1987.
Vol. 124. P. 451—456.
J'inotS., LeT., OhnoS., PawsonT., ALaroB., Louvet-l'alleeS.
Asymmetric distribution of PAR proteins in the mouse
embryo begins at the 8-cell stage during compaction //
Ibid. 2005. Vol. 282. P. 307—319.
ITangO. T, Piotrowska K., Ciemerych AL. A., ALilenkovic L.,
Scott AL. P., Davis R. IE, Zernicka-Goetz AL. A genome-
wide study of gene activity' reveals developmental signal-
ing pathways in the preimplantation mouse embryo /7 Dev.
Cell. 2004. Vol. 6. P. 133—144.
TToodH. B., Episkopou Г. Comparative expression of the mou-
se Soxl, Sox2 and Sox3 genes from pre-gastrulation to
early somite stages // Meeh. Dev. 1999. Vol. 86. P. 197—
20E
Xie Z.. KlionskyD.J. Autophagosome formation: core machin-
ery and adaptations // Nat. Cell Biol. 2007. Vol. 9.
P.’ 1102—1109.
YagiR, KolmAL. J., Karavanova L., Kaneko K. J., Cullhorst D.,
DePamphilis AL. L., BuonannoA. Transcription factor
Tead4 specifies the trophectoderm lineage at the begin-
ning of mammalian development // Development. 2007.
Vol. 134. P. 3827—3836.
YurttasP., YitaleA.AL, Fitzhenry R J, Cohen-GouldL,
П’и П’.. Gossen J. A., CoonrodS. A. Role for PADI6 and
the cytoplasmic lattices in ribosomal storage in oocytes
and translational control in the early' mouse embryo // Ibid.
2008. Vol. 135. P. 2627—2636.
Zhang J., Tam IT. L., TongG. О., П’и О., ChanH. Г., SohB. S.,
Lou Y., Yang J., ALa Y., Chai L., NgH.EL, Lufkin T,
Robson P., LimB. Sall4 modulates embryonic stem cell
pluripotency and early embryonic development by the
transcriptional regulation of Pou5fl // Nat. Cell Biol.
2006. Vol. 8. P. 1114—1123.
ZhengP., Dean J. Role ofFilia, a maternal effect gene, in main-
taining euploidy during cleavage-stage mouse embryo-
genesis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2009. Vol. 106.
P. 7473—7478.
ГЛАВА
9
ЭПИГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ
НОРМАЛЬНОГО И ПАТОЛОГИЧЕСКОГО
РАЗВИТИЯ ЧЕЛОВЕКА
СОДЕ РЖАН И Е
9.1. Основные механизмы эпигенети-
ческого регулирования, 226
9.2. Эпигенетическое программирова-
ние генома половых клеток чело-
века, 231
9.3. Эпигенетические процессы на ста-
диях имплантации и плацентации,
243
9.4. Начальные этапы постимпланта-
ционного развития и раннего орга-
ногенеза, 248
9.5. Структурно-функциональные осо-
бенности перицентромерного гете-
рохроматина, 249
9.6. Гипотеза главной программы раз-
вития (ГПР), 253
9.7. Эпигенетические ремоделирова-
ния и болезни человека, 256
Список литературы, 263
226 ЭПИГЕНЕТИКА
Удивительный парадокс, ставший очевидным
после расшифровки генома человека, состоит в
том, что только около 2 % информации генома
отвечает за синтез белка, т. е. за ту основную суб-
станцию, из которой собственно и состоит наше
тело. Примерно 20 % ДНК транскрибируется
только до нетранслируемых РНК, которые вы-
полняют самые разные функции, связанные с
обеспечением процессов реализации генетиче-
ской информации, ее сохранением и передачей.
Однако, функции почти 75 % гигантской молеку-
лы /ТНК, представленной в основном различными
повторяющимися элементами, транспозонами,
вирусоподобными последовательностями и пр.,
остаются практически неизвестными. Отсутствие
конкретных функций дало основание рассматри-
вать ее как «лишнюю» и даже «мусорную» ДНК
В настоящее время, по мере прогресса исследова-
ний в области функциональной геномики, такая
точка зрения существенно меняется. Более попу-
лярным становится представление о том, что ос-
новная часть ДНК в геноме человека необходима
для записи программы индивидуального разви-
тия. Удивительно, что информационная емкость
такой программы почти в 50 раз больше, чем про-
граммы, в которой закодирована первичная
структура всех белков организма! Естественно,
что реализоваться программа развития, как впро-
чем и всего генома, может только в строго опре-
деленных условиях и, прежде всего, при наличии
продуктов самих генов и сложной эпигенетиче-
ской системы, обеспечивающей координирован-
ную во времени и в пространстве работу’ генома.
Напомним, что ветвь биологии, изучающая
причинные взаимодействия между’ генами и их
продуктами, образующими фенотип, получила
название эпигенетика (Уоддингтон, 1947) [Wad-
dington, 1968]. «Эпигенетика» — неологизм, объ-
единяющий слова «эпигенез» (зародышевое раз-
витие) и «генетика». До К. Уоддингтона эмбрио-
логия и генетика были отдельными дисциплина-
ми. Эпигенетика устранила различия между’ эм-
бриологией и генетикой и привела к расширению
классической модели связи генотип—фенотип за
счет включения понятия «эпигенотипа»: гено-
тип + эпигенотип + среда = конкретный фенотип.
Согласно современным представлениям, эпи-
генетика — раздел функциональной геномики, а
эпигеном, или эпигенотип, — функционирую-
щая часть генома каждой дифференцированной
клетки. Отметим также, что эпигенетическая
регуляция — это наследственные и ненаследст-
венные изменения в экспрессии конкретного ге-
на без каких-либо изменений в его нуклеотидной
последовательности.
В настоящее время большинство исследова-
телей сводят эпигенетику’ к изучению систем
мечения хроматина: метилирование ДНК, моди-
фикации гистонов и изменения состояния хро-
матина. Однако, несмотря на то, что измене-
ния хроматина играют фундаментальную роль в
управлении транскрипцией, эпигенетика не
должна отождествляться с транскрипционной
регуляцией. Последняя имеет дело с факторами
и механизмами, участвующими в переключе-
нии активности генов, тогда как эпигенетика
оперирует с изменениями и клеточным на-
следованием активности генов, которые от-
носительно устойчивы.
В отличие от перманентно протекающих и
постоянно меняющихся процессов регуляции
функции генов эпигенетические изменения ге-
нома достаточно стабильны, они наследуются не
только дочерними клетками, но, согласно по-
следним данным, могут передаваться в поколе-
ниях. Процесс трансгенерационной передачи
эпигенетических меток показан для растений,
дрожжей, дрозофилы и мышей [Tollefsbor, 2011].
У людей нет прямых подтверждений эпигенети-
ческого наследования через поколение. Однако,
эпидемиологические исследования, особенно ка-
сающиеся роли эпигенетической изменчивости в
развитии и наследовании хронических заболева-
ний, указывают, что оно может иметь место и у
человека [Roach et al., 2010] (см. раздел 9.7.5).
Передача эпигенетических состояний через
половые клетки позволяет наследование приобре-
тенных признаков и, таким образом, дает основу’
для адаптивной эволюции, поскольку’ в результа-
те случайных или средовых эпигенетических из-
менений в популяции появляются новые эпигене-
тические варианты [Jablonka, Lamb, 1989].
Если они передаются через половые клетки и
выборочно благоприятны, они накапливаются в
популяции и позволяют своим генотипам зани-
мать новую адаптивную зону’. Под непрерывным
давлением отбора благоприятные эпигенетиче-
ские варианты могут устанавливаться в качестве
генетических изменений, передающихся потом-
ству’ более стабильным способом. Генетическая
фиксация эпигенетических изменений может
лежать в основе видообразования.
9.1. Основные механизмы
ЭПИГЕНЕТИЧЕСКОГО РЕГУЛИРОВАНИЯ
Исследование эпигенетических (не связанных
с первичной структурой ДНК) механизмов регу-
ляции функций генома — одно из бурно разви-
вающихся направлений современной генетики,
ГЛАВА 9 227
тесно связанное с решением медицинских про-
блем [Лебедев, Саженова, 2008]. Эпигенетиче-
ская регуляция может осуществляться путем ме-
тилирования цитозиновых нуклеотидов /ТНК,
модификаций хромосомных белков-гистонов ли-
бо воздействием на транскриптом клетки раз-
личных видов регу ляторных РНК.
9.1.1. Метилирование ДНК
Наиболее универсальным способом эпигене-
тической регуляции генной экспрессии млекопи-
тающих является метилирование цитозина в це-
пи ДНК (рис. 9.1). Большинство молекул 5-ме-
тилцитозина находятся в составе последователь-
ностей 5'-CG-3', называемых CpG-динуклсотида-
ми. Неметилированное состояние цитозин сохра-
няет в непротяженных участках ДНК — CpG-
островках. В настоящее время известно, что CpG-
островки присутствуют в премоторных областях
примерно 75 % генов, прежде всего, генов до-
машнего хозяйства. В геноме человека насчиты-
вается приблизительно 29000 CpG-островков.
В подавляющем большинстве случаев про-
цесс метилирования ДНК заключается в перено-
се метильной группы с S-аденозилметионина в
5-е положение цитозина с помощью ферментов
метилирования — метилтрансфераз (DNMT) (см.
рис. 9.1). Процесс метилирования ДНК касается
не только цитозинов в динуклеотидах CpG, но и
тринуклсотидов (ChNpG) в генах, имеющих со-
ответствующие тринуклсотидныс повторы. Их
метилирование, возможно, препятствует экспан-
сии триплетов ChNpG.
На сегодня описано два семейства ДНК-ме-
тилтрансфераз: поддерживающие метилирова-
ние (Dnmtl) и способные к метилированию
de novo (Dnmt3a, Dnmt3b и Dnmt3L). Кроме того,
идентифицирована Dnmt2. обладающая слабой
каталитической активностью и осуществляющая
метилирование цитозина в положении 38 анти-
кодона петли тРНК аспарагина [Li, Bird, 2010].
Ген метилтрансферазы-1 (Dnmtl) высоко-
консервативен. Его ортологи идентифицированы
у разных видов, в том числе и у человека
(DNMT1). Продукт гена поддерживает метили-
рованное состояние ДНК в делящихся клетках.
Метилируя вновь синтезированную ДНК, метил-
трансфераза-1 обеспечивает воспроизведение
родительского паттерна метилирования в дочер-
них цепях ДНК после каждого раунда реплика-
ции. Отсутствие фермента приводит к снижению
общего уровня метилирования и к гибели эм-
брионов мышей. Однако, эмбриональные ство-
ловые клетки таких мышей жизнеспособны и со-
храняют способность к метилированию de novo,
что указывает на наличие других метилаз.
Именно к таким метилазам относятся ферменты
Dnmt3a и Dnmt3b [Horsthemke, 2010]. Совмест-
ное действие метилаз приводит к метилирова-
нию CpG-динуклсотидов в неметилированной и
полумстилированной ДНК in vitro.
Метилирование может влиять на интенсив-
ность транскрипции как путем изменения эф-
фективности связывания позитивных и негатив-
ных факторов транскрипции с регуляторными
участками генов, так и через формирование не-
активных участков хроматина (рис. 9.2) [Hor-
sthemke, 2010].
Согласно первому2 механизму’, 5-метилци-
тозин ингибирует связывание с ДНК некоторых
факторов транскрипции (АР-26 с-Мус/Муп,
цАМР-зависимый активатор CREB, E2F NF-kB),
мишенями для которых являются последователь-
ности, содержащие CpG-динуклеотиды. Однако
некоторые транскрипционные факторы (SpL CTF)
нечувствительны к метилированию и связыва-
ются с участками ДНК, лишенными CpG-динук-
леотидов (см. рис. 9.2, о).
В реализации второго механизма участвуют
белки, которые специфично связываются с ме-
тилированными CpG-дину’клеотидами и ингиби-
руют присоединение к ДНК факторов транс-
крипции (ФТ) (см. рис. 9.2, б). Основная роль в
этом процессе принадлежит метилцитозинсвя-
зывающему’ комплексу’ (МЦСК), состоящему’ из
пяти основных белков: MBD1—MBD4 и МеСР2
[Li, Bird, 2010]. Все белки этого комплекса, за
исключением MBD4, выполняют репрессивную
функцию путем изменения структуры хромати-
на. Белок MBD4 участвует в репарации и пре-
дотвращает мутационные изменения метилцито-
зина. Главный из пяти белков — МЕСР2. кото-
рый первым связывается с CpG-динуклеотидами,
содержит домен для узнавания метилированного
CpG-динуклеотида (MBD) и домен репрессии
транскрипции (TRD). При связывании белка
МеСР2 с одиночными CpG-динуклеотидами ре-
5-Метилцитозин
SAM-S-аденозил метионин
Рис. 9.1. Схема метилирования цитозина.
228 ЭПИГЕНЕТИКА
ФТ
СНз СНз - СНз СНз
0
ФТ
СНз СНз СНз СНз СНз
II II П I.
МеСР-
2
МеСР-1
Рис. 9.2. Регуляция транскрипции посредством метилирования ДНК.
а — 5-метилцитозин ингибирует связывание с ДНК некоторых факторов транскрипции, сайтами-мишенями для которых явля-
ются последовательности, содержащие CpG-динуклеотиды. Другие транскрипционные факторы не чувствительны к метилиро-
ванию по причине отсутствия CpG-динуклеотидов в последовательностях, с которыми они связываются; б — белки и белковые
комплексы специфично связываются с метилированными CpG-динуклеотидами, что ингибирует присоединение факторов
транскрипции в силу ограничения доступа к регуляторным элементам. Основную роль в инактивации играет метилцитозинсвя-
зывающий комплекс (МеСР).
прессорный эффект распространяется на не-
сколько сот пар нуклеотидов. Установлено, что
белок МеСР2 находится преимущественно в G-
сегментах метафазных хромосом. Эмбрионы мы-
ши, гомозиготные по делеции гена МеСР2, поги-
бают до рождения. Это указывает на важную роль
белка МеСР2 в эмбриональном развитии [Ног-
sthemke, 2010]. Мутация в гене МеСР2, локализо-
ванном в Х-хромосоме человека, приводит к раз-
витию прогрессирующего нейродегенеративного
заболевания — синдрому’ Ретта (см. раздел 9.6).
Метилцитозинсвязывающий белок MBD2 вхо-
дит в состав комплекса MeCPl. В отличие от
МеСР2, для связывания с /ТНК ему’ необходимо
несколько CpG-дину’клеотидов. Учитывая слабое
сродство комплекса MeCPl к метилированной
ДНК, предполагается, что в процессе генной ре-
прессии он выполняет вспомогательные функции
[Li. Bird. 2010].
9.1.2. Эпигенетические
модификации гистонов
Процесс метилирования ДНК тесно связан с
друтим эпигенетическим феноменом — измене-
ниями гистонов — простых по структуре белков,
составляющих протеиновый остов хромосомы и
формиру’ющих глобулы (нуклеосомы), на кото-
рые наматывается спираль ДНК (1-й уровень
компактизации ДНК) Метилирование ДНК обыч-
но предшествует метилированию гистона НЗ, но
в целом этот процесс скорее бимодальный, т. е.
выключение работы гена может начинаться с
метилирования CpG-островков ДНК, после чего
метилируется гистон НЗ в премоторной области
гена либо процесс идет в обратном порядке [Ce-
dar, Bergman, 2009]. Эпигенетические изменения
гистонов более разнообразны, чем модификации
ДНК Помимо метилирования, аминокислотные
остатки гистонов могу’т подвергаться ацетилиро-
ванию, фосфорилированию (малые модифика-
ции), а также у’биквитинированию, су’моилиро-
ванию (большие модификации). При этом из-
вестно множество различных модификаций гис-
тонов, которые регулируют активность генов.
Так, их ацетилирование характерно для актив-
ного состояния гена, а деацетилирование — для
репрессированного. Триметилирование Lys4
(НЗК4) и ацетилирование Lys9 гистона НЗ
(НЗК9) связано с экспрессией гена, тогда как
триметилирование НЗК9 и НЗК27 — с транс-
крипционным молчанием. Фосфорилирование и
ГЛАВА 9 229
дефосфорилирование остатков серина в молеку-
лах гистонов катализируется киназами и фосфа-
тазами соответственно. Известно более 50 марке-
ров аминокислотных остатков гистонов, модифи-
кации которых по-разному сказываются на работе
генов, что позволяет предположить в клетках эу-
кариот, наряд}’ с кодом ДНК, наличие и особого
гистонового кода. До сих пор, однако, остается
неизвестным, как работает этот код, какова его
структура, передаются ли гистоновые маркеры
при делении клеток («гистоновый код») или они
формируют временные индикаторы транскрип-
ционного состояния («сигнальная модель»), В на-
стоящее время вопрос о том, действительно ли
существует какой-то другой код, кроме генетиче-
ского, остается открытым [Allis et al., 2010].
У человека существует, по крайней мере, 18
ферментов-деацетилаз (HDAC), входящих в три
класса. Классы HDAC I и II имеют каталитиче-
скую область, включающую ион цинка. Класс III
HDAC использует как кофактор восстановленный
никотинамид динуклсотид (NAD ). Деацетилиро-
вание гистонов приводит к «закрытой», репрес-
сивной конфигурации хроматина. Белки, связан-
ные с метилированным CpG, могут использовать
HDAC для подавления транскрипции генов.
Посттрансляционные модификации гистонов
играют ведущую роль в регуляции работы генов,
так как могут изменять структуру хроматина с
активной на неактивную (г/г/с-модифицирующий
эффект), разрушать связи белков с хроматином
или гистонами, адсорбировать на своей поверх-
ности хроматинсвязывающие белки [Kouzarides,
Berger, 2010].
У человека обнаружено несколько мутаций,
влияющих на гены — модификаторы гистонов.
Деацетилирование гистонов может тормозиться
небольшими молекулами, например, трихоста-
тином (TSA). Обработка клеток TSA может вос-
станавливать функцию выключенных генов. На-
пример, направленная мутация мышиного орто-
лога hdacl приводит к внутриутробной задержке
роста и к ранней гибели эмбрионов. У человека
мутации гена HDAC2 обнаружены в определен-
ных типах опухолей.
Мутации в гене RSK2. кодирующем рибосо-
мальную киназу S6, вызывают синдром Коффи-
на—Лоури (см. раздел 9.7.4). Мутации гена
CREBBP, кодирующего белок СВР, вызывают
синдром Рубинштейна—Тэйби (см. раздел 9.7.4).
Слияние генов CREBBP и MOZ (MYST3), вы-
званное транслокацией (8; 16)(pl 1; р13), играет
пусковую роль в развитии одного из подтипов
острого миелоидного лейкоза.
В настоящее время установлено, что эффек-
тивная репрессия транскрипции генов может
достигаться как метилированием /ТНК, так и де-
ацетилированием гистонов. Остается, однако, не-
ясным. какой из этих процессов является веду-
щим. Существуют две гипотезы. Репрессия
функции гена начинается с деацетилирования
гистона НЗ, а затем происходит метилирование
CpG (гипотеза 1). Согласно второй гипотезе, по-
следовательность событий обратная: сначала ме-
тилируется ДНК, затем модифицируются гисто-
ны [Roach et al., 2011].
9.1.3. Малые РНК как эпигенетические
регуляторы функции генов
Феномен РНК-интерференции, открытый поч-
ти 20 лет назад, в настоящее время привлекает
особенно большое внимание. Его основу состав-
ляют небольшие по размеру (20—40 п.н.) одно-
или двухцепочечные некодирующие молекулы
РНК. вызывающие направленную деградацию
мРНК генов-мишеней, содержащих комплемен-
тарную последовательность нуклеотидов и, та-
ким образом, блокирующих синтез соответст-
вующих белков на уровне трансляции. Отсюда
их второе название — короткие интерфери-
рующие РНК — short interfering RNA — siPHK.
В настоящее время известны сотни различных
siPHK, многие из которых нашли применение в
исследованиях, требующих направленного вы-
ключения генов. Некоторые siPHK в настоящее
время проходят клинические испытания в каче-
стве возможных противоопухолевых препаратов.
Механизм РНК-интерференции в настоящее
время рассматривается как главный регуля-
тор экспрессии генов, определяющих ответ
клетки на эндогенные и экзогенные воздейст-
вия. Роль siPHK в нормальном эмбриогенезе че-
ловека остается малоизученной. Нельзя, однако,
не обратить внимание, что по конечному’ резуль-
тату’ действия и многообразию фенотипических
эффектов малые РНК напоминают продукты ге-
нов ФТ. Имеются данные, что некоторые виды
микроРНК (миРНК), присоединяясь к ДНК, слу-
жат молекулярными маркерами для ДНК-мети-
лирования de novo, так называемое РНК-зависи-
мое ДНК-метилирование [Allis et al.. 2010].
Синтез миРНК представляет собой сложный
многоэтапный процесс (рис. 9.3). Вначале синте-
зируется пре-миРНК, от которой ферментным
комплексом Drosha отрезаются 3'- и 5'-концы,
продукт поступает в цитоплазму’, где разрезается
ферментом DICER с образованием миРНК-ду-
230 ЭПИГЕНЕТИКА
Цитоплазма
ген микроРНК
Ядро
РНК pol II/III Транскрипция
Первичная микроРНК
Расщепление
Предшественник микроРНК
uibEK Расщепление
TRBP ф
......... двунитевая
3......... микроРНК
Рис. 9.3. Многоступенчатый процесс синтеза микроРНК и их влияние на работу генов.
Шпилька первичной микроРНК транскрибируется полимеразами II и III и расщепляется до предшест-
венника микроРНК с помощью комплекса Drosha/DGCR8. Предшественник микроРНК экспортируется
в цитоплазму с помощью транспортера экспортин 5-Ran. Комплекс DICER/TRBP расщепляет предше-
ственник микроРНК до зрелой микроРНК. МикроРНК вместе с Argonaute (Ago2) взаимодействует
с комплексом RISC, который присоединяется к матричной РНК, что приводит к замолканию гена-
мишени [Roach et al., 2011 ].
ГЛАВА 9 231
плекса. При этом одна цепь РНК дегенери-
рует, вторая соединяется с белком Аргонавтом
(ARGO-2), который формирует РНК-репрес-
сионный комплекс RISC. Специфичность взаи-
модействия комплекса с мРНК гена-мишени оп-
ределяется входящей в его состав миРНК.
Таким образом, малые РНК действуют не
только как специфические транскрипционные
факторы, но, обладая выраженным эпигенетиче-
ским эффектом, направляют сайленсинг генов и
вносят вклад в гетерохроматиновые домены.
9.1.4. «Пермиссивное» и «репрессивное»
состояние хроматина
Пермиссивное и репрессивное состояния хро-
матина характеризуются специфическими ва-
риантами метилирования /ТНК, модификациями
гистонов и конфигурацией хроматина. Результи-
рующей этих эффектов, как правило, являются
конформационные изменения хроматина, делаю-
щие его доступным для РНК-транскриптаз (пер-
миссивный хроматин) или, наоборот, вызываю-
щие его гетерохроматизацию и стабильную ре-
прессию. Предполагается, что вначале происхо-
дит метилирование определенных последова-
тельностей ДНК, которые ведут к изменению
структуры хроматина. Не исключено также, что
обе программы дополняют друг друга, обеспе-
чивая в процессе клеточной дифференцировки
как лабильное (транзиторное) выключение от-
дельных генов (метилирование ДНК), так и бо-
лее длительное (перманентное) выключение круп-
ных информационных блоков активного хрома-
тина (конформационные изменения) [Horsthemke,
2010].
Два семейства белков регулируют ремодели-
рование хроматина: SNF2H (ISWI) (распределяет
нуклеосомы вдоль молекулы ДНК) и Brahma
(SWi/SNF) (изменяет форму нуклеосом, экспони-
руя контакты ДНК—гистон). Две основные груп-
пы белков обеспечивают поддержание клеточ-
ной идентичности, т. е. клеточную память: белки
Polycomb (гены семейства PcG) и Trithorax (гены
семейства lrx(i). Оба семейства — функциональ-
ные антагонисты. Белки Polycomb репрессируют
ДНК, сохраняя в клетке неактивный хроматин, а
белки триторакс активируют хроматин и под-
держивают его в рабочем состоянии на протяже-
нии нескольких клеточных генераций, т. е. обес-
печивают механизм молекулярной клеточной
памяти. Структурно белки Polycomb похожи на
белок гетерохроматина HP] и содержат иден-
тичный ему домен. У дрозофилы известно 20 ге-
нов PcG и 15 генов trxG [Albs et al., 2010]. Белки
PcG и trxG организованы в крупные мультимер-
ные комплексы, которые действуют на гены-ми-
шени, модулируя структуру хроматина. После
соединения с геном комплекса группы PcG —
PRC1 и PRC2 возникает состояние «молчащего
хроматина», которое стабильно наследуется во
многих генерациях. Мутации в гене PRC1 ведут
к нарушению экспрессии генов НОХ, к наруше-
ниям пролиферации гемопоэтических клеток
у человека [Grossniklaus, Pare, 2010].
Таким образом, эпигенетическая регуляция
передачи генетической информации представля-
ет собой сложный, многоэтапный и многоуров-
невый процесс, конечный результат которого за-
висит не только от эффективности транскрипции
и трансляции, но и от модифицирующих воздей-
ствий на уровне всего генома, связанных с эпи-
генетическими изменениями ДНК и гистонов, а
также наличием интерферирующих микроРНК.
Существенно, что в онтогенезе эти надмолеку-
лярные пути постоянно пересекаются или ока-
зываются комплементарными, создавая глобаль-
ную геномную сеть регуляции генной активно-
сти. При этом эпигенетические компоненты оп-
ределяют не только процессы транскрипции и
трансляции генетической информации, но и уча-
ствуют в таких ключевых процессах, как регуля-
ция репликации ДНК, репарации теломер, опре-
деляют структуру' и функцию центромер, созда-
ние и поддержание стабильно активного или ре-
прессивного состояния факультативного гетеро-
хроматина. Все эти критические для клетки
функции наследуются эпигенетически, а не ге-
нетически и в большей мере связаны с хромати-
ном, а не с первичными последовательностями
нуклеотидов.
9.2. Эпигенетическое программирование
ГЕНОМА ПОЛОВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА
Развитие организма, как и сама жизнь, пред-
ставляет собой повторяющиеся циклы эпигене-
тического репрограммирования генома, обеспе-
чивающие процессы гаметогенеза, оплодотворе-
ния, формирования организма, его развития и
репродукции. Каждая последующая стадия онто-
генеза определяется эпигенетическими процес-
сами, произошедшими на предшествующей ста-
дии. При этом начальные этапы развития, от оп-
лодотворения до первых делений дробления зи-
готы, в значительной мере запрограммированы
эпигенетическими событиями, происходящими
еще в гаметогенезе. Наиболее обширная эпиге-
232 ЭПИГЕНЕТИКА
Высокое
нетическая перестройка происходит в гаме-
тогенезе и в раннем эмбриогенезе, когда
эпигенетические метки почти всех локусов
стираются и переустанавливаются заново.
Эпигенетические изменения, происходящие
еще в гаметогенезе и по-разному влияющие
на экспрессию генов в зависимости от их
родительского происхождения, получили
название геномный импринтинг (см. раз-
дел 9.6). В процессах гаметогенеза и ранне-
го эмбриогенеза млекопитающих и человека
выделяют, по крайней мере две волны эпи-
генетического репрограммирования генома.
Первая соответствует периоду гаметогенеза,
вторая — дроблению оплодотворенной яй-
цеклетки и началу дифференцировки эм-
бриональных тканей. Метилирование ДНК
полностью «стирается» в первичных поло-
вых клетках (1111К) и вновь устанавливается
в гаметогенезе; при этом новые паттерны
метилирования специфичны для мужских и
женских гамет (первая волна). После опло-
дотворения геном зародыша полностью де-
метилируется, при этом не затрагиваются ге-
ны, импринтированные в гаметогенезе. Ме-
тилирование генома прогрессивно нарастает
на стадии первичной эмбриональной индук-
ции (появление трофоэктодермы — ТЭ) и на-
чала дифференцировки внутренней клеточ-
ной массы (ВКМ) (2-я волна) (рис. 9.4).
9.2.1. Эпигенетика гаметогенеза
Данных по эпигенетическим изменениям
в половых клетках у человека еще недоста-
точно, однако эти механизмы детально изу-
чаются в экспериментах на лабораторных
мышах. Процесс гаметогенеза начинается с
формирования первичных половых клеток.
Новая генерация ПИК устанавливается на
стадии ранней гаструлы (6,25 д. р.) как ком-
пактная группа Blimp 1 (транскрипционный
репрессор)-положительных клеток эпибла-
ста (внутренней клеточной массы), богатых
щелочной фосфатазой. В ПИК, мигрирую-
щих через экстраэмбриональную мезодерму’
в зачатки гонад, происходит глобальная мо-
дификация хроматина, включающая гисто-
ны НЗК4те2, НЗК4теЗ, НЗК9ас и демети-
лирование ДНК. Деметилирование хрома-
тина продолжается во время миграции и
внедрения 1111К в половые валики. Процесс
активного деметилирования мигрирующих
ППК у мышей контролируют гены Aid,
ГЛАВА 9 233
Apobecl, Gadd45, а также Dntmla 3b. Вместе c
тем, известно около 100 импринтированных ге-
нов 1П1К, в которых эпигенетические ДНК-
метки сохраняются до 9,5 д.р., т. е. вплоть до за-
селения гонад, после чего они быстро исчезают
[Surani, Reik, 2010].
Следовательно, часть ДНК-меток устойчива к
глобальному’ деметилированию в мигрирующих
НИК, однако, уже в зачатках гонад происходит
деметилирование всех ДНК-локусов — как им-
принтированных, так и неимпринтированных.
Деметилированное состояние генома сохра-
няется до возобновления митоза в сперматого-
ниях и мейоза в оогониях. Динамика изменения
гистонов в мейозе у самок и самцов, главным
образом у мышей, подробно исследована. Кине-
тический анализ метилирования ДНК свидетель-
ствует о том, что в сперматогониях это происхо-
дит до мейоза, а в оогониях еще внутриутробно
в профазе мейоза и завершается в период созре-
вания уже после рождения. При этом частота
мейотической рекомбинации у самцов значи-
тельно выше, чем у самок, и коррелирует с по-
вышенным содержанием в мужских гаметах фер-
ментов гистон-ацетилтрансфераз (HAT). Комби-
нации структурных особенностей ДНК с эпиге-
нетическими модификациями гистонов опреде-
ляют сайты инициации рекомбинации в мейозе.
Фермент PREDM9 (триметилаза гистона НЗК4)
критичен для рекомбинации в мейозе как самок,
так и самцов. Он инициирует сайты рекомбина-
ции, и при его отсутствии наблюдается блок ре-
парирования этих сайтов в сперматоцитах и
ооцитах на стадии пахитены. Инициации про-
цесса рекомбинации предшествует удаление ме-
тильных меток гистоновой деметилазой HDMT
[Barthes etal., 2011]. У самок активируется ген
Meisetz, включающий мейоз на ст. Е13.5. Его му-
тации ведут к стерильности самок и самцов. Ре-
прессия генов и конъюгация хромосом в профазе
мейоза регулируются генами метилтрансфераз
Suv39 и НЗК9 [Surani, Reik, 2010].
После кроссинговера в гаметах запускается
процесс метилирования de novo, который завер-
шается в сперматоцитах на стадии пахитены, а в
ооцитах — ко 2-му мейотическому делению. Та-
ким образом, эпигенетическое репрограммиро-
вание генома занимает значительную часть га-
метогенеза.
Анализ сперматозоидов человека обнаружил
различия в метилировании ДНК как между’ ин-
дивидами, так и между’ различными генерациями
половых клеток у одного и того же донора. При
этом 85—95 % ДНК спермия соединены с кис-
лыми белками протаминами или их производ-
ными, но 5—15 % ДНК сохраняют гистоны и
нуклеосомную организацию. Гистоны и их вари-
анты играют важную роль в структуре хромати-
на и в формировании сперматид. Их сохранение
в некоторых участках ДНК в зрелых спермато-
зоидах соответствует эпигенетической метке ге-
нов, импринтированных во время сперматогене-
за. В мужских половых клетках присутствует
также хроматоидное тельце — структура, спе-
цифичная для сперматогоний, которая взаимо-
действует с ядром, содержит компактную мРНК
и является РНК-процессинговым тельцем, со-
держащим белки Dicer, Argonaute и microRNA.
Большой неожиданностью было выявление
методом ПЦР в реальном времени РНК в зрелых
эякулированных спермиях человека [Miller, 2011].
Ее роль совершенно неизвестна. Имеются на-
блюдения, указывающие на значимость этой
РНК для оплодотворяющей способности спермы
и обеспечения нормального развития оплодотво-
ренной яйцеклетки, например, путем эпигенети-
ческого маркирования эмбрионального генома
или индукции транспозонной активности, сти-
мулирующей начало дробления [Miller, 2011].
Вероятным местом синтеза такой РНК может
быть гетерохроматин перицентромерных рай-
онов хромосом, играющий важную роль в эпи-
генетическом репрограммировании [Probst, Al-
mouzni, 2011] (см. раздел 9.6).
В то время как основные морфогенетические
изменения при сперматогенезе направлены на
создание биологически совершенного заряда по
доставке ДНК, эпигенетические превращения
яйцеклетки касаются, главным образом, созда-
ния запасов энергетических ресурсов, питатель-
ных веществ и рибонуклеопротеидов, достаточ-
ных для обеспечения начальных этапов развития
после оплодотворения. Никаких данных о нали-
чии детерминант дифференцировки, асиммет-
рично лежащих в ооплазме яйцеклеток млекопи-
тающих, нет. Эпигенетические изменения в оп-
лодотворенной яйцеклетке млекопитающих и че-
ловека на разных стадиях доимплатационного
развития рассмотрены в разделе 9.2.4.
Мы опускаем описание сложных морфогене-
тических и эпигенетических процессов, происхо-
дящих во время созревания мужских и женских
гамет, а также сопровождающих процесс оплодо-
творения (капацитация сперматозоидов, механиз-
мы пенетрации оболочек яйцеклетки, блок поли-
спермии, завершение 2-го мейотического деления
в яйцеклетке), ранее подробно рассмотренных в
научной литературе [Баранов, Кузнецова, 2007].
234 ЭПИГЕНЕТИКА
9.2.2. Репрограммирование генома
после оплодотворения
Яйцеклетка, как и сперматозоид, представля-
ет собой высокоспециализированную клетку’,
цель которой — продлить жизнь своих генов в
потомстве. При всей своей внешней несхожести,
яйцеклетка и спермий дают новому' развиваю-
щемуся организму’ три компонента: половину’
генома, белки и запасы РНК (они особенно зна-
чительны в яйцеклетке, тогда как в спермато-
зоиде недавно обнаружены только небольшое
количество РНК неизвестного назначения и бел-
ки, см. выше) и эпигенетическую информацию,
которая влияет на регуляцию функций генома
зародыша и несет метильные метки в ДНК, мо-
дификации гистонов и негистоновые белки хро-
матина. В геномах спермия и яйцеклетки эпиге-
нетические метки, сформировавшиеся еще в га-
метогенезе, различны, но взаимно комплемен-
тарны, т. е. являются импринтированными (вы-
ключенными) в гаметах одного пола и. наоборот,
деметилированными с сохраненной нуклеосом-
ной организацией в гаметах противоположного
пола. При этом геномы спермия и ооцитов со-
храняют высокий уровень метилирования ДНК.
Вскоре после оплодотворения (2—3 ч) на-
блюдается формирование мужского и женского
пронуклеусов, несущих гаплоидные геномы спер-
мия и яйцеклетки. События, происходящие в
пронуклеусах, а затем и в ядрах зиготы и бла-
стомеров дробящегося зародыша, представляют
собой процессы эпигенетического репрограмми-
рования генома (ЭРГ), которые состоят из двух
последовательных фаз: деметилирование и реме-
тилирование ДНК (см. рис. 9.4).
Замена протаминов на гистоны в мужском
пронуклеусе начинается с включения в ДНК
гистона НЗ.З с помощью шаперона HIRA, а так-
же гистонов H2K27mel, H2K27me2 и H2K27me3
и белков репрессивного комплекса Polycomb.
Вскоре после оплодотворения происходит то-
тальное деметилирование ДНК за исключением
кластеров импринтированных отцовских генов.
Процессы деметилирования в мужском пронук-
леусе идут особенно активно за счет работы осо-
бых ферментов. На сегодня предполагают нали-
чие двух механизмов активного деметилирова-
ния: эксцизионной репарации метилированного
цитозина и/или его ферментативного гидрокси-
лирования. Возможными кандидатами демети-
лирования ДНК мужского пронуклеуса посред-
ством экционной репарации у мышей является
семейство ферментов Aid/Apobec, а также фер-
менты Gadd45 и Dntm3a/3b, деметилирующие
5-метилцитозин, превращая его в тимидин. Пред-
полагается, что возникающее при этом несоответ-
ствие (некомплементарность) нуклеотидных пар
(T:G) может репарироваться путем эксцизии ос-
нований [Surani, Reik, 2010]. Активное деметили-
рование может происходить за счет гидроксили-
рования 5-метилцитозина белками семейства
ТЕТ (Ten-Eleven-Translocation) [Tahiliani etal.,
2009] — ТЕТ1, TET2 и ТЕТЗ, — осуществляю-
щих превращение 5-метилцитозина в его гидро-
ксильную форму’ с последующей его трансфор-
мацией в цитозин [Ito et al., 2010]. 5-гидроксиме-
тилцитозин, помимо участия в процессе актив-
ного деметилирования, способствует пассив-
ному’ деметилированию, предотвращая взаимо-
действие ДНК-метилтрансферазы DNMT1 с суб-
стратом [Valinluck, Sowers, 2007].
Деметилирование хроматина женского про-
нуклеуса происходит пассивно, без участия спе-
цифических ферментов — деметилаз. Предпола-
гается. что материнский пронуклеус обладает
определенной резистентностью к действию де-
метилаз благодаря наличию в его хроматине гис-
тона НЗК9те2 и специфического белка PGC7,
обеспечивающих повышенную устойчивость ме-
тильных групп цитозина к соответствующим
ферментам [Wossidlo et al., 2011].
На стадии пронуклеусов наблюдаются сущест-
венная асимметрия гистоновых белков и разли-
чия посттрансляционых модификаций гистонов
перицентромерного гетерохроматина (ПГХ) от-
цовских и материнских хромосом. Резкий подъ-
ем транскрипционной активности ПГХ совпада-
ет по времени с формированием первых хромо-
центров на стадии двух бластомеров. Предпола-
гается, что последующие изменения, связанные с
архитектоникой интерфазного ядра, расположе-
нием в нем хромосом и началом морфогенетиче-
ской активности генома зародыша, запускаются
транскриптами ПГХ [Probst, Almouzni, 2011].
Мы вернемся к детальному’ обсуждению этого
интересного предположения в разделах 9.5 и 9.6.
На 2-клеточной стадии отцовский геном мор-
фологически становится весьма сходным с мате-
ринским, хотя деметилирование в нем выражено
сильнее. Предполагается, что на этой стадии ус-
танавливаются геноспецифические различия в
модификации гистонов. Никаких данных о нали-
чии детерминант дифференцировки, асиммет-
рично лежащих в ооплазме и у зародышей 2-кле-
точной стадии, нет. Но уже на стадии четырех
бластомеров появляются небольшие различия,
направляющие развитие клеток во внутреннюю
ГЛАВА 9 235
клеточную массу (ВКМ) или в клетки трофоэк-
тодермы (ТЭ) [Surani, Reik, 2010].
Прогрессивное снижение уровня метилиро-
вания связано с истощением в ядре фермента
Dnmtl-метилтрансферазы, который поддержива-
ет полуконссрвативнос метилирование CpG-ди-
нуклсотидов во время репликации ДНК. Поэто-
му’ при митотическом делении количество всей
метилированной ДНК клетки после каждого ра-
унда репликации уменьшается вдвое. Единст-
венным исключением из этого остаются центры
импринтинга кластеров импринтированных ге-
нов (см. раздел 9.7), которые сохраняют свое ме-
тилированное состояние и после исключения из
ядра Dnmtl.
Точные стадии эмбриогенеза человека, когда
начинается экспрессия генов самого зародыша,
неизвестны. В экспериментах на мышах установ-
лено, что белковые продукты, контролируемые
отцовским геномом, могут быть выявлены уже на
стадии двух бластомеров (р2-микрогорбулин, ги-
поксантин-фосфорибозилтрансфераза) и даже на
стадии пронуклсусов (некоторые гены локуса
Н2 — гены Ped, контролирующие время наступ-
ления первого деления дробления) [Dyban,
Baranov, 1987]. К сожалению, сведений о начале
экспрессии этих генов у зародышей человека нам
обнаружить не удалось. Считается, что геном за-
родыша контролирует развитие, начиная со ста-
дии восьми бластомеров [Guraya, 2008]. Однако
имеются данные, свидетельствующие о возмож-
ности транскрибирования отцовского генома уже
на стадии пронуклеусов [Surani, Reik, 2010].
После трех—четырех делений дробления,
т. е. на стадии морулы, отмечается уплощение
наружных бластомеров, изменяются их меж-
клеточные контакты, происходит компактиза-
ция бластомеров. На этой стадии впервые воз-
никает расположенная обособленно группа кле-
ток, дающая при дальнейшем развитии ВКМ, из
которой берут начало все ткани и органы соб-
ственно зародыша. Лежащие снаружи от ВКМ
уплощенные клетки, соединенные между’ собой
прочными межклеточными контактами — дес-
мосомами, становятся клетками ТЭ, из которых
впоследствии формируются цитотрофобласт хо-
риона и плаценты. Морфогенетические процес-
сы, ведущие к дифференцировке гомогенной
массы бластомеров в клетки двух типов (ВКМ и
ТЭ), получили название первичной эмбрио-
нальной индукции. Большинство эпигенетиче-
ских программ индивидуального развития на-
чинает реализовываться именно на этой стадии
эмбриогенеза.
С помощью современных молекулярно-гене-
тических методов (экспрессионные кДНК-мик-
рочипы, глубокое параллельное секвенирование
коротких кДНК с последующей идентификацией
продуктов в соответствующих экспрессионных
библиотеках) изучены 10 различных линий эм-
бриональных стволовых клеток (ЭСК) человека
[Bhattacharya etal., 2009]. В результате иденти-
фицированы гены, общие для всех изученных
линий ЭСК, экспрессия которых происходит уже
на самых ранних стадиях эмбриогенеза человека,
а их белковые продукты необходимы для под-
держания плюрипотентного состояния и диффе-
ренцировки клеток. В общей сложности было
идентифицировано около 100 генов, которые ак-
тивно экспрессируются в ЭСК и, по-видимому,
необходимы для сохранения плюрипотентности
и пролиферации. Эти гены получили название
sternness genes (гены «стволовости»). Главными
генами «стволовости» являются гены ОСТ4,
NANOG, SOX2, DNMT3B, TDCF1, PODX1,
LEFTB, UTF1. Galanin, TERT, DPPA5. GJ Al.
Экспрессия первых трех генов во всех изучен-
ных линиях ЭСК была максимальной. Клетки
ВКМ приобретают высокий уровень метилиро-
вания ДНК с помощью метилтрансферазы
Dnmt3b (рис. 9.5) [Cedar, Bergman, 2009].
Метилирование гистонов НЗК9 и НЗК27 в
клетках ВКМ осуществляется ферментами G9a,
Eset и Ezh2, мутации в генах которых (опыты на
нокаутных мышах) ведут к нарушению развития
ВКМ. В отличие от ВКМ в клетках ТЭ ДНК ос-
тается гипометилированной. Дальнейший анализ
показал, что гены Oct4, Nanog, Sox2 необходимы
для поддержания плюрипотентности клеток ВКМ,
а ген Cdx2 — для детерминации и дифференци-
ровки ТЭ. Особенности метилирования генов
«плюрипотентности» показаны на рис. 9.6
[Cedar, Bergman. 2009]. При дифференцировке
клеток ТЭ к ДНК генов присоединяется ком-
плекс SET (гистонметилтрансфераза G9a + гис-
тондеацетилаза — HDAC), который приводит к
деацетилированию гистонов и метилированию
лизина НЗК9, что служит сигналом для присое-
динения гетерохроматинового протеина 1 (НР1)
и метилаз DNMT3A и DMNT3B. Происходит
локальная гетерохроматизация ДНК de novo.
Процесс первичной дифференцировки на мо-
лекулярном уровне сегодня достаточно детально
изучен в эксперименте и представлен на рис. 9.7.
На стадии морулы (8—16 бластомеров) экспрес-
сируется фактор транскрипции (ФТ) Tead4. Он
активирует гомеодомен каудального типа ФТ
Cdx2, который совместно с ФТ Gata3 индуциру-
236 ЭПИГЕНЕТИКА
Рис. 9.5. Бимодальное метилирование ДНК.
До имплантации большинство CpG-динуклеотидов генома
эмбриона неметилированы (светло-сиреневые кружки). Не-
которые области ДНК упакованы в нуклеосомы, содержащие
метилированный (Me) по лизину в положении 4 гистон НЗ
(НЗК4). Во время имплантации начинается экспрессия ме-
тилтрансфераз DNMT3A и DNMT3B. DNTM3L имеет сродство
к неметилированному НЗК4 и, связываясь с ним, способству-
ет метилированию ДНК в этом участке хроматина (темно-
сиреневые кружки). Если НЗК4 метилирован, то присоедине-
ния ДНК-метилтрансфераз не происходит, и ДНК в таких уча-
стках хроматина не подвергается метилированию de novo (по
[Cedar, Bergman, 2009]).
ет экспрессию Т-бокса гена Eomes. Продукты
последнего регулируют пролиферацию и диф-
ференцировку клеток ТЭ. Однако, их основная
роль, по-видимому, заключается в индукции ге-
на Elf5, который гипометилирован и функцио-
нально активен в клетках ТЭ, но метилирован и
выключен в клетках ВКМ. Так достигается пер-
вая эпигенетическая канализация онтогенеза,
предсказанная еще К. Уоддингтоном. В результа-
те первичной эмбриональной индукции форми-
руются два разных эпигенетических ландшафта:
зародыш оказывается разделенным на два мор-
фологически, функционально и проспективно
различные клона клеток: ТЭ и ВКМ. При этом
эпигенетическая асимметрия метилирования
премоторной области гена Elf5 в ТЭ и ВКМ чет-
ко сохраняется в этих клетках и их производных.
Существенно отметить, что продукты ключевого
гена этой цепочки Elf5 не только потенцируют
экспрессию генов, регулирующих пролифера-
цию и дифференцировку’ клеток ТЭ (Eomes), но
и по принципу’ положительной обратной связи
влияют на активность гена первичного звена
этой цепочки (Cdx2). Другие ФТ в клетках ТЭ
(Ets2, Tcfap2c, Esrrb) также усиливают и моди-
фицируют экспрессию генов основного каскада
(Cdx2—Eomes—Elf5) в клетках ТЭ. При этом
промоторы эмбриоспецифических генов (Oct4,
Nanog) в клетках ТЭ быстро метилирутотся, что
ведет к репрессии этих генов. Окончательная
эпигенетическая фиксация клеток ТЭ и ВКМ
происходит только на стадии бластоцисты. В
экспериментах на мышах показано, что направ-
ленное выключение синтеза ТФ Cdx2 приводит к
нару’шению процессов поляризации и компакти-
зациии бластомеров, блокирует дифференциров-
ку клеток ТЭ [Hemberger et al., 2010].
Включение каскада ФТ Cdx2 Eomes Elf5 на
стадии компактизации (8—16 клеток) является
первым и, по-видимому, основным сигналом к
дифференцировке изначально тотипотентных
Рис. 9.6. Выключение генов плюрипотентности.
В эмбриональных стволовых клетках CpG-островки в генах плюрипотентности Oct3/4 и Nanog неметилированы (светло-
сиреневые кружки) и упакованы с ацетилированным (Ас) гистоном НЗ и Н4 и метилированным НЗК4. При дифференцировке
гистоновая метилтрансфераза G9a вместе с гистоновой деацетилазой HDAC связываются с этими участками хроматина, что
приводит к локальному деацетилированию. При этом происходит деметилирование НЗК4. Затем метилтрансфераза G9a ката-
лизирует метилирование НЗК9, вследствие чего присоединяется НР1 и формируются гетерохроматиновые области. В завер-
шение происходит метилирование ДНК de novo (темно-сиреневые кружки) метилазами DNMT3A и DNMT3B (по [Cedar
Bergman, 2009]).
ГЛАВА 9 237
бластомеров в клетки ТЭ и ВКМ. Становление
двух клеточных линий происходит в результате
сложных взаимодействий генетических и эпиге-
нетических факторов, зависит от взаимоположе-
ния клеток в моруле относительно друг друга
(гипотеза «снаружи—внутри» А. Мак-Ларен и
А. Тарковского), их поляризации и числа пред-
шествующих делений дробления (пространст-
венно-поляризационная теория Джонсона) [Dy-
ban, Baranov, 1987]. Гипометилированное со-
стояние генов ТЭ и гиперметилированное клеток
ВКМ сохраняется при дальнейшем развитии и в
настоящее время рассматривается как важный
фактор успешной имплантации и плацентации
зародыша человека. При дифференцировке кле-
ток ТЭ к ДНК генов присоединяется комплекс
SET (гистонметилтрансфераза G9a + гистонде-
ацетилаза — HDAC), который приводит к деаце-
тилированию гистонов и метилированию лизина
НЗК9, что служит сигналом для присоединения
гетерохроматинового протеина 1 (НР1) и мети-
лаз DNMT3A и DMNT3B и приводит к локаль-
ной гетерохроматизации ДНК ТЭ de novo.
Важные успехи последних лет, связанные с
пониманием генетических механизмов диффе-
ренцировки клеток ТЭ, были достигнуты в опы-
тах с эмбриональными стволовыми клетками,
полученными из ТЭ [Schultz etal., 2008]. При
культивировании in vitro такие клетки агрегиру-
ют с образованием полых нузырьков — «эмб-
риоидных телец», напоминающих размерами и
формой бластоцисты. Введение в такие пузырь-
ки специфических малых РНК (siPHK) позволяет
избирательно выключать гены соответствующих
метаболических цепей и изучать их влияние на
дифференцировку.
Установлено, что выключение генов тотипо-
тентности ОСТ4. SOX2, NANOG и одновремен-
ная активация генов BMP4. CDX2. CGA. CGB,
EOMES, GCM1, GATA2, ID2 в ЭСК человека оп-
ределяет начало их дифференцировки в клетки
ТЭ [Ibid], Важная роль в выборе «трофобласти-
ческого» пути дифференцировки ЭСК отводится
гену’ ростового фактора BMP4.
Другим критическим геном дифференциров-
ки клеток ТЭ, определяющим их пролиферацию
и тотипотентность, оказался ген ростового фак-
тора фибробластов — FGF2. который также ин-
дуцирует включение генов инсулинподобных
ростовых факторов IGF2 и IGFfi. Последователь-
ность включения генов ТЭ зависит от содержа-
ния кислорода.
Рис. 9.7. Иерархия транскрипционных факторов, обеспечивающих специализацию, коммитирование и первичную
дифференцировку бластомеров дробящихся зародышей мышей на трофоэктодерму и внутреннюю клеточную
массу. Эпигенетическая фиксация проспективной судьбы клеток завершается на стадии бластоцисты, когда про-
исходит метилирование гена Elf5 (по [Hemberger et al., 2010]).
ICM — внутренняя клеточная масса; ТЕ — трофоэктодерма; РЕ — первичная эктодерма; EPI — эпибласт; ЕхЕ — экстра-
эмбриональная эктодерма.
238 ЭПИГЕНЕТИКА
9.2.3. Эпигенетические циклы
Х-хромосомы
Важнейшим эпигенетическим событием доим-
плантационных стадий эмбриогенеза является фе-
номен инактивации Х-хромосомы у особей жен-
ского пола. Его молекулярные механизмы под-
робно рассмотрены в других главах этой книги.
В течение развития организма Х-хромосома
у особей женского пола проходит несколько
циклов эпигенетического репрограммирования.
В 1111К, возникших в эпибласте (см. раздел 9.2.4),
одна из Х-хромосом инактивирована. Однако,
после достижения зачатка гонад и формирования
первичных фолликулов, т. е. уже в ооцитах, про-
исходит реактивация «молчащей» Х-хромосомы.
Обе Х-хромосомы функционально активны на
стадии созревания ооцитов вплоть до возобнов-
ления мейоза за несколько часов до овуляции
[Дыбан, Баранов, 1978; Баранов, Кузнецова, 2007].
Уже во время дробления оплодотворенной яйце-
клетки происходит активация гена X1ST отцов-
ской Х-хромосомы, которая оказывается инакти-
вированной. После первичной эмбриональной
индукции Х-хромосома отца остается «выклю-
ченной» в клетках ТЭ и ее производных (цито-
трофобласт хориона, плаценты), тогда как во
ВКМ она реактивируется, о чем свидетельствует
наличие двух активных Х-хромосом в эмбрио-
нальных стволовых клетках, полученных из
ВКМ [Surani, Reik, 2010]. Блок Х-хромосомы
связан с функцией гена Xist, нетранслируемая
РНК которого покрывает всю Х-хромосому и
ведет к сайленсингу’ ее генов. В клетках ВКМ
транскрипция гена Xist подавляется, происходит
реактивация Х-хромосомы, но с началом образо-
вания зародышевых листков и дифференцировки
ВКМ одна из Х-хромосом (отцовская или мате-
ринская) подвергается случайной инактивации,
которая стабильно сохраняется во всех клетках
женского организма.
9.2.4. Возникновение и развитие ППК
Со времен появления столь нашумевшей в
истории естествознания теории «непрерывности
зародышевой плазмы» А. Вейсмана проблема
возникновения ППК у млекопитающих и чело-
века постоянно волновала ученых. Ареал поиска
стадии эмбриогенеза, когда возникают ППК,
равно как и место их первичного появления, по-
стоянно уточнялись по мере того, как станови-
лись известными все новые, более ранние цито-
логические маркеры [Дыбан, 1988]. Согласно
последним данным [Surani, Reik, 2010], ППК
формируются в проксимальной части эпибласта
(первичной эктодермы — ПЭК) под влиянием
сигнальных молекул внеэмбриональной экто-
дермы — продуктов генов Втр4 и Втр8Ь. Пер-
выми маркерными белками ППК оказались
трансмембранный белок fragilis и цитоплазмати-
ческий белок Stella. Но основным геном, с кото-
рого начинается эпигенетическое становление
ППК у мышей, оказался ген Blimpl (B-lympho-
cyte maturation induced protein-1), который ранее
был известен как репрессор транскрипции плаз-
матических клеток. На стадии Е6.25 (ранняя га-
струляция) ген Blimpl экспрессируется только в
четырех—шести клетках, которые находятся в
непосредственном контакте с клетками эпибла-
ста. Мутации в гене Blimpl ведут к остановке
развития ППК, в то же время ген предохраняет
развитие ППК по соматическому’ пути. В ППК
также активно экспрессируются плюрипотент-
ные гены Sox 2. Oct-4, Nanas3 и репрессированы
гены семейства Hax (Haxlb, Haxla), которые оп-
ределяют соматическую судьбу’ клеток.
Начиная со стадии Е8, в хромосомах ППК ис-
чезает метильная метка гистона НЗК9те2,
уменьшается уровень HP 1а в эу хромали новых и
перицентромерных гетерохроматиновых рай-
онах (ст. Е9.0). Происходит снижение общего
уровня метилирования ДНК, которое коррелиру-
ет с репрессией ферментов Dnmt3a и Dnmt3b
[Surani. Reik. 2010].
9.2.5. Анализ репрограммирования генома
ранних зародышей человека
с помощью антител
к 5-метилцитозину
Согласно многочисленным исследованиям на
зародышах млекопитающих, метилирование ДНК
представляет собой универсальный и, по-види-
мому, один из основных механизмов регуляции
активности генов в развитии. Успешное получе-
ние антител к 5-метилцитозину’ сделало возмож-
ной прямую визуализацию распределения на
хромосомах участков ДНК, обогащенных мети-
лированными CpG-динуклсотидами. Естествен-
но. что на цитологических препаратах с помо-
щью т5С-антител можно выявлять только доста-
точно большие (не менее 100 динуклеотидов)
кластеры таких CpG-динуклеотидов. Использо-
вание этого метода обеспечивает хорошо вос-
производимые результаты и позволяет прово-
дить информативный анализ даже на небольшом
количестве материала [Santos, Dean, 2006].
ГЛАВА 9 239
Впервые такой подход был апробирован на
эмбрионах мышей [Rougier etal., 1998]. Был ис-
следован паттерн метилирования хромосом от
зиготы до стадии бластоцисты. Установлено, что
на метафазе 1-го деления дробления хромосомы
женского пронуклсуса обнаруживают яркий ри-
сунок поперечной исчерченности, подобный R-
бэндингу. Хромосомы из мужского пронуклсуса
были сильно вытянуты и слабо окрашивались
дифференциально. На стадии двух бластомеров
отцовские и материнские хромосомы были так-
же различимы по степени спирализации и ин-
тенсивности окраски, однако, наиболее примеча-
тельным на этой стадии было окрашивание ан-
тителами только одной из хроматид и отсутствие
связывания специфических антител с друтой. Фе-
номен асимметричной локализации 5-метилци-
тозина в ДНК сестринских хроматид был назван
гемиметилированием [Rougier et al., 1998]. Такое
состояние может достигаться как за счет пассив-
ного деметилирования, при котором новосинте-
зированная цепь ДНК не метилируется в отли-
чие от исходно метилированной старой цепи
[Howlett, Reik, 1991], так и за счет активного де-
метилирования ДНК. На отдельных асиммет-
рично меченных хромосомах были заметны се-
стринские хроматидные обмены. Число таких
асимметрично меченных хромосом уменьшалось
примерно вдвое после каждого раунда реплика-
ции и уже не определялось на стадии бластоци-
сты, когда все хромосомы были бледно окраше-
ны, хотя и обнаруживали поперечную исчерчен-
ность [Rougier et al., 1998].
Использование антител к т5С позволило по-
лучить данные о выраженном деметилировании
CpG-динуклсотидов в пронуклсусах у ряда мле-
копитающих и у человека [Beaujean et al., 2004;
Fulka etal., 2006]. Установлена разная степень
метилирования ДНК в пронуклсусах: отцовский
пронуклеус, как правило, был гипометилирован
в сравнении с материнским [Beaujean et al., 2004;
Fulka et al., 2004; Xu et al., 2005]. Анализ паттер-
на метилирования метафазных хромосом чело-
века на разных стадиях доимплантационного
развития проведен в наших исследованиях [Ба-
ранов и др., 2005; Pendina et al., 2011].
На стадии пронуклсусов и метафазы 1-го де-
ления дробления хромосомы человека характе-
ризуются неравномерным распределением 5-ме-
тилцитозина, при этом различия интенсивности
флуоресценции гомологичных хромосом свиде-
тельствуют о неодинаковом статусе метилиро-
вания. Сигнал на слабометилированных хрома-
тидах свидетельствует о том, что активному’ де-
метилированию подвергаются не все последова-
тельности ДНК. Некоторые участки сохраняют
свой метилированный статус, в результате чего
образуются так называемые недометилирован-
ные хромосомы (рис. 9.8, а).
После первого деления дробления отмечают-
ся существенные изменения статуса метилиро-
вания ДНК метафазных хромосом. На стадии
метафазы 2-го деления дробления все хромосо-
мы характеризуются асимметричным метилиро-
ванием сестринских хроматид. При этом разли-
чия в характере метилирования гомологов со-
храняются. На этой стадии, однако, они харак-
терны только для одной — сильнее метилиро-
ванной — сестринской хроматиды каждой хро-
мосомы. Степень метилирования второй хрома-
тиды меньше и одинакова в гомологах. В зави-
симости от степени метилирования можно выде-
лить три типа хроматид: метилированные, гипо-
метилированные и недометилированные (про-
межуточная степень метилирования). Разный
эпигенетический статус отцовских и материн-
ских хромосом после первого деления дробления
еще сохраняется (рис. 9.8, б).
У 4-клеточных зародышей характер метили-
рования ДНК хромосом меняется. Появляются
хромосомы, у которых обе хроматиды гипоме-
тилированы. Последнее может быть результатом
дальнейшего пассивного деметилирования гено-
ма зародыша, при сохранении низкого остаточ-
ного уровня метилирования ДНК в обеих хрома-
тидах. В свою очередь, это подтверждает пред-
положение о том, что некоторые последователь-
ности ДНК сохраняют метилированное состоя-
ние цитозина и после репликации. Выявляемые
на этой стадии три типа хромосом — два подти-
па гемиметилированных и гипометилирован-
ные — свидетельствуют о том, что сегрегация
по-разному’ метилированных хроматид после
второго деления дробления происходит случай-
ным образом. В результате в дочерних клетках
оказываются комбинации хромосом с разным
статутом метилирования. Число возможных
комбинаций для одной диады гомологов состав-
ляет 4, а для одной триады — 8. Следует отме-
тить, что в пределах всего генома число сочета-
ний диад с различными комбинациями гомоло-
гов составит 423 в случае диплоидного зародыша
и 823 в случае триплоидного (рис. 9.8, в, рис. 9.9).
На стадии пяти—восьми бластомеров число
гипометилированных хромосом продолжает уве-
личиваться, вероятнее всего, в результате пас-
сивного деметилирования. Примечательно, что
некоторые метафазные пластинки 8-клеточных
240 ЭПИГЕНЕТИКА
Рис. 9.8. Окрашивание метафазных хромосом человека методом QFH/AcD (голубой) и иммуноцитохимическая
детекция 5-метилцитозина с помощью моноклональных антител/FITC (зеленый).
а — метафазные хромосомы из трех отдельно лежащих пронуклеусов зиготы человека. Два гомолога метилированы слабее, чем
третий, б—фрагмент метафазной пластинки из бластомера 2-клеточного зародыша человека. Сестринские хроматиды всех хро-
мосом метилированы асимметрично — гемиметилированы. Гомологичные хромосомы характеризуются разными паттернами ме-
тилирования: одна хроматида метилирована одинаково слабо в каждом гомологе из пары хромосом, в то время как вторая мети-
лирована сильнее, но различается по интенсивности метилирования между гомологичными хромосомами, е — метафазные хро-
мосомы из бластомера 4-клеточного зародыша. Гемиметилированные и гипометилированные хромосомы встречаются в разных
сочетаниях в триадах гомологов, г — фрагмент метафазной пластинки из бластомера 8-клеточного зародыша. Паттерн метилиро-
вания ДНК сегментспецифичен. д — метафазные хромосомы из бластоцисты характеризуются сегментспецифичным распределе-
нием msC. е — метафазные хромосомы из культивированных лимфоцитов взрослого индивида имеют сегмент-специфичное рас-
пределение 5-метилцитозина [Пендина и др., 2005]. ж—фрагменты метафазных хромосом бластоцисты человека: хромосомы
метилированы гомогенно и слабо, з — прицентромерный гетерохроматин хромосом культивированных лимфоцитов 1, 9 и 16
взрослых и зародышей на стадиях одной, двух, четырех, восьми клеток и бластоцист. Гетерохроматиновые блоки (показаны крас-
ным) сильно метилированы в хромосомах из лимфоцитов, но характеризуются слабым метилированием или его полным отсутст-
вием у 1-, 2-, 4-, 8-клеточных зародышей и на стадии бластоцисты [Pendina et al., 2011].
ГЛАВА 9 241
Метилированная хроматида
Недометилированная хроматида
Гипометилированная хроматида
Зигота
первое
деление
дробления
2-клеточная стадия
Рис. 9.9. Схема возможных комбинаций в разной степени метилированных хроматид
гомологичных хромосом после первого и второго деления дробления триплоцдной зи-
готы человека.
После первого деления каждая хромосома состоит из одной метилированной/недомети-
лированной и одной гипометилированной хроматиды. Случайное расхождение хроматид на ста-
дии второго деления приводит к одной из восьми возможных комбинаций гомологичных геми- и
гипометилированных хромосом на стадии метафазы в каждом бластомере 4-клеточного эмбриона
[Pendina etal., 2011].
зародышей уже приобретают характерный сег-
ментспецифичный рисунок, напоминающий
т5С-сегментацию хромосом из ФГА-стимулиро-
ванных лимфоцитов (рис. 9.8, г, е). Неравномер-
ное распределение 5-метилцитозинобогащенной
ДНК вдоль плеч хромосом свидетельствует о
том, что на стадии восьми бластомеров начина-
ется метилирование /ТНК de novo. Это событие
совпадает с утратой тотипотентности и перехо-
дом к плюрипотентности.
На стадии бластоцисты характер метилирова-
ния ДНК метафазных хромосом зародышей че-
ловека претерпевает существенные изменения
(рис. 9.8, д). Гипо- и гемиметилированное со-
стояние хромосом почти повсеместно заменяет-
ся на рисунок типичной т5С-сегментации с пре-
имущественной локализацией флюоресцентной
метки в R-сегментах. Возможно, появление ри-
сунка МеС-сегментации свидетельствует о за-
вершении репрограммирования генома зароды-
ша. Однако такой рисунок характерен для хро-
мосом не всех бластомеров, что, возможно, свя-
зано с процессом их дифференцировки в трофоэк-
тодсрму и внутреннюю клеточную массу (см.
раздел 9.2.2). При изучении метилирования ДНК
интерфазных ядер зародыша человека показано,
что ДНК в клетках ТЭ метилирована сильнее,
чем в клетках ВКМ [Fulka et al., 2004]. Интерес-
но, что у доимплантационных зародышей мы-
шей наблюдается обратная зависимость: высо-
кий уровень метилирования ДНК характерен для
метафазных хромосом и ядер клеток ВКМ, в то
время как клеткам ТЭ свойственно гипометили-
рованное состояние ДНК [Rougier et al., 1998;
Fulka et al., 2004].
Для гетерохроматиновых блоков хромосом из
бластомеров человека на протяжении доимплан-
тационного развития до стадии бластоцисты ха-
рактерен низкий уровень метилирования или
даже его полное отсутствие (рис. 9.8, з). Др сих
пор спорным остается вопрос о значении гипо-
метилированного состояния гетерохроматина в
раннем эмбриогенезе млекопитающих. Полага-
ют, что низкий уровень содержания 5-метилци-
тозина в гетерохроматиновых районах перицен-
тромерного хроматина не только важен для ре-
программирования генома зародыша, но и свя-
зан с их транскрипционной активностью, обес-
печивающей функциональную активность гено-
ма зародыша (см. разделы 9.5 и 9.6).
242 ЭПИГЕНЕТИКА
9.2.6. Эпигенетические факторы
патологии ранних зародышей
Нарушения доимплантационого развития мо-
гут быть следствием неполноценности гамет,
нарушения процесса оплодотворения либо экс-
прессии генов, контролирующих раннее разви-
тие. Такие мутации многочисленны у лабора-
торных мышей [Дыбан, Баранов, 1978], но пока
неизвестны у человека, хотя опыт работы кли-
ник вспомогательных репродуктивных техноло-
гий (ВРТ) позволяет предполагать их наличие
[Verlinsky. Kuliev. 2000].
Вклад наследственных и эпигенетических
факторов в патологию развития ранних зароды-
шей человека не вызывает сомнения. Наиболее
частыми нарушениями на доимплантационных
стадиях являются отсутствие или задержка дроб-
ления, полиспермное оплодотворение, фрагмен-
тация и гибель бластомеров. Есть основание
предполагать, что основной вклад в патологию
доимплантационного развития человека вносят
хромосомные аномалии [Баранов, Кузнецова,
2007; Лебедев, Саженова, 2008].
Удивительной особенностью доимплантаци-
онных зародышей человека является необычно
высокая эпигенетическая пластичность в плане
возможностей коррекции своего хромосомного
набора. Еще в 1997 г. английскими исследовате-
лями Р. Эдвардсом и Е. Бэрд [Edwards, Beard.
1997] было установлено, что почти 80 % дробя-
щихся зародышей человека являются гетеропло-
идными, т. е. содержат бластомеры как с нор-
мальным диплоидным, так и с анеуплоидным
числом хромосом. Действительно, метод мас-
штабного сканирования генома (arrayCGH) не-
давно подтвердил наличие хромосомных абер-
раций у более чем 80 % зародышей человека,
полученных в программах ЭКО [Vanneste et al..
2009]. Эти результаты дают основание считать,
что хромосомный мозаицизм до 10—12-клеточ-
ной стадии, по всей видимости, является осо-
бенностью нормального развития человека, при-
чем в подавляющем большинстве случаев анеу-
плоидные бластомеры не попадают в состав кле-
ток ВКМ и подвергаются элиминации. Еще бо-
лее неожиданной оказалась коррекция кариоти-
па, т. е. возврат к диплоидному’ состоянию заро-
дышей, исключенных для трансплантации в мат-
ку’, после проведения доимплантационного ка-
риотипирования в связи с наличием анеуплои-
дии. Эти наблюдения подтверждают мнение ве-
дущих специалистов по ВРТ, предлагающих от-
казаться от диагностики анеуплодии на 3-й день
после ЭКО в связи с высокой вероятностью
ошибок при анализе единичных бластомеров
[Harper, 2010].
Итак, у млекопитающих и человека выделяют
две волны эпигенетического репрограммирова-
ния генома, которые соответствуют периодам
гаметогенеза, дробления и формирования бла-
стоцисты.
Эпигенетическое репрограммирование в гаме-
тогенезе касается стирания всей эпигенетиче-
ской информации в ПИК и избирательного ме-
тилирования генома женских и мужских гамет в
процессе их развития.
Эпигенетическое репрограммирование гено-
ма у доимплантационых зародышей включает
две последовательные фазы: деметилирование и
реметилирование ДНК. Процессы деметилиро-
вания в мужском пронуклеусе обеспечиваются
особыми ферментами — деметилазами, ДНК
женского пронуклсуса деметилируется пассивно,
и это связано с истощением запасов фермента
Dnmtl-метилтрансферазы, поддерживающего по-
луконсервативное метилирование CpG-динук-
леотидов во время репликации ДНК. Деметили-
рование ДНК бластомеров быстро нарастает уже
после первых делений дробления и достигает
максимума уже на стадии морулы, после чего
начинается реметилирование генома.
Включение каскада ФТ Cdx2Eomes Elf5 на
стадии компактизации (8—16 клеток) является
основным сигналом к дифференцировке изна-
чально тотипотентных бластомеров в клетки ТЭ
и ВКМ. Важная роль в каскаде отводится гену’
Elf5, который функционально активен в клетках
ТЭ, но метилирован и выключен в клетках ВКМ.
Установлено, что гены Oct4, Nanog, Sox2 необ-
ходимы для поддержания плюрипотентности
клеток ВКМ, а гены Cdx2 и Elf5 — для детерми-
нации и дифференцировки ТЭ.
Таким образом, становление двух клеточных
линий происходит в результате сложных взаи-
модействий генетических и эпигенетических фак-
торов, зависит от взаимоположения клеток отно-
сительно друг друга в моруле (гипотеза «снару-
жи—внутри» А. Мак-Ларен и А. Тарковского),
их поляризации и числа предшествующих деле-
ний дробления (пространственно-поляризацион-
ная теория Джонсона). Гипометилированное со-
стояние генов в ТЭ и гиперметилированное в
клетках ВКМ сохраняется при дальнейшем раз-
витии и рассматривается как важный фактор ус-
пешной имплантации и плацентации зародыша.
Вследствие первичной дифференцировки дости-
гается эпигенетическая канализация онтогенеза.
ГЛАВА 9 243
Формируются два эпигенетических ландшафта:
трофобластический и эмбриональный, соответ-
ствующие двум морфологически, функциональ-
но и проспективно различным клонам клеток:
ТЭ и ВКМ. Другим примером становления эпи-
генетических ландшафтов в эмбриогенезе явля-
ется феномен генетической инактивации одной
из Х-хромосом у особей женского пола. Эпиге-
нетическую изменчивость в эмбриональном раз-
витии хорошо иллюстрируют и механизмы воз-
никновения 1111К. В настоящее время установле-
но, что единичные ППК у мышей идентифици-
руются в эпибласте, начиная со стадии ранней
гаструлы (6,25 д. р.). Основным геном, вклю-
чающим программу их возникновения и разви-
тия, является ген Blimp 1, экспрессия которого
четко скоординирована с работой других «ран-
них» генов, прежде всего, генов «плюрипотент-
ности» (ОСТ4, SOX2, NANOG).
Цитогенетические исследования паттерна ме-
тилирования метафазных хромосом зародышей с
помощью моноклональных антител к 5-метилци-
тозину позволили обнаружить различия роди-
тельских наборов в окраске и степени спирали-
зации хромосом в 1-м делении дробления, появ-
ление гемиметилированных хромосом во 2-м, их
постепенное исчезновение при последующих
делениях дробления в результате включения ме-
ханизма метилирования и быстрое нарастание
числа хромосом с R-подобным ш5С-бэндингом
на стадиях морула—бластоциста. Полученные
результаты находятся в хорошем соответствии с
данными молекулярно-генетических исследова-
ний доимплантационных зародышей человека.
9.3. Эпигенетические процессы
НА СТАДИЯХ ИМПЛАНТАЦИИ
И ПЛАЦЕНТАЦИИ
Процесс имплантации знаменует собой пер-
вый непосредственный контакт двух самостоя-
тельных организмов и направлен на их взаимное
узнавание, удержание зародыша в матке, форми-
рование клетками ТЭ ворсин хориона, переход
от гистиотрофного к гемотрофному' способу пи-
тания. Итогом плацентации является формиро-
вание самостоятельного органа, обеспечивающе-
го всю трофику- зародыша, в том числе доставку
питательных веществ к плоду-, его дыхание,
энергетические потребности, процессы выделе-
ния, метаболизм гормонов и др. Таким образом,
имплантация и плацентация являются результа-
том сложных морфогенетических процессов, за-
трагивающих организмы как плода, так и мате-
ри. Необходимость синхронизации этих процес-
сов во времени и пространстве требует высокой
точности генетического и эпигенетического кон-
троля их реализации, что делает эти стадии
очень уязвимыми к любым неблагоприятным эк-
зогенным и эндогенным факторам. Неслучайно
именно имплантация и плацентация, по мнению
ведущего отечественного эмбриолога П. Г. Свет-
лова [1960], рассматриваются как главные кри-
тические периоды развития в эмбриогенезе мле-
копитающих и человека.
Эмбриология и гистология процессов им-
плантации зародыша человека изложена во мно-
гих руководствах по эмбриологии и акушерству.
Основные сведения на эту- тему суммированы в
нашей монографии по цитогенетике эмбрио-
нального развития человека [Баранов, Кузнецо-
ва, 2007].
9.3.1. Генетические аспекты
имплантации
Зародыши человека периода имплантации
практически недоступны для исследования. По-
этому- основные сведения о генетических меха-
низмах этого процесса были получены в иссле-
дованиях, выполняемых в рамках программ ВРТ,
на материале спонтанных и индуцированных
(медицинских, социальных) абортов, а также в
экспериментах на лабораторных животных (мы-
ши, обезьяны). В последние годы важные сведе-
ния на эту- тему- стали доступны благодаря ис-
пользованию в качестве экспериментальной мо-
дели эмбриональных стволовых клеткок [Schultz
et al., 2008].
Напомним, что зародыш человека попадает в
матку на стадии морулы — ранней бластоцисты
примерно на 4—5-й день после оплодотворения.
Непосредственный контакт бластоцисты с клет-
ками эндометрия, выстилающими полость мат-
ки, служит сигналом к «хэтчингу» — выходу-
вылуплению) бластоцисты из окружающей ее
блестящей оболочки, началу- активной экспрес-
сии многих генов как в клетках ТЭ, так и в клет-
ках децидуальной ткани матки. После разруше-
ния блестящей оболочки клетки ТЭ превраща-
ются в клетки трофобласта (ТБ) и начинают ак-
тивно синтезировать гормон — хорионический
гонадотропин (тест на беременность!), а также
ферменты, вызывающие гибель прилежащих к
ним клеток эндометрия, что провоцирует ло-
кальную воспалительную реакцию. Клетки ТБ
приобретают инвазивные свойства, обеспечива-
ют гистиотрофное питание зародыша и сам про-
244 ЭПИГЕНЕТИКА
цесс имплантации, т. е. проникновение зароды-
ша в глубь стенки матки, где они вступают в не-
посредственный контакт со слизистой оболочки
и с помощью литических ферментов разрушают
сначала эпителиальный, а затем и подлежащие
слои децидуальных клеток. Продолжительность
имплантации у человека от момента прикрепле-
ния плодного яйца до ее полного погружения в
эндометрий составляет около 40 часов.
Как уже отмечалось (см. раздел 9.2.3), ста-
новление клеток ТЭ и их превращение в клетки
ТБ, ограничивающие полость бластоцисты, —
бластоцель, находятся под контролем факторов
транскрипции основного каскада Cdx2 Eomes—
Elf5 и сопровождаются быстрым угнетением ак-
тивности ключевых генов плюрипотентности
(ФТ) — ОКТ4 и SOX2, которые включают каскад
новых ФТ, таких как FGF4 (фактор роста фиб-
робластов) и ВМР-4 — ростовой фактор, необ-
ходимый для дифференцировки клеток ТЭ и, как
ни удивительно, вовлеченный в индукцию ППК
(см. раздел 9.2.4). Он также индуцирует экспрес-
сию генов-ФТ: GATA2, GATA3, АР2 (TFAP2),
включает гены ФТ, ответственные за синтез хо-
рионического гонадотропина (hCG), HLA-G (см.
ниже), а также гены прогестерона (PG), эстра-
диола (ETS2) и цитохрома CYP11 [Rawn, Cross,
2008]. Главные генетические факторы диффе-
ренцировки и становления клеточных линий ТБ
приведены на рис. 9.10.
Основные исследования по изучению генети-
ческих механизмов имплантации до 2000 г. были
выполнены т vitro путем анализа образцов пи-
тательных сред, в которых культивировали до-
Мышь
GATA6., ВКМ
^Z^Nandg
Первичная
энтодерма Эпибласт
Экстраэмбрион ал ьная
Мезодерма эктодерма (хорион)
\ Gcm1 У
Лабиринт
(синцитиотрофобласт,
мезенхима,
эндотелии)
Oct4 [-]
Cdx2 [+]
Трофоэктодерма
Cdx2|
Eomes I
Errbl
-FGF4
тек
£
Fgfr2 [+]
Eomes [+]
Errb [+]
j?Sox2 [+]
Неделящиеся
полиплоидные
клетки
mSNA
Спонгиотрофобласт
+FGF4
Много-
* ядерные
клетки
Mash2 [-]
Handl [-]
Gcm1 [+]
Mash2 [-]
Handl [-]
Gcm1 [-]
Mmp9 [+]
uPa [+]
Gcm1 [+]
Рис. 9.10. Факторы транскрипции, регулирующие формирование плаценты у мышей и у человека (по [Roberts
et aL, 2004]).
ТСК — стволовые клетки трофобласта, ЭСК — эмбриональные стволовые клетки.
ГЛАВА 9 245
имплантационные зародыши человека. Найдено,
что экспрессия генов зародыша, контролирую-
щих имплантацию, происходит уже после пер-
вых делений дробления (4—8 бластомеров), т. е.
значительно раньше «хэтчинга». Несколько ус-
ловно в связи с многообразием и наличием
сходных или даже перекрывающихся функций
гены «имплантации» и контролируемые ими
продукты можно разделить на несколько групп:
1. Гены пролиферации и дифференцировки
ГБ: EGF, EGF-R, FGF-4, FGFa, PDGFA (росто-
вой фактор тромбоцитов), IGF-2, TIMP-1, VEGF,
VEGF-R.
2. Гены, контролирующие процесс инвазии'
IL2, IL6, TNFa, DAF, ММР 1—9 (семейство мат-
риксных металлопротеиназ), ЕТ (эндотелиин),
ВР (гены семейства связывающих белков).
Ъ.Гены, лимитирующие инвазивные свой-
ства ГБ: TIMP 1—3, TGF^, LIE
4. Гены воспалительной реакции: PAF (фак-
торы активации тромбоцитов), CSF (колоние-
стимулирующий фактор) IL1. IL6.
9.3.2. Метилом клеток трофобласта
Под термином метилом понимают метилиро-
ванную часть генома, включающую структурные
гены, их премоторные CpG-богатые участки, а
также метилированные межгенные последова-
тельности ДНК.
Первичным актом дифференцировки дробя-
щейся яйцеклетки человека является метилиро-
вание гена ELF5 в клетках презумптивной ВКМ
и сохранение его активного, гипометилирован-
ного состояния в будущих клетках ТЭ. Напро-
тив, промоторы генов тотипотентности (ОСТ4,
SOX3, NANOG) в клетках презумптивной ТЭ бы-
стро метилируются, и их транскрипция вскоре
прекращается. Эпигенетическая асимметрия ме-
тилирования многих генов ТЭ и ВКМ сохраня-
ется и при дальнейшем развитии и пролифера-
ции соответствующих клеточных клонов.
Характерной особенностью клеток ТБ явля-
ется выраженная гипометилированность межген-
ных областей, в частности, ДНК-повторов и
районов перицентромерного гетерохроматина
(рис. 9.11). Гипометилированное состояние этих
районов приводит к активации находящихся в
них ретротранспозонов и эндогенных ретрови-
русов. Продуцируемые ими малые РНК посту-
пают из ТЭ во ВКМ, где блокируют экспрессию
генов клеточной дифференцировки, поддер-
живая, наряду- с другими ФТ (ОСТ4, SOX3,
NANOG), тотипотентное состояние клеток эм-
бриобласта [Hemberger, 2010]. Считается, что
гипометилированный геном клеток ТБ важен для
нормальной плацентации, стимулирует экспрес-
сию генов, определяющих инвазивные свойства
ТФБ (см. выше), его полиплоидизацию и форми-
рование синцитиотрофобласта.
Рис. 9.11. Характер метилирования ДНК прицентромерного гетерохромати-
на хромосом 1, 9 и 16 из клеток эмбриональных и экстраэмбриональных
тканей и лимфоцитов периферической крови человека.
Окрашивание с помощью моноклональных антител к 5-метилцитозину/Б1ТС [Баранов
и др., 2005].
246 ЭПИГЕНЕТИКА
Отсутствие метилирования перицентромер-
ного хроматина в клетках цитотрофобласта хо-
риона и плаценты установлено нами в исследо-
ваниях с использованием моноклональных анти-
тел. специфичных к 5-метилцитозину [Баранов
и др., 2005]. Как видно на рис. 9.11, отсутствие
окраски перицентромерного хроматина в хромо-
сомах 1, 9, 16 было характерной особенностью
клеток цитотрофобласта, тогда как на хромо-
сомных препаратах из других тканей и органов
зародышей тех же стадий развития, а также
в стимулированных лимфоцитах перифериче-
ской крови эти же районы обнаруживали яркую
флюоресценцию. Полученные результаты свиде-
тельствовали о гипометилированном и, возмож-
но, функционально активном состоянии пери-
центромерных районов в клетках цитотрофобла-
ста. Эти любопытные данные будут подробно
рассмотрены в разделе 9.5.
9.3.3. Развитие плаценты
Процесс начинается с 3-й недели беременно-
сти и характеризуется активным ростом ворсин
хориона в месте врастания сосудов плода. В об-
ласти формирования плаценты — decidua basalis
(участок стенки матки между’ зародышевым пу-
зырем и миометрием матки) ворсинки хориона
растут особенно бурно. Сильно утолщенная deci-
duas basalis, пронизанная ворсинками хориона,
образует плодную часть дефинитивной хорио-ал-
лантоидной плаценты гемохориального типа.
Методами общегеномного скрининга в соче-
тании с методом экспрессионных чипов иденти-
фицированы новые гены и изучены экспресси-
онные профили генов плаценты человека на раз-
ных стадиях развития [Sood et al., 2006; Rawn,
Cross, 2008]. Так, при сравнении экспрессион-
ных профилей клеток плаценты с таковыми 20
других тканей организма были выявлены 54 ге-
на, резко различающихся по своей активности в
других тканях либо экспрессирующихся пре-
имущественно в плаценте (CDKN1L, РАРР-М,
SPARC-, CAVP, TIMP3-, HIF2x-, IGF2- GPC3 и др.)
[Sood et al., 2006]. Дальнейшие исследования по-
зволили существенно расширить и уточнить «ре-
пертуар» плацентарных генов. В частности, бы-
ли идентифицированы такие плацентоспецифич-
ные гены как Tpbp, Placl, Syncytin, целые се-
мейства плацентарных генов (Gcml, Mash2,
Rhox, Esxl6, Cathepsin, PAG, TKDP, Psg, Siglec),
гены плаценты, экспрессия которых тесно связана
с активностью входящих в их структуру или в
регуляторные области ретротранспозонов (PeglO,
Rtll, Endothelin В receptor, Leptin, I ns 14, Midline 1,
Pleiotrophiri). Показано, что функция этих генов
в плаценте аналогична таковой при экспрессии
этих генов в тканях самого эмбриона. Их про-
дукты также участвуют в других, не характер-
ных для плаценты метаболических путях и реак-
циях (развитие нервного гребня, конечностей,
сердца).
Идентифицирован X-сцепленный ген (PLAC1),
определяющий синтез специфического мембран-
ного белка плаценты Placl. Белок накапливается
в клетках цитотрофобласта и в апикальной части
клеток синцититрофобласта. Функция белка не-
известна, предполагается его участие в диффе-
ренцировке клеток ТБ и в сигнальном пути гена
фактора роста фибробластов (FGF7). Его экс-
прессия была зарегистрирована и в других орга-
нах. Широко представлены в плаценте продукты
всех 11 катепсиновых генов. Любопытно, что
ретротранспозоны и эндогенные ретровирусы,
индуцирующие экспрессию многих генов пла-
центы. неметилированы в клетках ТБ. но всегда
метилированы в клетках крови. Особый интерес
среди генов этой группы вызывают гены семей-
ства Syncitin (Syncitin UHERV-W & Syncitin2l
HERV-FRD). Обладая фузогенными свойствами,
продукты этих генов способствуют слиянию
клеток цитотрофобласта с образованием синци-
тиотрофобласта, а также контакту’ последних
с клетками эндометрия матки.
Среди других генов формирующейся плацен-
ты с транспозонрегулируемой экспрессией осо-
бый интерес представляют ген PEG 10 с пиком
экспрессии на 11—12-й неделе развития и ген
ароматазы (CYP19), регулирующий обмен эстро-
генов. Специфический промотор этого гена в
плаценте представлен терминальным ретро-
транспозоном .
9.3.4. Импринтированные гены плаценты
Многие гены, экспрессия которых зависит от
родительского происхождения (т. е. от того, пе-
редаются они зародышу- сперматозоидом или
яйцеклеткой), оказываются выключенными (им-
принтированными — см. раздел 9.1) в тканях пло-
да, но активно экспрессируются в плаценте. На-
рушения нормального паттерна импринтирован-
ности генов вследствие ошибок эпигенетическо-
го репрограммирования генома (так называемых
эпимутаций) во время гаметогенеза и на ранних
доимплантационных стадиях развития играют
важную роль и в нарушении имплантации и пла-
центации [Лебедев, Саженова, 2008]. При этом
ГЛАВА 9 247
патология развития может быть следствием
как выключения (импринтинга) генов, которые
должны быть в норме функционально активны-
ми, так и наоборот, активации вследствие гипо-
метилирования генов, которые при нормальном
развитии должны оставаться импринтированны-
ми (см. раздел 9.3.4). Так, гипометилирование
дифференциально метилированных генов пла-
центы PLANGL1 и KCNQ10T1 на материнских
хромосомах в клетках цитотрофобласта и мезен-
химы ворсин плаценты зарегистрировано почти
в 10 % всех случаев невынашивания беременно-
сти ранних сроков. А причиной грозных ослож-
нений беременности типа биродительский пол-
ный пузырный занос (Б11113) и хорионкарцинома
может быть аберрантное гипометилирование ге-
нов плаценты NLRP7 и PEG3 соответственно.
Известные импринтированные гены плаценты
и их локализация на хромосомах приведены на
рис. 9.12. Следует обратить внимание, что им-
принтированными могуч быть гены, полученные
как от матери, так и от отца. При этом многие из
них (PEG10, WEST, PEG3, IGF2, IGF2R) обеспе-
чивают пролиферацию клеток цитотрофобласта,
рост и формирование ворсинок хориона плаценты.
Важно отметить, что нарушения экспрессии
генов плаценты напрямую связаны с такими час-
тыми осложнениями беременности, как преэк-
лампсия (гестоз) и задержка внутриутробного
развития. Сравнительный анализ паттернов ме-
тилирования более 800 генов плацент в случаях
раннего гестоза (РГ), позднего гестоза (ПГ), за-
держки внутриутробного развития плода (ЗВУР)
и неосложненной беременности позволил обна-
ружить различия метилирования в 34 локусах
при РГ, в пяти локусах при ЗВУР и только в од-
ном гене, TUSC-3, ассоциированном с ПГ [Yuen
et al., 2010]. Наиболее четкая корреляция с РГ об-
наружена для гена TIMP-3, гипометилированный
промотор которого указывал на сохранение его
экспрессии в плаценте. Известно, что продукты
гена TIMP-3 ведут к угнетению ферментов се-
мейства металлопротеиназ, определяющих инва-
зивные свойства ТБ и, соответственно, препят-
ствуют нормальной имплантации и плацентации,
что приводит к дефициту' перфузии плаценты
кровью матери. Другие гены, мутации или гипо-
метилированное состояние которых ассоцииро-
ваны с развитием РГ, включали гены STOX1 и
ген-ингибитор плацентарной сериновой протеа-
зы. Достоверные различия метилирования CpG-
островков отмечены также для генов CAPG,
GL12, KRT13, однако, их действие на экспрес-
сию генов металлопротеаз и сосудистого эндо-
телиального фактора роста (VEGF) значительно
менее выражено, чем гена TIMP-3. Важно отме-
тить, что гипометилированное состояние промо-
торных районов генов SERPINA3 и особенно ге-
на TIMP-3 можно определить при исследовании
ДНК плода в крови матери. В настоящее время
ведутся исследования, в какой мере анализ ме-
тилирования премоторной области гена TIMP-3
в крови матери может найти клиническое при-
менение в качестве прогностического неинва-
зивного теста развития РГ у женщин групп вы-
сокого риска данной патологии. Следовательно,
наряду’ с увеличением содержания ДНК плода в
плазме крови беременной, анализ состояния ме-
тилирования гена TIMP-3, который всегда мети-
лирован в материнских клетках, может стать
IGF2R | П
М Р
GRBWf у
^SGCE
2 2 "^PEG10
" 9 mfst
COPG2
Chr7
М Р
• яi
|PEG3
Chr19
Н19
CDKN1C
М Р
$ г
* *
V
Chr11
Рис. 9.12. Хромосомная локализация импринтированных генов, которые экспрессируются на мате-
ринском (М) или на отцовском (Р) гомологе (по [Туско, 2006]).
Стимулирующие рост плаценты человека гены обозначены зеленым, ингибирующие — красным.
248 ЭПИГЕНЕТИКА
перспективным досимптоматическим маркером
развития РГ. Помимо гена TIMP-3 важную роль
в развитии гестоза играет ФТ HIllu, повышен-
ная экспрессия которого в условиях гипоксии
индуцирует активацию гена TGF-fy. Последний
переключает клетки ТБ с процессов инвазии об-
ратно на процессы пролиферации. Отмечалась
также ассоциация с гестозом гена аЗ катепсина
CTNNA3 [Туско, 2006].
При исследовании экспрессионного профиля
плацентарных генов в случае синдрома ЗВУР экс-
прессия генов Kill, Ml.ST, PG3, GATM, GNAS,
PLAGL1 была сниженной, а генов CDKMc и
PHLD2 — достоверно повышенной [Туско, 2006].
С ЗВУР ассоциировано и нарушение метилиро-
вания CpG-островков области Н 19 IGF [Borque
et al., 2010].
Итак, установление тесного контакта между’
клетками ТЭ и клетками эндометрия матки (им-
плантация), развитие хориона, появление вор-
син и формирование специального провизорного
органа — плаценты представляют собой цепь
сложно взаимосвязанных морфогенетических
процессов, находящихся под контролем как ге-
нов ТБ зародыша, так и генов эндометрия (деци-
дуальной ткани) материнского организма. При
помощи современных цитогенетических и моле-
кулярно-генетических методов, методов экспе-
риментальной эмбриологии на биологических
моделях, в том числе на ЭСК, а также на мате-
риале спонтанных и медицинских абортов под-
робно изучены генетические механизмы и иден-
тифицированы многочисленные гены и генные
семейства, контролирующие процессы имплан-
тации и плацентации у человека.
Выделены и частично охарактеризованы се-
мейства генов, контролирующих имплантацию
(факторы пролиферации ТФ воспалительной ре-
акции, дифференцировки ТБ на цито- и синци-
тиотрофобласт, факторы инвазии ТБ и факторы
децидуальных клеток, препятствующих экспан-
сии ТБ) и плацентацию (рост и ветвление ворсин
хориона, ангиогенез). Методами анализа экс-
прессионных профилей и паттерна метилирова-
ния идентифицированы многие гены, специфич-
ные для ткани плаценты. В частности, гены, кри-
тичные для процессов имплантации и плацента-
ции, гены, определяющие процесс инвазии ТБ (ге-
ны металлпротеаз — ММР, цитокиновые гены
(11,II, IL VI, TGF-fi), пролиферацию клеток ТБ
(ВРМ-4), рост и ветвление ворсин хориона и ан-
гиогенеза (VEGF, 14,(11).
Важным для нормальной имплантации и пла-
центации является гипометилированное состоя-
ние генома клеток ТБ и гиперметилированное
клеток эмбриобласта. Гипометилированными в
клетках ТБ являются районы ПГХ, что косвенно
свидетельствует в пользу их функциональной
активности.
Хромосомные аномалии, мутации генов, не-
благоприятные сочетания функционально ос-
лабленных аллелей этих генов, нарушения про-
цессов импринтинга (эпимутации) зачастую ве-
дут к гибели ранних зародышей (привычное не-
вынашивание, неудачи ЭКО) или к тяжелым ос-
ложнениям беременности (хорионэпителиома,
биродительский полный пузырный занос, преэк-
лампсия (гестоз), синдром задержки внутриут-
робного развития плода и др.).
9.4. Начальные этапы
ПОСТИМПЛАНТАЦИОННОГО
РАЗВИТИЯ И РАННЕГО ОРГАНОГЕНЕЗА
Основы любой наследственной патологии за-
кладываются и начинают реализоваться еще во
внутриутробном периоде. В настоящее время
накоплен обширный материал по генетике раз-
вития каждой ткани, системы и органа зародыша
человека. Для многих из них установлены глав-
ные гены и выявлены сигнальные пути, которые
определяют и контролируют процессы морфоге-
неза и функциональное состояние. С помощью
высокоэффективных методов молскулярной био-
логии идентифицированы тысячи генов, экс-
прессирующиеся в разных тканях и на разных
стадиях развития человека и других млекопи-
тающих. Детально изучаются спектры метили-
рования и экспрессии генома и отдельных генов
в эмбриогенезе.
9.4.1. Развитие после имплантации
Сложные морфогенетические процессы, свя-
занные со 2-й фазой гаструляции (появление 3-го
зародышевого листка — мезодермы), нейруля-
цией и закладкой осевого комплекса органов, по
продолжительности занимают около недели и
соответствуют 7 — X стадиям развития (гори-
зонтам Карнеги) [Баранов, Кузнецова, 2007].
Развитие зародыша на этих стадиях находится
под контролем многих тысяч генов. Решающая
роль в осуществлении индивидуальной про-
граммы раннего онтогенеза принадлежит генам,
контролирующим синтез сигнальных молекул
(индукторов дифференцировки) и генам факто-
ров транскрипции (ФТ). К уже известным генам
сигнальных молскул относятся гены следующих
ГЛАВА 9 249
семейств: Hedgehog (SHH)-, трансформирующих
ростовых факторов (7'G7-pi—TGF-^5, ВМР1—
ВМР4, Nodal, GCNF, Lefty)', факторы роста фиб-
робластов — FGF-1 FGF-&, эпидермального
ростового фактора (EGF)'. инсулинподобного
фактора роста (IGF). Транскрипционные факто-
ры гаструляции и нейруляции представлены се-
мейством многочисленных гомеобоксных генов
(НОХ, PAX, SOX). В зависимости от различных
комбинаций сигнальных молскул и ФТ, а также
локальной концентрации их белковых продук-
тов они направляют процессы дифференциров-
ки, связанные с появлением дорсо-вентральной
(эпибласт—гипобласт), переднезадней (первич-
ная полоска, гензеновский узелок, нотохорда) и
латеральной (право-левая асимметрия) осей тела,
а также с образованием мезодермы, прехордаль-
ной и нервной пластинок. Нарушения этих кар-
динальных процессов эндогенными (генетиче-
скими) и экзогенными (эпигенетическими) фак-
торами, как правило, ведут к гибели зародыша
во время имплантации и появлению пустых
плодных пузырей, не содержащих материала са-
мого эмбриона. Вместе с тем, наличие многих
сходных по структуре и функциям генов в каж-
дом таком семействе нередко позволяет отчас-
ти компенсировать функции мутантного гена.
В этом случае зародыш сразу не погибает, а спо-
собен к дальнейшему’ развитию, хотя зачастую
обнаруживает серьезные наследственные болез-
ни и аномалии в постнатальном периоде.
9.4.2. Начальный органогенез
Органогенез занимает практически весь пе-
риод эмбрионального развития вплоть до завер-
шения 1-го триместра беременности (90 д. р.).
Особенно активные процессы морфогенеза про-
исходят с 20-го по 35-й д.р. (стадии XI—XIV по
классификации Карнеги). Как и на предыдущих
стадиях, генетический контроль органогенеза
осуществляется в первую очередь регуляторны-
ми генами, транскрипционными факторами и
сигнальными молекулами (СМ). Особенно важ-
ную роль в дифференцировке органов по перед-
не-задней оси тела, метамерной (сегментной)
дифференцировке позвоночника, ребер, сомитов
играют гены семейства НОХ и друтие гомео-
боксные гены, а также сигнальные молскулы типа
SHH. Продукты этих генов определяют общий
план строения организма, диспозицию и диффе-
ренцировку его отдельных систем и органов.
Полиморфизм фенотипического эффекта регуля-
торных генов определяется градиентом концент-
рации их белковых продуктов в тканях-мише-
нях, стадией эмбриогенеза, взаимодействием с
продуктами других ФТ и СМ. Так, главными ге-
нами нейральной индукции являются гены
Noggin. Notch. Wnt. Dorsalin.
Мутации трех (SIX3, ZIC2, TGIF) и четырех
CM (SHH, 7'Gl f, GLI2, TDGF1) ФТ приводят к
тяжелому’ нарушению развития переднего отдела
нервной трубки — голопрозэнцефалии. Четкая
ассоциация с дефектами смыкания нервной
трубки (гидроцефалия, spina bifida) показана для
гена MTHFR. Идентифицированы многие гены,
мутации которых приводят к различным болез-
ням, связанным с нарушением миграции нерв-
ных клеток, формирующих нервные ганглии и
вегетативную нервную систему2. Подробно изу-
чены генетические механизмы морфогенеза и, в
частности, идентифицированы гены, контроли-
рующие развитие костной системы, сердечно-со-
судистой системы, мочевыделительной системы,
а также глаз и органа слуха. Для многих анома-
лий этих органов картированы соответствующие
гены и идентифицированы мутации. Более де-
тальная информация о генетическом контроле
развития этих и других органов и систем, а так-
же подробные списки мутаций, ведущих к на-
следственной патологии, приведены в соответст-
вующих монографиях (например, [Ferretti etal.,
2006]), а также в Интернете по адресу http://
yvyvyv.ncbi.nih.gov/projects/geo, где имеются по-
стоянно обновляемые базы данных по экспрес-
сии генов мозга, других органов и тканей —
Gene Expression Omnibus. Подробная информа-
ция по эмбриологии человека с акцентом на ге-
нетические и эпигенетические механизмы кон-
троля содержится во многих монографиях и об-
зорах. Последние и наиболее полные сводки
приведены в недавно опубликованных и сущест-
венно дополненных изданиях, таких как фунда-
ментальное руководство по генетике челове-
ка Фогеля и Мотульского [Spiecher etal., 2010]
и в монографии по эмбриологии и биологии
развития человека Б. М. Карлсона [Carlson,
2009].
9.5. Структурно-функциональные
ОСОБЕННОСТИ ПЕРИЦЕНТРОМЕРНОГО
ГЕТЕРОХРОМАТИНА
Рассматривая механизмы регуляции генной
экспрессии в онтогенезе, следует обратить осо-
бое внимание на такую сложную по структуре и
малопонятную по функциям часть генома как
гетерохроматин (ГХ).
250 ЭПИГЕНЕТИКА
Принято различать конститутивный ГХ
(КГХ) и факультативный ГХ (ФГХ). Классиче-
ским примером ФГХ является инактивированная
Х-хромосома. КГХ присутствует в центромер-
ных районах всех хромосом человека и дисталь-
ном отделе длинного плеча Y-хромосомы. В об-
щей сложности на долю КГХ приходится 30 %
генома человека [Dimitri et al., 2009].
Более полувека специфичными для районов
перицентромерного гетерохроматина (ПЦГХ)
считались конденсированное состояние на про-
тяжении всего клеточного цикла, поздняя репли-
кация в S-фазе и генетическая инертность. Эти
характеристики определяли ПЦГХ как конститу-
тивный, или структурный ГХ (КГХ) (см. [Про-
кофьева-Бельговская, 1986]).
Традиционные представления о функциональ-
ной инертности ПЦГХ в последние годы подвер-
гаются существенному2 пересмотру. Все больше
появляется данных, подтверждающих известную
гипотезу А. А. Прокофьевой-Бельговской [Там
же] о важной роли ГХ в регуляции активности
генома. Так, можно считать доказанным значе-
ние ГХ в стабилизации центромеры, в поддер-
жании 3-мерной пространственной архитектони-
ки ядра и в обеспечении точности процессов ре-
комбинации и хромосомных перестроек. Суще-
ственную роль в этом сыграли исследования, ка-
сающиеся структурно-функциональной органи-
зации ГХ, его роли в поддержании микроархи-
тектоники ядра (хромосомных территорий), уча-
стия в процессах рекомбинации и образовании
межхромосомных перестроек, а также в регуля-
ции генной экспрессии [Schramke, Allshire, 2004].
Подробно изучены и биомеханизмы репрессии
гетерохроматина [Жимулев, 2002; Elgin, Grewal,
2004; Смирнов, 2009]. Установлено, что триг-
герная роль в репрессии ГХ принадлежит корот-
ким (20—23 п.н.) некодирующим двухцепочеч-
ным молекулам РНК (малые интерферирующие
РНК — siPHK), которые синтезируются на ко-
ротких повторяющихся последовательностях
ПЦГХ. Присоединение этих siPHK к ДНК инду-
цирует каскад биохимических реакций, приво-
дящих к метилированию цитозина в составе CpG-
динуклеотидов, деацетилированию гистонов, а
также присоединению к этим фрагментам особых
белковых комплексов, изолирующих ДНК от
транскрипционных факторов, что блокирует экс-
прессию генов [Schramke, Allshire, 2004].
В области центромеры выделяют две части
КГХ. В первой, прилежащей непосредственно к
центромере (ЦГХ), ДНК качественно и количе-
ственно сохраняется постоянной, тогда как в пе-
рицентромерной области (ПЦГХ) размеры бло-
ков сатДНК, а также состав гистонов могут су-
щественно варьировать [Sullivan et al., 2004].
В плане молекулярной организации ПЦГХ
представляет собой комплексную, мозаичную
структуру [Horvath etal., 2000]. Его основу со-
ставляют блоки тандемно организованных высо-
коповторяющихся последовательностей ДНК,
различных по протяженности и нуклеотидному
составу. Особенно значительные по размерам и
числу повторов блоки сатДНК находятся в при-
центромерных районах хромосом 1, 9 и 16, а так-
же в дистальном отделе длинного плеча Y-хро-
мосомы. Благодаря методам дифференциальной
окраски установлен гетероморфизм гомологов
по районам ПЦГХ и для других хромосом (акро-
центрические хромосомы, хромосомы 3 и 4).
Хорошо известна молекулярная гетерогенность
этих вариабельных участков генома.
КГХ человека состоит из сателлитной ДНК 1,
2 и 3 классов (с длиной повторяющейся после-
довательности 1—20 п.н.), а также из сатДНК а-,
Р" и у-типов (с длиной отдельного повтора
170 п.н., 68 п.н. и 220 п.н. соответственно)
[Meneveri etal., 1993; Lee etal., 1997]. Сателлит-
ные повторы имеют различную обогащенность
АТ- и CG-парами оснований (класс 1 обогащен
АТ-парами, классы 2 и 3 содержат как АТ-, так и
CG-пары) и специфично распределены по хро-
мосомам. ПЦГХ хромосом 3 и 4 представлен, в
основном, сатДНК 1. В ПЦГХ акроцентрических
хромосом, а также в районе Yqh локализованы
сатДНК! и сатДНКЗ. В состав 16qh входит пре-
имущественно сатДНК2, Iqh — сатДНКЗ, 9qh —
сатДНКЗ [Mattei, Luciani, 2003]. Известно, что
сатДНКЗ хромосомы 9 состоит из пентамеров,
5—15 % которых содержат CpG-последователь-
ности [Jeanpierre, 1994]. Распределение а-, р- и
у-сателлитных ДНК также хромосомспецифично
[Meneveri et al., 1993; Lee et al., 1997].
В области ПЦГХ млекопитающих и человека
обнаружено высокое содержание ретротранспо-
зонов [Tomilin, 2008; Eymcry etal., 2009]. В на-
стоящее время считается, что высокое содержа-
ние и большое разнообразие различных по длине
и составу ДНК повторяющихся и ретровирусных
последовательностей необходимо для обеспече-
ния нормальной функции генома. Однако их
роль в реализации программы индивидуального
развития остается загадочной. Предполагается,
что эндогенные ретротранспозоны могут участ-
вовать в репрограммировании генома оплодо-
творенной яйцеклетки и регулировать экспрес-
сию многих генов на начальных стадиях эмбрио-
ГЛАВА 9 251
генеза мышей и, возможно, человека [Peaston
et al., 2004].
Следует отметить, что повторяющиеся после-
довательности существенно затрудняют молеку-
лярный анализ соответствующих регионов гено-
ма, а картирование кодирующих ДНК-последо-
вательностей, содержащих большое количество
повторяющихся элементов, практически невоз-
можно [Подгорная и др., 2009]. Поэтому’ после
секвенирования генома человека, где широко ис-
пользовались кДНК-технологии, центромерные
и перицентромерные районы остались «белыми
пятнами» на картах хромосом [Там же]. Вместе с
тем, разработка новых комплексных подходов
к картированию генов позволила выявить гены и
фрагменты генов в составе ПЦГХ человека
[Horvath etal., 2000; Dimitri etal., 2005]. Гетеро-
хроматиновые гены, как было установлено, в ос-
новном являются нефункциональными псевдо-
генами, возникшими за счет внутри- и межхро-
мосомных дупликаций эухроматиновых сегмен-
тов. Однако в ПЦГХ некоторых хромосом обна-
ружены экспрессирующиеся последовательности,
паралогичные белоккодирующим генам росто-
вых факторов, иммуноглобулинов, плазминогена
и др. [Dimitri etal., 2009]. По молекулярной ор-
ганизации гетерохроматиновые гены отличаются
от эухроматиновых генов, что, по-видимому, по-
зволяет им транскрибироваться в гетерохрома-
тиновом окружении [Dimitri et al.. 2005]. Транс-
крипция перицентромерных паралогов зарегист-
рирована в семенниках и опухолевых тканях
[Yasuhara, Wakimoto, 2006].
Одной из цитологических характеристик
ПЦГХ является их конденсированное состояние.
Однако для ГХР хромосом 1, 9 и 16 характерно
деконденсированное состояние в сперматогони-
ях, сперматоцитах 1-го порядка [Perez et al.,
1991] ив клетках хориона у эмбрионов человека
[Perez etal., 1991; Назаренко, Карагеоргий, 1995;
Баранов, Кузнецова, 2007]. Предполагалось, что
степень конденсации связана с уровнем метили-
рования ДНК в ГХР [Назаренко, Карагеоргий,
1995]. Исследования с помощью двух вариантов
метода ник-трансляции in situ (обработка ДНК-
азой I и рестриктазой Hpall) и с помощью анти-
тел к 5-мстилцитозину показали, что у эмбрио-
нов человека 6—12 недель развития ПЦГХ хро-
мосом 1, 9 и 16 метилирован в клетках внут-
ренних органов, тогда как в клетках цитотро-
фобласта хориона эти ГХР гипометилированы
[Mitchell, 1992; Kokalj-Vokac et al., 1998; Пенди-
на и др., 2001; Баранов, Кузнецова, 2007; Pendina
etal., 2011]. ПЦГХ гипометилирован также в
клетках сперматогенного эпителия [Mitchell,
1992], бластомерах дробящихся зародышей [Ба-
ранов и др., 2005; Pendina et al., 2011], плюрипо-
тентных эмбриональных стволовых клетках
[Szulwach etal., 2011], в амниоцитах [Fernandez
et al., 1995], лимфобластных клетках [Almeida
et al., 1993; Bensaada et al., 1998], клетках кост-
ного мозга при лейкозе [Roman-Gomez et al.,
2008], но метилирован в плаценте [Вайсертрей-
гер и др., 2007; Enukashvilly etal., 2007] и лим-
фоцитах пуповинной и периферической крови
[Fernandez etal., 1995; Пендина и др., 2001; Ба-
ранов, Кузнецова, 2007] (рис. 9.11).
Получены данные о структурно-функцио-
нальных особенностях других молекулярных
компонентов ПЦГХ, таких как модифицирован-
ные коровые гистоны, варианты гистона Н1, не-
которые негистоновые белки [Смирнов, 2009].
Вместе с тем, ГХР хромосом в клетках с разны-
ми степенью дифференцировки и пролифера-
тивной активностью могут различаться по соста-
ву модифицированных гистонов и других бел-
ков, специфических для конститутивного гете-
рохроматина. Так, показано, что при дифферен-
цировке и реактивации пролиферации покоя-
щихся лимфоцитов мышей митогенами в ГХР
происходят реципрокные изменения набора гис-
тоновых вариантов макроН2А и изоформ НР1, а
в зрелых лимфоцитах образуется особая апоцент-
рическая зона вокруг хромоцентров (см. |Gn’-
goriev et al., 2009]).
До недавнего времени отличительной харак-
теристикой КГХ считалась его транскрипцион-
ная инертность. Более того, характерный для
КГХ эффект положения мозаичного типа (по-
давление активности структурных генов, пере-
несенных в область ГХ) также свидетельствовал
против возможной транскрипционной активно-
сти КГХ [Wallrath, 1998]. Однако, начиная с
2002 г., появляется все больше данных, указы-
вающих на транскрипционную активность и
присутствие РНК в КГХ у дрожжей, дрозофилы,
мышей, в опухолевых клетках человека, в клет-
ках стареющих клеточных культур и в клеточ-
ных культурах, подвергавшихся тепловому шоку
[Rizzi et al., 2004; Ugarcovic, 2005; Enukashvilly
et al., 2007; Eymery et al., 2009]. Следует отме-
тить, что эти РНК гетерогенны и стадиоспеци-
фичны в клеточном цикле, поэтому’ их достаточ-
но сложно изучать на несинхронизированных
культурах клеток [Lu, Gilbert, 2007]. Наиболее
изученным является район 9ql2, содержащий
преимущественно сатДНКЗ. Этот район имеет
особую структуру, демонстрирующую одновре-
252 ЭПИГЕНЕТИКА
менно свойства гетеро- и эухроматина (отсутст-
вие типичных для гетерохроматина эпигенетиче-
ских маркеров и различная степень компактиза-
ции хроматиновых фибрилл) [Jolly et al., 2004;
Rizzi et al., 2004]. РНК-транскрипты, образую-
щиеся в ответ на тепловой шок в этом районе,
ассоциированы с ПЦГХ даже после прекраще-
ния транскрипции и визуализируются на микро-
скопическом уровне в виде ядерных стресс-гра-
нул (nSBs — nuclear stress bodies) [Jolly, Lakho-
tia, 2006]. Недавно показано, что сатДНКЗ, а так-
же сатДНК2 транскрибируются независимо от
статуса метилирования [Eymcry et al.. 2009],
a nSBs ассоциированы в клеточном цикле с ГХР
14 хромосом, включая полиморфные ГХР хро-
мосом 1, 9, 16, 13, 14, 15, 21, 22 и Y [Eymcry
et al., 2010].
Предполагается, что РНК-транскрипты вме-
сте с другими компонентами nSBs принимают
участие в моделировании структуры хроматина
не только в ответ на стресс, но и в процессе кле-
точной дифференцировки при нормальном раз-
витии [Eymeiy etal., 2009; 2010]. Так, транс-
крипты перицентромерного гетерохроматина
размерами от 2000 до 5000 п.н. образуются во
всех клетках зародыша мыши (особенно актив-
но в закладках нервной системы на 12,5 д. р.).
В тканях взрослых особей транскрипты ПЦГХ
не определяются. Исключение составляют толь-
ко семенники и печень, где в митотически деля-
щихся клетках зарегистрированы транскрипты
ПЦГХ [Eymcry etal., 2009]. Специфические тес-
тикулярные транскрипты сатДНКЗ Y-хромо-
сомы обнаружены и у человека [Jehan et al.,
2007]. Возможно, транскрипция сатДНКЗ хро-
мосомы 9 является нормальным физиологиче-
ским свойством некоторых типов клеток у чело-
века [Jolly, Lakhotia, 2006].
На присутствие РНК в ПГХР хромосом 1, 9 и
16 в спонтанно делящихся недифференцирован-
ных клетках косвенно указывает их красная
флуоресценция, характерная для одноцепочеч-
ных нуклеиновых кислот при окрашивании ак-
ридиновым оранжевым (рис. 9.13). Исчезно-
вение окраски после обработки препаратов
РНКазами А и Н, наблюдаемое только в клетках
цитотрофобласта хориона, возможно, обуслов-
лено особенностями организации ГХР в разных
клетках (рис. 9.14). Наличие РНК и ее ассоциа-
ция с ДНК в прицентромерных районах визуали-
зировано при анализе окрашенных АО хромосом
человека с помощью спектрофотометра и скани-
рующего ближнепольного микроскопа [Mahieu-
Williame et al., 2010].
Рис. 9.13. Особенности окраски флуорохромом акридиновым оранжевым хромосом на препаратах из ворсин-
чатого хориона (а), эмбриональной почки (б), костного мозга (е), сперматогоний (г), эмбриональных стволовых
клеток (б), амниоцитов (е), мезенхимальных стволовых клеток костного мозга (ж), ФГА-стимулированных лимфо-
цитов (з).
Прямые методы приготовления препаратов хромосом (а—г), культуры клеток (д—з).
ГЛАВА 9 253
Наличие транскрипционной активности ДНК
в ПЦГХ — один из важных аргументов в пользу
гипотезы «Главной программы развития»
Дж. Парриса (см. ниже).
Таким образом, суммируя современные пред-
ставления о КГХ хромосом человека, следует
прежде всего обратить внимание на важность
ПЦГХ в генетическом контроле индивидуально-
го развития. В пользу этого утверждения свиде-
тельствуют следующие факты:
1) наличие транскрипционной активности
ПЦГХ в эмбриональных, опухолевых клетках, а
также in vitro, и ее отсутствие в терминально
дифференцированных клетках:
2) высокая концентрация ретровирусных эле-
ментов в ПЦГХ, которые, возможно, участвуют
в активации генома зародыша на начальных ста-
диях развития;
3) молекулярная структура ПЦГХ, представ-
ленная транскрибируемыми вирусными и ге-
номными повторяющимися последовательно-
стями, является удобным субстратом для коди-
рования большого объема генетической инфор-
мации;
4) в процессе развития и дифференцировки
эпигенетические профили ПЦГХ в разных тка-
нях сильно различаются (клетки хориона и эмб-
риональных тканей);
5) в отличие от белок-кодирующих генов
первичная структура ДНК в ПЦГХ видоспеци-
фична.
Эти и некоторые другие факты, касающиеся
функций ПЦГХ, позволили американскому’ про-
фессору Джорджу Паррису (Tufts University
School of Medicine) сформулировать интересную
гипотезу — гипотезу «Главной программы раз-
вития» (Master Developmental Program) [Parris,
2010].
9.6. ГИПОТЕЗА ГЛАВНОЙ ПРОГРАММЫ
РАЗВИТИЯ (ГПР)
Гипотеза основана на предположении, что вся
программа индивидуального развития закодиро-
вана в ДНК ПЦГХ. Основной функциональной
единицей 1 ПР являются специфические генера-
ционные ключи развития (СГКР) — протяжен-
ные последовательности ДНК, представляющие
собой комплекс ДНК ретровирусных элементов
и фрагментов кДНК первичных транскриптов
геномных генов. ПЦГХ — это набор многочис-
ленных СГКР, обеспечивающий не только про-
грамму’ онтогенеза, но и сохранение уникальной
информации о филогенезе каждого вида.
Рис. 9.14. Особенности окраски прицентромерных ге-
терохроматиновых районов хромосом 1, 9 и 16 с по-
мощью флуорохрома акридинового оранжевого в
клетках цитотрофобласта хориона (а, е) и эмбрио-
нальных тканях (б, г) после обработок препаратов
РНКазой А (а, б) и РНКазой Н (е, г).
Этапы реализации генетической информации
согласно ГПР показаны на рис. 9.15. Как следует
из приведенной схемы, при каждом делении кле-
ток в результате транскрипции СГКР возникает
протяженный транкрипт ядерной РНК, который
распадается на несколько так называемых ядер-
ных мРНК-последовательностей (nuclear mRNA).
Последние, присоединяясь к соответствующим
участкам ДНК, активируют главные регулятор-
ные гены эмбрионального развития — гомеобокс-
ные гены (НОХ. PAX, SOX, T-box и др.), а также
гены сигнальных молекул (SHH, Noggin и др.),
которые включают экспрессию многих других
генов дифференцировки. Белковые продукты
этих генов во время митоза поступают в ядро,
репрессируют экспрессию предыдущего СГКР
и включают экспрессию следующей генерации
СГКР. Каждый клеточный клон, каждый акт диф-
ференцировки требует экспрессии своего набора
СГКР. При необходимости увеличения пула кле-
точного клона исходный СГКР остается актив-
ным в течение нескольких раундов репликации.
Смена СГКР регулируется, скорее всего, ме-
няющимися физиологическими условиями (уро-
вень глюкозы, кислотность, укорочение тело-
мерных районов и др.).
Многие из этапов действия СГКР хорошо
изучены и доказаны экспериментально (рис. 9.16).
В частности, не вызывает сомнения наличие в
ядре большого количества различных некоди-
254 ЭПИГЕНЕТИКА
Захваченные ретротранскрипты Я Ретровирус
Перицентромерный
~GSCK(1)~GSCK(2)
гетерохроматин
|GSCK(n-1)~GSCK(n) ~GSK(n+1 )~GK(n+2U
Транскрипция
специфических генерационных
ключей развития (СГКР)
Высвобождение
некодирующей
ямРНК (нямРНК)
V V
Активация главных ФТ
НОХ, PAX, SOX
нтрон ы
нямРНК
Каскад
активации генов
Транскрипты
Эволюция СГКР
Эухроматин— Кодирующие гены-
Экзоновый код
консервативных
белков цитоплазмы
Белки во время следующего
клеточного цикла попадают в ядро
и активируют следующую
Морфологические, физиологически© и биохимические признаки
Рис. 9.15. Гипотеза главной программы развития [Parris, 2010].
Поясн. см. в тексте.
рующих РНК, многие из которых имеют проис-
хождение из ПЦГХ [Pezer, Ugarcovic, 2009]. Бо-
лее того, выявлены новые типы РНК, обладаю-
щие регуляторными свойствами, такие как РНК,
индуцирующие транскрипцию (tiRNA), и ядер-
ные некодирующие информационные РНК
(nmRNA) [Chen, Carmichael etal., 2009]. Пер-
вые (tiRNA) связываются с межгенными ДНК-
последовательностями (link-DNA), экспрессия
которых приводит к хроматизации и стабильно-
му’ выключению сразу больших генных класте-
ров [Khali et al., 2009]. В настоящее время в ге-
номе человека известно около 3300 регулятор-
ных ДНК-последовательностей типа link-DNA.
Вторые (nmRNA) под действием нуклеазы Dicer
расщепляются до коротких РНК (sRNA) и регу-
лируют функции генома, связываясь с особыми
ДНК-последовательностями, так называемыми
pyknons [Rigoutsos etal., 2006]. Репрессия от-
дельных генов либо генных кластеров достига-
ется действием коротких РНК (sRNA) и направ-
ляемого ими репрессивного комплекса Poly-
comb. Значительную часть регуляторных ядер-
ных РНК составляют также РНК ретровирусных
последовательностей, многие из которых при-
сутствуют в ПЦГХ.
Дополнительным доказательством гипотезы
1 IIP могут служить данные клинической генети-
ки, указывающие на то, что причиной ряда син-
дромов и наследственных болезней могут быть
мутации, затрагивающие область ПЦГХ и облас-
ти повторяющихся ДНК. В частности, по мне-
ГЛАВА 9 255
RN> tiRNA
Ц u
u u
u u
u u
Ц Ц r?Dlcer
Рис. 9.16. Регуляция кодирующих и некодирующих генных кластеров специфическими генерационными
ключами развития [Parris, 2009]. Пояснения в тексте.
нию автора гипотезы, к таким болезням относят-
ся синдром Таунса—Брокса (16ql2.1), синдром
ICF (lql2), синдром ДиДжорджа (22ql 1.2), син-
дромы Прадера—Вилли и Ангельмана (15ql 1—
15ql3), синдром микроделеции (16р11.2—
16р12.12.2) [Parris, 2009]. Сравнительно неболь-
шое число таких болезней, возможно, объясня-
ется большой надежностью эволюционно закре-
пленной работы ПЦГХ как главного регулятора
программы индивидуального развития.
Еще одним важным достоинством предлагае-
мой гипотезы является конструктивность ее ос-
новных положений не только как гипотетиче-
ской программы эмбриогенеза (онтогенеза), но и
как программы, объясняющей многие сложные
проблемы эволюции.
В частности, сальтационный тип видообразо-
вания, согласно гипотезе 1 IIP, является резуль-
татом смены СГКР, происходящей вследствие
ретровирусных эпидемий и массового внедрения
их кДНК-копий в ПЦГХ. Следовательно, в соот-
ветствии с ГПР, объектом естественного отбора
являются не только и не столько сами гены или
отдельные регуляторные последовательности,
сколько сама программа развития. Гипотеза ло-
гично объясняет и удивительный феномен река-
питуляции процессов морфогенеза — биогенети-
ческий закон Геккеля—Мюллера «Онтогенез
есть краткое и быстрое повторение филогенеза».
Транскрипция эволюционно древних СГКР обес-
печивает повторение (рскапитуляцию) основных
этапов эмбриогенеза у животных разных видов и
у человека.
Наконец, следует отметить, что важную роль
гетерохроматиновых блоков сателлитной ДНК и
гетерохроматина в эволюции отводили и многие
другие исследователи, в том числе и такие из-
вестные отечественные ученые как Л. И. Короч-
кин, В. Н. Стегний, М. Б. Евгеньев (см. [Короч-
кин, 2002]). Однако только достижения молеку-
лярной биологии последних десяти лет сделали
возможным рождение гипотезы ГПР.
Вместе с тем, несмотря на всю свою привле-
кательность и конструктивность в объяснении
процессов онтогенеза и филогенеза, гипотеза
ГПР все еще остается гипотезой, а потому’ нуж-
дается в более четких прямых доказательствах.
Прежде всего, основным доказательством могла
бы стать идентификация реальных СГКР, со-
стоящих из ретровирусных последовательностей
и фрагментов кДНК первичных РНК-транскрип-
тов структурных или регуляторных генов. Даль-
нейшие исследования природы СГКР, их клас-
сификация и выяснение молекулярно-генети-
ческих механизмов их действия помогут суще-
ственно дополнить и конкретизировать эту’ ин-
тересную гипотезу.
В заключение отметим, что по изяществу’ за-
мысла и масштабности изложения гипотеза
Дж. Парриса весьма напоминает первоначаль-
ный вариант гипотезы А. М. Оловникова о тело-
мерных концах хромосом и их значении в про-
цессах старения клетки, которая, как известно,
завершилась присуждением Нобелевской пре-
мии, правда, не самому’ автору, а ученым, полу-
чившим теломеразу и изучившим ее свойства.
256 ЭПИГЕНЕТИКА
Тем не менее, обе гипотезы, адресованные про-
тивоположным концам хромосомы, на наш взгляд
удачно дополняют друг друга: программа разви-
тия начинается с центромерного района хромо-
сомы и завершается на ее теломерном конце, ко-
торый при каждом делении клетки укорачивает-
ся. В результате, каждая хромосома благодаря
активной роли ПЦГХ приобретает определен-
ную функциональную целостность.
Таким образом, доказательство реального на-
личия СГКР среди транскриптов ПЦГХ и выяс-
нение их структурно функциональных особенно-
стей на разных стадиях онтогенеза человека в
норме и патологии представляет собой одно из
интересных пограничных направлений генетики
развития на стыке цитогенетики и молскулярной
биологии.
9.7. Эпигенетические ремоделирования и
БОЛЕЗНИ ЧЕЛОВЕКА
Как уже упоминалось, эпигенетическое ремо-
делирование (ЭР) представляет собой сложный
процесс, включающий несколько различных ме-
ханизмов, связанных с метилированием ДНК,
модификациями гистоновых белков, действием
малых РНК, следствием чего являются митоти-
чески, а зачастую и мейотически наследуемые
изменения структуры хроматина (см. раздел 9.1).
Нарушения механизмов эпигенетической регуля-
ции, происходящие как в соматических, так и в
половых клетках, получили название эпимутаций
(ЭМ) (см. раздел 9.3). ЭМ представляют собой ва-
риации структурной организации хроматина, оп-
ределяющие активное или неактивное состояние
генов без изменения их кодирующей последова-
тельности [Лебедев, Саженова, 2008]. Считается,
что частота спонтанных ЭМ на несколько поряд-
ков выше, чем генных мутаций, но реальный
вклад ЭМ в патологию эмбрионального развития
и болезни человека пока не поддается оценке.
Различают первичные и вторичные ЭМ [Ле-
бедев, 2008]. Первые затрагивают сам ген. К их
числу’ относятся и так называемые импринти-
рованные гены (см. раздел 9.7.1). Вторичные —
ЭМ в других локусах, которые могут находиться
как в цис-, так и в транс-положениях по отно-
шению к генам-мишеням, контролирующим
эпигенетическую организацию хроматина. ЭМ
могут касаться как всего генома, так и отдель-
ных хромосом, их фрагментов или единичных
генов.
В течение онтогенеза выделяют несколько
периодов повышенной чувствительности к ЭМ,
когда геном утрачивает свою пластичность. Они
соответствуют периодам эпигенетического ре-
программирования генома во время гаметогене-
за, ранних стадий эмбриогенеза (см. разделы
9.2.1, 9.2.2) и переходу’ к постнатальной жизни.
Существенное влияние на частоту’ ЭМ могут
оказывать как генетические факторы, так и экзо-
генные воздействия (см. раздел 9.7.5).
9.7.1. Геномный импринтинг
Как уже упоминалось (см. разделы 9.2 и
9.3.2), изменения, связанные с эпигенетическим
репрограммированием в гаметогенезе, могут по-
разному влиять на экспрессию генов, что опре-
деляется родительским происхождением по-
следних. Данный феномен получил название ге-
номного импринтинга (ГИ), а болезни, обуслов-
ленные нарушениями ГИ, — болезни имприн-
тинга (БИ). Феномен ГИ зависит от функцио-
нального состояния особых, импринтированных,
генов (ИГ). Патогенетическую основу’ БИ со-
ставляет моноаллельная экспрессия или супрес-
сия активности ИГ, вызванная ЭМ, специфиче-
ских последовательностей, получивших назва-
ние центров импринтинга (ЦИ). ЭМ могут на-
рушать метилирование ЦИ. В результате гипо-
метилирования ИГ, которые должны быть вы-
ключенными, становятся активными, и, наобо-
рот, вследствие патологического гиперметили-
рования ЦИ выключаются ИГ, которые должны
быть функционально активными.
ИГ, согласно ориентировочным данным, со-
ставляют около 1 % экспрессирующейся части
генома, т. е. порядка 200 генов [Barlow, Barto-
lomei, 2010]. Анализ метилома эмбриональных
клеток (см. раздел 9.3.2) позволил определить
наличие у человека 52 импринтированных генов,
24 из которых экспрессируются материнскими, а
28 — отцовскими хромосомами [Лебедев, 2008].
Импринтированные гены расположены в ге-
номе не случайно, а стремятся объединяться в
кластеры. У человека кластеры импринтирован-
ных генов обнаружены в хромосомах 6, 7, 11, 14
и 15. У мышей 80 ИГ сформированы в 11 кла-
стеров на восьми хромосомах (2, 6, 7, 9,11, 12, 15
и 17), а одиночные — лишь на трех хромосомах.
Шесть кластеров содержат от трех до десяти ИГ
и занимают 100—3000 т.п.н. Общим для этих
кластеров является наличие импринта — облас-
ти дифференциального метилирования — DMR
(Differentially DNA Methylated Region). В четы-
рех кластерах импринт проявляется в оогенезе, в
двух — в сперматогенезе. Кластерное располо-
ГЛАВА 9 257
жение импринтированных генов указывает на то,
что первичное управление импринтингом осу-
ществлялось на уровне не одного гена, а целых
хромосомных доменов.
Другие характерные особенности ИГ вклю-
чают: асинхронность репликации, временную и
пространственную регуляцию экспрессии, ком-
плементарность, консерватизм у особей разных
видов, сходство продуктов экспрессии — не-
транслирумые РНК [Barlow, Bartolomei, 2010].
Подробно с феноменом ГИ, наследственной и
ненаследственной патологией, вызванной нару-
шениями функций ИГ, можно ознакомиться в
серии отечественных обзоров и монографий, по-
священных проблемам эпигенетики и геномного
импринтинга [Голубовский, 2000; Немцова, За-
летаев, 2004; Лебедев, Саженова, 2008; Паткин,
2008].
9.7.2. Роль ГИ в патологии
эмбрионального развития
Открытый экспериментально еще в 1970 г.
феномен ГИ, как оказалось, играет важную роль
в нормальном эмбриогенезе человека, а его на-
рушения, вызванные эпимутациями ИГ, приво-
дят к многочисленным нарушениям эмбриональ-
ного развития, спонтанным абортам и даже опу-
холям [Немцова, Залетаев, 2004; Лебедев, Саже-
нова, 2008]. Интригующим является то обстоя-
тельство, что ИГ — это в основном гены, обес-
печивающие раннее эмбриональное развитие.
Неравнозначность мужских и женских гамет
в развитии зародышей млекопитающих была до-
казана еще в экспериментах на мышах со струк-
турными и числовыми нарушениями хромосом,
патологический эффект которых проявлялся по-
разному и реализовался на разных стадиях эм-
бриогенеза в зависимости от того, с какими га-
метами — мужскими или женскими хромосом-
ные аберрации передаются зародышу [Дыбан,
Баранов, 1978; Dyban, Baranov, 1987].
Особенно яркие доказательства ГИ были по-
лучены в экспериментах с трансплантацией про-
нуклеусов при изучении развития гиногенетиче-
ских и адреногенетических эмбрионов у мышей.
Установлено, что нормальное развитие зароды-
ша обеспечивается обязательным присутст-
вием генетического материала обоих родителей
[MacGrath, Solter, 1984]. При наличии только
женских хромосом (гиногенез, партеногенез)
развиваются производные эпибласта, но заро-
дыш погибает к 9—10-му д. р. в связи с резким
недоразвитием плаценты. У андрогенетических
зародышей (только хромосомы спермия) разви-
вались производные ТЭ, но нарушался морфоге-
нез эмбриобласта [Surani etal., 1984]. Показа-
тельно, но и у человека андрогенез сопровожда-
ется активной пролиферацией клеток ТЭ и их
быстрой малигнизацией, в результате чего раз-
вивается очень злокачественная опухоль хорион-
эпителиома [Dyban, Baranov, 1987]. Именно в
этих исследованиях впервые был использован
термин «импринтинг» в значении геномной «па-
мяти» [Surani et al., 1984].
С помощью технологии гомологичной реком-
бинации определена функция 26 из 73 ИГ мы-
шей. Оказалось, что на рост эмбрионов и пла-
центы влияет самое большое число ИГ (около
50 %). Для половины из них была характерна
экспрессия с отцовских хромосом. Их продукты
оказались промоторами роста зародыша. Нару-
шение ИГ таких генов вследствие ЭМ приводило
к задержке развития. Материнские ИГ действо-
вали как репрессоры роста плода и плаценты, и
их ЭМ вызывали усиление роста. Примерно
25 % протестированных ИГ влияли на функции
нервной системы, другие 25 % не оказывали за-
метного фенотипического эффекта [Barlow, Bar-
tolomei, 2010].
Нарушение функций импринтированных ло-
кусов генома, ассоциированных с ранней эм-
бриолетальностью у человека, может быть обу-
словлено аберрантными эпигенетическими мо-
дификациями хроматина. Прослеживается ассо-
циация эпимутаций ИГ с привычным невына-
шиванием беременности, что заслуживает при-
стального внимания. Выявленные ЭМ имприн-
тированных генов характеризуются тканеспеци-
фичностью, затрагивают материнские аллели и
возникают на постимплантационных этапах раз-
вития [Лебедев, Саженова, 2008]. Вклад имприн-
тированных локусов в нарушения эмбриональ-
ного развития изучался при исследовании спон-
танных абортусов (СА). Были показаны повы-
шенная частота ЭМ в 1114 хромосом 11 и 15, ее
связь с ранней гибелью. У 9,5 % СА выявлено
тканеспецифическое гипометилирование ЦП —
гена KCNQ10T1 — на хромосоме 11, а у 9—20 %
СА — метилирование премоторных регионов
генов клеточного цикла P14ARF & RB1 на доим-
плантационных стадиях развития [Лебедев, 2008].
Однако во всех изученных вариантах оставалось
неясным, являются ли эпигенетические измене-
ния причиной или следствием уже начавшихся
патологических изменений в тканях плода.
Важность для развития ДНК-метилирования на
ранних стадиях доказывается тем, что гомозиготы
258 ЭПИГЕНЕТИКА
по мутации гена метилтрансферазы или гена
МеСР2 (белок, специфически связывающийся с
метилированными CpG-островками) неспособны
завершать эмбриогенез [Rougier et al., 1998].
9.7.3. Однородительская дисомия
Неравнозначность материнского и отцовского
геномов прослеживается в случае однородитель-
ских дисомий (ОРД) — наличия в геноме двух
копий одной хромосомы (или ее частей) только
одного родителя, при отсутствии такой хромо-
сомы от другого. Сейчас фенотипические прояв-
ления ОРД у человека известны практически для
всех хромосом человека, кроме хромосом 3 и 19.
ОРД большинства хромосом сама по себе не
создает помех для ГИ и не вызывает клиниче-
ских проблем. Исключение составляют только
хромосомы, несущие кластеры импринтирован-
ных генов, такие как хромосомы 7, 11, 13, 15
[Engel, 2002]. ОРД этих хромосом ведет к тому’,
что в зависимости от их родительского проис-
хождения оба аллеля ИГ у эмбриона будут вы-
ключены или активны. В этом случае присутст-
вие двух активных копий ИГ или, наоборот, их
отсутствие может создать серьезные помехи для
нормального развития и роста зародыша.
Так, наличие дисомии 15 по отцовской хро-
мосоме ведет к синдрому’ Прадера—Вилли, а ди-
сомия той же части материнской хромосомы вы-
зывает синдром Ангельмана (см. ниже).
9.7.4. Эпигенетические нарушения
и наследственные синдромы
Выделяют две группы эпигенетических бо-
лезней:
1) болезни, вызванные мутациями генов, конт-
ролирующих процессы метилирования и ремоде-
лирования хроматина:
2) болезни вследствие ДНК-модификаций (эпи-
генетических мутаций) в локусах, которые, изме-
няя метилирование ДНК, нарушают работу’ ИГ.
Основные эпигенетические болезни, их фено-
типические проявления и соответствующие гены
группы 1 приведены в табл. 9.1. Так, мутации
гена метилтрансферазы DNMT3B вызывают ау-
тосомно-рецессивный синдром ICF (от англ. I —
иммунодефицит, С — центромерная нестабиль-
ность, F — лицевые аномалии). Нестабильность
центромер вызвана выраженным гипометилиро-
ванием сателлитной ДНК. Нарушения метил-
трансферазы МЕСР2 ведут к тяжелому’ нейроде-
гснсративному заболеванию с ранней манифе-
стацией — синдрому2 Ретта. Друтие болезни этой
группы включают синдром Рубинштейна—
Тэйби (REBBP), синдром субтеломерной деле-
ции 9q34 (ЕНМ11) и синдром Коффина—Лоури
(RSK2).
Заболевания второй группы возникают de no-
vo или могут наследоваться. Они могут быть ге-
нетическими или эпигенетическими (табл. 9.2).
Классическими примерами таких болезней яв-
ляются достаточно частые и хорошо известные
синдромы Прадера—Вилли и Ангельмана, осно-
ву’ которых составляют нарушения импринтин-
га в кластерах генов хромосомы 15, хотя фе-
нотипические проявления этих синдромов силь-
но различаются и во многом противоположны.
При этом синдром Прадера—Вилли является
следствием эпимутации ЦП отцовской хромосо-
мы 15, которая ведет к инактивации в клетках
плода большого кластера генов (MAGEL2, NDN,
C15oif2, SNRPN, гены snoRNA). Основу синдро-
Таблица 9.1
Эпигенетические болезни и наследственные синдромы, обусловленные мутациями генов, контролирую-
щих процессы метилирования и ремоделирования хроматина (по [Spiecher et al., 2010])
Болезнь Локус Клинические данные
Синдром ICF DNMT3B Иммунодефицит, нестабильность центромер и лицевые аномалии; по- вторные инфекции
Синдром Ретта МЕСР2 Утрата приобретенных способностей, микроцефалия, умственная отста- лость, аутизм, стереотипные движения рук, апраксическая походка
Синдром Рубинштейна—Тэйби CREBBP Умственная отсталость, антимонголоидный разрез глаз, гипоплазия крыльев носа, широкие большие пальцы кистей и стоп
Синдром субтеломер- ной делеции 9q34 ЕНМТ1 Умственная отсталость, гипотония, брахицефалия, плоское лицо с гипер- телоризмом, синофрис, вывернутые ноздри, нависающая верхняя губа, вывернутая нижняя губа, прогнатия, конотрункальные пороки сердца, по- веденческие проблемы
Синдром Коффина— Лоури (Coffin—Lowry) RSK2 Умственная отсталость, полная нижняя губа, мягкие руки с конусообраз- ными пальцами, куриная грудь, сколиоз
ГЛАВА 9 259
ма Ангельмана составляют эпимутации (мута-
ции) регуляторного гена UBE3A, расположенно-
го в том же районе хромосомы 15. Эти синдро-
мы возникают не только вследствие эпимутаций
импринтированных генов, но и при наличии двой-
ной дозы таких генов одного из родителей (пол-
ная или частичная дисомия хромосомы 15), а
также в случае делеции этого фрагмента хромо-
сомы 15 в геноме одного из родителей. В зави-
симости от гендерного происхождения, избытка
или дефицита дозы генов хромосомы 15, разви-
вается либо синдром Прадера—Вилли (активны
материнские гены), либо синдром Ангельмана
(активны отцовские гены) [Немцова. Залетаев,
2004; Паткин, 2008].
Примерами БИ второй группы являются
синдромы Беквитта—Видемана и Сильвера—Рас-
села. При генетических синдромах, включающих
ИГ, большинство дефектов импринтинга — пер-
вичные эпимутации. Они могут быть вызваны
нарушениями стирания импринтинга в 1111К или
создания импринтинга на последующих этапах
гаметогенеза. У пациентов с синдромом Праде-
ра—Вилли с нарушениями импринтинга, не свя-
занными с мутациями ЦИ, аномальная хромосома
всегда наследуется от бабушки по отцу. Сле-
довательно, материнский импринтинг не теряется
в отцовских половых клетках. В отличие от синд-
рома Прадера—Вилли, гаметические нарушения
импринтинга при синдроме Ангельмана зачастую
реализуются только на постзиготических стадиях,
следствием чего является высокая частота сома-
тического мозаицизма, которая нередко достигает
30 %. При этом обнаружена определенная корре-
ляция между’ долей аномально импринтирован-
ных клеток и тяжестью болезни. Похоже, что
роль мозаичных дефектов импринтинга хромосом
15 в развитии умственной отсталости сильно не-
дооценивается [Horsthemke, 2010].
Мутации гена и нарушения ЦП могут быть
причиной и таких наследственных синдромов,
как синдром Беквитта—Видемана (гены LITH
KCNQ1OT1) и синдрома Сильвера—Рассела
(хромосома 7). Причем среди пациентов с син-
дромом Беквитта—Видемана наблюдается избы-
ток монозиготных близнецов. Почти все они —
девочки и различаются по наличию болезни. Все
пациенты со здоровым сибсом имеют гипомети-
лирование в материнском локусе LIT1 KCNQ1OT1.
Это эпигенетическое различие наиболее вероятно
вызвано нарушением импринтинга в клетках ран-
него эмбриона. Как следствие. LIT1IKCNQ1OT1
экспрессируется на обеих хромосомах, а оба ал-
леля CDKN1C репрессированы. Этот дефект мо-
жет увеличивать риск появления двойни. Предпо-
лагается, что группа клеток с импринтированным
(выключенным) кластером генов LITL KCNQ1OT1
имеет преимущество в пролиферации, что ведет
к асимметрии ВКМ и повышает шансы ее разде-
ления и возникновения близнецов.
Таблица 9.2
Эпигенетические болезни и наследственные синдромы, обусловленные модификациями локусов (генов),
изменяющих метилирование ДНК и нарушающих работу импринтированных генов [Spiecher et al., 2010]
Болезнь Локус Клинические данные
Болезни, вызванные эпимутациями в специфическом локусе гена
Синдром Прадера—Вилли MAGEL2, NDN, C15orf2, SNRPN, гены snoRNA Неонатальная мышечная гипотония, трудности вскармливания в раннем детстве, повышенный аппетит и ожирение, начинаю- щиеся в раннем детстве, гипогонадизм, низкий рост, маленькие кисти и стопы, асфиксия во сне, поведенческие проблемы, ум- ственная отсталость от легкой до умеренной степени
Синдром Ангельмана UBE3A Микроцефалия, атаксия, отсутствие речи, аномальная ЭЭГ, выраженная умственная отсталость, частый смех
Синдром Беквитта—Видемана IGF2, CDKN1C Большой вес при рождении, гипогликемия, макроглоссия, пу- почная грыжа, повышенный риск опухоли Вильмса
Синдром Сильвера—Рассела (Silver—Russell) IGF2 и другие Задержка роста до и после рождения
Синдром ломкой Х-хромосомы с умственной отсталостью FMR1 Умственная отсталость, макроорхидизм, удлиненное лицо, крупные уши, выступающая нижняя челюсть, поведенческие проблемы
Л и це-лопаточ н о-п леч евая мышечная дистрофия D4Z4 Прогрессирующая мышечная слабость, затрагивающая лицо и лопатки, с последующим поражением задних сгибателей стоп и тазового пояса
260 ЭПИГЕНЕТИКА
Синдром Беквитта—Видемана также может
вызываться дефектом импринтинга, влияющим
на центр импринтинга кластера IGF2H19
CTCF, метилирование которого приводит к ак-
тивизации материнского аллеля IGF2. удвоению
дозы IGF2 и чрезмерному’ росту’. Утрата метили-
рования отцовским центром импринтинга ведет
к репрессии гена IGF2, а недостаточность его
продукта — к до- и послеродовой задержке рос-
та и является одной из причин синдрома Силь-
вера—Рассела.
К эпигенетическим заболеваниям второй
группы несколько условно можно отнести на-
следственные заболевания, вызываемые мута-
циями повторяющихся последовательностей, на-
ходящихся в цис -положении. В случае аутосом-
но-доминантного заболевания — лице-лопаточ-
но-плечевой мышечной дистрофии (ЛЛПМД) —
уменьшение числа тандемных повторов разме-
ром 3,3 т. п.н. в субтеломерном районе хромо-
сомы менее 11 (норма от 11 до 150 блоков). При
синдроме Мартина—Белл (СМБ) — запредель-
ное по числу (иногда свыше 1000) триплетных
повторов CGG на 5'-конце гена. Предполагается,
что делеция D4Z4 (ЛЛПМД) приводит к образо-
ванию пермиссивной структуры хроматина в
4q35 и ошибочному’ включению других генов в
этом участке. Напротив, избыток CGG-трип-
летов при СМБ блокирует работу структурного
гена FMR1, что и является причиной заболева-
ния, ведущим клиническим симптомом которого
является задержка умственного развития. Хотя
СМБ относится к Х-сцепленным заболеваниям с
рецессивным типом наследования, его проявле-
ние в более легкой форме возможно и у девочек,
у которых тяжесть заболевания зависит от соот-
ношения клеток мозга с активной и неактивной
Х-хромосомами, несущих мутантный ген FMR1.
Все больше накапливается данных и о вкладе
ЭМ в развитие рака. Первичные ЭМ, связанные с
нарушением метилирования ДНК, обнаружены
почти 30 лет назад. В настоящее время известно,
что гипометилирование может вызывать актива-
цию онкогенов, а метилирование генов-супрес-
соров обнаружено фактически при всех опу-
холях. Подробно изучены эпигенетические мар-
керы, важные для диагностики различных онко-
логических заболеваний. Широкий крут вопро-
сов, связанных с эпигенетикой опухолевого рос-
та и эпигенетическими маркерами, подробно
рассмотрен в научной литературе [Пальцев, За-
летаев, 2009; Bavlin, Jones, 2010; Roach etal.,
2011].
9.7.5. Эпигенетика и хронические
заболевания
Изменения генной активности вследствие
эпигенетических модификаций происходят по-
стоянно и, по сути, являются адаптационными
реакциями организма в ответ на действие небла-
гоприятных эндогенных и экзогенных факторов
[Голубовский, 2010]. Как упоминалось (см. раз-
делы 9.2 и 9.3), они возникают особенно часто
во время эпигенетического репрограммирова-
ния генома, т. е. в гаметогенезе и на ранних ста-
диях развития (бласту’ляция, имплантация, пла-
центация, активный органо- и гистогенез). ЭМ,
возникающие на этих стадиях, нередко ведут к
эмбриональной гибели, аномалиям развития или
к болезням импринтинга (см. раздел 9.7.2).
Считается, что все эпигенетические болезни
человека закладываются еще в эмбриогенезе.
Накапливаются данные, свидетельствующие
о наличии выраженного эпигенетического ком-
понента в этиологии всех хронических МФЗ.
О природе неблагоприятных ЭМ и метаболиче-
ских путях, которые они нарушают, известно
еще очень мало. Между’ тем, предполагается, что
именно ЭМ может принадлежать основная роль
в развитии и многих хронических болезней
[Roach etal., 2011]. Гипотетическая схема взаи-
модействия генетических, эпигенетических и
средовых факторов в развитии хронических бо-
лезней (рис. 9.17) свидетельствует о том, что хро-
нические болезни мультифакторной природы воз-
никают при неблагоприятном сочетании аллелей
генов предрасположенностей, эпигенетических
изменениях, нарушающих функции соответст-
вующих генов, и действия провоцирующих пато-
логию повреждающих факторов внешней среды.
Первичные ЭМ, ведущие к нарушениям мети-
лирования и супрессии многих генов, известны
для сердечно-сосудистых, онкологических, ауто-
иммунных, неврологических и даже психических
заболеваний. Они зарегистрированы при таких
частых болезнях, как атеросклероз, диабет тип 2,
остеоартрит, бронхиальная астма. Так, атеро-
склеротические повреждения сосудов характери-
зуются общим гипометилированием и локальным
гиперметилированием ДНК. В интиме сосудов
вследствие метилирования гена эстрогенового ре-
цептора-а (ESR1) фенотип гладких мышечных
клеток переключается с сократительного на «не-
дифференцированный» [Ying et al., 2000].
Типичными эпигенетическими заболеваниями
являются и такие частые заболевания женщин, как
ГЛАВА 9 261
Метилирование ДНК
Метилирование и
ацетилирование гистонов
Импринтинг
Однонуклеотидный
полиморфизм (SNP)
Вариация числа
копий (CNV)
Эпигенетика
Генетика
Малые
некодирующие РНК
Структура
хроматина
Цис-
влияние
на эпигене-
тический
профиль
Хронические
болезни
Варьирующее
число тандемных
повторов
Взаимодействие
генетических
факторов и факторов
окружающей
среды
Эпигенетические
изменения, выз-
ванные воздейст-
вием окружающей
среды
Токсины
Питание
Окружающая среда
Воздействие факторов
в пренатальный период
развития
Стресс
Фармакологические
препараты
Рис. 9.17. Взаимодействие генетических, эпигенетических и средовых факторов в генезе хронических болезней
(по [Roach et al., 2011]).
гестоз (см. раздел 9.3.3) и эндометриоз (эктопиче-
ское разрастание ткани эндометрия за пределами
полости матки), в этиологии которых важная роль
отводится наследственной предрасположенности,
повреждающим экологическим факторам и небла-
гоприятным эпигенетическим модификациям. Ин-
гибиторы гистоновых деацетилаз типа трихоста-
тина рассматриваются как перспективные препа-
раты для лечении эндометриоза [Guo, 2009].
Частота спонтанных эпимутаций может из-
меняться факторами окружающей среды. При
этом, если причиной вторичных ЭМ являются му -
тации генов, обеспечивающих механизмы эпи-
генетической изменчивости (см. раздел 9.1), то
причины возникновения первичных ЭМ совер-
шенно неясны. Предполагается существование
генетической предрасположенности к формиро-
ванию ЭМ в определенных хромосомных локу-
сах, регулирующих активность генов, влияющих
на структуру хроматина или процессы метили-
рования ДНК [Лебедев, Саженова, 2008]. Из-
вестно, что определенные варианты последова-
тельности ДНК оказываются более подвержен-
ными ЭМ, чем другие.
262 ЭПИГЕНЕТИКА
Примером взаимодействия между’ генетиче-
ским фактором и окружающей средой, влияю-
щей на эпигенетические изменения, может слу-
жить корреляция процессов метилирования с уро-
внем фолиевой кислоты (ФК) [Horsthemke, 2010].
Известно, что основным донором метильных
групп в клетке является Л'-адснозилмстионин, со-
держание которого зависит от уровня ФК. Клю-
чевым ферментом обмена ФК является метилен-
тетрагидрофолат-5,10-рсдуктаза (MTHFR), пре-
вращающая ФК в ее метаболически активную
форму’ — тетрагидрофолиевую кислоту-, которая
через А-аденозил-метионин обеспечивает ме-
тильными группами ДНК и гистоны. Частый ва-
риант гена MTHFR (677С > Т) кодирует термо-
лабильный белок со сниженной ферментной ак-
тивностью. Гомозиготность по варианту- 677С >
> Т приводит к глобальному’ снижению метили-
рования ДНК при низких уровнях фолатов. Это
ведет к нехватке внутриклеточного Л'-адснозил-
метионина и неэффективному- пострепликатив-
ному- метилированию ДНК-метилтранферазой
DNMT1. Как следствие, в последующих циклах
репликации ДНК метилирование теряется. При
снижении содержания фолатов у пациентов с
гипергомоцистеинемией отмечается повышен-
ная частота биаллельной экспрессии ИГ вслед-
ствие их гипометилирования. Матери, гомози-
готные по варианту MTHFR 677 С > Д имеют
повышенный риск рождения ребенка с дефектом
импринтинга в хромосоме 15, приводящим к
синдрому Ангельмана. Следует напомнить, что
применение ФК до беременности и в течение
первых месяцев рекомендуется всем женщинам
и семьям, планирующим ребенка, с целью про-
филактики дефектов заращения невральной
трубки, снижения вероятности хромосомных бо-
лезней и БИ у плода.
В настоящее время активно разрабатываются
лекарственные препараты с целью модификации
метилирования и фосфорилирования гистонов. Хо-
тя эти препараты не являются локусспецифичны-
ми, некоторые из них обладают лечебным эффек-
тами при раке и проходят клинические испытания.
Итак, нарушения механизмов эпигенетиче-
ской регуляции, происходящие как в соматиче-
ских, так и в половых клетках, полу-чили назва-
ние эпимутаций. Они могут затрагивать сам ген
(первичные ЭМ) или находиться как в цис-, так и
в /7?/л7//с-положснии по отношению к генам-ми-
шеням, контролирующим эпигенетическую ор-
ганизацию хроматина (вторичные ЭМ). ЭМ мо-
гут затрагивать весь геном, отдельные хромосо-
мы, их фрагменты или единичные гены. ЭМ воз-
никают особенно часто во время эпигенетиче-
ского репрограммирования генома, т. е. в гаме-
тогенезе и на ранних стадиях развития (бласту-
ляция, имплантация, плацентация, активный ор-
гано- и гистогенез). ЭМ. возникающие на этих
стадиях, нередко ведут к эмбриональной гибели,
аномалиям развития или к болезням импринтин-
га. Естественной моделью эпигенетической ре-
гуляции у млекопитающих является геномный
импринтинг, основу- которого составляет раз-
личная экспрессия гомологичных генов, хромо-
сом или геномов в зависимости от их родитель-
ского происхождения. Рассмотрены особенности
фенотипического проявления ЭМ импринтиро-
ванных и неимпринтированных генов во время
эмбриогенеза, их роль в развитии частых на-
следственных и ненаследственных синдромов,
а также различных хронических заболеваний.
ЭМ характеризуются тканеспецифичностью,
возникают как в гаметогенезе, так и во время эм-
брионального развития. Нарушение функций им-
принтированных локусов ассоциированы с ран-
ней эмбриолетальностью у человека, с привыч-
ным невынашиванием беременности.
Выделяют две группы эпигенетических бо-
лезней: первичные (вызываются му-тациями ге-
нов, контролирующих процессы метилирования
и ремоделирования хроматина) и вторичные (мо-
дификации ДНК в локусах, которые изменяют
метилирование ДНК, нарушают работу- ИГ). При-
ведены примеры первичных и вторичных эпи-
генетических болезней, такие как синдром Ретта
(ген МЕСР2), синдром Рубинштейна—Тэйби
(REBBP), синдром субтеломерной делеции 9q34
(ЕНМ11) и синдром Коффина—Лоури (RSK2)
(группа 1). Заболевания второй группы возни-
кают de novo и могут наследоваться. Они могут
быть генетическими или эпигенетическими.
Классическими примерами таких болезней яв-
ляются достаточно частые и хорошо изученные
синдромы Прадера-Вилли и Ангельмана, основу
которых составляют нарушения импринтинга в
кластерах генов хромосомы 15. При этом в слу-
чав синдрома Прадера—Вилли выключенными
(импринтированными) оказываются отцовские
гены, а при синдроме Ангельмана — материн-
ские. Фенотипически оба синдрома сильно разли-
чаются, а по клиническому- проявлению во мно-
гом противоположны. К этой же группе ЭБ от-
носят и ряд болезней, связанных с нарушением
функции генов, обусловленных наличием близко
распложенных к ним тандемных повторов раз-
ной протяженности (синдром Мартина—Белл и
лице-лопаточно-плечевая мышечная дистрофия).
ГЛАВА 9 263
Приведены данные, свидетельствующие о на-
личии выраженного эпигенетического компо-
нента в этиологии частых, хронических много-
факторных заболеваний. Считается, что все эпи-
генетические болезни человека закладываются
еще в эмбриогенезе. Первичные ЭМ, ведущие к
нарушениям метилирования и супрессии многих
генов, известны для сердечно-сосудистых, онко-
логических, аутоиммунных, неврологических и
даже психических заболеваний. Они зарегистри-
рованы и при таких частых болезнях, как атеро-
склероз, диабет тип 2, остеоартрит, бронхиаль-
ная астма. О природе неблагоприятных ЭМ и
метаболических путях, которые они нарушают,
известно еще очень мало. Частота спонтанных
эпимутаций зависит от действия факторов окру-
жающей среды. Предполагается существование
генетической предрасположенности к формиро-
ванию ЭМ в определенных хромосомных локу-
сах, регулирующих активность генов, влияющих
на структуру хроматина или процессы метили-
рования ДНК. Известны некоторые гаплотипы
(варианты последовательностей ДНК), которые
более подвержены ЭМ, чем другие участки хро-
матина того же л оку са.
Примером взаимодействия между’ генетиче-
ским фактором и окружающей средой, влияю-
щей на эпигенетические изменения, может слу-
жить корреляция процессов метилирования ДНК
с уровнем фолиевой кислоты (ФК).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Баранов В. С., Кузнецова Т. В. Цитогенетика эмбрионально-
го развития человека. СПб.: Н-Л, 2007. 639 с.
Баранов В. С., Пендина .4. А., Кузнецова Т. В., Ефимова О. .4.,
Федорова II. Д, Леонтьева О. А., Корсак В. С., Николь-
ский Н. Н. Некоторые особенности статуса метилиро-
вания метафазных хромосом у зародышей человека до-
имплантационных стадий развития И Цитология. 2005.
Т. 47, № 8. С. 723—730.
Вайсертрейгер И. С., Подгорная О. II., Енукашвили Н. II.
ДНК прицентромерных участков конститутивного ге-
терохроматина деметилирована и деконденсирована в
клетках MRC5 и А431// Там же. 2007. Т. 49. № 1.
С. 62 69.
Голубовский hl. Д. Генетика — эволюция идей и понятий.
СПб.: Борей—Арт, 2000. 262 с.
Голубовский hl. Д. Принцип факультативности: обобщенная
концепция генома и наследственная изменчивость И
Чарльз Дарвин и современная биология. СПб.: Нестор-
История, 2010. С. 111—124.
Дыбан А. П. Раннее развитие млекопитающих. Л.: Наука,
1988. 228 с.
Дыбан .4. 77., Баранов В. С. Цитогенетика эмбрионального
развития человека. М.: Наука. 1978. 216 с.
Жимулев II Ф. Общая и молекулярная генетика. Новоси-
бирск: Изд-во ИГУ, 2002. 458 с.
Корочкин Л. II. Биология индивидуального развития. М.:
Изд-во МГУ, 2002. 264 с.
Лебедев II. 77. Эпигенетические модификации генома в эм-
бриональном периоде онтогенеза человека: Автореф.
дисс. ... докт. биол. наук. Новосибирск, 2008. 32 с.
Лебедев II. Н., Саженова Е. .4. Эпимутации импринтиро-
ванных генов в геноме человека: классификация, при-
чины возникновения, связь с наследственной патоло-
гией // Генетика. 2008. Т. 44. С. 1356- -1373.
Назаренко С.А.. Карагеоргий НМ. Межтканевые различия
С-полиморфных районов хромосом у эмбрионов чело-
века: возможная роль метилирования ДНК// Генети-
ка. 1995. Т. 31, № 11. С. 1578—1581.
Немцова М. В., Залетаев Д. В. Эпигенетические нарушения
экспрессии генов и наследственная патология у чело-
века И Введение в молекулярную медицину. М.: Меди-
цина, 2004. С. 94—146. ’
Пальцев hl. .4., Залетаев Д. В. Система генетических и эпи-
генетических маркеров в диагностике онкологических
заболеваний. М.: Медицина, 2009. 384 с.
Паткин Е. Л. Эпигенетические механизмы распространен-
ных заболеваний человека. СПб.: Нестор-История,
2008. 197 с.
Пендина А. .4., Кузнецова Т. В., Логинова Ю. А., Баранов В. С.
Особенности метилирования перицентромерного гете-
рохроматина хромосом 1, 9 и 16 у' эмбрионов че-
ловека // Цитология. 2001. Т. 43, № 8. С. 772—776.
Пендина А. .4.. Гринкевич В. В.. Кузнецова Т. В.. Баранов В. С.
Метилирование ДНК — универсальный механизм ре-
гуляции активности генов И Экологическая генетика.
2004. Т. 2, вып. 1. С. 27—37.
Пендина А. А., Ефимова О. А., Каминская А. Н, Кузнецо-
ва Т. В., Баранов В. С. Иммуноцитохимический анализ
статуса метилирования метафазных хромосом челове-
ка // Цитология. 2005. Т. 47. № 8. С. 731—737.
Подгорная О. II., Осшро.мьпиенский Д. II, Кузнецова II. ( .,
Матвеев II. В.. Комиссаров А. С. Парадоксы организа-
ции центромера и гетерохроматина И Цитология. 2009.
Т. 51, №3. С. 204—211.
Прокофьева-Бельговская А. А. Гетерохроматические рай-
оны хромосом. М.: Наука, 1986. 41 1 с.
Светлов П. Г. Теория критических периодов развития и ее
значение для понимания принципов действия среды на
онтогенез И Вопросы цитологии и общей физиологии.
М.; Л.: Изд-во АН СССР, 1960. С. 263—285.
Смирнов А. Ф. Структурно-функциональная организация
хромосом. СПб.: Нестор-История, 2009. 204 с.
Allis D., JemtweinT., ReinbergD. Общий обзор и основные
понятия И Эпигенетика / Ред. С. Д. Эллис, Т. Дженю-
вейн, Д. Райнберг. М.: Техносфера, 2010. С. 33—70.
Almeida A., Kokalj-Vokac N., Lefrancois D., Yiegas-Pequig-
notE., Jeanpierre hl, Dutrillaux B., Malfoy В. Hypomet-
hylation of classical satellite DNA and chromosome insta-
bility in lymphoblastoid cell lines // Hum. Genet. 1993.
Vol. 91, N 6. P. 538—546.
Barlow D. P., Bartolomei hl. S. Геномный импринтинг у млеко-
питающих И Эпигенетика / Ред. С. Д. Эллис, Т. Дженю-
вейн, Д. Райнберг. М.: Техносфера, 2010. С. 349—367.
Barthes Р., BuardJ., Massy В. Epigenetic factors and regulation
of meiotic recombination in mammals // Epigenetics and
Human reproduction/ K. Rousseaus, S. Khochbin (eds).
Berlin; Heidelberg: Springer-Verlag, 2011. P. 119—
156.
BaylinS. B., Jones P. .4. Эпигенетические детерминанты при
раковых заболеваниях/.' Эпигенетика / Ред. С. Д. Эл-
лис, Т. Дженювейн, Д. Райнберг. М.: Техносфера, 2010.
С. 445—464.
BeaujeanN., Hartshorne G., CavillaJ., Taylor J., Gardner J.,
Wilmutl, Meehan R, YoungL. Non-conservation of mam-
malian preimplantation methylation dynamics // Curr.
Biol. 2004. Vol. 14. P. R266—R267.
264 ЭПИГЕНЕТИКА
BensaadaAL, Kiefer H. Tachdjian G., Lapierre J. AL. Ca-
cheuxV., NiveleauA., Metezemt P. Altered patterns of
DNA methylation on chromosomes from leukemia cell
lines: identification of 5-methylcytosines by indirect im-
munodetection// Cancer Genet. Cytogenet. 1998. Vol. 103,
N2. P. 101—109.
Bhattacharya B., PuriS., PuriR. K. A review of gene express-
ing profiling of human embryonic stem cell lines and their
differentiation progeny // Curr. Stem Cell Res. Ther. 2009.
Vol. 4. P. 98—106.
BorqueD.K., Avila L., PenaherreraAL. S., von Dadelszen P.,
Robinson ГГ. P. Decreased placental methylation in the
H19/IGF2 imprinting control regions assotiated with nor-
matensive intrauterine growth retardation but not pree-
clampsia / Placenta. 2010. Vol. 31. P. 197—202.
Carlson B. AL Human embryology and developmental biology'.
4th ed. Philadelphia: Mosby, 2009. 541 p.
Cedar H., Bergman Y. Linking DNA methylation and histone
modification: patterns and paradigms // Nat. Rev. Genet.
2009. Vol. 10. P. 295—304.
Chen L. L., Garmichael G. G. Altered nuclear retention of
mRNA containing inverted repeats in human embryonic
stem cells: functional role of nuclear noncoding RNA //
Mol. Cell. 2009. Vol. 35, N 4. P. 467—478.
ChenZ., Riggs A. D. DNA methylation and demethylation in
mammals 11 J. Biol. Chem. 2011. Vol. 286. N 21. P. 18347—
18353.
Dean W., SantosF., Stojkovic AL, Zakhartchenko ] Walter J,
WolfE., Reik W. Conservation of methylation reprogram-
ming in mammalian development: aberrant reprogram-
ming in cloned embrvos H Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
2001. Vol. 98. P. 13734—13738.
Dimitri P., CorradiniN., RossiF., FerniF The paradox of
functional heterochromatin // Bioessays. 2005. Vol. 27,
NLP. 29—41.
Dimitri P., CaizziR, Giordano E., Carmela AccardoAL, Lat-
tanziG., BiamontiG. Constitutive heterochromatin: a sur-
prising variety' of expressed sequences П Chromosoma.
2009. Vol. 118, N 4. P. 419—435.
Dyban A. P., Baranov Г. S. Cytogenetics of Mammalian Embry-
onic Development. Oxford: Clarendon Press, 1987. 362 p.
Edwards R. G., BeardH. B. Oocyte polarity' and cell determina-
tion in early' mammalian embrvos // Mol. Human Reprod.
1997. Vol. 3, N 10. P. 863—905.
Elgin S. C, Grewal S. L. Heterochromatin: silence is golden//
Curr. Biol. 2003. Vol. 13, N 23. P. R895—R898.
Engel E., Antonarakis S. E. Genomic Imprinting and Uniparen-
tal Disomy' in Medicine: Clinical and Molecular Aspects.
N.Y.: Wiley-Liss, 2002. 304 p.
Enukashvilly N. L., DonevR, Weisertreiger 1. S.-R, Podgor-
naya O. L. Human chromosome 1 satellite 3 DNA is de-
condenced, demethylated and transcribed in senescent
cells and in A341 epithelial carcinoma cells // Cytogenet.
Genome Res. 2007. Vol. 118, N l.P. 42—54.
EymeryA., CallananAL., FourchC. The secret message of het-
erochromatin: new insights into the mechanisms and func-
tion of centromeric and pericentric repeat sequence tran-
scription 7 Int. J. Develop. Biol. 2009. Vol. 53, N 2—3.
P. 259 268.
EymeryA.. Souchier C. I'ourc'hC.. Jolly C. Heat shock factor
1 binds to and transcribes satellite II and III sequences at
several pericentromeric regions in heat-shocked cells '/
Exp. Cell Res. 2010. Vol. 316, N 11. P. 1845—1855.
Fernandez J. L., Campos A., Lopez-Fernandez C, GosdlvezJ.,
Goyanes F. Difference in constitutive heterochromatin be-
haviour between human amniocytes and lymphocytes de-
tected by a sequential in situ exonuclease П1 digestion-
random primer extension procedure U Med. Genet 1995.
Vol. 32, NLP. 32—35.
FerrettiP.. Copp A., Tickle Ch., ALoore G. Embryos, Genes and
Birth Defects. 2nd ed. Chichester: J. Wiley' & Sons, 2006.
550 p.
Fulka H., ALrazekAL, Tepla O., Fulka J. Jr. DNA methylation
pattern in human zygotes and developing embryos // Re-
production. 2004. Vol. 128. P. 703—708.
Fulka J., Fulka H, Slavik T., Okada K, Fulka J. Jr. DNA me-
thylation pattern in pig in vivo produced embryos // Histo-
chem. Cell Biol. 2006. Vol. 126. P. 213—217.’
Grossniklaus U., ParoR. Транскрипционный сайленсинг,
осуществляемый белками группы Polycomb И Эпиге-
нетика Ред. С. Д. Эллис, Т. Дженювейн, Д. Райнберг.
М.: Техносфера, 2010. С. 210—229.
GrygorievS., Bulynko Е, Popova Е. The end adjusts the means:
Heterochromatin remodelling during terminal cell differ-
entiation,/Chromosome Res. 2009. Vol. 14, N 1. P. 53- -69.
GuoS.-W. Epigenetics of endometriosis// Mol. Hum. Reprod.
2009. Vol. 15, N 10. P. 587—607.
Guraya S. S. Cellular and Molecular Biology of Human Ooge-
nesis, Ovulation and Early Embryogenesis. New Delhi:
New Age International, 2008. 267 p.
Harper J. Preimplantation Genetic Diagnosis. Cambridge: Uni-
versity' Press, 2010. 294 p.
Hemberger AL, Udayashankar R, Tesar P., ALoore H, Bur-
ton G. J. ELF5-enforced transcriptional networks define
an epigenetically regulated trophoblast stem cell com-
partment in the human placenta // Hum. Mol. Genet. 2010.
Vol. 19. P. 2456—2467.
Horsthemke B. Epigenetics // Vogel and Motulsky’s Human Ge-
netics. 4th ed. I M. R. Spiecher, S. E. Antonarakis, A. G. Mo-
tulsky (edrs). Berlin; Heidelberg: Springer-Verlag, 2010.
P. 299—318.
Horvath J. E., SchwartzS., Eichler E. E. The mosaic structure
of human pericentromeric DNA: a strategy for characteriz-
ing complex regions of the human genome // Genome Res.
2000. Vol. 10, N 6. P. 839—852.
Hou J.. Lei TH, Liu L„ CuiX.H, AnX.R, ChenY.F. DNA
methylation patterns in in vi/ro-fcrtilized goat zygotes //
Reprod. Fertil. Dev. 2005. Vol. 17. P. 809—813.
HowlettS. K, ReikW. Methylation levels of maternal and pa-
ternal genomes during preimplantation development //
Development. 1991. Vol. 113. P. 119—127.
LtoS., DAlessioA. C, Taranova О. F, HongK., SowersL. C,
Zhang Y. Role of Tet proteins in 5mC to 5hmC conver-
sion, ES-cell self-renewal and inner cell mass specifica-
tion//Nature. 2010. Vol. 466. P. 1129—1133.
Jablonka E., Lamb AL. J. The inheritance of acquired epigenetic
variations 11 J. Theor. Biol. 1989. Vol. 139. P. 69—83.
Jeanpierre AL. Human satellites 2 and 3// Ann. Genet. 1994.
Vol. 37, N 4. P. 163- 171.
Jehan Z.. Fallinayagam S.. TiwariS.. PradhanS.. Singh I..
SureshA., Reddy H. AL, AhujaY.R, JesudasanRA. No-
vel noncoding RNA from human Y distal heterochromatic
block (Yql2) generates testisspecific chimeric CDC2L2 /7
Genome Res. 2007. Vol. 17, N 4. P. 433—440.
Jolly C., ALetzA., GovinJ., FigneronAL, TurnerB. AL, Kho-
chbinS., Fourc'h C. Stress induced transcription of satellite
III repeats // J. Cell Biol. 2004. Vol. 164, NLP. 25—33.
Jolly C., LakhotiaS.C. Human sat III and Drosophila hsr
omega transcripts: a common paradigm for regulation of
nuclear RNA processing in stressed cells // Nucleic Acids
Res. 2006. Vol. 34, N 19. P. 5508—5514.
KangY. K, KooD.B, ParkJ.S., ChoiY. H„ Kim H. N„
Chang W. K, Lee К К, Han Г. AL. Typical demethylation
events in cloned pig embryos. Clues on species-specific dif-
ferences in epigenetic reprogramming of a cloned donor ge-
nome // J. Biol. Chem. 2001. Vol. 276. P. 39980—39984.
Khal A. AL, Guttman AL, HuarteAL, Garber AL, Raj A., Ri-
vea ALorales D., Thomas K, Presser A., Bernstein В. E.,
ГЛАВА 9 265
van Oudenaarden A.. RegevA., Lander E. S.. RinnJ.L.
Many human intergenic noncoding RNAs associate with
chromatin-modifying complexes and affect gene expres-
sion// Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2009. Vol. 106, N 28.
P. 11667—11672.
Kokalj-Vokac N, Zagorac A., PristovnikM., Bourgeois C. A.,
Dutrillaux B. DNA methylation of the extraembryonic tis-
sues: an in situ study on human metaphase chromosomes '/
Chromosome Res. 1998. Vol. 6, N 3. P. 161—166.
Kouzarides T, BergerS. L. Модификации хроматина и меха-
низмы их действия И Эпигенетика / Ред. С. Д. Эллис,
Т. Дженювейн, Д. Райнберг. М.: Техносфера, 2010.
С. 191—209.
Lee С., WevrickR, Fisher R В., Ferguson-Smith М. А.,
Lin С. С. Human centromeric DNAs И Hum. Genet. 1997.
Vol. 100, N 3- -4. P. 291 -304.
Li E., Bird А. Метилирование ДНК у млекопитающих '/
Эпигенетика / Ред. С. Д. Эллис, Т. Дженювейн, Д. Райн-
берг. М.: Техносфера, 2010. С. 333—348.
LuJ., Gilbert D.M. Proliferation-dependent and cell cycle-re-
gulated transcription of mouse pericentric heterochro-
matin // J. Cell Biol. 2007. Vol. 179,N3. P. 411—421.
MacGrath J., SolterD. Nuclear completion of mouse embryo-
genesis requires both the maternal and paternal genomes //
Cell. 1984. Vol. 37. P. 179—183.
Mahieu-Williame L., FalgayrettesP., NativelL., Gall-BorrutP..
Costa L., SalehzadaT., Bisbal C. Near-field microscopy
and fluorescence spectroscopy: application to chromo-
somes labelled with different fluorophores // J. Microsc.
2010. Vol. 238, N 1. P. 36—43.
Mattei M.-G., LucianiJ. Heterochromatin, from chromosome to
protein// Eur. Cytogenet. Assoc. Newsletter. 2003. Vol. 11.
P. 3—13.
Meneveri R., Agresti A., Marozzi A., Saccotie S. Molecular or-
ganization and chromosomal location of human GC-rich
heterochromatic blocks // Gene. 1993. Vol. 123, N 2.
P. 227—234.
Miller D. Sperm RNA: reading hidden message 7 Epigenetics and
Human reproduction/ K. Rousseaus, S. Khochbin (eds).
Berlin; Heidelberg: Springer-Verlag, 2011. P. 329—353.
Mitchell A. R. Hypomethylation of human heterochromatin de-
tected by restriction enzyme nick translation // Exp. Cell
Res. 1992. Vol. 202, NEP. 203—206.
MonkM.. BoubelikM.. LehnertS. Temporal and regional
changes in DNA methylation in the embryonic, extraem-
bryonic and germ cell lineages during mouse embryo de-
velopment//Development. 1987. Vol. 99. P. 371—382.
Oliva R, de MateoS. Medical implication of sperm nuclear
quality 7 Epigenetics and Human reproduction K. Rous-
seaus, S. Khochbin (eds). Berlin; Heidelberg: Springer-
Verlag. 2011. P. 45—83.
Parris G. E. A hypothetical Master Development program for
multi-cellular organisms: ontogeny and phylogeny'/ Bio-
sei. Hypotheses. 2009. Vol. 2. P. 3—12.
Parris G. E. Developmental diseases and hypothetical Master
Development Program // Med. Hypotheses. 2010. Vol. 74.
P. 564—573.
PeastonA., Rossant J., LiL., Knowles В. B. Retrotransposons
regulate host genes in mouse oocvtes and preimplantation
embryos // Dev. Cell. 2004. Vol. 7. P. 597—606.
Pendina A. A., Efimova O. A., Fedorova I. D., Leont’eva O. A.,
Shihttkova E. M., Lezhnina J. G., Kuznetzova T. Г., Bara-
nov E. S. DNA methylation patterns of metaphase chromo-
somes in human preimplantation embryos // Cytogenet.
Genome Res. 2011. Vol. 1—2. P. 1—7.
PerezM. M., Miguez L., Faster C, MiroR., Genescd G., Egoz-
cueJ. Heterochromatin decondensation in chromosomes
from chorionic villus samples// Prenat. Diagn. 1991.
Vol. 11,N9. P. 697—704.
PezerZ., Ugarcovic D. Transcription of pericentromeric chro-
matin in beetles-satellite DNA as active regulatory ele-
ments // Cytogenet. Genome Res. 2009. Vol. 124, N 3—4.
P. 768—676.
Probst A. Г., Almouzni G. Heterochromatin establishment in the
context of genome-wide epigenetic reprogramming //
Trends Genet. 2011. Vol. 27, N 5. P. 177 185.
Rawn S. M.. Cross J. C. The evolution, regulation and function
of placenta-specific genes // Ann. Rev. Cell. Dev. Biol.
2008. Vol. 24. P. 159—181.
Razin A., Cedar H. DNA methylation and embryogene-
sis // EXS. 1993. Vol. 64. P. 343—357.
RigoutsosL, HuynthT., Miranda K, Tsirigos A., McHardy A.,
Platt D. Short blocks from the noncoding parts of the hu-
man genome have instances within nearly all known genes
and relate to biological processes // Proc. Natl. Acad. Sci.
USA. 2006. Vol. 103. N 17. P. 6605—6610.
RizziN., DenegriM., CorioniM., Valgardsdottir R., Cobian-
chi F, Riva S., Biamonti G. Transcriptional activation of a
constitutive heterochromatic domain of the human genome
in response to heat shock 7 Mol. Biol. Cell. 2004. Vol. 15,
N2. P. 543—551.
Roach H., BronnerF, OreffaRO.C. Epigenetic Aspects of
Chronic Diseases. London: Spinger, 2011. 231 p.
Roberts R. M., EzashiT., DasP. Trophoblast gene expression:
Transcription factors in the specification of early tro-
phoblast 11 Reprod Biol. Endocrinol. 2004.
Roman-Gomez J., Jimenez-Velasco A., AgirreX., Castil-
lejoJ. A., Navarro G., San Jose-Eneriz E., GarateL., Cor-
deuL., Cervantes F, Prosper F, Heiniger A., Torres A.
Repetitive DNA hypomethylation in the advanced phase
of chronic myeloid leukemia 7 Leuk. Res. 2008. Vol. 32,
N3. P. 487 490.
Rougier N., Bourc’hisD., GomesD. M., Niveleau A., Pla-
chotM.. PaldiA.. Viegas-Pequiguot E. Chromosome me-
thylation patterns during mammalian preimplantation de-
velopment " Genes Dev. 1998. Vol. 12. P. 2108—
2113.
SantosF., Zakhartchenko Г., Stojkovic M., Peters A., Jenu-
wein T, WolfE., Reik IE, Dean IE. Epigenetic marking
correlates with developmental potential in cloned bovine
preimplantation embryos // Curr. Biol. 2003. Vol. 13.
P. 1116—1121.
SantosF., Dean IE Using immunofluorescence to observe me-
thylation changes in mammalian preimplantation em-
bryos // Methods Mol. Biol. 2006. Vol. 325. P. 129—137.
Schultz L.C., EzashiT., DasP., Westfall D., Livingston K. A.,
Roberts R. M. Human embryonic stem cells as models for
trophoblast differentiation // Placenta. 2008. Vol. 29.
Suppl. A. P. 10 16.
Shi IE, Dirim F. WolfE.. Zakhartchenko!., HaafT. Methyla-
tion reprogramming and chromosomal aneuploidy in in
vivo fertilized and cloned rabbit preimplantation em-
bryos 11 Biol. Reprod. 2004. Vol. 71. P. 340—347.
Schramke Г., Allshire R. Those interfering little RNAs! Silenc-
ing and eliminating chromatin // Curr. Opion. Genet. Dev.
2004. Vol. 14, N 2. P. 74—80.
SoodR., Zehender J., DruzinM. L., Brown P. O. Gene expres-
sion pattern in human placenta // Proc. Natl. Acad. Sci.
USA. 2006. Vol. 103. P. 5478—5483.
SpiecherM.R, Antonarakis S. E., Motulsky A. G. Vogel and
Motulsky’s Human Genetics. 4th ed. Berlin; Heidelberg:
Springer-Verlag, 2010. 981 p.
Sullivan B. A., Karpen G. H. Centromeric chromatin exhibits a
histone modification pattern that is distinct from both eu-
chromatin and heterochromatin // Nat. Struct. Mol. Biol.
2004. Vol. 11, N 11. P. 1076—1083.
Surani A., ReikW. Зародышевая линия и плюрипотентные
стволовые клетки // Эпигенетика / Ред. С. Д. Эллис,
266 ЭПИГЕНЕТИКА
Т. Дженювейн, Д. Райнберг. М.: Техносфера. 2010.
С. 368—386.
SuraniA., BartonS. С., Norris AL. L. Developmet of reconsti-
tuted mouse eggs suggests imprinting of the genome dur-
ing gametogenesis /'Nature. 1984. Vol. 308. P. 548—550.
Szulwach К. E., LiX., LiY., SongC.X., HanJ.W, KiniS.,
NamburiS., Hemietz K, Kim J. J., Rudd AL. K, YoonY.S.,
lieu IL. He C.. JinP. Integrating 5-hydroxymethylcytosine
into the epigenomic landscape of human embryonic stem
cells // PLoS Genet. 2011. Vol. 7, N 6. P. 61002154.
TahiliamAL, Koh К. P., Shen 1., Pastor W. A., Bandukwala H.,
BrudnoY., AgarwalS., LyerL.AL, LiuD.R, AravindL.,
Rao A. Conversion of 5-methylcytosine to 5-liydroxyniet-
hylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1 //
Science. 2009. Vol. 324. P. 930—935.
Tollefsbor T. Epigenetics: The new science of genetics // Hand-
book in Epigenetic. The New Molecular and Medical Ge-
netics / T. Tollefsbor (ed). San Diego: Academic Press,
2011. P. 1—8.
Tomilin N. V Regulation of mammalian gene expression by
retroelements and non-coding tandem repeats 11 BioEs-
says. 2008. Vol. 30. P. 338—348.
TyckoB. Imprinted genes in placental growth and obstetric disor-
ders// Cytogenet. Genome Res. 2006. Vol. 113. P. 271—
278.
Ugarcovic D. Functional elements residing within satellite
DNAs //EMBORep. 2005. Vol. 6,N 11. P. 1035—1039.
Valinluck V, Sowers L. C. Endogenous cytosine damage prod-
ucts alter the site selectivity' of human DNA maintenance
methyltransferase DNMT1 // Cancer Res. 2007. Vol. 67.
P. 946—950.
Vcmneste E., VoetT., Le Caignec C., AmpeAL, Konings P., ALe-
lotteC., DebrockS., AmyereAL, VikkulaAL, Schutt F,
FrynsJ.P., VerbekeG., D'HoogheT., ALoreauY., Ver-
meesch J. R. Chromosome instability' is common in hu-
man-cleavage-stage embryos// Nat. Med. 2009. Vol. 15.
P. 577—583.
Vertinsky Y. S., Kuliev A. AL Preimplantation Genetic Diagnosis.
N.Y.: London: The Parthenon Publishing Group, 2000.
174 p.
Waddington С. H. The basic ideas of biology' // Toyvards a Theo-
retical Biology' I С. H. Waddington (ed). Edinburgh: Edin-
burgh University'Press, 1968. Vol. 1. P. 1—32.
Wallrath L. L. Unfolding the mysteries of heterochromatin 11
Curr. Opin. Genet. Dev. 1998. Vol. 8,N2. P. 147—153.
WossidloAL, Nakamura T, Lepikhov K, ALarques C. J., Zak-
hartchenko V, BoianiAL, ArandJ, NakanoT., ReikW.,
Waller J. 5-Hydroxymethylcytosine in the mammalian zy-
gote is linked with epigenetic reprogramming // Nat.
Commun. 2011. Vol. 2. P. 241.
Xu E.. Zhang J. J.. GrifoJ. .1.. KreyL. C. DNA methylation pat-
terns in human tripronucleate zygotes // Mol. Hum. Re-
prod. 2005. Vol. 11. P. 167—171.
Ying A. K, Hassanian H. H., Roos C. AL, Smiraglia D. J.,
Lssa J. J., ALichlerRE., CaligiuriAL, PlassC., Gold-
schmidt-Clermont P. J. Methylation of estrogen receptor
alpha gene promoter is selectively increased proliferating
human aortic smooth muscle cells // Cardiovasc. Res.
2000. Vol. 46. P. 172—179.
YuenR К C.. PenaherraraAL. S.. DaelszenP., ALcFaddenD. E..
Robinson W. P. DNA methylation profiling of human pla-
centas reveals promoter hypomethylation of multiple
genes in early' onset preeclampsia // Europ. J. Hum. Genet.
2010. Vol. 107. P. 1 —7.
Yasuhara J. C., Wakimoto В. T. Oxymoron no more: the ex-
panding yvorld of heterochromatic genes // Trends Genet.
2006. Vol. 22, N 6. P. 330—338.
ГЛАВА
10
ЭВОЛЮЦИЯ И ОРГАНИЗАЦИЯ КЛАСТЕРОВ ГЕНОВ
С ИМПРИНТИРОВАННОЙ МОНОАЛЛЕЛЬНОЙ
ЭКСПРЕССИЕЙ
СОДЕ РЖАН И Е
10.1. Возникновение и эволюция имп-
ринтинга у млекопитающих, 268
10.2. Организация кластеров генов с
импринтированной моноаллельной
экспрессией, 275
Список литературы, 279
268 ЭПИГЕНЕТИКА
10.1. Возникновение и эволюция
ИМПРИНТИНГА У МЛЕКОПИТАЮЩИХ
Большинство аутосомных генов плацентар-
ных млекопитающих в каждой клетке экспрес-
сируется на эквивалентном уровне с двух алле-
лей, располагающихся на гомологичных хромо-
сомах. Однако ряд генов транскрибируется пре-
имущественно только с одного аллеля. Выбор
аллеля, с которого будет осуществляться моно-
аллельная экспрессия, может быть предопреде-
лен посредством импринтинга [Zakharova et al.,
2009]. Импринтингу в геноме мыши подвергает-
ся более 90 аутосомных генов [Beechev et al.,
2008].
Предполагают, что импринтинг у млекопи-
тающих возник как следствие механизма мети-
лирования ДНК, существующего для защиты ге-
нома от интеграции чужеродной ДНК [Barlow,
1993]. Инсерция, или быстрое увеличение числа
копий чужеродной ДНК внутри клетки, привле-
кает механизмы метилирования ДНК и модифи-
каций гистонов [Barlow, Bartolomei, 2007]. Пока-
зано, что кофактор de novo ДНК-метилтрансфе-
разы Dnmt3a белок Dnmt3L, участвующий в про-
цессе обеспечения геномного импринтинга, иг-
рает также решающую роль в метилировании и
сайленсинге ретротранспозонов в клетках заро-
дышевого пути особей мужского пола [Barlow,
1993; Bourc’his, Bestor, 2006; Barlow, Bartolomei,
2007]. Подтверждением гипотезы возникновения
импринтинга в результате действия механизма
защиты генома от инсерции чужеродной ДНК
являются также результаты сравнения последо-
вательностей импринтированных кластеров пла-
центарных, сумчатых и ортологичных последо-
вательностей яйцекладущих млекопитающих
[Pask et al., 2009]. Обнаружено, что у видов, для
которых описан импринтинг, значительно по-
вышается доля повторов — LTRs и элементов
ДНК. То есть возникновение импринтинга у
сумчатых и плацентарных совпадает с инсерци-
ей в геном большого количества чужеродных
элементов ДНК.
10.1.1. Гипотезы эволюции
импринтинга у млекопитающих
Вопросу эволюции и причинам селективного
преимущества геномного импринтинга у млеко-
питающих посвящен целый ряд теорий. В ос-
новных теориях обсуждается тесная связь со
способом репродукции и появлением плаценты в
классе млекопитающих. Общепринятой считает-
ся гипотеза генетического конфликта, хотя в по-
следнее время высказываются доводы также в
пользу теории коадаптации.
Считается, что следствие появления плацен-
ты в эволюции млекопитающих — неэквива-
лентность вклада материнских и отцовских ре-
сурсов в развитие плода после зачатия, ставшая
причиной «генетического конфликта» [Haig,
Westoby, 1989]. Плацентарные млекопитающие
имеют значительный вклад плаценты, через ко-
торую осуществляется питание эмбриона ресур-
сами матери, в развитие плода, благодаря дли-
тельному’ внутриутробному периоду развития. У
сумчатых вклад плаценты существенно меньше,
поскольку’ период внутриутробного развития
значительно сокращен по сравнению с плацен-
тарными, а развитие плода продолжается после
рождения во время сложно организованного пе-
риода грудного вскармливания. У яйцекладущих
млекопитающих питание плода лишь в течение
очень короткого срока на ранних этапах внутри-
утробного развития осуществляется через плод-
ные оболочки, хотя большую часть времени де-
теныш развивается в яйце вне материнского ор-
ганизма. Феномен импринтированной моноал-
лельной экспрессии генов широко распростра-
нен среди видов плацентарных млекопитающих,
всего для нескольких генов показан импринти-
рованный статус у сумчатых и до сих пор не из-
вестно о существовании импринтированных ге-
нов v яйцекладущих млекопитающих [Renfree
et al.,'2008, 2009] (рис. 10.1).
Согласно гипотезе конфликта [Haig, Westoby,
1989], позитивная селекция направлена в отно-
шении тех аллелей отцовского происхождения,
которые нацелены на получение максимального
количества питательных веществ от матери для
развития и роста эмбриона, даже если это будет
в ущерб матери [Haig, Westoby, 1989; Moore,
Haig, 1991]. В то же время аллели материнского
происхождения направлены на эквивалентное
распределение ограниченных материнских ре-
сурсов между' всеми существующими и буду-
щими потомками от этого же или друтого отца.
С гипотезой конфликта хорошо согласуется
наблюдение того факта, что отцовские гены не-
сут ответственность за формирование плаценты
как органа, посредством которого происходит
питание эмбриона за счет материнских ресурсов,
и за рост эмбриона, а материнские, по-видимо-
му, — направлены на репрессию роста эмбрио-
на. К примеру, импринтированная экспрессия
аллеля отцовского происхождения ростового
фактора IGF2 обеспечивает рост плаценты и эмб-
ГЛАВА 10 269
Рис. 10.1. Эволюционное древо, иллюстрирующее время и особенности, свя-
занные с возникновением импринтинга, у млекопитающих.
Красная линия указывает на наличие импринтированных аллелей, черная — отсутствие
к настоящему моменту данных о существовании импринтинга [Renfree et al., 2008].
риона [Constantia et al., 2002], в то время как экс-
прессия аллеля материнского происхождения ге-
на, кодирующего рецептор к IGF2 (IGF2R), дей-
ствует антагонистично по отношению к IGF2'.
связывает его белковый продукт и транспорти-
рует для дальнейшей деградации [Komfeld, 1992].
Одним из подтверждений гипотезы конфликта
считают данные, полученные при изучении гена
Igf2 у живородящих рыб семейства Poeciliidae
[O’Neill etal., 2007]. Несмотря на наличие пла-
центы, ген Igf2 экспрессируется биаллельно. Од-
нако анализ отношения синонимичных/неси-
нонимичных замен в последовательностях гена
7g/2 у 38 видов костистых рыб показал, что, не-
смотря на биаллсльную экспрессию, у живоро-
дящих рыб, имеющих плаценту, наблюдается по-
зитивная селекция Igf2. По-видимому, в данном
случае реализация генетического конфликта стала
возможной без установления механизма имприн-
тинга. Не исключено, что подобные способы мо-
гут действовать и у других живородящих видов за
пределами класса млекопитающих: морских конь-
ков, скорпионов, некоторых акул, амфибий или
рептилий, у которых к настоящему' моменту' не
обнаружено импринтированной моноаллельной
экспрессии генов [Renfree et al., 2009].
В рамках гипотезы конфликта можно объяс-
нить также влияние некоторых генов, прояв-
ляющих импринтированну'ю экспрессию в мозге,
на пищевое поведение. Например, белок XLal-
phaS, который кодируется в локу'се GNAS, экс-
прессируется с хромосомы отцовского происхо-
ждения у новорожденных мышей и людей [Hay-
ward et al., 1998; Peters et al., 1999]. В случае но-
каута этого гена мать полностью отказывается
кормить своих детенышей молоком [Plagge et al.,
2004; Genevieve et al., 2005].
Относительно недавно была высказана гипо-
теза коадаптации [Curley' et al., 2004, 2005; Swa-
ney' et al., 2007; Keveme et al., 2008]. Согласно ей,
основное значение импринтинга — это добиться
лучшей совместимости между' матерью и пло-
дом. Предполагается, что геномный импринтинг
коадаптивно регулирует эмбриональное разви-
тие млекопитающих и репроду'ктивное поведе-
ние [Keveme, Curley, 2008]. Существует ряд им-
принтированных генов, экспрессирующихся как
в плаценте, так и в гипоталамусе, и большинство
их экспрессируются с хромосом отцовского про-
исхождения. При этом действие таких генов в
плаценте, в материнском гипоталаму'се и гипо-
таламусе эмбриона скоординировано и направ-
лено не только на развитие организма, но и на
социальное поведение взрослых особей.
Один из наиболее изученных генов, Peg3,
экспрессиру'ется с хромосомы отцовского про-
270 ЭПИГЕНЕТИКА
похождения во всех трех тканях: плаценте, эм-
бриональном гипоталамусе, что предопределено
в клетках зародышевого пути, и в гипоталамусе
матери как результат импринтинга, уже реализо-
ванного ранее в клетках зародышевого пути ее
матери. Экспрессия гена Peg3 в этих тканях име-
ет значение для нормального материнского и
младенческого поведения, связанного с грудным
вскармливанием [Curley et al., 2005]. Мутация в
гене Peg3 приводит к нарушению выработки мо-
лока [Li et al., 1999]. Мыши, нокаутные по дан-
ному’ гену’, во время внутриутробного развития
имеют меньший размер, а после рождения у них
отсутствует сосательный рефлекс. Взрослые мы-
ши, нокаутные по Peg3, не могут выкармливать
детенышей молоком из-за отсутствия материн-
ского поведения [Curley et al., 2004, 2005].
Peg3 также участвует в формировании поло-
вого поведения самцов. Показано, что у мышей,
мутантных по данному’ гену’, нарушается поло-
вое поведение и отсутствует агрессия по отно-
шению к другим самцам [Swaney et al., 2007].
В этом случае импринтированная экспрессия ал-
леля отцовского происхождения не может быть
объяснена в рамках гипотезы генетического
конфликта. Полагают, что гипотеза конфликта
подходит для объяснения действий импринтиро-
ванных генов, участвующих в процессах роста и
развития организма, в то время как гипотеза ко-
адаптации — для генов, связанных с поведением
матери и ее детенышей [Renfree et al., 2009].
Наряду- с гипотезами конфликта и коадапта-
ции существуют также другие, менее распро-
страненные гипотезы эволюции импринтинга у
млекопитающих. Например, предполагается, что
импринтинг эволюционировал как защитный
механизм против партеногенеза или как меха-
низм, предотвращающий развитие опухоли в
женском организме из-за неограниченного роста
плаценты, в том числе и при спонтанном разви-
тии неоплод отворенной яйцеклетки [Varmuza,
Mann, 1994].
10.1.2. Способы формирования
импринтированных
локусов в эволюции
Несмотря на то, что развитие живорождения
и комплексной многофункциональной плаценты
у предка сумчатых и плацентарных, по-видимо-
му, послужило условием для селекции в направ-
лении импринтинга, импринтинг возник и по-
разному- регулировался в разных генетических
локусах. Филогенетический анализ ортологич-
ных последовательностей генов у трех видов
сумчатых (7И eugenii, М. domesticci, D. virginiana)
и мыши позволил заключить, что формирование
импринтинга в разных генетических локусах про-
исходило разными способами: посредством по-
этапного включения синтенно расположенных ге-
нетических элементов в импринтинг, вследствие
внедрения ретротранспозонов, благодаря внутри-
геномной реорганизации [Renfree et al., 2009].
10.1.2.1. Поэтапное включение
генетических элементов
в импринтинг
У трех проанализированных видов сумчатых
ген Igf2 импринтирован и, как и у плацентарных,
экспрессируется на хромосоме отцовского про-
исхождения [Killian etal., 2000, 2001; O’Neill
et al., 2000; Suzuki et al., 2005; Smits et al., 2008] и
имеет сходную функцию в развивающейся пла-
центе [Ager et al., 2007] (рис. 10.2). Ген Н19, ко-
дирующий некодирующую РНК. также обнару-
жен у сумчатых и имеет консервативную струк-
туру [Smits etal., 2008]. Также имеется район
связывания инсулятора CTCF [Ibid]. У опоссума
был также обнаружен дифференциально метили-
рованный район, однако деметилирование этого
района у опоссума вызывает активацию мате-
ринского аллеля Igf2. в то время как у мыши —
наоборот, репрессируется отцовский аллель Igf2
[Lawton et al.. 2008]. По-видимому, механизм
импринтированной регуляции данного локуса
возник у общего предка сумчатых и плацентар-
ных млекопитающих, эволюционировал в раз-
ном направлении после разделения этих двух
групп, что привело к различному- действию сход-
ных регуляторных элементов. Ген Cdknlc распо-
ложен в синтенном районе у мыши, человека
и трех проанализированных видов сумчатых.
