/
Автор: Кейтс М.
Теги: переводная литература издательство мир липидология химия липидов природные липиды
Год: 1975
Текст
TECHNIQUES OF LIP1DOLOGY
Isolation, analysis and identification of lipids
MORRIS KATES
Department of Biochemistry,
University of Ottawa, Ottawa, Canada
4
North-Holland Publishing Company — Amsterdam • London
American Elsevier Publishing Co., Inc. — New York 1972
М. КЕЙТС
ТЕХНИКА ЛИПИДОЛОГИИ
ВЫДЕЛЕНИЕ, АНАЛИЗ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ ЛИПИДОВ
Перевод с английского
доктора хим. наук В.А. Вавера
ИЗДАТЕЛЬСТВО "МИР"
Москва 1975
ПРЕДИСЛОВИЕ
Книга известного канадского спе-
циалиста по химии липидов Мориса
Кейтса - уникальное пособие по мето-
дам выделения, анализа и идентифика-
ции природных липидов. Автор в крат-
кой форме дает представление об ос-
новных типах природных липидов, об
оборудовании современной -липидной ла-
боратории, и главное внимание уделя-
ется методикам анализа основных ти-
пов липидных вешеств.
Книга предназначена для химиков,
работающих в области природных сое-
динений, биохимиков, медиков, работ-
ников научно-исследовательских инсти-
тутов пищевой промышленности.
Редакция лимераяуры по химии
72 — 75 (с) Перевод на русский язык, 'Мир'. 1875
В начале 60-х годов в области химии природных соединений
окончательно сформировалось новое бурно развивающееся направле-
ние - химия липидов. Основная задача этого направления заключа-
ется в изучении структуры, биосинтеза и метаболизма фосфолипидов,
гликолипидов и других полярных липидов, входящих в состав биоло-
гических мембран живых клеток. На основе новых физико-химичес-
ких методов разделения и идентификации природных соединений (тон-
кослойной хроматографии, газожидкостной хроматографии и масс-
спектрометрии) было разработано множество специальных методик
разделения, выделения, гидролитического расщепления и идентифика-
ции .природных липидов. Огромное число таких методик было опубли-
ковано за последние 10 лет в специальной липидологической и био-
химической литературе.
Хотя совершенствование методов химии и биохимии липидов все
еще продолжается, назрела необходимость в критическом обзоре ме-
тодов липидологии, который, с одной стороны, выделил бы основные
сложившиеся методические приемы, а с другой - показал бы, какие
методики исследования природных липидов еше нуждаются в усовер-
шенствовании. Таким критическим обзором (пожалуй, первым в ми-
ровой литературе) и явилась книга Мориса Кейтса 'Техника липидо-
логии'. Автору удалось собрать, причем в сравнительно скромном
объеме, подавляющее большинство-методик, применяемых в настоя-
щее время для выделения и установления строения природных липи-
дов. Отбор материала в большинстве случаев удачен, рекомендуемые
методики дают хорошо воспроизводимые результаты, не требуют
дорогостоящих реактивов, а в ряде случаев и специального оборудо-
вания.
Изложение материала начинается с главы 'Определение и клас-
сификация липидов'. Хотя эта глава и не имеет методического ха-
рактера, присутствие ее в книге вполне оправданно, так как она по-
зволяет читателю быстро сориентироваться в огромном многообра-
зии липидов, встречающихся в различных природных объектах. Ос-
новные главы, посвященные собственно липидологическим методам.
Предисловие
эВЬ1Чайно насышены фактическим материалом, богато иллюстри-
«цы хроматограммами и масс-спектрами. Менее содержательной
вставляется глава 'Материалы и оборудование', поскольку часть
даеденных в вей сведений общеизвестна (растворители, посуда),
[есть (перечень аналитических приборов) требует существенного
холиения.
К недостаткам книги следует отнести почти полное игнорирова-
е автором работ советских ученых, а также неполный или, пра-
вее сказать, случайный перечень оборудования, применяемого
в исследовании липидов. Мы постарались по мере возможности
есть вти недостатки при подготовке русского издания, снабдив от-
льные разделы книги примечаниями я дополнениями.
В целом книга М. Кейтса, по нашему мнению, будет очень пен-
ил пособием для широкого круга химиков, биохимиков, медиков
биологов, которым в той или иной степени приходится выделят»
исследовать природные липиды или изучать пути их биосинтеза и
етаболизма, поскольку в ней содержится все необходимое для та-
>й работы. Однако компактный и насыщенный сборник липидологи-
>ских методик, несомненно, явится ценнейшим подспорьем и для
хевиалистов по химии липидов.
В работе над переводом книги принимала участие Н.В. Прока-
эва. •
В. Вавер
ПРЕДИСЛОВИЕ АВТОРА
Липидология, т.е. изучение хнма в функций липидов или жиро-
подобных вешеств, была по настоящего времени областью, где ра-
ботало сравнительно мало химиков и биохимиков. Отчасти это было
связано с неопределенной природой 'смазок' и 'масел', которые
всегда относили к липидам, а отчасти с тем, что вопрос о роли
этих гетерогенных веществ в живых системах казался дискуссионным.
В последние годы отношение к липидологкж в корне изменилось
в результате ряда открытий. Особенно большое значение вмели раз-
витие хроматографической техники - бумажной, газожидкостной в
тонкослойной хроматографии - в применение эпос методов для ана-
лиза, разделения и выделения липидов из природных смесей. Столь
же важное влияние оказало совершенствование синтетических ме-
тодов, благодаря чему стали доступны чистые липиды определенно-
го строения*/24/. Применение электронной микроскопии в литологии
показало, что большинство биосинтетических и метаболитвческих
функций клетки связано с мембранами. Кроме того, было установле-
но, что клеточные липиды в значительной степени являются компо-
нентами биологических мембран и что функции и свойства мембран
во* многом -определяются химической структурой липидных компонен-
тов в их ориентацией в мембране.
В середине 50-х годов средн биохимиков, биологов, физиологов
растений, микробиологов и биофизиков интерес к липидам заметно
повысился. Как следствие в дополнение к двум издававшимся ранее
журналам, посвященным химии жиров (Jonraal of the American Oil
Chemist’s Society; Fette, Seifen, Anachrtchsmittel), появились новые жур-
налы, посвяшенные исключительно липидам. В настоящее время име-
В СССР исследования по синтезу липидов проводятся на кафедре тонко-
го органического синтеза МИТХТ им. М.В. Ломоносова. Эти работы были нача-
ты в 60-х годах по инициативе профессора Н.А. Преображенского и в настоящее
время успешно продолжаются под руководством профессора Р.П. Евстигнеевой.
См., например, наем В.И., Успехи химии, 40,625 (1971); Shvets V.I.. Bashkatova
A.I., Evstigneeva R.P., Chon. Phys. Lipids, Ю, 267(1973). ЗвошюваЕЛ., khaptep БЛ.
Bytajee A.C., Евстигнеева Р.П., ЖОрХ, W. 32, (1974); Тшюв В.И., Серебремкн-
коаа Г.А., Евсшнеева Р.П., ЖОрХ, 8, 1166, 2516 (1972). - При», перев.
Глава 1
1.1. Углеводороды.
класс соединений включает липиды простейшего типа.
поде встречаются нормальные, разветвленные и ненасыщенные
Лево породы с углеродными цепями различной длины.
1.1.1. Нормальные парафины
nft,„ая формула этих соединений СН3(СН2)ПСН3 (п=6 —36 и более),
екоторые представители углеводородов данного класса приведены
табл.
Таблица 1.1
Некоторые нормальные и разветвленные углеводороды
рормула Нормальные парафины Изопарафины Антеиэопарафииы
-10^22 Декан Додекан 2-Метилнонан 2-Метилунпекан З-Метнлнонан З-Метилундекаи
Тетрадекан 2-М етилтри декан.. 3-Метилтридекан
с,€н34 Гексадекан 2-Метилпента декан З-Метшхпента декан
Гептадекан 2-Метилгекса декан 3-Метилгексадекан
С,8^38 Октадекан 2-Метилгептадекай 3 -Метилгептадекан
^*20^42 Эйкозан 2-Метилнона пекан 3—Метилнонапекан
C2lH44 Генэйкозан 2-МетилэЙкоэан 3-Метил эйкозан
С22Н4В Докозан 2 -Метилген эйкозан 3-Метилген эйкозан
С24^Б0 Тетракозан 2-Метилтрикозан З-Метялтрикоэаи
С26НВ2 Пентакозан 2-Метилтетракозан З-Метилтетракозаъ
^2в»В4 Гексакозан 2-Метилпентакозан З-Метилпентакозан
^2в^6« Октакоэан 2-Метилгептакозан З-Метнлгептакозан
^30^62 Триаконтан 2-Метилнона контан З-Метилнонаконтаи
^32^ев Дотриаконтан 2-Метилгентриакон- тан 3 -Метнлгентриаков- тан
Сз«Н7о Тетратриакон— 2-Метилтритриакон- тан тан З-Метнлтритриакон- тан
С2«Н14 Гексатрнакон— 2-Метклпевтатриа- тан контан 3-Метилпента триа- контан
1.1.2. Моноразвемвмкные парафины
Такие углеводороды встречаются в природе в виде двух основ-
Типов: соединения ряда изопарафинов обшей формулы
СН,
CHjCHtCHJbCH, (и-4-32 гЛмш );
Определение я кисея^яяяцял липидов
11
в ряде антеизопарафкнов обшей формулы
СН3
СНаСН,СН(СН,КСН3 (Л.З-Э1Г4ММ )
В табл. 1.1 приведены некоторые изо- и аптеизоуглевопоршк.
1.1.3. Полиралеенилепиые парафины: насыщенные иеопреноиды
Наиболее известными представителями это* группы углмюиоро
дев являются
СНЭ
фарнезан H-fCHjCHCHaCH^-H
(С«Н»а) 2A№-mrmbuMmui
СН3
прислан H-fCHjCHCHjCHJj-CHjCB^Jh
(CjeH40) 2,д,т,Ц-шяралеаниптиаЛшшн
‘ СН3
фиыая H-fCHjCHCHjCH^-H
(СаоН42) Д«;ЖМ-ямл9штв<лмясв*тя>
сиволап, ядя мяяеяая (С30Н,2)
сн3 сн,
H-fCHjCHCHjCHJj-fCHjCHjCHCHJj-H
ZJS. - еекеагтижтетралазля
1.1.4. Нор молимые олефины
Эти углеводороды имеют общую формулу СН3(СНг)хСН - СН(СН2)уСИ3
Нечетные члены ряда можно получить пекарбоксжлировавием прироп»
ных моноеновых кислот с четным числом атомов углероде /249/.
Так, например, гептадецен-1О или гептацепеи-в могут быть полу-
чены из вакленово* или олеиновой кислоты соответственно, а пента-
пепен-8 - вэ пальмитолеиновой кислоты.
Глава 1
1.1.5. Разветвленные олефины
Известны представители моноразветвленных углеводородов, от-
-дшиеся к изо- и антеизоолефинам /324/, соответственно обшей
змулы
СН3
I
СН3СН (СН2)ХСН=СН(СН2),СН3 u+y= 16-23)
о СН3
СН3СН2СН(СН2)ХСН=СН(СН2),СН3 (х+у= 15-22),
1.1.6. Изопреноидные полиены
Представителями этой группы углеводородов являются: 0«жа<)и-
(2,6,10,14-тетраметилгексадекадиен, С2ОН38 ), для которого
зестны три позиционных изомера /39/:
сн„ сн3
i г
Н-[СН2СНСН2СН2]3-СН=ССН=СН2
(ритадиеи-1,3 (два. геометрических изомера,) —
СН3 СН3 СН3
I I I
Н-[СН2СНСН2СН2]2-СН2СНСН2СН=СНС=СНСН3
<рата.г)иен 2,4 /четыре геометрических изомера.)
СН, СН2
I ‘ и
Н-[СН2СНСН2СН2]3-СН2ССН=СН2
иеодтвадсеи
“леи, км спина*ен (С30Ц60)
СН3 СН3
I I
Н-[СН2С=СНСН2]3-[СН2СН=ССН2]3-Н
1*дроснвалеи (бактериальный "фитоин", С30Нв) [312]
СН3 СН3 СН3 СН3
। 1 । ।
Н[СН2С=СНСН2]2СН2С=СНСН=СНСН=ССН2[СН2СН=ССН2]2Н
Определение и классификация липидов
13
1.1.7. Ларотиноиды
Каротиноиды - это изопреноидные С4СГполиены с сопряженными
двойными связями. Они имеют характерные спектры поглощения
в ультрафиолетовой области: многие из каротиноидов ярко окраше-
ны. Ниже приведены формулы только некоторых наиболее часто
встречающихся представителей данной группы углеводородов:
фияоин (С40Нв4; бесцветный)
ликопин (С40Н6в; красный)
/3-каротин (С40НБе; оранжевый)
1.2. Спирты
Алифатические спирты встречаются в природе в свободном виде,
но значительно чаше они образуют сложные или простые эфиры. При
родные свободные алифатические спирты и их эфиры могут иметь
14
/ лава 1
вОрмальные, разветвленные или ненасыщенные рапикапы различной
длины и первичные, втор гчные или (реже) третичные гидроксильные
группы.
1.2.1. Нормальные насыщенные спирты
Первичные спирты общей формулы СН3(СН2)„СН2ОН (п = 6—30 и бо-
лее) широко распространены в природе (см. табл. 1.2). Примером
вторичных насыщенных спиртов, выделенных из бактерий, могут слу-
жить D-окта деканол-2 и Й-эйкозанол-2.
1.2.2. Моноразветвлениые спирты
Моноразветвленные спирты целятся на два основных типа: изо-
спирты общей формулы
СН,
I
СН3СН(СН2).СН2ОН (и«=4-24)
и антеизоспирты обшей формулы __
СН3
I
СН3СН2СН(СН2).СН2ОН (и=3-21)
Некоторые характерные представители разветвленных спиртов
приведены в табл. 1.2.
1.2.3. Нолираз в стеленные. спирты: насыщенные изопреноиды
Представителями этой группы являются
СН3
I
ъетраьидроъераниол Н-(СН2СНСН2СН2]2-ОН
^юН220) Дй-ймпмиотпншяиг-/
СН,
Фариезанол Н-£СН2СНСН2СН2]2-ОН
{Cj6H32O) 3,7,П-ярттвлидеепалы-1
сн3 сн3
I I
яркендиол Н-[СМ2СНСНгСН2]3-СН2ССН2ОН
С1»Н4Р0) ЧЖИ—й— нм-/
Некоторые Нормальные и разветвленные первичные спирты
Глава 1
Ifi
фщванол
(C20H420)
CH3
H-fCHjCHCHjCHj^-OH
тетражаятлеексадеяани-!
1.2,4. Ненасыщенные спиряы
Природные моноеновые спирты обычно представляют собой ана-
логи природных моноеновых кислот (см. разд. 1.6.6). Их общая
формула СН3 (СН2) СН « СН( СН2) у СН2 ОН; некоторые представители
таких спиртов приведены в табл. 1.3;
Таблица 1.3
Некоторые нормальные моноеновые спирты и альдегиды
Число атомов углерода Спирт Альдегид
10 Цис- Деден-3-ол—1
11 У ндеден-10-ол-1 У ндеден-10-аль—1
12 иис- Доцеден-7-юл-1 -
14 цис- Тетра децен-9-ол-1 цис- Тетраденен-9-аль-1
„(миристолеиновый) (миристолеиновый )
16 цис- Гексацецен—9—ол—1 (пальмитолеиновый ) Kite- Гексадеден-9-аль-1 (пальмитолеиновый )
18 иис- Октадеден-б-ол-1 (петроселиловый) кис-Октадепен-б-аль-1 (петроселиловый)
18 ии с- Окта деден-9-юл-1 (олеиновый) к« с-Октаденен-9-аль-1 (олеиновый)
18 кн с-Окта депен-11 -ол-1 (кис- вакненовый) ци с-Окта депен-11 -аль-1 (иис- вакненовый)
20 кис-Эйкоэен—9—ол-1 (гадолеиновый ) К«оЭйкоэен-9-аль-1 ( гадолеиновый)
22 цис- Докозен-13-ол-1 (эруковый) кв с- Докозен-13-аль-1 (эруковый)
24 цис-Т етракозен-15-ол-1 (нервоновый) цис- Т етракозен-15-аль- (нервоновый)_
Некоторые индивидуальные члены па'
1.2.5. Изопреноидные спирпы (яерпеиолы, или полипрехолы) [ 131 ]
Это ряд спиртов обшей формулы
СН3
H-fCHjCCHCHj-OH (п-2-13 и Лесе ,
пятого ряда представлены в таби
ипреоелвнне и класси/рккацал лнпхбов
17
Известны также полииэопреноидные спирты с одной насыщенной
изопреноидной, единицей (нитипропрейолы), например багмопренол (С66)
и долигол (С86 - С,10).
Следует еше упомянуть частично гидрированный природный тер-
пенол фшлол (С2ОН40)
СН3 СН3
Н-[СН2СНСН2СН2],-СН2ОСНСН2ОН
3,7,П,К-тетрале»ыытаМцея-2-»1-1
Некоторые изопреноидные спирты
Таблии» 1.4
п Число атомов углерода , , . Название , ..I! .1, ' . — 1... —
2 10 Гераниол
3 к 15 Фарнезол
4 20 Геранилгераниол
9 45 Соланеэол ( кране)
10 50 Декаиэопренол
11 55 Ундекаиэопренол Кастапренолы. или
12 60 Додекаиэопренол $нкапренолы ( цне -
13 65 Трипеканэопренол яфме)
1.2.6. Смрнпы
Эти соединения широко распространены в животных (эоостери-
ны) и растительных (фитостерины) тканях. К числу наиболее из-
вестных представителей стеринов (см. также /306/) относятся
холесяврня (С27Н4в0)
1Я
Глава 1
стигмастери» (С29Н48О)
стиемасп)а.даеи-5,г2-ол-3р
^.ситостерин (С29Н60О)
стигмастен-З-оя- Зр
1.2.7. Спирты алициклических и ароматических витаминов
В эту группу входят следующие жирорастворимые витамины:
витамин А, (С2ОНЗОО)
ретивая
CHjOH
витамин А2 (С2ОН28О)
CHjOH
дегвдрареятя
витамин D2 (С28Н440)
но’
зртлпжи^арвл
Определение и классификация липидов
витамин Е (смесь токоферолов), Известны четыре изомера токоферола:
Ь^юиофероя
1.2.8. Высшие полиолы
Полимеры липинов, построенных на основе высших полиолов, срав-
нительно немногочисленны •; однако известно, что докозандиол-1,145
* О диольных липидах см. в дополнении 1 к гл. 1. — Прим, перев.
20 _______________________Глма 1____________________________
был обнаружен в виде дисульфата в микроорганизмах /219/, а ок-
та декан диол—1,18 — в растении Spartium junceum. Более сложные по—
диолы, такие, как 'фтиоперолы' СЭдН7о0э и СзеН740э,были выделены
и3 Mycobacterium tuberculosis. Фтиоцерол-Сэе имеет следующее строение:
ОН ОН ОСНз
I I I
СН3(СН2)22СНСН2СН(СН2)4СНСНСН2СН3
I
CHS
J- метокси-4- мет итпетратриа. пентп.ндтл-9,11
В работе /21/ приведены разветвленные полиолы, найденные » ми-
кобактериях (Mvcobacteriaceae).
1.3. Высшие аминоспирты
Этот класс вешеств представлен производными или гомологами
сфингозина, С т8-аминодиола. Такие высшие аминоспирты встречают-
ся обычно в вице сфинголипидов: керамидов, цереброзидов, сфинго-
зилфосфатидов и ганглиозидов (см. разд. 1.11 и 1.12). К числу
наиболее известных высших аминоспиртов Относится
сфингозин СНЭ(СН2)12СН=СНСНСНСН2ОН
I I
но nh2
мрвлс-г-в-лмтюалтаЛ«^и-4^тг-1,3-о
^хндросфингозин СН3(СН2)14СНСНСН2ОН
I I
но nh2
2.-1г-ажте1та4еяаиОиае- 1J-D
С^-Ьигидросфичгозих СНЭ(СН2)14СНСНСН7ОН
I I
НО ЫН2
2-в-еятзтмкЗчая- 1,3-d
Ф»еосфимгозим СН3(СН2)13СНСНСНСН3ОН
I I I
НО НО NH2
2-в-атчеаапЗемятртл-1^-о-4-9
СН3(СН2)1,СНСНСНСН1ОН
I I I
HOHONHj
2-л-емеяывяезлтроая-1^-», 4-о
Определение к классификаиы липидов
дегндрофиносфимозин
СН3(СН2)8СН=СН(СН2)3СНСНСНСН2ОН
I I I
НО НО NH,
лднис-гд-вмк/гоотжа^наи-в-ииемЛ!», 4-d
1.4. Альдегиды
Высшие алифатические альдегиды встречаются как в свободном
виде, например в природных маслах и феромонах насекомых, так и
в виде виниловых эфиров в алкен-1-иловых аналогах глиперидов и
глицерофосфатадов (плазмалогены) (разд. 1.10 и 1.11).
1.4.1. Нормальные насыщенные алъдвлиды
Это альдегиды обшей формулы СН3(СН2)ПСНО (л = 6-20 и более).
Некоторые индивидуальные насыщенные альдегиды, содержащиеся
в природных соединениях, приведены в табл. 1.5.
Таблица 1.5
Некоторые нормальные альдегиды и кетоны
Формула Альдегиды Мети лк стоны Симметричные кетоны
СеН1вО Октаналь Октанон-2 —
свн,ео Нонаналь Нонанон-2 Дибутилкетон
CfoHaoO Деканаль (кап- риловый) Деканон-2 —
с,,н„о Гендеканаль Геидеканон-2 Дипеитилкетон
€12Н;4О - Додеканаль (лауриновый) Додеканои-2 ем
С1ЭН„О Три дек. ишь Тридеканон-2 Днгексилкетон
СцН2в0 Тетрадеканаль ( миристиновый) Тетрадекаион-2 ем К
С1вНзоО Пентадеканаль П ентадеканов-2 Дигептилкетон (каприлов)
^1в«32® Гексадеканаль (пальмитиновый Гексадекаион-2 ) —
Ci?H34O Ci»H3eO Гептадеканаль Гептадеканои-2 Дмоктилкетон
Октадекаваль (стеариновый) Октадеканон-2
с,.нзво Нонадеканаль Нонадеканои-2 Диноиилкетон (капрон)
СадНдоО Эйкозаналь (арахиповый) Эйкозанон-2
с2,н„о Генэйкоааваль Геиэйкозанон-2 Дипепилкетон
С22Н44О Докозаналь (бегеновый) Докозанои-2 -•
Глава 1
22
Продолжение табл. 1.5
Формула Альдегиды Метнлкетоны Симметричные кетоны
ПО мм М 1 Ч (Л ы КД К1 О» V» * оо Ъ Трикозаналь Трикозанон—2 Диундецилкетон (лаурон) Дидодепилкетои Дитридепилкетон (миристон)
С29Н5в0 с31нв2о Дитетрадецилкетон Дипентадепилкетон (пальмитон)
С33НввО » Дигекса децилкетон
СзбНтоО Дигептацепилкетон (стеарон)
1.4.2. Ненасыщенные альдегиды [107]
Высшие нормальные моноеновые а льде гады,. встречающиеся в ври-
родных соединениях, обычно являются аналогами соответствующих
жирных кислот (разд. 1.6.6). Общая формула таких альдегидов
СН3(СН2)ЖСН = СН(СН2)уСНО. В табл. 1.3 приведены некоторые наиболее
распространенные представители соединений этого класса.
1.4.3. Ллифавинесые альдегиды с цкклопропаиовой группировкой е боковой цепи
Альдегиды, являющиеся аналогами жирных кислот с пиклопропа—
новой группировкой в боковой пепи (разд. 1.6.4), входят в состав
плазмалогенов некоторых бактерий (вепример, Clostridium butyricum).
К таким альдегидам относятся, в частности, циклопропан-9, 10-гекс/
деканаль-1 и пиклопропан-11, 12-октадеканаль-1.
1.4.4. .Изопреноидные альдегиды
К этой группе веществ относятся альдегиды, являющиеся летуч»
мн компонентами запахов растений и феромонов насекомых /25©/:
СН3 СН, СНО
I I /
гераниаль СН3С=СН(СН2),О=СН
(С1ОНзв0) две Д7-ЛяяяниннявЛгт»-2,<-<«-/
нераль
<С,оИ,.О)
СН3 СН,
f I
CH3C=CH(CHt)jC=CH
СНО
явраж-3.7'Лпвеяивпюдиея-£^-апь~1
ияреое.ление и классидплацнл липиоов
Z3
СН3 СН3
цняронелалъ
(С1ОН,.О)
СН,С=СЩСН2}2СНСН3СНО
3,?~Фптяывкшп-е-ап-1
СНЭ СН3
фарнезолу
(С1ВН240)
* ерачил i вранном
(CjgH^jO)
Н-[СН2С=СНСН2]2-СН2С=СНСНО
ЗМ1-тртпшлЮеисшрнев-2,6,№-сия • /
СНз СНз
H-fCHiC=CHCH2]5-CH2C=CHCHO
17,^,15-»епра.метвпеясадек<1те»р<ии-2А10,14-ам-1
L5. Кетоны и хиноны
Высшие кетоны широко распространены в природе; чаше всего
они встречаются в свободном состоянии.
1.5.1. Меыилиемоны'
Это соединения обшей формулы СН3(СН2)П—СО-»-СН3 (я- 5 — 20
более). Отдельные представители метилкеготов приведены в табл. 1.Е
1.5.2. Симметричные «евояы
Такие кетоны имеют общую формулу [СН3(СЯ2)п]2С - О (л-3— 21
и более) с нечетным числом атомов углерода в молекуле. Некоторые
индивидуальные симметричные кетоны представлены в табл. 1.5.
1.5.3. Ненасыщенные, разветвленные к циилические.кевюны
Ненасыщенные циклические кетоны, например Л?-пальмитенон
(гентриаконтен-7-он-16; С31НвоО),встречаются в бактериях.
Ряд разветвленных ненасыщенных кетонов известен как феро-
моны насекомых, вапрвмер:
СНз
СНзСНз-СО-СНССН^СНэ
4~тяявпепмикя~3
СН3
CH2CHCH2-CO-(CH2)jCH,
2-миаяиатшпг-^
Глава 1
24
СН3
I
СН,С=СН(СН2),СО-СН3
2лгетотоптви-е-ви-6
Представителями циклических кетонов, некоторые из которых
также обладают свойствами феромонов, являются циветон (никло-
геПтааенен-1-он-10) и мускон (1-мети лциклолеита де канон-3).
1.5.4. Хиноны с изопреноидной боковой цепью [3061
Хорошо известны следующие представители этой группы веществ:
вюкамин К„ ил* филлохинон (К)
о
г-метая-Учютил-^-на^таХТтн
випамин К2> или фарнохинон
о
(л =6-10)
2мв9юл-Зтппрв1П1я-1,4-ял^паах»иы
х°фврменп Qn, или убихинон-п
о
(п=6-10)
г,3-4теяюкси-5~тиюл~б-мт^етлЧ,4~4а»9тпм4
’ивс*и*кох-я
о
^фгЬЧ"
2^-Лптял~6-1япирпил-1,4'6ыпвтав
(и-6-9)
Определение и классификация липидов
25
1.6. Жирные кислоты
Высшие карбоновые кислоты, входящие в состав природных ли-
пидов, различаются по степени и виду разветвлений углеродной цепи,
по числу двойных связей, по виду и числу других функциональных
групп и, наконец, по длине углеродной пели. В основном природные
жирные кислоты встречаются в этерифицированной форме как состав-
ные части восков, в виде глицеридов, фосфатидов и т. д.
16.1. Нормальные насыщенные «шеломы
Такие кислоты имеют общую формулу СН3(СН2)пС00Н (п-4 - 30 и бо-
лее). Отдельные представители природных насыщенных кислот при-
менены в таблице 1.6.
Таблица 1£
Некоторые нормальные и разветвленные жирные кислоты
Формула Нормальные кислоты Изокислоты А нтеизокислоты
с6н10о2 Пентановая (валериановая) З-Метилбутановая (изовалериановая) 2-Метялбутановая
свн,2оа Гексановая (капроновая) 4-Метилпентановаи (иэокалроиовая) З-Метжлпентановая
С7Н,4О2 Гептановая (энантовая) 5-Метилгексановая 4-Метилгексановая
с8н1во2 Октановая (каприловая) 6-Метилгептановая (иэокаприловая) 5-Метилгептановая
С9Н1 воа Нонановая *( пеларгоновая) 7 -Метилоктановая 6-Метилоктановая
С10Н4оОг ' Декановая (каприновая) . 8-Метилнонановая (иэокаприновая) 7 -Метилнонановая
1^22^2 Ундекановая (ундепиловая) 9-Метилдекановая 8-Метилдекановая
С12Н24О2 Додекановая (лауриновая) 10-Метилундекано- вая (изолауриновая) 9-Метялун пекановая
^13^20^2 Тридекановая 11 -Метилдодекано- вая 10-Метялаодекано- вая
С14Н28Ог Т етрадекановая (миристиновая) 12-Метилтри декано- вая (изомнрнстя- 11 -Метнлтри декано- вая
новая)
С|ВНзоО2 Пентадекановая 13-Метилтетрадека- 12-Метилтетра дека- новая новая
С1вН32О2 Гексапекановая 14-Метилпентадека- 13-Метялпентадека—
(пальмитиновая) новая (иэопальми- новая типовая)
Глава 1
26
Продолжение табл. 1.6
форму ла Нормальные кислоты Изокислоты А нтензокислоты
г 7Н,ДО2 Гептадекановая 15-Метилгексадека- 14-Метилгексаде- (маргариновая) новая кановая С еН36О-> Октадекановая 16-Метилгептадека- 15-Метилгепта де— (стеариновая) новая (изостеарино- кановая вая) С 9Н380„ Нонадекановая 17-Метилоктацекано- 16—Метилокта дека- вая новая С20Н4002 Эйкозановая 18-Метилнона дека- 17-Метилнонадека- (арахиновая) новая новая С22Н44О2 Докозановая 20-Метилгенэйкоза- 19-Метилгенэйкоза- (бегеновая) новая новая С24Н48О2 Тетракозане- 22-Метилтрикоза- 21-Метилтрикоза- вая (лигнопе— новая новая риновая) С,вН.,О, Гексакозано- 24-Метилпентакоза- ZD 5/ Z вая (пеооти— новая новая) С28Н56О2 Октакозановая 26-Метилгептакоза— (ментановая) новая СзоН60О2 Триаконтано- вая (мелиссино— вая) ^згН64О2 Дотриаконтано- вая
1.6.2. Моноразветвленные насыщенные кислоты
Кислоты этой группы делятся на два основных типа: изокислоты
общей формулы
СНЭ
I
СН3СН(СНЛСООН (л=1-20 в белее );
ж антетзотслоты обшей формулы
СН3
।
СН3СН2СН(СН2).СООН (п=0-20 и болев );
Индивидуальные представители природных моноразветвленных кислот
°Р*веаены в табл. 1.6. Следует отметить, что разветвленные анте-
Определение и классификация липидов Т1
изокислоты имеют асимметрический атом углерода и, следователь-
но, могут существовать в энантиомерных формах. Однако D*форма
в природе обычно не встречается.
Примером разветвленной кислоты, в которой боковая метильная
группа находится в середине углеродной цепи, является D-10-ме—
тилоктадекановая (туберкулостеариновая) кислота (С1вНэвО2).
1.6.3. Полиразветвленные кислоты
Микобактерии содержат ряд многократно разветвленных кислот
/21/: микоцерановую кислоту (С31Н62О2; 2,4,6-триметилоктахозано-
вую); микоцеразиновую кислоту (С32Нв4О2 ; 2,4,6,8-тетраметилоктако-
зановую); миколипиновую, или фтиеновую, кислоту (С27НБ2О2; 2,4,6—
триметил- яраяс-2-тетракозановую).
К этой же группе соединений относятся и приведенные ниже на-
сыщенные и ненасыщенные кислоты:
сн3 сн3
I I
фарнеэановал Н-[СН2СНСН2СН2]2-СН2СНСН,СООН
(С16НзоО2) 3,7,11-триметилМеканоеая
сн3 сн3
I I
пристановая Н-[СН2СНСН2СН2]3-СН2СНСООН
(Ci8H3BO2) 2,е,10,14-тетраметилпеивадвкаовая
сн3 сн3
фитановая Н-[СН2СНСН2СН2]3-СН2СНСН2СООН
(С20Н40О2) зугН'15-петраметилвексадекамвая
сн3 сн3
I I
фитеновал Н-[СН2СНСН2СН2]3-СН2С=СН-СООН
(С2 оНзвО2) 3,7,Н,15-жира»пяш«тм^ея-2-овая
1.6А. Алифатические кислоты с циклопропаковой
или циклопропвновой группировкой в боковой цепи
Жирные кислоты, содержащие циклопропановое кольцо, найдены
в некоторых бактериях и растениях. Биосинтез таких кислот проис-
ходит путем переноса метиленовой группы от S-аценозилметионина
на двойную связь моноеновых кислот. Представителями циклопропано-
Глава j
ых и циклопрспеновых кислот являются следующие кислоты:
q циклопропанов ал (С17Н32О2) CH j(CH 2)SCH-CH(CH 2)7СООН сн2 цисци.клопрог1а.м-9,Ю~ггкса.деиановая
си гиоросяреку.чоеал СН,(СН2)7СШСН(СН2)7СООН
(С19НЗЬО2' сн2 цис- циклспропа.я-9,10-опта.двканова.я
спрекуловал (С, вН34О2) СН3(СН2),С=С(СН2)7СООН СН2 цис- цийЛопропен-9,Ю-овая
лакяобацилловая, или фитомоновал '.CieH36O2) СН3(СН2)5СН-СН<СН2КСООН СН2* цас-цик.лопропая-Н,И-ттадекановая
1.6.5. Алифаяшческие кислоты с циклопенпвновой группировкой
в боковой цепи
Жирные кислоты, содержащие пиклопентеновое кольпо, встреча-
ются в растениях. К соединениям этой группы относятся следующие
кислоты:
алеприновая
(С,4Н240а)
гиднокарповая
<с»вн28о2)
0<HJCH2hCOOH
9Ф2-цамопвятегтя)-иаяаловал
0-СН2(СН2),СООН
М-(2-цимамнтети)-уидекал9валг
хаулъмугроввл
^ibH3202)
0~СН2(СН2)ПСООН
43Г2-цт<я<тяпекия)праРекаяовал
горловая
ОНСН2)вС№=СН(СН2)4СООН
0-(2-цпяопв1те1пи1-триРеце>г-&ооая
Опреоелвние и классификация липидов
29
терпеноидные
гераниоловая
<С1ОН1в02)
1.6.6. Нормальные моноеновые кислот
Нормальные моноеновые кислоты широко распространены в микро-
организмах, растениях и животных, гае они, как правило, встреча-
ются в виде цис- изомеров. Обшая формула нормальных моноеиовых
кислот СН3(СН2)ХСН » СН(СН2)уСООН.
В табл. 1.7 представлены некоторые моноеновые кислоты это-
го гомологического ряда.
1.6.7. Полиеновые кислот
Нормальные ненасыщенные жирные кислоты с двумя и более
двойными связями в молекуле широко распространены в раститель-
ных и животных тканях, а также в микроорганизмах, таких, как
дрожжи, грибы, плесени и водоросли, но практически отсутствуют
в бактериях. В табл. 1.8 приведены некоторые распространенные
полиеновые кислоты.
В природных объектах встречаются также изопреноидные или
полиеновые жирные кислоты, например:
СНЭ CHS СООН
I I /
СН3С=СН(СН2)2С=СН
3,?-димвлш-цш:-вкта9т-2,6-ввая
СН3 СН3
I I
СН3С=СН(СН2)2ОСН
I
СООН
i,7iuMemve-mpajtc-mmadveK-2,6eeMK
СН3 СН3
I I
H-[CHjC=CHCH2]2-CH2C=CHCOOH
3,7^1-крвжетвяШаяшмрвп^,{В-овая
1.6 Л. Ацетленовые кислот
Жирные кислоты, содержащие тройную связь, встречаются в рас-
тениях. Представителями этой группы кислот являются
июририновая кислот СН3(СН2)10СЬС(СН2)4СООН
(С18НЭ2О2) ята*цп-*овая
нероловая
(CiOH,6O2)
фарнезоловая
(С1БН2402)
Некоторые нормальные моноеновые кислоты
Таблица 7.7
Число ато- мов угле* рода в моле- куле Структурная формула Название Природные источники
рациональное тривиальное
Г
4 Н снАссоон 3 1 н тр а«с-Бутен-2-овая Кротоновая Кротоновое масло
В 10 ,11 сн3сн2си-снсн2соон н н CH3(CH2)SC-CCH2COOH СН--СН(СН,)ЯСООН н н II Гексен-З-овая цис-Децен-З-овая У ндецен-10-овая Дигидросорбиновая Ундециленовая Бактерии
12 ‘-'4 СН3(СН2)6С=С(СН2)3СООН \ " НН цис-Додецен-5-овац Дентицетовая Бактерии
*14' I 1 СН3(СН2)/-С(СН2)3СООН Н Н цис-Тетрадецен-5-овая Фисетеровая Бактерии
14 16 сн3(сн2)3с»(!:(сн2),соон н СН,(СН,)„С-ССН,СООН J { < 11 1 i * Н н н цшс-Тетрадецен-9- овая ! жраяс-Гексадецен-З-овая Миристолеиновая Бактерии, растения Растения
16 1 1 СН3(СН2)вС-С(СН2)7СООН цис-Гексадецен-9-овая Пальмитолеиновая Бактерии, растения
H Н i 1
18 СН3(СН2)10С=С(СН2)МСООН цис-Октадецен-6-овая Петроселиновая Растения
18 Н Н ( СНа(СН2)тС=С(СН2),СОЭН цис-Октадецен-9-овая Олеиновая Бактерии, растения
18 н CHJCH2)7C=C(CH2)2COOH яранс-Октадецен-9-овая Элаидиновая животные
18 н н н CHJCHJ-C-C^HJ-COOH 3 L О л. 9 цис- Октадецен-11 - овая цис-Вакценовая Бактерии
Й . н н СН3(СН2)9С-6(СН2)7СООН цис-Эйкозен-9-овая Гадолеиновая
22 н н СН3(СН2)7С-С(СН2)„СООН цис-Докозен- 13-овая Эруковая Растения
22 Н СН3(СН2)7С-С(СН2)„СООН жраяс-Докозен-13-овая Брассидиновая
24 Н Н Н СН3(СН2)7С-С(СН2)(3СООН цис-Тетракозен-15-овая Нервоновая Животные
Некоторые полиеновые жирные кислоты Таблица 1.
Число ато- мов углеро- да в молеку- ле Структурная формула Название
рациональное травиальнос
6 18 18 20 18 18 18 20 Диеновые кислоты СН3С1ЬСНСН»СНСООН н н СН3(СН2)4[С-ССН2]2-(СН2)аСООН н н силен,), Гс-ссн ,1, -(СН,) ,соон н н СН3(СН2)4 [С=ССН2] 2 -(СН 2)8СООН Триеновые кислоты н н сн3сн2[с=ссн2]3-(сн2)асоон н н г1 1 -1 СНЛСН,)4[С=-ССН, ,-(СН,)_СООН H H H 1 ‘1 1 CH3(CHJ3[C^C]2-C=C-(CH2)7COOH H H H CH3(CH2)4[C=CCH2],UCHJ.COOH Гексадиен-2,4-овая цис, «ас-Октадекадиен-9,12-овая цис, и«с-Октадекадиен-6,9-овяя цис, и«е-Эйкозадиен-11,14;овая 1 цис-Октадекатриен-9,12,15-овая кис-Октадекатриен-6,9,12-овая 1 цис, транс, яракс-Октадекатриен-9,11, 13-овая цис-Эйкозатриен-8,11,14-овая Сорбиновая Линолевая а-Линоленовам у-Линоленовая Элеостеаринова
20 20 20 22 22 22 н н СНЭСН2[С«ССН J,-(CHJatOOH Тетра-, пента- к гексавновые кислоты Н Н СН3(СН^4[С-ССН2]4-(СН2)2СООН н н СН3СН2ГС=ССН2]В-(СН2)2СООН н V СН3СН2[с^ССН2]в-(СН2)4СООЙ и н CH3(CH2)4[C-CCH2)g^CH2COOH н н сн3сн2[с-ссн2],-сн2соон цкс-Эйкозатриен-11,14,17-овая Мис-Эйкозатетраен-5,8,11,14-овая Арахидоновая цкс-Эйкозапентаен-5,8,11,14,17-овая Иис-Докозапентаен-7,10,13,16,19-овая цяс-Докозапентаен-4,7,10,13,16-овая И«с-Докозагексаен-4,7,10,13,16,19-овая
Глава ]
34
пК„0аецик-8-овая кислота СН3(СН jgC=C(CH2)6COOH
_ „ п ч актааецин-В-овая
(C18H32U2>
сяеароловая кислота СН3(СН,)7СжС(СН2)7СООН
(С еН3202) окта.Вецтг-9-овая
1.6.9. Оксикислоты
В природе встречаются различные позиционные изомеры как на-
сыщенных, так и ненасыщенных оксикислот. Насыщенные о-оксикяс-
лоты вхоцят в состав цереброзидов и образуют гомологический ряд
оксикислот с четным числом атомов углерода общей формулы
СН3(СН2)ПСН(ОН)СООН (п - нечетное число, от 7 до 21). Представите-
лями таких оксикислот являются: 2—оксилауриновая, 2-юксимиристи—
новая, 2-оксипальмитиновая, 2-оксистеариновая, 2-оксиарахидиновая,
2-оксибегеновая и 2-оксилигнопериновая (цереброяовая) кислоты.
Насыщенные /3-оксикислоты являются составными частями липо-
полисахаридов клеточных стенок грамотридательных бактерий; встре-
чаются они также в дрожжах в виде сложных эфиров и гликозидов,
входящих в состав липидов внешних клеточных мембран. /З-Оксикис-
лоты образуют гомологический ряд насыщенных кислот е-четным
числом атомов углерода обшей формулы СН3(СН2)ПСН(ОН)СН2СООН (п-
четное число, от 6 до 14). К данному гомологическому ряду окси-
кислот относятся, в частности, 3-оксикаприновая, 3-оксилауриновая.
3-оксимиристиновая, 3-оксипальмитиновая и 3-окснстеариновая кис-
лоты. 3-Оксикислоты D-ряда являются промежуточными продуктами
биосинтеза жирных кислот, а 3-оксикислоты L-ряда — промежуточ-
ными продуктами З-окислення.
со-Оксикислоты образуются как промежуточные продукты ^-окис-
ления жирных кислот бактериями и другими микроорганизмами и мо-
гут накапливаться в виде гликолипидов во внешней клеточной оболоч-
ке. Очная формула <о-оксикислот НОСН2(СН2)ПСООН (” = 8-16 и более).
В качестве примера оксикислот этого типа можно привести: 12-окси-
лауриновую, 14-оксимиристиновую, 16-оксипальмитиновую и 18-окси
стеариновую кислоты.
К ненасыщенным оксикислотам относятся 12-оксиолеиновая (ряш
волевая) и 2-окситетракозен-15-овая (оксинервоновая-) кислоты. Из-
вестны также нормальные полиоксикислоты, например 15,16-диокси-
гексадекановая, 9.10-стоксиоктадекановая (9,10-диоксистеариновая)
и 2,15,16—триоксигекса декановая кислоты.
Разветвленные оксикислоты (миколевые кислоты) встречаются
в микобактериях, коринебактериях и бактериях Nocardia. Представи-
тели таких оксикислот:
ОН СООН
। ।
кориномкколевал кислота СН3(СН2)|4СН-СН(СН2)13СН3
(С32Н44О3)
Определение и классификация липидов
ЗБ
а~смекмамиколввал кислопа (С78Н|6403)
CHS он СООН
СН3(СН2)17СН=СН(СН2)1?СН=СНСН(СН2)17СН-СН-С22Н43
Николевые кислоты и другие разветвленные бактериальные окси—
кислоты детально описаны Асселино /21/.
1.6.10. Квжохислояы
Кетокислоты существуют в виде различных позипионных изоме-
ров; наиболее известные соединения такого рода могут быть отне-
сены к следующим типам:
'а-квяояиелояы
/3-кепокислопы
СН3(СН2Ь-СО-СООН (и - 7-20 » 4мм)
СНз(СНэЖ?О-СНаСООН
(п=>6-20 в 4mw)
(<а - 1)-ямюкксжмм< CHj-COHCHjt-COOH (я«7-20 ибмег)
Выделены также 4- и 6-кетокислоты жирного ряда. Ненасыщен-
ная 9-«етодепев-2«свая кислота обладает феромоновой активностью.
1.6.11. Дикарбоновые кислопы
Это кислоты обшей формулы НООС -(СН2) -СООН (я = 4-18 и более
Отдельные представители дикарбоновых кислот приведены в табл. 1.9.
Таблица 1.9
Дикарбоновые кислоты
Формула Название
рациональное тривиальное
свн,0о4 Гександикарбоновая Адипиновая
СзН1204 Гептандикарбоновая Пимелиновая
С»Н,404 Октандикарбоновая Субериновая
свн, в04 Нонандикарбоновая Азелаиновая
С10Н1804 Декандикарбоновая Себапинсявая
Додекандикарбоновая
С,ЭН24О4 Т ридекандикдрбоновая Брассиловая
Ci<H2eO4 Т етрадеканднкарбоновая
С1вНэоО4 ГексадекандикДрбоновая
3fi
Глава 7
1.G.12. Простагландины
Простагландины - это группа ненасыщенных окси- или кетоокси—
производных С^-диклопентановой, простановой/7-(2'-октилпиклопен—
тил)гептановой/ кислоты. Простакгландины присутствуют в семен-
ной жидкости и в половых железах. Они вызывают сокращение глад-
кой мускулатуры и обладают вазодепрессорной активностью. Некото-
рые представители простагландинов приведены ниже (см. так-
же /257/):
о
простагландин £(
fx20H34cv
он ОН
На.,/5(5)диокси,-9кетотранс-прос1пек-
/3-овая кислота
простагландин
(С20Н36О5)
Sa, //a, 15(5)-триокси транс-просты-
13 овая кислота
простагландин Е2
^20^32^6^
На.,15(5)-диокси.-Элетолростади.ен5-г1ис-
13 транс овая кислота
простагландин Е3
(С2ОНзОО5)
На, 15(5)- диокси - Экетопростаприен5-цис-
13-транс-Г?-цис-овая кислота
ипреоеление и классификация липиоов
37
1.7. Воски
Воски - сложные эфиры жирных кислот и жирных спиртов - вхо-
цят в состав кожного жира животных, содержатся в черенках листве!
и в некоторых бактериях, например микобактериях и коринобактериях.
Известны два основных типа восков - простые и сложные-
1.7.1. Простые воски
К простым воскам относятся эфиры нормальных жирных кислот
и высших нормальных первичных спиртов
О
И
CHsfCHJ.jC-O-CH^CHj^CHj (л и 'п>=8-18 и бояее )
Представителями компонентов простых восков являются додецилгек-
садеканоат (лаурилпальмитат), гексадецилгексадеканоат (детплпаль-
митат), тетрадецилоктацеканоат (миристилстеарат), октаД^Чилокта -
деканоат (стеарилстеарат) и т. ц. Известны также ненасыщенные
воски, например гексадецилоктадецен-9-оат (цетилолеат), октадецен-
9—илгексадеканоат (олеилпальмитат) и т. д.
Воски сальной железы птиц содержат эфиры нормальных спиртов
с разветвленными жирными кислотами /244/.
1.7.2. Сложные воски
К сложным воскам относятся эфиры разветвленных одн°— или
двухатомных спиртов и разветвленных жирных кислот или оксикис-
лот. Примерами сложных восков являются 'дериды' - вое Xй Mycobac-
leriiim tuberculosis, которые представляют собой пиэфиры фтиоцеро-
лов (разветвленных С33 — С^-диолов) и микоцерозиновых кислот
(разветвленных С29 - С32-кислот). Детальный обзор этого класса ли-
пидов был сделан Асселино /21/.
Кожный жир животных содержит диэфирные воски двух типов*:
а) производные оксикислот, в которых гидроксильная группе окси-
кислоты проэтерифилирована жирной кислотой, а карбоксил - жирным
спиртом и б) производные а, /3 -алкандиолов, в которых г0ДР°ксиль—
ные группы диола проэтерифицированы жирными кислотами /240/.
1.8. Эфиры стеринов и спиртов витаминов A, D и Е
С терины и спирты витаминов часто встречаются в прир°°е в ®и-
Дв эфиров жирных кислот. Длина углеродной цепи и степени ненасы—
См. дополнение 2 к гл. 1. - Прим, нерве.
38
Глава 1
шенности остатков жирных кислот в таких эфирах обычно совпадают
с плиной углеродной цепи и степенью ненасыщенности жирных кис-
лот, входящих в состав соответствующих глицеридов.
1.8.1. Эфиры сяеринов
Представителями этой группы соединений являются:
3- О-ацапомсшвя-З-ал-ЗА
RCO « С „-Cjo,насыщенные и не-
насыщенные ацильные остатки.
ROD = С,2 - С20,насыщенные и не-
насыщенные ацильные остатки.
3'О-ачиязрлосятяртя-5,Т,ЗЛ‘»в^
эфиры сяииюсяврина
3-0-а^и<мтмасяаЛиа-541-яв-ЗА
эфиры fi-сияосиерина
RCO= С,2— Сде, насыщенные и не-
насыщенные ацильные остатки.
RCO = С^-С^, насыщенные и не
насыщенные ацильные остатки.
Определение и классификация липидов
39
1.8.2. Эфиры спиртов витаминов A, Du Е
Ниже приведены некоторые представители этой группы соедине-
ний:
эфиры витамина А
CHjOCO-R
R60-С^-Сда,насыщенные и не-
насыщенные апильные остатки.
ачмрептплы
эфиры витамина D
RCO = С12 - Сда> насыщенные и не-
насыщенные апильные остатки.
эфиры витамина Е
RCO = С12 _ СдоНасышенные и не-
насыщенные апильные остатки.
-- -- 1.9. Глицериды
Глицериды (нейтральные жиры) - эфиры жирных кислот и глице-
рина; встречаются в виде соединений трех основных типов?
1.9.1. Ионоллицериды
Моиоглипериды - моноэфиры глицерина и жирных кислот сущест-
вуют в двух изомерных формах:
* Для производных глицерина с асимметрическим атомом углерода исполь-
зуется стереоспецифическая система наименований (номенклатура sn). Эта но-
менклатура позволяет достаточно четко различать две первичные СН2ОН-
группы глицерина. Если вторичный гидроксил в проекционной формуле Фишера
расположен слева от вторичного атома углерода, то углеродный атом, располо-
женный над С-2, обозначается как С-1, а углеродный атом, расположенный
под С-2, - как С-3. При использовании этой номенклатуры перед названием
соединения ставится приставка вп.
Глава 1
Определение tt классификация липидов
41
а 1 CH2-O-CO-R СН2ОН I
Р 2 1 НО-С-Н CH-O-CO-R
а' 3 1 сн2-он 1 СН2-ОН
S4-1- ели а-изомер зп-2- ши fi-mnnp
Моноалкиловые эфиры CH2-O-R СН2-ОН
НО-С-Н CH-O-R
I I
сн2-он сн2-он
дат/-«да а-язомер sn-2-nv римепр
R - насыщенные или ненасыщенные углеводородные остатки. .
1.9.2. Диглицериды
Диглицериды - циэфиры глицерина и
шествуют в двух изомерных формах:
жирных кислот также су-
CH2O-CO-R 3 СН2ОН
। I
НО-С-Н 2 CH-O-CO-R
I I
CH-O-CO-R' 1 CH2-O~CO-R'
R и R'- насыщенные
или ненасыщенные угле-
водородные остатки.
а-Иэомеры моноалкиловых эфиров глицерина имеют обычно D-
или sл-1-конфетурацию, как, например, 1-О-гексадеиилглицерин
(цимиловый спирт), sa-1-О-октацепилглипернн (батиловый спирт),
«я- 1-ЛЭ-октадецен-Э-илглицерин (селахиловый спирт). Однако из-
вестен природный а-моноалкиловый эфир глицерина, имеющий L-или
sn- 3-конфигурапию: «я-зиЭ-^гетраметилгексадепилглицерин ( а- моно-
фитанилглиперин). Выделен также природный 2-0-тетраметилгекса-
депилглицерии ( /3-моиофитанидовый эфир глицерина) /146/.
Диалкиловые эфиры
sn-tj- яп a.,a4neietp sn-i,2- ши а,риштр
1.9.3. Триглицериды
ch2-o~r
I
R'-O-C-H
I
сн2-он
snl,t ши а,fl-извмир
CHj-O-R
I
сн-он
I
CHa-O~R'
зп*/3- ши etj’-иширр
Триглицериды представляют собой триэфиры глицерина и жирных
кислот, причем входящие в состав триглицеридов кислоты могут
быть и одинаковыми, и различными. Природные триглицериды, содер-
жащие по крайней мере две разные жирные кислоты, имеют асиммет-
рический атом углерода.
3 CHj-O-€O-R R, R‘ и R“- насыщенные или ненасы-
। шейные углеводородные остатки.
2 H-C-O-CO-R
I
1 CHj-O-CO-R'
3»-/,2,3^пртгО*вйнг&гндопг
1.10. Простые эфиры глицерина
Известны два основных типа простых эфиров глицерина: алкило-
вые и алкен-1-иловые (плаэмалогены). Детальный обзор свойств
этих соединений дан в работе /301/.
1.10.1. Алкиловые эфиры глицерина
Известны два типа алкиловых эфиров глицерина - моно- в диал-
Вловые эфиры.
К настоящему времени удалось выделить только одни природный
диалкиловый эфир глицерина - sn- 2,3-си-О-^гетраметилгексадедил-
глиперин (дифнтанилглиперин). Диалкиловые эфиры глицерина, в ко-
торых R и R' - нормальные насыщенные или ненасыщенные алкилы,
были синтезированы, но в природе до сих пор не обнаружены.
Триалкиловые эфиры CH2O-R R, R* и R" - насыщенные
I или ненасыщенные углево-
CH-O-R' дородные остатки.
CH2O-R"
Соединения такого рода синтезированы, но в природе не обнару-
жены.
1.10.2. Алкеи-1-иловые эфиры глицерина
Алкен-1-иловые эфиры глицерина с «кс-конфигурапией двойной
связи широко распространены в природе. Как правило, это моноалкен—
1-нловые эфиры; однако имеются косвенные доказательства сущест-
вования диалкен—1-еловых эфиров. Триалкен-1 -иловые эфиры обнару-
жены не были.
42 Глава 1
Определение к классификация липидов 43
Моноалкен-1-иловые эфиры глицерина
ch2-o-ch=ch-r
I
но—с—н
сн2-он
sn-1- ujni а-изомер
СН2-ОН
CH-O-CHCHHR
СН2ОН
sn-2- или р-изомер
В природе найден только sn-1-изомер. При кислотном гидроли-
зе природных плазмалогенов обычно образуется пальмитиновый, сте-
ариновый или олеиновый альдегид.
Диалкен-1-иловые эфиры
ch2-o-ch=ch-r
{
R-HOCH-O-C-H
।
сн2-он
CH2-O-CH=CH-R
сн-он
I
CH2-O-CH=CH-R
sn-f,2- in а.ризомер
snlj- un а,а‘-изяеер
1.10.3. Ацилалкиловые эфиры глицерина
1.11. Фосфолипиды (фосфатиды)
Природные фосфолипиды можно разделить на две большие груп-
пы: глшхерофосфатиды и сфкнгозинфосфатяды.
1.11.1. Г лицврофосфаяиды
К глиперофосфатадам относятся производные 1.2—диацил— «и- гли-
перо-3-фосфата (фосфатидной кислоты) обшей формулы
Н2С—О—СО—R’ R’ и насыщенные и ненасыщен-
ные углеводородные остатки.
R’-CO-O-CH
।
HjC-O-PO-O-R
I
О"
Группировка R может представлять собой амииоспирт или оста-
ток полиола. В табл. 1.10 приведены некоторые фосфатиды, содер-
жащие остатки аминоспиртов (азотистые основания), и указаны их
принятые сокращенные названия.
Природные апилалкиловые эфиры глицерина - это моно- и диа-
пильные производные алкилглидеринов.
ch2-o-r ch2-o-r
t I
R'-CO-O-C-H R'-COO-C-H
сн2-он
R, R' и R* - насыщенные
или ненасыщенные углево-
дородные остатки.
CH2-O-CO-R'
Глтил-2-ацил~зл-еиицерии 1ляял-2,1-1и.ачи.л-зп-иацери<
1.10.4. Алкен-1-кловые эфиры глицерина
(нейяралъные плазмалогены)
В природных соединениях часто встречаются моно— и диапильные
производные алкен-1-иловых эфиров глицерина.
CH2-O€H=CH-R
R'-CO-O-€H
сн2-он
CH2-O-CH»CH-R
I
R'-CO-O-CH
i
CHj-O-CO-R"
Таблица 1.10 Глиперсфосфатады, содержащие азотистые основания
R Название фосфолипида Принятое сокра- щение
Н - - - Фосфатидная кислота ФК
- CH2CH(NH2)COOH серин Фосфатидилсеригн ФС
- CH2CH2NH2 этаноламин Фосфата дялэтаноламии ФЭ
- CH2CH2NH(CH3) Фосфатидил- Н^метилэта-
ноламин МеФЭ
- CH2CH2N(CH3)2 Фосфатидил-N, N—диметял-
этаноламин ПиМеФЭ
- CH2CH2N(CH3)3 холин Фосфатадилхояин ФХ
Полиолсодержашие фосфатиды в свою очередь можно разделить
на полиглиперофосфатиды и фосфатадилинознты.
^алнея~^еи-2~вицгл-лп-илицерепг Геипея-fдиацил-sa-иицерп
R и R' - насыщенные или ненасыщенные углеводородные остатки.
44
Глава 1
а. Полиглииерофосфапиды:
фосфатидилглицерин (ФГ)
о
II
R—С—О-СН, н»с—он
° i I
II I I
R—С—О—СН НС—ОН
! ? !
н5с—о—р—о—сн2
I *
_о к+
Jsn- фосфатидил -t'-sn-глицерин
фосфапидил-О-аминоацилглицерии (ФААГ)
З-sn -<poc<pa. тидил- f'-CJ-O- аминоация) -sn - глицерин
/шияоаплльная группировка R" обычно представляет собой ос-
таток лизина, орнитина, аргинина или аланина.
фосфатидилглицерофосфат
(ФГФ)
о
II
р^С—о—снг
р—С—О-Сн
нс—он
3 sn -фосфатидил- /sn - глицеро - 3 ‘-фосфнип
дифосфаитдилглицерин (диФГ)
t',3'-du-0-(3-5п-фосфатгдил)-5П-глицерил
Определение и классификация липидов
б. Фосфатидилинозиты (номенклатуру см. в работе [177])
фосфатидилинозит (монофосфоинозикид.ФИ)
3-зп-фосфа.тидил-зп -i-миоинозит
фосфатидилинозипфосфат (дцфосфоинозияид, ФИФ)
S-sn-poctamuihiA-sn-f‘-миоинозит-4-ресрат
фосфаяидилинозиядифосфан (ярифосфоинозияид, ФИдиФ)
3-зп-фосфатидил-за -1 ' миоинозит-4^5 - дифосдюл
Самой распространенной формой глицерофосфата дов являются
пиапилглицерофосфатиды. хотя другие варианты глицерофосфата нов
46
Глава 1
также распространены достаточно широко. К числу последних отно-
сятся плаэмалогены (моноалкен-1-илмоноадилфосфатиды), моноапил-
моноалкилфосфатиды, диалкилфосфатиды и т. д. (табл. 1.11).
1.11.2. Сфингозинфосфаяиды
Наиболее известный липид этого класса - сфингомиелин, фосфо-
холиновый эфир N-ацилсфингозина (керамида).
Н НН О~
III I .
СН,(СН2)1?Оєї С-СН2О-РО-ОСН2СН 2 N(CH3)3
I I I
Н OHNH
CO-R
Ъ-ацилАсфенгеиилГдюсфохолин
Известны также соответствующие производные дигидросфингозина:
- — -
НН О~
I 1 1 +
СН3(СН2),4С—С-СН2О-РО-О-СН2СН 2 N(CH3)3
I I
OHNH
I
CO-R
и-ацшсдптати-1-дюсфохолан
В беспозвоночных были найдены фосфоновые аналоги сфингозинфос-
фа типов:
О"
I
CH3(CH2)l2CH=CH-CH-CH-CH2-O-P-CH2CH2NH2
II II
ОН NH О
I
CO-R
яерятЛиттпшлдюс^вивзв
О"
I
CHj(CH2)12CH=CH-CH-CH-CH2-O-P-CH2CH2NH-CH3
I I I!
ОН NH О
CO-R
etpatnd- 'Ы-гпппгтмяиозпшлфоСфвиаж
Таблица 1.11
Некоторые варианты структур глииерофосфатидов
Структура0 Структурный вариант Основные типы
О'
H2C-0-P0-0R HC-O-CO-R' 1 Н2С-0-С0-Н" О' Диацильная форма Все известные фосфатиды
H2C-0-P0-0R HC-O-CO-R' H2C-O-CH=CH-R" O' Моноацилмоноалкен-1- илфосфатид (плазмало- ген) ФС, ФЭ, ФХ
H2C-0-P0-0R HC-O—CO—R‘ 1 H2C-O-CH2R" 0- Моноацил моноал кил- фосфатид ФЭ, ФХ
H2C-O—PO-OR HC-0-CH2-R' H2C-0-CH2-R” ? ? Диалкилфосфатид ФГ, ФГФ
H2C-0-P0-OR H2C-0-P0-0R HC-OH HC-O-CO-R’ H2C-0-C0-R' H2C-0H а-изомер Д-иэомер 0‘ Лиэофосфатид ФС, ФЭ, ФХ
H2C-0-P0-R HC-O-CO-R H2C-O-C0-R" Фосфонолипид ФЭ
0 R - остаток азотистого основания или полиола; R* и R" - насыщенные
или ненасыщенные радикалы.
4-а
Глава 7
Опреоеление и классификация липидов
49
1.12. Гликолипиды
Под общим названием гликолипиды объединяют различные липид-
ные производные сахаров, которые можно разделить на следующие
шесть типов.
1.12.1. Г ликозилдиглииериды
Гллкозилдиглиперлпы — соединения, у которых моно—, ди— или
трисахариды связаны гликозидной связью с гидроксильной группой
диглицеридов. К соединениям этого типа относятся моногалакко зил-
ов глицериды (МГДГ) (содержатся в растениях /61/)
J-0-д о-галакгпопира.нозил-1,2-диацил-sn.-глицерин
ошалактозилоиглицериоы (ДГДГ) (содержатся в растениях /61/)
HjCon
5-0-{а.-огаплтатгра»озил(1'—6')-Ор-р-галаптоп1/ра.нозил]
1,2-ви(щил~зп глицерин
юлакяозилглюкозилдиглицериды (содержатся в бактериях)
1Г Таблица 1.12
Некоторые бактериальные sn-З—О-гликозилдигпиперины3
/50, 292/
Название Строение гликозидного фрагмента Источник
Моног люкози лдиг лицери д tz-D- Глюкопиранозид Pneumococcus, mycoplasma
Диглюкозил диглиперид /3 - D-Глюкопиранозил- (1— 6 )-0- /3 _ D-глюко- пиранозид Staphylococcus
Диглюкозилдиглицерид a-D- Глюкопиранозил- (1 — 2 )-0 - а - D -глюко- пиранозид Mycoplasma, Streptococcus
Диманнозилдиглицери д (9 - D-Майнопиранозил- (1—3)—0-а-D-манно- пиранозид Micrococcus lysodeik ticus
Г алактофуранозилди- глицерид /3 - D-Галактофуранозид Mycoplasma, Bacte- roides
Галактозилглюкозил— диглиперид а _ D-Галактопиранозил- (1—*’2)—0—a-D- глюко- пиранозид Lactobacillus
Г люкозилгалактозил- г лю козил диглиперид a - D- Глюкопиранозил- (1—6)-0-a-D- галак- топиранозил-Х 1—2 )- —a — D -глюкопиранозид Lactobacillus
а Диалкиловый аналог гликозил диглицеридов, был обнаружен в эк-
стремальных галофилах, например Halobacterium cutirubrum, И был
идентифицирован как sn-2.3-ди-0-фйтаНПл-1-0-/галактозил-( 1—• 6)-
0-маннозил-(1—2)-0-глюкозил/глицерин /161, 168/.
нс—о—со—я
• < i
HjC— О—СО—R
З-О^а-в-галалшепирантла'^^-О-сг^глялолирсиюзилУ^г-виацил-
sn-глицерол
Некоторые другие представители’ бактериальных гликозилдигли—
перидов приведены в табл. 1.12.
1.12.2. Гликозиды оксйкислок
Представителями гликозидов оксикислот являются
'рамнолипид (выделен из Р. aeruginosa)
О—CHCHjCO—о-снснг соон
C?4lB. Л|,,, СтН» ! . . , ......
2 0-а-ь-ратопорамозила-ъ-рамвепвринозил-ъуЗ окон \amae 3 аквРикалмая пата,
2- 0 р• о-глюпопиранозия-р- d- гякват/раиозаи
l- iJ-oKCuonmadtna-Htnan кислота
микозиОы (найдены в микобактериях) — гликозиды метилированных
сахаров и сложных ароматических гликолей ('феногликоля Б'),
этерифипированных микоперозиновой и пальмитиновой кислотами /21/.
1.12.3. Эфиры жирных кисло* к соларов _
Ниже приведены структуры некоторых природных жирных кислот,
эфиров и сахаров.
Тришмлглюкоза (найдена в микоплазме)
ch8o-co-r R-CO - олеил (тлинолеил).
Л-V
ОН
3,4,6-трвацил-р-о- глюкопираноза
6,6'-Дивцилжре1алоза (найдена в микобактериях)
Корд-фактор
R-СО«пальмитоил С..Н,,0
ТО л т
я -С0“ миколаноил С--Н.--О,
о i т *в чК
R — СОакориномиколаноил С,„Н«,О,
32 63 2
в 6,6'—дипальмитоил- а» D -
трегалозе
в 6,6*—акмикаланонл-а. D-
трегалозе
в 6,6'-ди-(2',-тетрапепял-
З'-оксиоктадеканонл)- a- D-
Определение ш классифика^ил липидов
51
1.12.4. Фосфорсодержащие «ляколяяяды
Представителями фосфорсодержащих гликолипидов являются:
фосфаяидилглюиоземинилглицерин (содержится в Bacillus megaterium)
3'3Ti-tpoc^Mudag~t'-(2‘-t>-ejnn»iUMmu)'sn-uw>ee
фосфааждилинозижмлижаннозиды (содержатся в микобактериях)
p-Manp
[е-ммр<1~б)]~6
О
II
О— ₽—O—CHg
О-
нс—о—со—я
HjfC-O-CO—R
3-sn-9oapajnodiusnf'-MuouH03uw-2-p-oieaHMonBpajn39i-6-
p(f—6) аоли-о-ишпгтиратпд
(n = 1) фосфатидилинозитдиманнозид
(п = 3) фосфатидилинозяттетраманнозад
(и « 4) . фосфатидилинозитпеитаманнозиц
1.12.5. Фиитликолипиды (содержала» о расленцлх)
Фитогликолипиды представляют собой ^адилфитосфингозилфос-
фатидилинозиты, связанные гликозидной связью со сложными олиго»
сахаридами /63/.
?’К+
CH^CHjhjCHHZH-CH-CH^-O-PO-O-l'-wejnT^-O-Max^
ill I
ОН ОН NH г-6'
I i
СО-R глтурпоеая кисята
еппвзалт
।
/" ‘ .. *• ‘ ' . '“*
ммжтм, арабапза^ухмг
Глава 1
1.12.6. Липопо.т"сахариды (сооержатся в бактериях)
Пнпополисахариды — высокомолекулярные комплексы липидов
полисахаридами; содержатся в клеточной стенке грамположитель-
&1Х бактерий- Липополисахариды состоят из полисахарида, связанно-
с Гликолипидом ("липид А") через остаток 3-дезоксиоктулозоната.
ПипиД А., по-видимому, поедставляет собой поли- ( N -анилглюкоз-
а1лин). этерифидированный фосфатом этаноламина и жирными кислотами.
Структура липида А из Escherichia coll установлена рядом авторов
/3, 4, 53/:
где R - СО- и R’ —СО - остатки уксусной, лауриновой, оксилауриновой.,
миристиновой, оксимиристиновой и пальмитиновой кислот.
1.12.7. Гликозиоы стеринов
Природные гликозиды стеринов представляют собой 3-0— /S-D-глю—
копиранозиды стеринов, преимущественно холестерина, ситостерина,
стигмастерина и обычно встречаются в растениях. В природе был
найден также 6-пальмитоил- fi- D-глюкозид /3-ситостерина /102/.
еипппды fl-cmnocmepna.
1.12.8. Цереброзиоы (кератдгехсозиды)
Цереброзиды - глюкозиды N-апилсфингозинов (керамидов);
ВстРечаются в животных и растительных тканях.
Определение и классификация липиоов
5J
Цереброзиды мозга
1р-ъгалалтопиранозил-Ъ-ацилсфимгозик
гдеВ — С0= лигноцерип(С24Н470) в керазине,
церебронил (2-оксилигноперил) в френозине,
нервонил (С24Н4Б0) в нервоне,
2—оксинервонил в оксинервоне.
Растительные цереброзиды [J60]
{-0-р-ъ-глюкопиранозил-'№'‘а-окси)-ацил<ригпосфпнгозт1
где R-C0=2--оксипальмитоил,
2-оксистеароил,
2-оксибегеноил,
2-оксилигноцерил.
Наряду с фитосфингозином в растительных цероброзидах мо-
гут присутствовать дигидросфингозин и дегидросфингозин.
Полигексозиды керамидов
Это соединения группы цереброзидов', в которых гликозидная
часть представляет собой олигосахаридную цепочку, содержащую си
двух до шести моносахаридов, Примером таких соединений могут
служить керамиолактозиды
/-0-[р-п-ылаята1траиозал-(i-*4)-0 р-в-гляиотп>амозил\-И-атясо1тявлпг
Глава ;
1.13.9. Ганглхозиоы [ 190, 313}
Ганглиозиды представляют собой комплексные переброзиды, вко-
торь1Х остаток керамида связан с углеводным фрагментом, состоя-
'. из глюкозы, галактозамина и сиаловой кислоты. Сиаловая
ДИМ
р. адетилнейраминовая ) кислота имеет такое строение:
Н»С—он
н—с—он
I
н—с—он
В связи с большим разнообразием углеводных фрагментов су-
шествуют многочисленные типы ганглиозидов. Ниже в качестве при-
мера приведено строение одного из основных ганглиозидов (Gm1 или
G, ) - моносиалоганглиозида:
Gal(l — 3)GalN-Ac-(1— 4)-Gal(1-4)-Glu d — <}-мрыой
Ы-ацевииейрамтюя
Большие количества ганглиозидов содержатся в мозгу, обнаруже-
ны они и в других тканях млекопитающих и в мембранах эритро-
цитов.
1.13. Серусодержашие липиды [120]
Известны три основные типа серусодержашях липидов:
1.13.1. Сулъфаяы еыаиит спиркое (алкилсулъфа/яы)
В настоящее время известен только один представитель такого
Рода сульфолипидов. Это дисульфат высшего диода, найденный в ми-
кроорганизмах, /219/:
OSOJ
CH^CHjj-CHHCHj.jCHj-oso;
1,М(5)-ЛкозаиЛпл9ги^ч^раЛ1
Определение к классификация липидов
55
1.13.2. Сульфаты цереброзидов (сульфамиды)
Эти содержащиеся в мозгу соединения представляют собой га-
лакТозил-Зя-сульфаты цереброзидов.
СНэ(СН2)14СН-СН^Н2О-^-1>гвМ1глвяьг-3-сулй»«»
। I
ОН NH
CO-R
1.13.3. Сульфаты гликолипидов необычного строения
Необычный сульфат гликолипида был найден в галофндьных бак-
териях; структура этого липида такова /166/:
_O3SO-3-Gal(l-*6)-Man(l-»2)-G1n(l-»r>-O-CH2
I
R-O-C-H
I
Н-О-СНг
R»C20H41 (фквапи)
Другой необычный сульфат гликолипида - 2,3,6,6‘-<гетраапетил-
а,а' трегалоза-2'-сульфат содержится в Mycobacterium tuberculosis [ПО
1.13.4. Сульфаты гликозилдиглицеридов
Известен только один представитель таких липидов - сульфохин
воаилдиглиперид, обнаруженный ь растениях.
CHgSOaH
Ho\j°H >—Снг
ОН НСО—СО—R
I
нгсо—со—я
е>-суп9»-а-в-»мм«П1фалашг-П-3>/'^:#ка<пг*
зп-ыицерю
1.14. Липиды, содержащие аминокислоты
Кроме фоофатидил-О-аминоапилглиперидов (см. разд. 1.11.1),
известно еше несколько типов липидов, ие содержащих фосфатной
группировки, но содержащих аминокислоты.
I лае о
56
2^1 /V- Ациламинокислоты и их эфиры с жирными кислотами
Представителями такого рода соединений являются:
^ражамоаая кислота [64]
СООН
I
CO-NH-CH
I I
сн2 СН2ОН
I
н-с-он
(СН2)6СН3
N- (D -3 - оксидеканоил)-l - серив
сиолипин Л [174]
(CH2)4-NH2
I
h,co-nh-ch-co-or2
Эфиры жирных кислая и N*-ацил- L-лазала,
R)COOH - нормальные, разветвленные и /3-оксиразветвленные кисло-
ты, R2_ОН — высшие полиолы;
сиолипин Б — ряд аналогичных производных N-ацил- L -орнитина*.
1.14.2. О- Ацилкарншюмы
Это соединения обшей формулы
СООН
I где RCO — остатки нормальных жир—
СН2 них кислот от С, 0 до С1в
RCO-O-CH-CH2-N(CH3)j
1.14.3. ЛипопетяиОы
Такие липиды встречаются в бактериях, принадлежащих к Мусо-
acteriaceae н Nocardia, и имеют строение N- адилолигопелтипов.
См. дополнение 3 к гл. 1. - Прим, перее. -
Определение и классификация липидов
’7
Липопептиды встречаются также в природе в виде гликозидов, на-
пример гликолипопептидов микобактерий /187/:
СиН51СНСНг- CO NH CH СО -NH -CH-CO-NH - СН-СО -
О О
Г лава 2
МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ
2.1. Растворители
В св яги с большой чувствительностью природных липидов к окис-
лению и гидролитической деградации важно, чтобы используемые
для работы с ними растворители не содержали примесей, вызываю-
щих деструкцию липидов. Кроме того, поскольку даже чистые раст-
ворители, предназначенные для лабораторных работ, могут содержать
до 0,001% нелетучих вешеств, имеется серьезная опасность загряз-
нения липидных экстрактов при использовании больших объемов раст-
ворителей. Примеси посторонних вешеств, занесенные в липидные
экстракты с растворителями, могут легко обнаружиться при дальней-
шем исследовании липидов такими чувствительными современными
методами, как тонкослойная и газожидкостная хроматография, ИК— и
ЯМР-спектроскопия или масс-спектрометрия.
Чтобы избежать такого рода осложненийр'рекомендуется во всех
случаях:
а) использовать самые чистые из числа выпускаемых химичес-
кой промышленностью растворители;
б) перегонять растворители в стеклянной аппаратуре перец упот-
реблением, отбрасывая по крайней мере 10% головной фракции и ос-
тавляя в перегонной колбе примерно такой же объем растворителя;
в) хранить перегнанные растворители в стеклянной посуде (луч-
ше из темного стекла); чтобы избежать загрязнения растворителей
при хранении, можно использовать специальные бутыли с впаянными
Б пришлифованные пробки пипетками (рис. 2.1).
Такие растворители, как бензол, толуол, четыреххлористый уг-
лерод, этилапетат, апетон, можно употреблять после простой пере-
понки и хранить в течение нескольких месяцев.
Другие растворители могут содержать вещества, разрушающие
лВДицы, или накапливать такие примеси при хранении. Так, например,
Небольшие количества альдегидов, содержащиеся Ъ первичных спир-
тах, могут реагировать с амино- и оксигруппами или активировании—
х<и метиленовыми группировками; фосген, образующийся при хранении
Хлороформа и дихлорметана, может реагировать с окси- и аминогруп-
перекиси, накапливающиеся в этиловом эфире, в других диалки—
новых эфирах и в петролейном эфире, окисляют двойные связи.
Материалы и оборудование
Чтобы удалить примеси из перечисленных ниже растворителей,
необходима специальная их обработка.
Спирты. Метиловый, этиловый (95%- или 99%-ный), «-пропило-
вый, изопропиловый спирты перед употреблением необходимо освобо-
дить от альдегидов (или перекисей) перегонкой над гранулированной
гидроокисью калия. Перегнанные спирты можно хранить в темных
склянках 1-2 месяца.
Хлорированные растворители. Из таких хлорированных раствори-
телей, как хлороформ или дихлорметан, необходимо удалить фосген.
Растворитель промывают водой, сушат над
хлористым кальцием и перегоняют. Для того
чтобы предотвратить дальнейшее образова-
ние фосгена, к хлороформу или дихлормета-
ну добавляют около 1% метилового или эти-
лового спирта и хранят в темных склянках.
Свежий продажный хлороформ, в котором
еще не накопилось заметного количества
фосгена, можно перегонять без предвари-
тельной промывки его водой.
Диалкилоеые эфиры, углеводороды к пет-
ролейный эфир. Свежие партии этилового
эфира, углеводородов (гексана, гептана и
т. д.) или петролейного эфира в том случае,
если они не содержат перекисей, можно ис-
пользовать после однократной перегонки.
Чтобы определить, содержатся ли в несме-
тнее юшихс я с водой растворителях переки-
си, поступают следующим образом.
2 мл растворителя встряхивают с 1 мл
свежеприготовленного 10%-ного раствора
KI, к которому предварительно добавляют
1 каплю раствора крахмала. Если в раст-
ворителе содержатся перекиси, то сразу же
появляется голубое окрашивание.
Чтобы удалить перекиси, которые, по-
Р и С. • 2.1. Склянка для
растворителей с пришли-
фованной пробкой и пипет-
кой.
1 - склянка объемом 2 или
1 л; 2- пипетка на 10 или
5 мл.
мимо всего прочего, еще н взрывоопасны,
растворитель встряхивают с 20%-ным (об.%) раствором сульфата
железа(П) в 1 н. серной кислоте, затем с 100 мл воды, сушат
над хлористым кальцием и перегоняют. Этиловый эфир можно осво-
бождать от перекисей и одновременно абсолютировать обработкой
алюмогидридом лития.Последний небольшими порциями (из расчета 5-
10 г/100 мл) осторожно прибавляют к растворителю, кипятят 1-
2 ч с обратным холодильником и перегоняют.
Диоксан и тетрагидрофуран, которые накапливают взрывоопас-
ные перекиси при хранении, также можно освободить от перекисей
'и от БОПЫ)> используя апюмогидрид лития. К растворителю неболь-
шими порциями (из расчета 10 г/100 мл) осторожно добавляют
.дюмогидрид лития, осторожно кипятят 1-2 ч и затем перегони- -
}СТ /96/.
Метопы очистки таких растворителей, как пиридин, сероуглерод,
метилэтилкетон, высшие спирты, метилпеллозольв и др., сравнитель-
но редко применяемых в липидологии, приведены в работах /96,336/.
2.2. Вешества-стандарты
В последние годы проводить анализ природных липидов стало
значительно легче, так как в продаже появилось большое число чис-
тых индивидуальных вешеств, относящихся практически ко всем клас-
сам липидов. Многие типы липидов - углеводороды, спирты, жирные .
кислоты - продаются в виде наборов, содержащих известные коли-
чества индивидуальных членов гомологических рядов (как не мечен-
ных, так и меченных 14С ). В табл. 2.1 приведены некоторые фирмы,
выпускающие липиды-стандарты, и перечислен ассортимент этих стан-
дартов.
Таблица 2.1
Липиды-стандарты, поступающие в продажу3
Фирма Вещества-стандарты
Analabs Жирные кислоты и их эфиры^ (С2 — нормаль- ные насыщенные и ненасыщенные, изо—, антеизо—, изопреноидные, окси-, кето- и дикарбоновые Алифатические альдегиды: нормальные насыщенные (С,о ~ ^2в) Кетоны (С3 — С47) Алифатические спирты: нормальные насыщенные и ненасыщенные (С6 — Сзо) Углеводороды: нормальные насыщенные и ненасы-^ шейные, разветвленные (С6 — С30) Воски Алкиловые эфиры глицерина Моно-, ди- и триглицериды® Алкилсульфаты (Св — С20) Стероиды, эфиры стеринов
Applied Science Laboratories Фосфолипиды, цереброзиды Жирные кислоты и их эфирьДв 7Св — Cjj): нормаль- ные насыщенные и ненасыщенные, изо-, антеизо-, окси- и дикарбоновые Алифатические спирты (Cg — С24)б Углеводороды (Св — С42)б
Про олжение таол. %.'
Фирма В ешества-станпарты
Моно-, ди- и триглицериды®*3 Стероиды®, эфиры стеринов® Фосфолипиды6.цереброзиды, гликолипиды, сульфоли- пиды
Calbiocbem Жирные кислоты и их эфирь? (Се-С^): нормальные насыщенные и ненасыщенные Углеводороды нормального и изопреноидного ряда Глицериды Витамины A, D, Е, К Моноалкиловые эфиры глицерина Стерины, стероиды -Фосфатиды
Chemed Стероиды®, эфиры стеринов Жирные кислоты и их эфиры Алифатические спирты
General Biochernicals Глицериды Стероиды, эфиры холестерина Фосфолипиды, цереброзиды
Hormel Жирные кислоты и их эфиры® (Св — С22): нормальные насыщенные и ненасыщенные Алифатические спирты Моно-, ди- и триглицериды® Эфиры холестерина®
ICN Жирные кислоты6, стеринь?, глицериды®, фосфоли- пиды6
Koch-Light Жирные кислоты и их эфиры (Св-С18): нормальные насыщенные и ненасыщенные Алифатические альдегиды Кетоны Алифатические спирты Углеводороды: нормальные и изопреноидные Алкиловые эфиры глицерина Витамины A, D, Е, К Стероиды, эфиры стеринов Фосфатиды, цереброзиды, ганглиозиды Литадиндифосфатдиглипериды
Lachat Жирные кислоты и их эфиры® (С2—С44): нормальные насыщенные и ненасыщенные, дикарбоновые Кетоны Алифатические спирты® Алкиламины® Углеводороды1'
Mann Research Жирные кислоты и их эфиры® (Св — С22): нормальные насыщенные и ненасыщенные
Продолжение табл. 2.1
Фирма Вещества-стандарты
Nu Chek Prep Алифатические спирты, фитол Моно-, ди- и триглицериды6 Алкилсульфаты и алкилсульфонаты Фосфолипиды0 Эфиры холестерина Витамины A. D, Е. К Жирные кислоты и их эфиры6
Miies>Jeda Алифатические спирты0 Глицериды У глеводороды6 Э^иры холестерина Алкилметансульфонаты Воски Сфингозины, керамиды, цереброзиды и другие
сфинголипиды •
Pierce Chemical Лигнонериновая и транс- гексадепен-2-овая кис- лоты _ Жирные кислоты и их эфиры: насыщенные и иена-
Co. сышенные
P.L. Biochemicala Моно-, ди- и триглипериды Моноалкиловые эфиры глицерина Эфиры стеринов Фосфолипиды, цереброзиды, ганглиозиды, сугъфатиды Жирные кислоты, эфиры жирных кислот и кофермен-
Serdary та А, глицериды, фосфолипиды, гликолипиды Эфиры холестерина
Sigma Chemical Моно-, ци и триглипериды6 Алкиловые эфиры глицерина6 Фосфолипиды (природные и синтетическпе) Жирные кислоты и их эфиры
Supelco Алифатические спирты Глицериды Фосфолипиды Цереброзиды, ганглиозиды Жирные кислоты и их эфиры6 (С12-С2в): нормальные
• насыщенные и ненасыщенные
Моно-, ди- и триглипериды Эфиры холестерина6 Фосфолипиды6 Цереброзиды, ганглиозиды, сульфолипиды
Steraloids Стерины. стероиды
& Перечень липидов-стандартов, выпускаемых Главхимреактивом, см. в
дополнении 1 к гл. 2. - Прим, иерее.
6 Имеются наборы для качественного и (или) количественного анализа ме-
тодами ТСХ и ГЖХ^
в Имеются меченые липиды.
Материалы в оборудование
63
2,3. Стеклянная посуда
При работе с лпшдами очень важно исключить все материалы,
из которых органические растворители могут извлечь смазки или
пластификаторы. Поэтому все операции следует проводить в стеклян-
ной аппаратуре со стандартными пришлифованными пробками и разъе-
мами. Нет необходимости напоминать о том, что смазкой для шли-
фов пользоваться нельзя. Если же смазка необходима, следует убе-
диться, что данный растворитель ее не извлекает. Последнее заме-
чание относится, в первую очередь, к стеклянной посуде с кранами,
в частности, к делительным воронкам, хроматографическим колонкам
и т. д. В этом случае можно использовать тефлоновые краны, ио
сначала следует удостовериться, что органические растворители из
материала ничего не извлекают. Необходимо подчеркнуть, что колбы
или пробирки нельзя закрывать корковыми или резиновыми пробками
или прикрывать их полиэтиленовой пленкой. Во всех случаях долж-
ны использоваться только стеклянные пробки, если же это невоз-
можно, то колбы или пробирки можно прикрывать алюминиевой фоль-
гой. При работе с липидами чаше всего употребляется следующая
специальная стеклянная посуда.
2.3.1, Пинетки
Калиброванные пипетки (0.1; 0,2; 0,5; 1,0; 2.0 и 5,0 мл)
с сильно оттянутым носиком для отбора аликвотных проб липядных
растворов.
Микропипетки (50 и 25 мкл с пеной деления 5 я 1О мкл)
для работ с мечеными соединениями и для нанесения веществ на
хроматограммы.
Капиллярные трубки (1; 5; 10; 25 и т. о. мкл; производятся
“Kensington Scietific Corp.”) Для нанесения растворов липидов на тон-
кослойные или бумажные хроматограммы.
2.3 2. Пробирки
Калиброванные или иекалиброванные конические центрифужные
пробирки со стандартными коническими пробками (12; 15; 40 и
50 мл) для экстракции и распределения липидов по методу Блайя
и Дауэра /38/.
Пробирки (16x150 мм, ~20 мл) со стандартных® коническими
пробками для колориметрического анализа и для работы с фермен-
тами.
Калиброванные или некалиброванные пробирки (1,0 я 3,0 мл;
выпускаются “Cleneo ineV) с хорошо притертыми стандартными кони-
ческими пробками для хранения растворов липидов известной кон—
централин.
64
Глава Я
Толстостенные пробирки из стекла пирекс (пробирки Льюисе »
Бенедикта для определения сахара в крови, 20x200 и 19х 190мм,
калиброванные на 12,5 и 25 мл) для определения липидного, фосфо»
ра и сахаров’".
2 3.3. Специальные колбы для гидролиза липидов
и экстракции гиоролизамов [157]
Такие колбы (выпускаемые “ КайееGiaws Со”) исключительно попое-
ны при проведении анализа большого числа образцов липидов мето-
дом ГЖХ. В одной и той же колбе производится гидролиз или мета-
нолиз липидов и разделение и экстракция продуктов гидролиза. По-
скольку продукты гидролиза не переносятся в какую-либо фугую
емкость, анализируемые вешества не теряются, и работа может ус-
пешно проводиться с полумикроколичествами вешеств.
Коническая колба Эрленмейера из стекла пирекс емкостью 50 мл
со стандартным коническим шлифом (19/16, 19/22 или 19/36)
снабжена боковым отростком емкостью око-
ло 5 млГ впаянным в боковую стейку пер-
пендикулярно поверхности колбы на расстоя-
нии приблизительно 1 см от шлифа (рис. 2.2).
