Текст
PLANT
VIROLOGY
R.E.F Matthews
Department of Cell Biology
University of Auckland
Auckland, New Zealand
ACADEMIC PRESS
New York and London
1970
R МЭТЬЮЗ
ВИРУСЫ
РАСТЕНИЙ
Перевод с английского
В. К. Випшиченко, А. А. Кричевской,
И. П. Родионовой и Н. Д. Шаскольской
Под редакцией и с предисловием
пр оф. И. Г. Атабекова
ИЗДАТЕЛЬСТВО «МИР»
МОСКВА 1973
УДК 576.858.8
Современное исчерпывающее руководство по вирусам растений.
Автор рассматривает методы обнаружения и выделения вирусов
и их компонентов; структуру вирусных частиц; изменчивость и реп-
ликацию вирусов растений; их передачу от одного растения другому;
различных переносчиков; типы вирусных болезней; системные пора-
жения; цитологические и биохимические изменения, происходящие
в зараженных вирусом растениях; проблему инактивации вирусов;
экологию вирусов и их экономическое значение; меры борьбы с вирус-
ными болезнями; проблему номенклатуры вирусов и теории их про-
исхождения.
Предназначена для вирусологов, фитопатологов, микробиоло-
гов, генетиков, биохимиков, физиологов растений, семеноводов,
селекционеров, энтомологов, эпидемиологов, а также для студентов
и преподавателей биологических факультетов и сельскохозяйствен-
ных институтов.
Редакция биологической литературы
2102-127 © Перевод на русский язык, «Мир», 1973 г.
041(01)-73
Р. Мэтьюз
ВИРУСЫ РАСТЕНИЙ
Редактор И. А. Сысина. Художник В. И. Кейдан. Художественный редактор Ю. Л. Максимов.
Технический редактор А. Г. Резоухоза
Сдано в набор 8/П 1973 г. Подписано к печати 27/VI 1973 г. Бумага тип. Ni 1 70xl081/u“21,5
бум. л. Усл. печ. л. 60,20, в т. ч. 7,35 печ. л. иллюстр. на мелов. бум. + 2 вкл. цвети.
Уч.-изд. л. 61,05. Изд. М 4/6169. Цена 5 р. 87 к.
Темплаи изд-ва «Мир», 1973 г. Пор. АЛ 127. Тираж 4300 экз. Зак. 0803
ИЗДАТЕЛЬСТВО «МИР»
Москва, 1-й Рижский пер., 2
Ордена Трудового Красного знамени
Московская типография АЛ 7 «Искра революции»
Союзполиграфпрома при Государственном комитете
Совета Министров СССР по делам издательств,
полиграфии и книжной торговли.
Москва, К-1, Трехпрудный пер., 9'
ПРЕДИСЛОВИЕ К РУССКОМУ ИЗДАНИЮ
Известно, что история вирусологии началась с открытия вируса табачной
мозаики (ВТМ). Таким образом, зарождение вирусологии связано с вирусом
растений, который наряду с некоторыми другими вирусами сыграл важную
роль в раинии период развития этой науки. Можно считать, что этот перво-
начальный период продолжался примерно до конца 50-х годов, когда
началось бурное развитие вирусологии, продолжающееся и поныне. Однако
важнейшие достижения этого второго периода связаны отнюдь не с виру-
сами растений. Главная роль принадлежала здесь вирусам животных
и бактериофагам.,
В настоящее время о вирусах растений известно гораздо меньше, чем
о бактериофагах и вирусах животных, что как будто бы находится в явном
противоречии с объемом книги, предлагаемой читателю. Впрочем, противо-
речие это кажущееся. Дело в том, что сейчас идет бурный процесс накопле-
ния фактов, касающихся вирусов растений. Эта информация, и без того
весьма обширная, растет подобно снежному кому. Такое ^сравнение в зна-
чительной степени оправдано еще и некоторой бессистемностью усилий
в данной области вирусологии, в частности преобладанием работ чисто опи-
сательного и прикладного характера.
Предлагаемая читателю монография Р. Мэтыоза — пример умелого
обобщения и систематизации обширного и порой очень разноречивого мате-
риала, накопившегося в области исследования вирусов растений.
Р. Мэтьюз широко известен своими научными публикациями и поль-
зуется большим и заслуженным авторитетом среди вирусологов всех на-
правлений. В этой'книге ему удалось с исключительной полнотой'/изложить
самые разнообразные вопросы и, в частности, проблемы прикладной'вирусо-
логии и фитопатологии. Пожалуй, именно исчерпывающая полнота в изло-
жении фактов, касающихся самых разных аспектов исследования вирусов
растений, составляет основную ценность этой книги, которая окажется
весьма полезной специалистам в различных областях биологии и сельского
хозяйства.
И. Г. АТАБЛКОВ
ПРЕДИСЛОВИЕ АВТОРА
Как и во многих других областях биологии, наши знания о вирусах
растений и вызываемых ими болезнях в последние годы быстро развиваются.
В связи с этим возникла необходимость в появлении нового руководства,
охватывающего все стороны этой проблемы.
Эта книга написана в первую очередь для студентов, специализирую-
щихся в области фитопатологии, изучения вирусов растений, общей вирусо-
логии и микробиологии, а также для преподавателей и научных работников.
Мы надеемся, что она будет полезна в качестве справочника и для исследова-
телей, изучающих смежные области науки — молекулярную биологию,
биохимию, физиологию растений и энтомологию.
Мы пытались хотя бы частично охватить все стороны проблемы, что
представляет большие трудности, если учесть широкий круг смежных дис-
циплин. В первой главе приводится краткий исторический обзор достижений
в области изучения вирусов растений, ио в целом подход не является исто-
рическим. Тем, кого интересует история вопроса, мы рекомендуем обра-
титься к ранее вышедшим руководствам.
В книге освещаются следующие вопросы: структура вирусов и вирус-
ных компонентов; репликация вирусов; макроскопические, цитологические
и биохимические проявления воздействия вирусов на растение-хозяина;
характер мутационного процесса вирусов; взаимоотношения вирусов с пере-
носчиками, относящимися к типу беспозвоночных, а также вопросы, свя-
занные с экологией и контролем. На протяжении всей книги мы пытались
показать, как прогресс в любой узкой области знаний зависит от разработки
и применения соответствующих экспериментальных методов.
Специфические детали методологии здесь не приводятся, поскольку они
описаны в других изданиях.
Рассматриваемый нами предмет охватывает столь широкий круг вопро-
сов и столь расширился, что было бы невозможно процитировать в книге
такого размера все имеющиеся статьи по каждому из интересующих читателя
вопросов. Как правило, мы ссылались на ранее вышедшие работы в этой
области, имеющие большое значение, а также на наиболее важные или наи-
более хорошо иллюстрированные работы последнего времени. Это должно
помочь читателю быстро найти нужную ему литературу по любому из отно-
сящихся к этой области знания вопросов. Мы считаем, что в руководстве
по проблеме, охватывающей большое число научных дисциплин, наиболее
важным является иллюстративный материал, особенно для студентов и для
начинающих исследователей. Поэтому мы старались при поддержке мио-
8
Предисловие автора
гих коллег как можно лучше подобрать рисунки и фотографии, которые
служили бы ярким дополнением к тексту.
В некоторых областях, особенно в области молекулярнобиологических
основ репликации вирусов, наши знания о вирусах растений отстают от
знаний о вирусах животных и бактерий. Поэтому мы заимствовали информа-
цию о двух последних типах вирусов там, где это представлялось наиболее
целесообразным, чтобы создать как бы платформу для рассмотрения более
отрывочных данных о вирусах растений.
Одним из последних открытий, позволивших поставить ряд новых вопро-
сов, было установление того факта, что некоторые болезни, возбудителями
которых ранее считались нестабильные вирусы, весьма вероятно, вызы-
ваются организмами типа микоплазм. Хотя, как правило, мы не включаем
в наше описание болезни, вероятность участия в возникновении которых
подобного рода организмов представляется высокой, одна глава о возбуди-
телях, вызывающих заболевания, подобные вирусным, посвящена в основ-
ном рассмотрению|роли таких организмов в фитопатологии. Результатом
других работ последнего времени, представляющих значительный интерес,
явилось открытие того, что генетический материал некоторых вирусов расте-
ний распределен между двумя или более вирусными частицами. В связи
с этим мы посвятили одну главу рассмотрению дефектных вирусных частиц,
зависимых вирусов и многокомпонентных вирусов.
Мы придерживались списка названий вирусов растений, опубликован-
ного Микологическим Институтом в Англии в 1968 г. [1164], и не пытались
описывать отдельные вирусы или вирусные болезни систематически или
всеобъемлюще. Поэтому упомянутый список следует рассматривать как цен-
ное приложение к настоящему руководству, особенно для тех, кто интере-
суется весьма обширной литературой по фитопатогенным вирусам.
В последней главе мы кратко описали различные мнения, касающиеся '
номенклатуры и классификации вирусов. Поскольку, согласно давно суще-
ствующей точке зрения, классификация вирусов должна учитывать их про-
исхождение, некоторое место мы уделили рассуждениям по этому вопросу.
ГЛАВА I
ВВЕДЕНИЕ
Как и в любой другой отрасли экспериментальной науки, развитие
наших знаний о вирусах растений тесно связано с существующими методами
их исследования. В настоящей главе мы кратко обрисуем достижения в этой
области и суммируем наиболее важные аспекты исследований последнего
времени.
Хотя около семидесяти лет назад вирусные болезни растений еще
не выделялись в самостоятельную группу, отличную от других инфекционных
заболеваний, имеются гораздо более ранние сообщения, которые в настоя-
щее время можно рассматривать как указания на существование вирусных
инфекций. Например, на цветной вклейке 1, А изображены цветки тюль-
пана с симптомами пестролепестности, характерными для вирусной инфек-
ции. В то время пестролепестные тюльпаны высоко ценились как особые
разновидности. В конце XIX в. утвердилась мысль о том, что инфекционные
болезни вызываются микроорганизмами, и появились фильтры, задерживаю-
щие возбудителей известных бактериальных заболеваний. Майер [1193]
описал заболевание табака, названное им мозаичной болезнью. Он показал,
что эта болезнь может быть передана здоровым растениям путем инокуляции
их соком больных растений. Ивановский [857] установил, что сок растений
табака, пораженных описанной Майером болезнью, оставался инфекцион-
ным после того, как был профильтрован через бактериальный фильтр, хотя
и не содержал бактерий. Это сообщение Ивановского не привлекло большого
внимания, пока те же опыты не были повторены Бейеринком [141]. Баур
[89] показал, что инфекционный хлороз абутилона может передаваться путем
прививки, но не передается механической инокуляцией. При описании воз-
будителей, вызывающих эти болезни, Бейеринк и Баур использовали термин
«вирус», чтобы противопоставить этих возбудителей бактериям. В старых
работах исследователи часто применяли этот термин как синоним термина
«бактерии». По мере обнаружения все большего числа болезней такого рода
неизвестных возбудителей стали называть фильтрующимися вирусами. В пе-
риод между 1900 и 1935 гг. были описаны многие болезни растений, возбу-
дителями которых считались фильтрующиеся вирусы, но поскольку в то
время еще не существовало адекватных методов, позволяющих дифферен-
цировать различные вирусы, положение оказалось очень запутанным.
Важным шагом вперед явилось установление того факта, что некоторые
вирусы могут переноситься от одного растения к другому насекомыми. Так,
Смит и Бонке [1631] подтвердили ранее существовавшие предположения,
что заболевание, называемое курчавостью верхушки сахарной свеклы, пере-
дается цикадкой Eutettix tenella (Baker). Они показали, что одно насекомое,
питавшееся на зараженном растении, способно передать инфекцию в резуль-
тате лишь пятиминутной подкормки на здоровом растении. Однако в то
время эти ученые еще не предполагали, что курчавость верхушки сахарной
свеклы вызывается вирусом.
На первых порах вирус определяли как инфекционное начало, способ-
ное проходить через фильтры с достаточно мелкими порами, задерживаю-
щими все известные до тех пор возбудители болезней, представляющие собой
10
Глава I
клеточные организмы. Однако вскоре были обнаружены болезни, сходные
но своим симптомам с вирусными заболеваниями; эти болезни не были свя-
заны с каким-либо патогенным агентом, который можно было обнаружить
с помощью светового микроскопа, и не передавались путем механической
инокуляции. К возбудителям таких болезней нельзя было применить кри-
терий фильтруемости. Инфекционная природа этих заболеваний была уста-
новлена передачей путем прививки, а в некоторых случаях — насекомыми-
переносчиками. Таким образом, оказалось, что некоторые болезни типа
желтух и ведьминых метел (например, желтуху астр) на основании недо-
статочно обоснованных данных стали рассматривать как вирусные. Только
в самое последнее время тщательные электронно-микроскопические иссле-
дования, а также применение ингибиторов ясно показали, что ряд считав-
шихся ранее вирусными болезней в действительности вызывается агентами
типа микоплазм [466].
На протяжении почти всего периода между 1900 и 1935 гг. внимание
исследователей было сосредоточено на описании как макроскопических
симптомов болезней, так и цитологических нарушений, обнаруживаемых
с помощью светового микроскопа. Проводилось также изучение спектра
растений-хозяев и способов передачи болезнетворных агентов. Были пред-
приняты довольно безуспешные попытки улучшить методы фильтрации,
чтобы иметь возможность более точно определить размеры вирусных частиц.
Это были почти единственные аспекты проблемы вирусных инфекций, кото-
рые можно было изучать с помощью существовавших в то время методов.
Проводилось также исследование влияния различных физических и химиче-
ских факторов на инфекционность вирусов, но методы тестирования инфек-
ционного материала были примитивными. Холмс [814] показал, что местные
поражения, возникающие у некоторых растений-хозяев в результате меха-
нической инокуляции, могут быть использованы для быстрого количествен-
ного определения инфекционности вируса. Этот способ значительно облег-
чил изучение свойств вирусов и явился основой методов их выделения и очист-
ки, появившихся несколько лет спустя.
Почти до 1930 г. большинство ученых расходились во мнениях и суще-
ствовала значительная путаница как в анализе болезней, вызываемых виру-
сами, так и в вопросах, касающихся самих вирусов. Это не удивительно,
так как о вирусах практически ничего не было известно, кроме того, что они
очень малы. Значительным оказался вклад Смита [1626] в изучение этого
вопроса, что помогло внести ясность в создавшуюся ситуацию. Работая
с вирусными болезнями картофеля, он понял необходимость использования
растений-индикаторов, т. е. растений других видов, чем картофель, кото-
рые по-разному бы реагировали на вирусы, содержащиеся в картофеле.
С помощью нескольких новых биологических методов разделения вирусов
он смог показать, что многие вирусные болезни картофеля вызываются
комбинацией двух вирусов с различными свойствами. Смит обозначил их
как вирусы X и Y. Х-вирус картофеля не передавался тлей Myzus persicae
(Sulz.),тогда какУ-вирус передавался. Таким образомСмит получил У-вирус,
не содержащий примеси Х-вируса. Оба вируса могли передаваться иноку-
ляцией иглой, но Смит обнаружил, что некоторые растения из семейства
пасленовых устойчивы к У-вирусу. Например, при подобном введении смеси
вирусов в растения дурмана (Datura stramonium) он смог получить Х-вирус,
не содержащий примеси У-вируса. Кроме того, Смит наблюдал, что в зави-
симости от источника Х-вируса степень жесткости вызываемых этим виру-
сом симптомов значительно варьировала у различных хозяев. Вот цитата
из работы Смита [1626]: «Таким образом, путаница, существующая в на-
стоящее время в вопросе о мозаичных болезнях картофеля, вызвана двумя
факторами. Во-первых, это до сих пор не подозревавшаяся двойственная
Введение
11
природа большого числа вирусных болезней мозаичной группы, поражаю-
щих картофель. Во-вторых, это колебание вирулентности одного из вирусов
этой группы, т. е. Х-вируса картофеля».
Другим открытием, которому суждено было сыграть важную роль,
явилась находка Била [133], обнаружившего, что растения, зараженные
вирусом табачной мозаики, содержат какой-то специфический антиген.
Грациа (671, 672] показал, что растения, зараженные разными вирусами,
содержат различные специфические антигены. Честер [369] установил, что
разные штаммы вируса табачной мозаики (ВТМ) и Х-вируса картофеля
можно различить серологически, и разработал первую серологическую
классификацию вирусов растений [370]. Как оказалось, серологические
методы можно использовать для грубого определения концентрации вируса.
Еще до выделения ВТМ Честер [367] на основании сравнительного определе-
ния предельных серологических титров с использованием сока зараженных
растений табака и некоторых очищенных невирусных антигенов установил,
что ВТМ должен содержаться в соке табака в концентрации по крайней
мере 0,1—1,0 мг на 1 мл. (Впоследствии было показано, что концентрация
вируса в растениях с системным поражением составляет около 2—4 мг
на 1 мл.)
Высокая концентрация некоторых вирусов в зараженных растениях
и их относительная стабильность сыграли решающую роль на первых этапах
выделения и изучения химических свойств вирусов, так как методы экстрак-
ции и очистки белков не были достаточно хорошо развиты. В 1926 г. Самнер
[1704] выделил первый из ферментов — уреазу, получил ее в кристалличе-
ском виде и доказал белковую природу этого фермента. Вскоре последовало
выделение других ферментов. В начале 30-х годов исследователями в раз-
личных странах были предприняты попытки выделить и очистить вирусы
растений при помощи методов, сходных с методами, используемыми для
ферментов.
После проведения детальных химических исследований, позволивших
высказать предположение о белковой природе инфекционного начала ВТМ,
Стэнли [1663] сообщил о выделении этого вируса в кристаллическом состоя-
нии. Сначала Стэнли [1663, 1664] считал, что этот вирус представляет собой
глобулин, не содержащий фосфора. Примерно в то же время Бест [180]
сообщил, что глобулиноподобный белок, обладающий вирусной активно-
стью, осаждался из экстрактов зараженных листьев при подкислении.
Боудэн и др. [130] выделили из зараженных ВТМ листьев нуклеопротеид,
имеющий структуру жидкого кристалла и содержащий нуклеиновую кисло-
ту, в которой углеводным компонентом была пентоза. Они показали, что
вирусные частицы имеют палочкообразную форму, подтвердив тем самым
более раннее предположение Такахаси и Роулипза [1738], основанное на
обнаружении анизотропии в потоке у растворов, содержащих ВТМ. Бернал
и Фаикухен [176] применили метод рентгепоструктурного апализа для иссле-
дования очищенных препаратов вируса. Они получили точные данные о ши-
рине частиц ВТМ и показали, что игловидные образования, формируемые при
солевом осаждении вируса, характеризуются правильной упаковкой только
в двух измерениях и поэтому их лучше обозначать как паракристаллы, а ие
как истинные кристаллы. Вскоре были выделены другие палочкообразные
и сферические вирусы, образующие истинные кристаллы. Было показано,
что все они состоят из белка и нуклеиповой'кислоты, углеводным компонен-
том которой является пентоза.
Электронная микроскопия и рентгеноструктурный, анализ являются
основными методами, используемыми для исследования строения вирусных
частиц. Ранние электронные микрофотографии [958] подтвердили данные
о палочкообразной форме ВТМ и позволили определить его приблизитель-
12 Глава I
ные размеры, но они были не очень четкими из-за недостаточного контраста
между вирусными частицами и пленкой-подложкой. Появление метода отте-
нения тяжелыми металлами [1239, 1912] значительно увеличило ценность
электронной микроскопии для определения общего размера и формы вирус-
ных частиц. Однако покрытие металлом в большей или меньшей степени
затрудняло выявление структурных деталей. С появлением в 1950-х годах
микроскопов с высоким разрешением и метода негативного контрастирова-
ния электронная микроскопия стала важным средством изучения субструк-
туры вирусов.
На основании сравнительного изучения физико-химических свойств
вирусного нуклеопротеида и пустой вирусной белковой оболочки, обнару-
женной в препаратах вируса желтой мозаики турнепса (ВЖМТ), Маркхэм:
[1147] пришел к выводу, что РНК вируса должна находиться внутри белковой
оболочки. Эта точка зрения сейчас уже широко подтверждена в отношении
этого и других вирусов данными рентгеноструктурного анализа. Крик и Уот-
сон [417] предположили, что белковые оболочки мелких вирусов построены
из большого числа идентичных субъединиц, образующих либо палочкообраз-
ные частицы со спиральной симметрией, либо сферические структуры с ку-
бической симметрией. Последующие рентгенографические и химические
исследования подтвердили эту точку зрения. Каспар и Клуг [332] сформули-
ровали общую теорию, ограничивающую возможное число и расположение
белковых субъединиц, образующих оболочки мелких изометрических виру-
сов. Наши современные знания о крупных вирусах с более сложной симмет-
рией и структурой основаны на данных электронной микроскопии с исполь-
зованием методов негативного контрастирования и ультратонких срезов.
Почти до 1948 г. наибольшее внимание исследователей концентрирова-
лось на белковом компоненте вирусов. Это обусловлено, вероятно, несколь-
кими причинами. В количественном отношении белок составляет большую
часть вирусных препаратов. Было известно, что ферменты, выполняющие
важные функции в клетках, являются белками, а знания о нуклеиновых
кислотах, углеводным компонентом которых является пентоза, были эле-
ментарными. Функция их в клетке была неизвестна, и обычно считалось,
что они представляют собой небольшие молекулы. Такое представление
возникло потому, что в то время было неизвестно, насколько легко нуклеи-
новые кислоты гидролизуются кислотами, щелочами, а также ферментами,
которые обычно содержатся в вирусных препаратах.
Маркхэм и Смит [1157] выделили ВЖМТ и показали, что очищенные
препараты содержат два класса частиц, одни из которых представляют собой
инфекционный нуклеопротеид с содержанием РНК около 35%, а другие
(внешне идентичные первым) — белковые частицы, не содержащие РНК
и не обладающие инфекционностыо. Эти данные ясно показали, что для био-
логической активности вируса необходима РНК. При проведении аналити-
ческих исследований [468, 1153—1156] было обнаружено, что разные вирусы
имеют сильно различающийся состав оснований, тогда как родственные
вирусы по составу оснований близки. К этому времени стало ясно, что раз-
меры вирусных РНК могут быть значительно больше, чем считалось ранее.
Херши и Чейз [773] установили, что при заражении Escherichia colt
вирусом бактерий вирусная ДНК проникала в клетку-хозяина, а большая
часть белка оставалась вне ее. Эти эксперименты подчеркнули важность
нуклеиновых кислот для репликации вирусов. Харрис и Найт [711] пока-
зали, что ферментативное удаление из ВТМ 7% треонина не сказывается
на его биологической активности и заражение таким вирусом приводит
к появлению нормального потомства с обычным содержанием треонина.
При введении в инфицированные растения аналога гуанина — 8-азагуа-
нина — последний частично включался в РНК ВТМ и ВЖМТ вместо гуа-
Введение
13
вина. Данные о том, что препараты вируса, содержащего аналог, обладали
меньшей инфекционностыо, чем нормальный вирус [1174, 1176, 1177],
послужили дальнейшим экспериментальным подтверждением того, что инфек-
ционность вируса обусловливается вирусной РНК. Однако классическими
экспериментами, которые продемонстрировали инфекциониость свободной
РНК ВТМ и защитную роль белковой оболочки, были эксперименты Гирера
и Шрамма [630], Френкель-Конрата и Вильямса [5391, а также Френкель-
Конрата [531]. Последующие исследования показали, что в вирусах, подоб-
ных ВТМ, РНК находится в виде одной нити и единичный разрыв этой нити
приводит к инактивации вирусной частицы.
Все вирусы растений, исследованные до недавнего времени, содержали
в качестве генетического материала одноцепочечную РНК. Сейчас известно,
что вирус раневых опухолей [210] и вирус карликовости риса [1228] содержат
двухцепочечную РНК, а вирус мозаики цветной капусты содержит двух-
цепочечную ДНК [1561; Шеферд, личное сообщение]. Вероятно, будут обна-
ружены также вирусы растений, содержащие одноцепочечную ДНК, по-
скольку такие вирусы известны среди вирусов бактерий и вирусов животных.
Разные вирусы растений отличаются друг от друга по объему частиц
примерно в 300 раз (от 2,6-103 нм3 для ^вируса-сателлита вируса некроза
табака до 8,0 -103 нм3 для вируса некротического пожелтения салата-латука
и сходных вирусов). Молекулярная масса нуклеиновых кислот вирусов
растений, размеры которых известны, различается приблизительно в 20 раз
(от 0,4 >105 дальтон для вируса-сателлита до 10’ дальтон для вируса раневых
опухолей), и, вероятно, будут обнаружены молекулы нуклеиновых кислот
еще больших размеров.
Полная последовательность оснований еще не определена ни для одной
из вирусных РНК. Связанные с этим технические проблемы и обычно боль-
шие размеры вирусных РНК заставляют думать, что определение последо-
вательности оснований у них будет возможно только через много лет. Однако
недавно была определена полная последовательность 120 оснований рибосом-
ной 5S-PHK Escherichia coli [293]. Подобно вирусным РНК, эта РНК не
содержит необычных оснований, облегчающих идентификацию фрагментов.
Таким образом, возможность определения полной последовательности осно-
ваний для РНК вируса-сателлита, содержащей около 1200 нуклеотидов,
не кажется столь отдаленной.
Уровень знаний о репликации вирусов растений в клетке-хозяине
значительно отстает от того, что известно о вирусах животных и вирусах
бактерий. Это обусловлено в основном техническими причинами. Так, до
сих пор не удалось разработать систему из тканей растений, в которой все
клетки могли бы быть инфицированы одновременно и последующие этапы
репликации вирусов проявлялись бы более или менее синхронно. Появление
такой системы явилось бы огромным шагом ^вперед. Другой трудностью при
работе с вирусами растений является крайне низкая эффективность суще-
ствующих методов инокуляции клеток. Для многих вирусов, которые могут
передаваться механической инокуляцией, требуется нанести на поверхность
листа около 10*—10е вирусных частиц в расчете на 1 клетку, чтобы добиться
ее инфицирования. В случае многокомпонентных вирусов, которые будут
рассмотрены ниже, эта величина значительно выше. Для сравнения укажем,
что для многих вирусов бактерий это отношение равно 1 : 1 и близко к нему
для некоторых вирусов животных.
Несмотря на перечисленные трудности, некоторый прогресс в этой обла-
сти достигнут. Из листьев, зараженных ВТМ и ВЖМТ, были выделены двух-
цепочечиые вирусные РНК [302,1139,1573], но о деталях функционирования
этих структур в процессе репликации вирусных РНК в настоящее время
можно судить лишь по экспериментам со сходными вирусами бактерий
14
Глава I
и животных. Известно, что в листьях, зараженных ВЖМТ, синтез вирусного
белка может продолжаться после подавления синтеза РНК каким-либо
ингибитором [550], однако и в этом случае о деталях процесса синтеза вирус-
ных белков можно говорить главным образом на основании результатов,
полученных на системах из клеток животных и бактериальных клеток.
Многие вирусы бактерий и вирусы животных вызывают гибель клеток,
в которых они размножаются. Это может также произойти и у растений,
но многие вирусы, как оказалось, встречаются в растительных клетках
в высокой концентрации, не оказывая сильного цитопатического воздействия.
У растений с системным поражением вирус инфицирует делящиеся клетки
вблизи точки роста и может достигать высокой концентрации в клетках,
которым предстоит еще пройти много циклов клеточного деления, прежде
чем образуется зрелый орган. В таких случаях синтез вируса, по-види-
мому, является процессом столь же четко регулируемым, как, например,
синтез рибосом. Природа такой регуляции совершенно неясна.
Известна полная последовательность 158 аминокислот в полипептидных
цепях капсидного белка ВТМ [23, 1797, 1928] и определена полная амино-
кислотная последовательность белков многих природных штаммов и искус-
ственно полученных мутантов. Эти исследования внесли важный вклад
в установление универсальной природы генетического кода и в наше пони-
мание химических основ мутаций.
После того как было показано, что генетический код представляет собой
последовательность триплетов оснований в нуклеиновой кислоте, каждый
из которых определяет одну аминокислоту в белке, выяснилось следующее:
большинство вирусов содержит значительно больше генетической инфор-
мации, чем требуется для кодирования белка или белков, обнаруженных
в составе вирусной частицы. Например, многие вирусы растений содержат
молекулу РНК с молекулярной массой 2-10° дальтон. Этого достаточно,
чтобы, кроме капсидного белка, кодировать еще 5—8 белков средней моле-
кулярной массы. Эти белки, по-видимому, нужны для размножения вируса
и синтезируются в инфицированной клетке. По аналогии с результатами
исследований на вирусах животных и вирусах бактерий можно предполо-
жить, что одним из таких белков является, вероятно, вирусоспецифичная
РНК-синтетаза. Выделение и изучение свойств этих некапсидных белков
является предметом дальнейших исследований.
Было проведено много исследований по изучению влияния вирусной
инфекции на такие процессы метаболизма растения-хозяина, как дыхание
и фотосинтез, а также на концентрацию различных встречающихся в норме
метаболитов и макромолекул. Связь между изменениями, наблюдаемыми
в ходе этих процессов, или содержанием указанных компонентов и размно-
жением вирусов останется, вероятно, невыясненной до тех пор, пока
не расширятся наши знания об активности различных белков, образующихся
в инфицированных клетках под влиянием вирусного генома.
Что касается взаимодействия вирусных капсидных белков и нуклеи-
новых кислот при формировании вирусных частиц, то мысль о том, что сборка
белковых оболочек мелких вирусов является спонтанным процессом, зави-
сящим от свойств субъединиц капсидного белка, была подтверждена экспе-
риментами на палочкообразных вирусах [539] и мелких изометрических
вирусах [76]. В этих экспериментах изолированные РНК и белковые субъ-
единицы воссоединялись в соответствующих условиях in vitro с образова-
нием интактных инфекционных вирусных частиц.
Усовершенствование методов получения тонких срезов для электронной
микроскопии в течение последних нескольких лет позволило наблюдать
полностью сформированные вирусные частицы непосредственно в клетке.
Иногда вирусные частицы видны в ядре. Чаще их можно видеть в цитоплазме
Введение
15
либо лежащими свободно, либо находящимися в различных включениях.
Однако место (или места) синтеза вирусных компонентов и их сборки с обра-
зованием зрелого вируса ни для одного вируса в растительных клетках еще
ясно не установлено.
После того как Фукуси [577] показал, что вирус карликовости риса может
передаваться с яйцами цикадки-переносчика на протяжении семи поколе-
ний, происходящих от одной вирофорной самки, без повторного доступа
вируса, возник большой интерес к вопросу о способности некоторых виру-
сов размножаться как в клетках растений, так и в клетках насекомых. Мно-
гие исследования по этому вопросу касались болезней, которые, как сейчас
стало известно, вызываются агентами типа микоплазм. Тем не менее несом
пенно, что некоторые вирусы размножаются в клетках хозяев обоих типов-
Это известно, например, о вирусе деформированное™ листьев клевер.
[204] и вирусе раневых опухолей [208].
Бракке [259, 260] разработал метод центрифугирования в градиенте
плотности сахарозы для очистки вирусов. Этот метод наряду с расширением
наших представлений о действии химических факторов, влияющих на ста-
бильность вирусов в экстрактах, позволил осуществит!, выделение и частич-
ное изучение большего числа нестабильных вирусов. В настоящее время
почти для 40 вирусов известны размер и форма частиц, а также количество
и тип содержащейся в них нуклеиновой кислоты. В очищенных препаратах
ряда вирусов были обнаружены вирусные частицы с неполным содержанием
нуклеиновой кислоты [1181, 1182, 1424, 1950]. С тех пор неполные частицы
такого рода уже выявлены в препаратах большинства мелких икосаэдриче-
ских вирусов. Исследование инфекционное™, этих частиц, выделяемых
обычно методом фракционирования в градиенте плотности, сначала навело
на мысль, что только полностью сформированные частицы инфекциопны.
Более тщательное фракционирование показало, что для проявления инфек-
ционное™ некоторых из этих вирусов необходимо взаимодействие частиц
двух типов (см., например, [1822, 1823]). Нечто подобное было обнаружено
и при исследовании препаратов палочкообразных частиц вируса погремко-
вости табака, которые содержат длинные и короткие палочки. Длинные
частицы могут осуществлять синтез вирусной РНК, ио не способны произ-
водить капсидный белок. Короткие палочки сами по себе инертны, но содер-
жат РНК, используемую в качестве матрицы для синтеза капсидного белка,
имеющегося как в длинных, так и в коротких частицах [568, 1077, 1078].
Более сложная система, состоящая из 4 или даже 5 компонентов, обнаружена
в препаратах вируса мозаики люцерны [1835]. Биологическое значение этих
многокомпонентных вирусов пока неясно, однако возможно, что у таких
вирусов, содержащих одноцепочечную РНК, достигается большая гене-
тическая гибкость. Их обнаружение, по-видимому, делает возможным про-
ведение генетических экспериментов на вирусах растений. Уже удалось
получить искусственно смешанные вирусы путем одновременного введения
в клетку крупной частицы одного штамма и малой частицы другого штамма
[1078, 1837].
Другая форма зависимости характерна для вируса-сателлита вируса
некроза табака [937]. Это самый мелкий из известных вирусов. В его РНК
содержится количество информации, достаточное для кодирования собст-
венного капсидного белка и, возможно, специфической РНК-полимеразы.
В отношении других существенных, но пока неизвестных функций он зави-
сит от присутствия неродственного ему вируса некроза табака.
В течение первых десятилетий этого века усилия, направленные па
борьбу с вирусными болезнями в поле, часто оказывались неэффективными.
Обычно они сводились к различным агротехническим приемам, удалению
явно зараженных растений и поискам генетически устойчивых линий. В по-
16
Глава I
следние годы новые достижения значительно улучшили возможности борьбы
с некоторыми болезнями. Обнаружение двух видов почвенных переносчиков
вируса — нематод [774] и грибов [683] — открыло возможности для борьбы
с рядом важных вирусных заболеваний. Достигнуты значительные успехи
в отношении выявления устойчивых к вирусам культурных растений.
Тепловая обработка и методы культуры апикальной меристемы при-
меняются по отношению ко все возрастающему числу вегетативно размно-
жающихся растений для получения не содержащего вирусов материала,
который затем может размножаться в условиях, сводящих к минимуму
возможность повторного заражения. Эти достижения часто включают введе-
ние сертификационных систем. Инсектициды системного действия, иногда
применяемые в распыленной форме во время посадки, в значительной сте-
пени защищают от некоторых персистентных вирусов (т. е. от вирусов, раз-
витие которых в течение определенного времени проходит в организме
насекомых), переносимых тлями. Болезни, возбудители которых (в данном
случае неперсистентные) переносятся механическим способом на стилетах
тлей, труднее контролировать. Проводимая в настоящее время работа позво-
ляет предположить, что покрытие растений очень тонкой пленкой раститель-
ного или минерального масла может служить полезным в коммерческом отно-
шении приемом для снижения распространения таких болезней.
В заключение этого краткого вступительного обзора мы хотели бы кос-
нуться трудного вопроса, связанного с определением понятия «вирус». С го-
дами, по мере детализации наших представлений о структуре и активности
вирусов, это определение претерпело изменения и стало еще более сложным.
Три приведенных ниже примера иллюстрируют эту тенденцию. Боудэн [94]
определял вирус как облигатно паразитический патогенный агент, характе-
ризующийся размерами меньше 200 нм. Как подчеркивал Боудэн, это опре-
деление не содержит ничего определенного о вирусах, а просто ставит своей
целью внести некоторые ограничения в употребление этого слова. Лурия
[1108] предложил следующее определение: «Вирусы есть субмикроскопиче-
ские объекты, способные проникать в определенные живые клетки и репро-
дуцироваться только внутри этих клеток». В этом определении ничего
не говорится о том, что вирусы вызывают болезнь, хотя на практике почти все
вирусы обнаруживают именно потому, что их наличие в организме некото-
рых хозяев приводит к заболеванию. В определении подразумевается произ-
вольный предел размеров, который был принят равным менее 200 нм (линей-
ные размеры частиц).
Согласно Львову и Турнье [1112], вирусы отличаются от всех осталь-
ных биологических объектов, обладающих признаками живого, по пяти
признакам:
1. Зрелые вирусные частицы содержат только один тип нуклеиновой
кислоты — ДНК или РНК. Другие агенты содержат оба типа нуклеиновых
кислот.
2. Целые вирусные частицы развиваются, начиная с одного исходного
компонента — своей нуклеиновой кислоты, тогда как другие биологические
объекты формируются при участии всех своих компонентов и размножаются
делением.
3. Вирусные частицы неспособны к росту и делению надвое.
4. Вирусы лишены генетической информации, необходимой для синтеза
важнейших систем, свойственных клеточным формам жизни, например си-
стем, ответственных за образование энергии.
5. Вирусы используют рибосомы клеток-хозяев.
Это определение четко разграничивает агенты, которые в настоящее
время принято считать вирусами, и те, которые не относят к вирусам, а имен-
но бактерии, микоплазмы, риккетсии и хламиды (возбудитель пситтакоза
Введение
17
и родственные агенты). В рассмотрении этого вопроса Львовым и Турнье
важно то, что ученые подчеркивают основные характерные особенности,
присущие вирусам позвоночных, беспозвоночных, растений и бактерий.
Однако результаты некоторых исследований самого последнего времени не
отражены в приведенном определении. Например, вирусу-сателлиту для
репликации недостаточно только своей собственной РНК. Утверждение,
что вирусные частицы воспроизводятся лишь на основе генетической инфор-
мации, заложенной в их собственной нуклеиновой кислоте, неприложимо
также и к многокомпонентным вирусам растений, у которых одна частица
представляет генетическую информацию, необходимую для репликации дру-
гой. Важным обстоятельством, касающимся нуклеиновой кислоты вируса,
может быть то, что вся она является материалом генома, а не то, что она
представляет собой нуклеиновую кислоту одного типа. По определению Льво-
ва и Турнье, зрелая частица ДНК-содержащего «вируса», которая содержит
также некоторое количество РНК, не может быть названа вирусом; с дру-
гой стороны, если в частице РНК-содержащего вируса будет присутствовать
некоторое количество транспортной или какой-либо другой негенетической
РНК, то такую частицу следует рассматривать как вирус.
В свете исследований последнего времени мы позволим себе внести
некоторые изменения в составленный Львовым и Турнье перечень характер-
ных признаков вируса.
Вирус представляет собой систему из одной или более молекул матрич-
ной нуклеиновой кислоты — ДНК или РНК — со следующими свойствами:
1. Репликация этих молекул возможна только в соответствующей внут-
риклеточной среде. К числу внутриклеточных компонентов, от которых зави-
сит размножение вируса, относятся рибосомы, транспортные РНК и систе-
ма, участвующая в образовании энергии. Для некоторых вирусов может
быть также необходимо наличие другого вируса.
2. В зрелой вирусной частице генетический материал обычно упакован
в белковую или липопротеидную защитную оболочку. В тех случаях, когда
геном вируса представлен более чем одной молекулой нуклеиновой кислоты,
либо каждая из них может быть заключена в свою собственную оболочку,
либо все они могут находиться в одной общей. Зрелый вирус не содержит
иной нуклеиновой кислоты, кроме нуклеиновой кислоты, составляющей
вирусный геном.
3. При наличии соответствующих условий вирус может вызвать болезнь
по крайней мере у одного хозяина.
Любая попытка точного определения вируса связана всегда с необхо-
димостью дополнительной проверки. Например, реовирус, вероятно, служит
исключением из приведенного выше определения. В каждой его частице
содержится генетический материал, представленный не менее чем десятью
дискретными единицами, состоящими из двухцепочечной РНК, а кроме того,
еще несколько сотен единиц, состоящих из какого-то низкомолекулярного
полирибонуклеотида, богатого адениловой кислотой. Функция этого низко-
молекулярного полирибонуклеотида, на долю которого приходится около
20% всей вирусной РНК, пока неизвестна [143, 144, 1840, 1867]. Таким
образом, реовирус содержит относительно большое количество полирибону-
клеотидпого материала, который, вероятно, не выполняет генетической
функции.
Читатель сейчас, возможно, склонен согласиться с мнением Локка,
высказанном в его трактате «Опыт о человеческом разуме», о том, что хотя
определения должны служить для объяснения наименования сущностей,
поскольку они выражают наши мысли, тем не менее они оставляют их несо-
вершенными, так как они олицетворяют вещи.
2-0893
ГЛАВА II
КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИРУСОВ
Количественная оценка содержания вирусов является в большинстве
случаев необходимым этапом их выделения и исследования. С этой целью
используют четыре главных метода: определение инфекционности, методы,
связанные с серологическими свойствами вирусов, а также основанные на
действии физических и химических факторов на вирусы. Среди этих методов
основным является метод определения инфекционности, так как именно
на основании биологической активности можно судить о присутствии вируса.
В большинстве экспериментов для количественного определения вирусов
полезно (а часто необходимо) одновременное применение двух или более
методов, основанных на различных свойствах вируса.
ИНФЕКЦИОННОСТЬ
Подсчет числа местных поражений
Холмс [814] показал, что местные некротические поражения, образую-
щиеся на листьях Nicotiana glutinosa в результате механической инокуляции
ВТМ, можно использовать для оценки относительной инфекционности
вируса. Этот метод оказался более точным и требовал меньше опытных расте-
ний, чем старый способ оценки в инокулируемой группе числа инфицирован-
ных растений с системным поражением. Начиная с этого времени много
усилий было направлено на поиски растений-хозяев, у которых те или иные
вирусы вызывали местные поражения. Вероятно, именно поэтому все имею-
щиеся в нашем распоряжении сведения о вирусах растений имеют тот недо-
статок, что большая часть исследований проводила^ с использованием виру-
сов, для которых были известны растения-индикаторы, реагирующие обра-
зованием местных поражений в ответ на заражение. Различные аспекты
механической передачи вирусов обсуждаются в гл. VI.
Во всех возможных случаях для подсчета числа местных поражений
используются виды растений-хозяев, реагирующие на заражение вирусом
образованием отчетливо выраженных некрозов или реакцией типа кольцевой
пятнистости (цветная вклейка 1 и фото 35). Некоторые вирусы вызывают
образование хорошо воспроизводимых хлоротических поражений, однако
в других случаях такие поражения могут варьировать от четких пятен до
неясных желтых зон, оценка которых оказывается произвольной и субъек-
тивной. При этом иногда удается использовать тот факт, что содержание
крахмала в клетках пораженного участка может отличаться от содержания
его в неинфицированных клетках [815]. В конце светового периода инфици-
рованные вирусом клетки могут содержать меньше крахмала, в конце тем-
нового — больше. Чтобы выявить подобные участки, листья обесцвечивают
этанолом и окрашивают иодом. Для получения удовлетворительных и вос-
производимых результатов при выявлении некрозов с помощью иод-крах-
мальной пробы необходимо тщательно контролировать условия окружающей
среды и время взятия образцов.
Количественное определение вирусов
19
На четкости образующихся местных поражений может отражаться
характер питания растения. Например, у растений китайской капусты,
страдающих от недостатка азота, ВЖМТ может вызывать отчетливо выражен-
ные некрозы фиолетового цвета, которые легче заметить, чем слабые хлоро-
тические поражения, возникающие при заражении обычным штаммом
вируса [455].
При внимательном проведении опыта, поставленного в соответствий?
с точно намеченным планом, количественное определение вируса, основанное
па подсчете числа местных поражений, позволяет выявит!, различия между
двумя препаратами даже в пределах 10—20%. Однако в литературе есть
много примеров, когда выводы, сделанные на основании такого подсчета
местных поражений, не гарантировали точных данных. При рассмотрении
этого вопроса следует иметь в виду три основных момента: 1) значительные
колебания в числе местных поражений, образуемых на разных листьях стан-
дартным инокулумом вируса; 2) общий вид кривой, описывающей зависи-
мость числа некрозов от разведения инокулума, и 3) необходимость статисти-
ческой обработки результатов для получения надежной сравнительной оценки
инфекциониости образцов.
Различия между листьями
В гл. XII мы рассмотрим физиологические факторы и факторы окру-
жающей среды, влияющие па чувствительность растения к инфекции. К их
числу относятся возраст растения, генетическая изменчивость растения-
хозяина, положение листа на стебле, питание, водный режим, температура,
интенсивность освещения, сезон года и время дня. Самуэль и Волд [1483]
установили, что при определении числа местных поражений, когда для
этого используются половинки одного и того же листа, наблюдается гораздо
меньше различий, чем в случае разных листьев растения. С тех пор в боль-
шинстве экспериментов по подсчету числа местных поражений применяется
метод сравнительной оценки па половинках листьев. У растений типа Phaseo-
lus vulgaris, имеющих два доступных для использования первичных листа,
находящихся в одинаковом положении на растении, в пашем распоряжении
имеется 4 совершенно одинаковые половинки листьев.
Число половинок листьев, необходимых для сравнения, зависит
от требуемой точности эксперимента, однородности используемых растений
и числа образцов, взятых для сравнения. При оценке растений, растущих
при вполне стандартных условиях, после проведения нескольких опытов
обычно можно отобрать отдельные растения, значительно отличающиеся по
чувствительности от группы, и изъять их. При единичном сравнении инфек-
ционное™ двух образцов должно быть использовано как минимум 6—8 ли-
стьев. При сравнении более чем двух образцов можно воспользоваться раз-
личными экспериментальными приемами. Половинка каждого листа может
быть ипокулирована одним и тем же стандартным препаратом вируса, а на
другую половинку листа наносят различные исследуемые препараты. Этот
прием прост, но требует довольно большого числа растений.
В определенных случаях эффективным оказывается метод латинских
квадратов. Например, при использовании растений типа TV. glutinosa, каж-
дое из которых имеет 4—8 листьев, пригодных для заражения, некоторое
ограниченное число образцов можно нанести таким образом, что для срав-
нения различных проб каждого образца можно использовать листья, нахо-
дящиеся в разных положениях на растении.
Если число обработок превышает количество листьев, то используется
один план, согласно которому каждый исследуемый инокулум следует
наносить в данном положении листа одинаковое число раз. Рядом авторов
2*
20
Глава II
1573, 985, 13591 были разработаны некоторые образцы более сложных экспе-
риментальных схем. Однако должен существовать разумный предел слож-
ности метода нри подсчете числа местных поражений. При проведении широ-
кого круга экспериментов увеличивается вероятность ошибок в процессе
инокуляции и маркировки. В связи с тем что инокуляция при этом занимает
много времени, на результатах могут сказаться изменения в чувствительно-
сти растений, которая зависит от времени дня. Избежать этого можно, толь-
ко усложняя схему эксперимента с учетом этого эффекта, который часто
бывает весьма значительным.
Зависимость между разведением инокулума.
и числом поражений
Бест [182] исследовал характер кривой, описывающей зависимость
между числом местных поражений, индуцируемых ВТМ на листьях N. glu-
tinosa, и разведением инокулума. Он показал, что кривую можно разделить
на три части: 1) часть кривой, соответствующую высоким концентрациям
вируса, где изменение этих концентраций сопровождается очень небольшим
изменением в числе местных поражений, 2) среднюю часть кривой, где изме-
нение концентрации более или менее эквивалентно изменению числа пора-
жений, 3) часть кривой, соответствующую области низких концентраций,
где изменение концентрации вируса незначительно отражается на числе пора-
Разведенае инокулума
Фиг. 1. Зависимость между числом местных поражений, индуцируемых двумя различ-
ными вирусами растений на Ntcotiana glutinosa [985].
I— вирус кустистой карликовости томатов; II — ВТМ.
Количественное определение вирусов
21
жений. Это справедливо в отношении многих, по не всех вирусов. Две кри-
вые, описывающие подобного рода зависимость, приведены на фиг. 1.
Кривые разведения вируса интересны как с теоретической, так и с прак-
тической точек зрения. Математический анализ процесса инфекции рассма-
тривается в гл. VI. С практической точки зрения форма кривой разведения
дает возможность сделать несколько важных выводов. Во-первых, пе имеет
смысла сравнивать два образца со слишком большим или слишком малым
числом местных поражений, так как при этом ошибка будет очень значитель-
ной. Во-вторых, сравнение инфекционности может быть проведено только
в той области концентраций, где число поражений более или менее пропор-
ционально разведению. В-третьих, наклон кривой разведения несколько
меняется от одного эксперимента к другому. Это означает, что два образца
следует сравнивать при нескольких разведениях (обычно двух-, пяти- или
десятикратных). Вообще говоря, для листьев, примерно сходных по размеру
с листьями N. glutinosa, средние цифры в пределах 10—100 поражений на
каждую половинку листа наиболее удобны при оценке инфекционности.
Для более крупных или более мелких листьев диапазон должен быть иным.
На наклон кривой разведения могут оказывать влияние следующие
факторы: 1) присутствие ингибиторов в инокулуме, причем при разбавле-
нии ингибитора кривая может пойти менее круто, чем ожидалось, 2) дез-
агрегация вируса, который находился ранее в агрегированном состоянии,
при разбавлении инокулума также может сделать кривую более пологой,
3) необходимость присутствия более чем одной вирусной частицы для мест-
ного поражения, что может сделать кривую круче, чем следовало ожидать
[587], и что было обнаружено в отношении нескольких вирусов, заражение
которыми возможно только с участием двух или более частиц (фиг. 21),
и 4) изменение в чувствительности испытуемых растений в течение времени,
необходимого для инокуляции, что может влиять на наклон кривой тем или
иным путем в зависимости от порядка инокуляции.
Зависимость числа поражений от концентрации
инфекционных вирусных частиц
Даже в том случае, если посредством введения оптимальной схемы
эксперимента учесть индивидуальные колебания в числе поражений для
разных листьев, а также при условии, что титрование проводится в средней
части кривой разведения, число поражений нельзя непосредственно выразить
в виде относительного содержания обладающего инфекционностыо вируса.
Самым простым практическим путем преодоления этой проблемы является
приведение инокулума к такому разбавлению (на основании предваритель-
ного исследования), при котором сравниваемые образцы дают приблизи-
тельно равное число некрозов в пределах наиболее рационального диапазона
примерно от 10 до 100 поражений на лист.
Для правильного использования данных титрования требуется приме-
нение некоторых элементов статистического анализа. Клечковский [984,
986, 988] обратил внимание на тот факт, что такие показатели, как число
местных поражений или логарифм этого числа (раньше ученые пользовались
логарифмом), непригодны для такого анализа. Число некрозов не подчи-
няется нормальному распределению, и дисперсия среднего возрастает с уве-
личением среднего. В качестве показателя, пригодного в тех случаях, когда
среднее число X > 10, Клечковский предлагает пользоваться величиной
y = logw(X+C),
где X — число местных поражений, а С — константа. Ее можно оценить
для каждого эксперимента в отдельности, но, вообще говоря, любая величина
22
Глава II
С в пределах от 5 до 20 вполне удовлетворительна. Для случаев, когда
X < 10, Клечковский предлагает несколько более сложный показатель.
Если среднее хотя бы в одной группе данных меньше 10, то для того> чтобы
применять дисперсионный анализ, нужно пользоваться вторым преобразо-
ванием ко всем данным.
Некоторые общие соображения
При планировании и применении системы анализа инфекционное™
и определения числа местных поражений следует иметь в виду многие фак-
торы, которые влияют на инфекционность вирусов и чувствительность расте-
ний. Изучая влияние какой-либо обработки на инфекционность препарата,
важно знать, не может ли эта обработка каким-то образом изменить условия
среды (например, pH) еще до того, как она окажет непосредственное воз-
действие на вирус.
Объем и сложность анализа должны соответствовать требованиям экспе-
римента. Бесполезно планировать сложную схему опыта со случайными
выборками, когда даже очень приблизительная оценка инфекционности дает
требуемый ответ. Чаще встречающийся недостаток заключается в том, что
выводы делают из неполностью обдуманных и неверно интерпретированных
экспериментов. В этой связи одним из факторов, которым часто пренебрегают,
является влияние времени дня па чувствительность испытуемых растений
(гл. XII). Степень этого влияния значительно варьирует, и для анализов,
продолжающихся лишь в течение часа или около того, этим, влиянием,
вероятно, можно пренебречь. Однако в случае сложных экспериментальных
схем и большего числа растений, требуемых для максимальной точности,
а также в случае большого количества анализируемых образцов этот фактор
может систематически влиять на результаты. В подобного рода эксперимен-
тах по исследованию этого эффекта при заражении листьев фасоли (Phaseolus
vulgaris L.) вирусом некроза табака мы нашли значимые различия (при
Р ==>0,1%) наклона кривых разведения в зависимости от того, инокулирова-
ли ли растения сначала низкими разведениями вируса или высокими или
некоторым растениям вводили по очереди каждую из суспензий вируса.
Инокуляцию проводили в этих опытах в течение трех часов.
Оценка инфекционности, основанная на определении числа
инфицированных растений
До того как Холмс [814] предложил метод подсчета местных поражений,
единственным способом определения инфекционности, имевшимся в распоря-
жении исследователей, было заражение нескольких групп растений образ-
цами различного разведения и последующая регистрация растений с систем-
ным поражением. Этот способ занимает много времени и требует гораздо
большего числа растений для получения надежных данных. Однако в отдель-
ных случаях такой метод определения инфекционности используется и сей-
час, например в отношении вирусов, которые не имеют растений-хозяев
с хорошо выраженной местной некротической реакцией, или вирусов, пере-
носимых насекомыми.
Механическая инокуляция растений и подсчет числа растений
с системным поражением
В этом случае группы, состоящие из 12—25 растений, заражают серией
разведений инокулума и впоследствии регистрируют наличие или отсутствие
симптомов системного поражения. Степень разведения должна быть не
Количественное определение вирусов
23
слишком малой (иначе заражение
будет 100%-ным) и не слишком
большой (тогда заражение совсем
не произойдет). Табл. 1 иллюст-
рирует характер полученных дан-
ных. На основании этого экспери-
мента можно сделать вывод, что
так называемый верхний компо-
нент вирусного препарата при-
мерно в четыре раза более инфек-
циопен, чем компонент, осаждае-
мый на дно (при центрифугирова-
нии). При наличии таких данных
можно использовать пробит-анализ
для определения LD50 и дать ста-
тистическую оценку точности по-
лученных результатов.
Инкубация образцов тканей
Иногда можно оцепить ско-
рость, с которой вирус передви-
гается из одной части растения
в другую, путем отбора многих
небольших кусочков ткани, не
содержащих вируса вовсе или со-
держащих его в небольших коли-
чествах. Изолированные образцы
ткани затем инкубируют, чтобы
дать возможность присутствующе-
му в них вирусу размножиться
и накопиться таким образом в ко-
личестве, достаточном для опреде-
ления, после чего присутствие или
отсутствие в них вируса выявляют
либо по инфекциоипости, либо
каким-то другим методом. Подоб-
ного рода процедура была исполь-
зована Фреем: и Мэтьюзом [571]
для определения времени, прошед-
шего после инокуляции, в течение
которого клетки, распределенные
под эпидермисом листа табака,
инфицируются ВТМ. Они удаляли
эпидермис с ипокулированной
части листа и вырезали затем
диски из нижележащей ткани,
которые инкубировали в течение
определенного времени. По отно-
сительному числу инфицирован-
ных дисков можно судить о вре-
мени, в течение которого вирус
передвигается в расположенные
под эпидермисом клетки мезо-
филла.
£3
СЧ
СО
СО
1.0
см
00
2
nF
CM
с\Т
1) В таблице представлена относительная инфекционность верхнего и нижнего компонентов, выделенных из препарата вируса деформирующей мозаики
гороха [858]- Вторая цифра в каждом случае означает число инокулпрованных растений гороха. Первая цифра соответствует числу заразившихся растений.
24
Глава II
Насекомые-переносчики
При определении инфекционности вирусов, которые не передаются
механическим путем, но имеют насекомых-переносчиков, для оценки отно-
сительного количества вируса можно использовать процент удачных передач
инфекции, осуществленных с помощью насекомых. Насекомые могут полу-
чать вирус (перед подкормкой на здоровых растениях) через мембрану на
содержащих вирус растворах или в результате инъекции насекомым таких
растворов [268, 439, 1243, 1717, 1900). Результаты, полученные в экспери-
ментах, в которых насекомые кормились на инфицированной ткани, отра-
жают, вероятнее всего, различия в доступности вируса для насекомых,
а не в его концентрации в ткани или в органе. Все эти методы трудоемки
и осложняются биологической изменчивостью как у насекомых, так и у ра-
стения-хозяина. Например, на результаты может влиять продолжительность
времени, необходимого для кормления насекомого на испытуемом растении.
Кроме того, насекомые могут погибать в различное время в ходе эксперимен-
та на опытных растениях. Если для каждого такого растения используется
больше чем одно насекомое, для оценки полученных результатов требуется
более сложная статистика. Все эти трудности ограничивают широкое при-
менение описываемого метода, однако таким путем удалось получить цен-
ную информацию в отношении некоторых интересных вирусов (например,
вируса раневых опухолей).
АНАЛИТИЧЕСКОЕ УЛЬТРАЦЕНТРИФУГИРОВАНИЕ
Вирусы растений имеют такие размеры, которые делают очень удобным
их анализ с помощью аналитического ультрацентрифугирования. Этот метод
особенно полезен для контроля этапов очистки вируса, а также для изуче-
ния влияния различных обработок на физическое состояние вирусных
частиц и определения количества вируса в неочищенном экстракте ткани.
При использовании шлирен-оптики обычно можно обнаружить вирус в кон-
центрации около 100 мкг на 1 мл. Иногда удается работать с вирусом даже
при концентрации 50 мкг на 1 мл. Верхний предел концентрации отчасти
зависит от вируса, а также от скорости центрифугирования. При концен-
трации вируса, составляющей 3—4 мг/мл, возможно зашкаливание, так что
появляется черная линия, пересекающая пик. Оптимальными являются
условия, при которых концентрация каждого компонента находится в преде-
лах 0,5—2 мг/мл.
При измерении поглощения в ультрафиолете нижний предел концен-
трации должен составлять около 5 мкг/мл для вирусов с высоким содержа-
нием РНК и 20 мкг/мл для вирусов с низким содержанием РНК. Естественно,
что при изучении нуклеиновых кислот или нуклеопротеидов ультрафиолето-
вая оптика оказывается намного более чувствительной, чем шлирен-система
(фото 1) К
С помощью интерференционного микроскопа можно очень точно опре-
делить количество вируса, но этот метод мало применяется при изучении
вирусов растений, главным образом потому, что для получения хороших
результатов необходимы высокие концентрации вируса (5—10 мг/мл).
При работе с неочищенными экстрактами, содержащими большое коли-
чество низкомолекулярных веществ, поглощающих в ультрафиолете, лучше
использовать шлирен-систему, а не ультрафиолетовую оптику.
1 Все фотографии помещены в конце книги.— Прим- ред.
Количественное определение вирусов
25
Одно из значительных преимуществ применения аналитического ультра-
центрифугирования при работе с вирусами состоит в том, что с помощью
этого метода, помимо определения количества вирусных частиц, их можно
также идентифицировать на основании физического критерия — коэффи-
циента седиментации. Коэффициент седиментации — это скорость седимен-
тации в воде при 20 °C, отнесенная к единице центробежной силы. Его обо-
значают через «го, w и выражают в единицах Сведберга (S). Величины s2o w
для большинства вирусов растений колеблются в пределах 50—200 S. Марк-
хэм [1150] предложил быстрый и простой графический метод определения
коэффициента седиментации вещества на основании первичных седимента-
ционных данных. Точное определение s2o.w из экстрактов листьев затруд-
нительно, поскольку не известны ионная сила и другие факторы, от которых
зависят результаты. Однако эти трудности можно преодолеть, добавляя
в качестве маркера в экстракт, содержащий неизвестные компоненты, такой
вирус, как ВЖМТ, величина s20, w для которого известна. Таким образом,
путем сравнения с маркером можно приблизительно вычислить коэффициент
седиментации компонента, для которого он не был известен. В неочищенном
экстракте из листьев большинства здоровых растений присутствуют четыре
основные группы макромолекул и частиц — фракция I и фракция II белков,
а также 68S- и 838-рибосомы. Фракция I (белки хлоропластов) имеет s201
«s 19, фракция II представляет собой сложную смесь растворимых белков
с меньшей молекулярной массой.
На фото 76 представлены шлирен-диаграммы, полученные при анализе
экстракта листьев китайской капусты, инфицированных ВЖМТ. Отчетливо
виден пик вируса (коэффициент седиментации 114 S), так же как пик,
соответствующий пустым белковым оболочкам вируса, или верхнему ком-
поненту (52 S). Другие вирусы по их седиментационным свойствам нельзя
четко отличить от рибосом (например, вирус крапчатости конских бобов [1151]).
При определенных условиях рибосомы могут мешать обнаружению на седи-
мептограмме и такого вируса, как ВЖМТ. При слишком высокой концен-
трации 838-рибосом (например, в экстрактах очень молодых листьев) в пре-
парате могут присутствовать димеры рибосом (s2o,w^ 122 8), седименти-
рующие немногим быстрее, чем ВЖМТ. Аналогичным образом высокое
содержание в препарате полисом, если условия экстракции не обеспечивают
полной их диссоциации на 68S- и 838-мономеры (например, при быстрой
экстракции на холоду), может привести к образованию серии рибосомных
компонентов с коэффициентом седиментации в пределах 100—200 8.
Аналитическое центрифугирование можно считать ценным методом
определения чистоты вирусных препаратов, имея при этом в виду: 1) вирусо-
подобные частицы с различной скоростью седиментации; 2) наличие какого-то
иного вируса; 3) такие примеси, как макромолекулы клетки-хозяина;
4) степень агрегации вируса. Частицы палочкообразных вирусов могут агре-
гировать либо конец в конец, либо соединяясь своей боковой поверхностью.
Как указал Маркхэм [1151], линейная агрегация незначительно отражается
на скорости седиментации, так как эффект увеличения массы частицы нивели-
руется возрастанием коэффициента трения палочковидного агрегата.
Поскольку в растворе могут иметь место оба типа агрегации, очищенные пре-
параты таких вирусов, как ВТМ, представляются весьма негомогенпыми
при исследовании в аналитической центрифуге. Сферические вирусы также
могут образовывать агрегаты, хотя это наблюдается не так часто. Маркхэм
[1151] описывает пример такого рода, наблюдавшийся при обработке вируса
кустистой карликовости томатов на ранних стадиях очистки осветляющим
агентом тиодигликолем. Это привело к появлению димеров, тримеров и
тетрамеров вируса, в которых отдельные частицы были, по-видимому, свя-
заны между собой дисульфидными мостиками. Коэффициенты седиментации
26
Глава II
мономеров, димеров и тримеров, как было найдено, находились в соотноше-
нии 1,0 : 1,4 : 1,7. Маркхэм [1151] указывал, что, если агрегация происхо-
дит в препаратах, содержащих целые вирусные частицы и пустые белковые
оболочки, димеры, состоящие из такой оболочки и вирусной частицы, должны
иметь величину saо, w, близкую к коэффициенту седиментации интактного виру-
са, и не могут быть выявлены обычными приемами седиментационного анализа.
Ультрафиолетовую оптику можно с успехом применять для исследования
очищенных вирусных препаратов. В этом случае требуется меньшее коли-
чество материала и можно обнаружить минорные вирусные компоненты или
примеси, не выявляемые с помощью шлирен-оптики. Для того чтобы пере-
вести площадь пика, измеренную на шлирен-диаграмме, в концентрацию
вируса (в мг на 1 мл), необходимо определить коэффициент пересчета площади
в концентрацию, используя для этого хорошо очищенный препарат вируса
известной концентрации. Проблемы, связанные с калибровкой, при опреде-
лении абсолютной концентрации вируса с помощью ультрафиолетовой
оптики значительно более сложны.
ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЕ В ГРАДИЕНТЕ ПЛОТНОСТИ
Метод центрифугирования в градиенте плотности, разработанный Бран-
ке [259, 260, 262, 265], можно использовать как для выделения, так и для
получения количественных характеристик вирусов растений. Как оказалось,
этот метод таит в себе многие возможности и в настоящее время широко
используется в области вирусологии и молекулярной биологии. При проведе-
нии исследований методом центрифугирования в градиенте плотности центри-
фужную пробирку частично наполняют раствором, плотность которого умень-
шается в направлении от дна к мениску. Для создания градиента при фрак-
ционировании вирусов растений наиболее часто используют сахарозу.
Перед началом центрифугирования частицы вируса могут быть либо распре-
делены во всем объеме раствора, либо нанесены на вершину градиента.
Бракке [262] предложил три различных приема центрифугирования в гра-
диенте плотности. При изопикническом (равновесном) центрифугировании
процесс продолжается до тех пор, пока все частицы в градиенте не достигнут
уровня, где плотность среды равна их собственной плотности. Таким обра-
зом, фракционирование частиц происходит в этом случае в соответствии
с различиями в их плотности. Растворы сахарозы не обладают достаточной
плотностью для изопикнического разделения многих вирусов. При скорост-
ном зональном центрифугировании вирус сначала наносят на предвари-
тельно созданный градиент. Частицы каждого типа седиментируют при этом
через градиент в виде зоны, или полосы, со скоростью, зависящей от их
размера, формы и плотности. Центрифугирование при этом закапчивают,
когда частицы еще продолжают седиментировать. Равновесное зональное
центрифугирование сходно со скоростным зональным центрифугированием,
но в этом случае центрифугирование продолжается до достижения изопикни-
ческого состояния. Роль градиента плотности при скоростном центрифуги-
ровании заключается в том, чтобы препятствовать конвекции и фиксировать
различные виды молекул в определенных зонах. Теория центрифугирования
в градиенте плотности сложна и не совсем понятна [262]. На практике же это
простой и изящный метод, который широко применяется при работе с виру-
сами растений. Для этого необходимы лишь высокоскоростная препаратив-
ная ультрацентрифуга типа Spinco L50 и соответствующие бакет-роторы.
После центрифугирования зоны, содержащие вирус, можно визуали-
зировать благодаря большой светорассеивающей способности. Перед ана-
лизом материала содержимое пробирки собирают с помощью одного из воз-
Количественное определение вирусов
27
•Фиг. 2. Количественное определение вирусов в неочищенном экстракте при центрифу-
гировании в градиенте плотности сахарозы (Аткинсон и Мэтьюз, неопубликованные
данные).
Экстракт из 30 мг эпидермиса (Л) или из нижележащей ткани листьен табака (В), пнфициропаппых
ВТМ, центрифугировали в градиенте сахарозы (10—40%) при 35 000 об/мин в течение 2 ч. Вдоль
по длине раствора сахарозы измеряли поглощение в ультрафиолете при 254 им с помощью автомати-
ческого сканирующего устройства. В эпидермальной ткани не удастся обнаружить (iSS-риГюсэм
в количестве, доступном для определения.
можных методов. Мощно проколоть дно пробирки и дать содержимому
вытечь, собирая его в виде серии фракций. Эффективное фракционирование
содержимого пробирки с раствором сахарозы высокой плотности может
быть достигнуто путем использования прибора ISCO. При этом обеспечи-
вается измерение и регистрация оптической плотности (при 254 нм) в объеме
пробирки; кроме того, можно отбирать фракции требуемого объема. Фиг. 2
иллюстрирует чувствительность этого метода.
Бракке [260] показал, что в светорассеивающей золе можно обнаружить
вирус желтой карликовости картофеля в таком незначительном количестве,
как 1 мкг. Применительно к более мелким вирусам эта величина должна
быть больше. С помощью прибора ISCO удается выявить с достаточной точ-
ностью зону, содержащую около 2 мкг нуклеопротеида ВЖМТ. После того
как фракции градиента собраны, для идентификации вируса, неипфекциоп-
пых вирусоподобных компонентов и материала хозяина можно использо-
вать различные методы. К ним относятся методы определения инфекцион-
пости, исследование спектров поглощения в ультрафиолете и анализ с помо-
щью электронного микроскопа. В тех случаях, когда известны коэффициенты
седиментации некоторых компонентов смеси, метод скоростного зонального
центрифугирования позволяет оцепить приблизительные значения s2o.w Дру-
гих компонентов.
При наличии антисыворотки полученные фракции могут быть проанали-
зированы с помощью серологических методов или антисыворотка смешивается
с образцом перед нанесением на градиент. При этом компоненты, реагирую-
щие с антисывороткой, удаляются из фракционируемой смеси (фото 80).
Штромейер [1688] предложил специальную секционную ячейку для фракцио-
нирования вирусных частиц в градиенте плотности. С помощью этого устрой-
ства можно вначале провести фракционирование неочищенного экстракта,
а затем после перестройки секции осадить частицы повторным центрифуги-
рованием с разных положений градиента па пленки-подложки для электрон-
но-микроскопического исследования. Таким образом можно обнаружить
вирус в концентрации 10s частиц на 1 мл, в то время как при обычно приме-
няемом методе распыления капель, описанном ниже, требуется концен-
трация порядка 1.011 частиц па 1 мл. Ширина зоны, образованной одиночным
компонентом, зависит от количества материала. Если два компонента, при-
сутствующие в разных количествах, образуют зоны, располагающиеся
непосредственно одна под другой, вещество, содержащееся в большем коли-
честве, может перекрывать минорный компонент. До недавнего времени ана-
лиз в градиенте плотности сахарозы, рассматривали как вполне надежный
метод при работе с вирусами растений. Однако Блэк [212] обнаружил, что
28
Глава II
квазиравновесное центрифугирование вируса раневых опухолей в градиенте
сахарозы приводит к потере одной трети количества вирусных частиц, опре-
деленного серологически, и связано со значительным снижением инфекцион-
ности оставшегося вируса. Эти потери не, обнаруживаются в условиях скоро-
стного зонального центрифугирования. Центрифугирование в течение 4 ч при
22 500 об/мин приводит к серьезным потерям, тогда как за 25 мин этого
не происходит. На основании этого можно предположить, что выталкиваю-
щаяся сила, отнесенная к единице массы, действующая на вирусную РЫК
и вирусный белок, может отличаться даже в 4 раза, что приводит либо к пря-
мому разрушению вирусной РНК, либо к разрыву белковой оболочки, вслед-
ствие чего РНК может остаться незащищенной.
С применением соответствующей ячейки можно выполнить эксперименты
в градиенте плотности в аналитической центрифуге, использовав таким
образом преимущества в чувствительности ультрафиолетовой оптики [1845].
При этом образец небольшого объема (15 мкл) вводится в колонку жидкости
с высокой плотностью. Во время седиментации образуется градиент, который
стабилизирует зоны седиментирующих частиц. При такой процедуре удается
обнаружить примерно до 0,2 мкг вируса или другого нуклеопротеида. Однако
при этом нельзя препаративно выделить фракции градиента, как это де-
лается при применении бакет-ротора.
СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
Особенности серологических реакций, применяемых при изучении виру-
сов растений, обсуждаются в гл. XV. Здесь же мы рассмотрим методы,
с помощью которых взаимодействие между вирусным антигеном и специфи-
ческим антителом можно использовать для количественного анализа вирусов.
Серологические тесты являются быстрыми и удобными методами для
обнаружения вирусов растений. Основные преимущества этих методов
состоят в следующем: 1) специфичность реакции позволяет обнаружить
вирус в присутствии материала клетки-хозяина и других примесей; 2) работа
требует наличия очень небольших количеств вируса; 3) результаты могут
быть получены в течение нескольких минут или часов, тогда как для опре-
деления инфекционности требуется несколько дней; 4) полученные данные
отражают содержание вируса в широком диапазоне концентраций; 5) подоб-
ного рода тесты особенно полезны при работе с вирусами, которые не имеют
растений-хозяев, реагирующих на заражение образованием четко выражен-
ных местных поражений, или не передаются соком растения (например,
вирус полосатой мозаики пшеницы [1606]); 6) антисыворотка может дли-
тельно храниться, что дает возможность проводить сравнительные исследо-
вания в течение весьма продолжительного периода.
Серологические методы имеют следующие основные недостатки: 1) поль-
зуясь ими, можно определить количество вирусного белкового антигена,
но не количество обладающего инфекционностью вируса: в некоторых слу-
чаях этот факт, конечно, имеет преимущество; 2) постановкой теста на инфек-
ционность обычно удается обнаружить и измерить приблизительно от 1/10
до Vido количества вируса, требуемого для проведения реакции преципитации
в пробирке. Однако при некоторых модификациях этот метод требует меньше
материала, чем при измерении инфекционности; 3) линейная агрегация
палочкообразных вирусов может заметно влиять на результаты некоторых
методов количественного определения, описанных ниже; 4) до сих пор
(и это самое главное) эти методы можно использовать лишь в отношении
ограниченного числа вирусов растений, хотя число это очень быстро уве-
личивается [1829].
Количественное определение вирусов
29
В вирусологии лучше всего использовать антисыворотки, которые можно
получить в большом количестве путем иммунизации кроликов. При этом
весьма желательно получать сыворотку с высоким титром. Это позволяет
использовать в работе сильно разбавленную сыворотку, исключая, таким
образом, неспецифические ингибиторные эффекты, наблюдаемые при низких
разбавлениях, и создает возможность постановки большего числа тестов
с одним и тем же количеством сыворотки. При наличии большого запаса
исходной сыворотки, приготовленной для использования в серийных иссле-
дованиях, имеет смысл получить диаграмму преципитации (подобную изоб-
раженной па фиг. 70). Такие диаграммы позволяют быстро определить соот-
ветствующие разбавления и количество реагентов, необходимое для раз-
личных целей.
Методы предельного разбавления при постановке тестов
на преципитацию
Преципитация в пробирках
В этом случае готовится серия двукратных разведений образцов вируса
в 0,14 М NaCl. Равные объемы разбавленной антисыворотки добавляют
в каждую пробирку, содержимое встряхивают и инкубируют при 30—37°С.
Затем отмечают предельное разбавление каждой пробы, при котором обра-
зуется видимый преципитат. Применительно к мелким сферическим вирусам
растений этот метод дает хорошо воспроизводимые результаты. Однако при
работе с палочкообразными вирусами чем более агрегирован препарат, тем
меньше вируса требуется для образования видимого преципитата.
Преципитация при диффузии в геле
Этот микрометод очень полезен при исследовании небольших сфериче-
ских вирусов растений. При этом в агаре на предметном стекле вырезают
ряд лунок, а также канавку для антисыворотки. Готовят ряд двукратных
разведений антигена и помещают небольшие пробы антигена (около 7 мкл)
в лунки. С помощью этого метода можно определить около 0,02 мкг ВЖМТ
путем визуальной оценки полос преципитации. При использовании меченного
35S ВЖМТ и последующей радио автографии мы смогли определить этот вирус
даже в количестве 0,002 мкг.
Иммуноосмофорез
Рагетли и Вайнтрауб [1377] разработали быстрый тест для определения
вирусов, имеющих достаточно высокий отрицательный заряд при pH 7,0.
При этом в агаре, содержащем буфер со значением pH, близким к нейтраль-
ному, вырезают группы из двух лунок. Антисыворотку помещают в одну
из лунок каждой пары, а раствор вируса — в другую, после чего создается
градиент напряжения. Антитела двигаются в этой системе с эндосмотическим
потоком, тогда как вирус перемещается благодаря своему отрицательному
заряду. В результате эти два реагента приходят в соприкосновение друг
с другом при условиях, обеспечивающих появление полосы преципитации
значительно быстрее, чем при простой гель-диффузии. Для образования
полос требуется приблизительно 60—90 мин. Джон [879] предложил гораздо
более быстро выполнимую и обладающую большей чувствительностью моди-
фикацию этой процедуры, при которой можно было обнаружить около
0,03 мкг ВТМ в течение 5 мин.
30
Глава II
Определение а-оптимума
Положение а-оптимума довольно строго пропорционально разведению
реагентов (фиг. 70). На этом основывается его использование в качестве
количественного теста. При применении этого метода готовят серию двукрат-
ных разведений вируса. Затем в каждую пробирку добавляют антисыворотку
определенного разбавления и содержимое перемешивают как можно быстрее.
Первая пробирка, в которой образуется видимый преципитат, фиксируется
как а-оптимум. Если антисыворотка была оттитрована с вирусом, абсолют-
ная концентрация которого известна, то результаты определения а-оптимума
можно перевести в приблизительную концентрацию вируса на 1 мл. Поло-
жение а-оптимума в том случае, когда объектами исследования служат
палочкообразные вирусы, вероятно, в значительной мере зависит от степени
агрегации вирусного препарата. Следует отметить, что копреципитация
компонентов хозяина, по-видимому, сильнее влияет на положение а-опти-
мума, чем на определение точки предельного разведения при преципитации
вируса. Положение а-оптимума нельзя использовать для оценки концентра-
ции штаммов вируса, пользуясь антисывороткой к одному из них, если
только они не близкородственны серологически.
Время, требуемое для преципитации
Для оценки концентрации сферических вирусов [1179.1 можно использо-
вать минимальное время, необходимое при нормальных условиях для обра-
зования видимого преципитата. Уиткомб и Блэк [1899] и Уиткомб [1900],
работая с вирусом раневых опухолей, применили этот способ для получения
количественных данных с помощью метода кольцевой преципитации, для
чего потребовалось гораздо меньше материала.
Количество специфического преципитата
Количество вируса в специфических преципитатах можно измерить
несколькими способами: путем определения общего азота, выделения и опре-
деления нуклеотидов из вирусной рибонуклеиновой кислоты и, наконец,
измерения радиоактивности. С помощью этих методов можно точно оценить
концентрацию вируса, на которую при исследовании палочкообразных
вирусов степень их агрегации не влияет вовсе или влияет весьма незна-
чительно.
Можно объединить серологический и хроматографический методы
(с характерной для них спецификой) и создать таким образом удобный микро-
метод для определения содержания вируса в растительных экстрактах
[1176, 1179]. При этом вирус осаждается количественно из осветленного
растительного экстракта путем добавления избытка антисыворотки. Нуклеи-
новую кислоту в преципитате гидролизуют щелочью, нуклеотиды выделяют
методом хроматографии, а концентрацию их определяют спектрофотометри-
ческим методом.
Рассеяние света
При взаимодействии антител с вирусом (образование комплекса анти-
ген — антитело) в растворе появляются агрегаты, большие по своему объему,
чем отдельные вирусные частицы, и рассеяние света этим раствором воз-
растает. Это свойство можно использовать для того, чтобы проследить ход
взаимодействия вируса с антителом, т. е. исследовать кинетику этой реак-
ции, а также для измерения количества вирусного антигена. Применение
Количественное определение вирусов
31
этого метода требует наличия довольно больших объемов исследуемого
раствора (5 мл и более). Однако этим методом можно пользоваться вплоть
до таких низких концентраций вируса, как мкг на 1 мл.
Добавление частиц или клеток для повышения чувствительности
серологической реакции
Чувствительность реакции преципитации определяется минимальным
количеством антигена, способного образовать видимый преципитат. Чем
меньше молекула антигена, тем большее его количество требуется для прояв-
ления реакции. Было разработано несколько различных методов, в которых
вирус перед реакцией с антисывороткой адсорбируется на значительно
больших по размеру частицах или эритроцитах. Чувствительность подоб-
ного рода методов выше, чем обычной реакции преципитации, однако пи один
из них не получил до сих пор широкого распространения. Например, Сайто
и Ивата [1472] использовали метод адсорбции очищенного вируса штрихова-
той мозаики ячменя на эритроцитах овцы, обработанных танинном.
С помощью этого метода можно было тестировать даже такое незначительное
количество вируса, как 0,01 мкг.
Бойцикевич и др. [236] адсорбировали вирусоспецифичные антитела
на бентоните, а затем окрашивали препарат метиленовым сипим, чтобы
улучшить возможность визуального определения преципитата. При этом
можно было выявить 0,015 мкг ВТМ, 0,03 мкг вируса южной мозаики фасоли
и 0,05 мкг вируса кольцевой пятнистости табака (каждый в объеме 0,1 мл).
Беркс [169] провел сравнительные исследования латекса, бентонита и суль-
фата бария и обнаружил, что сульфат бария дает неспецифическую реак-
цию, тогда как латекс было легче использовать и он требовал меньше анти-
сыворотки, чем бентонит.
ПОДСЧЕТ ЧИСЛА ВИРУСНЫХ ЧАСТИЦ С ПОМОЩЬЮ
ЭЛЕКТРОННОГО МИКРОСКОПА
Не очень точную, по быструю информацию об относительном содержа-
нии вирусных частиц в препаратах можно получить путем применения
метода контрастирования вирусных частиц фосфовольфрамовой кислотой
и последующего анализа препаратов в электронном микроскопе. Чтобы
точно определить число вирусных частиц с помощью электронного микро-
скопа, необходимо знать объем исследуемого раствора и суметь сосчитать
все частицы, находящиеся в этом объеме. Бекас и Вильямс [58] описали
метод, согласно которому образцы вирусов разбавляются растворами, содер-
жащими летучие соли (ацетат или карбонат аммония). Затем вирусный пре-
парат смешивают с раствором, содержащим частицы полистиролыгого латекса
какой-то определенной концентрации, а также известной и однородной
формы. Смесь распыляют с помощью пульверизатора на пленку-подложку,
которая должна находиться на таком расстоянии от пульверизатора, чтобы
микрокапли попадали именно на нее. Капли должны быть достаточно мел-
кими, чтобы их можно было легко различить в электронном микроскопе
при увеличении, необходимом для идентификации вирусных частиц
(около х 10 000). Можно использовата капли диаметром 5—10 мкм, но капли
диаметром в пределах 1—3 мкм предпочтительнее. На фото 2 представлена
электронная микрофотография капли, используемой для такого анализа.
Летучие соли не образуют осадка, затрудняющего обнаружение вирус-
ных частиц. Растворы ацетата аммония при высушивании имеют pH около 4,
тогда как pH раствора карбоната аммония равен при этом 10. Возможное
32
Глава II
воздействие такого изменения pH на вирусные частицы следует принимать
во внимание. К исследуемой смеси перед распылением можно добавить сыво-
роточный альбумин в низкой концентрации, чтобы сделать четким контур
высохшей капли. Затем образец оттеняется металлом. Никсон и Фишер [1278]
описали усовершенствованный метод получения микрокапель, достаточно
однородных по размеру, с помощью специального прибора.
Число частиц полистирольного латекса, присутствующих в капле,
можно подсчитать на микрофотографиях и таким образом определить объем
капли. Одновременно в капле подсчитывается число характерных вирусных
частиц. Соотношение числа вирусных частиц и числа частиц латекса варьи-
рует в разных каплях. Поэтому для получения надежной оценки числа частиц
следует исследовать несколько капель и результаты подвергнуть статисти-
ческой обработке [1110, 1914].
При таком подсчете имеется два источника ошибок: 1) неизбежные
колебания, обусловленные броуновским движением вирусных частиц и частиц
латекса в растворе; 2) различные привходящие обстоятельства, обусловлен-
ные отклонениями от точной схемы опыта, такими, как недостаточное смеши-
вание или загрязнение во время распыления.
Процесс подсчета вирусных частиц — это довольно трудоемкий процесс,
а при попытках определения числа частиц мелких изометрических вирусов
в растворах, содержащих значительное количество нелетучих веществ,
возникают, кроме того, дополнительные трудности, поскольку эти вещества
обычно скапливаются по краям капли, не позволяя таким образом рассмот-
реть вирусные частицы. Однако этот метод представляется ценным, особенно
при исследовании палочкообразных вирусов, когда необходимо выяснита
распределение частиц по длине (см., например, [725]).
Пинтерик и Тейлор [1333] описали методический прием, названный
ими методом уменьшающейся капли. При этом макрокапли вирусной суспен-
зии подсушивают таким образом, чтобы вирусные частицы на пленке-под-
ложке распределились равномерно. Хорошее распределение частиц было
получено лишь при добавлении к суспензии какого-либо белка, например
сывороточного альбумина. Как и в случае метода распыления капель, для
оценки объема раствора были использованы частицы латекса.
ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ, ПРИМЕНЯЕМЫЕ ПРИ РАБОТЕ
С ОЧИЩЕННЫМИ ВИРУСАМИ
Методы, применяемые для химического анализа, можно использовать
также для количественного определения вирусов, полученных в достаточно
очищенном состоянии. Самым простым методом, которым часто пренебре-
гают, является определение содержания сухого вещества в данном объеме
раствора. Правда, в этом случае нельзя разграничить, например, вирус
и неинфекционные частицы, содержащие меньшее количество нуклеиновой
кислоты, чем нативный вирус. Этот метод лежит в основе определения азота
и фосфора вируса, а также других его компонентов, например рибозы или
тех или иных аминокислот. Определение содержания одного из этих ком-
понентов можно затем использовать для количественного определения вируса
в очищенных растворах. Растворы же, содержащие известное количество
очищенного вируса, можно использовать для определения величины опти-
ческой плотности при 260 нм на единицу массы вируса в 1 мл. Аналогичный
прием можно применить для отыскания коэффициентов пересчета, которые
позволяли бы определять концентрацию вируса по величине коэффициента
преломления раствора, а также по площади пиков на шлирен-диаграмме
или абсорбционных пиков, полученных при анализе фракций после центра
Количественное определение вирусов
33
фугирования в градиенте плотности сахарозы. Эти величины можно затем
использовать для количественного определения вируса в других препаратах.
Определение оптической плотности при 260 нм может быть ненадежно при
работе с палочкообразными вирусами, степень агрегации которых в разных
препаратах сильно варьирует. Последнее обстоятельство приводит к изме-
нению интенсивности светорассеяния при дайной концентрации вируса, что
влияет па результаты измерения.
ПРИМЕНЕНИЕ РАДИОАКТИВНЫХ ИЗОТОПОВ
ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИРУСОВ
Эксперименты in vivo
Если в ткань, где размножается вирус, ввести радиоактивный изотоп заР
в виде ортофосфата, то вирусная РНК оказывается меченой. Для этого либо
целое растение выращивают на питательной среде, содержащей меченый
ортофосфат (в результате чего он попадает в растение через корни), либо
ткань погружают в раствор изотопа. Аналогичным образом для метки вирус-
ного белка можно использовать з58-сульфат. Эти два изотопа довольно
дешевы, и их высокая удельная активность в ткани достигается легко. При
определенных условиях их можно использовать для определения очень
небольших количеств вируса. Описанный ниже эксперимент с ВЖМТ
в листьях китайской капусты иллюстрирует этот метод.
В два растения, которые предварительно (за 48 ч до начала экспери-
мента) были заражены ВЖМТ, вводили через корни 5 мКи з2Р-ортофосфата.
Ииокулированиые листья собирали через 6 ч после введения изотопа. Шесть
молодых листьев китайской капусты бтлли заражены путем введения им
0,3 мл экстрагированного сока. Впоследствии па этих листьях было обнару-
жено в среднем по 30 некрозов на один лист. Для выделения содержащегося
в листьях меченого вируса брали 3 мл сока. К соку добавляли 10 мг неме-
ченого вируса в качестве носителя и выделяли из смеси вирус четырьмя цикла-
ми дифференциального центрифугирования с последующим фракционирова-
нием в градиенте хлористого цезия. Двадцать процентов вируса удалось
таким образом вновь выделить. Активность вирусного препарата составляла
.20 000 имп/мин. РНК вируса гидролизовали щелочью и половину гидролизата
подвергали хроматографии на бумаге в растворителе, который обеспечивал
разделение четырех рибонуклеотидов. Отношение радиоактивностей этих
четырех фракций было характерно для нуклеотидного состава РНК ВЖМТ.
Общая радиоактивность составляла 9000 имп/мин. Мы легко могли измерить
•сотую часть этого количества. Таким образом, эта процедура оказалась для
ВЖМТ приблизительно в 10—100 раз более чувствительной, чем анализ
инфекционности при определении вновь образованного вируса па ранних
стадиях инфекции. Недостаток этого метода, по крайней мере при кратко-
временном включении изотопа, состоит в том, что измеренную радиоактив-
ность невозможно перевести в абсолютные количества вируса, поскольку
удельная активность вирусной РНК в растении неизвестна.
Эксперименты in vitro
В работе с такими вирусами, как ВТМ и ВЖМТ, которые довольно легко
могут быть освобождены от большей части примесей, использование радио-
активного вируса позволяет повысить точность и чувствительность метода
его количественного определения в некоторых опытах in vitro. Чтобы подуг-
лить паилучший выход меченого вируса, в растение вводят изотоп в течение
3-0893
34
Глава II
нескольких дней в период максимального накопления вируса. Для>
интактных растений наибольшее количество изотопа, применяемое для
метки, составляет 10 мКи з2Р-ортофосфата или зб3-сульфата на растение.
Используя эти количества, мы получили очищенный вирус с удельной актив-
ностью 1000 имп (мин-мкг) при эффективности счета примерно 5%. Исполь-
зуя 50—100 мКи иСОг и вводя изотоп в течение 12—14 дней, Сигияма
и Френкель-Конрат [1699] получили препарат ВТМ с активностью,
2—10-103 имп(мии-мкг).
СМЕШАННЫЕ МЕТОДЫ
Метод, который применялся в вирусологии еще до того, как был выделен;
первый вирус, основывается на явлении анизотропии в потоке. Растворы
палочкообразных вирусов достаточно высокой концентрации становятся
анизотропными при перемешивании жидкости. Перемешивание вызывает
ориентацию частиц в направлении тока жидкости. Явление анизотропии
в потоке наблюдается при встряхивании или при вращении жидкости;
в небольшом сосуде, расположенном между скрещенными поляроидными
пластинками. Это грубый, но быстро дающий результаты метод для выявле-
ния в неразрушенном состоянии таких вирусов, как ВТМ или JV-вирус
картофеля, в растворах, содержащих более чем 100 мкг вируса на 1 мл..
Было описано несколько экспресс-методов количественного определения
вирусов. Эти методы обычно разрабатывают и применяют в работе с виру-
сами, которые накапливаются в высокой концентрации. К сожалению,
к этой категории относятся вирусы, для количественного определения кото-
рых уже существуют другие вполне удовлетворительные методы. Например,
применительно к ВТМ был описан метод экстракции дисков зараженной
ткани с помощью смеси воды с хлороформом [1741]. Вирус осаждали суль-
фатом аммония при 25 %-ном насыщении, осадок растворяли и измеряли
поглощение при 260 нм. Таким образом удалось определить содержание ВТМ;
в одном диске диаметром 9 мм.
ОТНОСИТЕЛЬНАЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ РАЗЛИЧНЫХ
МЕТОДОВ
В табл. 2 суммированы сведения относительно минимальных концентра-
ций и количеств вируса, определяемых с помощью различных методов. Эти
оценки очень приблизительны, поскольку они значительно варьируют у раз-
ных вирусов и зависят от условий проведения анализа. Тем не менее эти
данные позволяют подчеркнуть широкие различия в чувствительности
разных методов.
В зависимости от конкретной цели исследования чувствительность-
и точность отдельных методов следует оценивать критически в отношении
каждого изучаемого вируса и растительного материала. Например, при
сравнении относительной чувствительности методов электронной микроско-
пии, микропреципитации и инфекционности с целью количественного опре-
деления трех палочкообразных вирусов картофеля Сэмспон и Тейлор [1480]
показали, что выбор наиболее чувствительного метода зависит от вируса,
а также от той части растения, которая была взята для исследования.
Вообще метод подсчета числа местных поражений является гораздо-
более чувствительным, чем физические и химические методы. Некоторые
серологические методы приближаются по своей чувствительности к методам;
определения инфекционности. Применение изотопов для метки растений,.
Количественное определение вирусов
35
Таблица 2
Приблизительные минимальные количества вируса, которые можно выявить
и измерить с помощью различных методов!)
Количество вируса
выявляемое измеряемое
концен- трация, мкг на 1 мл количе- ство, мкг концен- трация, мкг на 1 мл количе- ство, мкг
1. Определенно путем подсчета числа 0,001 0,0001 0,01 0,01
местных поражении 2. Аналитическое центрифугирование а) шлиреп-оптика 50 20 100 40 б) ультрафиолетовая оптика 1,0 0,4 10 4,0 3. Центрифугирование в градиенте плотности а) видимые зоны — 1,0 — — б) спектрофотометрические измеро- 5 1,0 10 2 ния в градиенте сахарозы в) равновесный градиент в CsCl 1,0 0,3 1,0 0,3 4. Некоторые серологические методы а) предельное разбавление при пре- 1,0 0,5 1.0 0,5 ципитации в пробирках б) диффузия или электрофорез 1,0 0,02 1.0 0,02 в агаровом голо (визуальная оцен- ка) в) диффузия пли электрофорез в ага- 0,2 0,002 0,2 0,002 ровом геле (радиоавтография) г) флоккуляцнониая проба с бенто- 0,1 0,01 0,1 0,01 нитом I) Обратите внимание иа то, что некоторые из этих величин отличаются друг от друга в 10 и более раз, что зависит от вируса, а также от той тщательности, с которой проводится исследование.
в которых размножается вирус, может оказаться значительно более чув-
ствительным методом, чем определение инфекционности, позволяя выявить
очень небольшие количества вируса на ранних стадиях после заражения.
При проведении многих экспериментов наибольший интерес вызывают
результаты, полученные путем применения различных методов, основанных
па разных свойствах вируса. В таких случаях следует иметь в виду труд-
ности интерпретации результатов, связанные с различной чувствительностью
применявшихся методов. Некоторые примеры такого рода обсуждаются
в гл. VII.
3*
ГЛАВА III
ВЫДЕЛЕНИЕ ВИРУСОВ
Начиная с классических исследований Стэнли, Боудэна, Нири и других
в 1930-х годах, много усилий было направлено на разработку методов выде-
ления и очистки вирусов растений. Чтобы изучить основные свойства вируса,
необходимо уметь получать препараты, более или менее свободные от ком-
понентов клетки-хозяина, но сохраняющие, однако, при этом инфекцион-
ность. Не удивительно поэтому, что первыми выделенными и эффективно
изученными вирусами были те, которые достаточно стабильны и содержатся
в растении-хозяине в относительно высокой концентрации (ВТМ, А-вирус
картофеля и вирус кустистой карликовости томатов). В настоящее время
круг такого рода вопросов расширился и возник интерес к ряду вирусов,
сильно различающихся по своей концентрации в растении-хозяине, а также
по устойчивости к различным физическим и химическим воздействиям.
В этом случае нет общепринятых правил: методы, эффективные в отношении
одного вируса, могут быть совершенно неприменимы к другому, по всей
вероятности, сходному вирусу. Даже разные штаммы одного и того же
вируса могут требовать для успешного выделения применения различных
методов.
Много было написано о чистоте и гомогенности препаратов в приложе-
нии к вирусам растений. В химическом смысле нет такого понятия, как
очищенный препарат вируса растений. Даже в том случае, если допустить,
что препарат не содержит абсолютно никаких примесей низко- и высокомоле-
кулярных компонентов клетки-хозяина (что весьма маловероятно), имеются
другие обстоятельства, которые следует принять во внимание.
1. Можно почти с полной уверенностью утверждать, что большинство
вирусных препаратов представляет собой смесь инфекционных и неинфек-
ционных частиц вируса. Частицы последнего типа, вероятно, имеют один
или более разрывов в цепи РНК. Эти разрывы у разных частиц могут прои-
зойти в разных участках РНК.
2. Большинство вирусных препаратов почти всегда представляет собой
смесь мутантов, даже если родительский штамм в основном преобладает
в препарате. Травянистые растения, обычно используемые при работе
с вирусами, содержат в целом около 109—1010 клеток мезофилла. Если
инфицировано все растение, то в нем имеется около 104—10° вирусных частиц
на клетку (т. е. 1013—1016 вирусных частиц на растение). Благодаря этому
создаются широкие возможности для возникновения мутантов, которые
появляются даже в том случае, когда растение первоначально было зара-
жено одной-единственной вирусной частицей. РНК таких мутантов будут
различаться по крайней мере по одному нуклеотиду. Если такая мутация
происходит в цистроне, кодирующем белок оболочки, то этот белок в таком
случае также будет отличаться от белка родительского штамма.
3. Очищенные препараты некоторых вирусов могут содержать неполные
частицы, которые не обладают инфекционностыо.
4. В настоящее время известно несколько вирусов, существующих в виде
многокомпонентных систем, в которых две или более разные частицы взаимо-
действуют при репликации вируса.
Выделение вирусов
37
5. У некоторых крупных вирусов инфекционные частицы могут быть
самых разных размеров. При этом трудно ожидать, чтобы инфекционные
частицы крупных вирусов, окруженных мембраной, имели бы абсолютно
идентичную структуру.
6. Для таких вирусов, как ВЖМТ, которые содержат в качестве струк-
турного компонента низкомолекулярный полиамип, кажется маловероят-
ным, чтобы одно и то же число молекул полиамииа присутствовало в одних
и тех же участках вирусной частицы.
7. Харрис и Найт [712] показали, что удаление концевого остатка трео-
нина с помощью карбоксипептидазы не снижает; инфекционности препара-
тов ВТМ. Такие модификации вирусных частиц могут иметь место в растении
или возникать в процессе выделения вируса. Например, экстракт фасоли
(Phaseolus vulgaris) содержит фермент, подобный карбоксипептидазе, который
отщепляет концевой треонин белка ВТМ [1412].
Таким образом, для вирусов растений понятия чистоты и гомогенности
являются чисто рабочими терминами, целиком определяемыми самим вирусом
и методами, применяемыми для его выделения. Препарат вируса можно
считать практически чистым (для определенной цели), если имеющиеся
в нем примеси посторонних компонентов или мутантных частиц не влияют
на изучаемые свойства или если мы можем учесть это влияние. В настоящее
время для целого ряда вирусов растений разработаны эффективные методы
препаративного выделения. Прежде чем описать эти методы в деталях, мы
рассмотрим в общих чертах проблемы, возникающие в процессе выделения
вируса.
ВЫБОР РАСТИТЕЛЬНОГО МАТЕРИАЛА
Испытание на иифекциоипость
В процессе разработки процедуры выделения очень важно иметь воз-
можность произвести определение инфекционности во фракциях. Конечно,
лучше всего для этой цели использовать растения, реагирующие на зараже-
ние вирусом образованием местных поражений. В ходе предварительных
анализов большая точность обычно необязательна, однако надежность
и быстрое развитие некрозов дают большие преимущества в работе. В отсут-
ствие растений-хозяев с подобного типа реакцией для количественного опре-
деления вирусов можно использовать растения, реагирующие на заражение
возникновением симптомов системного поражения. В тех случаях, когда
метод механической инокуляции не может быть использован, растения зара-
жают с помощью насекомых-переносчиков.
Исходный материал
Выбор растения-хозяина для размножения вируса может иметь решаю-
щее значение и для его успешного выделения. По-видимому, одной из наи-
более важных особенностей, присущих такому растению, должно быть
отсутствие в его клетках некоторых веществ в концентрациях, достаточных
для того, чтобы вызвать ингибирование или необратимое осаждение вируса
(гл. XIV). К числу этих веществ относятся фенольные соединения, органи-
ческие кислоты, слизи и камеди, некоторые белки и ферменты, особенно
рибонуклеазы. Например, многие вирусы косточковых плодовых очень
трудно или даже невозможно выделить из природных хозяев, так как
в листьях большинства представителей сем. Rosaceae содержатся таинины,
и притом в высокой концентрации. Выделение нескольких таких вирусов
38
Глава, III
стало возможным после обнаружения других хозяев, не относящихся к сем.
Rosaceae, например огурца (Cucumis sativus L.) [1230]. В настоящее время
существует сравнительно небольшая группа растений-хозяев, которые
пригодны для выделения целого ряда вирусов. К этой группе, помимо
огурца и родственных ему растений, как, например, тыквы, относятся Vigna
sinenisis (Endl.) [585], Chenopodium amaranticolor (Goste et Reyn) и Petunia
hybrida (Vilm). Однако даже эти хозяева могут содержать сильные ингиби-
торы, действующие на некоторые вирусы.
Так, Франки [546] показал, что экстракты листьев огурца при смешивании
с очищенным вирусом огуречной мозаики снижают инфекционность этого
вируса в 100 раз. В присутствии ингибирующих веществ происходит
осаждение вируса.
Соответствующее растение, условия, в которых оно выращивается,
а также время, когда растение можно использовать для выделения вируса,
следует выбирать так, чтобы исходная концентрация инфекционных вирус-
ных частиц была как можно выше. Для многих вирусов их концентрация
достигает максимума через несколько дней или недель и затем довольно
быстро падает (фиг. 31). Иногда распределение вируса в растении столь
неравномерно, что имеет смысл использовать для выделения лишь те его
части, которые содержат вирус в высокой концентрации. Нередко содержа-
ние вируса оказывается более низким в средней жилке, чем в листовой пла-
стинке. Если средняя жилка и черешок велики по размеру, то их полезно
удалить. В отдельных случаях отделение определенной ткани является
почти обязательным приемом. Например, в случае выделения вируса раневых
опухолей это необходимо, так как вирус накапливается только в опухолевой
ткани.
Другая причина, заставляющая использовать для выделения вируса
лишь определенные части инфицированного растения, состоит в том, чтобы
избежать накопления высоких концентраций ингибиторов, а также веществ,
которые могли бы адсорбироваться на вирусе; такие вещества крайне трудно
удалять. В молодых растениях содержание таких веществ часто бывает
низким, и поэтому вирусы в некоторых случаях можно выделять только
из такой ткани.
Следует всегда иметь в виду возможность того, что растение-хозяин,
используемое для накопления вируса, еще раньше было заражено другим
вирусом или может быть инфицировано в процессе культивирования. Нередко
загрязнение материала нежелательным вирусом происходит в процессе
выращивания растений в теплице. Так, штаммы вируса табачной мозаики,
Х-вируса картофеля и вируса некроза табака могут преобладать в теплицах,
которые в течение некоторого времени использовались для работы с этими
вирусами. В этом случае для выделения примеси не всегда достаточно исполь-
зовать растения, реагирующие на заражение балластным вирусом лишь
образованием местных поражений (например, N. glutinosa — для удаления
примеси ВТМ). Даже при незначительном количестве такого стабильного
вируса его концентрация при выделении основного вируса может сильно
возрастать.
Замораживание растительной ткани перед экстракцией вируса облег-
чает последующее удаление компонентов клетки-хозяина, и этот прием
полезно применять при выделении таких стабильных вирусов, как ВТМ.
Однако для многих других вирусов замораживание оказывается вредным.
Инфицированные насекомые-переносчики (тли) недавно были использованы
как исходный материал для выделения небольших количеств вируса скручи-
вания листьев картофеля [1324].
Выделение вирусов
39
СРЕДА ДЛЯ ЭКСТРАКЦИИ
Такая среда, как, например, сыворотка, является естественной средой
для большинства вирусов животных. Аналогичная среда отсутствует в случае
вирусов растений. После разрушения растительных клеток и освобождения,
а также смешивания их содержимого вирусные частицы попадают в необыч-
ную для них среду. Поэтому для выделения вирусов обычно используется
искусственная среда, предназначенная для сохранения вирусных частиц
в инфекционном, интактном и пеагрегированиом состоянии иа различных
стадиях очистки. Условия, благоприятствующие сохранению стабильности
очищенного вирусного препарата, вероятно, отличаютсяйот условий, которые
необходимы для получения неочищенного экстракта или частично очищенных
вирусных препаратов [263, 264]. Кроме того, различные факторы могут
сильно воздействовать друг на друга, оказывая таким образом влияние
на стабильность вируса. Ниже мы рассмотрим основные факторы, которые
необходимо принимать во внимание при выборе подходящей среды для
выделения вируса.
pH и буферная система
Многие вирусы стабильны в довольно узком диапазоне значений pH,
и при выделении вируса pH экстракта не должен выходить за эти пределы.
Важное значение может иметь выбор подходящего буфера, а также соот-
ветствующая ионная сила. Часто применяют фосфатные буферы, но на неко-
торые вирусы они оказывают вредное влияние. Например, при использова-
нии фосфатного буфера не удается получить инфекционный препарат вируса
мозаики салата-латука, тогда как при использовании боратного буфера
могут быть выделены высокоинфекционные препараты [780]. Применявшийся
в этой работе боратный буфер имел незначительную емкость.
Ионы металлов и ионная сила
Для сохранения инфекционности некоторых вирусов необходимо при-
сутствие в среде дивалентных ионов (Са2+ или Mg2+). Важным фактором
является ионная сила буферного раствора. В средах с ионной силой ниже 0,2М
некоторые вирусы распадаются, тогда как другие нестабильны при более
высокой ионной силе [1671]. Вирус мозаики люцерны преципитирует при
концентрации Mg2+ выше 0,001 М и'деградирует при концентрации, превы-
шающей 0,1 М [845].
Восстанавливающие агенты и вещества, защищающие
от фенольных соединений
К средам для экстракции часто добавляют восстановители (сульфит
натрия, тиогликолят натрия или цистеингидрохлорид). Эти соединения
способствуют сохранению инфекционности, которую вирус легко теряет
в окислительных условиях, а также уменьшают адсорбцию на вирусе ком-
понентов клетки-хозяина. Как это показано в гл. XIV, фенольные соедине-
ния, встречающиеся в растительных тканях, могут серьезно затруднять
выделение и хранение вирусов. Ниже приведены некоторые методы, которые
более или менее успешно использовались для того, чтобы во время выделения
свести к минимуму действие фенолов на вирусы растений.
40
Глава III
Восстанавливающие серусодержащие агенты
Цистеин и сульфит натрия, добавляемые к среде для экстракции, вероят-
но, действуют путем ингибирования фенолоксидазы и соединения с хино-
ном [1329].
Хелатные агенты
Полифенолоксидаза является медьсодержащим ферментом. Два хелат-
ных агента — диэтилдитиокарбамат и этилксантагинат калия,— более или
менее специфично реагирующие с медью, были использованы для получения
инфекционных препаратов некоторых вирусов, например вируса некротиче-
ской кольцевой пятнистости вишни [698], вируса мозаики яблони, переда-
ваемого механически [1222], вируса огуречной мозаики [728, 1331].
Вещества, конкурирующие с вирусом за фенолы
Для получения инфекционных препаратов вируса деформации побегов
дерева какао из его листьев были применены различные растворимые белки
и суспензии белка [298]. При этом оказалось, что лучше использовать суспен-
зии, так как они легче удаляются из экстракта, в то время как яичный альбу-
мин до конца выделения присутствовал в препарате и в дальнейшем мешал
проведению серологических тестов. Для связывания таннинов достаточно
эффективными оказались синтетические полимеры, содержащие амидную
связь, которая необходима для образования комплексов с таннинами. Среди
них наибольшее значение имеет поливинилпирролидон [ПВП].
Как растворимая, так и нерастворимая формы ПВП образуют комплексы
с таннинами. «Поликлер АТ» является вполне удовлетворительным коммер-
ческим препаратом ПВП. При удалении фенолов с помощью ПВП важно-
контролировать значение pH, так как эффективность связывания быстро-
уменьшается при pH выше 8 [1097].
Никотин также осаждает таннины и используется для получения инфек-
ционных экстрактов вируса [409, 1772], однако с его помощью можно лишь
частично предотвратить потерю инфекционности ВТМ, вызываемую танни-
нами [1765].
Вещества, используемые для удаления растительных
белков и рибосом
Бентонит был первоначально применен для выделения РНК, свободной
от рибонуклеазы [292, 542]. Как известно, многие вирусы довольно быстро-
теряют инфекционность in vitro, что, в частности, может быть следствием
присутствия в экстрактах или в частично очищенных препаратах вирусов
рибонуклеаз из листьев. При внимательном изучении возможности исполь-
зования Mg-бентонита при выделении вирусов оказалось, что в соответствую-
щих условиях примесь нуклеаз в вирусном препарате существенно умень-
шалась или вовсе отсутствовала [475]. Кроме того, рибосомы, 188-белок
и содержащие частицы препараты, окрашенные в зеленый цвет, получаемые
из фрагментированных хлоропластов, легко адсорбировались на бентоните
при условии, что концентрация Mg2+ была 10~3 М или выше. Этот метод
оказался очень полезным для ряда вирусов и вирусных штаммов, однако-
некоторые вирусы адсорбировались на бентоните. В ряде случаев эту труд-
ность удавалось преодолеть, если внимательно контролировалась концен-
трация Mg2+. Нативный вирус и пустые белковые оболочки некоторых виру-
сов по-разному адсорбировались на бентоните [799]. Следует отметить, что
Выделение вирусов
4!
различные сорта бентонита различались по своей способности адсорбировать
рибосомы. Определенную трудность представляло также загрязнение вирус-
ных препаратов небольшими количествами тонкой фракции бентонита. Эти
примеси, по крайней мере у некоторых исследованных вирусов, удалялись
соответствующими обработками. Для адсорбции и удаления некоторых при-
месей клетки-хозяина и особенно пигментов можно использовать активиро-
ванный уголь. Однако при последующей фильтрации с целью удаления угля
возможны существенные потери вируса па фильтре, и для этой цели лучше
применять центрифугирование [598].
Использование этилендиаминтетраацетата (ЭДТА) в форме натриевой
соли в 0,01 М буфере при pH 7,4 приводит к разрушению большей части
рибосом, тем самым предотвращая их соосаждение с вирусом. ЭДТА также
ингибирует некоторые ферменты, нуждающиеся в металле. Однако это
соединение можно применять только в отношении вирусов, которые не тре-
буют дивалентных ионов для сохранения стабильности.
МЕТОДЫ ЭКСТРАКЦИИ
Для измельчения или гомогенизации небольших количеств инфициро-
ванной вирусом ткани пользуются ступкой и пестиком, для работы с более
значительными количествами материала используются различные типы гомо-
генизаторов и соковыжималок. Если требуется переработать до нескольких
килограммов ткани, применяются шаровые и коллоидные мельницы, а также
мясорубки. При использовании специальной среды для экстракции часто'
необходимо обеспечить непосредственный контакт разрушенных клеток
с этой средой. Измельченная ткань обычно отжимается через марлю или
другую ткань.
ПЕРВИЧНАЯ ОЧИСТКА ВИРУСА
Осветление экстракта
В неочищенном экстракте вирус смешивается с различными клеточ-
ными компонентами, размеры которых колеблются в тех же широких преде-
лах, что и размеры вируса, и свойства которых в некоторых отношениях
напоминают свойства вируса. К этой категории частиц относятся рибосомы,
IOS-белок хлоропластов (фракция I), имеющий тенденцию образовывать
агрегаты, фитоферритин [407], фрагменты мембран и фрагменты разрушен-
ных хлоропластов. В этой смеси присутствуют также неразрушенные клетки,
растворимые белки и вещества с низкой молекулярной массой.
Целью первого этапа выделения вируса обычно является удаление как
можно большей части макромолекулярных компонентов клетки-хозяина;
вирус при этом остается в растворе. Среда для экстракции может быть пред-
назначена для осаждения рибосом и других органелл или для их дезинтегра-
ции. Далее экстракт можно подвергнуть некоторой обработке, например
прогреть при 50—60 °C в течение нескольких минут, или добавить К2НРО4
с целью коагуляции большей части примесей. При очистке некоторых виру-
сов очень эффективным для осаждения компонентов клетки-хозяина является
добавление к экстракту органичесих растворителей, например этанола.
При выделении других вирусов экстракт встряхивают со смесью, содержа-
щей н-бутанол — хлороформ, что вызывает денатурацию большинства при-
месей. Обработанный таким образом экстракт затем центрифугируют при
довольно низкой скорости (например, 10—20 мин при 5000—10 000 g).
42
Глава III
При этом осаждается клеточный детрит и коагулируемый материал клеток
хозяина. В результате центрифугирования экстракт, обработанный и-бута-
иол — хлороформом, разделяется на две фазы, причем вирус остается в вод-
ной фазе, а основная часть денатурированного материала находится в интер-
фазе. Следует заметить, что, хотя некоторые вирусы устойчивы к обработке
н-бутаиол — хлороформом, у других она может вызвать довольно серьез-
ные потери. Обработка одним лишь хлороформом является более мягким
приемом, чем обработка смесью бутанол — хлороформ. Для некоторых
вирусов эмульгирование экстракта из листьев с фторуглеродом (фреон-113)
дает хорошее первоначальное осветление без серьезной потери инфекцион-
ности [423].
Иногда вместо центрифугирования для первичного удаления загрязняю-
щего экстракт материала клеток растения-хозяина применяют фильтрова-
ние через фильтры из бумаги и тому подобных материалов. Для многих
вирусов, вероятно, очень важно проводить их выделение как можно быстрее
после получения экстракта из листьев. Однако Боудэн и Пири [124] описали
систему из листьев табака, инактивирующую вирус. Когда вирус осаждали
из свежеотжатого сока, то инактивирующая система осаждалась вместе
с вирусом. В ресуспендированном осадке инактивирующая система была
стабильна и инактивировала вирус некроза табака и вирус кольцевой пят-
нистости табака (но не ВТМ). В экстракте из листьев, хранившихся при 18 °C
в течение дня, инактивирующая система разрушалась, в связи с чем из таких
экстрактов путем осаждения можно было получить гораздо более стабильные
препараты вируса.
В клетке некоторые вирусы существуют в виде окруженных мембранами
агрегатов (фото 54). Поэтому требуется время для высвобождения вируса
после получения экстракта из листьев. Если проводить центрифугирование
вскоре после экстрагирования, то даже при низкой скорости большая часть
вируса будет потеряна с первым же осадком.
Концентрирование вируса и удаление
низкомолекулярных примесей
Высокоскоростное центрифугирование
Центрифугирование при высокой скорости в течение достаточного
периода времени приводит к осаждению вируса. Если при этом вирус не дена-
турирует, то его можно затем перевести в активной форме обратно в раствор.
Этот этап выделения очень важен, так как он преследует сразу две цели.
Во-первых, при этом происходит концентрирование вируса, а во-вторых,
препарат вируса освобождается от низкомолекулярных примесей. Не следует
применять при центрифугировании растворы вирусов в низкой концентра-
ции, так как это приводит к значительным потерям (фиг. 3).
Центрифугирование в градиенте плотности
Многие вирусы, особенно палочкообразные, могут образовывать после
центрифугирования осадки, которые затем очень трудно вновь суспенди-
ровать. Центрифугирование в градиенте плотности дает возможность кон-
центрировать такие вирусы без осаждения (см., например, [404] для Х-вируса
картофеля). С появлением больших 6-местных бакет-роторов этот метод стал
находить все более широкое применение в качестве первой ступени кон-
центрирования вирусов. Описанная ниже модификация этого метода позво-
ляет использовать даже угловые роторы для первичного концентрирования
Выделение вирусов
43
вируса без осаждения на дно пробирки. При этом на дно пробирки наливают
слой раствора сахарозы высокой плотности толщиной в несколько милли-
метров, па него наслаивают слой сахарозы низкой плотности высотой около
2 см, а остаток пробирки заполняют осветленным клеточным экстрактом. При
соответствующих условиях вирус может быть собран в области иптерфазы
между двумя слоями сахарозы. Появление в последнее время зональных
роторов дает возможность еще шире использовать градиенты плотности для
препаративных целей [1783].
Высаливание и кристаллизация
Этот метод широко применялся еще до того, как в распоряжении иссле-
дователей появилась высокоскоростная центрифуга. До сих пор он остается
цепным для вирусов, которые не инактивируются в концентрированных
солевых растворах. Наиболее часто для высаливания применяют сульфат
аммония в концентрации, составляющей около х/3 насыщающей, хотя другие
соли также могут осаждать вирус и кристаллизовать его (фото 3). После
выдерживания в течение нескольких часов или дней препарат вируса осаж-
дают путем низкоскоростного центрифугирования и вновь растворяют
в небольшом объеме соответствующей среды.
Осаждение в изоэлектрической точке
Многие белки имеют низкую растворимость в изоэлектрической точке
или вблизи нее (фиг. 61, Б). Изоэлектрическое осаждение может приме-
няться для вирусов, которые стабильны при таких условиях. После центри-
фугирования или фильтрования осадок собирают и вновь растворяют в под-
ходящей среде.
Гелъ-филътрация
С помощью гель-фильтрации на сефадексе, агаре или агарозе из раствора
вируса удаляют примеси небольших молекул. Экстракт наслаивается на вер-
шину колонки гранулированного геля, уравновешенного соответствующей
средой. Частицы вируса, не проникая внутрь гранул геля, будут двигаться
через колонку быстрее, чем низкомолекулярные вещества, которые могут
проникать в гранулы. Гель-фильтрацию обычно используют на последнем
этапе очистки вируса. Этот метод удобен также для некоторых вирусов,
которые должны быть быстро удалены из первичного осветленного экстрак-
та, так как обеспечивает замену растворителя, в котором находится вирус.
Колонка с сефадексом G-100 диаметром 5 см и длиной 50 см обладает доста-
точной емкостью для нанесения 200 мл осветленного экстракта [1671].
Диализ
Для удаления низкомолекулярных веществ из первичного экстракта
или для смены среды можно провести диализ через целлюлозные мембраны.
Этот метод более длителен, чем фильтрование через гель, и чаще приме-
няется для удаления соли после высаливания и кристаллизации, а также
после фракционирования в градиенте плотности солей или сахарозы, что
обсуждается ниже.
Коацервация
При коацервации происходит разделение раствора макромолекул на две
жидкие фазы — богатую и бедную коллоидами. Описаны системы полимеров
[12, 13], которые разделяются вследствие своей несовместимости независимо
44
Глава III
от присутствия вируса. Если к такой системе добавить вирус, то он скон-
центрируется в одной либо в другой фазе или в интерфазе, что зависит
от концентрации соли. Хеберт [752] показал, что некоторые вирусы растений
можно избирательно осадить в однофазной системе, содержащей полиэтилен-
гликоль.
При сравнительном исследовании двухфазной системы, содержа-
щей полиэтиленгликоль и декстрансульфат, и однофазной системы из поли-
этиленгликоля в присутствии соли Леберман [1055] показал, что простая
процедура осаждения вируса с помощью полиэтиленгликоля так же эффек-
тивна, как и выделение вируса с помощью двухфазной системы. Эти методы
требуют дальнейшей разработки с использованием ряда вирусов. Их, вероят-
но, можно рассматривать как полезный этап на пути первичного концентри-
рования вируса из осветленного клеточного экстракта.
Венекамп и Мош [1842] описали метод выделения некоторых вирусов
с помощью колонки с порошком целлюлозы, смешанным с полиэтиленглико-
лем, декстраном, глюкозой и солями. Сходную смесь добавляли к экстрак-
там листьев и экстракт наносили на колонку. Вирус при этом осаждался
и задерживался на колонке, в то время как большая часть веществ, харак-
терных для клеток растения-хозяина, проходила сквозь нее. Вирус элюиро-
вали с колонки средой без полиэтиленгликоля и хлористого натрия. Однако
сомнительно, чтобы с помощью одного лишь этого метода удавалось получать
вирусные препараты, свободные от материала растения-хозяина.
ДАЛЬНЕЙШАЯ ОЧИСТКА ПРЕПАРАТОВ ВИРУСА
Вирусные препараты, прошедшие одну стадию очистки и концентриро-
вания, еще содержат некоторое количество низко- и высокомолекулярных
веществ, происходящих из ткани хозяина. Большая часть этих, примесей
может быть удалена на дальнейших стадиях очистки. Метод, который следует
при этом использовать, в значительной степени зависит от стабильности
вируса, количества выделенного препарата и цели, для которой требуется
препарат.
Иногда препараты вируса высокой степени чистоты можно получить
путем повторного применения одного и того же метода. Например, иногда
препарат можно подвергнуть повторной кристаллизации с помощью суль-
фата аммония или провести несколько циклов дифференциального центри-
фугирования. Последний метод предпочтителен для удаления макромолеку-
лярных примесей, так как они не растворяются при ресуспендировании
осадка, полученного после высокоскоростного центрифугирования. Однако
при этом часто наблюдаются и потери вируса, что происходит либо
вследствие того, что часть вируса или весь он становится нераство-
римым, либо из-за того, что для растворения осадка было недостаточно
времени.
Последнее обстоятельство представляет особую трудность при выделении
некоторых палочкообразных вирусов. При растворении небольших осадков,
для которых характерно высокое отношение поверхности к объему, серьез-
ные потери могут иметь место вследствие того, что вирус вновь переходит
в раствор еще до удаления надосадочной жидкости.
Вообще говоря, в процессе выделения полезно использовать сочетание
по крайней мере двух методов, которые зависят от разных свойств вируса.
По-видимому, для удаления примесей это более эффективный прием, чем
повторное применение одного и того же метода.
Выделение вирусов
45
Центрифугирование в градиенте плотности
Одним из наиболее распространенных методов, применяемых для даль-
нейшей очистки вирусов, является центрифугирование в градиенте плот-
ности, уже обсуждавшееся в гл. II как метод выявления вирусов. Самым
обычным материалом для создания градиента является сахароза. Для пол-
ной очистки вирусов наиболее часто используют метод центрифугирования
в градиенте плотности сахарозы. Несмотря на то что этот метод не связан
с жестким воздействием на вирус, все же случается, что некоторые вирусы
и в этом случае утрачивают инфекционность (стр. 28). Этот метод дает воз-
можность получить некоторое представление относительно чистоты препара-
та. Он позволяет выявить связь между частицами и инфекциоиностыо; с его
помощью также можно часто выявить присутствие неинфекционных вирусо-
подобных частиц или многокомпонентных вирусов. Зона отдельного компо-
нента может распределяться в градиенте более широко, чем это следует
из данных измерения оптической плотности. Может понадобиться несколько
циклов центрифугирования в градиенте плотности, чтобы в достаточной
степени исключить взаимное загрязнение компонентов. Недавние исследова-
ния с многокомпонентными вирусами показали, что даже при повторном
фракционировании в градиенте плотности сахарозы бывает чрезвычайно
трудно выделить один компонент, полностью свободный от другого ком-
понента (гл. VIII).
При недостаточно адекватных условиях седиментации зоны главного
и минорного компонентов могут перекрываться [266]. Способ удаления зон
из градиента также может заметно влиять на степень загрязнения одной
фракции другой. При фракционировании путем сбора фракций после про-
калывания дна порбирки может произойти довольно сильное смешивание,
если скорость вытекания слишком высока. Эффективным материалом для
создания градиента в случае достаточно стабильных вирусов являются также
концентрированные растворы таких солей, как тартрат калия или хлористый
цезий.
Электрофорез в градиенте плотности
При использовании этого метода, примененного Бракке [261] для работы
с вирусами растений, суспензия вируса наслаивается на соответствующим
образом забуференный градиент плотности, формируемый в U-образной
трубке. Макромолекулы с различным общим зарядом мигрируют с различной
скоростью и при соответствующих условиях разделяются, образуя дискрет-
ные полосы, которые можно выявить по данным светорассеяния it затем
изолировать с колонки. Этот метод не получил широкого распространения,
но может оказаться полезным для нестабильных вирусов. Описаны раз-
личные модификации аппаратов, используемых для электрофореза [1673,
1828].
Другие виды электрофореза
Электрофорез на агаровом, крахмальном геле и т. д. не находит широ-
кого применения для исследования вирусов растений. Мало применялся
также метод непрерывного электрофореза, при котором поперек листа вися-
щей фильтровальной бумаги прикладывается разность потенциалов. Через
лист сверху вниз протекает буфер. Этот метод не нашел широкого примене-
ния, что, по-видимому, обусловлено невозможностью разделения больших
количеств материала, слишком большой затратой времени и другими при-
чинами.
46
Глава III
Гель-фильтрация в агаре
Фильтрование через агаровый гель можно рассматривать как полезный
этап для дальнейшей очистки вирусов, которые оказываются нестабиль-
ными при осаждении путем высокоскоростного центрифугирования [5, 342,
1672]. Этот метод применяется также для разделения частиц различной
длины, встречающихся в препаратах таких палочкообразных вирусов, как
ВТМ [1670]. Фракции вируса, полученные с колонки агарового геля, могут
содержать также некоторое количество компонентов клетки-хозяина, сход-
ных по размеру с вирусом, для удаления которых требуется некоторая допол-
нительная обработка. Вирус получают в объеме жидкости, по крайней мере
в два раза превышающем объем исходного материала, и обычно требуется
проводить концентрирование элюата.
Хроматография
Иногда как эффективный этап дальнейшей очистки частично очищенных
препаратов вируса используют хроматографические методы. Например,
для очистки вируса некротического пожелтения салата-латука Мак-Лин
и Франки [1127] использовали метод хроматографии на колонках с кальций-
фосфатным гелем в фосфатном буфере. При элюции фосфатным буфером
(pH 7,6) вирус проходит через колонку, в то время как большая часть приме-
сей остается адсорбированной на геле. В таких условиях с колонки элюиро-
вали 50—80% инфекционного вируса, что составляло лишь 10% нанесенного
на колонку материала, поглощающего при 260 нм.
Концентрирование вируса и удаление низкомолекулярных веществ
На различных стадиях выделения вируса возникает необходимость
сконцентрировать вирусный препарат и удалить из него соли или сахарозу.
Для вирусов, которые стабильны при осаждении, с целью концентрирования
вируса и удаления низкомолекулярных примесей обычно применяют высоко-
скоростное центрифугирование, а для удаления или смены солей используют
обычный диализ. Для работы с нестабильными вирусами применяют неко-
торые другие приемы. К препарату можно добавить порошок сухого геля
(например, сефадекса) или поместить препарат в мешочек для диализа,
обложенный порошком сухого геля, и оставить на холоду в течение несколь-
ких часов. Для концентрирования больших объемов и удаления солей можно
применить ультрафильтрацию под давлением через мембранные фильтры.
Испарение, которое происходит в то время, когда препарат вируса нахо-
дится в мешочке для диализа и висит в токе воздуха, может вызвать потери
вируса вследствие локального подсушивания стенок мешка и концентрирова-
ния в таких местах солей, имеющихся в препарате. Для концентрирования
очищенных препаратов ВТМ применяются также бактериальные фильтры
из пористого стекла с размером пор 1,0—1,7 мкм [1308]. Задержка вируса
на фильтре зависит от концентрации соли и обусловлена, по-видимомут
эффектом высаливания и адсорбцией вируса на поверхности стекла. Далее
вирус элюируют с фильтра водой.
ХРАНЕНИЕ ОЧИЩЕННЫХ ВИРУСОВ
Хранение очищенных препаратов многих вирусов растений в течение
более чем нескольких дней обычно связано с определенными трудностями.
Поэтому наиболее желательно использовать препараты сразу после выделе-
ния. Многие вирусы (кроме ВТМ) теряют инфекционность даже при опти-
Выделение вирусов
47
мальных условиях хранения — при 4 °C в растворе или в виде кристалличе-
ских препаратов под сульфатом аммония. Такое хранение не исключает
полностью роста грибов и бактерий, в результате чего препараты вируса
загрязняются чужеродными антигенами и ферментами. Добавление азида
натрия или тимола в низких концентрациях предотвращает рост микро-
организмов. Препараты могут храниться при низкой температуре в присут-
ствии равного объема глицерина. Вирусный препарат может сохранить
инфекционность в течение довольно длительного времени в условиях глубо-
кого замораживания в виде растворов или лиофилизированных порошков.
При этом следует обращать внимание на среду, в которой хранится вирус
(использовать для хранения подходящий буфер и некоторые белки или
полисахариды, обладающие защитным действием). Препараты, которые
используются для аналитических исследований белка или нуклеиновой
кислоты, лучше всего хранить в виде замороженных растворов.
ИДЕНТИФИКАЦИЯ ИНФЕКЦИОННЫХ ЧАСТИЦ
И КРИТЕРИЙ ЧИСТОТЫ
Выбор метода для определения чистота препарата вируса зависит
от цели экспериментов. Наиболее часто препараты вируса выделяют для
двух основных целей: 1) установления идентичности и общей природы вирус-
ных частиц, связанных с каким-то определенным заболеванием, 2) проведе-
ния детальных физических или химических исследований этих частиц и их
компонентов.
Идентификация вирусных частиц
При работе с вновь выделенными вирусами или при попытках выделить
их главной задачей является очистка вируса, которая была бы достаточной
для того, чтобы идентифицировать инфекционные частицы и по крайней
мере предварительно охарактеризовать их. Наиболее удобным в этом случае
является метод центрифугирования очищенных препаратов в градиенте
плотности сахарозы. После фракционирования можно определить инфек-
ционность либо в каждой отдельной фракции, собранной из градиента, либо
комбинируя их, если присутствует многокомпонентный вирус. Далее можно
снять спектр поглощения в ультрафиолете и исследовать образцы в электрон-
ном микроскопе с целью обнаружения характерных частиц. При этом можно
пользоваться методом подсчета в капле, который позволяет выявить количе-
ственную связь по всему градиенту между инфекционностыо и присутствием
во фракциях характерных частиц вируса. Открытие многокомпонентных
вирусов, которые описаны в гл. VIII, привело к тому, что оказалось необ-
ходимым в первую очередь осторожно интерпретировать результаты, полу-
ченные после центрифугирования в градиенте сахарозы (или в других гра-
диентах). Одним из преимуществ экспериментов в градиенте сахарозы
является возможность применения относительно небольших количеств
вируса. Кроме того, в этом случае можно получить приблизительную оценку
коэффициентов седиментации исследуемых веществ. О том, как используется
градиент плотности сахарозы для характеристики многокомпонентных
вирусов, можно узнать, взглянув на фиг. 39.
Критерии чистоты
Для получения многих критериев оценки чистоты вирусных препаратов
необходимо применение методов количественного определения вирусов,
уже обсуждавшихся в гл. II. Используемая для выделения вирусов кристал-
48
Глава III
.лизация считается важным критерием чистоты, однако в этом случае нельзя
разграничить вирусоподобные частицы, которые кристаллизуются вместе
с вирусом. Часто как доказательство чистоты препарата используют наличие
спектра поглощения в ультрафиолете, характерного для нуклеопротеидов.
Однако этого совершенно недостаточно, так как таким образом примеси
больших количеств нуклеопротеидов клеток-хозяев, полисахаридов, а также
значительное количество клеточных белков могут легко остаться незамечен-
ными. Центрифугирование в градиенте плотности сахарозы или седимента-
ционный анализ в аналитической ультрацентрифуге часто позволяют обнару-
жить присутствие невирусного материала при условии, что примеси не седи-
ментируют вместе с вирусом и присутствуют в достаточно высокой кон-
центрации.
С помощью седиментационного анализа в очищенных препаратах некото-
рых сферических вирусов можно выявить присутствие димеров и тримеров
вирусных частиц [1151], однако без дополнительного контроля их можно
принять за примесь. Подобно этому препараты палочкообразных вирусов
часто содержат набор частиц различной длины, более коротких, чем вирус.
Эти короткие частицы и вирус могут агрегировать, создавая ряд частиц
такого диапазона размеров, которые седиментируют в виде широкой полосы
или образуют два или более дискретных пика. С меньшим успехом седимен-
тационный анализ применим для обнаружения материала невирусиого про-
исхождения при исследовании многокомпонентных вирусов, так как в этом
случае большая часть седиментационного профиля занята самими вирус-
ными частицами.
Применительно к вирусным компонентам или к вирусам, стабильным
в концентрированных солевых растворах, равновесное центрифугирование
в градиенте плотности хлористого цезия является более чувствительным
критерием гомогенности, чем скоростное центрифугирование. Например,
при скоростном центрифугировании очищенного препарата неинфекцион-
ного нуклеопротеида Во, выделенного из вируса желтой мозаики турнепса,
обнаруживается один компонент (фото 4, Л), тогда как при равновесном
центрифугировании того же препарата в хлористом цезии удается четко
выявить смесь, содержащую более чем один компонент (фото 4, В).
Применение метода электронной микроскопии для выявления примесей
целесообразно, если этот материал имеет достаточный размер и по внешнему
виду отличается от вируса. Таким образом, в очищенных препаратах можно
обнаружить белковую фракцию I, фитоферритин или фрагменты мембранных
структур клеток растения-хозяина. Низкомолекулярные белки и другие
низкомолекулярные вещества не обнаруживаются в этом случае, если только
они не кристаллизуются на пленке-подложке и не присутствуют в препара-
тах в относительно больших количествах.
Примесь клеточных веществ, которые способны диффундировать и обла-
дают антигенными свойствами, можно выявить с помощью очень чувстви-
тельных серологических методов, таких, как иммунодиффузия и иммуно-
электрофорез (гл. XV).
Для вирусов с хорошо установленным элементарным химическим соста-
вом (например, ВТМ) такие методы, как определение отношения фосфора
к азоту, позволяют обнаружить примеси, содержащие азот или фосфор, если
они присутствуют в значительном количестве. При определенных обстоя-
тельствах могут быть применены также более сложные химические методы,
например анализ концевых групп белков, позволяющий обнаружить всего-
навсего одну аминокислоту. Можно также использовать метод «отпечатков
пальцев» для разделения пептидов триптического гидролизата хорошо
охарактеризованных вирусных белков, но чувствительность его как критерия
чистоты также невысока.
Выделение вирусов
49
В качестве теста на чистоту можно использовать различные радио-
химические методы. Например, для определения фосфорсодержащих приме-
сей, иных, нежели РНК, в растение, в котором размножается вирус, в каче-
стве метки вводят мР-ортофосфат. Затем вирус выделяют и РНК гидролизуют
1 и. щелочью либо прямо в интактном вирусе, либо после выделения ее
из вируса. Гидролизат разделяют хроматографией или электрофорезом.
Радиоактивность должна обнаруживаться только в четырех рибонуклео-
тидах РНК. Другой метод использования радиоактивных изотопов для
контроля эффективности очистки состоит в следующем. В здоровое растение
в течение нескольких дней вводят 32Р-ортофосфат или :153-сульфат. Материал,
содержащий метку, затем смешивают (прежде чем получить экстракт
из листьев) с равным количеством немеченой инфицированной вирусом ткани.
При активности метки порядка нескольких милликюри чувствительность
этого метода поразительна. Но при всем том полученные результаты не могут
служить окончательным критерием отсутствия компонентов, содержащих Р
или S. В частности, не исключено, что при инфицировании вирусом в клетке
образуются вещества, которых нет в здоровой ткани. В настоящее время
имеется лишь одно общее правил,о при решении вопроса о чистоте препарата
вируса — он должен отвечать требованиям эксперимента.
КОНЦЕНТРАЦИЯ ВИРУСА В РАСТЕНИЯХ
И ВАЛОВОЙ ВЫХОД ОЧИЩЕННОГО ВИРУСА
Определение выхода
В вопросе, связанном с определением концентрации вируса в растении,
еще много сложного и неясного.
Неэкстрагируемый вирус
Часто при выделении вируса различное, но достаточно большое коли-
чество его остается связанным с клеточным детритом или с пузырьками
и органеллами клетки. Некоторые вирусы, особенно палочкообразные,
образующие в клетке крупные, типа волокон, включения, могут остаться
агрегированными па первоначальных стадиях выделения. Степень потери
вируса под влиянием этого фактора|часто в достаточной мере не учитывается.
Метод измерения концентрации
Путем определения инфекционности нельзя получить абсолютно точной
оценки количества вируса, и это зависит от многих условий. При использо-
вании физических и химических методов, для применения которых необхо-
димо наличие очищенных препаратов, довольно значительные и варьирую-
щие потери вируса могут иметь место еще до определения концентрации
в ходе его выделения. При работе с достаточно стабильным вирусом такие
потери можно оценить после добавления к исходному материалу известного
(небольшого) количества радиоактивного вируса. Содержание метки, остав-
шейся в конечном препарате, служит мерой потери вируса. Этот метод
не учитывает потери вируса, находящегося внутри клеточных частиц и т. д.
Для определения общего количества вируса в осветленном экстракте
используют, если это возможно, комбинацию серологических методов с хро-
матографическими; при этом специфичность серологических реакций соче-
тается с точностью химических измерений (гл. П). Вероятно, одним из наи-
более четких методов определения количества вируса в экстрактах растений
в том случае, когда концентрация его достаточно высока, является анализ
0893
50
Глава 1П
осветленных экстрактов в градиенте плотности сахарозы. Если вирусные
частицы имеют достаточно типичную форму, очень полезным даже в неочи-
щенных экстрактах и при низкой концентрации может оказаться метод
подсчета частиц в электронном микроскопе. Подсчитывают с помощью элек-
тронного микроскопа частицы также и на ультратонких срезах. Таким путем
можно получить непосредственную, хотя и приблизительную, оценку числа
вирусных частиц, содержащихся в одной клетке.
Образец ткани
Как обсуждается в гл. VII, концентрация вируса в разных частях расте-
ния может широко варьировать, что наблюдается даже в пределах одного
листа с симптомами мозаики.
Выражение результатов
Концентрацию, или выход, вируса обычно выражают величиной массы
на единицу сырой массы или величиной массы на 1 мл экстракта. Однако
разные ткани и разные листья даже в пределах одного и того же растения
и при одних и тех же условиях значительно различаются по содержанию
в них воды, что может быть следствием, например, разного размера вакуо-
лей или количества волокнистого материала.
Данные о валовом выходе вирусов
В настоящее время многие из проблем, связанных с этим вопросом, так
и не получили своего окончательного разрешения. Большинство исследо-
Таблица 3
Валовой выход очищенного вируса
Вирус Растение-хозяин Приблизи- тельный выход, мкг на 1 г Источник данных
Мозаики люцерны Табак 200 [99]
Желтой карликовости ячменя Овес 0,05 [1438]
Мозаики костра Ячмень 1000 [373]
Мозаики Centrosema Кроталярия 7,0 [421 [
Хлоротической крапчатости коровьего Коровий горох 300 [761
Мозаики коровьего гороха Коровий горох 1000 [1822]
Огуречной мозаики Табак 300 [1517[
Огуречный вирус 3 (штамм ВТМ) Огурец 300 [991
Желтой жилки винограда (родствен вирусу Фасоль обыкновен- 15 [661],
желтой почки персика) Мозаики белены пая Табак 2 [99]
Деформирующей мозаики гороха Горох 300 [8581
Х-вирус картофеля (штаммы) Томат 700 [991
У-вирус картофеля Табак 2 [991
Вирус-сателлит вируса некроза табака Табак, фасоль 0,3 [5601
Гравировки табака обыкновенная Табак 7 [99[
Южной мозаики фасоли Фасоль обыкновен- 400 199]
Мозаики тыквы пая Огурец 50 [1195]
Мозаики табака Табак 2000 [99]
Погремковости табака Ntcotiana Cleveland)) 50 [725|
Кольцевой пятнистости табака Коровий горох 100 [408]
Кустистой карликовости томатов Томат 150 [99]
Бронзовости томатов N. glutinosa 10 [189]
Желтой мозаики турнепса Китайская капуста 1000 [1157]
Выделение вирусов
51
вателей, сообщая о выделении вируса, если они вообще приводят данные
о выходе, выражают его в виде массы очищенного вируса, отнесенной к массе
исходного материала. Этот исходный материал обычно представляет собой
целые листья или листовые пластинки без средней жилки. Данные, при-
веденные в табл. 3, содержат информацию о широте диапазона концентраций,
получения которых следует ожидать при выделении разных вирусов. Этот
список не является исчерпывающим пи с точки зрения числа описанных
вирусов, ни с точки зрения цитируемой литературы. Цитируются в основном
работы последнего времени.
ФАКТОРЫ, ОГРАНИЧИВАЮЩИЕ ПРИМЕНЕНИЕ
СУЩЕСТВУЮЩИХ МЕТОДОВ ВЫДЕЛЕНИЯ ВИРУСОВ
На фиг. 3 суммированы данные о валовом выходе ряда вирусов растений,
для которых такие определения проводились. В литературе не имеется дан-
ных о выделении вирусов, выход которых был бы меньше чем 0,5 мкг па 1 г.
Почти все методы, используемые в настоящее время при выделении вирусов,
включают один или более циклов дифференциального центрифугирования.
Маркхэм [1147, 1151] теоретически рассмотрел те недостатки метода седи-
ментации, которые возникают при исследовании очень разбавленных раство-
ров макромолекул. В таких условиях на седиментограмме не может сформи-
роваться граница и наблюдается конвекционный тип седиментации. При
этом скорость уменьшения концентрации в иадосадочной жидкости падает
с точением времени по экспоненциальному закону.
Для определения концентрации, при которой седиментация становится
неэффективной, мы осаждали при различных концентрациях типичный мел-
кий икосаэдрический вирус (ВЖМТ), меченный по 3BS, при 29 000 об/мин
в течение 2 ч (ротор № 30, центрифуга Спиико) (Коллард и Мэтьюз, неопубли-
кованные данные). Количество вируса в осадке после центрифугирования,
измеренное по радиоактивности, быстро падало при концентрации ниже
примерно 0,02 мкг па 1 мл (фиг. 3). После двух или трех циклов цептрифуги-
Фиг. 3. Различия в величинах валового выхода у вирусов растений.
На гистограмме приведены данные для тех вирусов, у которых валовой выход различается в 10 раз.
Пунктиром показано относительное количество ВЖМТ, получаемого в осадке после одного цикла
высокоскоростного центрифугирования.
4*
52 Глава III
рования в этой области концентраций выход вируса приближался к пулю,
если исходная концентрация была ниже 0,01 мкг на 1 мл.
Таким образом, невозможность препаративного выделения некоторых
вирусов может быть обусловлена тем, что они содержатся в концентрациях,
слишком низких для того, чтобы обычные седиментационные методы оказа-
лись эффективными.
Маркхэм [1147] показал, что молекулы с относительно небольшим коэф-
фициентом седиментации, присутствующие в растворе в концентрации,
достаточной для образования границы при центрифугировании, могут
захватывать при соосаждении любые более крупные молекулы, присутствую-
щие в малом количестве. Этот способ можно использовать как начальную
стадию выделения вирусов, содержащихся в очень низкой концентрации.
Кроме того, подавно было показано, что ВТМ может адсорбироваться из
очень разбавленных растворов на поверхности нерастворимых сополиме-
ров производных малеиновой кислоты [890]. Потенциальные возможности
таких материалов для выделения вирусов еще не изучены.
Как мы уже отмечали в начале этой главы, концентрацию трудно выде-
ляемых вирусов в исходном материале можно значительно увеличить при
соответствующих условиях выра1цивания необходимого нам растения и вни-
мательном отношении к ряду других факторов.
ГЛАВА IV
СТРУКТУРНЫЕ КОМПОНЕНТЫ
Анализ элементарного химического состава очищенных вирусных пре-
паратов, выполненный в ранних работах, показал, что они содержат углерод,
азот, водород, серу, фосфор и металлы (зола). Углерод (около 50%), водород
(около 7%) и азот (около 15—17%) содержатся в сходных соотношениях
во всех исследованных вирусах. Содержание серы колеблется между 0
и 1,6% в зависимости от количества сорусодержащих аминокислот в белке
вируса. Количество фосфора варьирует от 0,5 до 4,0% и свидетельствует
о содержании РНК в вирусе, поскольку весь или почти весь фосфор скон-
центрирован в вирусной РНК, за исключением тех вирусов, которые имеют
в своем составе фосфолипиды. Зольные элементы — еще более вариабель-
ный компонент, что отчасти определяется вариабельностью содержания
фосфора, а отчасти — воздействием ионов при обработке вирусов в про-
цессе выделения. Углеводы в вирусе присутствуют в виде рибозы в случае
РНК и дезоксирибозы в случае ДНК. Однако препараты вируса часто бывают
загрязнены углеводами из клеток растения-хозяина.
Мелкие вирусы растений, описанные до сих пор, содержат одпоцепочеч-
ную или двухцепочечпую нуклеиновую кислоту, заключенную в белковую
оболочку. Структурный белок состоит из целого ряда правильно упакован-
ных идентичных субъединиц небольшого размера (молекулярная масса
обычно « 20 000). Некоторые мутанты вирусов, изолированные в лабора-
тории, по синтезируют функциональный структурный белок. Сообщалось
также о двух встречающихся в естественных условиях вирусах, которые
содержат только «голую» РНК [456, 1540, 1601]. В состав некоторых вирусов
растений входят такие вещества, как полиамины и липиды. В этой главе
мы рассмотрим вопросы, касающиеся выделения и некоторых свойств раз-
личных компонентов, входящих в состав вирусов.
НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ
Почти все изученные до сих пор вирусы растений содержат РНК. Утвер-
ждение, что вирус скручивания листьев содержит ДНК, не подтвердилось
[667, 1015], по Шеферд и др. [1561], а также Шеферд (личное сообщение)
показали, что вирус мозаики цветной капусты содержит двухцепочечную
ДНК. Этот вирус мы рассмотрим отдельно в конце этого раздела.
Выделение РНК вируса
Выделение РНК из очищенных или частично очищенных препаратов
вируса включает освобождение РНК от защитной белковой оболочки и после-
дующее отделение этой нуклеиновой кислоты от белка и любых других
вирусных компонентов, например липидов, а также от любых примесей,
имеющихся в препарате вируса. В большинстве ранних работ, связанных
с исследованием вирусной РНК, не учитывали лабильность молекул РНК,
так что обычно выделяли сильно деградированные продукты. Однако, с тех
54
Глава IV
пор как было показано, что именно РНК вируса обладает инфекционностыо,
возникла задача получать недеградированные, обладающие инфекцион-
ностыо препараты или выделять свободную РНК в состоянии, максимально
близком к тому, в котором она находится в вирусной частице.
В настоящее время совершенно очевидно, что, применяя различные
физические и химические агенты, можно удалить вирусный белок и выде-
лить инфекционную РНК при условии, что 1) еще в интактной вирусной
частице РНК была инфекционной, 2) во время выделения не применялись бы
крайние значения pH среды и 3) РНК была бы защищена от действия нуклеаз.
Методы, которые используются для удаления вирусного белка, иллюстри-
руют стабильность вирусов в отношении различных химических и физиче-
ских обработок. Другие аспекты этой проблемы обсуждаются в гл. XIV.
Факторы, имеющие важное значение для выделения
инфекционной РНК
I. Концентрация водородных ионов. При выделении
не следует применять крайние значения pH. Известно, что при pH выше 10
начинают гидролизоваться фосфодиэфирные связи, а при pH несколько
ниже 3 медленно высвобождаются пуриновые основания, тогда как при
еще более низких значениях pH наступает интенсивная и быстрая деграда-
ция молекул РНК.
П. Действие ферментов. Одноцепочечная вирусная РНК
крайне чувствительна к действию рибонуклеаз. Поскольку достаточно только
одного разрыва в молекуле РНК, чтобы она потеряла инфекционность,
крайне важно избежать действия фермента в процессе выделения РНК.
В очищенных вирусных препаратах часто присутствуют следы рибонуклеаз
из листьев. Они должны быть удалены либо из интактного вирусного пре-
парата, либо во время выделения РНК, либо, наконец, в ходе этого про-
цесса следует использовать ингибиторы рибонуклеаз. Деградация под дей-
ствием нуклеаз может быть также сведена к минимуму, если использовать
условия, при которых активность фермента минимальна — низкая тем-
пература (0—4 °C), соответствующие значения pH и ионной силы.
III. Повторные процедуры. Полностью удалить незначи-
тельные примеси нуклеаз весьма трудно. Поэтому при выделении нужно
избегать методов, к числу которых относятся продолжительный диализ или
повторное переосаждение из водных растворов.
IV. Гидродинамические воздействия. Опасность раз-
рушения под влиянием подобных воздействий не является проблемой для
одноцепочечных РНК мелких вирусов. Однако в случае больших двух-
цепочечных РНК (вирус раневых опухолей и вирус карликовости риса),
а также при работе с двухцепочечными формами одноцепочечных вирусных
РНК, обладающими выраженной ДНК-подобной структурой, следует избе-
гать различных жестких воздействий при выделении.
V. И о н н а я с и л а. В растворах с низкой ионной силой одноцепочеч-
пая РНК в значительной мере утрачивает вторичную структуру и поэтому
более чувствительна к действию нуклеаз, обнаруживающихся в виде при-
месей при выделении. Обычно РНК получают в растворах 0,1 М NaCl. Соле-
вые растворы высокой ионной силы (при концентрации NaCl > 1 М
или MgCl2 > 0,01 — 0,1 М) вызывают преципитацию высокомолекуляр-
ной РНК.
VI. Подготовка вирусного препарата к выде-
л е н и ю РНК. Первые исследования вирусной РНК были выполнены
главным образом на вирусе табачной мозаики. Однако РНК этого вируса,
находясь внутри белковой оболочки, в высшей степени стабильна; РНК
Структурные компоненты 55
большинства других вирусов даже внутри интактной вирусной частицы,
вероятно, подвержена некоторой деградации, выраженной в различной
степени и связанной с потерей инфекционности. Этот процесс имеет место
как в интактном растении, так и во время выделения и хранения вируса.