У мыши и человека он экспрессируется, в отли-
чие от Igf2, на хромосоме материнского проис-
хождения. Белок CDKN1C участвует в регуля-
ции продукта IGF2, имеет антагонистичную по
отношению к IGF2 функцию. Однако у сумча-
тых, несмотря на сохранение синтении ортоло-
гов, импринтирован только ген Igf2, Cdknlc экс-
прессируется биаллельно. У мыши в регуляции
импринтированного статуса гена Cdknlc задей-
ствована некодирующая РНК Kcnqlotl, которая
транскрибируется в антисмысловой ориентации
к рядом расположенному- гену’ Kcnql. У сумча-
тых также присутствует ортолог Kcnql и обна-
ружена антисмысловая транскрипция Kcnqlotl,
однако ген Cdknlc у сумчатых не импринтиро-
ГЛАВА 10 271
Вовлечение следующих элементов:
Увеличение количества дифференциально
метилированных районов
Распространение импринтинга на окружающие районы
Антисмысловая транскрипция в регуляции
V / импринтинга
'•/ Реципрокная регуляция импринтинга
Рис. 10.2. Поэтапное включение генетических элементов в импринтинг.
Показаны ортологичные районы кенгуру, мыши и человека. Голубым обозначены аллели, экспрессирующиеся с хромосомы от-
цовского происхождения, розовым — с хромосомы материнского происхождения, черным — не импринтированные гены, се-
рым— статус не исследован. Голубые и розовые линии с кружками на концах — дифференциально метилированные районы
на отцовской и материнской хромосомах соответственно (по [Renfree et al., 2008]).
ван. По-видимому, антисмысловая транскрипция
предшествовала вовлечению данного локуса в
импринтированную регуляцию [Ager et al.. 2008].
Ген IGF2R — рецептор белка IGF2 — им-
принтирован у мыши и человека. В регу’ляции
импринтированного статуса данного гена у мы-
ши задействованы дифференциальное метилиро-
вание CpG-динуклсотидов во втором интроне и
антисмысловая некодирующая РНК Air. У сум-
чатых Igf2r также импринтирован, экспрессия
материнского аллеля осуществляется без уча-
стия дифференциального метилирования, в от-
сутствие CpG-островка во втором интроне и ан-
тисмысловой транскрипции [Killian et al., 2000;
Weidman et al., 2006]. Есть предположения, что в
поддержании импринтированного статуса Igf2r у
сумчатых более существенную роль могут иг-
рать модификации гистонов, а не метилирование
ДНК [Vu etal., 2006]. Однако более конкретных
данных по этому’ вопросу к настоящему’ времени
не получено. Таким образом, импринтинг в дан-
ном локусе возник у общего предка сумчатых и
плацентарных млекопитающих, а механизмы его
регу’ляции и поддержания эволюционировали
по-разному после разделения этих двух групп
млекопитающих.
10.1.2.2. Образование новых
импринтированных локусов
вследствие внедрения
ретротранспозонов
PEG 10— первый пример гена, который при-
обретает механизм импринтированной моноал-
лельной экспрессии вследствие того, что являет-
ся привнесенным в геном в результате инсерции
ретротранспозона Sushi-ichi (рис. 10.3). В геноме
яйцекладущих отсутствуют последовательности,
ортологичные PeglO, т. е. инсерция ретротранс-
позона произошла после отделения яйцекладу-
щих от линии общего предка сумчатых и пла-
центарных млекопитающих. У последних под
импринтированный контроль попадают рядом
расположенные гены, в то время как у сумчатых
импринтированной моноаллельной экспрессии
подвергается только ген PeglO [Suzuki et al.,
2005]. Данный ген также является первым при-
мером наличия дифференциально метилирован-
272 ЭПИГЕНЕТИКА
Инсерция РедЮ произошла в линии общего предка сумчатых и плацентарных млекопитающих (показано стрелкой). Это сопро-
вождалось формированием дифференциально метилированного района и сайленсингом аллеля РедЮ материнского происхо-
ждения. В линии плацентарных млекопитающих (верхняя ветвь дендрограммы) дифференциальное метилирование распро-
странилось также на соседний ген Sgce. У сумчатых млекопитающих (вторая сверху ветвь дендрограммы) дифференциальное
метилирование выявлено только в районе гена РедЮ. У однопроходных и птиц (две нижние ветви дендрограммы) не обнару-
жено гена РедЮ, в районе гена Sgce отсутствует дифференциальное метилирование. Черные линии с кружками на концах по-
казывают метилирование ДНК в районах CpG, серые боксы — инактивированный аллель (по [Renfree et al., 2008]).
ного регуляторного района у сумчатых. Таким
образом, механизм регуляции импринтирован-
ной экспрессии в данном случае полностью
сформировался до разделения сумчатых и пла-
центарных млекопитающих. Также PEG10 пред-
ставляет собой подтверждение гипотезы возник-
новения импринтинга как результата действия
механизма защиты генома от чужеродной ДНК
посредством метилирования.
Другой пример образования нового имприн-
тированного локуса вследствие внедрения рет-
ротранспозонов— DLK1 DIO3 (рис. 10.4). Гены
данного локуса принимают участие в развитии,
экспрессируются в экстраэмбриональных и тка-
нях плода, а также в головном мозге у взрослых
особей [da Rocha et al., 2007]. У мыши и челове-
ка данный локус содержит белок-кодирующие
гены Dlkl (Delta-like homologue I), RtlUMartl
(retrotransposon-like gene 1) и Dio3 (type3 diodi-
nase), экспрессирующиеся на хромосоме отцов-
ского происхождения [Lin et al., 2003; da Rocha
et al., 2008], а также гены некодирующей РНК,
экспрессирующиеся на хромосоме материнского
происхождения. В регуляции имринтированной
экспрессии у мыши и человека принимает уча-
стие дифференциально метилированный район
[Takada etal., 2002]. У сумчатых гены DLK и
DIO3 экспрессируются биаллельно. У сумчатых
в данном локусе содержится большое количест-
во LINE-элементов, из-за чего размер локуса в
два раза больше, чем у плацентарных, и состав-
ляет 1,6 м.п.н. Существует два альтернативных
предположения на предмет пути эволюции им-
принтированной регуляции данного локуса. Ли-
бо инсерция гена Rtll после отделения яйцекла-
дущих привела к возникновению импринтинга в
данном локусе у общего предка сумчатых и пла-
центарных и в дальнейшем этот ген и импринти-
рованная регуляция экспрессии были утрачены в
линии сумчатых, либо импринтинг в данном ло-
ГЛАВА 10 273
Плацентарные
Сохранение Rtl1
фференциально
Эволюция дифференциально
метилированных районов
Появление антисмысловой РНК
анти-Rt/t
Сумчатые
Потеря Rtl1
Распространение повторов
Отсутствие импринтинга
\7 в локусе
Рис. 10.4. Эволюция импринтинга в локусе DLK1—DIO3.
На верхней диаграмме изображена организация Dio3 у общего предка сумчатых и плацентарных млекопитающих. Нижняя ле-
вая диаграмма — организация локуса у плацентарных, нижняя правая — у сумчатых. У сумчатых произошли утрата Rtl1 и рас-
пространение повторенных элементов при отсутствии импринтинга. У плацентарных — сохранение Rtl1, появление антисмы-
словой транскрипции, дифференциально метилированного района и формирование импринтинга в локусе. Красные боксы —
экспрессирующиеся аллели материнского происхождения, черные боксы — не импринтированные гены. Красная линия с круж-
ком на конце — дифференциально метилированный район на хромосоме материнского происхождения (по [Renfree etal.,
2009]).
кусе появился вместе с приобретением некоди-
рующей РНК у плацентарных после их отделе-
ния от сумчатых, которые утратили ген RtlJ
[Renfree et al., 2009].
10.1.2.3. Образование новых
импринтированных локусов
благодаря внутригеномной
реорганизации
Гены локуса синдрома Прадера—Вилли—Ан-
гельмана (AS) имеют импринтированный статус
только в линии плацентарных млекопитающих
(рис. 10.5). Сравнительный анализ ортологов ге-
нов данного л оку са у разных групп позвоночных
позволил заключить, что этот локус образовался
только в линии плацентарных млекопитающих
путем объединения в один локус последователь-
ностей генов Ube3a и Snrpn. которые у сумча-
тых и яйцекладущих располагаются на разных
Рис. 10.5. Образование новых импринтированных ло-
кусов благодаря внутригеномной реорганизации.
На верхних диаграммах изображена организация у сумчатых
и однопроходных генов UBE3A и SNRPN, расположенных на
разных хромосомах. У плацентарных (нижняя диаграмма) эти
два района объединяются в один благодаря внутригеномной
реорганизации, сопровождающейся инсерцией нескольких
генов и распространением кластера некодирующей РНК. Это
привело к появлению импринтинга только в линии плацен-
тарных млекопитающих. Синим обозначены аллели, экспрес-
сирующиеся с хромосомы отцовского происхождения,
красным — с хромосомы материнского происхождения, чер-
ным — не импринтированные гены, серым — статус не ис-
следован (по [Renfree et al., 2009]).
хромосомах и у сумчатых экспрессируются би-
аллельно. При этом ген Snrpn образовался путем
тандемной дупликации гена Snrpb у сумчатых
[Rapkins etal., 2006]. По-видимому, ключевым
моментом для возникновения импринтинга в
данном локусе у плацентарных стало появление
кластера некодирующей РНК и новых генов,
привнесенных в геном посредством инсерции
мобильных элементов.
Объединение районов
UBE3A и SNRPN
Инсерция MKRN3
Образование генов
SNURF, MAGEL2
Распространение
нкРНК NDN
274 ЭПИГЕНЕТИКА
Рептилии
(Reptilia)
Птицы Однопроходные Сумчатые
(Monotremata) (Metatheria,
Marsupialia)
Плацентарные
(Eutheria)
Настоящее
Рептилиеподобный предок
400 млн л. н.
Рис. 10.6. Эволюция импринтинга у млекопитающих.
Голубые боксы иллюстрируют эволюцию инсуляторного элемента CTCF/BORIS; желтые — эволюция импринтинга, опосредо-
ванного метилированием; зеленый — три гена, импринтинг которых у сумчатых регулируется посредством модификаций гисто-
нов, а у плацентарных — с помощью метилирования ДНК (по [Renfree et al., 2009]).
глава ю 275
10.1.3. Эволюция генетических
элементов, участвующих
в регуляции импринтинга
Подробный эволюционный анализ генов, во-
влеченных в эпигенетическую регуляцию им-
принтинга, позволяет проследить те филогене-
тические изменения, которые совпадают со вре-
менем появления импринтинга и могут являть-
ся его предпосылками. Так, инсуляторный эле-
мент — белок СССТС-связывающий фактор
(CTCF), экспрессирующийся повсеместно, вовле-
чен в регуляцию локуса IGF2 у плацентарных и
сумчатых млекопитающих. Близко родственный
ему белок BORIS (Brother of regulator of im-
printed sites), экспрессирующийся только в клет-
ках зародышевого пути, имеет идентичный
ДНК-связывающий домен и связывается с таки-
ми же сайтами ДНК, имеет отличия в N- и С-тер-
минальных районах, что свидетельствует о вы-
полнении этими белками различных функций
[Loukinov et al.. 2002]. Предполагают, что BORIS
участвует в установлении эпигенетического мар-
кирования в локусе IGF2 Fl9 в клетках зароды-
шевого пути, a CTCF — в его поддержании у по-
томства в соматических клетках [Jelinic et al.,
2006]. Филогенетический анализ показал, что
ген BORIS — древняя дупликация гена CTCF,
возникшая до отделения млекопитающих от об-
щего предка рептилий и птиц [Ноге et al.. 2008].
У яйцекладущих млекопитающих и рептилий, у
которых отсутствует импринтинг, Boris экс-
прессируется как во многих соматических тка-
нях, так и в половых клетках, в то время как у
сумчатых и плацентарных млекопитающих —
только в клетках зародышевого пути. Предпола-
гают, что ограничение экспрессии гена BORIS в
линии зародышевых клеток у общего предка
сумчатых и плацентарных после его отделения
от яйцекладущих млекопитающих послужило
толчком к привлечению этого гена в систему ре-
гуляции геномного импринтинга (рис. 10.6).
Важнейшую роль в регуляции геномного им-
принтинга играют de novo ДНК-метилтрансфе-
раза Dnmt3a и родственный белок Dnmt3L, не
имеющий метилтрансферазной активности. Они
участвуют в установлении de novo метилирования
ДНК импринтированных локусов во время гаме-
тогенеза [Bourc’his et al., 2001; Kaneda et al., 2004].
Филогенетический анализ гена Dnmt3L показал,
что ортологичные последовательности присутст-
вуют в геномах сумчатых и плацентарных. По-
следовательностей данного гена нет у рыб и птиц,
у которых импринтинг отсутствует [Y okomine
et al., 2006], а также у яйцекладущих (утконоса)
[Warren etal., 2008] (см. рис. 10.6). Невозмож-
ность осуществления импринтированного конт-
роля в геноме яйцекладущих млекопитающих в
отсутствие такого важного регулятора. как Dnmt3L,
также подтверждает идею о том, что импринтинг
появился у общего предка сумчатых и плацен-
тарных после его дивергенции от яйцекладущих.
10.2. Организация кластеров генов
С ИМПРИНТИРОВАННОЙ МОНОАЛЛЕЛЬНОЙ
ЭКСПРЕССИЕЙ
У мыши в составе кластеров генов с имприн-
тированной моноаллельной экспрессией кроме
белок-кодирующих генов всегда присутствует
один ген некодирующей РНК. Импринтирован-
ная экспрессия генов в кластере контролируется
одним г/г/с-действующим элементом ICE (imprint
control element). ICE представляет собой корот-
кую последовательность ДНК, богатую CpG-ди-
нуклеотидами, которая часто совпадает с CpG-
островками [Delaval, Feil, 2004]. Данная после-
довательность ДНК метилирована на одном из
двух родительских аллелей. Метилирование од-
ного из двух родительских аллелей устанавлива-
ется в гаметогенезе: в большинстве случаев — в
оогенезе, в некоторых случаях — в сперматоге-
незе, и впоследствии поддерживается в дипло-
идном организме после оплодотворения. Неко-
дирующая РНК экспрессируется только с той ро-
дительской хромосомы, которая несет неметили-
рованный ICE. Таким образом, ICE может счи-
таться позитивным регулятором экспрессии не-
кодирующей РНК. В разных кластерах ICE могут
располагаться либо в нескольких тысячах пар ос-
нований до промотора некодирующей РНК, либо
внутри транскрибируемой части нкРНК, либо — в
промоторе некодирующей РНК. Такая вариабель-
ность позиций ICE свидетельствует о разных спо-
собах действия ICE в регуляции экспрессии неко-
дирующей РНК. Экспрессия нкРНК коррелирует с
репрессией in cis белок-кодирующих генов, вхо-
дящих в состав кластера и, вероятно, вызывает их
транскрипционное молчание (сайленсинг). К на-
стоящему' времени изучены механизмы действия
трех некодирующих РНК на транскрипцию белок-
кодирующих генов в импринтированных класте-
рах: Н19 в кластере Igf2, Kcnqlotl в кластере
Kcnql, Air в кластере Igf2r [Pauler et al., 2007].
10.2.1. Igf2r
Igf2r — рецептор инсулинподобного фактора
роста 2. Ген кодирует белок, участвующий в
276 ЭПИГЕНЕТИКА
транспорте лизосомальных белков, интернали-
зации Igf2 и других лизосомальных лигандов для
деградации. В развитии млекопитающих наруше-
ние регу’ляции Igf2r связано со сверхростом эм-
бриона, нарушениями развития и деятельности
сердца, перинатальной смертностью. У человека
нарушение регу’ляции IGF2R связано с раковой
трансформацией клеток [Murphy, Jirtle, 2003]. Ген
Igf2r расположен на хромосоме 17 мыши и на
хромосоме 6 человека в районе q25.3.
У мыши экспрессия Igf2r импринтирована —
во всех тканях транскрибируется только ал-
лель материнского происхождения. В состав им-
принтированного кластера протяженностью
—500 т.п.н. кроме Igf2r входят еще два белок-
кодирующих гена: Slc22a2 и Slc22a3 — имприн-
тированная экспрессия их материнских аллелей
наблюдается только у мыши в экстраэмбрио-
нальных тканях [Pauler et al., 2007] (рис. 10.7).
В регуляцию импринтированной экспрессии
генов данного кластера у мыши вовлечены два
CpG-островка (см. [O’Neill. 2005]). Первый CpG-
островок (CpGl) локализован в промоторе Igf2r
и метилирован на хромосоме отцовского проис-
хождения. Метилирование данного района про-
исходит после оплодотворения и поддерживает-
ся во взрослом состоянии [Stoger et al., 1993].
Второй CpG-островок (CpG2) является в данном
локусе ICE. Он расположен во втором интроне
гена Igf2r и содержит промотор некодирующей
РНК Air (Antisense Igf2r RNA), транскрибирую-
щейся в антисмысловой ориентации к гену Igf2r
и имеющей размер 108 т.н. [Delaval, Feil, 2004].
Метилирование ICE гена Air устанавливается
в оогенезе и поддерживается в предымплантаци-
онном развитии [Stoger et al., 1993], в результате
чего ген Air репрессирован, а находящиеся под
его негативным контролем три белок-кодирую-
щих гена — активны. На хромосоме отцовского
происхождения последовательность ДНК района
1СЕ не метилирована, что обусловливает транс-
крипцию с отцовской хромосомы нкРНК Air
размером 108 т.н. [Pauler et al., 2007], которая
обеспечивает сайленсинг аллелей отцовского
происхождения как самого гена Igf2r, с которым
он частично перекрывается, так и генов Slc22a2
и Slc22a3. с которыми он не перекрывается
[Sleutels et al., 2002]. При делеции большей части
последовательности нкРНК Air, за исключением
премоторной области, не происходит сайленсинг
Igf2r, Slc22a2 и Slc22a3 [O’Neill, 2005]. Инсерция
в ICE гена Air сигнала полиаденилирования, в
результате которой образовывался короткий
усеченный транскрипт размером 3 т.н. [Sleutels
et al., 2002], нарушала сайленсинг гена Igf2r и
двух других генов кластера. Таким образом, ве-
роятно, решающую роль в обеспечении сайлен-
синга генов в данном локусе играет собственно
некодирующий транскрипт Air [Sleutels et al..
2003].
У человека и других приматов в большинстве
тканей взрослого организма наблюдается биал-
лельная экспрессия IGF2R Igf2r. Моноаллельная
экспрессия IGF2R у человека обнаруживается
в 40 % проанализированных образцов в плаценте,
а также в эмбриональных тканях, культуре ам-
ниотических клеток, лимфобластоидных клетках
и клетках опухоли Вильмса (нефробластомы)
[Yotova etal., 2008]. В ортологичной последова-
тельности IGF2R человека CpGl-район полно-
стью не метилирован, a CpG2 — метилирован
только на хромосоме материнского происхожде-
ния [Smrzka etal., 1995; Riesewijk etal., 1996].
Транскрипция нкРНК Air выявляется лишь в
16—40 % образцов опухоли Вильмса [Yotova
et al.. 2008]. В других тканях, несмотря на диффе-
ренциальное метилирование CpG2, транскрипции
нкРНК Air не обнаружено [Oudejans etal., 2001;
Vu, Hoffman, 2004; Yotova et al., 2008].
10.2.2. Kcnql
Kcnql (potassium voltage-gated channel, sub-
family Q, member 1) играет роль в развитии син-
дрома Видемана—Беквитта. Этот синдром харак-
теризуется увеличенной массой тела и внутрен-
них органов (печени, почек, поджелудочной же-
лезы, иногда — сердца), нарушением акта глота-
ния, повышенным риском возникновения опре-
деленных онкологических заболеваний. У чело-
века ген расположен на хромосоме 11 в районе
р15.5, у мыши — на хромосоме 7. В состав дан-
ного локуса размером -800 т.п.н. кроме Kcnql
входят гены: Osbpl5, Napl/4, Phlda2, Slc22al8,
Cdknlc, Trpm5, Tssc4, Cd81, Phemx, Ascl2 [Enge-
mann et al., 2000] (рис. 10.7). Гены Cdknlc и
Kcnql обнаруживают импринтированную экс-
прессию во всех тканях, остальные гены имеют
импринтированную экспрессию только в раннем
эмбрионе или в экстраэмбриональных тканях
[Pauler et al., 2007]. При этом три гена — Napl/4.
Тгрт5 и Phemx — не импринтированы [Ibid].
Импринтинг генов этого кластера регулируется
дифференциальным метилированием ICE, кото-
рый локализован в интроне 10 гена Kcnql и при-
ходится на район промотора некодирующей РНК
Kcnqlotl, расположенного в антисмысловой
ориентации к гену- Kcnql [O'Neill, 2005]. На хро-
глава ю 277
Osbpl5 Nap1/4 Phlda2 Cdknlc Kcnqlotl Ascl2
Slc22a18 Kcnql Trpm5 Tssc4 Cd81 Phemx
Osbpl5 Nap1/4 Phlda2 Cdknlc Kcnqlotl Ascl2
Slc22a18 Kcnql Trpm5 Tssc4 Cd81 Phemx
Рис. 10.7. Организация кластеров аутосомных генов с импринтированной моно-
аллельной экспрессией [Zakharova et aL, 2009].
ICE — элемент, контролирующий импринтинг (imprint control element). Линии с кружками
на концах, соединенные с ICE, — метилирование ДНК. Стрелки указывают направление
транскрипции. Стоппер — транскрипционно неактивный ген. Серые боксы представляют
собой неимпринтированные гены, р (paternal), m (maternal) — аутосомы отцовского и ма-
теринского происхождения соответственно, а — кластер Igf2r. Синие боксы представляют
собой импринтированные белок-кодирующие гены. Красный бокс — ген некодирующей
РНК Д/г. б—кластер Kcnql. Синие боксы — импринтированные белок-кодирующие гены,
экспрессия которых регулируется с помощью нкРНК Kcnqlotl. Фиолетовый бокс—им-
принтированный белок-кодирующий ген Cdknlc, экспрессия которого, по-видимому, регу-
лируется механизмом, связанным с фактором CTCF. е — кластер Igf2. Фиолетовые бок-
сы — импринтированные белок-кодирующие гены. Сиреневый бокс — ген некодирующей
РНК Н19. Е — энхансер. Фиолетовый овал — белок CTCF.
278 ЭПИГЕНЕТИКА
мосоме материнского происхождения ICE мети-
лирован, что обусловливает репрессию некоди-
рующей РНК Kcnqlotl и экспрессию всех генов
данного кластера только с этой хромосомы. На
хромосоме отцовского происхождения район,
контролирующий импринтинг, не метилирован,
поэтому’ происходит транскрипция некодирую-
щей РНК Kcnqlotl, вызывающая сайленсинг ге-
нов данного кластера [Pauler et al., 2007]. Размер
некодирующей РНК Kcnqlotl ~60 т.н. у челове-
ка и ~54 т.н. — у мыши [O’Neill, 2005]. При ин-
серции сигнала полиаденилирования в ICE об-
разовывался короткий усеченный транс-крипт
Kcnqlotl размером 1,5 т.н. [Mansini-DiNardo
et al., 2006]. На хромосоме отцовского происхо-
ждения экспрессия усеченной некодирующей
РНК приводила к полной реактивации имприн-
тированных генов кластера в эмбриональных и
экстраэмбриональных тканях. Таким образом,
транскрипт некодирующей РНК Kcnqlotl, как и
Air, играет важную роль в обеспечении сайлен-
синга импринтированных генов в кластере.
10.2.3. Igf2
Igf2 — инсулинподобный фактор роста 2. Му-
тации, нарушающие импринтированную экс-
прессию IGF2, лежат в основе значительного
числа врожденных ростовых отклонений, син-
дрома Видемана—Беквитта у человека [Weks-
berg etal., 1993: Reik. Maher. 1997]. Данный кла-
стер, как и кластер Kcnql, расположен на хро-
мосоме 7 у мыши и хромосоме 11 в районе р15.5
у человека. В состав данного импринтированно-
го кластера размером —80 т.п.н. входят ген Igf2,
экспрессирующийся во всех тканях, за исключе-
нием тканей мозга, только с хромосомы отцов-
ского происхождения, ген некодирующей РНК
Н19 (hepatic cDNA clone 19), экспрессирующий-
ся повсеместно с хромосомы материнского про-
исхождения, и ген Ins2, импринтированная от-
цовская экспрессия которого обнаруживается
только в экстраэмбриональных тканях висце-
рального желточного мешка [Pauler et al., 2007]
(см. рис. 10.7). В мозге у плацентарных Igf2 экс-
прессируется биаллельно из-за инициации транс-
крипции со специфического неимпринтирован-
ного промотора [Ohlsson etal.. 1994: Hemberger
et al., 1998].
Импринтированная экспрессия генов данного
локуса регулируется с помощью CTCF, который
участвует в дифференциальном метилированнии
ДНК ICE, расположенного в 2—4 т.п.н. перед
точкой старта транскрипции Н19 [Delaval, Feil,
2004; O’Neill, 2005]. В герминальной линии сам-
цов в ICE данного кластера происходит метили-
рование CpG-динуклеотидов, в то время как в
оогенезе у самок ICE связан с CTCF и защищен
от метилирования. После оплодотворения отсут-
ствие CTCF на отцовской хромосоме позволяет
энхансеру, расположенному’ за 3'-областью гена
Н19 взаимодействовать с промотором, что при-
водит к экспрессии lgf2 и сайленсингу’ Н19. На
материнской хромосоме взаимодействие между’
промотором Igf2 и энхансером заблокировано
инсуляторным действием CTCF-фактора, в ре-
зультате экспрессируется Н19 и неактивен Igf2
[Delaval, Feil, 2004: O’Neill. 2005].
Однако делеция размером 5 т.н., включающая
транскрибируемую часть и промотор гена Н19,
на материнской хромосоме не влияла на под-
держание сайленсинга гена Igf2 в печени. В мы-
шечной ткани обнаружена потеря сайленсинга
аллеля Igf2 материнского происхождения [Schmidt
et al., 1999]. Таким образом, нкРНК Н19 не играет
определяющей роли в обеспечении сайленсинга
импринтированного гена Igf2, несмотря на то, что
в норме имеет импринтированную родительскую
экспрессию, реципрокную по отношению к генам
данного кластера [Pauler et al., 2007].
10.2.4. Эпигенетические модификации
при импринтированной
моноаллельной экспрессии генов
Для всех импринтированных генов характер-
на асинхронная репликация в S-фазе. Активный
аллель реплицируется в ранней, а неактивный —
в поздней S-фазе. Время репликации отцовского
и материнского аллелей импринтированных ге-
нов детерминируется в примордиальных герми-
нальных клетках в премейотических митозах, за-
тем поддерживается в развитии и переопределя-
ется в следующем раунде гаметогенеза [Simon
et al., 1999]. Для локуса Igf2Н19 показано, что
неактивный поздно реплицирующийся аллель на
хромосоме, унаследованной от отца, располага-
ется ближе к периферии ядра, чем рано репли-
цирующийся активный материнский аллель. За
различия в ядерной локализации активного и не-
активного аллелей, вероятно, отвечает ICE. Де-
леция ICE рано реплицирующегося аллеля при-
водит к его перемещению к периферии ядра и
репликации в поздней S-фазе [Gribnau et al.,
2003]. Показано, что на хромосоме отцовского
происхождения кластеры Kcnql и Igf2r, которые
являются неактивными, располагаются в огра-
ниченном внутриядерном компартменте, лишен-
глава ю 279
ном РНК-полимеразы 2, как в случае с инактиви-
рованной Х-хромосомой [Terranova et al., 2008].
В регуляцию импринтированной моноал-
лельной экспрессии у плацентарных млекопи-
тающих вовлечены такие же модификации гис-
тонов, которые описаны для неактивной Х-хро-
мосомы. Экспрессия антисмысловой некодирую-
щей РНК вызывает гипометилирование НЗК4,
гипоацетилирование НЗК9, триметилирование
НЗК27, убиквитинирование Н2АК119 и распро-
странение транскрипционно неактивного статуса
на остальные гены, входящие в состав имприн-
тированного кластера (см. [Delaval, Feil, 2004;
Terranova et al. 2008]). Для генов с импринтиро-
ванной моноаллельной экспрессией показано,
что некодирующая РНК распространяется вдоль
кластера, подобно тому’, как некодирующая
РНК Xist распространяется по инактивируемой
Х-хромосоме. У человека некодирующая РНК
KCNQ1OT1 физически ассоциирована с двумя
генами кластера — CDKN1C и SLC22A1 8 [Mura-
kami etal., 2007]. У мыши показано ограниченное
распространение некодирующей РНК Kcnqlotl
вдоль кластера Kcnql [Terranova etal., 2008]. Как
и при инактивации Х-хромосомы, вслед за экс-
прессией нскодирующсй РНК привлекаются
РКС2-комплекс Polycomb-белков, обеспечивая с
помощью входящих в его состав метилтрансфераз
Eed/Ezh2 триметилирование НЗК27 (см. [Delaval,
Feil, 2004], и PRC1, ответственный за убиквити-
нирование Н2А К119 [Terranova et al. 2008].
Имеются подтверждения того, что появление
модификаций гистонов зависит от нскодирующсй
РНК. В первичной культуре нейронов мыши ген
Igf2r экспрессируется биаллельно [Yamasaki et al.,
2005]. При этом нс кодирующая РНК Air не экс-
прессируется. В отсутствие экспрессии Air промо-
торные районы обоих аллелей обнаруживают мо-
дификации. характерные для активного хромати-
на: гипометилирование ДНК, ацетилирование гис-
тонов НЗ и Н4 и диметилирование НЗК4. В куль-
туре глиальных клеток, где Igf2r экспрессируется
моноаллельно, в премоторном районе гена на
хромосоме материнского происхождения выяв-
ляются модификации, типичные для активного
хроматина, тогда как на хромосоме отцовского
происхождения обнаружены маркеры неактивно-
го хроматина. Эти данные свидетельствуют о том,
что антисмысловая транскрипция Air или транс-
крипт Air сам по себе могут устанавливать в про-
моторе lgf2r модификации гистонов, характерные
для транскрипционно неактивного хроматина.
Для кластера Kcnql показано, что некоди-
рующая РНК Kcnqlotl вовлечена в Polycomb-
зависимый сайленсинг in cis, играющий роль
в репрессии некоторых генов данного кластера.
В экстраэмбриональных тканях мыши сайлен-
синг некоторых генов на хромосоме отцовского
происхождения обеспечивается метилтрансфе-
разами Eed/Ezh2 РКС2-комплекса, осуществ-
ляющего триметилирование НЗК27 [Lewis et al.,
2004; Umlauf etal., 2004, Terranova etal. 2008].
Показано, что привлечение РКС2-комплекса на
аутосоме отцовского происхождения зависит от
транскрипции нскодирующсй РНК Kcnqlotl.
С помощью эписомной конструкции, в состав
которой был включен ICE, фланкированный
двумя репортерными генами, показано, что экс-
прессия Kcnqlotl способна вызывать сайленсинг
фланкирующих генов в обоих направлениях [Tha-
kur et al., 2004; Kanduri et al., 2006]. Длина неко-
дирующей РНК, транскрибирующейся в конст-
рукции, пропорциональна относительной степе-
ни сайленсинга: чем длиннее транскрипт, тем
строже репрессия фланкирующих генов [Kanduri
et al., 2006]. Более того, появление модификаций
гистонов, характерных для неактивного хрома-
тина, происходит во время элонгации транс-
крипции. В норме репрессия аллеля отцовского
происхождения зависит от транскрипции полно-
размерной нскодирующсй РНК Kcnqlot. В слу-
чае преждевременной терминации транскрипции
нскодирующсй РНК происходит активация от-
цовского аллеля [Mancini-DiNardo etal., 2006].
Следовательно, транскрипция нкРНК Kcnqlot
может привлекать комплекс, модифицирующий
гистоны для обеспечения сайленсинга имприн-
тированных генов.
Таким образом, транскрипция нскодирующсй
антисмысловой РНК играет роль в установлении
модификаций гистонов в импринтированных
кластерах. Исходная асимметрия отцовских и
материнских аллелей, установленная посредст-
вом метилирования ДНК в клетках зародышево-
го пути, поддерживается далее с помощью оп-
ределенных модификаций гистонов [Zakharova
et al., 2009].
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
AgerE., SuzukiS., PaskA., Shaw G., LshinoF., Renfree AL B. In-
sulin is imprinted in the placenta of the marsupial, Macro-
pus eugenii H Dev. Biol. 2007. Vol. 309. P. 317—328.
AgerE. I., PaskA. J., Gehring HAL, Shaw G., Renfree AL. B.
Evolution of the CDKN1C-KCNQ1 imprinted domain //
BMC EVol. Biol. 2008. Vol. 8. P. 163.
Barlow D. P. Methylation and imprinting: from host defense to
gene regulation? // Science. 1993. Vol. 260. P. 309—310.
Barlow D. P., Bartolomei AL. S. Genomic imprinting in mam-
mals // Epigenetics / C. D. Allis, T. Jenuwein, D. Reinberg
280 ЭПИГЕНЕТИКА
(eds). N. Y.: Cold Spring Harbor Lab. Press. 2007.
P. 357—376.
BeecheyC. Г., Cattanach B. AL, Blake A., Peters J. Mouse im-
printing data and references // MRC Mammalian Genetic
Unit, Harwell, Oxfordshire. 2008. http://www.har.mrc.ac.uk/
research/genomic imprinting/
Bourc’hisD., BestorT.H. Origins of extreme sexual dimor-
phism in genomic imprinting // Cytogenet. Genome Res.
2006. Vol. 113, N 1- -4. P. 36-Л0.
Bourc’hisD., NiiG.L., LinC.S., Bollman B., BestorT.H.
Dnmt3L and the establishment of maternal genomic im-
prints 11 Science. 2001. Vol. 294. P. 2536—2539.
Constancia AL, Hemberger AL, Huntes J., Dean W., Ferguson-
Smith A., Fundele R., Stewart F., Kelsey G., FowdenA.,
Sibley C, Reik IE Placental-specific IGF-II is a major
modulator of placental and fetal growth // Nature. 2002.
Vol. 417. P. 945—948.
Curley J. P., BartonS., Surani A., KevemeE.B. Coadaptation in
mother and infant regulated by a paternally expressed im-
printed gene// Proc. Biol. Sci. 2004. Vol. 271. P. 1303—
1309.
Curley J. P., PitmockS. B., Dickson S. L., Thresher R, ALiyo-
shi N., SuraniAL A., Keverne E. B. Increased body fat in
mice with a targeted mutation of the paternally expressed
imprinted gene Peg3 // FASEB J. 2005. Vol. 19.
P. 1302—1304.
da Rocha S. T, TevendaleAL, Knowles E., TakadaS., IYat-
kinsAL, Ferguson-Smith A. C. Restricted coexpression of
Dlkl and the reciprocally imprinted noncoding RNA,
Gtl2: implications for cis — acting control // Dev. Biol.
2007. Vol. 306. P. 810—823.
da Rocha S. T, Edwards C. A., Ito AL, Ogata T, Ferguson-
Smith A. C. Genomic imprinting at the mammalian Dlkl-
Dio3 domain // Trends Genet. 2008. Vol. 24. P. 306—316.
Delaval K, FeilR. Epigenetic regulation of mammalian ge-
nomic imprinting11 Curr. Opin. Genet. Dev. 2004.
Vol. 14. P. 188—195.
EngemannS., StrodickeAL, Paulsen AL, Franck O., Rein-
hardt R, Lane N, ReikW., Walter J. Sequence and func-
tional comparison in the Beckwith—Wiedemann region:
implications for a novel imprinting centre and extended
imprinting // Hum. Mol. Genet. 2000. Vol. 9. P. 2691—
2706.
Genevieve D., SanlavilleD., FaivreL., KottlerAL. L., JambouAL.
GossetP., Boustani-Samara D., Pinto G., OzilouC, Abe-
guile G., ALuimichA., RomanaS., Raoul O., Cormier-Dai-
re J~, J’ekemansAL Paternal deletion of the GNAS im-
printed locus (including Gnasxl) in two girls presenting
with severe pre- and postnatal growth retardation and in-
tractable feeding difficulties // Eur. J. Hum. Genet. 2005.
Vol. 13. P. 1033—1039.
Gribnau J., HochedlingerK, Hata K, LiE., JaenischR Asyn-
chronous replication timing of imprinted loci is independent
of DNA methylation, but consistent with differential subnu-
clear localization Genes Dev. 2003. Vol. 17. P. 759—773.
HaigD., Westoby AL Parent-specific gene-expression and the trip-
loid endosperm // Am. Nat. 1989. Vol. 134. P. 147—155.
Hayward B.E., KamiyaAL, StrainL., ALoranV., CampbellR,
Hayashizaki Y., BonthronD. T. The human GNAS1 gene
is imprinted and encodes distinct paternally and bialleli-
cally expressed G proteins // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.
1998. Vol. 95. P. 10038—10043.
Hemberger AL, RediesC., Krause R, Oswald.!., Walter J., Fun-
dele R. H. H19 and Igl2 are expressed and differentially im-
printed in neuroectoderm-derived cells in the mouse brain
Dev. Genes EVol. 1998. Vol. 208. P. 393 402.
Ноге T. A., Deakin J. E., Graves J. A. The evolution of epige-
netic regulators CTCF and BORIS, CTCFL in amniotes 11
PLoS Genet. 2008. Vol. 4. P. C1000169.
JelinicP., StehleJ. C. Shaw P. The testis-specific factor
CTCFL cooperates with the protein methyl-transferase
PRMT7 in H19 imprinting control region methylation //
PLoS Biol. 2006. Vol. 4. P. e355.
Kanduri C, Thakur N., PandeyR. The length of the transcript
encoded from the Kenqlotl antisense promoter deter-
mines the degree of silencing // EMBO J. 2006. Vol. 25.
P. 2096—2106.
Kaneda AL, OkanoAL, Hata K, SadoT., Tsujimoto N., Li E.,
Sasaki H. Essential role for de novo DNA methyltrans-
ferase Dnmt3a in paternal and maternal imprinting // Na-
ture. 2004. Vol. 429. P. 900—903.
Keverne E. B., Curley J. P. Epigenetics, brain evolution and beha-
viour // Front. Neuroendoerinol. 2008. Vol. 29. P. 398—412.
Killian J. K, Byrd J. C., JirtleJ.V., ALundav B. L., Stos-
kopfALK, ALacDonaldRG, JirtleRL. M6PTGF2R
imprinting evolution in mammals // Mol. Cell. 2000.
Vol. 5. P. 707—716.
Killian J. K, Nolan C. AL, Stewart N., ALundayB.L., Ander-
sen N. A., NicolS., JirtleRL. Monotreme IGF2 expres-
sion and ancestral origin of genomic imprinting // J. Exp.
Zool. 2001. Vol. 291. P. 205—212.
KomfeldS. Structure and function of the mannose 6-phosp-
hate/insulinlike growth factor II re-eeptors // Annu. Rev.
Biochem. 1992. Vol. 61. P. 307—330.
Lawton B.R, CaroneB.R, Obergfell C. J.. Ferreri G. C., Gon-
dolphiC.AL, VandebergJ.L., ImumorinL, O'NeillR J.,
O'Neill AL. J. Genomic imprinting of IGF2 in marsupials is
methylation dependent // BMC Genomics. 2008. Vol. 9.
P. 205.
Lewis A., ALitsuya K, VmlaufD., Smith P., Dean W. Imprinting
on distal chromosome 7 in the placenta involves repressive
histone methylation independent of DNA methylation 11
Nat. Genet. 2004. Vol. 36. P. 1291—1295.
Li L., KevemeE.B., Aparicio S. A.. IshinoF. BartonS. C.,
Surani AL. A. Regulation of maternal behavior and off-
spring growth by paternally expressed Peg3 // Science.
1999. Vol. 284. P. 330—333.
LinS.P., Youngson N, TakadaS., Seitz H, ReikW., Paul-
sen AL., Cavaille J., Ferguson-Smith A. C. Asymmetric re-
gulation of imprinting on the maternal and paternal chro-
mosomes at the Dlkl—Gtl2 imprinted cluster on mouse
chromosome 12 //Nat. Genet. 2003. Vol. 35. P. 97—102.
LoukinovD. I., PugachevaE., VatolinS.. PackS. D.. ALoonH,
ChemukhinI., ALamianP., LarssonE., Kanduri C., Kos-
trov A. A., Cui H, NiemitzE.L., RaskoJ.E., Docqui-
erF.AL, Kistler AL, Breen J. J., ZhuangZ., Quits-
chke W. W, RenkawitzR, KlenovaE.AL, Feinberg A. P.,
OhlssonR, ALorseH. C. 3rd, LobanenkovV. I’ BORIS, a
novel male germ-line-specific protein associated with epi-
genetic reprogramming events, shares the same 11-zine-
finger domain with CTCF, the insulator protein involved
in reading imprinting marks in the soma // Proc. Natl.
Acad. Sci. USA. 2002. Vol. 99. P. 6806—6811.
ALancini-Dinardo D., Steele S. J., LevorseJ.AL, Ingram R S.,
Tilghman S. AL. Elongation of the Kenqlotl transcript is
required for genomic imprinting of neighboring genes 11
Genes Dev. 2006. Vol. 20. P. 1268—1282.
ALoore T, HaigD. Genomic imprinting in mammalian deve-
lopment: a parental tug-of-war// Trends Genet. 1991.
Vol. 7. P. 45 49.
ALurakami K, OshimuraAL, KugohH. Suggestive evidence for
chromosomal localization of non-coding RNA from im-
printed LIT1 // J. Hum. Genet. 2007. Vol. 52. P. 926—933.
ALurphy S. K, Jirtle R. L. Imprinting evolution and the price of
silence 11 Bioessays. 2003. Vol. 25. P. 577—588.
O’Neill AL. J. The influence of non-coding RNAs on allele-
specific gene expression in mammals // Hum. Mol. Genet.
2005. Vol. 14. P. 113—120.
ГЛАВА 10 281
O’Neill Al. J., Ingram R. S.. JranaP. B.. Tilghman S. Al. Allelic
expression of IGF2 in marsupials and birds // Dev. Genes
EVol. 2000. Vol. 210. P. 18—20.
Ohlsson R., Hedborg F, Holmgren L., Walsh C, EkstromT.J.
Overlapping patterns of IGF2 and Hl 9 expression during
human development: biallelic IGF2 expression correlates
with a lack of H19 expression // Development. 1994.
Vol. 120. P. 361—368.
O'Neill AL J., Lawton B. R, AlateosAL, Carene D. AL, Fer-
rari G.C., HrbekT., Aleredith R. П’., ReznickD.N,
O'NeillR. J. Ancient and continuing Darwinian selection
on insulin-like growth factor II in placental fishes " Proc.
Natl. Acad. Sei. USA. 2007. Vol. 104. P. 12404—12409.
Oudejans С. B., Westerman B., Wouters D., Gooyer S., Leegwa-
ter РЛ., vanWijkl.J., SleutelsF. Allelic IGF2R repres-
sion does not correlate with expression of antisence RNA
in human extraembryonic tissue// Genomics. 2001.
Vol. 73. P. 331—337. ’
PaskA.J., PapenfussА. T, AgerE.L., ALcCollK. A., Spe-
ed T.P., Renfree ALB. Analysis of the platypus genome
suggests a transposon origin for mammalian imprinting //
Genome Biol. 2009. Vol. 10, N 1. P. Rl.
Pauler F. AL., Koerner AL. V., Barlow D. P. Silencing by imprin-
ted non-coding RNAs: is transcription the answer? //
Trends Genet. 2007. Vol. 23. P. 284—292.
PetersJ., Wroe S. F, WellsC.A., ALiller H. J.. Bodie D., Be-
echey С. Г., Williamson C. AL, Kelsey G. A cluster of op-
positely imprinted transcripts at the Gnas locus in the dis-
tal imprinting region of mouse chromosome 2 // Proc.
Natl. Acad. Sei. USA. 1999. Vol. 96. P. 3830—3835.
Plagge A., GordonE., Dean W., BoianiR, CintiS., PetersJ.,
Kelsey G. The imprinted signaling protein XLa sis re-
quired for postnatal adaptation to feeding // Nat. Genet.
2004. Vol. 36. P. 818—826.
RapkinsR W., Ноге T. Smithwick AL. Ager E., Pask A. J.. Ren-
free ALB., KoluiAL, Hameister H, Nicholls RD., De-
akinJ.E., Graves J. A. Recent assembly of an imprinted
domain from non-imprinted components // PLoS Genet.
2006. Vol. 2. el82. P. 1666—1675.
Reik W, Alaher E. R. Imprinting in clusters: lessons from
Beckwith—Wiedemann syndrome " Trends Genet. 1997.
Vol. 13. P. 330—334.
Renfree AL. B., Ager E. I., Shaw G, PaskA. J. Genomic imprint-
ing in marsupial placentation // Reproduction. 2008.
Vol. 136, N 5. P. 523—531.
Renfree AL. В., Ноге T. A., Shaw G., Graves J. A., PaskA.J.
Evolution of genomic imprinting: insights from marsupials
and monotremes // Annu. Rev. Genomics Hum. Genet.
2009. Vol. 10. P. 241—262.
RiesewijkA. AL, Schepens AL. T, Welch T. R, van den Berg-
LoonenE.AL., ALarimanE. AL. RopersHH. Kalsche-
uer V. AL. Maternal-specific methylation of the human
IGF2R gene is not accompanied by allele-specific tran-
scription /7 Genomics. 1996. Vol. 31. P. 158—166.
Schmidt J. V., Levorse J. AL, Tilghman S. AL. Enhancer competi-
tion between H19 and Igt2 does not mediate their imprint-
ing // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1999. Vol. 96. P. 9733—
9738.
Simon I., Tenzen T., ReubinoffB.E., Hillman D., ALcCar-
rey J. R. Cedar H. Asynchronous replication of imprinted
genes is established in the gametes maintained during de-
velopment//Nature. 1999. Vol. 401. P. 929—932.
SleutelsF., ZwartR., Barlow D. P. The non-coding Air RNA is
required for silencing autosomal imprinted genes " Na-
ture. 2002. Vol. 415. P. 810—813.
SleutelsF., TjonG., LudwigT., BarlowD. P. Imprinted silenc-
ing of Slc22a2 and Slc22a3 does not need transcriptional
overlap between Igt2r and Air // EMBO J. 2003. Vol. 22.
P. 3696—3704.
Smits G.. ALtmgallA. J.. Griffiths-Jones S., SmithP., Beury D..
ALatthewsL., Rogers J., PaskA.J., Shaw G., Vande-
BergJ.L., ALcCarrey J. R, SAVOIR Consortium, Ren-
free AL. B., ReikW., Dunham 1. Conservation of the H19
non-coding RNA and Hl9—IGI 2 imprinting mechanism
in therians //Nat. Genet. 2008. Vol. 40. P. 971—976.
SmrzkaO.W., Fael., StogerR, KurzbauerR, Fischer G. F,
Henn T, WeifhA.. Barlow D. P. Conservation of a mater-
nal-specific methylation signal at the human IGF2R lo-
cus 11 Hum. Mol. Genet. 1995. Vol. 4. P. 1945—1952.
StogerR, KubickaP., LiuC.G., KafriT., Razin A., Cedar H,
Barlow D. P. Maternal specific methylation of imprinted
mouse Igt2r locus identifies the expressed locus as carry-
ing the imprinting signal // Cell. 1993. Vol. 73. P. 61—71.
Suzuki S., Renfree ALB., PaskA.J., Shaw G., KobayashiS.,
KohdaT., Kaneko-LshinoT., LshinoF. Genomic imprinting
of IGF2. p57(KIP2) and PEG1 MEST in a marsupial, the
tammar wallaby // Meeh. Dev. 2005. Vol. 122. P. 213—
222.
Swaney W. T, Curley J. P., Champagne F. A., Keveme E. B.
Genomic imprinting mediates sexual experience-depen-
dent olfactory learning in male mice '/ Proc. Natl. Acad.
Sei. USA. 2007. Vol. 104. P. 6084—6089.
TakadaS., Paulsen AL, TevendaleAL, Tsai С. E., Kelsey G.,
Cattanach B. AL., Ferguson-Smith .1. C. Epigenetic analy-
sis of the Dlkl—Gtl2 imprinted domain on mouse chro-
mosome 12: implications for imprinting control from
comparison with Igl2—1119 // Hum. Mol. Genet. 2002.
Vol. 11. P. 77—86.
Terranova R, Yokobayashi S., Stadler ALB., Otte A. P.,
van Lohuizen AL., Orkin S. H, Peters A. H. Polycomb
group proteins Ezlr2 and Rnt2 direct genomic contraction
and imprinted repression in early mouse embryos // Dev.
Cell. 2008. Vol. 15. P. 668—679’.
Thakur N. TiwariV.K, Thomassin H, PandeyRR, Kandu-
riAL, Gondor A., Grange T, Ohlsson R, KanduriC. An
antisense RNA regulates the bidirectional silencing prop-
erty of the Kcnql imprinting control region // Mol. Cell
Biol. 2004. Vol. 24. P. 7855—7862.
VmlaufD., Goto Y., CaoR, Cerqueira F, WagschalA.,
Zhang Y., FeilR. Imprinting along the Kcnql domain on
mouse chromosome 7 involves repressive histone methy-
lation and recruitment of Polycomb group complexes //
Nat. Genet. 2004. Vol. 36. P. 1296—1300.
J’armuza S., AlannAl. Genomic imprinting — defusing the ovar-
ian time bomb//Trends Genet. 1994. Vol. 10. P. 118—123.
Ju TH, JirtleRL., Hoffman A. R. Cross-species clues of an
epigenetic imprinting regulatory' code for the IGF2R gene //
Cytogenet. Genome Res. 2006. Vol. 113. P. 202—208.
Vu T. H, Li T, Hoffman A. R. Promoter-restricted histone code,
not the differentially methylated DNA regions or antisense
transcripts, marks the imprinting status of IGF2R in hu-
man and mouse // Hum. Mol. Genet. 2004. Vol. 13.
P. 2233—2245.
Warren W. C., Hillier L. IF., ALarshall Graves J. A., Birney E.,
Ponting С. P., Griitzner F, Belov K, ALiller W., Clarke L,
Chinwalla A. T., YangS.P., HegerA., Locke D. P., ALi-
ethke P., Waters P.D., leyrunes F, Fulton L., Fulton B.,
Graves T, Wallis J., Puente X. S., Lopez-Otin C., Ordo-
nez G. R. Eichler E. E.. Chen L. Cheng Z.. Deakin J. E..
AlsopA., Thompson K, Kirby P., Papenfuss A. T, Wakefi-
eld Al. J., Olender T, Lancet D., Huttley G. A., Smit A. F,
Pask A., Temple-Smith P., BatzerALA., Walker J. A.,
KonkelAl. K, HarrisR. S., Whittington C. AL, WongE. S.,
Gemmell N. J., Buschiazzo E., Vargas Jentzsch 1. AL, Aler-
kel A., Schmitz J., Zemann A., Churakov G., Kriegs J. O.,
BrosiusJ., Alurchison E. P., Sachidanandam R, Smith C.,
Hamion G. J., Tsend-Ayush E., AlcAlillan D., Attenbor-
ough R. Rens W., Ferguson-Smith AL, Lefevre C. AL,
282 ЭПИГЕНЕТИКА
Sharp J. A., Nicholas К. R.. RayD.A.. Ku he AL, Rein-
hardt R., Pringle Т.Н., Taylor J., JonesRC., Nixon B.,
DacheuxJ. L., Niwa H., SekitaY., HuangX., Stark A.,
Kheradpour P., Kellis AL, FlicekP., ChenY., Webber C.,
Hardison R, Nelson J., Hallsworth-Pepin K., Delehaun-
ty K, Alarkovic C., ALinxP., FengY., Kremitzki C., Mi-
trevaAL, Glasscock J., Wylie T, Wdhldmatm P., ThirttP.,
Nhan AL. N.. Pohl C. S.. SmithS. AL., Hoti S.. Nefedov AL,
de Jong P. J., Renfree ALB., ALardisE.R, Wilson R. K.
Genome analysis of the platypus reveals unique signatures
of evolution /'/ Nature. 2008. Vol. 453. P. 175—183.
Weidman J. R, Dolinoy D. C., ALaloney К A., Cheng J. F, Jir-
tle R. L. Imprinting of opossum Igl2r in the absence of dif-
ferential methylation and air// Epigenetics. 2006. Vol. 1.
p. 49—54.
WeksbergR, ShenD.R, Fei Y L., SongQ.L., Squire J. Dis-
ruption of insulin-like growth factor 2 imprinting in
Beckwith—Wiedemann syndrome // Nat. Genet. 1993.
Vol. 5. P. 143—150.
Yamasaki Y., KayashimaT.. Soejima H, Kinoshita A.. Yoshi-
tira K., ALatsumoto N., OhtaT., UranoT., ALasuzaki H,
Ishimaru T, ALukaiT., Niikawa N, KishinoT. Neuron-
specific relaxation of Igl2r imprinting is associated with
neuron-specific histone modifications and lack of its an-
tisense transcript Air // Hum. Mol. Genet. 2005. Vol. 14.
P. 2511 2520.
YokomineT.. Hata K., TsudzukiAL, Sasaki H. Evolution of the
vertebrate DNMT3 gene family: a possible link between
existence of DNMT3L and genomic imprinting // Cytoge-
net. Genome Res. 2006. Vol. 113. P. 75—80.
YotovaL. E, ilatkovic 1. AL, Pauler F. AL, Warczok К. E., Am-
brosP. E, Oshimura AL, Theussl H. C., Gessler AL, Wag-
ner E. F, Barlow D. P. Identification of the human ho-
molog of the imprinted mouse Air non-coding RNA /7
Genomics. 2008. Vol. 92, N 6. P. 464 473.
Zakharova L. S.. Shevchenko A. L.. ZakianS.AL Monoallelic
gene expression in mammals // Chromosoma. 2009.
Vol. 1 18, N3. P. 279—290.
ГЛАВА
11
СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ
СОДЕ РЖАН И Е
11.1. Стволовые клетки эмбрионально-
го происхождения. Раннее эмб-
риональное развитие млекопитаю-
щих, 284
11.2. Эмбриональные карциномные клет-
ки. Тератомы, тератокарциномы,
288
11.3. Эмбриональные стволовые клет-
ки, 289
11.4. Трофобластные стволовые клет-
ки, 294
11.5. Стволовые клетки экстраэмбрио-
нальной (внезародышевой) энто-
дермы, 299
11.6. Эмбриональные герминальные
клетки, 302
11.7. Региональные стволовые клетки,
302
11.8. Альтернативные способы получе-
ния стволовых клеток, 306
11.9. Прикладное значение исследова-
ния стволовых клеток, 307
Список литературы, 309
284 ЭПИГЕНЕТИКА
Стволовые клетки представляют собой клет-
ки, способные к интенсивной пролиферации в
недифференцированном состоянии, а также к
дифференцировке в зрелые специализированные
типы клеток. Стволовые клетки являются экспе-
риментальной моделью in vitro для изучения мо-
лекулярных процессов поддержания недиффе-
ренцированного состояния и направленной диф-
ференцировки клеток. Данные процессы моде-
лируют аналогичные события /и vivo, происхо-
дящие при развитии организма и в клетках, и в
тканях и органах, образованных ими. Таким об-
разом, можно считать, что стволовые клетки
служат промежуточным звеном между’ система-
ми in vitro и in vivo. Научно-исследовательский
интерес многих ученых обращен на проблему’
получения, характеристики и дальнейшего при-
менения стволовых клеток различных видов жи-
вотных и человека. Изучаются возможности ши-
рокого применения этих клеток в лечении деге-
неративных, в том числе аутоиммунных, заболе-
ваний, а также в направленной дифференциров-
ке для образования различных органов и тканей.
Стволовые клетки, в отличие от клеток диф-
ференцированных типов, имеют ряд преиму-
ществ, которые позволяют использовать их в
фундаментальных исследованиях, в качестве мо-
делей различных заболеваний, для тестирования
лекарственных препаратов, а также в клиничес-
кой и экспериментальной медицине. Во-первых,
при неограниченной пролиферации стволовые
клетки сохраняют свои свойства на протяжении
многих делений [Petersen, Terada, 2001]. Во-вто-
рых, в соответствующих условиях стволовые
клетки способны дифференцироваться в клетки
определенных типов, что имеет особенную цен-
ность для клинической трансплантологии [Le-
venberg et al., 2002; Orlic et al., 2003; Shi, Garry-,
2006]. Таким образом, появляется возможность
получения из плюрипотентных стволовых кле-
ток человека большого количества чистых попу-
ляций эуплоидных клеток, таких как кардиомио-
циты, нейроны, гепатоциты и другие.
Многие заболевания: болезнь Паркинсона,
инфаркт миокарда, рассеянный склероз, цирроз
печени, сахарный диабет, возникают в результа-
те гибели или дисфункции клеток лишь одного
или нескольких типов. При трансплантации в
пораженный орган стволовых клеток, выделен-
ных из органов больного, или индуцированных
плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК), по-
лученных при репрограммировании соматиче-
ских клеток собственно пациента с последую-
щей дифференцировкой в необходимый тип кле-
ток, можно решить важнейшую проблему’ гисто-
несовместимости и иммунного отторжения. По-
этому работы по репрограммированию разных
типов дифференцированных клеток в плюрипо-
тентные являются революционными как в облас-
ти фундаментальной науки, так и для медицины
|Mahcrali etal., 2007; Takahashi etal., 2007; Yu
et al., 2007; Okita et al., 2008; Kim et al., 2009]. To
есть исследование стволовых клеток позволяет
изучать механизмы поддержания недифферен-
цированного состояния, направленной диффе-
ренцировки, а также репрограммирования диф-
ференцированных клеток до плюрипотентного
состояния, что поможет лучше понимать эти
процессы, позволит управлять ими и даст неис-
сякаемый источник биоматериала для регенера-
тивной медицины и тканевой инженерии.
11.1. Стволовые клетки
ЭМБРИОНАЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ.
Раннее эмбриональное развитие
МЛЕКОПИТАЮЩИХ
Работы по революционному- направлению со-
временной науки — репрограммированию сома-
тических клеток были бы невозможны без пред-
шествующего колоссального труда многих уче-
ных по изучению стволовых клеток эмбриональ-
ного происхождения. Известно, что при культи-
вировании в определенных условиях предым-
плантационных бластоцист можно получить три
основных типа стволовых клеток (рис. 11.1)
[Ralston, Rossant, 2005]. В зависимости от проис-
хождения их разделяют на эмбриональные ство-
ловые (ЭС) клетки, трофобластные стволовые
(ТС) клетки и стволовые клетки экстраэмбрио-
нальной (или внезародышевой) энтодермы (XEN-
клетки). Вышеупомянутые типы стволовых кле-
ток различаются по способу получения, куль-
тивирования, степени дифференцированности,
экспрессии специфичных молекулярных марке-
ров, вкладу- в химерные эмбрионы (рис. 11.2).
Недифференцированные клетки как in vivo,
так и in vitro различаются по потенциалу- разви-
тия (т. е. обладают способностью дифференци-
роваться и делать вклад в разные клеточные ти-
пы), по морфологическим и молекулярно-гене-
тическим характеристикам. Например, бласто-
меры эмбриона мыши на стадии восьми клеток
являются тотипотентными или эквипотенциаль-
ными, т. е. обладают равными возможностями и
способны воспроизвести полноценный организм
[Дыбан, 1988]. Более поздние стадии эмбриоге-
неза характеризуются уменьшением потенциала
глава 11 285
развития клеток эмбриона. Например, клетки
внутренней клеточной массы (ВКМ) бластоци-
сты формируют лишь собственно эмбрион, со-
стоящий из трех эмбриональных зародышевых
листков: эктодермы, дающей далее нейроны,
эпителиальные клетки; мезодермы, формирую-
щей кардиомиоциты, миоциты, адипоциты, хон-
дроциты, кроветворные клетки; и энтодермы,
образующей гепатоциты, спленоциты, клетки
поджелудочной железы, и, таким образом, явля-
ются плюрипотентными [Robertson, 1987]. Кле-
точные культуры in vitro, такие как ЭС-клетки,
эмбриональные герминальные (ЭГ) и эмбрио-
нальные карциномные (ЭК) клетки, тоже обла-
дают свойством плюрипотентности, поскольку
при дифференцировке дают производные трех
эмбриональных зародышевых листков, образую-
щих собственно эмбрион, a in vivo — способны
образовывать клетки всех типов химерного жи-
вотного, в том числе функциональные гаметы
[Stewart, Mintz, 1981; Robertson etal., 1986; Ды-
бан, Дыбан, 2002]. Клетки трофоэктодермы (ТЭ
или трофобласта) и гипобласта эмбриона, как и
их производные in vitro ТС- и XEN-клетки соот-
ветственно, представляют собой клетки с очень
ограниченным потенциалом развития. Они диф-
ференцируются в клетки небольшого числа ти-
пов, а именно участвуют в формировании экстра-
эмбриональных тканей, в том числе плаценты,
т. е. являются мульти- или унипотентными [Tana-
ka et al., 19981 Hemberger et al., 2004: Hughes et al.,
2004; Kunath etal., 2005]. На рис. 11.2 показаны
расположение предшественников линий стволо-
вых клеток эмбрионального происхождения в
бластоцисте и эмбрионе мыши, условия культи-
вирования, ростовые факторы, необходимые для
их получения, морфология стволовых клеток in
vitro, а также вклад в химерные эмбрионы.
Поскольку недифференцированные стволовые
клетки эмбрионального происхождения, такие
как ЭС-, ТС-, ЭГ- и XEN-клетки, являются произ-
водными клеток, выделенных из ранних эмбрио-
нов млекопитающих, рассмотрим некоторые ас-
пекты эмбрионального развития на примере мы-
ши. Надо отметить, что хотя ранние предымплан-
тационные эмбрионы разных видов млекопитаю-
щих практически не различаются по своей струк-
туре, различными у них являются темп роста и
развития бластоцист и время имплантации. Так,
например, у приматов время имплантации 7—
10 сут, а у мыши — всего 4,5 сут.
После оплодотворения сперматозоидом ооци-
та образуется зигота, которая при первом деле-
нии дает 2-клеточный эмбрион, после второго —
БЛАСТОЦИСТА
--- Бластоцель
Внутренняя
клеточная—
масса
Полярная
трофоэктодерма
Рис. 11.1. Схема строения предымплантационной
бластоцисты и получения из бластоцисты трех типов
стволовых клеток эмбрионального происхождения:
ЭС, ТС и XEN.
4-клеточный, далее 8-клеточный эмбрион. Как
уже упоминалось, эмбрион до этой стадии вклю-
чительно является тотипотентным. При перехо-
де к 16-клеточной моруле происходит компакти-
зация и поляризация бластомеров, в результате
чего эквипотенциальные клетки приобретают
различия в зависимости от места положения в
эмбрионе [Дыбан, 1988]. Далее ранняя диффе-
ренцировка клеток эмбриона приводит к появле-
нию первых двух различных линий клеток из
идентичных бластомеров на 3,5 день после оп-
лодотворения (д. и. о.): ВКМ и экстраэмбрио-
нального эпителиального слоя — ТЭ (или тро-
фобласта) (см. рис. 11.1 и 11.3) [Дыбан, 1988].
Клетки ВКМ и ТЭ формируют бластоцисту’, в
которой ТЭ образует поверхностный однокле-
точный слой, окружающий клетки ВКМ, необ-
ходимый для имплантации эмбриона в стенку’
матки и формирования плаценты. Внутри бла-
стоцисты образуется полость, заполненная жид-
костью,— бластоцель (см. рис. 11.1) [Robertson,
1987]. В процессе этой дифференцировки важ-
ную роль имеет воздействие транскрипционных
факторов на клетки [Niwa et al., 2005; Smith,
2005]. В результате у каждого типа клеток за-
пускаются разные внутриклеточные сигнальные
286 ЭПИГЕНЕТИКА
Рис. 11.2. Схематичное изображение происхождения стволовых клеток из бластоцисты мы-
ши, их морфология, условия культивирования in vitro и вклад в химерные животные при
инъекции в бластоцисты (по [Григорьева и др., 2010]).
ТС-клетки — производные полярной трофоэктодермы бластоцисты (синий), растут компактными эпите-
лиальными колониями клеток в присутствии FGF4, гепарина, эмбриональных фибробластов (ЭФМ) или
кондиционированной ими среды (ЭФМ-КС). ЭС-клетки получают из эпибласта (розовый), они растут
многослойными колониями в присутствии цитокина LIF и/или ЭФМ (ЭФМ-КС). XEN-клетки происходят из
гипобласта (фиолетовый), имеют круглую или звездчатую морфологию, растут в присутствии ЭФМ или
ЭФМ-КС. д. п. о. —день после оплодотворения.
глава 11 287
Морула ЭКСТРАЭМБРИОНАЛЬНЫЕ
ПЛАЦЕНТА
Рис. 11.3. Генеалогия зародышевых и внезародышевых листков млекопитающих.
пути, что приводит к экспрессии в клетках ВКМ
таких генов, как Nanog [Mitsui et al., 2003], Oct4
[Pesce, Scholer, 2001], а в ТЭ — гена Cdx-2
[Kunath et al., 2004; Rossant, 2007].
Инвазия эмбриона мыши в стенку’ матки на-
чинается на 4,5 д. и. о. и на первых этапах проис-
ходит за счет первичных трофобластных гигант-
ских (ТГ) клеток [Зыбина. 1986; Knofler et al.,
2008]. Эти гигантские клетки появляются из му-
ральной ТЭ, не имеющей контакт с ВКМ, в ре-
зультате прекращения пролиферации и продол-
жающейся эндоредупликации ДНК. Полярная
ТЭ, непосредственно контактирующая с ВКМ,
сохраняет пролиферативные способности и диф-
ференцируется в ЭкЭ и диплоидный эктопла-
центарный конус, которые впоследствии обра-
зуют плаценту^ (см. рис. 11.3). В это же время
происходит разделение ВКМ на два слоя: эпи-
бласт (примитивная, или эмбриональная, экто-
дерма) и гипобласт (примитивная, или экстраэм-
бриональная, энтодерма). По мере развития эм-
бриона эпибласт формирует три зародышевых
листка, первичные половые клетки (ПИК) и экс-
траэмбриональную мезодерму', тогда как гипо-
бласт образует париетальную и висцеральную
энтодерму' желточного мешка (см. рис. 11.3)
[Дыбан, 1988].
При дальнейшем развитии клеток ЭкЭ обра-
зуется эпителий хориона. Трофобласт совместно
с кровеносными сосудами эмбриона создает
плотно упакованную структуру' — лабиринт. Из
эктоплацентарного конуса образуется слой кле-
288 ЭПИГЕНЕТИКА
ток спонгиотрофобласта, который также под-
держивает структуру лабиринта. Трофобластные
клетки хориона дифференцируются в различные
типы, например, в многоядерные клетки синци-
тиотрофобласта, образующегося в результате
слияния клеток. Синцитиальный трофобласт
проникает внутрь капилляров матери, разрушая
их, а также связи с эндотелиальными клетками.
Материнская кровь проникает в образованные
расщелины, что приводит к появлению лакун,
заполненных кровью. Таким образом происхо-
дит образование сложной структуры плаценты
[Зыбина, 1986; Rossant, Cross, 2001]. Поверх-
ность клеток синцитиотрофобласта непосредст-
венно контактирует с эндотелиальными клетка-
ми кровеносных сосудов эмбриона и, благодаря
этому’, выполняет основную роль транспорта пи-
тательных веществ и газообмена между’ мате-
ринской и эмбриональной кровью [Adamson
et al., 2002].
При культивировании предымплантационных
бластоцист в присутствии определенных росто-
вых факторов (см. рис. 11.2) появляются стволо-
вые клетки разных типов, а именно, из ВКМ
(или позднее эпибласта) образуются ЭС-клетки;
ТЭ (или ЭкЭ) формируют ТС-клетки; ПИК дают
начало ЭГ-клеткам; а из гипобласта появляются
XEN-клетки. Далее более подробно остановимся
на характеристике этих типов стволовых клеток, а
также затронем общие аспекты изучения стволо-
вых клеток, выделенных из взрослого организма
и ЭК-клеток, работы с которыми являются осно-
вополагающими в этой области исследований.
11.2. Эмбриональные карциномные клетки.
Тератомы, тератокарциномы
История исследования свойств неограничен-
но делящихся клеток началась более 50 лет назад
с изучения спонтанно возникающих тестикуляр-
ных тератом (опухолей половых желез) у мышей
линии 129 [Stevens, Little, 1954; Damjanov et al.,
1987; Damjanov, 1990: Solter, 2006]. Термины «те-
ратома» (доброкачественная опухоль) и «терато-
карцинома» (злокачественная опухоль) произош-
ли от слова «teratos», что в переводе с греческого
языка означает «монстр, чудовище». Такое назва-
ние опухоль получила в связи с тем, что она при-
водит к образованию «уродливой» смеси диффе-
ренцированных тканей.
Тератокарциномы могут быть не только спон-
танными, но и индуцированными, возникающи-
ми после экспериментальной имплантации бла-
стоцисты под соединительнотканую капсулу’
почки [Damjanov etal., 1987]. Чаще всего для
этих процедур используют линии мышей с им-
мунными нарушениями разной степени. Часть
клеток таких опухолей обладает свойствами ство-
ловых клеток, может экстенсивно пролифериро-
вать и дифференцироваться в самые разные тка-
ни: кишечный и дыхательный эпителий, мышеч-
ную, нервную, жировую, хрящевую и костную
ткани [Ibid], что объясняет появление в опухолях
зубов, частей костей, мышц, кожи и волос. Диф-
ференцированные же клетки больше не делятся
и поэтому’ более не являются злокачественными.
При исследовании тератокарцином и ЭК-кле-
ток, которые были выделены из тератокарцино-
мы мыши [Kleinsmith, Pierce, 1964; Jakob et al.,
1973; Damjanov, 1990], были получены основные
представления о плюрипотентности, разработа-
ны базовые приемы работы с культурами ство-
ловых клеток. В работе Мартина и Эванса опи-
саны ЭК-клетки, растущие плотными колония-
ми. клетки в которых имеют большое и четкое
ядро и тонкую тусклую цитоплазму’. Они спо-
собны дифференцироваться in vitro в клетки раз-
личных типов, а также образовывать трехмерные
структуры — эмбриоидные тела (ЭТ) [Martin,
Evans, 1975]. Показано, что инъецированная внут-
рибрюшинно единственная ЭК-клетка может
дифференцироваться в клетки всех типов, встре-
чающихся в тератокарциномах, что демонстри-
рует ее свойство плюрипотентности [Kleinsmith,
Pierce, 1964]. ЭК-клетки также способны образо-
вывать химеры и участвовать в формировании
ПИК [Steyvart, Mintz, 1981]. Однако инъекция
суспензии ЭК-клеток иммунодефицитным мы-
шам зачастую приводит к формированию лишь
сарком, что говорит о частичной плюрипотент-
ности ЭК-клеток [Damjanov et al., 1987].
Изучение ЭК-клеток показало перспективы
использования культур плюрипотентных клеток
для фундаментальной и прикладной медицины.
Однако злокачественность, наличие многочис-
ленных аберраций Х-хромосомы, элиминация
хромосом, различные хромосомные перестройки
при длительном культивировании in vitro и за-
частую ограниченная дифференцировка [Damja-
nov et al., 1987] не позволяли использовать ЭК-
клетки в качестве идеального инструмента для
генетических исследований и потенциального
источника тканевых трансплантатов. Поэтому’
был продолжен поиск других, наиболее подхо-
дящих для обозначенных целей, типов стволо-
вых клеток.
глава 11 289
11.3. Эмбриональные стволовые клетки
ЭС-клетки млекопитающих являются произ-
водными плюрипотентных клеток, формирующих
собственно эмбрион, которые на ранних этапах
развития представлены ВКМ [Evans, Kaufman,
1981; Martin, 1981], а позднее клетками эпибласта
[Brook, Gardner, 1997]. До недавнего времени, а
именно до 2006 г. [Takahashi, Yamanaka, 2006] и
начала эпохи работ по репрограммированию со-
матических клеток, внимание многих исследо-
вателей было обращено на получение и изуче-
ние недифференцированных ЭС-клеток человека
[Thomson et al., 1998], различных видов животных
[Prelle etal., 1999] и процессов, происходящих в
них при дифференцировке. Интерес ученых к ЭС-
клеткам обусловлен тем, что они являются уни-
кальным инструментом для исследования раннего
эмбрионального развития млекопитающих, меха-
низмов поддержания недифференцированного
состояния. Более того, клетки данного типа явля-
ются неограниченным источником биологическо-
го материала для работ по клеточной трансплан-
тации и тканевой инженерии, что представляет
собой одно из самых востребованных и перспек-
тивных направлений медицины.
11.3.1. Получение и характеристика
плюрипотентных ЭС-клеток
Мышь является первым лабораторным живот-
ным, из клеток ВКМ которого более 30 лет назад
были получены плюрипотентные ЭС-клетки [Ev-
ans, Kaufman, 1981; Martin, 1981]. Модификация
этих стандартных процедур используется для по-
лучения ЭС-клеток из бластоцист многих видов
млекопитающих, в том числе и человека. Надо
отметить, что не существует единой методики для
выделения и культивирования ЭС-клеток разных
животных видов. Однако для ЭС-клеток мыши
экспериментально установлено несколько основ-
ных способов их получения и поддержания в не-
дифференцированном состоянии: во-первых, в
присутствии среды, кондиционированной BRL-
клетками (Buffalo rat liver) [Smith et al., 1988]; во-
вторых, на монослое эмбриональных фибробла-
стов, которые выделяют ростовые факторы, необ-
ходимые для поддержания недифференцирован-
ного состояния культуры [Robertson, 1987; Bari-
bault, Kemler, 1989]; а также на желатиновой под-
ложке в присутствии цитокина LIF (leukemia in-
hibitory- factor, фактор, подавляющий лейкемию),
препятствующего дифференцировке клеток [Smith
etal., 1988; Baribault, Kemler, 1989; Vassilieva
etal., 2000]. Наиболее распространено получение
и культивирование ЭС-клеток мыши с использо-
ванием подложки эмбриональных фибробластов
мыши (ЭФМ) и коммерческого фактора LIF мы-
ши [Robertson, 1987].
Надо отметить, что условия культивирования
ЭС-клеток человека, так же как и многие другие
характеристики, сильно отличаются от ЭС-кле-
ток мыши. Первые работы по получению ЭС-кле-
ток человека, аналогично линиям ЭС-клеток мы-
шей, осуществлялись в присутствии цитокина
LIF и питающего слоя фибробластов [Thomson
et al., 1998]. Однако при попытке культивирова-
ния без фибробластов, но в присутствии LIF про-
исходила их дифференцировка. Успех культи-
вирования ЭС-клеток человека без эмбриональ-
ных фибробластов был достигнут лишь при ис-
пользовании среды, кондиционированной эмб-
риональными фибробластами мыши (ЭФМ-КС),
которые выделяют в среду- различные, пока не
идентифицированные ростовые факторы [Sato
et al., 2004], а также в присутствии bFGF (basic
fibroblast growth factor, основной фактор роста
фибробластов) [Amit et al., 2000; Xu et al., 2005].
Для получения недифференцированных и не-
ограниченно пролиферирующих in vitro ЭС-кле-
ток главным образом используют ВКМ ранних,
средних, поздних и задержанных бластоцист,
т. е. ранние предымплантационные эмбрионы
[Evans, Kaufman, 1981; Martin, 1981; Robertson,
1987; Brook, Gardner, 1997; Thomson, 1998; Prelle
et al., 1999], и диссоциированные морулы [Delha-
ise etal., 1996]. Культивирование бластоцист
мыши в вышеописанных условиях, предотвра-
щающих дифференцировку- клеток, приводит к
разрастанию ВКМ. После механической диссо-
циации клеток ВКМ (см. рис. 11.1) в чашках
Петри появляются отличающиеся от соматиче-
ских клеток пухлые компактные колонии ЭС-
клеток с большим ядерно-цитоплазматическим
соотношением, тесными межклеточными кон-
тактами. Кроме того, ЭС-клетки способны диф-
ференцироваться в три зародышевых листка,
имеют высокий уровень теломеразной активно-
сти, формируют тератомы после инъекции под-
кожно бестимусным мышам [Notarianni et al.,
1991; Graves, Moreadith. 1993; Sukoyan etal.,
1993; Ouhibi et al.. 1995; Thomson et al., 1995;
Pain et al., 1996; Cibelli et al., 1998].
Неограниченно культивируемые линии ЭС-
клеток, так же как и любые стволовые клетки,
имеют характеристики, позволяющие называть
их стабильными. К таким характеристикам отно-
сятся интенсивная пролиферация in vitro без из-
290 ЭПИГЕНЕТИКА
менения морфологии и характера роста клеток,
сохранение нормального диплоидного кариотипа
на протяжении многих пассажей, а также под-
держание экспрессии генов, характерных для
недифференцированных стволовых клеток дан-
ного типа [Notarianni etal., 1991; Thomson etal.,
1995; Cibelli etal., 1998]. Одной из характери-
стик многих ЭС-клеток является экспрессия ос-
новных клеточных маркеров плюрипотентности
таких, как Oct4, Nanog, Sox2, а также стадио-спе-
цифичного антигена (Ssea)-1 (для мыши), SSEA-3
и -4 (для человека), STAT3, TRA-1-60 и -81 [Ouhi-
bi et al., 1995; Thomson et al., 1995; Pain et al.,
1996]. В большинстве случаев ЭС-клетки экс-
прессируют щелочную фосфатазу [Ouhibi etal.,
1995; Thomson et al., 1998].
ЭС-клетки разных видов животных могут
сильно различаться между собой по морфологии
колоний клеток, темпу роста, типу дифферен-
цированных производных, профилю экспрессии
маркеров плюрипотентности, вкладу’ в химерные
животные. При детальных исследованиях ЭС-
клеток были обнаружены не только существен-
ные различия в клетках разных видов млекопи-
тающих, но и некоторые различия в линиях кле-
ток одного вида. Например, большинство плюри-
потентных линий ЭС-клеток было получено из
нескольких линий лабораторных мышей, а имен-
но, 129, C57BL/6 и межлинейных гибридов. По-
казано, что ЭС-клетки, полученные из бластоцист
мышей линии C57BL/6, имеют более ограничен-
ный потенциал развития по сравнению с ЭС-клет-
ками мышей из линии 129, что выражается в ме-
нее эффективном получении химер и редком уча-
стии в образовании герминальных линий [Brook,
Gardner, 1997]. Более того, после изучения не-
сколькими международными лабораториями 59
линий ЭС-клеток человека были обнаружены
различия в профиле экспрессии генов в этих ли-
ниях [The International Stem Cell Initiative, 2007].
Таким образом, генотип биологического материа-
ла, а также условия получения и культивирования
ЭС-клеток накладывают отпечаток на индивиду-
альные особенности выделенных линий.
Стволовые клетки, выделенные из эпибла-
ста. После начала эры ЭС-клеток появились ра-
боты по получению плюрипотентных клеток из
эпибласта и его одноклеточной суспензии на
стадии яйцевого цилиндра [Brook, Gardner, 1997;
Brons et al., 2007; Tesar et al., 2007], которое ока-
залось более эффективным, чем из интактных
бластоцист. Однако из-за технических сложно-
стей, связанных с уже прошедшей имплантацией
бластоцист, этот метод мало применим. Надо
заметить, что полученные из эпибласта мыши и
крысы плюрипотентные эпибластные стволовые
клетки (ЭпиСК) отличаются от классических
ЭС-клеток мыши, хотя имеют некоторые ха-
рактеристики ЭС-клеток человека [Brons et al.,
2007; Tesar etal., 2007]. Во-первых, ЭпиСК, так
же как ЭС-клетки человека, растут плоскими
компактными колониями клеток. Во-вторых, при
пересадке колоний клеток ЭпиСК с использо-
ванием трипсина или других диссоциирующих
до одноклеточной суспензии агентов происхо-
дит гибель клеток. С аналогичными трудностями
сталкиваются ученые при культивировании ЭС-
клеток человека. В-третьих, ЭпиСК являются
LIF- и ВМР4-независимыми культурами. С дру-
гой стороны, эти клетки используют сигнальный
путь активин/Nodal, что делает их также похо-
жими на ТС-клетки (см. 11.5 «Трофобластные
стволовые клетки»). И, наконец, ЭпиСК мыши
могут быть получены в среде с использованием
активина и без FGF, хотя в присутствии FGF
культура ЭпиСК улучшается, что свидетельству-
ет о схожести ЭпиСК с ЭС-клетками человека
[Brons et al., 2007; Hanna et al., 2010].
Таким образом, принято считать, что ЭС-клет-
ки мыши и ЭпиСК мыши находятся в разных
стадиях плюрипотентности, нативной (naive)
и начальной (primed) соответственно [Nichols,
Smith, 2009]. Принимая во внимание многие
факты, исследователи считают, что ЭС-клетки
человека по своим характеристикам ближе ско-
рее к ЭпиСК, а не к «классическим» ЭС-клеткам
мыши. Иными словами, ЭС-клетки человека на-
ходятся в более продвинутой стадии развития,
т. е. менее плюрипотентны по сравнению с ЭС-
клетками мыши. Этот факт объясняет то обстоя-
тельство, что в последнее время появляются ра-
боты. в которых авторы пытаются «вернуть»
ЭС-клетки человека к нативному’ состоянию
[Hanna et al., 2010; Lengner et al., 2010].
Далее рассмотрим более детально характери-
стику’ некоторых маркеров плюрипотентных
клеток, механизмы поддержания недифференци-
рованного состояния, а также сигнальные пути,
свойственные для стволовых клеток.
11.3.2. Механизмы сохранения
плюрипотентности и гены,
участвующие в поддержании
плюрипотентного статуса
клеток
Понимание молекулярных механизмов, спо-
собствующих поддержанию ЭС-клеток в недиф-
ГЛАВА 11 291
ференцированном состоянии, поможет управ-
лять данными процессами, а также контролиро-
вать направленную дифференцировку, что от-
кроет широчайшие перспективы прикладного
использования стволовых клеток в медицине.
Сигнальный путь LIF/STAT3. В одной из
первых статей по получению и культивирова-
нию ЭС-клеток мыши из предымплантационных
эмбрионов Мартин описал появление плюрипо-
тентных прозрачных колоний на фибробластах
STO в присутствии кондиционной среды, полу-
ченной при культивировании ЭК-клеток [Martin,
1981]. В контроле на фибробластах STO в отсут-
ствие кондиционной среды появления анало-
гичных колоний не наблюдалось. Было сделано
предположение о продуцировании ЭК-клетками
эндогенного фактора или факторов, которые
способствуют пролиферации ЭС-клеток и под-
держивают их в недифференцированном плюри-
потентном состоянии.
В дальнейших исследованиях был определен
первый и наиболее важный фактор для получе-
ния и культивирования плюрипотентных ЭС-
клеток мыши — LIF [Smith et al., 1988; Williams
etal., 1988; Smith, 2001]. LIF принадлежит се-
мейству цитокинов, состоящих из ИЛ-6, ИЛ-11,
цилиарного нейротрофического фактора, онко-
статина М и кардиотрофина 1. Эффект цитокина
LIF опосредован через гетеродимерный клеточ-
ный комплекс поверхностных рецепторов, со-
стоящих из рецептора LIF (LIFR|3) и преобразо-
вателя сигнала гликопротеина gpl30 [Hibi et al.,
1990; Gearing etal., 1991]. Данный гетеродимер-
ный комплекс является наиболее важным для
активации транскрипционного фактора STAT3
(signal transducer and activator of transcription 3) и
для поддержания недифференцированного со-
стояния ЭС-клеток [Matsuda et al., 1999].
Однако фактор LIF не является универсаль-
ным для поддержания стволовых клеток других
видов млекопитающих в недифференцирован-
ном состоянии. В работах на ЭС-клетках челове-
ка была обнаружена их дифференцировка in vitro
в отсутствие питающего слоя (ЭФМ) даже при до-
бавлении LIF в больших концентрациях (2000—
3000 ед./мл), т. е. они являются LIF-независи-
мыми [Thomson et al., 1998; Sato et al., 2004]. Как
и следовало предполагать, в линиях ЭС-клеток
человека продукты LIFRJ3 и gpl30 практически
отсутствуют, что было показано при помощи
иммуноокраски и полимеразной цепной реакции
с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). Однако
данные сигналы отчетливо обнаруживаются в
культуре ЭС-клеток мыши [Ginis etal., 2004].
Слабый уровень экспрессии генов GP130 и LIFR/3
в линиях ЭС-клеток человека подтверждает, что
этот путь не является эффективным для поддер-
жания их плюрипотентности. Таким образом, ак-
тивация сигнального пути LIF/STAT3 для поддер-
жания ЭС-клеток в недифференцированном со-
стоянии является видоспецифичным механизмом.
Роль гена Oct4 в эмбриональном развитии и
сохранении ЭС-клеток в плюрипотентном со-
стоянии. Транскрипционный фактор гена Oct4
(Pou5fl, Oct3 4) необходим для регуляции судь-
бы клеток в раннем эмбриональном развитии
мыши. Ранние события дифференцировки тоти-
потентных клеток в соматические линии, проис-
ходящие на стадии морулы и при гаструляции в
развивающемся эмбрионе, связаны с по-
давлением экспрессии гена Oct4. Материнская
РНК гена Oct4 и белок этого гена в оплодотво-
ренном ооците присутствуют до двухклсточной
стадии, тогда как экспрессия зиготического гена
начинается с 4—8-клеточной стадии [Nichols
etal., 1998; Yoshimizu etal., 1999]. В процессе
раннего деления во всех бластомерах наблюда-
ется равное количество РНК гена Oct4, но ее
уровень снижается во внешних клетках морулы
вследствие начала экспрессии гена Cdx-2, что
приводит к образованию ТЭ (рис. 11.4) [Strumpf
etal., 2005]. После 3,5 д. и. о. экспрессия гена
Oct4 сохраняется в клетках ВКМ, но подавляется
в ТЭ и примитивной энтодерме. На стадии раз-
деления ВКМ на эпибласт и гипобласт (4,5 д.п.о.)
в этих двух типах клеток также наблюдается
различие в уровне транскрипции гена. Экспрес-
сия гена Oct4 сохраняется в эпибласте, тогда как
в гипобласте, в процессе его разделения на вис-
ВКМ
. Бластоциста
। 3,5 д. п. о.
V Эпибласт
y/у Гипобласт
/gSryj Бластоциста
4,5 д. п. о.
Рис. 11.4. Динамика экспрессии генов Oct4 и Cdx-2 в
эмбриогенезе мыши.
292 ЭПИГЕНЕТИКА
Рис. 11.5. Схематичное изображение «судьбы» ЭС-
клеток при подавлении или сверхэкспрессии генов
Oct4 и Nanog.
церальную и париетальную энтодерму, уровень
постепенно снижается до полного выключения
гена [Kunath etal., 2004]. В процессе гаструля-
ции экспрессия прекращается в соматических
клетках и детектируется только в 1П1К в преде-
лах экстраэмбриональной мезодермы на 7,2 день
развития эмбриона мыши. После рождения экс-
прессия гена Oct4 обнаруживается в пределах
пролиферирующих гоноцитов, просперматого-
ниях и позднее в недифференцированных спер-
матогониях [Kehler et al., 2004].
Исследования in vivo показали, что мутация
гена Oct4 на стадии бластоцисты является при-
чиной дифференцировки клеток ВКМ в клетки
ТЭ [Niwa et al., 2000], что приводит к гибели эм-
бриона во время имплантации. Если же ген вы-
ключен на более ранней стадии морулы, то фор-
мирования ВКМ не происходит [Nichols et al.,
1998]. Более того, показано, что из ВКМ, слабо
или совсем не экспрессирующих ген Oct4, не-
возможно получить плюрипотентные линии ЭС-
клеток мыши [Boiani etal., 2002]. Также по-
казано, что сверхэкспрессия гена Od4 приводит
к дифференцировке клеток ВКМ и ЭС-клеток
мыши в паристальную/примитивную энтодерму’
(рис. 11.5) [Niwa et al., 2000; Hay et al., 2004].
Ген Oct4 экспрессируется также в культурах
недифференцированных плюрипотентных ЭК-,
ЭГ- и ЭС-клеток [Ginis et al., 2004]. На ЭС-клет-
ках мыши и человека показано, что подавление
экспрессии гена Oct4 приводит к усилению экс-
прессии гена, специфичного для трофобласта, —
Cdx-2 (см. рис. 11.5), а также генов, характерных
для экстраэмбриональной энтодермы (Gata6 и
а-фетопротеина (Afp)), что может свидетельст-
вовать о перекрывании механизмов дифферен-
цировки трофобласта и энтодермы [Hay et al.,
2004]. Более того, при выключении гена проис-
ходит дифференцировка в клетки, подобные ТГ-
клеткам, которые в присутствии фактора роста
фибробластов (FGF4) образуют клетки, эквива-
лентные ТС-клеткам (см. рис. 11.5) [Niwa etal.,
2000]. Эти результаты согласуются с работой
Буера по получению и характеристике ЭС-кле-
ток крысы [Buehr et al., 2003], которые на ранних
пассажах культивирования прекращают экспрес-
сию гена Oct4, тогда как экспрессируют маркеры
ТЭ — Cdx-2 и cyclin D3 и спонтанно дифферен-
цируются в ТГ-клетки. Таким образом, подавле-
ние экспрессии гена Oct4 приводит к дифферен-
цировке плюрипотентных клеток в трофобласт-
ные и экстраэмбриональные линии клеток, не
образующиеся в норме при культивировании
ЭС-клеток мыши.
Вышесказанное отражает ключевую роль Oct4
в специализации и установлении плюрипотент-
ных клеток in vivo и in vitro и объясняет тот
факт, что экспрессию гена Oct4 используют для
оценки степени плюрипотентности клеток как
ключевого транскрипционного фактора.
Ген Sox2. Ген Sox2 является членом семейства
генов Sox (SRY-related HMG box). Показано, что
транскрипционный фактор гена Sox2 участвует в
поддержании потенциала плюрипотентных кле-
ток ранних эмбрионов мыши, продукт гена Sox2
обнаружен в ЭС-клетках мыши и человека. Одна-
ко роль этого гена не столь проста, поскольку’ его
экспрессия также была обнаружена в пролифери-
рующем трофобласте, мультипотентных клетках
ЭкЭ [Avilion et al., 2003] и в ТС-клетках, которые
можно получить из эмбрионов на этой стадии
развития [Tanaka et al., 1998].
Впервые РНК гена Sox2 обнаруживается на 2,5
день эмбрионального развития в некоторых клет-
ках морулы. Экспрессия сохраняется в эпибласте
бластоцисты, но на стадии 7,0—7,5 д.п.о. экс-
прессия идет в передней части (anterior) презум-
птивной нейроэктодермы и исчезает в задней час-
ти (posterior) и в клетках первичной полоски. На
6,5 д. п. о. РНК гена Sox2 найдена в эктоплацен-
тарном конусе и ЭкЭ, позднее — в экстраэмбрио-
нальной части хориона, а на стадии 9,5 д.п.о. де-
тектируется в мозге, нервной трубке, сенсорной
плакоде, жаберных дугах, энтодерме кишки и гер-
минальных клетках обоих полов. Большое коли-
чество белка SOX2 также обнаружено в цито-
плазме растущих и зреющих ооцитов взрослых
яичников и в некоторых окружающих стромаль-
ных клетках [Avilion et al., 2003].
Показано, что в бластоцистах с гомозиготной
мутацией по гену’ Sox2 не происходит образова-
ния быстро пролиферирующей и нормально
ГЛАВА 11 293
функционирующей ВКМ [Ibid]. Более того, в
дефектных Sox2~’~ ВКМ экспрессируется маркер
ТГ-клеток Pl-1 (Placental lactogen 1} и при их
культивировании образуются ТГ-клетки. Выше-
описанные процессы не позволяют получить
Sox2ЭС-клетки. Таким образом, ген Sox2, как
и ген Oct4 [Niwa et al., 2000], необходим для
поддержания клеток эпибласта в недифференци-
рованном состоянии и предотвращения их диф-
ференцировки в клетки трофобласта, а также в
дальнейшем участвует в судьбе не только произ-
водных клеток эпибласта, но и ЭкЭ [Kunath
et al., 2004].
Ген Nanog. Недавно был изучен транскрип-
ционный фактор гена Nanog, который необхо-
дим и достаточен для установления плюрипо-
тентности в ЭС-клетках мыши и эпибласте мы-
ши независимо от сигнального пути STAT3
[Chambers etal., 2003; Mitsui etal., 2003]. Ген
Nanog играет критическую роль в судьбе клеток
эмбриона и их дальнейшей способности образо-
вывать бластоцисту, в связи с чем и получил
свое название от «Tir nan og», что в кельтской
мифологии означает «земля вечно молодых». Он
экспрессируется во внутренних клетках ком-
пактной морулы, в ВКМ бластоцисты, эпибласте
и в 1111К на ранней стадии, а также в линиях ЭС-,
ЭГ- и ЭК-клеток, тогда как отсутствует в диффе-
ренцированных клетках [Chambers et al., 2003;
Mitsui et al., 2003; Hart et al.. 2004].
Делеция гена Nanog in vivo является причи-
ной потери способности детерминации плюри-
потентных клеток в ранних эмбрионах, после че-
го происходит их дифференцировка в висце-
ральную/паристальную энтодерму, т. е. в экстра-
эмбриональные линии [Mitsui etal., 2003]. Дан-
ный результат был подтвержден экспериментом
на Nanog-1- ЭС-клетках, в котором показано, что
исследуемые клетки экспрессируют многие мар-
керы экстраэмбриональной энтодермы (Gata6,
Tcf2 и Ihh) и морфологически очень похожи на
XEN-клетки (см. рис. 11.5). Таким образом, ген
Nanog, как и ген Oct4, играет важную роль во
вторичной детерминации эмбриональных клеток
ВКМ и необходим для подавления развития по
пути различных экстраэмбриональных линий:
ген Oct4 подавляет развитие трофобласта, Na-
nog— примитивной энтодермы (см. рис. 11.5).
Более того, показано, что ген Nanog участвует в
регуляции экспрессии генов Oct4 и Sox2 [Loh
et al., 2006].
До недавнего времени было известно, что по-
лучение ЭС-клеток мыши зависит от двух фак-
торов: активации STAT3 при помощи цитокина
LIF и экспрессии гена Oct4. Однако Митсуи и
Чамберс с коллегами показали, что избыточная
экспрессия гена Nanog делает пролиферацию
ЭС-клеток независимой от стимуляции сигналь-
ного пути LIF/STAT3. т. е. даже в отсутствие LIF
в ростовой среде ЭС-клетки мыши способны под-
держивать плюрипотентное состояние [Chambers
et al., 2003; Mitsui et al., 2003].
Таким образом, NANOG, OCT4 и LIF/STAT3
являются тремя различными сигнальными путя-
ми поддержания плюрипотентности, работаю-
щими в ЭС-клетках.
11.3.3. Маркеры, характерные для
плюрипотентных клеток
Щелочная фосфатаза. Выявление активнос-
ти эндогенной щелочной фосфатазы является
первым и наиболее доступным тестом на плю-
рипотентность вновь полученных линий стволо-
вых клеток. В данное время описано пять раз-
личных генов, кодирующих изоферменты ще-
лочной фосфатазы: ген эмбриональной щелоч-
ной фосфатазы (embryonic alkaline phosphatase,
PAP)', ген тканевой неспецифической щелочной
фосфатазы (tissue-nonspecific alkaline phospha-
tase, TNAP) и три гена тканевой специфической
щелочной фосфатазы (tissue-specific alkaline pho-
sphatase, TSAP): кишечной щелочной фосфатазы
(intestinal alkaline phosphatase, IAP)-. плацентар-
ной щелочной фосфатазы (placental alkaline pho-
sphatase, PLAPy, герминальной щелочной фосфа-
тазы (germ cell alkaline phosphatase, GCAP)
[Manes etal., 1990].
Известно, что, по крайней мере, три различ-
ные изоформы щелочной фосфатазы экспресси-
руются у взрослых мышей [Ibid], тогда как про-
дукты только двух генов, Еар и Тпар, обнаружи-
ваются у мышей в течение раннего развития
[Hahnel etal., 1990]. В бластоцистах до 4,5 д.п.о.
экспрессия гена Тпар не найдена. В задержанных
или вымытых незадолго до имплантации бла-
стоцистах продукт гена был обнаружен в основ-
ном в ТЭ и изредка в ВКМ, тогда как на 5 и
6 д.п.о. экспрессия была найдена исключитель-
но в ЭкЭ [MacGregor etal., 1995]. Продукт гена
Еар впервые обнаруживается в большом количе-
стве со стадии двух клеток, сохраняется в бла-
стоцисте, а также найден в клетках эпибласта
[Talbot et al.,1993]. На этой ранней стадии разви-
тия транскрипта ЕАР примерно в десять раз
больше, чем TNAP. Однако приблизительно на 7
день эмбрионального развития происходит пере-
ключение преобладающей изоформы с ЕАР на
294 ЭПИГЕНЕТИКА
TNAP. Позднее транскрипт ЕАР снова появляет-
ся в семенниках взрослых организмов [Hahnel
et al., 1990]. Важно отметить, что ген Еар экспрес-
сируется в ВКМ и ЭС-клетках, получаемых из
ВКМ предымплантапионных эмбрионов боль-
шинства млекопитающих. Поэтому экспрессию
щелочной фосфатазы, как правило, используют
как тест на плюрипотентность линий ЭС-клеток.
Однако в работах с ЭС-подобными клетками
крупного рогатого скота [Cibelli etal., 1998;
Yadav et al., 2005], а также на клетках эпибласта
постимплантационных эмбрионов данного вида
млекопитающих [Maddox-Hyttcl et al., 2003] бы-
ло обнаружено, что они не экспрессируют ще-
лочную фосфатазу, следовательно, данный мар-
кер не является обязательным маркером плюри-
потентности для всех видов млекопитающих.
Семейство SSEA. Еще одним из важных
маркеров плюрипотентности являются поверх-
ностные антигены семейства SSEA (stage-specific
embryonic antigen), к которым относятся SSEA-1,
SSEA-3. SSEA-4. SSEA-7 и антиген, опознавае-
мый моноклональными антителами ЕСМА7 (em-
bryonic cell membrane antigen) [Baribault, Kemler,
1989; Mummery etal., 1990]. Показано, что экс-
прессия наиболее изученного гена Ssea-1 появ-
ляется в раннем эмбриональном развитии на
стадии восьми бластомеров, сохраняется в мору-
ле и далее поддерживается в клетках ВКМ, тогда
как после имплантации экспрессию гена обна-
руживают в эмбриональной эктодерме и висце-
ральной энтодерме [Solter, 1986].
Плюрипотентные клетки мыши, такие как
ВКМ, примордиальные герминальные клетки,
ЭС- и ЭК-клетки экспрессируют ген Ssea-1, но
являются Ssea-З- и &ец-7-негативными [Solter,
Knowles, et al., 1978; Kannagi et al., 1983], при их
дифференцировке экспрессия гена Ssea-1 пре-
кращается и появляются продукты генов Ssea-3
и Ssea-4. Таким образом, анти-SSEA-l монокло-
нальные антитела обеспечивают универсальный
и эффективный мониторинг дифференцировки
плюрипотентных клеток мыши. Однако, по край-
ней мере для некоторых линий ЭС-клеток чело-
века и всех ЭК-клеток человека ситуация проти-
воположная, т. е. в недифференцированном со-
стоянии они SSEA-1 -негативны и экспрессируют
гены SSEA-З и SSEA-4. тогда как при потере
плюрипотентности экспрессия генов SSEA-З и
SSEA-4 прекращается, а ген SSEA-1 начинает
транскрибироваться [Andrews et al., 1987]. Из это-
го следует, что экспрессия антигенов семейства
SSEA является видоспецифичной.
11.4. Трофобластные стволовые клетки
Трофобластные стволовые клетки являются
производными клеток ЭкЭ, играющих важную
роль в имплантации эмбрионов и дальнейшем
развитии эмбриональной части плаценты — пер-
вого жизненно важного экстраэмбрионального
органа, нарушение формирования или функции
которого приводят к гибели эмбрионов. ТС-клет-
ки вызывают большой интерес в связи с их при-
менением в качестве модели in vitro для изучения
механизмов имплантации и плацентации, а также
для исследования сигнальных взаимодействий
между эмбриональными и экстраэмбриональны-
ми клетками в ранних эмбрионах. Поэтому’ осо-
бенно интересными представляются изучение
сигнальных факторов и взаимодействий у разных
видов млекопитающих, выявление общих зако-
номерностей и экстраполяция их на человека.
В течение эмбриогенеза все подтипы ин-
вазивного трофобласта дифференцируются из
стволовых клеток, которые локализованы в по-
лярной ТЭ (или ЭкЭ) бластоцисты и в хорионе
постимплантационных эмбрионов мыши [Ros-
sant, Cross, 2001]. Сохранение диплоидной, про-
лиферирующей клеточной попу’ляции ЭкЭ in vivo
зависит от сигналов, поступающих от клеток
ВКМ и, позднее, эпибласта, без которых клетки
дифференцируются в гигантские клетки или дру-
гие окончательно дифференцированные плацен-
тарные типы клеток [Gardner et al., 1973: Rossant,
Ofer, 1977]. Популяцию стволовых клеток, пред-
шественников дифференцированного инвазивно-
го трофобласта, можно получить при культиви-
ровании in vitro ранних эмбрионов, и эти ТС-
клетки способны сохранять недифференциро-
ванный статус in vitro в течение неограниченно-
го времени.
11.4.1. Получение и характеристика
ТС-клеток
Первые работы по получению и характери-
стике ТС-клеток были проделаны на мыши и
опубликованы в 1998 г. группой исследователей
под руководством Россант [Tanaka etal., 1998].
ТС-клетки другого вида млекопитающих, обык-
новенной полевки рода Microtus (Microtus. Arvi-
colidae) M. rossiaemeridionalis, впервые получе-
ны в лаборатории эпигенетики развития Инсти-
тута цитологии и генетики СО РАН [Grigor’ eva
etal., 2009]. Клетки обоих видов получают из
предымплантационных эмбрионов на стадии
глава 11 295
3,5 д.п.о. ТС-клетки мыши также выделяют из
дезагрегированных клеток ЭкЭ эмбрионов на
6,5 д.п.о. [Tanaka etal., 1998]. Для получения и
культивирования ТС-клеток используют питаю-
щий субстрат — ЭФМ. эмбриональные фибро-
бласты полевки или ЭФМ-КС.
В качестве необходимого ростового фактора
для ТС-клеток мыши в культуральую среду до-
бавляют экзогенный FGF4 и гепарин. Выбор в
пользу этих компонентов обусловлен следую-
щими фактами. Сигнализация, препятствующая
дифференцировке клеток ЭкЭ, у мыши осущест-
вляется через фактор FGF4 [Niswander, Martin,
1992; Rappolee et al., 1994: Nichols et al.. 1998],
который, связываясь с гепарином, активирует
Fgfr2 [Schlessinger etal., 2000; Allen etal., 2001].
Однако сигнальный путь FGF4/FGFR2 не явля-
ется необходимым для других видов млекопи-
тающих, поскольку при культивировании бла-
стоцист полевки без FGF4 и гепарина появляют-
ся FGF-независимые ТС-клетки [Grigor’eva et al.,
2009]. Несмотря на отсутствие FGF4 и гепарина,
ТС-клетки полевки пролиферируют без диффе-
ренцировки, экспрессируя маркеры недифферен-
цированных ТС-клеток, что говорит об актива-
ции альтернативного FGF-независимого сиг-
нального пути [Ibid]. Более того, в одной из по-
следних работ [Chuykin et al., 2010] было описа-
но получение ТС-подобных клеток крысы также
в отсутствие FGF4 и гепарина, что подтверждает
теорию альтернативного сигнального пути под-
держания недифференцированного состояния
ТС-клеток.
В отличие от ЭС-клеток мыши, образующих в
культуре многослойные колонии клеток с плот-
ными межклеточными контактами, ТС-клетки
растут монослойными колониями эпителиопо-
добной морфологии (рис. 11.6,6/) [Tanaka etal.,
1998: Hughes et al., 2004: Ralston, Rossant. 2005:
Grigor’eva et al., 2009]. Колонии ТС-клеток обра-
зованы интенсивно пролиферирующими клетка-
ми с большим ядерно-цитоплазматическим соот-
ношением, что характерно для стволовых клеток
различных видов млекопитающих [Notarianni
et al., 1991; Graves, Moreadith, 1993; Ouhibi et al.,
1995; Thomson et al., 1995, 1998; Pain et al., 1996;
Cibelli et al.. 1998].
При культивировании ТС-клеток в большой
плотности или при удалении любого из факто-
ров, поддерживающих линии ТС-клеток в не-
дифференцированном состоянии, — FGF4/rena-
рин (только для мыши) или ЭФМ (ЭФМ-КС),
происходит снижение пролиферации и диффе-
ренцировка по пути ТГ-клеток (рис. 11.6, б, в)
[Tanaka etal., 1998; Hemberger etal., 2004; Ullah
et al., 2008; Grigor’eva et al., 2009]. Этот факт под-
тверждает экспрессия маркера ТГ-клеток плацен-
тарного лактогена — Р1-1 (рис. 11.6, г) [Soares
etal.. 1996]. Дифференцировка ТС-клеток приво-
дит к образованию не только ТГ-клеток, но и кле-
ток синцитиотрофобласта [Hemberger et al., 2004;
Hughes et al., 2004] и спонгиотрофобласта [Hem-
berger et al., 2004], т. e. всех линий клеток произ-
водных трофобласта, наблюдаемых при имплан-
тации эмбриона и нормальном развитии плацен-
ты (см. рис. 11.3) [Rossant, Cross, 2001].
При инъекции в бластоцисты мыши ТС-клет-
ки демонстрируют свой ограниченный потенци-
ал, так как в полученных химерах делают вклад
исключительно в клетки трофобласта и различ-
ные типы клеток плаценты, но никогда не участ-
вуют в образовании собственно эмбриона [Ta-
naka et al., 1998; Erlebacher et al., 2004; Himeno
et al., 2008]. Этот эксперимент доказывает муль-
типотентные свойства ТС-клеток.
Другой способ выявления спектра дифферен-
цированных производных стволовых клеток —
инъекция суспензии клеток иммунодефицитным
мышам и анализ полученных опухолей. В рабо-
тах на ТС-клетках мыши [Kibschull et al., 2004],
полевки [Grigor’eva et al., 2009] и клетках хорио-
карциномы человека линии Jeg-3 [Griimmer et al.,
1999] описана способность образовывать опухо-
леподобные кистозные образования при подкож-
ной инъекции данных клеток иммунодефицит-
ным мышам (рис. 11.6, д). Полученные опухоли
представляют собой заполненные кровью лаку-
ны, стенки которых в основном формируются
донорными клетками. При инъекции происходит
вторжение клеток в сосуды и замещение эндоте-
лиальных клеток реципиента, что приводит к
образованию лакун. Аналогичный процесс инва-
зии трофобласта в стенку матки происходит при
имплантации и формировании плаценты мыши
[Зыбина, 1986; Rossant, Cross, 2001; Adamson
et al., 2002].
Показано, что ТС-клетки мыши [Cross etal.,
1995; Hughes et al., 2004] и полевки [Григорьева и
др., 2010], подобно клеткам трофобласта in vivo
[Зыбина, 1986; Adamson et al., 2002] и дифферен-
цированным злокачественным (хориокарцином-
ным) клеткам трофобласта крысы (линия Rcho-1),
обладают повышенной адгезией и фагоцитарной
активностью, благодаря чему способны прони-
кать во внеклеточный мембранный матрикс
[Hemberger etal., 2004]. Это объясняется важней-
шей биологической ролью трофобластных клеток
в процессе имплантации эмбрионов в слизистую
296 ЭПИГЕНЕТИКА
Рис. 11.6. Характеристика ТС-кпеток полевки (по [Григорьева и др., 2010]).
а—морфология плоских монослойных колоний ТС-клеток полевки. Увеличение хбО. Фазовый контраст; б —
гигантская клетка с гранулированной цитоплазмой, полученная в результате спонтанной дифференцировки ТС-
клеток полевки. Увеличение х200. Фазовый контраст; в — гигантские многоядерные клетки, образовавшиеся при
дифференцировке культуры ТС-клеток полевки. Увеличение х60. Фазовый контраст; г—ОТ-ПЦР-анализ экс-
прессии генов, специфичных для эмбриональной и внезародышевой эктодермы в различных типах клеток и тка-
ней полевки и мыши; д — внешний вид опухолеподобного кистозного образования через 1 неделю после под-
кожной инъекции суспензии ТС-клеток обыкновенных полевок М. rossiaemeridionalis мыши линии nude. СК —
стволовые клетки.
стенку матки. Таким образом, получение, изуче-
ние свойств и вклада ТС-клеток в процесс им-
плантации. совместно с методами направленной
трансдукции плаценто-специфичных генов в де-
фектную плаценту [Okada et al., 2007], способно
помочь в лечении различных патологий форми-
рования и функционирования плаценты.
11.4.2. Транскрипционные факторы
и сигнальные пути, характерные
для ТС-клеток мыши, полевки
и их производных
Линии эмбриональных и трофобластных ство-
ловых клеток различаются между собой не только
по морфологическим критериям и вкладу в хи-
мерных животных, но и по использованию раз-
ных сигнальных путей и транскрипционных фак-
торов, необходимых для поддержания клеток в не-
дифференцированном состоянии [Rossant, 2001].
В пролиферирующих ТС-клетках отсутствует
экспрессия генов Oct4 и Nanog, сохраняющих не-
дифференцированный статус плюрипотентных
ЭС-клеток (см. рис. 11.6,г) [Nichols etal., 1998;
Tanaka et al., 1998; Kirchhof et al., 2000; Chambers
etal., 2003; Mitsui etal., 2003; Loh etal., 2006].
В то же время, в ТС- и ЭС-клетках экспрессирует-
ся ген Sox2, отсутствующий в соматических клет-
ках (см. рис. 11.6, г), что говорит о «стволовости»
данных линий клеток [Avilion et al., 2003].
глава 11 297
Продолжительная пролиферация ТС-клеток
обеспечивается генами, ответственными за раз-
витие по трофоэктодермальному типу и харак-
терными для ЭкЭ, — Cdx-2, Eomes [Niwa etal.,
2005; Strampf et al.. 2005] и геном Errfy. обеспе-
чивающим поддержание недифференцированно-
го состояния и пролиферацию клеток трофо-
бласта (см. рис. 11.6,г) [Luo etal., 1997; Rossant,
Cross, 2001]. В дифференцированных производ-
ных экспрессия этих генов резко уменьшается
[Tanaka et al., 1998; Grigor’eva et al., 2009].
В недифференцированных ТС-клетках полев-
ки, в отличие от мыши, отсутствует продукт гена
Fgfr2 (см. рис. 11.6. г), который является неотъ-
емлемым компонентом сигнального пути FGF4/
FGFR2, поддерживающего недифференцирован-
ное состояние ТС-клеток мыши [Tanaka et al.,
1998]. Экспрессия данного гена, по-видимому,
является видоспецифичной, поскольку она от-
сутствует и в клетках плаценты полевок.
Независимо от степени дифференцированно-
сти в ТС-клетках обнаружен транскрипционный
фактор ТГ-клеток — ген Handl. а в дифферен-
цированных производных — плацентарный лак-
тоген Pl-1 [Tanaka et al., 1998; Grigor’eva et al.,
2009]. Дифференцировка ТС-клеток мыши со-
провождается включением генов, характерных
для эктоплацентарного конуса и спонгиотрофо-
бласта (Tpbp/4311, Mash2) [Lescisin etal., 1988;
Carney etal., 1993; Cross etal., 1995; Iwatsuki
etal., 2000; Yan etal., 2001]. Экспрессия гена
Tpbp отсутствует в дифференцированных ТС-
клетках полевки, что говорит об особенностях
данных линий клеток. Vсн Mash2 важен для под-
держания слоя клеток спонгиотрофобласта, так
как в его отсутствие количество данных клеток
уменьшается и образуется больше гигантских
клеток. В то же время сверхэкспрессия гена
Mash2 предотвращает дифференцировку клеток в
направлении ТГ-клеток [Cross etal., 1995]. Этот
ген также способен кратковременно стимулиро-
вать пролиферацию ТС-клеток мыши даже в от-
сутствие экзогенного FGF4 [Hughes et al., 2004].
В ТС-клетках полевки обнаружены продукты
маркеров экстраэмбриональной энтодермы —
гены Hnf4, Гоха 2, Gata6 (см. рис. 11.6, г). Однако
в ТС-клетках мыши экспрессия маркера прими-
тивной энтодермы — гена Hnf4 (hepatocyte nuc-
lear factor 4) отсутствует (см. рис. 11.6, г) [Duncan
etal., 1994; Tanaka etal., 1998], что свидетельст-
вует о видоспецифичной экспрессии данного гена.
Сигнальный путь фактора роста фибро-
бластов. Генетические исследования, проведен-
ные на мышах, позволили идентифицировать
большинство транскрипционных факторов и ге-
нов, контролирующих пролиферацию ТС-кле-
ток. Основным для получения и поддержания в
недифференцированном состоянии ТС-клеток
мыши является сигнальный путь фактора роста
фибробластов (FGF4/FGFR2), в котором прини-
мают участие фактор FGF4, его рецептор —
FGFR2 [Arman et al., 1998] и транскрипционные
факторы CDX-2 и EOMES [Tanaka et al., 1998;
Rossant, Cross, 2001]. Данный путь играет цент-
ральную роль во взаимодействии клеток трофо-
бласта и ВКМ. Семейство FGF у позвоночных со-
стоит по крайней мере из 23 генов, однако все
внимание исследователей сфокусировано на роли
гена Fgf4 в стимуляции развития трофобласта.
Продукт гена Fgf4 детектируется на самой
ранней стадии развития, в одноклеточном эм-
брионе мыши. мРНК накапливается на протяже-
нии развития бластоцисты в клетках ВКМ и об-
наруживается на ранней постимплантационной
стадии в клетках эпибласта [Rappolee et al., 1994],
а также в 6- и 8.5-дневных эмбрионах, однако по-
липептид не был найден в ТЭ. Известно, что
FGF4 существенно не влияет на развитие ВКМ,
что подтверждается успешным получением ЭС-
клеток из бластоцист мышей с гомозиготной му-
тацией по гену Fgf4 [Wilder et al., 1997]. Однако in
vivo эмбрионы /'g/4 z -мышей погибают, что, ско-
рее всего, является следствием нарушения более
поздних стадий развития трофобласта, процессов
имплантации и плацентации.
Так как развитие трофобласта зависит от
FGF-сигналов, существует ответный механизм в
качестве FGF-рецепторов в данных клетках. Од-
ним из таких рецепторов является FGFR2.
В бластоцисте и на ранних постимплантацион-
ных стадиях развития ген Fgfr2 интенсивно экс-
прессируется в диплоидном трофобласте и далее
в клетках ЭкЭ, что говорит о его роли в качестве
специфичного рецептора ТС-клеток. Эти данные
подтверждаются экспериментом, в котором му-
тантные эмбрионы мышей с делецией генов
Fgfr2 и Fgf4 погибают до имплантации [Arman
et al., 1998], что может быть вызвано нарушени-
ем пролиферации клеток трофобласта [Rappolee
et al., 1994]. Анализируя эксперимент по реци-
прокной экспрессии доменов Fgf4 и Fgfr2, ис-
следователи предполагают, что трофобласт мо-
жет являться тканью-мишенью для FGF-сигна-
лов [Rossant, Cross, 2001].
При изучении раннего развития трофобласта
было высказано предположение, что существуют
гены, специфично экспрессирующиеся в тро-
фобласте, которые необходимы для его развития
298 ЭПИГЕНЕТИКА
и являются ключевыми мишенями FGF-сигнала
[Ibid]. Ранее было предположено, что развитие ТЭ
в раннем эмбрионе происходит при отсутствии во
внешних клетках экспрессии гена Oct4 [Pesce,
Scholer, 2001]. Однако дифференцировка ТЭ на-
чинается до выключения Oct4 во внешних клет-
ках бластоцисты, что предполагает существова-
ние позитивно действующего фактора, стимули-
рующего развитие ТЭ и являющегося мишенью
для FGF-сигнала, — транскрипционного фактора
гомеодомена Caudal-related homeobox 2 (Cdx-2).
Ген Cdx-2 наиболее активно транскрибирует-
ся во внешних полярных бластомерах морулы и
в ТЭ, но отсутствует в клетках ВКМ (см. рис. 11.4)
[Kunath etal., 2004; Rossant, 2007]. Существует
предположение, что прекращение экспрессии ге-
на Cdx-2 во внутренних клетках ранней морулы
может являться первым событием в процессе
разделения двух типов клеток: ВКМ и ТЭ. Пока-
зано, что избыточная экспрессия гена Cdx-2 в
ЭС-клетках приводит к подавлению транскрип-
ции гена Oct3 4 и дифференцировке их в ТЭ. хо-
тя и без образования гигантских клеток [Niwa
et al., 2005]. При культивировании таких клеток
в присутствии FGF4, гепарина и ЭФМ-КС про-
исходило образование эпителиальных колоний
ТС-клеток, а при инъекции в бластоцисты мы-
ши, подобно ТС-клеткам, они делали вклад ис-
ключительно в плаценту [Ibid],
В экспериментах на эмбрионах с гомозигот-
ной делецией по ген}’ Cdx-2 обнаружили, что
мутация гена приводит к их гибели до стадии
имплантации. Происходит формирование нор-
мальных ранних бластоцист, но затем возникает
нарушение детерминации ТЭ, бластоцель «схло-
пывается», эмбрионы не способны вылупиться
из прозрачной оболочки и, следовательно, не в
состоянии имплантироваться в матку [Strumpf
etal., 2005]. В Cdx-2 -эмбрионах отсутствует
экспрессия генов Handl и Р1-1, маркеров гигант-
ских клеток, что подтверждает нарушение диф-
ференцировки ТЭ. Также показано, что ген Cdx-2
вызывает подавление экспрессии генов Oct4 и
Nanog во внешних клетках бластоцисты [Ibid]. Та-
ким образом, ген Cdx-2 является самым ранним из
известных генов, который приводит к разделению
линий ВКМ и ТЭ, его экспрессия необходима для
всех аспектов раннего развития ТЭ как для про-
лиферации диплоидных клеток, так и для развития
полиплоидных гигантских клеток.
Транскрипционный фактор Т-бокса, ген Eomes,
является другим геном-мишенью для FGF-сиг-
нала, важным для развития эмбриона и пролифе-
рации ТЭ. Он экспрессируется в ТЭ бластоцист
и в ЭкЭ ранних постимплантационных бласто-
цист [Ciruna, Rossant, 1999; Russ et al., 2000] и
подобно гену Cdx-2 может влиять на образова-
ние ТЭ. Исследователями на ЭС-клетках показа-
но. что ген Eomes может быть мишенью для гена
Cdx-2 [Niwa etal., 2005]. При гомозиготной му-
тации эмбрионов по гену Eomes формируются
бластоцисты, в ВКМ которых экспрессируется
ген Oct4, а в поверхностных клетках — ТЭ-
специфичный ген Cdx-2. Бластоцисты имплан-
тируются в матку, но развитие эмбриона пре-
кращается, так как не происходит дальнейшей
дифференцировки трофобласта, что приводит
к гибели эмбриона. Это говорит о том, что ТЭ
все же формируется, хотя и не пролиферирует.
Таким образом, оба гена Cdx-2 и Eomes пред-
ставляют два основных кандидата на роль регу-
ляторов дифференцировки трофоэктодермы.
Другие сигнальные пути. Сигнальный путь
FGF4/FGFR2 является не единственным путем,
вовлеченным в пролиферацию и дифференци-
ровку’ стволовых клеток раннего трофобласта.
Орфановый ядерный рецептор ERR|3 играет
важную роль в развитии трофобласта, а также
ранней плацентации. Ген Errfi экспрессируется в
недифференцированных линиях ТС-клеток [Ta-
naka et al., 1998], в ранней ЭкЭ и эктодерме хо-
риона. В эмбрионах с делецией этого гена со-
храняется экспрессия генов Cdx-2 и Eomes
[Strumpf et al.. 2005]. Однако в Errfi -эмбрионах
полностью отсутствует слой диплоидного тро-
фобласта, происходит нарушение в развитии хо-
риона, возникает сверхпродукция ТГ-клеток, по-
крывающих мощным слоем зародыш, что приво-
дит к смерти эмбриона на 9 д.п.о. [Luo et al.,
1997; Rossant, Cross, 2001; Tremblay etal., 2001].
В отличие от генов Cdx-2 и Eomes. ген Errfi не яв-
ляется необходимым для начального периода
пролиферации трофобласта, но нужен для его со-
хранения. Таким образом, ген Errfi является уча-
стником альтернативного сигнального пути под-
держания пролиферации и недифференцирован-
ного состояния трофобласта и ТС-клеток. Высо-
кий уровень экспрессии гена Errfi в ТС-клетках
полевки поддерживает гипотезу’ о запуске в них
FGF4/FGFR2-HC3aBHCHMoro сигнального пути.
Существует ряд работ, в которых говорится,
что FGF4 является ключевым фактором для по-
лучения и неограниченной пролиферации ТС-кле-
ток [Arman et al., 1998; Tanaka et al., 1998; Ros-
sant, Cross, 2001; Oda et al., 2006]. Однако недав-
ние исследования пролили больше света на ме-
ханизмы, вовлеченные в регуляцию судьбы ЭкЭ
и ТС-клеток, а также помогли идентифицировать
глава 11 299
факторы, существенные для поддержания про-
лиферации ТС-клеток [Erlebacher et al., 2004;
Guzman-Ayala etal., 2004]. Показано, что члены
суперсемейства трансформирующего ростового
фактора бета (transforming growth factor. TGFp).
в том числе фактор NODAL, необходимы для
поддержания постоянной экспрессии гена Fgf4.
Кроме того, фактор NODAL способен действо-
вать непосредственно на клетки ЭкЭ без актива-
ции гена Fgf4, поддерживая экспрессию генов
Егф, Eomes, Cdx-2 и супрессируя экспрессию ге-
на Mash2, что предотвращает дифференцировку
ТС-клеток (рис. 11.7) [Guzman-Ayala et а!.. 2004].
Факторы, запускающие и поддерживающие
альтернативный сигнальный путь (TGFp, NODAL,
активин А), продуцируются эмбриональными
фибробластами, так как и у мыши [Tanaka et al.,
1998], и у полевки [Grigor’eva et al., 2009] при-
сутствие подложки фибробластов или их конди-
ционной среды является необходимым условием
для получения и пролиферации в недифферен-
цированном состоянии ТС-клеток.
Важная роль суперсемейства TGFp была под-
черкнута исследованиями, которые показывают,
что кондиционная среда может быть замеще-
на факторами суперсемейства TGFp [Erlebacher
et al., 2004] или активином А, подавляющим экс-
прессию маркеров дифференцированных ТС-
клеток [Natale etal., 2009]. Таким образом, чле-
ны суперсемейства TGFp способны активиро-
вать альтернативный сигнальный путь, непо-
средственно запуская экспрессию генов Errfy
Eomes и Cdx-2 без кооперации с FGF4/FGFR2
сигнальным путем.
11.5. Стволовые клетки
ЭКСТРАЭМБРИОНАЛЬНОЙ
(ВНЕЗАРОДЫШЕВОЙ) ЭНТОДЕРМЫ
11.5.1. Получение и морфология
XEN-клеток
Другим типом внезародышевых клеток явля-
ются XEN-клетки (eXtra-embryonic ENdoderm
cells). Стволовые клетки этого типа были полу-
чены в результате культивирования предым-
плантационных бластоцист мыши [Kunath et al..
2004] и обыкновенной полевки [Шевченко и др.,
2008]. Морфология XEN-клеток, образующих
колонии с минимальными контактами между
клетками, сильно отличается от многослойных
колоний ЭС-клеток с плотными межклеточными
контактами и однослойных колоний ТС-клеток.
В культуре XEN-клеток мыши присутствуют два
Рис. 11.7. Схема взаимодействия генов эпибласта
(EPI), экстраэмбриональной эктодермы (EXE) и экто-
плацентарного конуса (ЕРС) у мыши (по [Guzman-
Ayala et al., 2004]).
различающихся между собой типа клеток, кото-
рые могул динамично переходить из одного в дру-
гой [Kunath etal., 2005]. Клетки первого типа —
округлые, напоминающие «рассыпанный бисер»,
второго типа— звездчатые. Однако при получе-
нии XEN-клеток полевки кроме клеток, напоми-
нающих «рассыпанный бисер» (рис. 11.8, а), вы-
делена субпопуляция клеток, растущих распла-
станными колониями в виде плоских «поло-
тен» с тесными контактами между клетками
(рис. 1 1.8, б) [Шевченко и др., 2008]. При боль-
шой плотности культивирования XEN-клетки
могут образовывать монослой клеток со струк-
турами сетчатого типа. При культивировании
XEN-клеток мыши в отсутствие среды, конди-
ционированной эмбриональными фибробласта-
ми, за 6 дней многие клетки увеличиваются в
размере, образуют вакуоли и не переносят пас-
сирования, то есть дифференцируются [Kunath
etal., 2005]. Однако XEN-клетки полевки спо-
собны продолжительное время пассироваться
без изменения своих характеристик на желати-
низированной подложке без добавления конди-
ционной среды [Шевченко и др., 2008]. Более
того, известно, что XEN-клетки не являются
FGF- или LIF-зависимыми, в отличие от ЭС- и
ТС-клеток мыши (см. рис. 11.2) [Tanaka etal.,
1998; Oda et al., 2006; Шевченко и др., 2008].
В химерах, полученных при инъекции GFP
lacZ XEN-клеток мыши в бластоцисты, вклад
данных клеток наблюдался исключительно во
внезародышевой энтодерме, образующей внеза-
родышевые органы (см. рис. 11.2), и не обнару-
живался в эмбрионе, мезодерме желточного
мешка или трофобласте. Подавляющее боль-
шинство химер (98 %) имели вклад XEN-клеток
в париетальной энтодерме, и лишь в одной хи-
мере из 50 (2 %) наблюдалось участие XEN-кле-
300 ЭПИГЕНЕТИКА
©
Рис. 11.8. Характеристика стволовых клеток внезародышевой энтодермы (XEN-клеток)
(из [Григорьева и др., 2010]).
а — морфология субпопуляции клеток типа «рассыпанный бисер». Увеличение х60. Фазовый кон-
траст; б— морфология колонии XEN-клеток полевки с тесными контактами между клетками. Уве-
личение х60. Фазовый контраст; в — ОТ-ПЦР-анализ экспрессии генов, специфичных для эм-
бриональной и внезародышевой эктодермы и внезародышевой энтодермы в XEN-клетках мыши,
XEN-клетках полевки и эмбрионах полевки на 7.5 день после оплодотворения (контроль). (-) не-
гативный контроль реакции обратной транскрипции; г — иммуноцитохимическое выявление
транскрипционных факторов GATA4 (зеленый) и GATA6 (красный). Ядра окрашены DAPI (синий).
Увеличение хбО; д — иммуноцитохимическое окрашивание XEN-клеток на цитокератин 18. Уве-
личение хЮОО. е — иммуноцитохимическое окрашивание XEN-клеток на виментин. Увеличение
хЮОО.
ГЛАВА 11 301
клеток в образовании исключительно висце-
ральной энтодермы [Kunath et al., 2005].
11.5.2. Экспрессия генов, характерных
для внезародышевой энтодермы
Исследование культур XEN-клеток мыши и
полевки показало, что они не экспрессируют
маркеры эпибласта (гены Oct4, Nanog, Rex-1) и
трофобласта (гены Cdx-2, Fgfr2, Eomes), тогда
как экспрессируют гены, специфичные для ли-
ний внезародышевой (париетальной и висце-
ральной) энтодермы: Gata4, Gata6, Sox7, Sall4,
Hnf4, Foxa2, Afp (рис. 11.8, в, г) [Kunath etal.,
2005]. Видоспецифичным отличием XEN-клеток
полевки от мыши является экспрессия в следо-
вых количествах гена Enf>. Маркер висцераль-
ной энтодермы ген Afp обнаруживается в не-
большом количестве в недифференцированной
культуре XEN-клеток, но при дифференцировке
сигнал усиливается, тогда как экспрессия генов
Gata4 и Sox7, характерных для внезародышевой
энтодермы, наоборот, уменьшается, а уровни
транскрипции генов Hnf4 и Foxa2, маркеров
висцеральной энтодермы, остаются без измене-
ний [Ibid]. Рассмотрим ряд транскрипционных
факторов, являющихся существенными для раз-
вития и функционирования внезародышевой эн-
тодермы.
Цитокератин 18 является белком цитоскеле-
та и относится к классу промежуточных фила-
ментов. При анализе экспрессии гена цитокера-
тина 18 установлено, что этот белок не обнару-
жен ни в одной ткани зародыша, кроме внезаро-
дышевой энтодермы [Oshima, 1981]. Поскольку
экспрессия этого гена является специфичной для
внезародышевой энтодермы, то в системе in vitro
цитокератин 18 экспрессируется в XEN-клетках
мыши [Kunath et al.. 2005] и полевки (рис. 11.8. д)
[Шевченко и др., 2008] на высоком уровне.
Экспрессия другого промежуточного фила-
мента — виментина — в клетках внезародыше-
вой энтодермы была исследована на эмбрионах
Bos teturus |Maddox-Hyttcl etal., 2003]. В резуль-
тате установлено, что виментин экспрессируется
во внезародышевой энтодерме только в клетках,
которые позднее входят в состав дефинитивного
висцерального желточного мешка, т. е. принад-
лежащих висцеральной энтодерме. Таким обра-
зом, иммуноцитохимическим методом можно
выявлять XEN-клетки, относящиеся к висцераль-
ной энтодерме, то есть экспрессирующих вимен-
тин, что продемонстрировано на XEN-клетках
полевки (рис. 11.8, е).
Транскрипционный фактор HNF4 участву-
ет в регуляции гаструляции и является членом
суперсемейства стероидных гормонов [Duncan
et al., 1994]. У млекопитающих фактор HNF4 свя-
зывается с промоторами различных генов висце-
ральной энтодермы и печени. В развивающемся
эмбрионе мыши экспрессия этого транскрипци-
онного фактора впервые обнаруживается на 5,5
день эмбрионального развития, тогда как позже
мРНК Hnf4 можно обнаружить в печени и в эпи-
телии кишечника [Ibid],
Другой транскрипционный фактор FOXA2
(HNF3P) появляется в эмбрионе в висцеральной
энтодерме на 6-й день эмбрионального развития.
Позже этот транскрипционный фактор экс-
прессируется в хорде, прихордальной мезодерме
и в дефинитивной энтодерме кишки [Ang et al.,
1994]. HNF3P -эмбрионы погибают между 6,5 и
9-м днем эмбрионального развития, они отстают
в развитии и имеют серьезные дефекты, такие
как отсутствие хорды, что влечет за собой нару-
шение развития нервной трубки в дорзо-вент-
ральном направлении [Ibid]. Также HNF3P -
эмбрионы часто демонстрируют аберрантные
связи между желточным мешком и эмбрионом
[Farringhton etal., 1997; Manova etal., 1998].
В мутантах слой висцеральной энтодермы в
норме, но при этом отсутствует экспрессия Afp в
висцеральном желточном мешке [Farringhton
et al.. 1997], что свидетельствует о роли транс-
крипционного фактора FOXA2 (HNF3P) в разви-
тии энтодермы.
Транскрипционный фактор GATA6, при-
надлежащий к семейству транскрипционных
факторов типа цинковых пальцев, сначала появ-
ляется на стадии бластоцисты в части клеток
ВКМ и в ТЭ. Позже продукт гена обнаруживает-
ся в париетальной энтодерме и в мезодерме
[Koutsourakis etal.. 1999]. В двух работах было
обнаружено, что линии, морфологически очень
похожие на XEN-клетки, можно получить из ста-
бильных линий ЭС-клеток при помощи сверх-
экспресии транскрипционных факторов GATA4
или GATA6 [Fujikura et al., 2002] или в результа-
те получения мутантной линии ЭС-клеток с де-
лецией гена Nanog [Mitsui etal., 2003]. Такие
культуры, помимо морфологического сходства,
экспрессируют многие маркеры внезародышевой
энтодермы, из чего следует участие генов Gata4
и Gata6 в регулировании развития клеток пер-
вичной энтодермы. Более того, мутантные гете-
розиготные эмбрионы по генам Gata4 и Gata6
погибают на 13,5 день эмбрионального развития
в результате ряда сердечно-сосудистых дефек-
302 ЭПИГЕНЕТИКА
тов, а также из-за нарушений формирования и
функционирования примитивной энтодермы [Кио
et al., 1997; Xin et al., 2006]. Эти факты говорят о
необходимости транскрипционных факторов
GATA как для функционирования внезародыше-
вых тканей, так и для раннего эмбрионального
развития.
Таким образом, поскольку XEN-клетки явля-
ются производными клеток внезародышевой эн-
тодермы, их можно использовать в качестве мо-
дели in vitro для исследования раннего развития
внезародышевых линий клеток млекопитающих.
11.6. Эмбриональные герминальные клетки
Особое биологическое значение для передачи
генетической информации от одного поколения
к следующему имеют предшественники гамет —
первичные половые клетки или примордиаль-
ные герминальные клетки. При культивировании
этих клеток in vitro получают плюрипотентные
ЭГ-клетки. ППК мыши возникают в ранних эм-
брионах из проксимального района эпибласта,
который также участвует в образовании первых
кроветворных линий эмбрионального желточно-
го мешка [Lawson et al., 1999]. После они обна-
руживаются в основании аллантоиса в процессе
гаструляции на 7,5 день эмбрионального разви-
тия [Ginsburg et al., 1990].
Линии ЭГ-клеток получают при культивиро-
вании эмбрионов мыши на стадии развития до и
после миграции ППК в половые валики, т. е. на
8,0—8,5 и 11,5—12,5 д.п.о. соответственно [Mat-
sui etal., 1992; Resnick etal., 1992]. В это время
они идентифицируются по экспрессии эндоген-
ной щелочной фосфатазы [Ginsburg et al., 1990;
Hahnel et al., 1990], а также экспрессируют ген
плюрипотентности Oct4, выключение которого
приводит к апоптозу ППК [Kehler et al.. 2004].
Аналогично культивированию ЭС-клеток, в
среду’ для получения и пассирования ЭГ-клеток
добавляют FCS (fetal calf serum, эмбриональная
телячья сыворотка), которая способствует под-
держанию стволовых клеток в недифференциро-
ванном состоянии. Однако было показано, что
FCS может стимулировать не только пролифера-
цию. но и дифференцировку’ ЭГ-клеток в фиб-
робластоподобные клетки [Horii et al., 2003]. По-
этому’ исследователи заменили FCS на KSR
(knock out serum replacement, нокаутированная
замещенная сыворотка), в присутствии которой
ЭГ-клетки приобретают ЭС-подобную шаровид-
ную форму’ и экспрессируют щелочную фосфа-
тазу, что подтверждает их плюрипотентность.
Культивирование с ростовыми факторами, таки-
ми как bFGF, SCF (stem cell factor, фактор ство-
ловых клеток) и LIF, приводит к неограниченной
пролиферации ЭГ-клеток без изменения феноти-
па и кариотипа. Эти бессмертные линии клеток,
как и ЭС-клетки, способны формировать ЭТ, со-
стоящие из дифференцированных клеток всех
трех зародышевых листков, а также при инъек-
ции в бластоцисты дают функциональные гаме-
ты в образованных химерах [Steyvart et al., 1994].
Ранее было показано, что в формировании
герминальных клеток существенную роль игра-
ют BMP (bone morphogenic protein) 4 и BMP8b.
которые продуцируются клетками ЭкЭ [Layvson
et al., 1999]. В экспериментах in vitro было пока-
зано, что агрегированные ЭС-клетки мыши при
стимуляции ВМР4, а также при спонтанной диф-
ференцировке в ЭТ способны дифференциро-
ваться в клетки герминальной линии, эквива-
лентные ППК, и такие, образованные ЭС-клет-
ками, ППК имеют потенциал подвергаться мейо-
зу и продуцировать сперму [Toyooka et al.. 2003;
Geijsen et al., 2004] и ооциты [Hubner et al., 2003].
Из вышесказанного следует, что ЭГ-клетки не
только обладают свойствами, характерными для
эмбриональных линий плюрипотентных клеток
[McLaren, 2001], но и способны развиваться в
половые клетки, передающие генетическую ин-
формацию. Таким образом, ЭГ-клетки играют
уникальную роль в клеточной биологии и гене-
тике.
11.7. Региональные стволовые клетки
Соматические, зрелые или региональные
стволовые клетки (РСК) отличаются от стволо-
вых клеток, получаемых из эмбрионов на разных
стадиях развития, так как предшественники РСК
различного типа локализованы в специализиро-
ванных тканях и органах взрослого организма в
качестве пула запасных клеток, обеспечивающих
воспроизведение зрелых клеток в течение всей
жизни организма. Эти тканеспецифичные ство-
ловые клетки, по сравнению с ЭС-клетками, об-
ладают меньшим потенциалом к самовоспроиз-
ведению и, несмотря на то, что дифференциру-
ются в различные линии клеток, они не являются
плюрипотентными. РСК обнаружены в роговице
и сетчатке глаза, печени, эпидермисе кожи, нерв-
ной ткани головного и спинного мозга, перифе-
рической крови, пульпе зубов, костном мозге,
скелетных мышцах, кровеносных сосудах, эпи-
телии желудочно-кишечного тракта, поджелу-
дочной железе. Как правило, РСК дифференци-
ГЛАВА 11 303
руются в ответ на повреждение клеток того ор-
гана или ткани, в котором они локализованы.
Было доказано, что в некоторых областях го-
ловного и спинного мозга у взрослых млекопи-
тающих животных и человека происходит по-
стоянный нейрогенез, который обеспечивается
за счет пула нейральных стволовых клеток
(НСК) [Doetsch et al., 1999; Palmer et al., 2000;
Temple, 2001]. Этот факт привлек внимание уче-
ных и средств массовой информации, так как ра-
нее нейроны головного мозга служили класси-
ческим примером статичной клеточной популя-
ции, которая не восстанавливается. НСК пред-
ставляют собой неограниченно пролиферирую-
щие клетки, способные к самовоспроизведению
и генерации мультипотснтных потомков, кото-
рые впоследствии дают дифференцированные
нейральные клетки трех основных типов: астро-
циты и олигодендроциты, относящиеся к клет-
кам глии, и нейроны (рис. 11.9). НСК были най-
дены в двух основных нейрогенных районах
взрослого мозга: гипокампе и субвентрикуляр-
ной зоне, и в нескольких не нейрогенных рай-
онах, включая спинной мозг [McKay, 1997; Rao,
1999; Gage, 2000]. В этих исследованиях описан
клеточный механизм взрослого нейрогенеза, ко-
торый был хорошо изучен у птиц и стал обще-
принятым у млекопитающих. Таким образом,
центральная нервная система, являющаяся наи-
более трудноизлечимой из тканей, имеет регене-
ративный потенциал.
Кардиальные стволовые клетки. В прошлом
столетии считалось, что сердце — это терминаль-
но дифференцированный постмитотический ор-
ган, в котором количество кардиомиоцитов при
рождении остается постоянным на протяжении
всей жизни организма. Однако исследования по-
казали, что в сердце находятся кардиальные ство-
ловые клетки (КСК). которые дифференцируются
в различные кардиальные линии клеток, что, та-
ким образом, в корне меняет представление о
миокардиальной биологии [Leri et al., 2011].
Скептицизм по поводу’ существования КСК
сменялся критикой о том, что если даже c-kit-
положительные КСК и существуют [Massberg
etal., 2007; Zaruba etal., 2010; Loffredo etal.,
2011], то их влияние должно быть ничтожно ма-
лым. Из этого следует, что использование кле-
точной терапии у пациентов с хроническими за-
болеваниями сердца было бы преждевременным
и потенциально опасным до тех пор, пока не бы-
ли бы проделаны все исследования на мышах и
окончательно не доказана «подлинность» КСК.
Однако, ввиду разрушительных последствий хро-
Нейральная
стволовая
клетка
Рис. 11.9. Схематичное изображение дифференци-
ровки НСК.
нических заболеваний сердца и недостаточности
терапевтического лечения, большинство ученых
соглашаются, что данные исследований на мы-
шах не могут быть руководством в изучении че-
ловека и должны проводиться клинические ис-
пытания клеточной терапии на человеке [Abdel-
Latif et al., 2007; Kang et al., 2008].
Несколько лабораторий сошлись во мнении,
что в сердце находится депо примитивных кле-
ток с характеристиками стволовых клеток. Од-
нако идентификация подлинных КСК, эквива-
лентных гемопоэтическим стволовым клеткам
(ГСК) в костном мозге, является спорным во-
просом. Стволовые клетки встречаются сравни-
тельно редко. Так у человека одна ГСК прихо-
дится на 10000—100000 клеток костного мозга
[Orlic et al., 1993], а одна c-kit-положительная
КСК — приблизительно на 30000 клеток сердца
(миоцитов и немиоцитов). Эти величины посто-
янны для маленьких и больших животных, вклю-
чая человека [Beltrami et al., 2003; Linke et al.,
2005; Urbanek et al., 2006; Bearzi et al., 2007].
КСК находятся в нишах [Leri etal., 2011] и
покидают их в течение жизни для замены умер-
ших клеток миокарда (миоцитов) после его по-
вреждения, таким образом восстанавливая сер-
дечную мышцу'. Эти ниши контролируют фи-
зиологическое обновление кардиальных клеток,
рост, миграцию и функцию КСК [Urbanek et al.,
2006; Hosoda et al., 2009]. Ниши создают микро-
окружение, в пределах которого стволовые клет-
ки остаются в недифференцированном состоя-
304 ЭПИГЕНЕТИКА
нии. После активации стволовые клетки делятся
симметрично или асимметрично, генерируя но-
вые стволовые клетки и специализированные
клетки, участвующие в восстановлении органа.
Мезенхимальные стволовые клетки. Наи-
большие надежды на применение в трансплан-
тологии ученые и медики возлагают на мезен-
химальные стволовые клетки (МСК) [Валу’, Mur-
phy, 2001; Ankrum, Karp, 2010]. Эти клетки
частично похожи на ЭС-клетки, но имеют ряд
преимуществ: доступность материала, возмож-
ность наращивания биомассы клеток in vitro, при-
годность для трансплантации и отсутствие этиче-
ских проблем при их использовании. МСК пред-
ставляют собой мультипотентные клетки, спо-
собные к мезодермальной дифференцировке в
клетки соединительной ткани различных типов:
хондроциты (клетки хряща), остеобласты (клетки
кости) и адипоциты (тучные клетки) [Kadiyala
etal., 1997; Phinney etal., 1999; Zvaifler etal.,
2000; Campagnoli etal., 2001; Hung etal., 2002; Ji-
ang et al.. 2002: In’t Anker et al.. 2003: Csaki et al.,
2007]. Более того, МСК способны диффе-
ренцироваться в скелетную, гладкую и сердечную
мышечную ткань, кроветворную строму’, клетки
сухожилий, а также нейроны, олигодендроциты и
астроциты [Minguell et al., 2001].
Для получения МСК из костного мозга выде-
ляют суспензию клеток и культивируют в росто-
вой среде на культуральном пластике, где они
прикрепляются, пролиферируют и формируют
кластеры фибробластоподобных клеток [Kadi-
yala etal., 1997; Jiang etal., 2002; Smith etal.,
2004; Krampera etal., 2005]. В процессе культи-
вирования они становятся все более гомогенной
популяцией клеток, которая может пролифери-
ровать без дифференцировки на протяжении бо-
лее 40 делений [Jiang etal., 2002; Smith etal.,
2004: Krampera et al., 2005].
Источником МСК слу’жит не только костный
мозг, но и друтие взрослые ткани: волосяные
фоллику’лы и подкожные ткани головы [Shih
et al., 2005], околозубные связки [Trubiani et al.,
2005], а также внутриутробные ткани: плацента
[In’t Anker et al., 2004], пуповинная кровь [Erices
et al., 2000], и эмбриональные ткани: костный
мозг, кровь, легкие, печень, селезенка [In’t Anker
etal., 2003]. Циркулирующие МСК, аналогично
ГСК, можно обнару’жить в периферической кро-
ви [Roufosse etal., 2004]. Вероятно, хранилище
мезенхимальных клеток, вовлеченных в ткане-
вый гомеостаз, может поддерживаться цирку’ли-
ру’ющими МСК из костного мозга. Данный факт
был показан при помощи инъекции МСК внут-
ривенно, после чего они распространились во
всех тканях, но преимущественно пролифериро-
вали в регенериру’ющих тканях и опухолях, в
которых становились сосу’дисто-стромальными
фибробластами. Таким образом, МСК могут быть
использованы как переносчики специфических
противоопухолевых лекарственных препаратов
[Studeny et al., 2002].
В одной из работ было показано, что из кост-
ного мозга совместно с МСК можно выделить
мущьтипотентные взрослые клетки-предшествен-
ники, или MAPCs (multipotent adult progenitor
cells), способные, по крайней мере. 120 раз удво-
ить свою популяцию in vitro [Jiang etal., 2002].
При инъекции в раннюю бластоцисту’ MAPCs
принимают участие в образовании многих, если
не всех, соматических тканей, в которых диффе-
ренциру’ются в клетки тканеспецифических ти-
пов в ответ на специфичные сигналы этих орга-
нов. MAPCs экспрессируют, по крайней мере,
некоторые генетические маркеры ЭС-клеток та-
кие. как Oct4. Rex-1. SSEA-1. Полученные из мы-
ши MAPCs являются негативными по экспрес-
сии генов CD34, CD44, CD45, c-Kit и главному’
комплексу’ гистосовместимости (МНС) I и II
класса, однако экспрессируют на высоком уров-
не CD13 и SSEA-1 [Jiang et al., 2002]. MAPCs, как
и плюрипотентные ЭС-клетки, интенсивно про-
лифериру’ют, имеют большое ядерно-цитоплаз-
матическое соотношение и высокий уровень те-
ломеразной активности. Из вышесказанного сле-
ду’ет, что данный тип клеток обладает рядом
стволовых характеристик и, таким образом, яв-
ляется перспективным биоматериалом для ис-
пользования в регенеративной медицине.
Пластичность РСК: за и против. Много
исследований посвящено возможной трансдиф-
ференцировке РСК, т. е. способности узкоспе-
циализированных стволовых клеток одного типа
ткани дифференцироваться в клетки другого, не
свойственного им типа. Хотя результаты иссле-
дования такой «пластичности» РСК остаются
сомнительными, имеется ряд работ, в которых
летально облученным мышам инъецировали
клетки костного мозга и обнаруживали экспрес-
сию генетических маркеров доноров в негемопо-
этических тканях: кожа, эпителий, кишечный
эпителий, а также в паренхиме печени, эпителии
почек, поджелудочной железе, скелетных мыш-
цах, эндотелии, миокарде, нейронах центральной
нервной системы в кортексе и мозжечке [Lagasse
et al., 2000; Krause et al., 2001; Wang et al., 2003].
В обзоре о пластичности РСК предложены
механизмы, которые могут объяснить процессы
ГЛАВА 11 305
Рис. 11.10. Схематичное изображение потенциальных механизмов пластичности РСК (по [Wagers, Weissman,
2004]).
а — трансдифференцировка клеток; б — дедифференцировка тканеспецифических клеток с последующей редифференциров-
кой; в — использование гетерогенных популяций клеток с множественными стволовыми клетками; г — присутствие в РСК ред-
ких плюрипотентных стволовых клеток; д — слияние клеток донора и реципиента.
«превращения» одних клеток в друтие (рис. 11.10)
[Wagers, Weissman, 2004]. Предполагают, что
трансдифференцировка происходит непосредст-
венно при помощи активации дремлющих про-
грамм. меняющих специфичность клеточной ли-
нии (см. рис. 11.10, а). Превращение линии мо-
жет теоретически происходить и благодаря де-
дифференцировке тканеспецифических клеток
до более примитивных, мультипотентных клеток
с последующей редифференцировкой по пути
новой линии (см. рис. 11.10,6). Третье объясне-
ние пластичности — это использование в экспе-
риментах гетерогенных популяций клеток, со-
держащих разнообразные стволовые клетки или
клетки-предшественники (см. рис. 11.10, в). Воз-
можно также присутствие среди попу’ляции РСК
редких плюрипотентных стволовых клеток, на-
ходящихся в костном мозге и других тканях (см.
рис. 11.10, г), а также слияние клеток донора и
реципиента (см. рис. 11.10,6). Последнее пред-
положение нашло свое подтверждение в ниже-
описанном исследовании [Wang et al., 2003].
В работе Лагазе было показано, что при
трансплантации ГСК происходило восстановле-
ние печени у мышей с дефицитом гидролаз фу-
марилацетоацетата [Lagasse etal., 2000]. Эти дан-
ные указывают на способность ГСК образовы-
вать как клетки крови, так и гепатоциты, что го-
ворит об их пластичности. Лежащий в основе
этого феномена механизм остается неизвестен.
Однако другая группа исследователей провела
серию экспериментов по трансплантации ГСК и
обнаружила, что печень восстанавливалась не
вследствие дифференцировки ГСК, а благодаря
слиянию кровяных клеток донора и гепатоцитов
реципиента [Wang etal., 2003]. Саузерн-блот-
анализ показал, что вновь полученные клетки
гепатоцитов в печени были гетерозиготами по
аллелям, уникальным для клеток костного мозга
донора, в отличие от первоначальных клеток до-
нора. Более того, цитогенетический анализ ге-
патоцитов, полученных при трансплантации мы-
шиных клеток самки донора в самца реципиента,
показал следующие кариотипы: 80. XXXY (ди-
плоид-диплоидное слияние) и 120, XXXXYY (ди-
плоид-тетраплоидное слияние), что свидетельст-
вует о слиянии между’ клетками донора и реци-
пиента (см. рис. 11.10, 6).
Также осуществлен большой объем работ по
трансплантации ГСК в сердце, пораженное ин-
фарктом миокарда. Так, в работе Орлик была
обнаружена экстенсивная кардиальная регенера-
ция после непосредственной инъекции Lin c-kit -
клеток в область инфаркта [Orlic etal., 2001].
При попытке повторить эти результаты другая
исследовательская группа проделала многочис-
ленные тщательные эксперименты in vivo и in vi-
tro с использованием специфичных для кар-
диомиоцитов репортерных трансгенов и получи-
ла опровергающие данные [Murry et al., 2004].
Важно отметить, что ГСК постоянно цирку-
лируют в крови животных, они функциональны
и могут устойчиво внедряться в костный мозг в
определенных местах и участвовать в гемопоэзе
[Wright etal., 2001]. Циркулирующие или стран-
ствующие ГСК, вероятно, «загрязняют» многие
негемопоэтические ткани и могут мешать интер-
претации экспериментов, тестирующих гемопо-
этический потенциал этих тканей. Причины не-
воспроизводимых результатов в различных ла-
бораториях не вполне ясны. Возможно, исполь-
зуются разные модели повреждения, технологии
очистки клеток, стратегия исследования или
идентификация маркеров доноров.
Таким образом, в настоящее время недоста-
точно изучены процессы, происходящие в орга-
низме пациента при трансплантации стволовых
клеток, и все возможные последствия воздейст-
306 ЭПИГЕНЕТИКА
вия трансплантированных стволовых клеток на
человека, поэтому’ фундаментальные исследова-
ния в этой области должны подготовить проч-
ную базу знаний для прикладной медицины.
11.8. Альтернативные способы
получения стволовых КЛЕТОК
В наши дни проблемами получения и практи-
ческого применения стволовых клеток как чело-
века, так и многих видов животных занимаются
большое количество исследователей. Особенно
важное направление — практическое примене-
ние ЭС-клеток человека в нерепродуктивном
клонировании различных тканей и органов для
лечения дегенеративных, в том числе аутоим-
мунных, заболеваний. Вследствие этических
проблем и законодательных препятствий, свя-
занных с получением ЭС-клеток из бластоцист и
герминальных клеток эмбрионов человека, боль-
шое внимание уделяется альтернативным спосо-
бам получения плюрипотентных клеток челове-
ка, использование которых могло бы решить
проблему гистонесовместимости.
Одним из таких способов является репро-
граммирование соматических ядер в результате
переноса ядер дифференцированных клеток че-
ловека в энуклеированные ооциты млекопитаю-
щих. В результате этих манипуляций происхо-
дит развитие ооцитов до стадии предымпланта-
ционных бластоцист, из которых в дальнейшем
выделяют ЭС-клетки с кариотипом дифферен-
цированных клеток [Chen etal., 2003]. Однако
такие репрограммированные ЭС-клетки невоз-
можно использовать для регенеративной меди-
цины, поскольку’ они несут митохондриальную
ДНК и цитоплазматические факторы ооцита до-
нора, а не пациента. На этих клетках можно изу-
чать механизмы, происходящие при репрограм-
мировании дифференцированного ядра до плю-
рипотентного состояния, а также тестировать
фармпрепараты.
Еще одно направление — это изучение ство-
ловых клеток человека, полученных из амниоти-
ческой жидкости (amniotic fluid-derived stem
cells, AFS) [De Coppi et al., 2007]. Данные клетки
имеют ряд неоценимых преимуществ. Во-пер-
вых, не возникают этические препятствия, так
как данные клетки получают в результате ру-
тинной процедуры амниоцентеза, проводимой
в клинических лабораториях. Во-вторых, в отли-
чие от плюрипотентных ЭС-клеток, клетки из
амниотической жидкости не образуют опухоли
in vivo при инъекции мышам линии nude, что яв-
ляется благоприятным для терапевтического
применения. В-третьих, они неограниченно про-
лиферируют в отсутствие фидера без спонтан-
ной дифференцировки, сохраняя стабильный
диплоидный кариотип. В-четвертых, способны
давать начало мультипотентным функциональ-
ным линиям, включающим все три эмбриональ-
ные герминальные слоя, т. е. являются плюрипо-
тентными стволовыми клетками. Таким образом,
в будущем эти стволовые клетки могут стать
удобным источником как для аутологичной те-
рапии, так и для трансплантации гистосовме-
стимому’ донору.
И наконец, самым перспективным направле-
нием фундаментальных исследований является
создание ИПСК [Медведев и др., 2011]. ИПСК
появляются из терминально дифференцирован-
ных соматических клеток в результате репро-
граммирования соматических ядер, которое про-
исходит при трансдукции вирусных векторов,
несущих гены следующих транскрипционных
факторов: ОСТ4 (также известный как POU5F1),
SOX2, C-MYC, KLF-4, NANOG и LIN28, в раз-
личных комбинациях [Maherali et al., 2007; Taka-
hashi et al., 2007; Wemig et al., 2007; Yu et al.,
2007]. В связи с тем, что частота образования
колоний ИПСК очень низка (0,001—0,1 %), ис-
следователи предполагали, что репрограммиро-
ванию подвергаются случайно попавшие в пер-
вичную культуру МСК, а не соматические клет-
ки [Takahashi, Yamanaka. 2006]. Однако репро-
граммирование терминально дифференцирован-
ных клеток иммунной системы — В-лимфоцитов
неоспоримо доказывает факт репрограммирова-
ния именно дифференцированных соматических
клеток [Hanna et al., 2008].
Многочисленные исследования показывают,
что ИПСК и ЭС-клетки, полученные из эмбрио-
нов. имеют схожие свойства, такие как морфоло-
гия, уровень основных транскрипционных фак-
торов плюрипотентности, модификации хрома-
тина, а также являются плюрипотентными, т. е.
дифференцируются во все типы тканей взросло-
го организма [Maherali etal., 2007; Takahashi
etal., 2007; Wemig etal., 2007; Yu etal., 2007].
Однако ИПСК, полученные при трансдукции
векторов, в состав которых входит протоонкоген
с-Мус, проявляют способность к злокачествен-
ным новообразованиям у химер [Takahashi, Ya-
manaka, 2006]. Поэтому’ использование в терапии
человека таких ИПСК недопустимо [Takahashi
etal., 2007]. Решение проблемы нашла группа
исследователей, получившая ИПСК в отсутствие
с-Мус, в результате чего репрограммированные
ГЛАВА 11 307
клетки не демонстрировали злокачественного
роста [Yu etal., 2007]. Более того, позднее были
получены ИПСК с использованием не встраи-
вающихся в геном хозяина аденовирусных век-
торов [Okita et al.. 2008; Stadtfeld et al.. 2008],
эписомальных векторов [Cheng etal., 2012], раз-
личных химических соединений, увеличиваю-
щих эффективность репрограммирования и за-
мещающих некоторые транскрипционные факто-
ры [Lyssiotis et al., 2009], а также ИПСК с мень-
шим количеством трансдуцируемых генов [Kim
et al., 2009; Utikal et al., 2009; Tsai et al., 2011].
На сегодня имеется огромное количество ра-
бот, посвященных репрограммированию различ-
ных клеток взрослого организма. Например, бы-
ли получены ИПСК из фибробластов кожи и ке-
ратиноцитов [Maherali etal., 2008], клеток дер-
мальных сосочков волосяных фолликулов [Tsai
et al., 2011], клеток крови [Loh et al., 2009], сли-
зистой оболочки полости рта [Miyoshi et al.,
2010], клеток пульпы зубов и стволовых клеток
молочных зубов [Tamaoki etal., 2010]. Из этих
работ следует, что исследователи ищут менее
инвазивный способ взятия биоматериала у паци-
ента и вместе с этим подбираются клетки, наи-
более эффективно поддающиеся репрограмми-
рованию.
Однако на данный момент применение ИПСК
в медицине сталкивается с проблемами, связан-
ными с необходимостью получения и культиви-
рования этих клеток в присутствии клеток фиде-
ра (ЭФМ), являющихся чужеродными по отно-
шению к ИПСК. Учеными предпринимаются
попытки адаптации протокола получения ИПСК
в отсутствие чужеродных клеток с использова-
нием «коктейля», содержащего различные инги-
биторы такие, как PD0325901 — ингибитор МЕК,
CHIR99021 — ингибитор GSK3, А-83-01 — инги-
битор рецептора TGF-b/aKTHBnn/Nodal. НА-
100 — ингибитор ROCK и LIF человека [Yu
et al., 2011]. Этими же авторами для получения и
культивирования ИПСК человека в отсутствие
экзогенной ДНК успешно используется репро-
граммирование соматических клеток таких, как
фибробласты кожи, клетки жировой ткани и
клетки пуповинной крови, без фидера в коммер-
ческой ростовой среде для культивирования ЭС-
клеток человека mTeSRl с добавлением bFGF и
N2B27.
В настоящее время процедура репрограмми-
рования соматических клеток становится рутин-
ной, однако, мы только начинаем понимать, как
эти факторы индуцируют плюрипотентность.
Несмотря на огромное количество способов ин-
дуцирования плюрипотентности соматических
клеток, только небольшая доля клеток, экспрес-
сирующих факторы, приобретает плюрипотент-
ное состояние. Считается, что причиной неэф-
фективного репрограммирования являются эпи-
генетические препятствия, которые преодолева-
ются крайне редко [Hanna etal., 2009]. Различ-
ные внешние сигналы могут регулировать ре-
программирование и даже активность репро-
граммирующих факторов, демонстрируя тесную
связь внешних и внутренних путей в регуляции
репрограммирования [Han etal., 2011; Li etal.,
2010; Mali etal., 2010]. Несмотря на многие
трудности, колоссальное количество работ про-
водится для изучения механизмов, протекающих
при переходе от дифференцированного состоя-
ния к плюрипотентному’, увеличения эффектив-
ности репрограммирования, а также в целях по-
вышения безопасности использования ИПСК в
регенеративной медицине.
11.9. Прикладное значение
ИССЛЕДОВАНИЯ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК
Нельзя переоценить потенциальную пользу
для человечества использования стволовых кле-
ток в области трансплантологии и тканевой ин-
женерии. В результате нарушения функциони-
рования или гибели клеток одного или несколь-
ких типов возникают инфаркт миокарда, сахар-
ный диабет, болезнь Паркинсона, цирроз печени
и многие другие заболевания. Поэтому’ работы в
направлении получения большого количества
чистых популяций эуплоидных человеческих
клеток таких, как кардиомиоциты, гепатоциты,
нейроны, клетки крови, позволили бы значи-
тельно улучшить состояние пациентов с выше-
перечисленными заболеваниями и, возможно,
полностью излечить их. Получение узкоспециа-
лизированных клеток в результате направленной
дифференцировки ИПСК пациента или исполь-
зование пациент-специфичных РСК позволяют
полностью исключить такое осложнение после
трансплантации клеток в пораженный орган, как
иммунное отторжение. Кроме того, стволовые
клетки можно использовать не только для раз-
личного рода клинических испытаний, но и для
тестирования медицинских препаратов.
Поскольку- направленная дифференцировка
различных типов стволовых клеток по пути об-
разования клеток определенного типа представ-
ляет собой неограниченный источник клеток для
трансплантации тканей, проводятся работы по
получению и изучению функциональных осо-
308 ЭПИГЕНЕТИКА
бенностей различных органов и тканей, образо-
ванных стволовыми клетками. Так, например, из
плюрипотентных ЭС-клеток мыши была полу-
чена функциональная трехмерная кожа, которая
состоит как из эктодермы (кератинонитов), так
и из мезодермы (фибробластов). Полученная
in vitro модель органогенеза кожи важна для изу-
чения регуляции ранней эпидермальной диффе-
ренцировки и морфогенеза [Coraux etal., 2003].
В другой работе была описана дифференцировка
ЭС-клеток человека в эндотелиальные клетки,
способные образовывать структуры, похожие на
сосуды при культивировании на матригеле [Le-
venberg etal., 2002]. Полученные клетки отбира-
ли при помощи антител РЕСАМ 1 (platelet endo-
thelial cell-adhesion molecule-1). Они экспресси-
ровали маркеры эндотелиальных клеток, таких
как РЕСАМ 1/CD31, VE-cad (vascular endothelial-
cadherin) и CD34, а в экспериментах in vivo при
трансплантации в SCID мышей образовывали
микрососуды. Данные клетки могут являться ис-
точником человеческих эндотелиальных клеток,
которые можно использовать в тканевой инже-
нерии новых кровеносных сосудов для индукции
ангиогенеза при лечении региональной ишемии,
а также при трансплантации эндотелиальных
клеток в сердце для регенерации миокарда.
В исследованиях на ЭС-клетках была показа-
на их способность генерировать в культураль-
ных чашках герминальные клетки, которые впо-
следствии могут образовывать сперму’ и яйце-
клетки [Toyooka et al., 2003; Surani, 2004]. Хотя
современные методы дифференцировки ЭС-кле-
ток в герминальные зависят от спонтанных и
стохастических событий, возможно, в будущем
ученым удастся контролировать данные процес-
сы. Такие «синтетические» яйцеклетки и сперму’
можно будет применять при размножении жи-
вотных. Более того, получение искусственных
герминальных клеток человека позволит изучать
причины бесплодия и раковых перерождений
ППК, а также лечить мужское бесплодие. Дан-
ные клетки можно будет использовать для изу-
чения роли ключевых генов в механизме им-
принтинга и в процессе мейоза.
Уже известно, что некоторые тяжелые забо-
левания человека связаны с генетическими де-
фектами. Например, нарушенная активация сиг-
нала Wnt, который поддерживает ЭС-клетки в
недифференцированном состоянии, может при-
водить к образованию злокачественных раковых
опухолей, т. е. к появлению в организме больно-
го неограниченно пролиферирующих клеток [Sa-
to etal., 2004]. Поэтому’ фундаментальные ис-
следования in vitro на ЭС-клетках процессов,
происходящих при изменении активации кано-
нического пути Wnt, будут способствовать кли-
ническим исследованиям данного заболевания.
Прикладное значение имеют не только ЭС-
клетки, а также другие типы стволовых клеток.
В последнее десятилетие огромное количество
исследований посвящено изучению свойств и
способов применения КСК и МСК в регенера-
тивной медицине. О том, насколько необходимы
исследования КСК, говорят статистические дан-
ные: смертность от сердечно-сосудистых заболе-
ваний в России стоит на первом месте среди
других заболеваний. Человеческие КСК пред-
ставляют собой идеальный инструмент для вос-
становления сердца у пациентов с хроническими
заболеваниями сердца. Эти клетки могут быть
изолированы при помощи эндомиокардиальной
биопсии [D’Amario etal., 2011] или хирургиче-
ского вмешательства [Bearzi et al., 2007] и после
наращивания in vitro возвращены пациентам.
При этом методе лечения отсутствуют неминуе-
мые неблагоприятные эффекты отторжения и
другие осложнения, вызванные неаутологичны-
ми трансплантациями. С другой стороны, росто-
вые факторы могут вызвать стимуляцию нахо-
дящихся в сердце КСК и запускать регенерацию
сердечной мышцы. Эти методики могут быть
применены для уменьшения миокардиальных
рубцов и восстановления работающей сердечной
мышцы.
Одним из направлений применения МСК,
выделенных из костного мозга, является обра-
ботка этими клетками внеклеточных матриц та-
ких, как, например, гидроксиапатит, и имплан-
тация в пораженную конечность для восстанов-
ления костей. После таких манипуляций in vivo у
мышей NOD/SCID наблюдается формирование
кости [Krebsbach etal., 1997]. Другое направле-
ние — изучение восстановления суставных хря-
щей после инъекции суспензии хондроцитов.
Предпосылками к этим исследованиям являются
работы по дифференцировке мезенхимальных
предшественников в хрящ [Schultz et al., 2000;
Jorgensen etal., 2001]. Так, например, МСК, вы-
деленные из костного мозга козы, были аллоген-
но инъецированы в комбинации с гиалуроновой
кислотой в колени козам после удаления сустав-
ного мениска и резекции передней связки [Murp-
hy etal., 2000]. У большинства коз наблюдалась
регенерация мениска. Более того, имеется рабо-
та, в которой показано увеличение размера ме-
ниска у 36-летнего пациента [Centeno et al.,
2008]. Потенциальное клиническое использова-
ГЛАВА 11 309
ние имеет получение пациент-специфичных
МСК и их дифференцировка в направлении об-
разования сухожилий и связок [Tuan et al., 2003].
Изначально МСК рассматривали как инстру-
мент для устранения дефектов соединительной
ткани, костей, сухожилий, однако доклиниче-
ские исследования обнаружили иммуномодули-
рующее свойство, которое позволит использо-
вать МСК для лечения воспалительных процес-
сов. Вероятно, что иммуномодулирующий эф-
фект МСК может зависеть, по крайней мере у
человека, от растворимых факторов: трансфор-
мирующий ростовой фактор (transforming growth
factor, TGF)-[51, фактор роста гепатоцитов (hepa-
tocyte growth factor, HGF) [Di Nicola et al., 2002;
Sotiropoulou etal., 2006], простагландины (pros-
taglandin, PG) [Sotiropoulou et al., 2006] и интер-
ферон-гамма (interferon-gamma, IFN-y) [Krampera
etal., 2006]. Таким образом, МСК представляют
собой стволовые клетки с очень широким спек-
тром возможных применений для регенератив-
ной медицины и тканевой инженерии.
Огромный прорыв в изучении стволовых кле-
ток и возможность их использования в клеточ-
ной терапии связаны с получением пациент-спе-
цифичных ИПСК [Медведев и др., 2011]. Пре-
имущество использования ИПСК заключается в
том, что эти плюрипотентные клетки можно по-
лучать в любой период жизни человека из сома-
тических клеток различного происхождения (ке-
ратиноциты, фибробласты кожи, клетки жиро-
вой ткани, клетки периферической крови, воло-
сяные фолликулы, слизистые оболочки полости
рта, клетки пульпы зубов и друтие). Далее
ИПСК можно подвергать направленной диффе-
ренцировке и использовать как для транспланта-
ций, так и для изучения воздействия различных
фармпрепаратов на клетки.
Несмотря на недостаточность знаний о меха-
низмах, протекающих в стволовых клетках при
трансплантации, клеточная терапия находит свое
применение в уникальной на сегодня клиниче-
ской практике при лечении аутоиммунных забо-
леваний (рассеянный склероз, ревматоидный арт-
рит), цирроза печени, постинфарктных рубцов
сердца и других патологий. Наблюдаются как
положительная динамика в лечении заболева-
ний, так и неудачные попытки. Надо отметить,
что одно из предположений о причинах восста-
новления клеток пораженных органов при транс-
плантации стволовых клеток заключается в сти-
мулировании донорными клетками небольшого
пула РСК больного органа, что приводит к ин-
тенсивной их пролиферации и дифференцировке
в клетки типа того органа, в котором находятся.
Так или иначе, самое важное в этих эксперимен-
тах заключается в том, что у людей появляется
надежда на выздоровление или хотя бы улучше-
ние качества жизни. Надо надеяться, что успеш-
ное взаимодействие фундаментальной и при-
кладной медицины поможет в эффективном ле-
чении многих болезней человечества и эти экс-
клюзивные разработки приобретут массовый,
общедоступный характер.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Григорьева Е. В., Шевченко А. II, Железова А. II., Ши-
лов .4. Г., Мазурок Н. .4., Дыбан П. .4., Дыбан .4. П., За-
киян С. М. Стволовые клетки, участвующие в образо-
вании внезародышевых тканей И Клеточные техноло-
гии в биологии и медицине. 2010. № 4. С. 183—194.
Дыбан А. П. Раннее развитие млекопитающих. Л.: Наука,
1988. 228 с.
Дыбан .4. П., Дыбан П. .4. Стволовые клетки в эксперимен-
тальной и клинической медицине 11 Медицинский ака-
демический журнал. 2002. Т. 2, № 3. С. 3—24.
Зыбина Е. В. Цитология трофобласта. Л.: Наука, 1986. 192 с.
Медведев С. П., Шевченко А. II, Сухих Г. Т., Закиян С. М.
Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки /
Отв. ред. В. В. Власов. Новосибирск: Изд-во СО РАН,
2011.216 с.
Шевченко А. II, Демина В. В., Мазурок Н. .4., Железова А. II,
Ефремов Я. Р.. Шилов А. Г.. Шевела А. II. Еелеванце-
ва .4. В., Власов В. В., Закиян С. М. Линии стволовых
клеток экстраэмбриональной эндодермы обыкновен-
ных полевок рода Microtus И Генетика. 2008. Т. 44,
№ 11. С. 1477—1485.
Abdel-Latif A., BolliR., Tleyjehl.M, Montori Г. AI, Pe-
rin Е. С., HomungC.A., Zuba-Surma Е. К., АГМаГ
lahAI., Dawn В. Adult bone marrowderived cells for car-
diac repair: a systematic review and meta-analysis // Arch.
Intern. Med. 2007. Vol. 167. P. 989—997.
Adamson S. L., LuY., W hiteley K. J., HolmyardD., Hember-
ger AI, PfarrerC, Cross J. C. Interactions between tro-
phoblast cells and the maternal and fetal circulation in the
mouse placenta // Dev. Biol. 2002. Vol. 250. P. 358—373.
AllenB. L., FillaAI. S., RapraegerA. C. Role of heparin sulfate as
a tissue-specific regulator of FGF-4 and FGF receptor recog-
nition // J. Cell Biol. 2001. Vol. 155, N 5. P. 845—858.
D’AmarioD., Fiorini C, CampbellP.AL, GoichbergP., Sa-
nadaE, ZhengH, HosodaT., RotaM.. Connell J. AI, Gal-
legos R P., Helt EG., GivertzAI. AI, Alitchell R. N., Le-
ri A., KajsturaJ., Pfeffer AI. A., Anversa P. Functionally
competent cardiac stem cells can be isolated from endo-
myocardial biopsies of patients with advanced cardio-
myopathies // Circ. Res. 2011. Vol. 108. P. 857—861.
AmitAL, Carpenter AI K., InokumaAI. S., Chiu С. P., Har-
risC.P.. WaknitzAI. A.. Itskovitz-Eldor J.. HiomsonJ. A.
Clonally derived human embryonic stem cell lines maintain
pluripotency and proliferative potential for prolonged peri-
ods of culture // Dev. Biol. 2000. Vol. 227. P. 271—278.
Andrews P. ТГ, Oosterhuis J., Damjanov I. Cell lines from human
germ cell tumours U Robertson E.J. (edr). Teratocarcinomas
and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach. Oxford,
UK: IRL Press. 1987. P. 207—248.
AngS.L, Conlon R. A., JinO., Rossant J. Positive and negative
signals from mesoderm regulate the expression of mouse
Otx2 in ectoderm explants // Development. 1994. Vol. 120.
P. 2979—2989.
310 ЭПИГЕНЕТИКА
In’l Anker P. S., Noort IE Scherjon S. .1.. Kleijburg-van der
KeurC, Knnsselbrink A. B., van Bezooijen R L., Beek-
InuzenH’., H’illemzeR., KanhaiH.H, FibbeH’.E. Mes-
enchymal stem cells in human second-trimester bone mar-
row, liver, lung and spleen exhibit a similar immunophe-
notype but a heterogeneous multilineage differentiation po-
tential " Haematologica. 2003. Vol. 88, N 8. P. 845 852.
Ln't Anker P. S., ScherjonS. .1.. Kleijburg-van derKeur C, de Groot-
Swings G. AL, ClaasF. H, Fibbe IT. E., KanhaiH. H. Isola-
tion of mesenchymal stem cells of fetal and maternal ori-
gin from human placenta '/ Stem Cells. 2004. Vol. 22.
P. 1338—1345.
AnkrumJ., Karp J. Al. Mesenchymal stem cell therapy: two
steps forward, one step back // Trends Mol. Med. Vol. 16,
N 5. P. 203—209.
Arman E., Hajjhef-Krausz R, ChenY., Heath J. K, LonaiP.
Targeted disruption of fibroblast growth factor (FGF) re-
ceptor 2 suggests a role for FGF signaling in pregastrula-
tion mammalian development // Proc. Natl. Acad. Sei.
USA. 1998. Vol. 95. P. 5082—5087.
Avilion A. A., NicolisS.K, PevnyL.H, Perez L., 1’ivian N.,
Lovell-Badge R. Multipotent cell lineages in early mouse
development depend on SOX2 function // Genes Dev.
2003. Vol. 17. P. 126—140.
Baribault H., Render R. Embryonic stem cell culture and gene
targeting in transgenic mice // Mol. Biol. Med. 1989.
Vol. 6. P. 481 492.
Barry’F. P., AlurphyJ. Al. Mesenchymal stem cells: clinical ap-
plications and biological characterization // Int. J. Bio-
chem. Cell Biol. 2004. Vol. 36. P. 568—584.
BearziC., Rota AL, HosodaT., Tillmanns J, Nascimbene A.,
DeAngelis A., Yasuzawa-Amano S., Trofimova L, Sig-
gins R. IE, Lecapitaine N, Cascapera S., Beltrami A. P.,
D’AlessandroD. A., ZiasE., QuainiF, UrbanekK, ALich-
lerRE., BolliR., KajsturaJ., LeriA., AnversaP. Human
cardiac stem cells // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2007.
Vol. 104. P. 14068—14073.
Beltrami A. P., Barlucchi L., Torella D., Baker AL, Limana F,
Chimenti S., Kasahara H., Rota AL, AlussoE., Urba-
nek К, LeriA., Kajstura J., Nadal-GinardB., Anversa P.
Adult cardiac stem cells are multipotent and support myo-
cardial regeneration 11 Cell. 2003. Vol. 114. P. 763—776.
BoianiAL, Eckardt S., Scholer H. R, ALcLaughlin J. Oct4 dis-
tribution and level in mouse clones: consequences for
pluripotency // Genes Dev. 2002. Vol. 16. P. 1209—1219.
Brons L. G. AL, Smithers L. E., Trotter AL. II. B., Rugg-Gunn P.,
Su B., Chuva de Sousa Lopes S. AL, Howlett S. K, Clark-
son A., Ahrlund-Richter L., Pedersen R A., Vallier L.
Derivation of pluripotent epiblast stem cells from mam-
malian embryos // Nature. 2007. Vol. 448. P. 191 195.
BrookF. A., Gardner R. L. The origin and efficient gerivation
of embryonic stem cells in the mouse // Proc. Natl. Acad.
Sei. USA. 1997. Vol. 94. P. 5709—5712.
BuehrAL, Nichols J., Stenhouse F, ALountfordP., Green-
halghC.J, Kantachuvesiri S., Brooker G., A Lullins J.,
Smith A. G. Rapid loss of Oct-4 and pluripotency in cul-
tured rodent blastocysts and derivative cell lines // Biol.
Reprod. 2003. Vol. 68. P. 222—229.
Campagnoli C, Roberts A. G., Kumar S., Bennett P. R, Bellantuo-
noL.. FiskN.AL. Identification of mesenchymal stem / pro-
genitor cells in human first-trimester fetal blood, liver, and
bone marrow // Blood. 2001. Vol. 98, N 8. P. 2396—2302.
Carney E. IE, Prideaux Г, Lye S. J., Rossant J. Progressive ex-
pression of trophoblast-specific genes during formation of
mouse trophoblast giant cells in vitro H Mol. Reprod. Dev.
1993. Vol. 34. P. 357—368.
Centeno C. J., Busse D., KisidayJ, KeohanC, Freeman AL,
Karli D. Regeneration of meniscus cartilage in a knee
treated with percutaneously implanted autologous mesen-
chymal stem cells// Med. Hypotheses. 2008. Vol. 71.
P. 900 908.
Chambers!., Colby D., Robertson AL, NicholsJ., LeeS.,
TweedieS., Smith A. Functional expression cloning of
Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem
cells 11 Cell. 2003. Vol. 113. P. 643—655.
ChenY., HeZ.X., Liu A., H’atigK, ALao IE IE, ChuJ.X., LuY.,
FangZ.F, Shi Y. T, YangQ.Z., ChenD. Y.. TTangAL K.
LiJ.S., HuangS. L., KongX.Y., ShiY.Z., II’angZ.Q.,
XiaJ.H., LongZ.G., XueZ.G., DingTT.X, ShengHZ.
Embryonic stem cells generated by nuclear transfer of
human somatic nuclei into rabbit oocytes // Cell Res.
2003. Vol. 13, N 4. P. 251—263.
ChengL., Hansen N. F, Zhao L., DuY., ZouC, Donovan F. X.,
ChouB.-K, Zhou G., LiS., DoweyS. N., Ye Z., NLSC Com-
parative Sequencing Program, Chandrasekharappa S. C,
YangH, ALullikinJ. C. LiuP. P. Low incidence of DNA
sequence variation in human induced pluripotent stem
cells generated by nonintegrating plasmid expression //
Cell Stem Cell. 2012. Vol. 10. P. 337—344.
Chuykin L, LapidusL, Popova E., Eilianovich L., ALosienko Г.,
Alenina N., BinasB., ChaiG., Bader AL, Krivokharchen-
koA. Characterization of trophoblast and extraembryonic
endoderm cell lineages derived from rat preimplantation
embryos // PLoS One. 2010. Vol. 5,N 3. P. e9794.
CibelliJ.B.. SticeS.L.. GoluekeP.J. Kane J. J., Jerry J..
Blackwell C, Ponce de Leon F. A., Robl J. Al. Transgenic
bovine chimeric offspring produced from somatic cell-de-
rived stem-like cells // Nat. Biotechnol. 1998. Vol. 16.
P. 642—646.
Ciruna B. G., Rossant J. Expression of the T-box gene Eome-
sodermin during early mouse development // Meeh. Dev.
1999. Vol. 81. P. 199—203.
Coraux C, HilmiC., Rouleau AL, Spadafora A., HitmraskyJ.,
OrtonneJ., DaniC, Aberdam D. Reconstituted skin from
murine embryonic stem cells // Curr. Biol. 2003. Vol. 13.
P. 849—853.’
Cross J. C., Flannery AL L., BlanarALA., Steingrimsson E.,
Jenkins N. .1., CopelandN. G., Rutter IE J., H erb Z. Hxt
encodes a basic helix-loop-helix transcription factor that
regulates trophoblast cell development " Development.
1995. Vol. 121. P. 2513—2523.
CsakiC, AlatisU., Alobasheri A., Ye H, ShakibaeiAL Chon-
drogenesis, osteogenesis and adipogenesis of canine mes-
enchymal stem cells: a biochemical, morphological and ul-
trastructural study 11 Histochem. Cell Biol. 2007. Vol. 128,
N 6. P. 507—520.
Damjanov I. Teratocarcinoma stem cells " Cancer Surv. 1990.
Vol. 9. P. 303—319.
Damjanov 1., Damjanov A., SolterD. Production of teratocarci-
nomas from embriyos transplanted to extra-uterine sites 7
Robertson E.J. (edr). Teratocarcinomas and Embryonic
Stem Cells: A Practical Approach. Oxford. UK: IRL
Press. 1987. P. 1—18.
De CoppiP., Bartsch G. Jr., SiddiquiAL AL, Xu T, Santos С. C,
Perin L., ALostoslavsky G., SerreA.C., Snyder E.Y.,
YooJ.J., FurthAL. E., SokerS., AtalaA. Isolation of am-
nionic stem cell lines with potential for therapv // Nat.
Biotechnol. 2007. Vol. 25, N 1. P. 100 106.
Di Nicola AL. Carlo-Stella C., ALagttiAL. AlilanesiAL, Lon-
goni P. D., Alatteucci P., Grisanti S., Gianni A. Al. Human
bone marrow stromal cells suppress T-lymphocyte prolif-
eration induced by cellular or nonspecific mitogenic stim-
uli // Blood. 2002’ Vol. 99. P. 3838—3843.
DelhaiseF, BralionE., Schuurbiers N., DessyF. Establisment
of an embryonic stem cell line from 8—cell stage mouse
embryos // Eur. J. Morphol. 1996. Vol. 34. P. 237—243.
Doetsch F, CaileL, Lint D. A., Garcia-KerdugoJ. AL, Alvarez-
BuyllaA. Subventricular zone astrocytes are neural stem
ГЛАВА 11 311
cells in the adult mammalian brainCell. 1999. Vol. 97.
P. 703—716.
Duncan S. ALanova K, Chen II’. S., Hoodless P., JTeins-
teinD.C., Bachvarova R. F, DanellJ.E. Expression of
transcription factor HNE-4 in the extraenibryoiiic endo-
derm, gut, and nephrogenic tissue of the developing mouse
embryo: HNE-4 is a marker for primary endoderm in the
implanting blastocyst " Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994.
Vol. 91. P. 7598—7602.
Erices A., CongetP., MinguelJ.J. Mesenchymal progenitor
cells in human umbilical cord blood // Br. J. Haematol.
2000. Vol. 109. P. 235—242.
Erlebacher A., Price K. A., Glimcher L. H. Maintenance of
mouse trophoblast stem cell proliferation by TGF-be-
ta/activin // Dev. Biol. 2004. Vol. 275. P. 158—169.
Evans AL J., Kaufman AL. H. Establishment in culture of pluri-
potential cells from mouse embryos// Nature. 1981.
Vol. 292. P. 154—156.
Farringhton S. AL, BelaousoffAL, BaronM. H. Winged-Helix,
Hedgehog, and BMP genes are differentially expressed in
distinct cell layers of the murine yolk sac // Meeh. Dev.
1997. Vol. 62. P. 197—211.
Fujikura J., YamatoE., Yonemura S., Hosoda K., Mosul S., Na-
kao K. Differentiation of embryonic stem cells is induced
bv GATA factors // Genes Dev. 2002. Vol. 16. P. 784—
789.
Gage F. H. Mammalian neural stem cells // Science. 2000.
Vol. 287. P. 1433—1438.
Gardner RE., Papaioannou I . E., BartonS. C. Origin of the
ectopiacental cone and secondary' giant cells in mouse
blastocysts reconstituted from isolated trophoblast and in-
ner cell mass // J. Embrvol. Exp. Morphol. 1973. Vol. 30.
P. 561—572.
GearingD. P., ThutC.J, I'andenbos T, GimpelS. D., Delan-
ey P. B., King J., Price]’.. Cosmati D.. Beckmann AL. P.
Leukemia inhibitory' factor receptor is structurally related
to the IL-6 signal transducer. gpl30 11 EMBO J. 1991.
Vol. 10. P. 2839—2848.
GeijsenN., HoroschakAL, Kim K, GribnauJ., EgganK, Da-
ley G. Q. Derivation of embryonic germ cells and male
gametes from embryonic stem cells" Nature. 2004.
Vol. 427. P. 148—154.
GinisL., LuoY., ALiuraT., ThiesS., Brandenberger R, Gerecht-
Nir S., AmitAL, Hoke A.. Carpenter AL. K, Ltskovitz-Eldor J..
Rao AL. S. Differences between human and mouse embryonic
stem cells I, Dev. Biol. 2004. Vol. 269. P. 360—380.
GinsburgAL., Snow AL. H. L., ALcLaren A. Primordial germ cells
in the mouse embryo during gastrulation '/ Development.
1990. Vol. 110.P. 521—528.
Graves К. H, ALoreadith R. JJ’. Derivation and characterization
of putative pluripotential embryonic stem cells from pre-
implantation rabbit embryos // Mol. Reprod. Dev. 1993.
Vol. 36. P. 424 433.
Grigor’evaE.I'., Shevchenko A. L., ALazurokN. A., Elisaphen-
koE.A., Zhelezova A. L., Shilov A. G., DybanP.A., Dy-
banA.P., NoniashviliE. AL, Slobodyanyuk S. Ya., Neste-
rova T.B., BrockdorffN, ZakianS.AL. FGF4 independent
derivation of trophoblast stem cells from the common
vole // PLoS One. 2009. Vol. 4,N 9. P. e7161.
Grummet- R. Donner A.. JJ’interhager E. Characteristic growth
of human choriocarcinoma xenografts in nude mice // Pla-
centa. 1999. Vol. 20. P. 547—553.
Guzman-Ayala AL, Ben-Haim N., BeckS., Constant D. B. Nodal
protein processing and fibroblast growth factor 4 syner-
gize to maintain a trophoblast stem cell microenviron-
ment " Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. Vol. 101.
P. 15656—15660.
HahnelA., RappoleeD., ALillanJ., ALanesT., ZiomekC.A.,
Theodosiou N. G., JJ'erb Z., Pedersen R .1., Schultz G. .1.
Two alkaline phosphatase genes are expressed during
early development in the mouse embryo // Development.
1990. Vol. 110. P. 555—564.
Hani). II., GreberB., JJ’u G., Tapia N., Arauzo-BravoAL. J.,
KoK, BernemannC, StehlingAL, Scholer H. R Direct
reprogramming of fibroblasts into epiblast stem cells /7
Nat. Cell Biol. 2011. Vol. 13. P. 66 71.
HatmaJ.. ALarkoulaki S., Schorderet P.. Carey B. JI’.. BeardC.
WentigAL, CreyghtonAL. P., Steine E. J., Cassady J. P.,
ForemanR, Lengner C. J., DausmanJ.A., JaenischR
Direct reprogramming of terminally differentiated mature
В lymphocytes to pluripotency // Cell. 2008. Vol. 133.
P. 250—264.
HatmaJ., Saha K, PandoB., vanZonJ., Lengner C. J., Crey-
ghtonAL. P., van Oudenaarden A., JaenischR Direct cell
reprogramming is a stochastic process amenable to accel-
eration i Nature. 2009. Vol. 462. P. 595—601.
Hanna J., Cheng A. JJ'., Saha К, Kim J., Lengner C. J., Sold-
nerF, Cassady J. P., ALuffatJ., Carey В. JJ'., JaenischR
Human embryonic stem cells with biological and epige-
netic characteristics similar to those of mouse ESCs //
Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2010. Vol. 107, N 20.
P. 9222—9227.
Hart A. H, Hartley L., Ibrahim AL., Robb L. Identification, clon-
ing and expression analysis of the pluripotency promoting
Nanog genes in mouse and human // Dev. Dyu. 2004.
Vol. 230, NLP. 187—198.
HayD. C, Sutherland L., Clark J., Burden T. Oct-4 knockdown
induces similar patterns of endoderm and trophoblast dif-
ferentiation markers in human and mouse embryonic stem
cells 11 Stem Cells. 2004. Vol. 22. P. 225—235.’
Hemberger AL., Hughes AL., Cross J. C. Trophoblast stem cells
differentiate in vitro into invasive trophoblast giant cells //
Dev. Biol. 2004. Vol. 271. P. 362—371.
HibiAL, ALurakamiAL, Saito AL. HiranoT.. TagaT., Kishimo-
to T. Molecular cloning and expression of an IL-6 signal
transducer, gp!30. ' Cell. 1990. Vol. 63. P. 1149—1157.
HimenoE., TanakaS., Kunath T. Isolation and manipulation of
mouse trophoblast stem cells // Curr. Protoc. Stem Cell
Biol. 2008. Chapter 1. Unit 1E.4.
Horii T, Nagao E, Tokunaga T, LmaiH. Serum-free culture of
murine primordial germ cells and embryonic germ cells //
Theriogenology. 2003. Vol. 59. P. 1257—1264.
HosodaT., D’AmarioD., Cabral-Da-SilvaAL. C. ZhengH,
Padin-IruegasAL.E., OgorekB., Ferreira-ALartins J., Ya-
suzawa-Amano S., Amano K, Lde-LwataN., Cheng JJ’.,
Rota AL, I’rbanek K, Kajstura J., Anversa P., Leri A. Clo-
nality of mouse and human cardiomyogenesis in vivo //
Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2009. Vol. 106. P. 17169—
17174.
Hughes AL. Dobric N.. ScottL.C, Su L. Starovic AL., St-Pier-
reB., EganS. E., Kingdom J. С. P., Cross C. The Handl,
Stral3 and Gcml transcription factors override FGF sig-
naling to promote terminal differentiation of trophoblast
stem cells // Dev. Biol. 2004. Vol. 271. P. 26—37.
Hubner K, Fuhrmann G., Christenson L. K, KehlerJ., Rein-
bold R, de la Fuente R, JJ'oodJ., Strauss J. F. 3rd, Boia-
triAL., Scholer H. R. Derivation of oocytes from mouse em-
bryonic stem cells// Science. 2003. Vol. 300. P. 1251
1256.
HungS.-C, Chen N.-J., Hsieh S.-L., Li H, ALaH.-L, Lo JJ’.-H.
Isolation and characterization of size-sieved stem cells
from human bone marrow // Stem Cells. 2002. Vol. 20.
P. 249—258.
Lwatsuki K, ShinozakiAL, Sun JJ’., YagiS., TanakaS., ShiotaK. A
novel secretory' protein produced by rat spongiotrophoblast //
Biol. Reprod. 2000. Vol. 62, N 5. P. 1352—1359.
Jakob H, Boon T, Gaillard J., Nicolas J., Jacob F. Teratocar-
cinoma of the mouse: isolation, culture and properties of
312 ЭПИГЕНЕТИКА
pluripotential cells H Ann. Microbiol. (Paris). 1973. Vol. 124.
P. 269—282.
Jiang Y., Jahagirdar B. N., Reinhardt R. L., Schwartz R E., Ke-
enekC.D., Ortiz-Gonzalez X. R, Reyes AL, LettvikT.,
LundT., BlackstadAL, Du J., Aldrich S., UsbergA.,
LowkW.C, Largaespada D. A., Verfaillie C. AL. Pluripo-
tency of mesenchymal stem cells derived from adult mar-
row’// Nature. 2002. Vol. 418. P. 41 -49.
Jorgensen C, NoelD., Apparailly F., Sony J. Stem cells for re-
pair of cartilage and bone: the next challenge in os-
teoarthritis and rheumatoid arthritis // Ann. Rheum. Dis.
2001. Vol. 60. P. 305—309.
KadiyalaS., YoungRG., Huede AL. A., BruderS. P. Culture
expanded canine mesenchymal stem cells possess osteo-
chondrogenic potential in vivo and in vitro // Cell Trans-
plant. 1997. Vol. 6, N2. P. 125 134.
KangS.. YangY. J.. LiC. J.. GaoR. L. Effects of intracoronary'
autologous bone marrow cells on left ventricular function
in acute myocardial infarction: a systematic review and
meta-analysis for randomized controlled trials // Coron.
Artery Dis. 2008. Vol. 19. P. 327—335.
Kawiagi R, Cochran N. A., Lshigami E, Hakomori S., An-
drews P. IT., Knowles В. B., Solter D. Stage-specific em-
bryonic antigens (SSEA-3 and -4) are epitopes of a unique
globo-series ganglioside isolated from human teratocarci-
noma cells 11 EMBO J. 1983. Vol. 2. P. 2355—2361.
KehlerJ., TolkunovaE., KoschorzB., PesceAL, Gentile L.,
Bioatii AL, Lomeli EL, Nagy A., ALcLaughlin K. J., Schd-
ler H. R., Tomilin A. Oct4 is required for primordial germ
cell survival " EMBO Rep. 2004. Vol. 5, N 11. P. 1078—
1083.
KibschullAL, NassiryAL, DunkC, GellhausA., Quinn J. A.,
Rossant J., Lye S. J., Winterhager E. Connexin31 -defi-
cient trophoblast stem cells: a model to analyze the role of
gap junction communication in mouse placental develop-
ment " Dev. Biol. 2004. Vol. 273. P. 63—75.
KimJ.B., Sebastiano V, WuG, Arauzo-BravoAL. J., SasseP.,
Gentile L., Ko K, RuauD., Eltrich AL, den Boom D., ALe-
yerJ., Hiibner K, Bernemann C, OrtmeierC, ZenkeAL,
Fleischmann В. K, Zaehres H., Scholer H. R. Oct4—indu-
ced pluripotency in adult neural stem cells // Cell. 2009.
Vol. 136. P. 411 419.
KirchhofN, Camwath J. II ., Lemme E., Anastassiadis K,
Scholer H.. Niemann H. Expression pattern of Oct-4 in
preimplantation embryos of different species // Biol. Re-
prod. 2000. Vol. 63. P. 1698—1705.
Kleinsmith L. J., Pierce G. B. Multipotentiality' of single em-
bryonal carcinoma cells // Cancer Res. 1964. Vol. 24.
P. 1544—1551.
KnoflerAL, Simmons D.G., LashG.E., HarrisL.K, Ar-
mant D. R. Regulation of trophoblast invasion — a workshop
report 7 Placenta. 2008. Vol. 29. Suppl A. P. S26—S28.
KoutsourakisAL, Langeveld A., Patient R, Beddington R.,
Grosveld F. The transcription factor GATA6 is essential
for early extraembryonic development " Development.
1999. Vol. 126. P. 723—732.
KramperaAL., PasiniA., RigoA., ScupoliAL. T, TecchioC.,
ALalpeli G., Scarpa A., Dazzi F, PizzoloG., Vinante F.
HB-EGF HER-1 signalling in bone marrow mesenchymal
stem cells: inducing cell expansion and reversibly' prevent-
ing multi-lineage differentiation // Blood. 2005. Vol. 106.
P. 59—66.
KramperaAL, CosmiL., AngeliR, PasiniA., LiottaF, Andre-
iniA., Santarlasci V., ALazzinghiB., PizzoloG., Vinan-
te E, RomaguaniP., ALaggiE., Romagnani S., Annunzia-
to F. Role for interferon-gamma in the immunomodulatory'
activity of human bone marrow mesenchymal stem cells //
Stem Cells. 2006. Vol. 24. P. 386—398. ’
Krause D. S.. TheiseN.D.. Collector AL. I.. Henedariu O..
HwangS., Gardner R, Neutzel S., SharkisS.J. Multi-
organ, multi-lineage engraftment by' a single bone mar-
row-derived stem cell// Cell. 2001. Vol. 105. P. 369—
377.
Krebsbach P. EL, Kuznetsov S. A., Satomura K, Emmons R V,
RoweD. IV., Robey P. G. Bone formation in vivo: com-
parison of osteogenesis by' transplanted mouse and human
marrow stromal fibroblasts, Transplantation. 1997.
Vol. 63. P. 1059—1069.
Kunath T, StnmipfD., Rossant J. Early' trophoblast determina-
tion and stem cell maintenance in the mouse — a review //
Placenta. 2004. Vol. 25. Suppl A. P. S32—S38.
Kunath T, ArnaudD., UyG.D., Okamoto I., ChureauC, Ya-
manaka E, HeardE., Gardner R L., AvnerP., Rossant J.
Imprinted X-inactivation in extra-embryonic endoderm
cell lines from mouse blastocysts // Development. 2005.
Vol. 132. P. 1649—166E
KuoCT, ALorrisey E. E„ AnadappaR, Sigrist K, Lu AL. AL,
Parmacek AL. S., SoudaisC., Leiden J. AL. GATA4 tran-
scription factor is required for ventral morphogenesis and
heart tube formation// Genes Dev. 1997. Vol. IE
P. 1048—1060.
Lagasse E., Connors H, Al-DhalimyAL, Reitsma AL, DohseAL,
Osborne L, WangX., FinegoldAL, Weissman I. L., Grom-
peAL. Purified hematopoietic stemcells can differentiate into
hepatocytes in vivo 11 Nature. 2000. Vol. 6. P. 1229—1234.
Lawson K. A., DunnN.R, RoelenB.A., Zeinstra L. AL, Da-
vis A. AL., Wright С. V., KorvingJ. P., Hogan B. L. Bmp4 is
required for the generation of primordial germ cells in the
mouse embryo // Genes Dev. 1999. Vol. 13. P. 424—436.