В колбе таких размеров удобно обрабаты-
вать образцы липидов от ОД до 100 мг.
Размеры прибора могут быть пропорциональ-
но увеличены; так, в колбе емкостью 125 мл
с боковым отростком, вмещающим 10-15 мл
жидкости, можно гидролизовать образам
липидов (fp 5 г.
В ор^саикых колбах можно проводить
работу с любой парой несмешиваюшкхся
растворителей, если анализируемые вешест-
ва переходят при экстракции из нижней
фазы в верхнюю. Объем нижней фазы под-
бирают с таким расчетом, чтобы она пол-
ностью заполняла боковой отросток (~5 мл); объем верхней фазы
при этом должен составлять 5-10 мл. После встряхивания смеси
и расслоения фаз колбу осторожно поворачивают на бок, так, чтобы
нижняя фаза заполнила боковой отросток, а верхняя могла бы сво-
бодно сливаться в соответствующую емкость. (Отделять всю верх-
нюю фазу не обязательно.) Затем горло колбы смывают раствори-
телем, используемым для экстракции, прибавляют еше некоторое ко-
Рис. 2.2. Колба для
гидролиза липидов и эк-
стракции продуктов гид-
ролиза (колба Эрленмейе-
ра емкостью 50 мл со
стандартным! шлифами
19/16, 10/22 или 19/38)
[1571.
* Перечень лабораторной посуды из стекла, фарфора и кварца, выпускае-
мой в СССР или поставляемой иностранными фирмами, можно найти в катало-
ге. См. "Каталог приборной продукции номенклатуры Союзглавприбора",
часть VI, М., 1972. — Прим, царев.
Материалы » оборудование 85
лпество верхнее фазы и повторяют экстракхию и разделение слоев
не менее орух раз. При миогократвой экстракпии практически всег-
да достигается копнчеСтвеквов разделение веществ, содаржалжхоя
в верхней и нижней фазах.
Наиболее употребительными смесями растворителей явшвотея
метанол - вода (4:1 или 9:1 по объему^ к петролейиый афир
(т. кип. 30-60^0) или этанол - вода (1:1 по объему) и петрояей-
ный афер. Эти сзстемы очевь редко дают эмульсии. Если применя-
ется петролейиый эфир, экстракты содержат очень мало воды, и их мо*-
80 упаривать без предварительной обработки осушающими агентами.
2.4. Испарители
В зависимости ст количества растворителя, который иеобходкмо
удалить, в пвшаояопи используются два метода упаривания. '
Рис. XX Лабораторный прибор дд> упаривания растворителей в токе ЖЭМНк'-
65
Глава 2
2.4.1. Упаривание растворителей в токе азота
Небольшие объемы растворов (10—15 мл и менее), находящих-
ся в небольших пробирках, удобнее всего упаривать, непосредствен-
но пропуская ток азота над поверхностью раствора, слегка подогре-
того на водяной бане ( —30°С). На рис. 2.3 показан простой лабо-
раторный прибор для упаривания растворителей таким способом. Ои
состоит из двух основных частей: 'кольца для подачи азота'
( а, рис. 2.3) и алюминиевого блока-подставки ( б, рис. 2.3). 'Кольцо
для подачи азота' (детальную конструкцию см. на рис. 2.4) пред-
назначено для направления тока азота на поверхность восьми об-
разцов, помешенных в центрифужные пробирки или колбы Эрленмей-
еоа. Это стеклянное пирексовое кольцо с вводом для азота и во-
семью отверстиями, к которым присоединены короткие отрезки теф-
Р и с. 2.4. "Кольцо для подачи азота” (см. рис. 2.3).
1 — ппрексовое кольцо; 2 - тефлоновая трубка; 3 - пипетка с оттянутым кок-
ком, 4 — пробка; 5 — ввод азота.
Материалы к оборудование
67
лоновой трубки, оканчивающиеся стеклянными пипетками с сильно
оттянутыми концами (в, рис. 2.3). Если число упариваемых образ-
цов меньше восьми, лишние отверстия в пирексовом кольце можно
закрыть специальными стеклянными пробками (t, рис. 2.3). Алюми-
ниевый блок-подставка рассчитан на восемь центрифужных пробирок
емкостью 15 мл или (и) на четыре колбы Эрленмейера; отверстия
для пробирок или колб высверлены в самом блоке (рис. 2.5). Блок-
подставка и кольцо для подачи азота расположены на опном штати-
ве таким образом, чтобы пипетки приходились точно над центрами
пробирок или колб и чтобы их легко было вводить в отверстия. Блок
подставку помещают в термостатируемую водяную баню. Последнюю
удобно ставить на лабораторный подъемный столик и поднимать или
опускать в зависимости от того, как глубоко надо вводить пипетки
•в пробирки с упариваемыми растворами (рис. 2.3).
Рис. 2.5. Алюминиевым блок-подставка (см. рис. 2.3).
1 — алюМинневый блок; 2 - отверстия для пробирок; 3 — отверстие для веерлло-
метра; 4 — отверстия оля колб.
68
Глава 2
В продаже имеется также более сложный прибор для одновре-
менного упаривания 12 образцов (N-Evup. Model 10, "Organomalion Assoc")
2.4.2. Роторные испарители
Упариьание растворителей с помощью роторного испарителя яв-
ляется наиболее эффективным и рациональным способом концентриро-
вания больших объемов липидных растворов. Используя роторный -ис-
паритель. можно быстро при. низкой температуре упарить раствор да-
пипот. не опасаясь загрязнить его смазками. Показанный на рис. 2.6
В и с. 2.6. Роторный испаритель " Buchi Rota vapor".
прибор (Buchi Rotavapor; "V. Buchi Co”. ) снабжен специальной ловушкой
(рис. 2.7). Такой испаритель особенно удобен для работы с липи-
дами, так как пары растворителей и жидкие растворители не контак-
тируют с какими-либо смазанными поверхностями*.
Упаривание растворителей с помощью роторного испарителя про-
изводится обычно в вакууме водоструйного насоса (10-20 Им рт. ст.).
Температуру упариваемого раствора, как правило, поддерживают
См. дополнениеJLк гл. 2. - Прим, перее.
Ммериалы « оборудование
6S
в интервале 30-35 °C с помошью термостатяруемой водяной бани.
Если в растворе имеется вода, то ее также можно удалить при от-
носительно низкой температуре в виде азеотропной смеси с бен-
золом или этанолом.
Растворители не следует упаривать досуха; по окончании упа-
ривания прибор лучше заполнять не воздухом, а азотом. Для этой
пели, а также для того, чтобы избежать потерь вещества при реэ-
Р и с. 2.7.. Ловушка с краном.
1 - тлиф-муфаа 24/40, 2 - мефло-
новый кран; 3 - тлнф-керн 24/40.
ком вспенивании раствора, применяют ловушку с краном, изображен-
ную на рис. 2.7. При работе с роторным испарителем ловушку по-
мещают между колбой с раствором и самим испарителем.
2.5. Аналитические приборы*
Этот раздел не претендует на детальное описание всех приборов,
имеющихся в настоящее время в продаже. Ниже просто будут пере-
числены основные виды аналитических приборов, которые, по мне-
* Описание аналитических приборов, выпускаемых в СССР, см. в допол-
нении 2 к гл 2 - Прим, перее.
70
"лава 2
нию автора настоящей книги, необходимы для анализа природных ли-
пидов* .
2.5.1. Колориметры
Для колориметрических анализов в интервале длин волн от 350
до 800 нм используются колориметры со специальными кюветами
или пробирками. В продаже имеются следующие типы колориметров:
Beckman; Model В Spectrophotometer, Coleman Junior it Spectrophotometer: Uni-
cam Model SB 600- Gilford Spectrophotometer с автоматическим вводом
образцов и выходом на ЭВМ**
2.5.2. Самопишущие спектрофотометры
оля работы в видимой и ультрафиолетовой областях спектра
Для автоматической записи УФ-спектров или спектров видимой
области применяются колориметры с рабочим интервалом длин волн
200-850 нм. В продаже имеются следующие типа приборов: Baush
and Lomb. Spectronic 505; Beckman .Model DBG: Cary Model 11 M; Perkin Elmer
Mode] 202; Unicam Model SP 800.
2.5.3. Саморишушие И К-спектрофотометры
Для автоматической записи ИК-спектров применяются спектро-
фотометры с рабочим интервалом длин волн 4000-650 см-1 . В про-
даже имеются приборы: Baush and Lomb Spectronic 270; Beekman Model IR-2!
Perkin-Elmer Mode! 700 или 24; Pve-Unicam.
2.5.4. Спектрометры ядерного магнитного резонанса
Применяются для записи спектров протонного магнитного ре-
зонанса при частоте 60 МГц. В продаже имеются приборы***: Vail ап
ТбО: Perkin-Elmer Model R 10.
2.5.5. Масс-спектрометры
Используются для определения молекулярного веса и для окон-
чательной идентификации веществ. Рабочий диапазон современных
масс-спектрометров от 1 до 2000 m /е. В комбинации с газожид-
костным хроматографом масс-спектрометры можно использовать для
” Более подробное описание аналитического оборудования и приборов, по-
ставляемых рядом фирм, приведено в каталоге Американского химического
Общества "ACS Laboratory Guide" ( American Chemical Society Publication, Wa-
shington, 1970) И в каталоге " Guide to Scientific Instruments" (Science, 19A
September, 1970).
* * См. дополнение^ к гл. 2. — Прим, neves.
••• См. дополнение 3 к гл. 2. — Прим, пер ее.
Материалы и Моруоование
71
идентификации компонентов смесей веществ, соответствующих от-
цельным пикам на хроматограмме. В продаже имеются масс-спек-
тпомэтры: A.E.I. MS-9; Atlas-Werkc Model CH-4; Hitachi-Perkin-Elmer RMIJ-6;
Shimadzu-LKB 9000; Varian MAT Mode! CH-7* **.
2.5.6. Поляриметры
В настоящее время выпускаются поляриметры с автоматическим
отсчетом углов вращения с точностью +0,001° при длинах волн
589, 578, 546, 436 и 365 нм. например приборы Bendit или Рег-
kin-Eimer Model 141.
2.5.7. ('пектрополяриметры
Современные самопишущие спектрополяриметры применяются
ап.-, определения дисперсии оптического вращения в интервале длин
воль ~ 185 по 650 нм. В продаже имеются приборы: Cary Model 60;
Iblrrum-.lasv — 1’erkin Elmer ModelP22; Shimadzu Model QV-50.
2.5.8. Газожидкостные хроматографы
Применяются для разделения смесей летучих веществ путем
распределения между подвижной газовой фазой (азот, гелий, аргон
ит. ц.) и неподвижной жидкой фазой (нелетучая жидкость, нане-
сенная на инертный твердый носитель) на стеклянных или металли-
ческих колонках в изотермическом режиме или при программирова-
нии температуры. В соответствии с этим выпускаются хроматогра-
фы со сдвоенными колонками и сдвоенными (пламенно-ионизацион-
ным;; и(или) термоионными и аргоновыми) детекторами, рассчитан-
ные на работу в изотермическом режиме или при повышении темпе-
ратуры в ходе анализа. Ниже приведены некоторые типы имеющихся
в продаже газожидкостных хроматографов: Barber-Colman, 500 series;
Beckrnan GC-M; Carlo-Erba Model GT; Hewlett-Packard (F&M) Model 5750; Pa-
ckard series 7300; Perkin-Elmer Model F7G: Pve series 104; Vprian (Aerograph)
series 1700 and 1800‘*.
* Упомянутый н разд. 2.5.5 прибор "Shirnadzu-LKB-9000" выпускался
фирмой "L.KB" 'Стокгольм, Швеция) Принятое название прибора "LKB-9000";
это хромато-масосиектрометр, т е. прибор для комбинированной газожидкост-
ной хроматографии и масс-спектрометрии.
Начиная с 1974 г. фирма "LKB" прекратила выпуск прибора LKB-9000,
заменив его еше более совершенной моделью — хромато-масс-спектрометром
LKB-9000S. - Прим, перев.
**См. дополнение Ьк гл. 2. — Прим, перев.
Глава 3
f*****»*"»**» т- " -Т 1 11»г - I > - - г.ип-- ГО- • - I. I
ЭКСТРАКЦИЯ липидов
3.1. Обшие соображения
В идеальном случае процедура экстракции липидов солжна при-
водить к количественному извлечению клеточных липидов в неизме-
ненном виде. Липидный экстракт не должен быть загрязнен нелипип-
ными веществами, такими, как сахара и аминокислоты. Эффективность
экстракт™ липидов в значительной степени зависит от химической
природы липидных компонентов и от вида комплексов, которые обра-
зуют липиды в клетке с другими трассами природных соединений. Из-
вестны три основные типа взаимодействия липиаов с другими вещест-
вами.
Во-первых, ван—дер-ваалърово гидрофобное взаимодействие 'ней-
тральных" или неполярных липидов, таких, как эфиры стеринов, гли-
цериды, углеводороды, каротиноиды, которое связывает относительно
слабыми нексвалентными связями их углеводородные цепи с другими
липидами или с гидрофобными участками белков. Такое взаимодейст-
вие осуществляется, в частности, в жировой ткани, хиломикронах,
комплексах альбумина с жирными кислотами, жировых образованиях
микробных клеток и т. и.
Во-вторых, образование водородных связей - электростатическое
или гидрофобное взаимодействие, при котором полярные липиды (фос-
фатиды, гликолипиды, холестерин) образуют связи с протеинами, как
это имеет место в плазматических мембранах, митохондриях, эндо-
плазматическом ретикулуме и липопротеинах сыворотки.
В-третьих, образование комплексов, в которых жирные кислоты
(нормальные или разветвленные) и оксикислоты связаны ковалентны-
ми связями (сложноэфирными, амидными или гликозидными) с поли-
сахаридами, как это имеет место в липополисахаридах клеточных сте-
нок бактерий.
Из комплексов, образованных в результате ван-дер-ваальсового
гидрофобного взаимодействия, липиды можно экстрагировать относи-
тельно неполярными растворителями, такими, как этиловый афир,
хлороформ или бензол. Липиды, связанные в мембранах, экстрагиру-
ются полярными растворителями, такими, как этанол или метанол,
разрушающими водородные связи и нарушающими электростатическое
взаимодействие липидов с белками. Ковалентно связанные липиды
Экстракция липиОос
73
не экстрагируются никакими растворителями; их можно выделить,
лишь расщепив комплекс с помощью кислотного или щелочного гидро-
лиза.
При выборе метода экстракции необходимо принимать во внима-
ние и химическую природу липидов. Обычно, чтобы предотвратить
окисление двойных связей, непосредственно перед проведением эк-
стракции растворители перегоняют и удаляют из них перекиси.
Растворители, применяемые для извлечения высоконенасыщенных
липидов, следует дезаэрировать, пропуская через них азот, и затем
все операции проводить в атмосфере азота. Липидные экстракты
не следует ни упаривать досуха, ни оставлять в упаренном виде
на долгое время; извлеченные липиды надо как можно скорее раст-
ворять в подходящем растворителе. Температура, при которой про-
водится экстракция, должна быть не выше комнатной (или ниже, ес-
ли это необходимо) для того, чтобы затормозить окисление и гидро-
литическое растепление липидов. Старые способы экстракции кипя-
щим растворителем в аппарате Сокслета должны быть исключены.
Другой фактор, который следует принимать "во внимание, особен-
но при работе с растительными материалами, это ферментативная
деградация липидов во время экстракции. Вообще содержащие спирт
смеси растворителей вызывают дезактивацию большинства фосфати-
да з и липаз. Более стабильные ферменты разрушаются при 1-2-ми-
нутном контакте с кипящей водой или горячим спиртом. Однако не-
которые части растений, как, например, зеленые листья, содержат
очень стабильный фермент - фосфолипазу D, которая дезактивирует-
ся только при погружении листьев на 1 мин в кипящую воду или
при экстракции кипящим изопропиловым спиртом в течение несколь-
ких минут.
Из сказанного выше следует, что спирт является необходимым
компонентом всех смесей, употребляемых для экстракции липидов,
так как он разрушает комплексы липидов с белками, растворяет ли-
пиды и дезактивирует ферменты, вызывающие расщепление липидов.
Однако смеси растворителей, содержащие спирт, наряду с липидами
экстрагируют содержащиеся в клетках нелипидные вещества, такие,
как сахара, аминокислоты, соли и т. д. Поэтому неочищенный липид-
ный экстракт нужно обработать так, чтобы удалить все водораство-
римые примеси. Наиболее распространенной процедурой такого рода
является промывка экстракта водой, приводящая в некоторых случа-
ях к образованию очень стабильных эмульсий. Освобождают липиды
от нелипидных примесей, также пропуская неочищенные экстракты
через колонки, заполненные пеллюлозой или сефадексом /275/,
или проводя диализ через специальные мембраны.
Одним из наиболее часто применяемых и эффективных способов
экстракции липидов является экстракция липидов по Блайю и Дайэру
74
Глава 3
/38/ - упрошенный вариант ''классической* методики Фолча /97/.
Пои экстракции липидов по этому методу используют однофазную
систему растворителей хлороформ - метанол - вода (1:2:О,8 по
| объему), которая быстро и эффективно извлекает липиды. Экстракт
I разбавляют одним объемом воды и одним объемом хлороформа. В ре—
I зультате образуется двухфазная система, нижний слой которой со-
стоит из хлороформа, а верхний - из смеси метанола и воды
(1,0:0,9).'Водорастворимые нелипидные примеси переходят в водно-
метанольныи слой, в то время как в хлороформном слое остаются
липиды, практически свободные от загрязнений.
Этот способ был модифицирован применительно к различным
тканям. Детальное описание методик экстракции липидов из живот-
ных и растительных тканей, а также из клеток микроорганизмов
приведено ниже.
3.2. Экстракция липидов из животных тканей
Процедура экстракции липидов из животных тканей, таких, как
печень крыс, сводится к следующему. К 6-7 г свежей печени при-
бавляют 3 мл воды и 30 мл смеси хлороформ-мстанол (1:2) и
ткань гомогенизируют в гомогенизаторе с ножамй* (емкость 60 мл)
в течение 2 мин при комнатной температуре. Для измельчения тка-
ни можно также использовать гомогенизатор Поттера - Эльвехейма
k Potter- Elvehjem ). но в этом случае ткань сначала гомогенизируют
в воде и лишь потом добавляют растворители. Гомогенат центрифу-
гируют. супернатант декантируют и остаток реэкстрагируют 38 мл
смеси хлороформ - метанол - вода (1:2:0,8) в гомогенизаторе
в течение 2 мин. Ткань отделяют центрифугированием, объединен-
ные супернатанты разбавляют 20 мл хлороформа и 20 мл воды.
Водно-метанольную и хлороформную фазу разделяют центрифугирова-
нием или отставанием в делительной воронке. Нижний хлороформный
слой концентрируют на роторном испарителе при 30—35°C (чтобы
удалить следы воды, прибавляют бензол и упаривают его в вакууме)
Остаток растворяют в 1О мл хлороформа.
а.З. Экстракция липидов из растительных тканей (1601
Для извлечения липидов из нефотосинтезируюших растительных
тканей 1например, морковь) или из фотосинтезирующих тканей (на-
пример, листья шпината), содержащих легко дезактивируемые фер-
менты, применяется модифицированный метод Блайя и.Дайэра. 100 г
свежего шпината или моркови мелко нарезают и сразу же запивают
300 мл смеси хлороформ - метанол (1:2 по объему). Смесь гомо-
* Гомогенизатор Lourdes ИЛИ Sorvall Omnimixer.
“Экстракция липидов
75
генизируют в течение 2 мин в гомогенизаторе с ножаъш. Гомогенат
фильтруют на воронке с отсасыванием, оставшуюся на фильтре ткань
повторно гомогенизируют в смеси 300 мл хлороформ — метанол
(1:2) и 80 мл воды. Гомогенат фильтруют, остаток промывают
на фильтре 150 мл смеси хлороформ — метанол (1:2). К объединен-
ному фильтрату прибавляют 250 мл хлороформа и 290 мл воды.
Хлороформный и водно-метанольный слои разделяют в делительной
воронке. Хлороформный слой разбавляют бензолом и концентрируют
в вакууме. Остаток немедленно растворяют в 25 мл хлороформа и
в случае необходимости осветляют центрифугированием.
Для экстракции липидов из листьев таких растений, которые
содержат относительно стабильные ферменты, вызывающие деграда-
цию липидов (бобовые, сахарная свекла), используется следующая
методика /166/. 100 г свежих листьев бобов мелко нарезают и
сразу же порциями прибавляют к 300 мл горячего иэопропанола.
Смесь гомогенизируют 1-2 мин в гомогенизаторе с ножами. Горя-
чий гомогенат фильтруют с отсасыванием, остаток на фильтре про-
мывают горячим изопропанолом (200 мл), снова гомогенизируют
его с 200 мл смеси хлороформ - иэопропанол (1:1). Гомогенат
фильтруют, остаток промывают на фильтре сначала смесью хлоро-
форм-изопропанол (1:1) и в заключение хлороформом. Объединенные
фильтраты упаривают в вакууме, остаток растворяют в хлороформе
(200 мл) и раствор несколько раз промывают водой (порциями
по 100 мл) или 1%-ным раствором хлористого натрия. Хлороформ-
ный раствор разбавляют бензолом и упаривают досуха в вакууме
при 30-35°С. Остаток немедленно растворяют в хлороформе (25мл),
раствор в случае необходимости осветляют центрифугированием.
3.4. Экстракция липидов из микроорганизмов
Из большинства микроорганизмов (бактерий, водорослей, дрож-
жей и вирусов) липиды экстрагируют из влажных бактериальных
клеток по модифицированной методике Блайя и Дайэра /38/. При
работе по этой методике клетки бактерий не гомогенизируют, так
как они легко распадаются при суспендировании в растворителях,
применяемых для извлечения липидов. Распространенная ранее ме-
тодика растирания лиофилизированной микробной биомассы с песком
в ступке может привести к ферментативной деградации или к окис-
лению липидов. Рекомендуемая процедура заключается в следующем.
Влажную пасту, содержащую 40-50 мг клеток (в расчете на сухой
вес), разбавляют водой до объема 1 мл (в случае галофильных бак-
терий вместо воды используют 0,4 М раствор хлористого натрия).
Суспензию помещают в центрифужную пробирку с пришлифованной
стеклянной пробкой и прибавляют 3,75 мл смеси хлороформ- мета-
нол (1:2); смесь встряхивают и оставляют при комнатной темпера-
76
Глава 3
туре на несколько часов, периодически встряхивая. Клетки осажда-
ют центрифугированием, экстракт декантируют в другую центрифуж-
ную пробирку объемом 15 мл. Микробные клетки снова суспендиру-
ют в 4.75 мл смеси хлороформ - метанол - вода (1:2:0,8 по объе-
му), смесь встряхивают и центрифугируют. К объединенному супер-
натанту прибавляют 2,5 мп хлороформа и 2,5 мл воды; хлороформ-
ный и водно-метанольный слои разделяют центрифугированием. Ниж-
ний хлороформный слой разбавляют бензолом и упаривают досуха
в вакууме на роторном испарителе (30—35°С). Остаток липидов
сразу же растворяют в смеси хлороформ — метанол (1:1), раствор
центрифугируют и доводят хлороформом до нужного объема.
Вес анализируемого образца и соответствующие объемы раст-
ворителей можно увеличить в 2—4 раза; экстракцию при этом про-
водят в центрифужных пробирках на 50 мл с пришлифованными стек-
лянными пробками. Большие количества микробных клеток экстраги-
руют в колбах Эрленмейера подходящего объема с пришлифованными
стеклянными пробками, смесь клеток с растворителями фильтруют
с отсасыванием, хлороформный и водно-метанольный слои разделяют
в делительной воронке (см. разд. 3.3).
3.5. Экстракция липидов из субклеточных частиц,
клеточных элементов и плазмы крови
а. Субклеточные фракции, такие, как митохондрии, микросомы,
хлоропласты, хромопласты и другие клеточные мембраны, можно
экстрагировать тем же самым методом, что и микроорганизмы
(см. разд. 3.4). В центрифужную пробирку емкостью 15 мл с при-
шлифованной стеклянной пробкой помешают 1 мл суспензии субкле-
точных фракций в сахарозе или какой-либо другой водной среде (со-
держащей 50 мг вещества в расчете на сухой вес) и прибавляют
3,75 мл смеси хлороформ - метанол (1:2 по объему). Смесь вы-
держивают в течение 1—2 ч, периодически встряхивая, центрифуги-
руют, супернатант переносят с помощью пастеровской пипетки в дру-
гую центрифужную пробирку, а остаток еше раз экстрагируют
4,75 мл смеси хлороформ — метанол - вода (1:2:0,8 по объему).
Объединенные экстракты разбавляют 2,5 мл хлороформа и 2,5 мл
воды. Хлороформный и водно-метанольный слои разделяют центрифу-
гированием. Хлороформный спой разбавляют равным объемом бензо-
ла и упаривают досуха в токе азота при 30°С. Остаток сразу же
растворяют в известном объеме хлороформа.
б. Липиды клеточных элементов и плазмы крови экстрагируют
следующим образом.
Реагенты. В 1л воды растворяют 0,73 г тринатриевой
соли лимонной кислоты, 0,35 г лимонной кислоты и 0,1 г глюко-
зы, На 100 мл цельной крови берут 15 мл полученного таким обра-
Экстракция липиОов
77
зам цитратного раствора. Физиологический раствор готовят, раство-
ряя 0,9 г хлористого натрия в 100 мл воды.
Методика. Смесь 1,0 мл цельной крови и 0,1 мл цитрат-
ного раствора центрифугируют и удаляют плазму с помощью пасте-
ровской пипетки так, чтобы не затронуть промежуточный слой бес-
цветных клеток. Клеточные элементы суспендируют в 1,0 мл 0,9%-
ного раствора хлористого натрия (физиологического раствора), сус-
пензию снова центрифугируют, супернатант присоединяют к плазме,
а клетки еше раз суспендируют в 1,0 мл физиологического раство-
ра. К 1,0 мл суспензии клеток или к 1,0 мл плазмы, объединенной
с промывным раствором, прибавляют 3,75 мл смеси хлороформ -
метанол (1:2 по объему) и экстрагируют липиды, как это описано
выше для субклеточных и мембранных фракций.
3.6. Экстракция липидов из других биологических материалов
Экстракция липидов из яичного желтка по методу Блайя и Дай-
эра /38/ детально описана в работе /344/.
3.7. Хранение липидных экстрактов
В связи с тем, что липиды при хранении всегда в той или иной
степени окисляются и гидролизуются, липидные экстракты не следу-
ет хранить слишком долго (не более 1-2 лет). Лучшие результаты
всегда получаются при анализе свежих экстрактов. Если же липиды
надо сохранять в течение сравнительно непродолжительного времени
(от нескольких дней до нескольких недель), лучше всего растворить
их в смеси свежеперегнанных хлороформа и метанола (2:1), помес-
тить в мерные колбы с притертыми стеклянными пробками, причем
колбы необходимо заполнить до самого горла, и поддерживать тем-
пературу раствора от О до -15°C. Удобно пользоваться также ка-
либрованными пробирками с пришлифованными стеклянными пробка-
ми (см. разд. 2.3.2). Если срок хранения составляет 1-2 года,
к раствору обычно добавляют антиоксидант - токоферол или 2,6-ци-
трет -бутил-4-метилфенол в концентрации 0,05%. Растворы липидов
следует хранить при -4С°С и более низкой температуре.
Глава 4
ОБЩИЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА
Если лили иные экстракты были получены так, как это описано
в гл. 3, то их следует перенести в мерные колбы и разбавить (обыч-
но для этой цели используется хлороформ) до такого объема, чтобы
концентрация липидов составляла примерно 1%. В случае необходи-
мости из этих растворов приготавливают более разбавленные раст-
воры. Точное определение концентрации растворов проводят как опи-
сано ниже, и аликвотные части исходного раствора или специально
полученных разбавленных растворов используют для различных ана-
лизов. Приведенные ниже аналитические методики являются модифи-
кациями хорошо известных методов, успешно применяемых в тече- .
ние ряда лет. Все эти методики можно использовать для анализа
смесей липидов без предварительного фракционирования последних.
4.1. Определение постоянного веса
Методика. Пипеткой отбирают необходимую аликвотную
часть стандартного раствора с таким расчетом, чтобы в ней содер-
жалось 15-20 мг (но не менее 1О мг) липидных веществ. Раствор
переносят во взвешенную колбу со стеклянной пробкой емкостью
25 мл или в колбу Эрленмейера той же емкости, растворитель уда-
ляют в токе азота при 30° С. Затем колбу помещают в вакуум-экси-
катор над свежей гранулированной гидроокисью калия; содержимое
эксикатора эвакуируют с помощью масляного насоса до остаточного
давления <0,1 мм рт. ст. Через несколько минут эксикатор напол-
няют азотом, колбу закрывают пробкой и взвешивают на аналитичес-
ких весах с точностью до ±0,05 мг. Образец сушат еше некоторое
время в вакуум-эксикаторе и снова взвешивают. Сушку в вакууме
и взвешивания повторяют до тех пор, пока не будет достигнут по-
стоянный вес образца с точностью ±0,05 мг.
4.2. Определение суммарного фосфора
4.2.1. Модифицированная меиодика Аллена[10]
Реагент ы. Хлорная кислома, 72%-ная.
МолибОая аммонал, 8,4%-ный. 4,2 г молибдата аммония растворяют
в 50 мл воды.
-Общие методы анализа
79
А-Мидолавый реагент, 1%-ный, свежеприготовленный. 0,5 г амипо-
па (дихлоргицрата 2,4—диаминофенола) и 10 г метабисульфита нат-
рия растворяют в 50 мл воды; раствор фильтруют.
Стандартный раствор фосфата. 1,097 г КН2РЭ4 растворяют в
250 мл воды; этот запасный раствор разбавляют водой и в резуль-
тате получают рабочий раствор, содержащий 10 мкг Р в 1 мл.
Мето дика. Пипеткой отбирают аликвотную часть раствора
липидов (содержащую 10—100 мкг Р, но не более 2 мг липидов) и
переносят ее в толстостенную пирексовую пробирку (пробирка Льюиса-
Бенедикта для определения сахаров) с пелениями, соответствующи-
ми 12,5 и 25 мл. Растворитель упаривают досуха в токе воздуха
при 35°С, к остатку прибавляют 2,0 мл хлорной кислоты, немного
стеклянных шариков и нагревают пробирку на электрической плитке
или на газовой горелке до тех пор, пока раствор не станет прозрач-
ным и бесцветным. Охлажденный раствор разбавляют водой до
12,5 мл, тщательно перемешивают, добавляют 2,0 мл амидолового
реагента, снова перемешивают, добавляют 1,0 мл раствора молиб-
дата аммония, перемешивают и оставляют на 20 мин до появления
голубой окраски. Окрашенный раствор разбавляют водой до 25 мл,
перемешивают. На спектрофотометре *" Coleman Junior" в круглых пар-
ных кюветах размером 19хЮ5 мм определяют поглощение при
680 нм полученного раствора и раствора холостого опыта. Для по-
строения калибровочной прямой используют аликвотные пробы стан-
дартного раствора фосфата, содержащие от 30 до 60 мкг Р. Закон
Бера соблюдается в интервале 10-100 мкг Р.
4.2.2. Модифицированный микрометод Бартлета [27}
Реагенты. Хлорная кислота, 72%-ная.
Молибдат аммония, 5%-ный.
Амидоловый реагент. 0.5 г амидола (дихлоргицрата 2,4-диамн-
нофенола) растворяют в 50 мл 20%-ного раствора бисульфита на-
трия; раствор фильтруют.
Стандартный раствор фосфата, содержащий 2 мкг Р в 1 мл (см.
разд. 4.2.1).
Методика. К образцу липидов, содержащему от 0,5 до 10 мкг
Р, прибавляют 0,4 мл хлорной кислоты; смесь нагревают в течение
4 мин так, как это описано в разд. 4.2.1, охлаждают, прибавляют 4,2 мл
воды, 0,2 мл амидолового реагента и 0,2 мл раствора молибдата ам-
мония, перемешивают. Затем накрывают пробирку небольшим стаканом,
нагревают? мин на кипядей водяной бане, охлаждают и через 15 мин из-
Подавляющее большинство колориметрических анализов, необходимых
для исследования природных липидов, можно провести на спектрофотометрах
СФ-4, СФ-4а или СФ-16. — Прим, перев.
80
Глава 4
меряют поглощение стойкого голубого раствора при 830 нм в кювете
с I 1 см или при 820 нм в круглой кювете с I 12 мм. При оп-
ределении фосфора по описанной методике 1 мкг Р дает поглоще-
ние около 0,13 или 0,18 соответственно; закон Бера соблюдается
до 10 мкгР. Калибровочную прямую рекомендуется строить по
аликвотным частям стандартного раствора фосфата, содержащим от
1 до 4 мкг Р .
4.3. Определение азота
4.3.1. Определение суммарною азота (метод Кьельдаля)
Реагенты. Смесь оля сжигания. 2.0 rCuSO4* 5Н2О и 1,0 г
SeOz растворяют в смеси 1ОО мл конп. H2SO4 и 100 мл воды.
Раствои борной кислоты. 2,5 г перекристаллизованной борной кис-
лоты растворяют в 1ОО мл воды.
ГиОпоокисъ натрия, 5(7% - «ал. 50 г Na ОН растворяют в 50 мл воды.
ИнОикатои для определения конечной точки титрования. 0,1%-ные
растворы метилового красного и метиленового голубого в аб-
солютном этаноле смешивают в соотношении 10:3; 1 мл смешанно-
го индикатора прибавляют к 100 мл раствора борной кислоты.
Станоартный раствор соляной кислоты, 0,010 н.
Методика. Пипеткой отбирают аликвотную часть раство-
ра липидов (10-25 мг, содержащую 0,1-1,5 mtN), переносят ее
в колбу Кьельдаля емкостью 30 мл. Растворитель удаляют током
воздуха, прибавляют 3 мл смеси для сжигания и нагревают колбу
до тех пор, пока раствор не станет прозрачным и беспветным. Со-
держимое колбы переносят в прибор для микроперегонки по методу
Кьельдаля, используя для ополаскивания 5 мл воды. К раствору при-
бавляют 10 мл 50%-ного раствора гидроокиси натрия и отгоняют
аммиак в колбу Эрленмейера емкостью 50 мл, в которую предвари-
тельно помешают 15 мл раствора борной кислоты с индикатором.
Дистиллат титруют 0,01 н. соляной кислотой до появления серого
окрашивания. Параллельно проводят холостой опыт.
Расчет.
а. Содержание азота (о), мг:
а « vx Сх 14,0,
где v - объем кислоты, пошедшей на титрование образца (с поправ-
кой на холостой опыт), мл; С - концентрация кислоты, г—экв/л.
б. Содержание азота (а-), %:
а'» (а/b) х 100,
где Ъ - вес образца, мг.
Обшие методы анализа
81
4.3.2. Определение аминного азота[188]
Определение аминного азота обычно проводят на смесях интакт-
ных липидов. Оно служит для определения первичной аминогруппы
в фосфатидилэтаноламине, фосфатилсерине, фосфатидиламиноапилглиперв
не и в сфингозиновых основаниях.
Реагенты. Раствор метилцеллозолъеа, 90%-ный. Перегнан-
ный над хлористым оловом метилделлозольв (монометиловый эфир
этиленгликоля) разбавляют водой в соотношении 9:1 (по объему).
Нингидриновый реагент /226/. 2,0 г нингидрина и 3,0 г гидрин-
дантина растворяют в 75 мл перегнанного метилпеллозольва, к по-
лученному раствору прибавляют 25 мл 4 н. буферного раствора
ацетата натрия (pH 5,5), смесь переливают в склянку из темного
стекла и хранят в атмосфере азота.
Буферный раствор ацетата натрия 4 н., pH 5,5. 54,4 г NaOCOCH3* ЗН2О
растворяют в 40 мп воды, прибавляют 10 мл ледяной уксусной
кислоты и разбавляют водой до объема ЮО мл.
Методика. Аликвотную часть раствора суммарных липидов
или хроматографически однородных липидных фракций (содержащую
1—5 мкг или 0.07-0,4 мкмоля аминного азота) переносят в пробир-
ку емкостью 15 мл с пришлифованной стеклянной пробкой. Раствори-
тель удаляют в токе азота, остаток растворяют в 1,0 мл перегнан-
ного метилпеллозольва, прибавляют 1,0 мл нингидринового реаген-
та и нагревают смесь 20 мин на кипящей водяной бане. После это-
го охлаждают, прибавляют 5,0 мл 90%-ного метилделлозольва, со-
держимое пробирки перемешивают и измеряют поглощение полученно-
го раствора и раствора холостого опыта при 575 нм в кюветах с
I 1 см. В качестве стандартов используют растворы глицина, содер-
жащие от 0,05 до 0,4 мкмоля вещества (молярный коэффициент эк-
стинкции приблизительно равен 19 000).
4.3.3. Определение суммарного азота по микрометоду Слоан- Стэнли [299]
Р еагенты. Все растворы для этих определений готовят
на деионизованной дистиллированной воде, которую хранят в бутылях
из боросиликатного стекла.
Стандартный раствор сульфата аммония, 0,5 мН. 33,04 мг (NH4)-SO4
растворяют в 500 мл воды; 1 мл этого раствора содержит 14 мкг N.
Хлорная кислота, 72%-ная.
Фенол (0,6 М)— нитропруссид натрия (1 мМ). 28,2 г фенола и
1'30 мг Na2[Fe(NO)(CN)slPQCTB°P5,1OT Б 500 мл воды.
Раствор тринатрийфосфата, 0,6 М. 107,5 г Na^HPO* • 12Н-,0 и 12,0 г
NaOH растворяют в 500 мл воды: раствор хранят в полиэтиленовых
бутылях.
Гидроокись натрия (0,75 и.) — гипохлорит натрия (0,03 М). 15,0 г
82
Глава 4
NaOH и 1,1 г NaOCl растворяют в 500 мл воды: раствор хранят
в полиэтиленовых бутылях.
Методика. Аликвотную часть стандартного раствора или
раствора суммарных липиаов или раствора хроматографически одно-
родных липидных фракций, содержащую 1-14 мкг N, переносят в про-
бирку размером 13x130 мм (толщина стенок 1,5 мм). Раствори-
тель упаривают досуха в токе азота, добавляют 0,05 мл хлорной
кислоты и кусочек (3x3 мм) пористого тефлона и нагревают про-
бирку на электрической плитке в течение 30—45 мин так, чтобы
кислота слабо кипела и конденсировалась на высоте 5 см от дна.
Содержимое пробирки охлаждают до комнатной температуры и при
интенсивном перемешивании прибавляют 0,25 мл смеси фенола и
нитропруссида натрия, 2,5 мл раствора тринатрийфосфата и 0,3 мл
раствора гидроокиси натрия и гипохлорита. Пробирку выдерживают
при комнатной температуре не менее 30 мин и измеряют поглоще-
ние голубого раствора при 635 нм в кюветах с I 1 см. Одновре-
менно определяют поглощение раствора холостого опыта. Калибро-
вочную прямую строят по аликвотным частям стандартного раство-
ра. содержащим 2,8; 7,0 и 14,0 мкг азота.
4.4. Определение сложноэфирных групп [ 260,305]
Реагент ы. Запасный.раствор перхлората железа* о г Fe(C104)3x
хбН20 растворяют в смеси 10 мл 7 0%-ной хлорной кислоты и 10 мл
воды и разбавляют полученный раствор холодным абсолютным эта-
нолом до конечного объема 100 мл. Запасный раствор можно хра-
нить при 4 °C в течение нескольких месяцев.
Разбавленный раствор перхпората железа, свежеприготовленный.
Смесь 4 мл запасного раствора перхлората железа и 3 мл 7 0%-ной
хлорной кислоты разбавляют абсолютным этанолом до 100 мл.
Щелочной раствор тороксилампна, готовят непосредственно пе-
ред употреблением. Смешивают равные объемы 4%-ного этанольно-
го раствора хлоргидрата гидроксиламина (2 г'растворяют в 2,5 мл
воды и разбавляют абсолютным этанолом до объема 50 мл) и
8 %—ного этанольного раствора гидроокиси натрия (4г растворяют в
2,5 мл воды и разбавляют абсолютным этанолом до объема 50 мл).
Осадок отделяют центрифугированием, для анализов используют про-
зрачный супернатант.
Стандартный раствор сложною эфира, 29,8 мг метилстеарата
растворяют в ЮО мл хлороформа: раствор содержит 1 мкмоль слож-
ного эфира в 1 мл.
Методика. В пробирку емкостью 15—20 мл с пришлифо-
ванной стеклянной пробкой переносят пипеткой аликвотную часть
раствора липидов, содержащую 0,2-2 мкмоля сложноэфирных
групп. Растворитель удаляют в токе азота и затем в вакуум—эксика-
Общие методы анализа
83
торе, эвакуированном до остаточного давления < 1 мм рт. ст. К ос-
татку прибавляют 1,0 мл щелочного раствора гидрокси ламина, про-
бирку закрывают пришлифованной пробкой и нагревают 2 мин на
водяной бане при 65°C. Дают пробирке охладиться (5 мин), прибав-
ляют 3,0 мл разбавленного раствора перхлората железа,перемешивают,
оставляют на 30 мин и измеряют поглощение розовато-лилового раст-
вора при 530 нм по сравнению с раствором холостого опыта. Кали-
бровочную прямую строят по аликвотным частям стандартного раст-
вора метилстеарата, содержащим 0,5; 1,0 и 2,0 мкмолей метилстеа-
рата. Закон Бера соблюдается при содержании сложного эфира цо
4 мкмоль; 1 мкмоль в кювете с I 1 см дает поглощение, приблизи-
тельно равное 0,24.
4.5. Определение суммарного сахара [86]
Реагенты. Раствор фенола, 5°/0 -ный. 5 г фенола растворя-
ют в 100 мл воды.
Концентрированная серная кислота.
Стандартный раствор сахара, 0,222 мН. 1ОО мг глюкозы растворя-
ют в 250 мл воды; перед употреблением этот раствор разбавляют
водой в соотношении 1:10. В 1 мл разбавленного раствора содержит-
ся 40 мкг (0,222 мкмоля) глюкозы.
Методика. Пипеткой отбирают аликвотную часть раство-
ра липида или липидного гидролизата, содержащую 10-80 мкг моно-
сахарида (в расчете на гексозу), переносят ее в пробирку Льюиса —
Бенедикта для определения сахаров емкостью 25 мл, растворитель
упаривают досуха в токе азота. К остатку прибавляют 2,0 мл воды,
содержимое пробирки тщательно перемешивают, прибавляют 1,0 мл
5%-ного раствора фенола, перемешивают, прибавляют 5,0 мл кон-
центрированной серной кислоты, еше раз тщательно перемешивают,
оставляют на 30 мин и измеряют поглощение полученного оранжево-
го раствора при 490 нм. Калибровочную прямую строят по аликвот-
ным частям стандартного раствора, содержащим 20, 40 и 80 мкг
глюкозы. Закон Бера соблюдается для проб, содержащих до 80 мкг
гексозы (глюкозы, галактозы или маннозы). В круглых кюветах с
/12 мм 10 мкг глюкозы дают поглощение, приблизительно равное
0,063.
4.6. Определение иодного числа [356]
Обычно иодное число определяют для суммарных липидов, фрак-
ций жирных кислот или высших алифатических альдегидов.
Реагент ы. Реагент Дома (0,05 н. раствор пиришгндибро-
мида). К раствору 2,5 г (1,85 мл) концентрированной серной кисло-
ты в 5 мл ледяной уксусной кислоты прибавляют раствор 2,0 г
84
Глава 4
(2,06 мл) пиридина в 5 мл ледяной уксусной кислоты. Смесь ох-
лаждают и прибавляют к ней 2,0 г (0,63 мл) брома и затем раз-
бавляют до объема 500 мл ледяной уксусной кислотой.
Раствор йодистого калия, 10%-ный. 10 г KI растворяют в 100мл
воды.
Раствор крахмала 1%-ный. 1 г крахмала растворяют в 100 мл
13%-ного раствора хлористого калия, нагревают до кипения и ох-
лаждают.
Стандартный раствор тиосульфата натрия, 0,020 н.
М е т о д и к а. К 5,0 мл хлороформного раствора, содержа-.
шего известное количество (2-5 мг) липидов, прибавляют 5,0 мл
раствора пиридиндибромида. Смесь встряхивают в колбе Эрленмейера
с пришлифованной стеклянной пробкой емкостью 50 мл и оставляют
при комнатной температуре в темноте на 15 мин; прибавляют 0,5 мл
раствора йодистого калия, 0,5 мл воды, несколько капель раствора
крахмала и титруют выделившийся иод стандартным 0,020 н. раст-
вором тиосульфата натрия. Холостой опыт проводят в описанных вы-
ше условиях с 5 мл хлороформа.
Расчет. Иодное число= (a—fe)/cx (1,27 /5 ), где а — резуль-
тат титрования холостого опыта, Ь — результат титрования образца,
с - навеска липидов, г.
Иодное число
Число двойных связей в расчете на моль= —ттт;—“------- х Мол. вес.
12 i х 2
4.7. Определение суммарного и свободного холестерина [74, 356]
Определение холестерина производится как в случае анализа
суммарных липидных экстрактов, так и хроматографически однород-
ных фракций. Суммарный (свободный и связанный) холестерин оп-
ределяют по специальной методике для "суммарного" холестерина,
свободный (неэтерифизированныйХ холестерин определяют по 'диги-
тониновому" методу.
Р ,е а г с н т ы. Запасный раствор хлорного железа. 2,5 г
FeCl,*6H,0 растворяют в концентрированной (85%-ной) ортофосфор-
ной кислоте; раствор доводят ортофосфорной кислотой до объема
100 мл и хранят в темных склянках с пришлифованными пробками
при комнатной температуре. Запасный раствор заменяют свежим
через 3 месяца или в том случае, если из него выпадает осадок.
Окрашивавший реагент. 4 мл запасного раствора хлорного же-
леза осторожно разбавляют концентрированной серной кислотой до
объема 50 мл; раствор охлаждают и хранят при комнатной темпера-
туре. Если раствор начинает мутнеть, его заменяют свежим.
Раствор оигитонина, 1%-ный. 1 г дигитонина растворяют в 50 мл
95%-ного этанола и разбавляют водой до объема 100 мл. Раствор
можно хранить в темноте в течение шести месяцев.
&6шие методы анализа
85
Стандартный раствор холестерина, 0,01%-ный. 1ОО мг чистого су-
хого холестерина растворяют в 100 мл ледяной уксусной кислоты,
полученный раствор разбавляют ледяной уксусной кислотой в отно-
шении 1:10.
Методика. Определение суммарного холестерина. Аликвот-
ную часть хлороформного раствора липидов, содержащую не более
0,3 мг суммарного холестерина, помешают в пробирку размером
16x150 мм с притертой стеклянной пробкой. Раствор выпаривают
досуха в токе азота, прибавляют 6,0 мл ледяной уксусной кислоты
(из бюретки), тщательно перемешивают, прибавляют 4,0 мл окраши-
вающего реагента - раствора хлорного железа, разбавленного серной
кислотой, снова перемешивают, охлаждают и через 10.. мин измеря-
ют поглощение пурпурного раствора и раствора холостого опыта при
550 нм. Калибровочную прямую строят по аликвотным частям стан-
дартного раствора, содержащим 0,1; 0,2 и 0,3 мг холестерина. За-
кон Бера соблюдается для проб, содержащих до 0,5 мг холестерина.
Образцы липидов не должны содержать пигментов, мешающих коло-
риметрированию.
Определение свободного холестерина. Аликвотную часть хлороформ-
ного раствора суммарных липидов, содержащую не более 0,3 мг
свободного холестерина, помешают в коническую центрифужную про-
бирку на 15 мл. Растворитель выпаривают в токе азота досуха,
к остатку прибавляют 1 мл смеси ацетон—95%-ный этанол (1:1 по
объему), перемешивают, прибавляют 1 мл 1%-ного раствора дигито-
нина, снова перемешивают и оставляют на 10 мин при комнатной
температуре. Полученную смесь разделяют центрифугированием при
3000 об/мин в течение 5 мин, супернатант отбрасывают, а осадок
сушат 5 мин, суспендируют в 4 мл ацетона и снова осаждают цен-
трифугированием. Осадок сушат 5 мин. оставшиеся следы раствори-
теля удаляют током азота. Затем осадок растворяют в 3 мл ледя-
ной уксусной кислоты и количественно переносят в пробирку для оп-
ределения сахаров, используя для этого пастеровскую пипетку; цен-
трифужную пробирку промывают 3 мл ледяной уксусной кислоты. Ана-
лиз заканчивают так же, как и определение суммарного холестерина.
Расчет. Количество свободного холестерина (мг^Количест-
во холестерина в дигитониновом осадке (мг), найденное по калибро-
вочной прямой, построенной для определения суммарного холестерина.
4.8. Определение суммарных жирных кислот
и неомыляемых веществ [ 157 )
Методика гидролиза (или метанолиза) смесей липидов, исполь-
зуемая для определения жирнокислотных и неомыляемых компонен-
тов липидов, зависит от структуры последних. Выбор метода дегра-
дации зависит от состава исследуемых липидов. Так, при анализе
86
Глава 4
смесей, содержащих только О-адиловые эфиры и не содержащих
плазмалогены или эфиры холестерина, проводится одностадийный ме—
танолиэ или гидролиз (кислотный или щелочной). Для анализа образ-
цов, содержащих О-апиловые эфиры, но не содержащих неомыляе^не
вещества и плазмалогены, проводится щелочной метанолиэ (с по-
мощью метанольного раствора метилата натрия). Однако, если в
смеси присутствуют плазмалогены, сначала проводится кислотный
метанолиэ, разрушающий группировки виниловых эфиров и освобож-
дающий альдегиды (или их диметилапетали). Во всех случаях гидро-
лиз и разделение продуктов гидролиза проводится в специальных
колбочках с боковым отростком, описанных в разд. 2.3.3.
4.8.1. Анализ липидов, содержащих только О-ациловые эфиры
Метанолиэ индивидуальных глицеридов, глиперофосфатидов или
гликозилциглиперидов, а также анализ смесей липидов этих типов
или превращение свободных жирных кислот в метиловые эфиры про-
водятся следующим методом.
Реагенты. Раствор хлористого водорода в метаноле,
2,5%-ный (-0,7 н.). 2,5 г газообразного хлористого водорода раство-
ряют в 1ОО мл метанола. Смесь метанол—вода, 9’-1 по объему.
Методика. Пипеткой отбирают аликвотную часть хлоро-
формного раствора липидов (содержащую 15-30 мг веществ) и по-
мешают ее в колбочку с боковым отростком (рис. 2.2); раствори-
тель удаляют в токе азота при ЗО°С. К остатку прибавляют 4,5 мл
раствора хлористого водорода в метаноле и кипятят 1-2 ч с обрат-
ным холодильником, защищенным от влаги хлоркальпиевой трубкой.
К охлажденной смеси прибавляют 0,5 мл воды и такой объем смеси
метанол-вода (9:1), чтобы раствор продуктов метанолиза заполнял
весь объем бокового отростка. Метиловые эфиры кислот экстрагиру-
ют петролейным эфиром (т. кип. 30-60°С), 3-4 раза порпиями по
5 мл, как описано в разд. 2.2.3. Экстракты сливают во взвешенную
колбу, растворитель упаривают досуха в токе азота при 30°С. Ос-
таток (метиловые эфиры кислот) сушат в вакуум-эксикаторе при ос-
таточном давлении< 0,1 мм рт. ст. до постоянного веса, затем раст-
воряют в известном объеме хлороформа, аликвотные части раствора
используют для определения содержания сложноэфирных групп и для
определения состава жирных кислот методом ГЖХ (см. разд. 5.5).
Для ГЖХ обычно используют образцы, содержащие 1—5 мг метило-
вых эфиров.
Расчет. Метиловые эфиры жирных кислот, %=
Вес метиловых эфиров, мг
=------------------------------х 100.
Вес исходного образца, мг
&6щие методы анализа
87
Средний молекулярный вес жирных кислот =
Вес метиловых эфиров, мкг
=-------------------------------------- - 14.
Содержание метиловых эфиров, мкмоли
Водно-метанольный раствор доводят до определенного объема
и анализируют на содержание водорастворимых компонентов, как
описано в разд. 7.2.1.7.
4.8.2. Анализ липидов, содержащих О-ациловые эфиры
и неомыляемые вещества
Описанный ниже метод используется для анализа смесей, содер-
жащих глицериды, диацилглинерофосфатиды, гликозилдиглицериды,
стерины, эфиры стеринов, воски, углеводороды, витамины Е или К,
но не содержащих плазмалогенов (виниловых эфиров глицерофосфата—
нов) или липидов, производных О-алкиловых эфиров. Само собой ра-
зумеется, что этот метоп можно использовать и для анализа инди-
видуальных компонентов смесей липидов, содержащих О-ациловые
эфирные группы.
Реагенты. 0,3 н. раствор гидроокиси натрия в 90%- ном
метаноле. 10 мл 3 н. водного раствора Na ОН разбавляют метанолом
до конечного объема 100 мл.
Гидроокись калия, 33%-ный раствор. 16,5 г КОН растворяют
50 мл воды.
Фенолфталеин, 1%-ный раствор. 1 г фенолфталеина растворяют
в 1$0 мл 90%-ного этанола.
Соляная кислота, 6 н. 50 мл концентрированной соляной кисло-
ты разбавляют водой до конечного объема 100 мл.
Методика. В колбу с боковым отростком пипеткой пере-
носят аликвотную часть раствора, содержащую 15-30 мг липидов.
Растворитель удаляют в токе азота при ЗО°С, к остатку немедлен-
но прибавляют 5,0 мл метанольного раствора NaOH. Смесь кипятят
1-2 ч. прибавляют несколько капель фенолфталеина и разбавляют
90%-ным метанолом с таким расчетом, чтобы раствор продуктов
реакции заполнил весь объем бокового отростка колбы для метано-
ли за. Неомыляемые вещества (алкен-1-иловые эфиры глицерина,
стерины, углеводороды, каротиноиды, высшие спирты и т. д.) экстра-
гируют пеЙЦрейным эфиром (т. кип. ЗО-6О°С) 3-4 раза порциями
по 5 мл. |ЭогЙ|о-спиртовую фазу подкисляют примерно 0,3 мл
6 н. соляНей кислоты и экстрагируют свободные жирные кислоты
петролейным эфиром (т. кип. 30-60°С). Экстракцию проводят 3-
4 раза порциями по 5 мл. Экстракты неомыляемых веществ и жир-
ных кислот упаривают досуха в токе азота, сушат в эксика-
торе над NaOH и взвешивают. Образцы, содержащие преимуществен-
88
Глава 4
но глицериды, кипятят 90 мин со смесью 2,5 мл этенола и 0,1мл
33%-ного раствора КОН, прибавляют 2,5 мл воды и экстрагируют
неомыляемые вещества петролейным эфиром (т. кип. ЗО-6О9С), под-
кисляют 6 н. соляной кислотой и экстрагируют жирные кислоты, как
описано выше.
Расчет. Содержание жирных кислот, % =
Вес жирных кислот, мг ,
=------------------------- х 100.
Вес образна, мг
Содержание неомыляемых веществ, % =
Вес неомыляемых вешеств, мг
=------------------------------ х 100.
Вес образца, мг
Свободные жирные кислоты можно оттитровать, чтобы опреде-
лить их эквивалент нейтрализации (разд. 4.9), затем перевести
в метиловые эфиры (кипячением с раствором НС1 в метаноле, как
описано в разд. 4.8.1.,или обработкой диазометаном, разд. 7.1.6.1)
и проанализировать метопом ГЖХ (разд. 7.1.6.2). Неомыляемые ве-
щества можно разделить методом ТСХ или ГЖХ (см. разд. 5.4 и
5.5 соответственно).
4.8.3. Анализ смесей липидов, содержащих О-аииловце эфиры,
плаз налог ены и неомыляемые вещества
Смеси глицеридов, диацилглицерофосфатидов, плазмалогенов,
гликозилдиглиперидов, стеринов, эфиров стеринов, гликозидов стери—
нов, углеводородов и восков (эфиров жирных кислот и высших спир-
тов) гидролизуют следующим образом.
Реагенты. 2,5%-ный раствор хлористого водорода в мета-
ноле (готовят, как описано в разд. 4.8.1).
Смесь метанол —вооа, 9:1.
Фенолфталеин, 1%-ный раствор в 90%-ном эталоне.
Гидроокись натрия, 7 н.
Соляная кислота, 6 н.
Методика. Образец липидов (15-50 мг) кипятят 1-2 ч
с 4,5 мл 2,5%-ного раствора НС1 в метаноле, прибавляют каплю
раствора фенолфталеина и 0,5 мл 7 н. раствора гидроокиси натрия
и снова кипятят реакционную смесь 1—2 ч. Неомыляемые вещества
и диметилацетали альдегидов экстрагируют 3—4 раза (порциями по
5 мл) петролейным эфиром (т. кип. 30-60°С). Объединенные эк-
стракты упаривают досуха в токе азота, остаток взвешивают и ана-
лизируют на содержание альдегидов (разд. 4.10), стеринов, углево-
дородов, высших спиртов и т. д. методом ТСХ и (или) ГЖХ (см.
Общие методы анализа
89
раэд.--5.4 и 5.5). Водно-метанольный слой подкисляют 0,4-0.5 мл
6 н. соляной кислоты и экстрагируют свободные жирные кислоты
3—4 порциями по 5 мл петролейного эфира с т'. кип. 30-6090. Объеди-
ненные экстракты упаривают досука в токе азота и высушивают по
постоянного веса (расчет см. в разд. 4.8.2). Жирные кислоты мож-
но оттитровать щелочью (оазд. 4.9), перевести в метиловые эфиры
(разд.-4.8.1) и проанализировать методом ГЖХ (раза. 7.1.6.2).
4.9. Определение эквивалента нейтрализации
Свободные жирные кислоты, кислые фосфатиды, кислые сульфо-
липипы и другие кислые липиды можно непосредственно оттитровать
и определить по приведенной ниже методике их эквивалентный вес
или эквивалент нейтрализации.
Реагенты. Метанольный раствор гидроокиси натрия, 0,025 н.
2,0 г Na ОН растворяют в 35 мл перегнанного метанола, раствор
центрифугируют, прозрачный супернатант разбавляют метанолом по
объема 50 мл. К 5,0 мл этого раствора прибавляют 20 мл дистил-
лированной воды и разбавляют метанолом до конечного объема
200 мл. Полученный водно-метанольный раствор титруют 0,010 н.
соляной кислотой, как описано ниже.
Раствор о-крезолового красного, 1% • ный. 0,5 г о-крезолового
красного растворяют в 50 мл 90%-ного метанола.
Смесь метанол — вода, 9:1.
Методика. Аликвотную часть хлороформного раствора
суммарных липидов или индивидуальных липидных фракций (например,
жирных кислот, полученных, как описано в раза. 4.8.2 и 4.8.3),
содержащих 25-250 микроэквивалентов свободных жирных кислот,
помещают в колбу Эрленмейера емкостью 50 мл с пришлифованной
стеклянной пробкой. Растворитель досуха выпаривают в токе азота,
остаток растворяют в 5 мл водного метанола, прибавляют 2 капли
индикатора и нагревают раствор на плитке почти по кипения. Горя-
чий раствор титруют метанольным 0,025 н. раствором гидроокиси
натрия по образования переходной (желтая —» красная) окраски ин-
дикатора. В холостом опыте таким же образом титруют 5 мл раст-
ворителя.
Расчет. Мкэквивалент кислот= (Объем раствора щелочи, ис-
пользованный пля титрования, мл — Объем раствора щелочи, исполь-
зованный для титрования в холостом опыте, мл) х Концентрация
щелочи, г-®кв/лх 1ООО.
Вес образца, мкг
Эквивалент нейтрализации = ---------------------
Мкэквивалент кислот
= Молекулярный вес одноосновной кислоты.
90
Глава 4
4.10. Анализ плазмалогенов
Для определения альдегидогенных липипов (плазмалогенов) ис-
пользуются цве методики, а именно количественное определение
высших альдегидов, выделившихся в результате кислотного’ гидро-
лиза^ определение содержания виниловых эфиров.
4.10.1. Определение высших альдегидов [95, 258, 346]
Реагенты. Раствор п-нитрофенилгидразина, 0,02 М.
75 мг я-нитрофенилгидразина растворяют в 25 мл свежеперегнанно—
го 95%-ного этанола.
Серная кислота, 1,0 к.
Водный этанол, 35%-ный.
Методика. Аликвотную часть хлороформного раствора
суммарных липидов (содержащую 0,05-0,10 мкмоля альдегидов)
или такую же аликвотную часть фракпии альдегидогенных липидов
(включая фракцию диметилацеталей, полученную так, как это описа-
но в разд. 4.8.3) помешают в центрифужную пробирку емкостью
15 мл с пришлифованной стеклянной пробкой. Растворитель выпари-
вают в токе азота, остаток сразу же растворяют в 1,6 мп 95%—кого
этанола, добавляют 0,2 мл раствора п-нитрофенилгидразина
и 0,2 мл 1 н. серной кислоты. Смесь нагревают 25 мин на водя-
ной бане при 6О°С, охлаждают в бане со льдом (5 мин), прибавля-
ют 1 мл воды и 2,0 мл я-гексана и встряхивают пробирку в тече-
ние нескольких минут. Гексановый и водно-спиртовый слои разделя-
ют центрифугированием, водно—этанольный слой удаляют с помощью
пастеровской пипетки; гексановый слой дважды промывают 35%-ным
этанолом (порпиями по 2 мл), разделяя слои центрифугированием.
Пипеткой отбирают 0,5 мл прозрачного гексанового раствора, раст-
воритель упаривают в токе азота, остаток растворяют в 3,5 мл
95%-ного этанола и измеряют поглощение при 395 нм по сравне-
нию с поглощением холостого опыта. Калибровочную прямую стро-
ят по аликвотным частям стандартного раствора чистого стеарино— •
вого альдегида (0,05; 0,075 и 0.10 мкмоля). Молярный коэффици-
ент экстинкции п —нитрофенилгидразона стеаринового альдегида при-
близительно равен 23 800. Витамин А мешает определению альде-
гидов; параллельно определяя это вещество в исследуемых липидах,
можно внести соответствующую поправку, кроме того, его можно
отделить методом ТСХ.
4.10.2. Определение виниловых эфиров [ 112, ИЗ]
Реагенты. Раствор иодиетою калия, 3%-ный. 3 г К1 непо-
средственно перед употреблением растворяют в ЮО мл воды.
Раствор иода, 0,6-10~3н. 76 мг кристаллического иода растворя-
Общие методы анализа
91
ют в 5.0 мл 3 %—него раствора К1; 1,0 мл этого раствора разбавля-
ют 3%-ным раствором KI до объема 100 мл.
Методика. Образен хлороформного раствора липидов (со-
держащий от 0,05 до 0,10 мкмолей виниловых эфиров) помещают
в пробирку емкостью 15 мл с пришлифованной стеклянной пробкой.
Растворитель удаляют в токе азота, остаток растворяют или суспен-
дируют в 0.5 мл метанола, прибавляют 0,5 мл раствора иода, встря-
хивают пробирку в течение 1 мин и оставляют на 10 мин при ком-
натной температуре. Содержимое пробирки разбавляют 4,0 мл 95%-
ного этанола и измеряют поглощение полученного раствора в кюве-
тах с I 1 см при 355 нм по сравнению с раствором контрольного
опыта, в котором к образцу вместо раствора иода прибавляют 0,5 мл
3%-ного раствора KI. Параллельно проводят холостой опыт без образ-
ца липидов. Средний коэффициент экстинкции иода определяют, из-
меряя поглощение различных количеств раствора иода в описанных
выше условиях, но в отсутствие липидов (молярный коэффициент эк-
стинкции равен приблизительно 27 500).
Расчет. Содержание виниловых эфиров, мкмоли = (Поглоще-
ние холостого опыта без липидов - Поглощение образца) хКоэффици-
ент молярной экстинкции иода х 10“6.
4.11. Анализ липидов, содержащих N-ацильные группировки
(анализ сфинголипидов). Определение состава жирных кислот
и сфингозиновых оснований
Липиды, содержащие группировки амидов жирных кислот, такие,
как сфинголипиды (керамиды, сфингозилфосфатиды, цереброзиды, ган-
глиозиды), липополисахариды и N-ациламинокислоты, можно гидро-
лизовать лишь в значительно более жестких условиях, чем липиды -
производные О-ациловых эфиров. Оптимальным методом расщепления
липидов, содержащих N-ацильные группировки, является метоп Свили
н Москатели, в котором используется 2 н. метанольный раствор НС 1.
Для работы со специальными колбами для метанолиза, имеющими бо-
ковой отросток, этот метод был модифицирован Кейтсом /157 /. Для
расщепления цереброзидов можно пользоваться также водно-метаноль—
ным кислотным реагентом, предложенным Гавером и Свили /103/.
Р е а г е н т ы. Водно-метанольный раствор соляной кислоты, 2 н.
Смешивают 10 мл концентрированной соляной кислоты и 50 мл ме-
танола.
Модифицированный водно - метанольный кислотный реагент, 1 н. Сме-
шивают 8,6 мл концентрированной соляной кислоты с 9,4 мл воды
и доводят метанолом до объема .100 мл.
Гиороокись натрия, 7 н.
Методика. Образец липидов (10-30 мг) кипятят в колбе
с боковым отростком с 5 мл 2 и. вопно-метанольного раствора со-
92
Глава 4
пяной кислоты или с 5 мл модифицированного 1 н. кислотного реа-
гента в течение 5 или 18 ч соответственно. Метиловые эфиры жир-
ных кислот экстрагируют низкокипяшим петролейным эфиром (3—4
порции по 5 мл), растворитель выпаривают, остаток метиловых эфи-
ров высушивают в вакууме и взвешивают. Метиловые эфиры кислот
анализируют на содержание сложноэфирных групп, как описано в
разд. 4,4, и определяют их состав методом ГЖХ (разд. 7.1.6.2).
Чтобы выделить сфингозиновые основания, кислую водно—метаноль-
ную фазу концентрируют в токе азота (35°С) до небольшого объе-
ма, прибавляют 1,5 мл 7 н. NaOH и такое количество воды, чтобы
общий объем раствора был равен 5 мл и раствор заполнил весь бо-
ковой отросток колбы. Сфингозиновые основания экстрагируют эти-
ловым эфиром (3-4 порции по 5-10 мл), экстракт разбавляют рав-
ным объемом бензола и упаривают досуха в токе азота во взвешен-
ной колбе; остаток высушивают до постоянного веса в вакуум-экси-
каторе (при высоком вакууме) и взвешивают. Полученные в резуль-
тате гидролиза сфингозиновые основания можно также проанализи-
ровать на содержание аминного азота (разд. 4.3.2). Состав сфинго-
зиновых оснований можно определить методом ГЖХ (разд. 7.2.2.4).
В водном слое гидролизата можно определить содержание водораст-
воримых компонентов (разд. 4.12).
4.12. Определение водорастворимых компонентов липидов
Водорастворимые составные части липидов, такие, как холин,
этанояамин. глицерин и инозит, а также сахара можно определить,
анализируя водно-метанольные растворы, полученные после экстрак-
ции гидролизатов липидов петролейным или этиловым эфиром.
4.12.1 . Опреоеление холина
4.12.1.1 . Рейнекатный метод [ 105]
Р е а г е н т ы. Гидроокись натрия, 2 н.
Стандартный раствор холина, 8,25 мМ. 1,150 г хлоргидрата холина,
высушенного над концентрированной серной кислотой, растворяют
в 1 л воды; 1 мл полученного раствора содержит 1 мг холина.
Раствор фенолфталеина, 1%-ный. 0,5 г фенолфталеина растворяют
в 50 мл смеси вода - этанол (1:1 по объему).
Метанольный раствор рейнеката аммония, 2% - ный. В 50 мл мета-
нола растворяют 1,0 rNH (Cr(NH )2(SCN)J. Если раствор мутный,
его осветляют центрифугированием.
Методика. Аликвотную часть водно-метанольного слоя
гидролизата (получение описано в разд. 4.8.2 или 4.8.3), содержа-
щего 0,5-2,0 мг (4-16 мкмолей) холина, помешают в градуирован-
ную центрифужную пробирку емкостью 15 мл. К раствору прибавля-
Общил-методы анализа
93
ют две капли фенолфталеина, подщелачивают его 2 н. NaOH и раз-
бавляют водой по объема 5 мл; прибавляют 2,5 мл метанольного
раствора рейнеката аммония, тщательно перемешивают и оставляют
на 2 ч при 5°С. Розовые кристаллы осаждают центрифугированием
при 3000 об/мин, супернатант осторожно сливают, кристаллы рейне-
ката холина дважды промывают н-пропанолом (порциями по 1 мл),
отделяя кристаллы центрифугированием и аккуратно удаляя супер-
натант с помощью пастеровской пипетки. Промытый рейнекат холи-
на растворяют в 5,0 мл ацетона, раствор центрифугируют для уда-
ления мути и измеряют поглощение при 526 нм по сравнению с
раствором холостого опыта (проведенного без холина). Калибровоч-
ную прямую строят по аликвотным частям стандартного раствора
холина, содержащим 4-20 мкмолей (0,5-2,5 мг) вещества.
Р а с ч е т. Содержание холина, %=
Поглощение образна х Количество холина в стандарте, мг
.=----------------------------------------------------х ЮО.
Навеска липидов, мгхПоглощение стандарта
4.12.1.2 . Перйодатный метод [ 16] •
Реагенты. Иодный реагент. 15,7 г кристаллического 12
и 20 г KI растворяют при механическом встряхивании в 100 мл
воды. Раствор сохраняет устойчивость неопределенное время при
4 °C.
Дихлорэтан. Растворитель встряхивают с 2 М раствором карбо-
ната калия, сушат безводным хлористым кальцием и фильтруют.
Стандартный раствор хлоргидрата холина, 1,65 мМ. 10,0 мл
8,25 мМ раствора хлоргидрата холина (разд. 4.12.1.1) разбавля-
ют водой до объема 50 мл.
Методика. Аликвотную часть водно—метанольного слоя,
содержащую 10-7 0 мкг, или 0,08-0,6 мкмоля, холина (гидролиз
липидов и разделение продуктов гидролиза рассматриваются в
разд. 4.8.2 или 4.8.3) переносят в коническую центрифужную про-
бирку емкостью 3 мл и подкисляют каплей 1 н. соляной кислоты.
Растворитель выпаривают в токе азота, к остатку прибавляют
0,5 мл воды, перемешивают, прибавляют 0,2 мл иодного реагента,
снова перемешивают и выдерживают на ледяной бане в течение
20 мин. Смесь центрифугируют (0°С, 15 мин) при 5000 д,с по-
мощью пастеровской пипетки осторожно удаляют супернатант. Крис-
таллы перйодата холина растворяют в 10 мл дихлорэтана и измеря-
ют поглощение полученного раствора при 365 нм в кювете с 1 1см
или круглой кювете с I 19 мм. Калибровочную прямую строят по
аликвотным частям стандартного раствора холина, содержащим от
0,08 до 0,6 мкмоля вещества.
94
Глава 4
Расчет. Содержание холина, мкмоли=
Количество стандарта, мкмоли
=Поглощение образцах .............. •
Поглощение стандарта
4.12.2 . Определение амино спирта в и аминокислот
Ниже приведен ряд методик анализа азотсодержащих компонен-
тов фосфолипидов. Методики описаны в порядке возрастания чувстви-
тельности.
4.12.2.1 . Определение суммарных с - аминоспиртов
( модифицированная методика Артема [18])
Реагенты. Щелочной раствор бората. 8,25 г Н3 ВО3 раст-
воряют в 100 мл 1,0 н. Na ОН.
Перйодат натрия, 0,2 М. 4.28 г Na I 04 растворяют в 100 мл воды.
Раствор иноикапора с борной кислотой для определения азота
по микрометоду Кьельдаля (см. разд. 4.3.1).
Стандартный раствор серина, 10 мМ. 105 мг D, L- серина раст-
воряют в 100 мл воды.
Станоартный раствор этаноламина, 10 мМ. 122 мг этаноламина
растворяют в 1ОО мл воды.
Методика. Аликвотную часть водно-метанольного гидро-
лизата суммарных липидов или хроматографически однородных липид-
ных фракций, содержащую 5-50 мкмолей а- аминоспиртов (см. разд.
4.8.2 и 4.8.3), упаривают в токе азота до полного удаления мета-
нола. Остаток разбавляют 5 мл воды, в случае необходимости ней-
трализуют несколькими каплями 1 н. NaOH и переносят в прибор
для микроперегонки по Къельдалю. используя для ополаскивания
1 мл воды. Прибавляют 3,5 мл щелочного раствора бората и 2,0 мл
0,2 М раствора перйодата (pH смеси должно быть около 9,6), в
течение 7 мин пропускают через смесь ток азота и затем отгоняют
аммиак и воду в приемник, содержащий 15 мл раствора борной кис-
лоты с индикатором. Отгонку ведут до тех пор, пока объем жидкос-
ти в приемнике не увеличится вдвоем Дистиллат титруют 0,01 н.
соляной кислотой до появления серого окрашивания. Холостой опыт
проводят по той же методике, но без а - аминоспиртов. Калибровоч-
ную прямую строят по аликвотным частям (5 мл) стандартных
растворов серина или этаноламина. Если в исследуемом растворе
присутствует холин, то при проведении холостого опыта перйодат
заменяют 2 мл воды.
Расчет. Содержание а* аминоспирта, мкмоли ^Количество
кислоты, использованной для титрования образца (с поправкой на
холостой опыт), мл х Концентрация кислоты, г-экв/лх 1000.
Общие методы анализа
95
’. .. ' 4.12.2.2. Определение серина и этаноламина
в виде динитрофенильных (ДНФ) производных [ 22 ]
Эта методика не является специфичной для этаноламина и сери-
на, и ее можно использовать только в том случае, когда образец
липидов не содержит других азотистых оснований.
Реагенты. Раствор динитрофторбензола. 0,1 мл динитро-
фторбензола растворяют в 2 мл 99%-ного этанола: раствор готовят
непосредственно перед употреблением.
Раствор бикарбоната натрия, 2,5%-ный. 5 г NaHCO3 растворяют
в 200 мл воды.
Сояяиал кислота, 1,0, 2,0 и 5,0 н.
Гидроокись натри*, 0,1 н.
Метилизобутилкетон. Реактив перегоняют непосредственно перед
употреблением.
Стандартные растворы серина (0,4 мН) и этаноламина (0,4 мН).
10 мл 1О мМ растворов (см. разд. 4.12.2.1) разбавляют водой
по 250 мл.
Методика. Аликвотные части хлороформных растворов
суммарных липидов или хроматографически однородных фракций фос-
фатидипэтаноламина или фосфатидилсерина (содержащие 1-4 мкмоля
аминов) помешают в колбочку с боковым отростком (рис. 2.2).Раст-
воритель выпаривают в токе азота, прибавляют 4,5 мл 2,5%-ного
раствора НС1 в метаноле (см. разд. 4.8.1) и кипятят смесь 1 ч.
После охлаждения продукты метанолиза разбавляют 0,5 мл воды и
экстрагируют метиловые эфиры жирных кислот и неомыляемые ве-
щества 3—4 порциями по 5 мл низкокипяшего (т. кип. 30-60°С)
летролейного эфира. Водно-метанольный слой сначала упаривают в
токе азота или воздуха при 40-50°С до небольшого объема, затем
высушивают в вакуум-эксикаторе над КОН при остаточном давлении
—10 мм рт. ст., к остатку прибавляют 2 мл 0,1 н. раствора NaOH.
Смесь нагревают 30 мин на кипяшей водяной бане, нейтрализуют
0,2 мл 1,0 н. НС1 и разбавляют 10 мл воды. В пробирку на 15 мл
с пришлифованной стеклянной пробкой помешают 2,0 мл водного гид-
ролизата, 0,1 мл раствора динитрофторбензола и 1,0 мл 2.5%-ного
раствора NaHCO3, плотно закрывают пробирку пробкой и нагревают
на водяной бане 1 ч при 75-8О°С. Охлажденную смесь разбавляют
10 мл хлороформа, интенсивно встряхивают 10 мин и центрифугиру-
ют при большом числе оборотов, чтобы разделить хлороформный и
водно-метанольный слои.
Определение серина. 2,0 мл водного слоя, полученного, как опи-
сано выше, переносят в пробирку емкостью 15 мл со стеклянной
пришлифованной пробкой, прибавляют 1,0 мл 1 н. соляной кислоты
и 10 мл метилизобутилкетона. Смесь интенсивно встряхивают 10 мин,
слои разделяют центрифугированием и 5,0 мл метилиэобутилкетоно-
96
Глава 4
Общие-методы анализа
97
вого раствора помешают в другую пробирку емкостью 15 мл, содер-
жащую 4,0 мл 0,1 н. раствора Na ОН. Содержимое пробирки интенсив,
ио встряхивают 5 мин, центрифугируют, органический слой удаляют
с помощью пастеровской пипетки с оттянутым концом. 3,0 мл вод-
ного слоя смешивают с 0,5 мл 2 к. соляной кислоты, помешают
в круглую кювету с I ~12 мм и измеряют поглощение при 420 нм
по сравнению с раствором холостого опыта.
Опреоеление .этаноламина. 5,0 мл хлороформного слоя (см. выше)
переносят в центрифужную пробирку емкостью 40 мл с притертой
стеклянной пробкой, растворитель выпаривают в токе азота при 40°С
почти досуха. К остатку прибавляют 10 мп низкокипяшего петролей-
ного эфира и 5,0 мл 5 н. соляной кислоты; смесь встряхивают 5 мин,
центрифугируют, слой петролейного эфира удаляют отсасыванием или
декантацией. 3 мл кислого водного слоя помешают в круглую кюве-
ту с I 12 мм и измеряют поглощение при 420 нм по сравнению
с поглошением холостого опыта. Калибровочную прямую строят по
аликвотным частям стандартных растворов этаноламина и серина
(от 0,2 до 0,8 мкмолей); при проведении калибровочных опытов оп-
ределения начинают непосредственно с реакции с динитрофторбензолом.
4.12.2.3. Определение аминокислот, аминоспиртов и аминосахаров
с помощью аминокислотного анализатора
Реагенты. Раствор хлористого вооорооа в метаноле, 2,5% -
ный, см. разд. 4.8.1.
Соляная кислота, 1,0 н.
Стандартные растворы .этаноламина (10 мМ ) и серина (10 мМ), см.
разд. 4.12.2.1.
М е т о дика. Аликвотную часть хлороформного раствора сум-
марных липидов (содержащую 1—10 мкмолей аминосоединений) поме-
щают в колбу для гидролиза с боковым отростком, растворитель вы-
паривают в токе азота, к остатку прибавляют 4.,5 мл 2,5%-ного ме-
танольного раствора хлористого водорода. Смесь кипятят 1 ч, охлаж-
дают, прибавляют 0,5 мл воды и экстрагируют метиловые эфиры кис-
лот и неомыляемые вещества петролейным эфиром (3—4 порции по
5 мл). Водно—метанольный раствор упаривают в токе азота при40°С
почти досуха, к остатку прибавляют 2 мл 1,0 н, соляной кислоты,
полученный раствор кипятят на водяной бане 2 ч, причем по истече-
нии часа холодильник удаляют, в результате чего реакционный раст-
вор упаривается до небольшого объема. Остаток высушивают в ваку-
ум-эксикаторе над свежей КОН и в заключение растворяют его в
2 мл воды. Аликвотная часть этого раствора (содержащая 0,1-0,5
мкмоля каждого аминосоединения) используется для количественного
определения аминоспиртов, аминокислот или аминосахаров (гексоз-
аминов) на аминокислотном анализаторе фирмы "Teeknieon" или "Beck*
man" /122, 307 /. Ошибки определения учитываются по данным предва-
рительного определения описанным методом известных количеств
(1-10 мкмолей) этаноламина, серина и т. д.
4.12.3 . Методы определения глицерина
-4.12.3.1. Определение глицерина в глицерофосфатидах
[126, 186, 261]
Чтобы определить глицерин в глицерофосфатидах, образцы под-
вергают жесткому кислотному гидролизу, вызывающему исчерпываю-
щий гидролиз эфирных связей.
Реагенты. Соляная кислота, 2 н.
Серная кислота, 10 и 24. к.
Перйодат натрия, 0,1 М. 2,14 г Nal 04 непосредственно перед
употреблением растворяют в 100 мл воды.
Бисульфит натрия, 10%-ный. 10 г NaHSO3 растворяют в 100 мл
воды.
Хромотроповая кислота, 0,18%-ная. 100 мг 1,8-диоксинафталин-
3,6-дисульфокислоты растворяют в 100 мл воды и разбавляют
45 мл 24 н. серной кислоты.
Стандартный раствор глицерина, 0,25 мМ. 230 мг глицерина раст-
воряют в ЮО мл воды; 1,0 мл этого раствора разбавляют водой
до конечного объема 100 мл (1 мл такого раствора содержит
23 мкг, или 0,25 мкмоля, глицерина).
Методика. Аликвотную часть раствора суммарных липи-
дов, содержащую 0,2-1,0 мкмоля глиперина, помешают в пробирку
из стекла пирекс (1,0x15 см), конец пробирки предварительно от-
тягивают. Растворитель выпаривают в токе азота, прибавляют
3,0 мл 2 н. соляной кислоты, пробирку запаивают в умеренном ва-
кууме и нагревают 48 ч при 125°С. Охлажденный гидролизат и
водную промывку (2,0 мл) переносят в пробирку с притертой стек-
лянной пробкой, добавляют 2,0 мл хлороформа, встряхивают и цент-
рифугируют. Пипеткой отбирают 2,0 мл водного слоя и переносят в
другую пробирку с притертой стеклянной пробкой, добавляют 0,1мл
Юн. серной кислоты и 0,5 мл 0,1 М раствора перйодата натрия,
перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 5 мин.
В заключение прибавляют 0,5 мл 10%-ного раствора NaHS03, со-
держимое пробирки перемешивают, 0,5 мл полученного раствора
(аликвотная часть) переносят в пробирку с притертой стеклянной
пробкой, прибавляют 5 мл раствора хромотроповой кислоты, плотно
закрывают пробирку стеклянной пробкой, в течение 135 мин нагре-
вают на кипящей водяной бане, охлаждают и измеряют поглощение
при 57 О нм. Калибровочную прямую строят по аликвотным частям
стандартного раствора глицерина (0,1-0,5 мкмоля). В кюветах с I
98
Глава 4
12 мм 0,5 мкмоля глицерина дают поглощение, приблизительно
равное 0,44*.
4.12.3.2. Определение глицерина в глицерида^
и гликозилдиглицеридах [ 281 ]
Реагенты. Раствор гиороокиси наярил в 90%-ном мета-
ноле, 0,Зн. (см. раза. 4.8.2).
Соляная кислота, 2,0 н.
Раствор перйодата натрия оля определения глицерина (см. разд.
4.12.3.1).
Гиоцоокисъ калил, 33%-ный раствор (см. разд. 4.8.2).
Методика. Определение глицерина в гликозилдиглицеридах.
Образеп гликозилдиглиперидов (содержащий 1-5 мкмолей глицерина)
омыляют кипячением в течение 1 ч с 5 мл водно-метанольного
раствора гидроокиси натрия в колбе с боковым отростком (рис. 2.2).
К реакционной смеси прибавляют цауэкс-50 ( Н+-форма). встряхива-
ют, затем жирные кислоты экстрагируют петролейным эфиром и до-
водят объем вопно-метанольного слоя до 10 мл, разбавляя его 90%-
ным метанолом. 2,0 мл этого раствора упаривают в токе азота
(в пробирке с пришлифованной стеклянной пробкой), добавляют 4 мл
2,0 н. соляной кислоты и гидролизуют гликозиды на кипящей водя-
ной бане в течение 1 ч. Гидролизат охлаждают, разбавляют 5,0 мл
воды. Аликвотную часть (2,0 мл) этого раствора анализируют на
содержание глицерина перйодат-хромотроповым методом, как описано
в разд. 4.12.3.1.
Определение глицерина в глицериоах. Образец глиперидов или
нейтральных липидов (содержащий 0,2-1,0 мкмоля глицерина) раз-
бавляют 2,5 мп 95%-ного этанола и омыляют в колбе с боковым
отростком 0,1 мл 33%-ного раствора гидроокиси калия при кипя-
чении в течение 90 мин. К охлажденному гидролизату прибавляют
2,5 мл 2,0 н. раствора соляной кислоты; жирные кислоты и неомы-
ляемые вещества экстрагируют- низкокипящим петролейным эфиром.
Водно—этанольный слой упаривают в токе азота (при температуре
не выше 30°С) наполовину и разбавляют 5 мл воды до объема 5 мл.
Берут аликвотную часть (2,0 мл) этого раствора и определяют
в ней глицерин перйодат- хромотроповым методом, описанным в
разд. 4.12.3.1.
4.12.4 . Определение инозита] 54, 81]
Содержание миоинозита обычно определяют микробиологическим
методом после освобождения его из липидов кислотным гидролизом.
См. дополнение 1 к гл. 4. — Прим, перев.
Общие методы анализа
99
Р-еагенты. Соляная кислота, 2н.
Ацетатный буфер, 0,2 М, pH 5,2. 158 мл 0,2 М раствора апе-
1та натрия смешивают с 42 мл 0,2 М уксусной кислоты.
Среда для выращивания микроорганизмов. Раствор I. В 750 мл
эды растворяют 40,0 г глюкозы; 3,0 гКН2ГО4,4,0 г D, L-acna-
агина; 0,98 гСаС12*6Н2О, 1,0 г MgS04; 4.0 r(NH4)2S04 и
раствору прибавляют 0,4 мл 0,05%-ного раствора KI .
РастворП. В 1 л воды растворяют 0,10 г борной кислоты;
),04 rZnS04- 7Н20;О,О2 г (NH4) 2 МоОДО,04 г MnSO4 • 4Н2О; 0,045г
.'uSO4- 5Н2О и 0,25 г FeS04* 7Н2О.
РастворШ. В 100 мл воды растворяют 10 мг тиамина. 10 мг
пиридоксаля, 10 мг кальциевой соли пантотеновой кислоты, 10 мг
никотиновой кислоты и 0,5 мг рибофлавина. К полученному раство-
ру прибавляют 1 мл 0,001%-ного раствора биотина.
Чтобы приготовить среду для выращивания микроорганизмов,
смешивают 750 мл раствора I, 2 мл раствора П и 4 мл раствора III.
разбавляют водой до объема 1 л и поводят pH до 5,0, прибав-
ляя 2 н. гидроокись натрия, после чего стерилизуют в автоклаве
при 1 атм в течение 15 мин.
Стандартный раствор инозита, 0,01 мМ. 45,0 мг миоинозита раст-
воряют в 250 мл воды и 5,0 мл полученного раствора разбавляют
водой до конечного объема 500 мл (1 мл стандартного раствора
содержит 1,8 мкг, 0,01 мкмоля, инозита).
Методика. Л. Гидролиз липидов. Образец суммарных липи-
дов или хроматографически однородной липидной фракции (содержа-
щий 0,1-0,5 мкмоля инозита) гидролизуют в запаянной ампуле из
стекла пирекс, нагревая с 4 мл 2 н. соляной кислоты при 125°С
в течение 48 ч (см. разд. 4.12.3.1). Гидролизат переносят в про-
бирку с пришлифованной стеклянной пробкой и встряхивают с 2 мл
хлороформа. Пипеткой отбирают 2,0 мл верхнего водного слоя и упа-
ривают его досуха в токе азота или воздуха при 5О°С, чтобы уда-
лить соляную кислоту. Остаток высушивают в вакуум—эксикаторе
над гранулированной гидроокисью калия и растворяют в 10 мл воды.