Оптимальные условия, необходимые для сохранения интактной РНК внутри
вирусной частицы, варьируют от вируса к вирусу. Некоторые вирусы отно-
сительно стабильны при pH 7,0, тогда как другие, например вирус хлоро-
тической крапчатости коровьего гороха, при таком pH теряют инфекцион-
ность и происходит частичная деградация РНК [74].
Методы выделения РНК
Характерной особенностью метода выделения РНК является использо-
вание фенола. Однако для некоторых вирусов использование фенола не дает
удовлетворительных результатов, и при выделении РНК из нового вируса
необходимо сравнение нескольких методов с целью выбора наилучшего
из пих. Детали различных методов, применяемых теперь для выделения
РНК вирусов, суммированы в обзоре Ральфа и Берквиста [1378].
I. Ф е п о л ь н а я о б р а б о т к а. Гирер и Шрамм [630] использо-
вали фенольную депротеинизацию при выделении инфекционной РНК
из ВТМ. Фенол активно денатурирует белок и ингибирует нуклеазы. В этом
случае суспензию вируса в буфере при pH около 7,0, содержащую не более
нескольких мкг вируса на 1 мл раствора, встряхивают с примерно равным
объемом насыщенного водой фенола. Вирусный белок отделяют от РНК
центрифугированием, в результате чего РНК остается в водной фазе. Затем
РНК можно осадить из водной фазы добавлением двух объемов этанола,
отмыть этанолом от следов фенола и растворить вновь в разбавленном буфере.
Существует много модификаций этой основной процедуры. Определенные
методы, эффективные для одного вируса, могут быть совершенно бесполезны-
ми для другого. Например, для выделения РНК из некоторых вирусов
была предложена однофазная фенольная система, содержащая фенол —
этанол — воду или фенол — детергент — воду [459]. Однофазная система,
вероятно, полезна при работе с небольшими количествами вируса, так как
при этом можно исключить потери РНК в белковом слое, что характерно для
двухфазной системы.
II. Применение детергентов. При выделении РНК ВТМ
с целью денатурации и солюбилизации белка можно использовать водный
1%-ный раствор додецилсульфата натрия. Белок затем удаляют путем
осаждения сульфатом аммония [1654]. Френкель-Конрат и др. [540] полу-
чили инфекционную РНК ВТМ при использовании додецилсульфата натрия
при 50 °C в присутствии ЭДТА. Однако применение одного лишь детергента
оказалось не особенно успешным для выделения РНК ряда вирусов, напри-
мер вируса кустистой карликовости томатов [1459]. Изолированная таким
образом РНК была инфекционка, но содержала 1—2% белка. Этот детергент
пе нашел широкого применения в качестве основного агента при выделении
РНК вирусов растений, но очень часто он является ингредиентом водной фазы
среды, используемой для экстракции фенолом.
III. II а г р е в а н и е в разбавленном солевом раст-
вор е. Боудэн и Пири [115] нагревали растворы ВТМ для освобождения
вирусной РНК от белка и осаждения белка, который при этом денатурирует.
Этот прием впоследствии использовали для многих вирусов. Нагревание
проводят обычно в присутствии соли (в основном в 0,1 М NaCl) в буферном:
растворе при pH, близком к 7,0. Температура, необходимая для высвобожде-
ния РНК, варьирует в зависимости от вируса. РНК, выделенная с помощью
нагревания, обычно неиифекциоина, довольно сильно деполимеризована
56
Глава IV
и полидисперсна, о чем можно судить по результатам седиментационного
анализа. Тот факт, что РНК, получаемая путем нагревания, обычно оказы-
вается деградированной, по-видимому, объясняется несколькими причи-
нами: 1) действием нуклеазных примесей на освобожденную от белка РНК,
ибо имеются данные о том, что если принять меры предосторожности с целью
удаления нуклеаз, то можно получить инфекционную РНК ВЖМТ [798];
2) разрывами в цепи РНК под влиянием высокой температуры и длительной
обработки; 3) тем, что в таких вирусах, как ВЖМТ, РНК, находящаяся еще
внутри вирусной частицы, может иметь разрывы, которые и выявляются
путем нагревания, тогда как при обработке фенолом отдельные фрагменты
РНК удерживаются вместе при помощи вторичных связей [738]. Кипячение
в течение коротких промежутков времени при тщательно контролируемых
условиях позволило получить инфекционную РНК, например, из вируса
кольцевой пятнистости табака [919] и из ВЖМТ [920].
РНК некоторых вирусов, как, например, вируса мозаики дикого огурца
и вируса морщинистости турнепса, не удается выделить фенольной обработ-
кой, в связи с чем Симонс и др. [1726] использовали для выделения РНК
этих вирусов нагревание в 2 М растворе КС1 при 100 °C в течение 10 мин.
IV. Гуанидин гидрохлорид. Рейхман и Стейс-Смит [1414]
использовали гуанидингидрохлорид для выделения инфекционной РНК
из Х-вируса картофеля. После обработки 2,5 М гуанидином в присутствии
5 мМ ЭДТА при pH 8,4 в течение 1 ч вирусная РНК осаждалась, тогда как
белок оставался в растворе. В то же время фенольная экстракция не дала
удовлетворительных результатов при выделении РНК из Х-вируса кар-
тофеля.
V. Мочевина. Концентрированный раствор мочевины был одним
из первых агентов, использованных для диссоциации ВТМ па белок и РНК
[1665]. Впоследствии, как показал Базел [309], оказалось, что таким образом
трудно полностью отделить белок от РНК. Однако Джонарду [895] путем
обработки ВЖМТ 8 М мочевиной при pH 7,0 удалось выделить высокомоле-
кулярную РНК, но при условии, что в качестве ингибитора рибонуклеазы
использовался бентонит.
VI. Уксусная кислота. ВТМ можно диссоциировать на белок
и РНК с помощью 67%-ной уксусной кислоты [115]; при этом РНК осаждается,
а белок остается в растворе. Однако РНК, выделенная таким способом, как
показал Френкель-Конрат [532], обладала низкой инфекционностыо. Кроме
того, не все вирусы растений диссоциируют под действием уксусной кис-
лоты [1726].
VII. Концентрированные растворы солей. Вирус
крапчатости конских бобов и вирус мозаики костра распадаются на РНК
и белок под действием 1 М СаС12 [1951, 1952].
VIII. Смешанные методы. Многие вирусы деградируют под
действием органических растворителей. Например, Маркхэм и Смит [1157]
использовали для денатурации ВЖМТ и освобождения РНК 33%-ный этанол
при комнатной температуре. Однако РНК, выделенная таким способом,
оказалась сравнительно низкомолекулярной [394], вероятно, вследствие
ее деградации под действием нуклеаз. При добавлении бентонита удалось
получить инфекционную высокомолекулярную РНК [476]. Для выделения
РНК из ВЖМТ Кейпер [912, 913] применил щелочную обработку при pH
12,0 и температуре 30 °C в течение 30 мин, но полученный таким образом
продукт имел очень низкую молекулярную массу. Для расщепления ВТМ
при комнатной температуре использовали нитрат стронция (7 М) [1335],
по выделенная при этом РНК оказалась неинфекционной. Для выделения
инфекционной РНК из ВЖМТ применяли также замораживание до —75 °C
с последующим оттаиванием [918].
Структур пае компо нент ы
57
Дальнейшая очистка РНК
I. Ф р а к ц и о и и р о в а и и е Р II К, в ы деле и и ой из о ч и -
щ е и н ы х в и р у с п ы х препарато в. Для фракционирования или
частичного фракционирования рибонуклеиновых кислот существуют раз-
личные методы. К ним относятся центрифугирование в градиенте плотности
сахарозы (см., например, фиг. 39), равновесное центрифугирование в гра-
диенте плотности растворов сульфата цезия, фракционирования на колон-
ках с метилированным бычьим сывороточным альбумином па кизельгуре
(MAH') [1913] и электрофорез в полиакриламидном геле [1094, 1320].
11. Ф р а к ц и о и и о п и р о в а п и е с м е с и и у к л е и и о в ы х
к и с л о т, в ы д е л е и и ы х из расти т о л ь и о й ткан и.
С помощью различных модификаций метода экстракции фенолом можно
выделить из инфицированной ткани нуклеиновые кислоты всех типов. Если
соблюдать меры предосторожности при выделении, такие препараты сохра-
няют высокую инфекциониость. Для последующего фракционирования смеси
нуклеиновых кислот наилучшими из существующих методов являются
обычно хроматография па колонках МАК или электрофорез в полиакрил-
амидном геле [1320], хотя емкость этих методов в препаративном плане
сравнительно невелика. Для некоторых экспериментов удобнее применять
фракционирование в градиенте плотности сахарозы. Следует заметить, что
с помощью существующих в настоящее время методов фракционирования
достигнуть четкого разделения многих вирусных РНК от рибосомной РНК
очень трудно или невозможно. В самом деле, для некоторых вирусов суще-
ствование комплекса, образованного между вирусной РНК и рибосомной
РНК, может накладывать серьезные ограничения на применение различных
методов фракционирования. Например, было найдено, что РНК ВЖМТ обра-
зует довольно стабильные комплексы с рибосомной РНК из листьев китайской
капусты (фиг. 4) [1191]. Этот комплекс возникает, вероятно, благодаря
высокому содержанию цитидиловой кислоты в РНК ВЖМТ и высокому
содержанию гуаниловой кислоты в рибосомной РНК. Данных о том, что
РНК ВТМ с более низким содержанием цитидиловой кислоты может образо-
вывать такие комплексы, не имеется.
Подобные же трудности возникают и при использовании других методов
фракционирования РНК ВЖМТ, например при хроматографии на колонках
МАК. Несмотря па то что случай с РНК ВЖМТ, вероятно, является исклю-
Фиг. 4. Образование комплекса между РНК ВЖМТ и рибосомной РНК [1191.
Центрифугирование в градиенте плотности сахарозы смеси молекул РНК, выделенных и.ч здоровых
листьев китайской капусты (Л) и ив листьев, инфицированных ВЖМТ в течение 14 дней
58
Глава IV
читальным, необходимо помнить, что такие комплексы наблюдали и в других
системах и они могут действительно служить препятствием в большей или
меньшей степени при фракционировании смесей нуклеиновых кислот из здо-
ровых или инфицированных клеток.
Компоненты, входящие в состав вирусной РНК
В состав РЫК вирусов растений, как и других РНК, входят фосфат,
D-рибоза, а также два пуриновых (аденин и гуанин) и два пиримидиновых
(цитозин и урацил) основания. Подобно РЫК из других источников, их остов
построен из чередующихся фосфатных и рибозных остатков, соединенных
3',5'-фосфодиэфирной связью. К .Г-атому углерода каждого остатка сахара
присоединено одно из азотистых оснований. Всего таких оснований в РНК
четыре: два пуриновых и два пиримидиновых. РНК вирусов растений исполь-
зовали в качестве объекта в тех основных исследованиях, которые внесли
большой вклад в наши знания о структуре РНК в целом [1154—1156].
В составе некоторых клеточных РНК, особенно транспортной РНК,
обнаружены некоторые необычные основания, например псевдоурацил
и различные метилированные пурины. Такие редкие, или минорные, основа-
ния не встречаются в составе РНК вирусов растений [1081, 1625].
В табл. 4 приведены нуклеотидный состав, число цепей, а также моле-
кулярная масса РНК различных вирусов растений. Для вирусов растений,
которые имеют в качестве генетического материала одноцепочечную РНК,
нельзя ожидать, чтобы количество гуанина было равно количеству цито-
зина, а количество аденина — количеству урацила. И действительно, кат?
явствует из табл. 4, такие вирусы не подчиняются никакому правилу спари-
вания оснований. Только для двух вирусов, у которых РНК двухцепочечная,
отмечается та же закономерность в составе оснований РНК, что и в случае
ДНК, а именно количество гуанина равно количеству цитозина, а количество
аденина — количеству урацила.
Размеры молекул РНК
Данные о размерах молекул некоторых РНК вирусов растений приве-
дены в табл. 4. Вопросы, касающиеся количества генетической информации,
заключенной в вирусной РНК, обсуждаются в гл. VII. У вирусных частиц,
содержащих одноцепочечную РНК, геном существует в виде одпой-един-
ственной полинук леотидной цепи. Лучшим доказательством этого в случае
ВТМ послужило совпадение данных о размерах молекул его РНК, рассчи-
танных на основании известной структуры вирусной частицы и измеренных
в экспериментах с изолированной РНК ВТМ. Каспар [331] вычислил, что
число нуклеотидов на 0,1 им длины вирусной палочки составляет 2,13,±
±0,5%. Длина палочкообразных частиц на основании электронно-микро-
скопических исследований (что наиболее достоверно) была определена рав-
ной 298 нм, что соответствует 6340 нуклеотидам на одну вирусную
частицу. Средняя молекулярная масса нуклеотидного остатка в РНК
с тем же составом оснований, который обнаружен в РНК ВТМ, составляет
322,3. Таким образом, молекулярная масса РНК ВТМ равна 6340-322,3 =
= 2,05-10° дальтон. Эта величина колеблется в пределах примерно ± 2%
[331] и рассчитана для свободной РНК. Натриевая соль РНК ВТМ должна
иметь молекулярную массу, равную 2,19-10° ±2%.
Гирер [627, 628] использовал физико-химические методы для определе-
ния размера РНК, выделенной из ВТМ. При этом необходимо было знать
коэффициент седиментации и величину характеристической вязкости
вирусной РНК. Измерение характеристической вязкости осложнялось тем,
Таблица 4
Молекулярная масса и состав оснований РНК некоторых вирусов растений
— ——- Мол. масса, Состав оснований, % Источник данных
Вирус дальтон гуанин аденин ЦИТОЗИН урацил
С одноцепочечной РНК 29,6
Мозаики люцерны (нижний компо- 1,3-106 21,1 27,8 21,6 [847, 1835]
нент) 1,4-106 1,1-Ю6 25,8 26,4 27,3 22,7 24,2 [910]
Кольцевой пятнистости гвоздики Хлоротической крапчатости коровье- 25,3 20,3 28,2 [82]
го гороха Мозаики коровьего гороха (нижний 1,7-106 23,8 29,1 18,3 28,7 [1822]
компонент) 1,0-106 1,6-Ю6 2,0-Ю6 4,0-105 23,4 24.3 23,2 29,0 [921]
Огуречной мозаики 26 1 24,1 24,0 25,8 [1560]
Деформирующей мозаики гороха 21,8 25,0 34,3 22,8 21,3 [1149, 1511]
Х-вирус картофеля Вирус-сателлит вируса некроза 28,0 22,1 24,9 [1415. 1416]
табака Вирус мозаики Chenopodium rubrum 1,4-10в 2,4-Ю6 26,0 25,8 22,8 25,3 23,0 24,4 28,0 •’3.0 23,0 26,8 [904] [1787]
Южной мозаики фасоли Мозаики тыквы (нижний компонент) зо’в 29,8 16,2 18,5 30,0 26,3 [1195] [331, 1011]
Табачной мозаики Некроза табака 1,6-Ю6 2,0-Ю6 1,5-106 24,4 24 7 27,9 23,9 22,0 23,2 25,7 28,2 [1149, 1511] [919, 1511, 1657]
Кольцевой пятнистости табака 28,4 26,0 20,8 25,8 [442, 1008]
Кустистой карликовости томатов 27,8 26.1 23,7 22,4 [1726]
Морщинистости турнепса 1,9-106 17,4 22,5 38,0 22,3 [1149, 1226]
Желтой мозаики турнепса 16,0 33,0 28,0 22,0 [1206]
Мозаики белого клевера Мозаики дикого огурца 2,4-106 16,4 17,0 41,0 25,6 [1726, 1949]
С двухцепочечной РНК 21,8 28,4 21.6 28,2 [1228]
Карликовости риса Раневых опухолей 10-106 18,6 31,1 19,1 31,3 [210, 656]
60
Глава ZF
что препараты содержали некоторое количество частично деградированной
РНК. Гирер определил экспериментально соотношение между молекуляр-
ной массой, коэффициентом седиментации и вязкостью. На основании полу-
ченных данных он вывел следующее соотношение между молекулярной
массой т и коэффициентом седиментации s: т = 1100 s2>2. Для интактной
РНК, выделенной из ВТМ и имевшей коэффициент седиментации (s), равный
31 S, молекулярная масса оказалась равной 2,1 -Ю6. Эта величина была
подтверждена путем измерения светорассеяния в препаратах биологически
активной РНК, полученной путем тепловой обработки [217]. РНК ВТМ,
выделенная с использованием дюпонола С или методом фенольной экстрак-
ции, имела коэффициент седиментации, равный 30 S, который был определен
с применением сепараторной ячейки. Молекулярная масса этой РНК, изме-
ренная методом рассеяния света, составила 2-10® [563]. Несколькими авто-
рами было предложено в общей форме следующее соотношение между моле-
кулярной массой РНК и коэффициентом седиментации: т = кзЛ. Спирин
предложил соотношение т = 1550 s3-1 [1652], тогда как Холл и др. [846]
на основании данных о 38 различных видах РНК получили следующее
соотношение: т = 1557 з2’07. Такие эмпирические формулы очень полезны,
но следует помнить, что величина коэффициента седиментации зависит
от условий эсперимента. В одних и тех же условиях значения коэффициентов
седиментации двух РНК одного и того же размера могут быть различными,
если они имеют в растворе различное относительное число участков со вто-
ричной структурой. После обработки различных РНК формальдегидом
можно получить истинное соотношение [219].
Инфекционность РНК
В настоящее время имеется ряд убедительных доказательств, что РНК
ВТМ, выделенная из вирусных частиц (т. е. лишенная белковой оболочки),
при соответствующих условиях обладает инфекционностыо. Гирер и Шрамм
[630] использовали несколько критериев для выявления различий между
инфекционностыо интактного вируса и инфекционностыо свободной РНК.
Так, под действием антисыворотки, специфичной в отношении ВТМ, интакт-
ный ВТМ полностью утрачивал свою инфекционность, тогда как инфекцион-
ность РНК лишь незначительно снижалась. Напротив, панкреатическая
рибонуклеаза в низкой концентрации лишала инфекционности вирусную
РНК и не влияла на инфекционность интактного вируса. Интактные инфек-
ционные вирусные частицы в отличие от свободной РНК осаждались при
центрифугировании в течение 1 ч при 50 000 об/мин. Вирус табачной мозаики
может длительное время выдерживаться при комнатной температуре, что
мало влияет на его инфекционные свойства, тогда как препараты РНК ВТМ
в значительной мере теряют свою инфекционность в этих условиях за
48 ч.
Инфекционность препаратов свободной РНК, выделенной из ВТМ,
составляла лишь 0,1% инфекционности интактного вируса, содержащего
эквивалентное количество РНК. Френкель-Конрат и Вильямс [539] пока-
зали, что инфекционность изолированной РНК значительно повышалась
в результате реагрегации белковых субъединиц ВТМ вокруг РНК и образо-
вания вновь палочкообразных вирусных частиц. Когда РНК одного штамма
ВТМ смешивали in vitro с белком другого штамма, с тем чтобы получить
«гибридную» частицу, и этим препаратом заражали растения, то оказалось,
что потомство такого вируса имело белок, специфичный для используемой
в реконструкции РНК [531]. Это было серьезным доказательством в пользу
того, что только РНК определяет специфичность структуры вирусного кап-
сидного белка.
Таблица 5
Сравнение инфекционности препаратов свободной РНК с инфекционностью интактных вирусов 1)
Вирус Растение-индикатор Метод выделения РНК Пн<1«кционность РНК по сравне- нию с инфекцпон- ноетью интакт- ного вируса, % Содержание белка в пре- паратах РНК, % (по массе) Источник данных
Табачной мозаики IV. glutlnosa Бентонпт —фенол 0,05 0,04 [542, 1594]
Табачной мозаики То же Фенол 0,1 0,4 [630]
Табачной мозаики Детергент 0,1 0,4 [540]
Желтой мозапкп турнепса Brassica pekinensis Нагревание 11,3 0,3 [920]
Полосатости висконсинско- го гороха Chenopodium amarantico- lor Бентонит—Na-ДС — фе- нол 0,18 ? [1134]
Кольцевой пятнистости та- бака Vigna sinensis Нагревание 0,1—1,0 0,7 [919]
Погремковости табака Nicotiana tabacum Фепол 1 ? [726]
Погремковости табака Pkaseolus vulgaris » 5 ? [726]
Крапчатости конских бобов Glycine max » 11 4,4 [1013]
Южной мозаики фасоли Phaseolus vulgaris Na-ДС—фенол 16 1 [453]
Крапчатости конских бобов Glycine max Бентонит—фенол 28 0,37 [1013]
Мозаики костра Ghenopodium hybridum. Бентонит—Na-ДС—фе- нол 30 ? [215]
Хлоротической крапчатости коровьего гороха Glycine max Бентонит— Na-ДС—фе- нол 46 (диапазон изменений 12-90) ? [74]
Огуречной мозапкп (У-штамм) Vigna sinensis Фепол 50 (диапазон изменений 10-100) 1 [455]
Огуречной мозапкп To же 1,5 М КС1 75 8 [915]
(Y-штамм)
1) Сравнение проводилось из расчета одинаковой концентрации РНК в ииокулуме. В таблице соблюдается последовательность в соответствии с увеличи-
вающейся инфекционностью по отношению к РНК интактного вируса.
62
Глава IV
В настоящее время инфекционную РНК удалось выделить из многих
вирусов растений. Инфекционность РНК, отнесенная к инфекционности
интактного вируса, сильно варьирует в зависимости от вируса и от метода
выделения РНК (табл. 5).
Может быть несколько причин, обусловливающих тот факт, что большая
часть препаратов вирусных РНК обладает значительно менылей инфек-
ционностыо по сравнению с эквивалентным количеством РНК в интактном
вирусе. Рассмотрим эти причины.
1. Свободная РНК большинства вирусов гораздо сильнее подвержена
инактивации под действием нуклеаз в сравнении с РНК интактного вируса.
Следы нуклеаз из препарата вируса, отстающиеся после экстракции фенолом
или случайно внесенные в раствор РНК из загрязненной стеклянной посуды,
а также из растительного материала во время инокуляции, могут привести
к быстрой инактивации РНК [532]. Однако при проведении всей процедуры
должным образом усовершенствованная техника выделения РНК позволяет
в настоящее время получать препараты РНК, сохраняющие инфекционность
в течение часов или даже дней, если выдерживать их при комнатной тем-
пературе в разбавленных солевых растворах. Инактивация в процессе
выделения РНК вряд ли является основной причиной тех различий в инфек-
ционное™, которые можно наблюдать, взглянув на табл. 5. Из исследован-
ных РНК изолированная РНК ВТМ имеет почти самую низкую инфекцион-
ность по сравнению с интактным вирусом. Тем не менее большая часть РНК
в этих препаратах остается потенциально инфекционной, так как при взаимо-
действии ее с белковыми субъединицами инфекционность реконструирован-
ных частиц может опять возрастать, составляя 50—70% инфекционности
исходного вируса (гл. VII).
2. Свободная РНК, несомненно, более чувствительна к действию нуклеаз
во время инокуляции. Различного рода данные подтверждают точку зрения
о том, что инактивация РНК в инокулуме нуклеазами происходит именно
на этой стадии. Например, добавление ингибитора нуклеаз бентонита к ино-
кулуму или распыление его на листья перед инокуляцией приводит к увели-
чению инфекционности РНК ВТМ в 10—30 раз при заражении листьев
TV. tabacum (сорт Ксапти); отчасти этот эффект, вероятно, может быть объяс-
нен абразивным действием бентонита [1594]. Растения могут очень заметно
отличаться друг от друга по чувствительности к вирусной РНК, причем их
чувствительность к РНК может быть совсем иной, чем при заражении интакт-
ным вирусом [903].
При исследовании зависимости между активностью РНКазы в листьях
Phaseolus vulgaris (сорт Пинто) и чувствительностью листьев к инфицирова-
нию ВТМ и РНК ВТМ при различных условиях Сантилли и др. [1484] пока-
зали, что во всех случаях наблюдается положительная корреляция между
уменьшением количества РНКазы и снижением чувствительности листьев
с увеличением их возраста [1484]. С другой стороны, в листьях, подвергну-
тых нагреванию в темноте, увеличение количества РНКазы сопровождалось
понижением чувствительности. Таким образом, по крайней мере для данной
комбинации растения-хозяина и вируса весьма сомнительно, чтобы низкая
инфекционность вирусной РНК была непосредственно связана с актив-
ностью РНКазы.
3. Различные предварительные обработки растений перед инокуляцией
влияют на число местных поражений, образуемых РНК, по-иному, чем
на число подобных же поражений, вызываемых интактным вирусом [125,
126]. Реакция РНК ВТМ на изменение pH инокулума очень отличается
от реакции интактного вируса [1473]. Так, для РНК имеется очень четкий
оптимум при pH около 9, который не обнаружен при изучении нативного
вируса. Применяя при инокуляции бентонит и щелочной фосфатный буфер,
Структурные компоненты
63
удалось значительно повысить инфекционность’’препарата РНК ВТМ, почти
достигнув инфекционности ВТМ (сравнения проводили, используя листья
N. tabacum (сорт Ксанти) [1473, 1475].
4. Нет никакого сомнения в том, что большая часть белка в препаратах
РНК, перечисленных в табл. 5, была представлена структурным белком,
однако возможность того, что в этих препаратах присутствовало также очень
небольшое количество какого-либо другого белка, нельзя исключить. Можно
предположить, например, что каждый инфекционный РНК-геном должен
содержать одну молекулу белка или один полипептид, необходимый при
проникновении вируса в клетку или для прикрепления к некоторому специ-
фическому рецептору клетки.
В вирусе, имеющем РНК с молекулярной массой 2,0 •10° дальтон, одна
белковая молекула, соответствовавшая по размеру химической субъединице
капсида, составляла бы 1% массы РНК. Это количество белка было доста-
точно легко обнаружить, но РНК в этом случае сохраняла лишь 0,1—1,0%
инфекционности интактного вируса. Таким образом, из 100 или даже из 1000
«комплектов» РНК только один мог иметь белок, необходимый для прикре-
пления к клеточным рецепторам. Кроме того, этот предполагаемый полипептид
должен иметь размеры значительно меньшие, чем капсидный белок вируса.
Вызывает сомнение, можно ли вообще выделить какую-либо инфекцион-
ную вирусную РНК таким образом, чтобы она была совершенно свободна
от белка, который можно было бы выявить в препарате. Наиболее низкое
содержание белка было обнаружено в препаратах инфекционной РНК,
выделенных Фреикель-Конратом и др. [534]. Используя для выявления
белка меченный 3SS вирус, они показали, что их препараты РНК, выделен-
ные с помощью бентонита, содержали ие более 0,03—0,05% белка, имевшего
аминокислотный состав, отличный от состава капсидного белка ВТМ. Это
количество белка в препарате РНК соответствовало одному полипептиду,
соизмеримому с капсидным белком, на каждые 23 молекулы РНК. Взаимо-
действие PHI? с немеченым структурным белком при реконструкции приво-
дило к вытеснению практически всей метки из препарата РНК . Эти экспери-
менты до сих пор, по-видимому, служат лучшим доказательством того, что
для проявления инфекционности вирусной РНК белок не требуется.
Тем не менее следует иметь в виду несколько обстоятельств. Для образо-
вания одного пораженного участка на листе необходимо примерно 10е моле-
кул РНК. Около 5-104 этих молекул в описанных выше препаратах могли
иметь связанную с ними молекулу белка. Возможно, что препараты белка
ВТМ, применяемые для реконструкции, содержат какой-то особый важный
белок (скажем, примерно одну молекулу на 2000 молекул капсидного белка),
который включается в препарат РНК при реконструкции. Холоубек [828]
показал, что белок ВТМ, добавленный к препаратам инфекционной РНК,
увеличивал инфекционность даже в тех случаях, когда реконструкция
не имела места. Яичный альбумин не обладал таким действием.
Размер молекул РНК, необходимый для обеспечения
инфекционности
Ранее предполагали, что РНК ВТМ состоит из нескольких сходных или
идентичных субъединиц, каждая из которых обладает инфекционностыо.
Различного рода эксперименты с очевидностью показали, что инфекцион-
ность обеспечивается всем РНК-геномом в целом.
Лауфер и др. [1046] показали, что облучение ВТМ рентгеновскими
лучами приводит к уменьшению характеристической вязкости РНК, выделен-
ной из такого вируса. Они пришли к выводу, что рентгеновские лучи инакти-
вируют ВТМ, вызывая одиночный разрыв где-то в полииуклеотидной цепи
64
Глава IV
РНК. Гиноза и Норман 1649] показали, что при стандартных условиях
интактный вирус так же чувствителен к инактивации рентгеновскими лучами,
как и свободная РНК (гл. XIV). Они смогли определить молекулярную
массу инфекционной РНК ВТМ, чувствительной к облучению, которая оказа-
лась в пределах от 1,4-Ю8 до 5,4 >10° дальтон. Гирер [627, 628] исследовал
скорость, с которой панкреатическая РНКаза уменьшает вязкость, средне-
весовую молекулярную массу и инфекциониость РНК ВТМ, и пришел к выво-
ду, что размер инфекционной единицы совпадает с размером целого РНК-
генома вируса и что ферментативный гидролиз одной межнуклеотидной связи
достаточен для того, чтобы молекула утратила инфекциоиность. Даже
удаление одного основания с 5'-конца цепи РНК оказывается достаточным
для потери инфекционности [1677].
Более прямым подходом к проблеме были опыты Фризена и Синсхей-
мера [563] с применением сепараторной ячейки в аналитической ультра-
центрифуге. В этом случае после седиментации в определенных условиях
можно непосредственно получить данные о величине коэффициента седи-
ментации инфекционной РНК путем определения инфекционности в капле
жидкости из верхней части центрифужной пробирки. Фризен и Синсхеймер
проанализировали нативную РНК и серию препаратов, содержащих от 4
до 61% первоначального количества недеградированной; РНК. Независимо
от степени деградации препарата РНК в целом коэффициент седиментации
инфекционного материала был равен приблизительно 30S.
Хазелькорн [738] использовал метод фракционирования в градиенте
плотности сахарозы препаратов РНК ВЖМТ, которые содержали как натив-
ные (молекулярная масса«2,3-10е) молекулы РНК, так и продукты деграда-
ции различного размера. При этом оказалось, что инфекционностью обладал
лишь материал, имевший большую молекулярную массу.
Поглощение в ультрафиолете
Подобно другим нуклеиновым кислотам, РНК вирусов растений погло-
щает в ультрафиолетовой области между 230 и 290 нм, что в основ-
ном обусловлено пуриновыми и пиримидиновыми основаниями. В результате
суммирования максимумов поглощения отдельных оснований образуется
сильный пик вблизи 260 нм с впадиной около 230—235 нм. Спектр поглощения
в ультрафиолете обычно мало полезен, если требуется отличить одну вирус-
ную РНК от другой. Однако в случае РНК, подобных РНК ВЖМТ, харак-
теризующейся высоким содержанием цитидиловой кислоты (максимум погло-
щения примерно при 280 нм), спектр поглощения в ультрафиолете заметно
отличается от спектра поглощения РНК с более обычным составом, напри-
мер РНК ВТМ.
Удобным методом определения концентрации РНК в растворе является
измерение поглощения в ультрафиолете при 260 нм в кювете шириной 1 см.
При этом поглощение на единицу массы несколько варьирует в зависимости
от состава оснований. При концентрации 1 мг на 1 мл величина оптической
плотности для РНК ВТМ и РНК ВЖМТ составляет примерно 29 и 23 соот-
ветственно (в 0,01 М растворе NaCl при pH 7,0) [738].
Различные факторы, влияющие на спектр поглощения РНК в ультра-
фиолете, обсуждаются ниже.
Вторичная структура одпоцепочечиых вирусных РНК
В интактной вирусной частице трехмерная структура молекулы РНК
частично или полностью определяется ее взаимодействием с вирусным белком
(гл. V). Здесь мы кратко рассмотрим сведения о конфигурации РНК вирусов
Структурные компоненты
65
240 260 280 300 320
Длина волны, им
Фиг. 6. Влияние изменения концентрации
ионов натрия и температуры па поглоще-
ние РНК ВТМ в ультрафиолете
(15 мкг/мл) [218].
1 — 0,06 мМ Na+; 11=0,17 Л1М Na+; III —
15 «М Na+; IV — 34 мМ Na+; V — 153 мМ Na+;
VIX— 1430 мМ Na+.
Фиг. 5. Влияние изменения pH па спектр
поглощения РНК ВЖМТ в ультрафиолете
(27 мкг/мл) [1226].
I — pH ,4,7 в ацетате калия; II — pH 4,4 п аце-
тате калии; III -- pH 6,9 в какодилате калия;
IV — pH 7,0 в фосфате калия; V — pH 8,0 в
mpue-HCl. Вос буферы содержали 0,1 МКС1 и име-
ли одинаковую ионную силу, равную 0,12.
в растворе. Двухцепочечная ДНК имеет хорошо выраженную вторичную
структуру, которая возникает как следствие спаривания оснований и уклад-
ки их в двойную спираль. Молекулы одноцепочечных РНК не имеют такой
регулярной структуры. Однако с помощью различных физических методов
было показано, что РНК, подобная РНК ВТМ, в растворе при pH около 7,0
и комнатной температуре, например в 0,1 М растворе NaCl, не может суще-
ствовать в форме вытянутой цепи.
При сравнительном изучении поведения ДНК, синтетических полину-
клеотидов и природных PI-IK при нагревании в растворе Доти и др. [469]
пришли к выводу, что при определенных условиях РНК содержит много-
численные незначительной длины спиральные участки, образованные спа-
ренными посредством водородных связей основаниями, перемежающиеся
с одноцепочечными областями. Молекулы РНК при этом имеют более или
менее компактную структуру. Степень спирализации молекулы РНК при
стандартных условиях в некоторой степени зависит от состава оснований.
При различных изменениях в окружающей среде спиральные участки
исчезают и молекула РНК превращается в беспорядочный клубок [165].
Такой эффект может быть достигнут при нагревании, повышении и пони-
жении pH, а также в результате снижения концентрации ионов или изме-
нения ионного состава среды. Переход от спирали к беспорядочному клубку
изменяет ряд физических свойств вирусной РНК. Оптическая плотность
при 260 нм и вязкость увеличиваются, в то время как скорость седимен-
тации уменьшается.
На фиг. 5 показано влияние изменения pH на спектр поглощения РНК
ВЖМТ в ультрафиолете. Изменение оптических свойств РНК при различ-
5-0893
66
Глава IV
Фиг. 7. Зависимость температуры плавле^
иия РНК ВЖМТ от pH [1226].
ных pH обусловлено отчасти изменением в степени спирализации моле-
кулы, а частично связано с изменением в спектре поглощения отдельных
оснований вследствие изменения их ионизации.
На фиг. 6 показано влияние одновременно концентрации ионов Na+
и температуры на оптическую плотность РНК ВТМ [218]. При высокой
концентрации соли (1430 мМ) и температуре 20 °C и ниже относительная
оптическая плотность наименьшая (наибольшая степень спирализации).
При повышении температуры оптическая плотность повышается, так как
происходит «плавление» спиральных участков. При понижении концентрации
соли температура, необходимая для перехода к беспорядочному клубку,
уменьшается.
Кривые, приведенные на фиг. 6, известны как кривые плавления, а тем-
пература, при которой возрастание оптической плотности составляет
половину максимального, называется температурой плавления (7"Пл)- Для
каждого данного типа нуклеиновой кислоты величина Тпл заметно зависит
от pH, как показано на фиг. 7 для РНК ВЖМТ.
Ионы Mg2+ в 25 000 раз эффективнее как стабилизирующие спиральные'
области РНК, чем ионы Na+, о чем свидетельствуют результаты изучения;
кривых плавления [218]. При изменении концентрации ионов Na+ в пределах
от 0,2 до 150 мМ коэффициент седиментации возрастает от 3,26 до 28,2 S;
параллельно с увеличением гипохромного эффекта при 258 нм. Бёдткер
пришла к выводу, что уменьшение скорости седиментации при низкой кон-
центрации соли обусловлено очень большим увеличением эффективной
величины молекул РНК вследствие утраты компактных спиральных
участков.
Поглощение в растворах полирибонуклеотидов, утративших вторичную'
структуру, составляет около 90% поглощения в ультрафиолете, характер-
ного для соответствующих нуклеотидных гидролизатов. С другой стороны,
для структуры, содержащей максимальное число спаренных водородными
связями оснований (например, синтетический спиральный полинуклеотид,
содержащий поли-А и поли-У), поглощение в ультрафиолете составляет
около 60% поглощения составляющих ее нуклеотидов. Доти и др. [469],
на основании сравнения влияния нагревания на оптические свойства РНК
ВТМ и некоторых синтетических полинуклеотидов с известной структурой
пришли к выводу, что при оптимальных условиях около 60% оснований
в растворе РНК должно быть спарено водородными связями. Подобным же-
образом Хазелькорн [738] установил, что в 0,01 М растворе соли около 2/3
оснований РНК ВЖМТ в интактном вирусе спарены, образуя спиральную
структуру и большая часть этой упорядоченной структуры сохраняется
при выделении РНК в благоприятных условиях.
Структурные компоненты
67
Киселев и др. [978] изучили переход спираль — клубок в растворах
РНК ВТМ с помощью электронной микроскопии. В зависимости от ионной
силы, температуры и pH растворов, из которых выделяли образцы для
исследований, удалось наблюдать три различные конфигурации: 1) ком-
пактные молекулы (растворы с высокой ионной силой при комнатной тем-
пературе), 2) палочки диаметром около 3 нм (растворы с низкой ионной
силой при комнатной температуре), 3) вытянутые нити (нагретые или под-
кисленные растворы). Эти конфигурации представлены на фото 5.
Кольцевая РНК
Известно, что одноцепочечная ДНК бактериофага <рХ174 существует
внутри вирусной частицы в виде замкнутого кольца [515]. В связи с этим
возникает вопрос, могут ли некоторые икосаэдрические или крупные вирусы
растений содержать кольцевую РНК. Такая возможность исключается для
палочкообразных вирусов, так как в этом случае имеется одиночная нить
РНК, расположенная по длине палочкообразной частицы.
Страциелли и др. [1686] провели сравнительное исследование деградации
РНК ВЖМТ под действием ЭДТА и панкреатической рибонуклеазы. Об изме-
нении средневесовой молекулярной массы и радиуса вращения судили
на основании данных светорассеяния. Для PITK ВЖМТ, применяя оба
метода деградации, они нашли, что радиус вращения увеличивался перед
началом интенсивной деградации молекулы, в то время как радиус вращения
и средневесовая молекулярная масса РНК ВТМ уменьшались с самого
начала этого процесса. Страциелли и др. объяснили эти данные, иредполб-
жив, что РНК ВЖМТ существует в форме замкнутой петли. Однако эти
результаты можно интерпретировать и по-иному. Например, Хазелькори
[738] показал, что РНК ВТМ и РНК ВЖМТ седиментировали совместно
в условиях pH и ионной силы, сходных с теми, которые были использованы
Страциелли и др. [738]. В противоположность этому кольцевая и линейная
форма ДНК фага срХ174 легко различимы по своим седиментационным свой-
ствам [515]. Кейпер [915] на основании данных о седиментации при различ-
ных условиях высказал предположение, что изолированная РНК вируса
огуречной мозаики (штамм Y) может существовать в двух формах: незамкну-
той цепи и кольцевой структуры. Однако эти данные, также как и в описан-
ном выше случае, можно объяснить по-разному.
Вторичная структура двухцепочечньхх вирусных РНК
Двухцепочечные РНК вируса раневых опухолей и вируса карликовости
риса, подобно двухцепочечной ДНК, обладают значительно более высоко-
упорядоченной вторичной структурой, чем одноцепочечные нуклеиновые
кислоты. Путем определения состава оснований этих РНК можно заключить,
что количество аденина равно количеству урацила, а количество гуанина —
количеству цитозина (табл. 4), т. е. в этом случае точно соблюдается правило
спаривания основанийУотсонаиКрика. Высокоупорядочениая структура этих
РНК позволяет исследовать их, пользуясь рентгенографическими методами,
Томита и Рич [1778] показали, что существует сходство дифракционных кар-
тин, полученных на препаратах нативной РНК вируса раневых опухолей
и препаратах нативной клеточной ДНК, особенно ДНК в A-форме (ДНК
существует в A-форме при низкой влажности, и плоскости пар оснований
в этой структуре наклонены к оси спирали. В В-форме ДНК плоскость пар
оснований перпендикулярна оси спирали). С другой стороны, по некоторым
другим свойствам, например по расстоянию между основаниями (0,303 нм),
РНК вируса раневых опухолей ближе к В-форме ДНК (0,34 нм), чем
5*
68
Глава IV
Температура/С
Фиг. 8. Сравнение крутой кри-
вой плавления двухцепочечной
РНК вируса карликовости риса
(ВКР), сходной с той, которая
обнаруживается для ДНК, с кри-
вой плавления рибосомной РНК
и денатурированной РНК вируса
карликовости риса [1228J.
Плавление проводили в буферном рас-
творе 0,15 М NaCl и 0,015 М цитрата
натрия при pH 7,0. I — РНК ВКР;
II — рибосомпая РНК; III — дена-
турированная РНК ВКР.
к А-форме (0,25 нм). Структурные свойства РНК вируса раневых опухолей
очень сходны со свойствами двухцепочечной РНК реовируса (крупного
вируса, патогенного для животных). Таким образом, как подчеркивают
Томита и Рич [1778], природные двухцепочечные РНК, по-видимому, обра-
зуют класс двухспиральных структур, сходных с ДНК, хотя и несколько
отличающихся от нее. >
При нагревании РНК вируса раневых опухолей в 0,15 М растворе NaCl
и 0,015 М растворе цитрата натрия наблюдали гиперхромный эффект, кото-
рый обнаруживается для ДНК; при этом температура плавления (Тпл) была
очень высока (около 90 °C) и в пределах нескольких градусов поглощение
в ультрафиолете резко возрастало [656].
Дальнейшее подтверждение двухцепочечного строения РНК вируса
раневых опухолей было получено при электронно-микроскопических иссле-
дованиях [1001]. Эта РНК по общему виду и жесткости структуры похожа
на двухцепочечную ДНК. Длина большей части цепей РНК оказалась значи-
тельно меньше 5 мкм, т. е. той величины, которой можно было ожидать,
если бы РНК внутри вирусной частицы представляла собой одиночную цепь.
Большинство цепей имело длину менее 1,5 мкм, а наиболее часто встреча-
лись частицы длиной около 0,3 мкм. Это может объясняться деградацией
интактной структуры РНК или же тем, что РНК может существовать в виде
нескольких единиц внутри вирусной частицы, как это было найдено для
реовирусов (см. ниже).
Двухцепочечное строение РНК вируса карликовости риса было подтвер-
ждено рентгеноструктурным анализом [1489]. Миураи др. [1228] исследовали
влияние повышения температуры на поглощение этой РНК в ультрафиолете
с целью оценки степени спирализации. Подобно РНК вируса раневых опу-
холей, РНК вируса карликовости риса имела кривую плавления, сходную
с кривой плавления ДНК — Тяп = 80 °C в 0,01 SSC (сокращение от 0,15 М
NaCl, 0,015 М цитрата натрия при pH 7,0) (фиг. 8). После денатурации РНК
вируса карликовости риса нагреванием с последующим быстрым охлажде-
нием она вела себя подобно рибосомной и транспортной РНК.
Дальнейшие рентгеноструктурные исследования подтвердили, что
ОН-группы рибозы в двухцепочечной РНК способны участвовать в образо-
вании водородных связей с другими молекулами РНК [36].
Структурные компоненты
69
РНК реовируса представляет собой не непрерывную двухцепочечную
структуру, а состоит приблизительно из 10 или И отдельных двухцепочеч-
ных фрагментов [1840, 1867]. Кроме того, каждая вирусная частица содер-
жит несколько сотен небольших одноцепочечных полинуклеотидов, богатых
адениловой кислотой, функция которых пока неизвестна [143, 1549]. Исходя
из наличия других черт сходства с реовирусами кажется вполне вероятным,
что в вирусе раневых опухолей и в вирусе карликовости риса будут найдены
такие же небольшие одноцепочечные фрагменты.
Вирус раневых опухолей и вирус карликовости риса содержат прибли-
зительно в пять раз больше РНК, чем многие другие вирусы растений (напри-
мер, ВТМ и ВЖМТ). В связи с этим высказывали мысль о том, что двух-
цепочечная структура для таких высокомолекулярных РНК необходима
для того, чтобы сделать их стабильными в отношении клеточных нуклеаз,
однако следует иметь в виду, что на единицу длины цепи небольшие моле-
кулы РНК так же чувствительны к деградации нуклеазами, как и крупные.
Кроме того, некоторые вирусы животных имеют еще более крупные РНК,
для которых характерна тем не менее одноцепочечная структура (например,
вирусы лейкоза птиц). Несмотря на то что эти вирусы, конечно, весьма
нестабильны, они в то же время обладают высокой степенью инфекционности;
Последовательность оснований
Хотя различного рода данные свидетельствуют о том, что общепринятая
концепция генетического кода является правильной, до сих пор не осла-
бевает интерес к попыткам непосредственного сопоставления данных хими-
ческого анализа последовательности оснований в природных информацион-
ных РНК и последовательности аминокислот в кодируемых ими белках.
Такие данные могут дать интересную информацию, касающуюся природы
«мест узнавания» и регуляции считывания полицистронной матрицы,
т. е. дать ответ на вопрос как начинается и как заканчивается трансляция
матрицы и как осуществляется контроль скорости считывания различных
цистронов.
Мелкие вирусы растений, как, например, ВТМ и вирус-сателлит вируса
некроза табака, представляются очень удобной моделью для такого рода
исследований. Преимущества ВТМ в этом плане связаны с доступностью
больших количеств вируса, а также с тем, что здесь известна аминокислот-
ная последовательность структурного белка большинства мутантов; удобство
использования вируса-сателлита обусловлено небольшими размерами его
РНК. Верхний компонент вируса мозаики люцерны (гл. VIII) благодаря
своему небольшому размеру также может служить подходящим материа-
лом для изучения нуклеотидной последовательности РНК.
Первичная структура полностью определена только для некоторых
транспортных РНК и 5S-PHK. В сравнении с ними даже небольшие РНК
вирусов растений выглядят слишком крупными, и к тому же в их составе
не обнаружено необычных оснований, которые могли бы облегчить иденти-
фикацию фрагментов. Определение последовательности нуклеотидов воз-
можно почти всегда только при использовании меченой РНК. Однако воз-
можность получения с помощью современных методов РНК вирусов растений
с достаточно высокой удельной активностью вызывает сомнение. Например,
вводя в зараженное растение МСО2 с активностью 50—10 мКи в течение
12—14 дней, Сугияма и Френкель-Коират [1699] получили ВТМ с удельной
активностью 2—10-10° имп (мин-мг). Таким образом, технические стороны
проблемы достаточно сложны.
Первой ступенью в исследовании последовательности оснований
является определение концевых групп в цепи РНК. Результаты ранних
70
Глава IV
работ в этой области оказались сведенными к нулю вследствие того, что
исследуемая РНК была уже частично деградирована, что обусловливалось
применявшимися тогда методами ее выделения, и, кроме того, вирусные
препараты содержали примесь загрязняющего их нуклеотидного материала.
Другой трудностью было присутствие следов рибонуклеазной активности
даже во многих высокоочищенных препаратах ВТМ [1908]. Витфельд
и Вильямс нашли, что обработка очищенного ВТМ 0,02 М версеном при
соответствуюпщх условиях почти полностью удаляет примесь фермента.
Два исследованных вируса растений — ВТМ [1700] и ВЖМТ [1413] —
содержат нефосфорилированный аденозин па 5'-конце РНК. С другой сто-
роны, РНК вируса-сателлита имеет на 5'-конце фосфорилированную после-
довательность: ффАфГфУ — [1416, 1920, 1921].
Предложенный Витфельдом [1906] метод ступенчатой деградации поли-
рибонуклеотидов и различные более современные его модификации дают
возможность определить лишь последовательность нескольких концевых
оснований вследствие того, что некоторые из используемых реакций не идут
до конца, а также в связи с лабильностью межнуклеотидных связей. В РНК
ВТМ была определена последовательность двух оснований на З'-копце
(— ЦфА) [1907]. Штейшпнейдер и Френкель-Конрат [1677], применяя анилин
в качестве катализатора при деградации межнуклеотидных связей, получили
данные, позволяющие предполагать, что концевая последовательность имеет
следующий вид: ГфЦфЦфЦфА, что и было в дальнейшем подтверждено [651].
Некоторую информацию об относительной частоте встречаемости опре-
деленных нуклеотидных последовательностей в вирусной РНК можно полу-
чить с помощью двух ферментов, которые расщепляют РНК в специфиче-
ских местах: 1) панкреатической рибонуклеазы, которая гидролизует 3',5'-
фосфодиэфирную связь со стороны 5'-атома углерода рибозы в местах, где
пиримидиновое основание расположено со стороны З'-фосфодиэфирной связи
.[1148], 2) рибонуклеазы Т17 выделенной из такадиастазы, которая специфически
расщепляет РНК там, где находятся остатки гуаниловой кислоты [485].
В своих классических исследованиях по изучению действия панкреа-
тической рибонуклеазы на РНК вирусов растений Маркхэм и Смит [1154—
1156] использовали хроматографию на бумаге и методы электрофореза для
разделения фрагментов длиной до трех нуклеотидов. Современные методы
хроматографии на колонках оказались более эффективными для разделения
длинных олигонуклеотидов. При фракционировании олигонуклеотидов на
колонках с ДЭАЭ-целлюлозой в 7 М мочевине смеси разделяют вплоть
до фрагментов, содержащих 8 нуклеотидов [1643]. Олигонуклеотиды такого
размера можно затем разделить с помощью ионообменной хроматографии
на колонках со смолой Дауэкс I. Солимози и др. [1643] удалось удачно фрак-
ционировать уникальные олигонуклеотиды, содержащие до 5 нуклеотидов.
Таким образом, оказалось возможным получить данные об относительной
частоте определенных последовательностей длиной до пяти нуклеотидов
и сравнить их с частотой, вычисленной в предположении беспорядочного
распределения нуклеотидов. Такой анализ можно провести для РНК раз-
личных штаммов одного вируса (гл. XIII). Однако это слишком длинный
путь для получения информации о полной последовательности оснований
в какой-то вирусной РНК. Необходимой промежуточной стадией при выяс-
нении полной последовательности оснований будет выделение фрагментов
РНК, достаточно больших, чтобы в них содержались уникальные последо-
вательности оснований и идентифицируемые участки перекрывания с дру-
гими последовательностями, но в то же время достаточно коротких для того,
чтобы было осуществимо определение последовательности оснований. Эти
требования ограничивают средний размер таких фрагментов РНК длиной
приблизительно 20—50 нуклеотидов.
С тру кту р ные компо ненты
71
Интересные данные, касающиеся этой проблемы, были полупены Мун-
дри [1247] при исследовании РНК ВТМ. РНК в этих опытах гидролизовали
рибонуклеазой и продукты гидролиза фракционировали па колонках
с гидроксилапатитом. В результате применения таких колонок не было
достигнуто хорошего разделения коротких нуклеотидов, по это позволило
сконцентрировать внимание на материале, элюируемом много позже, нем
основная масса гидролизата, и хорошо отделявшемся от всех других ком-
понентов (фиг. 9). Мундри установил, что этот полинуклеотид состоял из
39 ± 2 оснований и, по-видимому, содержал единственный остаток гуанина,
как и можно было ожидать, исходя из специфичности действия рибонукле-
азы Tt.
Мундри пашел такой полинуклеотид в обычном и далемском штамме
и штамме U2 ВТМ, тогда как в подорожниковом штамме Холмса он отсут-
ствовал. Существование этого полинуклеотида Мундри попытался связать
с современными данными о кодировании определенных аминокислот, встре-
чающихся в структурном белке различных штаммов ВТМ. Эта работа
наглядно показывает те трудности, с которыми мы сталкиваемся при опреде-
лении полной последовательности оснований в молекулах такого размера,
как ВИК ВТМ, и при попытках связать те или иные участки этой последо-
вательности со структурным белком.
Во-первых, упомянем технические трудности, связанные с необходимо-
стью специфичного расщепления РНК, с тем чтобы получить уникальные
полинуклеотиды нужного размера, выделить их и определить в них после-
довательности оснований. Во-вторых, высокая степень вырожденности гене-
тического кода делает возможным существование стольких различных вари-
антов последовательностей оснований, что предсказание, основанное на
известной последовательности аминокислот, может принести очень мало поль-
зы. В-третьих, как мы увидим в гл. VII, большая часть вирусных РНК типа
РНК ВТМ кодирует более чем один белок. Таким образом, возникает проб-
лема, является ли тот или иной фрагмент РНК цистроном структурного
белка, служит ли он частью этого цистропа или вообще не входит в него.
Полинуклеотид, содержащий 39 оснований, найденный в РНК ВТМ, воз-
можно, удастся идентифицировать путем сравнения РНК ряда штаммов,
различающихся по аминокислотной последовательности. Выбрав комбина-
ции триплетов, не содержащие гуанина, способные кодировать аминокис-
лоты структурного белка, Мундри рассчитал, что максимальная длина
устойчивого к рибонуклеазе Tt полинуклеотида в цистроне структурного
белка ВТМ пе должна превышать 31 нуклеотид. Следовательно, эксперимен-
тально выделенный полинуклеотид, состоящий из 39 оснований, должен,
Номер фракции
Фиг., 9. Профиль элюции олигонуклеотидов, полученных в результате гидролиза РНК
ВТМ (штамм Us) рибонуклеазой Ti, фракционированных на колонках с гидроксилапати-
том [1247].
Элюирование фосфатным буфером, содержащим мочевину. Компонент, элюируемый последним и хорошо
отделяемый от остального материала, представляет собой олигонуклеотид из 39 оснований (фракция
примерно 440). Но оси ординат справа отложена молярность фосфатного вуфера.
72
Глава IV
вероятно, содержать цо крайней мере несколько нуклеотидов, не имеющих
отношения к структурному белку.
Подобным же образом Менделес [1140] изолировал из Т,-гидролизата
РНК ВТМ три уникальных олигонуклеотида. Каждый из них встречался
в молекуле РНК только один раз, и самый большой из них содержал 70 нук-
леотидов. Состав оснований этих олигонуклеотидов еще не определен, но
Менделесу удалось установить приблизительное положение этих олигонук-
леотидов в молекуле РНК, удаляя структурный белок методом ступенчатой
депротеинизации под действием детергента со стороны З'-конца, как это
делали Мэй и Найт [1192] (гл. XIII). Удаляя разное количество структурного
белка, Менделес определил, какая часть каждой из уникальных последова-
тельностей «обнажалась» в каждом случае. Затем он смог определить их
положение относительно З'-конца. Оказалось, что они не выявлялись вблизи
того участка, где, как установили Кадо и Найт [906], находится ген, ответ-
ственный за возникновение местных поражений (фиг. 52).
Рассматривая возможную кодирующую роль 69 нуклеотидов, не содер-
жащих гуанина, Менделес пришел к выводу, что ближайшая it З'-концу
уникальная последовательность не могла целиком участвовать в кодирова-
нии капсидного белка и что поэтому, вероятно, данный цистрон распола-
гался не у З'-конца РНК.
Хайтон и Бир [776] в предварительном сообщении описали совершенно
иной подход к проблеме нуклеотидной последовательности РНК ВТМ. Они
определили условия, при которых удается расположить интактные моле-
кулы РНК на пленке-подложке электронного микроскопа в растянутом
виде. Расстояние между основаниями, как было установлено, составляет
0,6—0,7 нм. Если в принципе возможно связать малые электронноплотные
молекулы-маркеры со специфическими основаниями РНК, расположенными
на расстоянии 0,6—0,7 им, то, возможно, мы могли бы получить данные
о распределении оснований по длине молекулы РНК.
Вирус растений, содержащий ДИК
Шеферд и др. в 1968 г. представили первые убедительные доказатель-
ства существования вируса растений, содержащего ДНК. Было обнаружено,
что вирус мозаики цветной капусты, для которого характерны сферические
Фиг. 10. Установление природы нуклеиновой кислоты вируса мозаики цветной капусты
[1561].
Видно совпадение пиков, соответствующих ДНК, и пиков инфекционности после равновесного центри-
фугирования в градиенте плотности хлористого цезия. Содержание ДНК выражено числом микрограмм
на фракцию. I — оптическая плотность при 260 нм; II — инфекционность; III — ДНК. Л
Структурные компоненты
73
частицы диаметром около 50 нм [1343], после соответствующей очистки со-
держит только ДНК. Эта нуклеиновая кислота была идентифицирована как
ДНК на основании следующих признаков: 1) положительной реакции с ди-
фениламином; 2) наличия тимина; 3) потери инфекционности выделенной
из вируса нуклеиновой кислоты под действием панкреатической дезоксирибо-
нуклеазы, но не рибонуклеазы; 4) того факта, что при равновесном центри-
фугировании очищенного вируса в градиенте плотности хлористого цезия
материал, поглощающий при 260 нм, материал, определяемый как ДНК по
реакции с дифениламином, и материал, обладающий инфекционностью,
сосредоточивались в одной зоне градиента (фиг. 10).
Результаты более поздних исследований (Шеферд, личное сообщение)
позволяют предположить, что ДНК этого вируса является двухцепочечной.
БЕЛКОВАЯ СУБЪЕДИНИЦА
Обычно принято считать, что все белковые субъединицы, из которых
построена оболочка палочкообразных или мелких изометрических вирусов
растений, идентичны. Однако эта однородность не продемонстрирована до-
статочно убедительно ни для одного вируса. Наиболее вероятно, что это
утверждение справедливо для таких палочкообразных вирусов, как ВТМ.
Очищенные препараты вируса крапчатости бобов фасоли и вируса желтой
мозаики коровьего гороха (ВЖМКГ) обладают электрофоретической гетеро-
генностью. Электрофорез в полиакриламидном геле в 8 М мочевине позво-
ляет выявить в препарате белка, экстрагированного из интактного ВЖМКГ
67%-пой уксусной кислотой, 6 основных и 2 минорные полосы [1534]. При-
рода этих фракций пока не установлена, но вполне возможно, что это одна
и та же химическая субъединица в различных физических состояниях, а не
ряд разных полипептидов. Некоторые мелкие вирусы животных содержат
более одного типа структурных белков. Вероятно, то же будет обнаружено
и для некоторых вирусов растений. Так, исследования последнего времени
позволяют предположить, что в состав капсида вируса мозаики коровьего,
гороха, вероятно, входят по крайней мере два различных белка (Шеферд,
личное сообщение).
Выделение белка из вирусных препаратов
Многие условия и реактивы, применяющиеся для выделения вирусной
РНК, могут быть также использованы для получения вирусного белка, в боль-
шей или меньшей степени свободного от РНК. Однако наилучший метод,
применяемый для выделения интактной РНК данного вируса, обычно отли-
чается от метода, позволяющего получать удовлетворительные препараты
белка. Химическое и физическое состояние получаемого белка широко,
варьируют в зависимости от вируса и применявшейся обработки. Можно
получить несколько разных типов белковых продуктов: 1) интактные белко-
вые оболочки вируса, из которых удалена РНК; 2) нативные и в различной
степени агрегированные химические субъединицы; 3) необратимо денатури-
рованные белковые агрегаты, нерастворимые в водных растворах. Основным
фактором, приводящим к образованию нерастворимых агрегатов, является
образование дисульфидных мостиков между цистеиновыми остатками в бел-
ковых субъединицах вследствие окисления сульфгидрильных групп. Обра-
зование дисульфидных связей между цепями может быть блокировано раз-
личными способами.
74
Глава IV
Кислотная обработка
Френкель-Конрат [532] описал изящный и простой метод выделения
белковых субъединиц из ВТМ путем обработки вируса холодной 67%-ной
уксусной кислотой. Степень легкости, с которой диссоциирует вирус, варьи-
рует в зависимости от штамма данного вируса. При низких концентрациях
белка или в щелочной среде (pH 13,0) субъединицы существуют в виде моно-
меров с константой седиментации « 2,0 S. В других условиях субъединицы
находятся в состоянии различной степени агрегации. К сожалению, описан-
ный метод экстракции белка уксусной кислотой не всегда применим. Так,
обработка ВЖМТ 67%-ной уксусной кислотой приводит к образованию
нерастворимого агрегата благодаря тому, что четыре сульфгидрильные
группы в белке ВЖМТ чрезвычайно легко окисляются. После окисления
надмуравьиной кислотой или восстановления сульфитом в 8 М мочевине
агрегированный белок превращается в химически модифицированный водо-
растворимый продукт [710].
Широкие различия в степени устойчивости разных вирусов к обработке
67%-ной уксусной кислотой можно проиллюстрировать тем, что вирус мо-
заики дикого огурца, как было показано, не полностью диссоциирует на
белок и РНК [1726, 1949, 1950] и при этом возникает нерастворимый про-
дукт, тогда как вирус морщинистости турнепса вообще не деградирует.
Мики и Найт [1205] показали, что в результате обработки вируса крапчато-
сти конских бобов 66 %-ной муравьиной кислотой в течение 18 ч при 37 °C
образуется водорастворимый продукт, тогда как применение ряда других
методов было безуспешным. В настоящее время существуют более эффектив-
ные способы получения белка из этого вируса [775].
Белок большинства вирусов можно выделить в денатурированном со-
стоянии путем соответствующей кислотной обработки. Например, нагрева-
ние до 90 °C в 5—10%-ной трихлоруксусной кислоте в течение 10 мин обычно
приводит к деградации РНК до низкомолекулярного материала. Денатури-
рованный белок может быть выделен путем осаждения этанолом.
Концентрированные солевые растворы
Обработка 1 М раствором хлористого кальция приводит к диссоциации
и солюбилизации белка оболочки вируса крапчатости конских бобов [1951]
и вируса мозаики костра [1952]. Белок, полученный этим способом из вируса
мозаики костра, оказался, согласно данным седиментационного анализа,
относительно стабильным димером химических субъединиц. Был разработан
также простой метод получения низкомолекулярного белка из нескольких
мелких изометрических вирусов; этот белковый препарат при реконструк-
ции с РНК образует инфекционные вирусные частицы [775]. Белковые субъ-
единицы из вируса хлоротической крапчатости коровьего гороха, вируса
мозаики костра и вируса крапчатости конских бобов были получены путем
диализа вируса против раствора, содержащего 1 М NaCl, 0,02 М трис-
буфер, 10-3 М реактив Клеланда (pH 7,4 при 22 °C), в течение 24щ при 4 °C.
Далее белок выделяли центрифугированием.
Щелочная обработка
РНК ВЖМТ легко выделить в нейтральной или слабощелочной среде;
при этом выявляются интактные или почти интактные пустые белковые
оболочки (процесс зависит от температуры и ионной силы) (см. гл. XIV).
Обработка ВТМ при pH 10,0—10,5 использовалась многими исследо-
вателями (см., например, [118, 1507]) для диссоциации вируса и получения
Структурные компоненты
75
растворимого белкового препарата, названного А-белком. Основным компо-
нентом препарата А-белка является агрегат трех химических субъединиц,
сохраняющих нативное состояние [85], однако молекулярная масса его колеб-
лется от 50 000 и выше в зависимости от pH, температуры, ионной силы
и концентрации (гл. V).
В мягких щелочных условиях можно отделить белок от РНК также
у других вирусов, ио образующийся при этом продукт часто нерастворим
при pH около 7,0 или находится не в мономерном состоянии (например,
Х-вирус картофеля [111]; вирус мозаики дикого огурца [1950]).
Нагревание
Для выделения РНК большинства вирусов растений, а также для денату-
рации и осаждения белка достаточно нагревания при 95—100 °C в присут-
ствии. соли (>0,1 М) при pH 7,0 в течение пяти или более минут. Темпера-
тура, необходимая для освобождения РНК какого-то определенного вируса,
может сильно зависеть от pH и ионной силы среды.
Обработка детергентами
Для диссоциации некоторых вирусов на белок и РНК применяли доде-
цилсульфат натрия [533, 1654]. Образующийся при этом белок обычно рас-
творим и имеет низкую молекулярную массу, но денатурируется под дей-
ствием этого детергента. Детергент связывается с белком, и это может серьез-
но мешать дальнейшему исследованию материала. В случае ВТМ связанный
детергент делает белок непригодным для опытов по реконструкции. Мэй
и Найт [1192] установили, что обработка ВТМ додецилсульфатом натрия
приводит к удалению белка предпочтительно с того конца палочки, где
находится З'-конец РНК.
Действие гуанидингидрохлорида и мочевины
Эти два соединения, вызывающие денатурацию белка, также приме-
нялись для диссоциации вирусов на РНК и белковые субъединицы. Диссо-
циация в мочевине часто оказывается неполной. Джонард и др. [895] показа-
ли, что высокомолекулярная РНК может высвободиться из ВЖМТ в слу-
чае обработки 8 М мочевиной при pH 7,0, что приводит к образованию боль-
шого количества интактных пустых белковых оболочек. Однако Харрис
и Хиндли [710] осуществили карбоксиметилирование ВЖМТ иодацетатом
в присутствии 8 М мочевины при pH 8,2 и температуре 30 °C, получив водо-
растворимый мономер. Этот метод, вероятно, является лучшим среди извест-
ных в настоящее время методов получения водорастворимых белковых субъ-
единиц ВЖМТ.
Фенольная обработка
Обработка фенолом, применявшаяся для выделения вирусных РНК,
вызывает денатурацию вирусного белка. В большинстве случаев эта денату-
рация, вероятно, необратима. Однако Андерер [20, 21] нашел, что денату-
рированный белок ВТМ может быть выделен из фенольной фазы осаждением
метанолом и ренатурирован нагреванием до 60 °C при pH 7,0—7,5. О рена-
турации белка ВТМ свидетельствовали его растворимость в нейтральной
водной среде, серологическая активность, а также способность образовывать
вирусоподобные палочки при реполимеризации, а при инкубации с РНК
.ВТМ — инфекционные вирусные частицы.
76
Глава IV
Смешанные обработки
ВЖМТ деградирует под действием четвертичных солей аммония, имею-
щих общую формулу CnH2n+iN(CH3)3Br, в то время как пустые вирусные'
белковые оболочки значительно более стабильны в этих условиях. Реакция
вируса с янтарным [564] или уксусным [536] ангидридом приводит к обра-
зованию химически модифицированных белковых субъединиц.
Аминокислотный состав
Белки всех исследованных до сих пор вирусов растений построены
из тех же 20 аминокислот, которые обнаружены в белках клеток растений,,
животных и бактерий.
Аминокислотный состав вирусных белков определяют следующим обра-
зом: 1) выделяют вирус, не содержащий значительных примесей других
белков; 2) удаляют вирусную РНК; 3) гидролизуют белок (обычно с помо-
щью 6 п. НС1) для расщепления его на аминокислоты; 4) фракционируют
и определяют отдельные аминокислоты. Триптофан определяют отдельно,
при помощи специального метода.
Детали использованных методов мы не можем здесь рассматривать,
однако некоторые обстоятельства следует отметить. Например, в процессе
гидролиза происходит превращение амидов — аспарагина и глутамина —
в соответствующие кислоты. Поэтому если эти амиды содержатся в белках,
то они выявляются в виде аспарагиновой и глутаминовой кислот, как это
показано в табл. 6. Если в нативном белке содержится цистин, то при-
анализе он определяется как цистеин.
Чтобы определить число различных аминокислотных остатков в белко-
вой субъединице, необходимо знать ее размер. Его можно определить раз-
ными путями, например на основании седиментационных данных, по процент-
ному аминокислотному составу (приняв, что аминокислота, содержащаяся^
в наименьшей концентрации, представлена только одним остатком в субъ-
единице), по данным количественного определения триптических пептидов
и по анализу концевых аминокислот.
В табл. 6 приведено число остатков различных аминокислот в белковых
субъединицах ряда вирусов растений.
Зная аминокислотный состав, мы можем лишь в общих чертах судить
о сходстве белков между собой. В то же время последовательность амино-
кислот в полипептидной цепи, имеющая исключительно важное значение
в определении вторичной и третичной структуры, а тем самым и уникаль-
ного набора свойств каждого белка, позволяет нам понять, как белки раз-
личаются между собой. Тем не менее имеются некоторые моменты, на которые
стоит обратить внимание при рассмотрении аминокислотного состава. В струк-
турных белках вирусов растений не только найдены те же 20 аминокислот,
что и в других объектах, но и содержатся они в соотношениях, сходных
с теми, которые наблюдаются в других живых организмах. Например,
цистеин, метионин, триптофан, гистидин и тирозин обычно обнаруживаются-
в малых количествах.
С другой стороны, как указывали Харрис и Хиндли [710], относитель-
но высокое содержание оксиаминокислот (серина и треонина) является неиз-
менным свойством до сих пор изученных вирусов растений. Они предпо-
лагают, что возможности связывания водорода, обусловленные боковыми:
цепями этих аминокислот, вероятно, облегчают сборку вирусных частиц,.,
которые оказываются полностью сформированными.
Таблица 6
Аминокислотный состав капсидных белков 1)
Вирус Ала Apr Асп Цис Глу Гли Гис Иле Лей Лиз Мет Фен Про Сер Тре Три Тир Вал Всего Источник данных
Икосаэдрические вирусы
Мозаики люцерны 30 16 30 5 25 21 8 7 29 21 4 20 23 20 15 2 5 16 297 [846]
Крапчатости бобов фасоли 2) 14 6 21 — 17 21 3 12 18 9 7 11 13 18 14 — 2 15 201 [1534]
Крапчатости кон- 22 12 13 2 17 10 2 7 18 15 2 7 9 18 10 0 4 22 190 [1951]
ских бобов
Мозаики костра 33 13 10 1 18 10 4 8 15 13 3 5 7 13 11 2 5 18 189 [1689]
Крапчатости гвоз- дики 31 19 36 5 31 29 1 19 28 25 9 14 24 28 36 2 10 35 382 [1788]
Кольцевой пятни- 24 16 34 3 23 20 2 16 26 14 7 12 20 37 37 4 16 36 347 [910]
стости гвоздики
Хлоротической 25 9 И 2 16 10 2 7 16 12 1 4 7 16 17 4 5 19 183 (82]
крапчатости
коровьего гороха
Огуречной мозаи- 17 24 30 0 20 16 4 16 26 18 8 7 18 32 17 1 11 22 287 [1831]
ки
Некроза огурца 41 17 46 0 24 32 3 20 33 16 1 20 23 32 31 7 12 33 391 [1788]
Деформирующей 17 21 21 3 14 21 4 7 10 11 3 7 И 16 13 2 5 13 199 [1560]
мозаики гороха
Вирус-сателлит 28 25 57 3 32 28 8 25 29 15 9 14 9 24 34 — 8 25 373 Риис и Касса- ниСь личное
вируса некроза
табака сообщение
Мозаикп Chenopo- dium rubrum 15 8 16 2 12 16 3 9 12 12 5 4 12 14 13 3 7 13 176 [904]
Продолжение табл. 6
Вирус Ала Apr Асп Цис Глу Гли Гис Иле Лей Лиз Мет Фен Про Сер Тре Три Тир Вал Всего Источник данных
Южной мозаики фасоли 24 20 18 3 18 19 2 12 28 7 7 4 14 26 32 5 10 21 270 [1787]
Мозаики тыквы2) 19 7 21 — 14 15 3 14 19 8 4 10 10 16 17 — 3 9 189 [1195]
Кустистой карли- ковости тома- тов 2) 37 20 44 3 21 38 5 13 43 13 3 14 16 35 45 2 10 40 402 [442]
Кольцевой пятни- стости томатов 15 11 10 5 18 18 5 13 24 10 3 15 12 16 15 5 7 10 218 [1789]
Кольцевой пятни- стости табака 15 8 17 — 14 15 6 11 14 9 3 10 11 14 13 — 6 И 177 [1657]
Морщинистости турнепса 17 9 14 1 16 15 1 5 И 12 2 6 9 12 14 4 4 12 164 [1426]
Желтой мозаики турнепса 15 3 11 4 15 8 3 15 18 7 4 5 20 16 26 2 3 14 189 [1726]
Мозаики дикого огурца 15 5 15 2 11 9 3 13 24 9 1 8 Палочкообразные вирусы 19 26 13 1 3 12 190 [1726]
Х-вирус картофе- ля 38 8 19 2 15 11 2 10 8 10 6 10 14 14 24 6 2 И 210 [1207]
S-вирус картофеля 13 11 16 1 17 9 3 10 9 4 6 4 И 10 8 — 3 10 144 [1788]
Табачной мозаики 14 11 18 1 16 6 0 9 12 2 0 8 8 16 16 3 4 14 158 [1794]
Погремковости табака (нижний компонент) 21 10 20 — 16 7 1 3 14 15 3 И 13 21 10 — 5 8 178 [1533]
Мозаики белого клевера 19 6 12 2 9 7 2 9 10 8 2 6 8 10 И 2 3 7 133 [1206]
1) Вероятно, некоторые данные об общем числе аминокислотных остатков в капсидном белке ряда вирусов значительно завышены вследствие того, что гид-
родинамические измерения проводили на агрегатах субъединиц [1207]. 0 — аминокислота отсутствует; — аминокислота не определялась.
2) Данные пересчитаны Тременом и Голдшоком [1788].
Структурные компоненты
79»
Концевые аминокислоты
Харрис и Найт [711], используя карбоксипептидазу (одну из экзопеп-
тидаз, отщепляющих С-копцевую аминокислоту), доказали, что С-конце-
вой аминокислотой в белке ВТМ является треонин. Этот фермент действует
па интактный ВТМ, тогда как интактный ВЖМТ устойчив к действию карбо-
ксипептидазы. Однако в окисленном или карбоксиметилированном ВЖМТ'
треонин выявляется как С-концевая аминокислота. Концевые аминокислот-
ные остатки белков различных вирусов приведены в табл. 7.
Таблица 7
Концевые аминокислоты и молекулярная масса капсидных белков
некоторых вирусов растений
Вирус N-копцевая аминокислота С-копце- вая амино- кислота Молеку- лярная масса белковой субъеди- ницы Источник, данных
Мозапкп люцерны N-ацотилсерип Аргинин 32 600 [846, 1826J
Крапчатости конских бобов По определяется; вероятно, ацетили- рована Алапин 20 500 [1951]
Огуречный вирус 3 и 4 То же )> 29 000. [1276],
Х-вирус картофеля Неизвестная ацети- лированная амино- кислота Пролин [1207],
Вирус-сателлит ви- руса некроза табака Алании Алании 27 000 [1413,. 1452]'
Мозаики Chenopodium rubrum Не определяется; вероятно, ацетили- рована Лизин 19 200 [904].
Табачной мозаики N-ацетилсерин Треонин 17 530 [711, 1261]
Кустистой карлико- вости томатов Ие определяется; вероятно, ацетили- рована Лейцин — [1276]
Желтой мозаики тур- непса N-ацотилмотиоиин Треонин 20 000 [709, 710}
Мозаики белого кле- вера Не определяется; вероятно, ацетили- рована Аргинин 14 300 [1200]
Интересным свойством белков многих вирусов является отсутствие
в них свободной N-копцевой аминогруппы. Во многих капсидных белках,
исследованных до настоящего времени, N-концевая аминокислота ацетили-
рована. Это создавало большие трудности для исследователей, изучавших
аминокислотную последовательность белка ВТМ. Ведь именно то, что N-
концевая аминокислота ацетилирована, приводило к выводу об отсутствии
свободной N-концевой аминогруппы при использовании таких стандартных
методов анализа N-концевых групп, как обработка 1-фтор-2,4-динитробензо-
лом и лейцинаминопептидазой. Существование ацетилированных N-конце-
вых групп было показано путем выделения из ферментативного гидролизата
отдельного пептида, не содержащего основных групп, а также на основании
результатов химических тестов.
Последовательность аминокислот в структурных белках
Первичная структура белка ВТМ была установлена Френкель-Конра-
том и его сотрудниками [1797], а также группой немецких исследователей
[23]. Однако, прежде чем это удалось сделать, было много трудностей, касаю-
80
Глава IV
5 10 о 15
Ацетил-Я-Сер-Тир-Сер-Иле-Тре—Тре-Про-Свр-Елн-Фен-Вал-Фел-Лей—Сер —Сер %
30 25 20
С Ала—Лен — Тре — Цис—Лей—Асн—Иле-Лей—Глу—Иле—Про—Асп—Ала—Три—Ала.-4
35 40 /—ч 4S
Лей — Гли—Асн—Глн—Феи—Глн—Тре —Глн—Глн — Ала-(Арг)-Тре —Вал— Глн— Вал,
60 55 50 ч
С Вал—Тре —Вал— Глн—Про—Сер—Про —Лиз —Три -Вал-Глн - Сер—Фен —Глн — (Аре)
65 Z-X 70 х—, 75
Арг) -Фен-Про-Асп-Сер—Асп-Фен—(jluej-Вал-Тир-Мрг)—Тир-Лен—Ала— Вал,
90 85 80
С(Арг)—Тре —Асп —Фен — Ала— Гли—Лей —Лей -Ала-Тре —Вал—Леи —Про —Асп —Леи >
95 100 105
Асн -(Арг)-Иле-Иле-Глу —Вал-Глу —Асп —Глн —Ала—Асн — Про—Тре —Тре —Ала,
120 115 х-, 110
С Ала—Вал—Тре -Ала-Асп —Асп—Вал—Аре-(Apej-Tpe —Ала—Асп—Лей—Тре-Глу^
125 130 z-ч. 135
Иле—(Apaj-Cep—Ала—Иле—Асн — Асн— Леи-Иле-Вал—Глу—Лей — Илв-(Арг) — Гли,
150 145 ^-=4 140
С Лей —Гли—Сер-Сер— Сер—Глу—Фен—Сер—Сер-0рг)—Асн—Тир-Сер—Гли—Тре *
155 15.8
Вал—Три —Тре—Cep-Гли—Про—Ала—Тре
Фиг.' 11. Последовательность расположения аминокислот в капсидном белке ВТМ (обыч-
ный штамм) [535].
Кружками указаны места действия трипсина.
щихся методов определения аминокислотной последовательности и интер-
претации получаемых данных. Установление полной последовательности
158 аминокислот, приведенной на фиг. 11, является значительным дости-
жением.
Знание последовательности аминокислот в капсидном белке ВТМ имеет
огромное значение при изучении связи химических изменений РНК с изме-
нениями аминокислотной последовательности капсидных белков мутантов
вируса (гл. XIII).
Белок ВТМ является единственным капсидным белком вирусов расте-
ний, для которого полностью выяснена аминокислотная последовательность.
Частичные последовательности установлены также для ВЖМТ Харрисом
и- Хиндли [710]. Оказалось, что специфическое расщепление белка ВЖМТ
трипсином приводит к образованию четырех довольно больших пептидов,
которые плохо растворимы. Это и явилось препятствием на пути к опреде-
лению полной аминокислотной последовательности белка ВЖМТ. Однако
специфичность действия трипсина можно изменить. Так, аминоэтилирование
остатков цистеина делает их доступными триптическому расщеплению [1798].
Методы гидролиза белков рассмотрены Хиллом [778].
Вторичная и третичная структура белковой субъединицы
Благодаря изящным исследованиям с использованием рентгеноструктур-
ного анализа сейчас детально известна вторичная и третичная структура
нескольких белков. Однако это пока еще неосуществимо ни для одного
белка вирусов растений. Для получения данных рентгеноструктурного
анализа, которые можно было бы интерпретировать, используя современ-
Структурные компоненты
81
пые методы, необходимо иметь кристаллический белок, обладающий трех-
мерной симметрией. Палочкообразные вирусы (такие, как ВТМ) образуют
«паракристаллы», характеризующиеся только двумерной симметрией. При-
близительная трехмерная форма молекулы белка ВТМ была рассчитана
путем сравнения результатов рснтгеноструктуриого анализа интактного
вируса и белковых «палочек», образующихся при агрегации субъединиц
в отсутствие РНК (фото 8).
Белок ВТМ, подобно многим другим белкам, содержит несколько а-
слиральпых участков. Исходя из результатов измерения дисперсии оптиче-
ского вращения па частично диссоциированных субъединицах, Симмонс
и Блоут [1586] пришли к выводу, что 25—35% этого белка находится в а-
спиралыюй конфигурации. Изучение дихроизма интактного ВТМ в инфра-
красной области спектра позволяет предположить, что а-сниральные участки
могут располагаться более или менее перпендикулярно оси частицы (т. е.
вдоль длины субъединицы) [556].
ДРУГИЕ КОМПОНЕНТЫ ВИРУСА
Полиамины
Маркхэм [1149] обнаружил в вирусах растений присутствие веществ
основного характера, а Джонсон и Маркхэм [894] пришли к заключению,
что полиамин, содержащийся в ВЖМТ, является бис-(3-аминопропил)-ами-
иом (в настоящее время его называют 1,7-диамипо-4-азагептапом). Этот
амин раньше не обнаруживали в биологических системах, по в структурном
отношении он напоминает другие полиамины, например спермин и сперми-
дин, обнаруженные в вирусах бактерий [19]. Исследования последнего вре-
мени позволяют предположить, что основным полиамипом в ВЖМТ в дей-
ствительности является спермидин [140]. Джонсон и Маркхэм установили,
что по массе полиамин составляет около 0,7% ВЖМТ. Они обнаружили так-
же это соединение в вирусе морщинистости турнепса, вирусе крапчатости
конских бобов и в ВТМ. После диссоциации ВЖМТ на РНК и белок около
2/3 количества этого полиамина было выявлено во фракции РНК. Джонсон
и Маркхэм считают, что в интактном вирусе он в основном связан с РНК.
Опи не смогли обнаружить этот полиамип в здоровых растениях китайской
капусты, хотя он и мог содержаться в концентрациях, находящихся за пре-
делами чувствительности метода определения. В здоровых растениях были
обнаружены различные моноамины и диамины.
Липиды
Известно, что многие крупные вирусы животных содержат липиды,
которые, по-видимому, являются частью внешней оболочки, окружающей
внутренний пуклеокапсид, содержащий нуклеиновую кислоту. Большин-
ство вирусов растений, интенсивно изучавшихся при помощи химических
способов, относится к категории мелких икосаэдрических или палочко-
образных вирусов. Ни один из них, вероятно, не содержит липидов. Однако
недавно было показано, что некоторые крупные вирусы растений содержат
определенное количество липидов.
Препараты вируса бронзовое™ томатов (штамм Е), выделенного из
N. glutinosa, содержат после экстракции смесью метанол — хлороформ —
эфир около 19% липидов (по массе) [192]. Из них 9% приходятся на долю
липидов, экстрагируемых петролейным эфиром, и 10% составляют липиды,
6-0893
82
Глава IV
нерастворимые в петролейном эфире. Листья N. glutinosa, зараженные
вирусом, в расчете на сухую массу содержали на 10% больше липидов, чем
здоровые листья, хотя концентрация вируса в зараженной ткани весьма
невелика. Вирус желтой карликовости картофеля, выделенный из N. rustica,
содержит, как было показано, более 20% липидов после экстракции смесью
хлороформ — метанол [11].
Естественно, при этом возникает вопрос, в какой степени липиды, при-
сутствующие в этих вирусах, имеют клеточное происхождение, т. е. яв-
ляются ли они либо примесью, загрязняющей вирусный препарат, либо-
составными компонентами вирусных частиц. Ахмед и др. [И] пришли к за-
ключению, что не более х/в липидов в препаратах вируса желтой карлико-
вости картофеля обусловлено примесью балластных компонентов клетки-
хозяина, однако для точного установления этого факта требуются более
детальные химические исследования.
Как частицы вируса желтой карликовости картофеля, так и частицы
вируса бронзовости томатов имеют внешнюю оболочку. Способность этих
оболочек окрашиваться определенными красителями предполагает наличие
в них липидов. При электронно-микроскопическом исследовании ультра-
тонких срезов клеток, зараженных некоторыми вирусами, выявляются ча-
стицы, находящиеся в окруженных мембраной пузырьках (гл. VII). В связи
с этим было высказано предположение, что внешняя оболочка такого рода
вирусов образуется за счет отпочковывания от мембран этих структур. Та-
ким образом, эти внешние оболочки могут в равной степени включать как
компоненты клетки-хозяина, так и вирусоспецифичпые материалы. Смесь ком-
понентов клетки-хозяина и вируса обнаружена также во внешних оболочках
некоторых вирусов животных, которые, созревая у поверхности клеточной
мембраны, затем высвобождаются из нее.
Металлы
Со времени уже давно проведенного исследования состава вирусов ра-
стений [1664] было установлено, что зольная фракция очищенных препаратов
содержит различные металлы. Пири [1334] обнаружил кальций, натрий и сле-
ды 12 других металлов в вирусе кустистой карликовости томатов. Было-
показано, что ВТМ и РНК ВТМ содержат девять металлов в значительных
количествах [1100, 1853]. Лоринг и др. [1101] рассчитали, что подавляющее-
большинство кислотных групп в вирусе, выделенном в деионизированной
воде, связано с магнием и кальцием. Уокер и др. [1853] обнаружили, что-
общее содержание металлов в интактном ВТМ, подвергнутом исчерпываю-
щему диализу против не содержащей металлов воды, было значительно-
выше (260 г-ат/моль), чем в изолированной вирусной РНК (50 г-ат/моль).
Диализ целого вируса против 0,1 М ЭДТА снижал содержание металлов до-
уровня, сравнимого с найденным в препаратах РНК. Уокер и др. [1853],
заключили, что металлы присоединяются it ВТМ двумя различными путями:
1) соединяясь с белком (металл, удаляемый путем обработки ЭДТА); 2) обра-
зуя с РНК связь, которая устойчива по отношению к ЭДТА даже при повы-
шенных температурах. Уменьшение содержания металла после диализа
против ЭДТА не влияло на инфекционность вирусных препаратов. Таким
образом, те металлы, которые связаны, как предполагают, с белком, по-
являются необходимой частью вирусной структуры.
Содержание металлов в препаратах ВТМ, выделенных из трех различ-
ных хозяев, оказалось очень сходным. Эти данные наряду с тем, что резуль-
таты анализа интактного ВТМ, проведенного в разных лабораториях, в об-
щем одинаковы, позволяют предположить, что металлы являются обычным
компонентом ВТМ и РНК ВТМ. Вопрос о том, необходимы ли металлы, свя-
Структурные. компоненты 83
заиные с РНК ВТМ, для инфекционности, требует еще выяснения. Участки
РНК, связывающие металлы, точно не определены. Прочность связи свиде-
тельствует о том, что фосфатные группы в образовании связи участия не
принимают. Уокер и др. [1853] считают наиболее вероятным, что металлы
образуют хелатные комплексы с азотистыми основаниями.
Чео и др. [360] обнаружили, что присутствие в среде никеля в очень
низких концентрациях оказывало заметное стабилизирующее влияние на
инфекционность препаратов РНК ВТМ. Однако они пришли к выводу, что
защитное действие было обусловлено ингибированием какого-то внешнего
фактора. Вполне вероятно, что этим фактором могла быть рибонуклеаза.
Джонсон [892] исследовал содержание металлов в ВЖМТ, выделенном
различными методами. При этом оказалось, что содержание металла в пре-
паратах вируса широко варьировало в зависимости от метода выделения.
Изоэлектрическое осаждение с последующим ресуспендированием в рас'
творе этилепдиаминтетраацетата тетраэтил аммония позволило получать пре-
параты с очень низким содержанием металлов. Воздействие, которое оказы-
валось эффективным в отношении удаления ионов металлов из вирусов, при-
водило к необратимому осаждению пустых белковых оболочек в вирусных
препаратах, но нуклеопротеид сохранял высокую степень инфекционности.
ВЖМТ, полученный таким образом, был способен связывать большое коли-
чество ионов металлов неспецифически и ие очень прочно. Большая часть
связанных ионов металлов могла быть удалена диализом против воды или
солевых растворов. Ионы урана связывались с вирусом в количестве, доста-
точном для увеличения коэффициента седиментации на 20%. Небольшие
количества Mg2+ и Sr2+ оставались прочно связанными с вирусом, причем
большая часть Sr2+ была связана с вирусной РНК. Поведение препаратов
ВЖМТ в градиентах плотности хлористого цезия зависело от вида и коли-
чества ионов металла, связанных с вирусом.
Итак, представляется вероятным, что: 1) большая часть непрочно свя-
занных ионов металлов, обнаруженных в очищенных препаратах вирусов,
взаимодействует с кислотными группами белковой оболочки и иногда с РНК;
2) эти металлы не являются необходимой или фиксированной частью струк-
туры вируса и 3) «ассортимент» обнаруживаемых металлов в значительной
степени зависит от происхождения вирусного препарата. Значение прочно
связанных ионов металлов, подобных тем, которые обнаружены в РНК ВТМ,
пока не выяснено. На 6500 нуклеотидов приходится примерно 50 атомов раз-
личных металлов, и определить роль этих атомов — дело весьма трудное.
Если эти металлы действительно связаны с азотистыми основаниями, трудно
представить себе, какой механизм мог бы обеспечить их специфическое рас-
положение вдоль цепи. Возможно, прочно связанные металлы влияют на
матричную или информационную функцию вирусной РНК.
Наличие прочной связи металлов с изолированной РНК не обязательно
означает, что они также прочно связаны и в интактном вирусе. Не исклю-
чено, что в процессе освобождения РНК из интактного вируса некоторые
иопы металлов, ранее связанные с белком, связываются с РНК. Весьма
важным является выяснение вопроса о том, распределены ли прочно связан-
ные ионы металлов более или менее равномерно среди всех молекул РНК
в препарате или же содержание металлов в некоторых молекулах РНК
значительно выше среднего, тогда как в других они вовсе отсутствуют.
В таком сферическом вирусе, как ВЖМТ, небольшое число ионов ме-
таллов могло бы играть важную роль в стабилизации трехмерной вторичной
структуры РНК в интактном вирусе. С другой стороны, маловероятно, что
ионы металла играют такую роль в вирусе, подобном ВТМ, где РНК стаби-
лизуется в форме одноцепочечной спирали благодаря белковым субъеди-
ницам.
G*
84
Глава IV
Изучение связывания Са2+, К+ и С1~ с деполимеризованным и полимери-
зованным белком ВТМ при различных значениях pH показало, что эти
ионы не играют никакой существенной роли в полимеризации белка ВТМ
115431.
Вода
Важное значение, которое имеет вода в живых клетках, хорошо известно,
однако иногда забывают, что вирусы в растворе содержат значительное
количество связанной воды, причем содержание ее в мелких вирусах равно
примерно массе нуклеопротеидного материала частицы. Изучать гидратацию
вирусов можно в кристаллах и в растворе.
Бернал и др. [179] па основании изучения дифракции рентгеновских
лучей и непосредственных измерений под микроскопом кристаллов вируса
кустистой карликовости томатов, изменяющихся при высушивании, при-
шли к выводу, что эти кристаллы содержат около 47% воды. Аналогичные
исследования с ВЖМТ [175] позволили предположить, что содержание воды
в кристаллах этого вируса составляет около 58%. На основании дальнейших
исследований было высказано предположение, что степень гидратации
этих вирусов в кристаллах может быть еще более высокой [1047]. Бернал
и Фанкухен [177, 178] изучали структуру влажных и высушенных гелей,
образуемых очищенными препаратами ВТМ. Они обнаружили, что при всех
степенях гидратации вирусные палочки ориентируются параллельно друг
другу, причем в плоскости, перпендикулярной длинным осям параллельных
палочек, наблюдается гексагональная симметрия. С другой стороны, они
были расположены нерегулярно в направлении длинной оси. Расстояние
между параллельными палочками варьировало в зависимости от содержа-
ния воды в геле. Удовлетворительных сведений о степени гидратации не уда-
лось получить, так как расстояние между частицами непрерывно менялось
от 15,2 нм в высушенном геле до очень значительной величины, при которой
палочки начинали дезориентироваться. Далее было показано, что содержание
воды в гелях ВТМ и кристаллах других вирусов зависит от pH и концен-
трации солей в растворах, где эти кристаллы образуются.
Измерение различных гидродинамических свойств вируса в растворе
позволяет определить степень гидратации. Точность определения степени
гидратации варьирует в зависимости от метода измерения. Эту проблему
рассматривали Лауфер и Бендет [1047]. Они приводят следующие величины
гидратации некоторых вирусов растений в растворе (число граммов воды
на 1 г вируса), определенные различными методами: ВТМ — 0,27; вирус
кустистой карликовости томатов — 0,14—0,78; вирус южной мозаики
фасоли - 0,4-1,2; ВЖМТ - 0,68-0,71.
ГЛАВА V
СТРОЕНИЕ ВИРУСОВ
Три основных направления исследований привели нас к существующим
в настоящее время представлениям о строении вирусов: 1) физический
и химический анализ вирусных компонентов, о чем мы говорили в предыду-
щем разделе; подобного рода сведения важны для понимания структуры
интактного вируса; 2) электронная микроскопия, обеспечивающая возмож-
ность получения непосредственных данных о размере и форме вирусных
частиц, а также некоторой информации об их поверхности и внутренней
структуре; 3) методы рентгеиоструктурного анализа, позволяющие получить
однозначные сведения о трехмерной структуре при исследовании соответст-
вующих вирусов.
Рассматривая этот вопрос в историческом аспекте, можно отметить,
что с помощью других методов также удалось получить некоторые сведения
о структуре вирусов. Исследование анизотропии в потоке, обнаруживаемой
в растворах ВТМ, позволило предположить, что частицы этого вируса имеют
палочкообразную форму. Существование частиц двух типов в препаратах
ВЖМТ — частиц интактного вируса, содержащих около 35% РНК, и бел-
ковых частиц, не содержащих РНК, по очень сходных с первыми по разме-
рам и имеющих идентичные поверхностные свойства, что было установлено
на основании результатов электрофоретических и серологических исследо-
ваний,— позволило Маркхэму [1147] предположить, что вирусная РНК
должна содержаться внутри белковой оболочки. Эта точка зрения в даль-
нейшем была подтверждена рядом исследований. Тем не менее наиболее
детальную информацию о структуре вирусов нам удалось получить, исполь-
зуя сочетание методов рентгеноструктурного анализа и электронной микро-
скопии.
Термин «капсид» был предложен для обозначения оболочки сферических
или палочкообразных вирусов, а термин «капсомер»— для обозначения
групп субъединиц, выявляемых на электронных микрофотографиях. Зрелый
вирус называется вирионом [334]. Эти названия, вероятно, не являются
терминологически необходимыми. Мы будем применять термин «белковая
субъединица», или «структурная субъединица», для обозначения ковалентно
связанной пептидной цепи. В принципе структурная субъединица, выявляе-
мая кристаллографически, может содержать две или более идентичные
(или неидентичные) полипептидные цепи. Однако в вирусах растений такие
структуры обнаружены не были. Термином «морфологическая субъединица»
мы будем обозначать группы белковых субъединиц, обнаруживаемые мето-
дами электронной микроскопии и рентгеиоструктурного анализа. Термин
«белковая оболочка» соответствует защитному белковому слою вирусной
частицы.
В течение последних 12 лет теоретические и экспериментальные иссле-
дования структуры вирусов развивались параллельно. Так, Крик и Уот-
сон [417] выдвинули гипотезу относительно структуры мелких вирусов, кото-
рая была затем полностью подтверждена. Используя имевшиеся в то время
знания о ВЖМТ и ВТМ, а именно что вирусная РНК заключена внутри
белковой оболочки и что (данные только в отношении ВТМ в тот период)
86
Глава V
обнаженная РНК инфекционна, они предположили, что у мелких вирусов
основное назначение белковой оболочки состоит в защите их рибонуклеи-
новой кислоты. Они полагали, что наиболее эффективный путь образования
белковой оболочки, имеющей относительно крупные размеры, состоит
в синтезе в клетке под контролем вируса большого числа небольших иден-
тичных белковых субъединиц, а не одной или нескольких очень крупных
молекул.
Крик и Уотсон отметили, что если один и тот же тип взаимодействия
между субъединицами повторяется многократно при построении вирусной
частицы, то белковые молекулы должны быть правильно упакованы вокруг
молекулы РНК. Существует ограниченное число способов упаковки субъ-
единиц в вирусном капсиде. Большинство вирусов имеет либо палочко-
образную, либо сферическую форму. Число белковых субъединиц, распола-
гающихся в виде спирали в частицах палочкообразных вирусов, теорети-
чески неограниченно.
Исходя из кристаллографических соображений, Крик и Уотсон пришли
к выводу, что белковая оболочка мелкого «сферического» вируса, вероятно,
построена из идентичных белковых субъединиц, расположение которых ха-
рактеризуется кубической симметрией; в этом случае число субъединиц
должно быть кратным двенадцати. В дальнейших исследованиях Каспар
и Клуг [332, 333] развили эти принципы, касающиеся строения мелких
вирусов (особенно сферических).
В ранних электронно-микроскопических исследованиях для контрасти-
рования вирусных частиц использовали метод оттенения тяжелыми метал-
лами. Такое оттенение затрудняло исследование деталей поверхности, но
позволяло получить информацию об общем размере и форме сухой частицы.
В тех случаях, когда техника оттенения при исследовании сферических
вирусов применялась с достаточно высоким экспериментальным мастерством
и проводилось сравнение форм теней, наблюдаемых на электронных микро-
фотографиях, с тенями, образуемыми моделями, иногда удавалось сделать
заключение о симметрии наружной поверхности вирусной оболочки. Напри-
мер, Харрисон и Никсон [727] пришли к выводу о том, что некоторые вирусы,
распространяющиеся через почву, имеют форму икосаэдра, но не представ-
ляют собой ромбододекаэдр. Вильямс и Смит [1910] применили метод двой-
ного оттенения под двумя разными углами для получения более точных
данных о симметрии частиц крупного вируса насекомых (радужный вирус
долгоножки). Однако в случае мелких вирусов растений нанесение двой-
ного слоя металла затемняло детали и результаты оказывались неудовле-
творительными [727]. При изучении более крупного вируса раневых опухо-
лей двойное оттенение оказалось полезным и было установлено, что частицы
этого вируса, представляющие собой многогранники, имеют форму икоса-
эдра [199].
Для изучения тонкой структуры вирусных частиц был также разработан
метод негативного и позитивного контрастирования, который оказался зна-
чительно более ценным, чем метод оттенения металлами. При позитивном
контрастировании вещество с высокой электронной плотностью, например
различные соединения осмия, свинца и уранила, а также фосфовольфрамо-
вая кислота (ФВК) при соответствующих условиях, химически реагирует
с вирусом и связывается с ним. Химическое взаимодействие может приводить
к изменению или дезинтеграции структуры вирусов. Напротив, в методе
негативного контрастирования электронноплотное вещество не реагирует
с вирусом, но проникает в доступные микропространства на поверхности
или внутри вирусной частицы. В настоящее время при исследовании структу-
ры вирусов с помощью электронной микроскопии предпочитают применять
именно этот метод. При негативном контрастировании обычно используют
Строение вирусов
87
ФВК при pH 7,0, уранилацетат или уранилформиат при pH около 5,0.
Структура вируса при этом визуализируется иа фойе окружающего электроп-
поилотного вещества. Углеродные пленки, используемые в качестве под-
ложки для контрастируемых образцов, дают гранулярный фон. Часто детали
структуры удается различить наиболее четко на изображениях частиц в участ-
ках, где контрастирующее вещество оказывается нанесенным над отверстия-
ми в углеродной пленке-подложке. Контрастирующее вещество может
проникать или но проникать в пустые пространства внутри вирусной
частицы.
При использовании этого метода для изучения палочкообразных частиц,
обладающих спиральной симметрией, часто выявляется центральный полый
капал. При электронно-микроскопическом исследовании мелких сфериче-
ских вирусов, которые часто ассоциируются с пустыми белковыми оболоч-
ками, иногда обнаруживаются частицы с электропноплотпой внутренней
полостью; ио мнению некоторых исследователей, эти частицы представляют
собой пустые оболочки, содержащиеся в препарате. Однако оказалось, что
в определенных условиях контрастирования РНК той или иной части интакт-
ных вирусных частиц может теряться, давая возможность контрастирующему
веществу проникать внутрь вируса. Подобного рода вещества различаются
по их способности разрушать или изменять структуру вируса. Действие ФВК,
вероятно, является наиболее разрушающим. Например, частицы вируса
мозаики люцерны, не будучи предварительно фиксированы формальдегидом,
разрушаются ФВК [619]. Однако структура этого вируса сохраняется при
•обработке уранилацетатом (Р. Д. Вудс, личное сообщение). Следует все
же отметить, что даже на лучших электронных микрофотографиях тонкие
детали вирусной структуры несколько затемнены. Это обусловлено прежде
всего незначительными неправильностями в структуре вируса, а также
такими факторами, как неравномерности контрастирования. Кроме того,
изучение деталей структуры затрудняется тем, что при использовании кон-
трастирующих веществ степень контраста иа обеих сторонах частицы часто
оказывается различной [1007]. Для преодоления этих трудностей и получе-
ния наиболее достоверной и детальной информации о структуре отдель-
ных вирусных частиц при изучении их в электронном микроскопе
с помощью негативного контрастирования было использовано несколько
методов.
Маркхэм с сотрудниками разработали фотографический метод, позволяю-
щий более четко выявлять детали изображения в тех случаях, когда объект
состоит из периодически повторяющихся структур. Если объект обладает
вращательной симметрией, электронную микрофотографию частицы, ориен-
тированной соответствующим образом, поворачивают на определенный угол
и многократно фотографируют, причем следующие друг за другом снимки
накладываются на один и тот же негатив. Если выбран правильный для
данной симметрии угол и правильный центр вращения, детали изображения
при этом резко усиливаются [1159]. Маркхэм и др. [1160] применили этот
принцип к таким линейным объектам, как ВТМ. Они разработали прибор,
при помощи которого изображение определенной части вирусной частицы
перемещается последовательно на соответствующее расстояние и ряд фото-
графий накладывается друг на друга. Расстояние, на которое следует пере-
местить изображение, определяется методом нроб и ошибок.
Для выявления закономерностей структуры Клуг и Бергер [1007]
использовали дифракционные картины, получаемые путем увеличения элек-
тронных микрофотографий отдельных частиц. Позднее для той же цели был
разработан метод, по которому результаты наложения друг на друга воз-
можных моделей, полученных при помощи ЭВМ и сфотографированных с де-
монстрационного экрана, сравнивали с истинными электронными микрофо-
88
Глава V
Фиг. 12. Схема, иллюстрирующая разнообразие
размеров и формы вирусов растений.
а — вирус-сателлит; б — вирус желтой мозаики тур-
непса; в —вирус раневых опухолей; г — вирус бронзо-
вое™ томатов; В — вирус желтухи сахарной свеклы;
е — пять частиц вируса мозаики люцерны; ж — две ча -
стицы вируса погремковости табака (штамм ORB);
а — вирус табачной мозаики; и — Л'-впрус картофеля;
к — вирус некротического пожелтения салата-латука.
тографиями сферических частиц, наблюдавшихся в различных направле-
ниях [520].
Некоторые стороны структуры вирусов, особенно более крупных, можно
изучить, используя для этого ультратонкие срезы. Этот метод применяется
как для изучения вирусов в клетках, так и при изучении вирусов, находя-
щихся в осадке.
На современном уровне знаний можно разделить вирусы растений на
пять больших групп на основании различий в структуре их частиц. Наиболее
многочисленными и лучше всего исследованными являются палочкообраз-
ные частицы и частицы, характеризующиеся икосаэдрической симметрией.
Мы выделили вирус мозаики люцерны в самостоятельную группу, так как
он представляет собой многокомпонентный вирус, включающий как ико-
саэдрические, так и палочкообразные частицы. Хотя вирусы раневых опухо-
лей и карликовости риса, вероятно, имеют белковые оболочки, обладающие
икосаэдрической симметрией, они в настоящее время являются единствен-
ными представителями вирусов растений, содержащими двухцепочечную
РНК, и поэтому рассматриваются как самостоятельная группа. Наконец,
имеется группа крупных вирусов с внешними оболочками, мембранами,
окружающими центральный внутренний компонент. Ни один из таких виру-
сов точно не охарактеризован с химической точки зрения. Почти все наши
сведения об этой группе получены с помощью электронной микроскопии.
Вопрос об использовании морфологии частиц в классификации вирусов
рассматривается в гл. XX.
Схематические изображения вирусов на фиг. 12 приведены для того,
чтобы показать, насколько разнообразны формы и размеры, характерные
для вирусов растений.
Препараты многих вирусов содержат различные неполные или дефект-
ные вирусоподобные частицы. Их структуру мы рассмотрим в гл. VIII.
Строение вирусов
89-
Основы структуры нескольких многокомпонентных вирусов обсуждаются
в этой главе, тогда как некоторые другие ее аспекты — в гл. VIII. Как мы
знаем, нуклеиновая кислота почти всех вирусов, встречающихся в природе,
защищена белковой оболочкой. Однако известны мутанты, полученные в ла-
бораторных условиях, которые имеют дефектную оболочку (гл. XIII), а так-
же два вируса, вызывающие веретеповидность клубней картофеля и заболе-
вание коры цитрусовых, обладающие многими свойствами, характерными
для обнаженной двухцепочечпой молекулы РНК [456, 457, 1540, 1601].
ПАЛОЧКООБРАЗНЫЕ ВИРУСЫ
Электронная микроскопия оказалась весьма полезной для определения
длины и ширины частиц палочкообразных вирусов, в особенности чрезвы-
чайно длинных гибких частиц, которые было бы очень трудно измерить
каким-либо иным путем. Тем не менее при оценке результатов таких измере-
ний следует иметь в виду различного рода трудности и неясности, могущие
возникнуть в ходе их проведения: 1) необходимость точной калибровки уве-
личения микроскопа; 2) артефакты, вызванные процессом: приготовления
препарата, особенно при измерении ширины частиц в случае образцов,
оттененных металлами; 3) тот факт, что препараты почти всех палочкообраз-
ных вирусов содержат частицы одного или более классов, которые короче
частицы, обладающей инфекционностью. Инфекционные частицы сами по
себе могут агрегировать конец в конец. Таким образом, палочкообразные
вирусы широко варьируют по длине (примеры такого рода приведены
в гл. VIII); 4) даже если разделение по классам провести самым тщательным
образом, длины частиц, принадлежащих к каждому классу, будут характе-
ризоваться некоторым распределением около среднего. Обычно модальная
(наиболее часто встречающаяся) длина, соответствующая основному пику,
содержащему инфекционные частицы, принимается за нормальную длину
данного вируса. Часто оказывается невозможным выяснить, являются ли
наблюдаемые отклонения результатом ошибки измерений или они отражают
истинные колебания длины частиц; 5) высушивание па пленках-подложках
может приводить к некоторому сокращению длины палочек.
Введение методов с использованием ФВК и сходных контрастирующих
веществ дало возможность получить сведения о топкой структуре палочко-
образных вирусов, однако во многих случаях некоторые мелкие детали обна-
ружить не удается. Использование уранилформиата позволило выявить
закономерности субструктуры одного из наиболее широких палочкообразных
вирусов (вирус погремковости табака) [1283], а также некоторых других
вирусов со спиральной симметрией [1838].
В настоящее время выделены и в большей или меньшей степени охарак-
теризованы многие палочкообразные вирусы. Все они характеризуются
довольно высоким отношением белка к нуклеиновой кислоте, что соответст-
вует их структурным особенностям. Белковые субъединицы наиболее хорошо
исследованного представителя этой группы — ВТМ — расположены в виде
спирали. Все другие палочкообразные вирусы почти наверняка имеют ту же
структуру. Существует два типа палочкообразных вирусов. Одни из них,
подобно ВТМ и вирусу погремковости табака, представляют собой жесткие
палочки длиной порядка 300 нм или менее.
Другую, значительно более многочисленную группу образуют длинные
и достаточно гибкие палочки. У представителей первой группы шаг основной
спирали составляет 2,3—2,5 нм, в то время как у более длинных палочек
он равен 3,3—3,7 нм [1838].
1)0
Глава V
Жесткие палочкообразные частицы
ГШ
ВТМ, вероятно, является наиболее хорошо изученным и наиболее по-
нятным в структурном отношении нуклеопротеидом во всей биологии. Для
этого вируса характерна чрезвычайно стабильная структура. Имеются дан-
ные о том, что он сохраняет инфекционность в нестерильных экстрактах
при комнатной температуре в течение 50 лет [1584]. Стабильность обнаженной
РНК ВТМ не больше стабильности любой другой одноцепочечной РНК. Сле-
довательно, стабильность этого вируса является следствием взаимодействий
между соседними белковыми субъединицами, а также между белком и РНК.
Длина палочки ВТМ была определена на основании электронных микро-
фотографий. Вильямс и Стир [1911] нашли, что длина ВТМ равна 298 ±
± 1 нм, в то время как по данным Холла [693] наиболее частой является
величина 295—305 нм. Обычно длина палочки ВТМ принимается равной
300 ± 5 нм. Большинство исследователей, измерявших распределение длин
палочек ВТМ по электронным микрофотографиям, находит, что величина
стандартного отклонения составляет примерно ±2%. Хотя некоторые из
этих колебаний, несомненно, обусловлены ошибкой измерений, Маркхэм
и др. [1160] подчеркивали, что истинная длина палочек может быть не сов-
сем однородной вследствие того, что к концам этих палочек сверх того коли-
чества, которое требуется для защиты РНК, присоединяется не содержа-
щий нуклеиновой кислоты белок, количество которого варьирует. Приведем
основные величины, характеризующие структуру ВТМ [331]:
Экспериментально определенные величины^
Молекулярная масса белковой субъединицы 17 530
Число субъединиц на единицу длины (на 0,1 нм) 0,710±0,5%
Число нуклеотидов на единицу длины (иа 0,1 нм) 2,13±0,5%
Средняя молекулярная масса нуклеотида РЫК 322±0,2%
Длина сформированной частицы ВТМ 300 пм±1,7%
Производные величины,
Число субъединиц в частице ВТМ 2130±2%
Число нуклеотидов в частице ВТМ 634(1±2%
Молекулярная масса вирусной РНК 2,05-100±2%
Молекулярная масса частицы ВТМ 39,4-10|)±2%
После частичного'удалепия белка при помощи одного из известных мето-
дов (например, обработки детергентом при повышенной температуре или
щелочной обработки) можно визуализировать посредством электронной мик-
роскопии нить РНК, выходящую из интактных участков палочки ВТМ [735,
1508]. Корбетт [405] обнаружил, что фенол удаляет белок оболочки ВТМ,
начиная не с каких-то определенных мест, а случайно, в разных точках
вирусной частицы.
При рассмотрении электронных микрофотографий, полученных с пре-
паратов, оттененных металлом (фото 6), создается впечатление, что вирус-
ная РНК расположена в центре палочки. В действительности в центре
палочки имеется полый канал, а РНК погружена в белковую оболочку. Нали-
чие этого центрального полого канала впервые было продемонстрировано
Хаксли [851], использовавшим при негативном контрастировании фосфо-
вольфрамовую кислоту (фото 7).
Полый канал выявляется в электронном микроскопе как плотная линия,
заполненная контрастирующим веществом, в центре палочек. Кроме того,
Строение вирусов
91
<1>иг. 13. Радиальпоо распределение элект-
ронной плотности, полученное в резуль-
тате рентгеиоструктурного анализа ВТМ
{сплошная линия) и палочкообразных
агрегатов белка ВТМ (пунктирная линия
[330, 352].
При сравнении этих двух кривых распределения
электронной плотности становится очевидным,
что фосфатные группы РНК расположены па рас-
стоянии около 4 нм от центра палочки.
короткие фрагменты частиц часто могут быть ориентированы торцом вверх
таким образом, что центральная полость оказывается отчетливо видимой.
Многие исследователи изучали субструктуру ВТМ при помощи элек-
тронной микроскопии с высоким разрешением. Наблюдавшаяся при этом
периодичность,?не*согласу1ощаяся с данными рентгеиоструктурного анализа,
объясняется образованием групп субъединиц в процессе высушивания пре-
паратов при подготовке их для исследования в электронном микроскопе
(см., например, [690]).
Путем расчета распределения электронной плотности вдоль радиуса
частицы,{проведенного на основании рентгенографических данных, удалось
более’точио определить диаметр центральной полости и установить радиаль-
ное расположение РНК. Авторы провели сравнительное исследование ради-
ального распределения электронной плотности интактного ВТМ и белковых
палочек, образующихся при агрегации субъединиц in vitro [330,552,553].
Эти исследования (фиг. 13) ясно показали, что РНК, или, точнее, фосфатные
группы РНК, располагаются па расстоянии примерно 4 нм от центральной
•оси. Радиус центральной полости составляет примерно 2 пм. Ранние рент-
генограммы ВТМ показали, что отдельные палочки построены из правильно
расположенных субъединиц [177, 178]. Более поздние рентгенографические
исследования дали нам детальную картину расположения белковых субъ-
единиц и РНК в вирусной палочке. Рисунок на цветной вклейке 1 иллюстри-
рует ориентированный золь ВТМ, используемый для рентгеиоструктурного
анализа [678]. Субъединицы плотно упакованы в виде спирали. Шаг спирали,
по данным[рентгеиоструктурного анализа, равен 2,3 нм. Цепь РНК образует
компактную спираль, соответствующую спирали белковых субъединиц (фото 8).
На каждую белковую субъединицу в спирали приходится три нуклеотида
РНК, а на каждый виток — 49 нуклеотидов и 16Ц3 белковые субъединицы.
Вирус погремковости табака
Частицы вируса погремковости табака представляют собой жесткие
цилиндрические палочки, общий план строения которых сходен с планом
строения ВТМ. Существует много различных штаммов этого вируса. Для
92
Глава V
образования интактных частиц вируса погремковости табака в зараженной
клетке необходимо взаимодействие частиц двух типов — длинных и коротких
(см. гл. VIII). Здесь мы рассмотрим структуру длинных частиц, так как ко-
роткие частицы построены по той же схеме с участием тех же белковых субъ-
единиц. Большая часть информации о структуре этого вируса была полу-
чена с применением электронной микроскопии при использовании уранил
формиата для повышения разрешения [1283]. Некоторые сведения были полу-
чены при изучении оптической дифракции. У штаммов, изученных Оффор-
дом, длина частиц, обладавших инфекционностью, составляла примерно’
191 им. Диаметр частиц был равен 25,6 ± 0,3 нм, а шаг спирали (по-види-
мому, левовращающей, как и в случае ВТМ) составлял 2,55 -I- 0,0.3 нм.
Радиус центральной полости был равен около 2,7 им. На расстоянии при-
мерно 8,2 им от оси частицы наблюдалось кольцевидное образование, кото-
рое может представлять собой нить РНК. 1Та каждые три витка спирали
в частице вируса погремковости табака приходится 76 субъединиц, тогда
как для частицы ВТМ соответствующее число равно 49. Оба эти числа можно
выразить общей формулой 3q 1, где q — 42 для ВТМ и 52 для вируса по-
гремковости табака. Остается определить, является ли это совпадением или
же эта формула отражает какое-то общее свойство, присущее вирусам со
спиральной симметрией. На фото 9 суммированы некоторые особенности
структуры вируса погремковости табака и для сравнения в том же масштабе
изображен ВТМ.
Молекулярная масса белковых субъединиц, характерных для частиц
вируса погремковости табака, составляет « 24 000 дальтон. Спираль, обра-
зуемая белковой оболочкой в частицах изученного штамма этого вируса,
состоит из 72 витков, следовательно, молекулярная масса этой белковой
оболочки равна 44-10°. На одну белковую субъединицу приходится, вероят-
но, 4 нуклеотида, т. е. всего частица содержит 7100 нуклеотидов со сред-
ней молекулярной массой около 322. Таким образом, молекулярная масса
РНК этого вируса составляет 2-10°, а длинной частицы — около 46 -10'1.
Харрисон и Клуг [724], используя данные по измерению длины и гидродина-
мические данные, пришли к выводу, что молекулярная масса этого вируса
составляет 48-10° — 50-10°.
Харрисон и Вудс [731] отмечали, что на многих из их электронных мик-
рофотографий различных изолятов вируса погремковости табака концы
частиц имели разную форму. Один конец был слегка выпуклым, в то время
как на другом конце центральный канал был несколько расширен. Они пред-
положили, что такой вид концов палочек мог быть обусловлен формой бел-
ковых субъединиц (напоминающей форму банана), длинные оси которых не
располагались точно перпендикулярно по отношению к оси частицы.
Вирус штриховатой мозаики ячменя
О структуре вируса штриховатой мозаики ячменя известно не так много,
как о двух палочкообразных вирусах, описанных выше. Этот вирус интере-
сен тем, что обычно имеются палочки трех размеров — 111, 128 и 148 нм,
причем преобладают частицы длиной 128 нм, диаметр которых составляет
около 20 нм. Эти частицы слишком близки по размерам, для того чтобы их
можно было разделить в градиенте плотности сахарозы, так что еще не уста-
новлено, являются ли все три типа палочек инфекционными и требуется ли
для репродукции вируса присутствие более одного вида частиц. Харрисон
и др. [734] указывают на трудность определения в таких условиях длины
вирусных частиц, которая считалась бы нормальной. При использовании
метода негативного контрастирования в частицах обнаруживается цен-
тральный канал и поперечная исчерченность с интервалами между поло сами
Строение вирусов
93
около 2,5 нм. Эта испорченность может представлять собой последователь-
ные витки спирально расположенных субъединиц [734]. Некоторые частицы
обладают рыхлой структурой, что может быть результатом раскручивания
спирали, т. е. ранним этапом дезинтеграции частицы. Применение рентгено-
структурного анализа показало наличие субъединиц, расположенных в виде
спирали, шаг которой составляет 2,6 им [516].
Гибкие палочкообразные частицы
Брандес и Беркс [270] перечисляют 4 группы нитевидных вирусов,
имеющих более или менее гибкие палочкообразные частицы. Мы кратко
рассмотрим по одному представителю каждой из этих групп.
Х-вирус картофеля
Частицы этого вируса имеют форму относительно гибких палочек длиной
около 515 нм и шириной 11,5 ± 0,3 нм [1838] (фото 10, А, В). Используя
в качестве контрастирующего вещества при электронно-микроскопическом
исследовании уранилформиат, Варма и др. с помощью метода оптической
дифракции смогли установить, что шаг основной спирали таких палочек
составляет в среднем 3,4 ± 0,1 нм. На некоторых электронных микрофото-
графиях они наблюдали дисковидные частицы почти такого же диаметра,
что и интактный вирус. В этих частицах был виден центральный канал, диа-
метр которого варьировал, окруженный 10 радиально расположенными
субъединицами. Существование 10 субъединиц в этих дисках было определе-
но наложением фотографий 5 дисков и методом Маркхэма и др. [1159] (см.
стр. 87).
Y-вирус картофеля
Этот вирус имеет гибкие частицы длиной около 730 им. Ширина палочки
составляет 10,5 ± 0,3 им [1838], а шах1 основной спирали равен в среднем
3,3 им (фото 10,Б).
S-вирус картофеля
Этот вирус представляет собой относительно гибкую палочку диамет-
ром около 15 нм и длиной 650 нм. Для представителей этой группы, иссле-
дованных Варма и др. [1838], характерен шаг основной спирали, состав-
ляющий в среднем около 3,4 нм (фото 10, В).
Вирус желтухи свеклы
Частицы этого вируса имеют вид очень длинных гибких палочек (1250 нм),
диаметр которых составляет 13,3 ± 0,2 нм. У них имеется полый централь-
ный канал диаметром около 3,5 им. По длине палочки наблюдалась также
поперечная исчерченность поверхности с периодом 2,6—3,0 нм [831]. Варма
и др. [1838] установили, что шаг спирали составляет в среднем 3,4 нм и па
один виток спирали приходится 12—14 белковых субъединиц (фото 10, Г).
Однородность строения палочек по длине
На основании данных реитгеноструктурного анализа, все белковые
субъединицы в таких частицах, как ВТМ, находятся в одинаковом окруже-
нии (с точки зрения своих соседей), за исключением тех, которые располо-
жены иа концах палочки. Однако некоторые наблюдения наводят на мысль,
94
Глава V
Фиг. 14. Распределение частиц ВТМ по дли-
не после отщепления белковых субъединиц
путем обработки детергентом в контролируе-
мых условиях [1725].
А. Частицы не обрабатывались детергентом. Б. Про-
изводилась 15-мунутнал обработка; распределение
длин коротких палочек оказалось бимодальным. По
оси ординат отложено число частиц данного размера
по сравнению с общим числом частиц.
что в интактных частицах ВТМ по длине палочки существуют зоны различ-
ной устойчивости. Так, концы палочки различаются по их устойчивости
в отношении отщепления белковых субъединиц от РНК детергентом или
щелочью. Мэй и Найт [1192] показали, что субъединицы предпочтительно
удаляются с того конца палочки, где находится З'-конец вирусной РНК.
Саймингтон и Коммонер [1725], используя в качестве исходного материала
препарат, состоящий из палочек одинаковой длины, определили условия
контролируемого отщепления белковых субъединиц детергентом (начиная
с того конца палочки, который содержит З'-конец РНК). Распределение длин
коротких палочек, образующихся после отщепления, оказалось бимодаль-
ным с максимумами в области 80—90 и 180—190 нм. Это свидетельствовало
о том, что в частице могут быть участки с повышенной устойчивостью к дей-
ствию детергента (фиг. 14). Саймингтон [1724] в дальнейшем подтвердила
данные о том, что стабильность белковой оболочки по отношению к дей-
ствию детергента варьирует по длине палочки. Оказалось, что существуют
3 относительно устойчивые зоны: 1) вблизи З'-конца РНК, 2) в области между
225 и 150 нм и 3) в пределах 100 нм. Структурные основы этих различий пока
непонятны.
В недавно проведенном исследовании влияния различных препаратив-
ных методов на распределение частиц ВТМ по длине в свежевыжатом соке
[547] было найдено два чаще всего встречающихся значения длин коротких
палочек (фиг. 36). Их размеры очень хорошо согласуются с теми, которые
обнаруживаются после 15-минутной обработки интактного вируса детерген-
том (фиг. 14).
ИКОСАЭДРИЧЕСКИЕ ВИРУСЫ
Крик и Уотсон [417] указали, что изометрическая вирусная частица
должна обладать кубической симметрией. Имеется три типа кубической
симметрии: тетраэдрическая (2 : 3), октаэдрическая (4:3:2) и икосаэдри-
ческая (5:3:2). Таким образом, икосаэдр характеризуется вращательной
симметрией 5-го, 3-го и 2-го порядка. Для вирусной частицы три указанных
типа симметрии в кубической системе предполагают наличие 12, 24 или 60
идентичных субъединиц, симметрично расположенных на поверхности сферы.
Субъединицы могут иметь любую форму. В течение некоторого времени су-
Строение вирусов
95
щсствовала парадоксальная ситуация, например, с ВЖМТ. В соответствии
с данными рентгеиоструктурного анализа считалось, что по крайней мере
большая часть такой структуры (ВЖМТ) характеризуется икосаэдрической
симметрией, т. е. его капсид построен из 60 субъединиц (или это число крат-
но 60). На основании химического анализа было установлено, что число
субъединиц в составе частицы ВЖМТ гораздо больше 60. Вместе с тем элек-
тронно-микроскопические наблюдения выявили 32 морфологические субъ-
единицы [852, 1279].
Каспар и Клуг [332] с помощью выдвинутой ими теории квазиэквива-
лентности иашли решение этой дилеммы и заложили основы более глубокого
понимания того, каким образом построена оболочка мелких изометрических
вирусов. Если говорить в общих чертах, химические субъединицы в оболоч-
ке не располагаются строго эквивалентно (в математическом смысле слова),
а лишь квазиэквивалентно. Каспар и Клуг высказали предположение о том,
что основу структуры оболочки составляют однотипные связи, по в зависи-
мости от локальных условий эти связи могут несколько деформироваться.
Они подсчитали, что необходимая степень деформации является физически
приемлемой, и, приняв разумные допущения, касающиеся степени квази-
эквивалентности, пришли к выводу о том, что изометрические белковые
оболочки, построенные из большого числа идентичных субъединиц, могут
иметь только икосаэдрическую симметрию.
Икосаэдр — это правильный многогранник с 12 вершинами, 20 гра-
нями и 30 ребрами. Многогранник, все грани которого — равносторонние
треугольники, называют дельтоэдром. Каспар и Клуг [332] перечислили
возможные классы дельтоэдров, характеризующихся икосаэдрической сим-
метрией (икосадельтоэдры). Икосаэдр имеет 20 граней, представляющих
собой равносторонние треугольники, а любой икосадельтоэдр — 20 Т гра-
ней, где Т — триангуляционное число, равное Р/а (Р — любое число из
ряда 1, 3, 7, 13, 19, 21, 31, 37, . . ., а / — любое целое число).
Каждую структурную субъединицу оболочки можно представить как
третью часть треугольной грани, так что в оболочке будет 20-3-.Т — 60 Т
квазиэквивалеитных субъединиц. На фото 11 приведены модели простейших
икосадельтоэдров, относящихся к двум классам (Р — 1 и Р = 3).
Структурные субъединицы часто (но не всегда) объединяются в группы
из 5 или 6 субъединиц — пентамеры и гексамеры. Такое объединение делает
возможным установление максимального контакта между структурными
субъединицами па поверхности белковой оболочки. Могут быть образованы
также группы из двух или трех субъединиц (димеры или тримеры). Объеди-
нение структурных субъединиц в группе приводит к возникновению более
крупных морфологических субъединиц, обнаруживаемых в электронном
микроскопе. Иллюстрацией этому могут служить модели, изображенные
на фото 15.
Икосаэдрические вирусы растений, у которых структура поверхности
в настоящее время установлена, распадаются па два класса, соответствую-
щих значениям Р = 1 и Р = 3.
Исходя из принципа группировки в пентамеры и гексамеры, Каспар
и Клуг нашли, что число морфологических субъединиц можно описать фор-
мулой М = 10 7’ + 2 — 10 (Г — 1) гексамеров 12 пентамеров. В любой
оболочке будет 12 и только 12 пентамеров. Для двух классов икосаэдриче-
ских вирусов, известных в настоящее время, о которых мы говорили выше,
возможные числа морфологических и структурных субъединиц приведены
в табл. 8.
Расположение морфологических субъединиц у простейших вирусных
частиц, относящихся к этим двум классам, представлено на фото 12.
Участие этих структур в самосборке вирусов обсуждается в гл. VII.
96
Глава У
Таблица 8
Число морфологических и структурных субъединиц в квазиаквивалентиых
белковых оболочках, характеризующихся икосаэдрической симметрией,
в случае объединения структурных субъединиц в гексамеры и нептамеры
р= 1 Р = 3
1 т Ч исло морфоло- гических с у tn. еди- ниц Число структур- ных субъеди- ниц f т Число морфоло- гических субъеди- ниц Число структур- ных субъеди- ниц
1 1 12 60 — .—
—— — 1 3 32 180
2 4 42 24(1 .— .—,
3 9 92 540 —
— 2 12 122 72(1
4 16 162 960 — —
5 25 252 1500 —. —
3 27 272 162(1
В этом разделе мы рассмотрим несколько мелких изометрических виру-
сов, структура которых наиболее хорошо изучена, или же они представляют
особый интерес по другим причинам. Многие из не описываемых, здесь виру-
сов такого типа были исследованы при помощи электронной микроскопии,
например вирус желтой карликовости ячменя [1483], вирус риса (tuiigro)
1(500 , 601].
ВЖМТ
Используя метод негативного контрастирования, Хаксли и Зьгоби [852],
а также Никсон и Гиббс [1279] показали, что белковая оболочка ВЖМТ по-
строена из 32 морфологических субъединиц, занимающих в оболочке два
различных в структурном отношении типа участков. Клуг и его сотрудники
интенсивно использовали ВЖМТ при разработке методов рентгеноструктур-
ного анализа и электронной микроскопии, пригодных для изучения мелких
изометрических вирусов. В их более поздних работах [519, 1009] два обстоя-
тельства позволили получить более определенные данные при исследовании
частиц этого вируса методом рентгеноструктурного анализа. Во-первых,
они использовали охарактеризованные в химическом отношении свежевыде-
ленные препараты вирусов и, во-вторых, применяли усовершенствованный
метод рентгеноструктурпого анализа, обеспечивающий более высокое раз-
решение. Таким образом они пришли к выводу, что в белковой оболочке
имеется 180 рассеивающих центров, расположенных на расстоянии около
14,5 нм от центра частицы. По мнению авторов, они соответствуют высту-
пам структурных белковых субъединиц па поверхности частицы. Данные,
полученные методом рентгеноструктурного анализа, находились в соответ-
ствии с моделью, имеющей 32 рассеивающих центра, расположенных на рас-
стоянии около 12,5 нм от центра частицы. Эти 32 центра идентифицировали
как «пакеты» или складки РНК, что было подтверждено исследованием
препаратов, где в качестве контрастирующего вещества использовали ура-
нилацетат. Авторы пришли к заключению, что значительная доля РНК
глубоко погружена в белковую оболочку. Характер свертывания одиночной
цепи РНК внутри вирусной частицы должен быть таким, чтобы большие
сегменты этой цепи были тесло связаны с 32 морфологическими субъедини-
цами. По-видимому, именно наличие РНК внутри или вокруг этих участков
усиливает изображение 32 морфологических субъединиц, выявляемых па
электронных микрофотографиях ВЖМТ, по сравнению с тем, что мы видим
в том случае, когда имеются лишь пустые оболочки ВЖМТ [519] (фото 13).
Строение вирусов
97
Фиг. 15. Схема строения ВЖМТ и суммарные данные о его структуре.
Л. Схематическое изображение поверхности частицы, где можно видеть объединение структурных
субъединиц из группы б и В 1519). В. Схема, показывающая основные параметры ВЖМТ, вычисленные
на основании рентгеноструктурного анализа [10091. Внизу справа показаны усредненные размеры бел-
ковой оболочки: внешний радиус а «= 14 нм, внутренний радиус Ь = 10,5 нм. Внизу слева — усред-
ненный радиус сферы, заполненной РНК (е = 11,7 нм), вычисленный по результатам опытов с заменой
солей. Вверху справа схематически изображены колебания плотности белковой оболочки: расстояние
между частицами в кристалле е = 15 им; аффективный радиус рассеяния выступов, соответствующих бел-
ковым субъединицам, d = 14,5 им. Это расстояние существенно не отличается от внешнего радиуса.
Вверху слева — схематическое изображение колебаний плотности РНК: аффективный радиус (У) 32 высту-
пов РНК равен 12,5 ям. В. Схема, построенная па основании размеров, приведенных на фиг. Б, на кото-
рой показано расположение массы РНК вирусной частицы относительно белковых субъединиц, Схема
представляет собой разрез вирусной частицы, проведенный через ее центр. Точная форма субъединиц
и детали расположения РНК неизвестны. Распределение белка и РНК по направлению к центру
частицы также неизвестно [1009].
В рамках теории квазиэквивалеитпости мы можем установить следую-
щие численные соотношения, характеризующие число белковых субъеди-
ниц в оболочке ВЖМТ:
У (триангуляционное число)
Число структурных субъединиц
Класс:
М (число морфологических субъеди-
ниц)
= 3
= 60-3=180
р _ з
= 10-34-2 = 32 =
= 20 гексамеров-}-12 пента-
меров
На фиг. 15 изображена схема строения ВЖМТ и приведены все имею-
щиеся в настоящее время данные о расположении белковых субъединиц
и распределении РНК внутри вирусной частицы.
Разрешение на фото 13 недостаточно для четкого выявления структур-
ных субъединиц. На фото 14 представлена электронная микрофотография
отдельной частицы ВЖМТ, полученная методом Маркхэма (стр. 87).
Точное распределение РНК и положение полиамина в частицах ВЖМТ
неизвестны. Некоторые сведения, касающиеся взаимодействия оснований
РНК в интактном вирусе, получены при изучении оптических свойств
ВЖМТ [738]. Для интактного ВЖМТ относительное поглощение РНК по
7-0893
98
Глава V
сравнению с поглощением составляющих ее мононуклеотидов (с поправкой
на светорассеяние и поглощение белка) равно приблизительно 0,7. Сравнив
эту величину с данными, опубликованными для синтетического полимера
А 4- У, Хазелькорн [738] пришел к выводу, что по крайней мере две трети
оснований вирусной РНК имеют в достаточной мере упорядоченную ориен-
тацию, для того чтобы обеспечить наблюдаемую степень гипохромного
эффекта полинуклеотидной спирали.
Кратковременная щелочная обработка ВЖМТ при 30 °C и высокой
ионной силе in situ вызывает разрывы, приводя к образованию фрагментов
РНК, довольно однородных по величине, у которых s2o,w равно л; 5 S [915].
Этой величине должны соответствовать отрезки, составляющие примерло-
1/so всей молекулы РНК, что в свою очередь, вероятно, находится в соответ-
ствии (каким образом, мы пока не знаем) с наличием 32 участков, где РНК
связана с капсидным белком вируса, как это следует из данных рентгено-
структурного анализа [914]. Бош и др. [228] показали, что после мягкой
щелочной обработки этого вируса его РНК можно выделить из белковой
оболочки фенолом. В соответствующих условиях фрагменты РНК из отдель-
ной вирусной частицы существуют в виде компактной структуры, седимен-
тирующей быстрее и более однородно, чем интактная РНК ВЖМТ. Деталь-
ное изучение этих агрегатов может облегчить выяснение вопроса о располо-
жении РНК в интактном вирусе. Пока еще определенно не установлено,
имеет ли РНК ВЖМТ, находящаяся в интактном вирусе, форму замкнутой
петли или нет. Результаты рентгеноструктурного анализа говорят в пользу
существования такой структуры.
Вирус крапчатости конских бобов
Структура поверхности частицы вируса крапчатости конских бобов;
(ВККБ) сходна со структурой ВЖМТ. Судя по электронным микрофотогра-
фиям, полученным методом негативного контрастирования, оболочка ВККБ
состоит из 32 морфологических субъединиц, расположенных в узлах икоса-
эдрической решетки с триангуляционным числом, равным 3 [520]. Подобно
ВЖМТ, белковая оболочка этого вируса построена из 180 белковых субъ-
единиц с молекулярной массой около 20 500 дальтон. Морфологические
единицы выступают по крайней мере на 1,5 нм над поверхностью частицы;
при негативном контрастировании электронноплотное вещество проникает,
по-видимому, в центр вирусной частицы; это наводит на мысль о существо-
вании центральной полости, которая не обнаружена.у ВЖМТ. Наличие
такой полости, радиус которой составляет около 5,5 нм, было подтверждено-
рентгеноструктурным анализом [523]. Финч и Клуг высказали мысль о том,
что отсутствие центральной полости у ВЖМТ, возможно, обусловлено необ-
ходимостью упаковки в частице большего количества РНК (37% по сравне-
нию с 22% у ВККБ). Более детально морфология ВККБ была изучена пу-
тем сравнения изображений вирусных частиц, полученных методом негатив-
ного контрастирования, с полученными методом наложения расчетными мо-
делями возможного расположения единиц в икосаэдрической поверхностной
решетке с триангуляционным числом, равным 3.
Основные особенности структуры ВККБ, постулированные Финчем
и Клугом [520], представлены (и сравниваются с особенностями структуры
ВЖМТ) на фото 15 (пробковые модели).
Диаметр ВККБ примерно па 7% меньше диаметра ВЖМТ. Группы
из 5 или 6 структурных субъединиц располагаются в направлении, примерно
совпадающем с ближайшей осью симметрии 5-го или 6-го порядка. У ВЖМТ
субъединицы расположены под некоторым углом к ближайшей оси симмет-
рии 5-го или 6-го порядка. На основании сравнения распределения материи
Строение вирусов
99
в ВККБ, ВЖМТ и в пустых оболочках ВЖМТ Финч и Клуг [520] пришли
к выводу, что РНК ВККБ связана, по крайней мере частично, с 32 морфоло-
гическими субъединицами.
Вирус огуречной мозаики
Вирус огуречной мозаики (ВОМ) сходен с ВККБ по содержанию РНК
в частице, но для него характерны значительно большие размеры белковых
субъединиц (табл. 6). Финч и др. [522], используя методы электронно-мик-
роскопического исследования, аналогичные тем, которые применялись при
изучении ВККБ, показали, что эти вирусы очень сходны друг с другом как
по структуре их поверхности, так и по тому, что в частице этих вирусов имеет-
ся центральная полость. Белковая оболочка ВОМ состоит из 180 субъединиц,
сгруппированных в 32 морфологические субъединицы (12 пентамеров и 20 гек-
самеров). Диаметр частиц этого вируса при использовании для их изучения
метода негативного контрастирования составлял 30 нм (диаметр ВККБ
26 нм). Таким образом, по структуре поверхности вирус огуречной мозаики
можно рассматривать как увеличенный вариант ВККБ. На основании экспе-
риментов по изучению гипохромного эффекта интактного вируса и изоли-
рованной РНК ВОМ Кейпер и др. [92] пришли к выводу, что РНК в вирус-
ной частице обладает выраженной вторичной структурой, эквивалентной
степени спирализации порядка 70%.
Вирус хлоротической крапчатости коровьего гороха
Диаметр частиц вируса хлоротической крапчатости коровьего гороха
(ВХККГ) составляет ta 25 нм, а молекулярная масса структурной белковой
субъединицы — 19 500 дальтон. Морфологические субъединицы окружены
пятью или шестью соседями.. Четкая электронная микрофотография, полу-
ченная Банкрофтом и др. [81], говорит о том, что, так же как и ВЖМТ,
ВХККГ имеет 20 морфологических субъединиц, расположенных на осях
симметрии третьего порядка и состоящих каждая из 6 структурных субъ-
единиц, и 12 морфологических субъединиц на осях симметрии пятого поряд-
ка (по 5 структурных субъединиц в каждой), что в сумме дает 180 субъеди-
ниц во всей белковой оболочке.
Вирус некроза табака
Этот вирус содержит около 20% РНК, и его частицы имеют форму
многогранника. Диаметр частиц на электронных микрофотографиях, полу-
ченных методом негативного контрастирования, составляет от 26 до 30 нм,
что зависит от особенностей приготовления препарата [54, 949]. Детальная
структура этого вируса не выяснена, но он представляет значительный
интерес, поскольку некоторые изоляты содержат связанный с этим вирусом
вирус-сателлит, описанный ниже, а также в гл. VIII.
Вирус-сателлит
Вирус-сателлит (ВС) имеет форму многогранника и является одним из
самых мелких среди известных вирусов. Исходя из данных о коэффициенте
седиментации и коэффициенте диффузии, Рейхман и др. [1415] рассчитали,
что молекулярная масса частицы должна составлять 1,97 -Ю0. Диаметр
частицы равен примерно 18 нм. Вирус-сателлит содержит около 20% РНК,
которая представляет собой единую молекулу, состоящую примерно из
1200 нуклеотидов [1413]. Молекулярная масса белковой субъединицы ВС
7*
100 Глава V
составляет около 25 000 [1415], что соответствует 240 аминокислотным остат-
кам. Рейхман [1413] считает, что минимальная молекулярная масса белковой
субъединицы равна 13 000 (124 аминокислотных остатка). По данным: ана-
лиза концевых групп, показавшего, что на обоих концах пептидной цепи
находится аланин, величина молекулярной массы белковой субъединицы
ПС равна примерно 40 000 [1413, 1416]. Однако следует иметь в виду, что
результаты анализа концевых групп могут ввести в заблуждение. Рис и Кас-
санис (личное сообщение) повторно исследовали размер химической субъ-
единицы, используя исходный изолят ВС1, пассированный из единичного
некроза, чтобы избежать возможного загрязнения другими вирусами-сател-
литами. Было найдено, что белок ВС1 состоит из 213 аминокислот, что соот-
ветствует молекулярной массе субъединицы, равной 24 000. При обработке
трипсином образуется 22 пептида; это соответствует 8 остаткам лизина
и 14 — аргинина, обнаруженным при аминокислотном анализе. Три из
этих пептидов содержат гистидин, а четыре — тирозин, что также соответст-
вует данным аминокислотного анализа. На основании исследований мето-
дом гель-электрофореза Рой и др. [1452] полагают, что молекулярная масса
белковой субъединицы составляет 27 000.
Результаты исследования электронных микрофотографий и сравнения
их с моделями позволили Хёглунду [807] заключить, что ВС, по-видимому,
построен из 12 морфологических субъединиц (т. е. Т = 1, Р ~ 1, а число
химических субъединиц в белковой оболочке составляет 60). Такая струк-
тура подтверждается и более поздними исследованиями Клуга и Финча
(личное сообщение) (фото 16).
Вирусы, состоящие, возможно, из 42 структурных
субъединиц
Изучение электронных микрофотографий по методу Маркхэма (стр. 87)
позволило предположить, что частицы вируса кольцевой пятнистости табака
[351, 1387] и вируса мозаики резухи [8], возможно, представляют собой
икосаэдры, для которых характерно наличие 42 структурных субъединиц
(тип симметрии 532). Хотя вероятность того, что некоторые изометрические
вирусы растений имеют такую структуру, существует, этот факт нуждается
в подтверждении и требует более глубокого анализа.
ВИРУС МОЗАИКИ ЛЮЦЕРНЫ
Частицы вируса мозаики люцерны (ВМЛ) отличаются от других вирусов
растений своей бацилловидной формой. Структуре этих вирусов присущи
некоторые особенности, характерные как для палочкообразных, так и для
изометрических вирусов. Из вирусного препарата ВМЛ было выделено
5 компонентов (t0, ta, М и В). По крайней мере четыре из них оказались
необходимыми для возникновения инфекции (гл. VIII). Халл и др. [847]
исследовали размеры разных частиц и сопоставили их с величинами sanw,
полученными для компонентов, разделяемых в ультрацентрифуге. Эти
данные наряду с размерами, найденными для фиксированных препаратов,
таковы: нижний компонент (В) — 99 S, 59-18 нм; средний компонент (М) —
88 S, 53 -18 нм; верхний компонент tb — 76 S, 42 -18 нм; верхний компонент
tn—68 S, (26—39)-18 нм; верхний компонент t0 — 53S, сферические
частицы диаметром около 18—19 им.
Гиббс и др. [619] предложили модель, удовлетворительно объяснявшую
картины, наблюдаемые при негативном контрастировании частиц. Халли др.
[847], пересмотрев данные о размерах частиц и содержании РНК (17,8%
Строение вирусов
101
для частиц всех классов), провели расчеты, которые показали, что исходя
из модели Гиббса и др. [619] нельзя получить правильных значений молеку-
лярной массы частиц. Они предложили модель, комплементарную этой мо-
дели в том отношении, что расположение белка и контрастирующего веще-
ства в ней является обратным. В основе предлагаемой ими модели лежит
сфера (фото 17).
На основании изучения оптической дифракции они пришли к выводу,
что диаметр субъединиц составляет около 9,6 нм. Субъединицы такого раз-
мера должны были бы образовать икосаэдр, состоящий из 12 морфологи-
ческих субъединиц, диаметром около 18 нм, соответствующий по величине
наименьшему компоненту. Данные о размере и молекулярной массе хорошо
соответствуют предположению о том, что каждая морфологическая субъ-
единица состоит из 5 пептидов. Ряд начинается с частицы, содержащей
60 химических субъединиц, число которых в принципе может последова-
тельно увеличиваться на 18 (три гексамера). Существующие частицы не за-
полняют все теоретически возможные положения в ряду (компонент t.o со-
стоит из 60 химических субъединиц; ta — 96; tb — 114; М — 150 и В — 186
субъединиц). Вероятно, капсидный белок идентичен для всех частиц. Однако
детальный сравнительный анализ с применением метода «отпечатков паль-
цев» и серологических методов [1229] был осуществлен только в отношении
белка верхнего и нижнего компонентов.
Содержание РНК в ВМЛ высоко по сравнению с содержанием в палочко-
образных вирусах, и, возможно, имеющегося количества белка едва хватает
для эффективной защиты РНК. Вирусоподобные частицы сходной величины,
формы и внешнего вида были выделены из больных шампиньонов [810], но
в серологическом отношении они оказались не родственными ВМЛ. При
изучении препаратов вируса деформации побегов дерева какао было обна-
ружено, что они содержат палочки различной длины с округленными кон-
цами. Ширина палочек составляла около 28 нм, а средняя длина прибли-
зительно 121 нм [299]. Детали строения вируса неизвестны.
ВИРУСЫ, СОДЕРЖАЩИЕ ДВУХЦЕПОЧЕЧНУЮ РНК
Вирус раневых опухолей
Билс и Холл [199] исследовали вирус раневых опухолей в электронном
микроскопе, используя для этого метод оттенения металлами, а также пози-
тивное и негативное контрастирование. Применяя метод двойного оттенения,
они получили некоторые данные о том, что для частиц этого вируса, возмож-
но, характерна икосаэдрическая симметрия. Диаметр частиц на электрон-
ных микрофотографиях, полученных методом негативного контрастирова-
ния, составлял около 62 нм. Центральная часть частицы заметно выделялась
при контрастировании уранилацетатом. Это позволяет предположить, что
данная область диаметром около 35 нм, на долю которой приходится 20%
объема частицы, заполнена РНК. На поверхности частицы можно было на-
блюдать морфологические субъединицы диаметром около 7,5 нм. Билс и Холл
пришли к выводу, что число таких морфологических субъединиц составляет,
вероятно, 92. Согласно табл. 8, такая частица должна относиться к классу
Р--1, 7=9, а число структурных субъединиц в ней должно быть равно 540.
Вирус карликовости риса
Фукуси и др. [580] изучали строение вируса карликовости риса на уль-
тратонких срезах тканей растений и цикадок, а также в изолированных пре-
паратах. В вирусных препаратах можно было наблюдать многочисленные
102
Глава V'
сферические частицы или частицы, имеющие форму многогранника, размер
которых варьирует (диаметр около 70 нм). Внутри частиц были обнаружены
центральные темные участки, однородные по величине, диаметр которых
составлял около 40—50 нм. Частицы диаметром 70 нм нередко были окру-
жены мембранами, имеющими, вероятно, клеточное происхождение.
Эти вирусные частицы можно отделить от окружающих их мембран
путем обработки смесью хлороформа с бутанолом, и тогда на электронных
микрофотографиях, полученных методом негативного контрастирования,
выявляются некоторые из ожидаемых деталей структуры икосаэдра [578]
(фото 18).
КРУПНЫЕ ВИРУСЫ, ИМЕЮЩИЕ ВНЕШНЮЮ ОБОЛОЧКУ
Сферические частицы
Вирус броизовости томатов
Имеется много штаммов этого вируса, и разные исследователи исполь-
зовали различные его изоляты для изучения строения частиц либо на тонких
срезах листа, либо в изолированных суспензиях вируса, либо, наконец,
в исходных экстрактах. Этот вирус нестабилен, в связи с чем его структура
до сих пор окончательно не исследована. Судя по препаратам, полученным
методом распыления капель, частицы различных штаммов вируса, очевидно,
различаются по своей жесткости [189]. В листьях инфицированного расте-
ния N. glutinosa с системным поражением Бест [190] обнаружил частицы
различной величины и формы. Среди них были округлые, трубчатые и ните-
видные частицы, а также можно было наблюдать спиральные нити, которые,
возможно, представляли собой вытянутые центральные стержни. Ряд авто-
ров [193, 853, 979,1825] описали частицы, размеры которых колеблются от
55 до 120 нм. Вероятно, эти колебания в некоторой степени были обусловлены
уплощением и разрушением частиц в процессе высушивания. Частицы окру-
жены мембраной толщиной около 5 нм. С внешней стороны мембраны имеется
зона белковых субъединиц приблизительно такой же толщины (фото 19, Л).
Милн [1216] обратил внимание на сходство по величине, форме и внут-
реннему строению между вирусом броизовости томатов и вирусом гриппа
(фото 19, Б), когда методы, используемые для их электронно-микроскопи-
ческого исследования, были одинаковы. Бест [190] также пришел к выводу
о том, что вирус броизовости томатов является по существу плеоморфным
миксовирусом.