Lengner C. J., Gimelbrant A. A., Erwin J. A., Cheng A. IV.,
Guenther AL. G., Welstead G. G., Alagappan R, Framp-
ton G. AL., XuP., ALuffat J., Santagata S., PowersD., Bar-
rett С. B.. YoungRA.. LeeJ.T., JaenischR. ALitalipo-
vaAL. Derivation of pre-X inactivation human embryonic
stem cells under physiological oxygen concentrations //
Cell. 2010. Vol. 141. P. 872—883. ’
Leri A., Kajstura J., Anversa P. Role of cardiac stem cells in
cardiac pathophysiology: a paradigm shift in human mvo-
cardial biology /7 Circ. Res. 201E Vol. 109. P. 941—961.
Lescisin K. R., Varmuza S., Rossant J. Isolation and characteri-
zation of a novel trophoblastspecific cDNA in the mouse //
Genes Dev. 1988. Vol. 2, N 12A. P. 1639—1646.
LevenbergS., Golub J. S., AmitAL, Itskovits-Eldor J., Langer R
Endothelial cells derived from human embryonic stem
cells 11 Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. Vol. 99, N 7.
P. 4391 4396.
Li R, Liang J., Ni S., Zhou T, QingX., Li H, He W., Chen J.,
LiF, ZhuangQ., QinB., Xu J., Li W., Yang J., Gan Y.,
Qin D., FengS., SongH. YangD.. ZhangB.. ZengL.,
LaiL., Esteban AL. A., PeiD. A mesenchymal-to-epithelial
transition initiates and is required for the nuclear repro-
gramming of mouse fibroblasts // Cell Stem Cell. 2010.
Vol. 7. P. 51—63.
Linke A., ALullerP., Nurzynska D., Casarsa C, Torella D., Nas-
cimbene A., CastaldoC, CascaperaS., Bohm AL, Quai-
niF, Urbanek K, Leri A., Hintze Т.Н., Kajstura J., An-
versa P. Stem cells in the dog heart are self-renewing,
clonogenic, and multipotent and regenerate infracted myo-
cardium, improving cardiac function // Proc. Natl. Acad.
Sci. USA. 2005. Vol. 102. P. 8966—8971.
Loffredo F. S., Steinhauser AL L., Gannon J., LeeRT. Bone
marrow-derived cell therapy' stimulates endogenous car-
diomyocyte progenitors and promotes cardiac repair //
Cell Stem Cell. 2011. Vol. 8. P. 389—398.
LohY.-H, Wu O., ChewJ.-L., VegaV.B., ZangW., ChenX.,
BourcpieG., George J., LeongB., Liu J., WongK-Y,
Sung К W., LeeC. W. H, ZhaoX.-D., Chiv К.-P., Lipo-
ГЛАВА 11 313
vichL.. Kuznetsov J'. A., Robson P.. Stanton L. IF..
I lei C.-L., Ruan E, LimB., NgH-H The Oct4 and Nanog
transcription network regulates pluripotency in mouse em-
bryonic stem cells 11 Nat. Genet. 2006. Vol. 38, N 4.
P. 431—440.
LohY.-H., Agarwal S., ParkL.-H, Urbach A., HuoH., Heff-
ner G. C, KitnK., Miller J. D., NgK, Daley G. Q. Gen-
eration of induced pluripotent stem cells from human
blood 11 Blood. 2009. Vol. 113, N 22. P. 5476—5479.
Luo J., SladekR, Bader J. A., Alatthyssen A., Rossant J.,
Giguere J~. Placental abnormalities in mouse embryos
lacking the orphan nuclear receptor ERR-beta // Nature.
1997. Vol. 388. P. 778—782.
LyssiotisC.A., Foreman R K, Staerk J., Garcia AL, ALathur D.,
ALarkoulaki S., Hanna.J., LairsonL. L., CharetteB. D., Bo-
uchezLC., BollongM., KunickC., Brinker A., ChoC.Y.,
SchultzP. G., JaenischR. Reprogramming of murine fi-
broblasts to induced pluripotent stem cells with chemical
complementation of Klf4 // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.
2009. Vol. 106, N 22. P. 8912—8917.
MacGregor G. R, Zambrowicz В. P., Soriano P. Tissue non-
specific alkaline phosphatase is expressed in both embry-
onic and extraembryonic lineages during mouse embryo-
genesis but is not required for migration of primordial germ
cells // Development. 1995. Vol. 121. P. 1487—1496.
Maddox-HyttelP.. AlexopoulosN. L. J'ajtaG., Lewisl., Ro-
gers P., CannL., Callesen H, Tveden-NyborgP., Troun-
sonA. Immunohistochemical and ultrastructural characteri-
zation of the initial post-hatching development of bovine
embryos // Reproduction. 2003. Vol. 125. P. 607—623.
Maherali N., Sridharan R, Xie JI’., UtikalJ., EminliS., ArnoldK,
StadtfeldAL, Yachechko R, TchieuJ., Jaenisch R, Plath K,
Hochedlinger K. Directly reprogrammed fibroblasts show
global epigenetic remodeling and widespread tissue con-
tribution // Cell Stem Cell. 2007. Vol. 1. P. 55—70.
Maherali N., Ahfeldt T, Rigamonti A., Utikal J., Cowan C, Ho-
chedlinger K. A high-efficiency system for the generation
and study' of human induced pluripotent stem cells // Cell
Stem Ceil. 2008. Vol. 3. P. 340—345.
Mali P., ChouB.K, Yen J., Ye Z., ZouJ., DoweyS., Brod-
sky R A., OhmJ.E., YuJJ'., Baylin S. B., Yusa K, Brad-
ley A., MeyersD. J., .Mukherjee C, Cole P. A., ChengL. Bu-
tyrate greatly enhances derivation of human induced
pluripotent stem cells by promoting epigenetic remodeling
and the expression of pluripotency-associated genes //
Stem Cells. 2010. Vol. 28. P. 713—720.
Manes T, Glade K., ZiomekC. A., Millan J. L. Genomic structure
and comparison of mouse tissue-specific alkaline phos-
phatase genes // Genomics. 1990. Vol. 8. P. 541—554.
ALanova K, Tomihara-Newberger C., ITangS., Godelman A.,
Kalantry S., Uilly-Blease K. DeLeon I’. Chen JJ'. S.. La-
cy E., Bachvarova R. F. Apoptosis in mouse embryos:
elevated levels in pregastrulae and in the distal anterior re-
gion of gastrulae of normal and mutant mice // Dev. Dy-
namics. 1998. Vol. 213. P. 293—308.
Martin G. R, Evans M. J. Differentiation of clonal lines of terato-
carcinoma cells: formation of embryoid bodies in vitro И
Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1975. Vol. 72, N4. P. 1441—
1445.
Martin G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early
mouse embryos cultured in medium conditioned by terato-
carcinoma stem cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981.
Vol. 78, N 12. P. 7634—7638.
MassbergS., Schaerli P., Knezevic-Maramica I., Kollnber-
ger AL, Tu bo N., ALoseman E. A., Huff I. J’., JuntT., Ha-
gers A. J., ALazoL.B., von Andrian U. H. Immunosurveil-
lance by hematopoietic progenitor cells trafficking through
blood, lymph, and peripheral tissues // Cell. 2007.
Vol. 131.’P. 994—1008.
Matsuda T, Nakamura T., NakaoK., AraiT., Katsuki M, Hei-
ke T, Yokota T. STAT3 activation is sufficient to maintain
an undifferentiated state of mouse embryonic stem cells //
EMBO J. 1999. Vol. 18. P. 4261 4269.’
Matsui Y., ZseboK, Hogan B. L. Derivation of pluripotential
stem cells from murine germ cells in culture // Cell. 1992.
Vol. 70, N 5. P. 841 -847.
McKay R. Stem cells in the central nervous svstem 7 Science.
1997. Vol. 276. P. 66—71.
McLaren A. Mammalian germ cells: birth, sex, and immortal-
ity // Cell Struct. Funct. 2001. Vol. 26. P. 119—122.
Minguell J. J., Erices A., CongetP. Mesenchymal stem cells//
Exp. Biol. Med. 2001. Vol. 226, N 6. 507—520.
Mitsui K, Tokuzawa Y, Itoh H, Segawa K, Murakami M., Ta-
kahashi K, ALaruyamaAL, Maeda M, YamanakaS. The
homeoprotein Nanog is required for maintenance of pluri-
potency' in mouse epiblast and ES cells // Cell. 2003.
Vol. li3. P. 631—642.
Miyoshi K, Tsuji D„ Kudoh K, Satomura K, MutoT., Itoh K,
Noma T. Generation of human induced pluripotent stem
cells from oral mucosa // J. Biosci. Bioeng. 2010.
Vol. 110,N3. P. 345—350.
Mummery C. L., Feyen A., FreundE., ShenS. Characteristic
of embryonic stem cell differentiation: a comparison
with two embryonal carcinoma cell lines 11 Cell Differ.
Dev. 1990. Vol. 30. P. 195—206.
Murphy J. M., Kavalkovitch K. JJ’., FinkD., Barry F. P. Re-
generation of meniscal tissue and protection of articular
cartilage by injection of mesenchymal stem cells // Os-
teoarthr. Cartil. 2000. Vol. 8. Suppl. B. S25.
Murry C.E., SoonpaaAL.H, Reinecke H, Nikajima H, Nika-
jima H. O., Rubart AL, Pasumarthi К. B. S., J'iragJ.I.,
Bartelmez S. H, Poppa J'., Bradford G., Dowell J. D.,
JJ’illiamsD. A., FieldL. J. Haematopoietic stem cells do
not transdifferentiate into cardiac myocytes in myocardial
infarcts 11 Nature. 2004. Vol. 428. Р.6б4—668.
Natale D. R., Hemberger AL., Hughes AL., Cross J. C. Activin
promotes differentiation of cultured mouse trophoblast
stem cells toyvards a labyrinth cell fate // Dev. Biol. 2009.
Vol. 335, Nl.P. 120—131.
Nichols J., ZevnikB., Anastassiadis K, Niwa H, Klewe-Nebe-
niusD., Chambers L., Scholer H. R. Smith A. Formation of
pluripotent stem cells in the mammalian embryo depends
on the POU transcription factor Oct4 // Cell. 1998.
Vol. 95. P. 379—391.
Nichols J., Smith A. Naive and primed pluripotent states// Cell
Stem Cell. 2009. Vol. 4. P. 487 492.
NiswanderL., ALartinG.R. Fgf-4 expression during gastrula-
tion, myogenesis, limb and tooth development in the
mouse // Development. 1992. Vol. 114, N 3. P. 755 768.
Niwa H, ALiyazaki J., Smith .1. G. Quantitative expression of Oct-
3/4 defines differentiation, dedifferentiation or self-renewal
of ES cells ' Nat. Genet. 2000. Vol. 24. P. 372—376.
Niwa H, Toyooka Y., ShimosatoD., StrumpfD., Takahashi K,
Yagi R., Rossant J. Interaction between Oct3/4 and Cdx2
determines trophectoderm differentiation // Cell. 2005.
Vol. 123. P. 917—929.
Notariaimi E., Galli C, Laurie S., ALoor R AL, Evans Al. J.
Derivation of pluripotent, embryonic cell lines from the
pig and sheep// J. Reprod. Fertil. Suppl. 1991. Vol. 43.
P. 255—260.
Oda AL, Shiota K, TanakaS. Trophoblast stem cells// Methods
EnzymoL 2006. Vol. 419. P. 387 400.
Okada Y., UeshinY., Lsotani A., Saito-Fujita T, Nakashima H,
Kimura K, ALizoguchi A., Oh-hora AL, A Lori 1., Ogata AL,
OshimaR. G., OkabeAL., LkawaAL. Complementation of
placental defects and embryonic lethality by trophoblast-
specific lentiviral gene transfer // Nat. Biotechnol. 2007.
Vol. 25, N 2. P. 233—237.
314 ЭПИГЕНЕТИКА
Okita К.. Nakagawa М. HyenjongН, Ichisaka Т. Титаника S.
Generation of mouse induced pluripotent stem cells with-
out viral vectors // Science. 2008. Vol. 322, N 5903.
P. 949—953.
Orlic D., Fischer R, Nishikawa S., NienhuisA., BodineD. Puri-
fication and characterization of heterogeneous pluripotent
hematopoietic stem cell populations expressing high levels
ofc-kit receptor // Blood. 1993. Vol. 82. P. 762—770.
Orlic D., KajsturaJ., Chimenti S., JakoniukL, AndersonS. hl.,
Li B„ Bickel J., McKay K. Nadal-Ginard B„ BodineD. hl.,
LeriA., AnversaP. Bone marrow cells regenerate infarcted
myocardium //Nature. 2001. Vol. 410. P. 701—705.
Orlic D., KajsturaJ., Chimenti S., Bodine D. hi., LeriA., An-
versa P. Bone marrow stem cells regenerate infarcted
myocardium // Pediatr. Transplant. 2003. Vol. 7. Suppl. 3.
P. 86 88.
Osltima R. Identification and immunoprecipitation of cytoskele-
tal proteins from murine extra-embryonic endodermal
cells // J. Biochem. 1981. Vol. 256, N 15. P. 8124—8133.
Ouhibi N., Sullivan N. F, English J., Colledge JJ’. H, Evans hl. J.,
Clarke N. J. Initial culture behaviour of rat blastocysts on
selected feeder cell lines // Mol. Reprod. Dev. 1995.
Vol. 40. P. 311—324.
PainB., Clark hl. E., ShenhL, NakazawaH., Sakuraihl., Sa-
marut J., Etches R. J. Long-term in vitro culture and char-
acterization of avian embryonic stem cells with multiple
morphogenetic potential // Development. 1996. Vol. 122.
P. 2339—2348.
Palmer T. D., JJ’illhoite A. R., Gage F. H. Vascular niche for
adult hippocampal neurogenesis // J. Comp. Neurol. 2000.
Vol. 425. P. 479 494.
PescehL, Scholar H. R. Oct-4: gatekeeper in the beginnings of
mammalian development// Stem Cells. 2001. Vol. 19.
P. 271—278.
Petersen В. E., Terada N. Stem cells: a journey into a new fron-
tier /7 J. Am. Soc. Nephrol. 2001. Vol. 12. P. 1773—1780.
Phinney D. G., Кореи G., Isaacson R. L., Prockop D. J. Plastic
adherent stromal cells from the bone marrow of commonly
used strains of inbred mice: variations in yield, growth,
and differentiation // J. Cell Biochem. 1999. Vol. 72, N 4.
P. 570—585.
Prelle K. J’assiliev 1. hl, Fassilieva S. G., JJ’olfE., JJ’obusA.hL
Establishment of pluripotent cell lines from vertebrate
species — present status and future prospects // Cells Tis-
sues Organs. 1999. Vol. 165. P. 220—236.
Ralston A., Rossant J. Genetic regulation of stem cell origins in the
mouse embryo // Clin. Genet. 2005. Vol. 68. P. 106—112.
Rao hl. S. Multipoteut and restricted precursors in the central
nrevous system // Anat. Rec. 1999. Vol. 257. P. 137—148.
Rappolee D. A., Basilica C., Patel Y., R’erbZ. Expression and
function of FGF-4 in peri-implantation development in
mouse embryos // Development. 1994. Vol. 120. P. 2259—
2269.
Resnick J. L., Bixler L. S., Cheng L., Donovan P. J. Long-term
proliferation of mouse primordial germ cells in culture 7
Nature. 1992. Vol. 359. P. 550—551.
Robertson E. J. Teratocarcinomas and embryonic stem cells: a
practical approach. Oxford, UK: IRL Press, 1987.
Robertson E. J., Bradley A., Kuehn hl., Evans hl. Germ line
transmission of genes introduced into cultured pluripo-
tential cells by retroviral vector// Ibid. 1986. Vol. 323.
p. 445 448. ’
RossantJ. Stem cells from the mammalian blastocyst// Stem
Cells. 2001. Vol. 19. P. 477 482.
Rossant J. Stem cells and lineage development in the mammal-
ian blastocyst 11 Reprod. Fertil. Dev. 2007. Vol. 19.
P. 111—118.
Rossant J., Cross J. C. Placental development: lessons from mouse
mutants // Nat. Rev. Genet. 2001. Vol. 2. P. 538—548.
Rossant J.. OferL. Properties of extra-embryonic ectoderm iso-
lated from postimplantation mouse embryos // J. Embry ol.
Exp. Morphol. 1977. Vol. 39. P. 183—194.
Roufosse C. A., DirekzeN.C., OttoJJ’.R., JJ’right N. A. Circu-
lating mesenchymal stem cells // Int. J. Biochem. Cell
Biol. 2004. Vol.’36. P. 585—597.
RussA. P., JJ'attler S., Colledge JJ. H, Aparicio S. A., Carl-
ton hl. B.. Pearce J. J. BartonS. C., SuranihLA., Ry-
an K, Nehlshl. C., JJ’ilson J’., Evans hl. J. Eomesodermin
is required for mouse trophoblast development and meso-
derm formation //Nature. 2000. Vol. 404. P. 95—99.
SatoN, hleijerL., SkaltsounisL., GreengardP., Brivanlou A. H.
Maintenance of pluripotency in human and mouse embry-
onic stem cells through activation of Wnt signaling by a
pharmacological GSK-3—specific inhibitor // Nat. Med.
2004. Vol. 10. P. 55 -63.
Schlessinger J.. Plotnikov A. N., Ibrahimi O. ,4.. Eliseenkova A. J’.,
YehB.K, YayotiA., LinhardtR. J., hlohammadihl. Crystal
structure of a ternary FGF-FGFR-heparin complex reveals
a dual role for heparin in FGFR binding and dimeriza-
tion // Mol. Cell. 2000. Vol. 6. P. 743—750.
Schultz O., SittingerhL, HaeuplT., Burmester G. R. Emerging
strategies of bone and joint repair// Arthritis Res. 2000.
Vol. 2. P. 433 436.
ShiX., Garry D. J. Muscle stem cells in development, regenera-
tion, and disease // Genes Dev. 2006. Vol. 20. P. 1692—
1708.
ShihD.T., LeeD.C., ChenS. C., TsaiR Y„ HuangC.T.,
Tsai С. C., ShenE. T., Chiu ГГ. T. Isolation and characteri-
zation of neurogenic mesenchymal stem cells in human
scalp tissue // Stem Cells. 2005’ Vol. 23. P. 1012—1020.
Smith A. G., Heath J. K, Donaldson D. D., JJ'ongG.G., hlo-
reauJ., Stahlhl., RogersD. Inhibition of pluripotential
embryonic stem cell differentiation by purified polypep-
tides 'll Nature. 1988. Vol. 336. P. 688 ’ 690.
Smith A. G. Embryo-derived stem cells: of mice and men//
Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2001. Vol. 17. P. 435 462.
Smith A. G. The battlefield of pluripotency// Cell. 2005.
Vol. 122. P. 261—273.
Smith J. R., Pochampally R., Perry A., Hsu S. C., Prockop D. J.
Isolation of a highly clonogenic and multipotential sub-
fraction of adult stem cells from bone marrow stroma H
Stem Cells. 2004. Vol. 22. P. 823—831.
Soares hl. J.. Chapman B. hi., Rasmussen C. A.. Dai G.. Ka-
mei T., OrwigK. E. Differentiation of trophoblast endo-
crine cells H Placenta. 1996. Vol. 17. P. 277—289.
SolterD. Role of cell surface molecules in mammalian devel-
opment H Progr. Immunol. 6th Int. Congress Immunol.
1986. Vol. 6. P. 1070 1078.
SolterD. From teratocarcinomas to embryonic stem cells and
beyond: a history of embryonic stem cell research 7 Nat.
Rev. Genet. 2006. Vol. 7. P. 319—327.
SolterD., Knowles В. B. Monoclonal antibody defining a stage-
specific mouse embryonic antigen (SSEA-1) H Proc. Natl.
Acad. Sei. USA. 1978. Vol. 75. P. 5565—5569.
SotiropoulouP. A., Perez S. A., GritzapisA. D., Baxevanis C. N.,
Papamichailhl. Interactions between human mesenchymal
stem cells and natural killer cells H Stem Cells. 2006.
Vol. 24. P. 74- 85.
StadtfeldhL, NagayahL. UtikalJ.. JJ’eirG., HochedlingerK.
Induced pluripotent stem cells generated without viral in-
tegration 11 Science. 2008. Vol. 322, N 5903. P. 945—
949.
Stevens L. C. Jr., Little С. C. Spontaneous testicular teratomas
in an inbred strain of mice // Proc. Natl. Acad. Sei. USA.
1954. Vol. 40. P. 1080—1087.
Stewart C. L.. GadiL, Bhatt H. Stem cells from primordial
germ cells can reenter the germ line H Dev. Biol. 1994.
Vol. 161. P. 626—628.
ГЛАВА 11 315
Stewart Т. A., Mintz В. Successive generations of mice pro-
duced from an established culture line of euploid terato-
carcinoma cells// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981.
Vol. 78, N 10. P. 6314—6318.
StrimipfD., AlaoC.-A., Yamanaka Y., Ralston A., Chawengsak-
sophakK., BeckF., Rossant J. Cdx2 is required for correct
cell fate specification and differentiation of trophectoderm
in the mouse blastocyst // Development. 2005. Vol. 132.
P. 2093—2102.
StudenyAL, Marini F. C, Champlin RE., ZompettaC., Fid-
ler I. J., AndreeffAl Bone marrow-derived mesenchymal
stem cells as vehicles for interferon-P delivery into tu-
mours // Cancer Res. 2002. Vol. 62. P. 3603—3608.
SukoyanAI.A., Vatolin S. Y., Golubitsa A. N, Zhelezova A. L,
Semenova L. A., Serov O. L. Embryonic stem cells derived
from morulae, inner cell mass, and blastocysts of mink:
comparisons of their pluripotencies // Mol. Reprod. Dev.
1993. Vol. 36. P. 148—158.
Surani AL A. How to make eggs and sperm// Nature. 2004.
Vol. 427. P. 106—107.
Takahashi K, Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells
from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by de-
fined factors // Cell. 2006. Vol. 126. P. 663—676.
Takahashi K, Tanahe K., OhnukiAL, Narita AL, IchisakaT.,
Tomoda K, Yamanaka S. Induction of pluripotent stem
cells from adult human fibroblasts by defined factors //
Cell. 2007. Vol. 131. P. 861—872.
Talbot N. C, Rexroad С. E. Jr., Pursel Г. G., Powell A. AL. Al-
kaline phosphotase of pig and sheep epiblast cells in cul-
ture // Mol. Reprod. Dev. 1993. Vol. 36. P. 139—147.
Tamaoki N., Takahashi K, Tanaka T, Ichisaka T, Aoki H, Ta-
keda-Kawaguchi T, Lida K, Kunisada T, Shibata T, Ya-
manaka S., Tezuka K. Dental pulp cells for induced pluri-
potent stem cell banking // J. Dent. Res. 2010. Vol. 89.
P. 773—778.
TanakaS., Kunath T, Hadjntonakis A.-K, Nagy A., Rossant J.
Promotion of trophoblast stem cell proliferation by
FGF4 // Science. 1998. Vol. 282. P. 2072—2075.
Temple S. The development of neural stem cells // Nature. 2001.
Vol. 414. P.112—117.
Tesar P. J., Chenoweth J. G., Brook F. A., DaviesT.J., Ev-
ans E. P., Alack D. L, Gardner R L., AlcKayR. D. G. New
cell lines from mouse epiblast share defining features with
human embryonic stem cells // Nature. 2007. Vol. 448.
P. 196—202.’
The International Stem Cell Initiative. Characterization of hu-
man embryonic stem cell lines by the International Stem
Cell Initiative // Nat. Biotechnol. 2007. Vol. 25, N 7.
P. 803- 816.
Thomson J. A., Kalisimian J., Golos T. G., Fuming Al, Har-
ris C.P.. Becker R. A., Hearn J. P. Isolation of a primate
embryonic stem cell line // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.
1995’ Vol. 92. P. 7844—7848.
Thomson J. A., Itskovitz-Eldor J., Shapiro S. S., WaknitzAl A.,
Swiergiel J. J., Alarshall V. S., Jones J. AL Embryonic
stem cell lines derived from human blastocysts // Science.
1998. Vol. 282. P. 1145—1147.
Toyooka E, Tsunekawa N, Akasu R., Noce T. Embryonic stem
cells can form germ cells in vitro // Proc. Natl. Acad. Sci.
USA. 2003. Vol. 100. P. 1 1457—11462.
Tremblay G. B., Kunath T, Berderon D., Lapointe L., Champig-
nyC, Bader J.-A., Rossant J., Giguere Г. Diethylstilbest-
rol regulates trophoblast stem cell differentiation as a
ligand of orphan nuclear receptor ERRp " Genes Dev.
2001. Vol. 15. P. 833—838.
Trubiani O., DiPrimioR, Traini T, Pizzicannella J., Sca-
ranoA., PiattelliA., CaputiS. Morphological and cyto-
fluorimetric analysis of adult mesenchymal stem cells ex-
panded ex vivo from periodontal ligament // Int. J. Im-
munopathol. Pharmacol. 2005. Vol. 18. P. 213—221.
TsaiS. Y., BouwmanB.A., AngY.S., KimS.J., Lee D. F,
Lemischka I. R., RendlAL. Single transcription factor re-
programming of hair follicle dermal papilla cells to in-
duced pluripotent stem cells// Stem Cells. 2011. Vol. 29,
N6. P. 964 971.
TuanR. S., Boland G.. TuliR. Adult mesenchymal stem cell and
cell-based tissue engineering // Arthritis Res. Ther. 2003.
Vol. 5. P. 32—35.
L’llahZ., Kohn Al. J., Yagi R, Vassilev L. T, DePamphilisAl L.
Differentiation of trophoblast stem cells into giant cells is
triggered by p57/Kip2 inhibition of CDK1 activity //
Genes Dev. 2008. Vol. 22, N 21. P. 2908—2913.
Urbanek K, Cesselli D., RotaAL, Nascimbene A., De Angelis A.,
HosodaT., BearziC, Boni A., Bolli R, Kajstura J., An-
versaP, Leri A. Stem cell niches in the adult mouse
heart // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. Vol. 103.
P. 9226—9231.
UtikalJ., Alaherali N., KulalertW., Hochedlinger K. Sox2 is
dispensable for the reprogramming of melanocytes and
melanoma cells into induced pluripotent stem cells // J.
Cell Sci. 2009. Vol. 122. P. 3502 3510.
J’assilieva S., Guan K, PichU, WohusA.Al Establishment of
SSEA-1 and Oct-4-expressing rat embryonic stem-like cell
lines and effects of cytokines of the IL-6 family on clonal
growth // Exp. Cell Res. 2000. Vol. 258. P. 361—373.
WangX., Willenbring H, Akkari 1., Torimaru 1., Foster AL, Al-
DhalimyAL, LagasseE., FinegoldAL, OlsonS., GrompeAl
Cell fusion is the principal source of bone-marrow-derived
hepatocytes //Nature. 2003. Vol. 422. P. 897—901.
Ragers A. J., Weissman I. L. Plasticity of adult stem cells//
Cell. 2004. Vol. 116. P. 639—648.
Wemig AL, Aleissner A., Foreman R, Brambrink T, Ku AL, Ho-
chedlinger К, Bernstein В. E.. Jaenisch R In vitro repro-
gramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like
state // Nature. 2007. Vol. 448. P. 318—324.
Wilder P. J., Kelly D., Brigman K, Peterson C. L., NowlingT.,
GaoQ. S., AlcComb R D., Capecchi AL. R, RizzinoA. In-
activation of the FGF-4 gene in embryonic stem cells al-
ters the growth and/or the survival of their early differenti-
ated progeny // Dev. Biol. 1997. Vol. 192. P. 614—629.
Williams RL., Hilton D. J., PeaseS., Willson T. A., Stewart CL,
GearingD.P., Wagner E.F., AletcalfD.. Nicola N. A..
Gough N. AL Myeloid leukaemia inhibitory' factor main-
tains the developmental potential of embryonic stem
cells 11 Nature. 1988. Vol. 336. P. 684—687.
Wright D. E., Wagers A. J., Gulati A. P., Johnson F. L., Weiss-
man L L. Physiological migration of hematopoietic stem and
progenitor cells//Science. 2001. Vol. 294. P. 1933 1936.
Xin AL, Davis C. A., Alolkentin J. D., Lien C.-L.. Duncan S. A.,
Richardson J. A., Olson E. N. A threshold of GATA4 and
GATA6 expression is required for cardiovascular devel-
opment // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. Vol. 13,
N30. P. 11189—11194.
Xu C, Rosler E., Jiang J., LebkowskiJ.S., Gold J. D., O’Sul-
livan C., Delavan-Boorsma K, A Lok AL, Bronstein A., Car-
penter Al. K. Basic fibroblast growth factor supports undif-
ferentiated human embryonic stem cell growth without con-
ditioned medium /' Stem Cells. 2005. Vol. 23. P. 315—323.
YanJ., TanakaS., Oda Al, Alakino T, OhganeJ., Shiota K.
Retinoic acid promotes differentiation of trophoblast stem
cells to a giant cell fate// Dev. Biol. 2001. Vol. 235.
P. 422 432.
YoshimizuT., SugiyamaN., de Felice Al, YeomY., Ohbo K,
Alasuko K, ObinataAl, Abe K, Scholer HR., Alatsui Y.
Germline-specific expression of the Oct-4/green fluores-
cent protein (GFP) transgene in mice // Dev. Growth Dif-
fer. 1999. Vol. 41. P. 675—684.
316 ЭПИГЕНЕТИКА
YadavР. S., Kites JJ . A., HerrmamiD., CarnwathJ. JJ'., Nie-
mann H. Bovine ICM derived cells express the Oct4 ortho-
log // Mol. Reprod. Dev. 2005. Vol. 72, N 2. P. 182—190.
Yu J, J'odyanikM. A., Smuga-Otto K, Antosiewicz-Bourget J.,
Krone J. L, Tian S., Nie J., Jonsdottir G. A., Ruotti J'., Ste-
wart R., Slukvinl.L, Thomson J. A. Induced pluripotent
stem cell lines derived from human somatic cells // Sci-
ence. 2007. Vol. 318. P. 1917—1920.
Yu J., Chau K. F., J'odyanik til. A., Jiang J., Jiang Y. Efficient
feeder-free episomal reprogramming with small mole-
cules // PLoS One. 2011. Vol. 6, N 3. P. e!7557.
Zaruba til. til.. SoonpaatiL, ReuterS.. FieldL.J. Cardiomyo-
genic potential of C-kit(+)-expressing cells derived from
neonatal and adult mouse hearts " Circulation. 2010.
Vol. 121. P. 1992—2000.
Zvaifler N. J., Marinova-Mutafchieva L., Adams G., Ed-
wards C. J., Moss J., Burger J. A., Maini R. N. Mesen-
chymal precursor cells in the blood of normal individu-
als // Arthritis Res. 2000. Vol. 2, N 6. P. 477 488.
ГЛАВА
12
ЭПИГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ
В РЕГУЛЯЦИИ САМООБНОВЛЕНИЯ
И ПЛЮРИПОТЕНТНОСТИ КЛЕТОК
МЛЕКОПИТАЮЩИХ
СОДЕРЖАНИЕ
12.1 Бивалентные домены хроматина
плюрипотентных клеток, 319
12.2. Взаимодействие транскрипцион-
ных факторов системы поддержа-
ния плюрипотентности с белками
группы Polycomb и ремоделирую-
щими хроматин факторами, 319
12.3. Белки группы Polycomb. Комплек-
сы PRC1 и 2, 320
12.4. Комплекс Trithorax (trxG), 323
12.5. Комплекс BAF, 324
12.6. Комплекс NuRD, 325
12.7. Комплекс Tip60—р400, 326
12.8. Прямая регуляция генов, кодирую-
щих белки, модулирующие струк-
туру хроматина, транскрипцион-
ными факторами основной сис-
темы поддержания плюрипотент-
ности, 327
12.9. Метилирование ДНК и плюрипо-
тентность, 327
12.10. Факторы плюрипотентности в ре-
гуляции процесса инактивации X-
хромосомы, 328
12.11. Эпигенетические события, проис-
ходящие при репрограммирова-
нии клеток к плюрипотентному со-
стоянию. «Эпигенетическая па-
мять», 331
Список литературы, 336
318 ЭПИГЕНЕТИКА
Плюрипотентность — это свойство клеток
дифференцироваться в производные всех трех
первичных зародышевых листков, эктодермы,
энтодермы и мезодермы, а также образовывать
во время эмбрионального развития клетки —
предшественники функциональных гамет. Плю-
рипотентными являются клетки внутренней кле-
точной массы и эпибласта предымплантацион-
ных эмбрионов млекопитающих [Boiani, Scholer,
2005]. В онтогенезе из плюрипотентных клеток
полностью формируется взрослый организм.
Однако эти клетки не способны дать начало вне-
зародышевым органам и тканям.
Плюрипотентность ЭС-клеток делает их пер-
спективными объектами фундаментальных и
прикладных исследований. ЭС-клетки исполь-
зуют в качестве модельных систем при исследо-
вании процессов, происходящих в раннем эм-
бриогенезе млекопитающих, а также применяют
для моделирования заболеваний in vitro. Кроме
того, плюрипотентные клетки являются перспек-
тивным источником материала для заместитель-
ной клеточной терапии [Cohen, Melton, 2011;
Grskovic et al., 2011; Tiscomia et al., 2011].
После того, как были получены первые линии
ЭС-клеток мыши и человека, начались исследо-
вания молекулярно-генетических основ поддер-
жания недифференцированного, плюрипотент-
ного состояния ЭС-клеток. На сегодня известно,
что поддержание плюрипотентного статуса кле-
ток предымплантационных эмбрионов и ЭС-кле-
ток обеспечивается сложной системой клеточно-
поверхностных белков, их молекулярных сиг-
нальных путей и транскрипционных факторов,
инициирующих транскрипцию генов-мишеней.
Подсистема так называемых внешних регулято-
ров плюрипотентности включает в себя несколь-
ко сигнальных путей, основными из которых яв-
ляются каскады, запускаемые белками LIF,
ВМР4, TGF|3, ACTIVIN A, NODAL и bFGF (FGF2)
[Boiani, Scholer, 2005; Медведев и др., 2010].
Другой подсистемой, регулирующей плю-
рипотентность ЭС-клеток, является подсистема
внутренних регуляторов плюрипотентности —
транскрипционных факторов, действующих в
ядрах клеток. К числу’ ключевых регуляторов в
данной подсистеме относятся транскрипционные
факторы ОСТ4, NANOG и SOX2 [Boyer etal.,
2005; Loh et al., 2006; Медведев и др., 2010].
В 2006 г. произошло одно из наиболее ярких
открытий последнего десятилетия в области кле-
точной биологии. Японские ученые опубликова-
ли в журнале Cell результаты своих эксперимен-
тов по репрограммированию соматических кле-
ток мыши в плюрипотентное состояние [Taka-
hashi, Yamanaka, 2006]. Клетки, полученные в
результате репрограммирования соматических
клеток, были названы индуцированными плю-
рипотентными стволовыми клетками (ИПСК)
[Медведев и др., 2011].
Развитие технологии получения ИПСК жи-
вотных и человека открыло новые возможности
исследования динамики эпигенетических собы-
тий, происходящих при репрограммировании, и
особенностей эпигеномов плюрипотентных кле-
ток. К настоящему’ моменту’ известно множество
хорошо воспроизводимых способов получения
ИПСК из широкого спектра соматических кле-
ток. Большая часть исследователей использует
для репрограммирования определенный набор
генов, большинство из которых кодирует транс-
крипционные факторы. Это такие гены, как Oct4,
Sox2, Klf4, с-Мус, Nanog и Lin28 [Takahashi,
Yamanaka, 2006; Takahashi et al., 2007; Yu et al.,
2007; Maherali, Hochedlinger, 2008]. Кроме того,
в недавних работах было показано, что ИПСК
мыши и человека могут быть получены с помо-
щью микроРНК [Anokye-Danso etal., 2011;
Miyoshi etal., 2011]. Спектр типов соматических
клеток, из которых были успешно получены
ИПСК, очень широк. Впервые ИПСК были по-
лучены из фибробластов различного происхож-
дения, позже из кератиноцитов, меланоцитов,
клеток крови, нейральных стволовых клеток, [3-
клеток поджелудочной железы, В-лимфоцитов и
других [Aasen et al., 2008; Hanna et al., 2008;
Huangfu et al., 2008b; Stadtfeld et al., 2008; Utikal
etal., 2009; Loh etal., 2010; Medvedev etal.,
2011]. Таким образом, можно заключить, что
ИПСК могут быть получены из клеток, имею-
щих происхождение из всех трех первичных за-
родышевых листков (эктодермы, мезодермы и
энтодермы), хотя эффективность и динамика по-
лучения стабильных линий ИПСК существенно
зависит от выбранного способа получения и ти-
па использованных соматических клеток [Ma-
herali etal., 2008; Anokye-Danso etal., 2011]. По-
лучающиеся в результате прямого репрограмми-
рования ИПСК обладают рядом общих свойств,
которые и делают их столь перспективными мо-
делями для исследований в области биологии
плюрипотентных клеток, а также дают возмож-
ность использовать эти клетки для моделирова-
ния заболеваний человека и в регенеративной
медицине [Медведев и др., 2010; Grskovic etal.,
2011; Tiscomia etal., 2011]. Индуцированные
плюрипотентные стволовые клетки по своим
свойствам очень близки к ЭС-клеткам, которые
ГЛАВА 12 319
получают из предымлантационных эмбрионов
мыши и человека. Эти два типа клеток обладают
сходной морфологией, чувствительностью к
ростовым факторам и сигнальным молекулам,
паттерну’ экспрессии генов и дифференцировки
[Yamanaka, 2009]. В частности, ИПСК могут об-
разовывать при дифференцировке in vitro эм-
бриоидные тельца, состоящие из производных
всех трех зародышевых листков. Кроме того,
ИПСК человека могут образовывать тератомы, а
ИПСК мыши дают химеры и даже способны
формировать целый организм при инъекции в
тетраплоидные бластоцисты [Boland et al., 2009;
Kang et al., 2009; Zhao et al., 2009]. Совершенно
очевидно, что все эти свойства, характерные для
плюрипотентных клеток, определяются особым
состоянием эпигенома клеток, которое у ЭС-кле-
ток «наследуются» от клеток внутренней клеточ-
ной массы эмбрионов, а в случае ИПСК форми-
руется в процессе репрограммирования.
Исследования последних лет показывают, что
генетический уровень, включающий транскрип-
ционные факторы, сигнальные пути и микро-
РНК, тесно взаимодействует с системой фермен-
тов и других специфических белков, участвую-
щих в формировании структуры хроматина.
Взаимодействие этих двух систем формирует
уникальное состояние хроматина, существую-
щее в плюрипотентных клетках.
В данной главе будут рассмотрены особенно-
сти эпигеномов эмбриональных стволовых и ин-
дуцированных плюрипотентных стволовых кле-
ток. Особое внимание будет уделено взаимодей-
ствию транскрипционных факторов ОСТ4, SOX2
и NANOG с белками группы Polycomb и други-
ми молекулами, участвующими в регуляции
структуры хроматина. Будет обсуждено участие
транскрипционных факторов системы поддер-
жания плюрипотентности в процессе инактива-
ции Х-хромосомы. Кроме того, будут рассмот-
рены эпигенетические события, происходящие
при репрограммировании соматических клеток к
плюрипотентному состоянию, и проблемы, свя-
занные с «эпигенетической памятью».
12.1. Бивалентные домены хроматина
ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ КЛЕТОК
Бивалентными доменами называют области
хроматина, одновременно обогащенные метками
активного и неактивного хроматина — НЗК4теЗ
и НЗК27теЗ [Bernstein etal., 2006]. Данные до-
мены были обнаружены в ЭС-клетках мыши и
человека [Azuara et al., 2006; Bernstein et al.,
2006; Pan et al., 2007; Zhao et al., 2007]. Гены,
точки старта транскрипции которых ассоцииро-
ваны с бивалентными доменами, характеризуют-
ся низким уровнем транскрипции, несмотря на
наличие метки активного хроматина НЗК4теЗ,
что говорит о «доминировании» НЗК27теЗ по
отношению к НЗК4теЗ. Кроме НЗК27теЗ и
НЗК4теЗ в бивалентных доменах обнаружен
высокий уровень варианта гистона Н2А—H2AZ
[Creyghton etal., 2008]. Большинство бивалент-
ных доменов ассоциированы с точками начала
транскрипции генов, задействованных в разви-
тии, например, транскрипционных факторов из
семейств НОХ, SOX, FOX, PAX, IRX и POU
[Bernstein et al., 2006]. В ходе дифференцировки
происходит преобразование большинства бива-
лентных доменов в моновалентные, содержащие
либо НЗК27теЗ, либо НЗК4теЗ, в зависимости
от типа дифференцированных производных
[Bernstein et al., 2006; Mikkelsen et al., 2007]. Од-
нако часть доменов остается в бивалентном со-
стоянии и присутствует в эпигеномах клеток-
предшественников [Mikkelsen et al., 2007; Mohn
etal., 2008]. В целом, существование бивалент-
ных доменов и сохранение меток активного
хроматина в премоторных областях генов, за-
действованных в поддержании недифференци-
рованного состояния, позволяет быстро пере-
ключать программу’ транскрипции генов при
дифференцировке в те или иные производные.
12.2. Взаимодействие транскрипционных
ФАКТОРОВ СИСТЕМЫ ПОДДЕРЖАНИЯ
ПЛЮРИПОТЕНТНОСТИ С БЕЛКАМИ ГРУППЫ
Polycomb и ремоделирующими
ХРОМАТИН ФАКТОРАМИ
Существование в ЭС-клетках так называемо-
го открытого хроматина и одновременная на-
дежная репрессия генов дифференцировки обес-
печиваются системой взаимодействий как на
уровне белок—ДНК, так и на уровне белок—бе-
лок. Исследования протеомов плюрипотентных
клеток и, в частности, белков, образующих ос-
новную систему’ поддержания плюрипотентно-
сти (ОСТ4, NANOG, SOX2), показали, что они
не только взаимодействуют между’ собой, регу-
лируя транскрипцию множества генов, но и об-
разуют сложную сеть взаимодействий с другими
транскрипционными факторами и белками, уча-
ствующими в модификациях и ремоделинге
хроматина. Белки, участвующие в поддержании
плюрипотентности, взаимодействуют с компо-
нентами таких белковых комплексов, как PRC1
320 ЭПИГЕНЕТИКА
и 2, BAF, NuRD и других [Wang etal., 2006;
Liang et al., 2008; Pardo et al., 2010; van den Berg
et al., 2010].
12.3. Белки группы Polycomb.
Комплексы PRC1 и 2
Белки группы Polycomb являются эволюци-
онно консервативным семейством регуляторов
структуры хроматина, функция которых заклю-
чается в установлении и поддержании транс-
крипционного сайленсинга гомеозисных генов
[Ringrose. 2006, 2007; Hauenschild et al., 2008].
У млекопитающих известно два белковых
комплекса, относящихся к семейству Poly comb:
PRC1 (Polycomb Repressive Complexes 1) и
PRC2, которые выполняют важнейшие функции
в эмбриональном развитии, а также в поддержа-
нии самообновления и нормальной дифференци-
ровки стволовых клеток.
Комплекс PRC 1 млекопитающих состоит
из нескольких субъединиц, имеющих гомологи
v дрозофилы: СВХ 1, 2 и 3, MEL18, ВМП,
RING1A (RING1), RING1B (RNF2) и РНС1, 2 и
3. Функцией PRC1 считается поддержание ре-
прессии транскрипции генов, которая первона-
чально устанавливается комплексом PRC2. Реа-
лизуется данная функция благодаря активности
субъединиц RING1A и 1В. которые являются
ЕЗ-лигазами и производят моноубиквитини-
лирование гистона Н2А в положении К119
(H2AK119Ubl) [de Napoles etal., 2004; Wang
et al., 2004; Elderkin et al., 2007]. Мыши, мутант-
ные по генам, кодирующим субъединицы PRC1
(кроме RING1B), сохраняют жизнеспособность,
что может говорить о существовании дублирую-
щих механизмов либо об избыточности функции
PRC 1 для нормальной регуляции эмбрионально-
го развития мыши [Voncken et al.. 2003]. Однако
установлено, что компоненты комплекса PRC1,
например ВМП, необходимы для функциониро-
вания нескольких типов региональных стволо-
вых клеток (гематопоэтических, нейральных,
стволовых клеток легких и кишечника) [Lessard,
Sauvageau, 2003; Molofsky et al., 2003; Park et al.,
2003; Dovey etal., 2008]. Интересно, что функ-
ция BMIJ и PRC1 в региональных стволовых
клетках, по всей видимости, сводится к контро-
лю системы регу’ляции уровня активных форм
кислорода в митохондриях [Liu et al., 2009]. Кро-
ме того, показано, что делеция RING1A и 1В вы-
зывает спонтанную дифференцировку- ЭС-клеток
мыши и активацию генов, задействованных
в дифференцировке клеток и развитии. Интерес-
но, что в промоторах большого числа генов, ре-
прессируемых PRC1, обнаружено связывание с
транскрипционным фактором ОСТ4, который
также принимает участие в репрессии транс-
крипции данных генов. При этом связывание
PRC1 с генами-мишенями является ОСТ4-зави-
симым, а связывание ОСТ4, напротив, PRC1-
независимое [Endoh etal., 2008]. Протеомные
исследования показывают, что RING 1В (RNF2)
физически взаимодействует с транскрипцион-
ным фактором NANOG в ЭС-клетках [Wang
et al., 2006]. Данные факты говорят о тесной свя-
зи между- системой транскрипционных факто-
ров. поддерживающих плюрипотентность, и сис-
темой регуляторов структуры хроматина, в част-
ности, с PRC1.
Недавно была обнаружена новая функция
белков СВХ, которые являются одними из ком-
понентов PRC1, в регу’ляции самообновления и
дифференцировки ЭС-клеток мыши [Morey et al.,
2012; O'Loghlen etal., 2012] (рис. 12.1). У млеко-
питающих известно пять белков СВХ. ассоции-
рованных с комплексом PRC1, — СВХ2, СВХ4,
СВХ6, СВХ7 и СВХ8 [Morey, Helin, 2010]. С ис-
пользованием методов ChlP-Seq (иммунопреци-
питация хроматина с последующим секвениро-
ванием обогащенной ДНК) и коиммунопреципи-
тации было показано, что в недифференциро-
ванных ЭС-клетках мыши 97 % сайтов связы-
вания белка СВХ7 содержат комплексы PRC1
и PRC2, а 86 % из них также маркированы
НЗК27теЗ. Несколько из этих сайтов, располо-
женных в пределах генов, задействовано в раз-
витии, например, в кластере генов семейства
НОХ [Morey, Helin, 2010].
В друтой работе был использован количест-
венный протеомный анализ, который также по-
казал, что в недифференцированных ЭС-клетках
мыши только СВХ7 солокализуется с НЗК27теЗ.
в то время как в дифференцированных клетках и
фибробластах с данной модификацией гистона
взаимодействуют СВХ2 и СВХ8 [O'Loghlen et al.,
2012]. Кроме того, эксперименты по иммунопре-
ципитации хроматина показали, что СВХ7 в
комплексе с PRC1 взаимодействует с промото-
рами генов Cbx2, СЬх4 и СЬх8, подавляя их
транскрипцию в ЭС-клетках [Morey etal.. 2012].
Во время дифференцировки, напротив, в комп-
лекс с PRC1 вступают СВХ2, СВХ4 и СВХ8 и
могут участвовать в репрессии Cbx7 [Morey
etal., 2012; O'Loghlen etal., 2012]. Подавление
экспрессии Cbx7 в ЭС-клетках вызывает повы-
шение экспрессии генов Cbx2, СЬх4 и СЬх8, на-
рушение морфологии ЭС-клеток и спонтанную
ГЛАВА 12 321
а
Плюрипотентные клетки
б
Дифференцированные клетки
СЬх7
СЬх7
miR-125, miR-181
Гены дифференцировки
и развития
miR-125, miR-181
miR-125
miR-181
Гены плюрипотентности
и Cbx7
Рис. 12.1. Модель, иллюстрирующая роль белков СВХ в регуляции функции PRC1 в плюрипотентных
клетках и при дифференцировке.
а — в плюрипотентных клетках комплекс CBX7/PRC1 связывается с регуляторными областями генов, задействован-
ных в развитии и дифференцировке, а также генов, кодирующих белки СВХ2, 4 и 8, подавляя их транскрипцию. При
этом связывание комплекса зависит от присутствия метки НЗК27теЗ, устанавливаемой комплексом PRC2. б — во
время дифференцировки активируется экспрессия микроРНК miR-125 и miR-181, которые подавляют экспрессию
СВХ7. Исчезновение комплекса CBX7/PRC1 вызывает активацию генов дифференцировки, а также генов СЬх2, 4 и 8.
Комплекс PRC1 с белками СВХ2, СВХ4 и СВХ8 подавляет транскрипцию генов, ответственных за поддержание плю-
рипотентности и гена Cbx7 [Camahort, Cowan, 2012].
дифференцировку. Эктопическая, повышенная
экспрессия СЬх7, напротив, подавляет диффе-
ренцировку и инактивацию Х-хромосомы в клет-
ках самок, а также усиливает самообновление
[O'Loghlen etal., 2012]. Кроме того, было пока-
зано, что в подавлении транскрипции СЬх7 за-
действованы микроРНК miR-125 и miR-181, что
подтверждает тот факт, что микроРНК также
принимают важное участие в регуляции дейст-
вия белков Polycomb |O'Loghlen etal., 2012]. Та-
ким образом, в регуляции самообновления и
дифференцировки ЭС-клеток принимает участие
динамическая система комплексов PRC1 с бел-
ками СВХ, взаимно-регулирующих друг друга,
действие которых зависит от PRC2 (НЗК27теЗ),
а их комбинации меняются в зависимости от
статуса клетки (см. рис. 12.1).
Белковый комплекс PRC2 млекопитающих со-
держит субъединицы EED (Embryonic Ectoderm
Development), SUZ12 (Suppressor of Zeste 12) и
322 ЭПИГЕНЕТИКА
EZH1 (Enhancer of Zeste 1) или EZH2 (Enhancer of
Zeste 2). Субъединица EZH2 является белком, со-
держащим SET-домен, который присутствует у
белков, функционирующих как гистон-метил-
транферазы. осуществляя ди- и триметилирова-
ние гистона НЗ в положении К27 (H3K27me2/3).
В отличие от PRC1, мутации генов субъединиц
PRC2 вызывают значительные нарушения эмб-
рионального развития и приводят к гибели эмб-
риона [Shumacher etal., 1996; Voncken etal.,
2003; Pasini et al., 2007]. Например, в эмбрионах,
мутантных по гену Eed, отсутствует метилиро-
вание НЗК27, наблюдаются нарушение гастру-
ляции (нарушение паттерна первичной полоски
в переднезаднем направлении), гипертрофия вне-
зародышевой мезодермы и недоразвитие эмб-
риональной мезодермы [Faust et al., 1995; Shu-
macher et al., 1996]. Однако из мутантных no Eed
бластоцист можно получить ЭС-клетки, обла-
дающие свойством плюрипотентности, хотя и
имеющие тенденцию к спонтанной дифферен-
цировке [Chamberlain etal.. 2008]. Сходная си-
туация наблюдается и у мутантов по Suzl2. Му-
тантные по Suzl2 эмбрионы мыши гибнут во
время развития, а ЭС-клетки можно получить ус-
пешно. Хотя полученные из мутантных эмбрио-
нов ЭС-клетки имеют высокий уровень транс-
крипции генов дифференцировки, они не обра-
зуют нейроны при дифференцировке in vitro и
очень слабо формируют энтодермальные произ-
водные при формировании эмбриоидных телец
[Pasini et al., 2007]. Делеция гена Ezh2 вообще не
приводит к каким-либо изменениям свойств ЭС-
клеток, полученных из мутантных эмбрионов,
хотя это можно объяснить действием субъеди-
ницы EZH1, также обладающей гистон-метил-
трансферазной активностью и опосредующей ус-
тановление метки неактивного хроматина в пре-
делах генов-мишеней PRC2 [Shen et al.. 2008].
Недавно было обнаружено, что одной из
субъединиц комплекса PRC2 является белок
JARID2, относящийся к семейству JUMONJI С
(JMJ С). Белки семейства JUMONJI являются
гистон-деметилазами, однако JARID2 не облада-
ет такой активностью. Показано, что JARID2 не-
обходим для эффективного связывания PRC1 и
PRC2 с промоторами генов-мишеней, а также,
что паттерн связывания PRC2 и JARID2 с ДНК
генов-мишеней в масштабе генома ЭС-клеток
мыши совпадает более чем на 90 % [Peng et al.,
2009; Shen et al., 2009; Landeira et al., 2010; Li G.
et al., 2010; Pasini et al., 2010; Zhang et al., 2011а].
Существует множество противоречивых экспе-
риментальных данных о влиянии нокаута или
нокдауна гена Jarid2 на уровень НЗК27теЗ в
промоторах генов-мишеней PRC2. В некоторых
работах наблюдали понижение уровня НЗК27теЗ
[Landeira etal., 2010; Li G. etal., 2010; Pasini
etal.. 20101, в работе Пенг с соавторами не на-
блюдали изменения [Peng et al., 2009], в работе
Шен с соавторами и вовсе отмечали повышение
уровня H3K27me3 [Shen et al., 2009]. Однако по-
казано, что у 1АРЮ2-дсфицитных ЭС-клеток
наблюдается нарушение или замедление процес-
са дифференцировки, т. е. JARID2 каким-то об-
разом влияет на плюрипотентность [Shen et al.,
2009; Landeira etal.. 2010; Pasini etal.. 2010].
Кроме того. JARID2 совместно с белками MTF2
и esPRC2p48 способен усиливать эффективность
получения индуцированных плюрипотентных
стволовых клеток из эмбриональных фиброблас-
тов мыши с помощью сверхэкспрессии генов
Oct4, Sox2 и Klf4, при этом нокаут генов, коди-
рующих JARID2, MTF2 и esPRC2p48, напро-
тив, существенно подавляет репрограммирова-
ние [Zhang et al.. 201 lb|.
Существует несколько гипотез о молекуляр-
ных основах влияния JARID2 на плюрипотент-
ность клеток, ни одна из которых пока не нашла
достаточных экспериментальных доказательств
[Landeira, Fisher, 2011]. Возможно, что основная
функция JARID2 заключается не в модулирова-
нии гистон-метилтрансферазной активности PRC2,
а в привлечении особой инициирующей формы
РНК-полимеразы II [Landeira et al., 2010; Landei-
ra, Fisher, 2011] (рис. 12.2). Данная форма РНК-
полимеразы фосфорилирована по серину- в пя-
том положении (Ser5P-RNAP) (элонгирующая
форма дополнительно форфорилирована по се-
рину- во втором положении) и характерна для би-
валентных доменов генома, в формировании ко-
торых принимают участие PRC 1 и PRC2 [Guent-
her et al.. 2007; Stock et al.. 2007]. По всей види-
мости, наличие данной формы полимеразы в пре-
делах промоторов генов, задействованных в диф-
ференцировке клеток, необходимо для быстрого
и надежного переключения программ транс-
крипции при запуске процесса дифференци-
ровки.
Таким образом, можно заключить, что PRC2
играет важнейшую роль в регуляции развития
млекопитающих и дифференцировки ЭС-клеток,
но, в то же время, данный комплекс не оказывает
влияния на процесс получения ЭС-клеток и на
их самообновление. На сегодняшний момент
существует множество экспериментальных дока-
зательств совместной регуляции генов-мишеней
комплексом PRC2 и транскрипционными факто-
ГЛАВА 12 323
Дифференцированные клетки
Рис. 12.2. Белок JARID2 необходим для привлечения SerS-фосфорилированной формы РНК-полимеразы II в
бивалентные домены эпигенома ЭС-клеток мыши.
В плюрипотентных клетках формирование «бивалентных доменов» требует наличия РНК-полимеразы II, фосфорилированной
по серину в пятом положении (зеленый овал) в промоторных областях генов, экспрессия которых подавляется комплексом
PRC2. Субъединицы комплекса PRC2 осуществляют метилирование НЗК27, которое, в свою очередь, привлекает комплекс
PRC1, осуществляющий моноубиквитинилирование Н2АК119 [Landeira, Fisher, 2011].
рами ОСТ4, SOX2 и NANOG, находящимися в
центре системы регуляции транскрипции генов в
ЭС-клетках мыши и человека. Исследования,
проводимые в масштабе целых геномов, показа-
ли, что ОСТ4, SOX2, NANOG и субъединицы
PRC2 солокализуются в пределах генов, ответст-
венных за развитие, внутриклеточную передачу’
сигналов, морфогенез и органогенез, и, следова-
тельно, могут действовать совместно [Boyer
et al., 2005, 2006; Bernstein et al., 2006; Lee et al.,
2006].
12.4. Комплекс Trithorax (trxG)
Белки комплекса Trithorax являются одними
из основных регуляторов эмбрионального раз-
вития как беспозвоночных, так и позвоночных
животных [Ringrose, Pare, 2004]. В развитии
комплекс Trithorax действует противоположно
белкам группы Polycomb, устанавливая модифи-
кацию НЗК4теЗ, которая, в основном, ассоци-
ирована с активацией транскрипции генов. В от-
личие от комплексов PRC1 и PRC2, роль белков
Trithorax в поддержании плюрипотентности кле-
ток изучена слабо [Ang et al.. 2011]. Как и у бес-
позвоночных животных, у млекопитающих Trit-
horax представляет собой мультисубъединичный
комплекс, содержащий гистон-метилтрансфера-
зы SET/MLL. Сами по себе ферменты SET/MLL
неактивны и требуют наличия основных субъ-
единиц комплекса — WDR5, ASH2L и RBBP5 [Don
etal., 2006]. При этом известно, что гетеродимеры
ASH2L и RBBP5 напрямую участвуют в гистон-
метилтрансферазной активности комплекса MLL1
[Cao etal., 2010]. Кроме того, существуют экс-
периментальные доказательства того, что белок
ASH2L необходим для нормального эмбриогене-
за и процесса инактивации Х-хромосомы у са-
мок мыши [Pullirsch etal., 2010]. Субъединица
WDR5 также является основным компонентом
комплекса Trithorax млекопитающих. Ее функ-
ция заключается в «представлении» остатков
НЗК4, осуществлении эффективного взаимодей-
ствия всего комплекса с НЗК4 и его гистон-ме-
тилтрансферазной активности [Don etal., 2006].
Кроме того, известно, что WDR5 опознает
НЗК4те2 и опосредует переход НЗК4 в триме-
тилированное состояние (H3K4me3) [Wysocka
etal., 2005]. Недавно было обнаружено, что
WDR5 не только необходим для нормального
развития позвоночных, но и играет важнейшую
роль в поддержании плюрипотентности ЭС-
клеток и репрограммировании клеток к плюри-
потентному’ состоянию [Ang etal., 2011]. Уста-
новлено, что подавление экспрессии WDR5 рез-
ко снижает самообновление ЭС-клеток мыши.
Протеомные исследования позволили устано-
вить, что WDR5 физически взаимодействует с
транскрипционным фактором ОСТ4 в недиффе-
ренцированных ЭС-клетках и спектры мишеней
этих двух белков в значительной степени пере-
крываются. Таким образом, показано, что ком-
плекс Trithorax, совместно с транскрипционны-
ми факторами ОСТ4, SOX2 и NANOG, позитив-
но регулирует транскрипцию генов в ЭС-клетках
мыши. Более того, комплекс Trithorax (WDR5)
324 ЭПИГЕНЕТИКА
необходим для эффективного образования кло-
нов ИПСК в экспериментах по репрограммиро-
ванию соматических клеток [Ang et al., 2011].
12.5. Комплекс BAF
Многочисленные исследования показывают,
что АТФ-зависимые белковые комплексы, ремо-
делирующие хроматин, играют важнейшую роль
в эмбриональном развитии млекопитающих в
целом и в поддержании плюрипотентности кле-
ток в частности [Kim etal., 2001; Lessard etal.,
2007; Wu et al., 2007; Ho et al., 2009a, b; Wu et al.,
2009]. У млекопитающих известно около 30 бел-
ков, являющихся АТФ-зависимыми фермента-
ми, ремоделирующими хроматин. Данные белки
объединены в несколько семейств в соответст-
вии со структурой АТФазного домена. В клет-
ках млекопитающих ремоделирующие хроматин
АТФазы взаимодействуют друг с другом и с
другими белками и действуют в составе белко-
вых комплексов, состоящих из нескольких субъ-
единиц. Примерами таких комплексов могут
служить BAF, NuRD, ISWI. Белковый комплекс
BAF участвует в перераспределении нужлеосом
хроматина и присутствует во всех типах клеток.
Однако состав субъединиц этого комплекса мо-
жет различаться в клетках разных типов, за счет
чего и осуществляется специфичный для каждо-
го типа клеток контроль структуры хроматина.
ЭС-клетки содержат комплекс BAF, названный
esBAF. Данный комплекс, в свою очередь, со-
стоит из специфичного набора субъединиц Brg,
BAF155 и BAF60a, при этом в нем отсутствуют
такие суъединицы, как BRM, BAF170 или
BAF60c [Но etal., 2009а, Ь]. Экспериментально
показано, что инактивация большинства субъ-
единиц комплекса BAF вызывает гибель эмбрио-
нов мыши на ранних стадиях развития и онко-
генное перерождение клеток [Roberts et al., 2000;
Guidi etal., 2001; Kim etal., 2001; Bultman etal.,
2006; Gao etal., 2008]. Кроме того, известно,
что в случае потери субъединиц BRG, BAF47
и BAF155 эмбриональная гибель происходит
вследствие нарушения формирования плюрипо-
тентных клеток. Масштабный скрининг библио-
тек интерферирующих РНК также показал, что
такие субъединицы, как BRG и BAF155, необхо-
димы для поддержания морфологии колоний
ЭС-клеток и экспрессии гена Nanog [Fazzio et al.,
2008; Schaniel et al., 2009]. Протеомные исследо-
вания показали, что несколько субъединиц бел-
ковых комплексов, ремоделирующих хроматин,
физически взаимодействуют с белками ОСТ4 и
NANOG в ЭС-клетках [Wang etal., 2006; Liang
etal., 2008; Ho etal., 2009a, b; Pardo etal., 2010;
van den Berg et al., 2010].
Транскрипционные факторы OCT4 и NANOG
могут взаимодействовать с комплексами, ремо-
делирующими структуру хроматина через спе-
цифические белки [Wang et al., 2006; Seki et al.,
2010]. Например, показано, что белок скаффолда
хромосом TIFlb (Transcription Intermediary Fac-
tor-lb) необходим для поддержания активности
трансгена GFP под контролем промотора Oct4 в
ЭС-клетках [Hu etal., 2009]. Интересно, что ра-
нее TIFlb был известен как белок, участвующий
в транскрипционном сайленсинге и формирова-
нии гетерохроматина через привлечение гетеро-
хроматинового белка НР1, гистон-метилтрансфе-
разы SETDB1 и NuRD. Однако фосфорилиро-
ванная форма TIFlb может взаимодействовать
со специфичной для ЭС-клеток формой ком-
плекса BAF, локализуется в эухроматинс и спо-
собна влиять на эффективность получения инду-
цированных плюрипотентных стволовых клеток
[Seki et al., 2010]. Кроме того, было установлено,
что сверхэкспрессия специфичных для ЭС-кле-
ток компонентов этого комплекса BRG1 и
BAF155 повышает эффективность ре программи-
рования соматических клеток в отсутствие
сверхэкспрессии гена с-Мус [Singhal etal., 2010;
Не etal., 2012].
Недавно было показано, что комплекс esBAF
напрямую связан с работой сигнального каскада
LIF-STAT3, который необходим для поддержа-
ния плюрипотентности ЭС-клеток мыши [Matsu-
da etal., 1999; Но etal., 2011]. Ранее было из-
вестно, что транскрипционный фактор STAT3
активирует группы генов в разных типах клеток,
в которых существуют специфические комплек-
сы BAF, и только в ЭС-клетках он участвует в
регуляции набора генов-мишеней, которая необ-
ходима для сохранения недифференцированного
статуса ЭС-клеток. То, однако, каким образом
осуществляется такое специфическое действие
STAT3, долгое время оставалось неизвестным.
В работе, выполненной Л. Хо с соавторами,
установлено, что в геноме ЭС-клеток мыши свя-
зывание STAT3 с сайтами-мишенями зависит от
присутствия BRGL АТФазной субъединицы спе-
цифичного для ЭС-клеток комплекса esBAF.
Действие BRG1, в пределах сайтов связывания
STAT3, создает структуру хроматина, строго не-
обходимую для активации соответствующих ге-
нов интерлейкином LIF. Делеция BRG1 вызыва-
ет опосредованный PRC2 транскрипционный
сайленсинг множества генов в масштабе всего
ГЛАВА 12 325
генома, посредством установления модификации
гистона НЗК27теЗ. В том числе транскрипци-
онному’ сайленсингу подвергаются гены-мишени
STAT3. На основании этих фактов авторы за-
ключают. что основная роль BRG1 в ЭС-клетках
мыши заключается в усилении действия сиг-
нального каскада LIF-STAT3 и противодействии
подавляющему' влиянию на данный каскад бел-
ков Polycomb (PRC2). Интересно, что BRG1 мо-
жет действовать совместно с Polycomb, усиливая
подавление экспрессии генов дифференцировки,
например, генов семейства НОХ. Таким обра-
зом, комплекс esBAF действует как антагони-
стично, так и синергично с PRC2, однако оба ти-
па действия направлены на поддержание плю-
рипотентности [Но et al., 2011] (рис. 12.3).
12.6. Комплекс NuRD
Белковый комплекс NuRD (Nucleosome Re-
modeling Deacetylase) млекопитающих, который
проявляет АТФ-зависимую ремоделирующую и
гистон-деацетилазную активность), состоит ми-
нимум из шести субъединиц [Denslow, Wade,
2007; McDonel et al., 2009]. NuRD содержит гис-
тон-деацетилазы HDAC1 и HDAC2, активность
которых зависит от наличия хромодомен-содер-
жащих АТФазных субъединиц Mi2a и Mi2b.
Кроме того, в состав комплекса входят белки,
связывающие метилированный цитозин MBD 1,2
и 3 (Methyl-CpG-Binding Protein), белки МТА1, 2 и
3 (Metastasis-associated protein), WD40-coдepжa-
щие белки RbAP46 и RbAP48, а также два бел-
ка, содержащие домены типа цинковый палец —
рбба и рббЬ. Показано, что несколько субъеди-
ниц комплекса NuRD важны для поддержания
плюрипотентности и дифференцировки ЭС-кле-
ток. Эмбриональные стволовые клетки с делети-
рованным геном, кодирующим MBD3. сохраня-
ют жизнеспособность и экспрессию маркеров
плюрипотентности, однако при этом нарушается
их способность к дифференцировке как in vitro,
так и in vivo при формировании химерных жи-
вотных [Kaji etal., 2006]. Однако в одной из бо-
лее поздних работ было показано, что нокаут
Mbd3 в ЭС-клетках мыши вызывает повышение
уровня транскрипции таких генов, как Cdx2.
Eomesodermin и Handl, являющихся маркерами
трофобласта, и повышение уровня ацетилирова-
ния гистона НЗ в премоторных областях этих
генов. Более того, при культивировании нокаут-
ных клеток в среде для трофобластных стволо-
вых клеток наблюдалась дифференцировка в
клетки трофобласта экспрессирующие CDX2 и
LIF
Рис. 12.3. Схема совместного действия esBAF и PRC2
при поддержании плюрипотентности.
esBAF и PRC2 могут действовать как синергично, так и анта-
гонистично. Комплекс esBAF действует антагонистично по
отношению к PRC2 при регуляции генов-мишеней сигнально-
го каскада LIF—STAT3, подготавливая структуру хроматина
для активации фосфорилированной формой STAT3 (зеленая
стрелка). В то же время esBAF действует совместно с PRC2,
репрессируя транскрипцию генов семейства НОХ (красные
линии с тупыми кодами). Однако уровень экспрессии генов
плюрипотентности может активироваться или репрессиро-
ваться esBAF (синяя стрелка) [Но et al., 2011].
CADHERIN 3 [Zhu et al., 2009]. В экспериментах
in vivo было показано, что MBD3 необходим
для развития эпибласта из клеток внутренней
клеточной массы (ВКМ) после имплантации.
В МВОЗ-дефицитных эмбрионах наблюдается
нормальный уровень экспрессии генов плюри-
потентности Oct4, Nanog и Sox2 и их генов-ми-
шеней, однако отмечается нарутпение нормаль-
ного замолкания их транскрипции после им-
плантации. Культивируемые ВКМ МВОЗ-дсфи-
цитных эмбрионов, напротив, практически не
способны формировать линии плюрипотентных
ЭС-клеток, хотя формирутот значительное коли-
чество энтодермальных производных [Kaji et al.,
2007].
В ЭС-клетках мыши существует специфиче-
ское подсемейство комплексов NuRD, названное
NODE (NANOG and ОСТ4 associated Deacety-
lase). В качестве су’бъединиц комплекс NODE
326 ЭПИГЕНЕТИКА
содержит гистон-деацетилазы HDAC 1 и HDAC2,
а также белки МТА1 и 2, однако практически не
содержит (выявляются в субстехиометрических
количествах) субъединицы MBD3 и RBBP7.
Кроме того, данный комплекс интересен тем. что
физически взаимодействует с транскрипцион-
ными факторами ОСТ4 и NANOG в ЭС-клетках
мыши [Liang et al., 2008]. Комплекс NODE обла-
дает деацетилазной активностью, которая осу-
ществляется независимо от MBD3. Нокаут ге-
нов, кодирующих субъединицы NODE, вызывает
повышение экспрессии генов, ответственных за
дифференцировку и, как следствие, диффе-
ренцировку ЭС-клеток в различные клеточные
производные. Эксперименты по подавлению
трансляции Mtal показали, что, в отличие от
MBD3, который необходим для подавления
транскрипции генов, поддерживающих недиф-
ференцированное состояние клетки, МТА1 не-
обходим для подавления генов дифференциров-
ки, например, таких как Gata6 и Тох А 2 [Ibid].
Таким образом, в ЭС-клетках существует как
минимум два подсемейства комплесов NuRD,
действующих разнонаправленно: MBD3-содер-
жащие комплексы, регулирующие (подавляю-
щие) транскрипцию генов плюрипотентности
(таких как Oct4, Nanog и Sox2 и др.), и необхо-
димые для дифференцировки ЭС-клеток в раз-
личные клеточные производные и дифференци-
ровки клеток в раннем эмбриональном развитии,
а также HDAC1, HDAC2 и МТА1-содержащие
комплексы, взаимодействующие с белками ОСТ4
и NANOG и участвующие в активации транс-
крипции генов, отвечающих за поддержание не-
дифференцированного состояния клеток.
Недавно было установлено, что MBD3-содер-
жащий комплекс NuRD необходим для установ-
ления модификации НЗК27теЗ комплексом
PRC2 в пределах промоторов генов, задейство-
ванных в развитии и дифференцировке. Таким
образом, NuRD не просто выполняет функцию
репрессора транскрипции генов, но и ответствен
за установление баланса между- ацетилиро-
ванием и метилированием НЗК27 в эмбриональ-
ных стволовых клетках [Reynolds etal., 2011].
Однако это не единственный пример взаимо-
действия белковых комплексов, ремоделирую-
щих хроматин в ЭС-клетках. Комплекс NuRD, а
именно его субъединица MBD3, тесно взаимо-
действует с esBAF (BRG1) в ЭС-клетках мыши
[Yildirim etal., 2011]. Субъединицы MBD3 и
BRG1 солокализуются в пределах точек старта
транскрипции и разнонаправленно регулируют
транскрипцию обширного набора генов в ЭС-
клетках. Более того, показано, что MBD3 и
BRG1 играют важную роль в регуляции генной
транскрипции через гидроксиметилирование ци-
тозинов. Субъединица MBD3 солокализуется
с белком ТЕТ1 и 5-гидроксиметилцитозинами
(hmCyt) in vivo, при этом связывание MBD3
с промоторами зависит от присутствия ТЕТ1.
Эксперименты, проведенные in vitro, показали,
что MBD3 эффективнее связывается с 5-гидро-
ксиметилцитозинами, чем с 5-метилцитозинами,
при этом нокаут гена Mbd3 приемущественно
влияет на транскрипцию генов, маркированных
hmCyt, а наличие MBD3 и BRG1 необходимо
для поддержания уровня 5-гидроксиметилиро-
вания [Yildirim et al., 2011].
Ранее считалось, что 5-гидроксиметилиро-
вание ДНК является всего лишь промежуточным
состоянием в процессе деметилирования 5-ме-
тилцитозинов [Bhutani etal., 2011]. Однако было
обнаружено, что нокаут генов из семейства Tet,
которые кодируют белки, осуществляющие гид-
роксилирование 5-метилнитозинов, вызывает на-
рушение процессов дифференцировки (Tetl,
Tet2) и самообновления (Tetl) ЭС-клеток [Tahi-
liani etal., 2009; Ito etal., 2010; Koh etal., 2011].
Кроме того, известно, что состояние 5-гидрокси-
метилирования ДНК может занимать продолжи-
тельное время в процессе раннего эмбриональ-
ного развития и, возможно, выполнять регуля-
торные функции [Inoue. Zhang, 2011b; Iqbal et al..
2011]. Все представленные факты говорят о том,
что 5-гидроксиметилирование может быть само-
стоятельным регуляторным состоянием эпиге-
нома, а комплексы NuRD и esBAF играют важ-
нейшую роль в реализации его регуляторного
потенциала. В то же время, само 5-гидроксиме-
тилирование ДНК непосредственно влияет на
совместное регуляторное действие NuRD и es-
BAF.
12.7. Комплекс Tip60—р400
Комплекс Tip60—р400 обладает гистон-аце-
тилтрансферазной активностью, а также ремоде-
лирующей активностью и может выступать как
активатор и репрессор транскрипции [Ikura et al.,
2000; Cai etal.. 2003]. Кроме того, установлено,
что Tip60—р400 участвует в замене форм гисто-
нов H2AZ—Н2В [Sapountzi et al., 2006; Squatrito
etal., 2006]. Эмбрионы, нокаутные по генам
Tip60 и Trrap, кодирующим субъединицы Tip60—
р400, гибнут перед имплантацией [Herceg et al.,
2001; Gorrini etal., 2007]. Подавление трансля-
ции нескольких субъединиц Tip60—р400 в ЭС-
ГЛАВА 12 327
клетках с помощью РНК-интерференции пока-
зало, что комплекс Tip60—р400 важен для нор-
мального самообновления и дифференцировки
клеток. Эксперименты по иммунопреципитации
хроматина показали, что р400 солокализуется с
белком NANOG и меткой активного хроматина
НЗК4теЗ в недифференцированных ЭС-клетках
мыши. Показано, что спектры генов-мишеней
NANOG и Tip60—р400 в значительной степени
перекрываются. Более того, наличие NANOG и
НЗК4шеЗ необходимо для связывания Tip60—
р400 с генами-мишенями, который, в свою оче-
редь, осуществляет ацетилирование гистона Н4
[Fazzio et al., 2008].
12.8. Прямая регуляция генов, кодирующих
БЕЛКИ, МОДУЛИРУЮЩИЕ СТРУКТУРУ
ХРОМАТИНА, ТРАНСКРИПЦИОННЫМИ
ФАКТОРАМИ ОСНОВНОЙ СИСТЕМЫ
ПОДДЕРЖАНИЯ ПЛЮРИПОТЕНТНОСТИ
Кроме взаимодействия с белковыми комплек-
сами, транскрипционные факторы, входящие в
систему поддержания плюрипотентности, могут
напрямую регулировать гены, кодирующие фер-
менты, модифицирующие хроматин. В ЭС-клет-
ках транскрипционный фактор ОСТ4 активирует
гены, кодирующие деметилазы JMJD1A/KDM2A
и JMJD2C/KDM4B, которые осуществляют де-
метилирование НЗК9ше2 и НЗК9шеЗ соответст-
венно. Кроме того, показано, что KDM2A и
KDM4B в свою очередь осуществляют демети-
лирование в области промоторов генов Tell и
Nanog соответственно [Loh et al., 2007].
Транскрипционные факторы, регулирующие
плюрипотентность, взаимодействуют с промото-
рами генов, кодирующих белки, участвующие в
глобальной регу’ляции структуры хроматина.
Например, обнаружено, что такие факторы, как
ОСТ4, SOX2, NANOG, SMAD1, ZFX и E2F1,
связаны с промотором гена Chdl [Chen et al.,
2008]. Этот ген кодирует фермент, участвующий
в ремоделинге хроматина. С помощью двух хро-
модоменов CHD1 связывается с гистоном НЗ,
ди- и триметилированным в положении К4, ко-
торый является меткой активного хроматина и
транскрибирующихся генов [Sims etal., 2005].
Подавление экспрессии Chdl в ЭС-клетках мы-
ши не влияет на самообновление, однако смеща-
ет дифференцировку ЭС-клеток в нейрональное
направление [Gaspar-Maia et al., 2009].
В формировании глобальной структуры хро-
матина может принимать участие фактор UTF1
(Undifferentiated Embryonic Cell Transcription Fac-
tor 1), который транскрибируется на высоком
уровне в недифференцированных ЭС-клетках
мыши. Этот белок связан с хроматином и был
локализован в регуляторных областях более
1700 генов, значительная часть из которых пе-
рекрывается с ранее идентифицированными ге-
нами-мишенями транскрипционных факторов
NANOG, ОСТ4, KLF-4, C-MYC и REX1. Сниже-
ние экспрессии UTF1 приводит к повышению
уровня экспрессии большинства регулируемых
им генов и вызывает нарушение дифференци-
ровки ЭС-клеток. Это говорит о том, что UTF1 в
основном является репрессором транскрипции
генов, которые задействованы в дифференци-
ровке клеток [Kooistra etal., 2010]. Ранее было
известно, что энхансерный элемент, располо-
женный в З'-нетранслируемой области гена Utfl,
селективно связывается с транскрипционными
факторами ОСТ4 и SOX2 [Nishimoto et al., 1999].
Таким образом, в ЭС-клетках существуют ре-
гуляторы структуры хроматина, такие как CHD1
и UTFL экспрессия генов которых напрямую ре-
гулируется транскрипционными факторами,
входящими в основную внутреннюю систему’
поддержания плюрипотентности клеток.
12.9. Метилирование ДНК
и ПЛЮРИПОТЕНТНОСТЬ
Метилирование ДНК, наряду с ковалентными
модификациями гистонов, является основным
механизмом регу’ляции клеточных процессов у
млекопитающих [Cedar, Bergman, 2009]. На се-
годня известно, что метилирование ДНК задей-
ствовано в таких фундаментальных явлениях и
процессах, как эмбриогенез, дифференцировка
клеток, геномный импринтинг, канцерогенез, ре-
гуляция транскрипции мобильных элементов ге-
нома. инактивация Х-хромосомы у самок мле-
копитающих [Li et al., 1992; Okano et al., 1999;
Bestor, 2000; Lippman et al., 2004; Reik, 2007;
Straussman et al., 2009].
Безусловно, метилирование ДНК играет важ-
нейшую роль в регуляции самообновления и
плюрипотентности клеток [Fouse et al., 2008].
Промоторы основных генов, задействованных в
поддержании плюрипотентности и самообнов-
ления ЭС-клеток, таких как Oct4 и Nanog. гипо-
метилированы в недифференцированных клет-
ках и гиперметилированы в трофобластных ство-
ловых и соматических клетках [Hattori et al.,
2004, 2007]. При дифференцировке клеток в
культуре или во время эмбрионального развития
промоторы генов, поддерживающих самообнов-
328 ЭПИГЕНЕТИКА
ление, подвергаются метилированию, в котором
задействованы ДНК-метилтрансферазы DNMT1,
DNMT3A и DNMT3B [Li J. etal., 2007]. Нокаут
генов, кодирующих ДНК-метилтрансферазы
DNMTL DNMT3A и DNMT3B. вызывает нару-
шение эмбрионального развития и дифференци-
ровки ЭС-клеток in vitro [Li et al., 1993; Kaneda
etal., 2004; Ueda etal., 2006; Li J. etal., 2007].
Однако ЭС-клетки мыши с одновременно нокау-
тированными генами Dnmtl, Dnmt3a и Dnmt3b
сохраняют свойство самообновления [Tsumura
etal., 2006]. Метилирование ДНК, осуществляе-
мое DNMT3A и DNMT3B, участвует в надежной
репрессии генов плюрипотентности в эмбрио-
нальном развитии. Показано, что гистон-метил-
трансфераза G9a, устанавливающая модифика-
цию хроматина НЗК9теЗ в районе промотора
гена Oct4, привлекает в данную область гетеро-
хроматиновый белок НР1 и ДНК-метилтранс-
феразы [Feldman et al., 2006].
В геномах млекопитающих метилированию
подвергаются остатки цитозина в составе CpG-
динуклсотидов [Bird, 2002]. В плюрипотентных
клетках наблюдается пониженный уровень ме-
тилирования CpG-богатых промоторов (содер-
жащих так называемые CpG-островки), часто ас-
социированных с генами «домашнего хозяйства»,
и повышенный уровень метилирования CpG-
обедненных промоторов [Fouse et al., 2008; Meis-
sner et al., 2008]. Большинство CpG-обедненных
промоторов содержат метку активного хромати-
на— НЗК4шеЗ. По всей видимости, установле-
ние НЗК4шеЗ осуществляется за счет связыва-
ния неметилированных CpG-островков белком
CPF1, который ассоциирован с гистон-метил-
трансферазой SETD1 [Thomson etal., 2010].
В свою очередь, метилирование НЗК4 может
«защищать» промоторы генов от действия ДНК-
метилтрансфераз [Ooi et al.. 2007].
Исследования последних лет показывают, что
в геномах ЭС-клеток и ИПСК значительная
часть (до 25 % в ЭС-клетках человека) метили-
рованных остатков цитозина находится вне
CpG [Ramsahoye et al., 2000; Lister et al., 2009,
2011], причем He-CpG-метилированис наблюда-
ется в основном в экзонах генов, а не в их регу-
ляторных областях [Lister et al.. 2009; Lister et al..
2011]. В одной из работ показано, что паттерн
распределения не-СрО-метилирования в различ-
ных линиях плюрипотентных клеток очень ва-
риабелен, а в некоторых дифференцированных
клетках он практически отсутствует. Кроме того,
показано, что нокаут генов DNMT3A и DNMT3B
в ЭС-клетках человека вызывает резкое умень-
шение уровня не-СрО-метилирования [Ziller
etal., 2011].
Многие экспериментальные данные говорят о
том, что репрограммирование соматических кле-
ток к плюрипотентному' состоянию (получение
ИПСК) сопровождается глобальным изменением
метилома в сторону' состояния, характерного для
плюрипотентных клеток [Mikkelsen et al., 2008;
Lagarkova et al., 2010; Lister et al., 2011]. Демети-
лированию подвергаются промоторы генов, уча-
ствующих в поддержании самообновления, на-
пример, таких генов как Oct4 и Nanog [Okita
et al.. 2007; Takahashi et al.. 2007; Yu et al.. 2007].
В процессе репрограммирования могут быть за-
действованы ДНК-деметилазы, такие как ТЕТ1 и
AID. Показано, что фермент ТЕТ1, катализи-
рующий конверсию 5-метилцитозина в 5-гидро-
ксиметилцитозин, важен для поддержания само-
обновления ЭС-клеток мыши и регулирует ме-
тилирование ДНК в промоторе гена Nanog [Ito
etal., 2010]. Кроме того, на модели репрограм-
мирования с помощью образования гибридных
клеток между' ЭС-клетками мыши и фибробла-
стами человека показано, что деметилаза AID
необходима для деметилирования промоторов
генов ОСТ4 и NANOG человека [Bhutani et al.,
2010]. Важность деметилирования для осущест-
вления репрограммирования клеток подтвержда-
ется еще и тем, что применение ингибиторов
ДНК-метилтрансфераз позволяет повысить эф-
фективность получения ИПСК [Mikkelsen et al.,
2008; Shi et al., 2008а].
12.10. Факторы плюрипотентности
В РЕГУЛЯЦИИ ПРОЦЕССА ИНАКТИВАЦИИ
Х-ХРОМОСОМЫ
Инактивация Х-хромосомы является слож-
ным процессом, события которого происходят в
раннем эмбриогенезе млекопитающих. У мыши
уже во время первых делений дробления зиготы
происходит импринтированная инактивация X-
хромосомы, унаследованной от самца. При фор-
мировании бластоцисты Х-хромосома реактиви-
руется в клетках внутренней клеточной массы
(ВКМ). Во время гаструляции и дифференци-
ровки клеток ВКМ происходит случайная инак-
тивация одной из двух хромосом [Sado et al.,
2001; Mak et al., 2004; Okamoto et al., 2004; Шев-
ченко и др., 2006]. Процесс инактивации кон-
тролируется определенным локусом, располо-
женным на Х-хромосоме, названным центром
инактивации [Chureau et al., 2002]. В данный ло-
кус входят несколько генов, однако основными
ГЛАВА 12 329
регуляторами процесса инактивации считают
гены Xist и Tsix, которые транскрибируются ан-
типараллельно друг другу и кодируют нетранс-
лируемые ядерные РНК [Brockdorff et al., 1992;
Lee etal., 1999]. Показано, что РНК Xist транс-
крибируется моноаллельно с неактивной Х-хро-
мосомы, покрывает неактивную хромосому и
способствует появлению модификаций, соответ-
ствующих неактивному’ хроматину’ [Brockdorff
etal., 1992]. Ген Tsix, напротив, является нега-
тивным регулятором гена Xist и транскрибирует-
ся с активной хромосомы [Lee, Lu, 1999]. По-
скольку' события инактивации происходят в ран-
нем эмбриогенезе, исследование их динамики и
молекулярных основ является сложной задачей,
практически не выполнимой для такого объекта
как человек. Вследствие этого, наиболее адек-
ватными и используемыми в настоящий момент
моделями для исследования процесса инактива-
ции Х-хромосомы стали линии плюрипотентных
клеток, которые получают из предымплантаци-
онных эмбрионов (ЭС-клетки) или в результате
репрограммирования соматических клеток (ин-
дуцированные плюрипотентные стволовые клет-
ки, ИПСК) мыши и человека. Однако многочис-
ленные исследования статуса Х-хромосом и мо-
лекулярно-генетические исследования регуляции
процесса инактивации выявили ряд различий
между мышью и человеком.
Эмбриональные стволовые клетки самок мы-
ши, получаемые из предымплантационных бла-
стоцист (3,5 д.п.о.), сохраняют многие свойства
клеток ВКМ, в частности, способны поддержи-
вать в ряду’ митотических делений обе активные
Х-хромосомы [Mak etal., 2004]. При дифферен-
цировке ЭС-клеток мыши наблюдается случай-
ная инактивация одной из двух хромосом. При
этом данное свойство ЭС-клеток мыши является
воспроизводимым и стабильным [Mak et al.,
2004; Okamoto et al., 2004].
В случае с ЭС-клетками человека, которые
тоже получают из бластоцист (5—9 д.п.о.), дело
обстоит несколько сложнее [Thomson et al., 1998].
Масштабный анализ множества линий ЭС-кле-
ток человека показал, что их можно разделить на
три класса [Silva et al., 2008]. К первому классу
относятся ЭС-клетки, имеющие две активные X-
хромосомы. которые подвергаются случайной
инактивации в процессе дифференцировки, дан-
ный класс соответствует ЭС-клеткам мыши. Во
второй класс входят линии ЭС-клеток, в которых
одна из хромосом является неактивной, наблю-
дается транскрипция гена XIST, при этом клет-
ки сохраняют все признаки плюрипотентности.
К третьему классу относятся линии, в которых
одна из Х-хромосом является неактивной, одна-
ко транскрипции XIST не наблюдается даже при
дифференцировке клеток. Неактивные Х-хромо-
сомы в линиях второго класса несут метки не-
активного хроматина, такие как НЗК27теЗ,
Н4К20те и вариант гистона макроН2А. Инте-
ресно, что линии третьего класса практически
лишены меток неактивного хроматина, в то же
время, молекулярно-генетический анализ показы-
вает присутствие признаков подавления транс-
крипции большинства генов неактивных хромо-
сом [Ibid],
То, что плюрипотентность и эпигенетический
статус Х-хромосом не связаны между собой в
плюрипотентных стволовых клетках человека,
показано и на примере ИПСК. ИПСК мыши, как
и ЭС-клетки, имеют две активные Х-хромосомы
(в клетках, полученных от самок), одна из кото-
рых подвергается случайной инактивации при
запуске дифференцировки [Maherali etal., 2007].
Однако было показано, что у человека ИПСК
могут иметь все характерные черты плюрипо-
тентных клеток, при этом имея одну’ неактив-
ную Х-хромосому, т. е. соответствовать второму’
классу ЭС-клеток [Tchieu etal., 2010]. Однако
статус Х-хромосом может меняться в процессе
репрограммирования, в результате чего могут
получаться субклоны, соответствующие первому’
и третьему’ классам ЭС-клеток. В некоторых ра-
ботах отмечено, что реактивация неактивной
Х-хромосомы все-таки может происходить при
репрограммировании соматических клеток чело-
века [Lagarkova et al., 2010]. По всей видимости,
меняя условия культивирования клеток, можно
добиться получения клонов ЭС-клеток и ИПСК,
несущих активные хромосомы. Например, не-
давно было показано, что культивирование кле-
ток в условиях физиологической концентрации
кислорода (5 %) может значительно усилить эф-
фективность получения ЭС-клеток человека пер-
вого класса. Различные физиологические стрес-
сы могут, напротив, вызывать переход клеток во
второй и третий классы, согласно статусу Х-хро-
мосом [Lengner etal., 2010]. Кроме того, показа-
но, что сверхэкспрессия KLF4 в присутствии на-
бора ингибиторов сигнальных путей в ЭС-
клетках и ИПСК человека также может приво-
дить к реактивации неактивной Х-хромосомы
[Hanna etal., 2010]. Это говорит о том, что ста-
тус Х-хромосом в плюрипотентных клетках че-
ловека нестабилен.
Несмотря на то, что связь между’ состоя-
нием плюрипотентности клеток мыши и стату-
330 ЭПИГЕНЕТИКА
Xite
Рис. 12.4. Транскрипционные факторы плюрипотентности в регуляции процесса инактивации Х-хромосомы
(Х7с).
а — схема центра инактивации Х-хромосомы мыши. Красным цветом выделен ген Xist, зеленым Tsix, черным цветом вы-
делены активаторы данных генов — Rnf12 и Xite соответственно. В недифференцированных ЭС-клетках самок мыши
транскрипционные факторы ОСТ4, SOX2 и NANOG связываются с первым интроном Xist и Rnf12 , подавляя их транскрип-
цию. В то же время белки ОСТ4, SOX2, KLF4, REX1 и c-MYC связываются с регуляторными областями Tsix и Xite, активи-
руя их транскрипцию, б— в ЭС-клетках самок мыши происходит активация гена Tsix и подавление Xist белками, участ-
вующими в поддержании плюрипотентности. Во время дифференцировки происходит инактивация одной из Х-хромосом.
Инактивация является многостадийным процессом, включающим инициацию инактивации, установление и поддержание
транскрипционного сайленсинга. Инициация процесса инактивации связана со снижением экспрессии факторов плюрипо-
тентности и включением в процесс инактивации регуляторов структуры хроматина, например, SATB1 и PRC2. Сверхэкс-
прессия таких факторов, как ОСТ4, SOX2, NANOG и c-MYC, в соматических клетках вызывает репрограммирование к плю-
рипотентному состоянию, которое сопровождается реактивацией неактивной Х-хромосомы [Orkin, Hochedlinger, 2011].
ГЛАВА 12 331
сом Х-хромосом в эмбриогенезе и культуре до-
статочно очевидна, до недавнего времени не су-
ществовало прямых доказательств связи данных
феноменов на молекулярном уровне. Однако она
была обнаружена между’ транскрипционными
факторами и регуляцией генов Xist и Tsix. На-
пример, было установлено, что транскрипцион-
ные факторы NANOG, ОСТ4 и SOX2 имеют по-
тенциальные сайты связывания в первом интро-
не гена Xist и связаны с ним в недифференци-
рованных ЭС-клетках мыши [Navarro et al., 2008]
(рис. 12.4). Нокаут генов Oct4 и Nanog вызывает
активацию транскрипции Xist. Таким образом,
факторы плюрипотентности могут оказывать по-
давляющее действие на экспрессию гена Xist по
Ул/х-нсзависимому механизму’ [Ibid]. Позже бы-
ло установлено, что факторы NANOG, ОСТ4 и
SOX2 могут опосредованно подавлять транс-
крипцию Xist, репрессируя экспрессию его акти-
ватора — Rnfl 2, при этом удаление первого Xist
не вызывает инактивации Х-хромосомы [Barakat
et al., 2011; Navarro et al.. 2011] (см. рис. 12.4).
Кроме этого, показано, что факторы, участ-
вующие в поддержании плюрипотентности и ре-
прессии Xist, могут быть задействованы в ак-
тивации транскрипции гена Tsix [Navarro et al.,
2010] (см. рис. 12.4). Так, связывание факторов
ОСТ4, SOX2 и KLF4 обнаружено в районе эн-
хансера Xite, хотя в других работах это взаимо-
действие не было подтверждено [Donohoe et al.,
2009]. Связывание REXI, c-MYC и KLF4 обна-
ружено в регуляторном элементе DXPas34. Ус-
тановлено, что REX1 больше необходим для
элонгации РНК Tsix, чем для сборки транскрип-
ционного комплекса. Таким образом, все пере-
численные выше исследования подтверждают
связь системы поддержания плюрипотентности
и активного статуса обеих Х-хромосом в недиф-
ференцированных ЭС-клетках мыши. Подобные
закономерности не действуют в ЭС-клетках че-
ловека. Трансгены XIST человека продолжают
быть активными в ЭС-клетках мыши, несмотря
на наличие факторов, поддерживающих плюри-
потентность. По всей видимости, в регуляции
генов XIST и TSIX человека задействованы иные
механизмы, например, метилирование ДНК.
В ЭС-клетках мыши промотор Xist метилирован
лишь частично, даже на активной хромосоме, и
транскрипция гена, видимо, репрессируется
транскрипционными факторами. В ЭС-клетках
человека первого типа промотор XIST метилиро-
ван практически на 100 %. Кроме этого, разница
может быть объяснена тем, что ЭС-клетки чело-
века по своим свойствам (паттерн экспрессии
генов, чувствительность к сигнальным молеку-
лам) сильно сходны с эпибластными стволовыми
клетками мыши, в которых наблюдается инакти-
вация одной из Х-хромосом, несмотря на нали-
чие экспрессии факторов плюрипотентности
[Tesar et al., 2007].
По всей видимости, исследование статуса X-
хромосом в ИПСК человека должно стать одним
из пунктов в стандартном наборе тестов вновь
получаемых линий, наряду с анализом экспрес-
сии маркеров плюрипотентности, исследованием
паттерна транскрипции генов и дифференциров-
ки. Выбирая клоны клеток с инактивированной
отцовской или материнской хромосомой, воз-
можно избирательно получать линии с неактив-
ными мутантными аллелями, а следовательно,
клетки, которые можно применять как материал
для терапии болезней, сцепленных с Х-хро-
мосомой.
12.11. Эпигенетические
СОБЫТИЯ, ПРОИСХОДЯЩИЕ
ПРИ РЕПРОГРАММИРОВАНИИ КЛЕТОК
К ПЛЮРИПОТЕНТНОМУ состоянию.
«Эпигенетическая память»
Репрограммирование соматических клеток к
плюрипотентному’ состоянию сопровождается
глобальным изменением эпигеномов клеток
[Maherali et al.. 2007; Mikkelsen et al.. 2008; Mat-
tout etal., 2011]. В настоящие время для повы-
шения эффективности получения ИПСК челове-
ка и мыши применяют ряд химических ингиби-
торов ферментов, задействованных в формиро-
вании структуры хроматина. В частности, при-
менение ингибитора гистон-метилтрансферазы
G9a (BIX-01294), ингибиторов ДНК-метилтранс-
фераз (5'-азацитидин. RG108) и гистон-деацети-
лаз (вальпроевая кислота, TSA. SAHA, бутират
натрия) позволяет увеличить эффективность ре-
программирования в десятки раз [Huangfu et al.,
2008а, b; Shi etal., 2008a, b; Mali etal., 2010;
Medvedev etal., 2011]. Более того, недавно был
выяснен механизм действия аскорбиновой ки-
слоты (витамина С) на эффективность получения
ИПСК [Wang etal., 2011].
Ранее было известно, что аскорбиновая кис-
лота может существенно повышать (от 3,8 до
8,75 %) эффективность репрограммирования фиб-
робластов и стволовых клеток жировой ткани,
однако механизм ее действия оставался неиз-
вестным [Esteban etal., 2010]. Оказалось, что ос-
новным эффектором действия аскорбиновой ки-
слоты являются гистон-деметилазы JHDM1A и
332 ЭПИГЕНЕТИКА
1В. Показано, что аскорбиновая кислота вызыва-
ет опосредованное JHDM1A/1B деметилирова-
ние гистона НЗ в положении К36 (H3K36me2/3)
в культуре эмбриональных фибробластов мыши, а
также в процессе репрограммирования (рис. 12.5).
Доказано, что JHDM1A/1B необходимы для ре-
программирования и участвуют в ускорении
клеточного цикла и подавлении старения клеток
путем репрессии локуса Ink4,Arf (см. рис. 12.5).
Известно, что высокий темп деления клеток и
подавление механизмов старения и апоптоза яв-
ляются необходимыми условиями полного и эф-
фективного репрограммирования соматических
клеток [Hong et al., 2009: Kawamura et al., 2009: Li
etal., 2009; Marion etal., 2009; Ruiz etal., 2011].
Более того, Jhdmla/lb совместно с транскрипци-
онным фактором ОСТ4 участвуют в активации
экспрессии кластера микроРНК 302/367, который
также задействован в процессе репрограммирова-
ния клеток |Anokye-Danso etal., 2011; Miyoshi
et al., 2011; Wang et al., 2011] (см. рис. 12.5).
Интересные данные о роли ферментов, задей-
ствованных в путях метилирования гистонов и
ДНК, получены Т. Ондером с соавторами [Onder
et al., 2012]. В данной работе был проведен стри-
нинг набора интерферирующих РНК для подав-
ления трансляции двадцати двух генов, продук-
ты которых задействованы в метилировании ДНК
Рис. 12.5. Схема совместного действия аскорбиновой
кислоты (витамина С) и Jhdm1a/1b на процесс репро-
граммирования соматических клеток к плюрипотент-
ному состоянию.
Витамин С и Jhdml а/1 b противостоят старению клеток путем
подавления действия белков р53/р21 и Ink4/Arf. Кроме того,
аскорбиновая кислота и комплекс Jhdml b с Oct4 активируют
экспрессию кластера микроРНК 302/367, что также усиливает
эффективность репрограммирования [Wang et al., 2011 ].
и гистонов. Было обнаружено, что подавление
трансляции мРНК генов, кодирующих компо-
ненты комплексов PRC1 (ВМП, RING1) и PRC2
(EZH2, EED, SUZ12), существенно снижает эф-
фективность репрограммирования фибробластов
человека. Кроме того, снижение эффективности
наблюдалось при подавлении ЕНМТ1 и SETDB1,
кодирующих НЗК9 гистон-метилтрансферазы.
Среди генов, подавление трансляции которых,
напротив, существенно повышало эффектив-
ность репрограммирования, были YY1, SUV39H1
и DOT1L. Ген YY1 кодирует белок, который, в
зависимости от контекста, может быть активато-
ром или репрессором транскрипции, SUV39H1
кодирует НЗК9 гистон-метилтрансферазу, а
DOT1L НЗК79 гистон-метилтрансферазу. Ос-
новное внимание в своем исследовании авторы
уделили DOT1L. Было показано, что подавление
экспрессии DOT1L с помощью РНК-интерферен-
ции или химическое ингибирование DOT1L мо-
жет заменить KLF4 и c-MYС в экспериментах по
получению ИПСК из фибробластов человека.
Кроме того, ингибирование DOT1L на ранних
стадиях репрограммирования приводит к акти-
вации генов NANOG и LIN28, которые также ис-
пользуются для репрограммирования клеток че-
ловека. Анализ распределения НЗК79ше2 в
масштабе всего генома показал, что гены, экс-
прессия которых специфична для фибробластов
и ассоциированные с эпителиально-мезенхи-
мальным переходом, теряют дайную модифика-
цию на ранних стадиях репрограммирова-
ния. Ингибирование DOT1L ускоряет стирание
НЗК79ше2 в пределах генов, которые подверга-
ются транскрипционному замолканию в ИПСК
[Onder et al., 2012].
Все эти факты говорят о важнейшей роли
системы эпигенетических регуляторов в процес-
се репрограммирования.
Высокопроизводительные методы анализа
показывают, что ИПСК и ЭС-клетки очень сход-
ны между’ собой по паттерну’ экспрессии генов и
состоянию эпигеномов как на уровне метилиро-
вания ДНК, так и на уровне распределения кова-
лентных модификаций гистонов НЗК27шеЗ и
НЗК4шеЗ, за исключением незначительных разли-
чий [Guenther et al., 2010: Lagarkova et al., 2010].
Несмотря на то, что на молекулярном уровне
ИПСК и ЭС-клетки очень сходны, ряд исследо-
ваний показал, что отдельные линии ИПСК мо-
гут обладать некоторыми характерными особен-
ностями транскриптомов и эпигеномов, а также
сохранять ряд эпигенетических черт, свойствен-
ных исходным соматическим клеткам [Chin
ГЛАВА 12 333
etal., 2009; Newman, Cooper, 2010; Bock etal.,
2011; Nishino etal., 2011]. Эффект сохранения
некоторых черт эпигеномов соматических пред-
шественников называют «эпигенетической па-
мятью» [Kim et al.. 2010; Bar-Nur et al.. 2011].
Современные методы молекулярно-генети-
ческого анализа позволяют исследовать метили-
рование ДНК и распределение ковалентных мо-
дификаций гистонов в масштабе всего генома
с очень большим разрешением. Примером подоб-
ного исследования может служить работа Р. Лис-
тера с соавторами [Lister et al., 2011]. Здесь при-
менили метод MethilC-Seq. Метод позволяет ис-
следовать метилирование остатков цитозина на
уровне всего генома с разрешением в один нук-
леотид. Авторы постарались избежать возмож-
ного влияния способа получения ИПСК и типа
соматических клеток на результаты своего ана-
лиза. Они включили в работу пять линий ИПСК:
одну’ линию, полученную с помощью ретрови-
русной трансдукции генами ()( Т4. SOX2, KLF4 и
c-MYC клеток жировой ткани, вторую линию,
полученную с помощью лентивирусной транс-
дукции фибробластов легкого IMR90 генами
ОСТ4, SOX2, NANOG и LIN28, и три линии, по-
лученные с использованием неинтегрирующихся
эписомных векторов из фибробластов крайней
плоти. Кроме того, в исследование были включе-
ны две линии ЭС-клеток, а также трофобластные
производные ИПСК и ЭС-клеток. дифференци-
рованные с применением ВМР4. Таким образом,
в результате был определен статус метилирова-
ния 75,7—94,5 % всех цитозинов геномов в один-
надцати линиях клеток. Интересно, что авторы
сфокусировали свое внимание не только на мети-
лировании цитозинов в составе CpG-динуклсоти-
дов, но и на не-СрО-метилировании (СрН, где
Н = А, С или Т). Анализ показал, что в масштабе
геномов ИПСК и ЭС-клетки человека имеют
сходный паттерн метилирования. Геномы плюри-
потентных клеток в среднем более метилированы,
чем геномы соматических клеток. Серьезные раз-
личия наблюдаются на уровне СрН-метилирова-
ния. В соматических клетках, включая стволовые
клетки жировой ткани, наблюдается крайне низ-
кий уровень такого типа метилирования, в то
время как в ИПСК и ЭС-клетках доля метилиро-
ванных цитозинов в составе динуклсотидов СрН
составляет 20—30 % от всех метилированных ци-
тозинов геномов. Более того, как и в ЭС-клетках,
в ИПСК обогащение метилированных СрН на-
блюдается в составе экзонов и интронов.
Интересно, что, несмотря на общее сходство
исследованных метиломов ЭС-клеток и ИПСК,
был выявлен ряд отличий. Анализ показал нали-
чие 1175 дифференциально метилированных об-
ластей (ДМО) между ЭС-клетками и ИПСК,
длина которых варьирует в пределах от 1 до
11 т.п.н.. а в совокупности составляющих
1,68 м.п.н. Между двумя линиями ЭС-клеток,
взятых в анализ при тех же условиях, подобных
ДМО не выявлено. Обнаруженные между ЭС-
клетками и ИПСК дифференциально метилиро-
ванные области можно подразделить на две
группы. В первую группу входят ДМО, являю-
щиеся следствием «наследования» паттерна ме-
тилирования от соматических клеток предшест-
венников ИПСК (44—49 % от общего числа об-
наруженных). Во вторую групп}- входят ДМО,
паттерн метилирования которых отличается и от
соматических клеток, и от ЭС-клеток, т. е. яв-
ляющихся специфичными для ИПСК, такие
ДМО составляют 51—56 % от общего числа об-
наруженных. Расположение ДМО варьирует меж-
ду пятью изученными линиями ИПСК, 62 %
встречаются в двух из пяти линий и 16 % во всех
пяти линиях. Данные районы можно считать «го-
рячими точками» эпигенетического репрограм-
мирования, которые требуют повышенного вни-
мания при проведении экспериментов по полу-
чению ИПСК. Значительное число ДМО (80 %)
ассоциированы с CpG-островками, 62 % локали-
зуются возле или в генах, 29 и 19 % находятся в
пределах 2 т.п.н. от точек старта или термина-
ции транскрипции генов соответственно. Био-
информационный анализ функций генов, лока-
лизованных рядом с ДМО, встречающихся во
всех проанализированных ИПСК, не выявил
четкого преобладания генов, вовлеченных в оп-
ределенные клеточные процессы. Это говорит о
том, что нарушение метилирования, происходя-
щее при репрограммировании, может захваты-
вать множество клеточных функций. Еще одной
важной выявленной закономерностью является
преобладание (109 из 130, или 92 %) гипомети-
лирования в ДМО, выявленных во всех пяти ли-
ниях. Это говорит о том, что нарушения репро-
граммирования метилома при получении ИПСК
могут быть связанны с недостаточным метили-
рованием.
Внимательный анализ и сравнение СрН-мети-
лирования между ЭС-клетками и ИПСК также
выявили ДМО. Всего выявлено 29 областей, кото-
рые характеризуются большой протяженностью
(половина из них более 1 м.п.н. в длину’, самая
протяженная область 4,8 м.п.н.), общая протя-
женность СрН—ДМО составляет 32,4 млн п.н.
Большая часть СрН—ДМО гипометилированы
334 ЭПИГЕНЕТИКА
в ИПСК по сравнению с ЭС-клетками и локали-
зуются около центромер и теломер хромосом.
Кроме того, эти области характеризуются нали-
чием обогащения триметилированным по лизину
в положении 9 гистоном НЗ (НЗК9теЗ) и соло-
кализуются с гиперметилированными CpG—
ДМО. Большая часть генов, локализованных в
этих областях, имеет повышенный уровень ме-
тилирования премоторных областей и, как след-
ствие, сниженный уровень транскрипции. Инте-
ресно, что в данных районах наблюдается сни-
жение уровня метки неактивного хроматина —
НЗК27теЗ. Таким образом, в ИПСК человека
были выявлены протяженные области, ассоции-
рованные с прицентромерными и прителомер-
ными районами, которые характеризуются на-
рушением паттерна CpG- и СрН-метилирования,
аберрантным распределением мадификаций гис-
тонов и нарушенным уровнем транскрипции ге-
нов. Безусловно, данные «горячие точки» эпиге-
номов должны подвергаться тщательному ис-
следованию при получении новых линий ИПСК
человека [Lister et al., 2011].
Исследование CpG-метилирования в двадца-
ти двух линиях ИПСК человека, полученных из
различных типов соматических клеток (клетки
эндометрия, клетки эпителия пупочной вены,
клетки амниона, фетальные фибробласты легко-
го, клетки менструальной крови), также выявило
различия с ЭС-клетками [Nishino etal., 2011].
Для анализа использовали ДНК-микрочип, со-
держащий пробы на 24273 CpG-сайта в пределах
13728 генов. Авторы обнаружили 1459 CpG-сай-
тов, соответствующих 1260 генам, которые диф-
ференциально метилированы при сравнении
всех линий ИПСК и ЭС-клеток. Однако число и
распределение данных сайтов значительно варь-
ировали в различных линиях ИПСК. Вероятно,
это связано с тем, что линии были получены из
различных типов соматических клеток. Из два-
дцати двух линий только в пятнадцати были об-
щими двадцать сайтов. Интересно, что повышен-
ное число подобных сайтов было обнаружено в
ИПСК, имеющих набор половых хромосом XX.
Сравнение этих данных с результатами работы
Р. Листера с соавторами [Lister etal., 2011] вы-
явило 72 промотора генов, характеризующихся
дифференциальным метилированием в обоих ис-
следованиях. Однако в работе К. Нишино с соав-
торами [Nishino etal., 2011] было показано, что
большинство ДМО гиперметилированы в ИПСК
по сравнению с ЭС-клетками, и постулируется
тезис о том, что геном ИПСК более метилиро-
ван. В работе Р. Листера, напротив, отмечается
недостаток метилирования CpG-динуклсотидов
в ИПСК. Однако подобные различия вполне мо-
гут быть объяснены различными подходами к
анализу. В частности, тем, что в работе К. Ни-
шино анализировались CpG, расположенные в
основном в пределах CpG-островков, локализо-
ванных в премоторных областях генов, а в рабо-
те Р. Листера с соавторами исследовалось мети-
лирование большинства остатков цитозина всего
генома. Кроме того, в статье К. Нишино ясно
показано, что аберрантное гиперметилирование
значительно снижается на более поздних пасса-
жах (30—40) по сравнению с ранними (4—6). В
работе Р. Листера использовались линии ИПСК,
прошедшие десятки пассажей.
В ранних работах по получению ИПСК мыши
и человека подчеркивалось удивительное сходст-
во транскриптомов и эпигеномов данных клеток
с транскриптомами и эпигеномами ЭС-клеток.
Кроме того, было показано, что на уровне всего
генома в общем масштабе происходит макси-
мально полное изменение паттерна транскрип-
ции генов соматических клеток. Однако позже
было установлено, что ИПСК сохраняют неко-
торые, чаще очень малые, признаки соматиче-
ских транскриптомов и эпигеномов [Stadtfeld
etal., 2010]. Несмотря на кажущуюся незначи-
тельность неполного репрограммирования от-
дельных локусов, оно может существенно вли-
ять на свойства полученных плюрипотентных
клеток, меняя их способность к дифференциров-
ке. Например, в одной из работ сравнение транс-
криптомов ЭС-клеток и ИПСК мыши показало
большое сходство на уровне транскрипции
мРНК и микроРНК, за исключением нескольких
транскриптов. В частности, в некоторых клонах
ИПСК наблюдался аберрантный сайленсинг им-
принтированного локуса DlklDio3. При этом
сайленсинг наблюдался в ИПСК. полученных из
гематопоэтических предшественников, которые
также имеют низкий уровень транскрипции в
данном локусе. Авторы предположили, что дан-
ный эффект является следствием «эпигенетиче-
ской памяти». Нарушение транскрипции в локу-
се Dlkl Dio3 приводит к тому, что ИПСК не-
эффективно образуют химеры и не способны
формировать организм мыши при тетраплоид-
ной комплементации. Интересно, что обработка
вальпроевой кислотой, ингибитором деацетилаз
гистонов, приводит к активации транскрипции в
локусе Dlkl Dio3 и восстановлению способнос-
ти ИПСК к тетраплоидной комплементации и
эффективному образованию химерных живот-
ных [Stadtfeld et al., 2010].
ГЛАВА 12 335
Исследованию влияния происхождения ИПСК
на характер их дифференцировки посвящен ряд
интересных работ. Например, было проведено
сравнение свойств ИПСК мыши, полученных из
гематопоэтических и нейрональных предшест-
венников, а также фибробластов с ЭС-клетками.
Эмбриональные стволовые клетки, взятые в ис-
следование, были разного происхождения: из
бластоцист, полученных в результате переноса
ядер из соматических клеток, и бластоцист, по-
лучившихся в результате естественного оплодо-
творения. В результате проделанных экспери-
ментов было сделано несколько интересных вы-
водов. Во-первых, тип соматических клеток
очень сильно влияет на эффективность и качест-
во репрограммирования. ИПСК, полученные из
гематопоэтических клеток, были ближе по моле-
кулярно-генетическим характеристикам к ЭС-
клеткам, в то время как ИПСК из фибробластов
давали исключительно частично репрограмми-
рованные клоны. Наиболее близки к ЭС-клеткам
оказались ИПСК, полученные из нейрональных
предшественников. Во-вторых, анализ метили-
рования ДНК выявил различия между ИПСК и
плюрипотентными клетками, полученными из
эмбрионов. Как и в более ранних работах, было
обнаружено наличие множества ДМО между’
ИПСК и плюрипотентными клетками, получен-
ными из эмбрионов. ИПСК, полученные из ней-
рональных предшественников и фибробластов,
имеют остаточное метилирование в локусах, от-
ветственных за формирование гематопоэтичес-
кой линии, что сказывается на сниженном уров-
не дифференцировки этих ИПСК в соответст-
вующем направлении. В-третьих, ограничения
направлений дифференцировки ИПСК, имею-
щих то или иное происхождение, могут быть
сняты. Например, если дифференцировать ИПСК,
полученные из нейрональных предшественни-
ков, в клетки гематопоэтического ряда, а затем
получить из этих производных вторичные ИПСК,
эти вторичные ИПСК будут иметь более высо-
кий потенциал к дифференцировке в клетки кро-
ви. Кроме того, воздействие веществ, влияющих
на эпигеном, например, ингибиторов деацетилаз
гистонов и метилирования ДНК, таких как три-
хостатин А и 5-азацитидин, может существенно
снижать влияние происхождения клеток на их
дифференцировку [Kim etal., 2010]. Следует от-
метить, что для данного исследования были взя-
ты ИПСК на очень ранних пассажах. Аберрант-
ное метилирование цитозинов на ранних пасса-
жах и, как следствие, нарушения в паттерне экс-
прессии генов и дифференцировке ИПСК были
обнаружены в других исследованиях. Например,
исследование транскриптома и дифференциров-
ки ИПСК мыши, полученных из фибробластов,
В-лимфоцитов, гранулоцитов костного мозга и
клеток предшественников скелетных мышц, по-
казало наличие «эпигенетической памяти», ко-
торая проявляется на уровне транскрипции и вы-
зывает преимущественную дифференцировку
клеток в те типы клеток, из которых они были
получены [Polo etal., 2010]. Было обнаружено,
что гены, являющиеся маркерами того или иного
типа соматических клеток, могут продолжать
экспрессироваться на высоком уровне в плюри-
потентных клетках, при этом в премоторных об-
ластях этих генов наблюдается обеднение мет-
кой неактивного хроматина — НЗК27теЗ, обо-
гащение метками активного хроматина — НЗАс
и НЗК4теЗ. В то же время разницы в метилиро-
вании промоторов этих генов найдено не было
[Polo etal., 2010]. Важным фактом является то,
что подобные нарушения транскрипции и сдвиги
в дифференцировке клеток исчезают при про-
должительном пассировании клонов ИПСК. Эти
данные, как и сходные результаты других работ,
говорят о том, что репрограммирование — про-
цесс постепенный, становление полностью ре-
программированного состояния эпигенома и
клеток в целом требует множества раундов ре-
пликации генома.
Кроме представленных работ, касающихся
нарушений репрограммирования эпигеномов и
«эпигенетической памяти» в ИПСК мыши, уже
имеется несколько работ, подтверждающих на-
личие сходного феномена при репрограммиро-
вании клеток человека. Например, показано, что
дифференцировка ИПСК, полученных из нейро-
нальных предшественников, [3-клеток поджелу-
дочной железы и пигментного эпителия сетчатки
глаза человека, может носить неслучайный ха-
рактер, т. е. направление дифференцировки силь-
но сдвинуто в сторону предкового типа сомати-
ческих клеток [Marchetto etal., 2009; Hu etal.,
2010; Bar-Nur et al., 2011]. В ИПСК, полученных
из клеток пуповинной крови и кератиноцитов
новорожденного, также наблюдается наличие
аберрантно метилированных районов, а также
«эпигенетической памяти», выражающейся в
преимущественной дифференцировке в роди-
тельский тип клеток и сохраняющейся даже в
ряду многих пассажей [Kim et al., 2011].
Таким образом, на сегодня проблема «эпиге-
нетической памяти» является одной из основных
в области получения и применения индуциро-
ванных плюрипотентных стволовых клеток. Ре-
336 ЭПИГЕНЕТИКА
шение ее — крайне актуальная задача, особенно
в свете применения ИПСК в регенеративной ме-
дицине, а также в качестве моделей заболеваний
человека. Решение данной проблемы не только
позволит полноценно использовать ИПСК чело-
века и животных в биомедицине, но и способно
дать новые, фундаментальные знания об устрой-
стве и функционировании эпигеномов клеток в
культуре и эмбриональном развитии организмов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Медведев С. П„ Шевченко А. II., Закиян С. М. Молекуляр-
ные основы самообновления и плюрипотентности эм-
бриональных стволовых клеток млекопитающих '/
Acta Naturae. 2010а. Т. 2, № 3(6). С. 38—57.
Медведев С. П, Шевченко А. II, Закиян С. hl. Индуцирован-
ные плюрипотентные стволовые клетки: проблемы и
перспективы применения в заместительной клеточной
терапии 7 Там же. 20106. Т. 2. № 2(5). С. 18—28.
Медведев С. П., Шевченко А. II., Сухих Г. Т, Закиян С. hl.
Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки /
В. В. Власов (ред.). Новосибирск: Издательство СО
РАН, 2011. 216 с.
Шевченко А. II., Павлова С. В., Дементьева Е. В., Голубе-
ва Д. В., Закиян С. М. Модификации хроматина в про-
цессе инактивации Х-хромосомы у самок млекопи-
тающих // Генетика. 2006. Т. 42, № 9. С. 1255—1234.
Aasen Т. Raya A.. BarrerohLJ., GarretaE.. Consiglio А..
Gonzalez F., Vassena R, Bilic J., PekarikV., Tiscor-
niaG., Edel hi., Boue S., Izpisua Belmonte J. C. Efficient
and rapid generation of induced pluripotent stem cells
from human keratinocytes // Nat. Biotechnol. 2008.
Vol. 26. P. 1276- -1284.’
AngY. S„ TsaiS. 1., LeeD. F, Monk J., SuJ., Ratnakumar K,
Ding J., Ge Y., Darr H., Chang B., Wang J., RendlhL,
Bernstein E., Schaniel C., Lemischka I. R Wdr5 mediates
self-renewal and reprogramming via the embryonic stem
cell core transcriptional network// Cell. 2011. Vol. 145.
P. 183—197.
Anokye-Danso E, TrivediC. hl., Juhr D., Gupta hl, Cui Z.,
Tian Y, ZhangY., Yang W., Gruber P. J., Epstein J. A.,
Morrisey E. E. Highly efficienl miRNA-mediated repro-
gramming of mouse and human somatic cells to pluripo-
tency /'Cell Stem Cell. 2011. Vol. 8. P. 376—388.
Azuara E, Perry P., SauerS., SpivakovM, Jorgensen H. F,
John RM., GoutiM., CasanovahL. Wames G. Merken-
schlagerhl, Fisher A. G. Chromatin signatures of pluripo-
tent cell lines // Nat. Cell Biol. 2006. Vol. 8. P. 532—538.
Bar-NurO., Russ H. A., EfratS., Benvenisty N. Epigenetic
memory' and preferential lineage-specific differentiation in
induced pluripotent stem cells derived from human pan-
creatic islet Beta cells// Cell Stem Cell. 2011. Vol. 9.
P. 17—23.
Barakat T. S., Gunhanlar N., PardoC. G., Achame E.M., Gha-
zvinihl., BoersR, KenterA., RentmeesterE., Groote-
goedJ. A., GribnatiJ. RNF12 activates Xist and is essen-
tial for X chromosome inactivation// PLoS Genet. 2011.
Vol. 7. P. C1002001.
Bernstein В. E., Mikkelsen T. S., XieX., Kamal hi., Huebert D. J.,
Cuff J., FryB., Meissner A., WemigM., Plath K, Jae-
nisch R, WagschalA., FeilR, Schreiber S. L., Lander E. S.
A bivalent chromatin structure marks key developmental
genes in embryonic stem cells // Cell. 2006. Vol. 125.
P. 315—326.
Bestor T. H. The DNA methyltransferases of mammals // Hum.
Mol. Genet. 2000. Vol. 9. P. 2395—2402.
BhutaniN., Brady J. J., DamianhL, Sacco A., Corbel S. Y.,
Blau H. hl. Reprogramming towards pluripotency requires
AID-dependent DNA demethylation 11 Nature. 2010.
Vol. 463. P. 1042—1047.
Bhutani N., Burns D. M, Blau H. M. DNA demethylation dy-
namics // Cell. 2011. Vol. 146. P. 866—872.
Bird A. DNA methylation patterns and epigenetic memory //
Genes Dev. 2002. Vol. 16. P. 6—21.
BockC, KiskinisE., J’erstappen G., Gu H., Boulting G.,
Smith Z. D., Tiller hl., Croft G. F, AmorosoM. W., Oak-
ley D. H., GnirkeA., Eggan K., Meissner A. Reference
Maps of human ES and iPS cell variation enable high-
throughput characterization of pluripotent cell lines // Cell.
2011. Vol. 144. P. 439 452.
BoianiM., Scholer H. R Regulatory' networks in embryo-de-
rived pluripotent stem cells // Nat. Rev. Mol. Cell Biol.
2005. Vol. 6. P. 872—884.
Boland hl. J., Hazen J. L., Nazor K. L., Rodriguez A. R, Gif-
ford W., Martin G., Kupriyanov S., Baldwin К. K. Adult
mice generated from induced pluripotent stem cells // Na-
ture. 2009. Vol. 461. P. 91—94.
Boyer L. A., Lee T. I., Cole hl. E, Johnstone S. E., Levine S. S.,
Zucker J. P., Guenther hl. G., Kumar RM., Murray H. L.,
JennerRG., GiffordD.K. MeltonD. .1., JaenischR.
YoungR. A. Core transcriptional regulatory' circuitry' in hu-
man embryonic stem cells " Cell. 2005. Vol. 122.
P. 947—956.
Boyer L. A., Plath K, Zeitlinger J., Brambrink T, MedeirosL. A.,
LeeT.L, LevineS. S., WemigM., TajonarA., Ray hl. K,
Bell G. W., Otte A. P., Fidalhl., GiffordD. K, YoungR A.,
Jaenisch R. Polycomb complexes repress developmental
regulators in murine embryonic stem cells 11 Nature. 2006.
Vol. 441. P. 349—353.
BrockdorffN., Ashworth A., Kay G.E, McCabe V.M., Nor-
ris D. P., Cooper P. J., SwiftS., Rastan S. The product of
the mouse Xist gene is a 15 kb inactive X-specifie tran-
script containing no conserved ORF and located in the nu-
cleus // Cell. 1992. Vol. 71. P. 515—526.
Bultman S. J., Gebuhr T. C, Pan H., Svoboda P., Schultz R hl.,
Magnuson T. Maternal BRG1 regulates zygotic genome
activation in the mouse // Genes Dev. 2006. Vol. 20.
p. 1744—1754.
Cai Y., Jin J., Tomomori-Sato C., SatoS., Sorokina I., Par-
melyT.J., Conaway RC., Conaway J. W. Identifica-
tion of new subunits of the multiprotein mammalian
TRRAPzTIP60-eontaining histone acetyltransferase com-
plex // J. Biol. Chem. 2003. Vol. 278. P.’42733—42736.
CamahortR, Cowan C. A. Cbx proteins help ESCs walk the
line between self-renewal and differentiation // Cell Stem
Cell. 2012. Vol. 10. P. 4—6.
CaoF, Chen 1., Cierpicki T, Liu 1., Basrur Г., Lei hl., Doti Y.
An Ash2l./RblJP5 heterodimer stimulates the MLL1 me-
thyltransferase activity' through coordinated substrate in-
teractions with the MLL1 SET domain // PLoS One. 2010.
Vol. 5. P. 614102.
Cedar H., Bergman Y. Linking DNA methylation and histone
modification: patterns and paradigms // Nat. Rev. Genet.
2009. Vol. 10. P. 295—304.
Chamberlain S. J., Yee D., Magnuson T. Polycomb repressive
complex 2 is dispensable for maintenance of embryonic
stem cell pluripotency' // Stem Cells. 2008. Vol. 26.
P. 1496—1505.
ChenX., XuH., YuanP., FangE, HtisshL, I ega Г В., WongE.,
Orlov Y.L., Zhang W., Jiang J., LohY.H., YeoH.C.,
YeoZ.X., NarangV., Govindarajan К R, LeongB., Sha-
habA., Ruan Y., Bourque G., Sting WK, Clarke N.D.,
Wei C. L., NgH. H. Integration of external signaling path-
ГЛАВА 12 337
wavs with the core transcriptional network in embryonic
stem cells // Cell. 2008. Vol. 133. P. 1106—1117.
ChinM. H, Mason M J., Xie JJ'., J'olinia S., Singer M., Peter-
son C, Ambartsumyan G., Aimiuwu O., Richter L., Zhang J.,
Khvorostov L, OttJ'., GnmsteinM., LavonN., BenvenistyN.,
Croce CM., Clark A. T, Baxter T, Pyle A. D., Teitellhl. A.,
PelegriniM., Plath K, Lowry JJ . E. Induced pluripotent
stem cells and embryonic stem cells are distinguished by
gene expression signatures // Cell Stem Cell. 2009. Vol. 5.
P. 111—123.
Chureau C, PrissettehL, BourdetA., Barbe J'., CattolicoL.,
JonesL., EggenA., AvnerP., DuretL. Comparative se-
quence analysis of the X-inactivation center region in
mouse, human, and bovine // Genome Res. 2002. Vol. 12.
P. 894—908.
Cohen D. E., Melton D. Turning straw into gold: directing cell
fate for regenerative medicine h Nat. Rev. Genet. 2011.
Vol. 12. P. 243—252.
Creyghton hi. P„ Markoulaki S., Levine S. S., Hanna J., Lo-
datoM. A., Sha K, YoungR A., JaenischR., Boyer L. A.
H2AZ is enriched at poly comb complex target genes in ES
cells and is necessary for lineage commitment П Cell.
2008. Vol. 135. P. 649—661.
de Napoleshl., Mermoud J. E., JJ’akaoR, Tang Y. A., En-
doh M., Appanah R, Nesterova T. B., Silva J., Otte A. P.,
J'idal M. Koseki H.. BrockdorffN. Poly comb group pro-
teins RinglA В link ubiquitylation of histone H2A to heri-
table gene silencing and X inactivation // Dev. Cell. 2004.
Vol. 7. P. 663—676.
Denslow S. A., JJ’adeP.A. The human Mi-2/NuRD complex and
gene regulation // Oncogene. 2007. Vol. 26. P. 5433—5438.
Donohoe hl. E., Silva S. S., Pinter S. F., Xu N., LeeJ.T. The
pluripotency factor Oct4 interacts with Ctcf and also con-
trols X-chromosome pairing and counting /z Nature. 2009.
Vol. 460. P. 128—132.
DouY., Milne T. A., Ruthenburg A. J., Lee S., Lee J. JJ’., J’er-
dine G. L., Allis C. D., Roeder R. G. Regulation of MLL1
H3K4 methvltransferase activity by its core components 11
Nat. Struct. Mol. Biol. 2006. Vol. 13. P. 713—719.
DoveyJ. S., Zacharek S. J., Kim C. F., Lees J. .1. Bmil is criti-
cal for lung tumorigenesis and bronchioalveolar stem cell
expansion // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2008. Vol. 105.
P. 11857—11862.
Elderkin S., Maertens G. N. Endoh M. Mallery D. L.. Mor-
rice N., Koseki H., Peters G., BrockdorffN., Hiom K. A
phosphorylated form of Mel-18 targets the RinglB histone
H2A ubiquitin ligase to chromatin // Mol. Cell. 2007.
Vol. 28. P. 107—120.
Endoh hl., Endo T. A., Endoh T., FujimuraY., Ohara O., To-
yodaT., Otte A. P., OkanohL, BrockdorffN., J'ida! M,
Koseki H. Poly comb group proteins RinglA/B are func-
tionally linked to the core transcriptional regulatory' cir-
cuitry' to maintain ES cell identity // Development. 2008.
Vol. 135. P. 1513—1524.
EstebanM. A., JJ'angT., QinB., YangJ., QinD., Cai J., Li JJ'.,
JJ'eng Z., Chen J., Ni S., Chen K, LiY., Liu X., Xu J.,
ZhangS., LiF, He JJ’., Labuda K, Song!'., Peter-
bauer A., JJ’olhank S., Redl H., Zhong hl., CaiD., ZengL.,
PeiD. Vitamin C enhances the generation of mouse and
human induced pluripotent stem cells 11 Cell Stem Cell.
2010. Vol. 6. P. 71- -79.
Evans M. J., Kaufman hl. H. Establishment in culture of pluri-
potential cells from mouse embryos // Nature. 1981.
Vol. 292. P. 154—156.
Faust C., Schumacher A., HoldenerB., Magnuson T. The eed
mutation disrupts anterior mesoderm production in mice 11
Development. 1995. Vol. 121. P. 273—285.
Fazzio T. G., Huff J. T, Panning B. An RNAi screen of chroma-
tin proteins identifies Tip60—p400 as a regulator of em-
bryonic stem cell identity // Cell. 2008. Vol. 134. P. 162—
174.
Feldman N., Gerson A., Fang J., LiE., Zhang Y., Shinkai Y.,
Cedar H, Bergman Y. G9-a-mediated irreversible epige-
netic inactivation of Oct-3/4 during early' embryogenesis 11
Nat. Cell Biol. 2006. Vol. 8. P. 188—194.
FouseS.D., ShenY., Pellegrini hl., Cole S., Meissner A.,
J'anNesteL. JaenischR., FanG. Promoter CpG methyla-
tion contributes to ES cell gene regulation in parallel with
Oct4/Nanog, PcG complex, and histone НЗ K4/K27
trimethylation ' Cell Stem Cell. 2008. Vol. 2. P. 160—169.
GaoX., TateP., HuP., TjianR., Skarnes JJ. C., JJ’aiigZ. ES
cell pluripotency and germ-layer formation require the
SWI/SNF chromatin remodeling component BAF250a //
Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2008. Vol. 105. P. 6656—
6661.
Gaspar-Maia .1.. AlajemA., PolessoF, SridharanR, Ma-
son M. J., Heidersbach A., Ramalho-Santos J., McMa-
nus M T, PlathK, MeshorerE„ Ramalho-Santoshl. Chdl
regulates open chromatin and pluripotency of embryonic
stem cells // Nature. 2009. Vol. 460. P. 863—868.
Gorrini C, SquatritoM., Luise C., SyedN, Perna D., JJ’arkL.,
Martinato F, Sardella D., J'errecchia A., Bennett S., Con-
falonieri S., Cesaroni hl, Marches! F, Gascohl, Scan-
zianiE., Capra hl, hlai S., Nuciforo P., Crook T., Lough J.,
Amati B. Tip60 is a haplo-insufficient tumour suppressor
required for an oncogene-induced DNA damage re-
sponse //Nature. 2007. Vol. 448. P. 1063—1067.
Grskovichl, Javaherian A., StruloviciB., Daley G. Q. Induced
pluripotent stem cells — opportunities for disease model-
ling and drug discovery' // Nat. Rev. Drug Discov. 2011.
Vol. 10. P. 915—929.
Guenther hl. G., Frampton G. hl., SoldnerF, Hockemeyer D.,
Mitalipovahl, JaenischR., YoungR. A. Chromatin struc-
ture and gene expression programs of human embryonic
and induced pluripotent stem cells /7 Cell Stem Cell. 2010.
Vol. 7. P. 249—257.
Guenther hl G., Levine S. S., Boyer L. A., JaenischR,
YoungR. A. A chromatin landmark and transcription ini-
tiation at most promoters in human cells 11 Cell. 2007.
Vol. 130. P. 77—88.
GuidiC.J., Sands A. T.. Zambrowicz В. P., Turner T. K,
Demers D. A., JJ'ebster JJ’., Smith T. JJ’., Imbalzano A. N.,
Jones S.N. Disruption of Ini 1 leads to peri-implantation
lethality' and tumorigenesis in mice // Mol. Cell Biol.
2001. Vol. 21. P. 3598—3603.
HaimaJ., Cheng A. JJ’., Saha К, Kim J., LenguerC.J., Sold-
nerF., Cassady J. P., MuffatJ., Carey B. JJ’., JaenischR
Human embryonic stem cells with biological and epigenetic
characteristics similar to those of mouse ESCs // Proc. Natl.
Acad. Sci. USA. 2010. Vol. 107. P. 9222—9227.
Hanna J., Markoulaki S., Schorderet P., Carey B. JJ’., Beard C.,
JJ'ernighl, Creyghton hl. P„ SteineE.J., Cassady J. P.,
Foreman R, Lengner C. J., Dausman J. A., Jaenisch R
Direct reprogramming of terminally differentiated mature
В lymphocytes to pluripotency // Cell. 2008. Vol. 133.
P. 250—264.
Hattori N, Nishino K, KoY.G., OhganeJ., TanakaS., Shio-
ta K. Epigenetic control of mouse Oct-4 gene expression
in embryonic stem cells and trophoblast stem cells // J.
Biol. Chem. 2004. Vol. 279. P. 17063—17069.
HattoriN, ImaoY., NishinoK, OhganeJ., YogiS„ TanakaS.,
Shiota K. Epigenetic regulation of Nanog gene in embry-
onic stem and trophoblast stem cells // Genes Cells. 2007.
Vol. 12. P. 387—396.
Hauenschild A., Ringrose L., AltmutterC, ParoR, Rehm-
snieierhl Evolutionary plasticity' of polycomb/trithorax
response elements in Drosophila species // PLoS Biol.
2008. Vol. 6. P. e261.
338 ЭПИГЕНЕТИКА
HeL.. Liu H. Tang L. SWI/SNF chromatin remodeling com-
plex: a new cofactor in reprogramming // Stem Cell Rev.
2012. Vol. 8. P. 128—136.
HercegZ., Hulla JJ’., GellD., CueninC., LleonartM., Jack-
son S., JJ’angZ. Q. Disruption of Trrap causes early em-
brvonic lethalitv and defects in cell cycle progression //
Nat. Genet. 2001. Vol. 29. P. 206- -211’
HoL., Jothi R., Ronan J. L.. Cui K. Zhao K, Crabtree G. R. An
embryonic stem cell chromatin remodeling complex, es-
BAF, is an essential component of the core pluripotency
transcriptional network // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.
2009a. Vol. 106. P. 5187—5191.
HoL., Ronan J. L., JTuJ., StaahlB.T., ChenL., Kuo A., Les-
sard J., Nesvizhskii A. L, RanishJ., Crabtree G. R. An
embryonic stem cell chromatin remodeling complex, es-
BAF, is essential for embryonic stem cell self-renewal and
pluripotency 7 Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2009b.
Vol. 106. P' 5181—5186.
HoL., Miller E.L., Ronan J. L., Ho JJ’. Q„ JothiR, Crab-
tree G. R. esBAF facilitates pluripotency by conditioning
the genome for LIF/STAT3 signalling and by regulating
polycomb function 7 Nat. Cell Biol. 2011. Vol. 13.
P. 903—913.
HongH., Takahashi K., IchisakaT., Aoi T., Kanagawa O., Na-
kagawa M, Okita K, Yamanaka S. Suppression of in-
duced pluripotent stem cell generation by the p53—p21
pathway //Nature. 2009. Vol. 460. P. 1132—1135.
Hu G„ Kim J., Xu Q., LengY., Orkin S. H, Elledge S. J. A ge-
nome-wide RNAi screen identifies a new transcriptional
module required for self-renewal // Genes Dev. 2009.
Vol. 23. P. 837—848.
HuQ., Friedrich A. AL, Johnson L. J’., CleggD. O. Memory' in
induced pluripotent stem cells: reprogrammed human reti-
nal-pigmented epithelial cells show tendency' for sponta-
neous redifferentiation // Stem Cells. 2010. Vol. 28.
P. 1981—1991.
Huangfu D., MaeltrR, Guo JJ’., Eijkelenboom A., Snitow M.,
Chen A. E., Melton D. A. Induction of pluripotent stem
cells by' defined factors is greatly' improved by' small-
molecule compounds // Nat. Biotechnol. 2008a. Vol. 26.
P. 795—797.
Huangfu D., Osafune K, Maehr R, Guo JJ’., Eijkelenboom A.,
ChenS., Muhlestein JJ’., Melton D. A. Induction of pluri-
potent stem cells from primary' human fibroblasts with
only Oct4 and Sox2 // Nat. Biotechnol. 2008b. Vol. 26.
P. 1269—1275.
IkuraT., Ogryzko J . J’., Grigoriev M, Groisman R, JJ’angJ,
HorikoshiM, Scully R., Qin J., NakataniY. Involvement
of the TIP60 histone acetylase complex in DNA repair and
apoptosis // Cell. 2000. Vol. 102. P. 463- 473.
Inoue A., Zhang Y. Replication-dependent loss of 5-hydro-
xymethylcytosine in mouse preimplantation embryos //
Science. 2011. Vol. 334. P. 194.
Iqbal K, Jin S. G, Pfeifer G. P., Szabo P. E. Reprogramming of
the paternal genome upon fertilization involves genome-
wide oxidation of 5-methylcytosine // Proc. Natl. Acad.
Sci. USA. 2011. Vol. 108. P. 3642—3647.
ItoS., D'AlessioA. C, Taranova O. J’., HongK, Sowers L. C,
Zhang Y. Role of Tet proteins in 5mC to 5hmC conver-
sion, ES-cell self-renewal and inner cell mass specifica-
tion " Nature. 2010. Vol. 466. P. 1129—1133.
Kaji K, Caballero I. M., MacLeodR, Nichols J., JJ’ilson J . A.,
Hendrich B. The NuRD component Mbd3 is required for
pluripotency of embryonic stem cells // Nat. Cell Biol.
2006. Vol. 8. P. 285—292.
Kaji K, Nichols J., Hendrich B. Mbd3, a component of the
NuRD co-repressor complex, is required for development
of pluripotent cells // Development. 2007. Vol. 134.
P. 1123—1132.
Kaneda M, OkanoM., Hata K. SadoT., TsujimotoN., Li E..
Sasaki H. Essential role for de novo DNA methyltrans-
ferase Dnmt3a in paternal and maternal imprinting // Na-
ture. 2004. Vol. 429. P. 900—903.
KangL., JJ’angJ., Zhang Y., Kou Z., GaoS. iPS cells can sup-
port full-term development of tetrapioid blastocyst-comp-
lemented embryos // Cell Stem Cell. 2009. Vol. 5.
P. 135—138.
KawaniuraT., Suzuki J., JTangY.J'., MenendezS., More-
ra L. B., Raya A., JJ’ahl G. M, Belmonte J. C. Linking the
p53 tumour suppressor pathway' to somatic cell repro-
gramming -/ Nature. 2009. Vol. 4б0. P. 1140—1144.
KimJ.K, HuhS.O., ChoiH., Lee K. S., Shin D., LeeC,
NamJ.S., KimH, ChungH, Lee H. JJ'., ParkS. D.,
SeongR. H. Srg3, a mouse homolog of yeast SWI3, is es-
sential for early embryogenesis and involved in brain deve-
lopment "Mol. Cell Biol. 2001. Vol. 21. P. 7787—7795.
Kim K, Doi A., JJ’enB., NgK, ZhaoR, CahanP., Kim J.,
AryeeMJ., Ji H, Ehrlich L. I, YabuuchiA., Takeuchi A.,
Cunniff КС, Hongguang H, McKinney-Freeman S., Na-
veirasO., Yoon T. J., Irizarry R A., JungN., SeitaJ., Han-
na J., Murakami P., Jaenisch R, JJ'eissleder R, Orkin S. H,
JJ’eissman I. L, Feinberg A. P., Daley G. Q. Epigenetic
memory in induced pluripotent stem cells // Nature. 2010.
Vol. 467. P. 285—290.
Kim K, ZhaoR.. DoiA.. NgK. Untemaehrer J.. CahanP.,
HongguangH, LohY.H., AryeeMJ., LenschM. JJ’.,
Li H, Collins J. J., Feinberg A. P., Daley G. Q. Donor cell
type can influence the epigenome and differentiation po-
tential of human induced pluripotent stem cells // Nat. Bio-
technol. 2011. Vol. 29. P. 1117—1 119.
KohKP., YabtnichiA., RaoS., Huang Y., Cunniff K, Nar-
done J., Laiho A., TahilianiM, Sommer C. A., Mostos-
lavskyG., Lahesmaa R, Orkin S. H, RodigS.J., Da-
ley G. Q.. Rao A. Tetl and Tet2 regulate 5-hydroxymet-
hylcytosine production and cell lineage specification in
mouse embryonic stem cells// Cell Stem Cell. 2011.
Vol. 8. P. 200—213.
Kooistra S. M, van den Boom J’., Thummer R P., Johannes F.,
JJ’ardenaar R, TessonB.M, J’eenhoffL. M, FusettiF,
O'Neill L. P., Turner В. M, de Haan G., Eggen B. J. Un-
differentiated embryonic cell transcription factor 1 regu-
lates ESC chromatin organization and gene expression //
Stem Cells. 2010. Vol. 28. P. 1703—1714.
LagarkovaM. A., Shut ova M. J’., Bogomazova A. N., J’as-
sinaE.M., Glazov E. .1., ZhangP., Rizvanov .1. .1., Chest-
kov I. J’., Kiselev S. L. Induction of pluripotency' in human
endothelial cells resets epigenetic profile on genome
scale II Cell Cycle. 2010. Vol. 9. P. 937—946.
Landeira D., Fisher A. G. Inactive yet indispensable: the tale of
Jarid2 " Trends Cell Biol. 2011. Vol. 21. P. 74—80.
LandeiraD., SauerS., PootR, Dvorkina M, Mozzarella L.,
Jorgensen H. E, Pereira C. F, LeleuM., Piccolo F. M,
Spivakov M, Brookes E., PornboA., Fisher C., Skarnes JJ’.
C, SnoekT., Bezstarosti K, Demmers J., Klose R J., Casa-
novaM, TavaresL, BrockdorffN, MerkenschlagerM.,
Fisher A. G. Jarid2 is a PRC2 component in embryonic
stem cells required for multi-lineage differentiation and
recruitment of PRC 1 and RNA Polymerase II to develop-
mental regulators // Nat. Cell Biol. 2010. Vol. 12.
P. 618—624.
Lee J. T, Lu N. Targeted mutagenesis of Tsix leads to nonran-
dom X inactivation // Cell. 1999. Vol. 99. P. 47—57.
Lee J. T, Davidow L. S., JJ’arshawsky D. Tsix, a gene antisense
to Xist at the X-inactivation centre // Nat. Genet. 1999.
Vol. 21. P. 400 404.
Lee T. I., Jenner R G., Boyer L. A., Guenther M. G., Levi-
ne S. S., Kumar RM, Chevalier B., Johnstone S. E., Co-
le M. F, Isono K, Koseki H, Fuchikami T, Abe K, Mur-
ГЛАВА 12 339
rayH.L., Zucker J. P„ YuanB.. Bell G. IT., Herbolshei-
mer E., Hannett N. AL, Sun K., OdomD.T., OtteA.P.,
VolkertT.L., BartelD.P., AleltonD.A., GiffordD. K,
Jaenisch R., YoungR. A. Control of developmental regula-
tors by Polycomb in human embryonic stem cells // Cell.
2006. Vol. 125. P. 301—313.
Lengner C. J., Gimelbrant A. A., Erwin J. A., Cheng А. 1Г, Guen-
ther M. G.. WelsteadG. G.. Alagappan R, Frampton G. AL.
Xu P., Muffat J., SantagataS., Powers D., Barrett C.B.,
YoungR. A., Lee J. T, Jaenisch R, Mitalipova M. Deriva-
tion of pre-X inactivation human embryonic stem cells
under physiological oxygen concentrations // Cell. 2010.
Vol. 141. P. 872—883.’
Lessard J., SauvageauG. Bmi-1 determines the proliferative
capacity of normal and leukaemic stem cells /7 Nature.
2003. Vol. 423. P. 255 260.
Lessard J., H’uJ.I., RanishJ.A.. H an AL, Winslow Al. Al..
StaahlB.T., Wu H, AebersoldR, Graef I. A., Crab-
tree G. R. An essential switch in subunit composition of a
chromatin remodeling complex during neural develop-
ment ' Neuron. 2007. Vol. 55. P. 201—215.
Li E., Bestor T. H., Jaenisch R. Targeted mutation of the DNA
methyltransferase gene results in embryonic lethality //
Cell.1992. Vol. 69. P. 915—926.
Li E., Beard C, Jaenisch R. Role for DNA methylation in ge-
nomic imprinting // Nature. 1993. Vol. 366. P. 362—365.
Li G., Alargueron R, Ku Al., ChambonP., Bernstein В. E.,
ReinbergD. Jarid2 and PRC2, partners in regulating gene
expression // Genes Dev. 2010. Vol. 24. P. 368—380.
Li H., Collado AL, Villasante A., Strati K., OrtegaS., Canam-
eroAI., BlascoAl. A., Serrano Al. The Ink4Arf locus is a
barrier for iPS cell reprogramming 7 Nature. 2009.
Vol. 460. P. 1136—1139.
Li J. T., PuAl. T, Hirasawa R, Li B. Z., HuangY. N., ZengR,
JingN. H, Chen T. Li E.. Sasaki H. Xu G. L. Synergistic
function of DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b
in the methylation of Oct4 and Nanog " Mol. Cell Biol.
2007. Vol. 27. P. 8748—8759.
Liang J., Пап AL, ZhangY., GuP., Xin H, JungS. T., Qin J.,
H ong J., Cooney A. J., Liu D., Songyang Z. Nanog and
Oct4 associate with unique transcriptional repression
complexes in embryonic stem cells // Nat. Cell Biol. 2008.
Vol. 10. P. 731—739.
Lippman Z.. GendrelA. Black Al.. Vaughn AL. W.f Ded-
hiaN., AlcCombie W. R, Lavine K, AlittalV., AlayB.,
Kasschau K. D., Carrington J. C, Doerge R. W., Colot V.,
Alartienssen R. Role of transposable elements in hetero-
chromatin and epigenetic control // Nature. 2004.
Vol. 430. P. 471—476.
Lister R, PelizzolaAL, Dowen R. H, Hawkins RD., HonG.,
Tonti-FilippiniJ.. NeryJ.R. LeeL. YeZ., NgoQ.Al.. Ed-
sallL., Antosiewicz-Bourget J., StewartR, Ruotti V., Alil-
larA.H., Thomson J. A., RenB., Ecker J. R. Human DNA
methylomes at base resolution show widespread epigenomic
differences // Nature. 2009. Vol. 462. P. 315—322.
Lister R, PelizzolaAL., Kida Y. S., Hawkins RD., NeryJ.R,
HonG., Antosiewicz-Bourget J., OAlalleyR, Casta-
non R, Klugman S., Downes Al., Yu R, Stewart R., Ren B.,
Thomson J. A., Evans R. Al., Ecker J. R. Hotspots of aber-
rant epigenomic reprogramming in human induced pluri-
potent stem cells // Nature. 2011. Vol. 471. P. 68—73.
Liu J., CaoL., Chen J., SongS., Leel.H., Quijano C„ Liu H,
Keyvanfar K, ChenH, CaoL. T, AhnB. H, KumarN. G.,
Rovira 1. XuX. L, vanLohuizenAL, AlotoyamaN.,
DengC.X., Finkel T. Bmil regulates mitochondrial func-
tion and the DNA damage response pathway // Nature.
2009. Vol. 459. P. 387—392.
Loh 1. H, Hartung O., Li H, Guo C, Sahalie J. AL, Alanos P. D.,
Urbach A., HefJherG.C, GrskovicAL, VigneaultF,
LenschAl. W. Park I. H, Agarwal S.. Church G. AL, Col-
lins J. J., Irion S., Daley G. Q. Reprogramming of T cells
from human peripheral blood // Cell Stem Cell. 2010.
Vol. 7. P. 15—19.
LohY.H., Wu O., Chew J. L, FegaF.B., Zhang W., ChenX,
Bourque G., George J., LeongB., Liu J., WongKY.,
Sting К. W., Lee С. W., ZhaoX.D., Chiu К P., Lipovich L,
Kuznetsov V. A., Robson P.. Stanton L.W.. Wei C L, Ru-
an T., LimB., NgH. H. The Oct4 and Nanog transcription
network regulates pluripotency in mouse embryonic stem
cells // Nat. Genet. 2006. Vol. 38. P. 431- -440.
Loh Г. II., Zhang W., ChenX., George J., NgH. H. Jmjdla and
Jmjd2c histone H3 Lys 9-demethylases regulate self-
renewal in embryonic stem cells // Genes Dev. 2007.
Vol. 2l.P. 2545—2557.
Alaherali N, Hochedlinger K. Guidelines and techniques for the
generation of induced pluripotent stem cells // Cell Stem
Cell. 2008. Vol. 3. P. 595—605.
Alaherali N, SridharanR, Xie W„ Utikal J., Eminli S., Ar-
nold K, Stadtfeld AL, Yachechko R, TchieuJ., Jae-
nisch R., Plath K, Hochedlinger K. Directly reprogram-
med fibroblasts show global epigenetic remodeling and
widespread tissue contribution// Ibid. 2007. Vol. 1.
P. 55—70.
Alaherali N., Ahfeldt T, Rigamonti A., Utikal J., Cowan C, Ho-
chedlinger K. A high-efficiency system for the generation
and study of human induced pluripotent stem cells // Ibid.
2008. Vol. 3. P. 340—345.
AlakW., Nesterova T. B., de NapolesAL, AppanahR, Yama-
naka S., OtteA.P., BrockdorffN. Reactivation of the pa-
ternal X chromosome in early mouse embrvos // Science.
2004. Vol. 303. P. 666—669.’
AlaliP., ChouB. K, Yen J., YeZ., ZouJ., DoweyS., Brod-
sky R A., OhmJ.E., Yun., BaylinS.B., YusaK, Brad-
ley A.. AleyersD.J., Alukherjee C., ColeP. A.. ChengL.
Butyrate greatly enhances derivation of human induced
pluripotent stem cells by promoting epigenetic remodeling
and the expression of pluripotency-associated genes 11
Stem Cells. 2010. Vol. 28. P. 713—720.
Alarchetto AL C., YeoG.W., Kainohana O., AlarsalaAL,
GageF. H, ALuotri A. R. Transcriptional signature and
memory retention of human-induced pluripotent stem
cells // PLoS One. 2009. Vol. 4. P. e7076.
Alarion R AL, Strati K, Li H. Alurga AL, BlancoR, Ortega S..
Fernandez-Capetillo O., Serrano AL, BlascoAl. A. A p53-
mediated DNA damage response limits reprogramming to
ensure iPS cell genomic integrity // Nature. 2009.
Vol. 460. P. 1149—1153.
Alartin G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early
mouse embryos cultured in medium conditioned by' terato-
carcinoma stem cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981.
Vol. 78. P. 7634—7638.
AlatsudaT., Nakamura T, Nakao K, AraiT., KatsukiAL,
Heike T., Yokota T. STAT3 activation is sufficient to
maintain an undifferentiated state of mouse embryonic
stem cells // EMBO J. 1999. Vol. 18. P. 4261—4269.’
Alattout A., Biran A., AleshorerE. Global epigenetic changes
during somatic cell reprogramming to iPS cells // J. Mol.
Cell Biol. 2011. Vol. 3. P. 341 -350.
AlcDonel P.. Costello 1.. Hendrich B. Keeping things quiet:
roles of NuRD and Sin3 co-repressor complexes during
mammalian development // Int. J. Biochem. Cell Biol.
2009. Vol. 41. P. 108—116.
Aledvedev S. P., Grigor’eva E. V., Shevchenko A. 1., Alalakho-
va A. A., Dementyeva E. V., Shilov A. A., Pokushalov E. A.,
Zaidman A. AL, Aleksandrova AL A., Plotnikov E. Y., Suk-
hikh G. T, Zakian S. Al. Human induced pluripotent stem
cells derived from fetal neural stem cells successfully' un-
340 ЭПИГЕНЕТИКА
dergo directed differentiation into cartilage // Stem Cells
Dev. 2011. Vol. 20. P. 1099—1112.
Meissner A., Mikkelsen T. S., Gu H, JJ’ernigAL., Hanna J.,
Sivachenko A., ZhangX., Bernstein В. E., NusbaumC.,
Jaffe D. B„ GnirkeA., Jaenisch R, Lander E. S. Genome-
scale DNA methylation maps of pluripotent and differen-
tiated cells 11 Nature. 2008. Vol. 454. P. 766- -770.
Mikkelsen T. S.. KuAL, JaffeD. B.. IssacB.. LiebermanE..
Giannoukos G., Alvarez P., Brockman JJ'., KimT. K, Ko-
cheRP., Lee JJ'., MendenhallE., O'Donovan A., Pres-
ser A., Russ C, Xie X., Meissner A., JJ’ernigM., Jae-
nischR, NusbaumC., Lander E. S., Bernstein В. E. Ge-
nome-wide maps of chromatin state in pluripotent and
lineage-committed cellsNature. 2007. Vol. 448.
P. 553—560.
Mikkelseti T. S., Hanna J., ZhangX., Ku AL, JJ’ernigM., Schor-
deretP.. Bernstein В. E.. JaenischR. Lander E. S..
Meissner A. Dissecting direct reprogramming through in-
tegrative genomic analysis // Nature. 2008. Vol. 454.
P. 49—55.
Miyoshi N., Ishii H., Nagano H, Haraguchi N, Dewi D. L.,
KanoY., Nishikawa S., TanemuraAL, Mimori K, Tana-
ka F., Saito T, Nishimura J., Takemasa I, Mizushima T,
Ikeda AL, Yamamoto H., SekimotoAL, DokiY., A Lori AL.
Reprogramming of mouse and human cells to pluripotency
using mature microRNAs 11 Cell Stem Cell. 2011. Vol. 8.
P. 633—638.
ALohnF, JJ’eberAL, RebhanAL, RoloffT. C, Richter J.,
Stadler Al. B., BibelAI., SchubelerD. Lineage-specific
polycomb targets and de novo DNA methylation define
restriction and potential of neuronal progenitors // Mol.
Cell. 2008. Vol. 30. P. 755—766.
Alolofsky A. J '., Pardal R, Iwashita T, Park I. K, Clarke AL F,
Alorrison S. J. Bmi-1 dependence distinguishes neural
stem cell self-renewal from progenitor proliferation // Na-
ture. 2003. Vol. 425. P. 962—967.
ALoreyL., Helin K. Polycomb group protein-mediated repres-
sion of transcription U Trends Biochem. Sci. 2010.
Vol. 35. P. 323—332.
AIoreyL., Pascual G., CozzutoL., Roma G., JJ’utzA., Beni-
tah S. A., Di Croce L. Nonoverlapping functions of the
polycomb group cbx family of proteins in embryonic stem
cells 11 Cell Stem Cell. 2012. Vol. 10. P. 47—62.
NavarroP., Chambers I. Karwacki-Neisius J'.. Chureau C.,
ALoreyC, Rougeulle C, AvnerP. Molecular coupling of
Xist regulation and pluripotency // Science. 2008.
Vol. 321. P. 1693—1695.
NavarroP., Oldfield A., Legoupi J., FestucciaN, Dubois A.,
AttiaAL, Schoorlemmer J., Rougeulle C., Chambers I,
Avner P. Molecular coupling of Tsix regulation and pluri-
potency // Nature. 2010. Vol. 468. P. 457—460.
NavarroP., AIoffatAL, Alullin N. P., Chambers! The X-inac-
tivation trans-activator Rnfl2 is negatively regulated by
pluripotency factors in embryonic stem cells // Hum.
Genet. 201 i. Vol. 130. P. 255—264.
Newman A. AL, Cooper J. B. Lab-specific gene expression sig-
natures in pluripotent stem cells // Cell Stem Cell. 2010.
Vol. 7. P. 258—262.
Nishimoto AL, Fukushima A., OkudaA., Aluramatsu AL The
gene for the embryonic stem cell coactivator UTF1 carries
a regulatory' element which selectively interacts with a
complex composed of Oct-3/4 and Sox-2 // Mol. Cell Biol.
1999. Vol. 19. P. 5453—5465.
Nishino K, ToyodaAL, Yamazaki-lnoueAL.,FukawataseY., Chi-
kazawaE., Sakaguchi H, Akutsu H, Umezawa A. DNA me-
thylation dynamics in human induced pluripotent stem cells
over time // PLoS Genet. 2011. Vol. 7. P. 61002085.
OLoghlen A., ALunoz-CabelloA. AL, Gaspar-ALaia A., JJ’uH.A.,
Bonito A., Kunowska N., RacekT., Pemberton H. N, Beol-
chiP.. LavialE, ALasuiO., J'ermeulenAL. Carroll T,
GraimiatmJ., HeardE., DillonN, AzuaraJ’., Snij-
dersA. P., Peters G, Bernstein E., Gil J. MicroRNA Regu-
lation of Cbx7 mediates a switch of Polycomb orthologs
during ESC differentiation 7 Cell Stem Cell. 2012.
Vol. 10. P. 33—46.
Okamoto L., Otte A. P., Allis CD., ReinbergD., HeardE. Epi-
genetic dynamics of imprinted X inactivation during early
mouse development // Science. 2004. Vol. 303. P. 644—
649.
OkanoAL., BellD. JJ’., Haber D. A., LiE. DNA methyltrans-
ferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo me-
thylation and mammalian development // Cell. 1999.
Vol. 99. P. 247—257.
Okita K, Lchisaka T, Yamanaka S. Generation of germline-
competent induced pluripotent stem cells // Nature. 2007.
Vol. 448. P. 313—317.
OnderT. T, Kara N., Cherry A., Sinha A. U., Zhu N., Bemt К AL,
CahanP., ALancarci О. B„ Untemaehrer J., GuptaP.B.,
Lander E. S., Armstrongs. A., Daley G. Q. Chromatin-mo-
difying enzymes as modulators of reprogramming " Na-
ture. 2012. Vol. 483. P. 598—602.
Ooi S. K, QiuC, Bernstein E., Li K, Jia D., Yang Z., Erd-
jument-Bromage H, TempstP., LinS.P., Allis C. D.,
ChengX., Bestor T. H. DNMT3L connects unmethylated
lysine 4 of histone H3 to de novo methylation of DNA //
Nature. 2007. Vol. 448. P. 714—717.
Orkin S. H, Hochedlinger K. Chromatin connections to pluripo-
tency and cellular reprogramming // Cell. 2011. Vol. 145.
P. 835—850.
PanG., TianS., NieJ., YangC, Ruotti J’., JJ'ei H, Jonsdot-
tir G. A., Stewart R., Thomson J. A. Whole-genome analy-
sis of histone H3 lysine 4 and lysine 27 methylation in
human embryonic stem cells // Cell Stem Cell. 2007.
Vol. l.P. 299—312.
PardoAL, LangB., Yu L., Prosser H., Bradley A., BabuAL. AL,
Choudhary J. An expanded Oct4 interaction network: im-
plications for stem cell biology, development, and dis-
ease // Ibid. 2010. Vol. 6. P. 382—395.
Park I. K, Qian D., Kiel AL, Becker AL. JJ’., PihaljaAL, JJ’eiss-
manl.L., ALorrison S. J., Clarke AL. F. Bmi-1 is required
for maintenance of adult self-renewing haematopoietic
stem cells // Nature. 2003. Vol. 423. P. 302—305.
Pasini D.. Bracken A. P.. Hansen J. B., CapilloAL. Helin K.
The polycomb group protein Suzl2 is required for embry-
onic stem cell differentiation // Mol. Cell Biol. 2007.
Vol. 27. P. 3769—3779.
Pasini D., CloosP.A., JJ’alfridssonJ., Olsson L, Bukowski J. P.,
JohansenJ. J'., BakAL, Tommerup N., Rappsilber J.,
Helin K. JARID2 regulates binding of the Polycomb rep-
ressive complex 2 to target genes in ES cells // Nature.
2010. Vol. 464. P. 306—310.
Peng J. C, J’alouev A., SwigutT., Zhang J., ZhaoY., Sidow A.,
JJ’ysockaJ. Jarid2. Jumonji coordinates control of PRC2
enzymatic activity and target gene occupancy in pluripo-
tent cells 11 Cell. 2009. Vol. 139. P. 1290—1302.
Polo J. AL, Liu S., Figueroa AL. E., Kulalert JJ’., Eminli S.,
Tan К. E., Apostolou E., StadtfeldAL., Li 1., Shioda T, Na-
tesanS., JJ’agersA. J, ALelnickA., EvansT., Hochedlin-
ger K. Cell type of origin influences the molecular and
functional properties of mouse induced pluripotent stem
cells 11 Nat. Biotechnol. 2010. Vol. 28. P. 848—855.
Pullirsch D., HartelR, Kishimoto H, LeebAL, Steiner G.,
JJ’utzA. The Trithorax group protein Ash21 and Saf-A are
recruited to the inactive X chromosome at the onset of sta-
ble X inactivation" Development. 2010. Vol. 137.
P. 935—943.
Ramsahoye В. H, Biniszkiewicz D., LykoE, Clark J’., Bird A. P.,
JaenischR Non-CpG methylation is prevalent in embry-
ГЛАВА 12 341
onic stem cells and may be mediated by DNA methyl-
transferase 3a // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000.
Vol. 97. P. 5237—5242.
Reik IT. Stability and flexibility of epigenetic gene regulation in
mammalian development 7 Nature. 2007. Vol. 447.
P. 425—432.
Reynolds N., Salmon-Divon AL, Dvinge H, Hynes-Allen A.,
Balasooriya G., Leaford D., Behrens A.. Bertone P., Hen-
drich B. NuRD-mediated deacetylation of H3K27 facili-
tates recruitment of Polycomb Repressive Complex 2 to
direct gene repression h EMBO J. 2011. Vol. 31. P. 593—
605.
Ringrose L. Polycomb, trithorax and the decision to differenti-
ate // Bioessays. 2006. Vol. 28. P. 330—334.
Ringrose L. Polycomb comes of age: genome-wide profiling of
target sites // Curr. Opin. Cell Biol. 2007. Vol. 19.
P. 290—297.
Ringrose L., ParoR. Epigenetic regulation of cellular memory'
by the Polycomb and Trithorax group proteins // Annu.
Rev. Genet 2004. Vol. 38. P. 413 443.
Roberts С. JJ’., Galusha S. A., ALcALenaminAL. E., Fletcher C. D.,
Orkin S. H. Haploinsufficiency of Snf5 (integrase interactor
1) predisposes to malignant rhabdoid tumors in mice // Proc.
Natl. Acad. Sci. USA. 2000. Vol. 97. P. 13796—13800.
RuizS., Panopoulos A. D., Herrerias A., Bissig K. D., Lutz AL,
Berggren 1Г. 7.. Гетто I. AL, Lzpisua Belmonte J. C. A
high proliferation rate is required for cell reprogramming
and maintenance of human embryonic stem cell identity //
Curr. Biol. 2011. Vol. 21. P. 45—52.
SadoT., JJ’angZ., SasakiH, LiE. Regulation of imprinted X-
chromosome inactivation in mice by Tsix 11 Development.
2001. Vol. 128. P. 1275—1286.
Sapountzi J’., Logan I. R., Robson C. N. Cellular functions of
TIP60// Int. J. Biochem. Cell Biol. 2006. Vol. 38.
P. 1496—1509.
SchanielC., Angl'.S., Ratnakumar K, Cormier C., James T,
BernsteinE., LemischkaI. R, PaddisonP.J. SmarccU
Bafl55 couples self-renewal gene repression with changes
in chromatin structure in mouse embryonic stem cells //
Stem Cells. 2009. Vol. 27. P. 2979—2991.
Seki Y., KurisakiA., JJ’atanabe-Susaki K, Nakajima 1., Naka-
nishiAL, AraiY., Shiota K., Sugino H, AsashimaAL.
TIFlbeta regulates the pluripotency' of embryonic stem
cells in a phosphorylation-dependent manner // Proc. Natl.
Acad. Sci. USA. 2010. Vol. 107. P. 10926—10931.
ShenX., LiuY., Hsu Y. J., Fujiwara Y., Kim J., ALaoX.,
Yuan G. C., Orkin S. H. EZH1 mediates methylation on
histone U3 lysine 27 and complements EZU2 in maintain-
ing stem cell identity and executing pluripotency // Mol.
Cell. 2008. Vol. 32. P. 491 502.
ShenX., Kim JJ'., Fujiwara Y.. SimonALD., LiuY.. ALysli-
wiecAI. R., Yuan G. C, Lee Г., Orkin S. H. Jumonji modu-
lates polycomb activity and self-renewal versus differen-
tiation of stem cells /7 Cell. 2009. Vol. 139. P. 1303
1314.
Shi Y., DespontsC., DoJ.T., Hahm H. S., Scholer H. R,
DingS. Induction of pluripotent stem cells from mouse
embryonic fibroblasts by' Oct4 and Klf4 with small-
molecule compounds 11 Cell Stem Cell. 2008a. Vol. 3.
P. 568—574.
Shi Y., DoJ.T., DespontsC., HahmH.S., Scholer H. R,
DingS. A combined chemical and genetic approach for
the generation of induced pluripotent stem cells // Ibid.
2008b. Vol. 2. P. 525—528.
ShumacherA., Faust C, Alagnuson T. Positional cloning of a
global regulator of anterior-posterior patterning in mice //
Nature. 1996. Vol. 383. P. 250—253.
Silva S. S., Rowntree R K, AlekhoubadS., Lee J. T. X-chromo-
some inactivation and epigenetic fluidity in human em-
bryonic stem cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2008.
Vol. 105. P. 4820—4825.
Sims R. J. 3rd, Chen С. F, Santos-Rosa H, Kouzarides T.,
Patel S. S., ReinbergD. Human but not yeast CHD1 binds
directly' and selectively' to histone H3 methylated at lysine
4 via its tandem chromodomains // J. Biol. Chem. 2005.
Vol. 280. P. 41789- -41792.
SinghalN. GraummmJ.. JJ’uG.. Arauzo-BravoALJ.. HanD. JJ’..
GreberB., Gentile L., AlannAI., Scholer H.R. Chromatin-
remodeling components of the BAE complex facilitate re-
programming // Cell. 2010. Vol. 141. P. 943—955.
SquatritoAI., Gon-ini C, Amati B. Tip60 in DNA damage re-
sponse and growth control: many tricks in one HAT //
Trends Cell Biol. 2006. Vol. 16. P’ 433—442.
StadtfeldAI., Brennand K, Hochedlinger K. Reprogramming of
pancreatic beta cells into induced pluripotent stem cells //
Curr. Biol. 2008. Vol. 18. P. 890—894.
StadtfeldAI., Apostolou E., Akutsu H, Fukuda A., Follett P.,
Natesan S„ KonoT., Shioda T, Hochedlinger K. Aberrant
silencing of imprinted genes on chromosome 12qFl in
mouse induced pluripotent stem cells // Nature. 2010.
Vol. 465. P. 175—181.
Stock J. K, Giadrossi S., Casanova AL, Brookes E., J'idalAL,
Koseki H, BrockdorffN., Fisher A. G., PornboA. Ringl-
mediated ubiquitination of H2A restrains poised RNA po-
lymerase II at bivalent genes in mouse ES cells // Nat. Cell
Biol. 2007. Vol. 9. P. 1428—1435.
Straussnian R, NejmanD., Roberts D., Steinfeldl., BlumB.,
Benvenisty N., Simon L., Yakhini Z., Cedar H. Develop-
mental programming of CpG island methylation profiles
in the human genome H Nat. Struct. Mol. Biol. 2009.
Vol. 16. P. 564—571.
Tahiliani AL, Koh К. P., Shen 1., Pastor JJ’. A., Bandukwala H,
BrudnoY., AgarwalS., Iyer L. AL, Liu D. R, AravindL.,
Rao A. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymet-
hylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1 /7
Science. 2009. Vol. 324. P. 930—935.
Takahashi K, Tanabe K, OhnukiAL, Narita AL., IchisakaT.,
Tomoda K, Yamanaka S. Induction of pluripotent stem
cells from adult human fibroblasts by defined factors //
Cell. 2007. Vol. 131. P. 861—872.
Takahashi K, Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells
from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by de-
fined factors 11 Cell. 2006. Vol. 126. P. 663—676.
TchieuJ., KuoyE., Chin AL. H, Trinh H, Patterson AL,
ShermanS. P., Aimiuwu O., Lindgren A., HakimianS.,
Zack J. A., Clark A. T., Pyle A. D., Lowry JJ. E., Plath K.
Female human iPSCs retain an inactive X chromosome //
Cell Stem Cell. 2010. Vol. 7. P. 329—342.
Tesar P. J., Chenoweth J. G., BrookF. A., Davies T. J., Ev-
ans E. P.. ALackD.L.. Gardner R L., ALcKay R D. New
cell lines from mouse epiblast share defining features with
human embryonic stem cells // Nature. 2007. Vol. 448.
P. 196—199.’
Thomson J. A., Ltskovitz-Eldor J., ShapiroS. S., JJ’aknitzAL. A.,
Swiergiel J. J., ALarshall J’. S., Jones J. AL. Embryonic
stem cell lines derived from human blastocysts // Science.
1998. Vol. 282. P. 1145—1147.
Thomson J. P., Skene P. J., Selfridge J., ClouaireT., Guy J.,
JJ’ebb S., Kerr A. R. Deaton A.. Andrews R. James K. D..
Turner D. J., Illingworth R, Bird A. CpG islands influence
chromatin structure via the CpG-binding protein Cfpl //
Nature. 2010. Vol. 464. P. 1082—1086.
Tiscomia G., J’ivasE.L., Belmonte J. C. Diseases in a dish:
modeling human genetic disorders using induced pluripo-
tent cells //Nat. Med. 2011. P. 1570—1576.
TsumuraA., HayakawaT., KumakiY., Takebayashi S., Sa-
kaueAL, ALatsuoka C., Shimotohno K, Ishikawa F., Li E.,
Ueda H. R., Nakayama J., OkanoAL. Maintenance of self-
342 ЭПИГЕНЕТИКА
renewal ability of mouse embryonic stem cells in the ab-
sence of DNA methvltransferases Dnmtl, Dnmt3a and
Dnmt3b " Genes Cells. 2006. Vol. 11. P. 805—814.
UedaY., OkanoAL, Williams C., ChenT., Georgopoulos K.,
LiE. Roles for Dnmt3b in mammalian development: a
mouse model for the ICF syndrome 11 Development. 2006.
Vol. 133. P. 1183- 1192. ’
UtikalJ.. Alaherali N., KulalertW.. Hochedlinger K. Sox2 is
dispensable for the reprogramming of melanocytes and
melanoma cells into induced pluripotent stem cells // J.
Cell Sci. 2009. Vol. 122. P. 3502—3510.
van den Berg D. L, SnoekT., Mullin N. P., Yates A., Bezsta-
rosti K, Demmers J., Chambers!., Root R. A. An Oct4-
centered protein interaction network in embryonic stem
cells // Cell Stem Cell. 2010. Vol. 6. P. 369—381.
Voncken J. W., Roelen B. A., RoefsM, de Vries S., Verho-
even E., AlarinoS.. Deschamps J., van Lohuizen M. Rnl2
(Ringlb) deficiency causes gastrulation arrest and cell cy-
cle inhibition " Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003.
Vol. 100. P. 2468—2473.
WangH., WangL, Erdjument-Bromage H, Vidal AL, TempstP.,
Jones R. S, ZhangY. Role of histone 112Л ubiquitination in
Polycomb silencing //Nature. 2004. Vol. 431. P. 873—878.
Wang J, RaoS., ChuJ., ShenX., Levasseur D. N., Theunis-
sen T. W., Orkin S. H. A protein interaction network for
pluripotencv of embryonic stem cells // Nature. 2006.
Vol. 444. P’ 364—368.
WangP., Chen K., ZengX., Yang J., Wu Y„ ShiX., Qin B„
ZengL., Esteban AI. A., Pan G., PeiD. The histone de-
methylases jhdmla/lb enhance somatic cell reprogram-
ming in a vitamin-C-dependent manner // Cell Stem Cell.
2011. Vol. 9. P. 575—587.
Wu J. L, Lessard J.. Crabtree G. R. Understanding the words of
chromatin regulation 11 Cell. 2009. Vol. 136. P. 200—206.
Wu J. I.. LessardJ., Olavel.A.. Qiu Z.. GhoshA., Graef I. A..
Crabtree G. R. Regulation of dendritic development by
neuron-specific chromatin remodeling complexes " Neu-
ron. 2007. Vol. 56. P. 94—108.
WysockaJ, Swigtit T., Alilne T. A., DouY., ZhangX., Burlin-
game A. L, Roeder R G., Brivanlou A. H, Allis C. D.
WDR5 associates with Iristone H3 methylated at K4 and is
essential for НЗ K4 methylation and vertebrate develop-
ment " Cell. 2005. Vol. 121. P. 859—872.
Yamanaka S. A fresh look at iPS cells// Cell. 2009. Vol. 137.
P. 13—17.
Yildirim O., LiR.. Hung J. H. Chen P. B., DongX., EeL.S..
WengZ., Rando O. J., Fazzio T. G. Mbd3/NURD complex
regulates expression of 5-Hydroxymethylcytosine marked
genes in embryonic stem cells// Cell. 2011. Vol. 147.
P. 1498—1510.’
Yu J., VodyanikAL A., Smuga-Otto K., Antosiewicz-Bourget J.,
FraneJ.L., TianS., NieJ., Jonsdottir G. A., Ruotti V.,
Stewart R., Slukvin I. L, Thomson J. .1. Induced pluripotent
stem cell lines derived from human somatic cells // Sci-
ence. 2007. Vol. 318. P. 1917—1920.
Zhang Z., Jones A., SunC. IE, Li C, ChangC. W., Joo H. 1.,
Dai Q., Alysliwiec AI. R, WuL.C, Guo Y., YangW.,
Liu K, PawlikKAL, Erdjument-Bromage H, TempstP.,
Lee Y., Alin J., Townes T. AL, WangH. PRC2 complexes
with JARID2, and esPRC2p48 in ES cells to modulate ES
cell pluripotency and somatic cell reprogramming // Stem
Cells. 2011a. Vol. 29. P. 229—240.
Zhang Z., Jones A., SunC. W., Li C, ChangC. W., JooH. 1.,
Dai Q., Alysliwiec AL R, WuL. C, GtioY., YangW.,
Liu K., PawlikK. AI., Erdjument-Bromage H, TempstP.,
Lee Y., Alin J., Townes T. AL, WangH. PRC2 complexes
with JARID2, MTF2, and esPRC2p48 in ES cells to
modulate ES cell pluripotency and somatic cell repro-
gramming Stem Cells. 2011b’. Vol. 29. P. 229—240.
ZhaoX. D., HanX., Chew J. L., Liu J., Chiu К. P., Choo A., Or-
lov Y. L.. SungW.K. Shahab A., Kuznetsov V. A..
Bourque G., OhS., Ruan Y., Ng H. H, Wei C. L. Whole-
genome mapping of histone H3 Lys4 and 27 trimethyla-
tions reveals distinct genomic compartments in human
embryonic stem cells// Cell Stem Cell. 2007. Vol. E
P. 286—298.
ZhaoX. Y., Li W., LvZ., LiuL., Tong AL, Hai T, Hao J.,
Guo C. L„ Ala Q. W., WangL., ZengF, Zhou Q. iPS cells
produce viable mice through tetrapioid complementation //
Nature. 2009. Vol. 461. P. 86—90.
ZhuD., FangJ., Li E, Zhang J. Mbd3, a component of NuRDz
Mi-2 complex, helps maintain pluripotency of mouse em-
bryonic stem cells by repressing trophectoderm differen-
tiation 11 PLoS One. 2009. Vol. 4. P. e7684.
ZillerALJ., AIullerF, Liao J., ZhangY., GuH, BockC,
Boyle P., Epstein С. B., Bernstein В. E., LengauerT., Gnir-
keA., AleissnerA. Genomic distribution and inter-sample
variation of поп-CpG methylation across human cell
types // PLoS Genet. 2011. Vol. 7. P. C100238.
ГЛАВА
13
«ТЕСТ НА ХИМЕРИЗМ»:
ВОЗМОЖНОСТИ И ПРЕВРАТНОСТИ МЕТОДА
СОДЕРЖАНИЕ
13.1. Концепция проверки плюрипотент-
ности стволовых клеток в условиях
in vivo, 244
13.2. Виды химеризма у млекопитаю-
щих, 345
13.3. Эмбриологические основы фено-
мена экспериментального первич-
ного химеризма, 347
13.4. Основные методы получения пер-
вичных химер, 348
13.5. Закономерности заселения орга-
нов и тканей химеры потомками
партнеров по первичной химери-
зации, 350
13.6. Новые сферы применения химер-
ных живых моделей, 350
13.7. Феномен первичного эксперимен-
тального химеризма в контексте
современной биологии развития
млекопитающих, 352
Список литературы, 354
344 ЭПИГЕНЕТИКА
13.1. Концепция проверки
плюрипотентности
СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК В УСЛОВИЯХ IN VIVO
Проверка плюрипотентности стволовых кле-
ток в условиях in vivo строится на следующей
пресуппозиции: потенциал дифференцировки и
способность к морфогенезу наиболее полно и
корректно проявляется у СК только в условиях
естественного (или близкого к тому’) гумораль-
ного и тканевого окружения. Иными словами,
оптимальным условием для такого рода провер-
ки является возвращение ранее культивирован-
ных клеток в наиболее естественную (т. е. наи-
более соответствующую их актуальному онтоге-
нетическому' статусу) временную, тканевую и
пространственную нишу. Тесты in vitro являются
необходимым критерием для оценки плюрипо-
тентности СК, тесты in vivo — достаточным. Вся
совокупность тестов in vivo представлена на
рис. 13.1.
Анализируя тесты оценки плюрипотентности
in vivo, можно заметить существенное методи-
ческое ограничение: валидность доказательства
плюрипотентности увеличивается в направлении
от тератом к TEC-животным (см. рис. 13.1, голу-
бая стрелка). Более того, плюрипотентность СК
считается исчерпывающе доказанной, когда мы
имеем фертильных самок и самцов, которые
полностью развились из гамет-потомков вве-
денных СК (второе, третье и т. п. поколение, по-
лученное от химер или ТЕС-животных). Толь-
ко тогда можно заключить, что СК не претерпе-
ли существенных эпигенетических изменений,
влияющих на способность к дифференцировке и
нормальному’ морфогенезу. Только тогда можно
утверждать, что процедуры культивирования,
криоконсервации, трансформации, субклониро-
вания, сортинга и т. д. не привели к накоплению
геномных мутаций и хромосомных аберраций,
снижающих жизнеспособность и/или фертиль-
ность химер или животных — потомков СК. Это
сложно, долго и дорого. Не менее важно и то,
что вероятность получения желаемого результа-
та существенно снижается в направлении «тера-
тома—фертильные потомки (Fi, F2), происходя-
щие из СК» (см. рис. 13.1, малиновая стрелка).
Каков же оптимальный баланс? Сегодня оценка
плюрипотентности in vivo проводится преиму-
щественно тремя базовыми методами: индукци-
ей тератом (1). анализом заселения химерной
бластоцисты (2) и проведением «теста на химе-
ризм» (3).
Индукция тератом (1) осуществляется введе-
нием суспензии СК в организм животных, имею-
щих сниженный иммунный статус (чаще всего
это мыши, несущие пи пи или мыши SCID). «Те-
ратомный тест» можно рассматривать как свое-
Оценка плюрипотентности: тесты in vivo
зрелые тератомы
химерные бластоцисты
химерные ранние постимплантационные эмбрионы
(Е6—Е8)
первичные химеры с потомками СК только
в соматических органах и тканях
первичные химеры с потомками СК в соматических и
генеративных органах и тканях
первичные химеры с преимущественным заселением
всех органов и тканей потомками СК
(«сбалансированные химеры»)
ТЕС-животные
функциональные гаметы, происходящие из потомков СК
(germ-line transmission)
фертильные самки и самцы, которые полностью
развились из гамет-потомков СК (второе, третье и т. п.
поколение, полученное от химер или ТЕС-животных)
Рис. 13.1. Совокупность всех тестов оценки плюрипотентности различных СК в условиях in vivo.
ГЛАВА 13 345
образную дань традиции перевивания опухолей:
первоначально он использовался для работы с
культурами клеток эмбриональной карциномы
[Rossant, McBumey, 1982] и далее был адекватно
перенесен на исследования плюрипотентности
ЭС-клеток [Robertson, 1987]. Как правило, суспен-
зия СК вводится подкожно в область загривка
[Hogan et al., 1994]. При инъекции СК под капсулу
семенника, под капсулу почки или в переднюю
камеру глаза из-за сложности и травматичности
операции выход тератом снижается, однако при
инкубации клеток под капсулой органа удается
получить более широкий спектр дифференци-
ровки. Главный недостаток данного метода со-
стоит в том, что индуцированная in vivo диффе-
ренцировка СК происходит все-таки в эктопиче-
ских сайтах и в окружении «взрослых» тканей,
что практически полностью отменяет возмож-
ность нормального морфогенеза. Дериваты, по-
лучаемые при такой эктопической дифференци-
ровке, в лучшем случае не выходят за пределы
разнообразия клеточных форм зрелой тератомы, а
в худшем случае образуют обширные быстро-
растущие злокачественные опухоли карцином-
ного типа. Однако, несмотря на биологические и
методические ограничения, «тератомный тест»
широко используется как в исследовательской
работе [Ritner, Bernstein, 2010; Chen etal., 2011;
и мн. др. I, так и в практике оказания услуг в об-
ласти прикладных технологий СК (www.applied-
stemcell.com/product/detail/45: http://med.stanford.
edu/transgenic/teratoma-formation.html). Следует
подчеркнуть, что «тератомный тест» — единст-
венный способ проверки плюрипотентности СК
человека [Lensch et al., 2007], поскольку’ конст-
руирование внутривидовых химер в этом случае
совсем невозможно по причинам этического по-
рядка, а конструирование межвидовых химер
[Behringer, 2007: Siqueira da Fonseca et al., 2009]
также представляет собой пограничную этиче-
скую проблему [Karpowicz et al., 2005].
Анализ заселения химерной бластоцисты (2)
не является полноценным тестом in vivo, по-
скольку', по су’ти своей, дает ответ только на
один вопрос: интегрирутотся ли введенные СК в
герминальный компартмент бластоцисты, т. е. во
внутреннюю клеточную массу или эпибласт? В
настоящее время данный тест используется
очень редко, и область его применения ограни-
чена, преимущественно, моделью человеческие
СК <-» бластоциста мыши [Simerlv et al., 2011; Du
etal., 2012].
Таким образом, из всего названного выше
только тест на химеризм (3) полностью удовле-
творяет требованию возвращения СК и/или их
производных в естественну’ю нишу’. Если в ре-
зультате контакта СК с эмбрионом рождается
химерное животное, способное давать СК-про-
исходящих потомков, считается, что плюрипо-
тентность исследованной линии доказана de
facto. Если рождается сбалансированная химера,
однако прохождения потомков СК в зародыше-
вый путь не наблюдается, принято считать, что
плюрипотентность исследуемой линии СК в ус-
ловиях in vivo несколько снижена. В настоящее
время тест на химеризм проводится в двух ва-
риациях: post parhim. когда химеры определяют-
ся после рождения, и in utero, когда химеры оп-
ределяются в эмбриональный и плодный перио-
ды развития. Анализ in utero требует надежного
генетического маркирования линии СК, напри-
мер с помощью флуорохрома, экспрессирующе-
гося под конститутивным промотором [Hadjan-
tonakis et al., 2002], или же надежной дискрими-
нации партнеров с помощью молекулярно-гене-
тических маркеров [Tachibana etal.. 2012]. Ана-
лиз in utero позволяет увеличить число химер и
сократить время, необходимое для проведения
теста на химеризм, а также получить прямой от-
вет на вопрос о возможной избирательной или
неизбирательной гибели химерных эмбрионов.
13.2. Виды ХИМЕРИЗМА У МЛЕКОПИТАЮЩИХ
Как было отмечено в и. 13.1, достаточным ус-
ловием для доказательства плюрипотентности в
условиях in vivo для всех СК, кроме человече-
ских, по-прежнему’ является «тест на химеризм».
В современной биологии под «химерой» в самом
широком смысле этого слова понимают комби-
нированный организм, который происходит бо-
лее чем из одной зиготы. Различия в клеточных
популяциях, слагающих тело химеры, во многом
обусловлены изначальными генотипическими
различиями партнеров по конструкции. Химеры
принципиально отличаются от мозаиков, кото-
рые тоже являются комбинированными организ-
мами, однако возникают из одной зиготы [Мак-
Ларен, 1979]. Мозаик состоит из разных клеточ-
ных попу’ляций, но здесь причина клеточного
разнообразия другая — ранние бластомеры при-
обретают цитогенетические, генетические или
эпигенетические различия непосредственно в
онтогенезе, например, когда один из бластоме-
ров теряет половую хромосому’. Вопрос о том,
что из обозначенного — химера или мозаик —
является частным случаем, а что более общим,
на наш взгляд, не имеет особого биологического
346 ЭПИГЕНЕТИКА
смысла и решается каждым из исследователей
субъективно.
Феномен химеризма распространен как среди
животных, так и среди растений. Наибольший
интерес в последние несколько десятков лет вы-
зывают исследования химеризма у млекопи-
тающих. Из данного выше определения химеры
следует, что феномен химеризма может быть
рассмотрен в двух качествах — существование
«оформленной» взрослой химеры и сам по себе
процесс становления химерного паттерна орга-
низации тела. В зависимости от того, в каком из
периодов онтогенеза произошло становление
химерного паттерна тела, у млекопитающих тра-
диционно различают первичных и вторичных
химер [Там же]. Первичные (эмбриональные)
химеры — особи, организм которых скомбини-
рован из клеток разного генотипа на очень ран-
них стадиях эмбриогенеза, как правило, в доим-
плантационный период развития [Там же]. Вто-
ричные химеры образуются значительно позд-
нее — в плодный и даже постнатальный перио-
ды. Вторичными (ятрогенными) химерами счи-
таются все организмы, перенесшие траспланта-
цию органов, а также любого аллогенного или
ксеногенного тканевого или клеточного мате-
риала [Мак-Ларей, 1979; Kristt etal., 2005]. Про-
межуточное положение занимают фето-феталь-
ные химеры и химеры по типу’ «мать-плод», ко-
торые изучены преимущественно как клиниче-
ские случаи в развитии человека [Bianchi et al.,
1996; Tanaka et al., 2000; Khosrotehrani et al.,
2003; Ichinohe etal., 2005; Boklage, 2006]. Кроме
того, химеры бывают внутривидовыми (intra-
specific chimeras) и межвидовыми (interspecific
chimeras).
Одно из перспективных направлений — соз-
дание так называемых очеловеченных животных
моделей (humanized mice) [Behringer. 2007; Manz.
DiSanto, 2009; Strom etal., 2010]. Данные живот-
ные модели являются не чем иным, как межвидо-
выми трансплантационными химерами, полу-
ченными с помощью подсадки человеческого
клеточного или тканевого материала иммуноде-
фицитным животным. Так, если подобная под-
садка человеческих стволовых гематопоэтиче-
ских клеток или гепатоцитов проведена живот-
ным, у которых имеется врожденный дефицит
клеток костного мозга или печеночных клеток,
получаются вторичные химеры, у которых боль-
шая часть иммунных клеток [Traggiai et al., 2004]
или гепатоцитов [Azuma et al., 2007] развивается
из человеческого трансплантата. Эффективность
такого рода орган-специфической транспланта-
ции весьма высока, особенно по контрасту’ с по-
лучением, например, первичных межвидовых
химер агрегацией человеческих стволовых кле-
ток с дробящимися эмбрионами мыши или инъ-
екцией стволовых клеток человека в бластоци-
сты мыши, где вклад человеческих клеток ока-
зался небольшим [James et al., 2006; Siqueira da
Fonseca et al., 2009].
По механизму’ образования химеры бывают
спонтанные [Ford, Evans, 1977; Ross etal., 2007;
Dreger, Schmutz, 2012], индуцированные, напри-
мер процедурами BPT [Strain etal., 1998; Wil-
liams et al.. 2004; Miura. Niikawa. 2005; Bogdanova
etal., 2010], и экспериментальные [Prathel etal.,
1989; Tam, Rossant, 2003; Eckardt etal., 2011].
Партнерами по химеризации могут быть эмбрио-
ны разных стадий предымплантационного перио-
да развития [Prather et al., 1989], а также стволо-
вые клетки разного происхождения. Сегодня ме-
тод широко применяется для работы с самыми раз-
ными типами плюрипотентных клеток: SKPs —
Skin-Derived Progenitors [Zhao etal.. 2012].
NSCs — Neural Stem Cells [Greco et al., 2004; Zhao
etal., 2012]; FDCPmix cells (популяция, выделен-
ная после долгого культивирования клеток кост-
ного мозга) [Petrovic et al., 2004]; SSCs — Sper-
matogonial Stem Cells [Izadyar et al., 2008], а также
с различными индуцированными плюрипотент-
ными соматическими клетками [Yusa et al., 2009;
West etal., 2010; Araki etal., 2011; Chen etal..
2011; Tsai et al., 2011; Fischedick et al., 2012].
Отдельную группу образуют химеры, состав-
ленные партнерами, различающимися по плоид-
ности, например In 4п [Nagy et al., 1990; Eakin
etal., 2005]. Описаны и тщательно изучены хи-
меры, скомбинированные с партнерами, разли-
чающимися по онтогенетическому’ статусу, на-
пример химеры с партеногенетическими (Pg <-» F)
[Исаев и др.. 1999] или андрогенетическими
(Ag F) бластомерами [Stevens, 1978; Anderegg,
Markert, 1986; Paldi etal., 1989; Fundele etal.,
1990], или партеногенетическими ЭС-клетками
[Allen etal., 1994]. Ядерно-цитоплазматические
химеры [Свиридова и др., 1987; Tecirlioglu etal.,
2006] представляют собой особый класс химер, у
которых химерный паттерн тела задается не соб-
ственно комбинацией разных клеточных попу-
ляций, а комбинацией ядра и цитопласта. В этом
случае чаще всего речь идет о межвидовом
ядерно-цитоплазматическом химеризме [Tecir-
lioglu et al., 2006].
Для описания химер использу’ется простая
унифицированная номенклатура. Универсаль-
ный символ, обозначающий химеру, — обоюдо-
ГЛАВА 13 347
острая или равновесная стрелка. Например, за-
пись V|C57BE(8k.i, 2п) «-» 129 Ola, tau-GFP ES,
An «-> С57ВЬ(8кл, 2п)] означает, что перед нами
химерное животное, фенотипически — самец,
полученное сэндвич-агрегацией двух диплоид-
ных 8-клеточных эмбрионов генотипа C57BL и
группы тетраплоидных tau-GFP-маркированных
эмбриональных стволовых клеток, происходя-
щих из линии мышей 129 01а.
13.3. Эмбриологические основы
ФЕНОМЕНА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО
ПЕРВИЧНОГО ХИМЕРИЗМА
Эволюционной особенностью плацентарных
млекопитающих считается высокая регуляция
процессов их раннего развития [Дыбан, 1988;
Иванова-Казас, 1995]. Методы получения экспе-
риментальных эмбриональных химер основаны
на совокупности трех уникальных качеств ран-
него развития млекопитающих — относительной
автономности предымплантационного периода
(а), «гибком» обособлении основных клеточных
линий (Ь) и высокой компетенции ранних эм-
брионов (с).
(а) При исключительной эмбрионизации всех
стадий и процессов [Сахарова, 2004] в развитии
Eutheria, тем не менее, есть период относитель-
ной автономии, который включает в себя ста-
дию зиготы, дробление, моруляцию, кавитацию
и бластоцистогенез [Дыбан. 1988: Hogan etal.,
1994]. Автономность развития проявляется в
том, что эмбрионы, будучи изъятыми из мате-
ринского организма, способны далее развиваться
in vitro. Главное условие для этого — адекватное
культивирование, основанное на учете видоспе-
цифических особенностей метаболизма и тай-
минга [Hogan etal., 1994; Корсак, 2011|. Только
в этот короткий период, например у мыши он
длится не более 3,5 дней, эмбрионы доступны
для разного рода манит’ляций — разделения,
перемешивания, композиции и т. и. Однако по-
сле завершения манипуляций эмбрион должен
быть обязательно возвращен в материнский ор-
ганизм, причем не позднее, чем на стадии бла-
стоцисты [Hogan etal., 1994; Корсак, 2011]. Все
методы получения экспериментальных эмбрио-
нальных химер построены или на агрегации эм-
бриональных клеток с автономным эмбрионом,
или на инъекции эмбриональных клеток в авто-
номный эмбрион [Prather et al., 1989; Surani et al.,
1989; Prell et al., 2002; Tam, Rossant, 2003; Моро-
зова, Соломко, 2003; Eakin, Hadjantonakis, 2006;
Tanaka et al., 2009; Eckardt et al., 2011].
(b) Обособление первых клеточных линий и
закладка осей раннего эмбриона — эти две не-
разрывно связанные друг с другом темы вызвали
горячую научную дискуссию, которая началась
вместе с новым тысячелетием [Zernicka-Goetz.
2002, 2005, 2006; Hiiragi et al., 2006; Bischoff
et al., 2008; Rossant, Tam, 2009; Cockbum, Ros-
sant, 2010; Gasperowicz, Natale, 2011; Takaoka,
Hamada, 2012]. Сегодня предложено несколь-
ко принципиально разных сценариев обособле-
ния самых первых клеточных линий у млекопи-
тающих, обсуждаются и уточняются клеточные
и молекулярные механизмы пространственной
спецификации раннего эмбриона [Zemicka-Go-
etz, 2002, 2005, 2006; Hiiragi et al., 2006; Rossant,
Tam, 2009]. Наиболее ярко это проявляется на
примере разработки теории клональной структу-
ры бластоцисты и ранней закладки определяю-
щих осей [Plusa et al., 2005; Bischoff et al., 2008;
Grabarek etal., 2012]. В контексте феномена хи-
меризма интересно отметить, что и последовате-
ли теории клональной структуры бластоцисты, и
ее горячие оппоненты признают: какой бы ни
была структура раннего эмбриона, в закладке
первых клеточных линий у млекопитающих, по
всей видимости, отсутствует жесткая и одно-
значная детерминация, сопутствующая ооплаз-
матической сегрегации и динамической сегрега-
ции бластомеров [Иванова-Казас, 1995]. Обо-
собление первых клеточных линий представляет
собой, скорее, сложный баланс детерминирован-
ных и стохастических процессов [Zernicka-Goetz,
Huang, 2010], что, в свою очередь, обеспечивает
эквифинальность развития.
(с) Именно благодаря эквифинальности раз-
вития (или качеству компетенции) скомбиниро-
ванные в разных вариациях эмбрионы млекопи-
тающих образуют в условиях in vitro нечто еди-
ное, которое способно и далее развиваться как
целостная структура в условиях in vivo. Возмож-
но, видоспецифические отличия в компетенции
эмбрионов являются причиной наблюдаемых
отличий — как в частотах спонтанного химериз-
ма [Ford, Evans, 1977; Ross etal., 2007; Dreger,
Schmutz, 2012], так и в эффективности основных
методов получения химер у разных видов мле-
копитающих [Tashibana etal., 2012; Trounson,
Grieshammer, 2012]. Границы компетенции эм-
брионов лабораторной мыши, по-видимому,
весьма широки. Интересно, что даже эмбрионы,
витрифицированные на разных стадиях разви-
тия, практически не теряют своей компетенции и
способны давать агрегационных и инъекцион-
ных химер [Kite etal., 2003]. С другой стороны,
348 ЭПИГЕНЕТИКА
даже совсем «экзотические» стволовые клетки,
например ЭС-клетки, выделенные из бластоцист,
которые, в свою очередь, были получены с по-
мощью NT-технологии из замороженных-высу-
шенных ЭС и кумулюсных клеток. — даже эти
клеточные типы оказались способны интегриро-
ваться в развивающийся эмбрион и впоследст-
вии обширно заселять практически все органы и
ткани [Ono et al., 2008].
13.4. Основные методы
ПОЛУЧЕНИЯ ПЕРВИЧНЫХ ХИМЕР
Основных методов получения первичных хи-
мер всего три — инъекция, агрегация и TEC (tet-
raploid complementation, тетраплоидная компле-
ментация). Получение ядерно-цитоплазматиче-
ских химер будет рассмотрено отдельно.
Агрегация. Метод предложен Тарковским
[Tarkovsky, 1961] и Минц [Mintz, 1962] в начале
шестидесятых годов прошлого столетия, далее
он был серьезно модифицирован многими ис-
следователями для работы с ЭС-клетками (на-
пример, для обзора частных протоколов, см.