Б. Микробиологическое определение миоинозита. В 10 узкогор-
лых склянок емкостью по 25 мл с завинчивающимися пробками по-
мешают по 2,5 мл стерилизованной среды и по 0,5 мл 0,2 М аце-
татного буфера (pH 5,2). В первые 4 склянки прибавляют 0,5; 1,0;
1,5 и 2,0 мл анализируемого раствора, в остальные 6 склянок -
0,25; 0,5; 0,75; 1,0; 1,5 и 2,0 мл стандартного 0,01 мМ раст-
вора миоинозита. Содержимое всех склянок разбавляют водой по ко-
нечного объема 5,0 мл. Все склянки автоклавируют при 1 атм в те-
чение 15 мин, охлаждают и засевают свежеприготовленной суспензи-
ей клеток дрожжей Kloeckera brevis в 0,9%-ном растворе хлористого
натрия. Склянки инкубируют при 25 Чс в течение 72 ч, встряхивая
их 1 раз в день. По окончании инкубации в круглых кюветах с I
19 мм при 660 нм измеряют мутность суспензий дрожжевых кле-
100
Глава 4
ток. По образцам, содержащим известные количества стандартного
раствора миоинозита, строят калибровочную прямую; по этой прямой
и определяют количество инозита в анализируемых образцах.
4.13. Определение вицинальных гликолей
4.13.1. Анализ липидов с кониевыми гликолъными
группировками [15, 155]
Этот метод основан на определении формальдегида, образующе-
гося при действии перйодата на липиды, имеющие концевые гликоль-
ные или 1,2-аминооксигруппы, как, например, фосфатидиле лидер ин,
сфингозины, 1-О-алкиловые эфиры глицерина и т. д.
Реагенты. Иооная кислота. 1%-ная, 0,044 М. 0.5 г Н1О4-2Н2О
непосредственно перед употреблением растворяют в 50 мл 95%-ного
этанола.
Соляная кислота, 1,0 н.
Арсенит натрия, 1,2 н. 6,5 г NaAsO„ растворяют в 100 мл воды.
Хромотроповая кислота, 0,2%~ная. 0,1 г 1,8—диокси-3,6—нафталин-
дисульФокислоты растворяют в 10 мл воды и разбавляют 12,5 М
серной кислотой до объема 50 мп. Раствор готовят непосредственно
перед употреблением.
.Методика. Образец, содержащий 0,2-1,0 мкмоль гликоль-
иых группировок, растворяют в 0,5 мл 95%-ного этанола и помеша-
ют в центрифужную пробирку емкостью 15 мл с притертой пробкой.
К раствору прибавляют 0,5 мл 1%-ного раствора иодной кислоты,
перемешивают и оставляют на 1 ч при комнатной температуре. Реак-
ционную смесь разбавляют 1,5 мл воды, прибавляют 0,75 мл 1,0н.
соляной кислоты и 0,25 мл 1,2 н. раствора арсенита натрия и раз-
бавляют водой до объема 5,0 мл. Пипеткой отбирают 0,5 мл реак-
ционного раствора, переносят в пробирку с притертой стеклянной
пробкой, прибавляют 5,0 мл хромотроповой кислоты, пробирку плот-
но закрывают и нагревают 30 мин на кипяшей водяной бане. Погло-
щение окрашенного раствора измеряют при 57 О нм по сравнению
с поглощением раствора холостого опыта. Калибровочную прямую
строят по аликвотным частям растворов батилового спирта или гли-
церина (содержащим соответственно 0,2-1,0 или 0,1—0,5 мкмоля ука-
занных вешеств).
4.13.2. Определение суммарных вицинальных
гидроксильных групп [62,68]
Реагенты. Раствор иодной кислоты, 0,1 М. 2,28 г
Н104-2Н,0 растворяют в 100 мл 95%-ного этанола.
Стандартный раствор арсенита натрия, 0,03 М. 1,484 г As2O3 раст-
воряют в 30 мл теплой 1,0 н. гидроокиси натрия, прибавляют
50 мл воды, нейтрализуют раствор 3,0 н. соляной кислотой по фе-
Общаг методы анализа
101
нолфталёину, подкисляют нейтрализованный раствор 2 каплями той
же кислоты и разбавляют водой до конечного объема 500 мл.
Стандартный раствор иода, 0,01 н. 1,269 г свежесублимирован-
ного иода и 3,3 г К1 растворяют при встряхивании в 350 мл воды
и разбавляют водой до объема 1 л. Раствор титруют 0,03 М арсе-
нитом натрия.
Раствор йодистого калия, 20%-ный. 20 г KI растворяют в 80 мл
воды.
Насыщенный раствор бикарбоната натрия. 100 мл воды встряхивают
до насыщения с 12 г КаНСО3.
Раствор крахмала (индикатор), см. разд. 4.6.
Методика. Образец липидов (содержащий 10-15 мкмолей
вициальных гликольных группировок) растворяют в 1,0 мл 95%-ного
этанола, прибавляют 1,0 мл 0,1 М иодной кислоты и 2.5 мл 95%-
ного этанола; смесь выдерживают в темной комнате 30 мин. К
2,0 мл реакционной смеси (аликвотная часть) при интенсивном пере-
мешивании прибавляют 2 мл насыщенного раствора бикарбоната.
4,0 мл 0,03 М арсенита натрия, 0,4 мл 20%-ного раствора йодис-
того калия и 0,8 г безводного кристаллического бикарбоната натрия.
Смесь оставляют на 15 мин при комнатной температуре, прибавляют
0,1 мл раствора крахмала и титруют 0,01 н. раствором иода до по-
явления голубой окраски. Параллельно проводят холостой опыт без
липидов.
Расчет. Суммарное количество гликольных группировок,
мкмоли = (Объем раствора иода, использованного для титрования об-
разца, мл — Объем раствора иода, использованного для титрования
холостого опыта, мл) х Концентрация раствора иода, М к 1000 х
х2,5/2,0.
4.14. Определение алкиловых эфиров глицерина
Чтобы определить содержание алкиловых эфиров глицерина в фос-
фатидах, образцы липидов необходимо освободить от фосфатных и
сложноэфирных групп по одному из описанных ниже методов.
4.14.1. Метод ацетолиза [35, 128]
Р е а г е н т ы. Смесъ уксусной кислоты и уксусного ангидрида
(4 :1). Непосредственно перед употреблением смешивают 8 мл ледя-
ной уксусной кислоты и 2 мл уксусного ангидрида.
0,3 н. раствор гидроокиси натрия в 90-ном метаноле (см. разд. 4.8.2).
Методика. Образец суммарных липидов или хроматографи-
чески однородной липидной фракции ( ~ 25—50 мг липидов) домеша-
ют в колбу для гидролиза с боковым отростком (рис. 2.2), прибав-
102
Глава 4
ляют 3 мл смеси уксусной кислоты и уксусного ангидрида (4:1) и
кипятят 8,5 ч с обратным холодильником (защищенным хлоркальцие—
вой трубкой). К охлажденным продуктам ацетолиза прибавляют 3-
4 мл метанола и упаривают растворитель в вакууме на роторном
испарителе. К остатку прибавляют 5 мл смеси метанол—вода (9:1)
и экстрагируют ацетилированные алкиловые эфиры глицерина и жир-
ные кислоты несколькими порциями (по 5 мл) низкокипяшего петро-
лейного эфира. Экстракт переносят в другую колбу для гидролиза,
растворитель упаривают в токе азота, остаток растворяют в 5 мл
0.3 н. метанольного раствора гидроокиси натрия и кипятят 1-2 ч.
Шелочной раствор экстрагируют несколькими порциями (по 5 мл)
низкокипяшего петролейного эфира, экстракты объединяют, перено-
сят во взвешенную колбу и упаривают в токе азота. Остаток (ал-
киловые эфиры глицерина) высушивают в вакуум-эксикаторе над
гидроокисью калия и взвешивают. В случае большинства природных
липидов, за исключением липидов галофильных бактерий, остаток со-
стоит в основном из моноалкиловых эфиров глицерина; галофильные
бактерии в основном содержат липиды - производные диалкиловых
эфиров.
Расчет. Содержание алкиловых эфиров, %=
Вес неомыляемых вешеств, мг
=------------------------------- х 1ОО.
Вес образца липидов, мг
4.14.2. Метод кислотного гидролиза
4.14.2.1. Определение моноалкиловых эфиров глицерина [261, 2621
Реагенты. Соляная кислота. 2,0 н.
Гидроокись натрия, 7,0 н.
Методика. Гидролиз липидов проводят в тех же условиях,
что и при определении глиперина~ (см. разд. 4.12.3.1). Аликвотную
часть раствора липидов (10-20 мг вещества) помешают в ампулу
из стекла пирекс, конец ампулы оттягивают. Растворитель выпарива-
ют досуха, прибавляют 4,5 мл 2,0 н. соляной кислоты. Ампулу за-
паивают и нагревают 48 ч при 125°С. Охлажденный гидролизат
переносят в пробирку емкостью 20 мл, снабженную пробкой, прибав-
ляют 5,0 мл метанола и 5,0 мл хлороформа, встряхивают и центри-
фугируют. Хлороформный слой удаляют с помощью пастеровской пипет-
ки, водно-метанольный слой дважды экстрагируют хлороформом (пор-
циями по 2,0 мл). Объединенный хлороформный раствор разбавляют
бензолом и упаривают в колбе с боковым отростком. Остаток раст-
воряют в 4,5 мл метанола, к раствору прибавляют 0,5 мл 7,0 н.
гидроокиси натрия и экстрагируют алкиловые эфиры глицерина низко-
кипяшим петролейным эфиром. Экстракт упаривают досуха в токе
Общие-меиоОы анализа
103
азота, остаток (алкиловые эфиры глиперина) высушивают в вакуум—
эксикаторе и взвешивают. Алкиловые эфиры глицерина можно раст-
ворить в 5 мл хлороформа, отобрать аликвотную честь раствора и
проанализировать ее на содержание а- моноалкиловых эфиров глице—
. рина перйодат-хромотроповым методом (см. раза. 4.13.1). Жирные
кислоты можно экстрагировать из попкисленного воцно-метанольного
раствора л проанализировать метопом ГЖХ (см. разд. 7.1.6.2). Ос-
вобожденную от жирных кислот водно-метанольную фазу можно ис-
пользовать для определения водорастворимых компонентов липидов
(разд. 4.12).
Расчет. Содержание алкиловых эфиров глицерина, %=
Вес нейтральных продуктов гидролиза, мг ^qq
Вес образца липидов, мг
4.14.2.2. Определение диалкиловых эфиров глицерина,[171, 173]
Реагенты. Раствор хлористого водорода в метаноле, 2,5%-ный,
'•'0,7 н. (см. разд. 4.8.1).
Гидроокись натрия, 7 h„
Методика. Аликвотную часть раствора содержащую 10-
25 мг липидов, помешают в колбу с боковым отростком, раствори-
тель выпаривают в токе азота, прибавляют 4,5 мл метанольного
раствора хлористого водорода и кипятят 5 ч. К гидролизату прибав-
ляют 0,5 мл 7 н. раствора гидроокиси натрия, кипятят еше 1 ч,
экстрагируют диалкиловые эфиры глицерина петролейным эфиром
(30-60 С) порциями по 5 мл и упаривают досуха в токе азота,
остаток сушат в вакууме и взвешивают. Содержание диалкиловых
эфиров глицерина в экстракте можно также определить методами
ТСХ (табл. 7.1) и ГЖХ (разд. 7.1.9.3). Освобожденный от алки-
ловых эфиров метанольный раствор можно сконцентрировать до не-
большого объема, гидролизовать нагреванием с 1 н. водным раство-
ром соляной кислоты (2 ч, 1ОО°С) и проанализировать на содержа-
ние водорастворимых компонентов липидов, как это описано в разд.
4.12 и 7.2.1.5.
Описанный выше метоп применяется для анализа смесей, содер-
жащих диалкиловые аналоги фосфатидилглицерина, фосфатидилглиперо-
фосфата и гликозилдиглицеридов.
4.15. Определение серы
* *
4.15.1. Определение суммарной серы [270, 30$]
Реагенты. Концентрированная азотная кислота, 69%-нал.
Перекись водорода, 30%-ная.
Разбавленный раствор аммиака, 0,2 н.
104
Глава 4
Хлоранилам бария, кристаллический (чистый).
Раствор сульфата калия в ацетатном буфере, 0,5 М, pH 4,0.
164 мл 0,5 М уксусной кислоты смешивают с 36 мл 0,5 М раст-
вора ацетата натрия и прибавляют 14,5 мг K2SO4.
Станоартный раствор сульфата калия,. 4 мН. 174,3 мг K2S34 раство-
ряют в 250 мл воды.
Методика. Аликвотную часть раствора суммарных липи-
дов или хроматографически однородных фракций сульфолипидов (со-
держащую 1—5 мг липидов, или 80-400 мкг серы) помешают в про-
бирку Дьюиса - Бенедикта, растворитель удаляют в токе азота. Ос-
таток разбавляют 1 мл концентрированной азотной кислоты, получен-
ный раствор упаривают досуха на плитке для микроопределения азо-
та по Кьельдалю, прибавляют 0,2 мл раствора перекиси водорода и
содержимое пробирки снова упаривают досуха. Остаток растворяют
ь 1 мл воды, доводят pH раствора до 4,0, приливая разбавленный
оаствор аммиака. Если в растворе присутствуют двухвалентные ка-
тионы, их удаляют, пропуская раствор через небольшую колонку с
ионообменной смолой дауэкс-50, рексин RG-50 или амберлит 1R = 100
(Н’’-Форма), и только после этого частично нейтрализуют (до pH
4,0) разбавленным раствором аммиака. В заключение раствор раз-
бавляют водой до объема 5,0 мл. К аликвотной части раствора объе-
мом 1.0 мл (содержание серы 20-80 мкг), помешенной в центри-
фужную пробирку емкостью 15 мл, прибавляют 4,0 мл 95%-ного
этанола, 0,5 мл 0,5 М смеси апетатного буфера (pH 4,0) и раст-
вора K,SO4. Содержимое пробирки перемешивают, добавляют пример-
но 10 мг хлоранилата бария и в течение 10 мин с интервалами
в 1 мин энергично перемешивают реакционную смесь на миксере
"Vortex”. Смесь центрифугируют 5 мин при 3000 g, переносят супер-
натант в круглую кювету с I 1.2 мм и измеряют поглощение при
530 нм по сравнению с поглощением холостого опыта. Используя
стандартный раствор сульфата, строят калибровочную прямую в ин-
тервале концентраций от 20 до Г00 мкг серы (100 мкг серы да-
ют поглощение 0,14). Фосфат не мешает определению серы, если
его концентрация в растворе не превышает 0,01 молв/л.
Расчет. Содержание серы, мкг=Поглощение образцах (Ко-
личество стандарта, мкг/Поглощение стандарта).
4.15.2. Определение серы в сульфамидах [111, 219, 308]
При использовании этой методики сульфоэфиры (натриевые, калие-
вые "ли аммониевые соли) расщепляют мягким кислотным гидроли-
зом в диоксане или в тетрагидрофуране /111, 219/ и методом коло-
риметрии (разд, 4.15.1) определяют количество образовавшегося не-
органического сульфата.
Общие методы анализа
105
Реактивы. Раствор хлористого вооорооа в диоксане или в
тетрагидрофуране. 0,005 н. Запасный примерно 2 н. раствор НС! в ди-
оксане или в тетрагидрофуране готовят, пропуская хлористый водо-
род через растворитель, перегнанный непосредственно перед употреб-
лением над LiA!H4 (см. разд. 2.1). Аликвотную часть полученного
раствора разбавляют соответствующим растворителем, доводя кон-
пентрацию НС! в растворе до 0,005 н. Реактивы для колориметрическо-
го определения сульфата. Методика приготовления реактивов описа-
на в разд. 4.15.1.
Методика. Образец хроматографически однородного супь—
фатида в виде калиевой, натриевой или аммониевой соли (содержание
серы 2-10 мкмолей) помещают в круглодонную колбу объемом
25 мл и упаривают в токе азота. К остатку добавляют 2 мл
0,005 н. раствора НС! в диоксане или тетрагидрофуране; реакцион-
ную смесь в течение 15 мин кипятят с обратным холодильником,
упаривают в вакууме на роторном испарителе или в токе азота. К
остатку добавляют смесь 5,0 мл метанола, 2.0 мл воды и 2,5 мл
хлороформа, содержимое колбы переносят в пробирку емкостью 20 мл,
снабженную пробкой, добавляют 2,5 мл хлороформа и 2.5 мл воды,
встряхивают и центрифугируют. Аликвотную часть (~' 2,0 мл) верх-
ней водно-метанольной фазы переносят в центрифужную пробирку объе-
мом 15 мл и упаривают досуха в токе азота при 40-50°С. Остаток
растворяют в 1,0 мл воды и определяют в нем содержание серы ко-
лориметрическим методом, описанным в разд. 4.15.1. Липидные
фрагменты сульфатидов можно выделить из хлороформного слоя, полу-
ченного при распределении продуктов десульфирования между хлоро-
формом и водой, и исследовать методами ТСХ и ГЖХ.
4.16. Спектроскопический анализ
Практика показала, что спектроскопические методы анализа, та-
кие, как ИК-, УФ- и ЯМР-спектроскопия, весьма полезны при иден-
тификации липидов, и в настоящее время они широко применяются
при изучении этих соединений. Ниже кратко рассматриваются лишь
наиболее часто применяемые спектроскопические методы анализа.
Читателю, желающему подробнее ознакомиться с теорией и практикой
этих методов, следует обратиться к специальной литературе, ссылки
на которую даются ниже.
4.16.1. УФ-спектроскопия [89, 289]
Поглощение в ультрафиолетовой и видимой областях спектра обус-
ловлено возбуждением валентных электронов и переходом их на бо-
лее высокие энергетические уровни. Функциональные группы, содержа-
щие атомы с неподеленной парой электронов (карбонильные группы и
106
Глава 4
нитрогруппы), а также двойные и тройные связи, сопряженные двой-
ные связи и т. с., сильно поглощают в ультрафиолетовой области
спектра; максимумы поглощения соответствуют характеристическим
длинам - волн Лмакс и определяют коэффициенты молярной экстинкции
(‘макс)-
Методика. Чтобы удалить следы растворителей, образец
сушат в вакуум—эксикаторе над КОН в высоком вакууме, взвеши-
вают и приготовляют раствор известной концентрации (обычно 10“4М)
в неполярных растворителях, таких, как гексан, циклогексан или
иэооктан, или в свежеперегнанном 95%-ном этаноле. С помощью
двухлучевого записывающего спектрофотометра записывают спектр
(180—400 нм) вещества, помешенного в кварцевые кюветы (~3мл,
I 1.0 см), по отношению к растворителю, помещенному в стандарт-
ную кювету.
Частоты поглощения хромофорных групп. В табл. 4.1 приведены
некоторые полосы поглощения в УФ-области спектра, по которым
можно идентифицировать липиды /232/. Следует заметить, что зна-
чение А.макс для того или иного соединения может до некоторой
Таблица 4.1
Максимумы поглощения некоторых хромофорных групп
в УФ-спектрах /21, 89/
Хромофоры Пример ^макс, нм ‘макс Раство- рителе
г/ енасыщенные углеводороды -С = С - Октен 177 12600 Гептан
-С = С- Октин 178 10000 То же
196 2100 Г
-С=С-С=С- Бутадиен 217 20 900 Гексан
-С=С-С=С-С=С- Гексатриен- 247 68000 Хлоро-
1,3,5 форм
-(С = С)П- Сопряженные 217 + 20 000 Гексан
полиены 30(п-2) 100 000
снэ
_(С = С-С = С)П- £ -Каротин 452 139000 То же
( каротиноиды ) 478 12200 — * —
Бензол 184 47000 Циклогек-
202 • 7000 сан
255 230
Карбонильные соединения -НС-0 Ацетальдегид 290 17 Гексан
5С = 0 Ацетон 275 17 Этанол
-С = С-СО-С _ Метилвинилке- 213 7 100 То же
ТОН 320 27
Общие методы анализа
107
Продолжение табл. 4.1
Хромофоры Пример ^макс, нм (макс Раство- ритель
— СООН Уксусная —- 208—210 32—50 Этанол пальмитиновая кислоты -СО,Н Этилапетат • 211 50 То же -СН=СН—СООН Кротоновая 206 13 500 — * — кислота (цис) 242 250 — CH = CH-CH = СН — СООН Сорбиновая кис- 251 27 000 - * - лота (траке) 257 27 400 СН3(СН-2)6(СН = СН)2(СН2) 7СООН 'Сопряженная 231 29000 - ' - линолевая' кислота (траке) СН3(СН2)3(СН = СН)3(СН2)7С00Н 'Сопряженная 258 40 500 - ' - линоленовая* 268 57 000 кислота (траке) 279 44000 — СО—СН2 —СООН Этилацетоацетат 245 6700 Гексан q 1.4-Бензохинон 242 24000 То же 281 400 1,4—Нафтохинон 2431 -24000 Гексан 249 | 260 1 оп п-- 269 Г ~20 000
степени меняться в зависимости от применяемого растворителя. В
большей степени это относится к полярным соединениям и в мень-
шей степени - к неполярным. Если системы содержат сопряженные
двойные связи, на величину Лмакс влияет число двойных связей,
алкильных и циклоалкильных заместителей. Для полиеновых углево-
дородов или альдегидов действительно следующее общее правило:
к основному значению 217 нм (бутадиен) добавляют по 30 нм на
каждую двойную связь, продолжающую сопряжение, и по 5 нм на
каждый алкильный или циклоалкильный заместитель.
4.16.2. ИК-спектроснопия [37, 89, 234]
Поглощение в ИК-области спектра связано с возбуждением мо-
лекулярных колебаний квантами инфракрасного излучения. Существу-
ют два основных вида молекулярных колебаний: валентные и дефор-
мационные. Частота поглощенного излучения равна характеристичес-
кой частоте валентных и деформационных колебаний соответствующей
связи. Таким образом, при облучении молекулы инфракрасным све-
108
Глава 4
том будут поглощаться только кванты, частоты которых соответ-
ствуют частотам валентных или деформационных колебаний связей
этой молекулы.
Методика. Чтобы удалить следы летучих растворителей
и воды, образец сушат в вакуум—эксикаторе над гранулированным
NaOH в высоком вакууме. При работе с маслами, т. е. углеводоро-
дами, ненасыщенными жирными кислотами или жирными кислотами
с разветвленными цепями, ненасыщенными глицеридами или просты-
ми эфирами глицерина и т. п. каплю вещества помешают между дву-
мя пластинками из хлористого натрия и слегка сдавливают пластин-
ки, чтобы получить тонкую пленку вещества. Толщина пленки зави-
сит от того, с какой силой были сдавлены пластинки; при 2900 см
достигается максимальное поглощение, равное 1,5. При работе
с твердыми липидами ИК-спектры можно снять, поместив 1-2%-ный
раствор вещества (10-20 мг/мл) в четыреххлористом углероде или
хлороформе в сдвоенные кюветы из NaCl толщиной 0,2 мм. Пои
работе с высокополярными липидами, растворимость которых в ука-
занных выше растворителях может оказаться недостаточной, можно
снимать спектры образцов, запрессованных в таблетку с КВг.Таблет-
ку получают следующим образом. В круглодонной колбе объемом
50 мл смешивают 200 мг КВг с раствором образца (~2 мг) в
0,5-1,0 mjj смеси хлороформ-метанол (1:1) и упаривают на ротор-
ном испарителе в вакууме. Остаток высушивают в вакуум-эксикато-
ре над КОН в высоком вакууме и переносят в форму из нержавею-
щей стали. Под давлением примерно 1600 атм спрессовывают КВг
в прозрачную таблетку толщиной 1-2 мм, диаметром 10 мм. Поме-
шают таблетку в держатель и. используя двухлучевой ИК-спектро-
фотометр, записывают спектр в диапазоне 4000-600 см")
Полосы поглощения. В табл, 4.2 приведены некоторые характе-
ристические частоты поглощения ИК-спектров, по которым можно
идентифицировать основные классы липидов. Инфракрасные спектры
некоторых типов липидов показаны на рис. 7.1 (подробнее см./99/)
Следует отметить, что на полосы поглощения, соответствующие фос-
фатным группам /1/, влияет ионная форма фосфолипидов, и, интер-
претируя их спектры, следует иметь в виду это обстоятельство.
4.16.3. Я верный магнитный резонанс [89, 135, 140]
В методе ЯМР используется явление индукции резонанса в оп-
ределенных атомных ядрах, чаше всего протонах, при облучении их
радиоволнами в сильном магнитном поле. Ввиду несовершенства
техники абсолютные частоты поглощения не поддаются измерению.
Поэтому положение полос поглощения или химических сдвигов из-
меряется относительно произвольно взятого стандарта, обычно тет-
раметллсилана (ТМС), и выражаются в миллионных долях напряжен-
ности магнитного поля (м.д. или мпн-1).
Таблица 4.2
Характе)шстические полосы поглощения в ИК-спектрах различных
липидов, растворенных в хлороформе, четыреххлористом
углероде, или снятых в пленке /31, 89, 120, 234/
Рункниональные группы Тип колебаний /89/ Частота, см 1 [Интен- 1сивность J
-сн3 СН, валентные 2962 и 2872+10 Сильная
СН, деформацион—1 симм. 1375 ± 5 Средняя
ные (асимм 1450 + 20 То же
-ОСН3 СН, деформационные 1430 — -
—сн2 СН, валентные 2926 и 2853 + 10 Сильная
С Н, деформационные 1465 + 10 Средняя
(СН2)4, скелетные 750 - 720 То же
-СН —. в СН. дефор —
* • мационные 3100 — 3000
циклопропане скелегные ]025 _ ]000 — —
-С(СН3 )2 СН, деформационные 1385 и 1365 + 5 Средняя
(дуплет)
скелетные 1170 + 5 Средняя
-С(СН3)Э СН, деформационные 1395- 1385(ср.); 1365 Сильная
скелетные 1250 - 1200 Сильная
-СН СН, валентные 2890 + 10 Слабая
1 СН, деформационные 1340 + 20 То же
-с=с- С = С, валентные несо- 1680 - 1620 Перемен-
пряженные ная
С = С, валентные сопря- 1625 ± 20 То же
женные с бензольным
- кольпом
С=С, валентные;
С =О или С =С,
сопряженные 1600 + 20 _ г
СН, валентные 3040 - ЗОЮ Средняя
-сн=сн- СН. внеплоскостные 970 - 960 Сильная
(транс) деформационные
СН, плоскостные де- 1310- 1295 Сильная-
формационные слабая
—СН = СН—(час) СН, внеплоскостные -690 Средняя
деформационные
-сн»сн2 СН, валентные 3095 - 3075 То же
СН, внеплоскостные 995 - 985 Сильная
деформационные
СН^, внеплоскостные 915- 905 То же
деформационные
СН2, плоскостные 1420 - 1410
деформационные
Продолжение табл. 4.2
Функциональны е группы г. . - - Тип колебаний /89/ Частота, см 1 Интен- сивность
R, R2 С-СН2 СН, валентные 3095-3075 Средняя
СНг, внеплоскостные 895 -885 Сильная
деформационные СНи, плоскостные дефор— 1420-1410 То же
мапионные
R,R.C-CHR3 СН, внеплоскостные де- 840 - 790 — —
формационные
Изопреноицы СН внеплоскостные де- 835 г
~С(СН3 )=сн- формационные
А роматические =С-Н, валентные 3030 Узкая
соединения =С-Н, внеплоскостные:
-с=с- 5 атомов Н 770-730 и Очень
710—690(2 полосы) сильная
4 атома Н 770—735(1 полоса) То же
3 атома Н 810-750
2 атома Н 860 - 800 _ * _
С = С, скелетные 1600-1500 Слабая
НСв С—R Cs С, валентные 2260-2190 Средняя
R-C^C-H С=С, валентные 2140-2100 То же
С—Н, валентные 3300
-с-он О—Н, валентные, сво- 3650 -3590 Слабая
бедная группа ОН (узкая)
О —Н, валентные, ассо- 3400 - 3200 То же
пиированная группа ОН (широкая)
(водородные связи) С—О, валентные 1150 — 1140 (тпетичная) Сильная
1120-1100 (вторичная) То же
1075-1010 (первичная) - * -
Алкиловый С—О, валентные 1150-1060 Очень
эфир -С-О-С- сильная
Арилалкиловый эфир =С—О—С С —О. валентные 1270-1230 То же
иис- Алкен-1- С —О, валентные 1270-1230 Сильная
иловый эфир С=С, валентные 1670 Средняя
Н Н 1 1
-с= С-О-С СН, деформационные 732-730 То же
ИроОолжение яабл. 4.2
Функциональные Тип колебаний /89/ Частота, см 1 Интен—
группы сивность
-С-О-С С —О, валентные 1250 Сильная
миг 830 Средняя
траме 890 То же
Алкилперекиси С—О, валентные 890-820 Слабая, перемен-
ная
Ацилперекиси С-О 1820-1810 и 1800-1780 Сильная
Альцегиды С»О:
С=О насыщенные 1740-1720 То же
a, & ненасыщенные 1705-1680
Кетоны С=О, валентные:
СО насыщенные 1725-1705 Сильная
a, fi- ненасыщенные 1685-1665 Г ...
Карбоновые С = О, валентные:
кислоты насыщенные жирные 1725-1700 г
RCOOH а, /3-ненасыщенные 1715-1690 — * —
жирные С~О, валентные 1320-1210 _ г —
Сложные эфиры С=О, валентные:
RCO-OR насыщенные 1750-1730 — ж»
а, (8-ненасыщенные 1730-1717
fl- кетоэфиры (енолы) С-О, валентные: 1650-1640 — —
формиат 1200-1180 Средняя
ацетат 1250-1230 То же
пропионат и эфиры 1200-1150
высших кислот
Первичные NH, валентные (свобод-
амиды ная NH ) 3500 и 3400 — —
R-CO-NH, NH, валентные (связан- 3350 и 3180 *
ная NH ) С=О, валентные 1690-1650 Сильная
NH2, деформационные 1620-1590 То же
С — N, валентные 1420-1400 П времен-
ная
Вторичные NH, валентные 3440 - 3400 Средняя
амиды (свободная NH )
R -СО -NHR NH, валентные (связан- ная NH ) 3320-3140 То же
С=О, валентные 1680-1630 Сильная
NH, деформационные 1550-1510 То же
Третичные С=О, валентные 1670-1630 Г
амины
R-CO-NR.
112
Глава 4
Продолжение табл. 4.2
Ф уикци о нальни группы Тип колебаний /89/ i . Частота, см ’ Интен- сивность
Ангидриды С = О, валентные 1850-1800 и Сильная
со-о-со С—С, валентные 1790-1740 1170— 1056
Первичные NH. валентные 3500 — 3300 Средняя
амины —NH-, NH, деформационные (2 полосы) 1650-1590 Сильная —
средняя
Вторичные NH, валентные 3500-3300 Средняя
амины —NH Nil. деформационные (1 полоса) 1650-1550 Очень слабая
Фосфаты Р=О, валентные 1300-1250 Сильная
R-0-ГО-О- (свободная)
0“ Р=О. валентные 1250-1200 Очень
(связанная/ сильная
Р-О—С (алифатическая) 1050-1000 То же
Р-О- 1110-1090 Сильная
2700-2560 Слабая
О и
Свободная Р-ОН 1240-1180,960 Сильная
кислота 4
Фосфонаты Р = О, валентные 1300-1250 ’То же
R —Ю - Р — С, валентные 750 - 650 Перемен-
ная
Сульфаты S=O, валентные 1230-1150 и Сильная
R-O-SO,OR — 1440 - Г350
S-О, валентные 845- 760 То же
Сульфонаты С—О, валентные 1040- 930 ... — м
R-O-SOj-R S = O, валентные 1420-1330 и — ж —
1200-1145 — *4-.
S -О. валентные 900 Г _
С -S, валентные 800- 600 Слабая
Др • 106 -
й -
Частота магнитного поля (60 МГц)
где Дг - разность величин частот поглощения исследуемого образца
и стандарта, Гц. Если за стандарт принимать ТМС, то значение его
Общие методы анализа
113
полосы поглощения удобно принять за 10 и выразить поглощение
исследуемого образца значением г (м.д.), причем г = 1G-&,
Методика. Приготовление образца. Образен приготавли-
вают так же, как и при получении ИК-спектра. Желательно снимать
ЯМР-спектры относительно концентрированных растворов (35-
50 мг/мл). Как правило, в ЯМР используются апротонные раст-
ворители: четыреххлористый углерод, дейтерохлороформ, сероуглерод
или дейтериевая вода. Можно также использовать свободный от спир'
тов хлороформ высокой очистки, который дает единственный пик
.при г 2,75.
В качестве внутреннего стандарта к раствору добавляют 5-10%
ТМС. Поскольку минимальное количество раствора, необходимое
для получения спектра, составляет 0,3 мл, то для снятия ПМР-спек
тра требуется как минимум 10-15 мг вещества.
В табл. 4.3 дан перечень сигналов протонного резонанса, по ко-
торым можно идентифицировать основные классы липидов. Ряд харак-
терных ЯМР-спектров показан на рис. 7.2. Эти вопросы подробно
рассматриваются в работах /67, 134, 135/.
Таблица 4.3
Сигналы протонного резонанса /89, 135/
Соединение или группа1' i г
(CH > s; 10,00
- CII_-, циклопропан 9,78
СН,-, концевая в парафинах 9.10-9,12
(СН3)2 С, изопропил 8,7-8,8
—СН2—, парафины 8,65-8,80
RSH, сульфгидрильные 8,5-8,9е
RNlj2 (конц. 0.1-0,9 молей) (8,2)8,5-8,9 ь
R,NH (конц. 0,1-0,9 молей) (7,8)8,4-9,6^
R,C —Н, парафины 8,35-8,6
СН3—С=С-,аллильные метильные (сквален) 8,1-8,4
св3-с=о 7,4-8,1
СН,Аг 7.5-7,75(7,9)
-СН2—СО, эфиры жирных кислот 7,8-7,9
—Cjj2 —СО, кетоны 7,5-7,8
—CH, —С = С, аллильные метиленовые группы 7,96
CH3-N 7,0-7,9
Н —С = С—, несопряженные 7,35-7,55
Н— С=С—, сопряженные 6,9-7,2
СНз~О—, простые эфиры 6,2-6,7
СН^—О—, алифатические сложные эфиры 6,2—6,4
—СГ|,—0-, алифатические насыщенные спирты
или простые эфиры 6,3-6,6
1)4
Глава 4
ПроОолжение табл. 4.3
Соединение или группаа 1 " 1 1 г L
ROH (кони. 0,1-0.9 молей) С = СН -0—.виниловые эфиры 4,7-7,0 4,2(цис), 4,0 (транс)
СН2 = С, несопряженная Н —С = С— олефиновая несопряженная Н—С=С—, циклическая несопряженная СН3 Н—С= С—, изопреноидный олефиновый Н 1 сквален) СН2=С, сопряженная Н—С = С, сопояженная В —N —С =0, ами дпая NH Ar—Н RCHO, алифатическая насыщенная RCHO, алифатическая а. П- ненасыщенная —ЯО3Н КСО2Н, димер, в неполярных растворителях 5,0-5,4 (4,1) 4,3-4.8 (4,9) 4,3-4,8 4,88-5,00 (3,75) 4,3-4,7 (2,9) 3,5-4,0 (4,5) 1,5-4,5 (0,5) 2,0-3,4(4.0) 0.2-0,3(0,5) 0.35-0,50 -2.0 до -1,0 (-3,2) -2,2 до -1,0 (+0,3)
d Определяющий протон обозначен как Н, указаны обычные диапазоны
сигналов. В скобках приведены частоты поглощения тех соединений, которые
могут поглотать за пределами обозначенной области.
° Положение сигналов этих групп зависит от концентрации измеряемого
раствора; сигналы сдвигаются в область более высоких значении т , если
растворы более разбавленны.
Чтобы провести количественный-анализ этим "методом, площади
пиков суммируют (см. рис. 7.2), причем полученная величина про-
порциональна суммарному числу протонов в молекуле. Затем число
протонов в любой панной функциональной группе выражают отноше-
нием плошали данного пика или группы пиков к суммарной плошади.
Комбинированное применение И К- и ЯМР-спектроскопии явля-
ется наиболее эффективным методом исследования структуры липи-
дов. Оно дает обоснованное представление о молекулярной структу-
ре, которое можно использовать для дальнейших исследований.
4.16.4. Масс-спектрометрия [36, 51, 222, 279\
Как правило, масс-спектрометрию используют для получения ре-
шающих данных, необходимых для идентификации неизвестных веществ.
Следует, однако, помнить, что, применяя только масс-спектрометри-
ческий анализ, нельзя получить представление о некоторых опреде-
Общтге методы анализа
115
ленных структурных аспектах, например о стереохимии и о положе-
нии двойных связей в полиенах. Этот недостаток можно преодолеть,
объединяя масс-спектрометрию с другими методами (см., напри-
мер, /222/). х
Масс-спектр любого соединения состоит из характерных пиков,
соответствующих молекулярным фрагментам с разными соотношения-
ми масс к заряду электррна )т/е/' образовавшимся в результате
бомбардировки вещества электронами в ионизационной камере и (или)
в результате "крекинга* во время испарения вещества. Молекуляр-
ный пик, если таковой имеется, обладает наиболее высоким отноше-
нием m/е и соответствует нефрагментированной ионизированной
молекуле. Он дает значение молекулярного веса с точностью до од-
ной единицы.
-Приготовление образца. Метод приготовления образца зависит
от способа его введения в масс-спектрометр. Существуют три спо-
соба введения образца.
а. Введение с помощью делителя потока, установленного на вы-
ходе газожидкостного хроматографа, который направляет часть по-
тока газа-носителя с веществом через диффузионный натекатель Би-
мана прямо в масс-спектрометр /222/. Этот метод применяется
только при работе с приборами, объединяющими масс-спектрометр и
газожидкостной хроматограф (например, прибор фирмы "Hitachi Per-
kin-Elmer" ). В этом случае образец или его компонент, как только
он элюируется с колонки хроматографа, автоматически вводится в
спектрометр. Приготовление образца для анализа методом хромато-
графии описано в разд. 5.5.3.
б. Непосредственное введение в спектрометр. Несколько микро-
литров концентрированного 15—20%-ного раствора образца в лету-
чем инертном растворителе, например гексане, ацетоне, этиловом
эфире (свободном от перекисей) или бензоле, но не в хлороформе,
вводят микропипеткой в стеклянную пробирку с внутренним диамет-
ром 2 мм или в капилляр и упаривают почти досуха в токе азота.
Образец помешают в ампулу, которую вводят в высоковакуумную
систему масс-спектрометра. Систему откачивают, чтобы удалить
следы растворителя. Вводят ампулу через вакуумный шлюз в ионный
источник. Такая методика применяется при работе с веществами,
обладающими относительно низкой летучестью; вес образца должен
составлять 0,1-0,2 мг.
в. Раствор образца (0,2-1 мг) в одном из перечисленных выше
растворителей помешают в кругло донную колбу объемом 10 мл со
* Диффузионный натекатель Бимана используется в хроМато-масс^спек-
трометре LKB-9000. Этот прибор в последние годы чаще всего применяется
для хромато-масс-спектрометрии природных липидов и продуктов их расщепле-
ния. — Прим, перее.
116
Глава 4
стандартным шлифом и упаривают в токе азота. Колбу соединяют
с внешним выводом масс-спектрометра. В течение определенного
времени снижают давление и постепенно нагревают колбу с образ-
цом (до 300°С и выше). В результате испаряющийся образец через
тонкий капиллярный натекатель поступает в масс-спектрометр.
Масс-спехтрометричесхий анализ. Метод интерпретации масс-
спектров (на рис. 7.4 приведены примеры масс-спектров) не рас-
сматривается в данной книге. Читателю следует обратиться к соот-
ветствующим монографиям /36, 51, 222, 279/. Ниже перечислены
общие эмпирические правила фрагментации, весьма полезные для
интерпретации масс-спектров алифатических соединений (включая
липиды).
а. Соединения с разветвленными углеродными цепями или кето—
ппоизводные расщепляются по обеим сторонам цепи или соответ-
ственно кетогруппы.
5. Окси соединения расщепляются по а,/3-связям по отношению
к оксигруппе.
в. Метиловые эфиры жирных кислот отщепляют группу ОСН3, ос-
тается фрагмент R —С + = 0, т/е~ М’ - 31; кроме того, образуется фраг-
мент [СНЭО—С(ОН)=СНг]+, которому соответствует пик с т/е 74, ха-
рактерный - для метиловых эфиров. Фрагментация вдоль цепи вызыва-
ет образование сепии пиков, соответствующих фрагментам, отщепля-
ющимся от метилового и карбометоксильного концов молекулы (см.
рис. 7.4).
Глава 5
РАЗДЕЛЕНИЕ СМЕСЕЙ ЛИПИДОВ
Методы анализа функциональных групп природных липидов, опи-
санные в предыдущей главе, дают некоторое представление о клас-
сах соединений, содержащихся в смеси. Следующая стадия исследо-
вания состава липидов - разделение их сначала на отдельные клас-
сы, а затем на индивидуальные компоненты. Выбор методики раз-
деления, используемой на этой стадии, во многом зависит от того,
к какому классу относятся анализируемые липиды. Обычно липиды
животных и микробных клеток состоят на 60-85% из фосфолипидов
и гликолипидов, остальное приходится на полю нейтральных или не-
полярных липидов (глицеридов, стеринов, углеводородов, пигментов).
В листьях из-за высокого содержания хлорофилла и каротиноидов
большую долю составляют нейтральные липиды и значительно мень-
шую - фосфолипиды. Еше более высокое содержание нейтральных
липидов (в основном глицеридов) характерно для семян, они содер-
жат лишь небольшие количества фосфолипидов.
Неудивительно поэтому, что методика разделения, эффективная
для липидов, выделенных из одного природного источника, может
оказаться непригодной для липидов, полученных из другого источника.
В последующих разделах описаны наиболее распространенные и
эффективные методы разделения липидов, причем расположены эти
методики в порядке возрастания их эффективности.
5.1. Разделение по растворимости
5.1.1. Осаждение аиетоном
Это самый простой и часто самый эффективный метод отделения
фосфолипидов от нейтральных липидов, в том числе и от пигментов.
'^Большинство фосфолипидов, в частности кислые фосфолипиды (в ви-
*Дё солей), совершенно не растворяются в холодном ацетоне, в то
время как глицериды и другие нейтральные липиды хорошо раство-
ряются в ацетоне даже на холоцуу Метод наиболее пригоден для раз-
деления липидов животного и микробного происхождения, менее эф-
фективен при разделении липидов листьев и почти не применим для
118
Глава 5
разделения липидов семян или других смесей с высоким содержани-
ем нейтральных липидов и низким содержанием фосфолипидов.
М е т о д и к а. Аликвотную часть раствора липидов ("100 мг)
животных тканей (клеток крови, мозга, печени, почек и т. д.) или
микробных клеток (дрожжей, водорослей, непатогенных бактерий и
т. д.) помешают в центрифужную пробирку с притертой стеклянной
пробкой емкостью 15 мл. Раствор упаривают в токе азота при 30 °C
до объема 0,2-0,3 мл, добавляют 5 мл ацетона и 0,1'мл 10%-ного
раствора MgCl, • 6Н,О в метаноле, перемешивают и охлаждают вбане
со льдом в течение 1 ч. Суспензию центрифугируют 3—5 мин при
2500 об/мин и удаляют супернатант пастеровской пипеткой. Осадок
промывают, суспендируя в 1 мл холодного ацетона, суспензию ох-
лаждают в бане со льдом и центрифугируют, как описано выше. Опе-
рацию промывки повторяют два раза. .Осажденные фосфолипиды сушат
в токе азота в вакуум-эксикаторе над КОН. Высушенный остаток
взвешивают и растворяют в определенном объеме хлороформа. Объе-
диненный ацетоновый супернатант упаривают, нейтральные липиды
взвешивают и растворяют в определенном количестве хлороформа.
При работе с высоконенасышенными липидами стадию высушивания
опускают. Сухой вес определяют по аликвотной части хлороформного
раствора (разд. 4.1).
Как правило, нерастворимый в ацетоне материал содержит не
менее 95% липидного фосфора и лишь следы нейтральных липидов
(например, пигментов). Растворимая в апетоне фракция содержит
все нейтральные липиды - глипериды, стерины, эфиры стеринов, уг-
леводороды и пигменты (каротиноиды) - и лишь следы фосфолипи-
дов. Гликолипиды, например моногликозилдиглицериды гликози-
ды стеринов, как правило, содержатся в ацетоновом растворе, а ди—
или полигликозилдиглицериды, цереброзиды и сульфатиды могут на-
ходиться и во фракции, нерастворимой в ацетоне. Обе фракции ана-
лизируют методом бумажной хроматографии на бумаге^ пропитанной
кремневой кислотой, или ТСХ (разд. 5,3 и 5.4).
5.1.2. РазОеление распрвовлеки ем межоу несмешиваюшимися растворителями
(противоточное распреоеление)
Распределение вешеств между несмешиваюшимися растворителя-
ми, или противоточное распределение, зачастую представляет собой
эффективную предварительную стадию разделения смесей липидов,
особенно смесей, богатых глиперидами (липиды семян растений или
жировых тканей) или каротиноидами и пигментами (липиды листьев).
При противоточном распределении компоненты смеси распределяют
между двумя несмешиваюшимися растворителями, верхнюю и нижнюю
фазы разделяют, и вещества, содержащиеся в обеих фазах, снова
распределяют между теми же самыми растворителями столько раз.
Разделение смесей липидов
119
сколько требуется для разделения данной смеси. .Дйя смесей двух-
трех вешеств, значительно различающихся по полярности, обычно
бывает достаточно четырех распределений. Для разделения смесей,
состоящих из большего числа компонентов, могут потребоваться
сотни распределений. В настоящее время сконструированы приборы
для автоматического проведения в течение нескольких часов от 60
до 420 распределений. До 20 распределений можно без особого
труда выполнить вручную. Поскольку теоретические основы и прак-
тические методики противоточного распределения достаточно полно
описаны в литературе /75, 88/, в настоящей книге эти вопросы
обсуждаться не будут.
Что же касается применения противоточного распределения для
разделения очень сложных смесей клеточных липидов, то оно свя-
зано с рядом ограничений. Главная и пока непреодолимая трудность
состоит в том, что молекулы сильнополярных липидов, таких, как
фосфолипиды и гликолипиды, имеют большую склонность к ассоциа-
ции друг с другом, и как следствие этого при разделении получа-
ют не индивидуальные соединения, а группы родственных веществ.
Добавление в системы растворителей уксусной кислоты сводит до
минимума ассоциацию полярных липидов, но существенно ухудша-
ет качество разделения. Однако противоточное распределение мож-
но использовать для разделения клеточных липидов на три основные
группы, сильно различающиеся по полярности. К наиболее хорошо
зарекомендовавшим себя системам растворителей относятся следу-
ющие:
1) петролейный эфир (т. кип. 30—60°С) - 85%-ный этанол
(1:1 по объему);
2) четыреххлористый углерод - метанол - вода (62:35:4 по
объему, соотношение фаз 1:1);
3) 95%-ный гексан — метанол (соотношение фаз 1:1). Систе-
мы для противоточного распределения детально рассматриваются
в работе I2AQI.
В качестве «примера разделения сложных смесей липидов мы
рассмотрим методику разделения липидов листьев шпината /9/
и других смесей липидов, богатых глицеридами /102/.
А. Противоточное распреоеление липидов листьев [ 9]
Реагенты и аппаратура. Прибор для противо-
точного распределения Крейга - Поста с 60 стеклянными ячейка-
ми; разделение проводится вручную.
- • Суммарный липидный экстракт листьев шпината (разд. 3.3).
Система растворителей СС1 4—СНЭОН—Н20 (62:35:4).
Методика. Во все ячейки прибора, кроме первых четы-
рех, заливают по 10 мл верхней и нижней фаз указанной выше сис-
темы растворителей. В первые четыре ячейки помещают по 10 мл
120
Глава 5
верхней фазы и в каждую прибавляют раствор 1 г суммарных липи-
дов листьев шпината в 10 мл нижней фазы. Чтобы разделить липи-
ды, производят 120 переносов верхней и нижней фаз. Содержание
липидов в каждой ячейке контролируют методом ТСХ на микроплас-
тинках из силикагеля (разд. 5.4) в системах хлороформ - метанол
(9:1) (для нейтральных липидов) и диизобутил-кетон-уксусная кис-
лота - вода (40:25:4) для более полярных липидов. В результате
получают три основные фракции, каждую из которых разделить на
компоненты методом хроматографии значительно легче, чем смесь,
содержащуюся в тканевом экстракте. Первая фракция - неполярные
липиды: почти все каротины, хлорофилл, воски и глицериды (ячей-
ки 0-36). Вторая фракция - более полярные нейтральные липиды:
моногалактозилдиглицериды, некоторое количество дигалактозилди—
глицеридов, лецитин и фосфатидилэтаноламин (ячейки 34-90).
Третья фракция - высокополярные кислотные липиды: дигалактозил-
диглицериды, фосфатидилглицерин, сульфолипиды и фосфатидилинозит
(ячейки 82-120). Весь хлорофилл практически содержится во фрак-
ции неполярных липидов, так что глико- и фосфолипидная фракции
содержат мало (или вообще не содержат) примесей пигментов (хло-
рофилл). которые с таким трудом удаляются при хроматографирова-
нии. К сожалению, не удается удалить все каротиноиды (ксантофил-
лы); хотя они в основном попадают в неполярную фракцию, но и по-
следующие полярные фракции содержат в виде примесей некоторое
количество оранжевых или желтых пигментов.
Б. Противоточное распреоеление смесей липидов, богатых глицериоами [708]
М е т о д и к а. Распределение производится в двух делитель-
ных воронках способом удаления элюата /75/ с применением сис-
темы растворителей: петролейиый эфир (т. кип. 40-7 0°С) - 87 %-ный
этанол. 10 г суммарного липидного экстракта молока или яич-
ного желтка растворяют в 45 мл верхней фазы, полученной при сме-
шивании равных объемов петролейного .эфира и 87%-ного этанола.
Переносят раствор в делительную воронку и встряхивают с 15 мл
нижнеи этанольной Фазы. Через 3-4 мин отделившуюся нижнюю фа-
зу переносят во вторую воронку, содержащую 45 мл верхней фазы,
а в первую воронку добавляют 15 мл нижней фазы. Встряхивают
обе воронки и через 3—4 мин переносят нижнюю фазу из второй во-
ронки в колбу, из первой воронки во вторую. Повторяют такое рас-
пределение шесть раз, на последней стадии распределения в первую
вооонку уже не добавляют нижней фазы. Объединенные этанольные
фазы (8x15 мл) разбавляют бензолом и упаривают в вакууме на
роторном испарителе. Выход полярных липидов составляет более
97% (примесь нейтральных липидов 0,02-0,03%). Основную массу
Разделение смесей липидов
121
нейтральных липидов получают упариванием объединенной верхней
фазы (петролейиый эфир).
5.2. Колоночная хроматография
Хроматография липидов на колонке с соответствующим абсорбен-
том представляет собой эффективный метод предварительного раз-
деления липидных смесей. Обычно применяют три типа колоночной
хроматографии: адсорбционную (твердо-жидкостную), ионообменную
и распределительную (жидко—жидкостную). Эти метопы подробно
рассматриваются в работах /59, 275, 276/.
5.2.1. Адсорбционная хроматография
При разделении методом адсорбционной хроматографии анализи-
руемые вещества образуют с твердым адсорбентом водородные или
ионные связи или связи, обусловленные действием вандерваальсо-
вых сил. Таким образом, разделение липидных смесей происходит
в соответствии с относительной полярностью их компонентов, кото-
рая определяется числом и типом полярных групп в молекуле, а так-
же числом и типом неполярных или гидрофобных групп. Обычно, ес-
ли используются элюенты с возрастающей полярностью, липидные
смеси разделяются в такой последовательности: насыщенные углево-
дороды, ненасыщенные углеводороды, воски, сложные эфиры стеринов,
высшие жирные альдегиды, триглицериды, высшие спирты, свободные
жирные кислоты, хиноны, стерины, диглицериды, моноглицериды, це-
реброзиды, гликозилдиглицериды, сульфолипиды, кислые глицерофос-
фатиды, фосфатидилэтаноламины, лизофосфатидилэтаноламин, лецитин,
сфингомиелин, лизолецитин /59, 275/,
Следует подчеркнуть, что, поскольку в смеси имеются вещест-
ва с одинаковой полярностью, однократное хроматографирование обыч-
но не приводит к полному разделению полярных липидов. Чтобы вы-
делить чистые индивидуальные классы липидов, обычно необходимо
провести разделение фракций методом препаративной тонкослойной
хроматографии (ТСХ) или колоночной хроматографии другого типа.
Индивидуальные представители определенного класса, отличающиеся
длиной пепи жирных кислот и степенью ненасыщенности, этим мето-
дом либо не разделяются вообще, либо разделяются частично.
Для колоночной хроматографии липидов применяются несколько
видов адсорбентов, в частности окись алюминия, окись магния, фло-
ризил (силикат магния), обработанный кислотой флоризил, силика-
гель, Чаше всего применяется силикагель. По хроматографическим
свойствам обработанный кислотой флоризил похож на крупнозернис-
тый силикагель. Ниже описана колоночная хроматография липидов
на силикагеле.
122
Глава 5
Как показала практика, предварительное разделение большинства
липидных смесей можно осуществить методом колоночной хромато-
графии на силикагеле с последовательным элюированием хлороформом,
ацетоном и метанолом. Таким образом, суммарные липиды можно
разделить на три группы: нейтральные липиды, гликолипиды и фосфо-
липиды. Каждую из указанных групп затем разделяют на фракции,
используя описанные ниже методики.
5.2.1.1. Общая методика разделения на колонке с силикагелем [275]
Реагенты и аппаратура. Силикагель . Силика-
гель унисил (Bnisil, 100-200 или 200-325 меш, " Cla rkson Cbemica J
Со”.),биосил (Bio—Sil ВН, 100-200 или 200—325 меш, " Bio-Red Labo -
ratories") или адсорбсил (Adsorbosil-Cab., 100—140 меш, ” Applied
Science Laboratories" ) высушивают при 120°С.
Растворители. Хлороформ t химически чистый), ацетон и метанол,
свежеперегнанные.
ХроматогрсиВическая колонка диаметром 1,8— 2.0 см и длиной око-
ло 40 см, снабженная тефлоновым краном. С помощью шлифа (нш 24)
верхнюю часть колонки соединяют с делительной воронкой (250 или
500 мл), которая служит резервуаром для растворителя; в нижнюю
часть колонки плотно набивают небольшое количество стекловолокна
пирекс для удерживания адсорбента.
Методика, а. ПоОготовка колонки. В химическом стакане
емкостью 100 мл приготавливают однородную суспенпию 15 г сили-
кагеля в 30-50 мл хлороформа и переносят ее в хроматографичес-
кую колонку. Открывают коан и слегка постукивают по спускной
трубке, чтобы удалить пузырьки воздуха и чтобы оседание адсорбен-
та в колонке было равномерным. После этого дают уровню раствори-
теля опуститься до верхней границы .столбика силикагеля и дважды
промывают хлороформом в объеме, равном объему колонки (-45 мл).
Высота слоя адсорбента в колонке составляет 12-16 см.
о. Нанесение ооразиа и элюирование. Совместив уровень раствори-
теля с верхней границей адсорбента, осторожно по стенкам колонки
добавляют пастеровской пипеткой раствор 150-200 мг липидного
экстракта в 5 мл хлороформа, дают раствору распределиться по ад-
сорбенту и, чтобы количественно перенести липиды на колонку, кол-
бу, в которой первоначально находилась смесь, ополаскивают 1—2 мл
хлороформа; этот раствор также вводят в колонку. При скорости
элюирования 3 мл/мин колонку промывают следующими растворите-
.'1ля адсорбционной хроматографии липидов с успехом может быть ис-
пользован силикагель КСК производства Воскресенского химкомбината. —
Прим, перев.
РазОеление смесей липиОов
123
лями: 10 объемов хлороформа (~175 мл), 40 объемов ацетона
(~700 мл) и 10 объемов метанола (~175 мл). Можно собрать
три фракции, соответствующие каждому растворителю, или более
мелкие фракции, например по 10-15 мл для определения методом
ТСХ на микропластинках (разд. 5.4.1.1). Метод колоночной
хроматографии можно применить для больших количеств липидов.
При этом необходимо соблюдать следующие соотношения: вес сили-
кагеля: вес липидов=75:1; высота колонки с силикагелем: площадь
ее сечения=5:1.
. . Состав фракций. Хлороформные элюаты, получаемые при хроматогра-
фировании липидов большинства растительных, животных и микроб-
ных тканей или клеток, содержат нейтральные липиды, а именно уг-
леводороды, каротиноиды и хлорофилл (растения), стерины и эфиры
стеринов (растения и животные), глипериды, воски, жирные спирты,
альдегиды и кислоты. Ацетоновые элюаты, получаемые при хромато-
графировании липидов животных, содержат в основном гликолипиды
и следы кардиолипина (липиды мозга). Эти фракции состоят из це-
реброзидов, сульфатипов и керамидгексозидов.
Ацетоновые элюаты, полученные при хроматографировании липидов
растений (экстрагированных из семян, листьев, водорослей), содержат
моно- и дигалактозилдиглицериды, цереброзиды, гликозиды стеринов
и сульфолипиды, немного кардиолипина и фосфатидовой кислоты. При
хроматографировании липидов грамположительных бактерий (стрепто-
кокки и микрококки) получают апетоновые элюаты, содержащие глико
зил диглицериды и следы кислотных фосфатидов. Если суммарные ли-
пиды содержат сравнительно много кардиолипина (сердце, печень,
липиды Bacillus cereus), значительное количество кислых фосфолипи-
дов попадает в ацетоновый элюат.
Метанольные элюаты, получаемые при хроматографировании липи-
дов, выделенных из любых источников, содержат основную массу
фосфолипидов и лишь следы гликолипидов. Каждую из описанных
фракций подвергают дальнейшему разделению: нейтральные липиды
методом ТСХ (разд. 5.4.1.2) или колоночной хроматографии на си-
ликагеле (разд. 5.2.1.3), гликолипиды и сульфолипиды методом
препаративной ТСХ (разд. 5.4.1.2 ) или хроматографии на ДЭАЭ-
целлюлозе (разд. 5.2.3), фосфолипиды методом препаративной ТСХ
или комбинацией различных типов колоночной хроматографии.
5.2.1.2. Разделение нафлоризиле, обработанном кисло.той [ 58,601
Этот метод используют для разделения липидных смесей, бога-
тых кислыми компонентами.
Реагенты и аппаратура. Адсорбент. 100 г
флоризила (60-100 меш, " Floridin Со." ИЛИ "Fisher Scientific Со.")сме-
шивают с 350 мл концентрированной соляной кислоты в колбе Эр-
124
Глава 5
ленмейера емкостью 1 л, нагревают на паровой бане 3 ч, суперна-
тант тщательно декантируют, остаток промывают 50 мл концентри-
рованной соляной кислоты и нагревают 8 ч с новой порцией концен-
трированной соляной кислоты (350 мл). Супернатант декантируют
и промывают флоризин водой сначала декантацией, а затем на во-
ронке Бюхнера до тех пор, пока промывная вода не будет нейтраль-
ной. После этого осадок отжимают на фильтре досуха, перекладыва-
Р и с, 5.1. Стеклянная хромато-
графическая колонка с резервуаром
для растворителя.
1 - оелшяелъная воронка объемом
250 или 500 мл;2-яефлояовыи кран.
ют на плоскую стеклянную кювету
и сушат при 120°С примерно 12 ч.
Повторяют кислотную промывку и
промывку водой, как описано выше,
в конце промывают осадок на филь-
тре 150 мл метанола и такими же
порциями смеси хлороформа с мета-
нолом (1:1 по объему), хлороформа
и эфира. Адсорбент перекладывают в
в стеклянную кювету, сушат на воз-
духе и затем активируют при 120°С
примерно 12 ч.
Растворители. Свежеперегначные
хлороформ, ацетон и метанол.
Хроматографическая колонка.
Трубка 1,2 (внутренний диаметр)х
35-40 см (рис. 5.1),
Методика. Подготовка ко-
лонки (разд. 5.2.1.1). 12 г обра-
ботанного кислотой флоризила сус-
пендируют в хлороформе и получен-
ной однородной массой заполняют
колонку; высота слоя адсорбента
20 см.
-Нанесение образца и элкирова-
нас,Суммарные липиды печени, кро-
ви, мозга, почек, яичного желтка,
дрожжей или бактерий в количестве
100 мг растворяют в 5 мл хлоро-
форма и вносят в колонку, как опи-
сано в разд. 5.2.1.1. Липиды элюи-
руют со скоростью 3 мл/мин пере-
численными ниже системами раство-
рителей порциями по 75 мл (--4,5
объема колонки). В результате по-
лучают следующие фракции. Фракция
1, элюированная хлороформом, со-
Разделение смесей липидов
125
держит нейтральные липиды, такие, как углеводороды, стерины и их эфи-
ры, глицериды, жирные кислоты. Фракция 2, элюированная смесью
хлороформ - метанол (95:5 по объему), и фракция 3, элюированная
смесью хлороформ - метанол (90:10 по объему), содержат церебро-
зиды, дигликоэилдиглицериды, сульфолипиды, сульфатиды, фосфати-
довую кислоту и кардиолипин. Фракция 4, элюированная смесью
хлороформ - метанол (3:1 по объему), содержит фосфатидилсерин,
фосфата дилэтаноламин, керамидполигексозиды, фосфатидилглиперин.
Фракция 5, элюированная смесью хлороформ - метанол (1:1 по объе-
му), и фракция 6, элюированная метанолом, содержат лецитин, сфин-
гомиелин, лизоледитин. Авторами работ /60/ и /338/ предложен
другой вариант хроматографического разделения липидов бактерий,
мозга и листьев, богатых гликолипидами. При работе по этому ва-
рианту липиды элюируют следующими системами растворителей (пор-
циями по 60 мл): хлороформом (фракция 1, содержит неполярные
липиды и пигменты); смесью хлороформ - ацетон (1:1 по объему),
(фракция 2, содержит моногликозилдиглицериды и цереброзиды);
ацетоном (фракция 3, содержит дигликоэилдиглицериды, цереброзиды,
гликозиды стеринов, сульфатиды, продукты расщепления хлорофилла);
смесью хлороформ - метанол (9:1 по объему) (фракция 4, содер-
жит следы гликолипидов, фосфатидовую кислоту, кардиолипин): смесью
хлороформ - метанол (1:1 по объему) и чистым метанолом. Фрак-
ции 5 и 6 содержат кардиолипин, фосфата ди лглидерин, фосфатидил-
этаноламин, лецитин и сфингомиелин.
Полученные фракции и в том и в другом случае подвергают
дальнейшему разделению описанными ниже методами.
5.2.1.3. Разделение нейтральных липидов на силикагеле,
флоризиле или флоризиле, обработанном кислотой [ 59 ]
Наиболее эффективным методом разделения нейтральных липи-
дов (в частности, липидов животных тканей), содержащих свобод-
ные жирные кислоты, является хроматография на колонках с флори-
зилом, дезактивированном 7% воды. Обработанный таким образом
адсорбент удерживает свободные жирные кислоты и позволяет про-
водить элюирование с большой скоростью, при этом эффективность
разделения компонентов смеси не снижается. Флоризил вызывает
изомеризацию моно- и диглицеридов, но миграцию ацильных групп
можно устранить, если использовать флоризил, обработанный борной
кислотой. Используя силикагель или обработанный кислотой флори-
*зил, можно получить диглицериды в интактном состоянии, однако
моноглицериды при этом все же изомеризуются. Чтобы избежать
изомеризации-моноглиперидов, необходимо применять адсорбент, об-
126
Глава 5
работанный борной кислотой. Однако для обычного разделения ней-
тральных липидов на классы, при которо^ выделение индивидуальных
изомеров моно- и циглиперидов не обязательно, вполне допустимо
применять не обработанные кислотой адсорбенты.
Реагенты и аппаратура. Адсорбенты. Сили-
кагель унисил (100-200 меш), обработанный кислотой, биосил ВН
(100-200 меш), адсорбсил САВ (100-140 меш) и флоризил (60—
1ОО меш), активированный нагреванием при 650°C. Для приготов-
ления флоризила, дезактивированного 7% воды, к 100 г ф лори зила,
помешенного в колбу со стеклянной пробкой, прибавляют 7 мл воды
и встряхивают примерно 12 ч на механической качалке. Флоризил,
обработанный кислотой, приготовляют, как описано в разд. 5.2.1.2.
Силикагель, необработанный флоризил и флоризил, обработанный бор-
ной кислотой, приготовляют следующим образом. Смешивают 45 г
адсорбента с раствором 5 г борной кислоты в 100 мл метанола.
После упаривания растворителя на роторном испарителе адсорбент
высушивают при 110°С в течение 1 ч.
Растворители. Свежеперегнанные этиловый эфир и я-гексан
(или свежеперегнанные фракции петролейного эфира или скеллозоль-
ва В с т. кип. 68-71°С), не содержащие перекисей.
М етодика. Колонку диаметром 1,2 см наполняют одно-
родной смесью 12 г адсорбента и гексана. Раствор 120-180 мг
нейтральных липидов в гексане наносят на колонку, как описано
в разд. 5.2.1.1. Вещества последовательно элюируют элюентами,
приведенными в табл. 5.1, и получают фракции, соответствующие
по составу фракциям, перечисленным в той же таблице.
5.2.2. Распределительная хроматография
Распределительная колоночная хроматография для разделения
липидов пока не применяется. Однако недавно было разработано два
метода распределительной хроматографии, которые, возможно, ока-
жутся перспективными для разделения липидов. Один из них - это
распределительная хроматография на сефадексе - сшитом декстрано-
вом геле. Этим методом можно отделить водорастворимые примеси,
а также ганглиозиды и желчные кислоты от суммарных липидов. Не-
подвижная фаза при этом должна быть полярной, а подвижная - не-
полярной.
Кроме того, для разделения липидов применяется распредели-
тельная хроматография с обращением фаз. В качестве носителя ис-
пользуется фектис - липофильный полимер, полученный полимериза-
цией соевого масла в присутствии однохлористой серы. Этот метод
х
ф
С
£
ф
х
В
и
S
ф
X
л
о
а
X
Е
ё
£
ё
«с
X
X
X
?
Ф
2
с
с-
«
X
X
о
X
о
и
ф
X
о
W
2
ts
0
2
<0
ь
в
со
2
ф
£
-Q.
X
ф
2
п
СО
X
ф
?
ё
8
п
ф
’ S.
f
а
S
£
ф
X
О
и
8
2
' 2
ё
н
о
сэ
ф
о
X
8
ф
д
X
£Х
ф
ь
о
а
х
с,
ф
И
§
X
g.
ф
ь
о
ф
к
о
X
п
X
о,
ф
я
ё
S
ё
X
о.
ф
я
ё
с,
о
X
о
X
X
ф
в
р.
А
О
X
к
5.
ф
8
8
О
к
ф
ё
ё
О О
05 Ю
<Л
ID СО
05 00
к
х
8
X
ф
£ и
й 2
s ®
о е£
о
1Л
СМ
ID
ф
ё
И
о
сэ
О
н
о
СП
ф
X
О to о
О со Ю
со
05
in
§
g.
ф
и
ё
fe
й
х
ф
ci
3
X
t
ф
S
ё
5
ф
2
ю
о
2
§
о
3
ё
О
§
X
&
ф
X
ё
X
р
о
8
X
и
к
X
ф
с;
ф
ю
ф
X
ё
X
X
X
р
ф
И
X
р
ф
ё
о
о
X
X
О
со
CD
см
X
с
О
%
к
о
X
а?
о
ffi
ф
О
to
£
О О
о со
id
О
ID
О
ID
со
Ci
сг
о
х
2
о
с;
и
В
к
ф
X
о
о
05
о
s
X
X
X
8
ф
X
ф
о
т
ф
§ 2
2 о
Й «о
X
о
г
(Л СО (Л
Ю (Л CM LQ
X
8
X!
О
й
ф
*
ё
X
о
к
о
X
ф
ё
£Х
,., X
Н*
§
в
ф
fe
§
к
X
X
р
ф
ь
о
ф
X
о
X
ё
£
ф
«о
es
х
tn О (Л
О (Л
05 05
СМ
05
(Л
CD
CD
СО
(Л
s
X
8
X
ф
X
2
о
к
CD
см
04
сч
к
л
X
i
с
х £
R 2
С Ф
€
ф
ф
к!
§
X
о
Й
о
с
о
X
2
&
5
X
*
с
с
сг
к
о
о
а
Ё
Ё
ID
о
К
ё
§
ё
ё
<0
Зл
X
ё
см
к
см
(Л
6
со
см
ё
X
я
О
О
ф
с
- о
см
«
£
о
ф
о
X
ф
о
о
X
X
о
2
2
§
8
Ф
2
8
s
g
а
х •
х
ё
I *
2 и
о
см
о
со
о
й
а
ё
3
Я
X
СП
СО Q
ф a
Cl. О
Ю М
О О
128
Глава 5
применяется для разделения эфиров холестерина, триглиперидов и ме-
тиловых эфиров жирных кислот на индивидуальные компоненты. Оба
метопа кратко описаны ниже.
5.2.2.1, Распределительная колоночная хроматография на сефадексе
Реагенты и аппаратура. Адсорбент. Сефадекс
G-25, грубо измельченный, гранулированный (Pharmacia Fine Cnemicals).
Элюенты. 1) Смесь хлороформ - метанол (10:1), насыщенная во-
дой (содержание воды приблизительно 5 мл/л); 2) смесь 850 мл
хлороформ - метанол (19:1) и 170 мл ледяной уксусной кислоты,
насыщенная примерно 25 мл воды; 3) смесь 580 мл хлороформ —
метанол (9:1) и 170 мл ледяной уксусной кислоты, насыщенная
приблизительно 42 мл воды; 4) смесь метанол - вода (1:1).
Методика. Подготовка колонки. Приготавливают однород-
ную суспензию сефадекса в смеси метанол - вода (1:1), мелкие
частички удаляют декантацией, а растворенный воздух - вакуумиро-
ванием при небольшом вакууме. Несколько часов гель пропитывает-
ся растворителем, после этого однородную массу помешают в стек-
лянную колонку (1x30 см), снабженную тефлоновым краном. В ниж-
нюю часть колонки набивают немного стеклянной ваты, а верхнюю
с помощью шлифа соединяют с резервуаром для элюента - делительной
воронкой емкостью 1ОО мп. В колонку помешают такое количество
стспензии, чтобы после оседания сефадекса высота слоя равнялась
примерно 1О см. Сверху насыпают слой чистого песка толщиной 2 см.
Колонку промывают всеми перечисленными выше смесями раствори-
телей, этот цикл повторяют дважды и до начала разделения оставля-
ют в колонке смесь 4. Перед вводом липидов в колонку ее промыва-
ют смесью 1.
Нанесение образиа и элюирование. Приготовляют раствор или
суспензию не более 250 мг суммарных липидов в 5-10 мл смеси 1
и количественно наносят ее на колонку. Липиды элюируют смесями
1 — 4 порциями по 25, 50, 25 и 50 мл (скорость элюирования при-
близительно 0,5 мл/мин), собирая 4 фракции, соответствующие элюи-
рующим смесям.
Состав фъакиий. Системой растворителей 1 элюируются все ней-
тральные липиды (углеводороды, глицериды, стерины, воски и т. д.)
и свободные жирные кислоты, все гликолипиды (гликозилдиглицери-
ды. переброзиды, керамиды, керамиштолигексозиды, сульфатиды и
растительные сульфолипиды), все фосфатиды, включая лизофосфатиды,
свободные желчные кислоты и их соли (холевая кислота, дезоксихо-
левая кислота и т. д.) и связанные желчные кислоты (глицин. тау-
рин), а также некоторые нелипидные примеси, растворимые в орта—
Разделение смесей липиоов
129
ническйх растворителях. Системой ^растворителей 2 элюируются ган-
глиозипы, связанные с глицином, желчные кислоты, неизвестные
"продукты распада кислых фосфатидов, мочевина и другие раствори-
мые в органических растворителях не липидные вещества. Системой 3
элюируются следы ганглиозидов; связанные с таурином диоксихо-
латы (дезокси-и хенодезокси); неполярные аминокислоты (фенилала-
нин, тирозин, триптофан и др.); неизвестные нелипидные примеси.
Система 4 элюирует таурохолаты, водорастворимые нелипидные при-
меси (соли, аминокислоты, сахара и т. д.). Нейтральные липиды,
гликолипиды и фосфолипиды, элюируемые системой растворителей (2),
можно затем разделить, как описано в разд. 5.2.1.3.
5.2.2.2. Распределительная хроматография
с обращением фаз на (ректисе [132]
Реагенты и аппаратура. Адсорбент. Фектис
В-31 - продукт полимеризации соевого масла ( "Carter-Bell Manifactaring Со.").
Полимер размешивают с ацетоном до получения однородной массы
и просеивают через два сита 60 и 140 меш ’.Частицы, оставшие-
ся на сите 140 меш, размешивают с ледяной уксусной кислотой,
фильтруют и промывают еше одной порцией уксусной кислоты. Поли-
мер промывают на фильтре ацетоном. Готовый к употреблению поли-
мер можно хранить в ацетоне неопределенно долгое время.
Растворители. Для разделения нейтральных липидов на классы и
выделения индивидуальных эфиров .холестерина используют ацетон,
содержащий 2 об.% воды; для разделения смесей триглицеридов -
апетон с 5 об.% воды; применяя ацетон с 12 об.% воды, можно раз-
делять метиловые эфиры жирных С)4—кислот, а применяя аце-
тон с 15 об.% воды, - метиловые эфиры жирных С4-С,4- кислот.
Исходная смесъ липиоов. Чтобы отделить свободные жирные кис-
лоты и фосфатиды от нейтральных липидов, раствор суммарных ли-
пидов в хлороформе пропускают через маленькую колонку с флоризи-
лом /57/.
Подготовка колонки. Приготавливают однородную суспензию мел-
ких частиц фектиса (100 г фектиса грубого помола) в растворите-
ле, используемом для элюирования, и загружают ее порциями в стек-
лянную колонку с рубашкой (10 мм х 152 см); внизу колонки по-
мешают крупнопористый стеклянный фильтр. Верхнюю часть колонки
соединяют тефлоновой трубкой с большим резервуаром для раствори-
теля (полиэтиленовой бутылью емкостью 2-4 л). По мере того как
фектис оседает, самые мелкие частицы перед добавлением новой пор-
ции суспензии удаляют отсасыванием. Когда уровень осевших частиц
* Сита с 24 и 55 отверстиями на 1 см2.
130
Глава 5
постигнет верха колонки/ адсорбент уплотняют, подавая сверху азот
под небольшим давлением (0,7-1,4 кг/смг ) в течение приблизитель-
но 1-2 мин. Через готовую колонку растворитель должен протекать
со скоростью 1 мл/мин. На поверхность слоя фектиса кладут кру-
жок фильтровальной бумаги и пропускают растворитель в количест-
ве, равном 3-4 объемам колонки (объем колонки 60 мл), чтобы на-
сытить Фектис растворителем.
Нанесение образца и элюирование. На колонку наносят раствор
100-300 мг суммарных липидов (по 20-60 мг каждого компонента)
в минимальном объеме растворителя ( не более 2 мл). Элюирова-
ние проводят одной из перечисленных выше систем растворителей.
Фоакпии по 15 мл собирают с помощью автоматического коллектора
и анализируют их содержимое методом ТСХ. Поступающий с колон-
ки элюат может также проходить через автоматический дифференци-
альный рефлектометр \н/1пример, рефрактометр фирмы ’’Phoenix Preci-
sion instruments") или автоматический жидкостный хроматограф /144/.
При элюировании ацетоном с 2% водь! компоненты смеси произ-
водных жирных С1(_-кислот элюируются в следующем порядке: моно— и
ды, диглицериды, холестерин, триглипериды, эфиры холестерина. Ин-
дивидуальные насыщенные эфиры холестерина, от ацетата до стеара-
та включительно, элюируются после триглицеридов в виде отдельных
фракций, причем время элюирования каждого индивидуального эфира
стерина представляет собой логарифмическую функцию длины углерод-
ной пепи жирной кислоты (как при ГЖХ). Ненасыщенные эфиры сте-
ринов также разделяются: на хроматограмме они видны как плечо
у основания пика насыщенного сложного эфира жирной кислоты, уко-
роченной на два углеродных атома. Так, олеат холестерина предшест-
вует пальмитату7, а линолеат - миристату.
Насыщенные триглицериды (от трибутирата до тристеарата) элю-
ируются 95%-ным водным ацетоном, при этом логарифм времени
удерживания фракций прямо пропорционален длине пепи (как при ГЖХ).
Однако наличие двойных связей в цепях жирных кислот снижает вре-
мя удерживания до времени удерживания компонентов, содержащих
на два -углеродных атома меньше. Таким образом, триолеин и три-
пальмитин, тримчристин и трилинолеин, трилиноленин и трилаурин об-
разуют неразделяюшиеся пары.
Элюирование метиловых эфиров жирных кислот 88-85%—ным вод-
ным ацетоном также дает разделение, при котором логарифмы времени
удерживания Фракций, содержащих насыщенные метиловые эфиры,
пропорциональны длине пепи. Эквивалентность между укорочением
цепи на два углеродных атома и двойной связью соблюдается и в
этом случае: метилпальмитат и метилопеат не разделяются на ко-
лонке ни при каких температурах (от 2 до ЗО°С).
Разделение спесей липидов
131
5.2.3. Ионообменная хроматография [2751
Разделение липидов ионообменной хроматографией основано в
первую очередь на обмене ионных групп, однако на разделение вли-
яет также различие в полярности вешеств, обусловленное наличием
неионых групп, таких, как гидроксил. Этим методом легко разде-
лить природные липиды на три основные группы: неионные, биполяр-
ноионные и кислотные. Каждую из этих групп в дальнейшем можно
разделить, основываясь на различиях в полярности или кислотности.
Для ионообменной хроматографии липидов наиболее пригодны два
материала: ди этиламиноэтил- и триэтиламиноэтилделлюлоза, или
ДЭАЭ- и ТЭАЭ-целлюлоза. Целлюлозные ионообменные материалы
детально описаны в работе /359/. ДЭАЭ-пеллюлоза обычно приме-
няется для разделения липидов на основные классы, в то время как
ТЭАЭ-целлюлозу используют для разделения таких липидов, в кото-
рых единственной ионной группой является карбоксильная группа
(жирные кислоты, желчные кислоты и ганглиозиды), и для отделе-
ния фосфата ди лэтаноламина от керамидполигексозидов. Далее эти
методы будут описаны кратко, детально они рассматриваются в ра-
боте /275/.
5.2.3.1. Колоночная хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе [ 2751
Реагенты и аппаратура. Адсорбент. ДЭАЭ-
пеллюлоза с определенной величиной частиц и наивысшей обменной
емкостью ("Brown Со."; "Schleicher and Sehuli”). Чтобы удалить примеси,
адсорбент промывают на воронке Бюхнера при несильном отсасыва-
нии; в качестве фильтра используют лист фильтровальной бумаги.
Целлюлозу промывают тремя объемами каждого из перечисленных
ниже растворителей: 0,1 н. раствор соляной кислоты, вода до ней-
тральной реакции, 0,1 н. раствор гидроокиси калия, вода до ней-
тральной реакции. Этот цикл повторяют два раза, после чего ДЭАЭ-
пеллюлозу переводят в ацетатную форму, промывая ее тремя объе-
мами перегнанной уксусной кислоты. Избыток кислоты удаляют про-
мывкой адсорбента тремя объемами метанола. Адсорбент высушива-
ют до постоянного веса сначала на воздухе, а затем в вакуум-окси—
каторе над гранулированной гидроокисью калия. Готовая к употребле-
нию целлюлоза выпускается фирмами " Applied Science Laboratories";
"Sigma Chemical Co.".
Растворители. Хлороформ, метанол, уксусная кислота, свежепе-
регнанные.
Методика. Подготовка колонки. В стеклянную колонку
(2,5x30 см), снабженную краном и резервуаром для растворите-
132
Глава 5
ля, приливают порциями суспензию 15 г ДЭАЭ-целлюлозы в ледя-
ной уксусной кислоте (суспензию готовят накануне и выдерживают
в растворителе -^12 ч). Чтобы удержать слой целлюлозы, нижнюю
часть колонки плотно затыкают кусочком стеклянной ваты. Избыток
кислоты вытесняют, создавая небольшое давление азота, и оставляют
над поверхностью адсорбента лишь небольшой слой чистого раство-
рителя. Высота столбика адсорбента должна быть порядка 2О±2 см.
Колонку промывают 3-5 объемами метанола, 3 объемами смеси хло-
роформ - метанол (1:1) и в конце 3-5 объемами хлороформа. Для
проверки качества набивки колонки на нее наносят 10-30 мг холес-
терина в 5-10 мл хлороформа, элюируют нанесенное вещество хло-
роформом, собирая фракции по 10 мл, и анализируют их методом
ТСХ на микропластинках (разд. 5.4), Если холестерин обнару-
живается только в 7-9 фракциях, колонка пригодна для хроматогра-
фии. в противном случае набивку колонки необходимо провести зано-
во. Растворитель должен протекать через колонку со скоростью 2,5-
3,0 мл/мин.
Нанесение образиа и элюирование. На подготовленную колонку с
ДЭАЭ-пеллюлозой наносят раствор 100-300 мг суммарных липидов
в 10 мл хлороформа (липиды желательно предварительно освободить
от водорастворимых нелипидных примесей хроматографированием на
сефадексе в условиях, описанных в разд. 5.2.2) или раствор такого
же количества фосфолипидов или гликолипидов, выделенных хромато-
графией на силикагеле (разд, 5.2.1). Чтобы выделить основ-
ные типы липидных веществ из суммарного липидного экстракта,
элюирование компонентов смеси проводят системами группы I
(табл. 5.2). Растворители группы II (табл. 5.2) используют для
разделения фосиатидилэтаноламина, фосфатидилсерина и.сульфатидов,
выделенных хроматографией на силикагеле из липидов мозга
разд. 5.2.1 ). Растворителями группы III (табл. 5,2) элюируют сме-
си керамипгексозидов и сульфатидов, также выделенных из липидов
мозга. Растворители группы IV (табл. 5.2) применяют для разделе-
ния моногалактозилдиглицеридов, дигалактоэилдиглидеридов и суль-
фолипидов, выделенных из липидов растений колоночной хроматогра-
фией на силикагеле.
э.2.3.2. Колоночная хроматография на ТЭАЭ-целлюлозе[2751
Реагенты и аппаратура. Адсорбент. ТЭАЭ-
целлюлоза с определенным размером частиц (фирмы "Brown Со."или
"Schleicher und Schii 11"). Чтобы удалить примеси, адсорбент промывают
и сушат, как и ДЭАЭ-целлюлозу, см. выше.
Растворители. Хлороформ, метанол, ледяная уксусная кислота,
свежеперегнанные.
Таблииа 5.2
Ионообменная хроматография липидов на ДЭАЭ-целлюлозе
Элюент Объем элю- ента, объе- мы колонки Липиды, входящие в состав элюатов
I II III Хлороформ 8-10 Хлороформ - метанол 9 (9:1) Хлороформ - метанол 9 (7:3) Хлороформ - метанол 9 (1:1) Метанол 1О Хлороформ - уксусная 10 кислота (3:1) У ксусная кислота 1О Метанол 4 Хлороформ - метанол 1О (4:1) - соли аммония6 4 Хлороформ - метанол 9 (7:3) Метанол 6 Уксусная кислота 10 Метанол 8 Хлороформ - метанол 1О .(4:1) - соли аммония6 Метанол 10 Хлороформ - метанол 9 (9:1) Хлороформ - метанол 9 (7:3) Метанол 10 Хлороформ - метанол 10 (4:1) - соли аммония 6 Нейтральные липиды Цереброзиды, галактолипиды, лизолецитин, лецитин, сфинго- миелин Керами даминоэтилфосфонаты, керамидполигексозиды, фосфа- тидил этаноламин Керамидполигексозиды, лизофос- фатидилэтаноламин, продукты окисления0 Продукты окисления3, неорга- нические соли Жирные кислоты, связанные с глицином, и свободные желчные КИСЛОТЫ Фосфатидилсерин Отсутствуют Кардиолипин, фосфатидовая кис- лота, фосфатидилглицерин, фос- фата ди линозит. сульфолипиды, сульфатиды и неорганические соли Неорганические соли и следы липидов (фракцию отбрасывают) Ф осфатицилэтаноламин Неорганические соли Фосфатидилсерин Удаляют избыток уксусной кис- лоты Сульфатиды и неорганические соли Неорганические соли и следы липидов Цереброзиды Керамидполигексозиды Неорганические соли Сульфатиды, неорганические соли
134
Глава 5
Продолжение табл. 5.2
1 Элюент "" । 1 1 Объем элю-1 1 ента, объе-| 1 мы колонки j Липиды, входящие в состав элюатов
Метанол 1О IV Хлороформ - метанол 8 (98:2) Хлороформ - метанол 1О (9:1) Метанол 10 Хлороформ - метанол 10 (4:1) - соли аммония^ Метанол 10 Неорганические соли и слепы липидов Моногалактозилдиглипериды Дигалактозилдиглицериды Неорганические соли Сульфолипиды и неорганические соли Неорганические соли и следы
липинов
d Неохарактериэованные продукты окисления фосфатидилэтано-
амина.
°0,01-0,05 М раствор ацетата аммония или ацетата калия в
смеси хлороформ - метанол (4:1), разбавленный свежеприготовлен-
ным 2&%-ным раствором аммиака из расчета 20 мл/л.
Методика. Подготовка.колонки. 12 г ТЭАЭ-пеллюлозы за-
гружают в колонку с внутренним диаметром 2,5 см. Метод запол-
нения такой же, что и для ДЭАЭ-целлюлозы. Высота слоя адсорбен-
та должна составлять 20 см. Уксусную кислоту удаляют, промывая
колонку 3 объемами метанола, и адсорбент переводят в ОН,-форму,
промывая колонку последовательно 4 объемами 0,1 н. раствора КОН
в метаноле. 6-8 объемами метанола и 4 объемами смеси хлорофор-
ма с метанолом (1:1) и хлороформа.
Нанесение оог>::эиа и элюирование. Раствор 100—300 мг суммар-
ных липидов или фракций, полученных при хроматографии на силикаге-
ле, в 3-10 мл хлороформа наносят на колонку с Т ЭАЭ-целлюлозой
и элюируют липиды, как описано ниже.
1. Хлороформом (5 объемов) элюируют холестерин, глицериды
и другие нейтральные липиды.
2. Смесью хлороформ - метанол (1:1; 8 объемов) элюируют
цереброзиды, гликозилдиглипериды, лецитин и сфингомиелин-
3. Смесью хлороформ - метанол (2:1; 8 объемов) элюируют
керамидполигексозиды.
4. Метанолом (8 объемов) элюируют неорганические вещества.
5. Смесью хлороформ - метанол - уксусная кислота (2:1:0,03;
6 объемов) элюируют фосфатидилэтаноламии, керамидаминоэтилфос-
Разделение смесей липидов
135
фонат (липиды беспозвоночных), свободные жирные кислоты, свобод-
ные и связанные желчные кислоты, N- метил- , N, N-диметилфосфати-
дилэтаноламин.
6, Ледяной уксусной кислотой (6 объемов) элюируют фосфати-
дилсерин.
7, Метанолом (3 объема) удаляют из колонки уксусную кислоту.
8. 0,01-0,05 М раствором ацетата аммония в смеси хлоро-
форм - метанол (4:1), разбавленного до 20 мл/л 28%-ным свеже-
приготовленным раствором аммиака (8 объемов) и метанолом (6
объемов), элюируют фосфатидовую кислоту, кардиолипин, фосфатадил-
глидерин, растительные сульфолипиды, фосфатидилинозит и другие
кислотные липиды.
5.3. Хроматографии липидов на бумаге,
пропитанной кремневой кислотой
Первый удовлетворительный метод разделения сложных смесей
липидов бумажной хроматографией был предложен Маринетти и Сто-
цем /217/, которые использовали в качестве носителя бумагу, про-
питанную кремневой кислотой, и в качестве элюента - смесь раст-
ворителей диизобутилкетон - уксусная кислота - вода (45:25:5).
Хотя бумажная хроматография и вытесняется разработанной позднее
тонкослойной хроматографией, она все еще широко распространена
и является универсальным аналитическим методом. Действительно,
для некоторых типов Фосфолипидов лучшее разделение можно полу-
чить, используя хроматографию на бумаге, пропитанной кремневой
кислотой, а не ТСХ. Этот метод, модифицированный в последние го-
ды, будет подробно описан здесь. Читателю можно рекомендовать*
также работы Маринетти /213, 214/ и Кейтса /159/.