Бацилловидные частицы, или частицы,
имеющие форму пули
Эта группа крупных вирусов растений имеет сложное строение, причем
они поразительно сходны с некоторыми вирусами животных, особенно с ви-
русом везикулярного стоматита и другими рабдовирусами [333, 464]. По
своей форме все они напоминают пулю. Если наблюдается какая-либо иная
форма, то это следует, вероятно, рассматривать как артефакт, вызванный
процессом приготовления препарата. Размеры, которые определяли для
этих частиц (особенно диаметр), являются только приблизительными вслед-
ствие изменений, происходящих в таких крупных частицах в процессе
подготовки препаратов для электронно-микроскопического исследования.
Число сообщений о вирусах этого типа из разных стран быстро возрастает,
но пока выполнено мало исследований по выяснению возможных взаимо-
Строение вирусов
103
отношений между различными вирусами, относящимися к этому типу. Их
легко наблюдать в электродном микроскопе, но не так легко выделить и изу-
чить с химической точки зрения. Вполне вероятно, что они содержат РНК,
но это еще не установлено.
Вирус желтой карликовости картофеля,
Частицы вируса желтой карликовости картофеля (ВЖКК) имеют ба-
цилловидпую форму с округленными концами и средние размеры 380 -75 нм.
Вирусная оболочка состоит из трех слоев толщиной около 3,5 нм, располо-
женных па расстоянии 5 нм друг от друга [ИЗО] (фото 20). Отдельные слои
образованы, вероятно, из соединенных своей боковой поверхностью субъ-
единиц диаметром около 3,5 нм. При изучении электронных микрофотогра-
фий можно предположить, что внутренний компонент вируса расположен
в виде спирали.
На основании ранних исследований, выполненных на очищенных пре-
паратах этого вируса (см., например, [211]), был сделан вывод, что частицы
ВЖКК имеют форму, близкую it сферической. Как оказалось в дальнейшем,
эти частицы образовывались, вероятно, в результате разрушения бацилло-
видных частиц в процессе выделения и подготовки препаратов для электрон-
но-микроскопического исследования [1128, ИЗО].
Вирус некротического пожелтения салата-латука
Частицы вируса некротического пожелтения салата-латука (ВНПЛ)
бацилловидпые или имеют форму пули; ширина их составляет 66 пм, а наи-
более обычная длина — около 227 нм [722, 1930]. Для ВНПЛ характерно
наличие внешней оболочки, которая окружает внутреннюю трубчатую часть
вируса, но неплотно примыкает к ней. На этой оболочке имеются равномерно
расположенные выступы длиной около 6 нм, расстояние между которыми
составляет примерно 6 пм. Во внутренней части вируса обнаруживается
поперечная исчерчениость с интервалами 4,5 им. У некоторых частиц эта
поперечная исчерчениость соответствует, по-видимому, структуре, имеющей
вид спирали, тогда как для других частиц более вероятно, что структура
имеет вид стопки колец. На некоторых электронных микрофотографиях по-
перечные полосы представляются состоящими примерно из 10 бусинок
(25 па виток), что позволяет предположить наличие субъединиц. Во внут-
ренней части вируса имеется центральный канал, который выявляется мето-
дом негативного контрастирования.
Окончательный химический анализ ВНПЛ не проведен, так как до сих
пор не удавалось достаточно полно очистить вирус от примесей материала
растения-хозяина. Однако вполне вероятно, что вирус содержит РНК,
а исчезновение инфекционности после обработки хлороформом и диэтило-
вым эфиром позволяет предположить наличие в его составе липидов.
Вирус гомфрены
Этот вирус, найденный в Бразилии [980], относится к числу сложных
и очень напоминает по особенностям своей структуры ВНПЛ, обнаруженный
в Австралии, хотя, согласно имеющимся данным, несколько отличается
по своим размерам. Частицы этого вируса бацилловидпые, и для них харак-
терна длина 220—260 нм и диаметр 80—100 нм. Частицы имеют внешнюю
оболочку толщиной 8—10 нм. На этой мембране можно наблюдать равно-
мерно расположенные выступы типа бусинок длиной 6—7 нм. Во внутренней
104
Глава V
трубчатой части вируса длиной 200—240 им и диаметром 60—70 им имеется
осевой канал шириной 35—40 нм. В этой сердцевине видны 80—90 чередую-
щихся светлых и темных поперечных полос шириной 2,6 им каждая.
Вирус мозаики кукурузы
В тканях растений кукурузы, зараженных вирусом мозаики кукурузы,
были найдены бацилловидные вирусоподобные частицы [771]. Эти частицы,
длина которых оказалась равной около 240 нм и диаметр 48 нм (измерения
проводили на ультратонких срезах), имели две отграничивающие их мем-
браны и плотную палочковидную сердцевину диаметром около 10 нм.
Частицы подобного же размера наблюдались в слюнных железах и в клетках
эпителия стенки кишечника инфицированных особей насекомого-переносчика
Peregrinus maidis (Ashm.) [767]. Частицы, обнаруженные в препаратах, при-
готовленных методом распыления капель, имели значительно больший диа-
метр — около 90 нм [770]. Разница, вероятно, была обусловлена сморщива-
нием частиц, изучавшихся на срезах, и уплощением частиц при распылении
их на пленке-подложке. Вирус до сих пор не выделен, и вывод о том, что
эти частицы представляют собой вирус мозаики кукурузы, основан только
на отсутствии подобных частиц в тканях здоровых растений кукурузы или
здоровых насекомых-переносчиков. Частицы сходного строения, но несколь-
ко отличающиеся по размерам наблюдали в растениях ячменя, заражен-
ных вирусом риса (tungro), и в тканях цикадки-переносчика Laodelphax stri-
atellus Fallen [1563].
Вирус полосатой мозаики пшеницы
Этот вирус (не смешивать с европейским вирусом полосатой мозаики
пшеницы) имеет бацилловидные частицы длиной 250—275 нм, длй которых
характерен диаметр 78 нм. Частицы кажутся плоскими на одном конце
и имеют внешнюю оболочку шириной 5 нм, окружающую электроиноплот-
ную сердцевину с центральным полым каналом шириной 23 нм. Более
короткие частицы, наблюдаемые в очищенных препаратах, образуются,
вероятно, в результате разрушения частиц длиной 250 нм [1062].
В препаратах вируса, полученных методом негативного контрастирова-
ния, выявляется однослойная оболочка [1059, 1061]. На тонких срезах зара-
женной ткани вирусные частицы иногда кажутся имеющими двойную обо-
лочку. Ли [1061] высказал мысль о том, что внутренняя часть вируса, воз-
можно, представляет собой спиральный тяж, подобно тому как это был О'
установлено для некоторых вирусов животных, имеющих в основном сходное
строение. При выявлении этой внутренней спирали на поперечных срезах
вирусов мы и видим двойную оболочку.
Вирусоподобные частицы в растениях подорожника
Хитчборп и др. [1804] наблюдали в пораженных растениях подорож-
ника (Plantago lanceolata) вирусоподобные частицы, напоминающие по своей
форме пулю. Они имели приблизительно такую же ширину, что и частицы
ВНПЛ, и для них была характерна такая же поперечная исчерчеиность
центральной части частицы с полосами, расположенными на расстоянии
около 4,5 нм друг от друга. Наиболее часто встречающаяся длина частиц
была, однако, около 330 нм, т. е. значительно больше, чем длина ВНПЛ.
Центральный стержень частицы казался заполненным каким-то мате-
риалом.
Строение вирусов
105
Вирус пожелтения жилок осота
Бацилловидные частицы длиной приблизительно 220 нм и шириной
80 нм (фото 20, Д) наблюдали в ядрах клеток осота, зараженного этим виру-
сом, а также в ядрах клеток слюнной железы тли-переносчика Byperomyzus
lactucae, питавшегося на больных растениях [1426].
СВЯЗИ, СТАБИЛИЗИРУЮЩИЕ СТРУКТУРУ ВИРУСА
О характере связей, объединяющих белковые субъединицы друг с дру-
гом и РНК с белком в вирусной частице, известно немного.
Взаимодействия белок — белок
Белковые субъединицы ВТМ, выделенные из интактного вируса in
vitro, обнаруживают заметную тенденцию к образованию агрегатов. Такая
агрегация в значительной степени зависит от температуры, pH, ионной силы
и концентрации белка. Агрегаты разной величины образуются в различ-
ных условиях. Наиболее мелкие стабильные агрегаты являются, вероятно,
тримерами химических субъединиц и имеют величину s20,w, равную 4,3 3
[331, 1046]. Такой агрегат известен под названием А-белка. Такахаси и Исии
[1737] и Джинер и Лемойн [866] описали низкомолекулярный вирусоспе-
цифичпый белок, выделенный из зараженных листьев табака. Такахаси
и Исии назвали его Х-белком. Х-белок, вероятно, идентичен А-белку, обра-
зующемуся in vitro (фото 81). Более крупные агрегаты белка ВТМ (по более
короткие, чем вся вирусная частица) можно наблюдать на электронных
микрофотографиях, полученных при изучении инфекционного сока листьев,
а также в очищенных препаратах. Эти палочки могут содержать РНК или
состоят только из одного белка. В белковых палочках субъединицы могут
1
быть расположены в виде спирали, как в интактном вирусе (16 j белковых
субъединиц иа виток), или же они образуют стопку дисков. Из опытов с бел-
ком ВТМ in vitro очевидно, что наличие вирусной РНК не является необ-
ходимым условием для упаковки белковых субъединиц в виде палочек со
спиральной симметрией, что характерно для интактного вируса. При фор-
мировании стопки дисков 16 или 17 субъединиц образуют плоское кольцо,
и наименьшим стабильным агрегатом является двойной диск, состоящий из
двух колец, построенных из субъединиц. Такой тип агрегации представлен
на фото 21.
Мак-Карти [1118] изучал размеры агрегатов, обнаруживаемых в пре-
паратах А-белка, путем седиментационного анализа, электронной микроско-
пии и электрофореза в акриламидном геле. Полученные результаты нахо-
дятся в соответствии с данными о том, что стабильными агрегатами мономе-
ров являются тример, гептамер, двойной диск из 34 субъединиц, сегмент
спирали, состоящий из 3 витков, и димер двойных дисков.
На основании рентгеноструктурного анализа трехмерных кристаллов
белка ВТМ, образуемых из субъединиц при pH 8,0 в 0,5 М сульфате аммония,
Финч и др. [521] пришли к выводу, что элементарным «блоком» в кристал-
лической решетке служит диск, построенный из двух колец, образованных
субъединицами. Методами рентгеноструктурного анализа и электронной
микроскопии было установлено, что число субъединиц в каждом диске
равно 17. В соответствующих условиях in vitro могут образовываться истин-
ные трехмерные кристаллы белковых субъединиц ВТМ [1129] (фото 22).
106
Глава V
Мутантные штаммы ВТМ могут образовывать необычные формы белко-
вых агрегатов (гл. XIII).
Тот факт, что пустые белковые оболочки, внешне сходные с целыми
вирусами, существуют или их можно получить искусственно из интактных
икосаэдрических вирусов, таких, например, как ВЖМТ, говорит о том,
что структура оболочки, образованная субъединицами, может сохраняться
и в отсутствие РНК. Опыты по реконструкции, проведенные с использова-
нием белковых субъединиц как сферических, так и палочкообразных виру-
сов, которые рассматриваются в гл. VII, указывают на существование спе-
цифических связей между белковыми субъединицами, главным образом
и определяющих строение этих мелких вирусов.
Весьма вероятно, что поверхности белковых субъединиц ВТМ содержат
в основном гидрофобные группы и что наиболее важная роль при взаимо-
действии субъединиц принадлежит гидрофобным (неполярным) связям [1052].
Образование таких связей предполагает существование некоторой стерео-
специфичности [331]. Дополнительным источником специфичности при взаи-
модействии могут служить водородные и ионные связи между субъедини-
цами. Однако исследования кинетики реакции полимеризации — деполи-
меризации белка ВТМ позволяют предположить, что соединенные при помощи
водородных связей карбоксильные группы, вероятно, играют очень неболь-
шую роль при взаимодействии субъединиц ВТМ между собой [28].
Исследования Каспара показали, что атомы свинца связываются с кар-
боксильными группами с аномально высокими рК и располагаются в двух
различных местах па расстоянии 2,5 и 8,4 нм от оси частицы. В каждой
такой точке субъединицы связываются две карбоксильные группы. Каспар
[331] предполагает, что водородные связи между карбоксилами внутри субъ-
единицы обусловливают стабильность спирали ВТМ, ио не непосредственно,
а путем уменьшения отрицательного заряда субъединиц, снижая таким обра-
зом электростатическое отталкивание между ними.
Взаимодействия белок — РНК
Наличие РНК внутри белковой спирали ВТМ в значительной степени
стабилизирует структуру этого вируса. С каждой белковой субъединицей
связаны три нуклеотида спирали РНК. Кислые фосфатные группы, вероятно,
нейтрализованы ионными связями с основными группами на поверхности
белковой субъединицы, расположенными в желобке, где находится РНК,
или поблизости от пего. Минимальное количество полиамина, связанного
с ВТМ [894], могло бы нейтрализовать лишь небольшую долю фосфатных
групп.
Джонсон и Маркхэм [894] предположили, что в состав «пробок», запе-
чатывающих РНК в вирусной палочке с обоих ее концов, возможно, входит
полиамид. Число прочно связанных ионов металлов также мало по отно-
шению к числу фосфатных групп. Каспар [331] высказал мысль о том, что
могут существовать какие-то специфические связи менаду РНК ВТМ и бел-
ковыми субъединицами. Однако специфичность этих связей не должна быть
сильно выраженной, так как все возможные триплеты оснований, вероятно,
располагаются вдоль длины РНК и все они связаны с идентичными белко-
выми субъединицами. Кроме того, белковые субъединицы ВТМ в соответст-
вующих условиях образуют палочки с РНК ВЖМТ, имеющей совершенно
иной состав оснований [1184]. Одиако вполне возможно, что образование
более прочных связей происходит между субъединицами и триплетами, бога-
тыми каким-то одним или более основаниями. Образование подобного рода
сильных связей могло бы объяснить тот факт, что белок предпочтительно
отщепляется с одного конца РНК.
Строение вирусов
107
Известно, что реконструкция происходит более эффективно, когда белок
ВТМ смешивают с РНК ВТМ, а не, скажем, с РНК ВЖМТ. Возможно, это
связано с тем, что свободная РНК в растворе в условиях проведения экспе-
риментов по реконструкции обладает в той или иной мере вторичной струк-
турой и дело здесь вовсе не в специфичности последовательности оснований
как таковой.
Еще меньше известно о связях между РНК и белком у икосаэдрических
вирусов. В ВЖМТ содержится значительное количество полиамина, и он
может участвовать в нейтрализации фосфатных групп. При добавлении
этого полиамина к изолированной РНК in vitro он, по-видимому, стабили-
зирует молекулу, сохраняя тем самым более или менее сферическую форму,
что было установлено при помощи электронной микроскопии [8931; кроме
того, полиамин повышает устойчивость РНК к раскручиванию под дейст-
вием температуры [1226]. Спиральные участки в молекуле РНК могут спо-
собствовать стабильности частицы в целом. Благодаря экспериментам по
реконструкции, проведенным с использованием вирусной РНК и белковых
субъединиц in vitro, мы получили некоторые сведения о роли белка и РНК
в структуре вируса. Эти данные рассматриваются в гл. VII.
ГЛАВА VI
СПОСОБЫ ПЕРЕДАЧИ ВИРУСОВ
И МЕТОДЫ ИНФИЦИРОВАНИЯ РАСТЕНИИ
В отдельных особях долгоживущих древесных растений вирусы могут
сохраняться в течение сотен лет. Однако, будучи облигатными паразитами,
вирусы для того, чтобы выжить, должны обладать способностью переда-
ваться от одной чувствительной особи к другой с достаточной частотой. Зна-
ние тех способов, с помощью которых вирусы могут передаваться от одного
растения к другому, представляется важным для нас по нескольким причи-
нам: 1) при экспериментальной работе вывод о том, что данное заболевание
вызвано вирусом, можно сделать лишь в том случае, если с помощью какого-
либо метода удается передать вирус на здоровые особи и воспроизвести забо-
левание; 2) вирусы важны в экономическом отношении лишь тогда, когда
передаются от растения к растению с большой частотой, учитывая нормаль-
ную продолжительность вегетационного периода, характерного для данной,
ценной в хозяйственном отношении культуры; 3) для разработки успешных
защитных мероприятий необходимо знание путей распространения вируса
и механизмов развития инфекции; 4) вопрос о взаимоотношениях вирусов
с переносчиками — беспозвоночными и грибами — имеет значительный
общебиологический интерес; 5) некоторые способы передачи вирусов, особен-
но механические, играют большую роль при исследовании вирусов в лабо-
ратории.
Вирусы, по-видимому, не обладают способностью проникать через не-
поврежденную кутикулу листа растения. Возникающую при этом проблему
можно преодолеть, либо избежав необходимости проникать через кутикулу
(например, передача вирусов с помощью семян или при вегетативном размно-
жении), либо используя некоторые методы, обеспечивающие эту возмож-
ность, связанные с повреждением кутикулы, что можно наблюдать при ме-
ханической инокуляции и передаче вирусов с помощью насекомых-пере-
носчиков. Наши знания о способах передачи вирусов еще далеко не доста-
точны. Так, в отношении многих из них, для которых в настоящее время
известны лишь 1—2 способа передачи, можно почти с полной уверенностью
сказать, что будут найдены и другие способы. Многое еще предстоит выяс-
нить о взаимоотношениях между вирусами и насекомыми, вирусами и гри-
бами, а также о возможности переноса вирусов (или отсутствии этой воз-
можности) через завязь и пыльцу.
ПРЯМАЯ ПЕРЕДАЧА ВИРУСА
Передача вирусов с помощью семян
Примерно один из десяти известных вирусов растений передается через
семена инфицированных растений-хозяев или в результате опыления цветков
здоровых растений пыльцой зараженных. Передача вируса с помощью се-
мян представляет собой весьма эффективный способ заражения какой-либо
культуры на ранних стадиях развития, причем на участке, занятом этой
культурой, появляются беспорядочно разбросанные очаги инфекции. Таким
Способы передачи, вирусов и методы инфицирования растений 109
образом, если па данном участке вирус может передаваться от растения
к растению и какими-либо другими способами, внесение вируса с помощью
семян, вероятно, представляет собой очень важный экономический фактор.
Вирусы могут находиться в семени в течение длительного периода времени,
так что распространение подобного рода вирусов на очень большие расстоя-
ния с помощью семян может оказаться весьма эффективным. Фултон [588]
составил список, куда входят 36 вирусов, которые, как установлено, пере-
носятся с помощью семян, находясь внутри них. Этот список включает
вирусы: кольцевой пятнистости табака, мозаики салата-латука, штриховатой
мозаики ячменя, мозаики фасоли, южной мозаики фасоли, мозаики ильма
и кольцевой пятнистости сливы.
Иной тип передачи, когда распространение вируса в значительной сте-
пени ограничено семенной кожурой, можно наблюдать в случае передачи
ВТМ с помощью семян томатов. В своем недавнем исследовании, касаю-
щемся этого вопроса, Бродбент [284] подтвердил результаты более ранних
работ [1751], в которых было показано, что вирус у большинства инфициро-
ванных семян томатов переносится на их наружных покровах. Расположен-
ный на поверхности семян вирус можно легко инактивировать. Небольшое
и вместе с тем варьирующее количество семян может содержать вирус в эндо-
сперме, что наблюдается главным образом в семенах плодов, которые обра-
зовались из цветков, развившихся после заражения растения. В эндосперме
вирус может находиться, как было показано, в течение 9 лет, однако при
этом в зародыше вирус не обнаруживается. Заражение проростков вирусом,
находящимся в семени, происходит лишь при пикировке, неизбежно приво-
дящей к поранению растения. ВТМ, по-видимому, также может переноситься,
находясь внутри семян яблонь, груш [645] и винограда [644], однако эти
данные нуждаются в проверке, при которой соответствующие контрольные
опыты позволили бы исключить возможность контаминации исследуемых
растений вирусом.
Факторы, влияющие на количество инфицированных семян
I. Свойства вируса и вирусных штаммов. Коли-
чество содержащих вирус семян, образовавшихся на зараженных растениях,
широко варьирует в зависимости от типа вируса. Так, Этхау и Банкрофт
[43] показали, что процент передачи через семена отдельных растений сои
вируса кольцевой пятнистости табака может доходить до 100. Напротив,
растения салата, инфицированные вирусом мозаики салата-латука, обра-
зуют примерно 3—15% семяп, из которых развиваются зараженные расте-
ния [413, 569]. Большинство штаммов вируса южной мозаики фасоли инфи-
цируют зародыши, по вирус обычно инактивируется, когда семя созревает.
Шеферд и Фултон [1558] описали штамм вируса южной мозаики фасоли,
который передавался примерно 3—4% семян инфицированных растений
коровьего гороха.
II. Растение-хозяин. Некоторые вирусы, передача которых
обычно осуществляется с помощью семян, переносятся семенами многих •
видов растений-хозяев. Так, вирус черной кольцевой пятнистости томатов,
передавался всеми девятью исследованными видами растений из шести се-
мейств [1075]. Другие вирусы могут передаваться через семена одного ра-
стения-хозяина, но не передаются через семена другого. Например, латент-
ный вирус мозаики повилики передается 5% семян инфицированных расте-
ний Cuscuta campestris, но не передается через семена дыни-канталупки, гре-
чихи или кермеса.
Различные разновидности одного и того же вида растения-хозяина могут
широко варьировать в зависимости от их способности передавать какой-то
110 Глава VI
определенный вирус через семена. Так, вирус мозаики салата-латука, по-
видимому, не передается через семена сорта Чесхант Эрли Джайнт, тогда
как от 1 до 8% семян других сортов салата-латука обладают способностью
передавать этот вирус [680].
III. Сроки заражения растения. Вообще говоря, чем
раньше растение заражено, тем выше процент семян, которые оказываются
способными передавать вирус (см., например, [307]). Описано, по-видимому,
единственное исключение из этого правила. При инфицировании растения
ячменя на разных стадиях развития вирусом штриховатой мозаики ячменя
количество семян, способных передавать вирус, неуклонно возрастает но-
мере развития растения, достигая своего максимума при заражении растений
за 10 дней до колошения. Если производить заражение позже, то процент
инфицированных семян снижается [501]. Опытами других исследователей
[1774] было установлено, что семена растений ячменя, инокулированных
'за 7 дней до цветения или на более поздних стадиях развития, пе обладают
способностью передавать вирус.
Кроули [419] исследовал вопрос о связи между временем цветения и сро-
ками инокуляции растений на количество образовавшихся семян фасоли
(Phaseolus vulgaris L.), зараженных вирусом южной мозаики фасоли. Само-
опыление у этих растений происходит в тот момент, когда раскрывается
цветок. В проведенных опытах фиксировали время наступления этого собы-
тия и сроки проведения инокуляции. Из образовавшихся семян удаляли
зародыши еще до того, как они были полностью сформированы, и исследовали
их на инфекционность. Оказалось, что вирус способен инфицировать зародыш
как в результате заражения гамет, так и в результате заражения уже обра-
зовавшегося зародыша, однако лишь на ранних стадиях его развития (до-
четырех дней после оплодотворения). Аналогичные результаты были полу-
чены Кроули при исследовании вируса кольцевой пятнистости табака в ра-
стениях сои и вируса штриховатой мозаики ячменя в ячмене.
IV. Местоположение семени на растении. По-
видимому, не существует никакой закономерности в том, каким образом
расположены на растении инфицированные и неинфицированпые семена.
Так, было показано [44], что расположение семян в бобе и местоположение
бобов на растении, по-видимому, не оказывают влияния на количество се-
мян сои, зараженных вирусом кольцевой пятнистости табака. В этих экспе-
риментах были использованы растения, инфицированные вирусом в течение
продолжительного времени. У растений, семена которых образуются после-
довательно в течение какого-то определенного периода, заражение, проис-
ходящее незадолго до цветения или во время цветения, иногда приводит
к тому, что более молодые семена оказываются сильнее зараженными вирусом,
чем ранее созревшие семена.
V. Возраст семян. Некоторые вирусы, по-видимому, исчезают
из семян быстрее, чем снижается всхожесть семян. Так, Валло [1805] пока-
зал, что количество семян табака, зараженных вирусом кольцевой пятни-
стости, через 5,5 лет хранения уменьшилось, однако в этих опытах такой
эффект мог быть обусловлен понижением жизнеспособности семян. Фултон
[588] описал действительно имевшее место исчезновение вируса некротиче-
ской кольцевой пятнистости вишни из семян Primus pensylvanica. В этом
случае в течение первых четырех лет храпения семян при 2 °C процент ин-
фицированных семян оставался довольно постоянным и был равен 60—70.
Через 6 лет хранения инфицированными оказались менее 5% семян, тогда
как снижение жизнеспособности семян было ничтожным. Положение с ви-
русом южной мозаики фасоли в растениях Phaseolus vulgaris можно рассма-
тривать как крайний случай исчезновения вируса из зараженных семян.
Этот вирус можно выделить из зародышей еще не созревших семян, но ко
Способы передачи вирусов и методы инфицирования растений 111
времени созревания семени, когда оно становится уже сухим, вирус там не.
обнаруживается [357].
VI. Температура. Хорошо высушенные семена значительно бо-
лее устойчивы к действию высоких температур, чем большинство других
частей растения. Некоторые вирусы, которые передаются с помощью семян,
примерно в такой же степени, по-видимому, устойчивы к высоким темпера-
турам, как и семя, которое они инфицируют. Это справедливо, в частности,
в отношении вируса мозаики дыни-канталупки, который, возможно, пред-
ставляет собой вирус мозаики тыквы [1374]. Вирусы могут быть более устой-
чивы, находясь в сухом семени, чем при исследовании их in vitro. Так, ви-
рус мозаики фасоли не очень устойчив к нагреванию in vitro. Вместе с тем
тепловая обработка зараженных семян фасоли при 100 °C в течение несколь- ,
ких часов не приводит к элиминации вируса из семени [713].
Причина повышенной устойчивости вирусов, находящихся в семенах,
не совсем ясна. Возможно, эта устойчивость обусловлена общим стабилизи-
рующим воздействием иа интактные вирусные частицы, которое оказывают
па них низкое содержание воды и высокая концентрация белка.
Передача вирусов с помощью инфицированной пыльцы
Болыпинство переносимых с помощью семян вирусов, по-видимому,
передается также и через пыльцу зараженных растений, однако не все они
были адекватно изучены. Говоря иными словами, по-видимому, не существует
пи одного примера какого-либо вируса, переносимого с помощью пыльцы,
который по передавался бы также через семена.<Исследования, касающиеся
относительной эффективности переноса вирусов через зараженную яйце-
клетку и через пыльцу, немногочисленны. Что касается вируса мозаики
фасоли, находящегося в растениях фасоли, то Нелсон и Даун [126В] нашли,
что процент инфицированных семян, образовавшихся в результате опыления
цветков здоровых растений пыльцой зараженных, был примерно тем же, что
и в случае образования таких семян из цветков зараженных растений, опы-
ленных пыльцой здоровых. Однако Крэспин Медина и Гроган [415] пока-
зали, что передача этого вируса с помощью пыльцы несколько более эффек-
тивна. Напротив, передача вируса мозаики салата-латука осуществляется
через семяпочки этого растения; в результате переноса через пыльцу обра-
зуется менее 0,5% зараженных семян [1465]. Самоопыление зараженных ра-
стений может привести, по-видимому, к образованию большего количества
инфицированных семян, чем в том случае, когда в этом участвует лишь одна
из гамет инфицированного растения.
Вопрос о том, насколько важную роль играет инфицированная пыльца
в процессе передачи вирусов в полевых условиях, еще достаточно не изучен.
Вполне возможно, что в случае перекрестноопыляющихся древесных много-
летников этот способ передачи имеет более важное экономическое значение,
чем в случае однолетних культур. Для некоторых вирусов характерно, что
инфицированная пыльца может вызывать заражение только образующихся
в конце концов семяп, когда опыляются цветки здоровых растений. Однако
в случае других вирусов заражается, вероятно, само растение. Например,
Джилмер [642] сообщил об экспериментально!! передаче вируса желтухи
вишни от дерева к дереву с помощью пыльцы.
Локализация вируса в семенах
Некоторые вирусы, передача которых осуществляется с помощью семян,
как было показано, локализуются в зародыше, тогда как в отношении дру-
гих это можно лишь предположить. С помощью электронной микроскопии
112
Глава VI
установлено, что вирус штриховатой мозаики ячменя (палочкообразный
вирус) присутствует как в зародыше, так и в эндосперме. Содержание вирус-
ных частиц во всех исследованных семенах, взятых с зараженных растений,
было примерно таким же, как и в тканях листа, хотя передавать вирус могли
лишь 50% семян. Вирус обнаруживали также в пестиках (до и после оплодо-
творения), пыльниках и пыльце заболевших растений.
Различные теории относительно передачи вирусов
с помощью семян
На основании полученных до сих пор данных не создается ясной картины,
с помощью которой мы могли бы обрисовать процесс передачи вирусов через
семена. Подобная способность не является свойством, присущим определен-
ным группам или семействам покрытосеменных, так же как не ограничи-
вается и вирусами, принадлежащими к одному определенному морфологиче-
скому типу. Этим свойством обладают некоторые палочкообразные вирусы,
характеризующиеся спиральной симметрией, мелкие икосаэдрические ви-
русы и крупные вирусы, тогда как многие другие вирусы того же типа этим
свойством не обладают. Требует объяснения также тот странный факт, по-
чему многие вирусы, в том числе и стабильные, содержащиеся в листьях
в большом количестве, не передаются через семена. Обычно полагают, что
для передачи вируса действительно через семена он должен проникнуть
в зародыш и сохранить, находясь там, свои инфекционные свойства. По-
видимому, утрата вируса может иметь место на одной из двух стадий инфи-
цирования семени. При этом вирус либо оказывается неспособным проник-
нуть в зародыш, либо проникает туда, но затем элиминируется.
I. Неспособность вируса инфицировать заро-
дыш. Бэннет [157] высказал предположение, согласно которому именно
отсутствием сосудистых связей можно объяснить невозможность инфици-
рования зародыша вирусами, характеризующимися тропизмом к прово-
дящей ткани (гл. VII). Этим нельзя, однако, объяснить неспособность мно-
гих вирусов, инфицирующих клетки паренхиматозной ткани, передаваться
через семена.
Колдуэлл [319] обнаружил, что вирус аспермии томатов нарушает мойоз
в стадии профазы. Деление материнских клеток, как микроспор, так и мега-
спор, по-видимому, блокируется, в результате чего семена либо пе образуют-
ся вовсе, либо образуются в очень небольшом количестве (отсюда и проис-
ходит название вируса). Колдуэлл [320] отметил, что растения, инфициро-
ванные вирусами, обычно образуют меньше семян по сравнению со здоро-
выми растениями, и высказал предположение, что вызванные вирусами нару-
шения мейоза, вероятно, довольно широко распространены и, возможно,
служат причиной того, что вирус не передается через семена. Было показано,
например, [1653], что вирус штриховатой мозаики ячменя, который пере-
дается через семена ячменя, но не передается через семена кукурузы, ока-
зывает мутагенное действие на растения кукурузы. Это действие выражалось
в увеличении частоты утраты генов-маркеров семенами поколения Ft в тех
случаях, когда для опыления использовалась пыльца растений, зараженных
вирусом. При помощи тестов па инокуляцию вирус не удалось обнаружить
пи в нормальных проростках, ми в проростках с пониженным содержанием
хлорофилла поколения F2.
Бэпнет высказал также предположение, что некоторые вирусы, воз-
можно, не способны выжить, находясь в гаплоидных клетках. Это очень инте-
ресно, но непосредственных данных, которые подтверждали бы это пред-
положение, пе существует. Однако большинство вирусов, которые пере-
даются с помощью семян, могут передаваться также через пыльцу. Кроме
Способы передачи вирусов и методы инфицирования растений 113
того, Крэспип Медина и Гроган [415] обнаружили фасолевый вирус 1 (ви-
рус, передаваемый с помощью семян) в пыльце и семяпочках фасоли, но не
смогли обнаружить фасолевый вирус 2 (не передаваемый с помощью семян)
пи в семяпочках, пи в пыльце. Этот вирус был выделен из пестиков и лепестков,
по не из пыльников.
II. Неспособность вируса выживать в з а р о -
д ы in е. Некоторые вирусы, несомненно, проникают в зародыш, но позднее
исчезают из него. Этим молено объяснить многие из наблюдавшихся фактов.
Так, способен или не способен какой-либо определенный вирус передаваться
с помощью семян того или иного вида растения-хозяина, а также эффектив-
ность этой передачи могут зависеть от степени элиминации вируса из заро-
дышей, которые первоначально все или почти все были заражены вирусом.
Вещества, ингибирующие вирусную инфекцию, были обнаружены в эк-
страктах из семян, например в экстрактах из семян фасоли [357]; однако
нет никаких оснований полагать, что эти вещества обладают ингибирующей
активностью in vivo. Листья многих растений содержат значительные коли
чества обладающих ингибирующей активностью полифенолов и тем не ме-
нее способствуют развитию вирусов. Искусственный цитокинин, известный
под названием кинетина, оказывает ингибирующее действие на реплика-
цию некоторых вирусов растений (гл. XIV). В кукурузе естественные цито-
кинины, как известно, встречаются в развивающихся семенах в больших
концентрациях, чем в других частях растения [1210]. Активность цитокини-
нов высока в экстрактах прорастающих семян многих видов растений [1063].
Возможно, что естественные цитокинины играют какую-то роль в контро-
лировании распределения некоторых вирусов в семенах и плодах.
Существует и другой возможный фактор, который может нести неко-
торую долю ответственности за наблюдаемую нами неспособность вирусов
передаваться с помощью семян. Если какой-то вирус растений может всту-
пить во взаимосвязь со своей клеткой-хозяином, аналогичную наблюдаемой
в случае некоторых бактериофагов и их клеток-хозяев, то это лизогенное
состояние может сохраняться в клеточной линии, которая участвует в обра-
зовании семян. В результате этого можно ожидать, что какая-то часть (ве-
роятно, очень незначительная) потомства, возникшего из семян заражен-
ных растений, окажется устойчивой it вирусной инфекции.
Передача вируса в процессе вегетативного
размножения растений
Вегетативное размножение представляет собой важный прием, исполь-
зуемый в садоводстве, но, к сожалению, является столь же эффективным
способом сохранения и распространения вирусов. Вирусы, наносящие зна-
чительный ущерб экономике сельского хозяйства, обладают способностью
к системному распространению по большей части вегетативных органов рас-
тения, причем растение, однажды системно инфицированное вирусом, обычно
сохраняет вирус в течение всего периода своей жизни. Таким образом, любые
органы растения, служащие для вегетативного размножения, как, например,
клубни, луковицы, клубнелуковицы, усы, черенки, обычно инфицированы
вирусами. Во многих случаях каждая исследованная особь какого-либо опре-
деленного сорта инфицирована тем или иным вирусом; например, растения
некоторых сортов картофеля оказываются зараженными Х-вирусом карто-
феля. Однако, если заражается здоровое растение размножающегося веге-
тативным путем вида, причем даже на довольно ранней стадии развития,
распространения вируса по растению в течение первого сезона вегетации
может и не произойти (гл. VII).
8-0893
114
Глава VI
Передача вирусов в результате прививки
Прививка по существу представляет собой форму вегетативного размно-
жения, при которой часть одного растения растет на корнях другого. При
этом, как только произойдет срастание тканей, подвой и привой вместе
образуют одну особь. В том случае, когда для подвоя или для того растения,
часть которого использована в качестве привоя, характерна системная
инфекция, привитое растение в целом оказывается зараженным при условии,
что оба партнера чувствительны к вирусу. Начиная с первых дней исследо-
вания вирусов растений в качестве доказательств вирусной природы забо-
левания обычно принимались два рода фактов, а именно возможность пере-
дачи заболевания с помощью прививки и отсутствие какого-либо патоген-
ного агента, который можно было бы обнаружить с помощью светового
микроскопа. Теперь известно, что многие вирусы, которые, как когда-то
считалось, передаются только путем прививки, столь же успешно пере-
даются и другими способами.
В целях передачи вирусов в эксперименте применяется много разно-
образных способов прививки, используемых в практике садоводства
(см., например, фото 23). Оказалось также, что передачу некоторых вирусов
можно успешно осуществить с помощью и таких методов прививки или псевдо-
прививки, которые обычно не используются в садоводстве. Так, например,
передать вирусы можно, вставляя кусочки инфцированпых листьев под
кору, причем передача при этом происходит, вероятно, в результате объеди-
нения ткани подвоя и привоя в участках срезов жилохх листа [1858]. В резуль-
тате передачи вируса путем прививки может развиться заболевание, которое
отличается от заболевания, возникающего, скажем, в результате механиче-
ской инокуляции. Так, у N. glutinosa в случае механической инокуляции
его ВТМ обычно образуются местные некротические поражения, причем
системного распространения вируса не наблюдается. Однако прививка
на здоровые растения N. glutinosa черенков N. tabacum, системно инфи-
цированного ВТМ, приводит к гибели N. glutinosa в результате системного
некротического заболевания. Вероятно, описанное влияние прививки свя-
зано с проникновением вируса в проводящие элементы сверхчувствительного
хозяина [1973].
Прививка может оказаться эффективным способом передачи вирусов,
когда другие методы безуспешны, однако использование прививки не всегда
приводит к достижению ожидаемых результатов. В ряде случаев это может
объясняться тем, что в растении, от которого взят якобы зараженный привой,
не произошло полного системного распространения вируса. В других слу-
чаях, когда ткань здорового растительного материала, который используется
для прививки, реагирует на заражение вирусом местной некротической
реакцией, передачи болезни может и не произойти. Так, Чемберлен и др. [349]
показали, что если здоровые почки слив сортов Бербанк и Салтен привиты
на растение сливы, инфицированное вирусом мозаики, вызывающим пожелте-
ние жилок, то почки реагируют на это некротической реакцией и погибают.
Возможно, именно этим и объясняется тот факт, что эти сорта слив очень
редко оказываются инфицированными данным вирусом в садах. При обычных
условиях для различных вирусов необходимо различное минимальное время
для того, чтобы осуществилась их передача в результате прививки.
Так, для 12 вирусов, поражающих Prunus, которые были исследованы
Фридлендом [562], минимальное время, необходимое для передачи
вируса в 100% случаев при прививке почек, варьировало от, 48 до
152 ч [562].
Самопроизвольная прививка — довольно редкое событие, и подобный
способ передачи вирусов не имеет широкого распространения в природе.
Способы передачи вирусов и методы инфицирования растении 115
Тем не менее для некоторых видов растений этот способ, вероятно, представ-
ляет собой существенный фактор, играющий роль в их передаче. Так,
Шеффилд [1555] описала распространение заболевания гвоздичного дерева
(это заболевание известно под названием «внезапной гибели»), причиной
возникновения которого, как оказалось, служит самопроизвольная прививка
в его корень. Хотя в настоящее время прививка пе играет такой роли в
эксперименте, как это было ранее, она до сих пор имеет большое эко-
номическое значение, особенно при выращивании древесных многолетни-
ков, необходимые нам сорта которых можно сохранить лишь путем
прививки.
Передача вирусов с помощью повилики
Повилика (Cuscuta spp.) — это вьющееся растение, лишенное настоящих
листьев и хлорофилла и паразитирующее на высших растениях. Это расте-
ние принадлежит к сем. Convolvulaceae. Существует множество разных
видов этого рода, имеющих различный круг растений-хозяев, причем круг
растений-хозяев некоторых видов очень широк. Паразит образует гаустории,
соединяющиеся с проводящей системой растения-хозяина. Бэннет [156]
показал, что повилика способна передавать вирусы от растения к
растению.
Передача вирусов с помощью повилики в некоторых отношениях сходна
с их передачей путем прививки. Однако в последнем случае удачная совме-
стимость тканей привоя и подвоя наблюдается в пределах достаточно близко-
родственных друг другу растений, обычно в пределах рода. Напротив,
повилику можно использовать для передачи вирусов растениям, состоящим
друг с другом в отдаленном родстве. При экспериментальной передаче
с помощью повилики вирус может и не репродуцироваться в клетках пара-
зита. В таких случаях повилика выполняет пассивную функцию канала,
соединяющего два растения. Например, ВТМ, по-видимому, не размно-
жается в клетках повилики, и эффективная передача вируса наблюдается
лишь в том случае, когда с помощью одного и того же растения повилики
осуществляется связь между больным и здоровым растением того вида,
который способен служить хозяином вируса. Степень передачи ВТМ суще-
ственно увеличивалась в результате обрезки повилики и затемнения здоро-
вых растений, т. е. в условиях, которые, как предполагают, приводят
к перемещению питательных веществ от больных растений к здоровым [385].
Бэннету [156] удалось отделить вирус огуречной мозаики от ВТМ, исполь-
зуя способность первого сохраняться в клетках повилики, когда паразит
поражает растения, иммунные к обоим вирусам. При этих условиях ВТМ
исчезает.
В ряде случаев растения повилики, используемые в экспериментах
по передаче вирусов, могут служить резервуаром вирусов, о присутствии
которых не подозревали. Так, Бэннет [158] показал, что пе обнаруживающие
симптомов поражения растения Cuscuta californica (Choisy) были часто инфи-
цированы каким-то вирусом, названным вирусом латентной мозаики пови-
лики и вызывавшим тяжелые заболевания у ряда неродственных повилике
растений, например у свеклы, кермеса и картофеля.
Одним из основных достижений при использовании повилики в экспе-
рименте оказалась возможность передачи с помощью этого растения вирусов
от растений-хозяев, где их трудно изучать, на растения, которые удобны
для проведения экспериментальных исследований. Что касается поле-
вых условий, то, по-видимому, повилика не играет существенной роли
в распространении вирусов, приносящих большой ущерб сельскому
хозяйству.
8»
116
Глава VI
ПЕРЕДАЧА ВИРУСОВ С ПОМОЩЬЮ ОРГАНИЗМОВ,
НЕ ПРИНАДЛЕЖАЩИХ К ВЫСШИМ РАСТЕНИЯМ
Беспозвоночные
В природе многие вирусы растений передаются от растения к растению
с помощью беспозвоночных-переносчиков. Эта большая самостоятельная
тема обсуждается в гл. XVI.
Грибы
В настоящее время известно примерно 7 вирусов растений, которые
передаются обитающими в почве грибами. Наиболее изучен в этом отношении
гриб-переносчик Olpidium brassicas (Wor) Dang., относящийся к классу
архимицетов, который представляет собой распространяемый через почву
облигатный паразит, заражающий корни многих растений. В клетках корня
гриб образует покоящиеся споры, которые попадают в почву при разрушении
тканей корня. Из этих покоящихся спор при благоприятных условиях в корне
и в почве высвобождаются в почвенную влагу многочисленные зооспоры.
Зооспоры могут затем заразить корни здоровых растений. На фиг. 16 схе-
матически представлен жизненный цикл этого гриба. Проведенные недавно
электронно-микроскопические исследования [175] позволили установить
существование двух фаз в процессе заражения клеток корня грибом Olpidium.
В течение фазы цистообразования зооспора прочно прикрепляется к корню
и ее единственный жгутик исчезает, а внутри зооспоры видны беспорядочно
свернутые оксонемиалыше фибриллы. Затем зооспора образует оболочку
цисты. В ходе второй фазы заражения оболочка клетки-хозяина разру-
Фиг. 16. Схематическое изображение стадий жизненного цикла гриба Olpidium-
Относительно половой стадии имеются некоторые сомнения. 1 — зооспора; г — зооспорангии в клетках
корня; 3 — половое слияние; 4 — спорангии в растительных остатках в почве.
Способы передачи вирусов и методы инфицирования растений 117
шается и цитоплазма цисты проникает в эту клетку; эктопласт и тонопласт
цисты остаются при этом снаружи (фото 24).
Внутри клетки-хозяина цитоплазма гриба оказывается окруженной
вновь образованным тонопластом.
Взаимоотношения между грибом и вирусами еще далеки от того, чтобы
быть полностью понятыми, однако работы последнего времени позволяют
предполагать, что вирус может переноситься в корень, находясь на поверх-
ности зооспоры (например, вирус некроза табака) или внутри нее (например,
вирус крупных жилок салата-латука и вирус карликовости табака). Попытки
передать ряд других вирусов, используя Olpidium, оказались безуспешными
[1753].
Вирус некроза табака
Было описано несколько вирусов некроза табака (ВИТ), обладающих
аналогичными свойствами и легко передающихся через почву корням расте-
ний. Заражение листьев этим вирусом путем механической инокуляции
обычно приводит к образованию местных некротических поражений у чув-
ствительных растений-хозяев, однако системного распространения вируса
не происходит. Несмотря на отдельные расхождения в деталях, вся совокуп-
ность различного рода данных, полученных разными исследователями, фак-
тически свидетельствует о том, что вирус некроза табака передается корням
здоровых растений салата-латука зооспорами гриба Olpidium. Об этом
говорят следующие факты: 1) вирус проникает в корень примерно в то же
самое время, что и гриб (через 2—Зч после инокуляции) [944,1752]; 2) число
зараженных участков зависит от концентрации как ВНТ, так и зооспор
[944]; 3) если путем фильтрования из суспензии, содержащей ВНТ и зоо-
споры Olpidium, удалить зооспоры, то с помощью фильтрата, содержащего
только ВНТ, оказывается невозможным передать вирус корням здоровых
растений [570]; 4) Olpidium поражает зону, лежащую за кончиком корня,
и вирус некроза табака обнаруживается тоже в этой зоне [570]; 5) передачу
вируса можно предотвратить, если к суспензии зооспор незадолго до сме-
шивания с ВНТ или вскоре после него добавить антисыворотку к ВНТ
с высоким титром антител. Передача вируса прекращается и в том случае,
если зооспоры, освобождающиеся из корней инфицированных ВНТ растений,
попадали в антисыворотку к ВНТ [321].
Тот факт, что специфическая антисыворотка блокирует инфекционность
зооспор, позволяет предполагать, что вирус находится либо на поверхности
зооспоры, либо вблизи лее. Вместе с тем промывание зооспор, несущих ВНТ,
благодаря повторяющемуся несколько раз центрифугированию не препят-
ствует передаче этого вируса, заставляя предположить, что этот вирус
прочно связан с зооспорой [321]. Данные электронно-микроскопических
наблюдений, о которых говорилось выше, свидетельствуют о том, что клеточ-
ные мембраны инцистированпых зооспор не проникают в клетки корней
растений, тем самым подтверждая мысль о том, что вирус, вероятно, нахо-
дится в цитоплазме зооспоры. Однако вирус, проникающий в корень, может
быть расположен на том участке поверхности зооспоры, где происходит
разрыв, что позволяет цитоплазме переместиться в клетку растения-хозяина.
Кэмпбелл и Фрэй высказали предположение, согласно которому в момент
освобождения из клеток корня зооспоры не содержат ВНТ, но затем при-
обретают этот вирус, который также попадает в почвенную влагу. Olpidium,
по-видимому, является очень эффективным переносчиком, поскольку пере-
дача осуществляется даже с помощью суспензий, содержащих лишь около
50—100 зооспор в 1 мл [570, 944]. ВНТ может передаваться зооспорами этого
гриба в культивируемую ткань каллюса табака при использовании менее
118
Глава VI
концентрированного инокулума, чем тот, который эффективен в случае
механической инокуляции таких тканевых культур [945].
Способность различных изолятов Olpidium передавать ВНТ варьирует
[946, 1754]. Так, Кассанис и Мак-Ферлейн показали, что гриб, выделенный
из растений капусты, неспособен передавать два изолята ВНТ какому бы то
ни было растению-хозяину. Из двух изолятов Olpidium, выделенных из сала-
та-латука, один передавал оба изолята ВНТ с большей эффективностью,
чем другой. Эти различия не были связаны с чувствительностью растений-
хозяев к различным штаммам Olpidium. Моуот [1238] показал, что штаммы
Olpidium, обладающие способностью передавать ВНТ, и штаммы, не обла-
дающие этой способностью, различались по электрофоретической подвиж-
ности их зооспор. Этот исследователь высказал предположение, что фак-
торами, обусловливающими специфичность передачи вируса различными
переносчиками, возможно, являются различия в суммарных поверхностных
зарядах зооспор и в их способности связывать определенные ионы.
Вирус крутых жилок салата-латука {ВКЖС)
Этот вирус вызывает распространяющееся через почву заболевание
салата-латука, приносящее большой экономический ущерб, однако частицы
вирусаТдо настоящего времени не охарактеризованы. Результаты различных
наблюдений! показывают, что вирус передается спорами гриба Olpidium
и находится, вероятно, внутри спор. Данные эти являются, однако, косвен-
ными, поскольку Olpidium до сих пор не был выделен в чистой культуре,
и наши предположения^ 'подтверждаются лишь следующими фактами:
1) инфекционный агент имеет те же размеры, что и зооспоры Olpidium
(«5 мкм) [322]; 2) способность ВКЖС передаваться через почву утрачи-
вается в том случае, когда этот вирус передается с помощью прививки расте-
ниям салата-латука, свободным от Olpidium. Если эти растения затем зара-
жаются не содержащим вирус грибом, способность ВКЖС передаваться
через почву восстанавливается [322, 1781, 1782]; 3) культуры Olpidium,
не зараженные ВКЖС, Г приобретают этот вирус уже в первом вегетативном
поколении в корнях растений, инокулированных вирусом путем прививки
[323]; 4) инфекционность высушенной на воздухе почвы, содержащей ВКЖС,
сохраняется по крайней мере 8 лет [1367]. Кэмпбеллу и Фрэю [321] удалось
выделить покоящиеся споры Olpidium из корней растений, инфицированных
ВКЖС, после 39 мес хранения. Эти споры обрабатывали затем сильной
кислотой, и при этом способность гриба передавать вирус сохранялась.
Вопрос о том, размножается ли этот вирус в клетках гриба, до настоя-
щего времени не решен, и немногие имеющиеся в нашем распоряжении
данные позволяют предполагать, что этого не происходит.
Другие вирусы
Вирус карликовости табака; обнаруженный в Японии, который пред-
ставляет собой распространяющийся через почву вирус, имеет много общих
особенностей с ВКЖС, если рассматривать их с точки зрения взаимоотно-
шений с Olpidium, и передается через почву именно с помощью этого гриба
[791, 792]. Хируки [792] проанализировал чувствительность широкого
спектра видов растений к Olpidium и к вирусу карликовости табака. Иноку-
ляция производилась при этом либо механическим способом, либо с помощью
содержащих вирус зооспор. Как оказалось, исследованные виды растений
можно подразделить на четыре группы: 1) чувствительные как к Olpidium,
так и к вирусу карликовости табака; 2) чувствительные к Olpidium, но
нечувствительные к вирусу; 3) чувствительные к вирусу, но нечувстви-
тельные к Olpidium; 4) устойчивые и к Olpidium, и к вирусу.
Способы передачи вирусов и методы инфицирования растений 119
Некоторые виды оказались чувствительными к описываемому вирусу, пере-
даваемому грибом, но нечувствительными к этому же вирусу, введенному
путем механической инокуляции. Таким образом, взаимоотношения
между растением-хозяином, грибом и вирусом, по-видимому, очень
сложны.
В распространении некоторых других вирусов, передающихся через
почву, например вируса мозаики пшеницы [267], может принимать участие
гриб Polymyxa. Переносчиком вируса, вызывающего заболевание, известное
под названием курчавости верхушек картофеля (Джойс и Харрисон, личное
сообщение), служит другой вид гриба — Spongospora subterranea (Wallr.)
Lagerh. Данные эти были получены на основании подобного же рода экспе-
риментальных исследований, которые использовались и для того, чтобы
показать, что Olpidium является переносчиком: вирусов. Как грибы, так
и вирусы могут в течение долгого времени находиться в почве. Использование
фунгицидов, таких, как каптан, может предотвратить распространение
вирусов среди растений, выращиваемых на зараженной почве. Было выска-
зано предположение, оставшееся недоказанным, согласно которому Х-вирус
картофеля может передаваться зооспорами гриба Synchytriian endobioticum
(Schilb.) Percival. [1270]. Несмотря на то что успешная постановка экспе-
риментов, служащих для того, чтобы продемонстрировать способность гри-
бов, поражающих корни, служить переносчиками вирусов растений, часто
бывает затруднительной, можно почти с полной уверенностью утверждать,
что дальнейшие исследования, ^несомненно, расширят круг вирусов и грибов,
участвующих в их переносе.
МЕХАНИЧЕСКАЯ ПЕРЕДАЧА ВИРУСОВ
При механической инокуляции инфекционный вирус или вирусная
РНК вводятся в клетки через повреждения, вызванные тем или иным спо-
собом на поверхности растения. При этом, если вирус способен репродуци-
роваться в клетке, развивается инфекция. Этот способ передачи вирусов
имеет большое значение для многих разделов экспериментальной вирусоло-
гии, особенно для различных методов количественного определения вирусов
(гл. II), а также при изучении ранних этапов взаимодействия вируса с чув-
ствительными клетками (гл. VII). Использование вирусной РНК в качестве
инокулума мы рассматривали в гл. IV, а различные факторы, влияющие
на чувствительность растений-хозяев к вирусам, рассмотрим в гл. XII.
Инокуляция
Способы инокуляции
В ранних работах каплю инокулума наносили на лист, на поверхности
которого делали царапины или уколы, чтобы вызвать поранение. Эффектив-
ность этого метода была чрезвычайно низкой, и позднее было обнаружено,
что, если осторожно потереть поверхность листа каким-либо подходящим
предметом, смоченным инокулумом, эффективность передачи вируса возра-
стает. Для этой цели используют очень разнообразные предметы в зависи-
мости от выбора экспериментатора и объема имеющегося в его распоряжении
инокулума. Цель механической инокуляции состоит в том, чтобы вызвать
на поверхности листа возникновение множества мелких ранок, не вызвав
при этом гибели’клеток. Усилие, которое необходимо для этого применить,
зависит от многих факторов, таких, например, как вид растения, возраст
и состояние листа, природа добавок. Видимые невооруженным глазом участки
120
Глава VI
отмершей ткани, появляющиеся на инокулированиом листе в течение дня
или около того, указывают на то, что травмирование было излишним. Однако
при некоторых комбинациях вирусов и растений-хозяев жесткое воздействие
оказывается более эффективным [1104].
Для нанесения инокулума на лист могут быть применены пульвериза-
торы типа используемых художниками. Они полезны в тех случаях, когда
следует инокулировать большое число листьев одним и тем же инокулумом,
однако при этом необходима достаточно тщательная стандартизация вели-
чины давления воздуха и расстояния до поверхности листа. Иногда при-
меняется инъекция инфекционного материала в черешок листа или в стебель
с помощью шприца, но обычно этот способ оказывается малоэффективным.
Во избежание необходимости мытья пестиков, ступок и другой стеклянной
посуды в тех случаях, когда требуется произвести много индивидуальных
инокуляций, можно растереть кусочек больного листа непосредственно
на листе опытного растения [1250].
Добавки к инокулуму, увеличивающие эффективность
инокуляции
Эффективность механической инокуляции значительно возрастает, когда
какой-то абразив добавляют к инокулуму или посыпают им поверхность
листа перед инокуляцией. В качестве абразивов наиболее широко применяют
карборунд (400—500 меш) и диатомовую землю, например целит. Степень уве-
личения числа местных поражений, возникающих в результате использо-
вания абразивов, варьирует в зависимости от вида растения-хозяина
и вируса, но в ряде случаев число некрозов возрастает в 100 и более раз.
Если инокулум обладает низкой инфекционностыо, использование абразивов
бывает необходимым для успешного инфицирования. Важное значение
может иметь момент добавления абразивного материала. Так, например, оказа-
лось, что целит, добавленный после гомогенизации и разведения инфекцион-
ного материала, гораздо более эффективен, чем при его добавлении перед
гомогенизацией [1965].
Абразивные материалы — это единственные повсеместно применяемые
добавки, однако в некоторых случаях (определенные вирусы и растения-
хозяева) увеличение числа местных поражений можно наблюдать и при
использовании других веществ. Так, когда к инокулуму некоторых вирусов
добавляют раствор двузамещенного фосфорнокислого калия (1%), заметно
увеличивается их инфекционность в отношении листьев фасоли [1954],
причем влияние фосфата было наибольшим, когда его использовали совместно
с абразивом (фиг. 17).
Влияние фосфата на инфекционность других вирусов было выражено
значительно слабее. Механизм, посредством которого при добавлении
к инокулуму фосфата калия увеличивается число успешных заражений,
до настоящего времени неясен. Маловероятно, что фосфат оказывает непо-
средственное влияние на вирус или же используется растениями в процессе
инокуляции в качестве питательного вещества. Возможно, фосфат каким-то
образом увеличивает число «эффективных» повреждений, образующихся
в процессе травмирования листа. В случае некоторых вирусов действие
фосфата усиливается при добавлении MgCl2 (0,01 М) [902]. Танигучи [1743}
обнаружил, что при смешивании частиц ВТМ с клеточным гомогенатом
n vitro присутствие фосфата в смеси увеличивало степень адсорбции ВТМ
на клеточных обломках. Танигучи высказал предположение, что подобный же
эффект можно наблюдать при инокуляции интактного листа в присутствии
фосфата.
Способы передачи вирусов и методы инфицирования растений 121
Фиг. 17. Влияние карборунда и фосфата на число местных поражений, вызываемых
ВТМ па листьях фасоли (сорт Пинто) [1954].
I. Ипокулум без добавок. II. Добавлен К,НГО,. III. Добавлен карборунд. IV. Добавлена смесь
карборунда и KjHPO,.
Добавление 0,1—1%-ного бентонита к неочищенному соку растений
Erigeron glaucus Ker., инфицированных вирусом кольцевой пятнистости
томатов, облегчало передачу вируса на растения фасоли, но затрудняло
его передачу на некоторые другие растения-хозяева [19641. Применение
магниевого бентонита облегчает передачу вируса от одних растений папорот-
ника к другим [844]. Трисиликат магния — главный компонент бентонита —
также увеличивает число местных поражений, вызываемых некоторыми виру-
сами на определенных растениях-хозяевах [754]. Эти вещества, вероятно,
действуют, по крайней мере частично, адсорбируя ингибиторы вируса,
содержащиеся в неочищенном соке, и, кроме того, функционируя как абра-
зивные материалы [898]. В присутствии сахарозы (2 М) в инокулуме эфек-
тивность передачи некоторых вирусов увеличивалась в 30 раз [434, 1901]-
Исполъзование замороженного инокулума
Лаусон и Таконис [1053] описали метод передачи вируса мозаики Dahlia
на растения Verbesina encelioides (Cav.) Benth. and Hook. Передать вирус
с помощью обычных способов механической передачи не удавалось или эта
передача была очень малоэффективной. Когда же листья инфицированных
растений Dahlia замораживали в жидком азоте, измельчали затем в предва-
рительно охлажденной ступке и замороженный порошок наносили с помощью
кисти непосредственно на листья Verbesina, передача оказывалась успешной.
Возможно, низкая температура снижает степень инактивации вируса веще-
ствами, присутствующими в экстрактах из листьев Dahlia.
Другие компоненты инокулума
Существует много веществ, которые в том случае, если они присутствуют
в инокулуме, могут способствовать успешному осуществлению заражения,
вызываемого каким-то вирусом. Это могут быть различные вещества, присут-
ствующие в неочищенных экстрактах, а также вещества, добавленные к экст-
рактам или к очищенным вирусным препаратам. Эти вещества рассматриваются
в гл. III и XIV. Различные соединения, добавляемые к растительному материалу
122
Глава VI
с целью увеличения выхода вируса,{также могут быть использованьфщя того,
чтобы сделать возможной передачу вируса путем механической инокуляции.
Промывка листьев
Промывка листьев водой непосредственно после инокуляции стала широко
использоваться с того времени, как Холмс [814] показал, что этот прием
способствует увеличению числа образующихся местных поражений. Однако
промывка листьев, опрыскивание их водой или погружение инокулирован-
ных листьев в воду может и существенно снизить число местных поражений,
вызываемых некоторыми вирусами [1957]. Этот эффект промывки обычно
наблюдается в интервале от 2 до 4 ч после инокуляции. Ярвуд [1957] пришел
к выводу, что вредное действие воды в данном случае обусловлено сниже-
нием концентрации ионов, необходимых для адсорбции вируса и проникно-
вения его в клетку. Это предположение не было в достаточной мере проверено,
однако известно, что опрыскивание листьев в те первые часы, когда проводи-
лось заражение, растворами нитрата магния и солей некоторых других метал-
лов увеличивало число местных поражений, вызываемых ВТМ на листьях
фасоли [1187], а присутствие в инокулуме фосфата значительно увеличивало
его инфекционность (фиг. 17). Влияние промывки листьев или погружения
их в воду на число образующихся некрозов зависит, вероятно, от многих
факторов, и в особенности от того, присутствуют ли в инокулуме ингибиторы,
препятствующие осуществлению заражения. Если инокулум содержит такие
ингибиторы, промывка может свести их действие к минимуму.
Ярвуд [1963] обнаружил, что в случае ряда вирусов быстрое высушивание
листьев после инокуляции либо струей воздуха, либо каким-то гигроскопич-
ным материалом приводит к заметному увеличению числа местных пораже-
ний. Возможно, это связано с тем, что вода в процессе инокуляции оказывает
вредное действие на чувствительность растения. Влияние высушивания зна-
чительно варьирует в зависимости от вида растения-хозяина и, как было
показано, при некоторых условиях приводит к 100-кратному увеличению
числа местных поражений. Наиболее отчетливо действие высушивания про-
является в первую секунду после инокуляции, а затем оно быстро падает
(фиг. 18).
Фиг. 18. Влияние быстрого высушивания в различные моменты после инокуляции
па число местных поражений (по отношению к контролю), вызываемых вирусом огуречной
мозаики на листьях коровьего гороха (4) и вирусом табачной мозаики па листьях фасо-
ли (В). На оси ординат—отношение числа местных поражений после высушивания
к числу поражений у контроля [1963].
Способы передачи вирусов и методы инфицирования растений 123
Характер и число восприимчивых к инфекции участков
Структура поверхности листа
На верхней поверхности листьев, обычно используемых для механической
инокуляции, имеется около 1 -10е—5 -10е клеток различных типов. Болыпин-
ство из них представляет собой собственно эпидермальные клетки, среди
которых рассеяно небольшое число замыкающих клеток устьиц (фото 25, А).
Замыкающие клетки в зависимости от вида растения могут располагаться
па одном уровне с клетками эпидермиса, выступать над эпидермисом или же
быть погруженными, располагаясь ниже поверхности эпидермиса. У многих
растений имеются две околоустьичные, или побочные, клетки, окружающие
замыкающие клетки устьиц. Эти клетки имеют меньшие размеры, чем типич-
ные клетки эпидермиса. Эпидермальные клетки листьев многих растений
образуют трихомы. Существует много типов трихом, и па поверхности даже
одного и того же листа могут встречаться трихомы более чем одного типа.
Например, на листьях растений табака можно обнаружить наряду с обыч-
ными трихомами, или волосками, железистые волоски с многоклеточными
секреторными головками (фото 25,В). В целом поверхность листа покрыта
несколькими защитными слоями, причем число и расположение этих слоев
широко варьируют в зависимости от вида растения и от условий его выра-
щивания. Типичная картина расположения этих наружных слоев представ-
лена на фиг. 19.
Над целлюлозной наружной стенкой эпидермальной клетки распола-
гается слой пектина, а над ним — кутииизированиый слой с вкрапленными
в пем отложениями воска. Этот слой переходит в собственно кутикулу, пред-
ставляющую собой слой кутина, состоящего из жирных оксикислот, соеди-
ненных поперечными связями. Самый наружный слой представлен эпикути-
кулярным воском, количество, тонкая структура и химический состав кото-
рого значительно варьируют у разных видов растений (фото 25, А,Б). Этот
слой воска при механической инокуляции листа сильно влияет на такое
свойство его поверхности, как смачиваемость. Кутикула внедряется также
через устьичные отверстия и выстилает внутренние стенки эпидермальных
клеток, обращенные к межклетникам. В наружных стенках эпидермальных
клеток листа можно наблюдать плазмодесмы, носящие в данном случае наз-
вание эктодесм. Они доходят до кутикулы, по не проходят через нее. Воск
Фиг. 19. Схематическое изображение эпикутикулы на поперечном разрезе листа расте-
ния [486].
Линии, разделяющие отдельные слои, расположенные над эпидермальными клетками, нс представляют
собой четких, границ между слоями, а лишь указывают области основных изменений п структуре ком-
понентов. Расположение отих слоев у отдельных видов растений может значительно отличаться
от представленного па схеме.
1 — эпикутикулярный воск; 2 — кутикула; з — кутииизированиый слой о вкрапленными в нем отло-
жениями воска; 4 — пектиновый слой; з — целлюлозная оболочка клетки; в — эпидермальные клетки;
7 _ палисадный слой; 8 — изотропный слой; 9 — оптически негативный спой; ю — оптически пози-
тивный слой.
124
Глава VI
перемещается из эпидермальных клеток к поверхности листано микрокапаль-
цам, центральная полость которых составляет 6—10 нм, а диаметр в целом —
около 40 нм [694]. Даже во взрослых листьях эти канальцы наполнены рас-
плавленным воском (Д. М. Холл, личное сообщение). Маловероятно поэтому,
что вирусные частицы могут проникать в клетки по этим канальцам.
Характер восприимчивых к инфекции участков
Вирусные частицы, помещенные на неповрежденную поверхность листа,
не могут вызвать заражения. Для того чтобы это заражение осуществилось,
необходимо как-то поранить лист и сделать таким образом его поверхность
восприимчивой. Возможно, некоторые типы клеток, расположенные на листо-
вой поверхности, более чувствительны к поранению, чем другие. С помощью
микрургической техники было показано, что вирусные частицы можно ввести
в листовой волосок, однако интенсивность заражения оказывается при этом
очень низкой [148, 1981]. Эффективность инокуляции можно повысить, если
сделать разрез ткани под каплей раствора вируса в разбавленной желатине.
Контаксис и Шлегель [1020], а также Херридж и Шлегель [772] изучали
с помощью метода радиоавтографии распределение на поверхности инокули-
рованного листа ВТМ, меченного 14С. При этом было обнаружено, что вирус
аккумулируется на базальной перегородке разрушенной трихомы. Однако
нет никаких оснований полагать, что эти обнаруженные путем радиоавтогра-
фии вирусные частицы имеют какое-либо отношение к процессу инфекции.
При механической инокуляции огромное количество вируса в инокулуме
остается инертным на поверхности листа. Так, Рэдди [1409] показал, что
после промывки на листовой поверхности задерживается около 1/з частиц
ВТМ, нанесенных на лист, причем около 90% адсорбированных вирусных
частиц удается извлечь из листа в недеградированной форме через 48 ч после
инокуляции. Результаты работ Бойли и Мак-Кинни [233] делают сомнитель-
ными предположения, что трихомы играют важную роль в процессе инфекции
ВТМ. При осторожном втирании инокулума ВТМ между волосками листа
растений перца образуется столько же местных поражений на единицу поверх-
ности, как и в том случае, когда инокулум втирают по всей поверхности
листа. Удаление трихом за несколько дней до инокуляции, когда трут поверх-
ность листа, оказывает незначительное влияние на число образующихся при
этом местных поражений.
Бойли и Мак-Кинни обнаружили, что при механической инокуляции
верхней и нижней поверхности листа растений перца образуется примерно рав-
ное число местных поражений, хотя на нижнем эпидермисе число замыкаю-
щих клеток устьиц превышает их число на верхнем эпидермисе. Таким обра-
зом, нет оснований полагать, что замыкающие клетки устьиц играют сколько-
нибудь существенную роль в процессе инфекции.
Бранте [274—276] изучал возможную роль эктодесм в процессе зараже-
ния листьев и корней ВТМ. Инокуляция производилась меченным 14С ВТМ,
и срезы или полоски эпидермиса подвергались затем радиоавтогра-
фическому исследованию. Зерна серебра обнаруживали с большой частотой
в эктодесмах, особенно у основания волосков листа. В инокулированных
корнях томатов меченный радиоактивным изотопом вирус часто наблюдали
вблизи эктодесм, характерных для кончика корня и корневых волосков, причем
чувствительность корней к заражению оказалась связанной с наличием
эктодесм. Томас и Фултон [1759] показали,'что различия в чувствительности
двух сортов табака к инфекции ВТМ и изменения чувствительности в зави-
симости от возраста растения коррелировали с числом эктодесм, обнаружи-
ваемых с помощью окрашивания в наружных стенках эпидермальных
клеток.
Способы передачи вирусов и методы инфицирования растений 125
В общем представляется вероятным, что все типы клеток, составляющих
эпидермис, обладают потенциальной способностью быть инфицированными
с помощью механической инокуляции. Повреждения, проходящие прямо
сквозь кутикулу и клеточную стенку, вероятно, эффективны и делают воз-
можным проникновение вируса, однако эти повреждения могут и не быть
необходимыми, если эктодесмы на самом деле играют ту роль, которую им
можно приписать па основании результатов работ Брантса, а также Томаса
и Фултона. Вполне возможно, что необходимо просто разрушить кутикулу,
чтобы открыть вирусным частицам доступ к эктодесмам. В недавних иссле-
дованиях, проведенных с помощью электронного микроскопа [613], было
показано, что в результате механической инокуляции листьев Vigna sinensis
в клеточной стенке под кутикулой появляются пузырьки, прозрачные для
электронов. Эти пузырьки могут играть определенную роль в транспорти-
ровке вируса в клетки эпидермиса.
Процесс пипоцитоза, играющий важную роль при проникновении виру-
сов в животные клетки, до настоящего времени остается малоизученным
па клетках высших растений. Кокипг предложил метод получения прото-
пластов клеток из тканей плодов томатов. Когда такие протопласты инкубиро-
вали с ВТМ, вирус легко присоединялся к плазмалемме, особенно в участках
небольших впячиваиий поверхности. Позднее вирус можно было наблюдать
в цитоплазме, по-видимому, в пииоцитозных пузырьках [388]. Подобное
проникновение вируса сопровождалось его репликацией в клетке [389].
Возможно, присоединение вирусных частиц к плазмалемме и пииоцитоз
представляют собой важную стадию проникновения вируса в клетки интакт-
ных листьев при механической их инокуляции. В модельных опытах in vitro
было показано, что частицы ВТМ проникают сквозь фосфолипидные мембраны
толщиной 6—9 нм [1327]. Для проникновения вируса в клетки, по-видимому,
необходимо присутствие ионов Mg2+. Справедливость выводов, сделанных
па основании модельных опытов, для реально существующей ситуации
in vivo нуждается еще в экспериментальном подтверждении, однако
известно, что инфекционность ряда вирусов увеличивается в присутствии
двухвалентных ионов, таких, например, как ионы Mg2+. ,
Данные, основанные на изучении кривой разведения инфекционности
Связь между числом образующихся местных поражений и разведением
инокулума рассматривалась в гл. II с точки зрения идентификации вирусов.
Здесь мы вкратце рассмотрим теории, предложенные для объяснения кривой
разведения инфекционности, исходя из тех или иных допущений о числе
восприимчивых к инфекции участков.
Юдеп и др. [1968] и Волд [62, 63] высказали гипотезу, основанную на сле-
дующих предпосылках: 1) одна вирусная частица способна индуцировать
инфекционный процесс (в настоящее время известно, что для некоторых
вирусов это предположение неверно; см. гл. VIII); 2) все чувствительные
участки обладают чувствительностью в одинаковой степени; 3) распределе-
ние частиц в этих участках описывается функцией Пуассона. Подобная гипо-
теза требовала подсчета общего числа чувствительных участков листа. Эту
величину определяли обычно экспериментально, путем использования все
возрастающих концентраций вируса, что производилось до тех пор, пока
число образующихся местных поражений не становилось независимым от кон-
центрации инокулума. Полученная таким образом величина составляла
обычно 400—500 чувствительных участков на лист. В тех случаях, когда для
исследования использовали чувствительные растения, а концентрация вируса
в инокулуме была низкой, результаты, полученные на основании высказан-
ной гипотезы и в эксперименте, совпадали. В тех же случаях, когда исследо-
126
Глава VI
Концентрация ВТМ в инокулуме,мг/мл
Фиг. 20. График, показывающий совпа-
дение теоретической модели, предло-
женной для кривой разведения инфек-
циопности, с данными более чем 30
экспериментов, проведенных на ВТМ
[593].
вали растения с низкой чувствительностью и необходимо было использовать
ииокулумы с высокой концентрацией вируса, чтобы возникли местные пора-
жения, данные теоретических и экспериментальных исследований совпадали
плохо.
Клечковский [985] предложил другую гипотезу, согласно которой раз-
ные участки поверхности листа варьируют по своей чувствительности к вирусу
таким образом, что для каждого из них необходимо различное минимальное
количество вирусных частиц, чтобы вызвать инфекцию. Это означает, что
некоторые участки листа инфицируются лишь в том случае, если на них
попадет большее количество вирусных частиц, чем иа другие. Клечковский
предположил также, что существует какое-то максимальное число местных
поражений, которые могут возникнуть на поверхности листа, причем это
число меньше 500. В последнее время Фурумото и Мики [592, 593] предло-
жили модификацию первой гипотезы. Указав иа тот факт, что в системах
с вирусами бактерийи животных, как твердо установлено, одна вирусная части-
ца способна инфицировать одну клетку, они предположили, что это справед-
ливо и для вирусов растений. Основные положения их гипотезы таковы:
1) чувствительным участком поверхности листа является фактически отдель-
ная эпидермальная клетка; 2) все или почти все клетки эпидермиса потен-
циально чувствительны, из чего следует, что действительное число восприим-
чивых к инфекции участков значительно превышает принятое значение и приб-
лижается к 10е таких участков на лист; 3) вероятность проникновения в клет-
ку и заражения ее для всех вирусных частиц одинакова и зависит от случай-
ностей при взаимодействии с различными клетками. В первом приближении
события, происходящие на первых этапах взаимодействия вирусной частицы
с растительной клеткой, описываются уравнением
Y = Na loge (l-i-cF/p),
где Y — ожидаемое среднее число местных поражений; N — число чув стви-
тельных клеток на одной половинке листа; V — концентрация вируса,
мг/мл; с — константа, характеризующая связь между концентрацией вируса
и средним числом вирусных частиц на наружной поверхности клеток; аир —
константы, отражающие распределение вероятностей проникновения вирус-
ных частиц в клетки. На фиг. 20 показано, что экспериментальные данные
(более 30 экспериментов с ВТМ) хорошо согласуются с теоретической моделью.
Согласно этим данным, средние значения Na — 4,15 и с/р = 380. (В отдель-
ных экспериментах значения этих параметров значительно отличались
от средних, т. е. в этих случаях совпадение между теоретическими и экспери-
ментальными данными, особенно при высоких разведениях инокулума, не было
столь хорошим, как в опытах, представленных на фиг. 20.)
Способы передачи вирусов и методы инфицирования растений 127
На основе предложенной гипотетической формулировки нельзя пред-
сказать характер кривой разведения инфекционности в каждом данном
эксперименте. Совпадение теоретических и экспериментальных кривых еще
ничего не доказывает в отношении реальной биологической ситуации. Как
заметил Клечковский [996], лучшее соответствие данных этим, а не другим
уравнениям может быть просто результатом того тривиального факта, что
число параметров исследуемой системы больше принимаемого во внимание
предложенной моделью. В общем виде эта проблема в дальнейшем обсужда-
лась Клечковским [997].
Продолжительность существования восприимчивых к инфекции участков
после повреждения поверхности листа
Время, в течение которого поврежденный участок остается восприимчи-
вым к инфекции, определяют обычно следующим образом: после поврежде-
ния поверхности лист погружают в инокулум через различные интервалы
времени и подсчитывают затем число образующихся местных поражений.
В общем число восприимчивых к инфекции участков с течением времени
после повреждения снижается очень быстро. Например, Фурумото и Вайлд-
ман [594] обнаружили, что около 70% участков на листе N. glutinosa, которые
были чувствительны к заражению ВТМ путем погружения их в инокулум
через 2 с после повреждения, теряли эту чувствительность через 90 с.
Оставшиеся участки теряли свою чувствительность гораздо медленнее и сохра-
няли ее в течение примерно 1 ч. Однако обнаруженная закономерность не рас-
пространяется па все вирусы и растения-хозяева. Так, Едлинский [861, 862]
показал, что в течение первых 10 мин после повреждения число восприимчи-
вых к инфекции участков на поверхности листа может или увеличиваться,
или уменьшаться, или сохраняться на постоянном уровне, что зависит
от исследуемой системы вирус — растение. Кроме того, на изменение числа
чувствительных к заражению участков может оказывать влияние способ
обработки поверхности листа до и после повреждения^ (гл. XII и XIV).
Число вирусных частиц, необходимое для инициирования
инфекции
Нам следует рассмотреть три стороны этого вопроса. Во-первых, какое
количество вирусных частиц необходимо нанести на лист, чтобы заражение
было успешным? Во-вторых, достаточно ли одной частицы из числа нанесен-
ных, чтобы вызвать инфекцию? В-третьих, могут ли две или более частиц
независимо репродуцироваться в одной и той же клетке? Что касается первой
стороны этого вопроса, то считается общепринятым, что механическая ино-
куляция даже в лучших, достижимых в настоящее время условиях весьма
малоэффективна. Для таких вирусов, как ВТМ, необходимо нанести на лист
примерно от 10* до 105 частиц, чтобы индуцировать образование каждого
возникающего в результате этого местного поражения. Эти данные резко
противоречат результатам, полученным в отношении вирусов бактерий,
где при благоприятных условиях фактически каждая вирусная частица
может заразить чувствительную клетку, а также и в отношении вирусов
животных, где для успешного заражения достаточно, как было показано,
менее 10 вирусных частиц. Существуют три возможные причины для объяс-
нения ситуации, имеющей место в системах с вирусами растений: 1) низкая
эффективность процесса инокуляции; 2) наличие в инокулуме неинфекцион-
ных частиц; 3) необходимость присутствия двух или более типов частиц
для осуществления заражения, что имеет место в случае многокомпонентных
вирусов (гл. VIII).
128
Глава VI
Фурумото и Мики [593] рассчитали количество частиц ВТМ, приходя-
щееся на одну клетку при инокуляции N. glutinosa. Если объем инокулума
составляет 0,1 мл и концентрация ВТМ в инокулуме равна 10-3 мг/мл, то
на половинке листа образуется около 10 местных поражений. Поскольку
при указанной концентрации ВТМ в инокулуме содержится около 1,5-1010
частиц в 1 мл и число эпидермальных клеток в одной половинке листа
составляет примерно 4 -105, можно рассчитать, что в среднем на наружную
поверхность каждой клетки приходится около 103 вирусных частиц.
В большинстве вирусных препаратов, несомненно, имеются неинфекцион-
ные частицы и их доля в некоторых случаях может быть высока. Тем не менее
можно почти с полной уверенностью утверждать, что основным фактором,
вызывающим необходимость использования огромного количества вирусных
частиц для осуществления каждого успешного заражения, является низкая
эффективность процесса механической инокуляции. Существует, вероятно,
несколько причин, которыми можно объяснить недостаточную эффективность
этого процесса: 1) весьма вероятно, что лишь небольшая часть из примерно
10е эпидермальных клеток имеет потенциально восприимчивые к инфекции
поврежденные участки, возникшие в результате поранения расположенной
над ними листовой поверхности; 2) продолжительность существования этих
восприимчивых к инфекции участков коротка, и многие из вирусных частиц,
находящихся в инокулуме над каким-либо повреждением, никогда не всту-
пают в контакт с такими участками; 3) распределение вирусных частиц,
нанесенных на {поверхность листа, вероятно, очень неравномерно с точки
зрения участков поверхности, соответствующих размерам отдельных клеток;
4) значительная часть вирусных частиц, возможно, адсорбируется на неактив-
ных участках листовой поверхности и не принимает, таким образом, участия
в процессе инфекции; 5) некоторые вирусные частицы могут проникнуть
в потенциально восприимчивые к инфекции клетки, но не способны в них
репродуцироваться, не будучи тем или иным способом активированы. Суще-
ствование таких центров было продемонстрировано для некоторых систем
вирус — растение. Например, штамм Us ВТМ не вызывает видимых пораже-
ний у фасоли сорта Пинто при благоприятных для этого условиях, и инфек-
ционный вирус в инокулированных растениях не обнаруживается. Однако,
если эти растения прогреть в течение 1 мин при 50 °C в любое время по про-
шествии 6—24 ч после инокуляции, образуются многочисленные местные пора-
жения [1394].
При отсутствии эффективных методов инокуляции получить достовер-
ные данные о содержании инфекционных частиц в вирусных препаратах
не представляется возможным. Фурумото и Вайлдман [595] попытались
решить эту проблему косвенным путем, определяя инфекционность агрега-
тов ВТМ, образовавшихся в результате взаимодействия со специфическими
антителами. Они пришли к выводу, что по крайней мере 1 из 10 частиц в очи-
щенных препаратах ВТМ обладает инфекционностыо. Учитывая принятые
авторами допущения, полученные данные можно рассматривать лишь как
весьма приближенные. Эксперименты Френкель-Конрата и др. [543] подтвер-
ждают предположение о том, что необходимость нанесения на лист большого
количества вирусных частиц для образования какого-то пораженного участка
связана главным образом с тем, что большая часть инокулума остается неис-
пользованной в процессе инфекции.
Авторы инокулировали листья растений табака определенным количе-
ством ВТМ, затем отмывали их, а вирус, содержащийся в смыве, осаждали
в центрифуге и вновь использовали для инокуляции листьев табака. Оказа^
лось, что в смыве (что определялось по его инфекционности) содержится
значительное количество вирусных частиц, нанесенных на лист при первой
инокуляции.
Способы передачи вирусов и методы инфицирования растений 129
Хотя для образования одного местного поражения на лист приходится
наносить много вирусных частиц, ученые в общем согласны в том, что при
инокуляции многими вирусами для инфицирования клетки и образования
в дальнейшем уже заметного местного поражения .фактически необходима
лини, одиа-единствеппая вирусная частица. Результаты теоретического ана-
лиза кривой разведения, представленные в предыдущем разделе, согласуются
с этой точкой зрения.
Лауфор и Прайс [1050] работали со смешанным ииокулумом, содержащим
типичный штамм и штамм аукуба ВТМ в концентрациях, которые были тако-
вы, что при инфицировании растений Nicotiana langsdorfii Weinm. отдельно
каждым штаммом возникало примерно равное число местных поражений.
В процессе работы они исследовали пораженные участки, возникшие в резуль-
тате заражения смешанным ииокулумом, па наличие в них обоих штаммов.
Оказалось, что при высоких разведениях смешанного инокулума доля мест-
ных поражений, образуемых одним или двумя штаммами, значительно отли-
чалась от ожидаемой, рассчитанной иа основе предположения, что оба штамма
при репродукции не интерферируют между собой [985]. Из обнаруженного
Лауфером и Прайсом факта, что некоторые пораженные участки, возникшие
в результате заражения смешанным ииокулумом, содержат оба штамма,
не следует, что эти два штамма инфицируют одну и ту же клетку. Возможно,
они инфицируют соседние клетки, поскольку два первоначально самостоя-
тельных заражения в дальнейшем приводят к возникновению одного макро-
скопического пораженного участка.
Работы последнего времени, которые рассматриваются в гл. VIII, пока-
зывают, что генетический материал некоторых вирусов растений может быть
распределен между разными вирусными частицами. При этих условиях для
возникновения одного поражения необходимо кооперирование двух или более
частиц.
Это явление должно приводить к изменению характера кривой разве-
дения инфекционности. Фултон [587] описал такие кривые для двух неста-
бильных вирусов — вируса некротической кольцевой пятнистости вишни
и вируса карликовости сливы. Полученные кривые оказались значительно
круче, чем можно было ожидать для теоретической одноудариой кривой.
Степень отклонения экспериментальной кривой от теоретической варьиро-
вала в зависимости от вида растения-хозяина. Штамм вируса некротической
кольцевой пятнистости, не инфекционный для индикаторного вида Dolichos
bijlorusL., резко увеличивал инфекционность разведенных экстрактов дру-
гого штамма этого вируса, вызывающего поражения у этого растения. Вирус,
инактивированный ультрафиолетом или нагреванием, также увеличивал ин-
фекционность уже обладавших инфекционностыо экстрактов. На основании
полученных данных Фултон пришел к выводу, что необычная форма кривой
разведения обусловлена, вероятно, необходимостью двух или более вирусных
частиц для инициирования инфекции.
Для того чтобы вызвать инфекцию с помощью вируса мозаики люцерны,
необходимо, по-видимому, кооперирование четырех различных типов вирус-
ных частиц (гл. VIII). Следовательно, инфекционность при разведении ипоку-
лумов такого рода вирусов должна снижаться значительно быстрее, чем
в случае таких вирусов, как ВНТ (вирус некроза табака), который, как пола-
гают, состоит лишь из частиц одного типа. Кривые разведения для этих двух
вирусов, построенные на основании данных, полученных при использовании
одного и того же растения-хозяина, представлены на фиг. 21.
Необходимость более чем одного типа вирусных частиц для иницииро-
вания инфекции делает процесс инокуляции еще менее эффективным, чем
при работе с однокомпонентными вирусами. Так, для образования одного
местного поражения при механической инокуляции вирусом мозаики ко-
9—0893
130
Глава VI
Фиг. 21. Сравнение кривых разведения
инфекционности для вируса, являюще-
гося, по-видимому, однокомпопоптпым
(вирус некроза табака, ВНТ), и много-
компонентного вируса мозапкп люцерны
(ВМЛ) [1835].
Для образования местных поражений по-
пользовался один и тот же вид растения-хо-
зяина, а именно Phaseolus vulgaris. Для ВИТ
х = 0,15 мкг/мл, для ВМЛ х = 9 мкг/мл.
ровьего гороха (двухкомпоиентная система) необходимо 10“—108 вирусных
частиц [1823], а при инокуляции вирусом мозаики люцерны — 10s—1010>
частиц [1835].
Механическая передача вирусов в полевых условиях
По сравнению с передачей вирусов в полевых условиях с помощью
беспозвоночных или в результате вегетативного размножения передача меха-
ническим путем обычно играет меньшую роль. Однако для некоторых виру-
сов этот способ передачи имеет большое практическое значение. Так, вирус
табачной мозаики может распространяться на табачных плантациях и планта-
циях томатов, легко загрязняя инструменты, руки и одежду работающих
там людей. Этот способ передачи вируса имеет особенно большое практическое
значение на ранних этапах роста полевых культур, в частности при выса-
живании растений. Растения, инфицированные в ранний период роста,
являются источником распространения вируса в дальнейшем, что происхо-
дит либо во время проведения необходимых для данной культуры мероприя-
тий, например удаления почек, либо в результате соприкосновения больных
и здоровых растений при ветре. Х-вирус картофеля также легко может пере-
даваться, загрязняя орудия производства и обрабатывающие машины; пере-
дача осуществляется рабочими или животными, ранее контактировавшими
с больными растениями [1776], причем в некоторых случаях вирус может
сохраняться таким образом в течение нескольких недель.
Х-вирус картофеля может передаваться на здоровые растения как в ре-
зультате непосредственного контакта между листьями соседних растений,
так и в том случае, если листья таких растений не контактируют друг с дру-
гом [379, 1103]. Предполагают, что передача в этом случае осуществляется
в результате контакта между корнями соседних растений [1431], однако
нельзя исключить и возможности того, что определенную роль при этом
играют некоторые переносчики, обитающие в почве.
ЭКСПЕРИМЕНТЫ ПО ПЕРЕДАЧЕ ВИРУСОВ,
ПРОВОДИМЫЕ С ЦЕЛЬЮ УСТАНОВЛЕНИЯ ВИРУСНОЙ
ПРИРОДЫ ЗАБОЛЕВАНИЯ
Существует еще много болезней, которые, как уже известно или как
предполагают, вызываются каким-то вирусом, однако сами вирусные частицы
не выделены и не идентифицированы в качестве инфицирующего агепта.
В этих случаях, чтобы установить вирусную природу какого-то определен-
Способы передачи вирусов и методы инфицирования растений 131
пого заболевания с помощью косвенных методов, необходимо прежде всего
передать заболевание на здоровые растения (часто это приходится делать
с помощью прививки, если все остальные способы оказываются безуспеш-
ными) и затем показать, что это заболевание не вызвано клеточными парази-
тами или другими агентами невирусиой природы. Некоторые условия, кото-
рые могут стимулировать вирусную инфекцию, обсуждаются в гл. X. Посколь-
ку токсины также могут передаваться путем прививки, эту операцию, особен-
но па первом' пассаже инфекционного материала, необходимо осуществлять
при полном отсутствии клеточных паразитов или насекомых, что должно
обеспечить элиминацию токсинов как возможной причины заболевания.
Так, вирус крупных жилок салата-латука передавался при шести последо-
вательно проведенных прививках, и при этом степень выраженности симпто-
мов не снижалась [322]. Этот факт исключает возможность того, что симптомы
этого заболевания вызваны токсином, продуцируемым ольпидиумом.
При использовании механических способов передачи с целью выявления
присутствия вируса как возбудителя данного заболевания необходимо иметь
в виду основные причины, которые могут привести к появлению отрицатель-
ных результатов. Эти причины таковы: 1) присутствие ингибиторов в отжа-
том соке растений; 2) низкая концентрация вируса или слабо выраженная
чувствительность растения-хозяина; 3) нестабильность вируса в экстрактах
из листьев.
При инокуляции необходимо исследовать влияние различных добавок
к ипокулуму, таких, как фосфат или восстанавливающие агенты (например,
сульфит или цистеин), а также бентонит. Инокулум должен быть использо-
ван немедленно, причем для инокуляции необходимо отобрать молодые
растения, выращенные при средней или низкой освещенности. В качестве
абразива рекомендуется использовать карборунд. Немедленно после иноку-
ляции листья должны быть промыты водой. Помимо тех видов растений, кото-
рые служат источником инокулума, в качестве растений-хозяев следует
исследовать и ряд других видов. К их числу относятся такие растения, как
огурец, коровий горох и Chenopodium amar anticolor, которые, как известно,
высокочувствительны ко многим вирусам и являются хорошими индикатор-
ными растениями. В развитии наших знаний о вирусах, инфицирующих
древесные породы, большую роль сыграло использование в качестве первич-
ных индикаторных растений травянистых видов [589]. По ряду причин дре-
весные виды сами по себе обычно неудобно использовать в качестве опытных
растепий-хозяев при проведении механической инокуляции. В качестве
контроля па присутствие ингибиторов в отжатом соке рекомендуется смешать
его с ВТМ и инокулировать этой смесью растения N. glutinosa. В том слу-
чае, если экстракт из листьев содержит ингибиторы, следует исследовать
другие части растения, например чашелистики, лепестки или корпи. Проб-
лему ингибиторов можно решить иначе, применив простой способ инокуля-
ции, при котором кусочки ткани больных листьев растирают непосредственно
на листьях индикаторных растений [1959].
В ряде случаев, когда все другие методы оказываются неэффективными,
успешную инокуляцию можно осуществить, измельчая ткани листа в при-
сутствии водонасыщепного фепола и используя в качестве инокулума вод-
ную фазу после удаления фепола. Эффективность этого метода, возможно,
связана с удалением каких-то ингибиторов вируса, которые переходят
в фенольную фазу или в материал, накапливающийся на поверхности раздела
фаз; успех может быть обусловлен также тем, что этот вирус нестабилен или
существует в виде неполных частиц и легко разрушается нуклеазами листа
в отсутствие фепола. Кроме того, в ряде случаев обработка фенолом, воз-
можно, приводит к освобождению вируса из комплексов с некоторыми кле-
точными структурами, в которых вирус в неактивной форме находится в обыч-
9*
132 Глава VI
ных клеточных экстрактах. Следует помнить, что инфекционность этих
фенольных экстрактов остается полностью чувствительной к загрязнению
нуклеазами, присутствующими на стеклянной посуде, руках и инструментах,
используемых при инокуляции. Этот метод, однако, не всегда успешен. '1 ак,
Сакару [1474] не удалось передать с помощью фенольных экстрактов боль-
ных тканей картофеля вирус скручивания листьев картофеля.
Если в эксперименте заболевание удается передать беспозвоночным и-
переносчиками, которые принадлежат к группам, несомненно участвующим
в передаче вируса (например, нематоды, тли, цикадки; гл. XVI), само но себе
обнаружение этого факта представляет собой хорошее подтверждение пред-
положения о вирусной природе данного заболевания. При этом, однако,
необходимо иметь в виду возможное участие подобных микоплазмам агентов
(гл. X).
ГЛАВА VII
РЕПЛИКАЦИЯ И РАСПРОСТРАНЕНИЕ ВИРУСОВ
ПО РАСТЕНИЮ
Изучение процесса репликации вирусов в клетке — одна из наиболее
интересных и активно развивающихся областей современной вирусологии.
Успехи, достигнутые молекулярной биологией за последние полтора десятка
лет, сильно расширили наши представления об этом процессе. Вирусы
в свою очередь оказались весьма ценным экспериментальным объектом для
молекулярных биологов. В настоящее время нам гораздо больше известно
о репликации вирусов животных и бактерий, чем о репликации вирусов расте-
ний. В значительной степени это обусловлено ограничениями тех эксперимен-
тальных систем, с которыми приходится иметь дело специалистам по виру-
сам растений. Мы пока пе располагаем методом, который позволил бы нам
заражать вирусом одновременно все или почти все клетки растения и наблю-
дать события, происходящие в них более или менее синхронно, как это воз-
можно в случае вирусов бактерий и большинства вирусов животных. Разра-
ботка подобной системы — одно из главных условий успешного развития
фитовирусологии. Именно отсутствие такой системы, а также то обстоятель-
ство, что для заражения необходимо огромное количество вирусных частиц,
следует считать главными техническими причинами, затрудняющими иссле-
дования в области молекулярной биологии вирусов растений и обусловли-
вающими отставание этих исследований от работ, проводимых на вирусах
бактерий и животных.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СИСТЕМЫ
Обычно для исследований используются листовые пластинки. У боль-
шинства растений, применяемых в такого рода опытах, от 50 до 70% всей
свежей массы приходится на долю листьев, причем конечная концентрация
вируса в листе часто оказывается в 10—20 раз выше, чем в других частях
растения. Различают четыре типа систем, используемых для исследования:
1) интактные растения, 2) переживающие ткани, 3) клетки или органы
в культуре и 4) бесклеточные системы. Преимущества и трудности работы
с каждой из этих систем обсуждаются ниже. Некоторые вирусы растений
реплицируются в организме насекомых, которые являются их переносчиками.
Этот вопрос обсуждается в гл. XVI.
Интактные растения
В гл. II мы говорили о различиях между отдельными растениями, прояв-
ляющихся при любом способе подбора растений для опыта. Нужно, однако,
иметь в виду, что, хотя эти трудности и существуют, некоторые аспекты
процесса репликации вирусов могут быть изучены только на интактных,
развивающихся растениях. Лишь на них можно, например, проследить
зависимость между репликацией вируса и появлением симптомов мозаики.
134
Глава VII
Инокуляция листьев
Работа с ипокулировапными листьями имеет ряд преимуществ. Во-пер-
вых, в этом случае события можно точно проследить во времени (считая с мо-
мента инокуляции). Во-вторых, ив разных растений можно отобрать листья
примерно одинакового размера, а в качестве контроля использовать половинки
листьев. Два главных недостатка этого метода заключаются в следующем:
1. Типичный лист, например лист табака с площадью поверхности
200 см2, содержит около 32-10“ клеток. Число это распределяется между
разными типами клеток следующим образом:
Верхний эпидермис, включая замыкающие клетки устьиц 4•1(1»
Палисадная паренхима 14-10°
Губчатый мезофилл 1(1-11)°
Нижний эпидермис, включая замыкающие клетки устьиц 4-10®
Верхний предел числа клеток эпидермиса, которые могут быть инфици-
рованы при механической инокуляции в оптимальных условиях, точно
не известен, но вряд ли он превышает 104 клеток на лист. Поэтому в начале
эксперимента в такой системе инфицируется не более одной на каждые 103 кле-
ток. При этом даже у первично инцифироваипых клеток синхронность
инфекции, очевидно, не слишком велика, особенно если для инокуляции
используется интактный вирус. Таким образом, ранние изменения в неболь-
шой части инфицированных клеток должны, вероятно, оставаться невыявлеи-
ными из-за огромного числа пецифицированных клеток. Позже, с распростра-
нением инфекции, образуется смешанная клеточная популяция, т. е. популя-
ция, у которой в разных клетках протекают различные стадии инфекцион-
ного процесса.
2. Второе существенное неудобство данного метода (во всяком случае,
при исследовании инфекционного процесса в первые несколько часов)
связано с тем, что сама механическая инокуляция сильно повреждает лист,
вызывая изменения в дыхании, в потреблении воды и, вероятно, во многих
других процессах, включая и синтез нуклеиновых кислот. В связи с этим
особенно важную роль приобретает использование соответствующим образом
обработанных контрольных листьев.
Еще одна трудность возникает при постановке экспериментов, в которых
в качестве инокулума используется вирус, меченный радиоактивными изото-
пами. Большая часть вируса, нанесенного на лист, не инфицирует клетки;
в то же время значительная (непостоянная по величине) часть вируса не может
быть отмыта с листа после инокуляции. Исследование дальнейшей судьбы
инфекционных частиц сильно затрудняется из-за массы такого балластного
«неэффективного» инокулума, остающегося иа листе.
Для некоторых экспериментов могут оказаться полезными следующие
две модификации метода инокуляции листьев. У листьев, выросших при
определенных условиях, иногда удается относительно легко отделить участки
эпидермиса. Правда, таким путем можно получить весьма ограниченное
количество ткани, по этот прием позволяет увеличить приблизительно в 8 раз
число клеток, инфицируемых вскоре после инокуляции. В сочетании с совре-
менными микроаналитическими методами это дает возможность получить
ценные данные [571]. Некоторые авторы применяли микроманипуляционпые
методы для заражения единичных клеток листа (обычно это были клетки
листовых волосков) и затем следили за изменениями, происходящими непосред-
ственно в живых клетках, либо с помощью фазового контраста или ультра-
фиолетовой микроскопии, либо пользуясь препаратами, окрашенными флуо-
ресцирующими антителами. Этот способ позволяет получать ценную инфор-
мацию, но применение его ограничивается микроскопическими наблюдени-
ями; для биохимических исследований он непригоден.
Репликация и распространение вирусов по растению
135
Системно инфицированные листья
Перемещаясь из ииокулированпого листа, вирус может проникать вна-
чале в самые молодые листья, а затем последовательно во все более и более
старые. Таким образом, при системной инфекции стадии инфекционного
процесса в разных листьях могут быть совершенно различными. Более того,
время распространения инфицирующего материала от инокулированных
листьев к молодым может у разных растений очень сильно варьировать.
Вполне вероятно, однако, что в молодых, системно инфицируемых листьях
(у табака или китайской капусты они будут иметь в длину около 4 см) боль-
шая часть клеток заражается в течение 1—2 дней. Такие листья могут с мак-
симальным доступным нам приближением представлять ткань, в которой
большая часть клеток начинает продуцировать вирус приблизительно в одно
и то же время.
Lemnaceae
Представители этого семейства — небольшие водные растения — во мно-
гих отношениях удобны] для биохимических и физиологических исследова-
ний [779]. Их можно выращивать в культуре при контролируемых условиях
на средах известного состава. Показано, что Spirodela polyrhiza (L.) Shield,
инфицируется вирусом табачной мозаики и Х-вирусом картофеля [1018, 1019].
Возможно, эти растения удастся в будущем использовать в качестве системы,
пригодной для изучения определенных аспектов репликации вирусов.
Переживающие ткани
Отделенные листья
Метод отделенных листьев удобен в тех случаях, когда для эксперимен-
тов требуется большое количество листовой ткани. Черешки листьев можно
поместить в воду или в питательный раствор. Правда, в этих условиях листья
•обычно довольно сильно различаются по количеству поглощаемой ими жидко-
сти. Кроме того, они могут неожиданно оказаться увядшими. С другой сто-
роны, этот метод сводит к минимуму такую проблему, как рост микроорганиз-
мов в ткани во время инкубации. Чаще листья помещают во влажную каме-
ру, закрытую стеклом. Ииокулировапные и пеипокулировапные половинки
листьев можно инкубировать раздельно [748]. При этом приходится считаться
с возможностью роста бактерий, грибов и простейших. Было, например,
показано, что стерильные и нестерильные листья редиса различаются по]иитен-
сивности включения 32Р-ортофосфата в нуклеиновые кислоты [301].
Листовые диски
Довольно часто используют диски ткани диаметром 5—20 мм, вырезае-
мые из листьев с помощью сверла для пробок; эти диски плавают иа поверх-
ности дистиллированной воды или питательного раствора. Преимущество
данного метода состоит в том, что он позволяет объединять в один образец
кусочки из разных листьев и тем самым сглаживать различия, существующие
между отдельными листьями. Два вида помех возникают, если с одними
и теми же дисками работают слишком долго (более нескольких дней). Во-пер-
вых, на поверхности дисков и в межклетных пространствах развиваются
микроорганизмы. (Добавление антибиотиков не всегда обеспечивает полное
угнетение роста микроорганизмов; кроме того, они могут совершенно изме-
нить биохимические процессы в клетках.) Во-вторых, у многих листовых
136
Глава VII
дисков через довольно короткий срок начинают по краям (па срезах жилок)
закладываться корни. Одновременно зеленая ткань все больше и больше
стареет. Таким образом, биохимическое состояние листовых дисков непре-
рывно меняется.
Полоски эпидермиса
Исследовалась возможность изучения репликации ВТМ в полосках
эпидермиса, отделенных от листа непосредственно после инокуляции и пла-
вающих на поверхности питательного раствора или дистиллированной воды
[462]. В таких полосках эпидермиса через 21—45 ч после инокуляции наблю-
далось повышение инфекционности; через 50 ч, однако, инфекционность
снова снижалась. Удавалось также инокулировать вирусом табачной мозаики
нижнюю поверхность полосок эпидермиса, снятых со стебля томатов [787].
Обычно во влажных условиях полоски эпидермиса сохраняют жизнеспособ-
ность в течение нескольких дней.
Суспензии клеток и тканевые гомогенаты
В принципе суспензии живых, но не делящихся клеток обеспечивают
экспериментатору ряд преимуществ при изучении репликации вирусов;
однако на практике действительно эффективной системы такого рода до сих
пор предложено не было. Можно использовать также разобщенные клетки
из ткани каллюса, растущие в культуре, или клетки листьев, разделенные
ферментативной обработкой [1972]. Включение радиоактивных предшествен-
ников в ВТМ исследовалось на группах клеток из листьев [300]. С этой
целью инфицированные листья измельчали при контролируемых условиях
так, чтобы от 30 до 50% клеток оставались интактными. В этих гомогенатах
синтезировался меченый вирус. Изменения, вызываемые в клетках гомогени-
зацией, вероятно, довольно серьезны, однако они не были изучены.
Высокий выход интактных клеток (50—90%) из мезофилла листьев
табака удавалось получить, снимая с листьев вручную нижний эпидермис,
а затем мацерируя ткань с помощью препарата грибной пектиназы [1740].
При соответствующих условиях интактные клетки из листьев, инфицирован-
ных ВТМ, способны поддерживать репродукцию ВТМ в течение по край-
ней мере 24 ч. Если такие изолированные клетки инкубировать с препа-
ратом грибной целлюлазы, то они превращаются в сферические протопла-
сты. Это может открыть новые возможности для изучения репликации
вирусов, если только мы научимся эффективно осуществлять заражение
таких протопластов in vitro.
Тканевые культуры
Растительные клетки можно выращивать в культуре несколькими
способами: выращивают либо целые органы (например, корни или верхушки
стеблей), либо ткань каллюса, либо, наконец, клеточные суспензии. Все
эти способы были испробованы при изучении репликации вирусов, однако
результаты оказались неутешительными (если не считать некоторых микро-
скопических исследований). Количество вируса, продуцируемого в куль-
туре ткани, обычно намного ниже, чем в интактных зеленых листьях.
Ткань каллюса, выращиваемую на плотной среде, можно инфициро-
вать путем механической инокуляции [951]. Довольно легко выращивать
в большом количестве в суспензионной культуре клетки листовой паренхимы
табака (время удвоения составляет при этом около 36 ч). Такие культуры
содержат клетки различного размера и формы — от небольших сфериче-
Репликация и распространение вирусов по растению
137
ских диаметром 25 мкм до нитевидных длиной около 700 мкм. По большей
части клетки в суспензионной культуре объединены в агрегаты диаметром
около 400 мкм по 20—30 клеток в каждом. Подобная система, хотя опа
не является идеальной, во многих отношениях очень удобна для изуче-
ния репликации вирусов. К сожалению, попытки инфицировать клетки
в суспензионной культуре как самим вирусом табачной мозаики, так и его
РНК, потерпели неудачу (Беллами, личное сообщение). В то же время
клетки каллюса томата, выращиваемые в культуре, погибали, если их
инфицировать ВТМ [1250]. Имеются сведения о том, что клетки мезофилла
Arachis hypogaea L. могут длительное время расти в культуре на относи-
тельно простой среде [899]. Однако способность таких культур поддержи-
вать репликацию вируса не исследовалась.
Бесклеточные системы
Бесклеточные системы с успехом используются при изучении репли-
кации вирусов животных и бактерий. Предпринималось много попыток
приспособить их также и для изучения вирусов растений. Были испробо-
ваны: 1) системы, включающие клеточные органеллы, окруженные мембра-
нами; 2) неочищенные системы, не содержащие таких органелл; 3) системы,
содержащие частично очищенные ферменты и нуклеиновые кислоты из инфи-
цированных растений; 4) бесклеточные системы, полученные не из растений,
а из других организмов (обычно из бактерий) и содержащие в качестве
информационной РНК рибонуклеиновую кислоту фитопатогенных вирусов.
Однако в том виде, в каком они применялись, эти системы так и пе
дали возможности получить какие-либо определенные результаты. Объяс-
няется это, вероятно, несколькими причинами. Во-первых, в растительных
тканях обычно присутствуют фенолы; они не только создают затруднения
при выделении вирусов (гл. III), но также инактивируют ферменты в тка-
невых экстрактах. Во-вторых, в растительных тканях широко распростра-
нены нуклеазы, которые быстро инактивируют РНК, если их не удалить
или пе подавить их активность. В-третьих, наличие у растений целлюлозных
клеточных стенок означает, что для разрушения клеток требуются довольно
жесткие методы. Между тем хлоропласты — хрупкие органеллы, и потому
многие препараты, используемые в качестве бесклеточных систем, загряз-
нены их фрагментами, которые очень трудно удалить. Наконец, в-четвертых,
клетки взрослых, полностью развитых листьев имеют крупные вакуоли,
содержимое которых может повреждать цитоплазматические структуры
при разрушении клеток еще до того, как сыграют свою роль защитные
вещества, присутствующие в экстрагирующей среде.
Использование радиоактивных изотопов
При изучении репликации вирусов очень большую роль играет метод,
основанный на применении меченых предшественников вируса. Однако
использование меченых соединений в опытах с вирусами растений наталки-
вается в настоящее время на ряд трудностей. Существуют различные способы
введения меченого материала в исследуемую растительную ткань. Целое
растение можно извлечь из почвы, тщательно отмыть корни от земли
и затем ввести изотоп через корневую систему. Мы предпочитаем именно
эту процедуру при введении 32Р-ортофосфата и 388-сульфата. Поглощение
изотопа происходит при этом быстро и эффективно, если только он вводится
немедленно после отмывания корней. У таких растений, как быстро расту-
щая китайская капуста, 32Р может быть обнаружен в листьях уже через
несколько минут после введения, по истечении же нескольких часов погло-
138
Глава VII
щение вообще практически завершается. С указанными двумя радиоактив-
ными изотопами (32Р и 85S) введение в листья через корпи оказывается
намного более эффективным, чем поглощение листовыми дисками, плаваю-
щими иа поверхности соответствующего раствора (даже если диски выре-
зают таким образом, чтобы обнажить как можно больше жилок). Срезанные
листья ( в этом случае в раствор погружают их черешки) поглощают изотоп
очень неравномерно. Насколько нам известно, каких-либо систематических
исследований с целью выбора наилучшего способа введения таких пред-
шественников, как аминокислоты или нуклеотиды, до сих пор не проводи-
лось. В некоторых экспериментах метод с применением кусочков ткани
может обеспечить известные преимущества.
В листьях многих растений запас низкомолекулярных фосфорсодер-
жащих соединений довольно велик. С помощью различных манипуляций
можно несколько понизить или повысить общую концентрацию фосфорсо-
держащих компонентов, однако не более чем в 2—3 раза. Поэтому с листо-
вой тканью и радиоактивным фосфором не удается проводить достаточно
эффективные опыты с вытеснением метки. Показано, однако, что у водного
растения Spirodela в условиях недостатка фосфора пул резервного неор-
ганического фосфата, локализующийся в вакуоли, сильно истощается,
а содержание метаболически активных фосфорсодержащих компонентов
остается неизменным [198]. Подбирая соответствующие способы снабжения
таких растений фосфором и комбинируя их с современными методами
выделения и фракционирования фосфорсодержащих соединений, можно
добиться большего эффекта от применения радиоактивных изотопов при
изучении репликации вирусов [197].
Активно функционирующие листья служат постоянным эндогенным
источником большинства органических соединений, которые могут быть
использованы в качестве меченых предшественников вируса. Волее того,
в растительных тканях углеродные соединения подвергаются самым разно-
образным превращениям, так что меченый углеродный атом уже через
короткий срок может обнаруживаться в различных низкомолекулярных
продуктах.
ВЕРОЯТНЫЕ ЭТАПЫ РЕПЛИКАЦИИ ВИРУСОВ
РАСТЕНИЙ
Сведения, полученные в опытах с вирусами бактерий
и животных
До самого последнего времени считалось неразумным проводить
аналогии между вирусами, поражающими различные крупные группы
организмов. Однако достижения молекулярной биологии продемонстри-
ровали единство основных механизмов синтеза нуклеиновых кислот и белка
в природе. Поэтому, прежде чем анализировать довольно скудные экспери-
ментальные данные о размножении вирусов растений, мы кратко рассмотрим
основные особенности репликации некоторых РНК-содержащих бактерио-
фагов и вирусов животных. Даже в отношении этих вирусов детали про-
цесса репликации изучены еще далеко не достаточно.
С помощью генетического анализа удалось выявить по меньшей мере
три цистрона в геноме мелкого РНК-содержащего вируса R17, инфици-
рующего клетки Е. colt. Выяснилось, что цистрон А кодирует белок, необ-
ходимый для образования инфекционных фаговых частиц, цистроп В —
белок вирусной оболочки и цистрон С — вирусоспецифичную РНК-синтета-
зу, участвующую в синтезе новой вирусной РНК [689].
Репликация и распространение вирусов по растению
139
Рибонуклеиновые кислоты вирусов бактерий могут действовать
в белоксиитезиругощих бесклеточных системах как полицистрошше инфор-
мационные РНК, т. е. могут направлять синтез нескольких различных
белков. Генетические исследования и эксперименты, в которых матрицей
служила РНК вирусов R17 и f2 (молекулярная масса 1,1 -10е), позволили
идентифицировать продукты трех цистронов [1083, 1678]. Продукт цистропа
Л был идентифицирован как белок с молекулярной массой 35 000—40 000;
одна или несколько молекул этого белка являются структурными компо-
нентами вирусной частицы [1679]. Согласно некоторым расчетам, коли-
чество генетической информации в вирусной РНК достаточно для кодиро-
вания еще одного, четвертого белка. Рибонуклеиновая кислота с молеку-
лярной массой 1 -10" теоретически могла бы кодировать 1100 аминокислот.
А-белок содержит около 350 аминокислот, а белок оболочки — 129. Моно-
мер синтетазы состоит приблизительно из 450 аминокислотных остатков.
Таким образом, мог бы существовать и четвертый белок, содержащий около
170 аминокислот. Можно, однако, допустить и другое, а именно что нес-
колько оставшихся нуклеотидов входят в состав «участков узнавания»,
необходимых для синтеза упомянутых выше трех белков.
Jn vivo инфицирующая вирусная РЫК действует в качестве матрицы
для синтеза новых белков, образующихся уже через несколько минут после
заражения. Образовавшаяся РНК-сиптетаза синтезирует минус-цепь РНК,
комплементарную инфекционной плгос-цепи, согласно правилу спаривания
оснований в применении к РНК (аденин спаривается с урацилом и гуанин
с цитозином). Считается, что каждая минус-цепь служит матрицей для
образования плюс-цепей, которые используются в качестве информацион-
ных РНК при синтезе белка вирусной оболочки и включаются в новые
вирусные частицы.
РНК-сиптетазы, по-видимому, специфичны для отдельных вирусов.
Так, Харуна и Спигелмап [1737] показали, что полимеразы, индуцирован-
ные в клетках Е. colt двумя неродственными вирусами (MS2 и Q£>), отлича-
лись высокой степенью специфичности. В оптимальных условиях ионной
среды изолированные ферменты синтезировали новую РНК только в при-
сутствии интактной РНК соответствующего вируса. Спигелмап и др. [1647]
•описали бесклеточную систему, состоящую из высокоочищепной РНК-син-
тетазы (специфичной для бактериофага QP), матричной вирусной РНК,
четырех рибонуклеозидтрифосфатов и ионов Mg2'1'; эта система была спо-
собна синтезировать новые молекулы, вирусной РНК. Новая вирусная
РНК могла служить матрицей для последующего синтеза молекул вирусной
РНК in vitro и была способна инфицировать сферопласты Е. colt с образо-
ванием зрелых вирусных частиц. Индуцируемую в клетке репликазу,
специфичную для бактериофага Qp, удалось разделить па два белковых
компонента; один из них представляет собой белок клетки-хозяина [487].
Фрэиклип [554], а также Фраицке и Гофтпнайдер [544] выделили из
клеток Е. colt, зараженных, фагами R17 и MS2, «репликативный предшест-
венник», т. е. частично двухцепочечпые структуры РНК. Точный механизм,
при помощи которого эти двухцепочечпые структуры образуют копии
вирусной РНК, остается пока предметом экспериментов и дискуссий, но,
видимо, можно считать, что «репликативный предшественник» представляет
собой двухцепочечную репликативную форму, содержащую растущие новые
плюс (т. е. вирусные)-цепи [511, 1309]. Возможно, что эта изолированная
двухцепочечная форма в клетке как таковая не существует [1648, 1890],
Независимо от уточнения деталей процесса синтеза РНК несомненно,
что в случае бактериофага Qp очищенная одиночная минус-цепь, неинфек-
ционная сама по себе, служит in vitro матрицей для образования инфекци-
онных вирусных плюс-цепей.
140
Глава VII
Среди мелких РНК-содержащих вирусов животных больше всего
известно о репликации вируса полиомиелита, обычно изучаемой на линии
клеток человека (клетки HeLa), растущих в суспензионной культуре.
Сразу же после заражения клеток вирусная РНК высвобождается из своей
оболочки. Новые вирусоспецифичпые белки, необходимые для образования
вируса, синтезируются также вскоре после заражения. В их число входит
РНК-полимераза, которая, вероятно, функционально сходна с ферментом,
обнаруженным у РНК-содержащих бактериофагов. Синтез большей части
вирусной РНК и белка оболочки вируса происходит между 2,5 и 5 ч после
заражения. В зараженной клетке образуется двухцепочечная форма вирус-
ной РНК, и количество ее растет экспоненциально в течение первых
нескольких часов после заражения. Эксперименты с мечеными предшест-
венниками позволили установить, что синтез одной молекулы РНК вируса
полиомиелита в клетках HeLa занимает около 1 мин. Вирусная РНК функ-
ционирует в качестве информационной РНК в полирибосомах, которые
в зараженных клетках HeLa отличаются значительно большими размерами,
чем в незаряженных. По-видимому, эта вирусная РНК функционирует как
полицистронная информационная РНК. Вирусоспецифичные полирибосомы
прикрепляются в зараженной клетке к какой-то большой, содержащей
липиды структуре. Изучение вируса полиомиелита in vivo выявило, что по
меньшей мере 10 различных полипептидов, не входящих в состав оболочки,
и 4 полипептида вирусной оболочки кодируются вирусной РНК [1702].
Полностью сформированные (зрелые) вирусные частицы начинают появляться
приблизительно через 2,5 ч после заражения. Вслед за этим происходит
быстрое (в течение 2—3 мин) включение вновь синтезированной вирусной
РНК в зрелые вирусные частицы. В то же время для включения вирусного'
белка требуется в среднем около 20 мин. Это позволяет предполагать, что.
в процессе репликации вируса образуется пул вирусного белка, используе-
мого при формировании вирусных частиц.
Таким образом, установлены следующие основные особенности, харак-
терные для процесса репликации мелких РНК-содержащих вирусов, инфи-
цирующих бактериальные и животные клетки:
1. Инфицирующая РНК быстро теряет свою белковую оболочку.
2. Вскоре после заражения образуются новые вирусоспецифичпые
белки, кодируемые вирусной РНК; к их числу относится РНК-сиптетаза
(или синтетазы).
3. РНК-синтетаза синтезирует минус-цепи, используя вирусную РНК
в качестве матрицы для образования двухцепочечных структур.
4. При синтезе новых комплементарных цепей вирусной РНК матрицей
служат минус-цепи.
5. Вирусная РНК функционирует как информационная РНК при
синтезе белка (или белков) вирусной оболочки на рибосомах клетки-хозяина.
6. Сборка вирусных частиц происходит из вирусной РНК и белка
оболочки.
Количество генетической информации в вирусах растений
Молекулярные массы известных РНК фитопатогенных вирусов колеб-
лются от 4-105 дальтон (одноцепочечная РНК вируса-сателлита) до при-
мерно 107 дальтон (двухцепочечная РНК вируса раневых опухолей). Для
кодирования одной аминокислоты триплетом из трех нуклеотидов требуется
одноцепочечная РНК с молекулярной массой около 1000 дальтон (2000 для
двухцепочечной). Таким образом, РНК вируса-сателлита могла бы кодиро-
вать около 400 аминокислот, а РНК вируса раневых опухолей — около
5000. Число аминокислот в изученных структурных белках фитопатогеи-
Репликация и распространение вирусов по растению
141
пых вирусов колеблется в пределах 100—400. Размеры других белков,
кодируемых вирусной РНК, неизвестны. Наличие неизмененного белка обо-
лочки у многих искусственно полученных мутантов ВТМ (различающихся
по вызываемым ими симптомам) также указывает на то, что вирусная РНК
кодирует по только структурный белок (гл. XIII).
При проведении грубых подсчетов часто допускается, что средний
иекапсидпый белок состоит из 200 аминокислот. Если это так, то РНК ВТМ,
имеющая молекулярную массу 2-10° дальтон, могла бы кодировать около 9
различных белков. Эта оценка, однако, весьма условна. Во-первых, мы не
знаем, какая часть РНК может быть ответственной за такие функции, как
узнавание места прикрепления РНК-синтстазы. Во-вторых, некоторые
белки могут содержать значительно больше 200 аминокислотных остатков
(полимераза фага R17, например, состоит из 450 аминокислот). В-третьих,
некоторые активные полипептиды, синтезируемые вирусом, могут иметь
очень небольшую молекулярную массу. Недавно был выделен полипептид,
синтезируемый грибом Monilinta fructicola (Wint.). Этот полипептид
с молекулярной массой около 8000, состоящий примерно из 65 аминокислот,
очень активно индуцирует синтез фитоалексинов в клетках растения-хозяина.
Вполне вероятно, что вирусы используют такие мелкие белки для нарушения
функций хозяина.
Таким образом, хотя и несомненно, что РНК большинства фитопатоген-
ных вирусов содержит значительно больше информации, чем требуется
для кодирования белка оболочки, число и характер дополнительных коди-
руемых функций остается невыясненным.
Сведения, полученные в экспериментах по реконструкции
вирусов растений
Структура палочкообразных и мелких сферических вирусов растений
свидетельствует о том, что для сборки полных вирусных частиц не требуется
дополнительной информации, если синтезированы РНК и белковые субъеди-
ницы. Механизм, определяющий взаимодействие белковых субъединиц при
формировании сферической оболочки или пустой палочкообразной частицы,
зависит исключительно от пространственных свойств структурной субъеди-
ницы. Эти свойства определяются аминокислотной последовательностью
белка, которая в свою очередь определяется вирусной РНК. Описанные
ниже опыты по реконструкции вирусов в основном подтверждают эту точку
зрения.
Палочкообразные вирусы
Эксперименты Френкель-Конрата [539] и Вильямса [1955] по рекон-
струкции ВТМ, а также последующие работы Френкель-Конрата и его
сотрудников показали, что частицы ВТМ могут быть вновь собраны in vitro
из белковых субъединиц и РНК ВТМ. Были найдены следующие опти-
мальные условия для сборки вируса: 0,1 М пирофосфатный буфер (pH 7,25);
0,1%-ный раствор вирусного белка и 0,005%-ный раствор вирусной РНК;
инкубация в течение 6 ч при 30 °C [538].
Иифекционность свободной РНК ВТМ составляет всего 0,1% инфек-
ционности РНК интактного вируса. Реконструкция вирусных частиц при-
водит к резкому, хотя и не всегда одинаковому, возрастанию инфекцион-
ности, которая достигает при этом величины, колеблющейся в пределах от
10 до 70—80% инфекционности интактного вируса. Верхний предел (70—
80%) представляет собой ожидаемую величину, соответствующую коли-
честву интактной вирусной РНК в инкубируемых препаратах. Вирусные
частицы, образующиеся в опытах по реконструкции, неотличимы от натив-
142
Глава VII
ного вируса по ряду критериев, включая стабильность. У ВТМ РНК не
влияет на расположение белковых субъединиц в частице, по очень сильно
влияет иа стабильность структуры; об этом свидетельствует то обстоя-
тельство, что сами по себе субъединицы не образуют палочек при pH около.
7,0. РНК также определяет длину вирусной палочки. Проведенные недавно
исследования позволяют предположить, что реконструкция представляет
собой полярный процесс, начинающийся на одном конце цепи РНК [1693].
Способность белка ВТМ образовывать палочковидные структуры
с вирусной РНК не является специфичной. Холоубек [826] обнаружил, что
РНК, выделяемая из разных штаммов ВТМ, может образовывать инфек-
ционные частицы с белковыми субъединицами из одного и того же (типич-
ного) штамма. Некоторые искусственные полимеры также образуют палочки
с белком ВТМ [538]. Белок ВТМ образовывал палочки и с РНК ВЖМТ
[1184]. Однако валовой выход одетой белком РНК был в этом случае значи-
тельно ниже, чем с РНК ВТМ. Одетая белком РНК при тестировании па
растениях китайской капусты обнаруживала почти такую же инфекцион-
ность, как и свободная РНК ВЖМТ. В обоих случаях инфекционность была
чувствительна к рибонуклеазе, т. е. РНК ВЖМТ была, вероятно, не пол-
ностью покрыта белковой оболочкой. Обнаружилось, что палочкообразные
частицы могут образовываться и при реконструкции РНК бактериофага
MS2 с белком ВТМ [1689]. Продукт реконструкции не был инфекционным
для клеток или сферопластов Е. colt, хотя РНК, выделенная из этого мате-
риала, могла заражать сферопласты. Обработка реконструированных
частиц рибонуклеазой приводила к утрате инфекционности. Таким образом,
РНК ВЖМТ и РНК MS2 при реконструкции не полностью покрываются
белком ВТМ. Эти результаты предполагают существование некоторого
ограниченного числа типов вирусных РНК, с которыми белок ВТМ может
образовывать полностью «одетые» частицы.
Семанчик и Рейнолдс [1539] осуществили реконструкцию длинных
и коротких палочек вируса погремковости табака из РНК и белковых
субъединиц.
Сферические вирусы
Недавние работы Банкрофта и др. [81, 84] показали, что белковые
субъединицы некоторых сферических вирусов в отсутствие РНК могут
взаимодействовать друг с другом с образованием различных структур
в зависимости от условий инкубации. Белковые субъединицы выделяли
из вируса хлоротической крапчатости коровьего гороха (ВХККГ) путем
обработки панкреатической рибонуклеазой при значениях pH, близких
к нейтральному. Эти субъединицы оказалисхз способными агрегировать
с образованием различных структур: эллипсоидальных частиц диаметром
21 нм и длиной 28 нм, мелких икосаэдрических частиц диаметром 16 нм,
частиц с двойной оболочкой, имеющих диаметр 34 нм, и, наконец, длинных
трубок диаметром 15 нм. Были определены условия, при которых субъеди-
ницы ВХККГ образуют частицы псевдоверхнего (pseudotop) компонента,
сходные по размерам с вирусными частицами [83]. Эти оболочки отличаются
от интактного вируса по своей электрофоретической подвижности, а также
тем, что они нестабильны при pH 6,0, т. е. в условиях, в которых нативпый
вирус стабилен. Электронная микроскопия при высоком разрешении пока-
зала, что искусственно полученные пустые оболочки, образовавшиеся из
субъединиц вируса мозаики костра и ВХККГ, имеют практически ту же
структуру, что и оболочки нативных вирусных частиц [517].
Важный вывод из этих экспериментов с ВХККГ и другими вирусами,
белок которых может быть реагрегирован (например, с вирусом мозаики
Репликация и распространение вирусов по растению
143
костра), состоит в том, что в процессе сборки вируса в растении вирусная
РНК должна играть какую-то положительную структурную роль в обеспе-
чении стабильности вируса и в специфической упаковке белковых субъ-
единиц. В противном случае следовало бы ожидать образования также
и разных других форм белковых агрегатов в пораженном растении. С дру.
гой стороны, характер упаковки белковых субъединиц вокруг РНК контро-
лируется самим белком, как это следует из экспериментов, рассмотрен-
ных ниже.
Когда выяснилось, что белковые субъединицы ВХККГ можно выде-
лить из интактного вируса в условиях, при которых они сохраняют способ-
ности. вновь образовывать различные правильные структуры, стало ясно,
что этот вирус может служить удобным объектом для изучения реконструкции
сферических вирусов in vitro [81]. Такого рода эксперименты провели
Банкрофт и Хиберт [76]. Реконструкция происходила при инкубации
изолированной РНК и белка в среде, содержащей 0,01 М трис-^у^ор
(pH 7,4), 0,01 Л/ КС], 5-10-3 М MgCl2 и 1 -10~3 М реактив Клеланда при
4 °C в точение 2 ч. Реконструированный вирус легко идентифицировали
после центрифугирования в градиенте сахарозы. Он обладал инфекцион-
постыо, устойчивой к действию рибонуклеазы. Было обнаружено, что белок
ВХККГ способен образовывать с РНК правильные структуры, очень сильно
различающиеся по размеру и составу [76].
Путем реконструкции были получены гибридные частицы, содержав-
шие белок из какого-нибудь одного вируса (ВХККГ, вируса мозаики костра
или вируса крапчатости конских бобов) и РНК из другого [775]. Такие
частицы обладали инфекционностыо, причем спектр хозяев определялся вхо-
дящей в их состав РНК. Эти опыты были затем продолжены. Удалось полу-
чить гибридный вирус, оболочка которого состояла из смеси субъединиц
белка трех перечисленных вирусов [1854]. Выяснилось также, что белковые
субъединицы этих вирусов способны упаковываться вокруг РНК ВТМ
с образованием высокоинфекционных икосаэдрических частиц различной
структуры [1843].
Диссоциация белковых оболочек ВЖМТ in vitro иа белковые субъеди-
ницы приводит к обнажению реакционноспособных —SH-групп. Если эти
группы не блокировать химически (например, карбоксиметилированием), то
они реагируют друг с другом с образованием дисульфидных (—S—S—)
связей между субъединицами, что приводит к появлению нерастворимого
продукта [710]. В процессе синтеза субъединиц in vivo и сборки белковых
оболочек это беспорядочное взаимодействие —SH-групп должно каким-то
образом предотвращаться. Локальное окружение в клетке может быть
таким, что сшивание субъединиц не будет иметь места. Возможно, что
—SH-группы блокируются на то время, которое разделяет синтез белка
и сборку белковых оболочек, или же сборка субъединиц происходит сразу же
после их синтеза. Изучение процессов сборки палочкообразных и сферических
вирусов in vitro позволило сделать следующие выводы, способствовавшие
пониманию этих процессов in vivo:
1. Сборка интактных вирусных частиц представляет собой спонтанный
процесс, в значительной степени определяемый пространственной струк-
турой белковых субъединиц вируса.
2. РНК вируса играет вторичную, но иногда весьма важную роль
в стабилизации структуры вирусных частиц.
3. Повышению эффективности сборки может благоприятствовать лока-
лизация РНК и белковых субъединиц в некотором участке (или участках)
клетки. Это предположение имеет следующие серьезные основания. Во-пер-
вых, если допустить, что сборка in vivo происходит вследствие беспорядоч-
ного взаимодействия белковых субъединиц, то ясно, что поддержание высо-
144
Глава VII
кой локальной их концентрации должно благоприятствовать сборке. Во-вто-
рых, поскольку субъединицы способны упаковываться вокруг невирусной
РНК подходящего размера (а между тем в составе вирусных частиц не
обнаружено сколько-нибудь заметных количеств невирусной РНК), сво-
бодная РНК хозяина должна быть, очевидно, каким-то образом устранена
из мест сборки. В-третьих, исследования in vitro наводят па мысль о том,
что агрегация субъединиц заметно зависит от ионной силы и pH. И наконец,
в-четвертых, «неодетая» РНК должна быть защищена от действия нуклеаз.
Как уже указывалось выше, удалось синтезировать in vitro инфек-
ционную РНК фага QP- Кроме того, были синтезированы структурный
белок и белок созревания фага R17 и других бактериофагов. Небольшие
вирусы растений были реконструированы из их белка и РНК. Если бы все
это удалось осуществить для одной вирусной системы, то мы были бы
в состоянии синтезировать in vitro полную инфекционную вирусную частицу
из [нуклеотидов и аминокислот с помощью соответствующих ферментов,
рибосом, транспортных РНК и запаса АТФ.
ПЕРВЫЕ ФАЗЫ ИНФЕКЦИИ
Высвобождение родительской вирусной РНК
из белковой оболочки
[Можно с уверенностью считать, что для того, чтобы РНК могла слу-
жить матрицей при своей собственной репликации или же играть роль
матрицы при синтезе белка, она должна быть освобождена от капсидного
белка. Как прямые, так и косвенные эксперименты позволяют предполо-
жить, что такое высвобождение РНК из белковой оболочки имеет место;
однако для вирусов растений однозначные доказательства его до сих пор
отсутствуют. Косвенные эксперименты основаны на сравнении чувствитель-
ности инфекции, вызванной интактным вирусом или свободной РНК,
к различным инактивирующим агентам. Облучение ультрафиолетом инакти-
вирует ВТМ и РНК ВТМ или препятствует развитию инфекции, если
инокулированные листья облучаются непосредственно после заражения
(гл. XIV). Показано, что штамм Uj ВТМ значительно более устойчив к инак-
тивации in vitro или вскоре после инокуляции, чем штамм U2 [1581]. Однако
инфекционная РНК, выделенная из этих двух штаммов, обладает одина-
ковой чувствительностью к ультрафиолету как in vitro, так и после иноку-
ляции. РНК более чувствительна к облучению, чем интактный вирус. Это
было показано [1581] при изучении изменения чувствительности инфек-
ционных центров к УФ-облучению в зависимости от времени, прошедшего
после инокуляции (фиг. 22).
] [[В опытах с интактным вирусом был найден лаг-период, равный 2,5 ч
для штамма U2 и 5 ч для штамма Ut. Если в качестве инокулума использо-
вали РНК любого из этих штаммов, то лаг-период, наблюдаемый перед
началом повышения устойчивости к ультрафиолету, значительно сокра-
щался, причем РНК обоих штаммов вели себя сходным образом. Результаты,
касающиеся задержки в увеличении устойчивости при заражении интакт-
ным вирусом, были интерпретированы в смысле необходимости дополнитель-
ного времени для удаления белка с вирусной частицы [1581]. Это предпо-
ложение косвенно подкрепляется тем фактом, что для удаления белка Ut
требуется более серьезная обработка in vitro, чем для удаления белка U2, и
соответственно in vivo лаг-период для U2 оказался короче, чем для U<.
Три переходных состояния, характеризующие способность вируса
к реактивации, были обнаружены при исследовании УФ-инактивированных
Репликация и распространение вирусов по растению
145
Фиг. 22. Зависимость числа местных некрозов, вызываемых стандартным ииокулумом
ВТМ или РНК ВТМ на IV. glutinosa., от времени, прошедшего между заражением н
УФ-облучештем [1581].
• РНК штамма Нг, □ РНК штамма И2; О и X интактный штамм Ur, V интактный штамм U2.
частиц Х-вируса картофеля, инфицирующих растения N. glutinosa [109].
Первая стадия длилась в течение 15—60 мин; при этом последующее осве-
щение видимым светом не вызывало никакого эффекта (число некрозов не
увеличивалось). Во второй стадии, продолжавшейся 1—2 ч, вирус мог быть
фотореактивирован. Если до истечения этого срока лист не был подвергнут
действию видимого света, то в дальнейшем фотореактивация оказывалась
уже невозможной. Первая стадия могла соответствовать проникновению
вируса в клетку и высвобождению нуклеиновой кислоты из вирусной
частицы, вторая — размножению свободной нуклеиновой кислоты в клет-
ках эпидермиса, третья — деградации неактивной РНК под действием
нуклеаз хозяина [95].
Подобные отличия были найдены также при сравнении вируса некроза
табака и выделенной из него РНК (опыты проводились на фасоли и на 2V. glu-
tinosa). Если ииокулумом служила РНК, то устойчивость инфекционных
центров начинала расти непосредственно после инокуляции; если же
использовался интактный вирус, то росту устойчивости предшествовал
лаг-период, продолжавшийся 2—4 ч [934]. При этом было отмечено, что
самые первые некрозы, вызываемые как РНК, так и интактным вирусом,
появляются одновременно, однако некрозы, вызываемые свободной РНК,
достигают максимального числа и нормального вида раньше, чем те, кото-
рые возникают при инокуляции интактным вирусом. Различие во времени
появления максимума некрозов достигало 4 ч (фиг. 23).
Было показано, что при инокуляции свободной РНК появление новых
вирусных частиц можно обнаружить на несколько часов раньше, чем при
инокуляции интактным вирусом (например, ВТМ [541] или вииусом некроза
табака [934]).
Боудэн и Клечковский [ИЗ] и Боудэн [99] подвергли сомнению обос-
нованность предположения о том, что лаг-период при инокуляции интакт-
ным вирусом (по сравнению с инокуляцией свободной РНК) отражает время,
требуемое для высвобождения нуклеиновой кислоты вируса из его белковой
10—0893
146
Глава VII
Фиг. 23. Скорость появления
местных некрозов, вызываемых
вирусом некроза табака ( :--х)
и его нуклеиновой кислотой
(О — *) иа листьях фасоли
(при 25 °C) 1934].
оболочки. Оказалось, что при заражении вирусом табачной мозаики
и вирусом некроза табака частицы в инокулуме могут в течение значительно
более длительного времени, чем свободная РНК, сохранять способность
инициировать инфекционный процесс. При заражении клеток свободной
РНК инфекция оказывается более синхронизированной, так как молекулы
РНК, не проникшие в клетку, инактивируются вскоре после того, как зара-
жение произошло [991.
Была предпринята попытка прямым путем определить длительность
процесса депротеинизации вируса после заражения листьев табака интакт-
ным ВТМ, меченным 32Р [1409]. В этих опытах регистрировалось время
появления РНК, чувствительной к деградации РНКазой. Около 1% РНК
деградировало немедленно после инокуляции (в нулевое время). Значитель-
ный подъем чувствительности к РНКазе (до 2,5%) наблюдался через 3 ч
после инокуляции и через 6 ч (до 5%), после чего нарастание чувствитель-
ности прекращалось. Размер РНК, чувствительной к рибонуклеазе, не
определяли. Таким образом, в этих экспериментах не было получено дан-
ных о том, какой вклад в чувствительность вирусной РНК к РНКазе вносит
существование частично депротеинизированных частиц.
При другом прямом подходе к этой проблеме листья табака заражали
ВТМ, реконструированным из меченных 14С белковых субъединиц и неме-
ченой РНК [1550, 1551] (тем самым исключалисх? трудности, связанные
с присутствием меченых продуктов деградации РНК). В экстрактах листьев,
полученных через 10 мин после инокуляции, около 25% вирусного белка
обнаруживалось в верхней зоне градиента плотности сахарозы, четко отде-
ляясь от основной зоны вируса; количество это возрастало в течение 5—9 ч.
На первоначальное быстрое освобождение белка оболочки не влияли низкая
температура или циклогексимид. Таким образом, этот процесс, по-видимому,
не зависит от предсуществующих или индуцированных вирусом ферментов.
Главная трудность как в этом, так и в описанном выше эксперименте ока-
залась связанной с тем, что в лучшем случае только около 0,01% иноку-
лума успешно инфицирует клетки. Поэтому основная часть исследуемых
РНК и белка, очевидно, представляла собой избыток инокулума, который
не был удален при отмывании листа. Предпринимались также попытки
наблюдать процесс «раздевания» вируса в электронном микроскопе [389];
однако до сих пор такие попытки заканчивались неудачей.
Репликация и распространение вирусов по растению
147
Итак, представляется вероятным, что некоторые вирусные частицы
депротеинизируются в течение нескольких минут после инокуляции. Это
предположение подтверждается результатами описанных выше опытов
с радиоактивным ВТМ, а также тем фактом, что самые ранние некрозы, вызы-
ваемые ВТМ, совпадают по времени появления с самыми ранними некро-
зами, вызываемыми РНК ВТМ [934]. По-видимому, существует период
продолжительностью в несколько часов, во время которого отдельные
интактные вирусные частицы утрачивают белковую оболочку и либо вызы-
вают инфекцию, либо инактивируются.
Возможная роль ДНК растения-хозяина
Рядом авторов исследовалась возможность участия ДНК клетки-хозя-
ина в размножении вирусов растений. Было найдено, что ДНК, выделен-
ная из здоровых листьев табака и из листьев, зараженных ВТМ, имеет один
и тот же нуклеотидный состав и включает 32Р с одинаковой скоростью [1416].
Затем были получены более существенные доказательства того, что участие-
в синтезе РНК ВТМ не является прямой функцией ДНК хозяина [1470].
Здоровые и инфицированные листья табака обрабатывались актиномицином
D (антибиотиком, который при соответствующих условиях специфически
блокирует ДНК-зависимый синтез РНК). При этом синтез РНК вируса
табачной мозаики продолжался на несколько пониженном уровне, тогда как
синтез клеточных РНК был по существу блокирован.
Аналогичный результат был получен для РНК вируса мозаики костра,
размножающегося в растениях ячменя; синтез РНК вируса не затрагивался
при условиях, когда синтез клеточных РНК был в значительной степени
подавлен [793]. Действие актиномицина D на синтез вируса мозаики костра,
вируса табачной мозаики и синтез клеточных РНК было исследовано вто-
рично [1530]. В основном описанные выше данные удалось подтвердить;
однако было найдено, что влияние актиномицина D на ВТМ зависит от
времени введения этого антибиотика. Если актиномицин вводили немед-
ленно после инокуляции, то размножение вируса подавлялось, а если его
вводили через 12—14 ч, то оно, напротив, стимулировалось; на более позд-
них стадиях антибиотик практически влияния пе оказывал. Раннее угнете-
ние могло быть обусловлено повышенной проницаемостью листа для анти-
биотика сразу после инокуляции (что могло привести к токсической дест-
рукции инфицированных клеток). Не исключено также, что этот эффект
связан с ингибированием какой-то ДНК-зависимой функции клетки, необ-
ходимой на самых рапних этапах размножения вируса (такого рода сообра-
жения высказывались в отношении некоторых вирусов животных и бакте-
рий). Подобным образом можно интерпретировать и тот факт, что размно-
жение вируса желтой мозаики коровьего гороха в растениях коровьего
гороха ингибировалось актиномицином D, если антибиотик вводился на
протяжении 36 ч, начиная с 12—32 ч после инокуляции [1082]. Вероятно,
эта проблема требует дальнейших исследований. Кстати, следует заметить
что маннит, присутствующий в некоторых препаратах актиномицина D,
может влиять на число некрозов, вызываемых ВТМ (ван Луи, личное сооб-
щение).
Двухцепочечные вирусные РНК
Двухцепочечная форма РНК была выделена из листьев китайской
капусты, инфицированных ВЖМТ, и из листьев табака, инфицированных
ВТМ [302, 1139, 1384, 1573]. Эта двухцепочечная форма вирусной РНК
присутствует в растении в низкой концентрации (вероятно, около 2 мкг на
10*
1'48
Глава VII
1т сырой массы листьев для ВЖМТ в китайской капусте) [215]. Опа устой-
чива к гидролизу панкреатической рибонуклеазой, тогда как большая часть
клеточной РНК быстро расщепляется при такой обработке. Поэтому двух-
цепочечиая РНК может быть получена из РНКазных гидролизатов смеси
нуклеиновых кислот, выделенных из инфицированных клеток фракциони-
рованием гидролизата в градиенте плотности сахарозы или хроматогра-
фией на колонках с метилированным бычьим сывороточным альбумином на
кизельгуре (МАК) (фиг. 24). Электронная микрофотография двухцепочечной
РНК, выделенной из растений, инфицированных вирусом мозаики коровьего
гороха, приведена на фото 33. Сходные фотографии были получены для
двухцепочечных РНК из ВЖМТ и ВТМ [215].
Приведены следующие доказательства того, что устойчивая к рибо-
нуклеазе РНК из растений, инфицированных ВЖМТ, действительно пред-
ставляет собой двухспиральную структуру со спаренными основаниями,
образующуюся в результате вирусной инфекции:
: 1. Такие структуры были найдены только в ткани, инфицированной
вирусом.
2. Устойчивость к рибонуклеазе утрачивалась после нагревания пре-
парата до 100 °C в растворе с низкой концентрацией соли и последующего
быстрого охлаждения, т. е. после обработки, которая, как известно, при-
водит к денатурации двухцепочечной РНК. Соответствующий материал из
растений, инфицированных ВЖМТ, обнаруживал зависимость между тем-
пературой и поглощением в ультрафиолетовой области, типичную для
двухцепочечных нуклеиновых кислот [215].
3. Около 95% радиоактивного, устойчивого к рибонуклеазе материала
после щелочного гидролиза обнаруживало хроматографические и электро-
форетические свойства, характерные для 3'-(2')-мононуклеотидов.
4. В градиенте плотности сульфата цезия этот материал имел плотность,
значительно более высокую, чем можно было ожидать для ДНК или для
Номер фракции
Фиг. 24. Фракционирование на колонке МАК нуклеиновых кислот из листьев табака,
собранных через 3,5 дня после заражения ВТМ [1384].
Растения снабжались через корни 0!Р-ортофосфатом в течение ВО мин. А. Необработанная нуклеиновая
кислота. Б, Нуклеиновая кислота, обработанная РНКазой. I — оптическая плотность при 260 нм;
II — радиоактивность. Пик радиоактивности при 0,63 М соответствует двухцепочечной вирусной РНК.
Репликация и распространение вирусов по растению 149
ДНК — РНК-гибридов. Так, двухцепочечная РНК ВЖМТ имела плавучую
плотность 1,617 г/см3, а одноцепочечная — 1,642 г/см8 [215].
5. Удается выделить меченую двухцепочечную РНК при введении 32Р
в инфицированное растение. Если введение изотопа продолжается в течение
достаточно длительного периода времени, то нуклеотидный состав такой
РНК оказывается близким к составу, которого можно ожидать для двух-
цепочечных структур, содержащих цепь вирусной РНК, спаренную при
помощи водородных связей с комплементарной цепью (гуанин с цитозином
и аденин с урацилом).
Для анализа устойчивого к РНКазе материала, выделенного из ткани,
инфицированной ВТМ, был использован важный критерий гибридизации
in vitro [302, 1573]. Немеченый материал из инфицированных растений
после денатурации при отжиге был способен образовывать комплекс с РНК
ВТМ, меченной 32Р. В результате радиоактивная РНК становилась устой-
чивой к действию РНКазы в составе комплекса. Приблизительные расчеты
показали, что ткань, содержащая около 10° частиц ВТМ иа клетку, содер-
жала 102—103 вирусных эквивалентов двухцепочечной РНК [1573]. При
других условиях была получена существенно более высокая оценка —
около 0,5% от всей синтезированной вирусной РНК [302]. Далее, при соот-
ветствующих условиях денатурации и ренатурации из меченного 32Р устой-
чивого к РНКазе материала с помощью избытка немеченой РНК ВТМ вытес-
нили меченую РНК ВТМ, чувствительную к РНКазе [1888, 1890]. Таким
путем была выделена минус-цепь двухцепочечной РНК и показано, что ее
нуклеотидный состав действительно комплементарен нуклеотидному составу
РНК ВТМ.
Благодаря необычно высокому содержанию цитидиловой кислоты
в РНК ВЖМТ эту РНК можно достаточно легко отличить (иа основании
анализа нуклеотидного состава) от соответствующей двухцепочечной струк-
туры. При кратковременном введении метки нуклеотидный состав двухце-
почечной РНК из зараженных ВЖМТ растений (определенный по радиоак-
тивности отдельных нуклеотидов) оказался сходным с составом вирусной
РНК. При увеличении времени введения метки с 30 мин до 8 дней нуклеотид-
ный состав становился близким к тому, которого следовало ожидать для
двухцепочечиой РНК ВЖМТ. Аналогичные результаты были получены
для двухцепочечной РНК ВТМ [1384].
Эти данные позволяют предположить, что цепь вирусной PITK в дуп-
лексе реплицируется чаще, чем минус-цепь, и что вновь образованные плюс-
цепи вытесняются из дуплекса. Другими словами, эти РНК вирусов растений
реплицируются по асимметричному полуконсервативному механизму (пред-
положение о существовании такого механизма высказывалось в отношении
РНК-содержащих вирусов животных и бактерий). Детали механизма синтеза
комплементарной цепи и образования копий вирусных РНК ие установлены.
Оценивая приведенные выше рассуждения и результаты, представленные
иа фиг. 24, необходимо учитывать, что двухцепочечная структура, воз-
можно, возникает в процессе экстракции РНК (благодаря спариванию осно-
ваний между минус-цепыо и прикрепленной к ней частично синтезирован-
ной плюс-цепыо) [1890].
Некоторые авторы, использовавшие в своих опытах бесклеточные
экстракты или фракции из инфицированных листьев, утверждали, что мате-
риал, синтезированный in vitro, обнаруживал отдельные свойства, типич-
ные для вирусной РНК. Однако ни в одном из этих случаев не было пред-
ставлено несомненных доказательств синтеза новой инфекционной вирус-
ной РНК, как это было сделано в опытах с бактериофагом Q₽ [1647]. Для
синтеза РНК в бесклеточной системе использовались препараты, выделен-
ные из листьев китайской капусты и состоящие главным образом из хлоро-
150
Глава VII
пластов и ядер с добавлением четырех рибоиуклеозидтрифосфатов и АТФ-
регенерирующей системы [1381]. Такие препараты, выделенные как из здо-
ровых, так и из инфицированных ВЖМТ листьев, синтезировали одноце-
почечную РНК, причем этот синтез мог быть подавлен актиномицином D.
Препараты из листьев, инфицированных ВЖМТ, синтезировали также двух-
цепочечную РНК; синтез двухцепочечной РНК был устойчив к действию
актиномицина D [1381]. Однако четких доказательств синтеза интактной
РНК ВЖМТ in vitro в этой системе представлено не было. Сходные резуль-
таты были получены для экстрактов из листьев ячменя, инфицированных
вирусом мозаики костра [1531]. Утверждения, что в бесклеточной системе
была синтезирована инфекционная вирусная РНК (см., например, работы
[61, 970]), вызывают сомнения [1126, 1380].