[Eakin, Hadjantonakis, 2006]). Метод основан на
том, что после смешивания эмбрионов не проис-
ходит никакой рассортировки клеток, и потомки
разных по происхождению бластомеров разви-
ваются в соответствии со своим новым положе-
нием в составе зародыша [Мак-Ларей, 1979].
Метод сравнительно прост и не требует сверх-
точного оборудования, причем его развитие в по-
следние 10—15 лет идет в сторону еще большего
упрощения и унификации [Wood etal., 1993;
kondoh etal., 1999; Orimo etal., 1999; Gertsenstein
etal., 2010]. Метод отлично работает, если плю-
рипотентность ЭС-клеток уже доказана in vivo с
помощью инъекционного протокола, и задача ис-
следователя — получение как можно большего
числа сбалансированных и/или полностью засе-
ленных потомками ЭС-клеток химер: именно у
них вероятность заселения гонад очень велика.
Основное ограничение метода агрегации — высо-
кие требования к процедуре культивирования
эмбрионов и эмбриональных стволовых клеток
[Gertsenstein etal., 2010]. Культивирование эмб-
рионов в этом случае длится не менее 1—2 суток
и сильно отличается от кратковременной пере-
держки бластоцист после инъекции [Hogan et al.,
1994]. Несмотря на кажущуюся простоту’ испол-
нения, агрегация эмбрионов — очень чувстви-
тельный и уязвимый процесс.
Биологическое ограничение метода состоит в
том, что эффективность выхода химер сильно
зависит от синхронности эмбрионов [Stem, Wil-
son, 1972]. В агрегацию охотно вступают, в ос-
новном, бластомеры на стадии 6—8 клеток, об-
ладающие максимальной адгезивностью. Адге-
зивность у двухклсточных эмбрионов намного
ниже, чем у четырехклеточных, а бластомеры
32-клеточной компактной морулы и ранней бла-
стоцисты снова теряют способность к агрегации
[Collins, Flemming, 1995].
Инъекция. Метод был предложен Гарднером
[Gardner, 1968] в конце шестидесятых годов
прошлого столетия и модифицирован сначала
для работы с клетками эмбриональной карцино-
мы [Rossant, McBumey. 1982], а затем — и с эмб-
риональными стволовыми клетками [Robertson,
1986]. Метод, по сути, основан на процедуре
введения клеток (или ВКМ) одного генотипа в
бластоцисту’ другого генотипа. С тех пор он не
претерпел существенных изменений, кроме, по-
жалуй, разработки интересных, но очень слож-
ных и дорогих протоколов получения сбаланси-
рованных химер с помощью точечной лазерной
перфорации блестящей оболочки и последую-
щей инъекции небольшого числа ЭС-клеток под
блестящую оболочку’ восьмиклеточного эмбрио-
на [Saburi et al., 1997; Poueymirou et al., 2007; De
Repentigny, Kothary, 2010; DeChiara et al., 2010].
Техническими ограничениями метода явля-
ются высокая инструментальность, потребность
в опытном персонале и трудоемкость. Биологи-
ческим ограничением является относительная
кратковременность стадии бластоцисты у грызу-
нов. Для 2п бластоцист время, в течение которо-
го манипуляция эффективна, составляет не более
8 ч и оптимальна только стадия Е3.5 [Hogan
etal., 1994]. Для тетраплоидных эмбрионов (по-
дробнее об этом методе — см. ниже раздел «Тет-
раплоидная комплементация») эта временная
граница немного раздвигается. Так. было пока-
зано, что 4и бластоцисты, взятые на стадиях Е3.5
и Е4.5, сопоставимы по компетенции: доля про-
исходящих из ЭС-клеток животных практически
не различается для бластоцист этого возраста.
Однако при использовании бластоцист Е5.5 эф-
фективность манипуляций существенно умень-
шилась, что и было ожидаемо [Ohta et al., 2008].
Преимущество инъекции — высокая эффек-
тивность, т. е. в среднем более высокая, чем при
агрегации, доля химер среди рожденных транс-
плантированных потомков. В ряде случаев инъ-
екционный протокол является единственно воз-
можным. Например, при работе с ранними эм-
брионами кроликов, которые не могут разви-
ваться без блестящей оболочки [Moustafa, 1974],
ГЛАВА 13 349
а также при создании межвидовых химер. В по-
следнем случае во избежание отторжения плода
необходимо поддержание генотипического сход-
ства трофобласта с самкой-реципиентом [Surani
etal., 1987; Морозова. Соломко. 20031. Такой спо-
соб реконструкции (введение ВКМ Mus caroli в
бластоцисту’ Mus musculus) привел к успешному’
получению межвидовых химер с указанными ви-
дами [Rossant, Freis, 1980; Rossant etal., 1982]. По
сходному' принципу’ получены межвидовые химе-
ры коза <-» овца [Fehily et al., 1984; Willadsen,
1985] и крыса <-» мышь [Isotani et al., 2011].
Возвращаясь в контекст получения генетиче-
ски модифицированных животных методом инъ-
екции ЭС-клеток в бластоцисту, рассмотрим два
возможных варианта взаимодействия партнеров.
Во-первых, инъекция мутантных ЭС-клеток (или
других плюрипотентных клеток) в нормальную
бластоцисту’. Потомки введенных клеток будут
заселять только ткани, происходящие из эпибла-
ста. При условии заселения гонад такие химеры
могут послужить основателями новых мутант-
ных линий мышей. Они также могут быть ис-
пользованы для исследования мутантного (или
химерного) фенотипа и для тестирования плю-
рипотентных качеств новых мутантных линий
ЭС-клеток, ИПСК и подобных им [Mann et al.,
1990; Barton etal., 1991; Maandag etal., 1994;
Reiner etal., 2001; Takahashi, Yamanaka, 2006].
Во-вторых, нормальные ЭС-клетки, ИПСК и по-
добные им линии клеток могут быть инъециро-
ваны в мутантную бластоцисту’. Тогда производ-
ные трофобласта будут мутантными, а произ-
водные герминальной закладки будут представ-
лять собой смесь нормальных и мутантных кле-
точных клонов. В некоторых случаях сниженная
жизнеспособность или значимая рестрикция по-
тенциала к развитию, свойственная эмбриону-
холдеру. приводит к тому’, что в пределах экспе-
риментальной системы появляется свободная
ниша (empty developmental niche) [Eckardt et al.,
2011], которая может быть «заполнена» введен-
ными ЭС-клетками, ИПСК или другими плюри-
потентными клетками. Собственно, именно это и
составляет суть принципа эмбриональной ком-
плементации (blastocyst complementation) [Eck-
ardt etal., 2011], получивший наибольшее выра-
жение в TEC-тесте (Tetrapioid Embryo Comple-
mentation) [Eakin, Behringer, 2003; MacKay, West,
2005; Kirchain et al., 2008].
Тетраплоидная комплементация. Метод
TEC основан на избирательной элиминации по-
томков тетраплоидных бластомеров из всех эмб-
риональных линий [Eakin etal., 2005]. Экстра-
эмбриональные линии сохраняют при этом хи-
мерный паттерн или даже полностью состоят из
потомков тетраплоидных бластомеров. Тетра-
плоидные эмбрионы, полученные электрослия-
нием бластомеров, способны сформировать бла-
стоцисту и даже способны к имплантации, одна-
ко развитие тетраплоидных эмбрионов прекра-
щается достаточно рано — на стадиях Е8—ЕЮ
[Eakin, Behringer, 2003; Eakin etal., 2005]. В хи-
мерах с диплоидными эмбрионами тетраплоид-
ные клетки очень быстро и практически полно-
стью исключаются из эпибласта, но сами по се-
бе формируют трофоэктодерму. Таким образом,
инъекционные и агрегационные 2п 4и химеры
развиваются в животных, которые полностью
состоят из потомков диплоидных бластомеров
или диплоидных СК [Nagy et al., 1993; Eakin
et al., 2005]. Метод предложен достаточно давно
[Tarkowski et al., 1977], но широкое распростра-
нение и «второе дыхание» получил не ранее, чем
были разработаны приборы и предложены на-
дежные протоколы электрослияния [Nagy’ et al.,
1990, 1993]. Он оказался чрезвычайно востребо-
ван как способ быстрого получения мышей же-
лаемого генотипа [Eggan etal., 2001; Tam, Ros-
sant, 2003]. TEC также применяется для оценки
действия различных siRNA на фенотитипы, по-
лученные в результате нокаута и т. и. [Kunath
et al., 2003].
Ядерно-цитоплазматические химеры. Ис-
торически метод представлял собой замену’ од-
ного ядра двуклеточного эмбриона ядром бла-
стомера любой другой стадии развития или
ядром соматической клетки [Свиридова и др.,
1987]. Такие организмы можно было по праву’
считать химерными, поскольку' вторая популя-
ция клеток была представлена потомками ин-
тактного бластомера. Сейчас для получения
ядерно-цитоплазматических химер используется
межвидовая пересадка соматического ядра в
ооцит, находящийся в МП-стадии (interspecies
Somatic Cell Nuclear Transfer, iSCNT). Успеш-
ность данного метода была неоднократно про-
демонстрирована in vitro формированием нор-
мальных iSCNT-происходящих эмбрионов [Lor-
thongpanich etal., 2008; Imsoonthomruksa etal.,
2011; и мн. др.] и даже рождением химерного по-
томства у некоторых «удачных» пар видов. Так,
живое потомство получено как минимум в преде-
лах отрядов Bovidae, Cervidae и Equidae [Tecir-
lioglu etal., 2006]. С другой стороны, благодаря
именно этому’ подходу' были созданы iSCNT-гиб-
ридные ЭС-клетки, которые одновременно содер-
жали ядерный геном соматического донора и ми-
350 ЭПИГЕНЕТИКА
тохондриальную ДНК как донора, так и реципи-
ентного ооцита [Tecirlioglu et al., 2006].
Несмотря на значительные трудности — ано-
мальное ядерное репрограммирование, низкая
эффективность и одновременное присутствие
как минимум двух митохондриальных геномов,
принадлежащих разным видам, — данная мо-
дель химеризма оказалась востребованной при
изучении репрограммирования соматического
генома [Lorthongpanich et al., 2008, 2010; Kelly,
John, 2010]. Полагается также, что этот подход
может быть многообещающим в ВРТ (вспомога-
тельные репродуктивные технологии)-стратегии
сохранения угрожаемых видов [Imsoonthomruksa
et al., 2011]. Например, у мелких кошачьих уда-
лось получить полноценное живое потомство,
происходящее именно из бластоцист после
iSCNT [Gomez et al., 2009].
13.5. Закономерности заселения органов
И ТКАНЕЙ ХИМЕРЫ ПОТОМКАМИ ПАРТНЕРОВ
ПО ПЕРВИЧНОЙ ХИМЕРИЗАЦИИ
В целом на формирование химерного паттер-
на оказывают действие разные факторы: стадия
развития, на которой осуществляется контакт;
генетический фон партнеров по химеризации;
число накопленных пассажей у СК; плоидность,
онтогенетический статус и т. д. Основные зако-
номерности заселения органов и тканей химеры
потомками по первичной химеризации пред-
ставлены на рис. 13.2. Потенции бластомеров
восьмиклеточного эмбриона еще сравнительно
широки, поэтому’, при прочих равных, потомки
бластомеров разных эмбрионов в среднем про-
порционально вкладывают и собственно в тело
зародыша, и во все провизорные органы и ткани.
Когда агрегируют два диплоидных восьмикле-
точных эмбриона, химеризм имеет место и в эпи-
бласте, и в первичной энтодерме, и в трофобла-
сте. Однако, если в диплоидное эмбриональное
окружение (восьмиклеточный эмбрион, морула
или бластоциста) вводится только внутренняя
клеточная масса, ее потомки вносят вклад пре-
имущественно в эпибласт и первичную энто-
дерму’ и практически не заселяют трофоэктодер-
му [Tam, Rossant, 2003]. Подобным образом ве-
дут себя и ЭС-клетки: они дают вклад только в
герминальный зачаток, который, в свою очередь,
дает все эмбриональные ткани и некоторые экс-
траэмбриональные производные — амнион, ме-
зодерму’ желточного мешка, аллантоис и крове-
носные сосуды плаценты (только те, которые
имеют эмбриональное происхождение) [Bedding-
ton, Robertson, 1989].
Однако следует заметить, что представленная
схема очень обобщенно отражает имеющиеся
данные о формировании химерного паттерна
тела. Реальные ситуации, по-видимому, не так
просты и менее предсказуемы. Так, совсем не-
давно была опубликована работа [MacFarlan
etal., 2012], в которой показано следующее: в
некоторых линиях ЭС-клеток и ИПСК присутст-
вует очень немногочисленная (не более 2 %) по-
пуляция высокоплюрипотентных клеток, имею-
щих потенциал развития, сопоставимый с тако-
вым у бластомеров на стадии двух клеток. По-
томки этих практически тотипотентных клеток
равновероятно заселяют как эмбриональные, так
и экстраэмбриональные линии [Ibid]. Друтой при-
мер исключения из правил — это плюрипотент-
ность тетраплоидных и околотетраплоидных
ЭС-клеток. По аналогии с поведением 4и эмб-
рионов [Nagy et al., 1990; Eakin et al., 2005] сле-
довало бы ожидать, что потомки 4и ЭС-клеток
обширно заселят провизорные органы и ткани,
но будут полностью элиминированы из эмбрио-
нальной части. Однако в эксперименте никакой
элиминации не произошло, и химеры (4и)ЭС-
клетки «-» (2и)бластоциста ничем не отличались
от химер (2и)ЭС-клетки«->-(2и)бластоциста [Kru-
glova et al., 2008].
13.6. Новые сферы применения
ХИМЕРНЫХ ЖИВЫХ МОДЕЛЕЙ
Первичные экспериментальные химеры (de-
velopmental chimeras) [Eckardt et al., 2011], в осо-
бенности те, что получены методом инъекции
плюрипотентных СК в бластоцисты мутантного
генотипа, оказались весьма эффективной систе-
мой для исследования процессов, протекающих
во взрослых организмах. В этом случае бласто-
циста, несущая мутацию, которая вызывает спе-
цифический направленный дефект постнаталь-
ных органов и тканей, предоставляет в ходе соб-
ственного развития свободную нишу (empty de-
velopmental niche) [Eckardt etal., 2011], которая
может быть заполнена только потомками вве-
денных плюрипотентных СК. Этот подход
(АТС, Adult Tissue Complementation), был ус-
пешно реализован в течение последних лет. Так,
созданы мыши с полным замещением Т- и В-
лимфоцитов [Chen et al., 1993; Young et al., 2004;
Kim et al., 2005] и системы кроветворения [Jans-
son, Larsson, 2010] и др.
ГЛАВА 13 351
Рис. 13.2. Заселение эмбриональных и экстраэмбриональных линий потом-
ками GFP-маркированных клеток при разных методах конструирования химер
(по [Tam, Rossant, 2003]).
а — 2п эмбрион «-> 2п эмбрион; б— ЭС-клетки «-> 2п эмбрион; в — ЭС-клетки «-> 4п эмб-
рион; г — ТС-клетки «-> 2л эмбрион. I — процедура получения химер; II—III химерный пат-
терн на стадиях Е5.5—Е6.5; IV — химерный паттерн на стадии Е9.5. te — трофоэкто-
дерма; ех — экстраэмбриональная эктодерма; ve — висцеральная энтодерма; ре —
первичная энтодерма; ер — эпибласт; rm — мембрана Рейхарта; pl — плацента; vys —
висцеральный листок желточного мешка.
352 ЭПИГЕНЕТИКА
Первичные экспериментальные химеры в со-
четании с тканевой комплементацией (АТС) ак-
тивно используются для изучения регенерации
органов у взрослого организма. Пример такого
рода работ — исследование пролиферативных
возможностей ИПСК-происходящих гепатоци-
тов в мышах, дефицитных по FAH [Eckardt et al.,
2011]. Не менее интересно конструирование
межвидовых химер для продукции ксеногенных
органов. Так, для изучения регенерации подже-
лудочной железы были получены химеры кры-
са^мышь, у которых поджелудочная железа
развилась только из потомков ИПСК крысы
[Kobayashi et al., 2010].
Первичные экспериментальные химеры ус-
пешно используются для исследований функ-
ционального созревания и гомеостаза тканей.
Так, используя анализ GFP-маркированного хи-
мерного паттерна, показали, что у взрослых мы-
шей существуют как минимум два разных меха-
низма, обеспечивающих гомеостаз ткани легкого
[Giangreco et al., 2009].
13.7. Феномен первичного
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ХИМЕРИЗМА
В КОНТЕКСТЕ СОВРЕМЕННОЙ БИОЛОГИИ
РАЗВИТИЯ МЛЕКОПИТАЮЩИХ
В шестидесятых—семидесятых годах прош-
лого столетия эмбриологи-экспериментаторы
выполнили ряд работ, направленных на решение
достаточно узких академических вопросов о ре-
гуляции раннего развития млекопитающих. Ис-
следователи использовали при этом, можно ска-
зать, детский полу игровой прием «что будет,
если...?». Что будет, если уменьшить или увели-
чить число клеток в предымплантационном эмб-
рионе? А что будет, если разными способами
перемешать клеточный материал двух и более
эмбрионов? Казалось бы, далекие от жизни и не-
замысловатые по сравнению с дизайном совре-
менных исследований опыты с эмбрионами мы-
ши привели к важному’ заключению — в пред-
ымплантационный эмбрион могут быть введены
другие клетки, и эта манипуляция сама по себе
не нарушит целостного хода процессов развития
[Tarkowski, 1961; Mintz, 1967; Gardner, 1968].
Далее было убедительно показано, что плю-
рипотентные эмбриональные СК, происходящие
из внутренней клеточной массы бластоцисты,
будучи введенными в эмбрион, способны диф-
ференцироваться во все клеточные типы химе-
ры, включая клетки зародышевого пути [Robert-
son, 1986, 1987]. Демонстрация возможностей
гомологичной рекомбинации для получения му-
тантных линий ЭС-клеток [Thomas, Capecchi,
1987; Doetschman et al., 1988] практически «рас-
пахнула двери» в новую эру — эру направленно-
го мутагенеза млекопитающих. Сегодня получе-
ние химер с использованием генетически-моди-
фицированных ЭС-клеток представляет собой
ключевое звено в производстве лабораторных
животных с направленными изменениями гено-
типа (designer mice) [Tam, Rossant, 2003; Eckardt
etal., 2011].
Однако, химера — это не только частный ин-
струмент для того, чтобы просто и быстро полу-
чить мутантных мышей или оценить возможно-
сти новых линий плюрипотентных клеток [Prelle
etal., 2002]. Данный подход по-прежнему чрез-
вычайно важен для клонального анализа заклад-
ки органов и генезиса тканей, для фенотипики,
для преодоления барьера имплантации и для ре-
шения многих других фундаментальных и при-
кладных задач современной биологии развития
[Prather et al., 1989; Tam, Rossant, 2003; Морозо-
ва, Соломко, 2003; Eckardt et al., 2011].
Открытие экспериментального первичного
химеризма стимулировало, в свою очередь, серию
работ, посвященных проблеме естественного
первичного химеризма у человека. Эти иссле-
дования до сих пор остаются весьма актуальны-
ми, поскольку’ некоторые клинические случаи
конгенитальных аномалий у человека, по всей
видимости, индуцированы применением вспо-
могательных репродуктивных технологий [Strain
etal., 1998; Miura, Niikava, 2005; Shalev etal.,
2006; Souter etal., 2007; Bogdanova etal., 2010].
Сегодня исследователей этой большой проблемы
интересуют следующие вопросы [Golubovsky,
2003; Miura, Niikava, 2005; Boklage, 2006; Machin,
2009; Bogdanova et al., 2010; Otsuki et al., 2012]:
1. Существует ли естественный (спонтан-
ный) первичный химеризм у человека?
2. Если существует, то какими факторами
он управляется и посредством каких ме-
ханизмов он реализуется?
3. Что непосредственно индуцирует пер-
вичный и фетофетальный химеризм в
случае применения ВРТ-технологий при
терапии бесплодия у человека? Какой из
факторов является ведущим?
4. Как можно снизить риск рождения ВРТ-
индуцированных химер, особенно химер
XX/XY?
В качестве возможных механизмов, вызы-
вающих химеризацию у человека, сегодня назы-
вают агрегацию эмбрионов, образование бипо-
ГЛАВА 13 353
Независимое
формирование
пронуклеусов
в каждом
оплодотворенном
ооците
Оплодотворение
каждого из
ооцитов
Пенетрация,
независимое
выделение второго
полярного тельца
из каждого ооцита
Дупликация
хромосом
Начало митоза
Сингамия в каждой клетке
Два
двухклеточных
эмбриона
Два
четырехклеточных
эмбриона
Агрегация
эмбрионов
на стадии морулы
Химерная
бластоциста
с одной ВКМ
Рождение
химерного
потомства
Рис. 13.3. Гипотеза спонтанной первичной химеризации у млекопитающих на основе полигаметного оплодотво-
рения [Otsuki et al., 2012].
лярной бластоцисты (бластоцисты с двумя внут-
ренними клеточными массами) и развитие синд-
рома dZ-MCDAP (dizigotic monochorionic diam-
niotic placenta). Частью подобного рода гипотез
является допущение полигаметного оплодотво-
рения. Полигаметное оплодотворение может
иметь место, когда в результате сбоя естествен-
ной блокады полиспермии образуется триплоид-
ная зигота, и — далее — в процессе дробления у
бластомеров стабилизируются разные варианты
кариотипа [Golubovsky, 2003]. Либо под одной
блестящей оболочкой могут находиться два
ооцита МП, которые, соответственно, и оплодо-
*
Исследование феномена первичного химериз-
ма уже внесло значительный вклад в формиро-
вание современного понимания развития млеко-
питающих. Этот экспериментальный подход до
сих пор актуален, поскольку он широко востре-
бован в самых «резонансных» областях совре-
менной биологии развития: изучении плюрипо-
тентных СК и регенерации органов и тканей.
Технология сайт-специфической рекомбинации и
получения специфичных мутаций (tissue-specific,
time-specific and stage-specific mutations) стала ос-
новным инструментом для изучения функции ге-
на и клональной структуры органов и тканей, и —
параллельно — анализ химер стал неотъемлемой
творяются разными сперматозоидами [Machin,
2009: Otsuki etal., 2012]. После полигаметного
оплодотворения следует «каноническая» агрега-
ция бластомеров, как это происходит при полу-
чении экспериментальных первичных химер
(рис. 13.3). Следует, однако, отметить, что, не-
смотря на известную изящность гипотезы, пря-
мых доказательств существования таких химер
пока нет. Не созданы пока и ситуации, в которых
можно было бы получить экспериментальных
химер, реализуя механизм именно полигаметно-
го оплодотворения.
*
частью такого рода исследований. Химерный
анализ также позволяет определить роль гена,
если спсцифичсски-индуцированный мутантный
фенотип нежизнеспособен или стерилен. Конст-
руирование межвидовых химер помогает преодо-
леть барьер имплантации при межвидовой транс-
плантации эмбрионов. Исследование эксперимен-
тального первичного химеризма способствует
лучшему пониманию механизмов, лежащих в ос-
нове феномена спонтанного первичного химе-
ризма у млекопитающих. И, наконец, «тест на
химеризм» по-прежнему остается ведущим тес-
том при оценке плюрипотентности новых линий
СК в условиях in vivo на животных моделях.
354 ЭПИГЕНЕТИКА
Список ЛИТЕРАТУРЫ
Дыбан А. П. Раннее развитие млекопитающих. Л.: Наука,
1988. 228 с.
Нванова-Казас О. М Эволюционная эмбриология живот-
ных. СПб.: Наука, 1995. 565 с.
Исаев Д. А., Миронова О. В., Платонов Е. С., Конюхов Б. В.
Анализ партеногенетических клеточных клонов у
химерных мышей CBL,6(PG)**BALB/c// Онтогенез.
1999. Т. 30. С. 64—67.
Корсак В. С. Руководство по клинической эмбриологии. М.:
Издательство медицинских книг, 2011. 221 с.
Мак-Ларен Э. Химеры млекопитающих. М.: Мир, 1979. 176 с.
Морозова Л. М., СоломкоА.П. Экспериментальные химе-
ры — инструмент биологии развития 7 Б1опол1мери i
K.ii iииа. 2003. Т. 19, №2. С. 103 112.
Сахарова Н. Ю. Млекопитающие: эмбрион в личинке 7
Природа. 2004. Т. 5. С. 28—38.
Свиридова Т. А., Чайлахян Л. М. Веириницев Б. Н. Получе-
ние химеры заменой одного ядра у двуклеточного
эмбриона мыши И Докл. АН СССР. 1987. Т. 296, № 3.
С. 749—754.
Allen N. D., Barton S. С., Hilton К., Norris AL L., SuraniМ. А.
A functional analysis of imprinting in parthenogenetic
embryonic stem cells // Development. 1994. Vol. 120.
P. 1473—1482.
AndereggC, Markert С. I.. Successful rescue of microsurgical
produced homozygous uniparental mouse embryos via
production of aggregation chimeras // Proc. Natl. Acad.
Sci. USA. 1986. Vol. 83. P. 6509—6513.
Araki R., Hoki I., UdaAL, Nakamura AI., Jincho 1., Tamura C,
SunayamaAL, AndoS., SugiuraAL, Yoshida AL A., Kasa-
ma Г., Abe hl. Crucial role of c-Мус in the generation of
induced pluripotent stem cells// Stem Cells. 2011.
Vol. 29, N 9. P. 1362—1370.
Azuma H, PaulkN, Ranade A., Dorrell C., Al-Dhalimy AL,
Ellis E., StromS., KayM. .1., FinegoldM., GrompeM.
Robust expansion of human hepatocytes in l ali zRag2 7
II2rg ' mice // Nat. Biotechnol. 2007. Vol. 25. P. 903—
910.
BartonS. C., Ferguson-Smith A. C, FundeleR, Surani AI. A.
Influence of paternally imprinted genes on development 7
Development. 1991. Vol. 113. P. 679—687.
Beddington R. S.. Robertson E. J. An assessment of the devel-
opmental potential of embryonic stem cells in the midges-
tation mouse embryo//Development. 1989. Vol. 105, N 4.
P. 733—737.
Behringer R. R. Human-animal chimeras in biomedical re-
search // Cell Stem Cell. 2007. Vol. 1. P. 259—262.
BianchiD. IE, ZickwolfG. K., JTeil G. J., SylvesterS., Dema-
ria AL N. Male fetal progenitor cells persist in maternal
blood for as long as 27 years postpartum (pregnancy/chi-
merism/CD34/CD38) // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996.
Vol. 93. P. 705—708.
Bischoff AL, Parfitt D.-E., Zernicka-Goetz AI. Formation of the
embryonic-abembryonic axis of the mouse blastocyst: re-
lationships between orientation of early cleavage divisions
and pattern of symmetric/asymmetric divisions // Deve-
lopment. 2008. Vol. 135, N 5. P. 953 -962.
Bogdanova N. Siebers U.. KelschR, AlarkoffA.. Ropke A..
ExelerR., TsokasJ, U’ieackerP. Blood chimerism in a
girl with Down syndrome and possible freemartin effect
leading to aplasia of the Mullerian derivatives // Hum. Re-
prod. 2010. Vol. 25. P. 1339—1343.
Boklage С. E. Embryogenesis of chimeras, twins and anterior
midline asymmetries // Hum. Reprod. 2006. Vol. 21, N 3.
P. 579—591.
Chen J., LansfordR, Stewart I., YoungF, AltF. ГГ. RAG-2-
deficient blastocyst complementation: an assay of gene
function in lymphocyte development 7 Proc. Natl. Acad.
Sci. USA. 1993. Vol.’90. P. 4528—4532.
Chen J., Liu J., ChenY., YangJ., Chen J., Liu H., ZhaoX.,
AIoK., SongH., GuoL., ChuS., IFangD., DingK., PeiD.
Rational optimization of reprogramming culture condi-
tions for the generation of induced pluripotent stem cells
with ultra-high effciency and fast kinetics // Cell Res.
2011. Vol. 21. N 6. P. 884-894.
Cockburn K., Rossant J. Making the blastocyst: lessons from
the mouse // J. Clin. Invest. 2010. Vol. 120, N 4. P. 995—
1003.
Collins E., FlemmingT. P. Epithelial differentiation in the mo-
use preimlantation embryo: making adhesive cell contacts
for the first time // Trends Biochem. Sci. 1995. Vol. 20.
P. 307—312.
De Repentigny E, KotharyR. Production of mouse chimeras by
injection of embryonic stem cells into the perivitelline
space of one-cell stage embryos // Transgenic Res. 2010.
Vol. 19,N6. P. 1137—1144.’
DeChiara T. AL, Poueymirou IE T, Auerbach IE, Frendewey D.,
YancopoulosG. D., Valenzuela D. A I. Producing fully ES
cell-derived mice from eight-cell stage embrvo injections //
Methods Enzymol. 2010. Vol. 476. P. 285—294.
Doetschman T., Alaeda N, Smithies O. Targeted mutation of the
Hprt gene in mouse embryonic stem cells // Proc. Natl.
Acad. Sci. USA. 1988. Vol’ 85. P. 8583—8587.
DregerD. L, Schmutz S. AI. A case of canine chimerism diag-
nosed using coat color tests// Mol. Cell. Probes. 2012.
doi:10.1016/j.mcp.2012.03.004.
DuL., XuX, DuanX, Lu G., Lin G. Developmental incompati-
bility of human parthenogenetic embryonic stem cells in
mouse blastocysts // In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 2012.
Vol. 48, N3.P. 156—164.
Eakin G. S., Behringer R. R. Tetrapioid development in the
mouse 11 Dev. Dyn. 2003. Vol. 228. P. 751—766.
Eakin G. S., Hadjantonakis A. K. Production of chimeras by ag-
gregation of embryonic stem cells with diploid or tetra-
ploid mouse embrvos // Nat. Protoc. 2006. Vol. 1, N 3.
P. 1145—1153.
Eakin G. S., Hadjantonakis A. K., Papaioannou V. E., Behrin-
ger R. R. Developmental potential and behavior of
tetrapioid cells in the mouse embryo // Dev. Biol. 2005.
Vol. 288. P. 150—159.
Eckardt S.. AIcLaughlin K. J.. W’illenbringH. Mouse chimeras
as a system to investigate development, cell and tissue
function, disease mechanisms and organ regeneration //
Cell Cycle. 2011. Vol. 10, N 13. P. 2091—2099.
Eggan K., Akutsu H, Loring J., Jackson-Grusby L., Klemm AL,
Rideout IF. AI. Hybrid vigor, fetal overgrowth and viabil-
ity of mice derived by nuclear cloning and tetrapioid em-
bryo complementation 7 Proc. Natl. Acad. Sci. USA.
2001. Vol. 98, N 11. P. 6209—6214.
FehillyC.B., Il’illadsen S. AL, Tucker E. Interspecific chimae-
rism between sheep and goat // Nature. 1984. Vol. 307.
P. 634—636.
Fischedick G., Klein D. C, ITuG., EschD., HoingS., HanD. IF.,
ReinhardtP., Hergarten K, Tapia N., Scholer H. R, Ster-
neckertJ. L. Zfp296 is a novel, pluripotent-specific repro-
gramming factor 11 PLoS One. 2012. Vol. 7, N 4. P. e34645.
FordC.E.. Evans E. P. Cytogenetic observation on XX/XY
chimaeras and a reassessment of the evidence for germ
cell chimaerism in heterosexual twin cattle and marmo-
sets .7 J. Reprod. Fert. 1977. Vol. 49. P. 25—33.
FundeleR. H, NorrisAI. L., BartonS. C. Temporal and spatial
selection against parthenogenetic cells during develop-
ment of fetal chimeras // Development. 1990. Vol. 108.
P. 203—211.
Gardner R. L. Mouse chimeras obtained by the injection of cells
into the blastocyst // Nature. 1968. Vol. 220. P. 596—597.
ГЛАВА 13 355
Gasperowicz AL, Natale D. R. Establishing three blastocyst li-
neages— then what?// Biol. Reprod. 2011. Vol. 84.
P. 621—630.
Gertsenstein AL, Nutter LAL, ReidT., Pereira AL, Stanford IF. L.,
Rossant J., Nagy A. Efficient generation of germ line trans-
mitting chimeras from C57BL/6N ES cells by aggregation
with outbred host embryos // PLoS One. 2010. Vol. 5, N 6.
P. el 1260.
GiangrecoA., ArwertE.N., Rosewell L. R, Snyder J., H all F. AL,
Stripp B. R. Stem cells are dispensable for lung homeostasis
but restore airways after injury // Proc. Natl. Acad. Sci.
USA. 2009. Vol. 106. P. 9286—9291.
Golubovsky AL. D. Postzygotic diploidization of triploids as a
source of unusual cases of mosaicism, chimerism and
twinning // Hum. Reprod. 2003. Vol. 18, N 2. P. 236—242.
Gomez AL. C, Pope E., Ricks D. AL, Lyons J., Dumas C,
Dresser B. L. Cloning endangered felids using hetero-
specific donor oocytes and interspecies embryo transfer //
Reprod. Fertil. Dev. 2009. Vol. 21,N I. P. 76~ 82.
Grabarek J. B., Zyzynska K., SaizN, PiliszekA., Franken-
bergS., Nichols J., Hadjantonakis A. K., PlusaB. Differ-
ential plasticity of epiblast and primitive endoderm pre-
cursors within the ICM of the early mouse embryo // De-
velopment. 2012. Vol. 139. P. 129—139.
Greco B., Low H. P., Johnson E.C., Salmonsen R A., Gal-
lant J., Jones S. N. Ross A. FL. RechtL. D. Differentiation
prevents assessment of neural stem cell pluripotency after
blastocyst injection // Stem Cells. 2004. Vol. 22, N 4.
P. 600 608.
Hadjantonakis A. K, ALacmaster S., Nagy A. Embryonic stem
cells and mice expressing different GPP variants for mul-
tiple non-invasive reporter usage within a single animal //
BMC Biotechnol. 2002. Vol. 2. P. 11.
Hiiragi T., Louvet-Vallee S., SolterD., ALaroB. Does prepat-
terning occur in the mouse egg? // Nature. 2006. Vol. 442.
E3—4. discussion E4.
Hogan B., Beddington R, Constantini F, Lacy E. Manipulating
the Mouse Embryo. 2nd Ed. N.Y.: Cold Spring Harbor
Laboratory' Press. 1994. 497 p.
Lchinohe T, TeshimaT., Alatsuoka K, ALaruya E., Saji H. Fe-
tal-maternal microchimerism: impact on hematopoietic
stem cell transplantation // Curr. Opin. Immunol. 2005.
Vol. 17. P. 546—552.
Lmsoonthoniruksa S.. Lorthongpanich C. Sangmalee A.. Srirat-
tana K., Laowtammathron C., Tunwattana IE, Somsa IF.,
Ketudat-CairnsAL, NagaiT., Parnpai R The effects of
manipulation medium, culture system and recipient cyto-
plast on in vitro development of intraspecies and inter-
generic felid embryos// J. Reprod. Dev. 2011. Vol. 57,
N 3. P. 385—392. ’
Lsotani A.. Hatoyama U. Y.. Kaseda K., LkawaAL. OkabeAL.
Formation of a thymus from rat ES cells in xenogeneic
nude mouseMrat ES chimeras// Genes Cells. 2011.
Vol. 16. P. 397—405.
LzadyarF, PauF, ALarh J., SlepkoN, WangT., Gonzalez R,
Ramos T., Howerton K., Sayre C., Silva F. Generation of
multipotent cell lines from a distinct population of male
germ line stem cells // Reproduction. 2008. Vol. 135, N 6.
P. 771 784.
JamesD., Noggle S. A.. SwigutT.. Brivanlou A. H. Contribution
of human embryonic stem cells to mouse blastocysts //
Dev. Biol. 2006.’Vol. 295. P. 90—102.
Jansson L., Larsson J. W41/W41 blastocyst complementation: a
system for genetic modeling of hematopoiesis // Blood.
2010. Vol. 115. P. 47—50.
KarpowiczP., Cohen С. B., van der Коду D. Developing hu-
man-nonhuman chimeras in human stem cell research:
ethical issues and boundaries // Kennedy Inst. Ethics J.
2005. Vol. 15, N 2. P. 107—134.
Kelly R. D., St. John J. C. Role of mitochondrial DNA replica-
tion during differentiation of reprogrammed stem cells /7
Int. J. Dev. Biol. 2010. Vol. 54. P. 1659—1670.
Khosrotehrani K., Johnson K. J., LauJ., Dupuy A., Hyun ChaD.,
Bianchi D. IF. The influence of fetal loss on the presence of
fetal cell microchimerism // Arthritis Rheum. 2003. Vol. 48,
N 11. P. 3237 -3241.
Kim J. AL. IFhite J. AL., Shaw .1. S., Sleckman В. P. МАРК p38
alpha is dispensable for lymphocyte development and pro-
liferation // J. Immunol. 2005. Vol. 174. P. 1239—1244.
KirchainS.AL, Hayward A. AL, ALkandawire J. AL, QiP.,
Burds A. .1. Comparison of tetrapioid blastocyst microinjec-
tion of outbred CrkCDl(ICR), hybrid B6D2F1 Tac, and in-
bred C57BL/6NTac embryos for generation of mice derived
from embrvonic stem cells // Comp. Med. 2008. Vol. 58,
N2.P. 145 150.
KitoS., NoguchiY., Ohta Y.. Abe AL.. Shiomi N, ShiomiT.
Evaluation of developmental competence of vitrified-war-
med early cleavage stage embryos and their application for
chimeric mouse production experimental animals // Exp.
Anim. 2003. Vol. 52, N 2. P. 179—183.
Kobayashi T., Yamaguchi T., Hamanaka S., Katoitoh AL, Yama-
zaki E, LbataAL. Generation of rat pancreas in mouse by
interspecific blastocyst injection of pluripotent stem
cells // Cell. 2010. Vol. 142. P. 787—799.
Kondoh G., Yamamoto Y., Yoshida К. Suzuki Y.. OsukaS., Na-
kano Y., ALoritaT., Takeda J. Easy assessment of ES cell
clone potency for chimeric development and germ-line
competency by an optimized aggregation method // J. Bio-
chem. Biophys. Methods. 1999. Vol. 39, N 3. P. 137—
142.
KristtD., LsraeliAL., NarinskiR, OrN, YanivL, SteinJ.,
Klein T. Hematopoietic chimerism monitoring based on
STRs: quantitative platform performance on sequential
samples // J. Biomol. Tech. 2005. Vol. 16. P. 378—389.
Kruglova .1. A., Kizilova E. A., Zhelezova A. L, Gridina AL. AL,
Golubitsa A. N., Serov O.L. Embryonic stem cell/fibro-
blast hybrid cells with near-tetraploid karyotype provide
high yield of chimeras // Cell Tissue Res. 2008. Vol. 334,
N3. P. 371—380.
Kunath T, Gish G., LickertH, JonesN., Pawson T, Rossant J.
Transgenic RNA interference in ES cell-derived embryos
recapitulates a genetic null phenotype // Nat. Biotechnol.
2003. Vol. 21. P. 559—561.
Lensch IF., Schlaeger T. AL, Zon L. L., Daley G. Q. Teratoma
formation assays with human embryonic stem cells: a ra-
tionale for one type of human-animal chimera // Cell Stem
Cell. 2007. Vol. 1, N 3. P. 253—258.
Lorthongpanich C, Laowtammathron C., Chan .1. IE, Ketudat-
CairnsAL., Parnpai R. Development of interspecies cloned
monkey embryos reconstructed with bovine enucleated
oocyte // J. Reprod. Dev. 2008. Vol. 54(5). P. 306—313.
Lorthongpanich C., SolterD., LimC.Y. Nuclear reprogram-
ming in zygotes // Int. J. Dev. Biol. 2010. Vol. 54.
P. 1631—1640.
ALaandagE. C, van der Falk AL, VlaarAL, Feltkamp C,
О Brien J., van Roon AL. Developmental rescue of an em-
bryonic-lethal mutation in the reti-noblastoma gene in
chimeric mice // EMBO J. 1994. Vol. 13. P. 4260-
4268.
ALacfarlan T. S., Gifford IF. D., Driscoll S., Lettieri K, Ro-
we H. AL, BonanomiD., Firth A., Singer O., TronoD.,
PfaffS. Embryonic stem cell potency fluctuates with en-
dogenous retrovirus activity // Nature. 2012. Vol. 487,
N 7405. P. 57—63.
ALachin G. Non-identical monozygotic twins, intermediate twin
types, zygosity testing, and the non-random nature of
monozygotic twinning // Am. J. Med. Genet. C Semin.
Med. Genet. 2009. Vol. 151C. P. 110—127.
356 ЭПИГЕНЕТИКА
MacKay Е.. JJ’estJ.D. Fate of tetrapioid cells in 4n42n chi-
meric mouse blastocysts // Meeh. Dev. 2005. Vol. 122.
P. 1266—1281.
ALattnJ.R., Gadi L, Harbison AL L., Abbondanzo S. J., Stew-
art C. L. Androgenetic mouse embryonic stem cells are
pluripotent and cause skeletal defects in chimeras: impli-
cations for genetic imprinting// Cell. 1990. Vol. 62.
P. 251—260.
ALanzAL. G., Di Santo J. P. Renaissance for mouse models of
human hematopoiesis and immunobiology // Nat. Immu-
nol. 2009. Vol. 10. P. 1039—1042.
AlintzB. Formation of genotypically mosaic embryos // Amer.
Zool. 1962. Vol. 2. P. 432.
ALiuraK., Niikawa N. Do monochorionic dizygotic twins in-
crease after pregnancy by assisted reproductive techno-
logy? // J. Hum. Genet. 2005. Vol. 50. P. 1 6.
ALoustafa L. .4. Chimeric rabbits from embryonic cell transplan-
tation // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1974. Vol. 147.
p. 485—488.
Nagy A., Gocza E., DiazE. AL, Prideaux J’. R., LvanyAL, ALark-
kulaAL, Rossant J. Embryonic stem cells alone are able to
support fetal development in the mouse // Development.
1990. Vol. ПО. P. 815—821.
Nagy A., Rossant J., NagyR., Abramow-Newerly JJ’., RoderJ.
Derivation of completely culture-derived mice from early-
passage embryonic stem cells 7 Proc. Natl. Acad. Sci.
USA. 1993. Vol. 90. P. 8424—8428.
OhtaH., Sakaide F., JJ’akayama T. Generation of mice derived
from embryonic stem cells using blastocysts of different
developmental ages // Reproduction. 2008. Vol. 136.
P. 581 587.
OnoT., ALizutaniE., LiC., JJ’akayama T. Nunulear transfer
preserves the nuclear genome of freeze-dried mouse
cells // J. Reprod. Dev. 2008. Vol. 54, N 6. P. 486—491.
OrimoA.. Tominaga N., Suzuki AL, KawakamiT., KunoJ..
Sato AL, ALinowaO., InoueS., KatoS., NodaT., ALu-
ramatsuAL. Successful germ-line transmission of chimeras
generated by coculture aggregation with JI ES cells and
eight-cell embryos 11 Anal. Biochem. 1999. Vol. 269, N 1.
P. 204—207.
OtsukiJ., NagaiY., Lopata A., Chiba K., Yasmin L., SankaiT.
Symmetrical division of mouse oocytes during meiotic
maturation can lead to the development of twin embryos
that amalgamate to form a chimeric hermaphro-
dite // Hum. Reprod. 2012. Vol. 27, N 2. P. 380—387.
PaldiA., NagiA., ALorkkulaAL., BamaL, DezsoL. Postnatal
development of parthenogenetic fertilized mouse aggrega-
tion chimeras n Development. 1989. Vol. 105. P. 115—118.
Petrovic S., Cross Al., ALiiller A. AL Differentiation potential of
FDCPmix cells following injection into blastocysts // Cells
Tissues Organs. 2004. Vol. 178. N 2. P. 78—86.
Plusa B., Hadjantonakis A. K., GrayD, Piotrowska-Nitsche K,
JedrusikA., Papaioannou J'. E., Glover D. AL, Zernicka-
Goetz Al. The first cleavage of the mouse zygote predicts
the blastocyst axis // Nature. 2005. Vol. 434. P. 391—395.
Poueymirou JJ'. T, Auerbach JJ'., Frendewey D., Hickey J. F.,
Escaravage J. AL, EsauL., Dore A. T, Stevens S., Ad-
ams N. C., Dominguez AL G., Gale N. JJ’., Yancopou-
losG.D., DeChiara T. Al., J'alenzuela D. AL. F0 genera-
tion mice fully derived from gene-targeted embryonic
stem cells allowing immediate phenotypic analyses /z Nat.
Biotechnol. 2007. Vol. 25. P. 91—99. ’
Prather R. S., Hagemann L. J., First N. L. Preimplantation
mammalian aggregation and injection chimeras // Gamete
Res. 1989. Vol. 22, N 2. P. 233—247.
Prelle K., ZinkN, JJ’olfE. Pluripotent stem cells — model of
embryonic development, tool for gene targeting, and basis
of cell therapy// Anat. Histol. Embiyol. 2002. Vol. 31.
P. 169—186. ’
Reiner A., Del Alar N. ALeadeCA.. YangH. DragatsisL.,
Zeitlin S., Goldowitz D. Neurons lacking huntingtin differ-
entially colonize brain and survive in chimeric mice // J.
Neurosci. 2001. Vol. 21. P. 7608—7619.
RitnerC, Bernstein H. S. Fate mapping of human embryonic
stem cells by teratoma formation// J. Vis. Exp. 2010.
http:,,'www.jove.com/video/2036/ DOI: 10.3791/2036.
Robertson E. J. Pluripotential stem cell lines as a route into the
mouse germ line // Trends Genet. 1986. Vol. 2. P. 9- -13.
Robertson E. J. Embryo-derived stem cell lines // Teratocarci-
nomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach I
E. J. Robertson (ed). Oxford, UK: IRL Press, 1987.
P. 71—112.
Ross C. N., French J. A., Orti G. Germ-line chimerism and pa-
ternal care in marmosets (Callithrix kuhlii) 7 Proc. Natl.
Acad. Sci. USA. 2007. Vol. 104, N 15. P. 6278 6282.
Rossant J., Freis JJ’. I. Interspecific chimeras in mammals: suc-
cessful production of line chimeras between AIus musculus
and ALus caroli // Science. 1980. Vol. 208. P. 419—421.
Rossant J., ALcBurney AL. JJ’. The developmental potential of a
euploid male teratocarcinoma cell line after blastocyst in-
jection // J. Embiyol. Exp. Morphol. 1982. Vol. 70. P. 99—
112.
Rossant J., Tam P. P. Blastocyst lineage formation, early em-
bryonic asymmetries and axis patterning in the mouse //
Development. 2009. Vol. 136. P. 701—713.
Rossant J., Alauro J'. AL., Croy В. .4. Importance of trophoblast
genotype for survival of interspecific murine chimeras // J.
Embiyol. Exp. Morphol. 1982. Vol. 69. P. 141—149.
RoussetJ., BucchiniD., Jami J. Hybrids between F9 nulli-po-
tent teratocarcinoma and thymus cells produce multi-
differentiated tumors in mice // Dev. Biol. 1983. Vol. 96.
P. 331—336.
SaburiS., AzumaS., SatoE., Toyoda Y., TachiC. Developmen-
tal fate of single embryonic stem cells microinjected into
8—cell-stage mouse embryos // Differentiation. 1997.
Vol. 62. P. 1-11.
Shalev S. A., Shalev E., PrasE., ShneorY., GazitE., YaronY.,
LoewenthalR. Evidence for blood chimerism in dizygotic
spontaneous twin pregnancy discordant for Down syn-
drome И Prenat. Diagn. 2006. Vol. 26, N 9. P. 782—784.
SimerlyC., ALcFarlandD., Castro C., LinC.C., Redinger C,
Jacoby E., ALich-Basso J., OrwigK., ALillsP., Ahrens E.,
Navara C. Schatten G. Interspecies chimera between pri-
mate embryonic stem cells and mouse embryos: monkey
ESCs engraft into mouse embryos, but not post-im-
plantation fetuses// Stem Cell Res. 2011. Vol. 7, N 1.
P. 28—40.
Siqueira da Fonseca S. A., Ahdelmassih S., de Aiello Cintra La-
vagnolliT., Serafim RC., Clemente Santos E. J., A Lo-
ta ALendesC. de Souza Pereira J'.. Ambrosio С. E., ALigli-
noALA., J’isintin J. A., Ahdelmassih R, KerkisA., KerkisL.
Human immature dental pulp stem cells' contribution to de-
veloping mouse embryos: production of human/mouse pre-
term chimaeras// Celi Prolif. 2009. Vol. 42. N2. P. 132—
140.
Souter J . L., ParisiAL. A., NyholtD. R, Kapur RP., Head-
ers A. K., Opheim К. E., Gunther D. F, ALitchell AL. E.,
Glass L. A., ALontgomery G. JV. A case of true hermaphro-
ditism reveals an unusual mechanism of twinning // Hum.
Genet. 2007. Vol. 121. P. 179 185.
Stem AL. S., JJ’ilsonL. B. Experimental studies on the organiza-
tion of the preimplantation mouse embryo. I. Fusion of
asynchronously cleaving eggs // J. Embryol. Exp. Mor-
phol. 1972. Vol. 28, N 2. P. 247—254.
Stevens L. C. Totipotent cells of parthenogenetic origin in a
chimeric mouse //Nature. 1978. Vol. 276. P. 266—267.
Strain L., Dean J. C., Hamilton AL. P., Bonthron D. T. A true
hermaphrodite chimera resulting from embryo amalgama-
ГЛАВА 13 357
tion after in vitro fertilization // N. Engl. J. Med. 1998.
Vol. 15. P. 166—169.
StromS. C., Davila J., GrompeAL Chimeric mice with human-
ized liver: tools for the study of drug metabolism, excre-
tion and toxicity // Methods Mol. Biol. 2010. Vol. 640.
P. 491—509.
SuraniAL A., BartonS. C., Norris ALL. Experimental recon-
struction of mouse eggs and embryos: an analysis of
mammalian development// Biol. Reprod. 1987. Vol. 36.
P. 1—16.
Tachibana AL, Sparman AL, Ramsey C., ALa H., Lee H., Ceci-
lia AL., ALitalipov S. Generation of chimeric rhesus mon-
keys и Cell. 2012. Vol. 148, N 1—2. P. 285—295.
Takahashi K., Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells
from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by de-
fined factors // Cell. 2006. Vol. 126. P. 663- -676.
Takaoka K.. Hamada H. Cell fate decisions and axis determina-
tion in the early mouse embryo // Development. 2012.
Vol. 139. P. 3—14.
TamP.P., Rossant J. Mouse embryonic chimeras: tools for
studying mammalian development // Development. 2003.
Vol.’ 130, N 25. P. 6155—6163.
Tanaka A., Lindor K., Ansar A., Gershwin AL. E. Fetal micro-
chimerisms in the mother: immunologic implications //
Liver Transpl. 2000. Vol. 6,N2. P. 138—143.
Tanaka AL. Hadjantonakis A. K., Yintersten K.. Nagy A. Aggre-
gation chimeras: combining ES cells, diploid, and
tetrapioid embryos // Methods Mol. Biol. 2009. Vol. 530.
P. 287—309.
Tarkowski A. K. Mouse chimaeras developed from fused eggs //
Nature. 1961. Vol. 190. P. 857—860.
Tarkowski A. K., Witkowska A., OpasJ. Development of cyto-
chalasin in В-induced tetrapioid and diploid/tetraploid mo-
saic mouse embrvos // J. EmbryoL Exp. Morphol. 1977.
Vol. 4l.P. 47—64.
Tecirlioglu R. T, Guo J., Trounson A. O. Interspecies somatic
cell nuclear transfer and preliminary' data for horse-
cow/mouse iSCNT// Stem Cell Rev. 2006. Vol. 2, N4.
P. 277—287.
Thomas K. R., Capecchi At. R. Site-directed mutagenesis by
gene targeting in mouse embryo derived stem cells // Cell.
1987. Vol. 61. P. 503—512.
TraggiaiE., Chicha L., ALazzucchelli L., BronzL., Piffa-
rettiJ. C., Lanzavecchia A.. ALanz At. G. Development of a
human adaptive immune system in cord blood cell-trans-
planted mice // Science. 2004. Vol. 304. P. 104—107.
Trounson A., Grieshammer U. Chimeric primates: embryonic
stem cells need not apply' // Cell. 2012. Vol. 148, N 1—2.
P. 19—21.
TsaiS. Y.. Bouwman B. A., AngY.S.. KimS.J.. LeeD.F..
Lemischkal. R, RendlAL. Single transcription factor re-
programming of hair follicle dermal papilla cells to in-
duced pluripotent stem cells 11 Stem Cells. 2011. Vol. 29,
N6. P. 964—971.
WestF.D., Terlouw S. L., Kwon D. J., AhmiawJ.L., Dha-
ra S. K., Hasneen K., Dobrinsky J. R, Stice S. L. Porcine
induced pluripotent stem cells produce chimeric off-
spring " Stem Cells Dev. 2010. Vol. 19, N 8. P. 1211 —
1220.
Willadsen S. At. Micromanipulation of embryos of the large
domestic species h RASE. 1985. P. 160—170.
Williams C. A., Wallace AL R, Drury К. C., Kipersztok S., Ed-
wards R. K, Williams R. S., Haller AL J., Schatz D. A.,
Silverstein J. H., Gray B. A., Zori R. T. Blood lymphocyte
chimerism associated with IVF and monochorionic dizy-
gous twinning: case report // Hum. Reprod. 2004. Vol. 19.
N12.P. 2816—2821.
WoodS. A., Allen N. D„ Rossant J., Auerbach A., Nagy A. Non-
injection methods for the production of embryonic stem
cell-embryo chimaeras // Nature. 1993. Vol. 365, N 6441.
P. 87—89.
Young F. AL., Pinkert C. A., BottaroA. Analysis of lymphocyte
development and function using the RAG-deficient blasto-
cyst complementation system // Methods Mol. Biol. 2004.
Vol. 271. P. 77—90.
Yusa K., RadR., Takeda J., Bradley A. Generation of transgene-
free induced pluripotent mouse stem cells by the piggyBac
transposon // Nat. Methods. 2009. Vol. 6, N 5. P. 363—
369.
Zernicka-Goetz AL. Cleavage pattern and emerging asymmetry
of the mouse embryo nature reviews " Mol. Cell Biol.
2005. Vol. 6. P. 919—928.
Zernicka-Goetz AL. Patterning of the embryo: the first spatial
decisions in the life of a mouse // Development. 2002.
Vol. 129. P. 815—829.
Zernicka-Goetz AL. The first cell-fate decisions in the mouse
embryo: destiny' is a matter of both chance and choice //
Curr.’Opin. Genet. Dev. 2006. Vol. 16. P. 406—412.
Zernicka-GoetzAl., HuangS. Stochasticity versus determinism
in development: a false dichotomy' // Nat. Rev. Genet.
2010. Vol. 1 l.P. 743—744.
Zhao ALT., YangX., Lee K., ALaoJ., TesonJ.AL, Whit-
worth K. AL, Samuel AL. S., Spate L. D.. ALurphy C. N..
Prather R. S. The in vivo developmental potential of por-
cine skin-derived progenitors and neural stem cells // Stem
Cells Dev. 2012. Vol. 21, N 14. P. 2682—2688.
ГЛАВА
14
ДОЗОВАЯ КОМПЕНСАЦИЯ У ДРОЗОФИЛЫ:
МЕХАНИЗМ И ЭПИГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ
СОДЕ РЖАН И Е
14.1. Комплекс дозовой компенсации:
его состав и самцово-специфиче-
ское формирование, 360
14.2. Факторы, необходимые для кор-
ректного узнавания Х-хромосомы
MSL-комплексом, 364
14.3. Сайты связывания MSL-комплекса
в геноме, 367
14.4. Роль ацетилирования гистона
Н4К16 в процессе дозовой ком-
пенсации, 369
14.5. Модели дозовой компенсации у
дрозофилы, 369
14.6. Эволюция комплекса дозовой ком-
пенсации у дрозофилы, 371
14.7. Динамика связывания Х-хромо-
сомы с MSL-комплексом в клеточ-
ном цикле и в развитии, 373
14.8. Дозовая компенсация, ацетилиро-
вание и репликация, 374
14.9. MSL-независимые функции MSL-
белков, 374
14.10. Нерешенные вопросы и пробле-
мы существующей модели, 376
Список литературы, 379
360 ЭПИГЕНЕТИКА
Дозовая компенсация эволюционно возникла
у высших эукариот в ответ на необходимость
обеспечить равный уровень экспрессии генов,
располагающихся на гетероморфных половых
хромосомах. Этот уникальный механизм позво-
ляет однотипно регулировать большое количест-
во генов, общим для которых является не функ-
ция, а положение на одной из хромосом генома.
Рис. 14.1. У самцов дрозофилы явление дозовой ком-
пенсации выражается в том, что единственная Х-хро-
мосома набора продуцирует в два раза больше ген-
ных продуктов, чем каждая из двух Х-хромосом самки.
Рис. 14.2. Политенные хромосомы из клетки слюнной
железы личинки-самца D. melanogaster.
Х-хромосома выглядит значительно более декомпактной,
чем аутосомы, и примерно соответствует им по толщине, не-
смотря на двукратную разницу в количестве ДНК (рисунок
любезно предоставлен канд. биол. наук Т. Д. Колесниковой,
ИКМБ СО РАН).
В случае дрозофилы дозовая компенсация дву-
кратно усиливает транскрипцию с единственной
Х-хромосомы самца, чтобы обеспечить его тем
же количеством генных продуктов, которое об-
разуется у самки с двумя активными Х-хромосо-
мами (рис. 14.1). Усиление транскрипции с сам-
цовой Х-хромосомы коррелирует с более откры-
той структурой этой хромосомы. Вследствие это-
го на препаратах политенных хромосом слюнных
желез Х-хромосома самца выглядит значительно
более рыхлой, чем аутосомы и Х-хромосома сам-
ки (рис. 14.2).
Левое плечо хромосомы X составляет
22 м.п.н. (—15 % от общего количества ДНК ди-
плоидной клетки у самца дрозофилы) и со-
держит около 2500 генов [McQuilton et al., 2011].
Поскольку в основе дозовой компенсации у дро-
зофилы лежит изменение транскрипционного
статуса целой хромосомы, то практическая реа-
лизация данного изменения потребовала от при-
роды решения ряда конкретных задач.
Во-первых, дозовая компенсация должна про-
исходить только у одного пола — у самцов. Во-
вторых, в соматических клетках среди всех хро-
мосом набора необходимо корректно выбрать
именно Х-хромосому, гены которой и нуждают-
ся в компенсации. И, наконец, необходимо сфор-
мировать особый белковый комплекс по всей ее
длине так, чтобы он обеспечил двукратное уси-
ление транскрипции Х-сцепленных генов.
По современным представлениям, сложная и
динамичная картина активности эукариотиче-
ских генов определяется постоянно происходя-
щими изменениями в структуре хроматина, в
значительной степени связанными с ковалент-
ными гистоновыми модификациями (см. обзоры
[Gelato, Fischle, 2008; Campos, Reinberg, 2009;
Bannister, Kouzarides, 2011]). В процессе дозовой
компенсации за подобные изменения отвечает
особый рибонуклсопротсиновый комплекс, в со-
став которого входят белки с различными гис-
тон-модифицирующими активностями.
14.1. Комплекс дозовой компенсации:
ЕГО СОСТАВ И САМЦОВО-СПЕЦИФИЧЕСКОЕ
ФОРМИРОВАНИЕ
14.1.1. Состав комплекса дозовой
компенсации у дрозофилы
В комплекс дозовой компенсации у дрозофи-
лы входят белки, которые являются продуктами
генов msl (male-specific lethal). За время изуче-
ния феномена дозовой компенсации было выяв-
ГЛАВА 14 361
лено всего пять таких генов, мутации которых
избирательно приводили к гибели самцов дрозо-
филы: msll, msl2, msl3 (male-specific lethal 1, 2,
3), mof (males absent on the first) и mle (maleless)
[Fukunaga etal.. 1975; Belote. Lucchesi. 1980.
Lucchesi et al., 1982; Hilfiker et al., 1997]. Генети-
ческий анализ позволил исследователям пред-
положить, что продукты этих w?.s7-генов могут
функционировать в виде единого комплекса (см.
обзоры | Baker et al., 1994; Kelley, Kuroda, 1995;
Cline, Meyer, 1996; Lucchesi, 1996]). С помощью
иммуноокрашивания политенных хромосом ан-
тителами против MSL-белков было обнаружено,
что у самцов эти белки связываются в ядре поч-
ти исключительно с Х-хромосомой (рис. 14.3).
Паттерн распределения MSL-белков вдоль Х-хро-
мосомы имеет сложный прерывистый характер:
во-первых, MSL-белки никогда не обнаружива-
ются в дисках политенной Х-хромосомы, а во-
вторых, целый ряд протяженных районов выгля-
дят MSL-негативными, в связи с чем они полу-
чили специальное название: MSL-гэпы (от англ,
gap — пробел, промежуток) (рис. 14.4, верхняя
панель) [Baker etal., 1994; Kelley etal., 1999].
Оказалось, что паттерны локализации всех бел-
ков MSL-комплекса по всей длине Х-хромосомы
полностью совпадают [Bone et al., 1994; Bashaw,
Baker, 1995; Gorman et al., 1995; Kelley et al.,
1995; Gu etal., 1998]. В дальнейшем взаимодей-
ствие белков in vitro было подтверждено и био-
химическими методами [Copps et al., 1998: Scott
et al., 2000]. Таким образом, было постулировано
существование у самцов дрозофилы особого бел-
кового комплекса, получившего название комп-
лекса дозовой компенсации (Male Specific Lethal
complex, MSL complex, или Dosage Compensation
Complex, DCC) (рис. 14.5).
Одновременно был проведен масштабный
скрининг транскриптов, которые специфически
синтезировались только у самцов дрозофилы
[Amrein, Axel, 1997; Meller et al., 1997]. В резуль-
тате было идентифицировано два транскрип-
та, которые считывались с расположенных на
Х-хромосоме генов — roXl (RNA on the XI) и
roX2 (RNA on the X2). Они обнаруживались толь-
ко у самцов, не имели открытых рамок считыва-
ния и совместно локализовались с MSL-белками
по всей длине Х-хромосомы [Meller, 2000]. Ин-
тересно, что мутации по любому’ из этих двух
генов не имели какого-либо фенотипа, однако
одновременное отсутствие обеих гоХ-РНК вело к
гибели мутантных самцов. Компоненты MSL-
комплекса у таких самцов локализовались лишь
в некоторых районах Х-хромосомы, кроме того,
X
Рис. 14.3. Комплекс дозовой компенсации связывает-
ся специфически с Х-хромосомой самца.
Представлены политенные хромосомы личиночных слюнных
желез дрозофилы. Материал хромосом (ДНК) показан синим.
Локализация MSL-комплекса показана красным.
они обнаруживались в прицентромерном гетеро-
хроматине и аутосомах, т. е. там, где MSL-комп-
лекса в норме быть не должно [Meller, Rattner,
2002]. С помощью анализа гибридизации кДНК
с микрочипами показано, что у таких мутантов
снижена экспрессия генов с Х-хромосомы на
26 % [Deng, Meller, 2006]. Поскольку- при этом
не наблюдалось увеличения экспрессии ауто-
сомных генов в сайтах эктопического связыва-
ния с MSL-комплексом, то, по всей видимости,
самцовая смертность roXl т¥2-мутантов свя-
зана именно с недостатком компенсации дозы
Х-хромосомных генов.
АоХ-РНК сильно отличаются друг от друта по
размеру (-3700 и 600 и.). Тем не менее, в их ор-
ганизации прослеживаются общие черты. В ре-
зультате делеционного анализа и сравнения гоХ-
г" msl3*
msl3~ < ' 4 * > гоХ2 ' гоХ1
Рис. 14.4. В политенных хромосомах самцов дикого типа
(ms/3+, верхняя панель) MSL-комплекс (красный) обнаружи-
вается в подавляющем большинстве междисковых районов и
не обнаруживается в дисках (синий) и MSL-гэпах (скобки).
Неполный MSL-комплекс (нижняя панель) локализуется лишь
в нескольких десятках энтри-сайтов, два из которых соответ-
ствуют генам гоХ1- и гоХ2-РНК. Показана локализация MSL-
комплекса у трансгенных самок, мутантных по ms!3 и экс-
прессирующих MSL2 (рисунок любезно предоставлен проф.
Митци Курода, Артемом Алексеенко, Медицинская школа
Гарварда, Бостон, США).
362 ЭПИГЕНЕТИКА
Рис. 14.5. Субъединичная организация MSL-комплекса.
MSL-белки показаны цветными кругами, гоХ-РНК — синей
кривой. Обнаруживаемые MSL-белками активности показаны
черными стрелками. Зеленой стрелкой представлена связую-
щая НЗКЗбтеЗ активность хромодомена белка MSL3 (с мо-
дификациями из [Straub, Becker, 2007]).
транскриптов у разных видов дрозофилы в по-
следовательностях обеих гоХ-РНК были обна-
ружены районы, способные принимать «шпи-
лечную» структуру, а также короткие повторен-
ные мотивы, так называемые гоХ-боксы, кото-
рые крайне важны для сборки MSL-комплекса,
его локализации и активности [Stuckenholz et al.,
2003: Park et al., 2007, 2008: Kelley et al., 2008].
Анализ распределения MSL-белков у msl-му-
тантов свидетельствует о том, что два из них,
MSL1 и MSL2, формируют своего рода «плат-
форму», «сердцевину»> комплекса (complex core).
Без них комплекс не только не связывается с хро-
матином, но и не собирается вообще [Lyman et al.,
1997; Gu etal., 1998; Scott etal., 2000; Li etal.,
2005]. Напротив, у мутантов, утративших функ-
ции mle, ms 13 или mof, белки MSL1 и MSL2 в ви-
де неполного и нефункционального комплекса
локализутотся в нескольких десятках сайтов по X-
хромосоме (см. рис. 14.4, нижняя панель) [Palmer
etal., 1994; Gorman etal., 1995; Kelley etal., 1995;
Lyman et al., 1997]. В отличие от MSL1, MSL2
выполняет не только структурную фу’нкцию. Не-
давно было обнаружено, что MSL2 обладает
Н2ВК31-у’биквитин-лигазной активностью, для
полного проявления которой необходим белок
MSL1. Тандем MSL1/MSL2 способен убиквити-
лировать Н2В по остатку’ К31 (см. рис. 14.5) и тем
самым напрямую стиму’лировать метилтранс-
феразную активность комплекса COMPASS и
белка DOT1, что, в свою очередь, приводит к ме-
тилированию гистона НЗ по лизиновым остаткам
4 и 79. Кроме того, Н2ВКЗ lub усиливает НЗК4теЗ
и НЗК79те2 опосредованно, так как привлекает
комплекс белков RAD6/BRE1, накладывающий
модификацию H2BK120ub, которая также при-
влекает и активирует COMPASS и DOT1. Таким
образом, убиквитин-лигазная активность MSL2/1
запускает целый каскад модификаций гистонов,
которые в результате облегчают элонгацию РНК-
полимеразного комплекса [Wu et al., 2011 и ссыл-
ки там]).
Еще одна модификация гистонов, Н4К16ас,
производимая MSL-комплексом, связана с функ-
цией белка MOF (см. рис. 14.5) [Smith et al.,
2000], который относится к MYST-семейству
ацетилтрансфераз. Иммутгоокрашивание антите-
лами, специфически узнающими Н4К16ас, вы-
явило обогащенность Х-хромосомы самцов дро-
зофилы этой модификацией [Turner etal., 1992].
Показано, что паттерн распространения Н4К16ас
вдоль Х-хромосомы практически полностью со-
ответствует рисунку’ локализации MSL-комплек-
са [Bone et al., 1994: Kind et al., 2008: Regnard
etal., 2011], хотя H4K16ac и распределен не-
сколько шире, чем MSL [Gelbart et al., 2009]. Хо-
рошо известно, что ацетилирование гистонов сти-
мулирует транскрипцию [Akhtar, Becker, 2000],
более того, Н4К16ас — пока единственная из-
вестная модификация, необходимая для ослабле-
ния мсжнуклсосомных контактов, что приводит к
релаксации нуклеосомной у’кладки хроматина
[Shogren-Knaak et al., 2006: Robinson et al., 2008].
Анализ аминокислотной последовательнос-
ти MSL3 белка обнару’жил наличие двух родст-
венных стру ктур — хромодомена и MRG-домена
[Koonin etal., 1995]. Подобные домены высоко-
консервативны и выявляются у ряда белков, за-
действованных как в репрессии транскрипцион-
ной активности хроматина, так и у белков-актива-
торов транскрипции [Ibid]. Показано, что хромо-
домены белков MSL3 и MOF могут взаимодейст-
вовать с РНК [Akhtar et al., 2000]. Кроме того, по-
лучены данные, что хромодомен MSL3 необхо-
дим для у’знавания комплексом модификации
гистона НЗКЗбтеЗ (см. рис. 14.5) [Buscaino et al.,
2006; Sural et al., 2008], что, как выяснилось в
дальнейшем, является очень важным моментом
для осуществления дозовой компенсации (см.
ниже). Также необходимо отметить, что именно
опосредованное MRG-доменом присоединение
белка MSL3 к MSL1 и MOF существенно увели-
чивает активность и субстратную специфичность
последнего [Morales et al., 2004,2005].
Белок MLE, еще один белок дозовой компен-
сации, был первым компонентом комплекса,
ГЛАВА 14 363
охарактеризованным молекулярно. Этот высоко-
консервативный белок из семейства РНК-гели-
каз присутствует у большинства эукариот [San-
juan, Marin, 2001]. У самцов MLE преимущест-
венно связывается с Х-хромосомой. но, в отли-
чие от других белков комплекса, выявляется и на
аутосомах, а у самок дрозофилы локализуется на
всех хромосомах [Kuroda etal., 1991; Gorman
etal., 1993; Demakova etal., 2003]. У самцов,
в отсутствие белков MSL1/MSL2, MLE теряет
Х-хромосомную специфичность [Gorman et al.,
1993]. Кроме того, было показано, что связь
MLE с Х-хромосомой нарушается под воздейст-
вием РНКазы, т. е. является РНК-зависимой
[Richter et al., 1996]. Анализ различных мутантов
по гену’ mle выявил, что MLE необходим для
присоединения гоХ РНК к MSL-комплексу [Ме1-
ler et al., 2000], причем для этого необходима це-
лостность РНК-связующего домена RB2, но не
домена RB1 [Могга etal., 2011]. В структуре
MLE также выделяются два домена, нарушение
которых приводит к потере АТФазной и гели-
казной активностей (см. рис. 14.5). Выяснилось,
что при замене консервативных остатков в АТФ-
связующем домене (и потере обеих активностей)
MSL-комплекс собирается на Х-хромосоме, но
полностью лишен гоХ-РНК и не способен кор-
ректно связаться и дозово-компенсировать все
свои гены-мишени [Gu etal., 2000]. Детальный
анализ мутантов MLE, у которых сохранена
АТФазная, но потеряна геликазная активность,
свидетельствует о том, что именно геликазная
активность MLE необходима для правильного
распределения MSL-комплекса по Х-хромосоме
[Могга et al., 2008].
Помимо пяти хорошо охарактеризованных
субъединиц MSL-комплекса, существует еще
один белок, JIL-1, который также потенциально
входит в этот комплекс. Иммуноокрашивание
политенных хромосом антителами против JIL-1
выявило обогащенность данным белком Х-хро-
мосомы самцов дрозофилы [Jin etal., 1999].
Позднее было показано, что JIL-1 колокализует-
ся с MSL-комплексом и физически взаимодейст-
вует с составляющими его белками в экспери-
ментах по коиммунопреципитации [Jin et al.,
2000]. Совокупность данных о том, что MSL2 и
MOF фосфорилированы in vivo [Zhai et al., 2008]
и что JIL-1 обладает киназной активностью [Jin
etal., 1999], позволяет предполагать, что JIL-1
фосфорилирует некоторые MSL-белки, тем са-
мым влияя на активность MSL-комплекса. Также
было обнаружено, что гипоморфные мутации jil-
1 ослабляют дозовую компенсацию гена white в
классической системе white-apricot [Lerach et al.,
2005]. Показано, что JIL-1 является гистоновой
киназой и способен фосфорилировать H3S10
(см. рис. 14.5) в течение интерфазы [Jin et al.,
1999, Wang et al., 20011. Какова роль этой моди-
фикации в контексте дозовой компенсации,
не очень ясно. Существует модель, в которой
H3S10ph может блокировать метилирование
расположенного рядом остатка НЗК9 [Rea et al.,
2000] и, соответственно, предотвращать связы-
вание белка-репрессора HP 1 [Fischle etal., 2005;
Johansen, Johansen, 2006]. Возможно, JIL-1 таким
способом участвует в реализации гистоново-
го кода и регулирует баланс распространения ге-
терохроматиновых и эухроматиновых белков
[Lerach et al., 2006; Zhang et al., 2006; Bao et al.,
2007]. Таким образом, можно предполагать, что
JIL-1 в составе MSL-комплекса нужен для уси-
ления и эпигенетического поддержания откры-
того состояния хроматина, особенно в районах
тех генов, которые транскрибируются непосто-
янно и нуждаются в защите от связывания с бел-
ками-репрессорами [Regnard et al., 2011].
14.1.2. Самцово-специфическое
формирование MSL-комплекса
У обоих полов экспрессия белков MSL-комп-
лекса происходит примерно на равном уровне.
Как же достигается специфическая сборка комп-
лекса только у самцов? Ключевым моментом это-
го процесса является тот факт, что основная субъ-
единица MSL-комплекса, белок MSL2, образуется
только у самцов (хотя ген msl-2 транскрибируется
у обоих полов) [Bashaw, Baker, 1995; Kelley et al.,
1995; Zhou etal., 1995]. Это тесным образом свя-
зано с системой определения пола, в которой
главную роль у дрозофилы играет белок SXL (Sex
Lethal). Он способен репрессировать трансля-
цию транскриптов гена msl2, связываясь с их 3'-
и 5'-нетранслируемыми последовательностями
(рис. 14.6) [Kelley et al., 1997, Gebauer et al., 1999,
2003]. Активация или репрессия гена Sxl опреде-
ляется соотношением в геноме Х-хромосомных и
аутосомных наборов (соотношение X : А) на ста-
дии раннего эмбриогенеза. У самок (2Х : 2А = 1)
экспрессируется полноценный РНК-связывающий
белок SXL, в то время как у самцов (IX : 2А =
= 0,5), вследствие альтернативного сплайсинга,
белок SXL неактивен (см. обзор [Schutt, Nothiger,
2000]). Таким образом, SXL избирательно пре-
дотвращает трансляцию MSL2 у самок.
В отсутствие белка MSL2 остальные белки
дозовой компенсации, особенно MSL1, неста-
364 ЭПИГЕНЕТИКА
Самка: XX : АА = 1
Рис. 14.6. Самцово-специфичное формирование комплекса дозовой компенсации.
У самок образуется белок SXL, он связывается с 5'- и З'-нетранслируемыми районами транскрипта msl-2. На З’-конце собирается
комплекс белков SXL и UNR, блокирующий взаимодействие 435-субъединицы рибосомного преинициаторного комплекса с 5'-кон-
цом транскрипта. Таким образом осуществляется репрессия инициации трансляции. Связанные с 5'-концом msl-2 РНК молекулы
SXL блокируют фоновое сканирование транскрипта 435-субъединицей. Вследствие этих событий у самок предотвращается синтез
белка MSL2. У самцов SXL не образуется, и UNR не «запирает» трансляцию msl-2. Формируется белок MSL2, который в сочетании
с MSL1 образует платформу для сборки стабильного MSL-комплекса (с модификациями из [Shyu, 2006]).
бильны и не способны формировать полноцен-
ный комплекс [McDowell etal., 1996]. И, напро-
тив, эктопическая экспрессия белка MSL2 у са-
мок приводит к сборке полноценного активного
комплекса на обеих Х-хромосомах [Kelley et al.,
1995]. Несмотря на то, что полной дозовой ком-
пенсации при этом не происходит (ввиду’ недос-
таточного уровня MSL1), все же жизнеспособ-
ность таких самок значительно снижена [Kelley
et al., 1995; Chang, Kuroda, 1998].
14.2. ФАКТОРЫ, НЕОБХОДИМЫЕ
ДЛЯ КОРРЕКТНОГО УЗНАВАНИЯ
Х-хромосомы MSL-комплексом
14.2.1. ДНК-последовательности
Одной из наиболее интересных проблем до-
зовой компенсации является обеспечение ее
специфичности для одной из хромосом генома.
Наиболее простым объяснением этому’ могло бы
служить наличие у каждого гена Х-хромосомы
особых щ/с-регуляторных последовательностей,
определяющих такую избирательность. На поиск
подобных последовательностей, отличающих X
от аутосом, было направлено много исследова-
ний, и такие повторы и мотивы на Х-хромосоме
были обнаружены. Однако функциональную
связь этих последовательностей с дозовой ком-
пенсацией доказать не удалось [Pardue et al.,
1987; DiBartolomeis et al., 1992; Stenberg et al.,
2005; Gallach etal., 2007, 2010]. При переносе
случайных фрагментов Х-хромосомы в составе
трансгенов с генами-репортерами на аутосомы
их дозовая компенсация варьировала в значи-
тельных пределах или совсем не наблюдалась
(см. обзоры [Lucchesi, Manning, 1987; Baker
et al., 1994]). Это предполагало значительное
влияние на процесс дозовой компенсации хро-
мосомного окружения. Попытка систематиче-
ского поиска последовательностей, приводящих
к двукратному^ усилению экспрессии генов-ре-
портеров в аутосомном контексте у самцов дро-
зофилы, также оказалась безуспешной [Fitzsi-
mons et al., 1999]. Таким образом, с использова-
нием этих подходов не удалось найти ни одного
подтверждения существованию на Х-хромосоме
специфичных гщс-регуляторных элементов, от-
вечающих за дозовую компенсацию индивиду-
альных генов. Тем не менее, MSL-комплекс без-
ошибочно узнает Х-хромосому.
Что же обеспечивает специфичность связы-
вания комплекса дозовой компенсации с Х-хро-
мосомой? Пролить свет на этот вопрос удалось
при анализе локализации на Х-хромосоме му-
тантного комплекса дозовой компенсации, не
содержащего, вследствие соответствующей му-
тации, какого-либо MSL-белка «второго поряд-
ка»: MSL3, MLE или MOF. Иммуноокрашиванис
политенных хромосом таких мутантов антитела-
ГЛАВА 14 365
ми против центральных компонентов комплекса
позволило установить, что неполный MSL-комп-
лекс избирательно связывается с 30—70 района-
ми вдоль Х-хромосомы. Важно, что это не слу-
чайные сайты, а вполне определенный их набор.
Он практически идентичен в политенных хромо-
сомах у мутантов msl3, mof и mle [Palmer et al.,
1994; Gorman etal., 1995; Lyman etal., 1997; Gu
et al., 1998; Kageyama et al., 2001; Demakova et al.,
2003]. Эти сайты были названы энтри-сайтами
(CES, chromatin entry- sites — сайты вхождения в
хроматин) [Palmer et al., 1994; Lyman et al., 1997;
Kelley et al., 1999] и выделены в особую группу-,
которой отводится важная роль на первых эта-
пах «заселения» Х-хромосомы комплексом MSL
(см. рис. 14.4). Не только мутантный, но и пол-
ный комплекс MSL связывается именно с набо-
ром CES у трансгенных самок с низким уровнем
экспресии MSL2, причем CES различаются по
своей аффинности к комплексу, в соответствии с
которой и происходит постепенное связывание
комплекса с ними [Demakova et al., 2003].
Надежно определить последовательности ДНК,
ответственные за первоначальное рекрутирова-
ние комплекса на Х-хромосому, удалось только
после того, как выяснили, что представляют со-
бой на нуклеотидном уровне некоторые из CES-
последовательностей [Oh etal., 2004; Dahlsveen
etal., 2006; Gilfillan etal., 2007]. Анализ сайтов
связывания MSL-комплекса у мутантов msl3 или
при искусственном снижении количества MSL-
субъединиц при помощи РНК-интерференции
позволил идентифицировать все CES-последова-
тельности и систематически их охарактеризовать
[Alekseyenko et al., 2008; Straub et al., 2008]. Срав-
нив все последовательности CES между- собой,
у-далось выявить вырожденный GA-богатый мо-
тив ДНК длиной в 21 п. н„ который был назван
MRE (рис. 14.7). Оказалось, что существует по-
рядка 150 CES-последовательностей на Х-хро-
мосоме, 91 % которых имеют MRE-мотив. Плот-
ность распределения MRE-мотива на Х-хромосо-
ме всего в два раза выше, чем на аутосомах.
Кроме того, на той же Х-хромосоме MRE-моти-
вов несколько тысяч, а MSL-комплекс связыва-
ется лишь с теми MRE, которые входят в состав
CES. За счет чего же достигается эта избира-
тельность? По всей видимости, это обусловлено
тем, что MSL-комплекс функционирует на хро-
мосоме отнюдь не на «голой» матрице ДНК, а в
хроматиновом контексте. В последнее время
пришло понимание того, что существует ряд ус-
ловий, необходимых для обеспечения коррект-
ного связывания MSL-комплекса с конкретным
2-1
1 -
П ---LL—
и 1 23456789 1011 12131415161718192021
cesiidi CGAATATGAGCGAGATGGATG
CES5C2-1 CAACTTAGAAAGAGATAGCGA
CES5C2-2 TGAAAGAGAGCGAGATAGTTG
CES5C2-3 GAAATGAAAGAGAGGTAGTTT
Рис. 14.7. MRE-мотив: GA-богатая последователь-
ность ДНК, обогащенная в энтри-сайтах.
В верхней части рисунка показан консенсус для MRE-мотива,
где высота каждой из букв пропорциональна ее частоте в
данной позиции. Снизу показаны конкретные примеры MRE-
мотивов из энтри-сайтов в районах 11D1 и 5С2. Отчетли-
во прослеживается консервативность центральной части —
GAGCGAGA (из статьи [Alekseyenko et aL, 2008])).
районом хромосомы. К таким условиям, предпо-
ложительно, относятся: транскрипция соответст-
ву’ющих последовательностей, локализация MRE
в районах 3'-концов генов, триметилирование
H3K36 на соседних ну-клеосомах и специфи-
ческий GC-состав в прилежащих областях [Kind,
Akhtar, 2007; Alekseyenko etal., 2008, 2012;
Straub etal., 2008]. Вполне возможно, что сово-
купность всех этих факоторов и определяет раз-
личное сродство CES-последовательностей к
MSL-комплексу.
14.2.2. гоХ-РНК
гоХ1- и т¥2-РНК являются не только физи-
ческими компонентами MSL-комплекса. Оказа-
лось, что из множества CES-последователь-
ностей две точно соответствуют участкам генов
гоХ1 и roX2 [Amrein, Axel, 1997; Meller etal.,
2000], что вряд ли является случайностью (см.
рис. 14.4, нижняя панель). Более того, обнару-
жено, что сборка «полных» комплексов дозовой
компенсации, су’дя по всему, происходит именно
в сайтах синтеза гоХ-РНК и именно котранс-
крипционно [Oh et al., 2003; Kelley et al., 2008].
Считается, что это может приводить к измене-
нию или усилению активности MSL-комплекса
in cis [Meller, Rattner, 2002; Park et al., 2002; Oh
et al., 2003; Li et al., 2008]. To, что гоХ-РНК явля-
ется одним из ключевых факторов, определяю-
щих Х-специфичность дозовой компенсации,
подтверждается экспериментами, в которых экс-
прессирующие гоХ-РНК трансгены в аутосом-
ном окру’жении активно привлекали к себе MSL-
366 ЭПИГЕНЕТИКА
комплекс. В этих экспериментах обнаруже-
но, что в аутосомном окружении при транскрип-
ции гоХ-последовательностей может происхо-
дить распространение (англ, spreading) MSL-
комплекса в обе стороны от места встройки гоХ-
трансгенов (рис. 14.8) [Kelley et al., 1999, 2008;
Kageyama etal., 2001; Park etal., 2002; Oh etal.,
2003; Kotlikova et al., 2006].
Оказалось, что такое распространение в цис-
направлении напрямую зависит от уровня транс-
крипции гоХ-РНК и может осуществляться толь-
ко при среднем ее уровне [Kelley etal., 2008].
При этом на Х-хромосоме наблюдался частич-
ный или полный паттерн локализации MSL-
комплекса, поскольку roX-РНК, как выяснилось,
могут действовать не только в цис-, но и в транс-
положении [Kelley et al., 1999; Meller et al., 2000;
Park et al., 2002; Oh et al., 2003; Kelley et al., 2008].
Результатом г/г/с-распространения MSL является
двукратное усиление экспрессии аутосомных ге-
нов, локализованных рядом с гоХ1 или гоХ2-
трансгеном непосредственно в области эктопи-
ческого связывания MSL с аутосомой [Park et al.,
2010].
Важность roX-РНК для механизма дозовой
компенсации подтверждается и тем, что гомоло-
ги обеих некодирующих РНК были обнаружены
практически во всех отсеквенированных видах
Рис. 14.8. Распространение MSL-комплекса (красный)
с гаХ2-трансгена (стрелка) на левом плече второй
хромосомы (2L). гаХ-гены на Х-хромосоме делегиро-
ваны, и собирающиеся на 2L MSL-комплексы пере-
распределяются на Х-хромосому in trans.
дрозофилы. Более того, удалось определить ко-
роткий повторенный элемент, общий для обеих
гоХ-РНК. Если удалить все копии этого «гоХ-
бокс» элемента, то roX-РНК утрачивает актив-
ность и стабильность, и напротив, дополнитель-
ные его копии, похоже, способствуют локально-
му’ распространению MSL-комлекса в местах
синтеза roXl [Kelley et al., 2008].
Предположительно, roX-сайты могут пред-
ставлять собой относительно древние последо-
вательности, транскрипция которых позволяла
наиболее активно привлекать MSL-комплекс к
Х-хромосоме и «распространять» его на боль-
шие расстояния вдоль хромосомы, что было
крайне важно на этапе становления дозовой ком-
пенсации у дрозофилы. В этой связи, распро-
странение MSL-комплекса с остальных CES-no-
следовательностей, более эволюционно моло-
дых, необязательно должно быть таким же мощ-
ным, — порядка 5—10 т.п.н., что и наблюдается
в экспериментах [Alekseyenko et al., 2008; Sural
et al., 2008].
Следует отметить, что аналогичный механизм
распространения модифицирующих хроматин
факторов на большие расстояния от специфиче-
ских сайтов инициации известен у млекопитаю-
щих. В этом случае происходит «покрывание»
Х-хромосомы Xist РНК, распространяющейся
in cis из центра инактивации (Xie) (см. обзор
[Park, Kuroda, 2001]). Сходный процесс был не-
давно открыт и на аутосоме у D. melanogaster.
Белок POF (Painting of Fourth) специфически по-
крывает четвертую хромосому’, распространяясь
in cis из сайта инициации, локализованного в ее
проксимальной части [Larsson etal., 2001]. Та-
ким образом, общим принципом во всех извест-
ных на данный момент случаях специфического
выбора хромосомы, похоже, является наличие на
ней соответству’юших центров нуклеации.
14.2.3. Баланс MSL-белков
и roX-РНК в ядре
В ряде работ исследовались изменения пат-
терна распределения MSL-комплекса в результа-
те манипуляций количеством его компонентов,
проду’цируемых клеткой. Оказалось, что кор-
ректное распределение MSL-комплекса в ядре
зависит от баланса между MSL-белками и гоХ-
транскриптами. Так, при недостатке MSL2 (клю-
чевого белка комплекса) паттерн связывания
комплекса с политенной Х-хромосомой оставал-
ся неполным, причем число сайтов связывания
зависело от степени недостатка MSL2, синтези-
ГЛАВА 14 367
руемого у таких трансгенных мутантов [Kelley
etal., 1997, 1999; Demakova etal., 2003]. Напро-
тив, избыток MSL1 (MSL2) приводил к тому’, что
комплекс при иммунолокализации помимо X-
хромосомы был эктопически связан с хромо-
центром и с десятками аутосомных районов по-
литенных хромосом [Demakova et al., 2003]. Од-
нако лишь в части этих эктопических сайтов
формировался полный функциональный комп-
лекс, включающий в свой состав гоХ-РНК. Жиз-
неспособность мутантных самцов при значи-
тельном избытке MSL1 или MSL2 снижена [Oh
etal., 2003]. При анализе процесса распростра-
нения MSL-комплекса вокруг мест эктопической
встройки трансгенов гоХ в разные участки ау-
тосом было обнаружено, что от соотношения
MSL-белков и roX-РНК зависит, будет ли осу-
ществляться локальное распространение комп-
лекса в 7/г/с-направлении или нет [Park et al.,
2002]. Позднее процесс распространения MSL-
комплекса был продемонстрирован и в нативном
контексте (на Х-хромосоме) у мутантов, у кото-
рых при избытке MSL1 и MSL2 не синтезирова-
лась либо roXl, либо гоХ2-РНК. В политенных
хромосомах таких мутантов наблюдалось су-
щественное перераспределение MSL-комплекса
вдоль Х-хромосомы. Комплекс концентрировал-
ся вокруг функционального локуса гоХ, в ущерб
удаленным от этого локуса сайтам связывания
[Oh et al., 2003], что коррелировало с избыточно
диффузной, по сравнению с самцом дикого типа,
морфологией Х-хромосомы.
Все эти данные говорят о том, что MSL-комп-
лекс в принципе может связываться не только с
Х-хромосомой: такой потенциальной возможно-
стью обладают очень многие аутосомные рай-
оны, включая даже районы прицентромерного
гетерохроматина. Таким образом, чтобы обеспе-
чить Х-специфическое связывание комплекса
дозовой компенсации, требуется тонкое взаимо-
действие разных факторов, часть из которых,
возможно, пока неизвестна.
14.2.4. Специфическая конформация
Х-хромосомы самца в ядре
Еще одним немаловажным фактором, органи-
зующим многочисленные процессы, которые во-
влечены в механизм дозовой компенсации, по-
хоже, является особая конформация Х-хромо-
сомы самца в объеме ядра [Grimaud, Becker,
2009]. Очевидные различия в пространственной
организации этой хромосомы у самок и самцов в
интерфазном ядре были обнаружены при анали-
зе трехмерной локализации разных ее участков с
помощью подхода, который комбинировал дву-
цветный FISH, иммуноокрашиванис антителами
против MSL2 и конфокальную микроскопию.
Выяснилось, что в ядре Х-хромосома самца ор-
ганизована таким образом, что энтри-сайты ока-
зываются сближенными друг с другом в про-
странстве, в отличие от участков, соответст-
вующих MSL-гэпам. Возможно, в пространстве
создается особый домен, объединяющий энтри-
сайты и каким-то образом обеспечивающий их
наивысшую аффинность к MSL-комплексу. Важ-
но отметить, что такая специфическая конфор-
мация Х-хромосомы самца стабильно поддержи-
вается в ходе развития.
14.3. Сайты связывания MSL-комплекса
в ГЕНОМЕ
Полногеномный анализ сайтов связывания
MSL-белков и гоХ-РНК дал исследователям мно-
го новой информации о том. как этот комплекс
распространен по геному вообще и по генам в
частности [Legube et al., 2006; Alekseyenko et al.,
2006; Gilfillan etal., 2006; Chu etal., 2011; Simon
etal., 2011]. Так, оказалось, что MSL-комплекс
предпочтительно связывается с активными ге-
нами, причем не с их премоторными областями,
а по всей длине, с выраженным увеличением
связывания ближе к их 3'-концам. Важно отме-
тить, что не всякий транскрипционно активный
ген автоматически связывается с MSL-комплек-
сом. Выяснилось, что при прохождении по хро-
матиновой матрице РНК-полимеразного комп-
лекса происходит модификация подлежащих
нуклеосом. В частности, при этом в большинстве
случаев происходит метилирование гистона НЗ
по остатку’ К36 с образованием НЗКЗбтеЗ. Ана-
лиз распределения этой гистоновой модифика-
ции свидетельствовал о том, что она характерна
для большинства транскрибируемых генов и, как
и MSL, становится все более выраженной ближе
к 3'-концам этих генов. При сопоставлении пат-
тернов локализации MSL и НЗКЗбтеЗ стало
очевидно, что они в значительной степени сов-
падают и что НЗКЗбтеЗ является гораздо более
значимым хроматиновым маркером мест связы-
вания комплекса дозовой компенсации, чем сама
транскрипция (рис. 14.9). Корреляция распреде-
лений MSL и НЗКЗбтеЗ указывала на существо-
вание их функциональной взаимосвязи. Под-
тверждением этого явилось то, что при сниже-
нии уровня НЗКЗбтеЗ наблюдалось значитель-
ное уменьшение связывания MSL-комплекса и,
368 ЭПИГЕНЕТИКА
4300
4350
4400
4450
Геномные координаты, т.п.н.
Рис. 14.9. На Х-хромосоме распределение MSL-комплекса (синий) коррелирует с распределением модификации
НЗКЗбтеЗ (зеленый), где оба белка обнаруживаются преимущественно в районах транскрипционно активных ге-
нов (красный) (с модификациями из [Larschan et al., 2007]).
соответственно, Н4К16ас с активными генами
[Larschan et al., 2007; Bell et al., 2008]. Кроме то-
го, были получены данные, свидетельствующие
о возможной роли хромодомена белка MSL3 в
узнавании НЗКЗбтеЗ [Larschan et al., 2007; Sural
et al., 2008].
Интересно отметить, что в системе, когда
MSL-комплекс экспериментально удавалось за-
ставить связываться с аутосомным материалом
(гоХ- или CES-содержащий трансген на ауто-
соме), комплекс обнаруживался в активных
НЗКЗбтеЗ-маркированных генах [Larschan et al.,
2007; Alekseyenko etal., 2008]. Такое эктопиче-
ское связывание было функционально: гены-ми-
шени MSL-комплекса были ацетилированы и
частично или полностью дозово-компенсиро-
ваны [Henry etal., 2001; Park etal., 2010]. Более
того, если экспериментально смоделировать об-
ратную ситуацию и встроить на Х-хромосому
активный ген с аутосомы или репортерный ген
вообще из другого организма (при условии, что
этот ген будет транскрибироваться и маркирован
НЗКЗбтеЗ), то произойдет его узнавание MSL-
комплексом, ацетилирование и частичная или
полная дозовая компенсация (рис. 14.10) [Schol-
nik et al., 1983; Spradling, Rubin, 1983; Gorchakov
et al., 2009; Laverty et al., 2011].
Таким образом, можно предположить, что
после того, как на хроматиновой матрице соби-
рается полноразмерный MSL-комплекс, принцип
wee
CG17504
CG15460
CG12679 Syx16
1(1)д004 HERC2
Hrb27C Rati
CG17052 Rab10
**bfr.4Hk A
_______
Cdic CG17068 CG17065 CG17063
ч I I !! I ni_
4 I III"' г "I w
snRNP70K sip2Alad rHog CG18304 cq3773
CG1631 CG13775 nqp5 xl6
. CG(
CG10399 SA
Сортах CG3430
6970 6060 6950 6940 6930 6920 6910
20100 20110 20120 20130 20140 20150 20160 20170 20180 20100 20200
20210 20220 20230 20240 20250 20260 20270
Рис. 14.10. В контексте Х-хромосомы активные, связанные с НЗКЗбтеЗ гены привлекают MSL-комплекс.
Синим показано связывание с последовательностями Х-хромосомы, красным — с фрагментом аутосомы, перенесенным на X-
хромосому. MSL-комплекс игнорирует неактивные гены (черные) и предпочтительно связывается с активными (красными)
НЗКЗбтеЗ-маркированными генами независимо от их начальной хромосомной принадлежности. Области обогащения хрома-
тина MSL-комплексом показаны зеленым (с модификациями из [Gorchakov et al., 2009]).
ГЛАВА 14 369
его распространения по геному чрезвычайно
прост: он распознает транскрипцию генов, со-
провождающуюся метилированием нуклеосом
по НЗКЗбтеЗ.
14.4. Роль АЦЕТИЛИРОВАНИЯ ГИСТОНА Н4К16
В ПРОЦЕССЕ ДОЗОВОЙ КОМПЕНСАЦИИ
Хорошо известно, что ацетилирование гисто-
нов стимулирует транскрипцию | Akhtar, Becker,
2000], более того, Н4К16ас — пока единствен-
ная известная модификация, способная ослабить
мсжнуклсосомныс контакты, что приводит к ре-
лаксации нуклеосомной укладки хроматина
[Shogren-Knaak et al., 2006; Robinson et al., 2008].
Такое «разрыхление» хроматиновой матрицы яв-
ляется определяющим для прохождения по ней
РНК- и ДНК-полимеразных комплексов. Так,
недавно было показано, что при потере MSL-
комплекса на хромосомах культуры эмбрио-
нальных клеток самцов S2 происходило умень-
шение ацетилирования хроматина активных ге-
нов Х-хромосом с одновременным падением
процессивности РНК-полимеразы II [Larschan
etal., 2011]. Этот процесс имеет глубокий био-
логический смысл и может объяснять то, как в
процессе дозовой компенсации происходит дву-
кратное увеличение экспрессии генов независи-
мо от их абсолютных уровней транскрипции.
14.5. Модели дозовой компенсации
у дрозофилы
В настоящее время наиболее активно разра-
батывается так называемая двухэтапная модель
дозовой компенсации, поскольку она в наиболь-
шей степени объясняет совокупность накоплен-
ных экспериментальных данных [Park, Kuroda,
2001].
1. Котранскрипционное связывание MSL с гоХ-РНК и другими энтри-сайтами
(энтри-сайты несут особый MRE-мотив)
2. Локальное цпс-распространение по активным генам, маркированным НЗКЗбтеЗ
(сиквенс-независимый этап)
I II II III I II I L IIIIII IIIl№
5'__________3'
гоХ
активный ген
I | неактивный ген
О MRE-мотив
комплекс
НЗКЗбтеЗ
---Н4К16ас, H3S10ph, H2BK31ub
Рис. 14.11. Двухэтапная модель дозовой компенсации.
На первом этапе MSL-комплекс собирается на синтезирующихся гоХ-транскриптах и, возможно, в таком виде связывается с ос-
тальными энтри-сайтами, несущими специфическую последовательность ДНК— MRE-мотив. На втором этапе происходит сик-
венс-независимое распространение MSL-комплекса из энтри-сайтов в расположенные рядом в пространстве активные гены,
хроматин которых маркирован НЗКЗбтеЗ. MSL-комплекс специфически модифицирует Н4К16, H3S10 и Н2ВК31, что приводит
к некоторой деконденсации хроматина и облегчению прохождения РНК-полимеразного комплекса. Таким образом, происходит
однотипное увеличение уровней транскрипции генов Х-хромосомы (с модификациями из [Gelbart, Kuroda, 2009]).
370 ЭПИГЕНЕТИКА
Двухэтапная модель (рис. 14.11)
На первом этапе происходит идентификация
Х-хромосомы за счет связывания MSL-комплекса:
а) с экспонированными MRE-содержащими
CES-последовательностями (по-видимому, через
сиквенс-специфичные белки-посредники);
б) с синтезирующимися гоХ-транскриптами (с
одновременным его «дозреванием» и, возможно,
усилением/модификацией его активностей).
На втором этапе MSL-комплекс распростра-
няется по соседним активным генам в г/г/с-поло-
жении. Ключевым моментом для «узнавания»
таких генов, по-видимому, является не конкрет-
ная ДНК-последовательность, а совокупность хро-
матиновых модификаций, в частности НЗКЗбтеЗ,
и/или какие-то структурные особенности самих
нарождающихся транскриптов.
MSL-комплекс модифицирует нуклеосомную
матрицу’, привнося в нее Н4К16ас и H2BK31ub.
Модификация Н4К16ас приводит к ослаблению
межнуклеосомных контактов, т. е. своеобразно-
му’ «разрыхлению» хроматина, тем самым об-
легчая прохождение РНК-полимеразного ком-
плекса. Таким образом, элонгация транскрипции
проходит примерно в два раза быстрее на каж-
дом дозово-компенсируемом гене, независимо от
силы его промотора.
Другие модели
Помимо описанной двухэтапной модели до-
зовой компенсации, существует еще две модели,
на которых необходимо кратко остановиться.
Так называемая модель обратного дозового
эффекта подразумевает, что раз Х-хромосома
представляет собой по сути анеуплоидный район
генома самца, то не будь MSL-комплекса, гены
на всех хромосомах набора должны были бы
экспрессироваться сильнее, чем нужно. Дело в
том, что на любом достаточно протяженном уча-
стке генома обязательно есть гены, кодирующие
как белки-репрессоры, так и активаторы транс-
крипции, но последних, как правило, меньше.
При удалении или снижении дозы такого района
генома (анеуплоидии) «сила» репрессии будет
меньше и геном в целом будет работать актив-
нее. Чтобы этого не происходило, MSL-комп-
лекс убирает транскрипционные активаторы, та-
кие как MOF, с аутосом и сдерживает их ак-
тивность (ацетилирование) в разумных пределах
в контексте Х-хромосомы [Birchler, 1996; Bir-
chler etal., 2003; Bhadra etal., 1999, 2000, 2005].
Частично это и наблюдается в эксперименте.
Например, MSL-комплекс у самцов действитель-
но связывает и перераспределяет по Х-хромо-
сомным генам MOF, ограничивая его количество
на аутосомах, где он выполняет, отметим, забе-
гая вперед, функции, никак не связанные с дозо-
вой компенсацией [Prestel et al., 2010].
Проверить, какая из моделей верна, можно
относительно просто: надо узнать, что происхо-
дит с транскрипцией генов на Х-хромосоме и ау-
тосомах при уменьшении количества MSL-
комплекса. Из модели «обратного дозового эф-
фекта» следует, что экспрессия генов на Х-хро-
мосоме должна остаться неизменной, а на ауто-
сомах — увеличиться примерно вдвое. Одновре-
менно общепринятая модель дозовой компенса-
ции гласит, что произойдет только уменьшение
экспрессии генов Х-хромосомы без каких-либо
выраженных эффектов на аутосомах. Такие экс-
перименты были проведены, и полученные дан-
ные соответствовали именно классической двух-
ступенчатой модели [Hamada et al., 2005; Straub
et al., 2005b; Larschan et al., 2011].
Была предложена еще одна модель, модель
«аффинностей» [Fagegaltier, Baker, 2004; Gilfillan
et al., 2004; Oh et al., 2004], которая берет за ос-
нову существование иерархии сайтов на Х-хро-
мосоме по их сродству к MSL-комплексу [De-
makova et al., 2003]. Если интерпретировать этот
факт как визуализацию различной аффинности
сайтов в пределах группы CES, число которых
по настоящим оценкам достигает 300, то это
вполне согласуется с двуступенчатой моделью.
Что касается множества других мишеней комп-
лекса, они не обладают какими-либо специали-
зированными ДНК-последовательностями, при-
влекающими, хоть и слабо, MSL-комплекс: их
связывание происходит целиком и полностью в
зависимости от статуса НЗКЗбтеЗ.
Однако авторы модели аффинностей не вы-
деляют CES как особую группу последователь-
ностей. отличающуюся по своим молекулярным
свойствам от множества остальных слабоаф-
финных сайтов, соответственно, они не преду-
сматривают и существования сиквенс-независи-
мого этапа распространения MSL-комплекса
(соответствующего второму этапу двуступенча-
той модели). Напротив, постулируется, что свя-
зывание MSL-комплекса с континуумом сай-
тов — от самых сильных до самых слабых —
осуществляется исключительно за счет их инди-
видуальной аффинности.
В поддержку данной модели приводят цито-
логические данные, что при транслокациях ма-
териала Х-хромосомы на аутосому’ происходило
связывание транслоцированного материала с
MSL-комплексом независимо от того, содержал
ГЛАВА 14 371
он CES или нет [Fagegaltier, Baker, 2004; Oh
et al., 2004; Dahlsveen et al., 2006]. Так ли это на
самом деле, можно определить только с помо-
щью детального молекулярного анализа, по-
скольку было выяснено, что число CES гораздо
выше, чем предполагалось ранее,— 131—300
[Alekseyenko et al., 2008; Straub et al., 2008]. Кро-
ме того, было показано, что комплекс все же
способен проникать на несколько десятков т.п.н.
в аутосомный материал [Sun, Birchler, 2009] и
происходит это, как и на Х-хромосоме, в четкой
зависимости от статуса метилирования генов
H3K36 [Gorchakov et al., 2009] (см. рис. 14.9).
В любом случае, независимо от модели, в бу-
дущем предстоит определить, чем обусловлена
разная аффинность ДНК-последовательностей к
MSL-комплексу (например, их различной функ-
циональной требовательностью к особенностям
транскрипции, обогащенности MRE-мотивами
ит. д.).
14.6. Эволюция КОМПЛЕКСА ДОЗОВОЙ
КОМПЕНСАЦИИ У ДРОЗОФИЛЫ
Формирование половых хромосом в процессе
эволюции у высших эукариот напрямую связано
с необходимостью компенсировать разниц}’ в
экспрессии расположенных на них генов, при-
чем разниц}’ не только между полами, но и меж-
ду половыми и неполовыми хромосомами. Как
было показано в предыдущих главах, основной
«задачей» комплекса дозовой компенсации у
дрозофилы является избирательное ацетилиро-
вание Н4К16 на Х-хромосоме самца. Считается,
что это приводит к значительном}’ «разрыхле-
нию» хроматина и более «легком}’» прохожде-
нию РНК-полимеразного комплекса по хромати-
новой матрице, что в свою очередь выражается в
примерно двукратном усилении экспрессии ге-
нов на Х-хромосоме самца. Таким образом, цент-
ральным элементом в эволюции дозовой ком-
пенсации является Н4К16ас.
Если провести поиск гомологов генов, коди-
рующих белки дозовой компенсации, у других
видов животных, то такие гены существуют у
подавляющего большинства билатеральных ор-
ганизмов, вплоть до человека [Marin, 2003]. Бо-
лее того, показано, что, как и у дрозофилы, у че-
ловека белки hMOF, hMSL-1, 2 и 3 формируют
комплекс, обладающий Н4К16-ацетилтрансфе-
разной активностью [Smith et al., 2005, Taipale
etal., 2005]. Наиболее эволюционно консерва-
тивным среди MSL-белков является MLE, орто-
логи которого встречаются от грибов до челове-
ка. Однако входит ли hMLE в общий комплекс с
hMOF, не известно. Как бы то ни было, актив-
ность белков MOF и MLE в контексте дозовой
компенсации описана только для самцов мух из
рода Drosophila [Bone, Kuroda. 1996; Ruiz et al.,
2000]. И, наоборот, вне MSL-комплекса MOF за-
действован в процессах активации транскрипции
и репарации ДНК, в то время как MLE вовлечен в
метаболизм РНК и ДНК (см. ниже, раздел 14.9).
Помимо белковых составляющих, в MSL-
комплекс также входят крайне неконсерватив-
ные в эволюции гоХ-РНК. Их ортологи были об-
наружены у большинства видов дрозофил [Park
et al., 2007].
Таким образом, сами по себе гомологи белко-
вых составляющих комплекса дозовой компен-
сации, равно как и сама модификация Н4К16ас,
обнаруживаются у подавляющего большинства
эукариот [Marin, 2003]. Однако именно у самцов
дрозофил гистон-ацетилтрансферазная актив-
ность MOF специфически «приспособлена» под
решение конкретной биологической задачи.
Как решается проблема дозовой компенсации
у других гетерогаметных видов двукрылых, в
настоящее время не известно. По-видимому, у
некоторых видов на Х-хромосоме в принципе
мало генов, соответственно нет и необходимости
их компенсировать [Schutt, Nothiger, 2000; Shear-
man, 2002].
Вообще, стоит отметить, что дозовая ком-
пенсация на уровне целой хромосомы обнару-
живается далеко не у всех гетерогаметных орга-
низмов, а лишь у тех видов, где гетерогаметный
пол — самец [Jablonka, Lamb, 1990]. Ситуация с
дозовой компенсацией у видов, где гетерогамет-
ный пол — самка (модельные виды птиц, бабо-
чек и рыб), в настоящее время менее ясная (см.
обзор [Mank et al., 2011]).
Интереснейшие аспекты эволюции кариотипа
и становления дозовой компенсации можно про-
следить у близких видов, находящихся на раз-
ных этапах образования половых хромосом.
Считается, что «предковый» кариотип дрозо-
фил состоял из шести акроцентрических мюлле-
ровских элементов: А, В, С, D, Е, F, причем эле-
мент А соответствовал половой Х-хромосоме
(рис. 14.12). В ходе видообразования в разных
подгруппах дрозофил эти элементы сливались в
различных сочетаниях, образовывая метацентри-
ческие хромосомы. У Drosophila americana ате-
ricana такое слияние между элементами А и В
произошло лишь недавно, порядка 0,47 млн лет
назад [Vieira et al., 2003]. Более того, оставшийся
без пары гомолог, элемент В, у этого вида еще
372 ЭПИГЕНЕТИКА
ABCD
i— D. simulans
И- D. sechellia
1— D. malanogaster
-------- D. yakuba
--------D. erecta
----------- D. ananassae
- D. pseudoobscura
- D. persimilis
D. miranda
30 20 10 0
Время дивергенции,
млн лет
Рис. 14.12. Различные примеры кариотипов у некоторых видов дрозофил: D. melanogaster, D. pseudoobscura и
D. miranda.
Мюллеровские элементы А—F показаны на идиограмме цветом. Черным показана Y-хромосома. У D. pseudoobscura, D. per-
similis и D. miranda Х-хромосома образована за счет слияния элементов А и D. В дополнение к этому у D. miranda нео-У-хромо-
сома образована за счет слияния Y и элемента С. Оставшийся гомолог сформировал нео-Х (с модификациями с сайта
http://insects.eugenes.org/species/about/).
не успел дегенерировать [Charlesworth et al.,
1997]. Таким образом, формально нет никакой
необходимости дозово-компенсировать это пле-
чо новой Х-хромосомы, что и наблюдается на
практике [Bone. Kuroda, 1996]: MSL-комплекс и
ТИК 1 бас колокализуются только на А-плече X-
хромосомы самцов D. cimericcma cimericcma.
Разумеется, если при слиянии полового А-
элемента с аутосомой неспаренный гомолог де-
генерирует и теряется, то такая ситуация требует
адекватной компенсации «несбалансированных»
генов на новом плече. Именно такой сценарий
реализовался у группы видов из подгруппы pse-
udoobscura: D. pseudoobscura, D. persimilis и
D. miranda. Слияние элементов А и D у этих ви-
дов произошло, по разным оценкам, от 25 до
55 млн лет назад [Russo et al., 1995; Tamura et al.,
2004]. Полученная таким образом метацентриче-
ская Х-хромосома к настоящему времени полно-
стью «заселена» MSL-комплексом, и активные
гены на обоих плечах дозово-компенсированы
(см. рис. 14.12).
Уникальный промежуточный вариант «неус-
тоявшейся» дозовой компенсации был обна-
ружен у D. miranda. Порядка 2 млн лет назад
у данного вида произошло слияние элемента
С с Y-хромосомой, тем самым образовалась па-
ра нео-Y -хромосома/нео-Х-хромосома (см.
рис. 14.12) [Macknight, 1939; Norman, Doane,
1990; Russo et al., 1995]. Поскольку у самцов нет
рекомбинации, а Y-хромосома, как правило, на-
следуется по самцовой линии, то любые мутаци-
онные события на ней фактически мгновенно
фиксируются. Таким образом, около 50 % генов
на HCO-Y-хромосоме с течением времени превра-
тились в псевдогены [Bachtrog et al., 2008], а их
гомологи на нео-Х, очевидно, должны начать до-
зово-компенсироваться. Действительно, нео-Х-
хромосома D. miranda обнаруживает локальное
связывание MSL-комплекса и сопутствующее
ацетилирование Н4К16 (рис. 14.13) [Bone, Ku-
roda, 1996; Marin etal., 1996; Steinemann etal.,
1996]. Остается неясным, как комплекс дозовой
компенсации идентифицирует нео-Х-хромосому,
игнорирует аутосомы и высоко гомологичную
нео-Y-хромосому, и отличается ли его субъеди-
ничный состав на X и на нео-Х.
То, как комплекс дозовой компенсации «ос-
ваивает» новые для себя аутосомные территории
на нео-Х-хромосоме. неразрывно связано с псев-
догенизацией нео-Y. 11о-видимому, одним из
первых шагов является эпигенетическое сайлен-
сирование генов на nco-Y-хромосоме посредст-
вом распространения репрессирующих гисто-
новых модификаций, таких как НЗК9те2 и
НЗК9теЗ, с расположенных рядом последова-
ГЛАВА 14 373
тельностей мобильных элементов и повторов. На
первых этапах такая репрессия, скорее всего, но-
сит нестабильный и мозаичный характер, что да-
ет возможность оставшимся в дисбалансе го-
мологичным последовательностям на нео-Х при-
обрести ДНК-детерминанты, привлекающие
MSL-комплекс. Эффекты от связывания MSL-
комплекса с последовательностями на нео-Х, как
правило, не ограничены одним-двумя генами,
ведь при распространении по хромосоме MSL-
комплекс может связываться со многими актив-
но транскрибирующимися генами in cis. Тем са-
мым соседние гены начинают компенсироваться
избыточно, создавая условия для дальнейшей —
мутационной или эпигенетической — инактива-
ции гомологичных генов на нео-Y. Такая «гонка
вооружений» вначале затрагивает гены, потеря
активности которых на нео-У-хромосоме нано-
сит минимальный ущерб приспособленности
самцов [Kaiser et al., 2011], но неизбежно приво-
дит к полной гетерохроматинизации нео-Y-xpo-
мосомы и ее потере.
14.7. Динамика связывания Х-хромосомы
с MSL-комплексом в клеточном цикле
и в РАЗВИТИИ
Цитологически было показано, что компо-
ненты MSL-комплекса исключительно стабиль-
но связаны с Х-хромосомой в течение всего кле-
точного цикла, включая митоз [Lavender et al.,
1994; Straub etal., 2005а]. Тем не менее, неиз-
вестно, остаются ли все без исключения сайты
связывания MSL неизменными на молекулярном
уровне при митотической конденсации или в
части случаев MSL-комплекс диссоциирует со
своих мишеней. Можно предполагать, что, пра-
вильно установившись впервые еще в эмбриоге-
незе, паттерн MSL за счет своей постоянной свя-
зи с хроматином поддерживается эпигенетиче-
ски в относительно стабильном виде в ряду кле-
точных делений в течение последующего онто-
генеза [Kotlikova et al., 2006; Alekseyenko et al.,
2006]. Это бы позволило поддерживать постоян-
ный уровень Н4К16ас на Х-хромосоме и активно
противостоять действию гистон-деацетилаз. Тем
не менее, надо понимать, что эта стабильность
носит относительный характер, хотя бы потому,
что блокирование транскрипции способно инги-
бировать MSL-связывание с трансгенной мише-
нью [Kind, Akhtar, 2007]. Было бы чрезвычайно
интересно провести систематический анализ
связывания MSL-комплекса в развитии и выяс-
нить, насколько этот паттерн «реагирует» на ди-
Рис. 14.13. Иммунолокализация MSL-комплекса на
политенных хромосомах самца D. miranda.
У этого вида две Х-хромосомы: двуплечая Х-хромосома и
нео-Х-хромосома, прерывисто связанная с MSL-комплексом
(с модификациями из [Bone, Kuroda, 1996]).
намичные изменения в транскрипции в ходе раз-
вития.
Современные концепции ядерной организа-
ции предполагают взаимосвязь между активно-
стью хромосомных локусов и их расположением
внутри ядра интерфазной хромосомы. Однако
остается неясным, сохраняется ли этот принцип
в митотических хромосомах. Можно предполо-
жить, что MSL-комплекс меняет свою локализа-
цию в конденсирующихся хромосомах, но все
же это представляется маловероятным. Во-пер-
вых, известно, что масштаб времени изменений
в паттерне связывания хромосом с MSL-комп-
лексом приблизительно равен часам [Legube
et al., 2006], а это совершенно не соответствует
очень быстрым клеточным митозам и циклам
конденсации-деконденсации хроматина в разви-
вающихся тканях дрозофилы. Во-вторых, недав-
но было напрямую показано, что и в случае ми-
тоза локализация MSL-комплекса остается очень
схожей с локализацией НЗК4ше2,3 (и отличной
от H4K20mel), что, безусловно, указывает на
сохранение связи комплекса с активным хрома-
тином [Strukov etal., 2011]. Струков с соавтора-
ми исследовали распределение в ядре MSL-
комплекса, проведя флюоресцентный микроско-
пический анализ хромосом из живых и фиксиро-
ванных клеток эмбрионов и личинок дрозофилы,
экспрессирующих химерный белок MSL3-GFP.
Им удалось показать, что в ранней профазе хро-
матин, содержащий активно транскрибирующие
дозово-компенсирующиеся гены, расположен по
всей толщине Х-хромосомы, но, начиная с позд-
374 ЭПИГЕНЕТИКА
Рис. 14.14. Формирование радиально неоднородной
анафазной хромосомы.
В ранней профазе MSL-GFP сигналы часто выявляются в
пределах всей толщины хромосомы. Крупномасштабные пе-
рестройки внутри профазных 100—200-нанометровых фиб-
рилл приводят к периферийной локализации активных по-
следовательностей ДНК в 500-нанометровых метафазных и
анафазных хроматидах (с модификациями из [Strukov et al.,
2011]).
ней профазы и вплоть до поздней телофазы, ак-
тивные гены всегда локализованы на периферии
митотических Х-хромосом. Таким образом, пред-
ложенная авторами модель (рис. 14.14) постули-
рует, во-первых, отсутствие или очень неболь-
шие изменения в наборе сайтов связывания с
MSL и, во-вторых, наличие широкомасштабных
перестроек внутри хромосом в процессе их кон-
денсации.
14.8. Дозовая компенсация,
АЦЕТИЛИРОВАНИЕ И РЕПЛИКАЦИЯ
То, что Х-хромосома отличается от аутосом
по временным и качественным параметрам реп-
ликации, было известно уже давно. В то время
как у самок дрозофилы все хромосомы набора
вступают и завершают репликацию примерно
одновременно, Х-хромосома самцов заканчивает
репликацию значительно раньше аутосом [Ber-
endes, 1966; Rodman, 1968; Lakhotia, Mukherjee,
1969; Ananiev, Gvozdev, 1975]. Как известно,
районы политенных хромосом, которые репли-
цируются поздно в ходе S-фазы (так называемые
районы интеркалярного гетерохроматина), не
успевают полностью реплицироваться и выгля-
дят как хромосомные разломы. Было замечено,
что в Х-хромосоме самцов, в отличие от самок,
разломы отсутствуют и поздно-реплицирующие-
ся районы выглядят как обычные толстые диски
[Zhimulev et al., 1982].
Этот интересный феномен интуитивно связы-
вали с дозовой компенсацией, коррелирующей с
установлением на Х-хромосоме самца диффуз-
ной структуры хроматина, которая, по общим
представлениям, отражает повышенную доступ-
ность хроматина для различных регуляторных
факторов.
Когда появилась возможность точно картиро-
вать районы генома, различающиеся по времени
репликации, удалось напрямую показать влия-
ние дозовой компенсации на репликацию X-
хромосомы [Alekseyenko etal., 2002]. В этой ра-
боте впервые напрямую было показано, что рай-
оны интеркалярного гетерохроматина Х-хромо-
сомы у самцов, в отличие от самок, действи-
тельно полностью реплицируются. Поскольку
при недостатке MSL-комплекса самцы гибнут,
этот эффект был смоделирован на трансгенных
самках, в серии линий, которые различались по
количеству функционального MSL-комплекса
[Kelley etal., 1997]. Обнаружилось, что эктопи-
ческое установление дозовой компенсации на X-
хромосоме супрсссировало недорепликацию в
районе интеркалярного гетерохроматина, несмот-
ря на то, что это был MSL-негативный район
(«гэп»), причем полная супрессия отмечалась уже
на промежуточном уровне экспрессии MSL-комп-
лекса, еще недостаточном для визуализации ха-
рактерной диффузной морфологии Х-хромосомы.
Дальнейшие полногеномные исследования на
молекулярном уровне подтвердили и расширили
эти выводы. Так, в работе [Schwaiger et al., 2009]
были определены временные профили реплика-
ции в клеточных линиях, полученных из самок и
самцов, и более ранняя репликация Х-хромо-
сомы самца была продемонстрирована с очень
высоким уровнем разрешения. Эти изменения
времени репликации касались и позднореплици-
рующихся у самки районов, которые не являют-
ся объектом дозовой компенсации и не связаны с
MSL-комплексом. Интересно, что временной
профиль репликации у самца коррелирует с рас-
пределением не столько РНК-полимеразы II.
сколько Н4К16ас, что, безусловно, указывает на
связь структуры хроматина и программы репли-
кации (рис. 14.15).
14.9. MSL-независимые функции
MSL-белков
В настоящее время установлено, что MOF
входит в два комплекса. MSL и NSL. Последний
комплекс, помимо MOF, включает в себя, по
меньшей мере, еще шесть белков: MBD-R2,
NSL1, NSL2, NSL3, WDS и MCRS2 [Mendjian
et al., 2006, Prestel et al., 2010]. Мутации по всем
этим белкам — ранние летали, причем у обоих
полов, отсюда и название комплекса NSL —
ГЛАВА 14 375
25 -|
Транскрипция в клетках Кс
ю-
о-
30 q
15:
0J
5п
3-
1 -
-1 -
3-
1:
-1:
Транскрипция в клетках CI8
Н4К16ас
4.
0J
CI8
РНК-полимераза II в клетках Кс , . Кс
н jrwг “ir“ 1 1 vwn i1 i'rthw
РНК-полимераза II в клетках CI8 i
MSL3 в клетках CI8 -i.
5,0
5,1
5,2
5,3
5,4
Рис. 14.15. Х-хромосома реплицируется раньше у самцов (синий, клеточная линия
CI8), чем у самок (красный, клеточная линия Кс).
Время репликации коррелирует наиболее сильно не столько с транскрипционным статусом рай-
она, сколько с распределением Н4К16ас, модификацией хроматина, обеспечивающейся MSL-
комплексом. Зеленым показаны гены, экспрессирующиеся в обеих клеточных линиях, серым —
неактивные гены, синим и красным — дифференциально экспрессирующиеся в CI8 и Кс соот-
ветственно (с модификациями из [Schwaiger et aL, 2009]).
Non-Specific Lethal. MOF в составе NSL пред-
почтительно связывается с 5'-районами актив-
ных генов (в основном, генов домашнего хозяй-
ства) всех хромосом самок и аутосом самцов, где
выполняет функцию транскрипционного актива-
тора [Feller etal.. 2011]. На Х-хромосоме самца,
по всей видимости, NSL-комплекс становится
неполным, теряет MOF, но продолжает локали-
зоваться в районах 5'-областей активных генов,
также выполняя роль неспецифического актива-
тора транскрипции. Одновременно MOF захва-
тывается MSL-комплексом и перераспределяется
вдоль активных генов самцовой Х-хромосомы с
максимумом около их 3'-концов, поскольку
MSL-комплекс узнает модификацию НЗКЗбтеЗ,
образующуюся на генах во время активной элон-
гации транскрипции [Larschan et al., 2007; Alek-
seyenko etal., 2008; Bell etal., 2008]. «Оттягива-
ние» MSL-комплексом MOF на Х-хромосоме
самца не проходит бесследно и для NSL-комп-
лекса в аутосомном контексте, который либо
реже включает в себя MOF (так как MOF теперь
сконцентрирован на Х-хромосоме), либо собира-
ется на аутосомах самца в измененном сте-
хиометрическом составе (значительно меньше
MOF-субъединиц на комплекс).
Сравнивая MSL- и NSL-комплексы, стоит от-
метить, что MOF может отличаться в них и суб-
стратной специфичностью. Такое вполне воз-
можно, поскольку у человека hMOF в составе
hMSL ацетилирует специфически Н4К16, а в со-
ставе hNSL — еще и Н4К5 и Н4К8 [Cai et al.,
2010]. Более того, недавно было обнаружено, что
MOF напрямую задействован в системе ответа
клетки на повреждения ДНК, и эта его функция
консервативна между’ дрозофилой и млекопи-
тающими [Li et al., 2010; Bhadra et al., 2011]. По-
казано, что hMOF влияет на ход репарации как
376 ЭПИГЕНЕТИКА
опосредованно, через Н4К16ас, так и напрямую:
он взаимодействует и активирует ключевые бел-
ки репарационного ответа — киназу ATM, DNA-
PKcs и белок р53 (hMOF ацетилирует р53)
[Gupta et al.. 2005; Taipale et al.. 2005; Sykes et al..
2006; Rea et al., 2007; Shanna et al., 2010].
Как было указано выше, MLE — уникальный
белок в том плане, что в отличие от остальных
MSL-белков он образуется в равных количествах
и у самок, и у самцов [Kuroda et al., 1991]. С са-
мого начала было понятно, что у него есть MSL-
независимые функции. Во-первых, выяснилось,
что MLE участвует в сплайсинге многих транс-
криптов, в том числе транскрипта гена para, и
мутация mlets приводит к временному обратимо-
му параличу у обоих полов [Kernan etal., 1991;
Reenan etal., 2000]. Во-вторых, MLE, в отличие
от других MSL-белков, локализуется и активно
работает в клетках полового пути самцов [Ras-
telli, Kuroda, 1998]. Наконец, простое сравнение
хромосомной локализации MLE у самок и сам-
цов показывает, что MLE локализуется в рай-
онах активной транскрипции на всех хромосо-
мах независимо от пола, причем эта локализация
крайне динамична и соответствует наблюдае-
мым изменениям транскрипции [Kotlikova et al.,
2006]. Тем не менее, стоит отметить несколько
парадоксальный факт: несмотря на важную об-
щеклеточную роль MLE в сочетании с его чрез-
вычайной консервативностью в эволюции, самки
дрозофилы, мутантные по mle. великолепно об-
ходятся без него.
Белок JIL-1, хоть и связывается преимущест-
венно с самцовой Х-хромосомой, но обнаружи-
вается также и на остальных хромосомах, при-
чем у обоих полов. Соответственно, он необхо-
дим как самцам, так и самкам: утрата этого бел-
ка вследствие мутации приводит к гибели му-
тантов независимо от пола [Jin et al., 1999]. Ока-
залось, что распределение JIL-1 по геному в зна-
чительной степени коррелирует с НЗКЗбтеЗ и
обнаруживается в активных генах по всей их
длине как на аутосомах, так и на Х-хромосоме.
На чем основана эта корреляция, пока остается
неизвестным. Можно было предполагать, что
JIL-1 — это один из многих регуляторов транс-
крипции. Однако это оказалось не так. Снижение
количества JIL-1 влечет за собой слабое, но до-
стоверно выраженное снижение активности не-
скольких сотен генов. По всей видимости, задача
JIL-1 — не столько устанавливать районы ак-
тивного хроматина, сколько усиливать или под-
держивать утке существующий «открытый» транс-
крипционный статус района, создавая сложную
эпигенетическую маркировку хроматина: H3S10ph
в сочетании с НЗКЗбтеЗ [Regnard et al., 2011].
14.10. Нерешенные вопросы и проблемы
СУЩЕСТВУЮЩЕЙ МОДЕЛИ
Общепринятая двухступенчатая модель дозо-
вой компенсации у дрозофилы в общих чертах
описывает большую часть наблюдаемых эффек-
тов и правильно предсказывает поведение сис-
темы при экспериментальном манипулировании
ее компонентами. Тем не менее, в деталях дан-
ная модель не всегда работает и требует большо-
го числа допущений. Ниже приведены некото-
рые из вопросов, которые, как нам представляет-
ся, необходимо решить, чтобы привести теорию
и практику в полное согласие друг с другом.
Дозовая компенсация
в раннем эмбриогенезе
Известно, что зиготическая экспрессия генов
дрозофилы начинается на 10-м делении дробле-
ния в раннем эмбриогенезе, в то время как сбор-
ка функционального комплекса дозовой компен-
сации происходит примерно на час позже, на 14-
м делении [Rastelli et al., 1995; Franke et al.,
1996]. Само по себе «включение» зиготической
экспрессии — во многом таинственный процесс,
и понятно, что когда комплекс дозовой компен-
сации собирается в полном составе, перед ним
уже — активно работающий геном, организо-
ванный в транскрипционные территории и нуж-
дающийся в дозовой компенсации. Тем не менее,
оказалось, что еще до того, как начинается фор-
мирование комплекса дозовой компенсации, ге-
ны на одной Х-хромосоме эмбрионов-самцов
экспрессируются в среднем сильнее, чем гены на
одной из двух Х-хромосом эмбрионов-самок.
Таким образом, складывается парадоксальная
ситуация: MSL-белков еще нет, а дозовая ком-
пенсация уже есть [Lott etal., 2011]. Частично
это противоречие можно объяснить тем, что су-
ществуют MSL-независимые механизмы дозо-
вой компенсации. Так, среди рано экспресси-
рующихся генов на Х-хромосоме есть несколько
десятков генов, имеющих сайты узнавания бел-
ком SXL [Gergen, 1987; Bernstein, Cline. 1994].
В настоящее время предполагается, что именно
SXL может обеспечивать дозовую компенсацию
этих генов, снижая их транскрипцию у самок.
Очевидно, требуются дальнейшие исследования
в этой области, чтобы выяснить механизм ран-
ней дозовой компенсации генов, не имеющих
сайты узнавания SXL.
ГЛАВА 14 377
Дозовая компенсация в клетках полового
пути самцов дрозофилы
Разумно предполагать, что для организма са-
мым важным в плане дозовой компенсации яв-
ляется обеспечение равной активности тех ге-
нов, которые должны одинаково экспрессиро-
ваться у разных полов. Это относится, прежде
всего, к так называемым генам «домашнего хо-
зяйства», кодирующим общеклеточные функции
[Gilfillan etal., 2006]. Очевидно, что выравнива-
ние уровней экспрессии для полспецифичных
генов менее необходимо, ведь они по определе-
нию активны предпочтительно у одного из двух
полов. Таковы, например, гены, продукты кото-
рых задействованы в гаметогенезе и половом
поведении.
Действительно, при исследовании эффектов и
механизмов дозовой компенсации было отмече-
но, что MSL-комплекс детектируется в сомати-
ческих клетках самцов дрозофилы, но не в клет-
ках полового пути. Более того, в клетках полово-
го пути самцов ТИК 1 бас равноценно распреде-
лен по всем хромосомам [Rastelli, Kuroda, 1998].
В этой связи было удивительно, что, несмотря на
отсутствие MSL-комплекса, в клетках полового
пути самцов дрозофилы гены Х-хромосомы экс-
прессировались в среднем на том же уровне, что
и гены аутосом [Gupta et al., 2006; Sturgil et al.,
2007; Deng et al., 2011]. Это указывало на то, что
либо существует MSL-независимый механизм
дозовой компенсации в клетках полового пути,
либо имеет место «буферное» выравнивание
экспрессии генов за счет сложных генных взаи-
модействий [Stenberg et al., 2009; Stenberg, Lars-
son, 2011]. В то же время недавно были получе-
ны данные, свидетельствующие о том, что гены
на Х-хромосоме в клетках полового пути дозово
не компенсированы [Meiklejohn etal., 2011]. По-
видимому, различия в выводах исследований
связаны с тем, что, в отличие от «сторонников»
дозовой компенсации в клетках полового пути,
цитированные авторы использовали незагряз-
ненные соматическими клетками образцы тка-
ней и убрали из анализа гены, транскрибиро-
вавшиеся на предельно низком уровне и значи-
тельно смещавшие выборку.
Вопросы и проблемы
модели дозовой компенсации
Известно, что дозы подавляющего большин-
ства генов домашнего хозяйства компенсируют-
ся [Sass etal., 2003; Gilfillan etal., 2006], ведь
именно они создают основу фенотипического
равенства между полами. Ситуация с генами, ак-
тивирующимися на определенных стадиях раз-
вития, равно как и с тканеспецифичными гена-
ми, не столь прозрачна. С одной стороны, осо-
бой необходимости в их дозовой компенсации
может и не быть, ведь двукратная разница в экс-
прессии относительно небольшого числа генов
на непродолжительной стадии развития или в
небольшом числе клеток может и не сказываться
на приспособленности и фенотипе организма.
С другой стороны, необходимо помнить, что са-
ма дозовая компенсация в значительной мере
основана на эпигенетическом маркировании хро-
матина, а именно, она в большей степени связа-
на с НЗКЗбтеЗ, чем с самой транскрипцией. По-
этому, отвечая на вопрос, компенсируются ли
ткане- или стадиеспецифичные гены, надо пом-
нить, что прежде всего речь должна идти о
НЗКЗбтеЗ-позитивных генах.
Как правило, в литературе приводятся приме-
ры таких «парадоксальных» генов, которые явно
транскрибируются, но дозово не компенсирова-
ны [Roberts, Evan-Roberts, 1979; Kaiser etal.,
1986; Hofmann, Korge, 1987; Ghosh et al., 1989;
Weake, Scott, 2007; Laverty et al., 2011]. При этом
статус метилирования и ацетилирования таких
генов так и остается не исследованным, по всей
видимости, именно потому, что эти гены актив-
ны в узком промежутке времени, в специфиче-
ских условиях или в конкретной ткани, что соз-
дает значительные проблемы в сборе достаточ-
ного количества материала. Таким образом, во-
просы, связанные с дозовой компенсацией таких
генов, должны решаться всесторонне, с опреде-
лением локализации всех задействованных «иг-
роков»: MSL-белков, Н4К16ас, НЗКЗбтеЗ, РНК-
полимеразы II и т. д.
Отдельно стоит остановиться на генах, про
которые известно, что они дозово компенсиро-
ваны, но не связаны с MSL-комплексом [Chiang,
Kumit, 2003; Demakova etal., 2003]. Лишь для
части таких генов показано, что они действи-
тельно компенсируются по MSL-независимому
механизм) и находятся под контролем белка
SXL. Для остальных генов этой категории меха-
низм компенсации пока неизвестен. Несомнен-
но, было бы полезно разобраться с этой ситуаци-
ей и определить, связаны ли такие дозово ком-
пенсирующиеся, но MSL-негативные гены с
Н4К16ас, и если да, то как эта модификация об-
разуется в этих районах. Этот анализ позволил
бы привести в соответствие данные о статусе
дозово компенсированных генов, маркировках
хроматина, морфологии Х-хромосомы и локали-
378 ЭПИГЕНЕТИКА
зации SXL- и MSL-белков, и понять, как и поче-
му одни гены привлекают комплекс дозовой
компенсации, а другие активно или пассивно из-
бегают такой регуляции. Кроме того, это также
позволило бы оценить, насколько велик и как
реализуется эффект «непрямой» дозовой ком-
пенсации за счет масштабных структурных из-
менений хроматина целой хромосомы.
Как уже говорилось выше, паттерн распреде-
ления MSL-комплекса вдоль политенной Х-хро-
мосомы включает ряд гэпов [Baker etal., 1994;
Kelley et al., 1999]. Краницы ~30 таких районов
были определены на цитологическом уровне
[Demakova etal., 2003: Kotlikova etal., 2006].
Существование гэпов было подтверждено и мо-
лекулярно [Alekseyenko et al., 2006; Legube et al.,
2006]. Их позиции оказались в значительной ме-
ре консервативны между соматическими тканя-
ми, однако, детального и систематического ана-
лиза того, что собой представляют группы генов,
лишенных MSL-белков и ацетилирования, когда
и где они активны, есть ли на них НЗКЗбтеЗ.
компенсированы ли они — проведено не было.
Также было бы полезно проанализировать эво-
люционную историю таких MSL-негативных
районов. Вполне возможно, что это районы, ге-
ны в которых собраны вместе на хромосоме и
активны, скажем, только в очень узких времен-
ных рамках. Однако нельзя исключить, что гэ-
пы — не что иное, как цитологическое проявле-
ние продолжающегося и все еще не завершенно-
го процесса захвата комплексом дозовой ком-
пенсации Х-хромосомы у D. melanogaster [Gel-
bart, Kuroda, 2009].
Также известно, что MSL-комплекс на самом
деле локализуется не только на Х-хромосоме —
в норме существует около десятка аутосомных
сайтов [Baker et al., 1994; Bone et al., 1994]. Их
значение и особенности организации в настоя-
щее время никак не охарактеризованы, меж тем,
это могут быть потенциально интересные рай-
оны, содержащие, например, MRE-мотивы в по-
хожем на Х-хромосому контексте. Особый инте-
рес представляет вопрос, имеет ли связывание
MSL-комплекса с такими районами какой-либо
биологический смысл в плане транскрипции рас-
положенных в этих районах генов и находятся
ли они внутри активной Х-хромосомной терри-
тории, как и большинство MSL-позитивных рай-
онов Х-хромосомы [Grimaud, Becker, 2009].
Парадоксально, но факт: несмотря на то,
что MSL-комплекс всесторонне охарактеризован
биохимически и генетически, его структурный
анализ все еще не проведен. Неизвестно, ни ка-
кова стехиометрия субъединиц MSL-комплекса
и постоянна ли она (есть ли варианты, скажем,
только с одной из гоХ-РНК), ни как он связыва-
ется с хроматином, ни как он «выглядит». От-
части это связано с тем, что функциональный
MSL-комплекс включает в себя лабильные ком-
поненты, такие как гоХ-РНК, чрезвычайно плот-
но связан с хроматином и имеет большой раз-
мер. В этой связи интересно узнать, как относи-
тельно массивный MSL-комплекс умещается на
одной матрице с не менее объемным РНК-поли-
меразным комплексом, как физически реализу-
ется это динамическое взаимодействие в хрома-
тиновом контексте, и как «наследуется» MSL-
комплекс при репликации. В состав MSL-комп-
лекса не входят ДНК-связывающие сиквенс-спе-
цифичные компоненты, тем не менее, показано,
что MSL-комплекс каким-то образом узнает
MRE-мотив. Очевидно, что для создания целой
картины необходимо приложить усилия для
идентификации белка(ов), выполняющих эту
функцию.
То, что MSL-комплекс способен ацетилиро-
вать хроматин по Н4К16, уже традиционно рас-
сматривается в контексте общего влияния этой
модификации на структуру нуклеосомы и меж-
нуклеосомных контактов. Тем не менее, фор-
мально существует возможность того, что
Н4К16ас узнается каким-либо белком или бел-
ковым комплексом, ведь ацетил-специфичные
модули белков, такие как бромодомены, давно
описаны (см. обзор [Mujtaba et al., 2007]). Иден-
тификация такого «считывающего» белка позво-
лила бы расширить наше понимание того, как
реализуется гистоновый код в случае дозовой
компенсации. С другой стороны, Н4К16ас, впол-
не возможно, работает не через привлечение не-
известного «считывающего» белка, а как раз на-
оборот, путем ингибирования связывания како-
го-либо белка-репрессора [Corona et al., 2002].
При анализе механизмов привлечения MSL-
комплекса к Х-хромосоме было обнаружено, что
у подавляющего большинства энтри-сайтов есть
один или несколько MRE-мотивов [Alekseyenko
et al., 2008]. Тем не менее, есть несколько десят-
ков сайтов, где такие мотивы не обнаруживают-
ся, в связи с чем было бы интересно узнать, как
такие сайты привлекают MSL-комплекс. Кроме
того, известно, что при «заселении» Х-хромосо-
мы MSL-комплекс связывается далеко не со
всем набором энтри-сайтов, а существует опре-
деленная иерархия по аффинности к комплексу,
как если бы одни энтри-сайты были бы более
привлекательны для MSL-комплекса, чем другие
ГЛАВА 14 379
[Demakova et al., 2003]. Что это за сайты, что их
объединяет, важны ли они для правильной иден-
тификации Х-хромосомы, локализуются ли они
в одной точке ядра, консервативны ли их после-
довательности, — все это предстоит выяснить и
интегрировать в существующую статическую
модель, придав ей необходимую «подвижность»
во времени и пространстве.
Распространение MSL-комплекса с энтри-сай-
тов — загадочный процесс, который интуитивно
понятен, однако все выглядит не так просто, ес-
ли учитывать, что в действительности это пре-
рывистый процесс, протекающий нелинейно, в
объеме и зависящий от существующей укладки
хромосомы. Что будет, если удалить один или
серию энтри-сайтов? Как изменится связывание
MSL-комплекса с соседними генами? Будут ли
они все также дозово компенсированы?
Очевидно, что Х-хромосома — это не просто
удачная комбинация гоХ-генов, энтри-сайтов,
НЗКЗбтеЗ и MSL-белков. Будь это так, то было
бы относительно несложно экспериментально
собрать все эти компоненты на аутосоме и «пре-
вратить» ее в Х-хромосому. Таким образом, о
тонких механизмах дозовой компенсации и ее
регуляции еще многое предстоит узнать.
* * *
По определению, эпигенетика подразумевает
под собой наследуемые изменения фенотипа, не
связанные с изменениями последовательности
ДНК. У эукариот огромный класс эпигенетиче-
ских явлений связан с посттрансляционными
модификациями гистонов и их вариантов. Ко-
нечно, далеко не все из них наследуются из по-
коления в поколение, но многие стабильно со-
храняются в ряду клеточных делений и задают
программы транскрипции и репликации. Такая
регуляция позволяет, с одной стороны, сохра-
нять эпигенетическую память о принадлежности
клетки к определенной линии в ходе дифферен-
циации, а с другой — отражает воздействие на
нее внешних факторов, тем самым обеспечивая
динамический баланс реализации генетической
программы в меняющихся условиях среды.
Дозовая компенсация у дрозофилы полно-
стью основана на эпигенетической регуляции
активности генов одной из хромосом генома.
Механизм этой регуляции не связан с измене-
ниями в первичной последовательности ДНК.
Наоборот, он определяется активностями белко-
вого комплекса, который модифицирует хрома-
тин, накладывая Н4К16ас, H2BK31ub, H3S10ph
и локализация которого сама зависит как мини-
мум от НЗКЗбтеЗ. Важно отметить, что ком-
плекс белков дозовой компенсации крайне проч-
но связан с Х-хромосомой и, по-видимому, его
локализация стабильно наследуется в ряду кле-
точных поколений. Несмотря на то, что детали
дозовой компенсации еще во многом не ясны,
установлено, что комплекс дозовой компенсации
модифицирует хроматин Х-хромосомы, приводя
к более легкому прохождению РНК-полимераз-
ного комплекса, и тем самым обеспечивает при-
близительно двукратное усиление транскрипции
генов в широком диапазоне уровней экспрессии.
Это, казалось бы. простое природное решение
задачи «как заставить гены одной из хромосом
работать в два раза интенсивнее» основано на
тонком сочетании эпигенетических факторов.
И хотя в общих чертах картина событий уже яс-
на, в деталях того, как работает и как эволюцио-
нировала дозовая компенсация, еще предстоит
разобраться.
Исследования по данной главе поддержаны
грантом РФФИ № 12-04-00874-а.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Akhtar A., Becker Р. В. Activation of transcription through his-
tone H4 acetylation by MOF, an acetyltransferase essential
for dosage compensation in Drosophila // Mol. Cell. 2000.
Vol. 5. P. 367—375.
Akhtar A., ZinkD., Becker P. B. Chromodomains are protein-RNA
interaction modules // Nature. 2000. Vol. 407. P. 405—409.
Alekseyenko A. A., Demakova О. Г., Belyaeva E. S., Makare-
vich G. P, Kotlikova I. J'., Nothiger R., ZhimulevI. F. Do-
sage compensation and intercalary heterochromatin in X
chromosomes of Drosophila melanogaster 11 Chromo-
soma. 2002. Vol. 111. P. 106—113.
Alekseyenko A. A., LarschanE., Lai JJ . R., ParkP. J., Kuro-
da AL. I. High-resolution ChlP-chip analysis reveals that
the Drosophila MSL complex selectively identifies active
genes on the male X chromosome // Genes Dev. 2006.
Vol. 20. P. 848—857.
Alekseyenko A. A., PengS., LarschanE., Gorchakov A. A.,
Lee О. K, Kharchenko P., Mcgrath S. D., JJ’angC. I., Ma-
rdis E.R., ParkP. J., KurodaM. I. A sequence motif
within chromatin entry' sites directs MSL establishment on
the Drosophila X chromosome // Cell. 2008. Vol. 134.
P. 599—609.
Alekseyenko A. A., Ho J. JJ'. K, PengS., Gelbart AL, Tolstoru-
kovALY., PlachetkaA., Kharchenko P. J'., JungY.L.,
Gorchakov A. A., LarschanE., GuT., AlinodaA., Rid-
dle N. C., Schwartz Y. B., Elgin S.C.R., KarpenG.H.,
Pirrotta J'.. Kuroda AL. I.. Park P. J. Sequence-specific
targeting of dosage compensation in Drosophila favors an
active chromatin context // PLoS Genet. 2012. In press.
AmremH., Axel R. Genes expressed in neurons of adult male
Drosophila // Cell. 1997. Vol. 88. P. 459 469.
AnanievE. J'., Gvozdev J~. A. Differences in DNA replication
patterns in the X-chromosome of males, females and inter-
sexes of Drosophila melanogaster 11 Chromosoma. 1975.
Vol. 49. P. 233—241.
380 ЭПИГЕНЕТИКА
BachtrogD.. HomE., JJ’ongKAL, A Iasi de X.. De JongP. Ge-
nomic degradation of a young Y chromosome in Droso-
phila miranda // Genome Biol. 2008. Vol. 9. R30.
Baker B. S., Gorman AL., Alarm I. Dosage compensation in Dro-
sophila 11 Annu. Rev. Genet. 1994. Vol. 28. P. 491—521.
Bannister A. J., Kouzarides T. Regulation of chromatin bv histone
modifications // Cell Res. 2011. Vol. 21. P. 381 395.
BaoX., DengH. Johansen J.. Girton J.. Johansen K. AL. Loss-
of-function alleles of the JIL-1 histone H3S10 kinase en-
hance position-effect variegation at pericentric sites in
Drosophila heterochromatin И Genetics. 2007. Vol. 176.
P. 1355—1358.
Bashaw G. J., Baker B. S. The msl-2 dosage compensation gene
of Drosophila encodes a putative DNA-binding protein
whose expression is sex specifically regulated by Sex-
lethal 11 Development. 1995. Vol. 121. P. 3245 3258.
Bell O.. Conrad T.. Kind J.. JJ’irbelauer C. Akhtar A.. Schu-
belerD. Transcription-coupled methylation of histone H3
at lysine 36 regulates dosage compensation by enhancing
recruitment of the MSL complex in Drosophila melano-
gaster // Mol. Cell. Biol. 2008. Vol. 28. P. 3401—3409.
BeloteJ.AL., Lucchesi J. C. Control of X chromosome trans-
cription by the maleless gene in Drosophila // Nature.
1980. Vol. 285. P. 573—575.
Berendes H. D. Differential replication of male and female X-
chromosome in Drosophila // Chromosoma. 1966. Vol. 20.
P. 32 43.
Bernstein AL., Cline T. JJ’. Differential effects of Sex-lethal mu-
tations on dosage compensation early in Drosophila de-
velopment//Genetics. 1994. Vol. 136. P. 1051—1061.
Bhadra U., Pal-Bhadra AL, Birchler J. A. Role of the male spe-
cific lethal (msl) genes in modifying the effects of sex
chromosomal dosage in Drosophila // Genetics. 1999.
Vol. 152. P. 249—268.
Bhadra U.. Pal-Bhadra AL.. Birchler J. A. Histone acetylation
and gene expression analysis of sex lethal mutants in Dro-
sophila // Ibid. 2000. Vol’ 155. P. 753—763.
Bhadra AL. P., Bhadra U, Kimchi J., Birchler J. A. Gene expressi-
on analysis of the function of the male-specific lethal com-
plex in Drosophila '/ Ibid. 2005. Vol. 169. P. 2061—
2074.
Bhadra AL P., HorikoshiN, Pushpavallipvalli S. N., Sarkar A.,
Bagl., Krishnan A., Lucchesi J. C, Kumar R., YangQ., Pan-
ditaR K, Singh AL, BhadraU., EissenbergJ. C.. Pandi-
ta T. K. The role of MOF in the ionizing radiation response
is conserved in Drosophila melanogaster 11 Chromosoma.
2011. Vol. 121. P. 79—90.
Birchler J. A. X chromosome dosage compensation in Droso-
phila // Science. 1996. Vol. 272. P. 1190a.
Birchler J. A., Pal-Bhadra AL., BhadraU. Dosage dependent
gene regulation and the compensation of the X chromo-
some in Drosophila males// Genetica. 2003. Vol. 117.
P. 179—190.
Bone J. R., Kuroda AL. I. Dosage compensation regulatory pro-
teins and the evolution of sex chromosomes in Droso-
phila // Genetics. 1996. Vol. 144. P. 705—713.
Bone J. R., Lavender J., Richman E, Palmer AL. J., Turner B. AL,
Kuroda AL. I. Acetylated histone H4 on the male X chromo-
some is associated with dosage compensation in Droso-
phila 11 Genes Dev. 1994. Vol. 8. P. 96—104.
Buscaino A., Legube G., Akhtar A. X-chromosome targeting and
dosage compensation are mediated bv distinct domains in
MSL-3 11 EMBO Rep. 2006. Vol. 7. P. 531—538.
Cai 1., Jin J., Swanson S. K, Cole AL D., Choi S. H., Flo-
rensL., JJ’ashbum AL P., Conaway J. JJ'., Conaway EC.
Subunit composition and substrate specificity of a MOF-
containing histone acetyltransferase distinct from the
male-specific lethal (MSL) complex // J. Biol. Chem.
2010. Vol. 285. P. 4268 4272.
CamposE. I., EeinbergD. Histones: annotating chromatin//
Annu. Rev. Genet. 2009. Vol. 43. P. 559—599.
ChangK. A., Kuroda AL. 1. Modulation of MSL 1 abundance in fe-
male Drosophila contributes to the sex specificity of dosage
compensation // Genetics. 1998. Vol. 150. P. 699—709.
Charlesworth B., Charlesworth D., Hnilicka J., J и A., Gutt-
man D. S. Lack of degeneration of loci on the neo-Y
chromosome of Drosophila americana americana И Ibid.
1997. Vol. 145. P. 989—1002.
ChiangP. JJ’., KumitD.AL Study' of dosage compensation in
Drosophila//Ibid. 2003. Vol. 165. P. 1167—1181.
ChuC, Qu K, ZhongF.L., ArtandiS.E., Chang H. Y. Geno-
mic maps of long noncoding RNA occupancy reveal prin-
ciples of RNA-chromatin interactions// Mol. Cell. 2011.
Vol. 44. P. 667—678.
Cline T. JJ’., AleyerB. J. Vive la difference: males vs females in
flies vs worms 11 Annu. Rev. Genet. 1996. Vol. 30. P. 637—
702.
Copps K, Eichman E, Lyman L. AL, Chang К A., Eampersad-
Ammons J., Kuroda AL I. Complex formation by the Dro-
sophila MSL proteins: role of the MSL2 RING finger in
protein complex assembly // EMBO J. 1998. Vol. 17.
P. 5409—5417.
Corona D. F, Clapier С. E, Becker P. B., TamkunJ. JJ’. Modu-
lation of ISWI function by' site-specific histone acetyla-
tion // EMBO Rep. 2002. Vol. 3. P. 242—247.
Dahlsveen I. K, Gilfillan G. D., Shelest J'. L, LammE, Bec-
ker P. B. Targeting determinants of dosage compensation
in Drosophila 11 PLoS Genet. 2006. Vol. 2. P. e5.
Demakova O. J'., Kotlikova I. J'., GordadzeP.E, Alekseyen-
ko A. A., Kuroda AL. I., Zhimulev l.F. The MSL complex
levels are critical for its correct targeting to the chromo-
somes in Drosophila melanogaster iI Chromosoma. 2003.
Vol. 112.P. 103—115.
DengX.. A Letter J’. H. roX RNAs are required for increased ex-
pression of X-linked genes in Drosophila melanogaster
males // Genetics. 2006. Vol. 174. P. 1859—1866.
DengX., Hiatt J. B., Nguyen D. K, ErcanS., Sturgill D., Hill-
ier L. JJ’., Schlesinger F, Davis C. A., EeinkeJ’.J., Ginge-
ras T. E, Shendure J., JJ'aterston E H, Oliver B., Lieb J. D.,
DistecheC.AL. Evidence for compensatory upregulation of
expressed X-linked genes in mammals, Caenorhabditis
elegans and Drosophila melanogaster И Nat. Genet. 2011.
Vol. 43. P. 1179—1185.
Dibartolomeis S. AL., TartofK. D., Jackson F. E. A superfamily
of Drosophila satellite related (SR) DNA repeats restricted
to the X chromosome euchromatin // Nucleic Acids Res.
1992. Vol. 20. P. 11 13—11 16.
Fagegaltier D., Baker B. S. X chromosome sites autonomously
recruit the dosage compensation complex in Drosophila
males // PLoS Biol. 2004. Vol. 2. P. e341.
Feller C., Prestel Al., Hartmann H, Straub T., SodingJ.,
Becker P. B. The MOF-containing NSL complex associ-
ates globally with housekeeping genes, but activates only
a defined subset// Nucleic Acids Res. 2011. Vol. 40.
P. 1509—1522.
Fischle JJ’., JJ’ang E, Allis C. D. Binary switches and modifica-
tion cassettes in histone biology' and beyond // Nature.
2003a. Vol. 425. P. 475 479.
Fischle JJ’., JJ’ang Y., Allis C. D. Histone and chromatin cross-
talk // Curr. Opin. Cell. Biol. 2003b. Vol. 15. P. 172—183.
Fischle JJ’., JJ’ang Y., Jacobs S. A., KimY., Allis CD., Khora-
sanizadeh S. Molecular basis for the discrimination of re-
pressive methyl-lysine marks in histone H3 by Polycomb
and HP1 chromodomains // Genes Dev. 2003c. Vol. 17.
P. 1870—1881.
Fischle JJ'., TsengB. S., Dormaim H. L., Ueberheide B. AL,
Garcia B. A., Shabanowitz J., HuntD. E, Funabiki H, Al-
lis C. D. Regulation of HPl-chromatin binding by histone
ГЛАВА 14 381
НЗ methylation and phosphorylation // Nature. 2005.
Vol. 438. P. 1116—1122.
Fitzsimons H. L., Henry R. A., Scott A [.J. Development of an
insulated reporter system to search for cis-acting DNA se-
quences required for dosage compensation in Drosophila 7
Genetica. 1999. Vol. 105. P. 215—226.
Franke A., DernburgA., Bashaw G. J., Baker B. S. Evidence
that MSL-mediated dosage compensation in Drosophila
begins at blastoderm // Development. 1996. Vol. 122.
P. 2751—2760.
Fnknnaga A., Tanaka A., Oishi K. Maleless, a recessive auto-
somal mutant of Drosophila melanogaster that specifically
kills male zygotes// Genetics. 1975. Vol. 81. P. 135—
141.
GallachAL, Arnau I'., A Larin L. Global patterns of sequence
evolution in Drosophila // BMC Genomics. 2007. Vol. 8.
P. 408.
Gallach AL., Arnau E, AldecoaR, A Larin 1. A sequence motif
enriched in regions bound by the Drosophila dosage com-
pensation complex // Ibid. 2010. Vol. 11. P. 169.
Gebauer F, Corona D. F, PreissT., Becker P. B., Hent-
ze M. ГГ. Translational control of dosage compensation in
Drosophila by Sex-lethal: cooperative silencing via the 5'
and 3' UTRs of msl-2 mRNA is independent of the
poly(A) tail // EMBO J. 1999. Vol. 18. P. 6146—6154.
Gebauer I1'., Grskovic AL. HentzeAL. IE Drosophila sex-lethal in-
hibits the stable association of the 40S ribosomal subunit with
msl-2 mRNA //Mol. Cell. 2003. Vol. 11. P. 1397—1404.
Gelato K. A., Fischle IE. Role of histone modifications in defin-
ing chromatin structure and function // Biol. Chem. 2008.
Vol. 389. P. 353—363.
Gelbart AL. E., Kuroda AI. I. Drosophila dosage compensation: a
complex voyage to the X chromosome // Development.
2009. Vol. 136. P. 1399—1410.
Gelbart ALE.. Larschan E.. PengS., ParkP.J., Kuroda AL I.
Drosophila MSL complex globally acetylates H4K16 on
the male X chromosome for dosage compensation." Nat.
Struct. Mol. Biol. 2009. Vol. 16. P. 825—832.
Gergen J. P. Dosage compensation in Drosophila: evidence that
daughterless and Sex-lethal control X chromosome activ-
ity at the blastoderm stage of embryogenesis " Genetics.
1987. Vol. 1 17. P. 477 485.
Ghosh S., Chatterjee R N., BunickD., ALanningJ.E., Lucche-
si J. C. The LSP1—alpha gene of Drosophila melanogas-
ter exhibits dosage compensation when it is relocated to a
different site on the X chromosome // EMBO J. 1989.
Vol. 8. P. 1191—1196.
Gilfillan G. D., Dahlsveen L. K, Becker P. B. Lifting a chromo-
some: dosage compensation in Drosophila melanogaster 7
FEBS Lett. 2004. Vol. 567. P. 8 14.
Gilfillan G. D., Straub T., De Wit E.. GreilF, LammR.. Fan
Steensel В., Becker P. B. Chromosome-wide gene-specific
targeting of the Drosophila dosage compensation com-
plex // Genes Dev. 2006. Vol. 20. P. 858—870.
Gilfillan G. D., KonigC, Dahlsveen L. K, Prakoura N., Stra-
ub T, LammR., Fauth T, BeckerP. B. Cumulative contri-
butions of weak DNA determinants to targeting the Dro-
sophila dosage compensation complex // Nucleic Acids
Res. 2007. Vol. 35. P. 3561 3572.
Gorchakov A. A., Alekseyenko A. A., KharchenkoP.. ParkP.J..
Kuroda AL. L. Long-range spreading of dosage compensation
in Drosophila captures transcribed autosomal genes inserted
on X // Genes Dev. 2009. Vol. 23. P. 2266—2271.
Gorman AL, Franke A., Baker B. S. Molecular characterization
of the male-specific lethal-3 gene and investigations of the
regulation of dosage compensation in Drosophila " De-
velopment. 1995. Vol. 121. P. 463 475.
Gorman AL, Kuroda ALL., Baker B. S. Regulation of the sex-
specific binding of the maleless dosage compensation pro-
tein to the male X chromosome in Drosophila // Cell.
1993. Vol. 72. P. 39 49.
GrimaudC, Becker P.B. The dosage compensation complex
shapes the conformation of the X chromosome in Droso-
phila 11 Genes Dev. 2009. Vol. 23. P. 2490—2495.
Gu W, SzauterP., Lucchesi J. C. Targeting of MOF, a putative
histone acetyl transferase, to the X chromosome of Droso-
phila melanogaster // Dev. Genet. 1998. Vol. 22. P. 56—
64.
Gu W, WeiX, PannutiA., Lucchesi J. C. Targeting the chro-
matin-remodeling MSL complex of Drosophila to its sites
of action on the X chromosome requires both acetyl trans-
ferase and ATPase activities // EMBO J. 2000. Vol. 19.
P. 5202—5211.
Gupta A., Sharma G. G., Young C. S., Agarwal AL, Smith E. R,
Pauli T. T, Lucchesi J. C, Khanna К. K, LudwigT., Pan-
dita T. K. Involvement of human MOF in ATM function //
Mol. Cell. Biol. 2005. Vol. 25. P. 5292—5305.
Gupta Г., Parisi AL, Sturgill D., Nuttall R, DoctoleroAL., Dud-
ko O.K, ALalleyJ.D., Eastman P. S., OliverB. Global
analysis of X-chromosome dosage compensation // J. Biol.
2006. Vol. 5. P. 3.
Hamada F. N., ParkP. J., Gordadze P. R., Kuroda AL. L. Global
regulation of X chromosomal genes by the MSL complex
in Drosophila melanogaster 11 Genes Dev. 2005. Vol. 19.
P. 2289—2294.
Henry R. A., TewsB., LiX., Scott AL J. Recruitment of the
male-specific lethal (MSL) dosage compensation complex
to an autosomally integrated roX chromatin entry site cor-
relates with an increased expression of an adjacent re-
porter gene in male Drosophila// J. Biol. Chem. 2001.
Vol. 276. P. 31953—31958.
Hilfiker A., Hilfiker-Kleiner D., Pannuti A., Lucchesi J. C. mof,
a putative acetyl transferase gene related to the Tip60 and
MOZ human genes and to the SAS genes of yeast, is re-
quired for dosage compensation in Drosophila // EMBO J.
1997. Vol. 16. P. 2054—2060.
Hofmann A., Korge G. Upstream sequences of dosage-compen-
sated and non-compensated alleles of the larval secretion
protein gene Sgs-4 in Drosophila // Chromosoma. 1987.
Vol. 96. P. 1—7.
JablonkaE., Lamb AL. J. The evolution of heteromorphic sex
chromosomes // Biol. Rev. Philos. Soc. 1990. Vol. 65.
P. 249—276.
Jin 1., Wang}’., Walker D. L., DongH, Conley C, Johansen J.,
Johansen K. AL. JIL-1: a novel chromosomal tandem
kinase implicated in transcriptional regulation in Droso-
phila // Mol. Cell. 1999. Vol. 4. P. 129—135.
JinY., WangY’., Johansen J., Johansen K. AL. Jil-1, a chromo-
some kinase implicated in regulation of chromatin structure,
associates with the mall specific Ictal (MSL) dosage com-
pensation complex // J. Cell. Biol. 2000. Vol. 49, N 5.
P. 1005—1010.
Johansen K. AL., Johansen J. Regulation of chromatin structure
by histone H3S10 phosphorylation// Chromosome Res.
2006. Vol. 14. P. 393 404.
Kageyama Y., ALengusG., Gilfillan G., Kennedy H. G., Stuck-
enholzC, Kelley R. L., Becker P.B., Kuroda AL I. Asso-
ciation and spreading of the Drosophila dosage compensa-
tion complex from a discrete roXl chromatin entry site //
EMBO J. 2001. Vol. 20. P. 2236—2245.
Kaiser K, FuriaAL, Glover D. AL. Dosage compensation at the
sgs4 locus of Drosophila melanogaster 11 J. Mol. Biol.
1986. Vol. 187. P. 529—536.
Kaiser Г. B., Zhou Q., BachtrogD. Nonrandom gene loss from
the Drosophila miranda Neo-Y Chromosome // Genome
Biol. EVol. 2011. Vol. 3. P. 1329—1337.
Kelley R. L, Kuroda AL. L. Equality for X chromosomes// Sci-
ence. 1995. Vol. 270. P. 1607—1610.
382 ЭПИГЕНЕТИКА
Kelley R. L, Solovyeva!., LymanL. AL, Richman R.. Solo-
vyev J'., Kuroda AL I. Expression of msl-2 causes assem-
bly of dosage compensation regulators on the X chromo-
somes and female lethality in Drosophila // Cell. 1995a.
Vol. 81. P. 867—877.
KelleyR. L., JJ’angJ., BellL., Kuroda M. I. Sex lethal controls
dosage compensation in Drosophila by a non-splicing
mechanism //Nature. 1997. Vol. 387. P. 195—199.
Kelley R L., ALellerJ'.H., GordadzeP.R, Roman G., Da-
vis R. L, Kuroda AL. L. Epigenetic spreading of the Droso-
phila dosage compensation complex from roX RNA genes
into flanking chromatin// Cell. 1999. Vol. 98. P. 513—
522.
Kelley R. L, Lee О. K, Shim Y. K. Transcription rate of noncod-
ing roXl RNA controls local spreading of the Drosophila
MSL chromatin remodeling complex // Meeh. Dev. 2008.
Vol. 125. P. 1009—1019.
Kernan AL. J., Kuroda AL. L., KreberR, Baker B. S., Ganetzky B.
napts, a mutation affecting sodium channel activity in
Drosophila, is an allele of mle, a regulator of X chromo-
some transcription 11 Cell. 1991. Vol. 66. P. 949—959.
Kind J., Akhtar A. Cotranscriptional recruitment of the dosage
compensation complex to X-linked target genes // Genes
Dev. 2007. Vol. 21. P. 2030—2040.
Kind J., J’aquerizasJ. AL., Gebhardt P., GentzelAL, Luscom-
be N. AL., BertoneP.. Akhtar A. Genome-wide analysis re-
veals MOF as a key regulator of dosage compensation and
gene expression in Drosophila // Cell. 2008. Vol. 133.
P. 813—828.
KooninE. J’., ZhouS., Lucchesi J. C. The chromo superfamily:
new members, duplication of the chromo domain and pos-
sible role in delivering transcription regulators to chroma-
tin // Nucleic Acids Res. 1995. Vol. 23. P. 4229 4233.
Kotlikova L. J’., Demakova O. J'., Semeshin J . F., Shloma J’. J’.,
Boldyreva L. J’.. Kuroda AL. I.. Zhimulev L. F. The Droso-
phila dosage compensation complex binds to polytene
chromosomes independently of developmental changes in
transcription // Genetics. 2006. Vol. 172. P. 963—974.
Kuroda AL. L., Kernan AL. J., KreberR, Ganetzky B., Baker B. S.
The maleless protein associates with the X chromosome to
regulate dosage compensation in Drosophila // Cell. 1991.
Vol. 66. P. 935—947.
LakhotiaS. C, ALukherjee A. S. Chromosomal basis of dosage
compensation in Drosophila. I. Cellular autonomy of hy-
peractivity of the male X-chromosome in salivary' glands
and sex differentiation// Genet. Res. 1969. Vol. 14.
P. 137—150.
LarschanE., Alekseyenko A. A., Gortchakov .1. A., Peng S.,
Li B., YangP., Workman J. L., ParkP.J., Kuroda AL. L.
MSL complex is attracted to genes marked by' H3K36 tri-
methylation using a sequence-independent mechanism '/
Mol. Cell. 2007. Vol. 28, N 1. P. 121—133.
Larschan E., Bishop E. P., Kharchenko P. J '., CoreL. J., Lis J. T,
ParkP.J., Kuroda AL. L. X chromosome dosage compen-
sation via enhanced transcriptional elongation in Droso-
phila // Nature. 2011. Vol. 471. P. 115—118.
Larsson J., Chen J. D., RashevaJ’., Rasmuson-Lestander A.,
Pirrotta J’. Painting of fourth, a chromosome-specific pro-
tein in Drosophila// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001.
Vol. 98. P. 6273—6278.
Lavender J. S., BirleyA.J., Palmer AL. J., Kuroda AL. L., Tur-
ner B. AL. Histone H4 acetylated at lysine 16 and proteins
of the Drosophila dosage compensation pathway co-
localize on the male X chromosome through mitosis //
Chromosome Res. 1994. Vol. 2. P. 398—404.
Laverty C, LiF, BelikoffE.J., Scott AL. J. Abnormal dosage
compensation of reporter genes driven by' the Drosophila
glass multiple reporter (GMR) enhancer-promoter // PLoS
One. 2011. Vol. 6. P. c20455.
Legube G.. ALcweeney S. K. LercherAL. J.. Akhtar A. X-chro-
mosome-wide profiling of MSL-1 distribution and dosage
compensation in Drosophila " Genes Dev. 2006. Vol. 20.
P. 871—883.
Lerach S., Zhang JJ'., Deng EL, BaoX, Girton J, Johansen J.,
Johansen K. AL. JIL-l kinase, a member of the male-
specific lethal (MSL) complex, is necessary' for proper
dosage compensation of eye pigmentation in Drosophila //
Genesis. 2005. Vol. 43. P. 213—215.
Lerach S., Zhang JJ’., BaoX, Deng FL, Girton J., Johansen J.,
Johansen K. AL. Loss-of-function alleles of the JIL-l ki-
nase are strong suppressors of position effect variegation
of the wm4 allele in Drosophila // Genetics. 2006.
Vol. 173. P. 2403—2406.
LiF., Parry D. A., Scott AL. J. The amino-terminal region of
Drosophila MSL1 contains basic, glycine-rich, and leucine
zipper-like motifs that promote X chromosome binding,
self-association, and MSL2 binding, respectively // Mol.
Cell. Biol. 2005. Vol. 25. P. 8913—8924.
Li F, Schiemann .4. H., Scott AL. J. Incorporation of the noncod-
ing roX RNAs alters the chromatin-binding specificity of
the Drosophila MSL1/MSL2 complex// Ibid. 2008.
Vol. 28. P. 1252—1264.
LiX., CorsaC. A., PanP.JJ'., JJ’uL, Ferguson D., Yu X.,
ALinJ., Don Y. MOF and H4 K16 acetylation play' impor-
tant roles in DNA damage repair by modulating recruit-
ment of DNA damage repair protein Mdcl // Ibid. 2010.
Vol. 30. P. 5335—5347.
LottS. E., J’illalta J. E., SchrothG.P., LuoS., Tonkin L. A.,
Eisen AL. B. Noncanonical compensation of zygotic X
transcription in early' Drosophila melanogaster develop-
ment revealed through single-embryo RNA-seq // PLoS
Biol. 2011. Vol. 9. P. 61000590.
Lucchesi J. C. Dosage compensation in Drosophila and the
"complex' world of transcriptional regulation /' Bioessays.
1996. Vol. 18. P. 541—547.
LuccesiJ. C, Skripsky T, TaxF. E. A new male-specific lethal
mutation in Drosophila melanogaster!! Genetics. 1982.
Vol. 100. P. S42.
Lucchesi J. C, A Lanning J. E. Gene dosage compensation in
Drosophila melanogaster 11 Adv. Genet. 1987. Vol. 24.
P. 371 429.
Lyman L. AL, Copps K, Rastelli L., Kelley R L., Kuroda ALL.
Drosophila male-specific lethal-2 protein: structure/func-
tion analysis and dependence on MSL-1 for chromosome
association // Genetics. 1997. Vol. 147. P. 1743—1753.
ALacknight R. H. The Sex-determining mechanism of Droso-
phila miranda " Genetics. 1939. Vol. 24. P. 180—
201.
ALankJ.E., Hosken D. J., JJ’edellN. Some inconvenient truths
about sex chromosome dosage compensation and the po-
tential role of sexual conflict// Evolution. 2011. Vol. 65.
P. 2133—2144.
ALarinL. Evolution of chromatin-remodeling complexes: com-
parative genomics reveals the ancient origin of «novel»
compensasome genes // J. Mol. Evol. Vol. 2003. Vol. 56.
P. 527—539.
ALarinL., Franke A., Bashaw G. J., Baker B. S. The dosage
compensation system of Drosophila is co-opted by' newly
evolved X chromosomes // Nature. 1996. Vol. 383.
P. 160—163.
ALcdowell K. A., HilfikerA., Lucchesi J. C. Dosage compensa-
tion in Drosophila: the X chromosome binding of MSL-1
and MSL-2 in female embryos is prevented by the early'
expression of the Sxl gene // Meeh. Dev. 1996. Vol. 57.
P. 113—119.
ALcquilton P., St. Pierre S. E., Thurmond J. FtyBase 101 —the
basics of navigating FlyBase // Nucleic Acids Res. 2012.
Vol. 40. P. D706—D714.
ГЛАВА 14 383
ALeiklejohn С. D.. Landeen E. L. Cook J. AL, Kingan S. B..
Presgraves D. C. Sex chromosome-specific regulation in
the Drosophila male germline but little evidence for chro-
mosomal dosage compensation or meiotic inactivation П
PLoS Biol. 2011. Vol. 9. P. C1001126.
Meller Г. H. Dosage compensation: making IX equal 2X //
Trends Cell Biol. 2000. Vol. 10. P. 54- -59.
A Letter V. H. Rattner B.P. The roX genes encode redundant
male-specific lethal transcripts required for targeting of the
MSL complex // EMBO J. 2002. Vol. 21. P. 1084—1091.
ALeller V. H, Пи К. H, Roman G., Kuroda AL. I., Davis R L.
roXl RNA paints the X chromosome of male Drosophila
and is regulated bv the dosage compensation system H
Cell. 1997. Vol. 88.’P. 445 457.
ALendjan S., Taipale AL, Kind J., Holz H., Gebhardt P., Schel-
derAL., Vermeulen AL, BuscainoA., Duncan K, ALuel-
lerJ.. JVilmAL. StunnenbergH. G.. Saunrweber H. Ak-
htar A. Nuclear pore components are involved in the tran-
scriptional regulation of dosage compensation in Droso-
phila // Mol. Cell. 2006. Vol. 21. P. 811—823.
ALorales!'., StraubT., Neumann AL. F, ALengusG., Akhtar A.,
Becker P. B. Functional integration of the histone acetyl-
transferase MOF into the dosage compensation complex '/
EMBO J. 2004. Vol. 23. P. 2258—2268.
ALorales]'., RegnardC., LzzoA., Vetter I., Becker P. B. The
MRG domain mediates the functional integration of MSL3
into the dosage compensation complex // Mol. Cell. Biol.
2005. Vol. 25. P. 5947—5954.
ALorraR, Smith E. R, YokoyamaR, Lucchesi J. C. The MLE
subunit of the Drosophila MSL complex uses its ATPase ac-
tivity for dosage compensation and its helicase activity for
targeting H Mol. Cell. Biol. 2008. Vol. 28. P. 958—966’
ALorraR, Yokoyama R., LingH., Lucchesi J. C. Role of the
ATPase'heliease maleless (MLE) in the assembly, target-
ing, spreading and function of the male-specific lethal
(MSL) complex of Drosophila H Epigenetics Chromatin.
2011. Vol. 4. P. 6.
ALujtabaS., ZengL., ZhcruAL.AL. Structure and acetyl-lysine
recognition of the bromodomain H Oncogene. 2007.
Vol. 26. P. 5521—5527.
Norman R. A., Doane]]’. JV Dosage compensation and dietary
glucose repression of larval amylase activity' in Drosophila
miranda /Z Biochem. Genet. 1990. Vol. 28. P. 601—613.
OhH., ParkY.. Kuroda AL. L. Local spreading of MSL com-
plexes from roX genes on the Drosophila X chromo-
some 11 Genes Dev. 2003. Vol. 17. P. 1334—1339.
OhH., Bone J. R, Kuroda AL. L. Multiple classes of MSL bind-
ing sites target dosage compensation to the X chromosome
of Drosophila // Curr. Biol. 2004. Vol. 14. P. 481 487.
Palmer AL. J., Richman R, Richter L., Kuroda AL. L. Sex-specific
regulation of the male-specific lethal-1 dosage compensa-
tion gene in Drosophila H Genes Dev. 1994. Vol. 8.
P. 698—706.
Pardue AL. L., Lowenhaupt K, Rich A., Nordheim A. (dC-
dA)n.(dG-dT)n sequences have evolutionarily conserved
chromosomal locations in Drosophila with implications
for roles in chromosome structure and function " EMBO
J. 1987. Vol. 6. P. 1781—1789.
Park E, Kelley R. L, OhH., Kuroda AL. L., ALeller V. H. Extent of
chromatin spreading determined bv roX RNA recruitment
of MSL proteins // Science. 2002. Vol. 298. P. 1620—1623.
ParkY., Kuroda AL. L. Epigenetic aspects of X-ehromosome dos-
age compensation// Science. 2001. Vol. 293. P. 1083—
1085.
ParkS. TV, KangY., SypulaJ. G., Choi J., OhH., ParkY. An
evolutionarily conserved domain of roX2 RNA is suffi-
cient for induction of H4—Lysl6 acetylation on the Dro-
sophila X chromosome // Genetics. 2007. Vol. 177.
P. 1429—1437.
ParkS. ]]’., Kuroda AL. I.. ParkY Regulation of histone H4
Lysl6 acetylation by predicted alternative secondary
structures in roX noncoding RNAs H Mol. Cell. Biol.
2008. Vol. 28. P. 4952 4962.
ParkS. JJ’., OhH., Lin E R, ParkY. MSL eis-spreading from
roX gene up-regulates the neighboring genes 7 Biochem.
Biophys. Res. Commun. 2010. Vol. 399. P. 227- -231.
Prestel AL.. Feller C. Straub T, ALitlohner H. Becker P. B. The
activation potential of MOF is constrained for dosage
compensation // Mol. Cell. 2010. Vol. 38. P. 815—826.
Rastelli L., Kuroda AL. L. An analysis of maleless and histone
H4 acetylation in Drosophila melanogaster spermatogene-
sis 11 Meeh. Dev. 1998. Vol. 71. P. 107—117.
Rastelli L., Richman R, Kuroda AL. L. The dosage compensation
regulators MLE, MSL-1 and MSL-2 are interdependent
since early embryogenesis in Drosophila H Ibid. 1995.
Vol. 53. P’ 223—233.
ReaS., EisenhaberE, O'CarrollD., StrahlB.D., Sun Z. TT’.,
SchmidAL, Opravil S., A Lechtier K, PontingC.P., Al-
lis C. D., Jenuwein T. Regulation of chromatin structure by
site-specific histone H3 methyltransferases " Nature. 2000.
Vol. 406. P. 593—599.
Rea S, Nouri G, Akhtar .4. Males absent on the first (MOF): from
flies to humans // Oncogene. 2007. Vol. 26. P. 5385—5394.
ReenanRA., Hanrahan C. J., GanetzkyB. The mle(napts)
RNA helicase mutation in drosophila results in a splicing
catastrophe of the para Na+ channel transcript in a region
of RNA editing 11 Neuron. 2000. Vol. 25. P. 139—149.
RegnardC., StraubT., ALitterwegerA., DahlsveenL. K, Fa-
bian J'., Becker P. B. Global analysis of the relationship
between JIL-1 kinase and transcription // PLoS Genet.
2011. Vol. 7. P. 61001327.
Richter L, Bone J. R., Kuroda AL. L. RNA-dependent associa-
tion of the Drosophila maleless protein with the male X
chromosome 11 Genes Cells. 1996. Vol. 1. P. 325—336.
Roberts D. B., Evans-Roberts S. The X-linked a-ehain gene of
Drosophila LSP-1 does not show dosage compensation //
Nature. 1979. Vol. 280. P. 691—692.
Robinson P. J., An JJ’., Routh A., ALartinoF, Chapman L.,
Roeder R. G., Rhodes D. 30 nm chromatin fibre decom-
paction requires both H4—KI6 acetylation and linker his-
tone eviction // J. Mol. Biol. 2008. Vol. 381. P. 816—825.
Rodman T. C. Relationship of developmental stage to initiation
of replication in polytene nuclei /7 Chromosoma. 1968.
Vol. 23. P. 271—287.’
Ruiz AL. F, Esteban AL. R, DonoroC, Godoy C, Sanchez L.
Evolution of dosage compensation in Diptera: the gene
maleless implements dosage compensation in Drosophila
(Braehyeera suborder) but its homolog in Seiara (Nemato-
eera suborder) appears to play no role in dosage compen-
sation 7 Genetics. 2000. Vol. 156. P. 1853—1865.
Russo C. A., Takezaki N, NeiAL. Molecular phylogeny and di-
vergence times of drosophilid species H Mol. Biol.
Evol. 1995. Vol. 12. P. 391 404.
Sanjuan R., ALarinL. Tracing the origin of the eompensasome:
evolutionary history of DEAH helicase and MYST acetyl-
transferase gene families// Ibid. 2001. Vol. 18. P. 330—
343.
SassG. L., PamnitiA., Lucchesi J. C. Male-specific lethal com-
plex of Drosophila targets activated regions of the X
chromosome for chromatin remodeling И Proc. Natl.
Acad. Sci. USA. 2003. Vol. 100. P. 8287—8291.
Schohrik S. B., ALorgan B. A., Hirsh J. The cloned dopa decar-
boxylase gene is developmentally regulated when reinte-
grated into the Drosophila genome // Cell. 1983. Vol. 34.
P. 37 45.
Schutt C, Nothiger R. Structure, function and evolution of sex-
determining systems in Dipteran insects H Development.
2000. Vol. 127. P. 667—677.
384 ЭПИГЕНЕТИКА
Schwaiger AL, Stadler AL В., Bell О., Kohler H„ Oakeley E. J.,
Schubeler D. Chromatin state marks cell-type- and gender-
specific replication of the Drosophila genome // Genes
Dev. 2009. Vol. 23. P. 589—601.
Scott AL. J., Pan L. L., Cleland S.B., Knox A. L., Heinrich J.
MSL1 plays a central role in assembly of the MSL com-
plex, essential for dosage compensation in Drosophila '/
EMBO J. 2000. Vol. 19. P. 144—155.
Sharma G. G., SoS., Gupta A., Kumar R, Cayrou C., .Ivvu-
kumovN., BhadraU., PanditaRK., PorteusAL.H.,
Chen D. J, Cote J., PanditaT. K. MOF and histone H4
acetylation at lysine 16 are critical for DNA damage re-
sponse and double-strand break repair// Mol. Cell. Biol.
2010. Vol. 30. P. 3582—3595.
Shearman D. C. The evolution of sex determination systems in
dipteran insects other than Drosophila /7 Genetica. 2002.
Vol. 116. P. 25 43.
Shogren-Knaak AL, Ishii H, Sun J. AL, Pazin AL. J., Davie J. R,
Peterson C. L. Histone H4—K16 acetylation controls
chromatin structure and protein interactions // Science.
2006. Vol. 311. P. 844—847.
Simon AL. D.. jrangC.L. KharchenkoP. V.. JJ’estJA., Chap-
man B. A., Alekseyenko A. A., Borowsky AL. L., Kuro-
da AL. L., Kingston R. E. The genomic binding sites of a
noncoding RNA " Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2011.
Vol. 108. P. 20497—20502.
Shvu .1. B. UNRaveling the regulation of dosage compensa-
tion // Nat. Struct. Mol. Biol. 2006. Vol. 13. P. 189—190.
Smith E.R., PannutiA., Gu ГГ., SteurnagelA., CookR G.,
Allis C. D., Lucchesi J. C. The drosophila MSL complex
acetylates histone H4 at lysine 16, a chromatin modifica-
tion linked to dosage compensation // Mol. Cell. Biol.
2000. Vol. 20. P. 312—318.
Smith E. R, Cayrou C. HuangR. Lane JJ’. S., Cote J.. Lucche-
si J. C. A human protein complex homologous to the Dro-
sophila MSL complex is responsible for the majority of
histone H4 acetylation at lysine 16 // Ibid. 2005. Vol. 25.
P. 9175—9188.’
Spradling .1. C, Rubin G. AL. The effect of chromosomal posi-
tion on the expression of the Drosophila xanthine dehy-
drogenase gene // Cell. 1983. Vol. 34. P. 47—57.
SteinemannAL, Steinemaim S., Turner B. AL. Evolution of dosage
compensation// Chromosome Res. 1996. Vol.4. P. 185—
190.
StenbergP., Larsson J. Buffering and the evolution of chromo-
some-wide gene regulation// Chromosoma. 2011. Vol. 120.
P. 213—225.
StenbergP., Pettersson F., Saura A. O., Berglund A., Larsson J.
Sequence signature analysis of chromosome identity in
three Drosophila species // BMC Bioinformatics. 2005.
Vol. 6.P. 158.
StenbergP., Lundberg L. E., Johansson A. AL, Ry den P., Svens-
son AL. J., Larsson J. Buffering of segmental and chromo-
somal aneuploidies in Drosophila melanogaster 11 PLoS
Genet. 2009. Vol. 5. P. C1000465.
Straub T, Becker P.B. Dosage compensation, the beginning
and end of generalisation // Nat. Rev. Genet. 2007. Vol. 8,
NLP. 47—57.
Straub T, Neumann AL. F., Prestel AL, Kremmer E., Kaether C,
Haass C, Becker P. B. Stable chromosomal association of
MSL2 defines a dosage-compensated nuclear compart-
ment 11 Chromosoma. 2005a. Vol. 114. P. 352—364.
Straub T, Gilfillan G. D., ALaier J’. K, Becker P. B. The Droso-
phila MSL complex activates the transcription of target
genes // Genes Dev. 2005b. Vol. 19. P. 2284—2288.
Straub T., GrimaudC, Gilfillan G. D., ALitterweger A., Bec-
ker P. B. The chromosomal high-affinity binding sites for
the Drosophila dosage compensation complex // PLoS
Genet. 2008. Vol. 4. P. 61000302.
Strukov Y. G., Sural Т.Н., Kuroda AL. L., SedatJ. JJ’. Evidence
of activity-specific, radial organization of mitotic chromo-
somes in Drosophila ." PLoS Biol. 2011. Vol. 9.
P. 61000574.
Stuckenholz C, ALeller J’. H, Kuroda ALL. Functional redun-
dancy within roXl, a noncoding RNA involved in dosage
compensation in Drosophila melanogaster 11 Genetics.
2003. Vol. 164. P. 1003 1014.
Sturgill D., ZhangY., Parisi AL., Oliver B. Demasculinization of
X chromosomes in the Drosophila genus // Nature. 2007.
Vol. 450. P. 238 241.
Sun X., Birchler J. .1. Studies on the short range spreading of the
male specific lethal (MSL) complex on the X chromosome
in Drosophila // Cytogenet. Genome. Res. 2009. Vol. 124.
P. 158—169.
Sural Т.Н., PengS., Li B., Workman J. L., ParkP.J., Ku-
roda AL. L. The MSL3 chromodomain directs a key target-
ing step for dosage compensation of the Drosophila
melanogaster X chromosome // Nat. Struct. Mol. Biol.
2008. Vol. 15. P. 1318—1325.
SykesS.AL, ALellert H. S., Holbert ALA., Li K. ALarmors-
tein R., Lane JJ’. S, ALcmahon S. B. Acetylation of the p53
DNA-binding domain regulates apoptosis induction //
Mol. Cell. 2006. Vol. 24. P. 841—851.
Taipale AL, ReaS., Richter K, J’ilarA., LichterP., LmhofA.,
Akhtar A. hMOF histone acetyltransferase is required for
histone H4 lysine 16 acetylation in mammalian cells //
Mol. Cell. Biol. 2005. Vol. 25. P. 6798—6810.
Tamura K, Subramanian S., Kumar S. Temporal patterns of
fruit fly (Drosophila) evolution revealed by mutation
clocks /7 Mol. Biol. EVol. 2004. Vol. 21. P. 36--44.
Turner B. AL., BirleyA. J., Lavender J. Histone H4 isoforms ac-
etylated at specific lysine residues define individual chro-
mosomes and chromatin domains in Drosophila polytene
nuclei // Cell. 1992. Vol. 69. P. 375—384.
JJeira С. P.. CoelhoP. A.. J’ieiraJ. Inferences on the evolu-
tionary history of the Drosophila americana polymorphic
X/4 fusion from patterns of polymorphism at the X-linked
paralytic and elav genes // Genetics. 2003. Vol. 164.
P. 1459—1469.
JJ’angY., Zhang JJ'., JinY., Johansen J., Johansen K. AL. The
JIL-1 tandem kinase mediates histone H3 phosphorylation
and is required for maintenance of chromatin structure in
Drosophila 11 Cell. 2001. Vol. 105. P. 433 443.
JJ’eake J’. AL, Scott AL. J. The non-dosage compensated
Lspl alpha gene of Drosophila melanogaster escapes ace-
tylation by MOF in larval fat body nuclei, but is flanked
by two dosage compensated genes // BMC Mol. Biol.
2007. Vol. 8. P. 35.
JJ’uL., Zee B. AL, JJ’ang Y., Garcia B. A., Doti Y. The RING
finger protein MSL2 in the MOF complex is an E3 ubiq-
uitin ligase for H2B K34 and is involved in crosstalk with
НЗ K4 and K79 methylation// Mol. Cell. 2011. Vol. 43.
P. 132—144.
Zhai B., J’illenJ., Beausoleil S. A., ALintserisJ., Gygi S. P.
Phosphoproteome analysis of Drosophila melanogaster
embryos // J. Proteome Res. 2008. Vol. 7. P. 1675—1682.
Zhang JJ'., DengH, BaoX, Lerach S., Girton J., Johansen J., Jo-
hansen K. AL. The JIL-1 histone H3S10 kinase regulates di-
methyl H3K9 modifications and heterochromatic spreading
in Drosophila 11 Development. 2006. Vol. 133. P. 229—235.
ZhimulevL. F, Semeshin J . F., Kulichkov J . A., Belyaeva E. S.
Intercalary heterochromatin in Drosophila. I. Localization
and general characteristics // Chromosoma. 1982. Vol. 87.
P. 197—228.
ZhouS., YangY., Scott AL. J., Pannuti A., Fehr КС., Eisen A.,
KooninE.J’., FontsD. L., WrightsmanR., ALanningJ.E.
et al. Male-specific lethal 2, a dosage compensation gene of
Drosophila, undergoes sex-specific regulation and encodes a
protein with a RING finger and a metallothionein-like cys-
teine cluster // EMBO J. 1995. Vol. 14. P. 2884—2895.
ГЛАВА
15
РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ
Х-ХРОМОСОМЫ У МЛЕКОПИТАЮЩИХ
СОДЕРЖАНИЕ
15.1. Коэволюция половых хромосом и
процесса дозовой компенсации у
млекопитающих, 386
15.2. Дозовая компенсация генов Х-хро-
мосомы в онтогенезе млекопитаю-
щих, 387
15.3. Варианты экспрессии генов Х-хро-
мосомы в соматических тканях
млекопитающих, 390
15.4. Экспрессия генов Х-хромосомы в
экстраэмбриональных тканях мле-
копитающих, 393
15.5. Механизмы регуляции экспрессии
генов Х-хромосомы млекопитаю-
щих, 394
Список литературы, 399
386 ЭПИГЕНЕТИКА
15.1. Коэволюция ПОЛОВЫХ ХРОМОСОМ
И ПРОЦЕССА ДОЗОВОЙ КОМПЕНСАЦИИ
У МЛЕКОПИТАЮЩИХ
У большинства млекопитающих наблюдается
корреляция между’ половой принадлежностью и
набором половых хромосом. Сочетание XX ха-
рактерно для самок, a XY — для самцов. X- и Y-
хромосомы значительно отличаются друг от дру-
га по размеру, морфологии и генетическому’ со-
держанию. Х-хромосома современных плацен-
тарных млекопитающих составляет 5 % гапло-
идного набора |Ohno. 1967] и содержит около
тысячи генов [Ross et al., 2005]. Y-хромосома со-
стоит в основном из формирующих гетерохро-
матин видоспецифических повторяющихся по-
следовательностей ДНК и содержит не более 100
белок-кодирующих генов [Skaletsky etal., 2003].
Один из них, ген Sry, является ключевым в де-
терминации мужского пола [Koopman et al.,
1991]. Основная масса генов Y-хромосомы экс-
прессируется в сперматогенезе и неактивна в
соматических клетках.
Согласно принятой на сегодня модели эво-
люции половых хромосом, дивергенция X- и Y-
хромосом, которые изначально были парой го-
мологичных аутосом [Ohno, 1967], началась с
возникновения генетической системы определе-
ния пола и подавления рекомбинации между’ X-
и Y-хромосомами в соответствующих локусах
(рис. 15.1,б/). Возможно, что на будущей Y-xpo-
мосоме таким локусом был ген Sry, хотя не ис-
ключено более позднее его появление, после то-
го как первоначальные детерминирующие пол
гены были утрачены. Далее на Y-хромосоме во-
круг детерминирующего пол локуса стали нака-
пливаться гены, дающие преимущество самцам,
но при этом снижающие жизнеспособность са-
мок. Необходимость тесного сцепления таких
генов с Y-хромосомой приводила к подавлению
рекомбинации между X- и Y-хромосомами в но-
вых локусах и постепенному’ расширению нере-
комбинирующего района. Подавление рекомби-
нации способствовало накоплению мутаций и
делеций в не связанных с формированием муж-
ских признаков генах Y-хромосомы, что стало
причиной их последующей деградации |Charles-
yvorth, 1991, 1996]. В результате многие гены
Х-хромосомы у самцов оказались представлен-
ными в одной копии, и уровень их экспрессии
снизился в два раза по сравнению с экспрессией
генов на аутосомах и двух Х-хромосомах у са-
мок. Было высказано предположение о том, что
для восстановления исходного уровня транс-
крипции генов у самцов отбор благоприятство-
вал сохранению аллелей генов Х-хромосомы с
повышенным уровнем экспрессии [Ohno, 1967].
Удвоение уровня экспрессии генов на единст-
венной Х-хромосоме самцов было достаточно
давно известно и хорошо изучено у D. melanoga-
ster [Akhtar, 2003], однако существование такого
способа дозовой компенсации у млекопитающих
долгое время не удавалось доказать. Косвенное
подтверждение было получено при исследова-
нии транскрипционной активности гена С1сп4
двух видов мышей. У Mus spretus ген С1сп4 на-
ходится на Х-хромосоме и имеет в два раза бо-
лее высокий уровень экспрессии, чем у Mus mus-
culus с аутосомной локализацией данного гена
[Adler etal., 1997]. Окончательно гипотеза об
удвоении уровня экспрессии генов Х-хромосомы
у самцов млекопитающих подтвердилась срав-
нительно недавно. Средний уровень экспрессии
генов Х-хромосомы и аутосом был измерен сна-
чала методом microarray [Gupta et al., 2006; Ngu-
yen. Disteche, 2006; Johnston et al.. 2008], а затем
более чувствительным методом секвенирования
РНК [Deng etal., 2011; Yildirim etal., 2011].
В обоих случаях было убедительно показано,
что у самцов млекопитающих гены единствен-
ной Х-хромосомы экспрессируются на том же
уровне, что и аутосомные гены, представленные
двумя копиями. Возрастание уровня экспрессии
генов на Х-хромосоме могло привести к избытку
их продуктов у самок, поэтому параллельно с
удвоением уровня экспрессии генов Х-хромосо-
мы у самок эволюционировал дополнительный
механизм дозовой компенсации (см. рис. 15.1, а),
который был направлен на подавление транс-
крипции (инактивацию) генов на одной из двух
Х-хромосом [Lin et al., 2007].
Дозовая компенсация возникла у предка пла-
центарных млекопитающих. Х-хромосома кото-
рого содержала меньше генов, чем выявляется у
современных видов. Транслокации аутосомного
материала на предковую Х-хромосому, которые
наблюдаются у плацентарных, должны были
происходить таким образом, чтобы не наруша-
лась дозовая компенсация. В противном случае
такие перестройки элиминировались бы отбо-
ром. Предполагают, что дозовая компенсация не
нарушалась, когда аутосомный материал добав-
лялся в псевдоаутосомный район (ПАР) Х-хро-
мосомы (рис. 15.1,6), а затем в результате ре-
комбинации переносился в ПАР Y-хромосомы
[Graves, 1995]. ПАР — участок, сохраняющий
гомологию на X- и Y-хромосомах и необходи-
мый для их правильной конъюгации в мейозе у
ГЛАВА 15 387
самцов [Mohandas etal., 1992]. На начальных
этапах аутосомные гены, добавленные в ПАР X-
и Y-хромосом, не требовали дозовой компенса-
ции. Однако по мере расширения нерекомбини-
рующей области гены ПАР на Y-хромосоме под-
вергались специализации или деградации, а их
гомологи на Х-хромосоме вовлекались в процесс
дозовой компенсации [Jegalian, Page, 1998].
По степени дивергенции последовательно-
стей X- и Y-гомологов были выделены группы
генов, которые получили название «эволюцион-
ные страты» и последовательно располагались
на Х-хромосоме человека [Lahn, Page, 1999; Ross
et al., 2005]. Чем моложе эволюционная страта,
тем меньше степень дивергенции X- и Y-гомоло-
гов, поэтому’ молодые эволюционные страты со-
держат большее количество генов, сохраняющих
функциональный гомолог на Y-хромосоме [Car-
rel, Willard, 2005]. Соответственно, возраст эво-
люционной страты влияет на степень вовлечен-
ности ее генов в систему’ дозовой компенсации.
Первая и вторая эволюционные страты являются
наиболее древними и соответствуют консерва-
тивному’ району’ Х-хромосомы плацентарных
(XCR, X-chromosome conserved region). Гены
XCR также локализуются на Х-хромосоме сум-
чатых. Третья, четвертая и пятая эволюционные
страты составляют добавленный район Х-хро-
мосомы (XAR, X-chromosome added region), ко-
торый возникает у предка плацентарных в ре-
зультате транслокаций аутосомного материала
на половые хромосомы [Wilcox et al., 1996].
Дозовая компенсация генов половых хромо-
сом существует не только у млекопитающих, но
и у других организмов, пол которых детермини-
руется половыми хромосомами, значительно
различающимися по морфологии и генетическо-
му’ содержанию. Установлено, что у самцов Dro-
sophila melanogaster (XY) уровень экспрессии
генов единственной Х-хромосомы удваивается.
Этого оказывается достаточно как для поддер-
жания транскрипционного баланса генов Х-хро-
мосомы и аутосом у самцов, так и для сохране-
ния одинакового уровня экспрессии генов Х-хро-
мосомы у самцов и самок (XX) [Akhtar, 2003].
Удвоение уровня транскрипции генов Х-хромо-
сомы показано также у самцов Caenorhabditis
elegans (ХО). У гермафродитов С. elegans (XX),
по-видимому, тоже имеет место повышенная
экспрессия генов Х-хромосомы, которая ком-
пенсируется с помощью частичного подавления
экспрессии генов на обеих Х-хромосомах [Gupta
et al., 2006].
Специализация Y-хромосомы
Самец х Y X Y X Y
Рис. 15.1. Коэволюция половых хромосом и процесса
дозовой компенсации у млекопитающих.