5.3.1. Пропитка бумаги кремневой кислотой.
Реагенты. Фильтровальная бумага, ватман ЗММ. Бумагу
разрезают на полоски 11,5 х 45 см. На расстоянии 2 см от одного
из поперечных краев бумаги карандашом наносят линию, отделяющую
область, за которую бумагу можно брать руками.
Раствор силиката натрия. 310 г аналитически чистой кремневой
кислоты, размер частиц 100 меш ("Mallinckrodf*), медленно при пере-
мешивании магнитной мешалкой в тефлоновой оболочке добавляют
к 1 л 7,2 н. раствора гидроокиси натрия (288 г Na ОН в 1 л во-
*В 1961 г. А.А. Смирновым и сотр. [ Смирнов А.А., Чиркоеская Е.В., Ма-
нукян К.Г., Биохимия, 26, 1025 (1961)1 был описан вариант хроматографическо-
го разделения фосфолипидов на выпускаемой в СССР бумаге, пропитанной крем-
невой кислотой. Этот способ не уступает по эффективности разделения методу
Маринетти. — Прим, перее.
136
Глава 5
ды). Когда кремневая кислота растворится, смесь охлаждают до
комнатной температуры и разбавляют 1500 мл воды. Приготовлен-
ным раствором можно пропитать до 48 листов бумаги.
Методика. В стеклянную пирексовую кювету (23x35 см)
наливают раствор силиката натрия, погружают в него каждый лист
бумаги по отдельности и тотчас подвешивают листы на 3-4 мин для
просушки. С нижнего края каждого листа фильтровальной бумагой
удаляют скопившиеся капли кислоты. В другую стеклянную кювету
наливают 1 л 6 н. соляной кислоты (500 мл концентрированной со-
ляной кислоты разбавляют равным объемом воды), погружают в нее
один за другим все пропитанные кремневой кислотой листы бумаги
и выдерживают каждый лист в кювете 30 мин, периодически покачи-
вая кювету. После обработки соляной кислотой бумагу промывают
сначала 2 ч под слабой струей водопроводной воды, затем 1-2 ч
в дистиллированной воде; в процессе последней промывки воду не-
сколько раз меняют. Если промывная вода не содержит более ионов
хлопа (проба с азотнокислым сереором), промывку заканчивают и
бумагу вывешивают на ночь для просушки.
Для окончательного удаления, возможных примесей липидов и
кислоты пропитанные листы бумаги промывают следующим способом:
20-24 листа бумаги помешают в цилиндрическую хроматографичес-
кую камеру (15 х 45 см) таким образом, чтобы нижние края листов
были погружены в 200 мл смеси хлороформа с метанолом (1:1 по
объему). Через 20-24 ч, когда фронт растворителя почти достигает
верхнего края бумаги (расстояние между фронтом растворителя и
верхнем краем бумаги несколько дюймов), листы вынимают и сушат,
подвесив за верхний край. Высушенные листы прессуют в течение
нескольких часов между стеклянными пластинками, после чего бу-
мага готова к употреблению. Обработанную таким образом бумагу
заворачивают в лист фильтровальной бумаги и укладывают в ящики;
хроматографические свойства ее сохраняются в течение нескольких
месяцев.
5.3.2. Нанесение липиоов на бумагу
На расстоянии 5 см от проведенной ранее линии отмечают стар-
товую линию, на которой наносят пробы так, чтобы пятна были уда-
лены друг от друга на 1.5 см. На каждый лист пропитанной бумаги
можно наносить образцы липидов максимум в 7 точках.
В одно пятно наносят такое количество суммарных липидов, что-
бы содержание липидного фосфора равнялось 4-5 мкг; содержание
индивидуальных фосфолипидов должно соответствовать 1—2 мкг фос-
фора. Для анализа смеси липидов, выделенных из большинства тка-
ней, указанные количества являются оптимальными.
Разделение смесей липидов
137
Раствор образца пипидовл.предназначенного для бумажной хрома-
тографии, приготавливают следующим образом. Аликвотную часть раст-
вора липидов, содержащую необходимое для анализа количество веще-
ства, помешают в пентрифужную пробирку емкостью 15 мл и выпа-
ривают растворитель в токе азота. Остаток сразу же растворяют в
таком количестве хлороформа, чтобы концентрация липидного фосфора
равнялась 0,5-1 мкг/мл. Пробирку центрифугируют несколько секунд,
чтобы раствор собрался на дне. Микропипеткой (удобнее всего пи-
петка на 25 мкл с делениями через 5 мкл) или любым калиброван-
ным капилляром наносят 5-10 мкл этого раствора, подсушивая пят-
но слабым током азота. Диаметр пятна должен составлять 5-6 мм.
Снизу листа отрезают полоску в 2 см и немедленно начинают прояв-
ление хроматограммы.
5.3.3. Системы растворителей и хроматографические камеры
Хроматограммы обычно проявляют восходящим способом в сис-
теме растворителей /214/ диизобутилкетон-уксусная кислота-вода
(40:25:5 по объему) при 23-25°С. Рекомендуется проводить хро-
матографирование в комнате с контролируемой температурой в тече-
ние 16-16 ч. Разделение липидов с высоким содержанием плазма-
логенов следует вести при О—5°С в системах диизобутилкетон-уксус-
ная кислота—вода (40:20:3), шшзобутилкетон-н-бутиловый эфир-ук-
сусная кислота— вода (20:20:20:3) /214/ или диизобутилкетон-ук-
сусная кислота-вода (50:20:4) /118/. Применяя системы диизобу-
тилкетон-пиридин-воца (54:40:6 по объему или 50:37:5 по объему)
и циизобутилкетон-метанол-воца (100:25:4) /118/, также можно
получить хорошее разделение при комнатной температуре. Хромате—
графическая камера (рис. 5.2) представляет собой цилиндрический
сосуд из стекла пирекс (15 х 45 см), покрытый круглой стеклянной
пластинкой диаметром 15 см, прикрепленной герметизирующей лен-
той. В камеру наливают 200 мл растворителя и оставляют на 18-
20 ч для того, чтобы к началу работ в камере установилось равно-
весное давление паров. Хроматограмму в камере подвешивают (с по-
мощью подходящего держателя) таким образом, чтобы ее нижний ко-
нец был погружен в растворитель на 1-2 см. В качестве держате-
ля (рис. 5.2) можно использовать стеклянную палочку 7 мм х 13,5 см,
надев на каждый конец ее по кусочку резиновой трубки длиной 3 см.
Общая длина держателя регулируется таким образом, чтобы он плот-
но входил в камеру. Резиновые наконечники удерживают его от со-
скальзывания. Верхний конец бумаги обертывают вокруг стеклянной
палочки и закрепляют обычной скрепкой или пружиной из нержавею-
щей стали.
Хроматографирование можно также проводить в широкой банке
Мейсона объемом 2,5 л, используя свернутый в цилиндр лист бума—
138
Глава 5
гн размером 21 х 20 см. При этом применяется система раство-
рителей диизобутилкетон - уксусная кислота - вода (40:20:3),
температура комнатная, длительность проявления 3,5-4,5 ч /214/.
45см
Рис. 5.2. Хроматографическая
камера для разделения липидов ме-
тодом восходящей хроматографии.
1 — круглая стеклянная пластинка,
2 — герметизирующая лента, 3 — за-
жим из нержавеющей стали, 4 — ре-
зиновые труоки-наконечники; 5 —
стеклянный стержень 0,7 х 13 см;
6 — система растворителей, 200 мл.
5.3.4. Обнаружение
и идентификация липидов
Ниже приводятся наиболее рас-
пространенные обнаружители, ис-
пользуемые для идентификации ли-
пидных компонентов при разделе-
нии смесей на бумаге, пропитанной
кремневой кислотой. Необходимо
подчеркнуть, что идентификад по
только этими обнаружителями сле-
дует рассматривать как предвари-
тельную. а окончательные выводы
можно сделать после того, как
предполагаемое вещество выделено
и проведены соответствующие ана-
лизы.
5.3.4.1. Родамин 6 Я
Это наиболее широко распро-
страненный обнаружитель для лит -
дов. поскольку он окрашивает все
липидные компоненты, и цвет флу-
оресцирующих пятен часто характе-
рен для липидов определенного хи-
мического строения. Впервые он
был по ед ложен Маринетти и Стот-
пем /217/, методика обнаружения
впоследствии была подрооно описа-
на в работе /214/.
Реагенты. Раствор рода-
мина 6Ж. Растворяя 1,2 г родами-
на 6Ж ("Color Index, 752, National
Aniline Division, Allied Chemical and Dye
Corp., New York”) в 1 л дистиллиро-
ванной воды, получают 0,12%-ный
запасный раствор красителя, кото-
рый можно хранить в течение дол-
гого времени в темной посуде. Перед использованием 5 мл запас-
ного раствора разбавляют по 500 мл дистиллированной водой, полу
чают 0.0012%-ный раствор и наливают его в стеклянную кюв.ету
(23 х 35 см).
Разделение смесей липидов
139
Мето пика. Бумажную хроматограмму высушивают в вы-
тяжном шкафу в течение OyS-1 ч или нескольких минут, если липи-
ды очень легко образуют перекиси, и погружают в разбавленный
раствор родамина на 1-3 мин, покачивая время от времени кювету
с обнаружителем. По окончании выдержки избыток красителя смыва-
ют водой и просматривают влажную хроматограмму в ультрафиолето-
вом свете (Mineralipht Lamp.,366 нм), обводя флуоресцирующие пятна
карандашом. Кислотные фосфатиды и другие липиды дают голубые
или пурпурные пятна, а пятна нейтральных липидов и фосфатиды -
желтые или оранжевые. Однако нейтральные фосфатиды и другие ли-
пиды могут также давать голубовато-серые пятна, если они содер-
жат перекиси и пигменты (хлорофилл); каротиноиды дают ярко-голу-
бые или фиолетовые пятна. На высушенной хроматограмме пятна
большинства липидов флуоресцируют желтым цветом.
5.3.4.2. Нингидрин
Этот реагент используется для обнаружения фосфатидов или ли-
пидов, имеющих свободные аминогруппы, а также (в количестве не
менее до 1 мкг) аминофосфатидов, таких, как фосфатидилэтаноламин
или фосфатидилсерин. Мапинетти /214/ описал наиболее удобный и
эффективный метод обнаружения нингидрином бумажных хроматограмм,
пропитанных кремневой кислотой.
Реагенты. Нингиорин. 0.25 г химически чистого нингид-
рина растворяют в 100 мл смеси ацетона с лутидином (9:1 по объе-
му). Для обнаружения применяют свежеприготовленный раствор.
Методика. Высушивают хроматограмму в вытяжном шка-
фу в течение примерно 12 ч и опрыскивают ее раствором нингидри-
на или протягивают через 100 мл раствора, налитого в чашку Пет-
ри диаметром 15 см. Спустя несколько часов на хроматограмме
при комнатной температуре появляются розовато-лиловые пятна ами-
нолипидов. После протягивания бумаги через раствор нингидрина,
как правило, окрашенные пятна возникают быстрее, чем после оп-
рыскивания; повторное опрыскивание ускоряет появление пятен. Про-
явившиеся пятна обводят карандашом и хроматограмму обрабатывают
родамином, чтобы обнаружить другие липиды. Необходимо отметать,
что двойное обнаружение дает лучшие результаты в том случае, ес-
ли хроматограмму опрыскивают нингидрином: если же хроматограм-
му погружали в раствор нингидрина, последующее обнаружение рода-
мином дает нечеткие пятна.
5.3.4.3. Обнаружители для холинсодержащих липидов
1. Фосфорномолибденовал кислота.
Хотя этот реагент широко используют для обнаружения холин*
содержащих липидов, тем не менее он недостаточно специфичен, так
140
Глава 5
как обнаруживает ненасыщенные кефалины и другие ненасыщенные
липиды, например моно- и дигалактозилдилиноленивы. Однако с по-
мощью этого реактива можно получить достоверные результаты, ес-
ли предварительно обработать хроматограмму нингидрином по мето-
ду Леа и соавторов /188/, чтобы обнаружить фосфатидилэтаноламин
и серин. Обработанные нингидрином хроматограммы промывают дис-
тиллированной водой, после чего проявляют их фосфорномолибденовой
кислотой по способу Левина и Чаргаффа /196/, который описан ниже.
Р е а г е н т ы, Фосфорномолибденовал кислота. 5 г фосфорно-
молибденовой кислоты растворяют в 500 мл воды. Раствор готовят
непосредственно перец употреблением.
н-Бгтанол, химически чистый.
Клотсистое олово. 40 г SnCi2 растворяют в 1ОО мл концентриро-
ванной соляной кислоты. Полученный запасный раствор хранят на хо-
лоду. Перед использованием 1 мл запасного раствора SnCl2 разбав-
ляют водой до 100 мл.
М е т о д и к а. Хроматограмму (предварительно проявленную
нингидрином и хорошо промытую водой в течение 10 мин) быстро
высушивают и погружают в раствор фосфорномолибденовой кислоты
на 5-10 мин Раствор сливают и промывают хроматограмму снача-
ла в кювете тремя порциями бутанола по 50 мл (5-10 мин каждый
раз), затем под струей воды и, наконец, дистиллированной водой,
чтобы удалить следы реагента. Далее протягивают бумагу через
разбавленный раствор хлористого олова, после чего холинсодержащие
компоненты (лецитин, лизолепитин и сфингомиелин) и некоторые ли-
пиды с большим числом двойных связей (например, галактозилдигли-
нериды листьев) обнаруживаются в виде голубых пятен на белом
фоне.
2. Дипикриламиновыи реагент [171.
Реагенты. Запасный насыщенный раствор дипикриламина
в 500 мл 1О%—ного раствора Na-.C03. 25 мл запасного раствора
разбавляют водой до 500 мл и наливают в кювету.
Методика. Высушенную хроматограмму погружают на
10 мин в разбавленный раствор обнаружителя, после чего удаляют
избыток реагента, промывая бумагу под струей водопроводной во-
ды. Холинсодержашие липиды обнаруживаются в- виде розовых или
красновато-позовых пятен.
3. Реагент Драгендорфа [ЗЗР, 30].
Реагенты. Раствор!. 1,7 г основного азотнокислотного
висмута растворяют в 1ОО мл 20%—ной уксусной кислоты.
Раствор II. 10 г KI растворяют в 25 мл воды.
Перед использованием 20 мл раствора I смешивают с 5 мл
раствора II и разбавляют 70 мл воды.
Разделение смесей липидов
141
Методика. Высушенную хроматограмму опрыскивают ре-
агентом Драгендорфа; через несколько минут холинсодержащие ли-
пиды ‘обнаруживаются в виде оранжевых пятен.-
5.3.4.4. Обнаружитель для липидов,
содержащих NH-группы [221, [288] (см. также 5.4.4.2)
Реагенты. трет-Бутилгипохлорит, 1%-ный. 1 г яреж-бутил-
гипохлорита /319/ (т.кип. 78°С при атмосферном давлении) раство-
ряют в ЮО мл циклогексана.
Иодо-нрахмалъный раствор, 1%-ный. 1 г К1 и 1 г растворимого
крахмала растворяют в 10О мл дистиллированной воды, доводят
смесь до кипения и охлаждают до комнатной температуры.
Методика. Высушенную хроматограмму равномерно опрыс-
кивают 1%-ным раствором трет-бутилгипохлорита, после чего под-
вешивают в вытяжном шкафу с хорошей тягой и выдерживают в те-
чение 1 ч при комнатной температуре. После этого хроматограмму
опрыскивают 1%-иым ио до-кра хмельным раствором. Липиды, содер-
жащие NH-группы (сфингомиелин, керамиды переброэиды, сульфати-
цы, керамидгексозиды и ганглиозиды, а также N-адилФосфатидилэта-
ноламин, N- метилфосфатидилэтаноламин и т. д.), н липиды, содержа-
щие первичные аминогруппы, дают голубые или пурпурно-голубые
пятна на белом или слабо-голубом фоне. Чувствительность реагента
5-10 мкг липида.
5.3.4.5. Перйодат - реактив Шиффа
Это специфический реагент на гликолипиды (переброзиды, глико-
зилдиглипериды и т. д.) и фосфатиды, содержащие вицинальные гидро-
ксильные группы (например, фосфатидилглиперин и фосфатидилинозит).
Метод основан на расшеплении перйодатом соединений, содержащих
вицинальные гидроксильные группы, и обнаружении фуксин-бисульФит-
ным реагентом (реактивом Шиффа) образовавшихся альдегидолипидов.
Описанная методика является модификацией метода /23/ обнаружения
липидов на непропитанной бумаге.
Реагенты. Иериооат, 0,25%-ный. 0.25 г метапериодате
натрия растворяют в 100 мл воды и наливают в чашку Петри диа-
метром 15 см. Раствор готовят непосредственно перед употреблением.
Метабисульфит натрия, 1%-ный. 5 г метабисульфита натрия
GNa2S205) растворяют в 500 мл воды. Раствор готовят непосред-
ственно перед употреблением.
Реактив Шиффа. 1 г фуксина (основания) и 10 г метабисульфита
натрия растворяют в смеси 10 мл концентрированной соляной кисло-
ты и ЮО мл воды. Раствор обрабатывают активированным углем
в течение 1 ч, фильтруют и разбавляют дистиллированной водой до
объема 500 мл. Приготовленный запасный раствор должен быть бес-
142
Глава 5
цветным; его можно хранить в течение нескольких месяцев при ком-
натной температуре. Перец использованием запасный раствор раз-
бавляют 1%-ным раствором метабисульфита в соотношении 1:2 (по
объему).
М е т о о и к а. Высушенную хроматограмму обрабатывают
раствором метал ерио дата натрия, выдерживают 15-20 мин при ком-
натной температуре и протягивают ее несколько раз через 1%-ный
раствор метабисульфита натрия до тех пор, пока выделившийся иод
не обесцветится. Погружают хроматограмму в разбавленный раст-
вор реактива Шиффа, и через несколько минут липиды обнаруживают-
ся в виде розово-сиреневых пятен на белом фоне. Фон постепенно
розовеет, так как реактив Шиффа реагирует с бумагой. Хроматограм-
му промывают водой, обводят обнаруженные пятна и обрабатывают
родамином 6Ж, чтобы обнаружить остальные липиды (все пятна при
этом флуоресцируют фиолетово-голубым цветом).
5.3.4.6. -Обнаружение плазмалогенов
1. Метод Хека и Феррана \119}.
Реагенты. Реактив бисульфат — сулема. К 500 мл 0,05%-
него раствора метабисульфита натрия добавляют 5 мл 0,05 М раст-
вора HrC12(1,35 г HgCl2 в ЮО мл воды) и помешают раствор
в стеклянную кювету.
Реактив Шиффа. Запасный раствор реактива Шиффа готовят, как
описано в разд. 5.3.4.5.
Методика. Высушенную хроматограмму погружают в
500 мл раствора бисульфит — сулема, добавляют 5 мл реактива
Шиффа, раствор перемешивают, покачивая кювету, и оставляют в нем
хроматограмму на 10 мин. Свободные альдегиды (у фронта раство-
рителя) сразу же обнаруживаются в виде фиолетовых пятен, а груп-
пировка винилового эфира в плазмалогенах гидролизуется в течение
нескольких минут, после чего освободившиеся альдегиды также обна-
руживаются в виде фиолетовых пятен. Чтобы контролировать неспе-
цифическое обнаружение реактивом Шиффа, погружают хроматограм-
му сначала в раствор этого реактива, разбавленного 1:100 (по объе-
му) 0,05%-ным раствором метабисульфита, но без HgCl2 и отмеча-
ют карандашом все пятна, которые при этом появляются, затем до-
бавляют. раствор HgCl2 и выдерживают хроматограмму 10 мин. По-
сле появления пятен плазмалогенов хроматограмму прополаскивают
несколько раз 0,05%-ным раствором бисульфита и промокают между
двумя листами фильтровальной бумаги или опрыскивают родамином
6Ж, чтобы обнаружить другие липиды.
2.Метод Маринетт [214V
Реагенты. 2,4-Диниярофенилгидразин, 0,15%-ный. 0,75 г
2,4-динитрофенилгидразина (2,4-ДНФГ) растворяют-в 500 мл 3 н.
соляной кислоты и раствор наливают в стеклянную кювету.
Разделение смесей липидов
143
Мето цика. Промытую дистиллированной водой и высушен-
ную хроматограмму погружают в раствор 2,4-ДНФГ на 1-2 мин.
Промывают 4 раза по 10 мин дистиллированной водой, чтобы уда-
лить избыток реагента, и просматривают хроматограмму в УФ-свете
- (366 нм). Липидные компоненты, содержащие альдегидогенные груп-
пировки, видны как темные пятна на светлом фойе. Неспецифическая
адсорбция приводит к появлению оранжевых пятен, которые видны
при обычном свете, но они не дают темных областей в ультрафиоле-
товом свете.
5.3.4.7. Обнаружение фосфатов
1. Метод Хека и Феррана [119].
Реагенты. Молибдат аммония, 2,5%-ный. 1,25 г молибдата
аммония растворяют в 50 мл воды.
Хлористый натрий, 0,85%-яый.О,85 г NaCl растворяют в 1ОО мл
воды.
Обнаружитель для фосфатов. 12 мл раствора молибдата аммония
смешивают с 10 мл раствора хлористого натрия и 2 мл концентриро
ванной соляной кислоты. Раствор готовят непосредственно перед ис-
пользованием.
Хлористое олово, 40%-ное. В 50 мл концентрированной соляной
кислоты растворяют 20 г хлористого олова. Перед использованием
приготовленный запасный раствор разбавляют дистиллированной во-
дой 1:10.
Методика. Опрыскивают сухую хроматограмму свежепри-
готовленным обнаружителем для фосфатов и нагревают 1,5 мин при
100°С, после этого опрыскивают разбавленным раствором хлористо-
го олова и выдерживают при комнатной температуре. Фосфатиды про-
являются голубыми пятнами. Однако в тех экспериментах, которые
проводил сам автор, фон также быстро становился голубым, что за-
трудняло определение пятен фосфолипидов.
2. Метод Бейса [30].
Реагенты. Реактив Цини аде. В ЮО мл воды растворяют
6,85 г дигидрата молибдата натрия Na г Мо04* 2Нг О и 400 мг гидра---
зинсульфата, добавляют 250 мл концентрированной серной кислоты,
охлаждают и разбавляют водой до объема 600 мл. Раствор налива-
ют в стеклянную кювету.
Методика. Высушенную хроматограмму погружают на не-
сколько минут в реактив Циниаде, фосфатиды обнаруживаются в ви-
де голубых пятен. Избыток реагента отмывают водой и метанолом
и высушивают хроматограмму.
3. Метод Розенберга [271] (применяется для обнаружения не-
устойчивых в кислой среде фосфатов).
... .Реагенты. Молибдаякый реактив. 3 мл 5%-ного раствора
144
Глава 5
молибдата аммония и 7 мл 5 н. соляной кислоты разбавляют аце-
тоном по объема 100 мл. Раствор готовят непосредственно перед
употреблением.
Запасный раствор хлористого ванадия. В 20 мл кипящей концен-
трированной соляной кислоты растворяют 2 г пятиокиси ванадия
V205, кипятят еще 10 мин. После того как раствор станет
голубовато-аеленым, его разбавляют сначала 6 н. соляной кислоты
по объема 37 мп и затем водой до объема 400 мл. Раствор сохра-
няет устойчивость в течение долгого времени.
Восстанавливающий реактив. Приготавливают непосредственно пе-
ред использованием. Разбавляют 20 мл запасного раствора хлорис-
того ванадия 80 мл ацетона, добавляют 250 мг порошкообразного
цинка, встряхивают смесь 10—20 с, пока раствор не окрасится в
коричневый цвет. После осаждения пинка прозрачный реагент удаля-
ют декантацией.
Методика. Протягивают сухую хроматограмму через мо-
либдатный раствор и высушивают в вытяжном шкафу. Протягивают
сухую хроматограмму через восстанавливающий реагент и снова
высушивают. Через 2 мин появляются голубые пятна на белом фо-
не. который остается белым в течение суток. Чувствительность об-
наружителя около 0,1 мкг липидного фосфора. Неорганический орто-
фосфат и алкилпирофосфаты также дают голубые пятна, неорганичес-
кий пирофосфат, аллильные пирофосфаты и пирофосфаты полипрено-
лов - пурпурные пятна; алкилмонофосфаты обнаруживаются только
после нагревания.
5.3.4.8. Обнаружение липидов иодом [214)
Этот реагент можно использовать как универсальный обнаружи-
тель липидов, так как насыщенные и ненасышенные липиды адсорби-
руют иод (ненасышенные липиды обнаруживаются интенсивнее).
М е т о д и к а. На дно закрытого цилиндрического сосуда
(15 х 45 см) насыпают кристаллы иода. Сосуд подогревают на во-
дяной бане при 60°С, чтобы иод возогнался. Хроматограмму подве-
шивают в иодной камере на 0,5-1 мин. извлекают и просматрива-
ют при дневном и ультрафиолетовом свете (366 нм). Липиды обна-
руживаются коричневыми пятнами, которые видны как темные облас-
ти в ультрафиолетовом свете. Пятна обводят карандашом, так как
они выцветают при хранении.
5.3.4.9. Дифференциальный обнаружитель для липидов [1751
Этот комплексный метод был предложен для обнаружения всех
классов липидов. Однако в связи с большим разнообразием смесей
природных липидов его универсальность требует дополнительной про-
верки.
Разделение смесей липидов
145
Реагенты. Краситель диамонд с кай блу В (Diamond Sky Blue В,
"Buyer Dyestuff Ltd".), 0,25%-ный раствор в воде, 200 мл.
Краситель диамонд цианиновый R (Diamond cyanine R., "Bayer Diestuff
Ltd".), 1%-ный раствор в воде, 300 мл.
Аммонийные квасцы, 2,8%-ный раствор. В 100 мл воды растворяют
2,8 г NH4Al(S04)r 12Н20.
Обнаружитель 1. Перечисленные выше растворы смешивают в стек-
лянной кювете (~22 х 35 см).
Морфолин-вода (5:95 по объему). 25 мл морфолина растворяют
в 475 мл-воды.
Бромная вода. Разбавляют водой насыщенный раствор брома
(3,6 г брома в ЮО мл воды) в соотношении 1:10 (по объему).
Приготавливают 500 мл такого раствора.
Обнаружитель2. 0,05%-ный раствор крезолового ярко-фиолето-
вого (" George Gurr and Со. Ltd.") в 1%-ной уксусной кислоте. Приго-
тавливают 400 мл раствора.
Раствор молочной кислоты, 20%-ный. Разбавляют водой 40 мл мо-
лочной кислоты до объема 200 мл.
Методика. Высушенную хроматограмму погружают в раст-
вор обнаружителя 1, нагревают 35 мин при 6042, отмыЬвают избы-
ток красителя под струей воды, вновь погружают хроматограмму в
5%-ный раствор морфолина на 1,5 мин и снова отмывают бумагу под
струей воды. Погружают хроматограммы на 3 мин в бромную воду
и быстро промывают ее под струей воды, погружают в раствор об-
наружителя 2, нагревают 15 мин при 6042 и быстро промывают
под струей воды. Погружают хроматограмму в раствор молочной кис-
лоты, выдерживают 20 мин и промывают в проточной воде до появ-
ления яркой окраски. Разные типы липидов обнаруживаются пятнами
разных цветов: лепитин — коричневато-голубыми, фосфатидилэтанол-
мин — голубыми, фосфатидилсерин - ярко-розовыми, лизолегштин -
коричневато-голубыми, лизофосфати ди л этанол амин - голубыми, сфинго-
миелин - серыми, цереброзидсульфат - розовыми, трифосфоинозитив
- розовыми.
5.3.4.10. Радиоавтография и радиоактивное сканирование
Надежнее всего присутствие фосфатидов и сульфолипидов доказы-
вает обнаружение 32Р и 35S в пятнах на хроматограмме. Липиды ме-
тят изотопами 14С, 32Р< и 36g (разд. 6.2) и затем их разделяют
методом хроматографии на бумаге, пропитанной кремневой кислотой
(разд. 5.3.3). Хроматограмму сушат 1-2 ч в вытяжном шкафу и
подвергают радиоавтографии (разд. 6.5.1). Меченые пятна на хро-
матограммах можно обнаружить с помощью сканиметра радиоактив-
ности (разд. 6.5.2). Типичные хроматограммы-радиоавтограммы, по-
лученные таким способом, приведены на рис. 6.1-6.4.
146
Глава 5
5.3.5. Количественный анализ фосфатидов
В зависимости от количества материала, которым располагает
исследователь для количественного анализа липидного фосфора в ком-
понентах смеси фосфолипидов, разделенных хроматографией на бума-
ге, пропитанной кремневой кислотой, можно использовать один из
приведенных ниже методов.
5.3.5.1. Образцы, содержащие 5—6 мкг фосфора
(наносят на хроматограмму в виде одного пятна)
Реагенты. Хлорная кислота, 72% - нал.
Амидоловый реагент, 1%-ный.О,5 г амидола и 10 г метабисуль-
фита натрия Na2S2O5 растворяют в 50 мл воды.
Молибдат аммония, 5%-яы«.2,5 г молибдата аммония растворяют
в 50 мл воды.
Методика. Смесь липидов, содержащую 5-6 мкг липидно-
го фосфора, наносят в виде одного пятна (разд. 5.3.2). На од-
ной хроматограмме можно исследовать до трех липидных образцов,
нанося их в точки, расположенные на расстоянии 3 см друг от дру-
га. Хроматограмму проявляют, как описано в разд. 5.3.3, и обна-
руживают родамином 6Ж. От хроматограммы отрезают продольные
полоски шириной 3 см, соответствующие расположению пятен каждой
из разделяемых смесей. Затем эти полоски разрезают поперек в за-
висимости от положения каждого пятна. Из хроматограммы выреза-
ют также два чистых участка 2x3 см, один - выше фронта раст-
ворителя, другой - ниже стартовой полосы, для проведения холостых
опытов. В каждом пятне определяют фосфор микрометодом Аллена
/10/ и Бартлетта /27/, модифицированным Петтером /194/.
Для этого кусочки хроматограммы, соответствующие каждому
компоненту разделяемой смеси, измельчают ножницами и количест-
венно переносят в пробирку из стекла пирекс размером 1,9 х 19 см
добавляют 0,5 мл 72%-ной хлорной кислоты и одну каплю 5%-ного
раствора молибдата аммония. Содержимое пробирки сжигают в те-
чение 5-10 мин в несильном пламени газовой горелки. Молибдат
аммония катализирует окисление бумаги, поэтому в его присутствии
сжигание происходит спокойно и быстро. Когда сжигание липидов
заканчивается, содержимое пробирки должно обесцветиться. В охлаж-
денную смесь добавляют еще 0,1 мл 72%-ной хлорной кислоты, что-
бы компенсировать потери при сжигании, и 6 мл воды. После ин-
тенсивного перемешивания кремневую кислоту осаждают центрифуги-
рованием. К 5 мл прозрачного супернатанта добавляют 0,2 мл раст-
вора амидола, 0,2 мл раствора молибдата аммония и 7 мин нагре-
вают на кипяшей водяной бане, после чего охлаждают и через 20 мин
измеряют поглощение при 830 нм по сравнению с-холостым опытом.
Разделение смесей липидов
147
проведенным с теми же реактивами. Одновременно с исследуемыми
и холостыми образцами анализируют стандартные вещества, содержа-
щие 0,5—5 мкг фосфора; на~основании полученных данных строят ка-
либровочную прямую для количественного определения фосфора.
Расчет. Если в результате холостого опыта получают окра-
шенные растворы, необходимо вводить поправку.
Действительное содержание фосфора в пятне, мкг=Найденное ко-
личество фосфора, мкг - Среднее содержание фосфора в холостом
. опыте, мкг • №'/ 2,0, где U - ширина кусочка хроматограммы, занима-
емого пятном исследуемого вешества, см; 2,0 - ширина чистого
участка, см.
Результаты выражают в процентах содержания фосфора во
всем исследуемом образце.
5.3.5.2. Образцы, содержащие 100 мкг липидного фрсфора
(образец наносят на хроматограмму в виде 20 пятен)
Реагенты. Раствор хлористого водорода в метаноле, 2,5%-ный
(разд. 4.8.1).
Хлорная кислота, 72%-ная.
Растворы амидола и молибдата аммония, приготовление см. в разд.
4.2.1 и 4.2.2.
Методика. Чтобы одновременно определить липидный фосфор и
жирные кислоты, входящие в состав каждого компонента смеси ли-
пидов, образец суммарных липидов наносят на хроматограмму в ви-
де 20 пятен, причем каждое пятно должно содержать 5-6 мкг ли-
пидного фосфора. Пятна располагают близко друг к другу. Хромато-
грамму проявляют, как описано в разд. 5.3.3, сушат 5 мин в ка-
мере в токе азота и обнаруживают родамином 6Ж (разд. 5.3.4.1).
Обводят карандашом зоны, соответствующие каждому компоненту
смеси,, и сушат бумагу 15 мин в токе азота. Вырезают каждую эо-
ну, измеряют ее ширину, разрезают на мелкие кусочки и переносят
в колбу Эрленмейера емкостью 50 мл с боковым отростком, добав-
ляют 4 мл 2,5%—него раствора хлористого водорода в метаноле,
следя за тем, чтобы все кусочки бумаги были покрыты слоем жид-
кости, и кипятят с обратным холодильником 1-2 ч. После этого
добавляют 1 мл воды и экстрагируют смесь несколько раз петролей-
ным эфиром порциями по 5 мл. Экстракт упаривают досуха в токе
азота и в остатке определяют метиловые эфиры жирных кислот (и
диметилацетальдегидов, если в исходном образце присутствуют плаз-
малогены) методом ГЖХ (разд. 5.5; 7.1.5 и 7.1.6). Метанольную
фазу центрифугируют и переносят в пробирку для сжигания. Колбу
с боковым отростком ополаскивают 5 мл 90%-ного метанола. Объе-
диненный метанольный'раствор выпаривают досуха при 5О°С в токе
воздуха и определяют суммарный фосфор методом Аллена /1О/ или
148
Глава 5
Бартлетта /27/ (разд. 4.2.1 и 4.2.2). Холостые опыты про-
водят, как описано в разд. 5.3.5.1. Метод применим при содер-
жании липидного фосфора (для каждого компонента смеси) 5—
Рис. 5.3. Стеклянный прибор,
используемый для элюирования
вешеств из полосок, вырезанных
из бумажных хроматограмм.
1 — притертая стеклянная проб-
ка; 2— бумажные фитили; 3- по-
лоски бумаги, вырезанные из —
хроматограммы; 4— стеклянный
стержень оиаметром 3 мм.
нента разбавляют бензолом и
испарителе, остаток растворяют в определенном объеме хлоро-
форма. В соответствующих аликвотных объемах определяют со-
держание фосфора (разд. 4.2.1), входящие в состав липидов
ЮО мкг. Если компоненты
содержат менее 5 мкг фос-
фора, его определяют молиб-
датным методом, описанным
в разд. 5.3.5.1.
5.3.5.3. Образцы, содержащие
200 мкг (и более) липидного
фосфора
Методика. К опи-
санному ниже методу прибе-
гают в тех случаях, когда
необходимо провести лезяпи—
пирование фосфолипидов и иден-
тификацию фосфатов. Суммар-
ные липиды хроматографируют
на нескольких листах бумаги
по 100 мкг липидного фос-
фора на каждом; хроматогра-
фирование проводят, как опи-
сано в разд. 5.3.5.2. Выре-
зают зоны, соответствующие
каждому компоненту, прикреп-
ляют каждую вырезанную эо-
ну к полоске бумаги (ват-
ман ЗММ), которая служит
фитилем, и проводят разделе-
ние методом нисходящей хро-
матографии, используя для
элюирования смесь хлороформ -
метанол - вода (50:50:1 по
объему) и метанол. Хромато-
графирование проводят в стек-
лянном приборе, показанном
на рис. 5.3.
Элюаты каждого компо-
упаривают досуха на роторном
Разделение смесей липидов 141
жирные кислоты определяют методом ГЖХ (разд. 4.8; 5.5;
7.1.6), определяют сложнозфирные группы (разд. 4.4) или
проводят дезацилировааие*" и идентификацию фосфатов (разд.
7.2.1.5).
5.3 £. Бумажная хроматография липидов
на выпускаемой промышленностью бумаге,
пропитанной кремневой кислотой
Пропитанную кремневой кислотой хроматографическую бумагу
выпускают, фирмы "Schleicher and Schtill Со." (кизельгелевая бумага,
Schleicher and Schull 289) И ”Н. Reeve Angel and Со. Inc." ватман SG-
81, пропитанный силикагелем). Бумага фирмы "Schleicher and Schull Со.
была проверена Бейсом /30/, который проводил двумер-
ное хроматографирование в системах тетрагидрофуран-хлороформ -
дииэобутилкетон - уксусная кислота - вода (45:10:5:6:6 по объем
и хлороформ - дииэобутилкетон - метилизобутилкетон - метилэтил-
кетон - муравьиная кислота - вода (110:30:26:20:30:3 по объем
и получил великолепное разделение липидов растений на 23 компо-
нента.
Бумага ватман SG-81 была проверена Маринетти /215/, ко-
торый показал, что эта фирменная бумага равномерно пропитана и
по качеству пропитки и разрешаюшей способности при хроматограф!
не уступает бумаге, приготовленной им самим /214/. Природные
смеси липидов, выделенные из различных источников, великолепно
разделялись методом как одномерной, так и двумерной восходяще!
хроматографии, в системах растворителей хлороформ—метанол-вода
(65:25:4 по объему) или дииэобутилкетон - уксусная кислота - в<
да (40:25:5 по объему, содержащих 0,05% 2,6-ди- вгрет-бутил-
4'-метилфенола, добавленного в качестве антиоксиданта).
Сравнительно недавно Маринетти применил другие системы
растворителей для двумерной хроматографии: хлороформ — мета-
нол - вода (65:25:4 по объему) и дииэобутилкетон - пири-
дин - вода (25:25:4 по объему), которые можно использо-
вать вместе с упомянутой выше парой систем растворителей
для более полного разделения сложных смесей, таких, как ли-
пиды корней гороха.
Свойства бумаги ватман SG-81 исследовал Уитер /355/, ис-
пользуя для двумерного проявления хроматограмм несколько сист<
растворителей. Оптимальные результаты получены при проявлении
хроматограмм в системах хлороформ - метанол - дииэобутилкетон -
уксусная кислота — вода (45:15:30:20:4) в первом направлении *
хлороформ - метанол - дииэобутилкетон - пиридин - вода (30:25:
150
Глава 5
:25:35:8) во втором направлении. В результате удалось достичь пол-
ного разделения всех основных фосфолипидных компонентов и их лиэо-
производных (некоторые тканевые экстракты удалось разделить на
22 липидных компонента). Кроме того, этим способом можно раз-
делять довольно большие количества липидов (5-6 мкг липидного
фосфора в одном пятне), что позволяет проводить количественное
определение липидного фосфора в каждом пятне и делать заключение
о количественном составе липидной смеси.
Хроматография на бумаге, пропитанной кремневой кислотой, вы-
пускаемой промышленностью, с применением указанных систем раст-
ворителей является весьма перспективным методом; простота мето-
дики, высокая скорость разделения и высокая разрешающая способ-
ность делают этот метод в высшей степени удобным для анализа
сложных смесей природных липидов. Теперь, когда пропитанная бу-
мага для хроматограмм выпускается промышленностью, этот метод -
несомненно получит широкое распространение.
5.4 . Тонкослойная хроматография
В настоящее время тонкослойная хроматография (ТСХ) может
по праву считаться одним из наиболее эффективных и универсальных
способов разделения интактных смесей липидов (нейтральных липи-
дов, фосфолипидов, гликолипидов ит. д.) и их липофильных фрагмен-
тов. Более того, если в качестве адсорбента используется силика-
гель, обработанный нитратом серебра, то методом ТСХ можно раз-
делять липиды одного класса по числу двойных связей. Разделение
липидов методом ТСХ проводится обычно на силикагеле, однако мож-
но использовать окись алюминия, ионообменную целлюлозу, сефадекс,
целлюлозу и т. д.
Как и колоночная хроматография. ТСХ может быть адсорбцион-
ной, ионообменной и распределительной. Подобно хроматографии на
бумаге, пропитанной силикагелем, ТСХ отличается простотой, высо-
кой разрешающей способностью и требует малых количеств вещест-
ва. Кроме того, ТСХ обладает, еше целым рядом преимуществ, и в
большинстве случаев этот метод предпочитают другим способам раз-
деления. К преимуществам ТСХ относятся: быстрота разделения, воз-
можность обнаружить все органические соединения при обугливании
и возможность проводить препаративное разделение. Насколько быст-
ро происходит разделение, можно показать на следуюшем примере:
на одной микропластинке для ТСХ можно анализировать до 6 образ-
цов, проявление пластинки занимает 4-5 мин. Таким образом, в хо-
де колоночной хроматографии можно анализировать элюаты на микро-
пластинках, определяя почти немедленно, какие фракции надо объеди-
нить и когда следует заменить элюирующий растворитель. Достоин-
ство ТСХ состоит также и в том, что повышение разрешающей спо- .
Разделение смесей липидов
151
собности хроматографии, в частности проявление в двух измерениях
и многократное проявление в одном направлении, можно осущест-
влять сравнительно быстро без специального оборудования.
В настоящем разделе методы ТСХ описаны так подробно, что
их смогут применять исследователи, только начинающие осваивать
этот метод; для более глубокого изучения метода следует ознако-
миться с работами /203, 205, 211, 237, 230, 267, 275, 309/.
5.4.1. Приготовление тонкослойных пластинок
Ниже описано приготовление нескольких наиболее употребитель-
ных типов пластинок для ТСХ на силикагеле.
5.4.1.1. Микропластинки
Реагенты. Адсорбенты. Силикагель Н, обычный, без свя-
зующего материала ("Brinkmann Instrument Inc." или " Е. Merck”)-, MN -
силикагель N, обычный ("Brinkmann Instruments Inc." ИЛИ "Machery, Nagel
and Co.”); адсорбсил-2, без связующего материала ("Applied Science La-
boratories"); силикагель D-0 обычный ("Camag Co."). *«
Предметные стекла для микроскопа, 2,5 х7,5 см, промытые аце-
тоном и тщательно протертые.
Методика. Приготовляют однородную массу из 50 г си-
ликагеля и 120 мл дистиллированной воды, переносят ее в химичес-
кий стакан емкостью 250 мл. Окунают одну ‘за другой каждую плас-
тинку в суспензию силикагеля, затем постукивают то по одной, то
по другой стороне пластинки, чтобы сбросить избыток суспензии.
Протирают одну из плоскостей каждой пластинки и раскладывают
пластинки на горизонтальной поверхности. Используя 50 г силикаге-
ля, описанным выше способом можно приготовить до 48 пластинок.
Пластинки сушат на воздухе 1—2 ч, после чего активируют при
110 °C примерно 12 ч. Таким же способом можно приготовить ми-
кропластинки из силикагеля, пропитанного нитратом серебра (разд.
5.4.1.3). При помощи аппликатора микропластинки можно покры-
вать слоем адсорбента толщиной 0,25 мм (разд. 5.4.1.2).
5.4.1.2. Стандартные пластинки (аналитические и препаративные)*
Реагенты и аппаратура. Адсорбент. Силика-
гель Н, MN, N, D-О, или адсорбсил-2 (без связующего вещества,
разд. 5.4.1.1). Адсорбент, применяемый для приготовления пре-
паративных пластинок, необходимо предварительно промыть, чтобы
удалить возможные примеси липидов. С этой целью силикагель сус-
См. дополнение 1 к гл. 5. — Прим, перев.
J52 Глава 5
пендируют в смеси метанол - хлороформ (1:1), фильтруют на во-
ронке Бюхнера, сушат сначала на воздухе примерно 12 ч и затем
при 1Ю°С.
Раствор карбоната натрия, 0,01 %-ный.Ь 1 л воды растворяют
0.1 Г Na2CO3.
Стеклянные пластинки, 0,4 х 20 х 20 и 0,4 х 10 х 20 см. перед
употреблением промывают ацетоном.
Аппликаторы. Различными фирмами выпускается много типов
аппликаторов /309/. Однако, по мнению автора, наиболее надеж-
ным является аппликатор "Desaga" ("Brinkmann Instruments Inc."), выпол-
ненный из нержавеющей стали. Толщину слоя на этом приборе мож-
но регулировать в диапазоне 0-2 мм.
Рабочий шаблон, стандартная подставка из плексигласа, на ко-
торой можно разместить 5 пластинок 20x20 см или 1О пластинок
10x20 см и т. д.("Brinkmann"). Если пластинки имеют неодинаковую
толщину, применяют специальную подставку с поддувом воздуха
("Shandon”).
Подставка для сушки пластинок, на которой размешается 10
пластинок 20x20 см.
Шкаф для хранения пластинок на подставках для сушки, изготов-
ляется из плексигласа или дерева. Влага поглощается сульфатом
кальпия*.
Методика. Укладывают пластинки на рабочий шаблон,
устанавливают зазор аппликатора на заданную толщину слоя (0,25—
0,5 мм для аналитических пластинок и 0,75-1 мм для препаратив-
ных пластинок). Приготавливают однородную суспензию 50 г сили-
кагеля в 115 мл 0,01%-ного раствора карбоната натрия. Немед-
ленно загружают суспензию силикагеля в резервуар аппликатора: по-
следний равномерно прокатывают по ряду пластинок, расположенных
на рабочем шаблоне, слева направо. Указанного количества силика-
геля достаточно для приготовления 4-5 больших аналитических и
3-4 больших препаративных пластинок. После нанесения слоя сили-
кагеля пластинки ставят на подставку для сушки и сушат 1 ч при
комнатной температуре и 2 ч при 120°С. Готовые пластинки хра-
нят в специальном шкафу. Перед использованием пластинки необхо-
* В настоящее время завод "Дружная горка" освоил выпуск комплектов
аппаратуры для тонкослойной хроматографии (АТХ). В комплекты АТХ вхо-
дят камеры различных размеров для хранения, проявления и опрыскивания
хроматограмм, устройства для нанесения тонкого слоя адсорбента, приборы
для снятия с пластинок слоя адсорбента с веществом, пульверизаторы, стек-
лянные пластинки и т.Д.
По желанию заказчика в комплекты АТХ могут быть включены ультра-
хемископы, позволяющие рассматривать в УФ-свете тонкослойные хромато-
граммы, обнаруженные родамином 6Ж или другими красителями. - Прим.перев.
Разделение смесей липидов
153
димо вновь выдерживать в течение часа при 12О°С (см. выше).
Чтобы-удалить возможные следы липидов, пластинки промывают в
хроматографической камере смесью хлороформ - метанол (1:1);
фронт растворителя. должен дойти при этом до верхнего края плас-
тинки. После этого пластинки высушивают на воздухе и снова ак-
тивируют-при 120с'С.
5.4.1.3. Пластинки с силикагелем,
пропитанным нитратом серебра [2051
Реагенты и аппаратура. Адсорбент. Силика-
гель В. (или силикагель аналогичного типа).
Нитрат серебра, чистый для анализа.
Аппликатор. Во избежание коррозии при воздействии нитрата
серебра аппликатор должен быть сделан из нержавеющей стали, ано-
дированного алюминия или плексигласа или посеребрен.
Методика. Наиболее употребительные концентрации нит-
рата серебра - 2,5 - 10%, иногда 25% (разд. 7.1.6.3). Чаше все-
го применяют пластинки с силикагелем, содержащим 5% нитрата се-
ребра; способ их приготовления подробно описан ниже.
Пластинки с силикагелем, содержащим 5% нитрата серебра. Обычным
способом готовят однородную суспензию из 47,5 г силикагеля и
раствора 2,5 г нитрата серебра в 100 мл воды. Эту суспензию
наносят на микропластинки или обычные пластинки, как описано в
разд. 5.4.1.1 и 5.4.1.2.
5.4.1.4. Пластинки, пропитанные минеральным маслом
или силиконом [ 205]
Реагенты и аппаратура. Адсорбент. Силика-
гель Н (или силикагель аналогичного типа).
Раствор силикона, 5%-ный. 5 г силиконового масла ("Dow Coming
Corp.," 200 Fluid Silicon, вязкость 10 сСт) растворяют в 1ОО мл эти-
лового эфира.
Раствор минерального масла, 5%-ный. 5 г минерального масла
(жидкий парафин, "Merck" или "Nujol", "Applied Science Laboratories")
растворяют в 1ОО мл бензола.
Методика. Пластинки с силикагелем готовят, как опи-
сано в разд. 5.4.1.1 или 5.4.1.2, и помешают в хроматографичес-
кую камеру, содержащую раствор силикона или минерального масла.
Когда фронт растворителя поднимется до верхнего края пластинок,
их извлекают из камеры и высушивают в вытяжном шкафу. Плас-
тинки можно использовать сразу. Проявление хроматограмм прово-
дят в том же направлении, что и пропитывание.
154
Глава 5
5.4.1 5. Пластинки, пропитанные борной кислотой
Методика. Готовят суспензию 40 г силикагеля Н в раст-
воре 4 г борной кислоты в 100 мл 0,01%—ного раствора карбона-
та натрия. Суспензию наносят на пластинки, как описано в разд.
5.4.1.1 и 5.4.1.2. На этих пластинках великолепно разделяются а-
и В* моноглицериды или моноалкиловые эфиры глицерина.
5.4.2. Нанесение липиОов на пластинки
Реагенты и аппаратура. Капилляры. Для точеч-
ного нанесения веществ на микропластинку удобно пользоваться
капиллярами с внутренним диаметром 0,1-0,2 мм и длиной
10-12 см, вытянутых вручную из трубки диаметром 10-
12 мм. Промышленностью выпускаются калиброванные капилляры
на 1,5 и 10 мкл (при заполнении на половину длины) и микропипет-
ки на 5. 10 и 25 мкл (цена деления 5 мкл).
Прибор оля нанесения веществ на пластинки. Для этой цели можно
использовать прибор (стрикер) "Pelick Streaker" ("Applied Science Corp.")
с гамильтоновским микрошприцем на 0,25 или 0,5 мкл, а также
автоматический прибор с моторчиком "Autoliner" ("Desaga Со.").
М е т о д и к а. Аликвотную часть хлороформного раствора ли-
пидов упаривают в токе азота до получения 4-5%-ного раствора. Ис-
пользуя описанные выше капилляры, этот раствор наносят на микро-
пластинки и стандартные аналитические пластинки отдельными пятна-
ми, по 0.5-2 мкл (20-80 мкг липидов) хлороформного раствора на
пятно. Расстояние между пятнами 1,5 см, расстояние от нижнего
края пластинки 1,5 см. На препаративные пластинки в виде сплош-
ной полосы наносят 5-10%-ный хлороформный раствор липидов из
расчета 25-50 мг липидов на пластинку. С помощью автоматичес-
кого стрикера можно одновременно наносить раствор на 1 или 2
пластинки с толщиной слоя 1 мм. Никаких специальных мер для уда-
ления растворителя (хлороформа) применять не надо, так как при
комнатной температуре он быстро испаряется. Высоконенасышенны >
липиды можно наносить в специальной плексигласовой камере в токе
азота ("Brinkmann Instruments Incl'). Во всех случаях хроматографирование
следует проводить сразу после нанесения образца.
5.4.3. Хроматографические камеры и системы растворителей
Аппаратура. Стеклянные камеры с массивными стеклянными
крышками. Камера Дезага, 11x21x21 см (длина х ширина х высо-
та); камера Бринкмана, 10 х 30 х 27 см. Стенки камер обоих типов,
чтобы создать насыщенную атмосферу, выстилают фильтровальной бу-
магой.
Разделение смесей лнпиоов
155
Хроматографические С-камеры, илиЪэндвич-камеры, типа камер Деза-
га или Бринкмана ( рис. 5.4). Все камеры поставляются фирмой
"Brinkmann Instruments Inc.".
Широкогорлые сосуды (70 х 90 мм) с навинчивающейся крыш-
кой, выстланные фильтровальной бумагой, применяются для двух
микропластинок.
Me-то дика. В камеру наливают 60-80 мл растворителя,
спустя 1-2 ч, в течение которых происходит насыщение атмосферы
в камере, в нее помещают 1 или 2 пластинки и выдерживают (40-
50 мин) их там до тех пор, пока фронт растворителя не приблизит-
ся к верхнему краю (1-2 см от верхнего края) пластинки. После
этого хроматограмму извлекают из камеры, быстро высушивают в
вытяжном шкафу или в камере, продуваемой током азота (для высо-
коненасышенных липидов), и обнаруживают пятна на хроматограмме
(разд. 5.4.4).
При работе с С-камерами на пластинку для ТСХ накладывают
покровное стекло с тефлоновыми или стеклянными боковыми прок ла о
ками, скрепляют стекла зажимами из нержавеющей стали и помеша-
Р и с. 5.4. Хроматографические С-камеры (сэндвич-камеры) для ТСХ.
а— С-камера Бринкмана; 1 — пластинка для ТСХ, 2 —фильтровальная бумага,
3 —покровное стекло, 4—растворитель, 5 —тефлоновая прокладка. б-С-каме-
ра Дезага: 1 —пластинка для ТСХ; 2-покровное стекло с наплавленными сте\
лянными прокладками; 3— растворитель.
ют в спепиальный лоток, содержащий 15-30 мл растворителя. Хро-
матографирование проводят обычным (30—40 мин) или проточным
методом. В последнем случае (см. рис. 5.4. С-камера Бринкмана)
между рабочей и покровной пластинками на расстоянии 2 см от вер
ха помешают кусок фильтровальной бумаги (21 х 10 см), который
свешивается наружу. Когда растворитель поднимается до бумаги, от
испаряется или собирается в сосуде, помешенном под нижним краем
Этот метод позволяет получить очень хорошее разделение, особенно
156
Гяава 5
при препаративной хроматографии. Высушивание и обнаружение плас-
тинок провопят обычным способом.
При работе с маленькими хроматографическими камерами в них
наливают 5-10 мл растворителя и помещают 1 или 2 пластинки.
Когда фронт растворителя окажется на расстоянии 0,5-1. см от верх-
него края (4-5 мин), пластинки вынимают из камеры (при необхо-
димости используют пинцет), высушивают в течение нескольких ми-
нут и обнаруживают.
Для двухмерной хроматографии на стандартных пластинках для
ТСХ вещество наносят в один угол пластинки, хроматограмму про-
являют в первой системе растворителей, быстро высушивают и про-
являют во второй системе растворителей, высушивают и обнаружи-
вают.
Системы растворителей. Для разделения липидов на классаt одно-
мерной ТСХ используют следующие системы растворителей (см.
табл. 7.1 и 7.9).
УглевоОорооы (нормальные, насыщенные и ненасыщенные; изопре-
ноиды; каротиноиды) и воски: гептан - бензол (9:1)*; бензол.
Нейтральные липиоы (воски, эфиры стеринов, метиловые эфиры
жирных кислот, алифатические альдегиды, кетоны, хиноны, токоферо-
лы. триглицериды, стерины, высшие алифатические спирты высшие
жирные кислоты, ди- и моноглицериды, моноалкиловые эфиры глтце-
рина): гексан или петролейный эфир (т. кип. 6О-7О°С) - этиловый
эфир — уксусная кислота (90:10:1) /209/; гексан или петролейный
эфир (т. кип. 60-7 0°С) - этиловый эфир - уксусная кислота (80:
:20:1 или 70:30:1) /205/; петролейный эфир - этиловый эфир -
уксусная кислота (82:18:1) /286/; гептан - этиловый эфир - ме-
танол-уксусная кислота (90:20:2:3) /49/; гексан — изопропиловый
эфир - этиловый эфир - ацетон - уксусная кислота (85:12:1:4:1)
/193/: изопропиловый эфир - уксусная кислота (96:4), затем петро-
лейный эфир — этиловый эфир - уксусная кислота (90:10:1) в том
же направлении /297/; этиловый эфир — бензол - этанол-уксусная
кислота (40:50:2:0,2) /98/; гептан - изопропиловый эфир-уксусная
кислота (60:40:4) /42/. Для разделения простагландинов и их про-
изводных на пластинках, пропитанных нитратом серебра, применяет-
ся смесь этилацетат-метанол-вода (8:2:5) /116,257/.
Фосфолипиоы и гликолипиды: хлороформ - метанол - вода (65:35:5
или 65:25:4) /194/; диизобутилкетон - уксусная кислота - вода
(40:25:5) /237/; хлороформ - метацод.-.уксусная кислота - вода
(25:15:4:2) /208/; хлороформ - метанол - уксусная кислота - во-""
да (40:25:3:7) /237/.
Здесь и далее приводятся объемные соотношения растворителей.
Разделение смесей липидов
157
Для 'двумерной ТСХ фосфолипидов и гликолипидов используют
следующие системы растворителей. Система Никольса /237 /: сна-
чала хлороформ — метанол - 7 н. гидроокись аммония (65:30:4) и
затем хлороформ-метанол-уксусная кислота-вода (170:25:25:6);
система Лепажа/193/:хлороформ - метанол - вода (65:15:2) и
хлороформ-метанол-ацетон-уксусная кислота-вода (65:10:20:10:3
система Раузера /275/: хлороформ - метанол - вода (65:25:4) и
бутанол-1 - уксусная кислота - вода (60:20:20) или хлороформ -
метанол-конп. аммиак (65:35:5) и хлороформ-метанол-ацетон -
уксусная кислота - вода (5:1:2:1:0,5).
5.4.4. Обнаружение и идентификация липидов, разделенных методом ТСХ
Описанные ниже реагенты считаются наиболее эффективными
обнаружителями липидов в ТСХ. Однако идентификация только эти-
ми обнаружителями не является окончательной, и ее необходимо
подтверждать спектральными и химическими методами.
5.4.4.1. Основные неспецифические обнаружители
Ниже приведен перечень обнаружителей, вызывающих деструкцию
липидов.
1. Серная кислота, 30-40%-ный водный или 5%-ный этаноль-
ный растворы.
2. Серная кислота — бихромат калия, 0,6%-ный раствор бихро-
мата калия в 55%-ной серной кислоте /275/.
3. Сульфат аммония, 20%-ный водный раствор.
Мето дика. Этими реагентами опрыскивают пластинки из
пульверизатора, распыляющего раствор под давлением воздуха. Оп-
рысканные пластинки нагревают 2—5 мин на горячей плитке или 15-
30 мин в печи при 180°С, пока все липиды (и другие органичес-
кие вещества) не обуглятся и не образуют черные пятна. Микро-
пластинки можно нагревать на маленькой плитке или в пламени го-
релки Бунзена (осторожно).
• Перечисленные ниже обнаружители, не вызывающие деструкции
липидов, применяются для выявления зон на препаративных пластин-
ках.
4. Родамин 6Ж, 0,01%-ный раствор, способ приготовления см. в
разд. 5.3.4.1. Пластинки опрыскивают и во влажном состоянии про-
сматривают в УФ-свете (366 нм); обычно хорошо видны желтые и
голубые флуоресцирующие пятна.
5. Пары иода. Помещают пластинку на несколько минут в закры-
тый сосуд, насыщенный парами иода (разд. 5.3.4.8); на хромато-
грамме появляются желтые или коричневые пятна. Для того чтобы
увидеть только пятна свидетелей, обнаружение проводят пасторов-
15Я
Глава 5
ской пипеткой, наполненной кристаллами иона. Продувая струю воз-
духа через пипетку, можно направлять пары иода только на те об-
ласти пластинки, которые нужно обнаружить не затрагивая тех пя-
тен или полос, которые надо элюировать.
6. Веса. Препаративные пластинки можно опрыскивать водой, по-
ка липиды не обнаружатся в виде матовых полос или пятен на про-
зрачном фоне. Однако этот метод обнаружения недостаточно чувст-
вителен.
. 2',7'- Дихлорфлуоресиеин. Хроматограммы опрыскивают 0,2%-
ным раствором красителя в 95%-ном этаноле. В УФ-свете (366 нм)
на фиолетовом Фоне видны желтые пятна нейтральных липидов. Фос-
фолипиды и гликолипиды этим реагентом не обнаруживаются.
5.4.4.2. Специфические обнаружители
1. Реактив оля обнаружения фосфолипиоое.
Предложен Дитмером и Лестером и модифицирован Васьков-
ским и Костепким /335/.
Р еагенты. Раствор "а". 16 г молибдата аммония раство-
ряют в 120 мл воды.
Раствор "б". К 40 мл концентрированной соляной кислоты при-
бавляют 10 мл ртути и 80 мл раствора "а', встряхивают 30 мин
и фильтруют.
Обнаружитель, К оставшемуся раствору 'а' прибавляют 200 мл
концентрированной серной кислоты и весь раствор 'б* охлаждают и
разбавляют водой по объема 1 л.
Методика. Пластинку для ТСХ опрыскивают реагентом,
через несколько минут без нагревания на белом фоне появляются
синие пятна фосфолипидов. Это специфический обнаружитель фосфоли-
пидов; чувствительность его 10 мкг. Фосфаты* не устойчивые в кис-
лой среде, можно обнаруживать метопом Розенберга (разд. 5.3.4.7),
опрыскивая хроматограммы соответствующими реагентами.
2. Нингиорин [214 ].
Реагент. Нингидрин, 0,25%-ный раствор в смеси ацетон -
лутидин (9:1). Приготовление см. в разд. 5.3.4.2.
Методика. Высушенную хроматограмму опрыскивают раст-
вором нингидрина, высушивают и вновь опрыскивают. Через 1-2 ч
при комнатной температуре появляются фиолетово-розовые пятна ли-
пидов, содержащих первичную аминогруппу. Если пятна не проявляют-
ся, пластинку опрыскивают еше раз.
3. Реактив оля обнаружения холин содержащих фосфолипидов — реактив Дра-
гендорфа (30].
Реагент. Раствор Драгендорфа, приготовление см. в разд.
5.3.4.3.
Разделение смесей липидов
159
Методика. Хроматограмму опрыскивают реагентом Дра-
гендорфа, после чего холинсодержащие фосфолипиды проявляются
в виде оранжевых пятен.
4. Реактив для обнаружения гликолипидов —перйодат- реактив Шиффа[295^-
Реагенты. Перйодат натрия, 1%-ный раствор. 1 г метапер-
иодата натрия растворяют в 100 мл воды.
Двуокись серы. Для обнаружения хроматограмм этим метопом
необходимо иметь -камеру, атмосфера в которой была бы насыщена
so2.
Реактив Шиффа. 1 г солянокислого фуксина растворяют в 100 мл
воды и через раствор пропускают сернистый газ до полного обес-
пвечйвания раствора. Если желтая окраска раствора не исчезает,
его обрабатывают активированным углем и фильтруют.
Методика. Пластинку опрыскивают раствором перйодата
натрия, чтобы силикагель стал влажным, и выдерживают 5-10 мин
до полного окисления вешеств. Чтобы удалить избыток перйодата,
пластинку снова опрыскивают водой, помещают в камеру в атмосфе-
ру сернистого газа и выдерживают до исчезновения коричневой ок-
раски, обусловленной выделяющимся иодом. После слабого опрыски-
вания хроматограмм реактивом Шиффа почти сразу же обнаружива-
ются фиолетовые пятна фосфатидилглицерина. через некоторое время
проявляются синие пятна гликозилдиглидеридов, переброзидов и дру-
гих гликолипидов; фосфатидилинозит обнаруживается пятном желтого
цвета, характерного для соединений, образующих при окислении
перйодатом малоновый диальдегид.
5. Реактив для обнаружения гликолипидов—а-нафтол [294].
Реагенты. аЛафтол, 0,5%-ный раствор. В 100 мл смеси
метанол - вода (1:1) растворяют 0,5 г П’нафтола/ перекристалли-
зованного из смеси гексан - хлороформ.
Серная кислота. Концентрированную серную кислоту разбавляют
водой в соотношении 95:5 (по объему).
Методика. Хроматограмму опрыскивают раствором а- наф
тола до увлажнения слоя силикагеля, высушивают на воздухе и слег-
ка опрыскивают раствором серной кислоты. Нагревают в сушильном
шкафу при 120°С до максимального проявления окраски. Гликолипидь
(переброзиды, сульфатиды, ганглиозиды, гликоэилдиглицериды и т. д.)
проявляются сине-фиолетовыми, другие полярные липиды — желтыми,
а холестерин - серо-красными пятнами.
6. Реактив для обнаружения ганглиозидов — резорцин [227, 314].
Реагент. Резорциновый реагент. 2 г резорцина растворяют
в 100-мл воды (стабильный раствор). 3 а 4 ч до использования
10 мл этого раствора приливают к смеси 80 мл конпент-
160
Глага 5
рированной соляной кислоты (чда) и 0,5 мл 0,1 М раствора
сульфата меди (2,5 г CuS04 5Н2О в 100 мл воды) и разбавляют
водой до 100 мл.
Методика. Сухую хроматограмму опрыскивают резорци-
новым реагентом, тщательно закрывают стеклянной пластинкой и на-
гревают в сушильном шкафу при 120°С. Ганглиозиды и другие про-
изводные сиаловой кислоты обнаруживаются сине-фиолетовыми пят-
нами.
7. Реактив для обнаружения сфинголипидов [371.
Реагенты. Гипохлоршкный реактив ("Clorox"). 5 мл отбе-
ливающего раствора гипохлорита натрия марки "Clorox"("The Оогох Со.")
смешивают с 50 мл перегнанного бензола и 5 мл ледяной уксус-
ной кислоты. Этот раствор используют сразу после приготовления.
Бензиоиновыи реактив. 0,5 г бензидина и маленький кристаллик
йодистого калия растворяют в 50 мл смеси этанол - вода (1:1),
осадок отфильтровывают. Этот реактив надо приготавливать при сла-
бом освещении и использовать не позднее чем через 2 ч после при-
готовления.
Методика. Высушенную хроматограмму опрыскивают ре-
активом 'Clorox’' и оставляют в вытяжном шкафу, чтобы удалить из-
быток хлопа. После опрыскивания бензидиновым реактивом сфинго-
липиды I сфингомиелин, керамиды, цереброзиды, сульфатиды, керамид-
полигексозиды и ганглиозиды), а также липиды, содержащие вторич-
ные аминогруппы, обнаруживаются в виде голубых пятен на белом
Фоне. Чувствительность реагента 5-10 мкг.
Рипон и Смит /278/ предложили более простой вариант этого
метода. Пластинку выдерживают 1-5 мин в атмосфере хлора в за-
крытом сосуде; чтобы удалить избыток хлора, пластинку помешают
на 1 ч в вытяжной шкаф, через который пропускают ток сухого воз-
духа (25°С). После такой обработки пластинку опрыскивают смесью
0,5%-ного водного раствора крахмала и 0,5%-ного водного раство-
ра йодистого калия (разд. 5.3.4.4). Соединения, содержащие NH -
группу, обнаруживаются темно-синими пятнами на белом фоне. Этот
метод можно использовать после предварительного обнаружения NH-
групп нингидрином. Методику, описанную в разд. 5.3.4.4, также
можно применять и в ТСХ.
3. Реактив оля обнаружения стеринов и их эфиров.
а. Смесь серная кислота — уксусная кислота /145/
Р е а г е и т. Концентрированная серная кислота — ледяная уксус-
ная кислота, смесь 1:1 (по объему).
Методика. Пластинки опрыскивают реагентом и нагрева-
ют 15 мин при 90°С. Холестерин и его эфиры дают красные пятна
на белом фоне. Ненасыщенные липиды реагируют медленнее, они да-
ют пятна розово—коричневого цвета.
Разделение смесей липидов
161
б. Хлорное железо [ 199 ]
Реагент. Раствор хлорного железа. 50 мг FeCl3- 6Н2О раст-
воряют в 90 -мл воды, к раствору прибавляют 5 мл ледяной уксус-
ной кислоты и 5 мл концентрированной серной кислоты. Реагент мож-
но хранить 3 месяца при комнатной температуре.
Методика. Хроматограмму опрыскивают реагентом, со-
держащим хлорное железо, и спустя 2-3 мин нагревают при 100°C.
Холестерин при такой обработке дает красные или фиолетовые пят-
на; эфиры холестерина дают пятна такого же цвета, но несколько
позднее. Продолжительное нагревание вызывает обугливание других
липидов на хроматограмме.
9. Реактив для обнаружения ненасыщенных соединений.
Методика. Хроматограмму помещают в закрытый сосуд,
атмосфера в котором насыщена парами 0s04; при этом ненасыщен-
ные соединения обнаруживаются в виде черных пятен.
10. Реактив оля обнаружения сложных эфиров [296].
Реагенты. Щелочной раствор гидроксиламина, свежеприго-
товленный. Смешивают 100 мл Ю^—ного этанольного раствора со-
лянокислого гидрокси ламина (10 г NH,OH-HC1 растворяют в 25 мл
воды и разбавляют до 100 мл этанолом) с 200 мл 12%-ного эта-
нольного раствора гидроокиси натрия (24 г Na ОН юастворяют в
25 мл воды и разбавляют до 200 мл этанолом), осадок хлористо-
го натрия отделяют центрифугированием, используют чистый супер-
натант.
Раствор хлорного железа. 10 г FeCl ,• 6П20 растирают в ступке
с 20 мл концентрированной соляной кислоты, после чего смешива-
ют с 300 мл этилового эфира до полного растворения хлорного
железа.
Методика. После опрыскивания щелочным раствором гид-
роксиламина и непродолжительного высушивания хроматограмму об-
рабатывают раствором хлорного железа. Сложные эфиры дают фио-
летовые пятна на желтом фоне.
11. Реактив для обнаружения карбонильных соединений (альдегидов и
кетонов [297]).
Методика. Хроматограммы опрыскивают 0,4%-ным насы-
щенным раствором 2,4-динитрофенилгидразина в 2 н. соляной кис-
лоте. Свободные альдегиды или плазмалогены и кетоны после сла-
бого подогрева обнаруживаются в виде желтых пятен. Чтобы отли-
чить кетоны от альдегидов, пластинку опрыскивают 0,2%-ным раст-
вором феррицианида калия в 2 н. соляной кислоте. Кетоны сразу же
дают пятна голубого цвета, альдегиды реагируют медленнее и обра-
зуют оцивково-серые пятна. Чтобы подтвердить присутствие альде-
гидов, хроматограмму обрабатывают реактивом Шиффа.
162
Глава 5
12. Реактив оля обнаружения плазмалогенов (альдегидов) (реактив Шиф-
фа) [ 297] ( разд. 5.3.4.6.).
Р е а г е н т ы. Раствор хлорной ртути, 0,05 М.
Реактив Шиффа.0,2 г фуксина растворяют в 5 мл 10%-ного
раствора бисульфита натрия и разбавляют 85 мл воды. На следую-
щий день раствор обрабатывают активированным углем и фильтру-
ют; хранят бутыли из темного стекла.
Раствор бисульфита или метабисульфита натрия, 0,05 М.
Методика. Хроматограмму опрыскивают сначала реакти-
вом Шиффа, затек-i раствором HgCl 2 (чтобы расщепить плазмалоге—
ны до свободных альдегидов) и, наконец,.раствором бисульфита нат-
рия. Плазмалогены и свободные альдегиды сразу дают фиолетовые
пятна на розовом фоне, кетоны не окрашиваются. Чтобы отличить
свободные альдегиды от плазмалогенов, опускают обработку хрома—
тогоаммы раствором HgCl2; свободные альдегиды немедленно дают
лиловые пятна.
13. Реактив для обнаружения кислот.
е а г е н т. Раствор оромкрезолового зеленого. 0,04 г бром-
коезолового зеленого растворяют в 100 мл этанола и добавляют
0.1 к. раствор гидроокиси натрия до появления голубого окраши-
вания.
Методика. Если пластинку обрабатывают растворителями,
содержащими уксусную кислоту, то ее необходимо сушить при
120°С в течение часа, чтобы удалить все следы кислоты. После
опрыскивания раствором индикатора пятна жирных кислот окрашива-
ются в голубой цвет, фон желтый.
5.4.4.3. Хранение хдоматограмм
Тонкослойные хроматограммы неудобны для хранения, так как
слой легко повреждается, кроме того,-они очень громоздки. Поэ-
тому целесообразнее всего снимать с них фотокопии с помощью по-
ляроидной камеры или фотокопировального устройства Бринкмана
(''Brinkmann Instruments Inc. " ) И хранить наряду с другими данными.
5.4.4.4. Радиоавтография.и сканирование пятен радиоактивных веществ
Шля определения пятен радиоактивных веществ на пластинках
для ТСХ используют радиоавтографию на рентгеновской пленке или .
сканирование хроматограмм сканиметрами радиоактивности (разд.
6.5.2).
Разделение смесей липидов
163
5.4.5. Количественный анализ липидных компонентов
.. ___ при исследовании методом ТСХ
5.4.5.1. Денситометрическое определение
с предварительным обугливанием пятен на хроматограммах [272, 2731
Реагенты и аппаратура. Обнаружитель. 1,2 г
К2Сг2О7 растворяют в 200 мл 55%-ной серной кислоты (чда).
Стандартные вещества. Образцы хроматографически однород-
ных триглицеридов, холестерина, лецитина, фосфатидилэтаноламина
и т. д. (см. также табл. 2.1).
Денситометр фирмы "Photovolt Corp.'1
Мето ди к а. На пластинку для ТСХ размером 20x20 см
наносят в 2 пятна образеп липидов (100-600 мкг на пятно) и
2-3 пятна чистых стандартных веществ (25-100 мкг на пятно).
Проявляют хроматограмму соответствующим растворителем в одном
направлении и оставляют в вытяжном шкафу, пока она не высохнет.
После этого хроматограмму слегка опрыскивают раствором бихрома-
та калия в серной кислоте, создавая тонкий аэрозоль обнаружителя,
нагревают 30-60 мин при 180°С в печи с принудительной тягой.
Пластинку помешают в денситометр, устанавливают фон прибора на
нуль, используя область хроматограммы между пятнами в качестве
холостого опыта, и сканируют каждое пятно вручную с интервалом
в 1 мм. Записывают показания фотометра для каждой точки. Обшая
плотность окраски пятна определяется как сумма показателей каж-
дой его точки. Средние показатели могут быть затем выражены как
абсолютное количество вещества в микрограммах или содержание
компонента в процентах от веса смеси липидов. Этот метод имеет
ряд недостатков: 1) точность определения зависит от полноты раз-
деления компонентов в результате одномерного хроматографирования;
2) количество углерода, образующегося при обугливании, зависит
от степени ненасыщенности соединения, его структуры и его подвиж-
ности на пластинке для ТСХ; 3) для равномерного опрыскивания
пластинки обнаружителем и получения воспроизводимых результатов
требуются умение и опыт. Тем не менее, хорошо овладев этим
методом, его можно использовать для быстрой обшей оценки коли-
чественного состава смесей природных липидов.
5.4.5.2. Количественный анализ фосфолипидов [2771
Реагенты. Обнаружитель. 0,6%-ный раствор К2Сг2О7 в
55%-ной серной кислоте (разд. 5.4.5.1).
/Хлорная кислота, 72%-ный раствор.
Молибдат аммония, 2,5%.-ный раствор.
Аскорбиновая кислота, 10%-ный раствор. Приготавливают непо-
средственно перед употреблением.
164 Глава 5
Методика. После опрыскивания раствором бихромата в
серной кислоте и обугливания (разд. 5.4.5.1 ) пятна на хроматограм-
ме обводят, в правом верхнем углу пластинки отмечают соответст-
вующие по размерам чистые пятна. Каждое пятно переносят методом
аспирации в колбу Кьельдаля емкостью 30 мл, содержащую 0,9 мл
хлорной кислоты. Для проведения аспирации в колбу пропускают две
пластиковые трубки, вставленные в резиновую пробку (как у промыв-
ной склянки;. Образец всасывается через длинную изогнутую трубку,
а более короткую трубку присоединяют к водоструйному насосу. Дру-
гой конец короткой трубки, находящийся внутри колбы, защищают ку-
сочком фильтровальной бумаги. Большая часть адсорбента попадает
в колбу. Застрявший в изогнутой трубке адсорбент вытряхивают в
колбу с помощью легкого постукивания, а адсорбент, задержанный
шильтром, проталкивают кусочком проволоки.
Содержимое колбы сжигают на установке Кьельдаля с электри-
ческим или газовым нагревом в течение 20 мин. При сжигании при-
нимают меры для того, чтобы потери хлорной кислоты были минималь-
ными. Смывают стенки колбы 5 мл воды и добавляют 1 мл раство-
ра молибдата аммония. Содержимое колбы перемешивают и добавля-
ют 1 мл раствора аскорбиновой кислоты и 2 мл волы. Полученную
смесь переносят пастеровской пипеткой в центрифужную пробирку ем-
костью 15 мл, нагревают на кипяшей водяной бане 5 мин, охлажда-
ют и отделяют осадок центрифугированием. Прозрачный супернатант
помешают в кювету и определяют при 820 нм поглощение относитель-
но раствора холостого опыта. Вводят поправку, вычитая значение ад-
сорбции чистой зоны, соответствующей по размеру зоне образца.
Пересчитывают величину поглощения в микрограммы липидного фос-
аюра с помощью коэффициента, выведенного из значений, полученных
три определении фосфора в известных количествах стандартного ве-
щества - КН?ГО4 (разд. 4.2.1). Метод применим для определения
0.5-10 мкг фосфора.
5.4.5.3. Анализ жирных кислот и определение фосдюра[272, 275)
Р е а г е н т ы. Раствор хлористого вооороОа в метаноле, 2,5%-ный
(разд. 4.8.1). ~
Раствор рооам^на, 0,0012%-ный ( разд. 5.3.4.1).
Методика. На пластинку для ТСХ размером 20 х 20 см
наносят образцы и проявляют хроматограмму в подходящей системе
растворителей. На одно пятно может приходиться около 400 мкг
суммарных липидов: на одну пластинку можно наносить несколько
пятен одного и того же образца. Пластинку помешают в сосуд и то-
ком азота в течение 5 мин удаляют избыток растворителей. После
этого пластинку сразу же опрыскивают раствором родамина и еше
Разделение смесей липиоов
165
во влажном состоянии просматривают в УФ-свете. Пятна оЬводят и
соскабливают-(в том числе окно или два чистых пятна) и помешают
влажный адсорбент в колбы емкостью 50 мл с боковым отростком.
Ставят колбы в эксикатор и высушивают адсорбент над гранулирован-
ным едким кали в течение 1-2 ч в токе азота при атмосферном
давлении. Затем в колбы добавляют 4,5 мл 2,5%-ного раствора НС1
в метаноле и кипятят с обратным холодильником 1-2 ч. Реакцион-
ную смесь сразу же разбавляют 0,5 мл воды, экстрагируют метило-
вые эфиры жирных кислот петролейным эфиром (разд. 4.8.1) и
анализируют их методом ГЖХ (разд. 5.5). Водно-метанол., ную фазу
отделяют от силикагеля центрифугированием, переносят в пробирки
для сжигания, упаривают растворитель в токе воздуха и определяют
содержание фосфора по методу Бартлетта /27/ (см. также разд.
4.2.2).. Для введения поправки на возможное присутствие фосфора
в адсорбенте подобной обработке подвергают чистый силикагель, сня-
тый с пластинки. Если одно пятно содержит недостаточное для ана-
лиза количество материала, можно объединить адсорбент из несколь-
ких пятен.
5.4.6. Препаративная ТСХ
Реагенты и аппаратура. Препаративные плас-
тинки для ТСХ (толщина слоя 0,75-1,0 мм). Силикагель наносят на
пластинки размером 20x20 мм, как описано в разд. 5.4.1.2 и
5.4.1.З.
Растворители для элюированы нейтральны? полярных и неполяр-
ных липиоов: хлороформ-метанол-эфир (1:1:1), кислотных полярных
липидов: хлороформ—метанол—вода (1:2:0,8; нейтральный раствори-
тель Блайя-Дайэра) или хлороформ-метанол- 0,2 н.ИС! (1:2:0,8;
кислотный растворитель Блайя - Дайэра)
Методика. Образцы (20-35 мг) наносят на пластинку
для ТСХ с помощью стрикера (разд. 5.4.2) и обрабатывают в соот-
ветствующей системе растворителей (разд. 5.4.3). Пластинку извле-
кают из камеры и сушат 15-30 мин на воздухе или в камере, про-
дуваемой током азота. Опрыскивают пластинку водой или 0,01%-ным
раствором родамина 6Ж и обводят полосы, соответствующие разде-
ленным компонентам (разд. 5.4.4.1). Соскабливают адсорбент с каж-
дой полосы и помешают в колбу Эрленмейера емкостью 50 мл со
стеклянной пробкой. Добавляют 15-20 мл растворителя для элюиро-
вания, например смесь хлороформ - метанол - эфир (1:1:1), встря-
хивают смесь и фильтруют на стеклянном фильтре средней пористости.
Экстракцию повторяют дважды. Фильтраты переносят в круглодонную
колбу, разбавляют равным объемов "бензола и упаривают на роторном
испарителе в вакууме при 30°С, пока в колбе не останется несколь-
ко миллилитров раствора. Добавляют к остатку еше некоторое коли-
166
Глава 5
чество бензола и продолжают упаривание до полного удаления воды
(бензольный раствор должен быть прозрачным). Высушенный остаток
растворяют в 2-5 мл смеси хлороформ - бензол (1:1) или хлоро-
Форм - метанол (1:1), силикагель удаляют центрифугированием и
хранят раствор при низкой температуре.
Чтобы удалить все возможные растворимые в воде примеси,
силикагель и большую часть родамина, из нейтральных полярных
или неполярных липидов, можно использовать следующий модифици-
рованный вариант метопа Блайя и Дайэра /38/. Экстракт (воду
удаляют отгонкой с бензолом) растворяют в 10 мл смеси хлоро-
форм—метанол (1:1), раствор переносят в центрифужную пробирку
емкостью 15 мл с пробкой, приливают 4,5 мл воды, перемешивают,
быстро центрифугируют и удаляют хлороформный слой пастеровской
аипеткои. Хлороформный раствор разбавляют бензолом и упаривают
в токе азота. Остаток растворяют в смеси хлороформ-метанол (1:1)
п хранят раствор, как указано выше. Если образец содержит кислот-
ные липиды в виде солей, их можно превратить в свободные кисло-
ты и после этого в соли аммония, добавляя вместо воды 4,5 мл
0,5 н. HQ и сразу же нейтрализуя хлороформный слой 0,2 н. раст-
вором гидроокиси аммония в метаноле (pH контролируют по универ-
сальной индикаторной бумаге). После достижения нейтральной реак-
ции добавляют еше несколько капель раствора аммиака и упаривают
растворитель, как указано выше. Если необходимо получить натрие-
вую или калиевую соли, хлороформный слой нейтрализируют 0,1 н.
раствором гидроокиси натрия или калия в метаноле.
Метоо Блайл и Дайэра — элюирование нейтральными или подкисленны-
ми растворителями.
С четырех больших препаративных пластинок соскабливают поло-
су силикагеля шириной 1 см и помешают в центрифужную пробирку
объемом 90 мл. Добавляют 30 мл нейтрального растворителя Блайя-
Дайэра . перемешивают 1-2 мин, центрифугируют и сливают супер-
натант в мерный цилиндр. Повторяют экстракцию еще два раза, пос-
ле чего, добавляя растворитель Блайя - Дайэра, доводят объем
объединенных экстрактов до 95 мл. Добавляют 25 мл хлороформа
и 25 мл воды, смешивают и центрифугируют смесь. У цаляют хлоро-
формную фазу разбавляют ее бензолому упаривают на "роторном ис-
парителе досуха, растворяют остаток липидов в смеси хлороформ-
метанол (1:1) или в смеси хлороформ-бензол (1:1) тщательно цен-
трифугируют и хранят при низкой температуре. Для сильнополярных
липидов, которые элюируются с трудом, применяют тот же самый
метод, используя подкисленный растворитель Блайя-Дайэра. Чтобы
свести до минимума возможность растепления липидов в кислой сре-
де, хлороформную фазу нейтрализуют небольшим избытком 0,2 н.
метанольного раствора аммиака сразу после разделения двухфазной
Разделение смесей липидов
167
системы. Растворитель упаривают, как указано выше, и растворяют
липиды в смеси хлороформ-метанол (1:1). Для элюирования отдель-
ных пятен "радиоактивных липидов этот метод можно упростить: про-
водят двухкратную экстракцию 3,8 мл нейтрального или подкислен-
ного растворителя Блайя-Дайэра в пробирке объемом 15 мл с проб-
кой и добавляют 2 мл хлороформа и 2 мл воды, чтобы образовалась
двухфазная система.
5.5. Газожидкостная хроматография (ГЖХ)
Газожидкостная распределительная хроматография (впервые при-
менена Джеймсом и Мартином /143/) представляет собой прекрас-
ный метод быстрого количественного анализа летучих компонентов
липидов, таких, как углеводороды, алифатические спирты, эфиры жир-
ных кислот, стерины и т. д. Метод ГЖХ основан на распределении
компонентов смесей, находящихся в парообразном состоянии, между
подвижной газовой фазой и неподвижной нелетучей жидкой фазой, на-
несенной на инертный носитель. Теоретические основы ГЖХ и мето-
дика работы с газовым хроматографом рассматриваются в ряде ве-
ликолепных руководств по ГЖХ липидов; см., например, /2, 136.
142/. В данном разделе будут описаны только самые общие методи-
ки ГЖХ.
5.5.1. Приготовление.набивок для хроматографических колонок
[2, 136,1421
Перечень обычно употребляемых неподвижных фаз и инертных
носителей, а также их основные характеристики приведены в табл.
5.3. Ряд фирм, в частности "Analabs", " Applied Science" . "Chromatograp-
hic Specialities","Sjpelco", выпускает наборы неподвижных фаз и различ-
ных носителей.
Материалы. Неподвижные фазы, полярные и неполярные.
Перечислены в табл. 5.3.
Носители, перечислены в табл. 5.3.
Растворители. Петролейиый эфир, низкокипяший (т. кип. 4G-
60°С), хлороформ, ацетон.
Методика. Чтобы приготовить набивки с высокими концен-
трациями (10-20%) жидкой фазы, 1-2 г жидкой фазы растворяют
примерно в 60 мл подогретого растворителя в стакане емкостью
250 мл. Полярные фазы обычно растворяют в хлороформе, силиконы-
в хлороформе или ацетоне, а апиезоны - в петролейном эфире. К по-
лученному раствору медленно прибавляют необходимое количество
носителя (см. табл. 5.3), тщательно перемешивая смесь стеклянной
палочкой. Растворитель упаривают на горячей водяной бане (‘''80°С),
осторожно перемешивая до тех пор, пока не получится однородная.
Таблица 5.3
Неподвижные фазы и носители, используемые в газожидкостной хроматографии а)
Неподвижные фазы Носители®) 0 /о Рабочая темпе- ратура, °C Анализируемые вещества
фирменное название тип соединения концентрация 6) J
обычная макси- мальная
Неполярные фазы I ([ Апиезон L Насыщенные угле- 10 15-20 Гаэохром Р, ана- 190-200 250 Углеводороды, или М водороды кром АВ или хро- (С8-Сд2); мети- мосорб G (AW) новые эфиры жирных кислот; высшие спирты _С„) Силиконовый Метилсиликон 1-3 - 190-200 300 каучук GE SE-30 1 Силиконовый Метилфенилси- 1-3 -- 190-200 300 каучук GE SE-52 ликов Углеводороды, Газохром Q, ана- эфиры жирных Силиконовое Трифторпропил- 1-3 - , кром Q или 190-200 250 * кислот’ э^и“ масло DC OF-1 метилсиликон и хромосорб G (AW) ры оксикислот, стерины Силиконовый кау-> Диметилсиликон 2-3 10 200 300 чук 0V-1 Силиконовое Метилфенилси- 1-3 10 200 350 масло 0V-17 ликов Силиконовое Метилсиликон 1-3 - 200 350 масло OV-101 Силиконовый кау- Метилсиликон 1-3 - 190-200 300 чук JXR ' Полярные фазы - ' . Полибутандиолсукци- Полиэфир 10 15-20 170-180 220 нат (PBDS) । Полиэтиленгликоль- , 10 15-20 . 180-190 210 > адипинат JPEGA) • Метиловые Полидиэтиленгли- Полиэфир 10 15-20 Газохром А, 180-190 210 эфиры ненасы- кольадипинат анакром А или 1 шенных жир- ( PDEGS) хромосорб G(AW) ных кислот, Полиэтиленгликоль- Полиэфир 10 15-20 180 200 альдегиды, сукцинат ( PEGS) спирты, угле- Поли диэтиленгликоль- Полиэфир 10 15-20 180 200 водороды сукцинат (PDEGS) Полиэтиленгликоль- Сополимер поли- 10 15 200 225 сукнинатсиликон эфира и метилси- Метиловые (PEGSS-X) ликона Газохром Р или эфиры ненасы- Полиэтиленгликопь- Сополимер поли- 10 15 Q, анакром АВ 190 210 шенных жирных сукцинатсипикон эфира и цианэтил- или Q, хромо- кислот, альде- (PECNSS-S) силикона сорб G(AW-DMCS) гиды, спирты Карбовакс 20М Полиэтиленгликоль 10 - 100-200 220 углеводороды Игепал СО-990 Поверхиостно-ак- 10 - 180-200 220 тивное вещество (новилфенилполи- оксиэтиленэтанол) • а) Большой ассортимент неподвижных жидких фаз и носителей выпускается фирмами "Analabs", "Applied Science',' "Chromatographic Specialties:", "Pierce", "Supelco , " Varian . ч I - аналитические колонки, 11 - препаративные колонки. Bh3ce эти носители приготовлены из диатомитовой земли. Газохромы (" Applied Science' ): Р - обработан кислотой и спиртовой шелочью; А - обработай кислотой; Q - силаниэпрованный газохром Р. Анакромы ("Апа- Inbs"А - обработан кислотой; АВ - обработан кислотой и спиртовой шелочью; Q - обработан кислотой и сила- низирован; ABS - обработан кислотой, спиртовой шелочью и силаниэирован. Хромосорбы G ("Johns Mansville"): AW - обработан кислотой, AW-DMCS - обработан кислотой и сила визирован. Обычные размеры частиц, меш: 60/80, 80/100 и 100-120.