Сообщалось о выделении и частичной очистке РНК-синтетазы из
листьев китайской капусты, инфицированных ВЖМТ [39—41]. В соответст-
вующей среде, содержащей четыре рибонуклеозидтрифосфата, синтезирова-
лись полирибонуклеотиды. Они были идентифицированы как смесь одно-
и двухцепочечной РНК ВЖМТ в опытах по гибридизации меченого радиоак-
тивного продукта ферментативной реакции и немеченой двухцепочечиой
РНК. Размер синтезированных полинуклеотидов не определялся. Позже
выяснилось, что в таком препарате за время инкубации (30 мин) синтезиро-
валось больше одноцепочечной РНК. Была предпринята также попытка
выделить РНК-синтетазу, специфичную для ВЖМТ, путем фракциониро-
вания белков из экстрактов листьев, инфицированных ВЖМТ, на колонке
с ДЭАЭ-целлюлозой; однако уровень активности фермента оказался при
этом очень низким [1134]. Повышение РНК-полимеразной активности было
отмечено в листьях огурца, инфицированных вирусом огуречной мозаики
[640]. Потребуется, несомненно, еще много усилий для выделения и харак-
теристики этих ферментов из инфицированных растительных тканей.
Другие вирусоспецифичпые белки
Кроме структурного белка и условно идентифицированной вирусоспе-
цифичной синтетазы, никаких других вирусных белков из растений, инфи-
цированных вирусами, выделено не было. Не было обнаружено таких бел-
ков и среди продуктов, образующихся в белоксинтезирующей системе
in vitro (с использованием в качестве матрицы РНК фитопатогеииых виру-
сов). Вполне возможно, однако, что эти белки содержатся в растении
в низкой концентрации, а так как функции их неизвестны, задача их выделе-
ния оказывается, естественно, очень трудной. Наши попытки идентифици-
ровать вновь синтезированные неструктурные бедки в листьях, инфициро-
ванных ВЖМТ, потерпели неудачу (в этих опытах мы использовали для
разделения меченных изотопами продуктов хроматографические и микро-
иммунологические методы). Сообщалось, что в растениях табака, инфици-
рованных ВТМ, удалось обнаружить присутствие каких-то белковых ком-
понентов, которые отсутствовали в здоровых растениях и не принадлежали
к числу структурных вирусных белков [1650]; однако эти белковые компо-
ненты не были охарактеризованы. Если это действительно вирусоспеци-
фичные белки, то, судя по результатам иммуноэлектрофореза, они присутст-
вуют в ткани в поразительно большом количестве.
Природа и локализация синтеза РНК и белка па ранних стадиях
вирусной инфекции
Для многих вирусов с помощью электронной микроскопии и ряда
других методов было показано, что в цитоплазме клеток инфицированного
листа через некоторое время накапливается большое количество зрелого
Репликация и распространение вирусов по растению
151
вируса. Эти наблюдения, однако, абсолютно ничего не говорят относительно
внутриклеточной локализации синтеза вирусных компонентов и сборки
вирусных частиц. Исследование процессов, протекающих на ранних этапах
вирусной инфекции, может дать более определенную информацию на этот
счет. К сожалению, изучение ранних этапов инфекции с помощью имею-
щихся методов связано с большими трудностями. Известно, что только 1
из 10 000 клеток инфицируется при механической инокуляции. Если бы
мы исследовали период, в течение которого в этих клетках образуются пер-
вые 10% вируса, то к концу этого периода концентрация вируса в листе
равнялась бы 1/100 ооо его конечной концентрации (при условии, что вирус
не инфицировал соседние клетки).
Согласно распространенным представлениям о репликации мелких
РНК-содержащих вирусов бактерий и животных, проникшая в клетку сво-
бодная вирусная РНК присоединяется к рибосоме (или рибосомам) и дей-
ствует как матрица для синтеза вирусной РНК-полимеразы, после чего
образовавшаяся вирусная РНК-полимераза катализирует синтез одной
или нескольких комплементарных антипар аллельных цепей па матрице
родительской РНК. Однако до сих пор не удалось продемонстрировать
присоединение родительской вирусной РНК к рибосомам. Правда, было
показано, что небольшая часть родительской РНК ВЖМТ, меченной 32Р,
становилась устойчивой к рибонуклеазе вскоре после заражения [1041].
Количество такой РНК достигало максимума через 20 мин и затем очень
быстро падало. Этот результат очень хорошо согласовывался с предполо-
жением о том, что на родительской цепи синтезируется комплементарная ей
минус-цепь, после чего родительская РНК вытесняется из образовавшейся
двухцепочечной структуры новосинтезированной дочерней вирусной РНК.
Однако уровень радиоактивности в этих опытах был очень низок, и устой-
чивая it рибонуклеазе радиоактивность не была никак охарактеризована.
Более того, кажется вообще маловероятным, чтобы все процессы в инфи-
цированных клетках происходили бы так четко «в фазе», как можно пред-
полагать на основании этих опытов.
Цитологические данные различного рода свидетельствуют о том, что
вскоре после заражения клетки ВТМ в клеточном ядре происходят измене-
ния. Цех и др. [1851, 1981, 1982,1984] заражали концевую клетку листового
волоска и затем с помощью УФ-микроскопии исследовали процессы, проте-
кающие в соседней клетке (которая не была повреждена при введении
вируса). Оказалось, что через 30 мин усиливалось поглощение ядра в области
265 нм, поглощение при 280 нм также усиливалось, но в значительно мень-
шей степени. Повышенный уровень поглощения при 265 нм сохранялся
в течение приблизительно 1*/2 ч. Через 2 ч после заражения наблюдалось
внезапное усиление УФ-поглощения материалом, расположенным: в цито-
плазме вблизи ядра. Полученные данные позволяют предполагать, что
количество РНК в этой области за 30 мин возрастает в 25 раз. Можно думать,
что РНК, синтезированная в ядре, мигрирует затем в цитоплазму. Цитоплаз-
матическая зона, богатая РНК, видна в течение нескольких часов; посте-
пенно она расширяется. Приблизительно через 7 ч после заражения отно-
шение поглощения в цитоплазме при 280 нм к поглощению при 260 нм начи-
нает увеличиваться, что наводит на мысль о начинающемся синтезе белка.
Структурные изменения в инфицированных клетках листовых волосков
исследовались также с помощью электронной микроскопии [1851]. Ядерная
мембрана глубоко впячивается в массу ядра, образуя каналы, которые
заполняются цитоплазмой. В этих каналах появляются различные цито-
плазматические органеллы, в частности митохондрии. Цистерны и пузырьки
эндоплазматической сети во многих местах расширяются и заполняются
каким-то плотно упакованным материалом неизвестной природы; одновре-
152
Глава VII
Фиг. 25. Влияние инфекции ВТМ иа содержание ДНК (Z), РНК (If), гистонов (III)
и общего белка (77) в ядрах клеток эпидермиса листьев табака в течение первых 24 ч
после заражения [785].
менно эндоплазматическая сеть густо покрывается рибосомами. Электрон-
но-микроскопические данные говорят о том, что в этих областях образуются
кристаллы вируса. Вирусные частицы видны в таких клетках только в тель-
цах-включениях; обнаружить их в цитоплазме в свободном виде не удается.
Детальные исследования живого и фиксированного материалов с помо-
щью фазово-контрастной микроскопии привели к заключению, что РНК
ряда штаммов ВТМ синтезируется в ядре, а затем перемещается в цито-
плазму [64]. Однако при изучении характера окраски ядра в клетках стеб-
левых волосков томата в разное время после заражения никаких цитологи-
ческих изменений в ядре не отмечалось вплоть до 3-го или 4-го дня.
С помощью дифференциальной окраски и микроспектрофотометрических
методов удалось получить более точную информацию относительно изме-
нений в ядрах клеток эпидермиса, инфицированных ВТМ [785]. Через 6—
8 ч после заражения в ядрах клеток эпидермиса нижней поверхности листа
N. tabacum обнаруживалось кратковременное увеличение содержания РНК
приблизительно на 20% (фиг. 25).
Включение 3Н-урацила в здоровые клетки эпидермиса листьев табака
и в клетки, инфицированные ВТМ, изучали с помощью микрорадиоавтогра-
фии и последующего счета зерен для оценки включения. При этом не было
найдено различий во включении урацила в материал цитоплазмы, но
в первые несколько дней после заражения в ядрах инфицированных клеток
наблюдали приблизительно трехкратное усиление включения [1967].
Все эти наблюдения показывают, что иа ранних стадиях инфекции,
вскоре после заражения ВТМ, ядро заметно изменяется и в нем существенно
усиливается синтез РНК. Однако микроскопическая техника не позволяет
отличить один вид РНК от другого; новообразованная РНК может быть
вирусной, рибосомной, транспортной, информационной РНК клетки-хозя-
ина или, наконец, смесью разных видов — идентифицировать ее на основе
микроскопических данных невозможно. Позже была предпринята попытка
определить внутриклеточное место синтеза РНК, индуцированного виру-
Репликация и распространение вирусов по растению
153
сом. Для этого применяется ингибитор ДНК-зависимого синтеза РНК —
актиномицин D в сочетании с радиоавтографией [1495, 1633]. Диски, выре-
занные из листьев табака, и кончики корня Vicia faba метили 3Н-уридином
в течение нескольких часов, а затем фиксировали, делали срезы, окраши-
вали их и исследовали методом радиоавтографии. В необработанной акти-
номицином D здоровой ткани и в ткани, зараженной ВТМ (или вирусом
желтой мозаики клевера), было обнаружено довольно значительное вклю-
чение изотопа в клетки, особенно в ядро и ядрышко (фото 26, Л, Б). В здо-
ровую, но обработанную актиномицином D ткань) метка не включалась
(фото 26, В); включение же изотопа в ткань, инфицированную вирусом
и обработанную антибиотиком, было снижено, и меченый материал локали-
зовался в ядрышке (фото 26, Г). Если срезы здоровых неингибированных
клеток корней V. faba обрабатывались дезоксирибонуклеазой и рибонуклеа-
зой, то радиоактивность полностью исчезала. В то же время аналогичная
обработка ткани, инфицированной вирусом желтой мозаики клевера, приво-
дила только к снижению радиоактивности, но не к полному ее исчезнове-
нию. Радиоактивность, оставшуюся после ферментативной обработки, можно
было удалить 10 %-ной хлорной кислотой.
Полученные результаты более непосредственно подкрепляют предпо-
ложение о том, что синтез РНК у этих вирусов протекает в ядрышке. Вклю-
чение метки в ядрышко в присутствии актиномицина D позволяет считать,
что двухцепочечная форма вирусной РНК локализуется именно в нем. Оста-
точная радиоактивность, присутствующая в срезах, обработанных нуклеа-
зами, может соответствовать двухцепочечной вирусной РНК; однако факт
устойчивости двухцепочечной РНК к ферментам в фиксированных срезах
в настоящее время не установлен. Данные относительно накопления 3Н-ури-
дина в ядрышке (и в пространствах, остающихся между склеивающимися
хлоропластами) в ткани, обработанной актиномицином D, были получены
также при заражении растений китайской капусты ВЖМТ [1036].
Однако такая локализация радиоактивности, устойчивой к актиноми-
цину D, наблюдалась не во всех случаях. Так, при инфицировании корней
V. faba вирусом крапчатости конских бобов повышение уровня включения,
устойчивого к актиномицину D, было обнаружено в цитоплазме (главным
образом в эндоплазматической сети и в аппарате Гольджи) [449]. Предва-
рительные результаты такого рода были получены также для вируса кольце-
вой пятнистости томатов и вируса броизовости томатов.
Для решения вопроса о месте синтеза вирусной РНК в клетке был
применен метод фракционирования гомогенатов листьев табака, инфициро-
ванного ВТМ, с помощью дифференциального центрифугирования (двух-
цепочечную РНК вируса метили радиоактивным фосфором) [1379]. В этой
работе не удалось обнаружить двухцепочечной РНК во фракции ядер
и хлоропластов, но 40% общего количества устойчивой к нуклеазам РНК
находилось во фракции, которая по седиментационным свойствам соответ-
ствовала митохондриям. Было также найдено, что двухцепочечная РНК,
синтезированная в бесклеточных экстрактах из листьев табака, инфици-
рованного ВТМ, ассоциирована с какой-то цитоплазматической структу-
рой, а не с ядром [1383]. В настоящее время эти результаты трудно согла-
совать с данными цитологических исследований. Возможно, что заражение
ВТМ вызывает усиление синтеза определенного вида клеточной РНК,
а именно той РНК, которая относительно устойчива к ингибированию акти-
номицином D (например, тРНК).
Были проведены исследования, касающиеся изменений в содержании
общей РНК в эпидермисе листьев табака на ранних стадиях после иноку-
ляции ВТМ [571]. На фиг. 26 показана зависимость между изменением содер-
жания РНК на единицу поверхности эпидермиса и временем, прошедшим
154
Глава VII
Фиг. 26. Влияние инфекции ВТМ па
содержание общей РНК в эпидер-
мисе зараженных листьев табака
[571].
1 — инфицированные листья; II — пе-
инфицированные листья: III — разность
между содержанием РИН в инфицирован-
ных и неипфвдироппнных листьях.
после инокуляции. Механическая инокуляция вызывала в течение первых
нескольких часов сначала повышение, а затем снижение содержания РНК.
Через 6—8 ч после инокуляции в условиях этого опыта в эпидермисе, ино-
кулированном ВТМ, наблюдалось быстрое увеличение содержания РНК
(приблизительно на 10%). Этот подъем имел место по крайней мере за 3—
5 ч до того, как в экстрактах из клеток эпидермиса можно было наблюдать
повышение инфекционности.
График, представленный на фиг. 26, очень напоминает соответствую-
щий график на фиг. 25, хотя первый из них относится к общей клеточной
РНК, второй — к ядерной. Эти результаты, полученные с помощью раз-
личных методов, будучи сопоставлены, должны, очевидно, означать, что
синтез РНК в ядре примерно через 5—8 ч после заражения внезапно резко
усиливается и что позднее новосинтезированная РНК мигрирует в цито-
плазму. Подобная картина согласуется, по-видимому, с цитологическими
наблюдениями.
Было обнаружено, что двухцепочечная РНК ВЖМТ локализуется во
фракции хлоропластов из тканевых гомогенатов [1379]. В препаратах хло-
ропластов в этом случае практически отсутствовали интактные ядра (для
дезинтеграции ядер применялся концентрированный раствор соли); однако
было высказано предположение, что эти препараты могли быть загрязнены
примесью ядрышек [230]. При дальнейших попытках решить поставленную
проблему выявилась хорошая корреляция между содержанием хлорофилла
и содержанием двухцепочечной РНК в различных фракциях, тогда как
для ДНК такой корреляции найдено не было (Ральф и Войчик, личное сооб-
щение). Чтобы окончательно решить вопрос о локализации двухцепочечной
РНК, необходимы повторные исследования с фракционированием клеточ-
ных субструктур и их электронно-микроскопическим изучением. Это поз-
волит получить реальную оценку содержания органелл (или фрагментов
органелл) в различных фракциях.
Некоторые изоляты вируса погремковости табака дефектны в том смысле,
что они инициируют инфекцию, при которой хотя и синтезируется вирус-
ная РНК, но полных вирусных частиц не образуется (гл. VIII). Гомогенаты
листьев табака, инфицированных такими изолятами, подвергали фракцио-
нированию. В результате выяснилось, что большая часть инфекционности,
Репликация и распространение вирусов по растению
155
экстрагируемой при фенольной обработке, ассоциирована с фракцией,
осаждающейся при 1000 g за 10 мин [313]. Отсюда был сделан вывод, что наи-
более вероятным местом накопления вирусной РНК являются ядра.
Синтез структурного белка вируса
Бесклеточные системы дали пока очень мало для понимания процесса
синтеза структурных белков вирусов растений. Вследствие отмеченных
выше трудностей, на которые наталкивается использование бесклеточных
систем, выделенных целиком из растительной ткани, многие авторы при
попытке продемонстрировать синтез структурного белка фитопатогенных
вирусов в таких системах пользовались рибосомами, транспортными РНК
и растворимыми ферментами из бактериальных источников, обычно из
Е. coli. Рибонуклеиновая кислота, выделенная из препаратов фитопатоген-
ных вирусов, способна стимулировать включение аминокислот в полипеп-
тиды в бесклеточной системе из 2?. coli. Представляется наиболее вероят-
ным, что в качестве матрицы при синтёзе белков in vivo функционирует
плюс-цепь, а не минус-цепь вирусной РНК. Это предположение довольно
убедительно подкрепляется исследованиями мутантов ВТМ, полученных
при действии азотистой кислоты иа РНК вируса (гл. XIII). Однако лишь
недавно удалось получить частичную характеристику белка, синтезиро-
ванного in vitro, и таким образом идентифицировать его как структурный
белок (см. ниже). Вплоть до этого момента не было прямых доказательств
в пользу того, что транслируется только вирусная плюс-цепь. Вряд ли
можно думать, что двухцепочечная РНК вируса способна служить матри-
цей для белкового синтеза. На примере РНК вируса карликовости риса
было показано, что она действительно не выполняет такой функции.
РНК ВТМ стимулирует включение аминокислот в полипептиды, синте-
зируемые в бесклеточной системе из Е. coli, но синтезированный продукт
не удалось идентифицировать как структурный белок ВТМ ни путем ана-
лиза пептидов, ни с помощью серологических методов [2]. Синтез белка,
имеющего некоторые свойства структурного белка фага f2 (инфицирующего
Е. coli), наблюдался в бесклеточной белоксинтезирующей системе, выде-
ленной из Euglena gracilis, если в качестве матрицы к этой системе добавляли
РНК фага f2 [1516]. Однако в той же самой системе, но только с РНК ВТМ
не было обнаружено синтеза какого-либо материала, имеющего сходство
со структурным белком ВТМ. Рибонуклеиновая кислота из вируса-сател-
лита ВНТ кодирует, вероятно, не более двух белков. Используя в качестве
матрицы эту РНК в бесклеточной белоксинтезирующей системе из Е- coli,
удалось синтезировать полипептидный материал, который после гидролиза
трипсином дал серию пептидов, сходных с пептидами, обнаруженными
в структурном белке этого вируса (хотя и не идентичных им) [376].
В белоксинтезирующей системе из Е. coli использовалась также
в качестве матрицы РНК, выделенная из верхнего компонента препаратов
вируса мозаики люцерны (гл. VIII) [1826]. Приблизительно половину радио-
активности, включившейся при этом в белок in vitro, можно было сооса-
дить со структурным белком вируса мозаики люцерны. С помощью метода
обзорных хроматограмм было показано, что триптические пептиды из син-
тезированного материала очень сходны с пептидами, выделенными из струк-
турного белка. Молекулярная масса РНК верхнего компонента равна
0,5 -10°. Эта РНК, вероятно, содержит цистрон структурного белка и, воз-
можно, еще один какой-либо цистрон. Одной из возможных причин отсут-
ствия структурного белка среди продуктов синтеза белоксинтезирующей
системы, направляемой" РНК ВТМ, может быть довольно значительный
размер молекулы РНК ВТМ [1826]. Не исключены и другие причины.
156
Глава VII
На основании универсальности генетического кода исследователи
часто склонны считать, что транспортная РНК из одного организма спо-
собна функционировать без ошибок в белоксинтезирующей системе из дру-
гого организма. Однако результаты недавних экспериментов показывают,
что это не так [174]. Исследовался вопрос о том, насколько эффективно
и точно четыре дрожжевые глициновые тРНК, предварительно нагруженные
глицином, включают глицин в структурный белок фага R17, используя
при этом в качестве матрицы РНК фага R17 в бесклеточной системе из
Е. colt (бактериальные глициновые тРНК были из этой системы почти пол-
ностью удалены). Среди трех исследованных пептидов структурного белка,
синтезированных в системе, присутствовал пептид-2, в который дрожжевые
глициновые тРНК включали дополнительный глицин (вероятно, на место,
где в норме присутствует какая-то другая аминокислота). Таким образом,
некоторые трудности, возникающие при попытке продемонстрировать син-
тез структурного белка фитопатогенных вирусов в белоксинтезирующей
бесклеточной системе, можно, очевидно, объяснить именно подобными
ошибками, связанными с применением гетерологичных систем.
Было показано, что РНК ВТМ и РНК ВЖМТ обладают в растворе
хорошо выраженной вторичной структурой [740]. Вследствие этого считыва-
ние матрицы in vitro может прерываться из-за наличия в ней спирализован-
ных областей (если эти области включают какие-то последовательности,
кодирующие структурный белок). РНК меньшего размера, например РНК
вируса-сателлита ВНТ и РНК вируса мозаики люцерны, найденная
в верхнем компоненте этого вируса, возможно, обладают in vitro гораздо
менее выраженной вторичной структурой. Однако при использовании
в белоксинтезирующей системе из Е. colt РНК ВТМ, подвергнутой тепловой
деградации, было обнаружено, что молекулярная масса РНК не влияет
на степень включения аминокислот в белок до тех пор, пока она превы-
шает 400 000. При снижении молекулярной массы ниже 300 000 включение
постепенно уменьшается [220].
Обнаружено, что факторы, обычно ассоциированные с рибосомами, но
вымываемые из высокоочищениых препаратов рибосом, усиливают транс-
ляцию природных матриц (включая и РНК ВТМ), если их добавляют в бак-
териальную белоксинтезирующую бесклеточную систему [1666]. Эти фак-
торы принимают участие в инициации синтеза полипептидов in vitro. Воз-
можно, что неэффективность трансляции РНК вирусов растений в бакте-
риальной белоксинтезирующей системе объясняется видовой специфич-
ностью этих факторов. Структурные белки вирусов растений часто имеют
на N-конце полипептидной цепи N-ацетиламинокислоту. Пока неизвестно,
какую это может играть роль в инициации синтеза вирусных белков. Были
предприняты довольно безуспешные попытки исследовать свободные ацетил-
аминокислоты в инфицированных ВТМ листьях табака [923]. У вируса-са-
теллита в структурном белке на N-конце находится аланин. Концевой трип-
лет 5'-гидроксильиого конца РНК вируса-сателлита был идентифицирован
как ффАфГфУф [1920, 1921]. В системе из Е. colt это кодон серина, а не
аланина.
Было установлено, что белковый продукт, образуемый в белоксинте-
зирующей системе из Е. colt с использованием в качестве матрицы РНК
ВТМ, оказывается формилированным, если в системе присутствует донор
формильных групп [1515]. В такой системе синтезировались продукты
с молекулярной массой выше 14 000, однако структурного белка ВТМ среди
них обнаружено не было. N-формилметионил-тРНК участвует в инициации
белкового синтеза в белоксинтезирующей системе из Е. coll, направляемой
РНК ВЖМТ при достаточно низкой концентрации ионов Mg2+ [1418].
Сходные результаты были получены и для других вирусов растений [830].
Репликация и распространение вирусов по растению
157
N-формилметионин включался в N-концевое положение синтезируемого
продукта. Высказывалось, однако, опасение, что в случае применения гете-
рологических РНК (в качестве матриц в бесклеточной системе) может иметь
место ошибочная инициация белкового синтеза. Поэтому синтезированный
продукт нуждается в более точной характеристике.
Как известно, для освобождения вновь синтезированной полипептид-
иой цепи из комплекса матричная РНК-пептвдил-тРНК требуется какой-то
фактор, который, вероятно, представляет собой белок с молекулярной
массой 40 000—50 000 [324]. Необходимо выявить возможную видовую спе-
цифичность таких факторов в различных группах организмов. Если такая
специфичность существует, то она может служить одной из причин недоста-
точной эффективности трансляции РНК вирусов растений в бесконечной
белоксиитезирующей системе из бактерий.
Было показано, что в присутствии ионов Mg2+ РНК ВЖМТ связывается
с рибосомами из Е. coli и что по большей части одна молекула РНК связы-
вается только с одной рибосомой [741]. Однако на основании экспериментов
с фрагментированной РНК было вычислено, что в РНК ВЖМТ имеется
четыре участка, способных взаимодействовать с рибосомами [428]. В даль-
нейшем при исследовании РНК-рибосомных комплексов в градиенте плот-
ности сахарозы выяснилось, что РНК ВЖМТ может связываться с не-
сколькими (четырьмя или более) рибосомами [227, 228, 1815, 1852]. Отме-
чалось также, что при продолжительной инкубации с рибосомами из Е. coli
наблюдается довольно быстрая деградация вирусной РНК. Возможность
неспецифичного связывания РНК ВЖМТ с рибосомами вследствие высо-
кого содержания ГЦ-пар в полииуклеотидиой цепи не была достаточно изу-
чена (фиг. 4).
Детали синтеза белка in vivo изучены у вирусов растений очень мало.
Методом определения образования гидроксаматов было обнаружено [747],
что ферменты, активирующие аминокислоты, находятся в основном в над-
осадочной жидкости, получаемой при фракционировании гомогенатов из
листьев табака (правда, заметное количество присутствует также в ядрах
и во фракции хлоропластов). Через три дня после заражения листьев ВТМ
в надосадочной жидкости было отмечено усиление активации аминокислот
па 50%. Исследовалось также включение аминокислот в белки из разных
фракций листьев табака в зависимости от времени, прошедшего после ино-
куляции ВТМ [748]. Митохондрии, выделенные из листьев табака, инфици-
рованных ВТМ, включали в белки больше аминокислот, чем митохондрии,
выделенные из здоровых листьев [1730]. В настоящее время эти результаты
трудно как-то связать с синтезом вирусных белков.
В листьях имеется два класса рибосом: цитоплазматические, с кон-
стантой седиментации 80 S, и рибосомы из хлоропластов — с константой
седиментации 68 S [378, 1114]. Возможная роль этих двух классов' рибосом
в синтезе белков фитопатогенных вирусов четко не установлена. На основа-
нии экспериментов с ВТМ в листьях табака было высказано предположе-
ние, что освобожденная от структурного белка РНК ВТМ может быть ассо-
циирована с 808-рибосомами [1821]. Для удаления ВТМ из фракции рибо-
сом (которая выделялась с помощью довольно растянутой во времени про-
цедуры седиментации) использовали антитела к ВТМ. Инфекционность мате-
риала во фракции рибосом исчезала после обработки панкреатической рибо-
нуклеазой в довольно высокой концентрации. Инфекционный материал
появлялся через 24—36 ч после заражения, и количество его увеличивалось
непосредственно перед моментом быстрого увеличения концентрации вируса.
Высказывались некоторые сомнения по поводу того, изучался ли в этих
экспериментах истинный комплекс «голой» РНК ВТМ с рибосомами, обра-
зовавшийся in vivo, или просто j примесь ВТМ во фракции рибосом,
158
Глава VII
депротеинизированного в процессе выделения. Было бы, вообще говоря,
удивительно, если бы «голая» инфекционная РНК могла оставаться интакт-
ной во время столь продолжительной процедуры, какая использовалась
автором для выделения рибосом [1821].
Место синтеза структурного белка вируса внутри клетки не удалось
до сих пор определить ни у одного из вирусов растений. Метод флуоресци-
рующих антител дал возможность наблюдать появление антигена ВТМ
в клетках листовых волосков томата через 6 ч после прямой инъекции вируса
в эти клетки [784]. Авторы сообщают, что новый антиген был ассоциирован
с ядром (хотя трудно представить себе, как можно отличить антиген, дейст-
вительно находящийся в ядре, от антигена, находящегося на поверхности
ядра или вблизи него, в цитоплазме). Со временем антиген распространялся
из ядра в окружающую цитоплазму. Иногда наблюдали специфическую
реакцию вблизи места инъекции вируса, но она исчезала через 1—3 ч.
Подобной реакции не наблюдалось, если для заражения использовали РНК
ВТМ. При инокуляции клеток вирусом, который предварительно инактиви-
ровали УФ-облучением, отмечалось временное появление антигена в ядре
или на его поверхности приблизительно через 6 ч после инокуляции. Опыты
по выявлению антигена ВТМ в листьях N. glutinosa показали, что первона-
чально антиген появлялся в цитоплазме — в виде мельчайших крупинок
флуоресцирующего материала — приблизительно через 18—24 ч после
заражения [1255]. Через несколько часов в некоторых клетках удавалось
обнаружить антиген в больших количествах; в это время он уже частично
или полностью окружал хлоропласты. Внутри ядер или хлоропластов анти-
ген обнаружен не был. При электронной микроскопии клеток, обработан-
ных антителами, меченными ферритином (фото 83), было найдено, что боль-
шая часть белка ВТМ и все вирусные палочкообразные частицы накапли-
ваются в цитоплазме и только небольшая часть вирусного антигена (но не
палочек) обнаруживается внутри ядер инфицированных клеток [1547].
С помощью меченных 1а51 антител к ВТМ было показано, что вирусный белок
появляется как в ядре, так и в цитоплазме через 6 ч после заражения листьев
табака вирусом [1040].
На основании этих довольно фрагментарных данных представляется
наиболее вероятным, что структурный белок таких вирусов, как ВТМ или
ВЖМТ, синтезируется главным образом в цитоплазме на 803-рибосомах;
однако для получения более определенных результатов требуются дальней-
шие эксперименты. Влияние вирусной инфекции на количество тРНК
и рибосом в инфицированной ткани обсуждается в гл. XI.
ДИНАМИКА ПОЯВЛЕНИЯ И НАКОПЛЕНИЯ ВИРУСА
И ВИРУСНЫХ КОМПОНЕНТОВ
Независимость процессов синтеза РНК и белка вируса
В листьях китайской капусты, обработанных 2-тиоурацилом, синтез
вирусного нуклеопротеида подавляется, тогда как образование пустых
белковых вирусных оболочек, напротив, заметно стимулируется [551].
Общее количество вирусного белка в оболочках иногда превышает коли-
чество белка в необработанной ткани [551]. 2-тиоурацил также каким-то
образом блокирует включение 32Р в двухцепочечную РНК ВЖМТ (гл. XIV).
Из этих результатов напрашивается вывод, что синтез структурного
белка вируса может происходить в отсутствие синтеза вирусной РНК, т. е.
что белок должен синтезироваться на РНК-матрице, которая в клетке отно-
сительно стабильна. Коммонер и его сотрудники [396, 399, 401] исследовали
включение 14С в РНК и белок палочек ВТМ, неодинаковых по длине, а
Репликация и распространение вирусов по растению 159
также в продукты деградации интактных палочек in vitro. Рассматривая
в теоретическом плайе полученные результаты, авторы пришли к выводу,
что вирусная РНК и белок в любом определенном участке вирусной палочки
синтезируются одновременно и что по мере нарастания полинуклеотидиой
цепи РНК белковые субъединицы достраивают этот участок. Однако те же
данные можно интерпретировать и по-другому. Хотя, вообще говоря, не
исключено, что при размножении вирусов со спиральной структурой РНК
одевается белком последовательно с одного конца цепи, мы сейчас распо-
лагаем вескими данными, позволяющими считать, что РНК и белок
синтезируются раздельно, а затем соединяются, образуя зрелую частицу
вируса (к этому вопросу мы еще вернемся в гл. VIII).
Двухцепочечная вирусная РНК
Если двухцепочечная форма вирусной РНК имеет отношение к репли-
кации вируса, то можно было бы, очевидно, ожидать, что в клетке она будет
появляться раньше, чем интактный вирус. Экспериментально, однако, это
еще не было показано. Возможно, что продемонстрировать это вообще
довольно трудно. С помощью 32Р удалось обнаружить двухцепочечную
форму РНК ВЖМТ в листьях китайской капусты через 3 дня после зара-
жения, тогда как серологические тесты не позволяли выявить присутствие
вируса вплоть до 5-го дня [1379]. Этот результат почти несомненно отражает
относительную чувствительность использованных методов. Применяя 32Р
для обнаружения не только двухцепочечной РНК, но ВЖМТ, мы сумели
выявить вирус на 2-й день после заражения, а двухцепочечную форму РНК
лишь на 3-й день. Судя по содержанию РНК в клетках, можно думать, что
очень небольшого количества двухцепочечной РНК достаточно для обра-
зования значительных (возможно, в 1000 раз больших) количеств вирусной
РНК и зрелых вирусных частиц. Задержка во времени между образованием
двухцепочечной РНК и первым появлением зрелого вируса в клетке, по
всей вероятности, невелика, не более нескольких минут. С другой стороны,
минимальное время, необходимое для того, чтобы выявить включение 32Р
в отдельные компоненты вируса, составляет 30—60 мин. Если для исследо-
вания используются ткани листа, то лишь небольшая часть клеток оказы-
вается инфицированной в начале периода включения 32Р; остальные клетки
заражаются в значительной мере асинхронно, так что это заражение растя-
гивается иногда на несколько дней. Таким образом, почти неизбежно пер-
вым моченым вирусным продуктом, обнаруживаемым после заражения,
будет свободная одноцепочечная вирусная РНК или полный вирус, а не
двухцепочечная вирусная РНК.
Накопление свободной вирусной РНК
Результаты работ ряда авторов наводят на мысль о том, что в первые
депь-два после заражения ВТМ накапливается некоторое количество сво-
бодной вирусной РНК. Так, было показано, что фенольные экстракты, полу-
ченные через 20—40 ч после заражения растений, обладали большей инфек-
ционностыо, чем можно было ожидать, исходя из того количества интакт-
ного вируса, которое в них присутствовало [492]. Отметим, однако, что при-
мененный в этой работе метод определения инфекционности вызывает неко-
торое сомнение.
Для получения экстрактов из листьев, инфицированных ВТМ, приме-
няли также среду с высоким значением pH [452], которая предохраняла
инфекционную вирусную РНК от деградации. Затем РНК отделяли от
интактного вируса центрифугированием в градиенте плотности сахарозы.
160
Глава VII
Фиг. 27. J Повышение и снижение
содержания чувствительного к рибо-
нуклеазе материала в зараженных
ВТМ листьях табака в течение 72 ч
после заражения [1475].
Экстракты из листьев, полученные на 2-й или 3-й день после заражения,
обнаруживали значительную инфекционность в зоне градиента, соответст-
вующей нуклеиновой кислоте; если же экстракты получали через 3 недели
после заражения, то инфекционность в этой зоне оказывалась очень низкой.
На основании ряда контрольных опытов было сделано заключение, что
инфекционность в зоне, соответствующей нуклеиновой кислоте, следует
приписать либо РНК, которая имелась в листе в свободном виде, либо
некой лабильной форме ВТМ, которую можно обнаружить лишь на очень
ранней стадии инфекции. Эти результаты были затем подтверждены с при-
менением несколько иного метода экстракции. При этом исследовалось также
влияние времени, прошедшего после заражения, на содержание материала,
чувствительного к рибонуклеазе (фиг. 27) [1475].
Количество такого материала быстро увеличивалось между 12 и 36 ч
(считая с момента заражения), а затем быстро падало, начиная с 48 ч, т. е.
в то время, когда скорость синтеза вируса заметно снижалась. Примерно
такой и должна быть картина, если материал, чувствительный к рибонук-
леазе, является предшественником вируса. Небольшое количество свобод-
ной РНК вируса было обнаружено с помощью электрофореза в сырых
экстрактах из листьев табака, зараженных Х-вирусом картофеля [1204].
Однако инфекционный материал в этих опытах имел разную электрофоре-
тическую подвижность и не был достаточно хорошо охарактеризован.
Эклипс, или латентный период
Многие авторы пытались проследить нарастание содержания вируса
во времени после заражения. При любой вирусной инфекции появлению
новообразованного вируса предшествует определенный латентный период,
или эклипс, как это можно проиллюстрировать на примере вируса некроза
табака (фиг. 28). Продолжительность латентного периода сильно варьи-
рует у разных вирусов и зависит также от условий эксперимента, в особен-
ности от концентрации инокулума, от температуры, при’’которой выращи-
ваются растения, и от "метода выявления вируса. Если для заражения
используется полный вирус, то иногда выявляется инфекционность, обус-
ловленная наличием остатков инокулума. Она снижается в первые несколь-
Репликация и распространение вирусов по растению
161
Фиг. 28. Относительная ппфокцшш-
пость экстрактов из листьев в пер-
вые 12 ч после инокуляции листьев
фасоли вирусом покрова табака [934].
(х—X) — интактный вирус в качество
инокулума; (®—в) — РНК вируса.
Фиг. 29. Относительная нифокцшшпостт, экст-
рактов из клеток пижпого эпидермиса, .зара-
женного РНК ВТМ (X), п из зараженных
листьев, с которых этот эпидермис был удален
(•) [571].
ко часов после заражения, до появления новообразованного вируса.
Эту инфекционность, определяемую остаточным ииокулумом, можно прак-
тически исключить, если использовать для заражения вместо полного
вируса вирусную РНК. Некоторое количество интактной РНК, оставшейся
в инокулуме, инактивируется во время мацерации образца (фиг. 28).
Новосиитезированный вирус был обнаружен через 12—14 ч после зара-
жения нижнего эпидермиса листьев N. glutinosa с помощью РНК ВТМ.
В этом опыте листья выдерживались при 20 °C и через каждые 2 ч отбира-
лись образцы полосок эпидермиса для определения инфекционности [461].
В инфицированных РНК ВТМ листьях табака, которые инкубировались
при температуре 27 °C, новообразованный вирус можно было обнаружить
в полосках эпидермиса через 7 ч после заражения, а в лежащем под ним
мезофилле — приблизительно на 4 ч позднее (в эксперименте, представлен-
ном на фиг. 29, вирус был обнаружен в мезофилле иа 4,26 ч позднее; стан-
дартное отклонение составило при этом ±0,44 ч).
При концентрациях РНК в инокулуме менее 0,04 мг/мл снижение
концентрации приводило к удлинению латентного периода. Однако при
значениях, превышающих этот уровень (в пределах от 0,038 до 4,74 мг/мл),
заметного сокращения латентного периода отмечено не было [571]. Таким
образом, минимальное время, требуемое для появления первых новосинте-
зированных вирусных частиц при 27 °C, можно считать равным приблизи-
тельно 7 ч. Более короткий латентный период, наблюдавшийся в наших
экспериментах (по сравнению с описанными выше [461]), обусловливался,
вероятно, тем, что мы выдерживали растения при более высокой темпера-
туре. Эти величины согласуются с данными, полученными для мелких РНК-
1 1-0893
162
Глава VII
содержащих вирусов животных (их выращивают при 37 °C). Сообщалось,
например, что первые зрелые частицы вируса полиомиелита появлялись
в клетках HeLa приблизительно через 3 ч после заражения [431].
С помощью электронной микроскопии на ультратонких срезах пали-
садных клеток листьев табака (зараженного при 26 °C) удалось обнаружить
частицы ВТМ через 15 ч после заражения [1213]. Даже в тех случаях, когда
мы имеем дело с частицами характерной формы (например, с палочками
ВТМ), эти частицы должны присутствовать в клетке в большом количестве,
для того чтобы их можно было с уверенностью идентифицировать па осно-
вании исследования одного или нескольких ультратонких срезов клетки.
(Для проверки всего содержимого средней клетки мезофилла потребовалось
бы примерно 1000 срезов.)
Распространение вируса из первично инфицированных клеток
Чтобы проследить за распространением вируса из первично инфици-
рованных клеток, с зараженных листьев N. sylvestris удаляли эпидермис
через различные промежутки времени после заражения и выявляли вирус
в лежащем под ним мезофилле с помощью другого растения-хозяина [1.8011.
Выло найдено, что при 24—30 °C вирус проникает в клетки мезофилла через
4 ч после заражения. Снятие эпидермиса с листьев растений коровьего
гороха, зараженных вирусом огуречной мозаики (при 28 °C), пе предотвра-
щало последующего появления некрозов в лежащем под ним мезофилле,
если эта процедура выполнялась через 2 ч после заражения. По-видимому,
к этому времени инфекционный материал перемещался из эпидермиса
в мезофилл. Время, необходимое для инфицирования мезофилла, увеличи-
валось по мере снижения температуры [1892].
С помощью аналогичного метода было найдено, что ВТМ перемещался
из эпидермиса листьев N. glutinosa за 10 ч (при 20 °C) [461]. Используя
диски из листьев табака со снятым эпидермисом, предварительно проинку-
бированные в течение 7 дней (для того чтобы любой находящийся в них
инфекционный материал успел размножиться), мы нашли, что при 27 "С
инфекционный материал ВТМ перемещался из эпидермиса в мезофилл через
4 ч после инокуляции, т. е. за 3 ч до того, как новообразованный вирус
можно было бы обнаружить в эпидермисе.
По-видимому, в настоящее время пет способа определить, является ли
материал, инфицирующий мезофилл через 4 ч, инокулумом, который прошел
через эпидермис, или же это РНК или вирус, вновь образованные в клетках
эпидермиса. Вполне вероятно, что эту роль выполняет новосиитезировап-
ная вирусная РНК. Независимо от происхождения первичного инфициру-
ющего материала, проникающего в мезофилл, время между заражением
и появлением первого выявляемого вируса оставалось в наших опытах приб-
лизительно одинаковым для клеток эпидермиса и мезофилла (7 ч).
Зрелый вирус
При оценке типа кривой роста вируса нужно иметь в виду, что различ-
ное и не известное нам количество вируса может оставаться связанным
с нерастворимым остатком в анализируемых экстрактах. Этот фактор, веро-
ятно, не слишком важен, если вирус присутствует в цитоплазме в высокой
концентрации, но он может иметь серьезное значение для тех вирусов, кон-
центрация которых невелика, а также для вирусов, связанных с какими-ли-
бо клеточными органеллами или клеточными включениями.
На самых ранних этапах инфекции, после того как вирус уже можно
обнаружить, количество его нарастает по экспоненте. Мы не знаем, отра^
Репликация и распространение вирусов по растению
163
Фиг. 30. Время появления и скорость
увеличения концентрации нуклеопро-
теида ВЖМТ в экстрактах из заражен-
ных и системно инфицированных листьев
китайской капусты [551].
жает ли это действительное размножение вируса в отдельных клетках или
только распространение инфекции па новые клетки (а возможно, и то и дру-
гое). На более поздних этапах скорость увеличения количества вируса пос-
тепенно снижается. Между этими двумя стадиями может существовать опре-
деленный период, когда скорость размножения вируса близка к линейной.
С помощью аналитического ультрацептрифугирования было показано,
что ВЖМТ обнаруживается первоначально в зараженных листьях китай-
ской капусты через 6—8 дней после заражения, а в более молодых, системно
инфицированных листьях — через 8—10 дней [551]. Фиг. 30 демонстрирует
ход размножения вируса для нескольких образцов растительного мате-
риала.
Статистический анализ этих данных показывает, что все серии точек
ложатся иа прямую, однако наклоны разных прямых сильно варьируют.
Эти наклоны соответствуют скорости образования нуклеопротеида, кото-
рая в данном опыте колебалась в пределах от 0,05 до 0,25 мг на 1 г сырой
массы листовой ткани в день. Колебания, вероятно, обусловливались раз-
личиями в способности отдельных групп образцов растительного материала
поддерживать размножение вируса. Лилейный рост количества вируса,
показанный на фиг. 30, согласуется с предположением о том, что скорость
образования вируса в течение определенного периода не зависит от коли-
чества уже сформировавшегося интактного вируса. Самая высокая ско-
рость прироста вируса на фиг. 30 эквивалентна образованию приблизи-
тельно 5000 вирусных частиц на клетку за 1 ч (0,25 мг вируса па 1 г сырой
массы в день, если принять, что 1 мг сырой массы ткани соответствует
6,8-104 клеток, а 1 мкг ВЖМТ содержит 4-1010 частиц).
На основании данных о размножении ВТМ в листьях табака и ВНТ
в листьях фасоли было вычислено, что выход этих вирусов составляет 10°—
10“ частиц на клетку [714]. Прямой подсчет частиц на электронных микро-
li*
164
Глава VII
Фиг. 31. Относительная ппфокционность экстрактов листьев табака, зараженных вирусом
мозаики люцерны [1444].
1 — и расчете на 1 мл сока; II — в расчете на 1 растение.
фотографиях тонких срезов крупной клетки листового волоска показал,
что в клетке объемом 250 000 мкм3 присутствует 6 -107 вирусных частиц
[1277]. Как видно из табл. 3, концентрация большинства вирусов в клетках
растений-хозяев бывает более низкой.
При стандартных условиях выращивания растений (освещение, темпе-
ратура и питание) количество накапливающегося вируса, как правило,
довольно постоянно. Факторы, контролирующие верхний предел размно-
жения вируса, пока совершенно неизвестны. В условиях, обеспечивающих
максимальное размножение вируса, вовсе не обязательно происходит подав-
ление роста растения. В отношении некоторых вирусов высказывалось
предположение, что равновесие достигается в том случае, когда сбаланси-
рованы процессы синтеза и процессы распада вируса. Большинство частиц
ВТМ, образующихся при размножении вируса в клетке, морфологически
стабильны и инертны. Высокая концентрация ВТМ, однажды установив-
шаяся в листе, сохраняется затем при обычных условиях на протяжении
всей жизни листа (см., например, работу Гудчайлда и др. [659]). Однако у
некоторых других, менее стабильных вирусов концентрация обычно дости-
гает максимума через 7—14 дней после заражения и затем снижается. На
фиг. 31 это явление иллюстрируется иа примере вируса мозаики люцерны
[1444].
Потери вируса мозаики люцерны, определяемые по инфекционности
экстрактов, были связаны с уменьшением количества экстрагируемого
вируса. При этом количество вируса снижалось менее резко, чем инфекци-
онность. Аналогичное уменьшение удельной инфекционности было най-
дено и для вируса хлоротической крапчатости коровьего гороха [1026].
В большей части исследований, касающихся размножения, вирусов, исполь-
зуются зараженные листья, так как это дает возможность контролировать
время заражения. Обычно для этой цели служат листья, достигшие. зре-
лости, т. е. практически уже не растущие. Несколько ийаче обстоит дело,
Когда лист инфицируется системно на очень ранней стадии. В растениях
китайской капусты, хронически инфицированных ВЖМТ, в листе длиной
4 мм (содержащем приблизительно 5 -10Б клеток) концентрация вируса сос-
Репликация и распространение вирусов по растению 165
тавляла примерно половицу найденной в зрелом листе (содержащем около
107 клеток). Уровень репликации вируса соответствует уровню клеточного
деления и скорости роста листовой поверхности (Фаэд и Мэтыоз, неопубли-
кованные данные).
ЛОКАЛИЗАЦИЯ СБОРКИ ВИРУСА ВНУТРИ КЛЕТКИ
При попытках определить место сборки вируса в клетке использова-
лись два основных подхода: 1) фракционирование клеточных компонентов
из тканевых экстрактов с последующим выявлением вируса в различных
фракциях и 2) световая и электронная микроскопия.
Первый из этих подходов наталкивается на ряд трудностей.
1. Хлоропласты — хрупкие органеллы, и какая-то их часть всегда
разрушается при фракционировании; поэтому их фрагменты (более или
менее крупные) загрязняют другие фракции.
2. Такие вирусы, как ВТМ и ВЖМТ?, т. е. вирусы, присутствующие
в клетке в высокой концентрации, почти наверняка должны распределяться
по всем фракциям, хотя бы в небольшом количестве.
3. Вирусоспецифичные, связанные с мембранами структуры, если они
существуют, могут оказаться очень лабильными и неспособными выдержать
обработку, применяемую для разрушения клето!? и фракционирования кле-
точного содержимого.
4. Если вирусоспецифичные, связанные с мембранами структуры доста-
точно стабильны, то при фракционировании они могут оказаться связан-
ными с какой-либо клеточной органеллой (или с несколькими органеллами).
5. Вирусная инфекция может изменять поведение клеточных органелл
при фракционировании (примером служит влияние ВЖМТ иа хлоропла-
сты).
6. Если ткани исследуются вскоре после заражения, то при этом неиз-
бежно смешивается содержимое клеток, в которых развитие инфекционного
процесса проходит разные стадии.
На основании экспериментов по фракционированию высказывалось
мнение, что местом сборки ВТМ служат хлоропласты и ядра. Однако скорее
всего причиной этого вывода явилось загрязнение выделенных клеточных
органелл небольшими количествами вируса. Тот факт, что ВТМ размно-
жается очень эффективно в клетках эпидермиса (содержащих мелкие хлоро-
пласты и притом в небольшом количестве), позволяет думать, что эти орга-
неллы не являются обязательными для сборки вируса. Более тщательными;
исследованиями [343] было показано, что вирус появляется в изолированной
фракции хлоропластов лишь через 40 ч после того, как он может быть выяв-
лен в иефракционированной листовой ткани.
Различные авторы, используя технику ультратонких срезов, исследо-
вали появление ВТМ в инфицированных клетках с помощью электронной
микроскопии. Общий вывод из таких наблюдений сводится к тому, что
сборка частиц ВТМ происходит, вероятно, в цитоплазме. Через 48 ч после
инокуляции, т. е. до того, как иовосиитезированный вирус может быть
выявлен в ткани с помощью теста иа инфекционность, в цитоплазме клеток
листа томата были обнаружены характерные палочкообразные частицы ВТМ
[1545]. В цитоплазме клеток палисадной паренхимы табака частицы ВТМ
обнаруживались через 15 ч после инокуляции (т. е. примерно через 11 ч
после истинного заражения клеток) [1213]. В то же самое время в одном
или нескольких участках цитоплазмы можно было видеть вытянутые
слегка изогнутые нити длиной 1 мкм. На срезах в них удавалось различить
слабо окрашенную сердцевину и более плотную периферическую часть.
166
Глава VII
Диаметр нитей составлял около 25 им. Нередко эти нити объединялись
в группы по две или по три. Подобные трубочки удавалось наблюдать
и в клетках других растений-хозяев (фото 27).
Характер окрашивания этих трубочек наводит иа мысль, что они
содержат липиды или нуклеиновые кислоты [1216]. Принимая во внимание
тот факт, что они появляются па очень ранних стадиях инфекции, можно
предположить, что они каким-то образом связаны с синтезом или сборкой
вируса. Однако какими-либо определенными данными об их роли мы пока
еще не располагаем. Подобные структуры наблюдали и другие авторы в
клетках, инфицированных ВТМ. Было высказано предположение, что эти
трубочки являются прямыми предшественниками палочек ВТМ; полагают,
что палочки могли образовываться из них в результате процессов уплотнения
и сжатия [1545]. В качестве главного возражения против такого вывода вы-
двигают в настоящее время различия в характере окрашивания этих трубочек
и частиц ВТМ [1216], а также тот факт, что подобная стадия отсутствует при
реконструкции ВТМ in vitro. Не удавалось наблюдать палочек ВТМ па
тонких срезах ядер или хлоропластов в инфицированных клетках [1213,
1545]. Однако хлоропласты в клетках больных растений могут образовы-
вать впячивапия или вакуолизироваться, и в таких областях бывают видны
палочки ВТМ. Возможно, именно существованием таких впячивапий сле-
дует объяснить наличие небольших количеств ВТМ в препаратах изолиро-
ванных хлоропластов. Эсау и Кроншоу [496] обнаружили, правда, неболь-
шие группы вирусных палочек, не связанные с мембраной, также и в самих
хлоропластах табака. Локализация ВТМ в клетке может быть различной
у разных штаммов вируса. Большая часть описанных выше работ выпол-
нена па типичном штамме ВТМ. Однако для штамма Un, например, были
получены четкие доказательства присутствия вируса в хлоропластах [1546].
Некоторые имеющиеся в литературе противоречия могут быть обусловлены
различиями в поведении разных штаммов вируса.
Появление и распределение антигена ВТМ в клетках исследовали под
электронным микроскопом, используя для этой цели антитела, связанные
с ферритином [1547]. Прогрессирующее накопление антигена в области цито-
плазмы было обнаружено между 2-м и 4-м днем после заражения. Большая
часть гранул ферритина в цитоплазме оказалась прикрепленной к интакт-
ным вирусным палочкам (фото 83), ио в некоторых областях было отмечено
сильное скопление антител в отсутствие палочек.
Антиген вируса табачной мозаики был найден также в ядрах из клеток,
взятых на 4-й, 7-й и 14-й день после заражения. Количество антигена
в ядрах было невелико, и антитела не были связаны со зрелыми вирусными
частицами. Не обнаруживалось также и скопления антител в хлоропластах.
По мере развития инфекции палочкообразные частицы ВТМ, первоначально
рассеянные и беспорядочно ориентированные в цитоплазме, начинают выст-
раиваться в упорядоченные структуры, образуя внутриклеточные включе-
ния (гл. IX). В делящихся клетках молодых листьев Nicotlana tabacum
ядерная оболочка во время митоза разрушается. В клетках, инфицирован-
ных ВТМ, отдельные палочкообразные вирусные частицы видны среди хро-
мосом, однако во время формирования ядериой оболочки они обычно уда-
ляются из дочерних ядер [498].
Предварительное изучение распределения антигена ВТМ внутри кле-
ток было проведено с помощью специфических антител, меченных Ш1 [1038,
1039]. Специфическое связывание антител наблюдалось внутри (или на
поверхности) ядра через 6 ч после заражения. В это же время было обнару-
жено специфическое связывание антител и в цитоплазме. Этот метод, при-
годный как для световой, так и для электронной микроскопии, вероятно,
найдет широкое применение в будущем. Таким образом, на основании имею-
Репликация и распространение вирусов по растению
167
щихся сейчас сведений можно предположить, что палочкообразные частицы
ВТМ собираются в цитоплазме, будучи как-то связаны с более крупными
трубкообразными структурами неизвестного состава и функции.
С помощью микроскопических исследований нелегко получить четкие
данные даже для таких вирусов, как ВТМ, который морфологически отли-
чается от большей части структур, видимых в нормальной клетке. Проблема
значительно усложняется в случае небольших сферических вирусов, нап-
ример ВЖМТ. Па ультратоиких срезах in vivo их можно узнать только
в том случае, если они кристаллизуются, образуя регулярные структуры.
Одиночные рассеянные вирусные частицы обычно невозможно отличить
в цитоплазме от рибосом.
Недавно был предложен способ, который может помочь идентифициро-
вать вирусные частицы в клетках, инфицированных мелкими сферическими
вирусами 11218]. Было найдено, что вирусоподобные частицы в растениях
Chenopodium, обычно рассеянные в цитоплазме, образуют легко идентифи-
цируемые кристаллические структуры, если перед фиксацией дать листьям
слегка привянуть. Это наблюдение подкрепляет предположение о том, что
образование кристаллических структур в инфицированных клетках зави-
сит от концентрации вируса. Пользуясь такой методикой, мы не наблюдали
больших количеств ВЖМТ-подобпых частиц внутри ядер и хлоропластов.
Однако везикулярные структуры или виячивапия мембраны хлоропластов
могут содержать ВЖМТ-подобные частицы. В клетках увядших листьев
много таких частиц обнаруживалось также в пространствах между сгруп-
пированными хлоропластами (эти пространства имеют примерно сфериче-
скую форму; фото 58) (Усияма и Мэтьюз, неопубликованные данные). Мате-
риал, заполняющий пространства между хлоропластами, включал большое
количество меченого уридина [1036]. Эти эксперименты позволили нам
условно сделать заключение, что местом сборки ВЖМТ в клетке является
цитоплазма. Области цитоплазмы между сгруппированными хлоропластами,
возможно, играют какую-то специфическую роль в качестве места синтеза
и сборки ВЖМТ; однако этот вывод требует подтверждения.
Совершенствование методов подготовки образцов для исследования,
возможно, позволит отличать сферические вирусы от 808-рибосом: [780].
Описан случай, когда,, одиночные частицы вируса мозаики дикого
огурца были окружены более крупными мембранными структурами [800].
Неизвестно, случайная ли это упаковка субъединиц вирусного белка или
такие структуры имеют какое-то функциональное значение для сборки
вирусных частиц.
Вирус броизовости томатов благодаря крупным размерам: и наличию
липидной мембраны легко идентифицируется на тонких срезах. Практи-
чески все частицы вируса, видимые в цитоплазме, заключены внутри: неболь-
ших пузырьков, окруженных мембраной (фото 19). Весьма вероятно, что
сборка этого вируса происходит в цитоплазме; высказывалось предполо-
жение, что вирусные частицы созревают, т. е. приобретают свою липидную
мембрану, в результате отпочковывания в пузырьки [1213].
Другой крупный вирус, имеющий мембрану, а именно вирус некроти-
ческого пожелтения салата-латука, также может быть легко идентифици-
рован на тонких срезах в электронном микроскопе. Было высказано пред-
положение, что сборка частиц этого вируса происходит в цитоплазме внутри
окруженных мембраной включений [352]. Эти внутриклеточные включения
имеют двойную мембрану. Мембрана, окружающая вирусные частицы,
может вести свое происхождение от внутренней мембраны внутриклеточных
включений. Аналогичное предположение высказывалось и в отношении
вируса желтой карликовости картофеля [ИЗО]. Полагают, что этот вирус
образуется во включениях, связанных с внутренними и наружными ламел-
168
Глава VII
лами ядерной оболочки, и что внутренняя ламелла включается во внешнюю
оболочку вируса (фото 28).
В цитоплазме растительных клеток и клеток насекомых, инфицирован-
ных вирусом раневых опухолей, были обнаружены скопления каких-то
агрегатов с повышенной электронной плотностью, которые авторы назвали
вироплазмами [1567]. Эти агрегаты не были окружены мембраной.Харак-
терные вирусные частицы обнаруживались сначала вблизи края вироплаз-
мы, а затем внутри нее. В ядрах ни таких областей, ни вирусных частиц
обнаружено не было.
Электронно-микроскопические исследования других вирусов растений
позволяют предположить, что местом их сборки может быть ядро. Так,
было обнаружено, что на ранних стадиях после заражения вирусом дефор-
мирующей мозаики гороха (небольшой икосаэдрический вирус) вирусные
частицы накапливаются в большом количестве в ядрах и только позднее
появляются в цитоплазме [1566]. Внутриядерные кристаллы, или аморфные
включения, были также найдены на ранних стадиях инфекции при исследо-
вании вируса гравировки табака [1165], вируса желтой мозаики фасоли
[1241] и вируса курчавости листьев хлопчатника [1793]. Длинные палочко-
образные вирусные частицы, заражающие растения Lantana horrida (Н. В. К.),
накапливались одновременно как в ядре, так и в цитоплазме зараженных
клеток [35].
Итак, сборка большинства вирусов, изученных более или менее детально,
происходит главным образом или целиком либо в цитоплазме, либо в ядре.
Нет убедительных данных, подтверждающих участие хлоропластов или
митохондрий в сборке вирусов, хотя и было продемонстрировано сущест-
вование постоянного контакта между митохондриями и длинными палоч-
ками одного из изолятов вируса погремковости табака (фото 52).
ДВИЖЕНИЕ ВИРУСОВ ПО РАСТЕНИЮ
Существуют два типа перемещения вирусов в растениях: медленное
распространение от клетки к клетке и относительно быстрое перемещение
на большие расстояния по проводящим тканям.
Движение от клетки к клетке
Скорость движения от клетки к клетке измерялась несколькими спо-
собами. Радиус местных некрозов, вызываемых ВТМ у N. glutinosa, уъет-
чивается линейно в зависимости от времени [1392]. Для каждого из трех
изученных штаммов вируса характерна определенная скорость этого уве-
личения (в пределах от 1 до 6 мкм в час; фиг. 32).
Рассчитано, что скорость гибели клеток по краям этих постепенно рас-
ширяющихся некрозов равна 1 за каждые 4 ч для штамма Ut и 1 за каждые
5 ч для штамма ГД- Показано [1801], что ВТМ перемещается из верхнего
эпидермиса в нижний со скоростью около 8 мкм/ч [1801], что хорошо согла-
суется с приведенными выше данными о латеральном распространении.
Скорость распространения от клетки к клетке может значительно варьи-
ровать в зависимости от типа клеток и от направления, в котором вирус
перемещается по листу.
Очень трудно установить, на какое расстояние может перемещаться
вирус из клетки, в которой он образовался, через соседние клетки парен-
химы, не размножаясь в них. Несомненно, имеется достаточно тесная связь
между скоростью размножения вируса и скоростью его распространения
от клетки к клетке. Более или менее одинаковая последовательность цито-
Репликация и распространение вирусов по растению
169
Фиг. 32. Скорость латерального рас-
пространения местных некрозов, выз-
ванных тремя штаммами ВТМ [1392].
Z-Uf ZZ-U2; ZZZ-US.
Время после заражения, дна
логических явлений, наблюдаемых в пограничной зоне вызванного ВТМ
распространяющегося местного некроза, позволяет предположить, что
в большинстве клеток вирус обосновывается и начинает размножаться еще
до того, как начнется его перемещение в другую клетку. Крутизна гради-
ента между полностью инфицированными клетками и клетками, еще не
инфицированными, зависит от многих факторов, способных повлиять па
скорость размножения и перемещения вируса.
Обычно считается, что распространение от клетки к клетке происходит
по плазмодесмам; диаметр плазмодесм, как известно, довольно сильно варьи-
рует. Например, в молодых листьях табака он колеблется от 20 до 200 им
11544]. Такие размеры, очевидно, вполне достаточны, чтобы обеспечить
прохождение большей части вирусов. Наиболее прямые доказательства
перемещения вирусов по плазмодесмам получены при помощи электронной
микроскопии [500]. В плазмодесмах Beta vulgaris удалось обнаружить при-
сутствие характерных (длинных и изогнутых) палочек вируса желтухи са-
харной свеклы (фото 29).
Вирусные частицы были обнаружены в плазмодесмах, соединяющих
соседние клетки паренхимы, и в плазмодесмах, соединяющих клетки парен-
химы с ситовидными элементами листовых жилок. Показано, что частицы
изометрических вирусов также иногда присутствуют в плазмодесмах [447,
981]. Вирусная инфекция может привести к изменению тонкой структуры
плазмодесм [981]. В кончиках корней фасоли, зараженных вирусом кольце-
вой пятнистости табака, движение вирусных частиц по плазмодесмам каким-
то образом связано с трубочками, проходящими через цитоплазму [436].
Недавние исследования, посвященные распределению плазмодесм,
показывают, что число их на единицу площади в вертикальных стенках
клеток мезофилла обычно меньше, чем в стейках, расположенных более
или менее параллельно поверхности листа. Кроме того, клетки мезофилла
часто соединяются в цепочки, оканчивающиеся у какой-нибудь мелкой
жилки. Очевидно,’вирусы могут распространяться по таким путям быстрее,
чем по другим направлениям в мезофилле. Возможно, именно существова-
170
Глава VII
нием таких связей между клетками объясняется наблюдение Бэннета [160],
сообщившего, что, судя по цитологическим данным, вирус желтухи сахар-
ной свеклы в растениях Chenopodium capitatum распространяется в глубину
быстрее, чем в стороны.
Способ передвижения инфекционного материала от клетки к клетке
неизвестен, по так как сами вирусы не обладают способностью к перемеще-
нию, то, вероятно, важную роль играет в этом деле ток цитоплазмы (а может
быть, в какой-то мере и диффузия). Форма, в которой вирус передвигается,
также неизвестна. Поскольку как интактный вирус, так и свободная РНК
могут заражать здоровые клетки, в перемещении инфекции, вероятно,
способны участвовать обе эти формы. Третьим кандидатом на ту же роль
является минус-цепь вирусной РНК или какая-то структура, в состав кото-
рой она входит. До сих пор не было показано, что двухцепочечная РНК
вирусов растений в изолированном виде обладает инфекционностью, однако
не исключено, что она инфекционка в том виде, в каком присутствует в клетке.
У дефектных мутантных штаммов некоторых вирусов (например, ВТМ;
гл. XIII) полноценных вирусных частиц не образуется. Вместо этого в клет-
ках синтезируется инфекционная вирусная РНК и дефектный капсидный
белок. У таких штаммов перемещение от клетки к клетке, вероятно, проис-
ходит в форме «голой» РНК. Не наблюдается образования полноценных
вирусных частиц также и в клетках, зараженных одними только крупными
частицами вируса погремковости табака (гл. VIII). Следовательно, и в этом
случае от клетки к клетке должна передаваться «голая» РНК.
Перемещение на большие расстояния
Поскольку болезни растений, важные с экономической точки зрения,
обычно связаны с системной инфекцией, наибольшее внимание принято
уделять тем вирусам, которые способны перемещаться из места внедрения
и поражать различные части растения. Весьма немногие вирусы ограничи-
ваются проникновением только в листовую паренхиму. Это те вирусы, кото-
рые распространяются путем медленного перемещения от клетки к клетке
(вероятно, по плазмодесмам). Возможно, таким путем перемещаются упомя-
нутые выше дефектные вирусы, существующие в форме «голой» РНК. Однако
большинство вирусов обладает способностью довольно быстро передвигаться
по проводящим тканям.
Самуэль [1481] использовал иод-крахмальную пробу, чтобы показать,
как желтый штамм ВТМ сначала размножается локально, па небольшом:
участке вблизи места инокуляции, а затем перемещается по средней жилке
листа в стебель и вызывает системную инфекцию.
Возможность быстрого перемещения вирусов па большие расстояния
была впервые продемонстрирована классическими экспериментами Самуэля
[1482] с ВТМ на томатах. Самуэль заражал один верхушечный листочек и затем
следил за распространением вируса. С этой целью он через различные про-
межутки времени разрезал зараженное растение на части, инкубировал эти
кусочки ткани (чтобы дать возможность размножиться любому минималь-
ному количеству присутствующего в них вируса) и затем выявлял наличие
вируса с помощью теста па инфекционность. Фиг. 33 демонстрирует путь
распространения вируса в растении томата средней величины.
Вирус сначала перемещался в направлении к корням, а затем — к моло-
дым листьям. Листья среднего и более старшего возраста инфицировались
позднее. В очень молодых растениях все листья инфицировались вскоре
после заражения молодых листочков. В крупных растениях более старые
листья оставались незаряженными даже через несколько месяцев. Данные
о возможности продвижения таких вирусов, как ВТМ, на большие расстоя-
Репликация и распространение вирусов по растеншо
171
Здия
Фиг. 33. Распрострашшие ВТМ по относительно молодому растопню томата (указано
число дней, прошедших с момента заражения) (1482].
Ииоиулироваппый листочек заштрихован, а системно зараженные части растения показаны черным.
пия во флоэме получены в экспериментах нескольких типов. Во-первых, это
следует из опытов, продемонстрировавших влияние тока метаболитов
в растении на распространение вирусов [155]. Во-вторых, это доказывается
экспериментами, в которых часть стебля была убита или окольцована. Так,
было показано [317], что ВТМ не проходит через участки стебля, убитые
паром. Бэпнет [155] установил, что окольцовывание стеблей табака для
образования разрывов в ткани флоэмы задерживало, но не предотвращало
распространения ВТМ. Вероятно, медленное распространение через места
разрывов достигалось благодаря размножению вируса и передвижению
от клетки к клетке. В-третьих, было прямо показано присутствие скоплений
частиц вируса желтухи сахарной свеклы в ситовидных элементах Beta
vulgaris и в отверстиях ситовидных пластинок (фото 29).
Частицы ВТМ были также обнаружены в элементах флоэмы табака
[496]. Клюге [1010] нашел, что флоэмный сок растений огурца, зараженных
палочкообразным вирусом, был инфекционен и содержал вирусные частицы,
причем эта инфекционность оказалась устойчивой к рибонуклеазе. Хотя
эти наблюдения и не позволяют дифференцировать вирус, проникший во флоэ-
172
Глава VII
му из клеток паренхимы, и вирус, синтезированный in situ, они тем не менее
служат веским доводом в пользу того, что этот вирус может перемещаться
по флоэме.
Если вирус проник во флоэму, то продвижение его по растению оказы-
вается иногда очень быстрым. Скорость перемещения ВТМ достигает, как
сообщалось [157], 1,5 см/ч. По некоторым сообщениям [325], ВТМиХ-ви-
рус картофеля перемещаются в стеблях табака со скоростью 8 см/ч. Вирус
южной мозаики фасоли движется по флоэмным волокнам фасоли сорта Пинто
в 10—100 раз быстрее, чем при перемещении от клетки к клетке по паренхиме
[1935]. Уорли указал, что высокие скорости передвижения вируса по флоэме
могут быть обусловлены строгой направленностью тока протоплазмы в сито-
видных трубках (в клетках паренхимы движение протоплазмы носит доволь-
но беспорядочный характер). Вирус желтой карликовости ячменя перво-
начально локализуется во флоэме [1495]; однако при введении вируса в расте-
ние тлей-переносчиком локальные очаги размножения вируса (возможно,
во флоэмной паренхиме) могут возникать до того, как начнется его пере-
мещение [636].
Вирус курчавости верхушек сахарной свеклы, переносимый цикадками
и содержащийся только во флоэме, может перемещаться на большие расстоя-
ния (без первичной задержки) со скоростью, достигающей 2,5 см/мин [514].
Некоторые вирусы, обычно обнаруживаемые в других тканях, при опреде-
ленных условиях перемещаются по ксилеме. Так, было показано [1504,
1505], что вирус южной мозаики фасоли, введенный путем прививки или
инъекции в стебель, способен перемещаться как вверх, так и вниз через
участки стебля фасоли сорта Пинто, убитые паром. Инъекция вируса непо-
средственно в убитые участки стебля приводила к возникновению инфекции
на некотором расстоянии от этого места; отсюда следует, что локального
размножения для передвижения этого вируса не требуется.
Характерные частицы вируса некротического пожелтения салата-латука
обнаруживались в молодых клетках ксилемы листовых жилок, но не во
флоэме [350]. Инфекционный вирус можно было также выделить из сока,
содержащегося в ксилеме стебля. Однако этот вирус может присутствовать
не только в ксилеме; частицы его обнаруживались также в мезофилле,
в клетках эпидермиса и в листовых волосках.
Перемещение на большие расстояния, вероятно, не зависит от градиента
концентрации вируса иа пути перемещения. Скорее это быстрый случайный
перенос инфекционного материала. На ранних стадиях системного зараже-
ния вирус, очевидно, может проникать через восприимчивые к инфекции
ткани, не вызывая в них инфекции (см., например, [325]).
Системное заражение листа (в результате перемещения вируса на боль-
шие расстояния) может приводить к гораздо более равномерному распределе-
нию этого вируса в клетках мезофилла, чем заражение, возникающее вслед-
ствие механической инокуляции. С помощью флуоресцирующих антител,
позволявших определять расположение антигена вируса южной мозаики
фасоли в листьях фасоли сорта Блэк Валентайн, удалось наблюдать про-
грессирующее заражение от клетки к клетке в зараженном первичном
листе [1936]. В супротивном первичном листе, однако, перемещения от клетки
к клетке не происходило. Антиген обнаруживался одновременно во всех
клетках мезофилла примерно через 5—6 дней после заражения. В клетках
эпидермиса антиген появлялся приблизительно на день позже, чем в клетках
мезофилла. Эти результаты позволяют предположить, по крайней мере для
данной системы вирус — хозяин, что большинство клеток в системно инфи-
цированном листе может быть заражено вирусом, переместившимся из дру-
гих участков растения (а не в результате размножения нескольких внедрив-
шихся вирусных частиц).
Репликация и распространение вирусов по растению 173
Форма, в которой вирус быстро переносится иа большие расстояния
в интактном растении, достоверно не установлена. Мы пытались ответить
па этот вопрос применительно к ВЖМТ, помещая черешки отделенных
листьев китайской капусты в растворы с меченным: 32Р ВЖМТ или с 32Р-РНК
этого вируса. При условии, что растворы не были слишком концентрирован-
ными, значительные количества вируса или вирусной РНК поглощались
листьями. Последующего увеличения количества вируса не наблюдалось,
хотя в аналогичных условиях механическая инокуляция листьев приводила
к образованию больших количеств вируса. Значительную часть (около
60%) меченого ВЖМТ можно было вновь выделить из листьев в неповреж-
денном состоянии. По-видимому, в этих опытах вирус или его РНК пере-
мещались по ксилеме, а не по флоэме (которая является, вероятно, естествен-
ным путем распространения вируса па большие расстояния в интактном
растении). Опыты позволяют предположить, что интактный ВЖМТ не может
выйти из сосудов ксилемы для заражения окружающих клеток листа. Пред-
принимались попытки проследить при помощи радиоавтографии распределе-
ние меченного 14С ВТМ в листьях табака после инокуляции полоски ткани,
пересекающей середину листа [273]. Выяснилось, что повреждение верхушки
или основания листа влияло на направление распространения метки. Эти
результаты представляли бы большую ценность, если бы автору удалось
определить, какая доля измеренной радиоактивности принадлежала интакт-
ному вирусу.
Итак, существует два типа перемещения вирусов: 1) относительно
медленное распространение от клетки к клетке; в этом случае скорость рас-
пространения тесно связана с размножением вируса, и 2) быстрое распростра-
нение на большие расстояния по проводящим тканям — флоэме или ксилеме
(или же по той и другой); движение по флоэме следует считать более распро-
страненным. Перемещение на большие расстояния не зависит от размноже-
ния в проводящих ткапях. Способность вируса вызывать системную инфек-
цию у данного хозяина определяется, вероятно, тем, насколько легко инфек-
ционный материал проникает в проводящие ткани, а также выходит из них.
Клеточные факторы, от которых зависит возможность или невозможность
проникновения вируса в проводящую ткапь и выхода из ткани, нс установ-
лены. Не установлена также и форма (или формы), в которой инфекционный
материал перемещается из клетки в клетку или же па большие расстояния
в интактном растении. Присутствие интактных частиц некоторых вирусов
в элементах флоэмы наводит па мысль о том, что по крайней мере эти вирусы
могут перемещаться по растению в такой форме.
ОКОНЧАТЕЛЬНОЕ РАСПРЕДЕЛЕНИЕ ВИРУСА
В РАСТЕНИИ
Считается, что вирусы, вызывающие системную инфекцию, распреде-
ляются по растению достаточно равномерно. Однако это вряд ли соответ-
ствует действительности. Имеется ряд факторов, которые обычно обуслов-
ливают очень неравномерное распределение.
Ограниченное распространение инфекции
При многих комбинациях вирус — хозяин вирус проникает лишь
в небольшую группу клеток вблизи места заражения и размножается только
в них. Считается, что в тех случаях, когда инфекция приводит к быст-
рой некротизации и гибели клеток, дальнейшее распространение вируса
174
Глава VII
ограничивается, так как из мертвых клеток вирус далее перемещаться
не может.
Известны, однако, многие примеры возникновения ограниченной, местной
инфекции без гибели клеток. Ограничение распространения инфекции может
быть сложным явлением, зависящим от развития устойчивости к вирусу
в окружающей ткани (гл. XII).
Вирус, обычно вызывающий при механической инокуляции только
местные некрозы, может иногда вызывать системную инфекцию, если зараже-
ние производится прививкой. В качестве примера укажем вирус южной
мозаики фасоли. Этот вирус при механической инокуляции вызывает в расте-
ниях фасоли сорта Пинто только местные некрозы, а при заражении нутом
прививки продвигается как вверх, так и вниз по стеблю, вызывая при этом
возникновение рассеянных ограниченных очагов инфекции [1504]. Внешние
факторы, способные влиять иа степень и скорость распространения вирусов
по растению, рассматриваются в гл. XII.
Эффективность, с которой местная инфекция, возникшая в результате
механической инокуляции, приводит к системному заражению, очень широко
варьирует у разных вирусов и растений-хозяев. Известно, например,
что в случае ВТМ отдельного местного некроза, как правило, достаточно,,
чтобы вызвать системную инфекцию у быстро растущих томатов или
у табака.
Иная картина наблюдалась у Chenopodium capitatum [160]. В том случае,
когда вирус желтухи сахарной свеклы наносили па растение в 25 точках,
системная инфекция проявлялась лить у 10% растений. Для того чтобы
обеспечить системную инфекцию в каждом растении, требовалось до 200
и более местных некрозов.
Варьирует также и время перемещения разных вирусов из инокулиро-
ванного листа (у одного и того же растения-хозяина). Так, например, было
показано, что в растениях табака, зараженных смесью X- и У-вирусов
картофеля, У-вирус двигался впереди Х-вируса и его можно было выделить
из верхушки растения без примеси Х-вируса [1626].
Некоторые вирусы с трудом попадают в определенные листья. Вирус
южной мозаики фасоли и вирус кольцевой пятнистости табака размножаются
в инокулироваппом первичном листе фасоли сорта Блэк Вэлентайн и легко
перемещаются из него в молодые листья растения. Однако, в то время как
вирус южной мозаики фасоли легко перемещается и в неипокулироваиный
первичный лист (обычно уже через 4 дня), вирус кольцевой пятнистости
табака попадает в него лишь редко [1501]. Возможно, перемещение вируса
кольцевой пятнистости табака по какой-то неизвестной причине зависит
от медленного продвижения инфекции из клетки в клетку в черешке леипо-
кулированиого первичного листа. Сообщалось [924], что вирус желтой
мозаики почек персика (штамм вируса кольцевой пятнистости томатов)
ведет себя подобно вирусу кольцевой пятнистости табака в тканях коровьего
гороха. Авторы наблюдали перемещение меченных 14С соединений из первич-
ного листа и убедились в том, что лишь очень небольшое количество этих
соединений попадало в супротивный первичный лист. Возможно, что вирус
кольцевой пятнистости табака и вирус желтой мозаики почек персика пере-
двигаются по флоэме и потому редко попадают в супротивный первич-
ный лист, а вирус южной мозаики фасоли способен передвигаться по
ксилеме.
Еще более четко асимметричность инфекции может быть выражена
в случае вирусов, которые перемещаются в растении на большие расстояния.
Если инокулировать один первичный лист проростка сои вирусом некроза
табака, то все растение оказывается асимметрично зараженным. В большин-
стве тройчатосложных листьев при этом бывают заражены половина централь-
Репликация и распространение вирусов по растению
175
лого листочка и листочек со стороны зараженного первичного листа. Эта
асимметрия распространяется и на корневую систему [1421]. Некоторые
вирусы, легко попадающие в корневую систему при инокуляции листьев,
оказываются неспособными выйти из корневой системы при инокуляции
корней или же начинают перемещаться из корней вверх лишь после значи-
тельной задержки [1432]. Сообщалось [272], что удаление апикальной
меристемы не влияло па скорость перемещения ВТМ по растениям табака,
а при удалении пазушных почек эта скорость увеличивалась.
Что касается вирусов, заражающих различные древесные породы, то их
распределение в растении может быть очень неравномерным. Так, Джилмер
и Брэйз [643] обнаружили очень неоднородное распределение вируса кар-
ликовости сливы во взрослых деревьях черешни и вишни, зараженных
не менее 5 лет назад. В растениях цитранжа (гибрид Citrus sinensis (L.) Osheck
и Poncirus trifoliata (L.) Bat.), зараженных вирусом размочаливания листьев,
симптомы поражения проявляются очень неравномерно. Это касается как
растения в целом, так и отдельных листьев. По большей части симптомы
заболевания проявляются лишь па некоторых листьях побега. Па прочих
листьях они отсутствуют, и такие листья действительно не содержат вируса
(Гарпси, личное сообщение) (фото 30). Нередко в течение всего времени
в зараженных листьях сохраняются здоровые участки ткани.
Увеличение и снижение концентрации вируса
с возрастом листа
Как уже говорилось в разд. «Движение вирусов по растению», количе-
ство некоторых вирусов первоначально быстро увеличивается в зараженных
листьях, а затем снижается. Это может обусловливать очень неравномерное
распределение вируса в различных листьях в каждый данный момент.
На фиг. 34 показано, как изменяется распределение Л-вируса картофеля
в листьях растений табака па протяжении 14-недельпого периода.
Фиг. 34. Изменение концентрации Л-вируса картофеля с возрастом в листьях, одиноч-
ного растения табака (сорт Самсун) после инокуляции в лист № 1 [87].
Концентрацию вируса определяли серологически. Начиная с 15-й недоли некоторые более старые листья
отмирали. Цифры на графиках указывают число недель, прошедших с момента заражения.
176
Глава VII
Колебания концентрации вируса в различных
органах и тканях
При системной инфекции, длящейся в течение какого-то периода вре-
мени, концентрация вируса в разных органах растения может быть неодина-
ковой. У большинства вирусов, вызывающих мозаику, максимальная кон-
центрация отмечается в листовой пластинке. В случае ВЖМТ, например,
концентрация вируса в стебле, корневой системе, средней жилке и череш-
ках уже развернувшихся листьев в 10—20 раз ниже его концентра-
ции в листовых пластинках.
Вирусы, избирательно поражающие определенные ткани
Вирус тристецы цитрусовых не переносится механически, по может
быть передан тлей. Было обнаружено [1364], что в зараженных растениях
лайма клетки флоэмы заполнены вирусоподобными частицами. Эти частицы
отсутствовали в клетках паренхимы, так что вирус, по-видимому, локали-
зуется во флоэме. Вирус желтухи сахарной свеклы, вероятно, находится
во флоэме на первых стадиях инфекции, однако на более поздних стадиях
он обнаруживается повсюду в мезофилле и в эпидермисе [500]. С помощью
специфических флуоресцирующих антител было показано, что антиген
(белок) вируса раневых опухолей локализован в тканях псевдофлоэмы кор-
невой и стеблевой опухолей белого донника, а также в немногих толстостен-
ных клетках в области ксилемы [1256].
Неравномерное распределение в мозаичных листьях
Темно-зеленые участки мозаичных листьев обычно содержат очень мало
вируса по сравнению с желтыми или желто-зелеными участками. Это было
установлено для пораженных ВТМ растений Nicotiana spp. [45, 318, 583,
1639], растений Chenopodium capitatum, зараженных вирусом желтухи сахар-
ной свеклы [160], растений табака, зараженных вирусом огуречной мозаики
[1844], для вируса карликовости риса в растениях риса [973], вируса инфек-
ционного хлороза в растениях абутилона [1706], неидентифицированного
вируса в растениях Amaranthus lividus [1455], вируса желтой мозаики тур-
непса в растениях китайской капусты [1417], вируса мозаики турнепса в расте-
ниях турнепса и китайской капусты [45], для мозаичной болезни подсолнеч-
ника [34] и, наконец, для мозаики Cymbidium (Аткинсон и Мэтьюз, неопуб-
ликованные данные). Этот список охватывает вирусы, резко различающиеся
по структуре и заражающие как однодольные, так и двудольные растения.
Поэтому описанное явление может быть достаточно общим для болезней
мозаичного типа. Фиг. 35 иллюстрирует распределение ВТМ на границе
темно-зеленого и желто-зеленого участков мозаичного листа. Возможные
причины низкой концентрации вируса в темно-зеленых участках обсуж-
даются в гл. IX.
Такое неравномерное распределение вируса при мозаичных заболеваниях
наблюдается иногда и в лепестках пораженных цветков. Известно, напри-
мер, что ВТМ вызывает образование белых секторов на розовых цветках
табака; вирус при этом, очевидно, сосредоточивается в белых участках
лепестков.
Распределение вируса вблизи апикальной меристемы
Имеются данные о том, что некоторые вирусы могут внедряться в пер-
вичные меристемы. Смит и Макуортер [1621] нашли, например, что митоз
в апикальной меристеме корней и стеблей Vieta faba угнетается вирусом
12—0893
Фиг. 35. Распределение ВТМ на
границе между темно-зеленой
(справа от жирной линии) и жел-
то-зеленой (слева) зонами листа
табака с мозаичной картиной
(Аткинсон и Мэтьюз, неопублико-
ванные данные).
Вирус выявляли при помощи электрон-
ного микроскопа на тонком срезе, сде-
ланном поперек макроскопически ви-
димой границы. Слева от жирной ли-
нии во всех клетках обнаруживалось
по крайней мере по одному кристаллу
ВТМ. Справа кристаллы вируса отсут-
ствуют, все клетки кажутся цитологи-
чески нормальными. Цифры указывают
число вирусоподобных частиц на срезе
каждой клетки. х— видимый кристалл
ВТМ; ф — плазмодесмы между двумя
клетками.
178
Глава VII
кольцевой пятнистости томатов. Клетки вакуолизировались и затем поги-
бали. Внутриклеточные включения, подобные вирусным, возникали в про-
камбии и в клетках апикальной меристемы стебля. В кончиках корней
включения были видны в пределах 20 клеток от инициален. При заражении
конских бобов огуречным штаммом вируса кольцевой пятнистости томатов
вирус полностью поражал корневую меристему, что следовало из цитоло-
гических изменений, свидетельствующих о гибели копчика корня. Позже
отмирали и более старые клетки. Исследование отделенной апикальной
меристемы в электронном микроскопе позволило обнаружить в ней присут-
ствие вируса. Это было продемонстрировано для нескольких вирусов в раз-
ных растениях-хозяевах.
Однако для многих комбинаций вирус — хозяин установлено, что
вблизи верхушки побега и у кончика корня существует зона большего или
меньшего размера, совсем не содержащая вируса или содержащая очень
малое его количество. Это обстоятельство используется для получения
свободных от вируса клонов клеток (их получают, выращивая изолированные
верхушки побегов в культуре ткани; гл. XVIII).
Очень трудно доказать отсутствие вируса в апикальной меристеме.
Необходимо дать изолированной ткани расти в течение какого-то периода
времени, с тем чтобы, если в ней присутствует хоть малое количество виру-
са, этот вирус мог бы размножиться и его удалось бы выявить. С другой сто-
роны, в отношении некоторых вирусов отмечено, что культивирование зара-
женных верхушек стебля на синтетических средах приводит к потере
вируса.
Известно, что кинетин угнетает репликацию ряда вирусов. Некоторые
исследователи вводили это вещество или сходные с ним соединения в среду
для культивирования ткани. В какой степени подобные вещества влияют
на количество вируса, обнаруживаемого в апикальной меристеме, выращи-
ваемой в культуре ткани, пока неизвестно.
К вирусам, которые не поражают апикальную меристему стебля, отно-
сятся среди прочих вирус мозаики Dahlia в растениях георгин [1233] и ряд
вирусов в растениях картофеля: Л-вирус картофеля, У-вирус картофеля,
вирус морщинистой курчавости листьев картофеля, S-вирус картофеля
и Х-вирус картофеля [931, 1234]. Для этих вирусов длина свободной
от вируса зоны, вероятно, составляет всего 100—200 мкм. В случае других
вирусов она может быть гораздо больше. Например, растения батата, выра-
щенные из кусочков меристемы длиной 400—1000 мкм, в шести случаях
из семи были свободны от вируса внутреннего опробковения батата [1269].
За зоной апикальной меристемы, свободной от вируса, может суще-
ствовать градиент концентрации вируса, возрастающий по направлению
к более зрелой ткани. Солберг и Болд [1641] изучали несколько штаммов
ВТМ в растениях N. glauca. Штамм в отличие от штамма U5 не встре-
чается на этом растении в полевых условиях. Было показано, что штамм U5
проникает в точку роста, тогда как штамм U4 в ней не обнаруживается
[1641]. Способность штамма U6 проникать в ткани растения-хозяина, устой-
чивые к другим штаммам, дает ему в полевых условиях преимущество
по сравнению с этими штаммами.
Солберг и Болд также культивировали in vitro верхушки побегов расте-
ний N. glauca, зараженных ВТМ. Эти верхушки содержали 3 листовых
зачатка, из которых наиболее крупный имел длину около 400 мкм. У расте-
ний, зараженных любым из трех штаммов ВТМ, почти все верхушки
оказались свободными от вируса после 6-месячного выращивания в культуре.
Добавляемый в питательную среду этилендиаминтетраацетат (ЭДТА) в кон-
центрациях от 3,0 -10“4 до 6,0-IO-4 М вызывал почти 100-кратное увеличение
концентрации ВТМ в корневой меристеме томатов, выращиваемой в жидкой
Репликация и распространение вирусов по растению 179'
культуре [422]. 5-фтордезоксиуридин обладает сходным действием [465].
Механизм этого интересного явления непонятен.
Было обнаружено, что копчики корней растений, зараженных некото-
рыми вирусами, вируса не содержат. Смит и Шлегель [1632] изучали рас-
пределение вируса желтой мозаики клевера в кончиках корней Vieta faba.
Они готовили серию срезов различных участков корили определяли их инфек-
ционность (фото 31). Оказалось, что первые 400 мкм от копчика корня (эта
область включает корневой чехлик и меристему) были свободны от вируса.
(Разумеется, следует помнить об ограничениях метода, которым эти авторы
пользовались при определении инфекционности.)
В каллюсных культурах зараженных тканей концентрация вируса
обычно значительно ниже, чем в интактных тканях растений. Хансен и Гиль-
дебрандт [703] механически изолировали отдельные клетки из каллюсной
ткани растений табака, зараженных ВТМ, и определяли в них вирус при
помощи микрометода. Вирус был обнаружен лишь примерно в 40% всех
проверенных клеток. Удалось подтвердить и другим путем, что некоторые
клетки действительно не содержали вируса: часть выращенных из каллюса
растений табака оказалась свободной от вируса.
Причины, по которым меристемная зона часто оказывается неспособ-
ной поддерживать размножение вируса, пока еще совершенно неизвестны,.
На этот счет высказывались следующие предположения:
1. Точка роста удаляется слишком быстро, и вирус просто не успевает
ее достичь. Это, однако, представляется довольно маловероятным. Солберг
и Болд [1641] нашли, что верхушка стебля N. glauca перемещается со ско-
ростью 400 мкм/ч (1 см в день). Это действительно превышает установленную
скорость перемещения вируса от клетки к клетке, но если вирус уже попал
в ту область, где происходит увеличение размеров клеток, то с ростом клеток,
очевидно, и он должен переноситься вперед.
2. На пути вируса имеются механические преграды. Например, размеры
плазмодесм могут быть слишком малы. Экспериментальные данные, которые
подтверждали бы это предположение, отсутствуют.
3. Биохимическое состояние делящихся клеток исключает возможность
репликации вируса. Это всего лишь иной способ выразить ту простую мысль,
что мы ничего не знаем о состоянии этих клеток.
ГЛАВА VIII
ДЕФЕКТНЫЕ ВИРУСНЫЕ ЧАСТИЦЫ,
МНОГОКОМПОНЕНТНЫЕ ВИРУСЫ
И ВИРУСЫ-САТЕЛЛИТЫ
Вскоре после того, как удалось впервые выделить вирусные нуклеопро-
теиды, был поднят вопрос, представляет ли собой продукт вирусного синтеза
какую-то одну определенную частицу. Некоторые полагали, что в результате
вирусной инфекции может образоваться несколько вирусных продуктов,
обладающих биологической активностью. Другие считали, что при этом
образуется только один тип активных частиц, а все остальные структуры,
например короткие палочки, обнаруживаемые в препаратах ВТМ, есть
не что иное, как артефакт, возникающий в процессе выделения. Общеприня-
той стала вторая точка зрения. Однако в последние несколько лет из пре-
паратов многих вирусов были выделены неполные вирусные частицы. Ока-
залось, что у некоторых вирусов вообще не существует какой-то определен-
ной «инфекционной частицы». Генетический материал этих вирусов заклю-
чен в двух или более частицах разного размера.
Очень трудно однозначно доказать, что все неполноценные вирусные
частицы, о которых пойдет речь ниже, существуют в клетке в том же состоя-
нии, в каком их обнаруживают в очищенных препаратах. При электронно-
микроскопическом изучении ультратонких срезов клеток, зараженных
мелкими икосаэдрическими вирусами, трудно обнаружить разницу между
полноценными и неполноценными вирусными частицами. Однако в случае
некоторых палочкообразных вирусов при исследовании ультратонких срезов
удается четко различить палочковидные фрагменты меныпей по сравнению
с инфекционными частицами длины. В случае крупных окруженных мембра-
ной бацилловидных вирусов, таких, как вирус некротического пожелтения
салата-латука, вирусные частицы, видимо, вообще, как правило, несколько
варьируют по длине.
При электронно-микроскопическом исследовании крупных вирусов
часто удается различить неполные частицы, однако возможно, что многие
из них представляют собой фрагменты, возникшие в результате поврежде-
ния в процессе выделения, окрашивания и т. д.
Известны три вируса (в настоящей главе они не рассматриваются),
которые, судя по их необычным свойствам, видимо, в какой-то степени дефект-
ны, хотя и выживают в природе. Два из них — вирус веретеповидности клуб-
ней картофеля и вирус, вызывающий заболевание коры цитрусовых (citrus
exocortis virus),— существуют, вероятно, в форме «голой» двухцепочечиой
РНК (гл. V). Третий — это вирус мозаики озимой пшеницы. Из растений,
зараженных этим вирусом, удается выделить большие количества вирусного
белка, который в соответствующих условиях in vitro образует палочковидные
и другие структуры [42]; к сожалению, частицы этого вируса не удалось
охарактеризовать.
Дефектные вирусные частицы, многокомпонентные вирусы и ВС 181
ВИРУСЫ СО СПИРАЛЬНОЙ СТРУКТУРОЙ
Вирус табачной мозаики
Изучение коротких палочкообразных частиц, из которых состоят пре-
параты ВТМ, усложняется в связи с тем, что эти частицы имеют склонность
к агрегации. Как интактные частицы ВТМ, так и частицы меньших размеров
в определенных условиях соединяются конец в конец, так что образуются
линейные структуры, сильно различающиеся по длине. Распределение
частиц по длине в значительной степени зависит от способа получения вирус-
ного препарата. К числу факторов, влияющих иа длину частиц, относятся
pH, ионная сила, природа присутствующих в системе ионов, температура
и длительность хранения, однако следует отметить, что действие всех этих
факторов изучено еще недостаточно. Различные типы распределения вирус-
ных частиц по длине в препаратах ВТМ приведены в работе франки [547]
(фиг. 36).
Согласно имеющимся данным, короткие палочкообразные частицы ВТМ
сами по себе неипфекциотшы или обладают незначительной инфекцион-
ностыо. Однако Хьюлетт и Лоринг [837] при помощи подсчета числа мест-
ных некрозов па единицу стандартной длины (300 нм) установили, что при
использовании препаратов, обогащенных частицами мепыпей длины, воз-
никает больше некрозов, чем в случае препаратов, содержащих в основном
частицы стандартной длины. Эти авторы высказали предположение, что
хотя короткие частицы генетически неполноценны, они тем не менее способ-
ны проникать в ту же клетку, что и частицы стандартной длины, увеличивая
тем самым вероятность заражения, франки [547] также отмечает, что пре-
параты, обогащенные короткими частицами, отличаются большей ипфек-
циоиностыо по сравнению с теми, в которых содержание этих частиц невели-
ко. Однако в этих случаях увеличение инфекционности было выражено сла-
Длипа частиц,нм
Фиг. 36. Влияние условий выделения на распределение частиц ВТМ по длине [547].
Свежеэкстрагированный сок (А) растений табака, зараженных ВТМ, обрабатывали тремя различными
способами: Б— осаждение солями; В — ультрацсптрифугиропапие (pH 7,2; 0,02 М фосфат);
Г—ультрацентрифугирование (pH 4,8; 0,02 М ацетат).
182
Глава VIII
бее, чем у некоторых многокомпонентных вирусов, о которых речь пойдет
ниже. Возможно, влияние коротких частиц на инфекционность неспецифич-
но. Боксталер и Кэсберг [216] обнаружили, что инфекционность РНК вируса
мозаики костра возрастает примерно в 1,4 раза в присутствии дрожжевой
РНК или РНК фага R17, а добавление неинфекционной РНК вируса мозаи-
ки костра приводит к удвоению инфекционности.
Коммонеридр. [401] изучали распределение длины частиц, обнаруживае-
мое при исследовании зараженных листьев через несколько дней после ино-
куляции. Отношение числа коротких частиц ( « 50 —200 нм) к числу полно-
ценных вирусных частиц было наибольшим в первый день после инокуляции
и в течение последующих четырех дней постепенно снижалось. Однако
другим исследователям не удалось обнаружить неинфекционный вирусный
материал в течение первых нескольких дней после инокуляции. Таунсли
[1786] нашел, что концентрация коротких, неполноценных частиц ВТМ
непостоянна. Она была наименьшей в растениях в фазе интенсивного роста
и наибольшей, когда растения находились в условиях, неблагоприятных
для роста. Танигучи [1742] фракционировал очищенный препарат ВТМ
на колонках с катионообменной смолой и с экстеола-целлюлозой и с по-
мощью обоих методов выделил серию фракций. Связь между этими пре-
паратами и вирусоподобным материалом, выявляемым другими методами,
еще не установлена.
Таунсли [1786], используя методТэлектрофореза в агаровом геле, выде-
лил из зараженных ВТМ растений табака три фракции: «растворимый анти-
ген» (т. е. белок с низкой молекулярной массой), интактный ВТМ и быстрый
компонент, состоящий из коротких вирусоподобных частиц, содержащих
РНК. Эти короткие частицы включали меченый лейцин активнее, чем интакт-
ный вирус. Поведение меченой растворимой антигенной фракции свидетель-
ствует о том, что она, возможно, представляет собой быстро исчезающий
компонент. В экспериментах, в которых листовые диски сначала обрабаты-
вали 14С-лейцином, а затем нерадиоактивным лейцином, было показано, что
растворимый антиген быстро утрачивает радиоактивность, тогда как радио-
активность ВТМ и коротких частиц продолжает нарастать. Брайан и др.
[300] разработали систему размельченной ткани, в неразрушенных клетках
которой некоторое время идет синтез ВТМ. Аминокислоты, меченные 14С,
быстро потреблялись такими клетками и включались в состав частиц ВТМ.
В данном случае опять-таки более короткие частицы имели более высокую
удельную радиоактивность при кратковременном введении метки. Неясно,
являются ли короткие частицы (или хотя бы часть из них), найденные
в препаратах ВТМ, вирусными частицами, находящимися в процессе сборки,
или же они представляют собой продукты дефектного синтеза, возникшие,
скажем, в результате сборки белковых субъединиц на молекулах вирусной
РНК, имеющих неполную длину.
Вирус погремковости табака
Препараты вируса погремковости табака (ВПТ) состоят из палочкообраз-
ных частиц разной длины [1317]. Харрисон и Вудс [731] изучили 10 изолятов
ВПТ и распределили их на 3 группы в соответствии с длиной крупных частиц.
Эта длина составляет 188, 195 и 197 нм, что соответствует трем серологиче-
ским типам, выявленным среди этих изолятов. Во всех изолятах присутст-
вуют также более короткие нуклеопротеидные частицы, длина которых
находится в пределах от 43 до 114 нм. В соответствии с длиной коротких
частиц изученные изоляты удалось разделить на 6 групп. Для большинства
изолятов при повторных пассажах в условиях теплицы сохраняется харак-
терное распределение частиц по' длине, однако у двух изолятов длина частиц
Дефектные вирусные частицы, многокомпонентные вирусы и ВС 183
160
120
80
40
d>
! 80
а
о
5
§ 40
Фиг. 37. Распределение частиц по длине
у трех изолятов вируса погремковости
табака [731].
А — изопят ORE; В — пзолят SAL; В—изо-
лят SI3.
изменяется до величии, характерных для других групп. Распределение
по длине частиц для трех групп штаммов показано на фиг. 37. Ниже, говоря
о коротких частицах, мы будем иметь в виду частицы, соответствующие
частицам средней длины (фиг. 37), которые встречаются в большом количе-
стве. Каково значение самых коротких частиц, содержащихся в препарате,
не известно.
Частицы двух основных классов удается разделить путем центрифуги-
рования в градиенте плотности сахарозы. По своим антигенным свойствам
все они очень сходны или даже идентичны [725]. Инфекционны только длин-
ные частицы. Длинные частицы можно разрушить in vitro щелочью, моче-
виной или детергентом, однако при этом, по-видимому, не происходит пре-
имущественного образования фракции коротких частиц, идентичных по дли-
не обычным коротким частицам этого вируса [1537].
Анализ стабильности конечного инфекционного материала позволяет
считать, что в результате заражения ВПТ образуются две формы вирусоспе-
цифичного продукта: стабильная, легко передающаяся с’соком’и|устойчивая
к замораживанию и оттаиванию в листьях, и нестабильная, которая быстро
инактивируется в соке, но устойчива к фенолу [313, 314, 1467, 1469]. Ключ
к выяснению природы этих двух форм вируса дают работы Листера [1077,
184
Глава VIII
1078]. Он исследовал штамм PRN вируса погремковости табака путем цен-
трифугирования в градиенте плотности сахарозы. При этом были получены
две зоны. Фракция, соответствующая быстро седиментирующей зоне, оказа-
лась более инфекционной, причем после проверки отдельных некрозов
выяснилось, что около 98% из них появилось в результате заражения неста-
бильными частицами. Фракция, соответствующая медленно седиментирую-
щей зоне, вызывала образование гораздо меньшего числа некрозов, причем
из них примерно две трети были вызваны вирусом стабильной формы.
Во фракции коротких частиц содержалось некоторое количество длинных
частиц. Листер предположил, что в длинных частицах, возможно, отсут-
ствует часть генетической информации, необходимая для формирования ста-
бильной, одетой белком вирусной частицы, и что эта утраченная информация
заключена в РНК коротких частиц; в то же время короткие частицы неспо-
собны реплицироваться в отсутствие длинных. Специфичность этого взаимо-
действия была доказана тем, что стабильную форму вируса можно было
получить лишь при совместной инокуляции растений вирусными частицами,
относящимися к нестабильной форме, и короткими частицами близкородст-
венных штаммов. Образования стабильной формы не наблюдалось, если
при заражении использовали смесь стабильной формы и коротких частиц,
относящихся к отдаленным штаммам.
Фрост и др. [568] и Зенгер [1468] подтвердили и расширили результаты
Листера. В большинстве своих экспериментов Фрост и его сотрудники исполь-
зовали штамм САМ, у которого длина коротких частиц составляет всего
52 им, так что при центрифугировании в градиенте плотности сахарозы
достигается наиболее эффективное отделение длинных частиц от коротких.
У другого штамма (PRN) длина коротких частиц составляла 65—80 нм.
Короткие частицы обоих штаммов не вызывали образования некрозов на Che-
nopodium am ar anticolor в отсутствие длинных частиц, тогда как длинные
частицы каждого штамма индуцировали некрозы. В этих некрозах содержа-
лись не вирусные частицы, а инфекционная вирусная нуклеиновая кислота,
которую можно было экстрагировать фенолом. Инфекционность некрозов
утрачивалась после замораживания и оттаивания. При использовании для
инокуляции смеси коротких частиц с длинными частицами того же штамма
(в стандартной концентрации) число местных поражений не увеличивалось.
Однако в некоторых некрозах, образовавшихся при заражении таким сме-
шанным инокулумом, содержались одетые белком вирусные частицы и той
и другой длины, причем этот инфекционный материал бы устойчив к замора-
живанию и оттаиванию; число таких некрозов увеличивалось с повышением
концентрации коротких частиц в инокулуме. После обработки коротких
частиц ультрафиолетом в условиях, не приводящих к повреждению белка,
такого изменения природы продуктов после смешанного заражения в пора-
женных участках не наблюдалось (табл. 9).
При смешивании РНК, выделенной из коротких частиц, с инфекционной
РНК длинных частиц наблюдался тот же эффект. И в этом случае взаимодей-
ствие было штаммоспецифичным, так как короткие частицы штаммов САМ
и PRN не реагировали с длинными частицами другого штамма. Фрост и др.
[568], подтверждая гипотезу Листера, высказывают предположение, что
каждый штамм вируса погремковости табака представляет собой систему
двух, а возможно, и большего числа фрагментов инфекционной нуклеино-
вой кислоты, специфически взаимодействующих друг с другом.
По данным Зенгера [1468], короткие частицы одного штамма ВПТ
могут стабилизировать РНК другого, неродственного штамма. Используя
эту систему серологически различающихся компонентов, Зенгер убедитель-
но показал, что за специфичностг, структурного белка ответственна РНК-
коротких частиц. Семапчик и Каийяма [1538] изучали продукты, образующие-
Дефектные вирусные частицы, многокомпонентные вирусы и Б С 185
Таблица 9
Взаимодействие между короткими (пеипфекциопными)
и длинными (инфекционными) частицами ВПТ
Состав инокулума (108 частиц/мл) Число единичных покровов, содержащих стабильный инфекционный продукт, %
длинные частицы короткие частицы
2 Не добавляли 0
2 20 10
2 100 37
2 500 83
2 500 (обработка ультрафиолетом) 0
ся при смешивании длинных и коротких частиц трех близкородственных
штаммов. Короткие частицы этих штаммов они идентифицировали методом
центрифугирования в градиенте плотности сахарозы. Оказалось, что в любой
системе, состоящей из длинных частиц одного штамма и коротких частиц
другого, длина последних определяется типом коротких частиц, содержа-
щихся в инокулуме. Вероятно, это означает, что РНК коротких частиц
контролирует длину этих частиц. Листер и Брокер [1079], изучая три вариан-
та природного штамма, различающиеся по вызываемым ими симптомам, также
установили, что РНК коротких частиц контролирует длину этих частиц.
Смешивая короткие частицы одного штамма с длинными частицами дру-
гого, Листер и Брокер нашли, что симптомы, проявляющиеся на N. cleue-
landli, определялись штаммом — донором коротких частиц. В то же время
длинные частицы любого из трех штаммов поддерживали репликацию корот-
ких частиц всех этих штаммов. Однако Листер [1078] в сходных опытах
на других штаммах обнаружил, что развитие характерных некрозов на
Л’, glutinosa зависит от длинных частиц, содержащихся в смеси.
Все это позволяет заключить, что вирус погремковости табака состоит
из двух фрагментов РНК, одетых одним структурным белком. Ниже мы
приводим перечень свойств, обнаруженных к настоящему времени для
частиц этих двух типов:
Короткие частицы
Контролируют длину собственных
частиц
Содержат цистрон структурного
белка, используемый частицами
обоих типов
Контролируют симптомы, прояв-
ляющиеся на некоторых расте-
ниях-хозяевах
Длинные частицы
Содержат цистрон РНК-полимера-
зы, который, по-видимому, ис-
пользуется частицами обоих ти-
пов
Контролируют симптомы, прояв-
ляющиеся на некоторых расте-
ниях-хозяевах
СФЕРИЧЕСКИЕ ВИРУСЫ
Вирус желтой мозаики турнепса
Вирус желтой мозаики турнепса (ВЖМТ) был первым вирусом, в очи-
щенных препаратах которого наряду с инфекционным нуклеопротеидом был
обнаружен белковый компонент, не содержащий нуклеиновой кислоты
[11,57]. Эта фракция, так называемый верхний, или Т-компонент (от англий-
ского top — верх), оказалась неинфекционной, но размеры частиц, их форма
186
Глава VIII
и поверхностные свойства (связывание антител, электрофоретическая под-
вижность, способность образовывать смешанные кристаллы) были, по-види-
мому, теми же, что и у исходного вируса. Коэффициент седиментации
fee, w) этих частиц составляет 52 S, что соответствует молекулярной массе
около 3-10е дальтон. Молекулярная масса Т-частиц, вычисленная па основа-
нии размера белковой оболочки, составляет 3,6 -10е дальтон. Т-белок и белок
ВЖМТ не различаются сколько-нибудь существенно по аминокислотному
составу [555]; пептидные карты, полученные после обработки карбоксимети-
лированных субъединиц трипсином (Барнс и Мэтыоз, не опубликовано),
у этих двух белков также идентичны. Финч и Клуг [518], Лонгли и Либерман
[1096] провели сравнительное рентгенографическое исследование природ-
ного Т-компонента и Т-компонента, искусственно полученного из вируса
по методу Кейпера [912, 913]. Частицы обоих типов были неразличимы при
разрешении 1 нм. Таким образом, Т-компонент, по-видимому, очень сходен
с интактным вирусом, отличаясь от него лишь отсутствием РНК и, возможно,
полиамина, обнаруженного в вирусе.
Фракционирование очищенных препаратов ВЖМТ методом седимента-
ции в преформированном градиенте плотности хлористого цезия поз-
воляет выделить наряду с инфекционным нуклеопротеидом (BJ и Т-ком-
понентом три минорные нуклеопротеидные фракции: В2, Во и Воо [1182].
Методом диффузии в геле было показано, что все эти фракции серологиче-
ски идентичны [1188].
Минорный нуклеопротеид В2 содержится в препаратах вируса в боль-
ших по сравнению с другими минорными компонентами количествах (обычно
3—4% количества BJ. Этот компонент идентичен Bt по содержанию РНК
и по нуклеотидному составу. Фракция В2 имеет более высокую по сравнению
с Bj эффективную плотность в концентрированных растворах хлористого
цезия. Причина этого неизвестна, однако, возможно, она заключается в раз-
личной способности к связыванию ионов металлов, поскольку в присутствии
Mg2+ в градиенте хлористого цезия изменяется плотность фракций Bt и В2.
Фракция В2 имеет коэффициент седиментации s20, ю равный около 117 S,
тогда как для Bf коэффициент седиментации составляет 114 S.
При равновесном центрифугировании в градиенте плотности хлористого
цезия (О = 1,43 г/мл) компонент В2 образует одну гомогенную фракцию.
Де Розье и Хазелькорн [443] обнаружили две минорные фракции, плотность
которых превышала плотность фракции BP Один из этих минорных компо-
нентов соответствовал фракции В2, а второй имел более высокую плотность.
Инфекционность изолированной фракции В2, так же как и инфекцион-
ность полученной из нее РНК, очень низка. Эта РНК, свежевыделенная
фенольным методом, седиментирует как высокополидисперсный материал,
самый быстрый компонент которого имеет коэффициент седиментации s2o.w>
равный примерно 26—29 S. Обе тяжелые фракции, выделенные Де Розье
и Хазелькорном, также содержали фрагментированную РНК. Вероятно,
отсутствие инфекционности у фракции В2 связано с дефектностью ее РНК.
Во — минорная нуклеопротеидная фракция, составляющая приблизи-
тельно 1—2% фракции Bt и седиментирующая медленнее последней. Фрак-
ция Во содержит 24% РНК с нуклеотидным составом, типичным для ВЖМТ.
При аналитическом ультрацентрифугировании в 0,1 М NaCl фракция Во
образует один компонент с коэффициентом седиментации s20, w — 92 S. Это
соответствует величине, ожидаемой на основании того, что Во имеет снижен-
ное содержание РНК, если исходить из предположения, что оба типа частиц
(Bi и Во) идентичны друг другу во всем, кроме содержания РНК. Де Розье
и Хазелькорн определили, что коэффициент седиментации s2o. w фракции,
сходной с фракцией Во, составляет 90 S. РНК, свежевыделенная из фракции
Во, неинфекционна и имеет коэффициент седиментации s20,w около 21 S.
Дефектные вирусные частицы, многокомпонентные вирусы и ВС 187
Фракция В00 также неипфекционна и содержит около 10% РНК, которая
по своему нуклеотидному составу сходна с РНК фракции Вр, коэффициент
седиментации s20,w этой РНК равен примерно 16 S. В количественном отно-
шении фракция Воо составляет примерно 1—2% фракции Bt. При аналити-
ческом ультрацентрифугировапии в 0,1?И NaCl фракция В00 образует один
пик (коэффициент седиментации s20,w около 72 S), что примерно соответ-
ствует величине,ожидаемой на основании данных о содержании в этой фрак-
ции РНК.
Джонсон [892] фракционировал в равновесном градиенте плотности
хлористого цезия специально приготовленный препарат ВЖМТ с низким
содержанием ионов металлов. Он обнаружил три минорных компонента,
плавучая плотность которых была ниже, чем плотность вируса, и один
компонент с более высокой плотностью', по-видимому, соответствующий опи-
санным выше минорным компонентам.
Добавление (примерно в равном количестве) пеинфекциоиного нуклео-
протеида Воо, Во или В2 к очищенной фракции Вц не приводило к сколько-
нибудь заметному увеличению числа местных некрозов, индуцируемых
обычно фракцией В, при заражении растений китайской капусты. Ипфек-
ционность РНК, выделенной из фракции В4, не увеличивалась также при
добавлении РНК минорных компонентов (Фаэд и Мэтьюз, пе опубликовано).
Таким образом, ВЖМТ нельзя считать двухкомпонентным вирусом в отли-
чие от некоторых других мелких сферических вирусов, описанных ниже.
У этих вирусов частицы с более низким содержанием РНК и «полноценные»
частицы присутствуют в препаратах примерно в равных количествах, тогда
как в препаратах ВЖМТ неполноценных нуклеопротеидных частиц гораздо
меньше, чем частиц, относящихся к фракции В4.
Компонент Т удается обнаружить при ультрацентрифугировапии расти-
тельного сока не ранее чем через 2—3 дня после того, как в растении обна-
руживается вирусный нуклеопротеид. Через 2 дня после появления Т-ком-
попента отношение Т/иуклеопротеид резко возрастает, а затем начинает
медленно снижаться по мере того, как количество вирусного материала
в листе возрастает. Обычно на ранних стадиях заражения на 2 нуклеопротеид-
ные частицы приходится 1 частица верхнего компонента, а через несколько
недель это отношение становится равным 5:1.
Выло показано, что в процессе развития вирусной инфекции соотноше-
ние минорных неинфекционных нуклеопротеидных фракций Воо, Во и В2
существенно не меняется, однако следует отметить, что методы, использо-
ванные в этом случае, были недостаточно точными. Де Розье и Хазелькорн
[443] сравнивали препараты вируса, выделенные из молодых и старых
листьев через 2 недели после заражения растений. По их данным, в пре-
паратах, выделенных из более старых листьев, содержание минорных нук-
леопротеидных компонентов выше.
Джинер [846] с помощью 14СО2 и Мэтьюз [1182] с помощью сульфата,
меченного 3fSS, обнаружили, что после очень кратковременного введения
метки фракция пустых белковых оболочек (Т), выделенная из зараженных
листьев, имела более высокую удельную активность, чем нуклеопротеид
(В4). Это дает некоторое основание для того, чтобы предположить, что верх-
ний компонент служит предшественником компонента Bt. Однако последую-
щее развитие представлений о механизмах сборки сферических вирусов,
а также данные тщательных экспериментов с использованием радиоактивной
метки заставляют считать это предположение весьма маловероятным. Мэтьюз
и др. [1190] исследовали динамику включения S6S в белок и 82Р во фракции
Т, Воо, Во, В( и В2 с учетом относительных количеств этих компонентов
в листе и скоростей их увеличения. Фиг. 38 иллюстрирует полученные
результаты.
188
Глава VIII
Фиг. 38. Включение 3BS в белок ВЖМТ
[1190].
Динамика изменения удельной активности
пустых белковых оболочек (1) и нуклеопро-
теида Bi (II) после введения через корпи
«S-сульфата.
Анализ этих данных позволяет исключить некоторые теоретические
альтернативы. Что касается связи между Т-компоиентом и компонентом 1317
то совершенно очевидно, что Т-компонент не может быть продуктом деграда-
ции Вр Кроме того, он не может образовываться необратимо из того же пула
субъединиц, что и фракция Bt.
Наиболее простая схема, согласующаяся с полученными данными, сво-
дится к тому, что и верхний компонент, и фракция В t формируются из одного
и того же пула белковых субъединиц, но первый образуется обратимо,
а фракция Bi — необратимо. Характер действия 2-тиоурацила в этой системе
(гл. XIV) находится в соответствии с этой схемой.
В экспериментах с кратковременным введением метки 35S и заР порядок
уменьшения удельной активности для трех нуклеопротеидных фракций
был следующим: В00>В0>В.| или В2. Однако данные, полученные при
анализе включения 3BS, свидетельствуют о том, что фракции Воо и Ва
не являются промежуточными продуктами сборки В] из верхнего компонента.
Имеющиеся данные по кинетике включения радиоактивного материала
не вполне исключают возможность того, что фракции Воо и Во представляют
собой промежуточные продукты сборки нуклеопротеида В, (без участия
верхнего компонента), однако такая возможность не согласуется с общепри-
нятыми представлениями о сборке мелких сферических вирусов (гл. VII).
Вирусы группы мозаики тыквы
Это группа мелких сферических вирусов, более или менее отдаленных
серологически и передающихся жуками. Сюда входят вирус мозаики тык-
вы, вирус крапчатости бобов фасоли и вирус мозаики коровьего гороха;
каждый из этих вирусов можно разделить на несколько компонентов с раз-
личными коэффициентами седиментации.
Вирус мозаики тыквы
Очищенные препараты вируса разделяются в градиенте плотности хло-
ристого рубидия иа четыре компонента: верхний, неинфекционный (не содер-
жащий РНК), с коэффициентом седиментации s2o, w, равным 57 8; средний,
вероятно неинфекционный (содержит 27% РНК), с коэффициентом седи-
ментации S2o.w, равным 95 S; нижний, инфекционный (содержит 35% РНК),
с коэффициентом седиментации s201W, равным 118 S, и нижний 2 иеинфек-
Дефектные вирусные частицы, многокомпонентные вирусы и ВС 189
циоиный, который движется в градиенте плотности впереди нижнего компо-
нента и имеет тот же коэффициент седиментации [1195]. Белки среднего
и нижнего компонентов очень сходны по аминокислотному составу. Верх-
ний компонент (или Т-компонепт), возможно, несколько отличается от осталь-
ных. Наблюдаемая в данном случае картина разделения на фракции сходна
с тем, что наблюдается при фракционировании препарата ВЖМТ, с той
разницей, что в последнем случае присутствует большее число фракций, род-
ственных нижнему компоненту.
Вирус крапчатости бобов фасоли
В очищенных препаратах вируса крапчатости бобов фасоли имеются
три компонента, различающиеся по коэффициенту седиментации: верхний
(54 S), средний (91 S) и нижний (112 S), содержащие соответственно 0, 30
и 37% РНК [73]. Иифекционеи, по-видимому, только нижний компонент.
РНК, выделенная из среднего компонента, иеинфекциопна и имеет сравни-
тельно низкое содержание гуаниловой и уридиловой кислот по сравнению
с нижним компонентом [1535]. Средний компонент более неустойчив при
эмульгировании в хлороформе при pH 9,5, чем «полные» вирусные частицы
11536].
При заражении фасоли наблюдается быстрое увеличение инфекцион-
ности растительных экстрактов (примерно в течение 12 дней), после чего
инфекционность снижается без соответствующего снижения количества
вирусного материала. Снижение инфекционности не связано с уменьшением
относительного количества быстрого компонента [638].
Вуд и Банкрофт [1938] специально исследовали биологическую актив-
ность верхнего и среднего компонентов. Они получали эти компоненты
путем центрифугирования в градиенте плотности сахарозы и проверяли
их инфекционность по отдельности и в смеси (примерно в равных концентра-
циях), определяя число местных некрозов, индуцируемых па листьях фасоли.
Инфекционность нижнего компонента возрастала при добавлении среднего
компонента и не менялась при добавлении верхнего. Это позволило говорить
об участии РНК среднего компонента в заражении, тем более что при исполь-
зовании среднего компонента, обработанного ультрафиолетом, описанный
эффект ослаблялся. Вуд и Банкрофт [1933] приходят к выводу, что неполная
нуклеопротеидная частица может дополнять поврежденную полную частицу,
если опа содержит соответствующий недостающий участок РНК. Имеется
альтернативная гипотеза, согласно которой ни о какой поврежденной РНК
не может идти речи, а заражение в болыпинстве случаев происходит в резуль-
тате взаимодействия двух частиц с функционально различными РНК [295].
Это второе предположение кажется наиболее вероятным в свете изложенных
ниже данных, полученных при исследовании вируса коровьего гороха.
Опыты, проведенные с мутантами вируса крапчатости бобов фасоли, свиде-
тельствуют о том, что нуклеопротеидные частицы быстрого компонента
контролируют тип потомства, во всяком случае тип некрозов и количествен-
ное соотношение среднего и нижнего компонентов [Вуд, цит. по Банкроф-
ту, 74].
Вирус мозаики коровьего гороха
Было показано [7], что очищенные препараты вируса мозаики коровьего
гороха разделяются при аналитическом ультрацентрифугировании на три
компонента с коэффициентами седиментации s2o.w, равными примерно 58,
100 и 119 S. Эти же препараты путем электрофореза разделяются на два
компонента. Ван Каммен [1822] обнаружил в препаратах вируса сходные
190
Глава VIII
компоненты с коэффициентами седиментации з20, w, равными, примерно 59 S
(верхний, или Т-компонент), 95 S (средний, или М-компонент) и 115 S (ниж-
ний, или В-компонент); содержание РНК в них составляло соответственно
0, 23 и 32%. Относительные количества этих трех компонентов варьируют,
но средний (М) компонент обычно присутствует в наибольшем количестве.
На фото 32 представлены седиментационные диаграммы, полученные при
аналитическом ультрацентрифугировании осветленного сока и очищен-
ного вирусного препарата. Сравнение двух нижних диаграмм показывает,
что некоторое количество верхнего компонента теряется, если при очистке
вируса используются бутанол и хлороформ.
РНК среднего компонента содержит больше уридиловой и меньше
гуаниловой кислоты, чем РНК нижнего компонента. РНК среднего и ниж-
него компонентов, выделенные фенольным методом (s2o, w — 22 и 28 S соот-
ветственно), седиментируют раздельно. Однако следует иметь в виду, что
результаты тепловой обработки перед аналитическим ультрацентрифугиро-
ванием не исключают наличия скрытых повреждений в вирусных РНК. Агра-
вал [7] считает, что средний компонент обладает самой высокой инфекцион-
ностыо, однако результаты более поздних исследований не подтверждают
этого. Вуд и Банкрофт [1933] установили, что инфекционным является
не средний, а нижний компонент.
При добавлении среднего компонента к нижнему инфекционность послед-
него значительно возрастает. Бруенинг и Агравал [295] подтвердили этот
факт, а также показали, что эти два компонента серологически идентичны.
В опытах, проведенных с РНК этих двух компонентов, отмечается анало-
гичный синергический эффект. Авторы считают, что большинство местных
некрозов, возникающих при инокуляции нефракционированнымипрепарата-
ми вируса мозаики коровьего гороха,— это результат смешанного заражения
частицами среднего и нижнего компонентов.
Усовершенствовав технику разделения нижнего и среднего компонен-
тов, ван Каммен [1823] показал, что ни один из них сам по себе не инфекцио-
нен и что инфекционность смеси зависит от количества компонента, присут-
ствующего в меньшем количестве. Он не смог получить данных, которые
свидетельствовали бы о том, что активация одного компонента другим свя-
зана с дефектом вирусной РНК, вызванным разрывами. Весьма вероятно,
что вирус мозаики коровьего гороха сходен с вирусом погремковости табака
в том смысле, что полные вирусные частицы образуются из частиц двух
типов. Однако мы не имеем пока данных о том, индуцируется ли синтез
вирусной РНК при заражении растений одной только фракцией нижнего
компонента вируса мозаики коровьего гороха, подобно тому как это про-
исходит при инокуляции длинными частицами вируса погремковости табака.
В то же время показано, что средний компонент определяет присутствие или
отсутствие верхнего компонента [294].
Молекулярная масса РНК среднего компонента составляет 1,4-10® даль-
тон, а нижнего — 2,5 -10® дальтон. Ван Гринсвен и ван Каммен [1817] рас-
считали, что соответствующие двухцепочечные РНК должны иметь s20,w
примерно 15 и 18,5 S. Они выделили двухцепочечную РНК из растений,
зараженных вирусом мозаики коровьего гороха. Путем фракционирования
этого материала в градиентах удалось выявить пик поглощения при 260 нм
(коэффициент седиментации 15 8), имеющий дополнительный компонент
(плечо пика) с коэффициентом седиментации 18,5 S. Это соответствует тому,
что следовало ожидать для двухцепочечных РНК среднего и нижнего ком-
понентов. Были проведены измерения длины молекул РНК обоих типов
с помощью электронного микроскопа. Обнаружены молекулы длиной 1,45
и 2,6 мкм, что соответствует ожидаемой длине двухцепочечных РНК М-
и В-компонентов (фото 33). Все это заставляет считать весьма вероятным,
Дефектные вирусные частицы, многокомпонентные вирусы и ВС 191
что дне описанные цепи РНК реплицируются на двух различных мат-
рицах.
В препаратах вируса крапчатости красного клевера, родственного виру-
су мозапкп коровьего гороха, содержится два компонента — нижний и сред-
ний; при их смешивании отмечается значительное увеличение инфекцион-
ности [1804]. Возможно, этот вирус сходен с вирусом мозаики коровьего
гороха и представляет собой двухкомпонеитную систему.
Другие икосаэдрические вирусы
Вирус полосатости табака
Вирус полосатости табака — мелкий сферический вирус, имеющий
частицы диаметром 28 нм; переносчики этого вируса неизвестны. В препара-
тах этого вируса, выделенных из растений после инкубации в течение четы-
рех педель, Минк и др. [1223] обнаружили 4 класса частиц, однако полностью
эти фракции охарактеризованы не были. Инфекционностью обладали два
наиболее быстро седиментирующих компонента. В то же время Фултон
[590], используя другое растение-хозяин, нашел в препаратах вируса только
2 компонента. Быстро седиментирующий компонент обнаруживался в боль-
ших количествах и оказался инфекционным. Второй компонент седименти-
ровал несколько медленнее и содержал почти то ясе количество РНК. Этот
компонент сам по себе не был инфекционным, но при его добавлении к более
быстрому компоненту увеличивалось число местных некрозов; степень уве-
личения инфекционности зависела от вида растения-хозяина. При исполь-
зовании Vigna cylindrica Skeels кривая разведения инфекционности для
вируса полосатости табака была необычно крутой, а добавление неинфек-
ционного компонента приводило к заметному увеличению инфекционности.
Для Dolichos biflorus кривая разведения инфекционности имела обычный вид,
а добавление пеинфекциоиного материала сказывалось лишь весьма незна-
чительно.
Вирус деформирующей мозаики гороха
Структура и состав этого вируса изучены недостаточно полно. Известно,
что это мелкий сферический вирус, имеющий частицы диаметром около
30—36 нм [858, 620], передающийся тлей. При фракционировании очищен-
ных препаратов вируса в градиенте плотности сахарозы были обнаружены
два класса нуклеопротеидных частиц с коэффициентами седиментации
«го, w, равными 95 и 115 S [620]. На препаратах, полученных методом негатив-
ного контрастирования, частицы обоих классов сходны между собой по фор-
ме и размеру, хотя 95 S-частицы имеют менее правильные очертания. При
серологическом анализе методом диффузии в геле эти нуклеопротеиды ока-
зались идентичными, однако фракция 115 S образует дополнительную зону
преципитации. Эти исследования показали, что в экстрактах, выделенных
из зараженной растительной ткани, содержится растворимый антиген,
который не осаждается. при высокоскоростном центрифугировании; этот
аптиген родствен, хотя серологически и не идентичен целому вирусу [858].
Инфекционными оказались обе фракции. Однако инфекционность медленно
седиментирующей фракции, обнаруживаемой в гораздо меньшем количестве,
примерно в 4 раза выше инфекциоиности быстрого компонента при одном
и том же значении ОП26о [858]. Судя по спектру поглощения в ультрафиоле-
те, 95 S-компонент содержит несколько меньше РНК, однако точного опре-
деления содержания РНК не проводилось. Данные опытов по смешанному
заражению также отсутствуют в литературе. Вирус деформирующей мозаики
192
Глава VIII
гороха является двухкомпонентным вирусом, но убедиться в этом можно
лишь после того, как удастся добиться достаточно высокой степени очистки
обеих фракций.
Вирус крапчатости конских бобов
В препаратах этого мелкого вируса не удалось обнаружить частицы,
не содержащие РНК или нуклеопротеид с меньшим содержанием РНК.
Однако при центрифугировании очищенного препарата вируса в градиенте
плотности CsCl обнаруживаются два компонента, несколько отличающиеся
друг от друга по плотности [37]. Инфекционностыо обладал только более
плотный компонент, содержание которого в препарате было более высоким.
По составу оснований и по антигенным свойствам эти два типа частиц оказа-
лись очень сходными, если не идентичными. Аронсон и Банкрофт [37] рас-
считали, что в частицах меньшей плотности содержание РНК несколько
ниже (на 2%), нежели в более плотных инфекционных частицах, и что РНК
менее плотных частиц состоит примерно из 2,50 нуклеотидных остатков. Раз-
деление столь близких по плотности компонентов — дело весьма сложное.
Эксперименты с добавлением дефектных частиц с целью повышения ипфек-
циотшости не проводились.
Вирус кольцевой пятнистости табака
Препараты вируса кольцевой пятнистости табака можно разделить
путем центрифугирования в градиенте плотности на три зоны. Инфекцион-
ностыо обладает только нижний компонент с коэффициентом седиментации
s201W, равным 128 S, содержащий 42% РНК. Содержание РНК в среднем
компоненте составляет 28%, в верхнем компоненте РНК не обнаруживается
[1657]. Данных по смешанному заражению с использованием среднего
и нижнего компонентов не имеется. Установлено, что относительные количе-
ства этих трех компонентов изменяются в процессе развития инфекции [1502].
В свою очередь РНК, выделенная фенольным методом из нижнего компонен-
та, при фракционировании в градиенте плотности сахарозы дает два основ-
ных компонента. Быстрый компонент (содержание РНК 20%) имеет моле-
кулярную массу примерно 2,2-10° дальтон и обладает инфекционностыо,
а более медленный компонент (мол. масса ~ 1,2-10°) неиифекционен [458].
РНК, выделенная из среднего компонента, имеет примерно ту же молекуляр-
ную массу, что и меньшая по размерам РНК нижнего компонента, и также
не обладает инфекционностыо.
Вирус кольцевой пятнистости томатов
В препаратах этого мелкого сферического вируса путем центрифугиро-
вания удается обнаружить только два типа частиц: инфекционный нижний
компонент ($2o,w = 126S) и неинфекционные пустые белковые оболочки
(820. w ~ 53 S), серологически идентичные целым вирусным частицам [1655],
Вирус мозаики яблони, передаваемый механически
Itulare apple mosaic virus)
Это сферический вирус, частицы которого имеют диаметр около 33 нм.
В градиенте плотности сахарозы очищенные препараты этого вируса образуют
две фракции, из которых только одна обладает инфекционностыо [590].
Дефектные вирусные частицы, многокомпонентные вирусы и ВС 193
Вирус мозаики дикого огурца
Очищенные препараты этого мелкого сферического вируса удается раз-
делить на три компонента: верхний Та-компонент (s20lW- — 53 S), в котором
отсутствует РНК; верхний Т^-компонент (s20, w = 62,5 S), содержащий 11%
РНК, и нижний В-компонент (а20. w = 419,0 S), содержащий 35% РНК
11950]. Судя по аминокислотному составу, а также по данным электронной
микроскопии и рентгенографического анализа, структурные белки этих
компонентов очень сходны. Наблюдается сходство и по составу оснований
РНК, выделенной из верхнего Tj, и нижнего (В) компонентов, причем в целом
вирусе количество РНК примерно в 6 раз больше, чем во фракции Ть.
Нижний компонент обладает инфекционностыо; опыты по смешанному
заражению двумя РНК-содержащими компонентами, по-видимому, не про-
водились.
Вирус некроза верхушки томатов
Этот сферический вирус, вызывающий кольцевую пятнистость, выделен
из томатов и, по-видимому, не родствен другим вирусам кольцевой пятни-
стости [75]. В очищенных препаратах содержатся три компонента с коэффи-
циентами седиментации з‘2о, равными 52, 102 и 126 S. Смеси 102S- и 126S-
компоиентов отличаются большей инфекционностыо по сравнению с каждым
из компонентов в отдельности.
ВИРУС МОЗАИКИ ЛЮЦЕРНЫ
В очищенных препаратах вируса мозаики люцерны (ВМЛ) содержатся
частицы различных размеров. Исходя из размеров, их делят на несколько
классов, которые можно выявить путем седиментационного [77, 860, 963]
или электронно-микроскопического исследования [619]. Эти компоненты
названы нижним (В), средним (М), верхним «Ь» (Ть) и верхним «а» (Та). Ком-
понент верхний «а» (Та) в свою очередь состоит из двух компонентов
«а» и «о», которые удается разделить лишь с большим трудом. Размеры и состав
этих частиц были определены Келли и Кесбергом [963], а также Раусом
и др. [1402]. Результаты более поздиих исследований структуры этих частиц
[846, 847] обсуждаются в гл. V.
Количества компонентов, определяемых в препаратах ВМЛ, варьируют
в зависимости от штамма вируса и условий выращивания растений. Пептид-
ные карты, полученные после обработки трипсином белка, выделенного
из верхнего и нижнего компонентов, оказались очень сходными [860]. Как
показали Джилласпи и Банкрофт [637], РНК, выделенная из очищенных
иефракционированных препаратов ВМЛ, разделяется на три фракции с раз-
личными константами седиментации [637]. Джилласпи и Банкрофт выделили
инфекционную РНК с константой седиментации 22 S из наиболее быстро
седиментирующей фракции нуклеопротеида (99 S). Они полагают, что РНК
с меньшей молекулярной массой, выделяемые из других частиц, неинфек-
ционны.
Гиббс и др. [619] обнаружили инфекционность у трех различающихся
по размеру классов частиц ВМЛ, однако эти авторы отмечают, что во всех
фракциях, которые они анализировали, содержалось большое количество
длинных частиц. Вуд и Банкрофт [1933] изучили этот вопрос и пришли
к окончательному выводу, что инфекционностыо обладает только нижний
компонент (длинные частицы). Использование для инокуляции смеси ниж-
него и среднего компонентов увеличивало инфекционность.
13-0893
194
Глава VIII
В качестве основного подхода к изучению инфекционности различных
компонентов ВМЛ было использовано перекрестное испытание компонентов
друг с другом. Джаспарс с сотрудниками недавно вновь предприняли иссле-
дование биологической активности частиц ВМЛ. Они использовали РНК,
выделенную из различных фракций (или тотального вирусного препарата),
а не нативные вирусные частицы. Это имело два преимущества. Во-первых,
частицы вирусного нуклеопротеида, содержащие интактную РНК, и частицы,
содержащие фрагментированную РНК, осаждаются при фракционировании
в градиенте плотности сахарозы с одинаковой скоростью. Используя соответ-
ствующим образом обработанную свободную РНК, можно избавиться от
деградированной РНК. Во-вторых, свободные РНК различаются по скоро-
сти седиментации в большей степени, чем интактные частицы, и их раз-
деление путем центрифугирования осуществляется с большей эффектив-
ностью.
Ван Влотен-Дотинг и Джаспарс [183] выделили чистую РНК из верх-
него и нижнего компонентов. Каждый из препаратов этих РНК сам по себе
обладал лишь слабой инфекционностью, однако при их смешивании инфек-
ционность значительно возрастала. Хавранек и Завада [742] нашли, что
кривая разведения инфекционности вируса мозаики люцерны при зараже-
нии огурцов была двухударного типа в отличие от типичной одноударной
кривой, характерной для ВТМ при заражении фасоли.
Ио данным ван Влотен-Дотинга и др. [1837], характер кривой разведе-
ния инфекционности ВМЛ и в самом деле позволяет предположить, что один
некроз вызывается более чем одной вирусной частицей. При испытании
в качестве контроля в тех же условиях вируса некроза табака была полу-
чена одноударная кривая разведения инфекционности (фиг. 21). Эти же-
авторы показали, что препараты РНК, выделенные из нижнего компонента
или из компонента верхний «а», сами по себе не индуцировали или почти
не индуцировали некрозы, однако их смесь обладала инфекционностью.
По-видимому, в препаратах верхнего «а» и нижнего компонентов содержа-
лась небольшая примесь РНК верхнего «Ь» и среднего компонентов (ван Вло-
тен-Дотинг [1835] четко показал, что оба эти компонента необходимы для
заражения). На фиг. 39, А представлены результаты разделения смеси РНК
из верхнего «а» (Та), верхнего «Ь» (Ть) и среднего (М) компонентов в гра-
диенте плотности сахарозы. Инфекционность каждой из этих фракций
по отдельности и смесей по две фракции (в разных комбинациях) была очень-
низкой. Когда смесь РНК из фракций Та и В (выделенных независимо,
совсем в других градиентах) (фиг. 39, А) добавляли к изучавшимся в данном
опыте фракциям, наблюдалось существенное увеличение инфекционности
тех смесей, в которых присутствовали РНК фракций Ть и М (фиг. 39, Б).
Ван Влотен-Дотинг и др. [1837] выделили РНК верхнего «а» и нижнего-
компонентов из двух штаммов ВМЛ (А и Y), которые различаются по симпто-
мам заболевания, проявляющимся на табаке и фасоли. Затем проверяли
инфекционность обеих РНК того и другого штамма во всех возможных ком-
бинациях. Заметное увеличение инфекционности отмечалось даже для
смесей РНК двух штаммов. Более того, из значительной части некрозов,
индуцируемых смесью, содержащей РНК Та-компонента одного штамма-
и В-компоиента другого штамма, удавалось выделить штаммы с новой комби-
нацией симптомов, которые сохранялись при последовательном пассиро-
вании вируса через некроз. Показано, что эти новые штаммы серологически
идентичны тому родительскому штамму, который был донором РНК Та-ком-
понента. РНК, выделенные из В-компоиентов родительских штаммов, суще-
ственно различались по скорости седиментации. Скорость седиментации РНК
из В-компопента новых штаммов была такой же, как и у РНК пижпего
компонента, входившей в исходную смесь.
Дефектные вирусные частицы, многокомпонентные вирусы
и ВС 195
Фиг. 39. Опыт, демонстрирующий необхо-
димость верхнего (Т],) н среднего (М) ком-
понентов вируса мозаики люцерны (ВМЛ)
для проявления его ипфекциоппостп
Приводится иифекциопность фракций РНК ВМЛ,
полученных поело фракционирования и градиенте
плотности сахарозы, а также инфекционность
смесей этих фракций. Инфсиционпость фракций
представлена в квадратах. Каждый квадрат
в верхнем ряду соответствует одной фракции.
Квадраты, расположенные ниже, соотвстстпуют
смеси рапных объемов двух фракций. Точками
покапано среднее число местных некрозов на пяти
половинках листьев фасоли. А. Инфекционность
ГИК верхнего (Т])) и среднего (М) компонентов;
смесь равных объемов каждой фракции разводи-
ли в таком же объеме буфера. Б. Инфекционность
тех же фракций и смесей фракций, что и в А,
с той разницей, что здесь вместо буфера добав-
ляли равный объем смеси РНК компонентов Та
и В. Сама по себе смесь этих двух РНК (Та+В)
в данном опыте была неинфекциопной.
Были также проведены опыты, в которых РНК верхнего «а» и ниж-
него компонентов нового штамма смешивали in vitro с соответствующей
РНК верхнегоТ а или нижнего компонента, выделенной из родительских штам-
мов. Заражение этими смесями приводило к образованию изолятов, неотличи-
мых от исходных, родительских штаммов. Таким образом, в период репли-
кации, зависящей от РНК другого штамма, РНК компонентов Та и В не изме-
няется раз и навсегда. Эксперименты, в которых смешивали компоненты
Ti, и М, показали, что при заражении этой смесью тип симптомов также
может меняться [1835]. Майорана и Поль [1137] проводили сходные опыты,
в которых смешивали компоненты, выделенные из других штаммов этого
вируса.
Ван Влотен-Дотинг и др. [1837] предлагают следующее объяснение
полученным результатам. Компоненты Тп, Тъ, М и В взаимозависимы нри
репликации. Каждый компонент содержит какую-то часть полного вирус-
ного генома. Родственные штаммы могут обмениваться гомологичными фраг-
ментами, что ведет к появлению нового штамма с новой комбинацией свойств.
Тот факт, что белковая оболочка обоих компонентов новых штаммов имеет
серологическую специфичность, характерную для компонента Та, согла-
суется с данными более ранней работы [1827], свидетельствующими о том,
что цистрои структурного вирусного белка содержится в верхнем компо-
ненте «а». РНК этого компонента имеет достаточно большие размеры, чтобы
кодировать несколько белков, ответственных за разные признаки, которые
13*
196 Глава VIII
в штамме, полученном при смешивании компонентов, контролируются, как
известно, компонентом Та. К этим признакам относятся симптомы, прояв-
ляющиеся на растениях табака, и соотношение компонентов в вирусном
препарате. Эта система отличается от описанной выше системы вируса
погремковости табака тем, что РНК нижнего компонента сама по себе,
по-видимому, совершенно инертна. Никакой замаскированной инфекции
или репликации свободной РНК нижнего компонента обнаружить не удалось.
ВИРУС НЕКРОЗА ТАБАКА (ВНТ)
И ВИРУС-САТЕЛЛИТ (ВС)
Строение этих двух вирусов обсуждается в гл. V, а их передача грибами
Olpidium — в гл. VI. Здесь мы рассмотрим их основные свойства и взаимо-
действие в растении.
Зависимость ВС от ВНТ
Существуют многочисленные штаммы вируса некроза табака. Следует
отметить, что вопрос о том, какие вирусы следует относить к этой группе,
часто сопряжен с известными трудностями. Были выявлены два серотипа
ВНТ, каждый из которых включает несколько штаммов [54]: серотип А,
к которому относятся штаммы А, В, С и S, и серотип D, к которому отно-
сятся штаммы D и Е. Эти 6 штаммов отличаются друг от друга по симптомам,
которые они вызывают, и по некоторым другим признакам. Сравнительно
недавно Уемото и др. [1803] описали 11 изолятов ВНТ, в числе которых
они идентифицировали 8 родственных, но серологически различающихся
штаммов. Каких-либо четких различий между штаммами, относящимися
к серотипам А и D, выявить не удалось, так как при использовании различ-
ных антисывороток результаты варьировали от опыта к опыту. Вирус некроза
табака поражает широкий круг растений-хозяев (приблизительно 88 видов,
относящихся к 37 семействам). На многих растениях этот вирус вызывает
появление местных некрозов, однако лишь немногие заболевания имеют
большое экономическое значение.
Был изучен очищенный препарат изолята ВНТ [1337] и выделено три
компонента с различными константами седиментации (50, 116 и 240 S).
Что представляют собой эти компоненты, пока не вполне ясно, однако, судя
по данным, полученным Кассанисом с сотрудниками, вирусом некроза табака
является компонент с константой седиментации 116 S. Компонент с констан-
той седиментации 50 S оказался другим вирусом, названным Кассанисом
[937] вирусом-сателлитом. Материал, составляющий фракцию 240 S, пред-
ставляет собой сложные агрегаты, состоящие каждый из 12 частиц вируса-
сателлита, правильно соединенных друг с другом [948, 949]. С помощью
электронно-микроскопического исследования показано, что эти агрегаты
могут образовывать более крупные структуры, в частности димеры (23 части-
цы) и тримеры (34 частицы) [954].
При анализе различных изолятов ВНТ, полученных как из естественно
зараженных растений, так и при заражении растений экстрактами из
отдельных некрозов, было обнаружено, что некоторые из них содержат
только крупные частицы (ВНТ). В других изолятах содержалась смесь
мелких и крупных частиц (10—100 мелких на 1 длинную). Изоляты, состоя-
щие только из одних мелких частиц, обнаружены не были. Путем центрифу-
гирования в градиенте плотности сахарозы и электрофореза было обнаружено
два класса серологически неродственных частиц. Препараты, состоящие
Дефектные вирусные частицы, многокомпонентные вирусы и ВС 197
из мелких частиц, сами по себе были иеинфекциояны, однако вызывали забо-
левание при смешивании с некоторыми штаммами ВНТ. Частицы, образуе-
мые в результате смешанного заражения, состояли в основном из вируса-
сателлита [937, 948, 949]. Некоторое время считалось, что существует только,
один штамм ВС, однако в I960 году Кассанис [939] описал два штамма, а еще
через два года появилось сообщение о существовании трех серологически
различных штаммов ВС [1803].
Все попытки доказать возможность самостоятельной репродукции ВС
оказались безуспешными. Несмотря на то что такие негативные результаты
никогда не могут быть абсолютно убедительными, все же представляется
вероятным, что ВС действительно неспособен к репликации в отсутствие
ВНТ. Это подтверждается тем фактом, что в природных условиях, напри-
мер с помощью гриба Olpidium, ВС передается только совместно с ВНТ
Специфичность взаимосвязи между ВС и ВНТ
Было испытано большое число вирусов, серологически отличных от ВНТ,
однако ни один из них не обладал способностью поддерживать размноже-
ние ВС. В пределах группы ВНТ существуют многочисленные штаммы, раз-
личающиеся по способности активировать ВС, оцениваемой по количеству
ВС, продуцируемого в инокулированпых листьях. На табаке и фасоли наи-
более эффективным оказался штамм В, а наименее эффективным — штамм Е.
Штамм D, который по своим серологическим и другим свойствам сходен
со штаммом Е, вообще не активировал ВС [939]. Кассанис описал еще один
штамм ВС (ВС2), который серологически в значительной степени отличался
от исходного штамма (BCi). Он обнаружил, что как ВС*, так и ВС2 активи-
руются штаммами ВНТ, относящимися к обоим серотипам, однако антиген-
ная специфичность ВС пе зависит от ВНТ.
Гроган и Уемото [681] описали изолят ВНТ АС36, относящийся к серо-
типу D, который комплементирует с определенным природно связанным
с ним штаммом ВС, по не взаимодействует с другим штаммом, который свя-
зан с ВНТ, относящимся к серотипу А. Эти два штамма ВС серологически
пе родственны друг другу. Изучалась также связь между 11 изолитами
ВНТ и тремя серологически различными штаммами ВС [1803]. Два из них
активировались семью из одиннадцати изолятов ВНТ, а третий — четырьмя
остальными. Способность изолятов ВНТ активировать штаммы ВС ле корре-
лировала со степенью серологического родства. Эти результаты подтвер-
ждают данные, полученные в более ранней работе [54], в которой было пока-
зано, что все штаммы ВНТ, отнесенные к группе А, активировали штамм ВСЪ
который активировался также одним штаммом из группы D. Грогану и Уемо-
то [681] ие удалось полностью очистить некоторые культуры ВНТ от соот-
ветствующего вируса-сателлита при помощи многократного ультрацентри-
фугирования в градиенте плотности сахарозы с последующим повторным
проведением культуры через единичный некроз. Освободить такие культуры
от ВС легче в том случае, если фракционировать пе целый вирус, а препарат
свободной РНК (Гроган, личное сообщение).
Последовательность событий в инокулированном листе
Присутствие ВС в инокулуме, содержащем ВНТ, может влиять на раз-
мер и число продуцируемых некрозов, а также на урожай ВНТ. При исполь-
зовании для заражения растений табака и фасоли смешанного инокулума
размеры некрозов меньше, чем при заражении препаратами, содержащими
198
Глава VIII
только ВНТ. В мелких некрозах присутствует как ВИТ, так и ВС [949].
При увеличении относительного содержания ВС в инокулуме число мелких
некрозов возрастает до тех пор, пока число таких некрозов не будет состав-
лять 100%. Отношение ВС к ВНТ, при котором число мелких некрозов
составляет 50%, зависит от вида растения и условий, в которых оно выращи-
вается. Для каждого данного соотношения ВС и ВНТ разведение инокулума
приводит к увеличению относительного числа крупных некрозов. По-види-
мому, это объясняется тем, что при разведении препарата снижается вероят-
ность двойного заражения. Этот эффект был использован для изучения
последовательности событий, имеющих место в листе после инокуляции.
Если один и тот же лист инфицировать этими двумя вирусами по отдельно-
сти, то результат зависит от очередности введения вирусов и от времени
между инокуляциями. Мелкие некрозы образуются в том случае, если иио-
кулировать ВС после ВНТ с интервалом менее 5 ч. При обратном порядке
заражения время может достигать 5 сут. Следовательно, ВС способен довольно
долго сохраняться в листе в потенциально активном состоянии [939].
РНК, выделенная из ВС, сама по себе в листе не размножается. Размноже-
ние происходит только тогда, когда в инокулуме присутствует ВНТ или
его РНК. Для того чтобы при заражении с помощью РНК ВС получить
некрозы меньших размеров, инокуляцию ВНТ следует проводить не позднее
чем через 1 ч после инокуляции РНК ВС. Это, вероятно, связано с тем, что
РНК ВС в растении быстро разрушается. Когда отношение ВС к ВНТ боль-
ше, чем необходимо для того, чтобы количество мелких некрозов составляло
100%, общее число некрозов может уменьшаться (фото 34).