а — дивергенция X- и Y-хромосом и возникновение механиз-
мов дозовой компенсации; б—транслокация аутосомного
материала на половые хромосомы и его включение в систе-
му дозовой компенсации. Ха и Xi — активная и неактивная
Х-хромосома, А — аутосомный материал, ПАР — псевдо-
аутосомный район. 1 — экспрессия генов на аутосомном
уровне; 2 — удвоение уровня экспрессии генов Х-хромосомы;
3 — инактивация генов Х-хромосомы; 4 — специализирован-
ная часть Y-хромосомы; 5 — детерминирующие пол гены.
15.2. Дозовая компенсация генов
Х-хромосомы в онтогенезе
МЛЕКОПИТАЮЩИХ
Долгое время внимание исследователей было
направлено, главным образом, на изучение ме-
ханизмов инактивации Х-хромосомы. Показано,
что этот процесс начинается в раннем эмбриоге-
незе самок и контролируется специальным локу-
сом Х-хромосомы — центром инактивации (XIC,
X-inactivation centre). Процесс инактивации име-
ет две формы: импринтированную и случайную.
Импринтированная инактивация Х-хромосомы,
унаследованной от отца, наблюдается у некото-
рых видов плацентарных млекопитающих (на-
пример, у грызунов) на предымплантационных
стадиях развития эмбриона и сохраняется в клет-
ках, из которых формируются экстраэмбрио-
нальные органы: плацента и желточный мешок.
В клетках, из которых формируются ткани соб-
ственно эмбриона, во время имплантации проис-
388 ЭПИГЕНЕТИКА
ходят реактивация отцовской Х-хромосомы и
последующий процесс случайной инактивации
либо отцовской, либо материнской Х-хромосо-
мы [Mak et al., 2004; Okamoto et al., 2004]. Гораз-
до меньше было известно о сверхэкспрессии ге-
нов на активной Х-хромосоме у самок и самцов.
Методом микрочипов было измерено соотноше-
ние среднего уровня экспрессии генов Х-хро-
мосомы и аутосом (Х:А), что позволило выяс-
нить взаимодействие двух составляющих дозо-
вой компенсации на разных стадиях онтогенеза
млекопитающих (рис. 15.2). Х:А=1 означает,
что гены Х-хромосомы и аутосом экспрессируют-
ся на одинаковом уровне, в то время как X : А =
Самка
ооциты 1 порядка
Самец
сперматоциты
Ха Ха А А
V
ооциты 2 порядка сперматиды
ХаХа АА | XaY АА
предымплантационный эмбрион
ПП I1
a UU I UL
XaXi АА | XaY АА
эмбрион на стадии имплантации
ХаХа АА | XaY АА 1
соматические ткани м 2
IN ПП 03
4
XaXi АА XaY АА [3 5
Рис. 15.2. Дозовая компенсация генов Х-хромосомы в
онтогенезе млекопитающих (по [Dementyeva etal.,
2009]).
Ха и Xi — активная и неактивная Х-хромосома, А — набор
аутосом. Ост. поясн. см. в тексте. 1 — экспрессия генов на
аутосомном уровне; 2 — удвоение уровня экспрессии генов
Х-хромосомы; 3 — инактивация генов Х-хромосомы; 4 —
специализированная часть Y-хромосомы; 5 — неполная
инактивация генов отцовской Х-хромосомы.
= 0,5 означает отсутствие транскрипционного ба-
ланса между Х-хромосомой и аутосомами.
15.2.1. Оогенез
У самок мыши в ооцитах первого порядка,
содержащих два набора аутосом и две Х-хро-
мосомы, происходит реактивация неактивной
Х-хромосомы [de Napoles etal., 2007]. Тем не
менее, X : А составляет 0,67, что свидетельству-
ет о сниженном уровне экспрессии генов Х-хро-
мосомы по отношению к аутосомам и об отсут-
ствии сверхэкспрессии генов на активной Х-хро-
мосоме. В ооцитах второго порядка, содержащих
одну- Х-хромосому и один набор аутосом, сред-
ний уровень экспрессии генов Х-хромосомы и
аутосом приблизительно одинаков (X : А = 0,87).
Данные результаты позволяют заключить, что в
оогенезе млекопитающих не происходит удвое-
ния уровня экспрессии генов Х-хромосомы, хотя
транскрипционный баланс между’ Х-хромосомой
и аутосомами поддерживается, по крайней мере,
в ооцитах второго порядка (рис. 15.2) [Nguyen,
Disteche, 2006].
15.2.2. Сперматогенез
В сперматоцитах первого порядка X- и Y-хро-
мосомы формируют половое тельце и вовлека-
ются в процесс мейотической инактивации по-
ловых хромосом, действие которого распростра-
няется на несинаптированный хроматин [Turner,
2007]. X : А в сперматоцитах крысы составляет
0,22, что согласуется с мейотической инактива-
цией генов Х-хромосомы. На стадии сперматид
часть генов Х-хромосомы реактивируется [Wang
etal., 2005; Mueller etal., 2008]. В сперматидах
X : А = 0,46, но поскольку' сперматиды в равной
степени представлены клетками, имеющими как
Х-, так и Y-хромосому на один набор аутосом,
то полученное значение X : А необходимо уве-
личить в два раза (X : А = 0,92). Следовательно,
на стадии сперматид гены Х-хромосомы экс-
прессируются на равном уровне с аутосомными,
но удвоения уровня их экспрессии не происхо-
дит (см. рис. 15.2) [Nguyen, Disteche, 2006].
15.2.3. Предымплантационное и раннее
постимплантационное развитие
Во время раннего эмбриогенеза мыши, начи-
ная со стадии зиготы, устанавливается X: А
близкое к 1. От стадии зиготы до стадии блас-
тоцисты оно варьирует в пределах 0,87—1,02
ГЛАВА 15 389
[Nguyen, Disteche, 2006]. По-видимому, транс-
крипционный баланс между’ Х-хромосомой и ау-
тосомами устанавливается уже на стадии зиготы,
но трудности с определением пола эмбрионов на
столь ранних стадиях развития осложняют оцен-
ку уровня экспрессии генов Х-хромосомы у са-
мок и самцов. Некоторую ясность в данный во-
прос вносит исследование, в котором X : А было
определено в клетках внутренней клеточной
массы (ВКМ) типированных по полу бластоцист
мыши. В ВКМ X : А составляет 0,86 и 0,89 для
бластоцист самцов и самок соответственно [Lin
et al., 2007]. Результаты этих двух исследований
указывают на то. что в раннем эмбриогенезе
самцов уровень экспрессии генов Х-хромосомы
повышен [Nguyen, Disteche, 2006; Lin et al.,
2007]. В раннем развитии самок мыши на стадии
двух—четырех клеток начинается импринтиро-
ванная инактивация отцовской Х-хромосомы,
которая наблюдается в большинстве клеток бла-
стоцисты [Huynh, Lee, 2003; Okamoto etal., 2004].
Наличие транскрипционного баланса между- ге-
нами Х-хромосомы и аутосом в бластоцистах
самок (X : А = 0,89) предполагает, что имприн-
тированная инактивация на отцовской Х-хромо-
соме уравновешивает удвоенный уровень экс-
прессии генов, который, по-видимому, имеет ме-
сто на материнской Х-хромосоме [Nguyen, Dis-
teche, 2006; Lin etal., 2007]. Однако следует от-
метить, что инактивация Х-хромосомы в пред-
ымплантационном развитии является неполной,
причем степень инактивации гена, вероятно, за-
висит от его локализации относительно XIC
[Huynh, Lee, 2003; Patrat etal., 2009]. Следова-
тельно, вклад двух составляющих дозовой ком-
пенсации в транскрипционный баланс конкрет-
ных генов на предымплантационных стадиях
развития самок остается не вполне ясным (см.
рис. 15.2).
Экспрессия генов Х-хромосомы была также
исследована в эмбриональных стволовых (ЭС)
клетках мыши, которые могут отражать собы-
тия, происходящие в развитии собственно эм-
бриона при имплантации и в постимплантаци-
онный период. В недифференцированных ЭС-
клетках мыши уже произошла реактивация от-
цовской Х-хромосомы, инактивированной на
предыдущих стадиях эмбрионального развития,
и обе Х-хромосомы являются активными. В про-
цессе дифференцировки ЭС-клетки самок вновь
происходит инактивация одной из двух Х-хро-
мосом, однако выбор Х-хромосомы для инакти-
вации осуществляется случайным образом [He-
ard, Disteche, 2006]. В недифференцированных
ЭС-клетках X : А составляет 0,81 и 1,39 для сам-
цов и самок соответственно, что свидетельствует
о повышенном уровне экспрессии генов как
единственной Х-хромосомы у самцов, так и обе-
их Х-хромосом у самок. В процессе дифферен-
цировки ЭС-клетки значения X : А для обоих
полов постепенно приближаются к 1, т. е. уста-
навливается транскрипционный баланс между’
Х-хромосомой и аутосомами, а также равный
уровень экспрессии генов Х-хромосомы между’
полами. В ЭС-клетках самцов баланс обеспечи-
вается удвоением уровня экспрессии генов
Х-хромосомы. В ЭС-клетках самок имеет место
сочетание удвоения уровня экспрессии генов на
одной Х-хромосоме и инактивации второй
Х-хромосомы [Lin etal., 2007]. Выравнивание
экспрессии генов Х-хромосомы и аутосом при
дифференцировке ЭС-клеток самок, сопровож-
дающееся инактивацией одной из двух Х-хромо-
сом, подтверждает предположения о том, что
инактивация Х-хромосомы возникла для предот-
вращения избыточной экспрессии генов Х-хро-
мосомы у самок млекопитающих.
15.2.4. Соматические ткани
взрослых особей
У мыши, крысы и человека в соматических
тканях взрослых особей обоих полов средние
значения X : А близки к 1 [Gupta et al., 2006;
Nguyen, Disteche, 2006: Johnston et al.. 2008]. Это
означает, что и в соматических тканях поддер-
живается транскрипционный баланс между’
Х-хромосомой и аутосомами. У самцов он дос-
тигается за счет удвоения уровня экспрессии ге-
нов Х-хромосомы. В соматических тканях самок
млекопитающих дозовая компенсация генов
Х-хромосомы осуществляется за счет удвоения
уровня экспрессии генов на одной (активной)
Х-хромосоме и инактивации транскрипции на
второй Х-хромосоме (см. рис. 15.2). Интересно,
что в тканях мозга, несмотря на различия между’
отделами, уровень экспрессии генов Х-хромосо-
мы достоверно выше, чем в других соматиче-
ских тканях. Высокий уровень экспрессии генов
Х-хромосомы в мозге характерен для обоих по-
лов. Возможно, что увеличение уровня экспрес-
сии ряда генов Х-хромосомы в мозге приводило
к селективному’ преимуществу в размножении
[Nguyen, Disteche, 2006].
Таким образом, удвоение уровня экспрессии,
так же как и инактивация Х-хромосомы, проис-
ходит уже в раннем развитии. Транскрипцион-
ный баланс между’ Х-хромосомой и аутосомами
390 ЭПИГЕНЕТИКА
поддерживается в герминальных клетках, в эм-
бриональном развитии, а также в соматических
тканях взрослых млекопитающих обоих полов.
Это позволяет сделать заключение о важности
дозовой компенсации генов Х-хромосомы [He-
ard, Disteche, 2006; Nguyen, Disteche, 2006].
15.3. Варианты экспрессии генов
Х-хромосомы в соматических
ТКАНЯХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ
15.3.1. Сбалансированная экспрессия
генов Х-хромосомы
Большая часть генов Х-хромосомы современ-
ных видов плацентарных не имеет гомологов на
Сбалансированная экспрессия генов Х-хромосомы
самки
самцы
Рис. 15.3. Варианты экспрессии генов Х-хромосомы у
млекопитающих.
а — подвергающиеся инактивации гены без Y-гомолога или
со специализированным Y-гомологом; б—гены ПАР1; е — из-
бегающие инактивации гены с функционально эквивалент-
ным Y-гомологом; г — избегающие инактивации гены без Y-
гомолога или со специализированным Y-гомологом. Ха и
Xi — активная и неактивная Х-хромосома, А — набор ауто-
сом. Кругами обозначены уровни экспрессии генов на соот-
ветствующих хромосомах.
Y-хромосоме. Дозовая компенсация таких генов
осуществляется за счет повышения уровня их
экспрессии на активной Х-хромосоме у самок и
самцов и репрессии транскрипции на неактивной
Х-хромосоме у самок. Аналогичный способ до-
зовой компенсации характерен для генов Х-хро-
мосомы со специализированным Y-гомологом,
который, несмотря на сходство нуклеотидной
последовательности, функционально не эквива-
лентен гену’ Х-хромосомы (рис. 15.3, о). Инте-
ресный способ дозовой компенсации описан для
двух генов SPRY3 и SYBL1, локализующихся в
проксимальной части ПАР длинного плеча X- и
Y-хромосом человека (ПАР2) (рис. 15.4). Эти
гены подвергаются инактивации как на неактив-
ной Х-хромосоме у женщин, так и на Y-хромо-
соме у мужчин [Ciccodicola etal., 2000]. Репрес-
сию Y-гомологов генов SPRY3 и SYBL1 связы-
вают с их локализацией возле блока гетерохро-
матина [Matarazzo et al., 2002]. По характеру экс-
прессии Х-гомологи этих генов сходны с боль-
шинством генов Х-хромосомы и вовлечены не
только в инактивацию, но, по-видимому, и в
сверхэкспрессию на активной Х-хромосоме.
Следовательно, удвоение уровня экспрессии
и инактивация позволяют осуществить дозовую
компенсацию большинства генов Х-хромосомы.
Тем не менее, не все гены в равной мере вовле-
чены в систему’ сверхэкспрессии/инактивации.
Рис. 15.4. Половые хромосомы человека.
Xp/Yp — короткое плечо X/Y-хромосомы; Xq/Yq — длинное
плечо X/Y-хромосомы; сел — центромера; ПАР1 — псевдо-
аутосомный район короткого плеча X/Y-хромосомы человека;
ПАР2 — псевдоаутосомный район длинного плеча X/Y-xpo-
мосомы человека.
ГЛАВА 15 391
Судить об этом позволяют данные, показываю-
щие, что 15 % генов Х-хромосомы человека ста-
бильно избегают инактивации, а еще 10 % де-
монстрируют гетерогенную экспрессию, т. е. уро-
вень их экспрессии на неактивной Х-хромосоме
существенно варьирует (вплоть до полной инак-
тивации) между особями, тканями или даже
клетками [Carrel, Willard, 2005]. Избегающие
инактивации гены распределены вдоль Х-хромо-
сомы человека неслучайным образом. Они лока-
лизуются прсимущественно в ПАР и в коротком
плече Х-хромосомы человека.
В том случае, когда избегающие инактивации
гены имеют Y-гомологи, транскрибирующиеся
на том же уровне, что и Х-гомологи, их экспрес-
сия оказывается сбалансированной во всех от-
ношениях без участия механизмов дозовой ком-
пенсации (см. рис. 15.3, б). Примером могут
служить гены, локализованные в ПАР короткого
плеча X- и Y-хромосом человека (ПАР1) (см.
рис. 15.4). Избегание инактивации обеспечивает
равную экспрессию этих генов у обоих полов,
что было установлено для 12 из 13 генов ПАР1.
Только ген CD99 имеет более высокий уровень
экспрессии v мужчин. Исследование трех генов
ПАР1 (SLC25A6, CXYorf3, ZBDE1) у мужчин по-
казало, что их X- и Y-гомологи экспрессируются
на одинаковом уровне. Это, скорее всего, озна-
чает, что аллели активной и неактивной Х-хро-
мосом у женщин также имеют равный уро-
вень экспрессии, а гены ПАР1 исключены из
системы сверхэкспрессии/инактивации [Johnston
etal., 2008]. Интересно, что два дистально рас-
положенных в ПАР2 гена, IL9R и CXYorfl, избе-
гают инактивации у женщин и экспрессируются
на Y-хромосоме у мужчин подобно генам ПАР1.
Однако вопрос об уровне экспрессии генов ПАР2
на активной Х-хромосоме и их дозовой компен-
сации относительно аутосом пока остается от-
крытым. Возможные различия в механизмах до-
зовой компенсации генов ПАР1 и ПАР2 могут
объясняться особенностями происхождения дан-
ных районов. Гены современного ПАР1 пред-
ставляют собой остатки транслоцированного на
половые хромосомы аутосомного материала, ко-
торые продолжают участвовать в рекомбинации
между’ X- и Y-хромосомам и и не подвергаются
действию механизмов дозовой компенсации. Ге-
ны ПАР2 были независимо транслоцированы на
ту часть Х-хромосомы человека, которая к тому’
моменту’ уже была вовлечена в процессы сверх-
экспрессии и инактивации. На Y-хромосоме
ПАР2 появился, по всей вероятности, благодаря
незаконной рекомбинации [Kvaloy et al., 1994].
У части избегающих инактивации генов диф-
ференцированного района Х-хромосомы также
сохранились функционально эквивалентные го-
мологи на Y-хромосоме, но степень дивергенции
X- и Y-гомологов в данном случае выше, чем у
генов ПАРГ Исследование экспрессии четырех
пар X/Y-гомологов (USP9X/USP9Y, RPS4XRPS4Y,
UTX/UTY, DDX3X/DDX3Y) у человека показало,
что хотя уровень экспрессии Х-гомологов у
женщин выше, чем у мужчин, экспрессия их Y-
гомологов практически восстанавливает равный
уровень экспрессии этих генов у обоих полов.
Следует отметить, что у мужчин уровень экс-
прессии Y-гомолога обычно существенно ниже,
чем уровень экспрессии Х-гомолога и, вероятно,
соответствует уровню экспрессии данного гена
на неактивной Х-хромосоме у женщин [Disteche
et al., 2002; Johnston et al., 2008]. Таким образом,
избегающие инактивации гены с функционально
эквивалентным Y-гомологом экспрессируются
на одинаковом уровне у самок и самцов млеко-
питающих. Однако уровень их транскрипции на
активной Х-хромосоме и наличие транскрипци-
онного баланса с аутосомами остаются неясны-
ми (см. рис. 15.3, в). В пользу’ повышенного
уровня экспрессии генов на активной Х-хро-
мосоме свидетельствует более высокая экспрес-
сия Х-гомолога по сравнению с Y-гомологом у
самцов.
15.3.2. Несбалансированная экспрессия
генов Х-хромосомы
Экспрессия ряда генов Х-хромосомы, по-ви-
димому, может оставаться несбалансированной.
Речь идет, главным образом, об избегающих
инактивации генах, которые не имеют Y-гомоло-
гов, или их Y-гомологи выполняют специфиче-
скую функцию и экспрессируются преимущест-
венно в семенниках. В этой ситуации нарушает-
ся как транскрипционный баланс между2 генами
Х-хромосомы и аутосом, так и равный уровень
экспрессии генов Х-хромосомы между2 полами
(см. рис. 15.3, г). С одной стороны, более высо-
кий уровень экспрессии данных генов у самок по
сравнению с самцами может иметь функцио-
нальное значение. Например, данные гены могут
участвовать в формировании специфических для
женского пола признаков [Disteche, 1995; Brown,
Greally, 2003]. С друтой стороны, избегание
инактивации некоторыми генами Х-хромосомы
у самок млекопитающих может и не играть ни-
какой роли. Возможно, что, несмотря на отсут-
ствие или специализацию Y-гомологов, ряд ге-
392 ЭПИГЕНЕТИКА
нов Х-хромосомы не нуждается в срочной дозо-
вой компенсации и вовлекается в сверхэкспрес-
сию, а затем и инактивацию постепенно. Не ис-
ключено также, что экспрессия генов на неак-
тивной Х-хромосоме может быть связана с их ло-
кализацией рядом с другими избегающими ин-
активации генами, имеющими Y-гомолог или вы-
полняющими спсцифичсскую для формирования
женского пола функцию, и, как следствие, попа-
данием под действие защищающих от инактива-
ции механизмов [Graves, Disteche, 2007]. В од-
ном из исследований было установлено, что у
человека все различия в уровне экспрессии генов
Х-хромосомы между’ полами обеспечиваются
всего лишь 5,4 % генов Х-хромосомы [Johnston
etal., 2008]. Действительно, уровень экспрессии
большинства избегающих инактивации генов на
неактивной Х-хромосоме столь незначителен по
сравнению с уровнем экспрессии на активной X-
хромосоме [Carrel, Willard, 2005; Nguyen, Dis-
teche, 2006; Yang et al., 2010], что может и не вы-
зывать нарушений транскрипционного баланса.
И, наконец, дисбаланс, возникший после транс-
крипции генов Х-хромосомы, может устраняться
на трансляционном и/или посттрансляционном
уровне [Disteche, 1995; Brown, Greally, 2003].
К примеру, не было выявлено существенных
различий в количестве белкового продукта избе-
гающего инактивации гена Eif2s3x между- сам-
цами и самками мыши, а также между- нормаль-
ными самками и самками с моносомией по X-
хромосоме [Xu J. et al., 2006].
Изначально считалось, что статус экспрессии
гена Х-хромосомы является одинаковым для
всех самок одного вида. Необходимость опреде-
ления статуса экспрессии большого числа генов
Х-хромосомы человека привела к использова-
нию в качестве модельной системы гибридов
соматических клеток человека и грызунов, кото-
рые содержат либо активную, либо неактивную
Х-хромосому человека. Данные исследования
показали, что многие гены стабильно инактиви-
руются или избегают инактивации в соматиче-
ских гибридах. Однако наряду- с такими генами
были обнаружены гены с гетерогенной экспрес-
сией на неактивной Х-хромосоме, т. е. они ста-
новились объектом инактивации в одних сома-
тических гибридах и экспрессировались на неак-
тивной Х-хромосоме в других [Carrel et al., 1999;
Carrel, Willard, 2005]. Дальнейшие оценки транс-
крипционной активности генов неактивной X-
хромосомы в диплоидных женских клетках с не-
случайной инактивацией Х-хромосомы, вызван-
ной хромосомными перестройками, подтвердили
существование таких генов и согласовывались с
результатами, полученными для линий сомати-
ческих гибридов [Carrel, Willard, 2005]. Похоже,
что их экспрессия не сбалансирована ни относи-
тельно аутосом, ни между- полами. Гены с гете-
рогенной экспрессией варьируют по уровню экс-
прессии между- особями женского пола и могут
отвечать за индивидуальные различия [Вгоууп,
Greally, 2003; Carrel, Willard, 2005].
На примере человека видно, что экспрессия
15—25 % генов Х-хромосомы не является сба-
лансированной между- полами. Исследование
статуса инактивации генов Х-хромосомы мыши
позволило установить, что многие гены, избе-
гающие инактивации у человека, подвергались
инактивации у мыши, и только 3 % генов экс-
прессируются на неактивной Х-хромосоме у
мыши [Yang etal., 2010]. Та же самая законо-
мерность была обнаружена и при изучении экс-
прессии генов Х-хромосомы в соматических
тканях обыкновенных полевок рода Microtus
[Dementyeva etal.. 2010]. Более того, некоторые
гены Х-хромосомы, избегающие инактивации у
мыши, подвергаются инактивации у человека
[Yang etal., 2010], что указывает на различия
в наборе избегающих инактивации генов меж-
ду таксономическими группами. Похоже, что X-
хромосома грызунов более инактивирована по
сравнению с Х-хромосомой человека, а следова-
тельно, более сбалансирована по уровню экс-
прессии генов. В пользу- данного предположения
свидетельствует более высокая, чем у человека,
выживаемость эмбрионов самок мыши с моно-
сомией по Х-хромосоме. В постнатальный пери-
од женщины с кариотипом 45,X страдают син-
дромом Тернера, который характеризуется боль-
шим количеством нарушений, в том числе недо-
развитием женских половых органов. Самки
мышей с моносомией по Х-хромосоме фертиль-
ны, хотя и имеют укороченный репродуктивный
период и меньший размер помета относительно
самок с нормальным кариотипом [Hunt, 1991;
Zinn et al., 1993; Ogata, Matsuo, 1995].
По всей видимости, дозовая компенсация не
является необходимой для всех без исключения
генов Х-хромосомы млекопитающих. Это пред-
положение согласуется с данными об экспрессии
генов половых хромосом птиц и бабочек [Е1-
legren etal., 2007; Itoh etal., 2007; Zha etal.,
2009]. У представителей данных таксонов гете-
рогаметным полом являются самки, которые
имеют две морфологически и генетически раз-
личные Z- и W-хромосомы, в то время как поло-
вые хромосомы самцов представлены двумя
ГЛАВА 15 393
Z-хромосомами. Оказалось, что соотношение
уровней экспрессии генов Z-хромосомы у сам-
цов и самок в различных типах тканей имеет
промежуточные значения между’ 1 (равная экс-
прессия у обоих полов) и 2 (в 2 раза более высо-
кая экспрессия у самцов). Таким образом, на Z-
хромосоме самок уровень транскрипции удваи-
вается лишь у части генов. Получается, что для
многих генов Z-хромосомы разница в уровне их
экспрессии между’ полами и, вероятно, транс-
крипционный баланс с аутосомами не являются
важными. То же самое может быть справедли-
вым и для некоторых генов Х-хромосомы мле-
копитающих [Graves, Disteche, 2007].
На сегодня ситуация с дозовой компенсацией
генов Х-хромосомы у млекопитающих выглядит
следующим образом. Инактивация, хотя и про-
исходит на уровне целой хромосомы, необходи-
ма для регуляции уровня экспрессии лишь толь-
ко тех генов Х-хромосомы, которые обязательно
должны подвергаться дозовой компенсации.
Кроме того, на Х-хромосоме существуют гены,
которые должны избегать дозовой компенсации
и экспрессироваться на разных уровнях у самцов
и самок. Различия в уровне экспрессии осталь-
ных генов Х-хромосомы между полами и/или X-
хромосомой и аутосомами, по всей вероятности,
не имеют особого значения. При локализации
рядом с инактивирующимися генами они могут
вовлекаться в систему’ сверхэкспрессии/инакти-
вации. Локализация возле избегающих инакти-
вации генов, напротив, может привести к попа-
данию под действие защищающих от инактива-
ции механизмов и к их экспрессии на неактив-
ной Х-хромосоме.
15.4. Экспрессия генов Х-хромосомы
В ЭКСТРАЭМБРИОНАЛЬНЫХ ТКАНЯХ
МЛЕКОПИТАЮЩИХ
Как уже отмечалось, в предымплантационном
развитии самок мыши импринтированная инак-
тивация отцовской Х-хромосомы является менее
полной, чем в соматических тканях. По одним
оценкам, степень инактивации генов отцовской
Х-хромосомы в раннем эмбриогенезе зависит от
локализации гена относительно XIC. Полное по-
давление транскрипции происходит лишь у ге-
нов отцовской Х-хромосомы, расположенных в
пределах 10 сМ от XIC. По мере удаления от
XIC уровень экспрессии генов постепенно воз-
растает вплоть до избегания инактивации на
концах отцовской Х-хромосомы [Huynh, Lee,
2003]. В другом исследовании градиент инакти-
вации генов отцовской Х-хромосомы обнару-
жен не был, но показано, что первыми инакти-
вируются все-таки наиболее близкие к XIC гены.
По всей видимости, процесс инактивации генов
отцовской Х-хромосомы в предымплантацион-
ном развитии происходит постепенно. Одни ге-
ны вовлекаются в него на стадии четырех клеток
и подвергаются инактивации практически во
всех бластомерах уже на стадии восьми клеток.
Другая группа генов отцовской Х-хромосомы
включается в процесс импринтированной инак-
тивации достаточно поздно, на стадии морулы,
но быстро инактивируется к стадии бластоци-
сты. Для третьей группы генов характерна мед-
ленная инактивация, которая инициируется на
стадии восьми клеток и достигает своего макси-
мума только к стадии бластоцисты. Существуют
также гены, которые вовсе не подвергаются
инактивации в предымплантационном развитии
[Patrat et al., 2009].
В клетках, дающих начало эмбриональным
тканям, отцовская Х-хромосома реактивируется
и инактивация становится случайной. В экстра-
эмбриональных тканях импринтированная инак-
тивация сохраняется, но остается неясной сте-
пень дозовой компенсации генов Х-хромосомы.
Было показано, что в трофобластных стволо-
вых (ТС) клетках мыши инактивация отцовской
Х-хромосомы становится более полной, чем на
предымплантационных стадиях [Huynh, Lee.
2003: Chiba etal., 2008]. Однако когда была ис-
следована экспрессия 15 генов Х-хромосомы у
обыкновенных полевок рода Microtus, оказалось,
что часть генов, подвергающихся инактивации в
соматических тканях, может экспрессироваться
на неактивной Х-хромосоме в экстраэмбрио-
нальных тканях [Dementyeva et al., 2010]. Судить
о степени инактивации генов в экстраэмбрио-
нальных тканях можно также на основании изу-
чения трансгенов, встроенных в Х-хромосому.
В соматических клетках самок мыши многие
трансгены на неактивной Х-хромосоме подвер-
гаются инактивации. В клетках экстраэмбрио-
нальных тканей те же самые трансгены на от-
цовской Х-хромосоме могли как инактивиро-
ваться [Dandolo et al., 1993], так и избегать инак-
тивации [Krumlauf et al.. 1986; Hadjantonakis
etal., 2001]. Следует учитывать, что экспрессия
трансгенов может быть тканеспецифичной и за-
висеть от природы самого трансгена (его струк-
туры или размера) [Goto, Monk, 1998]. Кроме то-
го, для экспрессии трансгенов имеет значение
место их встройки [Goldman et al., 1987; Wu
et al., 1992], поскольку’ контроль экспрессии re-
394 ЭПИГЕНЕТИКА
нов Х-хромосомы, скорее всего, осуществляется
на доменном уровне. Тем не менее различия
в экспрессии генов и трансгенов на неактивной
Х-хромосоме между соматическими и экстраэм-
бриональными тканями свидетельствуют в поль-
зу меньшей полноты и/или стабильности им-
принтированной инактивации.
Таким образом, есть основания полагать, что
соматические и экстраэмбриональные ткани ха-
рактеризуются различной степенью инактива-
ции, а значит и дозовой компенсации генов
Х-хромосомы. Поскольку экстраэмбриональные
ткани необходимы в онтогенезе млекопитающих
ограниченный период времени, дозовая компен-
сация при импринтированной инактивации
Х-хромосомы может быть менее строгой [Heard,
2005], и значение имеет только уровень экспрес-
сии ограниченного набора генов Х-хромосомы.
15.5. Механизмы регуляции экспрессии
ГЕНОВ X-ХРОМОСОМЫ МЛЕКОПИТАЮЩИХ
15.5.1. Сверхэкспрессия генов
на активной Х-хромосоме
Показано, что гены активной Х-хромосомы
по сравнению с аутосомными генами обогащены
РНК-полимеразой II, фосфорилированной по се-
ринам в положениях 2 и 5, что соответствует бо-
лее высокому’ уровню элонгации и инициации их
транскрипции [Deng etal., 2011: Yildirim etal.,
2011]. Можно предположить, что более высокий
уровень транскрипции генов на активной Х-хро-
мосоме у млекопитающих обеспечивается с по-
мощью эпигенетических механизмов. Так, на ак-
тивной Х-хромосоме выявлено обогащение не-
которыми маркерами транскрипционно активно-
го хроматина: фосфорилированной по серину в
положении 5 РНК-полимеразой II и триметили-
рованным гистоном НЗ по лизину в положении 4
(НЗК4теЗ) в районах точек старта транскрип-
ции, фосфорилированной по серину’ в положе-
нии 2 РНК-полимеразой II и триметилирован-
ным гистоном НЗ по лизину в положении 36
(НЗКЗбтеЗ) в структурных частях генов. Стоит
отметить, что обогащение данными маркерами
не было двукратным, а значит, удвоенная транс-
крипция генов на активной Х-хромосоме млеко-
питающих может обеспечиваться относительно
небольшими изменениями в структуре хромати-
на. Похожая закономерность была обнаружена и
для аутосомных генов, т. е. сверхэкспрессия ге-
нов на активной Х-хромосоме может быть свя-
зана не столько со специфичными механизмами,
сколько с общими принципами регуляции транс-
крипции [Yildirim et al., 2011]. Интересно также,
что уровень метилирования ДНК на активной
Х-хромосоме более чем в два раза превышает
уровень метилирования ДНК на неактивной
Х-хромосоме. До начала инактивации гены на
обеих Х-хромосомах метилированы одинаковым
образом, т. е. по CpG-динуклеотидам в струк-
турной части. После установления неактивного
состояния аллели активной и неактивной Х-хро-
мосом самок млекопитающих метилируются по
различному’ принципу’. Гены на активной Х-хро-
мосоме самок остаются гиперметилированными
по CpG-динуклеотидам в структурной части.
Аналогичный тип метилирования имеют гены на
Х-хромосоме самцов. В то же время гены неак-
тивной Х-хромосомы утрачивают метилирова-
ние в структурной части и становятся гиперме-
тилированными по CpG-динуклеотидам промо-
торных областей [Hellman, Chess, 2007]. Однако
влияние уровня метилирования ДНК в структур-
ных частях генов на активной Х-хромосоме на
уровень их экспрессии пока никак не подтвер-
ждено. Кроме того, в литературе обсуждается
гипотеза, согласно которой усиление транскрип-
ции генов на активной Х-хромосоме у млекопи-
тающих может быть связано с изменениями нук-
леотидных последовательностей их регулятор-
ных районов [Heard, Disteche, 2006; Nguyen,
Disteche, 2006]. Таким образом, удвоение уровня
экспрессии генов Х-хромосомы является в на-
стоящее время наименее изученным аспектом
дозовой компенсации у млекопитающих.
15.5.2. Инактивация
Х-хромосомы
Для достижения одинакового уровня экспрес-
сии генов Х-хромосомы между’ полами у мле-
копитающих возник сложный, многостадий-
ный процесс инактивации Х-хромосомы. Слу-
чайная инактивация, которая имеет место в со-
матических тканях плацентарных млекопитаю-
щих, включает несколько стадий: подсчет числа
Х-хромосом на диплоидный набор аутосом, вы-
бор Х-хромосомы для инактивации, инициацию
инактивации, распространение неактивного со-
стояния и его поддержание в ряду’ клеточных
поколений [Heard, Disteche, 2006; Шевченко и
др., 2006; Erwin, Lee, 2008]. Этот процесс конт-
ролируется XIC. У мыши данный локус содер-
жит антисмысловые гены Xist (X inactive-specific
transcript) и Tsix. Ген Xist экспрессируется на бу-
дущей неактивной Х-хромосоме. С него транс-
ГЛАВА 15 395
крибируется некодирующая РНК, которая рас-
пространяется вдоль инактивируемой Х-хромо-
сомы, что приводит к транскрипционному’ сай-
ленсингу генов. Ген Tsix транскрибируется с
комплементарной гену’ Xist цепи ДНК и является
негативным регулятором его экспрессии. До на-
чала процесса инактивации на обеих Х-хромосо-
мах наблюдаются экспрессия гена Tsix и на не-
высоком уровне экспрессия гена Xist. Инициация
инактивации начинается со сближения и физи-
ческого взаимодействия XIC двух Х-хромосом
(рис. 15.5) [Bacher et al., 2006; XuN. et al., 2006].
Считается, что сближение XIC необходимо для
взаимоисключающего выбора будущих активной
и неактивной Х-хромосомы. На активной Х-хро-
мосоме сохраняется экспрессия гена Tsix и по-
давляется экспрессия гена Xist. На инактивируе-
мой Х-хромосоме, напротив, экспрессия гена
Tsix выключается, что вызывает активацию гена
Xist. Существуют данные о том, что изменение
уровня экспрессии гена Tsix может влиять на
структуру хроматина и статус метилирования
премоторной области гена Xist [Navarro et al.,
2005; Sado et al., 2005; Sun et al., 2006], но моле-
кулярные механизмы функционирования Tsix
РНК до сих пор остаются неизвестными.
Далее Xist РНК распространяется из центра
инактивации, вызывает репрессию транскрипции
генов и взаимодействует с модифицирующими
хроматин белками, что приводит к целой се-
рии эпигенетических изменений на неактивной
Х-хромосоме [Heard, Disteche, 2006; Шевченко
и др., 2006; Escamilla-Del-Arenal etal., 2011].
Инактивируемая Х-хромосома утрачивает ассо-
циацию с РНК-полимеразой II. Происходит ис-
ключение модификаций, характерных для транс-
крипционно активного хроматина: ди- и триме-
тилированного по лизину’ в положении 4 гисто-
на НЗ (H3K4me2/3), НЗКЗбтеЗ и ацетилирован-
ных форм гистонов НЗ и Н4 (НЗас и Н4ас). В то
же время на неактивной Х-хромосоме устанав-
ливаются модификации транскрипционно неак-
тивного хроматина: триметилированный по ли-
зину- в положении 27 гистон НЗ (НЗК27теЗ),
моноубиквитинированный по лизину’ в положе-
нии 119 гистон Н2А (иН2А), диметилированный
по лизину в положении 9 гистон НЗ (НЗК9те2)
и монометилированный по лизину’ в положении
20 гистон Н4 (H4K20mel). Кроме того, неактив-
ная Х-хромосома становится поздно реплици-
рующейся. Позднее в состав хроматина неактив-
ной Х-хромосомы включается вариант гистона
Н2А (макроН2А1.2), содержащий негистоновый
домен, и происходит гиперметилирование ДНК
премоторных областей генов. Данные эпигене-
тические изменения приводят к необратимости
неактивного состояния и его устойчивому- на-
следованию в ряду- клеточных поколений. Тем не
менее до сих пор остается открытым вопрос о
том, взаимодействует ли Xist РНК с модифици-
рующими хроматин комплексами напрямую или
посредством каких-то не известных на настоя-
щий момент факторов.
У млекопитающих не существует так назы-
ваемого «комплекса дозовой компенсации», и
все вышеперечисленные модификации хромати-
на устанавливаются с помощью различных бел-
ковых комплексов. Показано, что комплексы
polycomb белков PRC 1 (polycomb repressive
complex 1) и PRC2 отвечают за установление
иН2А и НЗК27теЗ соответственно [Silva et al.,
2003; Cao, Zhang, 2004; de Napoles etal., 2004;
Fang et al., 2004]. Данные комплексы являются
универсальными и участвуют в репрессии генов
не только на неактивной Х-хромосоме. Более
подробно роль центра инактивации и модифика-
ций хроматина в процессе инактивации Х-хро-
мосомы будет описана в следующих главах.
Несмотря на то, что процесс инактивации за-
пускается скоординированно, неактивное со-
стояние в развитии устанавливается для каждого
гена индивидуально. Так, в ЭС-клетках самок
мыши сигнал Xist РНК на одной из двух Х-хро-
мосом выявляется во всех клетках в первые дни
дифференцировки, однако инактивация генов
может устанавливаться в течение 2—3 недель
дифференцировки [Lin etal., 2007]. Некоторые
гены инактивируются практически сразу, дру-
гие — в ходе дифференцировки, а некоторые ге-
ны так и остаются неинактивированными, то
есть избегают инактивации.
Xist
Tsix
Рис. 15.5. Регуляция экспрессии генов Xist и Tsix в
процессе инактивации Х-хромосомы у самок млекопи-
тающих.
XIC — центр инактивации Х-хромосомы; Ха и Xi — активная и
неактивная Х-хромосомы. Стрелками показана транскрипция,
а линиями с тупыми окончаниями — ее отсутствие.
396 ЭПИГЕНЕТИКА
15.5.3. Избегание инактивации
Избегающие инактивации гены сохраняют
экспрессию на транскрипционно неактивной X-
хромосоме. Они не ассоциируются с Xist РНК
[Murakami et al., 2009] и связывают РНК-поли-
меразу II на неактивной Х-хромосоме, что согла-
суется с их транскрипционной активностью. Ин-
тересно, что уровень связывания РНК-полиме-
разы II избегающими инактивации генами за-
висит от уровня их экспрессии на неактивной
Х-хромосоме [Kucera etal., 20111. Избегающие
инактивации гены имеют низкий уровень моди-
фикаций транскрипционно неактивного хрома-
тина, таких как НЗК27теЗ, НЗК9теЗ, НЗК9те2,
и, напротив, обогащены модификациями транс-
крипционно активного хроматина: НЗас, Н4ас,
H3K4mc3 [Gilbert, Sharp, 1999; Boggs et al., 2002;
Шевченко и др., 2006; Khalil, Driscoll, 2007;
Goto, Kimura, 2009; Yang etal., 2010]. Кроме то-
го, в отличие от генов, подвергающихся инакти-
вации. у генов, избегающих инактивации, не на-
блюдается метилирования CpG-динуклсотидов в
5'-областях как на активной, так и на неактивной
Х-хромосоме [Carrel etal., 1996; Gilbert, Sharp,
1999; Matarazzo etal., 2002; Dementyeva etal.,
2010]. Более того, характер метилирования ДНК
избегающих инактивации генов очень сходен с
H3K9me3f CTCF I НЗКЭтеЗ
Н4К20теЗ | V Н4К20теЗ
инактивация ООО избегание инактивации
Модификации транскрипционно активного хроматина
- НЗас и Н4ас +
НЗК4теЗ +
Модификации транскрипционно неактивного хроматина
+ НЗК27теЗ
+ НЗК9те2/3
+ метилирование ДНК -
Состав геномной ДНК
+ LINE
+ АТ-богатые мотивы —
Alu +
— повторы ACG/CGT, AT, AC, AG, GATA +
Рис. 15.6. Сравнение доменов инактивирующихся и
избегающих инактивации генов Х-хромосомы. Возмож-
ные механизмы избегания инактивации.
H3K9me2/3 — ди-/триметилированный по лизину в положе-
нии 9 гистон НЗ, Н4К20теЗ — триметилированный по лизину
в положении 20 гистон Н4, Н3ас/Н4ас — ацетилированный
гистон НЗ/Н4, НЗК4теЗ — триметилированный по лизину в
положении 4 гистон НЗ, НЗК27теЗ — триметилированный по
лизину в положении 27 гистон НЗ. Белыми кругами обозна-
чены неметилированные CpG-динуклеотиды.
таковым у генов активной Х-хромосомы: гипо-
метилирование в премоторной области и гипер-
метилирование в структурной части гена [Mon-
dello etal., 1988; Sharp etal., 2011]. Таким обра-
зом, несмотря на распространение неактивного
состояния вдоль всей Х-хромосомы, избегающие
инактивации гены сохраняют модификации,
свойственные транскрипционно активному’ хро-
матину2 (рис. 15.6).
Очевидно, что регуляция экспрессии генов на
неактивной Х-хромосоме может происходить
различным образом, но по-прежнему2 остаются
неясными те факторы, которые отвечают за под-
держание транскрипционно активных генов на
неактивной Х-хромосоме. Сравнение нуклео-
тидных последовательностей и функциональная
характеристика премоторных областей инак-
тивирутощихся и избегающих инактивации генов
не позволили выявить каких-либо особенностей,
которые могли бы объяснить различия в статусе
экспрессии [Luoh etal., 1995; Tsuchiya, Willard,
2000]. По-видимому, на статую экспрессии ге-
нов неактивной Х-хромосомы не влияет нуклео-
тидная последовательность их премоторных
районов.
Избегающие инактивации гены короткого
плеча Х-хромосомы человека образутот класте-
ры. Их кластерная организация предполагает,
что между избегающими инактивации и инакти-
вирутощимися районами неактивной Х-хромо-
сомы могут находиться какие-то пограничные
элементы. В 5'-областях генов Jaridlc и Eif2s3
мыши и гена EEF2S3 человека были найдены
сайты связывания CTCF-фактора. Данные гены
избегают инактивации и локализуются рядом с
инактивирутощимися генами. Гси JARID1C, хотя
и избегает инактивации, но локализуются рядом с
другим избегающим инактивации геном и не
имеет в своей 5'-области сайта связывания CTCF-
фактора. Следовательно, CTCF-фактор специ-
фически связывается между2 инактивирутощими-
ся и избегающими инактивации генами, но не
между2 дву2мя избегающими инактивации генами.
Это указывает на возможное участие данного
фактора в регуляции экспрессии генов неактив-
ной Х-хромосомы на доменном уровне. Предпо-
лагается, что CTCF-фактор, связывание которого
является метил-зависимым, препятствует рас-
пространению метилирования ДНК и сопутст-
вутощих модификаций неактивного хроматина в
соседние районы, тем самым способствуя фор-
мированию избегающих инактивации доменов
[Disteche et al., 2002; Filippova et al., 2005; Heard,
Disteche, 2006] (рис. 15.6). Показано, что мети-
ГЛАВА 15 397
лирование CpG-динуклсотидов регуляторных
областей коррелирует с положением генов в пре-
делах хромосомной территории. Деметилирова-
ние приводит к перемещению гена ближе к гра-
нице хромосомной территории, а также может
влиять на локализацию соседних генов [Mataraz-
zo et al., 2007]. Вероятно, гены с метилирован-
ными CpG-островками включаются в компарт-
менты ядра, в которых нет РНК-полимеразы II и
которые содержат ферменты, обеспечивающие
наследование модификаций неактивного хрома-
тина при репликации ДНК. Неметилированные
гены, напротив, могут включаться в те компарт-
менты ядра, где происходит интенсивная транс-
крипция и поддерживается активное состояние
хроматина. Кроме того, CTCF-фактор считается
элементом, который может участвовать в форми-
ровании петель хроматина и приводить к «вы-
петливанию» доменов, содержащих избегающие
инактивации гены, за пределы хромосомной
территории неактивной Х-хромосомы [Filippova
et al., 2005].
Однако эксперименты с использованием ре-
портерных генов показали, что наличия сайта свя-
зывания CTCF-фактора недостаточно для предот-
вращения распространения неактивного состоя-
ния [Ciavatta etal., 2006]. Дополнительным фак-
тором может быть структура хроматина (см.
рис. 15.6). Так, в районе между’ инактивирующим-
ся (RBM10) и избегающим инактивации (UBE1)
генами человека происходит значительное сниже-
ние уровня двух модификаций транскрипционно
неактивного хроматина: НЗК9теЗ и Н4К20теЗ
[Goto, Kimura, 2009; Berletch et al., 2010].
Обнаружено, что кластеры инактивирующих-
ся и избегающих инактивации генов различают-
ся составом геномной ДНК (см. рис. 15.6). Ранее
было высказано предположение, что LINE-1 яв-
ляются теми нуклеотидными последовательно-
стями Х-хромосомы, которые отвечают за рас-
пространение и усиление сигналов инактивации
[Lyon, 1998]. Анализ нуклеотидной последова-
тельности генома человека показал, что на Х-хро-
мосоме содержится в два раза больше LINE-1,
чем на аутосомах. LINE-1 распределены по
Х-хромосоме неслучайным образом: их наиболь-
шая плотность приходится на подвергающиеся
инактивации районы и XIC, тогда как плотность
LINE-1 в избегающих инактивации районах сни-
жена [Bailey etal., 2000; Carrel, Willard, 2005;
Ross etal., 2005]. Вероятно, в районах с низкой
плотностью LINE-1 инактивация не иницииру-
ется или же не может эффективно поддержи-
ваться [Bailey etal., 2000]. Относительно недав-
но появились данные о том, что LINE-1 необхо-
димы для формирования неактивной Х-хромосо-
мой гетерохроматинового ядерного компартмен-
та, в который включаются гены по мере их инак-
тивации. В процессе инактивации была обнару-
жена экспрессия молодых LINE-1, которые ло-
кализуются в избегающих инактивации районах,
но вблизи инактивирующихся генов. По всей
видимости, молодые LINE-1 принимают участие
в распространении неактивного состояния в дан-
ных районах Х-хромосомы [Chow etal., 2010].
Кроме того, у мыши и человека в избегающих
инактивации районах содержится меньше АТ-
богатых мотивов [Wang et al., 2006: Nguyen et al.,
2011]. Помимо низкого содержания LINE-1 и
АТ-богатых мотивов, в избегающих инактива-
ции доменах наблюдается обогащение Alu-пов-
торами, последовательностями ACG/CGT [Car-
rel, Willard, 2005; Wang et al., 2006], а также оли-
гонуклеотидными повторами [AT]n, [AC]n,
|AG]n и [GATA]n [McNeil etal., 2006]. Следова-
тельно. способность некоторых генов избегать
инактивации может быть связана не только с не-
достатком последовательностей, которые отве-
чают за стабильное поддержание инактивации,
но и с присутствием последовательностей, пре-
дотвращающих формирование неактивного со-
стояния хроматина.
Сравнение ортологичных кластеров Х-хромо-
сомы у’ человека и мыши показало, что если у
человека все гены данного кластера избегают
инактивации, то у мыши большинство генов
инактивированы, и лишь единичные гены экс-
прессируются на неактивной Х-хромосоме [Tsu-
chiya, Willard, 2000; Yang etal., 2010]. Профиль
инактивации генов в одном из таких кластеров
коррелирует с распределением LTR. Более высо-
кая плотность LTR характерна для кластера на
Х-хромосоме мыши, где практически все гены
подвергаются инактивации, в то время как в со-
ответствующем кластере на Х-хромосоме чело-
века, где все гены избегают инактивации, плот-
ность LTR снижена [Tsuchiya et al., 2004]. Таким
образом, наблюдается связь между' наличием/от-
сутствием определенных последовательностей
ДНК и статусом экспрессии генов неактивной X-
хромосомы. Разные последовательности могут
иметь разное сродство к Xist РНК и сопутствую-
щим факторам, обеспечивающим транскрипци-
онный сайленсинг. Однако какие факторы опре-
деляют эффективность распространения и/или
поддержания неактивного состояния в процессе
инактивации Х-хромосомы и каковы механизмы
их действия, на данный момент не известно.
398 ЭПИГЕНЕТИКА
При изучении некоторых избегающих инак-
тивации генов у мыши оказалось, что рядом с
ними локализуются гены длинных некодирую-
щих РНК, которые также избегают инактивации.
По-видимому, у мыши, как и у человека, избе-
гающие инактивации гены формируют домены,
хотя и значительно меньшие по размеру. Ге-
ны данных некодирующих РНК не найдены на
Х-хромосоме человека, но выявляются на Х-хро-
мосоме крысы, что поднимает вопрос об участии
длинных некодирующих РНК в регуляции избе-
гания инактивации у грызунов [Reinius et al.,
2010; Lopes etal., 2011]. Каким образом это мо-
жет происходить? Во-первых, экспрессия длин-
ных некодирующих РНК в избегающих инакти-
вации доменах может регулировать транскрип-
цию соседних белок-кодирующих генов посред-
ством механизма, включающего расслабление ну -
клеосомных комплексов, увеличивающего до-
ступность хроматина для транскрипции и связы-
вание активирующих транскрипцию факторов.
Во-вторых, длинные некодирующие РНК могут
влиять на перемещение избегающих инактивации
доменов в транскрипционно активные компар-
тменты ядра. Кроме того, транскрипция длинных
нскодирующих РНК может обеспечивать форми-
Рис. 15.7. Организация Х-хромосом человека и мыши.
XCR — консервативный район Х-хромосомы, XAR — добав-
ленный район Х-хромосомы, сел — центромера, ПАР —
псевдоаутосомный район, ПАР1 — псевдоаутосомный район
короткого плеча Х-хромосомы человека, ПАР2 — псевдо-
аутосомный район длинного плеча Х-хромосомы человека,
1—5 — эволюционные страты Х-хромосомы.
рование границы между активным и неактивным
хроматином и препятствовать распространению
неактивного состояния в избегающие инактива-
ции домены [Reinius et al., 2010]. Однако не сле-
дует исключать, что гены длинных некодирую-
щих РНК могут не участвовать в регуляции экс-
прессии генов Х-хромосомы и подвергаться дей-
ствию механизмов, препятствующих установле-
нию неактивного состояния, наряд}' с другими
избегающими инактивации генами.
В литературе также обсуждается вопрос о
влиянии на экспрессию генов Х-хромосомы при-
центромерного гетерохроматина, который может
служить препятствием для распространения сиг-
нала инактивации (рис. 15.7) [Disteche, 1999].
В пользу данного предположения свидетельст-
вует тот факт, что прицентромерный гетерохро-
матин, а также крупные блоки конститутивного
гетерохроматина на Х-хромосомах грызунов не
связываются с Xist РНК в процессе инактивации
[Duthie etal., 1999]. Действительно, длинное
плечо Х-хромосомы человека, где локализуется
XIC, содержит небольшое количество избегаю-
щих инактивации генов, тогда как в коротком
плече избегающие инактивации гены образуют
целый ряд кластеров. У мыши Х-хромосома ак-
роцентрическая, и все ее гены находятся на од-
ном плече с XIC, что согласуется с небольшим
количеством избегающих инактивации генов
[Disteche. 1999]. Однако способность генов ко-
роткого плеча Х-хромосомы человека избегать
инактивации может быть обусловлена не столь-
ко влиянием прицентромерного гетерохромати-
на, сколько тем, что эти гены находятся в моло-
дых эволюционных стратах Х-хромосомы. В не-
скольких исследованиях достаточно четко про-
слеживается корреляция между числом избе-
гающих инактивации генов, возрастом эволюци-
онных страт, в которых они локализуются, а
также существованием Y-гомологов этих генов
[Jegalian, Page, 1998; Carrel, Willard, 2005; Yen
et al., 2007].
Х-хромосома человека считается наиболее
близкой к предковой Х-хромосоме плацентар-
ных млекопитающих, поскольку’ эволюционные
страты расположены вдоль нее в том же поряд-
ке. в каком они возникали в процессе эволюции
половых хромосом. У человека первая эволюци-
онная страта полностью занимает длинное плечо
Х-хромосомы, в то время как все остальные
страты приходятся на короткое плечо [Lahn,
Page, 1999; Ross et al., 2005]. Х-хромосома мыши
является одной из самых перестроенных относи-
тельно Х-хромосомы человека (см. рис. 15.7).
ГЛАВА 15 399
Порядок расположения эволюционных страт
вдоль мышиной Х-хромосомы сильно нарушен,
в хромосомные перестройки вовлечены все стра-
ты, независимо от возраста [Disteche et al., 1998],
при этом мышиная Х-хромосома содержит го-
раздо меньшее число избегающих инактивации
генов. Возможно, именно хромосомными пере-
стройками объясняется столь сильное различие в
числе избегающих инактивации генов у мыши и
человека.
* * *
Многие аспекты, связанные с регуляцией
экспрессии генов Х-хромосомы у млекопитаю-
щих, до сих пор остаются неизученными. Несо-
мненный интерес представляет вопрос о меха-
низмах удвоения уровня экспрессии генов на ак-
тивной Х-хромосоме, решение которого будет
ключом к пониманию феномена дозовой ком-
пенсации у млекопитающих. Кроме того, оста-
ются открытыми вопросы о том. какие гены X-
хромосомы на самом деле нуждаются в дозовой
компенсации и какие факторы определяют эф-
фективность распространения и/или поддержа-
ния неактивного состояния в различных районах
Х-хромосомы.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Шевченко .1. II.. Павлова С. В.. Дементьева Е. В.. Голубе-
ва Д. В., Закиян С. AL. Модификации хроматина в про-
цессе инактивации Х-хромосомы у самок млекопитаю-
щих // Генетика. 2006. Т. 42, № 9. С. 1225—1234.
Adler D. A., RugarliЕ. I., Lingenfelter Р. A., Tsuchiya К., Pos-
UnskiD., Liggitt Н. D., Chapman Г. AL, Elliott R. IT., Bal-
labioA., Disteche C. AL Evidence of evolutionary up-re-
gulation of the single active X chromosome in mammals
based on Clc4 expression levels in Mus spretus and Mus
musculusll Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. Vol. 94.
P. 9244—9248.
Akhtar A. Dosage compensation: an intertwined world of RNA
and chromatin remodelling // Curr. Opin. Genet. Dev.
2003. Vol. 13. P. 161—169.
BacherC.P., GuggiariAL, BrorsB., Augui S., Clerc P., .4v-
nerP., EilsR., HeardE. Transient colocalization ofX-ina-
ctivation centres accompanies the initiation of X inactiva-
tion n Nat. Cell Biol. 2006. Vol. 8. P. 293—299.
Bailey J. A.. CarrelL.. Chakravarti A.. Eichler E. E. Molecular
evidence for a relationship between LINE-1 elements and
X chromosome inactivation: the Lyon repeat hypothesis //
Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. Vol. 97.’ P. 6634—
6639.
BerletchJ. B., YangF, Disteche C. Al. Escape from X inactiva-
tion in mice and humans// Genome Biol. 2010. Vol. 11.
P. 213.
Boggs B. A., CheungP., HeardE., Spector D. L., Chinault A. C,
Allis C. D. Differentially methylated forms of histone H3
show unique association patterns with inactive human X
chromosomes // Nat. Genet. 2002. Vol. 30. P. 73—76.
Brown C. J.. Greatly J. AL A stain upon the silence: genes es-
caping X inactivation11 Trends Genet. 2003. Vol. 19.
P. 432 438.
CaoR, Zhang Г The functions of E(Z)/EZH2-mediated methy-
lation of lysine 27 in histone H3 // Curr. Opin. Genet. Dev.
2004. Vol. 14. P. 155—164.
Carrel L., Willard H. F. X-inactivation profile reveals extensive
variability in X-linked gene expression in females // Na-
ture. 2005. Vol. 434. P. 400 404.
CarrelL., Clemson C. AL, Dunn J. AL., ALiller A. P„ HuntP. A.,
Lawrence J. B., WillardH. F. X inactivation analysis and
DNA methylation studies of the ubiquitin activating en-
zyme El and PCTAIRE-1 genes in human and mouse //
Hum. Mol. Genet. 1996. Vol. 5. P. 391^101.
Carrel L., Cottle A. A., Goglin К. C, WillardH. F. A first-gene-
ration X-inactivation profile of the human X chromoso-
me// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. Vol. 96.
p. 14440—14444.
Charlesworth B. The evolution of sex chromosomes // Science.
1991. Vol. 251. P. 1030—1033.
Charlesworth B. The evolution of chromosomal sex determina-
tion and dosage compensation // Curr. Biol. 1996. Vol. 6.
P. 149—162.
Chiba H, HirasawaR, KanedaAL, Amakawa Y., Li E., Sa-
do T., Sasaki H. De novo DNA methylation independent
establishment of maternal imprint on X chromosome in
mouse oocytes // Genesis. 2008. Vol. 46, N 12. spc one.
Chow J. ( ., CiaudoC, FazzariALJ, ALise N, ServantN,
Glass J. L., AttreedAL, AvnerP., WntzA., BarillotE., Gre-
atly J. AL, J’ohmetO., HeardE. LINE-1 activity' in faculta-
tive heterochromatin formation during X chromosome in-
activation 11 Cell. 2010. Vol. 141. P. 956—969.
Ciavatta D., Kalantry S., Magnuson T, Smithies O. A DNA in-
sulator prevents repression of a targeted X-linked trans-
gene but not its random or imprinted X inactivation //
Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. Vol. 103. P. 9958—
9963.
Ciccodicola A., D'Esposito AL., EspositoT., Gianfrancesco F,
ALigliaccio C., ALianoAL. G., ALatarazzoAL. R, Dacca AL,
Frunze A., Cuccurese AL, Cocchia AL, Card A., Terrac-
cianoA., Torino A., Cocchia S., ALercadante G., Panno-
ne E., Archidiacono N., Rocchi AL, Schlessinger D., D'Vr-
soAL. Differentially regulated and evolved genes in the
fully sequenced Xq/Yq pseudoautosomal region // Hum.
Mol. Genet. 2000. Vol. 9. P. 395^101.
DandoloL., StewartC. L., ALatteiAL. G, AvnerP. R. Inactivation
of an X-linked transgene in murine extraembryonic and
adult tissues // Development. 1993. Vol. 118. P. б41—649.
de NapolesAL., ALermoud J. E., WakaoR, Tang Y. A., En-
doh AL, Appanah R, Nesterova T. B., Silva J., Otte A. P.,
Vidal AL.. Koseki H. Brockdorff N. Polycomb group pro-
teins RinglA/B link ubiquitylation of histone H2A to heri-
table gene silencing and X inactivation // Dev. Cell. 2004.
Vol. 7. P. 663—676.
de NapolesAL., Nesterova T, BrockdorffN. Early loss of Xist
RNA expression and inactive X chromosome associated
chromatin modification in developing primordial germ
cells 11 PLoS One. 2007. Vol. 2. P. e860.
Dementyeva E. V., Shevchenko A. I., Anopriyenko О. V., ALazu-
rokN.A.. Elisaphenko E. A.. Nesterova T. B.. Brock-
dorffN, ZakianS.AL. Difference between random and
imprinted X inactivation in common voles // Chromo-
soma. 2010. Vol. 119. P. 541—552.
Dementyeva E. V., Shevchenko A. I., ZakianS.AL. X-chromo-
some upregulation and inactivation: two sides of the dos-
age compensation mechanism in mammals // Bioessays.
2009. Vol. 31. P. 21 -28.
DengX., Hiatt J. B., Nguyen D. K., ErcanS., Sturgill D., Hill-
ier L. W., Schlesinger F., Davis C. A., Reinke V. J., Gin-
400 ЭПИГЕНЕТИКА
gerasT.R.. ShendureJ., WaterstonR. H. OliverB..
Lieb J. D., Disteche C. Al. Evidence for compensatory
upregulation of expressed X-linked genes in mammals,
Caenorhabditis elegans and Drosophila melanogaster /'
Nat. Genet. 2011. Vol. 43. P. 1179- -1185.
Disteche C. AL Escape from X inactivation in human and
mouse // Trends Genet. 1995. Vol. 11. P. 17 -22.
Disteche C. AL Escapees on the X chromosome 'z Proc. Natl.
Acad. Sci. USA. 1999. Vol. 96. P. 14180—14182.
Disteche C. AI., DinulosAL. B„ BassiAL. T„ ElliottR. W.f Ru-
garli E. I. Mapping of the murine tbll gene reveals a new
rearrangement between mouse and human X Chromo-
somes // Mamm. Genome. 1998. Vol. 9. P. 1062—1064.
Disteche C. AI., Filippova G. N, Tsuchiya K. D. Escape from X
inactivation // Cvtogenet. Genome Res. 2002. Vol. 99.
P. 36 43.
DuthieS. AL. Nesterova T. B.. Formstone E. J., Keohane A. AL.
Turner B. AI., Zakian S. AI., BrockdorffN. Xist RNA ex-
hibits a banded localization on the inactive X chromosome
and is excluded from autosomal material in cis // Hum.
Mol. Genet. 1999. Vol. 8. P. 195—204.
Ellegren H, Hultin-RosenbergL., Bnmstrom B., Dencker L.,
Kultima K., Scholz B. Faced with inequality': chicken do
not have a general dosage compensation of sex-linked
genes // BMC Biol. 2007. Vol. 5. P. 40.
Erwin J. A., Lee J. T. New twists in X-chromosome inactiva-
tion " Curr. Opin. Cell Biol. 2008. Vol. 20. P. 349—355.
Escamilla-Del-ArenalAL, da Rocha S. T, HeardE. Evolutionary
diversity' and developmental regulation of X-chromosome
inactivation 1 Hum. Genet. 2011. Vol. 130. P. 307—327.
Fang J., ChenT., Chadwick B., Li E., ZhangY. Ringlb-media-
ted H2A ubiquitination associates with inactive X chro-
mosomes and is involved in initiation of X inactivation '/
J. Biol. Chem. 2004. Vol. 279. P. 52812—52815.
Filippova G. N., ChengAI. K. ALoore J. AL. Truong J. P., Hu 1. J..
Nguyen D. K, Tsuchiya K. D., Disteche C. AI. Boundaries
between chromosomal domains of X inactivation and escape
bind CTCF and lack CpG methylation during early' deve-
lopment 11 Dev. Cell. 2005. Vol. 8’ P. 31 42.
Gilbert S. L, Sharp P. A. Promoter-specific hypoacetylation of
X-inactivated genes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999.
Vol. 96. P. 13825—13830.
Goldman AL A., Stokes ER, Idzerda R L., AIcKnightG. S.,
Hammer RE.. BrinsterR. L.. GartlerS.AI. A chicken
transferrin gene in transgenic mice escapes X-chromosome
inactivation " Science. 1987. Vol. 236. P. 593—595.
Goto E, Kimura H. Inactive X chromosome-specific histone H3
modifications and CpG hypomethylation flank a chroma-
tin boundary' between an X-inactivated and an escape
gene // Nucleic Acids Res. 2009. Vol. 37. P. 7416 7428.
Goto T. AIonkAI. Regulation of X-chromosome inactivation in
development in mice and humans // Microbiol. Mol. Biol.
Rev. 1998. Vol. 62. P. 362—378.
Graves J. .1. The origin and function of the mammalian Y
chromosome and Y-borne genes—an evolving under-
standing // Bioessays. 1995. Vol. 17. P. 311—320.
Graves J. A., Disteche C. AL Does gene dosage really matter? 11
J. Biol. 2007. Vol. 6. P. 1.
Gupta V., Parisi AL, Sturgill D., Nuttall R, DoctoleroAL,
Dudko О. K. Alalley J. D.. Eastman P. S.. Oliver B. Glo-
bal analysis of X-chromosome dosage compensation // J.
Biol. 2006. Vol. 5. P. 3.
Hadjantonakis A. K, CoxL.L., TamP.P., Nagy A. An X-lin-
ked GFP transgene reveals unexpected paternal X-chro-
mosome activity' in trophoblastic giant cells of the mouse
placenta 11 Genesis. 200E Vol. 29. P. 133—140.
Heard E. Delving into the diversity' of facultative heterochro-
matin: the epigenetics of the inactive X chromosome //
Curr. Opin. Genet. Dev. 2005. Vol. 15. P. 482 489.
HeardE.. Disteche C. AI. Dosage compensation in mammals:
fine-tuning the expression of the X chromosome // Genes
Dev. 2006. Vol. 20. P. 1848—1867.
Hellman A., Chess A. Gene body-specific methylation on the ac-
tive X chromosome " Science. 2007. Vol. 315. P. 1141—
1143.
HuntP. .1. Survival of XO mouse fetuses: effect of parental ori-
gin of the X chromosome or uterine environment? // De-
velopment. 199E Vol. 111. P. 1137—1141.
Huynh K. D., Lee J. T. Inheritance of a pre-inactivated paternal
X chromosome in early' mouse embryos /7 Nature. 2003.
Vol. 426. P. 857—862.’
ItohY., AlelamedE., YangX., KampfK, WangS., YeltyaN.,
VanNasA., Replogle K, Band AL R, Clayton D. F,
Schadt E. E., LusisA. J., Arnold A. P. Dosage compensation
is less effective in birds than in mammals // J. Biol. 2007.
Vol. 6. P. 2.
Jegalian K, PageD. C. A proposed path by which genes com-
mon to mammalian X and Y chromosomes evolve to be-
come X inactivated 11 Nature. 1998. Vol. 394. P. 776—780.
Johnston C. AL, Lovell F. L., Leongamornlert D. A., Stran-
ger В. E., Dermitzakis E. T, Ross Al. T. Large-scale popu-
lation study of human cell lines indicates that dosage
compensation is virtually' complete // PLoS Genet. 2008.
Vol. 4. P. e9.
Khalil A. AL. Driscoll D. J. Trimethylation of histone H3 lysine
4 is an epigenetic mark at regions escaping mammalian X
inactivation // Epigenetics. 2007. Vol. 2. P. 114—118.
Koopman P., Gubbay J., ITvianN., Goodfellow P., Lovell-Bad-
geR. Male development of chromosomally female mice
transgenic for Sry // Nature. 1991. Vol. 351. P. 117—121.
Krumlauf R., Chapman V. AL, HammerR E., BrinsterR, Til-
ghmanS. AL Differential expression of alpha-fetoprotein
genes on the inactive X chromosome in extraembryonic
and somatic tissues of a transgenic mouse line // Nature.
1986. Vol. 319. P. 224—226.
Kucera K. S., Reddy T. E., Pauli F, Gertz J., Logan J. E., Aly-
ersRAL, WillardH. F. Allele-specific distribution of
RNA polymerase II on female X chromosomes // Hum.
Mol. Genet. 2011. Vol. 20. P. 3964—3973.
Kvaloy K, GalvagniF., Brown W. R. The sequence organiza-
tion of the long arm pseudoautosomal region of the human
sex chromosomes // Hum. Mol. Genet. 1994. Vol. 3.
P. 771—778.
Lahn В. T, Page D. C. Four evolutionary strata on the human X
chromosome // Science. 1999. Vol. 286. P. 964—967.
Lin H, Gupta F., Vermilyea AL D., FalcianiE, LeeJ.T.,
O'NeillL. P., Turner B. AI. Dosage compensation in the
mouse balances up-regulation and silencing of X-linked
genes // PLoS Biol. 2007. Vol. 5. P. e326.
Lopes A. AL. Arnold-Croop S. E.. Amorim A.. Carrel L. Clus-
tered transcripts that escape X inactivation at mouse
XqD 11 Mamm. Genome. 2011. Vol. 22. P. 572—582.
Luoh S. W, Jegalian K, Lee A., ChenE.Y., Ridley A., Pa-
ge D. C. CpG islands in human ZFX and ZFY and mouse
Zfx genes: sequence similarities and methylation differ-
ences // Genomics. 1995. Vol. 29. P. 353—363.
Lyon AL. F. X-chromosome inactivation: a repeat hypothesis/7
Cytogenet. Cell Genet. 1998. Vol. 80. P. 133 137.
AlakW.. Nesterova T. B.. de NapolesAL, AppanahR, Yama-
naka S., OtteA.P., BrockdorffN. Reactivation of the pa-
ternal X chromosome in early mouse embiyos // Science.
2004. Vol. 303. P. 666—669.
Alatarazzo AL R, Boyle S., D'Esposito AL, Bickmore W A.
Chromosome territory reorganization in a human disease
with altered DNA methylation // Proc. Natl. Acad. Sci.
USA. 2007. Vol. 104. P. 16546—16551.
Alatarazzo AL R, De Bonis AL L, Gregory R. I., VaccaAI.,
Hansen R S., Alercadante G., D'Urso AL, FeilR, D'Espo-
ГЛАВА 15 401
sitoAL. Allelic inactivation of the pseudoautosomal gene
SYBL1 is controlled by epigenetic mechanisms common
to the X and Y chromosomes // Hum. Mol. Genet. 2002.
Vol. 11. P. 3191—3198.
McNeil J. A., Smith К. P., HallL.L., Lawrence J. B. Word fre-
quency analysis reveals enrichment of dinucleotide repeats
on the human X chromosome and [GATA]n in the X es-
cape region 11 Genome Res. 2006. Vol. 16. P. 477—484.
Mohandas T. K, SpeedP AL, Passage M. B., Yen P. H, Chan-
dleyA. C, Shapiro L. J. Role of the pseudoautosomal re-
gion in sex-chromosome pairing during male meiosis:
meiotic studies in a man with a deletion of distal Xp //
Am. J. Hum. Genet. 1992. Vol. 51. P. 526—533.
Mondello C, Goodfellow P. J., Goodfellow P. N. Analysis of me-
thylation of a human X located gene which escapes X inac-
tivation // Nucleic Acids Res. 1988. Vol. 16. P. 6813
6824.
ALueller J. L., ALahadevaiah S. K, ParkP. J., Warburton P. E.,
PageD. C, Turner J. AL. The mouse X chromosome is en-
riched for multicopy testis genes showing postmeiotic ex-
pression 11 Nat. Genet. 2008. Vol. 40. P. 794—799.
Murakami K, OhhiraT., Oshiro E., Qi D., OshimuraM., Ku-
goh H. Identification of the chromatin regions coated by
non-coding Xist RNA // Cytogenet. Genome Res. 2009.
Vol. 125. P. 19—25.
Navarro P., PichardS.. Ciaudo C. AvnerP.. Rougeulle C. Tsix
transcription across the Xist gene alters chromatin con-
formation without affecting Xist transcription: implica-
tions for X-chromosome inactivation U Genes Dev. 2005.
Vol. 19. P. 1474—1484.
Nguyen D. K, Disteche C. AL. Dosage compensation of the ac-
tive X chromosome in mammals // Nat. Genet. 2006.
Vol. 38. P. 47—53.
Nguyen D. K., YangF, Kaul R., AlkanC, Antonellis A., Bri-
ery K. F.. Zhu B.. de JongP. J.. Disteche C. AL. Clcn4-2
genomic structure differs between the X locus in ALus
spretus and the autosomal locus in ALus musculus: AT mo-
tif enrichment on the X// Genome Res. 2011. Vol. 21.
P. 402 409.
Ogata T., Alatsuo N. Turner syndrome and female sex chromo-
some aberrations: deduction of the principal factors in-
volved in the development of clinical features // Hum.
Genet. 1995. Vol. 95. P. 607—629.
OhnoS. Sex chromosomes and sex-linked genes. Berlin:
Springer-Verlag, 1967. 192 p.
Okamoto I., Otte A. P., Allis C.D., ReinbergD., HeardE. Epige-
netic dynamics of imprinted X inactivation during early
mouse development 11 Science. 2004. Vol. 303. P. 644—649.
Patrat C., Okamoto I., Diabangouaya P., Bialon F, Le Bac-
con P., Chow J., HeardE. Dynamic changes in paternal
X-chromosome activity during imprinted X-chromosome
inactivation in mice // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2009.
Vol. 106. P. 5198—5203.
Reinius B., Shi C, Hengshuo L., Sandhu K. S., Radomska K. J.,
Rosen G. D., LuL., Kullander K, Williams R. W., Jazin E.
Female-biased expression of long non-coding RNAs in
domains that escape X-inactivation in mouse // BMC Ge-
nomics. 2010. Vol. 11. P. 614.
Ross ALT., GrafhamD.F, Coffey A. J., SchererS., ALcLayK,
ALuznyD.. Platzer AL, Howell G. R, Burrows C. Bird С. P.,
Frankish A., Lovell F.L., HoweK.L., AshurstJ.L., Ful-
ton R. S„ SudbrakR., WenG, Jones AL. C„ HurlesAL.E.,
Andrews T. D., Scott С. E., Searle S., RamserJ., Whit-
taker A., Deadman R., Carter N.P., HuntS.E., Chen R,
Cree A., GunaratneP., HavlakP., Hodgson A., ALetz-
kerALL., Richards S., Scott G., Steffen D., Sodergren E.,
Wheeler D. A., Worley К. C, AinscoughR, Ambrose K. D.,
Ansari-Lari AL. A., Aradhya S., Ashwell BL., Babba-
ge A. K., Bagguley C. L., BallabioA.. Banerjee B, Bar-
ker G.E.. Barlow K. F. Barrett L.P., Bates K. N., Bea-
reD.AL, Beasley H, Beasley O., Beck A., Bethel G., Ble-
chschmidl K, Brady N., Bray-Allen S., Bridgeman A. AL,
Brown A. J., Brown AL. J., Bonnin D., BrufordE. A., Bu-
hay C, Burch P., BurfordD., Burgess J., Burrill W., Bur-
ton J., Bye J. AL., Carder C., Carrel L., ChakoJ., Chap-
man J. C., Chavez D., ChenE., ChenG., ChenY., Chen Z.,
ChinaultC. Ciccodicola A., ClarkS. Y., Clarke G..
CleeC.AL., CleggS., Clerc-BlankenburgK., CliffordK.,
CobleyV., ColeC.G., Conquer J. S., Corby N„ Con-
nor В E., DavidB, Denies J., Davis C., Davis J., Delga-
do O., DeshazoD., DhamiP., Ding Y., Dinh H, Dods-
worth S., Draper H., Dugan-Rocha S., DimhctmA.,
Dunn AL, Durbin K. J., DuttaL., EadesT., EllwoodAL,
Emery-Cohen A., Errington H, Events K. L., Faulkner L.,
Francis F, FranklandJ., Fraser A. E., Galgoczy P., Gil-
bert J., GillB, Glockner G., GregoryS. G.. Gribble S..
Griffiths C., GrocockB, GuY., Gwilliam B, Hamilton C,
Hart E. A., Hawes A., Heath P. D„ Heitmann K, Hen-
nigS., Hernandez J., Hinzmann B., HoS., Hoffs AL, How-
den P. J., Huckle E. J., Hume J., Hunt P. J., Hunt .1. B,
IsherwoodJ., JacobL, JohnsonD., JonesS., de JongP. J.,
Joseph S. S., Keenan S., Kelly S., Kershaw J. K, Khan Z.,
KioschisP., KlagesS., Knights.1. J., KosiuraA., Kovar-
Smith C, Laird G. K, Langford C, Lawlor S., Lever-
shaAL, LewisL. Liu W. LloydC., LloydD. AL. Lou-
IsegedH, Loveland J. E., Lovell J. D., LozadoB, Lu J.,
LyneB, ALa J., ALaheshwariAL, ALatthewsL. H,
ALcDowall J., ALcLaren S., ALcALurray A., ALeidlP., ALeit-
ingerT., ALilneS., ALinerG., AListry S. L., ALorganAL,
ALorrisS., Alullerl., ALullikin J. C, Nguyen N, Nord-
siekG., Nyakatura G., ODell C. N., Okwuonu G., Pal-
mer S., PandiemB, ParkerD., ParrishJ., PasternakS.,
Patel D., Pearce A. F, Pearson D. AL, Pelem S. E., Pe-
rezL., Porter K. AL. Ramsey Y.. ReichwaldK, RhodesS..
Ridler K. A., Schlessinger D., Schueler AL. G., Sehra H. K,
Shaw-Smith C, ShenH, SheridanE. AL, ShownkeenB.,
Skuce C. D., Smith AL. L, Sotheran E. C, Steingruber H. E.,
Steward C. A., Storey B, Swann B. AL, SwarbreckD., Ta-
bor P. E., TaudienS., Taylor T., Teague B., Thomas K,
Thorpe A., Timms K, Tracey A., Trevanion S., Tro-
mansA.C, dl'rsoAL, FerduzcoD., Fillasana D., Wal-
dron L., Wall AL, WangQ., Warren J., Worry G.L.,
Wei X.. West A.. Whitehead S. L.. Whiteley AL. N.. Wilkin-
son J. E., Willey D. L., Williams G., Williams L., William-
son A., Williamson H., WilmingL., Woodmansey В L.,
WrayP. W., Yen J, Zhang J, Zhou J., Zoghbi H, Zoril-
la S., BuckD., Reinhardt B, Poustka A., Rosenthal A., Le-
hrach H, Meindl A., ALinxP.J., Hillier L. W., Wil-
lard H. F., Wilson R. K, Waterston В. H, Rice C. AL,
Boudin AL. Coulson A.. Nelson D.L., Weinstock G.. Sul-
stonJ.E., DurbinR., HubbardT., GibbsRA., BeckS.,
Rogers J., Bentley D. R. The DNA sequence of the human
X chromosome // Nature. 2005. Vol. 434. P. 325—337.
Sado T, Hoki E, Sasaki H. Tsix silences Xist through modifica-
tion of chromatin structure // Dev. Cell. 2005. Vol. 9.
P. 159—165.
Sharp A. J., Stathaki E., ALigliavacca E., Brahmachary AL,
ALontgomery S. B., Dupre Y., Antonarakis S. E. DNA me-
thylation profiles of human active and inactive X chromo-
somes // Genome Res. 2011. Vol. 21. P. 1592—1600.
Silva J., ALakW., Zvetkova l„ Appanah R, Nesterova T. B„
Webster Z., Peters .1. H, JenuweinT., Otte A. P., Brock-
dorffN. Establishment of histone h3 methylation on the
inactive X chromosome requires transient recruitment of
Eed-Enxl polycomb group complexes // Dev. Cell. 2003.
Vol. 4. P. 481—-495.
Skaletsky H, Kuroda-Kawaguchi T, ALinxP. J., Cordum H. S.,
HillierL., BrownL. G., ReppingS., PyntikovaT., AliJ.,
402 ЭПИГЕНЕТИКА
BieriT.. Chinwalla A., Delehaunty A.. Delehaunty K..
DuH., FewellG., Fulton L., Fulton R, Graves T,
Hou S. F, Latrielle P., LeonardS., AlardisE., Maupin R.,
McPherson J., Miner T., Nash JJ'., Nguyen C., Ozersky P.,
Pepin K., RockS., RohlfingT., Scott K., Schultz B.,
StrongC., Tin-JJ’ollam A., YangS.P., JJ'aterstonR. H.,
JJ’ilson R. K., Rozen S., Page D. C. The male-specific re-
gion of the human Y chromosome is a mosaic of discrete
sequence classes " Nature. 2003. Vol. 423. P. 825—837.
SunB.K., Deaton A. AL, Lee J. T. A transient heterochromatic
state in Xist preempts X inactivation choice without RNA
stabilization // Mol. Cell. 2006. Vol. 21. P. 617—628.
Tsuchiya K. D., Greatly J. Al., 171., NoelK.P., Truong J. P.,
Disteche C. AL Comparative sequence and x-inactivation
analyses of a domain of escape in human xpll.2 and the
conserved segment in mouse 11 Genome Res. 2004.
Vol. 14. P. 1275—1284.
Tsuchiya K. D., JJ’illard H. F. Chromosomal domains and es-
cape from X inactivation: comparative X inactivation
analysis in mouse and human // Mamm. Genome. 2000.
Vol.’ 11. P. 849—854.
Turner J. Al. Meiotic sex chromosome inactivation// Develop-
ment. 2007. Vol. 134. P. 1823—1831.
JJ’angP. J., PageD. C., AIcCarrey J. R. Differential expression
of sex-linked and autosomal germ-cell-specific genes dur-
ing spermatogenesis in the mouse // Hum. Mol. Genet.
2005. Vol. 14. P. 2911—2918.
JJ’angZ., JJ’illardH. F, Alukherjee S., Furey T. S. Evidence of
influence of genomic DNA sequence on human X chro-
mosome inactivation // PLoS Comput. Biol. 2006. Vol. 2.
P. el 13.
JJ’ilcox S. A.. JJ’atson J. AL. Spencer J. A.. Graves J. A. Com-
parative mapping identifies the fusion point of an ancient
mammalian X-autosomal rearrangement // Genomics.
1996. Vol. 35. P. 66—70.
JJ’u H., FasslerR, SchniekeA., Barker D., Lee К. H., Chap-
man J’., Francke U., Jaenisch R. An X-linked human col-
lagen transgene escapes X inactivation in a subset of
cells /'Development. 1992. Vol. 116. P. 687—695.
Xu J., JJ’atkinsR., Arnold A. P. Sexually dimorphic expression
of the X-linked gene Eit2s3x mRNA but not protein in
mouse brain // Gene Expr. Patterns. 2006. Vol. 6. P. 146—
155.
Xu N, Tsai C. L., Lee J. T. Transient homologous chromosome
pairing marks the onset of X inactivation " Science. 2006.
Vol. 311. P. 1149—1152.
YangF., Babak T, Shendure J., Disteche C. Al. Global survey
of escape from X inactivation by RNA-sequencing in
mouse // Genome Res. 2010. Vol. 20. P. 614—622.
Yen Z. C., Aleyerl. Al., Karalic S., Brown C. J. A cross-species
comparison of X-chromosome inactivation in Eutheria //
Genomics. 2007. Vol. 90. P. 453 463.
Yildirim E., Sadreyev R 1, Pinter S. F, Lee J. T. X-chromo-
some hyperactivation in mammals via nonlinear relation-
ships between chromatin states and transcription 11 Nat.
Struct. Mol. Biol. 2011. Vol. 19. P. 56—61.
Zha X.. Xia Q„ Duan J.. JJ’angC.. HeN. Xiang Z. Dosage
analysis of Z chromosome genes using microarray in silk-
worm, Bombyx mori // Insect. Biochem. Mol. Biol. 2009.
Vol. 39. P. 315—321.
Zinn A. R., PageD. C., Fisher E. AL Turner syndrome: the case
of the missing sex chromosome // Trends Genet. 1993.
Vol. 9. P. 90—93.
ГЛАВА
16
СТРУКТУРА И ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ
ЦЕНТРА ИНАКТИВАЦИИ Х-ХРОМОСОМЫ
МЛЕКОПИТАЮЩИХ
СОДЕРЖАНИЕ
16.1. Строение центра инактивации X-
хромосомы, 404
16.2. Гены и генетические элементы
центра инактивации, контролирую-
щие процесс инактивации Х-хромо-
сомы, 406
16.3. Генетическая регуляция процесса
инактивации Х-хромосомы, 408
16.4. Модели случайной инактивации X-
хромосомы, 412
Список литературы, 415
404 ЭПИГЕНЕТИКА
Центром инактивации Х-хромосомы (XIC)
называют локус, содержащий гены и генетичес-
кие элементы, контролирующие процесс транс-
крипционного выключения генов Х-хромосомы.
В структуре XIC мыши выявлено одиннадцать
генов, четыре из которых (Xist, Tsix, Fix и Енох
(Jpx)) кодируют нетранслируемые ядерные РНК.
Кроме того, обнаружен ряд регуляторных облас-
тей, оказывающих влияние на транскрипцию Xist
и Tsix. Гены Xist и Tsix являются основными
участниками процесса инактивации Х-хромо-
сомы. РНК Xist распространяется вдоль Х-хро-
мосомы, с которой синтезируется, способствуя
ее инактивации. Транскрипция гена Tsix на вто-
рой Х-хромосоме препятствует синтезу РНК Xist
в г/г/с-положении, и Х-хромосома остается актив-
ной. Механизмы репрессии гена Xist пока до
конца не выяснены. Исследователями показано
участие множества факторов и генетических эле-
ментов на разных стадиях процесса инактивации
Х-хромосомы, предложено несколько моделей
инициации случайной инактивации Х-хро-
мосомы.
16.1. Строение центра инактивации
Х-хромосомы
Инактивация Х-хромосомы — это процесс,
при котором в раннем эмбриогенезе у самок
млекопитающих одна из генетически эквива-
лентных Х-хромосом претерпевает ряд преобра-
зований и становится транскрипционно неактив-
ной (Xi) [Lyon, 1961]. На предымплантационных
стадиях развития эмбриона происходит имприн-
тированная инактивация Х-хромосомы, унасле-
дованной от отца (Хр), которая сохраняется да-
лее в трофоэктодерме, экстраэмбриональной эн-
тодерме и их производных. Предполагают, что
импринтированная инактивация является эво-
люционно ранним приобретением эукариот, так
как наблюдается у сумчатых млекопитающих
[Cooper et al., 1990]. В клетках эпибласта во вре-
мя имплантации эмбриона происходят реактива-
ция Хр и последующий процесс случайной
инактивации либо отцовской, либо материнской
Х-хромосомы [Lyon, 1974; Takagi, Sasaki, 1975;
Cooper et al., 1990].
Инактивированная Х-хромосома плотно упа-
кована и генетически неактивна на протяжении
всего клеточного цикла, под микроскопом выяв-
ляется как тельце Барра [Barr, Bertram, 1949].
Такая плотно упакованная структу’ра из ДНК,
белков и РНК препятствует работе генов неак-
тивной Х-хромосомы (Xi). Кроме того, Xi под-
вергается серии биохимических преобразований,
основными из которых считают ковалентные
модификации аминокислот на N-концах гисто-
нов, обогащение ее особым вариантом гистона
Н2А — макроН2А1.2. а также метилирование
ДНК по CpG-островкам и премоторным районам
генов [Costanzi, Pehrson, 1998; Brockdorff, 2002;
Mermoud etal., 2002]. При делении клеток хро-
мосома Xi реплицируется позже, чем все осталь-
ные хромосомы (аутосомы и активная Х-хро-
мосома (Ха)) [Takagi et al., 1978].
Одновременно с репликацией ДНК хромосо-
мы Xi копируются ее метильные «метки», и не-
активная структура хроматина, сформированная
на ранних стадиях развития, восстанавливается,
т. е. неактивное состояние генов наследуются.
Таким образом, установившись однажды в эмб-
риогенезе, неактивное состояние Xi хромосомы
передается дочерним клеткам во всех после-
дующих клеточных генерациях [Brown, Willard,
1994].
Процесс инактивации контролируется слож-
ным генетическим локусом Х-хромосомы —
центром инактивации (XIC), который отвечает за
координированное выключение генов по всей
Х-хромосоме [Sefton etal., 1992]. Инактивация
Х-хромосомы начинается от локуса XIC, и далее
сигнал инактивации распространяется вдоль
всей хромосомы.
Доказательства существования единственного
локуса, отвечающего за инактивацию Х-хромо-
сомы, были получены в экспериментах на мы-
шах с Х-аутосомными транслокациями [Rastan,
Robertson, 1985]. Было обнаружено, что только
одна часть Х-хромосомы размером от 680 до
1200 т.п.н., разделенной реципрокной трансло-
кацией, способна инактивировать примыкающие
аутосомные локусы. С помощью импульсного
введения Н3-тимидина в клеточные культуры с
Х-аутосомными транслокациями показано, что
только один из продуктов транслокации подвер-
гался инактивации, а друтой оставался активным
и не проявлял аллоциклической репликации.
Был сделан вывод, что хромосомный материал
остается активным до тех пор, пока не получит
сигнала инактивации от XIC. Поэтому' для инак-
тивации любого района Х-хромосомы необхо-
дима физическая связь с центром инактивации
(иначе говоря, г/г/с-положение) [Lyon et al.,
1986]. Последующие эксперименты показали,
что район меньшего размера (80—450 т.п.н.), со-
держащий гены Xist, Tsix и регуляторный эле-
мент Xite, способен выполнять функции XIC в
том случае, когда происходит мультикопийная
ГЛАВА 16 405
ХРСТ CNBP2 FTX
Теломера
JPX XIST y-TSX CHIC1
CDX4 NAPIL2
Центромера
Рис. 16.1. Сравнительная карта локуса XIC мыши и человека [Chureau etal., 2002]. Стрелками обозначена ори-
ентация генов.
интеграция данного трансгена в геном, даже не-
смотря на неполное содержание генетических
элементов, необходимых для инициации процес-
са инактивации [Lee etal., 1999b; Heard etal.,
1999a; b; Chureau et al., 2002; Augui et al., 2007].
В XIC мыши (450 т.п.н.) было идентифици-
ровано одиннадцать генов: Xpct (Sic 16а2), Xist,
Tsx, Tsix, Brx (Chid}, Cdx4, Bpx, Cnbp2, Fix, Enox
(Jpx) иPpnx [Chureau etal., 2002] (рис. 16.1). Че-
тыре из них — Xist, Tsix, Ftx и Enox (Jpx) —
кодируют нстранслирусмую РНК. Все гены, за
исключением Ррпх и Tsix, имеются в структуре
XIC человека. Наиболее консервативными яв-
ляются гены Cnbp2, Jpx, Xpct (Slcl6a2), Cdx4 и
Bpx [Nesterova et al., 2001; Chureau et al., 2002].
Человеческий XIC имеет размер примерно
1800 т.п.н. [Chureau et al., 2002]. Расположение и
ориентация генов внутри локуса у мыши и че-
ловека совпадают, за исключением гена ХРСТ
(SLC16A2), который у человека ориентирован в
противоположном направлении (см. рис. 16.1).
Ген TSIX человека функционально неактивен и
редуцирован по сравнению с мышиным гомоло-
гом, что свидетельствует о видовых особенностях
регуляции экспрессии ключевого гена [Migeon
et al., 2002]. Ген TSXу человека представлен в ви-
де псевдогена, части которого диспергированы по
Х-хромосоме [Migeon et al., 2001].
Центр инактивации Х-хромосомы человека
локализован в районе Xql3 [Brown etal., 1991b]
и фланкирован белок-кодирующими генами —
CDX4 и CHIC1 с одной стороны и SLC16A2 и
RNF12 — с другой, — роль которых в процессе
инактивации Х-хромосомы пока до конца не вы-
яснена [Heard, Disteche, 2006]. Однако в послед-
нее время появились данные об участии гена
Rnfl 2 в регуляции транскрипции гена Tsix у мы-
ши [Jonkers et al., 2009].
Анализ нуклеотидной последовательности
локуса Xist Tsix обыкновенных полевок рода Mi-
crotus показал, что на расстоянии около 5 т.п.н.
от 5'-границы гена Tsix расположен ген Slc7a3
[Shevchenko etal., 2011] (рис. 16.2). Таким обра-
зом, у полевки обнаружено изменение порядка
генов центра инактивации Х-хромосомы. В ре-
зультате этой перестройки из локуса XIC полев-
ки оказались удалены минорный промотор гена
Tsix и регуляторный элемент Xite, которые у
Mus musculus
। ।—□------IZZ
Slc16a2 Cnbp2 Ftx
2,4 млн п.н.
Microtus rossiaemeridionalis
10 т.п.н.
Рис. 16.2. Схема расположения генов и генетических элементов центра инактивации Х-хромосомы мыши (Mus
musculus) и обыкновенной полевки (Microtus rossiaemeridionalis).
406 ЭПИГЕНЕТИКА
мыши играют важную роль в процессе инакти-
вации Х-хромосомы.
16.2. Гены и генетические элементы центра
ИНАКТИВАЦИИ, КОНТРОЛИРУЮЩИЕ ПРОЦЕСС
ИНАКТИВАЦИИ Х-ХРОМОСОМЫ
16.2.1. Ген Xist
Ген Xist (X-inactive specific transcript), опи-
санный в 1991 г., является основным участником
процесса инактивации Х-хромосомы [Brown
et al., 1991а].
Продуктом гена Xist является нетранслируе-
мая ядерная РНК. Длина первичного транскрип-
та у мыши составляет 17,9 т.п.н., а у человека он
длиннее— 19,3 т.п.н. [Chureau etal., 2002]. РНК
Xist после транскрипции проходит стадии созре-
вания, в результате которых приобретает кэп,
сплайсируется и полиаденилируется [Brown
etal., 1991а, 1992; Brockdorff etal., 1992; Hong
et al., 1999, 2000]. Эти характеристики сближают
ее с мРНК белок-кодирующих генов. Данные
модификации отвечают за связывание зрелой
мРНК с белковыми факторами, такими как ТАР/
NXF1 и pl5/NXTl, необходимыми для транс-
порта РНК в цитоплазму’ через ядсрную мембра-
ну’. Однако РНК Xist сохраняет ядерную локали-
зацию и не покидает пределы ядра [Cohen,
Panning, 2007]. Было обнаружено, что РНК Xist
совместно с хроматином Х-хромосомы образует
неактивный ядерный компартмент, из которого
исключаются ферменты транскрипции, в частно-
сти, РНК-полимераза II [Chaumeil etal., 2006].
Транскрипт накапливается вдоль Х-хромосомы,
с которой он синтезиру’ется, способствуй! инак-
тивации Х-сцепленных генов.
Вопрос о числе экзонов в гене Xist является
спорным. Анализ кДНК-библиотек выявил на-
личие восьми экзонов [Brown etal., 1992; Simmler
etal., 1996; Sheardown etal., 1997; Nesterova etal.,
2001; Chureau et al., 2002]. Однако Hong с сотруд-
никами [Hong et al., 1999, 2000] в своих исследо-
ваниях не обнару’жили седьмого и восьмого экзо-
нов XIST человека и восьмого экзона Xist мыши.
Вероятно, эти экзоны редко встречаются в сплай-
сированных вариантах РНК. Наиболее крупными
являются первый и шестой экзоны, размер кото-
рых у мыши составляет соответственно 9,5 т.п.н.
и 5 т.п.н. [Brockdorff et al., 1992]. Межвидовые
сравнения показали, что экзон-интронная струк-
тура гена Xist не является строго консервативной
среди млекопитающих [Elisaphenko etal., 2008;
Колесников, Елисафенко, 2010].
В 5'-конце гена Xist обнару’жены шесть
блоков повторяющихся последовательностей
ДНК — А, В, С, D, Е и F [Brockdorff et al., 1992;
Brown et al., 1992; Nesterova et al., 20011. Наибо-
лее высокий уровень консервативности между’
мышью, человеком и обыкновенной полевкой
проявляют повторы А и G/C-богатые повторы В.
Повторы С выявлены только у мыши, а повторы
D и Е демонстриру’ют высокий уровень вариа-
бельности по числу’ копий и последовательно-
стям нуклеотидов мономеров у разных видов
млекопитающих. Несколько мономеров повто-
ров F, располагающихся между’ блоками повто-
ров А и В, выявлено у четырех видов обыкно-
венных полевок [Nesterova etal., 2001]. У чело-
века и мыши повторы F представлены дву’мя не-
много измененными копиями мономеров. Мо-
номеры повторов F содержат потенциальный
сайт связывания фактора E2F, контролирующего
клеточный цикл, и могу'т принимать участие в
регуляции генаА7$/ [Ibid].
А-повторы (7.5 мономеров), находящиеся в
структуре гена Xist, включают в себя консерва-
тивный сайт связывания ASF/SF2 (alternative
splicing factor/splicing factor-2), и эксперимен-
тально показано связывание проду’кта гена Xist с
данным фактором сплайсинга [Royce-Tolland
et al., 2010]. Методом задержки в геле выявлено,
что мономеры A-повтора связывают белок ASFZ
SF2 в ядерном экстракте клеток. Делеция района
A-повторов приводит к нару’шению сплайсинга
РНК Xist в недифференцированных ЭС-клетках
мыши и усилению транскрипции гена Tsix. При
дифференцировке ЭС-клеток мыши отсутствие
нормального транскрипта гена Xist и повышен-
ная активность гена Tsix, вероятно, приводят
к тому’, что Х-хромосома, несущая делецию А-
повторов, всегда остается активной. Выключение
гена ASF/SF2 методом shPHK приводит к изме-
нению соотношения пре-мРНК Xist к сплайсиро-
ванной форме Xist, что свидетельствует об уча-
стии фактора ASF/SF2 в процессинге РНК Xist in
vivo. Таким образом, регуляция на уровне про-
цессинга РНК Xist оказывает влияние на случай-
ность выбора бу’ду’щей неактивной Х-хро-
мосомы.
16.2.2. Ген Tsix
Важным этапом в исследовании случайной
инактивации Х-хромосомы явилось открытие
нового генетического элемента в локусе Xist
мыши — гена Tsix. Ген Tsix был обнаружен при
изучении клеток, трансгенных по Xist. В транс-
ГЛАВА 16 407
гене отсутствовали промоторы Xist, однако при
этом транскрипция данного локуса происходила
по антисмысловой цепи ДНК [Lee etal., 1999а].
Дальнейший анализ показал, что большинство
транскриптов гена Tsix берут свое начало с CpG-
богатого района, локализованного на 15 т.п.н.
дистальнее 3'-конца гена Xi st, и перекрывают его
в антисмысловой ориентации. Ген Tsix размером
40 т.п.н. не имеет открытых рамок считывания и
кодирует нстранслирусмую РНК, выявляемую
исключительно в ядре. Ряд фактов говорит в
пользу того, что активность гена Tsix влияет на
экспрессию гена Xist. В недифференцированных
клетках до Х-инактивации Tsix экспрессируется
с каждой Х-хромосомы, однако после дифферен-
цировки транскрипция Tsix наблюдается только
с активной Х-хромосомы [Ibid].
Ген Tsix является одним из основных ге-
нов XIC, участвующих в процессе инактивации
Х-хромосомы [Stavropoulos et al., 2001]. У мыши
транскрипция Tsix начинается с двух промото-
ров [Lee et al., 1999а]. В структуре гена Tsix мы-
ши выявлено четыре экзона и три интрона. Раз-
меры выявленных транскриптов составляли
4,3 т.п.н. и 2,7 т.п.н. [Sado etal., 2001; Shibata,
Lee, 2003]. Основная точка старта транскрипции
Tsix располагается на расстоянии 15 т.п.н. от
3'-конца гена Xist, а на расстоянии 28 т.п.н. от 3'-
границы гена Xist обнаружен минорный про-
мотор [Sado et al., 2001].
Сравнительный анализ показал, что экзон-ин-
тронная структура гена и район промотора Tsix
не являются консервативными среди млекопи-
тающих [Chureau etal., 2002]. Обнаружены раз-
личия в экзон-интронной структуре гена Tsix
между’ мышью и полевками рода Microtus. У по-
левки не выявлено гомологии с минорным про-
*Xisf
1 23 456 7
мотором, а также первым и третьим экзонами
гена Tsix мыши (рис. 16.3). Кроме того, Tsix по-
левки имеет дополнительные экзоны В и С (С'
как вариант сплайсинга). Эксперименты по кар-
тированию 3'-конца гена Tsix выявили у полевок
М. cirvalis и М. rossiaemeridionalis наличие четы-
рех мажорных и нескольких минорных точек
терминации транскрипции [Shevchenko et al.,
2011]. Транскрипт начинается в области, гомоло-
гичной мажорному’ промотору гена Tsix мыши, и
заканчивается в позиции 1,5 т.п.н. выше точки
старта транскрипции гена Xist. Размер области
антисмысловой транскрипции к гену’ Xist у поле-
вок составляет 33747 п.н. У полевки, как и у
мыши, обнаружен альтернативный сплайсинг
транскриптов Tsix. По-видимому, сплайсинг Tsix
не является необходимым условием для выпол-
нения функции подавления транскрипции Xist у
грызунов [Sado et al., 2006; Shevchenko et al.,
2011]. Транскрипт Tsix полевок перекрывает
первый экзон и промотор Xist, что, как показано
у мыши, является обязательным для его функ-
ционирования в процессе инактивации Х-хромо-
сомы [Luikenhuis etal., 2001; Ohhata etal., 2006;
Shevchenko et al., 2011].
В экспериментах по трансгенезу локуса XIC
человека в ЭС-клетки мыши наблюдали экспрес-
сию антисмысловой РНК в локусе XIST [Migeon
etal., 2001]. По аналогии с мышью транскри-
бирующаяся последовательность была названа
TSIX. Однако TSIX человека несет делецию CpG-
островков, необходимых для функционирова-
ния Tsix мыши. При исследовании транскрип-
ции гена TSIX человека был обнаружен только
несплайсированный вариант РНК размером
37 т.п.н. с четырьмя разными точками инициа-
ции транскрипции. Сайт полиаденилирования
Мышь
8 DXPas34^Xite
---------------»»!.-----------------г
32 1
Ч---1 Ts/хч--------
Полевка
DXPas34
^>|
А]
Ts/хч-1
Slc7a3
Рис. 16.3. Схема локуса Xist/Tsix мыши и полевки.
408 ЭПИГЕНЕТИКА
гена TSIX расположен в пределах четвертого эк-
зона XIST. Другой важной особенностью TSIX
человека является то, что данный ген транскри-
бируется только с неактивной Х-хромосомы.
Экспериментально показано, что, в отличие от
мыши, у человека антисмысловая транскрипция
TSIX не оказывает подавляющего влияния на
экспрессию XIST и не препятствует накоплению
РНК XIST вдоль Х-хромосомы [Migeon et al.,
2001, 2002]. Миджен считает TSIX человека экс-
прессирующимся псевдогеном [Migeon et al.,
2001].
16.2.3. DXPas34
У мыши обнаружен ряд регуляторных эле-
ментов с 3'-стороны от гена Xist. К ним относит-
ся локус DXPas34, а также районы, деле-
ция которых может влиять на процессы подсчета
Х-хромосом в клетке и выбора Х-хромосомы для
инактивации.
DXPas34 представляет собой минисател-
литный локус общей протяженностью 3 т.п.н.,
состоящий из мономеров размером 34 п.н.
(рис. 16.4) [Avner, Heard, 2001]. Этот CpG-бо-
гатый район гиперметилирован на активной
Х-хромосоме в соматических клетках взрослых
особей [Courtier etal., 1995]. Эксперименты с
направленным мутагенезом района DXPas34 по-
казывают его участие как в случайной, так и в
неслучайной Х-инактивации [Debrand et al.,
1999; Lee, Lu, 1999; Cohen etal., 2007]. Однако
исследования с использованием метода бисуль-
фитного секвенирования не показали различий в
метилировании CpG-островков в гаметах и ран-
них (1,5—7,5 дней) эмбрионах мыши [Prissette
et al., 2001].
Район, гомологичный DXPas34 мыши, выяв-
лен также у крысы и четырех видов обыкновен-
ных полевок (см. рис. 16.4) [Малахова и др.,
2010]. /)А'/'бм37-подобныс районы мыши и кры-
сы организованы сходным образом. Они состоят
из нескольких блоков минисателлитных повто-
ров: большого (размером 800—1000 п.н.) и на-
ходящихся на некотором расстоянии от него
блоков меньшего размера (250—400 п.н.). В
районе DXPas34 обыкновенных полевок выяв-
лено три типа последовательно расположенных
блоков тандемных повторов. Во всех типах мо-
номеров /)А'/'бм37-подобного района грызунов
выявлен консервативный мотив, который может
являться сайтом связывания какого-либо регуля-
торного белка и играть роль в процессе инакти-
вации Х-хромосомы [Малахова и др., 2010].
Последовательность DXPas34 содержит мно-
го предполагаемых сайтов связывания транс-
крипционного фактора CTCF, большинство из
которых фланкировано мотивами связывания
М. arvalis
Rn-31
Rn-32
Rattus norvegicus
Рис. 16.4. Организация локуса DXPas34 различных видов полевок, мыши и крысы.
Показаны мономеры повторов, тандемно организованные в блоки. Числами указаны размеры консенсусной последовательно-
сти мономера данного блока повторов. Аг — повторы Microtus arvalis; Ro — повторы М. rossiaemeridionalis; Tr—повторы
М. transcaspicus; Ki — повторы М. kirgisorum; Mus — повторы мыши Mus musculus; Rn — повторы крысы Rattus norvegicus.
ГЛАВА 16 409
транскрипционного фактора YY1, действующего
как кофактор CTCF в процессах регу’ляции
транскрипции Xist и Tsix [Donohoe etal., 2007].
Некоторые из этих потенциальных сайтов свя-
зывания CTCF дифференциально метилированы
в гаметах и соматических клетках, что позволяет
предположить участие этих элементов в процес-
сах импринтированной и случайной Х-инакти-
вации [Prissette et al., 2001].
16.2.4. Регуляторный элемент Xite
В ходе детального исследования транскрип-
ционной активности внутри XIC мыши был об-
наружен регуляторный элемент, названный Xite
(X-inactivation intergenic transcription elements),
расположенный в районе 20—32 т.п.н. от 3'-гра-
ницы гена Xist. Транскрипция Xite оказывает по-
давляющее влияние на транскрипцию Tsix, хотя
уровень экспрессии Xite в сорок раз ниже уровня
экспрессии Tsix [Ogawa, Lee, 2003] (рис. 16.5).
Транскрипция Xite начинается с двух сайтов и
может перекрываться с локусом Tsix [Lee, 2003].
Регуляторному’ району’ Xite [Ogawa, Lee, 2003] и
5'-району’ гена Tsix [Morey et al., 2004; Lee, 2005]
приписывают функцию подсчета числа Х-хро-
мосом в клетке.
Анализ последовательности ДНК регулятор-
ного элемента Xite мыши показал насыщенность
данного района мобильными элементами. Выяв-
ленная транскрипция в этой области приходится
либо на район LTR, либо на микросателлитные
повторы, которые могут служить местом ини-
циации транскрипции [Ogayva, Lee, 2003]. 5'-
фланкирующая область Tsix полевки также на-
сыщена различными диспергированными эле-
ментами, в основном SINE и LINE, однако
транскрипции в данном районе не обнаружено
[Shevchenko et al., 2011].
16.2.5. Локус Хее
В экспериментах с межвидовыми гибридами
мышей обнаружен локус Хее (X controlling ele-
ment), участвующий в выборе Х-хромосомы, ко-
торая будет инактивирована [Cattanach, Рар-
yvorth, 1981]. Было выявлено три аллеля этого
локуса. Хсеа- самый сильный аллель, хромосома,
на которой он располагается, наиболее часто
подвергается инактивации у гетерозигот Хсеа/
Хсеь и Хсеа!Хсес. Аллель Хсеъ- промежуточный
по силе, аллель Хсес- самый слабый [Johnston,
Cattanach, 1981]. Генетическое картирование ло-
куса Хее у мыши позволило установить, что он
располагается в районе центра инактивации на
расстоянии около 100 т.п.н. от 3'-границы гена
Xist [Simmler et al., 1993]. Однако у человека и
полевок подобного локуса обнаружено не было
[Nesterova et al., 2001; Migeon, 2002].
16.3. Генетическая регуляция процесса
инактивации Х-хромосомы
16.3.1. Стадии процесса инактивации
Х-хромосомы
Процесс инактивации Х-хромосомы включает
в себя пять стадий: подсчет числа Х-хромосом в
клетке, выбор одной из Х-хромосом для инакти-
вации, инициация инактивации, распростра-
нение и поддержание неактивного состояния
[Lyon, 1999]. По крайней мере, первые четыре
стадии контролируются XIC [Broyvn, Willard,
1994; Lee et al., 1996; Heard et al., 1999а].
На первой стадии инактивации происходит
определение соотношения числа Х-хромосом к
плоидности клетки. Функционально активной
должна остаться лишь одна Х-хромосома на ди-
плоидный набор аутосом [Avner, Heard, 2001].
Выбор будущей активной и неактивной X-
хромосомы осуществляется взаимоисключаю-
щим образом [Lee, Lu, 1999; Avner, Heard, 2001].
Для обеспечения этого процесса необходимо,
чтобы гены центра инактивации Х-хромосомы
(Xist, Tsix и Xite) не только функционировали в
г/г/с-положении, но и участвовали в mpanc-\y>
гу’ляции процессов подсчета и выбора Х-хро-
мосом [Xu etal., 2006]. Основными компонента-
DXPas34
Tsix
DHS
i 5р“
Xite
Транскрипция Xite
Рис. 16.5. Транскрипция Xist, Tsix, Xite. DHS — сайты гиперчувствительности к ДНКазе I (по [Lee, 2003]).
410 ЭПИГЕНЕТИКА
ми выбора будущей активной Х-хромосомы яв-
ляется пара генов Xist и Tsix. Повреждение гена
Xist приводит к тому, что несущая его хромосо-
ма всегда остается активной. Если ген Xist в силу’
ряда генетических причин на одной Х-хромо-
соме более активен, чем на другой, то в 80—
90 % случаях это обстоятельство будет опреде-
лять будущий «неактивный» статус Х-хромо-
сомы. Повреждение и ослабление активности
гена Tsix «усиливают» ген Xist, что увеличивает
вероятность инактивации мутантной Х-хромо-
сомы [Courtier etal., 1995; Plenge etal., 1997;
Marahrens et al., 1998; Lee. Lu. 1999].
Поскольку инициация процесса случайной
инактивации Х-хромосомы совпадает с момен-
том прикрепления бластоцисты к стенке матки,
изучать этот процесс in vivo практически невоз-
можно. Прекрасной моделью для изучения ран-
него развития эмбриона является культура эм-
бриональных стволовых клеток, полученных из
клеток внутренней клеточной массы бластоцист
[Rastan, Robertson. 1985]. В недифференциро-
ванных эмбриональных стволовых клетках мы-
ши на обеих Х-хромосомах активно функциони-
рующий ген Tsix подавляет активность гена Xist
до уровня трех—пяти копий РНК на клетку’. При
дифференцировке клеток Х-хромосомы взаимо-
действу’ют между7 собой, и на будущей неактив-
ной Х-хромосоме аллель гена Tsix выключается.
В результате продуктивность гена Xist сущест-
венно возрастает, и в центре инактивации буду-
щей неактивной Х-хромосомы накапливается
РНК Xist [Lee etal., 1999а; Stavropoulos etal.,
2001]. РНК Xist распределяется вдоль всей X-
хромосомы, привлекает различные факторы ин-
активации, что приводит к выключению генов. На
другой Х-хромосоме ген Tsix не репрессируется,
и она остается активной. В первые 48 ч с начала
дифференцировки эмбриональных стволовых
клеток наличие РНК Xist служит необходимым и
достаточным условием для молчания генов. Од-
нако в этот период инактивация обратима, и при
выключении гена Xist гены Х-хромосомы реак-
тивируются [Wutz, Jaenisch, 2000].
Исследование района 540 п.н. промотора Xist
с помощью люциферазных репортерных конст-
рукций в ЭС-клетках на стадиях до и после
инактивации Х-хромосомы показало, что в клет-
ках с набором гоносом XY активность промото-
ра Xist низка до начала инактивации Х-хромо-
сомы и остается низкой во время дифференци-
ровки клеток, что согласуется с данными об от-
сутствии накопления РНК Xist у самцов [Sun
et al., 2006]. В клетках XX активность промотора
была низкой до начала Х-инактивации, но во
время дифференцировки повышалась в 2—10 раз.
По-видимому7, фрагмент премоторной последова-
тельности длиной 540 п.н. не содержит всех ге-
нетических элементов, необходимых для дости-
жения полного 31-кратного повышения уровня
экспрессии гена Xist, характерного для гена Xist в
дифференцирующихся ЭС-клетках самок.
При изучении роли антисмысловой транс-
крипции в районе промотора гена Xist установи-
ли, что преждевременная терминация транс-
крипции гена Tsix влияет на регуляцию гена Xist
в тканях висцеральной энтодермы зародышей
мыши [Ohhata et al.. 2006]. При встраивании
сигнала терминации транскрипции в район 4 эк-
зона гена Tsix ниже промотора Xist синтез анти-
смысловой РНК в районе промотора Xist нару-
шается. Несмотря на то, что 93 % последова-
тельности Tsix остается нативной, репрессии Xist
на мутантной Х-хромосоме не происходит. При
этом структура хроматина в районе промотора
Xist сохраняется активной [Ohhata et al.. 2006].
Транскрипция гена Tsix играет функциональ-
ную роль в процессе инициации инактивации
Х-хромосомы. Инсерции конститутивного про-
мотора EFla человека в аллели Tsix, усиливаю-
щие уровень транскрипции Tsix, оказывают бло-
кирующее влияние на аккумуляцию Xist РНК на
Х-хромосоме [Stavropoulos etal., 2001]. В попу-
ляциях дифференцированных клеток самок экс-
прессия Xist наблюдалась в основном на хромо-
соме без промотора EFla, что повышало частоту
неслучайной инактивации. Подобные результа-
ты были получены в экспериментах по инсерци-
ям и делециям в 5'-области гена Xist в ЭС-клет-
ках мыши. Преимущественной инактивации под-
вергалась мутантная Х-хромосома. Кроме того, в
недифференцированных ЭС-клетках наблюда-
лась эктопическая экспрессия трансгена, уровень
которой соответствовал степени сдвига случай-
ной инактивации в сторону мутантной Х-хро-
мосомы [Nesterova etal., 2003]. Эти данные го-
ворят о значительной роли соотношения смы-
словой и антисмысловой транскрипции в регу-
ляции инактивации Х-хромосомы. Однако дан-
ное соотношение у7 разных видов млекопитаю-
щих может обеспечиваться за счет экспрессии
различных районов локуса XIC [Shevchenko
et al., 2011].
Роль Xist в подавлении транскрипции генов
ограничена ранним развитием и определенными
типами соматических клеток, такими как клетки-
предшественники в кроветворной системе [Sava-
rese et al., 2006]. Таким образом, регуляция путей
ГЛАВА 16 411
транскрипционной репрессии генов специфична
для разного типа клеток.
Обнаружена связь между’ плюрипотентно-
стью и регуляцией экспрессии гена Xist [Navar-
ro etal., 2008]. Показано, что основные факто-
ры, поддерживающие плюрипотентное состоя-
ние ЭС-клеток и клеток ВКМ (Oct3/4, Nanog,
Sox2), связываются с ДНК в районе первого ин-
трона гена Xist в недифференцированных клет-
ках и препятствуют его экспрессии. В диффе-
ренцированных клетках взаимодействия данных
транскрипционных факторов с геном Xist не об-
наружено. Кроме того, при исследовании клеток,
дефектных по гену’ Tsix, обнаружено, что отсут-
ствие факторов Oct3/4, Nanog и Sox2 приводит к
активации гена Xist независимо от наличия
транскрипции Tsix — основного антисмыслового
регулятора генаXist.
Исследования пространственной организации
интерфазного ядра в клетках человека показали,
что структуру неактивной Х-хромосомы можно
подразделить на две части: наружную оболочку-,
представленную активно транскрибирующимися
генами, избегающими инактивации, и внутрен-
нюю сердцевинную часть, обогащенную повто-
ряющимися последовательностями ДНК и вклю-
чающую в себя ген Xist [Clemson etal., 2006].
В дифференцирующихся ЭС-клетках мышей Xist
формирует неактивный компартмент, из которо-
го на первой стадии инактивации Х-хромосомы
исключаются компоненты системы транскрип-
ции [Chaumeil et al., 2006]. Для репрессии генов
Х-хромосомы и их попадания в неактивный
компартмент необходима последовательность
5'-конца РНК Xist, содержащая A-повторы [Wutz
et al., 2002; Chaumeil et al., 2006]. Показано, что в
клетках с делецией в 5'-районе гена Xist, вклю-
чающей повторы А, гены неактивной Х-хро-
мосомы располагаются на периферии транскрип-
ционно неактивного домена, образованного РНК
Xist, и продолжают транскрибироваться после
установления «неактивного» состояния Х-хро-
мосомы.
Первичное А7х/-зависимос неактивное состоя-
ние генов закрепляется эпигенетическими моди-
фикациями хроматина. На участках хромосомы,
где присутствует РНК Xist. формируется структу-
ра неактивного хроматина, имеющая специфич-
ные для гетерохроматина ковалентные модифика-
ции гистонов: гипоацетилирование гистона НЗ по
лизину- К9, гипометилирование гистона НЗК4,
триметилирование НЗК27 (НЗК27теЗ), димети-
лирование НЗК9 (НЗК9те2), моноубиквитиниро-
вание гистона Н2А по лизину К119 (иН2А),
включение в состав нуклеосом гистона макро-
Н2А1.2 [Gilbert, Sharp, 1999; Csankovszki etal.,
2001]. Неактивная Х-хромосома проявляет позд-
нюю репликацию, происходит метилирование
CpG-динуклеотидов базальных промоторов и
5'-нетранслируемых областей генов Х-хромосо-
мы [Heard, 2005; Lucchesi et al., 2005].
Процесс поддержания неактивного состояния
Х-хромосомы не зависит от генетической актив-
ности XIC [Broyvn, Willard, 1994]. Для поддер-
жания неактивного состояния Х-хромосомы не-
обходимо совместное действие трех процес-
сов: метилирования ДНК и деацетилирования и
метилирования гистонов [Gilbert, Sharp, 1999:
Csanovszki etal., 2001]. После метилирования
ДНК наступает полная и необратимая инактива-
ция. Неактивное состояние Х-хромосомы под-
держивается в ряду клеточных поколений и уже
не зависит от РНК гена Xist, хотя та по-
прежнему присутствует [Wutz, Jaenisch, 2000].
16.3.2. Участие механизма
РНК-интерференции в процессе
инактивации Х-хромосомы
Участие двух антисмысловых некодирующих
РНК в инактивации Х-хромосомы наводит на
мысль о том, что в этом процессе может быть
задействован механизм РНК-интерференции.
Проверка этого предположения двумя независи-
мыми группами исследователей привела к про-
тиворечивым результатам. Одни исследования
показали, что РНК Xist и Tsix у мыши способны
к формированию дуплексов [Ogawa etal., 2008].
Во время инактивации Х-хромосомы эти дуп-
лексы на Ха процессируются до малых РНК
Dicer-зависимым способом. Удаление Dicer при-
водит к подавлению продукции малых РНК и
дерепрессии Xist. В отсутствие Dicer нарушают-
ся накопление РНК Xist и триметилирование
НЗК27 на неактивной Х-хромосоме. Авторам ис-
следования также удалось показать, что данные
дефекты частично компенсируются при повреж-
дении гена Tsix. На основании этих данных ав-
торы полагают, что механизм РНК-интерферен-
ции вовлечен в процесс дозовой компенсации
генов Х-хромосомы. оказывает подавляющее
действие на экспрессию Xist с Ха и способствует
распространению сигнала инактивации вдоль Xi.
Однако другие исследователи полагают, что
РНК-интерференция не принимает непосредст-
венного участия в процессе инактивации Х-хро-
мосомы [Nesterova et al., 2008]. При изучении
регуляции гена Xist в ЭС-клетках, дефектных по
412 ЭПИГЕНЕТИКА
белку Dicer, показано, что промотор Xist гипоме-
тилирован. Однако авторы связывают это с по-
ниженным уровнем синтезированных de novo
ДНК-метилтрансфераз в клетках. Кроме того,
профиль экспрессии Xist в Diccr-дефектных эм-
брионах XY и XX не был нарушен. Эти данные
подтверждают, что в регуляции экспрессии гена
Xist миРНК участия не принимают, а метилиро-
вание промотора Xist перед инициацией случай-
ной инактивации Х-хромосомы зависит от соот-
ношения уровней смысловой и антисмысловой
транскрипции в локусе Xist/Tsix.
16.4. Модели случайной инактивации
Х-хромосомы
Точный механизм процесса случайной инак-
тивации Х-хромосомы остается пока неясным.
Изучение стадий подсчета и выбора Х-хромосо-
мы показало, что в регу’ляции этих процессов
принимают участие множество факторов и гене-
тических элементов. Существует несколько то-
чек зрения на механизм, лежащий в основе про-
цессов подсчета и выбора Х-хромосом для инак-
тивации.
Многочисленные исследования процесса X-
инактивации на анеуплоидных и тетраплоидных
клеточных культурах показали, что остается ак-
тивной одна Х-хромосома на диплоидный геном.
Эти данные позволяют выдвинуть гипотезу о
существовании «блокирующего фактора», зако-
дированного на аутосомах, который связывается
с будущей активной Х-хромосомой и защищает
ее от инактивации (так называемая однофактор-
ная теория) [Lyon, 1971]. Поиск предполагаемых
сайтов связывания этого «блокирующего факто-
ра» привел к обнаружению минисателлитного
района DXPas34 в 5'-конце гена Tsix [Debrand
et al., 1999]. Делеция этого района нарушает
процесс подсчета у самцов и приводит к инакти-
вации единственной Х-хромосомы [Vigneau
etal., 2006]. Однако другие исследования эти
данные не подтверждают [Cohen etal., 2007].
Как замечает Миджен [Migeon, 2002], для цис-
инактивации необходим только ген Xist, в то
время как в защите активной Х-хромосомы от
инактивации участвуют другие гены и генетиче-
ские элементы. Высокий уровень транскрипции
Xist даже с одной Х-хромосомы, возможно, мог
бы обеспечить инактивацию обеих Х-хромосом
в клетке. Поэтому’ важным этапом в процессе
инактивации является поддержание активного
транскрипционного состояния только одной X-
хромосомы в диплоидных клетках обоих полов,
препятствуя повышению на ней уровня экспрес-
сии Xist. Таким образом, исчезает необходи-
мость стадии подсчета числа Х-хромосом в
клетке, поскольку наличие единственной актив-
ной Х-хромосомы обеспечивается количеством
молекул «защитного фактора», синтезирующих-
ся на аутосомах [Migeon, 2002].
На основе модели «блокирующего фактора»
была теоретически сформулирована модель «на-
рушенной симметрии», в соответствии с которой
множество свободно диффундирующих в про-
странстве ядра молекул «блокирующего факто-
ра» способны кооперативно связываться с буду-
щей активной Х-хромосомой за счет механизмов
межмолекулярного взаимодействия [Nicodemi,
Prisco, 2007b]. Авторы модели отмечают, что
быстрому’ связыванию молекул и дальнейшему’
определению активной и неактивной Х-хро-
мосом могла бы способствовать пространствен-
ная близость центров инактивации Х-хромосом.
Пространственное сближение локусов цент-
ров инактивации Х-хромосом действительно
было обнаружено [Bacher etal., 2006; Xu etal.,
2006]. В процессе изучения перемещения хромо-
сом внутри интерфазного ядра дифференци-
рующихся ЭС-клеток мыши с помощью флуо-
ресцентной гибридизации in situ было обнару-
жено, что на 2—4-й день дифференцировки про-
исходит временное сближение двух Х-хромосом
[Xu et al., 2006]. Наименьшее расстояние между’
двумя взаимодействующими Х-хромосомами на-
блюдалось в районе центра инактивации Х-хро-
мосомы и составляло около 0,2—0,5 мкм. Деле-
ция Tsix и Xite нарушает процесс образования
пар Х-хромосом, а также приводит к нарушению
процессов подсчета и выбора. Более того, инсер-
ция района XIC в аутосомы вызывает эктопиче-
ское образование пар X—аутосома, ингибируя
образование пар между’ эндогенными локусами
XIC на Х-хромосомах и блокируя тем самым за-
пуск процесса инициации Х-инактивации. На
основании этих данных было предположено, что
генетические элементы Tsix и Xite могут функ-
ционировать как в цис-, так и в /7?/л7//с-положснии.
Показано, что у самцов происходит сближение
эндогенного XIC с аутосомой, несущей встройки
трансгенов, содержащих разные участки регуля-
торного элемента Xite размером 1—2 т.п.н. [Хи
et al., 2006]. В отличие от самок, у самцов, несу-
щих трансгены Tsix и Xite, не выявляется ника-
ких видимых физиологических нарушений, что
является дополнительным свидетельством раз-
личного влияния дозы Tsix и Xite на развитие
самцов и самок [Ibid]. Описан также еще один
ГЛАВА 16 413
район «спаривания» Х-хромосом, расположен-
ный на 200 т.п.н. выше точки старта транскрип-
ции Xist [Augui et al., 2007].
Образование пар X—X может быть вызвано
небольшими районами (1—2 т.п.н.) внутри ло-
куса 15 т.п.н., ответственного за процессы под-
счета и выбора Х-хромосомы для инактивации.
Данные районы имеют различную последова-
тельность нуклеотидов, общим для них является
обогащенность сайтами связывания транскрип-
ционного фактора CTCF. Показано, что фактор
CTCF принимает участие в образовании меж-
хромосомных пар. Принимая во внимание плот-
ность расположения мотивов CTCF в 5'-области
Tsix (пять сайтов в районе регуляторного участка
DXPas34) и Xite (четыре сайта), можно предпо-
ложить, что эта функция CTCF является локус-
специфичной. Вероятнее всего, CTCF не являет-
ся единственным регулятором сближения и об-
разования пар Х-хромосом, а работает в ком-
плексе с другими факторами. Это подтверждает-
ся тем, что для образования межхромосомных
пар необходима транскрипция Tsix и Xite. Веро-
ятно, РНК Tsix и Xite совместно с CTCF форми-
руют рибонуклеопротеидный комплекс, выпол-
няющий роль «связующего моста» между двумя
взаимодействующими локусами XIC. Такой мост,
вероятно, имеет временную стабильность, по-
скольку в первые 0,5 ч после обработки эмбрио-
идных телец ингибиторами РНК-полимеразы II в
клетках сохраняются пары X—X [Xu et al.,
2006]. Предполагается, что процесс образования
пар хромосом участвует в подсчете числа Х-хро-
мосом в клетке [Augui et al., 2007].
Еще одной моделью взаимоисключающего
выбора можно назвать трансвекцию. Эта модель
предполагает координированную трансрегуля-
цию двух взаимодействующих локусов XIC
[Anguera etal.. 2006]. Точная функция взаимо-
действия районов XIC остается пока неясной.
Однако следует отметить, что в клетках самок с
делецией 65 т.п.н. в 3'-фланкирующей области
гена Xist не нарушен процесс подсчета числа
Х-хромосом, хотя сближения локусов XIC в та-
ких клетках не происходит [Bacher et al., 2006].
Запуску процессов подсчета и выбора, по-
видимому, предшествуют какие-то сигналы раз-
вития или дифференцировки клеток. Однако, со-
гласно модели «альтернативных состояний», до
инициации инактивации Х-хромосомы в клетке
находятся в различных состояниях. Было пока-
зано, что регуляция когезии (сближения) сест-
ринских хроматид на разных Х-хромосомах
происходит по-разному [Mlynarczyk-Evans et al.,
2006]. Это может указывать на «врожденные»
различия между двумя генетически одинаковы-
ми Х-хромосомами в клетке. Различные состоя-
ния Х-хромосом могут обеспечивать разную ве-
роятность связывания «блокирующего фактора»
либо разную доступность транскрипционных
факторов к генам центра инактивации Х-хро-
мосомы.
В соответствии с «двухфакторной моделью»
процессов подсчета и выбора Х-хромосомы, для
инактивации предполагается существование до-
полнительного фактора, необходимого для ин-
дукции Xist на будущей неактивной Х-хромо-
соме [Lee, Lu, 1999: Lee, 2005]. Возможно, этот
дополнительный фактор включается в механизм
запускаXist в клетках самок [Sun et al., 2006] или
является Х-сцепленным активатором Xist [Mon-
khorst et al., 2008].
«Стохастическая модель» инактивации Х-хро-
мосомы предполагает, что каждая Х-хромосома в
клетке имеет определенную независимую веро-
ятность инициировать инактивацию [Wutz.
Gribnau, 2007; Monkhorst et al., 2008]. Согласно
этой модели, в результате процесса инактивации
Х-хромосомы в диплоидной клетке с определен-
ными вероятностями могут инактивироваться
две, одна либо ноль Х-хромосом. Соотношение
численностей популяций клеток с разным чис-
лом Xi зависит от вероятности каждой Х-хро-
мосомы инициировать инактивацию. Действи-
тельно, в культурах дифференцирующихся ЭС-
клеток самок мышей и в клетках ВКМ, диффе-
ренцирующихся in vitro, было обнаружено около
2—3 % клеток с двумя Xi [Monkhorst et al.,
2008]. Доля таких клеток в культуре, по мнению
авторов, является статистически значимой, и ее
нельзя объяснить ошибкой процесса Х-инак-
тивации. Факторами, влияющими на вероятность
Х-хромосомы инициировать инактивацию, мож-
но назвать экспрессию генов Xist (положитель-
ный фактор) и Tsix (отрицательный фактор).
Кроме того, для объяснения соотношения чис-
ленностей популяций клеток с разным числом
неактивных Х-хромосом предположено сущест-
вование Х-сцепленного фактора — активатора
ХС1, — двойная доза которого у самок иниции-
рует инактивацию Х-хромосомы. Затем этот
фактор сам подвергается инактивации на Xi, его
концентрация в ядре падает, предотвращая тем
самым инактивацию второй Х-хромосомы.
В пользу последней гипотезы может говорить
тот факт, что в раннем эмбриональном развитии
(до начала действия гормональной системы ре-
гуляции роста) самки мышей отстают от самцов
414 ЭПИГЕНЕТИКА
по массе тела. Вероятно, это связано с селекцией
клеток с двумя неактивными Х-хромосомами
[Ibid],
Однако наиболее полной моделью, объяс-
няющей результаты многих экспериментов по
изучению процесса случайной Х-инактивации в
ЭС-клетках и эмбрионах мышей с делециями и
инсерциями в локусе XIC, на сегодня представ-
ляется модель «обратной связи» [Starmer, Mag-
nuson, 2009]. Согласно этой модели, на активных
Х-хромосомах синтезируется транс-действую-
щий фактор А, связывающийся с аутосомами.
В ответ на связывание фактора А на аутосомах
производится /7?/л7//с'-дсйствующий сигнал инак-
тивации I, способствующий инактивации X-
хромосомы. Предполагается, что фактор I явля-
ется многокомпонентным комплексом, состоя-
щим из молскул, синтезирующихся на разных
аутосомах. Как только одна из двух Х-хромосом
становится неактивной, уровень фактора А сни-
жается, и его количества становится недостаточ-
но для связывания с аутосомами и индукции
продукции молекул фактора I. Таким образом,
вторая Х-хромосома в диплоидной клетке оста-
ется активной. Возможно, что сигналом для син-
теза фактора А является сближение Х-хромосом
районами Хрг при инициации инактивации.
Можно также предположить, что ген, кодирую-
щий фактор А, расположен в районе «спарива-
ния» хромосом Хрг, хотя наиболее вероятным
представляется то, что фактор А является про-
дуктом более чем одного гена [Starmer, Mag-
nuson, 2009]. На роль фактора А может претен-
довать ЕЗ-убиквитинлигаза Rnfl2, являющаяся
дозозависимым активатором Xist [Jonkers et al.,
2009]. Кроме того, недавно было обнаружено,
что гены Enox (Jpx) и Ftx являются положитель-
ными транс-действующими регуляторами Xist
на Xi [ Tian et al., 2010; Chureau et al., 2011].
Остается неясным механизм распространения
РНК Xist вдоль всей Х-хромосомы. Существую-
щая модель «остановки в пути» предполагает
наличие «пересадочных станций», на которых
усиливается сигнал инактивации [Lyon, 1991].
Перенос центра XIC на аутосому’ никогда не вы-
ключает хромосому' целиком, создавая впечатле-
ние, что на аутосоме сигнал инактивации «зату-
хает». Внутривидовой и межвидовой анализ по-
казал, что в ДНК Х-хромосомы присутствует
больше повторяющихся генетических элементов
определенного класса LINE (Long interspersed
nuclear element), чем в ДНК аутосом. Элементы
LINE-1, распределенные вдоль Х-хромосомы,
считаются наиболее вероятными кандидатами на
роль усилителей инактивации. Это предположе-
ние возникло на основе цитогенетических дан-
ных, показывающих, что концентрация LINE-
элементов на Х-хромосоме значительно выше,
чем на аутосомах. Кроме того, в экспериментах
на мышах с Х-аутосомными транслокациями
районы, в которых распространение сигнала
инактивации было затруднено, чаще всего ока-
зывались обедненными LINE-элементами [Lyon,
1998; Popova etal., 2006]. Участие LINE-эле-
ментов в распространении сигнала инактивации
вдоль Х-хромосомы подтверждено также в экс-
периментах с ЭС-клетками мыши [Chow et al.,
2010: Tang et al., 2010].
Другие свидетельства в пользу’ гипотезы «ос-
тановки в пути» и некоторые предположения о
возможных механизмах были получены при ис-
следовании клеток, мутантных по генуг метил-
трансферазы DNMT3B (синдром ICF). Было об-
наружено, что данный фермент ответствен за
метилирование CpG-островков мобильных эле-
ментов LINE-1. локализующихся на неактивной
Х-хромосоме, в то время как остальные LINE-1-
элементы генома метилируются другими мети-
лазами [Hansen, 2003]. Автор предполагает, что
статус метилирования LINE-элементов может
играть роль при распространении сигнала инак-
тивации по Х-хромосоме.
Другая точка зрения на механизм выбора ак-
тивной Х-хромосомы основывается на феномене
компартментализации ядра. Существует много
экспериментальных данных, показывающих, что
активная и неактивная Х-хромосомы в ядре за-
нимают разные хромосомные территории [Eils
etal., 1996]. Считают, что структурные особен-
ности окружения влияют на транскрипционный
статус хромосомы. Возможно, в диплоидном яд-
ре существует единственный компартмент неак-
тивной Х-хромосомы. а стадия подсчета заклю-
чается в конкуренции Х-хромосом за этуг часть
ядра [Ealk et al., 2002].
Исследования показали, что за связывание
РНК Xist ответственны определенные компонен-
ты ядерного матрикса [Clemson, Lawrence, 1996].
После обработки ядер клеток, содержащих неак-
тивную Х-хромосому, ДНКазой! и последую-
щей солевой экстракции «облако» РНК Xist со-
храняет свое местоположение в ядре. Кроме то-
го, обнаружена солокализация неактивной X-
хромосомы с компонентом ядерного скэффолда
SAF-A. Причем делеция РНК-связывающего до-
мена SAF-A приводит к нарушению этой соло-
кализации [Helbig, Fackelmayer, 2003; Fackel-
mayer, 2005]. Чанг с соавторами продемонстри-
ГЛАВА 16 415
ровали, что в течение S-фазы клеточного цикла
неактивная Х-хромосома меняет свое местополо-
жение внутри ядра с перинуклеарного на пери-
нуклеолярное, и связь неактивной Х-хромосомы с
ядерным матриксом поддерживается, по-види-
мому, посредством РНК Xist [Zhang et al., 2007].
Однако для выявления действующей модели
инициации инактивации Х-хромосомы необхо-
димы, по-видимому, более детальные исследо-
вания молскулярных компонентов, участвующих
в этом процессе.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Колесников Н. Н., Елисафенко Е. .4. Экзон-интронная струк-
тура гена Xist слона, броненосца и предка плацентар-
ных млекопитающих// Генетика. 2010. Т. 46, №9.
С. 1379—1385.
Малахова .4. .4., Пяткова XL С., Елисафенко Е. .4., Шевчен-
ко Л. II., КельА. Э., Закиян С. XI. Сравнительный ана-
лиз регуляторного района DXPas34 грызунов // Там
же. 2016. Т. 46, № 10. С. 1236—1239.
Anguera XL. С., Sim В. К., XuN., LeeJ. Т. X-chromosome kiss
and tell: how the Xs go their separate ways // Cold Spring
Harb. Symp. Quant. Biol. 2006. Vol. 71. P. 429 437.
Augui S., FilionG.J., HuartS., NoraE., GuggiariXL, Xlares-
caXL, Stewart A. F, Heard E. Sensing X chromosome
pairs before X inactivation via a novel X-pairing region of
the XIC // Science. 2007. Vol. 318. P. 1632—1636.
AvnerP., HeardE. X-chromosome inactivation: counting, choice
and initiation // Nat. Rev. Genet. 2001. Vol. 2. P. 59—67.
BacherC.P., GuggiariXL, BrorsB., Augui S., Clerc P., .lr-
nerP., EilsR., HeardE. Transient colocalization ofX-ina-
ctivation centres accompanies the initiation of X inactiva-
tion H Nat. Cell Biol. 2006. Vol. 8. P. 293—299.
Bair XL L., Bertram E. G. A morphological distinction between
neurones of the male and female, and the behaviour of the
nucleolar satellite during accelerated nucleoprotein syn-
thesis // Nature. 1949. Vol. 163. P. 676—677.
BrockdorffN. X-chromosome inactivation: closing in on pro-
teins that bind Xist RNA // Trends Genet. 2002. Vol. 18.
P. 352—358.
BrockdorffN., Ashworth A.. KayG.F, XIcCabe V. XL, Nor-
ris D. P., Cooper P. J., SwiftS., Rastan S. The product of
the mouse Xist gene is a 15 kb inactive X-specific tran-
script containing no conserved ORF and located in the nu-
cleus // Cell. 1992. Vol. 71. P. 515—526.
Brown C. J., Willard H. F. The human X-inactivation centre is
not required for maintenance of X-chromosome inactiva-
tion//Nature. 1994. Vol. 368. P. 154—156.
Brown C. J., BallabioA., Rupert J. L., Lafreniere R. G., Grom-
peXI., TonlorenziR., WillardH. F. A gene from the re-
gion of the human X inactivation centre is expressed ex-
clusively from the inactive X chromosome // Nature.
1991a. Vol. 349. P. 38 44.
Brown C. J., Lafreniere R. G., Powers Г. E., Sebastio G., Balla-
bioA., Pettigrew A. L., Ledbetter D. H, LevyE., Craigl. W.,
Willard H. F. Localization of the X inactivation centre on
the human X chromosome in Xql3 // Nature. 1991b.
Vol. 349. P. 82—84.
Brown C. J., Hendrich B. D., Rupert J. L., Lafreniere R G.,
XingY., Lawrence J., Willard H. F. The human XIST
gene: analysis of a 17 kb inactive X-specific RNA that
contains conserved repeats and is highlv localized within
the nucleus // Cell. 1992. Vol. 71. P. 527—542.
Cattanach B. XL. Papworth D. Controlling elements in the
mouse. V. Linkage tests with X-linked genes // Genet.
Res. 1981. Vol. 38. P. 57—70.
Chaumeil J., Le Baccon P., WutzA., HeardE. A novel role for
Xist RNA in the formation of a repressive nuclear com-
partment into which genes are recruited when silenced //
Genes Dev. 2006. Vol. 20. P. 2223- -2237.
Chow J. C.. CiaudoC. Fazzari XL. J. Xlise N.. Servant N..
Glass J. L., AttreedXL, Avner P., WutzA., BarillotE.,
Greatly J. XL, FoinnetO., Heard E. LINE-1 activity in
facultative heterochromatin formation during X chromo-
some inactivation // Cell. 2010. Vol. 141. P. 956—969.
Chureau C, Chantalat S., RomitoA., Galvani A., DuretL., .4v-
nerP., Rougeulle C. Ftx is a non-coding RNA which af-
fects Xist expression and chromatin structure within the
X-inactivation center region// Hum. Mol. Genet. 2011.
Vol. 20. P. 705—718.
Chureau C., PrissetteXL, BourdetA., Barbel’., CattolicoL.,
JonesL., EggenA., AvnerP., DuretL. Comparative se-
quence analysis of the X-inactivation center region in
mouse, human, and bovine // Genome Res. 2002. Vol. 12.
P. 894—908.
Clemson C. XL, Hall L. L, Byron XL., XIcNeil J., Lawrence J. B.
The X chromosome is organized into a gene-rich outer rim
and an internal core containing silenced nongenic se-
quences // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. Vol. 103.
P. 7688—7693.
Clemson C. XL, Lawrence J. B. Multifunctional compartments
in the nucleus: insights from DNA and RNA localization /7
J. Cell. Biochem. 1996. Vol. 62. P. 181—190.
Cohen H. R., Paiming B. XIST RNA exhibits nuclear retention
and exhibits reduced association with the export factor
TAP/NXF1 // Chromosoma. 2007. Vol. 1 16. P. 373—383.
Cohen D. E., Davidow L. S., Erwin J. A., XuN., Warshaws-
kyD., LeeJ. T. The DXPas34 repeat regulates random and
imprinted X inactivation // Dev. Cell. 2007. Vol. 12.
P. 57—71.
Cooper D. W., JonstonP.G., VandeBergJ. L., Robinson E. S.
X-chromosome inactivation in marsupials // Mammals
from pouches and eggs: genetics, breeding and evolution of
marsupials and monotremes / J. A. M. Graves, R. M. Hope,
D. W. Cooper (eds). Melbourne. Australia: CSIRO. 1990.
Costanzi C, PehrsonJ. R. Histone macroH2Al is concentrated
in the inactive X chromosome of female mammals // Na-
ture. 1998. Vol. 393. P. 599—601.
CourtierB., HeardE., AvnerP. Xce haplotypes show modified
methylation in a region of the active X chromosome lying
3' to Xist// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. Vol’ 92.
P. 3531—3535.
Csankovszki G., Nagy A., Jaenisch R. Synergism of Xist RNA,
DNA methylation, and histone hypoacetylation in main-
taining X chromosome inactivation// J. Cell Biol. 2001.
Vol. 153. P. 773—784.
DebrandE., Chureau C., ArnaudD., AvnerP., HeardE. Func-
tional analysis of the DXPas34 locus, a 3' regulator of Xist
expression// Mol. Cell. Biol. 1999. Vol. 19. P. 8513—
8525.
Donohoe XI. E., Zhang L. F, XuN., Shi Г, LeeJ. T. Identifica-
tion of a Ctcf cofactor, Yy 1, for the X chromosome binary
switch // Mol. Cell. 2007. Vol. 25. P. 43—56.
EilsR., DietzelS., BerlinE., SchrockE., SpeicherXL. R., Ri-
ed T., Robert-NicoudXL, Cremer C„ Cremer T. Three-di-
mensional reconstruction of painted human interphase
chromosomes: active and inactive X chromosome territo-
ries have similar volumes but differ in shape and surface
structure // J. Cell Biol. 1996. Vol. 135. P. 1427—1440.
Elisaphenko E. A., Kolesnikov N. N, Shevchenko A. I., Rogo-
zin I. B., Nesterova T. B., BrockdorffN., ZakianS.XI. A
dual origin of the Xist gene from a protein-coding gene
416 ЭПИГЕНЕТИКА
and a set of transposable elements // PLoS One. 2008.
Vol. 3. P. e2521.
Fackelmayer F. O. A stable proteinaceous structure in the terri-
tory of inactive X chromosomes // J. Biol. Chem. 2005.
Vol. 280. P. 1720—1723.
Falk AT., Lukasova E., KozubekS., Kozubek M. Topography of
genetic elements of X-chromosome relative to the cell nu-
cleus and to the chromosome X territory determined for
human lymphocytes // Gene. 2002. Vol. 292. P. 13—24.
Gilbert S. L., Sharp P. Л. Promoter-specific hypoacetylation of
X-inactivated genes И Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999.
Vol. 96. P. 13825—13830.
Hansen RS. X inactivation-specific methylation of LINE-1
elements by DNMT3B: implications for the Lyon repeat
hypothesis // Hum. Mol. Genet. 2003. Vol. 12. P. 2559—
2567.
HeardE. Delving into the diversity of facultative heterochro-
matin: the epigenetics of the inactive X chromosome //
Curr. Opin. Genet. Dev. 2005. Vol. 15. P. 482—489.
HeardE., Disteche C. AL Dosage compensation in mammals:
fine-tuning the expression of the X chromosome // Genes
Dev. 2006. Vol. 20. P. 1848—1867.
HeardE., AlongelardF, ArnaudD., AvnerP. Xist yeast artifi-
cial chromosome transgenes function as X-inactivation
centers only in multicopy arrays and not as single copies //
Mol. Cell. Biol. 1999a. Vol. 19. P. 3156—3166.
HeardE., AlongelardE, ArnaudD., ChureauC., J’ourc'hC,
AvnerP. Human XIST yeast artificial chromosome trans-
genes show partial X inactivation center function in mouse
embryonic stem cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.
1999b. Vol. 96. P. 6841—6846.
HelbigR., Fackelmayer F. O. Scaffold attachment factor A
(SAF-A) is concentrated in inactive X chromosome terri-
tories through its RGG domain // Chromosoma. 2003.
Vol. 112. P. 173—182.
Hong 1. K, Ontiveros S. D., Chen C, Strauss II. AL A new
structure for the murine Xist gene and its relationship to
chromosome choice/counting during X-chromosome inac-
tivation И Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. Vol. 96.
P. 6829—6834.
Hong T. K, Ontiveros S. D., Strauss JJ’. Al. A revision of the
human XIST gene organization and structural comparison
with mouse Xist/z Mamm. Genome. 2000. Vol. 11.
P. 220—224.
Johnston P. G., Cattanach B. Al. Controlling elements in the
mouse. IV. Evidence of non-random X-inactivation '/
Genet. Res. 1981. Vol. 37. P. 151—160.
Jonkers I., Barakat T. S., AchameE.AL, Alonkhorst K., Ren-
ter A., Rentmeester E., GrosveldE, Grootegoed J. A.,
GribnauJ. RNF12 is an X-Encoded dose-dependent acti-
vator of X chromosome inactivation // Cell. 2009.
Vol. 139. P. 999- -1011.
Lee J. T. Functional intergenic transcription: a case study of the
X-inactivation centre // Philos. Trans. R. Soc. Loud. B. Biol.
Sci. 2003. Vol. 358. P. 1417—1423. Discussion 1423.
Lee J. T. Regulation of X-chromosome counting by Tsix and
Xite sequences // Science. 2005. Vol. 309. P. 768—771.
Lee J. T, LuN. Targeted mutagenesis of Tsix leads to nonran-
dom X inactivation // Cell. 1999. Vol. 99. P. 47- 57.
Lee J. T, Strauss JJ. AL. Daiisman J. A., Jaenisch R A 450 kb
transgene displays properties of the mammalian X-inac-
tivation center 11 Cell. 1996. Vol. 86. P. 83—94.
Lee J. T, Davidow L. S., JJ’arshawsky D. Tsix, a gene antisense
to Xist at the X-inactivation centre // Nat. Genet. 1999a.
Vol. 21. P. 400 404.
Lee J. T, Lu N., Han Y. Genetic analysis of the mouse X inacti-
vation center defines an 80—kb multifunction domain '/
Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999b. Vol. 96. P. 3836—
3841.
Lucchesi J. C. Kelly JJ’. G.. PanningB. Chromatin remodeling
in dosage compensation11 Annu. Rev. Genet. 2005.
Vol. 39. P. 615—651.
Luikenhuis S., JJ’utzA., JaenischR. Antisense transcription
through the Xist locus mediates Tsix function in embryonic
stem cells // Mol. Cell. Biol. 2001. Vol. 21. P. 8512—8520.
Lyon AL F. Gene action in the X-chromosome of the mouse (ALus
musculus L.) 11 Nature. 1961. Vol. 190. P. 372—373.
Lyon Al. F. Possible mechanisms of X chromosome inactiva-
tion/'Nat. New Biol. 1971. Vol. 232. P. 229—232.
Lyon Al. F. Mechanisms and evolutionary origins of variable X-
chromosome activity in mammals // Proc. R. Soc. Loud.
B. Biol. Sci. 1974. Vol. 187. P. 243—268.
Lyon AL F. The quest for the X-inactivation centre// Trends
Genet. 1991. Vol. 7. P. 69—70.
Lyon AL F. X-chromosome inactivation: a repeat hypothesis//
Cytogenet. Cell Genet. 1998. Vol. 80. P. 133—137.
Lyon Al. F. X-chromosome inactivation// Curr. Biol. 1999.
Vol. 9. P. R235—237.
Lyon Al. E, Zenthon J., Evans E. P., Burtenshaw AL D., JJ'are-
ham K. A., JJ’illiams E. D. Lack of inactivation of a mouse
X-linked gene physically separated from the inactiva-
tion centre // J. Embryol. Exp. Morphol. 1986. Vol. 97.
P. 75—85.
Alarahrens E, Loring J., Jaenisch R. Role of the Xist gene in X
chromosome choosing Г Cell. 1998. Vol. 92. P. 657—664.
AlermoudJ.E., Popova B., Peters .1. H, JenuweinT., Brock-
dorffN. Histone H3 lysine 9 methylation occurs rapidly at
the onset of random X chromosome inactivation // Curr.
Biol. 2002. Vol. 12. P. 247—251.
Aligeon B. R. X chromosome inactivation: theme and varia-
tions // Cytogenet. Genome Res. 2002. Vol. 99. P. 8—16.
Aligeon B. R, Chowdhury A. K.. Dunston J. A., Alclntoshl
Identification of TSIX, encoding an RNA antisense to
human XIST, reveals differences from its murine counter-
part: implications for X inactivation 11 Am. J. Hum. Genet.
2001. Vol. 69. P. 951—960.
Aligeon B. R, Lee CH, Chowdhury A. K, Carpenter H. Spe-
cies differences in TSIX/Tsix reveal the roles of these
genes in X-chromosome inactivation /7 Ibid. 2002.
Vol. 71. P. 286—293.
AIlynarczyk-Evans S., Royce-Tolland AL, Alexander AL K., An-
dersen A. A., Kalantry S., Gribnau J., PanningB. X chro-
mosomes alternate between two states prior to random X-
inactivation // PLoS Biol. 2006. Vol. 4. P. el59.
AlonkhorstK., Jonkersl., RentmeesterE., GrosveldI1., Grib-
nauJ. X inactivation counting and choice is a stochastic
process: evidence for involvement of an X-linked activa-
tor // Cell. 2008. Vol. 132. P. 410-Л21.
AloreyC., NavarroP., DebrandE., AvnerP., Rougeulle C,
ClercP. The region 3' to Xist mediates X chromosome
counting and H3 Lys-4 dimethylation within the Xist
gene и EMBO J. 2004. Vol. 23. P’ 594—604.
NavarroP., Chambers 1., Karwacki-Neisius J’., Chureau C.,
AloreyC., Rougeulle C, AvnerP. Molecular coupling of
Xist regulation and pluripotency // Science. 2008.
Vol. 321. P. 1693—1695.
Nesterova T. B., Johnston C. AL, Appanah R, NewallA.E.,
Godwin J., Alexiou AL, BrockdorffN. Skewing X chromo-
some choice by modulating sense transcription across the
Xist locus // Genes Dev. 2003. Vol. 17. P. 2177—2190.
Nesterova T. B., Popova В. C, CobbB.S., NortonS., Sen-
ner С. E., Tang Y. A., Spruce T, Rodriguez T. A., Sado T,
AlerkenschlagerAl, BrockdorffN. Dicer regulates Xist
promoter methylation in ES cells indirectly through tran-
scriptional control of Dnmt3a // Epigenetics Chromatin.
2008. Vol. 1.Р.2.
Nesterova T. B., Slobodyanyuk S. Y., ElisaphenkoE. A., Shev-
chenko A. L. Johnston C., Pavlova ALE., Rogozin 1. B.,
ГЛАВА 16 417
Kolesnikov N. N.. BrockdorffN.. ZakianS.AL Characteri-
zation of the genomic Xist locus in rodents reveals con-
servation of overall gene structure and tandem repeats but
rapid evolution of unique sequence 11 Genome Res. 2001.
Vol. 11. P. 833—849.
Nicodemi Al., Brisco A. Self-assembly and DNA binding of the
blocking factor in x chromosome inactivation " PLoS
Comput. Biol. 2007a. Vol. 3. P. e210.
Nicodemi AL, Brisco A. Symmetry-breaking model for X-chro-
mosome inactivation // Phys. Rev. Lett. 2007b. Vol. 98.
P. 108104.
Ogawa L, Lee J. T. Xite, X-inactivation intergenic transcription
elements that regulate the probability of choice // Mol.
Cell. 2003. Vol. 11. P. 731—743.
Ogawa L, Sun В. K., Lee J. T. Intersection of the RNA interfer-
ence and X-inactivation pathways // Science. 2008.
Vol. 320. P. 1336—1341.
Ohhata T, Hoki I'., Sasaki H., Sado T. Tsix-deficient X chro-
mosome does not undergo inactivation in the embryonic
lineage in males: implications for Tsix-independent silenc-
ing of Xist// Cytogenet. Genome Res. 2006. Vol. 113.
P. 345—349.
Plenge R. AL, Hendrich B. D., Schwartz C., Arena J. F, Nau-
mova A., SapienzaC, Winter R. AL, Willard H. F. A pro-
moter mutation in the XIST gene in two unrelated families
with skewed X-chromosome inactivation // Nat. Genet.
1997. Vol. 17. P. 353—356.
PopovaB.C., Tada T., TakagiN., BrockdorffN, Neste-
rova T. B. Attenuated spread of X-inactivation in an X;
autosome translocation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.
2006. Vol. 103. P. 7706—7711.
Prissette AL, El-ALaarri O., ArnaudD., Walter J., Avner P. Me-
thylation profiles of DXPas34 during the onset of X-inac-
tivation // Hum. Mol. Genet. 2001. Vol. 10. P. 31—38.
RastanS., Robertson E. J. X-chromosome deletions in embryo-
derived (EK) cell lines associated with lack of X-
chromosome inactivation // J. Embryol. Exp. Morphol.
1985. Vol. 90. P. 379—388.
Royce-TollandAL. E., Andersen A. A., Koyfinan H. R, Tal-
bot D. J., Wutz A., Tonks I. D., KayG. F, PanningB. The
А-repeat links ASF/SF2—dependent Xist RNA processing
with random choice during X inactivation // Nat. Struct.
Mol. Biol. 2010. Vol. 17. P. 948—954.
SadoT., WangZ.. Sasaki H.. Li E. Regulation of imprinted X-
chromosome inactivation in mice bv Tsix // Development.
2001. Vol. 128. P. 1275—1286.
Sado T, Hoki E., Sasaki H. Tsix defective in splicing is compe-
tent to establish Xist silencing // Development. 2006.
Vol. 133. P. 4925—4931.
Savarese F, Flahndorfer K., JaenischR, Busslinger AL,
Wutz A. Hematopoietic precursor cells transiently reestab-
lish permissiveness for X inactivation // Mol. Cell. Biol.
2006. Vol. 26. P. 7167—7177.
Sefton L., ArnaudD., Goodfellow P. N, Simmler AL. C, ,4v-
nerP. Characterization of the central region containing the
X-inactivation center and terminal region of the mouse X
chromosome using irradiation and fusion gene transfer
hybrids // Mamm. Genome. 1992. Vol. 2. P. 21—31.
Sheardown S. A., DuthieS.AL, Johnston C. Al., NewallA.E.,
FormstoneE. J.. ArkellRAL, Nesterova T. B., Alghi-
si G. C, RastanS., BrockdorffN. Stabilization of Xist RNA
mediates initiation of X chromosome inactivation // Cell.
1997. Vol. 91. P. 99—107.
Shevchenko A. 1.. Alalakhova A. A., Elisaphenko E. A.. Ala-
zurokN.A., Nesterova T. B., BrockdorffN., ZakianS.AL.
Variability of sequence surrounding the Xist gene in ro-
dents suggests taxon-specific regulation of X chromosome
inactivation //PLoS One. 2011. Vol. 6. P. e22771.
Shibata S., Lee J. T. Characterization and quantitation of differ-
ential Tsix transcripts: implications for Tsix function //
Hum. Mol. Genet. 2003. Vol. 12. P. 125—136.
Simmler AL C., Cattanach B. AL, Rasberry C., RougeulleC.,
AvnerP. Mapping the murine Xce locus with (CA)n re-
peats И Mamm. Genome. 1993. Vol. 4. P. 523—530.
Simmler AL. C, Cunningham D. B., ClercP., Fermat T, Caud-
ron B., Cruaud C, Pawlak A., Szpirer C, Weissenbach J.,
Claverie J. Al., AvnerP. A 94 kb genomic sequence 3' to
the murine Xist gene reveals an AT rich region containing
a new’ testis specific gene Tsx // Hum. Mol. Genet. 1996.
Vol. 5. P. 1713—1726.
Starmer J., Alagnuson T. A new model for random X chromo-
some inactivation // Development. 2009. Vol. 136. P. 1 —
10.
Stavropoulos N, LuN, Lee J. T. A functional role for Tsix
transcription in blocking Xist RNA accumulation but not
in X-chromosome choice // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.
2001. Vol. 98. P. 10232—10237.
SunB. K., Deaton A. Al., Lee J. T. A transient heterochromatic
state in Xist preempts X inactivation choice without RNA
stabilization // Mol. Cell. 2006. Vol. 21. P. 617—628.
TakagiN., Sasaki Al. Preferential inactivation of the paternally
derived X chromosome in the extraembryonic membranes
of the mouse // Nature. 1975. Vol. 256. P. 640—642.
Takagi N., Wake N., Sasaki Al. Cytologic evidence for preferen-
tial inactivation of the paternally derived X chromosome
in XX mouse blastocysts // Cytogenet. Cell Genet. 1978.
Vol. 20. P. 240—248.’
Tang Y. A.. Huntley D., Alontana G.. Cerase A., Nestero-
va T. B., BrockdorffN. Efficiency of Xi st-mediated silenc-
ing on autosomes is linked to chromosomal domain or-
ganisation // Epigenetics Chromatin. 2010. Vol. 3. P. 10.
TianD., Sun S., Lee J. T. The long noncoding RNA, Jpx, is a
molecular switch for X chromosome inactivation // Cell.
2010. Vol. 143. P. 390 403.
Figneau S., AuguiS., NavarroP., AvnerP., ClercP. An essen-
tial role for the DXPas34 tandem repeat and Tsix tran-
scription in the counting process of X chromosome inacti-
vation " Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. Vol. 103.
P. 7390—7395.
Wutz A., GribnauJ. X inactivation Xplained// Curr. Opin.
Genet. Dev. 2007. Vol. 17. P. 387—393.
WutzA., JaenischR. A shift from reversible to irreversible X
inactivation is triggered during ES cell differentiation //
Mol. Cell. 2000. Vol. 5. P. 695—705.
WutzA., Rasmussen T. P., JaenischR. Chromosomal silencing
and localization are mediated by different domains of Xist
RNA // Nat. Genet. 2002. Vol. 30. P. 167—174.
Xu N., Tsai C. L., Lee J. T. Transient homologous chromosome
pairing marks the onset of X inactivation // Science. 2006.
Vol. 311. P. 1149—1152.
ZhangL. F, Huynh K.D., Lee J. T. Perinucleolar targeting of
the inactive X during S phase: evidence for a role in the
maintenance of silencing // Cell. 2007. Vol. 129. P. 693—
706.
ГЛАВА
17
ЭВОЛЮЦИЯ ПРОЦЕССА
ИНАКТИВАЦИИ Х-ХРОМОСОМЫ
СОДЕРЖАНИЕ
17.1. Феноменология процесса инакти-
вации у млекопитающих, 420
17.2. Гипотезы о происхождении и эво-
люции процесса инактивации X-
хромосомы, 426
17.3. Происхождение и эволюция цент-
ра инактивации и генаХ/sf, 427
Список литературы, 430
420 ЭПИГЕНЕТИКА
Класс Mammalia (млекопитающие) разделяет-
ся на два подкласса: Prototheria (первозвери, или
яйцекладущие) и Theria (звери). В подклассе
Theria, в свою очередь, выделяют инфраклассы
Metatheria (сумчатые) и Eutheria (плацентарные).
Дивергенция однопроходных и сумчатых про-
изошла 166 млн лет назад, дивергенция сумча-
тых и плацентарных — 147 млн лет назад [Bin-
inda-Emonds et al., 2007].
Онтогенез самок сумчатых и плацентарных
млекопитающих сопровождается уникальным
эпигенетическим феноменом — гетерохромати-
зацией одной из двух Х-хромосом и инактиваци-
ей ее транскрипции, которые поддерживаются в
поколениях клеток [Lyon, 1961; Escamilla-Del-
Arenal etal., 2011]. Предполагают, что этот ме-
ханизм произошел из-за необходимости компен-
сировать дозу генов гетероморфных половых
хромосом у особей разного пола. У представите-
лей Theria пол детерминируется парой гетеро-
морфных половых хромосом — X и Y. Мужской
пол детерминируется сочетанием половых хро-
мосом XY, а женский — XX. Поскольку Y-xpo-
мосома содержит лишь несколько десятков ге-
нов, а Х-хромосома — несколько сотен, боль-
шинство генов Х-хромосомы представлены од-
ной копией у самцов (XY) и двумя копиями у
самок (XX). Инактивация одной Х-хромосомы у
самок приводит к тому’, что у особей обоих по-
лов транскрипционно активной является только
одна копия генов Х-хромосомы, и соответствен-
но в клетках синтезируется приблизительно рав-
ное количество продуктов Х-сцепленных генов.
Инактивация Х-хромосомы осуществляется за
счет специфических ядерных РНК и привлече-
ния репрессирующих транскрипцию модифика-
ций хроматина, которые различаются у сумча-
тых и плацентарных млекопитающих [Escamilla-
Del-Arenal etal., 2011; Grant etal.. 2012]. В дан-
ной главе будет рассмотрена эволюция процесса
инактивации Х-хромосомы.
17.1. Феноменология процесса
ИНАКТИВАЦИИ У МЛЕКОПИТАЮЩИХ
17.1.1. Однопроходные не используют
процесс инактивации как
механизм дозовой компенсации
Нынеживущих представителей самого древ-
него среди млекопитающих подкласса первозве-
ри (Prototheria) — один вид утконосов и четыре
вида ехидн — объединяют в отряд однопроход-
ные (Monotremata). В отличие от остальных мле-
копитающих, однопроходные имеют сложную
систему’ определения пола. Самцы утконоса Ог-
nithorhychus anatimis имеют пять X- и пять Y-
хромосом, у’ самцов ехидны Tachuglossus aculea-
tus обнаружено пять X- и четыре Y-хромосомы
[Griitzner et al., 2004; Rens et al., 2004, 2007]. Ге-
ны, свойственные Х-хромосомам сумчатых и
плацентарных млекопитающих, у однопроход-
ных располагаются на аутосомах (рис. 17.1). Од-
нако на Х-хромосомах однопроходных обнару-
жены гены, характерные для половой хромосо-
мы Z птиц, включая ген Dmrtl, который у птиц,
предположительно, играет основную роль в оп-
ределении пола [Rens et al.. 2007: Veyrunes et al.,
2008]. Наиболее протяженный участок, гомоло-
гичный Z-хромосоме курицы, обнаружен у утко-
носа на хромосоме Х5, менее протяженные об-
ласти гомологии располагаются на хромосомах
Х1,Х2иХЗ.
На всех X- и Y-хромосомах однопроходных
имеются гомологичные (недифференцирован-
ные) псевдоаутосомные районы, благодаря кото-
рым X- и Y-хромосомы объединяются друг с
другом в мейозе [Griitzner et al., 2004; Rens et al.,
2004, 2007]. Однако протяженные районы хро-
мосом XI—Х5, на долю которых приходится
суммарно около 12 % генома, дифференцирова-
ны и не имеют сходства с Y1—Y5. Можно ожи-
дать, что для генов, локализующихся в этих рай-
онах, существует какой-то механизм дозовой
компенсации. Количественный анализ транс-
крипции генов, локализующихся в дифференци-
рованных районах разных Х-хромосом утконоса
[Deakin et al., 2008], показал, что часть из них
имеют одинаковый уровень транскрипции в
клетках самок и самцов. Экспрессия остальных
генов либо компенсируется лишь частично, либо
не компенсируется вообще: т. е. оказывается в
два раза выше в клетках самок по сравнению
клетками самцов (табл. 17.1). Таким образом, ве-
роятно, дозовая компенсация у однопроходных
действует лишь в отношении отдельных генов
половых хромосом, напоминая неполную и ва-
риабельную дозовую компенсацию, наблюдаю-
щуюся у птиц [Ellegren et al., 2007; Itoh et al.,
2007]. С частотой от 50 до 70 % в ядрах клеток
самок утконоса транскрипция генов, обнару-
живающих дозовую компенсацию, выявляется
только на одной из гомологичных Х-хромосом.
Тем не менее, в суммарной мРНК на равном
уровне обнаруживаются аллели каждого гомоло-
га. Эти данные позволяют предположить, что
дозовая компенсация у однопроходных осуще-
ствляется за счет снижения уровня транскрип-
ГЛАВА 17 421
Курица
Chr 1q
Chr4p
Рис. 17.1. Происхождение и эволюция Х-хромосомы
млекопитающих.
а — у птиц (курица) и однопроходных (утконос, ехидна) гены
Х-хромосомы млекопитающих локализованы на аутосомах.
У сумчатых (валлаби, опоссум) Х-хромосома представляет
собой наиболее древнюю часть Х-хромосомы млекопитаю-
щих (на рисунке отображена синим цветом) и содержит две
трети генов, представленных на Х-хромосоме плацентарных.
Х-хромосома плацентарных млекопитающих содержит до-
бавленный участок (на рисунке отображен красным цветом),
который у сумчатых локализуется на аутосоме [Rens et al.,
2007]. б — у однопроходных выявлено пять Х-хромосом,
которые не имеют ничего общего с Х-хромосомой плацен-
тарных, однако содержат последовательности, гомологичные
Z-хромосоме птиц [Deakin et al., 2008]. В основании ветвей
филогенетических деревьев указано время дивергенции
таксонов в миллионах лет назад.
Aves s Mammalia
----Опоссум |
X X
PROTOTHERIA
Таблица 17.1
Соотношение уровня экспрессии генов Х-хромо-
сом в клетках у самок и самцов утконоса, а также
частота их моноаллельной экспрессии [Deakin
et al., 2008]
Хромо- сома Ген Соотношение уровня экспрессии у самок и самцов Доля ядер с моноал- лельной экспрессией
Полная компенсация
Х1 Ox_plat_124086 1,10 46
Х5 ZNF474, * 1,01 53
Х5 LOX 1,06 53
ХЗ АРС 1,17 48
Х5 SHB 1,23 53
Курица
Последовательности 2-хромосомы
Консервативный район Х-хромосомы млекопитающих
Добавленный район Х-хромосомы плацентарных
Частичная компенсация
Х5 FBXO10 1,37 50
Х5 EN14997 1,40 61
Компенсация отсутствует
Х5 SEMA6A 1,82 74
Х5 DMRT2 2,04 47
Х5 SLC1A1 2,78 45
422 ЭПИГЕНЕТИКА
ции одного из аллелей, выбор которого в каждой
клетке осуществляется случайным образом [De-
akin et al., 2008]. Поскольку на цитологическом
уровне у самок утконоса каждая пара Х-хромосом
не имеет видимых различий в модификациях
хроматина, предполагают, что дозовая компенса-
ция у однопроходных затрагивает отдельные ге-
ны, а не хромосомы в целом [Rens et al., 2010].
Псевдоаутосомная часть хромосомы XI ехид-
ны демонстрирует в некоторых типах клеток
позднюю репликацию [Wrigley, Graves, 1988],
которую можно рассматривать как признак не-
активного хроматина, хотя гены, локализующие-
ся в данном районе, присутствуют как на XI. так
и на Y1 и не нуждаются в дозовой компенсации.
Ранее этот район, учитывая его предрасполо-
женность к инактивации, рассматривался в каче-
стве предковой области, в которой мог бы сфор-
мироваться механизм сайленсинга целой хромо-
сомы. Однако поскольку’ содержащиеся в дан-
ном районе гены у сумчатых и плацентарных
млекопитающих располагаются на аутосомах и
не задействованы в инактивации, от этого пред-
положения отказались.
Таким образом, очевидно, что однопроход-
ные, в отличие от сумчатых и плацентарных
млекопитающих, используют для дозовой ком-
пенсации механизм, независимый по происхож-
дению и отличающийся от процесса инактива-
ции Х-хромосомы.
17.1.2. Инактивация Х-хромосомы
у сумчатых импринтированная,
неполная и тканеспецифичная
Инфракласс сумчатые (Metatheria) влючает
270 видов, 200 из которых обитают в Австралии,
69 — в Южной Америке и один — в Северной.
Эволюционное разделение австралийских и аме-
риканских сумчатых произошло 70 млн лет на-
зад [Kirsch et al., 1997; Deakin et al., 2009]. По-
ловые хромосомы сумчатых и плацентарных
млекопитающих имеют общее происхождение.
Х-хромосома сумчатых представляет собой две
трети Х-хромосомы плацентарных млекопитаю-
щих, оставшаяся треть генов локализуется на
аутосоме (см. рис. 17.1). Сумчатые — наиболее
древние млекопитающие, у самок которых дозо-
вая компенсация происходит за счет инактива-
ции Х-хромосомы, однако процесс инактивации
у сумчатых и плацентарных млекопитающих
имеет ряд существенных различий.
Для всех тканей сумчатых характерна неслу-
чайная импринтированная инактивация, при ко-
торой происходит подавление транскрипции ге-
нов и устанавливается поздняя репликация в
S-фазе клеточного цикла исключительно на X-
хромосоме, унаследованной от отца [Richardson
etal.. 1971; Sharman. 1971]. Вероятно, за процесс
инактивации в масштабах хромосомы отвечает
специфическая для сумчатых нетранслируемая
ядерная РНК Rsx (RNA-on-the-silent X), кото-
рая способна распространяться по неактивной X-
хромосоме и репрессировать транскрипцию ге-
нов [Grant etal., 2012]. Импринтированная инак-
тивация в тканях изучена для трех генов Х-хро-
мосомы у восьми видов (табл. 17.2). Обнаруже-
но, что неактивное состояние Х-хромосомы от-
цовского происхождения является нестабиль-
ным, и зачастую наблюдается реактивация ге-
нов. Инактивация у сумчатых затрагивает не все
гены в равной мере, т. е. является неполной.
Кроме того, в зависимости от ткани одни и те же
локусы Х-хромосомы могут быть инактивирова-
ны в разной степени. Например, показано, что у
североамериканского вирджинского опоссума
Didelphis virginiana ген фосфоглицераткиназы А
(Pgkl) полностью инактивирован во всех тканях,
тогда как для гена глюкозо-6-фосфатдегидроге-
назы (G6pd) стабильной репрессии отцовского
аллеля в большинстве тканей не наблюдается
[Cooper etal., 1993]. У серого короткохвостого
опоссума Monodelphis domestica. в отличие от
вирджинского опоссума, напротив, отцовский
аллель G6pd стабильно инактивирован, тогда как
Pgkl демонстрирует во всех тканях неполную
инактивацию [Homecker et al., 2007]. Таким об-
разом, ортологичные гены у разных видов сум-
чатых могут инактивироваться в разной степени.
Следует отметить, что инактивация Х-хромо-
сомы — не единственный механизм дозовой
компенсации у сумчатых. У представителей се-
мейства бандикутов (сумчатые барсуки. Рага-
melidae) на разных стадиях онтогенеза в сомати-
ческих клетках элиминируются Y-хромосома
у самцов и одна из двух Х-хромосом у самок
[Hayman, Martin, 1965]. Элиминация половых
хромосом в разных тканях может наблюдаться
как во всех клетках, так и в части из них. Иссле-
дование экспрессии аллелей Х-сцепленного гена
Pgkl у южного бандикута Isodon obesulus свиде-
тельствует, что у самок утрачивается исключи-
тельно Х-хромосома, унаследованная от отца
[Johnston et al., 2002b]. В тех клетках, где элими-
нация половых хромосом не произошла, Х-хро-
мосома отцовского происхождения у самок и
Y-хромосома у самцов являются позднореплици-
рующимися. Механизм утраты половых хромо-
ГЛАВА 17 423
Таблица 17.2
Статус экспрессии генов Х-хромосом у разных видов сумчатых [Deakin et al., 2009]
Ген Вид Методы Инактивация в соматических тканях
G6pd Macropus robustus Macropus rufogriseus Didelphis virginiana Monodelphis domestica Изоферментный анализ, SNuPE Изоферментный анализ Изоферментный анализ ОТ-ПЦР Полная Полная Неполная Полная
Gia Antechinus stuarttii Kangaroo hybrids Изоферментный анализ Изоферментный анализ Полная Полная
Pgk1 Macropus giganteus Macropus parryi Trichosurus vulpecula Didelphis virginiana Monodelphis domestica Изоферментный анализ Изоферментный анализ Изоферментный анализ Изоферментный анализ SNuPE Т канеспецифичная Т канеспецифичная Т канеспецифичная Т канеспецифичная Неполная
сом неизвестен, однако преимущественная поте-
ря Х-хромосомы отцовского происхождения и
асинхронная репликация Х-хромосом у самок
свидетельствуют, что этот процесс у сумчатых,
вероятно, возник как направление в эволюции
процесса инактивации Х-хромосомы.
17.1.3. Плацентарные млекопитающие
имеют импринтированную
и случайную инактивацию
Х-хромосомы, которые
контролируются центром
инактивации и геном Xist
Инфракласс плацентарных (Eutheria), подраз-
деляющийся на четыре надотряда Afrotheria,
Xenarthra, Euarchontoglires и Laurasiatheria, явля-
ется самым многочисленным, разнообразным и
распространенным среди млекопитающих. Х-хро-
мосома плацентарных млекопитающих на две
трети состоит из генов, составляющих Х-хромо-
сому сумчатых, а также содержит добавленный
участок, который у сумчатых локализуется на
аутосоме [Deakin etal.. 2009] (см. рис. 17.1).
В отличие от сумчатых, у самок плацентарных в
клетках взрослых особей Х-хромосомы отцов-
ского и материнского происхождения инактиви-
рованы с равной вероятностью, таким образом, в
среднем половина клеток экспрессирует гены
отцовской Х-хромосомы, а другая половина —
материнской. Случайная инактивация, в отличие
от импринтированной, охватывает большинство
генов Х-хромосомы и стабильно поддерживается
в ряду клеточных поколений. Следует заметить,
что гены добавленного района Х-хромосомы
плацентарных млекопитающих, которые у сум-
чатых локализовались на аутосоме и не были
вовлечены в процесс инактивации, инакти-
вируются менее эффективно и способны избе-
гать инактивации | Dementyeva et al., 2009]. Про-
цесс случайной инактивации у плацентар-
ных включает несколько стадий: подсчет чис-
ла Х-хромосом на диплоидный геном, выбор X-
хромосомы для инактивации, инициацию инак-
тивации, распространение неактивного состоя-
ния и его поддержание в ряду’ клеточных поко-
лений (см. обзор [Heard, Disteche, 2006; Es-
camilla-Del-Arenal et al., 2011]). Вероятно, стадия
выбора Х-хромосом, на которой происходит
взаимоисключающий выбор будущей активной и
неактивной Х-хромосом, как у мыши, характер-
на не для всех видов плацентарных. Например, в
раннем развитии кролика инактивация происхо-
дит стохастически, в результате образуются раз-
ные клетки, в которых ни одна из двух Х-хро-
мосом не инактивирована, инактивированы обе
Х-хромосомы, случайным образом инактивиро-
вана одна из двух Х-хромосом. Впоследствии из-
за нарушений дозы генов первые два типа клеток
погибают, а оставшиеся с нормальной инактива-
цией формируют органы и ткани организма
[Okamoto et al., 2011].
В некоторых таксонах плацентарных млекопи-
тающих, например у грызунов и парнокопытных,
наряду’ со случайной имеется также импринтиро-
ванная, неполная и нестабильная инактивация X-
хромосомы, унаследованной от отца, которая, од-
нако, происходит только на предымплантацион-
ных стадиях развития эмбриона и сохраняется в
клетках, из которых формируются внезародыше-
вые органы — плацента и желточный мешок [Та-
kagi, Sasaki, 1975; Dindot et al., 2004].
Как случайная, так и импринтированная инак-
тивация у плацентарных контролируется цент-
424 ЭПИГЕНЕТИКА
ром инактивации (XIC) и геном Xist, которые не
обнаружены у однопроходных и сумчатых
[Heard, Disteche, 2006; Escamilla-Del-Arenal et al.,
2011]. Во время случайной инактивации ген Xist
обеспечивает инициацию инактивации и распро-
странение неактивного состояния, тогда как дру-
гие элементы центра инактивации работают на
стадии подсчета Х-хромосом и выбора Х-хромо-
сомы для инактивации.
17.1.4. Эволюция эпигенетических
механизмов инактивации
Х-хромосомы у сумчатых
и плацентарных
Несмотря на различия, инактивация Х-хромо-
сомы у сумчатых и плацентарных млекопитаю-
щих имеет много общих черт, которые, вероят-
но, отражают фундаментальные и наиболее
древние механизмы, заложенные в этот процесс
(рис. 17.2) [Mahadevaiah etal., 2009; Rens etal.,
2010; Chaumeil etal., 2011]. Для процесса инак-
тивации сумчатых и плацентарных характерен
ряд сходств. Как у сумчатых, так и у плацентар-
ных млекопитающих неактивная Х-хромосома
выявляется в интерфазных ядрах самок в виде
цитологически различимой глыбки компактного
хроматина, называемой тельцем Барра. Из хро-
мосомной территории неактивной Х-хромосомы
в интерфазных ядрах практически полностью
исключена отвечающая за транскрипцию генов
ДНК-зависимая РНК-полимераза 2. Неактивная
Х-хромосома является позднореплицирующейся
и на время репликации перемещается в околояд-
рышковую область ядра, обогащенную фермен-
тами, необходимыми для воспроизведения струк-
туры неактивного хроматина. На неактивной X-
хромосоме исключены ковалентные модифика-
ции гистонов, характерные для транскрипционно
активного хроматина, и присутствуют модифи-
Поздняя репликация Xi
Исключение РНК-полимеразы 2 и модификаций активного хроматина
Метилирование ДНК
Привлекаются на Xi РНК Xist, выявляются стабильно
в течение всего клеточного цикла
РНК Xist
Модификации конститутивного гетерохроматина на Xi
Распространены по всей Xi Распространены в G-позитивных бэндах Xi
Репрессирующие модификации, специфичные для Xi
Только в период S-G2
РНК Rsx
Protothena
105
Eutheria
Полная, стабильная, случайная
инактивация Х-хромосомы,
контролируемая центром инактивации
и геном Xist. РНК Xist привлекает
специфические для Xi модификации,
которые чередуются на Xi с
модификациями конститутивного
гетерохроматина. Для стабильного
поддержания неактивного состояния Xi
используется метилирование ДНК
Metatheria
Импринтированная, неполная,
нестабильная, тканеспецифическая
инактивация Х-хромосомы происходит
с участием некодирующей ядерной
РНК Rsx. Хроматин Xi содержит
преимущественно модификации,
характерные для конститутивного
гетерохроматина. Метилирование
ДНК в процессе инактивации не
задействовано
Thena
166
Mammalia
Рис. 17.2. Эволюция эпигенетических механизмов процесса инактивации Х-хромосомы у млекопитающих
[Chaumeil et aL, 2011].
Xi — неактивная Х-хромосома. В основании ветвей филогенетического древа указано время дивергенции таксонов в
миллионах лет назад.
ГЛАВА 17 425
кации, свойственные транскрипционно неактив-
ному’ хроматину’. Хроматин неактивной Х-хро-
мосомы содержит нетранслиру’ему’Ю ядерну’ю
РНК, которая экспрессируется только с неактив-
ной Х-хромосомы и распространяется по ней.
вызывая инактивацию генов.
Следует особо подчеркнуть, что сумчатые и
плацентарные млекопитающие используют в
процессе инактивации совершенно разные, не
родственные по происхождению некодирующие
ядерные РНК Rsx и Xist, которые обладают
сходными свойствами и поведением в процессе
инактивации [Grant et al.. 2012]. Обе некодирую-
щие РНК обогащены микросателлитными по-
вторами, которые, как показано для РНК гена
Xist, являются важными функциональными до-
менами, необходимыми для репрессии транс-
крипции, распространения по неактивной Х-хро-
мосоме и связывания белковых комплексов, от-
ветственных за модификацию хроматина [Koh-
Imaier et al., 2004].
Следует также отметить, что неактивная X-
хромосома сумчатых стабильно на протяжении
всего клеточного цикла ассоциирована с гетеро-
хроматиновым белком НР1, триметилированным
гистоном НЗ по лизину’ К9 и триметилирован-
ным гистоном Н4 по лизину2 К20, которые харак-
терны для районов центромерного и теломерно-
го конститутивного гетерохроматина [Rens et al.,
2010; Chaumeil etal.. 2011; Zakharova etal.. 2011].
Некоторые из модификаций, специфичных для
неактивной Х-хромосомы плацентарных (на-
пример триметилированный гистон НЗ по лизи-
ну’ К27), появляются на неактивной Х-хромосо-
ме сумчатых временно в период с S- до ранней
О2-фаз клеточного цикла.
У плацентарных на ранних стадиях имприн-
тированной инактивации, подобно сумчатым,
репрессия всей Х-хромосомы может осуществ-
ляться исключительно за счет модификаций,
свойственных районам конститутивного гетеро-
хроматина [Дементьева, 2010].
На более поздних стадиях импринтирован-
ной, а также при случайной инактивации эти мо-
дификации представлены на неактивной Х-хро-
мосоме только в районах, обогащенных повто-
ренными последовательностями ДНК, которые
соответствуют G-позитивным бэндам. Обога-
щенные генами области неактивной Х-хромосо-
мы стабильно в течение всего клеточного цикла
репрессированы с помощью триметилирования
НЗ по лизину’ К27, моноубиквитинирования Н2А
по лизину’ К119, а также включения в состав
хроматина гистона макроН2А1.2, которые соло-
кализуются с РНК гена Xist [Chadwick, Willard,
2004; Brinkman et al., 2006; Chadwick, 2007;
Coppola et al., 2008; Shevchenko et al., 2009].
Еще одним эпигенетическим различием в
процессе инактивации у сумчатых и плацентар-
ных млекопитающих является метилирование
ДНК неактивной Х-хромосомы. У плацентарных
млекопитающих в процессе случайной инакти-
вации в тканях эмбриона ДНК неактивной X-
хромосомы, в отличие от активной, гипермети-
лируется по CpG-динуклеотидам, располагаю-
щимся в промоторах и 5'-нетранслируемых об-
ластях генов [Hellman, Chess. 2007]. Подобного
метилирования не выявляется при нестабиль-
ной импринтированной инактивации в экстраэм-
бриональных тканях плацентарных и в сомати-
ческих тканях сумчатых [Kratzer et al., 1983;
Cooper etal., 1993; Homecker etal., 2007]. Веро-
ятно, метилирование ДНК промоторов во время
случайной инактивации возникло у плацентар-
ных как дополнительная стадия для стабилиза-
ции неактивного состояния неактивной Х-хро-
мосомы в соматических клетках.
Более стабильная и полная инактивация у
плацентарных может быть связана с эволюцией
определенных последовательностей Х-хромо-
сомы, которые позволяли бы более эффективно
распространяться и поддерживаться неактивно-
му7 состоянию генов. Роль таких последователь-
ностей могли бы выполнять ретротранспозоны
LINE1, плотность которых у7 мыши на Х-хромо-
соме больше, чем на аутосомах [Lyon, 1998]. Эта
гипотеза получила дальнейшее подтверждение
при анализе секвенированных геномов млекопи-
тающих. Содержание LINE1 на Х-хромосомах
мыши, крысы и человека в два раза выше, чем на
аутосомах. На протяжении Х-хромосомы пла-
центарных LINE1 распределены более-менее
равномерно, их доля снижена только в районах,
содержащих гены, избегающие инактивации
[Bailey etal., 2000]. У американского сумчатого
опоссума М. domesticci число LINE1 на Х-хромо-
соме и аутосомах достоверно не различается, что
согласуется с данными о неполной и нестабиль-
ной инактивации у7 сумчатых и показывает, что
повышенное содержание LINE1, действительно,
связано с их ролью в процессе инактивации, а не
является следствием менее эффективного нега-
тивного отбора LINE1 из-за уменьшения часто-
ты мейотической рекомбинации Х-хромосомы
по сравнению с аутосомами [Mikkelsen et al.,
2007]. Экспериментальные данные показывают,
что LINE1 могут принимать участие в организа-
ции хромосомной территории неактивной Х-хро-
426 ЭПИГЕНЕТИКА
мосомы, при этом наиболее эволюционно моло-
дые LINE! экспрессируются на инактивируемой
Х-хромосоме и способствуют распространению
неактивного состояния [Chow et al., 2010].
17.2. Гипотезы о происхождении и эволюции
ПРОЦЕССА ИНАКТИВАЦИИ Х-ХРОМОСОМЫ
17.2.1 Импринтированная инактивация,
по-видимому, является более
древней
Считают, что исходной и наиболее прими-
тивной является импринтированная инактивация
Х-хромосомы, которая наблюдается во всех тка-
нях и органах сумчатых и во внезародышевых
органах (плацента, желточный мешок) у ряда
плацентарных. В дальнейшем импринтирован-
ная инактивация эволюционировала в более
предпочтительный процесс случайной инакти-
вации, интегрировав в себя контролируемые
центром инактивации механизмы подсчета числа
Х-хромосом на диплоидный набор и выбора бу-
дущей неактивной Х-хромосомы.
Импринтированная инактивация в отдельных
таксонах у плацентарных могла сохраняться или
возникать заново, интегрировав в себя новые
механизмы, предлагаемые центром инактивации
и геном Xist. Так, по крайней мере у мыши, им-
принтированная инактивация происходит с уча-
стием XIC и Xist, при этом в XIC обнаружен им-
принтинг, предотвращающий экспрессию Xist и
защищающий от инактивации Х-хромосому, уна-
следованную от матери (см. обзор [Heard, Dis-
teche, 2006]). Однако в других таксонах, например
у человека, произошла полная утрата импринти-
рованной инактивации [Zeng, Yankowitz, 2003].
17.2.2. Процесс инактивации мог
произойти от механизмов
импринтированной или случайной
моноаллельной экспрессии
аутосомных генов, а также
от процесса мейотического
сайленсинга половых хромосом
В настоящее время нет удовлетворительных
объяснений того, как произошел процесс инак-
тивации Х-хромосомы. Механизм инактивации
мог возникнуть на Х-хромосоме de novo или
быть заимствован от уже существовавшего про-
цесса сайленсинга.
Предполагают, что основой для импринтиро-
ванной инактивации Х-хромосомы мог стать ме-
ханизм, который используется для импринтиро-
ванной моноаллельной экспрессии генов на од-
ной из двух гомологичных аутосом [Reik, Lewis,
2005]. Импринтинг экспрессии генов на аутосо-
мах широко распространен и консервативен
у сумчатых и плацентарных млекопитающих.
У плацентарных млекопитающих как при им-
принтинге генов на аутосомах, так и при инакти-
вации Х-хромосомы задействованы ядерные РНК,
экспрессия которых вызывает транскрипционное
молчание генов in cis, утрату’ модификаций, ха-
рактерных для активного хроматина, и привле-
чение модификаций, свойственных неактивному’
хроматину. У Eutheria оба эти процесса проис-
ходят на ранних стадиях эмбрионального разви-
тия, сохраняются в плаценте и утрачиваются в
собственно эмбрионе.
Следует отметить, что моноаллельная экс-
прессия аутосомных генов, устанавливающаяся
случайным образом, — тоже достаточно распро-
страненный феномен. Так, гены иммуноглобу-
линов. обонятельных рецепторов. Т-клеточных
рецепторов, рецепторов нормальных киллерных
клеток являются примером генов с моноаллель-
ной экспрессией, которая устанавливается сто-
хастически. Многие гены со случайной моноал-
лельной экспрессией характеризуются асин-
хронной репликацией: в S-фазе аллели на одном
гомологе реплицируются рано, на другом —
поздно. Похоже, что асинхронная репликация
этих генов устанавливается в раннем развитии.
Кластеры разных генов с моноаллельной экс-
прессией, локализующиеся на одной хромосоме
на большом расстоянии друг от друга, в преде-
лах одного гомолога имеют одинаковое время
репликации [Singh et al., 2003]. Это позволяет
предположить, что для каждого гомолога из па-
ры, вероятно, существует собственная специфи-
ческим образом организованная хромосомная
територрия, подобная тельцу Барра [Heard, Dis-
teche, 2006]. Таким образом, не исключено, что
инактивация Х-хромосомы произошла от меха-
низма стохастической моноаллельной экспрес-
сии генов, в который затем мог быть привнесен
импринтинг [Ohlsson et al., 2001].
Предполагают также, что импринтирован-
ная инактивация Х-хромосомы, унаследованной
от отца, произошла от процесса мейотической
инактивации половых хромосом в сперматогене-
зе либо является его продолжением [Cooper
etal., 1990]. В пользу’ этого предположения, на-
пример, свидетельствуют данные о том, что при
импринтированной инактивации у сумчатых и
на ранних стадиях импринтированной инактива-
ГЛАВА 17 427
ции у плацентарных используются те же моди-
фикации хроматина, которые задействованы в
мейотической инактивации [Дементьева, 2010].
Предполагаемое родство мейотической и им-
принтированной инактивации дает основание
думать, что на начальных этапах эволюции про-
цесс инактивации Х-хромосомы мог бы осуще-
ствляться без участия не кодирующей белок
ядерной РНК, а если подобная РНК существова-
ла, то не играла ключевой роли в репрессии
транскрипции. Почву для такого предположе-
ния дают сведения о том, что сходные модифи-
кации, обеспечивающие репрессию хроматина,
при мейотической и импринтированной инакти-
вации неспецифичны для неактивной Х-хро-
мосомы, а характерны для всех областей консти-
тутивного гетерохроматина в геноме и их появ-
ление, по крайней мере на Х-хромосоме плацен-
тарных, не зависит от экспрессии Xist. Более то-
го, показано, что мейотическая инактивация и
начальные стадии импринтированной инактива-
ции у плацентарных могут успешно осуществ-
ляться в отсутствие РНК Xist [Turner et al., 2002;
Kalantry etal., 2009]. Мейотическая репрессия
генов в сперматогенезе у сумчатых также не за-
висит от гена Rsx, который на данной стадии не
экспрессируется [Grant etal., 2012]. Таким обра-
зом, можно предположить, что изначально роль
ядерной РНК в процессе инактивации Х-хро-
мосомы могла заключаться в организации спе-
цифической хромосомной территории или пере-
мещении неактивной Х-хромосомы в околояд-
рышковый компартмент для обеспечения ее реп-
ликации, которые происходят с непосредствен-
ным участием РНК генаXist [Chaumeil et al., 2006;
Clemson etal., 2006; Zhang etal., 2007], и лишь
впоследствии ядерные РНК стали использоваться
непосредственно для репрессии транскрипции и
привлечения белковых комплексов, репресси-
рующих хроматин. Следует, однако, помнить, что
коровые гистоны вместе с эпигенетическими све-
дениями о транскрипционном статусе хроматина
при упаковке хромосом в спермин в большинстве
случаев замещаются на протамины, а метилиро-
вание CpG-островков ДНК, использующееся для
наследования неактивного статуса, у Х-сцеплен-
ных генов не обнаруживается [Homecker etal.,
2007]. Таким образом, не вполне ясно, как неак-
тивное состояние хроматина после мейотической
инактивации может передаваться в зиготу’. Кроме
того, поскольку’ молекулярные механизмы как
мейотической, так и импринтированной инакти-
вации не известны, трудно судить, насколько,
действительно, родственны эти процессы.
17.3. Происхождение и эволюция
ЦЕНТРА ИНАКТИВАЦИИ И ГЕНА X/ST
17.3.1. Гены центра инактивации
произошли из белок-кодирующих
генов и мобильных элементов
У плацентарных процесс инактивации управ-
ляется сложным генетическим локусом Х-хро-
мосомы — центром инактивации (XIC). Кроме
Xist, в его составе у эволюционно далеких видов
плацентарных выявляются еще два гена, коди-
рующих ядерные РНК, Enox (Jpx) и Ftx, которые,
как показано в экспериментах на мышах, явля-
ются активаторами экспрессии Xist [Chureau
et al., 2002, 2011; Johnston et al., 2002a; Tian et al.,
2010]. Также в составе XIC содержатся белок-
кодирующие гены Tsx и Cnbp2, продукты кото-
рых не участвуют в инактивации [Chureau et al.,
2002]. Показано, что несколько белок-кодирую-
щих генов на хромосоме 4 курицы в районе син-
тении с XIC имеют гомологию с генами центра
инактивации и, вероятно, были их предшествен-
никами [Duret et al., 2006]. Основой для образо-
вания Xist послужил ген ЕпхЗ, белковый продукт
которого содержит убиквитин-лигазный домен
PDZ (рис. 17.3). Сравнение этих генов показало,
что премоторная область и. по крайней мере, три
экзона гена Xist произошли из последовательно-
стей гена Lnx3 (рис. 17.4). Самый большой пер-
вый экзон гена Xist, вероятно, произошел из эн-
догенных ретровирусов, фрагменты которых по-
сле инсерции в локус амплифицировались и
сформировали несколько типов простых тан-
демных повторов, выявляющихся в его составе.
Остальные экзоны гена Xist имеют сходство с
мобильными элементами разных классов [Elisap-
henko etal., 2008]. Белок-кодирующие гены, ок-
ружающие ген Lnx3, дали начало другим генети-
ческим элементам центра инактивации млекопи-
тающих (см. рис. 17.3). Из гена Fipll2 произо-
шел ген Tsx. Два других гена — Uspl и Wave 4 —
стали основой для формирования Enox(Jpx) и Ftx
соответственно. Можно отметить, что в составе
гена Enox (Jpx). аналогично Xist, обнаружены
экзоны, образованные из мобильных элементов,
которые у разных видов соответствуют разным
типам повторов [Chureau et al., 2002; Johnston
et al., 2002a; Elisaphenko et al., 2008].
428 ЭПИГЕНЕТИКА
Н. sapiens (-1000 т.п.н.)
Рис. 17.3. Сравнение центра инактивации Х-хромосомы человека (/7. sapiens) и мыши (М. musculus) с гомологич-
ным районом на хромосоме 4 курицы (G. gallus).
Цветными стрелками показано расположение генов и направление их транскрипции. Стрелки гомологичных генов окрашены в
одинаковый цвет. Cdx4, Chid и Slc16a2 — консервативные белок-кодирующие гены, фланкирующие как XIC на Х-хромосоме
плацентарных, так и гомологичный ему район на хромосоме 4 курицы. Cnbp2 — белок-кодирующий ген, встроившийся в локус
XIC плацентарных в результате ретропозиции. Tsx— белок-кодирующий ген, специфически экспрессирующийся в семенниках,
который частично произошел из гена Fip1l2. У человека ген TSX не функционален и представляет собой псевдоген. Гены XIC:
Xist, Епох (Jpx) и Ftx— кодируют протяженные нетранслируемые ядерные РНК; они обнаруживают гомологию с родственными
белок-кодирующими генами курицы Lnx3, Uspl и Wave4 соответственно. Дивергировавшие остатки последовательностей бе-
лок-кодирующего гена Rasl11c обнаружены у плацентарных между генами Ftx и Епох. Размеры локусов приведены в скобках.
Рис. 17.4. Происхождение генаХ/sf из последовательностей белок-кодирующего гена Lnx3 и мобильных элемен-
тов разных классов.
Синие прямоугольники — экзоны, эволюционировавшие из гена Lnx3', красные прямоугольники — экзоны, произошедшие из
мобильных элементов. Заштрихованные синие и красные прямоугольники — последовательности экзонов, выявляющиеся в
геноме, но не входящие в состав транскрипта Xist у данного вида. Консенсус — предположительная предковая структура гена
Xist. Для генов Xist человека (Н. sapiens) и мыши (М. musculus) приведена нумерация экзонов (ml—m8 — экзоны Xist мыши,
hi —h8 — экзоны XIST человека).
ГЛАВА 17 429
17.3.2. У однопроходных и сумчатых
ген Xist отсутствует, и район,
гомологичный центру
инактивации плацентарных,
разделен на части
хромосомными перестройками
У однопроходных и сумчатых в результате
скрининга геномных библиотек и тщательного
поиска гомологии в последовательностях секве-
нированных геномов не обнаружено прямого
ортолога гена Xist или других последовательно-
стей XIC [Ноге et а!.. 2007]. Более того, у них
выявлены белок-кодирующие гены-предшест-
венники XIC, разделенные независимыми хро-
мосомными перестройками и локализующиеся
в виде двух отдельных групп у сумчатых на X-
хромосоме и у однопроходных на хромосоме 6
[Duret et al., 2006; Davidov et al., 2007; Ноге et al.,
2007; Shevchenko etal., 2007]. РНК гена Lnx3 y
сумчатых имеет нативную рамку считывания,
экспрессируется как у самцов, так и у самок и,
очевидно, функционирует как белок-кодирую-
щий ген, а не как нетранслируемая ядерная РНК,
подобная Xist. Таким образом, белок-кодирую-
щие гены-предшественники XIC преобразова-
лись в гены центра инактивации только у пла-
центарных млекопитающих, и процесс инакти-
вации у сумчатых происходит без участия Xist и
XIC. Ген Rsx, который у сумчатых, вероятно,
выполняет функции, сходные с геном Xist пла-
центарных, примыкает к бслок-кодирующсму
гену Х-хромосомы Hprt и не имеет общего про-
исхождения сXist и XIC [Grant et al., 2012].