170
Глава 5
не содержащая комков набивка. Набивку для хроматографических ко-
лонок можно готовить также в кругло донной колбе емкостью 250 мп
и удалять растворитель в вакууме на роторном испарителе. Следы
растворителя рекомендуется удалять из набивки в вакуум-эксикато-
ре нац гранулированной гицроокисью калия при комнатной температу-
ре <но не при нагревании в сушильном шкафу). Готовую набивку
хранят в вакуум-эксикаторе или в запаянных склянках.
Набивки с низкими концентрациями (1-3%) жидких фаз приго-
тавливают следующим образом. 1 г жидкой фазы растворяют в та-
ком количестве хлороформа или ацетона, чтобы получился 1-3%-ный
раствор. Прибавляют примерно 5-Й г носителя, смесь осторожно
перемешивают, быстро фильтруют с отсасыванием через крупнопо-
ристый стеклянный фильтр, не допуская высыхания массы на филь-
тре. Влажную наоивку распределяют тонким слоем и сушат сначала
на воздухе, затем в вакуум—эксикаторе. Количество адсорблрованной
носителем жидкой фазы определяют по разности веса носителя с
жидкой фазой и носителя без жидкой фазы.
5.5.2. Приготовление колонок
Ниже будет описано приготовление двух основных типов приме-
няемых в ГЖХ колонок - набивных и капиллярных.
Г». 5.2.1. Приготовление набивных колонок
В открытую с обоих конпов стеклянную колонку с внутренним
диаметром 4 мм сначала помешают небольшую пробку из стеклозо-
локна пирекс, чтобы она плотно закрывала один конеп колонки. К
другому концу, используя тефлоновую трубку, присоединяют неболь-
шую стеклянную воронку. Колонку ставят в вертикальное положение,
прижимают к работающему смесителю "Vortex”, чтобы колонка вибри-
ровала, и через воронку начинают понемногу всыпать готовую набив-
ку. Чтобы колонка заполнялась более равномерно, ее вращают и пе-
риодически поднимают. Наполнение колонки набивкой продолжают
до тех пои, пока вся она не будет заполнена. Для окончательного
уплотнения набивки выходной коней колонки ненадолго присоединяют
к водоструйному насосу и постепенно снижают давление. Если высо-
та полученного слоя недостаточна, в колонку засыпают еше неко-
торое количество наоивки и уплотняют ее таким же образом. Верх-
нюю часть заполненной колонки закрывают еше одним комочком стек-
лянной ваты, U-образные и спиральные стеклянные колонки запол-
няют так же, только отсасывание проводят все время, чтобы набив-
ка легче продвигалась по колонке.
Металлические колонки перец наполнением очищают от следов
смазки на внутренней поверхности, тщательно промывая их хлоро-
Разделение смесей липидов
171
формом, метанолом или ацетоном и в заключение хлороформом в
(или) петролейным эфиром (т. кип. 40—6О°С). Следы растворите-
ля удаляют, продувая колонку азотом (очистку капиллярных коло-
нок сы.в. разд. 5.5.2.2). Подготовленную таким образом металли-
ческую колонку сворачивают в спираль нужной формы и размера и
заполняют, как описано выше.
Заполненные колонки перед использованием стабилизируют в
специальном термостате или непосредственно в хроматографе; в по-
следнем случае колонки не присоединяют к детектору. Стабилизация
обычно проводится при нормальном расходе газа-носителя и при
температуре, на 10-20°С превышающей нормальную рабочую или
максимальную температуру (до которой нагревается колонка в кон-
це анализа с программированием температуры) (табл. 5.3). Для
стабилизации большинства колонок с неполярными неподвижными фа-
зами достаточно 2-3 ч; для стабилизации колонок с полэфирными
неподвижными фазами необходимо 5-24 ч.
5.5.2.2. Приготовление капиллярных колонок
Для работы при температурах выше 100°С обычно используют
стальные капилляры ( ”*30 м х 0,25 мм: ~ 60 м х 0,5 мм или
90 м х 0,75 мм), для более низких температур можно пользоваться
капиллярами из полимерных материалов. Очистка внутренней поверх-
ности металлических капилляров, заполнение их неподвижными фаза-
ми и стабилизация проводятся описанными ниже способами (см., на-
пример, /327/).
Очистка капилляров.
Мето д и .к а. Капиллярную колонку присоединяют к устрой-
ству для заполнения, показанному на рис. 5.5. Новые капиллярные
колонки промывают (в указанной последовательности, порциями по
10 мл) хлороформом, ацетоном, водой, концентрированной азотной
кислотой, водой, концентрированным раствором гидроокиси аммония,
водой, метанолом и в заключение хлороформом. Капиллярные колон-
ки, бывшие ранее в употреблении, особенно колонки, заполнявшиеся
ранее силиконами, промывают теми же растворителями, только азот -
ную кислоту заменяют газообразным фтористым водородом. Каждый
растворитель по очереди пастеровской пипеткой вводят в трубку А
(рис. 5.5) и продавливают через капилляр азотом (давление
2,8 кг/см2). В заключение колонку сушат, пропуская через нее не-
сколько часов (предпочтительно "“12 ч) медленный ток азота.
Заполнение капилляров.
Методика. В трубку А (рис. 5.5) устройства для запол-
нения капиллярных колонок помешают примерно 10 мл 1-10%-«ого
хлороформного или метанольного раствора неподвижной фазы (поли-
1,4-бутандиолсукцинат, 0V-17 и т. д., см. табл. 5.3). Раствор не-
Глава 5
подвижной фазы продавливают через капиллярную колонку (для ко-
лонки размером "ЭО м х 0,75 мм оптимальное давление равно
0,7 кг/см/ для колонки *>60 м х0,5 мм — 1 кг/см 1 2 * * 5 для колонки
•*30 м х 0,25 мм - 2,8 кг/см2). После того как неподвижная фаза
Рис. 5.5. Устройство для заполне-
ния капиллярных колонок неподвижной
Фазой 1327 J.
1 — баллон с азотом; 2 — разъемное
соеоинение Свагелоиа (-^3 мм); 3-
труока i ~ 12 мм); 4 - разъемное
соеоинение Свагелока (-1,5 мм);
5 - капиллярная трубка; 6 — "хвос-
товой" отрезок капиллярной трубки
(UJr> !Ц0 мм).
прошла через трубку, давление
на входе уменьшают и через ко-
лонку в течение примерно 12 ч
пропускают слабый ток азота,
чтобы удалить следы раствори-
теля.
Стабилизация капиллярных ко-
лонок.
Методика. Заполнен-
ную неподвижной фазой капилляр-
ную колонку помешают в специ-
альный термостат для стаб>. лиза-
нии колонок или в термостат га-
зового хромографа, не поисоели-
няя его, однако, к детектору.
Пропускают через колонку слабый
ток газа и в течение нескольких
часов медленно повышают тем те-
ратуру до максимально допусти-
мой для данной неподвижной фа-
зы. Повышают расход газа-носи-
теля до нормального значения,
присоединяют вывод из колонки
к детектору и стабилизируют ко-
лонку до тех пор. пока при мак-
симальной температуре прибор не
будет давать стабильную нулевую
линию.
5.5.3. Ввод пробы
5.5.3.1. Подготовка образца
Подготовка образцов метило-
вых эфиров жирных кислот и не-
омыляемых вешеств для гаэохро-
матографического анализа рас-
сматривалась в разд. 4.8. Если
смесь неомыляемых липидов не
очень сложна по составу, ее мож-
но непосредственно анализировать
методом ГЖХ. Если же она со-
Разделение смесей липидов
173
стоит из углеводородов, альдегидов, спиртов и стеринов, то сначала
ее необходимо разделить на фракции методом колоночной хромато-
графии (разд. 5.2.1.3; табл. 5.1) или препаративной ТСХ (разд.
5.4.6). By деленные липиды можно далее анализировать методом
ГЖХ. ’
Для количественного определения компонентов смесей (в моляр-
ных или весовых единицах) с помощью внутреннего стандарта обра-
зец обрабатывают следующим образом. К аликвотной части хлоро-
формного раствора анализируемой фракции (метиловых эфиров, угле-
водородов, спиртов и т. д.) прибавляют известное количество (от
2/3 до V2 веса образца) чистого стандартного вещества, отсут-
ствующего в анализируемой смеси или присутствующего там в не-
значительном количестве (например, метилового эфира нонадекано-
вой или эйкозановой кислоты для метиловых эфиров; нона деканола-1
для спиртов; гептацеканаля для альдегидов; эйкозана для углеводо-
родов ит. д.), тщательно перемешивают и вводят в хроматограф
без дальнейшего разбавления или в виде раствора в хлороформе или
в гексане (см. ниже).
5.5.3.2. Ввод образца
а. Ввод образца в аналитическою колонку.
Раствор 0,1-1 мг смеси вешеств в хлороформе помещают в ко-
ническую центрифужную пробирку емкостью 10-15 мл и упаривают
растворитель в токе азота до конечного объема примерно 0,1 мл.
После этого, чтобы смыть образец со стенок пробирки, ее поочеред-
но помещают в горячую водяную баню (6О-8СРС) и в баню с холод-
ной водой. Остатки растворителя удаляют в токе азота, обвазец
растворяют в таком количестве хлороформа или гексана, чтобы по-
лучился примерно 10%-ный раствор, и вводят его в хроматограо,-
Объем пробы и метод введения зависят от типа используемого
детектора. Если в хроматографе используется аргоновый ионизацион-
ный детектор или детектор по плотности, не чувствительные к изме-
нению расхода газа—носителя, то ток газа прерывают, дают давлению
газа на входе в колонку понизиться до атмосферного, открывают ко-
лонку и микропипеткой позируют пробу непосредственно на комочек
стеклянной ваты, закрывающей сверху колонку (при работе с аргоно-
вым детектором объем пробы равен 0,025-0,1 мкл, при работе с
детектором по плотности - 1-2 мкл). Как только проба введена, ко-
лонку закрывают и вновь пускают ток газа-носителя. Воздух, попав-
ший в колонку при дозировании образца, дает на хроматограмме ха-
рактерный пик, который отмечает собой фронт газа-носителя. При
работе с катарометрами (детекторами по теплопроводности) и пла-
менно-ионизационными детекторами, чувствительными к изменению
расхода газа-носителя, 5-10%-ный раствор анализируемых вешеств
174
Глава 5
в хлороформе вводят в хроматограф с помощью микрошприца объ-
емом 10 мкл. При работе с пламенно-ионизационным детектором оп-
тимальный объем пробы равен 0,2-1 мкл (10-100 мкг образца),
при работе с катарометром - 2—5 мкл (100-500 мкг образца).
6. Ввод образца в капиллярную колонку.
Образцы подготавливают так, как это описано в пункте а. Раст-
вор образца в хлороформе объемом 0,1-1 мкл (раствор 1—10 мкг
образца) вводят с помощью микрошприца непосредственно в капил-
лярную колонку /327/.
в. Ввод образца в препаративную колонку.
Для препаративного разделения образцов, не превышающих 10 мг,
можно использовать аналитические колонки с набивками, содержащи-
ми 15-20% неподвижной фазы (табл. 5.3). Образец (1-10 мг) под-
готавливают так, как это описано выше, и вводят в колонку без
растворителя или в виде 50%-ного раствора в хлороформе.
5.5.4. Отбор фракций {153 ]
Отбор фракций в ГЖХ дает возможность выделять чистые инди-
видуальные вешества или отдельные компоненты смесей, необходи-
мые для определения их радиоактивности, проведения спектрофото-
метрического анализа или для идентификации их другими методами.
В настоящее время оольшинство выпускаемых промышленностью
газожидкостных хроматографов укомплектовано специальными кол-
лекторами для отбора разделенных фракций; кроме того, в любой ла-
боратории легко можно изготовить простые коллекторы, пригодные
для решения большинства практических задач. Описанные ниже ус-
тройства для отбора фракций предназначены для работы с аналити-
ческими колонками диаметром 4 мм, содержащими набивку с 5-10%
!т. е. вес образца может составлять 20-500 мкг) или
10-20% неподвижной фазы (образцы весом 1-10 мг).
Простейшим типом коллектора—ловушки для относительно высо-
кокипяших (> Ст > метиловых эфиров кислот, алифатических спиртов,
углеводородов и т. н. является трубка типа хлоркальциевой, напол-
ненная ватой или стекловолокном, смоченным метанолом или петро-
леиным эфиром (рис. 5.6 а). Когда на хроматограмме появляется
пик вешества, ловушку присоединяют к хроматографической колонке
с помощью короткой силиконовой трубки или просто вводят ее в ко-
лонку’. Когда данный компонент смеси полностью элюируется из ко-
лонки. ловушку удаляют или заменяют ее другой такой же, но пред-
назначенной для следующего вешества. Для улавливания более лету-
чих компонентов смесей (низшие алифатические спирты, метиловые
эфиры низших жирных кислот ит. д.) в качестве ловушек можно ис-
пользовать капиллярные Е-образные трубки, протравленные внутри
плавиковой кислотой (рис. 5.6 б}. Чтобы конденсация вешества из
Разделение смесей липиОов
175
потока газа—носителя была полной, U-образную ловушку помешают
в баню со смесью ацетона и сухого льпа. Выделенные вещества
растворяют в 10 мл низкокипяшего петролейного эфира и переносят
в центрифужные пробирки емкостью 15 мл, растворитель удаляют
на водяной бане или в токе азота.
Рис. 5.6. Простые ловушки для отбора фракций в ГЖХ.
о — трубка типа хлоркалъииевой: 1 — соеОинителъная трубка из силиконового
каучука. 2— вата или стекловолокно{_б— 11-образная трубка: 1 — соеОинителъ-
нал трубка из силиконового каучука, 2 — капиллярная трубка с внутренним
оиаметиом 2 мм.
Радиоактивные компоненты смесей /153/ собирают, пропуская
элюат непосредственно через кювету сцинтилляционного счетчика,
заполненную толуолом или толуольным раствором сцинтиллятора
кювету помешают в стакан с сухим льдом /139/. Поток газа-носи-
теля удобно подавать в сосуд со сцинтиллятором через стальную иг-
лу от шприца, как это показано на рис. 5.7, а. Для полного выделе-
ния радиоактивных вешеств из газа-носителя рекомендуется последо-
вательно соединять две или три ловушки.
В тех случаях, когда за относительно небольшой отрезок вре-
мени надо отобрать сравнительно много фракций, используются авто-
матические коллекторы /154/, например коллектор фирмы "Packard
Instrument Со.," Model 803, показанный на рис. 5.7,6. Этот коллектор
присоединяется непосредственно к выводу из газохроматографичес-
кой колонки с помощью короткого отрезка стальной трубки. Чтобы
избежать конденсации разделенных компонентов смеси, необходимо
предусмотреть возможность электроподогрева соединительной трубки.
Элюируемые компоненты улавливают в отдельных ловушках, напол-
ненных стекловолокном (для нерадиоактивных компонентов) или
кристаллами я-терфенила, покрытыми (10%) силиконом DC 550 (для
176
Глава 5
радиоактивных веществ) Нагревательный элемент коллектора фрак-
ций (со стальным капилляром, присоединенным к выводу из хрома-
тографической колонки) прикрепляется к каждой ловушке с помощью
прокладки из силиконового каучука, позволяющей легко присоединять
ловушку к нагревательному элементу и легко отсоединять ее по окон-
чании разделения смеси (рис. 5.7, б ). На поворотном столике, кото-
рый приводится в движение устройством, снабженным таймером, мои-
Р и с. 5.7. Устройство для отбора радиоактивных фракций в ГЖХ.
а — немец воете енныи отбор в кювету сиинтилляиионного счетчика 1139]:
-тооха uj силиконовою каучука; 2 —кювета; 3—толуол или толуольный раст-
вор сиинтиллятоца; -±— трубка из нержавеющей стали б — автоматический кол-
лектор фракций фирмы "Packard"[7541: 7 — блок нагревателя;2-пробка из
силиконового каучука; 3— кристаллы терфенила или стекловолокно: 4 — Филгля-
ры из целлюлозы; 5—трубка из нержавеющей стали.
тируется до 50 ловушек с нагревательными элементами, что позво-
ляет отбирать фракции с интервалами от 30 с до 10 мин. Чтобы с
минимальными потерями собрать фракции нерапиоактивных вешеств,
каждую ячейку коллектора (ловушку с нагревательным элементом)
промывают низкокипяшим петролейным эфиром, растворы переносят
в центрифужные пробирки емкостью по 15 мл, растворитель удаляют
в токе азота. При работе со смесями радиоактивных вешеств каж-
дую ячейку помещают в сосуд с толуольным раствором сцинтиллято-
ра и встряхивают до тех пор, пока кристаллы терфенила с адсорби-
рованными на них веществами не растворятся в толуоле. Количест-
венное определение радиоактивности -выделенных фракций описано
в разд. 6.4.2.
5.5.5. Качественный анализ методом ГЖХ
5.5.5.1. Идентификация пиков
Хотя окончательную идентификацию веществ, соответствующих
пикам на газожидкостных хроматограммах, можно провести только
после определения физических и химических свойств индивидуальных
Разделение смесей липидое
177
вешеств, выделенных иэ смеси препаративной ГЖХ. (что не всегда
возможно), важную информацию о компонентах смесей можно полу-
чить непосредственно из данных аналитической ГЖХ. В действитель-
ности основные типы тех вешестпт которые входят в состав смесей,
предназначенных для анализа методом ГЖХ, обычно становятся из-
вестны в процессе подготовки образцов (разд. 4.8) или из данных,
полученных метопами ТСХ и спектроскопии (разд. 7.1.1). Типы
углеродных цепей, их длина, число двойных связей и виды функцио-
нальных групп компонентов смесей можно определить по парамет-
рам удерживания этих компонентов.
й.5.5.2. Определение длины углеродной цепи
и степени ее разветвленности
Для любого гомологического ряда органических вешеств при по-
стоянной температуре и постоянном расходе газа-носителя отношение
времени элюирования вещества с п атомами углерода в цепи (вре-
мя удерживания tn ) к времени удерживания вещества с п +1 или
п - 1 атомами углерода является постоянным.
£n+1/rn = ^/ln-i = F- (5Л>
где Т _ фактор разделения вешеств, отличающихся на одну СН,-
группу. Следовательно, фактор разделения вешеств. отличающихся на
две СН2-группы (рис. 5.8), выражается уравнением
!п+ 2 11п = 1п ! 1п-г ~ F 1 ^.2)
а для вешеств, различающихся на %СНг-гругт,
+ (5.3|
где %- 1,2,3, ... .
Фактор разделения F зависит только от типа неподвижной фазы
и температуры, но не зависит от типа соединений и длины углерод-
ной цепи. В табл. 5.4 приведен перечень факторов разделения для
ряда веществ, различающихся на одну СН7- группу.
На практике всегда удобнее пользоваться не абсолютным вре-
менем удерживания tn, которое зависит от температуры и скорости
газа-носителя, а относительным временем удерживания, вычисленным
по отношению к стандарту с s атомами углерода, т. е. величиной
I п / t,. Относительное время удерживания не зависит от небольших
колебаний температуры и расхода газа-носителя, но зависит от ти-
па неподвижной фазы. Общая зависимость между относительным вре-
менем удерживания и фактором разделения F выражается соотно-
шением
78
Глава 5
или
1 g(tn /ts ) = nlgF — slgF.
(5.5)
Из уравнения (5.5) следует, что зависимость десятичного ло-
гарифма относительного времени удерживания tn / ts от числа ато-
мов углерода в молекуле для членов одного гомологического ряда
выражается прямой линией, наклон которой определяется величиной
ig F.
Рис. 5.8. Расчет относительных параметров удерживания и факторов раз-
деления с помощью хроматограммы, полученной методом ГЖХ.
На оси ординат эта прямая отсекает отрезок, равный — slgF
(рис. 5.9). Длину углеродной цепи неизвестного вещества можно
легко определить графически путем интерполяции или экстраполяции
логарифмической прямой, построенной по нескольким стандартным
веществам, относящимся к тому же гомологическому ряду, что и
анализируемое вещество. Длину углеродной цепи можно также найти
по 'углеродному числу* вещества, которое в свою очередь можно
вычислить, зная параметры удерживания, по уравнению
"Углеродное число” = п = s. (5.6)
ig F
Это уравнение легко получить, преобразовав уравнение (5.5).
Эычисленные указанным способом *углеродные числа* всех нормаль-
ных насыщенных гомологов являются целыми. Дробные значения угле—
зонных чисел указывают на наличие в исследуемом веществе боко-
вых групп, двойных связей или дополнительных Функциональных групп.
Гааохроматографические факторы разделения углеводородных цепей
Факторы разделения
насыщен- цикло- 1 t ный изо- пропано- моно- пиенг'триенг тет- пен- гек- преноидВ) вое копь- енН раенг) таен саен цо Апиезон L (10%) 197 1,53 0,85- 0,88- 0,41- 0,91 0,85- 0,81 0,80 0,64 0,60 0,5 0,88 0,90 0,42 0,87 SE-52 (2%) 200 1,39 - - - - ------ SE-52 (2%) 220 1,32 - - 0,44 - - - PBS (10%) 178 1,41 0,86- 0,90- 0,44- 1,17 1,14- 1,33 1,63 1,8 2,0 2,2 0,87 0,92 0,48 1,10 . PBS (10%) 197 1,36 - - 0,52 1,13 1,12 - J - - PEGA (10%) /142/180 1,41 - - - 1,12- 1,36 1,78 1,7 2,2 2,4 1,15 PEGA (12%) 195 1,36 - _ - - 1,11 - - _ - - PEGS (13%) 197 1,31 - - - - 1,18 - - - - - PDEGS /136/ 203 1,28 1,17 1,44
антеизо- 6) С 1
изогруп-
сн2
Т емпе- Непоцвижная фаза ратура, °C
ат/метилми- 1 2 ф Й a ь ф Я 2 ф а Я ё ф в о (0
s г о й S & (М аз Я о я я аз fr- Г 1 к 1 2 а о
VJ ё S с 1 Я ь Я & S № Ф ё.
X к ё СЕ СП S К U G) 2 я ё 03 а S К О. я я о X « **. я аз a s Ф ф
а Ф Й ("* к R С
К № о ё ф я ё К Е аз
Хч 0) СС £ 0) ф с. с л , 2 К £ е. ш g &
ё ф 3 о £ о ё ф 3 о Я & ф й R 2 ф CU £ ё ф 2 ф &
к о К
ь ф ф ь ф I а
2 ё к Я аз 2 § § я •
S См Е с Я а, Е а? S & 5 г* с 2 S 5
кА Ь ф н ф ь о 2 Г
2 с о аз 2 аз К >
кА аз С £ О ё о X о Я ф £ У 05 Е О Е о Я Й О X о я ф СО аз о X аз X ф Й аз ь Я ф g Е О О Я Й о X о 5 Ф CQ У новый фактор вычис С 1> 5 S 5 X г X р
й 03 X CQ се аз & & ф я аз X CQ «О’ я f- ф 2 о Я р* аз х £П 8 § - 1 с ? £ &
180
Глава 5
На практике определение длины цепи соединений одного гомоло-
гического ряда можно упростить следующим образом. Смесь двух
или трех вешеств-стандартов (различающихся между собой на два
атома углерода) анализируют в тех же условиях (на колонке с той
же неподвижной фазой, при той же температуре и при том же расхо-
де газа-носителя), которые были подобраны для разделения смеси
Рис. 5.9. Зависимость логарифма относительного времени удерживания от
длины углеродной цепи метиловых эфиров насыщенных жирных' кислот.
ХроматогпаФирование провооилосъ с использованием в качестве жиоких фаг
11) апиезона L при 197еС и (2) полйбртаноиолсукиината при 179еС.
природных вешеств. Измеряют время удерживания для стандартов
(рис. 5.6} и по уравнению (5.2) вычисляют факторы Г (или F2 ).
Принимают относительное время удерживания г, одного из стандар-
тов за 1.00 и по отношению к этому веществу определяют относи-
тельное время удерживания других стандартов и затем других чле-
нов гомологического ряда /уравнение (5.3 )/. После этого анализи-
руют смесь природных вешеств и найденное время удерживания ком-
понентов смеси делят на ig, чтобы получить относительное время
удерживания анализируемых компонентов. Полученные значения срав-
нивают с относительным временем удерживания, рассчитанным для
стандартов, ч]обы установить, какие из пиков принадлежат к тому’
же гомологическому ряду, и таким образом определить длину их це-
пи (см., например, табл. 7.3).
При наличии боковых метильных групп относительное время
удерживания (как на полярной, так и на неполярной неподвижных фа—
Разделение, смесей липидов
181
зах) снижается в 0,85-0,90 раз (табл. 5.4). Положение метиль-
ных групп в боковой цепи мало влияет на величину относительного
времени удерживания, хотя у антеизопроизводных оно несколько
больше,' чем у иэосоединений с тем же числом атомов углерода.
Увеличение числа метильных групп в боковой цепи приводит к про-
порциональному уменьшению времени удерживания (табл. 5.4). Изе—
и антеизопроизводные можно разделить методом ГЖХ после окисле-
ния их в производные ацетона или бутанона-2 под действием перман-
ганата калия в серной кислоте /239/. Изо- и антеизосоединения
можно также идентифицировать методом масс-спектрометрии /222/.
5.*5.5.3. Определение числа двойных связей
и циклопропановых колец
Ненасышенные вешества и вещества, содержащие пиклопропано-
вые группировки, можно идентифицировать следующим образом.
а. Образец хроматографируют на полярной и неполярной непод-
вижных фазах (полибутандиолсукнинат и апиезон L соответственно).
Компоненты смеси, содержащие двойные связи и пиклопропановые
группировки, имеют на полярных Фазах большее, а на неполярных фа-
зах меньшее время удерживания, чем соответствующие насыщенные
соединения (табл. 5.4). Двойные логарифмические прямые зависи-
мости относительного времени удерживания на неполярной неподвиж-
ной фазе от величины относительного времени удерживания на поляр-
ной фазе образуют серию параллельных прямых, каждая из которых
соответствует определенному гомологическому ряду - насыщенным
углеводородам, моноенам. диенам, триенам и т. д. /2. 142/. Исполь-
зуя такие графики, можно определять число двойных связей и длину
цепи компонентов анализируемых смесей. На практике число двойных
связей определяют непосредственно по фактору разделения ненасыщен-
ных соединений (отношение времени удерживания ненасыщенных со-
единений к времени удерживания соответствующих насыщенных про-
изводных) на полярных неподвижных фазах (табл. 5.4). Следует от-
метить, что на набивных колонках не удается разделять изомеры,
различающиеся положением двойных связей, а также их геометри- у
ческой конфигурацией. Такие задачи можно, однако, решать, приме- {
няя ГЖХ на капиллярных колонках /2/.
' б. Образец липидов (1-10 мг) растворяют в 0,5-1 мл мета-
нола и гидрируют в присутствии платинового катализатора (5 мг
PtO2 ) в центрифужной пробирке емкостью 15 мл в течение 15-
30 мин при комнатной температуре пропуская ток водорода через
раствор. По окончании гидрирования через раствор продувают ток
азота, чтобы удалить водород; катализатор отделяют центрифугиро-
ванием, промывают его 0,5 мл метанола. Объединенный метаноль-
ный раствор упаривают в токе азота, остаток растворяют в хлоро—
182
Глава tj
форме и анализируют ГЖХ на полярной и на неполярной неподвиж-
ных тазах. Пики, соответствовавшие ненасыщенным веществам, по-
сле гидрирования исчезают, в то время как число пиков, соответ-
ствующих насыщенным веществам с тем же числом атомов углеро-
да, увеличивается. Пики, соответствующие циклопропановым произ-
водным. не меняют своего положения и своей величины.
в. К раствору приблизительно 1 мг негидрированного или гидри-
рованного образца в 0,2 мл абсолютного свободного от перекисей
эфира 1разд. 2.1) прибавляют по каплям раствор брома в абсолют-
ном эфире (1:5 по объему) до тех пор, пока реакционный раствор
не поиооретет устойчивую желтую окраску. Растворитель и избы-
ток брома удаляют в токе азота; остаток анализируют методом ГЖХ.
Пики, исчезающие после бромирования с хроматограмм негидриро-
ванных ооразпов, соответствуют ненасыщенным и никлопропановым
производным. Пики, исчезающие в результате аналогичной обработ-
ки с хроматограмм гидрированных образцов, соответствуют вещест-
вам, содержащим циклопропановые группировки /44/. Позиционные
изомеры пиклопропановых производных можно идентифицировать мето-
дом ГЖХ на капиллярных колонках /108, 222/.
г. Число двойных связей в индивидуальных компонентах природ-
ных смесей, выделенных препаративной ГЖХ, можно определить по
их иодным числам (разд, 4.6), однако при этом необходимо знать
вес или число молей анализируемых веществ. Положение двойных
связей в индивидуальных метиловых эфирах жирных кислот можно
определять с помощью озонолиза или окисления смесью пермангана-
та и перйодата с последующей ГЖХ образующихся при этом моно-
и дикарооновых кислот (разд. 7.1 2.3 и 7.1.6.4) или с помощью
масс-спектрометрии триметилсилильных или изопропилиденовых про-
изводных диолов, полученных гидроксилированием двойных связей
/222/. Конфигурацию двойных связей можно определять методом
ИК-спектроскопии ^разд. 4.1.6.2) или стереоспецифичным окислени-
ем ненасыщенных углеводородов до диолов и масс-спектрометрирова-
нием изопропилиденовых производных последних /223/ (разд.7.1.2.3
и 7.1.6.4).
5.5.5.4. Определение различных функциональных групп
3 табл. 5.5 приведен перечень факторов разделения для соеди-
нении с различными функциональными группами на некоторых поляр-
ных и неполярных неподвижных фазах. Факторы разделения обычно
определяются по отношению к исходным углеводородам. Однако в
связи с тем, что колонки для ГЖХ липидов удобнее калибровать
по метиловым эфирам жирных кислот, факторы разделения также
вычисляют по соответствующим метиловым эфирам. Такие факторы
можно получить, разделив приведенные в табл. 5.5 параметры на
Разделение смесей липиоов
183
факторы разделения метиловых эфиров насыщенных кислот. Следует
также заметить, что относительные параметры удерживания вешеств,
имеющих в молекуле две или более функциональные группы, можно
вычислить отдельно для каждой функциональной группы. Так, напри-
мер, относительное время удерживания метилового эфира метокси-
кислоты на апиезоне L равно 5,0 по отношению к исходному угле-
водороду и лишь 1,5 по отношению к соответствующему метилово-
му эфиру кислоты. Следует отметить, что эта зависимость наблю-
дается только в том случае, когда между функциональными группа-
ми нет никакого взаимодействия.
Хотя окончательная идентификация компонентов природных сме-
сей не может быть произведена только по данным ГЖХ, значения
относительных параметров удерживания, полученные на полярной и
на -неполярной неподвижных фазах, достаточно четко говорят о при-
роде функциональных групп анализируемых веществ (табл. 5.5).
Так, время удерживания первичных спиртов на полибутандиопсукци-
нате (PBDS) приблизительно в 4 раза больше (по отношению к соот-
ветствующим углеводородам), чем на апиезоне L. Если же время
удерживания определялось по отношению к соответствующим метило-
вым эфирам, то оно лишь в 2 раза больше, чем на апиезоне L . Да-
лее, относительное время удерживания' метоксипроизвопных на апиезо-
не L приблизительно вдвое меньше, чем у первичных спиртов, в тс
воемя как на полибутандиолсукцинате соотношение тех же парамет-
ров равно 1/6. Относительное время удерживания ацетатов первич-
ных спиртов в 1,5 раза больше, чем у спиртов на апиезоне L и
равно 0,8 относительного времени удерживания тех же соединений
на PBDS.
Время удерживания альдегидов по отношению к соответствующим
углеводородам на PBDS вдвое больше, чем на апиезоне L, но по от-
ношению к соответствующим метиловым эфирам кислот время удержи-
вания альдегидов на PBDS равно 0,8, а на апиезоне L - около 1.
Время удерживания диметилапеталей на апиезоне L в 1,3 раза боль-
ше, чем у альдегидов, но на PBDS оно больше только в 1,1 раза.
Метилкетоны имеют на PBDS приблизительно в 6 раз большие пара-
метры удерживания, чем соответствующие углеводороды, и приблизи-
тельно в 0.8 раз меньшие, чем метиловые эфиры кислот. На апие-
зоне L время удерживания метилкетонов вдвое больше, чем у ис-
ходных углеводородов, но равно только 2/3 времени удерживания
метиловых эфиров кислот.
Время удерживания метиловых эфиров оксикислот существенно
зависит от положения оксигрупп в углеродной цепи /242/. На апие-
зоне L и PBDS время удерживания метиловых эфиров а-оксикис-
лот в 1,6 и соответственно в 4 раза больше, чем у метиловых
эфиров насыщенных кислот (с тем же числом атомов углерода). При
Факторы разделения, используемые в ГЖХ при проведении анализа соединений
с различными функциональными группами
I Темпе- Функциональные группы
О
о)
СО СО <0
о'
со о) со ।
i 1 1 ‘Ч CD ! i 1
см см to
хг CD co
см i i I CO 1 O) t
со co’
i LO i i 1 i i о
со CO
со in
см CD
1 1 i I 1 i I
т—( с c
см см CD
со
с Г- I i CO p i r-
см г-i 10 CO
CD
со tn I CD о 5Г t CD
т-5 т-5 T-5 XT CD CM
р < to r- CO
со co CD CM sr 1
CM о CO to to
05 СО O) о O) CO co
CM CM rH t-5
гР г£
с О
1—J J CM se О О *“5 тЧ о
S
о о ()
й <У (0 <У К C9 Ф К tM Ю ZO C. о О
К U1 co co
<£ сл Qe a. a.
Факторы разделения вычислены как отношение времени удерживания данного вешества к времени
удерживания соответствующего углеводорода, например октацеканол/октадекан; 2-гептадеканол/гептадекан
и т. д. (данные Кейтса, публикуются впервые).
б) Вычислено из отношения времени удерживания 2-, 3-,..., <и-оксиметилпальмитата к метилпальмита-
ту /242/.
Разделение смесей липидов
185
греходе от а- оксикислот к & и j-оксикислотам значения па—
аметров удерживания возрастают и становятся на всех типах не-
одвижных фаз постоянными- для от 8 - до ( Ь) - 1)-оксикислот
табл. 5;5).' Самое большое время удерживания как на полярных,
ак и на неполярных неподвижных фазах имеют ы-оксикислоты.
5.5.6. Количественный анализ методом ГХХ
5.5.6.1. Линейность сигнала детектора [21
Сигнал детектора зависит от типа последнего (катарометр,
аргоновый ионизационный, пламенно-ионизационный и т. д.) и от
класса анализируемого вешества. Любой детектор можно поэтому
прокалибровать по стандартной смеси вешеств, принадлежащих к тем
классам, которые предстоит анализировать. Калибровка производит-
ся следующим образом.
Готовят смесь навесок нескольких компонентов тех классов со-
единений, которые предстоит анализировать (например, для анализа
метиловых эфиров кислот составляют смеси равных весовых коли-
честв лауриновой, миристиновой, пальмитиновой и стеариновой кис-
лот). Стандартные смеси известного процентного состава имеются
также в продаже (табл. 2.1) Смесь стандартных вешеств растворя-
ют в хлороформе с таким расчетом, чтобы получился раствор из-
вестной концентрации (1-10%). Аликвотные части этого раствора
вводят в колонку хроматографа в таком количестве, чтобы высоты
пиков составляли от 10 до 100% полной шкалы самопишущего по-
тенциометра. Измеряют площади пиков ( А, мм2 ) для каждого из
компонентов в каждом из ряда последовательных определений и де-
лением полученных значений на весовые количества каждого веше-
ства во введенном образце ( т, мкг) вычисляют коэффициенты детек-
тирования г « Ai т.
Та область, в которой коэффициент детектирования - постоянная
величина, и является областью линейного сигнала детектора ( );
ее легко найти для каждого компонента смеси. При анализе образ-
цов, не попадающих в область линейного сигнала детектора, в вели-
чины площадей пиков вводят поправку, умножая их на фактор
глин; Гнелин" практике, однако, удобнее, чтобы сигналы анализи-
руемых образцов не выходили за пределы, соответствующие глин /2/
5.5.6.2. Измерение площадей пиков
На хроматограмме, полученной с помощью хорошо работающего
хроматографа, каждый пик представляет собой гауссову кривую рас-
пределения, -и площадь его определяется уравнением
А ж ij 2noh ж 2,507д8,
(5.7)
186
Глава 5
где А - площадь пика, Л - высота пика, а - стандартное откло-
нение. В зависимости от способа определения а площади пиков рас-
считываются двумя методами.
а. ПооизвеОение высоты пика на его ширину. Этот метод основан
на том, что о прямо пропорциональна ширине пика и> при данной
высоте над нулевой линией (например, <т» ш при 0.882ft; о=а/2 при
0.607 ft; <т = w/'i при 0,324ft и т. д.). Удобнее всего определять
значение w при 0,50Л. Для этого случая a =kw, где Л-коэффици-
ент пропорциональности (постоянный при 0,5Л ). Подставляя значе-
ние а в уравнение (5.7 ), получим
А - 2,507 ftwft- Kwh. (5-8)
Таким образом, площадь пика А пропорциональна произведению
высоты пика Л на его ширину w, измеренную на половине высоты.
Высоты пиков на хроматограмме ( BE, рис.5.10) измеряют
Рис. 5.10. Параметры, необходимые для определения площадей пиков в ГЖХ.
в миллиметрах, и на перпендикуляре, опушенном из вершины каждо-
го пика, откладывают значения 0,5ft (ЕН, МВ. Ширина пика на поло-
вине его высоты также измеряется в миллиметрах (CG, КО,
Содержание анализируемого вещества (в процентах)^ соответству-
Разоеление смесей липидов
187
юшего, например, первому пику на рис, 5.10, вычисляют следующим
образом:
А’ = х то = !0Г= :-------------- х то. (5.9)
SKAnwB ±hnWn BE • CG + JM • KQ + ...
Этот метод, теоретически дающий очень точные результаты,
на практике приводит к заметным ошибкам при измерении узких
пиков быстро элюирующихся веществ.
б. ПроизвеОение высоты пина на время удерживания [56]. Этот
метод основан на том, что э пика шириной к’ является линейной
функцией времени удерживания г п. Преобразуя в соответствии с этик1
уравнение (5.8), получаем
А = К'ht (5.10)
п
Чтобы определить процентное содержание какого-то компонента^из-
меряют (в миллиметрах) высоту пика (BE, рис, 5.10) и
время удерживания (ОЕ, ОМ,...), Время удерживания измеряют в ми-
нутах. Пропентное содержание анализируемого вещества (первого
пика на рис. 5.10) вычисляют следующим образом:
K'h i ВЕ-ОЕ
А = х ЮО = ----------------------х 100. (5.11)
ВЕ-ОЕ+JM*0MT...
Этот метод удобнее первого и позволяет быстрее и. с большей точ-
ностью определять содержание компонентов анализируемой смеси.
Для определения площадей пиков применяются и другие методы.
Коротко рассмотрим некоторые из них.
Триангуляционный метоО. При использовании этого метода пло-
щади пиков, очерченные гауссовой кривой, приближенно определяют-
ся как плошади треугольников, ограниченных прямыми AD. AF, JL,
JN и нулевой линией (рис. 5.10). Содержание анализируемого ком-
понента смеси (в процентах) определяется по уравнению
% ( основание х высота) DF • АЕ
А = —!----------------------100 ---------------------------х 100. (5.12)
УУг (основание х высота) DF• АЕ + LN • MJ +...
Получаемые таким способом значения площадей на 4% меньше
действительных. Однако данный метод не лишен и достоинств: это
простой метод, используя его, можно определять плошади пиков, вы-
ходящих за пределы шкалы, при условии, что высота построенного
треугольника не превышает 3/2 ширины диаграммной бумаги.
188
Глава 5
Планиметрический метод. Площади пиков определяют с помощью
планиметра, которым по крайней мере три раза обводят контур каж-
дого пика и берут средний результат из трех измерений. Точность
планиметрического метода такая же, как и триангуляционного .Дор его
нельзя использовать для определения площадей пиков, выходящих
за шкалу.
Метои в.) в вшивания. При определении площадей пиков по этому
методу их вырезают из хроматограммы и взвешивают с точностью
до 0,1 мг. Процентное содержание каждого вещества опведеляют
как отношение веса каждого вырезанного пика к суммарному весу
всех вырезанных площадей, выраженное в процентах. Этот метод
очень точен, но слишком трудоемок, чтобы его было целесообразно
использовать как стандартный.
Механическое или электронное интегрирование. Это наиболее
точный и удобный способ определения плошадей пиков, требующий,
однако минимального дрейфа нулевой линии. Если дрейф нулевой
линии все же имеет место то введение поправки на этот дрейф
так же трудоемко, как и определение плошадей пиков методом триан-
гуляции. Следует заметить, что в настоящее время выпускаются
электронные интеграторы, снабженные устройствами для автомати-
ческой коррекции дрейфа нулевой линии.
В настоящее время выпускаются промышленностью:
а> дисковый механический интегратор ("Disc instruments"), который
присоединяется к каретке пера самопишущего потенциометра; инте-
гратор наносит черточки в нижней части хроматограммы, каждая
черточка соответствует единице плошади,
б) автоматический электронный интегратор "Инфотрсникс"
Infotronics Corp." 1 с цифровым печатающим устройством или с
компьютером на выходе;
ъ) электронным интегратор "Хромав" (" Consolidated Eiectrodvna-
mics Corp."I или интегратор "Вариан модель 480" (" Varian Aerograph" )
с печатающим устройством, выдающим значения плошадей пиков и
времени удерживания, и автоматическим устройством для коррекции
дрейфа нулевой линии.
Глава6
. РАДИОИЗОТОПНЫЕ МЕТОДЫ В ЛИПИДОЛОГИИ
Изучение биосинтеза и метаболизма липидов связано с примене-
нием радиоизотопов, в частности 3Н, 14 С, 32Ри 35S .Изложение общих
радиоизотопных методов выходит за рамки настоящей книги, поэтому
в данной главе рассматриваются лишь те радиоизотопные методы,
которые применяются специально для изучения липидов, а именно:
синтез меченых предшественников, включение радиоизотопных меток
в липиды, выделение и разделение меченого материала, радиоавто-
г рафия и подсчет радиоактивности. Ьолее подробную информацию чи-
татель может найти в статьях Мангольда /206/, Снайдера и Пианта —
доси /304/.
6.1. Меченые соединения
6.1.1. Меченые преОшественнини, выпускаемые фирмами
Наиболее специфичным и универсальным предшественником, кото-
рым в ходе биосинтеза метят углеводородные цепи (нормальные, раз-
ветвленные, изопреноидные) в клетках, тканях или организмах, явля-
ется ацетат, меченный либо 14С (до С-1, С-2 или по обоим ато-
мам), либо 3Н (цо С-2 ). Углеводородные пепи липидов высших расте-
ний или водорослей можно метить 14С0„, при этом также будут ме-
титься гидрофильные части молекул липидов. Во всех системах мож-
но использовать меченные 14 С или3Н глюкозу или глицерин; при
этом гидрофильные части молекул и углеводородные цепи будут ме-
титься одинаково. Мевалоновая- 14 С кислота является превосходным
специфическим предшественником, которым метят изопреноидные со-
единения (каротиноиды, стерины и т. а.) во всех системах. Специфи-
ческим предшественником, которым метят фосфатиды в интактных
клетках или пелых организмах, является ортофосфат-32Р. Для полу-
чения меченых серусодержаших липидов применяется сульфат—35S. Пе-
речень некоторых меченых предшественников, выпускаемых рядом
фирм, приведен в табл. 6.1.
При работе с бесклеточными системами для получения меченых
липидов можно использовать макроэргические фосфаты или другие ак-
тивированные промежуточные соединения, которые в целые клетки
Таблииа 6.1
Меченные радиоизотопами предшественники,
используемые для изучения биосинтеза липидов
Меченый предшественник Липидный фрагмент или соединение, включающее метку Фирма-поставщик8'
Ацетат-1,2-’4С или равно- Углеводородные цепи, Amersham/Searle, Atomic
мерно меченный iнатри- евая СОЛЬ} изопреноиды, стероиды Energy, Calbiochem, CEA- CEN-Sonn, New England, Schwarz, Radiochemical Cent- re
Ацетат-2-3Н (натриевая Углеводородные цепи, Amersham/Searle, CEA-CEN-
СОЛЬ; изопреноиды, стероиды Sorin, New England. Radio- chemical Centre, Schwarz
Ацетил-3 H-Со А^) Жирные кислоты, изо- преноиды, стероиды New England
Аденозин- 5'-трифосфат- Фосфатные группы Amersham/Searle, Radio ch e-
>32Р фосфолипидов mi cal Centre.
S -Аденозил-Ь-метионин- Ииклопропановые кис- Amersham/Searle. Cal bio-
метил-’4 С61 лоты, лецитин chem. New England. Radio- chemical Centre, Schwarz, ICN
Карбонат- ’4 С (натри- Углеводородные цепи, Amersham/Searle. Atomic
евая солы изопреноиды и т*д.» глицерин, остатки са- харов Energy, Calbiochem, CEA- CEN-Sorin, New England, Radiochemical Centre,Schwarz
Холинметил-1.2- Холин в лецитине, Amersham/Searle, Calbiochem,
14С-хлоргидрат сфингомиелин CEA-CEN-Sorin. New Eng- land, Radiochemical Centre, Schwarz
X оли нметил- 3 Н-хлор- Холин в лецитине, Amersham/Searle, New Eng-
гидрат сфингомиелин land, Radiochemical Centre
Нитидиндифосфохолин- 1,2- ’4 С-хлоргидрат Холин в лецитине, сфингомиелин ICN
Нитидин ди фосфат ди- пальмитин, меченный по карбоксильному Фосфолипиды ICN
углероду —
Этаноламин-1,2-’4 С Этаноламин в фосфа- Amersham/Searle, New Eng-
(или 2-’4С)-хлоргидрат тидил этанол амине land, Radiochemical Centre
Этаноламин-2-3 Н-хлор- Этаноламин в фосфа- Amersham/Searle, Radi о ch e-
гидрат тидил этанол амине mi cal Centre
D-глюкоза-!, 2,3, 4-’4С Углеводородные цепи. Amersham/Searle, Calbio-
или D-глюкоза-’4С, рав- глицерин, остатки с а- chem, CEA-CEN-Sorin, New
номерно меченная харов England, Radiochemical Centre, Schwarz, ICN
ПроОолжение табл. 6.1
________________&___
Меченый предшественник Липидный фрагмент или соединение, включающее метку Фирма-пост авщика!
D-Глюкоза-!, 2, 3, 5 или Углеводородные цепи. Amersham/Searle, hew Eng-
D-глюкоза-Р-3 Н глицерин, остатки са- харов land, Radiochemical Centre
Глицерин-1(3), 2-,4С Углеводородные цепи, Amersham/Searle. Calbiochem
или равномерно мечен- глицерин, остатки са- CEA-CEN-Sorin, ICN, New
ный харов England, Radiochemical Centre, Schwarz. ICN
Глицерин-1 (3)-3Н или Углеводородные цепи, Amersham!Searle, New Eng-
глииерин-2-3 И глицерин, остатки са- харов land. Radiochemical Centre
L-Глинерофосфат-З-14С или .равномерно мечен- ный Фосфолипиды ICN
D.L-а- или в-Глицеро- фосфорная-32 Р кислота (натриевая соль^)) Фосфолипиды Amersham/Searle. Radioche- mical Centre
Миоинозит-’ 4С или миоинозит-3Н Фосфатидилинозит Amersham/Searle, Calbiochem New England, Radiochemi- cal Centre
Малоновая-1-14С или Остатки жирных Amersham/Searle, Calbio-
малоновая-2-14С кис- лота (натриевая соль^И КИСЛОТ chem, CEA-CEN-Sorin. New England, Radiochemical Centre. Schwarz
Малонил-1.3-14 С-Со А^) Остатки жирных кислот New England
Метионинметил-’4 С или Циклопропановые кис- Amersham/Searie. Calbio-
метионинметил-3Н лоты, холиновые липи- ды chem, CEA-CEN-Sorin. New England, Radiochemical Centre, Schwarz
D.L-Мевалоновая кис- Изопреноиды, стеро- Amersham/Searle, Calbio-
лота-’4С или D, L- мевалоновая кис- лота- 3Н ИДЫ chem, New England, Radio- chemical Centre, Schwarz
Ортофосфат-32 Р Фосфолипиды Amersham/Searle, Atomic Energy, New England. Radio- chemical Centre, ICN
Пальмитил-1-’4 С-СоДб) Жиркокислотные цепи в сложных липидах New England, ICN
Фосфорилхолин- ’4 С Лецитин, сфингоми- елин New England, ICN
Фо сфори л этанол - айин-,4С Фосф ати ди л этанол- амин ICN
192 Радиоизотопные методы е липидологии
Продолжение табл. 6.1
Меченый предшественник Липидный фрагмент или соединение, включающее метку Фирма-поставщик2»
Фосфорилсерин-3- ’ 4С Серин ,4С или серин-3Н Серная-35S кислота или сульфат-35 S ФосФатидилсерин Фосфатидилс.ерин Сульфолипиды 1CN Amersham/Searle, Calbiochem, CEA-CEN-Sorin. New England, Radiochemical Centre,Schwarz Am ersh am/Searle, Atomic Energy*, CEA-CEN-Sorin, New England, Radiochemical Centre
d> Меченые липиды и фирмы-поставщики перечислены в табл. 2.1 Чита-
тель не должен считать этот список полным.
Эти соединения ооычно используются для изучения биосинтезов в бес-
клеточных системах или для опытов с чистыми ферментами, а не для исследо-
вания пчтеи оиосинтеза липидов в клетках и тканях.
или ткани обычно не включаются и, попав в клетку, быстро расщеп-
ляются Ферментами. Однако после химической активации такие пред-
шественники легко включаются в липиды бесклеточных систем (в
присутствии необходимых ферментов и коферментов). Примерами
предшественников такого типа являются: ацетил-S-Со А и малонил-
S-CoA для биосинтеза жирных кислот; изоамилпирофосфат для био-
синтеза изопреноидов; ацил-b-СоА. глицерофосфат, адеьозинтриФос-
Фат (АТФ). цитидиндиФосфохолин (ЦДФ-холин), цитидиндифосфоэта-
ноламин (ЦДФ-этаноламин), S-ааенозилметионин и цитидиндифосфо-
глинерин (ЦДФ-диФосФоглицерид) для биосинтеза глицеридов и фос-
фолипидов.
Многие из перечисленных меченных радиоизотопами предшест-
венников поставляются фирмами* (табл. 6.1). однако в ряде слу-
чаев их приходится синтезировать в лабораторных условиях. Неко-
торые из поставляемых меченых предшественников слишком неста-
бильны, чтобы их можно оыло хранить даже в течение короткого
периода времени, или имеют очень небольшой период полураспада
(например, соединения, меченные ~ZP ), поэтому их лучше приго-
тавливать сразу перед использованием s~
6.1.2. Синтез водорастворимых меченых предшественников
6.1.2.1. Аденозинтрифосфат-у-32 Р [1061
Этот препарат можно купить (табл. 6.1) или синтезировать
описанным ниже методом.
См. дополнение 1 к гл. 6. — Прим, перев.
Радиоизотопные методы в липиоологии
19?.
Г
Реагенты. Огтофосфорная- 32 Р кислота, раствор в 0,01 н.
НС1.
трис-НС1-буфер, 1 М раствор ( pH 8,0).
Раствор хлористого магния, 1 К:
Раствор гиороокиси натрия, 0,1 н.
- Раствор пирофосфата натрия, 0.04 М.
Цистеин, основание (фирма "Sigma”.).
АТФ, кристаллическая динатриевая соль тригицрата (фирма "Sig-
ma" ).
З-Фосфоглииерат, трипиклогексиламмониевая соль тригицрата
(фирма " Bohnnger " ).
3-ФосфоглииериналъбегидоегиОрогенаэа из мышечной ткани
(фирма " Bohnnger " ).
3-Фосфоглииераткиназа из дрожжей (фирма "Bohnnger" ).
М е толика. В пробирку объемом 15 мл со стеклянной
пробкой последовательно добавляют 5.0 мл воды: 0,5 мл -бу-
фера; 0.06 мл раствора MgCl2; 1,02 мл 0,1 н. NaOH; 2,42 мг
(20 мкмолей) цистеина; 36 мг (60 мкмолей) АТФ; 4,В мг
(10 мкмолей) 3-глицерофосфата; 1 мг фосФоглицеринальдегидде-
гидрогеназы в 0,1 мл 2,5 М (NH ) S04; 100 мкг 3-фосфоглипе-
раткиназы в 0,05 мл 2,4 М раствора ( NH4).S04 в 0,04 М раст-
воре Na4P20j; 0,1-0,5 мКи ортофосфата-3 2Р и воду до конечного
объема 10 мл. Смесь выдерживают при 26°С в течение 1 ч и вы-
ливают в пятикратное по объему количество 95%-ного этанола: опо-
ласкивают пробирку 10 мл 17%-ного этанола и присоединяют его
к основной смеси. Осадок растворяют, добавляя около 15 мл воды,
и при 40°С упаривают на роторном испагителе по конечного объе-
ма 5-8 мл. Концентрат переносят на колонку с 1 г смолы дауэкс
1 (диаметр колонки 7-8 мм, длина 35 мм), ополаскивают колбу
10 мл воды и промывную воду также наносят на колонку. Элюиру-
ют следующие фракции: 1) АМФ, АДФ и неорганический фосфат,
элюент - 40 мл 20 мМ NH4 С1 в 0,02 н. ИСК 2) соли NH*, элю-
ент - 40 мл воды; 3 ) АТФ-у-32 Р, элюент - 14 мл 0,25 н. НС(.
Первый элюат собирают в колбу, погруженную в лед. По мере элюи-
рования в приемную колбу порциями добавляют 3,4 мл 1 М раст-
вора иркс-основания с таким расчетом, чтобы pH элюента равня-
лось 7,4. Выход АТФ 85-90%, удельная активность 1,6 —
8.0 мкКи/мкмоль.
6.1.2.2. Рацемический 3-глицерофосФат-згР [225, 2841
НОСН2СН(ОН)СН2С1 + Na*2PO4->
НОСН,СН(ОН) CH2O32PO3Na2 + NaCl (6. D
Реагенты. Раствор ортофосфорной кислоты-32Р в 0.01 н.
НС (нейтрализованный 0,1 н. NaOH ).
194
Глава 6
Трехзамешенный фосфат натрия Na3PO/12Н.0, кристаллический.
З-Хлорпропаноиол-1,2.
Раствор трехзамешенного фосфата натрия, 1 М.
Раствор соляной кислоты, 1 н.
Раствор хлористого бария, 0,6 М.
Раствор гиороониси бария, 0,1 М.
М е т о п и к а. Раствор ортофосфата-32Р активностью 3 мКи
упаривают досуха в токе воздуха в центрифужной пробирке объемом
15 мл с пробкой. Добавляют 80 мкмолей (30.5 мг) трехзамещен-
ного фосфата натрия, 80 мкмолей (8,8 мг) хлорпропандиола и
0,16 мл воды, тщательно перемешивают и выдерживают смесь при
37°C в течение 20 ч. Добавляют 0,15 мл 1 М раствора трехза-
мещенного фоората натрия, нейтрализуют смесь 0,2 мл 1 н. HCI,
осаждают неорганический Фосфат, добавляя 0.8 мл 0,5 М ВаС12 и
затем 0.5 мл 0,1 М Ва(ОН)2 до pH раствора 9,0. Осадок удаляют
центрифугированием и промывают его тремя порциями воды по
0,5 мл. Объединенные супернатант и промывку упаривают в центри-
фужной пробирке емкостью 15 мл в токе воздуха при 40-50°С по
объема 1 мл и добавляют равный объем 99%-ного этанола. Охлаж-
дают смесь в течение нескольких часов при 0°С и центрифугирова-
нием осаждают бариевую соль а- глицерофосфата- с* Р. Промывают
осадок 0,5 мл 50%-ного этанола и высушивают его в эксикаторе
над гранулированной гидроокисью калия. Выход глицерофосфата со-
ставляет 16-19 мкмолей (20-24%.), удельная активность 20-
24 Ки/моль. Чтобы перевести бариевую соль в натриевую, первую
суспендируют в 0,5 мл воды, добавляют примерно 100 мг пауэк-
са 50 (Ю) и интенсивно размешивают смесь по сильнокислой реак-
ции. Центрифугированием осаждают смолу, переносят супенатант па-
стеровской пипеткой в мерную колбу, нейтрализуют раствором 0.1 н.
гидроокиси натрия и разбавляют водой до метки.
6.1.2.3. sп-3-Глицерофосфат-2-3Н или «п-3-глицерофосфат-1,3- 14С [66]
Глицерин-2-3 Н (или глицерин-1,3-,4С>+АТФ глицерокиназа
5п-3-Глииерофосфат-2- 3 Н (или sn-3-глииерофосфат-] ,3-14С) (6.2)
Реагенты. Глиисрин-2-3И <'100— 500 Ки/моль или глиие-
рин-1,3-14 С (10—30 Ки/молъ)( табл. 6.1).
Раствор немеченого глицерина, 1,0 М.
трис-Буфер, 1 М раствор ( pH 8,0).
Аоенозин-5-трифосфат, Оинатриевая соль, кристаллическая (фирма
"Calbiochem").
Раствор хлористого магния, 0,2 М.
Раствор сывороточного альбумина, 2%-ный.
Р аОиоизопопные методы в липидологиъ
Раствор fi -меркаптоэтахола, 1 М.
Раствор глицерокиназы, 5 мг/мл. Кристаллический препарат, по-
лученный из Candida mvcoderma, растворяют в 2,2 Р‘\ растворе суль-
фата аммония (фирма "Calbiochem^ ).
Раствор муравьиной кислоты, 4 Ж.
Методика. В пробирку объемом 15 мл с пробкой поме-
шают 0,25 мл трас-буфера (250 мкмолей); 0,02 мл раствора не-
меченого глицерина (20 мкмолей); глицерин-2- 31i или глицерин-
1,3- 14С (1 мкмоль); АТФ (60,5 мг, 100 мкмолей); 0.50 мл раст-
вора хлористого магния (100 мкмолей): 0,05 мл раствора меркапто
этанола (50 мкмолей); 0,25 мл раствора сывороточного альбумина
(5 мг); 0,01 мл раствора фермента глицерокиназы (0,05 мг) и раз-
бавляют водой до объема 5,0 мл. Выдерживают смесь 3 ч при
37°C, после этого нагревают 5 мин на кипяшей водяной бане и
быстро центрифугируют. Разбавляют супернатант 50 мл дистиллиро-
ванной воды и помешают в колонку размером 1,3 х 16 см, запол-
ненную смолой дауэкс 1 (размер частиц 50-100 меш). Сначала
100 мл дистиллированной воды элюируют не вступившие в реакции
глицерин и соли. После этого, используя установку Хуберта /136/.
проводят градиентное элюирование. В нижнюю смесительную камеру
наливают 250 мл воды, верхний резервуар заполняют 4 М муравьи-
ной кислотой. Элюирование проводят со скоростью 1,5—2,0 мл/мин
и отбирают фракции объемом 10 мл для измерения радиоактивности.
Пик радиоактивного глицерофосфата появляется во фракциях 25-41’.
Эти фракции объединяют и упаривают досуха на роторном испарите-
ле в вакууме лри 10°С. Остаток разбавляют 2 мл воды, нейтра-
лизуют аммиаком и разбавляют 3.5 мл 0,1 М яря г-буфера
(pH 5,2). Чтобы удалить из раствора адениновые нуклеотиды его
встряхивают 1 ч с 400 мг активированного угля норит (животного
происхождения), промытого кислотой. Суспензию центрифугируют,
уголь промывают тр и с- буфером, супернатант нейтрализуют раст-
вором аммиака и добавляют воду до объема 10 мл. Раствор мечено-
го глицерофосфата хранят при 441. Выход хроматографически чисто-
го вешества составляет 70-85% по глицерину; удельная активность
для 3Н - 5-25 Ки/моль, для 4С -0.5-1,5 Ки/моль.
6.1.2.4. sn-3-Глиперофоефат- 32Р[66]
глицерокиназа
Глицерин + АТФ-у-32Р ------------- хп-3-Г'лицерофосфат-32Р ((>••“
Реагенты. Реактивы и растворы для приготовления АТ<₽-
у-32Р приведены в разд. 6.1.2.1; другие используемые реактивы и
растворы см. в разд. 6.1.2.3.
196
Глава 6
,М е т о и и к а. Для приготовления АТФ-у-згР (см. разд.
6.1.2.1) выдерживают смесь ферментативной реакции (10 мл) в
течение часа при 26°С, добавляют 0,5 мл раствора глицерина
(500 мкмолей), 0,4 мл раствора меркаптоэтанола (400 мкмолей),
0.05 мл раствора сывороточного альбумина (1 мг), 0,02 мл раст-
вора глицерокиназы (0,1 мг/ и 0,03 мл воды. Смесь выдерживают
2 ч при 37ОС, после чего раствор переносят непосредственно на кс
лонку со смолой дауэкс-1 (1,2 х 20 см) и элюируют меченый гли-
церофосфат, как описано в разд. 6.1.2.3. Выход составляет 80%
от взятого в реакцию 32 Р.
6.1.2.5. Фосфорилхолин-32Р[2б8)
-Н20
СГ(СН,)3ГГ - СН2СН,0Н 4 н32ро4 ---<
CI-(CH3)3N+ - СН,СН20згР03Н2 (6.4)
Реагенты. ОртоФосфорнал кислота ^в%-нал, химически чистая
Раствор ортфосфорной кислоты- р в 0.01 н. НС1.
Хлоргионат холина, высушенный в вакууме над Р2 О, при 65°С.
Хлористый калъиий, безводный.
Раствор чиороокиси кальция, насыщенный (~0,1%-ный).
Методика. В грушевидную двугорлую колбу емкостью
25—50 мл со стандартными шлифами помешают 112 мт (1 ммоль)
88%-ной Н. РО, и дозируют 4 мКи раствора ортоФосфорной 32Р кисло-
ты ( ~2 мл). Смесь постепенно нагревают на масляной бане до
180°С. пропуская через колбу ток воздуха, чтобы удалить воду.
Затем смесь охлаждают, добавляют 140 мг (1 ммоль) сухого хлор-
гидрата холина, хопошо перемешивают его с фосфорной кислотой, за-
крывают колбу хлоркальциевой трубкой и 12 ч нагревают при!65°С
(чтобы удалить воду, время от времени можно пропускать через
смесь медленный ток сухого воздуха). Охлажденную смесь переносят
в центрифужную пробирку, используя для этого 3-4 мл воды, добав-
ляют 65 мг Са Ср и нейтрализуют насыщенным раствором Са(ОН),,
применяя в качестве индикатора фенолфталеин. Осадок фосфата каль-
ция удаляют центрифугированием и промывают его двумя порциями
воды по 0.5 мл. Объединяют супернатант и промывную воду и упа-
ривают в центрифужной пробирке до объема 1 мл в токе воздуха
при 50°С; осадок отделяют центрифугированием. Нерастворимый оса-
док промывают 0,3 мл воды. Разбавляют объединенный супернатант
и промывную воду ( ~1.3 мл) равным объемом 99%—кого этанола и
охлаждают смесь примерно 12 ч при -20°С. Кристаллический осадок
отделяют центрифугированием, промывают 1 мл 60%-ного этанола,
Радиоизотопные метооы в липидологии
197
99%—ным этанолом и. сушат в вакуум-эксикаторе. Выход кристалли-
ческой кальциевой соли хлоргидрата фосфорилхолина (CKH1304NPCaClx
х 411,0, мол. вес 329,5) составляет примерно 45 мг (-~ 15%); удель-
ная активность ~ 4 Ки/моль. Чтобы получить натриевую или калие-
вую соль фосфорилхолина. перемешивают кальциевую соль со смолой
цауэкс-5О (Н* ) и 1—2 мл воды. Суспензию центрифугируют, промы-
вают смолу небольшими порциями воды, нейтрализуют объединенный
супернатант 0,2 н. раствором гидроокиси калия или натрия и раз-
бавляют водой до определенного объема (5 или 10 мл.)
6.1.2.6. Другие водорастворимые меченые предшественники (233)
Ниже перечислены предшественники, методики синтеза которых
детально описаны в литературе: фосфорилэтаколамин-32Р /19/, фос-
форилхолин-14 С, фосфорилэтаноламин-1“ С. цитидиндифосфатхолив-' 4С,
дезоксшштидиндифосфатхолин-14 С, цитидичдифосФатэтаноламин-14 С
и дезоксицитидиндиФосФатэтаноламин-’4 С /303/, пентен-2-илпирофос
фат-1-’4С /73/; глицерин-1 (3)-*4С и глицерин-2-’4С /104/.
6.1.3. Получение меченых липионых субстратов
6.1.3.1. 5п-1,2-Диглицерид-14С, равномерно меченный [ 127 j
фосфолипаза С
sn-3-Фосфатидилхолин- ’ 4С ~ *
-» 5п-1,2-Диглицерид-'4С + Фосфорилхолин
Реагенты. sn-3-Фосфатидилхолин-1 4 С, равномерно мечен-
ный (разд. 6.3.1.Ц, выделенный из меченных ,4С липидов листьев
(разд. 6.2.2) или липидов печени крыс (разд. 6.2.3).
Фосфолипаза С, полученная из Clostridium perfrinpes /251/,
1 мг белка / 1мл дистиллированной воды.
Раствор хлористого налъиия, 0,02 М.
Методика. К раствору 6 мкмолей лецитина-’4 С в 1,5 мл
смеси 95%-ного этанола и этилового эфира (2:98) добавляют 45 мкл
0,02 М раствора хлористого кальция и 60 мкл раствора фосфолипа-
зы С (1 мг/мл). Смесь инкубируют при 25°С в течение 2 ч, после
этого упаривают растворитель досуха в токе азота. Сразу же раст-
воряют остаток в смеси 5 мл метанола и 5 мл хлороформа, добав-
ляют 4,5 мл воды, перемешивают и разделяют фазы центрифугирова-
нием. Отделяют нижнюю хлороформную фазу, разбавляют ее бензо-
лом и упаривают раствор почти досуха в токе азота. Остаток раст-
воряют в 2 мл смеси хлороформ-метанол (1:1) и хранят при -Ю°С.
Анализ методом ТСХ в системе этиловый эфир-хлороформ (1:9)
198
Глава 6
дает только оцно радиоактивное пятно (Я, 0,3), соответствующее
стандарту 1.2-лиг пиперину. Выделенное вещество можно освободить
от примесей препаративной ТСХ в этой же системе растворителей.
6.1.З.2. sn-3-Фосфатидная кислота-’4С, равномерно меченная [ J70]
sn-3-ФосФатидилхолин-14 С фосфолипаза Р
----- sn-3-Фосфатидная кислота-14С + Холин (6.6)
° е а г е н т ы. sn-3-Фосфатидилхолин-14 С, равномерно мечен-
ный (разд. 6.3.1.1).
Аиетатный буферный раствор, 0,2 М (pH 5,6).
Раствор хлористого калъцы, 1 Я.
Раствор фосфолипазы D, неочищенный препарат из капустных листь-
ев. 20 мг/мл (фирмы "CalbiochenT: "Koch-Zight"; " Boehringer" ).
.Рпимвыи эфир, химически чистый, свежеперегнанный.
Соляная кислота, 0,5 н.
Раствор гиороокиси натрил, калия или аммония в метаноле, 0,2 к.
М етоцика. К суспензии 10-15 мкмолей меченного 14С
лепитина в 1.0 мл ацетатного буфера и 0.2 мл раствора хлористого
кальпня добавляют 0,8 мл препарата фосфолипазы В и 0.5 мл эти-
лового эфира. Смесь энергично встряхивают и инкубируют 3—4 ч
при 25°С. Добавляют 5 мл метанола и 2,5 мл хлороформа, встря-
хивают и через 15 мин добавляют еше 2,5 мл хлороформа, разбав-
ляют объединенную хлороформную фазу 1 мл бензола. Упаривают
□аствор в токе азота до конечного объема приблизительно 0,1 мл
и разбавляют 1 мл метанола. Смесь выдерживают несколько часов
пои 3°С, при этом выпадает бесцветный осадок кальциевой соли
меченой фосфатидной кислоты-14С. Его отделяют центрифугированием,
промывают 0.5 мл холодного метанола, растворяют в хлороформе
H хранят раствор при -10°С. Конечный продукт содержит 4.2-4.3%
фосфора и дает только одно радиоактивное пятно с Ri 0.9 при хро-
матогсафировании на бумаге, пропитанной кремневой кислотой в сис-
теме пиизооутилкетон - уксусная кислота - вода (45:25:5 по объе-
му ) г. оцно пятно с R. С’,1 при хроматографировании методом
ТСХ в системе хлороформ-метанол-аямиак (65:35:5- по объему).
В полученной калыгиевой соли фосфатидной кислоты содержится 80-
Q С? О'. I А
Кальциевую соль можно превратить в свободную кислоту или
в натриевую, калиевую или аммониевую соли следующим образом.
Раствор примерно 10 мкмолей кальциевой соли в 4 мл хлороформа
помешают в пробирку объемом 15 мл с пробкой, добавляют 4,0 мл
метанола и 3,6 мл 0,5 н.НС1. Смесь осторожно перемешивают и
Радиоизотопные методы в липидологии
199
центрифугируют, хлороформную фазу удаляют пастеровской пипеткой.**
а водную фазу промывают 2 мл хлороформа. Чтобы получить сво-
бодную кислоту, объединенную хлороформную фазу разбавляют 2 мл
бензола и упаривают досуха в токе азота. Остаток фосфатидной кис-
лоты высушивают в эксикаторе над гранулированным КОН. Свобод-
ная фосфатидная кислота весьма нестабильна в растворе и немного
более устойчива в сухом виде, поэтому ее следует использовать
как можно скорее. Чтобы получить динатриевую, дикалиевую или
диаммониевую соль, хлороформный раствор свободной кислоты ней-
трализуют 0,2 М метанольным раствором соответствующей соли
до pH 8. Нейтрализованный раствор разбавляют бензолом, упарива-
ют в токе азота приблизительно до 0,2 мл и разбавляют 10 объе-
мами ацетона. Смесь охлаждают льдом, осадок соли фосфатидной
кислоты пентрифугируют, промывают холодным ацетоном и высуши-
вают в эксикаторе нац гранулированным КОН. Соли фосфатидной
кислоты гораздо более стабильны, чем сама кислота. Их можно хра-
нить- при низкой температуре в виде раствора в хлороформе или
в сухом виде.
6.1.3.3. Нитидиндифосфйт-sn-l ,2-диглицерид-14С.
равномерно меченный [ 51
sn-3-Фосфатидная кислота-14С (равномерно меченная) +
пиридин
+ Питидинмонофосфатморфолидат —------* (6.7)
- ПитидинДифосфДТ-«п-1,2-аиглицерил
Реагенты. Кальциевая соль фосфатидной кислоты-14 С
равномерно меченная, получение см. в разд. 6.1.3.2.
Иитиоинмонофосфатморфолиоат (ИМФ-морфолидат) (фирма " Cal bio-
ch em”).
Пиридин, безводный.
Смесь метанол - вода. 2:1.
Раствор соляной кислоты, 1 н.
Раствор гидроокиси аммония в метаноле, 2 н.
Методика. 25 мкмолей ( "1S мг) кальциевой соли фос-
фатидной кислоты переводят в свободную фосфатидную кислоту (разд.
6.1.3.2) и помещают в кругло донную колбу емкостью 50 мл. До-
бавляют 25 мкмолей (17 мг) ИМФ-морфолидата и 3 мл бензола,
смешивают и упаривают в ваку-уме досуха. Добавляют 5 мл безвод-
ного пиридина, закрывают колбу пробкой, смешивают и инкубируют
65 ч при комнатной температуре. Пиридин удаляют упариванием
в вакууме, предварительно приливают примерно 5 мл толуола. Оса-
док высушивают в вакууме-эксикаторе и разбавляют смесью 10 мл
хлороформа, 10 мл метанола и 0,2 мл 1 н. раствора соляной кис—
200
Глава б
лоты. Сразу после этого добавляют 8,8 мл воды, смешивают и цен-
трифугируют. Отделяют хлороформный слой, а водный промывают
3 мл хлороформа. К объединенной хлороформной фазе добавляют
8.2 мл смеси метанол-вода (2:1) и 0,1 мл 2 н. раствора гидро-
окиси аммония в метаноле. Встряхивают смесь, центрифугируют и
удаляют верхнюю метанольную (щелочную) фазу. Нижнюю хлороформ-
ную фазу промывают двумя порциями по 9 мл смеси метанол - во-
да (2:1). Объединенный водно-метанольный раствор упаривают в ва-
кууме. добавив бензол ( ~ 30 мл). Остаток сушат и хранят в ваку-
ум—эксикаторе над гранулированным КОН. При хроматографировании
методом ТСХ в системе диизобутилкетон-уксусная кислота - вода
(40:30:7) аммониевая соль ЦДФ-циглицерида имеет Hr 0,64.
6.1.3.4. Приготовление'других меченых липидных субстратов [3041
Ниже перечислены меченые липиды, методика синтеза которых
описана в литературе, многие из них поставляются фирмами (см.
табл. 2.1): жирные насыщенные-1-'4С кислоты /12, 13, 34, 76,
291/: олеиновая-1-’4С кислота /236/: олеиновая-’н кислота /182/
полиненасышенные-3Н и полиненасышенные-i-14С жирные кислоты
/311/; высшие ацильные-14 С (или-3 Н ) производные Со А /290,
330, 351, 6/; диолеин-1,2-JH /180/; триолеин-3-3Н /182/. выс-
шие спирты-1-’4С (получают восстановлением метиловых-1-14С
эфиров жирных кислот алюмогидридом лития') /241/: а-алкиловые-
-JH и о -алкиловые-1-’4 С эфиры глиперина /250/; холестерин-
4-’4 С /352/; холестерин-^Н /233/; эфиры холестерина-4-14С
/252, 254/; эфиры холестерина-3Н /202, 233/; пинолеил-2-14С
или пальмитоил-1-JH -фосфатидилхолин и линолеил—2—14С - или
пальмитоил-1-л Н - Фосфатидилэтаноламин /340/.
6.2. Введение радиоактивной метки в клеточные липиды
Скорость включения радиоизотопных меток в. клеточные липиды
зависит прежде всего от скорости обмена или биосинтеза липидов
в клетке. Однако действительную скорость включения радиоизотоп-
ных предшественников в липиды будет определять проницаемость
клетки или ткани для каждого из предшественников. Поскольку про-
ницаемость клеток или тканей зависит от организма, которому' они
принадлежат, то для каждого класса организмов требуется своя
методика введения метки.
6.2.1. Микроорганизмы
Введение метки в клеточные липиды микроорганизмов можно
легко осуществить, выращивая последние в обычной культуральной
среде, содержащей легко ассимилирующиеся меченые предшествен-
Раоиоизонопные меяооы в липидологии
201
ники (например, ортофосфат-32Р, ацетат-14С, глицерин-’*С и глю-
коза-’4 С или НСО~ 14 С в случае различных водорослей, в том чис^-
пе диатомовых). Если среда содержит "холодные предшественники*
(например, .фосфат или глюкоза), cjjgnyer избегать чрезмерного
разбавления меченых предшественников. Для этого концентрацию
"холодных" предшественников в среде снижают до минимума, кото-
рый, Ринако, обеспечивает нормальный рост. Ниже приводится не-
сколько примеров, иллюстрирующих общий подход, но, как уже го-
ворилось, в каждом конкретном случае следует применять свой осо-
бый метод включения метки.
6.2.1. К Escherichia coli [1501
Реагенты. Культуральная среоа: а) богатая фосфатом:
0,535% КН,Р04;1,063% К2НРО ; 0,20% (NH ) S04 , 0,020% MgSO4>
х7Н2О; 0 ,5 мг/л FeS04-7Н2О и 0.20% глюкозы (стерилизованной
отдельно);
б) не содержащая фосфатов, включает все перечисленные выше
компоненты, за исключением КН2ГО4 и К 2 НР04, которые заменяют
на 1% КС1 и 0,42% NaHCO3.
Ортофосфорная-32 Р кислота в 0,01 н. НС1 (нейтрализованная
0,2 н. NaOH 1.
Фосфапнъй. буфер, 0,5 М (pH 6,5). 70 мл 0,5 М КН.РО4 смешива-
ют с 30 мл 0,5 М НРО4.
М ето пика. "К 100 мл богатой фосфатом среды добавля-
ют 1 мл культуры клеток Е. coli В и инкубируют при 37°C на воз-
духе при потряхивании, пока не достигнут ранней логарифмической
фазы роста (определяется турбидиметпически). Клетки отделяют
центрифугированием и промывают 100 мл культуральной среды не
содержащей фосфатов. Суспендируют клетки в 100 мл этой культу-
ральной среды, встряхивая в течение 15 мин при 37 °C, добавляю!
1 мл раствора ортофосфата-32 Р (обшая активность 0.5 - 2,0 мКи)
и продолжают встряхивание при 37°C в течение 2 ч. Переносят ме-
ченую культуру в литровую делительную воронку, содеожашую
250 мл метанола и 125 мл хлороформа, и перемешивают. Через
I ч добавляют 125 мл хлороформа и 125 мл 0,5 М Фосфатного
буфера, осторожно перемешивают и оставляют примерно на 12 ч
до полного расслоения фаз. У даляют хлороформную фазу, разбавля-
ют ее бензолом и упаривают досуха на роторном испарителе. Оста-
ток растворяют в 4-5 мл смеси хлороформ - метанол (2:1). пентри-
фугируют и, добавляя хлороформ, доводят по определенного объема.
Определяют активность 32 Р в аликвотной части раствора липидов
(разд. 6.4). Ниже перечислены в порядке убывания активности ли-
пиды, меченные 32Р: фосфатидилэтаноламин, фосфатидилглицерин, Фос-
фатидилсерин, кардиолипин и фосфатидная кислота.
202
Глава 6
6.2.1.2. Halobaclerium cutirubrum [172 J
Реагенты. Культуральная среда: а) нормальная: 0,73%
казеинового гидролизата (фирма "Difco" ); 1,0% дрожжевого экс-
тракта (фирма "Difco" ): 0,3% трехзамещенного цитрата натрия;
0,0023% FeCl 2, 2,0%MgS04-7H20;0,2%KCl; 25% Na Cl; pH 6,2-6,5;
б) бедная фосфатом, включает все компоненты нормальной сре-
ды, только содержание казеинового гидролизата и дрожжевого экс-
тракта снижается до 0,375% и 0,5% соответственно.
Солевой раствор: 25% NaCI; 0,2% КС1 j 2% MgS04* * 7Н„0.
Раствор ортофосфата-32 Р в 0,01 н. НС1 (нейтрализованный Na ОН ).
Глицерин-1 (3 / ’4 С.
Ацетат-1-1 вС натрия.
Фосфатный буферный раствор, 0,5 М (pH 6,5).
Мето дика. К 50 мл нормальной культуральной среды до-
бавляют 1 мл культуры Н. cutirubrum* и инкубируют 48 ч при
37*%' на воздухе, встряхивая на механической качалке при
120 об/мин до тех пор, пока не будет достигнута средняя логариф-
мическая фаза роста (определяется турбидиметрически). Клетки от-
деляют центрифугированием, промывают 50 мл солевого раствора,
суспендируют в 49 мл бедной фосфатом среды в колбе Эрленмейера
емкостью 250 мл и встряхивают смесь 15 мин при 37°С. После
этого добавляют 1 мл раствора ортофосфата-32Р, ацетата-’4С или
глицерина-14С с активностью 1, 10 или 100 мкКи соответственно
и инкубируют 48 ч. Содержимое каждой колбы (50 мл) экстрагиру-
ют в делительной воронке смесью 125 мл метанола и 62,5 мл хло-
роформа, добавляют по 62,5 мл хлороформа и фосфатного буфера и
дают фазам разделиться. Обрабатывают хлороформную фазу, как опи-
сано для Е. со И (разд. 6.2.1.1). Изотоп 32Р включается главным
образом в простые ди-О-фитаниловые эфиры глицерина - аналоги
фосфатидилглиперофосФата и фосфатидилглицерина. Ацетат-14С и
глицерин-14С включаются в сульфогликолипиды, нейтральные липиды
и пигменты, а также в фосфолипиды (рис. 6.1). Степень включения
радиоизотопов составляет в каждом случае около 2% исходной ак-
тивности.
6.2.1.3. Chlorella vulgaris [252, 253, 283]
Реагенты. Культуральная среоа (на дистиллированной
воде): 0,63% KN03;0,25% MgS04- 7Н, О; 0,020% КН2РО4 и следую-
щие микроэлементы (мг/л): 5,6 Fe2<SO4)3" 9Н20; 1,0 СаС0з;62 ЭДТА*
0,6 Н3ВО3; 0,9MnCi2; O.lZnCU; 0,0026 CoCi 2 и 27x10-6 CuCl2; pH 5,5.
* Коллекция типовых культур Национального исследовательского сове-
та. Оттава, Канада (N.R.C. Type Culture Collection, National Research Coun-
cil, Ottawa, Canada).
* * Динатриевая соль.
Cj to Ф co
204
Глава 6
Раствор ортофосфаяа-згР в разбавленной НС1 (нейтрализуют
Na ОН).
Фосфатный буферный раствор, 0,5 М (pH 6,5).
Методика. В колбу Эрленмейера объемом 500 мл, со-
держащую культуру Chlorella vulgaris, помешают 100 мл культу-
ральной среды и инкубируют смесь при 22°С, перемешивая ее на
механической качалке на свету (1800 лк). Через две недели клет-
ки отделяют центрифугированием и суспендируют в свежей культу-
ральной среде в колбе Эрленмейера с магнитной мешалкой так, что-
бы получилась 1%-ная суспензия водорослей (или 10 мг сухих кле-
ток в 1 мл). Суспензию инкубируют 15 мин при 22°C на свету
(21 500 лк), добавляют необходимую аликвотную часть раствора
ортофосфата-32Р, доводя конечную концентрацию приблизительно
до 10 мкКи/1 мл среды, и продолжают инкубировать при перемеши-
вании еше 48 ч при 22°C. После этого экстрагируют всю культу-
ру 3,75 объемами смеси метанол - хлороформ (2:1) в делительной
воронке. Через 30 мин добавляют по 1,25 объема хлороформ; и
фосфатного буфера, осторожно смешивают и дают фазам разделяться.
Обрабатывают хлороформную фазу', как описано в разд. 6.2.1.1. для
£. coli. Примерно 1% введенного изотопа 32Р включается в липи-
ды. В результате получают следующие меченые фосфолипиды: фосфа-
тидилглиперин, лепитин, фосфата дилэтаноламин, фосфатадилинозит и
кардиолипин (рис. 6.2).
Введение радиоактивной метки ,4С в липиды Chlorella vulgaris
при фотосинтезе с помощью ,4С0„ рассматривается в работе /94/.
fj.2.1.4, Navicula pelliculosa (пресноводная диатомовая водоросль) [171]
Реагенты. Кулыхуралъная среоа (на дистиллированной во-
де): 0,01% Ce(N03)2-4Н2О; 0,00135% К2НРО4’ЗН2О (при работе
с изотопом 32Р К, НР04 не добавляют); 0,0025% MgSO- 7На0 (при
работе с изотопом3SS заменяют 0,002% MgCL ); 0,02% Na2Si03>
х9Н2О; 0.002% Na С03; 0,1% пептон ("Difco"), а также следы
элементов (мг/л): 0,57Н3В03; 0,62 2nd 2; 0,27 СиС12- Н20; 0,25
Na2MoO4-2H2O;O,42 CoQ2-6H20; 1,36 FeSO4; 0,36 MnCl2-4H20; 1,77
тартрат натрия.
Натрия бикарбонат-'*С, ортофосфат-32Р в разбавленной НС1 (перед
употреблением нейтрализуют NaOH) или сульфат- 35$, в разбавлен-
ной НС! (перед употреблением нейтрализуют NaOH).
Методика. Выращивают в течение 24 ч диатомовые во-
доросли N. pelliculosa, штамм FW- 50 (выделен Lewin R.A.. Scripps
Institution of Oceanography, La Jolla, California) в 50 мл Среды
О-----О------О------<5----О-------О------------
О 3 € <8 24 4 2 чись:
206 Глава 6
в колбе Эрленмейера емкостью 125 мл при непрерывном освещении
сверху (4300 лк) лампой дневного света ("Silvanie", "холодный
белый*' или "теплый белый", TL 33 и 32) и перемешивании на меха-
нической качалке (120 об/мин). Чтобы ввести изотоп 14С, к 50 мл
культуральной среды, помешенной в колбу Эрленмейера емкостью
150 мл, добавляют 3 мл культуры, которая выращивалась 24 ч, и
помещают в вакуум-эксикатор внутренним диаметром 166 мм. Ва-
куумируют до остаточного давления 15 мм рт. ст. и впрыскивают
шприцем 14СО,, полученную из Nall1 4СО активностью 1,4 мКи. От-
крывая доступ воздуху в эксикатор, доводят давление до 600 мм
рт. ст. и инкубируют культуру 4 дня на свету при непрерывном не-
сильном встряхивании.
Чтобы ввести изотопы 32Р и 35S, к 50 мл соответствующей
культуральной среды, содержащей ортофосфат-32Р активностью
1 мКи или сулъфат-365 активностью 1 мКи, добавляют 1 мл куль-
туры клеток, которая выращивалась в течение 2 ч, и инкубируют
4 дня в таких же условиях, в которых инкубируются немеченые
клетки.
Отделяют меченые клетки центрифугированием (5 мин при
3000 об/мин) и промывают 10 мл полной питательной среды. Сус-
пендируют клетки в воде (объем суспензии 1,6 мл), добавляют 4 мл
метанола и 2 мл хлороформа и встряхивают. Выдерживают 1 ч, до-
бавляют 2 мл хлороформа и 2 мл воды, осторожно смешивают и
разделяют слои центрифугированием. Удаляют хлороформную фазу
пастеровской пипеткой и промывают метанольно-водную фазу 1 мл
хлороформа. Разбавляют объединенные хлороформные фазы 2 мл бен-
зола и упаривают в токе азота. Остаток сразу же растворяют в хло-
роформе, центрифугируют и доводят, объем раствора до 1-2 мл. Оп-
ределяют суммарную радиоактивность по аликвотной части раствора
(разд. 6.4). Хроматограммы меченых липидных компонентов пока-
заны на рис. 6.3.