Природа взаимодействия между ВС и ВНТ
Вероятно, вирус-сателлит сам кодирует свой собственный структур-
ный белок, так как серологически он не родствен ВНТ. В растениях, зара-
женных ВНТ, не удалось обнаружить антигены, которые были бы сероло-
гически родственны ВС [1413], однако результаты опытов нельзя считать
окончательными, так как свободные белковые субъединицы могут и не реа-
гировать с антисывороткой, специфичной в отношении интактного вируса.
Более веским доводом в пользу предположения, что ВС кодирует специфиче-
ский структурный белок, служит отсутствие серологической связи между
ВС и BITT, как отмечалось выше, хотя ВНТ и способствует репликации
вируса-сателлита. Кларк и др. [376] поставили эксперименты, в которых
использовали РНК ВС в качестве матрицы для белкового синтеза в бесклеточ-
ной системе из Е. coli. Анализ пептидов триптического гидролизата продук-
тов синтеза in vitro показал, что при этом образуется материал, сходный
со структурным белком ВС.
Другие вирусы растений содержат РНК, кодирующие несколько виру-
соспецифичных белков. По-видимому, можно не сомневаться в том, что
зависимость вируса-сателлита от ВНТ обусловлена малыми размерами пер-
вого. В гл. V говорилось о том, что РНК ВС содержит достаточно информа-
ции для кодирования структурного белка ВС и, возможно, еще одного виру-
соспецифичного белка. Результаты, полученные Харуна и Спигелманом [737]
в работе с двумя РНК-содержащими бактериофагами, показали, что вирус-
ная РНК-полимераза является высокоспецифичным ферментом. Эти авторы
обнаружили, что РНК ВС непригодна в качестве матрицы для двух выделен-
ных ими РНК-полимераз. Таким образом, на основании имеющихся данных
можно заключить, что, вероятнее всего, ВС кодирует как собственную РНК-
полимеразу, так и собственный структурный белок.
Дефектные вирусные частицы, многокомпонентные вирусы и ВС 199
ОБСУЖДЕНИЕ
В настоящее время ясно, что наличие в очищенных вирусных препаратах
частиц более чем одного типа является не исключением, а правилом.
Хотя морфологически: различные классы частиц, продуцируемые раз-
ными вирусами, кажутся сходными, они могут различаться по происхожде-
нию и функциям. Здесь еще очень многое остается выяснить, однако на осно-
вании всего того, что нам уже известно о палочкообразных и икосаэдриче-
ских вирусах, можно, по-видимому, сделать вывод о существовании трех
•основных типов взаимосвязи между различными классами частиц.
Многокомпонентные вирусы
У вирусов погремковости табака, мозаики коровьего гороха и, возмож-
но, крапчатости бобов фасоли полный геном, вероятно, заключен в двух раз-
личных частицах, причем необходимое условие репродукции вируса — при-
сутствие обеих частиц при заражении. Вирус мозаики люцерны состоит,
ло-видимому, из четырех (а возможно, из пяти) частиц. Несомненно, будут
найдены и другие многокомпонентные вирусы. В частности, известно, что
в препаратах вируса штриховатой мозаики ячменя содержатся частицы, трех
типов, различающиеся по длине; однако эти различия настолько незначитель-
ны, что удовлетворительного разделения осуществить пока но удалось.
Весьма вероятно, что препараты некоторых вирусов, состоящие как будто
бы из частиц одного типа, в действительности содержат два класса зависи-
мых друг от друга частиц, которые нельзя разделить известными в настоящее
время физическими способами. Частицы, составляющие все описанные
выше многокомпонентные вирусы, различаются по размерам (молекулярной
массе) и по количеству РНК. По составу оснований РНК различные частицы
•одного вируса сходны, но не обязательно идентичны. Доказано, что РНК
малых частиц вируса погремковости табака и малых частиц вируса мозаики
люцерны содержит цистрон структурного белка, который используется дру-
гими частицами. Это вполне достаточная, хотя, возможно, и не единственная
причина зависимости крупных частиц от малых.
Размеры молекул РНК малых частиц достаточно велики, для того чтобы
•обеспечить кодирование по крайней мере одного или двух белков помимо
•структурного белка. Оффорд [1283], в частности, рассчитал, что длинные
частицы Голландского штамма вируса погремковости табака содержат около
7100 нуклеотидов, тогда как короткие частицы содержат около 2400 нуклео-
тидов. Белок этого вируса состоит из 218 аминокислот [1284], для синтеза
которых требуется всего 654 нуклеотида. Вероятно, РНК крупных частиц
кодирует РНК-полимеразу, поскольку известно, что эти частицы сами
по себе способны инициировать синтез вирусной РНК. Значит, у этой груп-
пы вирусов короткие частицы зависят от крупных, так как только последние
кодируют РНК-полимеразу. Вполне возможно, что РНК длинных частиц
ответственна за несколько функций и при этом дублирования функций
не происходит, так что синтез частиц одного класса полностью зависит
от информации, которая содержится в РНК частиц другого класса.
Имеющиеся результаты свидетельствуют о том, что у многокомпонент-
ных вирусов РНК разных частиц синтезируются в клетке независимо друг
от друга. Инфекционная РНК длинных частиц вируса погремковости табака
может синтезироваться в отсутствие коротких частиц. Ван Каммен [1822]
обнаружил, что количества среднего и нижнего компонентов вируса мозаики
коровьего гороха возрастают с разной скоростью и что в препаратах нуклеи-
новой кислоты, выделенных из больных растений, присутствуют двухцепочеч-
ные РНК двух различных размеров [1817]. Остается выяснить, используют
200
Глава, VIII
ли все РНК многокомпонентного вируса РНК-синтетазу, кодируемую одной
из этих РНК. Если это так, то, вероятно, у всех у них имеется одинаковый
«участок узнавания», взаимодействующий с РНК-полимеразой.
Такое распределение генетического материала между несколькими
компонентами должно иметь какое-то преимущество для выживания. Вероят-
нее всего, преимущество подобной многокомпонентной системы заключается
в ее большей генетической гибкости по сравнению с вирусами, у которых
весь генетический материал заключен в одном фрагменте. Известно, что
у некоторых РНК-содержащих вирусов животных, в частности у реовиру-
сов (гл. IV) и вируса гриппа [433], РНК заключена внутри одной вирусной
частицы в виде нескольких фрагментов. Многокомпонентные вирусы расте-
ний можно рассматривать как своего рода морфологический вариант такой
системы, т. е. системы, в которой генетический материал разделен на несколь-
ко фрагментов. У вирусов, для которых характерно присутствие нескольких
фрагментов РНК в одной частице, вероятно, происходит перераспределение
генетического материала в процессе репликации. Кроме того, у таких вирусов
возможны отбор и перераспределение генетического материала также па дру-
гих стадиях жизненного цикла, например при передаче вируса, его проник-
новении в клетку и в процессе перемещения по растению.
В опытах ван Влотен-Дотипга [1837] показано, что при смешивании
верхнего компонента «а» одного штамма вируса мозаики люцерны и нижнего
компонента другого штамма этого вируса могут возникать новые «штаммы»;
кроме того, было показано [1835], что на симптомы заболевания могут ока-
зывать влияние частицы всех четырех классов. При смешанном заражении
двумя штаммами, каждый из которых содержит четыре класса частиц,
имеется возможность для возникновения 16 различных комбинаций. Благода-
ря этому при изменении условий в данном растении-хозяине может произой-
ти быстрая адаптация. Если это постоянное свойство данной системы, то сле-
дует ожидать, что в природе часто имеют место инфекции, при анализе
которых возможно обнаружить смесь штаммов, возникших отнюдь не в
результате недавних мутаций.
Недавно Листер (личное сообщение) сообщил, что различные расте-
ния-хозяева могут избирательно поддерживать репликацию частиц сред-
него компонента отдельных штаммов вируса погремковости табака в том
случае, когда их инокулируют совместно. Листер заражал разные растения
эквивалентными количествами слабого и сильного Орегонского штамма,
а затем определял, какая часть общего количества частиц среднего компо-
нента продуцируется каждым штаммом. Например, в препарате вируса,
выделенного из N. clevelandii, частицы среднего компонента составляли 71%;
из них 63% приходилось на долю слабого штамма и 8% — на долю сильного.
В случае Petunia hybrida частицы среднего компонента составляли 59%;
из них на долю слабого штамма приходилось 33 %, а на долю сильного — 26%.
Возможно, многокомпонентность имеет и другие преимущества. Разде-
ление генома на фрагменты может играть некоторую положительную роль
при инициации ранних событий вирусной репликации внутри клетки в том
случае, если разные функции осуществляются в разных участках.
Вероятно, эволюция вирусов частично связана с увеличением или умень-
шением количества генетической информации.
Геометрические ограничения, накладываемые иа процесс построения
икосаэдрической белковой оболочки из субъединиц, приводят к тому, что.
возможные размеры оболочки, которую вирус может образовать из одного'
и того же или очень близких структурных белков, примерно одинаковы.
Некоторые икосаэдрические двухкомпонентные системы могут представлять
собой вирусы, находящиеся в промежуточной стадии увеличения или умень-
шения размера, предшествующей образованию новой белковой оболочки,
Дефектные вирусные частицы, многокомпонентные вирусы и ВС 201
в которую будет упакован весь генетический материал. Однако, как показали
недавно Хиберт и др. [775], у различных икосаэдрических вирусов РЫК,
заключенные в белковые оболочки, могут весьма значительно различаться
по размерам.
Вирус мозаики люцерны передается тлями при проколе растительной
ткани, так что представляется весьма сомнительным, чтобы распределение
генетического материала между несколькими частицами было связано
с какой-то специальной функцией в организме насекомого. Что касается
вирусов группы погремковости табака, которые передаются нематодами,
то здесь взаимоотношения вируса с переносчиками не до конца ясны. Вирусы
этой группы представляют собой жесткие палочки, диаметр которых значи-
тельно превышает диаметр частиц ВТМ. Палочкообразные частицы вирусов
группы погремковости табака очень лабильны и разламываются в организме
нематоды или в растении. В данном случае наличие двухкомпонептиой систе-
мы молото рассматривать как приспособление, позволяющее избежать
последствий многочисленных беспорядочных поломок вирусных частиц.
Отрицательное свойство многокомпонентной системы, по крайней мере
теоретически, заключается в том, что уменьшается вероятность успешного
заражения, так как две или большее число частиц должны, по-видимому,
вводиться совместно в одну и ту же клетку или в соседние клетки, связанные
плазмодесмами. Чтобы индуцировать образование одного некроза, для виру-
са, подобного ВТМ, требуется около 104—105 частиц. В случае вируса мозаи-
ки коровьего гороха, у которого для заражения необходимо присутствие
частиц двух типов, эта величина повышается до 10°—108, а в случае вируса
мозаики люцерны, состоящего, по-видимому, из частиц четырех типов,—
до 10s—1010 [1835]. Это явное затруднение, видимо, компенсируется тем,
что концентрация многокомпонентных вирусов в зараженных растениях
бывает очень высокой и путем механической инокуляции или с помощью
беспозвоночных-переносчиков передается большое число частиц.
Открытие группы многокомпонентных вирусов создает возможность
использования генетических методов для более детального изучения струк-
туры и функции вирусов растений. Дополнительные данные, касающиеся
функций, которые обеспечиваются частицами двух классов, могут быть
получены при использовании в качестве мутагена азотистой кислоты. Так,
если наши предположения верны, то обработка азотистой кислотой коротких
частиц вируса погремковости табака должна привести к образованию мутан-
тов по структурному белку как среди коротких, так и среди длинных частиц
этого вируса, тогда как в результате обработки длинных частиц должны
появиться другие типы мутантов, в частности мутанты, чувствительные
к температуре in vivo вследствие дефектности РНК-полимеразы.
Вирусы-сателлиты
Вирусы-сателлиты, связанные с вирусом некроза табака, по-видимому,
представляют крайнюю форму паразитизма. Система ВС — ВНТ отличается
от двухкомпонентных вирусов в нескольких отношениях. Структурный
белок ВС, вероятно, не родствен белку BITT; в то же время ВНТ является
автономным вирусом, независимым от ВС.
Дефектные вирусные частицы
Пустые белковые оболочки, не содержащие РНК, которые присутствуют
в препаратах многих вирусов, не вносят никакого генетического вклада
в их репликацию. Некоторые частицы, содержащие часть целой РНК или
целую, но неинфекционную РНК, также, видимо, не могут оказывать на нее
202
Глава VIII
никакого влияния. Например, нуклеопротеиды вируса желтой мозаики
турнепса (Воо, Во и В2) или РНК, выделенные из них, не увеличивают инфек-
ционное™ компонента В;. По-видимому, для этих дефектных частиц имеется
четыре возможных способа образования.
Этапы созревания (сборки) вируса
Большинство описанных выше неполных частиц нельзя рассматривать
как продукты промежуточных стадий сборки полного вируса. Исключение,
возможно, составляют лишь короткие фрагменты вирусного белка, обнару-
живаемые в препаратах ВТМ, частицы ВТМ длиной менее 300 нм (их срав-
нительно немного в препаратах) и сходные сними частицы, найденные в пре-
паратах других вирусов со спиральной структурой.
Продукты деградации вирионов
Поскольку при кратковременном введении меченого материала в непол-
ные частицы вируса желтой мозаики турнепса включается больше радио-
активных предшественников, чем в интактный вирус, предположение, что
эти неполные частицы являются продуктами деградации интактного вируса
in vivo, представляется неправдоподобным. С этим выводом согласуется
и то обстоятельство, что инактивация ВЖМТ in vivo путем повышения
температуры не приводит к увеличению числа неполных частиц.
Ошибки при синтезе вируса
Неполные частицы, обнаруживаемые в препаратах некоторых вирусов,
возможно, возникают как следствие ошибок на стадии сборки частиц или
образуются в результате синтеза большего числа белковых субъединиц, чем
это необходимо для того, чтобы покрыть синтезированную РНК. Обработка
2-тиоурацилом блокирует синтез РНК ВЖМТ и значительно стимулирует
синтез пустых белковых оболочек. Дефектные нуклеопротеиды, содержащие
неполные молекулы РНК, могут образовываться в том случае, когда субъеди-
ницы структурного белка упаковываются вокруг не до конца синтезирован-
ных или частично деградированных молекул вирусной РНК. Беспорядочная
частичная деградация или синтез РНК едва ли может привести к образова-
нию вполне определенных по размерам классов частиц, состоящих в основ-
ном из не полностью сформированных нуклеопротеидов. Возможно, в зара-
женной клетке фрагменты вирусной РНК используются в качестве информа-
ционной РНК с тем же успехом, что и полные молекулы РНК, и что некото-
рые из них одеваются в белковую оболочку.
Возможные сателлитные системы
Казалось бы, нет причин, исключающих использование вирусами-сател-
литами структурного белка вируса-помощника. Такая система будет отли-
чаться от многокомпонентного вируса тем, что репликация каждого компо-
нента системы протекает совершенно независимо. Не исключена также
возможность существования многокомпонентных вирусов-сателлитов. Такой
многокомпонентный вирус-сателлит, способный использовать тот же, струк-
турный белок, что и вирус-помощник, следует попытаться обнаружить
в препаратах вирусов с дефектными частицами неизвестной функции.
ГЛАВА IX
СИМПТОМЫ ВИРУСНЫХ БОЛЕЗНЕЙ
Вирусы приобретают экономическое значение в том случае, если они
вызывают значительные нарушения нормального роста растений. В экспе-
риментальных исследованиях возможность наглядно показать биологическую
активность вируса обычно определяется появлением симптомов заболевания
в той или иной форме. Изучение таких симптомов имело особенно большое
значение в ранних вирусологических исследованиях еще до того, как вирусы
были выделены и охарактеризованы как возбудители болезни. Поскольку
иа проявление симптомов заболевания, вызываемого каждым данным виру-
сом, оказывают заметное влияние многие факторы, что не всегда можно уста-
новить, идентификация и классификация вирусов, основанная на симпто-
матологии, приводит часто к большим недоразумениям.
Используемые обычно названия вирусов включают в качестве составной
части термин, отражающий существенные признаки заболевания, вызывае-
мого вирусом на основном растении-хозяине, и (или) название вида расте-
ния, из которого данный вирус был впервые выделен. Существует обширная
литература, описывающая болезни, вызываемые вирусами. Большая часть
ранних данных суммирована Смитом [1627], а более поздние обзоры в этой
области опубликованы Босом [222] и Холмсом [824]. Некоторые вирусы при
соответствующих условиях инфицируют растения, не вызывая каких-либо
явных симптомов заболевания, тогда как заражение другими вирусами
может приводить к быстрой гибели всего растения. Между этими крайними
проявлениями инфекции наблюдается широкий спектр симптомов заболе-
вания различных типов. В этой главе мы рассмотрим некоторые из обычных
и наиболее интересных типов заболеваний, вызываемых вирусами.
МАКРОСКОПИЧЕСКИЕ СИМПТОМЫ
Местные симптомы
Местные поражения, появляющиеся иа листе вблизи участка инокуля-
ции, обычно не имеют экономического значения, однако играют чрезвы-
чайно важную роль в биологическом определении вирусов (гл. II). Инфици-
рованные клетки могут оказаться лишенными хлорофилла и других пигмен-
тов, что приводит к образованию хлоротических местных поражений
(фото 35, А). Эти участки могут быть почти бесцветными или только несколь-
ко более бледными, чем остальная, зеленая часть листа. При некоторых
заболеваниях, таких, например, как вызываемые вирусом кустистой карли-
ковости, в пораженных участках на более старых листьях томатов содержит-
ся больше хлорофилла, чем в окружающих тканях. Во многих системах
вирус — растение инфицированные клетки отмирают, образуя, таким обра-
зом, некротические местные поражения, причем поражения этого типа
могут затрагивать различные по площади участки — от очень мелких,
размером с острие булавочной головки, до беспорядочно распространяю-
щихся участков большой площади (фото 35, Б, В; цветная вклейка 1).
Местные поражения третьего типа — кольцевая пятнистость —, имеют форму
204
Глава IX
округлых пятен, причем в центре пятна вблизи инокулированного участка
располагается группа отмерших клеток. Кроме того, при этом типе заболе-
вания отмершие клетки образуют одну или более концентрических окруж-
ностей, между которыми находится нормальная зеленая ткань (фото 35, Б).
В некоторых случаях концентрические окружности носят хлоротичный,
а не некротический характер. Ряд вирусов у определенных растений-хозяев
не вызывает видимых поражений в интактных листьях, и скрытые, так
называемые «крахмальные поражения» обнаруживаются лишь в результате-
обесцвечивания листьев этанолом и окрашивания иодом.
Вирусы, вызывающие местные поражения при механической инокуля-
ции листьев, могут не образовывать их при другом способе заражения.
Например, вирус желтухи сахарной свеклы при механической инокуляции
Chenopodium capitatum вызывает некротические местные поражения, а если
заражение осуществляется с помощью тлей Myzus persicae, питающихся
содержимым паренхимных клеток, поражения этого типа не возникают.
Симптомы системного поражения
В настоящем разделе суммированы данные относительно основных
типов симптомов, возникающих при системной вирусной инфекции. Необ-
ходимо иметь в виду, что при определенных заболеваниях эти различные-
симптомы часто сопутствуют друг другу и что в ряде других случаев разви-
тие заболевания сопровождается последовательной сменой симптомов раз-
личного типа.
Задержка роста
Задержка роста является наиболее часто встречающимся симптомом,
характерным для вирусной болезни (см., например, фото 36 и 69). Вероятно,
даже в условиях «маскированной», или «латентной», инфекции, когда инфи-
цированные растения не обнаруживают явных признаков заболевания,
обычно наблюдается какая-то незначительная задержка в росте. Например,
умеренные штаммы Х-вируса картофеля, инфицирующие картофель в поле,
могут не вызывать заметных симптомов заболевания, и лишь специально
и тщательно проведенные эксперименты показывают, что урожай клубней
при этом снижается на 5—10%. Степень задержки роста обычно коррели-
рует со степенью выраженности других симптомов, особенно в тех случаях,
когда листья растения оказываются лишенными хлорофилла.
В некоторых случаях вирусная инфекция может приводить к более
или менее равномерной задержке роста всех органов растений, включая
листья, цветки и плоды, а также к укорачиванию черешков и междоузлий.
В ряде других случаев рост одних органов может замедляться в значительно
большей степени, чем других. Например, при мелкоплодное™ вишни плоды
ее остаются мелкими в результате уменьшения числа клеточных делений,
листья же продолжают расти достаточно хорошо. Снижение урожая плодов
является обычным симптомом вирусных болезней и имеет важное экономи-
ческое значение. Это снижение урожая обусловлено, вероятно, уменьшением
как размеров, так и количества образующихся плодов. При некоторых
заболеваниях, например при заболевании, носящем название карликовости
сливы, количество образующихся плодов сильно уменьшается, тогда как
размер их больше, чем в норме. Описан один интересный пример, когда
урожай плодов с деревьев, которые были здоровыми в момент цветения, ока-
зался меньше обычного. Такой урожай плодов наблюдался на вишне, кото-
рая была опылена пыльцой с деревьев, зараженных вирусом желтухи
вишни [1880].
Симптомы вирусных болезней 205
Мозаика и аналогичные симптомы
Один из наиболее часто наблюдаемых симптомов вирусного заболева-
ния — это появление на инфицированных листьях чередующихся светло-
и темно-зеленых участков, образующих мозаичный узор. Характер этого
узора в деталях широко варьирует при различных сочетаниях растений-
хозяев и вирусов. У двудольных растений участки листа, образующие мозаич-
ный узор, обычно имеют неправильные контуры и для них характерны только
два оттенка одного цвета (например, темно-зеленый и бледно-зеленый или
желто-зеленый). Именно так часто обстоит дело при заражении растений
табака ВТМ. В других случаях, например при заражении китайской капу-
сты ВЖМТ, мозаичный узор может быть образован несколькими различными
оттенками зеленого или желтого цвета. Границы между участками различ-
ного цвета могут быть в этом случае резкими, и такого рода вирусные болезни
напоминают мозаику, развивающуюся в результате генетически обусловлен-
ной аномалии хлоропластов (фото 65). Хорошим примером заболевания
такого типа может служить инфекционный хлороз абутилона. При зараже-
нии китайской капусты ВЖМТ развивается мозаичное заболевание, которое
по характеру четко очерченных границ между участками также напоминает
генетически обусловленную пестролистность (фото 37).
Границы между темными и светлыми участками могут быть и расплыв-
чатыми; если при этом различные участки лишь слегка различаются по интен-
сивности окраски, то мозаичная пестрота становится почти незаметной (как
это, например, имеет место при заболеваниях, вызываемых умеренными штам-
мами Х-вируса картофеля). При заражении травянистых растений обычно
наблюдается определенная последовательность в развитии системных мозаич-
ных симптомов. Вирус из инокулированного листа перемещается в растущий
побег и в еще не полностью развернувшиеся листья. В этих листьях первым
обнаруживаемым симптомом заболевания обычно является «посветлеиие»
или пожелтение жилок; этот симптом может быть выражен очень слабо
или же настолько сильно, что контуры сети жилок становятся поразительно
контрастными (фото 38, А). При некоторых вирусных инфекциях посветле-
ние жилок может сохраняться как основной симптом в ходе всего заболе-
вания.
На инфицированных листьях, уже прошедших стадию клеточного деле-
ния в ходе их развития (длина листьев растений табака и китайской капу-
сты в этот период составляет примерно 4—6 см), мозаика не развивается,
и такие листья оказываются равномерно окрашенными и более бледными,
чем в норме. В старых листьях с симптомами мозаики на основном, более
•светлом фоне обнаруживается большое количество мелких островков темно-
зеленой ткани. В ряде случаев мозаичные участки могут быть приурочены
к наиболее молодым частям листовой пластинки, т. е. к ее основанию и цен-
тральной части листа. В следующих друг за другом системно инфицирован-
ных молодых листьях количество мозаичных участков становится в среднем
все меньше и меньше, тогда как их размер увеличивается, однако у различ-
ных растений можно наблюдать и значительные отклонения от этой общей
закономерности. Характер мозаики определяется на какой-то очень ранней
стадии развития листа и может оставаться неизменным в течение большей
части его онтогенетического развития, за исключением того, что мозаичные
участки всегда увеличиваются в размерах. При некоторых мозаичных забо-
леваниях темно-зеленые участки оказываются связанными в основном с жил-
ками, что придает листу характерный вид (фото 38, Б).
У однодольных обычным симптомом вирусной болезни является образо-
вание полос, или штрихов, имеющих более светлый оттенок по сравнению
с окружающими тканями. Цвет их варьирует от светло-зеленого до желтого
206
Глава IX
или белого, и эти более или менее нерегулярные полосы или штрихи распо-
лагаются параллельно длинной оси листа (фото 39).
Развитие заболевания типа полосатости у однодольных следует той же
общей схеме, что и при мозаичности у двудольных. На одном или нескольких
листьях, расположенных выше инокулированного листа, которые уже пол-
ностью развернулись в момент инфицирования, полосы не появлялись.
На листе, первым обнаружившем штриховатость, симптомы появлялись
слабо и наблюдались лишь в базальной (молодой) части листовой пластинки.
В более молодых листьях полосы обычно больше и распространены по всей
поверхности листа. Характер полосатости определяется, по-видимому,
на ранней стадии развития листа и в основном остается неизменным в течение
почти всего периода его жизни. Пожелтевшие участки листа с возрастом
могут некротизироваться.
Мозаичность и полосатость листьев часто сопровождаются пестро-
лепестностью лепестков цветка. Нарушение окраски возникает вследст-
вие появления пятен, полос или секторов ткани, окраска которых отли-
чается от нормальной (фото 40). Это изменение часто происходит в резуль-
тате исчезновения антоцианинов, что приводит к тому, что выявляется не обна-
ружившаяся ранее окраска, определяемая пигментами пластид. В некоторых
случаях, как, например, при заражении вирусом локальной пигмента-
ции (color-adding) тюльпанов, наблюдается увеличение степени пигмента-
ции некоторых участков лепестков.
Инфицированные цветки обычно мельче нормальных и часто вянут
раньше времени. Генетически обусловленная пестролепестность иногда
может быть принята за симптом вирусного заболевания, ио обычно пестроле-
пестность представляет собой надежный диагностический признак вирусного
заболевания мозаичного типа. Пестролепестность вирусной природы, наблю-
даемая у некоторых растений, приобрела коммерческое значение. Так,
одно время тюльпаны, инфицированные вирусами, очень высоко ценились
и рассматривались как новые сорта (цветная вклейка 1). Так же как
и мозаичное заболевание листьев, петролепестность цветков развивается
лишь при заражении на определенной стадии развития цветка. Так, на цвет-
ках тюльпанов, инфицированных вирусом пестролепестности менее чем
за 11 дней до цветения, пестролепестность не возникает, даже если вирус
и присутствует в лепестках [1948].
Плоды, образующиеся на растениях с мозаичными симптомами, могут
обнаруживать крапчатость, что наблюдается, например, у растений огур-
цов, инфицированных вирусом огуречной мозаики (фото 41, Л). При некото-
рых заболеваниях наблюдается значительное уменьшение размеров и иска-
жение формы плодов (фото 41, 5). Семенная кожура инфицированных семян
часто бывает крапчатой, и это обстоятельство в ряде случаев может служить
указанием на передачу вируса с помощью семян [964].
Симптомы типа желтух
Группа вирусов, вызывающих общее пожелтение листьев, не так много-
численна, как вирусы, вызывающие симптомы типа мозаики, однако некото-
рые из них, например вирус желтухи сахарной свеклы, имеют большое эко-
номическое значение. Первый признак заболевания этого типа — посветле-
ние или пожелтение жилок у молодых листьев, сопровождающееся общим
пожелтением листьев, которое может быть выражено в большей или мень-
шей степени. При подобном типе заболевания отсутствуют симптомы мозаи-
ки, однако на некоторых листьях можно наблюдать участки пожелтевших
и нормальных тканей. При вирусной болезни, вызывающей поражение
листьев земляники, пожелтение ограничено краем листа (фото 42).
Симптомы вирусных болезней 207
Кольцевая пятнистость
При многих вирусных болезнях основным их симптомом: является обра-
зование концентрических колец и полос неправильной формы на листьях,
а иногда также на плодах (фото 41, В). Полосы могут состоять из пожелтев-
ших тканей или возникают в результате гибели поверхностных слоев клеток,
что приводит к образованию узора, напоминающего гравировку. При тяже-
лых заболеваниях может иметь место полная некротизация всей листовой
пластинки. Характерные кольцевые и линейные поражения представлены
на фото 43. В случае типичных вирусов, вызывающих кольцевую пятнистость,
например вируса кольцевой пятнистости табака, существует четкая тен-
денция к «излечиванию» после начального периода выраженного заболева-
ния. Это проявляется в том, что, хотя иа более старых листьях симптомы
заболевания пе исчезают, молодые листья могут не иметь видимых пораже-
ний, несмотря на присутствие в них вируса.
IIекротизация
Если при некоторых вирусных болезнях типа кольцевой пятнистости
клетки отмирают лишь в каких-то определенных участках, то основным симп-
томом при других болезнях является отмирание больших групп клеток,
органов или даже гибель целого растения. Системная инфекция может при-
водить к возникновению на листьях разбросанных пятен или участков
отмерших тканей; поскольку вирус в листе распространяется по жилкам,
очаги некротизации возникают первоначально вблизи жилок (фото 44).
При некоторых заболеваниях лист отмирает целиком. Известны также
случаи, когда некротизация может распространяться очень быстро по всему
растению. Например, при заражении некоторых сортов картофеля X-
и У-вирусами картофеля первые некротические полосы появляются на стеб-
ле. Затем некротизация быстро распространяется, захватывая точку роста,
которая затем отмирает (фото 23), вслед за чем увядают и погибают все
листья. Подобного рода системному некротическому заболеванию обычно
предшествует завядание части растения, которая почти полностью некро-
тизируется. В результате вирусной инфекции могут появляться некротиче-
ские участки па клубнях картофеля, которые видны с поверхности или
становятся заметными лишь в том случае, если сделать срез клубня.
Нарушения нормального роста растения
Кроме общего уменьшения размеров, растения, инфицированные виру-
сами, характеризуются самыми разнообразными типами аномального роста.
Такого рода изменения могут быть либо основным симптомом заболевания,
либо могут сопутствовать другим симптомам. Например, при мозаичных
заболеваниях часто имеет место неравномерный рост листовой пластинки,
при котором темно-зеленые участки образуют вздутия, а края листа скру-
чены и имеют неправильную форму (фото 45, 4). При некоторых заболева-
ниях, в частности при заражении растений томатов смесью ВТМ и вируса
огуречной мозаики, рост листовой пластинки может быть почти полностью
подавлен (фото 45, В). При других заболеваниях листовая пластинка бывает
скручена кверху или книзу.
Некоторые вирусы вызывают разрастание тканей стебля, которое у дре-
весных растений, например при заболевании, носящем название деформации
побегов дерева какао, бывает очень сильно выраженным. Вирусная инфек-
ция вызывает также своеобразное уплощение ветвей яблонь (фото 45, Б).
Другую форму отклонений от нормального роста представляют собой
выросты (энации) верхней или нижней поверхности листа, связанные обычно
208
Глава IX
с жилками. Эти образования могут иметь форму небольшой выпуклости либо
представлять собой большие, неправильной формы листоподобные структуры.
Вирусы вызывают у растений и подобие опухолевого роста, причем
опухолевые ткани представляются менее организованными, чем энации.
В некоторых случаях они имеют форму бородавок, которые можно наблю-
дать на стебле и плодах (например, при заболевании, носящем название
бородавчатости персиков).
Наиболее изученными являются опухоли, вызываемые вирусом раневых
опухолей клевера. Образование опухолей — это типичный симптом данного
заболевания (фото 46). При системной инфекции растений расположепные
снаружи опухоли возникают вблизи поврежденных участков стебля или
листа. На корнях инфицированных растений опухоли возникают спонтанно,
начиная свое развитие в непосредственной близости к перициклу в клетках,
которые повреждаются в тот момент, когда зачаток бокового корпя проби-
вается сквозь кору. Описываемый нами вирус может вызывать также множе-
ство мелких внутренних опухолей во флоэме листа, стебля и корня [1058].
Выздоровление
Нередко в течение того или иного отрезка времени симптомы вирусного
заболевания у растения бывают выражены очень отчетливо, а затем появ-
ляются новые побеги, на которых симптомы заболевания оказываются выра-
женными значительно слабее или отсутствуют вовсе, хотя вирус все еще
присутствует в тканях растения. На характер описанного явления выздоров-
ления оказывают влияние многие факторы, в частности условия окружаю-
щей среды (гл. ХП). Степень проявления симптомов заболевания в замет-
ной мере зависит от того, на какой стадии развития растение было инфици-
ровано. Например, при заражении растений табака вирусом курчавости
верхушки сахарной свеклы развиваются симптомы заболевания, после чего
часто наступает выздоровление растения. При инокуляции очень молодых
проростков часть из них никогда не обнаруживает ясных симптомов забо-
левания, хотя инфицированные растения, как было показано, содержат
вирус [149].
ГИСТОЛОГИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ
Макроскопически выраженные симптомы вирусного заболевания отра-
жают гистологические изменения, происходящие в инфицированном расте-
нии. Различают три основных типа таких аномальностей: 1) некротизация,
или отмирание клеток и тканей; 2) гиперплазия, или избыточный рост
и дифференциация; 3) гипоплазия, или подавление роста и дифференциации.
Для пожелтевших участков мозаичных листьев часто бывает характер-
на гипоплазия. Толщина листовой пластинки в этих участках меньше, чем
в темно-зеленых, клетки мезофилла менее дифференцированы и содержат
меньше хлоропластов, а межклетные пространства между ними невелики
или отсутствуют вовсе. Общий вид пожелтевших тканей во взрослом листе
сходен с тем, что мы наблюдаем на срезах листьев, находящихся еще на ран-
ней стадии своего развития (фото 47). Посветление жилок, по крайней мере
в случае некоторых вирусов, возникает благодаря увеличению размеров
клеток вблизи жилок [494]. Межклетные пространства исчезают, и ткань
в отличие от нормальной становится полупрозрачной, так как в ней содер-
жится пониженное количество хлорофилла.
В некоторых случаях наиболее ранние патологические изменения,
вызываемые вирусами, появляются во флоэме. При заболевании, носящем
Симптомы вирусных болезней
209
название скручивания листьев картофеля, флоэма развивается нормально,
но в процессе инфекции составляющие ее элементы отмирают. Процесс
некротизации может распространяться на флоэму, захватывая все растение,
но этого не происходит, и он ограничивается лишь данной тканью. При дру-
гих заболеваниях некротизации предшествует аномальный рост и диффе-
ренциация флоэмы. Например, во флоэме растений, инфицированных виру-
сом курчавости верхушки сахарной свеклы, развивается большое количество
аномальных ситовидных элементов, связанных иногда с клетками-спутни-
ками. Клетки эти расположены беспорядочно и в дальнейшем отмирают
'[494]. В ряде случаев, например при болезнях типа верхушечного некроза
картофеля, процесс некротизации, начавшись во флоэме, быстро распро-
страняется на другие ткани. При заболевании картофеля, вызываемом У-ви-
русом, некротизация начинается в листьях, распространяется вдоль жилок,
главным образом по колленхиме, причем проводящие элементы при этом
оказываются незатронутыми [93]. Некоторые вирусы при инфицировании
картофеля вызывают образование островков некротизации в клубнях. Клу-
бень реагирует на это типичной раневой реакцией. При этом в зоне клеток
вокруг некротизированного участка исчезают крахмальные зерна и разви-
вается активно функционирующий слой пробкового камбия (фото 48).
При некоторых заболеваниях наблюдается избыточный или аномальный
рост, который не обязательно сопровождается некротизацией. В побегах
растений, инфицированных вирусом деформации побегов дерева какао,
образуется избыточное количество ксилемы, однако клетки этой ткани
по своей структуре остаются, по-видимому, нормальными [1349].
При заболевании, носящем название стеблевой поровости яблонь
’(stem-pitting), эта поровость обнаруживается иа поверхности древесины,
если содрать кору. Происходит это вследствие того, что некоторые камбиаль-
ные инициали теряют способность к нормальной дифференциации клеток
и в результате образуется как бы клин флоэмы, который оказывается погру-
женным во вновь образованную ксилему [777]. Эта поврежденная флоэма
некротизируется и с течением времени дерево может погибнуть.
При инфицировании пунцового клевера (Trifolium incarnatum) вирусом
раневых опухолей наблюдается аномальное развитие камбиальных клеток,
дифференцирующихся во флоэму. Во флоэме листа, стебля и корня клетки
флоэмной паренхимы превращаются в опухолевые клетки меристематиче-
ского типа [1058].
ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ В ИНФИЦИРОВАННЫХ
РАСТЕНИЯХ
Вирусная инфекция часто приводит к изменению размеров и числа крах-
мальных зерен, которые можно наблюдать в клетках листа. При мозаичных
заболеваниях эти клетки содержат обычно меньше крахмала, чем в норме,
однако в некоторых других случаях (например, при курчавости верхушек
сахарной свеклы, скручивании листьев картофеля) крахмал может накап-
ливаться в избыточных количествах.
Некротизация тканей приводит к глубоким цитологическим измене-
ниям в клетках, которые можно наблюдать по мере приближения сроков
их гибели. Эти изменения, имеющие место при вирусной инфекции, изучали
с помощью как светового, так и электронного микроскопов, однако результаты
подобного рода исследований нам не дали много в отношении понимания
тех механизмов, с помощью которых именно вирус фактически приводит
клетку к гибели. Так, Хаяши и Матсуи [744] изучали тонкую структуру
клеток на периферии распространяющихся местных некротических пораже-
14-0893
210
Глава IX
ний, вызываемых ВТМ на листьях растений N. glutinosa. Они показали,,
что в инфицированных клетках прежде всего исчезает строма хлоропластов;:
затем граны и ламеллы становятся аморфными, и хлоропласт разрушается.
В ядре прежде всего исчезает его матрикс. Вещество цитоплазмы агреги-
рует, и граница между цитоплазмой и вакуолью становится незаметной.
На периферии таких пораженных участков можно было обнаружить клетки
на всех стадиях дегенерации. Если растения N. glutinosa после инокуляции
ВТМ выдерживали в темноте при температуре 28 °C, то вместо некротиче-
ских поражений возникали темно-зеленые пятна. Клетки в этих участках
не отмирали, по крайней мере в течение некоторого времени, и основной
отмеченной при этом аномальностью было появление множества пузырьков
и слившихся мембран [745].
Наиболее общим результатом вирусной инфекции на клеточном уровне
является образование включений, которые можно наблюдать в инфициро-
ванных клетках с помощью светового микроскопа. Эти структуры были обна-
ружены еще в начале XX века, и их открытие привело в дальнейшем к ряду
недоразумений. Так, на основании того факта, что включения одного типа
ттлпомипятот определенные микроорганизмы, некоторые исследователи при-
шли к ошибочному выводу, что эти включения действительно являются^
внутриклеточными паразитами или представляют собой какую-то стадию
жизненного цикла этого паразита, что и служит причиной заболевания.
С помощью световой микроскопии было обнаружено два основных типа
внутриклеточных включений: аморфные частицы, или Х-тела, и кристалли-
ческие включения. Природа включений, а также взаимосвязь между виру-
сами и включениями были одними из наиболее дискуссионных вопросов
в литературе раннего периода вирусологических исследований.
Результаты экспериментов Шеффилд [1553] показали, что Х-тела, обра-
зующиеся при заражении растений вирусом мозаики томатов (штамм ауку-
ба), содержат большое количество вирусных частиц. Данные, полученные-
с помощью световой микроскопии и различных методов окрашивания,
не имели большого значения с точки зрения определения природы внутрикле-
точных включений, за исключением того, что эти исследования показали,
что включения обычно содержат белок и всегда дают фёльген-отрицательную
реакцию (т. е. в них не обнаруживается ДНК). Современное развитие тех-
ники тонких срезов и соответствующих методов фиксации и окрашивания
для электронной микроскопии дает нам теперь возможность глубже про-
никнуть и разобраться в природе вирусных включений, которые мы наблю-
дали с помощью светового микроскопа. Кроме того, с помощью электронной
микроскопии в инфицированных клетках обнаружены также и другие, инду-
цированные вирусами структуры, которые не были видны в световой микро-
скоп. Надо отметить, что возможности техники получения препаратов
с применением замороженных тканей использованы еще далеко не пол-
ностью [448].
К сожалению, в некоторых работах последнего времени электронно-
микроскопические исследования проводились без предварительного изуче-
ния того же материала под световым микроскопом. Исследование препаратов
под световым микроскопом представляется ценным по следующим причи-
нам: 1) такого рода работа позволила бы сравнить данные, получаемые при
больших разрешениях электронного микроскопа, с ранее полученными
детальными данными исследований аналогичных материалов с помощью
светового микроскопа; 2) под световым микроскопом просматриваются зна-
чительно большие участки ткани, что обеспечивает типичность образцов,
взятых для электронно-микроскопического исследования; 3) живой мате-
риал можно исследовать с использованием фазового и светлопольного кон-
траста.
Симптомы вирусных болезней
211
Согласно современным представлениям, существует четыре основных
типа внутриклеточных включений: 1) включения, имеющие кристаллическую
форму при наблюдении их под световым микроскопом, которые состоят,
по-видимому, в значительной степени, ио не полностью из более или менее
правильно расположенных вирусных частиц; 2) включения, имеющие под
световым микроскопом вид аморфных тел и содержащие разное количество
вирусных частиц, а также некоторые компоненты клетки-хозяина; 3) вклю-
чения, состоящие почти исключительно из видоизмененных клеточных орга-
нелл; 4) включения, наблюдаемые обычно только с помощью электронного
микроскопа, которые содержат вирусный структурный белок или некий
неидентифицировапный белок, упакованный в виде волокон или трубочек.
Существуют доказательства того, что некоторые типы включений соответ-
ствуют определенным вирусам или группе структурно родственных виру-
сов. Ниже мы рассмотрим некоторые вирусные болезни, наиболее тщательно
изученные с цитологической точки зрения. Можно думать, что в дальнейшем
анализ специфической структуры включений найдет гораздо более широкое
применение, чем в настоящее время в целях идентификации вирусов.
Необходимо иметь в виду, что различные структуры, встречающиеся
в незаряженной клетке, по своей морфологии могут напоминать вирусные
включения. Так, в молодых хлоропластах корней фасоли найдены кристаллы
запасного белка и связанные с ними пузырьки [12671; кристаллические
включения обнаружены в хлоропластах внешне здоровых листьев Macadamia
[1360]. Маринос [1146] описал пластиды, содержащие вакуоли и мембраны,
в меристеме глазков клубней картофеля. Он назвал эти образования «поли-
функционалышми пластидами», но возможно, что некоторые из обнаружен-
ных им ультраструктур возникли в результате «замаскированной» вирусной
инфекции клубней.
Вирус табачной мозаики
В клетках, инфицированных ВТМ, с помощью светового и электронного
микроскопов обнаружены различные типы включений.
Кристаллические включения, образуемые обычным
штаммом ВТМ
Такого рода включения наиболее часто встречаются в эпидермальных
клетках и в клетках волосков. В листьях табака, обнаруживающих типич-
ные мозаичные симптомы, кристаллические включения обнаруживаются
почти во всех волосках и в эпидермальных клетках, расположенных в желто-
зеленых участках листьев, тогда как клетки в темно-зеленых участках
вообще не содержат включений. Граница между желто-зелеными и темно-
зелеными участками может быть достаточно четкой, так что существует
зона, в которой соседние волоски листа либо совсем не содержат кристалли-
ческих включений, либо содержат их почти в каждой клетке (фото 25).
В пассируемых каллюсных клетках табака, инфицированных ВТМ,
обнаружены гексагональные кристаллы и игловидные включения, сходные
по размерам и другим свойствам с включениями, обнаруженными в инфици-
рованных растениях [353].
Кристаллические включения в форме пластинок весьма нестабильны
и легко разрушаются при проколе или каком-либо другом повреждении
клеток. Эти кристаллы обладают двойным лучепреломлением в направле-
нии осей, перпендикулярных боковым граням, но не обладают им в направ-
лении плоской поверхности. Кристаллы содержат около 60% воды и состоят
в основном из последовательно расположенных слоев плотно упакованных
14*
212
Глава IX
параллельных палочек, ориентированных не вполне перпендикулярно пло-
скости слоя. Палочки в соседних слоях располагаются под углом друг к
другу [1669, 1674].
На ультратонких срезах кристаллы представляются состоящими из рядов
таких палочек, расположенных по отношению друг к другу более или менее
параллельно. Ряды этих вирусных частиц располагаются под углом друг
к другу, что напоминает кладку кирпича «в елочку» (фото 49).
Болд и Солберг [67, 1640] с помопдыо фазово-контрастпой микроскопии
обнаружили структуры, названные ими «серыми пластинками», которые
образуются на ранней стадии формирования кристаллов и которые, возмож-
но, состоят из одиночного или двойного слоя ориентированных вирусных
частиц. Вармке и Эдвардсон [1865] описали процесс роста кристаллов в клет-
ках волосков табачного листа. На первых стадиях в цитоплазме инфициро-
ванных клеток вирусные частицы находились в свободном состоянии в форме
небольших агрегатов параллельно расположенных палочек, соединяющихся
торцами. «Эти агрегаты затем увеличиваются в размерах и образуют струк-
туры, аналогичные «серым пластинкам» Солберга и Волда. В процессе роста
кристаллы не окружены какой-либо мембраной, и, поскольку они стано-
вятся многослойными, между их слоями оказываются иногда включенными
часть эндоплазматической сети, митохондрии и даже хлоропласты.
В некоторых случаях с помощью светового микроскопа можно обнару-
жить длинные изгибающиеся волокнистые включения, а также шипообраз-
ные или веретенообразные включения [950]. Вармке и Эдвардсон [1865]
пришли к выводу, что эти включения, представляющие собой паракристал-
лические структуры, построенные из вирусных частиц, формируются на позд-
них стадиях инфекции в процессе перераспределения частиц, ранее
образовывавших настоящие кристаллы.
На основании электронных микрофотографий, подобных фото 49, Л,
очевидно, что кристаллы состоят в основном из вирусных палочкообразных
частиц, однако вопрос о том, почему частицы располагаются именно таким
образом и вовлекаются ли в процесс формирования кристалла другие веще-
ства, остается открытым.
In vitro в условиях высоких концентраций солей или низких значений
pH очищенные препараты ВТМ образуют паракристаллические агрегаты,
в которых палочки упакованы каким-то регулярным образом конец в конец,
однако расположение частиц по длинной оси агрегата оказывается непра-
вильным. Майлн [1217] показал, что смешивание очищенного ВТМ с неко-
торыми основными белками, такими, как цитохром с или гистоны, при
соответствующих значениях pH и ионной силы приводит к образованию
кристаллов, выпадающих в осадок. С помощью электронной микроскопии
обнаружено, что эти кристаллы построены из параллельных рядов палочко-
образных частиц, соединенных конец в конец (фото 49, Б). Имеет ли это
наблюдение какое-либо отношение к образованию кристаллов in vivo, не уста-
новлено, однако оно подтверждает предположение о возможности участия
мелких основных белков невирусной природы в процессе формирования
кристаллов.
Кристаллические включения обнаружены в клетках многих системно
инфицированных ВТМ растений, относящихся к семейству Solanaceae. Так,
в местных некротических поражениях, возникающих на Nicotiana glutinosa
и Chenopodium amaranticolor, найдены мелкие кристаллические агрегаты
[1214, 1215].
Большинство исследователей обнаруживали кристаллические включе-
ния только в цитоплазме клеток растений, инфицированных ВТМ. Однако
другие (см., например, [655]) описали многочисленные включения, особенно
в форме паракристаллических игл, в ядрах каллюсных клеток и клеток:
Симптомы вирусных болезней
213
Фиг. 40. Схематическое изображение кристаллического включения необычного типа,
которое можно наблюдать в клетках растений Capsicum аппиит L., инфицированных
одним из штаммов ВТМ [763].
Сечение по диагонали, сделанное в плоскости, показанной линиями а — а, 5 — бив — в, образует
рисунок, характерный для кладки кирпича «в елочку».
волосков листьев растений табака, инфицированных казахским штаммом
ВТМ. Сайн и Гильдебрандт [1600] наблюдали явное передвижение кристал-
лических включений из цитоплазмы в ядро каллюсиых клеток табака, инфи-
цированных ВТМ. Таким образом, кристаллические включения, наблюдае-
мые при некоторых условиях в ядрах клеток, могут формироваться факти-
чески в цитоплазме. Эсау и Кроншоу [496] показали, что в ядрах клеток
инфицированных растений табака обнаруживаются небольшие группы вирус-
ных палочек.
Включения, образуемые в клетках, зараженных другими
штаммами В ТМ
Некоторые штаммы ВТМ, в частности подорожниковый штамм Холмса,
образуют включения в форме округлых пластин, а не гексагональных призм
[1209]. Герольд и Мунц [768] описали необычное расположение палочко-
образных частиц в кристаллических включениях, которые можно наблюдать
в Capsicum annum L., зараженном одним из штаммов ВТМ. Схема располо-
жения вирусных частиц, построенная на основании электронных микро-
фотографий ультратонких срезов, представлена на фиг. 40.
Вармке [1862, 1863] описал довольно сходные агрегаты ВТМ в клетках,
инфицированных томатным штамом аукуба ВТМ. Эти агрегаты состояли
из слоев палочкообразных частиц, перекрещивающихся под каким-то Опре-
деленным углом (около 60°) и расположенных друг над другом таким обра-
зом, что создавалось впечатление гравировки перекрестными штрихами.
Структурный белок мутантного штамма ВТМ РМ2 не способен форми-
ровать нормальные вирусные частицы (фото 75). Как видно на полученных
методом негативного контрастирования препаратах листового эксудата инфи-
цированных растений табака, дефектный белок агрегирует, образуя кристал-
лические массы в виде одиночных незамкнутых спиралей. Шаг спирали
был равен 28—29 нм, а диаметр — 12 нм [1853].
Аморфные включения
Аморфные включения в клетках, инфицированных ВТМ, изучались
Шеффилд [1552, 1553] и другими исследователями (фото 50). Включения
этого типа в форме гранул появляются в цитоплазме йнфицированных кле-
ток. С течением времени гранулы сливаются, образуя Вакуолизированные
214
Глава IX
включения диаметром около 5—30 мкм. Аморфные включения более ста-
бильны по сравнению с кристаллическими и выдерживают более низкие
значения pH. Шеффилд [1554] с помощью микрургических методов удалось
изолировать эти включения и показать, что они содержат вирус, а также
другой материал неизвестной природы. С возрастом в таких аморфных вклю-
чениях могут иногда появляться небольшие кристаллы, обладающие двой-
ным лучепреломлением: [950].
С помощью электронной микроскопии в составе амофных включений,
встречающихся в клетках табака, обнаружены элементы эндоплазматической
сети, рибосомы, вирусные палочки и широкие нити, которые, возможно,
представляют собой пучки трубочек [496]. Вся эта масса, как выяснилось, не
окружена какой-либо мембраной (фото 51).
Включения, наблюдаемые только с помощью электронного микроскопа
С помощью электронного микроскопа в инфицированных клетках наблю-
даются два типа включений: прямые палочки (длина этих структур значи-
тельно превышает длину частиц ВТМ), расположенные параллельно друг
другу, и беспорядочно расположенные нити [1017, 1213, 1545]. Включения
первого типа появляются иа поздних стадиях инфекции, а включения вто-
рого типа впервые обнаруживаются примерно в то же самое время, что
и вирусные палочки [1213]. Их возможную взаимосвязь с формированием
вирусных частиц мы рассматривали в гл. VII. Эсау и Кроншоу [497] под-
черкивают, что необходима осторожность при разграничении трубчатых
элементов, которые можно наблюдать на тонких срезах здоровых клеток,
и подобного же типа структур, образование которых вызывается вирусами.
В цитоплазме и хлоропластах клеток в зоне хлоротических местных
некрозов, вызываемых ВТМ и огуречным вирусом 4, обнаружены группы
аномальных окруженных мембранами пузырьков, причем в хлоропластах,
как полагают, они образуются в результате выпячивания окружающих
их мембран. Сферосомы клеток в зоне вокруг некротических местных пора-
жений, образуемых ВТМ на листьях растений N. glutinosa, часто содержат
одиночные включения с хорошо выраженной кристаллической структурой;
в нормальных клетках подобные включения не обнаружены [855].
Вирус погремковости табака
В зараженных клетках Nicotiana clevelandii длинные палочкообразные
частицы вируса погремковости табака (штамм САМ) связаны с митохондриями
[729] (фото 52). Концы палочкообразных частиц тесно соприкасаются с мемб-
раной митохондрий, ио не проникают сквозь нее. Хотя для этого штамма
характерно наличие большого числа коротких частиц, с митохондриями
связаны именно длинные палочкообразные частицы. С другими клеточными
органеллами частицы этого штамма не связаны. Вопрос о том, связана ли
подобного рода локализация вирусных частиц вблизи митохондрий с дейст-
вительным местом синтеза вируса или же вирусные палочки присоединяются
к митохондриям после того, как синтезируются в каких-то других участках
клетки, остается еще нерешенным. Непосредственная связь частиц кали-
форнийского штамма этого вируса с митохондриями при изучении их в клет-
ках N. tabacum не была обнаружена [445].
Группа У-вируса картофеля
Включения, образуемые различными вирусами группы У-вируса карто-
феля, наблюдаются с помощью светового микроскопа с различной частотой.
Однако при электронно-микроскопическом исследовании клеток, инфици-
Симптомы вирусных болезней
215
рованных различными вирусами этой группы, обнаруживается уже какая-то
степень единообразия в характере образующихся при этом включений.
На тонких срезах таких клеток различные исследователи наблюдали пучки
палочкообразных частиц и структуры типа мельчайших колесиков. Подоб-
ные структуры были обнаружены Эдвардсоном [480] в клетках, инфицирован-
ных вирусом гравировки табака, У-вирусом картофеля, вирусом мозаики
арбуза, вирусом желтой мозаики фасоли, вирусом обыкновенной мозаики
фасоли, вирусом мозаики сахарного тростника и вирусом мозаики салата-
латука. В некоторых случаях эти структуры были достаточно плотно
скручены, тогда как при заражении другими вирусами этой группы они
были более рыхлыми.
Исследуя серийные срезы инфицированных клеток, Эдвардсон [481],
а также и Пурцифал и Эдвардсон [1369] показали, что пучки, цилиндры,
трубочки и мельчайшие колесики, видимые иа срезах, представляют собой
части геометрически сложных включений. Эдвардсон [481] схематически
воспроизвел структуру включений этого типа, образующихся при инфици-
ровании клеток растений табака вирусом гравировки табака (фото 53).
Характерные особенности включений, образуемых при заражении виру-
сом гравировки табака, сохранялись и при смешанной инфекции с ВТМ.
В клетках, инфицированных ВТМ, вирусом погремковости табака и рядом:
вирусов из группы Х-вируса картофеля, Эдвардсон не обнаружил структур
типа мельчайших колесиков. Таким образом, по его мнению, структуры
этого типа характерны только для вирусов, относящихся к группе У-вируса
картофеля. Если эта точка зрения верпа, то вирус, вызывающий мозаичное
заболевание подсолнечника, который был описан Арнотом и Смитом [34],
должен принадлежать к этой группе. Некоторое время считали, что включе-
ния типа мельчайших колесиков построены из палочкообразных вирусных
частиц, однако недавние исследования высушенных в вакууме тканей [484]
показали, что для этого типа включений характерна регулярная исчерчен-
ность с периодичностью около 5 нм (фото 53, В), что исключает участие
в создании этого типа структур вирусных палочкообразных частиц. Шеферд
и Шалла [1556], использовав меченные ферритином антитела, показали, что
структуры типа мельчайших колесиков не реагируют с антителами, специ-
фичными в отношении вирусных палочек. Пурцифал и др. [1372] обнаружили
в клетках растений люпина, инфицированных вирусом мозаики арбуза,
крупные, удлиненные и имеющие правильную структуру агрегаты вирусных
палочкообразных частиц, связанные с мембранами. Длина этих агрегатов
составляла несколько микрон, а ширина 0,5—1,0 мкм. Ширина же отдель-
ных агрегатов была постоянной. На негативно контрастированных препара-
тах из экстракта листьев растений, зараженных У-вирусом картофеля, обна-
ружены пучки вирусных частиц, окруженные мембраной (фото 54).
Внутриядерные включения были обнаружены при заражении немногими
вирусами растений. Два из этих вирусов принадлежат к группе У-вируса
картофеля. В клетках листьев растений табака, инфицированных сильным
штаммом вируса гравировки, обнаружены с помощью светового микроскопа
кристаллические пластинчатые структуры [925]. Пластинки обладали двойным
лучепреломлением при наблюдении сбоку, и их связь с этой вирусной инфек-
цией представляется несомненной. При изучении их с помощью электронного
микроскопа они оказались состоящими из сложенных в пачки длинных пало-
чек, которые, вероятно, представляют собой вирусные частицы [1454].
В ходе инфекции сильным штаммом вируса гравировки ядрышко, по-ви-
димому, заметно не изменяется. Однако Матсуи и др. [1166] отмечали увели-
чение размеров ядрышек на ранних стадиях заражения растений дурмана
вирусом гравировки табака. Хаяши и Матсуи [745] метили листья, заражен-
ные вирусом гравировки, 3Н-уридином и ®Н-лейцином и исследовали внутри-
216
Глава IX
клеточное распределение метки методом радиоавтографии с использова-
нием электронного микроскопа. Путем исследования старых листьев они
показали, что включение радиоактивных предшественников в клетки конт-
рольного здорового материала весьма незначительно. В клетках инфициро-
ванных растений обе метки обнаруживались в цитоплазматических вирусных
включениях, тогда как в ядерные индуцированные вирусом структуры
включался лишь лейцин. Этот факт дает основание полагать, что ядерные
вирусные включения состоят из свободного вирусного белка без примеси
нуклеиновой кислоты. Полученные таким образом данные могут представ-
лять определенный интерес, если эти результаты будут подтверждены
с помощью прямых методов.
Внутриядерные включения обнаружены также в случае заражения дру-
гим вирусом из группы У-вируса картофеля — вирусом желтой мозаики
фасоли. Мюллер и Кёниг [1241] использовали размер включений в качестве
индикатора инфекции определенным вирусом в тесте перекрестной инокуля-
ции со штаммами вируса желтой мозаики. Один из этих штаммов продуци-
ровал небольшое число очень крупных кристаллов в инфицированных клет-
ках, другие — агрегаты мелких кристаллов. В опытах по перекрестной ино-
куляции растения, инфицированные штаммами, вызывающими образование
мелких кристаллов, инокулировали штаммом, продуцирующим крупные
кристаллы; о результатах теста судили по тому, присутствуют ли крупные
кристаллы в ядрах клеток листа или нет. Вайнтрауб и Рагетли [1885] нашли,
что кристаллические включения, индуцируемые вирусом желтой мозаики
фасоли, часто обнаруживаются в ядрышках зараженных клеток Vicia faba.
В хлоропластах такие включения не наблюдали.
Группа X-вируса картофеля
Штаммы Х-вируса картофеля вызывают образование аморфных вклю-
чений в зараженной клетке [129]. Размер и число этих включений значи-
тельно варьируют в зависимости от штамма вируса и исследуемого вида
растения-хозяина. Например, у растений табака включения по своим разме-
рам не больше клеточного ядра, тогда как у картофеля они занимают около'
половины всего объема клетки. G помощью электронного микроскопа Кику-
мото и Матсуи [968] обнаружили в клетках Datura stramonium, инфициро-
ванных Х-вирусом картофеля, большие нитевидные массы, иногда окружен-
ные мембранами, а также упаковки нитевидных частиц. Предполагают, что.
эти большие нитевидные массы соответствуют аморфным вирусным включе-
ниям, которые можно наблюдать под световым микроскопом, однако это-
предположение нуждается в проверке.
С помощью электронного микроскопа было показано, что другой пред-
ставитель данной группы — вирус желтой мозаики клевера — вызывает
образование многочисленных цитоплазматических включений в клетках
листьев гороха [1371]. Эти включения состоят из агрегатов гибких частиц
палочкообразной формы, срезы через которые прошли в различных плоско-
стях. Частицы часто располагаются в форме спирали. Большинство агрегатов
встречается в свободном состоянии в цитоплазме, а некоторые из них видны
во впячиваниях хлоропластов.
Группа вирусов желтухи сахарной свеклы
Исследованиями Эсау с сотрудниками установлено, что в растениях,,
инфицированных вирусом желтухи сахарной свеклы, вирусные включения
появляются главным образом во флоэме, однако встречаются и в других
тканях, например в мезофилле. При исследовании с помощью светового микро-
Симптомы вирусных болезней
217’
скопа эти включения часто представляются веретенообразными и могут иметь
поперечную исчерченность (фото 55,<4). При электронно-микроскопическом
исследовании в этих включениях обнаруживаются слои гибких палочко-
образных вирусных частиц (фото 55,В).
Большая часть вирусных включений обнаруживается в цитоплазме,
в которой можно наблюдать также многочисленные небольшие пузырьки
диаметром около 100 нм. Более мелкие агрегаты вирусоподобных частиц,
обнаруживаются в ядрах и в хлоропластах [418].
Вирус штриховатой мозаики ячменя
В клетках листьев Hordeum vulgare, инфицированных вирусом штрихо-
ватой мозаики ячменя, вирусные частицы обнаруживаются в цитоплазме
либо в свободном состоянии, либо в составе крупных включений, где они
неплотно примыкают друг к другу [606]. В небольших количествах вирусные
частицы обнаруживаются в ядрах многих инфицированных клеток. Часто,
вирусные палочки можно наблюдать связанными с наружной мембраной
хлоропластов. Некоторые цитоплазматические включения состоят из боль-
шого количества мембран. Число гран, которые можно наблюдать в хлоро-
пластах, встречающихся в пожелтевших участках, меньше или они имеют
меньшие размеры.
Вирус желтой мозаики турнепса
С помощью световой микроскопии было показано, что вирусные включе-
ния в клетках листьев китайской капусты, инфицированных ВЖМТ, при-
надлежат к аморфному типу и формируются, по-видимому, из хлоропластов.
[1453]. Мы вновь исследовали влияние этого вируса на цитологию клетки,
используя как световую, так и электронную микроскопию [345—347; Усияма.
и Мэтьюз, неопубликованные данные]. В инокулированных листьях хлоро-
пласты округлялись и объединялись в клетках друг с другом, причем боль-
шинство штаммов ВЖМТ оказывало довольно сходное действие. Влияние
вируса па ламеллы граи и ламеллы стромы хлоропластов оказалось незначи-
тельным. Хлоропласты в инфицированных клетках приобретали форму
чаши, обращенной открытой частью обычно к клеточной стенке. Внутри
таких хлоропластов появлялись многочисленные окруженные мембранами
пузырьки. Отмечалось накопление крахмальных зерен. «Белые» штаммы
ВЖМТ вызывали дегенерацию гран хлоропластов в инокулированных листьях.
В уже развернувшихся листьях, которые оказались полностью заражен-
ными, но не обнаруживали симптомов мозаичности, влияние вируса на хло-
ропласты было аналогичным его действию на инокулированные листья.
На срезах листьев, находившихся в момент заражения в очень молодом воз-
расте, на которых развивалось типичное мозаичное заболевание, с помощью»
светового микроскопа легко можно обнаружить ряд патологических отклоне-
ний в структуре хлоропластов. Островки ткани в мозаичных участках, имею-
щие различные оттенки зеленого, желтого и белого цветов, содержали раз-
личные штаммы ВЖМТ, действующие на хлоропласты каждый своим особым»
и характерным образом (фото 37, цветная вклейка 1 и фото 56).
В темно-зеленых островках ткани, содержащих вирус в небольшом коли-
честве, хлоропласты выглядят нормальными. В других типах тканей наблю-
даются различные изменения хлоропластов, из которых наиболее важны
следующие: 1) окраска — от почти нормальной зеленой до полного обесцве-
чивания; 2) агрегация — при умеренной агрегации соприкасающиеся друг
с другом хлоропласты образуют ряды (фото 56, Б). В случае более тяжелой
формы заболевания хлоропласты образуют агрегаты неправильной формы,
в которых очертания отдельных хлоропластов едва различимы (фото-
218
Глава IX
56, В). При очень тяжелых формах заболевания, вызываемых белыми штам-
мами вируса, агрегаты хлоропластов выглядят в виде округлой аморфной
массы (фото 54, Е); 3) образование пузырьков — во всех хлоропластах инфи-
цированных клеток, исследованных с помощью электронной микроскопии,
присутствует некоторое количество пузырьков. С помощью светового микро-
скопа можно наблюдать лишь крупные пузырьки (фото 56, Д). Крупные
пузырьки, по-видимому, чаще появляются в листьях, инфицированных
в течение достаточно продолжительного периода, однако при заражении
некоторыми штаммами ВЖМТ пузырьки образуются значительно быстрее;
4) фрагментация хлоропластов — некоторые штаммы ВЖМТ вызывают
фрагментацию агрегированных хлоропластов (фото 56, Г).
Штаммы ВЖМТ могут вызывать специфические сочетания различных
аномальностей в хлоропластах инфицированных клеток. В тканях каждого
данного типа почти все клетки характеризуются обычно одним типом пов-
реждений, которые сохраняются (по крайней мере некоторое время) после
заражения здоровых растений.
На многих листьях с мозаичными симптомами обнаруживаются участки,
состоящие из пораженной ткани одного типа с вкраплениями небольших
•островков ткани другого типа («пунктирные участки»). Эти участки бывают
видны невооруженным глазом. Основной цвет такого рода участков чаще
всего белый или желтовато-белый с многочисленными мелкими темно-зеле-
ными или бледно-зелеными островками. Темно-зеленые участки появляются
обычно на верхней поверхности листа и не всегда видны, если смотреть
с его нижней поверхности. Цитологически описываемый тип ткани в уча-
стках микроскопической мозаики состоит из какого-то островка обесцвечен-
ной, почти обесцвеченной ткани или ткани того или иного оттенка желтого
цвета, однако в нем имеется множество мелких островков темно-зеленых
или бледно-зеленых палисадных клеток. В некоторых «пунктирных участ-
ках» зеленые островки приподняты над поверхностью листа, в других слу-
чаях листовая поверхность остается ровной.
Участки мозаичного листа, которые при макроскопическом исследова-
нии выглядят как одноцветные, при изучении их под микроскопом могут
оказаться состоящими из смешанной ткани, в которой различные горизон-
тальные слои клеток мезофилла содержат разные типы хлоропластов. Подоб-
ные участки представляют собой смесь самых разнообразных типов пора-
женных тканей. По-видимому, наиболее часто встречается такое сочетание,
когда один верхний или два слоя палисадных клеток принадлежат к одному
типу, т. е. они темно-зеленые или бледно-зеленые, тогда как остальная часть
мезофилла состоит из желто-зеленых или бесцветных клеток. Возможно
и другое сочетание, когда один нижний или два слоя губчатой паренхимы
•содержат темно-зеленые клетки, а остальные клетки мезофилла в той или
иной степени аномальны. В некоторых участках как палисадная, так и ниж-
ние слои губчатой паренхимы могут состоять из темно-зеленой ткани, тогда
как центральная зона клеток листовой пластинки оказывается бесцветной
или желто-зеленой (фото 57, Л). Возможна и обратная картина, когда цент-
ральная зона содержит нормальные темно-зеленые клетки, а верхние и ниж-
ние слои состоят из пораженных клеток (фото 57, Б).
Как видно на срезах, эти участки горизонтальной слоистости могут
иметь протяженность в несколько миллиметров или быть совсем небольши-
ми, образуя островки из нескольких клеток или даже одной клетки какого-то
другого типа. Граница между островками темно-зеленых и аномальных кле-
ток при микроскопическом изучении мозаичных участков выражена часто
очень четко (цветная вклейка 1).
При электронно-микроскопическом исследовании клеток системно инфи-
цированных листьев можно наблюдать, что в желто-зеленых участках хлоро-
Симптомы вирусных болезней
219
-нласты агрегируют друг с другом, образуя большие комочки, в которых
отдельные хлоропласты подогнаны друг к другу и разделены лишь узкими
промежутками. Эти промежутки обычно увеличиваются со временем и обра-
зуют пространства, выглядящие более или менее округлыми па срезах.
Пространства между хлоропластами заполнены частицами, которые зани-
мают такой же объем и так же окрашиваются, как и основная цитоплазма.
Никаких признаков, которые свидетельствовали бы о наличии каких-либо
мембран, ограничивающих эти агрегаты хлоропластов, мы не обнаружили.
Многочисленные пузырьки различных размеров наблюдаются главным обра-
зом вблизи краев хлоропластов (фото 58). Содержимое этих пузырьков
таково, что они обычно не окрашиваются. Ламеллы стромы широко разбро-
саны в пораженных хлоропластах. Пачки, образуемые ламеллами гран, встре-
чаются в меньшем количестве и имеют меньшие размеры, чем обычно. Более
сильные штаммы вируса, по данным визуальных наблюдений, вызывают
'более резко выраженную дегенерацию ламелл гран и ламелл стромы. В обес-
цвеченных тканях нередко наблюдается полная дезинтеграция структуры
хлоропластов. Внутри хлоропластов не обнаружено каких-либо частиц,
которые могли бы быть по своим размерам или способности к окрашиванию
идентифицированы как частицы ВЖМТ. Ядра и митохондрии инфицирован-
ных клеток выглядят в основном нормальными. Джерола и др. [611], а также
Рубио-Хуэртос и др. [1456] обнаружили в клетках растений, инфицирован-
ных ВЖМТ, агрегаты хлоропластов, аналогичные описанным нами.
Объединение аномальных хлоропластов с образованием включений весьма
характерно для ВЖМТ и его штаммов. Миличич и Стефанек [1208] обнару-
жили сходные включения в клетках растений, инфицированных тремя раз-
ными штаммами ВЖМТ. Образование вакуолей наблюдается также в хлоро-
пластах растений, инфицированных вирусом морщинистости турнепса.
Другие исследованные вирусы, например вирус мозаики турнепса, вирус
мозаики цветной капусты и вирус огуречной мозаики, не вызывают в хло-
ропластах изменений, характерных для ВЖМТ. Однако Сан [1706] описал
•исчезновение гран и вакуолизацию хлоропластов в клетках желтых участ-
ков листьев Abutilon striatum, зараженных вирусом инфекционного
хлороза.
В растениях, инфицированных некротическим штаммом ВЖТМ, Хитч-
'борн и Хиле [802, 803] обнаружили трубочки диаметром 110—250 нм и дли-
ной до нескольких микрон (фото 59). Эти трубочки состояли, по-видимому,
из какого-то белка, сходного в химическом и иммунологическом отношении
•с белком оболочки ВЖМТ. Они были образованы гексагонально упакован-
ными гексагональными субъединицами, напоминающими гексамеры, построен-
ные из белковых субъединиц вирусных частиц. Эти трубочки, вероятно,
имеют форму спирали с переменным шагом и несколько напоминают поли-
головки, обнаруживаемые в клетках Е. coli, инфицированных фагом Т4
[510, 962].
Другие мелкие сферические вирусы
У растений, инфицированных другими мелкими сферическим вирусами,
четко выраженных патологических изменений хлоропластов, сопутствующих
инфекции ВЖМТ, по-видимому, не наблюдается. С помощью электронной
микроскопии на тонких срезах клеток, инфицированных вирусом некроза
•табака или вирусом южной мозаики фасоли, обнаружены многочисленные
вирусоподобные частицы и агрегаты регулярно расположенных частиц
в цитоплазме [483]. Частицы в агрегатах располагаются на таком же расстоя-
нии друг от друга, как и в осадке очищенного вируса (что показано исследо-
ванием ультратонких срезов через преципитат вируса in vitro).
220
Глава IX
Уолки и Уэбб [1856] выделяли апикальную меристему растений, инфи-
цированных одним из мелких вирусов, соответствующим образом окраши-
вали и исследовали ее с помощью электронного микроскопа. На препаратах
были обнаружены вирусные частицы, выстроенные в один ряд в виде длин-
ных трубочек, окруженных двойной мембраной. Диаметр таких трубочек
из клеток Nicotiana rustica, инфицированных вирусом скручивания листьев
вишни, был равен приблизительно 40 нм, их длина доходила до 4 мкм, и тру-
бочки содержали около 150 вирусных частиц. Вирус деформирующей мозаики
гороха — это один из немногих мелких сферических вирусов, накапливаю-
щихся, как теперь известно, в ядрах инфицированных клеток. Этот вирус
обнаруживается также в цитоплазме. СикатаиМараморош [1566] показали, что
вирусные частицы первоначально накапливаются в ядрах клеток пораженных
листьев и бобов гороха. В течение инфекции ядрышки разрушаются, и ядро
оказывается наполненным массой вирусных частиц. В цитоплазме вирус-
ные частицы иногда присутствуют либо в кристаллической форме, либо
в виде беспорядочных групп внутри пузырьков, окруженных мембра-
нами.
В цитоплазме клеток растений, инфицированных вирусом мозаики
цветной капусты или родственным вирусом мозаики Dahlia, с помощью
светового микроскопа обнаружены внутриклеточные включения характер-
ной округлой формы. Эти структуры легко можно наблюдать в полосках
эпидермиса листа системно инфицированных растений после окрашивания
пиронином. Присутствие подобных включений в клетках может служить
хорошим диагностическим признаком при идентификации вирусов этой
группы (Шеферд, личное сообщение). Как следует из результатов электрон-
но-микроскопических наблюдений, вокруг этих включений, содержащих
рассеянные в аморфном матриксе вирусные частицы, мембраны отсутствуют.
Крупные вирусы
На ультратонких срезах листьев растений пшеницы, инфицированных
вирусом полосатой мозаики пшеницы, в паренхимных клетках наблюдались
включения, состоящие из вирусных частиц бацилловидной формы [1059,
1061]. В некоторых включениях частицы были расположены регулярным
образом, а некоторые включения были окружены мембранами. Часто можно-
было наблюдать группы частиц, тесно связанные с мембраной ядра, ограни-
чивающей его снаружи, тогда как другие находились внутри ядра. Для
некоторых внутриядерных включений были характерны мембраны, а дру-
гие не имели их.
Мак-Леод и др. [ИЗО] обнаружили, что вирус желтой карликовости
картофеля скапливается в форме агрегатов либо в ядрах, либо в цитоплазма-
тических впячиваниях в ядро. Эти агрегаты могут содержать некоторые
клеточные органеллы, например митохондрии, или состоят почти исключи-
тельно из вирусных частиц (фото 60, Л). Аналогичные структуры присут-
ствуют в ядрах клеток, инфицированных вирусом пожелтения жилок осота
(фото 60, Б).
В цитоплазме клеток листьев растений, инфицированных вирусом некро-
тического пожелтения салата-латука, можно наблюдать группы вирусных
частиц, заключенных в структуры, окруженные двойной мембраной [352].
Включения аналогичного типа обнаружены в клетках, инфицированных
вирусом гомфрены [980].
Частицы вируса бронзовости томатов в цитоплазме инфицированных
клеток часто объединены в небольшие группы, окруженные мембраной
[1163] (фото 19). По данным Фукуси и др. [580], частицы вируса карликовости
риса в цитоплазме также часто объединены в группы, окруженные мембра-
Симптомы вирусных болезней
221
ной. Возможно, структуры этого типа идентичны включениям, наблюдаемым
в инфицированных клетках листьев риса с помощью светового микроскопа
1788].
ВЗАИМОСВЯЗЬ МЕЖДУ РЕПЛИКАЦИЕЙ ВИРУСА,
РОСТОМ РАСТЕНИЯ И СИМПТОМАМИ ЗАБОЛЕВАНИЯ
В настоящее время очень немногое известно относительно того, каким
образом репликация вируса связана с развитием заболевания. В этом разделе
мы обсудим некоторые аспекты взаимосвязи, существующей между реплика-
цией вируса, ростом растения и симптомами заболевания. В гл. XI суммиро-
ваны данные относительно влияния вирусной инфекции па биохимические
процессы в растении.
Концентрация вируса и степень тяжести заболевания
В некоторых случаях растение с более тяжелыми симптомами заболева-
ния содержит большее количество вируса, чем растение с менее выражен-
ными симптомами, хотя это и не является общим правилом. Например,
штаммы ВТМ, вызывающие заболевания средней тяжести, накапливаются
в больших концентрациях, тогда как мутанты, вызывающие очень тяжелые
заболевания,— в гораздо меньших. Выше приводились данные, свидетель-
ствующие о том, что различные участки ткали листьев китайской капусты
с симптомами мозаичного заболевания, вызванного ВЖМТ, содержат раз-
ные штаммы этого вируса. Некоторые штаммы вызывают очень серьезные
нарушения структуры хлоропластов, действие других штаммов может быть
значительно слабее, но, несмотря па эти различия, вирусы различных штам-
мов накапливаются в примерно равных количествах.
Иногда усиление степени выра?кенности симптомов заболевания прямо
связано с увеличением интенсивности репродукции вируса. Так, Джилласпи
и Банкрофт [638] наблюдали через 1,5 и 4,5 нед после инокуляции сои виру-
сом крапчатости бобов фасоли резкое усиление степени выраженности симпто-
мов, вслед за чем следовал период выздоровления. Анализ экстрактов листьев
инфицированных растений показал, что накопление инфекционного вируса
Фиг. 41. Концентрация и удельная инфек-
ционность вируса мозаики люцерны, вы-
деленного из целых растений табака через
различные периоды времени после иноку-
ляции [Ю27].
I. Количество очищенного вируса (левая шкала).
II. Число местных поражений, образующихся
в ответ на инокуляцию экстрактом инфицирован-
ных листьев. III. Число местных поражений,
образующихся при инокуляции очищенными пре-
паратами вируса равной концентрации. Появ-
ление второго максимума концентрации вируса
в растениях коррелирует с большей степенью
выраженности симптомов заболевания на моло-
дых побегах.
222
Глава IX
в максимальных концентрациях приходится на период первого резкого уси-
ления степени выраженности симптомов (1,5 вед); далее концентрация инфек-
ционного вируса в экстрактах падает, а затем вновь достигает максимума
к периоду второй вспышки заболевания (4,5 иед). Аналогичная ситуация
описана Куном и Банкрофтом [1027] при заражении растений табака виру-
сом мозаики люцерны (фиг. 41). В этом случае вторичное увеличение концен-
трации вируса и усиление степени выраженности симптомов совпадали
с периодом более быстрого роста растений.
Роль штаммов вируса в определении характера мозаичного
заболевания
В некоторых случаях (например, при заражении табака ВТМ) заболева-
ние отдельного растения вызывается, по-видимому, в значительной степени
каким-то одним штаммом вируса. Тем не менее уже много лет известно, что
иногда светло-желтые участки мозаичного листа содержат различные штаммы
вируса.
Мозаичное заболевание листьев китайской капусты, инфицированной
ВЖМТ, обычно развивается при участии серии штаммов этого вируса. Мы
предложили следующие гипотезы, объясняющие природу этого мозаичного
заболевания [347]: 1) инфекционный вирус передвигается из инокулироваи-
ного листа к зоне делящихся клеток, расположенных ниже апикальной мери-
стемы. С помощью тестов на инфекционность было установлено, что частицы
ВЖМТ присутствуют в этой зоне у системно инфицированных растений
(Фаэд и Мэтьюз, неопубликованные данные); 2) вирус мутирует с образова-
нием штаммов, оказывающих различное действие иа хлоропласты клеток
инфицированных растений. В полученном нами изоляте ВЖМТ мы наблю-
дали различные штаммы вируса, причем все попытки получить препарат,
содержащий только один штамм повторным пассивированием через некроз,
были безуспешны; 3) репликация первой молекулы РНК, инфицирующей
данную клетку, предотвращает репродукцию других штаммов в этой клетке.
При делении первой инфицированной клетки исходный штамм вируса пере-
дается дочерним клеткам, и таким образом формируется клон клеток, содер-
жащих только один штамм вируса. Клоны образовавшихся при этом клеток
дают начало островкам ткани, которые видны невооруженным глазом,
а также слоям клеток, обнаруживаемым с помощью микроскопа в участках
с уже развившимися симптомами мозаичного заболевания. Результаты наблю-
дений за развитием этого заболевания и окончательным распределением кле-
ток, инфицированных различными штаммами вируса, свидетельствуют
в пользу предположения о том, что отдельные островки ткани, наблюдаемые
в инфицированных ВЖМТ листьях, представляют собой клоны клеток, про-
исшедших от одной клетки или довольно небольшой группы клеток, заражен-
ных каким-то одним вирусным штаммом па ранней стадии онтогенеза листа.
Согласно общепринятой схеме гистогенеза, характерной для многих
листьев растений [1773], наружный слой клеток (LI) листового примордия
дает начало эпидермису. Следующий слой (LII), состоящий из одного ряда
клеток, дает начало палисадной и ниже расположенной губчатой паренхиме,
а из третьего многоклеточного слоя (LIII) примордия формируются жилки
и центральный участок листовой пластинки. Некоторые из наблюдаемых
картин распределения темно-зеленых и пораженных клеток мозаичных
листьев достаточно хорошо согласуются с приведенной схемой гистогенеза
листа (см., например, фото 57).
Б аркоми др. [304] были обнаружены размножающиеся семенами мутанты
табака, характеризующиеся аномалиями пластид, которые были использо-
ваны для изучения гистогенеза листа. Мутанты китайской капусты анало-
гичного типа до настоящего времени обнаружить не удалось. Тем не менее
Симптомы вирусных болезней 223
различные картины распределения слоев, наблюдаемые па листьях локаль-
ных пластидных мутантов китайской капусты, весьма напоминают карти-
ны, обнаруживаемые при микроскопировании как мозаичных листьев, инфи-
цированных ВЖМТ, так и листьев пластидных мутантов табака, описанных
Барком и др. 1304] (фото 65).
Однако результаты многих наших наблюдений не могут быть объяс-
нены с точки зрения классической схемы распределения слоев Ы, Ы1 и ЫП.
Например, как можно объяснить возникновение ткани «пунктирного» типа
с многочисленными мелкими группами темно-зеленых палисадных клеток,
заключенных в обесцвеченную или желто-зеленую ткань мезофилла мозаич-
ного листа, инфицированного ВЖМТ? Результаты недавней работы Барка
и Стюарта (личное сообщение), проведенной с пластидными мутантами таба-
ка, позволяют предполагать, что нормальный процесс развития листа, вероят-
но, гораздо более сложен и изменчив, нежели это считали ранее. Для того
чтобы объяснить присутствие небольших островков нормальных клеток
в палисадной ткани, мутантной по слоям LII и ЫП, ученые предположили,
что нормальные эпидермальные клетки (LI) могут мигрировать в палисадный
слой (LII) па некоторой стадии развития листа. Эти клетки (Ы) приобре-
тают свойства палисадных, и таким образом возникают занявшие чужое
владение островки клеток с нормальными хлоропластами. Мы предпо-
ложили, что островки темно-зеленых клеток в ткани пунктирного типа
образуются именно в результате такого внедрения. Ткань приобретает
характерный «пунктирный» вид после того, как слой LII, содержащий вирус
в высокой концентрации, покрывается эпидермисом Ы темно-зеленого типа.
Таким образом, островки темно-зеленых клеток во взрослом листе представ-
ляют собой потомство клеток слоя Ы, мигрировавших в слой LII. Микро-
скопические и небольшие макроскопические островки темно-зеленой ткани,,
появляющиеся в других участках мозаичного листа, почти всегда связаны
с верхним эпидермисом. Причина этого неясна, однако Барк и Стюарт (лич-
ное сообщение) обнаружили аналогичное распределение островков клеток
мезофилла с нормальными хлоропластами в пластидных мутантах табака.
Если слой ЫП действительно дает начало центральному слою листовой
пластинки, то с точки зрения нашей гипотезы трудно объяснить, например,
почему па границе между темно-зелеными и желто-зелеными участками
темпо-зеленая площадь (ЫП) часто соответствует верхнему и нижнему темпо-
зеленым слоям, происшедшим из слоя Ы1. По данным Барка и Стюарта (лич-
ное сообщение), из слоя ЫП могут образоваться в разных случаях разные
части центральной области листовой пластинки растений табака. В исследо-
ванных нами пластидных мутантах китайской капусты часто обнаруживается
четкая граница между нормальными и мутантными тканями во всех слоях
мезофилла. Таким образом, представляется вероятным, что и в китайской
капусте все слои мезофилла многих листьев происходят из слоя LII листового
примордия.
Если верно предположение, что различные островки мозаичного листа
представляют собой клоны клеток, возникших из небольшого количества
клеток, зараженных в ходе клеточных делений, которые происходят на ран-
них этапах онтогенеза листа, то из этого следует, что вирусный штамм, инфи-
цировавший эти клетки, способен подавлять репродукцию другого штамма,
действие которого на хлоропласты отличается от действия первого штамма.
Иначе не могли бы существовать участки листа с различными типами повре-
ждений хиоропластов. Возможна, однако, и такая ситуация, когда вирус
мутирует в уже зараженной клетке, причем эти мутации наблюдаются в ходе
клеточных делений, происходящих на ранних этапах онтогенеза листа.
Этот процесс должен привести к возникновению сублипии клеток, содер-
жащих мутантный штамм. Это обстоятельство представляет собой дополни-
'.224
Глава IX
тельный фактор, возможно, участвующий в создании сложной картины листо-
вой мозаики.
Мы предположили [1417], что островки темно-зеленой ткани, содержа-
щей очень небольшое количество вируса, могут развиваться из одиночных
клеток в результате процесса, аналогичного лизогении. Позже с помощью
метода подсчета числа клеток-предшественников (этот метод в применении
к анализу мозаичной картины, вызываемой ВТМ, описан ниже) мы показали,
что многие островки темно-зеленой ткани происходят из групп в несколько
сотен клеток и что такие группы не могут возникнуть в результате случай-
ного события (Фаэд и Мэтьюз, неопубликованные данные).
При анализе природы темно-зеленых островков мозаичного листа пред-
оставляется весьма трудным выбор между возможным участием в их образо-
вании процессов, аналогичных лизогении, и возможностью присутствия
в темно-зеленых участках дефектных мутантов, продуцирующих очень неболь-
шое количество нормальных частиц, ио блокирующих репродукцию в этих
участках других вирусных штаммов. Таким образом, для установления при-
чины появления темно-зеленых островков ткани в мозаичном листе требуются
еще дополнительные исследования.
Иногда темно-зеленые участки мозаики исчезают, давая начало серии
желтых пятен, подобных местным поражениям. Что контролирует исчезно-
вение темно-зеленых участков, также остается неизвестным. По нашему мне-
нию, маловероятно, что темно-зеленая ткань просто представляет собой
участки, свободные от вирусной инфекции. В пользу этой точки зрения гово-
рят следующие факты: 1) граница между темно-зеленой и пораженной тка-
нями может оставаться четкой в течение нескольких недель, несмотря иа то
что не удается обнаружить каких-либо заметных ограничений в распростра-
нении инфекционного вируса; 2) листья того же возраста, что и те, на кото-
рых обнаруживаются островки темно-зеленой ткани, при системном их инфи-
цировании, когда они уже развернулись, оказываются полностью заражен-
ными вирусом, однако мозаичные симптомы на этих листьях не появляются.
Возникает вопрос, насколько широко наша гипотеза применима к виру-
сам, вызывающим мозаичные заболевания, хотя существование специфи-
ческих деталей при разных мозаичных заболеваниях несомненно. В самом
деле, даже в случае ВЖМТ не все изоляты вызывают сходную картину подоб-
ного рода заболеваний у всех разновидностей растения-хозяина при изме-
няющихся условиях окружающей среды. Например, при инфицировании
одной из разновидностей Brassica pekinensis изолятом ВЖМТ, использованным
Бовэ [230], развивается почти классическая картина системного пожелтения.
В других случаях у некоторых разновидностей турнепса (Brassica тара L.)
ВЖМТ индуцирует образование диффузной крапчатости без четких границ.
Исследуя природу темно-зеленых участков на мозаичных листьях таба-
ка, инфицированных ВТМ, мы определяли число клеток в первом системно
инфицированном листе, обнаруживающем признаки мозаичного заболевания,
как в момент инокуляции, так и в тот момент, когда лист уже полностью
развернулся и на нем можно было обнаружить многочисленные мелкие
участки темно-зеленой ткани (Аткинсон и Мэтьюз, неопубликованные дан-
ные). Подсчеты показали, что одна клетка не может образовать темно-
зеленый островок наблюдаемого размера и в среднем в его формировании
должна принимать участие группа, состоящая из 20—40 палисадных клеток.
Мелкие темно-зеленые островки, включающие все слои мезофилла, образо-
вались, как было показано, в листьях, для которых было характерно нали-
чие 7 слоев клеток мезофилла к моменту их инокуляции ВТМ. Таким обра-
зом, каждый темно-зеленый островок должен возникать из группы, состоя-
щей примерно из 200 клеток. Статистический анализ показывает, что группы
такого размера не могли появиться случайно. Представляется вероятным,
Симптомы вирусных болезней 225
что агент, вызывающий превращение здоровых клеток в темно-зеленые дол-
жен передаваться от клетки к клетке на какой-то ранней стадии после того,
как произошло системное распространение вируса.
В то время как некоторые участки темно-зеленого типа исчезают и в них
репродуцируется ВТМ, другие участки инфицированного листа остаются
почти полностью свободными от вируса в течение всей жизни листа. Темно-
зеленые участки такого типа, по-видимому, не поддерживают репродукции
ВТМ. Этот вывод можно сделать на том основании, что, во-первых, при
суперинфицировании этих участков ВТМ концентрация инфекционного
вируса в них не увеличивается и, во-вторых, граница между желто-зелеными
тканями с высокой концентрацией инфекционного ВТМ и темно-зеленым
участком остается четкой в течение многих недель, несмотря на то что клетки
обоих участков соединены плазмодесмами. В темно-зеленых участках вблизи
границ с желто-зелеными тканями обнаружен градиент концентрации сво-
бодных частиц ВТМ, которые, как мы полагаем, диффундируют из соседних
желто-зеленых тканей (фиг. 35).
Лист однодольных растений развивается благодаря деятельности мери-
стемы, располагающейся перпендикулярно основанию листа, причем клетки
меристемы делятся в поперечном направлении. В случае пластидных мутантов
эта форма развития приводит it образованию продольных полос нормальных
и мутантных тканей. Наблюдаемая при мозаичных заболеваниях однодоль-
ных полосатость или штриховатость (фото 39) согласуется с точкой зрения,
согласно которой отдельные островки ткани возникают из одиночных клеток
или небольших групп клеток в процессе онтогенеза листа. Чандра и Гиль-
дебрандт [354] показали, что отдельные клоны клеток, происходящих из
тканевой культуры каллюса табака, инфицированного ВТМ, не содержат
ни включений, ни инфекционного вируса. Из клонов таких клеток авторам
удалось регенерировать целые растения табака без каких "бы то ни было
симптомов заболевания, полностью свободные от инфекционного вируса.
Возможно, что отдельные клеточные линии в тканевой культуре каллюса,
свободные от вируса, эквивалентны островкам темно-зеленых тканей
в интактных инфицированных растениях.
15-0893
ГЛАВА X
АГЕНТЫ, ВЫЗЫВАЮЩИЕ СИМПТОМЫ,
СХОДНЫЕ С СИМПТОМАМИ ВИРУСНЫХ
БОЛЕЗНЕЙ
Появление патологических симптомов, сходных с теми, которые вызы-
ваются вирусами, может быть обусловлено воздействием на растения ряда
физических, химических и биологических агентов. Иногда легко сделать
ошибочное заключение об участии вируса в возникновении болезни в поле-
вых условиях. Так, например, результаты исследований, опубликованных
недавно, содержат веские доводы в пользу того, что целая группа болезней,
возникновение которых раньше приписывалось вирусной инфекции, в дей-
ствительности вызываются организмами типа микоплазм.
ОРГАНИЗМЫ ТИПА МИКОПЛАЗМ
До самого последнего времени считалось, что группа болезней, харак-
теризующихся такими признаками, как общее пожелтение листьев, карлико-
вость, израстание побегов типа ведьминых метел, изменение строения цвет-
ков, в результате которого лепестки видоизменяются в листья, вызывается
вирусами.
Заболевания этой группы обычно не передаются механическим путем,
но их вирусное происхождение обосновывалось следующим образом: 1) бак-
терии, риккетсии, грибы или простейшие как возбудители исключались;
2) эти заболевания могут передаваться прививкой; 3) они передаются цикад-
ками; 4) по крайней мере некоторые из них могут передаваться повиликой;
5) имелись данные, что возбудитель желтухи астр — относительно наибо-
лее изученной болезни этого типа — является фильтрующимся агентом.
Блэк [201] показал, что возбудитель желтухи астр может передаваться нор-
мальным цикадкам путем инъекции экстракта из цикадок — носителей
вируса. Используя этот прием, Блэк [203] изучил некоторые свойства этого
агента in vitro. Оказалось, что он с трудом проходит через фильтры Берк-
фельда N и V, которые задерживают Serratia marcescens, но не препятствуют
прохождению «бактерий, которые были нормальной примесью в препаратах».
Инфекционный агент удавалось осадить центрифугированием в течение 8 мин
при скорости 500 об/с, в связи с чем Блэк пришел к следующему выводу:
«Результаты, полученные при фильтровании и ультрацентрифугировании,
позволяют предположить, что активность связана с частицей большего раз-
мера, чем изученные до сих пор вирусы растений». В течение десятилетий
даже наиболее критически настроенные исследователи — специалисты по ви-
русным болезням растений принимали представление о том, что болезни
типа желтух и ведьминых метел вызываются вирусами. Некоторые клас-
сические «вирусологические» исследования были выполнены на возбудителях
этой группы болезней, например эксперименты по тепловой терапии расте-
ний, зараженных возбудителями желтухи персиков и желтухи астр [1028—
1030]. К этой группе относятся некоторые болезни, имеющие серьезное
экономическое значение.
Невирусные агенты, вызывающие симптомы вирусных болезней 227
Многочисленные попытки выделения и очистки вируса из растений,
пораженных болезнями типа желтух, оказались безуспешными. Считалось, что
вирус должен содержаться в очень низкой концентрации и быть нестабиль-
ным или агрегировать в условиях, обычно применявшихся при его выделе-
нии. Благодаря усовершенствованию методов получения ультратонких сре-
зов для электронной микроскопии в клетках растений, зараженных самыми
разными вирусами, удалось выявить характерные вирусные частицы. Тот
факт, что на ультратонких срезах растений, пораженных болезнями типа
желтух, вирусоподобные частицы никогда не были видны, заставил Асуяму
и его сотрудников [466, 854] заняться более пристальным изучением некото-
рых из этих болезней.
Дой и др. [466] исследовали растения петунии, пораженные желтухой
астр, павловнию и растения картофеля, пораженные болезнью типа ведьминых
метел, а также тутовые деревья с симптомами карликовости. Во флоэме
всех больных растений они обнаружили организмы типа микоплазм, отсут-
ствовавшие в здоровых растениях. Распространение микоплазмоподобных
организмов ограничивалось элементами флоэмы (ситовидные трубки, клетки-
спутники и флоэмная паренхима), где они обнаруживаются только в цито-
плазме клеток. Эти организмы имели вид телец сферической, эллипсоидной
или неправильной формы, диаметром от 80 до 800 им (фото 61,А), окружен-
ных одинарной мембраной, но лишенных клеточной стенки. Самые мелкие
тельца, диаметром 100—250 нм, имели более или менее сферическую форму
и были заполнены напоминающими рибосомы частицами диаметром около-
13 нм. Во многих тельцах были видны нити какого-то вещества, внешне-
напоминающие ДНК бактерий. В крупных тельцах (диаметром более 300 им}
присутствовала центральная вакуоль с рибосомоподобными гранулами вблизи
мембраны. Оба типа телец обнаруживались в одной и той же клетке. Часто
между мелкими и крупными тельцами удавалось увидеть перемычку; это
наводило на мысль, что мелкие тельца образуются путем отпочковывания
от крупных. Тельца, обнаруженные во флоэме всех четырех растений, были
неразличимы морфологически.
Число телец во флоэме коррелировало со степенью тяжести заболева-
ния. На ранних стадиях инфекции, когда болезнь еще слабо выражена,
число их невелико. Значительно большее число телец содержалось в сильно
пораженных растениях или органах растений.
Известно, что многие микоплазмы, поражающие млекопитающих, чув-
ствительны к антибиотикам группы тетрациклина, тогда как вирусы нечув-
ствительны к ним. Ишии и др. [854] обработали шелковицу, пораженную
карликовостью, тремя антибиотиками этой группы, опрыскивая листья,
поливая почву или погружая корни в соответствующие растворы на один
день. Два препарата, ахромицин и ауреомицин, в концентрации 100 ч. на млн.
подавляли развитие симптомов, тогда как каиамицин был неактивен. Наи-
более эффективным способом воздействия оказалось погружение корней
в раствор антибиотика. В побегах, которые излечивались от болезни (фото
62), микоплазмоподобные организмы во флоэме исчезали. Излечение не было
устойчивым, и по прошествии некоторого времени симптомы болезни вновь
проявлялись на молодых побегах.
Некоторые микоплазмы, инфицирующие млекопитающих, можно культи-
вировать in vitro на соответствующих средах. Они предпочитают -несколько
щелочную среду. Паразитические микоплазмы, несмотря на отсутствие у них
клеточной оболочки, вполне устойчивы к осмотическому лизису, хотя в лога-
рифмической фазе роста чувствительность к нему возрастает [1404]. Дой
и др. [466] высказали предположение, что флоэма является благоприятной
средой для роста микоплазм, так как для флоэмного сока характерно высо-
кое осмотическое давление и слабощелочное значение pH.
15*
228
Глава X
Известно, что микоплазмы в культуре нуждаются в стерине; было выска-
зано предположение, что во флоэме содержится достаточное количество
стеринов и что это служит второй возможной причиной локализации мико-
плазм в этой ткани. Это было показано экспериментально на примере расте-
ний, из которых удается выделить содержимое флоэмы [1988].
Болезни типа желтух и карликовости переносятся цикадками, питающи-
мися на флоэме, и тот факт, что микоплазмоподобные организмы связаны
с флоэмой, вполне соответствует представлению, что они являются возбуди-
телями болезни. Гранадос и др. [670], а также Мараморош и др. [1144] иден-
тифицировали микоплазмоподобные организмы на электронных микрофото-
графиях клеток растений кукурузы, пораженных карликовостью, а также
в организме вирофорных цикадок-переносчиков Dalbulus elimatus Ball.
У этих насекомых возбудители обнаруживались в клетках центральных
ганглиев и в области фильтрующей камеры кишечника. В то же время в здо-
ровых растениях кукурузы, а также в организме цикадок, не являющихся
носителями возбудителя карликовости, микоплазмоподобные организмы
не обнаруживались. Микоплазмоподобные организмы обнаружены также
у переносчиков, заражающих растения желтухой астр (фото 63).
По отношению к организмам, обнаруживаемым в больных растениях,
следует применять термин «микоплазмоподобные». Дело в том, что в настоя-
щее время известны три группы возбудителей, которые трудно или невоз-
можно различить только на основании морфологических признаков. Это
группа возбудителей PLT (возбудители пситтакоза, венерической лимфо-
грануломы и трахомы), микоплазмы и L-формы бактерий. Представители
группы PLT — облигатные внутриклеточные паразиты с простой клеточной
оболочкой, содержащей мурамовую кислоту; их размеры составляют 200 —
1000 нм. У них, вероятно, отсутствует система генерирования энергии; насе-
комые-переносчики для них неизвестны. Эти организмы чувствительны как
к пенициллину, так и к антибиотикам группы тетрациклина.
Микоплазмы, инфицирующие млекопитающих, открыты сравнительно
недавно. Некоторые из них удается культивировать in vitro. По своему строе-
нию они очень сходны с описанными выше организмами, обнаруженными
в растениях. Одни микоплазмы обладают ферментативной активностью, дру-
гие же лишены ее. Они резистентны к пенициллину, по многие из них чув-
ствительны к препаратам группы тетрациклина.
L-формы бактерий образуются при культивировании бактерий в присут-
ствии пенициллина. Они лишены клеточной оболочки, но способны синтези-
ровать некоторые ее компоненты. Они плеоморфны и по величине сходны
с микоплазмами, хотя минимальные размеры, видимо, не ниже 600 нм.
L-формы могут превращаться в нормальные бактерии после удаления пени-
циллина, но далеко не всегда. Было высказано предположение, что мико-
плазмы — это просто стабильные L-формы бактерий. Однако эксперименты
по гибридизации ДНК не подтвердили этого (например, [1119]). Предпола-
галось, что некоторые болезни растений, например увядание гороха [755],
вызваны L-формами бактерий; впрочем, эта точка зрения не была примята
большинством фитопатологов.
Судя по имеющимся в настоящее время данным, организмы, обнаружи-
ваемые во флоэме больных растений, скорее всего представляют собой мико-
плазмы. Однако пока нельзя считать доказанным, что именно они являются
возбудителями желтухи и подобных ей болезней. Так, вполне можно допу-
стить, что болезнь вызывается вирусом, носителем которого являются мико-
плазмы. В ряде лабораторий ведутся исследования, имеющие целью получе-
ние чистых культур микоплазм in vitro, с тем чтобы попытаться воспро-
извести обычное течение патогенного процесса с помощью таких чистых
культур.
Таблица 10
Болезни растений, предположительно вызываемые возбудителями
типа микоплазм х)
Болезнь
Хозяин
Исследователи
А. Болезни, при которых в растениях и переносчиках возбудители типа
микоплазм обнаружены при помощи электронной микроскопии
1. Карликовость шелковицы
2. Ведьмины метлы карто-
феля
3. Клеверный штамм желту-
хи астр
4. Ведьмины метлы навловпии
5. Американская желтуха
астр (штамм AYV 6, по-
ражающий сельдерей)
6. Карликовость кукурузы
(штамм Луизиана)
7. Крымская желтуха
8. Европейская карликовость
клевера
9. Сто лбу р
10. Парастолбур
11. Vinca proliferation (евро-
пейская желтуха астр)
12. Желтая карликовость риса
13. Карликовость травянисто-
го покрова (grassy stunt)
14. Побеление листьев сахар-
ного тростника
15. Ведьмины метлы
16. Ведьмины метлы
17. Филлодии клевера
18. Мелколистноеть бобовых
Сеянцы шелковицы
Картофель
Петуния
Павловния
Callistepkus chlnensis
Nicottana rustica
Macrosleles jascifrons
Zea mays
Dalbulus elimalus
Vinca rosea
To ясе
» »
» »
» »
Nephotettix cincticeps
Сахарный тростник
Cryptolaenia japonica
Батат
Trijoliurn repens,
Euscelis plebejus
Vinca rosea
19. Филлодии яблони
20. Пожелтение листьев ново-
зеландского льна
Phormium lenax,
Oliarus atkinsonii
И. Дон, M. Теранака,
К. Йора, X. Асуяма
То же
» »
» »
К. Мараморош, Р. Гра-
надос
П. Плоайе, К. Марамо-
рош, Р. Гранадос
То же
» »
» »
» »
» »
Е. Сиката
Нэйсу и сотр.
С. Лип, К. Ли
Асуяма и сотр.
И. Дой и сотр.
Дж. Джиаиноти, Г. Де-
вашель, К. Ваго
Дж. Бауйер, Дж. Атер-
тон, Д. Тикл, Г. Эй-
херн
Дж. Джианноти, Г. Мор-
ван, К. Ваго
Р. Усияма, Р. Мэтьюз
Б. Болезни растений, возбудителями которых считаются агенты типа микоплазм
(на основании экспериментов по химиотерапии растений-хозяев и насекомых-переносчиков')
1. Карликовость шелковицы Сеянцы шелковицы T. Ишии, K. X. Асуяма Йора,
2. Американская желтуха Chrysanthemum cari- P. Дэвис, Дж. Фрайтаг,
астр (штамм, поражающий сельдерей) 3. Карликовость кукурузы (штамм Луизиана) 4. Западный Х-вирус мелко- плодности вишни nalum, Apium gra- veoens, Calllstephus chinensis, Macrosle- les fascifrons Zea mays P. Виткомб, P. Гранадос Д. Йенсен Р. Стир
1) Этот список составлен при участии X. Асуямы и К. Мараморота и включает некоторые
сведения, находящиеся в печати или не опубликованные (данные на сентябрь 1968 года).
230
Глава X
Следующие факты, взятые в совокупности, служат веским свидетель-
ством в пользу того, что микоплазмоподобные организмы действительно
вызывают желтуху, ведьмины метлы и сходные с ними болезни:
а) они присутствуют в больных растениях и отсутствуют в здоровых;
б) они присутствуют в цикадках — переносчиках возбудителя и отсут-
ствуют в тех цикадках, которые не являются переносчиками;
в) в больных растениях не обнаружено вирусоподобных частиц;
г) удается добиться временного излечения с помощью антибиотиков
группы тетрациклина, причем в ткани после излечения возбудитель
не обнаруживается;
д) микоплазмы уже известны как патогенные организмы — возбудители
различных болезней животных и человека.
Если допустить, что микоплазмы действительно вызывают пять упомя-
нутых выше болезней, то вполне возможно, что многие другие так называе-
мые вирусные болезни растений на самом деле обусловлены микоплазмами.
Это предположение подтвердилось, и уже имеется ряд сообщений на этот
счет [435, 790, 1144, 1571], причем список таких заболеваний быстро попол-
няется (табл. 10).
В перечне вирусов растений, опубликованном Институтом микологии
в Кыо [1164], болыпинство заболеваний, при которых в растениях обнару-
живают микоплазмоподобные организмы, объединено в группу переносимых
цикадками болезней семенных растений, вызываемых вирусами, о физических
или химических свойствах которых не имеется никаких данных.
Эта группа охватывает 54 заболевания, и вполне вероятно, что большин-
ство из них (а возможно, и многие другие, пока не известные) вызываются
не вирусами, а микоплазмами.
Во многих статьях, появившихся в последнее время, эти болезни рас-
сматриваются. как вирусные (например, [1608] — о размножении в организме
переносчика; [977] — о генетической изменчивости в организме переносчи-
ка; [1903]—о патологии инфицированных переносчиков; [896] — о влия-
нии на образование клубеньков Fihizobium у бобовых). В настоящей книге
мы не обсуждаем эти работы, ибо считаем, что в действительности рассмот-
ренные заболевания нельзя относить к группе вирусных.
ТОКСИНЫ, ВЫРАБАТЫВАЕМЫЕ ЧЛЕНИСТОНОГИМИ
Насекомые и другие членистоногие, питающиеся на растениях, могут
выделять очень сильные токсины, системно распространяющиеся по расте-
нию, вызывая симптомы, сходные с симптомами вирусных заболеваний.
Calligypona pellucida (F.) (Homoptera) вырабатывает слюнные токсины, кото-
рые вызывают общую задержку роста и угнетение кущения; токсины выраба-
тывают только самки Calligypona [1281]. Эриофидные клещи, питающиеся
а клевере, могут вызывать мозаичную крапчатость на молодых листьях.
Одного клеща достаточно, чтобы вызвать эти симптомы (фото 64). Эти клещи
очень малы, и их легко не заметить, тем более что они как бы зарываются
в лист. Массивное заражение клещами может вызвать у клевера болезнь
типа ведьминых метел, ошибочно приписываемую вирусу [1692]. Токсины,
вырабатываемые червецами, очень затрудняют идентификацию возбудителя
увядания ананаса [328].
Появление выростов на жилках при кормлении цикадок на растении
также приписывается действию токсинов этих насекомых (например, болезнь
кукурузы, вызываемаяDalbulus elimatus [1143]). Такие патологические состоя-
ния легко спутать с вирусными болезнями [224]. Следует также учитывать
и еще одну возможность: не исключено, что некоторые из этих болезней,
Невирусные агенты, вызывающие симптомы вирусных болезней 231
возбудителями которых считаются токсины, в действительности вызываются
кратковременной ограниченной инфекцией микоплазмоподобными организ-
мами.
ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОТКЛОНЕНИЯ
Многие разновидности декоративных растений отбирались садоводами по
признаку пестролепестности или мозаичности, обусловленному генетически.
Эти признаки обусловлены наследуемыми по материнской линии дефектами
пластид. У спонтанно возникшего пластидного мутанта Epilobium hirsutum
с помощью электронного микроскопа удается наблюдать дегенерацию граи
и вакуолизацию мутантных пластид; эта картина имеет некоторое сходство
с патологическими изменениями, появляющимися у китайской капусты при
заражении ВЖМТ. Как уже обсуждалось в гл. IX, возникающая при этом
пестролепестность по своему характеру иногда очень напоминает мозаику,
вызываемую вирусами. Однако в случае мозаики, вызванной мутациями
пластид, границы между участками ткани с различной окраской резче, чем
при многих мозаичных болезнях вирусного происхождения (фото 65).
Генетические аномалии могут имитировать и другие симптомы вирусных
заболеваний. Например, Эдвардсон и Корбетт [482] описали «проволочный»
мутант томатов сорта Марглоб, имеющий внешнее сходство с растениями,
зараженными некоторыми штаммами вируса огуречной мозаики и ВТМ.
Главная особенность этого мутанта — сильная редукция всех листовых пла-
стинок, что придает растению своеобразный вид (фото 66).
Эта болезнь, как было установлено, не передается прививкой. На осно-
вании данных генетических экспериментов было сделано предположение, что
фенотип мутанта контролируется парой рецессивных генов.
Найленд [1282] наблюдал любопытное проявление некротической ржа-
вой крапчатости и желтухи вишни иа Prunus avium и Р. cerasus. У сеянцев,
выращенных из семян, взятых от зараженных деревьев, имеются симптомы
вирусной болезни, но большинство их не содержит вируса в определяемом
количестве (по данным стандартных тестов с прививкой). Симптомы сохра-
няются при размножении почками и семенами. Благодаря этому создается
впечатление, что генетические отклонения у растения-хозяина индуцированы
вирусом. В тканях таких деревьев с явными симптомами вирусного заболе-
вания не удается обнаружить вирус даже через, 13 лет (Найленд, личное
сообщение).
НЕДОСТАТОК ПИТАТЕЛЬНЫХ ВЕЩЕСТВ
Растения могут страдать от недостатка различных питательных веществ,
в результате чего ткани листа приобретают аномальную окраску, обесцве-
чиваются или погибают [135, 1859]. ГТекоторые из этих патологических сос-
тояний можно довольно легко спутать с картиной симптомов, наблюдае-
мой при той или иной вирусной инфекции. Например, недостаток магния
и железа приводит к появлению у растений сои зеленых полос вдоль жилок
и хлоротических участков между жилками. Пожелтение, однако, имеет
более диффузный характер, чем это бывает при вирусной инфекции. У са-
харной свеклы пожелтение и некрозы, вызванные недостатком магния,
могут быть сходны с картиной, наблюдаемой при вирусной желтухе сахар-
ной свеклы. Недостаток калия и магния вызывает у картофеля краевые
и междужилковые некрозы, сходные с некрозами, возникающими при неко-
232
Глава X
торых вирусных болезнях. Электронно-микроскопическое исследование
листьев бобовых растений, страдающих от недостатка фосфора [1761], выя-
вило дегенеративные изменения в хлоропластах, подобные тем, которые
обнаруживаются при некоторых вирусных инфекциях. При резко выражен-
ной недостаточности фосфора ламеллярная система разрушается и появля-
ются крупные осмиофильные глобулы. При менее выраженной недостаточ-
ности граны исчезают, а вместо них появляются высокоупорядоченные
системы ламелл с упрощенной структурой.
ВЫСОКИЕ ТЕМПЕРАТУРЫ
Выращивание растений при температурах, значительно превышающих
нормальную, может приводить к появлению симптомов, подобных тем, кото-
рые возникают при вирусных болезнях. Если растения N. glutinosa выдер-
живать при температуре 37,8 °C в течение 4—8 дней, а затем вновь перепо-
сти в помещение с температурой 22 °C, то на новых листьях появляется
мозаичный рисунок, отмечается посветление жилок, хлороз и другие ано-
малии, напоминающие картину, характерную для вирусной инфекции
(фото 67). Эти симптомы постепенно исчезают на вновь образующихся
листьях, но могут возникнуть на этом же растении снова при повторном
воздействии высокой температуры [880]. С помощью методов механической
инокуляции и прививок различным хозяевам и метода электронной микро-
скопии в прогретых растениях не удалось выявить вируса.
В молодых листьях таких прогретых растений сначала исчезали ламол-
лы стромы хлоропластов, а затем граны. Липидные глобулы увеличива-
лись в размерах. Возникали также другие цитологические изменения, при-
чем некоторые из них были сходны с изменениями, обусловленными рядом
вирусных инфекций, тогда как другие больше напоминали картину, наблю-
даемую в этиолированных растениях [1883].
ПОВРЕЖДЕНИЯ, ВЫЗЫВАЕМЫЕ ГОРМОНАМИ
Выпускаемые в продажу препараты гормонов, используемые в качестве
гербицидов, могут вызывать у некоторых растений симптомы, подобные
симптомам тех или иных вирусных инфекций. Томаты и виноград особенно
чувствительны к действию 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-Д).
Нарушения роста, проявляющиеся под влиянием 2,4-Д, несколько напоми-
нают симптомы вирусных инфекций, проявляющиеся у этих и других
растений-хозяев (фото 68). Соединения, родственные 2,4-Д, могут приводить
к почти полному угнетению развития мезофилла. В других случаях, наобо-
рот, рост жилок задерживается в большей степени, чем рост мезофилла.
В этих случаях мезофилл может выпячиваться между жилками, придавая
листьям вид, сходный с симптомом курчавости листьев (например, у табака
и хлопчатника) [48].
ПОЯВЛЕНИЕ АНОМАЛЬНОЙ ОКРАСКИ ПОД ВЛИЯНИЕМ
ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ
Известно, что у различных представителей Gesneriaceae (например,
у глоксинии и сентполии) при поливе холодной водой на солнце появляется
необычный рисунок в виде колец и линий из желтоватой и коричневатой
Невирусные агенты, вызывающие симптомы вирусных болезней 233
ткани. Эти рисунки часто поразительно напоминают проявления вирусных
болезней, однако Холлингсу [809] не удалось обнаружить вирус в пора-
женных растениях; он пришел к выводу, что рисунки эти обусловлены
резким изменением температуры в фотосинтезирующих тканях.
АКТИНОМИЦИН D
Было показано, что при введении актиномицина D в нижний лист моло-
дых растений табака иа молодых распускающихся листьях приблизительно
через день после введения антибиотика можно отметить посветление жилок
[781]. На распустившихся молодых листьях возникают мозаичные рисунки,
очень сходные с теми, которые характерны для инфекции обычным штаммом
ВТМ. В листьях, появляющихся позднее, симптомы, вызванные действием
антибиотика, оказывались выраженными слабее, а затем образовывались и
вовсе нормальные листья. Объяснить это явление в настоящее время невоз-
можно, но, вероятно, актиномицин D в момент проникновения в молодой
лист повреждает некоторые клетки, причем продолжает действовать па
протяжении последующих клеточных делений, вызывая образование остров-
ков пожелтевшей ткани; в то же время другие клетки остаются неповре-
жденными (если иметь в виду состояние хлоропластов).
ГЛАВА XI
ВЛИЯНИЕ НА МЕТАБОЛИЗМ РАСТЕНИЙ
Различные макроскопические и микроскопические симптомы болезни,
рассмотренные в гл. IX, несомненно, обусловлены биохимическими сдви-
гами, прямо или косвенно вызванными вирусом. В течение последних 60 лет
появилось множество статей, посвященных описанию различий между
здоровыми, и зараженными вирусом тканями по составу или по скоростям
тех или иных метаболических процессов. Обычно исследовались следую-
щие параметры: общее содержание углеводов и сахаров; общий азот и раз-
личные азотсодержащие фракции; отношение углерода к азоту; общее содер-
жание золы и содержание различных зольных элементов; скорости фотосин-
теза, дыхания и транспирации. Многие из этих исследований, выполненных
в надежде на то, что удастся пролить некоторый свет на природу вирусных
заболеваний, были проведены еще до того, как впервые был выделен вирус.
Однако эти исследования почти ничего не дают для понимания влияния
вирусной инфекции на метаболизм хозяина. Анализы часто выполнялись
на фракциях, содержащих множество самых разных соединений (например,
определение «растворимого азота»). Большинство аналитических исследо-
ваний проводилось на полностью зараженных растениях, возможно, спустя
многие недели после заражения. Вполне естественно, что в таких растениях
оказываются измененными как содержание многих веществ, так и скорости
большинства биохимических процессов, однако эти изменения, вероятно,
имеют лишь самую отдаленную связь с размножением] вируса в клетках
и с инициацией заболевания.
ПЕРЕМЕННЫЕ, КОТОРЫЕ СЛЕДУЕТ УЧИТЫВАТЬ
В ЭКСПЕРИМЕНТЕ
Для изучения влияния вирусов на организм растения-хозяина применя-
ют в основном те же экспериментальные системы, которые описаны в гл. VII.
Хотя крайне желательна была бы разработка эффективной системы с исполь-
зованием культуры ткани для изучения репликации вирусов и для иссле-
дования некоторых сторон метаболизма зараженных клеток, избежать рабо-
ты с интактными растениями и органами совершенно невозможно, если иметь
целью когда-нибудь понять процессы, связанные с болезнью. При исполь-
зовании интактных растений или органов следует принимать во внимание
множество параметров. Все, что сказано ниже, касается главным образом
изменений, происходящих в листьях, поскольку они составляют основную
массу большинства травянистых растений. Большинство вирусов обычно
развивается в листьях, которые чаще всего и используются в разного рода
экспериментах.
Имеются три группы переменных факторов, которые следует иметь
в виду при постановке экспериментов по изучению влияния вирусной
инфекции на метаболизм хозяина. Во-первых, это измеряемые параметры,
служащие критерием для выражения результатов; во-вторых, факторы
и компоненты исследуемого материала, которые меняются во времени;
Влияние на метаболизм растений
235
в-третьих, неоднородность материала, который служит исследуемым образ-
цом в каждый данный момент.
Измеряемые параметры
К величинам, которые могут служить основой для выражения резуль-
татов, относятся сырая и сухая масса ткани, содержание белкового азота,
содержание ДНК, площадь листа; результаты выражаются в расчете на
растение, па лист или на клетку. Данные о сырой массе получить легче всего,
и соответствующие измерения издавна проводились наиболее широко. Этот
метод является удовлетворительным, когда нужно обнаружить сильно выра-
женные различия на самых ранних стадиях после заражения. Однако
в результате вирусной инфекции содержание воды в тканях вскоре после
заражения может нарушаться. В более поздние сроки возможно прекраще-
ние роста, что обусловливает серьезные трудности с использованием этого
параметра. В зараженных вирусом листьях концентрация многих компо-
нентов па единицу сырой массы может оказаться выше из-за того, что
листья у таких растений имеют меньшие размеры, чем здоровые листья того
же возраста. В то же время если сравнивать листья одинакового размера,
то концентрация этих компонентов на единицу сырой массы в зараженных
листьях может оказаться ниже, чем в здоровых. Аналогичные осложнения
возникают также при измерениях сухой массы. Сам вирус может составлять
около 10% сухой массы листа. В результате остановки роста доля инертных
компонентов клеточной оболочки возрастает, а за счет накопления крахма-
ла, вызванного вирусной инфекцией, может увеличиться сухая масса. Содер-
жание белкового азота также может значительно изменяться в связи с при-
сутствием вируса и с общей остановкой роста.
В тех случаях, когда содержание ДНК в расчете на клетку остается
неизменным, эту величину удобно использовать для целей сравнения. Извест-
но, что в некоторых листьях содержание ДНК продолжает увеличиваться
в течение длительного времени после прекращения клеточного деления.
Например, в листьях табака содержание ДНК в расчете на лист может воз-
расти в 30 раз, в то время как лист увеличивается в длину с 5 до 15 см [1116].
Предполагается, что это обусловлено возрастанием плоидности. Влияние
вирусной инфекции на этот процесс пока не исследовано. Площадь листа
может служить удовлетворительной основой для сравнения, если в резуль-
тате вирусной инфекции поверхность листьев не нарушена (например,
в ранние сроки после инокуляции). Однако использование этого параметра
при изучении листьев, остановившихся в росте, может ввести в заблужде-
ние. Измерения в расчете иа растение могут быть вполне удовлетворитель-
ными при исследовании растений с хронической инфекцией, например расте-
ний картофеля, выращенных из зараженных клубней. Если нас интересуют
экономические аспекты заболевания, то лучше всего выражать результаты
в расчете на целое растение или соотносить их с теми частями растения,
которые имеют хозяйственное значение. Однако при использовании целых
зараженных растений в образце будут содержаться ткани, находящиеся на
самых разных стадиях инфекционного процесса.
Для многих целей удобнее всего выражать результаты в расчете на
лист, особенно если измерения удается начать до заражения и продолжить
в ходе развития болезни и если размеры листа увеличиваются. Клетка может
служить в качестве единицы для оценки результатов в экспериментах с гомо-
генатами тканей или с клетками в тканевой культуре. Возможно, вообще
не существует идеального метода выражения результатов, поэтому весьма
желательно при оценке результатов на одном экспериментальном мате-
риале использовать два или более различных критерия.
236
Глава XI
Факторы, меняющиеся во времени
Возраст листа
У большинства травянистых растений, используемых в вирусологиче-
ских экспериментах, отдельные листья никогда не находятся в стационарном
состоянии. Они обычно проходят через четыре стадии, плавно переходящие
одна в другую. Первая стадия, в ходе которой лист табака, например, дости-
гает около 2 см в длину, — это стадия интенсивного клеточного деления.
Ее сменяет стадия, на которой рост (растяжение) клеток и синтез белка ста-
новятся преобладающими. По мере того как лист приближается к своим
окончательным размерам, самым активным процессом становится фотосин-
тез (он продолжается с самой ранней стадии), и, наконец, на четвертой ста-
дии берут верх процессы старения. В качестве иллюстрации непрерывных
изменений в растущем листе на фиг. 42 приведены изменения содержания
рибосом в листьях китайской капусты.
Таким образом, вирус, инфицирующий листья на разных стадиях их
развития, окажется в разных условиях и будет по-разному влиять на кле-
точные процессы.
Суточные колебания
Многие важнейшие процессы в листьях растений, произрастающих
в обычных условиях смены дня и ночи, имеют суточный ритм. Например,
доля рибосом, входящих в состав полисом, отражающая, вероятно, скорость
белкового синтеза, характеризуется суточным циклом с минимумом в конце
ночи и максимумом в середине дня [378]. Заражение вирусом в разное вре-
мя суток, возможно, по-разному сказывается на растении.
Сезонные колебания
Растения, выращиваемые в разное время года в неконтролируемых или
частично контролируемых условиях (в теплицах), сильно различаются по
Фиг. 42. Изменение содержания экст-
рагируемых рибосом в процессе роста
листьев китайской капусты [378].
I — сухая масса листа (г х 10); П — сырая
масса листа, г; III — содержание 833-рибо-
сом; IV — содержание 688-рибосом. Справа
на оси ординат концентрация рибосом выра-
жена числом миллиграммов рибосом на 1 г
сырой массы.
Влияние на метаболизм растений 237
многим свойствам и могут по-разному реагировать на вирусную инфекцию.
Этот источник колебаний может быть устранен, если растения выращивать
из семян в полностью контролируемых условиях окружающей среды.
Неоднородность в момент взятия образца
Различия между листьями
Между двумя первичными листьями различия минимальны, поэтому
такие листья служат полезным экспериментальным материалом у таких
растений, как Phaseolus vulgaris. Кроме первичных листьев, пет двух дру-
гих таких листьев среди множества листьев растений, используемых для
изучения вирусов, которые находились бы па одной и той же стадии разви-
тия. Эту трудность можно до некоторой степени преодолеть, если работать
с группами растений, отбирая для изучения по одному листу данного раз-
мера. Даже в этом случае очень немногие листья в группе будут находиться
абсолютно па одной и той же стадии развития, так как образование листьев
у разных растений происходит неодновременно. При работе с такими быстро
растущими растениями, как китайская капуста, у которых молодые листья
могут удваиваться в размере за 30—40 ч, группа растений для отбора (с целью
получения достаточно однородного набора молодых листьев) должна быть
более многочисленной.
Различия в разных участках листьев
Части листовой пластинки, симметрично расположенные по отноше-
нию к средней жилке, обычно очсш> сходны друг с другом. В связи с этим
в тех случаях, когда это возможно, следует применять в качестве материала
для сравнительных исследований половинки листьев, разрезанных вдоль сред-
ней жилки. Однако в каждой половинке листа ткань неоднородна. Вер-
хушка листа обычно старше, чем основание. Могут различаться также тол-
щина листовой пластинки и рисунок жилок. Скорость включения радиоак-
тивных соединений в различных частях листа может варьировать.
Типы клеток листа
Клетки мезофилла обычно составляют большую часть ткани листа,
но клетки эпидермиса и выросты, эпидермиса могут составлять 10—15%
сырой массы. Среднюю и наиболее крупные жилки при биохимическом
исследовании вирусной инфекции обычно удаляют (если они не представ-
ляют какого-либо специального интереса).
Листья с симптомами мозаики
Как отмечалось в гл. IX, листья с симптомами мозаичной болезни весьма
гетерогенны с точки зрения вирусной инфекции. Кроме макроскопической
мозаики, ВЖМТ вызывает у китайской капусты «микроскопическую» моза-
ику. Оценка однородности инфекции в том или ином участке ткани может
оказаться очень трудной без микроскопического исследования состояния
хлоропластов на свежих срезах. Неизвестно, насколько широко распростра-
нены такие микромозаики в листьях с массивным мозаичным поражением.
В случае мозаичных рисунков, вызываемых ВЖМТ, темно-зеленые участки
вполне можно использовать в качестве контроля при изучении некоторых
аспектов влияния хронической вирусной инфекции на клеточные компо-
238
Глава XI
ненты и процессы. Темно-зеленый участок вырезают из одной половинки
листа, а из противоположной половинки листа берут соответствующий
участок, пораженный вирусом.
Изменения в клеточных органеллах
Джибор [623] обнаружил, что у водоросли Nitella некоторые хлоро-
пласты, кажущиеся вполне нормальными, не включают СО2 в высокомоле-
кулярные соединения. Он объяснял это отклонение фенотипическими раз-
личиями между хлоропластами вследствие неравномерного распределения
ферментов во время их деления. Изолированные хлоропласты высших расте-
ний, внешне совершенно интактные, при центрифугировании в градиентах
плотности часто образуют две или более зон. У некоторых высших растений
выявлено два морфологических типа хлоропластов, которые, очевидно,
фиксируют углерод разными путями [1613]. Все эти наблюдения позволяют
предположить, что даже в одной клетке или группе клеток возможны раз-
личия между хлоропластами, причем различия отнюдь не патологического
характера, которые, однако, неизбежно должны осложнять изучение вирус-
ной инфекции.
НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ И БЕЛКИ
Появление в клетках особого вида РНК (двухцепочечиой вирусной
РНК), возможное накопление свободной вирусной РНК и образование вирус-
ного белка в процессе инфекции обсуждались в гл. VII. Здесь мы рассмот-
рим вопросы, касающиеся влияния вирусной инфекции на синтез нуклеи-
новых кислот и белка клетки-хозяина.
ДНК
Исследования, посвященные изучению возможного влияния вирусной
инфекции на ДНК растения-хозяина, очень немногочисленны. Портер
и Вайнштейн [1347] не обнаружили значительных различий в содержании
ДНК (в расчете на одно растение) между здоровыми и зараженными виру-
сом огуречной мозаики растениями табака в течение первых 280 ч после
заражения. В то же время в листьях Prunus mahaleb, дважды зараженных
определенными вирусами, содержание ДНК на единицу сухой массы через
несколько месяцев после заражения (когда симптомы болезни в листьях исчез-
ли) было снижено примерно на 20% [828]. Отмечалось также снижение содер-
жания РНК, однако за неимением других данных нельзя решить, в чем на
самом деле проявляется действие вируса — в снижении содержания нукле-
иновых кислот или же в увеличении сухой массы по сравнению со здоро-
выми растениями.
Мисава и др. [1224] с помощью гистохимического метода определения
ДНК в ядрах показали, что в листьях растений табака через 4—10 ч после
заражения вирусом огуречной мозаики происходит временное увеличение
содержания ДНК в расчете на ядро. Эти результаты нуждаются в подтверж-
дении другими методами.
Итак, вирусная инфекция, по-видимому, оказывает некоторое влияние
на синтез ДНК в клетке, однако это влияние, вероятно, очень мало и его
трудно выявить, так как, во-первых, содержание ДНК на клетку может
в течение какого-то времени увеличиваться и в нормально растущем листе и,
во-вторых, минорные фракции ДНК, которые могут подвергаться воздей-
ствию вирусной инфекции, часто трудно выделить и идентифицировать.
Влияние на метаболизм растений
239
РНК и рибосомы
Имеются данные о том, что количество транспортной РНК в листьях
растений табака через 48 ч после заражения ВТМ увеличивается почти
в 4 раза [1562]. Однако Кубо и др. [1025], используя сходные методы, не обна-
ружили такого увеличения. Джонсон и Янг [891] использовали аминоацил-
тРНК-синтотазы из Е. coli для определения индивидуальных тРНК из
здоровых и зараженных ВТМ листьев табака. Для 7 обследованных амино-
кислот не было обнаружено никаких количественных различий (на'моло-
дых растениях).
Бабос [51] сравнивал включение меченного заР ортофосфата в РНК боль-
ных листьев табака (через 2—3 дня после заражения ВТМ) и здоровых
(контрольных) листьев. За включением метки следили примерно в течение
2 ч, используя для этого вырезанные кусочки листа, инфильтрированные
меченым соединением. В течение первого часа инкубации с меченым пред-
шественником удельная активность РНК, выделенной из фракции ядер и
хлоропластов, а также из фракции рибосом, была одинакова в здоровой
и в зараженнпой ткани. Между 80 и 140 мин удельная активность РНК
обеих фракций была выше в зараженной ткани. Интерпретируя эти данные,
Бабос предположил, что заражение ВТМ стимулирует синтез РНК во фрак-
ции ядер и хлоропластов. Трудно сказать, почему эта стимуляция не про-
является па ранних стадиях инкубации с меченым предшественником.
Другое возможное объяснение этих результатов сводится к тому, что зара-
жение ВТМ отодвигает наступление изменений в нормальном синтезе РНК
в ткани листа, вызываемых отделением листа от растения.
Эксперименты другого рода позволяют предположить, что количество
РНК в клетках растения-хозяина может значительно возрастать вскоре
после заражения ВТМ, однако какая именно фракция РНК синтезируется
с повышенной интенсивностью, пока неизвестно (см., например, [1443]).
Рэдди [1407, 1408] предположил, что при заражении ВТМ рибосомы
хозяина быстро разрушаются и нуклеозиды рибосомной РНК используются
для синтеза вирусной РНК; однако данных, которые приводит Рэдди, недо-
статочно для доказательства влияния вируса на рибосомы. Бабос [52], нап-
ротив, не нашел никаких различий в содержании рибосом на единицу пло-
щади листовой поверхности у здоровых и зараженных ВТМ листьев табака
в течение первых 10 дней после заражения. По данным Кубо [1024], метка
включается в рибосомную РНК дисков из зараженных ВТМ листьев быстрее,
чем в рРНК здоровых листьев (через 24 ч после заражения), однако неиз-
вестно, какая доля введенной метки поглощалась в обоих случаях.
Семаль и Куммер [1532] изучали включение меченного 14С уридина
в кислотонерастворимую фракцию, считая его величину мерой общего
синтеза РНК в здоровых и зараженных вирусом мозаики костра листьях
ячменя. В случае старых зараженных листьев отмечалась лишь небольшая
разница, тогда как для молодых системно зараженных листьев наблюдалось
значительное увеличение включения метки — почти на 50 % по сравнению
с контролем (между 2-м и 6-м днями после заражения). Фракция РНК,
содержащая увеличенное количество метки, не идентифицирована.
В упомянутой выше работе не делалось различия между рибосомами
хлоропластов и цитоплазмы. В зоне активных клеток мезофилла, окружаю-
щих некротизированный центр местного поражения, вызванного ВТМ
у N. glutinosa, было обнаружено [855] значительное увеличение массы эндо-
плазматической сети и связанных с нею рибосом. Кроме того, оказалось,
что в хлоропластах клеток этой зоны содержится больше рибосом, чем
в нормальных хлоропластах. С другой стороны, Хираи и Вайлдман [782]
установили, что на ранних стадиях заражения табака ВТМ синтез рибосом
240
Глава XI
и белка хлоропласта подавлен, тогда как синтез цитоплазматических рибо-
сом не затронут.
В листьях китайской капусты при заражении ВЖМТ общее содержа-
ние РНК не изменялось сколько-нибудь значительно [1180]. Данные о соот-
ношении оснований общей РНК здоровых и зараженных листьев свиде-
тельствуют о том, что единственное выраженное изменение, которое удается
отметить в зараженных листьях, состоит в добавке РНК ВЖМТ к нормаль-
ному набору РНК хозяина. Выявить изменения в минорных фракциях РНК
хозяина не удалось.
В желто-зеленых островках ткани в случае мозаики, вызванной ВЖМТ,
концентрация 688-рибосом резко снижена [1417]. Степень уменьшения числа
рибосом хлоропластов зависит от штамма ВЖМТ; кроме того, она возрастает
со временем после заражения. Уменьшение числа рибосом происходит более
или менее параллельно уменьшению содержания хлорофилла, причем этот
эффект более резко выражен при заражении «белыми» штаммами (Усияма и
Мэтыоз, неопубликованные данные). Заражение ВЖМТ сравнительно
слабо влияет на содержание 838-рибосом.
В системно инфицированных ВЖМТ молодых (длиной около 3 см) листьях
китайской капусты концентрация 838-рибосом временно возрастает; это
увеличение содержания 838-рибосом отмечается при анализе экстрактов,
приготовленных непосредственно перед тем, как вирус становится доступ-
ным определению в градиенте плотности. Однако дело здесь, вероятно, в том,
что под влиянием вируса рибосомы легче поддаются экстрагированию,
а вовсе не в интенсификации синтеза (Рэндле и Мэтыоз, неопубликован-
ные данные).
Растворимые белки
Иногда около V3 азота, содержащегося в зараженных ВТМ растениях
табака, может находиться в составе вируса [121]. В растениях, получаю-
щих много фосфора и мало азота, эта доля может достигать 60% [808]. При
образовании столь большого количества вируса увеличения содержания
общего азота не происходит [1732]. В этих условиях часть нормальных бел-
ков разрушается.
Вайлдман и др. [1909] обнаружили, что по мере увеличения концентра-
ции ВТМ в листьях табака (примерно через 3—12 дней после заражения)
величина белковой фракции листа, выделяемой электрофоретически,
уменьшается. В плавающих кусочках зараженных листьев табака наблю-
дался избыток неидентифицированной электрофоретической фракции белка
по сравнению с контрольной тканью [400]. Этот прирост примерно совпадал
по времени с максимальным образованием вируса. В митохондриях, выде-
ленных из листьев табака через 2 дня после заражения ВТМ, 14С-лейцин
включался в белок со значительно большей скоростью, чем в митохондриях
здоровых листьев [1730]. Боудэн и Клечковский [110], используя метод
электрофореза, исследовали концентрацию растворимых белков в несколь-
ких системах вирус — хозяин. При этом не удалось установить каких-либо
определенных изменений в растворимых белках растений под влиянием
вирусной инфекции. Корреляция между содержанием нормальных белков
и тяжестью симптомов или содержанием вируса в листьях отсутствовала.
Темно-зеленые островки ткани в листьях китайской капусты, заражен-
ных ВЖМТ, практически не содержали вируса, а концентрация белковых
фракций 1 и 11 в них почти не отличалась от нормы. В желто-зеленых ост-
ровках ткани, в которых содержались существенные количества ВЖМТ,
концентрация белковой фракции I была почти в два раза меньше, чем
в темно-зеленых участках того же листа; различий в концентрации белковой
Влияние на метаболизм растений
241
фракции II не обнаружено [1417]. В обесцвеченных участках листа, зара-
женного ВЖМТ, концентрация белковой фракции I была даже ниже, чем
в желто-зеленых участках.
АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ
Определяли активность некоторых ферментов в нормальной и в зара-
женной вирусом ткани. При этом обычно принималось, что обнаруживае-
мые различия отражают изменения в содержании фермента, происходящие
под влиянием вирусной инфекции, и обращали недостаточно внимания на
другую возможность — изменение активности ферментов в результате высво-
бождения ингибиторов или активаторов фермента при разрушении клеток.
Кроме того, часто не учитывались трудности, связанные с выбором адек-
ватного способа выражения активности фермента. Многие исследования
были выполнены до того, как было установлено широкое распространение
изоферментов. Некоторые из опубликованных данных приведены в табл. 11.
Высказывалось предположение, что повышенная активность полифе-
нолоксидазы, отмечаемая в местных покровах при заражении многими виру-
сами, непосредственно ответственна за ограничение распространения вируса
в некротических участках [508, 881]. Предполагалось, что причиной гибели
клеток служит накопление токсических продуктов активности полифеноло-
ксидазы. Однако различные эксперименты показали, что образование мест-
ных некрозов нельзя объяснить простым накоплением полифеполоксидазы
и ее субстрата [1314, 1842].
Амипоацил-тРНК-сиптетазы, которые должны принимать непосред-
ственное участие в синтезе вируса, пока еще слабо изучены у растений.
Термин изоферменты, или изозизмы, используется для обозначения
множественных форм фермента, встречающихся у одного и того же вида.
Изоферменты представляют значительный интерес в связи с проблемой
биохимических изменений в процессе развития организма, а в последнее
время еще и в связи с различными патологиями. Изучение влияния вирус-
ной инфекции на количественный и качественный изофермептный состав
должно оказаться значительно более плодотворным, чем измерения общей
ферментативной активности; такие исследования на вирусах растений уже
начаты. Множественные формы ферментов обычно выявляются после разде-
ления смеси методом электрофореза с использованием соответствующей плот-
ной поддерживающей среды.
Было известно о существовании у растений множественных форм перок-
сидаз. Фаркаш и Штахман [507] показали, что в молодых здоровых листьях
присутствуют два фермента — пероксидаза I и пероксидаза IV. Две другие
пероксидазы были обнаружены в некрозах, вызываемых вирусом тожпой
мозаики фасоли. Из зараженной ткани были выделены все четыре перокси-
дазы, причем оказалось, что они представляют собой разные белки с совер-
шенно различными физико-химическими и энзимологическими свой-
ствами.
В связи с этим возник вопрос, обусловлено ли появление дополнитель-
ных изоферментов вирусом или хозяином. Для изучения этой проблемы
Солимози и др. [1644] исследовали пероксидазу у Phaseolus vulgaris и N. glu-
tinosa после заражения некоторыми вирусами. Их результаты четко пока-
зали, что новые изоферменты пероксидазы, образующиеся после заражения
вирусом, определяются хозяином, а не вирусом. Они появляются только
после того, как начали образовываться видимые некрозы. Фаркаш и Штах-
мап [507] обнаружили пероксидазу III (но не пероксидазу II) в стареющей
здоровой ткани. В результате обработки солями никеля и ртути, вызываю-
16-0893
Таблица 11
Некоторые сведения о влиянии вирусной инфекции па активность ферментов
Фермент Вирус Растение-хозяин Действие на активность Источник данных
Оксидаза 1. Оксидоредуктазы Вирус бронзово- Томаты Повышение [183]
То же сти томатов Вирус скручива- Картофель То же [1451|
» » ния листьев Вирусы плодовых Тыква » » [698]
6-Фосфоглтоко- ВТМ Табак (местные » » [1642]
пат — дегидроге- некрозы)
паза
НАДФ-Н-хинон — То жо То же » » [1642]
редуктаза
НАД-Н-хинон — » » » » » » [1642]
редуктаза
Полифенолокси- » » » » » » [1642]
даза
Цитохромокси- » » » » » » [1(542]
даза
Изоцитратдегидро- » » » » » » [1642]
геназа
Малатдегидроге- » » » )> Не влияет [1G4.2]
лаза
Пероксидаза Вирус посветле- Батат Повышение [1087]'
То же НИЯ жилок ВТМ Табак То же [1711Г
Оксидаза аскорби- То же Томаты [19711
ПОВОИ кислоты
То же Х-вирус карто- То же феля » » [19711
Гексокиназа 2. Трансферазы Вирус скручива- Картофель » » [229]
Фос фоглюкому таза ния листьев То же То же Снижение [229]
Гексокиназа ВТМ Табак (местные Повышение [1642]'
Уридинмонофос- некрозы) Вирус кольцевой Огурец То же [641]
фаткииаза ЦМФ-, АМФ- и ГМФ-киназы пятнистости та- бака То же То же Не влияет [639[
Рибонуклеаза ВТМ Табак Снижение [451,
То же То же То же Повышение 1406J [1727]
Фосфатаза 3. Гидролазы ВТМ Табак Повышение [1931]
Кислая фосфатаза Вирус желтухи Сахарная свекла Снижение [1645]
Аденозинтрифос- фатаза Хлорофиллаза свеклы ВТМ Табак Повышение [1727]
То же То же То же [1326]
Аконитаза 4. Лиазы То же Табак (местные » » [1642]
Пентозофосфати- некрозы) 5. Изомеразы То же То же Снижение [1642]
зомераза
Фосфогексоизоме- » » » » Не влияет [1642]
раза
Влияние на метаболизм растений
243
щей гибель клеток, пероксидазная активность увеличивалась, а в изофер-
мептпом составе происходили изменения, сходные с теми, которые наблю-
даются при вирусной инфекции. Авторы пришли к выводу, что изменение
ферментного состава есть косвенный результат вирусной инфекции и час-
тично связано с преждевременным старением ткани, а частично — с гибелью
клеток в некротических участках. Новацкий и Хэмптон [1280] отметили
изменение изофермептных профилей при некоторых вирусных инфекциях,
однако им не удалось обнаружить новых изоферментов пероксидазы. Изме-
нения были специфичны для растения-хозяина. В листьях китайской капусты,
зараженных ВЖМТ, были исследованы изоферменты рибонуклеазы; новых
изоферментов обнаружить не удалось, но инфекция приводила к заметному
увеличению содержания одного из трех обычных ферментов, обнаруживае-
мых в здоровых листьях [1386]. В листьях табака были выявлены две рибо-
нуклеазы; активность одной из них резко возрастала после заражения виру-
сом огуречной мозаики [1215]. В присутствии хлорамфеникола этого не отме-
чалось, что позволяет связать повышение ферментативной активности с син-
тезом нового белка.
ЛИПИДЫ
Специалисты в области биохимии растений обычно проявляют весьма
слабый интерес к метаболизму липидов. О влиянии вирусной инфекции
па липиды известно гораздо меньше, чем о других биохимических измене-
ниях в зараженных вирусами растениях. Согласно цитологическим данным,
полученным в последнее время, в клетках, зараженных вирусами, обычно
наблюдаются изменения мембранных структур. Кроме того, эти данные
свидетельствуют о возможной связи мембран со сборкой некоторых вирусов.
Таким образом, весьма полезным было бы биохимическое исследование вли-
яния вирусной инфекции на липиды и липопротеиды в клетках и изолиро-
ванных клеточных органеллах, особенно в сочетании с соответствующими
цитологическими исследованиями.
Симомура и Хираи [1572] изучали включение 14С-глиципа в липидные
фракции листовых дисков табака в процессе развития инфекции ВТМ.
На ранних стадиях, до того как концентрация вируса сильно возрастала,
наблюдалось повышенное включение метки в липопротеидную фракцию А.
На более поздних стадиях отмечалось также более интенсивное включение
в липопротеидную фракцию Б (по сравнению со здоровой тканью). Содержа-
ние липидов в листьях N. glutinosa, зараженных вирусом бронзовости тома-
тов, оказалось значительно более высоким, чем в здоровых листьях [190].
УГЛЕВОДЫ
Некоторые вирусы незначительно влияют на углеводы в листьях, тогда
как другие могут нарушат!, как скорость их синтеза, так и скорость переме-
щения по растению. Если листья через несколько дней после заражения
вирусом, не вызывающим образования местных некрозов, собрать (утром
или после пребывания в течение нескольких часов в темноте), обесцветить
и обработать иодом, то локальные повреждения могут проявиться в виде
темных участков, контрастирующих с бледным фоном. Это наблюдение
говорит о том, что крахмал не исчезает только в участках хлоренхимы, инфи-
цированной вирусом. Таким образом, эта задержка не зависит от изменений
в проводящих тканях. Каково значение изменений клеточной проницаемости
и активности ферментов в этом процессе, неизвестно.
16*
244
Глава XI
Если обесцветить и окрасить иодом зараженные листья, собранные
после полудня, по окончании периода фотосинтеза, то локальные поврежде-
ния выявляются в виде бледных пятен иа темном фоне неинфицировашюй
ткани. Таким образом, вирусная инфекция может приводить к снижению ско-
рости накопления крахмала в листьях, подвергающихся воздействию света.
Заражение картофеля вирусом скручивания листьев приводит к уве-
личению содержания углеводов в листьях в 2—3 раза по сравнению с нор-
мой при соответствующем снижении содержания углеводов в клубнях. Под
влиянием вируса развивается также некроз флоэмы, поэтому было высказа-
но предположение, что накопление крахмала в листьях является результа-
том нарушения функций флоэмы. Вероятно, это и в самом деле одна из при-
чин, способствующих накоплению углеводов, однако существуют и другие
факторы, от которых зависит этот процесс. Накопление крахмала начи-
нается до того, как некроз флоэмы становится явно выраженным. Мерфи
11253] не обнаружил корреляции между положением первого участка види-
мого накопления крахмала и некротизацией флоэмы. Когда некроз появ-
лялся в нижней части стебля, накопление крахмала происходило в мезо-
филле более старых листьев, однако при этом все еще продолжалось быстрое
перемещение углеводов из более молодых листьев. В отдельных листьях
концентрация всех углеводов в клетках вблизи проводящей ткани была очень
низкой, ио в главных участках палисадной ткани отмечалось значительное
накопление крахмала. Таким образом, вирус скручивания листьев пора-
жает отдельные клетки хлоренхимы, иммобилизуя углеводы.
Снижение общей сухой массы растений картофеля, вызываемое вирусом
скручивания листьев, почти полностью обусловлено уменьшением массы
клубней. Сухая масса листьев и стеблей даже увеличивается, а масса столо-
нов и корней уменьшается лишь очень незначительно [1869].
Аналогичная ситуация наблюдается при заражении сахарной свеклы
{Beta vulgaris) вирусом желтухи свеклы. В больных листьях по сравнению
со здоровыми обнаруживается значительный (иногда четырехкратный) избы-
ток углеводов. Первоначально считали, что это накопление обусловлено
подавлением перемещения во флоэме, приводящим к развитию гуммоза
в зараженных растениях. Однако позднее было установлено [1879], что зара-
женные и здоровые листья в темноте теряют одинаковое количество крах-
мала и растворимых углеводов. Был сделан вывод, что накопление углево-
дов в листьях, зараженных желтухой, обусловлено влиянием вирусной
инфекции на клетки листа и, возможно, связано с изменением активности
ферментных систем, контролирующих взаимопревращения различных форм
углеводов. При опрыскивании листьев сахарной свеклы раствором сахарозы
содержание сахарозы в корнях увеличивается как у здоровых, так и у зара-
женных желтухой растений. Это служит дальнейшим подтверждением того,
что под влиянием инфекции перемещение углеводов из листьев не блоки-
руется [1871]. Если растениям картофеля, иммунным к Х-вирусу, привить
черенок зараженного растения, то углеводные запасы в корневой системе
истощаются, а крахмал накапливается выше места прививки [167].