17.3.3. Ген Xist и центр инактивации
в процессе эволюции быстро
накапливают видоспецифические
различия
Ген Xist выявлен в геномах у представителей
всех четырех надотрядов млекопитающих, вклю-
чая наиболее древних представителей Afrotheria
и Xenarthra [Ноге et al., 2007]. Однако последова-
тельность гена Xist не консервативна и эволю-
ционирует очень быстро [Nesterova etal., 2001;
Chureau et al., 2002; Duret et al.. 2006; Elisaphenko
etal., 2008]. Экзоны гена Xist изменяются мед-
леннее, чем интроны. Самым консервативным
является экзон 4, который демонстрирует наи-
большее сходство с экзоном гена /,ихЗ. Парадок-
сально, что имеющий определенные функции
первый экзон и, в частности, район А-повтора,
необходимый для установления транскрипцион-
ного молчания генов, изменяются в эволюции
быстрее, чем экзон 4, делеция которого не влия-
ет на инактивацию. У разных видов плацентар-
ных число экзонов в гене варьирует от шести до
восьми (рис. 17.5). Последовательности, являю-
щиеся экзонами у одних видов, могут входить в
состав интронов у других. Размер некоторых эк-
зонов может изменяться за счет образования но-
вых экзон-интронных границ. Размер самого
большого первого экзона гена Xist изменяется за
счет амплификации и делеций входящих в его
состав тандемных повторов и инсерций/делеций
таксоноспецифических мобильных элементов.
В результате этой вариабельности длина РНК
Xist у представителей разных отрядов может
различаться приблизительно в два раза. Счита-
ют, что различия гена Xist по размеру РНК, на-
личию экзонов, повторов и мобильных элемен-
тов — его адаптация к функционированию в ге-
номе и Х-хромосоме каждого конкретного вида.
В XIC мыши имеются еще два гена, продуци-
рующих ядерную РНК. — Tsix. экспрессирую-
щийся по антисмысловой цепи к гену Xist, и Xite
(X-inactivation intergenic transcriptional element).
Как показано, они регулируют экспрессию Xist
при импринтированной и случайной инактива-
ции и задействованы в механизмах подсчета
числа Х-хромосом на диплоидный набор ауто-
сом и выбора будущей неактивной Х-хромосомы
[Lee. 2005]. Эти гены менее консервативны. Xite
выявляется даже не у всех грызунов и не обна-
ружен у человека [Shevchenko etal., 2011]. Ан-
тисмысловая транскрипция к гену Xist, подобная
Tsix, обнаружена у человека, однако она не име-
ет таких же функций, как у мыши [Migeon et al.,
2002; Migeon, 2003]. Таким образом, не обнару-
жено консервативных элементов XIC, отвечаю-
щих за функции «подсчета» и «выбора», а сле-
довательно, функциональные элементы XIC, ре-
гуляция Xist и процесса инактивации, хотя бы
отчасти, являются видоспецифичными [Shev-
chenko et al., 2011].
В целом, можно отметить, что в XIC плацен-
тарных млекопитающих гены ядерных РНК, во-
влеченных в процесс инактивации, изменяются
очень быстро. Меняются их экзон-интронная
структура и границы, в процессе эволюции про-
исходят утрата одних и появление новых неко-
дирующих РНК, вовлеченных в реализацию
процесса инактивации. На этом фоне замена гена
Rsx сумчатых на ген Xist у млекопитающих вы-
глядит рядовым явлением, которое вполне укла-
дывается в общие тенденции эволюции процесса
инактивации.
430 ЭПИГЕНЕТИКА
Рис. 17.5. Вариабельность экзон-интронной структуры и размеров гена Xist у человека (Н. sapiens), коровы
(В. taurus) и полевки (М. arvalis).
Серые прямоугольники — экзоны (1—8). Зеленые прямоугольники — фрагменты интронов Xist, которые являются экзонами
у других видов. Гомологичные элементы Xist у разных видов соединены линиями. Цветные прямоугольники внутри экзонов
Xist — тандемные микросателлитные повторы А, В, В*, С, D, Е, и F. Эволюционно молодые видоспецифические мобиль-
ные элементы LINE и SINE указаны синими и красными стрелками соответственно. Размеры локусов даны в тысячах пар нук-
леотидов.
* * *
В заключение можно отметить, что процесс
инактивации Х-хромосомы у сумчатых и пла-
центарных млекопитающих имеет общие эпиге-
нетические и, вероятно, молекулярные механиз-
мы (см. рис. 17.2). Ключевая особенность про-
цесса инактивации млекопитающих — скоорди-
нированная репрессия генов в масштабах X-
хромосомы, по-видимому, достигается за счет
распространения по ней нскодирующсй ядерной
РНК. Однако в эволюции у плацентарных про-
изошла замена гена нскодирующсй ядерной РНК
Rsx на Xist, который, вероятно, по сравнению со
своим предшественником, способен привлекать
на Х-хромосому модификации, более подходя-
щие для стабильной инактивации генов. Вокруг
гена Xist сформировался центр инактивации с
элементами, способными производить подсчет и
выбор будущих активной и неактивной Х-хро-
мосом, что позволило осуществлять репрессию
одной из двух Х-хромосом случайным образом.
Кроме того, формированию более полной и ста-
бильной инактивации у плацентарных способст-
вовало привлечение к поддержанию неактивного
состояния механизмов метилирования ДНК и
обогащение Х-хромосомы последовательностя-
ми LINE1, позволяющими более эффективно
распространять неактивное состояние. Тем не
менее, эволюция процесса инактивации Х-хро-
мосомы у млекопитающих изучена недостаточ-
но. Изложенные в этой главе предположения о
его происхождении и эволюции не всегда логич-
ны и пока слишком спекулятивны, поскольку’
опираются, в основном, на феноменологические
данные, а не на знания о механизмах, которые
при одинаковой феноменологии могут разли-
чаться. Вероятно, дальнейшие исследования мо-
лекулярных и эпигенетических механизмов это-
го процесса позволят восстановить более пол-
ную картину’ эволюции системы дозовой ком-
пенсации у млекопитающих.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Дементьева Е. В. Статус экспрессии генов и модификации
хроматина на активной и неактивной Х-хромосоме у
обыкновенных полевок: Автореф. дисс. ... канд. биол.
наук. Новосибирск: Институт цитологии и генетики
СО РАН, 2010. 17 с.
ГЛАВА 17 431
Bailey J. A.. CarrelL., Chakravarti A.. Eichler E. E. Molecular
evidence for a relationship between LINE-1 elements and X
chromosome inactivation: the Lyon repeat hypothesis //
Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. Vol. 97. P. 6634—6639.
Bininda-EmondsO. R, Cardillo M, Jones K.E., MacPhee R. D.,
Beck RM., GrenyerR, PriceS. A., T’osRA., Gittle-
manJ. L., Purvis A. The delayed rise of present-day mam-
mals /'Nature. 2007. Vol. 446. P. 507—512.
Brinkman A. B., RoelofsenT., Pennings S. П’., Martens J. H,
Jemtwein T, ShnmenbergH. G. Histone modification pat-
terns associated with the human X chromosome // EMBO
Rep. 2006. Vol. 7. P. 628—634.
Chadwick В. P. Variation in Xi chromatin organization and
correlation of the H3K27me3 chromatin territories to tran-
scribed sequences bv microarray analysis 7 Chromosoma.
2007. Vol. 1 16. P. 147 157.
Chadwick В. P.. Willard H.F. Multiple spatially distinct types
of facultative heterochromatin on the human inactive X
chromosome // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004.
Vol. 101. P. 17450—17455.
Chaumeil J., Ее Baccon P., WutzA., HeardE. A novel role for
Xist RNA in the formation of a repressive nuclear com-
partment into which genes are recruited when silenced //
Genes Dev. 2006. Vol. 20. P. 2223—2237.
Chaumeil J., Waters P. D., Koina E., Gilbert C., Robinson T. J.,
Graves J. A. M. Evolution from XIST-independent to
XIST-controlled X-chromosome inactivation: epigenetic
modifications in distantly related mammals // PLoS One.
2011. Vol. 6. P. el9040.
Chow J. C, CiaudoC, Fazzari M. J., Mise N., ServantN.,
Glass J. L., AttreedM., AvnerP., WutzA., BarillotE.,
Greatly J. M., VoinnetO., Heard E. LINE-1 activity in
facultative heterochromatin formation during X chromo-
some inactivation // Cell. 2010. Vol. 141. P. 956—969.
Chureau C.. PrissetteM.. BourdetA., Barbe]'.. CattolicoL..
JonesL., EggenA., AvnerP., DuretL. Comparative se-
quence analysis of the X-inactivation center region in
mouse, human, and bovine // Genome Res. 2002. Vol. 12.
P. 894—908.
Chureau C., ChantalatS., RomitoA., Galvani A., DuretL.,
Avner P., Rougeulle C. Ftx is a non-coding RNA which
affects Xist expression and chromatin structure within the
X-inactivation center region// Hum. Mol. Genet. 2011.
Vol. 20. P. 705—718.
Clemson С. M, Hall L. L., Byron M., McNeil J., Lawrence J. B.
The X chromosome is organized into a gene-rich outer rim
and an internal core containing silenced nongenic se-
quences // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. Vol. 103.
P. 7688—7693.
Cooper D. W., Johnston P. G., Graves J. A. M. X-inactivation
in marsupials and monotremes // Sem. Dev. Biol. 1993.
Vol. 4. P. 117—128.
Coppola G., Pinton A., Joudrey E. M„ BasrurP. K, King W. .1.
Spatial distribution of histone isoforms on the bovine ac-
tive and inactive X chromosomes // Sex Dev. 2008. Vol. 2.
P. 12—23.
DavidowL.S., Breen M., Duke S. E., Samollow P. B., McCar-
rey. J. R., LeeJ. T. The search for a marsupial Xie reveals
a break with vertebrate synteny // Chromosome Res. 2007.
Vol. 15. P. 137—146.
Deakin J. E., Chaumeil J., Ноге T. A., Marshall Graves J. A. Un-
ravelling the evolutionary' origins of X chromosome inacti-
vation in mammals: insights from marsupials and monot-
remes // Chromosome Res. 2009. Vol. 17. P. 671—685.
Deakin J. E., HoreT.A., KoinaE., Graves J. .1. M. The status
of dosage compensation in the multiple X chromosomes of
the platypus 11 PLoS Genet. 2008. Vol. 4. P. el000140.
Dementyeva E. J ’., Shevchenko A. I., Zakian S. M. X-chromoso-
me upregulation and inactivation: two sides of the dosage
compensation mechanism in mammals // Bioessays. 2009.
Vol. 3l.P. 21—28.
DindotS. I~, Kent К. C, Evers B., LoskutoffN, Womack J.,
Piedrahita J. .1. Conservation of genomic imprinting at the
XIST, IGF2, and GTL2 loci in the bovine / Mamm. Ge-
nome. 2004. Vol. 15. P. 966—974.
Duret L., Chureau C., SamainS., Weissenbach J., AvnerP. The
Xist RNA gene evolved in eutherians by pseudogenization
of a protein-coding gene// Science. 2006. Vol. 312.
P. 1653—1655.
Elisaphenko E. A., Kolesnikov N. N., Shevchenko A. I., Ro-
gozin 1. B., Nesterova T. B., BrockdorffN., Zakian S. M. A
dual origin of the Xist gene from a protein-coding gene
and a set of transposable elements " PLoS One. 2008.
Vol. 3.P. e2521.
Ellegren H, Hultin-RosenbergL., Brunstrom B., DenckerL.,
Kultima K. Scholz B. Faced with inequality: chicken do
not have a general dosage compensation of sex-linked
genes // BMC Biol. 2007. Vol. 5. P. 40.
Escamilla-Del-Arenal M., da RochaS. T, Heard E. Evolution-
ary' diversity and developmental regulation of X-chro-
mosome inactivation// Hum. Genet. 2011. Vol. 130.
P. 307—327.
Grant J., Mahadevaiah S. K, Khil P., Sangrithi M. N, Royo H,
Duckworth J., McCarrey J. R, VandebergJ. L., Ren-
free M. B., Taylor W.. Elgar G.. Camerini-OteroR D..
Gilchrist M. J., Turner J. M. Rsx is a metatherian RNA
with Xist-like properties in X-chromosome inactivation //
Nature. 2012. Vol. 487. P. 254—258.
Griitzner F, Rens W., Tsend-Ayush E., El-Mogharbel N,
OBrienP.C., JonesRC., Ferguson-SmithM. A., Gra-
ves J. A.M. In the platypus a meiotic chain of ten sex
chromosomes shares genes with the bird Z and mammal X
chromosomes //Nature. 2004. Vol. 432. P. 913—917.
Hayman D. L.. MartinP. G. Sex chromosome mosaicism in the
marsupial genera Isoodon and Perameles // Genetics.
1965. Vol. 52. P. 1201—1206.
HeardE., Disteche С. M. Dosage compensation in mammals:
fine-tuning the expression of the X chromosome // Genes
Dev. 2006. Vol. 20. P. 1848—1867.
Hellman A., Chess A. Gene body-specific methylation on the
active X chromosome// Science. 2007. Vol. 315.
P. 1141—1143.
HoreT.A.. KoinaE.. Wakefield M J.. Marshall Graves J. .1. The
region homologous to the X-chromosome inactivation cen-
tre has been disrupted in marsupial and monotreme mam-
mals // Chromosome Res. 2007. Vol. 15. P. 147—161.
Homecker J. L., Samollow P. B., Robinson E. S., i'ande-
bergJ. L., McCarrey J. R. Meiotic sex chromosome inac-
tivation in the marsupial Monodelphis domestica " Gene-
sis. 2007. Vol. 45. P. 696—708.
ItohY., MelamedE., YangX., KampfK, WangS., YehyaN,
I'anNasA., Replogle K, BandM.R, Clayton D. F,
Schadt E. E., LiisisA. J., Arnold A. P. Dosage compensa-
tion is less effective in birds than in mammals // J. Biol.
2007. Vol. 6. P. 2.
Johnston С. M., NewallA. E., BrockdorffN., Nesterova T. B.
Enox, a novel gene that maps 10 kb upstream of Xist and
partially escapes X inactivation // Genomics. 2002a.
Vol. 80. P. 236—244.
Johnston P. G., Watson CM., Adams M., Pauli D. J. Sex
chromosome elimination, X chromosome inactivation and
reactivation in the southern brown bandicoot Isoodon obe-
sulus (Marsupialia: Peramelidae) // Cytogenet. Genome
Res. 2002b. Vol. 99. P. 119—124.
Kalantry S., Punishothaman S., Bowen R B., Starmer S., Mag-
nuson T. Evidence of Xist RNA-independent initiation of
mouse imprinted X-chromosome inactivation // Nature.
2009. Vol. 460. P 647—651.
432 ЭПИГЕНЕТИКА
Kirsch J. Л. W, Lapointe F. J., Springer M. S. DNA hybridisa-
tion studies of marsupials and their implications for
metatherian classification // Aust. J. Zool. 1997. Vol. 45.
P. 211—280.
Kohlmaier A., Savare.se F., LachnerAL, Martens J., Jenu-
wein T, WutzA. A chromosomal memory triggered by
Xist regulates histone methylation in X inactivation //
PLoS Biol. 2004. Vol. 2. P. el71.
Kratzer P. G., Chapman E. AL, Lambert H., Evans R. E., Lis-
kay R. AL Differences in the DNA of the inactive X chro-
mosome of fetal and extraembrvonic tissues of mice //
Cell. 1983. Vol. 33. P. 37 42.
Lee J. T. Regulation of X-chromosome counting by Tsix and
Xite sequences // Science. 2005. Vol. 309. P. 768—771.
Lyon A I. F. Gene action in the X-chromosome of the mouse (Ahis
mt/sctihisL.) //Nature. 1961. Vol. 190. P. 372 373.
Lyon Al. F. X-chromosome inactivation: a repeat hypothesis 7
Cytogenet. Cell Genet. 1998. Vol. 80. P. 133—137.
Alahadevaiah S. K, RoyoH., EandeBergJ. L., ALcCarrey J. R,
Alackay S., Turner J. Al. Key features of the X inactivation
process are conserved between marsupials and eutheri-
ans // Curr. Biol. 2009. Vol. 19. P. 1478—1484.
Aligeon B. R. Is Tsix repression of Xist specific to mouse?//
Nat. Genet. 2003. Vol. 33. P. 337—338.
Aligeon B. R, LeeC.H., Chowdhury A. K, Carpenter H. Spe-
cies differences in TSIX/Tsix reveal the roles of these
genes in X-chromosome inactivation11 Am. J. Hum.
Genet. 2002. Vol. 71. P. 286—293.
AlikkelsenT. S., WakefieldM. J., AkenB., Amemiya С. T,
Chang J. L, Duke S., Garber AL, Gentles A. J., Good-
stadtL., HegerA., JurkaJ., Kamal AL, AlauceliE., Se-
arle S. AL, Sharpe T., Baker Al. L, BatzerAl.A., Be-
nos P. E, Belov K, Clamp Al., Cook A., Cuff J., DasR, Da-
vidowL., Deakin J. E., Fazzari AL. J., Glass J. L, Grab-
hen-AL, Greally J. Al.. Gu W.. Ноге T. A., HuttleyG.A..
Kleber AL, JirtleRL., KoinaE., LeeJ.T., AlahonyS.,
AlarraAL A., Aliller RD., Nicholls RD., Oda AL, Papen-
fuss A. T, Parra Z. E., PollockD. D., RayD.A.,
Schein J. E., Speed T.P., Thompson K, EandeBergJ. L.,
Wade C. Al, Walker J. A., Waters P. D., Webber C., Weid-
man J. R., Xie X., Zody Al. C; Broad Institute Genome Se-
quencing Platform; Broad Institute Whole Genome Assembly
Team, Graves J. A. AL, Ponting C.P., Breen AL, Samol-
lowP. B., Lander E. S, Lindblad-Toh K. Genome of the mar-
supial Alonodelphis domestica reveals innovation in non-
coding sequences ' Nature. 2007. Vol. 447. P. 167—177.
Nesterova T. B., Slobodyanyuk S. Y., ElisaphenkoE. A., Shev-
chenko A. L, Johnston C, Pavlova ALE., Rogozin I. B.,
Kolesnikov N. N, BrockdorffN., Zakian S. AL Characteri-
zation of the genomic Xist locus in rodents reveals con-
servation of overall gene structure and tandem repeats but
rapid evolution of unique sequence // Genome Res. 2001.
Vol. 11. P. 833—849.
Ohlsson R., Paldi A., Graves J. A. AL Did genomic imprinting
and X chromosome inactivation arise from stochastic ex-
pression? // Trends Genet. 2001. Vol. 17. P. 136—141.
Okamoto 1., PatratC, ThepotD., PeynotN., FauqueP., Da-
niel N., Diabangouaya P., Wolf J. P., Renard J. P., Duran-
thon E, HeardE. Eutherian mammals use diverse strate-
gies to initiate X-chromosome inactivation during devel-
opment // Nature. 2011. Vol. 474. P. 239—240.
ReikW., Lewis A. Co-evolution of X-chromosome inactivation
and imprinting in mammals // Nat. Rev. Genet. 2005.
Vol. 6. P. 403 410.
Rens W., Griitzner F, OBrien P.C., Fairclough H., Gra-
ves J. A., Ferguson-Smith Al. A. Resolution and evolution
of the duck-billed platypus karyotype with an
XIY1X2Y2X3Y3X4Y4X5Y5 male sex chromosome con-
stitution// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. Vol. 101.
P. 16257—16261.
Rens W., OBrien P. C, Griitzner F, Clarke O., Graphodat-
skaya D., Tsend-Ayush E., Trifonov E A., Skelton H, Wal-
lis AL C., JohnstonS., EeynmesF., Graves J. A., Fergu-
son-Smith Al. A. The multiple sex chromosomes of platy-
pus and echidna are not completely identical and several
share homology with the avian Z // Genome Biol. 2007.
Vol. 8. P. R243.
Rens IE, Wallduck AL S., Lovell F.L., Ferguson-Smith Al. A.,
Ferguson-Smith A. C. Epigenetic modifications on X
chromosomes in marsupial and monotreme mammals and
implications for evolution of dosage compensation 11 Proc.
Natl. Acad. Sci. USA. 2010. Vol. 107. P. 17657—17662.
Richardson B. J., CzupponA.B., Shannon G. B. Inheritance of
glucose-6-phosphate dehydrogenase variation in kanga-
roos // Nat. New Biol. 1971.Vol. 230. P. 154—155.
Shannon G. B. Late DNA replication in the paternally derived
X chromosome of female kangaroos// Nature. 1971.
Vol. 230. P. 231—232.
Shevchenko A. 1., Alalakhova A. A., Elisaphenko E. A., Ala-
zurokN.A., Nesterova T. B., BrockdorffN., Zakian S. Al.
Variability of sequence surrounding the Xist gene in ro-
dents suggests taxon-specific regulation of X chromosome
inactivation // PLoS One. 2011. Vol. 6. P. e22771.
Shevchenko A. I., Pavlova S. E, Dementyeva E. E, Zakian S. Al.
Mosaic heterochromatin of the inactive X chromosome in
vole Alicrotus rossiaemeridionalis 11 Mamm. Genome.
2009. Vol. 20. P. 644—653.
Singh N., Ebrahimi F. A., Gimelbrant A. A., Ensminger A. W.,
Tackett Al. R., QiP., Gribnau J., Chess A. Coordination of
the random asynchronous replication of autosomal loci //
Nat. Genet. 2003. Vol. 33. P. 339—341.
Takagi N. Sasaki Al. Preferential inactivation of the paternally
derived X chromosome in the extraembrvonic membranes
of the mouse 11 Nature. 1975. Vol. 256. P. 640—642.
TianD., Sun S., Lee J. T. The long noncoding RNA, Jpx, is a
molecular switch for X chromosome inactivation " Cell.
2010. Vol. 143. P. 390 403.
Turner J. AL, Alahadevaiah S. K, Elliott D. J., GarchonH.J.,
PehrsonJ.R, JaenischR. BurgoyneP.S. Meiotie sex
chromosome inactivation in male mice with targeted disrup-
tions of Xist 11 J. Cell Sci. 2002. Vol. 115. P. 4097 4105.
EeynmesF., WatersP.D., AliethkeP., Rens W., AlcAlillanD.,
AlsopA.E., Griitzner F, Deakin J. E., Whittington C. AL,
Schatzkamer K, Kremitzki C. L, Graves T, Ferguson-
Smith Al. A., Warren W, Graves./. .1. Al. Bird-like sex chro-
mosomes of platypus imply recent origin of mammal sex
chromosomes // Genome Res. 2008. Vol. 18. P. 965 973.
Wrigley J. Al.. Graves J. A. Sex chromosome homology and
incomplete, tissue-specific X-inactivation suggest that
monotremes represent an intermediate stage of mammal-
ian sex chromosome evolution // J. Hered. 1988. Vol. 79.
P. 115—118.
Zakharova I. S., Shevchenko A. 1, Shilov A. G., Nesterova T. B.,
EandebergJ.L, Zakian S. AL Histone H3 trimethylation
at lysine 9 marks the inactive metaphase X chromosome in
the marsupial Alonodelphis domestica 11 Chromosoma.
2011. Vol. 120. P. 177—183.
ZengS. AL, Yankowitz J. X-inactivation patterns in human em-
bryonic and extra-embryonic tissues // Placenta. 2003.
Vol. 24. P. 270—275.
ZhangL. F, Huynh K. D., Lee J. T. Perinucleolar targeting of
the inactive X during S phase: evidence for a role in the
maintenance of silencing // Cell. 2007. Vol. 129. P. 693—
706.
ГЛАВА
18
МОДИФИКАЦИИ ХРОМАТИНА
В ПРОЦЕССЕ ИНАКТИВАЦИИ Х-ХРОМОСОМЫ
У САМОК МЛЕКОПИТАЮЩИХ
СОДЕРЖАНИЕ
18.1. Феномен инактивации Х-хромосо-
мы у самок млекопитающих, 434
18.2. Динамика модификаций хроматина
неактивной Х-хромосомы в эмб-
риогенезе, 434
18.3. Два типа факультативного гетеро-
хроматина неактивной Х-хромосо-
мы, 436
18.4. Распределение модификаций хро-
матина на уровне отдельных генов
неактивной Х-хромосомы, 438
18.5. Репликация неактивной Х-хромо-
сомы, 439
18.6. Дифференциальное метилирова-
ние ДНК активной и неактивной X-
хромосом,439
18.7. Пространственная организация не-
активной Х-хромосомы в ядре, 441
18.8. Роль некодирующей РНК гена Xist
в инактивации транскрипции и
формировании хроматина неактив-
ной Х-хромосомы, 441
18.9. Потенциальные механизмы, участ-
вующие в распространении и под-
держании неактивного состояния
Х-хромосомы, 443
Список литературы, 446
434 ЭПИГЕНЕТИКА
В раннем развитии самок плацентарных мле-
копитающих на одной из Х-хромосом устанав-
ливается стабильно наследуемая инактивация
транскрипции генов, связанная с глобальным из-
менением структуры хроматина. В процессе ин-
активации Х-хромосома утрачивает модифика-
ции, ассоциированные с транскрипционно ак-
тивным хроматином, приобретает модификации,
ассоциированные с транскрипционно неактив-
ным хроматином, и формирует специфическим
образом организованную хромосомную террито-
рию. Ключевая роль в процессе инактивации
принадлежит РНК гена Xist. которая является не-
отъемлемым компонентом хроматина неактив-
ной Х-хромосомы, участвует в инактивации транс-
крипции генов и привлечении белковых комп-
лексов, ответственных за ковалентные модифи-
кации гистонов. В данной главе будут подробно
рассмотрены модификации хроматина неактив-
ной Х-хромосомы, их распределение, динамика
во времени, а также известные и предполагаемые
механизмы распространения и поддержания.
18.1. Феномен инактивации
Х-хромосомы у самок
МЛЕКОПИТАЮЩИХ
Инактивация Х-хромосомы — это процесс,
при котором в раннем эмбриогенезе у самок
млекопитающих одна из генетически эквива-
лентных Х-хромосом становится транскрипци-
онно неактивной, и это состояние устойчиво на-
следуется при делении клеток. Существует две
формы процесса инактивации: импринтирован-
ная и случайная [Heard, Disteche, 2006]. Имприн-
тированной инактивации подвергается Х-хромо-
сома, унаследованная от отца (Хр), в клетках
внезародышевых органов у некоторых видов
плацентарных млекопитающих (например, гры-
зунов). Во время случайной инактивации шансы
Х-хромосом стать неактивными равны вне зави-
симости от их родительского происхождения.
Случайная инактивация у плацентарных млеко-
питающих происходит в клетках собственно эм-
бриона, хотя у человека наблюдается также в
клетках внезародышевых органов. Модельной
системой для изучения случайной инактивации
Х-хромосомы являются эмбриональные стволо-
вые (ЭС) клетки мыши, в которых в момент за-
пуска дифференцировки реализуются процессы
подсчета числа Х-хромосом на диплоидный на-
бор, выбор Х-хромосомы для инактивации, ини-
циация инактивации и распространение неак-
тивного состояния.
Процесс инактивации контролируется слож-
ным генетическим локусом Х-хромосомы — цент-
ром инактивации (XIC). Данный локус содержит
ген Xist (X inactive specific transcript), продуктом
которого является некодирующая ядерная РНК
размером —16 т.н. В период инициации инакти-
вации транскрипция гена Xist усиливается в 100
раз, его РНК распространяется по всей длине
будущей неактивной Х-хромосомы, запуская по-
давление транскрипции и глобальные изменения
структуры хроматина [Heard, 2005]. В первую
очередь, в процессе инактивации на Х-хромосо-
ме изменяются ковалентные модификации N- и
С-концов гистонов. Утрачиваются модификации,
ассоциированные с транскрипционно активным
хроматином. Приобретаются модификации, ас-
социированные с транскрипционно неактивным
хроматином. В состав хроматина инактивируе-
мой Х-хромосомы включается вариант гистона
Н2А — макроН2А1, содержащий негистоновый
домен. Ковалентные модификации коровых гис-
тонов и их вариантов изменяют суммарный за-
ряд, конформацию и другие свойства хроматина,
способствуют привлечению в нужное место и
время негистоновых факторов и ферментов, от-
вечающих за репрессию транскрипции и паттерн
репликации. Устанавливается поздняя реплика-
ция, происходит гиперметилирование CpG-ди-
нуклсотидов в промоторах генов неактивной X-
хромосомы [Heard, 2005; Lucchesi et al., 2005].
18.2. Динамика модификаций
ХРОМАТИНА НЕАКТИВНОЙ Х-ХРОМОСОМЫ
В ЭМБРИОГЕНЕЗЕ
Суммарно динамика инактивации и реакти-
вации Х-хромосомы в онтогенезе мыши пред-
ставлена на рис. 18.1. Со стадии двух—четырех
клеток на Хр выявляется транскрипт гена Xist.
На 8-клеточной стадии в части бластомеров про-
исходит подавление транскрипции генов
Хр, расположенных в непосредственной близо-
сти от XIC, Х-хромосома утрачивает модифика-
ции транскрипционно активного хроматина и
становится гипоацетилированной по лизину в
положении 9 гистона НЗ (НЗК9) и гипометили-
рованной по лизину в положении 4 гистона НЗ
(НЗК4). К 32-клеточной стадии доля бластоме-
ров с гипоацетилированными НЗК9 и НЗК4 на
Хр превышает 90 % [Okamoto et al., 2004].
На стадии морулы (16 клеток) на Хр появля-
ются белки комплекса PRC2 (Polycomb repressor
complex 2), которые осуществляют триметили-
рование гистона НЗ по лизину К27 (НЗК27теЗ),
ГЛАВА 18 435
Импринтированная инактивация Хр
Реактивация Хр
2 кл. 4 кл. 8 кл. морула бластоциста
Экспрессия РНК гена XISTс Хр
гипометил НЗК4;
гипоацетил НЗК9
Eed/Enx1; триметил НЗК27;
макроН2А
диметил НЗК9; Ring1A/B;
uH2A; гипоацетил Н4
Случайная инактивация X хромосомы
* ВКМ
I *
I Экстраэмбрионапьная
* энтодерма
Трофоэктодерма
неактивная Хр
РНК X/ST
гипометил НЗК4
гипоацетил НЗК9
триметил НЗК27
макроН2А; цН2А
Eed/Enx1; Ring1A/B
диметил НЗК9
неактивная
Хр РНК XIST
гипометил
НЗК4
гипоацетил
НЗК9
Эпибласт
инактивация
транскрипции
Распространение
РНК XIST
ДНК
Соматические
клетки
стабильная
наследуемая Xi
РНК XIST
метилирование ДНЧ
гипометил НЗК4
гипоацетил НЗК9
метилирование триметил НЗК27
макроН2А; UH2A
гипоацетил Н4
диметил НЗК9
поздняя репликация
Eed/Enx1; триметил
НЗК27; диметил НЗК9;
Ring1A/B; uH2A;
поздняя репликация
Герминальные
клетки
Реактивация Xi
гипоацетил Н4
макроН2А
Рис. 18.1. Последовательность эпигенетических событий при инактивации Х-хромосомы в эмбриогенезе мыши.
характерное для неактивного хроматина. К стадии
ранней бластоцисты доля бластомеров с белками
комплекса PRC2 и НЗК27теЗ на Хр составляет
более 90 %. Кроме того, для Хр на стадии морулы
характерны гипоацетилирование гистона Н4 и ас-
социация с вариантом гистона Н2А — макро-
Н2А1.2 [Mak et а!.. 2004; Okamoto et al., 2004].
На стадии ранней бластоцисты в базальных
промоторах выявляется диметилирование НЗК9
[Heard etal., 2001; Rougeulle etal., 2004]. В это
же время с хроматином инактивируемой Х-хро-
мосомы ассоциируется комплекс белков PRC1
(Polycomb repressive complex 1), что приводит к
моноубиквитинированию гистона Н2А по лизи-
ну К119 (uH2A) [de Napoles et al., 2004; Smith
etal., 2004]. Таким образом, к стадии средней
бластоцисты, в которой четко идентифицируют-
ся трофоэктодерма и внутренняя клеточная мас-
са (ВКМ), во всех клетках Хр имеет практически
все модификации (за исключением поздней ре-
пликации), характерные для неактивного хрома-
тина. Однако транскрипционный статус генов
Хр у предымплантационных эмбрионов варьи-
рует. Полностью транскрипция инактивирована
лишь у генов Хр. находящихся в непосредствен-
ной близости (в пределах 10 сМ) от XIC. Более
удаленные гены могут избегать инактивации
| Huynh, Lee, 2003]. Транскрипционное молчание
генов на данной стадии является нестабильным,
и возможна реактивация транскрипции. В це-
лом можно заключить, что у мыши инактивация
Х-хромосомы во время предымплантационного
развития является импринтированной, неполной
и обратимой.
Дальнейшая судьба Хр в трофоэктодерме и
ВКМ бластоцисты различается. В трофоэктодер-
ме на Хр сохраняются модификации хроматина,
приобретенные к стадии средней бластоцисты,
но происходит сдвиг времени репликации от-
цовской Х-хромосомы сначала в раннюю, а по-
том в позднюю S-фазу [Sugawara et al., 1983].
В клетках ВКМ начинается реактивация X-
хромосомы: теряется связь с белками комплекса
PRC2, снижается уровень НЗК27теЗ, теряется
H3K9me2 [Mak etal., 2004]. На данной стадии
ВКМ подразделяется на клетки внезародышевой
энтодермы и эпибласта. Во внезародышевой эн-
тодерме, по крайней мере у недифференциро-
ванных клеток в культуре, статус экспрессии
генов остается таким же, как в трофоэктодерме,
хотя Хр все-таки утрачивает некоторые модифи-
кации хроматина. На Хр наблюдаются транс-
крипция гена Xist, гипоацетилирование НЗК9 и
гипометилирование НЗК4, в небольшом коли-
честве клеток выявляется H3K27me3 [Kunath
et al., 2005]. Таким образом, как и в трофобласте,
во внезародышевой энтодерме поддерживается
импринтированная инактивация отцовской X-
хромосомы, однако за счет меньшего числа мо-
дификаций хроматина, что, по всей видимости,
является результатом начавшегося в ВКМ про-
цесса реактивации Хр.
В клетках эпибласта бластоцисты Хр полно-
стью реактивируется: утрачиваются все ранее
приобретенные модификации неактивного хро-
матина, восстанавливаются экспрессия генов и
модификации гистонов, характерные для актив-
ного хроматина (НЗК4те2 и Н4ас). Ген Xist экс-
прессируется на обеих Х-хромосомах на низком
уровне, и его транскрипт выявляется в ядре в
виде двух точечных сигналов [Huynh, Lee, 2003;
Mak et al., 2004; Okamoto et al., 2004].
436 ЭПИГЕНЕТИКА
Во время имплантации, на 5,5 день эмбрио-
нального развития, в клетках эпибласта (собст-
венно эмбриона) снова начинается инактивация.
Однако теперь обе Х-хромосомы имеют равные
шансы стать неактивными. На одной из Х-хро-
мосом (независимо от происхождения) экспрес-
сия гена Xist сверхактивируется, и начинается
распространение его транскрипта [Panning et al.,
1997; Sheardown et al., 1997]. Вслед за этим про-
исходит репрессия транскрипции генов, которая
первые два дня является обратимой и напрямую
зависит от экспрессии гена Xist [Wutz, Jaenisch,
2000]. Далее, как и при импринтированной инак-
тивации, наблюдаются гипометилирование НЗК4,
гипоацетилирование НЗК9, НЗК27шеЗ комплек-
сом PRC2, нН2А с участием PRC1, устанавлива-
ются гипоацетилирование Н4 и поздняя реплика-
ция [Keohane etal., 1996; Heard etal., 2001;
Chaumeil et al., 2002; Plath et al., 2003; de Napoles
et al., 2004; Kohlmaier et al., 2004; Okamoto et al.,
2004; Smith etal., 2004]. Позже в состав хрома-
тина неактивной Х-хромосомы включается
макроН2А1 [Costanzi, Pehrson, 1998; Mermoud
etal., 1999]. После отделения линии герминаль-
ных клеток в соматических клетках происходит
гиперметилирование ДНК в промоторах и гипо-
метилирование ДНК в структурных частях генов
неактивной Х-хромосомы, неактивное состояние
становится необратимым и устойчиво наследу-
ется в ряду’ клеточных поколений. В линии гер-
минальных клеток самок ДНК премоторных об-
ластей генов на неактивной Х-хромосоме оста-
ется неметилированной, и впоследствии Х-хро-
мосома реактивируется [Heard et al., 1997].
В целом у разных видов плацентарных мле-
копитающих набор модификаций, выявляемых
на неактивной Х-хромосоме, практически оди-
наков, однако существуют различия в эмбрио-
нальном развитии, в том числе связанные с ини-
циацией процесса инактивации. Так, в эмбриоге-
незе человека инактивация инициируется только
на стадии поздней бластоцисты, в которой уже
четко выявляются трофоэктодерма и ВКМ [Oka-
moto etal., 20111. При этом как в трофоэктодер-
ме, так и в ВКМ происходит случайный выбор
Х-хромосомы для инактивации. Последователь-
ность эпигенетических событий, сопровождаю-
щих инактивацию Х-хромосомы у человека, ве-
роятно, сходна с той, что наблюдается в эмбрио-
генезе мыши, однако их динамика, очевидно,
должна быть иной.
Следует отметить, что, несмотря на согласо-
ванность и строго определенную последователь-
ность событий в процессе инактивации, репрес-
сия транскрипции происходит индивидуально
для каждого гена Х-хромосомы. Период време-
ни, в течение которого у разных генов прекра-
щается транскрипция после распространения
РНК гена Xist по Х-хромосоме. занимает от не-
скольких часов до двух недель [Lin et al., 2007;
Patrat et al., 2009; Chow et al., 2010], а некоторые
гены вообще не подвергаются (избегают) инак-
тивации. Различия в скорости репрессии транс-
крипции, вероятно, зависят от эффективности
распространения и поддержания неактивного
состояния в различных районах Х-хромосомы,
которые могут быть связаны с различиями в ло-
кальном контексте нуклеотидных последова-
тельностей ДНК.
После того как на Х-хромосоме установилось
неактивное состояние, у большинства располо-
женных на ней генов наблюдается репрессия
транскрипции. Исключение составляют ген Xist,
экспрессирующийся только с неактивной Х-хро-
мосомы, гены, чей статус экспрессии определя-
ется импринтингом, и ряд избегающих инакти-
вации генов, многие из которых имеют функ-
циональные гомологи на Y-хромосоме и, следо-
вательно, не нуждаются в дозовой компенсации
[Anoprienko, Zakiian, 2004; Carrel, Willard, 2005;
Raefski, O'Neill, 2005].
18.3. Два типа факультативного
ГЕТЕРОХРОМАТИНА НЕАКТИВНОЙ
Х-ХРОМОСОМЫ
Методом иммунофлуоресцентного окраши-
вания метафазных хромосом плацентарных мле-
копитающих (человека, мыши, крысы, полевки и
коровы) показано, что на неактивной Х-хромосо-
ме снижен уровень модификаций, характерных
для активного хроматина, а модификации неак-
тивного хроматина распределены неравномерно
и формируют два типа факультативного гетеро-
хроматина, которые чередуются и не перекры-
ваются между’ собой (рис. 18.2).
Первый тип факультативного гетерохромати-
на формируется в районах Х-хромосомы, кото-
рые соответствуют обогащенным генами Гимза-
негативным бэндам, и представлен модифика-
циями: НЗК27теЗ, гистоном макроН2А1.2 и
uH2A [Chadwick, Willard, 2004: Brinkman etal.,
2006; Chadwick, 2007; Coppola et al., 2008; Shev-
chenko et al., 2009]. В Гимза-негативных бэндах
локализуется также РНК гена Xist [Duthie et al.,
1999]. Более детальные исследования характера
распределения модификаций хроматина в гено-
ме позволили установить, что НЗК27теЗ марки-
ГЛАВА 18 437
а
DAPI H3K27me3 uH2A
н
DAPI HP1 uH2A
Рис. 18.2. Распределение модификаций, характерных для двух типов факульта-
тивного гетерохроматина, на неактивной Х-хромосоме полевки Microtus rossi-
aemeridionalis.
Солокализация H3K27me3 (красный сигнал) и иН2А (зеленый сигнал), образующих факульта-
тивный гетерохроматин первого типа (а). Чередование двух типов факультативного гетеро-
хроматина неактивной Х-хромосомы, выявляемое с помощью маркеров: НЗК27теЗ (красный
сигнал, гетерохроматин первого типа) (б), иН2А (красный сигнал, гетерохроматин первого
типа) (в) и гетерохроматин специфического белка НР1 (зеленый сигнал, гетерохроматин вто-
рого типа) (б, в). Слева показано распределение модификаций на Х-хромосоме, справа при-
ведено графическое представление распределения сигналов. Х-хромосомы окрашены DAPI
(синий сигнал).
рует протяженные участки хроматина, содержа-
щие неактивные гены, фланкирующие межген-
ные районы и SINE-элементы [Chadwick. 2007:
Pauler et al., 2009]. Первый тип факультативного
гетерохроматина представлен в основном моди-
фикациями, выявляющимися преимущественно
на неактивной Х-хромосоме, он задействован в
инактивации генов, его формирование тесно свя-
зано с распространением РНК гена Xist.
Второй тип факультативного гетерохромати-
на выявляется в районах неактивной Х-хромосо-
мы, соответствующих Гимза-позитивным бэн-
дам, и содержит другой набор модификаций не-
активного хроматина: гетерохроматиновый бе-
лок НР1, НЗК9теЗ и Н4К20теЗ. Локализация
этих модификаций не ограничивается неактив-
ной Х-хромосомой. Они также выявляются в
центромерных и теломерных районах на обеих
Х-хромосомах и на аутосомах [Chadwick, Wil-
lard, 2004; Brinkman et al., 2006; Chadwick, 2007;
Coppola et al., 2008; Shevchenko et al., 2009] (cm.
рис. 18.2). На молекулярном уровне H3K9me3 и
H4K20me3 обнаруживаются в участках гено-
ма. обогащенных диспергированными повтора-
ми ДНК: LINE (Long Interspersed Nuclear Ele-
ments) и LTR (Long Terminal Repeats) [Pauler
etal., 2009]. Следует отметить, что второй тип
факультативного гетерохроматина неактивной
438 ЭПИГЕНЕТИКА
Х-хромосомы обнаруживается не у всех видов.
Так, например, он не выявлен у мыши [Rens
etal., 2010; Escamilla-Del-Arenal etal., 2011].
Предполагают, что его формирование не связано
с РНК гена Xist, хотя динамика этого процесса в
онтогенезе не исследована.
Таким образом, неактивная Х-хромосома со-
стоит из двух типов факультативного гетеро-
хроматина, которые различаются по набору моди-
фикаций [Chadwick, Willard, 2004; Brinkman et al.,
2006; Chadwick, 2007; Coppola et al., 2008; Shev-
chenko et al., 2009] и ассоциированы с нуклеотид-
ными последовательностями различного типа.
18.4. Распределение модификаций
ХРОМАТИНА НА УРОВНЕ
ОТДЕЛЬНЫХ ГЕНОВ НЕАКТИВНОЙ
Х-ХРОМОСОМЫ
Метод иммунофлуорссцснтного окрашивания
позволяет определить присутствие различных
гистоновых модификаций на неактивной Х-хро-
мосоме, но его разрешение не достаточно для
выявления распределения тех или иных форм
гистонов на уровне отдельных генов, которые
могут отличаться статусом экспрессии, а также
для выявления компонентов хроматина, присут-
ствующих в небольшом количестве. Более де-
тально распределение ковалентных модифика-
ций гистонов по активной и неактивной Х-хро-
мосомам у генов, различающихся статусом экс-
прессии, исследовано с помощью метода имму-
нопреципитации хроматина.
НЗК27шеЗ выявляется в геноме в премотор-
ных и структурных областях инактивированных
генов, а его уровень на активной Х-хромосоме и
аутосомах незначителен [Rougeulle etal., 2004;
Chadwick, 2007; Pauler etal., 2009]. В то же вре-
мя H3K9me2 присутствует в структурной части
генов не только на неактивной Х-хромосоме, но
и на активной Х-хромосоме, единственной X-
хромосоме самцов и аутосомах. Для статуса
экспрессии принципиальное значение имеет уро-
вень НЗК9ше2 в районах базальных промоторов
генов. Так, у подвергающихся инактивации ге-
нов на неактивной Х-хромосоме район базально-
го промотора обогащен НЗК9ше2. У избегаю-
щих инактивации генов данная модификация в
премоторных областях на активной и неактив-
ной Х-хромосомах не выявляется. У гена Xist,
который экспрессируется только на неактивной
Х-хромосоме, обогащение НЗК9ше2 наблюдает-
ся в премоторной области аллеля на активной
Х-хромосоме [Rougeulle et al., 2004].
Что касается модификаций, характерных для
активного хроматина, то ацетилированный Н4
также представлен на одинаковом уровне в
структурной части генов Х-хромосомы незави-
симо от их статуса экспрессии, который корре-
лирует с уровнем ацетилирования Н4 в премо-
торной области. Премоторные области двух
подвергающихся инактивации генов человека
OCRL и PGK1 гиперацетилированы по гистону’
Н4 на активной Х-хромосоме и недоацетилиро-
ваны на неактивной Х-хромосоме. В случае из-
бегающих инактивации генов ZFX и SMCX ги-
перацетилированный гистон Н4 выявляется в
премоторных областях обоих аллелей. Наконец,
гиперацетилированный гистон Н4 присутствует
только в хроматине премоторной области гена
XIST на неактивной Х-хромосоме [Gilbert, Sharp,
1999]. Те же закономерности были обнаружены
и при исследовании распределения ацетилиро-
ванного Н4 вдоль активных и репрессированных
аллелей генов Pgkl, Hprt и Xist в двух линиях
фибробластов мышей с неслучайной инактива-
цией Х-хромосомы [Goto etal., 2002]. Совсем
иной характер распределения на уровне генов
имеет НЗК4ше2. Данной модификацией обога-
щены премоторные области подвергающихся
инактивации генов Х-хромосомы и импринтиро-
ванных аутосомных генов, т. е. генов с моноал-
лельной экспрессией. В их структурной части
НЗК4ше2 выявляется на незначительном уровне.
Напротив, у генов с биаллельной экспрессией, то
есть аутосомных генов и избегающих инактива-
ции генов Х-хромосомы, высокий уровень
НЗК4ше2 не ограничивается премоторной обла-
стью и представлен также в структурной части
[Rougeulle et al., 2004].
В целом, данные экспериментов по иммуно-
преципитации хроматина свидетельствуют о
том. что статус экспрессии гена определяется
модификациями хроматина, главным образом, в
премоторной области. Модификации гистонов,
характерные для неактивного хроматина, уста-
навливаются на инактивированной Х-хромосоме
только у тех генов, которые подвергаются инак-
тивации. Гены, избегающие инактивации, сохра-
няют модификации, свойственные активному’
хроматину’. Следуют также отметить, что репрес-
сированные на активной Х-хромосоме гены, на-
пример ген Xist, имеют те же модификации хро-
матина, что и подвергающиеся инактивации ге-
ны на неактивной Х-хромосоме. В этой связи
интересен пример гена SYBL1 Х-хромосомы че-
ловека, известного необычным вариантом экс-
прессии. Он подвергается инактивации, но имеет
ГЛАВА 18 439
гомолог на Y-хромосоме, который не экспресси-
руется в соматических клетках. Это послужило
поводом проверить статус метилирования и аце-
тилирования гистонов НЗ и Н4 этого гена не
только на активной и неактивной Х-хромосомах
у женщин, но и на X- и Y-хромосомах у мужчин.
Премоторные области экспрессирующихся ал-
лелей на Х-хромосомах женщин и мужчин ха-
рактеризовались ацетилированной и гиперацети-
лированной формами гистона Н4, ацетилирован-
ной формой гистона НЗ. НЗК4те2 также оказал-
ся компонентом активного хроматина. Однако
НЗК9те2 выявлялся как на аллеле неактивной
Х-хромосомы, так и на транскрипционно неак-
тивном Y-аллеле [Matarazzo etal., 2002]. Эти
данные еще раз подчеркивают, что модификации
хроматина, устанавливающиеся при инактива-
ции на неактивной Х-хромосоме, не являются
уникальными и характерны для неактивного
хроматина генов на других хромосомах.
18.5. Репликация неактивной
Х-хромосомы
В целом, неактивная Х-хромосома реплици-
руется позже, чем ее активный гомолог [Gartler,
Riggs, 1983; Heard etal., 1997]. Поздняя репли-
кация является одним из наиболее консерватив-
ных свойств неактивной Х-хромосомы [Sharman,
1971]. Предполагают, что она нужна для оптими-
зации взаимодействия неактивной Х-хромосомы
с ферментами, ответственными за установление
и поддержание модификаций неактивного хро-
матина, а также для ограничения доступности
транскрипционных факторов, необходимых ак-
тивной Х-хромосоме [Hansen et al., 1996; Heard,
Disteche, 2006]. Тем не менее, в отдельных лини-
ях соматических клеток мышей, например в мио-
бластах и эмбриональных фибробластах, неак-
тивная Х-хромосома может реплицироваться в
период ранней и средней S-фазы [Casas-Delucchi,
Cardoso, 2011]. Установлено, что во время ре-
пликации неактивная Х-хромосома перемещает-
ся в околоядрышковую область ядра, обогащен-
ную ферментами, ответственными за установле-
ние и поддержание модификаций неактивного
хроматина [Zhang et al., 2007].
Время репликации двух типов факультатив-
ного гетерохроматина неактивной Х-хромосомы
отличается. Гетерохроматин второго типа, ис-
пользуемый для инактивации повторов, репли-
цируется в заключительном периоде S-фазы со-
вместно с конститутивным гетерохроматином
центромер и теломер. Гетерохроматин первого
типа, служащий для инактивации генов, репли-
цируется раньше [Chadwick, Willard, 2004; Shev-
chenko etal., 2009]. Неактивная Х-хромосома
мыши, на которой не выявляется гетерохрома-
тин второго типа, реплицируется как единый
блок раньше конститутивного гетерохроматина
[Casas-Delucchi, Cardoso, 2011].
Время репликации отдельных генов коррели-
рует с их транскрипционной активностью. Гены,
подвергающиеся инактивации, реплицируются
на неактивной Х-хромосоме в поздний период
S-фазы [Schmidt, Migeon, 1990; Boggs, Chinault,
1994; Torchia et al., 1994; Hansen et al., 1995; Ka-
wame et al., 1995; Torchia, Migeon, 1995; Hansen
etal., 1996]. Гены, избегающие инактивации, ре-
плицируются синхронно на активной и неактив-
ной Х-хромосоме в ранний период S-фазы
[Boggs, Chinault, 1994].
Одной из предполагаемых причин поздней ре-
пликации может быть использование меньшего
числа ориджинов репликации на неактивной X-
хромосоме по сравнению с активной. В таком
случае для полной репликации Х-хромосомы
должно понадобиться больше времени, и, следо-
вательно, завершение репликации смещается в
более позднюю S-фазу. Однако исследования от-
дельных локусов Х-хромосомы показывают, что
на активном и неактивном гомологе Х-хромосо-
мы используются одни и те же ориджины репли-
кации и подавление транскрипции не влияет на
их доступность [Gomez, Brockdorff, 2004; Rownt-
ree, Lee, 2006]. Кроме того, была предпринята
попытка определить, имеет ли место задержка
активации ориджинов репликации ДНК на неак-
тивной Х-хромосоме. Используя сортировку кле-
ток по стадиям клеточного цикла, удалось вы-
явить, что ориджины, располагающиеся на неак-
тивной Х-хромосоме, активируются позднее, чем
их гомологи на активной Х-хромосоме [Gomez.
Brockdorff, 2004]. Задержка активации ориджинов
репликации может определяться структурой хро-
матина, и одной из модификаций, необходимой
для запуска поздней репликации неактивной X-
хромосомы, по-видимому, является гипоацетили-
рование гистонов [Casas-Delucchi, Cardoso, 2011].
18.6. Дифференциальное метилирование
ДНК АКТИВНОЙ И НЕАКТИВНОЙ
Х-хромосом
Активная и неактивная Х-хромосомы имеют
различный характер метилирования CpG-дину-
клеотидов [Hellman, Chess, 2007]. Уровень мети-
лирования ДНК активной Х-хромосомы более
440 ЭПИГЕНЕТИКА
чем в два раза превышает уровень метилирова-
ния ДНК неактивной Х-хромосомы. До начала
инактивации гены на обеих Х-хромосомах мети-
лированы по CpG-динуклсотидам в структурной
части, но после установления неактивного со-
стояния аллели активной и неактивной Х-хромо-
сом самок млекопитающих метилируются по-
разному. Гены на активной Х-хромосоме оста-
ются гиперметилированными по CpG-динуклсо-
тидам в структурной части, тогда как гены неак-
тивной Х-хромосомы утрачивают метилирова-
ние в структурной части и становятся гиперме-
тилированными по CpG-динуклеотидам промо-
торных областей. Известно, что метилирование
CpG-динуклсотидов в премоторных областях
может препятствовать связыванию транскрип-
ционных факторов. Кроме того, существуют бел-
ки, которые преимущественно связываются в
районах метилированных последовательностей
ДНК и поддерживают в районе связывания ко-
валентные модификации гистонов, способные ре-
прессировать транскрипцию [Defossez, Stancheva,
2011]. Сравнение статута метилирования различ-
ных генов Х-хромосомы человека, а также ортоло-
гичных генов показало, что для экспрессии гена
большее значение имеет сам факт метилирования
CpG-островков в премоторной области, чем мети-
лирование определенных сайтов [Heard et al.,
1997]. Это позволяет предположить, что метили-
рование CpG-динуклеотидов промоторов в про-
цессе инактивации необходимо для привлечения
белков, связывающихся с метилированными рай-
онами ДНК Тем не менее, пока не подтверждено,
что хотя бы одна из известных функций метили-
рования ДНК в репрессии транскрипции реализу-
ется в процессе инактивации Х-хромосомы.
Гиперметилирование ДНК премоторных об-
ластей — это одна из наиболее поздних модифи-
каций в процессе инактивации, которая появля-
ется лишь в соматических клетках эмбриона по-
сле отделения линии герминальных клеток. Счи-
тается, что метилирование служит для стабили-
зации и поддержания неактивного состояния ге-
нов неактивной Х-хромосомы в соматических
клетках самок [Pfeifer et al., 1990; Heard et al.,
1997]. Однако динамика метилирования ДНК
при инактивации, вероятно, является достаточно
сложной, так как для отдельных генов показано,
что гиперметилирование их премоторных облас-
тей может происходить в разное время. Так, у
самок мыши метилирование промоторов генов
G6pd и Pgkl происходит на 5,5 день эмбрио-
нального развития, т. е. тогда, когда начинается
случайная инактивация [Singer-Sam etal., 1990;
Grant etal., 1992]. В то же время промотор гена
Hprt метилируется лишь на 8,5 день эмбрио-
нального развития [Lock et al., 1987]. Таким об-
разом, время метилирования каждого гена может
варьировать, что. вероятно, связано с индивиду-
альностью инактивации транскрипции.
В соматических клетках для генов Х-хромо-
сомы четко прослеживается корреляция между’
паттерном метилирования ДНК и транскрипци-
онной активностью. CpG-островки, локализую-
щиеся в промоторах подвергающихся инактива-
ции генов, метилированы на неактивной Х-хро-
мосоме и не метилированы на активной Х-хро-
мосоме, хотя степень гиперметилирования у раз-
ных генов может сильно различаться [Yasukochi
etal., 2010]. Гены, избегающие инактивации, не
обнаруживают метилирования CpG-островков в
5'-областях на обеих Х-хромосомах [Carrel et al.,
1996; Gilbert, Sharp, 1999; Matarazzo et al., 2002],
однако их CpG-островки метилированы на обеих
Х-хромосомах в структурной части [Mondello
et al.. 1988]. Следует отметить, что ген Xist в со-
матических клетках метилирован на активной и
не метилирован на неактивной Х-хромосомах,
что согласуется с его ролью в процессе инакти-
вации Х-хромосомы [Norris et al., 1994]. Тем не
менее, для некоторых генов неактивной Х-хро-
мосомы в соматических клетках плацентарных
млекопитающих эффективное поддержание не-
активного состояния может осуществляться без
метилирования ДНК. Этот факт был установлен
при изучении модификаций хроматина двух ге-
нов SPRY3 и SYBL1. Премоторный район ге-
на SYBL1 в норме метилирован на неактивной
Х-хромосоме у женщин и Y-хромосоме у муж-
чин и характеризуется рядом модификаций гис-
тонов, свойственных транскрипционно неактив-
ному’ хроматину-. При синдроме ICF (immunode-
ficiency. centromeric instability’, facial abnormali-
ties) нарушается метилирование гена SYBL1 на
неактивной Х-хромосоме и Y-хромосоме, что со-
провождается его реактивацией. По-видимому,
метилирование ДНК имеет большое значение для
поддержания неактивного состояния гена SYBL1
[Matarazzo etal., 2002]. Другой ген, SPRY3, не
имеет канонических CpG-островков и не реакти-
вируется у пациентов с ICF-синдромом, сохра-
няя на неактивной Х-хромосоме и Y-хромосоме
модификации гистонов, присущие неактивно-
му’ хроматину’. Это означает, что для ряда генов
Х-хромосомы в соматических клетках неактив-
ное состояние может успешно поддерживаться и
в отсутствие метилирования ДНК [De Bonis
et al., 2006; Yasukochi et al., 2010].
ГЛАВА 18 441
Уровень метилирования ДНК во внезароды-
шевых тканях постимплантационного эмбриона
выше, чем на стадиях морулы и бластоцисты.
Тем не менее, внезародышевые ткани остаются
недометилированными относительно эмбриональ-
ных тканей [Monk etal., 1987; Reik etal., 2003;
Dementyeva et al., 2010]. Отдельные молчащие
гены на неактивной Х-хромосоме в клетках вне-
зародышевых органов могут быть метилирова-
ны, так же как и в соматических клетках. Во вне-
зародышевых органах самок мыши обнаружено
метилирование CpG-динуклеотидов в промотор-
ной области двух генов Х-хромосомы: Pgkl и
G6pd [Grant etal., 1992]. Метилирование было
также установлено для аллеля AR на неактивной
Х-хромосоме в трофобластных клетках ворсин
хориона человека [Goto et al., 1997].
Важную роль в метилировании ДНК неактив-
ной Х-хромосомы и, соответственно, стабилиза-
ции неактивного состояния играет de novo ме-
тилтрансфераза DNMT3B. При синдроме ICF,
который является результатом мутации гена
DNMT3B, наблюдаются нарушения метилирова-
ния гетерохроматиновых районов, в том числе
неактивной Х-хромосомы. Многие гены неак-
тивной Х-хромосомы, несмотря на гипометили-
рование CpG-островков, сохраняют инактива-
цию транскрипции, но ряд генов начинает экс-
прессироваться, что сопровождается сдвигом вре-
мени их репликации и изменением структуры
хроматина в премоторной области [Hansen etal.,
2000; Matarazzo etal., 2002]. Помимо этого про-
исходит гипометилирование LINE-1 элементов на
неактивной Х-хромосоме, однако сохраняется
метилирование элементов LINE-1 на активной X-
хромосоме и аутосомах, которое, вероятно, осу-
ществляется с помощью другой de novo метил-
трансферазы [Hansen, 2003]. Кроме того, участие
в метилировании ДНК неактивной Х-хромосомы
приписывают белку’ SMCHD1 (structural mainte-
nance of chromosomes hinge domain containing 1).
Этот белок выявляется на неактивной Х-хромо-
соме в соматических клетках. Каким образом
данный белок участвует в метилировании ДНК,
остается неизвестным, однако нарушение его
экспрессии приводит к деметилированию промо-
торов и частичной реактивации генов на инакти-
вированной Х-хромосоме [Bleyvitt et al., 2008].
18.7. Пространственная организация
НЕАКТИВНОЙ X-ХРОМОСОМЫ В ЯДРЕ
Хроматин неактивной Х-хромосомы опреде-
ленным образом организован в пространстве яд-
ра, а соответствующая ему’ хромосомная терри-
тория давно известна как тельце Барра [Chaumeil
et al., 2006; Zhang et al., 2007; Rego et al., 2008;
Choyv etal., 2010]. Коровую часть тельца Барра
занимают некодирующие последовательности
ДНК Х-хромосомы, включающие тандемные и
диспергированные повторы. Более внешний слой
образуют последовательности генов, подвергаю-
щихся инактивации. Инактивированные гены
совместно с повторами находятся в пространст-
ве, где отсутствует ДНК-зависимая РНК-полиме-
раза II. Избегающие инактивации гены Х-хро-
мосомы в основном располагаются за пределами
или на периферии области, где локализуются
инактивированные гены и повторы.
18.8. Роль НЕКОДИРУЮЩЕЙ РНК ГЕНАХ/ST
В ИНАКТИВАЦИИ ТРАНСКРИПЦИИ
И ФОРМИРОВАНИИ ХРОМАТИНА
НЕАКТИВНОЙ Х-ХРОМОСОМЫ
РНК гена Xist является неотъемлемым компо-
нентом хроматина неактивной Х-хромосомы,
участвует в инактивации транскрипции генов и
привлечении белковых комплексов, ответствен-
ных за ковалентные модификации гистонов
(рис. 18.3).
Исследования функционирования РНК гена
Xist были проведены на трансгенной линии ЭС-
клеток с кариотипом 40.XY, в которой на един-
ственной Х-хромосоме в локусе гена HPRT была
встроена экспрессирующая конструкция, пред-
ставляющая собой кДНК гена Xist под управле-
нием тетрациклин-чувствительного промотора
[Wutz, Jaenisch, 2000; Wutz et al., 2002]. В данной
конструкции удаляли различные участки кДНК
Xist и анализировали влияние делеций на спо-
собность конструкции инициировать инактива-
цию. Таким образом, было установлено, что за
эффективное распространение по Х-хромосоме
отвечает кумулятивное действие нескольких раз-
личных последовательностей, которые рассредо-
точены по РНК гена Xist. Репрессия транскрип-
ции генов происходит вслед за распространени-
ем РНК гена Xist по инактивируемой Х-хромо-
соме [Wutz, Jaenisch, 2000]. В течение 48 ч с мо-
мента запуска дифференцировки ЭС-клеток ин-
дукция синтеза РНК Xist вызывает подавление
транскрипции генов, а репрессия трансгенного
Xist приводит к реактивации инактивированных
генов. Однако по прошествии этого времени
экспрессия гена Xist уже не влияет на транс-
крипционный статус генов и не способна ини-
циировать инактивацию. Способность гена Xist
442 ЭПИГЕНЕТИКА
инициировать инактивацию в строго определен-
ный период времени ограничена стадиеспеци-
фической экспрессией ядерного белка SATB1,
который взаимодействует с факторами, ремоде-
лирующими хроматин [Brockdorff, 20091. Ре-
прессия транскрипции генов Satb 12с помощью
РНК-интерференции в ЭС-клетках мыши приво-
дит к тому’, что ген Xist не способен иницииро-
вать инактивацию. Напротив, эктопическая экс-
прессия этих генов в эмбриональных фибробла-
стах позволяет с помощью индуцированной экс-
прессии РНК гена Xist искусственно иницииро-
вать инактивацию на той стадии развития, когда
в норме это уже невозможно.
Важную роль в инактивации транскрипции
генов Х-хромосомы играют эволюционно кон-
сервативные минисателлитные A-повторы, рас-
положенные в первом экзоне гена Xist [Wutz
et al., 2002]. Делеция A-повторов приводит к то-
му’, что РНК Xist не способна вызывать инакти-
вацию транскрипции Х-сцепленных генов, хотя
нормально распространяется по Х-хромосоме, на
которой в дальнейшем происходит связыва-
ние комплекса белков PRC2, триметилирование
НЗК27, гипоацетилирование Н4, включение
макроН2А1.2 [Kohlmaier etal., 2004; Pullirsch
etal., 2010]. Дальнейшие эксперименты показа-
ли, что A-повторы гена Xist могут быть задейст-
вованы в формировании хромосомной террито-
рии неактивной Х-хромосомы, отвечая за созда-
ние области, не содержащей ДНК-зависимую
РНК-полимеразу II, и миграцию последователь-
ностей инактивирующихся генов внутрь данной
области [Chaumeil etal., 2006; Clemson etal.,
2006]. Однако механизм того, каким образом это
происходит, остается неизвестным.
В другом эксперименте, выполненном на ЭС-
клетках и соматических клетках мышей, РНК
гена Xist гибридизовали in vivo с конформацион-
но ограниченными сайт-специфическими олиго-
нуклеотидами. Такая гибридизация приводит к
образованию двухцепочечного участка РНК, ко-
торый может препятствовать сплайсингу, транс-
ляции или связыванию белковых факторов. Ус-
тановлено, что при блокировании района мини-
сателлитных С-повторов с помощью конформа-
ционно ограниченных олигонуклеотидов проис-
ходило удаление РНК гена Xist с неактивной
Х-хромосомы [Sarnia etal., 2010]. Таким обра-
зом, показано, что у мыши район С-повторов
необходим для обеспечения локализации РНК
Xist на неактивной Х-хромосоме. Далее было
обнаружено, что район С-повторов в РНК гена
Xist взаимодействует с белком hnRNP U/SP120/
SAF-A, который связан с неактивной Х-хромосо-
мой в дифференцированных клетках. Этот белок
содержит РНК-связывающий домен, ответствен-
ный за взаимодействие с С-повторами РНК Xist
и с неактивной Х-хромосомой [Helbig, Fackel-
mayer, 2003; Hasegawa etal., 2010]. Отмечено,
что белок hnRNP U/SP120/SAF-A появляется не
в процессе распространения РНК Xist, а лишь че-
рез несколько клеточных циклов после этого
[Pullirsch et al., 2010].
Репрессия гена Xist и нарушения в распро-
странении его РНК в соматических клетках не
влияют на гипоацетилирование гистона Н4, позд-
нюю репликацию и не приводят к реактивации
транскрипции, однако происходит утрата таких
компонентов хроматина неактивной Х-хромосо-
мы, как макроН2А1.2, H3K27mc3, uH2A, hnRNP
U/SP120/SAF-A [Csankovszki etal., 1999; Kohl-
maier etal., 2004: Pullirsch etal., 2010]. Методом
иммунопреципитации белков, связанных с РНК,
было обнаружено, что в РНК гена Xist имеется
два сайта, способных связываться с комплексом
PRC2 [Zhao et al., 2008]. Один из этих сайтов
локализуется в районе А-повторов.
Кроме того, установлено, что при делеции по-
следовательностей ДНК гена Xist в дифференци-
рованных клетках прекращается перемещение
неактивной Х-хромосомы в околоядрышковую
область при репликации и некоторые неактивные
гены могут реактивироваться [Zhang et al., 2007].
PRC2
Xist
A F
В
AAAA
D
Рис. 18.3. Функциональные домены РНК гена X/st.
А, В, С, D, Е, F — минисателлитные повторы, входящие в РНК X/st. (+++) — последовательности, ответст-
венные за распространение гена Xist по Х-хромосоме. Стрелки показывают районы А- и Е-повторов, уча-
ствующие в связывании PRC2, и район С-повторов, отвечающий за связывание РНК Xist с неактивной
Х-хромосомой посредством белка hnRNP U/SP120/SAF-A. A-повторы РНК гена Xist необходимы также для
установления транскрипционного молчания генов и формирования хромосомной территории неактивной
Х-хромосомы (по [Escamilla-Del-Arenal et al., 2011]).
ГЛАВА 18 443
18.9. Потенциальные механизмы,
УЧАСТВУЮЩИЕ В РАСПРОСТРАНЕНИИ
И ПОДДЕРЖАНИИ НЕАКТИВНОГО
СОСТОЯНИЯ Х-ХРОМОСОМЫ
До сих пор практически ничего не известно о
том, каким образом при инактивации происхо-
дит утрата модификаций, характерных для ак-
тивного хроматина. Поскольку гипоацетилиро-
вание гистонов НЗ и Н4 происходит не одновре-
менно, предполагают, что в этих процессах за-
действованы различные механизмы [Chaumeil
etal., 2002]. Восстановление ацетилирования
гистонов на инактивированной Х-хромосоме при
использовании неспецифических ингибиторов
деацетилаз показывает, что в гипоацетилирова-
нии гистонов при инициации инактивации и
поддержании гипоацетилированного состояния
гистонов на неактивной Х-хромосоме могут уча-
ствовать гистондеацетилазы семейства HDAC
[Csankovszki etal., 2001; Do etal., 2008; Casas-
Delucchi etal., 2011]. У млекопитающих извест-
но более 10 представителей семейства деацети-
лаз HDAC, которые могли бы осуществлять ги-
поацетилирование гистонов НЗ и Н4 на инакти-
вируемой Х-хромосоме. У человека при некото-
рых обстоятельствах две гистондеацетилазы дан-
ного семейства HDAC 1 и HDAC2 могут входить
в состав комплекса PRC2, взаимодействуя с гис-
тон-метилтрансферазами EED и ENX1 [van der
Vlag, Otte, 1999]. Однако на неактивной Х-хро-
мосоме мыши HDAC 1 и HDAC2 не обнаружены
[Yang et al., 2003].
Механизмы появления ряда модификаций,
характерных для факу льтативного гетерохрома-
тина неактивной Х-хромосомы, известны час-
тично. Так, точно установлено, что за НЗК27шеЗ
на начальных этапах процесса импринтирован-
ной и случайной инактивации отвечает комплекс
белков PRC2, который временно связывается с
неактивной Х-хромосомой за счет взаимодейст-
вия с РНК гена Xist [Plath et al., 2003; Silva et al.,
2003; Zhao et al., 2008]. В состав комплекса PRC2
входят три белка: EED (embryonic ectoderm deve-
lopment), способный выполнять функции гистон-
метилтрансферазы, гистон-метилтрансфераза EZH/
ENX1 (гомолог enhancer of zeste protein дрозофи-
лы) и SUZ12 (гомолог suppressor of zeste protein
дрозофилы), содержащий домен типа цинковых
пальцев [Wang etal., 2002]. Кроме того, на ран-
них стадиях эмбрионального развития в составе
комплекса PRC2 выявляется еще один белок
PCL2 (Polycomblike 2), который, вероятно, отве-
чает за связывание и/или временное поддержа-
ние PRC2 на неактивной Х-хромосоме [Casanova
etal., 2011] (рис. 18.4, а). Гистон-метилтрансфе-
разой, осуществляющей НЗК27теЗ на неактив-
ной Х-хромосоме, является EZH [Silva et al.,
2003; Cao, Zhang, 2004].
За процесс убиквитинирования гистона Н2А
по лизину К119 отвечают уби к вит ин-ли газы
RING1A и RING1B [de Napoles et al., 2004; Fang
et al., 2004; Plath et al., 2004]. Об этом свидетель-
ствуют сходное время появления иН2А и RING1B
на неактивной Х-хромосоме и существенное сни-
жение уровня иН2А в клетках RING 1В мыши.
б
PRC1
PRC2 Канонический PRC1
PCL2
SUZ12
EED
RING1A
' RING1B
EZH
РНС1
РНС2
РНС RING
ВМИ
EZH1 ''
EZH2
ВМИ
MELI 8
СВХ
— СВХ2
СВХ4
СВХ6
СВХ7
СВХ8
PRCI-подобные
комплексы
NSPC1
Рис. 18.4. Состав белковых комплексов PRC2 и PRC1.
a— PRC2 состоит из трех коровых элементов: EED, EZH и SUZ12. Кроме того, в состав PRC2 может входить ряд кофакторов,
одним из которых является стадиеспецифический белок PCL2, отвечающий за временную ассоциацию PRC2 с инактивируемой
Х-хромосомой; б—канонический комплекс PRC1 имеет четыре коровых компонента: СВХ, ВМИ, RING и РНС. RING и ВМИ
также могут формировать другие PRCI-подобные комплексы. Списком перечислены альтернативные белки, входящие в состав
коровых элементов PRC2 и PRC1, жирным шрифтом отмечены те из них, которые выявлены на неактивной Х-хромосоме (по
[Escamilla-Del-Arenal et al., 2011]).
444 ЭПИГЕНЕТИКА
Когда клетки имеют фенотип RING1A /RING1B ,
иН2А вообще не выявляется на неактивной
Х-хромосоме, из чего следует, что оба белка
вносят свой вклад в установление данной моди-
фикации. RING1B экспрессируется преимущест-
венно в период раннего развития мышиного эмб-
риона, в то время как для RING1A характернее
экспрессия в дифференцированных клетках. Бел-
ки RING1A и RING1B являются субъединица-
ми PRC1 и ему’ подобных комплексов (см.
рис. 18.4, а). В настоящее время из-за большого
числа паралогов субъединиц данного комплекса
и массы их комбинаций невозможно точно ска-
зать. какой состав имеет комплекс белков PRC1,
принимающий участие в инактивации. Тем не
менее, отмечено, что среди субъединиц СВХ
наиболее часто с неактивной Х-хромосомой свя-
зана СВХ7 [Bernstein et al., 2006].
Комплекс PRO содержит домен, узнающий
НЗК27шеЗ. В связи с этим принято считать, что
сначала на неактивной Х-хромосоме мыши по-
является НЗК27шеЗ. который узнается комплек-
сом PRC1, осуществляющим uH2A [de Napoles
etal., 2004; Fang etal., 2004; Plath etal., 2004].
Однако позже было установлено, что при запус-
ке случайной инактивации в ЭС-клетках иН2А
на неактивной Х-хромосоме может происходить
независимо от комплекса PRC2 и НЗК27шеЗ
[Schoeftner et al., 2006].
Следует отметить, что связь неактивной
Х-хромосомы с PRC2 и PRC1 является времен-
ной и наблюдается только в раннем эмбриогене-
зе. Какие ферменты и комплексы отвечают за
поддержание НЗК27шеЗ и иН2А в соматических
клетках, до конца не известно. Существует пред-
положение, что поддержание данных модифика-
ций происходит с помощью тех же комплексов
PRC, которые в ядре дифференцированных кле-
ток содержатся в околоядрышковом районе, куда
неактивная Х-хромосома перемещается на время
репликации [Hernandez-Munoz et al., 2005b; Zhang
et al., 2007].
Обнаружено, что убиквитинированию под-
вергается не только гистон Н2А, но и его вариант
макроН2А1. Показано, что за эту’ модификацию
гистона макроН2А1 отвечают белки CULL1N3
и SPOP, которые, взаимодействуя, формируют
ЕЗ убиквитин-лигазу. Подавление экспрессии
CULLIN3 и SPOP с помощью РНК-интерферен-
ции нарушает убиквитинирование макроН2А1 и
его интеграцию в состав хроматина неактивной
Х-хромосомы [Hernandez-Munoz et al., 2005а].
За H3K9me2 может отвечать метилтрансфера-
за G9a. Показано, что в ЭС-клетках, мутантных
по гену- G9a, уровень НЗК9ше2 снижается. Од-
нако при пониженном уровне НЗК9те2 у мутан-
тов по гену’ G9a неактивное состояние нормаль-
но устанавливается и поддерживается [Ohhata
et al., 2004; Rougeulle et al., 2004].
Остается неизвестным, каким образом и с
участием каких ферментов происходит форми-
рование факультативного гетерохроматина неак-
тивной Х-хромосомы, содержащего НЗК9теЗ и
гетерохроматиновый белок НР1. Ниже рассмот-
рены возможные механизмы, установленные при
исследовании гетерохроматиновых районов ге-
нома, содержащих данные модификации. Роль
белков НР1 в сайленсинге генов заключается в
привлечении к сайтам связывания на хроматине
DNMT, которые метилируют ДНК и тем самым
регулируют транскрипцию [Smallwood et al.,
2007]. В геноме млекопитающих существуют
три гена, кодирующих НР1, — альфа, бета и гам-
ма. Для формирования сайта связывания белка
НР1 с хроматином необходимо наличие НЗК9теЗ
[Bannister etal., 2001; Jacobs etal., 2001; Lachner
etal., 2001]. Наличие HP1 белка в прицентро-
мерном гетерохроматине обеспечивается гистон-
метилтрансферазой НМТ Suv(3)9hl, которая, с
одной стороны, триметилирует хроматин по
НЗК9 и создает сайт взаимодействия [Aagaard
et al., 1999; Rea et al., 2000; Krouwels et al., 2005],
а с другой стороны, физически взаимодействует
с одним из белков НР1 — НР1 альфа. [Yamamo-
to, Sonoda, 2003]. Помимо этого НМТ Suv(3)9hl
способна привлекаться в гетерохроматин неза-
висимо от белка НР1 [Krouyvels etal., 2005]. Ас-
социация Suv(3)9hl с центромерным гетерохро-
матином стабильна, и нарушение Suv(3)9hl при-
водит к потере ассоциации НР1 с прицентромер-
ным хроматином. Существует другая метил-
трансфераза SETDB1 (SET Domain Bifurcation!),
которая выявляется при локализации белка НР1
вне центромерных районов. Недавно в системе
in vivo было показано, что гетерохроматин фор-
мируется при взаимодействии НМТ, SETDB1 и
НР1, причем было обнаружено, что, связавшись
с H3K9me3, НР1 привлекает дополнительно
SETDB1 в сайт гетерохроматизации, в результа-
те чего происходит распространение гетерохро-
матинового состояния [Verschure et al., 2005].
Метилтрансфераза SETDB1, в свою очередь, при-
влекается в хроматин комплексом белков КАР-1/
KRAB-ZFP (КАР-1 или TIFlbeta (KRAB-associa-
ted protein-1; transcriptional intermediary factor 1
beta co-repressor for the KRAB-ZFP (Kruppel-asso-
ciated box-containing zinc finger))) [Nielsen et al.,
1999; Ryan et al., 1999; Lechner et al., 2000; Mat-
ГЛАВА 18 445
suda etal., 2001; Schultz etal., 2002]. KAP-1,
SETDB1, H3K9me3 и HP1 обогащены в районах
промоторов тех генов, которые регулируются
системой KRAB—КАР-1. КАР-1 связывается с
KRAB—ZFPs в специфических локусах, коор-
динируя метилирование гистонов и привлечение
белков НР1 для инактивации транскрипции ге-
нов [Schultz et al., 2002]. В дифференцирующих-
ся клетках эмбриональной карциномы мыши бы-
ло показано взаимодействие между’ ген-специ-
фическим репрессором KRAB—КАР-1 и компо-
нентом гетерохроматина НР1 бета и гамма (но
не альфа). При дифференцировке клеток эмб-
риональной карциномы происходит репрессия
генов путем распространения гетерохроматино-
вого состояния. Белок НР1 взаимодействует
также с метилтрансферазой G9A in vivo. При
этом белок НР1 физически взаимодействует с
доменом G9A [Sampath et al., 2007].
После модификации гистонов неактивная
Х-хромосома связывается с рядом белков, основ-
ная функция которых, вероятно, состоит в ста-
билизации неактивного состояния и обеспечении
его эффективного наследования (рис. 18.5). Так,
хроматин неактивной Х-хромосомы связывает
белок ATRX [Baumann, De La Fuente, 2009], ко-
торый участвует в ремоделировании хроматина,
относится к семейству SWI/SNF2 АТР-зависи-
мых геликаз, а также может контролировать ме-
тилирование ДНК [McDowell et al., 1999; Gib-
bons et al., 2000]. На неактивной Х-хромосоме
также появляется белок SMCHD1, который опо-
средованно задействован в метилировании ДНК
[Blewitt et al., 2008]. Другой белок hRNP U/SP120/
SAF-A поддерживает связывание РНК гена А/.s/ с
хроматином неактивной Х-хромосомы и участ-
вует в организации ее хромосомной территории
[Helbig, Fackelmayer, 2003; Hasegawa et al., 2010].
Кроме того, на неактивной Х-хромосоме выяв-
ляется белок ASH2, который обычно связан с
активным хроматином как субъединица комп-
лекса, участвующего в H3K4me3 [Pullirsch et al.,
2010]. На Х-хромосоме белок ASH2 не связан с
субъединицами, выполняющими функцию гис-
тон-метилтрансфераз, и, вероятно, служит для
облегчения доступа белков, участвующих в про-
цессе инактивации.
Значительную роль в процессе поддержания
неактивного состояния Х-хромосомы может иг-
рать белок BRCA1. Показано, что супрессор ра-
ка молочной железы и яичников BRCA1 (Breast
cancer susceptibility gene 1) играет ключевую
роль в процессах регуляции транскрипции, реп-
ликации, репарации двухцепочечных разрывов
ДНК, структурных преобразованиях хроматина
и поддержании стабильности генома (см. обзор
[Starita, Parvin, 2003]). При иммунофлуорссцснт-
ном анализе BRCA1 интенсивно окрашивает не-
активную Х-хромосому в S-фазе клеточного
цикла. Мутации в гене BRCA1, летальные в со-
матических клетках, в клетках карциномы яич-
ников и молочной железы нарушают связывание
РНК гена XIST с хроматином неактивной Х-хро-
мосомы. Уменьшение уровня BRCA1 или его
полное отсутствие приводят к реактивации ряда
генов неактивной Х-хромосомы. Методом имму-
нопреципитации хроматина продемонстрирова-
но. что BRCA1 солокализуется с РНК XIST и
H3K27me3 [Ganesan etal., 2004]. Связывание
BRCA1 с хроматином неактивной Х-хромосомы
в поздней S-фазе клеточного цикла происходит
одновременно с фосфорилированием варианта
гистона Н2АХ по серину S139 (уН2АХ) [Chad-
wick, Lane, 2005]. Последний известен как мар-
кер двухцепочечных разрывов ДНК, необходи-
мый для привлечения основных факторов репа-
рации [Pauli et al., 2000]. Кроме того, уН2АХ, так
же как и BRCA1, является маркером мейотиче-
ской инактивации половых хромосом (MSCI)
в составе XY полового тельца. В отсутствие
BRCA1 не происходит ассоциации киназы ATR с
хроматином полового тельца, нарушается фос-
форилирование гистона Н2АХ, что в дальней-
шем приводит к нарушению процесса MSCI
[Turner et al., 2004]. Возможно, что белок BRCA1
необходим для фосфорилирования Н2АХ, кото-
рый, в свою очередь, отвечает за быстрое при-
влечение многочисленных факторов репарации и
ремоделинга хроматина. Таким образом, BRCA1
и уН2АХ создают условия для эффективно-
го наследования гетерохроматин-специфических
модификаций. С другой стороны, дефицит белка
BRCA1 в клетках (а также в системе in vitro) вы-
зывает проблемы декатенации ДНК и сегрегации
хромосом. Дело в том, что белок BRCA1 отно-
сится к классу ЕЗ убиквитин-лигаз (содержит
RING-finger домен) и отвечает за убиквити-
нирование топоизомеразы 11 альфа. При этом
происходит значительное усиление декатени-
рующей активности топоизомеразы, которая не-
обходима для распутывания вновь синтезиро-
ванных цепей ДНК, особенно в гетерохромати-
новых районах [Lou etal., 2005]. По всей види-
мости, роль белка BRCA1 в процессе инактива-
ции связана с репликацией конденсированного
хроматина, а именно: с поддержанием модифи-
каций хроматина и реинтеграцией специфиче-
ских вариантов гистонов после репликации и,
446 ЭПИГЕНЕТИКА
<iabol|i—►
v 1Л л л
Ш
Д Ацетилирование НЗ/Н4 НЗК4теЗ
f НЗК27теЗ
4 НЗК4те2
Метилирование H3K36 Q H2AUb
• Н4К20те1
4 НЗК9те2
xis/PHK
Включение
макроН2А
Рис. 18.5. Преобразования хроматина Х-хромосомы в процессе случайной инактивации.
а — транскриционно активный хроматин до инактивации; б— изменения хроматина при инициации инактивации и распростра-
нении неактивного состояния по Х-хромосоме: распространение РНК гена Xist; исключение ДНК-зависимой РНК-полимеразы II;
привлечение ферментов, модифицирующих хроматин; изменения ковалентных модификаций гистонов; е — стабилизация не-
активного состояния: включение макроН2А1.2, метилирование ДНК промоторных областей генов, включение белков SMCHD1,
ASH2L, ATRX, hnRNP U (по [Escamilla-Del-Arenal et al., 2011]).
таким образом, наследованием неактивного со-
стояния хроматина в ряду клеточных поколений
за счет общих механизмов, обеспечивающих ге-
нетическую стабильность генома.
В заключение можно отметить, что неактив-
ное состояние Х-хромосомы в соматических
клетках является высокостабильным и частота
случайной реактивации составляет <10 8 [Heard,
2005]. Нарушение отдельных модификаций
практически не увеличивает частоту’ реактива-
ции. Одновременное нарутпение нескольких мо-
дификаций Х-хромосомы: метилирования ДНК,
гипоацетилирования гистонов и экспрессии гена
Xist, не приводит к облигатной реактивации
Х-хромосомы, а лишь увеличивает вероятность
этого события [Csankovszki et al.. 2001].
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
AagaardL., LaibleG., Selenko P., SchmidAL, Dorn R., Schot-
ta G., KuhfittigS., Wolf A., Lebersorger A., Singh P. B.,
Reuter G., Jenuwein T. Functional mammalian homolo-
gues of the Drosophila PEV-modifier Su(var)3-9 encode
centromere-associated proteins which complex with the
heterochromatin component M31 // EMBO J. 1999.
Vol. 18. P. 1923— 1938.
Anoprienko О. Г., Zakiian S. AL Evolution of mammalian sex
chromosomes: cooperation of genetic and epigenetic fac-
tors // Genetika. 2004. Vol. 40. P. 1013—1033.
Bannister A. J., Zegerman P., Partridge J. F., ALiska E. A., Tho-
mas J. O., Allshire R. C, Kouzarides T. Selective recogni-
tion of methylated lysine 9 on histone H3 by the HP1
chromo domain // Nature. 2001. Vol. 410. P. 120—124.
Baumann C., De La Fuente R. ATRX marks the inactive X
chromosome (Xi) in somatic cells and during imprinted X
chromosome inactivation in trophoblast stem cells // Chro-
mosoma. 2009. Vol. 118. P. 209—222.
Bernstein E., Duncan E. AL., ALasui O., Gil J., HeardE., Al-
lis C. D. Mouse polycomb proteins bind differentially to
methylated histone H3 and RNA and are enriched in facul-
tative heterochromatin // Mol. Cell. Biol. 2006. Vol. 26.
P. 2560—2569.
Blewitt AL. E., GendrelA.F., Pang Z., Sparrow D. B., White-
law N., Craig J. AL., Apedaile A., Hilton D. J., Dutrwo-
odieS.L, BrockdorffN., Kay G. F, Whitelaw E. SmcHDl,
containing a structural-maintenance-of-chromosomes hin-
ge domain, has a critical role in X inactivation // Nat.
Genet. 2008. Vol. 40. P. 663—669.
Boggs B. A., Chinault A. C. Analysis of replication timing prop-
erties of human X-chromosomal loci by fluorescence in
situ hybridization // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994.
Vol. 91. P. 6083—6087.
Brinkman A. B., RoelofsenT., Pennings S. W., ALartens J. H.,
Jenuwein T., StunnenbergH. G. Histone modification pat-
terns associated with the human X chromosome // EMBO
Rep. 2006. Vol. 7. P. 628—634.
BrockdorffN. SAT in silence// Dev. Cell. 2009. Vol. 16.
p. 483 484.
CaoR., Zhang E The functions of E(Z)/EZH2-mediated methy-
lation of lysine 27 in histone H3 // Curr. Opin. Genet. Dev.
2004. Vol. 14. P. 155—164.
CarrelL., Clemson C. AL, Dunn J. AL, ALiller A. P., Hunt P. A.,
Lawrence J. B., Willard H. F. X inactivation analysis and
DNA methylation studies of the ubiquitin activating en-
zyme El and PCTAIRE-1 genes in human and mouse //
Hum. Mol. Genet. 1996. Vol. 5. P. 391^101.
Carrel L., Willard H. F. X-inactivation profile reveals extensive
variability in X-linked gene expression in females // Na-
ture. 2005. Vol. 434. P. 400 404.
Casanova AL, PreissnerT., Cerase A., Pool R., Yamada D.,
Li X., Appanah R., Bezstarosti K, Demmers J., Koseki H.,
BrockdorffN. Poly comblike 2 facilitates the recruitment of
PRC2 Polycomb group complexes to the inactive X chro-
mosome and to target loci in embryonic stem cells // De-
velopment. 2011. Vol. 138. P. 1471—1482.
ГЛАВА 18 447
Casas-Delucchi С. S.. BreroA., Rahn H. P., Soloveil.. Wutz A..
Cremer T., Leonhardt H, Cardoso hl. C. Histone acetyla-
tion controls the inactive X chromosome replication dy-
namics // Nat. Commun. 2011. Vol. 2. P. 222.
Casas-Delucchi C. S, Cardoso Al. C. Epigenetic control of DNA
replication dynamics in mammals // Nucleus. 2011. Vol. 2.
P. 370- 382’
Chadwick B.P. Variation in Xi chromatin organization and
correlation of the H3K27me3 chromatin territories to tran-
scribed sequences bv microarrav analysis // Chromosoma.
2007. Vol. 1 16. P. 147—157.
Chadwick В. P., Lane T. F. BRCA1 associates with the inactive
X chromosome in late S-phase, coupled with transient
H2AX phosphorylation// Ibid. 2005. Vol. 114. P. 432—
439.
Chadwick В. P., Willard II. F. Multiple spatially distinct types of
facultative heterochromatin on the human inactive X chro-
mosome 11 Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. Vol. 101.
P. 17450—17455.
Chaumeil J, Le Baccon P., Wutz A., HeardE. A novel role for
Xist RNA in the formation of a repressive nuclear com-
partment into which genes are recruited when silenced //
Genes Dev. 2006. Vol. 20. P. 2223—2237.
Chaumeil J., Okamoto I., GuggiariAL., HeardE. Integrated
kinetics of X chromosome inactivation in differentiating
embryonic stem cells // Cytogenet. Genome Res. 2002.
Vol. 99. P. 75—84.
Chow J. C, CiaudoC, Fazzari M. J, ALise N, Servant N,
Glass J. L., AttreedAL, AvnerP., WutzA., BarillotE.,
Greally J. AL, VoinnetO., HeardE. LINE-1 activity in
facultative heterochromatin formation during X chro-
mosome inactivation// Cell. 2010. Vol. 141. P. 956—
969.
Clemson C. AL, Hall L. L., Byron AL., ALcNeilJ, Lawrence J. B.
The X chromosome is organized into a gene-rich outer rim
and an internal core containing silenced nongenic se-
quences // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. Vol. 103.
P. 7688—7693.
Coppola G., Pinton A., Joudrey E. AL, Basrur P. K, King W. A.
Spatial distribution of histone isoforms on the bovine ac-
tive and inactive X chromosomes // Sex Dev. 2008. Vol. 2.
P. 12—23.
Costanzi C, PehrsonJ. R. Histone macroH2Al is concentrated
in the inactive X chromosome of female mammals // Na-
ture. 1998. Vol. 393. P. 599—601.
Csankovszki G., PanningB., Bates B., PehrsonJ. R, Jae-
nisch R. Conditional deletion of Xist disrupts histone
macroH2A localization but not maintenance of X inactiva-
tion // Nat. Genet. 1999. Vol. 22. P. 323—324.
Csankovszki G., Nagy A., Jaenisch R. Synergism of Xist RNA,
DNA methylation, and histone hypoacetylation in main-
taining X chromosome inactivation// J. Cell Biol. 2001.
Vol. 153. P. 773—784.
De Bonis AL. L., Cerase A., ALatarazzoAL. R, Ferraro AL, Straz-
zulloAL., Hansen R. S., Chiurazzi P., Neri G., D'Esposi-
to AL. Maintenance of X- and Y-inactivation of the pseu-
doautosomal (PAR2) gene SPRY3 is independent from
DNA methylation and associated to multiple layers of epi-
genetic modifications// Hum. Mol. Genet. 2006. Vol. 15.
P. 1123—1132.
de Napoles AL, ALermoud J. E., WakaoR, Tang Y. A., En-
doh AL, Appanah R, Nesterova T. B., Silva J., Otte A. P.,
FidalAL, Koseki H, BrockdorffN. Polycomb group pro-
teins RinglA В link ubiquitylation of histone H2A to heri-
table gene silencing and X inactivation // Dev. Cell. 2004.
Vol. 7. P. 663—676.
Defossez P. A., Stancheva L. Biological functions of methyl-CpG-
binding proteins11 Prog. Mol. Biol. Transl. Sci. 2011.
Vol. 101. P. 377—398.
Dementyeva E. J~, Shevchenko A. L.. Anopriyenko O. J '.. ALazu-
rokN.A., Elisaphenko E. A., Nesterova T. B., Brock-
dorffN., Zakian S. AL. Difference between random and
imprinted X inactivation in common voles // Chromo-
soma. 2010. Vol. 119. P. 541—552.
DoJ.T., HanD.W., GentileL., Sohek-Klocke I., StehlingAL.,
Scholer H. R. Enhanced reprogramming of Xist by in-
duced upregulation of Tsix and Dnmt3a 7 Stem Cells.
2008. Vol. 26. P. 2821—2831.
Duthie S. AL, Nesterova T. B., Formstone E. J., Keohane A. AL,
Turner B. AL., Zakian S. AL, Brockdorff N. Xist RNA ex-
hibits a banded localization on the inactive X chromosome
and is excluded from autosomal material in cis // Hum.
Mol. Genet. 1999. Vol. 8. P. 195—204.
Escamilla-Del-Arenal AL, da Rocha S. T., HeardE. Evolution-
ary diversity and developmental regulation of X-chromo-
some inactivation 7 Hum. Genet. 2011. Vol. 130. P. 307—
327.
Fang J., ChenT., Chadwick B., LiE., Zhang Y. Ring lb-media-
ted H2A ubiquitination associates with inactive X chro-
mosomes and is involved in initiation of X inactivation //
J. Biol. Chem. 2004. Vol. 279. P. 52812—52815.
GanesanS., Silver D. P., DrapkinR, GreenbergR, Feunte-
unJ., Livingston D. AL. Association of BRCA1 with the
inactive X chromosome and XIST RNA // Philos. Trans.
R. Soc. Loud. B. Biol. Sci. 2004. Vol. 359. P. 123—128.
GartlerS. AL., Riggs A. D. Mammalian X-chromosome inactiva-
tion // Annu. Rev. Genet. 1983. Vol. 17. P. 155—190.
Gibbons R. J., ALcDowell T. L, Raman S., O'Rourke D. AL,
Garrick D., Ayyub H, Higgs D. R Mutations in ATRX,
encoding a SW1 SNF-like protein, cause diverse changes
in the pattern of DNA methylation " Nat. Genet. 2000.
Vol. 24. P. 368—371.
Gilbert S. L, Sharp P. A. Promoter-specific hypoacetylation of
X-inactivated genes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999.
Vol. 96. P. 13825—13830.
Gomez AL, BrockdorffN. Heterochromatin on the inactive X
chromosome delays replication timing without affecting
origin usage // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. Vol. 101.
P. 6923—6928.
GotoT., Wright E., ALonkAL. Paternal X-chromosome inactiva-
tion in human trophoblastic cells // Mol. Hum. Reprod.
1997. Vol. 3. P. 77—80.
GotoY., Gomez AL. BrockdorffN.. Feil R. Differential patterns
of histone methylation and acetylation distinguish active
and repressed alleles at X-linked genes // Cytogenet. Ge-
nome Res. 2002. Vol. 99. P. 66—74.
Grant AL, Zuccotti AL., ALonkAL. Methylation of CpG sites of
two X-linked genes coincides with X-inactivation in the
female mouse embryo but not in the germ line // Nat.
Genet. 1992. Vol. 2. P. 161—166.
Hansen R. S. X inactivation-specific methylation of LINE-1
elements by DNMT3B: implications for the Lyon repeat
hypothesis // Hum. Mol. Genet. 2003. Vol. 12. P. 2559—
2567.
Hansen R S., Canfield T. K, Fjeld A. D., GartlerS. AL. Role of
late replication timing in the silencing of X-linked genes //
ibid. 1996. Vol. 5. P. 1345—1353.
Hansen R.S., Canfield T. K, Gartler S. AL. Reverse replication
timing for the XIST gene in human fibroblasts // Ibid.
1995. Vol. 4. P. 813—820.
Hansen RS., StogerR, WijmengaC, Stanek A. AL, Canfi-
eldT.K, LuoP., ALatarazzoAL. R, D'Esposito AL, FeilR,
Gimelli G., Weemaes C. AL, Laird C. D., Gartler S. AL. Es-
cape from gene silencing in ICF syndrome: evidence for ad-
vanced replication time as a major determinant ' Ibid. 2000.
Vol. 9. P. 2575—2587.
Hasegawa Y., BrockdorffN., KawanoS., Tsutui K, Nakaga-
wa S. The matrix protein hnRNP U is required for chro-
448 ЭПИГЕНЕТИКА
mosomal localization of Xist RNA '/ Dev. Cell. 2010.
Vol. 19. P. 469 476.
Heard E. Delving into the diversity of facultative heterochro-
matin: the epigenetics of the inactive X chromosome U
Curr. Opin. Genet. Dev. 2005. Vol. 15. P. 482—489.
HeardE., Disteche C. AL Dosage compensation in mammals:
fine-tuning the expression of the X chromosome // Genes
Dev. 2006. Vol. 20. P. 1848—1867.
HeardE., ClercP., AvnerP. X-chromosome inactivation in
mammals// Annu. Rev. Genet. 1997. Vol. 31. P. 571—
610.
HeardE., RougeuUe C, Arnaud D., AvnerP., Allis C. D., Spec-
tor D. L. Methylation of histone H3 at Lys-9 is an early
mark on the X chromosome during X inactivation // Cell.
2001. Vol. 107. P. 727—738.
HelbigR., Fackelmayer F. O. Scaffold attachment factor A
(SAF-A) is concentrated in inactive X chromosome terri-
tories through its RGG domain // Chromosoma. 2003.
Vol. 112. P. 173—182.
Hellman A., Chess A. Gene body-specific methylation on the
active X chromosome // Science. 2007. Vol. 315. P. 1141—
1143.
Hernandez-ALunoz I., Lund A. H, van der Stoop P., Boutsma E.,
ALuijrersL, Verhoeven E., Nusinow D. A., PanningB.,
Alarahrens Y., van Lohuizen AI. Stable X chromosome in-
activation involves the PRC1 Polycomb complex and re-
quires histone MACROH2A1 and the CULLIN3/SPOP
ubiquitin E3 ligase // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005a.
Vol. 102. P. 7635—7640.
Hernandez-ALunoz I., Taghavi P., Kuijl C., NeefesJ., van Lo-
huizen AI. Association of BMI1 with polycomb bodies is
dynamic and requires PRC2/EZH2 and the maintenance
DNA methyltransferase DNMT1 // Mol. Cell. Biol. 2005b.
Vol. 25. P. 11047—11058.
Huynh K. D.. LeeJ. T. Inheritance of a pre-inactivated paternal
X chromosome in early mouse embryos // Nature. 2003.
Vol. 426. P. 857—862.’
Jacobs S. A., Tavema S. D., ZhangY., Briggs S. D., Li J., Eis-
senbergJ.C, Allis C. D., Khorasanizadeh S. Specificity
of the HP1 chromo domain for the methylated N-terminus
of histone H3 // EMBO J. 200E Vol. 20. P. 5232—524E
KawameH, Carlier S. AL, Hansen R. S. Allele-specific replica-
tion timing in imprinted domains: absence of asynchrony at
several loci // Hum. Mol. Genet. 1995. Vol. 4. P. 2287—
2293.
KeohaneA.AL, ONeillL. P., Belyaev N. D., Lavender J. S., Tur-
ner B. AI. X-Inactivation and histone H4 acetylation in em-
bryonic stem cells " Dev. Biol. 1996. Vol. 180. P. 618—
630.
KohlmaierA., Savarese F, LachnerAL, Alartens J., Jenuwe-
in T, WutzA. A chromosomal memory triggered by Xist
regulates histone methylation in X inactivation // PLoS
Biol. 2004. Vol. 2. P. el71.
Krouwelsl. AL, Wiesmeijer K, Abraham T.E., AlolenaarC.,
VerwoerdN. P., Тапке H. J., Dirks R. II. A glue for het-
erochromatin maintenance: stable SUV39H1 binding to
heterochromatin is reinforced by the SET domain // J. Cell
Biol. 2005. Vol. 170. P. 537—549.
Kunath T., ArnaudD., UyG.D., Okamoto I., Chureau C., Ya-
manaka Y.. HeardE.. GardnerR. L.. AvnerP.. Rossant J.
Imprinted X-inactivation in extra-embryonic endoderm
cell lines from mouse blastocysts // Development. 2005.
Vol. 132. P. 1649—1661.
LachnerAL, O'CarrollD., ReaS., AlechtlerK., JenuweinT.
Methylation of histone H3 lysine 9 creates a binding site
forHPl proteins //Nature. 2001. Vol. 410. P. 116—120.
LechnerAI. S., BeggG. E., Speicher D. W., RauscherF. J. 3rd.
Molecular determinants for targeting heterochromatin pro-
tein 1-mediated gene silencing: direct chromoshadow do-
main-KAP-1 corepressor interaction is essential 7 Mol.
Cell. Biol. 2000. Vol. 20. P. 6449—6465.
Lin H, Gupta V., VermilyeaAL. D., FalcianiE, LeeJ.T.,
O'Neill L.P., 'turner B. AI. Dosage compensation in the
mouse balances up-regulation and silencing of X-linked
genes // PLoS Biol. 2007. Vol. 5. P. e326.
LockL. F, Takagi N, Alartin G. R. Methylation of the Hprt
gene on the inactive X occurs after chromosome inactiva-
tion . Cell. 1987. Vol. 48. P. 39 46.
LouZ., Alinter-Dykhouse K., Chen J. BRCA1 participates in
DNA decatenation // Nat. Struct. Mol. Biol. 2005. Vol. 12.
P. 589—593.
Lucchesi J. C, Kelly IF. G., PanningB. Chromatin remodeling
in dosage compensation " Annu. Rev. Genet. 2005.
Vol. 39 P. 615—651.
AlakW., Nesterova T. B., de NapolesAL, AppanahR., Yama-
naka S., OtteA.P.. BrockdorffN. Reactivation of the pa-
ternal X chromosome in early mouse embrvos // Science.
2004. Vol. 303. P. 666—669.’
Alatarazzo AL R., De Bonis AI. L, Gregory R. I., Dacca AL,
Hansen R. S., Alercadante G., D'Urso AL, FeilR, D'Espo-
sito AI. Allelic inactivation of the pseudoautosomal gene
SYBL1 is controlled by epigenetic mechanisms common
to the X and Y chromosomes // Hum. Mol. Genet. 2002.
Vol. 11. P. 3191—3198.
AlatsudaE., AgataY.. SugaiAL. Katakai T., Gonda H, Shimi-
zu A. Targeting of Kruppel-associated box-containing zinc
finger proteins to centromeric heterochromatin. Implica-
tion for the gene silencing mechanisms it J. Biol. Chem.
2001. Vol. 276. P. 14222—14229.
AIcDowellT.L, Gibbons R. J., SutherlandH, O'Rourke D. AL,
Bickmore W. A., Pombo A., Turley H, Gutter К, Pic-
ketts D. J., Buckle V. J., Chapman L, Rhodes D., Higgs D. R.
Localization of a putative transcriptional regulator (ATRX)
at pericentromeric heterochromatin and the short amis of ac-
rocentric chromosomes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999.
Vol. 96. P. 13983—13988.
AlermoudJ. E., Costanzi C, PehrsonJ.R, BrockdorffN. His-
tone macroH2A1.2 relocates to the inactive X chromo-
some after initiation and propagation of X-inactivation // J.
Cell Biol. 1999. Vol. 147. P. 1399—1408.
AlondelloC, Goodfellow P. J., Goodfellow P. N. Analysis of
methylation of a human X located gene which escapes X in-
activation // Nucleic Acids Res. 1988. Vol. 16. P. 6813—
6824.
AIonkAL, BoubelikAI., LehnertS. Temporal and regional
changes in DNA methylation in the embryonic, extraem-
bryonic and germ cell lineages during mouse embryo de-
velopment // Development. 1987. Vol. 99. P. 371—382.
Nielsen A. L., Ortiz J. A., You J., Oulad-Abdelghani AL, Khe-
chumian R.. GansmullerA., Chambon P.. Losson R. Inter-
action with members of the heterochromatin protein 1
(HP1) family and histone deacetylation are differentially
involved in transcriptional silencing by members of the
TIF1 family // EMBO J. 1999. Vol. 18. P. 6385—6395.
Norris D. P., Patel D., Kay G. F, Penny G. D., BrockdorffN.,
Sheardown S. A., Rastan S. Evidence that random and im-
printed Xist expression is controlled by preemptive methy-
lation//Cell. 1994. Vol. 77. P. 41- 51.
OhhataT., TachibanaAL. TadaAL, TadaT.. Sasaki H. Shin-
kai 1’., Sado T. X-inactivation is stably maintained in mou-
se embrvos deficient for histone methyl transferase G9a //
Genesis’ 2004. Vol. 40. P. 151—156. ’
Okamoto I., Otte A. P., Allis C. D., ReinbergD., HeardE. Epige-
netic dynamics of imprinted X inactivation during early
mouse development // Science. 2004. Vol. 303. P. 644—
649.
Okamoto I., Patrat C., Thepot D., Peynot N, Fauque P., Da-
niel N. Diabangouaya P., Wolf J. P., Renard J. P., Duran-
ГЛАВА 18 449
thon Г.. HeardЕ. Eutherian mammals use diverse strate-
gies to initiate X-chromosome inactivation during devel-
opment // Nature. 2011. Vol. 472. P. 370—374.
Panning B., DausmanJ, Jaenisch R. X chromosome inactiva-
tion is mediated by Xist RNA stabilization 11 Cell. 1997.
Vol. 90. P. 907—916.
Patrat C., Okamoto I., Diabangouaya P., Bialon I., Le Вас-
сой P.. Chow J.. HeardE. Dynamic changes in paternal
X-chromosome activity during imprinted X-chromosome
inactivation in mice // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2009.
Vol. 106. P. 5198—5203.
Pauler F. AL, Sloane AL A., HuangR., ReghaK, Koerner AL V,
Tamir I., Sommer A., AszodiA., Jenuwein T, Barlow D. P.
H3K27me3 forms BLOCs over silent genes and intergenic
regions and specifies a histone banding pattern on a mouse
autosomal chromosome" Genome Res. 2009. Vol. 19.
P. 221—233.
Pauli T.T., Rogakou E. P., YamazakiB., Kirchgessner C. U,
Gellert Al., Bonner IF. Al. A critical role for histone И2АХ
in recruitment of repair factors to nuclear foci after DNA
damage // Curr. Biol. 2000. Vol. 10. P. 886—895.
Pfeifer G. P., Tanguay R. L., Steigerwald S. D., Riggs A. D. In
vivo footprint and methylation analysis by PCR-aided ge-
nomic sequencing: comparison of active and inactive X
chromosomal DNA at the CpG island and promoter of
human PGK-1 // Genes Dev. 1990. Vol. 4. P. 1277—1287.
Plath K, Fang J., Allynarczyk-EvansS. K, CaoR., Il'orrin-
ger К A., II’angH, de la Cruz С. C., Otte A. P., Pan-
ning B., Zhang Y. Role of histone H3 lysine 27 methylation
in X inactivation // Science. 2003. Vol. 300. P. 131—135.
Plath K., Talbot D., Hamer K. Al., Otte A. P., YangT. P., Jae-
nischR., Panning B. Developmentally regulated altera-
tions in Polycomb repressive complex 1 proteins on the
inactive X chromosome // J. Cell Biol. 2004. Vol. 167.
P. 1025—1035.
Pullirsch D., HartelR., KishimotoH, LeebAL, Steiner G.,
IFutzA. The Trithorax group protein Ash21 and Saf-A are
recruited to the inactive X chromosome at the onset of sta-
ble X inactivation И Development. 2010. Vol. 137.
P. 935—943.
RaefskiA. S., O'Neill AL J. Identification of a cluster of X-lin-
ked imprinted genes in mice // Nat. Genet. 2005. Vol. 37.
P. 620—624.
ReaS., EisenhaberF. O'CarrollD., StrahlB.D.. Sun Z. IE,
SchmidAL, Opravil S., AlechtlerK, PontingC.P., Al-
lis C. D., Jenuwein T. Regulation of chromatin structure
by site-specific histone H3 methyltransferases // Nature.
2000. Vol. 406. P. 593—599.
Rego A., Sinclair P. B., Tao IV., Kireev L, Belmont A. S. The
facultative heterochromatin of the inactive X chromosome
has a distinctive condensed ultrastructure // J. Cell Sci.
2008. Vol. 121. P. 1119- -1127.
Reik IF., SantosF., Alitsuya K, Alorgan H, Dean IE Epigenetic
asymmetry in the mammalian zygote and early embryo:
relationship to lineage commitment? // Philos. Trans. R.
Soc. Loud. B. Biol. Sci. 2003. Vol. 358. P. 1403—1409.
Discussion 1409.
Rens IE, IFallduck AL. S., Lovell F.L., Ferguson-Smith Al. A.,
Ferguson-Smith А. C. Epigenetic modifications on X chro-
mosomes in marsupial and monotreme mammals and im-
plications for evolution of dosage compensation // Proc.
Natl. Acad. Sci. USA. 2010. Vol. 107. P. 17657—17662.
Rougeulle C, Chaumeil J., Sarma K, Allis C. D., ReinbergD.,
Avner P., HeardE. Differential histone H3 Lys-9 and Lys-
27 methylation profiles on the X chromosome 11 Mol. Cell.
Biol. 2004. Vol. 24. P. 5475—5484.
RowntreeR. K, Lee J. T. Mapping of DNA replication origins
to noncoding genes of the X-inactivation center // Mol.
Cell. Biol. 2006. Vol. 26. P. 3707—3717.
Ryan R. F, Schultz D. C. Ayyanathan K, Singh P. B.. Fried-
man J. R., Fredericks IF. J., RauscherF.J. 3rd. KAP-1
corepressor protein interacts and colocalizes with hetero-
chromatic and euchromatic HP! proteins: a potential role
for Kruppel-associated box-zine finger proteins in hetero-
chromatin-mediated gene silencing // Mol. Cell. Biol. 1999.
Vol. 19. P. 4366- 4378.
SampathS.C, Alarazzil., YapKL.. Krutchinsky A. N.. Aleck-
lenbrauker I., lialeA., Rudensky E., Zhou ALAI, Chait В. T.,
Tarakhovsky A. Methylation of a histone mimic within the
histone methyltransferase G9a regulates protein complex as-
sembly // Mol. Cell. 2007. Vol. 27. P. 596—608.
Sarma K, Levasseur P., Aristarkhov A., Lee J. T. Locked nucleic
acids (LNAs) reveal sequence requirements and kinetics of
Xist RNA localization to the X chromosome Г Proc. Natl.
Acad. Sci. USA. 2010. Vol. 107. P. 22196 22201.
Schmidt Al., AligeonB.R. Asynchronous replication of homolo-
gous loci on human active and inactive X chromosomes //
Ibid. 1990. Vol. 87. P. 3685—3689.
Schoeftner S., Sengupta A. K, KubicekS., Alechtler K, SpahnL.,
Koseki H, Jenuwein T, IIutzA. Recruitment of PRC] func-
tion at the initiation of X inactivation independent of PRC2
and silencing // EMBO J. 2006. Vol. 25. P. 3110—3122.
Schultz D. C, Ayyanathan K, Negorev D., Alaul G. G., Rau-
scherF.J. 3rd. SETDB1: a novel KAP-l-associated his-
tone H3, lysine 9-specific methyltransferase that contrib-
utes to HPl-mediated silencing of euchromatic genes by
KRAB zine-finger proteins // Genes Dev. 2002. Vol. 16.
P. 919—932.
Sharman G. B. Late DNA replication in the paternally derived
X chromosome of female kangaroos// Nature. 1971.
Vol. 230. P. 231—232.
Sheardown S. A., DuthieS.AL, Johnston C. AL, Newall A. E.,
Formstone E. J., ArkellR.AL, Nesterova T. B., Alghi-
siG.C., RastanS., BrockdorffN. Stabilization of Xist
RNA mediates initiation of X chromosome inactivation /7
Cell. 1997. Vol. 91. P. 99—107.
Shevchenko A. 1, Pavlova S. E, Dementyeva E. B, Zakian S. AL
Mosaic heterochromatin of the inactive X chromosome in
vole Microtus rossiaemeridionalis // Mamm. Genome.
2009. Vol. 20. P. 644—653.
Silva J., Alakll’., Zvetkova I., Appanah R., Nesterova T. B.,
Webster Z., Peters A. H, Jenuwein T., Otte A. P., Brock-
dorffN. Establishment of histone h3 methylation on the
inactive X chromosome requires transient recruitment of
Eed-Enxl polycomb group complexes // Dev. Cell. 2003.
Vol. 4. P. 481—-495.
Singer-Sam J., Grant AL, LeBonJ.AL, Okuyama K, Chap-
man B., AlonkAl., Riggs A. D. Use of a Hpall-polymerase
chain reaction assay to study DNA methylation in the Pgk-
1 CpG island of mouse embryos at the time of X-
chromosome inactivation // Mol. Cell. Biol. 1990. Vol. 10.
p. 4987 4989.
Smallwood A., Esteve P.O., PradhanS., Carey’Al. Functional
cooperation between HP1 and DNMT1 mediates gene si-
lencing // Genes Dev. 2007. Vol. 21. P. 1169—1178.
Smith К. P., Byron AL, Clemson C. AL, Lawrence J. B. Ubiquit-
inated proteins including uH2A on the human and mouse
inactive X chromosome: enrichment in gene rich bands //
Chromosoma. 2004. Vol. 113. P. 324—335.
Starita L. Al., Parvin J. D. The multiple nuclear functions of
BRCA1: transcription, ubiquitination and DNA repair//
Curr. Opin. Cell Biol. 2003. Vol. 15. P. 345—350.
Sugawara O., Takagi N, Sasaki Al. Allocyclic early replicating
X chromosome in mice: genetic inactivity and shift into a
late replicator in early embrogenesis // Chromosoma.
1983. Vol. 88. P. 133—138.
TorchiaB. S., Call L. Al., AligeonB. R. DNA replication analy-
sis of FMRI, XIST, and factor 8C loci by FISH shows
450 ЭПИГЕНЕТИКА
nontranscribed X-linked genes replicate late 11 Am. J.
Hum. Genet. 1994. Vol. 55. P. 96—104.
TorchiaB. S., ALigeonB. R. The XIST locus replicates late on
the active X, and earlier on the inactive X based on FISH
DNA replication analysis of somatic cell hybrids // Somat.
Cell Mol. Genet. 1995. Vol. 21. P. 327—333.
Turner J. AL, Aprelikova О., Xu X., IPangR., Kim S., Chandra-
mouliG.P., Barrett J. C.. Burgoyne P. S., DengC.X.
BRCA1, histone H2AX phosphorylation, and male meiotic
sex chromosome inactivation " Curr. Biol. 2004. Vol. 14.
P. 2135—2142.
van der JlagJ, Otte A. P. Transcriptional repression mediated
by the human polycomb-group protein BED involves his-
tone deacetylation ." Nat. Genet. 1999. Vol. 23. P. 474—
478.
Ferschure P. J., van der Kraan de Leeuw IE, van der Plug J.,
Carpenter A. E.. Belmont A. S, vanDrielR. In vivo HP1
targeting causes large-scale chromatin condensation and
enhanced histone lysine methylation // Mol. Cell. Biol.
2005. Vol. 25. P. 4552—4564. ’
[Pang J, ALager J., Schnedier E., ALagnuson T. The mouse PcG
gene eed is required for Hox gene repression and extraem-
brvonic development // Mamm. Genome. 2002. Vol. 13.
P. 493—503.
Putz A., Jaenisch R. A shift from reversible to irreversible X
inactivation is triggered during ES cell differentiation //
Mol. Cell. 2000. Vol. 5. P. 695—705.
Putz A.. Rasmussen T. P.. JaenischR. Chromosomal silencing
and localization are mediated bv different domains of Xist
RNA // Nat. Genet. 2002. Vol. 30. P. 167—174.
Yamamoto K., Sonoda AL. Self-interaction of heterochromatin
protein 1 is required for direct binding to histone methyl-
transferase, SUV39H1 // Biochem. Biophys. Res. Com-
mun. 2003. Vol. 301. P. 287- -292.
YangL.. ALei Q.. Zielinska-Kwiatkowska A., ALatsui Y., Black-
bum AL. L., Benedetti D., KrummA. A., Taborsky G. J. Jr.,
Chansky H. .1. An ERG (ets-related gene)-associated his-
tone methyltransferase interacts with histone deacetylases
1/2 and transcription co-repressors mSin3A/B // Biochem.
J. 2003. Vol. 369. P. 651—657.
YasukochiY., ALaruyamaO., ALahajanALC., PaddenC., Eus-
kirchen G. AL, Schulz P, Hirokawa H, KuharaS.,
PanX.H., NewburgerP.E., Snyder AL, P’eissman S. AL. X
chromosome-wide analyses of genomic DNA methylation
states and gene expression in male and female neutrophils //
Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2010. Vol. 107. P. 3704—3709.
Zhang L. F, Huynh K. D., Lee J. T. Perinucleolar targeting of the
inactive X during S phase: evidence for a role in the mainte-
nance of silencing 7 Cell. 2007. Vol. 129. P. 693—706.
Zhao J., SunB.K., Erwin J. A., Song J. J., Lee J. T. Polycomb
proteins targeted by a short repeat RNA to the mouse X
chromosome // Science. 2008. Vol. 322. P. 750—756.
ГЛАВА
19
МЕЙОТИЧЕСКАЯ ИНАКТИВАЦИЯ
ПОЛОВЫХ ХРОМОСОМ
СОДЕРЖАНИЕ
19.1. Мейотическая инактивация поло-
вых хромосом у млекопитающих,
452
19.2. Мейотическая инактивация поло-
вых хромосом у Caenorhabditis ele-
gans, 457
19.3. Мейотическая инактивация поло-
вых хромосом у насекомых, 459
Список литературы, 462
452 ЭПИГЕНЕТИКА
У многих эукариотических организмов рай-
оны хромосом или целые хромосомы, не имею-
щие гомологов, подвергаются инактивации
транскрипции и хроматина в ходе первой профа-
зы мейоза. Этот феномен, получивший название
мейотического сайленсинга, впервые был описан
у нитевидных грибов Neurospora crassa [Shiu
etal., 2001] и далее обнаружен у целого ряда
таксонов — плоских червей Caenorhabdites ele-
gans [Bean et al., 2004], насекомых, птиц, млеко-
питающих [Kelly, Aramayo, 2007].
Более частный случай мейотического сайлен-
синга — мейотическая инактивация половых хро-
мосом (MSCI: meiotic sex chromosome inacti-
vation). Процесс MSCI имеет место в мейозе у
особей гетерогаметного пола, которые содержат
либо две гетероморфные, либо одну-единствен-
ную половые хромосомы. На стадии пахитены
мейоза, когда все гомологичные аутосомы свя-
заны попарно синаптонемным комплексом, по-
ловые хромосомы/а, не имеющие гомолога, ста-
новятся транскрипционно неактивными и фор-
мируют так называемое половое тельце.
Данный обзор посвящен феномен) MSCI в
различных таксонах царства животных. Основ-
ные данные представлены для наиболее изучен-
ного класса — млекопитающих, где подробно
описан механизм, факторы, участвующие в фор-
мировании неактивной структуры полового тель-
ца, динамика модификаций гистонов хроматина.
В других рассмотренных таксонах (нематода,
насекомые, птицы) процесс MSCI изучен в мень-
шей степени, потому’ представлены различные
мнения о механизмах, продолжительности и да-
же о существовании самого процесса MSCI.
Процесс MSCI достаточно широко распро-
странен, однако биологическая роль этого явле-
ния до сих пор обсуждается. На сегодня сущест-
вуют различные гипотезы о биологической роли
MSCI. Например, считают, что формирование
структуры полового тельца позволяет маскиро-
вать неспаренные половые хромосомы при про-
хождении «точки контроля» в клеточном цикле
[Odorisio et al., 1998], так как присутствие аси-
наптированного хроматина на данной стадии
приводит к апоптозу. Кроме того, MSCI может
быть необходима для инактивации генов, сцеп-
ленных с полом, которые оказывают подавляю-
щее действие на процесс сперматогенеза [Lif-
schytz, Lindsley, 1972]. MSCI также можно рас-
сматривать в качестве механизма, предотвра-
щающего рекомбинацию [McKee, Handel, 1993]
и/или повреждения ДНК [Ayoub et al., 1997]
в асинаптированных районах половых хромосом
в процессе мейоза. Наконец, вероятно, гетеро-
хроматизация половых хромосом может способ-
ствовать установлению синапса между’ гомоло-
гичными псевдоаутосомными районами [Turner
et al., 2000].
19.1. Мейотическая инактивация
половых ХРОМОСОМ У МЛЕКОПИТАЮЩИХ
19.1.1. Динамика модификаций хроматина
половых хромосом на разных
стадиях сперматогенеза
В процессе сперматогенеза в половых клетках
происходит реорганизация структуры хромати-
на: соматические коровые гистоны и линкерный
гистон HI частично замещаются на специфиче-
ские для семенника изоформы или варианты
гистонов [Hoyer-Fender, 2003]. Замена гистонов
в хроматине может происходить как во время
репликации, так и без нее. Инкорпорация изо-
форм гистонов, характерных для сперматогони-
ального хроматина, завершается к стадии спер-
матоцита I порядка. Гистоны и их варианты ди-
намически подвергаются различным посттранс-
ляционным модификациям: метилированию, аце-
тилированию, фосфорилированию, убиквитини-
рованию, которые соответствуют активному' или
неактивному' состоянию хроматина на разных
стадиях сперматогенеза. Кроме того, в состав
хроматина при сперматогенезе могут включать-
ся различные негистоновые структурные белки,
ферменты и РНК.
Процесс сперматогенеза можно разделить на
три этапа: сперматогониогенез, мейоз и спер-
миогенез. На стадии сперматогониогенеза спер-
матогонии типа А являются стволовыми клетка-
ми и способны как к самопроизводству, так и к
образованию клеток другого типа — спермато-
гониев типа В, вступающих в мейоз. В процессе
мейоза каждая клетка претерпевает серию цито-
логически идентифицируемых стадий. На стадии
лептотены хромосомы изменяют свою интер-
фазную конформацию и переходят в конденси-
рованное состояние. Сближение хромосом и об-
разование синапса свидетельствуют о переходе
лептотены в зиготену. Когда происходит конъю-
гация гомологов, образуются аксиальные эле-
менты синаптонемного комплекса. На стадии
пахитены полностью завершается синапс гомо-
логичных аутосом, образуются центральные эле-
менты синаптонемного комлекса, который по-
парно связывает все гомологичные хромосомы,
гетероморфные X- и Y-хромосомы конъюгируют
ГЛАВА 19 453
не полностью. На стадии диплотены/диакенеза
происходят деградация синаптонемного ком-
плекса и разделение хромосом. На стадии мета-
фазы первого деления мейоза завершается раз-
деление гомологичных хромосом. Образовав-
шиеся диплоидные клетки далее подвергаются
второму’ мейотическому делению. В результате
образуются клетки, имеющие гаплоидный набор
хромосом, — округлые сперматиды, которые
вступают в заключительную стадию спермато-
генеза — спермиогенез. На этой стадии ядро уп-
лотняется, происходят значительные перестрой-
ки в структуре хроматина: большинство гисто-
нов замещаются на протамины, происходит фор-
мирование акросомы и жгутика, утрачивается
практически вся цитоплазма. В результате такой
клеточной дифференцировки сперматиды пре-
вращаются в сперматозоиды [Holstein et al.,
2003; Handel, 2004].
На ранних стадиях сперматогенеза (спермато-
гония, лептотена, зиготена) как на аутосомах,
так и на половых хромосомах выявляется ацети-
лированный по лизину’ К5, К8, К12, К16 гистон
Н4 (Н4К5ас, Н4К8ас, Н4К12ас, Н4К1 бас), а так-
же НЗК9ас, что свидетельствует о транскрипци-
онно активном состоянии хроматина. Гетеро-
хроматиновые белки НР1у и HPip выявляются
исключительно в районах конститутивного гете-
рохроматина. На стадии пахитены происходит
формирование полового тельца, что сопровож-
дается изменениями в структуре и экспрес-
сии генов половых хромосом. С XY-хромосом
происходит исключение модификаций гисто-
нов, ассоциированных с транскрипционно актив-
ным хроматином (НЗК9ас, Н4К12ас, Н4К16ас),
а также исключение РНК-полимеразы II [Khalil
et al., 2004]. Одновременно наблюдается аккуму-
ляция модификаций, ассоциированных с транс-
крипционно неактивным хроматином. На ранних
стадиях пахитены происходит значительное обо-
гащение половых хромосом НЗК9шс2 и -теЗ,
тогда как на стадии средней пахитены данные
модификации отсутствуют, реинтегрируясь сно-
ва на стадии поздней пахитены. На стадии пахи-
тены также происходит убиквитинирование гис-
тона Н2А. Ассоциация иН2А с половыми хромо-
сомами на стадии пахитены показана также для
человека и крысы. Функция убиквитинирования
гистонов еще не до конца изучена, однако дан-
ная модификация, по крайней мере, вовлече-
на в поддержание неактивного статуса поло-
вых хромосом [Baarends etal., 2005]. Половой
хроматин характеризуется также ассоциацией
с НЗК27ше2, -теЗ.
Кроме ковалентных модификаций гистонов
неактивное состояние генов половых хромосом
обеспечивается ассоциацией с гетерохроматино-
выми белками НР1|3 и НР1у. Как было показано
на человеке [Metzler-Guillemain etal., 20031 и
мыши [Greaves et al., 2006], HP ip и HPIy вовле-
каются в состав половых хромосом на стадии
поздней пахитены и ассоциируются с ними до
конца спермиогенеза. По некоторым данным,
белки НР1у и НР1|3 в составе половых хромосом
переносятся в зиготу- [Ooi et al., 2006; van der
Heijden etal., 2006]. Интересно, что у сумчатых
наблюдается более ранняя ассоциация с гетеро-
хроматиновыми белками НР1у и HPip, происхо-
дящая уже на ранних стадиях пахитены [Name-
kayva et al., 2007].
На стадии пахитены в составе полового хро-
матина появляются и друтие компоненты гете-
рохроматина, как, например, макроН2А1.2 [Grea-
ves et al., 2006]. На начальных этапах конденса-
ции хроматина макроН2А1.2 локализуется на
половых хромосомах, а лишь затем в прицент-
ромерных и псевдоаутосомных районах X- и Y-
хромосом [Turner et al., 2001; Hoyer-Fender et al.,
2004]. Напротив, HPip сначала выявляется в
районах центромер и псевдоаутосомных районах
и только затем в составе полового хроматина
[Hoyer-Fender etal., 2004]. Предполагают, что
макроН2А1.2 вовлечен в процесс распростране-
ния гетерохроматинизации половых хромосом
[Turner etal.. 2001] и, возможно, привлекает
HPip. В образовании неактивной структуры X- и
Y-хромосом принимают участие и друтие вари-
анты гистона Н2А, например, H2A.Z, уровень
которого значительно возрастает на стадии па-
хитены [Greaves et al., 2006].
На стадии ранней диплотены изменяется си-
туация с ацетилированием гистона Н4: гипоаце-
тилированию подвергаются также лизины в по-
ложении 5 и 8, а в положении 16 лизин подвер-
гается ацетилированию [Khalil et al., 2004], а
HPIy и HPip распределены уже вдоль всего XY-
тельца [Namekayva et al., 2006].
Таким образом, к стадии пахитены/дипло-
тены половые хромосомы имеют гипоацетили-
рованный гистон Н4 по лизинам К12, К16 и ги-
поацетилированный гистон НЗ по лизину’ К9.
Кроме того, они обогащены характерными для
неактивного хроматина НЗК9ше2 и НЗК9шеЗ,
иН2А, а также ассоциированы с макроН2А1.2,
гетерохроматиновыми белками HPip, HPly и
РНК гена Xist. Неактивное состояние половых
хромосом сохраняется после первого и второго
деления мейоза и даже на постмейотических
454 ЭПИГЕНЕТИКА
стадиях в спермиогенезе, когда происходит ут-
рата ряда модификаций неактивного хроматина.
Такой неактивный хроматин постмейотических
X- и Y- хромосом получил название «постмейо-
тический половой хроматин» (PMSC: post mei-
otic sex chromatin) [Namekawa et al., 2006].
19.1.2. Постмейотический половой
хроматин
Изменения в ядерной организации и структу -
ре хроматина продолжаются в течение всего
процесса сперматогенеза.
На стадии округлых сперматид аутосомы за-
нимают определенные хромосомные территории
таким образом, что прицентромерный гетеро-
хроматин всех хромосом оказывается располо-
женным радиально в центре ядра, образуя еди-
ный, крупный хромоцентр. Половые хромосомы
образуют компактный домен около данного
хромоцентра [Greaves et al., 2006].
На этой стадии на половых хромосомах гис-
тон Н4 подвергается ацетилированию в положе-
ниях К5 и К12 и происходит ацетилирование
НЗК9 [Khalil et al., 2004]. Кроме того, в половом
хроматине у мыши наблюдается снижение уров-
ня uH2A [Baarends et al., 1999], тогда как у кры-
сы уровень нН2А практически не изменяется
[Chen et al., 1998]. Следует отметить, что на ста-
дии элонгации сперматид у мыши снова проис-
ходит убиквитинирование гистона Н2А. Причем,
новая волна убиквитинирования предшествует
замене гистонов на протамины. Таким образом,
вероятно, убиквитинирование гистонов играет
роль в постмейотической реорганизации полово-
го хроматина [Baarends et al., 1999].
В постмейотическом половом хроматине в
сперматидах у плацентарных и сумчатых млеко-
питающих выявляются НР1у. НР1|3 и НЗК9теЗ,
которые характерны для мейотического сайлен-
синга. У плацентарных млекопитающих пост-
мейотический половой хроматин ассоциирован
также с НЗК9те2. Тем не менее, некоторые мо-
дификации гистонов различаются во время мей-
отического и постмейотического сайленсинга.
Например, в постмейотическом половом хрома-
тине отсутствует фосфорилированная форма
гистона Н2АХ (уН2АХ), макроН2А, который не-
значительно обогащен в районах центромеры Y-
хромосомы в сперматоцитах второго порядка и
сперматидах, и появляется Н4К16ас [Namekawa
etal., 2006]. РНК-полимераза II вновь выявляет-
ся как на аутосомах, так и на половых хромосо-
мах [Khalil et al., 2004].
19.1.3. Экспрессия генов половых
хромосом на мейотических
и постмейотических стадиях
Уровень экспрессии генов аутосом на мейо-
тических и постмейотических стадиях варьирует
незначительно. Гены половых хромосом подвер-
гаются репрессии в результате процесса мейоти-
ческой инактивации на стадии пахитены. Неак-
тивное состояние для большинства генов сохра-
няется на постмейотических стадиях.
Индивидуальный анализ уровня транскрип-
ции генов половых хромосом у мыши, имеющих
специфическую для семенников экспрессию, по-
казал, что для Х-сцепленных генов Usp26, Tktll
и Тех13, а также Y-сцепленного гена Rbmy
уменьшение уровня транскрипции наблюдается
уже на стадиях лептотены и зиготены, а инакти-
вация Х-сцепленного гена FM17 выявляется на
стадии прелептотены. Таким образом, возможно,
что инициация процесса подавления транскрип-
ции генов половых хромосом, обусловленная
MSCI, имеет место на ранних стадиях профазы
первого деления мейоза, а различия во времени,
когда детектируется инактивация для отдельных
генов, связаны с различной стабильностью их
мРНК [Wang et al., 2005]. Сравнительный анализ
времени инактивации отдельных генов у сумча-
тых и плацентарных показал, что сайленсинг не-
которых генов, локализованных на Х-хромосоме
у сумчатых, происходит гораздо медленнее, чем
у мыши. Одним из возможных объяснений явля-
ется то, что у сумчатых мРНК данных генов яв-
ляется более стабильной. Скорее всего, процесс
MSCI у сумчатых в целом является менее «стро-
гим», чем v плацентарных [Homecker et al.,
2007].
При анализе экспрессии 676 уникальных бе-
лок-кодирующих генов Х-хромосомы мыши ме-
тодом ДНК-микрочип показано, что все они
инактивируются в ходе мейоза и у 87,0 % генов
наблюдается репрессия транскрипции на пост-
мейотических стадиях [Namekawa et al., 2006].
В отличие от уникальных генов большинство
многокопийных генов подвергаются реактива-
ции после мейотической инактивации [Mueller
et al.. 2008]. Установлено, что у мыши из 14 из-
вестных генов половых хромосом, экспресси-
рующихся исключительно в семенниках и инак-
тивирующихся в процессе MSCI, частично или
полностью реактивируются на постмейотиче-
ских стадиях 13 генов. Показано, что не сущест-
вует корреляции между расположением генов на
половых хромосомах и степенью постмейотиче-
ГЛАВА 19 455
ской реактивации. Скорее всего, степень реакти-
вации отдельных генов отражает картину по-
требности в их продуктах на разных стадиях
спермиогенеза [Wang et al., 2005].
Можно отметить, что Х-хромосома у млеко-
питающих обогащена генами, необходимыми
для развития и созревания сперматозоидов на
премейотических и постмейотических стадиях,
однако не содержит генов, специфически рабо-
тающих на стадии мейоза [Wang et al., 2001; Khil
et al., 2004]. Таким образом, инактивация транс-
крипции генов половых хромосом в результате
MSCI не нарушает процесс мейоза. Ряд генов X-
хромосомы. прерывание экспрессии которых во
время MSCI может нарушить важные клеточные
процессы, продублированы посредством ретро-
позиции на аутосомах. Экспрессия аутосомных
ретрогенов может компенсировать транскрипци-
онный сайленсинг белок-кодирующих генов-
предшественников на Х-хромосоме во время
мейоза. Известно 20 аутосомных генов, которые
образовались в результате ретропозиции из бе-
лок-кодирующих генов-предшественников, ло-
кализующихся на Х-хромосоме. Показано, что
14 ретрогенов экспрессируются исключительно
в семенниках, тогда как их Х-сцепленные пред-
шественники являются генами «домашнего хо-
зяйства» [Wang, 2004]. Одним из примеров яв-
ляются гены фосфоглицерат киназы PGK1
PGK2. У человека ретроген PGK2 локализуется
на хромосоме 6, не содержит интроны и экс-
прессируется в семенниках. А ген PGK1 являет-
ся Х-сцепленным геном, содержит 10 интронов,
экспрессируется во всех тканях и подвергается
MSCI [McCarrey, Thomas, 1987]. Ретрогены мо-
гут также функционировать после завершения
мейоза, компенсируя частичную репрессию уни-
кальных генов Х-хромосомы в постмейотиче-
ский период [Wang et al., 2005].
19.1.4. Механизм мейотической
инактивации половых хромосом
Наличие в составе полового тельца РНК гена
Xist позволило предположить, что инактива-
ция транскрипции и формирование неактивной
структуры хроматина при MSCI происходят по-
добно механизму инактивации Х-хромосомы в
соматических тканях самок млекопитающих
[Ayoub et al., 1997]. Известно, что у самок РНК
гена Xist вызывает транскрипционный сайлен-
синг и привлекает белковые комплексы, вызы-
вающие гетерохроматинизацию инактивируемой
Х-хромосомы [Heard, Disteche, 2006]. Тем не ме-
нее, исследования MSCI показали, что для ини-
циации сайленсинга и поддержания неактивного
состояния половых хромосом транскрипт гена
Xist не является необходимым [McCarrey et al.,
2002; Turner et al., 2002]. He исключено, что РНК
гена Xist в процессе MSCI имеет какую-то дру-
гую функцию.
На сегодня предложена следующая модель
формирования полового тельца у млекопитаю-
щих: на стадии пахитены BRCAI (Breast cancer
susceptibility gene 1) привлекает киназу ATR, ко-
торая в свою очередь фосфорилирует Н2АХ, и
далее запускается каскад событий, приводящих к
конденсации хроматина и репрессии транскрип-
ции [Turner etal., 2004]. Следует отметить, что
сходные процессы, а именно связывание BRCAI
и последующее фосфорилирование Н2АХ, про-
исходят в поздней S-фазе клеточного цикла на
неактивной Х-хромосоме у самок млекопитаю-
щих [Heard, Disteche, 2006; Shevchenko et al.,
2006]. Предполагают, что BRCAI уН2АХ обес-
печивают быстрое привлечение различных фак-
торов репарации и ремоделинга хроматина и ин-
теграцию в состав хромосомы специфических
вариантов гистонов, что необходимо для под-
держания неактивного состояния Х-хромосомы
у самок [Femandez-Capetillo et al., 2003; van At-
tikum, Gasser, 2005]. Вероятно, в процессе MSCI
BRCAI и уН2АХ также могут отвечать за бы-
строе формирование неактивной структуры по-
лового хроматина. Например, уН2АХ способен
привлекать при репарации двуцепочечных раз-
рывов ДНК хроматин ремоделирующие белки
Mrell и Rad50, участвующие в замене нуклео-
сом [van der Heijden etal., 2007]. Тем не менее,
остается неясным, как BRCA1 и уН2АХ могут
вызывать транскрипционное молчание генов по-
ловых хромосом, особенно учитывая тот факт,
что инактивация, по крайней мере некоторых, ге-
нов в мейозе предшествует связыванию BRCA1 и
фосфорилированию Н2АХ.
В составе полового тельца у мыши было обна-
ружено присутствие белка MAEL, который может
взаимодействовать с двумя белками MILLI и
MIWI, участвующими в механизме РНК-интерфе-
ренции, специфической для герминальной линии
[Costa et al.. 2006]. На основании этих данных
предполагают, что в установлении транскрипци-
онного молчания генов в составе полового тельца
может быть задействован механизм РНК-интер-
ференции. Однако других сведений, подтверж-
дающих это предположение, пока нет.
В составе XY-тельца на стадии пахитены вы-
явлено еще несколько ферментов, необходимых
456 ЭПИГЕНЕТИКА
для изменения структуры хроматина, которые
могут быть вовлечены в процесс формирования
полового хроматина у млекопитающих. Так, по-
казано, что половое тельце на стадии пахитены
обогащено ремоделирующим хроматин белком
SNF5/INI1, а также белком SIN3B, являющимся
компонентом гистон ацетилазного комплекса
[Costa et al., 2006]. Показано, что аккумуляции
уН2АХ на половых хромосомах предшествует
появление белка SUMO-1 (small ubiquitin-like
modifier), который, вероятно, также участвует в
инициации мейотической инактивации [Vigod-
ner, 2009].
19.1.5. MSCI как возможный предковый
механизм импринтированной
инактивации Х-хромосомы
у самок млекопитающих
На ранних этапах эмбрионального развития в
клетках самок млекопитающих имеет место про-
цесс импринтированной инактивации Х-хромо-
сомы, унаследованной от отца (Хр). У плацен-
тарных импринтированная инактивация сохра-
няется только в клетках экстраэмбриональных
органов, тогда как у сумчатых Хр остается неак-
тивной во всех типах клеток [Heard, Disteche,
2006; Shevchenko et al., 2006]. Существуют две
основные гипотезы о природе импринтинга, ле-
жащего в основе инактивации Хр (рис. 19.1).
Первая гипотеза предполагает существование
эпигенетического маркирования (импринтинга),
защищающего от инактивации Х-хромосому,
унаследованную от матери (Xm) [Burgoync et al.,
2009]. Вторая гипотеза предполагает, что Хр
предрасположена к инактивации, так как пере-
ходит в зиготу’ уже в преинактивированном со-
стоянии, в результате процесса MSCI в сперма-
тогенезе у самцов [Lyon, Rastan, 1984]. Второе
предположение подвергают сомнению на том
основании, что в сперматозоидах большинство
гистонов заменяются на протамины. Тем не ме-
нее. в настоящее время имеются данные о том.
что эпигенетическая информация в виде различ-
ных вариантов и модификаций гистонов способ-
на сохраняться в хроматине сперматозоидов и
передаваться в зиготу [McLaren, Monk, 1981; van
der Heijden etal., 2006]. Например, для человека
было показано, что ряд модификаций как актив-
ного хроматина (H3K4me2/me3), так и неактив-
ного (НЗК27теЗ), ассоциированных с хромати-
ном, выявляются в сперматозоидах и переходят
в зиготу [Hammond et al., 2009].
В настоящее время получены неопровержи-
мые доказательства того, что Xm эпигенетиче-
ски защищена от инактивации. Эксперименты по
переносу ядер в энуклеированный ооцит показа-
ли, что у эмбрионов мыши, имеющих генотип
XmXmY или XmXmXp, ни одна из Xm не спо-
собна к инактивации, в результате чего у таких
эмбрионов не развиваются экстраэмбриональные
органы, и они гибнут на ранних стадиях разви-
тия [Goto, Kinoshita, 1999; Ooi, Henikoff, 2007].
Результаты другого эксперимента по переносу’
ядер указывают на то, что Хр действительно
может быть предрасположена к инактивации.
Мыши с генотипом ХрО жизнеспособны, однако
у них наблюдается задержка в раннем развитии,
которая связана с более низкой экспрессией ге-
нов с Хр, имеющей преинактивированное со-
стояние [Heard, Disteche, 2006]. Таким образом,
импринтинг Xm более строгий, и его нарушение
вызывает гибель эмбрионов, тогда как наруше-
ние импринтинга Хр если и имеет негативные
последствия для эмбрионального развития, то,
по крайней мере, не является летальным.
Эпибласт
Экспрессия гена Xist, с Х-хромосомы,
унаследованной от отца
Сперматогенез
Мейотическая Преинактивированное
инактивация состояние отцовской
половых хромосом Х-хромосомы?
XY-тельце
Зигота
2-кл.
4-кл.
Бластоциста
Первичный Зрелый
ооцит ооцит
Оогенез
Сперматоцит Сперматозоид
Материнский
импринтинг
Случайная инактивация
Х-хромосомы
Ха Xi
I ИЛИ
Xm Хр
Xi Ха
Xm Хр
Импринтированная
инактивация Х-хромосомы
Ха Xi
fll
XmXp
Экстраэмбриональная
энтодерма
Трофоэктодерма
Рис. 19.1. Гипотезы происхождения импринтированной инактивации Х-хромосомы у самок млекопитающих.
ГЛАВА 19 457
Основным контраргументом против предпо-
ложения о преинактивированном состоянии Хр
являются данные о том, что аутосомы, содержа-
щие встройку гена Xist, наследующиеся от отца,
но предварительно не вовлекавшиеся в MSC1,
демонстрируют сходную с процессом имприн-
тированной инактивации динамику модифика-
ций хроматина [Goto, Takagi, 1998]. В связи с
этим следует заметить, что неактивная структура
хроматина Хр, устанавливающаяся у плацентар-
ных млекопитающих в результате экспрессии
гена Xist, формируется не мгновенно, а занимает
как минимум промежуток от двухклсточной ста-
дии до стадии бластоцисты [Shevchenko et al.,
2006]. Более того, показано, что, по крайней ме-
ре у мыши, процесс импринтированной инакти-
вации происходит в два этапа. Так, начиная с
двухклеточной стадии вплоть до стадии морулы
или даже бластоцисты, неактивными являются
районы повторов Хр. Данный этап процесса им-
принтированной инактивации является Xist-нс-
зависимым. Следующий этап импринтированной
инактивации Х-хромосомы инициируется соот-
ветственно на стадии морулы/бластоцисты и
включает в себя А7л7-зависимый сайленсинг ге-
нов Х-хромосомы [Namekawa etal., 2010]. По-
этому’ не исключено, что во время, пока зависи-
мые от экспрессии Xist модификации хроматина
устанавливаются на Хр, ее неактивное состоя-
ние может поддерживаться за счет модификаций
хроматина, приобретенных в MSCI. Следует так-
же подчеркнуть, что неактивное состояние Хр у
сумчатых устанавливается в отсутствие гена
Xisi, а следовательно, существует А7л7-нсзависи-
мый механизм инактивации, в качестве которого
может выступать мейотическая инактивация X-
хромосомы в мейозе у самцов и который можно
рассматривать как предковую форму’ процесса
импринтированной инактивации Х-хромосомы у
самок млекопитающих. Очевидно, что одно-
значного ответа о природе импринтированной
инактивации до сих пор не существует, и этот
вопрос требует дополнительных исследований.
19.2. Мейотическая инактивация половых
хромосом у Caenorhabditis elegans
19.2.1. Динамика модификаций хроматина
половых хромосом на разных
стадиях сперматогенеза
Нематода С. elegans является гермафродит-
ным видом и имеет два пола: самцы (Х0), обра-
зующиеся, как правило, в результате нерасхож-
дения Х-хромосом в мейозе, и гермафродиты
(XX). Самцы в своем развитии образуют только
один тип гамет — сперматозоиды. У гермафро-
дитных особей в период ювенильной стадии раз-
вития в клетках полового пути образуются спер-
матозоиды, а в период линьки, предшествующей
формированию взрослой особи, клетки полового
пути морфологически и функционально преоб-
разуются и начинают продуцировать ооциты
[Seydoux, Schedl, 2001]. Таким образом, на раз-
ных этапах эмбриогенеза С. elegans процесс
сперматогенеза имеет место как у самцов, так и
у гермафродитов.
Полногеномный ДНК-микрочип-анализ пока-
зал, что у’ обоих полов С. elegans на всех стадиях
сперматогенеза экспрессия Х-сце пленных генов
снижена в 2—3 раза относительно аутосом
[Kelly’ et al., 2002]. Об этом свидетельствует так-
же структу’ра хроматина половых хромосом.
Хроматин Х-хромосомы характеризуется исклю-
чением ряда модификаций гистонов, ассоцииро-
ванных с транскрипционно активным хромати-
ном: H3K4me2/3, НЗК9ас, НЗК14ас, Н4К5ас,
Н4К8ас, Н4К12ас, Н4К16ас, фосфорилирован-
ного по серину’ в положении 10 гистона НЗ,
элонгирующей формы РНК-полимеразы II, фос-
форилированной по серину в S2 [Fong etal.,
2002; Kelly et al., 2002; Reuben, Lin, 2002]. Изо-
форма гистона НЗ.З, характерная для транскрип-
ционно активного хроматина, также не выявля-
ется в структу’ре Х-хромосом у гермафродитов
С. elegans до стадии поздней пахитены, а у сам-
цов — и на более поздних стадиях мейоза [Ooi
et al., 2006].
На стадии пахитены мейоза у самцов С. ele-
gans происходит формирование полового Х-тель-
ца. Интересно, что у гермафродитов, несмотря
на то, что обе гомологичные Х-хромосомы пол-
ностью конъюгируют, также наблюдается фор-
мирование более конденсированной структуры
полового хроматина. Однако стоит отметить, что
поведение, транскрипционный статус и структу’-
ра хроматина Х-хромосомы различаются у сам-
цов и гермафродитов С. elegans. Так, у самцов, в
отличие от гермафродитов, со стадии ранней
пахитены наблюдается обогащение неактивной
Х-хромосомы маркером, характерным для неак-
тивного хроматина — H3K9me2 [Kelly et al., 2002:
Reuben, Lin, 2002] (рис. 19.2).
Появление данной модификации на Х-хромо-
соме предшествует формированию неактивной
структу’ры Х-тельца, однако не является специ-
фичным для Х-хромосомы, поскольку^ данная
модификация выявляется также в несинапсиро-
458 ЭПИГЕНЕТИКА
Х-хромосома -
Аутосомы-
H3K9me2
H3K27me3
H3K4me2
H3K9me2
H3K27me3
H3K4me2
Ядра на стадии пахитены
Рис. 19.2. Динамика модификаций гистонов в процессе сперматогенеза и оогенеза у гермафродитов (верхняя
панель) и в сперматогенезе у самцов (нижняя панель) С. elegans (а). Цветные полосы обозначают относитель-
ный уровень распределения модификаций неактивного (НЗК9те2, НЗК27теЗ) и активного (НЗК4те2) хроматина
на аутосомах и Х-хромосоме/ах. Иммунофлуоресцентное окрашивание ядер на стадии пахитены сперматогенеза
у гермафродитов антителами к НЗК4те2 и у самцов антителами к НЗК9те2 (б). ДНК окрашена красным цветом,
маркеры хроматина — зеленым. Стрелкой обозначена Х-хромосома. Исключение НЗК4те2, маркера активно-
го хроматина, с Х-хромосомы у гермафродитов и обогащение НЗК9те2, маркера неактивного хроматина, на
Х-хромосоме у самцов С. elegans свидетельствуют о репрессии транскрипции и формировании неактивного
Х-тельца [Maine et al., 2005].
ванных районах аутосом. Это свидетельствует о
том, что аккумуляция НЗК9те2 на неактивной
Х-хромосоме у самцов является результатом от-
сутствия гомологичной хромосомы для форми-
рования синапса [Bean etal., 2004]. Хроматин
Х-тельца у самцов и у гермафродитов характе-
ризуется также специфическим обогащением
НЗК27теЗ. НЗК27те2 также выявляется в
структуре Х-хромосомы, однако его уровень со-
поставим с таковым на аутосомах [Kelly et al.,
2002; Bender et al., 2004].
На стадии диплотены мейоза у самцов и у
гермафродитов наблюдается снижение уровня
НЗК27ше2 и НЗК27шеЗ на Х-хромосоме/ах, у
самцов также — H3K9me2 [Bean etal., 2004].
Однако, несмотря на то, что модификации неак-
тивного хроматина уходят с Х-тельца, репрессия
транскрипции Х-сцепленных генов, подобно
млекопитающим, сохраняется далее, вплоть до
созревания зрелых сперматозоидов.
19.2.2. Эпигенетический импринтинг
Х-хромосомы
При оплодотворении геном ооцита активно
транскрибируется, тогда как геном сперматозои-
да находится в транскрипционно неактивном
состоянии. В зиготе происходит быстрая смена
эпигенетических модификаций в геноме сперма-
тозоида: на аутосомах аккумулируются модифи-
ГЛАВА 19 459
кации активного хроматина и происходит их де-
конденсация. В отличие от аутосом хроматин
Х-хромосомы не подвергается модификациям
еще в течение ряда клеточных делений [Bean
et al., 2004J. Таким образом, при оплодотворении
у С. elegans для Х-хромосомы, унаследованной в
составе сперматозоида, наблюдается явление
эпигенетического импринтинга. Интересно, что
стабильность импринтинга различается у Х-хро-
мосом, унаследованных от самца и от гермафро-
дита. Так, у потомков с Х-хромосомой, унасле-
дованной от гермафродитной особи, изменения в
структуре хроматина (аккумуляция НЗК4те2)
детектируется уже на 10-клеточной стадии раз-
вития. Для Х-хромосомы, унаследованной от
самца, хроматин не подвергается модификациям
вплоть до 20—24-клеточной стадии. Таким об-
разом, эпигенетический импринтинг Х-хромосо-
мы, унаследованной от самца, сохраняется доль-
ше и является более стабильным. Вероятно, это
связано с различным спектром эпигенетических
модификаций, которым подвергается Х-хромо-
сома в гаметогенезе у самцов и у гермафродитов
[Schaner, Kelly, 2006]. В установлении и насле-
довании эпигенетических маркеров у С. elegans
задействован гистон НЗ. Показано, что во время
спермиогенеза, когда происходит компактизация
хроматина, именно варианты и модификации
гистона НЗ остаются ассоциированными с ДНК
и способны наследовать в зиготу' [Arico et al..
2011].
19.2.3. Механизм мейотической
инактивации половых хромосом
Формирование неактивной структуры хрома-
тина Х-хромосомы обусловлено у С. elegans как
минимум двумя различными механизмами. Один
из них включает участие малых некодирующих
РНК, а второй — систему’ MES-белков.
Так, было показано, что за специфическую
аккумуляцию НЗК9те2 в неспаренных районах
хроматина в герминальной линии, в том числе и
на неактивной Х-хромосоме у самца С. elegans,
отвечает гистонметилтрансфераза МЕТ-2 (орто-
лог белка SETDB1 человека) [Bessler etal., 2007].
В привлечении МЕТ-2 в неспаренные районы
ДНК принимают участие белки EGO-1, CSR-1,
EKL-1 и DRH-3, относящиеся к системе синтеза,
процессинга и транспорта микроРНК. Белок
EGO-1 является РНК-полимеразой (RdRP —
RNA-directed RNA polymerase) и, вероятно, во-
влечен в синтез малых интерферирующих РНК,
мишенью которых является мРНК гена met-2.
Белок CSR-1 относится к семейству Argonaut;
белок EKL-1 содержит Tudor-домен, участвую-
щий в распознавании диметилированого аргини-
на генов-мишеней, а белок DRH-3 является
DEAH/D-геликазой. У мутантов по всем трем
белкам наблюдается не только снижение уровня
НЗК9ше2 на Х-хромосоме, но и увеличение —
на аутосомах [Maine et al., 2005; She et al., 2009].
Аккумуляция H3K9me2 в мейозе зависит так-
же от ряда других белков, не задействованных
в системе РНК-интерференции, как например,
РНК-геликаза A, HIM-17, СНК-2 и SIN-3 [Maine
et al.. 2005]. У мутантов по РНК-геликазе А про-
исходит не только снижение уровня НЗК9ше2,
но и установление модификаций активного хро-
матина (Н4К16ас/Н4К8ас) на аутосомах и кон-
денсированной Х-хромосоме [Walstrom et al.,
2005]. Особое внимание привлекают белки HIM-
17 и SIN-З. Так, хроматин-связывающий белок
HIM-17 участвует в формировании двуцепочеч-
ных разрывов в ДНК и также вовлечен в процесс
установления H3K9me2 [Maine etal., 2005]. Это
свидетельствует о связи между регуляцией ра-
боты хроматина, формированием неактивной
структуры Х-тельца и формированием двуцепо-
чечных разрывов ДНК. Белок SIN-З, являющий-
ся ортологом белков SIN3A и SIN3B млекопи-
тающих, возможно, как компонент HDAC деаце-
тилазного комплекса также опосредованно уча-
ствует в аккумуляции H3K9me2 [Maine et al..
2005].
В установлении другой модификации неак-
тивного хроматина на Х-хромосоме — НЗК27шеЗ
принимают участие белки MES-2, -3 и -6. Белки
MES-2 и MES-6 являются ортологами белков
группы Polycomb. Показано, что белок MES-2
обладает метилтрансферазной активностью, тог-
да как белки MES-3 и MES-6 необходимы для
активации MES-2 in vitro [Ketel et al.. 2005].
19.3. Мейотическая инактивация
ПОЛОВЫХ ХРОМОСОМ У НАСЕКОМЫХ
На сегодня нет однозначного ответа на воп-
рос о том, существует ли MSCI у насекомых.
Так, например, у кузнечика Eyprepocnemis
plorans у самцов (Х0) в сперматогенезе были
обнаружены процессы, сходные с таковыми при
MSCI у млекопитающих. На стадии ранней леп-
тотены мейоза у Е. plorans модификации гисто-
нов, ассоциированные с транскрипционно ак-
тивным хроматином (НЗК9ас), утрачиваются
с Х-хромосомы. К стадии поздней пахитены на
Х-хромосоме выявляются модификации гисто-
460 ЭПИГЕНЕТИКА
нов, характерные для транскрипционно неактив-
ного хроматина, и происходит фосфорилирова-
ние гистона Н2АХ. При этом сайленсинг Х-хро-
мосомы у Е. plorans сохраняется и на постмейо-
тических стадиях развития, даже в округлых
сперматидах [Cabrero et al., 2007].
Однако данный процесс не обнаружен у Dro-
sophila melanogaster. Анализ экспрессии генов с
помощью методов ДНК-микрочип, ОТ-ПЦР и
флюоресцентной гибридизацией in situ показал,
что большинство Х-сцепленных генов не под-
вергаются сайленсингу в процессе мейоза; для
некоторых из них показано даже увеличение экс-
прессии [Meiklejohn et al.. 2011: Mikhaylova, Nur-
minsky, 2011].
Таким образом, вполне вероятно, что процесс
MSCI в различной степени присутствует у ряда
представителей класса насекомых. Наличие или
отсутствие мейотического сайленсинга половых
хромосом может быть обусловлено различными
системами определения пола и/или разницей в
эволюционном развитии.
15.3.1. Мейотическая инактивация
половых хромосом у птиц
У птиц гетерогаметным полом являются сам-
ки (ZW), а гомогаметным — самцы (ZZ). Преоб-
ладающая по размеру Z-хромосома обогащена
генами по сравнению с W-хромосомой, большая
часть которой представлена функционально не-
активным гетерохроматином. Несмотря на то,
что гетероморфные Z- и W-хромосомы имеют
для спаривания лишь небольшой псевдоауто-
сомный район, было замечено, что в процессе
оогенеза на стадии пахитены половые хромосо-
мы полностью конъюгируют. С помощью элект-
ронной микроскопии было показано, что конъю-
гация половых хромосом достигается с помо-
щью механизма, описанного как «синаптическая
регулировка» [McKee, Handel, 1993]: свободные,
негомологичные районы Z-хромосомы уплотня-
ются, укорачиваются и «обворачиваются» во-
круг W-хромосомы. Такая конфигурация являет-
ся кратковременной и называется «стадия стаби-
лизации». Далее, к стадии диплотены Z- и W-
хромосомы расходятся, за исключением гомоло-
гичного псевдоаутосомного района [Solari, 1992].
Однако связана ли конъюгация половых хромо-
сом у птиц с инактивацией транскрипции в мей-
озе, не ясно. В одной работе было описано фор-
мирование более конденсированной структуры
хроматина в районе Z- и W-хромосомных терри-
торий на стадии поздней пахитены—ранней ди-
плотены, что свидетельствует о том, что на дан-
ных этапах развития может иметь место сайлен-
синг половых хромосом [Solari, 1992]. Другая
группа исследователей полагает, что конъюга-
ция гетероморфных Z- и W-хромосом позволяет
поддерживать транскрипционно активное со-
стояние Z- и/или W-сцепленных генов, продукты
которых необходимы для поддержания и роста
ооцитов [Jablonka, Lamb, 1988]. Таким образом,
на сегодня нет единого мнения относительно
вопроса существования MSCI у птиц в оогенезе.
В пользу существования процесса MSCI у
птиц свидетельствуют данные, полученные в
работе [Schoenmakers etal.. 2009]. Показано, что
со стадии ранней пахитены и до стадии поздней
диплотены у Gallus gallus domesticus наблюда-
ются значительное снижение РНК-полимеразы II
в районе ZW-хромосом и исключение марке-
ра активного хроматина — Н4К16ас. На стадии
«стабилизации» происходит обогащение поло-
вых хромосом модификациями, ассоциирован-
ными с неактивным хроматином НЗК9теЗ и
иН2А. Стоит отметить, что W-хромосома, веро-
ятно, переходит в профазу мейоза уже в инакти-
вированном состоянии, поскольку НЗК9теЗ вы-
является на W-хромосоме на всех стадиях ооге-
неза, тогда как существование данной модифи-
кации гистона на Z-хромосоме носит временный
характер и ограничено стадией «стабилизации».
Интересно, что аналогичный паттерн модифика-
ций гистонов, выявляемых для половых хромо-
сом на стадии «стабилизации», сходен с тако-
вым, описанным для полового тельца у млекопи-
тающих.
В пользу существования MSCI у птиц также
свидетельствуют данные количественного ана-
лиза уровня экспрессии десяти Z- и четырех W-
сцепленных генов у курицы. Было показано, что
четыре Z-сцепленных гена и один W-сцеплен-
ный ген снижают экспрессию на стадии пахите-
ны, с последующей реактивацией на более позд-
них стадиях мейоза. Для остальных проанализи-
рованных генов было показано отсутствие экс-
прессии на всех стадиях мейоза [Schoenmakers
et al., 2009]. Цитированные авторы предлагают
следующую модель MSCI у птиц (рис. 19.3): W-
хромосома переходит на стадию мейоза уже в
неактивном состоянии, что характеризуется на-
личием ряда модификаций неактивного хрома-
тина: H3K9me3, иН2А и НЗК27теЗ. Конъюга-
ция W- и Z-хромосом приводит к тому’, что такие
маркеры неактивного хроматина, как НЗК9теЗ и
иН2А, в /////«///«-конфигурации переходят на Z-
хромосому. Последующее их распространение в
ГЛАВА 19 461
НЗКЭтеЗ
< > НЗК27теЗ
иН2А
-/Н2АХ
W-хромосома | Z-хромосома
Рис. 19.3. Динамика модификаций хроматина половых хромосом в процессе сперматогенеза у птиц.
На стадии зиготены мейоза наблюдается первая волна фосфорилирования Н2АХ, W-хромосома ассоциирована с маркерами
неактивного хроматина: НЗК27теЗ, НЗКЭтеЗ и UH2A. На стадии ранней пахитены конъюгация Z- и W-хромосом приводит к
тому, что НЗКЭтеЗ и иН2А в транс-конфигурации переходят на Z-хромосому. Дальнейшее распространение данных модифи-
каций гистонов вдоль Z-хромосомы сопровождается исключением РНК-полимеразы II. Эти изменения в структуре хроматина
половых хромосом приводят к репрессии транскрипции на стадии пахитены мейоза [Schoenmakers et al., 2009].
г/г/с-положении по Z-хромосоме, а также исклю-
чение модификаций активного хроматина и
РНК-полимеразы II обеспечивают сайленсинг
половых хромосом v птиц [Schoenmakers et al.,
2009].
Однако другая группа исследователей пола-
гает, что у курицы процесс MSCI отсутствует.
Одним из основных доводов против существо-
вания данного процесса является различие в ди-
намике уН2АХ. Аналогично процессу MSCI у
млекопитающих у курицы в оогенезе наблюда-
ется две волны уН2АХ. Время выявления первой
волны совпадает и соответствует стадии лепто-
тены—зиготены, что связано с репарацией дву-
цепочечных разрывов, тогда как на стадии «ста-
билизации», т. е. в процессе предполагаемой
инактивации половых хромосом у птиц уН2АХ
отсутствует [Schoenmakers et al., 2009; Guioli
etal., 2012], что не совпадает с динамикой у
млекопитающих. Вторая волна фосфорилирова-
ния Н2АХ имеет место уже после разделения Z-
и W-хромосом [Schoenmakers et al., 2009].
Кроме того, методом РНК-FISH был проана-
лизирован уровень экспрессии девяти Z-сцеп-
ленных генов и трех генов, локализованных на
аутосомах. Полученные данные показали, что у
курицы на стадии ранней профазы происходит
снижение транскрипции не только генов, сцеп-
ленных с полом, а также и генов аутосом вплоть
до стадии ранней диплотены. Таким образом,
снижение уровня экспрессии генов, сцепленных
с полом, не является специфичным для стадии
пахитены оогенеза, что также свидетельствует
против существования процесса MSCI у курицы
[Guioli et al., 2012].
Таким образом, понятно, что однозначного
ответа, имеет ли место MSCI в оогенезе у птиц,
пока нет. Однако если MSCI имеет место быть,
то, во-первых, это кратковременное событие,
которое может затрагивать лишь определенные
локусы половых хромосом. Во-вторых, в основе
MSCI лежит механизм, отличный от такового у
млекопитающих.
* * *
MSCI — один из ключевых процессов в целом
ряде таксонов, который приводит к сайленсингу’
хроматина и генов половых хромосом в мейозе.
Несмотря на то, что процесс MSCI является дос-
таточно консервативным, время начала, продол-
жительность данного процесса, молекулярные
механизмы у представителей различных таксонов
различаются. Это свидетельствует о том, что, ве-
роятно, процесс MSCI неоднократно возникал в
процессе эволюции и, возможно, имел различную
функциональную принадлежность.
MSCI является эпигенетическим процес-
сом. Сайленсинг половых хромосом обусловлен
включением в структуру хроматина ряда пост-
462 ЭПИГЕНЕТИКА
трансляционных модификаций гистонов, соз-
дающих его уникальную структуру. Однако у
разных таксонов задействованы различные ме-
ханизмы, обусловливающие аккумуляцию неак-
тивных модификаций хроматина. Так. например,
у мыши сайленсинг половых хромосом зави-
сит от белка BRC1, фосфорилирования гистона
Н2АХ, тогда как у нематоды С. elegans главная
роль принадлежит действию малых интерфери-
рующих РНК. Однако, несмотря на различные
механизмы, обусловливающие сайленсинг поло-
вых хромосом, для всех таксонов наблюдается
сходная динамика модификаций гистонов.
Традиционно считалось, что процесс сайлен-
синга половых хромосом — это явление, отно-
сящееся к стадии пахитены мейоза. На сегодня
стало понятно, что MSCI является более про-
должительным процессом, и, например, у С. ele-
gans, мыши, человека репрессия транскрипции
генов половых хромосом в некоторой степени
сохраняется и на постмейотических стадиях и
даже способна наследоваться при оплодотворе-
нии в зиготу’. Эти данные позволили по-новому’
взглянуть на природу' импринтированной инак-
тивации Х-хромосомы у самок млекопитающих.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
AricoJ. К., KatzD. J., van der JlagJ., Kelly JJ’. G. Epigenetic
patterns maintained in early Caenorhabditis elegans
embryos can be established by gene acti vi ty in the parental
germ cells // PLoS Genet. 2011. Vol. 7. P. 61001391.
Ayoub N., RichlerC, TTahrmanJ. Xist RNA is associated with
the transcriptionally inactive XY body in mammalian male
meiosis 11 Chromosoma. 1997. Vol. 106. P. 1—10.
Baarends JJ'. AL., Hoogerbrugge J. JJ’., RoestH.P., OomsAL,
J’reeburgJ., Hoeijmakers J. H, Grootegoed J. A. Histone
ubiquitination and chromatin remodeling in mouse
spermatogenesis 11 Dev. Biol. 1999. Vol. 207. P. 322—333.
Baarends JJ. AL, JJ'assenaar E., van der Laan R, Hoogerbrug-
ge J., Sleddens-Linkels E., Hoeijmakers J. H., de Boer P.,
Grootegoed J. .1. Silencing of unpaired chromatin and his-
tone H2A ubiquitination in mammalian meiosis // Mol.
Cell. Biol. 2005. Vol. 25. P. 1041—1053.
Bean C. J., Schaner С. E., Kelly JJ’. G. Meiotic pairing and im-
printed X chromatin assembly in Caenorhabditis ele-
gans // Nat. Genet. 2004. Vol. 36. P. 100— 105.
Bender L.B., CaoR., Zhang Y., Strome S. The MES-2/MES-
3/MES-6 complex and regulation of histone H3 methyla-
tion in C. elegans II Curr. Biol. 2004. Vol. 14. P. 1639—
1643.
BesslerJ.B., Reddy К. C, Hayashi AL., Hodgkin J., J'illene-
uve A. AL. A role for Caenorhabditis elegans chromatin-
associated protein HIM-17 in the proliferation vs. meiotic
entry' decision // Genetics. 2007. Vol. 175. P. 2029—2037.
Burgoyne P. S., ALahadevaiah S. K, Turner J. AL. The conse-
quences of asynapsis for mammalian meiosis И Nat. Rev.
Genet. 2009. Vol. 10. P. 207 216.
CabreroJ, TeruelAL., CarmonaF.D., JimenezR. Camac-
ho J. P. Histone H3 lysine 9 acetylation pattern suggests
that X and В chromosomes are silenced during entire male
meiosis in a grasshopper H Cytogenet. Genome Res. 2007.
Vol. 119. P. 135—142.
ChenH.Y., Sim J. AL, Zhang Y., Davie J. R, ALeistrich AL. L.
Ubiquitination of histone H3 in elongating spermatids of rat
testes H J. Biol. Chem. 1998. Vol. 273. P. 13165—13169.
Costa Y., SpeedR AL, Gautier P., Semple C. A., ALaratou K,
Turner J. AL, Cooke H. J. Mouse MAELSTROM: the link
between meiotic silencing of unsynapsed chromatin and
microRNA pathway? H Hum. Mol. Genet. 2006. Vol. 15.
P. 2324—2334.
Femandez-Capetillo O., ALahadevaiah S. K, Celeste A., Roma-
nienkoP.J., Camerini-OteroR D., Bonner JJ. AL, ALa-
novaK, Burgoyne P., NussenzweigA. H2AX is required
for chromatin remodeling and inactivation of sex chromo-
somes in male mouse meiosis H Dev. Cell. 2003. Vol. 4.
P. 497- 508.
FongY.. Bender L.. JJ’ang JJ’.. Strome S. Regulation of the dif-
ferent chromatin states of autosomes and X chromosomes
in the germ line of C. elegans П Science. 2002. Vol. 296.
P. 2235—2238.
Goto T, Kinoshita T. Maternal transcripts of mitotic checkpoint
gene, Xbub3, are accumulated in the animal blastomeres
of Xenopus early embryo // DNA Cell Biol. 1999. Vol. 18.
P. 227—234.
Goto Г., Takagi N. Tetrapioid embryos rescue embryonic lethal-
ity' caused by' an additional maternally' inherited X chro-
mosome in the mouse H Development. 1998. Vol. 125.
P. 3353—3363.
Greaves L. K, Rangasamy D., Devoe AL, ALarshall Graves J. A.,
TremethickD. J. The X and Y chromosomes assemb-
le into H2A.Z, containing facultative heterochromatin,
following meiosis H Mol. Cell. Biol. 2006. Vol. 26.
P. 5394—5405.
Guioli S., Lovell-Badge R, Turner J. AL. Error-prone ZW pair-
ing and no evidence for meiotic sex chromosome inactiva-
tion in the chicken germ line // PLoS Genet. 2012. Vol. 8.
P. C1002560.
Hammoud S. S., NixD.A., Zhang H, Purwar J., Carrell D. T,
Cairns B. R. Distinctive chromatin in human sperm pack-
ages genes for embrvo development H Nature. 2009.
Vol. 460. P. 473—478?
Handel AL. A. The XY body: a specialized meiotic chromatin
domain H Exp. Cell Res. 2004. Vol. 296. P. 57—63.
HeardE.. Disteche C. AL. Dosage compensation in mammals:
fine-tuning the expression of the X chromosome // Genes
Dev. 2006. Vol. 20. P. 1848—1867.
Holstein .1. F, Schulze JJ’., DavidoffAL. Understanding sper-
matogenesis is a prerequisite for treatment H Reprod. Biol.
Endocrinol. 2003. Vol. 1. P. 107.
Homecker J. L., Samollaw P. B., Robinson E. S., J’ande-
bergJ. L.. ALcCarrey J. R. Meiotic sex chromosome inac-
tivation in the marsupial ALonodelphis domestica 11 Gene-
sis. 2007. Vol. 45. P. 696—708.
Hoyer-Fender S. Molecular aspects of XY body' formation /7
Cytogenet. Genome Res. 2003. Vol. 103. P. 245—255.
Hoyer-Fender S., Czirr E., RaddeR, Turner J. AL, ALa-
hadevaiah S. K, PehrsonJ. R., Burgoyne P. S. Localisa-
tion of histone macroH2A1.2 to the XY-body' is not a re-
sponse to the presence of asynapsed chromosome axes H J.
Cell Sci. 2004. Vol. 117. P. 189—198.
JablonkaE., Lamb AL. J. Meiotic pairing constraints and the
activity of sex chromosomes " J. Theor. Biol. 1988.
Vol. 133. P. 23—36.
Kelly JJ'. G, Aramayo R. Meiotic silencing and the epigenetics
of sex H Chromosome Res. 2007. Vol. 15. P. 633—651.
Kelly JJ’. G, Schauer С. E., Deniburg A. F., Lee AL. H,
Kim S. K, J'illeneuve A. AL., Reinke J’. X-chromosome si-
lencing in the germline of C. elegans П Development.
2002. Vol. 129. P. 479—492.
ГЛАВА 19 463
Ketel С. S.. Andersen Е. F. Pargas ALL., Suh J.. StromeS.,
Simon J. A. Subunit contributions to histone methyltrans-
ferase activities of fly and worm polycomb group com-
plexes // Mol. Cell. Biol. 2005. Vol. 25. P. 6857—6868.
Khalil A. AL, Boyar F. Z., Driscoll D. J. Dynamic histone modi-
fications mark sex chromosome inactivation and reactiva-
tion during mammalian spermatogenesis // Proc. Natl.
Acad. Sci. USA. 2004. Vol. 101. P. 16583—16587.
Khil P. P., Smirnova N. A., Romanienko P. J., Camerini-Ote-
roR.D. The mouse X chromosome is enriched for sex-
biased genes not subject to selection by meiotic sex chro-
mosome inactivation // Nat. Genet. 2004. Vol. 36. P. 642—
646.
Lifschytz E., Lindsley D. L. The role of X-chromosome inactiva-
tion during spermatogenesis (Drosophila-alloeyely-
chromosome evolution-male sterility-dosage compensa-
tion)// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1972. Vol. 69.
P. 182—186.
Lyon Al. F, RastanS. Parental source of chromosome imprint-
ing and its relevance for X chromosome inactivation //
Differentiation. 1984. Vol. 26. P. 63—67.
AlaineE.AL, HauthJ., Ratliff T, Fought RE., SheX., Kel-
ly IE G. EGO-1, a putative RNA-dependent RNA poly-
merase, is required for heterochromatin assembly on un-
paired DNA during C. elegans meiosis // Curr. Biol. 2005.
Vol. 15. P. 1972—1978.
AIcCarrey J. R., Thomas K. Human testis-specific PGK gene
lacks introns and possesses characteristics of a processed
gene //Nature. 1987. Vol. 326. P. 501—505.
AIcCarrey J. R, Watson C, Atencio J., Ostermeier G. C,
Alarahrens E, Jaenisch R, Krawetz S. .1. X-chromosome
inactivation during spermatogenesis is regulated by an
Xist/Tsix-independent mechanism in the mouse // Genesis.
2002. Vol. 34. P. 257—266.
AIcKeeB.D., Handel AL A. Sex chromosomes, recombination,
and chromatin conformation /7 Chromosoma. 1993.
Vol. 102. P. 71—80.
AIcLaren A., AIonkAI. X-chromosome activity in the germ cells
of sex-reversed mouse embryos // J. Reprod. Fertil. 1981.
Vol. 63. P. 533—537.
Aleiklejohn C. D., LandeenE.L., Cook J. AL, Kingan S. B.,
Presgraves D. C. Sex chromosome-specific regulation in
the Drosophila male germline but little evidence for chro-
mosomal dosage compensation or meiotic inactivation '/
PLoS Biol. 2011. Vol. 9. P. C1001126.
Aletzler-Guillemain C, LucianiJ, Depetris D., GuichaouaALR,
AlatteiAI. G. HPlbeta and HPlgamma, but not HPlalpha,
decorate the entire XY body during human male meiosis //
Chromosome Res. 2003. Vol. 11. P. 73—81.
Alikhaylova L. AL., Nurminsky D. I. Lack of global meiotic sex
chromosome inactivation, and paucity of tissue-specific
gene expression on the Drosophila X chromosome // BMC
Biol. 2011. Vol. 9. P. 29.
Alueller J. L., Alahadevaiah S. K, ParkP.J., Warburton P. E.,
PageD. C, Turner J. AL. The mouse X chromosome is en-
riched for multicopy testis genes showing postmeiotie ex-
pression // Nat. Genet. 2008. Vol. 40. P. 794—799.
Namekawa S. H, ParkP.J., ZhangL. F., Shima J. E., ALcCar-
reyJ. R., Griswold AL. D., Lee J. T. Postmeiotie sex chro-
matin in the male germline of mice // Curr. Biol. 2006.
Vol. 16. P. 660—667.
Namekawa S. H, Payer B., Huynh K. D., Jaenisch R, Lee J. T.
Two-step imprinted X inactivation: repeat versus genic si-
lencing in the mouse // Mol. Cell. Biol. 2010. Vol. 30.
P. 3187—3205.
Namekawa S. H, FandeBerg J. L., AIcCarrey J. R, Lee J. T.
Sex chromosome silencing in the marsupial male germ
line // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2007. Vol. 104.
P. 9730—9735.
OdorisioT., Rodriguez T. A., Evans E.P., Clarke A. R. Bur-
goyne P. S. The meiotic checkpoint monitoring synapsis
eliminates spermatocytes via p53—independent apop-
tosis //Nat. Genet. 1998. Vol. 18. P. 257—261.
Ooi S. L., HenikoffS. Germline histone dynamics and epigenet-
ies '/ Curr. Opin. Cell Biol. 2007. Vol. 19. P. 257—265.
OoiS. L., PriessJ. R., HenikoffS. Histone НЗ.З variant dynam-
ics in the germline of Caenorhabditis elegans!I PLoS
Genet. 2006. Vol. 2. P. e97.
Reuben AL., Lin R. Germline X chromosomes exhibit contrasting
patterns of histone H3 methylation in Caenorhabditis ele-
gans // Dev. Biol. 2002. Vol’ 245. P. 71—82.
Schaner С. E., Kelly W. G. Germline chromatin // WormBook.
2006. P. 1—14.
Schoenmakers S., Wassenaar E., Hoogerbrugge J. W, La-
ven J. S., Grootegoed J. A., Baarends IT. AL. Female mei-
otic sex chromosome inactivation in chicken '! PLoS
Genet. 2009. Vol. 5. P. C1000466.
Seydoux G., Schedl T. The germline in C. elegans: origins, pro-
liferation, and silencing // Int. Rev. Cytol. 2001. Vol. 203.
P. 139—185.
SheX., XuX., Fedotov A., Kelly IE G., A Laine E. AL. Regulation
of heterochromatin assembly on unpaired chromosomes
during Caenorhabditis elegans meiosis by components of
a small RNA-mediated pathway // PLoS Genet. 2009.
Vol. 5. P. C1000624.
Shevchenko A. I., Pavlova S. F., Dement'eva E. F., Golube-
va D. F, Zakiian S. AL. Chromatin modifications during X-
ehromosome inactivation in female mammals // Genetika.
2006. Vol. 42. P. 1225—1234.
ShiuP.K, Raju N. B., ZicklerD., AletzenbergR. L. Meiotic
silencing by unpaired DNA// Cell. 2001. Vol. 107.
P. 905—916.
Solari A. J. Equalization of Z and W axes in chicken and quail
oocytes // Cytogenet. Cell Genet. 1992. Vol. 59. P. 52—
56.’
Turner J. AL, Aprelikova О., Xu X., JFangR, Kim S., Chandra-
mouli G. F., Barrett J. C., Burgoyne P. S., DengC.X.
BRCA1, histone H2AX phosphorylation, and male mei-
otic sex chromosome inactivation // Curr. Biol. 2004.
Vol. 14.P. 2135—2142.
Turner J. AL., Burgoyne P. S., SinghP.B. M31 and maero-
H2A1.2 colocalise at the pseudoautosomal region during
mouse meiosis// J. Cell Sei. 2001. Vol. 114. P. 3367—
3375.
Turner J. AL, Alahadevaiah S. K, Benavente R, Offen-
bergHH, HeytingC, Burgoyne P. S. Analysis of male
meiotic «sex body» proteins during XY female meiosis
provides new insights into their functions /7 Chromosoma.
2000. Vol. 109. P. 426 432.
Turner J. AL. Alahadevaiah S. K. Elliott D. J., Garchon H. J..
PehrsonJ.R., JaenischR., BurgoyneP. S. Meiotic sex
chromosome inactivation in male mice with targeted dis-
ruptions of Xist/7 J. Cell Sci. 2002. Vol. 115. P. 4097—
4105.
van Attikum H, Gasser S. AL. The histone code at DNA breaks:
a guide to repair? // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2005.
Vol. 6. P. 757—765.
van der Heijden G. W., DerijckA.A., PosfaiE., GieleAI.,
Pelczar P.. Ramos L., Wansink D. G.. van der Hag J.. Pe-
ters A. H, de Boer P. Chromosome-wide nucleosome re-
placement and НЗ.З incorporation during mammalian
meiotic sex chromosome inactivation // Nat. Genet. 2007.
Vol. 39. P. 251—258.
van der Heijden G. W., DerijckA.A., Ramos L., GieleAI., van
der Hag J., de Boer P. Transmission of modified nu-
cleosomes from the mouse male germline to the zygote
and subsequent remodeling of paternal chromatin // Dev.
Biol. 2006. Vol. 298. P. 458—469.
464 ЭПИГЕНЕТИКА
J’igodnerAl. Sumoylation precedes accumulation of phosphory-
lated H2AX on sex chromosomes during their meiotic in-
activation // Chromosome Res. 2009. Vol. 17. P. 37—45.
JJ’alstroni K. AL, Schmidt D., Bean C. J., Kelly JJ’. G. RNA heli-
case A is important for germline transcriptional control,
proliferation, and meiosis in C. elegans II Meeh. Dev.
2005. Vol. 122. P. 707 -720.
JJ’angP. J. X chromosomes, retrogenes and their role in male
reproduction// Trends Endocrinol. Metab. 2004. Vol. 15.
P. 79—83.
JJ’angP. J., AIcCarrey J. R. YangF.. Page D. C. An abundance
of X-linked genes expressed in spermatogonia 11 Nat.
Genet. 2001. Vol. 27. P. 422—426.
JJ’angP. J., PageD. C., AIcCarrey J. R. Differential expression
of sex-linked and autosomal germ-cell-specific genes dur-
ing spermatogenesis in the mouse H Hum. Mol. Genet.
2005. Vol. 14. P. 2911—2918.
ГЛАВА
20
ДИМИНУЦИЯ ХРОМАТИНА С ТОЧКИ ЗРЕНИЯ
ЭПИГЕНЕТИКИ. МЕХАНИЗМ РНК-ОПОСРЕДОВАННОЙ
ПЕРЕСТРОЙКИ ГЕНОМА В ХОДЕ ЭЛИМИНАЦИИ
У ИНФУЗОРИЙ
СОДЕРЖАНИЕ
20.1. Диминуция хроматина — введение
в проблему, 466
20.2. Ядерный диморфизм у инфузорий,
467
20.3. Реорганизация генома в ходе со-
зревания макронуклеуса у разных
видов инфузорий, 469
20.4. Доказательства эпигенетического
наследования последовательнос-
тей старого макронуклеуса и учас-
тие малых РНК в процессах элими-
нации, 472
20.5. Модель эпигенетического наследо-
вания с участием скан РНК у Tetra-
hymena thermophila, 473
20.6. Модель эпигенетического наследо-
вания с участием протяженных
РНК-матриц у Oxytricha trifallax, 475
Список литературы, 477
466 ЭПИГЕНЕТИКА
20.1. Диминуция хроматина —
ВВЕДЕНИЕ В ПРОБЛЕМУ
В ходе развития многоклеточного организма
из зиготы образуются два функционально раз-
личных типа клеток — клетки зародышевого
пути (germ-line) и соматические клетки. Диффе-
ренцировка соматических клеток в ходе эмбрио-
генеза (от оплодотворенной яйцеклетки до ста-
дии эмбрионального роста) проходит в первую
очередь на уровне хроматина и проявляется в
увеличении количества эпигенетических (гисто-
новых) модификаций [Allis etal.. 2006]. Диффе-
ренцированные клетки обладают своеобразной
эпигенетической памятью и способны не только
поддерживать свое дифференцированное состоя-
ние, но и передавать его следующим клеточным
поколениям [Henberger et al., 2009]. У некоторых
организмов существуют механизмы дифферен-
цировки, происходящие не только на эпигенети-
ческом уровне, но и на уровне генома, приводя-
щие к необратимой дифференцировке клеток.
Среди них наиболее яркими примерами являют-
ся рекомбинация V(D)J в иммунных клетках по-
звоночных [V(D)J Recombination, 2009], дими-
нуция хроматина (ДХ) в презумптивных сомати-
ческих клетках у ряда организмов [Гришанин и
др., 2006] и, пожалуй, самый экстраординарный
пример перестройки — удаление ядра в эритро-
цитах и в клетках хрусталика млекопитающих
[Felka etal., 2007].
Явление ДХ, впервые открытое Теодором Бо-
вери еще в 1887 г. [Boveri, 1887] у аскариды Ра-
rascaris univalens (рис. 20.1), в дальнейшем было
обнаружено также у миксин, насекомых, цикло-
пов и у одноклеточных — инфузорий. На рис. 20.1
представлена картина диминуции при развитии
аскариды Р. univalens'. во время второго деления
дробления в одной из клеток аскариды (презум-
птивная соматическая линия клеток) происходят
конденсация концевых участков хромосом и де-
конденсация их прицентромерных районов. В
дальнейшем происходят фрагментация прицен-
тромерных районов и образование новых хромо-
сом. В анафазе диминуционного деления мелкие
соматические хромосомы расходятся к полюсам
клетки, в то время как концевые участки остают-
ся в районе экватора, где в дальнейшем дегене-
рируют (элиминируются).
Явление ДХ в царстве животных широко рас-
пространено: так, у аскарид, циклопов и миксин
ДХ является первым этапом дифференцировки
на клетки зародышевого пути и соматические
клетки, у некоторых двукрылых программа эли-
минации хромосом в раннем эмбриогенезе опре-
деляет пол особи, у инфузорий элиминирование
части хромосом связано с формированием мак-
ронуклеуса — аналога соматических клеток у
ресничных одноклеточных (см. обзор [Гришанин
и др., 2006]). Виды, претерпевающие ДХ, прохо-
дят сложную программу’ дифференцировки со-
матических клеток, включающую избиратель-
ную элиминацию целых хромосом, разрезание
додиминуционных хромосом в определенных
сайтах и сшивание образовавшихся последова-
тельностей в целую хромосому’, а также удале-
ние из клетки вырезанных хромосомных фраг-
ментов [Там же]. Итак, из клеток (а в случае ин-
Рис. 20.1. Диминуция хроматина у Parascaris univalens [Boveri, 1899].
1,2,3 — последовательные стадии ДХ; S1—соматическая клетка, Р1—клетка зародышевого пути. S1 (АВ) — предсома-
тическая клетка первого порядка.
ГЛАВА 20 я 467
фузорий из двух ядер), одинаковых по комплек-
тации генома, на определенном этапе выбирают-
ся клетки, с поразительной точностью повто-
ряющие программу- дифференциации, которая
использовалась предыдущими поколениями ор-
ганизмов.
На инфузориях впервые было показано, что
наследование таких программ дифференцировки
(а именно дифференцированного состояния мак-
ронуклеуса у инфузорий) происходит эпигене-
тически, т. е. независимо от генома [Sonnebom,
1937]. В ходе мейоза у инфузорий происходит
передача дифференцированного состояния ста-
рого макронуклеуса из поколения в поколение,
отражая стабильность эпигенома, в то время как
собственно геном (геном микронуклеуса — ана-
лог germ-line клеток) в мейозе претерпевает из-
менения.
Ниже мы рассмотрим более подробно про-
цессы дифференцировки у инфузорий — не-
обычных представителей одноклеточных, обла-
дающих ядерным диморфизмом и уникальным
процессом элиминации хроматина, приводящим
к такой ядерной дифференцировке.
20.2. Ядерный диморфизм у инфузорий
Все ресничные обладают так называемым
ядерным диморфизмом, т. е. в их цитоплазме
представлено два типа ядер — микронуклеус и
макронуклеус, количество их в клетке различа-
ется у разных видов. Эти ядра не только различ-
ны по размерам, форме (бобовидные, вытянутые,
в виде нитки бус макронуклеусы и обычно плот-
ные округлые микронуклсусы), числу’ хромосом,
но также по функциям. Микронуклсус или гене-
ративное ядро содержит диплоидный набор хро-
мосом, которые не активны в период вегетатив-
ного роста. Транскрипция происходит в макро-
нуклеусе (вегетативное полиплоидное ядро), ко-
торый состоит из большого количества (в ряде
случаев 10000—20000) коротких молекул ДНК
[Prescott, 1994].
При бесполом размножении микронуклсус
делится обычным митозом, а макронуклсус —
амитозом, при котором происходит расщепление
ядра пополам, в результате чего дочерним клет-
кам достается неравное количество хромосом
[Goldfarb, Gorovsky, 2009]. Половой процесс
у инфузорий обычно индуцируется голоданием.
У разных видов он может значительно разли-
чаться, так, например, у наиболее изученного ви-
да инфузорий Tetrahymena thermophila он выгля-
дит следующим образом (рис. 20.2). В начале
конъюгации две клетки частично объединяются
и формируют пару, при этом их микронуклсусы
подвергаются мейозу (см. рис. 2, б). Одно из че-
тырех мейотических ядер в каждой клетке под-
вергается одному’ митотическому’ делению, обра-
зуя два гаплоидных ядра: мигрирующее и ста-
ционарное. Три других ядра деградируют. Клет-
ки обмениваются одним из этих ядер (мигри-
рующее ядро) (см. рис. 20.2, в), далее стационар-
ное и мигрирующее ядра сливаются, образуя зи-
готическое диплоидное ядро. Далее зиготиче-
ское ядро подвергается двум митотическим де-
лениям (см. рис. 20.2, г); при этом два ядра диф-
ференцируются в макронуклеусы и два дру-
гих — в микронуклсусы (см. рис. 20.2, д, е). Па-
раллельно с процессом дифференцировки ядер
происходит исчезновение (деградация) роди-
тельского макронуклеуса. Один из двух образо-
вавшихся микронуклеусов в дальнейшем дегра-
дирует и претерпевает еще одно митотическое
деление, в то время как два новых макронукле-
уса в первом клеточном делении не делятся, а
распределяются между’ дочерними клетками (см.
рис. 20.2, ж, з) (см. обзоры [Prescott, 1994; Yao,
Chao, 2005; Goldfarb, Gorovskv, 2009; Mochizuki,
2010a, b; Chalker, Yao, 2011]).'
Таким образом, основными процессами, про-
исходящими во время конъюгации инфузорий,
являются обмен генетическим материалом мик-
ронуклеусов и дифференцировка микронуклеуса
в макронуклсус (созревание макронуклеуса).
Процесс созревания макронуклеуса сопровожда-
ется различными перестройками генома, имею-
щими свои особенности у изученных групп ин-
фузорий [Jahn, Klobutcher, 2002]. Общими чер-
тами для всех инфузорий являются: фрагмента-
ция хромосом (сопровождающаяся удалением
небольших участков ДНК и присоединением те-
ломер), удаление внутригенных последователь-
ностей ДНК и эндорепликация полученных ко-
ротких хромосом [Jahn, Klobutcher, 2002; Mochi-
zuki, Gorovsky', 2004]. Следует отметить, что на-
следование последовательностей ДНК микронук-
леусов происходит по менделевскому типу’, в то
время как последовательности ДНК старого мак-
ронуклеуса наследуются абсолютно по-другому, а
именно: старый (уже дифференцированный) мак-
ронуклеус служит матрицей для создания нового
макронуклеуса, хотя исходным материалом для
его постройки являются последовательности ДНК
микронуклсуса [Duharcourt etal., 1995; Chalker,
Yao, 1996]. Совсем недавно было показано, что
перестройки генома при образовании нового
макронуклеуса (полностью идентичного старо-
468 ЭПИГЕНЕТИКА
CnjE ।
H3K9/K27me
РНК-транскрипты
PM и
©
Скан РНК
ОООО
ООО О KGiwIp
ОООО
ОООО
РНК-транскрипты^
РМйч
Л/agi
Ета1р
iv/1p?
Разрушение
скан
РНК
РНК-транскрипт
HMa
ДНК HMa
Ezllp u
______Неизвестным
Г комплекс
+ Pdd3p
Pddlp
Этап 5 Этап 4 Этап 3 Этап 2 Этап 1
НОВЫЙ ФОРМИРУЮЩИЙСЯ ЦИТОПЛАЗМА РОДИТЕЛЬСКИЙ МИКРОНУКЛЕУС ЦИТОПЛАЗМА МИКРОНУКЛЕУС
МИКРОНУКЛЕУС
Рис. 20.2. Механизм элиминации у Tetrahymena thermophila (из [Mochizuki, 2010а; Chalker, Yao,
2011] с изменениями).
Пояснения в тексте.
ГЛАВА 20и469
му) осуществляются под контролем эпигенети-
ческой регуляции с участием молскул РНК [Мо-
chizuki et al., 2002; Yao et al., 2003].
Ядерный диморфизм проявляется не только в
сосуществовании двух различных ядер в цито-
плазме инфузорий, но и прежде всего в том, что
гомологичные последовательности ДНК пред-
ставлены в двух состояниях: активного хрома-
тина (макронуклсус) и молчащего хроматина
(микронуклсус) [Meyer, Chalker, 2006]. При этом
выбор между программами дифференцировки
(стать микронуклсусом или макронуклеу’сом) оп-
ределяется. по-видимому, цитоплазматическими
детерминантами: ядра, расположенные вблизи
переднего края инфузории, дифференцируются в
макронуклсусы, в то время как ядра, располо-
женные у заднего конца, станут микронуклсуса-
ми. При изменении позиции ядра в цитоплазме
будущий микрону’клсус меняет свою программу’ и
становится макронуклеусом [Nanney, 1953; Gold-
farb, Gorovsky, 2009]. Интересно отметить, что
макронуклеу’С и микронуклеу’С также различаются
по составу нуклеопоринов в комплексе ядерной
поры (см. обзор [Goldfarb, Gorovsky, 2009]).
20.3. Реорганизация генома в ходе
СОЗРЕВАНИЯ МАКРОНУКЛЕУСА
У РАЗНЫХ ВИДОВ ИНФУЗОРИЙ
Дифференцировка ядерного аппарата инфу-
зорий повторяется в каждом цикле полового
размножения, в результате два из четырех зиго-
тических ядер претерпевают значительные из-
менения своего генетического аппарата и стано-
вятся макрону’клеу’сами, а два друтих остаются
неизменными и становятся микрону’клеу’сами.
Дифференцировка макронуклеуса заключается в
необратимой реорганизации его генома, так как
основным этапом такой реорганизации является
элиминация так называемых germ-line-послсдо-
вательностей ДНК, т. е. тех последовательностей
ДНК, которые характерны только для микронук-
леуса. Эти удаляемые внутригенные последова-
тельности получили название Internal Eliminated
Sequences (далее по тексту — IES). Все последо-
вательности, которые сохраняются в геноме мак-
ронуклеуса. получили название Macronucleus-
Destined Sequences (далее по тексту — MDS).
Процесс элиминации характерен для всех изу-
ченных представителей типа Ciliophora: для
класса Spirotrichea (или брюхоресничных инфу-
зорий) (родов Stylonychia, Oxytricha и Euplotes),
для класса Oligohymcnophorca (род Tetrahymena),
и для класса Nassophorea (род Paramecium).
Хотя у разных инфу’зорий нет общей про-
граммы перестройки генома, тем не менее, со-
зревание макронуклеуса всегда включает три
основных этапа (см. обзоры [Coyne et al., 1996;
Jahn, Klobutcher, 2002; Коряков, Жимулев, 2009;
Mochizuki, 2010b; Раутиан, 2010; Chalker, Yao,
2011; Nowacki etal., 2011]). Первый этап — это
политенизация хромосом микрону’клеу’са. Вто-
рой этап — это удаление IES с последующим
лигированием MDS и фрагментация хромосом.
Третий этап — это присоединение теломер к об-
разовавшимся коротким хромосомам макрону’к-
леуса и их эндорепликация. Данные о пере-
стройках генома, сопровождающих созревание
макронуклеуса, представлены в табл. 20.1.
Рассмотрим все эти этапы у разных предста-
вителей более подробно.
1. Политенизация хромосом микронуклеу’са в
ряде случаев сопровождается удалением целых
хромосом. Этап политенизации присутствует у
всех инфу’зорий — спиротрих, но только у Stylo-
nychia lemnae сопровождается еще и удалением
до 2/3 целых хромосом, затем 1/3 оставшихся
хромосом политенизиру’ется в ходе пяти репли-
кационных этапов [Ammermann et al., 1974].
2. Удаление IES, состыковка (лигирование)
MDS (перетасовка генов у’ некоторых инфузорий)
и фрагментация ДНК. Этот второй этап фактиче-
ски состоит из двух процессов. Первый — это
вырезание внутренних элиминируемых последо-
вательностей (IES) со сшиванием образовавшихся
MDS в минихромосому, второй — это фрагмен-
тации хромосом в местах хромосомных разры-
вов — (Cbs). Этот этап у всех видов происходит
по-разному и зависит, прежде всего, от природы
удаляемых последовательностей.