6.2.2. Высшие растения
Включение радиоактивной метки в липиды высших растений тре-
бует специальных методов, некоторые из них описаны ниже.
6.2.2.1. Включение радиоактивной метки в изолированные листья
[90. 1561
Реагенты. Раствор ортофосфата- 32Р в разбавленной PCI
(нейтрализованный до pH 5-6).
Глюкоза-14С, равномерно меченная.
Ацетат-!-'* С натрия.
Бикарбонат-'4 С натрия.
Радиоизотопные методы в липидологии
207
Сулъфат-Зъ3 в разбавленной PCI (нейтрализованный цо pH
5—6).
Раствор для промывки: 1 М раствор Na С1, содержащий
0,25 моль/л КПНРО и 0,25 моль/л Na, SO
2 4 4
Рис. 6.3. Радиоавтограмма липидов Naviculla peZZicuZosa. меченных 32Р, 1лС
и 36S (пояснения см. в тексте). Хроматографирование проводилось на бумаге
ватман 3 ММ, пропитанной кремневой кислотой, в системе растворителей ди-
изобутилкетон — уксусная кислота —вода ( 40:25:5 по объему ); для обнаружения
применялись родамин 6Ж (цвета флуоресценции: В - голубой, G —серый, О-
оранжевый, У — желтый) и перйодат — реактив Шиффа (интенсивность пятен:
S—сильная, т—умеренная, и-слабая). Идентификация пятен: 1, 5а, 8а, Р—не
идентифицированы; 2,3- сульфохиновозилдиглицерид и фосфатидилинозит;
4 — дигалактозилдиглицерид; 5-лецитин и цереброзиды; 6,7- фосфатидилгли-
церин и фосфатидилэтаноламин; 8— моногалактозилдиглицерид; 10— фосфатид-
ная кислота; 11 — пигменты и нейтральные липиды [171).
208
Глава 6
Растительный материал: отделенные от растений первичные
листья (с черенком) бобов (Phaseolus multi floras), выращиваемых
в течение 16-23 дней в тепличных условиях на почве, содержащей
вермикулит; листья шпината (с черенком), можно использовать
имеющийся в продаже шпинат.
Методика. При введении изотопов 32Р, 36S и глюкозы ~’*С
или ацетата-’4С меченый предшественник включается в лист
через черенок следующим образом. Черенок листа погружают в мен- •
зурку с водопроводной водой, срезают кончик черенка лезвием брит-
вы и инкубируют лист в водопроводной воде не свету ( ~1050—
2100 лк) 10-15 мин. После этого лист вынимают из мензурки и
погружают черенок в стеклянную пробирку (6x70 мм), содержа-
щую 1 мл радиоактивного раствора (0,5 мКи фосфат-32Р; 0,5 мКи
сульфат-35S; 100 мкКи глюкоза-’4С или 70 мкКи ацетат-’4 С)
и дают листу впитать радиоактивный раствор или его часть на све-
ту (21 500 лк на поверхности листа) в течение 30-45 мин. Выни-
мают лист из пробирки, погружают черенок в пробирку с водопровод-
ной водой и инкубируют на свету (21 500 лк) еше 60-75 мин. Ис-
пользуя эту методику, можно вводить радиоактивные метки одновре-
менно в несколько листьев.
При введении метки с использованием 14СО. каждый лист по-
мешают в отдельный полиэтиленовый мешочек с 14СО., последний
получают из NaHl4C0, (активность 100 мкКи) и вводят в мешочек
шприцем. Мешочек с листом инкубируют на свету (21 500 лк) в те-
чение 1 мин. Затем лист вынимают, погружают черенок в мензурку’
с водопроводной водой и дают возможность фотосинтезу продолжать-
ся на воздухе при той же интенсивности освещения в течение 90 мин.
Чтобы можно было провести экстракцию меченых липидов, лист
помешают в колбу Эрленмейера емкостью 125 мл и осторожно с по-
мощью стеклянной палочки измельчают в жидком азоте. Аналогичным
образом обрабатывают по отдельности еше 4 листа. Трижды в тече-
ние нескольких минут экстрагируют объединенные фрагменты листь-
ев порциями по 50 мл пропанола-2, нагревая суспензию на водяной
бане при 80°С, после этого экстрагируют один раз 40" мл смеси
пропанол-2 - хлороформ (1:1) и. наконец, двумя порциями хлоро-
форма по 30 мл. После каждой экстракции смесь центрифугируют,
объединенные экстракты упаривают досуха не роторном испарителе,
остаток растворяют в 10 мл смеси хлороформ-метанол (1:1), до-
бавляют 4,5 мл раствора для промывки (Na Cl -К. HPOZ—Na2SO4), ос-
торожно смешивают, центрифугируют и удаляют хлороформную фазу.
Промывают водно-метанольную фазу 2 мл хлороформа, разбавляют
объединенные хлороформные экстракты бензолом и упаривают в то-
ке азота. Растворяют остаток в определенном объеме хлороформа
и определяют суммарную радиоактивность по аликвотной части раст-
вора. На рис. 6.4 показано разделение липидных компонентов, ме-
Р и с. 6.4. Радиоавтогпамма липидов листьев стелющихся бобов Phaseolus
multiflorus, меченных згР, 36S и ,4С (пояснения см. в тексте). Хроматогра-
фирование проводилось на бумаге ватман ЗМ.М, пропитанной кремневой кисло-
той, в системе растворителей дииэобутилкетон - уксусная кислота — вода
(40:25:5 по объему), для обнаружения применялся родамин 6Ж (цвета флуорес-
ценции: BL -голубой, РК — розовый, У —желтый). Идентификация пятен:
1 - фосфатидилиноэит; 2- сульфохиновозилдиглицерид; 3 - дигалактозилдигли-
иерид; 4 - лецитин и цереброзиды; 5 - фосфатидилглицерин; 5'— фосфатилил-
серин; 6'-' фосфатидилэтаноламин; 7 - кардиолипин; 8 - моногалактозилди-
глицерид; 9 — фосфатидная кислота; 10 — пигменты и нейтральные липиды [156).
210
Глава 6
ченных различными предшественниками. Выход составляет примерно
15 мг липидов и 0,14 мг липидного фосфора на лист; активность -
1-2 мкКи на лист.
6.2.3. Животные
Наиболее удобным методом введения радиоактивной метки в ли-
пиды тканей животных является инъекция раствора радиоактивного
вещества, после которой через необходимое для биосинтеза вре-
мя проводят экстракцию липидов.
Ниже приведены примеры применения основных методик.
6.2.3.1. Введение метки в липиды печени крысы
Реагенты, Раствор Рингера: 0,9% NaCI; 0,03% КС!;
0.025% Се С12 ; 0,02% NaHOO ,0,005% NaH,P04 (нейтрализуют до
pH 7,4).
РаОиоахтивный раствор: а) к 0,5 мл раствора ортофосфата-32Р
натрия активностью 1 мКи в разбавленной НС! (нейтрализован
NaOH до pH 7) добавляют 1,5 мл раствора Рингера; б) к раствору
апетата-1-14С натрия активностью 0,5 мКи (нейтрализован до
pH 7 разбавленной НС!) добавляют 8 мг Na С! и разбавляют дис-
тиллированной водой до объема 2,0 мл.
Методика. Четырем белым крысам (голодавшим в тече-
ние 20 ч и накормленным за 3 ч до инъекции) вводят внутрибрю-
шинно 0,5 мл раствора ортофосфата-32 Р. Через 8 ч после инъекпии
животных забивают, извлекают их печень и сразу же экстрагируют,
как описано ниже. При введении изотопа ’4С крысе вводят внутри-
брюшинно 0,5 мл раствора ацетата-'4 С четырьмя порциями с ин-
тервалом в 30 мин. Через 2 ч забивают животное, извлекают пе-
чень и экстрагируют (разд. 3.2) следующим образом: взвешенную
печень нарезают ножницами крупными кусками в стеклянный гомоге-
низатор Поттера. К 6-10 г свежей печени добавляют 3 мл воды,
20 мл метанола и 10 мл хлороформа и растирают смесь в гомоге-
низаторе. Центрифугируют смесь в центрифужной пробирке объемом
50 мл, сливают супернатант и экстрагируют осадок 19 мл смеси
метанол-хлороформ-вода (10:5:4 по объему). Смесь центрифугируют
и объединенный супернатант разбавляют смесью 15 мл хлороформа
и 15 мл'воды, осторожно смешивают, центрифугируют. Хлороформ-
ную (разу разбавляют бензолом и упаривают на роторном испарите-
ле. Остаток растворяют в определенном количестве хлороформа и оп
ределяют его радиоактивность по аликвотной части (разд. 6.4).
6.3. Разделение и выделение меченых липидных компонентов
Суммарные меченые липиды клеток или тканей, полученные, кек
описано в разд. 6.2, можно фракционировать и (или) выделять из
них индивидуальные компоненты, используя колоночную хроматогра-
Радиоизотопные методы в липидологии 2Н
фию на силикагеле и (или) ДЭАЭ-целлюлозе (если выделено более
100 мг липидов) или препаративную ТСХ (если липидов меньше
100 мг), как описано в разд. 5.2.1, 5.2.3 и 5.4.6 (см. также
/206, 304/). Рассмотрим в качестве примера разделение меченых
липидов листьев.
6.3.1. Разделение липидов листьев, меченных ,4С [90, 281]
Реагенты и аппаратура. Стеклянная хромато-
графическая колонка, диаметр 1,9 см.
Силикагель, размер частиц 100-200 меш. Используется сили-
кагель следующих марок: унисил, биосил ВН, адсорбосил-САВ.
Рластинки оля ТСХ, 20 х 20 см, толщина слоя силикагеля Н
0,75 мм (разд. 5.4.1).
Ваяман 3 ММ, пропитанный кремневой кислотой (разд. 5.3.1).
М е т о д и к а. На колонку размером 1,9 х 9 см (разд,
5.2.1.1) с 12 г силикагеля наносят 4-5 мл хлороформного раст-
вора суммарных липидов десяти листьев бобов или шпината, мечен-
ных изотопом 14 С. Общая радиоактивность приблизительно 10-
15 мкКи, содержание липидов ~ 150 мг, липидного фосфора
~1,4 мг. Ниже перечислены липидные фракции, полученные в ре-
зультате хроматографирования, и указана их радиоактивность в про-
центах от суммарной радиоактивности (в качестве предшественников
используется глюкоза-4С или 14С02.) Фракция 1. 220 мл хлорофор-
ма, пигменты и нейтральные липиды (35%). Фракция 2. 130 мл
смеси хлороформ-метанол (5:1), гликолипиды, сульфатиды, фосфати-
дилэтаноламин, фосфатидилглицерин (38%). ФрахшглЗ.13,5 мл смеси
хлороформ-метанол (1:1), фосфатидилинозит, сульфолипиды (1%),
Фракция 4. 130 мл смеси хлороформ - метанол (1:1), лецитин (22%).
Суммарный выход ,4С составляет 96%. Каждую фракцию упаривают
досуха в вакууме на роторном испарителе, остаток растворяют в
1 мл хлороформа. Определяют активность ’4С каждой фракции (разд.
6.4). Для идентификации компонентов соответствующие аликвотные
части каждой фракции хроматографируют на пропитанной кремневой
кислотой бумаге в системе растворителей Маринетти (разд. 5.3.3),
(см. рис. 7.6). Методика выделения основных липидных компонентов,
меченных ’4 С, рассматривается в следующем разделе.
6.3.1.1. Выделение* лецитина, меченного ,4С
Согласно приведенным выше результатам хроматографического
анализа, фракция 4, т. е. лецитиновая фракция, содержит только
один главный компонент, меченный ,4С. Эту фракцию можно исполь-
зовать без последующей очистки. Однако для удаления следов пиг-
Данные Састри и Кейтса, публикуются впервые.
212
Глава 6
ментов и нейтральных липинов необходима окончательная очистка
с помощью осаждения ацетоном. Очистка выполняется следующим
образом.
Хпоооформный раствор фракции 4, не содержащий осадка, упа-
оивают по небольшого конечного объема ( ~О,2 мл) в пентрифужной
пробирке емкостью 15 мл в токе азота и добавляют при перемеши-
вании 2 мл апетона. В течение 1-2 ч смесь охлаждают льдом. Ле-
цитин осаждают центрифугированием. Промывают воскообразный оса-
док двумя порциями холодного апетона по 0,5 мл, растворяют в
1 мл метанола и хранят раствор при -10°С. Выход лецитина, мечен-
ного 14 С, из десяти листьев составляет примерно 13 мг (16 мкмо-
лей Р ) при удельной активности 0,17 Ки/моль. Основными компо-
нентами жирных кислот лецитина листьев являются следующие кисло-
ты: пальмитиновая (26%), линолевая (38%) и линоленовая (26%).
Если меченный 14С лецитин содержит значительное количество
примесей других липидов, например лизолегштина, их отделяют пре-
паративной ТСХ на пластинках с силикагелем Н (разд. 5.4.6) в
системе хлороформ-метанол—вода (65:25:4). Радиоактивный леци-
тин ( R. 0,3) обнаруживают радиоавтографией (разд. 6.5) и элюи-
руют смесью хлороформ-метанол (1:1). Объединенные элюаты раз-
бавляют бензолом, упаривают в токе азота до маленького объема,
при необходимости осадок отделяют центрифугированием и осажда-
ют растворенный в хлороформе лецитин ацетоном, как описано выше.
6.3.1.2. Выделение* моно- и дигалактозилдиглицеридов, меченных’4С
Фракцию 2, содержащую галактолипиды, сульфолипипы и кислые
фосфолипиды, упаривают в токе азота до 0,5 мл, разбавляют раст-
вор 5 мл апетона и инкубируют в течение примерно 12 ч при О С.
Осадок Фосфо- и сульфолипидов отделяют центрифугированием, про-
мывают 2 мл холодного апетона и переосаждают из 0,3 мл хлоро-
формного раствора, добавляя 3 мл апетона. Объединенный апетоно-
вый супернатант упаривают в токе азота до 0,4 мл, остаток раст-
воряют в Ч мл апетона и охлаждают во 0°С. Отделяют осадок цен-
трифугированием и, чтобы удалить последние следы фосфолипидов,
эту процедуру повторяют. Объединенный осадок, выпавший при добав-
лении ацетона, растворяют в хлороформе и хранят при оЧз. Ацето-
новый раствор упаривают в токе азота почти досуха, растворяют
остаток в 4 мл метанола, в течение 2 ч охлаждают смесь льдом.
Осадок отделяют центрифугированием, упаривают супернатант в то-
ке азота почти досуха и растворяют остаток в 1 мл хлороформа.
Полученный продукт свободен от фосфолипидов и содержит только
моно- и дигалактозилдиглипериды и небольшое количество церебро-
зидов и гликозидов стеринов.
Данные Састри и Кейтса, публикуются впервые.
Радиоизотопные методы в липидолоъии
213
Наиболее удобным способом разделения галактолилинов является
препаративная ТСХ на пластинках с силикагелем Н в системе раст-
ворителей Лепажа /193/: хлороформ-метанол-ацетон-уксусная кисло-
та-вол а (50:10:20:10:5). Радиоактивные моногалактозилглицерид
{Rr 0,90) и дигалактозилциглицериц (Rf 0,40) обнаруживают ме-
тодом радиоавтографии (разд. 6.5) и элюируют смесью хлороформ-
метанол (1:1). Элюаты разбавляют бензолом, упаривают почти до-
суха на роторном испарителе, а остатки сразу же растворяют в
1 мл хлороформа и хранят при 0°С. Выход моногалактозилдиглипе-
ридов из десяти листьев составляет примерно 20 мг (26 мкмолей
сахара), удельная активность 0,04 Ки/моль. Выход дигалактозилди-
глидерида равен примерно 14 мг (30 мкмолей сахара), удельная
активность 0,02 Ки/моль. Главным жирнокислотным компонентом
этих галактолипидов является линоленовая кислота (93-96%).
6.3.1.3. Выделение фосфатидилглицерина, меченного 14С [1291
Полученный из фракции 2 нерастворимый в апетоне продукт
(разд. 6.3.1.2) состоит главным образом из фосфатидилглицерина
и небольшого количества фосфатидилэтаноламина, фосфатидилсерина
и сульфолипида, которые можно разделить методом препаративной
ТСХ на силикагеле Н в системе хлороформ-метанол-конпентрирован-
ный аммиак (70:20:2 по объему). Радиоактивный фосфатадилглипе-
рин ( Rf 0,46) обнаруживают методом радиоавтографии, элюируют
смесью'хлороформ-метанол (1:1), элюаты разбавляют бензолом и
упаривают досуха. Остаток растворяют в хлороформе и хранят при
0°С. Выход фосфатидилглицерина равен примерно 6 мг(7 мкмолей Р).
6.3.1.4. Другие методы выделения различных меченых липидов
из природных источников
Методом препаративной ТСХ разделяют равномерно меченные
,4С липиды Chlorella pvrenoidosa и выделяют препаративные коли-
чества фосфатидилэтаноламина-’4 С, моногалактозилдиглиперида-14С
и дигалактозилдиглиперида-’4С /235/. Метиловые эфиры жирных
кислот, равномерно меченные 14С, получают методом мягкого ще-
лочного метанолиза (дезацилирование см. в разд. 7.2.1.5) сум-
марных ЛИПИДОВ—^4С Chlorella pyrenoidosa.
Разделение метиловых эфиров жирных кислот методом препара-
тивной ГЖХ на колонке с силиконом SE-30 (15%) дает возможность
получить металпальмитат-14С и метилолеат-’4 С более чем 95%-
нэй чистоты. Разделение равномерно меченных метиловых эфиров
жирных кислот- ’ 4С,полученных из липидов Chlorella, проводят с
помощью перегонки и противоточной распределительной хроматогра-
фии. Выделяют чистые меченные 14 С метиловые эфиры пальмитине-
214
Глава 6
вой. пальмитолеиновой, пальмитолинолевой. пальмитолиноленовой,
стеариновой, олеиновой, линолевой и линоленовой кислот /210/.
Из неомыляемых липинов Chlorella, используя адсорбционную
и распоеделительную хроматографию с обращением фаз, выделяют
меченный’4!' фитол /208/.
6.4. Определение радиоактивности липидов,
меченных радиоизотопами
Наиболее распространенные радиоизотопы, применяемые для
включения в качестве метки в липиды, являются источниками В -
излучения 1ЛН, 0.018 мэВ; 14С, 0,155 мэВ; 3bS, 0,167 мэВ: 32Р,
1,71 мэВ).
Для определения радиоактивности липидов, меченных указанны-
ми изотопами, применяют главным образом три метода, используя
1) торцевой счетчик Гейгера - Мюллера (ГМ); 2) газопроточный
счетчик; 3 > сцинтилляционный счетчик. Первый метод наименее чув-
ствительный; он используется для исследования образцов средней и
высокой радиоактивности, меченных ’ 4C,35S и 32Р. Радиоактивность
лилицое, меченных3!!, этим методом определить нельзя из-за низ-
кой энергии В- излучения изотопа 3Н. Чувствительность второго
метода выше; его можно использовать для определения радиоактив-
ности липидов, меченных как 3Н, так и14С, 3iS и 32Р. Наиболее
чувствительным является третий метод; его можно использовать
для определения радиоактивности липидов, меченных одним или не-
сколькими из указанных изотопов, характеризующихся как низкой,
так и высокой радиоактивностью. Далее кратко рассматриваются ме-
тоды подсчета радиоактивности, причем основное внимание уделяет-
ся методике подготовки образца. Теория и методика работы с при-
борами подробно рассматривается в специальной литературе.
6.4.1. Опреоеление радиоактивности
с. использованием ториевого и газопроточного счетчиков
Аппаратура. Алюминиевые подложки, диаметр 3 см. про-
мытые хлороформом и перед использованием высушенные на воздухе.
Счетчики, трубка Гейгеоа-Мюллера с тонким окошком или хоро-
шо экранированный газопроточный счетчик с окошком "Микромил"
(или без него).
Измеритель скорости поосчета с автоматическим приспособлени-
ем для смены образцов и печатающим приспособлением (фирмы "Nuc-
lear-Chicago"; "Beckman"; "Packard").
Метан, газ для пропорционального подсчета, или *0 -газ" для
подсчета в диапазоне Гейгера.
Методика. Липиды, меченные ,4С. згР, ЛН илиЭ55, раство-
ряют в определенном объеме хлороформа (полярные или нейтральные
Радиоизотопные меяоды в липиоологии
215
липиды) или гексана (нейтральные липиды). Нужную аликвотную
часть раствора (25-100 мкл, от 10 000 до 100 имп/мин) нано-
сят на подложку в вытяжном шкафу, распределяя раствор равномер-
но по поверхности подложки мелкими каплями с такой скоростью,
чтобы капля раствора испарялась до падения следующей капли. Под-
ложки, включая пустую, помешают на приспособление для смены об-
разцов. Радиоактивность определяют с помощью счетчика Гейгера-
Мюллера или газопроточного счетчика с проточной газовой смесью,
продолжительность подсчета каждой мишени должна быть достаточ-
на для аккумуляпии как минимум 1000 импульсов (статистическая
ошибка 1-2%). Каждый образец обсчитывают не менее трех раз и
затем берут среднее арифметическое. Вычитают фоновые импульсы
и вносят поправку на распад3*Р h36S по формуле
log(Ct,/Ct ) -0,301/ T(t2- t,).
где С, и Ct - число импульсов, регистрируемых в 1 мин, в те-
чение И12 2дней; Т - период полураспада изотопа (14,3 дней
для 32Р и 87 дней дляЗЕ5 ). Эффективность определения радиоак-
тивности для каждого радиоизотопа определяют, обсчитывая на под-
ложках известные количества соединений, содержащих ,4С, 32Р, 3Н и355,
и сравнивая число импульсов в минуту с числом распадов в мину-
ту, вычисленным исходя из активности образпов, выраженной в кю-
ри (Ки), при условии, что 1 мкКи = 2,22 х 10ь расп./мин. Эффектив-
ность определения радиоактивности счетчиком Гейгера-Мюллера с
тонким окошком составляет около 5% для 14 С, 7% для 3sS и 28%
для 32Р (радиоактивность 3Н этим методом измерить не представ-
ляется возможным). Эффективность определения радиоактивности
газопроточным счетчиком с окошком 'Микромил* составляет при-
мерно 40% для 14 С, 50% для 3bS и 90%. для32Р. Эффективность
определения радиоактивности * Н счетчиком без окошка с Q -газом
равна примерно 45%.
Активность пятен радиоактивных соединений на бумажной хро-
матограмме можно определить следующим образом: радиоактивные
пятна, обнаруженные радиоавтографией или сканированием, выреза-
ют и (разд. 6.5) помещают на подложку (если пятно слишком ве-
лико, его разрезают пополам) и определяют радиоактивность так
же, как для образцов, нанесенных на подложку. Чтобы определить
.-•солютную радиоактивность, приходится вносить поправку на абсорб-
цию бумагой, но и в этом случае результат скорее всего не будет
достаточно точным. Однако это затруднение можно преодолеть, вы-
разив, радиоактивность каждого пятна в процентах от суммарной
радиоактивности всех пятен бумажной хроматограммы.
216
Глава 6
6.4.2. Орреоеление раоиоактивности
с использованием сиинтилляционного счетчика [206, 300\..
Реагенты и аппаратура. Кюветы для подсчета,
стеклянные или поэтиленовые, диаметр 22 мм.
Сиинпиллятопы: 2.5-пиФенилоксазол (ППО): 1,4-6ис-2-(5-Фенил-
оксазолил)бензол (ПОПОП): диметил-ПОПОП: 2,5- бис -2-(S-tnpem - •
бутилбензоксазолил)тиофен (ППОТ). Поставляются фирмами "Pac-
kard”, "Picker” и ’’Beckman''.
Солюбилизатор: Бекман биосолъ?., формула BBS-3 ( Beckman
Bio-Solv, Formula BBS-3k
Диспергирующий реактив: карбосил — высоко дисперсный силика-
гель, образующий тиксотропный гель в сцинтилляционных растворах
(поставляют фирмы "Packard" и "Beckman").
Растворитель оля сиинтилляииочной смеси: толуол.
Меченые станоарты: тритилированный толуол, стандартные раст-
воры толуола-’4С в запаянных кюветах.
Жидкостный сиинпилляииинный спектрометр (фирмы " Beckman",
" Nuclear- Chicago" или "Packard Tr:carb") с тремя каналами, внешним
стандартом и печатающим устройством.
Методика. Для образцов липидов, растворимых в толуоле,
т. е. нейтральных липидов, используют следующую сцинтилляционную
смесь: а) 0.5% ППО и 0,05% ПОПОП (или 0,03% диметил-ПОПОП)
в толуоле. Для более полярных липидов, т. е. глико— и фосфолипидов,
используют смесь, состоящую из б) 5 г ППО, 0,3 г ПОПОП, 130 мл
метанола и 100 мл солюбилизатора биосольв в 1 л толуола. Для
гидрофильных фрагментов молекул липидов (глиперин, эфиры глицеро-
фосфата, сахара и т. д.) в водных или метанольно-водных растворах
используют смесь б) или смесь в) 10,5 г ППО; 0,45 г ПОПОП;
150 г нафталина; 1500 мл диоксана и 300 мл воды /300/ или
смесь г) 4,0 г ППОТ; 80г нафталина; 400 мл метилпеллозольва;
600 мл толуола и 35 мл воды. В кювету счетчика помешают необ-
ходимую аликвотную часть раствора липидов в хлороформе или вод-
ный оаствор гидрофильных фрагментов молекул липидов с активностью
не менее 100 имп/мин и упаривают раствооитель в токе азота.
(Пои объеме образна менее 100 мкл удалять растворитель нет не-
обходимости, если вносятся поправки на затухание.) Добавляют
15 мл соответствующей сцинтилляционной смеси, смешивают и опре-
деляют радиоактивность сцинтилляционным счетчиком. Если имеют
дело с пятнами или зонами на пластинках для ТСХ, адсорбент со-
скабливают в кювету, добавляют 15 мл смеси а) для нейтральных
липидов или смеси б) для полярных липидов. Можно также испольэо-
Раоиоизояопные меяооы в липиоологии
217
вать смесь в) или г), добавив 0,6 г карбосила*. Смесь тщательно
перемешивают встряхиванием и определяют радиоактивность /300/.
Радиоактивность пятен на бумажных хроматограммах можно опре-
делять в смеси б). В сцинтилляционную смесь вводят стандартный
меченый толуол и, постепенно увеличивая количество хлороформа,
определяют кривую затухания. Вносят поправку на затухание, фон
и на распад (разд. 6.4.1), Для определения затухания можно так-
же использовать набор стандартов, поставляемый фирмами "Amersham-
Scarle" ," Beckman","Packard".и вносить поправку методом соотношения
каналов 725/. Эффективность подсчета радиоактивности определяют
с помошью меченого толуола, переводят значения импульсов с по-
правкой на затухание и фон в абсолютные значения (расп./мин или
мкКи).
6.5. Радиоавтография и сканирование хроматограмм
6.5.1. Радиоавтография [206]
У добным методом обнаружения радиоактивных липидов на хрома-
тограммах является рациоавтография с использованием рентгенов-
ской пленки. Этот метод достаточно чувствителен, и с его помонг’г
можно обнаружить меченные ,4С или 4bS пятна с активностью все-
го лишь на 30—40 имп/мин выше фона при недельной экспозиции и
пятна, меченные32 Р, при экспозиции в течение 2—3 дней. Чтобы
можно было обнаружить пятна, меченные 3Н, количество импульсс-н
должно быть в 50-100 раз. а время экспозиции - 2-3 раза боль-
ше чем для пятен, меченных ’4 С.
Материалы. Светонепроницаемые картонные кассеты !" East-
man Kodak" ) для экспонирования рентгеновской пленки размен»
ром 20 х 25 см для бумажных хроматограмм и 35 х 45 см для
пластинок ТСХ.
Безопасная медицинская рентгеновская пленка, покрытая эмуль-
сией только с одной стороны, чувствительная к синему свету, раз-
мером 35 х 45 см и 20 х 25 см ("Eastman Kodak", "Picker Апясо",
Ilford" ИЛИ " Agfa-Gevaert" ;.
Методика. Лист рентгеновской пленки помешают в тем-—
ноте в кассету; высушенную бумажную хроматограмму накладыва-
ют лицевой сторонок на рентгеновскую пленку. Хроматограмму и
пленку скрепляют сверху и снизу скрепками. Накладывают второй
* Существует и другой-эффективный способ определения радиоактивно-
сти [ 181 ]. Адсорбент суспендируют и определение радиоактивности ведут не-
посредственно в растворе для жидкостного сцинтилляционного счетчика. В
качестве такого раствора в этом случае применяется аквазол (Aquasol. " New
England Nuclear Corp." ).
218
Глава 6
лист пленки на хроматограмму и также скрепляют (если уровень
радиоактивности на хроматограмме известен, второй лист пленки
можно не накладывать). Тщательно закрывают кассету и хранят ее
в шкафу или другом соответствующем месте иод ‘'прессом' , напри-
мер под деревянной доской, на которую кладут несколько тяжелых
книг. При рапиоавтографировании тонкослойных хроматограмм плас-
тинку помешают в кассету, тщательно закрывают пленкой, закрыва-
ют кассету и экспонируют, как описано для бумажных хроматограмм.
Внимание. Не накладывайте хроматограммы с пятнами, меченными
л2Р, на другие хроматограммы, так как {3- излучение пройдет через
кассету и оставит ложные пятна на других радиоавтограммах.
Длительность экспонирования зависит от уровня радиоактивнос-
ти пятна и энергии излучения изотопа. Для пятен, меченных’* С и
36 S, можно использовать следующую формулу:
106
Длительность экспонирования =
1
60
где длительность экспонирования измеряется в часах. Для32 Р вре-
мя экспонирования в два раза меньше, а для 3 Н - в три раза боль-
ше. чем для 14 С. После окончания выдержки кассету осторожно от-
крывают в темноте, удаляют скрепки со специальным приспособле-
нием и проявляют пленку методом, принятым в обычной фотографии.
Во избежание чрезмерного потемнения пленки время проявления
должно быть минимально иеоиходимым для проявления пятен (1-
2 мин при 20ЧЗ). Если длительность экспонирования оказалось не-
достаточной. пленку и хроматограмму вновь помешают в кассету
и продолжают экспонирование. Пленку проявляют и высушивают на-
кладывают на хроматограмму, совмещают по отверстиям от скрепок.
7 аким образом, можно точно определить положение радиоактивных
пятен на хроматограмме. Затем пятна вырезают, определяют радио-
активность торцевым или сцинтилляционным счетчиком (разд. 6.4.1
и 6.4.2 ) или элюируют радиоактивный материал (разд. 5.3.5.3).
6.5.2. Сканирование радио активных хроматограмм [2061
Для обнаружения радиоактивных пятен на пластинках и бумаж-
ных хроматограммах можно использовать имеющиеся в продаже
сканиметры. например приборы фирм "Desaga'', "NuclearChucafp", "Verian",
"Panax", "Bain) Atomic". Сканиметры состоят из газопроточного счет-
чика, соединенного с измерителем скорости подсчета и записываю-
щим устройством. Хроматограмма помешается на 'тележке*, кото-
рая движется под счетчиком с заданной скоростью. Радиоактивные
пятна соответствуют пикам на выписываемой кривой. Их можно лег-
ко определить путем сопоставления кривой с хроматограммой. Этот
Радиоизотопные методы в липидолоът 219
метоп гораздо более быстрый, чем радиоавтография, однако он не-
достаточно надежен при обнаружении пятен, уровень активности ко-
торых" менее .100 имп/мин.
Гораздо более чувствительно»/, прибором для сканирования плас-
тинок ТСХ является "Zonal Scraper1’, сконструированный Снайдером
/304/. Принцип его работы состоит в том, что адсорбент соскабли-
вается автоматически с зон шириной 1-5 мм в кюветы и его радио-
активность подсчитывается сцинтилляционным счетчиком. Указанный
прибор поставляется фирмой "Analabs Inc.”.
Г лава 7
ИДЕНТИФИКАЦИЯ ИНДИВИДУАЛЬНЫХ ЛИПИДОВ
И ЛИПИДНЫХ КОМПОНЕНТОВ
В силу сложности и разнообразия состава клеточных и тканевых
липидов различных организмов (и даже одного и того же организма)
невозможно выделить какой-либо опин метод, который приводил бы
к полной идентификации каждого липидного компонента смеси, по-
лученной из определенного источника. Несомненно, существуют еше
новые типы липидов, и их структуры необходимо будет определять
точными химическими методами. В этой главе авторы попытались
описать такие методы, которые, как уже доказано, могут быть по-
лезны в установлении строения и идентификации большинства типов
липидных молекул. Обзор этот никак нельзя считать полным, и в ря-
де случаев автор ссылается на соответствующие публикации, в кото-
рых дается детальное описание методик.
7.1. Нейтральные липиды
7.1.1, Отдельные классы нейтральных липиоое
Фракции нейтральных липидов, выделенных из суммарных кле-
точных липидов, включают углеводы, каротиноидные пигменты, эфи-
ры стеринов. воски, глицериды, стерины, высшие жирные спирты, ал -
дегиды, кетоны, жирные кислоты, витамины (спиртовые формы,1, хи-
ноны и т. д. Как уже говорилось в гл. 5, эти фракции чаше всего
получают либо фракционированием по-растворимости "(разд. 5.1), ли-
бо колоночной хроматографией на силикагеле (разд. 5.2.1.1, табл.
5.1) или ДЭАЭ-целлюлозе (разд. 5.2.3.1, табл. 5.2), либо препа-
ративной ТСХ, если фракции эти малы (разд. 5.4.6). В последнем
случае в качестве системы растворителей используют смесь хлоро-
форм - метанол - вода (65:35:5), в которой нейтральные липиды
идут с фронтом растворителя.
Следующим этапом является разделение нейтральных липидов на
перечисленные выше компоненты хроматографией на колонке с сили-
кагелем (.разд. 5.2.1.3 и табл. 5.1). На этой стадии идентификация
неитоальных липидов по мере элюирования их с колонки проводится
методом ТСХ в различных системах растворителей с использованием
Таблица 7.1
Разделение нейтральных липидов ТСХ
в различных системах растворителей3'
"Класс липидов •'f
система растворителей
2 Л’ | 4 | 5 1 6 i _
Углеводороды (.парафины 0,7-0,9 0,9- 0,98 0,95 0,9- 0.95
и олефины) Сквален 0.4 1.0 0,95 0,98 0,90 1.0
Каротиноиды 0,2-0,3 — — — —
7риапкиловые эфиры гли— — 0,90 0.85 а» — —
дерина Эфиры стеринов 0,90 0,94 0.85 0,80 0,90
Воски — 0,90 0,88 0,90 — —
О-Диалкилмот ;глипериды — 0,70 0,88 — — —
Алкев-1 -илдит лидери дь: — 0 65 0,82 — — —
О -А лкилдиглицериды — 0,55 0,78 — — —
Метиловые эфиры жирных 0,08 0,65 0,77 0,75 - —
кислот Высшие алифатические —. 0.63 — —
метилкетоны Высшие алифатические — 0,55 0,73 0,70
альдегиды Диметилапетали альдегидов =- 0,73 —.
Витамин К 0,07 0.55 — — — —
Т риглидериды — 0,3-0.4 0.60 0,70 0.60 0,82
Кофермент Q 0,02 0,25 - — — —
а-Токоферол * 0,19 — - — —
Жирные кислоты — 0.18 0,39 0.62 0,25 0,50
Высшие алифатические 0,0 0.15 0,30 0,50 — —
спирты Стерины 0,0 0,10 0,19 0.38 0,38 0.30
С—Диалкиловые эфиры 0,0 0,09 0,30 о» — -
глицерина 1 „3-Диглицериды 0,0 0.08 0,21 0.46 0.50 0,40
1,2 -Диг линери ды 0,0 0,08 0.15 0.41 0,45 0,25
1 -О-Моноалки ловые 0.0 0,0 0,03 0,14 — —
эфиры глицерина М оноглидериды 0,0 0,0 0.02 0,10 0,15 0.05
а) Величины Rf перечисленных соединений немного меняются по аб< ыют-
ной величине в зависимости от температуры, влажности, типа камеры и т.н.
Однако относительный порядок подвижности соединений будет таким, как он
указан-в таблице.
.Системы растворителей:/) гептан-бензол (9:1); 2} петролейный эфир
(т.кип. 60-70°С) - этиловый эфир - уксусная кислота (90:10:1)1209]; 3)петре-
лейный эфир — этиловый эфир — уксусная кислота (00:20:1) 1205]; 4) изопрон^
ловый эфир — уксусная кислота (96:4) и после этого растворитель 2 в том же
направлении (297]; 5.) этиловый эфир — бензол — этанол - уксусная кислота
(40:50:2:0,2) и затем этиловый эфир — гексан (6:94) [98]; 6) гептан— изопропи-
1овыи эфир - уксусная кислота (60:40:4) [ 421.
Обнаружение и идентификация
Специфические обнаружители ТС Xя'
1ненасы- 1шенные |соеди- ' нения !(OsO4) сложные эфиры (NH,OH- -FeCl3) стерины е-н FeCl3) альдеги- ды (ре- актив Шиффа — Hgtij кислоты (бром- крезо- ловый зеленый) вициналь- ные он (НЮ4 - реактив Шиффа)
Углеводороды (пара- + фины и олефины) Сквален + Т риалкиловые + эфиры глицерина сфиры стеринов + + -+ Воски ± + О-Диалкилмоноглине- t + риды 0—Алкилдиглицериды i + Алкен-1 -и лдиглидериды + + + (нейтральные плазма- логены) Метиловые эфиры жир- X +• ных кислот Высшие алифатические - кетоны Высшие алифатические i " ~ + альдегиды Витамин К + Триглицериды 1 + Кофермент Q + Жирные кислоты — + Высшие алифатические 1 спирты Стерины + + О-Диалкиловые эфиры ± — глицерина Диглицериды - + ... - 1-0-Моноалкиловые ± + эфиры глицерина 1-Моноглицериды i + +
а.1 Методики обнаружения см. в разд. 5.4.4; знак ± означает положительную
реакцию на ненасышенные связи только в высших алифатических соединениях.
Все классы нейтральных липидов можно обнаружить парами иода, родамином
6 Ж. дихлорфлуресцеином или сжиганием с H2SO4.
°) Ьолее подробные данные приведены в табл. 4.2. Спектры всех классов
нейтральных липинов по ИК-спектрам
Характеристические полосы поглощения^1) (v}, см-1
карбо- нильные соедине- ния (2,4- ДНФГ) ОН (3600; 3200) (~с (3020; 1650) сложный эфио (1740; 1160) альде- гиды С=О (1730) кетоны 0=0 в) (1715) СООН (17Ю; 2700) простой (1110) вини- ловый эфио (1250)
ХИНО-
ныП
(1665;
1295)
липидов содержат также интенсивные полосы поглощения для СН,- и СН3-групп
- при 2960-2850, 1465-1450 и 1375 см~’ (см. рис. 7.1).
в1Кетоны имеют также характеристические полосы поглощения в УФ-спект-
ре при 275 нм (см. также табл. 4.1).
ПДают характеристические полосы и в УФ-спектре (см. также табя. 4.1).
224
Глава 7
соответствующих стандартов и специфических обнаружителей. Иден-
тификация классов липидов, разделенных препаративной ТСХ, после
элюирования с пластинки проводится спектральными методами (УФ—,
И К- и ЯМР-спектроскопия).
В табл. 7.1 приведены данные ТСХ для большинства классов
липидов, а в табл. 7.2 указаны специфические обнаружители и ха-
рактеристические полосы ИК—спектров этих липидов. Инфракрасные
спектры некоторых характерных представителей нейтральных лици-
Рис. 7.1. Инфракра ле спектры некоторых классов липидов.
1 — сквалан; 2 — сквален; 3 — 6. 10, 14-траметилпентаоеканон-2; 4 — меишлпри-
станая,
И дектфикациа липидов
225
пов (углеводороды, кетоны, метиловые эфиры жирных кислот, дигли-
цериды моноглицериды, ди- и моноалкиловые эфиры глицерина) при-
ведены на рис. 7.1, и их ЯМР-спектры - на рис. 7.2. Характерис-
тические полосы поглощения функциональных групп приведены в
табл. 4.1 (УФ-спектры) и 4.2 (ИК-спектры). В табл. 4.3 указаны
химические сдвиги в ЯМР-спектрах липидов.
После того как определены классы нейтральных липидов, иден-
тификацию отдельных представителей каждого класса проводят, как
. . .... - Рис. 7.1. (продолжение)
5 — D-a-моностеарин; 6 — D-a-оюпадецилглицерин (батиловый спирт); 7 —
D-a ,($-дистеарин; 8 - D-a, fi-ди-О-октадеиилглицерин.
Рис. 7.2. ЯМР-спектры некоторых классов нейтральных липидов.
1 — сквалан; 2 — сквален; 3-6,10,14-приметилпенпадеканон-2;
Рис. 7.2. (продолжение)
4 — дигйОрофитилиодид [/73]; 5 — мепилпристанап; 6 — метилфшланат;
Рис. 7.2. (продолжение)
7 — D-а-моносяеарин; 8 — D-a-оияиюецилглицерин (бшпиловый сяиря); 9 — D~a,fl~
мстеарин; 10- D-a,&- ди-О-онтадецилглицерин;
Идентификация липидов
229
Рис. 7.2. (продолжение)
11 — бактериальный витамин МКр из И. cutirubrum [3251.
правило, методом ГЖХ или комбинированным методом ГЖХ - масс-
спектрометрия - ТСХ на пластинках со слоем силикагеля, пропитан-
ного азотнокислым серебром, для разделения соединений по степени
ненасыщенности. Разделение и идентификация индивидуальных стери-
нов или терпеноидов подробно рассматривается в обзорах Клейтона и
Маринетти /72, 216/.
7.1.2. Углеводороды
7.1.2.1. Разделение по типам углеводородных цепей
Разделение суммарной фракции углеводородов на насыщенные,
олефиновые, изопреноидные и каротиноидные углеводороды обычно
производят методом препаративной ТСХ следующим образом.
Образец наносят на промытую хлороформом пластинку размером
20 х 20 см со слоем силикагеля Н и проявляют смесью гептан - бен-
зол (9:1) /324, 325/. При работе с углеводородами листьев ТСХ
проводят в бензоле, причем проявление хроматограмм заканчивают,
когда фронт растворителя окажется на расстоянии 5 см от верхне-
го края пластинки. Хроматограмму высушивают и вновь проявляют
гексаном, при этом фронту растворителя дают подняться до 1 см до
края пластинки /14"9/. Полосы разделенных компонентов обнаружи-
вают парами иода или раствором родамина 6 Ж (разд. 5.4.4.1) и
после этого элюируют хлороформом. Зона, фронт которой движется
230
Глава 7
быстрее других, содержит алканы и алкены (фракция I ). За ней сле-
дует фракция II, содержащая изопреноиды (сквалены и т, ц.), и мед-
леннее всех перемещается зона (или зоны) каротиноидов (фракция III)
(см. табл. 7.1). В некоторых случаях можно наблюдать разделение
частично гидрированных скваленов (рис. 7.3).
Рис. 7.3. Разделение липидов
H.cutirubrum методом ТСХ на
силикагеле И (данные Торна-
бена и Кейтса, публикуются
впервые).
1 — сквален,2 — оигиоросква-
лен, 3 — тетрагидроенвален.
И дянтфииакия липидов
231
Чтобы разделить алканы и алкены, фракцию I хроматографиру-
ют-на препаративных пластинках с силикагелем, пропитанным азотно-
кислым серебром (разд. 5.4.1.3, 5.4.6), в системе этиловый эфир
-(10%) - гексан /148, 149/. Наименее полярная фракция-алканы;
за ней следуют по мере снижения К/ фракции, содержащие моноено-
вые и диеновые соединения и т. д.
Выделенные алканы разделяют на нормальные и разветвленные
(или циклические), используя молекулярное сито 5А (фирмы Апа-
labs", "Applied Science", "Chromatographic Specialties”, ’’Fisher"), ко-
торое представляет собой обезвоженные алюмосиликаты щелочных
металлов. Молекулярное сито задерживает молекулы с нормальными
углеводородными цепями /148, 243/. Разделение проводится сле-
дующим образом.
Раствор алкановой фракции в изооктане встряхивают с молеку-
лярным ситом 5 А при комнатной температуре и оставляют пример-
но на 12 ч. Иэооктановый раствор сливают, молекулярное сито про-
мывают несколько раз изооктаном, заливают гептаном и выдержива-
ют примерно 12 ч при комнатной температуре. Объединенные изоок-
тановые и гептановый растворы содержат только углеводороды с раз-
ветвленными цепями. Чтобы извлечь нормальные углеводороды, к
молекулярному ситу добавляют гептан и кипятят с обратным холо-
дильником примерно 12 ч. Выход нормальных углеводородов состав-
ляет в лучшем случае только 30%. В комбинации с ГЖХ этот метод мо-
жет быть весьма эффективен для отделения углеводородных компоненте
с разветвленными цепями от нормальных углеводородов /148, 149/.
Алканы и алкены можно также разделить, используя реакцию
каталитического гидрирования (разд, 5.5.5.3). Анализ метопом ГЖХ
исходных и гидрированных образцов показывает, что на хроматограм-
мах пики, соответствующие алканам (и алканам, содержащим цикло-
г.оопановые группировки), не изменяют своего положения после гидри
рования, в то время как пики алкенов перекрываются пиками соот-
ветствующих насыщенных углеводородов. Чтобы обнаружить циклсиро-
пановые алканы, гидрированные углеводороды обрабатывают раство-
ром брома в этиловом эфире и анализируют продукты бромирования
ГЖХ /44/ (см. разд. 5.5,5.3). Полученные хроматограммы сравни-
вают с хроматограммой исходной гидрированной смеси. Пики, исче-
зающие после бромирования гидрированной смеси, соответствуют
циклопропановым алканам. Изо— и антеизоалканы можно разделить,
окисляя их смеси KMnO<-H2SOA и проводя идентификацию ацетона
или соответственно бутанона-2 методом ГЖХ на порапаке 0^ (гра-
нулированный пористый полимер, поставляется фирмами "Analabe",
"Applied Science". "Chromatographic Specialties", "Supelco”) /239/.
Окончательно идентифицировать тип углеводородной цепи можно
с помощью комбинированного метода ГЖХ - масс-спектрометрия.
232
Глава 7
Отличное описание методики идентификации липидов методом масс-
спектрометрии дано в работе /222/.
7.1.2.2. Определение длины углеводородных цепей методом ГЖХ
Чтобы определить длину цепи индивидуальных компонентов, каж-
дый из типов углеводородов, выделенных описанным выше способом,
можно анализировать, используя либо только ГЖХ, либо объединяя
ГЖХ и масс-спектрометрию. При анализе углеводородов методом
ГЖХ целесообразно пользоваться следующими неподвижными фазами
/248/ (см. табл. 5.3).
а. Алканы: 1-5% SE-30 (метилсиликон) /7, 148, 149, 325/,
2% 0V-2 (диметилсиликон) /93/. Изо- и антеизоалканы разделя-
ют на капиллярной колонке с апиезоном L или игепалом СО 990
/324/.
б. Алкены: апиезон L(капиллярная колонка /324/, набивная
колонка /40/); 3-5% поли-1,3-диметоксипиклогексансукцинат /8/;
игепал СО 990 (капиллярная колонка) /325/.
в. Изопреноидные полиеновые соединения: 1О% апиезон Е, карбо-
вакс 20 М /40/: 2% 0V-1 /325/.
Анализ длины цепей большого набора углеводородов, встречающих-
ся в природных смесях, с помощью ГЖХ наиболее целесообразно про-
водить при программировании температуры (2-6 град/мин) в диапа-
зоне 120-230% и выше в зависимости от природы используемой
жидкой фазы. Для некоторых жидких фаз, таких, как игепал СО 990,
ГЖХ углеводородов с успехом можно проводить в изотермическом
режиме /325/.
Углеводороды с нормальной цепью и с одной боковой цепью,
а также моноеновые углеводороды можно легко идентифицировать
на различных неподвижных фазах по их времени удерживания или
по углеродному числу (разд. 5.5.5). Необходимо только провести
предварительную калибровку колонок с помощью стандартных смесей
углеводородов и установить СН,-фактор и другие факторы разделения
(табл. 5.4). Объединяя ГЖХ и мате-спектрометрию, можно подтвер-
дить правильность определения длины цепи, числа двойных связей и
степени разветвленности, установленные методом ГЖХ /222, 324/,
7.1.2.3. Установление положения и конфигурации двойных связей
Положение двойной связи в олефиновой цепи можно определить
несколькими способами.
с. Окисление смесью периодат-перманганат /7,337/.
Реагенты. Запасный раствор окислителя. 0,01 М раствор
Идентификация липиоов
233
перйодата натрия и 0,0025 М_раствор перманганата калия. 214 мг
NalO и 39,5 мг КМпО4 растворяют в 100 мл воды.
"Раствор карбоната наярил, 0,002 М. 21,2 мг Na?CO3растворяют
в 1ОО мл воды.
трет-Бртиловый спирт.
Методика. К раствору 1-5 мг углеводорода в 4 мл трет-
бутилового спирта добавляют 1 мл 0,002 М раствора карбоната
натрия, 2 мл запасного раствора окислителя и 1 мл воды. Реакци-
онную смесь интенсивно перемешивают 3 ч при 25°С и добавляют
твердый метабисульфит натрия до тех пор, пока не исчезнет окрас-
ка, обусловленная присутствием перманганата. Добавляют 1 мл 1 н.
раствора NeOH и упаривают бутиловый спирт в вакууме на ротор-
,но. испарителе. Чтобы удалить насыщенные углеводороды и ней-
тральные продукты, добавляют 5 мл воды и экстрагируют смесь
двумя порциями по 10 мл гексана или низкокипяшего петролейного
эфира. Сильно подкисляют водную фазу 6 н. H2S04 и экстрагируют
свободные жирные кислоты несколькими порциями гексана или петро-
лейного эфира по 5-10 мл. Упаривают растворитель в токе азота,
метилируют свободные жирные кислоты с помощью метанольного
раствора НС1 или диазометана, как описано в разд. 4.8.2 и 7.1.6.1
и анализируют их методом ГЖХ (разд. 7.1.6). На каждый моль мо-
ноенового соединения образуются два моля соответствующей жирной
кислоты ( в эквимолярных количествах), длина цепи которой прямо
указывает на положение двойной связи. Но если двойная связь на-
ходится близко к концу молекулы, то одна из кислот будет иметь
короткую углеродную цепь, и при длине цепи, меньшей чем Cg она
может быть потеряна, если не принять соответствующих мер. Таким
образом, с помошью ГЖХ следует определять только кислоты с бо-
лее длинной цепью. Этого будет достаточно для определения положе-
ния двойной связи при анализе индивидуального углеводорода. При
окислении смеси углеводородов такая ситуация может привести к не-
ясностям, которых можно избежать, окисляя только индивидуальные
углеводороды, разделенные препаративной ГЖХ.
б. Озонолиз—пиролиз—ГЖХ /40/.
Реагенты. Озон, Кислород, очищенный с помощью молеку-
лярного сита яинде 5 А, пропускают со скоростью 4 мп/с через
стеклянную трубку с внешним диаметром 9 мм. Озон образуется
под воздействием электрического разряда между проводом (который
соединен с катушкой Тесла и через боковой отросток пропущен внутр
трубки) и заземленной полоской алюминиевой фольги длиной 8 см,
находящейся на внешней стенке трубки. Охлаждения не требуется.
Выход озона 3 мл/мин.
Методика. На внешнюю протравленную поверхность стек-
лянной трубки 3 (внешний диаметр) х 7 мм наносят тонким слоем
образец олефина (1-10 мкг) и помешают ее в другую трубку боль-
234
Глава 7
шего диаметра, соединенную с генератором озона. Внешнюю трубку
заполняют чистым кислородом и охлаждают сухим льдом до -70°С,
после этого в течение 30 с через трубку пропускают озон, затем
отсоединяют катушку Тесла, прекращают подачу газа и оставляют
обоазен в смеси озон - кислород на 4 мин при -70°С. По оконча-
нии выдержки дают образцу нагреться до комнатной температуры
(в течение 6 мин), откачивают озон н трубку вместе с продуктами
озонолиза вводят в нагретый до 100 °C дозатор газожидкостного
хроматографа. Дозатор быстро закрывают завинчивающейся крышкой,
в течение 3 мин выдерживают колонку при комнатной температуре
и начинают элюирование пиролитических фрагментов продуктов озо-
нолиза при программировании температуры. Нормальные моноолефи-
ны при этом образуют два моля альдегидов, которые можно легко
идентифицировать ГЖХ. Длина их цепи, как и при окислении смесью
перйодат - перманганат, прямо указывает на положение двойной свя-
зи. Разветвленные и изопреноидные олефины расщепляются при этом
до смеси альдегидов и кетонов, идентификация которых требует при-
менения ГЖХ - масс-спектрометрии. Поскольку при использовании
этого метода фрагменты альдегидов или кетонов не теряются, то с
его помощью однозначно могут быть идентифицированы даже угле-
водороды с винильными и аллильными двойными связями. Этот ме-
тод успешно применялся для установления структуры серии изопр->-
ноидных углеводородов с 1—3 двойными связями, выделенных из
морского зоопланктона и рыб /40/.
В. Масс-спектромеприя О-иэопропилидендиола, полученного из олефина
/347;.
Реагенты. Растворитель, смесь абсолютных пиридина и
диоксана (1:8).
Раствор четырехокиси осмия, Ю' мг четырехокиси осмия раст-
воряют в 1 мл диоксана.
Раствор сульфита натрия в метаноле. 16г сульфита натрия
растворяют в 100 мл воды. Перед употреблением 1,5 мл раствора
разоавляют 5 мл метанола.
Л^етодика. К раствору 1 мг олефина в 0,2 мл смеси пи-
ридин - диоксан добавляют 0,1 МЛ раствора четырехокиси осмия (со-
держит 1 мг четырехокиси осмия). Оставляют смесь на 2 ч при
комнатной температуре, добавляют к ней 6 мл метанольного раст-
вора сульфита натрия, хорошо перемешивают и выдерживают при ком-
натной температуре 1 ч. Суспензию центрифугируют, супернатант
упаривают досуха в вакууме, остаток растворяют в эфире (при не-
обходимости центрифугирую! ) и упаривают досуха. Растворяют ос-
таток, представляющий собой диол, в 0,5 мл абсолютного ацетона,
добавляют 50 мг безводного сульфата меди и 1 ч при 50°С нагре-
вают смесь в пробирке, закрытой навинчивающейся крышкой с теф-
Идентификация липидов
235
лонов.ой прокладкой. Суспензию центрифугируют и супернатант, со-
держащий изопропилиден, подают непосредственно на колонку для
ГЖХ, соединенную с масс-спектрометром.
Обычно цис- олефины дают зритро- диолы, которые образуют
нкг-О-изопропилиденовые производные; кране -олефины дают прео-
диолы, которые образуют транс. -О-изопропилиденовые производные.
При проведении масс-спектрометрии изопропилиденовых произ-
водных расщепляется связь С-С в а-положении к диоксолаиовому
кольцу. Соотношение интенсивности пиков образующихся фрагментов
явно различается для цис- к трен с-изомеров, что позволяет опре-
делить как положение, так и конфигурацию двойной связи /222/.
. 7.1.2.4. Определение состава углеводородов,
полученных из различных источников
Основные углеводороды восков - секреций насекомых - состоят
в основном из- нормальных алканов с нечетным числом атомов угле-
рода (С _ С ); кроме того, в них содержатся, но в меньшем коли-
честве, нормальные цис- олефины с нечетным числом атомов угле-
рода (С 1 — Сз_) и следы разветвленных углеводородов /327/. Угле-
водороды поверхностных восков насекомых состоят главным образом
из изоалканов (С2д — С31) и других метилизоалканов (С33—С37) /141/.
В углеводородах восков листьев преобладают три гомологические се-
рии алканов: нормальные парафины (главным образом с нечетным
числом атомов углерода, С _С3 ) .изопарафины (главным образом
с нечетным числом атомов углерода, С2О-С33 ) и антеизопарафины
(главным образом с четным числом атомов углерода, С30—С34). Ва-
риации длины цепи и соотношения цепей с нечетным и четным
числом атомов углерода в этих трех сериях углеводородов найдены
у нескольких видов растений /178/.
Однако к настоящему времени исследованы углеводороды лишь
небольшого числа видов бактерий. Виды Sarema и Micrococcus со-
держат преимущественно серии моноолефинов с изо- или антеиэоуг-
леводородными цепями на обоих концах цепи и двойной связью около
центра цепи. Длина цели колеблется в пределах С23— С29, а соотно-
шение цепей с четным и нечетным числом атомов углерода зависит
от состава культуральной среды /8, 324/. В морских бактериях ь
сине-зеленых водорослях преобладают углеводороды п-С^и п-Д-<.,7
с примесями 7- и 8—метилгептапеканов /93. 249/. Пристан и фитан
также обнаружены в морских водорослях /249/, дегидросквален най-
ден в Staphylococcus aureus /312/, а сквален, дигидросквален й
тетрагидросквален - в Halobaclerium cutirubrum (см. рис. 7.3) /325/.
В морском зоопланктоне и рыбах обнаружены моно-, ди- и триоды
с 19 атомами углерода в цепи; эти соединения являются производ-
ными фитола /40/.
236
Глава 7
7Л.З. Высшие спирты
7.1.3.1. Получение производных спиртов
Длину и тип углеродной цепи высших спиртов определяют, про-
водя ГЖХ свободных спиртов или соответствующих производных,
а. Получение ацетатов.
R—ОН + (СН3С0) ,0 = R-0-COOCH3
М е т о дика. 1-10 мг высшего спирта растворяют в 0,5-
1,0 мл смеси уксусный ангидрид - абсолютный пиридин (1:2 по
объему), 15 мин нагревают при 37°С в закрытой пробирке или кол-
бе с боковым отростком, добавляют 5 мл воды и экстрагируют аце-
таты несколькими порциями петролейного эфира. Упаривают досуха
в токе азота, осадок сушат в вакуум-эксикаторе над КОН и раство-
ряют в нескольких каплях хлороформа. Раствор ацетатов анализиру-
ют методом ГЖХ.
б. Получение метохсипр.оизвооных I1A6;.
Ае,0
R—ОН + СН31 ——* R-OCH3
Методика. Раствор 1-10 мг спирта в 4 мл йодистого
метила нагревают с обратным холодильником, закрытым хлоркаль-
циевой трубкой в течение 3 ч в присутствии 50-100 мг окиси се-
ребра. Смесь разбавляют 4 мл этилового эфира, соли серебра от-
деляют центрифугированием и промывают осадок 1-2 мл эфира. Объе-
диненный супернатант упаривают в токе азота до небольшого объе-
ма (не досуха), разбавляют бензолом и вновь упаривают до объема
меньше 0,1 мл. Раствор метоксипроизводных анализируют методом
ГЖХ.
в. Получение триметилрилиловых (ТМС) эфиров /146/.
[(СН,), Si], NH
R—ОН + (CH3),SiCl ----—-------- ROSi(CH3)3
J пиридин
Методика. В пробирку со стеклянной пробкой или в колбу
с боковым отростком помешают 1-5 мг высшего спирта, 1 мл абсо-
лютного пиридина. 0,2 мл гексаметилдисилазана и 0,1 мл триметил-
хлорсилана (силилируюшие смеси поставляются фирмами "Analabs",
"Anplied Science", "Pierce","Supelco"). Смесь перемешивают встряхивани-
ем и выдерживают при комнатной температуре 1-2 ч. Разбавляют
смесь 5 мл гексана и 5 мл воды и экстрагируют несколькими пор-
циями гексана по 5 мл. Объединенный экстракт разбавляют бензо-
лом и упаривают досуха в токе азота. Остаток высушивают в вакуум-
И двнтифмация липидов
237
эксикаторе, растворяют в нескольких каплях хлороформа или гексана
и анализируют ТМС-эфиры ГЖХ.
7.1.3.2. Определение длины и типа углеводородной цепи
ГЖХ свободных спиртов, их ацетатов или метоксипроизводных
проводят на неполярных фазах типа апиезона L или М /91, 92/
или 0V 101 (метилсиликон) /240/, а также на полярных фазах,
например PBBS или PEGA.Насыщенные и ненасыщенные спирты
с нормальными и разветвленными цепями идентифицируют по време-
ни удерживания относительно стандартных спиртов как минимум на
двух различных неподвижных фазах, используя данные, приведенные
в табл. 5.4 и 5.5 (разд. 5.5.5). Иногда бывает полезно также
сравнить относительное время удерживания анализируемых углево-
дородов и метиловых эфиров жирных кислот (табл. 7.3).
Чтобы различить ненасыщенные и пиклопропаиовые спирты ме-
тодом ГЖХ, необходимо сравнивать хроматограммы этих веществ
с хроматограммами их продуктов гидрирования и бромирования
(разд. 5.5.5.3). Сложные смеси следует разделять на насыщенные
и ненасыщенные углеводороды, проводя разделение ацетатов этих
смесей методом ТСХ на силикагеле, пропитанном азотнокислым се-
ребром (разд. 5.4.1.3). Положение двойной связи определяют окис-
лением Н10д—КМпО4 (разд. 7.1.6.4).
В литературе описана идентификация ГЖХ ряда спиртов со слож-
ными углеводородными цепями: спиртов терпенового ряда /147/,
стеринов /101, 354/, витамина А и витамина D /83, 87/. Окон-
чательное подтверждение структуры спиртов проводится методом
масс-спектроскопии /222/. Интерпретируя масс-спектры высших
спиртов, следует иметь в виду, что при высокой температуре может
произойти дегидратация, в результате чего повысится интенсивность
пика иона с массой М-18, а не пика молекулярного иона (рис. 7.4,6).
Вицинальные алкандиолы идентифицируют, используя ГЖХ - масс-
спектрометрию их триметилсилиловых эфиров и изопропилиденовых
производных (разд. 7.1.2.3).
7.1.4. Высшие кетоны и хиноны
Систематическая идентификация семейств кетонов (например,
2-кето-, 3-кето-, 4-кетоалканов и т. д.) методом ГЖХ до настоя-
щего времени не проводилась. Значение времени удерживания метил-
кетона на колонке с PBDS по отношению к соответствующему угле-
водороду (C-0/CHj)составляет 6,2, как и по отношению к соответ-
ствующему альдегиду (табл. 5.5). Следовало бы ожидать, что по ме-
ре того, как кетогруппа будет смещаться к центру углеродной цепи.
238
Глава 7
коэффициент будет уменьшаться. Однако идентификация высших кето-
нов методом ГЖХ - масс-спектрометрия не представляет особой труд-
ности, поскольку масс-спектры кетонов поддаются однозначной интер-
претации /222/.
Одно из семейств высших кетонов, в частности метилкетоны,
можно идентифицировать по их способности вступать в галоформную
т/е
Р и с. 7.4. Масс-спектры липидов.
а — метилстеарая, мол. вес. 298 /222/', б — дигиорофитол /173Г, в — витамин
МК* /325/.
И дентифинацггя липидов
239
реакцию (^см. ниже), в результате которой образуются карбоновые
кислоты, у которых число атомов углерода меньше на единицу, чем
у соответствующих кетонов. Метиловые эфиры этих кислот иденти-
фицируют ГЖХ.
7,1,4.1. Определение метилкетонов
путем превращения их в карбоновые кислоты
R—СО-СН3
NaOl
NaOH
IT-t
— CHI3 + RCOOH
CH3OH/HC1
RCOOCH3
. . Реагенты. Раствор иода, 1 и. Раствор гидроокиси натрия в
метаноле, 3 н. Бисульфит натрия, 10%-ный. Серная кислота, 6 н.
Методика. Раствор 1-10 мг кетонов в 1 мл метанола
помещают в колбу с боковым отростком, добавляют 0,5 мл раствора
иода и 0,5 мл метанольного раствора гидроокиси натрия. Через
15 мин смесь подкисляют 0,3 мл 6 н. серной кислоты, обесцвечива-
ют иод, добавляя 0,3 мл раствора бисульфита натрия, добавляют
5 мл метанола, чтобы заполнить боковой отросток колбы, и экстра-
гируют кислоты петропейным эфиром. Экстракт упаривают в токе
азота, метилируют свободные кислоты и анализируют (см. разд.
7.1.6).
7.1.4.2. Идентификация хинонов (витамин К и кофермент Q)
После выделения препаративной ТСХ витамина К или кофермен-
та Q (разд. 7.1.1) соединения этого класса идентифицируют по
их УФ-спектрам; характеристические полосы поглощения нафтохино-
нов и бензохинонов приведены в табл. 4.1, некоторые из них исче-
зают после восстановления гидридом бора. Характеристические по-
лосы поглощения этих соединений в ИК- и ЯМР-спектрах приведе-
ны в табл. 4.2 и 7.2 (ИК) и табл. 4.3 (ЯМР) (см. также рис.
7.2). Окончательную идентификацию изопреноидной боковой цепи,
подтверждение нафтохинонового (витамин К) или бензохинонового
(кофермент Q) типа структуры проводят методом масс-спектромет-
рии. На рис. 7.4 (спектр 3) в качестве примера приведен масс-
спектр витамина К.
7.1.5. Шысшие. альдегиды
7.1.5.1. Получение производных
Альдегиды можно анализировать и идентифицировать как таковые
с помощью ГЖХ. Однако учитывая их нестабильность - легкость,
с которой они полимеризуются и окисляются, - целесообразнее по-
лучать их стабильные летучие производные /92, 114, 115/.
240
Г лака 7
а. Получение оиметилацеталей.
RCHO + 2СН3ОН RCH (ОСН3)2 + Н2О
Методика. Альдегиды или плазмалогены превращают в ди-
метилацетали (ДМА), как описано в разд. 4.8.3 (см. также /114,
115/), и хранят в хлороформном растворе при -10°C, если нельзя
пронести анализ сразу же после получения.
6. Получение спиртов и ацетатов спиртов /92/.
LiAlH. (СН,СО)?О nnrru
RCHO ------ RCri,OH -Нйрйдйн— RCH5OOCCH3
Методика. 1-10 мг свободных альдегидов растворяют
в 1 мл абсолютного этилового эфира, охлаждают до —2О°С, добавля-
ют при перемешивании магнитной мешалкой 3 мл 3%-ного раствора
алюмогидрида лития в абсолютном эфире и выдерживают 2 ч при
-20°С. Чтобы разложить избыток алюмогидрида лития, по капля».!
добавляют 90%-ный водный метанол. Осадок отделяют центрифугиро-
ванием и промывают эфиром. Объединенные супернатанты разбавля-
ют бензолом и упаривают досуха в вакууме. Сухой остаток высших
спиртов ацетилируют, как описано в разд. 7.1,3.1.
в. Окисление оо жирных кислот и метилирование послеоних.
СгО сн,он
лено RCOOH —RCOOCH3
СН,СООН HCI
М е т о дика. Этот метод можно применять только для на-
сыщенных альдегидов, поскольку ненасыщенные альдегиды могут
окисляться и по двойным связям. Диметиладетали необходимо сна-
чала превратить в свободные альдегиды. Делают это следующим об-
разом. Около 50 мг (или меньше) вешества растворяют в 2 мл
90%-ной уксусной кислоты, помешенной в колбу с боковым отрост-
ком. Добавляют 0,1 мл 2,5%~ного_метанольного раствора HCI и на-
гревают смесь 1 ч при 90-10042. Разбавляют раствор 2-3 мл во-
ды и экстрагируют альдегиды несколькими порциями петролейного
эфира. Объединенный экстракт упаривают досуха. Растворяют альде-
гидный остаток в 1,5 мл ледяной уксусной кислоты, подогревают
раствор до 40°С и небольшими порциями добавляют концентрирован-
ный раствор окиси хрома в ледяной уксусной кислоте. Реактив до-
бавляют с небольшим избытком. Припивают 3-3,5 мл воды и экстра-
гируют смесь бензолом. Упаривают досуха бензоп в токе азота в дру-
гой колбе с боковым отростком, растворяют остаток в смеси 4 мл
метанола и 0,5 мл 3 н. водного NaOH и экстрагируют все нейтраль-
ные продукты реакции петролейным эфиром. Подкисляют метанольную
Идентификация липидов
241
фазу. 6 н. НС1, экстрагируют свободные жирные кислоты петролей-
ным эфиром и метилируют их, как описано в разд. 4.8.1. и 7.1.6.
7.1.5.2. Определение длины и типа углеродной цепи
Хроматографирование ДМА проводят на колонке с апиезоном, L
(10%). Перед нанесением жидкой фазы носитель следует обработать
шелочыо /114/. Диметилацетали можно также анализировать на по-
лярных фазах, например PBDS, РЕЗА и EGSS-X. (табл. 5.3), но при
этом полярная фаза не должна содержать следов кислотного ката-
лизатора, например п-толуолсульфокислоты, используемого при син-
тезе этой фазы. Свободные альдегиды можно анализировать на упо-
мянутых выше полярных фазах, а также на колонке с апиезоном , L,
не обработанном щелочью. Следует избегать проводить газожидкост-
ное хроматографирование диметилацеталей на кислых неподвижных
фазах, например на полиэтиленгликольсукцинате, обработанном фос-
форной кислотой, так как диметилацетали при этом превращаются
в алкен-1-иловые эфиры /203/.
Определение длины и типа цепи альдегидов методом ГЖХ сле-
дует проводить как минимум на двух различных неподвижных фазах,
используя факторы разделения, приведенные в табл. 5.4 и 5.5. Зна-
чения относительного времени удерживания (табл. 7.3) для метило-
вых эфиров жирных кислот в равной степени применимы и для аль-
дегидов или ДМА. Эти данные следует использовать при идентифика-
ции нормальных насыщенных и ненасыщенных и разветвленных угле-
водородов. Идентификация альдегидов, содержащих циклопропановые
группировки, должна быть подтверждена ГЖХ веществ до и после
гидрирования и бромирования (разд. 5.5.5.3 ), а также ГЖХ на капил-
лярной колонке /108/. Разделение ненасыщенных альдегидов мето-
дом ТСХ на силикагеле, пропитанном нитратом серебра, и опреде-
ление положения двойных связей проводят, как описано для жирных
кислот (разд. 7.1.6). Окончательная идентификация альдегидов и
ДМА-производных осуществляется по их масс-спектрам.
7.1.6. Жирные кислоты
7.1.6.1. Определение свободных жирных кислот
Обычно свободные жирные кислоты составляют только относи-
тельно небольшую часть (~1 - 3%) нейтральной фракции большин-
ства природных липидов. Высокое содержание свободных жирных кис-
лот свидетельствует о ферментативном гидролизе клеточных липидов
в ходе выделения. Лучшим способом разделения свободных жирных
кислот и нейтральных липидов, как уже говорилось в разд. 7.1.1,
является препаративная ТСХ. Следует помнить, что природные липи-
ды почти никогда не содержат метиловых или этиловых эфиров жир-
Таблица 7.3
Относительное время удерживания метиловых эфиров жирных кислот
на различных неподвижных фазах для ГЖХ, вычисленное по метилпальмитату
Метиловые эфиры жирных кислот Относительное время удерживания, вычисленное по метилпальмитату ( tn/t, в)
название обозначение а) апиезон L0’ PEGA6' PDE^> PBDS
197°C 180°С 203°C 180°Сп> 17О°СГ)
Мирисголеат 14:19 0,39 0,615 — 0,58 -
И зомиристат i -14:0 0,365 — - 0,44 —
Миристат 14:0 0,42 0,51 0,60 0,51 0,485
Д-Оксимиристат Д-ОН-14:0 0,84 — — 2,85 —
12-Метилтетрадеканоат j а-15:0 - 0,58 — 0,65 —
Пентадекаиоат 15:0 0,66 0,705 0,78 0,71 0,70
Гексадекатриеноат 16:36,9’’2 0,80 1,78 — 1,63 -
Гексадекадиеноат 16:29,12 0,81 1,35 1,42 1,28 —
Пальмитолеат 19:19 0,90 1,15 1,17 1.14 1,10
Изопальмитат 1-16:0 0,86 •м — 0,87 0,86
Пальмитат 16:0 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00
Гептадеценоат I 17:19 1,31 1,62 — 1,59 1,58
9,10-Метиленгексадеканоат су -17:0 1,38 — - 1,63 —
15-Метилгексадеканоат /-17:0 — — — 1,23 1,22
14 —М етилгекса деканоат а-17:0 1,38 — — 1,28 1,29
Гептадеканоат 17:0 1,52 1,40 1,28 1,41 1,43
а -Линоленат I8.39j2.i5 1,93 3,51 — 3,24 3,51
Y-Линоленат I8.36.9.12 — — — 3,12
Линолеат 18:29-’2 1,9 2,69 2,40 2,57 2,72
Олеат 18:19 2,03 2,21 1,93 2,20 2,25
ци С. — »Л ‘ сч! Л т 18:111 — — — — 2,30
Стеарат. 18:0 2,36 1,97 1,66 1,97 2,04
Лактобациллат су -19:0 3,20 — 3,18
Нонадеканоат 19:0 3,58 2,78 2,14 2,78 2,92
Эйкоэапентаеноат 2O:55-e-’i.u.i7 3,48 8,5 — 7,73 8,55
Арахидонат 20:45Л-1’’и 3,48 6,56 5,95 6(70
Арахиноат 20:0 5,6 3,87 2,76 3,82 4,20
’ i -изо; а - антеизо; су - пиклопропан; положение двойной связи дано надстрочными числами; все ненасы
шейные эфиры являются цид -изомерами.
б)Данные Джеймса /142/.
в)Набивная колонка (данные Кейтса, публикуются впервые).
г'Капиллярная колонка /2/.
244
Глава 7
ных кислот, и если таковые обнаруживаются при ТСХ липинов, то,
следовательно, свободные жирные кислоты этерифицируются в про-
цессе экстракции или другой обработки, связанной с использовани-
ем метанола или этанола. При проведении анализа методом ГЖХ
эти эфиры следует объединять со свободными жирными кислотами.
Свободные жирные кислоты (и их метиловые или этиловые эфи-
ры), которые присутствуют только в смеси неомыляемых липидов
(углеводороды, высшие спирты, стерины, алкиловые эфиры глицери-
на и т. д.), можно отделить обработкой метанольным раствором
Na ОН, как описано в разд. 4.8.2. Выделенные таким образом сво-
бодные жирные кислоты метилируют кипячением в метанольном
растворе НС1 (разд. 4.8.1) или обработкой диазометаном, какопи-
сано ниже.
Метилирование.
Р е а г е н т ы. Диазометан, свежеприготовленный. В круглодон—
ной колбе емкостью 100 мл растворяют 3 г КОН в 4 мл воды при
перемешивании на магнитной мешалке. Охлаждают раствор в бане
со льдом, добавляют сначала 25 мл этилового эфира и затем пор-
циями 2 г нитрозометилмочевины. К колбе присоединяют дефлегма-
тор без охлаждающей рубашки и холодильник с приемником, заме-
няют ледяную баню водяной, подогретой до 30—40°С, и перемеши-
вают смесь и отгоняют пиазометан в приемник, куда предваритель-
но помешают примерно 25 мл этилового эфира, охлажденного на
бане со льдом. Внимание! Не отгоняйте весъ оиаэометан или этиловый
эфир. Диазометан растворяется в эфире, окрашивая раствор в
ярко-желтый цвет. Чтобы удалить следы воды, в приемник можно
положить гранулы КОН. Помните, что оиаэометан токсичен и взрывоопа-
сен. Работать с ним слеоует только под тягой.
М е т о д и к а. 1—2 мг (или меньше) вещества растворяют
в 0,5-1 мл этилового эфира, добавляют несколько капель метано-
ла и затем по каплям раствор диазометана, пока смесь не окрасит-
ся в желтый цвет. При добавлении диазометана должны выделять-
ся пузырьки газообразного азота. Смесь выдерживают 15 мин при
комнатной температуре, после чего растворитель удаляют, пропус-
кая через раствор ток азота, добавляют этиловый эфир и опять
пропускают ток азота до полного удаления избытка диазометана.
Остаток растворяют в нескольких каплях хлороформа и анализируют
ГЖХ, как описано ниже.
Если свободные жирные кислоты нельзя предварительно отделить
методом ТСХ, их можно анализировать в обшей массе нейтральных
липидов по следующей методике.
Определенное весовое количество суммарных или нейтральных
липидов обрабатывают диазометаном, как описано выше. Добавляют
определенное количество (по весу) чистого метилового эфира эйко-
И денпификаиил липидов
245 .
зановой кислоты (или другоге- соответствующего метилового эфира -
стандарта) и анализируют смесь ГЖХ. Содержание свободных жир-
ных кислот (в процентах) можно подсчитать следующим образом:
Содержание свободных жирных кислот =
Сумма площадей пиков смеси Вес стандарта
=— ---------------------------- х — --------------—- х ЮО,
Площадь пика стандарта Вес смеси
вес стандарта и вес смеси определяется в миллиграммах.
Если вес образна не известен, вес свободных жирных кислот
(мг) можно подсчитать так:
Вес свободных кислот =
Сумма площадей пиков смеси
= ——---------------------------- х Вес стандарта,
Площадь пика стандарта
вес стандарта определяется в миллиграммах.
7.1.6.2. Определение длины и типа углеводородных цепей
ГЖХ метиловых эфиров жирных кислот (получение суммарных
эфиров жирных кислот см. в разд. 4.8,; получение эфиров свободных
жирных кислот см. в разд. 7.1.6.1.) следует проводить как на непо-
лярных (апиезон L, SE-30 ) так и на полярных неподвижных фазах
(PBDS.PEGA, PDEGSh т. д.).
Обычно для предварительной идентификации нормальных насыщен-
ных или ненасыщенных, а также изо- и антеизокислот достаточно
сравнить время удерживания метилпальмитата и время удерживание,
стандартов на двух (или более) неподвижных фазах. В табл. 7.3 при-
ведено относительное время удерживания наиболее часто встречаю-
щихся жирных кислот на нескольких неподвижных фазах. При экстра-
поляции и интерполяции данных табл. 7.3 целесообразно пользовать-
ся факторами разделения для отдельных гомологических рядов, приве-
денными в табл. 5.4 и 5.5; таким путем можно рассчитать относи-
тельное время удерживания для гомологов, не приведенных в перечне
(разд. 5.5.5).
Идентификацию эфиров насыщенных, разветвленных, ненасыщенных
жирных кислот, а также жирных кислот с циклопропановой группиров-
кой в боковой цепи, проведенную методом ГЖХ, следует подтвердись
ГЖХ смесей до и после гидрирования и бромирования (разд. 5.5.5.3).
При сравнении хроматограмм исходных и гидрированных смесей ста-
новится очевидным, что после гидрирования положение пиков, соот-
ветствующих эфирам насыщенных, разветвленных жирных кислот, а
также жирных кислот с циклопропановой группировкой в боковой пепи,
246
Глава 7
остается неизменным, в то время как пики, соответствующие эфи-
рам ненасыщенных жирных кислот на хроматограммах исходных об-
разцов, совмещаются с пиками, соответствующими насыщенным жир-
ным кислотам. Сопоставление хроматограмм бронированных и ис-
ходных образцов показывает, что после бромирования смеси пики
эфиров ненасыщенных и циклопропановых жирных кислот исчезают
/44/. В результате более активного гидрирования в ледяной уксус-
ной кислоте с катализатором Адамса циклопропановое кольпо раз-
мыкается и образуется соответствующий эфир с нормальной цепью
и смесь двух возможных изомеров с разветвленными цепями /162,
223/. Ниже описаны методики дальнейшей идентификации типов жир-
ных кислот.
а. Насыщенные нормальные метиловые эфиры.
Метиловые эфиры насыщенных нормальных жирных кислот мож-
но разделять и идентифицировать по длине углеводородной цепи, ис-
пользуя распределительную ТСХ с обращением фаз. Хроматографи-
рование проводят на силанизированном силикагеле или на силикаге-
ле, пропитанном минеральным маслом (разд. 5.4.1.4), в системах
ацетонитрил - уксусная кислота - вода (70:10:25 по объему) или
уксусная кислота - вода (85:15 по объему). Хроматограммы на
силанизированных пластинках обнаруживают концентрированной сер-
ной кислотой с последующим обугливанием; если же используются
пластинки, пропитанные минеральным маслом, то для обнаружения
применяется смесь иод - а- циклодекстрин /204, 205/. Недоста-
ток этого метода состоит в том, что данный насыщенный метило-
вый эфир не отделяется ни от моноенового эфира, алифатическая
пепь котового длиннее на два атома углерода, ни от диенового эфи-
ра, алифатическая пепь которого длиннее на четыре атома углево-
да, и т. д. Следовательно, таким путем не удается добиться раз-
деления пар: метилпальмитат и олеат, метипмиристат и линоле-
ат и т. д. В связи с этим анализируемую смесь следует предва-
рительно разделить методом ТСХ на силикагеле, пропитанном нит-
ратом серебра (разд. 7.1.6.3).
Более убедительные результаты можно получить с помощью
препаративной ГЖХ на колонке с апиезоиом L (10%) при 190°С.
Колонку соединяют с делителем потока, установленным перед
плазменно-ионизационным детектором, так, чтобы 10% потока га-
за-носителя с веществом проходило через детектор. Остальную часть
потока газа-носителя с метиловыми эфирами жирных кислот, соот-
ветствующими отдельным пикам на хроматограмме, собирают в кол-
лекторе фракций фирмы "Packard" (разд. 5.5.4 и рис. 5.7,6 ) или
какого-либо другого типа (рис. 5.6), который присоединяют непо-
средственно к выходу из колонки. Полученные индивидуальные ме-
тиловые эфиры жирных кислот можно идентифицировать с помощью
Идентификация липиоов
247
ИК--(табл. 4.2; 7.2) или ЯМ₽-спектроскопии (табл. 4.3, рис. 7.2)
или масс-спектрометрии. Наиболее совершенным и точным является
комбинированный метод ГЖХ - масс-спектрометрия /222/, так как
путь распаца поп электронным ударом всех метиловых эфиров жир-
ных кислот с неразветвленной цепью одинаков и характеристические
пики отличаются только сдвигом массовых чисел, связанным с раз-
личной длиной углеродной цепи (см. рис. 7.4, масс-спектр метил-
стеарата).
б. Эфиры с разветвленной цепью.
Эфиры изо- и антеизокислот и других жирных кислот с развет-
вленной цепью можно дифференцировать после расщепления их
КУ1пОд — H2SO4. Образующиеся при этом ацетон, бутанон-2 или дру-
гой кетон-2 анализируют ГЖХ на колонке с порапаком QS /239/.
Эфиры жирных кислот с разветвленной цепью можно также легко
идентифицировать масс-спектрометрически /222/. В частности, ком-
бинация ГЖХ на капиллярной колонке с масс-спектрометрией явля-
ется идеальным способом разделения и идентификации эфиров изо-
и антеизокислот жирного ряда /324/,
в. Метиловые эфиры с циклопропановым кольцом в алифатической цепи и
оругие циклические эфиры.
Позиционные изомеры эфиров пиклопропановых кислот иденти-
фицируют методом ГЖХ на капиллярной колонке /108/. Каталити-
ческое гидрирование циклопропановых кислот приводит либо к рас-
щеплению одной связи циклопропанового кольца, в результате ко-
торого образуются равные количества двух кислот с метипизоалка-
новой цепью, либо к растеплению двух связей что приводит к об-
разованию кислоты с нормальной углеводородной цепью, которая
содержит на один углеродный атом меньше, чем исходная циклопро-
пановая кислота. Все три образующиеся кислоты легко идентифици-
ровать в виде метиловых эфиров комбинированным метопом ГЖХ -
масс-спектрометрия; этим способом легко определить все позицион-
ные изомеры циклопропановых кислот /223/. Эфиры циклопентано-
вых и циклопентеновых кислот можно также идентифицировать по
данным масс-спектрометрического анализа /70/.
?. Эфиры оксикислот.
Эфиры оксикислот определяют ГЖХ по увеличению относитель-
ного времени удерживания на полярных фазах по сравнению с ие-
полярными фазами (табл. 5.5 и 7.3). Эфиры оксикиспот можно
также анализировать ГЖХ в виде метоксипроизводных, ацетатов
или ТМС-эфиров (разд. 7.1.3.1). Производные оксикислот имеют
значительно меньшее время удерживания на полярных фазах, чем
эфиры оксикислот со свободными оксигруппами. Относительное вре-
мя удерживания эфиров оксикиспот на полярной фазе сильно зави-
сит от положения гидроксильных групп в цепи (табл. 5.5), что мо-
248
Глава 7
жет быть успешно использовано для точного установления положе-
ния гидроксильной группы; заключительную идентификацию все-таки
проводят с помощью масс-спектрометрии. Под электронным ударом
оксикислоты подвергаются характеристическому распаду по связи
С-С в а-положении по отношению к гидроксильной группе /223/.
7.1.6.3. Выделение индивидуальных эфиров
Прежде чем опрепелять положение двойной связи, смесь эфиров
жирных кислот необходимо сначала разделить на насыщенные, моно—
еновые, диеновые, триеновые и т. д. углеводороды фракционирова-
нием ТСХ на силикагеле, пропитанном азотнокислым серебром, а
затем разделить на индивидуальные эфиры препаративной ГЖХ/255/.
а. ТСХ на силикагеле, пропитанном нитратом серебра /230, 352/
Реагенты и аппаратура. Препаративные плас-
тинки с тонким слоем силикагеля, пропитанным нитратом серебра. Плас-
тинки с силикагелем, сооержащим 20% AgNO^, Готовят 12,5%-ный
раствор нитрата серебра в 28-30%-ном растворе гидроокиси ам-
мония или в воде. Суспензию 30 г силикагеля G в 60 мл получен-
ного раствора наносят на пластинку.
Пластинки с силикагелем, содержащим 5% AgNOy Наносят на
пластинки суспензию 28,5 г силикагеля G в 60 мл 2,5%-ного
водного раствора нитрата серебра. Пластинки сушат на воздухе
30 мин и активируют при 110°С еще 30 мин (см. разд. 5.4.1.3).
Хроматографирование на силикагеле, пропитанном нитратом се-
ребра. проводят в смеси хлороформ - этанол (99:1 по объему) для
пластинок с 20% AgNO,, или этиловый эфир — петролейиый эфир
(т. кип. 40-60°С) (5:95) для пластинок с 5% AgN03.
М ето дика. Образец метиловых эфиров жирных кислот на-
носят на пластинку и хроматографируют в соответствующей системе
растворителей (разд. 5.4.2 и 5.4.3). Обнаруживают зоны опрыски-
вания хроматограммы родамином 6Ж или 2' ,7'- дихлорфлуореспином
и элюируют обнаруженные вещества этиловым эфиром. Полученные
Фракции содержат эфиры следующих типов жирных кислот (перечис-
лены в порядке уменьшения подвижности при ТСХ"): насыщенные,
моноеновые, диеновые, триеновые и т. д. Этим методом разделяют-
ся тс- и трвкс-изомеры /230, 255, 352/.
б. Препаративная ГЖХ /255/.
Каждую из фракций ненасыщенных эфиров жирных кислот, полу-
ченную описанным выше методом, разделяют в соответствии с дли-
ной цепи препаративной ГЖХ на колонке (2,4 м х 6 мм) с PBDS
или полиэтиленгликольсукпинатом при 190°С. На выходе из колонки
хроматографа помешается разделитель потока, соединенный с ката-
рометром или пламенно-ионизационным детектором. Фракции, соот-
ветствующие пикам индивидуальных метиловых эфиров, собирают,
И дентификаиия липиаов
249
пропуская ток газа—носителя с~веществом из разделителя (через
детектор проходит приблизительно 10% потока) через хлороформ (в
пробирку добавляют примерно 5 мл хлороформа). Можно также ис-
пользовать для этой пели коллектор фракций (разд. 5.5.4). Выход
разделенных веществ составляет примерно 90%.
7.1.6.4. Определение конфигурации и положения
двойных связей
Определение положения двойной связи в молекулах эфиров инди-
видуальных жирных кислот проводят описанным ниже методом.
а. Окисление смесью перйодат — перманганат /8/. Окисление эфи-
ров жирных кислот по этой методике проводят так же, как окисление
углеводородов, см. разд. 7.1.2.3. При окислении эфиров жирных кис-
лот образуются моно— и дикарбоновые кислоты, которые можно лег-
ко идентифицировать ГЖХ на подходящей полярной или неполярной
фазах.
б. Озонолиз с последующим восстановлением /238, 255/.