Хотя число исследованных болезней очень невелико и иа основании
полученных данных нельзя сделать каких-либо обобщений, тем не менее
следует подчеркнуть несколько особенностей, которые, вероятно, являются
достаточно распространенными:
а) в зараженных вирусом листьях содержание глюкозы,' фруктозы
и сахарозы увеличено [662, 1879];
б) содержание этих сахаров при заражении слабыми штаммами вируса
выше, чем при заражении сильными штаммами [662]; вероятно, во втором
случае тенденция к накоплению сахаров уравновешивается более актив-
ным воздействием на фотосинтезирующий аппарат;
Влияние на метаболизм растений 245
в) в результате инфекции в клетках мезофилла происходят какие-то
неизвестные изменения, приводящие к подавлению перемещения углеводов
из листьев.
КОМПОНЕНТЫ КЛЕТОЧНОЙ ОБОЛОЧКИ
Влияние вирусной инфекции иа компоненты клеточной оболочки мало
исследовано. У N. glutinosa, зараженных ВТМ, в оболочках клеток, окру-
жающих некротические участки на листьях (в радиусе примерно 50 клеток),
в срединной пластинке содержится пектат кальция. В то же время в клет-
ках здоровой ткани срединная пластинка содержит в основном пектиновую
кислоту. В этой зоне клеток активный вирус не был обнаружен [1884].
Необычный структурный дефект отмечается при заражении деревьев:
яблони вирусом поникания ветвей. Такие деревья неспособны синтезировать
нормальные количества лигнина, т. е. не происходит нормального одревес-
нения [132].
КОНЦЕНТРАЦИЯ НЕКОТОРЫХ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ
СОЕДИНЕНИЙ
Аминокислоты и родственные соединения
Имеются многочисленные сообщения о влиянии вирусной инфекции
па концентрацию свободных аминокислот в различных частях зараженных
растений. Однако эти результаты часто довольно противоречивы. Что же
касается методов выделения и определения аминокислот (особенно в более
ранних работах), выбора материала для контроля и способов выражения
результатов, то они иногда оказываются весьма спорными. Заслуживают
внимания четыре важных момента:
1. Наиболее постоянное из наблюдаемых изменений состоит в увели-
чении содержания одного или обоих амидов аминокислот (аспарагина и
глутамина). Это отмечается, например, для клубней картофеля, зараженного'
вирусом скручивания листьев [17, 766]; листьев табака, зараженных виру-
сом огуречной мозаики [1347]; листьев томатов, зараженных вирусом брон-
зовости [1527]; листьев табака, зараженных Х-вирусом или У-вирусом
картофеля (а также обоими этими вирусами вместе) [234]; растений
Cajanus cajan, зараженных вирусом стерильной мозаики [1260]; растений
коровьего гороха, зараженных вирусом огуречной мозаики [1893]. В расте-
ниях томатов, зараженных вирусом бронзовости, концентрация всех иссле-
дованных свободных аминокислот была выше, чем в здоровых тканях [1527].
Наиболее выраженным оказалось увеличение концентрации аспарагина
и глутамина, причем их содержание в стеблях было выше, чем в листьях.
Известно, что содержание этих амидов в тканях здоровых растений повы-
шается при выращивании в почве, богатой азотом. Глутамин рассматривается
как ловушка для эндогенного аммиака. Источник амидов в зараженных
вирусом листьях не установлен; они могут образовываться в результате'
разрушения белков хозяина и накапливаться вследствие подавления нор-
мального белкового синтеза.
2. Имеются сведения о том, что в некоторых зараженных вирусом расте-
ниях в сравнительно высоких концентрациях обнаруживается пипеколино-
вая кислота (имииокислота). Это отмечено для растений табака, зараженного'
смесью X- и У-вирусов картофеля [234]; томатов, зараженных вирусом
бронзовости [1527]; устойчивых сортов коровьего гороха, зараженных виру-
246 Глава.Х!
сом огуречной мозаики [1893]. Накопление больших количеств этой кислоты
может быть вызвано не только вирусной инфекцией. Пипеколиновая кислота
довольно часто встречается у вполне здоровых растений и является следую-
щим более высоким (после пролина) гомологом в ряду, содержащем пролин.
Определенное значение может иметь тот факт, что в некоторых растениях,
зараженных вирусами, пролин накапливается вместе с пипеколиновой
кислотой.
3. Во время быстрого синтеза вируса может наблюдаться общий недо-
статок растворимых азотистых соединений по сравнению со здоровыми
листьями. Так, было показано [1203], что на стадии быстрого системного рас-
пространения Х-вируса картофеля в растениях табака концентрация сво-
бодных аминокислот и амидов оказывается несколько ниже, чем в здоровых
растениях. С другой стороны, в листьях длительно инфицированных расте-
ний концентрация этих соединений была выше нормы.
4. Содержание растворимых и нерастворимых азотистых соединений
в листьях сахарной свеклы, зараженной вирусом желтухи, ниже, чем у здо-
ровых растений. В то же время содержание этих соединений (особенно раство-
римого азота) в корнях свеклы несколько выше (см., например, [1645]).
Фосфорсодержащие соединения
Общее содержание фосфора в здоровых и в зараженных ВТМ или Х-ви-
русом картофеля листьях табака весьма сходно, однако относительное
содержание фосфора нуклеиновых кислот временно возрастает во время
наиболее интенсивного синтеза вируса [488].
В зараженных ВЖМТ листьях китайской капусты, взятых для исследо-
вания через 12—20 дней после заражения, увеличение содержания вирус-
ного фосфора сопровождалось соответствующим снижением содержания
нерастворимого невирусного фосфора (фиг. 43). Это наводит на мысль о том,
что вирус использует (не обязательно непосредственно) часть запасов нера-
створимого фосфата листьев. При устоявшейся инфекции ВЖМТ может
содержать около 20% общего фосфора листа. В листьях N. glutinosa и в ткани
каллюса X. tabacum, зараженных ВТМ, наблюдалось изменение концентра-
ции некоторых нуклеотидов*[1707—1709].
Ряд наименее стабильных фосфорных соединений, обнаруживаемых
в животных клетках (такие, как креатинфосфат и ацетилфосфат), в клетках
растений не найден. Оказалось, что многие имеющиеся фосфорные эфиры
Фиг. 43. Изменение содержания фос-
фора в листьях китайской капусты
в процессе размножения ВЖМТ.
Брали молодые листья с системным зараже-
нием через 12 дней после инокуляции и на про-
тяжении 190 ч определяли в них содержание
фосфора [1190].
I — общий фосфор; II — спирторастворимый
фосфор; III — фосфор ВЖМТ; IV — невирус-
ный фосфор, не растворимый в этаноле.
Влияние на метаболизм растений 247
трудно экстрагировать в недеградированном виде. Однако в настоящее
время разработаны методы [197] экстракции, фракционирования и опре-
деления ДИК, РНК, фосфолипидов, различных фосфорных эфиров и неор-
ганического фосфата, позволяющие довольно полно охарактеризовать
баланс фосфора в растении. Эти методы могут быть с пользой применимы
для получения более четкого представления о действии вирусной инфекции
на метаболизм фосфора.
Аскорбиновая кислота
В листьях фасоли, зараженных ВТМ, содержание аскорбиновой кислоты
возрастает, достигая максимума примерно через 6—15 ч после инокуляции
[1219]. Это повышение содержания аскорбиновой кислоты (почти на 50%
по сравнению с контролем) сопровождалось Последующим быстрым сниже-
нием ее концентрации. В результате к моменту проявления местных некро-
зов содержание аскорбиновой кислоты оказывается ниже, чем в контроле.
Такой ход событий отмечался при различных условиях выращивания расте-
ний. Содержание дегидроаскорбиновой кислоты изменялось во времени
в обратном направлении; это позволяет предположить, что под влиянием
ВТМ активируется система окисления аскорбиновой кислоты. В основе
такого окисления, возможно, лежит индукция образования хинонов виру-
сом и последующее восстановление хинонов аскорбатом [508]. В эксперимен-
тах Мило и Сантилли механическое повреждение само По себе вызывало
увеличение содержания аскорбиновой кислоты, однако этот подъем наблю-
дался только у растений, выдерживаемых в условиях сильной освещен-
ности. Мило и Сантилли считают маловероятным, чтобы повышение содер-
жания аскорбиновой кислоты играло роль в ограничении размеров местных
некрозов, поскольку к тому моменту, когда некрозы начинают появляться,
концентрация аскорбиновой кислоты уже падает ниже нормы. Следует,
однако, отметить, что эти результаты получены на половинках листьев или
па листовых дисках, т. е. отражают усредненную концентрацию аскорби-
новой кислоты в ткани. Такой метод взятия образцов не позволяет обнару-
живать локальное увеличение концентрации аскорбиновой кислоты в зоне,
непосредственно примыкающей к развивающимся некрозам.
Органические кислоты
Заражение ВТМ не сопровождается сколько-нибудь значительным изме-
нением концентрации ряда важных в метаболическом отношении органиче-
ских кислот в листьях интактных растений табака [1493], хотя содержание
лимонной кислоты было несколько выше нормы. Имеются данные о том, что
в растениях, зараженных некоторыми другими вирусами (вирус желтухи
сахарной свеклы на растениях свеклы [765]; вирус некроза табака на Pha-
seolus vurgarts [1917], вирус огуречной мозаики на табаке [1346]), содер-
жание лимонной, а иногда яблочной и изолимонной кислот повышено.
Ароматические соединения
Скополетин (6-метокси-7-окси-1,2-бензпиреи), флуоресцирующий при
облучении ультрафиолетом, встречается в норме во многих растениях.
Это вещество накапливается вокруг первичных некрозов, вызываемых виру-
сом бропзовости томатов, и вокруг некрозов, возникающих под воздейст-
вием ВТМ у N. glutinosa [181, 184]. При системной инфекции ВТМ скопо-
летин накапливается в небольшом количестве, тогда как при заражении
вирусом бронзовости томатов накопление его настолько значительно, что
248
Глава XI
Фиг. 44. Влияние трех различных штаммов ВЖМТ на размер гран и содержание
хлорофилла в местных некрозах-
Исследовались листья китайской капусты через 12 дней после инокуляции. Содержание вируса п некро-
зах было одинаковым при заражении всеми тремя штаммами. Концентрация хлорофилла выражена
в расчете на единицу сырой массы.
А. Здоровые листья. Б. Заражение «бледно-зеленым» штаммом. В. Заражение «желто-зеленым» штам-
мом. Г. Заражение «белым» штаммом.
позволяет проследить путь распространения вируса [181] (фото 44). Было
высказано предположение, что скополетин накапливается за счет индолил-
уксусной кислоты [1319]. Накопление скополетина не является вирусоспе-
цифичным, поскольку это соединение обнаруживают в растениях, заражен-
ных различными другими патогенными агентами. Ван Флеет [1816] пред-
положил, что скополетин представляет собой довольно неспецифичный
антибиотик. При вирусных инфекциях отмечено увеличение концентрации
некоторых других фенольных соединений (см., например, [609, 634, 699]).
Вероятно, накопление большинства ароматических соединений является
неспецифическим эффектом, связанным с гибелью клеток независимо от
вызвавших ее причин — заражения вирусами, грибами или действия других
агентов.
Пигменты
Вирусная инфекция часто приводит к появлению желтой мозаичной
крапчатости или общего пожелтения листьев. Такие изменения, очевидно,
обусловлены влиянием иа пигменты, содержащиеся в листьях. Многочислен-
Влияние на метаболизм растений
249
пые исследования посвящены влиянию вирусной инфекции на количество
пигментов в листьях. Нередко инфекция проявляется в снижении содержа-
ния хлорофилла и — как следствие этого — в возникновении желтоватой
окраски, обусловленной каротином или ксантофиллом. Однако при неко-
торых болезнях содержание этих пигментов также снижается. Часто изме-
нения содержания пигментов хлоропластов, вероятно, вторичны, поскольку
известно, что многие вирусы размножаются и накапливаются в разных
участках клетки. К тому же родственные штаммы одного и того же вируса
могут оказывать различное влияние па пигменты хлоропластов даже в тех
случаях, когда они размножаются с одинаковой интенсивностью.
Уменьшение содержания пигментов в листьях может быть обусловлено
либо подавлением развития хлоропластов, либо разрушением пигментов
в зрелых хлоропластах. Первый процесс, вероятно, преобладает в молодых
листьях, развивающихся по мере развития инфекции. Хлороз, часто наблю-
даемый вблизи местных некрозов при инокуляции зрелых зеленых листьев,,
должно быть, обусловлен разрушением уже имевшихся в них пигментов.
Некоторые штаммы ВЖМТ вызывают хлоротические местные поражения,
не сопровождающиеся структурной деградацией грап, тогда как «белые»
штаммы вызывают дегенерацию граи в зрелых хлоропластах (фиг. 44).
Что касается биохимических и генетических исследований окраски
цветков в норме, то в этой области сделано уже довольно много, и кажется
поразительным, насколько плохо изучена биохимия процесса нарушения
окраски цветков, столь характерного для многих вирусных заболеваний.
У растений табака,зараженных ВТМ, участки нормальной розовой окраски
па лепестках могут чередоваться с белыми полосами или секторами. Мы
установили, что вирус содержится только в белых участках. Однако при-
сутствие или отсутствие вируса, вероятно, не единственная причина изме-
нения окраски. При заражении душистого горошка (Lathyrus odoratus)
вирусом желтой мозаики фасоли цветки, имеющие обычно бледио-розовук>
окраску, приобретают пятнистый рисунок из темно-розовых и белых участков.
Это, разумеется, может быть обусловлено также присутствием различных
штаммов вируса, по-разному изменяющих окраску и локализующихся
в разных участках лепестков в процессе их развития.
Нередко вирусная инфекция оказывает влияние только иа антоциани-
ны клеточного сока, тогда как пигменты хромопластов оказываются
незатронутыми. Например, цветки Chieranthus cheiri, в которых присутствуют
антоцианин, цианин и желтый пигмент пластид [596], желтеют при заражении
вирусом мозаики турнепса. Предварительный хроматографический анализ
измененных и нормальных частей лепестков, зараженных различными
вирусами, показал, что обесцвечивание обусловлено отсутствием определен-
ных пигментов, а не другими факторами, такими, например, как изменение pH
в вакуоли.
Минеральные вещества
При заражении ВТМ в листьях томатов, выращенных па очеш> плодо-
родной суглинистой почве, отмечалось значительное уменьшение (до 50%)
содержания марганца, меди и цинка (в процентах от сухой массы). В то же-
время инфекция совсем или почти совсем не влияла на процентное содер-
жание калия, кальция, магния, железа, бора и алюминия [173].
Не установлено, снижает ли вирус интенсивность всасывания элементов,
корнями или же он влияет на их перемещение к листьям. Эти исследования
привлекли внимание к вопросу, который заслуживает дальнейшего изуче-
ния. Некоторые симптомы вирусных болезней сходны с проявлениями недо-
статочности микроэлементов. Известно, что металлы, содержание которых
250
Глава XI
уменьшается при заражении ВТМ, необходимы для проявления активности
ряда ферментов. Таким образом, возможно, что снижение количества того
или иного минерального вещества в ряде случаев играет роль в появлении
•симптомов вирусной болезни.
РОСТОВЫЕ ВЕЩЕСТВА
Подавление или стимуляция роста, вероятно, наиболее характерные
симптомы вирусных болезней растений. Многих исследователей привлекала
идея, согласно которой вирусы каким-то образом изменяют действие гормо-
нов, тем самым влияя на ход развития болезни. Сравнительно недавно был
сделан значительный шаг вперед в изучении природных соединений, которые
являются стимуляторами и ингибиторами роста или служат факторами
органогенеза. Сейчас известны три типа стимуляторов роста: ауксины,
цитокинины и гиббереллины. Представители каждой из этих групп были
изучены химически и биологически на изолированных тканях или органах
в условиях контролируемого роста. В интактном растении, однако, действие
этих веществ на рост и физиологическую активность может быть самым
различным [1063]. Их функции до некоторой степени перекрываются, а взаи-
модействия оказываются весьма сложными. Влияние этих веществ на тот
или иной процесс может быть сходным, синергичным или антагонистическим.
Помимо действия в интактных растениях, цитокинины влияют на ряд физио-
логических процессов в изолированных листьях. Они задерживают старение
листьев, продлевают синтез белка и РНК, регулируют транспорт питатель-
ных веществ и повышают устойчивость изолированных листьев к высокой
температуре. Гиббереллины оказывают в некоторых случаях сходное
действие.
Многие вещества, выделенные из растений, оказывают тормозящее
действие на рост, ио только одно из них — абсцизовую кислоту — удалось
охарактеризовать. Показано, что этот ингибитор служит регулятором роста
in vivo.
Можно представить себе много разных путей, посредством которых
вирусная инфекция могла бы влиять на рост растений, стимулируя или подав-
ляя синтез, перемещение или эффективность действия ростовых веществ
в различных органах и на разных стадиях роста.
Долгое время в работах, посвященных влиянию вирусной инфекции
на регуляторы роста растений, термин «ауксин» определяли менее четко,
чем теперь. Сейчас под ним подразумевается стимулирующая рост активность
в какой-либо изучаемой системе. Многочисленные данные, полученные
с использованием различных вирусов и растений-хозяев, позволяют пред-
полагать, что под влиянием вирусной инфекции определяемая в экстрактах
из листьев активность ауксинов снижается. Именно такой эффект вызывает,
например, вирус бронзовости у томатов [679], ВТМ у томатов [1318] и табака
[1319] и вирус курчавости верхушки сахарной свеклы у различных хозяев
[1634].
Скополетин в зависимости от условий либо подавляет, либо стимулирует
фотоокисление индолилуксусной кислоты [25, 26]; было высказано предпо-
ложение, что накопление скополетина в зараженных вирусами растениях,
быть может, влияет на концентрацию в них ауксина. В присутствии гиб-
берелловой кислоты эффект подавления роста, вызываемый вирусом гра-
вировки у табака [362] и вирусом раневых опухолей у клевера [1142], частично
снимается. Трехкратное (с недельными интервалами) опрыскивание гиббе-
релловой кислотой (100 ч. на млн.) через 6 нед. после заражения приводило
к значительному усилению роста, однако другие симптомы болезни при
Влияние на. метаболизм растений
251
этом не исчезали и в зараженных растениях присутствовал активный вирус.
Стейн [1676] обнаружил, что обработка гибберелловой кислотой растений
табака, зараженных сильным штаммом вируса гравировки, сопровождалась
резкой стимуляцией роста. Обработанные зараженные растения были при-
мерно в 2,5 раза выше контрольных зараженных растений, однако их высота
составляла всего 0,8 высоты обработанных здоровых растений. Таким обра-
зом, обработка больных растений гибберелловой кислотой в этих усло-
виях не полностью снимала эффект подавления роста, вызываемый
вирусом:.
Принимая во внимание сложность проблемы в целом, изучение
влияния вирусной инфекции на гормональный баланс — дело очень труд-
ное. Однако значительного успеха можно достигнуть с помощью уже разра-
ботанных специфичных биологических тестов при условии, что удастся
подобрать подходящую экспериментальную систему. Такая система исполь-
зована в работе ван Стевенинка [1833], который показал, что вирус мозаики
гороха по-разному влияет на цветение и плодоношение растений Lupinus
luteus L. в зависимости от времени заражения растений. Если заражение
проводить до появления главного соцветия, то увеличивается число цветков
в соцветии, но эти цветки стерильны и вегетативный рост продолжается.
Если заражать растения после появления соцветий, то наблюдается значи-
тельное увеличение числа плодов в каждом соцветии. Это наводит на мысль
о нарушении образования или распределения гормонов. Следовало бы изу-
чить эту систему с использованием современных методов фракционирования
и оценки активности регуляторов роста.
Уже давно известно, что в растениях содержатся многочисленные стеро-
идные соединения, функции которых неизвестны. Недавно было показано,
что некоторые стероиды стимулируют половое размножение грибов [489,
764]. Не исключено, что некоторые из соединений этой группы, возможно,
окажутся гормонально активными в отношении высших растений. До сих
пор не обнаружено каких-либо изменений в содержании этих веществ под
влиянием вирусов. Баур и др. [92] исследовали стерины в здоровых и зара-
женных ВТМ растениях табака, вводя в них меченый предшественник стери-
нов — 2-14С-мевалоновую кислоту. В растениях табака были идентифици-
рованы холестерин, кампестерин, стигмастерин и p-ситостерин. Заражение
ВТМ не оказывало сколько-нибудь заметного влияния на содержание этих
стеринов в листьях, стеблях и корнях.
ФИЗИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ГАЗЫ
Все чаще физиологически активный газ этилен рассматривают как регу-
лятор роста. Симптомы, вызываемые У-вирусом картофеля у Physalis floridia-
па, напоминают изменения, наблюдаемые у некоторых растений при воз-
действии этилена; в частности, в обоих случаях отмечается эпинастическая
реакция листьев с последующим опадением. Это наблюдение заставило
Росса и Вильямсона [1448] исследовать различные физиологически актив-
ные газы у разных видов растений. Газы определяли на основании физиологи-
ческих тестов (тропизмы у проростков растений гороха Pisum sativum), а не
химическими методами. Активные газы практически не образовывались
в интактных листьях здоровых растений Physalis floridiana, однако их уда-
валось обнаружить в исследованных для сравнения листьях растений, зара-
женных У-вирусом картофеля. Газы присутствовали в большем количестве
в некротизированных листьях, чем в листьях с большим содержанием вируса,
но без некрозов. При исследовании различных комбинаций хозяин — вирус
большее количество газа обнаруживалось в тех случаях, когда имело место
252
Глава XI
развитие некрозов. На основании данных различных биологических тестов-
Росс и Вильямсон предположили, что некоторые характерные для вирусных
инфекций симптомы вызваны этиленом, образующимся при некрозе тканей.
ФОТОСИНТЕЗ
Было показано, что обычно в инфицированных листьях через несколько'
дней после заражения фотосинтетическая активность снижается [871, 1303,
1305, 1430, 1799, 1800]. Спайкс и Стаут [1649] исследовали реакцию Хилла
в изолированных хлоропластах сахарной свеклы, зараженной вирусом
желтухи, в широком диапазоне освещенности, почти до 14 000 эрг/(см2-с).
Как световая, так и темновая реакции были подавлены почти иа 50% (в ра-
счете на постоянное количество хлорофилла).
Оуэн [1304] сообщил о снижении скорости ассимиляции в течение 1 ч
после заражения листьев табака ВТМ. Это довольно неожиданный резуль-
тат, который, впрочем, не был подтвержден [1976]. Зайтлин и Ягендорф [19771
на растениях табака, зараженных ВТМ, получили результаты, совпадающие
с теми, которые были получены для других инфекций: вирус не оказывал
влияния на реакцию Хилла и фотосинтетическое фосфорилирование в изо-
лированных хлоропластах почти примерно до 7-го дня после заражения.
Через 7—9 дней скорости обоих процессов в расчете на единицу хлорофилла
уменьшались почти на 40% по сравнению с их скоростями в незаряженных
листьях. Таким образом, активность ферментов снижалась быстрее, чем
содержание хлорофилла. Если растения получали больше азота, то содержа-
ние хлорофилла снижалось в меньшей степени и влияние ВТМ на реакцию'
Хилла снималось, несмотря на то что содержание вируса в листьях
возрастало.
В хлоропластах, выделенных из листьев китайской капусты, заражен-
ных ВЖМТ, реакция Хилла, а также циклическое и нециклическое фото-
фосфорилирование на стадии активного размножения вируса протекали
с большей скоростью, чем в здоровых листьях (в расчете иа постоянное коли-
чество хлорофилла) [1652]. При измерении на хлоропластах, выделенных
из целых растений, фотосинтетическая активность на поздней стадии инфек-
ции была ниже, чем в контроле.
Когда листья Datura stramonium с развивающимися в результате зара-
жения ВТМ некрозами помещали в атмосферу 14СО2, меченые метаболиты
накапливались преимущественно вокруг пораженных участков [1769]. В на-
чинающих проявляться некрозах накопление метки наблюдалось после
десятиминутной экспозиции, что позволяет предположить усиленный фото-
синтез в этих зонах. В то же время, когда растения выдерживали в атмо-
сфере с меченым СО2 на свету в течение 3 ч, а затем переносили в темноту,
в зоне некроза все еще сохранялись метаболиты.
Итак, наиболее общим результатом воздействия вирусной инфекции на
растение является снижение фотосинтетической активности. По-видимому,,
это вторичное следствие инфекции, проявляющееся через некоторое время
после образования вируса и развития симптомов заболевания. На первый
взгляд такое снижение фотосинтетической активности кажется неудиви-
тельным, так как содержание хлорофилла в листьях, зараженных многими
вирусами, уменьшается. Шмид и Гафрои [1499] описали мутант табака,
в котором содержание хлорофилла составляло от х/8 до Чзо нормального
количества на единицу площади листа при несколько сниженном содер-
жании каротиноидов. Необычное свойство таких мутантов заключалось
в их способности фиксировать СО2 при высокой освещенности (ниже
50 000 эрг/(см2-с)) со скоростью, в 2—3 раза превышающей скорость фикса-
Влияние на метаболизм растений
253
ции в нормальном зеленом листе. В то же время при низкой освещенности
^ниже 5000 эрг/(см2 -с)) скорость поглощения СО2 в расчете иа освещенную
площадь была ниже нормальной. Аномальное строение хлоропластов у этих
мутантов (особенно отсутствие гран) напоминает картину, наблюдаемую
при некоторых вирусных инфекциях.
В большинстве проведенных в последнее время исследований, посвя-
щенных изучению влияния вирусной инфекции па фотосинтез, использова-
лись довольно высокие освещенности (порядка 104—-10Б эрг/(см2-с)). Тем
не менее некоторые из описанных .эффектов вирусной инфекции следовало
бы проверить еще раз, обращая особое внимание иа условия освещения,
точнее па длины волн и освещенность.
ДЫХАНИЕ
Большинство исследований, посвященных изучению влияния вирусной
инфекции на дыхание, ограничивается измерением скоростей потребления
кислорода или выделения СО2. Эксперименты обычно проводились на расте-
ниях с системным заражением, и результаты выражались самыми различ-
ными способами. До недавнего времени насчитывается немного серьезных
исследований, касающихся возможных механизмов нарушения процессов
образования энергии в растениях под влиянием вирусной инфекции.
Имеются сообщения об усилении дыхания у растений с хронической
инфекцией, а также в зараженных листьях, па которых не развиваются не-
крозы [306, 871, 872, 1084, 1799, 1905, 1958], об ослаблении дыхания [1733]
и о различных других эффектах, зависящих от условий и способа выражения
результатов [1301—1303, 1305].
Такахаси и Хираи [1728, 1729] использовали полоски эпидермиса для
изучения изменений, происходящих в ранние сроки после заражения табака
ВТМ. Они обнаружили временный подъем дыхания по сравнению с кон-
тролем, наблюдавшийся в течение 1—2 дней после заражения, до образования
значительных количеств вируса (фиг. 45, Л). На основании исследований
с использованием различных субстратов и ингибиторов они пришли к выво-
ду, что митохондрии из зараженного эпидермиса отличались в количествен-
ном (но не в качественном) отношении по их окисляющей и фосфорилирую-
щей активности. По окончании периода увеличения концентрации вируса
происходит снижение уровня дыхания по сравнению с контролем.
Увеличение скорости дыхания в листьях нескольких сортов перца
{Capsicum sp.), зараженных сильным штаммом вируса гравировки, удается
выявить в момент проявления видимых симптомов, причем высокая скорость
дыхания сохраняется и в дальнейшем [614]. По-иному обстоит дело с корне-
вым дыханием больных растений. Вирус не оказывал влияния па интенсив-
ность дыхания у тех сортов, у которых он не вызывал симптомов увядания.
В то же время при инокуляции перца сорта Табаско, реагирующего на зара-
жение вирусом увяданием, снижение интенсивности корневого дыхания
происходило через 12—24 ч после того, как проницаемость корней возросла
(см. стр. 255). Было высказано предположение, что снижение дыхания в этом
случае обусловлено утечкой субстратов и активаторов ферментов.
Результаты Меретта [1199] иллюстрируют важность выбора правиль-
ного принципа для выражения результатов при подобного рода исследова-
ниях, особенно иа тех стадиях заболевания, когда наступает задержка роста
растений. Меретт изучал потребление кислорода срезами стеблей здоровых
и зараженных ВТМ (штамм аукуба) растений томатов. Оказалось, что па
результаты сильно влияли условия выращивания. В условиях, благоприят-
ствующих полному развитию симптомов болезни, величина сырой и сухой
254
Глава XI
Время после инокуляции ,дт
Фиг. 45. Влияние вирусной инфекции на дыхание [1947].
Л. Отношение скорости дыхания в эпидермисе листьев растений табака, зараженных ВТМ, в течение
8 дней после инокуляции к скорости дыхания в незараженных листьях (I — концентрация ВТМ в ткани,
измеренная серологическим методом; II — отношение скоростей дыхания). Б. Зависимость увели-
чения скорости дыхания от появления местных некрозов у N. glutinosa после инокуляции ВТМ.
массы на клетку снижалась под влиянием вирусной инфекции. В этих усло-
виях инфекция сопровождалась повышением интенсивности дыхания в ра-
счете как на сырую, так и на сухую массу. Меретт изучал влияние инфекции
на дыхание, применяя в качестве основы для сравнения междоузлие (в здо-
ровых и зараженных междоузлиях число клеток одинаково). При таком!
расчете отмечалось значительное снижение дыхания под влиянием вирусной
инфекции.
Имеются данные, что в различных комбинациях хозяин — вирус, харак-
теризующихся развитием местных некрозов, появление некрозов сопровож-
дается увеличением скорости дыхания.
Ямагути и Хираи [1947] установили, что в листьях N. glutinosa, зара-
женных ВТМ, интенсивность дыхания (на единицу сухой массы) увеличи-
вается только после того, как начинают появляться некрозы (фиг. 45, В).
Поскольку быстрое увеличение концентрации вируса начиналось до появ-
ления некрозов, они предположили, что усиление дыхания связано с образо-
ванием некрозов, а не с накоплением вируса. Однако Сандерленд и Меретт
[1710] и Вейнтрауб и др. [1886], исследуя влияние ВТМ на N. glutinosa,
а также некоторые другие системы хозяин — вирус, характеризующиеся
Влияние на метаболизм растений
255
развитием местных некрозов, обнаружили, что увеличение скорости дыха-
ния происходило за несколько часов до того, как местные некрозы стано-
вились видимыми. В то же время при местных некрозах иа листьях табака,
вызванных опрыскиванием сульфатом меди, усиления дыхания не отмечалось.
Кроме того, было показано, что в зеленых участках ткани, вырезанных из
зон между некротическими очагами, скорость дыхания была выше. Вейн-
трауб и др. [1887] предположили, что число митохондрий па клетку в зара-
женных ВТМ листьях N. glutinosa увеличивается (в 2—3 раза) до появле-
ния местных некрозов, но этот результат не получил подтверждения в более
поздней работо [1330].
Активность ферментов пентозофосфатного цикла возрастает в желтых
участках ткани, окружающих некротические очаги, возникающие у N. taba-
сит под влиянием одного из штаммов ВТМ [506, 1642]. Белл [142] исследо-
вал дыхание двух сортов Phaseolus vulgaris, зараженных вирусами мозаики
люцерны и южной мозаики фасоли. Наибольшая стимуляция дыхания наблю-
далась в тех случаях, когда развивались хорошо выраженные местные некро-
зы; в этом случае происходило также увеличение активности ферментов
пентозофосфатного пути. Меретт и Сандерленд [1200] обнаружили, что общее
усиление дыхания в листьях табака сорта Ксапти при образовании некро-
зов затрагивало как гликолитический, так и пентозофосфатный пути.
Баур и др. [90—92] исследовали более детально влияние инфицирова-
ния ВТМ иа катаболизм глюкозы у растений табака с системным зараже-
нием. Используя несколько методов расчета, они нашли, что в здоровых
растениях табака дыхание на 80% осуществляется по пути Эмбдена — Мей-
ергофа — Парнаса и лишь примерно на 20% — через гексозомонофосфатный
шунт. Заражение ВТМ не влияло на это соотношение. Авторы не обнару-
жили различий в способности зараженной и здоровой тканей превращать
1-14С-рибозу, 1-14С-ксилозу и 6-14С-глюконовую кислоту в 14СО2. Представ-
ление, согласно которому системное заражение ВТМ не приводит к повы-
шению активности гексозомонофосфатного шунта, подтверждается так’же
тем, что ингибирующее действие малоновой кислоты на дыхание в нормаль-
ной и зараженной тканях проявляется одинаково [91], а активность (па еди-
ницу сырой массы) четырех ферментов этого пути в нормальной ткани не
отличается от их активности в зараженной ткани [92].
Итак, во многих комбинациях хозяин — вирус, характеризующихся
отсутствием местных некрозов, происходит увеличение скорости дыхания,
которое может начаться до появления симптомов и продолжаться в течение
некоторого времени по мере развития болезни. У растений с хронической
инфекцией уровень дыхания часто ниже нормального. При системном раз-
витии симптомов вирусной инфекции до сих пор не удалось обнаружить
изменений в дыхательном пути. При образовании местных некрозов наблю-
дается усиление дыхания по мере их развития. Это усиление обусловлено,
по крайней мере частично, активацией ферментов гексозомонофосфатного.
шунта.
ТРАНСПИРАЦИЯ, СОДЕРЖАНИЕ ВОДЫ И ПЕРЕНОС
РАСТВОРЕННЫХ ВЕЩЕСТВ
На основании данных весьма немногочисленных исследований можно*
предположить, что скорость транспирации и содержание воды у больных
растений ниже, чем у здоровых (по крайней мере в момент наивысшего
развития инфекции) [657, 1295, 1306, 1312].
Сильный штамм вируса гравировки табака вызывает увядание растений
перца сорта Табаско [675]. В начале увядания обнаруживается некроз
256
Глава XI
флоэмы и камбия вокруг ксилемы, ио не наблюдается блокады ксилемы
[1904]. У других сортов перца увядание вызывает сильный штамм вируса
деформирующей мозаики. Увеличение проницаемости корней перца сорта
Табаско, обнаруживаемое по выходу электролитов в среду, происходит
за 1—2 дня до увядания или появления каких-либо явных гистологических
изменений [614]. При этом выход калия выражен в наибольшей степени.
Известно, что калий является основным ионом, выделяющимся при обра-
ботке корней некоторыми токсинами грибов, повышающими проницае-
мость. В момент изменения проницаемости вирус удавалось обнаружить
в корнях.
Никаких изменений в проницаемости листьев и корней не было обна-
ружено у перца сорта Табаско, зараженного другими вирусами, не вызы-
вающими увядания. Изменений в проницаемости корней не отмечалось
также при заражении других сортов перца сильным штаммом вируса гра-
вировки. Данные о наличии вируса в корнях этих растений па ранней стадии
отсутствуют. Увядшие растения перца сорта Табаско выздоравливали
после того, как кончики корней удаляли и помещали корни в воду. Из этого
следует, что увядание обусловлено невозможностью проникновения воды
в ксилему, а не блокированием ее передвижения по этой ткани. Торможение
дыхания в корнях зараженных растений обнаруживалось через 12—24 ч после
повышения проницаемости. Спустя 1—2 дня после изменения проницае-
мости снижается содержание аскорбиновой кислоты, отмечается значи-
тельное увеличение содержания полифенолов и повышение активности
пероксидазы. Весьма вероятно, что все эти изменения являются вторич-
ными и обусловлены потерей калия.
Вопрос о влиянии вирусной инфекции на перемещение углеводов обсуж-
дался выше.
ОБСУЖДЕНИЕ
Наиболее общие физиологические и биохимические изменения, встре-
чающиеся у зараженных вирусами растений, следующие:
а) снижение скорости фотосинтеза;
б) увеличение скорости дыхания;
в) повышение активности некоторых ферментов, в частности полифе-
нолоксидаз, и накопление окисленных полифенолов;
г) снижение активности регуляторов роста растений.
Нет основания предполагать, что основные нарушения метаболизма
растения-хозяина обязательно определяются узловыми процессами, непо-
средственно связанными с репликацией вирусов. Какое-то незначительное
первоначальное воздействие, обусловленное внедрением вируса и его репли-
кацией, может привести к глубоким вторичным изменениям в клетке-хозяние.
Такие изменения могут завуалировать важные первичные воздействия даже
на очень ранней стадии после заражения.
Многие изменения метаболизма растения-хозяина, отмеченные выше,
вероятно, являются вторичными следствиями вирусной инфекции, несу-
щественными для репликации вируса. Изменение одного гена хозяина или
единичная мутация в вирусном геноме могут превратить почти бессимптом-
ную инфекцию в тяжелое заболевание. Изменения метаболизма под влия-
нием вирусной инфекции часто оказываются неспецифичпыми. Сходные
изменения могут возникать при болезнях, вызванных другими патогенными
агентами, а также механическим или химическим повреждением. При мно-
гих вирусных болезнях изменения метаболизма по своему общему характеру
напоминают ускоренный процесс старения. Поэтому методы быстрой диаг-
Влияние на метаболизм растений
257
иостики, основанные на определении изменений химического состава зара-
женных вирусами растений, следует применять с осторожностью.
Согласно одной из весьма распространенных точек зрения, некоторые
изменения метаболизма возникают в связи с тем, что вирус потребляет мета-
болиты, необходимые для клетки-хозяина. Вообще говоря, маловероятно,
чтобы это могло служить основной причиной. Большинство известных виру-
сов построено из тех же строительных блоков, из которых состоят клеточ-
ные белки и РНК, и притом в тех же соотношениях. Содержание белка
и РНК в здоровых листьях сильно колеблется в зависимости от условий
роста. У растений, выращенных в оптимальных условиях, затраты энергии
и строительных материалов, связанные с синтезом большинства вирусов, не
должны резко истощать синтетическую активность растений или приводить
к недостаточности основных питательных веществ. Однако в условиях недо-
статка питательных веществ при заражении вирусами, накапливающимися
в высокой концентрации в растении, инфекция может усугублять влияние
недостатка фосфора или азота.
Известно, что вредное воздействие неблагоприятной температуры на
рост растения может быть частично или полностью снято при помощи неко-
торых важных метаболитов, которые в нормальных температурных усло-
виях безразличны для растения [967]. Их влияние оказывается до некоторой
степени видоспецифичным. Например, воздействие неблагоприятной темпе-
ратуры на рост растения может быть обусловлено, по крайней мере частично,
недостаточностью некоторых метаболитов, и вирусная инфекция может еще
более усугублять эту недостаточность.
Конечно, очень бы хотелось дать полное биохимическое и молекулярно-
биологическое описание всего процесса возникновения болезни при зараже-
нии растения вирусом. Однако мы в настоящее время еще очень далеки от
этого, что явствует из приведенного выше изложения сведений о влиянии
вирусной инфекции иа метаболизм растения-хозяина. Принято говорить,
что «вирусы не имеют собственного обмена веществ». Это справедливо для
изолированных вирусных частиц, но не для вируса в клетке. Даже у мелких
вирусов генетический материал содержит достаточно информации для коди-
рования нескольких белков, помимо капсидного. До тех пор пока мы не
выясним функции этих белков, мы не сможем понять, каким образом вирусы
нарушают метаболизм клетки-хозяина.
17-0893
ГЛАВА XII
ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА ТЕЧЕНИЕ
И ХАРАКТЕР ИНФЕКЦИИ
Течение и характер инфекции, развивающейся в результате заражения
данного вида растений определенным вирусом, зависят от ряда различных
факторов. В некоторых случаях существенное влияние может оказывать спо-
соб инокуляции (гл. VI). Некоторые вирусы представлены многочисленными
штаммами, и при заражении одних и тех же видов растений в одинаковых
условиях различными штаммами одного и того же вируса могут развиваться
заболевания совершенно различного характера (гл. XIII).
В настоящей главе мы обсудим влияние на течение инфекции наследуе-
мых свойств самих растений-хозяев, факторов окружающей среды, взаимо-
действия между неродственными вирусами, а также между вирусами и гри-
бами; наконец, в этой главе мы рассмотрим интересное и малоизученное
явление приобретенной устойчивости к вирусной инфекции.
ФАКТОРЫ, СВЯЗАННЫЕ С РАСТЕНИЕМ-ХОЗЯИНОМ
Возраст
Восприимчивость к заражению
Восприимчивость листьев к определенному вирусу может быстро изме-
няться по мере их старения. Как правило, молодые листья более восприим-
чивы, чем старые. Например, летом 10-дневиые листья растений фасоли
могут быть легко инфицированы при инокуляции вирусом некроза табака,
в то время как 13—14-дневные листья могут не образовать ни одного пора-
жения [99]. Вместе с тем очень молодые листья могут оказаться менее вос-
приимчивыми, чем более развитые. Шеин [1491] обнаружил, что листья
фасоли в период развертывания мало восприимчивы к ВТМ, ио их восприим-
чивость возрастает и становится максимальной к тому времени, когда они
достигают 1/3 своих окончательных размеров. Как только листья достигли
окончательных размеров, их восприимчивость вновь падает до очень низкого'
уровня. Таким образом, па растении с листьями различного возраста можно-
наблюдать некий градиент восприимчивости, однако для разных вирусов
этот градиент может быть различным. Так, у растений N. glutinosa с 8—10-
хорошо развитыми листьями ВТМ вызывает больше местных поражений
на листьях нижнего и среднего ярусов, чем на молодых листьях. Напротив,
вирус кустистой карликовости томатов часто не вызывает ни одного местного
поражения на самых старых листьях, но зато очень много поражений на
самых молодых [99]. Самые старые и самые молодые листья N. glutinosa
оказались значительно менее восприимчивыми к вирусу некротического
пожелтения салата-латука, чем листья среднего яруса [420].
Системное распространение вируса
При инокуляции самых молодых листьев хорошо развитых растений
табака или томатов ВТМ листья нижних ярусов могут оставаться здоровыми
(если только не ввести им вирус непосредственно). Чем старше растениеf
Факторы, влияющие на течение и характер инфекции
259
тем сильнее выражена эта тенденция к локализации инфекции. Важную роль
играет при этом физиологический, а не календарный возраст растения. При
заражении растения картофеля A-вирусом как естественным путем в поле,
так и путем инокуляции некоторые образовавшиеся на нем клубни могут
оставаться свободными от вируса. Вимстер [1371 обнаружил, что доля клуб-
ней и глазков, зараженных У-вирусом картофеля, зависит от того, на какой
стадии развития растения была произведена инокуляция. Например, у 8-ие-
дельных растений картофеля, срединные листья которых были ииокулиро-
ваны вирусом, все клубни, собранные через 3 иед после заражения, содер-
жали вирус, тогда как у растений, инокулированных в возрасте 13 иед,
доля зараженных клубней составляла только 25%. Потери урожая по эко-
номически важным культурам нередко зависят от времени заражения
растений. Например,потери урожая, причиняемые вирусом желтой карлико-
вости ячменя, как правило, более значительны, если заражение растений
произошло на ранней стадии развития [1622] (фото 69). Интенсивность ино-
куляции также может оказывать влияние иа степень подавления роста
растений (ср. А и Б на фото 69). Возможно, что иа самом деле этот эффект
определяется возрастом растений, поскольку очевидно, что системное рас-
пространение вируса происходит быстрее с увеличением интенсивности
инокуляции.
Подавление роста растения может проявляться и по-иному. Например,
растения картофеля, инфицированные X- или У-вирусом или смесью этих
двух вирусов, в течение первых нескольких недель растут быстрее, чем
здоровые растения, если судить о росте по удлинению стебля, а па более
поздних стадиях быстрее растут здоровые растения [859].
У растений, размножающихся вегетативным путем, подавление роста
часто носит прогрессирующий характер. Например, растения земляники
и луковицы тюльпанов, зараженные вирусом, год от года могут становиться
все мельче и мельче.
Генотип
Генетическая природа растения-хозяина часто оказывает глубокое
влияние па результат заражения растения определенным вирусом. Мы рас-
смотрим несколько типов реакции растения па заражение: а) иммунность —
растения не заражаются ни при каких условиях; б) устойчивость к зараже-
нию; в) сверхчувствительность — в месте инокуляции развиваются некро-
тические поражения, причем в другие участки листа вирус ле распростра-
няется; г) толерантность — вирус размножается и распространяется по тка-
ням растения, по симптомы заболевания выражены слабо. Кроме того, важ-
ное значение для распространения вируса в полевых условиях может иметь
наследственная устойчивость растения-хозяина к насекомому-переносчику
гл. XVI).
Иммунность
Если рассматривать иммунность применительно к возможности кон-
такта всех видов растений со всеми вирусами, то она представляется самым
обычным свойством растений. Однако в группе близкородственных видов
растений, некоторые члены которой восприимчивы к какому-либо вирусу,
истинная иммунность к этому вирусу — явление редкое. Проростки карто-
феля сорта USDA 41 956 иммуины к Х-вирусу картофеля. Ни один из штам-
мов этого вируса, по-видимому, не может размножаться в растениях этого
сорта, однако распространение вируса по стеблю не подавляется. Если здо-
17*
260
Глава XII
ровые черенки сорта, чувствительного к Х-вирусу, привить па зараженные
растения через промежуточный срез проростков сорта 41 956, здоровые че-
ренки заражаются.
Устойчивость и сверхчувствительность
С практической точки зрения сверхчувствительность растения к зара-
жению вирусом весьма полезна, так как придает растению устойчивость
к заболеванию в полевых условиях (так называемая полевая устойчивость).
В некоторых случаях трудно отличить истинную устойчивость от сверхчув-
ствительности, при которой очень небольшое число клеток сразу погибает,
так что видимый некроз образоваться не может.
В пределах группы близкородственных видов растений, некоторые из
которых восприимчивы к данному вирусу, генетически обусловленная устой-
чивость к заражению встречается гораздо чаще, чем иммунность. Устойчи-
вость может контролироваться одним или несколькими генами.
Устойчивость к системному распространению вируса или одного из
штаммов вируса, связанная с образованиемместныхиекротических поражений,
часто контролируется одним доминантным геном (например, реакция растений
сафлора на заражение вирусом мозаики салата-латука [1005]). У некоторых
сортов табака при заражении определенными штаммами ВТМ развивается
некротическая реакция без последующего системного распространения вируса,
тогда как обычно после образования хлоротических пятен развивается
мозаика. Различие реакции двух таких сортов может определяться парой
генов, причем ген, определяющий некротический тип реакции, доминирует
[1882]. У гибридов Ft развивается местная некротическая реакция, за кото-
рой следует системное некротическое заболевание. На фото 70 можно видеть
тип реакции, подобный описанному Вебером для других сортов табака.
Большинство сортов стручкового перца реагирует на инфицирование
вирусом гравировки табака развитием мозаичной болезни. Перец сорта
Табаско {Capsicum frutescens) реагирует на заражение увяданием. Реакция
увядания контролируется одним доминантным геном, отсутствующим у сор-
тов перца, не поражаемых увяданием [676].
Симмондс и Харрисон [1585] показали, что реакция растений перца на ин-
фекцию У-вирусом картофеля контролируется двумя иесцеплеииыми локу-
сами Vi и У2- Растения, рецессивные по обоим локусам (щщ, заразить
вирусом было трудно. Если их удавалось заразить, то у них возникали незна-
чительные симптомы мозаики и они развивались достаточно хорошо. Расте-
ния сохраняли устойчивость к заражению, однако инфицированные
растения были низкорослыми и теряли часть листьев. При введении другого
доминантного гена (щщТ272) восприимчивость к заражению увеличивалась,
растения были низкорослыми и проявляли отчетливые симптомы мозаичной
болезни. Растения, гомозиготные по обоим доминантным генам (УУУзРг),
заражались легко. При этом у них развивался некроз жилок, они теряли
листья и погибали.
Делались многочисленные попытки вывести сорта, обладающие высокой
устойчивостью к ВТМ. Известно несколько генов, контролирующих реак-
цию табака на заражение этим вирусом. Доминантный ген N определяет
местный некротический тип реакции растений N. glutinosa на заражение ВТМ.
Холмсу [817] удалось ввести ген N в N. tabacwn, использовав амфидиплоид-
ный вид табака N. digluta. Сорт табака, известный как Т. 1.245, при слабой
инокуляции ВТМ обнаруживает способность избежать инфекции. Этот
сорт частично устойчив также и к ряду других вирусов [586, 822]. Холмс
[822] пришел к выводу, что реакция табака сорта Т.1.245 иа вирусную ин-
фекцию определяется двумя генами.
Факторы, влияющие на течение и характер инфекции 261
Толерантность сорта табака Амбалема к ВТМ контролируется двумя
рецессивными генами гт1 и гт2 (см. ниже). Образование хлоротичного ореола,
обычно появляющегося вокруг местных поражений типа N (локализация
ВТМ, характерная для N. glutinosa), подавляется двумя доминантными ге*
нами Gt и б?2. Холмс [822] скомбинировал все эти гены, обусловливающие
сверхчувствительность, толерантность и устойчивость, и получил сорта
табака, высокоустойчивые к ВТМ. Эти новые сорта реагировали на зараже-
ние образованием небольшого количества медленно развивающихся местных
некрозов меньшего размера. Холмс [823] исследовал устойчивость двух линий,
унаследовавших устойчивость к ВТМ от сорта Т. 1.245, к шести другим ви-
русам. Обе линии оказались устойчивыми ко всем шести вирусам. Поскольку
эти линии были отобраны из расщепляющейся популяции только по при-
знаку устойчивости к ВТМ, представляется вероятным, что устойчивость
ко всем вирусам определяется сходным генетическим механизмом.
При взаимодействии вируса броизовости с растениями томатов наблю-
дается противоположная ситуация. Были обнаружены различные генетически
контролируемые факторы устойчивости томатов к вирусу броизовости.
Каждый из этих факторов оказывается действенным только в отношении
некоторых штаммов вируса. В Австралии, где существует широкий спектр
различных штаммов вируса, устойчивость томатов к пяти группам штаммов
вируса контролируется тремя независимо наследуемыми рецессивными ге-
нами и двумя доминантными аллелями [524].
О физической или биохимической основе устойчивости к заражению
известно мало. Быть может, в некоторых случаях определенную роль играют
количество эктодесм и их величина (стр. 123). Симонс и Мосс [1592] не
обнаружили различий в толщине кутикулы между сортами перца, восприим-
чивыми к У-вирусу, и устойчивым сортом Итальянский Е1. Прививка черен-
ков устойчивого сорта на растения, восприимчивые к вирусу, не влияла
на устойчивость или восприимчивость. Тли Myzuspersicae одинаково питались
как на устойчивых, так и на восприимчивых сортах. При инокуляции вос-
приимчивых растений высушенным из замороженного состояния экстрактом
неочищенного сока устойчивых растений, производимо!! механически или
при помощи тлей, восприимчивость понижалась. Симонс и Мосс высказали
предположение, что устойчивость растений сорта Итальянский Е1 связана
с присутствием в соке какого-то ингибитора вируса. Однако наличие такого
ингибитора в экстрактах листьев еще не означает, что этот ингибитор дей-
ствует и в интактных растениях. Не было получено доказательств того, что
ингибитор, специфически действующий против У-вируса, присутствует
в других устойчивых сортах перца [402]. Различные сорта перца разли-
чаются по устойчивости к различным штаммам вируса [1590]. Хукеру и Киму
[831] не удалось обнаружить различий в содержании ингибитора Х-вируса
картофеля между сортами картофеля, толерантными, сверхчувствительными
или иммунными к Х-вирусу.
Устойчивость может полностью утрачиваться при возникновении вирус-
ных штаммов, способных вызывать заражение ранее устойчивых сортов
и размножаться в них (см., например, [437]).
Толерантность
Классический пример растений, характеризующихся генетически кон-
тролируемой толерантностью, представляет собой сорт табака Амбалема.
ВТМ заражает эти растения и репродуцируется в них, но в полевых усло-
виях зараженные растения на вид кажутся здоровыми. В данном случае
толерантность контролируется парой независимо расщепляющихся рецес-
сивных генов rmi и гт2, а также, возможно, другими генами, оказывающими
меньший эффект.
262
Глава XII
ФАКТОРЫ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ
Условия среды, в которых растения выращивались до инокуляции, усло-
вия, в которых производилась инокуляция, и условия, в которых развива-
лось заболевание, могут оказывать четко выраженное действие на течение
инфекции. Растение, обладающее высокой восприимчивостью к данному
вирусу при одних условиях, может оказаться полностью устойчивым в дру-
гих условиях. В ходе инфекции в зависимости от условий окружающей среды
концентрация вируса может быть высокой или низкой, симптомы заболева-
ния бывают выражены очень отчетливо или маскируются.
Факторы, влияющие на восприимчивость растений
к заражению
Любой фактор, влияющий на чувствительность листовой поверхности
к повреждению при механической инокуляции, изменяет вероятность успеш-
ного проникновения вируса в клетки, а физиологические изменения, проис-
ходящие в листе, могут создавать в клетках условия, более или менее под-
ходящие для успешного развития инфекции. Растения, выращиваемые в теп-
лице, обычно бывают наиболее восприимчивыми к заражению при следующих
условиях: 1) достаточное минеральное питание и обеспеченность водой;
2) средняя или низкая интенсивность света; 3) температура от 18 до 30° С,
в зависимости от вида растения и вируса; 4) инокуляция, проводимая после
полудня.
Освещенность
На восприимчивость растений к заражению вирусом оказывают влия-
ние изменения освещенности двух типов, а именно: 1) кратковременные изме-
нения интенсивности света (отклонения от нормальных условий на период
не более 1 или 2 дней) и 2) изменения освещенности на протяжении длитель-
ных периодов, влияющие иа рост растения.
Боудэн и Робертс [127, 128] обнаружили, что в летний период снижение
интенсивности света или полное затемнение в течение примерно 24 ч повы-
шает восприимчивость некоторых растений к вирусам. Затемнение или выдер-
живание растений в полной темноте за день до инокуляции используется
часто в качестве практического приема, позволяющего повысить восприим-
чивость растений-хозяев к вирусам, плохо передающимся механическими
способами. Так, Коста и Бэннет [411] показали, что выдерживание растений
сахарной свеклы в темноте на протяжении нескольких дней перед иноку-
ляцией повышало их восприимчивость к вирусу желтухи сахарной свеклы.
При этом степень повышения восприимчивости зависит также от возраста
растения. Например, выдерживание 10-дневных растений фасоли в темноте
в течение суток резко повышало их восприимчивость к вирусу некроза таба-
ка, тогда как восприимчивость 22-дневных растений в тех же условиях не
изменялась [971].
Различными экспериментами установлено, что свет может действовать
на восприимчивость растений к заражению в двух прямо противоположных
направлениях. Избыточное освещение может понизить восприимчивость,
но вместе с тем даже кратковременное освещение после периода затемнения
приводит к заметному увеличению числа местных некрозов. Например,
если растение фасоли после 18 ч полного затемнения облучали в течение
1 мин лампами мощностью 800 Вт и инокулировали вирусом некроза табака,
число образующихся местных поражений было вдвое больше, чем на расте-
Факторы, влияющие на течение и характер инфекции
263
Фиг. 46. Влияние продолжительности содержания в темноте па время появления
и число местных некрозов па листьях Gomphrena globosa, зараженных Х-вирусом карто-
феля [836].
I — контроль (без затемнения); II — VI — затемнение в течение 3 дней (II), 4 дней (III), 6 дней (IV),
7 дней (V) и 14 дней (VI).
ниях, которые инокулировали при минимальном освещении, едва позволяв-
шем различать листья [1172]. Аналогичные результаты были получены
Хельмсом и Макинтайром [761, 762] при заражении растений фасоли ВТМ.
Эти авторы пришли к выводу, что в темноте происходит инактивация (или
снижение концентрации) некоего вещества, прямо или косвенно влияющего
на процесс размножения вируса; при освещении это гипотетическое вещество
синтезируется вновь или (если оно присутствует) активируется. Предположе-
ние о существовании такого вещества может объяснить, по крайней мере
частично, суточный цикл восприимчивости растений к заражению, а также
увеличение числа местных некрозов при содержании на свету после периода
затемнения.
Содержание растений в темноте после инокуляции может подавить обра-
зование местных некрозов. Так, растения Gomphrena globosa, зараженные
Х-вирусом картофеля, в норме реагируют на заражение образованием через
3—8 дней местных некрозов, не сопровождающихся системным распростра-
нением вируса. Развитие местных некрозов зависело от световых условий
после инокуляции. Если листья после заражения освещали в течение 48 ч,
последующее продолжительное затемнение не влияло на число местных
некрозов. Если же растения затемняли сразу же после инокуляции, местные
некрозы появлялись позже, причем период задержки был примерно равен
периоду затемнения [836]. При этом число образующихся местных некрозов
•было меньше, чем в контроле (фиг. 46).
Высокая интенсивность света может изменять характер некрозов, инду-
цируемых Х-вирусом картофеля в растениях G. globosa, а также может вызы-
вать появление спонтанных некрозов, аналогичных тем, которые вызывает
вирус [548].
Почти во всех работах, в которых исследовалось влияние света на вос-
приимчивость растений к заражению вирусом, растения выращивались
в обычных условиях в теплице. Таким образом, на результаты опытов влияли
не только экспериментальные изменения освещенности, но и естественные
циклы восприимчивости растений к вирусной инфекции, которые обсуж-
даются ниже. Кроме того, на результаты экспериментов может оказывать
сильное влияние время дня (фиг. 47). Число местных некрозов на листьях
264
Глава XII
Фиг. 47. Влияние времени дпя иа резуль-
таты экспериментов по определению дейст-
вия затемнения на число местных пора-
жений, возникающих на листьях растений
фасоли при заражении вирусом некроза
табака [1172].
Log R характеризует отношение числа местных
некрозов иа листьях опытных растений к числу
некрозов, образующихся на листьях контрольных
незатемненных растений, инокулироиаиных в 8 ча-
сов утра, / — растения содержались в.темноте
в течение 30 мин непосредственно перед инокуля-
цией; II — растения содержались в темноте в те-
чение 30 мин непосредственно после инокуляции.
растений, содержавшихся до инокуляции в темноте, увеличивается (по срав-
нению с контролем в течение суток за период от 8 до 17 часов).
Касаясь влияния длительных изменений светового режима на восприим-
чивость растений к заражению, следует отметить, что высокая интенсивность
освещения в течение всего периода роста делает их более устойчивыми по
сравнению с растениями, выращенными при более низкой интенсивности
освещения.
Температура
Обычно преинкубация растений до инокуляции при более высокой тем-
пературе, чем обычно, повышает их восприимчивость к вирусной инфекции
[658, 928]. Например, контрольные растения N. glutinosa, зараженные ВТМ,
при обычной температуре образуют 32 местных некроза на лист. Если расте-
ния за день до инокуляции инкубировали при 36 °C, то на одном листе воз-
никало 98 некрозов, при инкубации в течение 4 дней при 36 °C — 171 не-
кроз. Характер воздействия тепловой обработки растений после инокуля-
ции зависит от вида [928] или от штамма вируса [758, 1271].
Ниенхауз иЯрвуд[1271] обнаружили, что нагревание одного из первич-
ных листьев фасоли сорта Пинто до температуры, летальной для тканей листа
(70 °C в течение 20 с), приводит к увеличению в 100 раз числа местных некро-
зов, возникающих при заражении ВТМ (штамм из батата) на другом первич-
ном листе. Если нагретый лист удаляли в течение 2 мии после нагревания,
увеличения числа некрозов на втором листе не наблюдалось. Влияние нагре-
вания было выражено очень отчетливо, если его производили в период до
1 ч после инокуляции, но оставалось довольно заметным и при нагревании
листа в любой момент в период за 10 ч до или спустя 10 ч после инокуляции.
Авторы пришли к выводу, что нагревание действует непосредственно на ме-
ханизм, ответственный за возникновение местных некрозов, а не па число
успешно инфицируемых участков. Действие нагревания на образование не-
крозов, выявляемых иод-крахмальной пробой, оказалось значительно слабее.
Было детально исследовано действие кратковременного нагревания
на число местных поражений, индуцируемых штаммами Uj и Щ ВТМ и соот-
ветствующими свободными РНК на листьях фасоли сорта Пинто [760, 1394],
однако полученные результаты трудно поддаются интерпретации. By и др.
Факторы, влияющие на течение и характер инфекции
265
[1944] высказали предположение, что исключительно малые размеры мест-
ных некрозов, вызываемых штаммом U2 на листьях фасоли Пинто, объяс-
няются образованием в оболочках живых клеток, соприкасающихся с не-
кротизированными клетками, местных уплотнений, которые играют роль
барьера, препятствующего дальнейшему распространению вируса. Воз-
можно, что нагревание замедляет процесс образования уплотнений, способ-
ствуя тем самым увеличению размеров местного поражения.
Растения сахарного тростника, выращенные из черенков, подвергнутых
тепловой обработке для удаления вируса карликовости, оказались более
восприимчивыми к заражению вирусом карликовости сахарного тростника
(rattoon stunting) как при механической инокуляции, так и при передаче
с помощью'тлей [1890]. Эта повышенная восприимчивость не передавалась
следующему поколению растений, выращенных из прогретых черепков.
Температура может также влиять на скорость и эффективность передачи
вируса путем прививки. Так, оптимальной для передачи вируса кольцевой
пятнистости сливы оказалась температура 30 °C; при более высокой или более
низкой температурах эффективность передачи заметно снижалась [561].
Водный режим и влажность
Непосредственное влияние промывки инокулированных листьев водой
обсуждается в гл. VI. Обычно при выращивании в условиях минимального
снабжения водой рост растений подавляется, их листья становятся жесткими
и число местных некрозов значительно уменьшается по сравнению с кон-
трольными растениями, не испытывающими недостатка в воде. Так, Тинсли
[1775] обнаружил, что при достаточном снабжении водой некоторые вирусы
вызывают на листьях растений N. glutinosa и табака в 10 раз больше мест-
ных поражений, чем на листьях растений, выращиваемых в условиях недо-
статка влаги. Влияние постоянного недостатка влаги на восприимчивость
растений к заражению можно, по крайней мере частично, объяснить изменением
структуры листовой поверхности. Клетки растений, хорошо снабжавшихся
водой, имели более тонкую кутикулу, причем Тинсли показал, что различия
в восприимчивости растений, выращиваемых в условиях недостаточного'
и нормального снабжения водой, были значительно менее выражены, если
в инокулуме присутствовал целит.
Большая часть данных свидетельствует о том, что некоторое завядайте-
растений перед инокуляцией повышает восприимчивость к заражению. Так,
показано, что если водный дефицит листьев фасоли, отделенных перед ино-
куляцией, составлял от 0 до 15% их сырой массы, то их восприимчивость
к ВТМ повышалась. Большой дефицит (от 15 до 29%) приводил к снижению'
восприимчивости. Если листья после инокуляции подсушивали с целью
вызвать у них искусственное завядание, число местных некрозов увеличива-
лось с возрастанием водного дефицита от 0 до 35 % [1957], причем максималь-
ное число поражений, образующихся на таких листьях, было выше, чем
у контрольных растений, в 4—8 раз. И наоборот, восприимчивость листьев:
фасоли, содержавшихся перед инокуляцией вирусом некроза табака в усло-
виях высокой относительной влажности, была выше, чем восприимчивость
листьев, инкубировавшихся перед инокуляцией при низкой относительной
влажности [971, 972].
Условия питания растений
Условия питания растений оказывают сильное влияние па число местных
некрозов при заражении рядом вирусов, причем, как и следовало ожи-
дать, взаимодействия между различными питательными элементами доста-
266
Глава XII
точно сложны. Так, Боудэн и Кассанис [104] исследовали влияние различ-
ных концентраций азота, фосфора и калия на восприимчивость растений та-
бака и N. glutinosa к заражению различными штаммами ВТМ. Исследованные
варианты удобрений оказывали заметное влияние на рост растений и на их
восприимчивость к заражению. В общем восприимчивость была наивысшей
при наиболее благоприятных условиях питания. Данных, которые бы сви-
детельствовали о влиянии на повышение восприимчивости какого-либо опре-
деленного компонента, получено не было. Заметную роль играет при этом
соотношение различных питательных веществ, причем действие добавочного
количества одного из компонентов сильно зависит от наличия других. Напри-
мер, в присутствии достаточного количества доступного фосфора добавление
азота улучшает рост и повышает восприимчивость растений к вирусной
инфекции, но при недостатке фосфора добавление такого же количества
азота приводит к подавлению как роста, так и восприимчивости к зараже-
нию. Баланс питательных веществ оказывал сильное влияние на число
местных поражений, вызываемых вирусом огуречной мозаики на листьях
Chenopodium, amaranticolor [528].
Время суток
Поскольку многие важные физиологические процессы в листьях подчи-
няются суточным ритмам, не удивительно, что и восприимчивость растений
к заражению вирусами, передающимися механическими способами, также
различна в зависимости от времени суток. Эффективность инокуляции дости-
гает максимума к полудню, а затем в течение ночи снижается до минимума,
который обычно достигается перед самым рассветом (фиг. 48).
Суточные колебания восприимчивости обнаружены при исследовании
различных сочетаний вирус — растение-хозяин (например, ВТМ — расте-
ние фасоли [762], вирус некротического пожелтения салата-латука — расте-
ния N. glutinosa [420]) и, вероятно, представляют собой общее явление. Воз-
можно, что степень суточных изменений восприимчивости растений к вирус-
ной инфекции зависит от многих факторов, однако эти факторы еще недоста-
точно хорошо изучены. Так, суточные изменения восприимчивости расте-
ний N. glutinosa к ВТМ наиболее четко выражены в молодых листьях [1171].
Вероятно, свет представляет собой более важный фактор, влияющий па суточ-
ные изменения восприимчивости, чем температура, однако эксперименталь-
ных доказательств этого еще недостаточно.
Время инокуляции
Фиг. 48. Влияние времени дня, в которое проводилась инокуляция, на число местных
поражений, возникающих на листьях фасоли при заражении вирусом некроза таба-
ка [1172].
Log R характеризует отношение числа некрозов, образующихся на листьях опытных растений, к числу
некрозов, образующихся на листьях контрольных растений, инокулированных в 8 часов утра. Отре-
зок А, представляет собой величину достоверного различия между любыми двумя точками прир = 1%.
Факторы, влияющие на течение и характер инфекции
267
Изменения в самом листе, приводящие к суточным колебаниям вос-
приимчивости, имеют, по всей вероятности, биохимическую природу и пе
связаны с физическим изменением чувствительности листовой поверхности
к повреждению. Однако нельзя исключит!, возможности того, что определен-
ную роль в суточных колебаниях восприимчивости играют небольшие изме-
нения тургора клеток листа. Поскольку суточному ритму подчиняются очень
многие процессы в листе, нелегко идентифицировать процесс(ы) или факто-
рны), непосредственно влияющие па эффективность вирусной инфекции.
Проблема осложняется еще и тем, что суточные колебания восприимчиво-
сти не зависят непосредственно от изменений окружающих условий, ио ана-
логично некоторым другим физиологическим процессам в листьях как бы
«заложены» в них. Так, если растения фасоли затемнить в 4 часа дня и оставить
затем в темноте в течение следующего дня, суточный цикл восприимчивости
этих растений к заражению оказывается аналогичным циклу растений, нахо-
дящихся в нормальных условиях освещения [1172].
Время года
В областях, характеризующихся значительными сезонными колеба-
ниями климатических условий, восприимчивость растений к вирусам замет-
но изменяется в зависимости от времени года. Например, некоторые сорта
фасоли (Phaseolus vulgaris), выращиваемые иа Ротамстедской станции (Анг-
лия), летом иммунпы к вирусу огуречной мозаики, а зимой этот вирус вызы-
вает у них образование многочисленных местных некрозов [195]. Аналогич-
ные, по менее выраженные различия описаны при работе с другими виру-
сами, вызывающими местные поражения. Боудэн и Робертс [127] показали,
что типичную зимнюю реакцию растений на заражение вирусом можно
вызвать искусственно, путем затемнения растения; это дает основания пред-
полагать, что основным фактором, изменяющим восприимчивость растений,
выращиваемых в теплице, является свет. Воздействие кратковременных
изменений окружающей среды на восприимчивость растений может привести
к различным результатам в разное время года. Так, Хитчбори [795] обна-
ружил, что выращивание растений фасоли в темноте в течение 1—4 дней
до инокуляции повышает их восприимчивость к вирусу некроза табака
летом и понижает ее зимой.
Загрязнение воздуха
Некоторые вещества, загрязняющие воздух, могут усиливать рост расте-
ний. Трешоу [1792] показал, что окуривание растений парами фтора при
некоторых контролируемых условиях увеличивает число местных некрозов,
вызываемых обычным штаммом ВТМ. По-видимому, этот эффект связан со
стимуляцией роста растений.
Факторы, влияющие на размножение вируса и степень
проявления заболевания
Свет
Влияние интенсивности и продолжительности освещения иа размноже-
ние вируса и степень проявления заболевания может быть различным для
разных вирусов, однако обычно высокая интенсивность света и длинный
световой день благоприятствуют размножению [72, 1354, 1355, 1733].
Затемнение растений Gomphrena globosa, зараженных Х-вирусом карто-
феля, сразу же после инокуляции снижало число образующихся местных
268
Глава XII
некрозов, но не подавляло размножения вируса [836]. Так, содержание
инфекционного вируса в листьях растений, которые после инокуляции поме-
стили на 8 дней в темноту, было в 2—3 раза выше, чем в листьях растений,
выращиваемых на свету, хотя на затемненных листьях местные некрозы не
возникали. Было обнаружено, что в затемненных листьях вирус мигрирует
из места инокуляции в другие участки. На листьях, отделенных от растения
и инкубировавшихся в темноте на среде с глюкозой, развивалось больше
местных поражений, чем на листьях растений, выращивавшихся после
инокуляции на свету и без глюкозы. Таким образом, в данной системе виру-
су для образования местных поражений необходима глюкоза или какое-
либо производное глюкозы, хотя для размножения вируса они не нужны.
С увеличением содержания в среде глюкозы титр инфекционного вируса
в затемненных листьях уменьшался. С другой стороны, присутствие различ-
ных сахаров в среде повышало содержание инфекционного вируса в отде-
ленных листьях растений табака, зараженных ВТМ [929].
Как показали эксперименты с тканевыми культурами каллюса табака,
фитохромная система может оказывать некоторое влияние на размножение
вируса кольцевой пятнистости табака [1419]. Ежедневное воздействие на
зараженные культуры красного света в течение 5 мин, проводимое на протя-
жении 2 иед, повышало содержание вируса на 50% по сравнению с культу-
рами, выращиваемыми в темноте. Дополнительное ежедневное воздействие
красного света в течение 5 мин предотвращало это повышение содержания
вируса в тканях. Облучение растений синим светом как до, так и после иноку-
ляции приводило к повышению содержания Х-вируса картофеля в тканях
зараженных растений N. tabacum и вируса мозаики люцерны — в тканях
N. clevelandii [335]. На основе экспериментов по влиянию распыленных рас-
творов сахаров на листья сахарной свеклы было высказано предположение,
что воздействие света на проявление симптомов желтухи сахарной свеклы свя-
зано с изменением содержания углеводов в зараженных листьях [1871].
Симптомы заболевания были более отчетливо выражены у растений, листья
которых ежедневно опрыскивали 10%-ным раствором сахарозы. Высокая
интенсивность света подавляет образование опухолей на стеблях и корнях
растений какао, зараженных вирусом деформации побегов дерева какао
[38]. В Гане, где деревья какао часто бывают затенены другими высокими
деревьями, болезнь эта проявляется в общем значительно сильнее, чем
в Нигерии, где деревья какао получают больше света.
Температура
Интенсивность размножения вирусов и скорость их распространения
по растению обычно увеличиваются, когда температура превышает уровень,
оптимальный для роста растений. Однако, как и в случае других биологи-
ческих явлений, существует некий уровень температур, при котором наблю-
дается подавление размножения вируса.
Температура может также оказывать влияние на скорость передвиже-
ния вируса из первично инокулированных эпидермальных клеток и на успеш-
ность заражения клеток мезофилла. Используя тот факт, что облучение
ультрафиолетом инактивирует вирус главным образом в клетках эпидермиса,
Харрисон [715] показал, что время, необходимое для перемещения вируса
некроза табака из эпидермиса в мезофилл, составляет в среднем 30 ч при
10 °C и 6 ч при 22 °C. При температурах выше 22 °C не наблюдалось замет-
ного увеличения скорости перемещения. С помощью более прямого метода
отделения эпидермиса листа на различных стадиях заражения было пока-
зано, что скорость распространения вируса огуречной мозаики из эпидермиса
листа растений коровьего гороха (Vigna sinensis) в клетки мезофилла возра-
Факторы, влияющие на течение и характер инфекции
269
Фиг. 49. Влияние температуры на
размножение ВТМ (типичный штамм)
в дисках, вырозаппых из листьев
табака [1056].
Концентрация вируса измерялась серо-
логическим методом.
стает с повышением температуры в интервале от 16 до 28 °C [1892]. Однако
максимальное количество поражений образуется при 20 °C.
После достижения максимума концентрация ВТМ в листьях растений
табака может либо сохраниться на том же уровне, либо заметно снизиться,
причем степень снижения зависит от температуры, при которой выращивают
растения [80, 1056] (фиг. 49).
В экспериментах, представленных на фиг. 49, оптимальная температура
(при которой концентрация вируса была наивысшей) составляла около 24 °C.
При более высокой температуре после достижения максимума содержание
вируса снижалось. При 34 °C и выше вирус образуется в очень небольших
количествах. Некоторые штаммы вируса, однако, размножаются достаточно
хорошо и при 36 °C (гл. ХШ). Вирус погремковости табака размножается
в растениях табака с наибольшей скоростью при 18—22 °C. Если заражен-
ные растения выращивали при 26 °C, то наблюдалось значительное сниже-
ние количества вирусных частиц, которые можно было выделить из листьев
в момент максимального накопления вируса [567]. Иногда предлагают раз-
делять вирусы на две группы по их реакции на действие температуры. К пер-
вой группе относят вирусы, которые, подобно ВТМ, X- и У-вирусам карто-
феля и вирусу бронзовости томатов, могут размножаться при повышении
температуры вплоть до 36 °C; ко второй группе относят вирусы, которые,
подобно вирусу некроза табака и вирусу кустистой карликовости томатов,
не размножаются при 36 °C. Однако влияние изменений температуры на
интенсивность размножения вируса может быть различным в зависимости
•от вида растения, штамма вируса и возраста листа, в котором происходит
размножение вируса.
Повышение температуры до определенного уровня увеличивает ско-
рость системного распространения вируса и сокращает время между иноку-
ляцией и появлением первых симптомов заболевания. При этом самый
короткий инкубационный период, предшествующий системному распростра-
нению вируса, не всегда наблюдается при температуре, наиболее благоприят-
ной для размножения вируса.
270
Глава XII
У растений, выращиваемых при различных температурах, иногда
наблюдается корреляция между степенью проявления симптомов заболевания
и концентрацией вируса. Подобная корреляция четко выражена в интервале'
температур от 16 до 28 °C при заражении растений табака ВТМ или Х-виру-
сом картофеля [79, 1356]. С другой стороны, наиболее тяжелое заболевание-
растений, инфицированных вирусом броизовости томатов, развивается при
36 °C, однако для максимального накопления вируса необходимы более
низкие температуры [930].
Изменение температуры может вызывать резкие изменения симптомов-
заболевания. Нередко при повышении температуры симптомы заболевания
па молодых побегах становятся выражены слабее, вплоть до полной маски-
ровки (см., например, [529]). Однако влияние температуры может быть самым
различным в зависимости от данного сочетания вируса и растения-хозяина.
Четкие изменения симптомов в зависимости от температуры наблюдаются
при заражении ВТМ растений N. glutinosa. При 20 °C на листьях растений,
зараженных ВТМ, появляются местные некрозы и вирус накапливается
только в этих участках. Если растения выращивать при 36 °C, появляются
желтоватые местные некрозы, вслед за чем развивается системная мозаичная
крапчатость [1481]. Если затем эти мозаичные растения вновь перенести
в прежние условия (20°), то они погибают от системного пекротического-
заболевания в течение примерно 24 ч [928].
Средняя длина частиц некоторых вирусов зависит от температуры, при
которой выращиваются растения. Так, родственный ВТМ штамм вируса
пролиферирующей мозаики лобии образует при 20 °C (но не при 32 °C)’
много коротких дефектных частиц [943].
В ряде случаев изменение температуры может приводить к избиратель-
ному размножению штаммов, приспособленных к этой температуре
(гл. XIII). Возможные механизмы тепловой инактивации вирусов in vivo-
обсуждаются в гл. XIV, а практическое приложение методов тепловой тера-
пии — в гл. XVIII.
Водный режим и влажности
Влияние водного режима на размножение вируса изучено еще пока недо-
статочно. В общем в условиях хронического дефицита воды у растений с за-
держанным ростом наблюдаются менее выраженные симптомы заболевания
типа мозаик. Высокая влажность приводит к появлению на листьях томатов,
зараженных ВТМ, тяжелых симптомов полосатости [1525]. При умеренном-
снабжении почвы водой повышается частота заболевания среди инфицирован-
ных ВТМ растений томатов, которое выражается в коричневой пигментации
внутренних тканей плодов [235].
Условия питания растений
Был проведен ряд исследований с целью выяснить влияние условий
питания растений на размножение вирусов (главным образом ВТМ) в ра-
стениях табака. Полученные результаты нередко противоречивы, что, воз-
можно, связано с различными методами выращивания растений, использо-
ванием различных штаммов вируса, применением удобрений, эффективность
которых различна, с различными методами выявления вируса, а также раз-
личными подходами к интерпретации результатов. Максимальное размно-
жение вируса наблюдается обычно при наилучших условиях питания расте-
ния. Так, Боудэн и Кассанис [104] пришли к выводу, что действие азота
и фосфора на размножение ВТМ хорошо коррелирует, с влиянием этих
веществ иа рост растений. Условия питания, благоприятно сказывающиеся
Факторы, влияющие на течение и характер инфекции
271
иа росте растений, способствуют и повышению концентрации вируса как
в расчете на единицу сырой массы, так и в расчете на целое растение; к анало-
гичным заключениям пришли и другие авторы [359, 1074, 1357, 1881].
Влияние микроэлементов (цинка, молибдена, магния, железа, брома
и меди) па размножение вирусов в том или ином растении-хозяине оказалось
различным [525, 763, 1342, 1358, 1488, 1559, 1891]; нередко они оказывают
на вирус такое же действие, как и на рост растений, хотя имеются и неко-
торые исключения. Так, например, недостаток магния способствует повы-
шению концентрации ВТМ в листьях зараженных растений. Биохимиче-
ская природа такого рода явлений до сих пор не ясна.
Время года
На рост растений в течение года влияет целый комплекс факторов, в том;
числе продолжительность дня, интенсивность света, температура почвы
и воздуха и водный режим. Колебания этих факторов в течение года влияют
также на размножение вируса и па степень проявления вызываемого им
заболевания. Симптомы заболевания, вызываемые некоторыми вирусами,,
такими, как вирус скручивания листьев картофеля или вирус желтухи сахар-
ной свеклы, в летний период проявляются более отчетливо, чем зимой.
Другие вирусы вызывают более серьезные симптомы зимой. В Англии вирус
ксантозиса земляники (yellow edge virus in strawberries) вызывает наиболее
отчетливые симптомы весной и осенью, что определяется, очевидно, сочета-
нием достаточной влажности почвы и температуры воздуха выше 16 °C.
[974].
СМЕШАННОЕ ЗАРАЖЕНИЕ
Для большинства вирусов характерна высокая частота мутаций, при-
водящих к возникновению новых штаммов. Присутствие мутантных штам-
мов может оказывать заметное влияние на проявление симптомов заболева-
ния (гл. IX). Скорость размножения вируса в том или ином растении-хозяине-
и характер развивающегося при этом заболевания иногда довольно сильно-
зависят от присутствия другого, неродственного вируса или каких-либо-
клеточных паразитов.
Взаимодействия между неродственными вирусами
Взаимодействие между вирусом некроза табака и вирусами-сателлитами,
которое обсуждалось в гл. VIII, представляет собой пример абсолютной
зависимости размножения одного неродственного вируса от другого. Из-
вестно много случаев взаимодействия неродственных вирусов, каждый из
которых способен самостоятельно заражать растение и размножаться в нем.
Присутствие неродственного вируса может уменьшать или увеличивать
число местных поражений, вызываемых другим вирусом; характер заболе-
вания, развивающегося в присутствии двух вирусов, может быть совершенно-
иным, чем при заражении одним из них; концентрация данного вируса может
увеличиваться или уменьшаться в присутствии другого. Как было показано-
в этой главе, многие факторы, действующие на растение, могут изменять
течение инфекции и характер заболевания. Поскольку самый факт вирусного-
заражения вносит глубокие изменения в течение физиологических процес-
сов в растении, не вызывает удивления, что заражение растения одним виру-
сом может влиять на заражение его другим вирусом. Однако сведения отно-
сительно механизмов этого взаимодействия в настоящее время очень огра-
272
Глава XII
ниченны. В этом разделе мы обсудим взаимодействие между неродственными
вирусами при заражении ими одних и тех же клеток и тканей. В клетках
растений, зараженных вирусами, не удалось найти вещества, аналогичного
«стимулонам», обнаруженным недавно в некоторых клетках животных, зара-
женных вирусами [355]. Явление приобретенной устойчивости к инфекции
в отсутствие инфекционного вируса обсуждается в последнем разделе этой
главы.
Влияние на число местных некрозов
В присутствии неродственного вируса число местных некрозов, вызы-
ваемых другим вирусом, иногда увеличивается, иногда уменьшается, а иногда
остается неизменным. Томсон [1762] изучил взаимодействие между парами
вирусов, образующих и не образующих местные некрозы, при инокуляции
растений смесью этих вирусов. Некоторые неродственные вирусы снижали
число местных некрозов примерно в той же степени, как и родственный
вирус при аналогичных условиях. Например, типичный штамм ВТМ снижал
число местных некрозов на половинке листа, вызываемых штаммом аукуба
ВТМ, со 108 до 9, а число поражений, вызываемых вирусом черной кольце-
вой пятнистости капусты,— с 38 до 3. В этих опытах в качестве инокулума
использовали экстракты больных листьев. Очищенные препараты ВТМ не
обладали таким ингибирующим действием; это свидетельствует о присутст-
вии в экстрактах зараженных листьев неких веществ невирусной природы,
которые способны подавлять размножение вирусов, не родственных ВТМ.
Томсон [1763] обнаружил, что при заражении листьев табака смесью
ВТМ и X- или Y-вируса картофеля поражения, вызываемые Х-вирусом,
были более многочисленны и некротизированы. В зависимости от условий
число их увеличивалось в 2—80 раз. Изменяя разведения и варьируя соот-
ношение двух вирусов в инокулуме, удалось установить [380], что стимуля-
ция образования местных некрозов, вызываемых Х-вирусом, зависит от
концентрации в инокулуме ВТМ, но не зависит от соотношения вирусов.
Нитзани и Села [1274] описали интерференцию между штаммом вируса
огуречной мозаики, образующим местные некрозы, и ВТМ. Интерференция
имела место в том случае, если вирус огуречной мозаики выполнял защит-
ную функцию в растениях N. glutinosa и N. repanda, а также если растения
Zinnia elegans Jacq. инокулировались сначала ВТМ. Интерференция не
наблюдалась при пользовании обычным штаммом вируса огуречной мозаики
или некоторыми другими вирусами.
Изменение симптомов заболевания
В ряде случаев при смешанном заражении растения двумя неродствен-
ными вирусами симптомы заболевания бывают выражены более четко, чем
при заражении каждым вирусом в отдельности. Классический пример та-
кого рода — смешанное заражение растений табака X- и У-вирусами карто-
феля, при котором развивается тяжелый некроз жилок, тогда как каждый
вирус в отдельности вызывает крапчатость листьев или слабое просветле-
ние жилок [1626]. При заражении многих разновидностей картофеля смесью
X- и У-вирусов развивается более тяжелая «морщинистая» мозаика, чем
при заражении каждым из этих вирусов в отдельности. Многие штаммы
ВТМ вызывают мозаичное заболевание растений томатов, но при заражении
смесью ВТМ и Х-вируса картофеля развиваются тяжелые симптомы полоса-
тости и растение обычно гибнет.
Факторы, влияющие на течение и характер инфекции 273
Влияние на концентрацию вирусов в растении
Хорошо известно, что два неродственных вируса могут одновременно
заражать одно и то же растение, однако детальных исследований относи-
тельно влияния одного вируса на концентрацию другого проводилось мало.
Как показывают полученные данные, некоторые вирусы взаимно антаго-
нистичны, тогда как в некоторых других сочетаниях один из вирусов при сме-
шанном заражении достигает больших концентраций, чем в случаях, когда
растение заражено им одним. Степень антагонизма или синергизма в зна-
чительной степени зависит от последовательности заражения растения раз-
ными вирусами. Боудэн и Кассанис [102] показали, что заражение растений
табака вирусом суровой гравировки предотвращает размножение в них
У-вируса картофеля или вируса 3 растений белены. В том случае, если ра-
стения ииокулировали одновременно двумя вирусами, вирус гравировки
табака подавлял развитие вируса-партнера.
С помощью световой микроскопии было показано [1133], что два нерод-
ственных вируса могут сосуществовать в одной и той же клетке. При сме-
шанном заражении в одних и тех же клетках были обнаружены цитоплазма-
тические включения, характерные для ВТМ, и внутриядерные включения,
характерные для вируса суровой гравировки табака. Фуисава и др. [574]
подошли к изучению взаимодействия между ВТМ и вирусом суровой гра-
вировки в растениях табака с цитологической стороны, используя для этого
электронный микроскоп. Эти два палочкообразных вируса образуют характер-
ные включения (фото 49 и 53). Авторы исследовали две группы растений.
У растений первой группы нижние листья ииокулировали одним вирусом
и неделей позже ииокулировали другим вирусом лист расположенного выше
яруса. Через месяц исследовали верхние молодхле листья, развившиеся
после инокуляции, у которых были сильно выражены симптомы заболева-
ния. Независимо от того, какой именно вирус использовали для первой ино-
куляции, в 90% клеток присутствовали включения, характерные как для
ВТМ, так и для вируса суровой гравировки; в некоторых клетках оба типа
включений были смешаны в цитоплазме, а примерно в 10% клеток были обна-
ружены только включения, характерные для ВТМ.
У растений второй группы нижний лист ииокулировали либо ВТМ, либо
вирусом гравировки. Через 15 дней молодые листья с отчетливыми симпто-
мами заболевания ииокулировали вторым вирусом. Затем листья собирали
через различные промежутки времени вплоть до 12-го дня после второй
инокуляции. В том случае, если растения сначала ииокулировали ВТМ,
в клетках встречались включения, характерные только для ВТМ. По-види-
мому, после заражения растения ВТМ размножение в нем вируса гравировки
становится невозможным. Если же растения ииокулировали сначала виру-
сом гравировки, около 80% клеток содержали включения, характерные
для вируса гравировки, в некоторых клетках обнаруживали только вклю-
чения ВТМ или оба типа включений (характерные для ВТМ и для вируса
гравировки табака). По мнению авторов [574], размножение ВТМ в отдель-
ных клетках возможно благодаря тому, что вирус гравировки табака ко
времени инокуляции ВТМ распространился не во все клетки листа. Таким
•образом, по-видимому, ВТМ и вирус гравировки табака способны размно-
жаться в одних и тех же клетках и заражать одно и то же растение, если
только один из вирусов не имел возможности ко времени инокуляции вто-
рым вирусом инфицировать большую часть клеток и достигнуть в них высо-
кой концентрации.
Отчетливо выраженное синергическое действие оказывает У-вирус кар-
тофеля на размножение Х-вируса картофеля в растениях табака. Ранние
работы с этой системой выявили различия между ипокулированными и си-
18— 0893
274
Глава XII
стемно инфицированными листьями. Обычно использовались штаммы двух
вирусов, вызывающие в условиях одиночной инфекции очень слабые симп-
томы. При инокуляции одновременно обоими штаммами симптомы появля-
лись, но были не очень сильно выражены. Такие листья содержали в два
раза больше Х-вируса, чем листья, зараженные только Х-вирусом, причем
этот эффект не зависел от порядка, в котором растения инокулировали этими
двумя вирусами. С другой стороны, на системно инфицированных листьях
симптомы заболевания были выражены в очень сильной степени; листья,
зараженные обоими вирусами в период быстрого роста, содержали в 10 раз
больше Х-вируса, чем аналогичные листья, зараженные одним вирусом;
очень четкий синергический эффект двойной инфекции наблюдали в тех
случаях, когда растения инокулировали одновременно обоими вирусами
или когда У-вирусом инокулировали растения, системно инфицированные
Х-вирусом [381, 1440. 1441, 1668].
Форд и Росс [527] обнаружили, что некоторое влияние на характер
взаимодействия между двумя вирусами оказывает возраст листа во время
инокуляции, однако это влияние было слишком незначительным, чтобы
объяснить различия, описанные выше. Было изучено влияние последова-
тельности заражения растений двумя вирусами на степень проявления синер-
гизма [430]. Полоску на одной поверхности листа инокулировали Х-виру-
сом, а полоску на другой поверхности — У-вирусом. При инокуляции одно-
временно двумя вирусами в участке ткани вдоль средней жилки развивалась
отчетливая синергическая реакция. Если же растения инокулировали виру-
сами в разное время, зона реакции определенным образом смещалась. Ре-
зультаты этих опытов позволяют считать, что основным условием для про-
явления отчетливого взаимодействия является заражение клеток сначала
У-вирусом, а затем Х-вирусом, причем заражение вторым вирусом следует
произвести в такое время, чтобы У-вирус еще продолжал активно размно-
жаться. Эта точка зрения была подтверждена опытами, в которых листья
инокулировали смесью вирусов, причем концентрация У-вируса была по-
стоянной, а концентрацию Х-вируса снижали вплоть до 1 : 1000. Оказалось,
что более выраженные симптомы заболевания развивались в том случае,
когда инокулум содержал Х-вирус в разведении 1 : 1000, а не в разведении
1 : 1 (фото 71). Размножение Х-вируса в этих листьях усиливалось не стоят,
сильно (всего примерно в 2,5 раза), как в системно инфицированных листьях
с менее выраженными симптомами заболевания, однако следует заметить,
что выводы, основанные иа определении содержания вируса в сильно некро-
тизированных тканях, могут быть ошибочными.
Форд и Росс [527] обнаружили, что на взаимодействие между X- и У-
вирусами картофеля влияет температура окружающей среды. Так, при
повышении температуры до 30 °C относительное увеличение концентрации
Х-вируса в присутствии У-вируса было больше. То же самое наблюдал
Клоуз [381] при 31 °C. При заражении только одним Х-вирусом этот вирус
не перемещался из инокулированных листьев в другие части растения, одна-
ко в присутствии У-вируса такое перемещение наблюдалось. В присутствии
некоторых других вирусов, способных размножаться и распространяться
по растению при 31 °C (например, ВТМ, вирус огуречной мозаики, вирус
мозаики белены) Х-вирус картофеля также приобретал способность рас-
пространяться по растению при этой температуре. Клоуз высказал предпо-
ложение, что влияние этих вирусов на Х-вирус состоит, возможно, в облег-
чении передвижения Х-вируса в растении.
Факторы, влияющие на течение и характер инфекции 275
Взаимодействие между вирусами и грибами
Влияние вирусной инфекции на заболевания,
вызываемые грибами
На основании полевых наблюдений был сделан вывод о том, что забо-
левание, вызываемое грибом Phytophthora infestans, развивается медленнее,
если растение заражено вирусами [1240]. Этот вывод был подтвержден лабо-
раторными опытами с X- и У-вирусами картофеля. Подавляющее действие
вирусной инфекции на грибное заболевание тем больше, чем сильнее выра-
жены симптомы вирусного заболевания; этот вывод сделан па основании
опытов с различными штаммами вирусов и сортами картофеля. Аналогич-
ные наблюдения были сделаны в полевых условиях [478].
Противоположные результаты были получены Шлёссером [1497], кото-
рый установил, что инфицирование сортов свеклы, устойчивых к грибу
Cercospora, вирусом желтухи свеклы значительно снижало их устойчивость
в полевых условиях.
Рассел [1464] показал, что растения сахарной свеклы, зараженные ви-
русом слабого пожелтения (mild yellowing), обладали повышенной устойчи-
чивостыо к грибу Alternaria в поле. Вирус желтухи сахарной свеклы подоб-
ным действием не обладал. Оказалось, что вирус слабого пожелтения увели-
чивал, а вирус желтухи свеклы снижал чувствительность растений сахарной
свеклы к другому виду патогенных грибов — Erisyphe polygoni. Растения,
зараженные обоими вирусами, обладали примерно такой же восприимчи-
востью к заражению этим грибом, как и здоровые растения. В зависимости
от генетической конституции растений-хозяев и условий окружающей среды
степень влияния вирусной инфекции на восприимчивость растений к гриб-
ным заболеваниям была несколько различной.
По-видимому, чаще всего вирусная инфекция повышает чувствитель-
ность растений к патогенным грибам (см., например, [509, 1037, 1272]). Пока-
зано, что изоляты некоторых грибов, поражающих яблони, растут лучше
на культуральных средах, содержащих экстракты тканей яблонь, заражен-
ных вирусами, чем в присутствии экстрактов тканей здоровых растений [10].
При некоторых сочетаниях вируса и гриба влияние экстрактов тканей зара-
женных вирусами яблонь на рост грибов оказывалось очеш> значительным.
Вещества, оказывающие подобное действие, идентифицированы не были.
В почве, содержащей эксудаты гипокотилей растений фасоли, заражен-
ных вирусом некроза табака, эффективность прорастания хламидоспор
гриба Fusarium solani была на 50% выше, чем в почве, на которой росли
здоровые растения [1509].
Влияние грибной инфекции на восприимчивость к вирусам
Зараженность растений грибами, вызывающими ржавчину, может зна-
чительно повысить их восприимчивость к некоторым вирусам [1953, 1958].
Так, сначала половину листа фасоли сорта Пинто инокулировали грибом
Uromyces phaseoli на стадии уредоспор, а затем всю поверхность листа ипоку-
лировали ВТМ. Как показали измерения, такие листья содержат в 1000 раз
больше вируса, чем листья, не зараженные грибом. При заражении ржав-
чинными грибами развитие видимых некрозов частично подавляется. Это1
обстоятельство не позволяет установить, объясняется ли повышение кон-
центрации вируса в тканях растений, инфицированных грибами, большим
числом участков, через которые вирус проникает в клетку, или усилением
размножения вируса, или же обоими этими факторами одновременно. Ста-
рые листья, инфицированные ржавчинными грибами, оставались восприим-
18*
276
Глава XII
чивыми к вирусной инфекции, тогда как здоровые листья такого возраста
становились устойчивыми к ней. Зараженность двумя другими патогенными
грибами — Erysiphe и Colleotrichum — не стимулировала размножение ви-
русов. Джилл [632] обнаружил аналогичное влияние зараженности грибами
рода Uromyces на размножение некоторых других вирусов в растениях фасо-
ли. Такое же явление наблюдалось при размножении некоторых вирусов
в растениях подсолнечника (Helianthus annuus), зараженных грибами из
рода Puccinia. Концентрация вируса в листьях продолжала увеличиваться
после того, как гриб убивали с помощью тепловой терапии; это свидетель-
ствует о том, что вирус размножается не в мицелии гриба. Далее было обна-
ружено [633], что промежуток времени между инокуляцией растений спо-
рами гриба и ВТМ влияет на появление некрозов, вызываемых вирусом.
Если растения ииокулировали вирусом в течение первых 16 ч после иноку-
ляции спорами гриба, развивались некрозы, вызываемые ВТМ, и число их
было больше, чем на листьях контрольных растений. Если же растения иноку
лировали вирусом через 26 ч или более после инокуляции спорами гриба,
развитие некрозов подавлялось, однако размножение вируса все-таки уси-
ливалось.
Другие виды грибов могут индуцировать в растении истинную или
кажущуюся устойчивость к вирусной инфекции. Так, на растениях табака
сорта Ксанти, в стебель которых вводили суспензию спор гриба Регопо-
spora tabacina Adam., образовывалось меньше по сравнению с контролем
местных некрозов, если растения ииокулировали ВТМ через 3 нед после
заражения спорами гриба; образующиеся некрозы были мельче, чем на
контрольных растениях [1141]. Гриб Thielaviopsis basicola вызывает местные
некрозы у растений табака. Хехт и Батеман [753] обнаружили, что при зара-
жении нижних листьев растений табака этим грибом верхние листья при-
обретают устойчивость к вирусу некроза табака и к ВТМ (об устойчивости
судили по размеру местных некрозов, вызываемых вирусами). Быть может,
размер видимых поражений и их число нельзя считать достаточным крите-
рием для оценки изменения устойчивости растений к вирусной инфекции,
так как в приведенной выше работе при заражении растений фасоли ржав-
чинными грибами размножение вируса резко усиливалось, тогда как обра-
зование некротических поражений было полностью подавлено.
Показано, что экстракты из пораженных участков (а также из тканей,
окружающих эти участки) листьев растений картофеля, зараженных гри-
бом Phytophthora infestans, подавляют размножение Х-вируса картофеля
[805].
ПРИОБРЕТЕННАЯ УСТОЙЧИВОСТЬ К ИНФЕКЦИИ
У высших животных в процессе выздоровления от вирусного заболева-
ния и последующего приобретения более или менее длительного иммунитета
к повторному заражению участвуют, по-видимому, два защитных меха-
низма. На ранней стадии инфекции в зараженной клетке индуцируется
синтез белка с небольшой молекулярной массой, способного подавлять раз-
множение вируса. Этот белок, известный под названием интерферона, коди-
руется геномом клетки, а не является вирусоспецифичным; он синтези-
руется в первые несколько дней после инфекции. На более поздних стадиях
инфекции происходит синтез антител, специфичных в отношении инфицирую-
щего вируса. Именно антитела играют роль в процессе выздоровления и сооб-
щают организму иммунитет к повторной инфекции этим же вирусом (гл. XV).
Результаты недавних исследований с различными сочетаниями растений-
хозяев и вирусов, вызывающих развитие местных некрозов, свидетельствуют
Факторы, влияющие на течение и характер инфекции
277
о способности некоторых растений синтезировать какие-то вещества, по-
давляющие размножение вируса; эти вещества по некоторым свойствам
напоминают интерферон, синтезирующийся в зараженных вирусами живот-
ных клетках. Однако защитные механизмы, аналогичные синтезу антител
в клетках животных, у растений неизвестны. Это обстоятельство может быть
одной из главных причин, обусловливающих присутствие активного вируса
в растении до конца жизни последнего, тогда как при многих вирусных ин-
фекциях животных активный вирус с выздоровлением исчезает.
Растения могут приобретать устойчивость к повторному заражению
тем же самым вирусом или родственными ему штаммами двумя путями.
В одном случае вирус может присутствовать в большинстве органов растения,
и при этом растение оказывается устойчивым к инфекции родственными штам-
мами вируса. Это явление носит название «нестерильной приобретенной
устойчивости» и обсуждается в гл. ХШ. Для другого типа приобретенной
устойчивости, обсуждаемого в настоящем разделе, характерно, что в то
время, как одни участки растения инфицируются вирусом, другие участки,
более или менее удаленные от тканей, содержащих вирус, приобретают
устойчивость к заражению тем же вирусом, родственными ему штаммами,
а в ряде случаев — и к заражению неродственными вирусами. Это явление
может бытг, названо «стерильной приобретенной устойчивостью».
Ярвуд [1955, 1962] описал следующее явление: если листья растений
фасоли, ипокулироваппые ВТМ, через 3 дня вновь ииокулировать этим
вирусом, то местные некрозы развиваются при этом на некотором расстоя-
нии от участка первой инокуляции. Этот тип приобретенной устойчивости
исследовался главным образом Россом с сотрудниками [1089, 1092, 1445,
1446] при заражении ВТМ растений табака сорта Самсун NN (местные не-
крозы) и при заражении растений фасоли сорта Пинто вирусом некроза
табака. В опытах с растениями табака нижние листья инокулировали ВТМ,
а спустя несколько дней те же листья или листья верхнего яруса вновь
инокулировали этим вирусом. О степени приобретенной устойчивости судили
по уменыпеиию диаметра некрозов (в случае некоторых вирусов — также
по уменьшению числа местных некрозов). В опытах с растениями фасоли
инокулировали один первичный лист, спустя несколько дней инокулирова-
ли супротивный лист.
Росс [1445] показал, что в зоне диаметром 1—2 мм вокруг местных не-
крозов, вызванных ВТМ на листьях табака сорта Самсун NN, развивалась
высокая устойчивость к ВТМ (фото 72, А). Площадь зоны и степень ее
устойчивости к ВТМ увеличивались в течение шести дней после инокуляции.
Наивысшая устойчивость развивалась у растений, выращиваемых при 20—
24 °C; при 30 °C приобретенной устойчивости не наблюдалось. При зараже-
нии листьев растений табака Х-вирусом картофеля зоны, устойчивые к ВТМ,
не развивались. Однако возникающая таким образом устойчивость не спе-
цифична в отношении вируса. Так, зоны вокруг местных некрозов, образуе-
мых ВТМ, оказались устойчивыми к вирусу некроза табака и к некоторым
другим вирусам, но не к вирусу мозаики турнепса.
Наибольший интерес представляют собой зоны устойчивости, возни-
кающие на некотором расстоянии от места инокуляции [1446] (фото 72),
Устойчивость развивалась не только в иеинокулированной части иноку-
лированного листа, но также и в других листьях растения. Размер возни-
кающих при этом некрозов составлял примерно от одной пятой до одной
трети диаметра некрозов на контрольных листьях, однако число поражений
на листьях растений табака Самсун NN, инокулированных ВТМ, не сни-
жалось. Устойчивость в заметной степени развивалась через 2—3 дня, до-
стигала максимума к 7-му дню и сохранялась до 20-го дня после инокуляции.
Листья, в которых развивалась устойчивость, были свободны от вируса
278
Глава XII
Фиг. 50. Системная приобретенная
устойчивость, развивающаяся в одном
из первичных листьев Phaseolus vulgaris
в результате инокуляции противолежа-
щего первичного листа вирусом южной
мозаики фасоли [1477].
Группы неинфицированных листьев инокули-
ровали вирусом через различные интервалы
после инокуляции противолежащих листьев.
Диаметр местных некрозов (II) и общая пло-
щадь некрозов (III) в первоначально неинфи-
цированных листьях начинали уменьшаться
через 3 дня после первой инокуляции, но число
некрозов (I) не снижалось до тех пор, пока
интервал между двумя инокуляциями не уве-
личивался до 8 дней. Листья контрольных
растений натирали буферным раствором.
перед второй инокуляцией. Таких условий, при которых развивалась бы
абсолютная устойчивость, найдено не было. При температуре 30 °C разви-
тия приобретенной устойчивости не наблюдалось. Устойчивость не разви-
валась ни в результате механических или химических повреждений, вызы-
вающих гибель клеток, ни в результате заражения вирусами, не вызываю-
щими местной некротической реакции.
Устойчивость, индуцированная ВТМ, не была специфична только для
этого вируса, а распространялась также на вирус некроза табака и неко-
торые другие вирусы. Аналогичная неспецифичность приобретенной устой-
чивости, развивающейся в результате образования местных некрозов, на-
блюдалась и при заражении растений фасоли и коровьего гороха (Vigna sinen-
sis Endl. [1447]). Лёбенштейн [1086] обнаружил явление системной приобре-
тенной устойчивости, развивающейся вслед за местной некротической реак-
цией у растений Datura stramonium L., инокулированных ВТМ, и растений
Gomphrena globosa, инокулированных Х-вирусом картофеля. В обеих систе-
мах отмечалось заметное снижение числа некрозов и их размеров при ино-
куляции неинфицированных листьев тем же самым вирусом. Экстракты
из тканей растений дурмана, обладающих приобретенной устойчивостью,
снижали инфекционность препаратов ВТМ в большей степени, чем экстракты
из тканей контрольных растений.
Росс [1447] пришел к выводу, что влияние первичной инокуляции на
число местных некрозов проявляется позднее и степень этого влияния варьи-
рует в широких пределах. На фиг. 50 показана зависимость между разви-
тием системной приобретенной устойчивости и изменением числа и величины
некрозов от времени, прошедшего после первой инокуляции.
По мнению Росса, снижение числа местных некрозов просто означает,
что в листьях с высокой степенью приобретенной устойчивости размеры
некрозов столь малы, что их трудно заметить и они не учитываются.
Развитие системной приобретенной устойчивости, как полагают, связано
с распространением по тканям зараженных растений какого-то вещества
или веществ. Росс [1447] представил веские доказательства в пользу пред-
положения о распространении по тканям вещества, ответственного за раз-
витие приобретенной устойчивости. Так, если среднюю жилку верхнего
листа растения табака перерезали, то в части листовой пластинки, располо-
Факторы, влияющие на течение и характер инфекции
279
женной за срезом, устойчивость не возникала. Если участок черешка иноку-
лированного листа обрабатывали кипящей водой, это приводило к гибели
части тканей черешка в обработанном участке; при этом лист сохранял нор-
мальный тургор, однако устойчивость в других листьях не развивалась.
Результаты ряда экспериментов показали, что в достаточно развитых расте-
ниях табака вещество, ответственное за развитие устойчивости, переме-
щается одинаково хорошо как вверх, так и вниз по стеблю.
Известно, что вокруг местных некрозов накапливаются различные
метоболиты, однако, как показали Бозарт и Росс [235], маловероятно, что
возникновение устойчивости в неинокулированных листьях связано со сни-
жением концентрации метаболитов, необходимых для репродукции вируса.
Авторы ииокулировали очень молодые листья растений табака, спустя
7 дней удаляли инокулированные листья, а спустя 18—25 дней инокулиро-
вали образовавшиеся за это время молодые листья. Оказалось, что вновь
образовавшиеся листья обладали устойчивостью к вирусной инфекции.
Результаты экспериментов, в которых изучалась временная зависимость
между размножением вируса и разрастанием некроза, привели Росса [1447]
к выводу, что системная приобретенная устойчивость является результатом
усиления механизма, который обычно действует в здоровых растениях, отзы-
вающихся местной некротической реакцией, и ограничивает размер местных
некрозов в этих растениях. Села и Эппльбаум [1521] адсорбировали вирус
из экстрактов инфицированных растений на геле фосфата кальция. При
смешивании полученных таким образом неинфекционных растворов с вирус-
ным инокулумом число образующихся местных некрозов снижалось. Кон-
трольный материал, обработанный аналогичным образом, таким действием
не обладал. Фактор, снижающий инфекционность вирусных препаратов,
обнаружен в листьях растений, зараженных ВТМ и У-вирусом картофеля,
а также в неинфицированных верхних листьях растений N. glutinosa, нижние
листья которых были инокулированы ВТМ. Как показано в опытах с груп-
пой растений-хозяев и различных вирусов, обнаруженный фактор не обла-
дал заметной специфичностью. Села и др. [1522—1524] изучили более де-
тально свойства обнаруженного ингибитора и пришли к выводу, что он
представляет собой некую фракцию РНК. Однако этот вывод требует до-
полнительных доказательств, так как представленный авторами спектр
поглощения этого вещества в ультрафиолете не типичен для РНК. Лёбен-
штейн и др. [1092] показали, что фактор устойчивости, индуцируемый ВТМ
и вирусом некроза табака в листьях растения Datura stramonium, обладает
следующими свойствами, свидетельствующими о его возможной белковой
природе: 1) разрушается при нагревании до 78 °C в течение 15 мин, но не
при 68 °C; 2) активность его снижается в результате обработки трипсином;
3) он не проходит сквозь полупроницаемые мембраны и не разрушается
в результате диализа; 4) его молекулярная масса равна 20 000—30 000.
Результаты описанных выше экспериментов приводят к выводу, что
развитие местной некротической реакции необходимо для возникновения
приобретенной устойчивости. Однако Лёбенштейн [1085] показал, что частич-
ная устойчивость может развиться в результате инокуляции листьев натив-
ным структурным белком вирусных частиц. Так, чувствительность верхних
листьев растений N. glutinosa ж D. stramonium к вирусу некроза табака сни-
жается в результате инокуляции нижних листьев структурным белком ВТМ.
Инокуляция белком ВТМ была эффективна при заражении верхних листьев
через 4 дня после инокуляции нижних листьев, но не через 1 день или менее.
В отличие от этого некоторые белки невирусной природы, в частности белок
снятого молока, непосредственно подавляли заражение ВТМ, если листья
ииокулировали вирусом вскоре после инокуляции белком, 1 но не позже;
системная устойчивость при этом не развивалась. Приобретенная устойчи-
280 Глава XII
вость, развивающаяся в результате инокуляции растений вирусным струк-
турным белком, не обладала абсолютной специфичностью в отношении инфи-
цирующего вируса. Неизвестно, лежит ли в основе приобретенной устойчи-
вости этого типа тот же механизм, который определяет возникновение устой-
чивости при заражении вирусами, вызывающими местную некротическую
реакцию. Лёбенштейн и др. [1093] обнаружили, что инъекция актиномицина
D в соответствующий момент частично или полностью подавляла развитие
локализованной приобретенной устойчивости в листьях растений табака,
зараженных ВТМ. Авторы на основании этих данных сделали вывод, чти
для синтеза вещества, ответственного за развитие устойчивости, необходим
процесс транскрипции клеточной ДНК. Однако ван Луп показал, что иа
число местных поражений может влиять маннит, содержащийся в препаратах
актиномицина D, которые использовали Лёбенштейн с сотрудниками. Таким
образом, необходимо повторить эти эксперименты, либо используя чистый
актиномицин D, либо включив в них контрольные варианты с маннитом.
Томас и Фултон [1760] обратили внимание на некоторое сходство между
системной приобретенной устойчивостью растений табака сорта Т. 1.787
к ВТМ и генетической устойчивостью к ВТМ растений табака сорта Т. 1.245.
Различные воздействия, успешно индуцировавшие развитие системной' при-
обретенной устойчивости в растениях сорта Т.1.787, не повышали устойчи-
вости сорта Т. 1.245.
ГЛАВА XIII
ИЗМЕНЧИВОСТЬ
Как и все живое, вирусы в процессе репродукции дают потомство, подоб-
ное в основном родительским частицам; однако иногда в результате мутаций
могут появиться новые типы, или штаммы. Изучение вирусных штаммов
представляет собой один из наиболее интересных и важных аспектов виру-
сологии. Результаты анализа мутантов ВТМ, полученных путем химического
мутагенеза, внесли существенный вклад в наши представления о природе
и универсальности генетического кода. Существование разных штаммов
одного и того же вируса, вызывающих у растений в полевых условиях раз-
личные типы болезни, представляет большой практический интерес для
фитопатолога.
ВЫДЕЛЕНИЕ ШТАММОВ
Принимая во внимание приводимые ниже данные о частоте мутаций
вирусов, следует признать маловероятным, чтобы та или иная вирусная
культура могла содержать частицы только одного штамма. Даже в процессе
развития одного местного некроза может возникнуть много мутантных частиц
(хотя подавляющее большинство частиц обычно принадлежит к одному
штамму). Разнообразные химические и физические анализы, описанные ниже,
дают полезную информацию только потому, что современные методы не
выявляют тех штаммов, которые присутствуют в вирусном препарате в не-
большом количестве. Возникновение нового штамма устанавливается почти
всегда по его биологическим свойствам, обычно по характерным симптомам
заболевания у соответствующего растения-хозяина. Существует несколько’
способов получения новых штаммов вирусов.
Штаммы, возникающие естественным путем в некоторых
растениях-хозяевах
В природе различные штаммы вируса часто возникают либо в опреде-
ленных видах или разновидностях растений-хозяев, либо в особых условиях.
Возникшие новые штаммы можно поддерживать в определенных растениях-
хозяевах в теплице. Если мы располагаем соответствующим видом растений,
то изолят вируса, полученный в полевых условиях, следует несколько раз
пассировать через некроз. Цель этих пассажей состоит в том, чтобы по воз-
можности убедиться в том, что перед нами один штамм и что полученный
изолят свободен от примеси неродственных вирусов.
Выделение штаммов из системно инфицированных растений
У растения, системно инфицированного вирусами, часто встречаются
атипичные участки ткани, в которых содержатся штаммы вируса, отличаю-
щиеся от основного штамма данной культуры. Эти участки могут представ-
лять собой либо часть мозаичного рисунка (гл. IX), либо мелкие некрозы:
.282
Глава XIII
или желтые пятна на листе растения, системно инфицированного вирусом
(например, растения табака, инфицированные слабым крапчатым штаммом
Х-вируса картофеля). Если гомогенатом, приготовленным из ткани такого
участка, инокулировать здоровое растение, то можно выделить необычный
.штамм вируса.
Отбор новых штаммов путем заражения особых растений-хозяев
или изменения условий выращивания растений
Известны растения, в которых преимущественно репродуцируются опре-
деленные штаммы вируса (см. ниже). Такое растение-хозяин может быть
использовано для отбора некоторых штаммов. Различные вирусные штаммы
могут отличаться по степени репродукции и скорости распространения
в данном растении при различных температурах. Так, в целях получения
штамма ВТМ, обладающего способностью к наиболее эффективной репро-
дукции при 36 °C, Леберье и Хирт [1056] применили метод серийных пасса-
жей вируса на растениях табака в условиях постепенного повышения тем-
пературы.
Выделение искусственно индуцированных мутантов
Большинство работ по получению искусственных мутантов вирусов
растений проводилось с ВТМ. С целью выделения мутантов были исполь-
зованы растения-хозяева, реагирующие на инокуляцию всеми штаммами
появлением местных некрозов, как, например, N. glutinosa и N. tabacum,
сорт Ксанти. Были использованы также другие виды растений рода Ntco-
tiana, у которых обычно возникают системные мозаичные заболевания, а при
заражении некоторыми штаммами — местные некрозы. Один из обычных
методов выделения мутантов состоит в том, чтобы инокулировать растения,
реагирующие местными некрозами, при таких условиях, при которых боль-
шинство некрозов возникает в результате заражения одной вирусной ча-
стицей. Иногда мутанты вызывают местные некрозы, легко отличимые от
вызываемых обычным штаммом. Часто поражения, вызываемые новым штам-
мом, бывают меньше по размеру [1576]. Для выявления других различий
в характере симптомов болезни, вызываемых известным и мутантным штам-
мами, экстрактами ткани, полученной из местных поражений, вызываемых
мутантным штаммом, инокулировали растения, реагирующие системным
заболеванием. При этом мутантные штаммы можно идентифицировать по
характеру симптомов развивающегося заболевания.
Другой метод выделения мутантов и определения частоты мутаций со-
стоит в инокуляции родительским штаммом вируса растений, которые реа-
гируют системным заболеванием без некрозов или каких-либо других явных
местных поражений. В этом случае можно выявить мутанты, вызывающие
некрозы, желтые пятна или другие характерные местные поражения в ипоку-
лированном растении. Этот прием позволяет отбирать мутанты, принадле-
жащие к определенному классу, причем в ряде случаев бывает трудно даже
с помощью повторных пассажей материала, выделенного из отдельного мест-
ного поражения, получить изолят, свободный от примеси родительского
штамма (фото 73).
По-видимому, более надежный способ выделения мутантного штамма
из смеси состоит в инокуляции вирусом крупных листовых дисков с после-
дующей инкубацией их в чашках до появления некрозов [905]. Причина
эффективности этого метода неясна; возможно, здесь играет определенную
роль то обстоятельство, что в крупных листовых дисках размножение вируса
идет быстрее.
Изменчивость
283
Описанные методы могут быть использованы для количественной оценки
мутагенного действия на вирус того или иного агента. Можно, однако, воз-
разить, сославшись на то, что различные штаммы, уже присутствующие
в вирусных препаратах, обладают различной чувствительностью к инакти-
вирующему действию исследуемого мутагенного агента; та или иная обра-
ботка может инактивировать родительский штамм в большей степени, чем
спонтанные мутанты, уже присутствующие в препарате [97]. По крайней
мере по отношению к мутантам, полученным с помощью азотистой кислоты,
такое возражение высказывалось (см. ниже).
Третий метод выделения мутантов основан иа использовании инокулу-
мов в таком разведении, при котором заражается лишь половина (или менее)
инокулировапных растений. В опыт берут растения, реагирующие систем-
ным заболеванием. Можно допустить, что при этих условиях большинство
заболевших растений инфицированы одной вирусной частицей. В отноше-
нии количества растений указанный метод расточителен, однако с его помо-
щью удается изолировать дефектные мутанты, которые не могут быть выде-
лены в инфекционной форме с помощью методов экстракции, используемых
для выделения обычных штаммов.
МУТАГЕННЫЕ АГЕНТЫ
В ряде работ изучалось действие па вирусы растений физических и хи-
мических агентов, обладающих мутагенным действием иа другие биологиче-
ские объекты. Почти все работы такого рода проводились па ВТМ. Некотоые
агенты (например, азотистая кислота) оказались явно мутагенными для
ВТМ; что касается многих других агентов, то данные о них не столь убе-
дительны.
Действие рентгеновских и ультрафиолетовых лучей
Кауше и Штуббе [956, 957] первыми предприняли попытку индуциро-
вать мутации ВТМ с помощью облучения листьев растений табака рентгенов-
скими лучами (12 000—14 000 Р) до или после заражения. При этом было
выделено несколько мутантов, однако из-за низкой частоты их появления
нельзя было с уверенностью считать, что речь идет об индукции мутантов
облучением. Подобные возражения вызвали и результаты опытов Гоуэна
[668], который облучал ВТМ in vitro. Действие рентгеновских и ультрафио-
летовых лучей па ВТМ позднее изучал Мундри [1245]. Видимое увеличение
числа мутантов после облучения очищенных вирусных препаратов наблю-
далось лишь в том случае, если в экспериментах использовали препарат,
обладающий некоторым уровнем спонтанных мутаций, причем концентра-
ция инфекционного вируса в контрольном препарате была более высокой,
чем в облученном. Видимая частота мутаций увеличивалась в том случае,
если количество активного вируса снижалось либо в результате инактиви-
рующего действия облучения, либо в результате разведения инокулума
буферным раствором. Иа основании этих данных Мундри пришел к выводу,
что данные о мутагенном действии рентгеновских и ультрафиолетовых лучей
на ВТМ неубедительны.
Ионизирующее излучение и ультрафиолетовые лучи инактивируют
вирусы, содержащие двухцепочечную ДНК; эти же агенты способны также
вызывать мутации таких вирусов. Ферменты клетки-хозяина могут репари-
ровать вызванные облучением разрывы двухцепочечной ДНК, однако нару-
шение структуры одиоцепочечных ДНК и РНК бактериальных вирусов
в клетках не репарируется. В настоящее время не существует адекватных
284
Глава XIII
методов исследования мутагенного действия рентгеновских и ультрафиоле-
товых лучей на вирусы растений, содержащие двухцепочечную РНК, на
вирус мозаики цветной капусты, содержащий двухцепочечную ДНК, или
ла двухцепочечпые внутриклеточные формы РНК вирусов растений, содер-
жащих одиоцепочечную РНК.
Недавно было обнаружено, что мутагенное действие на бактериальные-
ДНК-вирусы оказывают лучи с длиной волны 320—400 нм (область, близ-
кая к зоне видимого света), обладающие низкой интенсивностью [1023].
Возможное влияние радиации в этом диапазоне длин волн на вирусы расте-
ний пока не обнаружено.
Действие высоких температур
В ряде исследований было показано, что из инфицированных растений,
выращенных при повышенной температуре, удается выделить больше раз-
ных вирусных штаммов. Так, Мундри [1246$ исследовал появление па ли-
стьях табака, инфицированного ВТМ, ярко-желтых пятен, содержащих
мутантные штаммы вируса. Используя высокоочищенные изоляты ВТМ,
он показал, что при 17 °C на каждое растение приходится по 3 ярко-желтых
пятна, а при 35° — по 35 пятен. По мнению автора, описанное явление свя-
зано с увеличением частоты: мутаций при повышении температуры. Однако,,
как будет показано в этой главе далее, имеются убедительные данные о том,,
что существуют определенные температуры, благоприятствующие размно-
жению и инвазии некоторых штаммов вирусов, так что повышение темпера-
туры можно рассматривать как фактор, благоприятствующий отбору спон-
танных мутантов.
Ферменты
В принципе представляется возможным индуцировать мутации вирусов:
путем обработки вирусной РНК ферментами, изменяющими функциональ-
ные группы пуриновых и пиримидиновых оснований, но не действующими
на фосфодиэфирные связи. Сэгал и Зигель [1520] предприняли попытку
использовать в этих целях аденозинаминогидролазу, очищенную от такадиа-
стазы. Несмотря на то что фермент участвовал в дезаминировании аденозино-
вых остатков в деградированной РНК, он не оказывал видимого действия
на интактную молекулу РНК ВТМ, о чем можно было судить по отсутствию'
мутантов.
5-фторурацил
Некоторые аналоги азотистых оснований могут включаться в вирусную'
РНК при обработке этими соединениями инфицированных растений (гл. XIV).
Известно, что эти соединения вызывают увеличение частоты мутаций у бак-
терий и бактериальных вирусов. Установлено, что 5-фторурацил в значи-
тельных количествах включается в РНК ВТМ. Крамер и др. [1022] показали,,
что если в препарате вируса 36—56% урацила РНК замещено на 5-фторура-
цил, то частота мутаций в 5—10 раз превышает контрольную.
По-видимому, 5-фторурацил действует как мутаген, замещая в цепи
РНК урацил. Обычно в процессе репликации вирусной РНК 5-фторурацил,
находясь в кетоформе, ведет себя подобно урацилу. Однако иногда 5-фтор-
урацил переходит в енольную форму и в этом случае ведет себя как цитозин,
т. е. спаривается с гуанином. Если 5-фторурацил, спаривающийся как цито-
зин, стоит в плюс-цепи вирусной РНК и в такой форме участвует в синтезе
минус-цепей, то это приводит к появлению мутации У -» Ц. Если же 5-
Изменчивость
285
«фторурацил и енольной форме находится в минус-цепи, на которой синтези-
руется плюс-цепь, то имеет место мутация А->Г. Приводимые ниже дан-
ные о замещениях аминокислот в вирусном белке согласуются с описанным
механизмом мутагенеза под влиянием 5-фторурацила.
Гпдроксиламин
Пто соединение (NH2OH) считается эффективным мутагеном, действую-
щим на ДПК in vitro. Гидроксиламин вызывает мутации при обработке
им свободной РНК ВТМ, но не интактных вирусных частиц [1514]. Обра-
ботка Р1П£ гидроксиламином при pH 9,1 приводит к ее инактивации без
образования мутантов (гл. XIV); при pH 6,1 возникают мутанты, но проис-
ходит также и частичная инактивация РНК. По-видимому, мутации возни-
кают благодаря взаимодействию гидроксиламина с цитозиновыми остат-
ками в цепи РНК, в результате чего цитозин превращается в соединения,
ведущие себя в процессе репликации подобно урацилу [1328]. Гидроксил-
амип оказывает значительно менее эффективное мутагенное действие на ВТМ,
чем азотистая кислота.
Азотистая кислота
Мутагенное действие азотистой кислоты на ВТМ изучено особенно
подробно, и в настоящее время нет никаких сомнений в том, что это соедине-
ние действительно вызывает мутации ВТМ. Характер почти всех детально
изученных мутантов согласуется с предполагаемым механизмом действия
азотистой кислоты. Гирер и Мундри [629] и Мундри и Гирер [1248] доказали
высокую эффективность мутагенного действия азотистой кислоты на ВТМ.
В своей работе эти авторы использовали в качестве дифференцирующего
хозяина растения табака сорта Ява, которые реагируют на зараженные роди-
тельским штаммом образованием хлоротических пятен, а на мутантный
штамм возникновением местных некрозов. Было обнаружено, что с увели-
чением длительности обработки препаратов азотистой кислотой возрастает
число местных некрозов. Так, в одном из экспериментов поражения некро-
тического типа составляли 0,21% общего числа поражений, вызываемых
вирусным ипокулумом, не обработанным азотистой кислотой; после 96-ми-
путной обработки препарата РНК ВТМ 1 М NaNO2 (при pH 4,8) такие пора-
жения составили 15,5%. Число местных некрозов при инокуляции растений
обработанной таким образом РНК оказалось значительно выше, чем при
инокуляции контрольными препаратами РНК с такой же удельной инфек-
циоппоетыо. С увеличением длительности обработки абсолютное число мест-
ных некрозов сначала увеличивается, а затем начинает снижаться, причем
максимум наблюдался в опытах с препаратами, содержавшими около 37%
выживших частиц. Полученные авторами количественные данные достаточно
хорошо согласуются с теоретической кривой, построенной исходя из допуще-
ния, что одиночный акт взаимодействия азотистой кислоты с РНК может
приводить как к инактивации, так и к возникновению мутантов.
Мундри и Гирер показали, что присутствие структурного вирусного
белка по влияет на частоту мутаций (которую определяли по числу местных
некрозов иа растениях табака сорта Ява). В их опытах частота мутаций ока-
залась одинаковой для цельного вируса, вирусной РНК и РНК, выделен-
ной из цельного вируса, обработанного азотистой кислотой.
Опыты Зигеля [1576] со всей убедительностью подтвердили точку зре-
ния, согласно которой азотистая кислота действительно вызывает мутации,
а не' способствует отбору предсуществовавших спонтанных мутантов. В опы-
тах этого автора, в которых обработка азотистой кислотой приводила к инак-
286
Глава XIII
тивации 90% вирусных частиц, из 10% оставшихся примерно половину со-
ставляли мутанты. Если бы эти частицы присутствовали уже в исходных
препаратах, они должны были составлять до 5% родительской популяции,
причем пришлось бы допустить, что все они полностью устойчивы к инакти-
вирующему действию азотистой кислоты. Кривая выживания, однако, носила
экспоненциальный характер, по крайней мере до того момента, пока в ис-
ходной популяции оставалось около 0,5% выживших частиц. Данные Зигеля
позволяют предположить, что каждый акт дезаминирования оказывает
ощутимое биологическое действие, причем при этом на каждые 2—3 леталь-
ных события приходится одна мутация.
В условиях этих опытов азотистая кислота участвует в реакции окисли-
тельного дезаминирования оснований РНК и не влияет на фосфодиэфирные
связи [1512]. При этом аденин превращается в гипоксантин, а гуанин —
в ксантин, т. е. в основания, которые обычно в состав РНК ВТМ не входят;
цитозин превращается в «нормальное» основание урацил.
Обнаружено, что пуриновые основания свободной РНК ВТМ взаимодей-
ствуют с азотистой кислотой чаще, чем цитозин (примерно на 50%). Однако
при обработке интактных частиц дело обстоит по-иному. При некоторых
условиях интактные вирусные частицы инактивируются азотистой кислотой
значительно медленнее, чем свободная РНК, и при этом остатки гуанина
не вступают в реакцию [1513]. Цитозин РНК в составе интактных частиц
дезаминируется в 1,8 раза быстрее, чем аденин, тогда как скорость дезами-
нирования цитозина в составе свободной РНК составляет 0,7 скорости деза-
минирования аденина.
Различные химические мутагены
Диметилсульфат — один из нескольких исследованных Фреикель-Кон-
ратом [534] алкилирующих агентов, оказывающих мутагенное действие на
ВТМ и РНК ВТМ. Тонкие детали механизма действия этого соединения не
известны, однако показано, что в присутствии диметилсульфата многие
остатки гуанина метилируются с образованием 7-метилгуанина.
Азотистый иприт — метил-бис(Р-хлорэтил)амин — оказывает мутаген-
ное действие на многие живые объекты. Ларсон и др. [1042] выделили мутан-
ты Х-вируса картофеля из инфицированных растений Nicotiana rustica L.r
выращенных в атмосфере паров этого соединения. В исходном препарате
родительского штамма подобные мутанты не были обнаружены. Хотя вполне
возможно, что азотистый иприт в этом случае действительно вызывает мута-
ции, но, поскольку количественные данные в работе не приводятся, пе исклю-
чается возможность отбора спонтанно возникших мутантов.
Известно, что сильным мутагенным действием на ДНК обладает N-
метил-Н'-нитро-Н-нитрозогуанидин. Зингер и Френкель-Конрат [1598] по-
казали, что это соединение легко инактивирует РНК ВТМ; частота мутаций
при этом оказывается очень низкой. Интактные вирусные частицы инакти-
вируются этим соединением значительно медленнее, а частота мутаций при
этом высока. Химический механизм мутагенного действия этого соединения
не установлен. В водной среде происходит метилирование гуанина в поло-
жении 7, но, по-видимому, не эта реакция лежит в основе мутагенеза [1599].
ИЗМЕНЕНИЯ СТРУКТУРНЫХ КОМПОНЕНТОВ
В МУТАНТАХ ВТМ
В настоящее время не представляется возможным локализовать хими-
ческие изменения в мутантных цепях РНК ВТМ, так как для этого при-
шлось бы определить последовательность оснований в молекуле РНК
Изменчивость
287
иа достаточно большом отрезке. Поскольку полная последовательность
аминокислот в структурном белке ВТМ нам известна, можно точно установить
какие именно замещения аминокислот, если только они произошли, имеют
место в структурном белке различных мутантов ВТМ [591, 1794—1796],
1922—1927]. Данные о замещениях аминокислот, полученные в результате
анализа около 200 мутантных штаммов ВТМ, суммированы в табл. 12.
Таблица 12'
Число мутантов ВТМ, индуцированных различными мутагенными агентами
и отобранных на основании различий в симптомах вызываемых ими болезней [1928р
Число мутантов
Замещения аминокислот в структурном белке (на один мутант) 1) индуцированных спонтанных
азотистой кислотой гидроксил- амином 5-фторурацилом
0 112 5 8 8
1 35 1 3 6
2 8 0 0 1
3 0 0 0 1
>3 0 0 0 0
Сумма 155 6 и 16
1) Аминокислотный состав всех триптических пептидов каждого мутанта сравнивали с амино-
кислотным составом, родительского штамма.
Приблизительно у 2/3 исследованных мутантов, отобранных на осно-
вании различий в симптомах вызываемых ими болезней, не было аминокис-
лотных замещений в структурном белке. Как полагают, мутанты этого,
типа несут изменения в той части РНК, которая контролирует синтез не-
структурных вирусоспецифичных белков, определяющих тип симптомов.
Наибольшее число замещений аминокислот в структурном белке оказалось,
равным двум для мутантов, индуцированных химическими соединениями,
и трем — в одном из полученных в теплице спонтанных мутантов. В струк-
турном белке некоторых других природных штаммов ВТМ обнаружено'
значительно большее число замещений.
МУТАНТЫ ВТМ- И ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОД
В настоящее время генетический код известен почти во всех деталях
[416]. Большая часть наших знаний в этой области получена в экспериментах
in vitro с использованием в качестве информационной РНК синтетических
полирибонуклеотидов известного состава или с известной последовательно-
стью оснований. Однако для того, чтобы окончательно доказать правиль-
ность генетического словаря, необходим был соответствующий анализ белков,
синтезирующихся in vivo. В этой области сыграли важную роль исследо-
вания структурных белков мутантных штаммов ВТМ. Они подтвердили
данные о неперекрываемости и вырожденности кода и послужили веским-
доказательством его универсальности. Если бы код был перекрывающимся,
замена одного основания должна была привести к замещению более чем?
одной аминокислоты в полипептидной цепи, причем именно соседних амино-
кислот. В структурном белке большинства изученных мутантов ВТМ обна-
ружено замещение лишь одной аминокислоты; в тех же случаях, когда-
имеют место два замещения, они не соседствуют друг с другом. На стр. 288-
Мутант Замещение Положение Мутант Замещение Положение
А14 С понтанные Иле —> Тре 129 N1462 Тре-) АЦУ -Иле АУУ 5
АУУ АЦУ Сер — >- Лей 55
В13 Аси —> Лиз 33 УЦГ УУГ
ААУ ААА Ni568 Тре — > Иле 5
СР415 Асн—> Лиз 140 АЦУ АУУ
Е66 ААУ ААА Тре- »• Мет 107
GK1 Асн -> Сер 73 АЦГ АУГ
ААУ АГУ NI630 Тре - >- Мет 107
Flavum Асп — Ала 19 Ni725 АЦГ АУГ
ГАУ ГЦУ N11055 Иле- »- Мет АУГ 21
Necans Фен -> Лей 10 АУА
УУУ ЦУУ №1103 Асн — ААУ >- Сер АГУ 73
19
ГЦУ ГУУ Иле — АУУ » Вал ГУУ 125
Сер —> УЦУ Фен УУУ 138
Nil045 №1196 Про — ЦЦЦ >- Сер УЦЦ 63
Reflavescens Лей—> Фен 10 №1234
ЦУУ УУУ №1118 Иле — АУУ >Вал ГУУ 24
Revirescens Лей —> 10
ЦУУ УУУ Иле - АУУ »- Вал ГУУ 125
Вал —>- Асп ГУУ ГАУ 19
№1688 Про - ЦЦЦ > Сер УЦЦ 63
FU27 Вал —> ГУУ -Ала ГЦУ 58 Про - ЦЦЦ > Лей ЦУЦ 156
FU41 Тре—» АЦУ -Ала ГЦУ 28 №1927 №2029 Про - ЦЦЦ » Лей ЦУЦ 156
— №2032 Тро - АЦУ >Иле АУУ 136
FU243 Сер -> АГУ Гли ГГУ 65
NilO2 Азотистая Асп —> кислота Гли 66 №2068 Тир - УАЦ > Цис УГЦ 139
ГАУ ГГУ №2204 Сер - УЦГ > Лей УУГ 15
Nil09 Глу—» ГАА Гли ГГА 97
Тре - АЦУ > Иле АУУ 153
N1118 Лей ЦУЦ —
Про —» ЦЦЦ 20 №2239 Сер - УЦГ -»- Лей УУГ 15
Ni445 Сер УЦУ Фен УУУ 138 РМ2 Тре- АЦУ >Иле АУУ 28
№458 Ni470 Тре —> АЦУ Иле АУУ 59 Глу- ГАА -> Асп ГАУ 95
Изменчивость
289
приведен список мутантов ВТМ с указанием замещений аминокислот в струк-
турном белке. Эти замещения можно локализовать на полипептидпой цепи
типичного штамма, последовательность аминокислот в которой представлена
на фиг. 11.
Состав кодонов показывает, что каждое замещение аминокислоты свя-
зано с заменой одного основания в триплете (в соответствии с правилами,
установленными для вырожденного кода).
Из 24 перечисленных здесь азотистых мутантов ВТМ 23 согласуются
с постулированным механизмом мутагенного действия азотистой кислоты,
т. е. дезаминированием цитозина в урацил и аденина в гипоксантин (послед-
нее соединение участвует в спаривании подобно гуанину, что приводит
к замене аденина гуанином). Исключение составляет штамм РМ2,в струк-
турном белке которого глутаминовая кислота (ГАА) замещена па аспара-
гиновую кислоту (ГАУ). Возможно, штамм РМ2 возник не под действием
азотистой кислоты, а спонтанно. Недавно был описан еще один азотистый
мутант РМ5 [707], в структурном белке которого аргинин в положении
112 замещен цистеином. Это замещение могло произойти в результате одного
из двух изменений: ЦГЦ-> УГЦ или ЦГУ->УГУ.
Данные о замещениях аминокислот в структурных белках трех мутан-
тов, возникших в результате включения в РНК 5-фторурацила, согласуются
с предполагаемым механизмом мутагенного действия этого агента,
т. е. У —Ц и А -* Г.
Теоретически представляется возможным, что в процессе синтеза вирус-
ного белка in vivo считываться могут либо плюс-цепи РНК, либо минус-цепи
(у которых последовательность оснований комплементарна последователь-
ности оснований РНК вириона). Частота некоторых замещений аминокислот
с несомненностью свидетельствует, что в роли матрицы при синтезе белка вы-
ступает РНК вириона, а не комплементарная ей минус-цепь [1923]. Так, фенил-
аланин (УУУ или УУЦ) часто замещает другие аминокислоты в структур-
ном белке азотистых мутантов ВТМ, однако не обнаружено ни одного азо-
тистого мутанта, в белке которого фенилаланин был бы замещен другой
аминокислотой, так как ни УУУ, ни УУЦ при дезаминировании не дают трип-
лета, кодирующего какую-либо другую аминокислоту. Результат был бы
противоположным, если бы роль матрицы играла минус-цепь, поскольку
известно, что первичное мутационное событие совершается в плюс-цепи
РНК, обработанной мутагеном. Если бы матричную функцию действительно
выполняла минус-цепь, то соответствующий комплементарный триплет для
фенилаланина в РНК вириона (ААА) в результате дезаминирования превра-
щался бы в триплеты, кодирующие другие аминокислоты, которые в этом
случае могли бы замещать фенилаланин в структурном белке.
Существует несколько причин, по которым выделение индуцированных
мутантов, подобных приведенным в табл. 12, не может быть результатом
случайного отбора всех возможных мутантов. Во-первых, первичная иденти-
фикация мутантов основывается на различиях в симптомах вызываемых
ими болезней нескольких отобранных растений-хозяев. Во-вторых, обычно
отбираются мутанты, дающие ощутимое количество вирусных частиц; Вэлди
и Френкель-Конрат [1841] обнаружили, что интенсивность репродукции
многих мутантов, индуцированных азотистой кислотой, очень низка. Если
экстрактом ткани местного некроза инокулировать другое растение, также
реагирующее на заражение образованием местных некрозов, число последних
очень невелико; таким образом, представляется возможным, что многие
«стерильные» некрозы, возникающие в результате заражения вирусом, обра-
ботанным азотистой кислотой, вызываются мутантами, обладающими очень
низкой продуктивностью (около 0,1 % продуктивности дикого штамма ВТМ).
19-0893
290
Глава XIII
Некоторые штаммы вообще неспособны формировать интактные вирусные
частицы (см. ниже). В-третьих, в настоящее время с помощью химических
методов могут быть обнаружены мутации только в цистроне структурного'
белка. Около а/3 мутантов, представленных в табл. 12, несут мутациив других
цистронах. В-четвертых, возможно появление «молчащих» мутаций, когда
в результате замены основания в том или ином триплете образуется другой
триплет, кодирующий, однако, ту же самую аминокислоту, например УЦЦ
(серин) -> УЦУ (серин).
ЧАСТОТА МУТАЦИЙ И ПРОИСХОЖДЕНИЕ ВИРУСНЫХ
ШТАММОВ В ПРИРОДЕ
Такие вирусы, как ВТМ или ВЖМТ, размножаясь, могут накапливаться
в очень больших концентрациях; так, в тканях одного местного некроза
может находиться около 1011 частиц, а в полностью инфицированном листе —
до 10м, так что существуют весьма широкие возможности возникновения
спонтанных мутаций. В настоящее время расчет частоты спонтанных мутаций
вирусов растений, основанный на определении вероятности событий, при-
водящих к возникновению мутантов, весьма затруднителен. Расчеты были
сделаны на основе определения числа мутантов в вирусном препарате или
числа мутантов, которые могут быть выделены из листа или из целого
растения. При таком определении частота мутаций ВТМ оказалась равной
0,1—2,0% [1012, 1131]. На основе опытов по заражению растений табака
Х-вирусом картофеля в различных разведениях Мэтьюз [1167] рассчитал,
что в среднем в каждом системно инфицированном листе образуется около
трех мутантных штаммов, вызывающих кольцевую пятнистость и некрозы.
Это, по-видимому, заниженная величина, так как мутантные штаммы автор
выделял из мелких желтых или некротических пятен, видимых простым
глазом, т. е. учитывались лишь те штаммы, которые были способны кон-
курировать с родительским штаммом и давать различимые симптомы.
Неродственные вирусы сильно различаются по частоте образования
новых штаммов. Так, у ВТМ имеется множество мутантов, тогда как вирус
кустистой карликовости томатов представлен всего лишь несколькими
штаммами. Различные штаммы одного вируса также порой сильно варьируют
по способности образовывать мутанты. Так, некоторые штаммы Х-вируса
картофеля, вызывающие хлоротические местные поражения иа листьях
растений табака, часто образуют мутанты, вызывающие поражения типа
кольцевой пятнистости; другие штаммы этого вируса вовсе не образуют
таких мутантов [1167]. Штаммы вируса некроза табака, вызывающие белые
некрозы на листьях растений коровьего гороха, часто превращаются
в штаммы, вызывающие красные некрозы [584]. Поражение этого последнего
типа всегда первоначально возникает как пятно в форме сектора в области
белого некроза. Частота образования «красных» мутантов варьирует в 5 раз
в зависимости от природы «белого» штамма. Обратный процесс (превращение
«красных» штаммов в «белые») не наблюдался.
Видимые различия в частотах появления штаммов не всегда служат
отражением различий в действительной частоте мутаций, так как встре-
чаются штаммы, продуцирующие много дефектных или нежизнеспособных
форм. В некоторых случаях получаемые результаты на самом деле отражают
лишь эффективность наших методов выявления мутантов.
Существующие в природе родственные штаммы можно рассматривать
как потомков какого-то общего прародительского типа, возникших в резуль-
тате р яда последовательных мутаций. Некоторые из этих мутаций аналогичны
тем, которые вызываются азотистой кислотой, т. е. связаны с заменой одного
Изменчивость
291
основания в РНК. Это приводит к превращению данного триплета в триплет,
кодирующий другую аминокислоту, которая включается в синтезирующийся
белок. Первичная структура белка оболочки природных штаммов ВТМ
подтверждает это предположение. В структурных белках изученных штам-
мов ВТМ только около 36% положений в полипептидной цепи (насчитываю-
щей 158 аминокислот) занято у всех штаммов одними и теми же аминокис-
лотами [1420, 1925, 1929]. Если в аналогичном аспекте рассмотреть
искусственно индуцированные штаммы ВТМ, то окажется, что в струк-
турных белках этих штаммов только 30 % положений занято одними и теми же
аминокислотами [1929]. Появление штаммов, все более и более отличающихся
от родительского типа, можно рассматривать как результат изменений,
накапливающихся в структурном белке, а также в других белках, програм-
мируемых вирусом. Выживание и распространение таких штаммов будет
зависеть, конечно, от их приспособленности к условиям репродукции в расте-
нии-хозяине, в котором они первоначально возникли, а также в растениях,
которые заражаются этими штаммами впоследствии. Отбор штаммов, имею-
щий место при репродукции вирусов в том или ином растении-хозяине,
обсуждается в этой главе ниже.
Кроме замен одних оснований другими, в процессе эволюции вирусных
штаммов могут играть роль и другие типы изменений в вирусных РНК,
Как показано в гл. V, серологически родственные изоляты вируса погрем-
ковости табака, изученные Харрисоном и Вудсом [731], разделяются на три
группы в зависимости от длины частиц. Аналогичные данные получил
Корбетт [406], описавший орхидпый штамм ВТМ с нормальной длиной
частиц, равной 320 нм, тогда как длина частиц большинства штаммов ВТМ
равна 300 нм. Не установлено, в какой степени эти различия в длине частиц
определяются конформацией спирали РНК, а в какой — истинной длиной
молекулы РНК. Увеличение длины частицы можно рассматривать как
результат вставки оснований или дупликации участков полииуклеотидной
цепи, а уменьшение длины частицы — как следствие обратных процессов.
Для вирусов со спиральной структурой, по-видимому, не существует каких-
либо геометрических ограничений в отношении небольшого увеличения пли
уменьшения длины частицы. Для икосаэдрических вирусов вряд ли можно
представить себе значительное изменение длины РНК без глубоких изме-
нений геометрии частицы, однако результаты недавних исследований свиде-
тельствуют, что в этом отношении возможны достаточно широкие вариации
(гл. VII).
КРИТЕРИИ ИДЕНТИФИКАЦИИ ВИРУСНЫХ ШТАММОВ
' Целям идентификации вирусных штаммов служат два типа доступных
для изучения свойств вирусов: структурные критерии, основанные па свой-
ствах самой вирусной частицы, и биологические критерии, основанные
па различиях в характере взаимодействия вирусов с растением-хозяином,
с насекомыми или другими переносчиками. С точки зрения общей проблемы
классификации вирусов указанные критерии обсуждаются в гл. XX.
Структурные критерии
РНК
В РНК вирусных мутантов, индуцированных химическими способами,
имеет место замена одного или нескольких оснований из нескольких тысяч.
К сожалению, существующие в настоящее время методы не позволяют
19*
292
Глава XIII
обнаружить подобные замены в полинуклеотидной цепи такой длины. Однако
эволюционирующие в природе штаммы вирусов могут накапливать замены
оснований в РНК до такого уровня, что в конце концов это может быть
обнаружено с помощью простого анализа состава оснований. Симонс
и др. [1726] исследовали состав оснований 6 изолятов ВЖМТ, полученных
из различных мест в Англии и других европейских странах. Оказалось, что
по уровню содержания цитозина эти штаммы разделяются на две хорошо
различимые группы. Содержание цитозина в РНК штаммов группы 1 состав-
ляет 38,2%, а в РНК штаммов группы 2 — 41,6% (табл. 13).
Более подробные данные о взаимоотношениях между РНК различных
штаммов можно получить путем определения частоты некоторых олигонуклео-
тидов среди продуктов ферментативного гидролиза РНК. Подобная работа,
Таблица 13
Состав оснований шести штаммов ВЖМТ *) [1726]
Штаммы ВЖМТ
Гуанин
Аденин
Цитозин
Группа 1
Типичный
1 ‘эй д:махер
Опэсти
Группа 2
Штамм цветной капусты
Ротамстед
Дания
17,2±0,17
17,2+0,14
17,5+0,16
16,7±0,11
16,7+0,14
16,5+0,16
22,4+0,11
22,8+0,14
22,4+0,17
21,4±0,27
21,3+0,03
21,6±0,10
38,3+0,19
37,9±0,24
38,6+0,17
42,1+0,34
41,7+0,23
41,1+0,11
22,1+0,17
22,1+0,3()
21,6+0,28
19,8±0,08
20,3+0,14
20,7=1=0,21
1) Содержание оснований дано в мол. %; стандартное отклонение рассчитано на основании
4—в определений.
Таблица 14
Содержание1) олигонуклеотидов среди продуктов гидролиза РНК
шести штаммов ВЖМТ панкреатической рибонуклеазой [1726]
Содержание и штаммах ВЖМТ
НУКЛРОТНД ТИП П’ШЫЙ Рэйдмахер OflDCTlI Штамм цвет- ной капусты Ротамстед Дания
вд> 26,5±0,17 25,5+0,13 26,2+0,18 29,0+0,08 29,2+0,08 28,0+0,14
Уф 14,6+0,18 14,4±0,10 14,6+0,09 13,3±0,06 13,4+0,18 13,9+0,10
АфЦф 10,1+0,08 10,3+0,10 10,0+0,08 9,95+0,05 10,0+0,07 10,6±0,08
АфУф 5,60+0,08 5,28+0,14 5,72+0,14 4,69+0,05 4,85+0,07 4,70+0,09
ГфЦф 6,30+0,0.1 5,88±0,08 6,64+0,16 6,35+0,11 6,60+0,06 6,41+0,13
ГфУф 4,12-4-0,10 3,80+0,07 4,30+0,13 3,39+0,15 3,68±0,04 3,96+0,09
АфАфЦф 3,97+0,06 3,60+0,24 3,78+0,22 4,37+0,01 4,50+0,02 4,36+0,03
АфАфУф 1,45+0,04 1,53+0,12 1,47+0,10 2,12+0,17 2,08±0,08 1,76+0,07
ГфАфГф ,1 АфГфЦф Ч 6,72+0,08 6,15+0,13 6,51+0,07 6,57+0,07 6,35+0,09 6,52+0,20
ГфАфУф 1,77+0,04 1,71+0,03 1,75+0,02 1,22+0,01 1,38+0,03 1,15+0,04
АфГфУф 1,31+0,04 1,56+0,08 1,60+0,11 1,11+0,10 1,13+0,03 1,39+0,09
82,4 79,7 82,6 82,1 83,2 82,8
1) Цифры и таблице представляют средние значения содержания олигонуклеотидов, выражен-
ные в процентах от оГицето количества нуклеотидов, нанесенных на колонку, ± стандартное откло-
нение. Средние значения рассчитывались на основании 3—8 независимых определений.
Изменчивость
293
в которой была использована панкреатическая рибонуклеаза, была про-
делана па шести штаммах ВЖМТ. Полученные при этом результаты пред-
ставлены в табл. 14.