Следу’ет отметить, что удаление части IES, а
именно транспозон-подобных элементов, у Eup-
lotes crassus (так называемое «точное» выреза-
ние) происходит между' дву’мя циклами полите-
низации [Sharp et al., 2003] и во время политени-
зации (момент начала и окончания процесса не
известны) у 5. lemnae [Juranec etal., 2005]. При
исследовании развития макронуклеу’са у Para-
mecium tetraurelia была отмечена взаимосвязь
между’ процессом эксцизии (вырезания) IES и
синтезом ДНК. Так, в развивающемся макрону’к-
леусе детектиру’ется четыре пика синтеза ДНК, и
процесс удаления IES происходит во время
третьего пика [Betermier et al., 2000; Betermier,
2004]. У T. thermophila удаление последователь-
ностей, специфичных для микрону’клеу’са, про-
исходит в ходе увеличения количества ДНК от
4С до 8С [Austcrbcrry, 1984].
470 ЭПИГЕНЕТИКА
У Р. tetraurelia в ходе элиминации происхо-
дит удаление двух типов последовательностей.
Во-первых, удаление повторенных ДНК, вклю-
чающих транспозоны или минисателлиты, про-
исходит неточно (т. е. может захватывать окру-
жающие эти IES последовательности) и приво-
дит к фрагментации хромосом или же неточному
лигированию образующихся последовательно-
стей. Во-вторых, точное удаление коротких IES
(порядка 100 и. и. длиной), находящихся часто в
кодирующих районах генов, приводит к лигиро-
ванию полученных фрагментов. Все изученные
1ES у Р. tetraurelia содержат короткие прямые
повторы, кроме того, по крайней мере, один из
них содержит на конце последовательность нук-
леотидов ТА. При удалении IES один из повто-
ров всегда остается в геноме макронуклсуса
[Prescott, Greslin, 1992; Betermier et al., 2000; Be-
termier, 2004].
В ходе созревания макронуклсуса у Т. ther-
mophila удаляется порядка 6000 IES, причем
происходит их неточное вырезание с последую-
щим лигированием фрагментов. Большинство
таких IES содержат концевые короткие повторы
длиной до 8 п.н., но консенсусной последова-
тельности для таких повторов найдено не было.
Помимо этого происходит фрагментация хромо-
сом в Cbs-сайтах и вырезание окружающих их
так называемых BES-последовательностей (по-
рядка 50 п.н.), т. е. последовательностей ДНК
микронуклсуса, обозначающих границы буду-
щих хромосом. Процесс фрагментации доста-
точно точен и разрезание происходит в консер-
вативном участке — Cbs длиной 15 п.н. [Mochi-
zuki, Gorovsky, 2004; Yao, Chao, 2005].
Процесс реорганизации генома у Е. crassus
включает удаление транспозон-подобных эле-
ментов — Tec IES (Transposon-like element,
Е. crassus IES) и небольших уникальных после-
довательностей — SU IES (Small Unique IES).
Интересной особенностью протекания S-фазы,
следующей за двумя митотическими делениями
зиготы, у Е. crassus является наличие двух цик-
лов репликации хромосом. При этом Tec IES
удаляются как после первого цикла репликации,
так и после второго. Что касается SU IES, то они
удаляются лишь после второго цикла реплика-
ции [Freis etal.. 1996: Sharp. 2003]. Как SU IES,
так и Tec IES содержат на концах динуклсотиды
ТА и при удалении образуют круговые экстра-
хромосомные молекулы ДНК. Более того, коль-
цевые молекулы вырезаются, захватывая не
только ТА-повторы, но и часть фланкирующих
IES-последовательностей длиной 10 п.н. [Jarac-
zewski, Jahn, 1993]. Далее происходит фрагмен-
тация хромосом в сайтах, свойственных только
роду' Euplotes, — E-Cbs длиной 10 п.н., внутри
которых присутствует консервативный «коро-
вый» участок 5'-TTGAA-3'. Помимо этого, этот
консервативный участок содержит сайт, гипер-
чувствительный к ДНКазе I [Klobutcher et al.,
1998; Jahn, Klobutcher, 2002].
Более сложные перестройки генома происхо-
дят при созревании макронуклсуса у инфузорий
рода Stylonychia. Первым этапом этого процесса
является удаление целых хромосом, которые
элиминируются без политенизации и не прини-
мают участия в процессах развития макронукле-
уса. Так, около 130 из 200 хромосом 5. lemnae
удаляется на данном этапе. Оставшиеся хромо-
сомы в дальнейшем проходят несколько циклов
репликации и образуют политенные хромосомы
(у S. lemnae п = 64) [Ammermann et al., 1974;
Prescott, 1994]. Во время политенизации прохо-
дит удаление IES [Juranec etal., 2005], причем
удаляемые и остающиеся участки хромосом
различаются цитологически: так IES образуют
30-нанометровые нити, формируют кольцевые
структуры, отделяются от хромосом и в даль-
нейшем деградируют. Остающиеся участки —
новые хромосомы макронуклсуса выглядят как
более тонкие нити диаметром 12 нм [Meyer,
Lipps, 1981].
У 5. lemnae при образовании новых хромосом
макронуклсуса в некоторых генах происходит не
просто удаление IES, но еще и перестановка
фрагментов этих генов местами. Гены в микро-
нуклеусе называются «перемешанными» (scram-
bled genes), и при созревании макронуклсуса ус-
танавливается их правильный порядок. Два типа
IES описаны при таких перестройках: первый
тип — стандартные IES, они удаляются первыми
до событий перестановки генных фрагментов.
Второй тип — «перемешанные» IES, они удаля-
ются после эксцизии стандартных IES, в ходе их
удаления восстанавливается правильный поря-
док генов. Фланкирующие последовательности
(«pointers» — указатели) между- двумя IES — это
прямые повторы, которые не просто разделяют
кодирующие и некодирующие последовательно-
сти. но и, взаимодействуя между собой по прин-
ципу гомологичной рекомбинации, направляют
процессы удаления, перестановки или инверсии
генных фрагментов [Landweber et al., 2000; Mol-
lenbeck etal., 2008]. Что касается сайтов фраг-
ментации, то у 5. lemnae в обоих субтеломерных
районах хромосом существуют инвертирован-
ные повторы с коровой последовательностью 5'-
ГЛАВА 20 и471
Таблица 20.1
Типы геномных перестроек в ходе созревания макронуклеуса у разных видов инфузорий
Вид инфузорий 1 2 3
Удаление целых хромосом Политени- зация хромо- сом микро- нуклеуса Удаление IES Фрагмен- тация в сайтах Cbs Перета- совка генов Эндорепликация хромосом макро нуклеуса
Stylonychia lemnae [Prescott, Greslin, 1992; Jonsson et al., 2001; Juranec et al., 2005; Mollenbeck et al., 2008; Mochizuki, 2010a, b] + + + (между циклами политенизации) + + +
Oxytricha nova, O. triffalax [Prescott, 1994; Prescott, DuBois, 1996; Nowacki et al., 2008] — + + + + +
Euplotes crassus [Sharp, 2003] — + + (между циклами политенизации) + — +
Tetrahymena thermophila [Mochizuki, Gorovsky, 2004] - + + + - +
Paramecium tetraurelia [Betermier et al., 2000; Betermier, 2004] — + (ДНК синтез) + + — +
Примечание. 1—3 — типы перестроек.
TGAA, так называемые St-Cbs (Stylorrichia-Cbs)
[Jonsson et al., 2001].
Удаления целых хромосом у Oxytricha нет, и
в начале конъюгации происходит политенизация
хромосом микронуклеуса [Prescott, 1994]. Про-
цесс удаления IES практически во всех деталях
сходен с процессом, описанным для Stylonichia.
По-видимому, на ранних этапах во время поли-
тенизации происходит точная эксцизия транспо-
зона ТВЕ (telomere-bearing elements) с образова-
нием кольцевых структур, затем происходит
удаление «перемешанных» IES [Williams etal.,
1993]. Впервые открытый при исследовании гена
actin I у Oxytricha nova [Prescott, Greslin, 1992]
процесс перестановки генных участков был най-
ден и для других генов инфузорий этого ро-
да [Prescott, 2000]. Наличие коротких «pointers»
длиной лишь 2 п.н. [Cavalcanti, Landweber,
2006] говорит о том, что такие последовательно-
сти недостаточны для эффективной и правиль-
ной сборки генов, более того, в такой сборке не
могут участвовать и короткие молекулы РНК
(как, например, у Tertrahymena) [Noyvacki et al.,
2011]. Показано, что для «распутывания» генов
инфузории-окситрихи используют образцы (мат-
рицы), представляющие собой молекулы РНК,
считанные с нанохромосом макронуклсуса (МАК-
хромосом) перед тем, как макронуклсус был раз-
рушен [Noyvacki et al., 2008] (подробнее см. 20.6).
Перестановка генов в ходе элиминации IES
была обнаружена также и у других инфузорий, а
именно у Chilodonella uncinata (класс Phyllopha-
ryngca) [Katz, Kovner, 2010]. Для процесса реор-
ганизации генома этого вида, так же как и пред-
ставителей класса Spirotrichea, характерно обра-
зование гигантских политенных хромосом в бу-
дущем макронуклеусе до элиминации, а также
образование в макронуклеусе так называемых
одногенных хромосом (gene-sized).
3. Образование теломер и амплификация ми-
нихромосом происходит у всех представителей
инфузорий. Копийность образовавшихся хромо-
сом различна. Так, у Т. thermophila геном макро-
нуклеуса представляет собой 200 хромосом раз-
мером около 600 т.п.н., копийность которых
составляет примерно 50 (см. обзор [Mochizuki,
2010b|). У О. nova геном макронуклеуса состоит
из 20000 коротких одногенных хромосом, ко-
пийность которых составляет порядка 1000 [см.
обзор Hoffman etal., 1995]. Есть гипотеза, что
копийность ДНК наследуется эпигенетически и
существует количественная корреляция между’
копийностью материнской ДНК, материнской
РНК и ДНК потомства [Noyvacki et al., 2011].
472 ЭПИГЕНЕТИКА
20.4. Доказательства эпигенетического
НАСЛЕДОВАНИЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
СТАРОГО МАКРОНУКЛЕУСА И УЧАСТИЕ
МАЛЫХ РНК В ПРОЦЕССАХ ЭЛИМИНАЦИИ
Впервые материнское наследование призна-
ков у инфузорий в ходе полового процесса было
отмечено при изучении передачи пола у Parame-
cium aurelia [Sonnebom, 1937]. При этом после
конъюгации все потомки одной особи опреде-
ленного пола (I или II, в дальнейшем получили
название О и Е) всегда были такого же пола, как
и родитель. В дальнейшем было показано, что
тип пола у инфузорий определяется при необра-
тимой дифференцировке, происходящей во вре-
мя формирования нового макронуклсуса, и, та-
ким образом, всегда передается посредством мак-
ронуклеуса. Интересно отметить, что при этом
во время бесполого размножения, когда макро-
нуклеус делится амитотически (т. е. просто рас-
падается примерно на две равные части), могут
появляться потомки обоих полов. Однако, при
конъюгации с формированием больших цито-
плазматических мостиков, приводящих к обшир-
ному’ обмену’ цитоплазмой, потомки обоих роди-
телей всегда наследовали лишь один пол —
Рис. 20.3. Эпигенетическая регуляция элиминации
хроматина у инфузорий.
А — перестройки генома у дикого штамма, а, b — уда-
ляющиеся в норме IES. Б— инъекция в родительский макро-
нуклеус последовательности а приводит к ее сохранению в
новом макро нуклеусе. В — при переносе в родительский
микронуклеус гена устойчивости к неомицину (neo) Es-
cherichia coli происходит его удаление в дочерних поколениях
макронуклеуса (по [Kataoka, 2011]).
Е [Sonnebom, 1977]. Следовательно, наследова-
ние пола у конъюгирующих инфузорий опреде-
ляют цитоплазматические факторы. Но в этом
случае встает вопрос: какие это факторы и каков
механизм их действия?
При дальнейших исследованиях было показа-
но, что такие цитоплазматические факторы не
просто осуществляют передачу’ признаков, но и
направляют процесс перестройки генома при
формировании макронуклсуса. Например, у му-
тантов Р. tetraurelia по гену- d48 в геноме макро-
нуклеуса отсутствует ген, кодирующий иммоби-
лизационный антиген А, в то время как в микро-
нуклеусе он представлен. Какая бы клетка ни
скрещивалась с данным мутантом, все поколе-
ния дочерних клеток имели тот же мутантный
фенотип. Инъекции нуклеоплазмы из клеток ди-
кого типа или же ДНК нормального гена d48 в
макронуклеус исправляли этот эффект [Epstein,
Forney, 1984; Harumoto, 1986].
Материнский эффект на процесс перестройки
генома также был отмечен при изучении двух
линий Р. teraurelia, различающихся только при-
сутствием в геноме макронуклсуса одной из ли-
ний определенного типа IES длиной 222 п.н. —
IES+ мутантная линия и отсутствием этой по-
следовательности в другой линии — IES- линия
(дикого типа). При инъекции полноразмерного
гена, содержащего IES-последовательность, в
родительский макронуклеус линии дикого типа в
геноме развивающегося макронуклсуса проис-
ходило «появление» IES-последовательности
(рис. 20.3, А, Б). Таким образом, присутствие IES
в старом макронуклсусс препятствует их собст-
венной элиминации в развивающемся макронук-
лсусс [Duharcourt etal., 1995]. В клетке инфузо-
рий должны существовать факторы, подавляю-
щие элиминацию. Предполагалось, что в роли
таких факторов могут выступать либо сами IES-
последовательности, либо же их РНК-копии, ко-
торые транспортируются в развивающийся мак-
ронуклеус и взаимодействуют с гомологичными
им germ-line-послсдовательностями [Duharcourt
etal., 1995]. Так как во всех вышеприведенных
случаях материнского наследования удаление
или сохранение какой-либо последовательности
макронуклсуса осуществляется независимо от
наследования последовательностей микронукле-
уса, более того, последовательности ДНК старо-
го макронуклсуса разрушаются во время мейоза,
то такое наследование можно назвать эпигене-
тическим. Похожие эпигенетические эффекты
были отмечены при исследовании IES (М и R
микронуклсус-спсцифичныс элементы) у Т. ther-
ГЛАВА 20 я 473
mophikr. элиминация IES, в норме происходящая
при развитии нового макронуклсуса, блокирует-
ся при их инъекции в родительский макронукле-
ус [Chalker, Yao, 1996].
Итак, перестройка генома клеток зародыше-
вого пути направляется в соответствии с уже
существующим перестроенным геномом (гено-
мом старого макронуклсуса). Мишенью для уда-
ления при таких перестройках в gcrm-line-геноме
выступают все те последовательности, которые
отсутствуют в соматическом геноме предыду-
щих поколений. В таком случае любые транс-
генные последовательности, введенные в геном
микронуклсуса, должны удаляться из генома.
Ряд экспериментов по трансформации микро-
нуклеуса у Tetrahymena thermophila показал, что
чужеродные последовательности всегда удаля-
ются при созревании макронуклсуса (рис. 20.3, В)
[Yao et al., 2003; Liu et al., 2005].
Многочисленные примеры эпигенетического
наследования, эксперименты по инъекции чуже-
родной ДНК в микронуклсус или ДНК IES в мак-
ронуклеус свидетельствуют о том, что в клетке
инфузорий существуют молекулы, способные
переносить информацию о структуре ДНК меж-
ду’ ядрами. Кандидатами таких переносчиков
информации могли бы быть молекулы РНК. Так,
впервые активный синтез РНК на стадии, пред-
шествующей удалению IES, был показан для
Р. tetraurelia [Berger, 1973], а в дальнейшем был
отмечен и у других представителей инфузорий
[Martindale etal., 1985; Chalker, Yao, 2001]. Но
транскрибируются ли в этот период именно
germ-line последовательности? Ответ на этот
вопрос был получен при исследовании транс-
крипции некоторых IES-элементов у Т. thermop-
hila. Эксперименты показали, что такие элемен-
ты начинают транскрибироваться в профазе
мейоза I (примерно 2—3 ч после конъюгации) и.
более того, часть таких элементов транскриби-
руется двунаправленно [Chalker, Yao, 2001].
Транскрипция germ-line-послсдовательностей так-
же была отмечена у Euplotes crassus для транс-
позоноподобного элемента Tec [Jaraczewski et al.,
1994].
В дальнейшем на стадии конъюгации были
обнаружены молекулы РНК размером примерно
28 п.н., синтез которых прекращался при нокау-
те вновь охарактеризованного гена, гомологич-
ного генам семейства piwi — TWI (Tetrahymena
piWI) [Mochizuki et al., 2002]. Этот факт, а также
участие в процессах элиминации белка PDD1
(Programm DNA Degradation) [Соуне et al., 1999;
Mochizuki et al., 2002] говорит о том, что меха-
низм вырезания IESs сходен с механизмом РНК-
интерференции.
Не хватало лишь экспериментального под-
тверждения непосредственного участия моле-
кул РНК в перестройке генома у инфузорий.
В 2003 г. был проделан эксперимент [Yao et al.,
2003], в котором двухцепочечные молекулы
РНК были инъецированы в цитоплазму’ скрещи-
вающихся инфузорий на разных стадиях конъю-
гации. Такие молекулы РНК были получены с
помощью транскрипции in vitro с тех последова-
тельностей, которые в норме не удаляются при
созревании макронуклсуса (всего было выбрано
три последовательности). Было показано, что,
во-первых, такая инъекция вызывает делецию в
гомологичном этой двухцепочечной РНК рай-
оне, а во-вторых, что вероятность возникновения
таких делеций зависит от стадии конъюгации
(самая высокая эффективность возникновения
делеций: 7,5—8,5 ч после конъюгации).
Малые молекулы РНК, гомологичные после-
довательностям микронуклсуса, были найдены
также при конъюгации инфузорий Stylonychia
lemnae [Juranec et al., 2005] и Paramecium tet-
raurelia [Lepere etal., 2009]. Интересным откры-
тием у другого рода брюхоресничных инфузо-
рий было обнаружение при созревании макро-
нуклеуса не малых молекул РНК, а протяженных
РНК-транскриптов, считанных с генома старого
макронуклсуса. Было показано, что именно та-
кие протяженные молекулы обеспечивают пра-
вильную сборку’ так называемых перемешанных
генов у Oxytricha trifallax [Nowacki et al., 2008].
Итак, на сегодня у инфузорий было описано
два различных механизма перестройки генома
при созревании макронуклеса:
1) с участием скан РНК при удалении IES у
Т. thermophila (и возможно, у Р. tetraurelia) (см.
часть 5);
2) с участием протяженных РНК-матриц хро-
мосом макронуклсуса при удалении IES и «пе-
ремешивании» генов у О. trifallax (см. 20.6).
20.5. Модель эпигенетического
НАСЛЕДОВАНИЯ С УЧАСТИЕМ СКАН РНК
у Tetrahymena thermophila
На сегодня механизм элиминации достаточно
подробно изучен на примере Tetrahymena ther-
mophila. Поскольку’ непосредственную роль в
элиминации последовательностей микронукле-
уса, как было показано, играют малые РНК, ска-
нирующие геном на наличие определенных по-
следовательностей, эта модель была названа Мо-
474 ЭПИГЕНЕТИКА
chizuki скан РНК моделью [Mochizuki et al.,
2002]. Итак, выделяют пять основных этапов
элиминации ДНК у Tetrahymena thermophila (см.
рис. 20.2):
1. Образование молекул скан РНК в микро-
нуклеусе.
2. Образование комплекса между’ скан РНК и
Twilp белком в цитоплазме и транспорт этого
комплекса в родительский макронуклеус.
3. Селективная деградация молекул скан
РНК, гомологичных последовательностям роди-
тельского макронуклеуса.
4. Скан РНК-зависимое метилирование по-
следовательностей IES в развивающемся макро-
нуклеусе.
5. Удаление метилированных IES-последова-
тельностей.
Рассмотрим характерные особенности каждо-
го этапа более подробно.
1. В ходе профазы мейоза обычно инертный
микронуклеус начинает активную транскрип-
цию, при этом некоторые районы генома микро-
нуклеуса подвергаются двунаправленной транс-
крипции. Так как все изученные на сегодня IES и
MDS транскрибируются на этой стадии, то пред-
положительно и весь геном на этом этапе транс-
крибируется, причем двунаправленно. Транс-
крипция осуществляется с помощью РНК поли-
меразы II. Синтезированные длинные двухцс-
почечные РНК разрезаются белком семейства
Dicer — Dcllp и образуют малые РНК размером
28—29 п.н. Механизм, с помощью которого эти
короткие РНК перемещаются в цитоплазму', не
известен (см. обзор [Mochizuki, 2010aJ).
2. В цитоплазме скан РНК связывается с бел-
ком семейства Argonaute — Tyvilp. Белок Tyvilp,
во-первых, стабилизирует молскулу скан РНК, а
во-вторых, обладая эндорибонуклеазной актив-
ностью, удаляет одну’ из цепей РНК из комплек-
са. Здесь, в цитоплазме полученный комплекс
(Tyvilp-скан РНК) связывается с белком Giwlp,
который опознает лишь комплексы с одноцепо-
чечными РНК-молекулами и направляет их в
макронуклеус.
3. На этой стадии происходит сканирование
генома макронуклеуса с помощью скан РНК на
нахождение гомологичных этим скан РНК по-
следовательностей.
Но прежде этого одноцепочечная скан РНК в
комплексе с белком Tyvilp подвергается даль-
нейшим изменениям, а именно метилируется
РНК-метил трансферазой — Henlp. Этот белок
детектируется на ранних стадиях конъюгации в
родительском макронуклеусе и взаимодействует
с белком Tyvilp, вызывая метилирование одно-
цепочечной РНК, таким образом, стабилизируя
ее. Так, у мутантов по гену’ HEN1 не только ко-
личество, но и длина малых РНК уменьшается,
вызывая в дальнейшем блокирование процесса
элиминации и нежизнеспособность потомства
[Kurth, Mochizuki, 2009].
Итак, «зрелая» РНК начинает «сканирование
генома». А именно, в ходе этого этапа скан РНК
(в комплексе с Tyvilp) взаимодействует с ДНК
старого макронуклеуса опосредованно, т. е. че-
рез не сошедшие с матрицы ДНК некодирующие
транскрипты. Немаловажную роль в таком взаи-
модействии играет геликаза—Emalp. Во-пер-
вых, эта геликаза служит посредником (или сти-
мулирует взаимодействие) между’ белком Tyvilp
и хроматин-связанными транскриптами, считан-
ными с генома старого макронуклеуса. Во-вто-
рых, Emalp-геликаза, по-видимому, необходима
в избирательной элиминации молекул скан РНК,
гомологичных MDS-последовательностям |Аго-
nica et al., 2008]. В процессе избирательной эли-
минации участвуют недавно охарактеризован-
ные белки — Waglp и CnjBp, они колокализу-
ются с белком Tyvilp в родительском макронук-
леусе на ранних этапах конъюгации и в разви-
вающемся макронуклеусе в ходе поздней стадии
развития [Bednenko et al., 2009].
Далее «просеянные через сито» макронукле-
уса молекулы скан РНК (вместе с комплексом
белков Tyvilp + Emalp) направляются в новый
макронуклеус [Kataoka, Mochizuki, 2011].
4. В развивающемся макронуклеусе начина-
ется второй этап сканирования. Теперь удале-
нию подлежат все последовательности, специ-
фичные для микронуклеуса, — т. е. IES-последо-
вательности. Этот многостадийный процесс так-
же начинается с Emalp-опосредованного взаи-
модействия между скан РНК—Tyvilp и транс-
криптами нового макронуклеуса. Далее к этому’
комплексу подключается (по неизвестному’ ме-
ханизму’, предположительно, играет роль белок
Drb2p [Motl, Chalker, 2011], гистон метилтранс-
фераза Ezllp и метилирует 9-й и 27-й лизин гис-
тона НЗ. Показано, что для процесса метилиро-
вания необходимы все компоненты «сканирую-
щего» комплекса, т. е. для индукции метилиро-
вания нужна не только образовавшаяся связь
скан РНК—транскрипт ДНК нового макронукле-
уса, но и белок Emalp и белок Tyvilp [Aronica
et al., 2008; Schoeberl, Mochizuki, 2011]. Метили-
рованный гистон НЗ связывается с двумя хромо-
домен-содержащими белками Pddl, Pdd3 и при-
водит к образованию типичной гетерохромати-
ГЛАВА 20 я 475
новой структуры. При цитологических исследо-
ваниях было выяснено, что во время элиминации
такие гетерохроматиновые IES-локусы обнару-
живаются на периферии ядра в определенных
точках [Madireddi et al.. 1996].
5. Каким же образом идет удаление таких
«гетерохроматиновых локусов» и какие белки
задействованы в этом процессе? На сегодня уже
охарактеризован белок ТгЬ2р — транспозаза, де-
тектируемый в гетерохроматиновых локусах.
Роль этого белка, по-видимому, заключается в
узнавании и разрезании IES [Cheng etal., 2010].
Эксперименты по генному’ нокауту’ показали, что
для эффективной элиминации IES у Tetrahymena
thermophila также необходимы четыре белка LIA
(localize in macronuclear anlagen) и еще один хро-
модомен-содержащий белок — Pdd2p [Yao et al.,
2007; Chalker, Yao, 2011].
Следует отметить, что существует критиче-
ский размер для IES — примерно 300 п.н. До-
статочно протяженный участок ДНК, вероятно,
нужен либо для точного узнавания малыми РНК
при сканировании генома, либо для формирова-
ния динуклеосомной структуры и последующей
эффективной элиминации [Kowalczy k et al., 2006].
Итак, многоэтапный процесс элиминации IES-
последовательностей ДНК у Tetrahymena ther-
mophila — гомологозависимый механизм, и про-
ходит он при участии в качестве информацион-
ных агентов малых некодирующих РНК, скани-
рующих геном и отсеивающих то. что не нужно
для «рабочего» генома — генома макронуклеуса.
Есть несколько фактов, подтверждающих, что
реорганизация генома у Paramecium aurelia в
ходе созревания макронуклеуса осуществляется
по сходному’ механизму’ с участием малых РНК.
1. Во-первых, в профазе мейоза у Paramecium
tetraurelia также были найдены короткие моле-
кулы РНК. размером примерно 25 п.н., считан-
ные со всех germ-line-последовательностей. По-
видимому’, в созревании таких молекул также
играют роль белки Dcl2 и Dcl3, которые по сво-
ей структуре сходны с белком Dell у Tetrahyme-
па thermophila [Lepere et al., 2009].
2. Узнавание IES-последовательностей, так
же как и у Tetrahyrnena, происходит не при пря-
мом взаимодействии скан РНК—ДНК, а опосре-
дованном, через РНК-транскрипты, синтезиро-
ванные с матрицы ДНК нового макронуклеуса
[Lepere et al., 2008].
3. У Paramecium также была описана транс-
позаза, необходимая для процессов элиминации
и, по-видимому, участвующая именно в разреза-
нии молекулы /ТНК, — так называемая PiggyMac
транспозаза (PgM). Поразительно, что ген, коди-
рующий эту транспозазу, — транспозон Piggy Вас,
и сам удаляется в ходе элиминации [Baudrv et al.,
2009; Motl, Chalker, 2009].
Все эти вышеописанные факты прекрасно
объясняют удаление эпигенетически наследуе-
мых IES у Paramecium, но остается загадкой, ка-
ким образом удаляются те IES, которые не прояв-
ляют «материнского» наследования [Duharcourt
et al., 1998; Lepere et al., 2008; Chalker, Yao, 2011].
Более сложный механизм наследования ге-
номных перестроек при созревании макронукле-
са используют инфузории-спиротрихи, у кото-
рых происходит не просто вырезание IES, но и
перестановка их местами.
20.6. Модель эпигенетического
НАСЛЕДОВАНИЯ С УЧАСТИЕМ ПРОТЯЖЕННЫХ
РНК-матрицу Oxytricha trifallax
Несколько другой механизм используется при
наследовании геномных перестроек у Oxytricha
trifallax. Известно, что при созревании макро-
нуклеуса Oxytricha в его геноме происходит не
только удаление последовательностей, но и так
называемое «перемешивание» фрагментов генов.
Было выяснено, что при этих перестройках на-
правляющую роль играют также молекулы РНК,
только более протяженные. Такие молекулы
РНК считываются с генома родительского мак-
ронуклеуса двунаправленно и определяют поря-
док генных фрагментов в геноме нового макро-
нуклеуса. Методом ПЦР с обратной транскрип-
цией было показано, что такие РНК-матрицы
появляются в клетках инфузорий через 5—30 ч
после конъюгации и соответствуют целым хро-
мосомам макронуклсуса вместе с концевыми
участками — теломерами. Инъекция в конъюги-
рующие клетки инфузорий искусственных ДНК-
и РНК-матриц с измененным порядком фрагмен-
тов приводила к формированию хромосом как с
неправильным, так и с правильным порядком
фрагментов генов. Если же инъецировать РНК-
матрицы с неправильным порядком фрагментов
для тех последовательностей, которые в геноме
не являются «перемешанными», то и в соответ-
ствующих районах хромосом макронуклсуса
ДНК перестроится неправильным образом [No-
wacki etal., 2008]. Следовательно, именно РНК-
матрицы направляют процесс перестановки
фрагментов генов.
А по какому’ механизму’ у Oxytricha удаляют-
ся IES? При анализе последовательностей гено-
ма макронуклсуса у Oxytricha trifalax на наличие
476 ЭПИГЕНЕТИКА
малых некодирующих РНК были обнаружены
С/D и Н/АСА малые ядрышковые РНК и новое
семейство, названное Аризонг РНК. Такие Ари-
зонг РНК могли бы выполнять роль сплайсосом-
ных РНК [Jung etal., 2011] или же подобно ма-
лым РНК Т. thermophila направлять удаление
IES в формирующемся макро нуклеусе.
Итак, в процессе элиминации у тех видов ин-
фузорий, в геноме которых происходит переста-
новка фрагментов генов, по-видимому, участву-
ют два типа РНК: малые некодирующие (анало-
гичные скан РНК у Т. thermophila) и длинные
Рис. 20.4. Гипотетическая модель РНК-направленных перестроек генома у Oxyricha (по [Nowacki, Landweber,
2009] с изменениями).
Пояснения см. в тексте.
ГЛАВА 20 я 477
РНК-транскрипты, которые помогают поставить
гены в нужном порядке. Последовательность
процессов удаления IES до перестановки генов,
детекция протяженных РНК-матриц на опреде-
ленных стадиях развития у Oxytricha (позднее,
чем появление скан РНК у Tetrahymena) говорит
о том, что события реорганизации генома проис-
ходят следующим образом (рис. 20.4). На первом
этапе происходит двунаправленная транскрип-
ция генома микронуклсуса и образуются корот-
кие малые РНК (см. рис. 20.4, а). Далее они на-
правляются в макронуклсус (см. рис. 20.4, б).
В макронуклсусс все малые РНК, гомологичные
последовательностям макронуклсуса, удаляются
(см. рис. 20.4, в). Оставшиеся молекулы идут в
формирующийся макронуклсус и индуцируют
удаление всех IES без каких-либо перестроек
(см. рис. 20.4, г). Далее синтезированные с гено-
ма родительского макронуклсуса длинные РНК-
транскрипты переходят в формирующийся мак-
ронуклеус и направляют перестановку7 генных
фрагментов (см. рис. 20.4, б).
* * *
Процесс диминуции хроматина у инфузо-
рий — яркий пример необратимой реорганиза-
ции генома, приводящей к дифференцировке
ядерного аппарата инфузорий. Так, зиготическое
ядро после конъюгации дает начало четырем
ядрам, два из которых станут микронуклсусами
или генеративными ядрами, а два других — мак-
ронуклеусами или соматическими ядрами. Такой
процесс образования или созревания генома мак-
ронуклеуса на базе генома микронуклсуса со-
провождается сложными перестройками, а имен-
но, диминуцией IES, фрагментацией хромосом, а
в ряде случаев — перестановкой генных фраг-
ментов (у7 Oxytricha) и последующей полиплои-
дизацией полученных соматических хромосом.
Недавние исследования показали, что «дириже-
рами» этого процесса перестройки являются мо-
лекулы родительской РНК двух типов: короткие
РНК, считанные с генома микронуклсуса (скан
РНК), и протяженные некодирующие РНК-транс-
крипты макронуклсуса. На примере Т. thermo-
phila показано, что геном макронуклсуса в отли-
чие от микронуклсуса характеризуется низким
содержанием повторяющихся нуклеотидных по-
следовательностей и мобильных генетических
элементов (транспозонов): они занимают всего
2% генома [Eisen etal., 2006]. Следовательно,
одно из возможных объяснений явления дими-
нуции— это избавление от ненужного «генети-
ческого мусора» и создание «рабочей» копии
генома. При этом для узнавания таких «молеку-
лярных паразитов» служат молекулы РНК, счи-
танные со старого микронуклсуса и проверенные
на наличие лишних «паразитарных» последова-
тельностей при сравнении с родительским сома-
тическим геномом. Так как все процессы опо-
знавания и удаления транспозонов, микросател-
литов и других удаляемых фрагментов направ-
ляются в зависимости от исходного соматиче-
ского генома и новый макронуклсус полностью
идентичен материнскому7, то можно говорить о
соматическом геноме инфузорий как об эпигено-
ме, который наследуется от предыдущих поко-
лений [Nowacki, Landweber, 2009]. Все полезные
мутации в макронуклсусс в таком случае могут
передаваться будущим поколениям. Но тогда
зачем нужен геном микронуклсуса, все измене-
ния в котором лишь бережно передаются поко-
лениям, но никогда не используются? Этот во-
прос, как и многие другие, до сих пор остается
нерешенным. До сегодняшнего момента не вы-
яснено, какими механизмами индуцируется про-
цесс полногеномной транскрипции микронуклс-
уса в ранней профазе мейоза, какие ферменты и
какие механизмы задействованы при опознава-
нии сайтов фрагментации хромосом, какие ком-
плексы белков участвуют при перемещении ген-
ных фрагментов у Oxytricha. Часть этих вопро-
сов, возможно, будут разрешены при сравнении
процесса диминуции с процессами реорганиза-
ции генома и эпигенома при дифференцировке
клеток у многоклеточных организмов. В таком
случае процесс диминуции хроматина можно
рассматривать как механизм регулировки функ-
ционального состояния генома.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Гришанин А. К, Шеховцов С. В., Бойкова Т. В., Акифьев А. П,
Жимулев II. Ф. Проблема диминуции хроматина на
рубеже XX и XXI веков it Цитология. 2006. Т. 48, № 5.
С. 379—397.
Коряков Д. Е., Жиму лев II. Ф. Хромосомы. Структура и
функции. Новосибирск: Изд-во СО РАН, 2009. 258 с.
Раушиан М. С. Молекулярная организация генома инфузо-
рии // Генетика. 2010. Т. 46, № 9. С. 1192 1195.
Allis С. D., Jemtwein Т., ReinbergD. Overview and Concepts //
Epigenetics / C. D. Allis, T. Jenuwein, D. Reinberg,
M. L. Caparros (eds). N. Y.: Cold Spring Habor Labora-
tory7 Press, 2006. P. 23—61.
Antmermann D., Steinbruck G., von Berger L., Hennig W. The
development of the macronucleus in the ciliated protozoan
Stvlonyclna mytilus // Chromosoma. 1974. Vol. 45.
P.' 401 429.
AronicaL., Bednenko J., NotoT., DeSouza L. J~, Siu К. ГГ.,
LoidlJ, Pearlman RE., Gorovsky M. A.. Mochizuki K.
Study of an RNA helicase implicates small RNA-
478 ЭПИГЕНЕТИКА
noncoding RNA interactions in programmed DNA elimi-
nation in Tetrahymena // Genes Dev. 2008. Vol. 22.
P. 2228—2241.
Austerberry C. F, Allis C. D., Yao AL. C. Specific DNA rearra-
ngements in synchronously developing nuclei of Tetrahy-
mena/' Proc.’ Natl. Acad. Sci. USA. 1984. Vol. 81.
P. 7383 7387.
BaudryC. AlalinskyS.. RestitiritoAL. Kapusta A.. RosaS..
Meyer E., BetermierAl. PiggyMac, a domesticated piggy-
Bac transposase involved in programmed genome rear-
rangements in the ciliate Paramecium tetraurelia // Genes
Dev. 2009. Vol. 23. P. 2478—2483.
Bedneiiko J., Noto T, DeSouza L. J’., Siu K. JJ'., Pearlman R. E.,
Mochizuki K., Gorovsky AL A. Two GW repeat proteins
interact with Tetrahymena thermophila argonaute and
promote genome rearrangement // Mol. Cell Biol. 2009.
Vol. 29. P. 5020—5030.
Berger J. D. Nuclear differentiation and nucleic acid synthesis
in well-fed exconjugants of Paramecium aurelia // Chro-
mosoma. 1973. Vol. 42. P. 247—268.
Betermier Al. Large-scale genome remodelling by the develop-
mentally programmed elimination of germ line sequences
in the ciliate Paramecium // Res. Microbiol. 2004.
Vol. 155. P. 399 408.
Betermier AL, DuharcourtS., SeitzH., Meyer E. Timing of
developmentally programmed excision and circularization
of Paramecium internal eliminated sequences // Mol. Cell
Biol. 2000. Vol. 20. P. 1553—1561.
Boveri T. Ueber Differenzierung der Zellkerne waehrend der
Furchung des Eies von Ascaris megalocephala 11 Anat.
Anz. 1887. Vol. 2. P. 688—693.
Boveri T. Die Entwickelung von Ascaris megalocephala mit
besonderer Rtidsicht auf die Kernverlialtnisse (Abdruck
aus der Festschrift zum siebenzigsten Geburtstag von Carl
von Kupffer). Jena: G. Fischer, 1899.
Cavalcanti A., LandweberL. Insights into a biological com-
puter: Detangling scrambled genes in Ciliates // Nano-
technology: Science and Computation. Natural Computing
Series / J. Chen, N. Jonoska, G. Rozenberg (eds). Berlin:
Springer, 2006. P. 349—359.
ChalkerD.L., Yao AL C. Non-Mendelian, heritable blocks to
DNA rearrangement are induced by loading the somatic
nucleus of Tetrahymena thermophila with germ line-
limited DNA // Mol. Cell Biol. 1996. Vol. 16. P. 3658—
3667.
ChalkerD.L., YaoM. C. Nongenic, bidirectional transcription
precedes and may promote developmental DNA deletion
in Tetrahymena thermophila // Genes Dev. 200L Vol. 15.
P. 1287—1298.
Chalker D. L., YaoM. C. DNA elimination in ciliates: transpo-
son domestication and genome surveillance // Annu. Rev.
Genet. 2011. Vol. 45. P. 227—246.
Cheng С. E., JMgt .1., Mochizuki K, YaoM. C. A domesticated
piggyBac transposase plays key roles in heterochromatin
dynamics and DNA cleavage during programmed DNA
deletion in Tetrahymena thermophila 11 Mol. Biol. Cell.
2010. Vol. 21. P. 1753—1762.
Coyne R. S., Chalker D.L., YaoM.C. Genome downsizing
during ciliate development: nuclear division of labor
through chromosome restructuring // Annu. Rev. Genet.
1996. Vol. 30. P. 557—578.
Coyne R S., NikiforovM. A., Smothers J. F„ Allis C. D., Yao Al. C.
Parental expression of the chromodomain protein Pddlp is
required for completion of programmed DNA elimination
and nuclear differentiation // Mol. Cell. 1999. Vol. 4.
P. 865—872.
Duharcourt S., Butler A., Meyer E. Epigenetic self-regulation of
developmental excision of an internal eliminated sequence
on Paramecium tetraurelia 11 Genes Dev. 1995. Vol. 9.
P. 2065—2077.
Duharcourt S., Keller .1. AL, Meyer E. Homology-dependent
maternal inhibition of developmental excision of internal
eliminated sequences in Paramecium tetraurelia ." Mol.
Cell Biol. 1998. Vol. 18. P. 7075—7085.
Epstein L. AL, Forney J. D. Mendelian and non-mendelian
mutations affecting surface antigen expression in Parame-
cium tetraurelia // Mol. Cell Biol. 1984. Vol. 4. P. 1583—
1590.
Eisen J. A., Coyne R S., JJ’uAL, JJ’uD., Thiagarajan AL, JJ’ort-
manJ.R, Badger J. H., RenO., Amedeo P., Jones К. M,
TallonL.J., Delcher .1. L., Salzberg S. L., Silva J. C.,
Haas B. J., Majoros JJ'. H, FarzadM, Carlton J. M,
Smith R K. Jr., Garg J., Pearlman RE., KarrerKAL,
SunL., Manning G., EldeN. C, Turkewitz A. P., Asai D. J.,
JJ’ilkes D. E., JJ’angY.. Cai H. Collins K.. StewartB. A..
Lee S. R., JJ’ilamowska K, JJ’einbergZ., RuzzoJJ’.L., JJ’lo-
gaD., GaertigJ., Frankel J., TsaoC. C, Gorovsky AL A.,
KeelingP. J., JJ’aller R F, Patron N. J., Cherry J. AL,
Stover N. .1., Krieger C. J., del Toro C, Ryder H. F, JJ’il-
liamson S. C, Barbeau R A., Hamilton E. P., OriasE.
Macronuclear genome sequence of the ciliate Tetrahy-
mena thermophila, a model eukaryote // PLoS Biol. 2006.
Vol. 4, N 9. P. 1620—1642.
Felka T, Lemke J., Lemke C. Michel S.. LiehrT.. Claussen U.
DNA degradation during maturation of erythrocytes —
molecular cytogenetic characterization of Howell-Jolly
bodies // Cytogenet. Genome Res. 2007. Vol. 119. P. 2—8.
Freis J. S., TebeauCAL, DoktorS.Z., JahnC.L. Differential
replication and DNA elimination in the polytene chromo-
somes of Euplotes crassus " Mol. Biol. Cell. 1996. Vol. 7.
P. 755—768.
Goldfarb D. S, Gorovsky AL .1. Nuclear dimorphism: two peas
in a pod // Curr. Biol. 2009. Vol. 19. P. R449 452.
Harumoto T. Induced change in a non-Mendelian determinant
by transplantation of macronucleoplasm in Paramecium
tetraurelia II Mol. Cell. Biol. 1986. Vol. 6. P. 3498—
3501.
Hemberger M, Dean JJ’., Reik JJ’. Epigenetic dynamics of stem
cells and cell lineage commitment: digging Waddington’s
canal // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2009. Vol. 10. P. 526—
537.
Hoffman D. C. Anderson R. C. DuBoisAl.L., PrescottD. AL
Macronuclear gene-sized molecules of hypotrichs // Nu-
cleic Acids Res. 1995. Vol. 23. P. 1279—1283.
JahnC.L., Klobutcher L. A. Genome remodeling in ciliated
protozoa // Annu. Rev. Microbiol. 2002. Vol. 56. P. 489—
520.
Jaraczewski J. JJ’., Jahn C. L. Elimination of Tec elements in-
volves a novel excision process // Genes Dev. 1993.
Vol. 7. P. 95—105.
Jaraczewski J. JJ’., Freis J. S., JahnC.L. Developmentally re-
gulated, low abundance Tec element transcripts in Euplo-
tes crassus—implications for DNA elimination and trans-
position 11 Nucleic Acids Res. 1994. Vol. 22. P. 4535—
4542.
Jonsson F, Steinbruck G., Lipps H. J. Both subtelomeric re-
gions are required and sufficient for specific DNA frag-
mentation during macronuclear development in Stylonyc-
hia lemnae П Genome Biol. 2001. Vol. 2,N 2. P. 1—11.
JungS., SwartE. C, AHnxP.J., Magrini J'., AlardisE.R,
Landweber L. F, Eddy S. R Exploiting Oxytricha trifallax
nanochromosomes to screen for non-coding RNA genes //
Nucleic Acids Res. 2011. Vol. 39. P. 7529—7547.
JuranekS.A., RupprechtS., PostbergJ., LippsH. J. snRNA
and heterochromatin formation are involved in DNA exci-
sion during macronuclear development in stichotrichous
ciliates H Eukaryot. Cell. 2005. Vol. 4. P. 1934—1941.
ГЛАВА 20 я 479
Kataoka К., ALochizuki К. Programmed DNA elimination in
Tetrahymena: a small RNA-mediated genome surveillance
mechanism" Adv. Exp. Med. Biol. 2011. Vol. 722.
P. 156—173.
Katz L. A., Kovner A. AL Alternative processing of scrambled
genes generates protein diversit}' in the ciliate Chilo-
donella uncinata // J. Exp. Zool. B. Mol. Dev. Evol. 2010.
Vol. 314. P. 480—488.
Klobutcher L. .1., Gygax S. E., Podoloff J. D., J’ermeesch J. R,
Price C. AL, Tebeati C. AL, Jahn C. L. Conserved DNA
sequences adjacent to chromosome fragmentation and te-
lomere addition sites in Euplotes crasstis // Nucleic Acids
Res. 1998. Vol. 26. P. 4230 4240.
Kowalczyk C. .4., Anderson A. AL, Arce-LarretaAL., Chal-
ker D. L. The germ line limited M element of Tetrahy-
mena is targeted for elimination from the somatic genome
by a homology-dependent mechanism // Nucleic Acids
Res. 2006. Vol.’34. P. 5778—5789.
Kurth H. AL, ALochizuki K. 2'-O-methylation stabilizes Piwi-
associated small RNAs and ensures DNA elimination in
Tetrahymena // RNA. 2009. Vol. 15. P. 675—685.
Landweber L. F., Kuo T. C, Curtis E. .1. Evolution and assem-
bly of an extremely scrambled gene // Proc. Natl. Acad.
Sci. USA. 2000. Vol. 97. P. 3298—3303.
Lepere G., Betermier AL, ALeyerE., Duharcourt S. Maternal
noncoding transcripts antagonize the targeting of DNA
elimination by scanRNAs in Paramecium tetraurelia 11
Genes Dev. 2008. Vol. 22. P. 1501—1512.
Lepere G., Nowacki AL, Serrano J~, Gout J. F, Guglielmi G.,
DuharcourtS., ALeyerE. Silencing-associated and meio-
sis-specific small RNA pathways in Paramecium tetra-
urelia 11 Nucleic Acids Res. 2009. Vol. 37. P. 903—915.
LiuY., SongX., Gorovsky AL. A., KarrerKAL. Elimination of
foreign DNA during somatic differentiation in Tetrahy-
mena thermophila shows position effect and is dosage de-
pendent // Eukaiyot. Cell. 2005. Vol. 4. P. 421- -431.
ALadireddi AL. T., Coyne R. S., Smothers J. F, ALickey K. AL,
Yao AL. C., Allis C. D. Pddlp, a novel chromodomain-
containing protein, links heterochromatin assembly and
DNA elimination in Tetrahymena // Cell. 1996. Vol. 87.
P. 75—84.
ALartindale D. JJ’., Allis CD., Bruns P. J. RNA and protein
synthesis during meiotic prophase in Tetrahymena ther-
mophila // J. Protozool. 1985. Vol. 32. P. 644—649.
ALeyerE., Chalker D. L. Epigenetics in ciliates// Epigenetics/
C. D. Allis, T. Jenuwein, D. Reinberg, M. L. Caparros
(eds). N. Y.: Cold Spring Habor Laboratory Press, 2006.
P. 127—150.
ALeyerG.F, Lipps H. J. The formation of polytene chromo-
somes during macronuclear development of the hypotrich-
ous ciliate Stvlonychia mytilus " Chromosoma. 1981.
Vol. 82. P. 309—314.
ALochizuki K. DNA rearrangements directed by non-coding
RNAs in ciliates /7 Wiley Interdiscip. Rev. RNA. 2010a.
Vol. 1. P. 376—387.
ALochizuki K. RNA-directed epigenetic regulation of DNA rear-
rangements // Essays Biochem. 2010b. Vol. 48. P. 89—
100.
ALochizuki K, Gorovsky AL. A. Small RNAs in genome rear-
rangement in Tetrahymena // Curr. Opin. Genet. Dev.
2004. Vol. 14. P. 181—187.
ALochizuki K, Fine N. .1., Fujisawa T, Gorovsky AL. .1. Analysis
of a piwi-related gene implicates small RNAs in genome
rearrangement in tetrahymena// Cell. 2002. Vol. 110.
P. 689—699.
ALollenbeckAL., ZhouY., Cavalcanti A. R, Jonsson F, Hig-
gins В. P„ Chang JJ. J., JuranekS., DoakT.G., Rozen-
bergG., Lipps H. J., Landweber L. F. The pathway to de-
tangle a scrambled gene // PLoS One. 2008. Vol. 3.
P. e2330.
ALotlJ. A., Chalker D. L. Subtraction by addition: domesticated
transposases in programmed DNA elimination // Genes
Dev. 2009. Vol. 23. P. 2455—2460.
ALotlJ. ChalkerD. L. Zygotic expression of the double-
stranded RNA binding motif protein Drb2p is required for
DNA elimination in the ciliate Tetrahymena thermo-
phila ' Eukaiyot. Cell. 2011. Vol. 10. P. 1’648—1659.
NanneyD.L. Nucleo-cytoplasmic interaction during conjuga-
tion in Tetrahymena " Biol. Bull. 1953. Vol. 105.
P. 133—148.
Nowacki AL., Landweber L. F. Epigenetic inheritance in cili-
ates // Curr. Opin. Microbiol. 2009. Vol. 12. P. 638—
643.
Nowacki AL.. Shetty K, Landweber L. F. RNA-mediated epige-
netic programming of genome rearrangements // Annu.
Rev. Genomics Hum. Genet. 2011. Vol. 12. P. 367—389.
NowackiAL, J'ijayanJ'., ZhouY., SchotanusK, DoakT.G.,
Landweber L. F. RNA-mediated epigenetic programming
of a genome-rearrangement pathway // Nature. 2008.
Vol. 451. P. 153—158.
Prescott D. AL. The DNA of ciliated protozoa // Microbiol. Rev.
1994. Vol. 58. P. 233—267.
Prescott D. AL. Genome gymnastics: unique modes of DNA
evolution and processing in ciliates // Nat. Rev. Genet.
2000. Vol. 1. P. 191—198.
PrescottD. AL., DuBoisAL.L. Internal eliminated segments
(lESs) of Oxytrichidae// J. Eukaryot. Microbiol. 1996.
Vol. 43. P. 432—441.
Prescott D. AL., GreslinA. F. Scrambled actin I gene in the mi-
cronucleus of Oxytricha nova // Dev. Genet. 1992.
Vol. 13. P. 66—74.'
Schoeberl U. E., ALochizuki K. Keeping the soma free of trans-
posons: programmed DNA elimination in ciliates /7 J.
Biol. Chem. 2011. Vol. 286. P. 37045—37052.
SharpS. I., Pickrell J. K, JaltnC. L. Identification of a novel
«chromosome scaffold» protein that associates with Tec
elements undergoing en masse elimination in Euplotes
crassus // Mol. Biol. Cell. 2003. Vol. 14. P. 571—584.
Sonnebom T. AL. Sex. sex inheritance and sex determination in
Paramecium aureliaH Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1937.
Vol. 23. P. 378—385.
Sonnebom T. AL. Genetics of cellular differentiation: stable
nuclear differentiation in eucaryofic unicells " Annu. Rev.
Genet. 1977. Vol. 11. P. 349—367.
J'(D)J Recombination. Ferrier P. (edr). In: Advances in Experi-
mental Medicine and Biology. Vol. 650. Landes Biosci-
ence. 2009. XII. 199 p.
JJ’illiams K. DoakT. G., Herrick G. Developmental precise
excision of Oxytricha trifallax telomere-bearing elements
and formation of circles closed by a copy of the flanking
target duplication // EMBO J. 1993. Vol. 12. P. 4593—
4601.
Yao AL. C., Chao J. L. RNA-guided DNA deletion in Tetrahy-
mena: an RNAi-based mechanism for programmed ge-
nome rearrangements // Annu. Rev. Genet. 2005. Vol. 39.
P. 537- 559.
YaoAL. C. FullerP.. XiX. Programmed DNA deletion as an
RNA-guided system of genome defense // Science. 2003.
Vol. 300. P. 1581—1584.
YaoAL. C., Yao CH, HalaszL.AL., FullerP., RexerC.H.,
JJ’angS. H., JainR., CoyneR. S., Chalker D. L. Identifica-
tion of novel chromatin-associated proteins involved in
programmed genome rearrangements in Tetrahymena // J.
Cell Sci. 2007. Vol. 120. P. 1978—1989.
ГЛАВА
21
ПРИОНЫ, «БЕЛКОВАЯ НАСЛЕДСТВЕННОСТЬ»
И ЭПИГЕНЕТИКА
СОДЕРЖАНИЕ
21.1. Феномен прионизации и его отно-
шение к эпигенетике, 482
21.2. Прион млекопитающих, 483
21.3. Прионы низших эукариот, 485
21.4. Фактор [URE3], 486
21.5 Фактор [PS/+], 487
21.6. Фактор [Р//\Г], 488
21.7. Факторы [/SP+], [Sl/I/Г], [МОТЗ+] и
[ОСТ], 489
21.8. Фактор [Het-s] мицелиального гри-
ба Podospora anserina, 490
21.9. Прионы и память — белок СРЕВ
Aplysia, 492
21.10. Взаимодействие инфекционных
и неинфекционных амилоидов.
Прионные сети, 493
21.11. Расширение матричного принци-
па. Центральная Догма молеку-
лярной биологии и конформаци-
онные матрицы, 494
Список литературы, 495
482 ЭПИГЕНЕТИКА
Быстрое развитие генетики в последние деся-
тилетия обогатило наши представления о на-
следственности и изменчивости сведениями о
целом ряде явлений, связанных с регуляцией
экспрессии генетической информации. К ним
можно отнести метилирование ДНК, ремодели-
рование хроматина, интерференцию РНК (см.:
[Novina, Sharp, 2004]), геномный импринтинг
(см.: [Конюхов, Платонов, 2001]), инактивацию
Х-хромосомы (см. настоящую монографию) и
взаимную регуляцию оперонов [Чураев, 1975,
2005; Чураев, Ратнер, 1975]. Эту группу’ явлений,
порой весьма разнородных, объединяет понятие
эпигенетической изменчивости (наследственно-
сти) (см.: [Allis et al., 2007]). Эпигенетика в наши
дни — область активного экспериментирования.
Поэтому’ в ней гораздо больше феноменологии,
не всегда строго интерпретируемой, нежели
концептуальной завершенности. В общем виде
эпигенетические явления можно отнести к яв-
лениям наследственности и наследственной из-
менчивости, которые лишь косвенно зависят от
сохранения или изменения нуклеотидных после-
довательностей ДНК в той мере, в которой ге-
нотип определяет норму реакции организма.
Эпигенетические изменения можно рассматри-
вать как один из вариантов регуляции экспрес-
сии генетической информации, который не оп-
ределяется изменением нуклеотидной последо-
вательности ДНК.
Прионизация заключается в изменении про-
странственной укладки полипептида без измене-
ния его первичной структуры, без изменения
последовательности кодирующих его нуклеоти-
дов ДНК. В дальнейшем такой измененный бе-
лок перестраивает «по своему’ образу и подо-
бию» вновь синтезируемые гомологичные, а
Расщепление прионного
полимера на олигомеры
Новые акты прионной конверсии
Рис. 21.1. Схема амилоидогенеза (1) и прионогенеза
(2).
иногда и гетерологичные, полипептиды. В ре-
зультате изменения пространственной структу-
ры белок может инактивироваться или приобре-
тать новые функции, что приводит к наследуе-
мому изменению признака. Таким образом, при-
онизация белков, описанию которой посвящена
данная глава, может вызывать наследуемые из-
менения и представляет собой эпигенетический
феномен. Возникновение и доказательство при-
онной концепции требует небольшой, но суще-
ственной модификации Центральной Догмы мо-
лекулярной биологии [Crick, 1958, 1970], к чему’
мы обратимся в конце нашего обзора.
21.1. Феномен прионизации
И ЕГО ОТНОШЕНИЕ К ЭПИГЕНЕТИКЕ
Прионы представляют собой белки, которые
могут существовать в двух или более структурно
и, в ряде случаев, функционально различающих-
ся конформациях, из которых как минимум одна
обладает инфекционными свойствами. Приони-
зация белка в большинстве случаев связана с
амилоидогенезом, т. е. с формированием белко-
вых агрегатов, имеющих упорядоченную [3-
структуру (по: [Serpell etal., 1997]). Прионный
агрегат, состоящий из белков-мономеров с изме-
ненной конформацией, служит матрицей для
присоединения новых мономеров, которые в
свою очередь меняют свою конформацию. В от-
личие от прочих амилоидных агрегатов прион-
ные полимеры расщепляются на олигомеры, что
приводит к запуску повторных актов прионной
конверсии (рис. 21.1).
У млекопитающих прионная конверсия белка,
получившего название PrP (Prion Protein), при-
водит к развитию ряда инфекционных нейроде-
генеративных заболеваний [Prusiner, 1998]. При-
онные агрегаты млекопитающих не передаются
из поколения в поколение, но воспроизводятся в
тканях головного мозга и, таким образом, име-
ют отношение к онтогенетической эпигенетике.
К настоящему’ времени прионы выявлены в раз-
личных систематических группах, в том числе
доказаны прионные свойства белка СРЕВ, ответ-
ственного за долговременную память у моллю-
ска Aplysia californica [Si etal., 2010], и белка
HET-s, обусловливающего цитоплазматическую
несовместимость у Podospora anserina [Coustou
etal., 1997]. Есть основания полагать, что обра-
зование цитоплазматических стресс-гранул мле-
копитающих связано с прионоподобной конвер-
сией белка TIA-1 [Gilks etal., 2004]. Семь бел-
ков, способных к прионизации, идентифициро-
ГЛАВА 21 483
ваны у пекарских дрожжей Saccharomyces cere-
visiae. Дрожжи 5. cerevisiae представляют собой
одноклеточный организм, размножающийся по-
средством почкования, при этом часть цито-
плазмы материнской клетки переходит в дочер-
нюю. В силу того, что у дрожжей прионные аг-
регаты локализованы в цитоплазме и стабильно
передаются в митозе и мейозе, прионы дрожжей
рассматривают как цитоплазматические наслед-
ственные детерминанты [Сох, 1965; Wickner,
1994]. Таким образом, прионизация дрожжевых
белков, которая зачастую вызывает изменение
признаков, представляет собой эпигенетическое
событие, поскольку наследуемое изменение при-
знака происходит не в результате изменения ге-
нетического материала, а вследствие повторяю-
щихся актов конформационных изменений бел-
ка. На основании данных о передаче дрожжевых
прионов из поколения в поколение возник и
прочно утвердился в науке термин «белковая на-
следственность». Возможно, наследуемые при-
оны встречаются и у других организмов, в част-
ности, у млекопитающих. На нынешнем этапе
развития науки открытие каждого нового приона
является событием.
21.2. Прион млекопитающих
Термин прион (см. далее) появился в конце
XX в., однако, первые упоминания о прионном
заболевании («скрэпи» у овец) восходят к сере-
дине XVIII в. Первые значимые успехи в изуче-
нии прионных болезней относятся к 30-м годам
XX в., когда Кьюилу и Челе удалось экспери-
ментально передать болезнь скрэпи сначала от
овец овцам [Cuille, Chelle, 1936; цит. по: Wickner
et al., 2007], а затем и козам [Cuille, Chelle, 1939].
Спустя примерно 20 лет Гайдушском и Зигасом
было описано летальное нейродегенеративное за-
болевание «куру», распространенное среди або-
ригенов Пата-Новой Гвинеи, связанное с риту-
альным каннибализмом [Gajdusek, Zigas, 1957].
Гайдушску с соавторами удалось показать, что
инъекция белкового экстракта из мозга человека,
умершего от «куру», в мозг шимпанзе приводит
к развитию аналогичного заболевания [Gajdusek
et al., 1966]. Спустя несколько лет сходным спо-
собом была доказана инфекционность еще одной
гу бчатой энцефалопатии человека — болезни
Крейцфельдта—Якоба [Gibbs etal., 1968]. Не-
смотря на успехи, связанные с доказательством
передачи прионных заболеваний, природа по-
следних долгое время оставалась неясной. Пер-
воначально большинство ученых склонялось к
тому’, что причиной заболеваний являются виру-
сы. Именно за развитие этой концепции («мед-
ленных вирусов») Д. К. Гайдушск был удостоен
Нобелевской премии в 1976 г. В то же время ин-
фекционный агент обладал не характерными для
вирусов свойствами. Он оказался устойчивым к
УФ-облучению при длине волны 254 нм, иони-
зирующей радиации, а также к действию нуклеаз
и некоторых других агентов, что свидетельство-
вало о том, что в его состав не входят ДНК и
РНК [Alper et al., 1967]. На основании этих дан-
ных Гриффитсом было высказано несколько ги-
потез, одна из которых постулировала, что ин-
фекционный агент, вызывающий губчатые эн-
цефалопатии, представляет собой измененную
форму’ одного из клеточных белков, способную
воспроизводить свои свойства за счет автоката-
литического механизма [Griffith, 1967].
Экспериментальное подтверждение этой ги-
потезы было получено в начале 1980-х гг. Стен-
ли Прусинером с коллегами, которые выделили
и очистили инфекционный агент, вызывающий
скрэпи, из мозга больных животных [Prusiner,
1982]. Для обозначения не содержащего нуклеи-
новых кислот белкового инфекционного агента
Прусинер предложил термин «прион» (Prion —
от proteinaceous infectious (particles)). Белок, вы-
зывающий скрэпи и друтие инфекционные губ-
чатые энцефалопатии, был назван РгР (от Prion
Protein). Аномальная изоформа получила назва-
ние PrPSc (Sc — аббревиатура первого описанно-
го прионного заболевания «Scrapie»). Нормаль-
ная изоформа белка РгР обозначается РгРс (от
cellular) (по [Prusiner, Scott, 1997]). На основании
определения первичной структуры белка РгР
позже был идентифицирован кодирующий его
ген, названный Ртр, обнаруживший высокий
уровень эволюционной консервативности у всех
исследованных млекопитающих [Chesebro et al.,
1985; Oeschetal., 1985; Prusiner, 1998].
Множество работ посвящено исследованию
функций белка РгР. Мыши, нокаутные по гену’
Ртр, как правило, не претерпевают видимых
физиологических изменений [Bueler et al., 1992],
за исключением линии, в которой происходило
нарушение режима «сон—бодрствование», что
указывает на возможную роль белка РгРс в регу-
ляции циркадных ритмов [Tobler et al., 1996]. РгР
продуцируется в разнообразных тканях и орга-
нах: почках, сердце, поджелудочной железе,
мышцах, вторичных лимфоидных органах, а так-
же в центральной и периферической нервной
системе, что может указывать на широкий
спектр функций данного белка (по [Aguzzi et al.,
484 ЭПИГЕНЕТИКА
2008]). Так, в частности, он участвует в регуля-
ции Т-клеточного ответа, выполняет функции
нейропротектора, связан с регуляцией апоптоза,
участвует в сигнальной трансдукции и синапти-
ческой передаче, связывает ионы меди и других
двухвалентных металлов и является антиокси-
дантом, взаимодействует с молекулами клеточ-
ной адгезии (по [Heikenwalder et al., 2007; Vana
et al., 2007; Aguzzi et al., 2008]). В ряде работ по-
казано, что РгР участвует в формировании мие-
линовых облочек [Radovanovic et al., 2005; Bre-
mer et al., 2010]. Есть данные, что PrPc является
универсальным рецептором для самых разнооб-
разных амилоидных олигомеров [Resenberger
etal., 2011]. В результате прионной конверсии
белок частично или полностью инактивируется,
но самое важное, что олигомеры PrPSc приобре-
тают нейротоксическую активность, что не ха-
рактерно для РгРс.
Две альтернативные изоформы белка РгР от-
личаются друг от друга по своим физико-хими-
ческими свойствами. Так. PrPSc, в отличие от
РгРс, устойчив к нагреванию, отличается плохой
растворимостью в детергентах и устойчив к дей-
ствию протеолитических агентов [Prusiner, 1982;
Prusiner et al., 1983; Oesch et al., 1985]. После об-
работки PrPSc протеиназой-К интактным остает-
ся С-терминальный фрагмент белка РгР, кото-
рый, как показано в экспериментах in vivo и in
vitro, способен к прионизации и может индуци-
ровать прионизацию полноразмерного белка РгР
[Caughey etal., 1991; Shmerling etal., 1998;
Supattapone et al., 1999]. Различия в свойствах
PrPc и PrPSc объясняются разной пространствен-
ной структурой двух форм белка. Так, по дан-
ным спектрального анализа было обнаружено,
что РгРс содержит 42 % а-спиралей и 3 %
P-структур, тогда как PrPSc содержит 30 %
а-спиралей и 43 % P-структур [Pan et al., 1993]
(рис. 21.2). На основании этих данных было вы-
сказано предположение, что приобретение ин-
фекционных свойств белком РгР связано с кон-
формационным переходом, при котором проис-
ходит образование Р-складчатых структур.
Позднее было показано, что конформацион-
ный переход РгРс в PrPSc может происходить
спонтанно (спорадические заболевания) благо-
даря попаданию в организм PrPSc извне (инфек-
ционные заболевания) или вследствие мутаций
в гене Ртр, способствующих образованию PrPSc
(наследственные заболевания). Окончательные
доказательства прионной концепции в экспери-
ментах на млекопитающих были получены со-
всем недавно — в 2010 г. в лаборатории И. Бас-
какова. Полученные in vitro фибриллы полно-
размерного белка РгР интрацеребрально иноку-
лировали сирийским хомячкам, после чего на-
блюдалось развитие инфекционной губчатой эн-
цефалопатии [Makarava et al., 2010].
Инфекционность PrPSc определяется тремя
основными параметрами:
1) способностью полимеров PrPSc фрагменти-
роваться на олигомеры, которые являются за-
травкой для новых раундов прионной конверсии;
Рис. 21.2. Третичная структура различных изоформ белка РгР (по [Aguzzi, Polymenidou, 2004]).
а — структура растворимой изоформы (РгРс) белка РгР с 90 по 231 а. к. сирийского хомячка; б—пред-
полагаемая модель третичной структуры человеческого белка РгР в прионной изоформе (PrPSc). Бордовым
цветом окрашены а-спиральные участки, голубым — p-слои, желтым — неструктурированные области РгР.
ГЛАВА 21 485
2) поразительной устойчивостью PrPSc к дей-
ствию протеолитических ферментов. Попадая в
организм, полимеры PrPSc не расщепляются фер-
ментами желудочно-кишечного тракта и, прони-
кая через его слизистую оболочку в кровь, они
также остаются интактными;
3) наличием специфического механизма транс-
порта частиц PrPSc. Детальный механизм транс-
порта пока не известен, однако установлено, что
чужеродные частицы PrPSc попадают через кровь
в лимфатические органы и накапливаются в фол-
ликулярных дендритных клетках. Именно в этих
клетках чужеродный агрегат PrPSc конвертирует
клеточный белок РгРс в аномальную изоформу.
На следующем этапе олигомеры PrPSc организ-
ма-хозяина транспортируются в клетки перифе-
рической, а затем и центральной нервной систе-
мы [Heikenwalder et al., 2007].
Передача прионных заболеваний между ви-
дами млекопитающих ограничена межвидовыми
барьерами (по [Prusiner, 1998]). Заболевания мо-
гут передаваться между’ особями одного вида
или особями близкородственных видов в резуль-
тате употребления в пищу’ больных животных
или инъекций инфекционного материала. На-
пример, куру и болезнь Крейцфельдта—Якоба
передаются от человека человеку и от человека
шимпанзе; скрэпи передается между’ овцами и
козами, но не передается шимпанзе и человеку
(по [Prusiner, 1998]). Молекулярные механизмы,
определяющие наличие межвидовых барьеров,
на данный момент исследованы недостаточно.
По всей вероятности, для успешной конверсии
белка в прионную изоформу за счет чужеродной
частицы PrPSc необходимо, чтобы различия в
последовательности аминокислот, вовлеченных
в формирование P-структур, не были критичны
для образования упорядоченных межмолекуляр-
ных связей.
Экспериментально доказано существование
различных конформационных вариантов PrPSc,
которые могут отличаться друг от друга инфек-
ционностью, повреждать разные участки мозга,
влиять на длительность инкубационного периода
и клинические проявления болезни [по Prusiner,
2001]. В экспериментах на модельных животных
(по [Morales et al., 2007]), а также in vitro [Castilla
et al., 2005] показано, что варианты прионов ста-
бильно поддерживаются. Это означает, что если
заражать лабораторных животных разными ва-
риантами PrPSc, то при развитии болезни у них
будет поддерживаться именно тот вариант при-
она, которым их заразили [Telling et al., 1996].
Предполагается, что разнообразие вариантов PrPSc
связано с различиями в гликозилировании PrPSc
и конформационной гибкостью белка РгР, по-
зволяющей ему’ приобретать различные патоло-
гические конформации [по Prusiner, 1998; по
Aguzzi et al., 2008].
21.3. Прионы низших эукариот
Существенный прогресс в понимании фено-
мена прионизации был достигнут благодаря об-
наружению и изучению прионоподобных факто-
ров дрожжей Saccharomyces cerevisiae. В 1994 г.
Рид Викнер выдвинул гипотезу, согласно кото-
рой два цитоплазматически наследуемых нехро-
мосомных детерминанта [РХГ] и | С/?/.3| явля-
ются дрожжевыми прионами [Wickner, 1994].
Неменделевски наследуемые детерминанты |/'S7 |
и [ТЖЕЗ] были выявлены и генетически охарак-
теризованы более 30 лет назад [Сох, 1965; Lac-
route, 19711, однако их физическая природа оста-
валась загадкой до 1993 г. Прорыв в этой облас-
ти произошел после того, как Чернов и др. пока-
зали, что амплификация гена SUP35 у дрожжей
5. cerevisiae приводит к появлению в клетках
фактора | [Chemoff etal., 1993]. Поведение
обоих упомянутых детерминантов было успеш-
но объяснено в рамках прионной модели, со-
гласно которой | и [URE3] представляют
собой прионные изоформы белков [Wickner,
1994] Sup35 (фактора терминации трансляции)
[Zhouravleva et al., 1995: Stansfield et al., 1995] и
Ure2 (негативный регулятор азотного метабо-
лизма) [Lacroute, 1971] соответственно. К на-
стоящему’ времени число идентифицированных
дрожжевых прионов выросло до семи: помимо
[As/4] и [URE3], в их число входят |/W|
[Derkatch etal., 1997, 2001], [ZSP*] [Volkov etal.,
2002], [SIL/' | [Du et al., 2008], \M()T3'\ [Alberti
etal., 2009]. [OCT*] [Patel etal., 2009] (табл. 21.1).
Недавно было выявлено еще 18 дрожжевых бел-
ков, демонстрирующих некоторые прионные
свойства [Alberti et al., 2009].
Для стабильного наследования всех извест-
ных дрожжевых прионов, за исключением [ZSP*]
[Rogoza et al., 2010], необходим шаперон Hspl04.
Все прионы дрожжей, кроме [ISP ], элиминиру-
ются на фоне делеции HSP104, а сверхэкспрес-
сия HSP104 вызывает элиминацию приона [ |
[Chemoff et al., 1995; Derkatch et al., 1997; Mo-
riyama et al., 2000; Du et al., 2008; Alberti et al.,
2009; Patel etal., 2009; Rogoza etal., 2010]. Со-
временные представления о действии Hspl04 на
прионы основаны на модели, в соответствии с
которой Hspl04 расщепляет прионные агрегаты
486 ЭПИГЕНЕТИКА
Таблица 21.1
Прионы грибов
[Прион] (фенотип, продукт) Структурный ген Вид Источник
[PS/+] (нонсенс-супрессия) SUP35* Saccharomyces cerevisiae Cox, 1965; Chernoff et aL, 1993
[URE3\ (усвоение уреидосукцината) URE2 S. cerevisiae Wickner, 1994
[PIN+] (инициация [PS/]) RNQ1 S. cerevisiae Derkatch et aL, 2001
[Het-s] (фактор несовместимости) HET-s Podospora anserina Coustou et aL, 1997
[/SP+] (антисупрессор к sup35, SFP1* S. cerevisiae Rogoza et aL, 2010
транскрипционный фактор)
[Sl/W+] (регуляция хроматина) SWI1/SNF5 S. cerevisiae Du et aL, 2008
[ОС7*] (транскрипционный фактор) CYC8/SSN6* S. cerevisiae Patel et aL, 2009
[/WOT3] (транскрипционный фактор) МОТЗ* S. cerevisiae Alberti et aL, 2009
Примечание. Звездочкой обозначены структурные гены, кодирующие белки, участвующие в транскрипции или трансляции
(см. раздел 21.11).
на олигомеры [Paushkin etal., 1996; Kushnirov,
Ter-Avanesyan, 1998]. При определенном уровне
продукции Hspl04 скорости роста полимеров и
их расщепления находятся в динамическом рав-
новесии, что обеспечивает стабильное наследо-
вание прионов. При сверхэкспрессии HSP104
расщепление идет более активно, образуется
большое количество мономеров, что нарушает
наследование приона |/А/ | и вызывает его эли-
минацию [Chemoff etal., 1995]. В случае других
дрожжевых прионов, например |/7/V | и [URE3],
сверхпродукция Hspl04 усиливает олигомериза-
цию агрегатов. Мелкие олигомеры, по-видимо-
му, не распознаются в качестве субстрата для
дальнейшего расщепления на мономеры. Деле-
ция HSP104. напротив, приводит к увеличению
размеров и уменьшению количества прионных
агрегатов, что препятствует их передаче в до-
черние клетки |Wcgrzyn etal., 2001]. АТФ-азная
активность Hspl04 инактивируется под действи-
ем гидрохлорида гуанидина (ГГХ). Добавление
ГГХ в питательную дрожжевую среду инактиви-
рует Hspl04 и вызывает полную элиминацию
дрожжевых прионов. Некоторые шапероны из
семейств Hsp70 и Hsp40 также влияют на ста-
бильность «репликации» дрожжевых прионов
(см.: [Masison et al., 2009]).
21.4. Фактор [URE3]
Фактор [URE3] представляет собой прионную
форму белка Ure2 — продукта гена URE2 [Wic-
kner, 1994; Wickner etal., 2004]. Показано, что
[7ЖЕЗ] эффективно изгоняется из клеток дрож-
жей при инкубации на среде с 1 мМ гидрохло-
ридом гуанидина (ГГХ) и способен после этого
появляться de novo с частотой 10-6. Временная
сверхпродукция белка Ure2 увеличивает частоту’
возникновения [URE3] de novo примерно в 100
раз. Фенотип [7ЖЕЗ] сходен с фенотипическим
проявлением мутаций в гене URE2, а воспроиз-
ведение приона [7ЖЕЗ] связано с наличием ин-
тактного гена URE2 (по [Wickner, 1994; Wickner
et al., 2004]).
Белок Ure2 участвует в регуляции катаболиз-
ма азота и функциониру’ет в клетке в виде диме-
ра. При росте на средах с богатыми источниками
азота белок Ure2 блокирует активность белка
Gln3 — позитивного регулятора транскрипции
многих генов, проду’кты которых участвуют в
утилизации бедных источников азота, в частно-
сти, уреидосукцината [Mitchell, Magasanik, 1984].
Мутации в гене URE2. как и наличие фактора
[7ЖЕЗ], приводят к дерепрессии ферментов ка-
таболизма азота, активность которых в норме,
при наличии богатого источника азота, подавле-
на. При этом клетки использу’ют уреидосукцинат
в качестве источника азота даже на средах с та-
кими богатыми источниками азота, как глутамин
[Drillien et al., 1973; Wickner, 1994].
Белок Ure2 дрожжей состоит из 354 амино-
кислотных остатков, и его можно подразделить
на N- и С-терминальные домены [Femandez-
Bellot etal., 1999]. К С-терминальной части бел-
ка (аминокислоты 66—354) приурочена фу’нкция
Ure2 как негативного транскрипционного регу-
лятора генов, проду’кты которых участвуют в
утилизации «бедных» источников азота, таких
как уреидосу’кцинат. N-терминальная часть Пге2
(аминокислоты 1—65) является минимальным
участком, способным обеспечивать как поддер-
жание [URE3\, так и его инду’кцию при сверхпро-
дукции этого домена [Masison, Wickner, 1995;
Masison etal., 1997]. Этот домен обладает спо-
ГЛАВА 21 487
собностью образовывать агрегаты, имеющие
[З-складчатую структуру [Taylor et al., 1999].
Следует отметить, что N-домен Ure2 не несет
аспарагин-глутаминовых повторов, характерных
для многих белков-предшественников прионов и
белков-кандидатов на эту роль [Osherovich, Weis-
sman, 2001], но обогащен аспарагиновыми ос-
татками (их содержание составляет около 40 %).
Аспарагин-богатая область продолжается вплоть
до 80-го аминокислотного остатка. Более де-
тальные исследования белков Ure2 показали, что
аминокислоты с 10 по 39 идентичны у дрожжей
5. cerevisiae, Ashbya gossypii, Candida kefyr,
C. glabrata. C. lactis [Edskes. Wickner, 2002].
Химерный белок Ure2-GFP образует агрегаты
в клетках дрожжей [Edskes et al., 1999]. Тем не
менее, экспрессия соответствующих химерных
генов в некоторых штаммах [URES\ приводила к
потере фактора [СЖЕЗ], что, возможно, связано с
тем, что присоединение химерного белка к агре-
гатам нарушает цикл генерации приона. Изуче-
ние формы агрегатов в клетках [URES\ показало,
что белок Ure2 образует глобулярные структуры
из филаментозных полимеров [Speransky et al.,
2001], причем эти структуры устойчивы к кипя-
чению и для их разрушения необходима допол-
нительная обработка мочевиной [Ripaud et al.,
2004]. Белок Ure2 также может образовывать
амилоидные структуры in vitro, сходные с фиб-
риллами прионных белков млекопитающих [Tay-
lor et al., 1999; Thual et al., 1999].
Стабильность фактора [СЖЕЗ] зависит от на-
личия в клетке белков-шаперонов Hspl04 и Ydjl
(Hsp40), при этом сверхэкспрессия гена HSP104
не изгоняет прион, тогда как сверхэкспрессия
YDJ1 приводит к элиминации приона. Штаммы с
делецией гена HSP104 не могут поддерживать
[СЖЕЗ] [Moriyama et al., 2000]. На поддержание
[СЖЕЗ] влияют также мутации в гене SSA2, ко-
дирующем шаперон Hsp70. Показано, что белки
Ure2 из дрожжей X paradoxus и X uvarum также
способны прионизоваться в дрожжах X cerevi-
siae, при этом возможна передача прионной
конформации между белками из дрожжей раз-
ных видов [Baudin-Baillieu etal., 2003; Crapeau
et al., 2009].
21.5 Фактор [PST]
|/'>S7| является слабым доминантным омни-
потентным нонсенс-супрессором или аллосу-
прессором, т. е. его появление в клетке дрожжей
способствует считыванию всех трех кодонов-
нонсенсов как значащих (рис. 21.3) [Сох, 1965;
Liebman, Sherman, 1979]. Гипотеза о прионной
природе фактора [ 7<S7 | была высказана Р. Вик-
нером. Фактор |/'<S7| представляет собой прион-
ную форму’ фактора терминации трансляции
[PS/+]
[ps/ ]
SUP35
Агрегаты Sup35
Рис. 21.3. Фенотипическое проявление прионизации белка Sup35.
Слева: мутация ade1-14 (UGA) приводит к преждевременной терминации транс-
ляции в штаммах [ps/-], что приводит к ауксотрофности по аденину: отсутствие
роста на среде -Ade и образование красных колоний на полноценной среде YPD.
Справа: в штаммах [PS/+j фактор терминации трансляции Sup35 инактивирован
вследствие прионизации, что приводит к «осмысливанию» нонсенса UGA. В ре-
зультате такой нонсенс-супрессии восстанавливается прототрофность по аденину
(рост на среде -Ade). На среде YPD образуются неокрашенные колонии.
488 ЭПИГЕНЕТИКА
eRF3 — продукта гена SUP35 [Zhuravleva et al.,
1995, Derkatch et al., 1996].
Белок Sup35 (685 а.к.) состоит из трех функ-
циональных доменов: N (1—123 а.к.), М (124—
253 а.к.), С (254—685 а.к.) [Kushnirov et al..
1988]. С-домен необходим для поддержания
жизнеспособности клетки и выполнения функ-
ции eRF3 в терминации трансляции, он консер-
вативен у всех эукариот и имеет высокую сте-
пень гомологии с фактором элонгации трансля-
ции EF-1A эукариот и EF-Tu прокариот. N- и М-
домены не существенны для жизнеспособности
клеток [Ter-Avanesyan et al., 1993]. N-домен име-
ет участки, обогащенные Gln/Asn, и олигопеп-
тидные повторы из девяти аминокислотных ос-
татков PQGGYQQYN [Kushnirov etal., 1988],
необходимые для прионизации [Ter-Avanesvan
et al., 1994].
Аспарагин-глутаминбогатый участок необхо-
дим для взаимодействия молекул Sup35 между’
собой в процессе прионизации, что обеспечивает
поддержание и передачу’ приона [PS/ ] при кле-
точных делениях. Специфичность этого взаимо-
действия — один из факторов, опосредующих
видовой барьер, — затрудненность передачи при-
онного состояния молекулам Sup35 с измененной
первичной структурой. N-терминальный участок
содержит гептапептидную последовательность
GNNQQNY (остатки а.к. 7—13), склонную к фор-
мированию стабильных связей между’ |3-склад-
чатыми слоями молеку’л Sup35, что приводит
к образованию амилоидных агрегатов. Участок
олигопептидных повторов (остатки а.к. 41—97)
содержит пять олигопептидных повторов. Де-
леционный анализ Sup35 показал, что минималь-
ный фрагмент, достаточный для индукции [PSP],
включает аспарагин-глутаминбогатый участок и
первые два олигопептидных повтора. Для под-
держания [PSP | необходимо наличие всех пяти
олигопептидных повторов [Osherovich et al., 2004].
Одно из характерных свойств приона
|/<S7| — зависимость от уровня экспрессии гена
HSP104 [Chemoff etal., 1995]. Передача |/<S7 |
дочерним клеткам требу’ет оптимального уровня
продукции шаперона Hspl04, необходимого для
разрезания крупных агрегатов Sup35 и образова-
ния так называемых прионных зерен — неболь-
ших агрегатов, за счет которых происходит пе-
редача приона в дочернюю клетку при клеточ-
ном делении.
Агрегаты белка Sup35, как выделенные из
клеток штамма [РХД], так и полученные in vitro,
при введении их в клетки дрожжей с помощью
метода белковой трансформации индуцируют
прионизацию клеточного белка Sup35 [King,
Diaz-Avalos, 2004]. Эти же эксперименты пока-
зали, что наличие вариантов прионов у дрожжей
связано исключительно со структурными осо-
бенностями прионных агрегатов и не зависит от
других белков.
21.6. Фактор [Р/лГ]
В экспериментах И. Л. Деркач с соавторами
было показано, что возможность индукции фак-
тора |/А/| в штаммах |/л>7| при сверхэкспрессии
полноразмерного гена SUP35 зависит от другого
прионоподобного элемента — |7'//V| (|7<S7| in-
ducibility). Фактор |/'//V|, так же как и фактор
|7<S7|, наследуется цитоплазматически, изгоня-
ется под воздействием ГГХ и способен возни-
кать в клетках [pin] de novo. В отличие от фак-
тора [РХГ], к элиминации фактора |/'//7| приво-
дит только делеция гена HSP104, но не его
сверхэкспрессия. Фактор |7'Л7 | может быть ин-
дуцирован в штаммах [pin ] при сверхпродукции
N-терминальных фрагментов белка Sup35, со-
держащих специфические С-концевые последо-
вательности (так называемые магические пепти-
ды), при этом возникающие клоны |/'5>7| сохра-
няют фенотип [pin ] [Derkatch et al., 1997; 2000].
Данные о молекулярной природе фактора
|7'//V| были получены в работах групп С. Либ-
ман и Дж. Вейссмана [Derkatch et al.. 2001; Oshe-
rovich, Weissman, 2001]. В этих работах были
идентифицированы несколько белков У. cerevi-
siae, прионизация которых может определять
|7'/Лг |-состоянис клетки. Оказалось, что |/'//У |-
стату’с штаммов 5. cerevisiae, в которых фактор
|7'//V | был впервые идентифицирован и которые
использовались для его дальнейшего изучения,
определяется наличием прионной формы белка
Rnql [Derkatch etal., 2001; Osherovich. Weissman.
2001].
Белок Rnql подразделяют на два домена: N-
терминальный (1—152 а.к.) и С-терминальный
(153—405 а.к.), богатый Asn/Gln и способный к
переходу’ в прионную конформацию [Sondhei-
mer, Lindquist, 2000]. Какие-либо функции этого
белка, не связанные с участием в прионизации
eRF3, неизвестны, однако диплоиды, гомозигот-
ные по делеции гена RNQ1, образуют восьми-
споровые аски с частотой 1—4 % [Orlowska-Ma-
tuszewska, Wawrzycka, 2006]. Показано, что для
поддержания |7'//V| необходимо наличие ин-
тактного гена RNQ4, а сверхпродукция Rnql
увеличивает частоту’ возникновения |7'//V| de
novo [Derkatch etal., 2001]. Роль [РТАД-фактора
ГЛАВА 21 489
могут выполнять также другие известные при-
оны X cerevisiae, например, [URE3] [Derkatch
et al., 2001; Osherovich, Weissman, 2001].
Прионная природа фактора |/'/Аг| была под-
тверждена в экспериментах по трансформации
клеток дрожжей [pin]-агрегатами белка Rnql,
полученными in vitro, и экстрактами клеток, не-
сущих фактор [Р7ЛГ]. В обоих случаях эндоген-
ные агрегаты белка Rnql вызывали прионизацию
клеточного белка Rnql [Patel, Liebman, 2007].
Показано, что фенотип Pin+ может возникать
при сверхэкспрессии 11 генов, продукты кото-
рых участвуют в различных клеточных процес-
сах [berkatch et al., 2001]. Так, белки Swil и Сус8
связаны с регуляцией транскрипции, Yckl и
Stel8 участвуют в сигнальной трансдукции,
Nupll6 важен для ядерного транспорта, a Lsm4
вовлечен в процессинг мРНК. В число этих 11
генов попали и гены RNQ1, URE2 и NEW1, коди-
рующие структурные белки известных прионов.
Продукты других генов не охарактеризованы, но
известно, что все они содержат Q- или N-бога-
тые домены. Таким образом, ЦУМ-домены струк-
турных белков различных прионов могут взаи-
модействовать, при этом взаимодействие может
быть позитивным и приводить к сборке одного
приона на матрице другого, а может быть и не-
гативным. Например, фактор |7'Л7| ингибирует
возникновение фактора |А7?/.3| при сверхэкс-
пресии URE2 [Bradley et al., 2002; Derkatch et al.,
2004]. Сверхпродукция белка RnqlAlOO, у кото-
рого делетирован N-терминальный неприонный
домен, приводит к элиминации факторов |/<S7|,
[URE3] и агрегатов polyQ в штаммах |7'/Аг|
[Kurahashi etal., 2008]. Белок RnqlAlOO спосо-
бен как включаться в агрегаты, образованные
полноразмерным белком Rnql, так и агрегиро-
вать сам по себе. При этом в штаммах с прион-
ной формой белка RnqlAlOO индукция фактора
|/'5>7| приводит к потере фактора [RnqlAlOO^]
[Kurahashi et al., 2009].
В работе И. Л. Деркач с соавторами была по-
казана колокализация in vivo агрегатов |7'/Аг| с
образующимися агрегатами [РАТ]. Эти данные
подтверждают «модель затравки» (seeding mo-
del), в соответствии с которой можно говорить,
что |/'/Аг| служит матрицей, или затравкой
(«seed»), на которой начинают собираться агре-
гаты [PSP] [Derkatch etal., 2004]. Для сборки
прионных агрегатов Sup35 требуется не только
физическое сближение мономеров за счет при-
соединения к затравке, но и изменение их изо-
формы. С этим положением согласуются данные
по замене С-домена белка Sup35 на один из
ферментов биосинтеза пуринов — Ade2, постро-
енного из идентичных субъединиц [Борхсе-
ниус и др., 2002]. Продукция химерного белка
Sup35NM-Ade2 в штаммах |7'/Аг| стимулирует
нонсенс-супрессию, которая связана с повышен-
ной эффективностью возникновения |/<S7 |-по-
добного фактора. В то же время в штаммах [pin ]
белок Sup35NM-Ade2 также образует агрегаты,
по-видимому, за счет взаимодействия последо-
вательностей Ade2, но эти агрегаты не являются
прионными и не вызывают индукцию фактора
[РАТ] [Там же].
21.7. Факторы [/SP+], [SWf], [ЛЮТЗ+]
и[ОСГ]
Целенаправленный поиск прионов и исследо-
вание факторов, предположительно имеющих
прионную природу, привели к открытию в нача-
ле XXI в. ряда новых белков дрожжей A. cere-
visiae, способных к прионному’ превращению.
Первым в этом ряду’ был фактор 11SP ]. присут-
ствие которого в клетке снижает эффективность
нонсенс-супрессии у мутантов по гену SUP35.
Фактор |/Л7' | обратимо изгоняется при инкуба-
ции на среде с ГГХ, проявление этого детерми-
нанта доминантно при скрещивании штаммов
[7ХРЦ со штаммами [А/f]. [7ХР*] проявляет не-
хромосомный характер наследования. Отсутст-
вие шаперона Hspl04, так же как и его сверх-
продукция, не влияет на проявление и поддер-
жание |/Л7' | [Рогоза и др., 2009]. Структурный
ген фактора |ISP+] — SFP1 кодирует транскрип-
ционный фактор, участвующий в контроле экс-
прессии рибосомных генов, определяющий раз-
мер дрожжевой клетки и ее готовность к митозу
[Xu, Norris, 1998; Marion et al., 2004; Cipollina
et al., 2005]. Сверхэкспрессия гена SFP1 индуци-
рует появление [7SF+], делеция гена SFP1 приво-
дит к потере этого фактора [Рогоза и др., 2009;
Rogoza et al., 2010].
Фактор [S7F/| — это прионная форма белка
Syvil, входящего в эволюционно консерватив-
ный АТФ-зависимый хроматинремодулирую-
щий комплекс SWI/SNF, участвующий в транс-
крипционной регуляции экспрессии 6 % генов
дрожжей A. cerevisiae. N-концевая область белка
Syvil обогащена глутамином и аспарагином и
необходима для поддержания фактора [ХИТ].
Белок Syvil агрегирует в клетках [S7k7 |, при
этом наблюдается частичная инактивация ком-
плекса SWI/SNF. Фактор [S7F/ | изгоняется при
инкубации на среде с ГГХ или делецией гена
HSP104. Сверхэкспрессия гена HSP104 не влияет
490 ЭПИГЕНЕТИКА
на стабильность фактора |Л'1Г/|. Фактор |Л'1Г/|
доминантен и способен передаваться цитоплаз-
матически [Du etal., 2008]. Позднее была пока-
зана способность Swil образовывать амилоид-
ные агрегаты в цитоплазме клеток дрожжей
[Alberti et al., 2009].
Фактор \MOT3 ' \ обнаружен в процессе поис-
ка дрожжевых белков, способных к прионизации
[Ibid]. Белок Mot3p — это транскрипционный
фактор, участвующий в регуляции скрещивания,
метаболизма углерода и стресс-ответа [Grishin
etal., 1998]. В аэробных условиях он подавляет
экспрессию генов, отвечающих за рост в ан-
аэробных условиях, в частности, DAN1. Прион-
ный домен белка Mot3, слитый с желтым флуо-
ресцирующим белком EYFP, образует видимые
агрегаты. Прионный домен белка Mot3 образует
in vitro амилоидные агрегаты, устойчивые к 2 %
SDS. Фактор \MOT3 ] наследуется доминантно,
изгоняется при инкубации на среде с ГГХ, его
стабильность зависит от шаперона Hspl04 [Al-
berti et al., 2009].
Фактор [OCT"] — прионная форма белка
Сус8, входящего в состав транскрипционного
регуляторного комплекса Cyc8-Tupl, контроли-
рующего экспрессию более 7 % генов дрожжей
5. cerevisiae. Белок Сус8 был выявлен в скринин-
ге белков, сверхпродукция которых повышает
частот^’ возникновения фактора |7'Л7| de novo.
Сверхпродукция прионного С-терминального
домена (а.к. 465—966) белка Сус8 приводит к
появлению фактора [ОС’7^]. Фактор [ОС Т"] на-
следуется доминантно, передается при цитодук-
ции, изгоняется при инкубации на среде с ГГХ и
инактивации белка Hspl04. Сверхэкспрессия ге-
на HSP104 не влияет на стабильность фактора
| ОС 7|. В клетках | ОС'7 | химерный белок Сус8-
YFP образует агрегаты как в цитоплазме, так и в
ядре [Patel et al., 2009].
21.8. Фактор [Het-s] мицелиального гриба
PODOSPORA ANSERINA
Фактор [Het-s]— это еще один пример эпиге-
нетического изменения, обусловленного прион-
ной конверсией, которое стабильно наследуются.
Слияние гиф грибов, принадлежащих к дву’м
разным мицелиям, приводит к образованию ге-
терокариона. Однако чаще всего этот процесс
заканчивается гибелью образовавшейся гетеро-
ядерной клетки из-за различий между’ двумя ми-
целиями по аллелям генов несовместимости
(рис. 21.4). У гриба-аскомицета Podospora anse-
rina известно девять локусов het (от heterokaryon
[Het-s] [Het-S]
Мейоз
образование спор
спора [Het-s*]
Гибель гетерокариона (несовместимость)
спора [Het-s]
погибшая спора [Het-S]
Рис. 21.4. Система несовместимости [Het-s]l[Het-S] [Saupe, 2011].
а — гетерокарион, образующийся в результате слияния мицелиев [Het-s] и [Het-S], погибает; б—прион [Het-s] способен пере-
даваться при половом размножении.
ГЛАВА 21 491
formation), контролирующих вегетативную несо-
вместимость. Один из них — локус het-s пред-
ставлен двумя аллелями (het-s и het-S). Номенк-
латура, принятая для обозначения аллелей ге-
на het-s и конформационных состояний соответ-
ствующего белка, представлена в табл. 21.2.
В штаммах | Hct-s* | белок HET-s находится в
нативной конформации; если происходит при-
онизация белка HET-s, то фенотип штамма обо-
значают как [ffet-s], Штаммы fHet-sJ несовмес-
тимы со штаммами |Не7-5|, тогда как штаммы
[Het-5*], в которых белок HET-s находится в не-
прионном состоянии, могут образовывать гете-
рокарионы со штаммами [Het-5],
Мейотические сегреганты, полученные от
скрещивания штаммов [Het-5] и [Het-5], могут
быть двух фенотипов: два потомка имеют фено-
тип [Het-5], а два других — фенотип [Het-5*],
который не дает реакции несовместимости ни со
штаммом [Het-5], ни с [Het-5], Таким образом,
продукт аллели het-S «излечивает» клетки от фе-
нотипа [Het-5], Фенотип [Het-5*] стабильно под-
держивается во время вегетативного роста, но
может с низкой частотой спонтанно становиться
[Het-5'J (обратимое излечивание). Эта фенотипи-
ческая конверсия происходит во всех случаях
после слияния гиф и смешивания цитоплазмы со
штаммом [Het-5], При этом фенотип [Het-5] до-
минантен и не зависит от переноса ядер. Скре-
щивания между [Het-5] и |Het-5*] дают единооб-
разное потомство [Het-5] в том случае, когда
штамм [Het-v] является женским партнером. Ес-
ли женским партнером является [Het-5*], то по-
томки в основном имеют фенотип [Het-5*]. Та-
ким образом, детерминант [Het-5] ведет себя как
неменделевски наследуемый цитоплазматиче-
ский фактор (по [Coustou etal., 1997; Wickner
et al., 2004]).
Tаблица 21.2
Обозначения, принятые для компонентов системы
вегетативной несовместимости het-s
het-S Аллель het-S
het-s Аллель het-s
HET-S Белок, кодируемый аллелью het-S
HET-s Белок, кодируемый аллелью het-s
[Het-S] Фенотип штамма с аллелью het-S в хромосоме
[Het-s*] Фенотип штамма с аллелью het-s в хромосоме и белком HET-s в неприонной конформации
[Het-s] Фенотип штамма с аллелью het-s и белком HET-s в прионной конформации, а также обозначение соответствующего приона
Для фактора [Het-5] характерен ряд свойств,
сходных для многих прионов: (1) для превраще-
ния [Het-5*] в [Het-5] необходима аллель het-s (на
фоне делеции гена het-s фенотип [Het-51 не мо-
жет поддерживаться); (2) сверхэкспрессия гена
het-s увеличивает частоту индукции фенотипа
[Het-5]; (3) превращение [Het-5*] в [Het-5] идет в
отсутствие белкового синтеза; (4) белок HET-s
имеет одинаковую электрофоретическую по-
движность и содержится в одинаковом коли-
честве как в штаммах [Het-5*], так и в штаммах
[Het-5] [Coustou etal., 1997, 1999]; (5) показана
способность белка HET-s образовывать амилои-
доподобные агрегаты in vivo [Coustou-Linares
et al., 2001] и in vitro [Dos Reis et al., 2002], при
этом агрегаты, полученные in vitro, являются
инфекционными [Maddelein et al., 2002].
В то же время детерминант [Het-5] отличается
от дрожжевых прионов:
1) его невозможно элиминировать с помощью
ГГХ при обычных условиях, однако этого можно
добиться при регенерации мицелия из протопла-
стов [Coustou et al., 1997];
2) ни сверхэкспрессия, ни делеция гена
HSP104 Р. anserine не изгоняет [Het-5] [Malato
et al., 2007].
Еще одно важное отличие [Het-5] от боль-
шинства известных прионов: прионное превра-
щение белка HET-s не приводит к его инактива-
ции и, более того, является необходимым усло-
вием функционирования этого белка в клетке
[Coustou et al., 1997].
Белок HET-s отличается от всех остальных
известных прионных белков низших эукариот
отсутствием участков с повышенным содержа-
нием глутамина и аспарагина. В ходе изучения
трехмерной структуры белка HET-s границы и
функции доменов были определены следующим
образом: N-домен (а.к. 1—217), образованный в
основном а-спиралями, важен для несовмести-
мости, тогда как неструктурированный С-домен
(а.к. 218—289) участвует в прионизации [Ва1-
guerie et al., 2003]. После перехода в прионную
конформацию в структуре С-домена преоблада-
ют [3-слои, образующие кор, устойчивый к про-
теиназе К [Balguerie etal., 2004]. Изучение фиб-
рилл, полученных in vitro, показало, что HET-s
(а.к. 218—289) образует левозакрученный |3-со-
леноид с треугольным гидрофобным кором
[Wasmer et al., 2008]. Каждый мономер содержит
два несовершенных повтора 21 аминокислоты,
которые, в свою очередь, образуют по 4 |3-тяжа,
при этом первые три |3-тяжа образуют кор, а чет-
вертый выступает наружу. Сравнение данных о
492 ЭПИГЕНЕТИКА
структуре прионных фибрилл показало, что для
дрожжевых прионов (|/7Л' |, [РХД], [URE3]) ха-
рактерна структура Р-серпентина, когда каждый
мономер образует несколько Р-тяжей, находя-
щихся в одной плоскости. Такая структура по-
зволяет варьировать размер и число Р-тяжей, по-
этому’ для дрожжевых прионов характерно нали-
чие так называемых штаммов прионов, разли-
чающихся по структуре и фенотипическому’ про-
явлению. Более жесткая структура Р-соленоида
препятствует образованию разных вариантов
укладки, и «штаммов» [Het-s] до сих пор обна-
ружено не было.
Для фибрилл HET-s (а.к. 218—289) харак-
терна полярность, и добавление новых мономе-
ров в условиях in vitro при комнатной темпера-
туре происходит только с одного конца. Меха-
низм добавления мономера к уже имеющемуся
амилоиду’ включает в себя присоединение не-
структурированного прионного домена к по-
верхности фибриллы с последующим конформа-
ционным изменением и встраиванием в структу-
ру фибриллы [Baiesi et al., 2011].
Гомологи het-s обнаружены у многих мице-
лиальных грибов, в частности, у гриба Fusarium
graminearum найден ген Fghet-s. Хотя эти два
рода грибов разошлись примерно 400 млн лет
назад, идентичность двух белков составляет
50 %, при этом возможна межвидовая передача
прионного состояния [Benkemoun etal.. 2011].
Прионный домен FgHET-s (а. к. 218—289) обра-
зует амилоиды in vitro, и эти фибриллы могут
быть матрицей для полимеризации HET-s (а.к.
218—289), и наоборот. Более того, фибриллы
FgHET-s, полимеризованные in vitro, способны
инициировать прионизацию HET-s in vivo в клет-
ках Р. ansenna. Важным отличием прионной
формы FgHET-s (а.к. 218—289) является час-
тичная зависимость ее стабильности от наличия
шаперона Hspl04. Делеция, но не сверхэкспрес-
сия гена HSP104 приводит к потере прионной
формы белка FgHET-s (а.к. 218—289) в клетках
Р. anserina [Benkemoun et al., 2011].
Белок HET-s (а.к. 218—289) способен при-
онизоваться и при экспрессии его структурного
гена в клетках дрожжей 5. cerevisiae. В этом
случае поддержание, но не индукция прионной
конформации требует наличия белка-шаперона
Hspl04 [Taneja et al., 2007].
21.9. Прионы и память — белок СРЕВ Aplysia
Белки семейства СРЕВ обнаружены в разных
типах тканей животных, их основная функция —
регуляция трансляции специфических мРНК.
Связывание этих белков с U-богатыми цито-
плазматическими сигналами полиаденилиро-
вания (cytosolic polyadenilation element — CPE) в
З'-нетранслируемых областях мРНК стимулиру-
ет полиаденилирование этих мРНК [Richter,
2007]. Нейрон-специфическая форма СРЕВ син-
тезируется в пресинаптических терминалях мол-
люска Aplysia, где ее активация приводит к си-
наптической стимуляции. Активированная фор-
ма СРЕВ стимулирует элонгацию поли(А)после-
довательностей CPE-содержащих мРНК, коди-
рующих структурные и регуляторные белки,
обеспечивающие рост синапсов. Для активации
необходима мультимеризация белка СРЕВ, по-
вышающая его стабильность. Нейрональная
форма СРЕВ отличается от других клеточных
форм наличием глутамин-богатого N-терминаль-
ного участка, сходного с дрожжевыми прион-
ными доменами [Si et al., 2003]. Усиленный син-
тез белка СРЕВ в нейронах Aplysia приводит к
образованию мультимеров амилоидной приро-
ды. Конверсия в мультимеры стимулируется
нейротрансмиттерами, в частности серотонином,
а блокирование конверсии с помощью специфи-
ческих антител приводит к нарушению проведе-
ния сигнала в синапсах. Более того, гомолог
СРЕВ дрозофилы — белок ОгЬ2 необходим для
формирования нормального поведения ухажива-
ния у самцов. У белка ОгЬ2, так же как и у СРЕВ
Aplysia, есть N-концевая глутаминбогатая после-
довательность, делеция которой нарушает фор-
мирование долговременной памяти, что указы-
вает на важную физиологическую роль этой по-
следовательности [Hafer et al., 2011].
Синтез СРЕВ, слитого с GFP, приводил к
образованию видимых агрегатов в нейронах
(рис. 21.5), делеция N-домена белка СРЕВ по-
давляла эту’ способность. Специфические анти-
тела к агрегированной форме СРЕВ выявили ее
наличие в нервной ткани. Для мультимсризации
в нейронах нужен полноразмерный белок СРЕВ,
прионный домен СРЕВ сам по себе агрегаты в
нейронах не образует. Мышиный СРЕВ не имеет
N-терминального прионного домена и не обра-
зует агрегатов, если его экспрессировать в ней-
ронах Aplysia. Если пришить к белку- СРЕВ мы-
ши прионный домен белка СРЕВ Aplysia, то та-
кой химерный белок агрегирует в нейронах
Aplysia, если же к нему- пришить последователь-
ность ho.hhQ — не агрегирует. Таким образом,
для прионизации белка СРЕВ необходимо спе-
цифическое взаимодействие между’ его N- и С-
доменами [Si et al., 2010].
ГЛАВА 21 493
В дрожжах белок СРЕВ может существовать
в двух формах: активированной и неактив-
ной. Активированная форма СРЕВ стимулирует
трансляцию репортерной мРНК, у которой есть
специфический сигнал. Эта форма СРЕВ пред-
ставляет собой комплекс с РНК, больший по
размерам, чем неактивная форма, при этом воз-
можно формирование различающихся по актив-
ности форм — вариантов прионов. Эти прион-
ные варианты стабильно наследуются в ряду' по-
колений, передаются при цитодукции, домини-
руют в скрещивании со штаммами, не несущими
приона. Предполагаемый прионный домен СРЕВ
имеет в длину' 128 а.к._ он способен образовы-
вать агрегаты in vitro, эти агрегаты связывали
тиофлавин Т, подобно другим амилоидам, и вы-
зывали при белковой трансформации агрегацию
СРЕВ in vivo [Heinrich, Lindquist, 2011].
21.10. Взаимодействие инфекционных
И НЕИНФЕКЦИОННЫХ АМИЛОИДОВ.
Прионные сети
Накопленные к настоящему’ времени данные
свидетельствуют о том, что инфекционные и не-
инфекционные амилоиды могут взаимодейство-
вать и наличие амилоидных полимеров одного
белка может инициировать прионогенез другого.
Неинфекционные амилоиды, в отличие от при-
онов, не фрагментируются и, вследствие этого,
не наследуются. Однако они могут способство-
вать индукции прионов и, таким образом, вовле-
каются в регуляцию эпигенетических событий.
Например, пролонгированная полиглутаминовая
последовательность белка Хангтигтина форми-
рует неинфекционные амилодные полимеры в
дрожжевой клетке, что значительно повышает
частоты индукции приона |/А/| [Derkatch et al.,
2004]. В присутствии дрожжевого приона |/'/Аг|
возрастает частота индукции |/А/| и [tZRE3], а
наличие в клетке |7А/| или |1/7?/.3| усиливает
эффективность спонтанного возникновения de
novo |7'/Ar| [Derkatch etal., 2001]. При этом
|7<S7| или [ URE3\ являются антагонистами по
отношению друг к другу, что выражается в по-
вышении частоты элиминации одного из сосу-
ществующих прионов [Schwimmer, Masison,
2002]. Следует упомянуть о том, что некоторые
варианты |7'/Аг| оказывают дестабилизирующее
воздействие на слабые варианты |/А/| (по [Der-
katch, Liebman, 2007]). Взаимодействие дрож-
жевых прионов может быть связано со сходст-
вом их первичной структуры, а именно с нали-
чием Q/N-обогащенных последовательностей,
Рис. 21.5. Агрегация белка СРЕВ, слитого с белком
GFP, в нейронах улитки Aplysia [Si et al., 2010].
которые и формируют амилоидные полимеры.
В работе И. Л. Деркач было выявлено 11 белков,
сверхпродукция которых повышала частоту ин-
дукции [ 7<S7 | [Derkatch et al., 2001]. Большинст-
во из них были обогащены Q/N-последователь-
ностями. Можно предположить, что Q/N-обо-
гащенные прионы, такие как |/'/Аг |, связывают
сходную по структуре последовательность Sup35,
что способствует физическому^ сближению мо-
номеров, последующему’ изменению их конфор-
мации и, как следствие, индукции |/'Л7 |. Есть
основания полагать, что взаимодействующие
друг с другом инфекционные, а также инфекци-
онные и неинфекционные амилоиды объединя-
ются в так называемые прионные сети, хотя
функциональная роль такого рода взаимодейст-
вий остается неясной.
Сходные взаимодействия отмечены и для
амилоидных белков млекопитающих. В частно-
сти, РгР входит в состав амилоидных образова-
ний, которые выявляются в головном мозге в
случаях болезней Альцгеймера и Паркинсона
[Kovacs etal., 2002]. Более того, РгР в прионной
изоформе инициирует агрегацию пептида АВ,
образующего амилоиды при болезни Альцгей-
мера [Schwarze-Eicker etal., 2005]. Агрегация
АВ, а также а-синуклеина вызывает гиперфос-
форилирование и, как следствие, олигомериза-
цию пептида tau, что приводит к развитию ней-
родегенерации [Rank etal., 2002: Giasson etal.,
2003]. Агрегаты tau, в свою очередь, индуциру-
ют образование амилоидных включений а-си-
нуклеина [Giasson etal., 2003]. Наиболее полно
494 ЭПИГЕНЕТИКА
охарактеризованы взаимодействия РгР и АВ. Не-
давно были опубликованы данные, согласно ко-
торым белок РгР, заякоренный на мембране ней-
ронов, является рецептором для патогенных
олигомеров Ар [Lauren etal.. 2009J. Парадок-
сально, но факт — белок РгР, конформационные
изменения которого вызывают прионные забо-
левания, в нормальной клеточной изоформе мо-
жет быть вовлечен в патогенез болезни Альц-
геймера. Более того, показано, что олигомеры
Ар индуцируют болезнетворную агрегацию РгР,
так же как прионные полимеры РгР инкорпори-
руют пептид Ар и способствуют его агрегации
[Morales etal.. 2010]. Важно отметить, что физи-
ческое связывание РгР и Ар отмечается лишь в
том случае, когда один из этих двух белков
представлен в виде амилоидных олигомеров,
мономеры РгР и Ар друг с другом не взаимодей-
ствуют [Freir etal., 2011]. Исходя из этих дан-
ных, можно заключить, что взаимодействие про-
воцируется конформационным изменением од-
ного из партнеров.
Далеко не всегда наличие амилоидных поли-
меров одного белка провоцирует прионизацию
другого белка. По всей видимости, для этого не-
обходимо определенное структурное сходство
амилоидогенных последовательностей. Вместе с
тем, амилоидные полимеры разных белков могут
демонстрировать неспецифическое связывание,
которое объясняется случайными взаимодейст-
виями последовательностей, формирующих не-
упорядоченные P-структуры. Так, при одновре-
РНК » Белок
ч ч
I ч
/ *
х Конформер белка
МП II рода | |
Конформер белка
Рис. 21.6. Модификация Центральной Догмы молеку-
лярной биологии. Кольцевые стрелки — репликация,
прямые — транскрипция и трансляция; сплошные ли-
нии — типичные, штрих — нетипичные клеточные про-
цессы (по [Crick, 1970] с модификациями). МП — мат-
ричные процессы.
менной продукции в дрожжевой клетке амило-
идного белка транстиретина млекопитающих и
прионного домена белка Sup35 в ряде случаев
наблюдали колокализацию агрегатов [Derkatch
et al.. 2004].
Как можно видеть из представленных дан-
ных, в большинстве случаев прионизация или
формирование неинфекционных амилоидов при-
водят к негативным последствиям. Вместе с тем,
как уже было отмечено, прионная изоформа бел-
ка СРЕВ необходима для формирования долго-
временной памяти у Aplysia. а дрожжевой прион
[ZSP-1-] (прионная изоформа белка Sfpl) способ-
ствует повышению темпов роста дрожжей и их
устойчивости к антибиотикам, по крайней мере,
на определенном генетическом фоне. Таким об-
разом, нельзя говорить о роли прионов или при-
онизации вообще, а необходимо рассматривать
конкретные примеры. Можно допустить, что
в ходе эволюции прионная конверсия, как и
в большинстве случаев доминантные мутации,
чаще всего отметается отбором, но иногда может
приводить к возникновению адаптивных изме-
нений.
21.11. Расширение матричного принципа.
Центральная Догма молекулярной
БИОЛОГИИ И КОНФОРМАЦИОННЫЕ
МАТРИЦЫ
Современные представления о механизмах
наследственности и изменчивости наиболее аде-
кватно отражает матричный принцип, восходя-
щий к идее Н. К. Кольцова о воспроизведении
хромосом [Кольцов, 1936] и позже нашедший
воплощение в Центральной Догме молскулярной
биологии Ф. Крика [Crick, 1958, 1970]. При та-
ком понимании Центральной Догмы (сравните с
ее распространенной и неверной интерпретацией
как путей переноса информации в клетке) она
четко отображает воспроизведение генетическо-
го материала и экспрессию генов. При этом су-
щественно, что Центральная Догма оперирует с
матрицами последовательности, когда чередова-
ние элементов исходного полимера (матрицы)
определяет чередование элементов дочернего
полимера: полидсзоксирибонуклсотидов при
репликации ДНК, рибонуклеотидов при транс-
крипции и аминокислотных остатков при транс-
ляции. Эти матричные процессы мы предлагаем
назвать матричными процессами I рода. Вместе
с тем, явления, которым посвящена настоящая
глава, требуют рассматривать и матричные про-
цессы II рода (рис. 21.6) [Инге-Вечтомов, 2003].
ГЛАВА 21 495
Их существование основано на так называемых
конформационных, или пространственных, мат-
рицах, когда пространственная укладка поли-
пептидной цепи индуцирует аналогичную ук-
ладку вновь синтезируемых гомологичных (и не
только гомологичных) полипептидных цепей,
как мы показали ранее.
Важно, что существование конформационных
матриц подразумевает возможность пространст-
венной изменчивости белков без изменения их
первичной структуры. Изменяется только кон-
формация, которая далее воспроизводится в ходе
матричных процессов II рода.
Для матричных процессов I рода характерны
некоторые общие свойства. Это три этапа: ини-
циация, элонгация (копирование), терминация.
Кроме того, этим матричным процессам свойст-
венны неоднозначность (ошибки, употребляя бо-
лее антропоморфный термин) и возможность
коррекции или репарации. Баланс этих двух по-
следних свойств определяет оптимальный уро-
вень неоднозначности матричных процессов
I рода и тем самым задает уровень наследствен-
ной и модификационной изменчивости, поддер-
живаемый в процессе эволюции на постоянном
уровне, характерном для различных таксонов.
Матричные процессы II рода изучены значи-
тельно хуже. Поэтому’ подобные обобщения для
них были бы преждевременными. Тем не менее,
очевидно, что исследование конформационных
матриц — это путь к более глубокому понима-
нию белок-белковых взаимодействий, воспроиз-
ведения надмолекулярных структур и трехмер-
ной организации клетки. При этом следует учи-
тывать, что МП I и II рода взаимодействуют. Эти
взаимодействия практически еще не изучены.
В табл. 21.1 отмечены (*) гены дрожжей, про-
ду’кты которых способны к прионизации и уча-
ствуют в регуляции МП I рода.
Часть данных, представленных в настоящем
обзоре, была получена в ходе выполнения сле-
дующих проектов: Программа президиума РАН
«Фундаментальные науки медицине»; проект
«Поиск белков, контролирующих амилоидогенез
при болезни Альцгеймера»; грант РФФИ 10-04-
00395-а «Идентификация нового дрожжевого
прионоподобного фактора [ЖГ]: грант Президен-
та РФ для государственной поддержки ведущих
научных школ НШ-5345.2012.4 «Роль организа-
ции и экспрессии генетического материала в на-
следственной и ненаследственной изменчивости»;
ФЦП Научные и научно-педагогические кадры
инновационной России «Изучение молекулярных
механизмов нейродегенеративных заболеваний
человека и животных с использованием модель-
ного организма дрожжей-сахаромицетов».
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Борхсениус А. С., Саснаускас К., Гедвилайте А., Пнге-Веч-
томов С. Г. Химерные прионы дрожжей с нестабиль-
ным наследованием // Генетика. 2002. Т. 38. С. 300—305.
Пнге-Вечтомов С. Г. Матричный принцип в биологии И
Экологическая генетика. 2003. Т. 1, спец. вып. С. 6—15.
Кольцов Н. К. Наследственные молекулы И Организация
клетки. М.; Л.: Гос. изд. биол. и мед., 1936. С. 585 <520.
Конюхов Б. В.. Платонов Е. С. Геномный импринтинг у
млекопитающих и Генетика. 2001. Т. 37. С. 5—17.
Рогоза Т. AL, Викторовская О. В., Родионова С. . I., Ива-
нов М. С.. Волков К. В.. Миронова Л. Н. Поиск генов,
влияющих на поддержание антисупрессорного прио-
ноподобного детерминанта [ISP ] у дрожжей с помощью
инсерционной библиотеки генов // Молекулярная
биология. 2009. Т. 43. С. 392—399.
ЧураевР.Н. Гипотеза об эпигене// Исследования по ма-
тематической генетике / ИЦиГ СО АН СССР. Ново-
сибирск, 1975. С. 77—94.
Чураев Р. Н. Контуры неканонической теории наследствен-
ности: от генов к эпигенам 7 Журнал общей биологии.
2005. Т. 66, № 2. С. 99—122.
Чураев Р. Н., Ратнер В.. I. Моделирование динамики сис-
тем управления развитием Z-фага // Исследования по
математической генетике / ИЦиГ СО АН СССР.
Новосибирск, 1975. С. 5—66.
Allis С. D.. Jenuwein Т., ReinbergD.. CaparrosM.-L. Epige-
netics. N. Y.: Cold Spring Harbor Eaboratory Press. 2007.
(Русский перевод: Эпигенетика. M.: Техносфера, 2010.
496 с.).
Aguzzi A., Polymenidou AL. Mammalian prion biology: one
century' of evolving concepts// Cell. 2004. Vol. 116.
P. 313—327.
Aguzzi A., Baumann F, Bremer J. The prion's elusive reason for
being 11 Annu. Rev. Neurosci. 2008. Vol. 31. P. 439—477.
Alberti S., Halfinann R., KingO., Kapila A., LindquistS. A sys-
tematic survey identifies prions and illuminates sequence
features of prionogenic proteins // Cell. 2009. Vol. 137.
P. 146—158.
Alper T., Cramp JJ’. A., HaigD. A., Clarke AL C. Does the agent
of scrapie replicate without nucleic acid? // Nature. 1967.
Vol. 214. P. 764.
liaiesi M., SenoF., TrovatoA. Fibril elongation mechanisms of
HET-s prion-forming domain: topological evidence for
growth polarity' / Proteins. 2011. Vol. 79. P. 3067—3081.
Balguerie A., DosReisS., Ritter C., Chaignepain S., Coulary-
Salin B., Forge J’., Bathany K., Lascu I., Schmitter J. AL,
RiekR., Saupe S. J. Domain organization and structure-
function relationship of the HET-s prion protein of Po-
dospora anserina // EMBO J. 2003. Vol. 22. P. 2071 —
2081.
Balguerie A., DosReisS., Coulary-Salin B., ChaignepainS.,
SabourinAL, Schmitter J. AL., Saupe S. J. The sequences
appended to the amyloid core region of the HET-s prion
protein determine higher-order aggregate organization in
vivo " J. Cell Sci. 2004. Vol. 1 17. P. 2599—2610.
Baudin-Baillieu A., Femandez-Bellot E., ReineF, Coissac E.,
Cullin C. Conservation of the prion properties of Ure2p
through evolution" Mol. Biol. Cell. 2003. Vol. 14.
p. 3449—3458.
Benkemoun L., NessE, Sabate R, Ceschin J., Breton A.,
Clave C, Saupe S. J. Two structurally similar fungal pri-
ons efficiently cross-seed in vivo but form distinct poly-
mers when coexpressed // Mol. Microbiol. 2011. Vol. 82.
P. 1392—1405.
496 ЭПИГЕНЕТИКА
Bradley Л/. Л., Edskes Н. К., HongJ.Y., Wickner R В., Lieb-
man S. W. Interactions among prions and prion «strains»
in yeast // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. Vol. 99.
P. 16392—16399.
Bremer J., Baumann F, TiberiC., WessigC., Fischer H,
Schwarz P., Steele A. D., Toyka K. V, Nave K. A., Weis J.,
Aguzzi A. Axonal prion protein is required for peripheral
myelin maintenance // Nat. Neurosci. 2010. Vol. 13.
P.310 318.
BiielerH, Fischer AL, LangY., Bluethmann H, Lipp H. P.,
DeArmondS. J., Prusiner S. B., AguetAL, Weissmann C.
Normal development and behaviour of mice lacking the
neuronal cell-surface PrP protein '/ Nature. 1992.
Vol. 356. P. 577—582.
Castilla J., Sad P., Hetz C, Soto C. In vitro generation of infec-
tious scrapie prions/7 Cell. 2005. Vol. 121. P. 195—
206.
CaugheyB., Raymond G. J., Ernst D., Race R. E. N-terminal
truncation of the scrapie-associated form of PrP by ly-
sosomal protease(s): implications regarding the site of
conversion of PrP to the protease-resistant state // J. Virol.
1991. Vol. 65. P. 6597—6603.
ChernoffY. O., Derkach I. L., Inge-Vechtomov S. G. Multicopy'
SUP35 gene induces de-novo appearance of psi-like fac-
tors in the yeast Saccharomyces cerevisiae // Curr. Genet.
1993. Vol. 24. P. 268—270.
ChernoffY. O., LindquistS. L., OnoB., Inge-VechtomovS. G.,
Liebman S. W. Role of the chaperone protein Hspl04 in
propagation of the yeast prion-like factor |/<S7| 11 Sci-
ence. 1995. Vol. 268’. P. 880—884.
ChesebroB.. RaceR. Wehrly K., NishioJ.. Bloom Al.. Lech-
ner D., Bergstrom S., Robbins K., Mayer L., Keith J., Ga-
ron C., Haase A. Identification of scrapie prion protein-
specific triRNA in scrapie infected and uninfected brain '/
Nature. 1985. Vol. 315. P. 331—333.
Cipollina C, Alberghina L., PorroD., Vai AL SFP1 is involved
in cell size modulation in respiro-fermentative growth
conditions // Yeast. 2005. Vol. 22. P. 385—399.
Coustou V., Deleu C., Saupe S, Begueret J. The protein product
of the het-s heterokaryon incompatibility' gene of the fun-
gus Podospora anserina behaves as a prion analog // Proc.
Natl. Acad. Sci. USA. 1997. Vol. 94. P. 9773—9778.
Coustou V., Deleu C, Saupe S., Begueret J. Mutational analysis
of the \I!et-s\ prion analog of Podospora anserina. A short
N-terminal peptide allows prion propagation " Genetics.
1999. Vol. 153. P. 1629—1640.
Coustou-Linares V., AladdeleinAI. L., Begueret J., Saupe S. J.
In vivo aggregation of the HET-s prion protein of the fun-
gus Podospora anserina // Mol. Microbiol. 2001. Vol. 42.
P. 1325—1335.
Cox B. S. q/, a cytoplasmic suppressor of super-suppression in
yeast 11 Heredity'. 1965. Vol. 20. P. 505—521.
CrapeauAL, Alarchal C, Guilin C, MailletL. The cellular
concentration of the yeast Ure2p prion protein affects its
propagation as a prion // Mol. Biol. Cell. 2009. Vol. 20.
P. 2286—2296.
CrickH. F. C. On protein synthesis// SymP. Soc. Exptl. Biol.
1958. Vol. 12. P. 138—163.
CrickF. Central dogma of molecular biology' // Nature. 1970.
Vol. 227. P. 561—563.
Cuille J., Chelle P. L. Pathologic animate: la maladie dite de la
tremblante du mouton est-elle inoculable? // C. R. Acad.
Sci. 1936. Vol. 203. P. 1552—1554.
Cuille J., Chelle P. L. Experimental transmission of trembling
to the goat // C. R. Seances Acad. Sci. 1939. Vol. 208.
P. 1058 1060.
Derkatch I. L., Liebman S. W. Prion-prion interactions// Prion.
2007. Vol. l.P. 161—169.
Derkatch I. L., ChemoffY.O., Kushnirov V. V., Inge-Vechto-
movS. G., Liebman S. W. Genesis and variability' of |/<S7 |
prion factors in Saccharomyces cerevisiae 11 Genetics.
1996. Vol. 144. P. 1375—1386.
Derkatch I. L, Bradley ALE., Zhou P„ ChemoffY.O., Lieb-
man S. W. Genetic and environmental factors affecting the
de novo appearance of the |/<S/| prion in Saccharomyces
cerevisiae // Genetics. 1997. Vol. 147. P. 507—519.
Derkatch L. L., Bradley AL. E., ALasseS., Zadorsky S. P., Poloz-
kov G. L, Lnge-Vechtomov S. G., Liebman S. W. Depend-
ence and independence of |/<S7 | and [PLN+]: a two-prion
system in yeast? H EMBO J. 2000. Vol. 19. P. 1942—
1952.
Derkatch L. L, Bradley AL. E., Hong J. Г., Liebman S. W. Prions
affect the appearance of other prions: the story of | / J/7V| 11
Cell. 2001. Vol. 106. P. 171 182.
Derkatch L. L., UptainS.AL, OuteiroT.F, KrishnanR, Lind-
quist S.L., Liebman S. W. Effects of Q/N-rich, polyQ, and
non-polyQ amydoids on the de novo formation of the |/<S7|
prion in yeast and aggregation of Sup35 in vitro," Proc.
Natl. Acad. Sci. USA. 2004. Vol. 101. P. 12934—12939.
DosReisS., Coulary-SalinB., Forge V., LascuL., Begueret J.,
Saupe S. J. The HET-s prion protein of the filamentous fun-
gus Podospora anserina aggregates in vitro into amyloid-
like fibrils // J. Biol. Chem. 2002. Vol. 277. P. 5703—5706.
Drillien R., AigleAL., Lacroute F. Yeast mutants pleiotropically
impaired in the regulation of the two glutamate dehydro-
genases // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1973.
Vol. 53. P. 367—372.
DuZ, ParkK. W., YuH, FanQ., LiL. Newly identified prion
linked to the chromatin-remodeling factor Swil in Sac-
charomvces cerevisiae Nat. Genet. 2008. Vol. 40.
p. 460 465.
Edskes H. K, Wickner R. B. Conservation of a portion of the
S. cerevisiae Ure2p prion domain that interacts with the
full-length protein // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002.
Vol. 99. P. 16384—16391.
EdskesH. K. Gray V. T., Wickner R. B. The [t/RZ?3] prion is an
aggregated form of Ure2p that can be cured by' overex-
pression of Ure2p fragments '/ Ibid. 1999. Vol. 96.
P. 1498—1503.
Femandez-Bellot E., Guillemet E., Baudin-Baillieu A., Gau-
nter S., Komar A. A., Cullin C. Characterization of the in-
teraction domains of Ure2p, a prion-like protein of yeast //
Biochem. J. 1999. Vol. 338. P. 403—407.
FreirD.B., Nicoll A. J., KfyubinL., PanicoS., ALc Donald J. AL,
Risse E., Asante E. A., Farrow ALA., SessionsRB., Sai-
bil H. R, Clarke A. R., RowanALJ., Walsh D. AL, Col-
linge J. Interaction between prion protein and toxic amyloid
P assemblies can be therapeutically targeted at multiple
sites // Nat. Commun. 2011. Vol. 2. P. 336.
Frolova L., LeGoffX., Rasmussen H. H, Cheperegin S., Dru-
geon G., Kress AL, Arman L, HaenniA.L., Celis J. E.,
Philippe AL., Justesen J., Kisselev L. A highly conserved
eukaryotic protein family possessing properties of poly-
peptide chain release factor // Nature. 1994. Vol. 372.
P. 701—703.
Gajdusek D. C, Zigas V. Degenerative disease of the central
nervous system in New Guinea: the endemic occurrence of
‘kunf in the native population // N. Engl. J. Med. 1957.
Vol. 257. P. 974—978.
Gajdusek D. C, Gibbs C. J., Alpers AL. Experimental transmis-
sion of a kuru-like syndrome to chimpanzees // Nature.
1966. Vol. 209. P. 794—796.
Giasson B. L, FormanALS., HiguchiAL, GolbeL.L., Gra-
ves C. L., Kotzbauer P. T., Trojanowski J. Q., Lee V. AL.
Initiation and synergistic fibrillization of tau and alpha-
synuclein // Science. 2003. Vol. 300. P. 636—640.
Gibbs C. J. Jr, Gajdusek D. C., Asher D. AL, Alpers ALP.,
BeckE., DanielP. AL, ALatthews W. B. Creutzfeldt-Jakob
disease (spongiform encephalopathy): transmission to the
chimpanzee 11 Science. 1968. Vol. 161. P. 288—389.
GilksN., Kedersha N., Ayodele AL, ShenL., Stoecklin G., Dem-
berL.AL, Anderson P. Stress granule assembly' is medi-
ated by prion-like aggregation of TIA-1 // Mol. Biol. Cell.
2004. Vol. 15. P. 5383—5398.
ГЛАВА 21 497
Griffith J. S. Self-replication and scrapie// Nature. 1967.
Vol. 215. P. 1043—1044.
Grishin .1. Г., RothenbergAL, Downs AL. .1., Blunter K. J. Mot3,
a Zn finger transcription factor that modulates gene ex-
pression and attenuates mating pheromone signaling in
Saccharomyces cerevisiae // Genetics. 1998. Vol. 149.
P. 879—892.
Hafer N., Xu S., Bhat К AL, SchedlP. The Drosophila CPEB
protein Orb2 has a novel expression pattern and is impor-
tant for asymmetric cell division and nervous system func-
tion // Genetics. 2011. Vol. 189. P. 907—921. ’
HeikenwalderAL., Julius C., Aguzzi A. Prions and peripheral
nerves: a deadly rendezvous // J. Neurosci. Res. 2007.
Vol. 85. P. 2714—2725.
HeinrichS. U., LindquistS. Protein-only mechanism induces
self-perpetuating changes in the activity of neuronal Aply-
sia cytoplasmic polyadenylation element binding protein
(CPEB)//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2011. Vol. 108.
P. 2999—3004.
KingC. E, Diaz-Avalos R. Protein-only transmission of three
yeast prion strains // Nature. 2004. Vol. 428. P. 319—323.
Kovacs G. G.. Zerbi P., Voigtlander T., Strohschneider AL.
Trabattoni G., Hainfellner J. A., BudkaH. The prion pro-
tein in human neurodegenerative disorders // Neurosci.
Lett. 2002. Vol. 329. P. 269—272.
Kurahashi H, Lshiwata AL, Shibala S., Nakamura E A regula-
tory' role of the Rnql nonprion domain for prion propaga-
tion and polyglutamine aggregates // Mol. Cell. Biol.
2008. Vol. 28. P. 3313—3323.
Kurahashi H, Shibata S., lshiwata AL, Nakamura 1. Selfish
prion of Rnql mutant in yeast 7 Genes Cells. 2009.
Vol. 14. P. 659-668.
Kushnirov Г. Г., Ter-Avanesvan AL. D. Structure and replication
of yeast prions // Cell. 1998. Vol. 94. P. 13—16.
Kushnirov V. V., Ter-Avanesyan AL D., Telckov AL. V., Surgu-
chov A. P., Smirnov Г. N., Inge-Vechtomov S. G. Nucleo-
tide sequence of the SUP2 (SUP35) gene of Saccharomy-
ces cerevisiae II Gene. 1988. Vol. 66. P. 45—54.
Lacroute F. Non-Mendelian mutation allowing ureidosuccinic
acid uptake in yeast// J. Bacteriol. 1971. Vol. 106.
P. 519—522.
Lauren J., Gimbel D. A., Nygaard H. B., Gilbert J. W., Stritt-
matter S. AL. Cellular prion protein mediates impairment of
synaptic plasticity by amyloid-beta oligomers H Nature.
2009. Vol. 457. P. 1128—1132.
LiebmanS. W, Sherman F. Extrachromosomal psi+ determinant
suppresses nonsense mutations in yeast H J. Bacteriol.
1979. Vol. 139. P. 1068—1071.
ALaddelein AL. L., Dos ReisS., Duvezin-Caubet S., Coulary-
Salin B., Saupe S. J. Amyloid aggregates of the HET-s
prion protein are infectious H Proc. Natl. Acad. Sci. USA.
2002. Vol. 99. P. 7402—7407.
ALakarava N, Kovacs G. G., Bocharova O., SavtchenkoR., Ale-
xeeva L., BudkaH., RohwerR G., BaskakovL. E Recom-
binant prion protein induces a new transmissible prion dis-
ease in wild-type animals H Acta Neuropathol. 2010.
Vol. 119. P. 177—187.
ALalatoL., Dos Reis S., Benkemoun L, Sabate R, Saupe S. J. Ro-
le of Hspl04 in the propagation and inheritance of the [Het-
s] prion II Mol. Biol. Cell. 2007. Vol. 18. P. 4803—4812.
ALarionRAL, RegevA., SegalE., Barash Y., Koller D., Fried-
man N, O'Shea E. K. Sfpl is a stress- and nutrient-sen-
sitive regulator of ribosomal protein gene expression 7
Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. V. 101. P. 14315—
14322.
ALasisonD. C, Wickner R.B. Prion-inducing domain of yeast
Ure2p and protease resistance of Ure2p in prion-con-
taining cells // Science. 1995. Vol. 270. P. 93—95.
ALasisonD. C, ALaddeleinAL. L., Wickner R. B. The prion mo-
del for [СЖЕЗ] of yeast: spontaneous generation and re-
quirements for propagation H Proc. Natl. Acad. Sci. USA.
1997. Vol. 94. P. 12503—12508.
ALasisonD. C, KirklandP. A., SharmaD. Influence ofHsp70s
and their regulators on yeast prion propagation H Prion.
2009. Vol. 3. P. 65- -73. ’
ALitchell A. P., ALagasanik B. Three regulatory' systems control
production of glutamine synthetase in Saccharomyces cer-
evisiae 11 Mol. Cell. Biol. 1984. Vol. 4. P. 2767 2773.
ALoralesR., AbidK, SotoC. The prion strain phenomenon:
molecular basis and unprecedented features H Biochim.
Biophys. Acta. 2007. Vol. 1772. P. 681 69L
ALoralesR, EstradaL.D., Diaz-EspittozaR, ALorales-Schei-
IringD., Jara AL. C., Castilla J., SotoC. Molecular cross
talk between misfolded proteins in animal models of Alz-
heimer's and prion diseases /7 J. Neurosci. 2010. Vol. 30.
P. 4528—4535.
ALoriyamaH, EdskesH.K, Wickner R. B. [URZ?3] prion pro-
pagation in Saccharomyces cerevisiae: requirement for
chaperone Hspl04 and curing by overexpressed chaperone
Ydjlp " Mol. Cell. Biol. 2000. Vol. 20. P. 8916—8922.
Novina C. D., Sharp P. .4. The RNAi revolution 11 Nature. 2004.
Vol. 430. P. 161—164.
OeschB., Westaway D., WalchliAL, ALckinleyAL. P., KentS. В. H,
AebersoldR. BarryR. A., TempstP., Teplow D. B.. Ho-
od L. E., Prusiner S. B., Weissmann C. A cellular gene en-
codes scrapie PrP 27—30 protein // Cell. 1985. Vol. 40.
P. 735—746.
Orlowska-ALatuszewska G., Wawrzycka D. A novel phenotype
of eight spores asci in deletants of the prion-like Rnqlp in
Saccharomyces cerevisiae И Biochem. Biophys. Res.
Commun. 2006. Vol. 340. P. 190—193.
Osherovich L. Z., Weissman J. S. Multiple Gln/Asn-rich prion
domains confer susceptibility to induction of the yeast
[BST| prion /7 Cell. 2001. Vol. 106. P. 183—194.
Osherovich L. Z., CoxB. S., TuiteAL. F, Weissman J. S. Dissec-
tion and design of yeast prions H PLoS Biol. 2004. Vol. 2.
p. 442—451.
Pan К AL, Baldwin AL, Nguyen J., Gasset AL, SerbanA.,
GrothD.. ALehlhomL., HuangZ.. FletterickR J.. Co-
hen F. E., Prusiner S. B. Conversion of alpha-helices into
beta-sheets features in the formation of the scrapie prion
proteins 7 Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. Vol. 90.
P. 10962—10966.
Patel В. K, LiebmanS. W. «Prion-proof» for [PLAT]: infection
with in vitro-made amyloid aggregates of Rnqlp-(132—
405) induces [PLAfj/'i J. Mol. Biol. 2007. Vol. 365.
P. 773—782.
Patel В. K, Gavin-Smyth J., LiebmanS. W. The yeast global
transcriptional co-repressor protein Cyc8 can propagate as
a prion H Nat. Cell Biol. 2009. Vol. 1L P. 344—349.
Paushkin S. V., Kushnirov V. V., Smirnov E N., Ter-Avane-
syanAL. D. Propagation of the yeast prion-like [psi+1 de-
terminant is mediated by oligomerization of the SUP35-
encoded polypeptide chain release factor H EMBO J.
1996. Vol. 15. P. 3127—3134.
Prusiner S. B. Novel proteinaceous infectious particles cause
scrapie // Science. 1982. Vol. 216. P. 136—144.
PrusinerS. B. Prions// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998.
Vol. 95. P. 13363—13383.
Prusiner S. B. Shattuck lecture — neurodegenerative diseases
and prions H N. Engl. J. Med. 2001. Vol. 344. P. 1516—
1526.
Prusiner S. B., Scott AL. R. Genetics of prions// Annu. Rev.
Genet. 1997. Vol. 31. P. 139—175.
Prusiner S. B., ALcKinleyAL. P., Bowman K. A., Bolton D.C.,
BendheimP. E., Groth D. R, Glenner G. G. Scrapie pri-
ons aggregate to form amyloid-like birefringent rods П
Cell. 1983. Vol. 35. P. 349—358.
Radovanovic L., Braun N., Giger O.T., ALertzK, ALieleG.,
Prinz AL, NavarroB., Aguzzi A. Truncated prion protein and
Doppel are myelinotoxic in the absence of oligodendrocytic
PrPC H J. Neurosci. 2005. Vol. 25. P. 4879—4888.
RankK.B., Pauley A. AL, Bhattacharya K, WangZ., Ev-
ans D. B., Fleck T. J., Johnston J. .1.. SharmaS. K. Direct
498 ЭПИГЕНЕТИКА
interaction of soluble human recombinant tau protein with
Abeta 1—42 results in tau aggregation and hyperphos-
phorylation by tau protein kinase II // FEBS Lett. 2002.
Vol. 514. P. 263—268.
Resenberger U. K., HarmeierA., JJ'oerner .1. C., Good-
man J. L., AlfdlerJ’., Krishnan R., J’abulasR. AL, Kretz-
schmarH.A., LindquistS., HartlF. U„ AIulthaupG.,
Winklhofer K. F, TatzeltJ. The cellular prion protein me-
diates neurotoxic signalling of P-sheet-rich conformers in-
dependent of prion replication 11 EMBO J. 2011. Vol. 30.
P. 2057—2070.
Richter J. D. CPEB: A life in translation" Trends Biochem.
Sci. 2007. Vol. 32. P. 279-285.
RipaudL., MailletL., Lmmel-TorterototF, DurandF, Gui-
lin C. The [URE3] yeast prion results from protein aggre-
gates that differ from amyloid filaments formed in vitro 11
J. Biol. Chem. 2004. Vol.’279. P. 50962—50968.
RogozaT., Goginashvili A., Rodionova S., Ivanov AL, J’iktorov-
skayaO.. Rubel A.. J’olkov K. Mironova I.. Non-Men-
delian determinant [ISP+] in yeast is a nuclear-residing
prion form of the global transcriptional regulator Sfpl //
Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2010. Vol. 107. P. 10573—
10577.
Saupe S. J. The [Het-s] prion of Podospora anserina and its role
in heterokaryon incompatibility' // Semin. Cell Dev. Biol.
2011. Vol. 22. P. 460—468.
Sclrwarze-Eicker K., Keyvani K., GortzN., JJ’estaway D., Sach-
serN., Paulus JJ’. Prion protein (PrPc) promotes beta-amy-
loid plaque formation // Neurobiol. Aging. 2005. Vol. 26.
P. 1177—1 182.
Schwimmer C., Masison D. C. Antagonistic interactions bet-
ween yeast [PSI(+)] and [URE3] prions and curing of
[URE3] by' Hsp70 protein chaperone Ssalp but not by'
Ssa2p // Mol. Cell Biol. 2002. Vol. 22. P. 3590—3598.
SerpellL. C., SundeAL., Blake С. C. The molecular basis of amy-
loidosis // Cell Mol. Life Sci. 1997. Vol. 53. P. 871—887. ’
ShmerlingD.. Hegyi I.. Fischer AL. BlattlerT.. BrandnerS..
GotzJ, Riilicke T, FlechsigE., CozzioA., vonMeringC.,
Hangartner C., Aguzzi A., Weissmann C. Expression of
amino-terminally truncated PrP in the mouse leading to
ataxia and specific cerebellar lesions // Cell. 1998.
Vol. 93. P. 203—214.
Si K., LindquistS., KandelE. R. A neuronal isoform of the
Aph’sia CPEB has prion-like properties // Cell. 2003.
Vol. 115. P. 879—891.
Si K., ChoiY. B., JJTiite-GrindleyE., MajumdarA., Kan-
del E. R. Aplysia CPEB can form prion-like multimers in
sensory' neurons that contribute to long-term facilitation '/
Cell. 2010. Vol. 140. P. 421—435.
SondheimerN., Lindquist S. Rnql: an epigenetic modifier of
protein function in yeast // Mol. Cell. 2000. Vol. 5.
P. 163—172.
Speransky J . J'., Taylor K.L., Edskes H.K, H ickner R. B.,
Steven A. C. Prion filament networks in [URE3] cells of
Saccharomyces cerevisiae // J. Cell Biol. 2001. Vol. 153.
P. 1327—1336.
Stansfield I., Jones К. M, Kuslmirov J . J’., Dagkesamanska-
ya A. R., Poznyakovski .1.1., Paushkin S. J’., Nierras C. R,
CoxB.S., Ter-Avanesyan AL. D., TuiteM.F. The products
of the SUP45 (eRFl) and SUP35 genes interact to mediate
translation termination in Saccharomyces cerevisiae //
EMBO J. 1995. Vol. 14. P. 4365—4373.
Supattapone S., Bosque P., ALuramotoT., JJ’ille H, AagaardC.,
PeretzD., Nguyen H. O., Heinrich C., TorchiaM., Safar J.,
Cohen F. E., DeArmond S. J., Prusiner S. B., Scott AL. Prion
protein of 106 residues creates an artifical transmission bar-
rier for prion replication in transgenic mice // Cell. 1999.
Vol. 96. P. 869—878.
TanejaJ’., ALaddelein AL L., TalarekN., SaupeS. J., Lieb-
man S. JJ’. A non-QZN-rich prion domain of a foreign
prion. [Het-s], can propagate as a prion in yeast 11 Mol.
Cell. 2007. Vol. 27. P. 67—77.
Taylor K. L., ChengN., JJ’illiamsR. JJ’., Steven A. C., JJ’ick-
nerR. B. Prion domain initiation of amyloid formation in
vitro from native Ure2p // Science. 1999. Vol. 283.
P. 1339- 1343.
TellingG. C., ParchiP., DeArmondS. J., CortelliP„ ALon-
tagna P., Gabizon R, Alastrianni J., Lugaresi E., Gam-
bettiP., Prusiner S. B. Evidence for the conformation of
the pathologic isoform of the prion protein enciphering
and propagating prion diversity' 11 Science. 1996. Vol. 274.
P. 2079 2082.
Ter-Avanesyan AL. D., Kuslmirov Iz. J’., Dagkesamanska-
yaA.R, Didichenko S. A., ChemoffY. O., Lnge-J’echto-
mov S. G., Smirnov J’. N. Deletion analysis of the SUP35
gene of the yeast Saccharomyces cerevisiae reveals two
non-overlapping functional regions in the encoded pro-
tein // Mol. Microbiol. 1993. Vol. 7. P. 683—692.
Ter-Avanesyan AL. D., Dagkesamanskaya A. R. Kuslmirov J’. J’..
Smirnov J’. N. The SUP35 omnipotent suppressor gene is
involved in the maintenance of the non-Mendelian deter-
minant [psi ] in the yeast Saccharomyces cerevisiae И Ge-
netics. 1994. Vol. 137. P. 671—676.
ThualC, Komar A. A., BoussetL., Femandez-Bellot E., Gui-
lin C.. ALelkiR. Structural characterization of Saccharo-
myces cerevisiae prion-like protein Ure2 // J. Biol. Chem.
1999. Vol. 274. P. 13666—13674.
ToblerL, GausS. E.. Deboer T. AchermannP.. Fischer AL.
RulickeT., ALoserAL, OeschB., ALcBride P. A., Alan-
son J. C. Altered circadian activity' rhythms and sleep in
mice devoid of prion protein // Nature. 1996. Vol. 380.
P. 639—642.
J’ana K., Zuber C., NiklesD., JJ’eiss S. Novel aspects of prions,
their receptor molecules, and innovative approaches for
TSE therapy // Cell Mol. Neurobiol. 2007. Vol. 27.
P. 107—128.
J’olkov K. J’., Aksenova A. Y.. SoomAL.J.. Osipov K. J’.. Svi-
tinA.J’., KurischkoC., Shkundina I. S., Ter-Avanesy-
anALD., Inge-J’echtomov S. G., Alironova L. N. Novel
non-Mendelian determinant involved in the control of
translation accuracy' in Saccharomyces cerevisiae И Ge-
netics. 2002. Vol. 1’60. P. 25—36.
JJ’asmer C., Lange A., J’anAIelckebekeH, Siemer A. B.,
RiekR., AleierB. H. Amyloid fibrils of the HET-s(218—
289) prion form a beta solenoid with a triangular hydro-
phobic core 7 Science. 2008. Vol. 319. P. 1523—152’6.
JJ'egrzyn R. D., Bapat K., NewnamG.P., Zink A. D., Cher-
noffY. O. Mechanism of prion loss after Hspl04 inactiva-
tion in yeast// Mol. Cell. Biol. 2001. Vol. 21. P. 4656—
4669.
JJ’ickner R. B. [URE3] as an altered URE2 protein: evidence for
a prion analog in Saccharomyces cerevisiae // Science.
1994. Vol. 264. P. 566—569.
JJ’ickner R. B., Edskes H. K., RossE. D., Pierce AL. AL, Baxa U.,
Brachmann A., ShewmakerF. Prion genetics: new rules
for a new kind of gene // Annu. Rev. Genet. 2004. Vol. 38.
P. 681—707.
JJ’icknerR. B., EdskesH. K., ShewmakerF., Nakayashiki T.
Prions of fungi: inherited structures and biological roles //
Nat. Rev. Microbiol. 2007. Vol. 5. P. 611—618.
Xu Z., Norris D. The SFP1 gene product of Saccharomyces
cerevisiae regulates G2/M transitions during the mitotic
cell cycle and DNA-damage response // Genetics. 1998.
Vol. 150. P. 1419—1428.
Zhouravleva G., Frolova L., LeGoffX., LeGuellecR, Inge-
J’echtomov S., KisselevL., Philippe AL. Termination of
translation in eukaryotes is governed by two interacting
polypeptide chain release factors, eRFl and eRF311
EMBO J. 1995. Vol. 14. P. 4065—4072.
ГЛАВА
22
ЭПИГЕНЕТИЧЕСКАЯ ФЕНОМЕНОЛОГИЯ
У УСЛОВНЫХ МУТАНТОВ
DROSOPHILA MELANOGASTER:
МОРФОЗЫ И МОДИФИКАЦИИ
СОДЕ РЖАН И Е
22.1. Условные мутации у дрозофилы,
501
22.2. Способы получения условных му-
таций, 501
22.3. Способы поддержания условных
мутаций в культуре, 504
22.4. Генетические особенности услов-
ных мутаций, 504
22.5. Эпигенетическая феноменология:
морфозы, 505
22.6. Эпигенетическая феноменология:
модификации, 524
22.7. Обсуждение (эпигенетическая фе-
номенология и что за ней стоит),
528
Список литературы, 532
500 ЭПИГЕНЕТИКА
Появление генетики стало главным событием
биологии 20 века. Открытие роли ДНК в наслед-
ственности сделало возможным коррекцию жи-
вых структур и их функций путем изменения
ДНК молекулы. Вместе с тем, в наше время на-
ряду’ с осознанием больших возможностей гене-
тики приходит понимание того, что молекула
ДНК — только инструмент в построении живо-
го, а гены «порождают признаки» только в ме-
тафорическом смысле. ДНК в пробирке ничего
породить не может. По меткому’ выражению
И. С. Шкловского [1976] «современная ДНК са-
ма по себе совершенно беспомощна». ДНК —
шаблон для тиражирования живых организмов,
инструмент, созданный природой для обеспече-
ния круговорота вещества и энергии в форме
живого организма [Чадов, 2007, 2009, 2010]. Ин-
струмент восхищает своим устройством, но и,
как всякий инструмент, не совершенен. Молеку-
ла ДНК, к примеру, не в состоянии избежать из-
менений, влекущих за собой нарушения функ-
ции или структуры (уродства), ставящие орга-
низм на грань выживания. Не ДНК управляет
жизнью, а жизнь для своего существования соз-
дала ДНК.
Способом организации живого организма со
стороны ДНК является генетический код ДНК,
однако именно в силу’ того, что ДНК — не ис-
точник, не творец, а средство для поддержания
жизни, существует феноменология живого вне
компетенции ДНК-кода. Современная генетика
организует область исследования этой феноме-
нологии под названием «эпигенетика». В новом
распределении функций за генетикой в ее клас-
сическом значении оставлена область исследо-
вания структур и функций, подконтрольных по-
следовательностям ДНК, а к эпигенетике — не
подконтрольных.
Исторически генетическое мировоззрение на-
чиналось с идеи полной и безусловной транс-
формации генома (гены, ДНК) в признаки живо-
го организма. Идейная борьба велась с биолога-
ми, не разделяющими этой идеи. В настоящее
время ясно, что изначальная генетическая пози-
ция была верной, но страдала максимализмом.
Под генетическим контролем находятся многие,
но не все процессы, происходящие в живом [Бе-
лоусов, 2009]. Генетическая система в процессе
формирования «собирала живое» из элементов,
между’ которыми уже существовали устойчивые
функциональные и структурные отношения. Эти
отношения генетике необходимо учитывать, но
нельзя контролировать. Да и целесообразность
такого контроля не очевидна, поскольку’ отно-
шения устойчивы. Генетике приходится учиты-
вать также взаимодействия физического и хими-
ческого порядка, возникающие в системе живо-
го. Они очень устойчивы, однако низкая вариа-
бельность указанных отношений не означает их
полного отсутствия. Если они случаются, диссо-
нанс с генетикой налицо.
Современная генетика, входя в свой зрелый
возраст (теперь уже в лице эпигенетики), при-
ступает к определению круга негенетических
событий, происходящих с генетически детерми-
нированными структурами. Для генетики, твер-
до занявшей свое место в биологии, уже «не
опасно» говорить о явлениях негенетического
толка, происходящих с генетически детермини-
рованными объектами [Jablonka, Lamb, 1995,
2005; Малецкий, 2005]. Присоединение исследо-
ваний по негенетическому контролю к генетике
также логически оправдано, поскольку’ генети-
ческий контроль развития живого уже освоен
биологической наукой. Теперь он может послу-
жить отправной точкой для изучения негенети-
ческого контроля. Более того, во многих случаях
наличие негенетического контроля выявляется в
качестве исключения из правил генетического.
Как говорится, исключения из правил обязаны
своим существованием существованию правил.
В круг эпигенетических событий, в первую
очередь, входят регуляторные процессы онтоге-
неза. Термин «эпигенетика» настойчиво вне-
дрялся одним из основателей генетики развития
Уоддингтоном, но в классический период разви-
тия генетики не был принят [Чадов, 2006]. В на-
стоящее время доподлинно известно, что разли-
чие клеток и тканей в процессе специализации
идет за счет изменения регуляторных воздейст-
вий, а не изменения первичной последователь-
ности ДНК-молекулы. В этой части эпигенетика
смыкается с генетикой, занимающейся регуля-
цией работы генома в развитии. Генетика в раз-
витии (это одним из первых понял Уоддингтон)
определяет многое, но далеко не все [Уоддинг-
тон, 1947, 1970; Белоусов, 2009; Савостьянов,
1976, 2005, 2012].
В круг событий входят также вопросы пе-
нетрантности и экспрессивности генов, подня-
тые Н. В. Тимофеевым-Ресовским еще в 1930-х гг.
В природных популяциях дрозофилы им были
найдены мутации, стабильно передающиеся по
потомству, но изменяющие свое проявление от
особи к особи [Тимофеев-Ресовский, 1925, 1996].
Ярким примером изменения проявления генов,
не связанного с первичной структурой ДНК, яв-
ляется эффект Астаурова — билатеральная асим-
ГЛАВА 22 501
метрия признака [Бабков, 1985]. Асимметрия
имеет место у одной и той же особи, следова-
тельно, вызвана не первичной последовательно-
стью ДНК и не условиями внешней и внутренней
среды | Астауров. 1927. 1974; Astauroff, 1930]. По-
следователи Б. Л. Астаурова назвали феномен ре-
ализационной изменчивостью [Струнников, 1989;
Струнников, Вышинский, 1991]. Все возрастаю-
щий список эпигенетических явлений можно
найти в обзорах по этому’ вопросу [Jablonka,
Lamb, 2005; Holliday, 2006; Яблонка, Лэмб,
2008]. Ряд эпигенетических явлений рассматри-
вается в данной книге.
Вниманию читателей этой главы будет пред-
ставлена эпигенетическая феноменология из-
менчивости, не связанная с изменчивостью пер-
вичной последовательности ДНК, но происхо-
дящая со специфически измененным генетиче-
ским материалом. Эта изменчивость касается так
называемых условных мутаций. По нашему’ мне-
нию, условные мутации — это мутации регуля-
торных генов, ответственные за образование приз-
наков внутривидового сходства [Чадов и др.,
2004в]. Последнее обстоятельство, на наш
взгляд, несет основную ответственность за бо-
гатство эпигенетической феноменологии у’ му-
тантов этого класса [Чадов, 2006]. Изучение эпи-
генетической феноменологии у генетических
мутантов может пролить свет на механизмы эпи-
генетических явлений.
22.1. Условные мутации у дрозофилы
Генетической мутацией называют наследуе-
мое нарушение последовательности ДНК, а так-
же проявление этого нарушения на уровне орга-
низма. У диплоидной особи одни нарушения
проявляются, находясь в геноме в одной дозе
(доминантная мутация), друтие — в двойной (ре-
цессивная мутация). В обоих случаях речь идет
об автономном, не зависимом от остального ге-
нома, проявлении мутации. Классическая ге-
нетика имеет дело с именно этими «настоящи-
ми» мутациями. На уро вне фенотипа они «заяв-
ляют о своем присутствии», находясь в геноме
любой особи данного вида
Существует еще один тип генетического по-
вреждения. Его назвали условной мутацией [Ча-
дов и др., 2004в]. Условная мутация проявляется
не у каждой особи данного вида, а только у не-
которых. Проявление зависит от конкретного
генотипа особи. В отличие от мутаций с непол-
ной пенетрантностью, для которых причины не-
проявления мутации не определены [Тимофеев-
Ресовский, 1925, 1996], для условной мутации
генетические условия «проявления — не прояв-
ления» четко обозначены методикой выделения.
В процессе работы с условными мутациями сна-
чала получили мутации с летальным проявлени-
ем, так называемые условные доминантные ле-
тали [Чадов и др., 2000; Chadov, 2000], затем —
условные мутации с видимым проявлением [Ча-
дов и др., 2004а]. Условиями проявления были:
пол мутантной особи [Чадов и др., 2000; Chadov,
2000] и хромосомная перестройка [Чадов и др.,
20046]. На данный момент времени условной
мутацией называем локальное повреждение
ДНК, проявление которого на уровне организма
зависит (целиком или частично) от структуры
других районов генома [Chadov etal., 2011].
Первая партия условных мутантов у’ Drosophila
melanogaster была получена нами с помощью
специально разработанной методики в 2000 году’
[Чадов и др., 2000; Chadov, 2000].
Классическая генетика построена на мутаци-
ях с автономным проявлением. На них открыты
законы наследования признаков, сформулирова-
но представление о существовании дискретных
и независимых единиц наследственности — ге-
нов, построена хромосомная теория наследст-
венности. Мутации с неавтономным проявлени-
ем только начали изучать специально, хотя они
заслуживают этого не меньше, чем мутации с
автономным проявлением. Есть все основания
считать, что гены, ответственные за появление
мутаций с неавтономным проявлением, форми-
руют особые признаки. Это признаки, форми-
рующие инвариантную часть видового облика
живого организма [Чадов и др., 2004в]. Полу-
чить такие признаки с помощью генов, ответст-
венных за появление мутаций с автономным
проявлением, нельзя.
22.2. Способы получения условных мутаций
Мутации вызывали ионизирующей радиаци-
ей. Потомков облученного родителя отбирали на
двух генетических фонах. Искомой являлась му-
тация, проявляющаяся на одном генетическом
фоне и не проявляющаяся на другом. В качестве
примера на рис. 22.1 представлена схема полу-
чения условных доминантных деталей (УДЛ) в
Х-хромосоме Drosophila melanogaster [Чадов
и др., 20046, в]. Самцы дрозофилы облучены
гамма-лучами. Сыновья самцов индивидуально
скрещены с самками линии yellow. В качестве
мутантных отобраны те сыновья, которые не да-
ли женского потомства в этом скрещивании. Эти
502 ЭПИГЕНЕТИКА
сыновья содержат условную мутацию в Х-хромо-
соме. Мутация не нарушает их жизнеспособность
и фертильность, однако, попав в геном самки (ус7-
/<ж7 I), становится доминантной деталью: дочери
гибнут на эмбриональной стадии и потомство на
стадии имаго оказывается состоящим только из
сыновей. Условной мутацией в этом примере яв-
ляется доминантная леталь. Условной она названа
потому’, что проявляется как леталь у мутантных
самок, гетерозиготных по yellow (один генетиче-
ский фон), но не проявляется у мутантных самцов
(другой генетический фон).
УДЛ в хромосоме 2 дрозофилы получили по
другой схеме [Чадов и др., 2004в] (рис. 22.2). Му-
тация проявляла себя как доминантная леталь в
том случае, когда гомологичная аутосома 2 была
структурно-нормальной, но не проявляла как ле-
таль в случае, если гомологичная хромосома со-
держала инверсию In(2L + 2R)Curly. Летальное
действие мутации, полученной по этой схеме, не
зависит от пола особи, как это имеет место в слу-
чае УДЛ в Х-хромосоме [Чадов и др., 2000].
Еще один способ получения УДЛ в Х-хромо-
соме представлял собой модификацию извест-
ного способа получения рецессивных деталей
Мёллер-5 [Чадов и др., 20046]. Коллекцию та-
ких деталей в виде мутантных самок !_Пп(1)М-5
скрестили с самцами, содержавшими маркиро-
ванную структурно-нормальную Х-хромосому.
Обнаружили четыре культуры, содержащие ле-
таль в Х-хромосоме с необычными свойствами.
Леталь была типичной рецессивной деталью при
условии скрещивания самки 1_Пп(1)М-5 с самцом
1п(1)М-5 (обычный способ поддержания рецес-
сивных летальных мутаций в Х-хромосоме).
В этом скрещивании у мутантной самки появля-
ется один тип дочерей и один тип
сыновей (1п(1)М-5). Однако в случае скрещива-
ния самки 1_Пп(1)М-5 из отобранных культур с
нормальными самцами возникали сыновья не од-
ного, а двух фенотипов: самцы 1п(1)М-5 и самцы
дикого типа. Последние также получали от му-
тантной самки рецессивную леталь, но ее леталь-
ное действие прекращалось ввиду изменения ге-
нотипа отца с инверсионного на нормальный.
Во всех трех выше приведенных схемах ус-
ловные мутации были рецессивными летальны-
ми мутациями на обычном генетическом фоне.
По двум первым схемам при переводе на прово-
кационный фон мутации становились доминант-
ными деталями. По третьей схеме при переводе
на провокационный фон мутации переставали
Индивидуальное
тестирование
самцов
F1 Норма:
Мутация:
// 30 Гр
$ XXY ® d X Y
в)
2 ln(2LR)Cy/2
$ XX ® dX Y
$ХХ ® dy(\
9 XX ® d X*Y
Индивидуальное
тестирование
самцов
2 2/2
2 2/2
2 2/2
// 30 Гр
® d 212
О7
® d 2lln(2LR)Cy
® d 2Hn(2LR)Cy
® d 2*‘ln(2LR)Cy
дочери X X
дочери
сыновья XY
сыновья XY
Норма:
F1
Мутация [*]:
2/2 и 2lln{2LR)Cy
и 2lln(2LR)Cy
Рис. 22.1. Обнаружение условных доминантных лета-
лей в Х-хромосоме D. melanogaster.
Облученных гамма-лучами самцов дрозофилы скрестили с
самками, содержащими сцепленные Х-хромосомы. Сыновей
из потомства индивидуально скрестили с самками «yellow».
Штриховкой отмечена Х-хромосома от облученного самца,
звездочкой — такая же Х-хромосома, содержащая мутацию.
В отличие от сыновей, не содержавших летальной мутации,
сыновья, получившие Х-хромосому с доминантной леталью,
не давали дочерей в своем потомстве.
Рис. 22.2. Обнаружение условных доминантных ле-
талей в аутосоме 2 D. melanogaster.
Облученных гамма-лучами самцов дрозофилы скрестили с
самками, содержащими инверсию ln(2LR)Cy с доминантным
маркером Curly в одной из аутосом 2. Сыновей, содержащих
эту аутосому вместе с облученной аутосомой 2 (штриховка),
индивидуально скрестили с самками yellow, содержащими
структурно-нормальные хромосомы 2. Сыновья, получившие
аутосому 2 с доминантной леталью, давали только потомков
Curly.
ГЛАВА 22 503
быть деталями. Понятно, что понятия обычного
и провокационного фона условны. Существенно
то, что реакции мутаций на изменение генетиче-
ского фона воспроизводятся в повторных скре-
щиваниях [Чадов и др.. 2000; Chadov. 2000]. Все
три методики выделения мутаций обобщенно
назвали «методом условных деталей» [Чадов
и др., 2004в].
В одном из опытов после проверки на услов-
ную доминантную летальность (тест с самками
yellow} четыре мутации дали гомозигот с види-
мым мутантным фенотипом (рис. 22.3). Это бы-
ли только самки, содержащие две мутантные X-
хромосомы. Самцы же, содержащие одну му-
тантную Х-хромосому, имели нормальный фе-
нотип. Первоначально эти условные мутации
были названы диморфными, поскольку одна и та
же мутация обладала способностью давать два
фенотипа: один у самца (нормальный) и друтой
у самки (мутантный) [Чадов и др., 20046].
Самки первой диморфной линии, названной
«коротконожка», имели сложный мутантный фе-
нотип: косо срезанные опущенные крылья, от-
сутствие второй радиальной жилки на крыле,
пузырь на крыле, заполненный лимфой, резко
укороченные лапки, состоящие из одного члени-
ка вместо положенных пяти (см. рис. 22.3, а).
Самки второй линии имели пузырь на каждом
крыле (см. рис. 22.3, б). Самки третьей и четвер-
той линий имели перерыв второй радиаль-
ной жилки с некоторой разницей в локализации
дефекта. Самка и самец линии «прерванная жил-
ка 1» представлены на рис. 22.3, в, а самка линии
«прерванная жилка 2» — на рис. 22.3, г. Самцы
всех четырех линий были фенотипически нор-
мальны.
Эти четыре мутанта также могут быть при-
числены к условным мутациям. Однако это —
условные мутации с видимым фенотипом. Усло-
вием проявления мутантного фенотипа является
пол особи. Напомним, что указанные мутации
имеют еще и фенотип условной доминантной
летали, проявляющийся в скрещивании мутант-
ного самца с самками линии yellow.
Отличительной чертой всех полученных ус-
ловных мутаций является образование односто-
Рис. 22.3. Диморфные мутации.
a — мутация «коротконожка»: самцы фенотипически нормальны, у самок укорочены
лапки, косо срезаны крылья, пузыри на крыльях; б— мутация «пузыри на крыльях»:
самцы нормальны, у самок пузыри на крыльях; е — мутация «прерванная жилка 1»:
самцы нормальны, у самок радиальная жилка L2 имеет перерыв; г — самка линии
«прерванная жилка 2» крупным планом.
504 ЭПИГЕНЕТИКА
ронних пороков индивидуального развития —
морфозов. Это явление будет специально рас-
сматриваться ниже. На свойстве образовывать
морфозы была построена четвертая методика
выделения условных мутаций. Она состояла в
отборе из F1 облученного потомства потомков с
уродствами. Далее их испытывали на содержа-
ние рецессивных леталей [Федорова и др., 2010].
В общей сложности за период с 2000 г. было
предпринято восемь опытов по выделению ус-
ловных мутаций у D. melanogaster. Было обна-
ружено около 60 УДЛ в Х-хромосоме, 10 УДЛ в
хромосоме 2. четыре условные мутации в хромо-
соме 3. Шесть мутаций имеют видимый фенотип.
Окончательные данные по числу обнаруженных
мутаций будут представлены после окончания
проводящейся в настоящее время локализации
мутаций на карте политенных хромосом.
22.3. Способы поддержания условных
МУТАЦИЙ В КУЛЬТУРЕ
Условные мутации поддерживались в культу-
рах по-разному, в зависимости от специфики ус-
ловной мутации. Условные доминантные летали
в Х-хромосоме поддерживали двумя способами
(рис. 22.4). По первому (рис. 22.4, а) — культура
содержала самок — гетерозигот по мутации и ин-
версии 1п(1)М-5. Самки давали сыновей 1п(1)М-5
и сыновей + с мутацией. Последние были фер-
тильны, но самок +/+ в культуре не возникало
из-за летального действия мутации в гомозиготе
у самок. По второму' (рис. 22.4, б) — мутантная
Х-хромосома передавалась по отцовской линии.
Самки в линии содержали сцепленные Х-хро-
мосомы.
Условные рецессивные мутации в Х-хромосо-
ме, полученные из типичных рецессивных лета-
лей методом Мёллер-5, поддерживали как ти-
пичные рецессивные летали в Х-хромосоме.
Условные доминантные летали в аутосоме 2
поддерживали в культуре. состоящей из гетеро-
зигот 1п{2ЬК)Сиг1у1мутация. Гомозиготы по ка-
ждой из аутосом были летальными.
Четыре условные мутации в Х-хромосоме с
видимым проявлением поддерживали в гомози-
готе. В этих культурах самки-гомозиготы имели
мутантный фенотип, а самцы гомозиготы — нор-
мальный.
22.4. ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ
УСЛОВНЫХ МУТАЦИЙ
Полученные условные мутации отличаются
от обычных мутаций целым набором свойств.
Главнейшими из них (кроме условности прояв-
ления) являются: доминантный тип проявления,
зависимость проявления от пространственного
1п(Т)М-5 1п(1)М-5
® в у
/л(7)/М-5
$
/л(7)/М-5
/л(7)/М-5
°
/л(7)/М-5
Рис. 22.4. Два способа поддержания условных доминантных мутаций в Х-хро-
мосоме.
а — в гетерозиготе у самок, содержащих инвертированную хромосому Muller-5 (1п(1)М-5) и
мутантную Х-хромосому (+, жирная линия); б— в культуре со сцепленными Х-хромосома-
ми (у v f/y v f). В первом случае (а) мутантную Х-хромосому получают дочери 1п(1)М-5/+ и
сыновья +. Дочери 1п(1)М-5/1п(Т)М-5 и сыновья 1п(1)М-5 мутантной Х-хромосомы не полу-
чают. Во втором случае (б) — мутантную Х-хромосому получают сыновья, но не дочери.
ГЛАВА 22 505
расположения хромосомного материала в гено-
ме, родительский эффект, повышение уровня
энергообмена мутанта, способность переводить
геном из стабильного состояния в нестабильное.
Нестабильность выражается: в образовании но-
вых мутаций, потере и нерасхождении хромосом
в мейозе и митозе, образовании модификаций и
морфозов, изменении проявления мутации в за-
висимости от времени нахождения ее в культурс.
Предполагается, что условные мутации являют-
ся мутантными вариантами обширной Gene Re-
gulator}' Network дрозофилы. Наиболее полный
обзор данных о генетических особенностях по-
лученных условных мутаций представлен [Cha-
dov et al., 2011].
22.5. Эпигенетическая феноменология:
морфозы
22.5.1. Общая картина образования
морфозов
Самое яркое свойство условных мутаций —
образование морфозов. Термин «морфоз» в био-
логической и генетической литературе употреб-
ляется для обозначения ненаследуемых морфо-
логических нарушений (уродств), возникающих
в результате воздействия на развивающийся ор-
ганизм экстремальных факторов внешней среды
[Фризен, 1935; Рапопорт, 1939; Goldschmidt, Pi-
temick, 1957]. В словаре генетических терминов
морфоз определяется как «неадаптивная и обыч-
но нестабильная вариация индивидуального
морфогенеза, связанная с изменением внешней
среды. Морфозы, повторяющие облик известных
мутаций, обозначаются как «фенокопии» [Riger
et al., 1991]. В случае возникновения уродств под
действием мутагенов говорят о тератогенном
эффекте мутагенов [Ауэрбах, 1978]. Ашбурнср в
известном руководстве по генетике дрозофилы
вопросу о нснаслсдусмых нарушениях посвяща-
ет главу «Фенокопии» [Ashbumer, 1989]. Часто
рассматривают возможность роли уродств в эво-
люционном процессе [Goldschmidt, 1940; Грод-
ницкий, 2000]. В настоящей работе термин «мор-
фоз» обозначает нснаслсдусмыс морфологиче-
ские нарушения, вызванные не внешними усло-
виями, а генетическими особенностями самого ро-
дителя. Речь идет о морфозах, вызываемых при-
сутствием условной мутации. Их можно назвать
«эндоморфозами» в отличие от ранее известных
«экзоморфозов». Из последующего изложения
будет ясно, что эндоморфозы среди морфозов
представляют собой весьма характерную группу'
уродств. Они обладают некоторыми характер-
ными свойствами, позволяющими их четко от-
личать от так называемых модификаций.
Морфозы, появляющиеся у условных мутан-
тов. представляют собой нарушения развития
разной степени выраженности. Большинство из
них не мешают мухам вылупиться из куколки,
существовать, спариваться и даже давать потом-
ство. Экспериментатор, работающий с дрозофи-
лой достаточно продолжительное время, безус-
ловно, сталкивался со случаями образования
морфозов. Однако такие случаи — большая ред-
кость. В потомстве полученных мутантов мор-
фозы возникают часто. После начала работы с
условными мутациями коллекция цветных изо-
бражений морфозов быстро достигла внуши-
тельных размеров (около тысячи). Поражает раз-
нообразие морфозов и глубина нарушений, не
становящихся, как правило, преградой сущест-
вованию мухи.
Характерная черта морфоза — асимметрич-
ность. Морфоз возникает на левой или правой
стороне тела, на одном крыле или одной ноге.
Похоже, что симметричных морфозов не бывает.
Здесь речь идет о морфозах одной и той же фор-
мы. Мутантная муха может содержать не один, а
несколько разных по форме морфозов, в этих
случаях морфозы могут оказаться на симмет-
ричных структурах.
22.5.2. Распределение морфозов
по частям тела
О разнообразии морфозов можно судить по
изображениям на рисунках. Морфозы сгруппи-
рованы по частям тела. Проведем краткий обзор
нарушений.
Голова', изменение формы головы, увеличе-
ние числа и размеров различных групп щетинок
на голове, удвоение и утроение антенны и ари-
сты, отсутствие половины или четверти головы
(рис. 22.5), удвоение головы (рис. 22.6).
Глаз: изменение формы глаза, редукция глаз,
замещение части фасеток или всего глаза вырос-
тами, покрытыми щетинками, разрастание во-
лосков между' фасетками до размера щетинок,
изменение размеров и правильности расположе-
ния омматидиев (рис. 22.7).
Грудь и среднегрудъ: редукция половины гру-
ди или ее части с отсутствием или сохранением
мезоторакальной (средней) ноги, раздвоение
груди, изменение формы и размеров щитка, из-
менение числа и формы щетинок, выросты на
передней поверхности, покрытые щетинками,
506 ЭПИГЕНЕТИКА
Рис. 22.5. Морфозы головы.
а — три антенны вместо двух в норме; б — слева головная капсула со щетинками отсутствует; в — отсутствие части головы и глаза справа; г — голова асимметрично
изменена, антенна справа черного цвета (некроз?); д — асимметричное разрастание тканей в передней части головы; е — голова уплощена, разделена на две полови-
ны, видна шея; ж— дополнительная антенна слева некротического вида (черный цвет); з — изменение формы глаза слева, по нижнему краю глаза разрастание щети-
нок в виде пучка; и — голова асимметрична, разделена желобом на две половины.
Рис. 22.6. Морфозы «две головы».
а — уменьшенная вторая голова на месте левого глаза, глаз на уменьшенной копии головы имеет фенотип Ваг, такой же, как глаз на основной голове; б — на месте
правого глаза вырост в виде головы с двумя глазами типа w3; в — на месте левого глаза голова с придатками и двумя глазами красного цвета; г — две головы с придат-
ками на одной шее; д — вторая голова с глазами типа ш3 на месте правого глаза; е — одна голова (снизу) с двумя глазами типа w, вторая (сверху) — с одним глазом
типа w.
ГЛАВА 22
сл
о
508 ЭПИГЕНЕТИКА
Рис. 22.7. Морфозы глаза.
а — складчатая поверхность глаза слева; б — глаза резко редуцированы, не симметричны по форме; в — глаз справа уменьшен, часть фасеток заменена щетинками;
г — «двухэтажный» глаз справа; д — глаз слева в виде двух отдельных фрагментов; е — отдельные омматидии (красные пятна) на затылке; ж— «висячий» глаз слева;
з — дополнительный глаз в виде шарика справа; и — глаз слева уменьшен, треугольной формы.
Рис. 22.8. Морфозы груди.
а — прямоугольная вырезка в передней части груди, асимметрия груди; б—отсутствие правой части груди вместе с крылом; в — раздвоение груди на две половины,
формы щитков асимметрично изменены; г — правая половина груди отсутствует, форма щитка нормальная; д — правая половина груди отсутствует, щиток изменен;
е — вырост на нижней стороне груди (аналог головы?); ж— изменение груди, трехчастная грудь, левое крыло уменьшено, с пузырем; з — отсутствие левой половины
груди с темным пятном в основании метаторакса; и — отсутствие грудных щетинок в виде полосы слева, щетинки на щитке отсутствуют.
ГЛАВА 22 509
510 ЭПИГЕНЕТИКА
Рис. 22.9. Морфозы крыла.
а — левое крыло скомкано; б — левое крыло заполнено меланоподобной массой; в — левое крыло уменьшено, жилка L5 почти полностью отсутствует; г —
дополнительное крыло слева в виде трубчатого выроста; д — крылья уменьшены, асимметричные вырезки по краю крыла типа Notch; е — крыло справа заменено дву-
мя мешкообразными выростами со щетинками; ж— отсутствие крыла слева с измененем груди и некротическими зонами (чернота); з — правое крыло укорочено, имеет
нетипичную круглую форму; и — изменение формы крыла справа.
Рис. 22.10. Морфозы ноги.
а — бедро, голень и лапка левой метаторакальной ноги деформированы; б — отсутствие левой проторакальной ноги; в — отсутствие правой метаторакальной ноги; г —
левая проторакальная нога в виде «клешни» (раздвоение лапки); д — культя правой метаторакальной ноги; е — отсутствие бедра и голени левой метаторакальной ноги;
ж— дополнительная седьмая нога (извита); з — голень правой проторакальной ноги утолщена, лапка раздвоена; и — раздвоение правой метаторакальной ноги (голень
и лапка).
ГЛАВА 22
512 ЭПИГЕНЕТИКА
Рис. 22.11. Морфозы брюшка (I) и тергитов брюшка (II).
I: а — полное отсутствие анально-генитальной пластинки; б — удвоение мужских наружных половых органов; в — деформация мужских наружних половых органов; г —
деформация мужских наружных половых органов и нарушение рисунка тергитов слева; д — последняя пара стернитов у самки изменена и смещена со средней линии
вправо; е — отсутствие наружних половых органов; ж — деформация яйцеклада; з — ротация брюшка на 180° (вид сверху); и — ротация брюшка на 180° (вид снизу). II:
а — нарушение симметрии тергитов у двух сестер одного выводка; б— отсутствие правой части среднего тергита; в — полное отсутствие тергитов слева, справа остат-
ки тергитов; г — асимметричное слияние тергитов у самца; д — резкая редукция тергитов у самца с изменением формы брюшка; е — редукция медиальной части пла-
стинки тергита у самки; ж — отсутствие соединения правой и левой частей двух тергитов; з — отсутствие правых половин двух тергитов; и — асимметрия рисунка терги-
тов (дефект средней части тергита и отсутствие правой половины другого тергита).
ГЛАВА 22 513
514 ЭПИГЕНЕТИКА
темные пятна («меланомы») с сопутствующим
втягиванием наружних покровов рядом с пят-
ном, полосы отсутствия щетинок и волосков,
области отсутствия только волосков, отсутствие
гальтеры и среднегруди с одной стороны с ис-
кривлением туловища в эту сторону’, изменение
(асимметрия) расположения гальтер (рис. 22.8).
Крыло: редукция разной степени вплоть до
полного отсутствия с одной стороны, изменение
жилкования разных типов (утолщение жилки,
разветвление, дельтообразное расширение у края
крыла, несмыкание с краем крыла), отсутствие
расправления крыловой пластинки, образование
пузырей, вырезки с наружного и внутреннего
края, отсутствие или изменение расположения
волосков по наружному краю крыла (рис. 22.9).
Ноги', отсутствие одной из ног (про-, мезо- и
метаторакальной) или отдельных ее частей, по-
явление дополнительных «суставов» на бедре,
голени, изменение числа члеников и изменение
их формы (обычно утолщение), поворот послед-
них члеников в обратную сторону (рис. 22.10).
Брюшко: нарушение числа и симметрии тер-
гитов, обесцвечивание тергитов, изменение фор-
мы и расположения стернитов, втянутость кон-
чика брюшка, отсутствие наружних половых ор-
ганов, образование измененных анально-гени-
тальных комплексов, темные пятна (рис. 22.11,1).
Нарушения тергитов ввиду’ их многочислен-
ности представлены на отдельном рисунке
(рис. 22.11,11).
В порядке классификации морфозов можно
выделить два больших класса морфозов: «+
ткань» и «- ткань». Примеры того и другого клас-
са представлены на рис. 22.12 и 22.13. В общем,
трудно найти часть тела мухи, которая не оказа-
лась бы в результате морфоза мультиплициро-
ванной или отсутствующей. Могли отсутство-
вать, к примеру, половина головы, глаз, ариста и
антенна, щетинки на голове и тораксе, половина
торакса, гальтера, крыло целиком и отдельные его
части, сегменты брюшка (тергиты), стерниты,
ноги (одна, две и все три с одной стороны), от-
дельные части ноги (бедро, голень, лапка), аналь-
но-генитальный комплекс целиком. На рис. 22.6
представлены варианты удвоения головы.
Отдельный большой класс морфозов — соче-
танные морфозы, когда изменение типа «+ ткань»
и «- ткань» одного участка тела сочетается с из-
менением другого участка тела. Примеры соче-
танных морфозов представлены на рис. 22.14.
В потомстве родителей может возникнуть
единственная особь, содержащая уродство, но
может их оказаться несколько. Были случаи, ко-
гда все потомство, состоящее из нескольких
десятков потомков, оказывалось носителями
уродств. В последнем случае форма морфозов
чаще всего имела сходный характер. Примеры
массового образования морфозов приведены на
рис. 22.15.
Наличие условной мутации гарантирует по-
явление морфозов в последовательных поколе-
ниях. Этот факт надежно прослежен в процессе
долгого ведения культур условных мутаций.
Точно можно сказать, что тип морфоза не на-
следуется. Если в первом поколении морфоз, к
примеру, касался изменения крыльев, во втором
поколении морфоз может изменить ноги или
что-то другое. Вместе с тем отмечены случаи по-
явления абсолютно идентичных по форме мор-
фозов, как это случается при массовом воз-
никновении морфозов в одном поколении (см.
рис. 22.15).
Необычны морфозы, названные «меланома-
ми». Они представляют собой конгломераты
темной ткани, похожие на некрозы. Размеры их
варьируют. В одном случае почернение касалось
одной стороны тела, на вторые сутки почерне-
ние стало распространяться на вторую сторону,
и после почернения хоботка муха издохла
(рис. 22.16). Образование «меланом» может при-
обретать вид модификации, когда число потом-
ков, содержащих под эпителием темный конг-
ломерат, приближается к 100 %. Было несколько
случаев, когда отбор потомков с «меланомами»,
казалось, привел к образованию культуры, в ко-
торой каждая из особей обладала этим призна-
ком. Однако на определенном этапе ведения
культуры число потомков с признаком начинало
уменьшаться, и в последующих генерациях они
вообще переставали появляться.
В процессе работы с условными мутациями
возникла необходимость различать три вида фе-
нотипических изменений: мутации, модифика-
ции и морфозы. Довольно скоро процесс разли-
чения был унифицирован и свелся к следующе-
му. К морфозам относили только асимметрич-
ные нарушения фенотипа и те более редкие слу-
чаи, когда нарушения парных органов имели яв-
но различающийся характер. К модификациям
относили симметричные нарушения фенотипа
(как правило, не сильно меняющие общий вид
мухи). Они, как правило, возникали у несколь-
ких особей в потомстве, а главное, наследова-
лись у части потомков в нескольких генерациях.
Попытки введения модификации в культуру, как
правило, заканчивались полным исчезновением
фенотипического нарушения в культуре. Мута-
Рис. 22.12. Морфозы типа «+ ткань».
а — группы омматидиев глаза (красные пятна) на затылке; б — дополнительный глаз справа; в — дополнительная грудь с видоизменным крылом слева, левое крыло в
виде бесструктурного пузыря; г — дополнительное крыло слева (направлено вперед), грудь слева изменена; д — кусок тергита со щетинками на брюшной стороне; е —
удвоение наружных гениталий у самца; ж—вместо нормального крыла справа четыре крыловидных придатка со щетинками; з — лапка ноги на брюшке; и —
дополнительная видоизмененная седьмая нога.
ГЛАВА 22 515
516 ЭПИГЕНЕТИКА
Рис. 22.13. Морфозы типа «-ткань».
а — отсутствие крыла (культя) и щетинок на левой половине груди; б — отсутствие проторакальной ноги слева; в — отсутствие головной капсулы и большей части глаза
справа; г — отсутствие крыла слева, круговое расположение щетинок на левой части груди; д — одна пара ног вместо трех пар в норме, формы правой и левой ног в
паре разные; е — лапка метаторакальной ноги слева редуцирована; ж—отсутствие половины груди слева, включая крыло; правое крыло с вырезками типа Notch; з —
правое крыло кругообразно обрезано; и — отсутствие крыла слева, левая половина груди конусообразно вытянута.
ГЛАВА 22
Рис. 22.14. Сочетание морфозов.
а — асимметричные нарушения формы груди, крыльев и ног; б—нарушения головы, глаза, крыла (пузырь), тергитов (прерыв третьего тергита); в — асимметричные
нарушения головы и груди, крыльев, ног; г — нарушения крыла и ноги (укорочение бедра) справа; <3, е — излом крыла и отсутствие ноги слева; ж— извитая нога и де-
фект крыльев; з — раздвоение торакса и щитка, пузырь на правом крыле; и — уменьшен левый глаз, левая часть торакса в виде бугра с выростом вместо крыла. ел
518 ЭПИГЕНЕТИКА
Рис. 22.15. Массовые морфозы (появление в потомстве двух и более особей с одинаковыми морфозами).
а — крыло, обрезанное по внутреннему краю; б— нарушение жилкования крыльев; в — нарушение рисунка тергитов; г — узкое крыло с пузырем; д — редукция левого
крыла; е — раздвоение груди, пузыреобразное левое крыло; ж— поднятые крылья; з — скомканное редуцированное крыло; и — уменьшено одно крыло.
Рис. 22.16. Морфоз «меланома».
а — «меланома» в основании правого крыла; б— на брюшке у самки; в — на брюшке у самца; г — ног и хоботка; д — на линии разделения груди на две половины; е —
«меланома» культи левого крыла; ж— правого крыла; з — «генерализованная» меланома; и — «меланома» жилок крыла.
ГЛАВА 22 519
520 ЭПИГЕНЕТИКА
ции представляли собой обычно единичные слу-
чаи появления нового фенотипа с двухсторонним
проявлением и последующим стойким наследо-
ванием в неограниченном числе поколений.
Как видно, мутации четко отличаются от
морфозов и модификаций стабильным наследо-
ванием в чреде поколений. Отличить морфоз от
модификации нетрудно сразу же по их появле-
нию. Односторонний характер морфоза придает
ему’ вид уродства, т. е. изменения, нарушающе-
го гармонию (симметрию) живого организма.
В редких случаях для дискриминации «морфоз»
от «модификации» следовало получить следую-
щее поколение особи. Модификации в неизмен-
ном фенотипическом обличии продолжали на-
следоваться в следующих генерациях, морфозы
не наследовались. Модификации, как правило,
появлялись в виде группы, морфозы чаще все-
го — поодиночке.
Мутации, модификации и морфозы могли со-
четаться в одной особи. К примеру, в культуре
условной мутации возникала мутация, а уже на
ее фоне шло образование морфозов (рис. 22.17).
Целые наборы морфозов получены у диморфных
мутантов (рис. 22.18).
22.5.3. Родительские эффекты
образования морфозов
В процессе поддержания условных мутаций в
культуре оказалось, что морфозы возникают не
только у потомков, содержащих мутацию, но и у
потомков, не получивших ее. Так, в случае веде-
ния УДЛ(Х) в культуре со сцепленными Х-хро-
мосомами морфозы возникали не только у пат-
роклинных самцов «+», содержащих мутантную
Х-хромосому (см. рис. 22.4, б), но и у самок у w f,
не содержащих мутантной Х-хромосомы. В слу-
чае ведения УДЛ(Х) в культуре с инверсионной
хромосомой Мёллер-5 (см. рис. 22.4, а) морфозы
возникали не только у самок +/Мёллер-5 и сам-
цов < + >, но и у самок — гомозигот по Мёллер-5
и самцов Мёллер-5. Последние не содержали ус-
ловной мутации.
По изображениям морфозов, представленных
на рисунках, можно определить, образовался ли
морфоз у особи, содержащей условную мута-
цию, или у особи, не содержащей ее. Так, при
поддержании мутаций УДЛ(Х) на сцепленных
Х-хромосомах самки у w f (желтое тело, белые
глаза, загнутые щетинки) не содержали мутации.
При поддержании мутаций в культуре с инвер-
сией Мёллер-5 не содержали УДЛ(Х) самки и
самцы фенотипа у В wa (желтое тело, полоске-
ГЛАВА 22
Рис. 22.18. Морфозы на диморфных мутациях.
а — извитая левая метаторакальная нога и редукция левого крыла; б—нарушение жилкования правого крыла; в — редукция правой половины торакса; г — редукция
правого крыла (разной степени выраженности); д — отсутствие левого крыла; е — редукция и деформация лапки мезоторакальной ноги справа; ж— изменение формы
правого прыла; з — вырезки по наружнему краю крыла типа Notch; и — левое крыло смято и уменьшено в размере. <-л
522 ЭПИГЕНЕТИКА
Рис. 22.19. Родительские эффекты образования морфозов (присутствие морфозов у потомков, не получивших от родителей условной мутации (самки
yellow, самки и самцы ln(1)Muller-5, и/5 В).
а — деформация головы; б — деформация головы и крыльев; в — замена левого крыла двумя выростами (самец + не содержал условной мутации); г — нарушения
прикрепления жилок типа Delta на левом крыле; д — асимметричное изменение формы крыльев; е — пузырь на правом крыле, правое крыло короче левого; ж — дефект
формы крыла справа; з — полоса отсутствия щетинок на правой стороне груди; и — деформация ног на правой стороне тела.
ГЛАВА 22 523
видные глаза абрикосового цвета). Изображения
морфозов у особей описанных выше фенотипов
означают, что морфозы возникли у потомков, не
получивших условной мутации от родителя.
На иллюстрациях морфозов можно видеть
самок и самцов желтого цвета (мутация yellow).
Они возникли в F1 и F2 скрещиваний самок yel-
low с мутантными самцами УДЛ(Х) и тоже не
имели мутантных Х-хромосом. Несмотря на это,
и они оказывались с морфозами. Образование
морфозов у особей, не имевших условной мута-
ции, имело место и в потомствах условных му-
тантов по хромосомам 2 и 3. Таким образом, в
части образования морфозов условные мутации
имели отчетливый родительский (материнский
или отцовский) эффекты. Образование морфоза у
потомка обусловлено наличием условной мутации
у одного из родителей, но отнюдь не получением
от родителя самой мутации (рис. 22.19).
22.5.4. Частота образования морфозов
Появление морфозов в потомстве мутантов
явилось неожиданностью и поначалу наблюде-
ние за образованием морфозов ограничивалось
их разглядыванием и фотографированием. В
дальнейшем была поставлена задача определить
частоты появления морфозов в скрещиваниях с
участием мутантов. Так, частоты морфозов были
определены в опыте по изучению кроссинговера
между мутантной Х-хромосомой и маркерной X-
хромосомой у cv ес ct v f (табл. 22.1). Частоты
образования морфозов были большими: от не-
скольких процентов до десятка процентов. Не-
обходимо отметить, что учет числа морфозов
велся по единичным морфозам. Кроме этого,
были и случаи массового образования морфозов.
Образование идентичных морфозов в потомстве
пары родителей считали за один случай образо-
вания морфозов. Всего в опыте по кроссингове-
ру было пять случаев массового образования
морфозов, в каждом из которых было по не-
сколько десятков ненормальных особей. При-
мерно та же частота (от одного до 10 %) образо-
вания морфозов была зафиксирована в большом
опыте с диаллельными скрещиваниями услов-
ных мутаций (табл. 22.2).
В общем, можно отметить, что процесс обра-
зования морфозов в культурах мутаций не явля-
ется монотонным, хотя причины повышения или
понижения частоты образования морфозов не
ясны. Общее впечатление, что процесс образо-
вания морфозов ускоряется скрещиванием му-
тантной культуры с другими культурами. Скре-
Таблица 22.1
Образование морфозов в потомстве самки
«mutation/у2 ес cv ct v f»
Номер мутант- ной линии Общее количе- ство потомства Доля потомков с морфозами, %
2 485 11,3
3 244 10,7
5 362 26,0
6 596 2,4
7 317 17,9
8 405 14,0
9 428 14,7
10 271 6,6
11 390 16,7
27 108 6,5
29 471 3,2
30 243 11,1
31 417 8,6
32 415 12,8
33 97 15,5
34 737 10,9
35 478 11,9
36 327 25,7
38 126 3,2
41 408 16,4
Control 3687 0
щивание мутантных культур между’ собой также
усиливает образование морфозов. Кажется, что в
процессе ведения условных мутаций в культуре
образование уродств со временем затихает, хотя
специального исследования на этот счет не про-
ведено.
22.5.5. Образование морфозов
в лабораторном фонде мутаций
Массовое образование морфозов у мутантов
поставило вопрос об образовании морфозов в
«контроле», у особей, не содержащих условных
мутаций. В качестве подхода к решению вопроса
предприняли наблюдение за образованием мор-
фозов в лабораторном фонде мутаций Drosophila
melanogaster. Фонд мутаций в лаборатории со-
бирался в течение многих лет и использовался
для проведения разнообразных генетических
работ. В течение года исследовали образование
морфозов в фонде, состоящем из 146 культур. Из
них 118 — содержат перестройки в хромосомах
1, 2, 3, а 28 культур — не содержат.
Потомство каждой линии фонда на момент
его максимального вылета из куколок просмат-
ривали под бинокуляром. Обычно это были два
524 ЭПИГЕНЕТИКА
Таблица 22.2
Диаллельный анализ условных доминантных
летальных мутаций в Х-хромосоме (скрещивание: самка УДЛ(Х)п11п(1)Ми11ег-5 х самец УДЛ(Х)п + 1)*
Номер линии УДЛ(Х) самки Дочь В/+ Дочь +/+ Сын М-5 Сын + Всего ПОТОМКОВ Из них потомков с морфозами
Всего Доля в потомстве, %
1 129 47 147 109 432 37 8,6
2 208 76 229 272 785 58 7,4
3 51 27 46 48 172 8 5,7
5 227 163 253 270 913 72 8,9
6 354 115 203 270 942 21 2,3
7 93 27 87 100 307 16 5,2
8 224 126 153 212 715 34 4,8
9 227 126 176 241 770 33 4,3
10 192 97 178 235 702 37 5,3
11 251 162 204 195 812 37 4,6
27 169 68 170 176 583 45 7,7
29 96 34 89 103 322 24 7,5
30 152 86 133 176 547 24 4,4
31 161 111 144 210 626 19 3,0
32 62 40 44 50 196 2 1,0
33 77 33 92 70 272 5 1,8
34 58 50 43 42 193 7 3,6
35 144 91 135 136 506 15 3,0
Всего 2875 1479 2526 2915 9795 494 5,0
* УДП(Х) — краткое обозначение условных доминантных леталей в Х-хромосоме. Проведено 306 реципрокных скрещиваний
между 18 УДП(Х).
стаканчика с потомством, состоящим из 80—100
особей. За год было просмотрено потомство 146
культур, образовавшееся, как минимум, за 16
генераций. В среднем в каждой линии за год
просмотрели около 1200 потомков. Морфозы
выделяли и фотографировали, как было сказано
выше.
Всего за год зарегистрировано 108 морфозов,
представляющих собой хорошо выраженные на-
рушения развития. Большая часть морфозов (78)
возникла в 13 линиях фонда. Девять были из
числа линий, содержащих хромосомные пере-
стройки, четыре — из числа не содержащих. По
уровню образования морфозов указанные 13 ли-
ний приближаются к линиям с условными мута-
циями. В общем, несмотря на появление морфо-
зов в отдельных линиях, частота обнаружения
морфозов в лабораторном фонде гораздо ниже,
чем в коллекции полученных мутаций. Действи-
тельно, в 146 линиях фонда было найдено 108
морфозов, по сравнению с тысячей зафиксиро-
ванных цветных изображений морфозов в кол-
лекции мутаций, состоящей из пяти десятков
мутаций. Надо учитывать при этом, что фикси-
ровали в виде файлов только наиболее яркие де-
фекты развития и не включали в коллекцию по-
хожие дефекты. Примеры морфозов в лабора-
торном фонде представлены на рис. 22.20. Об-
щий вывод из наблюдения за образованием
морфозов в лабораторном фонде состоит в том,
что у Drosophila melanogaster 1) существует низ-
кий «спонтанный» уровень образования морфо-
зов и 2) среди линий дрозофилы, находящихся в
лабораторных фондах, некоторая часть линий
может содержать не идентифицированные ус-
ловные мутации. Наблюдение за несколькими
трансгенными линиями дрозофилы показало
очень высокий уровень образования морфозов.
Пока не ясно, насколько типично для трансген-
ных линий иметь высокий уровень уродств.
22.6. Эпигенетическая феноменология:
модификации
В культурах мутаций появляются волны фе-
нокопий. В одном или нескольких поколениях
воспроизводится тот или иной фенотип извест-
ных мутаций: black, purple, brown, trident, ab-
normal abdomen. Notch, yellow. Dichaete и др.
(рис. 22.21, 22). В большинстве случаев появля-
ется сразу несколько особей (от 3 до 10) нового
фенотипа. В следующей генерации, как правило,
Рис. 22.20. Морфозы в лабораторном фонде.
а — изменение расположения и формы правой мезоторакальной ноги; б — дефект лапок справа; в — дефект тергитов; г — отсутствие правого крыла и вырезки типа
Notch на левом крыле; д — замена правого крыла четырьмя отростками; е — отсутствие большей части левой половины груди и редукция левого крыла; ж—
раздвоение груди и дефект правого крыла; з — редукция левой половины груди и дефект правой крыловой пластинки; и — отсутствие правой половины груди, темное
пятно на метатораксе.
ГЛАВА 22 525
526 ЭПИГЕНЕТИКА
Рис. 22.21. Модификации-1.
а — вставка участков головной капсулы в глаз; б—«треугольный» глаз; в — дефекты формы глаза; г — узкие крылья; д — разведенные крылья; е — редуцированные не
расправленные крылья; ж — крылья измененной формы; з — крылья измененной формы с пузырями и нарушением жилкования; и — перерыв крыловых жилок L4 и L5.
ГЛАВА 22
Рис. 22.22. Модификации-2.
а — «везикулярные» крылья; б — уменьшение общего размера особи (в середине самка и самец в норме); в — два малых самца по сравнению с нормальным самцом (в
середине); г — два укороченных самца с округленными крыльями (снизу), нормальный самец сверху; д — узкое тело у самки и самца (сверху — нормальная самка); е —
разная степень редукции крыльев; ж — узкие крылья (слева), норма справа; з — крылья типа dumpy; и — самка типа black, самец нормален. <-л
528 ЭПИГЕНЕТИКА
число таких особей увеличивается. Однако через
несколько поколений они начинают постепенно
исчезать из потомства. Попытка закрепить но-
вый фенотип в отводке оказывается безуспеш-
ной. Так. например, одной из часто возникаю-
щех фенокопий является образование меланомо-
подобных образований. Удавалось получить от-
водки со 100%-м наличием «меланомы» у по-
томка, однако через некоторое количество поко-
лений фенотип терялся окончательно.
В культурах мутаций периодически появля-
ются мелкие особи. Вывести культуру с таким
фенотипом, несмотря на неоднократные попыт-
ки. не удалось. Периодически возникают резкие
нарушения в соотношении полов. Эти изменения
ведут себя так же, как было указано выше для
фенокопий.