Реагенты и аппаратура.
Растворитель. Пентан, обработанный озоном при —20°С, промы-
тый сначала серной кислотой, затем водой и перегнанный.
Катализатор. Палладий на угле.
Генератор озона Боннера /Ы/. См. также разд. 7.1.2.3.
Методика. Готовят примерно 5 мл 0,03 М раствора озо-
на в пентане (раствор голубого цвета) при —65°С, пропуская в тече-
ние 10 мин кислород, содержащий 2% озона, через очищенный пентан
К раствору образца (10-100 мкг) в 2 мл пентана, охлажденному
до -65°С, добавляют избыток раствора озона (об избытке свидетель-
ствует неисчезающая голубая окраска) и выдерживают 5 мин при
-65°С. После этого удаляют избыток озона и кислорода, пропуская
через раствор азот, переносят пентановый раствор озонидов в аппа-
рат для микрогидрирования и восстанавливают озонидные группы ка-
талитическим гидрированием.
Полученные восстановлением озонидов многоатомные спирты
можно анализировать методом ГЖХ как таковые или в виде ацетатов
и триметилсилиловых эфиров (получение см. в разд. 7.1.3.1). Хро-
матографирование проводят на колонке с 3% силикона на носителе
газохром Р при программировании температур в диапазоне 60-
190°С со скоростью 5 град/мин. Метильная группа, находящаяся .
в конце цепи полиненасышенного эфира, дает первичный спирт, внут-
ренние двойные связи — диол, а карбоксильная группа на конце угле-
родной цепи эфира - полуэфир. Например, метилолеат дает по одному
молю ионанола-1 и метил—9—оксинонаиоата, метиллинолеат — по од-
ному молю гексанола-1, пропандиола-1,3 и метил-9-оксинонаноата,
и, наконец, а-линоленат - 1 моль пропанола-1, 2 моля пропандио-
ла-1.3 и 1 моль 9-оксинонаноата.
250
Глава 7
Применяется и другой метод озонолиза, при котором озониды
переводят в альдегиды и анализируют ГЖХ /17 6, 255/.
в. Масс-спектрометрия 0-изопропилендиолов, полученных из олефинов
/224/.
Реагенты. Те же, что и в разд. 7.1.2.3 (в).
Методика. К раствору 1 мг метилового эфира ненасы-
щенной жирной кислоты в 0,2 мл смеси пиридин - диоксан (1:8)
прибавляют 0.2 мл диоксанового раствора OsO^, содержащего 2 мг
OsO . Через 2 ч добавляют 6 мл суспензии сульфита натрия, кото-
рую получают, смешивая 8,5 мл 16%-ного раствора сульфита нат-
рия и 2,5 мл метанола. Смесь центрифугируют, супернатант упари-
вают в вакууме досуха, растворяют остаток в этиловом эфире,
центрифугируют и вновь упаривают растворитель в вакууме. Остаток
растворяют в 0,5 мл ацетона и в течение 2 ч нагреваю - с 50 мг
Сц50д при 50°С. После этого суспензию центрифугируют и супер-
натант вводят непосредственно на колонку для ГЖХ, соединенную
с масс-спектрометром. Как и изопропилиденовые производные дио-
лов, полученных из алкенов, соответствующие производные ненасы-
щенных эфиров жирных кислот расщепляются при проведении масс-
спектрометрического анализа по связям С-С в а-положении к ди-
оксолановому кольцу. Масс-спектры иис- и трап с- изомеров отли-
чаются интенсивностью пиков, а не массовыми числами образовав-
шихся фрагментов /222/.
7.1.7. Воски
При выделении и идентификации восков приходится иметь дело
со сложными смесями, которые, помимо восков, содержат углеводо-
роды, эфиры стеринов, глицериды и т. д. Поэтому методы анализа
следует модифицировать в зависимости от состава смеси нейтра 1ь-
ных липидов, полученных из различных источников. Как правило,
идентификация включает предварительное разделение нейтральных
липидов на колонке с силикагелем (разд. 5.2.1.3, табл. 5.1), при
этом фракцию сложных эфиров элюируют смесью гексан - эфир
(09:1), бензолом /179/ или смесью гексан — хлороформ (9:1; 4:1)
/328/, а затем методом препаративной ТСХ в бензоле выделяют
Фракцию чистых эфиров одноатомных спиртов жирного ряда(Л^
.0,65-0,70) /17 9, 327/ или методом ТСХ в системе гексан -эфир
(95:5) ( Rг 0,28—0,36) выделяют диэфиры высших алкандиолов и
оксикислот /100/. Полученные воски анализируют, используя ИК—
(табл. 4.2) и ЯМР-спектроскопию /328/, а также подвергают омы-
лению. Моноэфиры при этом дают по 1 молю высших спиртов и жир-
ных кислот, диэфиры - по 2 моля жирных кислот и 1 молю алканди-
ола или по 1 молю высших спиртов, жирных оксикислот и нормаль-
ных жирных кислот.
И дентификация липидов
251
При достаточном количестве материала на этой стадии пелесооб-
разно разделить фракцию восков по длине их цепей на индивидуаль-
ные компоненты. В этих целях используют ГЖХ в следующих вари-
антах: моноэфиры (С ~С ) разделяют на колонке с 3% SE-30
при 335°С и скорости газа-носителя 400 мп/мин /179/, диэфиры
(Сд0-Св0) разделяют на колонке (30 х 0,012 см) с 1,5% 0У_Ю1
на хромосорбе G (100-200 меш, промыт кислотой, обработан
ДМСО) при программировании температуры от 300 до 400°С в те-
чение 16 мин при скорости газа-носителя (гелия) 35 мл/мин. Ко-
лонки стандартизуют для определения длины цепи соответствующими
синтетическими эфирами нормальных высших спиртов и кислот. По-
сле этого каждый индивидуальный компонент смеси восков омыляют
(разд. 4.8.2) и выделенные алифатические спирты и кислоты (кис-
лоты превращают в метиловые эфиры) идентифицируют ГЖХ, как
описано в разд. 7.1.3 и 7.1.6 соответственно. Как правило, из-за
малого количества материала омыляют всю фракцию восков и ана-
лизируют методом ГЖХ смесь спиртов и кислот. Строение индиви-
дуальных компонентов восков вычисляют исходя из статистического
распределения спиртов и кислот в восках /17 9/. Полученные ре-
зультаты следует проверять масс-спектрометрией фракций негидро-
лизованных восков или комбинированным методом ГЖХ - масс-спек-
трометрия. Кислоты с разветвленными цепями, например кислоты
восков сальной железы птиц /244/, также следует идентифициро-
вать комбинированным методом ГЖХ - масс-спектрометрия.
В последнее время публикуется много материалов, посвященных
изучению состава восков, полученных из различных природных ис-
точников. Более подробная информация о восках содержится в сле-
дующих статьях: воски животных /240/, воски насекомых /141,
327, 328/, воски растений /178/ и воски морских организмов
/235/.
7.1.8. Глииериоы
7.1.8.1. Определение моно-, ди- и триглицеридов
У казанные три класса глицеридов легко можно выделить из ней-
тральных липидов хроматографией на колонке с силикагелем (разд.
5.2.1.3, табл. 5.1) и очистить препаративной ТСХ, используя сис-
темы растворителей, приведенные в табл. 7.1 (системы 3-5).
Более эффективного разделения 1,2- и 1,3-диглинеридов можно до-
биться с помощью препаративной ТСХ на силикагеле G, пропитан-
ном борной кислотой (25 г силикагеля G суспендируют в 40 мл
Энного водного раствора борной кислоты, сушат и активируют)
сначала в системе растворителей этиловый эфир — петролейный
эфир (т. кип. 40—60°С) (8:92), затем в системе растворителей
252
Глава 7
этиловый эфир - петропейный эфир /47 /. Можно использовать так-
же систему гексан - этиловый эфир (1:1) /70/, Разделение методом
ТСХ можно также проводить на силикагеле G в системе раствори-
телей гептан-изопропиловый эфир-уксусная кислота (60:40:4)/42/.
1 - и 2-Моноглипериды разделяют на силикагеле, пропитанном бор-
ной кислотой, используя смесь хлороформ-ацетон (94:4) /320/.
С помощью указанных методов можно добиться хорошего разделения
без изомеризации моно- и диглицеридов.
Чистоту фракций выделенных глицеридов проверяют с помощью
ИК- (рис. 7.1, табл. 4.2) и ЯМР-спектрометрии (рис. 7.2, табл.
4.3), а также определяют молекулярные соотношения жирные кисло-
ты: сложноэфирные группы: глицерин (3:3:1; 2:2:1; 1:1:1 для три-
ди— и моногпиперинов соответственно). При этом пользуются мето-
дами, описанными в разд. 4.8.2, 4.4 и 4.1.2.3.
Каждый класс глицеридов следует также характеризовать с по-
мощью ГЖХ их суммарных жирных кислот (разд. 7.1.6.2). После
чего, используя ТСХ на силикагеле, пропитанном серебром, и ГЖХ,
каждый класс глицеридов разделяют на молекулярные компоненты,
различающиеся по длине цепи и степени ненасыщенности.
7.1.8.2. -Разделение методом ТСХ по степени ненасыщенности /26/
а. Разделение триглииериоов.
Разделение триглицеридов по степени ненасыщенности можно
проводить методом ТСХ на силикагеле Gr пропитанном 10-30%
нитрата серебра, в следующих системах растворителей: хлороформ-
уксусная кислота (99,5—0,5, по объему) /26/, хлороформ-метано
(99,2:0,8%) /185, 256/или бензол—хлороформ (9:1) /267/. Сп’-
мошью указанных систем растворителей насыщенные, моно-, ди-,
три— и тетраеновые глицериды легко можно отцепить как друг от
друга, так и от компонентов с более высокой степенью ненасыщен-
ности. Последние компоненты остаются на старте хроматограммы,
однако их можно разделить с помощью систем белее полярных рас-
творителей, в частности хлороформ - метанол (97:3) или хлороформ-
метанол - вода (65:25:4), если в глицеридах содержится от 6 до
12 двойных связей /267/. Разделение геометрических и конфигура-
ционных изомеров триглицеридов, а также изомеров триглицеридов -
производных различных жирных кислот, имеющих одинаковое число
двойных связей, можно также проводить методом ТСХ на силикаге-
ле, пропитанном нитратом серебра /183 , 267/. Разделенные ком-
поненты обнаруживают дихлорфпуоресцином и элюируют с силикаге-
ля смесями хлороформ - метанол (9:1), метанол - этиловый эфир
(1:1) или метанол - этиловый эфир - вода (5:5:1) /183/.
И деняификаиия липиоов
253
6; Разделение моно- и диглицеридов,
Ди- или моноглицериды можно разделять, как и тэиглинериды,
методом ТСХ на силикагеле, пропитанном нитратом серебра, после
превращения их в ацетаты, которое осуществляется тем же спосо-
бом, что и превращение триглицеридов. Ацетилирование моно- или
диглицеридов производится следующим образом /185/. К помешен-
ному в пробирку со стеклянной пробкой раствору 1-10 мг моно-
или диглицерида в 0,1 мл сухого пиридина (перегнанного над ВаО)
добавляют 0,25 - 0,5 мл уксусного ангидрида и выдерживают смесь
при комнатной температуре 12 ч. Упаривают смесь в токе азота,
ацетаты выделяют ТСХ на силикагеле Н в системе растворителей
пстролейный эфир - этиловый эфир (3:1) и элюируют ацетилирован-
ный глицеридный компонент хлороформом или эфиром.
7.1.8.3. Разделение по молекулярному весу или
длине цепи /185/
Аналитическое или препаративное разделение моно—, ди- и три-
глицеридов в настоящее время можно осуществить с помощью ГЖХ,
используя методики, разработанные Куксисом. В настоящем разделе
дается лишь краткое изложение этих методик, подробно они описаны
в статье Куксиса» /185, .
Как правило, триглицериды разделяют по суммарному числу ато-
мов углерода в жирнокислотных остатках. Число двойных связей при
этом мало влияет на разделение на неполярных фазах. Исключение
составляют триглицериды с шестью и более двойными связями. Гли-
цериды, отличающиеся лишь двумя атомами углерода, легко поддают-
ся разделению. Моно- и дигпицериды также можно разделить, прово-
дя газожидкостное хроматографирование их ди- и соответственно
моноацетатов. Таким способом осуществлено разделение 1- И 2-моно-
глицеридов и 1,3— и 1.2-диглицеридов и их ацетатов.
Аналитическую ГЖХ триглицеридов или ацетатов моно- и дигли-
церидов проводят на сравнительно коротких колонках (46-51 см х
х 6 мм) с 1-3% неполярных неподвижных фаз (силиконовые полиме-
ры SE-30, QF-1 и JXR) на хромосорбе W или газохроме A, R и Q
(60-80 или 100—120 меш) при программировании температуры в
диапазоне 17 5—350°С (со скоростью 1-4 град/мин). Препаративная
i ЖХ выполняется так же, как и аналитическая ГЖХ, отличие состо-
ит лишь в том, что препаративное разделение проводится на колонке
(cl см х 6 мм) с 5% SE-30 или 3% JXR. Кроме того, на выходе из
колонки устанавливается делитель потока, который направляет неболь-
шую часть фракции в пламенно—ионизационный детектор. Остальную
•Высокотемпературная ГЖХ суммарных липидов, триглицеридов и дигли-
шри.дов детально рассматривается в обзорной статье Куксиса [Kuksis А..
1'ette. Seifen, Anstrichmittel, 75, 517 (1973) ]. - Прим, перее.
254
Глава 7
часть фракции собирают вручную или с помощью автоматического
коллектора /185/. Метиловые эфиры жирных кислот каждого из
глицеридных компонентов, полученные в результате метанолиза
(разд. 4.8.1), затем анализируют ГЖХ, как описано в разд. 7.1.6.2.
7.1.8.4. Стереоспецифический анализ триглицеридов /46, 47/
В результате проведенных в последние годы исследований было
установлено, что жирные кислоты в триглицериде распределяются
не статистически между тремя гидроксильными группами молеку-
лы глицерина, а стереоспепифически, т. е. гидроксильные группы
при первом и третьем атомах углерода глицерина не одинаковы, что
можно установить ферментативными методами. Метод анализа жир-
ных кислот в каждом положении молекулы глицерина разработан
Брокерхоффом /46, 47/. С помощью этого метода при анализе фрак-
ций ТСХ на силикагеле, пропитанном нитратом серебра, или при ана-
лизе ГЖХ триглицеридов, полученных описанным в предыдущем раз-
деле метопом, можно определить стереоспецифическую структуру
триглицеридов природных жиров (свиного сала и кукурузного масла
/70/, жира женского молока /43/ и жира коровьего молока /42.
48/).
Методика стереоспепифического анализа/45, 46/, усовершенство-
ванная Кристи и Моором /70/, состоит в следующем. Триглицериды
обоабатывают этилмагнийбромидом и получают смесь 1,2-. 2,3- и
1.3-диглииеридов. Методом ТСХ на силикагеле G, пропитанном бор-
ной кислотой, выделяют 1,2- и 2,3-диглипериды и, обработав их
фенилдихлорфосфатом в пиридине, получают фосфатидилренолы, кото-
рые под действием змеиного яда отщепляют жирные кислоты, нахо-
дящиеся в положении 2. Жирные кислоты, находящиеся в положении
1, определяют, анализируя образующиеся лизофосфолипиды. Жир-
ные кислоты в положении 3 подсчитывают по разности. Жирные кис-
лоты в положении 2 определяют так же, анализируя моноглицериды,
образующиеся под воздействием липазы на первоначальную смесь
глиперидов. Подробное описание используемых методик дается в ра-
ботах Брокерхоффа /46, 47/, а также Кристи и Моора /70/.
7.1.9. Алкиловые эфиры глицерина /301 /
7.1.9.1. Определение алкиловых и алкен-1-илрвых
эфиров /302/
Природные типы простых эфиров глицерина, встречающиеся в
нейтральных липидах животных тканей, представлены главным обра-
зом О-алкилдиглицеридами и О-алкен-1-илдиглипернцами (нейтраль-
ные плазмалогены/, содержащими лишь следы 0-алкиповых и 0-ал-
Идентификация лигтоое
255
кен-1 -иловых эфиров глицерина. Первые два типа соединений со-
держатся в триглицеридных фракциях, получаемых при хроматогра-
фировании нейтральных липидов на колонке с силикагелем (табл.5.1).
Полное разделение простых эфиров глицерина производят методом
препаративной ТСХ на силикагеле G в системе растворителей Пет-
ре лейный эфир - этиловый эфир - уксусная кислота (90:10:1)
(табл. 7.1). за которой следует повторная ТСХ в системе петро-
пейный эфир - бензол (95:5) /207/. Фракция нейтральных плаз-
малогенов располагается на хроматограмме между фракциями алкил-
диглицеридов и диапкипмоноглицеридов. Она обнаруживается в виде
желтого пятна после опрыскивания пластинки 2,4-динитрофенилгид-
разином. Нейтральные плазмалогены идентифицируют методом ТСХ:
хроматографирование проводят дважды в одном направлении в сис-
теме петролейиый эфир - этиловый эфир (95:5). После этого плас-
тинку в течение 5 мин подвергают воздействию паров концентриро-
ванной соляной кислоты, которую для этой цели помещают в плос-
кую кювету. В результате такой обработки плазмалоген расщепля-
ется, образуя альдегиды и диг.тицериды. Высушенную над КОН хро-
матограмму проявляют во втором направлении в системе петролей-
ный эфир - этиловый эфир (80:20). Пятна обнаруживают обуглива-
нием /207/. После элюирования с силикагеля этиловым эфиром раз-
деленные алкиловые эфиры глицерина: а) анализируют на со-
держание алкиловых эфиров (разд. 4.4), альдегидов (разд.
4.10) и глицерина (разд. 4.1.2.3); б) снимают ИК-спектры.
которые должны содержать интенсивные полосы поглощения сложно-
го (17 35 и 1180 см-’) и простого эфира (1110 см-1) для 0-ал-
килдиглицеридов; полосы поглощения сложного эфира и цис- винилово-
го эфира (167 0, 1250 и 730 см-i) для О-алкен-1-илдиглицеридов
(табл. 4.2 и 7.2, рис. 7.1); в) снимают ЯМР-спектр, который со-
держит сигналы химических сдвигов, характерных для СН./групп,
расположенных при простых эфирных связях (рис. 7.2, табл. 4.3).
7.1.9.2. Получение О-алкил- и О-алкен- 1-илглицеридов
/321,353/
Ацилалкиповые эфиры превращают в свободные алкиловые эфиры
глицерина гидрогенолизом апильных и фосфатных групп алкилфосфа-
тидов с помощью LiAlH . Этот метод применим также к плазмало-
генфосфатидам (см. разд. 7.2.1.3).
Реагент ы.Алюмогидрид лития. Приблизительно 50 мг
I.iAlH растворяют в 10 мл этилового эфира, предварительно высу-
шенного над LiAlH . Смесь используют не центрифугируя.
Уксусная кислота, 4%-ная. 4 мл ледяной уксусной кислоты раз-
бавляют водой цо 100 мл.
Методика. К раствору 3-5 мг хроматографически одно—
256
Глава 7
родной фракции нейтральных липидов или фосфолипидов в 0,5 мл
этилового эшира, помешенному в пробирку емкостью 15 мл со стек-
лянной пробкой, добавляют 3 мл раствора LiAlH4 (5 мг/мл). Про-
бирку соединяют с обратным холодильником с хлоркальпиевой труб-
кой и кипятят 30 мин. Осторожно добавляют 3 мл воды, 3 мл 4%-
ной уксусной кислоты и 6 мл этилового эфира. Энергично встряхи-
вают смесь, центрифугируют и удаляют эфирную фазу пастеровской
пипеткой. Водную фазу промывают еше двумя порциями эфира по 6 мл.
Объединенный эфирный экстракт разбавляют бензолом и упаривают
досуха в токе азота. Растворяют продукты восстановления (высшие
спирты, 0-алкил- и О-алкен-1-иловые эфиры глицерина) в хлоро-
форме и разделяют ТСХ на силикагеле G в системах растворителей
этиловый эфир-30%-ный раствор аммиака (100:0,25) или этило-
вый эфир - вода (100:0,5). О-Алкил- и 0—алкен-1 -чиповые эфиры
глицерина хорошо разделяются в этих условиях Hr 0,16 и 0,26 со-
ответственно. Хроматограммы высушивают на воздухе, обнаружива-
ют серной кислотой с последующим обугливанием и определяют ко-
личество каждого простого эфира глицерина денситометрическим
анализом (разд. 5.4.5.1). Для количественной опенки строят кали-
боовочную кривую по известному количеству простого эфира глице-
рина. Алкиловые эфиры глицерина разделяют препаративной ТСХ, об-
наруживают дихлорофлуореснином и элюируют этиловым эфиром. Моно-
алкиловые эфиры глицерина можно также определить количественно
перйодатным расщеплением (разд. 4.1.3) /321/.
7.1.9.3. Определение длины углеродной цепи алкильных
заместителей
а. О-Алкен~1-иловые эфиры.
Алкильные заместители этой группы отшепляют с помощью кис-
лотного гидролиза /11/. С этой целью 1,5 мл раствора винилового
эФира (0,1-2 мг) в этиловом эфире встряхивают 1-2 мин в пробир-
ке объемом 15 мл со стеклянной пробкой с 1 мл концентрированной
НС1. Отделяют водную фазу центрифугированием и экстрагируют ее
один раз эфиром и один раз гексаном. Объединенный экстракт промы-
вают водой, чтобы удалить возможные слепы кислоты, разбавляют
бензолом и упаривают досуха в токе азота. Растворяют остаток в
эфире и анализируют альдегиды препаративной ТСХ в системе раство-
рителей гексан — этиловый эфир (80:20). После этого альдегиды
анализируют ГЖХ (разд. 7.1.5).
6. О-Алкиловые эфиры.
О-Алкиловые эфиры глицерина можно анализировать как таковые
методом ГЖХ на короткой (0,5 м) колонке с 1-3% SE-52 при
220°С и высокой скорости газа-носителя (давление газа на входе
в колонку 2,1 кг/см2) /165, 173/.
Идентификация липидое
257
Указанные эфиры можно также анализировать в вине апетатов
или производных ТМС (см. палее). Моноалкиловые эфиры рекомен-
дуется, опнако, анализировать в виде менее полярных производных,
например диадетатов (получение см. в разд. 7.1.8.2), ТМС-эфиров
/207, 352/ (разд. 7.1.3.1), 2,3 -О -изопропи ли ценовых производ-
ных /207, 321/ или диметоксипроизводных /121, 146/ (разд.
7.1.3.1). Кроме того, для этой цели можно также использовать
алкоксиапетальдегиды /207 / и трифтораиетаты /352/. Для иденти-
фикации алкиловых эфиров можно применять ГЖХ алкилиодидов или
алкилхлоридов, образующихся при растеплении алкиловых эфиров
11CI или ВС1 соответственно /173/.
• . 3
Газохроматографический анализ диалкил-, алкиланил- или моно-
алкиловых эфиров в виде ацетатов или ТМС-зфиров проводя! на ко-
лонке (70x0,4 см) с 1% 0V-1, нанесенным на газохром Q (100-
120 меш), при программировании температуры в интервале 150-
275 °C со скоростью примерно 5 град/мин на приборе, модернизи-
рованном для ГЖХ соединений с высоким молекулярным весом
(разд. 7.1.S.3) /350/. ТМС—производные моноэфиров можно также
анализировать на колонке с 5% апиезона L на хромосорбе W (60-
80 меш) при 250°С /207, 352/. Трифторапетаты или изопропили-
□еновые производные моноэфиров анализируют на колонке с 15%
F.GSS-X на газохроме Р (100-120 меш) при 170°С /207, 352/.
И зопропили ценовые производные можно также анализировать на ко-
лонке с 20% PEGS на газохроме Е ПрИ 210°С /207/ или с 15%
TEGS на анакроме АВ (60—70 меш) при 175°С /321/. Димет-
оксипроизводные моноэфиров можно анализировать на колонке с 35%
PEGS на кизельгуре (60-80 меш) при 243°С /121/ или на колон-
ке с 10% PBDS на газохроме А при 180°С /146/. Методика ана-
лиза ГЖХ этих и других производных 0-алкиловых эфиров подробно
описана Снайдером /302/. В соответствии с этой методикой выпол-
нен целый ряд анализов алкиловых эфиров глицерина, полученных из
самых различных природных липидов /207, 303. 301/.
7.2. Фосфолипиды
7.2.1. Глицерофосфаяиды
Приступая к идентификации этой сложной и разнообразной rimr—
пы липидов, весьма полезно сначала провести предварительный ана-
лиз исследуемой липидной смеси. По мнению автора, хроматография
на бумаге ватман 3 ММ и 1 М, пропитанной кремневой кислотой,
и обнаружение компонентов смеси специфическими и обычными ре-
агентами (разд. 5.3) является эффективным и, как правило, надеж-
ным метопом. Это не значит, что другие методы, например ТСХ, ху-
же; многие добиваются таких же или даже лучших результатов с ее
258
Глава 7
помощью. Однако в соответствии с собственным опытом автор счи-
тает. что хроматография на бумаге препставляет собой более гиб-
кий и простой способ.
Клеточные липиды, выделенные из различных источников, обыч-
но различаются по составу фосфолипидов и других полярных липи-
дов, поэтому полезно будет привести данные о некоторых смесях
природных липидов, состоящих из наиболее распространенных фосфо-
липидных компонентов.
7.2.1.1. Предварительная идентификация полярных липидов
методом бумажной хроматографии
а. Липиды животного происхожоенил.
На рис. 7.5 приведены хроматограмма и радиоавтограмма ме-
ченных 32Р липидов клеток почек теленка, культивированных in
vitro в присутствии ортофосфата -32Р. Клетки экстрагировали, как
описано в разд. 3.5. Суммарные липиды анализировали хроматогра-
фией на бумаге, пропитанной кремневой кислотой ^>азд. 5.3.1 -
5.3.3). В табл. 7.4 указан цвет пятен, количественный и качест-
венный состав фосфолипидов. Хроматограмма (рис. 7.5) свидетель-
ствует о хорошем разделении основных (лецитин, фосфатидилэтанол-
амин. сфингомиелин) и примесных компонентов (фосфатипилсерин,
Фосфатидилинозит и кардиолипин). Однако следует заметить, что
лизофосфатидилэтаноламин и сфингомиелин не разделяются в этих
условиях так же. как плазмалогенфосфатидилэтаноламин и плазмало-
генФосФатидилхолин не отделяются от соответствующих диацильных
производных (табл. 7.4).
6. Липиды растений,
Сложная смесь липидов, получаемая при экстракции листьев,
не поддается полному разделению на индивидуальные компоненты
хроматографией на бумаге, пропитанной кремневой кислотой. Более
эффективная методика включает предварительное разделение на ко-
лонке с силикагелем смесями хлоррформ-метанол 4 с возрастающим
содержанием последнего, см. разд. 5.2.1.1 и 5.2.1.2). После это-
го полученные фракции легче разделить хроматографией на бума-
ге. как показано на рис. 7.6. Характеристика окраски пятен и ко-
личественный состав приведены в табл. 7.5.
Следует отметить, что некоторые компоненты, в частности фос-
Фатидилинозит, сульфохиновозилдиглиперид и фосфатидилглицерин,
фосфатипилсерин и фитосфингозилглюкоцереброзиды, разделить этим
методом до сих пор не удалось Для их разделения следует исполь-
зовать: повторное хроматографирование на колонке, осаждение аце-
тоном, разделение методом противоточной распределительной хрома-
тографии и тонкослойную хроматографию (разд. 5.4).
ИдемпшЬинаиил липидов
259
На рис.. 6.3 и 6.4 приведены радиоавтограммы липидов, кото-
рые могут- служить примером анализа фосфо-, глико- и сульфолипи-
дов растений с использованием радиоактивных изотопов 32Р,’*С и
36S соответственно.
в. Липиды микрооргаяизмов.'
На рис. 7.7 показаны хроматограммы
липидов дрожжей Candida livolvtica (мезо-
фильный штамм, культивированный при 25 и
10°С), грамположительных бактерий Bacil-
lus cereus и грамотрицательных бактерий
Serratia marcescens . В табл. 7.6-7.8 по-
казано, как проводилось обнаружение эти?:
хроматограмм, и приведены данные иденти-
фикации компонентов смесей липидов.
При сравнении хроматограмм бактериаль-
ных липидов и липидов животных тканей,
растений и дрожжей (рис. 7.5—7.7) прежде
всего обращает на себя внимание тот факт,
что в бактериальных липидах отсутствует
лецитин и содержится много фосфатидилэта-
ноламина. Фосфатидилглиперин также принад-
лежит к числу основных компонентов; он
встречается и как таковой, и в виде О-амино-
адильного производного (липоаминокислоты) -
фосфолипида, впервые найденного в бактери-
ях /200/. На рис. 7.8 показана хромато-
грамма ди-С—фитаниловых эфиров глицерина,
выделенных из сильно галофильных бактерий;
эта хроматограмма сильно галофильных бак-
терий будет рассматриваться в разд. 7.2.1.3.
7.2.1.2. Разделение и идентификация
полярных липидов методом ТСХ
Главными преимуществами ТСХ при иден-
тификации фосфолипидов и других полярных
липидов являются высокая разрешающая спо-
собность (в особенности при двухмерной ТСХ)
и возможность легкого получения с помощью
препаративной ТСХ разделенных компонентов
в количествах, достаточных для последующей
химической идентификации. Методика коли-
чественного и качественного анализа поляр-
ных липидов методом ТСХ в одном и двух
направлениях подробно описана в работах
ф а к- ю w ю — С 1 1 1 1 J 1 J 1 1 ! А У
Родамин 6ж з2р
Рис. 7.5. Радиоавто-
грамма меченных 32Р
липидов клеток почек г
ленка (см. табл. 7.4)
[163].
260
Глава 7
Таблица 7.4
Хроматографический анализ фосфолипидов клеток почек
теленка"' /163/
Номер пятна (рис. 7.5) i.-,. Рода- мин 6Ж Обнаружи- тель липи- дов, со- держащих холив Нин- гид- рин Обнару- житель плаз- малоге— нов г> Г . /0 от об- щего П редварителъная и дентификапи я
2 0,27 0,34 Синий Синий Следы Следы 6 Не идентифицирован ФосФатидилинозит
3 0,40 Желто- оран- жевый + Следы Следы 16 Сфингомиелин и слепы лизофоарати- дилэтаноламина
4 0,48 Желтый + — 4- 45 Лецитин (диацильное производное и плаз- малоген)
5 0,53 Синий — + + 8 Фосфатидилсерин (дианильвс- произ- водное и плььмало- ген;
6 0.62 Желтый - + Слабая реакция 21 Фосфатидилэтанол- амин
7 0,69 Синий — — — 3 Дифосфати ди лг ли - церин (кардиоли- пин ;
8 0,88 Синий - — • - 1 Фосфатидная кис- лота
9 0,95- 1.0 Желтый - — - 0 Нейтральные ли- пиды
Хроматографирование проводилось на ватмане ЗММ, пропитанном
кремневой кислотой, в системе диизобгтилкетон-уксусная кислота-вода
(40:25:5) (раза. 5.3.1-5.3.3). Применявшиеся для обнаружения реактивы
приведены в разд. 5.3.4.
°*Методика анализа рассматривается в разд. 5.З.Т.
/267, 272. 275, 276, 297/. В табл. 7.9 приведены значе-
ния Rr различных полярных липидов, полученные при проведе-
нии ТСХ в нескольких системах растворителей, а также ука-
зана характерная окраска пятен компонентов. На рис. 7.9
приведены в качестве примера двухмерные тонкослойные хрома-
Идентификация липиоое
Ни с. 7.6. Хроматограмма фракций липидов листьев стелющихся бобов (281].
Хроматографирование проводилось на бумаге, пропитанной кремневой кисло-
той. Предварительное разделение на фракции велось на колонке с силикагеле?
(см. текст): фракции I и И элюировались 2 и 3,5 объемами смеси хлороформа
с метанолом (5:1); фракции III и IV - 2 и 4 объемами смеси хлороформ-мета-
нол (1:1); фракция V — метанолом. Более подробные данные о методике хрома
тографирования и идентификации пятен приведены в табл. 7,5.
тогоаммы липидов мозга и почек. Данные, приведенные в
табл. 7.9 и на рис. 7.9, показывают, что с помощью ТСХ,
в частности с помощью двухмерной ТСХ /272, 276/, можно
осуществить разделение, идентификацию и количественный ана-
262
Глава 7
Таблица 7.5
Хроматографический анализ липидов листьев
стелющихся бобов а)/156, 281/
Номер пятна (рис. 7.6) Рода- мин 6Ж Обнаружи- тель ли- пидов, со- держащих холин Нин- гид- рин Перйо- дат - реактив Шиффа Р, % от обще- го 6) Предварительная идентификация
а 1 0,10 Синий 0,30 Синий 0,42 Желтый J.B) - Слабая реакция + б) 9 Не идентифицирован Фосфатидилинозит и сульфохиновозилци— глицерид Дигалактозилдигли- нерид
3 0,46, Розовый — — 45 Лецитин
4 0,52 Синий — Слабая реакция + 28 Ф осфати дилглинерин, фос<Ьатидилсерин и цереброзиды
5 0,60 Розовый Слабая реакция В) 17 Фосфати дилэтанол- амин
6 0.66 Синий — — + Слепы д ифосфати цилг пипе- рин, глюкозид сте- рина
7 0.72 Желтый + В) - + - Моногалактозилди- глицерид
8 0,78 Синий - - - - Не идентифицирован
9 0.84 Синий - - - 1 Фосфатидная кис- лота
10 0,95 Фиоле товыи - - - - Пигменты, нейтраль- ные липиды
‘‘ч Хроматограйирсжание проводилось на бумаге, пропитанной кремневой
гислотой, в системе диизобутилкетон -—уксусная кислота - вода (40:25:5
по объему) для обнаружения использовались реактивы, указанные
в разд. 5.3.4.
1,1 Методику анализа см. в разд. 5.3.5.
к) Реакция на холин положительна, так как в этих компонентах присут-
ствуют высоконенасыщенные жирные кислоты.
лиз основных фосфо- и гликолипидных компонентов липидов жи-
вотного и микробного происхождения. Более того, используя
препаративную ТСХ. указанные компоненты можно выделить в
Иоентификаиия липиоов
263
Рис. 7.7. Хроматография липидов на бумаге,пропитанной кремневой кислотой.
Яипиоы, выделенные из- а — дрожжей Candida lipolilica, мезофильный штамм,
культивированный при 25 и 1СРС [764]; б — грамположительных бактерий Bacil-
lus cereus, культивированных 1) в отсутствие пропанола, 2) в присутствии 0,08 М
пропанола [1641(3)— грамотрицателъных бактерий Serratia marcescens, культи-
вированных в условиях интенсивной аэрации (пигментированная) и низкой аэра-
ции (непигме.нтированная) [1621. Методики хромы графирования и идентифика-
ции пятен приведены в табл. 7.6 и 7.8 соответственно.
количествах, измеряемых миллиграммами, что достаточно для
аналитического (разд. 7.2.1.4), химического (разд. 7.2.1.5),
спектрального (рис. 7.10) и т. п. исследования. Изучение бо-
лее сложных липидных смесей, например липидов листьев /9/,
требует предварительного разделения этих смесей на колонке
с силикагелем (разд. 5.2.1.1).
Таблица 7.6
Хроматографический анализ липидов Candida lipolytica,
культивированных при 10 и 25°С aV164/
Номер пятна ‘у рис. 7.7) ’Ч ГУ Роде- мин 6Ж Обнаружи- тель липи- дов. содер- жащих хо- лин Нин- гид- рин „ л. _ б) Р, % от оощего Предварительная идентификация
10°С 25°С
а 1 0,25 Серый 0,26, Синий Слабая реакция 3 14 5 18 Не идентифицирован л . в) Фосфатидилинозит ’
Z 0.48 Желтый + — 36 41 Лецитин '•
3 0,54 Синий — 4- 17 15 Фосфатиднлсерин
4 0,59 Желтый - 4- 29 20 Фосфатидилэтанол- амин
5 0,70 Синий — — 1 X. Кардиолипин
6 0,85 Синий — — Следы Следы Не идентифициро- ван
7 0,95 Синий - - Следы Следы Фосфатидная кис- лота
8 0,98 Желтый - - Нейтральные ли- пиды
dl Хроматографирование проводилось на бумаге, пропитанной кремне-
вой кислотой, в системе диизобутилкетон - уксусная кислота - вода
-(40125:5 по объему); для обнаруживания использовались реактивы,
указанные в разд, 5.3,4.
°'Методику анализа см. в разд. 5.3.5.
в| Этот компонент дает слабую положительную окраску при обнаруже-
нии реактивом Шиффа, реакция остальных компонентов смеси была отри-
цательной.
Таолииа 7.7
Хроматографический анализ липидов Bacillus cereus •
/164/
Номер пятна = ‘ ряс. J ? Рода- }МИН ! Обнаружи- тель лили— 1дов, со дер- Шерио- Р, % от 6) оошего 1 Предваритель- ная ипентифи-
Нин- гид- дат - реактив
7.7) | 1 6Ж 1 |жатих хо— | ЛИН рин Шиффа 1 2 кация __
1 0,2а Желтый Следы - — о 1 Не идентифи- цирован
2 0,32 Серый - Следы - 2 3 Не идентифи- цирован
Продолжение табл. 7.7
Номер пятна (рис. 7.7) Рода- мин 6Ж Обнаружи- тель липи- дов, содер- жащих хо- лин Нин- гид- рин Перйо- дат - реактив Шиффа Р, % от общего0» Предвари- тельная иден- тификация
1 2
3 4 G.40 Желтый 0,45 Желтый Слабая реакция + - 9 5 3 5 Аминоанилфос- фатипилгли- церинв' Не идентифи- цирован г!
5 0.51 Синий — — ч- 26 28 Фосфатидил- глицерин
6 0,57 Желтый - + 41 50 Фосфатидил- этаноламин
7 0.60 Синий — - - 14 10 Кардиолипин
& 0.6S Сеоый - - - Слепы Следы Не идентифи- цирован
9 0.96 Желтый - - - - - Нейтральные липиды
‘^'хроматографирование проводилось на бумаге, пропитанной кремне-
вой кислотой, в системе диизобутилкетон - уксусная кислота - вода
(40:25:5), для обнаружения применялись реагенты, указанные
в разд. 5.3.4.
Приведены данные анализа (разд. 5.3.5) для 1 - нормальных
клеток, 2 - клеток, культивированных в присутствии 0,08 М пропа-
нола.
в5 Этот компонент ведет себя при хроматографировании так же, как
и лизоФосфатидклзтаноламин, но продуктами его дезанилирования являют-
ся глиперилфосфорилглиперин и орнитин.
1 > Хотя это пятно дает слабую положительную реакцию на холин, это,
вероятно, не леиитин.
Таблица 7.6.
Хроматографический анализ липидов Serrano marcescensA'
/162/
Номер пятна (рис. 7.7) r’f Родамин 6Ж Нин- гидрин Периопат- реактив Шиффа Р, % от об- щего ? ' 9 П редварительная идентификация
1 0,36 Желтый + - 3 1 0 -Аминоацилфэсфа- тидилглиперин
2 0,45 Синий — + 4 3 Фосфатидилглиперин
266
Глава 7
Продолжение табл. 7.8.
Номер пятна (рис. 7.7) А Родамин 6Ж Нин- гидрин Перйодат - реактив Шиффа Р, % от об- щего®» Предварительная идентификация
•? X
3 0,52 Синий — 8 1 Фосфатипилсерин
4 0,59 Оранже- вый + - 63 91 Фосфатидилэтанол- амин
5 0,62 Синий — — 6 <1 Кардиолипин
6 0,69 Синий — — 12 4 Не идентифицирован
0,76 Серый — — 3 — Не идентифицирован
8 0,98 Сине- — — — — Не фосфолипиды
оранже-
вый
а) Хроматографирование проводилось на бумаге, пропитанной кремневой
кислотой, в системе дииэобутилкетон - уксусная кислота - вода (40:25:
:5). для обнаружения применялись реагенты, указанные в разд. 5.3.4.
Приведены данные анализа (разд. 5.3.5) для 1 - клеток с пигмен-
том, культивированных в условиях интенсивной аэпации, и 2 - клеток
без пигмента, культивированных в условиях низксё аэрации.
В| Основные обнаруженные аминокислоты: орнитин, глинин. аланин,
лейцин, аспарагиновая кислота.
7.2.1.3. Разделение и идентификация различных
глицерофосфатидов
а. Плазмалогенфосфатиоы и алкилацилфтсфатиоы.
Алкеи-i—илацил- и алкилацилфосфатидилэтаноламин отделяют от
диапильных производных по методу, разработанному Ренконеном /265/.
Смесь Фосфатидилэтаноламинов обрабатывают фтординитробензолом в
тризтиламине и метилируют диазометаном. Полученные метилированные
динитрошенильные производные разделяют метопом препаративной ТСХ
на силикагеле G в условиях многократного проявления сначала в сис-
теме гексан - хлороформ (2:3) и затем толуол - хлороформ (2:3).
В указанных системах можно четко разделить три формы фосфатидил—
этаноламина: плазмалогенную (наименее полярную), алкилацильную
(средней полярности) и диацильную (наиболее полярную). В результате
последующего элюирования с силикагеля получают каждую из трех форм
1'ис. 7.8. Хроматограмма суммарных липидов нескольких видов сильно гало-
фильных бактерий. Хроматографирование проводилось на бумаге ватман ЗММ,
пропитанной кремневой кислотой, в системе дииэобутилкетон — уксусная кис-
лота — вода (40:25:5 по объему); для обнаружения применялся родамин 6Ж.
Цвет пятен: В — синий, У' — желяый, G - серый. Идентификация пятен: 1, 2s.
и 5 - не идентифицированы, 2 - илъфогликолипид, 3 — гликолипид, 4 — фос-
фатидилглицерилсулъфат, 6 и 7 - фосфалиоилглицерофосфая, 8 — фосфатоилгли-
церин, 9 - пигменты, сквалены и другие нейтральные липиды. Все компоненты
фосфо- и гликолипидов являются производными дифияанилглицерина 1169].
Таблица 7.9
Величины Rj и результаты обнаружения полярных липидов методом ТСХ в различных системах растворителей
Компоненты липидов Обнаружение по функциональным группам^ Rf к 100 в системах растворителей^
NH холин мц-ОН сахара стерины 1 2 1221 4 5
фосфолипиды
Л изо лецитин
Фосфати дилинозит
Сфингомиелин
Лецитин
Лиэофосфатидилэтаио ламин
Фосфатинилглицерин
Фосфатидилэтаноламин j
Фосфатицилсерин
N, N-Диметилфосфатидилэта-
но ламин
N-Метилфосфатидилэтанопамин
Кардиолипин
Фосфатидилглицерофосфат
Лизофосфатидная кислота '
Фосфатидная кислота
Гликолипиды
Сульфохиновозилдиглицерид
Дигалактозилдиглицерид
Цереброзиды
Сульфаты, цереброзидов
Гликозиды стеринов
Гликозиды эфиров стеринов
Моногалактозилдиглицериды
— а. 10 8 15
а. 23 14 47 11 42
— 16 18 22 26
33 25 31 33 40
» 20 40
а» 48 30 — 37 75
62 35 83 41 65
» 15 6 55 5 44
- 52 - 66 - -
83 62 а. —
71 41 38 85
— . 6В) «а
— 70 • 75 5 —
- 74 79 - 5 66
шш ’ 42 22 а. а. —
62 18 » а» —
70- а. 45- 78-
1
- 8 36 — а» 18- 66.
20 ' 70
+ 73 43 а. от —.
+ 78 65 а. а*
«а 77 51 а. а.
а’См. разд. 5.4.4.2.
Системы растворителей: 1) хлороформ - метанол - вода (65:25:4) 1192]; 2) диизобутилкетон - уксусная кислота-
вода (40:25:5) [192]; 3).хлороформ - метанол - уксусная кислота - вода (25:15:4:2) (2981; 4) хлороформ - метанол -28%-
ный аммиак (65:25:5fr"5) хлороформ - ацетон - метанпл - уксусная кислота - вода (6:8:2:2:1) (272, 276].
в) В системе растворителей хлороформ - метанол - аммиак (65:35:5) [77].
270
Глава 7
Рис. 7.9. Хроматограммы липидов [272]
Получены методом тонкослойной двухмерной хроматографии на силикагеле Н
в системах растворителей: 1) хлороформ — метанол — 28%-ный аммиак (65:25:5
по объему/ и 2) хлороформ — ацетон — метанол — уксусная кислота — вода
16:8:2:2:1 по объему). Нсслеоуемые материалы: А —липиды мозга человека,В—
липиды внутренних мембран митохондрий почек коровы. Принятые сокращения:
С!\'. СП — цереброзиды с нормальными жирными кислотами и оксикислотами;
DPG — дифосфстиоилглицерин; FF А - свободные жирные кислоты- LBPA —
лизобисфосфатионая кислота; LDPG - лизооифосфатиоилглицерин; LPC — лизо-
фосфатиоилхолин; ЕРЕ - лизофосфатидилэтаноламин; LPL - менее полярные
липиоы (холестерин, триглицериды и т.д.); Or - фитиновые липиды; РА - Фос-
Фотионая кислота; PC — фосфатидилхолин; PG — фосфатидилглицерин; РЕ -
фосфатиОилэтаноламин: PI - фосфатидилинозит; SN, SH - сульфатиды с нор-
мальными кислотами и оксикислотами; Sph — сфингомиелин.
-•— Система 2
Сиг тс мт.
в чистом виде. После этого алкен-1-ил- и алкилапильную фор-
мы можно превратить в соответствующие алкен-1-»ил-1 или алкилгли-
дерины и проанализировать их, как описано в разд. 7.1.9.
о, Ди-О-алкилпроизвооные.
В настоящее время идентифипированы только аналоги ди-О-фи-
танилового эфира фосфатидилглицерина и фосфатидилглицерофосфата,
которые встречаются в сильно галофильных бактериях (например,
Halobacterium cutirubrum ;. Указанные бактерии синтезируют только
полярные липиды - производные дифитанилового эфира глицерина
/168/. Основными их компонентами (рис. 7.8) являются: ди-О-фи-
танил- вп -глидерин-1 -фосфат (пятна 6 и 7 ), ди-О-фитанил-sn-
глиперо-1-фосфорил-3 -глицерин (пятно в ) и сульфогликолипид с пред-
положительной структурой ди-О-фитанил- «п-глицерин-1-(глюкозил-
И денямфинация липиоов
271
Р и с, 7.10. Инфракрасные спектпы некоторых дианильных и диалкильных про-
изводных фосфолипидов [171].
1 - фосфатиОилэтаноламин; 2 — фосфатидилхолин (лецитин); 3 — фосфаяидил-
глицерин (Оифитаниловый эфир); 4 — фосфатидилглицерофосфат (бифитанило-
вый эфир).
маннозил-галактозил-3'~сульфат) (пятно 2 ). Все у казанные компо-
ненты облапают более высокой подвижностью при хроматографирова-
нии на бумаге, пропитанной кремневой кислотой, чем соответствую-
щие диацильные формы с иеразветвленной цепью (ср., например, Rj
глава
диалкилового эфира фосфатипилглицерина, рис. 7.8, с R, диацилфос-
фатидилглицерина, рис. 7.6 и 7.7). Объясняется это, —-видимому,
присутствием в диалкилглицеринах сильно разветвленных фитанилъ-
ных групп. Наличие диалкиловых эфиров ясно видно по отсутствию
полос поглощения сложных эфиров С=0 (17 30 см-1 ) и С—О
(1180 см-1! и по четким полосам поглощения простого эфира
С—О—С (1110 см~’ ) в их ИК-спектрах.
Дифитаниловые аналоги глиперофосфатидов и гликозилдиглицери-
дов можно идентифицировать в виде ди—О-фитанилглицерина, с этой
целью их кипятят 4-5 ч в 2,5%-ном растворе НС1 в метаноле
(разд. 4.8.1). Образующийся дифитанилглиперин идентифицируют ме-
топами ТСХ (в системе хлороформ-эфир, 9:1), ГЖХ (диэфир или
производные фитанилгалогенидов) и ИК-спектроскопии (рис. 7.1).
Водно-метанольные растворы упаривают досуха. Полученные в остат-
ке метиловые эфиры фосфатов нагревают 1 ч при Ю0°С с 1 н. со-
ляной кислотой, чтобы расщепить эфирные связи, и свободные фосфа-
ты идентифицируют хроматографией на бумаге ватман №1 в несколь-
ких системах растворителей (табл. 7.11). В результате такой об-
работки дифитаниловые аналоги фосфатидилглицерина и фосфатидил-
глииерофосфата дают соответственно глицерофосфат и глицеро-1,3-
дифосфат, идентифицированные по значениям их R,.
Попытки разделить ди- и моноалкиловые аналоги Фосфатидилэта-
ноламина ТСХ на силикагеле G до сих пор безуспешны /151/.
•>. Фосазоно?лииеполипиоы.
Фосфонолипнды можно отделить от фосфолипидов ТСХ на силика-
геле G в системах, содержащих сильно полярные растворители, на-
пример хлороформ - 85%-ная уксусная кислота (1:1) /151/. В та-
ких системах фосфоновые аналоги лецитина и фосфати ди лэтаноламина
хорошо отделяются от соответствующих фосфолипидов. Идентификацию
фосфонолипипов можно провопить комбинированным мягким шелочным
и жестким кислотным гидролизом (разд. 7.2.1.5) /197/.
7.2.1.4. -ХимическиЖанализ липидов _
После пазделения и предварительной идентификации фосфо- или
гликолипидов хроматографическими методами с применением специ-
фических обнаружителей необходимо подтвердить правильность иден-
тификации разделенных вешеств методами химического анализа. Для
чь.-ых разделенных компонентов следует провести элементный ана-
лиз (Р, N, S, Na или К, С и И ), хотя это не всегда Возможно "из-за
малого количества материала. Анализ на аминный азот, азотистые
основания, аминокислоты, сложнозфирные группы, альдегиды, вици-
нальные ОН-группы, глицерин, инозит и сахара можно проводить
на образцах липидов порядка микромолей (и меньше) и затем под-
считать молярные соотношения компонентов (соответствующие ме-
Идентификация липидов
273
тодики' рассматривались в гл.4'). В табл. 7.10 приведены рассчи-
танные величины молярных соотношений для наиболее распространен-
ных фосфо- и'гликолипидных компонентов.
Чтобы можно было рассчитать содержание элементов в молеку-
ле липида, сначала следует определить метопом ГЖХ жирные кис-
“лоты, ‘альдегиды или другие группы с длинной углеродной цепью.
По полученным данным проводятся идентификация алкильных частей
молекул и определение средней длины углеродной цепи и рассчиты-
вается молекулярный вес фосфо- или гликолипидов. Если липиды
содержат только ацильные группы, средний молекулярный вес липи-
дов определяют, основываясь на данных ГЖХ входящих в их состав
жирных кислот:
ЖК, + Мол. вес,
Средний молекулярный вес жирных кислот =---------------- +
ЖК, х Мол. вес, ЖК„ •*- Мол. вес.
<---:----------1 = 1,^г -------“--------------(7.1)
1ОО ' " 100
где "К - жирная кислота, %; индексами 1,2... п обозначены вхо-
дящие в состав липида кислоты. Разумеется, средний мс анулярный
вес жирных кислот можно также определить титрованием суммар-
ных жирных кислот, как описано в разд. 4.9./Если эксперимента-
тор не располагает ни данными ГЖХ, ни титриметрическими данны-
ми, молекулярный вес диацилглицерофосфолипида (наприадер, лецитит
уд. кефалина и т. д.) можно округленно принять за 800 !(при этом
предполагают, что фосфолипид содержит главным образом жирную
.кислоту С ). Именно это предположение используется в обычно
применяемой формуле. Вес фосфолипида = вес липидного Р х 25 (вес
дается в миллиграммах).
Аналитические данные сами по себе не могут рассматриваться
как окончательное доказательство строения липида, в особенности
такого, который до этого не был известен. Поэтому липид следует
расщепить, используя химические или ферментативные реакции, и
идентифицировать продукты растепления. Ниже описан ряд соответ-
ствующих методик,
7.2.1.5. Мягкое щелочное деэанилирование фосфолипидов
и гликолипидов
Излагаемая ниже методика является модификацией методов, опи-
санных Брокерхоффом /45/, Даусоном/80, 82/и Хюбшером/137/.
. .Реагенты. Раствор гидроокиси натрия в метаноле, 0.2 я.
В 50 мл метанола растворяют 0,4 г гранулированного NaOH. Исполь-
зуют свежеприготовленный раствор, при наличии осадка центрифуги-
руют.
Япниые химического анализа фосфолипидов и гликолипидов Таблица 7.10
Молярные соотношения3)
Липиды р ы ыц азотистые амино- жирные альдо- кислот- вининаль- глице- ИН03ИТ сфингози- саха-
гл о) (4 а |) /л а основания кислоты кислоты гиды ные ные ОН- рин (4 12 41 новые ос- ра
(4. J2.1; (4.12.2) (4.3;4.11) (4.10.1) ц.уппы группы (4.12.3) нования (4.3)
4.12.2) (4.9) (4.13) (4.И)
Фосфатиды
Лецитин 11-1 - 2 - 1
ХолинпЯазмалоген 11-1 - 11- - 1 — —
Лизолецнтин 11-1 - 1 - - - 1 — -
Фосфатипилотаноламнн 1 1 1 L - 2 - - 1 - —
Этаноламинплазмапо- 1111 - 1 1 - - 1 - ~
ГОН
Лиэофосфатидилэтанол- 1111 - 1 - - - 1 - -
амин
N- Метилфосфатипил- 11-1 - 2 - -1 - - -
этанола мин
Фосфатипиисерин 1111 1 2-1 - 1 — .
Фосфатпдилглииерин 1-- - - 2-1 1 2 — -
Аминоацилфосфатипнл- 111- .1 2 - t - 2 - -
глицерин
Фосфатидилглиперо- 2-- - - 2-3 - 2 — м
фосфат
Кардиолипин 2 - 4-2 - 3 — _
Фосфатидилинознт 1. - - - - 2-1 л 1 1 “ —
Фосфатидная кислота 1 - - - _ 2 - 2 • - 1 -
Лпэофосфатилная 1 _ 1-2 - 1 _ —
кислота
Сфингомиелин 12-1 - 1 _ 1-.
Гликолипиды 1
Моногалактоэиллигли- _ 2- - 2 1 1
цериа
Дигалактозилпигли- - - _ _ _ 2 - - 4 1 2
церид
Сульфохиновозилди- ____ _ 2-1 2 1 1
глицерид
Цереброзиды - 1 - 1 2 1 1
Цереброэи д-3-сульфат -1- - _ 1-1 1 1
% скобках указаны те разделы книги, в которых описаны соответствующие методики разделения.
276
Глава 7
Раствор аммиака в метаноле, 1,5 к. 10 мл концентрированного
NH4OH разбавляют метанолом до конечного объема 100 мл.
Смесь метанол — вода (10:9).
Катионообменная смола. Дауэкс-5О (Н+), рексин RG-50 (Н+)
или амберлит IR-100 (Н+) промывают сначала 1 н. НС1, затем
водой до тех пор, пока промывная вода не станет нейтральной, под-
сушивают и используют во влажном состоянии.
Методика. В пробирку объемом 15 мл со стеклянной
пробкой помешают раствор 1-16 мг суммарных липидов (или хрома-
тографически однородной фракции липидов), что соответствует 30-
600 мкг липидного Р. Раствор упаривают в токе азота, к остатку
последовательно добавляют 0,2 мл хлороформа, 0,3 мл метанола и
0.5 мл раствора NaOH в метаноле (0,2 ф.), интенсивно перемеши-
вают и выдерживают 15 мин при комнатной температуре. Сразу пос-
ле этого добавляют 0,2 мл метанола, 0,8 мл хлороформа и 0,9 мл
воды, смешивают и центрифугируют 1 мин при 600 g. Быстро и
по возможности более полно переносят пастеровской пипеткой водно-
метанольную фазу в другую центрифужную пробирку емкостью 15 мл,
содержащую 0,3-0,5 мл катионообменной смолы, и энергично пере-
мешивают до тех пор, пока супернатант не станет нейтральным или
слегка кислым по индикаторной бумаге (pH ~ 5-6). Если нейтрали-
зация идет слишком медленно, добавляют еше порцию смолы. Сус-
пензию центрифугируют и супернатант переносят пастеровской пипет-
кой в другую пробирку объемом 15 мл. Дважды промывают хлоро-
формную фазу 0,5 мл смеси метанол — вода (10:9), водно-метаноль-
ный слой используют для промывания ионообменной смолы. Нейтра-
лизуют (или слегка подщелачивают) объединенные метанольно-водные
Фазы несколькими каплями метанольного раствора NH4OH и упарива-
ют раствор почти досуха в токе азота при 30°C. Остаток растворя-
ют в 0,1 мл смеси метанол - вода (10:9) и анализируют водораст-
воримые продукты хроматографией на бумаге (см. далее). В хлоро-
формной фазе определяют метиловые эфиры жирных кислот и неомы-
ляемые липиды. _
Обнаружение и иОентификация вооорастворимых продуктов Оезацили-
рования.
Метанольно-водный раствор водорастворимых продуктов дезацили-
рования липидов хроматографируют на бумаге ватман № 1 ( '-' 20-
30 мкг Р на пятно) в одной или нескольких системах растворите-
лей. перечисленных в табл. 7.11. Для двухмерной хроматографии
глиперофосфорных эфиров, полученных из фосфолипидов: глицерина,
полученного из глицеридов, и глиперилгликозидов, полученных из
гликолипидов, используются в основном две системы растворителей:
фенол - вода (100:38) и бутанол - пропионовая кислота - вода
(15:7:10) /33, 94/. На рис. 7.11 в качестве примера приведены
Идентификация липидов
277
хроматограммы продуктов дезаиклирования липидов диатомовой водо-
росли, проявленные этой системой растворителей.
Фосфатные эфиры, содержащие вицинальные группы, а также глице-
рин, инозит, гликозиды глицерина, свободные сахара и др., легко об-
наружить следующим образом /345/. Хроматограмму погружают в
0,16 М раствор перйодата натрия в смеси ацетон - вода (95:5),
сушат 5 мин, погружают в 0,01 М раствор о-толуидина и 0,1 М
раствор уксусной кислоты в смеси апетон - вода (95:5). Вещест-
ва, содержащие вицинальные оксигруппы, дают пятна желтого цвета
на зеленом фоне.
Фосфатные группы, включая неорганические фосфаты, лучше все-
го обнаруживать смесью сульфосалициловой кислоты и хлорного же-
леза /338/. Хроматограмму погружают в раствор обнаружителя (1,5 г
FeCl3-6H2O растворяют в 30 мл 0,3 н. HCI и разбавляют до объе-
ма 970 мл ацетоном). Дают бумаге высохнуть и погружают в 1,5%-
ный раствор сульфосалициловой кислоты в ацетоне. Фосфаты обнару-
живаются в виде белых пятен на фиолетовом фоне. Для обнаружения
фосфатных групп можно также использовать реактив Берроуза /52/.
представляющий собой раствор молибдата аммония в хлорной кисло-
те. Чтобы обнаружить аминосоединения, хроматограммы опрыскивают
раствором нингидрина (разд. 5.3.4.2).
Продукты дезапилирования липидов, меченных ^Р, и 14С, как
показано на рис. 7.11, обнаруживают методом радиоавтографии
(разд. 6.5.1).
Водорастворимые продукты дезацилирования можно также разде-
лять и идентифицировать анионообменной колоночной хроматографией;
эта методика подробно описана в работе /85/. Для обнаружения
продуктов дезапилирования фосфонолипидов /197/ берут аликвотную
часть водно-метанольной фазы, по которой определяют суммарный
фосфор. Вторую аликвотную часть нагревают с 6 н. НС! при 120°С
в течение 48 ч в запаянной ампуле. Затем неорганические фосфаты
и органические фосфонаты, содержащиеся в гидролизате, разделяют
хроматографией на колонке с дауэксом-1 Х2 (ацетатная Форма). Для
элюирования органических фосфонатов и неорганических фосфатов ис-
пользуют соответственно 5%-ную уксусную и 2 н. соляную кислоты.
Определив суммарный органический фосфор и неорганические фосфаты
в соответствующих элюированных фракциях, можно установить содер-
жание фосфонолипидов в смеси суммарных липидов.
Идентификация жирных кислот и кеомыляемых липидов.
Хлороформные растворы, получаемые в результате мягкого ще-
лочного гидролиза, содержат неомыляемые вещества , метиловые
* Липиды, содержащие эфиры жирных кислот, количественно переэтсрифи-
цируются абсолютным метанолом в присутствии щелочи в течение 15 мин при
комнатной температуре в метиловые эфиры жирных кислот. В этих условиях
образование солей жирных кислот не происходит (229).
tftPtT! «:
MeSf e-CtSPW
/«fr «'CCH.tr .Ж
3^ «
Идентификация липидов
279
С
•с
16
Р и с. 7.И. Радиоавтограмма дезацилированных липидов Navicula pelhcuio-
sa, меченных ЩР(А), 14С (В) и 3SS 'VO (способы введения метки см. в разд.
6.2.1.4). Хроматографирование проводилось на бумаге ватман Ml в системе
растворителей фенол — вода (100 :38 по весу i в одном направлении и в систе-
ме бутанол - пропионовая кислота - вода (15 :7:10 по объему) в другом на-
правлении. Пятна 2,3.7—9 и 10-15 не идентифицированы. Используемые сокра-
щения приведены в подписи к рис. 7.10 и в табл. 7.11 [1711
эфиры жирных кислот, лизоплазмалогены, моноалкиловые аналоги
лизоФосфатидов, гликозилы стеринов, сфинголипиды, цереброзилы v
другие стойкие к действию щелочной среды липиды. После последней
промывки смесью метанол - вода (смесь при этом должна быть ней-
тральной) хлороформный раствор разбавляют 2 мл бензола, упарива-
ют досуха в токе азота при ЗО°С и растворяют остаток приблизи-
тельно в 0,1 мл хлороформа. Чтобы можно было провести идентифи-
кацию жирных кислот (и других неомыляемых летучих компонентов,
например углеводородов, спиртов и т. д.), часть раствора анализи-
руют ГЖХ. Вторую аликвотную часть хлороформного раствора ана-
лизируют методом ТСХ (разд. 5.4) или хроматографии на бумаге,
пропитанной кремневой кислотой (разд. 5.3); таким путем опреде-
ляют лизоплазмалогены, моноалкилфосфатипы, сфингомиелин, цере-
брозиды и другие неомыляемые липиды (значения Rf приведены
в табл. 7.4-7.9). Дальнейшая идентификация сфинголипидов описа-
на в разд. 7.2.2 и 7.3.2.
Таблица 7.11
Разделение водорастворимых продуктов дезацилирования или гидролиза фосфолипидов
и гликолипидов при хроматографии на бумаге ватман №1
Исходные ЛИПИДЫ3' Продукты разложения Rf х 168б1
система растворителей
1 2 3 4 5 6 7 8
PC ил и Lyso PC Мег кое дезамидирование Глицерилфосфорилхолин ( GPC) + циклический 88 88 22 39 67 45
1,2-глицерофосфат (eye GP) 49 49 20 27 66 те - -
РЕ или Lyso РЕ Глицерилфосфорилэтаноламин (GPE) 62 66 17 19 47 - 45 те
РЕ-Ме N -Метилглицерилфосфорилэтаноламия — 84 те те — те 5 6 —
PE-diMe (GPE-Me) Глицерилфосфорил-N, N-диметилэтаноламин — 79 68
PS (GPE-ф.^е) • Глицерилфосфорилсерин (GPS) 26 30 14 12 50 — 15 те
F*G или PG-AA Глицерилфосфорилглинерин (GPG) 46 51 17 26 - 54 -
PGP Гпицерилфосфорилглиггерофосфат (GPGP) те те те те те 8
di-PG б«с-(Глицерофосфорил)глицерин (GPGPG) 18 28 6 ан» 59 26 те
Глицерилфосфорилинозит (GPI) + 14 18 6 2 43 21 и.
PI и ноэитм енофосфат (IMP) + 15 20 6 7 42 те те те
метилглинерофосфат (MeGP) 58 55 30 35 те те те
DPI Глицерофосфорллфосфоинозит ( GPIP) те 7 те те те те те те
TPI Глицерофосфорилдифосфоинозит (GPIDP) — 5 те те те те ан»
PA или LysoPA я -Глицерофосфат (GP) 35 33 17 32 73 - 13 те
MGD Галактозилглицерин (G-Ga 1) 65 63 33 30 - 26 п те
DGD Дигалактозилглиггерин ( G-Gal -Gal) 45 45 20 9 те 7 те те
SQD Сульфохиновоэилпиглицерид (SQG) 18 - 8 4 12 " -
Фосфатиды Ферцентапивиый или жесткий гидролиз 1,3-Глннеро дифосфат ( GDP) 17 13 — 15 те ; 4 -
1,2 ~Глидередифосфат (GDP) 15 те те 12 — —
Неорганический фосфат (Pi) 20 25 36 85 — 7 „ —
Фосфорилхолин 85 89 •• 44 - » —
Фосфорилэтаноламин 40 — — — - — — 10
Фосфорилсерин 15 те — — - — — 2
2-Аминоэтилфосфонат 0,36 0,57 — — те — —
Холин те 93 — — — 13 43
Этаноламин 55 51 те» - - — 8 38
N-Монометилэтаноламин — 71 те - те 16 47
N, N -Диметилэтаноламин - 84 — — - - 25 49
Серин 25 14 23 те - - 6 19
Аланин 40 те те — — — — те
Лизин 30 те те - — те - 1 —
Инозит те — те — те 12 те
Гликолипиды Г пиперин 75 те 50 70 те 93 65 пн
Галактоза те - те те те 32 те нн
Глюкоза 28 те 20 те — 38 НН »н»
Манноза те — те 43 те те
Арабиноза те - те — те 52 те те
Глюкоза мин те — те те те 19 те те
Сокращения названий фосфатидов см, в разд, 1. JI и табл. 1.8, сокращения названий гликолипидов см. в разд,
1.12.Т и 1.13.4.
Системы растворителей (восходящая хроматография): 1) фенол - вода (106:38) [ 55, 80, 94, 156, 171, 345]; 2) на-
сыщенный раствор фенола в воде— этанол-уксусная кислота (50:5:6) [80, 85]; 3) бутанол —пропионовая кислота —вода
(15:7:10) [ у5, 80, 3451; j) бутанол - уксусная кислота - вода (5:3:1) (156]; 5) метанол - 98%-ная муравьиная кислота - во-
да (80:13:7) [80, 85); 6) пиридин - этилацетат - вода (2:5:5, верхняя фаза) [281, 282|; 7) изопропанол-вода- концентри-
рованный аммиак (7:2:1) [77, 78, 80, 195]; 8) бутанол - диэтиленгликоль - вода (4:1:1) [196].
282
Глава 7
Лиэоплазмалогены можно также идентификировать селективным
мягким кислотным гидролизом /85/. Для этого аликвотную часть
хлороформной фазы упаривают досуха, остаток растворяют в 1,5 мл
смеси хлороформ - метанол (1:2), добавляют 0,4 мл 25 мМ раст-
вора НеС12 в 0,05 н. НС1 и выдерживают 15 мин при 37®С. Пос-
ле этого добавляют по 0,5 мл хлороформа и воды, смешивают,
центрифугируют и разделяют фазы пастеровской пипеткой. Чтобы оп-
ределить природу плазмалогенфосфатидов, глицерофосфаты идентифи-
цируют хроматографией на бумаге (табл. 7.11).
Фосфоносфинголипиды в липидах, устойчивых к щелочному гидро-
лизу, можно также определить, подвергая аликвотную часть хлоро-
формного раствора жесткому кислотному гидролизу /197 /. Для этой
пели аликвотную часть хлороформной фазы упаривают досуха в стек-
лянной пробирке, остаток гидролизуют 6 н. НС1 в запаянной ампуле
в течение 48 ч при 120°С. Реакционную смесь охлаждают и липо-
фильные продукты экстрагируют этиловым эфиром. После разделе-
ния на колонке с дауэксом-1 определяют содержание фосфора
в водорастворимых органических фосфатах.
7.2.1.6. Ферментативный гидролиз глицерофосфауидов
Правильность определения фосфатидов и гликолипидов можно
подтвердить гидролизом высокоспепифичными ферментами (фосфоли-
пазы, гликолипидгидропазы и т. д.) с последующей идентификацией
продуктов гидролиза. Стереоспецифичность указанных ферментов по-
зволяет также установить конфигурацию липида. Действие фосфоли-
паз подробно изучено Ван Деененом и Де Хаасом /332, 333/.
В табл. 7.12 приведены продукты гидролиза различных фосфолипи-
дов. При исследовании структуры фосфолипидов чаще всего исполь-
зуются следующие фосфолипазы:
а. Фосфолипаза А2 (Е.С.3.1.1.4) [129,344].
Этот фермент специфически гидролизует сложноэфирную связь
во втором положении глицерофосфатидов (включая плазмалогены),
ь результате чего образуются жирные кислоты (табл. 7.12) и лизо-
фосфолили ды.
Методика. К раствору приблизительно 5 мг (6-7 мкмо-
лей) глинерофоссатида (лецитин, фосфатидилэтаноламин, фосфатндил-
глицерин, фосфатидная кислота или суммарные клеточные липиды)
в 5 мл смеси этиловый эфир - метанол (98:2 по объему), помешен-
ному в пробирку объемом 15 мл с пробкой, добавляют 0,5 мл
раствора 1 МГ лиофилизированного яда Crotalus adamanteus (Rose
Allen Reptil Institute, Miami Serpentarium, Koch-Light; Calbiochem.) В
0,5 мл 0,1 M боратного буфера (pH 7,0—7,5), содержащего 1,6мг
ацетата кальция. Смесь энергично встряхивают 30 с и инкубируют
несколько часов при комнатной температуре. Растворители упарива-
ют в токе азота, добавляя бензол, который способствует удалению
шшдные субстраты Ферменты Липофильные продукты г и про ли за Водорастворимые продук-
ты гидролиза
U О <Г
8
to
в
о
о
е
cd
к
Е
о
о
е
&
о
е
8
со
К
со ш g
О СП й
to ей to
EKE
Е S К
ООО
осо
е е е
Ш
с
§ Е 5
ООО
ООО
Е СО
к к
к
а
ё
ё
X
к
X
<0
о
&
284
Глава 7
воды. Остаток сушат в вакууме, растворяют в смеси хлороформ -
метанол (1:1),, центрифугируют, чтобы полностью отделить осадок,
и полученные продукты разделяют ТСХ в соответствующей системе
растворителей на свободные жирные кислоты, лизофосфолипиды и
непрореагировавшие исходные липиды (см. табл. 7.9 и рис. 7.9).
б. Фосфолипаза В (Е.С.3.1.1.5) [2Р1.,
Ценная ферментная система наряду с лизофосфолипазой содер-
жит Фосфолипазы А и А,. Она эффективно катализирует гидролиз
обеих сложноэфирных связей лецитина и фосфатидилэтаноламина, в
результате которого образуются свободные жирные кислоты и соот-
ветствующий водорастворимый глицерофосфорный эфир (табл. 7.12).
М е т о дика. К 0,4 мл обработанной ультразвуком суспен-
зии 2,5-2,8 мкмолей глицерофосфатидного субстрата в 0,5 М бу-
ферном растворе ацетата (pH 4,0) добавляют 0,4 мл препарата
фермента /7 9/ из Prnicillium notatum (•'-'1 мг белка/мл, диализо-
ванного против дистиллированной воды за 2 ч до использования),
встряхивают реакционную смесь и инкубируют ее 2 ч при 37°C.
Охлажденную смесь разбавляют 2,0 мл метанола и 1,0 мл хлоро-
форма, смешивают в течение 1 мин и снова разбавляют 1,0 мл
хлороформа и 1,0 мл воды. Фазы разделяют центрифугированием
и водно-метанольную фазу упаривают до небольшого объема в токе
азота. Водорастворимые продукты идентифицируют хроматографией
на бумаге ватман №1 в соответствующей системе растворителей
(например, фенол - вода. 100:38) (табл. 7.11). Свободные жир-
ные кислоты, находящиеся в хлороформной фазе, метилируют диазо-
метаном и анализируют ГЖХ (разд. 7.1.6).
-5 . Фосфолипаза С (Е.С.3.1.4.3) [127, 2511.
Этот фермент катализирует гидролиз диглицеридфосфатных свя-
зей в глииерофосфатидах и керамидфосфатной связи в сфингомиели-
не. В результате ферментативного гидролиза освобождаются водо-
растворимые фосфорилаты, перечисленные в табл. 7.12.
М етодика. К раствору примерно 5 мг (6—7 мкмолей)
глицерофосфатида (или сфингомиелина) в 1 мл смеси этиловый эфир-
этанол (98:2) добавляют 0,3 мл неочищенного ферментного препа-
рата ('vl мг белка/мл) ИЗ С. perfrin^ens (" Calbiochem" ; "Koch-Light"
"Siema") в 0,1 M ярас-буфере (pH 7,2), содержащем 0,02 моль/л
СаС1„. Смесь встряхивают, инкубируют при комнатной температуре
3 ч, упаривают досуха в токе азота, остаток растворяют в 2,0 мл
метанола и 2.0 мл хлороформа, добавляют 1,8 мл воды, смешива-
ют и центрифугируют. Продукты, растворимые в хлороформе, разде-
ляют методом ТСХ в системе хлороформ - этиловый эфир (9:1) и
идентифицируют выделенные таким образом 1.2-диглицериды. Кера-
миды идентифицируют, как описано в разд. 7.2.2.5. Водораствори-
мые продукты идентифицируют хроматографией на бумаге в смесях
Идентификация липиОое
285
фенол - вода (100:38) или бутанол - уксусная кислота - вода (5:
:3:1-) .(табл. 7-11).
г. Фосфолипаза 1)(Е.С.3.1.4.4) [ 170].
Фосфолипаза D катализирует гидролиз глиперофосфатидов, в ре-
зультате которого образуются фосфатидная кислота и соответствую-
щие азотистые основания или другие фрагменты (например, фосфа-
тидилглицерин дает глицерин).
Методика (см. также разд. 6.1.3.2). К суспензии 5-
6 мкмолей глицерофосфатида в 0,5 мл 0,2 М буферного раствора
ацетата добавляют 0,1 мл 1 М раствора хлористого кальция, 0,4мл
раствора фермента (неочищенный препарат капустных листьев,
20 мг/мл; "Boehringer”; "Calbiochem"; "Sigma"; " Koch-Lighl ') и 0,4 мл
этилового эфира. Смесь энергично встряхивают и инкубируют при
комнатной температуре 3—4 ч. Большую часть эфира упаривают в
токе азота, добавляют 2,5 мл метанола и 1,25 мл хлороформа,
встряхивают и добавляют еше 125 мл хлороформа и 1.25 мл во-
ды, смешивают и слои разделяют центрифугированием. Растворимые
в хлороформе продукты разделяют методом хроматографии на бума-
ге. пропитанной кремневой кислотой, или тонкослойной хроматографией
(табл. 7.9) и идентифицируют фосфатидную кислоту. Используя,
хроматографию на бумаге ватман №1 в соответствующем раствори-
теле (табл. 7.11), идентифицируют свободные основания, глицерин,
глицерофосфаты и т. д.
7.2.1.7. Жесткий гидролиз глицерофосфатидов и гликолипидов
В ряде случаев для более полного структурного анализа смеси
липидов или индивидуальных липидных компонентов иногда полезно
проводить жесткий гидролиз с последующей идентификацией образо-
вавшихся водорастворимых продуктов методами хроматографии. В
разд. 4.12.2.3 описана хорошая общая методика последовательного
кислотного гидролиза 2,5%-ной НС! в метаноле и водной НС1. Для
расщепления алкильных производных глицерина и для омыления
глицерофосфата или фосфата инозита с образованием полиолов и не-
органических фосфатов требуется проводить еще более жесткий гид-
ролиз. Для этой цели используют 2 н. НС], гидролиз провопят при
125°С в течение 48 ч в запаянной ампуле (разд. 4.12.3.1).
Водорастворимые продукты (высушенные в эксикаторе над КОН
по полного удаления следов НС]) хроматографируют на бумаге ват-
ман №1 (15-30 мкг Р на пятно) в соответствующих системах раст-
ворителей (фенол — вода или бутанол — пропионовая кислота - вода
для эфиров фосфатов, бутанол - пиэтиленгликоль - вода для азотис-
тых оснований и пиридин - этилацетат - вода для сахаров, глицери-
на и инозита; см. табл. 7.11). Фосфатные эфиры обнаруживают на
хроматограмме смесью сульфосалицлловой кислоты и хлорного желе-
286
Глава 7
за (разд. 7.2.1.5) или реактивом Берроуза, содержащим молибдат
аммония и хлорную кислоту /52/; аминосоепинения обнаруживают,
нингидрином (разд. 5.3.4,2); холин и другие четвертичные аммо-
ниевые основания - Фосфомолибденовой кислотой или дипикриламино-
вым реактивом (разд. 3.4.3); свободные сахара - 1%-ным раст-
вором хлоргидрата п-< изидина в этаноле; полиоксисоецинения и
сахара - смесью перйодат - толидин (разд. 7.2.1.5) или последо-
вательным обнаружением 1%-ньгм раствором нитрата серебра в аце-
тоне и 2%-ным раствором гидроокиси натрия в этаноле /326/.
7.2.1.8. Идентификация молекулярных типов глицерофосфолиги цов
ГлиперофосФолипиды типа леиитина и фосфатидилэтаноламина
можно разделить на молекулярные типы, используя ТС.Х на силика-
геле, пропитанном нитратом серебра /20/ (разделение фосдэлипи-
дов по числу двойных связей), гидролиз змеиным ядом (фос-Юлипа-
за Аг) ив заключение ГЖХ (анализ жирных кислот, отшеп дих-
ся из положения 2) /334/. Кроме того, хроматографически здно-
ропные фосфолипиды можно превратить в диглицериды с помоню
гидролиза фосфолипазой С (разд. 7.2.1.6) и провести стереоспе-
цифический анализ диглицеридов в виде диацетатов, как описат о в
разд. 7.1.8. Последнюю методику используют для определения лол-
ного состава молекулярных типов лецитинов /184. 212, 256, 263,
334/ и Фосфатидил эта но ламинов /133, 334/, выделенных из раз-
личных источников.
7.2.2. СфингозинфосфатиОы
Если в смеси липидов методами хроматографии (разд. 7.2.1 и
табл. 7.9) обнаружены сфинголипиды (сфингомиелин, керамид -
аминоэтилфосфонат и т. д. J, то дальнейшую их идентификацию мож-
но проводить только после выделения. Существуют два общих мето-
да выделения таких липидов. —
а. Хроматография на колонке с силикагелем или флорисилом.
обработанным кислотой (разд. 5.2.1.1 и 5.2.1.2), с последующей
препаративной ТС.Х фосфатидной фракции (метанольный элюат) в со-
ответствующей системе растворителей, например хлороформ - мета-
нол - уксусная кислота - вода (25:15:4:2) или хлороформ - мета-
нол - аммиак (65:25:5) (табл. 7.9).
б. Щелочной метанолиз для удаления диапильных глицерофосфата-
лов с последующим разделением методом препаративной ТС.Х или
колоночной хроматографии. Этот способ особенно полезен в тех слу-
чаях, когда из сложных смесей нужно выделить малые количества
сфинголипидов. Подробнее он описывается ниже.
Идентификация липиоос
287
7.2.2.1. Выделение сфингомиелина и цереброзидов
методом щелочного метанолиза [280 . 317]
Методика (разд. 7.2.1.5). К раствору 10-20 мг сум-
марных липидов или фосфолипидной фракции (липиды плазмы крови,
эритроцитов, мозга и т. д.) в 2,0 мл хлороформа, помешенному
в пробирку объемом 15 мл с пробкой, добавляют 2,0 мл 0.6 н. раст-
вора NaOH в метаноле, смешивают и инкубируют при комнатной тем-
пературе в течение часа. Добавляют 1.3 мл 1 н. НС1 и 0,5 мл во-
ды. содержимое пробирки перемешивают и центрифугируют. Хлоро-
формную фазу отделяют, разбавляют ее бензолом и упаривают досу-
ха В токе азота. Чтобы удалить плазмалогены, остаток растворяют
в 3 мл смеси хлороформ - метанол (1:2) и добавляют 0.& мл
раствора (25 мМ) Н~С12 в 0,05 н. водной НС1, выдерживают 15 мин
при 37°С. добавляют по 1,0 мл хлороформа и воды, смешивают и
разделяют фазы центрифугированием. Хлороформную фазу упаривают
досуха в токе азота, остаток разделяют препаративной ТСХ на сили-
кагеле Н в системе хлороформ - метанол - аммиак (65:25:5).
.Методом ТСХ отделяют сфингомиелины от метиловых эфиров жирных
кислот, альдегидов, цереброзидов, сульфолипидов и других липидов
устойчивых к щелочному гидролизу (см. табл. 7.9). Кроме тоге,
липиды, устойчивые к щелочному и кислотному гидролизам, можно
хроматографировать на колонке с 2 г силикагеля унисил или малин—
кродт (100 меш). При этом последовательно элюируют: метиловые
дайры жирных кислот и альдегиды (25 мл хлороформа);
цереброзиды и сульфолипиды (25 мл смеси хлороформ - метанол,
4:1) и сфингомиелин (25 мл смеси хлороформ - метанол, 1:4).
7.2.2.2. Химический анализ сфинголипидов
Как и при определении глинерофосФолипидов (разд. 7.2.1.5), в
полученных хроматографически однородных сфинголипидах следует
также установить суммарное содержание фосфора и азота (разд. 4.2
.и 4.3 соответственно), а также сфингозиновых оснований и жирных
кислот (разд. 4.11). Теоретически для сфинголипидов, содержащих
водорастворимые азотистые основания (т. е. сфингомиелина, кера-
мидаминоэтилфосфоната и т. д.), молярные соотношения Р: N : сфин-
гозиновые основания: жирные кислоты равны 1:2:1:1 (табл. 7.10).
Для дальнейшей идентификации сфинголипиды расщепляют и иденти-
фицируют образующиеся фрагменты молекул, как указано ниже.
7.2.2.3. Методы расщепления Сфинголипидов
а. Кислотный гидролиз [703]-
Смесь сфинголипидов гидролизуют 2 н. метанольным раствором
соляной кислоты или в соответствии с модифицированной методикой
1 н. водно-метанольным раствором соляной кислоты /103/ и раз де-
288
Глава 7
ляют продукты гидролиза на метиловые эфиры жирных кислот, выс-
шие жирные основания и водорастворимые компоненты, как описа-
но в разд. 4.11. Проводят анализ метиловых эфиров на содержание
сложноэрирных групп (разд. 4.4) и методом ГЖХ определяют жир-
ные кислоты и оксикислоты (разд. 7.1.6.2). Фракцию сфингозино-
вых оснований анализируют методом ГЖХ, как описано ниже (разд.
7.2.2.4). Водорастворимая фракция содержит весь липидный фос-
фор и водорастворимые азотистые основания. Так, например, сфин-
гомиелин дает фосфорилхолин и только следы свободного холина и
неорганических фосфатов; керамидфосфорилэтаноламин дает фосфорил-
этаноламин; керамидиилиатин дает 2-аминоэтилфосфат. Указанные
продукты можно разделить и идентифицировать хроматографией на
бумаге (табл. 7.11) или с помощью аминокислотного анализатора
(разд. 4.12.2.3).
7. Ферментативным гиоролиз [231, 280\,
К 5-6 мг Сфингомиелина добавляют 1,5 мл 0,1 М трис-бу-
шера (pH 7.4), содержащего 0,03 моль/л СаС1г. Смесь обрабатыва-
ют ультразвуком в течение 10 с и добавляют 3 мг фосфолипазы С,
препарат из С. pcrlnngens (" Caibiochem’1; " Koch-Light”; "Pierce”; "Sigma’’)
и 1,5 мп этилового эфира, смесь энергично встряхивают и выдер-
живают при комнатной температуре 3 ч при частом периодическом
встряхивании. Добавляют 3 мл эфира, снова встряхивают смесь, фа-
зы разделяют центрифугированием, эфирный раствор отделяют и
смесь опять экстрагируют 3 мл эфира. Объединенный эфирный эк-
стракт промывают водой, каждый раз разделяя слои центрифугиро-
ванием, и упаривают досуха в токе азота, добавляя бензол. Содер-
жащиеся в остатке керамиды определяют методами ТСХ, ГЖХ или
масс-спектрометрии, как описано ниже (разд. 7.2.2.5).
7.2.2.4. Анализ сфингозиновых оснований ’ 341]
а. Окисление оо алъоегидов [2SJ],
К раствору 1-5 мг сфингозинового основания в 4 мл метанола,
помешенному в колбу с боковым отростком, добавляют 0,5 мл
0,5 М свежеприготовленного раствора иодной кислоты (5,7 г
НЮ,-2Н,0 в 50 мл метанола). Инкубируют смесь в темноте при
комнатной температуре в течение 2 ч, добавляют 0,5 мл воды и
экстрагируют высшие жирные альдегиды тремя порциями петролей-
ного эфира (т. кип. 30-60°С) по 5 мл. Объединенный экстракт
упаривают почти досуха в другой колбе с боковым отростком и пре-
вращают альдегиды в ДМА кипячением с 4,5 мл 2,5%-ного раст-
вора НС! в метаноле в течение 1 ч. Добавляют 0,5 мл водного
оаствора 7 н. NaOH, кипятят 1 ч с обратным холодильником, чтобы
удалить эфиры жирных кислот, и экстрагируют ДМА низкокипяшим
петролейным эфиром. Растворитель упаривают в токе азота и опре-
деляют ДМА методом ГЖХ, как описано в разд. 7.1.5.2.
Идентификация липидов 28S
Для определения фитосфингозина в присутствии других сфинго-
зиновых оснований сфингофосфолипиды, цереброзиды или соответству-
ющие керамиды окисляют иодной кислотой точно так же, как это
описано для сфингозиновых оснований, и превращают образующиеся
альдегиды в ДМА. Последние образуются только из липидов, содер-
жащих фитс.зфингозин. Альдегиды, образующиеся в результате окис-
ления сфингозиновых оснований или интактных сфинголипидов иод-
ной кислотой, можно, как и свободные альдегиды, анализировать
методом ГЖХ (разд. 7.1.5.2). При определении длины и типа угле-
родной цепи основания следует иметь в виду, что сфингозиновые
или дигидросфингозиновые основания образуют альдегид, у которого
число атомов углерода равно п - 2, в то время как фитосфингозино-
вые основания образуют альдегид с числом атомов углерода п- Й.
б. Н епосредственный анализ оснований [703].
К раствору примерно 10 мг сфингозиновых оснований в 1 мл
пиридина добавляют 0,3-0,4 мл смеси гексаметилписилазана и три-
мета лхлорсилана (2:1) и инкубируют смесь при комнатной темпера-
туре в течение 1 ч. Аликвотную часть смеси переносят непосред-
ственно на газожидкостную колонку с 2,5% SE-30 на носителе газо-
хром S (100-120 меш), промытом кислотой и силанизированном.
Хроматографирование проводят при 210°С. Получают хорошее раз-
деление сфингозина, дигидросфингозина, О-метилсфингозина. X-
анетилсфингозина и 0-метил- X -ацетилсФингозина.
в. iTCX динитрофенилъныг производных
К раствору приблизительно 5 мг смеси сфингозиновых оснований
в 1 мл метанола, помешенному' в центрифужную пробирку емкостью
15 мл, добавляют 5 мкл 2,4—динитрофторбензола и затем по каплям
4 мл 2 М бората калия (pH 10,5). Смесь инкубируют 30 мин
при 60°С, разбавляют 0,5 мл воды, 4 мл метанола и 5 мл хлоро-
форма, встряхивают, центрифугируют, удаляют хлороформную фазу и
упаривают растворитель в токе азота. Остаток хроматографируют
на колонке с силикагелем (1 г), элюирование проводят последова-
тельно 20 мл смеси этиловый эфир - гексан (3:7) (удаляют ком-
поненты буфера и продукты дегидратации, образующиеся в процессе
кислотного гидролиза, например 3,5-циеновые или тетрагидрофура—
новые производные) и 20 мл смеси этиловый эфир — гексан (1:1).