Исследованные штаммы, как и в предыдущей работе, отчетливо раз-
деляются иа две группы, причем особенно четким оказалось различие в содер-
жании Цф, АфУф, Уф, АфАфЦф, АфАфУф и ГфАфУф. Как показали
Симонс и др. [1726], разница в 1% между данными табл. 14 соответствует
изменению около 60 нуклеотидов в вирусной РНК. Более тонкие методы,
с помощью которых можно выделять олигонуклеотиды большей длины [1643],
а также использование наряду с панкреатической рибонуклеазой нуклеазы
Т1 должны позволить обнаружить более редкие различия в составе оснований
РНК различных штаммов, причем чем больше длина выделенного олиго-
нуклеотида, тем вероятнее обнаружение различий между штаммами
(см. гл. IV).
Структурный белок
В настоящее время представляется вполне надежным установление
структурных различий между вирусными штаммами на основании данных
о свойствах белка оболочки и архитектуре вирусных частиц. У таких виру-
сов, как ВТМ или ВЖМТ, структурный белок кодируется участком РНК,
который составляет всего лишь V10 вирусного генома. Таким образом, совре-
менные представления о взаимоотношениях между вирусными штаммами
одной группы, основанные па данных о свойствах, определяемых характером
белка оболочки (аминокислотный состав, серологическое родство, электро-
форетическая подвижность), может быть, и очень неточно отражают истинное
положение вещей. Если частота мутаций в цистронах неструктурных белков
Таблица 15
Аминокислотный состав1) структурных белков шести штаммов ВЖМТ [1726]
Аминокислота Состав штаммон ВЖМТ
группа 1 группа 2
ТИПИЧ- НЫЙ t Оплети I ц «йИ- ма хор штамм цветной капусты Р< нам- етен Дания
Лизни 7 7 7 4 4 4
Гистидин 3 3 3 5 5 5
Аргинин 3 3 3 6 6 6
Триптофан 2 2 2 2 2 2
Аспарагиновая кислота И 11 11 17 17 17
'Грооиип й) 26 26 26 20 19 20
Серии 3) 16 16 16 20 19 20
Глутаминовая кислота 15 14 14 15 14 15
Пролин 20 20 20 20 21 20
Глицин 8 8 8 7 7 7
Аланин 15 14 14 13 13 13
Полуцистин 4 4 4 5 5 5
Валин 14 15 13 14 13 14
Метионин 4 4 4 4 4 4
Изолойцин 15 15 17 13 13 14
Л ейцин 18 17 17 19 19 18 :
Тирозин 3 3 3 3 3 3
Фенилаланин 5 5 5 3 3 3
1) Содержание аминокислотных остатков рассчитано на 1 моль белка.
2) Содержание треонина и серина рассчитано с учетом потерь в результате кислотного гидро-
лиза: 5% для треонина и 10,6% для серина.
294
Глава XIII
более или менее близка к частоте мутаций в цистроне структурного белка,
наши современные взгляды на взаимоотношения между существующими
в природе штаммами могут оказаться достаточно близкими к истине. Симонс
и др. [1726] определили аминокислотный состав структурных белков тех же
шести штаммов ВЖМТ, которые были использованы ими для изучения взаи-
моотношений между РНК (табл. 15).
Оказалось, что по данным об аминокислотном составе структурного
•белка эти шесть исследованных штаммов делятся на такие же две группы,
как и по данным о частоте встречаемости олигонуклеотидов в РНК.
Поскольку данные о штаммовых различиях РНК отражают изменения в той
большей части генома, которая не имеет отношения к кодированию струк-
турного белка, можно с достаточным основанием полагать, что у вирусных
штаммов этой группы частоты мутаций в цистронах структурных и неструк-
турных белков приблизительно равны.
Архитектура вирусных частиц
Можно было бы ожидать, что размер, форма и геометрическое рас-
положение субъединиц у родственных вирусов должны быть очень сходными.
Тем не менее в пределах группы родственных штаммов обнаружены значи-
тельные различия в морфологии частиц (например, частицы различных
штаммов ВТМ и вируса погремковости табака имеют различную длину).
Электрофоретическая подвижность
Электрофоретическая подвижность вирусных частиц зависит прежде
всего от аминокислотного состава белка оболочки, а также от характера его
третичной структуры, определяющего доступность ионизированных групп.
На величину электрофоретической подвижности влияют и присутствующие
в буфере ионы. По электрофоретической подвижности восемь исследованных
штаммов ВТМ разделяются на четыре группы [648].
Было показано, что и другие группы вирусных штаммов различаются
по электрофоретической подвижности. Так, изоэлектрические точки пяти
изолятов вируса мозаики фасоли варьировали от 3,95 до 6,03 [1135]. Раз-
личия в электрофоретической подвижности можно использовать для раз-
деления смеси различных вирусов [1687].
Серологическое родство
Обоснование серологических тестов, служащих для идентификации
вирусных штаммов, используемые методы и их ограничения обсуждаются
в гл. XV.
Биологические критерии
Различие и сходство биологических свойств изолятов вирусов могут
контролироваться той частью вирусного генома, которая не имеет отноше-
ния к синтезу белка оболочки, так что можно ожидать, что исследование
биологических свойств вирусов позволит обнаружить такие различия между
штаммами, которые не выявляются с помощью химических или физических
методов.
Симптомы болезней
Как указывалось в начале этой главы, различия в симптомах болезни
играют наиболее важную роль в идентификации вирусных штаммов. Следует,
«однако, заметить, что степень различий в симптомах вызываемой болезни
Изменчивость
295
может и не отражать степень близости между различными представителями
группы штаммов. Так, из восьми изученных Зигелем и Вайлдманом [1578]
штаммов ВТМ два штамма (П2 и U7) вызывали сходные мозаичные заболе-
вания средней тяжести у растений табака, но существенно различались
по другим свойствам: но реакции растений N. sylvestris, чувствительности
к инактивации УФ-облучением, электрофоретической подвижности и степени
загрязнения препаратов окрашенным растительным материалом.
Проявления болезни, вызываемой различными штаммами вирусов
у одних и тех же видов и сортов растений-хозяев, могут варьировать
в широких пределах от состояния бессимптомного «носительства» до леталь-
ных некрозов; кроме этих крайних форм, могут развиваться мозаичные забо-
левания различной тяжести.
Тип болезни, вызываемой данной rpynnoii штаммов у одного растения-
хозяина, может вовсе не коррелировать с типом болезни, вызываемой этими
вирусами у других растений-хозяев. Болыпинство вирусов, в том числе
такие распространенные, как ВТМ, X- и У-вирусы картофеля, вирус мозаики
люцерны и вирус огуречной мозаики, встречаются в природе в виде много-
численных штаммов. Многие вирусы, которые по характеру симптомов
болезни и другим биологическим свойствам были описаны как «новые»,
при последующих исследованиях оказывались штаммами одного из извест-
ных, часто встречающихся вирусов. Судя по характеру симптомов болезни,
несколько вирусов (вирус скручивания листьев картофеля и некоторые
другие) образуют сравнительно мало штаммов.
Вирус, вызывающий тяжелую форму болезни, часто называют более
«вирулентным», чем вирус, вызывающий более легкое заболевание. Принимая
во внимание данные, изложенные выше, а также в других разделах, мы долж-
ны признать, что это определение приложимо только к определенной системе,
включающей конкретный штамм вируса и вид растения-хозяина, причем
необходимо учитывать также способ инокуляции и условия выращивания
растений.
Ввиду того что партии продажных семян в различных сельскохозяй-
ственных районах отбираются по разным критериям, реакция на вирусную
инфекцию отдельных особей, принадлежащих к одной и той же разновид-
ности, может быть различной. Это создает дополнительные трудности при
идентификации штаммов по характеру симптомов вызываемой ими болезни
у растений определенной разновидности.
Спектр хозяев и генотип растения-хозяина
Проблема спектра хозяев вирусов в общем виде обсуждается в гл. XIX.
Спектры хозяев некоторых штаммов того или иного вируса могут быть весьма
сходными, ио могут и различаться. Так, многие штаммы ВТМ легко зара-
жают многие виды растений сем. Solanaceae и других семейств. У растений
сем. Cucurbitaceae заражение ВТМ вызывает лишь местные некрозы. Огуреч-
ные вирусы 3 и 4, которые считаются штаммами ВТМ, обычно заражают
только растения из сем. Cucurbitaceae, у которых они вызывают системную
реакцию.
Вполне возможно, что утрата способности вызывать инфекцию у того
или иного вида растения бывает связана с единичной мутацией. Были изу-
чены 12 азотистых мутантов томатного штамма ВТМ; один из них утратил
способность вызывать инфекцию томатов [427].
Часто штаммы, характеризующиеся различными спектрами хозяев,
вызывают различные симптомы болезни у некоторых общих растений-хозяев.
Однако это не всегда так. Например, четыре штамма ВТМ, неразличимые
по симптомам болезни у растений N. tabacum и у обычных сортов Lycopersicon
296
Глава XIII
esculentum, успешно дифференцируются по спектру хозяев при использовании
набора растении Lycopersicon, включающего два сорта L. esculentum и три
сорта L. peruvianum [1132]. Специфичность спектров хозяев этих штаммов
ВТМ контролируется, вероятно, РНК, а не структурным белком. Этот
вывод сделан на основании результатов опытов, в которых исследовали
спектр хозяев частиц, содержащих РНК одного штамма и структурный
белок другого. Оказалось, что спектр хозяев смешанной частицы идентичен
спектру хозяев штамма — донора РНК.
Известно, что три разновидности перца (Capsicum annuumL.) устойчивы
к природному штамму У-вируса картофеля, так как эти разновидности
гомозиготны по общему рецессивному аллелю. Куку [403] удалось выделить
различные штаммы У-вируса, обладающие специфичной вирулентностью для
каждой из разновидностей перца, устойчивых к природному штамму вируса.
Эти штаммы были выделены с использованием метода инокуляции прививкой
устойчивых разновидностей перца; присутствие вируса определяли через
несколько месяцев. Специфическая вирулентность новых изолированных
штаммов для растений перца поддерживалась путем последовательных пас-
сажей на растениях N. glutinosa и в меньшей степени на других видах
из рода Nicotiana.
Методы передачи
Различные полевые изоляты родственных вирусов могут передаваться
разными видами насекомых-переносчиков. Так, изоляты Нью-Йорк и Нью-
Джерси вируса желтой карликовости картофеля передаются различными
видами цикадок [202]. В гл. XVI указаны другие примеры специфической
передачи вирусов беспозвоночными.
Что касается механических способов передачи, необходимо иметь в виду
возможность возникновения дефектных вирусных штаммов, РНК которых
не защищена структурным белком. Успешная передача подобных штаммов
с помощью механических способов возможна лишь при особых условиях
защиты РНК от действия нуклеаз (например, в присутствии фенола или
при высоких значениях pH среды).
Интерференция между штаммами
Мак-Кинни [1121] показал, что после заражения штаммом зеленой мозаики
(ВТМ) у растений табака не появляются новые симптомы при последующем
заражении их штаммом желтой мозаики. Тунгу [1771], который повторил
опыты Мак-Кинни, не удалось выделить вирус желтой мозаики из листьев,
зараженных обоими этими штаммами. Эти результаты свидетельствуют
о том, что при смешанном заражении второй вирус не репродуцируется.
Саламан [1478] показал, что растения табака, инокулированные слабым
штаммом Х-вируса картофеля, оказываются иммунными к последующему
заражению сильным штаммом этого вируса даже в том случае, если вторую
инокуляцию производили через 5 дней после первой. Растения эти не приоб-
ретали иммунности ни к вирусам, не родственным вирусу ВТМ, ни к У-ви-
русу картофеля. Вскоре было показано, что описанное явление, получив-
шее несколько названий (перекрестная защита, антагонизм,интерференция),
очень распространено среди родственных вирусных штаммов. Особенно
отчетливо интерференция проявляется в том случае, когда первый штамм
вызывает относительно легкую форму системного заболевания средней
тяжести, а второй — местные некрозы. Результаты такого опыта поддаются
количественной оценке, так как число местных некрозов легко подсчитать.
Было время, когда явление, перекрестной защиты широко использовали
Изменчивость
297
для установления родства изолятов и штаммов вирусов, однако потом убе-
дились, что при интерпретации результатов подобных исследований необ-
ходимо соблюдать осторожность. При совместной инфекции растений штам-
мами, которые по многим признакам представляются несомненно родствен-
ными, в одних случаях наблюдается полная перекрестная защита, а в дру-
гих— лишь частичная. Нафото74этопоказанонапримере штаммов Х-вируса
картофеля, инфицирующих растения дурмана (Datura).
В группе штаммов Х-вируса картофеля, инфицирующих растения Datura,
по-видимому, имеет место корреляция между степенью перекрестной защиты
и степенью серологического родства [1168]. Имеются и другие данные, свиде-
тельствующие о высокой степени перекрестной защиты в случае близкород-
ственных штаммов и о неполной перекрестной защите между более отдален-
ными штаммами. Так, перекрестная защита обнаружена между близкород-
ственными штаммами ВТМ, однако более отдаленные от ВТМ по ряду свойств
огуречные вирусы 3 и 4 не интерферируют с ВТМ при инокуляции растений
огурца [1943].
Вест [18(5] исследовал защитное действие слабого штамма (Е) вируса
бронзовости томатов иа репродукцию сильного штамма (В). Растения ипоку-
лировалп штаммом В через 10 дней после инокуляции штаммом Е; при этом
штамм Е защищал растения от действия сильного штамма В, однако симп-
томы заболевания, вызываемого этим штаммом (Е) в условиях двойной
инфекции, были несколько более выраженными, чем в условиях одиночной
инфекции. Измерения сырой и сухой массы инфицированных листьев
также показали, что в этом случае имеет место неполная защита. Существует
несколько штаммов вирусов, между которыми перекрестная защита вовсе
отсутствует. Так, при заражении растений Samolus parviflorus (Raf.) раз-
ными штаммами вируса курчавости верхушки сахарной свеклы интерферен-
ции не наблюдалось [159]. Тот факт, что между некоторыми неродственными
вирусами имеет место достаточно отчетливо выраженная интерференция,
также придает неоднозначность результатам тестов, использующих явление
перекрестной защиты в качестве критерия при определении родства вирусных
штаммов (гл. XII).
В большинстве ранних работ, в которых изучалось явление перекрестной
защиты, растения обычно заражали сначала слабым штаммом, а затем
сильным, вызывающим образование дискретных некротических или хлороти-
ческих местных поражений. Интерференцию между родственными штаммами
можно продемонстрировать и путем инокуляции растений смешанным иноку-
лумом, содержащим вирусы или штаммы, один из которых или оба вызывают
образование местных некрозов. На фото 73 показана интерференция типич-
ного штамма ВТМ со штаммом, вызывающим хлоротические местные пора-
жения. Результатом интерференции является уменьшение числа местных
некрозов. Это показано для штамма Uj ВТМ в присутствии возрастающих
концентраций штамма VM и в присутствии вируса некроза табака. Пораже-
ния, вызываемые штаммом VM, легко отличите от поражений, вызываемых
штаммом Ui на листьях растений N.'glutinosa, по их малым размерам (фиг. 51).
В таких опытах для верной интерпретации результатов необходимо
точно знать, что наблюдаемое уменьшение числа местных поражений
не связано с уменьшением размеров поражений до пределов видимости
невооруженным глазом [759].
Присутствие в инокулуме неинфекциониого вирусного белка или инак-
тивированного вируса также может привести к уменьшению числа некрозов.
Существуют указания на то, что этот тип интерференции обусловлен особым
механизмом. Так, By и др. [1945] показали, что для того, чтобы вызвать
интерференцию такой же степени, какую вызывает инфекционный штамм
ВТМ, инактивированный ВТМ или структурный белок должны присутство-
298
Глава XIII
Фиг. 51. Иптерфорепцпя между Двумя
штаммами ВТМ, индуцирующими мест-
ные некрозы при совместной инокуля-
ции растений N. glutinosa [1942].
Концентрация штамма Ui в инокулуме сохра-
нялась постоянной, концентрация штамма
VM сменялась (II). Неродственный вирус
некроза табака (I) в таких же концентрациях,
как и штамм VM, не влияет иа число мест-
ных некрозов, индуцированных штаммом Uj.
Концентрация вируса выражена в мкг/мл.
ватт, в 100—1000-кратном количестве. Эти авторы высказали предположение,
согласно которому неинфекционный вирусный материал интерферирует
с вирусом на стадии адсорбции, тогда как инфекционный вирус интерферирует
на ранних стадиях процесса репликации.
Степень интерференции между вирусными штаммами смешанного ипо-
кулума оказывается значительно выше при использовании экстрактов инфи-
цированных листьев, а ие очищеггных вирусных препаратов (см., например,
[1762]). Факторы, способствующие такому усилению интерференции, ие иден-
тифицированы, однако есть основания полагать, что в неочищенных экстрак-
тах присутствуют нестабильные вирусоспецифичиые белки, нарушающие
репродукцию инфекционного вируса.
В тех случаях, когда оба вирусных штамма, присутствующих в иноку-
луме, вызывают системную реакцию инфицированного растения, степень
доминирования того или другого штамма определяется рядом факторов.
Так,' было обнаружено, что частота появления симптомов, вызываемых
штаммом U2 ВТМ, при совместной инокуляции со штаммом Uj зависит
от соотношения Uj. : U2 в инокулуме, от концентрации инокулума и от числа
инокулированных листьев растения [391].
В большинстве работ по перекрестной защите использовали механи-
ческие способы передачи вирусов. Явление перекрестной защиты обнаружено
также в тех случаях, когда вирусы передаются насекомыми-переносчиками.
Харрисон [716] обнаружил, что заражение растений слабым штаммом вируса
скручивания листьев картофеля создает устойчивость к заражению сильным
штаммом этого вируса, который переносится тлей Myzus persicae (Sulz).
Заражение проростков овса авирулентным штаммом вируса желтой карли-
ковости ячменя (штамм MAY) защищает растения от последующего заражения
одним из сильных штаммов — CV или SIV, переносимых тлями Macrosiphum
avenae (Fab.) и Rhopalosiphum padi (L.) [863]. В этой же работе сообщалось
о феномене взаимного исключения одного штамма другим. Болезнь разви-
валась лишь в том случае, если очень молодые растения инокулировали
любой парой штаммов. Если же растения инокулировали всеми тремя
штаммами одновременно, появлялись очень слабо выраженные симптомы,
за которыми наступало полное выздоровление, причем в этих здоровых расте-
ниях обнаружить вирус не удавалось. Если через месяц после этого растения
вновь инокулировали одновременно тремя штаммами, развивалась очень
тяжелая форма болезни. Механизм описанного явления не известен, однако,
по-видимому, оно как-то связано с близким родством между штаммами,
По поводу интерференции между вирусными штаммами в организме
беспозвоночных животных-переносчиков Харрисон высказал предположе-
ние, что штаммы вирусов, способные репродуцироваться в организме пере-
Изменчивость
299
носчика, подавляют передачу других штаммов, однако переносчик может
одновременно передавать несколько штаммов вирусов, не репродуцирующихся
в его организме. Так, было обнаружено, что цикадка, питающаяся па расте-
нии, инфицированном одним штаммом вируса курчавости верхушки сахар-
ной свеклы, позднее оказывалась способной переносить и другой штамм
вируса [626]. Аналогичная ситуация обнаружена и для вируса скручивания
листьев: переносчик — тля Myzus persicae оказалась способной успешно пере-
давать два штамма вируса [716]. Гипотезы, постулирующие механизмы пере-
крестной защиты, рассматриваются в этой главе далее.
Накопление вирусов в инфицированных растениях (продуктивность)
Различные штаммы вируса могут в различных количествах накапли-
ваться в данном растении при стандартных условиях [1841] (табл. 16). Из этих
данных следует, что типичный штамм ВТМ обладает наибольшей продуктив-
ностью; продуктивность же других природных штаммов варьирует в широ-
ких пределах, доходя до 0,1 величины, характеризующей продуктивность
типичного штамма.
Таблица Тв
Продуктивность природных штаммов ВТМ в местных некрозах,
развивающихся в инфицированных растениях TV. tahaeum сорта Ксанти [1841]
Штамм 11 мело исследсшап- пы х местных некрозов Средняя продуктивность 1) Диапазон иродуктинпостп
Типичный штамп ВТМ 18 69 32-144
Зеленый аукуба 14 30 5—98
Маскированный 14 18 3—39
Подорожниковый Холмса 22 15 4—43
Желтый аукуба 9 8 1—16
G-T AMV 17 5 2-13
1) Указано число местных некрозов, выаыпаемых вирусом, содержащимся в одном некрозе (•
Продуктивность индуцированных мутантов также варьирует в широких
пределах, всегда, однако, оставаясь иа более низком уровне, чем продуктив-
ность типичного штамма ВТМ. Некоторые из индуцированных мутантов
вызывают тяжелые формы болезни, однако никакой корреляции между
тяжестью симптомов и продуктивностью вируса не установлено. Интенсив-
ность репродукции данного мутанта при последовательных пассажах доста-
точно постоянна, на основании чего можно сделать вывод, что продуктив-
ность представляет собой генетически устойчивый признак штамма. Мута-
ции, индуцированные воздействием химических веществ, достаточно часто
приводили к появлению у вируса способности вызывать более тяжелые формхя
болезни и очень редко (если это вообще имело место) — к увеличению про-
дуктивности. Кассанис (личное сообщение) выделил из типичной культуры
ВТМ штаммы, вызывающие медленно распространяющиеся ярко-желтые
местные поражения (обычно без последующего системного инфицирования)
на листьях растений табака сорта Уайт Барли (фото 73). Содержание вируса
в подобных поражениях оказалось чрезвычайно низким: экстракт одного
некроза вызывал образовавапие около 10 местных некрозов иа листе расте-
ний табака сорта Ксанти или Уайт Барли, что соответствует примерно 0,01
продуктивности наименее урожайного из штаммов, перечисленных в табл. 16.
Такие штаммы очень трудно поддерживать в лаборатории, и они никогда не
сохраняются в природных условиях.
300
Глава. XIII
Удельная инфекционность
Боудэн и Пири [123] показали, что инфекционность, рассчитанная
на единицу массы очищенного препарата типичного штамма ВТМ, выше, чем
инфекционность штамма, инфицирующего растения Datura. В качестве хозяи-
на авторы использовали в этих опытах растения N. glutinosa. При этих же
условиях «табачная» форма штамма ВТМ, инфицирующего растения коровьего
гороха, оказалась примерно в 10 раз более инфекционной, чем «фасолевая»
форма этого штамма. Причины этих различий неизвестны. Однако некоторые
данные позволяют думать о том, что они как-то связаны со структурным
белком. Френкель-Конрат и Зингер [537] установили, что удельная инфек-
ционность штамма HR составляет около 5 % удельной инфекционности типич-
ного штамма ВТМ. Однако удельная инфекционность смешанных частиц,
содержащих структурный белок типичного штамма, а РНК штамма HR,
оказалась примерно в 4 раза выше удельной инфекционности штамма HR.
Реконструированные частицы ВТМ обычно характеризуются более низкой
удельной инфекционностыо по сравнению с нормальными частицами. Причи-
на повышения удельной инфекционности смешанных частиц, содержащих
РНК штамма HR, в присутствии белка типичного штамма не ясна; быть может,
это связано с тем, что реконструированные частицы такого типа легче под-
вергаются депротеинизации in vivo по сравнению с нормальными частицами
штамма HR.
Чувствительность к различным агентам
Вирусные штаммы часто обладают различной устойчивостью к таким
инактивирующим воздействиям, как нагревание, УФ-облучение и хранение.
Возможно, степень чувствительности вирусов к инактивации отражает струк-
турные различия между штаммами, однако детально этот вопрос не изучен.
Так, штамм Uj ВТМ в 5 раз более устойчив к действию УФ-облучения, чем
штамм U2, но степень чувствительности свободных РНК обоих штаммов оди-
накова и равна чувствительности менее устойчивого к облучению штамма
[1580]. Чувствительность частиц штамма Uj, реконструированных in vitro,
не восстанавливается до уровня чувствительности исходного вируса.
ВЗАИМОСВЯЗЬ МЕЖДУ СТРУКТУРОЙ И БИОЛОГИЧЕСКОЙ
АКТИВНОСТЬЮ ВИРУСОВ
В настоящее время представляется несомненным, что изучение собственно
структуры вирусных частиц не дает возможности полностью осмыслить
взаимосвязь между структурой вируса и его биологической активностью,
поскольку данные о структуре вирусной частицы не содержат информации
относительно природы неструктурных белков, кодируемых вирусной РНК.
Кроме общих соображений о существовании вирусоспецифичной РНК-поли-
меразы, мы ничего не знаем даже о числе неструктурных белков ни у одного
из вирусов растений, не говоря уже об отсутствии сведений об их строении
и функциях. Тем не менее начаты сравнительные исследования вирусных
штаммов с целью получить некоторые указания относительно взаимозависи-
мости между структурой вирусной частицы и ее биологической активностью.
Так, при сравнении известных последовательностей аминокислот в структур-
ном белке природных штаммов и мутантов ВТМ было обнаружено, что неко-
торые участки полипептидных цепей различных структурных белков одина-
ковы (например, 10 аминокислот в положениях 113—122 и 8 аминокислот
Изменчивость
301
в положениях 87—94) [1929]. Возможно, эти участки могут иметь существен-
ное значение для функции структурного белка. Фон Сепгбуш [1848] устано-
вил некоторую корреляцию между замещениями аминокислот в структурном
белке ВТМ и характером вызываемых вирусом симптомов болезни. Например,
замещение серин-»-фенилаланин 7 раз встречалось в трех разных положениях
и всегда коррелировало со сверхчувствительностью растения N. tabacum
(сорт Ява) или N. sylvestris. Значение обнаруженной корреляции еще не
выяснено.
Дефектные штаммы
Почти все из упомянутых в этой главе химически индуцированных мутан-
тов 13ТМ можно считать дефектными в том смысле, что они в процессе репро-
дукции образуют меньше вирусных частиц, чем родительский штамм. Эти
мутанты были взяты для исследования потому, что из образующихся частит!,
можно было выделить структурный белок для изучения аминокислотных
замещений. Около ®/s мутантов, идентифицированных по симптомам болезни,
не содержали никаких изменений в структурном белке. Причина понижен-
ной продуктивности многих мутантных штаммов ие известна. Вполне воз-
можно, что в РНК-полимеразе или каком-либо другом вирусоспецифичном
ферменте происходит замещение той или иной аминокислоты, что приводит
к снижению функциональной активности фермента и как результат — к сниже-
нию урожая вируса. Мутация, приводящая к синтезу нефункционирующей
РНК-лолимеразьт, должна быть летальной, так как в этом случае вирусная
РНК по синтезируется, мутация же, приводящая к нарушению функции
структурного белка, может и ие быть летальной, если каким-то образом
будет обеспечена сохранность вирусной РНК внутри клетки. Несколько
мутантов такого рода были выделены.
Зигель и др. [1582] обнаружили в популяции частиц ВТМ (штамм U.,),
сохранивших активность после обработки азотистой кислотой, частицы,
вызывающие местные некрозы в соответствующих растениях-хозяевах,
однако выделение вируса в инфекционной форме из зараженных растений
с помощью обычных методов оказалось невозможным. Из мутантов, обладаю-
щих этими свойствами, наиболее изучены изоляты РМ1 и РМ2, которые вызы-
вают на листьях растений табака образование желтых местных поражений;
системное распространение происходит медленно и неравномерно. По чув-
ствительности к действию рибонуклеазы и по характеру распределения
в гомогенатах листьев инфекционный агент, присутствующий в листьях,
инфицированных этими мутантами, напоминает свободную РНК ВТМ.
В осветленных экстрактах листьев растений, инфицированных штаммом
РМ2, содержится достаточно большое количество белка, который реагирует
с антисывороткой к ВТМ и ведет себя подобно Х-белку ВТМ и в других отно-
шениях. При взаимодействии с РНК штамма Ui этот белок, однако, не обра-
зует вирусных частиц. Зайтлин и Феррис [1974] обнаружили, что при
pH 5,3 белок штамма РМ2 агрегирует с образованием длинных и гибких
открытых спиральных структур, а ие компактных палочкообразных частиц
(фото 75).
В экстрактах листьев, инфицированных штаммом РМ1, белок с анало-
гичными свойствами обнаружить не удалось [1582], однако Париш и Зайтлин
[1313] выявили в таких экстрактах антиген, серологически родственный
ВТМ. Этот антиген седиментировал при значительно меньших скоростях,
чем белок ВТМ и Х-белок, что объясняется, вероятно, большими размерами
белковых агрегатов, а не адсорбцией белка па клеточных структурах. Анти-
ген растворялся в концентрированной уксусной кислоте и вновь осаждался
при ее удалении. На основании этих данных Париш и Зайтлин пришли к выво-
302
Глава XIII
ду, что в тканях растений, инфицированных штаммом РМ1, содержится
дефектный белок, формирующий в клетке крупные агрегаты. Цитологические
наблюдения подтвердили это предположение: в клетках, зараженных штам-
мом РМ1, был обнаружен гелеобразный материал, который окрашивался
аналогично вирусному белку [65]. В клетках, зараженных РМ2, вирусный
белок агрегировал с образованием длинных исчерченных игл и петель.
Зайтлин и Кэсуони [1978] показали, что инфекционность экстрактов
листьев, инфицированных штаммом РМ4, аналогичным штаммам РМ1 и РМ2,
после инокуляции сначала возрастает, а затем снижается, что отличает этот
штамм от типичного штамма ВТМ, инфекционность которого сохраняется
на высоком уровне. По мнению этих авторов, утрата этим штаммом инфекцион-
ности, наблюдаемая с течением времени in vivo, объясняется тем, что вирус-
ная РНК не защищена структурным белком от разрушения.
В структурном белке описанных дефектных штаммов встречаются заме-
щения одной или нескольких аминокислот [1927, 1979]. Так, в белке штамма
РМ2 обнаружены замещения в двух положениях: треонин в положении 28
замещен изолейцином, а аспарагиновая кислота в положении 95 — глутами-
новой. По-видимому, одна из этих аминокислот (а может быть, и обе) играет
важную роль, определяя характер «упаковки» белка вокруг вирусной РНК.
Раппапорт и Зайтлин [1395] обнаружили, что при температурах ниже
37 °C поведение растворимого белка штамма РМ2 отличается от поведения
белка типичного штамма ВТМ при диффузии в геле и иммуноэлектрофорезе.
При температуре выше 37 °C поведение белков обоих штаммов идентично.
Было высказано предположение, что в результате аминокислотных замеще-
ний белок штамма РМ2 пе способен формировать «правильные» агрегаты при
температурах ниже 37 °C; при температурах выше 37 °C и нормальный и му-
тантный белки дезагрегируют, причем конформации полипептидиых цепей
обоих типов оказываются сходными.
Описанные мутанты можно разделить па два больших класса в зависимо-
сти от того, к каким последствиям приводят замещения аминокислот в струк-
турном белке: к первому классу относятся мутанты, имеющие нефункциональ-
ный растворимый структурный белок (РМ2, РМ5 иРМб); ко второму классу —
мутанты, имеющие нефункциональный нерастворимый белок (РМ1 и РМ4).
Белки мутантов второго класса имеют несколько аминокислотных замещений
и не могли возникнуть в результате обработки РНК азотистой кислотой
[1975].
Были выделены также и температурочувствительные мутанты ВТМ
[877]. Структурный белок мутантов этого типа утратил способность нормально
агрегироват!. при повышенных температурах (30—35°), по сохраняет эту
способность при 20—25 °C. Частицы, образовавшиеся с участием этого белка
при низких температурах, выдерживают нагревание (60°) в течение 10 мин.
Это свидетельствует о том, что для мутантного белка характерно нарушение
процесса агрегации, а не образование менее устойчивых к температуре вирус-
ных частиц. В белке большинства температурочувствительных мутантов
обнаружены аминокислотные замещения. Вместе с тем в структурных белках
мутантов Ni2516 и Ni2519 такие замещения отсутствовали. In vivo оба эти
мутанта ведут себя подобно другим мутантам, однако in vitro структурные
белки этих мутантов агрегируют нормально как при низких, так и при высо-
ких температурах. Вероятно, мутация, приводящая к замещению аминокис-
лоты, происходит в той части РНК этих мутантов, которая кодирует фермент,
имеющий отношение к репродукции вируса [878, 1928].
Нестабильные варианты описаны также у вирусов, не родственных
ВТМ (например, у вируса некроза табака) [53, 953].
Изменчивость
303
Структура вирусных частиц и специфичность
в отношении хозяина
Химические механизмы, определяющие специфичность вирусов в отно-
шении хозяина, неизвестны, однако исследования Уонга и Найта [1861]
свидетельствуют о том, что в ряде случаев приуроченность природных штам-
мов к тем или иным растениям может коррелировать со специфическим харак-
тером структурного вирусного белка. Авторы исследовали 13 изолятов ВТМ,
полученных из растений томатов, выращенных в полевых условиях в ряде-
стран. Судя по аминокислотному составу и пептидным картам, структурные
белки всех этих изолятов очень близки. Особый интерес представляет тот
факт, что, во-первых, С-концевой аминокислотой в структурных белках
всех изолятов оказался серии, а не треонин, как это имеет место в белках
большинства штаммов ВТМ, и, во-вторых, в белках всех изолятов присут-
ствовал метионин, тогда как типичный штамм ВТМ метионина не содержит.
Указанные особенности структурных белков исследованных изолятов, по-ви-
димому, не играли определяющей роли в способности этих вирусов инфици-
ровать растения томатов, так как и типичный штамм ВТМ успешно инфици-
рует растения этого вида. Однако эти особенности структурных белков свя-
заны, очевидно, с некоторыми неизвестными свойствами томатных штам-
мов, способствующими их выживанию в полевых условиях при инфициро-
вании этого растения-хозяина. В отличие от томатных штаммов аминокислот-
ный состав белков семи орхидных изолятов ВТМ варьировал в широких
пределах: состав структурных белков одних изолятов оказался очень близ-
ким составу белка типичного штамма ВТМ, а в белке других изолятов были
обнаружены многочисленные аминокислотные замещения [908]. Возможно,
вариации аминокислотного состава связаны со специфической ассоциацией
данного штамма с тем или иным родом орхидных, однако для того, чтобы
сделать обоснованный вывод о том, что различия аминокислотного состава
отражают адаптацию штамма к данному виду растения-хозяина, необходимы
дополнительные исследования.
Число и локализация вирусных генов
На первый взгляд представляется, что число биологических свойств,
таких, например, как характер симптомов, вызываемых штаммами вируса
(в частности, ВТМ) у тех или иных растений-хозяев, достаточно велико.
Число таких свойств и степень их независимых изменений изучены недоста-
точно. Прайс [1362] детально изучил в этом отношении 14 штаммов ВТМ.
Он выделил шесть различных свойств, в том числе и характер симптомов,
вызываемых вирусом у некоторых растений-хозяев, причем все эти свойства
наследовались независимо одно от другого. Взаимосвязь этих свойств виру-
сов с действием вирусоспецифичиых белков еще ждет своего исследо-
вания.
В настоящее время пе представляется возможным использовать для
построения генетической карты вирусов растений методы, успешно применяе-
мые в исследованиях бактериофагов и некоторых вирусов животных. Быть
может, открытие многокомпонентных систем позволит провести подобного
рода генетический анализ (гл. VIII).
Прямой подход к решению вопроса о последовательности генов в цепи
вирусной РНК предложили Кадо и Найт [906]. Они воспользовались тем
благоприятным обстоятельством, что с помощью додецилсульфата натрия
можно постепенно отщеплять с одного конца палочки ВТМ белковые субъеди-
ницы (первым «обнажается» З'-ОН-коиец РНК) [1192]. В своей работе Кадо-
304
Глава Х.Ш
и Найт использовали штамм ВТМ, который оРычно вызывает системное
заболевание растений N. syluestris. В результате обработки азотистой кисло-
той этот штамм образует мутанты, индуцирующие на этом растении только
местные некрозы. Общее количество активного вируса в препаратах рассчи-
тывали по числу местных некрозов, возникающих при заражении растеши"!
N. tabacum, сорт Ксаити. Затем готовили препараты ВТМ, в той или иной
степени депротеинизированные с З'-ОН-конца; длину частиц контролировали
с помощью электронного микроскопа. Полученные препараты подвергали
кратковременному воздействию азотистой кислоты в условиях, при которых
реагировали только свободные участки РНК, участки же, заключенные
в белок, в реакции не участвовали. Авторы ожидали обнаружить увеличение
частоты мутаций в тот момент, когда отщепляющийся белок обнажит участок
РНК, ответственный за возникновение некрозов. В этих опытах частота мута-
ций оставалась низкой до тех пор, пока ие менее 60% РНК оказывались
доступными действию мутагена. Хотя эти данные не могут быть точными, они
дают основание полагать, что ген, контролирующий местный тип реакции
инфицированных растений JV. sylvestris, расположен в той половине моле-
кулы вирусной РНК, которая включает 5'-ОН-конец (фиг. 52, отмечено
скобкой).
Кадо и Найт [907] использовалитот же метод полярного отщепления струк-
турного белка ВТМ и для приблизительной локализации цистрона белка
оболочки. Авторы исходили из предположения, согласно которому фрагменты
РНК типичного штамма ВТМ должны синтезировать собственный структур-
ный белок при заражении растений совместно с целыми вирусными части-
цами штамма, имеющего структурный белок другого типа (штамм HR). Этот
штамм должен был играть роль помощника, выполняющего функции, отсут-
ствующие у фрагментов типичного штамма. Это предположение оправдалось.
Авторы инокулировали растение штаммом HR совместно с фрагментами части
типичного штамма, полученными в результате отщепления того или иного
количества структурного белка и последующего удаления свободных кон-
цов РНК с помощью рибонуклеазы. Присутствие в инфицированных тканях
структурных белков типичного штамма и штамма HR определяли с помощью
серологических методов (эти белки легко дифференцируются серологически).
Оказалось, что фрагменты, утратившие 48—52% белка, индуцируют синтез
белка типичного штамма, а фрагменты, утратившие 72—90% белка, такой
способностью не обладают. Отсюда следует, что цистроп структурного белка
ВТМ располагается в той половине молекулы РНК, которая включает
б'-ОН-конец.
В гл. IV обсуждались результаты Менделеев [1140], который использо-
вал метод частичной депротеинизации с. целью приблизительной локализации
трех длинных полинуклеотидов, образуемых при обработке РНК ВТМ
рибонуклеазой Т1. Известная или предполагаемая локализация различных
структур в РНК ВТМ представлена на фиг. 52.
5'1-Ю
______д_____в С
................118
0,9 0,8 0,7 0.6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1
-г-ц-ц-ц-д
/-ОН2'
'-ОН0’
Фиг. 52. Локализация различных химических и биологических структур в РНК ВТМ
Участки А, В и С соответствуют трем уникальным полирибонуклеотидам [1140]. Участки А и В содер-
жат примерно по .30 нуклеотидных остатков каждый, участок С — около 70. Каждый из участков пред-
ставлен черной чертой, ее ширина приблизительно соответствует масштабу, в котором изображена
полирибоиунлеотидная нить РНК, а полная длина ее составляет 6400 оснований. Приблизительная
локализанпя днух биологических функций представлена па основе работ Надо и Найта [906, 907].
Изменчивость
305
ВИРУСНЫЕ ШТАММЫ В РАСТЕНИИ
В этом разделе мы обсудим различные механизмы взаимодействия вирус-
ных штаммов в растении, а также различные типы взаимодействий между
отдельными штаммами вируса и растением-хозяином. Взаимоотношения
штаммов вирусов с беспозвоночными животными-переносчиками обсуждаются
в гл. XVI, а роль этих взаимоотношений в экологии вирусов — в гл. XVII.
Генетическая рекомбинация
Впервые генетическая рекомбинация у вирусов была обнаружена при
исследовании крупных ДНК-содержащих бактериофагов (например, Т2),
инфицирующих Е. colt. В этих исследованиях бактерии инфицируют двумя
мутантными штаммами одновременно и при равных множественностях зара-
жения. Эти два штамма отличаются по крайней мере по двум легко иденти-
фицируемым генетическим маркерам. Затем исследуется потомство фагов,
и если часть его содержит оба маркера, считается, что имела место рекомби-
нация между двумя фагами. Частота рекомбинации измеряется отношением
числа рекомбинантных частиц к общему числу частиц, образовавшихся при
скрещивании. Частота рекомбинации зависит от расстояния между марке-
рами, условий эксперимента (в особенности от числа скрещиваний к моменту
анализа потомства), а также от множественности заражения и от соотноше-
ния двух штаммов в инокулуме.
Некоторое время предполагали, что явление рекомбинации ограничено
только вирусами, содержащими в качестве генетического материала ДИК.
Однако были получены доказательства рекомбинации между штаммами
некоторых вирусов животных, содержащих одноцепочечную РНК (см. обзор
Фэппера [513]). Возможно, хотя прямые экспериментальные данные, свиде-
тельствующие в пользу этого предположения, отсутствуют, в акт рекомби
нации вступают молекулы вирусной РНК, находящиеся в процессе реплика-
ции в двухцепочечной форме. Аналогичные эксперименты с вирусами расте-
ний малочисленны вследствие технических трудностей, па которые наталки-
ваются попытки предпринять подобного рода опыты. Тем не менее Бесту
удалось получить данные, свидетельствующие о рекомбинации между штам-
мами вируса броизовости томатов [185—188, 190, 191].
Бест работал с двумя полевыми штаммами этого вируса, различающи-
мися по типу симптомов, вызываемых ими на трех растениях-хозяевах (силь-
ный штамм А и штамм Е, вызывающий легкую форму болезни). Очищенные
изоляты этих штаммов получали из единичных местных некрозов, образую-
щихся в результате инокуляции растений очень разведенными препаратами
вирусов. Растения томатов, табака и N. glutinosa заражали смешанным ипо-
кулумом, содержащим оба штамма. Брали образцы тканей заболевших расте-
ний и выделяли вирусы из единичных местных некрозов. Среди полученных
изолятов были обнаружены новые штаммы, отличные от исходных штаммов
А и Е. По своему характеру симптомы, вызываемые этими изолятами, пред-
ставляли собой комбинацию некоторых особенностей симптомов, специфич-
ных для каждого из использованных штаммов. Полученные изоляты под-
держивались последовательными пассажами в течение ряда лет.
Бест проанализировал вопрос о том, не являются ли новые штаммы спон-
танными мутантами. В растениях, зараженных только штаммом А, мутанты
вообще не обнаруживались; при заражении растений штаммом Е отдельные
мутанты обнаружились, но они отличались от штаммов, выделенных при
описанной выше смешанной инфекции (А + Е). Кроме того, частота появле-
ния мутантов при одиночной инфекции штаммом Е составляла всего 0,01 час-
20-0893
306
Глава XIII
тоты возникновения новых штаммов при смешанной инфекции (А Е)1
[190].
Результаты описанных экспериментов свидетельствуют в пользу пред-
положения о возможности рекомбинации между штаммами вируса бронзо-
вости томатов, но не доказывают этого. Далее Бест [190] предположил, что
в результате «возвратного скрещивания» рекомбинантного штамма с одним
из родительских штаммов в потомстве должен появиться второй родительский
штамм. Автор утверждает, что это предположение оправдалось. Проведение
подобного рода экспериментов с гаплоидными организмами, по-видимому,
бессмысленно.
Были предприняты попытки выделить рекомбинанты при совместном
заражении растений некоторыми другими вирусами. Интересна работа Уот-
сона [1874], результаты которой свидетельствуют о возможности рекомбина-
ции между Y- и С-вирусами картофеля, причем рекомбинируют маркеры,
контролирующие поведение вируса в растении и в организме насекомого-
переносчика. Тем не менее результаты, представленные в этой и в другой рабо-
те (см. [1764]), не являются несомненным доказательством того, что рекомби-
нация действительно имеет место. Данные об экспериментальном получении
«смешанных» штаммов в опытах с многокомпонентными вирусами обсуждаются
в гл. VIII.
В случаях заражения бактерий облученными УФ-бактериофагами при
достаточно высокой множественности образуется значительно больше нор-
мальных вирусных частиц, чем этого можно было бы ожидать. Объясняли
это тем, что между двумя вирусными частицами, несущими дефект в различ-
ных локусах и инфицирующих одну и ту же клетку, происходит рекомбина-
ция, приводящая к образованию нормальных вирусных частиц. Такахаси
и др. [1731] представили данные, свидетельствующие о том, что аналогичное
явление множественной реактивации имеет место при заражении растений
N. glutinosa РНК ВТМ, инактивированной УФ-облучением; при пользова-
нии интактным вирусом это явление не обнаружено.
Механизм перекрестной защиты
Существует общепринятая точка зрения, согласно которой иммунность,
растения к вирусу связана с присутствием в тканях защищающего вируса..
Если по какой-либо причине растение или его часть освобождается от защи-
щающего вируса, растение приобретает восприимчивость как к повторному
заражению защищающим штаммом, так и к инфекции другими штаммами.
Таким образом, проблема перекрестной защиты близко связана с вопросом
о том, могут ли два родственных вируса заражать одну и ту же клетку и реп-
родуцироваться в ней. Для того чтобы дать определенный ответ па постав-
ленный вопрос, необходимо, заразив одну и ту же клетку двумя штаммами
одновременно или последовательно, исследовать природу штаммов, образую-
щихся в таких клетках. В настоящее время провести подобные эксперименты
с вирусами растений не представляется возможным.
Эксперименты, наиболее близко отвечающие требованиям поставленной
задачи, провел Бенда [148]. Он вводил два штамма ВТМ (типичный и аукуба)
в одну и ту же клетку листового волоска N. glutinosa. Через 4 дня после
этого экстрактами пораженных тканей инокулировали листья индикаторного
растения. В опытах были исследованы 29 некрозов, в 14 был обнаружен только-
типичный штамм ВТМ, в одном — только штамм аукуба, а в 5 — оба штам-
ма. Эти данные могут служить доводом в пользу предположения о возможно-
сти совместной репродукции двух штаммов вирусов растений в одной клетке,,
однако не являются несомненным доказательством этого положения. По мне-
Изменчивость
307
пито Бенда, вирус мог переместиться из первично инфицированной клетки
в соседние до того, как'начался процесс его репродукции, так что в смешан-
ном некрозе могут оказаться клетки, в которых репродуцируется либо тот,
либо другой штамм, но не оба вместе.
Проведя количественное изучение ингибирующего действия системного
штамма ВТМ на появление некрозов, вызываемых некротическим штаммом
ВТМ у растений N. glutinosa, Зигель [1575] пришел к выводу, что получен-
ные данные соответствуют простой модели, в основу которой положен ряд
допущений, в том числе идея о том, что одна-едииственная частица способ-
на индуцировать инфекционный процесс. Несмотря на то что неко-
торые из этих допущений сомнительны, представленные автором данные
хорошо согласуются с предположением о том, что интерференция между
штаммами проявляется на очень ранних стадиях инфекции.
Аналогичная система была исследована Раппапортом и By [1393], кото-
рые использовали метод дифференциальной инактивации двух УФ-облучен-
пых штаммов ВТМ. В этих опытах не было получено однозначного ответа
па вопрос о механизме взаимного исключения.
В гл. IX суммированы данные, свидетельствующие о том, что в мозаич-
ных листьях растений китайской капусты, зараженных ВЖМТ, каждый
отдельный островок мозаичной ткани представляет собой клоп, развив-
шийся из одной клетки или группы клеток, инфицированных на ранней ста-
дии онтогенеза листа одним вирусным штаммом. Если принять основное допу-
щение, высказанное в этой работе, согласно которому специфический харак-
тер поражения хлоропластов может служить указанием па присутствие
в клетках того или иного штамма вируса, тогда картина развивающегося
мозаичного заболевания служит строгим подтверждением того, что делящиеся
клетки или группы клеток листьев растений китайской капусты инфицируют-
ся только одним штаммом ВЖМТ, причем этот штамм может исключить
другие из этой клетки и ее потомства. Вместе с тем, если примять, что между
штаммами возможна генетическая рекомбинация, необходимо допустить, что
два штамма должны инфицировать одну и ту же клетку и репродуцироваться
в пей совместно, по крайней мере некоторое время. Описанные в гл. VIII
результаты экспериментов со смешанными штаммами доказывают, что в
клетке, в которой присутствует одна часть генома многокомпонентного
вируса, может репродуцироваться другая часть генома родственного
штамма.
Таким образом, в настоящее время мы не можем дать определенного
ответа на этот вопрос. Вполне возможно, что в делящихся клетках существует
некий механизм, способствующий репродукции только одного штамма, вслед-
ствие чего эта клетка и ее потомство оказываются инфицированными исклю-
чительно этим штаммом. В зрелых клетках этот механизм, по-видимому,
отсутствует и оба штамма могут, по крайней мере некоторое время, репроду-
цироваться в одной клетке совместно.
Для объяснения явления перекрестной защиты было предложено
несколько гипотез, которые последовательно обсуждаются ниже.
Идея одной из гипотез сводится it тому, что в процессе репродукции
один штамм использует незаменимые метаболиты, в которых нуждается для
своей репродукции и второй штамм. По ряду причин это предположение мало-
вероятно. Ввиду того что по крайней мере все мелкие вирусы построены
в основном из одних и тех же аминокислот и нуклеотидов, специфичность
перекрестной защиты нельзя объяснить снижением содержания этих метабо-
литов. В нормально развивающихся растениях количество образовавшегося
вируса, возможно, не ограничено доступностью аминокислот и нуклеотидов.
Так, заражение растений табака ВТМ значительно стимулирует репродук-
цию Х-вируса картофеля (гл. XII). Садашван [1466] пришел к выводу о том,
20*
308
Глава XIII
что степень ингибирования репродукции штамма аукуба ВТМ типичным
штаммом ВТМ прямо пропорциональна количеств^ активного типичного
штамма, присутствующего в тканях растения к моменту инокуляции штам-
мом аукуба. Действительно, полученные этим автором результаты пока-
зали, что к 5-му дню после заражения растений типичным штаммом ВТМ
эффективность перекрестной защиты достигает 80% максимального значе-
ния, максимальное же увеличение концентрации типичного штамма ВТМ
наблюдалось лишь после 5-го дня. Результаты одного из экспериментов
Зигеля [15751 также свидетельствуют о том, что интенсивная репродукция
одного из интерферирующих штаммов не может быть единственной причи-
ной исключения другого штамма. При концентрации штамма Uj в смешан-
ном инокулуме, в 100 раз превышающей концентрацию штамма U2, число
местных некрозов, вызываемых штаммом U2 в растениях N. sylvestris, в силь-
ной степени снижалось. Если же растения инокулировали только штам-
мом U 2, а затем через 1ч — штаммом Ut в концентрации, превышающей
в 100 раз концентрацию U2, снижения числа местных поражений не наблю-
далось.
Вторая гипотеза предполагает синтез в инфицированных растениях
защитного вещества, аналогичного по функциям антителам, возникающим
в организме животных. Действительно, в экстрактах из зараженных расте-
ний было обнаружено какое-то вещество, обладающее ингибирующей актив-
ностью (это не был инфекционный вирус); однако нет оснований полагать,
что синтез этого вещества имеет какое-либо сходство с иммунным ответом,
описанным у животных, и что этот агент как-то связан с явлением перекре-
стной защиты. В растениях могут распространяться молекулы достаточно
большого размера, однако до сих пор не было обнаружено ничего, что хотя бы
отдаленно напоминало сложную систему органов и клеток, участвующих
в образовании антител у животных.
Третья гипотеза, выдвинутая Каванау [961], предполагает, что агрегаты
того или иного вируса внутри инфицированной клетки обладают определен-
ными «адсорбционными» свойствами. Попадающая в эту клетку частица
того же или достаточно близкого штамма адсорбируется на одном из таких
агрегатов. Эта гипотеза весьма привлекательна, однако требует ряда допу-
щений. Приходится допускать, что проникающая в клетку вирусная частица
должна оставаться интактной и обладать способностью перемещаться до тех
пор, пока не встретит на своем пути предсуществующий вирусный агрегат.
Такой ход событий легко представить себе в клетках, зараженных ВТМ,
в которых находятся правильно сформированные агрегаты вирусных палочко-
образных частиц. Труднее объяснить, почему явление перекрестной защиты
имеет место и в том случае, когда второй инфицирующий штамм находится
в форме свободной РНК. Возможно, проникшая в клетку молекула РНК
реагирует с предсуществующим в клетке вирусным структурным бел-
ком, образуя вирусную частицу еще перед’тем, как начнется процесс репли-
кации.
Согласно четвертой гипотезе, инфицирующий штамм исключается в ре-
зультате генетической рекомбинации с уже присутствующим в клетке штам-
мом. Такую идею высказал Бест [185, 186] для объяснения частичной защиты
и появления новых штаммов, обнаруженных в популяции вируса бронзо-
вости томатов. Этот механизм не объясняет всех известных особенностей
явления перекрестной защиты, хотя он и может играть существенную роль
при заражении растений вирусом бронзовости томатов и некоторыми другими
вирусами.
Наконец, было высказано предположение о наличии в клетке специфи-
ческих центров репликации вируса [94, 102]. Число подобных центров,
по-видимому, ограничено, и если все центры данного типа будут заняты
Изменчивость
309
вирусными частицами, то инфицирующий родственный штамм, для которого
необходимы те же самые центры, не будет репродуцироваться. Неродствен-
ным вирусам должны соответствовать другие центры репликации, так что
такие вирусы сохраняют способность репродуцироваться в клетках. Эта
общая идея согласуется с основными особенностями явления перекрестной
защиты, но до настоящего времени нет ясного представления ни о природе
вирусоспецифичпых центров в клетке, ни о том, какую роль играет структура
вирусной частицы в процессе «узнавания» центров того или иного типа. Спе-
цифичность взаимодействия вируса с внутриклеточными центрами реплика-
ции должна определяться: 1) вирусной РНК (и в этом случае играет роль
либо образование водородных связей в процессе взаимодействия вирусной
РНК с молекулами некоторой клеточной РНК, либо специфическое «узнава-
ние» вирусной РНК неких клеточных белков); 2) структурным белком или
особым белком, выполняющим функцию узнавания, находящимся в составе
вирусной частицы; 3) каким-то неструктурным белком, кодируемым вирус-
ной РНК и образующимся после заражения; этот белок может «узнать»
и запять те или иные центры в клетке, специфичные для данного вируса.
Джокуш [878] описал два мутантных штамма ВТМ, репродукция которых
при повышенной температуре подавлена. Структурный белок одного штамма
дефектен и накапливается при повышенной температуре. При 35 °C этот
штамм интерферирует с типичным штаммом ВТМ. Другой штамм, обладаю-
щий нормальным структурным белком, оказался температурочувствитель-
пым по некоторой функции, необходимой для репродукции. Этот штамм
не нарушал репродукции типичного штамма. Таким образом, представляется
вероятным, что интерференция между штаммами контролируется некоторой
функцией, не связанной с синтезом структурного белка.
Результаты экспериментов By [1941] свидетельствуют о том, что меха-
низм подавления репродукции одного штамма ВТМ другим при совместной
инокуляции ие связан с блокированием проникновения одного из штаммов
в клетку. В этих опытах было удачно использовано различие по двум приз-
накам между штаммами VM и Up Штамм VM более чувствителен к УФ-облу-
чению и вызывает образование мелких местных некрозов на листьях расте-
ний N. glutinosa, ио не вызывает видимых некрозов на листьях растений фасоли
сорта Пинто. Автор ииокулировал эти виды растений смесью двух штаммов
и затем подвергал инокулированные листья УФ-облучению в течение различ-
ных промежутков времени. При соответствующих условиях облучение при-
водило к увеличению числа местных некрозов, вызываемых штаммом Ut,
что, возможно, связано с инактивированием блокирующего штамма (VM).
Влияние облучения на образование местных некрозов штаммом Ut было
более эффективным в первые 2 ч после инокуляции; в промежутке между
двумя и девятью часами после инокуляции влияние облучения равномерно
снижалось до нуля. Подобный тип зависимости степени инактивации от вре-
мени облучения показан и для другого чувствительного к инактивации
штамма — U2 (гл. VII). Представленные результаты свидетельствуют о том,
что механизм блокирования репродукции штамма Uj штаммом VM связан
с ранними стадиями репликации вируса, а не с элиминацией зрелого вируса
из клетки.
Совершенно очевидно, что в настоящее время мы не знаем, каков меха-
низм взаимодействия вирусных штаммов в растительной клетке. Что касается
явления перекрестной защиты, то представляется вероятным, что в случае
различных вирусов могут действовать несколько описанных выше механиз-
мов, каждый из которых выражен в разной степени в определенных условиях.
Кроме того, определенную роль в явлении перекрестной защиты могут играть
пока не известные нам детали механизма репродукции вирусов.
310
Глава XIII
Избирательная репродукция вирусов в специфических
растениях-хозяевах
В ряде случаев обнаружено, что если данный вирус, свойства которого
очевидным образом пе изменяются при последовательных пассажах в дан-
ном растении-хозяине, перенести на другой вид растения и затем вновь ино-
кулировать им обычный вид растения, свойства этого штамма оказываются
измененными. Карснер [326] показал, что один пассаж на растениях Cheno-
podium murale может изменить свойства вируса курчавости верхушки сахар-
ной свеклы. Инокулирование таким вирусом растений сахарной свеклы вызы-
вает легкую форму болезни. Лэки [1035] обнаружил, что такое изменение
вируса обратимо и в результате пассажа на Stellaria media (L) вирус приоб-
ретает прежние свойства. По данным Саламана [1439], штамм Х-вируса карто-
феля, вызывающий ла листьях растений табака кольцевую пятнистость,
ипдуцирует в инокулировапных проростках свеклы только образование мел-
ких кольцевых некрозов. При инокуляции растений табака экстрактами
некротизированной ткани развивалась лишь слабо выраженная крапча-
тость. Обратную ситуацию описал Мэтыоз [1169]. Если Х-вирус картофеля,
вызывающий слабую крапчатость на листьях растений табака, пассировали
па Cyphomandra betacea, а затем вновь ииокулировали им растения табака,
то развивалось местное и системное заболевание типа кольцевой пятнистости.
Среди 19 исследованных видов семейства Solanaceae этот вид цифомаидры
оказался единственным способным вызывать подобное изменение Х-вируса
картофеля. Культуры использованного в этих экспериментах слабого вируса
содержали некоторое количество штаммов, вызывающих кольцевую пятни-
стость; штаммы эти, по-видимому, возникли в результате мутации. Было
высказано предположение, согласно которому эти штаммы более эффективно
репродуцируются в растениях Cyphomandra, что приводит к преобладанию
их в растениях этого вида. Штаммы, вызывающие кольцевую пятнистость,
накапливаются в растениях Cyphomandra в значительно большей степени,
чем в растениях табака: напротив, слабые штаммы, вызывающие крапчатость,
репродуцируются в растениях табака в 4—8 раз более эффективно, чем штам-
мы, вызывающие кольцевую пятнистость.
Джонсон [886] обнаружил, что в результате пассажа на растениях
Eryngium aquaticum L. сильный типичный штамм ВТМ вызывает у. расте-
ний табака лишь слабые симптомы. Этот автор показал, что сильный штамм
распространяется по тканям Eryngium очень медленно; этот вид растения
представляет собой как бы фильтр. В более подробной работе было иссле-
довано распределение трех штаммов ВТМ (U4, U5 и А) в тканях растений
Nicotiana glauca Grah. [1641]. Штамм Ui в природных условиях обычно
обнаруживается в растениях N. tabacum, однако он легко инфицирует
и N. glauca, хотя в природе редко присутствует в растениях этого вида.
Штаммы U5 и А в природных условиях присутствуют обычно в растениях
N. glauca. Солберг и Волд [1641] культивировали верхушки стебля инфици-
рованных растений, беря для опыта отрезки большей или меныпей длины,
и определяли присутствие в них вирусов. Эти опыты показали, что штамм
U5, перемещаясь по стеблю, подходит ближе к верхушке, чем штаммы Uj
и А. Вследствие этого при смешанной инфекции штамм U5 может элимини-
ровать штамм Uj из молодых листьев. Причина сохранения штамма А в расте-
ниях N. glauca достоверно не установлена. При инокуляции ВТМ растений
томатов, обладающих генетической устойчивостью к этому вирусу, про-
исходит очень медленная репродукция небольшого количества ВТМ. Через
некоторое время вирус хорошо адаптируется к условиям репродукции в пе-
рвоначально устойчивом хозяине [438]. Подобные изменения вируса могут
приводить к утрате полевой культурой устойчивости к вирусной инфекции.
Изменчивость
311
Штаммы вирусов, приспособленные к репродукции в том или ином хозяи-
не, характеризуются сходными физическими и химическими свойствами.
•Одно необычное исключение описал Боудэп [96, 99]. Штамм ВТМ, вызываю-
щий системное мозаичное заболевание растений коровьего гороха и других
видов бобовых, в результате пассажа на некоторых других видах, в частно-
сти иа растениях табака, быстро превращается в штамм с существенно иными
свойствами; исходный и новый штаммы различаются по характеру местных
некрозов, вызываемых ими па растениях N. glutinosa, по электрофоретической
подвижности и серологическим свойствам. По данным Риса и Шоота [1412],
структурный белок бобового штамма вируса отличается от штамма, получен-
ного путем пассажей на растениях табака, по аминокислотам в 23 положе-
ниях. Судя по опытам Боудэна, присутствие двух штаммов (в различных
количествах) в обоих видах растений маловероятно.
Биохимические механизмы, обеспечивающие отбор вирусных штаммов
при пассировании на том или ином виде растения, неизвестны. Эти механизмы
должны бытх> высокоспецифич тыми, так как известно, что таким образом мо-
гут отбираться достаточно близкородственные штаммы. Представляется мало-
вероятным, что отбор определяется различиями в потребностях у таких близко-
родственных штаммов в отношении аминокислот и нуклеотидов. Определенную
роль в процессе отбора может играть преимущественное и специфическое
связывание вирусной РНК, структурного или неких других вирусоспеци-
фичных белков компонентами клетки. Вряд ли эта специфичность опреде-
ляется вирусной РНК, так как известно, что в результате пассажа на дан-
ном: виде растения-хозяина может иметь место отбор между штаммами, РНК
которых различаются между собой одним или несколькими основаниями
из нескольких тысяч. Столь же маловероятна специфическая роль в отборе
структурного белка вирусной частицы, поскольку серологически идентичные
мутантные штаммы могут быть разделены в результате пассажа на соответ-
ствующем виде растения-хозяина. Таким образом, вполне возможно, что
в процессе специфического отбора вирусных штаммов определенным видом
растения-хозяина участвует какой-то неструктурный вирусоспецифичпый
‘белок (или белки).
Избирательная репродукция вирусов при различных условиях
окружающей среды
Из всех факторов окружающей среды, влияющих на репродукцию
вирусных штаммов, наиболее подробно изучалось действие температуры,
при которой выращивается растение-хозяин. Холмс [816] показал, что в стеб-
лях растений томатов и табака, инокулированных сильным штаммом ВТМ
и инкубируемых затем при 35 °C, обнаруживаются слабые штаммы ВТМ.
В этих условиях репродукция исходного сильного штамма полностью подав-
лена. Эти результаты были подтверждены другими авторами (см., например,
Кассапис [932]). Кассанис, кроме того, показал, что при 36 °C типичный
штамм ВТМ нестабилен в тканях растения и его концентрация в листьях
при этой температуре медленно снижается. В растениях, инфицированных
типичным штаммом ВТМ, при 35 °C накапливается избыточное количество
свободного вирусного структурного белка [1476]. Инкубируя листовые диски,
инфицированные типичным штаммом ВТМ в условиях постепенного повы-
шения температуры, Леберье и Хирт [1056] выделили термофильный штамм
этого вируса. При 35 °C репродукция типичного штамма происходила весьма
неинтенсивно, вирусный структурный белок накапливался в свободном
состоянии, параллельного накопления свободной вирусной РНК не отме-
чалось. Термофильный штамм хорошо репродуцировался при 36 °C, однако
не столь интенсивно, как типичный штамм при 16 °C. При 24 °C обнаружено
312
Глава XIII
накопление структурного белка термофильного штамма в свободном сос-
тоянии. Штаммы других вирусов также различаются по своей реакции на
повышение температуры (см., например, [56, 796]).
Результаты изучения искусственно индуцированных температурочув-
ствительных мутантов ВТМ, которые обсуждались выше, могут помочь
составить некоторое представление о механизме действия температуры на при-
родные штаммы вирусов. Штаммы, не способные эффективно репродуциро-
ваться при более высоких температурах, имеют аминокислотные замещения
либо в структурном белке, что не позволяет этому белку нормально участво-
вать в образовании палочковидных вирусных частиц, либо в том или ином
ферменте, программируемом вирусным геномом (например, в РНК-полиме-
разе), что приводит к неспособности фермента нормально функционировать
при более высоких температурах (или — в случае термофильных штаммов —
при более низких температурах).
Утрата вирусом инфекционности для определенного
растения-хозяина в результате пассажа через другое растение
Утрата вирусом инфекционности для определенного хозяина в резуль-
тате пассажа на другом хозяине часто встречается у вирусов животных.
В применении к вирусам растений это явление изучено мало, и мы не знаем,
насколько часто наблюдается подобный тип изменений вирусов. Несколько
Фиг. 53. ^Утрата инфекционности тремя штам-
мами Х-вируса картофеля в результате длитель-
ного культивирования на других растениях-
хозяевах [1167].
штаммов Х-вируса картофеля
в результате длительного пасси-
рования на растениях табака
утрачивает инфекционность для
растений картофеля (фиг. 53).
Утрата штаммом АР инфек-
ционности для картофеля не
сопровождалась изменением
симптомов заболевания, вызы-
ваемого этим штаммом у расте-
ний табака, N. glutinosa и
Datura. Причина изменения
спектра хозяев этого штамма
неизвестна; возможно, оно об-
условлено образованием штам-
ма, лучше приспособленного к
репродукции в растениях та-
бака.
Вирусы, которые перено-
сятся насекомыми, иногда утра-
чивают способность к распро-
странению таким способом. Это'
бывает в случаях длительной
передачи вируса без помощи на-
секомых или при передаче на другой вид растения-хозяина (гл. XVI).
Вероятнее всего, утрата вирусом инфекционности для одного растения-
хозяина в результате пассажа иа другом объясняется присутствием ингибито-
ра, а не каким-либо изменением свойств самого вируса. Так, вирус мозаики
арбуза вызывает местные некрозы у растений Chenopodium amaranticolor
и может быть легко передан на другие растения этого вида. Однако обратный
перенос вируса с помощью экстрактов инфицированных растений Ch. amaran-
ticolor видам сем. Cucurbitaceae не удавался до тех пор, пока не был удален
содержащийся в экстрактах ингибитор (Гроган, личное сообщение).
ГЛАВА XIV
ИНАКТИВАЦИЯ ВИРУСОВ
Многие агенты вызывают потерю характерных структурных и биологи-
ческих свойств вирусов и могут препятствовать их проникновению в растение
и последующему размножению. Исследование способов воздействия различ-
ных инактивирующих агентов на вирусы дало нам полезную информацию,,
касающуюся структуры вирусов и процесса репликации их в растении.
Такие исследования позволили также высказать предположения о возможных
механизмах, обусловливающих устойчивость растений к вирусной инфекции,
и способах освобождения растений от вируса или защиты их от инфекции.
Важным критерием при идентификации и классификации вирусов еще
до того, как появились современные методы исследования, служила различ-
ная степень устойчивости вирусов, присутствующих в отжатом раститель-
ном соке, к инкубации их при комнатной температуре, а также к нагрева-
нию в течение короткого периода. Даже теперь подобного рода критерии
полезны в отношении вирусов, которые еще не выделены и не охарактеризо-
ваны с помощью более точных методов. Имеется большая литература по инак-
тивации вирусов, возвращающая нас к раннему периоду их исследования.
Работы в этой области велись по нескольким основным направлениям. Во-пер-
вых, большая часть экспериментов, особенно экспериментов по инактивации
in vitro, была выполнена на вирусах, которые весьма легко передавались
механическим путем. Вероятно, такие вирусы вообще более стабильны, чем
те, которые не передаются механически, хотя вовсе не обязательно дело^
обстоит именно так. Например, было найдено, что вирус желтой карликовости
ячменя, который не передается механически, довольно устойчив к нагрева-
нию и инактивируется при температуре 65—70 °C [749]. Во-вторых, в тече-
ние длительного периода (вплоть до 1956 г.) внимание многих исследователей
было поглощено белковой частью вируса и полученные в эксперименте резуль-
таты стремились интерпретировать с точки зрения возможного воздействия
на вирусный белок. Такое положение существовало несмотря на то, что дан-
ные ряда проведенных в то время экспериментов показывали, что белковый
компонент ВТМ может в значительной степени изменяться, не оказывая при
этом влияния на биологическую активность. Например, 70% аминогрупп
белка ВТМ могли быть блокированы с помощью ацетильных или фенилуреи-
догрупп без существенного изменения в инфекционности вируса [1211].
В-третьих, большинство ранних работ было выполнено на ВТМ еще до того,
как выяснилось, что инфекционным началом вируса является именно РНК.
Свободная РНК ВТМ обладает только 0,1% инфекционности РНК интакт-
ного вируса, хотя потенциально она почти так же инфекционна, как и вирус,,
что было показано экспериментами по реконструкции. Таким образом, любой
агент, с помощью которого вирусный белок отщепляется от ВТМ, вызывает
заметную инактивацию вируса. В дополнение к этому следует отметить, что
в ранних работах отщепление капсидного белка, вероятно, приводило к инак-
тивации РНК под действием загрязняющих препарат нуклеаз.
С тех пор как в 1956 г. было установлено, что «голая» интактная РНК
вируса обладает инфекционностыо, наибольшее внимание было сосредото-
чено на том, какое влияние оказывает действие различных факторов на вирус-
314
Глава XIV
ную РНК как in vitro, так и in vivo. Как обсуждалось в гл. VII, в процессе
репликации вируса вирусная РНК кодирует, кроме структурного белка, еще
один или более белков. Роль специфичной РНК-полимеразы известна, тогда
как функции других белков неизвестны; возможно, они обеспечивают потреб-
ности собственного метаболизма вируса внутри клетки. Инактивация виру-
сов in vivo может затрагивать активность именно таких белков. Определен-
ные факторы, обладающие мутагенным действием, так же как инактивирующие
агенты in vitro, возможно, приводят к гибели вируса, вызывая летальную
мутацию в той части вирусной РНК, которая кодирует некоторые неструктур-
ные вирусные белки.
Множество химических и физических факторов инактивируют вирусы
in vitro. Под действием некоторых из них, например сильных кислот, про-
исходит быстрая инактивация в результате того, что вирус теряет все прису-
щие ему свойства. Такие обработки обычно не представляют большого инте-
реса. Поэтому мы рассмотрим главным образом такие агенты, которые при
определенных условиях in vitro вызывают потерю инфекционности, не нару-
шая, однако, при этом общей структуры вируса.
Если под действием той или иной обработки инфекционность вирусного
препарата по мере увеличения времени обработки уменьшается, то обычно
считают, что имеет место процесс инактивации in vitro. Действие некоторых
веществ, подавляющих вирусную инфекцию, проявляется в полном объеме
непосредственно после их смешивания с вирусом, и этот эффект можно снять
после удаления ингибитора или разбавления его. Для таких веществ часто
не удается четко разграничить разницу в их действии in vitro и in vivo.
В настоящей главе различного типа агенты, инактивирующие вирусы,
разделены на несколько категорий. В некоторых случаях это подразделение
довольно искусственно, так как оно не отражает тесного взаимодействия
различных агентов в процессе инактивации вируса. Например, влияние тем-
пературы при изучении действия различных факторов на вирусы in vitro
зависит от значения pH раствора, а включение 5-фторурацила в РНК вируса
in vivo повышает ее чувствительность к инактивации под действием ультра-
фиолета.
ТЕМПЕРАТУРА
Нагревание in vitro
Начиная с самых ранних этапов исследования вирусов растений в каче-
стве признака, служащего для идентификации вирусов, использовали так
называемую «термальную точку гибели», причем опыт проводили в свеже-
отжатом соке листьев. Для различных вирусов самые высокие температуры,
при которых после нагревания в течение 10 мин еще можно обнаружить
некоторую инфекционность, лежат в пределах 40—95 °C, а для многих
из них — в пределах 50—60 °C. Концентрация вируса в исходном материале,
pH и состав сока, характер материала, используемого для разбавления,
состояние испытуемых растений — все это может влиять на результаты подоб-
ного рода исследований. Для более детального изучения процесса тепловой
инактивации вирусов используют очищенные вирусные препараты.
Для некоторых вирусов, таких, например, как ВТМ и Х-вирус карто-
феля, тепловая инактивация, по-видимому, тесно связана с денатурацией
вирусного белка. Температурный коэффициент инактивации велик, что
вообще характерно для денатурации белка. У подобного рода вирусов невоз-
можно вызвать полную потерю инфекционности, если при этом не наблю-
дается также выраженная в значительной степени денатурация белка. Лау-
Инактивация вирусов
315
Фиг. 54. Тепловая денатурация ВТМ [1049].
По оси ординат отложен десятичный логарифм концентрации (мг/мл) ВТМ, сохраняющего растиори-
мость, по оси абсцисс — продолжительность нагревания при 69,8 °C в 0,1 М фосфатном буфере, pH 7,0.
фер и Прайс [1049] пришли к выводу, что тепловая денатурация белка ВТМ
в 0,1 М фосфатном буфере при pH 7 представляет собой реакцию, подчи-
няющуюся кинетике первого порядка и характеризующуюся энергией акти-
вации примерно 153 000 кал/моль. О том, что денатурация действительно
подчиняется кинетике первого порядка, свидетельствует тот факт, что коли-
чество вируса, инактивированного к моменту времени прямо пропорцио-
нально концентрации С активного вируса, присутствующего в препарате
в данный момент:
In С —In C0-k't,
где Со — концентрация в нулевое время, а к' — скорость инактивации. Гра-
фик, описывающий зависимость логарифма концентрации активного вируса
от времени, имеет вид прямой (фиг. 54).
Лауфер и Прайс [1049] показали, что на скорость тепловой денатурации
сильно влияет величина pH раствора. Например, при 71 °C денатурация
происходила приблизительно в 3500 раз быстрее при pH 7,05, чем при pH
5,77. В поставленных ими опытах вирус терял инфекционность даже несколько
быстрее, чем денатурировался белок.
Харт [736] исследовал морфологические изменения, наблюдаемые вчасти-
це ВТМ при нагревании, с помощью электронной микроскопии. При этом
оказалось, что в области температур 80—98 °C частицы разбухают с обоих
концов. В результате палочкообразная частица ВТМ превращается в части-
цу, приближающуюся по своей форме к сферической, но имеющую прибли-
зительно тот же объем, что и исходная палочка. В присутствии солей про-
исходит высвобождение РНК, а белок денатурируется. Гииоза [646] провел
кинетические исследования тепловой инактивации инфекционной РНК ВТМ
и показал, что данная реакция подчиняется кинетике первого порядка.
На основании умеренно низкого значения энергии активации Гииоза пришел
к выводу, что утрата инфекционности при нагревании РНК не сопряжена
с разрывом большого числа слабых связей. Он высказал предположение, что
316
Глава XIV
активированный промежуточный продукт представляет собой циклический
трифосфат; при этом достаточно, чтобы произошел гидролиз даже одной
фосфодиэфирной связи, чтобы инактивировать молекулу РНК.
При исследовании фосфатных концевых групп, образующихся во время
тепловой инактивации РНК ВТМ, Гордон и Хаф [663] пришли к выводу,
что разрыв полипуклеотидной цепи не приводит к образованию моноэфирных
фосфатных групп (2', 3' и 5'). Они полагали, что разрыв цепи при pH 6,8,
по-видимому, приводит к образованию концевого 2', З'-циклического фосфата.
Очевидно, что РНК описанных нами палочкообразных вирусов надежно'
защищена и стабилизирована белковой оболочкой. При тепловой денатура-
ции оболочка удаляется и РНК может подвергнуться термическому расщеп-
лению (которое катализируется следовыми количествами некоторых метал-
лов) и, что более важно, действию загрязняющих препарат рибонуклеаз,
которые часто сохраняют активность при относительно высоких температу-
рах. Примеси нуклеаз, вероятно, присутствовали во многих вирусных пре-
паратах, которые использовали для изучения тепловой денатурации.
Тепловой инактивации мелких сферических вирусов присущи несколько
иные особенности. Так, для вируса кустистой карликовости томатов и вируса
некроза табака значение (?10 для тепловой инактивации невелико, так что
имеется довольно широкий интервал температур, в пределах которых насту-
пает частичная потеря инфекционности. Для таких вирусов потеря инфекцион-
ности не связана непосредственно с денатурацией вирусного белка. Можно
получить препараты, полностью утратившие инфекционность, однако при
этом они неотличимы от инфекционных препаратов по своей антигенной спе-
цифичности, способности кристаллизоваться и другим свойствам [94].
Для штаммов вируса некроза табака было проведено более детальное
изучение процесса тепловой инактивации [55]. Эти штаммы инактивирова-
лись таким образом, как будто они содержали смесь более устойчивого и менее
устойчивого компонентов. Гордон и др. [666] отметили подобное же отклоне-
ние от кинетики первого порядка для реакции инактивации изолированной
РНК вируса полиомиелита (в отличие от РНК ВТМ, дававшей линейную
зависимость в определенном диапазоне температур). Характер инактивации
разных штаммов вируса некроза табака был различным, но для каждого дан-
ного штамма кривые инактивации вируса и свободной РНК были идентичны
(фиг. 55).
Таким образом, особенности процесса инактивации, характерные для
двухкомпонентной системы, можно объяснить изменениями только в самой
молекуле РНК. Природа этих изменений пока точно не установлена, но они
могут быть обусловлены присутствием молекул РНК с различной вторичной
структурой. Тот факт, что РНК, выделенная из различных штаммов вируса
некроза табака, отличалась по скорости инактивации, позволяет предполо-
жить, что помимо фосфодиэфирных связей в стабилизации молекул РНК при
тепловой инактивации участвуют еще и другие связи.
Что касается инактивации интактного вируса некроза табака, то препа-
раты, сохранившие лишь 1—0,1% инфекционности после нагревания в дис-
тиллированной воде или в фосфатном буфере, не отличались от исходного
вируса по серологической активности, внешнему виду частиц в электронном
микроскопе и седиментационным свойствам. Инактивация не сопровожда-
лась высвобождением из вирусных частиц поглощающего ультрафиолет
материала.
Действие повышенной температуры на ВЖМТ сильно зависит от вели-
чины pH (стр. 335). Нагревание при температуре 37 °C и выше при значе-
ниях pH, превышающих 6,2, приводит к удалению всей РНК из части вирус-
ных частиц в препарате. РНК, освобожденная при этих условиях, неинфек-
ционна и имеет низкую молекулярную массу (4—5S) [1117]. Нагревание при
Инактивация вирусов
317
О
I_________I_________I_________1_________1
30 60 90 120 150
Время ,<мин
Фиг. 55. Потеря инфекционности при нагревании у двух штаммов вируса покрова табака
(А и Е) и у выделенной из них РНК (в 0,07 М) фосфатном буфере при pH 7,0) [55].
N — доля инактивированных частиц илиинактивиропанной РНК. I и II — кривые инактивации интакт-
ных вирусов штаммов А и В соответственно; кружочки соответствуют изолированной пуклеиновой
кислоте (штамм А), треугольники — то же для нуклеиновой кислоты штамма Е.
pH 6,0 или pH 7,0 при более низкой температуре (33 °C), но в течение более
продолжительного периода (около 5 дней) приводит к фактически полной утра-
те инфекционности без высвобождения РНК из вируса [1186]. Как полагал
Хазелькори [738], потеря инфекционности обусловлена, вероятно, появлением
разрывов в цепи РНК внутри вируса.
Таким образом, очевидно, что при тепловой инактивации мелких
сферических вирусов in vitro критическим моментом является возникновение
по крайней мере одного разрыва в вирусной РНК. На скорость появления
таких разрывов может влиять вторичная структура РНК, находящейся
в вирусной частице или в растворе. Значительное влияние иа скорость тепло-
вой инактивации частицы и на другие эффекты нагревания может иметь вели-
чина pH и состав ионов в среде. Для палочкообразных вирусов, таких, как
ВТМ, инактивация РНК сопровождается также денатурацией структурного
белка. В случае же мелких сферических вирусов известны различные усло-
вия, при которых инактивация не сопровождается большими изменениями
в вирусной частице. Ионы металлов катализируют in vitro инактивацию
вирусной РНК (стр. 337). Возможно, что следы металлов, прочно связан-
ных с вирусной РНК, могут играть роль катализаторов при термическом
расщеплении РНК интактного вируса.
Считают, что нагревание вирусов животных приводит к изменениям
в белковой оболочке, вследствие которых частица не может адсорбироваться
на чувствительных клетках или РНК не может высвободиться из белковой
оболочки после того, как произошло заражение. Подобный тип изменения
вполне может иметь место при тепловой инактивации некоторых крупных
вирусов растений, но этот вопрос еще не исследован сколько-нибудь детально.
318
Глава XIV
Нагревание in vivo
Вопрос о влиянии изменения температуры на чувствительность расте-
ний-хозяев к инфекции, а также па репликацию вируса мы рассматривали
в гл. XII. В гл. XIII были описаны чувствительные и устойчивые к темпера-
туре штаммы. В этом разделе рассматривается вопрос о влиянии высокой
температуры на вирус, находящийся в растении.
Выдерживание инфицированного растения при более высокой, чем обычно
температуре может привести к частичной или полной инактивации вируса,
не вызывая при этом гибели растения. Нагревание инфицированных расте-
ний или частей растений в воде или па воздухе (иногда в сочетании с культу-
рой изолированных верхушек побегов) является пока единственным извест-
ным способом, который позволяет полностью освободить растительный мате-
риал от вирусной инфекции (гл. XVHI).
Кинетика тепловой инактивации in vivo для нестабильных вирусов
(вирус мозаики люцерны) представлена на фиг. 56.
17одобного рода эксперименты не позволяют нам глубоко проникать
в сущность ин активации in vivo, которая, вполне возможно, представляет
собой сложный процесс. Остается неясным, какое отношение к этой проблеме
имеют результаты, полученные в экспериментах in vitro. Вообще же мелкие
сферические вирусы быстрее инактивируются in vivo, чем палочкообразные
Фиг. 56. Инактивация вируса мозаики люцерны in vivo в растениях табака, содержав-
шихся при трех различных температурах [1027].
А — относительное число местных поражений.
Инактивация вирусов
319'
частицы, однако это не всегда так. Как мы уже видели в гл. XIII, штаммы
одного и того же вируса могут сильно различаться по своей способности сохра-
нять инфекционность и размножаться при высоких температурах. Вирус
некроза табака инактивируется быстрее при 32—35 °C, если он находится
в листе, чем в том случае, когда отжатый растительный сок выдерживают
мри той же температуре [715]. Кассаиис [932] полагал, что механизм, инакти-
вации in vivo должен быть совсем иным, чем механизм инактивации in vi tro,
и что при высокой температуре растение, очевидно, способствует разруше-
нию вируса. Мысль о том, что растение-хозяин, возможно, влияет па скорость
инактивации, подтверждается тем, что вирус хлоротической крапчатости
коровьего гороха при 32 °C инактивируется быстрее в растениях Vigna
sinensis, чем Nicotiana tabacum [608].
С другой стороны, было найдено, что ВЖМТ в растениях китайской
капусты при 33° С инактивировался медленнее, чем очищенный вирус, выдер-
живаемый in vitro при 33 °C и pH 6,0 или 7,0 [1186]. Таким образом, для этого
вируса не удалось получить данных, которые свидетельствовали бы в пользу
существования в растении-хозяине какого-то фактора, ускоряющего процесс
тепловой инактивации. Сравнение свойств ВЖМТ, инактивированного
в растении при 33 °C, со свойствами нормального вируса не позволило обна-
ружить каких-либо значительных изменений в способности кристаллизо-
ваться из солевых растворов, в спектре поглощения ультрафиолета, скорости
высвобождения РНК при pH 7,0 и 37 °C, а также в способности реагировать-
с антителами и в доле имеющихся неполных нуклеопротеидных частиц.
Очень вероятно, что инактивация этого вируса обусловлена разрывами
в цепи РНК, которые имели место in vivo. Такие разрывы могут возникать
даже при более низкой температуре. Так, Дан и Хитчборп 1476] показали,
что для ВЖМТ, сформированного в растениях при средней температуре
25 °C, было характерно более высокое содержание частиц с деградированной
РНК, чем для ВЖМТ из растений, выращенных при 17 °C.
Ярвуд и Холм [966] описали любопытное явление, при котором нагрева-
ние инфицированных вирусом листьев в течение коротких периодов времени
повышало устойчивость вируса к нагреванию, проводившемуся несколькими
часами позже. Это не было, по-видимому, обусловлено генетическим изме-
нением вируса. Подобный результат был получен для ВТМ, находящегося
в растениях табака, при адаптивной обработке этих растений в диапазоне
температур 15—30 °C [897]. В случае обработки растений при 13 °C адаптив-
ный эффект отсутствовал; в то же время Ярвуд и Холм [966] описали подобного
рода эффект для вируса погремковости табака, находящегося в том же расте-
нии-хозяине, обрабатываемом при 13 °C. Таким образом, адаптация
является в некоторой степени вирусоспецифичпой. Основы этого явления
неясны.
Некоторые вирусы удается уничтожить выдерживанием инфицированных
растений при низких температурах. Так, выращивание растений донника
(Melilotus officinalis L. (Cam.)), инфицированных одним из штаммов вируса
раневых опухолей, при 14 °C приводило к увеличению числа незаряженных
побегов [1528]. Механизм описанного воздействия неизвестен, ио, возможно,
он обусловлен понижением интенсивности репликации и скорости передви-
жения вируса в растении при низких температурах.
В заключение следует отметить, что существует по крайней мере пять
возможных механизмов, с помощью которых нагревание in vivo может при-
вести к инактивации вируса, ограничению его продукции и к появлению
свободных от вируса растений (или частей растений): 1) инактивация интакт-
ных вирусных частиц, присутствующих в клетке, вследствие разрыва цепи
РНК, причем каких-либо других значительных изменений в вирусной частице
при этом не происходит. Таким путем инактивируются, вероятно, вирус
320
Глава XIV
некроза табака и ВЖМТ. Этот процесс сам по себе не может привести к осво-
бождению растения от инфекции, даже если все интактные вирусные частицы
инактивируются. Если синтезирующий вирус механизм остается неповреж-
денным (хотя и не функционирует), он может снова прийти в действие, как
только растение окажется в нормальных температурных условиях; 2) разру-
шение вирусной частицы с последующей ферментативной деградацией ее ком-
понентов. Это, вероятно, случается с очень нестабильными вирусами типа
вируса мозаики люцерны; 3) инактивация таких ферментов, как, например,
вирусоспецифичная РНК-полимераза, что приводит к прекращению синтеза
вирусной РНК. Это, возможно, происходит с чувствительными к температуре
мутантами ВТМ, имеющими нормальный структурный белок (гл. XIII); 4)
предотвращение процесса сборки вирусной частицы вследствие того, что
структурный белок не может принять правильную трехмерную конфи-
гурацию при высокой температуре. Последнее происходит с некоторыми
чувствительными к температуре мутантами ВТМ; 5) высокие (или низ-
кие) температуры могут замедлить или прекратить вовсе передвижение
вируса по растению, несмотря на то что верхушечный рост продолжается.
При этом вновь образовавшиеся части растения часто оказываются свобод-
ными от вируса.
Замораживание и оттаивание
Замораживание и оттаивание инфицированных листьев или сока из боль-
ных растений оказывает лишь незначительное влияние на некоторые вирусы
и поэтому часто используется для осветления экстрактов при выделении
вируса. При этом большая часть клеточных белков растения-хозяина и мате-
риала клеточных структур утрачивает растворимость. Некоторые вирусы
(такие, как вирус мозаики люцерны и гравировки табака) теряют инфекцион-
ность при замораживании и оттаивании, однако в основном этот эффект обус-
ловлен, по-видимому, адсорбцией вируса на поверхности коагулированного
клеточного белка, а не непосредственной их инактивацией [94]. Вирус кусти-
стой карликовости томатов устойчив к замораживанию в листьях, но инакти-
вируется при замораживании очищенных препаратов. Оттаивание приводит
к образованию нерастворимых и не обладающих инфекционностью преципи-
татов, утративших в основном серологическую активность [116, 119]. При
замораживании интактных листьев или отжатого из них сока значительная
часть верхнего компонента ВЖМТ (и меньшее количество вирусного нуклео-
протеида) превращается в материал, седиментирующий как гетерогенный
компонент и располагающийся при этом между белковыми и нуклеопротеид-
ными фракциями [551]. Предварительное замораживание и оттаивание вируса
в растворе делает ВТМ более чувствительным к щелочной деградации (pH
9,8—10,8, боратный буфер) [444]. Вирусы, инактивирующиеся при медленном
замораживании, могут не инактивироваться, если замораживание проводить
очень быстро (например, в жидком азоте). При быстром замораживании до
—75 °C с последующим оттаиванием удалось получить инфекционные препа-
раты РНК ВЖМТ [918].
Лиофилизация кусочков ткани листьев или тканевых экстрактов создает
возможность для долгосрочного хранения вирусов, которые нестабильны
в жидкой среде или чувствительны к замораживанию в растворе. Большин-
ство нестабильных вирусов может храниться более или менее удовлетвори-
тельно в экстракте листьев, высушенном из замороженного состояния [812].
Палочкообразные вирусы обычно более подвержены инактивации во время
лиофилизации, чем мелкие сферические вирусы. Многие нестабильные вирусы
можно хранить в течение нескольких лет в кусочках химически дегидрати-
рованной ткани при 10 °C [1124]. В листовой ткани молодых, активно расту-
Инактивация, вирусов
321
щих инфицированных растений, хранящейся в закрытых пузырьках, инфек-
ционный вирус может сохранять свои свойства в течение длительного вре-
мени. Стабильность очищенных препаратов при лиофилизации в значитель-
ной степени зависит от присутствующих в препарате материалов. Так, раз-
личные добавки (например, лактоза) повышают стабильность вируса и облег-
чают последующий переход лиофилизированного материала в раствор [1937].
ДЕЙСТВИЕ ИЗЛУЧЕНИЙ
Для исследований процесса инактивации вирусов растений изучали
действие на эти частицы различных ионизирующих (а-частицы, у- и рент-
геновские лучи) и неионизирующих излучений (ультрафиолетовые лучи и ви-
димый свет). Поглощение ионизирующего излучения зависит только от поряд-
кового номера атомов, входящих в состав вещества, но не зависит от хими-
ческой структуры, частью которой эти атомы являются. Поглощение иеиони-
зиругощего излучения зависит от химической структуры. Доля инфекцион-
ных частиц, сохраняющих свою активность после облучения, является экспо-
ненциальном функцией дозы [1054]. Степень инактивации, обусловленной
действием излучения, зависит не от его интенсивности, а от общей дозы,
полученной препаратом. Ионизирующее излучение может действовать на боль-
шие молекулы (например, вирусы) либо непосредственно, изменяя структуру
вируса (прямое действие), либо косвенно, вызывая образование коротко-
живущих химически активных радикалов в среде, окружающей вирус.
Рентгеновские лучи
Ранние работы показали, что рентгеновские лучи уменьшают инфекциои-
пость ВТМ., не вызывая при этом денатурации вирусного белка, которую
можно было бы обнаружить, о чем свидетельствовали результаты серологи-
ческого анализа, анизотропия в потоке и способность образовывать жидкие
кристаллы [115]. Более поздние исследования наряду с установлением того
Фиг. 57. Инактивация ВТМ в резуль-
тате воздействия рентгеновскими луча-
ми [649].
Кривая построена на основании данных трех
экспериментов, что представлено различными
знаками.
21—0893
322
Глава XIV
факта, что вирусная РНК является генетическим материалом, ясно показа-
ли, что инактивация при облучении рентгеновскими лучами происходит
вследствие разрывов в цепи РНК.
Рядом экспериментов было подтверждено, что повреждение вируса
происходит по типу «все или ничего». Так, Базел и др. [311] показали, что
ВТМ, не утративший инфекционности после облучения высокой дозой рент-
геновских лучей, был так же стабилен при 80 °C, как и вирус, не подвергав-
шийся действию излучения. Подобным же образом Лауфер и др. [1051] пока-
зали, что для ВТМ, получившего большую дозу рентгеновских лучей, была
характерна примерно такая же скорость седиментации и характеристическая
вязкость, как и для нормального вируса. РНК, выделенная из облученного
вируса, имела более низкую характеристическую вязкость, чем РНК из геоб-
работанного вируса, и, следовательно, ее средняя длина была меньше. Лау-
фер и др. [1051] предположили, что облучение рентгеновскими лучами вызы-
вает разрывы:^вирусной РНК, заключенной внутри белковой оболочки,
и что летальный исход вызывается единичным разрывом в цепи РНК. Эта
мысль получила свое конкретное подтверждение в исследованиях по инакти-
вации ВТМ и РНК ВТМ [649] (фиг. 57).
Доза облучения, обеспечивающая 37% выживания для РНК, составляла
3,9-10® Р, т. е. была близка к величине, найденной для интактного вируса.
На основании экспериментов по инактивации Гииоза и Норман [649] нашли,
что молекулярная масса РНК составляет 1,4-10°—5,4-10е; наиболее вероят-
ная величина равна 2,7 -10е. Это хорошо согласуется с данными о размерах
РНК, определенными другими способами (гл. IV). Объем мишени для несколь-
ких сферических вирусов также довольно хорошо соответствовал объему,
занимаемому РНК [311].
Быстрые электроны
Подвергая ВТМ или инфекционную РНК ВТМ действию пучка быстрых
электронов с энергией 5 МэВ, было обнаружено, что свободная РНК инакти-
вировалась приблизительно втрое быстрее, чем целый вирус [365]. Вирус
подвергали облучению в растворе, и вполне вероятно, что в процессе инакти-
вации важную роль играло косвенное действие излучения через посредство
веществ, образующихся под его влиянием в растворителе. Эти результаты
не совпадают с данными Гинозы и Нормана [649], приведенными выше и полу-
ченными при облучении рентгеновскими лучами вируса в замороженном или
высушенном состоянии.
у -Лучи
Гииоза [647] исследовал процесс инактивации одноцепочечной вирус-
ной нуклеиновой кислоты, подвергая ее действию у-излучения с энергией
1 МэВ (источником служил 00Со). Различные добавления к среде либо защи-
щали от инактивации (глутатион), либо способствовали ей (фосфат). Эти дан-
ные наглядно показывают, насколько рискованно пытаться определить вели-
чину мишени вирусов in vivo, используя для этого ионизирующие излуче-
ния: ведь микроокружение вируса в этих условиях неизвестно. В тех слу-
чаях, когда листья табака, инфицированные ВТМ, в течение нескольких
месяцев подвергали действию у-лучей при интенсивности дозы 0—100 Р/ч,
не было обнаружено значительных изменений в количестве вируса, содержав-
шегося в клетках [695]. Однако облучение листа N. glutinosa непосредственно
после заражения вызывало некоторое уменьшение числа пораженных участ-
ков.
Инактивация вирусов
323
Включение радиоактивных изотопов в вирус
Вирусы бактерий, содержащие значительное количество 32Р, могут инак-
тивироваться в результате распада этого радиоактивного элемента внутри ви-
русной частицы (так называемый эффект «самоубийства»). Детальных исследо-
ваний подобного рода явлений у вирусов растений ие проводилось, однако
известно, что присутствие 32Р в листьях табака может уменьшать количество
вновь образующихся частиц ВТМ и подавлять развитие симптомов системного
поражения [1496]. При радиоактивности, равной примерно 6000 расп/мин
па 1 мг сырой массы листьев, количество вируса, обнаруживаемого в листьях
с системным поражением, через 10 дней после инокуляции значительно умень-
шалось. Был ли наблюдавшийся эффект в большей степени обусловлен
ингибированием заражения, чем ингибированием репликации^ вируса, уста-
новлено ие было.
Равномерно меченные препараты ВТМ, содержащие такое количество
14С, что в течение 10 дней происходил один распад па каждые 4—10 частиц,
теряли 96% инфекционности после 5 месяцев хранения [772]. ВТМ, мечен-
ный 1261, при удельной активности 2—3 мКи на 1 мг вируса, терял свою
инфекционность за 5 дней при температуре —20 °C [1194].
Ультрафиолет
Вирусы растений инактивируются при облучении ультрафиолетом
in vitro. Инактивация имеет место при дозах излучения, которые не влияют
па основные физические, химические и серологические свойства вирусной
частицы. Реакция инактивации характеризуется кинетикой первого порядка,
однако, как подчеркивал Клечковский [989, 991], это не обязательно озна-
чает, что вирусная частица инактивируется в результате поглощения одного
кванта энергии. Квантовые выходы для вирусов растений (и для других
вирусов) невелики [989]. Так, в среднем для инактивации частицы ВТМ
требуется, чтобы она поглотила 15 000—30 000 квантов, а для инактивации
частицы вируса южной мозаики фасоли — примерно 9000 квантов [1363].
Клечковский [989] предположил, что в результате вызываемого облучением
возбуждения в различных частях молекулы она переходит в некоторое нерав-
новесное состояние, в котором инактивация может произойти в любой момент
времени. Поглощенная энергия может вызвать либо временное, либо постоян-
ное изменение (последнее может быть летальным или нелетальным) или же
она может рассеяться в виде тепла.
Различными авторами было показано, что скорость инактивации сни-
жается при использовании концентрированных растворов вирусов. Как пола-
гали Боудэн и Клечковский [108], этот эффект обусловлен тем, что при высо-
кой концентрации меньшее количество ультрафиолета поглощается на^одну
частицу вируса в единицу времени. С другой стороны, было найдено, что
инактивация РНК ВТМ не зависит от концентрации РНК, но па этот процесс
оказывает влияние концентрация ионов в среде, в которой проводится облу-
чение [509].
Количество ультрафиолета, поглощенного белковым и нуклеиновокислот-
ным компонентами вируса, зависит главным образом от процентного содер-
жания РНК в вирусе и от длины волны. Даже для вирусов, в которых содер-
жание РНК невелико (например, ВТМ), поглощение в диапазоне 240—280 нм
обусловлено в основном РНК. Результаты, полученные Зигелем и Норманом
[1577], дают основание предполагать, что при длинах волн 254 и 280 им основ-
ным поглощающим компонентом является РНК и именно ее повреждения
приводят к инактивации вируса. Однако при длине волны 226 нм важным
компонентом, поглощающим инактивирующее излучение, является, по-види-
21*
324
Глава, XIV
Фиг. 58. Спектры поглощения в ультрафиолете (правая ось ординат) и спектры действия
инактивации ультрафиолетом (левая ось ординат) вируса некроза табака и изолированной
из пего РНК [9411.
I__спектр поглощения вирусной РНК; II — спектр поглощения интактного вируса; III — спектр
поглощения вируса с поправкой на светорассеяние. Измеренные в эксперименте константы инактивации
для интактного вируса обозначены кружками, а для вирусной РНК — крестиками.
мому, также белок. Как штамм Ui( так и штамм U2 ВТМ имели сходный
характер инактивации при длине волны 226 им, хотя при 254 и 280 им
штаммU2 был в 5 раз более чувствителен к ультрафиолету, чем штамм Ut. РНК,
выделенная из обоих штаммов, обладает приблизительно одинаковой чувстви-
тельностью к ультрафиолету [1580]. Вероятно, различия между этими двумя
штаммами обусловлены различиями в характере связывания РНК с белком.
Квантовый выход для инактивации РНК ВТМ в диапазоне 230—280 пм
не зависит от длины волны, т. е. спектр действия для изолированной РНК
совпадает со спектром поглощения [999, 1460]. Спектр действия для частиц
ВТМ, реконструированных из РНК и белковых субъединиц, был таким же,
как и для нативного ВТМ. В составе интактной вирусной частицы РНК была
приблизительно в 24 раза чувствительнее к инактивации при длине волны
230, чем при 280 им [999].
Заключенная внутри вируса РНК в значительной степени защищена
от инактивации облучением при длинах волн 280 и 254 нм; в то же время
при длине волны 230 нм чувствительность РНК, находящейся в составе
вируса, сходна с чувствительностью изолированной РНК.
В отличие от ВТМ вирусу некроза табака не присуща значительно боль-
шая устойчивость к инактивации ультрафиолетом, чем свободной РНК. При
сравнении спектров действия инактивации ультрафиолетом штамма вируса
некроза табака и изолированной из него РНК было установлено, что они
очень сходны с ультрафиолетовым спектром поглощения РНК [941] (фиг. 58).
Инактивация вирусов
325
Таким образом, инактивация ультрафиолетом происходит одинаково неза-
висимо от того, находится ли РНК внутри или вне вирусной частицы.
Облучение листьев, зараженных ВТМ, соответствующими дозами ультра-
фиолета позволяет инактивировать центры инфекции. Устойчивость к инакти-
вации увеличивается со временем, прошедшим после заражения. Кинетику
инактивации использовали при попытках исследовать процессы, протекаю-
щие на ранних этапах после заражения (гл. VII).
Относительно действия ультрафиолета на вирус в разные моменты после
проникновения вируса в растение известно мало. При коротких воздействиях
ультрафиолета иа растения табака, системно инфицированных У-вирусом
картофеля, происходит инактивация большей части вирусных частиц, нахо-
дящихся в эпидермисе, однако основная масса вируса в листе остается непов-
режденной [239, 254]. Верхний эпидермис N. glutinosa пропускает 25—50%
падающего на него излучения с длиной волны 254 им [147], так что при дозах,
не летальных для растения, излучение практически не проникает в нижерас-
положенные ткани листа.
Во многих биологических системах эффекты, вызываемые облучением
ультрафиолетовыми лучами, можно спять, воздействуя па систему видимым
светом (фотореактивация). Так, у вирусов, инактивированных ультрафиоле-
том, вызванные таким образом повреждения можно частично устранить
(репарировать) с помощью видимого света. Вирусы in vitro не поддаются
реактивации этим способом, однако если растения подвергнуть действию
видимого света вскоре после инокуляции, то фотореактивация наблюдается.
Это явление не наблюдалось при облучении и последующем освещении интакт-
ного ВТМ, что является довольно редким случаем среди вирусов. Боудэн
и Клечковский [112] показали, что облученная свободная РНК ВТМ способна
к фотореактивации, тогда как инактивированная ультрафиолетом РНК,
выделенная из облученного вируса, не реактивируется. Таким образом, бел-
ковая оболочка, вероятно, препятствует образованию в РНК ВТМ таких
повреждений, которые могут быть затем устранены посредством фотореакти-
вации. Подобная же ситуация имеет место в случае вируса погремковости
табака. Облученный интактный вирус не поддается фотореактивации, тогда
как облученная свободная РНК реактивируется [726].
В отличие от ВТМ интактный вирус некроза табака и РНК вируса некроза
табака в одинаковой степени поддаются реактивации при действии дневного
света на зараженные растения [941]. Степень фотореактивации после инакти-
вации ультрафиолетом не зависела от длины волны инактивирующего света
в диапазоне 230—290 нм.
Фотореактивация не может иметь места непосредственно после зараже-
ния облученным вирусом. Так, чтобы большая часть частиц Х-вируса карто-
феля достигла того состояния, при котором они могли быть «спасены» види-
мым светом, требовалось около 30 мин. После этого 30-минутного периода
освещение дневным светом в течение 15 мин приводило к почти полной фото-
реактивации [109]. Частицы Х-вируса картофеля, находившиеся в заражен-
ных листьях, которые выдерживали в темноте в течение 1 ч после заражения,
сохраняли свою способность к реактивации, но если этот период был более
продолжительным, они становились биологически инертными. Облученная
РНК вируса некроза табака поддается фотореактивации почти сразу после
заражения и сохраняет эту способность приблизительно в течение часа [109,
112].
Спектр действия фотореактивации не определяли, но установлено, что
эффективны длины волн короче 450 нм [363].
РНК ВТМ, инактивированная при 254 нм, реактивировалась видимым
светом в листьях трех различных растений-хозяев, но наибольшая степень
реактивации была обнаружена в листьях табака [1896]. Таким образом,
326
Глава XIV
каким бы ии был механизм реактивации, это явление широко распространено
в растениях.
Хотя при фотореактивации инфекционность облученного препарата
увеличивается, первоначальный уровень инфекционности все же не восста-
навливается. Таким образом, могут существовать по крайней мере два типа
процессов инактивации, из которых только один может быть обращен при
действии видимого света.
Как подчеркивал Клечковский [991], процессы этих двух типов должны
быть независимы друг от друга, так как они оба подчиняются кинетике первого
порядка. Если бы они не были независимы, то наблюдалось бы отклонение
от кинетики первого порядка.
Механизм инактивации под действием ультрафиолета и фотореактивации,
несомненно, сложен. Зависимая от клетки хозяина фотореактивация РНК
ВТМ, облученной при 300 им, оказалась более эффективной, чем фотореакти-
вация РНК, облученной при 253,7 нм [1201]. Включение 5-фторурацила в нук-
леиновую кислоту ВТМ повышает чувствительность как интактного вируса,
так и изолированной РНК к инактивации ультрафиолетом [136, 1106], при-
чем чем большее количество аналога включается в РНК, тем сильнее увели-
чивается чувствительность. Механизм этого эффекта неясен. Фотореактива-
ция инактивированного ультрафиолетом вируса была несколько эффективней
в том случае, если РНК содержала аналог.
Недавно были получены данные, которые позволяют предположить, что
Chenopodium amaranticolor обладает репаративным механизмом, с помощью
которого в темноте репарируются некоторые повреждения, вызванные
у вируса некроза табака облучением ультрафиолетом [998]. У растений Nico-
tiana tabacum и Phaseolus vulgaris такая способность выражена в меньшей
степени или вовсе отсутствует. Явление это, по-видимому, наблюдается
не у всех вирусов, поскольку Вербину и др. [1896] не удалось получить каких-
либо доказательств, подтверждающих существование темновой реактивации
РНК ВТМ в Chenopodium amaranticolor.
При облучении вирусных препаратов достаточно высокими дозами ультра-
фиолета удалось обнаружить, помимо потери инфекционности, и некоторые
другие изменения. Так, Клечковский [987] показал, что облученный ВТМ
легче поддается тепловой денатурации при pH 7,0 и температуре 69 °C, чем
необлученный вирус. При этом было отмечено повышение чувствительности
к действию тепла по мере увеличения дозы ультрафиолета. Кроме того, наблю-
далась также потеря антигенных свойств и разрушение вирусных частиц
с образованием все более и более коротких фрагментов, что приводило
в конце концов к появлению аморфной массы вирусного материала [993].
Электронно-микроскопическое исследование ВТМ, облученного при 254 им,
позволило обнаружить существование в вирусных палочках беспорядочно
расположенных разрывов, тянущихся от краев к центру частицы и имевших
разную длину вдоль ее оси [1125]. В этой же работе было определено коли-
чество вирусного белка, растворимого в трихлоруксусной кислоте (т. е. низко-
молекулярных компонентов), до гидролиза и после гидролиза трипсином. На
основании этих данных исследователи пришли к заключению, что по мере
возрастания дозы облучения от вирусной палочки отщепляются фрагменты
различного размера (в том числе и некоторое количество молекул капсидного
белка), гидролизуемые трипсином. При этом небольшое количество белка пре-
вращалось в растворимый в трихлоруксусной кислоте продукт только под
действием ультрафиолета. Это позволяет предположить, что облучение вызы-
вает разрыв пептидных связей. Средняя длина частиц постепенно уменьша-
лась. Вероятно, разрывы палочкообразной частицы происходили в тех местах,
где белок уже отделился от РНК. Облучение при 230 нм, приводящее к инак-
тивации 75% вируса, не влияло на вирусный белок таким образом, как это
Инактивация вирусов
327
описано выше; это позволяет предположить, что наиболее важные события
при инактивации связаны с РНК.
Исследования, проведенные на модельных соединениях, позволили сде-
лать вывод, что при облучении ультрафиолетом нуклеиновых кислот могут
возникать два основных типа повреждений пиримидиновых оснований: 1) гид-
ратация в 5', б'-положении и 2) димеризация пиримидиновых остатков.
Тао и др. [1746] предприняли попытку разграничить эти два механизма путем
сравнения скорости инактивации ВТМ ультрафиолетом в обычной и тяжелой
воде. Отношение констант скоростей инактивации РНК ВТМ в обычной
и тяжелой воде составляло приблизительно 1,9. РНК, облученная как в обыч-
ной, так и в тяжелой воде, в одинаковой степени обладала способностью
к фотореактивации. Эти результаты позволяют предположить, что основной
причиной инактивации при облучении ультрафиолетом является присоеди-
нение молекулы воды по 5',6'-двойиой связи пиримидиновых остатков:
СН Н]
II + I
см он
Если бы существенную роль играло образование димеров, указанное выше
отношение было бы равно 1,0, а не 2,0 (по аналогии, с образованием тимино-
вых димеров в ДНК). Кроме того, РНК, инактивированная в DaO, должна
легче поддаваться фотореактивации. Смолл и др. [1619] выделили 5 фото-
продуктов из облученной ультрафиолетом РНК ВТМ. Одним из них был
гидрат уридина. То обстоятельство, что квантовый выход инактивации РНК
ВТМ уменьшается с возрастанием упорядоченности молекулы РНК (т. е.
при более высоких концентрациях солей), подтверждает точку зрения, сог-
ласно которой летальным повреждением является образование гидратов
пиримидина [503].
В отличие от изолированной РНК эффект облучения интактного ВТМ
при суспендировании вируса был одинаковым как в Н2О, так и в D2O даже
для препарата ВТМ, который предварительно выдерживался в D2O в тече-
ние 8 дней. Это служит дополнительным доказательством того, что белковый
компонент может быть вовлечен каким-то образом в процесс инактивации
интактного вируса [1746].
Видимый свет
Хотя видимый свет сам по себе обычно не приносит вреда, уже давно
известно, что в присутствии некоторых красителей клетки и вирусы стано-
вятся чувствительными к свету и инактивируются под его действием. Инак-
тивация под действием видимого света характерна как для вирусов растений,
так и для изолированной из них РНК [364, 1289, 1292]. На фиг. 59 можно
видеть, как повышается скорость инактивации ВТМ на свету.
РНК ВТМ обладает более высокой чувствительностью к инактивации,
чем целый вирус. При взаимодействии толуидинового синего с целым виру-
сом наблюдали два эффекта. Если краситель присутствовал в инокулуме
в высокой концентрации, то после удаления его избытка инактивирующее
действие уменьшалось, на основании чего можно было предположить, что
краситель оказывает некоторое воздействие на растение-хозяина in vivo.
Однако тот факт, что некоторая инактивация все же имела место даже после
удаления свободного красителя, говорит о том, что за инактивацию под
действием света был ответствен краситель, связанный с вирусом. О связыва-
328
Глава XIV
Фиг. 59. Кривые, описывающие ско-
рость инактивации РНК ВТМ под
действием красителей иа свету и в
темноте [1292].
I— нейтральный красный, 10s М, темнота;
II — нейтральный красный, 10’ М, свет;
III — толуидиновый синий, 10-а М, тем-
нота; IV — толуидиновый синий, 10-ам,
свет.
нии красителя с вирусом свидетельствовало также изменение в спектре пог-
лощения обработанного вируса или РНК.
Вирус мозаики люцерны и вирус огуречной мозаики, а также изолиро-
ванная из них РНК инактивировались быстрее, чем ВТМ или РНК ВТМ,
что говорит о некоторой специфичности при взаимодействии вируса с краси-
телем. Вирус огуречной мозаики и его PITK отличались от двух других изу-
ченных вирусов тем, что в этом случае заметная инактивация на свету про-
исходила даже в отсутствие красителя. Что лежит в основе этого различия,
неизвестно; возможно, оно связано с присутствием в вирусном препарате
больших количеств металла, особенно железа.
Спектр действия инактивации РНК ВТМ акридиновым оранжевым имеет
сходство со спектром поглощения комплекса краситель — РНК ВТМ [856].
В модельных экспериментах было показано, что акридиновый оранжевый
и толуидиновый синий вызывают избирательное разрушение гуанозина
на свету с образованием рибозы, мочевины, гуанидина, рибозилмочевины
и других продуктов [1486, 1487, 1866]. По-видимому, наиболее вероятным
механизмом инактивации ВТМ в мягких условиях является отщепление или
изменение остатков гуанина без разрыва цепи РНК. Зингер и Френкель-
Коират [1597] показали, что два других красителя — профлавин и тиопиро-
нин — являются очень активными катализаторами, причем тиопиронин
примерно в 1000 раз более эффективен. Инактивация под действием этих
двух красителей была связана с изменением остатков гуанина. Цепь РНК
при этом не разрушалась, но небольшое количество измененного гуа-
нина освобождалось из инактивированной РНК. Если вирус размножался
в листовых дисках в присутствии красителя, то образование вируса было
слегка угнетено и удельная инфекционность образованного вируса несколько-
уменьшалась.
Инактивация вирусов
329
Зингер и Фреикель-Конрат [1595, 1596] показали, что скорость инакти-
вации РНК ВТМ под влиянием железа значительно увеличивалась при воз-
действии видимого света. При этом потеря инфекционности, наблюдавшаяся
при О °C и нейтральном значении pH, сопровождалась разрывом цепи РНК,
о чем свидетельствовало уменьшение молекулярной массы. Эксперименты,
выполненные па модельных соединениях типа нуклеотидов, показали, что
при комбинированном действии железа и света основания разрушались
и разрывалась гликозидная связь.
Зингер и Френкель-Коират пришли к выводу, что в ходе инактивации
интактной РНК изменения в основаниях предшествовали разрыву фосфо-
диэфирной связи. Поскольку даже трех эквивалентов железа па 1 моль
РНК ВТМ достаточно для того, чтобы вызвать заметный эффект, вполне
вероятно, что следы железа, прочно связанные с РНК в вирусах [835], слу-
жат фактором, ответственным за нестабильность изолированных РНК.
Инактивацию нестабильных вирусов in vivo обычно считают результатом
тепловой инактивации или действия ферментов. Однако вполне возможно,
что присутствие железа и видимый свет также оказывают влияние иа процессы
инактивации in vivo.
ОБРАБОТКА УЛЬТРАЗВУКОМ
Такахаси и Христеисен [1735] впервые показали, что обработка ВТМ
в растворе ультразвуком приводит к инактивации вируса. Количество инак-
тивированного вируса возрастает с увеличением времени обработки. Жидко-
кристаллические препараты ВТМ немедленно после обработки теряют свою
способность к двойному лучепреломлению. С увеличением длительности
обработки анизотропия в потоке уменьшается, а количество мелких частиц
увеличивается [959]. Число палочкообразных частиц длиной приблизительно
280 им, как показал Остер [1298], уменыпалос1> в процессе обработки. При
этом число частиц, длина которых составляла половину этой величины, вна-
чале возрастало, а затем снижалось, в результате чего препарат содержал
большое количество коротких частиц. Уменьшение числа частиц длиной 280 нм
было тесно связано с потерей инфекционности. С тех пор подобные результаты
были получены для ВТМ различными авторами, и можно считать, в сущно-
сти, доказанным, что инактивация под действием ультразвука обусловлена
разрушением вирусных палочек до все более и более мелких фрагментов.
Белковая часть вируса не денатурировала при обработке ультразвуком,
поскольку белок сохранял способность реагировать с антисывороткой к ВТМ.
Было обнаружено, что обработанный таким образом вирус связывал большее
количество антител, присутствующих в этой антисыворотке, чем интактный
вирус [1138]. Это происходит, вероятно, вследствие увеличения доступной
поверхности и более тесной упаковки молекул антител при взаимодействии
с более мелким антигеном.
Томлинсон [1785] исследовал действие ультразвука на вирус мозаики
турнепса, представляющий собохй гибкие палочки, значительно более длин-
ные, чем палочки ВТМ. На фиг. 60 представлено распределение по длине
палочкообразных частиц этого вируса до и после обработки ультра-
звуком.
Кроме коротких палочкообразных частиц, на электронных микрофотогра-
фиях были видны очень маленькие фрагменты вируса. Препараты Х-вируса
картофеля и вируса мозаики турнепса почти полностью утрачивали инфек-
ционность через 160 с обработки [1784]. В результате обработки ультразву-
ком Х-вирус картофеля разрушался до более мелких фрагментов, чем вирус
мозаики турнепса.
330
Глава XIV
Фиг. 60. Влияние обработки ультразвуком на распределение частиц по длине в пре-
паратах вируса мозаики турнепса [1785].
А. Обработка не производилась. J5. После обработки ультразвуком. Распределение частиц по длине
определялось с помощью олектродного микроскопа.
Действие ультразвука иа инфекционную РНК не было изучено сколько-
нибудь детально. То же можно сказать и о мелких изометрических вирусах.
Вероятно, сферическая форма делает их более устойчивыми к дезинтеграции
ультразвуком. В предварительных исследованиях было обнаружено, что
обработка ультразвуком не оказывала никакого влияния на инфекционность
вируса огуречной мозаики при условиях, обеспечивающих быструю инакти-
вацию палочкообразных частиц [1784]. При серологических исследованиях
с помощью гель-диффузии палочкообразные вирусы нередко образуют сла-
бые полосы преципитации или не образуют их вовсе.После обработки ультра-
звуком таких вирусов, как Х-вирус картофеля и вирус мозаики турнепса,
каждый из них давал одну четкую полосу преципитации.
ОБЕЗВОЖИВАНИЕ
Многие вирусы инактивируются при высушивании листьев или сока,
содержащего вирус, при комнатной температуре. ВТМ резко выделяется
по своей устойчивости к высушиванию. Однако и в этом случае повторное
увлажнение и высушивание может привести к значительной потере инфекци-
онности [115]. Вирус, инактивированный высушиванием, отличается от виру-
са, инактивированного нагреванием, тем, что он осаждается из солевых
растворов подобно активному вирусу. Белок такого вируса чувствителен
Инактивация вирусов
331
к гидролизу трипсином, но скорость гидролиза намного ниже, чем в случае
инактивации нагреванием. При инактивации вируса высушиванием в отли-
чие от инактивации нагреванием РНК не высвобождается при денатурации
вирусного белка. Степень инактивации ВТМ значительно снижается при мед-
ленном высушивании.
Если растворы очищенного ВТМ разбрызгать на какую-то поверхность,
температура которой поддерживается на низком уровне (от —22 до —15 °C),
а затем лиофилизовать, то многие палочкообразные частицы разрушаются
до мелких фрагментов [1423]. Механизм этого разрушения неясен, однако
многие частицы по своему внешнему виду похожи на вирусные палочки,
частично депротеинизированные под действием щелочи. Тем пе менее лиофи-
лизацию при контролируемых условиях можно использовать для длительного
хранения некоторых нестабильных вирусов.
ВЫСОКОЕ ДАВЛЕНИЕ
Многие белки денатурируются, если подвергнуть их в течение короткого
периода действию давления в 5000—10 000 атм. ВТМ также инактивируется
при высоких давлениях (около 8000 атм) [88, 1048]. При температуре 30 °C,
pH 7,0 и давлении 5000—10 000 атм реакции инактивации и коагуляции
ВТМ подчиняются кинетике первого порядка. По мере коагуляции происхо-
дит высвобождение РНК. Таким образом, действие высоких давлений на
вирус сходно с действием нагревания. Температура и давление взаимодей-
ствуют в ходе процесса инактивации. Например, при более низких темпе-
ратурах (30 °C) скорость денатурации увеличивается по мере увеличения
давления, тогда как при 68,8 °C она уменьшается с увеличением давления
до 680 атм [884].
СТАРЕНИЕ ВИРУСОВ
In vitro
Много лет в качестве одного из критериев при идентификации вирусов
использовали промежуток времени, в течение которого экстракт из инфици-
рованной вирусом ткани сохранял в какой-то мере инфекционность, т. е.
был устойчив к инкубации при комнатной температуре. Теперь подобного
рода критерии используются редко и применяются только в отношении тех
вирусов, которые еще не охарактеризованы с помощью более точных мето-
дов. Принимая во внимание, что обычно исследовали нестерильные и неочи-
щенные экстракты, становится очевидным, что на процесс инактивации могли
оказывать влияние многие факторы. К их числу относятся величина pH
экстракта и изменение значения pH со временем, а также действие протеаз
и нуклеаз, которые, возможно, присутствовали в экстракте с самого начала
либо появлялись в нем позднее, освобождаясь из клеточных компонентов
или из микроорганизмов, загрязняющих этот экстракт. Нитзани и Фрид-
мен [1273] высказали мысль, что для оценки стабильности экстрактов сле-
дует использовать промежуток времени, в течение которого их инфекцион-
ность снижается на 50%, а не тот длительный период, на протяжении которо-
го инфекционность сохраняется. В принципе это достаточно удовлетвори-
тельный критерий; однако в случае неочищенных экстрактов, в которых
на стабильность вирусов влияет так много различных факторов, сомнитель-
но, стоит ли проводить столь трудоемкую работу, чтобы получить кривую
инактивации, пригодную для оценки лишь одного исследуемого образца.
332
Глава XIV
Определение времени «полужизни» было бы целесообразным при исследова-
нии долговечности очищенных препаратов вирусов, которые хранились
в стерильной среде определенного состава.
In vivo
Для некоторых стабильных вирусов типа ВТМ содержание активного
вируса при нормальных условиях остается высоким в продолжение всей
жизни растения. Содержание же других вирусов после достижения максиму-
ма более или менее быстро падает (rjr. VII). Вирусная частица утрачивает
инфекционность, по-видимому, еще до того, как происходит изменение
других, присущих этой частице свойств. Механизмы инактивации вирусов
in vivo при нормальных условиях точно не установлены. Здесь могут иметь
значение по крайней мере четыре возможных фактора: 1) термическая неста-
бильность вируса в обычном диапазоне температур, приводящая к разрыву
цепи РНК; 2) действие протеолитических ферментов и нуклеаз, обнаружи-
ваемых в листьях; 3) взаимодействие вируса с инактивирующими его расти-
тельными белками или адсорбция вируса на структурных компонентах клет-
ки; 4) катализируемая железом деградация вирусной РНК под действием
видимого света.
Для нескольких мелких изометрических вирусов потеря свойственной
им инфекционности in vitro и in vivo сопровождается разрывом РНК внутри
вирусной частицы (например, ВЖМТ [738], вирус крапчатости конских
бобов [1013] и вирус кольцевой пятнистости табака [1503]). У таких вирусов
разрывы в РНК, по-видимому, не зависят от активности рибонуклеаз, нахо-
дящихся вне вирусной частицы.
КОНЦЕНТРАЦИЯ ВОДОРОДНЫХ ИОНОВ
Все белки и РНК, в том числе и те, которые находятся в вирусах, раз-
рушаются при крайних значениях pH. Действие pH зависит от температуры,
ионного состава среды, а также от возможного присутствия других веществ.
При комнатной температуре фосфодиэфириые связи в РНК начинают гидро-
лизоваться при значениях pH ниже 2,0 и выше 10,0. Стабильность каждого
данного вируса при различных значениях pH в значительной степени зависит
от природы капсидного белка и его связи с РНК. При изменении рЕ1 в кислую
сторону вирус кольцевой пятнистости табака инактивируется при рР1
ниже 6,0, У-вирус картофеля — несколько ниже 4,5, а препараты ВТМ
и вируса кустистой карликовости томатов могут сохранять некоторую ипфек-
ционность даже при таком низком значении pH, как 2,0. Большинство изу-
ченных вирусов остается, по-видимому, стабильным вплоть до pH, равного
примерно 8,0, однако некоторые вирусы инактивируются при pH выше 7,0.
ВТМ стабилен при pH, равном 8,0; при pH 9,0 начинается некоторая дезинте-
грация, а при pH 11 вирусные частицы мгновенно разрушаются [1946].
На фиг. 61, А можно видеть, в каком диапазоне pH стабилен вирус бронзо-
вости томатов в анаэробных условиях.
Осаждение вирусов из растворов в изоэлектрической точке может при-
водить к заметной потере инфекционности (фиг. 61, Б), однако инфекцион-
ность может восстанавливаться до нормы при подведении pH раствора
к значениям, при которых вирус снова переходит в раствор.
Характер продуктов распада, образующихся при инактивации вируса
под действием слабых кислот и слабых щелочей, непосредственно связан
с теми условиями, в которых проводится опыт. Наиболее детально процесс
деградации был изучен применительно к ВТМ и ВЖМТ. ВТМ инкубировали
Инактивация вирусов
333
Фиг. 61. Влияние величины pH иа инфекционность вируса.
А. Влияние различных значений pH на вирус бронзовости томатов (пыдержиианис в течение одного
часа). Все буферные системы содержали 0,01 М NaaSOj для предотвращения инактивации вследствие
окисления [100]. В. Осаждение ВТМ в изоэлектрической точке при pH, близком к 3,4. Инфекционность
снова может достичь нормы при подведении pH раствора, в котором находится осажденный материал,
к значению, равному примерно 7,0 [180). По оси ординат показано количество поражений, вызываемых
испытуемой суспензией вируса, в процентах от контроля.
при pH 9,8 в условиях различных температур и исследовали характер про-
дуктов распада в аналитической ультрацентрифуге [708]. На особенности
вновь образующихся компонентов значительное влияние оказывала темпе-
ратура. Из множества таких компонентов только два оказались действитель-
но продуктами распада. Один из них представлял собой белок с молекуляр-
ной массой около 105, а другой — палочкообразную нуклеопротеидную
частицу, длина которой составляла х/а длины ВТМ. Другие компоненты,
по-видимому, образовывались путем реагрегации более мелких продуктов
распада. РНК в этих опытах не была охарактеризована, но можно почти
334
Глава. XIV
Фиг. 62. Влияние различных значений pH на количество ГНК, освобожденной из пре-
парата ВЖМТ после нагревания в течение 30 мин при 45 °C в 0,025 М фосфатном буфере,
содержавшем 0,1 М NaCl [1177].
с полной уверенностью говорить о том, что в этих условиях опа сильно
деградировала.
Боудэн и Пири [115] показали, что при обработке ВТМ ледяной уксусной
кислотой РНК отделялась от белка; при этом РНК осаждалась, а белок
оставался в растворе. Вирусный белок, выделенный под действием 67%-ной
уксусной кислоты на холоду, имел коэффициент седиментации, равный
5,2S [532], на основании чего можно предположить, что по размеру эти части-
цы белка были сходны с теми, которые образуются при щелочной деградации.
Рядом: авторов было отмечено, что при обработке слабыми щелочами
какая-то часть частиц ВТМ оказывается более устойчивой, чем остальные
частицы. Подобным же образом некоторые частицы в препаратах других
палочкообразных вирусов также оказались более устойчивыми к щелочной
деградации (JV-вирус картофеля [111]; вирус гравировки табака [1368]).
При попытке объяснить это явление было исследовано влияние добавления
различных невирусных белков иа устойчивость ВТМ к щелочи [454]. Добав-
ление панкреатической рибонуклеазы, р-лактоглобулина, трипсина или
проназы защищало ВТМ от деградации при pH 9,8. Чтобы сохранить физи-
ческую целостность частицы, достаточно было присутствия одной молекулы
рибонуклеазы на частицу ВТМ, однако предотвратить таким образом потерю
инфекционности не удавалось. При pH 7,0 рибонуклеаза в той же концентра-
ции не снижала инфекционности препаратов. Механизм этого защитного
эффекта неясен, но на основании полученных результатов можно предполо-
жить, что различная устойчивость частиц ВТМ к действию щелочей обуслов-
лена влиянием клеточных белков, связываемых вирусом при выделении
и хранении. Танигучи [1744] показал, что в действительности^ присутствии
рибонуклеазы при pH 10 в препарате ВТМ деградирует лишь очень неболь-
шая часть вируса. В то же время при щелочном pH рибонуклеаза не предот-
вращает деполимеризации вирусных белковых палочек, пе содержащих
РНК [1745].
Инактивация вирусов
335
При нагревании препарата ВЖМТ в диапазоне температур 37—50 °C
в буферных растворах, pH которых близок к 7,0, РНК высвобождается из
белковой оболочки, которая при этом частично деградирует, и препарат
теряет инфекционность [1117]. На высвобождение РНК заметно влияет вели-
чина pH (фиг. 62).
Было проведено детальное исследование высвобождения РНК из части-
цы ВЖМТ в щелочной среде и при более низкой температуре (30 °C) [915].
При pH 11,5 и высокой ионной силе (1 М КС.1) in situ происходит разрыв це-
пи РНК, в результате чего образуются фрагменты одинакового размера
(приблизительно 5 S). 5 S-РНК высвобождалась из некоторых частиц, что
приводило к появлению пустых белковых оболочек. Частицы, содержащие
РНК, были неиифекциоины, и РНК, изолированная из них фенольной
депротеинизацией, имела низкую молекулярную массу.
Бош и др. [228], проводя опыты в подобных же условиях, показали,
что фрагментация РНК in situ сопровождалась агрегацией фрагментов
in situ [228]. Возможно, наличием примесей в лабораторных реактивах
можно объяснить то, что фрагменты РНК агрегировали [696].
При детальных исследованиях кинетики процесса деградации РНК
in situ были обнаружены три последовательные стадии [1344]. Первоначаль-
но скорость седиментации фрагментов РНК уменьшается, затем агрегация
фрагментов приводит к увеличению скорости седиментации и наконец агре-
гаты распадаются. Степень проявления каждой из этих стадий зависит от
того, каким образом был получен вирусный препарат, а также от условий
его обработки.
Ничего не известно относительно возможных локальных изменений
величин pH in vivo и влияния этих изменений на вирусы. Однако величину
pH иа поверхности листа можно изменить в ходе процесса заражения. Так,
натирание листьев N. glutinosa 0,06 и. НС1 непосредственно перед заражением
или после него приводит к уменьшению числа местных некрозов [1529].
Если в качестве инокулума пользоваться РНК, то центры инфекции ста-
новятся устойчивыми к обработке кислотой приблизительно через 2—3 ч
после заражения, тогда как в случае инокуляции ВТМ соответствующего
уровня устойчивости нельзя было достигнуть даже по прошествии 6 ч после
заражения.
ОКИСЛЕНИЕ И ВОССТАНОВЛЕНИЕ
Устойчивость вирусов в окислительной или восстановительной среде
бывает различной. При осторожной обработке ВТМ перекисью водорода
можно получить неинфекционные вирусные препараты, полностью сохра-
нившие серологическую активность. ВТМ более устойчив к денатурации
под влиянием этого реагента, чем Х-вирус картофеля [99]. Вирусы, неста-
бильные при действии других реагентов (например, вирус бронзовости тома-
тов; фиг. 63), часто оказываются очень чувствительными к изменению окисли-
тельных или восстановительных свойств среды.
НЕОРГАНИЧЕСКИЕ ВЕЩЕСТВА
Азотистая кислота
Мутагенное действие азотистой кислоты на ВТМ мы рассматривали
в гл. ХШ. При относительно мягких условиях, используемых для получе-
ния мутантов, азотистая кислота также инактивирует большое число частиц
336
Глава XIV
Фиг. 63. Инактивация вируса бронзовости томатов при различных значениях окисли-
тельно-восстановительного потенциала в том случае, когда pH равен 7,0.
ВТМ, причем в основе механизма инактивации лежит, по-видимому, тот же
процесс, что и при мутагенном действии, а именно дезаминирование основа-
ний. Мягкие условия обработки незначительно влияют на серологическую
активность вируса, однако содержание аминогрупп в белке может при этом
снижаться. При более жестких условиях вирусная частица разрушается.
Шустер и Шрамм [1512] в своих исследованиях изучали ту скорость, с кото-
рой вирусные частицы утрачивают инфекционность, а также скорость деза-
минирования аденина, гуанина, цитозина и пришли к выводу, что для инак-
тивирования целой молекулы РНК ВТМ достаточно дезаминирования одного
нуклеотида примерно па каждые 3000 нуклеотидов без расщепления цепи
РНК.
Иод
Реакция ВТМ с иодом при соответствующих условиях приводит к окис-
лению SH-групп в вирусном белке с образованием S—S-связей, ио утраты
инфекционности при этом не наблюдается. При несколько более жестких
условиях (более высокая концентрация иода или повышенная температура)
остатки тирозина превращаются в дииодтирозин и вирусные частицы теряют
инфекционность [29]. Инактивация, по-видимому, не связана непосредствен-
но с изменениями, происходящими в вирусном белке, а обусловлена какими-
то еще не идентифицированными изменениями в РНК.
Соли
Нейтральные соли оказывают, по-видимому, слабо выраженное непо-
средственное воздействие на многие вирусы, хотя присутствие таких солей
в инокулуме и может влиять на число продуцируемых вирусом местных
Инактивация вирусов
337
норажопий. Некоторые вирусы деградируют под действием, солей высокой
концентрации, тогда как другие — низкой. Так, под действием 1 М хлористо-
го кальция происходит отщепление белка от РНК у вируса крапчатости
конских бобов и вируса мозаики костра [1951, 1952]. Вирус некроза табака
(штамм Ротамстед) теряет инфекционность под действием концентрированно-
го раствора соли (1 М NaCl), но частицы его не разрушаются и сохраняют
свою серологическую активность [120]. Концентрированные растворы солей,
таких, например, как сульфат аммония, обычно уменьшают инфекционность
палочкообразных вирусов, вызывая агрегацию частиц. Однако утраченная
при таких условиях инфекционность может быть восстановлена при обработ-
ке очень слабыми щелочами. Частицы ВТМ диссоциируют на денатурирован-
ный белок и свободную РНК в растворах Sr(NO3)2, SrCl2, Ba(NO3)2 и Ca(NO3)a
(концентрация 1 моль/л) при комнатной температуре [1335].
На стабильность препаратов инфекционной РНК ВТМ заметно влияют
условия ионной среды, в которой проводится инкубация. Препараты в зна-
чительной степени теряли свою инфекционность в случае инкубации при
36 1С в течение 1 ч в 0,1 М растворе соли, однако были более стабильны
в 0,01 М и еще более — в 0,001 М буфере [540]. С другой стороны, при дей-
ствии растворов солей высокой концентрации (1—2 М) возникал некоторый
защитный эффект, который, возможно, был частично обусловлен агрегацией
и осаждением РНК. Действие соли в этих экспериментах, по-видимому,
объясняется ее влиянием на активность следов нуклеаз из листьев, которые
присутствовали в препаратах РНК.
Известно, что с изолированными вирусными РНК прочно связаны раз-
личные металлы (в очень небольших количествах) (гл. IV). Присоединение
ионов металлов к молекуле РНК приводит к различным результатам. Так,
соли ртути (1 эквивалент на 1—2 нуклеотида) инактивируют РНК ВТМ
и вызывают значительное изменение в спектре поглощения ультрафиолета.
Ацетат серебра вызывает гипохромный эффект и небольшое изменение
в спектре поглощения ультрафиолета, но не влияет иа инфекционность.
Хлорид индия оказывает меньшее влияние, не изменяя спектральных свойств,
а утрата инфекционности наблюдается лишь в том случае, если используется
раствор этой соли высокой концентрации. Все три металла (по одному экви-
валенту на два нуклеотида) оказывают защитное действие на РНК при обра-
ботке панкреатической рибонуклеазой и очищенной растительной нуклеазой.
Свободную инфекционную РНК можно выделить из комплекса с металлом
посредством одновременной обработки комплекса ферментом, ЭДТА и бенто-
нитом [1595]. Среди ряда других- исследованных металлов только железо
вызывало необратимую инактивацию РНК ВТМ (стр. 329).
При. повышенных температурах присоединение ионов металлов может
вызвать изменения двух типов в структуре РНК [835]. Ионы металлов ста-
билизируют вторичную структуру РНК, о чем свидетельствует уменьшение
поглощения в ультрафиолете нагретыми растворами. Вместе с тем, несмотря
па эту стабилизацию, инфекционность при нагревании утрачивается и фосфо-
диэфириые связи гидролизуются. Даже при комнатной температуре и pH 5,8
в присутствии ионов свинца происходит гидролиз РНК до 2', З'-моиопуклео-
тидов и в конечном счете — до нуклеозидов. Особый интерес представляет
собой тот факт, что ионы кальция и магния (которые являются обычными
ингредиентами среды в экспериментальных системах) в концентрации 10~3 М
и при pH 8,5 вызывают быструю утрату инфекционности при 65 РС. Пред-
ставляется вполне вероятным,. что ионы металлов, связанные с вирусной
частицей, играют роль в тепловой инактивации вирусов.
22-0893
338
Глава XIV
ОРГАНИЧЕСКИЕ СОЕДИНЕНИЯ
Было изучено множество синтетических органических соединений
и природных веществ с целью определения инактивирующего воздействия
на вирусы растений как in vitro, так и in vivo. Учитывая те возможности,
которыми обладают все эти вещества (в смысле специфического антивирусно-
го действия), основное внимание исследователей при изучении химических
средств борьбы с вирусными болезнями было направлено именно па эту груп-
пу. Мы можем рассмотреть здесь лишь некоторые из многих изученных соеди-
нений. Их можно подразделить на три произвольные группы. В этом разделе
мы рассмотрим главным образом простые синтетические органические соеди-
нения, далее метаболиты и антиметаболиты, а затем различные вещества
биологического происхождения, обладающие ингибирующим действием.
Мочевина
Мочевина хороню известна как агент, вызывающий денатурацию белка;
считают, что опа действует, ослабляя водородные связи и гидрофобные
взаимодействия в молекулах белков [960]. ВТМ и другие вирусы деградируют
в концентрированных растворах мочевины (около 6 М), теряя ипфекциоп-
ность и серологическую активность [117, 1665]. Утрата значительной части
инфекционности в этих ранних экспериментах была, возможно, обусловлена
активностью загрязняющих препарат нуклеаз, а не действием мочевины
на РНК. Инактивация ВТМ и Х-вируса картофеля при воздействии мочевины
сопровождается отделением белка от РНК, однако в случае вируса кустистой
карликовости томатов и вируса некроза табака этого не происходит.
Лауфер показал, что диссоциация полимеризованного белка ВТМ. в
0,2 М мочевине при pH 6,5 и температуре около 2 °C происходит более
интенсивно, чем в отсутствие мочевины [1045]. Под действием 1,8 М мочевины
при pH 6,6 и температуре 23 °C происходит очень быстрая деполимеризация
с последующей медленной и необратимой денатурацией белка. Базел [309,
ЗЮ] провела детальные исследования процесса деградации ВТМ в присут-
ствии 6 М мочевины при 0 °C и показала, что при этом образуются два основ-
ных типа палочкообразных частиц — длиной около 160 нм и 60—80 нм.
С помощью седиментационного анализа и электронной микроскопии было
установлено, что более длинные палочки имели «хвосты» РНК, выступающие
с одного конца. Это в свою очередь позволило предположить, что под действи-
ем мочевины белок отщепляется с одного конца вирусной частицы. Неболь-
шая часть палочкообразных частиц ВТМ в этих препаратах обладала зна-
чительно большей устойчивостью к мочевине, чем основная их масса.
Хотя известно, что в органах некоторых растений мочевина может
содержаться в достаточно высоких концентрациях (например, 0,12% в семе-
нах Canavalia ensiformis [1705]), все же сомнительно, чтобы это соединение
оказывало какое-либо влияние на стабильность вируса in vivo.
Гидроксиламин
Воздействие гидроксиламина приводит к инактивации РНК ВТМ,
а также к возникновению мутаций (гл. XIII). Обе реакции зависят от вели-
чины pH. При pH 4,7 инактивация не наблюдается. В пределах значений pH
от 6 до 9 инактивация происходит, но процесс этот протекает с различной
скоростью [1514]. При pH 6,2 одна молекула гидроксиламина присоединяет-
ся по 4—5-двойной связи цитозина, что приводит к появлению иминогруппы
при С-6. Вторая молекула гидроксиламина замещает затем иминогруппу
Инактивация вирусов
339
NHZ 1 О
I I ' II
N^eScH I HNzC'"CH
I* ’ll I I II
.C^sJCH I 'C CH
Ox N I O' XNZ
1 , 1 I
Фосфат---Риооза-----Фосфат------'Рибоза-Фосфат...
+
NH2OH,pH 6,1
T
NH2OH,pH 9,1
t ।
NH 1- IO
II r II
C ‘ c
HN"" ''СЩ I NH2 O'" XCH2
I 1 1 I I . I
.C. .CHNHOH _.C\ №CH
O' N , O' NH
I 1 । ,
• Фосфат ----Рибоза---Фосфат-------Риооза-Фосфат..,
+ I
. NH2OH,pH 6,1 .
NOH |
И
С<
HN CH, 1
। 1 I
.CHNHOH1
I * ।
Фосфат------Риооз а---Фосфат •
Фиг. 64. Схематическое изображение реакции гидроксиламина о пиримидиновыми осно-
ваниями РНК при pH 6,1 и 9,1 [1514].
при С-6, в результате чего образуется 4,5-гидроксиламино-№-оксицитозин
(фиг. 64). Иминогруппа может подвергаться гидролизу с образованием 4,5-
гидроксиламиноурацила. Эти новые соединения способны участвовать
в спаривании оснований по типу урацила, а не цитозина. Следствием этого
может быть летальный или мутагенный исход.
С другой стороны, при pH 9,0 отщепляется урацил, так что на месте
этого основания образуется пропуск (фиг. 64). Этот эффект является не мута-
генным, а летальным, однако он не приводит к разрыву полинуклеотидной
цепи.
Интактный ВТМ довольно устойчив к действию гидроксиламииа при
pH 6,0, т. е. в тех условиях, когда изолированная РНК инактивируется.
Алкилирующие агенты
Различные алкилирующие агенты, в частности иодацетат, окись этилена
и пропилена, иприт и диметилсульфат, инактивируют РНК ВТМ [534].
Степень инактивации зависит от условий проведения реакции и веществ,
22*
340
Глава XIV
участвующих в ней. Чтобы инактивировать молекулу РНК, достаточно
одного или нескольких актов алкилирования; мутагенным действием обла-
дает только диметилсульфат, но скорость возникновения мутаций при этом
намного ниже, чем в случае обработки азотистой кислотой. Френкель-Конрат
предположил, что введение в основание более крупной группы, чем СИ3-
группа, может нарушить процесс репликации вирусной РНК. Поэтому при
воздействии реагентов, включающих в молекулу РНК такие группы,
должна происходить инактивация РНК, а не образование мутаций.
Формальдегид
Это соединение очень широко используется в качестве инактиватора
вирусов животных при изготовлении: вакцин. Реагент этот очень удобен,
так как он подавляет инфекционность вирусов, однако серологическая
активность их при этом сохраняется.' Формальдегид является соединением
с высокой реакционной способностью, которое может реагировать с различ-
ными группами как белка, так и РНК вируса.
Возможность того, что в процессе инактивации ВТМ при воздействии
на него формальдегида играет роль РНК, была отмечена Френкель-Копратом
иа основании изменений в спектре, наблюдаемых после обработки вируса
этим соединением, а также того факта, что после обработки .интактного
вируса около 0,8% формальдегида было обнаружено в РНК и только около
0,05% — в белке 1530].
Результаты, полученные Катрайтом и др. [329] при изучении кинетики
утраты инфекционности ВТМ, привели их к выводу, что инактивация оди-
ночной вирусной частицы может произойти в результате реакции с одной
молекулой формальдегида. На основании кинетических исследований и дан-
ных об инактивации под действием других реагентов, специфичных для
определенных групп, они высказали мысль о том, что формальдегид с наиболь-
шей вероятностью связывается с ^-гидроксильными группами серина и
треонина, гидроксильными группами рибозы и аминогруппами пуринового
и пиримидинового колец.
Инфекционная РНК ВТМ очень чувствительна к действию формальде-
гида: для ее инактивации достаточно,- чтобы концентрация этого реагента
составляла менее V1Oo той концентрации, которая необходима длН инактива-
ции интактного вируса [1658, 1659]. РНК полностью инактивируется при
воздействии 0,1%-ного формальдегида в течение 1 ч. Отсюда можно сделать
вывод, что белковая оболочка вируса играет значительную роль в защите
РНК И задерживает ее инактивацию. Формальдегид связывается со свобод-
ной РНК ВТМ таким образом, что при диализе большая его часть теряется.
Меньшая же часть этого реагента оказывается связанной более прочно,
и относительное количество такого материала увеличивается с увеличением
времени реакции. В условиях, приводящих к частичной инактивации пре-
парата РНК, связывается только одна молекула формальдегида на несколько
сотей Нуклеотидов. Имеются некоторые данные, говорящие в пользу того,
что в’ результате реакции с формальдегидом в молекуле РНК могут возник-
нуть поперечные сшивки.
Двуокись углерода
При искусственном повышении содержания двуокиси углерода в атмосфе-
ре, окружающей растения, чувствительность растений фасоли к вирусу
некроза табака уменьшается [911]. Эта обработка -эффективна, если, она
цроцзводилась в разные сроки на протяжении 2 ч после заражения;,через 4 ч
Инактивация вирусов
341
опа оказывается неэффективной. Механизм такого ингибирования неясен.
Если растения табака поместить перед заражением в атмосферу, содержащую
50% двуокиси углерода, то это не оказывает никакого влияния на их чувстви-
тельность к У-вирусу картофеля, передаваемого тлями [254].
Органические кислоты
Х-вирус картофеля почти полностью теряет свою инфекциоппость,
серологическую активность и другие свойства после инкубации в цитрате
натрия при pH 7,0 и температуре 37 °C [100]. Напротив, вирус некроза табака
(штамм Ротамстед) утрачивает инфекциоппость, однако серологическая
активность и способность этого вируса кристаллизоваться пе претерпевают
никаких изменений [122]. Присутствие цитрата и некоторых других орга-
нических кислот вполне может быть фактором, приводящим к инактивации
некоторых вирусов растений в растительных экстрактах. Вместе с тем цитрат
иногда присутствует в среде при выделении вирусов.
Эти кислоты могут также служить фактором, ограничивающим проникно-
вение в клетку некоторых вирусов и их размножение. Разбрызгивание на
листья растений фасоли ряда органических кислот (в концентрации около
0,1 М) перед инокуляцией или примерно в течение 2 ч после заражения
приводит к значительному уменьшению числа местных некротических пора-
жений, вызываемых вирусом некроза табака [1187]. Известно, что соедине-
ния, подобные лимонной или янтарной кислоте, образуют хелатные комплек-
сы с ионами некоторых металлов, например с ионами кальция и магния.
Ингибирующее действие подобного рода кислот можно снять путем добавле-
ния солей этих металлов. Так, вирус некроза табака, как и некоторые виру-
сы бактерий, нуждается для своего успешного развития в наличии ионов
некоторых металлов. Однако Вилтшайр [1918, 1919] не обнаружил никакой
корреляции между концентрацией различных органических кислот в листьях
фасоли и изменением в чувствительности растений при заражении их вирусом
некроза табака.
Органические растворители
Некоторые органические растворители при благоприятных условиях
вызывают осаждение и денатурацию вирусов. Очищенный препарат ВТМ
осаждается из бессолевых растворов (pH 7,0) лишь при концентрации эта-
нола не выше 80%. В 80 %-пом этаноле наблюдается медленная денатурация
вируса [115]. ВЖМТ гораздо более чувствителен к действию этанола, и уже
в 30%-ном его растворе при pH 7,0 и комнатной температуре происходит
отщепление белка от РНК с последующей денатурацией [1157]. Состояние
РНК, освобожденной из частицы ВЖМТ под действием этанола, зависит
в первую очередь от того, имеются ли в вирусном препарате следы рибонуклеа-
зы. Использование органических растворителей для выделения вирусов
и вирусных компонентов мы рассматривали в гл. III и IV.
Поверхностноактивные вещества
Воздействие додецилсульфатом натрия в мягких щелочных условиях
приводит к отделению белка от РНК не только у частиц ВТМ, Х-вируса
картофеля, ио также и у вируса кустистой карликовости томатов [118, 1654].