12.7. Обсуждение (эпигенетическая
ФЕНОМЕНОЛОГИЯ И ЧТО ЗА НЕЙ СТОИТ)
Феноменологию образования морфозов и мо-
дификаций с полным правом можно считать
эпигенетической — не зависящей от последова-
тельности ДНК. Действительно, морфоз или мо-
дификация оказываются у одного или несколь-
ких потомков условной мутации, в то время как
у большинства потомков фенотип соответствует
генотипу’. В случае морфозов эпигенетическая
картина более полная и более яркая, чем в слу-
чае модификации.
Картина образования морфозов у исследо-
ванных мутантов объединяет в себе две класси-
ческие эпигенетические картины. Одна из них
под названием неполная пенетрантность была
описана Н. В. Тимофеевым-Ресовским [1925,
1996], другая под названием билатеральная
асимметрия признака — Б. Л. Астауровым [1927,
1974].
Объектом работы Н. В. Тимофеева-Ресов-
ского послужила мутация radius incompletus (ri),
обнаруженная в ходе учебной работы летом
1923 г. в нормальной «чистокровной» культуре
D. funebris. Культура происходила от самки-ро-
доначальницы, взятой из дикой популяции Гид-
рофизиологической станции близ Звенигорода.
Фенотипическим выражением признака является
нехватка дистального конца второй продольной
жилки (radius) на крыльях гомозиготной мухи
[Бабков, 1985]. Степень проявления (пенетрант-
ность) признака определялась долей измененных
мух в гомозиготных по ri культурах. Из исход-
ной линии ri были выведены «слабые» сублинии
с 34—39 % непроявления и «сильные» сублинии
с полным 100%-м проявлением [Тимофеев-Ре-
совский, 1925].
Объектом работы Б. Л. Астаурова явилась
мутация tetraptera. возникшая в учебной линии
мутации dumpy Drosophila melanogaster. Для му-
тации характерно превращение пары жужжалец
в недоразвитые крылья. Муха становилась как
бы четырехкрылой. Феномен состоял в резкой
асимметрии новообразованных крылышек спра-
ва и слева. Гальтера, близкая к своей типичной
форме на одной стороне, сочеталась с гальтерой,
превратившейся в достаточно хорошо развитое
крылышко на другой стороне. В случае образо-
вания морфоза «неполная пенетрантность» (по
Тимофееву-Ресовскому’) состоит в том, что мор-
фоз наблюдается у единичных особей потомст-
ва, а «билатеральная асимметрия» (по Астауро-
ву) — в том, что морфоз находится на одной
стороне тела (правой или левой).
Работы упомянутых выше авторов были сде-
ланы в классический период генетики — период
доминирования идеи тотального и универсаль-
ного генетического контроля живого организма.
В соответствии с ней Н. В. Тимофеев-Ресовский
истолковывал свои данные в духе универсальной
схемы реализации гена в фен [Тимофеев-Ресов-
ский, Иванов, 1966; Иванов, 1983], а Б. Л. Аста-
уров — в духе существования автономной измен-
чивости для любого признака [ Астауров, 1974]. В
обоих случаях исходные мутации, на которых
была получена неклассическая картина проявле-
ния признака, рассматривались не более как ат-
рибуты специфической генетической аранжиров-
ки эксперимента. Для генетики характерно счи-
тать мутантные формы приемлемыми моделями
для изучения нормы. В случае с условными мута-
циями эта точка зрения не кажется приемлемой: в
первую очередь приходит мысль о том, что осо-
бенная (эпигенетическая) феноменология связана
с особенностью исследованных мутаций.
Наблюдение за образованием морфозов в ли-
ниях лабораторного фонда показывает, что урод-
ства встречаются у разных мутантов, но частота
уродств у условных мутантов намного выше, не
говоря уже о нормальных линиях в лаборатор-
ном фонде. Внимательный анализ случаев эпи-
генетической феноменологии в литературе пока-
зывает. что эпигенетическая феноменология вы-
является в геномах, уже измененных конкрет-
ными генетическими мутациями, или в геномах,
подвергнутых изменению теми или иными ма-
нипуляциями .
Опыты Н. В. Тимофеева-Ресовского по варь-
ирующей пенетрантности были проведены на
ГЛАВА 22 529
мутантах radius incomplenis (ri) и venae transver-
sae incompletae (vti) D. funebris. Опыты Б. JI. Ac-
таурова по билатеральной асимметрии проведе-
ны на мутации tetraptera D. melanogaster. Урод-
ства (морфозы) наблюдал Н. Н. Соколов у меж-
видовых гибридов между D. virilis и D. littoralis
(рис. 22.23, 22.24) [Соколов, 1959]. Появление
асимметрии в виде пегостей у лис и норок было
следствием отбора на «ручное» поведение [Тра-
пезов, 1996]. Перечисленные выше примеры
возникновения эпигенетической феноменологии
позволяют предположить, что первым шагом к
эпигенетическим нарушениям является частич-
ное разрушение регуляции генома в результате
повреждения регуляторных генов.
От правильной работы регуляторных генов
зависят и проявление количественных признаков
типа ri и vti, проявление гомеозисной мутации
tetraptera. У межвидовых гибридов, определен-
но, оказывается нарушенной система генетиче-
ской регуляции. Отбор на тип поведения то-
же ведет к изменению работы генной регуляции.
В опытах с условными мутантами о нарушении
генной регуляции можно заключить по целому’
ряду фактов. О нарушении регуляторных отно-
шений свидетельствуют наличие родительских
эффектов у условных мутаций, зависимость про-
явления мутаций от пространственных взаимо-
отношений в геноме и, прежде всего, сам услов-
ный характер проявления мутаций [Chadov et al.,
2011]. Ниже предлагается сценарий возникнове-
ния морфозов, в котором одним из центральных
моментов патогенеза является генетическая му-
тация в регуляторном гене.
Предполагаемый механизм образования мор-
фоза. Исследование условных мутаций, прове-
денное ранее, позволило предполагать, что ус-
ловные мутации представляют собой мутации
генов (= последовательностей ДНК), ответст-
венных за регуляцию части генома, состоящей
из структурных генов [Chadov etal., 2011]. По-
следние данные о локализации мутаций и вто-
ричном мутагенезе в мутантных линиях [Чадов
и др., 2012] подтверждают предположение. Раз-
деление генов на регуляторные и структурные
принято [Льюин, 1987]. На рис. 22.25, взятом из
публикации авторов [Чадов и др., 2004а], схема-
тично представлен онтогенез, осуществляемый
двумя сортами генов. Несмотря на то, что те и
друтие гены представляют собой отрезки ДНК,
их работа качественно различается [Chadov et al.,
2011]. Одной из особенностей генов регулятор-
ного пути является то, что они дублированы. При
выходе из строя (мутации) одного из регулятор-
Рис. 22.23. Типы уродств у гибридов F1 от скрещива-
ния '(’О. virilisх.3D. littoralis.
a — уродливый глаз, уменьшенные щетинки и крыло; б —
уродливый торакс; е — два крыла от одной и той же гибрид-
ной особи; г — два семенника от одного и того же самца (из
[Соколов, 1959]).
Рис. 22.24. Аномалии гибридов F1 от скрещивания $D.
virilisx.W. littoralis, связанные с удвоением органов,
а — раздвоение лапки; б—раздвоение гальтера; е — раз-
двоение антенны; г — раздвоение крыла (из [Соколов, 1959]).
530 ЭПИГЕНЕТИКА
Рис. 22.25. Генетическая модель онтогенеза (из [Чадов и др., 2004а]).
а — гены и сигнальные пути. Геном особи состоит из структурных генов (темные кружки) и регуляторных ге-
нов (онтогенов) разных рангов (светлые круги, квадраты и треугольники). Регуляторный ген представлен
набором цис-аллелей (разделение значков на сектора). to_4 — стадии онтогенеза. Активация генома идет по
регламентированной системе сигнальных путей (линии между генами, стрелки). Сигнальные пути заверша-
ются включением структурных генов. Онтогенез представляет собой процесс последовательного включения
регуляторных генов разного ранга по принципу эстафеты. При переходе от предыдущей стадии онтогенеза к
последующей отключаются онтогены, работавшие на предыдущей стадии, а также структурные гены, обес-
печивавшие появление презумптивных структур (заштрихованные кружки), б — онтогенез на одной из по-
следних стадий (t4). Пунктиром показаны отключенные гены и недействующие сигнальные пути. Остается
включенной большая часть структурных генов и некоторые онтогены, близкие к ним по времени включения
(регуляторные гены стволовых клеток).
ных генов (летальная мутация) часть потомства
остается в живых по причине следования регуля-
торного сигнала по запасному’ пути [Чадов, 2002].
Предполагаем, что работа по запасному’ вари-
анту' проведения сигнала менее эффективна. Ре-
гуляторные продукты обладают сниженной спе-
цификой взаимодействия с ДНК-матрицей. По
этой причине осуществляются неправильные
регуляторные включения. Регуляторные продук-
ты не являются ни ДНК, ни РНК, а белками. На-
ходясь в цитоплазме, они претерпевают моди-
фикации и конкурируют с друтими регулятор-
ными продуктами. Именно поэтому' дефекты,
возникающие при работе таких продуктов, яв-
ляются мозаичными и проявляются асимметрич-
но. ДНК-матрица, как известно, не меняется в
организме от клетки к клетке, несмотря на то,
что клетки фу'нкциониру'ют по-разному.
Заметим, что морфозы, какими бы глубокими
они ни были, не нару'шают общего расписания
развития мухи. Нет ни случаев возврата в разви-
тии, ни ускорения в развитии. Включалось (или
не включалось) то, чему' и положено было вклю-
чаться в это время, но происходило это не в по-
ложенном месте. Если бы оставались открытыми
для взаимодействия ранее проработавшие ДНК-
мишени или преждевременно открывались бы
для взаимодействия ДНК-мишени, расписание
общего развития страдало бы. Сбои на уровне
работы проду'ктов, осуществляющих геннуто ре-
гу'ляцию развития, — вот причина образования
морфозов.
Специфика эпигенетического нару'шения со-
стоит в том, что она касается регу'ляторных ге-
нов и образованной ими системы регуляции.
Мутация регуляторного гена отключает главный
регуляторный пу'ть. Жизнеспособность особи
сохранится, если развитие пройдет по запасному'
пу'ти, однако эффективность пути не будет столь
же высокой из-за более низкой специфичности
ГЛАВА 22 531
регуляторных продуктов. Особенность эпигене-
тического нарушения — в том, что последствия
первичного генного нарушения нельзя предска-
зать. Какие несовершенства таит запасной путь,
нельзя знать заранее. Более того, действующими
лицами на этом пути являются регуляторные
химические проду’кты, подверженные самым
разнообразным воздействиям и находящиеся в
конкурентной среде.
Приведенное объяснение согласуется с идеей
«эпигенетического ландшафта», представленной
Уоддингтоном для объяснения механизма инди-
видуального развития. Основные пути развития
представлены креодами — руслами, окружен-
ными высокими водоразделами [Waddington,
1957]. Эпигенетические нарушения в случае ус-
ловной мутации можно представить в виде при-
нудительного закрытия главного русла движения
и возникновения другого русла с обилием низ-
ких мест в водоразделе. Несовершенство этого
русла состоит в повышенной частоте ошибок
развития — переводе развития на пути, ведущие
к появлению иных признаков.
Стоит напомнить, что условные мутации, ис-
пользованные в опытах, представляют собой осо-
бый класс мутаций, характерной чертой которых
является доминантная летальность в довольно
широком круге генотипов. Лабораторные культу-
ры условных мутаций — это те варианты геномов,
в которых доминантная летальность мутаций от-
сутствует. Используя условных мутантов, удается
наблюдать реализацию вариантов развития, кото-
рые в нормальных условиях происходят редко или
очень редко. Они не совершенны. Это либо ста-
рые пути развития, на смену’ которым пришли бо-
лее совершенные пути, либо новые пути, которые
еще не стали совершенными.
Модификации схожи с морфозами: те и дру-
гие представляют собой эпигенетическую из-
менчивость, не связанную с изменением после-
довательности ДНК. Однако уже по проявлению
видно, что морфоз и модификация имеют разное
происхождение. Симметричность проявления
модификации и передача по потомству, хотя бы
в нескольких генерациях, позволяет предполо-
жить, что механизм появления модификации
состоит в изменении регуляторной зоны струк-
турного гена или самого структурного гена.
Проявление модификации выглядит более про-
стым, чем проявление морфоза. Если не считать
неустойчивости передачи по потомству, моди-
фикация равнозначна мутации. Большинство
мутаций, с которыми работала классическая ге-
нетика, являются мутациями структурных генов.
* * *
Из сказанного выше можно заключить, что
необычная феноменология у’ условных мутаций
у дрозофилы носит, определенно, эпигенетиче-
ский характер. О механизме явлений пока можно
строить только предположения, однако высокие
частоты образования морфозов и модификаций
делают условные мутации хорошей эксперимен-
тальной моделью для подробного и многосто-
роннего изучения эпигенетических явлений.
Эпигенетическая феноменология, полученная
на условных мутациях, продолжает картину па-
тологии, вызванную условными мутациями, что,
однако, не означает отсутствия эпигенетичес-
ких феноменов в норме, хотя и встречающихся
с меньшей частотой. Принципиально важно,
а это и показывает проделанная работа, что в
организме наряду’ с генетической изменчиво-
стью, обусловленной изменением последова-
тельности ДНК, существует эпигенетическая
изменчивость, не связанная с изменением ДНК-
последовательности .
Наряду- со стандартным путем индивидуаль-
ного развития, воспроизведенным несчетное ко-
личество раз и закрепленным, насколько это
возможно, генетически, существуют дополни-
тельные варианты развития, касающиеся регуля-
торных путей разной иерархии. Они менее эф-
фективны. менее помехоустойчивы, но и они
способны довести развитие до финала. Многие
из обладателей морфозов и модификаций спо-
собны к существованию и оставляют потомство.
В норме примером программы, работающей в
двух вариантах, является программа полового
диморфизма. Достаточно часто включение муж-
ского или женского пути развития происходит
под действием условий окружающей среды.
Ключевое событие, без которого не может су-
ществовать эпигенетическая изменчивость, от-
носится к генетической системе. Это событие —
выработка регуляторными генами регуляторных
продуктов, способных к изменениям в ответ на
воздействия внешней или внутренней среды.
Эти изменения трансформируются в регулятор-
ные сигналы, запускающие разные регуляторные
каналы. Предположения о том, что указанный
механизм лежит в основе модификационной из-
менчивости у растений, в настоящее время по-
лучают экспериментальное подтверждение на
культурных растениях. Показано, что смена ли-
митирующего фактора внешней среды на мягкой
пшенице влечет за собой смену’ спектра локусов,
определяющих генотипическую изменчивость
532 ЭПИГЕНЕТИКА
признака [Чесноков и др., 2008; Кочерина, Дра-
гавцев, 2008].
Эпигенетика, изучающая типы и механизмы
эпигенетической изменчивости, расширяет пред-
ставление о живом организме как системе. На
смену’ классической генетике, представляющей
живой организм как закрытую систему’ реализа-
ции генетической информации, идет представ-
ление о живом организме как генетической сис-
теме, находящейся в «общении» с внешней и
внутренней средой.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Астауров Б. Л. Исследование наследственного изменения
галтеров у Drosophila melanogaster И Жури, эксперим.
биологии. 1927. Т. 3, вып. 1—2. С. 1—61: Вып. 3—4.
С. 199—201.
Астауров Б. Л. Исследование наследственных нарушений
билатеральной симметрии в связи с изменчивостью
одинаковых структур в пределах организма И Наслед-
ственность и развитие. Избр. тр. М.: Наука. 1974.
С. 54—109.
Ауэрбах Ш. Проблемы мутагенеза. М.: Мир, 1978. 463 с.
Бабков В. В. Принцип Астаурова: автономная изменчивость
признаков И Московская школа эволюционной гене-
тики. М.: Наука, 1985. С. 59—72.
Eenovcoe Л. В. Морфогенез, морфомеханика и геном 7/
Вестник ВОГиС. 2009. Т. 13, № 1. С. 29—35.
Гродницкий Д. Л. Две теории биологической эволюции / ИЛ
СО РАН. Красноярск. 2000. 180 с.
Иванов В. И. Генетический контроль развития дрозофилы И
Чтения памяти Н. В. Тимофеева-Ресовского. Ереван:
Изд-во АН Армянской ССР, 1983. С. 91—104.
Кочерина Н. В., Драгавцев В. .4. Введение в теорию эколого-
генетической организации полигенных признаков рас-
тений и теорию селекционных индексов. СПб.: АФИ,
2008. 87 с.
Льюин Б. Гены. М.: Мир. 1987. 544 с.
Малецкий С. И. (ред.). Эпигенетика растений: Сб. науч. тр. /
ИЦиГ СО РАН. Новосибирск. 2005. 373 с.
Рапопорт И. .4. Специфические морфозы у Drosophila me-
lanogaster, вызванные химическими соединениями 7/
Бюл. эксп. биол. мед. 1939. № 7. С. 415—417.
Савостьянов Г. .4. Аксиоматический подход к изучению
процедуры специализации и интеграции как основы
становления многоклеточности И Цитология. 1976.
Т. 18. №5. С. 611—619.
Савостьянов Г. .4. Основы структурной гистологии. Про-
странственная организация эпителиев. СПб.: Наука.
2005. 375 с.
Савостьянов Г. .4. Возникновение элементарных единиц
многоклеточности и формирование пространственной
организации клеточных пластов 77 Изв. РАН. Серия
биологическая. 2012. № 2. С. 1—11.
Соколов Н. Н. Взаимодействие ядра и цитоплазмы при от-
даленной гибридизации животных. М.: Изд-во АН
СССР, 1959. 147 с.
Струнников В. А. Третья изменчивость// Природа. 1989.
№ 2. С. 17—27.
Струнников В. А., Вышинский И. М. Реализационная из-
менчивость у тутового шелкопряда И Проблемы гене-
тики и теория эволюции. Новосибирск: Наука, 1991.
С. 99—114.
Тимофеев-Ресовский Н. В. О фенотипическом проявлении
генотипа. I. Геновариации radius incompletus у Droso-
phila funebris II Жури, экспер. биол. Сер. А. 1925. Т. 1.
вып. 3^1. С. 93—142.
Тимофеев-Ресовский И. В. Связь между геном и внешним
признаком И Н. В. Тимофеев-Ресовский. Избранные
груды / О. Г. Газенко, В. И. Иванов (ред). М.: Меди-
цина, 1996. С. 59—84.
Тимофеев-Ресовский Н. В., Иванов В. И. Некоторые вопро-
сы феногенетики. М.: Изд-во МГУ. 1966. С. 114—130.
Трапезов О. В. Эволюционирующие системы левосторонне-
асимметричны? И Философия науки. 1996. № 1(2).
С. 55—67.
Уоддингтон К. X. Организаторы и гены. М.: Изд-во иностр,
лит., 1947. 240 с. (Waddington С. Н. Organisers and Ge-
nes. Cambridge: Cambridge Univ. Press, 1940. 160 p.)
Уоддингтон К. X. Основные биологические концепции 7
На пути к теоретической биологии. Пролегомены. М.:
Мир, 1970. С. 11—38. (In: Waddington С. Н. (edr). To-
wards a Theoretical Biology. I. Prolegomena. Birming-
ham: Aldine Publ.Company. 1968).
Федорова H. Б., Чадова E. В., Хоцкина E. А., Чадов Б. Ф.
Условные мутации: получение методом морфозов И
Факторы экспериментальной эволюции. Сборник на-
учных трудов. Т. 8. Киев: Логос, 2010. С. 78—83.
Фризен Г. Рентгеноморфозы у Drosophila Биол. журнал.
1935. Т. 4, № 4. С. 687—704.
Чадов Б. Ф. Образ регуляторного гена в опытах на дрозо-
филе И Генетика. 2002. Т. 38, № 7. С. 725—734.
Чадов Б. Ф. Новый этап в развитии генетики и термин «эпи-
генетика» И Там же. 2006. Т. 42, № 9. С. 1261—1275.
Чадов Б. Ф. Квазицикл «ген—проген» — имманентное
свойство живого // Философия науки. 2007. № 1(32).
С. 129—156. Интернет-ресурс. Режим доступа: http://
www.evolbiol.ru/ large files/chadov2007.pdf.
Чадов Б. Ф. Энергетическое предназначение живого и ви-
дообразование. Науковий BicHHK Луганьского Нацю-
нального Аграрного Ушверситету. bio.iioii'iiii науки.
Луганск: Элтон-2. 2009. №1. С. 72—105. Интернет-
ресурс. Режим доступа: http: www.evolbiol.ru/ large files/
chadov2009. pdf.
Чадов Б. Ф. Квазицикл «ген—проген» и эволюция И Эволю-
ция: Проблемы и дискуссии 7 Л. Е. Гринин, А. В. Мар-
ков. А. В. Коротаев (ред). М: URSS, 2010. 352 с.
Чадов Б. Ф., Чадова Е. В., Федорова И. Б. Условные мута-
ции у D. melanogaster: особенности локализации и
вторичного мутирования И Международная конферен-
ция «Chromosoma 2012», 2—7 сентября 2012. Новоси-
бирск.
Чадов Б. Ф., Чадова Е. В., Копыл С. А., Федорова И. Б. Но-
вый класс мутаций у Drosophila melanogaster!! Докл.
РАН. 2000. Т. 373, № 5. С. 714 717.
Чадов Б. Ф.. Чадова Е. В.. Копыл С. А.. Хоцкина Е. .1.. Фе-
доровой. Б. Гены, управляющие онтогенезом: морфо-
зы, фенокопии, диморфы и другие видимые проявле-
ния мутантных генов И Генетика. 2004а. Т. 40, № 3.
С. 353—365.
Чадов Б. Ф., Чадова Е. В., Хоцкина Е. А., Артемова Е. В.,
Федорова И. Б. Главное действие хромосомной пере-
стройки — изменение работы регуляторных генов И
Там же. 20046. Т. 40, № 7. С. 893- -902.
Чадов Б. Ф., Чадова Е. В.. Копыл С. А.. Артемова Е. В.. Хоц-
кина Е. А., Федорова И. Б. От генетики внутривидовых
отличий к генетике внутривидового сходства И Там
же. 2004в. Т. 40, № 9. С.1157—1172.
Чесноков Ю. В., Почепня И. В., Бернер А., Ловассер У, Гон-
чарова Э. А., Драгавцев В. .4. Эколого-генетическая ор-
ганизация количественных признаков растений и кар-
тирование локусов, определяющих агрономически
важные признаки у мягкой пшеницы 77 Докл. РАН.
2008. Т. 418, № 5. С. 693—696.
ГЛАВА 22 533
Шкловский II. С. Вселенная, жизнь, разум. М.: Наука. 1976.
368 с.
Яблоика Е., ЛэмбМ. Эпигеном в эволюции: за пределами
современного синтеза И Вестник Украинского обще-
ства генетиков и селекционеров. 2008. Т. 6, №2.
С. 337—355.
Ashburner hl. Drosophila. A Laboratory Handbook. N. Y.: Cold
Spring Harbor Laboratory Press. 1989. P. 1065—1074.
AstauroffB. L. Analyse der erblichen Storungsfalle der bilater-
alen Symmmetiy im Zusammenhang mit der selbstandigen
Varialitatanchlicher Structuren // Ztschr. f. inductive Ab-
stammungs — und Vererbungslehre. 1930. Bd. 55. Heft 3.
S. 183—262.
Chudov B. F. Mutations in the regulatory genes in Drosophila
melanogaster 11 Proc. Intern. Conf. Biodiversity and Dy-
namics of Ecosystems in North Eurasia. Novosibirsk, Rus-
sia, August 21—26,2000. P. 16—18.
ChadovB.F., Fedorova N. B., ChadovaE.V., Khotskina E. A.
Conditional mutations in Drosophila // J. Life Sciences
(USA). 2011. Vol. 5, N 3. P. 224—240.
Holliday R. Epigenetics: a historical overview 7 Epigenetics.
2006. NLP. 76—80.
Goldschmidt R. The Material Basis of Evolution. New Haven:
Yale Univ. Press, 1940. 436 p.
Goldschmidt R. B., PitemickL.K. The genetic background of
chemically induced phenocopies in Drosophila 11 J. Exp.
Zool. 1957. Vol. 135. P. 127 -202; Vol. 136. P. 201
228.
Jablonka E., Lamb hl. J. Epigenetic Inheritance and Evolution:
the Lamarckian Dimension. Oxford: Oxford Univ. Press,
1995. 360 p.
Jablonka E., Lamb hl. J. Evolution in Four Dimensions: Ge-
netic, Epigenetic, Behavioral, and Symbolic Variation in
the History' of Life. Cambridge: MIT Press, 2005. 472 p.
Rieger R., Michaelis A., GreenhI.hl. Glossary' of Genetics.
Classical and Molecular. Berlin: Springer-Verlag, 1991.
553 p.
TTaddington С. H. The Strategy of Genes. London: Allen &
Unwin, 1957. 262 p.
ГЛАВА
23
СОВРЕМЕННЫЕ ТЕХНОЛОГИИ
СЕКВЕНИРОВАНИЯ ДНК В ЭПИГЕНЕТИКЕ
СОДЕРЖАНИЕ
23.1. Основные концепции высокопро-
изводительного секвенирования,
536
23.2. Создание библиотек для высоко-
производительного секвенирова-
ния, 539
23.3. Методы высокопроизводительного
секвенирования, 540
23.4. Обработка результатов высоко-
производительного секвенирова-
ния, 554
22.5. Высокопроизводительное секвени-
рование ДНК в эпигенетике, 555
Список литературы, 561
536 ЭПИГЕНЕТИКА
О существующих методах высокопроизводи-
тельного секвенирования ДНК написано немало
превосходных обзоров (см., например, [Metzker,
2010; Shendure etal., 2011]). Однако скорость
прогресса в этой молодой области биотехноло-
гий настолько велика, а сфера применения на-
столько разнообразна, что необходимость напи-
сания свежего обзора на русском языке ощуща-
ется необычайно остро. Эта глава посвящена ис-
тории возникновения технологий высокопроиз-
водительного секвенирования, описанию основ-
ных платформ, которые в настоящее время ак-
тивно и широко используются в современных
лабораториях, а также применению этих техно-
логий для исследований в области эпигенетики.
23.1. Основные концепции
высокопроизводительного
СЕКВЕНИРОВАНИЯ
Хотя метод Сэнгера вот уже более 30 лет
безупречно служит нуждам молекулярных био-
логов, потребность в более производительном и
дешевом методе секвенирования постоянно на-
растала. Эта потребность катализировала появ-
ление новых высокопроизводительных и эконо-
Выделение ДНК
Случайная фрагментация ДНК
Клонирование фрагментов в плазмидные векторы
Трансформация бактерий; рост; выделение плазмидной ДНК
То о Э° э
Секвенирование библиотеки плазмид
Сборка перекрывающихся фрагментов в контиг
Рис. 23.1. Последовательные этапы метода «дробо-
вика».
Метод основан на создании плазмидной библиотеки случай-
ным образом фрагментированной ДНК с последующим сек-
венированием индивидуальных клонов. Сборка протяженных
последовательностей производится за счет выравнивания
последовательностей перекрывающихся фрагментов.
мичных методов расшифровки ДНК, в основе
которых лежат разные биохимические принци-
пы. Новорожденные технологии секвенирования
очень быстро эволюционировали и продолжают
стремительно развиваться, сменяются «поколе-
ния», появляются все новые и новые подходы.
Стоит сказать несколько слов об истории воз-
никновения высокопроизводительного секвени-
рования.
Существующие сегодня технологии секвени-
рования «нового поколения» во многом отлича-
ются друг от друга, однако эксплуатируют ряд
общих принципов. Можно сказать, что создание
таких технологий стало возможным только по-
сле появления и освоения научным сообществом
трех концепций. Это
1) «метод дробовика» (shotgun method);
2) мультиплексирование (параллельное секве-
нирование);
3) пошаговая регистрация этапов синтеза
ДНК.
Метод дробовика. Метод дробовика был раз-
работан для секвенирования протяженных уча-
стков ДНК [Messing et al., 1981]. Его суть заклю-
чается в том, что ДНК случайным образом фраг-
ментируется на сравнительно небольшие фраг-
менты, которые встраиваются в вектор для мо-
лекулярного клонирования, образуя библиотеку’
клонов. Индивидуальные клоны ДНК из библио-
теки секвенируют, используя универсальный
олигонуклеотидный праймер для секвенирова-
ния, который отжигается на известной (и общей
для всех молекул ДНК) последовательности век-
тора, в который были встроены исходные фраг-
менты ДНК (рис. 23.1). После секвенирования
проводится «сборка» последовательности ис-
ходного участка ДНК из полученных перекры-
вающихся фрагментов. При помощи такой стра-
тегии были полностью расшифрованы первые
крупные эукариотические геномы — дрозофилы
и человека. Первичная расшифровка генома че-
ловека стоила 3 млрд долл, и заняла около 13 лет
работы десятков институтов во многих странах.
Наивысшего развития метод дробовика дос-
тиг после разработки компанией Applied Biosys-
tems первых автоматических секвенаторов ДНК.
В них используется метод терминации цепи (так
называемый ди-дезокси-метод) [Smith et al.,
1986], а электрофорез и разделение фрагментов
ДНК разной длины проводится не в пластине
полиакриламидного геля, а в специальном поли-
мере, заполняющем капилляры. В каждом ка-
пилляре анализируется набор фрагментов, полу-
ченный в результате удлинения затравки на мат-
ГЛАВА 23 537
рице (точнее, на множестве копий) одноцепо-
чечной молекулы ДНК (рис. 23.2).
Совершенствование методов приготовления
ДНК-библиотек и биоинформатических подхо-
дов к сборке геномов также привело к значи-
тельному ускорению и удешевлению секвениро-
вания. Так, система усовершенствований, пред-
ложенная компанией Celera Genomics, позволила
расшифровать и собрать геном человека за три
года «всего» за 300 млн долл.
Важным свойством метода дробовика, на-
шедшим применение в дальнейших разработ-
ках, является унификация реакции секвенирова-
ния — все клоны одной библиотеки секвениру-
ются в идентичных условиях. Это позволило
значительно сэкономить расходы и повысить
надежность метода.
Мультиплексирование. Второй важной кон-
цепцией является идея параллелизации (мульти-
плексирования), суть которой состоит в том, что
секвенирование ДНК можно сделать существен-
но дешевле и быстрее, если один и тот же объем
реактивов использовать для многих (десятков,
тысяч или миллиардов) различных молекул-ми-
шеней. анализируемых параллельно.
Одна из первых оригинальных реализаций
этой идеи была осуществлена и запатентована
Джорджем Черчем (George М. Church) в 1988 г.
[Church, Kieffer-Higgins, 1988], который предло-
жил использовать систему' из 20 векторов для
клонирования и секвенирования. Каждый вектор
содержал в себе последовательность («тэг», от
англ, tag — ярлык), отличающую его от осталь-
ных 19 векторов. Эти векторы использовались
для клонирования 20 различных фрагментов ДНК
так, что каждому’ фрагменту’ однозначно соот-
ветствовал один из векторов. После этого два-
дцать клонов объединяли в единый пул, подвер-
гали процедуре секвенирования по Максиму и
Гилберту' [Maxam, Gilbert, 1977] и разделяли по-
Реакционная смесь
отжиг праймера
достройка цепи
ДНК-полимераза, дНТФ,
матрица, праймер,
флуоресцентно
меченные терминаторы
матрица
денатурация
Разделение продуктов
в геле и анализ
Термоциклер
Рис. 23.2. Принцип секвенирования по Сенгеру.
В реакционной смеси происходит синтез цепи, комплементарной матрице. Включение в растущую цепь ди-
дезоксинуклеотидов приводит к остановке синтеза. Каждый тип ди-дезокситерминатора помечен своим
флуорохромом. Смесь фрагментов, образовавшихся в результате случайного включения терминаторов,
разделяется электрофорезом. Фрагментам одинаковой длины соответствует один из типов терминатора.
538 ЭПИГЕНЕТИКА
Фрагменты ДНК
(1000 п.н.)
Геномная ДНК
Секвенирование
по Максаму—Гилберту
(расщепление по GYRC)
Объединение 20
рекомбинантных
колоний
Выделение
плазмидной ДНК;
Рестрикция Not I
Секвенирующии гель
Электроперенос
Рис. 23.3. Мультиплексирование с помощью молекулярных ярлыков, предложенное Черчем.
Двадцать типов плазмидных векторов позволяют секвенировать двадцать разных последовательностей в одном
геле. Выявление сигнала каждой последовательности происходит при помощи гибридизации специфических
зондов.
Нейлоновая
мембрана
Закрепление ДНК
на мембране
гибридизация;
промывка;
авторадиография;
удаление зонда
ГЛАВА 23 539
лученные фрагменты в акриламидном геле. Что-
бы идентифицировать и расшифровать каждую
из 20 последовательностей, участвовавших в ре-
акции, фрагменты ДНК, разделенные в геле,
гибридизировали с радиоактивным олигонуклсо-
тидным зондом, комплементарным последо-
вательности одного из 20 молекулярных «тэ-
гов» (рис. 23.3). Таким образом, видимым дела-
ли только один из векторов, что позволяло опре-
делить последовательность клонированного в
него фрагмента ДНК. Затем метку’ отмывали и
проводили гибридизацию с другим зондом. По-
следовательная визуализация 20 тэгов позволяла
определить последовательности всех 20 фраг-
ментов ДНК.
В таком варианте производительность («муль-
типлексность») метода определяется количеством
повторных гибридизаций и отмывок метки, что
представляет серьезное ограничение, поскольку’
сигнал с каждым циклом быстро слабеет.
В современных системах применяется страте-
гия молекулярных колоний («полоний»). Назва-
ние «полония» произошло от двух слов — ПО-
лимераза и коЛОНИЯ. Полонии представляют
собой отдельные фрагменты ДНК, многократно
размноженные в ограниченном обьеме за счет
полимеразной реакции. Множество идентичных
молекул ДНК в полонии облегчает детекцию, а их
локализованность в пространстве позволяет на-
блюдать за множеством полоний одновременно.
В сочетании с методами пошаговой регистра-
ции этапов синтеза ДНК полонии нашли приме-
нение в существующих методах параллельного
секвенирования.
Пошаговая регистрация синтеза ДНК. По-
шаговая регистрация синтеза ДНК подразумева-
ет детекцию и идентификацию каждого нуклео-
тида, включенного в ДНК полимеразой. Реали-
зация этой идеи достигается двумя основными
путями. Во-первых, включение нуклеотида и его
идентификацию можно проводить при помощи
флуоресцентных меток. Во-вторых, включение
нуклеотида можно детектировать при помощи
биохимического анализа побочных продуктов
полимеразной реакции. В этом случае в реакцию
подается только один тип нуклеотидов (А, Т, G
или С) за шаг. Оба пути были реализованы и ле-
жат в основе современных систем высокопроиз-
водительного секвенирования. Подробный обзор
этих систем приведен ниже.
Для пошаговой регистрации необходимо, что-
бы полимераза включала только один нуклеотид
за один цикл секвенирования. В случае флуорес-
центной детекции это достигается при помощи
химической модификации нуклеотидов-пред-
шественников, которая позволяет им включаться
в цепь ДНК, но препятствует включению сле-
дующих нуклеотидов. Перед каждым следую-
щим циклом эта модификация удаляется вместе
с флуоресцентной меткой. В случае детекции
побочных продуктов включения нуклеотида в
цепь ДНК в реакцию добавляется только один
тип нуклеотидов. Если в последовательности
этот нуклеотид повторен несколько раз подряд,
количество побочного продукта увеличивается в
соответствующее количество раз, поэтому’ метод
его регистрации должен быть очень чувстви-
тельным и точным.
23.2. Создание библиотек
для ВЫСОКОПРОИЗВОДИТЕЛЬНОГО
СЕКВЕНИРОВАНИЯ
В качестве материала для высокопроизводи-
тельного секвенирования служит специально
подготовленная библиотека ДНК (или кДНК, по-
лученная из РНК путем обратной транскрип-
ции). Единственное требование к ДНК — это
чистота препарата и достаточное количество мо-
лекул для создания репрезентативной выборки.
ДНК (или РНК) фрагментируют под действием
ультразвука или при помощи ферментов, после
чего из полученной популяции фрагментов раз-
ного размера отбирают фракцию требуемой дли-
ны, которая определяется конкретной техноло-
гией секвенирования и/или типом библиотеки.
В простейшем случае (при получении так назы-
ваемых фрагментных библиотек, или «библиотек
одиночных фрагментов») к молекулам ДНК дли-
ной от ста пятидесяти до нескольких сот пар ос-
нований лигируются двуцепочечные олигонук-
леотидные адаптеры известной последователь-
ности. Предварительно фрагменты библиотеки
обрабатывают смесью ферментов, которые пре-
вращают выступающие концы молекул ДНК в
тупые, несущие 5'-фосфат. Для этого обычно
используют 5'—>3'-полимеразную активность
и 3'—>5'-экзонуклеазную активность фрагмента
Кленова и Т4 ДНК-полимеразы, а также З'-фос-
фатазную активность и 5'-киназную активность
Т4 полинуклеотид киназы. После этого получен-
ные фрагменты ДНК, фланкированные адапте-
рами, за раз «репарируют» (удаляют одноцепо-
чечные разрывы, оставшиеся после реакции ли-
гирования) и амплифицируют посредством не-
скольких циклов НЦР (рис. 23.4).
Для того чтобы секвенирование было муль-
типлексным по числу’ секвенируемых библиотек
540 ЭПИГЕНЕТИКА
Образец ДНК
Фрагментация !
V
3'
Т4 ДНКП
—!©3'
“5* \
Т4 ПНК
Т4 ПНК
3'
©5'
Т4 ПНК
। + адаптеры А1 и А2
।
t
А1 „ А2
Taq ДНКП (ПЦР)!
I
у
Библиотека
Рис. 23.4. Этапы создания библиотеки фрагментов
ДНК для высокопроизводительного секвенирования.
ДНК деградируют на короткие фрагменты, достраива-
ют концы с помощью ДНК-полимеразы фага Т4 и вос-
станавливают 5'-фосфат с помощью полинуклеотид-
киназы фага Т4. Затем к фрагментам лигируют двуце-
почечные адаптеры и подвергают библиотеку не-
скольким раундам амплификации.
(не только молекул ДНК), используют молеку-
лярные штрихкоды (barcodes). По сути, это по-
следовательности ДНК, включаемые в последо-
вательность одного из адаптеров, которые по-
зволяют идентифицировать все фрагменты ДНК,
несущие этот адаптер, как принадлежащие той
или иной библиотеке. При этом каждая библио-
тека получает свой штрихкод, после чего ме-
ченные подобным образом библиотеки можно
объединить в метабиблиотеку для дальнейшего
секвенирования. В процессе секвенирования по-
следовательность адаптера, несущую молскуляр-
ный ярлык (штрихкод), прочитывается и иден-
тифицируется .
Важным этапом подготовки любой библиоте-
ки для секвенирования является проверка каче-
ства и точное измерение количества полученной
ДНК, как правило, для этого используют коли-
чественную ПЦР с детекцией в режиме реально-
го времени. Без всякого преувеличения можно
сказать, что данный этап определяет успех всего
эксперимента.
23.3. Методы высокопроизводительного
СЕКВЕНИРОВАНИЯ
Пиросеквенирование. Первая коммерческая
система параллельного секвенирования, полу-
чившая широкое распространение, основана на
применении нефлуоресцентного метода детек-
ции включения нуклеотида, получившего назва-
ние пиросеквенирования. Статья, описывавшая
метод пиросеквенирования, была опубликована
еще в 1988 г. Эдвардом Дэвидом Хайманом, в
ней оно преподносилось как «совершенно новый
метод секвенирования ДНК, ...не использующий
электрофорез, радиоактивность или флуорес-
ценцию» |Hyman, 1988]. Действительно, Хайман
максимально абстрагировался от популярных
методов Сэнгера и Максама—Гилберта и пред-
ложил первый метод секвенирования ДНК, ос-
нованный на синтезе с пошаговой детекцией
включения того или иного нуклеотида в строя-
щуюся цепь ДНК. В качестве способа регистра-
ции включения нуклеотида Хайман предложил
измерение количества пирофосфата, выделяю-
щегося при включении нуклеотида полимеразой
в цепь ДНК:
dNTP +ДНК(Х) РР, + ДНК(Х + 1).
Для этого он применил систему’ капиллярных
хроматографических колонок, содержащих фер-
менты, иммобилизованные на сефарозе. Раствор,
содержащий аденозин-5'-фосфосульфат (APS),
глюкозу, глицерин, люциферин и один из четы-
рех нуклсотид-трифосфатов (dNTP), пропускает-
ся через колонку с фосфатазой, закрепленной на
сефарозе. Фосфатаза расщепляет следы пиро-
фосфата в буферном растворе; APS, глюкоза,
глицерин, люциферин и один из четырех dNTP
проходят беспрепятственно. Затем раствор про-
пускается через колонку с DEAE-сефарозой, на
которой нековалентно закреплен комплекс ДНК-
матрицы, праймера и ДНК-полимеразы. Поли-
меризация происходит только в том случае, если
dNTP оказывается комплементарным матрице, в
результате чего образуется пирофосфат (РР,).
Смесь APS, глюкозы, глицерина, люциферина,
dNTP и РР, поступает на колонку’ с глицерокина-
зой и гексокиназой. Киназы селективно расщеп-
ляют dNTP с образованием dNDP. APS и люци-
ГЛАВА 23 541
ферин проходят далее на колонку с АТР-сульфу-
рилазой. Этот фермент катализирует реакцию
РР, + APS АТР.
Эта быстрая реакция проходит до конца. АТР.
образовавшаяся в результате этой реакции, про-
ходит вместе с люциферином на колонку с лю-
циферазой, которая катализирует превращение
люциферина в оксилюциферин, сопровождаемое
хемилюминесценцией:
люциферин + АТР + О2 —> оксилюциферин +
+АМР + РР, + СО2 + свет.
Свет детектируется фотоумножителем. Таким
образом количество АТР определяется с высо-
кой точностью, позволяющей установить, на-
сколько был удлинен праймер. Отсутствие АТР
говорит о том, что полимеризация не происхо-
дила, и комплекс матрица—праймер требует
другого dNTP для продолжения полимеризации
(рис. 23.5).
Таким образом, пиросеквенирование можно
описать как биолюминесцентный метод, кото-
рый позволяет измерять количество неорганиче-
ского пирофосфата, превращая его в видимый
свет в результате ряда ферментативных реакций
[Hyman, 1988; Ronaghi etal., 1996, 1998; Margu-
lies etal., 2005]. Пирофосфат выделяется при
встраивании очередного комплементарного нук-
леотида, который подается в ограниченном ко-
личестве, один тип за раз, в результате чего
праймер удлиняется, а ДНК-полимераза оста-
навливается. Синтез возобновляется, когда по-
является следующий подходящий нуклеотид.
Порядок и интенсивность световых вспышек
детектируются и однозначно переводятся в по-
следовательность ДНК.
Во второй половине 1990-х гг. аспирант Ко-
ролевского технологического института в Сток-
гольме Мостафа Ронаги (Mostafa Ronaghi) и его
руководитель Пал Нирен (Pal Nyren) существен-
но доработали технологию пиросеквенирования,
предложив два варианта метода — твердофаз-
ный и жидкофазный [Ronaghi etal., 1996, 1998].
Твердофазный вариант позволяет проводить про-
мывку’ и удалять не участвовавшие в полимери-
зации dNTP; для жидкофазного варианта было
предложено использовать апиразу — фермент,
APS, dNTP, люциферин,
глюкоза, глицерол
глицерол, глицерол-Р,
Свет
РР„ APS, dNTP, люциферин,
глюкоза, глицерол
Фосфатаза-Sepharose
Глицерокиназа-Sepharose
Гексо киназа-Sepharose
АТР-сульфурил аза-Sepharose
Люцифераза-Sepharose
dNTP или dADP,
глюкоза, глюкоза-Р,
РР„ APS, люциферин
АТР, люциферин
ДНК-ДНК-полимераза-DEAE-Sepharose
Рис. 23.5. Принцип пиросеквенирования.
Последовательное пропускание реакционной смеси через хроматографические колонки
с закрепленными на них различными ферментами позволяет детектировать и измерять
количество пирофосфата, высвобождающегося при включении каждого нуклеотида в
цепь ДНК.
542 ЭПИГЕНЕТИКА
Образование
эмульсии
который расщеплял оставшиеся dNTP. В таком
виде технология была автоматизирована и ком-
мерциализована в начале 2000-х гг. в Упсале.
Мостафа Ронаги основал компанию Pyrosequen-
cing АВ. которая в 2003 г. была переименована в
Biotage, а в 2008 г. куплена Qiagen. В таком
формате пиросеквенирование применяется для
генотипирования однонуклеотидных полимор-
физмов (SNP) и микроорганизмов, анализа ме-
тилирования, а также ресеквенирования. Все эти
задачи не требуют длинных прочтений, получе-
ние которых невозможно в данном формате ге-
нетического анализа.
Для того чтобы раскрыть потенциал, зало-
женный в технологии пиросеквенирования, и
сделать ее пригодной для высокопроизводитель-
ного геномного анализа, потребовались усилия
еще одного человека. В 2000 г. Джонатан Рот-
берг (Jonathan Rothberg) основал компанию 454
Life Sciences (с 2007 г. — часть компании Roche
Applied Science), которая получила лицензию на
метод пиросеквенирования. Усилиями этой ком-
пании впервые была создан секвенатор, в основе
которого лежала технология, сочетавшая в себе
все три описанные выше концепции, характер-
ные для технологии секвенирования ДНК «ново-
го поколения»: метод дробовика, мультиплекси-
рование и синтез ДНК с пошаговой регистраци-
ей этапов синтеза [Margulies et al., 2005]. Следу-
ет отметить, что данный метод секвенирования
работает с природными нуклеотидами и ДНК-
полимеразой, что, несомненно, является пре-
имуществом.
Для создания матриц высокопроизводитель-
ная платформа 454/Roche использует метод
эмульсионной 11ЦР (эмПЦР), в результате кото-
рой фрагменты библиотеки, фланкированные
универсальными адаптерами, амплифицируются
на поверхности микросфер (рис. 23.6). Эмульси-
онная ПЦР очень похожа на обычную ПЦР, од-
нако осуществляется в водно-масляной эмульсии
таким образом, что водная фаза, в которой и
проходит амплификация, разбита на миллионы
стабильных микрореакторов одинакового разме-
ра [Tawfik, Griffiths, 1998; Dressman et al., 2003].
Можно подобрать условия, в которых сложная
смесь фрагментов, присутствующих в библиоте-
ке, распределяется в эмульсии таким образом,
что в один микрореактор попадает только один
фрагмент ДНК. При этом набор ампликонов, об-
разованный от этого фрагмента ДНК, останется
заключенным в отдельный микрореактор. Если в
эмПЦР использовать микросферы, на поверхно-
сти которых закрепить один из универсальных
ГЛАВА 23 543
праймеров, то возможна амплификация фраг-
ментов ДНК на твердой поверхности микрочас-
тиц [Dressman etal., 2003]. Отдельные фрагмен-
ты ДНК библиотеки оказываются «клонально
амплифицированными» на микросферах, причем
каждая микросфера должна нести копии только
одного исходного фрагмента (т. е. быть «моно-
клональной полонией») (см. рис. 23.6).
При создании библиотек получают молскулы
ДНК длиной по 300—900 пар оснований, в зави-
симости от предполагаемой длины прочтений.
Длина прочтений, которую обеспечивает техно-
логия пиросеквенирования на сегодня, составля-
ет от 250 до 700—800 пар оснований (длинные
прочтения используются далеко не всегда — они
дороже).
После клональной амплификации на поверх-
ности микросфер диаметром в 5 мкм удержива-
ется около 10 млн копий уникальной ДНК-мат-
рицы. Затем эмульсия разрушается и микросфе-
ры, несущие одноцепочечные копии ДНК-мат-
рицы. помещаются в лунки так называемой пи-
котитровальной плашки особой конструкции.
Каждая лунка такой плашки является отдельным
пиколитровым реактором, в котором протекают
реакции пиросеквенирования.
Пикотитровальная плашка представляет со-
бой срез блока, полученного путем нескольких
раундов вытягивания и сплавления оптических
волокон. В результате каждой итерации диаметр
индивидуальных волокон уменьшается по мере
того, как волокна формируют пучки шестигран-
ной упаковки увеличивающегося поперечного
диаметра. Каждое волокно имеет сердечник диа-
метром 44 мкм, окруженный 2—3-микромет-
ровым слоем плакировки (оболочки). Затем сер-
дечники вытравливаются, и в результате полу-
чаются лунки —55 мкм глубиной, с расстоянием
—50 мкм между центрами соседних лунок. Объем
полученных реакторов — 75 пиколитров; плот-
ность размещения на поверхности плашки —
480 лунок на квадратный миллиметр. Каждая
плашка несет около 1,6 миллионов лунок, в каж-
дую из которых попадает только одна микро-
сфера с ДНК-матрицей.
Загруженная микросферами пикотитроваль-
ная плашка помещается в проточную камеру та-
ким образом, что над отверстиями лунок созда-
ется канал высотой 300 мкм, по которому в лун-
ки поступают необходимые реактивы. Достав-
ляемые в проточную камеру реактивы текут в
слое, перпендикулярном оси лунок. Такая кон-
фигурация позволяет одновременно осуществ-
лять реакции на микросферах, несущих ДНК-
матрицы, внутри отдельных лунок. Добавление
и удаление реагентов и продуктов реакции про-
исходит за счет конвекционного и диффузион-
ного переноса. Временные рамки диффузии ме-
жду’ потоком и лунками составляют порядка 10 с
и зависят от высоты проточной камеры и глуби-
ны лунок. Глубина лунок тщательным образом
рассчитана исходя из следующих соображений:
1. Лунки должны быть достаточно глубоки-
ми, чтобы микросферы, несущие ДНК-матрицу,
не выскакивали из них под действием конвек-
ции.
2. Они должны быть достаточно глубокими,
чтобы исключить диффузию продуктов реакции
из лунок, где имело место включение нуклеоти-
да, в лунки, где включения не произошло.
3. Лунки должны быть достаточно мелкими
для осуществления быстрой диффузии нуклео-
тидов в лунку и быстрого вымывания оставших-
ся нуклеотидов и продуктов реакции в конце ка-
ждого цикла, что, в свою очередь, необходимо
для обеспечения высокой продуктивности сек-
венирования и снижения расходов реактивов.
Не так давно компания Roche/454 выпустила
покрытые титаном пикотитровальные плашки,
что позволило существенно увеличить длину
прочтений (до 700—800 пар оснований) и повы-
сить их качество за счет снижения перекрестно-
го сигнала, поступающего из соседних лунок в
процессе секвенирования.
Помимо микросфер с ДНК-матрицей, в каж-
дую лунку помещают микросферы меньшего
размера с иммобилизованными на их поверх-
ности ферментами, необходимыми для пиросек-
венирования. Высвобождающаяся молекула пи-
рофосфата превращается в молскулу АТФ под
действием АТФ-сульфурилазы, как описано вы-
ше. АТФ является необходимым компонентом
реакции окисления люциферина до оксилюци-
ферина, катализируемой люциферазой светлячка
Photimis pyralis. Эта реакция сопровождается
люминесценцией (рис. 23.7).
Дно пикотитровальной плашки находится в
оптическом контакте с оптико-волоконным све-
товодом, подключенным к прибору с зарядовой
связью (CCD-сенсор, от англ, «charge coupled
device»). Это позволяет регистрировать излучае-
мые фотоны каждой индивидуальной лунки, в
которой произошло встраивание известного ну-
клеотида. Связывая зарегистрированные от каж-
дой лунки вспышки с типом нуклеотида, присут-
ствующего в проточной камере в данный момент
времени, компьютер последовательно отслежи-
вает рост цепочек ДНК в сотнях тысяч лунок
544 ЭПИГЕНЕТИКА
1—2 млн микросфер с ДНК в лунках ПТП
Флоуграмма
Циклы подачи dNTP
TCAGGTTTTTTAACAATCAACTTTTTGGMTAAAArGFAGATAADTG
CATAAATTAATAACATCACATTAGTCTGATCAGTGAATTTAT
7-1
6-
5-
4-
3-
2-
1-
0-1
ПИОЖ }б-мер
}• 5-мер
}• 4-мер
}• 3-мер
- 2-мер
}• 1-мер
Рис. 23.7. Использование пиросеквенирования в плат-
форме 454.
Молекулярные колонии, полученные методом эмульсионной
ПЦР, помещаются в индивидуальные ячейки пикотитроваль-
ной плашки. Каждая ячейка служит реактором для проведе-
ния секвенирования и позволяет детектировать люминес-
центный сигнал от индивидуальной микрочастицы.
одновременно. Время, необходимое для проте-
кания ферментативной реакции, производящей
достаточно фотонов для детекции, составляет
порядка 0,02—1,5 с. Таким образом, скорость
реакции определяется скоростью массопереноса,
что оставляет место для улучшений за счет ус-
корения доставки реактивов.
Перед поступлением в проточную камеру
следующего нуклеотида она промывается рас-
твором. содержащим апиразу [Ronaghi et al.,
1998; Margulies etal., 2005]. Таким образом из
всех лунок удаляются любые нуклеотиды, ос-
тавшиеся там от предыдущего раунда.
Выявление микросфер с ДНК-матрицей осу-
ществляется прочтением «последовательности-
ключа» адаптерного олигонуклеотида, пришитого
к началу каждого фрагмента ДНК-матрицы. Из
регистрируемого сигнала вычитается уровень фо-
на, затем сигнал нормализуется и корректируется.
Интенсивность нормализованного сигнала про-
порциональна числу' встроенных нуклеотидов.
Линейность зависимости сохраняется для гомо-
полимеров не очень большой длины. Это связа-
но с тем, что при пиросеквенировании неболь-
шая доля ДНК-матриц теряет синхронизм, т. е.
вырывается вперед или начинает отставать. При-
чиной этому’, прежде всего, служат остающиеся в
лунке нуклеотиды или неполное удлинение цепи.
Потеря синхронизма создает кумулятивный эф-
фект, снижающий качество прочтения при увели-
чении его длины. Исходя из подробной модели
лежащих в основе этого эффекта физических
процессов, разрабатываются специальные алго-
ритмы коррекции, позволяющие оценивать и вно-
сить поправки на «перелет» и неполную дострой-
ку’ цепи, происходящие в отдельных лунках. Не-
смотря на это, наиболее частыми являются ошиб-
ки двух типов — небольшие (как правило, одно-
нуклеотидные) инсерции и делеции.
Секвенирование ДНК с использованием
обратимых терминаторов. Этот метод изна-
чально был разработан компанией Solexa, кото-
рая была куплена корпорацией Illumina. Особен-
ностью данного метода секвенирования является
использование флуоресцентно меченных нук-
леотидов с обратимо блокированными З'-гидро-
ксилами, останаливающими синтез ДНК после
их включения. Процесс имеет циклический ха-
рактер, каждый цикл состоит из стадии встраива-
ния комплементарных нуклеотидов, стадии запи-
си изображения и стадии отщепления флуорофора
и блокирующей группы, что дает возможность
продолжить синтез в следующем цикле.
Для библиотек используют фрагменты ДНК
длиной не более 200—300 пар оснований, по-
скольку’ максимальная длина индивидуальных
прочтений, которую обеспечивает технология
Solexa/Illumina сегодня, составляет 150 пар ос-
нований.
ГЛАВА 23 545
«Клональная амплификация» для создания
массива полоний осуществляется на поверхно-
сти стеклянного слайда методом bridge-ампли-
фикации (рис. 23.8). Оба универсальных прай-
мера (прямой и обратный) равномерно распре-
делены по поверхности стеклянного слайда и
ковалентно с ней связаны. Последовательности
праймеров соответствуют последовательностям
универсальных адаптеров, фланкирующих фраг-
менты ДНК библиотеки. ПЦР осуществляется
термоциклированием слайда, причем все необ-
ходимые для этого реактивы, за исключением
праймеров, находятся в водной фазе.
Фрагменты ДНК библиотеки подвергаются
денатурации, затем одноцепочечные молекулы
спариваются с комплементарными олигонуклео-
тидами, иммобилизованными на поверхности
слайда. Слайд имеет размеры обычного слайда
для микроскопии, однако разделен на восемь
независимых дорожек, что позволяет анализиро-
вать восемь отдельных образцов ДНК. Новая
цепь синтезируется продолжением 3'-конца им-
мобилизированного праймера ДНК-полимера-
зой; родительская же цепочка удаляется после
денатурации новообразованного дуплекса. Адап-
терная последовательность на З'-конце скопиро-
ванной цепи отжигается на новом иммобилизо-
ванном олигонуклеотиде (обратном праймере),
расположенном в непосредственной близости,
формируя «мост» и образуя новый сайт для син-
теза комплементарной цепи в результате до-
стройки. Множественные циклы отжига, до-
стройки и денатурации приводят к образованию
и росту- кластеров, содержащих около 1000 ко-
пий и имеющих размер около одного микромет-
ра в диаметре (см. рис. 23.8).
ДНК кластера линеаризуется путем расщеп-
ления особой «надрезающей» эндонуклеазой
(расщепляющей только одну’ цепь двуцепочеч-
ной молекулы ДНК), узнающей последователь-
ность одного из адапторов. Затем ДНК денату-
рируют. что приводит к образованию одноцепо-
чечной матрицы для секвенирования синтезом.
Затем на каждом фрагменте ДНК в кластерах
отжигается праймер для секвенирования, ком-
плементарный одному’ из адаптеров, после чего
слайд помещается в проточную камеру’ секвена-
тора, куда последовательно подаются реактивы
для секвенирования.
Прежде всего, в проточную камеру поступа-
ют ДНК-полимераза и смесь четырех типов нук-
леотидов-терминаторов, каждый тип несет свой
характерный флуоресцентный краситель. Только
один нуклеотид присоединяется к 3'-концу’ каж-
дого праймера, и синтез останавливается, по-
скольку’ все нуклеотиды несут блокирующую 3'-
Рис. 23.8. Bridge-амплификация для получения полоний в платформе Illumina.
Принцип метода аналогичен эмульсионной ПЦР, но вместо отдельных микросфер применяется поверхность предметного стек-
ла. Молекулы ДНК из библиотеки в результате амплификации образуют индивидуальные кластеры, расположенные случай-
ным образом.
546 ЭПИГЕНЕТИКА
гидроксил-группу. На следующем этапе проточ-
ная камера промывается буферным раствором,
чтобы удалить все нуклеотиды, не вступившие в
реакцию, после чего проточная камера сканиру-
ется двумя лазерами через специальные оптиче-
ские фильтры для возбуждения флуоресценции
всех четырех флуорофоров. CCD-камера скани-
рует каждую проточную дорожку, а изображе-
ния сохраняются для анализа. Для получения
изображений используется метод микроскопии с
полным отражением флуоресценции (total inter-
nal reflection fluorescence microscopy, сокращен-
но T1RFM). Специальное программное обеспе-
чение сохраняет информацию о расположении
каждого кластера и о цвете встроившегося нук-
леотида. Для продолжения синтеза флуорес-
центный краситель и блокирующую группу уда-
ляют специальным расщепляющим реактивом,
затем проточную камеру еще раз промывают
перед началом следующего цикла (рис. 23.9).
Для прочтения комплементарной последова-
тельности продукт первого прочтения — ново-
синтезированную цепь — отделяют денатураци-
ей, а матрица образует мост; комплементарная
цепь достраивается, и тогда противоположная
цепь расщепляется еще одной «надрезающей»
эндонуклеазой, узнающей последовательность
другого адаптера (помечено звездочкой). Так
образуется матрица для прочтения комплемен-
тарной цепи.
Высокая плотность кластеров и прочтение
парных концов каждого фрагмента в кластерах
позволяет считать секвенаторы Illumina самыми
высокопроизводительными среди аналогичных
платформ. Производительность самого мощного
секвенатора Illumina HiSeq2000 достигает 200—
600 млрд пар оснований за запуск, который
длится около 12 дней. Секвенаторы Illumina до-
минируют на рынке высокопроизводительного
секвенирования и широко используются при ра-
боте с организмами, геном которых уже извес-
тен, для анализа однонуклеотидных полимор-
физмов, анализа РНК и, разумеется, для эпиге-
нетических исследований [Shendure et al., 2011].
При анализе результатов геномного секвени-
рования на платформе Illumina было обнаружено,
что АТ- и GC-богатые прочтения представлены
меньше, чем прочтения со средним GC-составом.
Вероятно, это вызвано их более предпочтитель-
ной амплификацией в ходе приготовления матри-
цы. Наиболее частые ошибки, присущие данному
методу секвенирования, — однонуклсотидныс за-
мены, особенно часто встречающиеся, если пре-
дыдущий нуклеотид G [Metzker, 2010].
Секвенирование ДНК посредством лиги-
рования олигонуклеотидов. Третья (по време-
ни появления на рынке секвенаторов) платформа
для высокопроизводительного секвенирования
была разработана усилиями нескольких иссле-
довательских лабораторий и лабораторий ком-
паний Agencourt Bioscience и Applied Biosystems
[Valouev etal., 2008]. Эта разновидность метода
«циклического параллельного секвенирования»
вместо обратимых терминаторов и полимеразы
использует флуоресцентно меченные олигонук-
леотиды и лигазу.
Подход к приготовлению библиотек и матриц
для секвенирования на платформе SOLiD очень
схож с подходом, применяемым в технологии
Roche/454. Для получения полоний здесь также
применяется эмГП IP однако используемые мик-
росферы значительно меньше (1 мкм) и облада-
ют парамагнитными свойствами. Это свойство
значительно упрощает манипуляции с микросфе-
рами во время приготовления матриц и дало
возможность автоматизировать этот процесс.
Другое отличие от платформы Roche/454 состо-
ит в том, что микросферы с одноцепочечными
ДНК-матрицами (порядка 10—15 тысяч копий)
наносятся не в лунки пикотитровальной плашки,
а на химически модифицированную поверхность
стеклянного слайда. Предварительно 3'-концы
молскул ДНК также модифицируют, присоеди-
няя специальную реактивную группу’. При нане-
сении таких микросфер протекает химическая
реакция, в результате которой микросферы ока-
зываются ковалентно связанными с поверхно-
стью слайда. Микросферы случайным образом
распределяются по поверхности слайда, образуя
на ней локальные полонии, аналогичные класте-
рам платформы Solexa/Illumina.
Название SOLiD можно расшифровать как
support oligonucleotide ligation detection или sequ-
encing by oligonucleotide ligation detection. Как
следует из названия, секвенирование осуществ-
ляется лигированием флуоресцентных олиго-
нуклеотидных зондов (рис. 23.10). Зонды пред-
ставляют собой октонуклеотиды, несущие флуо-
ресцентный краситель на 5'-конце. Цвет зонда
определяется двумя нуклеотидными остатками
на З'-конце. Поскольку’ используемых красите-
лей всего четыре (FAM, СуЗ, TXR, Су5), а ком-
бинаций возможных динуклеотидов 16, каждому’
цвету2 соответствует набор из четырех динуклео-
тидов. Правила, которые определяют соответст-
вие красителей (цветов) и динуклеотидов, фор-
мируют специально разработанный вырожден-
ный код, подробное описание которого можно
ГЛАВА 23 547
Субстрат для секвенирования системой Solexa/lllumina
Обратимые терминаторы
Пример обратимого терминатора
.......................................з-
5' Адаптер 1 Последовательность матрицы Адаптер 2
Стеклянный слайд
Сайт расщепления
при удалении
флуоресцентного красителя
v флуоресцентный
** краситель
группа, блокирующая
3'-гидроксил
3- О-аз идом стильная
группа, блокирующая
гидроксил
1. Удлинение праймера
4. Удлинение праймера
Полимераза
IA1AlИ1А1Al1А1111А1А1И11
Матрица
Универсальный
праймер
НИИ II
Адаптер 2
Адаптер 1
Встраивание всех
четырех нуклеотидов,
каждый из которых
несет свой флуорофор
и группу, блокирующую
дальнейший синтез
И ............
IllIIII 11 3.
Встраивание следующих
четырех нуклеотидов
5. Запись изображения
Поглощение Флуоресценция
hy,
2. Запись изображения
Поглощение Флуоресценция
3. Удаление флуорофора и блокирующей группы
I III I Illi
-Ш-3
Удаление невстроившихся нуклеотидов,
запись 4-цветъюго изображения
6. Удаление флуорофора и блокирующей группы
Отщепляющий агент
IIIIIIIIIIIIIIIIIIII
Отщепляющий агент
-Ш-3
IIIIIIIII
Удаление флуорофора и бокирующей
группы, промывка
Удаление флуорофора и бокируюшей
группы, промывка
Повторение циклов
IIIIIIII
IIIIIIIIIIIIIIIIIII
Рис. 23.9. Последовательность событий при секвенировании на платформе Illumina.
Цикл состоит из удлинения праймера за счет включения обратимого терминатора, считывания его флуоресценции, удаления
блокирующей группы и включения следующего терминатора.
548 ЭПИГЕНЕТИКА
Субстрат для секвенирования системой SOLiD
1 ij а ...............
5' Адаптер Р1
3.
Последовательность матрицы
Стеклянный слайд
Динуклеотидные зонды
Таблица динуклеотодов,
Сайт расщепления (между 5-м и 6-м нт)
флуоресцентный
краситель
«вы рожденные»
основания
«универсальные»
основания
1. Отжиг праймера и лигирование
6. Замена праймера
3'
5'
Универсальный
сек. праймер (л -1) , 1 Денатурация дуплекса
2. Замена праймера и удаление продленной
последовательности
♦I .................................... у
5'
2. Запись изображения
7. Повторение стадий 1-5 с новым праймером
Поглощение Флуоресценция
Раунд 2-й
3. Удаление фосфата с недостроенных цепей
-1
Универсальный^!
г сек, праймер (п-1 }JAA CG АА А СС 5i
. I.............И1Н11111111111111111111111111111111 ,
5Г т GT ОС AG П AT GG у
[фосфатаза
8. Повторение замены с праймерами п — 2, п-3, п-4
ИИ 3'
п
Z
4. Удаление флуорофора
5. Повторение стадий 1—4 и удлинение последовательности
Цикл лигирования 1 2 3 4 5 6 7... (л циклов)
Отжиг праймера и лигирование при секвенировании
в обратном направлении
матрицы
Раунд
отмечает положение прочитываемого основания
Цикл лигирования 2 3 4 5 6 Q
ГЛАВА 23 549
найти на сайте компании Life Technologies (см.
http://tools.invitrogen.com/content/sfs/brochures/cm
s_058265.pdf). После динуклеотида, определяю-
щего цвет зонда, следует последовательность из
трех так называемых вырожденных нуклеотид-
ных остатков. Это означает, что там может ока-
заться любая последовательность. За вырожден-
ными остатками следуют одинаковые для всех
зондов «универсальные» остатки, несущие ис-
кусственно синтезированные азотистые основа-
ния, способные образовывать водородные связи
с любым природным основанием. Таким обра-
зом, набор зондов, участвующих в секвенирова-
нии, состоит из 1024 уникальных последова-
тельностей, по 256 каждого цвета, перебираю-
щих все возможные последовательности из пяти
нуклеотидных остатков.
Весь процесс секвенирования разбит на пять
раундов, для каждого раунда используется свой
праймер для секвенирования, который отжигает-
ся на последовательности адаптера. Многочис-
ленные циклы гибридизации (отжига) зонда, ли-
гирования, записи изображения и отщепления
флуорофора используются для удлинения прай-
мера и синтеза комплементарной матрице цепи
ДНК (см. рис. 23.10). После гибридизации прай-
мера в проточную камеру поступают зонды, сре-
ди которых находятся зонды, комплементарные
последовательности из пяти нуклеотидных ос-
татков, следующих сразу за остатками, компле-
ментарными праймеру. Такие зонды отжигаются
на цепи ДНК-матрицы, после чего в камеры по-
ступает лигаза, которая лигирует олигонуклео-
тиды зондов и праймеров. Затем камеру промы-
вают буферным раствором, чтобы удалить все
лишние зонды, а затем CCD-камера сканирует
слайд, сохраняя изображения для последующего
анализа.
Г1оскольку эффективность любой химической
реакции меньше 100 %, малая часть праймеров
для секвенирования остается без присоединенного
зонда. Такие праймеры теоретически смогли бы
участвовать в реакции лигирования в следующем
цикле, что создавало бы эффект сдвига фазы. По-
этом}’ слайд перед следующим циклом обрабаты-
вается фосфатазой, которая удаляет все 5'-конце-
вые фосфаты, тем самым блокируя будущие реак-
ции лигирования с участием этих молекул.
Затем в проточную камеру’ поступает отщеп-
ляющий агент, который удаляет флуорофор, раз-
рушая фосфотиоэфирную связь между’ пятым и
шестым нуклеотидным остатками зонда, остав-
ляя на 5'-конце фосфат, необходимый для осу-
ществления последующих циклов лигирования.
Итогом первого цикла лигирования оказыва-
ется праймер, удлиненный на пять нуклеотид-
ных остатков и готовый к участию в следующем
цикле, а также цвет, определяемый первым и
вторым нуклеотидными остатками неизвестной
последовательности ДНК-матрицы. Циклы ли-
гирования повторяют нужное количество раз,
именно их число и определяет длину’ индивиду-
альных прочтений (на сегодня это 75 пар осно-
ваний). По завершении раунда информация о
последовательности матрицы остается по-преж-
нему неполной (цвета динуклеотидов в позициях
1—2, 6—7, 11—12 ит. д.). Для полной расшиф-
ровки последовательности матрицы синтезиро-
ванную в результате первого раунда цепь ДНК
удаляют. Затем проводят еще четыре раунда се-
квенирования, используя праймеры, каждый из
которых отжигается на адаптере с отступом в
один нуклеотидный остаток (см. рис. 23.10).
Такой метод секвенирования обладает рядом
уникальных особенностей, каждая из которых
вносит вклад в поддержание высокого уровня
точности секвенирования, характерного для тех-
нологии SOLiD:
1. Праймер для секвенирования обновляется
для каждого из пяти раундов секвенирования,
что улучшает соотношение сигнал/шум, прису-
щее системе.
2. Природа каждого основания определяется
дважды в двух независимых раундах секвениров-
ния. что повышает достоверность определения.
3. Четыре красителя используются для коди-
рования шестнадцати динуклеотидных комбина-
ций. Свойства кода включают встроенный меха-
низм исправления ошибок.
Вырожденный код был специально разрабо-
тан для того, чтобы иметь возможность исправ-
лять ошибки секвенирования, что обеспечивает-
ся рядом интересных свойств:
1) для каждого динуклеотида обратная после-
довательность (например, АС и СА) всегда име-
ет такой же цвет;
Рис. 23.10. Секвенирование на платформе SOLiD.
Секвенирование происходит без использования полимеразы за счет лигирования комплементарных олигонуклеотидов. Четыре
флуорохрома используются для кодирования шестнадцати динуклеотидов на конце каждого олигонуклеотида. Определение
точной последовательности происходит за счет объединения результатов двух раундов, использующих разные первоначаль-
ные праймеры со сдвигом в один нуклеотид.
550 ЭПИГЕНЕТИКА
2) для каждого динуклсотида комплементар-
ная последовательность (например, СА и GT)
всегда имеет такой же цвет;
3) для каждого динуклсотида обратная ком-
плементарная последовательность (например.
СА и TG) всегда имеет такой же цвет.
Такой метод кодирования повышает точность
системы. Поскольку' каждое основание опреде-
ляется дважды в двух независимых реакциях се-
квенирования, информация о природе основания
содержится в двух соседствующих цветах. Су-
ществует 16 возможных двухцветных комбина-
ций, которые могут кодировать всевозможные
од но нуклеотидные замены. Однако замена одно-
го нуклеотида в конкретной позиции может быть
выражена только в определенном подмножестве
из всех возможных 16 сочетаний (только три
двухцветовые замены разрешены, остальные 12
недопустимы). Это ограничение позволяет от-
брасывать различные аномалии как ошибки сек-
венирования (рис. 23.1 1).
Метод секвенирования лигированием позво-
ляет прочитывать один и тот же фрагмент ДНК
как в 3'—>5'-, так и 5'^>3'-направлснии (см.
рис. 23.10). Современные секвенаторы Life Tech-
nologies прочитывают 75 пар оснований в пря-
мом и 35 в обратном направлении.
В результатах секвенирования на платформе
SOLiD, как и в случае с платформой Illumina, и
по той же причине, АТ- и GC-богатые прочтения
представлены меньше, чем прочтения со сред-
ним GC-составом. Наиболее частыми ошибками
здесь также являются од но нуклеотидные заме-
ны, однако заявленная точность индивидуаль-
ных прочтений SOLiD несколько выше (до
99,99 % при использовании специальной химии).
Полупроводниковое секвенирование ДНК.
Последней технологией, появившейся в 2010 г. и
стремительно завоевавшей популярность, стало
полупроводниковое секвенирование. Эта техно-
логия также является детищем Джонатана Рот-
берга, который в 2009 г. основал компанию Ion
Torrent, разработавшую полупроводниковый се-
квенатор, получивший название Personal Genome
Machine. Компания Ion Torrent осенью 2010 г.
была куплена корпорацией Life Technologies,
взявшей на себя дальнейшую разработку- и под-
держку- данной технологии.
Появление полу-проводникового секвениро-
вания представляет собой важную веху- в разви-
тии технологий секвенирования [Rothberg et al.,
2011]. Стоит отметить, что на сегодня это един-
ственная технология секвенирования, которая
никоим образом не использует световое излуче-
ние. Все прочие современные технологии в ос-
нове своей опираются на флуоресценцию (Сэн-
гер, SOLiD, Solexa/Illumina, Pacific Biosciences,
Helicos) и люминесценцию (Roche/454, пиросек-
венирование). Метод секвенирования Ion Tor-
rent, реализованный в секвенаторе Personal Geno-
me Machine (PGM), сочетает в себе простую био-
химию и полу-проводниковые технологии, что
делает этот метод очень быстрым, недорогим и
легко масштабируемым.
Этапы создания библиотек и подготовки мат-
рицы очень схожи с аналогичными этапами в
технологиях SOLiD и Roche/454. Так же как и в
случае с технологией SOLiD, Life Technologies
предлагает приборы для автоматизации процес-
сов подготовки библиотек и проведения эмП1 IP
Амплификация каждого фрагмента ДНК ис-
ходной библиотеки приводит к образованию
около 800 тысяч копий на поверхности акрил-
амидных микросфер размером 2 мкм. Это обеспе-
чивает хорошее соотношение сигнал/шум при
секвенировании. Затем на одноцепочечные мо-
лекулы ДНК-матриц, закрепленные на поверх-
ности микросфер, отжигается универсальный
праймер для секвенирования, местом посадки
которого служит один из адаптеров; туда же
приходит и ДНК-полимераза. Подготовленные
таким образом микросферы с ДНК помещаются
в отдельные лунки, формирующие независимые
реакторы на поверхности полупроводникового
микрочипа. Поверхность микрочипа несет упо-
рядоченный двухмерный массив реакторов, чис-
ло которых определяет число независимо секве-
нируемых фрагментов ДНК. Поверхность мик-
рочипа образует дно проточной камеры, через
которую пропускают реактивы, необходимые
для секвенирования (немодифицированные нук-
леотидтрифосфаты, по одному- типу за цикл).
Главное отличие полу-проводникового секве-
нирования заключается в методе детекции этапов
синтеза. По мере того, как полимераза встраивает
комплементарный нуклеотид в растущую цепь
ДНК, удлиняя праймер, в раствор выделяются
неорганический пирофосфат (который детектиру-
ет метод пиросеквенирования) и ион водорода
(протон). Выделение протонов изменяет локаль-
ный показатель pH в лунке. Это приводит к изме-
нению потенциала на сенсорной пластине, распо-
лагающейся на дне лунки, что является детекти-
руемым сигналом, который регистрирует полу-
проводниковый секвенатор PGM.
Производительность методов, опирающихся
на оптическую детекцию, определяется возмож-
ностью CCD-камер получать и обрабатывать
ГЛАВА 23 551
Таблица динуклеотидов,
кодированных четырьмя цветами
Расшифровка
ТА АС АА
CG СА СС
GC GT (GG)
тт
------Последовательность цветов
(GA)
ТС I
1 ° 1---Возможные динуклеотиды
AG
СТ J
- Нулевое основание
AT TG GG GA------
Расшифрованная последовательность
Последовательность оснований
Каждое основание прочитывается дважды
Принцип цветного кодирования для анализа однонуклеотидных замен
Допустимые
замены
Недопустимые
замены одного цвета
Недопустимые
замены двух цветов
сА т
Рис. 23.11. Схема расшифровки данных, полученных на платфоме SOUD.
Последовательность, в которой флуорохромы детектируются в двух раундах секвенирования, однозначно переводится в по-
следовательность исходной матрицы. При этом каждое основание прочитывается дважды, а свойства вырожденного кода по-
зволяют обнаруживать ошибочные прочтения.
изображения высокого качества как можно
большего массива полоний. Создатели полупро-
водникового секвенатора пошли другим путем.
Был найден подходящий электронный сенсор
для создания интегральной микросхемы, спо-
собной детектировать ионы водорода, высвобо-
ждаемые ДНК-полимеразой. в отличие сенсоров,
регистрирующих фотоны. Наиболее подходя-
щим сенсором оказался ион-чувствитсльный по-
левой транзистор (англ, «ion-sensitive field-effect
552 ЭПИГЕНЕТИКА
transistor», ISFET), который способен детектиро-
вать ионы водорода, а также совместим с прин-
ципом создания интегральных микросхем, по-
всеместно используемым в современной компь-
ютерной индустрии.
Производство микрочипов осуществляется на
полупроводниковых пластинах поликристалли-
ческого кремния, которые затем нарезают на от-
дельные микрочипы и упаковывают в одноразо-
вые поликарбонатные проточные камеры, огра-
ничивающие подачу’ жидких реактивов для сек-
венирования областью сенсорного массива, не
затрагивая вспомогательную электронику’. Ка-
мера обеспечивает удобную загрузку образца
микросфер, а также предоставляет электронный
и жидкоструйный интерфейс с секвенатором.
На сегодня уже доступны для использования
микрочипы, несущие 1,5 млн, 7,2 млн и 13 млн
сенсорных элементов. После помещения микро-
чипов в проточную камеру доступными для за-
грузки и реактивов остаются соответственно
1,2 млн. 6.1 млн и 11 млн лунок, при этом 99.9 %
сенсоров чувствительны к изменению pH и при-
годны для секвенирования.
Увеличение числа сенсоров на микрочипе
было достигнуто, прежде всего, увеличением его
общей площади (с 10,6 х 10,9 мм до 17,5 х
х 17,5 мм), а затем увеличением плотности сен-
соров путем уменьшения числа транзисторов,
формирующих один сенсор, с трех до двух.
Плотность сенсоров в принципе ограничивается
выбранной архитектурой, а также количеством
транзисторов на сенсор. Для архитектуры с раз-
мером узла в 0,35 мкм минимальное расстояние
между- сенсорами составляет 5,1 мкм для трех-
транзисторных сенсоров и 3,8 мкм для двухтран-
зисторных. Однако разработчиками PGM уже
было показано, что секвенирование возможно
проводить и в лунках размером 1.3 мкм (против
сегодняшних 3,5 мкм). При переходе на архитек-
туру с размером узла НО нм будет возможно
выпускать микрочипы размером 23,7 х 20,0 мм
с 165 млн двухтранзисторных сенсоров и лунка-
ми размером в 1,3 мкм с межцентровым рас-
стоянием в 1,68 мкм, и это еще не предел.
Уменьшение количества транзисторов на сенсор
до одного и увеличение площади чипа до 31,7 х
х 25,8 мм позволит построить микрочип с 1 млрд
сенсоров (размер лунки 0,5 мкм, межцентровое
расстояние 0,8 мкм).
Во время автоматического секвенирования
четыре нуклеотидтрифосфата подаются в про-
точную камеру один за другим. Когда подавае-
мый нуклеотид оказывается комплементарным
основанию в матрице, которое следует сразу за
праймером для секвенирования, такой нуклеотид
встраивается полимеразой и праймер удлиняется
на один нуклеотидный остаток (или на несколь-
ко остатков, если сразу за праймером идет гомо-
полимерная последовательность). При встраива-
нии нуклеотид гидролизуется с высвобождением
одного иона водорода. Высвобождение протона
вызывает сдвиг pH окружающего раствора, ко-
торый пропорционален числу’ встроившихся
нуклеотидов (0,02 единиц pH на нуклеотид). Из-
менение pH детектируется сенсором, переводит-
ся в изменение электрического потенциала (ска-
чок напряжения) и оцифровывается вспомога-
тельной электроникой (за пределами микрочипа
в самом секвенаторе). Генерация сигнала и его
детекция занимает около 4 с, после чего следует
стадия промывки для удаления оставшихся нук-
леотидов. Небольшой размер лунок обеспечива-
ет высокую скорость диффузии (порядка десятой
доли секунды), что избавляет от необходимости
энзиматического удаления излишков реакти-
вов (как в пиросеквенировании). Оцифрованные
результаты записываются в виде ионограммы
(рис. 23.12). Для прочтения библиотеки фраг-
ментов ДНК длиной 200—250 пар оснований
требуется около 3 ч. Сегодня же суммарная про-
изводительность запуска варьирует от типа ис-
пользуемого микрочипа от 100 до 1000 млн пар
оснований.
Метод полупроводникового секвенирования,
как и всякий метод, основанный на работе поли-
меразы, позволяет прочитывать один и тот же
фрагмент ДНК только в 5'—>3'-направлении. Для
того чтобы прочитать фрагмент ДНК с противо-
положного конца (но по-прежнему в направле-
нии 5'—>3'), используется специальный подход,
позволяющий «переключить матрицу». Секвена-
торы PGM в лабораториях компании Life Tech-
nologies уже прочитывают более 500 пар основа-
ний в прямом и в обратном направлениях.
В результатах полупроводникового секвени-
рования, в отличие от данных других платформ,
АТ- и GC-богатые прочтения представлены на-
равне с прочтениями со средним GC-составом,
что является большим преимуществом, посколь-
ку дает более однородное покрытие геномов.
Наиболее частыми ошибками здесь, как и в ме-
тоде Roche/454, являются инсерции и делеции в
гомополимерных участках.
Новые разработки. По мере того, как секве-
наторы компаний 454/Roche, Illumina и Applied
Biosystems/Life Technologies распространялись
по научным лабораториям во всем мире, стали
ГЛАВА 23 553
появляться статьи, описывающие все новые и
новые технологии. Во-первых, это технология
секвенирования одиночных молекул (Single-Mo-
lecule Sequencing, SMS) с использованием обра-
тимых терминаторов от компании Helicos Bio-
Sciences, которая была реализована в секвенато-
ре HeliScope [Harris etal., 2008]. Во-вторых, это
технология секвенирования одиночных молекул
с детекцией в режиме реального времени от
компании Pacific Biosciences (Single-Molecule
Real-Time Sequencing, SMRT), реализованная в
приборе PacBio RS, которая постепенно набира-
ет обороты [Eid et al., 2009; Chin et al., 2011]. Эти
технологии часто называют технологиями «вто-
рого» или «третьего поколения» (все зависит от
того, с какой технологии вести отсчет), посколь-
ку они позволяют работать с отдельно взятыми
молскулами, не требуют сложной и порой весь-
ма дорогостоящей процедуры подготовки мат-
рицы, дают возможность расшифровывать по-
следовательность ДНК (или РНК) в режиме ре-
ального времени, то есть гораздо быстрее других
методов, опирающихся на синтез ДНК с пошаго-
вой регистрацией каждого этапа синтеза. К этой
же группе методов «последнего поколения» сле-
дует отнести и технологию секвенирования с
применением нанопор, над которой работает не-
сколько групп исследователей, однако ученые
компании Oxford Nanopore, по-видимому, про-
двинулись дальше всех, построив секвенатор
GridlON (в продажу, однако, до сих пор не по-
ступивший).
Поскольку пока ни одна из технологий «по-
следнего поколения» не стала широко приме-
няться для секвенирования ДНК, мы позволим
себе не останавливаться на их описании, отослав
читателя к существующим обзорам [Metzker,
2010; Shendure etal., 2011]. Потенциал этих ме-
тодов секвенирования трудно переоценить, од-
нако ряд технологических препятствий ограни-
чивает их рутинное применение. Эти препятст-
вия так и не позволят некоторым из них выжить
в гонке технологий: например, компании Helicos
BioSciences, по-видимому, уже не удастся пре-
одолеть финансовые трудности, в результате че-
го платформа HeliScope может прекратить суще-
ствование.
dNTP
Сенсорный слой из оксида металла
Пластина сенсора
Металлический
плавающий
затвор
База Сток Исток —► к ресиверу
Кремниевый субстрат
Рис. 23.12. Секвенирование на полупроводниковой
платформе Ion Torrent. Каждая лунка, содержащая
микросферу, представляет собой миниатюрный полу-
проводниковый pH-метр. Прибор детектирует измене-
ние pH в лунке после включения в цепь каждого нук-
леотида.
Циклы подачи нуклеотидов
554 ЭПИГЕНЕТИКА
23.4. Обработка результатов
высокопроизводительного
СЕКВЕНИРОВАНИЯ
Перед тем как представить последователь-
ность прочитанной ДНК, из всего массива дан-
ных для дальнейшей работы отбираются только
высококачественные прочтения. Отбор основы-
вается на том, что в прочтениях низкого качест-
ва велика доля сигналов, не позволяющих отли-
чить циклы с включением нуклеотида от цик-
лов без включения. Такие двусмысленные сиг-
налы — причина ошибок в записи последова-
тельности отдельных прочтений. Для увеличе-
ния числа пригодных для использования про-
чтений разрабатываются алгоритмы, позволяю-
щие оценивать ab initio вероятность правильного
определения нуклеотида в каждой конкретной
позиции отдельных прочтений.
Например, для полупроводникового секвени-
рования используется специальный алгоритм, в
основе которого лежит физическая модель про-
цессов, происходящих в лунке. Он используется
для нормализации сигнала (скачков потенциала)
и превращения его в последовательность осно-
ваний в молекуле ДНК. Индивидуальные про-
чтения пропускаются через два специальных
фильтра, первый отбрасывает прочтения, полу-
ченные с поликлональных микросфер, второй
отбрасывает прочтения низкого качества. На по-
следнем этапе каждому основанию в прочтениях
присваивается значение уровня качества, кото-
рое рассчитывается, исходя из адаптированного
метода Phred. Такие, полученные ab initio, пока-
затели качества хорошо коррелируют с показа-
телями, полученными после сравнения прочте-
ний с референсной последовательностью, и ис-
пользуются для укорачивания прочтений с 3'-
конца и удаления некачественных оснований,
что облегчает дальнейший анализ результатов.
Нужная точность расшифровки последова-
тельности достигается тем, что система осуще-
ствляет многократное прочтение одного и того
же участка ДНК, что позволяет построить кон-
сенсусную последовательность.
При анализе результатов секвенирования
ДНК организмов, геномы которых уже расшиф-
рованы, большая часть работы может быть сде-
лана автоматически компьютером. Как правило,
все начинается с картирования прочтений, полу-
ченных на секвенаторе, на геном (или специаль-
но указанный исследователем участок генома).
Это позволяет выявить однонуклсотидныс по-
лиморфизмы, мутации (включая редкие сомати-
ческие варианты, если кратность прочтения по-
зволяет), небольшие инсерции или делеции
(рис. 23.13).
Сегодня существует немалое число компа-
ний — производителей программного обеспече-
ния, которые специализируются на выпуске про-
грамм для анализа данных, полученных методом
высокопроизводительного секвенирования. При-
чем платформа, которая использовалась для по-
лучения данных, не имеет значения — форматы
получаемых данных если не совсем универсаль-
ны, то легко переводятся один в другой. Боль-
Референсная
последовательность ДНК
AAACGTGAACTCGTCGCAGAAGCAGCATTTTCCAAGCCCATAGCGCTTGCAATTGTAATTGTTGCCACAAGCAGGCCAGCCAAATC
ACGTGAACTCGTCGGAGAAGCAGCA TTCCAAGCCCATAGCGCTTGTAATTG TGTTGGCACAAGCAGGCCAGCCAAA
CGTGAACTCGTCGCAGAAGCAGCAT TCCAAGCCCATAGCGCTTGTAATTGT GTTGGCACAAGCAGGCCAGCCTAAT
GTGAACTCGTCGCAGAAGCAGCATT CCAAGCCCATAGCGCTTGTAATTGTA TTGGCACAAGCAGGCCAGCCTAATC
TGAACTCGTCGCAGAAGCAGCATTT CCAAGCCCATAGCGCTTGTAATTGTA а
TGAACTCGTCGGAGAAGCAGCATTT CAAGCCCATAGCGCTTGTAATTGTAA Т
TGAACTCGTCGGAGAAGCAGCATTT CGCTTGTAATTGTAATTGTTGGCAC Ошибка
TGAACTCGTCGGAGAAGCAGCATTT GCTTGTAATTGTAATTGTTGGCACA Секвенирования
GAACTCGTCGCAGAAGCAGCATTTT GCTTGTAATTGTAATTGTTGGCACA (или соматическая
AACTCGTCGGAGAAGCAGCATTTCC GCTTGTAATTGTAATTGTTGGCACA мутация?)
ACTCGTCGCAGAAGCAGCATTTTCC CTTGTAATTGTAATTGTTGGCACAA
CTCGTCGGAGAAGCAGCATTTACCA TTGTAATTGTAATTGTTGGCACAAG
f 1 f f
SNP ошибки SNP SNP
(гетерозиготный)
секвенирования
(гомозиготные)
Рис. 23.13. Выявление однонуклеотидных полиморфизмов (SNP), соматических мутаций и ошибок секвенирова-
ния в данных высокопроизводительного секвенирования.
Однонуклеотидные полиморфизмы могут быть гомозиготными или гетерозиготными. Ошибки секвенирования и соматические
мутации присутствуют лишь в некоторых прочтениях.
ГЛАВА 23 555
шинство программ поддерживают несколько
форматов данных и позволяют решать самые
разные задачи, от сборки геномов de novo до
анализа экспрессии генов и иммунопрсципити-
рованного хроматина.
22.5. Высокопроизводительное
СЕКВЕНИРОВАНИЕ ДНК В ЭПИГЕНЕТИКЕ
Иммунопреципитация хроматина. Несо-
мненно, центральным методом эпигенетики яв-
ляется иммунопреципитация хроматина (chro-
matin immunoprecipitation) — процедура, позво-
ляющая определять сайты связывания белков с
ДНК. Этот метод позволяет определять регуля-
торные последовательности, с которыми связы-
ваются специфические белки, регулирующие
экспрессию генов, а также определять общее
состояние хроматина путем картирования бел-
ков ремоделинга и посттрансляционных моди-
фикаций гистонов. Эта информация помогает
правильно интерпретировать экспрессионные
данные и необходима для понимания регуля-
торных генетических механизмов в самых раз-
нообразных задачах.
В первую очередь хроматин фиксируют фор-
мальдегидом в условиях, максимально близких к
условиям in vivo. При этом между’ компонентами
ДНК-белковых комплексов хроматина образу-
ются ковалентные связи (поперечные сшивки),
которые не позволяют комплексам разрушаться
в течение дальнейших манипуляций. Затем хро-
матин обрабатывают ультразвуком, который
случайным образом разрывает длинные молску-
лы ДНК на небольшие фрагменты, обычно дли-
ной в 200—600 нуклеотидных остатков.
ДНК-белковые комплексы инкубируют с ан-
тителом, которое специфически узнает иссле-
дуемый компонент хроматина. Это может быть
определенная разновидность посттрансляцион-
ной модификации гистона из тех, что формиру-
ют так называемый гистоновый код или другой
хромосомный белок. Высокое качество антитела
является критичным параметром, поскольку’ оп-
ределяет специфичность выделяемой хромати-
новой фракции.
После этого конгломераты, состоящие из
ДНК-белковых комплексов и связанных с ними
антител, осаждают с использованием твердого
носителя. Как правило, это частицы сефарозы с
иммобилизированным белком А или G. Белок А,
выделенный из золотистого стафилококка, обла-
дает высокой аффинностью к консервативным
Fe-участкам тяжелых цепей иммуноглобулинов.
Белок G был выделен из стрептококка и об-
ладает сходными свойствами. Белки А и G име-
ют несколько разную аффинность к разным ти-
пам антител, что должно учитываться при пла-
нировании эксперимента.
В результате этих манипуляций получается
препарат хроматина, обогащенного исследуе-
мым белком и связанными с ним последователь-
ностями ДНК. ДНК высвобождается из ком-
плекса с белками после того, как разрушаются
поперечные ковалентные сшивки, образованные
формальдегидом, а белки расщепляются протео-
литическими ферментами. Полученную ДНК
очищают и определяют ее характерный размер и
концентрацию.
После проведения процедуры иммунопреци-
питации хроматина встает вопрос, каким мето-
дом определить последовательности, с которы-
ми преимущественно связывается исследуемый
фактор. В качестве контрольного образца чаще
всего используется непреципитированный хро-
матин, в котором все последовательности пред-
ставлены одинаково.
В простых случаях, когда исследователю тре-
буется информация об одной или нескольких
заранее определенных последовательностях, для
анализа подходит метод количественной ПЦР.
Если требуется охарактеризовать связывание
хроматинового фактора в масштабах всего гено-
ма, часто используют технологию микрочипов.
Однако применение высокопроизводительного
секвенирования вывело метод на принципиально
новый уровень чувствительности и разрешаю-
щей способности (см. обзор [Park, 2009]).
Высокопроизводительное секвенирование по-
зволяет прочитывать сотни миллионов фрагмен-
тов ДНК параллельно за один запуск. Это дает
возможность фактически пересчитывать полу-
ченные при помощи иммунопреципитации фраг-
менты ДНК их прямым секвенированием (ChlP-
Seq, от англ. Chromatin Immunoprecipitation —
Sequencing). Такой подход обладает рядом су-
щественных преимуществ по сравнению с дру-
гими методами анализа: высоким разрешением и
уровнем покрытия, меньшим числом артефак-
тов, более широким динамическим диапазоном.
Улучшенное пространственное разрешение осо-
бенно важно для построения точных профилей
расположения нуклеосом, а также для локализа-
ции сайтов связывания специфических транс-
крипционных факторов. Высокая производи-
тельность современных платформ для секвени-
рования нового поколения настолько высока, что
позволяет проводить мультиплексный анализ
556 ЭПИГЕНЕТИКА
множества образцов ДНК, полученных методом
иммунопреципитации с использованием молску-
лярных штрихкодов.
Обычно количество ДНК, получаемой в ре-
зультате иммунопреципитации, оказывается
очень небольшим (5—50 нг). Поэтому’ при соз-
дании библиотеки для дальнейшего высокопро-
изводительного секвенирования нужно исполь-
зовать соответствующий протокол, рассчитан-
ный на небольшие количества ДНК (как прави-
ло, специальные протоколы и наборы предос-
тавляются компаниями-производителями секве-
наторов).
При планировании ChIP-Scq-эксперимента
нужно обратить внимание на ряд важных дета-
лей. Прежде всего, это наличие подходящего
антитела. Специфичное и эффективно взаимо-
действующее с антигеном антитело обеспечит
высокий уровень обогащения ДНК по сравне-
нию с базовым уровнем, что сделает легким об-
наружение места и оценку’ эффективности свя-
зывания белков с ДНК. На рынке существует
множество доступных антител, для многих из
которых заявлено качество, подходящее для
ChIP-Scq-экепериментов. Однако, их качество
зачастую сильно варьирует, включая различия от
партии к партии. Необходимо проводить тща-
тельную проверку’ антител, которые будут ис-
пользованы для ChIP-Scq-экепериментов, что
является довольно трудоемким занятием. На-
пример. при исследовании посттрансляционных
модификаций гистонов нужно проверять вес-
терн-блоттингом способность антител узнавать
^модифицированные гистоны. Более того, сто-
ит также проверять наличие кросс-реактивности
антител со структурно схожими модификациями
(например, проверить узнавание одного и того
же остатка лизина, несущего два или три ме-
тильных радикала). Для этого необходимо ис-
пользовать два различных антитела в сочетании
с подавлением экспрессии фермента, осуществ-
ляющего данную модификацию, методом РНК-
интерференции или же с масс-спектрометриче-
ским анализом иммунопреципитированных пеп-
тидов. Важность таких предварительных экспе-
риментов иллюстрирует тот факт, что в резуль-
тате подобных проверок около 20—35 % дос-
тупных на рынке антител против модификаций
гистонов дрозофилы оказались не приемлемыми
для экспериментальной работы [Park, 2009].
Другой важный момент — это планирование
контрольных экспериментов, поскольку’ не-
сколько стадий процедуры ChlP-Seq могут при-
вести к артефактам. Обычно используют три ос-
новных типа контрольных образцов — ДНК, по-
лученная до иммунопреципитации; ДНК, полу-
ченная при «иммунопреципитации» без антите-
ла; ДНК, полученная при иммунопреципитации
белка, не связывающего ДНК. Поскольку нали-
чие всех трех контролей существенно увеличи-
вает количество образцов, которые нужно отсек-
венировать, на практике ограничиваются одним
или двумя контролями, в зависимости от специ-
фики эксперимента.
При проведении ChlP-Seq-экспериментов
важно проанализировать как можно большее
число индивидуальных фрагментов ДНК (так
называемая глубина секвенирования), при этом
длина прочтений не играет большой роли. Чем
больше прочтений, тем более статистически дос-
товерной оказывается полученная информация.
Поэтому^ выбор платформы высокопроизводи-
тельного секвенирования ДНК определяется ко-
личеством индивидуальных прочтений, которые
будут получены за запуск. На сегодня платформы
компаний Illumina и Life Technologies (SOLiD)
являются наиболее подходящими. Однако уже в
2012 г. микрочипы для полупроводникового сек-
венирования станут достаточно производитель-
ными, чтобы поддерживать ChlP-Seq.
Вообще, глубина секвенирования каждого
эксперимента должна быть определена особо.
Если ожидается, что количество сайтов связыва-
ния белка с ДНК в эксперименте будет большим,
нужно увеличить глубину секвенирования, что-
бы все сайты были представлены. Критерием
для определения достаточной глубины прочте-
ния может служить тот факт, что результаты
анализа не изменяются при увеличении числа
индивидуальных прочтений. Другими словами,
есть некая «точка насыщения», по достижении
которой количество новых сайтов связывания не
увеличивается с увеличением числа прочтений.
Достижение точки насыщения в полученном
массиве данных можно проверить при помощи
эксперимента in silico [Kharchenko et al., 2008].
Для этого из множества всех имеющихся про-
чтений случайным образом создаются экспери-
ментальные «подмножества», содержащие раз-
ное число прочтений. Для каждого подмножест-
ва определяется число сайтов связывания с при-
емлемой степенью достоверности. Если точка
насыщения достигнута, количество выявленных
сайтов будет увеличиваться до определенного
уровня, а затем выйдет на плато. Это означает,
что появление новых сайтов замедлилось до та-
кой степени, что дальнейшее увеличение числа
прочтений не требуется.
ГЛАВА 23 557
Исследования показывают, что в некоторых
экспериментах достигнуть точки насыщения не
удается, если для выявления сайтов связывания
используется только их статистическая значи-
мость [Park. 2009]. Тогда стоит рассмотреть точ-
ку насыщения для выявления сайтов на основа-
нии пороговой величины. Под пороговой вели-
чиной подразумевается степень обогащения для
каждого сайта — отношения числа прочтений,
полученных в эксперименте, к числу’ прочтений
в контрольном образце. В этом случае к рас-
смотрению принимаются только те сайты, засе-
ленность которых превышает пороговую вели-
чину’. и точка насыщения достигается тогда, ко-
гда их число перестает существенно меняться.
Иногда, в случаях, когда размер генома ис-
следуемого организма невелик (например, дро-
зофила, нематода, дрожжи и т. д.), мощность со-
временных высокопроизводительных секвенато-
ров позволяет получать избыточное количество
прочтений (происходит насыщение), что приво-
дит к нерациональному’ использованию ресурса
инструмента. Чтобы этого избежать, можно про-
водить одновременный (мультиплексный) ана-
лиз нескольких образцов, для чего используются
молекулярные штрихкоды — короткие последо-
вательности-идентификаторы, вставляемые в по-
следовательность адаптеров на стадии подготов-
ки библиотек для секвенирования.
Анализ данных ChIP-Seq-эксперимента начи-
нается с картирования прочтений на референс-
ный геном. Сегодня существует масса различ-
ных алгоритмов картирования, которые вынуж-
дены балансировать между’ точностью, скоро-
стью, потребляемой компьютерной памятью и
гибкостью. Именно поэтому’ не существует уни-
версального, годного для всех задач, алгоритма.
Картирование прочтений в ChIP-Seq-экспери-
менте должно разрешать небольшое количество
однонуклеотидных замен и короткие делеции
или инсерции для учета ошибок секвенирования
и полиморфизмов, присутствующих в каждом
конкретном геноме.
После картирования прочтений необходимо
провести выявление участков, которые более
представлены в ChIP-образце по сравнению с
контролем. Каждый сайт связывания определя-
ется множеством перекрывающих его фрагмен-
тов ДНК, полученных в результате иммунопре-
ципитации. Современные алгоритмы для выяв-
ления «пиков» на карте генома используют ин-
формацию о полярности прочтений (рис. 23.14).
Фрагменты прочитываются с 5'-конца, при этом
локализация картированных на геном прочтений
образует характерные распределения на смысло-
вой и антисмысловой цепях ДНК, с характерным
расстоянием между’ пиками распределений. Ал-
горитм выстраивает сглаженный профиль для
каждой цепи ДНК, а затем и комбинированный
профиль. Для этого оба распределения сдвига-
ются к центру’ либо каждое картированное про-
чтение продлевается до характерной длины
фрагментов библиотеки, ориентированного долж-
ным образом. После этого фрагменты суммиру-
ются. Последний вариант позволяет получать
более точный профиль по отношению к ширине
сайтов связывания, однако требует точной оцен-
ки длины фрагментов, а также допущения, что
эта длина достаточно стабильна.
В полученном подобным образом профиле
каждый пик характеризуется отношением его
высоты в ChIP-образце и в контрольном образце
(степень обогащения). При этом необходимо
усчитывать статистическую значимость получен-
Смысловая цепь
Белок или нуклеосома
Антисмысловая цепь
Секвенирование ]
5-концевых
участков 1
Рис. 23.14. Выявление сайтов связывания хроматино-
вых белков с помощью тотального секвенирования ма-
териала. Мерой связывания является число прочтений
на нуклеотид референсной последовательности.
558 ЭПИГЕНЕТИКА
ных значений, которая напрямую зависит от
числа прочтений для каждого пика, а также мо-
дели рапределения прочтений — биномиальной
или модели Пауссона. Модель также может учи-
тывать как абсолютное количество прочтений,
так и локальные колебания плотности прочте-
ний, вызванные структурой хроматина, количе-
ством повторов в геноме или эффективностью
ПЦР-амплификации при подготовке библиотеки.
Корректность полученного профиля требует
подтверждения независимым методом, в качест-
ве чего наиболее часто используют количест-
венную ПЦР.
Профили, полученные после анализа СЫР-
Seq-эксперимента, можно подробно анализиро-
вать, для чего разработано большое количество
компьютерных алгоритмов. Для ДНК-связываю-
щих белков возможно определение последова-
тельности, а точнее, мотивов сайта связывания.
Для этого последовательности сайтов с наивыс-
шей степенью обогащения и статистической
достоверностью анализируют при помощи спе-
циальных алгоритмов, выявляющих общую для
всех них консенсусную последовательность.
Чаще всего такие последовательности имеют
размер около 10 нуклеотидов и в значительной
степени вырождены по некоторым позициям.
Другой распространенный тип анализа —
картирование пиков по отношению к известным
элементам генома: сайтам старта транскрипции
генов, границам экзон—интрон, З'-концам генов.
Содержательность подобных исследований су-
щественно возрастает, когда аннотированные
Картирование прочтений
на референсный геном
Качество
прочтений
Проверка достаточности
глубины секвенирования
Контрольные
образцы
Выявление
пиков
Секвенирование
Визуализация участков
в геномном браузере ,
Анализ групп
генов
Обогащенные участки
генома
Соотнесение
Обнаружение \ со структурой генов
мотивов \
Соотнесение
с экспрессией генов
Рис. 23.15. Схема планирования эксперимента ChlP-
seq. Секвенирование материала, полученного с по-
мощью хроматин-иммунопреципитации, дает большой
объем информации, но требует применения многих
критериев для оценки качества первичных данных.
данные ChIP-Scq-эксперимента соотносятся с
результатами анализа экспрессии генов. Напри-
мер, локализация транскрипционных факторов и
модификаций гистонов, характерных для промо-
торных или транскрибируемых участков, в мес-
тах, где никаких открытых рамок считывания
не обнаружено, может привести к открытию
длинных некодирующих регуляторных РНК
(рис. 23.15).
Анализ метилирования ДНК. Формирова-
ние эпигенетики как раздела современной моле-
кулярной биологии во многом происходило бла-
годаря изучению роли метилирования ДНК в
регуляции экспрессии генов. Сегодня возможно-
сти классических методов по исследованию ме-
тилирования ДНК, таких как рестрикционный
анализ, иммунопреципитация метилированных
последовательностей, бисульфитное секвениро-
вание, существенным образом расширяются за
счет преимуществ, которые предоставляет вы-
сокопроизводительное секвенирование ДНК [Lis-
ter. Ecker, 20091.
Ранние попытки осуществления анализа ме-
тилирования в полногеномном масштабе прово-
дились путем ферментативного расщепления
ДНК с последующей гибридизацией на микро-
чипах или двухмерным электрофорезом; либо
путем захвата метилированных участков ДНК с
помощью метил-связывающих белков или анти-
тел. специфично связывающих 5-метилцитозин,
с последующей гибридизацией на микрочипах
(MeDIP, от англ, methyl DNA immunoprecipita-
tion). Все эти методы имеют ряд недостатков.
Рестрикционный анализ ограничивается после-
довательностями, которые узнает фермент-рес-
триктаза, тем самым сводя анализ к некоторому’
подмножеству всех присутствующих в геноме
метилированных участков. Метод MeDIP, в со-
четании с гибридизацией на микрочипах, обла-
дает невысоким разрешением, требует создания
специальных микрочипов, а также искажает ре-
зультаты, отдавая предпочтение последователь-
ностям с высоким содержанием метилированных
цитозинов.
Новый подход, получивший название MeDIP-
Seq [Down et al., 2008], как следует из названия,
вместо гибридизации на микрочипе предполага-
ет прямое секвенирование иммунопрсципитиро-
ванных фрагментов ДНК, по аналогии с СЫР-
Scq-экспериментом (рис. 23.16). Такой подход
лишен недостатка, связанного с недостаточной
дискриминацией схожих по последовательности
участков. Однако, в силу’ того, что метод осно-
ван на использовании метил-связывающих бел-
ГЛАВА 23 559
ков или антител, он по-прежнему недостаточно
чувствителен к участкам с небольшим содержа-
нием метилцитозинов.
Альтернативой методам, описанным выше,
предлагающим невысокое разрешение при ана-
лизе статуса метилирования, является метод би-
сульфитной конверсии и секвенирования. Этот
подход позволяет картировать участки метили-
рованной ДНК с точностью до одного нуклеоти-
да [Frommer et al., 1992]. Он основан на различи-
ях в химических свойствах азотистых оснований
цитозина и 5-метилцитозина в составе одноце-
почечной ДНК: первый, в отличие от второго,
можно превратить в урацил под воздействием
бисульфита натрия последовательно через реак-
ции сульфонирования, деаминирования и де-
сульфонирования [Hayatsu etal., 1970; Shapiro
etal., 1973] (рис. 23.17). Далее, при ПЦР-ампли-
фикации модифицированной таким образом
ДНК, все урацилы прочитываются полимеразой
как тимины. При последующем секвенировании
фрагментов и сравнении полученных прочтений
с известной исходной последовательностью
можно точно определить положение метилиро-
ванных цитозинов, поскольку’ только они не бу-
дут превращены в тимины (рис. 23.18).
До возникновения высокопроизводительных
методов анализ метилирования ДНК при би-
сульфитной конверсии ограничивался пропуск-
ной способностью секвенирования по Сэнгеру.
С тех пор, как стали доступны высокопроизво-
дительные методы, стало возможно говорить о
полногеномном анализе метилирования ДНК
высокого разрешения.
Технологии секвенирования разрабатывались
с учетом того, что последовательность ДНК со-
ставлена из четырех нуклеотидных остатков.
Однако обработка бисульфитом значительно
снижает содержание цитозина, что превращает
ДНК в полимер, состоящий практически из трех,
а не четырех мономеров. Такое снижение слож-
ности приводит к многочисленным ошибкам во
Образец ДНК
Захват на магнитных
частицах
метил-связывающий
белок или антитело
Элюция ДНК
Секвенирование Бисульфитное
секвенирование
Рис. 23.16. Картирование сайтов метилирования ДНК.
Библиотека приготавливается из фракции, обогащенной
метилированными последовательностями ДНК. Определе-
ние метилированных последовательностей может быть осу-
ществлено обычным секвенированием. Для определения
точного паттерна метилирования необходимо использовать
бисульфитное секвенирование.
время анализа последовательности (при иденти-
фикации оснований, картировании ит. д.). В не-
сколько более выгодном положении оказывается
платформа Life Technologies SOLiD, которая ис-
пользу’ет принцип динуклеотидного четырех-
цветного кодирования. Это приводит к тому, что
на ранних стадиях анализа программа работает
не с основаниями, а с цветами, число которых не
Рис. 23.17. Последовательность химических реакций при бисульфитном превращении.
Результатом реакций является превращение всех неметилированных цитозинов в урацилы. Метилированные цитозины в ре-
акции не участвуют.
560 ЭПИГЕНЕТИКА
Образец ДНК
Денатурация
сн3
—— ATCAGTACGA
Бисульфитная
конверсия
си,
ATUAGTACGA
Лигирование
адаптеров
v
СИ,
ATUAGTACGA
ПЦР
о
СИ,
ATUAGTACGA
— g >
— — А—— С
— ннннаТG
Секвенирование,
выравнивание v
референсная
A-rCAGTACGA'""""""'^ последовательность
выравненное ATAAGTACGA
прочтение |
сайт метилирования
Рис. 23.18. Последовательность действий при массо-
вом бисульфитном секвенировании.
При изготовлении фрагментной ДНК-библиотеки после би-
сульфитного превращения все неметилированные цитозины
заменяются на тимины, а метилированные цитозины остают-
ся цитозинами. Выравнивание последовательностей с рефе-
ренсной последовательностью позволяет определить места
расположения метилированных цитозинов в исследуемом
образце.
уменьшается после конвертации цитозинов в
тимины. В любом случае, добавление к экспери-
ментальным образцам контрольной библиотеки,
полученной из не обработанной бисульфитом
ДНК, существенно улучшает результаты анализа.
Интересной комбинацией описанных выше
методов является получение метилированной
ДНК путем процедуры MeDIP. с последующей
бисульфитной конверсией и секвенированием
(см. рис. 23.16). Такой подход позволяет не-
сколько снизить количество ДНК для секвени-
рования, что повышает кратность (и точность)
прочтения метилированных участков. Возмож-
но, что с увеличением производительности сек-
венаторов такое усложнение процедуры окажет-
ся излишним.
* * *
Описанные выше методические подходы не
исчерпывают всего разнообразия применения
высокопроизводительного секвенирования в эпи-
генетических исследованиях. Однако они демон-
стрируют основные идеи, лежащие в основе та-
ких исследований, которые могут быть экстра-
полированы и на другие задачи. Для метода им-
мунопреципитации хроматина решающим фак-
тором является количество индивидуальных
прочтений, осуществляемых той или иной тех-
нологией секвенирования, и не требуется боль-
шой длины и экстремальной точности каждого
прочтения. Сходные требования предъявляют и
другие методы для количественной оценки об-
разцов ДНК, такие как DamID (DNA adenine
methyltransferase identification) или 3C (Chromatin
Conformation Capture). Информацию по этим ме-
тодам можно найти в специальных обзорах. Би-
сульфитное секвенирование анализирует моди-
фикации последовательностей ДНК, поэтому’
требует высокого покрытия генома, которое мо-
жет быть достигнуто увеличением длины про-
чтений. Высокая точность также имеет значи-
тельно большее значение.
Существующие технологии высокопроизво-
дительного секвенирования имеют широкий
диапазон возможностей. Поэтому’ для планиро-
вания экспериментов необходимо усчитывать их
сильные и слабые стороны, чтобы выбрать под-
ход, наилучшим образом подходящий для реше-
ния каждой конкретной задачи, как в отношении
качества полученных результатов, так и с точки
зрения оптимизации материальных затрат.
Исследования по данной главе поддержаны
грантами РФФИ № 12-04-01007, 12-04-01030,
12-04-00160.
ГЛАВА 23 561
Список ЛИТЕРАТУРЫ
Chin С. S., Sorenson J., Harris J. В., Robins ТГ. P., Char-
les R. C, Jean-Charles R R, Bullard J., TYebster D. R,
KasarskisA., PelusoP.. PaxinosE. E., Yamaichi J.. Cal-
derwoodS.B., ALekalanosJ.J., SchadtE. E., TT’aldor M. K.
The origin of the Haitian cholera outbreak strain // N.
Engl. J. Med. 2011. Vol. 364, N 1. P. 33—42.
Church G. AL, Kieffer-Higgins S. Multiplex DNA sequencing //
Science. 1988. Vol. 240, N 4849. P. 185—188.
Down T. A., Rakyan Г. K., Turner D. J., FlicekP., Li H, Ku-
lesha E., GrafS., JohnsonN., Herrero J., Tomazou E. AL,
Thome N. P., BackdahlL., HerberthAL, HoweKL., Jack-
son D. K., ALiretti AL. AL, ALarioni J. C, Birney E., Hub-
bard T. J.. DurbinR., TavareS.. BeckS. A Bayesian decon-
volution strategy for immunoprecipitation-based DNA
methylome analysis // Nat. Biotechnol. 2008. Vol. 26, N 7.
P. 779—785.
Dressman D., YanH, Traversa G., Kinzler К. TT’., Fogelstein B.
Transforming single DNA molecules into fluorescent
magnetic particles for detection and enumeration of ge-
netic variations // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003.
Vol. 100, N 15. P. 8817—8822.
Eid J., Fehr A., Gray J., Luong K, Lyle J., OttoG., PelusoP.,
Rank D., BaybayanP., Bettman B., Bibillo A., Bjorn-
son K, ChaudhuriB., Christians F, CiceroR, ClarkS.,
Dalal R, Dewinter A., Dixon J., FoquetAL, GaertnerA.,
HardetibolP., Heiner C, Hester K, Holden D., Kearns G.,
KongX., KuseR, Lacroix Y., Lin S., LundquistP., ALaC,
ALarksP., ALaxhamAL, ALurphy D., ParkT., PhamT., Phil-
lips AL, Roy J., Sebra R, Shen G., Sorenson J., Tomaney A.,
TraversK, TrulsonAL, YiecehJ., HegenerJ., TYtiD.,
Yang A., ZaccarinD., ZhaoP., ZhongF, KorlachJ., Tur-
ners. Real-time DNA sequencing from single polymerase
molecules // Science. 2009. Vol. 323, N 5910. P. 133—
138.
FrommerAL, ALcDonaldL. E., ALillarD.S., Collis C. AL.,
TT’attF., Grigg G. TY., ALolloyP. L., Paul C. L. A genomic
sequencing protocol that yields a positive display of 5-
methylcytosine residues in individual DNA strands // Proc.
Natl. Acad. Sci. USA. 1992. Vol. 89, N 5. P. 1827—1831.
Harris T. D., Buzby P. R, Babcock H, Beer E., Bowers J., Bra-
slavsky L., Causey AL, ColonellJ., DimeoJ., Efca-
vitchJ. TY, Giladi E., Gill J., Healy J., JaroszAL, La-
pen D., ALoulton K, Quake S. R, Steinmann K, Thayer E.,
Tyurina A., TT’ardR., TYeiss H, Xie Z. Single-molecule
DNA sequencing of a viral genome 7 Science. 2008.
Vol. 320, N 5872. P. 106—109.
Hayatsu H, TT’ataya Г., Kai K, LidaS. Reaction of sodium bi-
sulfite with uracil, cytosine, and their derivatives // Bio-
chemistry. 1970. Vol’ 9,N 14. P. 2858—2865.
Hyman E. D. A new method of sequencing DNA // Anal. Bio-
chem. 1988. Vol. 174, N 2. P. 423—436.
Kharchenko P. V., TolstorukovAL. Y., ParkP.J. Design and
analysis of ChlP-seq experiments for DNA-binding pro-
teins// Nat. Biotechnol. 2008. Vol. 26, N 12. P. 1351—
1359.
Lister R., Ecker J. R. Finding the fifth base: genome-wide se-
quencing of cytosine methylation // Genome Res. 2009.
Vol. 19, N 6. P. 959—966. ’
ALarguliesAL, EgholmAL, Altman TY. E, Attiya S., Bader J. S.,
Bemben L. A.. Berka J.. BravermanAL S., Chen Y. J.,
Chen Z., Dewell S. B., DuL, Fierro J. AL, Gomes Х.Г.,
Godwin В. С, He TY., HelgesenS., HoC.H., LrzykG.P.,
JandoS.C, AlenquerAL L., JarvieT.P., Jirage К. B.,
KimJ.B., Knight J. R, Lanza J. R, LeamonJ.H, Lefko-
witzS.AL, Lei AL, Li J., Lohman K. L., Lu H, ALakhi-
jani Г. B., ALcDadeK.E., AlcKennaALP., ALyersE.TT'.,
Nickerson E., Nobile J. R, Plant R. Рис В. P., Ronan AL. T,
RothG. T, Sarkis G. J., Simons J. F, Simpson J. TY, Srini-
vasan AL, Tartaro К R, Tomasz A., Fogt K. A., T’olk-
merG.A., TFangS. H, TFangY., Weiner ALP., Yu P., Beg-
ley R.F., RothbergJ. AL. Genome sequencing in microfab-
ricated high-density picolitre reactors // Nature. 2005.
Vol. 437, N 7057. R 376—380.
ALaxam A. AL, Gilbert TY A new method for sequencing DNA //
Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. Vol. 74, N 2. P. 560—
564.
ALessingJ.. Crea R. SeeburgP. H. A system for shotgun DNA
sequencing// Nucleic Acids Res. 1981. Vol. 9, N2.
P. 309—321.
ALetzker AL. L. Sequencing technologies — the next generation //
Nat. Rev. Genet. 2010. Vol. 11, N 1. P. 31—46.
ParkP. J. ChlP-seq: advantages and challenges of a maturing
technology // Ibid. 2009. Vol. 10, N 10. P. 669—680.
RonaghiAL, Karamohamed S., Pettersson B., UhlenAL, Ny-
renP. Real-time DNA sequencing using detection of py-
rophosphate release // Anal. Biochem. 1996. Vol. 242,
N 1. P. 84—89.
RonaghiAL., UhlenAL., NyrenP. A sequencing method based on
real-time pyrophosphate // Science. 1998. Vol. 281,
N 5375. P. 363—365.
RothbergJ. AL, Hinz TY., RearickT.AL, Schultz J., ALileski TT’.,
Davey AL. LeamonJ.H.. Johnson K. ALilgrew AL J.. Ed-
wards AL, HoonJ., Simons J. E, ALarran D., AfyersJ. TY,
Davidson J. F, Brattling A., Nobile J. R, PucB.P.,
Light D., ClarkT.A., Huber AL., Branciforte J. T, Sto-
ner LB., Cawley S.E., Lyons AL, FuY., Homer N., Se-
dovaAL, ALiaoX.. ReedB., Sabina J.. Feierstein E..
Schom AL, AlanjaryAL, DimalantaE., Dressman D.,
KasinskasR, SokolskyT., FidanzaJ.A., NamsaraevE.,
ALcKeman K. J., Williams A., RothG. T, BustilloJ. An in-
tegrated semiconductor device enabling non-optical genome
sequencing // Nature. 2011. Vol. 475, N 7356. P. 348—352.
Shapiro R, Braverman B., Louis J. B., Servis R. E. Nucleic acid
reactivity and conformation. П. Reaction of cytosine and
uracil with sodium bisulfite // J. Biol. Chem. 1973.
Vol. 248, N 11. P. 4060—4064.
Shendure J. A.. PorrecaG.J.. Church G. AL. Gardner A. F.
Hendrickson C. L., Kieleczawa J., SlatkoB.E. Overview
of DNA sequencing strategies // Curr. Protoc. Mol. Biol.
2011. Chapter 7. Unit7.1.
Smith L. AL, Sanders J. Z., Kaiser R J., Hughes P., DoddC,
Connell C.R.. Heiner C.. KentS. B.. HoodL.E. Fluores-
cence detection in automated DNA sequence analysis //
Nature. 1986. Vol. 321, N 6071. P. 674—679.
Tawfik D. S., Griffiths A. D. Man-made cell-like compartments
for molecular evolution 7 Nat. Biotechnol. 1998. Vol. 16,
N 7. P. 652—656.
T alouevA., Ichikawa J., TonthatT., Stuart J., Ranade S.,
Peckham H, ZengK, ALalekJ.A., Costa G., ALcKer-
nan K, SidowA., Fire A., Johnson S. AL. A high-reso-
lution, nucleosome position map of C. elegans reveals a
lack of universal sequence-dictated positioning // Genome
Res. 2008. Vol. 18, N 7. P. 1051—1063.
СПИСОК СОКРАЩЕНИИ
APS — аденозин-5'-фосфосульфат;
АР-сайт — апурин-апиримидиновый сайт;
АР-эндонуклеаза — эндонуклеаза апурин-апи-
римидиновых сайтов;
АТС — тканевая комплементация (adult tissue
complementation);
BES — последовательности микронуклсуса, уда-
ляющиеся во время фрагментации хромосом
вместе с Cbs (breakage-eliminated sequences);
BrdU — 5-бромдезоксиуридин;
Cyt — цитозин;
caCyt — 5-карбоксицитозин;
caUra — 5-карбоксиурацил;
Cbs — сайты разрезания последовательностей
микронуклсуса (chromosome breakage site);
CES — сайты вхождения в хроматин (chromatin
entrv sites);
ChlP-Seq — прямое секвенирование получен-
ных при помощи иммунопреципитации фраг-
ментов ДНК (chromatin immunoprecipita-
tion — sequencing);
CTCF — СССТС-связывающий фактор (СССТС-
binding factor);
dNMP — 2'-дезоксирибонуклеозид-5'-фосфат;
DNMT — ДНК-метилтрансфераза;
dNTP — дсзоксинуклсозидтрифосфаты;
dRP — 2'-дезоксирибозо-5'-фосфат;
Е — день эмбрионального развития (embryonic
day);
fCyt — 5-формилцитозин;
FGF — фактор роста фибробластов (fibroblast
growth factor);
FISH — флуоресцентная гибридизация in situ
(fluorescent in situ hybridization);
lira — 5-формилурацил;
Gua — гуанин;
GPD-петля — петля в структуре белка с боль-
шим числом остатков глицина, пролина и ас-
парагиновой кислоты;
НЗас — ацетилированный гистон НЗ;
НЗК9ас — ацетилированный по лизину в 9 по-
ложении гистон НЗ;
НЗК18ас — ацетилированный по лизину в 18 по-
ложении гистон НЗ;
НЗК27ас — ацетилированный по лизину в 27 по-
ложении гистон НЗ;
Н4ас — ацетилированный гистон Н4;
Н4К5/К8/К12/16ас — ацетилированный по ли-
зину в положении 5/8/12/16 гистон Н4;
Н4К16ас — ацетилированный по лизину в 16 по-
ложении гистон Н4;
H3K4mel — монометилированный по лизину
в 4 положении гистон НЗ;
H3K36mel — монометилированный по лизину
в 36 положении гистон НЗ;
H3K79mel — монометилированный по лизину в
79 положении гистон НЗ;
НЗК27те2 — диметилированный по лизину в
27 положении гистон НЗ;
H3K4me2/3 — ди-/триметилированный по лизи-
ну в 4 положении гистон НЗ;
H3K9me2/3 — ди-/триметилированный по лизи-
ну в 9 положении гистон НЗ;
НЗК27теЗ — триметилированный по лизину’
в 27 положении гистон НЗ;
НЗКЗбтеЗ — триметилированный по лизину’
в 36 положении гистон НЗ;
H4K20mel — монометилированный по лизину в
20 положении гистон Н4;
HAT — гистон-ацетилтрансфераза;
HDAC — гистондеацетилаза;
HDMT — гистондеметилаза;
HhH — мотив «спираль—шпилька—спираль»;
hmCyt — 5-гидроксиметилцитозин;
hmUra — 5-гидроксиметилурацил;
HU — гидроксимочевина;
ICE — элемент, контролирующий импринтинг
(imprint control element);
IES — внутренние удаляемые последовательно-
сти (internal eliminated sequences);
Ig — имму’ноглобу’лин;
iSCNT — межвидовая пересадка соматического
ядра в ооцит (interspecific somatic cell nuclear
transfer);
LCR — локус-контролирующий элемент (locus
control region);
LIF — фактор, подавляющий лейкемию (leuke-
mia inhibitory’ factor);
LINE — длинный диспергированный ядерный
элемент (long interspersed nuclear element);
LTR — длинный концевой повтор (long terminal
repeat);
msC — 5-метилцитозин;
m6A — Кб-метиладенин;
564 ЭПИГЕНЕТИКА
MAR — районы прикрепления к матриксу
(matrix attachment regions);
MDS — последовательности, сохраняющиеся в
макронуклсусс после элиминации (macronu-
cleus-destined sequences):
MeDIP — преципитация метилированных уча-
стков ДНК с помощью белков или антител,
специфично связывающих 5-метилцитозин, с
последующей гибридизацией на микрочипах
(methyl DNA immunoprecipitation);
mH2A — макроН2А;
МНС — главный комплекс гистосовместимости;
miPHK — микроРНК;
MSCI — мейотическая инактивация половых хро-
мосом (meiotic sex chromosome inactivation);
ncPHK — нскодирующая РНК (non-coding RNA);
NPC — ядерный поровый комплекс (nuclear pore
complex);
OAS — 2-5 '-олигоаденилатсинтетаза;
ORC — комплекс узнавания ориджинов (origin
recognition complex);
PGM — секвенатор Personal Genome Machine:
PMSC — постмейотический половой хроматин
(post-meiotic sex chromatin);
PPi — пирофосфат;
PRC1 — Polycomb repressive complex 1;
PRC2 — Polycomb repressive complex 2;
pre-IC — преинициаторный комплекс;
pre-RC — пререпликационный комплекс;
RdMD — РНК-зависимое метилирование ДНК
(RNA-directed DNA methylation):
RdRp — РНК-зависимая РНК-полимераза
(RNA-dependent RNA polymerase);
RISC — индуцируемый РНК комплекс, вызы-
вающий сайленсинг (RNA-induced silencing
complex);
RITS — вызываемый РНК транскрипционный
сайленсинг (RNA-induced transcriptional silen-
cing):
Rsx — ген RNA-on-the-silent X;
SAM — S-адснозил-Л-мстионин;
SAR — ассоциированные co скэффолдом рай-
оны (scaffold associated regions);
shPHK — короткая шпилечная РНК (short hair-
pin RNA);
SINE — короткий диспергированный ядерный
элемент (short interspersed nuclear element):
siRNA* — малая интерферирующая РНК (small
interfering RNA);
sisiPHK — малая внутрсннс-ссгмснтированная
интерферирующая РНК (small internally seg-
mented interfering RNA);
*
В главе 7 siPHK.
SNP — однонуклсотидный полиморфизм (single
nucleotide polymorphism);
Thy — тимин;
TEC — тетраплоидная комплементация (tetra-
ploid embryo comlementation);
Tsix — ген, транскрибирующийся с цепи ДНК,
комплементарной к гену’ Xist (TSIX— у чело-
века);
TSS — сайт инициации транскрипции (transcrip-
tion start site);
TTR — переходный район между’ репликацион-
ными доменами (temporal transition region);
Ura — урацил:
uH2A — моноубиквитинированный по лизину в
119 положении гистон Н2А (ubiquitvlated
Н2А);
VEGF — фактора роста васкулярного эндотелия
(vascular endothelial groyvth factor);
Ха — активная Х-хромосома;
XAR — добавленный район Х-хромосомы (X-
chromosome added region):
XCR — консервативный район Х-хромосомы
(X-chromosome conserved region);
XEN-клетки — клетки экстраэмбриональной
(или внезародышевой) энтодермы (eXtra-emb-
ryonic ENdoderm cells);
Xi — неактивная Х-хромосома;
XIC — центр инактивации Х-хромосомы (X-
chromosome inactivation center);
Xist — ген X-inactive specific transcript (XIST—
у человека):
Xite — район межгенной транскрипции в центре
инактивации Х-хромосомы мыши (X-inacti-
vation intergenic transcription element);
Xm — Х-хромосома, унаследованная от матери;
Хр — Х-хромосома, унаследованная от отца;
уН2АХ — вариант гистона Н2АХ, фосфорили-
рованный по серину’ в 139 положении;
sCyt — 3_А4-этеноцитозин:
а.к.о — аминокислотный остаток;
ВКМ — внутренняя клеточная масса;
ВРТ — вспомогательные репродуктивные тех-
нологии;
ГГХ — гидрохлорид гуанидина;
ГПР — Главная программа развития;
ГСК — гемопоэтические стволовые клетки;
ГХ — гетерохроматин:
д.п.о — день после оплодотворения:
ДК — дендритная клетка;
ДМО — дифференциально метилированные об-
ласти;
ДХ — диминуция хроматина;
ДЦРНК — двуцепочечная РНК;
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 565
ИПСК — индуцированные плюрипотентные ство-
ловые клетки;
кДНК — комплементарная ДНК;
КСК — кардиальные стволовые клетки;
м.п.н. — миллион пар нуклеотидов.
МГЭ — мобильные генетические элементы;
мск — мезенхимальные стволовые клетки;
н. — нуклеотид;
нкРНК — некодирующая РНК;
НМа — новый макронуклсус (дочерний);
НМи — новый микро нуклеус (дочерний);
НСК — нейральные стволовые клетки;
ОТ-ПЦР — полимеразная цепная реакция с об-
ратной транскрипцией:
п.н. — пара нуклеотидов;
ПАР — псевдоаутосомный район;
ПАР1 — псевдоаутосомный район короткого
плеча X/Y-хромосомы человека;
ПАР2 — псевдоаутосомный район длинного
плеча X/Y-хромосомы человека;
ППК — первичные половые клетки;
ПЦР — полимеразная цепная реакция:
РМа — родительский макронуклсус;
РМи — родительский микронуклеус;
РНКи — РНК-интерференция;
РПК — рекомбинация с переключением класса;
РСК — региональные стволовые клетки;
СГКР — специфические генерационные ключи
развития;
СГМ — соматический гипермутагенез;
СК — стволовые клетки;
сМ — сантиморган;
т.н. — тысяча нуклеотидов;
т.п.н. — тысяча пар нуклеотидов:
ТБ — трофобласт;
ТГ-клетки — трофобластные гигантские клетки;
ТС-клетки — трофобластные стволовые клетки;
ТЭ — трофоэктодерма;
УДЛ — условные доминантные летали;
УДЛ(X) — условные доминантные летали в X-
хромосоме;
ЭГ-клетки — эмбриональные герминальные
клетки:
ЭК-клетки — эмбриональные карциномные
клетки;
ЭкЭ — экстраэмбриональная эктодерма;
эмПЦР — эму’льсионная ПЦР;
ЭпиСК — эпибластные стволовые клетки;
ЭПР — эндоплазматический ретикулум;
ЭРО — эксцизионная репарация оснований;
ЭС-клетки — эмбриональные стволовые клет-
ки;
ЭТ — эмбриоидное тело;
ЭФМ — эмбриональные фибробласты мыши;
ЭФМ-КС — среда, кондиционированная эмб-
риональными фибробластами мыши.
СЛОВАРЬ ТЕРМИНОВ
Адаптер — синтетический двуцепочечный оли-
гонуклеотид с одним тупым и одним липким
концами или с двумя липкими концами.
Аденовирусы — семейство ДНК-содержащих ви-
русов позвоночных, лишенных липопротеи-
новой оболочки и состоящих из белкового
капсида и двуцепочечной линейной молскулы
ДНК. Имеют размер 70—90 нм, вызывают
острые респираторные заболевания.
Аденокарцинома — злокачественная опухоль
железистого эпителия внутренних и наруж-
ных органов.
Акроцентрическая хромосома — хромосома,
плечи которой очень сильно различаются по
длине.
Активное деметилирование ДНК — процесс,
приводящий к удалению остатков 5-метил-
цитозина из ДНК в отсутствие репликации.
Аллантоис — временный внезародышевый ор-
ган. развивающийся из задней кишки эм-
бриона. Участвует в газообмене зародыша с
окружающей средой и выделении жидких от-
ходов. Вместе с амнионом и хорионом явля-
ется определяющим признаком высших по-
звоночных животных — млекопитающих,
птиц и рептилий.
Аллели — различные формы одного и того же
гена, расположенные в одинаковых участках
гомологичных хромосом и определяющие
альтернативные варианты развития одного и
того же признака.
Аллогенный трансплантат — трансплантат,
полученный от донора, который относится к
тому’ же биологическому’ виду’, что и реципи-
ент, но обладает иной гистосовместимостью.
Амилоид — белок, образующий агрегаты с упо-
рядоченной Р-структурой.
Амитоз — прямое (простое) деление интерфаз-
ного ядра путем перетяжки, без образования
веретена деления, при этом генетический ма-
териал распределяется случайным образом.
Может как сопровождаться делением всей
клетки, так и ограничиться делением ядра без
разделения цитоплазмы.
Амнион — временный внезародышевый орган,
образующийся из экстраэмбриональных эк-
тодермы и мезодермы и заполненный жидко-
стью. Предохраняет эмбрион от высыхания и
защищает от механических повреждений.
Амниоцентез — инвазивная процедура, заклю-
чающаяся в пункции амниотической оболоч-
ки с целью получения околоплодных вод для
последующего лабораторного исследования,
амниоредукции или введения в амниотиче-
скую полость лекарственных средств.
Ангиогенез — процесс образования новых кро-
веносных сосудов в органе или ткани. Проте-
кает с умеренной интенсивностью в норме и
активизируется при регенерации поврежден-
ных тканей, канализации тромбов, ликвидации
очагов воспаления, образовании рубца и т. д.,
а также при росте и развитии организма.
Андрогенез — форма размножения организмов,
при которой в развитии зародыша участвует
только ядро, привнесенное в яйцеклетку’
сперматозоидом.
Аномальный полюс — область яйцеклетки жи-
вотных, содержащая наибольшее количество
свободной от желточной массы цитоплазмы.
К анимальному полюсу смещены ядро яйце-
клетки и полярные тельца.
Апираза — кальций-зависимый фермент (АТФ-
дифосфогидролаза), отщепляющий фосфат от
аденозинтрифосфата и аденозиндифосфата.
Апоптоз — программируемая клеточная смерть,
регулируемый процесс самоликвидации на
клеточном уровне, в результате которого
клетка фрагментируется на отдельные апоп-
тотические тельца, ограниченные плазмати-
ческой мембраной. Фрагменты погибшей
клетки фагоцитируются макрофагами либо
соседними клетками без развития воспали-
тельной реакции. Необходим для уничтоже-
ния дефектных (поврежденных, мутантных,
инфицированных) клеток.
Аск — сумка, орган полового спороношения
аскомицетов. Клетка, в которой развиваются
аскоспоры — гаплоидные продукты индиви-
дуального мейоза.
Атеросклероз — заболевание, связанное с на-
рушением липидного обмена и отложением
липидов на стенках сосудов. Приводит к по-
степенному’ сужению их просвета вплоть до
полной закупорки.
568 ЭПИГЕНЕТИКА
Атрофия — уменьшение размеров органа или
ткани, характеризующееся нарушением или
прекращением их функции.
Аутоиммунные заболевания — класс разно-
родных по клиническим проявлениям заболе-
ваний, развивающихся вследствие патологи-
ческой выработки аутоиммунных антител или
размножения аутоагрессивных клонов кил-
лерных клеток против собственных тканей
организма. Приводят к повреждению и раз-
рушению нормальных тканей и к развитию
аутоиммунного воспаления.
Аутосомы — парные неполовые хромосомы, оди-
наковые у мужских и женских организмов.
Бактериофаг — вирус, поражающий бактери-
альные клетки.
Библиотека клонов — неупорядоченная кол-
лекция клонов (клонированных нуклеотид-
ных последовательностей определенного ор-
ганизма).
Бластомеры — клетки, образующиеся при
дроблении зиготы на ранних стадиях эмбрио-
нального развития.
Бластоцель — полость бластулы, образующаяся
между бластомерами у зародышей животных.
Заполнена жидкостью, отличающейся по хи-
мическому составу от окружающей среды.
Увеличивает площадь поверхности эмбриона,
улучшая его способность усваивать питатель-
ные вещества и кислород. Достигает наиболь-
шего размера к концу дробления (стадия бла-
стулы) и постепенно исчезает при гаструляции.
Бластоциста — этап развития оплодотворенно-
го яйца млекопитающих, представляющий
собой полый пузырек, заполненный жидко-
стью, всасываемой из полости яйцевода и
матки. Состоит из трофобласта (внешний
слой) и внутренней клеточной массы. На ста-
дии бластоцисты эмбрион перемещается в
полость матки и имплантируется в ее стенку.
Болезнь Паркинсона (дрожательный пара-
лич) — хроническое прогрессирующее деге-
неративное заболевание центральной нервной
системы, связанное с разрушением и гибелью
дофаминовых нейронов. Проявляется в не-
произвольном дрожании конечностей (тремо-
ре), мышечной ригидности, нарушении коор-
динации и речи, а также затруднениях с пере-
движением. Впервые описано в 1817 г. анг-
лийским врачом Дж. Паркинсоном, обычно
развивается после 60 лет.
Бромодомен — белковый домен размером около
ПО аминокислот, который специфически взаи-
модействует с ацетилированными лизинами.
Вегетативная несовместимость — невозмож-
ность слияния вегетативных клеток у грибов
и водорослей.
Вегетативный полюс — область яйцеклетки
животных, содержащая наибольшее количе-
ство желтка и противоположная месту’ отде-
ления редукционных телец.
Вектор — молекула нуклеиновой кислоты, в ко-
торую интегрируют целевой фрагмент ДНК.
Используется для переноса генетического ма-
териала в клетку-реципиент. Примеры векто-
ров: плазмиды, космиды, искусственные дрож-
жевые хромосомы, вирусные векторы.
Витрификация эмбрионов — сверхбыстрый
способ замораживания эмбрионов, при кото-
ром вода сразу переходит в желеобразное со-
стояние. При этом не происходит образова-
ния микроскопических кристаллов льда, ко-
торые могут травмировать клетки эмбриона.
Внутренняя клеточная масса — совокупность
клеток, которая располагается под трофобла-
стом в полости бластодермического пузырька
у одного из полюсов бластоцисты. Начинает
формироваться до имплантации зародыша в
эндометрий матки. Впоследствии разделяется
на эпибласт и гипобласт.
Гаструляция — сложный процесс морфогене-
тических изменений, сопровождающийся раз-
множением, ростом, направленным переме-
щением и дифференцировкой клеток, в ре-
зультате чего образуются зародышевые лист-
ки (эктодерма, мезодерма и энтодерма) —
источники зачатков тканей и органов. В ре-
зультате перемещения клеточных масс из
бластулы образуется двухслойный или трех-
слойный зародыш — гаструла.
Геликазы — ферменты, расплетающие двуце-
почечные ДНК или РНК, используя энер-
гию гидролиза нуклеозидтрифосфатов. Не-
обходимы для таких процессов, как репли-
кация, репарация, рекомбинация и транс-
крипция.
Гемопоэтические стволовые клетки — муль-
типотентные региональные стволовые клет-
ки, дающие начало всем типам клеток крови.
Находятся в костном мозге, а также встреча-
ются в системном кровотоке и скелетных
мышцах.
Герминальные клетки — ряд поколений кле-
ток от первичных половых клеток зародыша
до гамет.
Гетерогаметность — наличие у особи различ-
ных по морфологии, размеру и генетическому’
содержанию половых хромосом, что приво-
СЛОВАРЬ ТЕРМИНОВ 569
дит к образованию разных по набору хромо-
сом гамет.
Гетерокарион — клетка, содержащая два или
более гаплоидных ядра разных генотипов.
Гетерохроматин — участки хроматина, нахо-
дящиеся в конденсированном (компактном)
состоянии и характеризующиеся низкой
транскрипционной активностью и поздней
репликацией в S-фазе клеточного цикла.
Гипергомоцистеинемия — состояние, обуслов-
ленное накоплением в крови гомоцистеина,
который образуется в процессе метаболизма
метионина. Является фактором повышенного
риска многих патологических состояний че-
ловека. При беременности приводит к нару-
шениям фетоплацентарного кровообращения,
дефектам имплантации зародыша и может
быть причиной бесплодия и невынашивания
беременности.
Гиперхолестеринемия — заболевание, характе-
ризующееся повышенным содержанием холе-
стерина в крови.
Гипобласт (примитивная энтодерма) — часть
внутренней клеточной массы бластоцисты,
прилежащая к полости бластодермического
пузырька (бластоцели). Дает начало экстра-
эмбриональным тканям.
Гистонесовместимость (тканевая несовмес-
тимость) — явление, обусловленное генети-
ческим своеобразием каждой особи и заклю-
чающееся в отторжении органа или ткани,
пересаженных от одного организма другому’.
Гистоны — небольшие сильно основные белки,
связывающиеся с ДНК и участвующие в ее
упаковке.
Гликозидазы — ферменты, катализирующие гид-
ролиз гликозидных связей в молекулах угле-
водов.
Гомеобокс — участок гена размером 180 п.н.,
кодирующий белковый домен (гомеодомен),
способный специфически связывать ДНК.
Выявляется в генах, вовлеченных в регуля-
цию развития (гомеозисных генах).
Гомогаметность — наличие у особи одинако-
вых по морфологии, размеру и генетическому’
содержанию половых хромосом, что приво-
дит к образованию одинаковых по набору
хромосом гамет.
Губчатая энцефалопатия — нейродегенератив-
ная прионная болезнь, приводящая к необра-
тимым, летальным изменениям в головном
мозге зараженных животных.
Деацетилазы — ферменты, катализирующие уда-
ление ацетильной группы.
Делеция — потеря участка хромосомы разме-
ром один нуклеотид и более.
Деметилазы — ферменты, катализирующие уда-
ление метильной группы.
Дендритные клетки — клетки костномозгового
происхождения, презентирующие антигены
на своей поверхности для активации В- и Т-
лимфоцитов.
Десмосомы — межклеточные контактные струк-
туры, характерные для эпителиальных и не-
которых других типов клеток. Обеспечивают
механическую связь между7 клетками.
Детерминация — латентная дифференцировка,
возникновение качеств, различий между7 час-
тями развивающегося организма на стадиях,
предшествующих появлению морфологиче-
ски различимых закладок органов и тканей.
Децидуальные клетки — клетки децидуальной
оболочки (трансформированного в связи с
беременностью функционального слоя эндо-
метрия), участвующей в формировании мате-
ринской части плаценты.
Диминуция хроматина — запрограммирован-
ная потеря части генетического материала
в соматических клетках в ходе развития. Ха-
рактерна для некоторых двукрылых насеко-
мых, нематод, веслоногих ракообразных,
миксин и инфузорий.
Дифференциально метилированная область —
район генома, имеющий различный уровень
метилирования ДНК, в зависимости от типа
клеток или стадии развития организмов.
Дифференцировка — процесс, в результате ко-
торого клетки приобретают специализиро-
ванный фенотип и способность к выполне-
нию специализированных функций.
ДНК-гликозилаза — фермент, катализирую-
щий гидролиз TV-гликозидной связи между7
основанием и остатком дезоксирибозы в со-
ставе ДНК.
ДНК-полимераза — фермент, осуществляющий
полимеризацию дезоксирибонуклеотидов по
принципу7 комплементарности, используя
в качестве матрицы цепочки нуклеотидов
ДНК (репликация) или РНК (обратная транс-
крипция).
Дозовая компенсация — механизм, возникший
для уравнивания уровня экспрессии генов X-
хромосомы между самками (набор половых
хромосом XX) и самцами (набор половых
хромосом XY). Как оказалось в дальнейшем,
данный механизм нужен еще и для выравни-
вания уровня экспрессии генов на Х-хро-
мосоме и аутосомах у7 обоих полов.
570 ЭПИГЕНЕТИКА
Домен — участок белка, характеризующийся
определенной последовательностью амино-
кислот и пространственной структурой и вы-
полняющий определенную биологическую
функцию.
Дробление — ряд последовательных митотиче-
ских делений оплодотворенного или иниции-
рованного к развитию яйца, в результате ко-
торых оно разделяется на все более мелкие
клетки — бластомеры. При этом масса заро-
дыша и его объем не меняются.
Желточный мешок — орган питания, дыхания
и кроветворения у зародышей млекопитаю-
щих. птиц, пресмыкающихся, хрящевых и
костистых рыб, головоногих моллюсков. Воз-
никает путем обрастания желтка энтодермой
и висцеральной мезодермой и представляет
собой расширенный вырост среднего отдела
первичной кишки.
Зародышевые листки — зародышевые пласты,
слои тела зародыша многоклеточных живот-
ных, образующиеся в процессе гаструляции
и дающие начало разным органам и тканям.
У большинства организмов образуется три за-
родышевых листка: наружный — эктодерма,
внутренний — энтодерма и средний — мезо-
дерма.
Зигота — оплодотворенное яйцо; диплоидная
клетка, образовавшаяся в результате слияния
гамет — начальная стадия эмбрионального
развития.
Зонд (проба) — одноцепочечная молекула ДНК
или РНК, несущая метку (радиоактивную,
флуоресцентную, иммунологическую). Гиб-
ридизация зонда с комплементарной ему’ по-
следовательностью означает наличие в анали-
зируемом образце определенной нуклеотид-
ной последовательности.
Иммуноокрашивание — методика, основанная
на детекции специфических белков в образце
с помощью меченых антител.
Иммунопреципитация — метод, который осно-
ван на преципитации определенного бел-
ка/белкового комплекса из раствора/клеточ-
ного экстракта с помощью специфичных ан-
тител.
Имплантация — прикрепление эмбриона к стен-
ке матки у плацентарных млекопитающих.
Импринтинг (от англ, imprint — отпечаток, за-
печатление) — механизм обратимой избира-
тельной модификации аллелей генов в зави-
симости от их родительского происхождения,
приводящий к дифференциальной экспрессии
в развитии [Surani, 1998].
Инактивация Х-хромосомы — подавление
транскрипции генов и гетерохроматизация
одной из двух Х-хромосом на ранних этапах
развития самок млекопитающих. Является
одним из механизмов дозовой компенсации,
который служит для обеспечения одинаково-
го уровня экспрессии генов Х-хромосомы в
клетках самцов и самок млекопитающих.
Индуцированные плюрипотентные стволо-
вые клетки — плюрипотентные клетки, по-
лучаемые в результате репрограммирования
соматических клеток с помощью эктопиче-
ской экспрессии определенного набора транс-
крипционных факторов.
Инсерция — вставка фрагмента ДНК. Размер
вставки может варьировать от одного нуклео-
тида до нескольких миллионов пар оснований.
Инсуляторы (инсуляторные элементы) —
последовательности ДНК, которые могут, во-
первых, блокировать взаимодействие между’
энхансером и промотором, а во-вторых, раз-
делять районы транскрипционно активного и
неактивного хроматина.
Интерфаза — период жизненного цикла клетки
между’ двумя митотическими делениями, в
течение которого синтезируются вещества,
необходимые для существования и после-
дующего деления клетки, а также возникают
специальные структуры в зависимости от ее
функциональных особенностей. В случае кле-
ток, утративших способность к делению, —
период от последнего митоза и до смерти
клетки.
Интерфероны — группа низкомолекулярных
гликопротеидов, вырабатываемых клетками
человека или животных в ответ на вирусную
инфекцию или под действием различных ин-
дукторов и обладающих противовирусным
действием.
Интрон — участок гена эукариот, не кодирую-
щий белок. Удаляется из молекулы РНК в хо-
де сплайсинга.
Инфаркт миокарда — одна из клинических
форм ишемической болезни сердца, проте-
кающая с развитием ишемического некроза
участка миокарда, обусловленного абсолют-
ной или относительной недостаточностью его
кровоснабжения. Другое название — сердеч-
ный приступ.
Кариотип — совокупность признаков (число,
размеры, форма и т. д.) полного набора хро-
мосом, присущая клеткам данного биологи-
ческого вида (видовой кариотип), данного ор-
ганизма (индивидуальный кариотип) или ли-
СЛОВАРЬ ТЕРМИНОВ 571
нии (клона) клеток. Кариотипом иногда также
называют и визуальное представление полно-
го хромосомного набора (кариограммы).
Картирование — установление локализации.
Карцинома — злокачественная опухоль, разви-
вающаяся из клеток эпителиальной ткани раз-
личных органов.
Кератоз — обобщенное название группы кож-
ных заболеваний, характерной чертой кото-
рых является чрезмерное утолщение рогового
слоя эпидермиса.
Киназы — ферменты, катализирующие перенос
фосфатной группы от молекулы аденозин-
трифосфата на какой-либо субстрат (фосфо-
рилирование).
Кинетохор — белковая структура, контактирую-
щая с центромерой и нитями веретена деле-
ния. Участвует в правильном распределении
хроматид между’ дочерними клетками во вре-
мя деления.
Клеточная терапия — биомедицинская техно-
логия, основанная на использовании стволо-
вых клеток или их продуктов.
Клеточный цикл — период существования
клетки от момента ее образования путем де-
ления материнской клетки до собственного
деления.
Клонирование — процесс получения генетиче-
ски идентичной группы клеток (клона) из од-
ной первоначальной клетки. Клонирование
ДНК — процесс получения множественных
копий отдельного гена или фрагмента ДНК.
Коммитирование — постепенное ограничение
возможных направлений развития клетки.
Компартмент ядра — область (зона) ядра, ха-
рактеризующаяся определенным набором фак-
торов.
Комплекс дозовой компенсации — белковый
комплекс, который может также содержать
некодирующие РНК и участвует в регуляции
экспрессии генов половых хромосом, обеспе-
чивая их дозовую компенсацию.
Конститутивный гетерохроматин — гетеро-
хроматин, представленный повторенными
последовательностями и выявляемый в одних
и тех же участках хромосом (главным обра-
зом, в центромерных и теломерных районах)
во всех типах клеток.
Криоконсервация — низкотемпературное хра-
нение живых биологических объектов с воз-
можностью восстановления их биологиче-
ских функций после размораживания. Как
правило, осуществляется в жидком азоте при
температуре -196 °C.
Ксеногенный трансплантат — трансплантат,
полученный от донора, который относится
к иному' биологическому' виду’, чем реци-
пиент.
Кумулюсные клетки — окружающие и питаю-
щие ооцит клетки.
Лентивирусы — род вирусов сем. ретровирусов
с длительным инкубационным периодом, от-
носятся к медленным вирусам. В отличие от
ретровирусов способны заражать непролифе-
рирующие клетки.
Лигазы — см. синтетазы.
Лигирование — соединение двух молекул с об-
разованием новой химической связи с уча-
стием фермента лигазы.
Липосомы — искусственно создаваемые липид-
ные везикулы (пузырьки), состоящие из одно-
го или нескольких фосфолипидных бислоев,
разделенных водной фазой. Используются
для доставки различных веществ в клетки.
Макронуклеус — большое соматическое ядро у
инфузорий, полиплоидное. Контролирует все
процессы жизнедеятельности, но не участвует
в размножении. При половом процессе раз-
рушается и заменяется новым, развивающим-
ся из продуктов деления микронуклсуса.
Мезенхимальные стволовые клетки — муль-
типотентные стволовые клетки, содержащие-
ся во всех мезенхимальных тканях (главным
образом, в костном мозге), способные к диф-
ференцировке в различные типы клеток,
включая остеобласты, хондроциты и адипо-
циты.
Мезодерма — средний зародышевый листок у
многоклеточных животных, из которого раз-
виваются мышцы, хрящи, стенки кровенос-
ных сосудов, органы крово- и лимфообразо-
вания, выделения, половые органы и др.
Мейоз — способ деления диплоидных клеток, в
результате которого число хромосом умень-
шается вдвое, что приводит к образованию
гаплоидных клеток.
Мейотическая инактивация половых хромо-
сом — транскрипционный сайленсинг X- и
Y-хромосом (полового тельца) на стадии па-
хитены в мейозе самцов.
Метацентрическая хромосома — хромосома с
центрально расположенной центромерой и
практически равными по длине плечами.
Метилирование ДНК — процесс ковалентного
присоединения метильной группы к основа-
ниям в составе ДНК.
Метилом — паттерн метилирования генома
клетки или группы клеток.
572 ЭПИГЕНЕТИКА
Миелоидный лейкоз — злокачественное забо-
левание, поражающее клетки крови миелоид-
ной (нелимфоидной) линии.
Микронуклеус — малое генеративное ядро у
инфузорий, обычно диплоидное, характери-
зуется очень плотным хроматином. Является
«депо» наследственной информации, переда-
ваемой из поколения в поколение. Вне перио-
да конъюгации неактивен или малоактивен.
При половом процессе претерпевает мейоз и
дает начало гаплоидным пронуклсусам.
МикроРНК — класс некодирующих РНК. Име-
ют размер 20—25 нуклеотидов и играют важ-
ную роль в транскрипционной репрессии ге-
нов за счет подавления трансляции матрич-
ной РНК.
Микрочип — технология гибридизации ДНК с
микропробами, точечно нанесенными на под-
ложку’. Используется для изучения экспрес-
сии генов (RNA-chip), распределения моди-
фикаций в хроматине (ChIP-on-chip) и других
задач.
Митоз — способ деления соматической клетки,
который обеспечивает одинаковое распреде-
ление редуплицированных хромосом между’
ядрами дочерних клеток.
Мобильные элементы (транспозоны) — по-
следовательности ДНК, которые могут пере-
мещаться или увеличивать свою копийность в
геноме.
Модификации гистонов — ковалентные пост-
трансляционные изменения N- и С-хвостов
коровых гистонов путем определенных хими-
ческих модификаций: ацетилирования, мети-
лирования, убиквитинирования, фосфорили-
рования и др. Ковалентные модификации ко-
ровых гистонов изменяют суммарный заряд,
конформацию и друтие свойства хроматина,
способствуют привлечению в нужные место и
время негистоновых факторов и ферментов,
отвечающих за репрессию либо активацию
транскрипции и паттерн репликации.
Модификация — изменение фенотипа особи не
наследственного характера.
Моноаллельная экспрессия — экспрессия ал-
леля только с одной из пары родительских
хромосом: отцовской или материнской.
Моноклональные антитела — антитела, выра-
батываемые иммунными клетками, принад-
лежащими к одному’ клеточному’ клону, т. е.
произошедшими из одной плазматической
клетки-предшественницы. Могут быть выра-
ботаны на почти любое вещество (в основном
белки и полисахариды), которое антитело бу-
дет специфически связывать, и далее исполь-
зованы для детекции (обнаружения) этого
вещества или его очистки.
Моносомия — отсутствие в хромосомном набо-
ре диплоидного организма одной из гомоло-
гичных хромосом.
Морула — стадия развития, когда эмбрион
представляет собой скопление клеток (бла-
стомеров) без обособленной полости.
Морфоз (уродство) — нарушение симметрии
строения особи.
Мультипотентность — способность формиро-
вать клетки многих клеточных типов, кото-
рые образуют разные ткани и органы. Приме-
рами таких клеток являются гемопоэтические
и мезенхимальные стволовые клетки.
Муральная трофоэктодерма — трофоэктодер-
ма, не имеющая непосредственного контакта
с внутренней клеточной массой бластоцисты.
Нейротрансмиттеры — биологически активные
химические вещества, посредством которых
осуществляется передача электрического им-
пульса с нервной клетки через синаптическое
пространство между' нейронами.
Некодирующие РНК — молекулы РНК, кото-
рые не транслируются в белки, не выходят в
цитоплазму’ и выполняют свои функции внут-
ри ядра.
Неменделевское наследование — отклонение в
расщеплении гибрида от ожидаемого соглас-
но законам Менделя соотношения частот фе-
нотипов как следствие не хромосомного на-
следования.
Несинонимичная замена — замена одного ос-
нования в последовательности ДНК, изме-
няющая кодон и приводящая к замене коди-
руемой аминокислоты.
Нокаут — экспериментальное направленное по-
вреждение обоих аллелей гена с целью его
необратимого «выключения».
Нокдаун — обратимое подавление экспрессии
гена, например, при помощи РНК-интер-
ференции.
Нуклеосома — структура, являющаяся элемен-
тарной единицей упаковки хромосомной ДНК.
Состоит из гистонового октамера и обернутой
вокруг него двойной спирали ДНК.
Овуляция — выход яйцеклетки (ооцита второго
порядка) из яичника в полость тела в резуль-
тате разрыва зрелого фолликула.
Однородительская дисомия — наследование
обеих гомологичных хромосом или их частей
от одного родителя.
СЛОВАРЬ ТЕРМИНОВ 573
Омнипотентный нонсенс-супрессор — фактор,
способный вызывать прочтение всех трех ти-
пов нонсенс-кодонов как значащих.
Онкоген — ген, активация которого вследствие
мутаций или других причин приводит к пре-
вращению клетки в раковую. В норме функ-
ционирует в определенных фазах клеточного
цикла и стадиях дифференцировки клеток, а
затем находится в репрессированном состоя-
нии.
Оогенез — процесс превращения первичных
женских половых клеток в зрелые яйцеклетки.
Оогоний — диплоидная женская половая клетка
на первом этапе оогенеза до вступления в
мейоз, претерпевающая ряд митотических
делений.
Ооплазматическая сегрегация — перераспре-
деление биологически активных молскул (ло-
кальных детерминант) в цитоплазме яйце-
клетки в результате ее активации. Приводит к
возникновению презумптивных зон.
Ооцит — женская половая клетка. Различают
ооциты первого и второго порядка. Ооциты
первого порядка формируются после репли-
кации ДНК перед вступлением в мейотиче-
ские деления. Ооциты второго порядка обра-
зуются после первого мейотического деления.
Ориджин репликации — участок генома, на
котором происходит инициация репликации.
Ортологи — гомологичные гены и белки у раз-
ных видов.
Остеоартрит — дегенеративно-дистрофическое
заболевание суставов, причиной которого яв-
ляется поражение хрящевой ткани суставных
поверхностей.
Открытая рамка считывания (ORF) — по-
следовательность нуклеотидов в составе ДНК
или РНК, потенциально способная кодиро-
вать белок. Об этой способности свидетель-
ствует отсутствие стоп-кодонов на достаточ-
но продолжительном участке последователь-
ности после стартового кодона.
Паралоги — дуплицированные гены, эволюцио-
нировавшие в разных направлениях в геноме
одного вида.
Партеногенез — форма полового размножения,
при которой яйцеклетки развиваются во
взрослый организм без оплодотворения.
Первичные половые клетки — группа клеток
эмбриона, из которых впоследствии разви-
ваются гаметы.
Плазмида — кольцевая суперспирализованная
молекула ДНК, несущая дополнительные
факторы наследственности и способная к ав-
тономной репликации. Используется в каче-
стве векторной системы для переноса генети-
ческой информации.
Плацента — эмбриональный орган у всех самок
плацентарных млекопитающих, некоторых
сумчатых, живородящих хрящевых рыб и ря-
да других групп животных. У млекопитаю-
щих плацента образуется из зародышевых
оболочек плода (ворсинчатой, хориона и ал-
лантоиса), которые плотно прилегают к стен-
ке матки, образуют выросты (ворсинки),
вдающиеся в слизистую оболочку, и устанав-
ливают таким образом тесную связь меж-
ду’ зародышем и материнским организ-
мом, служащую для питания и дыхания заро-
дыша.
Плюрипотентность — способность клеток диф-
ференцироваться в производные трех заро-
дышевых листков: эктодермы, энтодермы и
мезодермы.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — метод
амплификации фрагментов ДНК с использо-
ванием термостабильной ДНК-полимеразы и
пары олигонуклсотидных праймеров.
Политенизация — множественная репликация
ДНК, не сопровождающаяся расхождением
сестринских хроматид.
Половые хромосомы — пара хромосом, в кото-
рых расположены гены, определяющие поло-
вую принадлежность индивида. Выделяют
две системы половых хромосом: XY и ZW.
В системе половых хромосом XY самки яв-
ляются гомогаметным полом (XX), а сам-
цы — гетерогаметным полом (XY). В системе
половых хромосом ZW, наоборот, гетерога-
метным полом являются самки (ZW), а гомо-
гаметным полом — самцы (ZZ).
Праймер — короткая одноцепочечная молскула
нуклеиновой кислоты (олигонуклеотид), к ко-
торой полимераза присоединяет новые нук-
леотиды в процессе синтеза ДНК или РНК.
Пресинаптические терминали — участки пе-
редающей нервной клетки, образующие си-
напс в комплексе с постсинаптическими уча-
стками воспринимающей клетки.
Преэклампсия — быстропрогрессирующее,
представляющее угрозу’ для жизни состояние
во время беременности, характеризующееся
повышенным артериальным давлением, про-
теинурией и периферическими отеками. Про-
исходит из-за нарушения функционирования
эндотелия кровеносных сосудов матери и ог-
раничивает поступление кислорода и пита-
тельных веществ к плоду.
574 ЭПИГЕНЕТИКА
Прион — белок с особой конформацией, спосо-
бен перестраивать «по своему’ образу и подо-
бию» вновь синтезируемые гомологичные, а
иногда и гетерологичные, полипептиды. В ре-
зультате изменения пространственной струк-
туры белок может инактивироваться или при-
обретать новые функции, что приводит к на-
следуемому изменению признака.
Прионизация — изменение пространственной
укладки полипептида без изменения его пер-
вичной структуры (без изменения последова-
тельности кодирующих его нуклеотидов ДНК).
Прионная конверсия — вовлечение в приони-
зацию клеточного белка с использованием
уже имеющихся прионных агрегатов в каче-
стве матрицы.
Пролиферация — разрастание ткани организма
или культуры клеток путем митотических де-
лений клеток.
Промотор — последовательность нуклеотидов
ДНК, с которой связывается РНК-полимераза
для инициации транскрипции соответствую-
щего гена.
Пронуклеус — каждое из двух гаплоидных ядер
гамет в зиготе до момента их слияния.
Протамины — низкомолекулярные белки, отли-
чающиеся высоким содержанием щелочных
аминокислот, особенно аргинина. В ходе спер-
матогенеза замещают гистоны и участвуют
в упаковке ДНК в ядрах сперматозоидов.
Протеолиз — ферментативный гидролиз белков.
Протеасома — белковый комплекс, осуществ-
ляющий гидролиз ненужных или поврежден-
ных белков до коротких пептидов.
Процессинг — процесс формирования зрелых
молекул РНК из их предшественников (пре-
РНК).'
Псевдоаутосомный район — участок, сохра-
няющий гомологию на X- и Y-хромосомах и
необходимый для правильной конъюгации X-
и Y-хромосом в мейозе у самцов.
Псевдоген — последовательность, происходя-
щая от обычного функционального гена, но
утратившая способность экспрессироваться в
клетке.
Пузырный занос — патология развития, сопро-
вождающаяся перерождением ворсин хорио-
на: резким отеком ворсин, их разрастанием и
превращением в пузырьки, наполненные
светлой жидкостью.
Рассеянный склероз — хроническое аутоим-
мунное заболевание, при котором поражается
миелиновая оболочка нервных волокон го-
ловного и спинного мозга. «Склероз» означа-
ет «рубец», «рассеянный» — «множествен-
ный», т. е. наличие рассеянных по всей цент-
ральной нервной системе очагов склероза,
в которых происходит замена нормаль-
ной нервной ткани на соединительную. Рас-
сеянный склероз впервые описал в 1868 г.
Ж.-М. Шарко.
Регенеративная медицина — восстановление
пораженной болезнью или поврежденной
(травмированной) ткани с помощью актива-
ции эндогенных стволовых клеток или с по-
мощью трансплантации клеток (клеточной
терапии).
Региональные (зрелые) стволовые клетки —
взрослые соматические мультипотентные ство-
ловые клетки различных органов, способные к
дифференцировке в клетки «своего» органа.
Рекомбинация — обмен участками между’ дву-
мя молекулами ДНК. В мейозе — обмен уча-
стками между’ гомологичными хромосомами
во время их конъюгации (кроссинговер).
Рекомбинация с переключением класса —
процесс, протекающий в клетках иммунной
системы в константных частях генов имму-
ноглобулинов для изменения класса синтези-
рующихся белков с IgM на другие иммуно-
глобулины (IgA, IgD, IgE или IgG).
Ремоделинг хроматина — изменение связыва-
ния ДНК и гистонов, включающее перемеще-
ние нуклеосом, их сборку-, разборку- и замену
гистонов. Позволяет регулировать экспрес-
сию генов и делать ДНК доступной для таких
процессов, как репликация, транскрипция,
репарация и рекомбинация.
Репарация ДНК — процесс исправления по-
вреждений ДНК: модифицированных основа-
ний и нуклеотидов, разрывов, неканониче-
ских пар оснований.
Репликация — процесс удвоения молекулы
ДНК, обеспечивающий точное копирование
генетической информации и ее передачу’ от
поколения к поколению.
Репликон — участок генома, репликация кото-
рого находится под контролем одного орид-
жина репликации.
Репрограммирование — изменение свойств
клетки, основанное на стирании старой и уста-
новлении новой эпигенетической программы.
Ретровирусы — семейство РНК-содержащих
вирусов, заражающих преимущественно по-
звоночных. Используют для репликации сво-
его генома механизм обратной транскрипции.
Образовавшаяся в результате двуцепочечная
молекула /ТНК интегрируется в геномную
СЛОВАРЬ ТЕРМИНОВ 575
ДНК клетки (провирус) и далее служит мат-
рицей для синтеза новых молскул вирусных
РНК. Эти РНК выходят из клеточного ядра и
в цитоплазме клетки упаковываются в вирус-
ные частицы, способные инфицировать новые
клетки.
Ретротранспозоны — мобильные генетические
элементы (транспозоны), использующие для
своей амплификации в геноме обратную
транскриптазу, обладают способностью встра-
ивать в геном клетки-хозяина ДНК-копии сво-
их РНК-геномов, образуя провирус.
Рибонуклеазы — ферменты класса гидролаз,
катализирующие гидролиз фосфодиэфирных
связей между нуклеозидами в РНК.
РНК-интерференция — подавление экспрессии
гена при помощи малых молскул РНК.
РНК-полимераза — фермент, осуществляющий
синтез молскул РНК на матрице ДНК (транс-
крипция).
Сайленсинг генов — репрессия генов, которая
может осуществляться как на уровне инакти-
вации транскрипции, так и на посттранскрип-
ционном уровне.
Саркома — группа злокачественных опухолей,
состоящих из незрелой соединительной тка-
ни; имеет на разрезе розовато-белый цвет, на-
поминает рыбье мясо. Характерны инфильт-
рирующий рост с разрушением соседних тка-
ней, рецидивы после удаления, раннее обра-
зование метастазов с распространением их в
легкие (при саркоме конечностей, головы,
шеи, туловища) и печень (при саркоме
брюшной полости).
Сателлитная ДНК — фракция генома эукари-
от, состоящая из высокоповторяющихся ко-
ротких нуклеотидных последовательностей
ДНК, которые расположены тандемно друг за
другом.
Сахарный диабет — группа эндокринных забо-
леваний, развивающихся вследствие абсо-
лютной или относительной (нарушение взаи-
модействия с клетками-мишенями) недоста-
точности гормона инсулина, в результате чего
развивается гипергликемия — стойкое увели-
чение содержания глюкозы в крови. Заболе-
вание характеризуется хроническим течением
и нарушением всех видов обмена веществ:
углеводного, жирового, белкового, минераль-
ного и водно-солевого.
Секвенатор — прибор, предназначенный для
определения порядка расположения нуклео-
тидов в молскуле ДНК (РНК) или порядка
аминокислот в белке.
Секвенирование — определение порядка рас-
положения нуклеотидов в молекуле ДНК
(РНК) или порядка аминокислот в белке.
Синаптическая стимуляция — активация си-
напсов. приводящая к изменениям в эффек-
тивности передачи сигнала.
Синдром Тернера — заболевание, развиваю-
щееся у женщин из-за отсутствия одной X-
хромосомы (моносомия по Х-хромосоме).
Для больных характерны недоразвитие жен-
ских половых органов, низкий рост, низко
расположенные уши, низкая линия роста во-
лос на затылке, кожные складки на затылке,
укорочение фаланг пальцев. Часто встреча-
ются врожденные пороки сердца, нарушения
в развитии почек, а также сахарный диабет и
ожирение.
Синонимичная замена — замена одного осно-
вания в последовательности ДНК, изменяю-
щая кодон, но не приводящая к замене коди-
руемой аминокислоты.
Синтения — сходство групп сцепления генов у
организмов из разных таксонов.
Синтетазы (лигазы) — класс ферментов, ката-
лизирующих соединение двух различных мо-
лекул за счет энергии сопряженной реакции
гидролиза аденозинтрифосфата.
Синцитиотрофобласт — внешний слой трофо-
бласта зародыша человека, представляющий
собой симпласт с гигантскими и фрагменти-
рованными ядрами. Выполняет функцию вса-
сывания питательных веществ из крови мате-
ри и вырабатывает гистолитические фермен-
ты, способствующие внедрению ворсин хо-
риона в ткани матки.
Солидная опухоль — опухоль, развившаяся не
из клеток кроветворной системы (негемопо-
этическая).
Соматические гибриды — клетки, полученные
в результате слияния соматических клеток
различного типа.
Соматические клетки — клетки, формирую-
щие тело организма. К соматическим клеткам
относятся все клетки тела за исключением кле-
ток зародышевого пути!
Соматический гипермутагенез — процесс мута-
генеза, протекающий в клетках иммунной сис-
темы в вариабельных частях генов иммуногло-
булинов для повышения их разнообразия.
Сперматида — мужская половая клетка, кото-
рая образуется из сперматоцита второго по-
рядка после второго мейотического деления и
в результате спермиогенеза превращается в
зрелый сперматозоид.
576 ЭПИГЕНЕТИКА
Сперматогенез — процесс превращения пер-
вичных мужских половых клеток в зрелые
сперматозоиды.
Сперматогоний — диплоидная мужская поло-
вая клетка на первом этапе сперматогенеза,
до вступления в мейоз претерпевающая ряд
митотических делений.
Сперматоцит — мужская половая клетка. Раз-
личают сперматоциты первого и второго по-
рядков. Сперматоциты первого порядка фор-
мируются после репликации ДНК перед всту-
плением в мейотические деления. Спермато-
циты второго порядка образуются после пер-
вого мейотического деления.
Сплайсинг — вырезание из молскулы РНК ин-
тронов и соединение экзонов в одну молеку-
лу. Происходит во время процессинга РНК.
Стволовые клетки — клетки, обладающие дву-
мя основными свойствами: способностью под-
держивать свое стволовое/недифференциро-
ванное состояние (самообновление) и диффе-
ренцироваться в различные клеточные произ-
водные.
Стволовые клетки экстраэмбриональной эн-
тодермы — стволовые клетки, получаемые
из гипобласта (примитивной энтодермы) бла-
стоцисты.
Строма — основа (или остов) органа животного
организма, состоящая из неоформленной со-
единительной ткани (интерстиция), в которой
расположены специфические элементы орга-
на, имеются способные к размножению клет-
ки, а также волокнистые структуры, обуслов-
ливающие ее опорное значение.
Тандемные повторы — множественные копии
одной исходной последовательности ДНК,
расположенные подряд.
Теломера — концевой участок эукариотической
хромосомы, необходимый для стабильности
хромосомы в митотическом цикле.
Теломераза — фермент, достраивающий ДНК
на концах хромосом (теломеры), которая уко-
рачивается в процессе репликации. Активна в
клетках зародышевого пути, стволовых клет-
ках и клетках опухолей.
Тератокарцинома — злокачественная опухоль,
получаемая на основе тератомы.
Тератома — дезорганизованная масса клеток,
содержащая дифференцированные ткани
(производные одного, двух или трех зароды-
шевых листков) вперемешку с недифферен-
цированными стволовыми клетками, кото-
рые продолжают делиться и дифференциро-
ваться.
Тетраплоидная комплементация — метод, ос-
нованный на получении тетраплоидных бла-
стоцист и внесении в них диплоидных клеток
других генетических линий животных. При
этом ткани зародыша развиваются целиком из
диплоидных клеток, а внезародышевые тка-
ни — из тетраплоидных клеток.
Топоизомеразы — ферменты, способные ме-
нять топологическое состояние кольцевых
ДНК и уровень их спирализации путем соз-
дания временного однонитевого или двуните-
вого разрыва в молекуле ДНК, проведения
сквозь разрыв другого, целого сегмента цепи
и воссоединения цепи в месте разрыва.
Тотипотентность — способность клетки путем
деления дать начало любому’ клеточному’ ти-
пуг организма. Оплодотворенные яйцеклетки
животных являются тотипотентными. У боль-
шинства животных бластомеры сохраняют
тотипотентность в течение определенного ко-
личества делений дробления.
Трансген — чужеродный фрагмент ДНК. который
вводится в геном определенного организма.
Трансдифференцировка — способность взрос-
лой региональной стволовой клетки диффе-
ренцироваться в клетки другого органа и/или
другого зародышевого листка.
Транскриптом — совокупность всех транскрип-
тов, синтезируемых одной клеткой или груп-
пой клеток.
Транскрипционный фактор — белок, контро-
лирующий процесс синтеза мРНК на матрице
ДНК (транскрипцию) путем связывания со
специфичными участками ДНК. Он обеспечи-
вает снижение (репрессор) или повышение
(активатор) константы связывания РНК-поли-
меразы с регуляторными последовательно-
стями гена.
Транслокация — хромосомная перестройка, при
которой происходит перенос участка одной
хромосомы на другую.
Трансплантология — раздел медицины, изу-
чающий проблемы трансплантации органов, а
также перспективы создания искусственных
органов.
Транспозоны — см. мобильные элементы.
Трансферазы — класс ферментов, катализи-
рующих реакции переноса групп атомов от
молекулы одного вещества (донора) на моле-
кулу’ другого вещества (акцептор).
Трипсин — фермент класса гидролаз, расщеп-
ляющий пептиды и белки; обладает также эс-
теразной (гидролиз сложных эфиров) актив-
ностью.
СЛОВАРЬ ТЕРМИНОВ 577
Трихостатин А — органическое соединение,
которое является противогрибковым анти-
биотиком и ингибирует гистондеацетилазы I
и II класса.
Трофобласт — см. трофоэктодерма.
Трофобластные стволовые клетки — ство-
ловые клетки, получаемые из трофобласта
бластоцисты.
Трофоциты — питающие клетки яичников на-
секомых с нутримснтарным типом оогенеза.
Выполняют функцию обеспечения необходи-
мыми веществами растущего ооцита.
Трофоэктодерма (трофобласт) — наружный
слой клеток бластоцисты. Участвует в им-
плантации эмбриона в стенку’ матки и образо-
вании плаценты. Обеспечивает контакт эм-
бриона с материнским организмом.
Унипотентность — способность дифференци-
роваться только в клетки одного типа. При-
мером таких клеток являются сперматогони-
альные стволовые клетки, дающие начало
сперматозоидам.
Фактор транскрипции — см. транскрипцион-
ный фактор.
Факультативный гетерохроматин — гетеро-
хроматин, представленный транскрипционно
неактивными генами; его распределение мо-
жет быть неодинаковым в различных типах
клеток.
Фибробласты — клетки соединительной ткани
позвоночных животных, синтезируют внекле-
точный матрикс этой ткани: предшественни-
ки белков коллагена и эластина, а также му -
копо лисахариды.
Фосфатазы — ферменты класса гидролаз, от-
щепляющие фосфат (дефосфорилирование)
от многих типов молскул.
Фрагмент Кленова — большой белковый фраг-
мент, образующийся при ферментативном
расщеплении ДНК-полимеразы I Е. coli и об-
ладающий 5'—>3'-полимеразной активностью
в сочетании с 3'—>5'-экзонуклеазной (коррек-
торной) активностью.
Химера — организм, состоящий из клеток, про-
исходящих из двух и более зигот.
Хорда — длинный эластичный продольный тяж,
присущий представителям типа хордовые.
У большинства хордовых хорда присутствует
только в период эмбрионального развития,
в дальнейшем замещаясь позвоночником.
У низших хордовых сохраняется всю жизнь,
выполняя опорную функцию.
Хорион — наружная зародышевая оболочка,
полностью окружающая эмбрион. Образуется
из трофобласта и плотно соединяется с ал-
лантоисом. Покрыт богатыми кровеносными
сосудами ворсинками, которые врастают в
слизистую оболочку’ матки, образуя плаценту’.
Хорионэпителиома (хорионкарцинома) — зло-
качественная опухоль, развивающаяся из эпи-
телиальных элементов хориона.
Хроматин — нуклеопротеид клеточного ядра,
составляющий основу’ хромосом. В состав
хроматина входят ДНК, гистоны, негистоно-
вые белки и РНК.
Хромодомен — белковый домен, который спе-
цифически взаимодействует с метилирован-
ными гистонами.
Хромосомная территория — область ядра, за-
нимаемая хромосомой и выявляемая с помо-
щью флуоресцентной гибридизации in situ и
трехмерной микроскопии.
Хромоцентр — структура, образованная гетеро-
хроматином различных хромосом.
Центр инактивации Х-хромосомы — район X-
хромосомы млекопитающих, содержащий ге-
ны и генетические элементы, контролирую-
щие процесс транскрипционного выключения
генов (инактивации) одной из Х-хромосом у
самок.
Центромера — участок хромосомы, обеспечи-
вающий правильное распределение сестрин-
ских хроматид между’ дочерними клетками во
время митоза и мейоза.
Цирроз печени — тяжелое заболевание печени,
сопровождающееся необратимым замещени-
ем паренхиматозной ткани печени фиброзной
соединительной тканью или стромой.
Цитокинез — разделение цитоплазмы между’
дочерними клетками после завершения деле-
ния ядра.
Цитокинины — класс фитогормонов 6-амино-
пуринового ряда, стимулирующих деле-
ние, рост и дифференцировку растительных
клеток.
Цитокины — небольшие пептидные информа-
ционные молекулы, которые регулируют
межклеточные и межсистемные взаимодейст-
вия. Определяют выживаемость клеток, сти-
муляцию или ингибирование их роста, диф-
ференцировку’, функциональную активацию и
апоптоз.
Цитоскелет — клеточный каркас, находящийся
в цитоплазме клетки. Динамичная, изменяю-
щаяся структура, в функции которой входит
поддержание и адаптация формы клетки ко
внешним воздействиям, экзо- и эндоцитоз,
обеспечение движения клетки как целого, ак-
578 ЭПИГЕНЕТИКА
тивный внутриклеточный транспорт и кле-
точное деление.
Цитотрофобласт — внутренний слой трофобла-
ста, образованный базальным слоем клеток и
клеточными колонками — зачатками новых
ворсинок; играет роль камбия трофобласта, а
во второй половине беременности вырабаты-
вает хориальный гонадотропин.
Шапероны — класс белков, функция которых
заключается в формировании правильной тре-
тичной структуры белков, а также образова-
нии и диссоциации белковых комплексов.
Щелочная фосфатаза — фосфатаза, проявляю-
щая наибольшую активность в щелочной
среде.
Эволюционные страты — группы генов на X-
хромосоме, выделенные по степени дивер-
генции нуклеотидных последовательностей
X- и Y-гомо логов.
Экзон — участок гена эукариот, сохраняющийся
в молскуле РНК после сплайсинга. Может со-
держать как кодирующие белок, так и не-
транслируемые последовательности.
Экзонуклеаза — фермент, последовательно от-
щепляющий нуклеотиды от конца полинук-
леотидной цепи путем гидролиза фосфоди-
эфирных связей между’ нуклеотидами.
Экстраэмбриональная энтодерма — см. гипо-
бласт.
Экстраэмбриональные (провизорные, внеза-
родышевые) ткани — ткани (органы), раз-
вивающиеся и функционирующие в ходе эм-
бриогенеза и обеспечивающие рост и разви-
тие эмбриона. У позвоночных представлены
амнионом, хорионом, желточным мешком и
аллантоисом.
Эксцизионная репарация оснований ДНК —
тип репарации ДНК, при котором повреж-
денное основание удаляется в виде свободно-
го основания после гидролиза TV-гликозидной
связи ДНК-гликозилазой.
Эктодерма — наружный зародышевый листок у
многоклеточных животных, из которого раз-
виваются покровы животных и их производ-
ные, кожные железы, органы чувств, нервная
система, эпителий передней и задней кишки.
Эктоплацентарный конус — диплоидная про-
изводная раннего постимплантационного тро-
фобласта, которая, по-видимому, дает начало
спонгиотрофобласту.
Эмбриоидные тельца — конгломераты клеток,
находящихся на различных стадиях диффе-
ренцировки. Формируются при спонтанной
или направленной дифференцировке эмбрио-
нальных стволовых клеток в случае культи-
вирования на малоадгезивных поверхностях
или в суспензии.
Эмбриональные стволовые клетки — стволо-
вые клетки, получаемые из внутренней кле-
точной массы бластоцисты и обладающие
свойством дифференцироваться в производ-
ные всех трех зародышевых листков (плюри-
потентность).
Эндонуклеаза — фермент, гидролизующий фос-
фодиэфирные связи внутри полинуклсотид-
ной цепи.
Эндорепликация (эндоредупликация) — репли-
кация ДНК в S-фазе клеточного цикла без по-
следующего вступления в клеточное деление.
Энтодерма — внутренний зародышевый листок
у многоклеточных животных, из которого об-
разуются эпителий средней части кишечника
и связанные с ним железы: поджелудочная,
печень и др.
Энхансер — участок ДНК, который за счет взаи-
модействия с белками (например, факторами
транскрипции) многократно увеличивает уро-
вень транскрипции гена или группы генов.
Эпибласт — часть внутренней клеточной массы
бластоцисты, прилежащая к трофобласту’. Да-
ет начало всем трем зародышевым листкам
эмбриона.
Эпигенетика — наследуемые изменения генной
активности в ходе развития и клеточной про-
лиферации. не затрагивающие первичную
структуру ДНК.
Эпигенетическая память — способность кле-
ток сохранять свойства своего эпигенома, на-
пример, после клеточного деления или в ре-
зультате репрограммирования.
Эпигеном — совокупность эпигенетических ха-
рактеристик клетки или группы клеток.
Эпимутация — наследуемое изменение в экс-
прессии гена, не связанное с изменением пер-
вичной последовательности ДНК.
Эухроматин — участки хроматина, находящие-
ся в деконденсированном состоянии в интер-
фазе. Характеризуется высокими плотностью
генов и транскрипционной активностью, а
также ранней репликацией в S-фазе клеточ-
ного цикла.
Ядерная ламина — фибриллярная сеть, под-
держивающая ядерную мембрану-, ядерные
поровые комплексы и участвующая в органи-
зации хроматина, репликации и клеточных
делениях.
Ядерный матрикс — внутриядерная фибрил-
лярная сеть, необходимая для организации
СЛОВАРЬ ТЕРМИНОВ 579
хроматина, а также процессов транскрипции
и репликации.
Alu-повтор — мобильный элемент типа SINE,
содержит сайт эндонуклеазы рестрикции AluL
АР-сайт — дсзоксирибонуклсозид в составе
ДНК, потерявший свое азотистое основание.
АР-эндонуклеаза — фермент, катализирующий
гидролиз фосфодиэфирной связи с 5'-стороны
от АР-сайта.
CpG-островок — последовательность ДНК,
имеющая длину не менее 200 п.н. с содержа-
нием оснований G и С более 50 % и CpG ди-
нуклеотидов более 60 %. Наиболее часто
CpG-островки обнаруживаются в 5'-регуля-
торных участках генов.
CTCF-фактор — белок, содержащий 11 доме-
нов «цинковые пальцы» и выполняющий ин-
суляторную функцию, препятствуя распро-
странению неактивного состояния в транс-
крипционно активные районы.
FISH (флуоресцентная гибридизация in
situ) — метод физического картирования, ко-
торый использует флуоресцентные метки для
выявления гибридизации зонда с хромосомой
или интерфазным хроматином.
LINE элементы (long interspersed nuclear ele-
ments) — мобильные элементы класса рет-
ротранспозонов, не имеющие длинных кон-
цевых повторов (LTR). Кодируют обратную
транскриптазу, т. е. являются автономными
ретротранспозонами.
LTR (long terminal repeats) — последователь-
ности на концах ретровирусов и ретротранс-
позонов. Необходимы для встраивания в ге-
ном хозяина, инициации транскрипции и по-
лиаденилирования РНК.
Polycomb белки — семейство белков, регули-
рующих структуру хроматина, и участвую-
щих в подавлении транскрипции генов.
Р-тельца — структуры в цитоплазме эукариоти-
ческой клетки. Участвуют в таких процессах,
как деградация мРНК, трансляционная ре-
прессия мРНК посредством микроРНК и со-
хранение мРНК до возобновления ее транс-
ляции.
8ШЕэлементы (short interspersed nuclear ele-
ments) — мобильные элементы класса рет-
ротранспозонов, не имеющие длинных кон-
цевых повторов и не кодирующие обратную
транскриптазу.
S-фаза — период интерфазы клеточного цикла,
во время которого происходит репликация
ДНК клеточного ядра.
Tritorax белки — семейство белков, регули-
рующих структуру хроматина и участвующих
в поддержании экспрессии генов.
Авторы выражают благодарность члену-корреспонденту РАН
О. И. Лаврик, профессору К. В. Северинову, доктору биол. наук
А. В. Вершинину, академику РАН И. Ф. Жимулёву, профессору
Л. А. Васильевой, академику РАН Л. Н. Ивановой, а также акаде-
микам РАМН А. М. Караськову и Г. Т. Сухих за критические заме-
чания и предложения, высказанные в процессе работы над кни-
гой. Особую признательность авторы выражают О. А. Черепано-
вой и А. Е. Стекленевой за помощь в оформлении рисунков. Ав-
торский коллектив признателен ООО «БиоВитрум-Сибирь» в ли-
це генерального директора А. А. Кувяткина, ЗАО «Научное обо-
рудование» в лице директора В. И. Казарезова, ООО «Компания
Хеликон» в лице генерального директора А. С. Смирнова, ООО
«Восточно-Европейская Управляющая Компания», ООО «Диаэм»
в лице генерального директора Т. Д. Халматовой за финансовую
поддержку издания книги, работникам Издательства СО РАН за
их квалифицированную помощь, а также ООО «Рош Диагностика
РУС» в лице О. П. Яценко. Кроме того, авторы благодарны про-
грамме Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология»
(координатор — академик РАН Г. П. Георгиев) и Министерству
образования и науки Российской Федерации (соглашение 8264),
без поддержки которых не были бы получены некоторые автор-
ские данные, представленные в монографии.
КОНТАКТНЫЕ ДАННЫЕ АВТОРОВ
Артемов Глеб Николаевич
лаборатория эволюционной цитогенетики
Научно-исследовательский институт био-
логии и биофизики Томского государст-
венного университета
g-artemov@mail. ш
Баранов Владислав Сергеевич
лаборатория пренатальной диагностики
наследственных и врожденных заболева-
ний
Федеральное государственное бюджетное
учреждение Научно-исследовательский
институт акушерства и гинекологии им.
Д. О. Отта Северо-Западного отделения
Российской академии медицинских наук
baranov@ VB2475. spb. ed
Белякин Степан Николаевич
лаборатория геномики
Федеральное государственное бюджетное
учреждение науки Институт молекуляр-
ной и клеточной биологии СО РАН
belyakin@mcb.nsc.ru
Брусенцова Ирина Витальевна
Федеральное государственное бюджетное
учреждение науки Институт цитологии и
генетики СО РАН
Ванюшин Борис Федорович
отдел молекулярных основ онтогенеза
Научно-исследовательский институт фи-
зико-химической биологии им. А. Н. Бе-
лозерского Московского государственно-
го университета им. М. В. Ломоносова
vanyush@belozersky.msu.ru
Васькова Евгения Андреевна
лаборатория эпигенетики развития
Федеральное государственное бюджетное
учреждение науки Институт цитологии и
генетики СО РАН
vaskova@bionet.nsc.ru
Галкин Алексей Петрович
Санкт-Петербургский государственный
университет,
Санкт-Петербургский филиал Института
общей генетики им. Н. И. Вавилова РАН
apgalkin@mail.ru
Горчаков Андрей Александрович
лаборатория хромосомной инженерии
Федеральное государственное бюджетное
учреждение науки Институт молекуляр-
ной и клеточной биологии СО РАН
andrey ,gorchakov@gmail. com
Григорьева Елена Викторовна
лаборатория эпигенетики развития
Федеральное государственное бюджетное
учреждение науки Институт цитологии и
генетики СО РАН
evlena@bionet.nsc.ru
Грин Инга Ростиславовна
группа взаимодействий биополимеров
Федеральное государственное бюджетное
учреждение науки Институт химической
биологии и фундаментальной медицины
СО РАН
grin@niboch.nsc.ru
Демакова Ольга Викторовна
лаборатория молекулярной цитогенетики
Федеральное государственное бюджетное
учреждение науки Институт молекуляр-
ной и клеточной биологии СО РАН
demakova@mcb.nsc.ru
Дементьева Елена Вячеславовна
лаборатория эпигенетики развития
Федеральное государственное бюджетное
учреждение науки Институт цитологии и
генетики СО РАН
dementyeva@bionet.nsc.ru
584 ЭПИГЕНЕТИКА
Елисафенко Евгений Анатольевич
лаборатория эпигенетики развития
Федеральное государственное бюджетное
учреждение науки Институт цитологии и
генетики СО РАН
antares@bionet.nsc.ru
Ефимова Ольга Алексеевна
лаборатория пренатальной диагностики
наследственных и врожденных заболева-
ний
Федеральное государственное бюджетное
учреждение Научно-исследовательский
институт акушерства и гинекологии им.
Д. О. Отта Северо-Западного отделения
Российской академии медицинских наук
efimova_o82@mail.ru
Жарков Дмитрий Олегович
группа взаимодействий биополимеров
Федеральное государственное бюджетное
учреждение науки Институт химической
биологии и фундаментальной медицины
СО РАН
dzharkov@niboch.nsc.ru
Закиян Сурен Минасович
лаборатория эпигенетики развития
Федеральное государственное бюджетное
учреждение науки Институт цитологии и
генетики СО РАН
zakian@bionet.nsc.ru
Захарова Ирина Сергеевна
лаборатория эпигенетики развития
Федеральное государственное бюджетное
учреждение науки Институт цитологии и
генетики СО РАН
zakharova@bionet.nsc.ru
Зенкова Марина Аркадьевна
лаборатория биохимии нуклеиновых ки-
слот
Федеральное государственное бюджетное
учреждение науки Институт химической
биологии и фундаментальной медицины
СО РАН
marzen@niboch.nsc.ru
Иванкина Елена Андреевна
лаборатория молекулярной цитогенетики
Федеральное государственное бюджетное
учреждение науки Институт молекуляр-
ной и клеточной биологии СО РАН
zotkevich@mcb.nsc.ru
Инге-Вечтомов Сергей Георгиевич
С анкт-Петербургский государственный
университет,
Санкт-Петербургский филиал Института
общей генетики им. Н. И. Вавилова РАН
inge-vechtomov@bio.pu.ru
Кизилова Елена Александровна
лаборатория генетики развития
Федеральное государственное бюджетное
учреждение науки Институт цитологии и
генетики СО РАН
pinus@bionet.nsc.ru
Колесников Николай Николаевич
лаборатория молекулярной генетики
Федеральное государственное бюджетное
учреждение науки Институт молекуляр-
ной и клеточной биологии СО РАН
kolesnikovnn@mcb.nsc.ru
Колесникова Татьяна Дмитриевна
лаборатория молекулярной цитогенетики
Федеральное государственное бюджетное
учреждение науки Институт молекуляр-
ной и клеточной биологии СО РАН
trotsenko@mcb .nsc.ru
Короткова Анна Михайловна
лаборатория эпигенетики развития
Федеральное государственное бюджетное
учреждение науки Институт цитологии и
генетики СО РАН
korotkova@bionet.nsc.ru
Коряков Дмитрий Евгеньевич
лаборатория молекулярной цитогенетики
Федеральное государственное бюджетное
учреждение науки Институт молекуляр-
ной и клеточной биологии СО РАН
koryakov@mcb .nsc.ru
КОНТАКТНЫЕ ДАННЫЕ АВТОРОВ 585
Кузнецова Татьяна Владимировна
лаборатория пренатальной диагностики
наследственных и врожденных заболева-
ний
Федеральное государственное бюджетное
учреждение Научно-исследовательский
институт акушерства и гинекологии им.
Д. О. Отта Северо-Западного отделения
Российской академии медицинских наук
tkuznetzova@mail. ru
Мазурок Нина Алексеевна
лаборатория эпигенетики развития
Федеральное государственное бюджетное
учреждение науки Институт цитологии и
генетики СО РАН
mazurok@bionet.nsc.ru
Малахова Анастасия Александровна
лаборатория эпигенетики развития
Федеральное государственное бюджетное
учреждение науки Институт цитологии и
генетики СО РАН
amal@bionet.nsc.ru
Медведев Сергей Петрович
лаборатория эпигенетики развития
Федеральное государственное бюджетное
учреждение науки Институт цитологии и
генетики СО РАН
medvedev@bionet.nsc.ru
Натальин Павел Борисович
Компания Life Technologies
Pavel Natalin@lifetech. com
Павлова Софья Викторовна
лаборатория эпигенетики развития
Федеральное государственное бюджетное
учреждение науки Институт цитологии и ге-
нетики СО РАН
spav@bionet.nsc.ru
Пендина Анна Андреевна
лаборатория пренатальной диагностики
наследственных и врожденных заболева-
ний
Федеральное государственное бюджетное
учреждение Научно-исследовательский
институт акушерства и гинекологии им.
Д. О. Отта Северо-Западного отделения
Российской академии медицинских наук
pendina@mail.ru
Покушалов Евгений Анатольевич
Федеральное государственное бюджетное
учреждение Новосибирский научно-ис-
следовательский институт патологии кро-
вообращения им. академика Е. Н. Мешал-
кина Министерства здравоохранения РФ
e.pokushalov@gmail.com
Рубель Александр Анатольевич
Санкт-Петербургский государственный
университет,
Санкт-Петербургский филиал Института
общей генетики им. Н. И. Вавилова РАН
Сопова Юлия Викторовна
Санкт-Петербургский государственный
университет,
Санкт-Петербургский филиал Института
общей генетики им. Н. И. Вавилова РАН
sopova@hotmail. com
Сорокин Михаил Алексеевич
лаборатория эпигенетики развития
Федеральное государственное бюджетное
учреждение науки Институт цитологии и
генетики СО РАН
sorokin@bionet.nsc.ru
Стегний Владимир Николаевич
Томский государственный университет,
лаборатория эволюционной цитогенетики
Научно-исследовательский институт био-
логии и биофизики Томского государст-
венного университета
stegniy@res.tsu.ru
Трофимова Прина Леонидовна
лаборатория пренатальной диагностики
наследственных и врожденных заболева-
ний
586 ЭПИГЕНЕТИКА
Федеральное государственное бюджетное
учреждение Научно-исследовательский
институт акушерства и гинекологии им.
Д. О. Отта Северо-Западного отделения
Российской академии медицинских наук
irina31 l@inbox.ru
Усов Константин Евгеньевич
лаборатория эволюционной цитогенетики
Научно-исследовательский институт био-
логии и биофизики Томского государст-
венного университета
usovke@rambler. ru
Федорова Ирина Дмитриевна
Отделение вспомогательных репродук-
тивных технологий
Федеральное государственное бюджетное
учреждение Научно-исследовательский
институт акушерства и гинекологии им.
Д. О. Отта Северо-Западного отделения
Российской академии медицинских наук
irendf@mail.ru
Федорова Нина Борисовна
лаборатория механизмов клеточной диф-
ференцировки
Федеральное государственное бюджетное
учреждение науки Институт цитологии и
генетики СО РАН
bonife@bionet.nsc.ru
Чадов Борис Федорович
лаборатория механизмов клеточной диф-
ференцировки
Федеральное государственное бюджетное
учреждение науки Институт цитологии и
генетики СО РАН
chadov@bionet.nsc.ru
Чадова Евгения Васильевна
лаборатория механизмов клеточной диф-
ференцировки
Федеральное государственное бюджетное
учреждение науки Институт цитологии и
генетики СО РАН
euchad@bionet.nsc.ru
Черноловская Елена Леонидовна
лаборатория биохимии нуклеиновых ки-
слот
Федеральное государственное бюджетное
учреждение науки Институт химической
биологии и фундаментальной медицины
СО РАН
elena_ch@niboch.nsc.ru
Шевченко Александр Игоревич
лаборатория эпигенетики развития
Федеральное государственное бюджетное
учреждение науки Институт цитологии и
генетики СО РАН
epigene@bionet.nsc.ru