Этой смесью элюируются динитрофенильные производные сфингози-
новых оснований, динитрофенол остается на колонке.
Очищенные ДНФ-производные анализируют методом ТСХ на
пластинках с силикагелем, пропитанным 2% бората натрия, в систе-
ме растворителей хлороформ - гексан - метанол (5:5:2). Компонен-
ты дают на хроматограмме желтые пятна или полосы. В этой сис-
теме разделяются насыщенные диоксисфингозины, ненасыщенные
.ipumpo—диоксисфингозины и иред-диоксисфингозины в соответствии
290
Глава
с их возрастающей полярностью. Разделенные компоненты элюируют
этиловым эфиром и переводят их в альдегиды, окисляя иодной кис-
лотой (методика описана выше) или тетраанетатом свинца. В послед-
нем случае 0,1-0,5 мг раствора Д НФ-производных в 0,1 мл бензе-
ле окисляют приблизительно 1О мг тетраацетата свинца при 50°С
в течение часа, разбавляют смесь 1 мл воды, экстрагируют альде-
гиды 2 мл гексана и сразу анализируют альдегиды как таковые или
в виде ,ДМА-произвоцных.(разц. 7.1.5.2).
7.2.2.5. Анализ керамидов
Анализ керамидных фрагментов сфинголипидов позволяет опре-
делить индивидуальные молекулярные типы сфинголипидов, поскольку
керамиды представляют собой амиды жирных кислот и сфингозиновых
оснований. Приведем несколько примеров методик анализа керамидов.
а. Разделение ацетилированных нерамиоов методом ГЖХ [280].
5-10 мг смеси керамидов ацетилируют 2 мл смеси пиоидин -
уксусный ангидрид (2:1) в течение 16 ч при комнатной температу-
ре, смесь упаривают в токе азота, остаток сушат в вакууме над
гранулированным КОН и концентрированной серной кислотой. Ацети-
лированные керамиды растворяют в 0,1 мл хлороформа и наносят
на препаративную пластинку’ с силикагелем G, пропитанным 6% нит-
рата серебра. Пластинку проявляют в системе хлороформ — бензол -
метанол (80:20:1), опрыскивают 0.2%-ным 2',7’-дихлорфлуоресци-
ном и просматривают в ультрафиолетовом свете. Элюируют каждый
из разделенных компонентов 10 мл метанольного 0,6 н. раствора
\a0Ii и 2 мл хлороформа. Силикагель удаляют центрифугированием.
Элюат разбавляют 8 мл хлороформа и инкубируют в течение часа
при комнатной температуре, чтобы отшепить О-апильные группы
(в этих условиях амидные связи не расщепляются). Добавляют 9 мл
воды, смесь перемешивают, центрифугируют, отделяют хлороформную
Фазу и утеривают в токе азота. Эта методика позволяет разделить
кесамиды главным образом по числу двойных связей жирнокислот—
ных остатков. Если последние содержат только одну двойную связь,
их удается разделить по длине цепи. Таким образом, диацетаты N-
стеарил-, Х-нервоноил-, N-олеил- и Х-линолеоилсфингозинов
будут иметь соответственно следующие значения Лю 0,75; 0,60;
0,44; 0.23. После этого каждый из керамидных остатков/разделен-
ных ТСХ, анализируют методом ГЖХ или ГЖХ - масс-спектроскопии,
чтобы определить длину и тип углеродной цепи жирнокислотных ос-
татков и сфингозиновых оснований в молекулярных типах индивидуаль-
ных керамидов.
Идентификация липиаов
291
б, Н епосредственный анализ керамидов методом ГЖХ мили ГЖХ - масс-
спектрометрии.
Керамиды можно анализировать непсеведственно методом ГЖХ
в виде их ТМС-производных /65, 280/, которые получают следую-
щим образом /103/. К раствору приблизительно 1 мг керамидов
в 0,1 мл абсолютного пиридина добавляют 20 мкл гексаметилдиси-
лазана и 10 мкл триметилхлорсилана и выдерживают смесь при ком-
натной температуре в течение часа, упаривают в токе азота, оста-
ток сушат в вакууме. ТМС-эфиры растворяют в 0,2 мл сероуглеро-
да. ГЖХ или комбинированную ГЖХ — масс-спектрометрию ТМС—про-
. изаодных насыщенных или ненасыщенных керамидов, содержащих выс-
:иие жирные кислоты или 2-оксикислоты, проводят на колонке с 1%
силикона SE-30 на газохроме Р (100 меш - 120 меш), промытом
кислотой и силанизированном, при программировании температуры
со скоростью 2 град/мин от 230°С /65/ или на колонке длиной
1.2 м с 1% силикона 0V-I на газохроме Q (60-80 меш), промы-
том кислотой и силанизированном, при температуре 27 О °C или в
диапазоне температур 260-290°С в зависимости от полярности ке-
рамидов /124, 280/.
Керамиды, содержащие фитосфингазин, анализируют в виде ТМС-
л'нрон на колонке с 1% 0\-1на газохром- Q при 280°С /123/
или на колонке с 1,5% ECNSS-S на газохроме S (100-120 меш),
промытом кислотой и силанизированном, при 215°С для ТМС-эФиров
или триацетатов 14- ацетилфитосфингозина /322/. Подробное описа-
ние комбинированного метода ГЖХ - масс-спектрометрия дается
ь специальной литературе, ссылки на котовую приведены выше.
в. Щелочной гидролиз керамиоов \22ti, 231\.
Растепление керамидов щелочным гидролизом с образованием
сфингозиновых оснований и жирных кислот имеет ряд преимуществ,
поскольку позволяет избежать образования нежелательных побочных
продуктов (что имеет место при кислотном гидролизе) и сохранить
стереохимическую конфигурацию оснований. Смесь керамидов (4 мг)
гидролизуют 2 мл 1 М раствора КОН в метаноле при 7 0°С в те-
ч.'Ние 18 ч. Сфингозиновые основания экстрагируют 4 мл этилово-
го эфира, предварительно добавив 2 мл воды. Чтобы извлечь жир-
ные кислоты, водный слой сильно подкисляют 6 н. НС1 и экстраги-
руют смесь этиловым эфиром. Сфингозиновые основания анализиру-
ют ГЖХ или ТСХ, как указано в разд. 7.2.2.4, жирные кислоты
превращают в метиловые эфиры и также анализируют ГЖХ (разд.
7.1.6.2).
• • .7.3. Гликолипиды
Полное описание методик идентификации различных типов глико-
липидов, перечисленных в разд. 1.12, можно найти в специальной
литературе, и ниже мы рассмотрим методы исследования лишь не-
скольких, наиболее часто встречающихся типов гликолипидов.
292
Глава
.копилииной фракции
на колонке с си-
' .-астворителей, содер-
.. «йшее разделение и
.дов проводят методом
ьствооителей хлороформ -
7.3.1. Гликозилоиг лиц °;ыды
Одним из лучших способов вылей-: ’•
является хроматография суммарны:
ликагелем. Гликолипиды элюируют ск.
жашими ацетон /338/ (разд. 5.2.1..
выделение индивидуальных гликознлднгли:
ТСХ на силикагеле Н или G в системе
метанол - концентрированный аммиак (70:20:2).
Предварительную идентификацию гликозилдиглицеридов прово-
пят на основании величин fif. полученных при проведении анализа
метопом ТСХ в нескольких системах растворителей или метопом
хроматографии на бумаге, пропитанной кремневой кислотой, а также
путем обнаружения специфическими реактивами, например перйодат -
реагент ШифФа и а-наФтоловый обнаружитель для сахаров (табл.7.S
На этой стадии желательно располагать аналитическими данными
для установления молярных соотношений сахар: глицерин: ацильные
группы : жирные кислоты (табл. 7.10).
Для идентификации углеводородного остатка (или остатков) про-
водят жесткий кислотный гидролиз (разд. 7.2.1,7). Водораствори-
мые продукты (сахара, глицерин и т. п.) идентифицируют хромато-
графией на бумаге (табл. 7.11). При мягком щелочном дезапилиро-
вании образуются гликозиды глицерина, которые также идентифици-
руют хроматографией на бумаге (разд. 7.2.1.5. табл. 7.11) /50/.
Метиловые эфиры жирных кислот анализируют ГЖХ (разд. 7.1. 6.2).
Гликозиды глицерина можно также разделить и выделить препаратив-
ной хроматографией водорастворимых продуктов шелочного гидролиза
обработанных амберлитом МВ-3 (смесь анионе— и катионообменных
смол), на бумаге ватман ЗММ в системе растворителей этилацетат -
пиридин - вода (2:5:5, верхняя фаза). Разделенные гликозиды гли-
церина элюируют водой, элюаты упаривают досуха, остаток перекрис-
таллизовывают из соответствующего растворителя-/61, 130, 281/
и затем характеризуют по температуре плавления, величине угла
оптического вращения и ПК-спектрам /130/. Гликозиды глицерина,
входящие в состав некоторых гликозилдиглицеридов (моно- и пига-
лактозилпилиноленин), можно также получить с помощью специфичес-
ких галактозилдиглицеридапилгидролаз из листьев бобов /281, 285/
Для определения связей между сахарами гликозилдиглицериды
метилируют иодистым метилом в течение 30 ч в диметилформамиде
в присутствии окиси серебра /130/. После метанолиза раствором
НС1 в метаноле при кипячении с обратным холодильником метил-
гликозиды метилированных сахаров идентифицируют ГЖХ на карбо-
ваксе 6000 при 175°С /168/. Гидролизом метилированных глико-
липидов 0.5 М H2SO4 их можно также превращать в метилированные
сахара, которые разделяют и идентифицируют хроматографией на бу-
Иоеняшфшевцих липиоое
293
маге в системе бутанол - этанол - вода (5:1:4, верхняя фаза)
/130/. Результаты метилирования следует подтвердить количествен-
ным перйодатным окислением интактного гликозилдиглицерида или
г.тикозилглицерина (разд. 4.13) /61, 130/. Конфигурацию гликозид-
ных связей определяют гидролизом специфичными а- и /4-гликози-
дазами и хроматографической идентификацией образующихся свобод-
ных сахаров /50,61 /. Конфигурацию связей сахаров в ди- или три-
г.чикозилдиглиперидах можно определить мягким кислотным гидроли-
зом и идентификацией свободных сахаров, полиолов или гликозидов
в гидролизате с помощью хроматографии на бумаге /50/.
7.3.2. Цереброзиды и керамидполигексозиды.
Методика выделения цереброзидов и керамидлолигексозидов в
основном совпадает с методикой, описанной для сфингомиелинов
в разд. 7.2.2.1, см. также /218, 231/. Окончательную очистку
провопят методом препаративной ТСХ на силикагеле G в системе
хлороформ - метанол - вода (65:25:4) /218/ или на силикагеле
Н в системе хлороформ - метанол - вода (32:8:1)’. После этого
индивидуальные компоненты керамидгликозидов гидролизуют 2 в. ме-
танольным раствором НС1 и подвергают количественному анализу
на содержание сахаров, сфингозиновых оснований и жирных кислот
(табл. 7.11), как описано в разд. 4.11 и 7.2.2.3. Длину и тип уг-
леродной цепи сфингозиновых оснований определяют методом ГЖХ,
как описано в разд. 7.2.2.4. Нормальные жирные кислоты и окси-
кислоты анализируют ГЖХ (разд. 7.1.6.2.). Сахара идентифицируют
хроматографией на бумаге (разд. 7.3.1).
Данные Хайяши и Кейтса, публикуются впервые.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Abramson М.В., Norton W.T., Katzman R., J. Biol. Chem., 240, 2389 (1965).
2. Ackman R.G., Methods in Enzymology, Academic Press, New York, vol. 14,
1969, pp. 329-381.
3. Adams G.A., Singh P.P., Biochim. Biophys. Acta, 202, 553 (1970).
4. Adams G. A., Kates M., Shaw D.H., Yaguchi M., Can. J. Biochem., 46,
1175 (1968).
5. Agranoff B. IF., Suomi H.D., Biochem. Preparations,TO, 47 (1963).
6. Al-Arif A., Blecher M., J. Lipid Res., TO, 344(1969).
7. Albro P. IF., Dittmer J. C., Biochemistry, 8, 394(1969).
8. Albro P.W., Dittmer J.C., Lipids, 5, 320 (1970).
9. Allen C.F., Good p., Davis H.F., Chisum P., Flowler S.D., J. Amer. Oil
Chem. Soc., 43, 223 (1964).
10. Allen R.J.L., Biochem. J., 34, 858 (1940).
11. Anderson R.E.. Garrett R.D., Blank M.L., Snyder F., Lipids, 4, 327 (1969).
12. Anker H.S., J. Biol. Chem., 194, 177 (1952).
13. Anker U.S., Methods in Enzymology, Academic Press, New York, vol. 4, 1957,
pp. 779-809.
14. Ansell G.B., Hawthorne J .N., Phospholipids, Elsevier, Amsterdam, 1964.
15. Ansell G.B.. Spanner S.. Biochem. J., 88. 56, (1963).
16. Appleton H.D., La Du B.N., Jr., Levy~B.B., Steele J.M. J Brodie B.B.,
J. Biol. Chem., 205. 803 (1953).
17. Armbruster ()., Beiss V., Z. Naturforsch., 13b, 79 (1958).
18. Arum C., J. Biol. Chem., 157, 585(1945).
19. Arum C.. Methods in Enzymology, Academic Press, New York, vol. 4, 1957,
pp. 809-840.
20. Arvidson G.A.E., J. Lipid Res., 6, 574 (1965).
21. Asselineau J., The Bacterial Lipids, Hermann, Paris, 1966.
22. Axelrod J., Reichenthal )., Brodie B.B., J. Biol. Chem., 204,-903 (1953).
23. Baddiley J., Buchanan J.G.. H andschumacher R.E., Prescott J.F., J. Chem.
Soc., 1956, 2818.
24. Baer E., J. Am. Oil Chem. Soc., 42, 257 (1965).
25. Baillie L.A., Int. J. Appl. Radiation Isotopes, 8, 1 (I960).
26. Barrett C.B., Dallas M.S., Padley F.B., .1. Am. Oil Chem. Soc., 40, 580 (1963)-
Списоялияер амуры
295
-27; Ballett G.R., J. Biol. Chem., 234, 466 (1959).
28. Baumann N.A., Hagen P.O., Goldfine H., J. Biol. Chem., 240, 155911965).
29. Beare J.L., Kates M., Can. J. Biochem., 4Б, 101 (1967).
30. Beiss V., J. Chromatog., 13, 104 (1964).
31. Беллами Л.р Инфракрасные спектры сложных молекул,"Мир", М., 1963.
32. Benson A. A., Advan. Lipid Res., 1, 387 (1963).
33. Benson A.-A., Maruo B.t Biochim. Biophys. Acta, 27, 189 (1958).
34. Bergstrom S., Bergstrom B., Rettenberg M., Acta Physiol. Scand., 25, 120
(1952).
35. Bevan Т.Н., Brown D.A., Gregory G.I., Malkin T., J. Chem. Soc., 1953, 127.
36. Bieman K., Mass Spectrometry : Organic Cemical Applications, McGraw-Hill,
New York, 1962.
37. Bischel M.C., Austin J.H., Biocbim. Biophys. Acta, 70, 598 (1963).
38. Bligh E.G., Dyer W.J., Can. J. Biochem. Physiol., 37, 911 (1959).
39. Blumer M., Thomas D.V., Science, 147, 1148 (1965).
40. Blumer M., Robertson J.C., Gordon J.E., Sass J.. Biochemistry, 8, 4067 (1965
41. Bonner ILA., J. Chem. Educ., 30, 452(1953).
42. Breckenridge W.C.,Kuskis A., Lipids, 3, 291 (1968).
43. Breckenridge V.C., Moral L., Kuskis A., Can. J. Biochem., 47, 761 (1969).
44. Brian B.L., Gardner E.W., Appi.-Microbiol., 16, 549 (1968).
45. Brockerhoff H., J. Lipid Res., 4, 96 (1963).
46. Brockerhoff H., J. Lipid Res., 6, 10 (1965).
47. Brockerhoff H., J. Lipid Res., 8, 167 (1967).
48. Brockerhoff H., Hoyle R.J., Volmark N., Biochim. Biophys. Acta, 116, 67
(1966).
49. Brown J.L., Johnston J.M., J. Lipid Res., 3, 480 (1962).
50. Brundish D.E., Show N., Baddiley J., Biochem. J., 99, 546 (1966).
сА..Будзипевич Г., Джерасси К., Уильямс Д.,< Интерпретация масс-спектров
органических* соединений, "Мир", М., 1966.
52. Burrows S., Grylls F.S., Harrison J.S., Nature, 170, 800 (1952).
53. Burton A.J., Carter Й.Е., Biochemistry, 3, 411 (1964).
54. Campling J .D., Nixon D.A., J. Physiol., 126, 71 (1954).
55. Card G.L., Georgi C.E., Militzer V.E., J. Bacteriol., 97, 186 (1969).
56. Carroll K.K., Nature, 191, 377 (1961).
57. Carroll K.K., J. Lipid Res., 2, 135 (1961).
58. Carroll K.K., J. Am. Oil Chem. Soc., 40, 413(1963).
59. Carroll K.K., Serdarevich B., Lipid Chromatographic Analysis, Dekker Inc.,
New York, vol. 1, 1967, pp. 205-237.
60. Carroll K.K., Cults J.H., Murray G.D., Can. J. Biochem. 46, 899 (1968).
61. Carter H.E., McCluer R.H., Slifer E.D., J. Am. Chem. Soc., 78. 3735 (1956).
62. Carter H.E.. Smith D.B., Jones D.N., J. Biol. Chem., 232, 68) (1958).
63. Carter H.E., Strobach D.R., Hawthome J.N., Biochemistry, 8, 383 (1969).
64. Cartwright N.J., Biochem. J., 67, 663 (1957).
296
Список литературы
65. Casparini С., Homing E.G., Homing M.G., Chem. Phys. Lipids,3, 1 (1969).
66. Chang Kennedy E.P., J. Lipid Res., 8, 447 (1967).
67. Chapman D-, J. Chem. Soc., 1963, 131.
68. Cheronis N.D., Ha T.S., Organic Functional Group Analysis, Interscience
Publishers, New York, 1964, p. 507.
69. Christiansen K., Mahadevan 1'., Viswanathan C.V., Holman R.T., Lipids,
4, 421 (1969).
70. Christie U'.R'., Moore J.H., Biochim. Biophys. Acta, 176, 445(1969).
71. Christie R'.B'., Rebello D., Holman R.T., Lipids, 4, 229 (1969).
72. Clayton R.B-, (ed.), Methods in Enzymology, Steroids and Terpenoids,
Academic Press, New York, vol. 15, 1969.
73. Comforth R.H., Popjak G., Methods in Enzymology, Academic Press,
New York, vol. 15, 1969, pp. 359—390.
74. Courchaine A.J., Miller V.H., Stein D.B., Jr., Clin. Chem., Б, 609 (1959).
75. Craig L.G., Craig D., Technique of Organic Chemistry, Interscience Publi-
shers, New York, vol. 3, 1950, p. 171.
76. Dauben ff'.G., J. Am. Chem. Soc., 70, 1376 (1948).
77. Davidson J.B., Stanacev N.Z., Can. J. Biochem., 48, 633 (1970).
78. Davidson J.B., Stanacev N.Z., Can. J. Biochem., 49, 1117 (1971).
79. Dawson R.M.C., Biochem. J., 68, 352 (1958).
80. Dawson R.M.C., Lipid Chromatographic Analysis, Dekker Inc., New York,
vol. 1, 1967, pp. 163-189.
81. Dawson R.M.C.. Freinkel N., Biochem. J., 78, 606 (1969).
82. Dawson R.M.C.. H emington N., Davenport J.B., Biochem. J., 84, 497 (1962).
83. Deluca H.F., Zile M.H., Neville P.F., Lipid Chromatographic Analysis,
Dekker Inc., New York, vol. 2, 1969, pp. 345—457.
84. Dittmer J.D., Lester R.L., J. Lipid Res., 6, 126 (1964).
85. Dittmer ].C., H ells M.A., Methods in Enzymology, Academic Press, New York,
vol. 14, 1969, pp. 482-530.
86. Dubois M., Gilles K.A., Hamilton J.K., Rebers P.A., Smith F., Anal. Chem.,
28, 350 (1956).
87. Dunagin P.E.,Jr., Olson J. A., Methods in Enzymology, Academic Press,
New York, vol. 15, 1969, pp. 289 -301.
88. Dutton H-J-, Holman R.T., (ed.), Progress in Chemistry of Fats and Other
Lipids, Pergamon Press, London, vol. 2,1954 p. 292.
89. Dyer J.R., Applications of Absorption Spectroscopy of Organic Compounds,
Prentice-Hall, Inc. Englewood Cliffs, N.J., 1965.
90. Eberhardt F.M., Kates M., Can. J. Botany, 35, 907 (1957).
91. Emery E.E., Gear J.R., Can. J. Biochem., 47, 1195 (1969). .
92. Farquar /.IL, J. Lipid Res., 3, 21 (1962).
93. Fehler S.H.G., Light R.J., Biochemistry, 9, 418 (1970).
94. Ferrari R.A., Benson A. A., Arch. Biochem. Biophys., 93, 185 (1961).
Список литераторы
297
95. Ferrell V.J., Radloff J.F., J ackiw A.B., Lipids, 4. 278 (1969).
96. Физ ер Л., Физер M., Реактивы для органического синтеза, "Мир", М.,
1970.
97. Folch J., Lees М., Sloane-Stanley G.A., J. Biol. Chem., 225, 497 (1957).
98. Freeman C.P., West D., J. Lipid Res., 7, 324 (1966).
99. Freeman N.K., Ann. N.Y. Acad. Sci., 69, 131 (1957).
100. Fu H.C., Nicolaides N., Lipids, 4, 170 (1969).
101. Fumagali R., Lipid Chromatographic Analysis, Dekker Inc., New York, vol.2,
1969, pp. 187-213.
102. Galanos D.S., Kapoulas V.M., J. Lipid Res., 3, 134 (1962).
103. Caver E.C., Sweeley C.C., J. Am. Oil Chem. Soc., 42, 294 (1965).
104, Gidez L.I., Kamovsky M.L., J. Am. Chem. Soc., 74, 2413(1952).
105. Glick D., J. Biol. Chem., 156, 643 (1944).
106. Glynn I.M., Chappell J.B-, Biochem. J., 90, 147 (1964).
107. Goldfine H., J. Biol. Chem., 239, 2130 (1964).
108. Goldfine Hl, Panos C., J. Lipid Res., 12, 214 (1971).
109. Goodwin T.W., (ed.). Chemistry and Biochemistry of Plant Pigments,
Academic Press, London and New York, 1965.
110. Goren M.B-, Biochim. Biophys. Acta, 210. 127 (1970).
111. Goren M.B., Lipids, 6, 40 (1971).
112. Gottfried E., Rapport M.M., J. Biol. Chem., 237, 329 (1962).
113. Gottfried E., Rapport M.M., Biochemistry, 2, 646 (1963).
114. Gray G.M., Lipid Chromatographic Analysis, Dekker, New York, vol. 1, 1967,
pp. 401—427.
115. Grey G.M., Methods in Enzymology, Academic Press, New York, vol. 14,
1969, pp. 678-684.
116. Green K., Samuelsson B., J. Lipid Res., 5, 117 (1964).
117. Gunstone F.D., An Introduction to the Chemistry and Biochemistry of Fatty
Acids and their Glycerides, Chapman and Hall Ltd., London, 1967.
118. Hack M.H-, J. Chromatog., 5, 531 (1961).
119. Hack M.H., Ferrans V.J., L. Physiol. Chem., 315, 157 (1959).
120. Haines Т.Н., Progress in Chemistry of Fats and Other Lipids, Pergamon
Press, Oxford, vol. 11, 1971, pp. 297—345.
121. Hallgren B., Larsson S., J. Lipid Res., 3, 31 (1962).
122. Hamilton P.B., Methods in Enzymology, Academic Press, New York, vol. 11,
1967, pp. 15-27.
123. Hammarstrom S., J. Lipid Res., 11, 175(1970).
124. Hammarstrom S., Samuelsson S.B., Samuelsson K,, J. Lipid Res., 11,
150 (1970).
125. Hanahan D.J., Lipid Chemistry, Wiley, New York, 1959.
126. Hanahan D.J., Olley J.N., J. Biol. Chem., 231, 813 (1958).
127. Hanahan D.J., Vercamer R., J. Am. Chem. Soc., 76, 1804 (1954).
128. Hanahan D.J., Watts R., J. Biol. Chem.. 236, 59 PC (1961).
298
Список литературы
129. Haverkate F., Van Deenen L.L.M., Biochim. Biophye. Acta, 10S, 78 (1965).
130. Heinz E., Biochim. Biophye. Acta, 144, 321 (1967).
131. Hemming F. W’., Biochem. J., 113, 23 P (1969).
132. Hirsch J., J. Lipid Res., 4, 1 (1963).
133. Holub B.J., Kuksis A., Lipids, 4, 466 (1969).
134. Hopkins C.Y., J. Am. Oil Chem. Soc., 38, 664 (1961).
135. Hopkins C.Y., in “Progress in Chemistry of Fats and Other Lipids”,
Holman R.T. (ed.l, Pergamon Press, London, vol. 8, 1965, pp. 213—257.
136. Horning E.C., Karmen A., Sweeley C.C., in “Progress in Chemistry of Fats
and Other Lipids”. Holman R.T. (ed.), Pergamon Press, Oxford, vol. 7,
1964, p. 167.
137. Hubcher G., Nawthome J.N., Kemp P., J. Lipid Res., 1, 1453 (1960).
138. Hurlbert R.B., Brumm A.F., Schmitz H., Potter I.R., J. Biol. Chem., 209,
23 (1954).
139. Iddings F-A., Wade J.T., J. Gas Chromatog., 1, 31 (1963).
140. Jackman L.M., Application of Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy
in Organic Chemistry, Pergamon Press, Oxford, 1959.
141. Jackson L.L., Baker G.L., Lipids, 5, 239 (1970).
142. James A.T., Methods Biochem. Anal., В, 1 (1960).
143. James A.T., Martin A.J.P., Biochem. J., 50, 679 (1952).
144. James A.T., Ravenhill J.R., Scott R.P.W., Chem. Ind., London, 1964, p. 746.
145. J atzkewitz H., Mehl E., Ъ. Physiol. Chem., 320, 251 (1960).
146. Joo C.N., Shier T., Kates M., J. Lipid Res., 9, 782 (1968).
147. Jungalawala F.B., Porter J. if'., Methods in Enzymology, Academic Press,
New York, vol. 15, 1969, pp. 454—460.
148. Kaneda T., Biochemistry, 6, 2023 (1967).
149. Kaneda T., Phytochemistry, 8 , 2039 (1969).
150. KanferJ., Kennedy E.P., J. Biol. Chem., 23S. 2919 (1963).
151. Kapoulas V.M.. Biochim. Biophys. Acta, 176, 324 (1969).
152. Karlsson K.A., Chem. Phys. Lipids, 5, 6 (1970).
153. Karmen A., Methods in Enzymology, Academic Press, New York, vol. 14,
1969, pp. 465—482.
154. Karmen A-., Giuffrida L., Bowman R.L., J. Lipid Res., 3, 44 (1962).
155. Kamovsky M.L., Brumm A.F., J. Biol. Chem., 216, 689 (1955).
156. Kates M., Biochim. Biophys. Acta, 41, 315 (1960).
157. Kates M., J. Lipid Res., 5, 132 (1964).
158. Kates M.. Advan. Lipid Res., 2, 17 (1964).
159. Kales M., Lipid Chromatographic Analysis, Dekker Inc., New York, vol. 1,
1967, p. 1-39.
160. Kales M., Advan. Lipid Res., 8, 225 (1970).
161. Kates M., in “The Ether Bond in Lipids”, Snyder F. (ed.), Academic Press,
New York, 1972, pp. 351-398.
162. Kates M., Adams G.A., Martin S.M., Can. J. Biochem., 42. 461 (1964).
Список Mimepaetypbt 299
163. Kates М., Allison A.C., Tyrrell D.A.J., Janies A.T., Biochim. Biophys.
‘ Acta, 52, 455 (1961).
164. Kates M-, Baxter R.M., Can. J. Biochem. Physiol., 40, 1213 (1962).
165. Kates M., Chan Т.Н., Stanacev N.Z., Biochemistry, 2, 394(1963).
166. Kales M., Eberhardt F.M., Can. J. Botany, 35, 895 (1957).
167. Kates M., Kushner D.J., James A.T., Can. J. Biochem. Physiol., 40, 84
(1962).
168. Kates M., Palameta B., Perry M.B., Adams G.A., Biochim. Biophys. Acta,
137. 213 (1967).
169. Kates M., Palameta B., Joo C.N., Kushner D.J., Gibbons N.E., Bioche*
• mistry, 6, 4092 (1966).
170. Kates M., Sastry P.S., Methods in Enzymology, Academic Press, New York,
vol. 14, 1969, pp. 197-203.
171. Kates Ji., Volcani B.E., Biochim. Biophys. Acta, 116, 164(1966).
172. Kates M., Wassef K.„ Kushner D.J., Can. J. Biochem., 46, 971 (1968).
173. Kales M., Уengoyan L.S., Sastry P.S., Biochim. Biophys. Acta, 98, 252(196
174. Kauianami J., Kimura A.. Otsuka H., Biochim. Biophys. Acta, 152, 808 (1968
175. Kennedy С.У., Collier R., Comp. Biochem. Physiol., 7, 179 (1962).
176. Kleiman R., Spencer G.F., Earle F.R., Wolff I. A., Lipids, 4, 135(1969).
177. Klvashchitskii B.A., Shvets V.J., Preobrazhenskii N.A., Chem. Phys.
Lipids, 3, 393 (1969).
178. Kolaltukudy P.E., Lipids, 5, 259 (1970).
179. Kolaltukudy P.E., Lipids, 5, 398 (1970).
180. Krabisch L-, Borgstrbm B., J. Lipid Res., 6, 156 (1965).
181. Kritchevsky D., Malhotra S., J. Chromatog., 52, 498 (1970).
182. Kritchevsky D., Mccandless F.J., Knoll J.E., Eidinoff M.L., J. Am- Chem.
Soc., 77, 6655 (1955).
183. Kuksis A., Lioid Chromatographic Analysis, Dekker Inc., New Y ork, vol.l,
1967, pp. 239—337.
)84.Kufcsis A.. Berckenridge W.C., Stachnyk O., J. Lipid Res., 10, 25 (1969).
» 185. Kuksis A., Marai L., Lipids, 2, 217 (1967).
186. Lambert M., Neish A.C., Can. J. Res., Sect. B, 28, 83 (1950).
187. Laneele G., Asselineau J., Europ. J. Biochem., 5. 487 (1968).
188. Lea C.H.. Rhodes D.N., Biochim. Biophys. Acta, 17, 416(1955).
189. Lea C.H., Rhodes D.N., Stoll R.D., Biochem. J., 60, 353 (1955).
190. Ledeen R., J. Amer. Oil Chem. Soc., 43, 57 (1966).
191. Lee Ballou C.E., J. Biol. Chem., 239, 1316 (1964).
192. Lepage M-, J. Lipid Res.. 5. 587 (1964).
193. Lepage M., Lipids, 2, 244 (1967).
194 Letters R.. Biochem. J., 93, 313(1964).
195. Letters R., Biochim. Biophys. Acta, 116, 489 (1966).
196. Levine C., Chargaff E., J. Biol. Chem., 192. 465, 481 (1951).
197. Liang C.R., Rosenberg H., Biochim. Biophys. Acta, 125, 548 (1966).
300
Список литературы
198. Lowenstein J.M. (ed.), Methods in Enzymilogy ; Lipids, Academic Press,
New York, vol. 14, 1969.
199. Lowry R.R.. J. Lipid Res., 9, 397 (1968).
200. MacFarlane M. G.. Nature, 196, 136 (1962).
201. Mahadevan V., Lipid Chromatographic Analysis, Dekker, Inc., New York,
vol. 1, 1967, pp. 191-203.
202. Mahadevan V., Lindberg W.O., J. Lipid Res., 3, 106 (1962).
203. Mahadevan V., Viswanathan C.V., Fillips F., J. Lipid Res., 8, 2 (1967).
204. Matins D.C., Mangold U.K., J. Amer. Oil Chem. Soc., 37, 576 (1960).
205. Mangold H.K., in “Thin Laver Chromatography”, Stahl E. (ed.), Springer
Verlag, New York, 1969, pp. 363—421.
206. Mangold H.K. in “Thein Layer Chromatography”, Stahl E. (ed.) Springer
Verlag, New York, 1969, pp. 155—200.
207. Mangold H.K.., Baumann W.J., Lipid Chromatographic Analysis, Dekker Inc.,
New York, vol. 1, 1967, pp. 339—359.
208. Mangold H.K., Kammereck R., Matins D.C. in “International Symposium on
Microchemical Techniques”, Cheronis N. (ed.), Wiley Interscience,
New York, 1962, p. 697.
209. Mangold H.K., Malins D.C., J. Amer. Oil Chem. Soc., 37, 383 (1960).
210. Mangold H.K., Schlenk H., J. Biol. Chem., 229, 73) (1957).
211. Mangold H.K., Schmid H.H.O., Stahl E., Methods Biochem. Anal., 12, 393
(1964).
212. Marai L., Kuksis A., J. Lipid Res., 10, 141 (1969).
213. Marinetti G.V., J. Lipid Res., 3, 1 (1962).
214. Marinetti G.V., New Biochemical Separations, Van Nostrand, Princeton,
N.J., 1964, p. 339.
215. Mannetti C.V., J. Lipid Res., 6, 315(1965).
216. Marinetti G.V., (ed.), Lipid Chromatographic Analysis, Dekker Inc.,
New York, vol. 2, 1969.
217. Marinetti G.V., Stolz E., Biochim. Biophys. Acta, 21, 168 (1956).
218. Martensson E., Biochim. Biophys. Acta, 116, 296 (1966).
219. Mayers G.M., Pousada M., Haines Т.Н., Biochemistry, 8. 2981 (1969).
220. Mazliak P., in “Biochemistry of Fruits”, Hulme A.C. (ed.), Academic
Press, New York, 1970.
221. Mazur R.H., Ellis B.U., Cammarala P.S., J. Biol. Chem., 237, 1619 (1962).
222. McCloskey J.A., Methods in Enzymology, Academic Press, New York,
vol. 14, 1969, pp. 382—450.
223. McCloskey J. A., LawJ.H., Lipids, 2, 225 (1967).
224. McCloskey ).A., McClelland M.J., J. Amer. Chem. Soc., 87, 5090 (1965).
225. McMurray JT.C., Strickland K.P., Berry J.F., Rossiter R.J., Biochem. J.,
66. 634 (1957).
226. Michalec C., Kolman Z., J. Chromatog., 31, 632(1967).
Список литературы
301
227. Mietlinen Т.,. Takki-Luukainen 1.Т., Acta Chem. Scand., 13, 856 (1959).
228. Moore $., Stein W.H., J. Biol. Chem., 211, 907 (1954).
229. Morgan T.E., Hanahan D.JEkholmJ., Federation Proc., 22, 414(1963).
230. Morris L.J., J. Lipid Res., 7, 717 (1966).
231. Morrison W.R., Biochim. Biophys. Acta, 176, 537 (1969).
232. Morton R.A., Comprehensive Biochemistry, Elsevier, Amsterdam and
New York, vol. 3, ch. 4, 1962.
233. Murray P., Williams D.L., Organic Syntheses with Isotopes, Wiley Inc. and
Interscience Publ., New York, Part 1 and 2 (1958).
234. Наканиси K.y Инфракрасные спектры и строение органических соедине-
' ний, "Мир", М„ 1965.
235. Newenzel J.C., Lipids, 5, 308 (1970).
236. Newenzel J.C., Howton D.R., J. Org. Chem., 22, 319 (1957).
237. Nichots B.W.. New Biochemical Separation, Van Nostrand, Princeton, N.J.,
1964, p. 321.
238. Nickell E.C., Privett O.S., personal communication, 1970.
239. Nicolaides N., Fu H.C., Lipids, 4, 83 (1969).
240. Nicolaides N., Fu H.C., Ansari M.N.A., Lipids, 5, 299 (1970).
241. Nystrom R.F., Brown W.G., J. Amer. Chem. Soc., 69, 2548 (1947).
242. O’Brien J ,S.,'Rouser G-, Anal. Biochem.. 7, 288 (1964).
243. O' Conner J.G., Burrow F.H., Norris M.S., Anal. Chem., 34, 82 (1962).
244. Odham G., Fette, Seifen, Anstrichmiltel, 69, 164(1967).
245. O’Leary W.M., The Chemistry and Metabolism of Bacterial Lipids, World
Publishing Co., Cleveland and New York, 1967.
246. Olley J., Chem. and Ind. (London), 1956, p. 1120.
247. Op Den Kamp J.A.F., Bonsen P.P.M., Van Deenen L.L.M., Biochim.
Biophys. Acta, 176, 298 (1969).
248. Oro Nooner D.W., Olson R.j., Lipid Chromatographic Analysis, Dekker
Inc., New York, vol. 2, 1969, pp. 479—521.
249. Oro J., Toma'bene T.G., Nooner D.W., Gelpi E., J. Bacteriol., 93, 1811 (1967
250. Oswald E.O., Piantadosi C., Anderson C.E., Snyder F., Lipids, 1, 241 (1966
251. Ottolenghi A.C., Methods in Enzymology, Academi c Press, New York, vol. 14
1969, pp. 188-197.
252. Pelick N., Henly R.S., Sweeny R.F., Miller M., J. Amer. Oil Chem. Soc.,
40, 419 (1963). ’
253. Pelick N., Wilson T.L., Miller M.E., Angeloni F.M., Steim J.M., J. Amer.
Oil Chem., Soc., 42, 393 (1965).
254. Pinter K.G., Hamilton J.G., Muldery J.E., J. Lipid Res., 5, 273 (1964).
255. Privett O.S., Blank M.L., Ramanus 0., J. Lipid Res., 4, 260 (1963).
256. Privett O.S., Nutter L.J., Lipids, 2, 149 (1967).
257. Ramwell P.W., Daniels E.G., in “Lipid Chromatographic Analysis’’,
Dekker Inc., New York, vol. 2, 1967, pp. 313—344.
258. Rapport M.M., Alonzo N.F., J. Biol. Chem., 235, 1953 (1960).
302
Список ликеражуры
259. Refiner F.E., Law J.H., J. Lipid Res., 9, 541 (1968).
260. Renkonen O., Biochim. Biophys. Acta, 54, 361 (1961k
261. Renkonen O., Biochim. Biophys. Acta, 56, 367 (1962).
262. Renkonen O., Biochim. Biophys. Acta, 59, 497 (1962).
263. Renkonen O., Biochim. Biophys. Acta, 125, 288 (1966).
264. Renkonen O., Advances in Lipid Res., 5, 329 (1967).
265. Renkonen O., J. Lipid Res., 9, 34 (1968).
266. Renkonen O., Hirvisalo E.L., J. Lipid Res., 10, 687 (1969).
26". Renkonen O., Varo P., in “Lipid Chromatographic Analysis’’, Dekker Inc.,
New York, vol. 1, 1967, pp. 41—98.
268. Riley F.R., J. Amer. Chem. Soc., 66, 512(1944).
269. Roberts R.N., in “Lipid Chromatographic Analysis’’, Dekker Inc., New York,
vol. 1, 1967, pp. 447—463.
270. Rosenberg A., Biochemistry, 2, 1148 (1963).
271. Rosenberg H., J. Chromatog., 2, 487 (1959).
272. Rouser G., Fleischer S., Yamamoto A.. Lipids, 5, 494(1970).
273. Rouser G., Galli C., Lieber E., Blank M.L., Privett O.S., J. Amer. Oil
Chem. Soc., 41, 836 (1964).
274. Rouser G., Kritchevsky G., Heller D., Lieber E., J. Amer. Oil Chem. Soc.,
40, 425 (1963).
275. Rouser G., Kritchevsky G., Yamamoto A., in “Lipid Chromatographic
Analysis’’, Dekker Inc., New York, vol. 1, 1967, pp. 99—162.
276. Rouser G., Kritchevsky G., Yamamoto A., Simon G., Galli C., Bauman A.J.,
in “Methods in Enzymology”, Academic Press, New York, Vol. 14, 1969,
pp. 272-317.
277. Rouser G., Siakotos A.N.. Fleischer S., Lipids, 1, 85 (1966).
278. Rydon H.N., Smith P.W., Nature, 169, 922 (1952).
279. Ryhage R.. Stenhagen E., J. Lipid Res., 1, 361 (1960).
280. Samuelsson B., Samuelsson K., J. Lipid Res., 10, 47 (1969).
281. Sastry P.S.. Kates Biochemistry, 3, 1271 (1964).
282. Sastry P.S., Kates M., Biochemistry, 3, 1280 (1964).
283. Sastry P.S., Kat^s M., Can. J. Biochem., 43, 1445 (1965).
284. Sastry P.S., Kates M., Can. J. Biochem., 44, 459 (1966).
285. Sastry P.S., Kates in “Methods in Enzymology”, Academic Press,
New York, vol. 14, 1969, pp. 204—208.
286. Schlierf G., Wood P., J. Lipid Res., 6, 317 (1965).
287. Schneider IF.C., in “Methods in Enzymology”, Academic Press, New York,
vol. 14, 1969, pp. 684—690.
288. Schwarz D.P., Pallansch M.J., Anal. Chem., 30, 219 (1958). '
289. Scott A.L. The Interpretation of Ultraviolet Spectra of Natural Products,
Pergamon Press, Oxford, 1962.
290. Seubert IF., Biochem. Prep., 7, 80 (1959).
291. Sgoutas D.S., Kummerow F.A., Biochemistry, 3, 406 (1964).
Список литературы
303
292. ShawN., Biochim. Biophys. Acta, 164, 435(1968).
293. Shaw N., Bacteriol. Rev., 34, 365 (1970).
294. Siakotos A.N., Rouser G., J. Amer. Oil Chem. Soc., 42, 913 (1965).
295. Simon G., Rouser G., Lipids, 2, 55 (1967).
296. Skidmore W.D., Entenman C., J. Lipid Res., 3, 471 (1962).
297. Skipski V.P., Barclay M., in “Methods in Enzymology”, Academic Press,
New York, voL-14, 1969, pp. 530—598.
298. Skipski V.P., Peterson R.F., Barclay M., Biochem. J., 90, 374(1964).
299. Sloane-Stanley G.H., Biochem. J., 104, 293 (1967).
300. Snyder F., Anal. Biochem., 9, 183 (1964).
301. Snyder F., in “Progress in Chemistry of Fats and Other Lipids”, Pergamon
Press, Oxford and New York, vol. 10, 1969, pp. 287—335.
302. Snyder F. in “Progress in Thin-Layer Chromatography and Related Methods”,
Pataki G., Niederwieser A., (eds), Ann Arbor Science Publishers Inc., Ann
Arbor., vol. 2, 1971, pp. 105—141.
303. Snyder F., Blank M.L., Morris H.P., Biochim.Biophys. Acta, 176, 502 (1969).
304. Snyder E., Piantadosi C.. Advances in Lipid Res., 4, 257 (1966).
305. Snyder F., Stephens N., Biochim.Biophys. Acta, 34, 244(1959).
306. Sober H. A., Handbook of Biochemistry, The Chemical Rubber Co., Cleve-
land, 1968.
307. Spackman D.H., Accelerated Amino Acid Analysis in “Methods in Enzymo-
logy”, Hirs C.H.W., Academic Press, New York, vol. 11, 1967, pp. 3—15.
308. Spencer B., Bsochem. J., 75, 435 (1960).
309. Stahl E. (ed.), Thin Layer Chromatography, Springer-V erlag, New York,
Inc., New York, 1969.
310. Stein R.A.. Slawson V., Mead J. F., in “Lipid Chromatographic Analysis”,
Dekker Inc., New York, 1967, vol. 1, p. 361.
311. Stoffel IF., J. Amer. Oil Chem. Soc., 42, 583 (1965).
312. Suzue G., Tusukada K., Tanaka S., Biochim. Biophys. Acta, 164, 88 (1968).
313. Svennerholm E., Svennerholm L., Biochim. Biophys. Acta, 70, 432 (1963).
314. Svennerholm L., Biochim. Biophys. Acta, 24, 604(1957).
315. Swennerholm L., J. Lipid Res., 5, 145 (1964).
316. Swennerholm L., J. Lipid Res., 9, 570 (1968).
317. Sweeley C.C., J. Lipid Res., 4. 402 (1963).
318. Sweeley C.C., Vance D.E., in “Lipid Chromatographic Analysis”, Dekker
Inc., New York, vol. 1, 1967, pp. 463—493.
319. Teeter H.M., Bell £.U„ Org. Syn., 32, 20 (1952).
320. Thomas A.E., Scharoun J.E., Ralston H., J. Amer. Oil Chem. Soc., 42,
. . 789(1965).
321. Thompson G.A., Jr., Kapoulas V.M., in “Methods in Enzvmology”, Acade-
mic Press, New Y'ork, vol. 14, 1969, pp. 668—678.
322. Thorpe S.R., Sweeley C.C., Biochemistry, 6, 887 (1967).
323. Tomabene T.G., Personal communicaUon of unpublished data.
304
Список литературы
324. Tomabene T.G., Gelpi Е., Отб J. Bacterio!., 94, 333 (1967).
325. Tomabene T.G., Kates M., Gelpi E., Ord J. Lipid Res., 10, 294 (1969).
326. Trevelyan W.E., Proctor D.P., Harrison J.S.. Nature, 166, 444 (1950).
327. Tulloch A.P., Lipids, 5, 247 (1970).
328. Tulloch A.P., Chem. Phys. Lipids, 6, 235 (1971).
329. Tulloch A.P-, Weenink R.O., Can. J. Chetn., 47, 3319 (1969).
330. Vagelos P.R., in “Methods in Enzymology”, Academic Press, New York,
vol. 6, 1959, pp. 544-549.
331. Van Deenen L.L.M., in “Progress in Chemistry of Fats and Other Lipids”,
Pergamon Press, Oxford and New York, vol. 8, 1965, p. 1.
332. Van Deenen L.L.M., De Haas G.H., Advances in Lipid Res., 2. 167 (1964).
333. Van Deenen L.L.M., De Haas G.H., Ann. Rev. Biochem., 35, 157 (1966).
334. Van Golde L.M., Van Deenen L.L.M., Biochem. Biophys. Acta, 125, 496(1966).
335. Vaskovskv V.E.. Kostetsky E.Y., J. Lipid Res., 9, 396 (1968).
336. Vogel A.I., Practical Organic Chemistry, 3rd ed., Longmans, Green and
Co., London, 1956.
337. Von Rudloff E., Can. J. Chem., 34, 1413 (1956).
338. Vorbeck M.L., Marinetti G.V., J. Lipid Res., 6, 3 (1965).
339. Wagner H., Hbrhammer L., Wolff P., Biochem. Z.. 334, 175(1961).
340. Waite M., Van Deenen L.L.M., Biochim. Biophys. Acta, 137, 498 (1967).
341. Heiss B., in “Lipid Chromatographic Analysis”, Dekker Inc., New York,
vol. 1, 1967, pp. 429—446.
342. Heiss S.B.. Kennedy E.P., Kiyasu J.Y., J. Biol. Chem., 235, 40 (1960).
343. Weiss S.B., Marx IL, J. Biol. Chem., 213, 349 (1955).
344. Wells M.A.. Hanahan D.J.f in “Methods in Enzymology”, Academic Press,
New York, vol. 14, 1969, pp. 178—184.
345. White D.C., Frerman F.E., J. Bacterio!., 94, 1854 (1967).
346. Wittenberg J. B., Korey S.R., Swenson-F.H., J. Biol. Chem., 219, 39 (1956).
347. Wolff R.E., Wolff G., McCloskey J. A., Tetrahedron, 22, 3093 (]966).
348. Wood R., Lipids, 2, 199 (1967).
349. Wood R,, Baumann W.J., Snyder F., Mangold U.K., J.Lipid Res., 10, 128(1969).
350. Wood R., Piantadosi C.. Snyder F., j. Lipid Res., 10, 370 (1969).
351. Wood R., Snyder F., J. Amer. Oil Chem. Soc., 43, 53 (1966).
352. Wood R., Snyder F., Lipids, 1, 62(1966).
353. Wood R., Snyder F., Lipids, 3,129 (1968).
354. Wotiz H.H., Clark S.J., in “Methods in Enzymology”, Academic Press,
New York, vol. 15. 1969, pp. 158-200.
355. Wuthier R.E., J. Lipid Res., 7, 544 (1966).
356. YasudaM., J. Biol. Chem., 94, 401 (1931/1932).
357. Zlalkis A., Zak B., Boyle A.J., j. Lab. Clin. Med., 41, 486 (1963).
358. Fischer L., “An introduction to Gel Chromatography”, Pharmacia Fine
Chemicals, AB, Uppsala, 1969.
359. Peterson E.A., Cellulosic Ion Exchangers, National Cancer Institute, 1970.
ДОПОЛНЕНИЯ
_ К .гл, 1. . -
1. В последние годы было показано, что в природе наряду с
глицеролипидами широко распространены липиды, построенные на
основе этиленгликоля и некоторых других С 3— С g-диолов (диольные
липиды)* .
Как и глицеролипиды, диольные липиды подразделяются на прос-
тые и сложные. К простым диольным липидам относятся вещества,
молекулы которых состоят только из остатков диолов и алифатичес-
ких кислот или спиртов ( I —V ). К сложным диольным липидам от-
CILOCOR | 2 CILOCOR CH,OCOR j 2
сн2он 1 х CH2OCOR’ CH2OCH=CHR‘
I II III
ch2och2r
CHjOCOR'
IV
ch2och2r
CHjOCHjR'
V
носятся этиленгликолевые аналоги лецитина (VI), различные фосфа-
тидилдиоль! (VII),диольные гликолипиды (VIII), а также диольные липо-
аминокислоты (IX)**
ch2och=chr ch2ocor
£h2OPOCH2CH2N(CH3)3 R'OCO-CH о
О- CH,OPOCH,CH,он
2 । 2 2
OH
VI VII
* Вавер B.A., Ушаков A.H., Бергельсон Л.Д., Успехи биологической хи-
мии, 14. 227 (1973).
**В формулах 1-1Хв качестве примера приведены структуры производ-
ных этиленгликоля.
306
Дополнения
vra
nh2
(CH2)n
rconh_chcooch2
ch2ocor-
n = 3,4
IX
В тканях млекопитающих и семенах растений содержание смоль-
ных липидов мало, однако в условиях усиленной функциональной ак-
тивности (регенерирующая печень крыс, созревающие семена куку-
рузы) оно может возрастать.
Диольные фосфолипиды обладают значительной и многообразной
функциональной активностью: в ничтожных концентрациях они инги-
бируют действие ацетилхолина, вызывают гемолиз эритроцитов, вли-
яют на иммунные реакции клетки. По—видимому, все эти эффекты
основаны на взаимодействии диольных липидов с клеточными мем-
бранами.
2. Диэфиры жирных кислот и высших алкандиолов-1,2 содержат-
ся не только в кожном жире животных, они входят также в состав
кожного воска новорожденных детей (Vemix caseosa). Липиды V. ca-
seosa детально исследованы рядом авторов. Проведя ГЖХ изопропи-
лиденрвых производных, Дауинг [Dowing D. Т., Austrell. J. Chem., 18,
1287 (1965)1 показал, что основными спиртовыми компонентами ди-
ольных липидов 1. caseosa являются разветвленные диолы-1,2 с 20-
23 атомами углерода. Одновременно группа финских исследовате-
лей \K'arkkainen J., Nikkari Т., Ruponen S., Haahli Е., J. Invest. Dermatol.,
44, 333 (1965)] установила, что среди диолов V. caseosa, напротив,
поеобладают неразветвленные диолы-С20 — Си. Этот-вывод позднее
подтвердили Фу и Николаидес [Fu Н.С., Nicolaides N., Lipids, 4. 170
(1969)]. Они также нашли, что в состав диэфиров диолов V. caseosa
входят исключительно неразветвленные алкандиолы-1,2.
Недавно в сальных железах птиц был обнаружен еше один тип
диэфиров жирных кислот высших алкандиолов - диэфиры Си — С?4 -•
алкандиолов-2,3 (уропигиолов). Строение последних было доказа-
но сравнением ИК- и масс-спектров изопропилиденовых производных
природных диолов и синтетического изопропилиденового производно-
го нона декан диола-2,3, а также выделенных из липидных гидролиза-
тов методом ГЖХ производных природных диолов.
3. Структура сиолипинов А и Б в настоящее время полностью
установлена \Hansen 1.А., Tang В.К., Edkins Е., J. Lipid Res., 10. 267
(1969)].
Дополнения
307
Показано, что они представляют собой производные этиленгликоля,
в которых последний этерифипирован N—( окси)апил- L-лизином
(сиолипин-А) или N-( £ -окси) ацил- L -орнитином (сио липин Б) и
о -оксикислотами (см. структуру IX в Дополнении 1. гл. 1).
К гл. 2.
1. Липиды - стандарты, выпускаемые Главхимреактивом
Наименование ГОСТ или ТУ Квалифи- кация
Индивидуальные вещесява
Глицерин ГОСТ 6259-52 чдв
Лауриновая кислота МРТУ 6-09-995-64 ч
Линолевая кислота МРТУ 6-09-4980-68 ч
Линоленовая кислота ТУ 14П-754-68 ч
Метиловый эфир линолевой ТУ 14П-636-67 ч
кислоты
Метиловый эфир линоленовой МРТУ 6-09-657 3-70 ч
кислоты
Метиловый эфир миристиновой МРТУ 6-09-3185-66 ч
кислоты
Метиловый эфир олеиновой кислоты МРТУ 6-09-6329-69 ч
Метиловый эфир пальмитиновой ТУ 6-09-336-70 ч
кислоты
Метиловый эфир стеариновой ТУ 6-09-13-70 ч
кислоты
Пальмитиновая кислота МРТУ 6-09-5841-69 ч
Пентадекановая кислота МРТУ 6-09-3996-67 ч
Пентадециловый спирт ТУ 6-09-128-70 ч
Стеариновая кислота ГОСТ 9419-60 чда
Стеариловый спирт ТУ 18П-17-69 ч
Триолеин МРТУ 6-09-2463-65 ч
Т рипальмитин МРТУ 6-09-6609-70 ч
Т ристеарин МРТУ 6-09-2189-65 ч
Холестерилацетат ТУ 9П—370-70 ч
Холестерилпальмитат ТУ 10П-130-67 ч
X олестерилстеарат ТУ 10П-370-70 ч
Эргостерин ТУ 10П-393-69 ч
Наборы химреактивов
Набор №2 'Насыщенные угле- ТУ 6П-64-68
водороды*
Набор №4 'Алифатические ТУ 6П-79-68
спирты'
308
Дополнения
Продолжение табл.
Наименование ГОСТ или ТУ Квалифи- кация
Набор №5 * Кетоны и эфиры на- ТУ 6П-80-68
сыщенного ряда'
Набор углеводов (большой) МРТУ 6-09-3033—66
Леченые вещества
Каприловая кислота 1-14С
Капроновая кислота 1-,4С
Капроновая кислота 2-14С
Лауриновая кислота 1-14С • ТУ И-169-71
Стеариновая кислота Т14С
Стеариновая кислота 3Н
Стеариновая кислота 9,10-2 3 4Н
2. Серийный выпуск роторных испарителей в СССР освоен заво-
дом 'Химлаборприбор' (г. Клин, Московская область). Роторные ис-
парители завода 'Химлаборприбор' (тип ИР—1М) рассчитаны на упа-
ривание растворов объемом от 50 до 1000 мл при остаточном дав-
лении 15-30 мм рт. ст. Скорость вращения испарительной колбы ре-
гулируется в пределах от 20 до 140 об/мин. Испаритель ИР-1М)
снабжен водяной баней с автоматическим терморегулятором, обеспе-
чивающим поддержание постоянной температуры бани в интервале от
15 до 1ОО°С. Габаритные размеры роторного испарителя 580 х 320 х
97 О мм, вес 15 кг.
3. В настоящее время фирма "Varian" выпускает следующие типы
спектрометров ЯМР.
XL-ЮО: рабочая частота для ’Н 100 МГц; снабжен компьюте-
ром серии 620: позволяет также получать спектры на ядрах ,3С, 19F.
31р и
SC-300/320: рабочая частота для’Н 300 и 360 МГц; имеет
сверхпроводимый магнит; снабжен компьютером.
С FT-2 О: специализированный импульсный спектрометр для
ядер 13С, рабочая частота 20 МГц.
Спектрометры ЯМР высокого разрешения выпускаются также
фирмами Японии "JE0L"(C-60; HL и PS-100), ФРГ "Bruker" (при-
боры серий НХ и WH ) и Франции "Cameca"( IRN-250 с компьюте-
ром "Nicolet" ).
4. Перечень газожидкостных хроматографов, приведенный в разд.
2.5.8, следовало бы продолжить, включив в него новые приборы
фирмы "Perkin-Elmer” (модели 800, 880', 900), рассчитанные как
на ручной, так и на автоматический ввод проб и на подключение ин-
Дополнения
309
тегратора или специального компьютера с печатающим устройством,
а также автоматический препаративный хроматограф 4ирмы "Pye"
(серия 105).
В. СССР серийный выпуск газожидкостных хроматографов осво-
ен Дзержинским филиалом ОКБА (г. Дзержинск, Горьковская об-
ласть). Приборы Дзержинского ОКБА марки "'Цвет' (модели 1-64,
2-65., 3—66, 4-67, 5-66 и 6-69) снабжены наборами детекторов
и рассчитаны на работу как в изотермическом режиме, так и при
программировании температуры. С 1970 г. хроматографы 'Цвет*
выпускаются в виде унифицированной серии *Цвет-100*. включаю-
- щей -20 моделей.-
Детальное описание современных хроматографов, выпускаемых
как в СССР, так и за рубежом, дано в книге Сакодынского и др.
(СаноОынский К.И., Бражников В.В., Буров А.Н., Волков С.А., Зелъвенский
В.Ю., Приборы для хроматографии, М., 1973).
К гл. 4.
1. Определение глицерина в глиперофосфатидах удобно проводить
по методике, заключающейся в последовательном щелочном дезаци-
лировании фосфолипидов, ацетолизе полученных глицерофосфатов и
определении триацетата глицерина в продуктах ацетолиза методом
ГЖ {Вавер В.А., Колесова Н.П., Диренина М.Л., Ушаков АЛ., Химия
природных соединений, 1972, 156).
К гл. 5.
1. В 1972 г. В.Е. Васьковский и В.И. Светашев предложили
высокоэффективный метод микротонкослойной хроматографии (МТСХ)
липидов, основанный на использовании маленьких пластинок с очень
тонким слоем специально приготовленного мелкого силикагеля [Sve-
ta.shev V.I., Vaskovsky V.E.. J. Chromatog., 67. 376 (1972); J. Chromatog., 6Б,
451 (1972)].
На таких пластинках за 15-20 мин можно разделить самые
сложные смеси липидов. Определение содержания липидного фосфо-
ра в пятнах на микрохроматограммах позволяет с высокой точнос-
тью рассчитать количество отдельных типов фосфолипидов в смесях.
В настоящее время метод МТСХ широко используется в лабора-
тории химии липидов ИБХ АН СССР.
Приведенные ниже методики приготовления пластинок для микро-
тонкослойной хроматографии, нанесения образцов и проявления хро-
матограмм, а также определения липидного фосфора в пятнах липи-
дов на хроматограммах детализированы и усовершенствованы Свеш-
никовым и сотрудниками.
31Р
Дополнения
Приготовление пластинок для микротоннослойной хроматографии
Пластинки размером 6x6 см тщательно промывают детерген-
том, водой и погружают на 10 мин в горячий раствор шелочи (50г
КвОН в 1 л воды), споласкивают водопроводной и дистиллированной
водой и сушат в сушильном шкафу.
Силикагель марки КСК Воскресенского химкомбината размалы-
вают в шаровой мельнице в течение 48 ч. К 200 см3 измельчен-
ного силикагеля прибавляют 2 л воды. Суспензию перемешивают и
оставляют на 40-45 мин. Супернатант сливают в другую колбу и
оставляют его на 2 ч. За это время осаждается фракция мелкого
силикагеля, необходимая для приготовления микропластинок. Эту
фракцию выделяют, декантацией, разбавляют равным объемом воды
и тщательно перемешивают. Аликвотную часть полученной суспензии
(15 мл) переносят пипеткой в бюкс. К суспензии силикагеля, интен-
сивно перемешиваемой магнитной мешалкой, добавляют 250 мг гип-
са. Перемешивание продолжают еще 20 мин, после чего аликвотные
части суспензии силикагеля с гипсом (по 1,0 мл) наносят на микро-
пластинки, которые сушат 20 мин на воздухе и затем активируют
5-10 мин при 110°С.
Нанесение образцов и проявление хроматограмм
5-10 мкл раствора сложной смеси липидов (суммарные липиды
мозга млекопитающих, морских беспозвоночных и т. д.), содержащей
25-50 мкг смеси липидных веществ (по 1-3 мкг каждого типа ли-
пидов), наносят на микропластинку в виде 5—6 пятен на расстоянии
7 мм от нижнего края пластинки. Для двухмерной ТСХ образец на-
носят в угол пластинки на расстоянии 10 мм от обоих краев. Хро-
матограмму проявляют до тех пор, -пока фронт растворителя не под-
нимется на 50 мм от нижнего края. Пятна фосфолипидов обнаружи-
вают модифицированным молибдатным реагентом (см. дополнение
2 к гл. 5). Гликолипиды обнаруживают модифицированным реагентом
Хоннегера \У askojsky 1.Е., Kostetsky E.V., Svetashev И./., Lhukova I.G.,
Smirnova G.P., Comp. Biochim. Physiol.. 34. 163 (1970)1. Неспецифическое обна-
ружение липидов производят 10%-ным раствором серной кислоты в
метаноле с последующим нагреванием хроматограмм в течение 5 мин
при 180°С [Liminsky Т., Borovsky Е., J. Chromatog., 2Б. 480 (1966)1.
Определение липидного фосфора в пятнах веществ
на микрохромотограммах
П ятна фосфолипидов, обнаруженные реагентом Васьковского, вы-
резают с микротонкослойных хроматограмм. Силикагель (с адсорби-
рованными на нем фосфатидами) помещают в центрифужные пробирки
Дополнения
311
-размером 60 х 15 мм. Одновременно с той же пластинки снимают
область чистого силикагеля, соответствующую по размеру пятнам
фосфолипидов и также помешают ее в пентрифужную пробирку. Во
все пробирки добавляют по 0,08 мл 58%-ной хлорной кислоты и
нагревают их в алюминиевом блоке 20 мин при 18О°С. Образцы
охлаждают, добавляют 0,92 мл реагента для обнаружения фосфоли-
пидов (приготовление см. в разд. 5.4.4.2), разбавленного водой
в соотношении 1:15. Содержимое пробирок тщательно перемешива-
ют и нагревают 15 мин на кипящей водяной бане. Поглощение всех
образцов измеряют при 815 нм на спектроколориметре "Specol"
(ГДР) с приставкой "ЕКА" или на спектрофотометре С<Р-4, снабжен-
ном специальными кюветами емкостью 1 мл. При проведении холо-
стого опыта сжигают вырезанную с той же пластинки зону чистого
силикагеля. Количество фосфора в образцах определяют по калибро-
вочной прямой, построенной по аликвотным частям стандартного
раствора фосфата, содержащего 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 и 0,5 мкг фос-
фора.
2. В 197 2 г. В.Е. Васьковский и В.И. Светашев предложили
новый реагент для обнаружения фосфолипидов на тонкослойных хрома-
тограммах (SveZasAev Г./., Vaskovsky V.E., J. Chromalog., 66, 451 (1972)1.
Реагент готовят следующим образом; 10 г молибдата натрия раст-
воряют в 100 мл 5-6 н. соляной кислоты; одновременно в 100 мл
воды растворяют 0,9 хлоргидрата гидразина. Оба раствора смеши-
вают и нагревают на кипящей водяной бане 5 мин. По охлаждении
объем раствора доводят до 1 л 2 н. соляной кислотой. Реагент ус-
тойчив при хранении; он обнаруживает фосфолипиды синими пятнами
на белом фоне.
К гл 6.
1. В качестве меченых предшественников при изучении биосинте-
за липидов можно использовать следующие соединения, выпускаемые
в СССР:
Меченый предшественник Липидный фрагмент или соедине- ние, включающее метку
У ксусная кислота 1- 3Н У ксусная кислота 1, 2- 3Н Ацетат калия 1- ,4С Ацетат калия 2- ,4С Ацетат натрия 2- 14С Карбонат натрия 14С Углеводородные цепи» изопреноиды, стерины Углеводородные радикалы, изопрено- иды, глицерин, сахара
Продолжение жабл.
Меченый предшественник Липидный фрагмент или соедине- ние, включающее метку
D—Глюкоза 1-мС D-Глюкоза 2-мС D-Глюкоза 6-мС D-Глюкоза 6-3Н Глицерин J-14C Глицерин 2-,4С Малоновая кислота 1-мС Малоновая кислота 2-мС NaH2MPO4 Na332PO4 Углеводородные радикалы, глице- рин, сахара Жирные кислоты, углеводородные радикалы
Н,32РО4 (свободная от носителя) Фосфолипиды
Н»РОД
3 4
СОДЕРЖАНИЕ
Предисловие.............................................. 5
Предисловие автора ...................................... 7
Глава 1. Определение и классификация липидов............. 9
1.1. Углеводороды....................................... Ю
1.1.1. Нормальные парафины.......................... 10
1.1.2. Монораэветвленные парафины................... 10
1.1.3. Полиразветвленные парафины: насыщенные
изопреноиды......................................... 11
1.1.4. Нормальные олефины.......................... 11
1.1.5. Разветвленные олефины....................... 12
1.1.6. Изопреноидные полиены........................ 12
1.1.7. Каротиноиды.................................. 13
1.2, Спирты............................................. 13
1.2.1. Нормальные насыщенные спирты................. 14
1.2.2. Монораэветвленные спирты..................... 14
1.2.3. Полиразветвленные спирты: насыщенные
изопреноиды....................................... 14
1.2.4. Ненасыщенные спирты.......................... 16
1.2.5. Изопреноидные спирты (терпенолы. или
полипренолы)........................................ 16
1.2.6. Стерины...................................... 17
1.2.7. Спирты алициклических и ароматических
витаминов........................................... 16
1.2.8. Высшие полиолы............................... 19
1.3. Высшие аминоспирты................................ 20
1.4. Альдегиды......................................... 21
1.4.1. Нормальные насыщенные альдегиды.............. 21
1.4.2. Ненасыщенные альдегиды....................... 22
1.4.3. Алифатические альдегиды с пиклопропановой
группировкой в боковой цепи......................... 22
1.4.4. Изопреноидные альдегиды..................... 22
1.5. Кетоны и хиноны................................... 23
1.5.1. Метилкетоны..................>............... 23
1.5.2. Симметричные кетоны.......................... 23
1.5.3. Ненасыщенные, разветвленные и циклические
кетоны.............................................. 23
314
Содержание
1.5.4. Хиноны с изопреноидной боковой пенью............ 24
1.6. Жирные кислоты...................................... 25
1.6.1. Нормальные насыщенные кислоты .................. 25
1.6.2. Моноразветвленные насыщенные кислоты........ 26
1.6.3. Полиразветвленные кислоты .......................27
1.6.4, Алифатические кислоты с циклопропановой и
циклопропеновой группировкой в боковой цепи . .. 27
1.6.5. Алифатические кислоты с циклопентеновой
группировкой в боковой пели ........................ 28
1.6.6. Нормальные моноеновые кислоты............... 29
1.6.7. Полиеновые кислоты.............................. 29
1.6.8. Ацетиленовые кислоты............................ 29
1.6.9. Оксикислоты..................................... 34
1.6.10. Кетокислоты................................. 35
1.6.11. Дикарбоновые кислоты.......................... 35
1.6.12. Простагландины................................ 36
1.7. Воски............................................. 37
1.7.1. Простые воски................................... 37
1.7.2. Сложные воски .................................. 37
1.8. Эфиры стеринов и спиртов витаминов A, D и Е......... 37
1.8.1. Эфиры стеринов.................................. 38
1.8.2. Эфиры спиртов витаминов A, Dm Е................. 39
1.9. Глицериды........................................... 39
1.9.1. Моноглицериды................................. 39
1.9.2. Диглицерицы................................... 40
1.9.3. Триглицериды.................................... 40
1.10. Простые эфиры глицерина............................ 40
1.10.1. Алкиловые эфиры глицерина..................... 40
1.10.2. Алкен-1-иловые эфиры глицерина................ 41
1.10.3. Ацилалкиловые эфиры глицерина................. 42
1.10.4. Алкен-1-иловые эфиры глицерина (нейтральные
плазмалогены).............................. . . . 42
1.11. Фосфолипиды (фосфатиды)............................ 43
1.11.1. Глицерофосфатады.............................. 43
1.11.2. Сфингозинфосфатиды............................ 46
1.12. Гликолипиды ..................................... 48
1.12.1. Гликозил диглицериды.......................... 48
1.12.2. Гликозиды оксикислот.......................... 49
1.12.3. Эфиры жирных кислот и сахаров................. 50
1.12.4. Фосфорсодержащие гликолипиды.................. 51
1.12.5. Фитогликолипиды (содержатся в растениях) . . 51
1.12.6. Липополисахариды (содержатся в бактериях). . . 52
1.12.7. Гликозиды стеринов ........................... 52
1.12.8. Цереброзиды (керамидгексозиды)................ 52
1.12.9. Ганглиозиды............................. . 54
Содержание 3J5
1.13. Серусодержашие липиды............................. 54
1.13.1. Сульфаты высших спиртов (алкилсульфаты) . . . 54
1.13.2. Сульфаты переброзидов (сульфатиды)........... 55
1.13.3. Сульфаты гликолипидов необычного
•строения............................................ 55
1.13.4. Сульфаты гликоэилдиглипериоов................ 55
1.14. Липиды, содержащие аминокислоты.................. 55
1.14.1. N-Ациламинокислоты и их эфиры
с жирными кислотами................................ 56
1.14.2. О-Ацилкарнитины........................... 56
. Х.14.3. Липопептиды................................ 56
Г лава 2. Материалы и оборудование....................... 58
2.1. Растворители....................................... 58
2.2. Вещества - стандарты............................... 60
2.3. Стеклянная посуда.................................. 63
2.3.1. Пипетки........................................ 63
2.3.2. Пробирки..................................... 63
2.3.3. Специальные колбы для гидролиза липидов
и экстракции гидролизатов ........................... 64
2.4. Испарители......................................... 65
2.4.1. Упаривание растворителей в токе азота........... 66 ,
2.4.2. Роторные испарители............................ 68
2.5. Аналитические приборы.............................. 69
2.5.1. Колориметры................................. 7 0
2.5.2. Самопишущие спектрофотометры для работы
в видимой и ультрафиолетовой областях
спектра.............................................. 70
2.5.3. Самопишущие ПК-спектрофотометры................ 70
2.5.4. Спектрометры ядерного магнитного резонанса 70
2.5.5. Масс-спектрометры.............................. 70
2.5.6. Поляриметры.................................. 71
2.5.7. Спектрополяриметры............................. 71
2.5.8. Газожидкостные хроматографы.................... 71
Г лава 3. Экстракция липидов............................ 72
3.1. Общие соображения.................................. 72
3.2. Экстракция липидов из животных тканей.............. 74
3,3. Экстракция липидов из растительных тканей.......... 74
3.4.. Экстракция липидов из микроорганизмов ........ 75
3.5. Экстракция липидов из субклеточных частиц, клеточ-
ных элементов и плазмы крови............................ 76
3.6. Экстракция липидов из других биологических мате-
риалов ................................................. 77
3.7. Хранение липидных экстрактов....................... 77
316
Содержание
Глава 4. Общие методы анализа.......................... 78
4.1. Определение постоянного веса..................... 78
4.2. Определение суммарного фосфора................... 78
4.2.1. Модифицированная методика Аллена............. 78
4.2.2. Модифицированный микрометод Бартлета......... 7 9
4.3. Определение азота................................ 80
4.3.1. Определение суммарного азота,метод
Кьельдаля........................................... 80‘
4.3.2. Определение аминного азота.................. 81
4.3.3. Определение суммарного азота по микрометоду
Слоан-Стэнли.......................................... 81
4.4. Определение сложноэфирных групп...................... 82
4.5. Определение суммарного сахара........................ 83
4.6. Определение иодного числа............................ 83
4.7. Определение суммарного и свободного холестерина . . . 84
4.8. Определение суммарных жирных кислот и неомыляемых
веществ................................................... 85
4.8.1. Анализ липидов, содержащих только 0-ациловые
эфиры................................................. 86
4.8.2. Анализ липидов, содержащих О-ациловые эфиры
и неомыляемые вешества................................ 87
4.8.3. Анализ смесей липидов, содержащих 0-апиловые
эфиры, плазмалогены и неомыляемые
вешества......................................... 88
4.9. Определение эквивалента нейтрализации ............... 89
4.10. Анализ плазмалогенов ............................... 90
4.10.1. Определение высших альдегидов.................. 90
4.10.2. Определение виниловых эфиров................... 90
4.11. Анализ липидов, содержащих N-ацильные группировки
(анализ сфинголипидов). Определение состава жирных
кислот и сфингозиновых основании................... ... 91
4.12. Определение водорастворимых компонентов липидов, 92
4.12.1. Определение холина............................. 92
4.12.1.1. Рейнекатный метод........................ 92
4.12.1.2. Перйодатный метод........................ 93
4.12.2. Определение аминоспиртов и аминокислот .... 94
4.12.2.1. Определение суммарных а-аминоспиртов
(модифицированная методика Артома) . . . 94
4.12.2.2. Определение серина и этаноламина в виде
динитрофенильных (ДНФ) производных ; . . 95
4.12.2.3. Определение аминокислот, аминоспиртов и
аминосахаров с помощью аминокислотного
анализатора....................................... 96
4.12.3. Методы определения глицерина................... 97
Содержание 317
- -...4.12.3.1. Определение глицерина в глицерофосфати-
дах...................................... 07
4.12.3.2. Определение глиперина в глицеридах и
гликозилдиглицеридах ............................... 08
4.12.4. Определение инозита......................... 08
4.13. Определение вицинальных гликолей.................. 100
4.13.1. Анализ липидов с концевыми гликольными
группировками........................................ 100
4.13.2. Определение суммарных вицинальных гидрок-
сильных групп........................................ 100
4.Т4. Определение алкиловых эфиров глицерина............. 101
4.14.1. Метод ацетолиза.............................. 101
4.14.2. Метод кислотного гидролиза................... 102
4.14.2.1.'Определение моноалкиловых эфиров
глицерина........................................... 102
4.14.2.2 . Определение диалкиловых эфиров
глицерина......................................... 103
4.15. Определение серы.................................. 103
4.15.1. Определение суммарной серы................... 103
4.15.2. Определение серы в сульфатидах............... 104
4.16. Спектроскопический анализ ........................ 105
4.16.1. УФ-спектроскопия............................. 105
4.16.2. ИК-спектроскопия............................. 107
4.16.3. Ядерный магнитный резонанс.................. 108
4.16.4. Масс-спектрометрия........................... 114
Глава 5. Разделение смесей липидов....................... 117
5.1. Разделение по растворимости........................ 117
5.1.1. Осаждение ацетоном............................ 117
5.1.2. Разделение распределением между несмешиваю-
шимися растворителями (противоточное распре-
деление) ............................................. 118
5.2. Колночная хроматография............................ 121
5.2.1. Адсорбпионная хроматография................... 121
5.2.1.1. Общая методика разделения на колонке
с силикагелем.................................... 122
5.2.1.2. Разделение на флоризиле, обработанном
кислотой......................................... 123
5.2.1.3. Разделение нейтральных липидов на сили-
кагеле, флоризиле или флоризиле, обрабо-
танном кислотой.................................. 125
5.2.2. Распределительная хроматография............... 126
5.2.2.1. Распределительная колоночная хроматография
на сефадексе..................................... 128
318
Содержание
5.2.2.2. Распределительная хроматография с обра-
щением фаз на фектисе............................. 129
5.2.3. Ионообменная хроматография..................... 131
5.2.3.1. Колоночная хроматография на ДЭАЭ-
целлюлозе .................................... .. 131
5.2.3.2. Колоночная хроматография на ТЭАЭ-
целлюлозе.......................................... 132
5.3. Хроматография липидов на бумаге, пропитанной крем-
невой кислотой........................................... 135
5.3.1, Пропитка бумаги кремневой кислотой............. 135
5.3.2. Нанесение липидов на бумагу.................... 136
5.3.3. Системы растворителей и хроматографические
камеры................................................ 137
5.3.4. Обнаружение и идентификация липидов.......... , 138
5.3.4.1. Родамин 6Ж............................... 138
5.3.4.2. Нингидрин................................ 139
5.3.4.3. Обнаружители для холинсоцержаших
липидов........................................... 139
5.3.4.4. Обнаружитель для липидов, содержащих
NH- группы......................................... 141
5.3.4.5. Перйодат - реактив Шиффа................. 141
5.3.4.6. Обнаружение плазмалогенов............... 142
5.3.4.7. Обнаружение фосфатов..................... 143
5.3.4.8. Обнаружение липидов иодом................ 144
5.3.4.9. Дифференциальный обнаружитель для липи-
дов ............................................... 144
5.3.4.10. Радиоавтография и радиоактивное
сканирование ..................................... 145
5.3.5. Количественный анализ фосфатидов............... 146
5.3.5.1. Образцы, содержащие 5-6 мкг фосфора .. . 146
5.3.5.2. Образцы, содержащие 100 мкг липидного
фосфора .........—. . . . 147
5.3.5.3. Образцы, содержащие 200 мкг (и более)
липидного фосфора ................................. 148
5.3.6. Бумажная хроматография на выпускаемой про-
мышленностью бумаге, пропитанной кремневой
кислотой.............................................. 149
5.4. Тонкослойная хроматография......................... 150
5.4.1. Приготовление тонкослойных пластинок........... 151
5.4.1.1. Микропластинки........................... 151
5.4.1.2. Стандартные пластинки (аналитические'
и препаративные)................................... 151
5.4.1.3. Пластинки с силикагелем, пропитанные
нитратом серебра................................... 153
5.4.1.4. Пластинки, пропитанные минеральным
маслом или силиконом............................. 153
Содержание 318
5.4.1.5. Пластинки, пропитанные борной
кислотой........................................ 154
5.4.2. Нанесение липидов на пластинки............... 1^4
5.4.3. Хроматографические камеры и системы
растворителей....................................... 154
5.4.4. Обнаружение и идентификация липидов, разделен-
ных методом ТСХ..................................... 157
5.4.4.1. Основные неспецифические обнаружители 157
"5.4.4.2. Специфические обнаружители............. 158
5.4.4.3. Хранение хроматограмм.................. 162
5.4.4.4. Радиоавтография и сканирование пятен
радиоактивных вешеств........................... 162
5.4.5. Количественный анализ липидных компонентов
при исследовании методом ТСХ........................ 163
5.4.5.1. Денситометрическое определение с предва-
рительным обугливанием пятен на хромато-
граммах ........................................ 163
5.4.5.2. Количественный анализ фосфолипидов .... 163
5.4.5.3. Анализ жирных кислот и определение
(фосфора........................................ 154
5.4.6. Препаративная ТСХ............................ 165
5.5. Газожидкостная хроматография ГЖХ................. 157
5.5.1. Приготовление набивок для хроматографических
колонок............................................. 157
5.5.2. Приготовление колонок ....................... 170
5.5.2.1. Приготовление набивных колонок ........ 170
5.5.2.2. Приготовление капиллярных колонок .... 171
5.5.3. Ввод пробы................................... 172
5.5.3.1. Подготовка образца..................... 172
5.5.3.2. Ввод образца........................... 173
5.5.4. Отбор фракций ............................... 174
5.5.5. Качественный анализ методом ГЖХ ............. 176
5.5.5.1. Идентификация пиков................... 17 6
5.5.5.2. Определение длины углеродной цепи и
степени ее разветвленности ..................... 177
5.5.5.3. Определение числа двойных связей и
циклопропановых колец........................... 181
5.5.5.4. Определение различных функциональных
групп ............................................ 182
5.5.6. Количественный анализ методом ГЖХ............ 185
- • 5.5.6.1. Линейность сигнала детектора........... 185
5.5.6.2. Измерение плошадей пиков................ 185
Глава 6. Радиоизотопные методы в липидологии.......... 189
6.1. Меченые соединения.............................. 189
320
Содержание
6.1.1. Меченые предшественники, выпускаемые
фирмами.............................................. 169
6.1.2. Синтез водорастворимых меченых пред-
шественников ........................................... 192
' 6.1.2.1. Аденозинтрнфосфат- ЖР ........... 192
6.1.2.2. Рацемический 3-глицерофосфат-згр........ 193
6.1.2.3. sn -З-Глкцерофосфет-2- 3Н или
sn-3-глицерофоофат—1.3-МС........................... 194
6.1.2.4. жп-3-Глицерофосфат-32?.................... 195
6.1.2.5. Фосфорилхолин- 32Р........................ 196
6.1.2.6. Другие водорастворимые меченые пред-
шественники ........................................ 197
6.1.3. Получение меченых липидных субстратов......... 197
6.1.3.1. sn -1 ,2-Диглиперид- МС, равномерно
меченный...................................... . 197
6.1.3.2. sn—З-Фосфатидовая кислота- ’«С, равномер-
но меченная......................................... 198
6.1.3.3. Цитипиидифосфат- «п-1.2-диглиперид-»«С,
равномерно меченный................................. 199
6.1.3.4. Приготовление других меченых липидных
субстратов.......................................... 200
6.2. Введение радиоактивной метки в клеточные липиды 200
6.2.1. Микроорганизмы.................................. 200
6.2.1.1. Escherichia coli ........................ 201
6.2.1.2. W alobacterium cutirubrum..... 202
6.2.1.3. Chlorella vulgaris ....................... 202
6.2.1.4. Navicula pelliculosa (пресноводная диато-
мовая водоросль).................................... 204
6.2.2, Высшие растения ................................ 206
6.2.2.1. Включение радиоактивной метки в изоли-
рованные листья..................................... 206
6.2.3. Животные..............................-......... 210
6.2.3.1. Введение метки в липиды печени крысы. . . 210
6.3. Разделение и выделение меченых липидных компо-
нентов ................................................... 210
6.3.1. Разделение липидов листьев, меченных ,4С . . . . 211
6.3.1.1. Выделенке лецитина, меченного ИС .... 211
6.3.1.2. Выделение моно- и дягалактозилджглкцерн-
дов, меченных «С................................... 212
6.3.1.3. Выделение фосфатидилглицерина, меченного
’«С............................................... 213
6.3.1.4. Другие методы выделения различных ме-
ченых липидов из природных источников. .. 213
6.4. Определение радиоактивности липидов, меченных радио-
изотопами ...................................... ...... . 214
Содержание
321
- 6.4.1. Опре мление радиоактивности с использованием
ториевого и гаэопроточного счетчиков ..................... 214
6.4.2. Определение радиоактивности с использованием
сцинтилляционного счетчика ........................... 216
6.5, Радиоавтографня и сканирование хроматограмм....... 217
6.5.1. Рашгоавтография............................. . 217
6.5.2. Сканирование радиоактивных хроматограмм .... 218
Глава 7. Идентвйякапия индивидуальных липидов и липид-
ных компонентов................................... 220
7.1. Нейтральные липиды................................. 220
7.1.1. Отдельные классы нейтральных липидов...... 220
7.1.2. Углеводороды ................................ 229
7.1.2.1. Разделение по типам углеводородных
цепей............................................... 229
7.1.2.2. Определение длины углеводородных целей
методом ГЖХ......................................... 232
7.1.2.3. Установление положения и конфигурации
двойных связей...................................... 232
7.1.2.4. Определение состава углеводородов, полу-
ченных из различных источников...................... 235
7.1.3. Высшие' спирты................................. 236
7.1.3.1. Получение производных спиртов....... 236
7.1.З.2. Определение длины и типа углеводородной
пени................................................ 237
7.1.4. Высшие кетоны и хиноны......................... 237
7.1.4.1. Определение метилхетонов путем превраще-
ния их в карбоновые кислоты................. 239
7.1.4.2. Идентификация хинонов (витамин К и коэф-
фициент Q )......................................... 239
7.1.5. Высшие альдегиды............................... 239
7.1.5.1. Получение производных.................... 239
7.1.5.2. Определение длины и типа углеродной
пали................................................ 241
7.1.6. Жирные кислоты.................................. 241
7.1.6.1. Определение свободных жирных кислот . . . 241
7.1.6.2. Определение длины и типа углеводородных
цепей............................................... 245
7.1.6.3. Выделение индивидуальных эфиров.......... 248
7.1.6.4. Определение конфигурации я положения
двойных связей...................................... 249
7.1.7. Воски.......................................... 250
7.1.8. Глицериды....................................... 251
7.1.8.1. Определение моно-, ди- и триглицеридов 251
322
Содержание
7.1.8.2. Разделение методом ТСХ по степени
ненасыщенности.................................... 252
7.1.8.З. Разделение по молекулярному весу пли
длине пели......................................... 253
7.1.8.4. Стереоспецифический анализ
триглицеридов..................................... 254
7.1.9. Алкиловые эфиры глицерина...................... 254
7.1.9.1. Определение алкиловых и алкеи-1««ловых
эфиров . ........................................ 254
7.1.9.2. Получение О-алкил- и 0-алкен-1»«лгяше-
ридоь.............................................. 255
7.1.9.3. Определение длины углеродной пели алкиль-
ных заместителей.................................. 256
7.2. Фосфолипиды ....................................... 257
7.2.1. Глиперофосфатиды............................... 257
7.2.1.1. Предварительная идентификация полярных
липидов методом бумажной хромато-
графии ......................................... 258
7.2.1.2. Разделение и идентификация полярных ли-
пидов методом ТСХ................................. 259
7.2.1.З. Разделение и идентификация различных
глнперофосфатидов.................................. 266
7.2.1.4. Химический анализ липидов................ 272
7.2.1.5. Мягкое щелочное дезапилироваиие фосфо-
липидов и гликолипидов........................... 273
7.2.1.6. Ферментативный гидролиз глиперофосфатя-
дов................................................ 282
7.2.1.7. Жесткий гидролиз глииерофосфатидов и
гликолипидов ......... ... . 285
7.2.1.8. Идентификация молекулярных типов гяипе-
рофосфолипидов . . ..................... . . . 286
7.2.2. Сфиигозинфосфатнды............................. 286
7.2.2.1. Выделение сфингомиелина и цереброзидов
методом щелочного метанолиза...................... 287
7.2.2.2. Химический анализ сфинголипидов....... 287
7.2.2.3. Методы расщепления сфинголипидов .... 287
7.2.2.4. Анализ сфингозиновых оснований........... 287
7.2.2.5. Анализ керамидов......................... 290
7.3. Гликолипиды........................................ 291
7.3.1. Гликозилдиглипернды....................'. . 292
7.3.2. Цереброзиды и керамидполигексозиды............. 293
Список литературы....................'................... 294
Дополнение ............................................. 305
УВАВАВШ ЧВТАТВЛЫ
Ваши замечания о содержании книги, ее
оформлении, качестве перевода и др. про-
сим присылать по адресу: 129820, Москва
И-110, ГСП, 1-й Рижский пер., 2, Изд-во "Мир
М. Кейтс
ТЕХНИКА ЛИПИДОЛОГИИ
Редактор Р.И. Краснова
Художник Е.Н. Урусов
Художественный редактор Н.Г. Блинов
Технический редактор М.А. Страшнова
Подписано к печати 22/IV-75 г.
Бумага офсетн. №1 60х901/1б = 10,13 бум. л.
Печ.л. 20.25 Уч.-изд. л. 20,26
Изд. № 3/7951 Цена 2р. ОЗк. Зак. 565
Издательство "Мир"
Москва, 1-й Рижский пер., 2
Тульская типография «Союзполиграфпрома»
при Государственном комитете Совета Министров СССР
по делам издательств, полиграфии и книжной торговли,
г. Тула, проспект им. В. И. Ленина, 109.