В случае обработки ВТМ додецилсульфатом натрия при более четко опре-
деленных условиях (pH 8,5—8,8 и температуре 50 °C в течение нескольких
минут) удается получить препараты инфекционной РНК [1540].
342
Глава XIV
При обработке детергентом комплекса ВТМ с метиленовым синим был
получен другой набор продуктов [1894]. В частности, появился комплекс,
образовавшийся в результате взаимодействия полимерного красителя с бел-
ковыми субъединицами вируса, и возникали линейные полимеры (полимери-
зация конец в конец), а также комплекс, в который входили белок, метиле-
новый синий и 1/3 РНК вируса. Эти результаты подтверждают другие дан-
ные, позволяющие предполагать, что в частицах ВТМ имеется какая-то
область, отличающаяся по стабильности и расположенная на расстоянии
около х/3 длины палочкообразной частицы (фиг. 14 и 36).
Синтетические полиэлектролиты
Синтетические полипептиды, построенные из лизина, ингибируют ин-
фекционность ВТМ [1661]. Такие основные полипептиды реагируют с виру-
сом, осаждая его из раствора. Свободный лизин не вызывает осаждения виру-
са [303]. Ингибирующее действие синтетического полипептида на ВТМ воз-
растает с увеличением средней длины его цепи. Основные пептиды, как
полагают [303], соединяются с вирусным белком путем образования множе-
ства ионных связей между противоположно заряженным вирусом и пептидом.
В результате такой комбинации и происходит ингибирование инфекцион-
ности.
Применение полилизина перед инокуляцией растения или после нее
не оказывает влияния на число местных поражений, вызываемых ВТМ.
В противоположность этому кислый полиэлектролит — полиглутаминовая
кислота — уменьшает число местных поражений, если она нанесена на
листья при pH 7,0 до заражения ВТМ, но не после него. При pH 7,0 полиглу-
таминовая кислота и ВТМ заряжены отрицательно и не реагируют друг
с другом. Возможно, полиглутаминовая кислота ингибирует инфекцию
в результате взаимодействия с каким-то клеточным компонентом, а не с виру-
сом [1660].
Красители и производные акридина
Влияние различных красителей и производных акридина на инактива-
цию вирусов in vitro мы уже рассматривали в связи с вопросом о воздействии
видимого света. Некоторые соединения этого типа приводят к ослаблению
вирусной инфекции и замедляют репликацию вируса in vivo [1268, 1734].
Полиамины
Спермин — природный полиамин — превращается под действием сыво-
роточной аминооксидазы в окисленный спермин. Это вещество, будучи сме-
шанным с инокулумом, ингибирует заражение Х-вирусом картофеля, виру-
сом мозаики люцерны и ВТМ. Окисленный спермин связывается с вирусом
и, очевидно, действует непосредственно на вирус, а не на растение-хозяина,
поскольку инфекционность уменьшается по мере увеличения времени инку-
бации [57].
/г-Меркурибеизоат
Это соединение специфически реагирует с сульфгидрильными группами
белков. В результате его взаимодействия с сульфгидрильными группами
ВЖМТ происходит заметное изменение стабильности вируса [916]. Изме-
ненный вирус деградирует при таких величинах pH и ионной силы, когда
нормальный вирус стабилен. Полагают, что введение этого вещества вызывает
Инактивация вирусов
343
конформационные изменения вируса, приводящие к обнажению фототропных
групп вирусного белка и, возможно, нуклеиновой кислоты. Введение /г-мерку-
рибеизоата модифицирует вирусную оболочку таким образом, что РНК, кото-
рая была ранее защищена, становится чувствительной к действию рибонуклеа-
зы. Интенсивный гидролиз РНК внутри вирусной частицы приводит к раз-
рушению белковой оболочки [917].
МЕТАБОЛИТЫ И АНТИМЕТАБОЛИТЫ
В 1940 г. Вудс [1934] показал, что n-аминобензойная кислота может
снимать ингибирующий эффект стрептоцида на рост гемолитического стрепто-
кокка. Он предположил, что стрептоцид вызывает конкурентное ингибиро-
вание фермента, действие которого зависит от присутствия п-аминобеизойной
кислоты, и что это ингибирование обусловлено структурным сходством
между стрептоцидом и н-аминобензойной кислотой. С тех пор много усилий
было направлено на получение и исследование синтетических аналогов
нормальных метаболитов с целью выяснить, могут ли они служить ингибито-
рами роста in vivo, в особенности роста вирусов и опухолевых клеток. Ника-
ких существенных практических успехов в этой области еще не достигнуто.
Многие соединения этого типа были также исследованы в отношении воз-
можного специфического ингибирования вирусов, находящихся в растениях.
И в этом случае каких-либо значительных практических результатов до сих
пор ие получено, однако некоторые группы соединений оказались очень
интересными в качестве рабочего инструмента, могущего быть использован-
ным при изучении процессов, происходящих при репликации вируса. Имею-
щиеся в нашем распоряжении методы исследования соединений этого типа
подробно рассмотрены нами в другой работе [1183].
Аналоги природных пуринов и пиримидинов
Основной трудностью при разработке эффективных химических мер
•борьбы с заболеванием является необходимость найти какое-то соединение,
которое оказывало бы летальное или токсическое действие на патогенные
агенты, по при этом не вызывало бы серьезных нарушений в организме
хозяина. Рассматривая различные типы синтетических соединений, которые
могут оказывать специфическое ингибирующее действие па вирусы растений,
представляется вероятным, что подобными возможностями должны обладать
аналоги пуриновых и пиримидиновых оснований, встречающихся в РНК,
поскольку именно РНК представляет собой генетический материал боль-
шинства вирусов растений. jv
H,N^ N
Н
8-Азагуанин
2-Тиоураи,ил
Б-Фторурацил
Первыми изученными соединениями были 8-азагуаиин [1170] и 2-тиоурацил
[397], и хотя с тех пор было исследовано много аналогов, эти два соединения
наряду с 5-фторурацилом привлекают наибольший интерес.
344
Глава XIV
Работа с этими аналогами была начата еще до того, как появилась какая-
либо возможность проникнуть в глубь процесса репликации вируса. Трудно
было представить, каким образом можно заблокировать синтез вирусной
РНК, не вызвав повреждения клетки вследствие нарушения синтеза клеточ-
ных РНК. Однако теперь известно, что вирусные РНК реплицируются
на РНК-матрице. Данных о том, что такой РНК-зависимый синтез РНК
происходит в незаряженной клетке, не имеется. Таким образом, по крайней
мере в принципе возможно блокировать синтез вирусной РНК, не влияя
иа синтез клеточных РНК.
Аналоги пуринов и родственные соединения
Опрыскивание листьев раствором 8-азагуанина вызывает заметное
уменьшение или предотвращение системного развития некоторых вирусов
[1170, 1173]. Это соединение в концентрации около 0,01 М приводит к незна-
чительной задержке в росте и служит причиной деформации молодых листьев.
Можно, однако, добиться полного ингибирования системного развития виру-
са мозаики люцерны и вируса огуречной мозаики без заметного нарушения
роста растения. Фиг. 65 иллюстрирует влияние различных концентраций
8-азагуанина на развитие симптомов системного поражения, вызываемых
вирусом мозаики люцерны.
Нам еще не приходилось встречать соединение, которое было бы спо-
собно предотвратить дальнейшее распространение системной инфекции, если
системное заболевание уже развилось. Вообще эффективность действия
соединения зависит также от метода его применения и способа заражения
растения. Например, аналог не оказывает ингибирующего воздействия
на вирус огуречной мозаики у огурцов, если его применять одновременно
с поливкой почвы вокруг растений, механически инокулированных этим
Фиг. 65. Действие различных концентраций
8-азагуанина при опрыскивании растений та-
бака на системное развитие вируса мозаики
люцерны [1189].
Шесть растений в каждой группе.
Инактивация вирусов 345
вирусом. Однако подобный метод введения этого соединения оказался эффек-
тивным для ряда растений, инфицированных с помощью тлей.
Из всего найденного до сих пор действие 8-азагуанииа на вирус мозаики
люцерны и вирус огуречной мозаики — это пока паше лучшее достижение
в области химической защиты от инфекции. Среди целого ряда исследованных
соединений 8-азагуанип оказался единственным аналогом, который способен
замедлять или предотвращать системное развитие вируса мозаики костра
у пшеницы, не оказывая при этом токсического действия [372]. Тем пе менее
это соединение пе нашло практического применения вследствие небольших
различий в дозах, токсичных для растений, и дозах, оказывающих апти-
вирусисе действие. Кроме того, применение этого аналога ограничивается
также необходимостью его использования в сроки, очень близкие ко времени
заражения растений вирусом.
На некоторые другие вирусы, например X- и У-вирусы картофеля и вирус
броизовости томатов, 8-азагуанин не оказывает сильного ингибирующего
действия. Под влиянием этого аналога у табака, инфицированного ВТМ.
или в листьях китайской капусты, инфицированных ВЖМТ, происходит
замедление развития заболевания и уменьшение выхода вируса, но при этом
никогда пе наблюдалось полного ингибирования системной инфекции.
Была исследована антивирусная активность ряда других замещенных
8-азапуринов. Среди них только 8-азаадении обладал в какой-то мере замет-
ным ингибирующим действием, однако он был значительно более токсичным,
чем аналог гуанина. Замещенный триазол — 4(5)-амино-1Н-1,2,3-триазол-
5(4)-карбоксиамид — можно рассматривать как аза-аналог замещенного
имидазола, который является, как известно, предшественником пуринового
кольца в некоторых системах. Это соединение обладает некоторой инги-
бирующей активностью, но менее эффективно, чем 8-азагуанин.
Антивирусную активность 8-азагуапина можно ликвидировать, если
опрыснуть растения некоторыми природными пуринами (например, адени-
ном, гуанином или гипоксантином), а также их рибонуклеозидами или
рибонуклеотидами. Структура 8-аза-аналогов, обладающих ингибирующей
активностью, и структура природных соединений, снимающих это ингибиро-
вание, говорят о том:, что 8-азагуанин каким-то образом нарушает синтез
вирусной РНК или влияет на ее функции.
Анализ ВТМ и ВЖМТ из обработанных растений показал, что 8-аза-
гуанин включается в РНК вирусной частицы, замещая часть (несколько
процентов) остатков гуанина [1174, 1176, 1177]. Вирусные препараты, содер-
жащие аналог, были менее инфекциоииы, чем нормальный вирус, и мы пред-
положили, что ингибирующий эффект может быть обусловлен (по крайней
мере частично) образованием стерильных вирусных частиц. В свете совре-
менных данных о репликации вирусов весьма маловероятно, чтобы такой
процесс лежал в основе ингибирования. Более вероятно, что аналог пре-
пятствует функционированию репликативной формы вирусной РНК или
влияет па эффективность матричной функции вирусной РНК, однако пока
этот вопрос не исследован.
Изучение бактериальных транспортных РНК, содержащих 8-азагуанин,
позволило предположить, что стабильность структур, в которых основания
спарены за счет водородных связей, уменьшается в присутствии этого анало-
га [1064]. Исследования in vitro с использованием модельных соединений
позволили сделать вывод о том, что 8-азагуанин способен снижать эффектив-
ность информационной РНК в качестве матрицы при синтезе белка. Синте-
тический полимер, содержащий 8-азагуанин, стимулировал включение тех
же аминокислот, что и соответствующий полимер, содержащий гуанин,
однако с меньшей эффективностью [684]. Синтетические триплеты, содержа-
щие вместо гуанина 8-азагуанин, были менее эффективными стимуляторами
346
Глава XIV
связывания амипоацил-тРНК с рибосомами [685]. Полирибосомы из обра-
ботанных 8-азагуанином клеток HeLa обладали меньшем эффективностью
в синтезе белка in vitro, чем нормальные полирибосомы [1987].
Описываемый аналог не оказывал значительного влияния на число
пустых белковых оболочек, образующихся в растениях, инфицированных
ВЖМТ, чем его действие заметно отличалось от действия 2-тиоурацила
(см. ниже). Была исследована антивирусная активность и ряда других ана-
логов пуринов, однако ни одно из этих соединений не вызывает какого-либо
особого интереса в отношении его действия на вирусы растений.
Аналоги пиримидинов
Коммонер и Мерсер 1397, 398] показали, что в дисках из листьев табака,
плавающих на поверхности растворов, которые содержат 2-тиоурацил (в низ-
кой концентрации), образование ВТМ сильно тормозится. Опрыскивание
этим соединением ли'стьев интактных растений вызывало заметное их пожел-
тение и приводило к задержке роста молодых листьев. Действие 2-тиоура-
цила как ингибитора вируса мозаики люцерны и вируса огуречной мозаики
не столь эффективно, как действие 8-азагуаиина, однако это соединение
гораздо более эффективно в отношении ВТМ [1173]. Боудэн и Кассанис [105]
показали, что кроме ингибирования ВТМ 2-тиоурацил замедляет размноже-
ние X- и У-вируса картофеля, а также вируса мозаики белены в плавающих
на поверхности растворов листьях табака. Ингибирующее действие 2-тиоура-
цила на ВТМ снимается добавлением урацила, но не снимается добавлением
цитозина или тимина [1198].
Подобно 8-азагуанину, 2-тиоурацил включается в РНК ВТМ, синтези-
руемую в обработанных листьях [867, 1178]. Как сообщалось, происходит
замещение приблизительно 3 — 10 % урацила в РНК.
Препараты ВТМ, содержащие 2-тиоурацил, менее инфекционны, чем
нормальный вирус, и степень уменьшения инфекционности коррелирует
со степенью замещения урацила на 2-тиоурацил [551]. При исследовании
препаратов изолированной РНК снижение инфекционности, обусловленное
включением 2-тиоурацила, было несколько меньшим, чем у интактного
вируса, и причины этого нам пока неясны. РНК ВТМ, содержащая 2-тиоура-
цил, имеет размеры нормальной РНК, о чем можно судить на основании
седиментационного анализа; палочкообразные частицы ВТМ, содержащие
аналог, характеризуются нормальным распределением по длине при иссле-
довании их в электронном микроскопе [545]. Обработка тиоурацилом может
вызвать некоторые изменения в белке вируса. Серологические исследования
позволили предположить, что у ВТМ, синтезированного в присутствии
2-тиоурацила, капсидный белок серологически изменен [865]. При этом не
было получено данных о появлении новых детерминантных групп; выясни-
лось, однако, что для осаждения какого-то определенного количества антител
из антисыворотки к ВТМ требуется больше вируса, содержащего 2-тиоура-
цил, чем нормального вируса.
2-тиоурацил, меченный 3SS, включается как в РНК клеток растения-
хозяина, так и в двухцепочечную РНК ВТМ [1384]. При одних и тех же
условиях обработка 2-тиоурацилом заметно подавляет включение 32Р
в двухцепочечную РНК, но мало сказывается па включении этого изотопа
в РНК клеток-хозяина. Поэтому представляется вероятным, что 2-тиоурацил
специфически действует на репликацию ВТМ в клетках табака, подавляя
РНК-зависимый синтез РНК более эффективно, чем ДНК-зависимый. Основ-
ным способом блокирования синтеза ВТМ 2-тиоурацилом, возможно, являет-
ся включение его в минус-цепь репликативной формы, в результате чего она
не может затем функционировать при образовании цепей вирусной РНК.
Инактивация вирусов
347
Можно почти с полной уверенностью утверждать, что 2-тиоурацил ие вклю-
чается в ДЫК, т. е. синтез РНК клетки-хозяина может продолжаться нор-
мально, несмотря на то что новообразованная РНК и содержит некоторое
количество аналога.
Серологические изменения, наблюдавшиеся в капсидном белке [365],
нельзя полностью объяснить включением аналога в вирусную информацион-
ную РНК. Включение аналога в минус-цепь может быть не менее важным,
поскольку оно приводит к ошибкам при спаривании оснований, когда на пей
строится плюс-цепь. Образование неправильных триплетов обычных основа-
ний привело бы далее к включению неправильных аминокислот при синтезе
капсидного белка. Если капсидный белок оказывается действительно изме-
ненным благодаря включению 2-тиоурацила в РНК, как это можно предпо-
ложить на основании серологических исследований [865], то вероятно,
что вирусная РНК-полимерааа, образующаяся в листьях, обработанных
2-тиоурацилом, также является дефектной. Это может быть еще одной из
причин, определяющих нарушение функции репликативной формы РНК.
Действие 2-тиоурацила па ВЖМТ в некотором отношении отличается
от действия на систему ВТМ. Аналог угнетает образование инфекционного
нуклеопротеида, ио не включается в РНК вируса, и очищенные препараты,
выделенные из обработанных листьев, имеют нормальную инфекционность
[551]. 2-тиоурацил вызывает заметное увеличение образования пустых бел-
ковых оболочек (фото 76). Поэтому, несмотря па то что образование вирусно-
го нуклеопротеида уменьшается, общее содержание вирусного белка (пустые
оболочки 4- нуклеопротеид) может превышать содержание белка в необра-
ботанных листьях.
Действие 2-тиоурацила не ограничивается ВЖМТ. Так, Гиббс и др. [622]
показали, что содержание пустых белковых оболочек в препаратах двух
других мелких изометрических вирусов (латентного вируса картофеля
и вируса крапчатости паслена) заметно увеличивалось, если растения опрыс-
кивали 2-тиоурацилом. Аналогичное действие на эти вирусы оказывал
‘6-азаурацил.
Изучая действие 2-тиоурацила на ВЖМТ, мы не смогли обнаружить
накопления свободной вирусной РНК в количестве, эквивалентном избытку
наблюдавшихся при этом пустых белковых оболочек. Это объясняется тем,
что 2-тиоурацил блокирует включение изотопа 32Р в репликативную форму
РНК ВЖМТ [1385]. Ингибирование РНК-зависимого синтеза РНК является
довольно специфичным, как и в случае с ВТМ, поскольку нам: не удалось
обнаружить сколько-нибудь существенного умёньшепия включения 32Р
в нуклеиновые кислоты клетки-хозяина. Детали механизма, лежащего в
основе блокирования РНК-зависимого синтеза РНК,- предстоит еще выяс-
нить. В отличие от того, что мы наблюдали в случае с'ВТМ, нам не удалось
обнаружить включения аналога в репликативную форму РНК ВЖМТ.
Репликативная форма РНК, присутствующая в листьях к началу обработки,
ие разрушается, но остается в неактивном состоянйи.
В настоящее время неясно, каким образом 2-тиоурацил стимулирует
образование пустых белковых оболочек. Франки и Мэтьюзу [551] при сравне-
нии ряда свойств нормальных и образованных под действием 2-тиоурацила
пустых оболочек не удалось обнаружить каких-либо различий между ними.
Попытки применения бесклеточной системы из листьев китайской капусты
с целью получения более детальной информации относительно механизма
действия 2-тиоурацила [1381, 1382] имели очень незначительное отношение
к событиям, происходящим в интактном растении, возможно потому, что
2-тиоурацил не утилизировался в бесклеточной системе.
5-фторурацил ингибирует образование ВТМ в зараженной ткани листьев
табака, плавающих на поверхности растворов, содержащих это соедине-
348
Глава XIV
пие [665]. Этот аналог включается в вирусную РНК гораздо легче, чем 8-аза-
гуанин или 2-тиоурацил. Включение больших количеств 5-фторурацила
(т. е. замещение 28—47% урацила), по-видимому, не оказывает влияния
на инфекционность вируса, о чем можно судить по числу образующихся
при этом местных поражений. Однако у растений с системным поражением,
возникающим после заражения ВТМ, содержащим аналог, образуется
меньшее количество вируса |665]. ВТМ, содержащий 5-фторурацил, более
чувствителен к инактивации ультрафиолетом, чем нормальный вирус.
В ВТМ, выделенном из обработанной 5-фторурацилом ткани, не обна-
ружено никаких изменений в капсидном белке. Так, Холоубек [827] не
обнаружил никаких изменений в аминокислотном составе этого белка,
а другие авторы [1712] — в серологических свойствах вируса, однако метод,
который использовали в этой работе, не обладал особой чувствительностью.
Таким образом, полученные данные позволяют предположить, что вклю-
чение больших количеств 5-фторурацила в вирусную РНК не приводит
к ошибкам в считывании матрицы при синтезе вирусного капсидного белка.
Несмотря па это, можно постулировать, что некоторые ошибки все-таки
имеют место и что большая их часть приводит к образованию полипептидов,
неспособных полимеризоваться в палочкообразные вирусные частицы. Такие
молекулы должны теряться при выделении интактного вируса из обработан-
ных растений.
Аминокислоты
Как показали наблюдения, ни одна из исследованных до сих пор амино-
кислот и ни один из аналогов аминокислот не обладают какой-либо заметной
антивирусной активностью [1427, 1494]. Поскольку при синтезе белков
клетки-хозяина и вирусных белков используются одни и те же аминокисло-
ты, довольно трудно рассматривать вопрос о возможном механизме их спе-
цифического действия.
Регуляторы роста растений и родственные им соединения
Различные соединения типа регуляторов роста снижают содержание
вируса в растениях или маскируют симптомы заболевания, например нафтил-
уксусная кислота [1033], ипдолилмасляная кислота [1032], гибберелловая
кислота [1403], 2,4-Д [706]. В последнее время интерес привлек кинетин.
Было найдено, что это соединение (6-фурфуриламинопурин) стимулирует
синтез РНК и белка в дисках, вырезанных из листьев различных здоровых
растений. Таким образом, весьма удивительно, что это соединение ингибирует
размножение некоторых вирусов или уменьшает число местных поражений,
возникших после механической инокуляции. Подобного рода данные полу-
чены в отношении вируса бронзовости томатов в полосках листа петунии
и в листочках томата [1526], ВТМ в дисках, вырезанных из листа табака [975],
вируса некроза табака в листовых дисках растений фасоли [1286] и ВЖМТ
в листовых дисках китайской капусты [346]. Однако действие кинетина
может зависеть от условий его применения. Так, синтез ВТМ в интактных
растениях табака либо стимулируется, либо подавляется в зависимости
от количества кинетина и от возраста листьев [426].
№-бензиладенин, синтетическое соединение, обладающее некоторым
действием на рост растений и структурно родственное кинетину, также инги-
бирует вирус бронзовости томатов в отделенных от растения листьях N. rusti-
са, причем его действие не зависит от того, применяется ингибитор до или
после заражения [14]. Однако при воздействии этого соединения на интактное
растение оно ингибирует образование вируса, если обработка проводится
Инактивация вирусов 349
до инокуляции, но вызывает стимуляцию этого процесса в случае его приме-
нения после заражения.
N-диметиламиноянтариая кислота (соединение, замедляющее рост расте-
ния) при нанесении ее на листья Vigna sinensis через 45 мин после заражения
их вирусом кольцевой пятнистости табака вызывает заметное уменьшение
числа образуемых впоследствии местных некротических поражений [922|.
ВЕЩЕСТВА БИОЛОГИЧЕСКОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ
Антибиотики и другие вещества, образуемые
микроорганизмами
На основании того, что сейчас известно о механизме действия анти-
биотиков, нам не кажется удивительным, что многие из этих веществ, выяв-
ленные по их способности оказывать специфическое действие иа клеточных
паразитов, влияют очень незначительно или но оказывают никакого влияния
на вирусы растений (например, пенициллин, стрептомицин и ауромицип [134|).
Лишь немногие продукты жизнедеятельности грибов обладают антивирусной
активностью. Цитовирин (метаболит Streptomyces sp.) был впервые описан
в 1957 г. [673]. Разбрызгивание его на листья незадолго до заражения пол-
ностью предотвращает возникновение местных некротических поражений,
вызываемых вирусом южной мозаики фасоли на растениях фасоли и ВТМ
на N. rustica, а также заражение растений табакаХ-вирусом картофеля [1548].
Гупта и Прайс [687, 6881 исследовали культуральную жидкость 49 видов
грибов и обнаружили, что культуральная жидкость Trichothecium roseum
(Link) обладает ингибирующим: действием. Боудэн и Фримен [101] показали,
что это действие обусловлено двумя компонентами. Основной активностью
•обладает полисахарид, который содержит в качестве главного углеводного
компонента D-галактозу. Этот полисахарид пе осаждает ВТМ и ие образует
с ним растворимого комплекса. Действие его эффективно при опрыскивании
листьев перед заражением, ио не после него.
Другой ингибитор был идентифицирован как трихотеции (эфир изокро-
тоиовой кислоты и кетонового спирта трихотеколона). Это вещество обладает
также антигрибной активностью. Ингибитор был эффективен против несколь-
ких вирусов, если его разбрызгивали на листья ие ранее чем за два дня
до инокуляции и не позднее чем через один день после нее. В противополож-
ность трихотецину трихотеколон и ацетилтрихотеколоп более эффективно
предотвращали заражение N. rustica, чем заражение Phaseolus vulgaris.
Следовательно, относительная эффективность этих ингибиторов зависит
скорее от видовых различий менаду инокулированными растениями, чем
от вируса (исследованы были ВТМ, вирус кустистой карликовости томатов
и вирус некроза табака). На основании полученных результатов можно
предположить, что ингибитор действует па растение-хозяина, а ие па вирус.
Однако пе исключено также, что эти соединения, попадая па лист, могут
быть превращены под действием определенных видов растений-хозяев либо
в инертные вещества, либо в обладающие активностью ингибиторы, дей-
ствующие непосредственно на вирус или на синтез вируса. Брэдли и Ганонг
[254] показали, что трихотеции, разбрызганный на листья табака в концен-
трациях, безвредных для растения, защищает большую часть растений от
заражения У-вирусом картофеля, переносимого тлями.
Под действием бластицидина S заметно снижается количество ВТМ,
образуемого в дисках, вырезанных из зараженных листьев табака, когда эти
диски плавают на поверхности растворов, содержащих бластицидин S в кон-
центрации 0,05—0,2 ч. иа млн. При этих условиях данный антибиотик дей-
350
Глава, XIV
ствует гораздо более эффективно, чем 2-тиоурацил [786, 789]. Разбрызганный
на листья табака непосредственно после заражения их ВТМ, он ингибирует
синтез РНК ВТМ, не нарушая при этом синтеза РНК клетки-хозяина-
[790].
Актиномицин D в концентрации, при которой он ингибирует синтез
клеточных РНК, не оказывает заметного влияния на синтез вирусов растений
(например, ВТМ [1470], вирус крапчатости бобов фасоли [78]). Это не удиви-
тельно, поскольку этот антибиотик блокирует, как полагают, главным обра-
зом ДНК-зависимый синтез РНК. Однако при определенных условиях анти-
биотик ингибирует вирус желтой мозаики коровьего гороха (гл. VII) [1082].
Лёбенштейн и Ловрекович [1088] показали, что убитые нагреванием
клетки Pseudomonas syringae van Hall, инъецированные в межклетные про-
странства N. tabacum, вызывают заметное уменьшение числа местных пора-
жений, возникающих под действием ВТМ. Инъекция была эффективна, если
выполнялась в период 0—7 дней перед заражением и 1—2 дня после зараже-
ния. Бесклеточная надосадочная жидкость из бактериально!! культуры
не обладала ингибирующей активностью, в то время как разрушенные клетки
бактерий были активны. Ингибирование выражалось не только в маскировке
видимых симптомов поражения, но при этом блокировались также процессы
репликации вируса. Препарат не оказывал инактивирующего действия
на ВТМ in vitro. Лёбенштейн и Ловрекович высказали предположение, что
образование некоего ингибитора ВТМ стимулируется в листе под действием
какого-то компонента бактериальной клетки.
Дрожжевая РЫК снижала число местных поражений, возникающих
под действием ВТМ на листьях N. glutinosa, если ее в довольно высоких кон-
центрациях (5 мг/мл) наносили на листья или смешивали с ииокулумом.
Этот эффект снимался, если использовали гидролизованную РНК. Подобные
же результаты были получены Чео и др. [361] на других растениях-хозяевах.
Ингибирование проявлялось лишь по прошествии 1—2 дней после обработки
листьев РНК, и это заставляет предполагать, что чужеродная РНК индуци-
рует в растении образование какого-то антивирусного вещества.
Кроличья сыворотка
Серология вирусов растений рассматривается в гл. XV. Здесь мы обсу-
дим вопрос о влиянии нормальной и вирусоспецифичной иммунной сыворот-
ки на инфекционность вирусных препаратов. Если вирусы смешиваются
с нормальной кроличьей сывороткой или со специфической антивирусной
сывороткой, то инфекционность препаратов уменьшается. Кассанис [9271
показал, что при использовании свежей сыворотки неспецифический эффект
довольно силен и в значительной степени затемняет специфическую нейтра-
лизацию, тогда как при использовании уже хранившейся сыворотки пре-
обладают специфические эффекты. Необратимая инактивация вируса при
смешивании с нормальной сывороткой или с антивирусной сывороткой про-
исходит не всегда. Так, ВТМ вновь приобретает некоторую инфекционность
при разбавлении смеси, а ферментативный гидролиз белка антител также
приводит к освобождению активного вируса из специфических преципита-
тов [115]. Если неинфекционные преципитаты ВТМ со специфическими
антителами подкислить до pH 2,0, происходит диссоциация комплекса,
сопровождаемая высвобождением инфекционного вируса и белка антитела
[1388]. При использовании антисыворотки с высоким содержанием антител
Раппапорту и Зигелю [1391] удалось разграничить специфическое действие
антител на ВТМ от неспецифического действия сывороточных компонентов.
В опытах по инактивации эта антисыворотка в 100 раз эффективнее, чем
нормальная сыворотка. При исследовании специфической антисыворотки
Инактивация вирусов
351
Фпг. (Hi. Инактивация ВТМ нормальной кроличьей сывороткой и антисывороткой
к ВТМ [1391].
I — антисыворотка; II — нормальная сыворотка.
и нормальной сыворотки связь между выживаемостью и концентрацией
сыворотки оказалась различной (фиг. 66).
Инактивация под действием антисыворотки происходит очень быстро.
Было найдено, что половина активности препарата ВТМ теряется через 15 с
после смешивания с антисывороткой, однако дальнейшего снижения инфек-
ционности в течение последующих 15 мин инкубации не наблюдается. Хотя
некоторое связывание ВТМ с белком антител и происходит в этих условиях,
оно лишь в очень небольшой степени ответственно за инактивацию вируса.
В литературе отсутствуют данные о том, что РНК вирусов растений
играет какую-либо роль в связывании белка антитела с вирусом. В условиях,
при которых происходит ВТМ-инактивация целого вируса, антисыворотка
не оказывает выраженного влияния на инфекционную РНК ВТМ [630].
Френкель-Конрат и др. [540] показали, что как нормальная сыворотка,
так и ВТМ-антисыворотка часто вызывают некоторую инактивацию РНК
ВТМ, что, вероятно, связано с присутствием нуклеаз. В опытах с у-глобу-
липовыми фракциями не отмечалось повреждения РНК, хотя инактивация
целого вируса имела место. Эти результаты позволяют с очевидностью пред-
положить, что белок антител инактивирует вирус непосредственно, а не
косвенно путем какого-то воздействия на растение-хозяина. ВТМ, частично
деградированный под действием лаурилсульфата натрия, чувствителен к
рибонуклеазе, поскольку часть РНК оказывается при этом обнаженной.
Кроме того, такой препарат инактивируется антисывороткой, что, по-види-
мому, объясняется образованием комплекса между антителами и сохра-
нившейся частью капсидного белка [1397]. Связывание антител с вирусным
белком может предотвратить освобождение РНК из белковой оболочки
на ранних стадиях инфекции или препятствовать адсорбции вируса на опре-
деленных структурах внутри клетки.
Ферменты, атакующие РИК
Панкреатическая рибонуклеаза быстро инактивирует «голую» инфек-
ционную РНК ВТМ. При очень высоких концентрациях фермента происхо-
дит также инактивация интактного ВТМ, несмотря даже на то, что РНК
внутри вирусной палочки защищена от действия фермента in vitro.
При смешивании фермента с достаточно концентрированными препарата-
ми ВТМ в отсутствие соли из раствора выделяется комплекс фермента с виру-
352
Глава XIV
сом в виде длинных нитевидных частиц, содержащих около 14% рибонуклеа-
зы [1099]. Комплекс вирус — фермент пеипфекциопеп, по при разбавлении
он легко может диссоциировать, что сопровождается образованием в полной
мере активного вируса. Данные о возможности ферментативного разрушения
вируса пе были при этом получены, поскольку при увеличении времени
инкубации вируса с ферментом более сильно выраженной инактивации
не наблюдалось. Появления комплекса между ферментом и вирусом в ней-
тральных растворах можно было ожидать, так как изоэлектрическая точка
для вируса соответствует pH 3,5, в то время как изоэлектрическая точка
рибонуклеазы лежит при pH 8. Однако другие наблюдения говорят о том,
что основную роль в инактивации, по-видимому, играет не образование
комплекса между ферментом и вирусом.
Обратимое окисление рибонуклеазы перекисью водорода подавляет как
ее ферментативную активность, так и способность ингибировать заражение
ВТМ, но при этом фермент сохраняет способность образовывать комплекс
•с ВТМ [337]. Кастермаи и Джинер [337] в качестве альтернативы инактива-
ции в результате образования комплекса высказали мысль о том, что в про-
цессе инфекции ВТМ проходит какую-то первоначальную стадию, когда
вирус чувствителен к рибонуклеазе. Это подтверждается тем, что инфекцион-
ная РНК ВТМ очень чувствительна к инактивации ферментом. Концентра-
ции фермента, в 1000 раз большие, чем те, при которых инактивируется
РНК ВТМ, пе оказывают влияния на интактный вирус. При инфильтрации
разбавленных растворов рибонуклеазы в листья табака [336, 337] было
обнаружено, что это введение перед заражением блокировало развитие ВТМ.
Инфильтрация после заражения проявлялась в постепенном ослаблении
эффективности действия фермента в течение 2 ч; через 6 ч фермент не оказы-
вал никакого влияния на развитие ВТМ. В листьях, которые просто погру-
жали в раствор фермента на один час и затем отмывали перед заражением,
размножение вируса протекало нормально. Вероятно, на недавно освобожден-
ную из капсида инфекционную РНК можно воздействовать ферментом при
его добавлении только на очень ранних стадиях инфекции.
Обнаженная вирусная РНК крайне чувствительна к действию клеточных
нуклеаз. При погружении в инокулум РНК подушечки для инокуляции
или шпателя, однажды использованных при натирании листа, туда может
быть внесено достаточное количество фермента, чтобы вызвать быструю
инактивацию. Для предположения о том, что рибонуклеазы листьев играют
какую-то роль в устойчивости растений к инфекции, нет достаточных осно-
ваний. В самом деле, Сантилли и др. [1484] показали, что при определенных
условиях наблюдается положительная корреляция между содержанием рибо-
нуклеазы и чувствительностью листьев фасоли (Phaseolus vulgaris L.) к
ВТМ [1484].
Гирер [627] провел количественные исследования действия панкреати-
ческой рибонуклеазы на инфекционность, характеристическую вязкость
и среднюю молекулярную массу РНК ВТМ в зависимости от увеличения
времени инкубации. Инфекционность уменьшалась значительно быстрее,
чем средняя молекулярная масса. На основании этих данных Гирер рассчи-
тал, что молекулярная масса инфекционной РНК ВТМ составляет 2,2 -10s.
При смешивании интактного ВТМ с панкреатической рибонуклеазой
происходит стабилизация ВТМ к щелочной деградации (pH ж 10), сопро-
вождающаяся, однако, потерей инфекционности (см. стр. 334).
РНК, содержащаяся в некоторых мелких изометрических вирусах,
при обычных условиях устойчива к действию рибонуклеазы. Однако у других
изометрических вирусов белок, по-видимому, не может обеспечить полную
защиту РНК. Так, Франки [549] показал, что один из штаммов вируса огу-
речной мозаики утрачивает инфекционность, а его РНК деградирует при
Инактивация вирусов
353
“° zxtxtx" при рн Ког»а
.. б“™“« 1-1'У^>(,тся'„ 6мок выпадаетвосади МэГ””"’
Протеолитические ферменты
Некоторые вирусы (например, ВТМ) устойчивы к протеолитическому
действию трипсина, тогда хсак другие под действием трипсина разрушаются
(например, Х-вирус картофеля). Стэнли [1662] показал, что утрата инфек-
ционное™ наблюдается сразу же после смешивания ВТМ и трипсина При
этом вирус теряет свою активность при таких значениях pH, когда трипсин
вообще не обладает протеолитическим действием; более того, дальнейшей
утраты активности при условиях, благоприятных для протеолиза, не про-
исходит. Стэнли показал также, что инфекционность может быть вновь вос-
становлена после разбавления смеси вируса с ферментом или в результате
гидролиза пепсином.
Инфекционность препаратов Х-вируса картофеля также уменьшается
непосредственно мосле добавления трипсина, однако в этом случае наблю-
дается второй этап понижения инфекционности, если условия благоприятны
для протеолиза [114]. Эта вторая стадия сопровождается утратой серологи-
ческой активности и деструкцией вируса. Как ВТМ, так и Х-вирус картофеля
образуют комплекс с трипсином, однако этот комплекс вирус — фермент
легко разрушается при разбавлении [982]. Ингибирующая активность
трипсина в отношении этих вирусов составляет примерно лишь V100 актив-
ности рибонуклеазы. Поскольку примесь рибонуклеазы встречается во
многих препаратах трипсина, очень вероятно, что присутствие этого фермен-
та может быть важным фактором в наблюдаемой инактивации. Теоретически
чистый трипсин должен был бы гидролизовать белок чувствительного вируса,
освобождая при этом препарат инфекционной РНК, однако это справедливо,
конечно, только в том случае, если вирусная РНК не связана с какой-то
особой молекулой белка, необходимой для осуществления заражения.
При благоприятных условиях пепсин гидролизует Х-вирус картофеля,
который утрачивает при этом инфекционность и серологическую активность
[114]. На инфекционность ВТМ пепсин оказывает небольшое влияние и не
связывается с этим вирусом [982]. Однако денатурированный белок ВТМ
гидролизуется пепсином.
Низкомолекулярный белок, выделенный из ВТМ, гидролизуется как
химотрипсином, так и папаином, однако при реагрегации и образовании
палочкообразных частиц белок оказывается устойчивым к действию этих
ферментов. Таким образом, в интактном вирусе часть белковых субъединиц,
в принципе чувствительных к действию ферментов, может быть защищена
от этого действия [1000].
Вещества из высших растений
Вирусная инфекция может индуцировать появление в растении веществ,
ингибирующих вирус. Подобного рода воздействия мы рассмотрели в гл. XII.
Экстракты из многих здоровых высших растений также содержат вещества,
ингибирующие вирусную инфекцию. Ингибиторы очень широко распростра-
нены, па что указывает тот факт, что из 75 исследованных в одном случае
видов растений, относящихся к 30 семействам, экстракта! 30 из них оказались
способными на 95—100% ингибировать инфекцию ВТМ [1593]. Непред-
виденное присутствие таких ингибиторов часто приводило к ошибочным пред-
ставлениям относительно спектра растений-хозяев и передачи некоторых
вирусов. В тех случаях, когда вирус инфицирует растения, содержащие
23-0893
354
Глава XIV
высокие концентрации ингибитора, выделение и очистка такого вируса силь-
но осложняются. Активность ингибиторов, присутствующих в соке какого-то-
определенного вида растений, часто может проявляться только в том случае,
если вирус инокулируется другому виду растения-хозяина. Например,
вирус огуречной мозаики может быть передан механическим путем от одного
растения Phytolacca другому, ио не передается от растений Phytolacca расте-
ниям Nicotiana tabacum. Вирус мозаики сахарной свеклы и вирус огуречной
мозаики могут передаваться механическим путем от зараженного растения
свеклы на здоровое, ио не передаются от свеклы табаку, если используется
неразбавленный сок. Однако в том случае, если сок свеклы разбавить,
в 10 раз водой, вирус огуречной мозаики передается табаку [195]. В система-
тическом исследовании некоторых вирусов растений и видов растений-хозяев,
проведенном Гендроном и Кассанисом [610], они показали, что степень
уменьшения числа образуемых вирусами под влиянием ингибиторов местных
поражений не зависит от исследуемого вируса, а зависит только от вида
растения-хозяина, инокулированного вирусом.
Ингибитор из Phytolacca
Сок из растений видов рода Phytolacca является одним из наиболее силь-
но действующих ингибиторов, известных среди высших растений, и одним
из немногих, чья химическая природа изучена. Из сока Р. esculenta Кассанис
и Клечковский [940] изолировали ингибитор, который, судя по его хими-
ческому составу, можно было считать гликопротеидом. Изоэлектрическая
точка этого материала примерно соответствует pH 7,0, и он связывается
с ВТМ. При соответствующих условиях этот ингибитор осаждал ВТМ в виде-
паракристаллических нитей, а также вирус кустистой карликовости томатов.
При смешивании с ВТМ и с некоторыми другими вирусами этот ингибитор
вызывал немедленное уменьшение инфекционности. При разбавлении таких
смесей инфекционность вновь становилась нормальной. Работы более поздне-
го времени позволяют предполагать, что ингибитор представляет собой
основной белок с молекулярной массой 13 000, а не гликопротеид. Лизин
составляет 12% массы молекулы ингибитора. Биологическая активность
ингибитора исчезает при сукцинилировании свободных аминогрупп. Белок
не обладает рибонуклеазной активностью [Шеферд, личное сообщение].
Возможно, что некоторую роль в ингибировании играет связывание белка
из Phytolacca с вирусом. Однако другие белки, как, например, клупеин
и глобин, которые могут связываться с ВТМ и осаждать его, обладают гораз-
до меньшей инактивирующей способностью [938].
Для уменьшения инфекционности необходимо не только осаждение
вируса. Кассанис и Клечковский [942] показали, что два вируса, очень
сильно различающиеся по изоэлектрической точке (для ВТМ она соответ-
ствует pH 3,5, а для вируса мозаики костра — pH около 8,0), взаимно-
осаждают друг друга из раствора в отсутствие соли. Суспензия таких пре-
ципитатов вызывает столько же местных поражений у N. glutinosa, как
и ВТМ в растворе той же концентрации.
Фенольные соединения,
Фенольные соединения могут реагировать с белком и инактивировать
его различными путями. Как правило, для животных клеток не характерно-
присутствие фенольных соединений, не считая аминокислоты тирозина.
В противоположность этому фенольные соединения очень широко распростра-
нены в растениях, и содержание их часто бывает весьма высоко. Для некото-
рых семейств высших растений характерно большее содержание таких соеди-
Инактивация вирусов
355
нений, чем для других, причем концентрация их может варьировать в зави-
симости от возраста ткани. В растениях имеется много различных фенольных
соединений. Некоторые из них представляют собой мономеры, содержащие
одну, две или более (полифенолы) гидроксильных групп в бензольном кольце,
другие же являются полимерами. Термин «таннин» не имеет какого-либо
определенного химического смысла. Это несколько расплывчатый термин,
используемый для обозначения растительных фенолов, осаждающих белки
или превращающих сыромятную кожу в выделанную.
Многие фенолы могут непосредственно реагировать с определенными
группами белков путем образования водородных связей. Более важно то,
что они могут окисляться в хиноны, которые являются соединениями с очень
высокой реакционной способностью. Окисление фенолов может происходить
без участия ферментов или же катализироваться фенолоксидазами и перокси-
дазами. Эти ферменты широко распространены в растениях. Химическая
природа инактивации белков под действием фенолов еще не вполне понятна.
Некоторые возможные реакции растительных фенолов можно проиллюстри-
ровать на примере хлорогеиовой кислоты [1329], которая представляет собой
главный полифеиольный компонент, встречающийся в экстрактах листьев
табака:
(R в данном случае — это остаток хинной кислоты в молекуле хлорогеиовой
кислоты, АН2 соответствует восстанавливающему соединению, такому, как
аскорбиновая кислота или тиогликолят, которые .ингибируют образование
хинона).
Затем фенолы, способные превращаться в хиноны, могут ковалентно
связываться с белком через SH-группы и свободные аминогруппы. Если
хинон имеет вторую реакционноспособную группу, то может происходить.
образование поперечных сшивок между молекулами белка. Реакции такого
23*
356
Глава XIV
типа, по-видимому, имеют место между фенолами и белками вирусов расте-
ний и часто могут вызывать серьезные трудности в выборе подходящей про-
цедуры, необходимой для выделения вируса (гл. III).
В литературе нет данных о том, что виды растений, содержащие фенолы
в высокой концентрации, каким-то образом защищены в природе от вирусной
инфекции. Многие виды розоцветных обычно инфицируются рядом вирусов,
и тем не менее экстракты из этих растений большей частью являются силь-
ными ингибиторами вирусов. Водные экстракты из мацерированных листьев,
стеблей и корней растений земляники содержат достаточное количество
таннинов, чтобы осадить все растительные белки из экстракта [107]. Даже
после удаления осадка в надосадочной жидкости остается достаточное коли-
чество таннинов, чтобы осадить добавленный к ней ВТМ и сделать его неип-
фекциониым для N. glutinosa. Более того, Чео и Линдер [358] показали, что
инфильтрация дубильной кислоты в семядоли огурца увеличивает образова-
ние ВТМ в таких листьях, хотя число наблюдаемых поражений, которые
выявляются иод-крахмальной пробой, уменьшается. При подобного рода
обработке оказывается также возможным системное передвижение ВТМ.
В отличие от многих других ингибиторов препараты дубильной кислоты
не обнаруживают ингибирующей активности при натирании листьев непосред-
ственно после заражения [1765].
Чео и Линдер [358] показали, что дубильная кислота может инактивиро-
вать РНК ВТМ, так же как и интактный вирус in vitro [358], причем РНК
гораздо более чувствительна, чем интактный вирус. Изменения в спектре
поглощения ультрафиолета говорят о том, что дубильная кислота связывает-
ся при этом как с ВТМ, так и с РНК. Инактивацию РНК нельзя было объяс-
нить примесью нуклеаз, поскольку инфекционность полностью восстанавли-
валась после инкубации неинфекционной РНК с кофеином в течение 1 ч
при комнатной температуре.
Хэмптон и Фултон [698] показали, какую важную роль выполняют
окисленные фенолы, вызывая утрату инфекционности различных вирусов
в неочищенных экстрактах. Значение хинонов, образованных из полифено-
лов, в инактивации вирусов описано в работе Минка [1220]. Хлорогеновая
кислота сама по себе вызывает некоторую инактивацию очищенного вируса
мозаики яблони. При добавлении же к смеси тирозиназы (фермента, превра-
щающего хлорогеновую кислоту в хинон) инактивация вируса становится
значительно эффективнее и происходит пропорционально количеству обра-
зовавшегося хинона. Отделить хинон от хлорогеиовой кислоты не удается,
однако более стабильные хиноны, такие, как о-бепзохипоп, полученный
химическим путем, вызывают быструю и полную инактивацию вируса мозаи-
ки яблони. Минк [1221] разработал количественные методы для того, чтобы
иметь возможность сравнивать влияние различных хинонов па инактивацию
вирусов.
Инактивирующая система из листьев табака
Боудэп и Пири [124] описали систему из листьев табака, которая может
инактивировать вирус некроза табака (штамм Ротамстед). Они обнаружили,
что различия в удельной инфекционности очищенных препаратов вируса
некроза табака в основном можно объяснить присутствием этой системы.
Эта инактивирующая система сосредоточена в материале, выделяемом из
клеточного сока листьев центрифугированием при 4000—8000 g. Инактива-
ция этого материала происходит на воздухе и ингибируется азидом. В про-
цессе хранения материала при 0 °C в течение нескольких часов из него выде-
ляется низкомолекулярное вещество, инактивирующее вирус независимо
Инактивация вирусов
357
от присутствия азида и от того, проводится ли эксперимент па воздухе или
в анаэробных условиях. Это вещество пе было охарактеризовано химически,
но Боудэн и Пири подчеркивают аналогию, существующую между этим
инактиватором и хелатными агентами, как, например, цитратом, который
также инактивирует вирус некроза табака. Этот вирус инактивируется
также при воздействии различных альдегидов, взятых в низкой концентра-
ции. Препараты вируса некроза табака (штамм Ротамстед), инактивирован-
ные под действием системы из листьев табака, сохраняют свою серологи-
ческую активность и сходны с инфекционными препаратами по всем другим
свойствам. Ингибитор способен также инактивировать вирус кольцевой
пятнистости табака, но пе действует на ВТМ. Значение инактивирующей
системы in vivo совсем неясно, по в результате ее действия мы можем наблю-
дать неожиданные результаты in vitro. Вирус некроза табака, полученный
центрифугированием свежеотжатого сока при О °C, может быть менее инфек-
ционным, чем материал, выделенный при помощи явно менее мягких методов.
Другие белки, находящиеся в листьях
Различные ингибиторы, идентифицированные более или менее опреде-
ленно как белки, были обнаружены в здоровых растениях-хозяевах, напри-
мер выделены из листьев Nicotiana tabacum [1980] и из Dianthus caryophyllus\L
[1375, 1376]. Внимание исследователей было привлечено физическим и хими-
ческим сходством между подобного рода факторами из гвоздики и птичьим
интерфероном, полученным из клеток птиц, однако данных о том, что фактор,
выделенный из гвоздики, играет какую-либо роль в возникновении устойчи-
вости к вирусной инфекции у этого растения, пока не имеется [505].
КРАТКИЕ ЗАМЕЧАНИЯ ОТНОСИТЕЛЬНО ПРОЦЕССОВ,
ПРОИСХОДЯЩИХ ПРИ ИНАКТИВАЦИИ ВИРУСОВ
Агенты, непосредственно инактивирующие РНК
По-видимому, существует четыре пути, по которым различные агенты
могут инактивировать вирусную РНК, находящуюся либо в составе интакт-
ного вируса, либо в свободном состоянии: 1) возникновение разрывов в фос-
фодиэфирном остове РНК, причем одного разрыва в одноцеп очечной вирус-
ной РНК достаточно для ее необратимой инактивации. К числу факторов,
действующих исключительно или в основном таким образом, относятся рент-
геновские лучи, нагревание, ультразвук, высушивание, высокие давления,
неблагоприятные значения pH, «старение» и нуклеазы; 2) утрата какого-то
основания (или оснований) РНК без разрыва фосфодиэфирного остова, напри-
мер в случае действия гидроксиламина при pH 9 па РНК ВТМ; 3) изменение
оснований РНК, приводящее к образованию нефункциональных групп, без
разрыва фосфодиэфирного остова. Такие изменения in vitro можно вызвать
действием различных химических реагентов при соответствующим образом
контролируемых условиях, примером чего может служить дезаминирование
некоторых оснований под действием азотистой кислоты. In vivo такие изме-
нения можно вызвать введением в растение соответствующего аналога основа-
ний, который включается в вирусную РНК и тем самым делает ее неинфек-
ционной (например, включение 8-азагуанина и 2-тиоурацила в РНК ВТМ);
4) образование комплекса или химическое присоединение к вирусной РНК
(например, в результате связывания толуидинового синего и других красите-
лей с РНК ВТМ).
358
Глава XIV
Агенты, которые связываются с интактным вирусом,
но не действуют непосредственно на РНК
Механизм действия подобного рода приписывали многим веществам,
особенно неидентифицироваиным ингибиторам, присутствующим в клеточ-
ных экстрактах. Однако, вероятно, единственным примером, когда связыва-
ние, как было установлено, является необходимым этапом инактивации,
служит образование комплекса между специфическим антителом и вирусом.
Неясно, каким образом антитело инактивирует вирус, но оно может пол-
ностью предотвращать депротеинизацию РНК в клетке. К этой категории
ингибиторов можно также отнести полиэлектролиты, например полилизин.
Агенты, вызывающие абортивную инфекцию in vivo
К этой группе относятся аналоги пуринов и пиримидинов, такие, как
8-азагуанин и 2-тиоурацил, однако детали механизма их действия неизвестны.
Некоторые возможные механизмы таковы: 1) нарушение спаривания основа-
ний в репликативной системе во время синтеза вирусной РНК; 2) образование
дефектной вирусной матрицы, приводящее к появлению нефункциональных
или лишь частично функциональных вирусоспецифичных белков; 3) включе-
ние аналогов в антикодоны или в участки, предназначенные для узнавания
ферментов на транспортных РНК, что приводит к возникновению ошибок
при трансляции и в конечном итоге к появлению дефектных белков; 4) недо-
статочное снабжение предшественниками, необходимыми для синтеза РНК,
в результате нарушения функций ферментов, участвующих в синтезе нуклео-
тидов.
Прочие вещества
Имеется целый ряд веществ, не обнаруживающих какого-либо действия
на вирус in vitro, но препятствующих развитию инфекции, если их приме-
няют до заражения растения или в период, примерно соответствующий
времени его инокуляции. Часто полагают, что такие вещества блокируют
участки, необходимые для проникновения вируса. Существование таких
мест представляется чисто гипотетическим. В качестве альтернативы можно
допустить, что подобного рода вещества изменяют процесс метаболизма,
характерный для растения-хозяина. Однако это просто другой способ выра-
жения нашей неосведомленности в этом вопросе. Можно представить себе
три возможных объяснения механизма действия таких веществ: 1) они могут
убивать клетки, поврежденные во время заражения, тем самым устраняя
возможность для проникновения вируса; 2) эти соединения могут способ-
ствовать удалению некоторых факторов (например, ионов двухвалентных
металлов), необходимых для того, чтобы заражение произошло. Таким обра-
зом могут действовать и некоторые органические кислоты; 3) эти вещества
могут воздействовать на проникшую в клетку вирусную РНК после ее осво-
бождения из белковой оболочки. Вероятно, так действует рибонуклеаза,
введенная в зараженный лист.
ГЛАВА XV
СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ
При вирусных болезнях растений серологические реакции не играют
такой важной роли, как при вирусных инфекциях животных, при которых
иммунный ответ представляет собой неотъемлемую часть реакции организма
иа инфекцию. Тем не менее большинство исследованных вирусов растений
оказалось иммуногенным для животных, и в частности для такого лаборатор-
ного животного, как кролик. Чувствительность и специфичность реакций
между вирусом растений и соответствующими антителами можно с успехом
использовать в экспериментальной работе с самыми разнообразными целями:
1) соответствующие серологические тесты, особенно в сочетании с другими
методами, сыграли важную роль в развитии наших теоретических пред-
ставлений о вирусах растений; 2) серологические методы имеют экономиче-
ское значение, так как позволяют быстро выявлять больные растения; 3) та-
кие белки, как структурный белок ВТМ, последовательность аминокислот
в котором известна, могут служить подходящей моделью для изучения тон-
кой структуры антигенных детерминант.
В настоящее время мы располагаем антисыворотками против 90 различ-
ных вирусов растений. Детали, касающиеся применения серологических
методов при изучении вирусов растений, можно найти в ряде обзоров [1179,
1185, 1813, 1829, 1897], и потому здесь они обсуждаться не будут. Мы рас-
смотрим основные свойства антигенов и антител, наиболее распространенные
виды серологических реакций, используемых при работе с вирусами расте-
ний, структуру антигенов этих вирусов и применение серологических тестов
с целью определения родства между различными вирусами растений. Исполь-
зование серологических реакций для определения концентрации вируса
обсуждается в гл. II, действие нормальной и иммунной сывороток на инфек-
ционность вирусов — в гл. XIV, общие свойства вирусов, относящихся
к серологически родственным группам,— в гл. XX. В иммунологии издавна
дело осложнялось путаной и нечеткой терминологией. Поэтому мы здесь
попытаемся ограничиться минимальным числом терминов.
ПРИРОДА АНТИГЕНОВ И АНТИТЕЛ
Антигены
Антигенами обычно являются довольно крупные молекулы или частицы,
содержащие белки или полисахариды, чужеродные по отношению к тем
видам животных, которым они вводятся. Молекулярная масса большинства
антигенов превышает 10 000 дальтон, хотя описаны и низкомолекулярные
пептиды, способные вызывать образование антител. Функция антигена скла-
дывается из двух компонентов. Во-первых, антиген индуцирует в организме
животного образование антител — белков, способных к специфическому
взаимодействию с данным антигеном; сейчас это принято называть иммуно-
генностью. Во-вторых, антиген обладает способностью связываться с обра-
зующимися специфическими антителами; эту способность обычно называют
антигенностью. Некоторые небольшие молекулы, имеющие специфическую
360
Глава XV
структуру (например, молекулы аминокислот), не будучи сами иммуноген-
ными, тем пе менее обладают способностью соединяться с антителами, обра-
зованными в ответ на введение высокомолекулярного антигена, в состав
которого входит данная небольшая молекула. Такие низкомолекулярные
вещества называют гаптенами.
Как правило, крупные молекулы более иммуногенны, чем мелкие.
Так, вирусы растений, которые представляют собой белковые макромолеку-
лы, весьма эффективно индуцируют образование специфических антител.
Субъединицы вирусного структурного белка значительно менее эффективны
в этом отношении.
Антитела
В организме животного белки, выполняющие функцию антител, обра-
зуются клетками лимфатической ткани. Клеточные аспекты образования
антител подробно рассмотрены в обзоре Эллиса и др. [491].
Антитела, циркулирующие в крови, представляют собой весьма гетеро-
генную популяцию белков типа глобулинов, которые могут отличаться друг
от друга по физическим, химическим и серологическим свойствам. Различают
три основных класса иммуноглобулинов: IgG (или yG) с константой седи-
ментации ($2о, w) 7S, обычно устойчивый к действию меркаптоэтанола; IgM
(или уМ) с константой седиментации 19S, чувствительный к действию мер-
каптоэтанола, и IgA (или уА), у которого константа седиментации варьирует
от 7 до 19S.
Наиболее распространенными иммуноглобулинами являются IgG
и IgM. Именно эти классы иммуноглобулинов описаны в серологических
реакциях с участием вирусов растений. Сравнительное значение IgG и IgM
иммуноглобулинов в различных описанных ниже серологических тестах
варьирует в зависимости от характера антигена. Как правило, в тестах,
используемых обычно при работе с вирусами растений (реакции преципи-
тации, агглютинации и связывания комплемента), чаще фигурирует класс
7S (IgG).
Известно, что многие антигены вначале стимулируют образование IgM-
антител. Затем количество антител этого класса снижается, и через несколько
недель они могут исчезнуть полностью. IgG-антитела появляются через
несколько дней после IgM, но титр их достигает более высоких значений
и они длительное время циркулируют в организме. Для выявления иммуно-
глобулинов сывороточные белки можно фракционировать различными спо-
собами. Обычно используют ультрацентрифугировапие (аналитическое и
в градиентах плотности), ионообменную хроматографию или гель-фильтра-
цию. На фиг. 67 представлены сроки появления антител — IgM и IgG —
при иммунизации мышей вирусом желтой мозаики турнепса.
На фото 77 показан основной пик, соответствующий антителам класса
IgG, при аналитическом ультрацентрифугировапии сыворотки кролика после
введения ему больших доз ВЖМТ. Пик, соответствующий антителам IgM,
значительно меньше и почти не выявляется.
Предложены многочисленные модели структуры антител. Пожалуй,
самая известная из них — это модель IgG, предложенная Портером [1348].
Согласно этой модели, молекула IgG состоит из двух одинаковых половин,
каждая из которых содержит тяжелую и легкую полипептидные цепи. Есть-
основания полагать, что каждая полипептидная цепь имеет вариабельный
участок вблизи N-конца; последовательность аминокислот в этом участке
у разных антител различна. Природа этого вариабельного участка и его
связь с активным центром антител, определяющим их специфичность, являют-
ся предметом интенсивного изучения.
Серологические реакции
361
Фиг. 67. Сроки появления и количество антител класса 7S и 19S поело однократного
введения 6 мышам 30 мкг ВЖМТ.
Антитела фракционировали в градиенте плотности сахарозы. Количество антител выражено в произ-
вольных единицах.
Высокая разрешающая способность электронного микроскопа позволяет
обнаружить молекулы антител, связанные с вирусом, а также соединяющие
одну вирусную частицу с другой (фото 78) [806, 807].
ПОЛУЧЕНИЕ АНТИСЫВОРОТКИ
Антисыворотки, специфичные в отношении вирусов растений, можно
получить путем иммунизации самых разнообразных животных — птиц,
морских свинок, лошадей, кроликов и мышей. Чаще всего используют кро-
ликов, так как они активно реагируют на антигены вирусов растений обра-
зованием высоких титров антител. Лошадей иммунизируют в тех случаях,
когда необходимы особенно большие количества сыворотки, а мышей — в тех
опытах, которые ставят во многих повторностях.
Иммунный ответ на введение какого-либо определенного антигена
характеризуется выраженными индивидуальными колебаниями. Количество
антител, продуцируемых в ответ на введение в качестве антигена определен-
ного вируса, по-видимому, детерминировано генетически [1636]. На фиг. 68
показаны различия в иммунном ответе кроликов и мышей после однократного
введения ВЖМТ.
На фиг. 69 показано увеличение титра преципитирующих антител
в кроличьей антисыворотке после введения животным двух вирусов двумя
различными способами.
Для вирусов растений вопрос о влиянии способа введения антигена на
специфичность образующихся антител в деталях не изучен; известно, однако,
что иногда способ иммунизации играет существенную роль. Так, при внутри-
венной инъекции вируса огуречной мозаики (штамм Y), обладающего срав-
нительно слабой иммуногенностью, образуется антисыворотка, реагирующая
при диффузии в геле только с целым вирусом. Антисыворотка, полученная
путем иммунизации внутримышечными инъекциями этого же антигена,
362
Глава. XV
Фиг. 68. Различия в титрах антител, полученных после однократной инъекции антигена
кроликам и мышам [1185].
Л. 12 кроликам вводили внутривенно 100 мкг нуклеопротеида ВЖМТ и брали кровь через ЗТиед.
Б.[37 мышам линии СЗН вводили внутрибрюшинно 3 мкг нуклеопротеида ВЖМТ и брали кровь через
3 иед. На оси абсцисс отложены величины, обратные титру.
Фиг. 69. Сравнение титра антисывороток, получаемых при внутривенных (Z) и под-
кожных (17) инъекциях [1185].
Для иммунизации использовали 1 мкг антигена; адъювантом служили минеральное масло и ланолин.
А. ВТМ. В. ВЖМТ. На оси ординат отложены величины, обратные титру.
вступала в реакцию как с целым вирусом, так и с продуктами его деграда-
ции [1518]. Фельдман и Бонинсегна [512], вводя кроликам денатурированные
прогреванием экстракты больных растений, получали антисыворотку к весь-
ма лабильному вирусу (вирус бронзовости томатов).
ВИДЫ СЕРОЛОГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ
Реакция преципитации
Взаимодействие между антигеном и антителами можно выявить различ-
ными способами. Один из самых прямых методов — это наблюдение за фор-
мированием видимого специфического преципитата. Реакция преципитации
чаще других используется при работе с вирусами растений. В тех случаях,
когда под влиянием специфической антисыворотки склеиваются клетки
(например, бактерии) или клеточные органеллы, принято говорить об «агглю-
тинации». Термин «преципитация» используется в применении к антигенам,
представляющим собой молекулы белков и полисахаридов. По своему разме-
ру вирусы растений занимают промежуточное положение между клетками
и низкомолекулярными белками, однако при работе с ними обычно поль-
зуются термином «преципитация».
Антигены вирусов растений поливалентны, т. е. каждая вирусная части-
ца способна связываться с несколькими молекулами антител. Истинное число
молекул, вступающих в реакцию, зависит от размера вирусного антигена.
Серологические реакции
363
Поливалентные антигены, взаимодействуя с двухвалентными антителами,
образуют структуру решетки, которая, увеличиваясь, образует видимый
преципитат. Так как для реакции преципитации существенным моментом
является возникновение решетки, изменение растворимости комплекса
вирус — антитело играет в этой реакции важную роль [994]. Образование
такого видимого преципитата можно выявить несколькими способами.
Преципитация в пробирках
Это классический тест, используемый в работе с вирусами растений.
Реакция вируса со специфической антисывороткой выявляется лучше всего
в серии проб, в которых оба реагента последовательно разводятся вдвое
и смешиваются в различных комбинациях; опыт должен проводиться в стан-
дартных условиях (температура, перемешивание). Регистрируя время появле-
ния видимого преципитата, можно составить диаграмму преципитации
(фиг. 70). Эта диаграмма иллюстрирует несколько самых важных особенно-
стей реакции преципитации.
Верхняя правая часть диаграммы соответствует условиям, при которых
преципитации не отмечается. Это объясняется подавлением образования
преципитата избытком антисыворотки. Нижняя левая часть соответствует
второй зоне отсутствия преципитации — в результате избытка вируса
в смеси.
Анализируя данные, относящиеся к антисыворотке в разведении 1/4
(третья горизонтальная строка на фиг. 70)., можно видеть, что преципитация
быстрее всего происходит при реакции с вирусом, взятым в концентрации
0,19 мг/мл. Эта проба принимается за а-оптимум. Отношение реагентов при
а-оптимуме постоянно для всех концентраций антисыворотки. Таким обра-
зом, мы можем провести диагональ, соединяющую все пробы с а-оптимумом.
На основании этих соотношений а-оптимум можно использовать для опре-
деления концентрации вируса и антител.
По фиг. 70 видно, что максимальное разведение вируса, при котором
еще появляется видимый преципитат, соответствует его концентрации
0,00145 мг/мл. Это так называемая конечная точка разведения вируса.
Вирус,
мг/мл
1/1
g ’/2
1 J/4
| 1/8
| 1/18
I 1/32
03
1 V64
1/128
1/256
Фиг. 70. Диаграмма преципитации кроличьей антисыворотки к ВЖМТ, иллюстрирую-
щая основные особенности реакции преципитации в пробирках [1179].
Цифры в рамке — время (в минутах) начала появления видимого преципитата; отсутствие преципитации
через 24 ч обозначено знаком минус, опыт не ставился — точкой.
364
Глава XV
В пределах ошибки, которая связана с последовательными разведениями
вдвое, такая диаграмма является для данного вируса постоянной и может
использоваться для определения его концентрации. При работе с палочко-
образными вирусами следует, однако, иметь в виду, что на количество антигена
в конечной точке разведения может оказать значительное влияние степень
агрегации вирусных частиц конец в конец. Усиление агрегации снижает
количество вируса, необходимое для появления видимого преципитата.
Максимальное разведение антисыворотки, при котором происходит
образование видимого преципитата, называют титром антисыворотки; оно
служит мерой содержания преципитирующих антител в сыворотке. Следует
обратить внимание на то, что в зоне избытка вируса истинный титр анти-
сыворотки не определяется (фиг. 70). Эта особенность присуща всем вирусным:
антисывороткам. Поэтому при определении активности антисыворотки мето-
дом разведения следует использовать такие пробы, концентрация вируса
в которых отличалась бы вдвое или вчетверо от его концентрации в когте иной
точке разведения.
Анализируя данные, относящиеся к вирусу в концентрации 0,0475 мг/мл
(шестая колонка на фиг. 70), можно видеть, что преципитация быстрее всего
происходит с антисывороткой в разведении 1/4. Эта проба принимается за
0-оптимум. На фиг. 70 точки, соответствующие 0-оптимумам, соединены
пунктирной линией. Для данной сыворотки соотношение реагентов при
0-оптимуме является более или менее постоянным. Раньше многие исследова-
тели использовали 0-оптимум для определения концентрации вируса и анти-
сыворотки. Однако этот критерий очень ненадежен, и при работе с антисы-
воротками высокого титра его использовать нельзя.
Сплошные контурные линии на фиг. 70, так называемые «изохроны»,
получены в результате соединения точек, соответствующих тем пробам,
в которых, судя по визуальным наблюдениям, для реакции преципитации
требовалось одинаковое время. Эти линии отражают общие свойства данной
конкретной антисыворотки в данных конкретных условиях.
Состав специфических преципитатов
Различные «зоны» реакции преципитации между вирусом и аптисыгюрот-
кой, взятыми в разных соотношениях, можно охарактеризовать более точно,
если определить химическим путем количество белка в специфическом пре-
ципитате и провести анализ надосадочной жидкости для выявления избытка
одного из реагентов. Существует так называемая зона, «эквивалентности»,
когда оба реагента целиком входят в состав преципитата.
Для мелких сферических вирусов растений проба, в которой форми-
руется максимальное количество преципитата, и проба, в которой реакция
преципитации происходит наиболее быстро, располагаются у того конца
зоны, который граничит с зоной избытка антигена. Для палочкообразных
вирусов эти пробы располагаются в зоне избытка антигена; их точное
местоположение зависит от степени агрегации вирусного препарата.
Отношение веса антител к весу осажденного вируса в зоне эквивалент-
ности в значительной степени зависит от размера вирусного антигена. Эта
зависимость представлена на фиг. 71.
В зоне эквивалентности отношение веса антител к весу интактного ВТМ
составило примерно 0,2, а к весу неагрегированного А-белка — 2,0. Таким
образом, для преципитации А-белка требуется примерно в 10 раз больше
антител, чем для преципитации эквивалентного количества интактного ВТМ
[995]. Следовательно, целый вирус можно обнаружить, используя гораздо
меньшее количество антител, чем требуется для обнаружения А-белка.
Серологические реакции
365
Фиг. 71. Влияние размера антигена на соотношения антигена и антител в специфических
преципитатах [995] •
По оси ординат отложено количество преципитата, образуемого при добавлении возрастающих коли-
честв различных антигенов it 1 мг гомологичных антител. / — сывороточный альбумин человека;
II — неагретироваиный А-быюк; 1II — вирус кустистой карликовости томатов; IV — вирус табачной
мозаики. Кружками на кривых отмечены примерные окпивалсптпыс соотношения. Следует обратить
внимание на то, что более крупные антигены преципитируют в более широком, диапазоне концентраций
соответствующих реагентов.
В зоне избытка антител соотношение антител к антигену ВТМ составило
в преципитате около 2,0 [992, 1389]. Таким образом, с поверхностью одной
частицы ВТМ связывается около 600—700 молекул антител. Данные, полу-
ченные с помощью электрофореза и электронной микроскопии, свидетель-
ствуют о том, что в этих условиях вирусная частица полностью покрыта
молекулами антител [990, 992]. Следовательно, максимальное число моле-
кул антител, вступающих в реакцию с ВТМ, составляет примерно лишь
одну треть количества белковых субъединиц в частице (их всего 2130). Эта
разница обусловлена стерическими препятствиями, так как отдельные моле-
кулы антител гораздо крупнее белковых субъединиц ВТМ.
Внешний вид специфического преципитата зависит от формы вирусной
частицы. Палочкообразные вирусы, например ВТМ и Х-вирус картофеля,
дают рыхлый, мягкий преципитат, похожий на преципитат, который обра-
зуют жгутики бактерий, тогда как сферические вирусы, такие, как ВЖМТ,
дают плотный, зернистый преципитат, больше сходный с преципитатом, кото-
рый образуют соматические бактериальные антигены.
Существует модификация реакции преципитации в пробирках, извест-
ная как кольцепреципитация: небольшой объем неразведенной или слабо-
разведенной сыворотки помещают в узкие стеклянные пробирки и осторожно
наслаивают на нее раствор вирусного антигена. Через некоторое время анти-
тела диффундируют в вирусный раствор, а вирус диффундирует в антисыво-
ротку. Если оба реагента взяты в подходящих концентрациях, в области
контакта антигена с антителом возникает зона специфического преципитата.
При таком способе постановки реакции преципитации вопрос об оптималь-
ном соотношении реагентов не является проблемой. Такая реакция идет
быстро, но она недостаточно чувствительна.
366
Глава XV
Реакции агглютинации
Если каплю свежего сока, отжатого из листа больного растения, в кото-
ром вирус присутствует в больших количествах, смешать на предметном
стекле с каплей антисыворотки, мелкие частицы растительного материала
склеиваются, образуя агрегаты. Это можно видеть невооруженным глазом,
но еще лучше вести наблюдения с помощью лупы или при малых увеличе-
ниях микроскопа. Хлоропласты и их фрагменты можно наблюдать в виде
агрегатов.
Описаны различные модификации реакции агглютинации на стеклах
[1667, 1832].
Иногда при постановке реакции используют бентонит [236], на котором
адсорбируется глобулиновая фракция антисыворотки или антигеи. Адсорб-
ция на бентоните позволяет наблюдать образование очень небольшого коли-
чества специфического преципитата. Бозикевич и др. [236] считают данный
метод быстрым, чувствительным и специфичным; его применяют для выявле-
ния некоторых вирусов в клубнях картофеля, находящихся в состоянии
покоя [909, 1579].
Реакции преципитации в геле
В последние годы широкое применение получил метод серологической
преципитации в геле. Большие преимущества этого метода, выполняемого'
на стеклах, состоят в следующем. Он позволяет разделять смесь молекул
антигена и соответствующих антител благодаря различной скорости диффу-
зии в геле, различной подвижности в электрическом поле (метод иммуно-
электрофореза) или же используя оба эти свойства. С помощью этого метода
можно|непосредственно сравнить два антигена, поместив их в соседние лунки
на одной пластинке. Быть может, этот метод не столь чувствителен, как метод
преципитации в пробирках, в смысле выявляемых концентраций вируса
[1940]. Однако для постановки реакции этим способом, безусловно, требуются
гораздо меньшие объемы реагентов.
В ранних работах по иммунодиффузии пользовались небольшими про-
бирками (одномерная диффузия). Реакцию ставили таким образом, что диф-
фундировал либо один реагент (простая диффузия), либо оба (двойная диф-
фузия). Но в дальнейшем все эти модификации были вытеснены методом
двойной двумерной диффузии на пластинках геля. Общее описание этих
методов дает Ухтерлони [1300].
В слое агара пробивают лунки, располагая их в определенном порядке.
В обычных опытах по двойной диффузии антисыворотку вносят в централь-
ную лунку, а растворы антигена — в несколько лунок, располагая их вокруг
центральной. Растворы антигена и антител диффундируют в агаре навстречу
друг другу, и через какое-то время в зоне, где оба реагента оказываются
в подходящих соотношениях, образуется преципитирующий комплекс.
В этой точке реагенты выпадают из раствора и появляются видимые полосы
преципитации. Нереагирующий антиген (или антитела) может проходить
сквозь полосу преципитации, ие задерживаясь. Полосы преципитации можно
наблюдать визуально при подходящем освещении, их можно сфотографиро-
вать, а можно и воспользоваться белковыми красителями. Если в препарат
вируса ввести радиоактивную метку, то для выявления полос преципитации
можно воспользоваться радиоавтографией; в соответствующих условиях метод
радиоавтографии отличается высокой чувствительностью [1185].
Особенно важное значение в опытах по иммунодиффузии имеют концент-
рации и соотношения реагентов. Наилучшие результаты получаются в том
случае, когда антиген и антитела используются в соотношениях, близких
Серологические реакции
367
к оптимальным. Отклонение от оптимальных соотношений ведет к тому, что
полоса преципитации перемещается и располагается ближе к одной из лунок.
При достаточно выраженном нарушении соотношений один антиген может
дать несколько полос преципитации.
При сравнении полос преципитации, образуемых двумя антигенами,
находящимися в соседних лунках, различают несколько типов расположе-
ния этих полос (фото 79).
Материал, содержащийся в полосах преципитации на пластинках агара,
можно исследовать с помощью электронного микроскопа, применив метод
негативного контрастирования [1868].
При отсутствии тщательного контроля возможны артефакты и нередко
возникают трудности при интерпретации результатов [1300, 1829]. Работая
с вирусами растений, следует иметь в виду некоторые дополнительные факто-
ры. Диффузия вирусного антигена в агаровом геле в значительной мере
зависит от размера и формы вирусной частицы. Для мелких сферических виру-
сов растений эти методы вполне пригодны; палочкообразные частицы могут
диффундировать медленно или не диффундировать вовсе. Интактный ВТМ
хотя и медленно, но диффундирует в агаре; для некоторых же других палочко-
образных вирусов этот метод оказывается непригодным [1813]. При работе
с вирусами, имеющими форму длинной палочки, в качестве антигена можно
использовать продукты деградации вируса [1370]. Интактный вирус мозаики
турнепса не дает в геле реакции преципитации, однако после обработки ультра-
звуком, приводящей к разрушению вирусных частиц, антиген образует
в агаре четкую полосу преципитации [1784]. Скорость диффузии в агаровом
геле используется для определения размера антигенов изучаемых вирусов
(см., например, [1790]). Поведение ВТМв агаровом геле в значительной мере
зависит от концентрации солей; использование концентрированных раство-
ров усиливает агрегацию [1898]. Применение соответствующего детергента
нередко обеспечивает быструю миграцию в геле продуктов деградации виру-
са [697].
Чтобы предотвратить фрагментацию или агрегацию вируса в ходе реак-
ции, необходимо тщательно контролировать такие факторы, как тепемпера-
тура, pH и величина ионной силы.
При иммуноэлектрофорезе сначала разделяют смесь антигенов действием
электрического поля (антигены с разной скоростью мигрируют в агаровом
геле, приготовленном на соответствующем буфере). Затем заполняют анти-
сывороткой траншею, идущую параллельно движению антигенов под дей-
ствием электрофореза, и проводят иммунодиффузию.
При иммуноосмофорезе [1377] препарат вируса помещают в лунку в жид-
ком слое соответствующим образом забуференного агара (pH 6,8—7,6),
а антисыворотку — в лунку, находящуюся на расстоянии около 2 см. На-
правление тока в электрическом поле должно быть параллельно линии, соеди-
няющей обе лунки. Если вирус заряжен отрицательно, он будет двигаться
по направлению к лунке с антисывороткой, тогда как антисыворотка под
действием эндоосмоса будет перемещаться из своей лунки по направлению
к вирусу. Через 60 мин в результате перемещения образуются видимые полосы
преципитации.
Центрифугирование специфических агрегатов
Для выявления взаимодействия вируса со специфическими антителами
можно использовать различные способы высокоскоростного центрифугиро-
вания. Например, аналитическое ультрацентрифугирование неочищенного
растительного экстракта, смешанного с нормальной или иммунной сыворот-
368
Глава XV
кой, позволяет идентифицировать седиментирующие компоненты, которые
являются вирусными антигенами (фото 80).
При определенных условиях аналитическое ультрацентрифугирование
можно использовать для обнаружения растворимых комплексов сферического
вируса (например, вируса кустистой карликовости томатов), состоящих
из двух, трех и четырех вирусных частиц [237]. Для выявления специфических
димеров вирусных частиц, вступивших в реакцию с антителами [1902], или
для наблюдения за исчезновением вирусных мономеров при увеличении кон-
центрации антисыворотки [71] можно использовать центрифугирование в гра-
диенте плотности сахарозы. Чувствительность этого метода легко повысить,
введя в вирус или в антитела радиоактивную метку, по эта процедура непри-
годна для тех случаев, когда приходится обрабатывать большое количество
проб. Данный метод можно применять в комбинации с методом измерения
инфекционности.
Использование твердых иммуносорбентов
Существует метод, в основе которого лежит присоединение антител
к диазотированной п-амипобеизилцеллюлозе. Такой целлюлозой с фиксиро-
ванными на ней антителами набивают хроматографическую колонку. При
пропускании через такую колонку неочищенных растительных экстрактов
содержащийся в них вирус удерживается, а другие компоненты экстракта
проходят. Затем этот вирус можно элюировать путем понижения pH. Данный
метод оказался весьма эффективным при работе с ВТМ и соответствующей
антисывороткой [599]. Его можно использовать с различными целями, напри-
мер для очистки небольших количеств вирусных препаратов и разделения
близких штаммов.
Реакция связывания комплемента
Реакция этого типа широко используется при работе с вирусами живот-
ных. Ограниченное применение этого метода для выявления вирусов расте-
ний объясняется главным образом тем, что в большинстве неочищенных
или частично очищенных растительных экстрактов присутствуют вещества,
которые мешают проведению реакции, а также тем, что для этой реакции
требуется много разнообразных реагентов. Вместе с тем создается впечатле-
ние, что по крайней мере для некоторых вирусов растений эта реакция
не отличается более высокой чувствительностью, чем реакция преципитации
[1179]. Детали этого метода описаны в работе Кабата и Майера [901], а его
применение при работе с вирусами растений рассматривается у Мурхеда
[1231], Райта и Херди [1939] и Райта [1938].
Реакция анафилаксии
Реакция анафилаксии in vivo не получила широкого распространения.
In vitro эта реакция ставится чаще всего следующим образом. Рог матки
морской свинки, предварительно сенсибилизированной инъекциями анти-
гена, помещают в сосуд с раствором Рингера и соединяют с кимографом.
(Морские свинки легче всего поддаются сенсибилизации.) При добавлении
к раствору соответствующего антигена происходит быстрое сокращение
мышцы матки и затем медленное расслабление. Честер [368] применял этот
метод при работе с ВТМ, однако широкого распространения в исследованиях
вирусов растений реакция анафилаксии не получила.
Серологические реакции
369
Реакция гемагглютинации
Эритроциты многих животных после обработки таннином приобретают
способность к неспецифической адсорбции белков, и в частности антигенов.
Такие эритроциты с адсорбированным иа них антигеном можно затем инку-
бировать с антисывороткой. В результате специфического взаимодействия
между антигеном и антителами происходит агглютинация эритроцитов.
Из-за трудностей, связанных с повторной обработкой эритроцитов таннином,
метод этот не получил широкого применения в работе с вирусами растений,
однако Сайто и Ивата [1472] испытывали его при очистке вируса штрихова-
той мозаики ячменя и отметили его специфичность и высокую чувствитель-
ность (гл. П).
При другом типе реакции гемагглютинации используется способность
комплекса вируса с антителами связывать комплемент. Затем этот комплекс
добавляют к суспензии эритроцитов, что приводит к их агглютинации. Этот
метод был использован Нелсоном и Деем [1265] при работе с вирусом мозаики
цветной капусты.
Реакция нейтрализации инфекционности
В гл. XIV шла речь о применении специфической антисыворотки для
нейтрализации инфекционности тех вирусов, которые передаются механи-
ческим путем. Этот метод не вошел в повседневную практику из-за неспеци-
фических эффектов, а также из-за того, что он связан с большой затратой
времени и необходимостью использовать большое число растений. Голд
и Даффус [653] описали интересный способ использования этого метода при
изучении вируса, который переносится тлями и ие передается механически.
Тлей-переносчиков подкармливали через мембраны препаратами вируса
западной желтухи свеклы, обработанными различными способами, а затем
проверяли способность тлей заражать растения. При подкармливании тлей
непосредственно смесью вируса с нормальной сывороткой наблюдалось
песпецифическое ингибирование инфекционности.
При центрифугировании смесей вируса с антисывороткой в градиенте
плотности зона, соответствующая вирусу, исчезала в результате связывания
его с антителами. Подкармливая тлей препаратами, приготовленными из этой
•«вирусной» зоны, удавалось измерить специфическое действие антисыворот-
ки. Этот метод был использован для установления серологического родства
между штаммами; его можно применять при соответствующей работе с дру-
гими вирусами [1437].
Связывание гаптенов с антителами
Обладая способностью связываться со специфическими молекулами
антител, гаптены ие образуют преципитатов, так как имеют только один
центр связывания. Поэтому для выявления такой специфической реакции
приходится использовать тот или иной косвенный метод. Иногда с этой
целью можно использовать торможение гаптеном преципитации с гомоло-
гичным полным антигеном. В следующем разделе обсуждаются опыты с мече-
ными пептидами, полученными из структурного белка ВТМ. После реакции
таких меченых пептидов с антисывороткой осаждали глобулиновую фракцию
50%-ным раствором сульфата аммония. Измеряя радиоактивность преципи-
тата, можно определить количество определенного пептида, связанного
с белком антител [1970].
24-0893
370
Глава XV
СТРУКТУРА АНТИГЕНОВ ВИРУСОВ РАСТЕНИЙ
Роль различных компонентов вируса
в серологических реакциях
Мы не располагаем убедительными данными о том, что РНК вирусов-,
растений может индуцировать образование специфических антител. Анти-
тела, образующиеся в ответ иа введение животному того или иного из виру-
сов растений, реагируют либо с вирусным белком, либо с интактным виру-
сом, либо с различными продуктами частичной деградации интактной белко-
вой оболочки.
Формально роль белка в индукции антител была показана в работе
Френкель-Конрата и Зингер [537]. Они провели опыты по смешанной рекон-
струкции серологически различающихся штаммов ВТМ. Искусственно создан-
ные вирусные гибриды относились к серологическому типу того штамма,
который был донором структурного белка, структурный же белок вирусных
частиц потомства, образующегося при заражении, относился к серологи-
ческому типу штамма — донора РНК. Тем не менее вирусная РНК может
играть некую вторичную роль в индукции антител к белковой оболочке
вируса. Есть основания полагать, что при введении кроликам и мышам интакт-
ный ВЖМТ более иммуногенен, чем серологически идентичные ему «пустые»-
белковые оболочки, не содержащие РНК (гл. VIII) [1145]. Это различие-
обнаруживается у кроликов и мышей как при первичном, так и при вторич-
ном иммунном ответе.
. Одновременная инъекция изолированной РНК ВЖМТ не повышает-
иммуногенности таких пустых белковых оболочек (фиг. 72).
Искусственный препарат пустых белковых оболочек, полученный in vit-
ro, не обладал более высокой иммуногенностью по сравнению с белковым
препаратом, выделенным из природного вируса (фиг. 72, Z1). Можно, следо-
Фиг. 72. Иммуногенность различных компонентов,
выделенных из препаратов ВЖМТ [1145].
Группу мышей иммунизировали однократным внутрибрю-
шинным введением антигена: антитела получали через-
25 дней. А. 1,9 мкг Т и 10 мкг РНК ВЖМТ. В. 1,9 мкг
Т. В. 1,9 мкг В>. Г. 1,9 мкг препарата искусственно полу-
ченного верхнего компонента. Д. 1,9 мкг В,. Е. 1,9 мкг В,
По оси абсцисс отложены величины, обратные титру анти-
сыворотки.
Серологические реакции
371
вателыю, считать, что повышенная иммуногенность нуклеопротеида связана
с присутствием РНК в вирусной частице. При этом РНК не обязательно
должна быть инфекционной. Например, нуклеопротеид В2, содержащий
неинфекционпую РНК, обладал такой же иммуногенностью, что и препарат
инфекционного ВЖМТ (фиг. 72, Е). Предстоит выяснить, можно ли считать
такое повышение иммуногенности вирусного нуклеопротеида общим свой-
ством вирусов растений. Создается впечатление, что ВТМ обладает более
высокой иммуногенностью, чем структурный белок и его субъединицы [1098,
1145].
РНК может повышать иммуногенность оболочки вируса, либо влияя
на судьбу инъецированного белкового антигена в организме животного, либо
каким-то более прямым действием. Некоторые исследователи считают, что
нуклеиновые кислоты и продукты их деградации могут быть не специфическими
стимуляторами клеточного деления и синтеза белка. Браун и Накапо [277]
показали, что одновременное введение полиадениловой и полиуридиловой
кислот стимулирует раннюю фазу образования антител клетками селезенки
мышей, иммунизированных эритроцитами барана. Эти синтетические поли-
рибонуклеотиды были более эффективными, если при введении удавалось
защитить их от действия нуклеаз (либо при совместном введении, ведущем
к спонтанному формированию двухспирального комплекса поли-А — поли-У,
либо в комплексе с метилированным бычьим сывороточным альбумином).
Вирусный антиген, подобный ВЖМТ, вносит в организм животного защи-
щенную от разрушения РНК, которая, возможно, неспецифически стимули-
рует деление клеток, вырабатывающих соответствующие антитела.
Химическая структура центров связывания
Для многих вирусов и других белковых антигенов точная структура
центра (или центров) связывания с антителами неизвестна. Структурный
белок интактной вирусной частицы состоит из многих идентичных субъеди-
ниц, поэтому в данном случае речь может идти об антигенном центре одного
типа, многократно повторяющемся на поверхности частицы. Этого взгляда
придерживается Раппапорт [1389, 1390] в отношении ВТМ. В настоящее время
на основании обсуждаемых ниже результатов создается впечатление, что
вирусы, подобные ВТМ, несут на своей поверхности несколько, а возможно
и множество, более или менее различных потенциальных центров связыва-
ния. Кроме того, диссоциированные белковые субъединицы и белок интакт-
ного вируса могут существенно различаться по набору антигенных детерми-
нант.
Так как структурный белок ВТМ можно получать в больших количествах
и для него известна полная последовательность 158 аминокислот, этот вирус
представляет собой весьма удобный объект для детального изучения центров
связывания. При решении этой проблемы использовали три подхода.
Контролируемое удаление аминокислот
из вирусного белка
Харрис и Найт [712] обнаружили, что при обработке типичного ВТМ
карбоксипептидазой А отщепляется только одна аминокислота, а именно
С-концевой треонин (положение 158). Пролин, занимающий положение 156,
блокирует последующую деградацию. Эти авторы показали, что вирус,
в белке которого отсутствует концевой треонин, реагирует слабее интакт-
ного с антисывороткой, специфичной в отношении типичного ВТМ. Точно
так же антисыворотка, полученная путем иммунизации детреонинизирован-
ным вирусом, продолжает реагировать с ним и после полного истощения
24*
372
Глава XV
нативным ВТМ. Фон Сенгбуш и Витман [1849] продолжили эти исследова-
ния, используя мутантный штамм Nil927, у которого имеется одно амино-
кислотное замещение в положении 156 (пролин-*- лейцин). Благодаря такому
замещению карбоксипептидаза А может отщеплять от вирусного белка этого
штамма три терминальные аминокислоты. Было установлено, что такая частица
продолжает реагировать с антисывороткой к типичному штамму после пол-
ного истощения последней белком типичного ВТМ. Фон Сенгбуш и Витман
высказали предположение, что на поверхности частицы ВТМ находится
антигенная детерминанта, которая у типичного штамма маскирована тремя
выступающими аминокислотами. Удаление этих аминокислот с помощью
фермента приводит к «обнажению» детерминанты. Вместе с тем истощение
антисыворотки, специфичной в отношении типичного штамма ВТМ, препара-
том вируса NH927, обработанным карбоксипептидазой, не приводит к ней-
трализации антител, специфически реагирующих с препаратом типичного
вируса, содержащим С-концевой треонин.
Таким образом, типичный ВТМ имеет по крайней мере две антигенные
детерминанты: одна из них — содержащая С-концевой треонин, а вторая —
обнажающаяся при удалении трех концевых остатков.
Пептидные фрагменты и конъюгированные аминокислоты
в качестве антигенов
По-видимому, С-концевая часть белка ВТМ расположена вблизи поверх-
ности частицы, так как она чувствительна к воздействию фермента [712].
Андерер [22] получил комплекс концевого гексапептида типичного ВТМ
(Тре-Сер-Гли-Про-Ала-Тре) с бычьим сывороточным альбумином в качестве
носителя и показал, что ВТМ реагирует с антисывороткой против этого гекса-
пептида. Антитела были специфичны в отношении С-концевой последователь-
ности аминокислот, характерной именно для типичного штамма ВТМ, так
как Далемский штамм: (имеющий иной концевой гексапептид: Тре-Сер-Ала-
Про-Ала-Сер) не реагировал с антисывороткой к гексапептиду обычного
штамма, связанному с бычьим сывороточным альбумином.
Янг и др. [1969] показали, что белок ВТМ сохраняет иммуногенность
и после обработки трипсином. Об этом свидетельствовала анафилактическая
реакция у сенсибилизированных морских свинок. Бенджамини и его сотруд-
ники достигли больших успехов в определении пептидов, способных реаги-
ровать с кроличьими антителами, индуцированными введением белка ВТМ,
полученного ацетатным методом [150, 151, 1681, 1970].
Триптический пептид белка ВТМ № 8 содержит аминокислоты, занимаю-
щие положения от 93 до 112. Последовательность аминокислот в этом пептиде
следующая: Иле-Иле-Глу-Вал-Глу-Аси-Глн-Ала-Асн-Про-Тре-Тре-Ала-Глу-
Тре-Лей-Асп-Ала-Тре-Арг.
Показано, что этот пептид тормозит специфическую реакций связыва-
ния комплемента при соединении белка ВТМ с соответствующей антисыво-
роткой. Установлено также, что меченный 14С пептид реагирует с глобули-
нами этой антисыворотки. Если антисыворотка предварительно истощается
белком ВТМ, то указанная реакция не происходит. В следующей работе
были синтезированы и испытаны на способность реагировать с глобулинами
антисыворотки к белку ВТМ С-концевые пептиды возрастающей длины, начи-
ная с дипептида Тре-Арг и кончая декапептидом Тре-Тре-Ала-Глу-Тре-Лей-
Асп-Ала-Тре-Арг. Было обнаружено, что с антисывороткой, которая обычно
использовалась в опытах, специфически реагирует пентапептид Лей-Асп-Ала-
Тре-Арг и все пептиды большего размера. Антисыворотки к белку ВТМ,
полученные при иммунизации разных кроликов, различались по способности
связывать эти пептиды. Некоторые из них не реагировали даже с декапенти-
Серологические реакции
373
дом, но все реагировали с самим пептидом № 8. Сыворотки, полученные при
иммунизации разных кроликов, не всегда давали специфическую реакцию
с одним и тем же участком пептида № 8. Индивидуальный иммунный ответ
зависел от продолжительности периода иммунизации и количества введен-
ного антигена. Например, в антисыворотке некоторых животных были анти-
тела и к N-концевому и к С-концевому декапептиду, а сыворотка одного
кролика содержала антитела только к С-концевому декапептиду [152]. Были
обнаружены и более тонкие различия, свидетельствующие о том, что анти-
тела, образующиеся в организме одного животного в ответ на введение одного
антигена, могут быть крайне гетерогенными. Повышение гидрофобности
N-концевых тетра- и трипептидов при введении неполярной группы увели-
чивало их способность специфически связываться с глобулином антисыво-
ротки к ВТМ [153].
Известно, что у некоторых белков с известной третичной структурой
С-коицевой участок расположен на поверхности. Исходя из предположения,
что С-копцевая аминокислота всех белков содержит свободный карбоксил,
Андерер и др. [24] синтезировали искусственные антигены, присоединяя
отдельные аминокислоты к бычьему сывороточному альбумину. Удалось
показать, что в соответствующих условиях структурный белок ВТМ, содер-
жащий определенную аминокислоту, реагирует предпочтительно с анти-
сывороткой против этом аминокислоты, конъюгированной с бычьим сыворо-
точным альбумином.
Сравнение мутантов с известными аминокислотными замещениями
в структурном белке
Фон Сенгбуш и Витман [1849] установили, что замещения одной амино-
кислоты при условии, если оно локализуется в определенном участке поли-
пептидной цепи, достаточно для появления новой серологической специфич-
ности у частицы ВТМ. Так, замещение пролина на лейцин в положении 156
(штамм Nil927) приводит к изменениям, выявляемым с помощью перекрест-
ной серологической адсорбции (фото 82). Вместе с тем штамм NillS с тем же
аминокислотным замещением (пролин -> лейцин) в положении 20 серологи-
чески неотличим от типичного. Дальнейшие исследования такого рода с боль-
шой группой природных штаммов ВТМ и индуцированных мутантов этого
вируса дали аналогичные результаты [1830, 1847]. Например, мутант 378
с тремя аминокислотными замещениями (все Асн -> Сер) в положении 25,
33 и 126 неотличим серологически от родительского штамма, тогда как еди-
ничное аминокислотное замещение у мутанта 419 (Сер —>- Тре, положение
148) приводит к определенному изменению серологических свойств. Число
испытанных штаммов еще недостаточно для того, чтобы можно было сделать
определенные выводы о том, какие участки цепи имеют значение для серо-
логической специфичности. Ясно, однако, что четко выраженной корреляции
между степенью сходства в аминокислотном составе и серологическим родст-
вом ожидать нельзя. Отсутствие такой корреляции отчетливо показал вал
Регенмортель [1830] для ряда природных штаммов ВТМ.
Роль четвертичной структуры в серологической специфичности
По ряду причин можно ожидать, что нативные вирусы (такие, как ВТМ
и ВЖМТ) и выделенные из них белковые субъединицы должны отличаться
друг от друга по антигенным детерминантам: 1) некоторые центры связывания
нативной вирусной частицы могут быть образованы свободными участками
поверхности двух или нескольких субъединиц; изолированные субъединицы
таких центров пе имеют; 2) у отдельных субъединиц могут существовать
Глава XV
374
специфические центры связывания, которые маскируются при образовании
интактной белковой оболочки; 3) при агрегации субъединиц, по-види-
мому, происходят конформационные изменения, так что конфигурация откры-
той поверхности упакованной субъединицы не такая, как у субъединицы-
мономера.
Получить определенные экспериментальные данные по этим вопросам
трудно. В химическом смысле белковые субъединицы ВТМ достаточно стабиль-
ны, но, как отмечалось в гл. V, они обладают выраженной тенденцией к агре-
гации и образованию палочковидных структур. Степень полимеризации
А-белка в значительной степени зависит от pH, температуры, концентрации
белка и ионной силы. Поддерживать соответствующие условия при постановке
серологических опытов трудно. При работе с ВЖМТ имеется другая труд-
ность. Разрыв белковой оболочки приводит к тому, что у каждой субъединицы
демаскируются четыре активные —SH-группы; если эти группы не будут
блокированы (например, карбоксиметилированием), субъединицы могут сое-
диняться друг с другом, образуя нерастворимый продукт (гл. IV).
Аах [1 ] и другие исследователи изучали эту проблему методом перекре-
стной адсорбции. Аах обнаружил, что антисыворотка к ВТМ, полностью
адсорбированная А-белком, продолжает реагировать с ВТМ или агрегиро-
ванным А-белком. Он считает, что в сыворотке содержатся антитела, кото-
рые реагируют с ВТМ (или с агрегированным А-белком), но не с А-белком.
Аналогичные результаты получили Такахаси и Голд [1736]. Однако, по мне-
нию Клейновского [995], эти результаты могут быть следствием гораздо
большего сродства к антителам у ВТМ по сравнению с А-белком. Клечковский
повторил опыты по адсорбции, используя для истощения большие количества
А-белка, и не обнаружил после этого остаточных антител, которые реагиро-
вали бы с ВТМ. Однако использование в его опытах высоких концентраций
А-белка могло привести к агрегации и образованию вирусоподобных частиц.
Аах [1] также показал, что антисыворотка к А-белку, адсорбированная
ВТМ (или агрегированным А-белком) и не дающая реакции преципитации
с этими антигенами, продолжает реагировать с неагрегироваиным А-белком.
Это свидетельствует о том, что у А-белка имеется антигенная группировка,
которая в интактном вирусе скрыта. Другие авторы не смогли воспроиз-
вести этот результат, возможно потому, что пользовались иными антисыво-
ротками. А-белок часто образует две полосы преципитации (фото 81, А) или
больше двух.
На фото 81, Б показана реакция идентичности между А-белком и Х-бел-
ком штамма ВТМ.
Проведя серию опытов по иммунодиффузии при различных температу-
рах (от 2 до 50 °C), Раппапорт и др. [1398] показали, что число полос, обра-
зуемых А-белком, в значительной степени зависит от температуры, что свя-
зано, вероятно, с влиянием последней на степень агрегации А-белка. Авторы
считают, что серологические различия между А-белком и ВТМ в основном
связаны, по-видимому, с конформационными изменениями, однако это пред-
положение не доказано. Аналогичные низкомолекулярные антигены обнару-
жены и у других палочкообразных вирусов (например, у вируса штриховатой
мозаики ячменя [686]).
Раппапорт и др. [1398] вообще не обнаружили перекрестной реакции
между ВЖМТ и препаратом белковых субъединиц, полученным фенольным
методом. Физическая характеристика субъединицы в этой работе не приве-
дена. Интактный вирус огуречной мозаики, штамм Y, и вирусный белок, полу-
ченный методом солевой деградации, по-видимому, реагируют с различными
специфическими антителами [1518]. Проведя более детальное исследование,
в котором тщательно учитывалась степень разрушения вируса и реагрегации
белковых субъединиц, фон Вехмар и ван Регеимортель [1850] показали, что
Серологические реакции
375
.димеры белковых субъединиц вируса мозаики костра имеют центры связыва-
ния, которых нет у нативного вируса, и что активные центры вирусной бел-
ковой оболочки также отличаются от центров любого из димеров. По-види-
мому, эти центры могут возникать при агрегации димеров с образованием
фрагментов белковой оболочки. Вирус некротической кольцевой пятнисто-
сти сливы и низкомолекулярный белок этого вируса различаются по анти-
генной специфичности [16].
Эта проблема нуждается в дальнейшем подробном исследовании. Пол-
ную картину строения антигенных детерминант и различий в этом отноше-
нии между субъединицами и интактным вирусом мы получим только тогда,
когда станет известна третичная структура белка ВТМ или какого-либо
другого вирусного белка. Весьма перспективным представляется изучение
химическими, физическими и серологическими методами субъединиц вируса
хлоротической крапчатости коровьего гороха, так как субъединицы этого
икосаэдрического вируса легко выделить и они полимеризуются in vitro
с образованием белковых оболочек и других структур (гл. VII). Банкрофт
и др. [83] получили in vitro препарат белковых оболочек этого вируса. Хотя
такой препарат по электрофоретической подвижности отличался от нативного
вируса, он был идентичен последнему по серологическим свойствам при
.диффузии в геле и в опытах по перекрестной адсорбции.
СЕРОЛОГИЧЕСКОЕ РОДСТВО МЕЖДУ ВИРУСАМИ
РАСТЕНИЙ
Наличие или отсутствие серологического родства
Для вирусов растений, в отношении которых могут применяться сероло-
гические тесты, последние служат обычным критерием для установления род-
ства между двумя вирусными изолитами. Можно использовать любой из опи-
санных выше тестов, но чаще всего применяется одна из модификаций реак-
ции преципитации. Тщательно поставленные серологические тесты весьма
полезны для классификации вирусов. Серологические свойства вирусов, как
правило, хорошо коррелируют с другими свойствами этих объектов (гл. XX).
••Однако при использовании серологических методов следует иметь в виду
ряд важных моментов.
Антитела к компонентам растения-хозяина
Присутствие таких антител — частая причина ошибок при серологи-
'ческих тестах, особенно если для инъекции используют неочищенный или
плохо очищенный препарат и проводят длительные курсы иммунизации.
При иммуноэлектрофорезе экстрактов здоровых растений китайской капу-
сты удается выявить по крайней мере семь различных антигенов. Белок
'фракции I обнаруживается в высоких концентрациях в большинстве расте-
ний; он легко образует агрегаты, обладает иммуногенностью и серологически
сходен у растений многих видов [1829].
Неспецифическая преципитация за счет компонентов
растения-хозяина
Спонтанная не специфическая преципитация растительного материала
встречается довольно часто, как бы тщательно ни производили очистку
прогреванием или другими способами, поэтому каждый раз необходимо
проводить анализы соответствующих контрольных смесей.
376
Глава XV
Неспецифическая преципитация вирусов
Такая преципитация не часто, но встречается, особенно если очищенный
вирус используется в высоких концентрациях и подвергается инкубации при
высоких температурах. Иногда такая неспецифическая преципитация внешне
может проявляться в виде оптимальной зоны преципитации. При работе
с некоторыми палочкообразными вирусами это явление представляет собой
очень серьезную проблему (см., например, [1557]).
Загрязнение другими вирусами
При постановке серологических тестов всегда существует опасность-
загрязнения препаратов неродственными вирусами. Чаще вего препараты
загрязняются такими стабильными, широко распространенными вирусами,
как ВТМ и вирусы некроза табака. Следует всегда иметь в виду возможность
того, что изучаемое растение, являющееся естественным хозяином какого-то-
вируса, может содержать в себе второй, ие родственный первому вирус,
который нередко поддерживается в культуре.
Перекрестное тестирование антисывороток
Для доказательства отсутствия серологического родства между вирусами
следует приготовить специфические антисыворотки и показать, что каждый
вирус реагирует с соответствующей антисывороткой и ие дает реакции с гете-
рологичной. Постановка именно перекрестных реакций необходима, так как
легко представить себе случай, когда родственный вирус, присутствуя
в экстракте в низкой концентрации, может не дать видимой реакции. Как будет
сказано ниже, для доказательства отсутствия серологического родства лучше
пользоваться антисыворотками высоких титров.
Степень серологического ро ства между штаммами вирусов,
принадлежащих к одной группе
В отличие от вирусов, поражающих человека и животных, для вирусов-
растений идентификация серологических типов в пределах группы родствен-
ных штаммов не имеет столь важного значения. Тем не менее опубликовано
довольно много работ, посвященных определению степени родства между
штаммами, принадлежащими к одной группе, и попыткам связать серологи-
ческие свойства с другими биологическими и химическими признаками.
Если два изолята вируса идентичны, они при постановке перекрестной
реакции будут однотипно реагировать, с антисыворотками, какой бы из серо-
логических тестов ни использовался. Если, однако, они родственны, но отли-
чаются друг от друга, перекрестная реакция в какой-то степени будет иметь-
место, тем не менее эти реакции не будут идентичны. Для выявления разли-
чий между штаммами могут быть использованы различные типы серологи-
ческих тестов (см., например: перекрестная адсорбция [1168], снижение иыфек-
ционности [1396]).
При работе с группой штаммов и их антисыворотками можно использо-
вать метод иммунодиффузии в агаре. Некоторые сведения о степени родства
между штаммами может дать реакция идентичности или частичной идентич-
ности, когда при постановке перекрестной реакции используются различные-
штаммы и их антисыворотки.
В сочетании с диффузией в геле можно применять перекрестную адсорб-
цию. Этот метод известен как внутригелевая адсорбция. Лунку, предиазна-
Серологические реакции
377
ченную для антисыворотки, вначале заполняют гетерологичным антигеном,
который диффундирует в окружающий слой агара. Затем в ту же лунку
помещают антисыворотку; тест-антигеиы располагают каждый в свою лунку.
По мере диффузии антител те из них, которые способны реагировать с адсор-
бирующим вирусом в геле, будут там задерживаться. Антитела, не вступив-
шие в реакцию, продолжают диффундировать дальше, образуя полосу пре-
ципитации с тем из тест-антигенов, с которым они могут реагировать. С помо-
щью этого теста можно выявить различия между теми штаммами, кото-
рые в прямых опытах по диффузии в геле дают реакцию идентичности
(фото 82).
Данные опыта, представленные на фото 82,5, свидетельствуют о том, что
ВТМ индуцирует образование некоторого количества антител, вступающих
в реакцию только с мутантами.
Если в изучаемую группу входят всего два или три изолята, то при
условии соблюдения упомянутых выше предосторожностей сравнительно
легко определить, являются ли эти изоляты серологически идентичными,
серологически неродственными или обладают различной степенью серологи-
ческого родства. Используя один и тот же набор изолятов и одну и ту же
антисыворотку, можно, получать хорошо воспроизводимые результаты, пока-
зывающие, например, что штаммы А и Б являются серологически близко-
родственными и что оба они серологически отличаются от штамма В. Другой
вопрос — в какой мере эти результаты отражают действительную связь
между данными изолятами? По ряду причин к серологическим показателям
родственной связи между вирусными изолятами следует относиться с боль-
шой осторожностью.
Корреляция с аминокислотным составом
Работа со штаммами ВТМ, различающимися по аминокислотному соста-
ву структурного белка, показала, что между числом аминокислотных заме-
щений и степенью серологического родства нет какой-либо четкой корреля-
ции. Представляется более вероятным, что в третичной структуре белка
имеются «горячие точки», в зоне которых единичные аминокислотные заме-
щения приводят к гораздо большим изменениям серологических свойств,
чем несколько аминокислотных замещений, локализующихся вне этих зон.
Присутствие других вирусоспецифичных белков
Родство между штаммами вирусов определяется последовательностью
оснований их РНК. Структурный вирусный белок, от которого зависит ход
серологических реакций, отражает последовательное™ оснований лишь
небольшой доли молекулы РЕЕК (для таких вирусов, как ВТМ и ВЖМТ,—
около одной десятой). Тот факт, что степень серологического родства в пре-
делах группы родственных штаммов обычно не коррелирует с другими био-
логическими свойствами, не вызывает удивления, так как эти свойства могут
зависеть от активности белков, не относящихся к структурным.
Изменения вируса при выделении
Следует всегда иметь в виду, что в процессе выделения вирус может
меняться и эти изменения могут повлиять на его серологическую специфич-
ность. Это происходит, например, при утрате С-концевой аминокислоты под
действием фермента (гл. III).
378
Глава ХУ
Тестирование большого числа штаммов
Когда методами перекрестной адсорбции или иммунодиффузии тестируют
большое число родственных штаммов, ситуация становится очень сложной
и значение этой оценки уменьшается по мере увеличения числа испытуемых
штаммов [1179].
Изменчивость антисывороток
Вообще говоря, способность антисывороток против двух штаммов вируса
участвовать в перекрестных реакциях связана с содержанием в них антител.
При постановке перекрестной реакции сыворотки низкого титра менее актив-
ны, чем сыворотки высоких титров. Это иллюстрирует фиг. 73 на примере
двух штаммов ВЖМТ.
Тримейн и Райт [1791] показали, что в антисыворотках к двум штам-
мам вируса южной мозаики фасоли доля перекрестно реагирующих антител
возрастает с повышением титра антисыворотки в процессе иммунизации.
'Затем эти авторы показали, что доля перекрестно реагирующих антител
в 19S- и 73-иммуноглобулинах одинакова на протяжении всего курса иммуни-
зации. Напротив, в антисыворотках к двум штаммам вируса кустистой карли-
ковости томатов доля перекрестно реагирующих антител в IgM была выше,
чем в IgG. На протяжении иммунизации доля перекрестно реагирующих
антител в IgG медленно нарастала, тогда как в IgM она оставалась посто-
янной [15].
Серологические различия между близкородственными штаммами лучше
выявлять с помощью антисыворотки низкого титра, а при работе с отдален-
ными штаммами более эффективны антисыворотки высокого титра (это было
показано для палочкообразных [168, 270] и некоторых полиэдрических [9]
вирусов). Отмеченная закономерность соблюдается далеко не всегда. Так,
Брандес и Беркс [270] приводят примеры того, как антисыворотки низкого
и высокого титров давали при постановке перекрестной реакции сходные
результаты, тогда как другие антисыворотки близких титров в значительной
•степени различались по своей способности реагировать с гетерологичными
вирусами. Антисыворотка низкого титра может не давать реакции с гетеро-
логичным антигеном не потому, что в ней отсутствуют перекрестно' реагиру-
ющие антитела, а потому, что их концентрация слишком мала. Так, анти-
Доля шшалгмоспецофочньгх антител
Фиг. 73. Зависимость между титром анти-
сыворотки и долей штаммо специфичных
антител [1179].
Светлые кружки — для типичных штаммов
ВЖМТ; черные кружки — для штамма Савой.
Серологические реакции
379
«сыворотка к Х-вирусу картофеля, характеризующаяся низким титром,
которая не реагировала с вирусом мозаики белого клевера, давала с этим
антигеном положительную реакцию, после того как концентрацию фракции
антител удалось повысить [170]. В последовательных пробах крови, взятых
у одного и того же животного с месячными интервалами, доля перекрестно
реагирующих антител в антисыворотке широко варьировала [1014].
Хорошим примером противоречивости получаемых результатов может
служить разная степень серологического родства между огуречными вирусами
3 и 4 и ВТМ, согласно данным различных исследователей [106, 1830].
Таким образом, при определении степени серологического родства очень
важно пользоваться антисыворотками от нескольких разных животных.
Максимум, чего можно добиться серологическими методами для большинства
вирусов растений,— это подразделить изоляты на три основные категории —
близкородственные, отдаленные и неродственные. Кассанис [941, 942] счи-
тает, что термин «штамм» следует применять только к серологически родствен-
ным вирусам, а термин «серотип» — к серологически отдаленным. Однако
подобное строгое разделение не всегда возможно, так как, несомненно, суще-
ствуют промежуточные ситуации. Использование серологических критериев
при классификации вирусов подробно обсуждается в гл. XX.
МЕЧЕНЫЕ АНТИТЕЛА КАК ЦИТОХИМИЧЕСКИЕ РЕАГЕНТЫ
Соединение вирусных антигенов со специфическими антителами, проис-
ходящее внутри клеток, нельзя наблюдать, если не пометить молекулы анти-
тел каким-либо способом. Предложено много различных меток, с помощью
которых можно добиться специфического «окрашивания», позволяющего
определить локализацию вирусного антигена в клетках и клеточных органел-
лах. Применение этих методов связано с двумя основными трудностями.
Во-первых, необходимо обеспечить проникновение конъюгата антител в клетку
и его взаимодействие с вирусным антигеном. В отношении вирусов растений
эта проблема исключительно сложна. И во-вторых, применение этих методов
связано с различными неспецифическими воздействиями.
При световой микроскопии
Для изучения внутриклеточной локализации вирусов и их распростра-
нения по тканям растения-хозяина и насекомого-переносчика применяют
метод флуоресцирующих антител.
Нагараи [1254,1255] подробно описывает методику приготовления и хра-
нения флуоресцирующих антител к ВТМ; эта методика позволит избежать
неспецифического окрашивания, для учета которого ставится ряд контролей:
1) инфекционный материал, обработанный гетерологичной антисывороткой,
конъюгированной с флуоресцеином; 2) инфекционный материал, предвари-
тельно обработанный неконъюгированной специфической антисывороткой;
3) здоровая ткань, обработанная вирусоспецифическими флуоресцирующими
антителами.
Способность антител проникать в клетки мезофилла зависит от возраста
листа. В клетки более старых листьев антитела проникают легко; проникно-
вение их в клетки молодых листьев происходит лишь после фиксации послед-
них в спирте, ацетоне или жидкости Карнуа. Этот метод оказался малопри-
годным для изучения внутриклеточной локализации вируса, но его можно
с успехом применять для изучения распространения вируса в тканях. Недавно
данный метод был использован в работе с протопластами клеток мезофилла,
зараженных ВТМ [1299].
380
Глава XV
Многие авторы [371, 1605, 1610] успешно использовали метод флуорес-
цирующих антител для выявления вирусных антигенов в насекомых-пере-
носчиках (гл. XVI).
При электронной микроскопии
Белок антител, специфически связанных с антигеном внутри клетки,
не отличается по проницаемости для электронов от белков самой клетки,
и потому с помощью электронного микроскопа его выявить нельзя.
Однако разработаны методы конъюгации антител с ферритином —
низкомолекулярным белком, содержащим большое количество железа. Такие
конъюгированные с ферритином антитела можно использовать в качестве
«красителя» при электронной микроскопии. Шалла и Амици [1547] приме-
няли этот метод при изучении распределения белка ВТМ в клетках листьев
томатов. Он дает гораздо более высокое разрешение по сравнению с методом
флуоресцирующих антител и позволяет обнаруживать единичные вирусные
частицы (фото 83).
Основная трудность при работе этим методом связана с достижением
эффективного проникновения конъюгированных антител в ткани растения,
однако в будущем он обещает стать самым плодотворным методом изучения
внутриклеточной локализации вирусных антигенов.
ГЛАВА XVI
ВЗАИМООТНОШЕНИЯ МЕЖДУ ВИРУСАМИ РАСТЕНИИ
И БЕСПОЗВОНОЧНЫМИ
Передача вирусов от растения к растению с помощью беспозвоночных
очень интересна с двух точен зрения. Во-первых, эти переносчики — глав-
ное орудие распространения в полевых условиях многих вирусов, которые
причиняют большой экономический ущерб. Во-вторых, связх> между перенос-
чиками и вирусами, особенно те случаи, когда вирусы размножаются в орга-
низме переносчика, представляет общий биологический интерес. Такие вирусы
можно считать и вирусами растений и вирусами животных. Но даже если
вирус не размножается в переносчике, связь между ними может быть более
сложной, нежели просто пассивный перенос вируса на наружной поверхно-
сти тела животного. Передача инфекции беспозвоночными-переносчиками
обычно представляет собой сложнейшее явление, зависящее от вируса, пере-
носчика, растения-хозяина и окружающих условий. Исследованию этого
явления посвящено громадное число работ. В настоящей главе мы рассмотрим
как переносчиков вирусных заболеваний, так и различные формы взаимоот-
ношений между вирусами и переносчиками. Вопросы о переносчиках в связи
с экологиехй вирусов рассматриваются в гл. XVII, а в связи с мерами борьбы
против вирусных болезней — в гл. XVIII.
ГРУППЫ БЕСПОЗВОНОЧНЫХ-ПЕРЕНОСЧИКОВ
Беспозвоночные делятся на 22 типа, причем большинство видов, питаю-
щихся на живых зеленых наземных растениях, относится к двум группам.
Это нематоды (Nematoda) и членистоногие (Arthropoda). К этим типам отно-
сятся многочисленные переносчики вирусов растений. Еще два типа, коль-
чатые черви (Annelida) и моллюски (Mollusca), имеют несколько представи-
телей, питающихся иа растениях; возможно, среди них есть потенци-
альные переносчики, которые могли бы передавать) вирус механическим
способом.
Нематоды (Nematoda)
Эта группа делится на 10 отрядов [660]. Большинство видов, паразити-
рующих на живых зеленых растениях, относится к тиленхидам (Tylenchidae),
однако пи один из представителей этой группы пока не зарегистрирован
в качестве переносчика вирусов. Все известные в настоящее время пере-
носчики относятся к группе Dorylaimida, которая включает всего несколько
видов нематод, паразитирующих на растениях.
Членистоногие (Arthropoda)
Из всех классов членистоногих только в двух (насекомые, Insecta, и пау-
кообразные, Arachnida) имеются виды, питающиеся на живых зеленых назем-
ных растениях, и в том числе переносчики вирусных заболеваний.
382
Глава XVI
Насекомые (Insecta)
Этот класс насчитывает 32 отряда, причем виды, питающиеся на живых
зеленых наземных растениях, т. е. потенциальные переносчики, встречаются
в 10 из них. Ниже приводится список этих отрядов (отряды, включающие
переносчиков вирусных заболеваний, помечены знаком +).
1. Ногохвостки (Collembola) — ротовой аппарат грызущий; некоторые
виды питаются на зеленых растениях.
2. + Прямокрылые (Orthoptera) — ротовой аппарат грызущий; некото-
рые виды питаются на зеленых растениях.
3. 4-Уховертки (Dermaptera) — ротовой аппарат грызущий; немногие-
виды питаются на зеленых растениях.
4. 4-Жесткокрылые (Coleoptera) — ротовой аппарат грызущий; многие
виды питаются на зеленых растениях.
5. 4-Чешуекрылые (Lepidoptera) — ротовой аппарат грызущий; личинки
многих видов питаются на зеленых растениях.
6. 4-Двукрылые (Diptera) — личинки нескольких видов питаются
на зеленых растениях.
7. Перепончатокрылые (Hymenoptera) — личинки нескольких видов-
живут на зеленых растениях; немногие виды (взрослые особи) могут питаться
спелыми плодами.
8. 4- Трипсы (Thysanoptera) — ротовой аппарат колюще-сосущий; многие-
виды питаются на различных частях растений.
9. 4- Равнокрылые хоботные (Homoptera) — сосущие насекомые, пита-
ются на зеленых растениях. Сюда входят тли, цикадки, белокрылки, чер-
вецы и т. д.
10. 4-Полужесткокрылые (Heteroptera) — ротовой аппарат колюще-сосу-
щий; многие виды питаются на зеленых растениях.
К первым семи отрядам, перечисленным выше, относятся только насе-
комые с грызущим ротовым аппаратом; па живых зеленых растениях питают-
ся личинки, или взрослые формы, или и те и другие. Насекомые, передаю-
щие вирус чисто механическим путем, обнаруживаются в отрядах прямо-
крылых (Orthoptera), уховерток (Dermaptera) и жесткокрылых (Coleoptera),
а также чешуекрылых (Lepidoptera) (личинки) и двукрылых (Diptera)
(личинки). Вирусы, которые передаются переносчиками из этих отрядов,
за немногими исключениями, не имеют большого экономического значения.
Среди представителей Collembola и Hymenoptera относительно мало видов,,
являющихся распространенными вредителями сельскохозяйственных расте-
ний; возможно, некоторые служат переносчиками вирусных заболеваний.
В отряде Thysanoptera известен лишь один вид, способный передавать вирус;
этот единственный вирус, передаваемый трипсами, имеет существенное
значение.
Отряд Homoptera, куда входят тли, червецы и различные цикадки,
по числу относящихся к нему переносчиков вирусов растений является наи-
более важной группой. Насекомые этого отряда питаются на живых зеленых
растениях. Для большего удобства мы при описании различных групп пере-
носчиков будем следовать классификации, предложенной Брюсом и др.
[296]. По этой классификации отряд Homoptera включает следующие надсе-
мейства (в более поздних работах других авторов некоторые из них рассматри-
ваются как семейства): Cicadoidea (певчие цикады); 4-+ Membra coidea (гор-
батки); Cercopoidea (церкопиды); 4- Jassoidea (цикадки); 4“+ Fulgoroidea
(светоноски); +4- Ghermoidea (псиллиды); 4- Aleyroidea (белокрылки); 4- Aph-
idoidea (тли); 4-Coccoidea (червецы, щитовки); Coleorrhyncha.
Надсемейства, помеченные знаком 4- , включают в себя по крайней мере-
один вид насекомых-переносчиков. Знаком 4~ 4- отмечены те надсемейства,
Взаимоотношения между вирусами растений и переносчиками 383
о которых ранее было известно, что они передают какие-то вирусоподобные
патогенные агенты, оказавшиеся, как выяснилось в более поздних работах,
микоплазмоподобными организмами. Представители надсемейства Jassoidea
передают также вирусы. Aphidoidea и Jassoidea — наиболее важные группы.
К надсемейству Cicadoidea относятся насекомые, личинки которых питаются
на корнях растений, а взрослые особи обитают главным образом в кронах
деревьев. Представители Coleorrhyncha встречаются чаще всего в зарослях
новозеландского бука (Nothofagus). К этому надсемейству относится всего
12 видов, представители которых весьма редко встречаются в коллекциях.
Не удивительно поэтому, что среди представителей этих двух групп пока
не описаны переносчики вирусов. Менее понятно, почему не удается обнару-
жить переносчиков среди представителей надсемейства Cercopoidea. Как
личинки, так и взрослые особи насекомых этой группы питаются на кустар-
никах и травянистых растениях.
Отряд Heteroptera также объединяет насекомых с сосущим ротовым аппа-
ратом, причем многие из них питаются на зеленых растениях. Сюда входят
клопы-черепашки, клопы земляные и слепняки; все они характеризуются
затвердевшими сильно хитинизированными передними крыльями, превращен-
ными в надкрылья. Любопытно, что среди представителей этого отряда заре-
гистрировано очень небольшое число переносчиков.
Паукообразные (Arachnida)
Этот класс состоит из 11 отрядов, причем на живых зеленых наземных
растениях паразитируют только представители отряда Acarina (клещики
и клещи). Бейкер и Уортон [59] разделили отряд Acarina на пять подотрядов,
из которых только подотряд Trombidiformes включает в себя виды, питаю-
щиеся на зеленых растениях. Этот подотряд делится на три надсемейства:
+ Tetrapodili (Eriophydae); Tarsonemini; + Prostigmata (Tetranychidae).
В каждом из этих надсемейств имеются семейства, представители которых
питаются на зеленых растениях. Переносчики вирусов найдены в надсемей-
ствах, отмеченных знаком + •
Резюме
Рассматривая беспозвоночных в целом, можно видеть, что из 13 отря-
дов, включающих в себя по крайней мере по нескольку видов, постоянно-
питающихся на живых зеленых наземных растениях, 10 отрядов имеют пред-
ставителей, которые служат переносчиками вирусных болезней растений;
Основные исключения — это отряды Tylenchidae из нематод, а также Col-
lembola и Hymenoptera из насекомых; однако и среди них вполне могут
оказаться переносчики, иногда невольные. Из тех 10 отрядов, в которые
входят переносчики вирусов растений, наиболее важен отряд Homoptera
(класс насекомых). Он включает различные группы насекомых, питающихся
на растениях, в том числе переносчиков, из которых большинство относится
к двум надсемействам — Jassoidea и Aphidoidea.
Почти всегда переносчики определенного вируса относятся к какой-то-
одной определенной группе. Известны лишь очень немногочисленные исклю-
чения из этого правила. Например, вирус мозаики Centrosema передается
двумя видами тлей, а также двумя видами растительных клопов из рода
Nysius (отряд Heteroptera), причем почти с той же эффективностью [1834].
О другом исключении сообщают Бергесон и др. [171]: вирус кольцевой пят-
нистости табака передается нематодой Xiphinema americanum и несколькими
видами трипсов. Эффективность передачи этого заболевания трипсами незна-
чительна, от 0,5 до 8,0%. Столь низкая эффективность предполагает необхо-
384
Глава XVI
димость проверки этих экспериментов, особенно в том, что касается чистоты
использовавшихся культур вируса; при этом следует также учесть возмож-
ность передачи вирусов механическим путем — либо случайно, либо при
помощи одного из предполагаемых переносчиков.
Вначале мы рассмотрим переносчиков из класса нематод как наиболее
примитивных, а затем — различных представителей Homoptera, начиная
с тлей и цикадок, поскольку это наиболее важные группы насекомых-перенос-
чиков и поскольку они изучены лучше всего.
НЕМАТОДЫ (NEMATODA)
После того как Хыоит и др. [774] обнаружили, что переносчик вируса
папоротниковидности винограда относится к нематодам, было показано, что
через почву с помощью нематод передаются многие широко распространенные
вирусы. Установлено, что три рода нематод, способных передавать вирусы,
относятся к отряду Dorylaimida. Из них два рода, Xiphinema и Longidorus,
являются близкородственными и относятся к надсемейству Tylencholaiminae,
семейству Dorylaimidae. Это крупные нематоды: взрослые особи достигают
длины 3 мм и более. Третий род, в который входят переносчики вирусов,—
Trichodorus — относится к семейству Trichodoridae. Представители этого
рода мельче (длина взрослых особей около 1 мм). Все нематоды, относящиеся
к этим трем родам, являются эктопаразитами и имеют довольно длинные
стилеты. Они питаются на клетках эпидермиса корня (фото 84) и при пита-
нии делают проколы, обычно вблизи корневого чехлика.
В табл. 17 приведен перечень вирусов, передающихся нематодами,
и самих нематод-переносчиков. Сферические вирусы, приведенные в этом
списке, передаются видами родов Xiphinema та Longidorus, а палочкообраз-
ные — видами рода Trichodorus.
Экспериментировать с нематодами — дело весьма сложное из-за их малых
размеров и требовательности к определенным условиям — типу почвы, ее
влажности и в меньшей степени к температуре. Ниже мы приводим факты,
на основании которых был сделан вывод, что вирусы передаются нематода-
ми-переносчиками, перечисленными в табл. 17.
1. Распределение в поле тех или иных видов нематод может очень близко
коррелировать с расположением участков, занятых больными растениями.
2. Здоровые растения, растущие в одном ящике с больным, заражаются
лишь в том случае, если внести в почву соответствующего переносчика из нема-
тод. Так, Хыоит и др. [774] установили, что если растения растут в одном
ящике, то вирус папоротниковидности винограда передается от больного
растения здоровому, только если в почву вносится Xiphinema index.
3. Если нематод, собранных вручную с больных растений или из почвы,
в которой росли эти растения, внести в стерильную почву вместе со здоро-
выми индикаторными растениями, то растения могут быть заражены.
4. Дополнительные полезные данные можно получить, наблюдая воздей-
ствие на нематод и на передачу вируса различных способов обработки зара-
женной почвы. Так, Кедмен и Харрисон [315] показали, что если почву,
зараженную вирусом черной кольцевой пятнистости томатов и вирусом мозаики
резухи, высушивать в течение недели, то нематоды погибают и почва утрачи-
вает инфекционность. Точно так же при просеивании почвы инфекционность
сохраняется в тех фракциях, в которых находятся нематоды [721]. Обра-
ботка почвы химикатами, которые не действуют на вирус в экстрагирован-
ном соке растения, но уничтожают присутствующих в почве нематод, предот-
вращает передачу вирусов черной кольцевой пятнистости томатов и мозаики
резухи.
Взаимоотношения между вирусами растений и переносчиками 385
Таблица 17
Нематоды — переносчики вирусных болезней растений
Нематоды Вирусы Источник данных
А. Сферические вирусы.
Longidorus atienuatus Черной кольцевой пятнистости [732]
томатов
Longidorus elongatus То же [732]
Longidorus elongatus Кольцевой пятнистости малины [1748]
Longidorus macrosoma То же [718]
Xiphinema americanum Кольцовой пятнистости табака [587]
Xiphinema americanum Кольцевой пятнистости томатов [278]
Xiphinema diversicaudatum Мозаики райграса многоукосиого [150(1]
Xiphinema diversicaudatum Скручивания листьев вишни [565]
Xiphinema diversicaudatum, Латентной кольцевой пятнистости [1076]
земляники
Xiphinema diversicaudatum Мозаики резухи [873]
Xiphinema index То же [774]
Xiphinema coxi » » [566]
Xiphinema coxi Мозаики райграса многоукосиого [1500]
Xiphinema coxi Скручивания листьев вишни [565]
Б. Палочкообразные вирусы
Trichodorus viruliferus Раннего побурения гороха [617]
Trichodorus teres То же [1819]
Trichodorus pachydermus » » [1819]
Trichodorus pachydermus Погремковости табака [1638]
Trichodorus teres То же [1820]
Trichodorus christiet » » [1857]
Trichodorus allius » » [870]
Trichodorus similis )> » [414]
Trichodorus primitivus » » [1467]
[717]
Trichodorus porosus » » [49]
По-видимому, нематоды неспособны передавать инфекцию в том случае,
если вирус просто присутствует в почве. Например, когда почву, в которой
находились пематоды-переносчики, промывали суспензией, содержащей вирус
черной кольцевой пятнистости томатов, нематоды оставались неинфекцион-
ными; они становились инфекционными лишь тогда, когда в почве росли
больные растения 1315].
Минимальные сроки питания, которые требуются для того, чтобы нема-
тоды получили вирус и передали его здоровому растению, установить труд-
но, так как невозможно проследить, когда отдельные особи действительно
питаются. Легче определить те периоды, в течение которых нематоды имеют
доступ к растениям. Установлено [874], что X. diversicaudatum может полу-
чить вирус мозаики резухи через одни сутки (самое короткое время в опыте).
В экспериментах, в которых время контакта нематод с больными растениями
было меньше, показано [1756], что нематоды X. americanum получают вирус
кольцевой пятнистости томатов в течение 1 ч и передают его здоровому расте-
нию примерно за такое же время. Сходные данные приводятся в работе Аялы
и Аллена [50], показавших, что нематоды Trichodorus allius могут получать
вирус погремковости табака при питании в течение часа и приблизительно
за такое же время передавать этот вирус здоровым растениям. Недавно уста-
новлено, что нематода X. index получает и передает вирус папоротниковид-
ное™ винограда после 15-минутного контакта с растением [432].
25-0893
386
Глава XVI
Нематоды, однажды получившие вирус, могут в течение долгого периода
сохранять способность к заражению растений. Например, Харрисон и Уинс-
лоу [730] культивировали инфекционных нематод (X. diversicaudatum) на том
сорте малины, который не заражается вирусом мозаики резухи. Через 8 мес
эта популяция все еще сохраняла инфекционность, которая утрачивалась
лишь через 11 мес. Вирус погремковости табака сохранялся в голодающих
Т. pachydermus по крайней мере в течение 36 дней [1637]. Еще твердо не уста-
новлено, могут ли нематоды передавать вирусы после линьки, подобно
насекомым, передающим устойчивые вирусы. Принято считать, что вирусы
могут передаваться как личинками, так и взрослыми нематодами, однако
известно, что вирус черной кольцевой пятнистости томатов передается личин-
ками и обычно не передается взрослыми особями [732]. Через яйца нематод
вирусы, по-видимому, не передаются. Это подтверждается тем фактом, что
популяция X. diversicaudatum, зараженная вирусом мозаики резухи, при
питании на невосприимчивых к вирусу растениях малины теряла инфекцион-
ность через 11 мес, хотя численность нематод при этом увеличивалась [730].
Если бы вирус передавался через яйца, то инфекционность этой популяции
поддерживалась бы постоянно.
Вирус, содержащийся в экстрактах инфицированных нематод, опреде-
ляется путем инокуляции растений; четкие данные, которые доказывали бы,
что вирусы размножаются в переносчиках, отсутствуют.
В некоторых случаях имеется специфическая связь вирусов с перенос-
чиками-нематодами. Из группы икосаэдрических вирусов нематодами рода
Longidorus передаются вирусы черной кольцевой пятнистости томатов и коль-
цевой пятнистости малины, тогда как вирус мозаики резухи и вирус кольце-
вой пятнистости табака передаются видами рода Xiphinema. Могут иметь
место и более специфичные взаимоотношения. Так, шотландская и английская
формы вируса кольцевой пятнистости малины, серо логически родственные,
но не идентичные, передаются различными видами Longidorus [719]. Природа
этой специфичности неясна. В то же время X. americanum передает два виру-
са — вирус кольцевой пятнистости табака и вирус кольцевой пятнистости
томатов [582]. Нематоды могут получать и передавать оба вируса, питаясь
как на растениях, зараженных сразу двумя вирусами, так и на растениях,
зараженных каждым из вирусов в отдельности.
ТЛИ (APHIDOIDEA)
Особенности питания и жизненный цикл
В зонах с умеренным климатом тли часто мигрируют с первичного расте-
ния-хозяина, которым обычно бывает древесное растение, на травянистые
растения. Жизненный цикл тлей характеризуется сменой большого числа
форм. Ниже приводится полный цикл развития (табл. 18).
Известны многочисленные варианты этого цикла — различные у разных
видов тли и в разных климатических условиях. Например, у некоторых видов
зимуют партеногенетические живородящие формы. Известны случаи, когда
весь жизненный цикл может проходить на одном хозяине.
У тлей отмечается три вида изменчивости, что, как будет показано ниже,
связано с их способностью передавать вирус: 1) возможен случай, когда вид
тли может состоять из разных клонов или рас, которые не всегда имеют четкие
морфологические различия; 2) как указывалось выше, у тлей существует
множество разных форм; 3) особую форму представляют нимфы. Последова-
тельные линьки определяют число стадий или возрастов. Бескрылая взрослая
тля показана на цветной вклейке 1. На фото 85 приведена группа тлей, в кото-
рой видны насекомые на разных стадиях развития.
Взаимоотношения между вирусами растений и переносчиками 387
Таблица 18
Цикл развития тлей
Сезон
Форма
Хозяин
Зима
Весна
Лето
Осень
Зима
Яйца
Самки-основательницы (бескрылая форма).
Размножение живорождением, партеногене-
тическое
Потомство самки-основательницы (бескрылая
форма). Размножение живорождением,
партеногенетическое
Самки расселительницы (крылатая форма).
Миграция к вторичному хозяину, размноже-
ние живорождением, партеногенетическое
Потомки самок-расселительпиц (крылатые
и бескрылые формы). Многочисленные по-
коления размножаются все пето бесполым
способом, живорождением
Полоноски (крылатые живородящие самки).
Миграция к первичному хозяину, размно-
жение живорождением, партеногенетическое
Половые особи (раздельнополые формы). Спа-
ривание
Яйца
Первичный хозяин
Вторичный хозяин
Первичный хозяин
Группы тлей-переносчиков
В табл. 19, составленной Кеннеди и др. 1966], приведены данные о числе
видов тлей-переносчиков, зарегистрированных среди различных семейств
и подсемейств Aphidoidea. Наиболее важным с интересующей нас точки зре-
ния является семейство Aphididae: из 192 видов тлей-переносчиков 173 вида
относятся именно к этому семейству. В работе Кеннеди и др. [966] говорится,
что с тлями проделана лишь очень небольшая часть работы. К тому време-
Таблица 19
Группа тлей-перепосчиков [966]
Семейство Общее число видов в семей- стве (по ли- тературным данным на 1853 г.) Число про- веренных видов Число видов, передающих хотя бы один вирус
Lachnidae 175 4 0
Chaitophoridae Callaphididae Aphididae 75 10 6
270 14 10
1570 205 173
Greenideidae 60 0 0
Thelaxidae 205 1 1
Pemphigidae 230 8 2
Adelgidae 40 0 . 0
Phylloxeridae 65 0 0
Всего 2690 242 192
25*
388
Глава XVI
ни, когда составлялся этот список, 242 вида тлей (из 2690 видов, зарегистри-
рованных к 1962 году) было проверено на способность передавать один или
более из 247 вирусов. Из 59 774 возможных комбинаций тля — вирус было
проверено всего 1549 (т. е. 2,6%). Как отмечается в работе Кеннеди и др.
[966], эти данные по различным причинам нельзя считать вполне достовер-
ными. Так, не исключено, что отрицательные результаты попросту не публи-
ковались. Почти наверняка следует относиться с осторожностью к работам,
проводившимся па определенных видах тлей (Myzus persicae, Aphis gossypii),
которые широко распространены и легко культивируются на целом: ряде
растений.
Возможно, предпочтение, которое отдают тли тому или иному растению,
связано с присутствием в нем специфических химических стимуляторов.
Так, Венслер [1895] показал, что введение синигрииа (глюкозид горчитгного
масла крестоцветных) в листья бобов (Vicia faba L.) способствует тому, что
тли Brevicoryne brassicae начинают питаться па этом растении и дают на нем
потомство, тогда как в обычных условиях этого не происходит. В экспери-
менте можно использовать такие специфичные стимуляторы питания для
расширения круга вирусов, передаваемых отдельными тлями.
Типы взаимоотношений между вирусами и тлями
Уотсон [1870] и Уотсон и Робертс [1877, 1878] считают, что вирусы, рас-
пространяемые тлями, по-видимому, можно разделить на две группы — яепер-
систентных и персистентных. Первые сохраняются в переносчике только
в течение короткого периода, меныпего, чем период сохранения вируса в необ-
работанных экстрактах листьев, тогда как вторые могут находиться в насе-
комых долгое время, иногда в течение нескольких недель или месяцев.
Такое деление какое-то время сохранялось, ио вскоре исследователи
стали обнаруживать все больше вирусов, которые несомненно обладали
промежуточными свойствами. Было показано, например, что вирус мозаики
цветной капусты имеет некоторые свойства как стойких, так и нестойких
вирусов [440]. Сейчас ясно, что в основе деления на группы должны лежать
четкие данные, касающиеся путей перемещения вируса, а не те или иные
эмпирические критерии. Известны два таких пути [1873]: 1) внешний, кото-
рый заключается в передаче вируса па конце стилета (при этом насекомое
теряет инфекционность после линьки), и 2) внутренний, когда активный
вирус, поглощенный насекомым, проходит через гемоцель, а затем может
попасть вновь в слюнные железы. Этот тип инфекционности не утрачивается
после линьки.
Кеннеди и др. [966] предложили термин «передаваемый с помощью
стилета» вместо «внешний» как более соответствующий для тех случаев, когда
вирусы транспортируются внутри губного желобка, где возможно взаимо-
действие между слюной насекомого, вирусом и соком растения. Вирусы,
которые передаются другим способом (внутренним), они предпочитают назы-
вать «циркулирующими», т. е. используют термин, который применял Блэк
[207] в отношении некоторых вирусов, передающихся цикадками. Термины
«передаваемый с помощью стилета» и «циркулирующий» стали общеприня-
тыми. Большинство вирусов, передающихся тлями, удается четко разделить
на эти две группы. Однако некоторые вирусы нельзя отнести к какой-либо
группе, главным образом потому, что они недостаточно изучены. Существуют
вирусы (например, вирус желтухи свеклы), которые передаются обоими
способами. Ниже мы будем говорить также о некоторых циркулирующих
вирусах, способных размножаться в организме переносчика. В этом случае
они обозначаются термином «размножающиеся» или «пропагативные».
Взаимоотношения между вирусами растений и переносчиками 389
Вирусы, передаваемые с помощью стилета
Главная особенность этого типа передачи состоит в том, чтч, тля может
получить вирус после очень кратковременного питания на больном растении
и немедленно передать его одному или нескольким здоровым растениям. Спо-
собность передавать вирус быстро утрачивается. Эффективность передачи
часто увеличивается в том случае, если перед тем, как поместить тлей на боль-
ные растения, их некоторое время выдерживают без нищи. Для приобрете-
ния вируса длительные периоды питания па больных растениях могут быть
менее эффективными, чем короткие. В табл. 20 приводятся некоторые данные,
взятые из классической работы Уотсон и Робертса [1877].
5 Таблица 20
Влияние предварительного голодания и времени питания па больных растениях
иа эффективность, с которой Муяив регягсае передает растениям табака вирус
3 растений белены [1877]т)
Время предвари-
тельного голода-
ния
Число зараженных растений (из 50) в опыте при
различном времени питания па Сольном растении
2 мин
15 мин
Не голодали 5
1 ч 28
4 ч 31
1) Пять тлей кормились на каждом адороном растении в течение 20 ч.
Эти основные особенности передачи инфекции с помощью стилета прямо
свидетельствуют о том, что вирус пассивно переносится па частях ротового
аппарата тли. Вполне возможно, что именно такой механизм лежит в основе
процесса, однако здесь имеется много осложняющих факторов и неясных экспе-
риментальных фактов, которые еще пе имеют объяснения. Судя по данным,
собранным Кеннеди и др. [966], тли переносят с помощью стилета около
100 вирусов, многие из которых имеют большое экономическое значение.
Таким образом, тли, передающие вирусы с помощью стилета, представляют
собой наиболее важную группу среди переносчиков вирусов растений.
Вирусы,
Имеется по крайней мере три неясных вопроса, касающихся особенно-
стей вирусов, передаваемых с помощью стилета:
1. Почему некоторые вирусы передаются этим способом, тогда как дру-
гие, имеющие несомненное сходство с первыми, им не передаются?
2. Почему одни штаммы некоторых вирусов иногда передаются, а другие
не передаются?
3. Почему некоторые вирусы передаются только в присутствии другого
вируса?
Многие вирусы, переносимые стилетом, имеют некоторые общие свой-
ства. Это нитевидные частицы с точкой термической инактивации около
60 °C, при комнатной температуре они инактивируются в течение нескольких
дней. Однако не все вирусы обладают этими свойствами. Например, вирус
огуречной мозаики имеет изометрические частицы. Если передача стилетом
является пассивным процессом, то довольно трудно объяснить, почему такие
390
Глава XVI
относительно стабильные вирусы, как ВТМ, Х-вирус картофеля и вирус
желтой мозаики турнепса, которые содержатся в растении в высокой концент-
рации, не передаются этим способом. Имеются четкие данные о том, что тли
могут получать ВТМ [969] и ВЖМТ [849]. Сохраняет ли такой поглощенный
тлями вирус свою инфекционность, показано не было.
Различные штаммы одного и того же вируса могут различаться по эффек-
тивности, с которой они передаются отдельными видами тлей. Некоторые
штаммы вообще не передаются тлями. Известны случаи, когда какой-то
штамм вируса приобретает или теряет способность передаваться определен-
ными тлями. Так, С-вирус картофеля (штамм У-вируса картофеля) в течение
многих лет не передавался тлями [103]. Впоследствии было обнаружено
[1872], что один штамм вируса С передается тлями после длительного культи-
вирования в растениях N.glutinosa и N.tabacum.
Кассанис [935] показал, что вирус аукуба-мозаики картофеля пере-
дается тлями с помощью стилета только в присутствии М-вируса картофеля
или У-вируса картофеля. Он исследовал 12 штаммов вируса аукуба-мозаики
картофеля и показал, что они сильно различаются по легкости, с которой
они передаются тлей Myzus persicae в присутствии А -или У-вируса картофеля.
Некоторые штаммы вообще не передавались в присутствии вируса А. Как
и при смешивании с некоторыми другими вирусами, концентрация вируса
аукуба-мозаики в растении увеличивалась в присутствии А- или У-вируса.
Однако это увеличение концентрации не коррелировало с эффективностью
передачи тлями. Обычно вирус аукуба-мозаики, будучи освобожден от вируса
А или У, утрачивал способность передаваться тлями. Таким образом, изме-
нения способности вируса к передаче могут быть весьма разнообразны.
По-видимому, при передаче насекомыми с помощью стилета различные
штаммы одного и того же вируса передаются независимо друг от друга в отли-
чие от того, что наблюдается иногда в случае пропагативных вирусов. Так,
Кастилло и Орлоб [338], используя в опытах два штамма вируса огуречной
мозаики и два штамма вируса мозаики люцерны, нашли, что каждый штамм
вводится независимо от другого. Как показали Кастилло и Орлоб, соотно-
шение тлей, передающих один или оба штамма, находилось в соответствии
с тем, что ожидалось для независимой передачи.
Растения-хозяева
В экспериментальной работе по передаче вирусов растения используются
для культивирования тлей как источник зараженного вирусом материала
(инфицированные растения) и для проверки способности тлей к заражению
(здоровые растения). Не содержащих вируса тлей обычно культивируют
на растениях, иммунных к изучаемому вирусу. Когда тлей помещают на расте-
ние, зараженное вирусом, тем самым изменяют вид растения-хозяина, что
может повлиять на особенности питания насекомых.
Эффективность передачи может зависеть от вида или даже от сорта расте-
ния, используемого в качестве источника вируса или в качестве индикатор-
ного растения. На фиг. 74 иллюстрируется такая вариабельность эффектив-
ности передачи инфекции с различных зараженных растений на примере
вируса карликовой мозаичности кукурузы (штамм вируса мозаики сахарного
тростника) и его переносчика М. persicae [1202].
Тлей М. persicae, которые передают этот вирус с помощью стилета, поме-
щали на зараженные растения перечисленных на фиг. 74 видов и оставляли
питаться на них в течение 1 мин. Оказалось, что при питании на растениях
пяти видов тли не инфицировались. Можно было бы предположить, что это
объясняется низкой концентрацией вируса, однако с растений всех 15 видов
вирус легко удавалось передать механической инокуляцией. Предпочтение
Взаимоотношения между вирусами растений и переносчиками 391
Фиг. 74. Сравнительная эффективность передачи тлями М. persicae вируса карликовой
мозаичности кукурузы с различных зараженных растений на кукурузу [1202].
тлями тех или иных растений можно объяснить некоторыми различиями
последних. Так, было обнаружено [1202], что М. persicae с трудом вводит
стилет в Eragrostis trichodes (Nutt.) Wood, хотя питается на остальных четы-
рех видах растений, на которых инфицирования тлей также не происходит.
Эффективность больных растений как источника вируса может меняться
в зависимости от времени после инокуляции, если меняется концентрация
вируса в растении (см., например, [1683]). Как обсуждается в гл. VII, кон-
центрация вируса в системно зараженных растениях часто значительно
варьирует даже в соседних участках ткани. Это может сказываться на эффек-
тивности инфицирования тлей. Так, Брэдли [244] показал, что у растений
табака, зараженных У-вирусом картофеля, эпидермис различных листьев
средних размеров неодинаково пригоден для передачи вируса тлями и что
это тесно связано с количеством вируса в экстрактах (количество вируса
определялось серологически). Восприимчивость данного вида или сорта расте-
ний к тому или иному вирусу может быть различной в зависимости от того,
какой вид тлей использовался в качестве переносчика [1587, 1723]. Это явле-
ние иллюстрируется данными, приведенными в табл. 21.
Таблица**?!
Взаимоотношения между видами тлей-переносчиков, видами инфицированных
растений—источников вируса и видами заражаемых растений при передаче вируса,
поражающего Brassica niff га [1723]
Вид переносчика Вид инфицирован- ного растения Вид заражаемого растения Число заразив- шихся растений из (60 инокули- ровапных)
Myzus persicae Brassica chinensis В. chinensis 0
В. juncea 23
В. juncea В. chinensis 1
В. juncea 27
Rhopalosiphum В. chinensis В. chinensis 8
pseudobrassicae В. juncea 11
В. juncea В. chinensis 3
В. juncea 7
Различного рода обработка, влияющая иа восприимчивость растений
к вирусу при механической инокуляции (гл. XII), может ие оказывать того же
действия при введении инфекции тлями. Показано, что минеральные пита-
392
Глава XVI
тельные вещества, которые в значительной степени усиливают рост растений
табака и картофеля, оказывают весьма незначительное влияние па их воспри-
имчивость к У-вирусу картофеля при инокуляции [104]. Различные условия,
воздействующие на эффективность механической передачи, могут влиять,
а могут и не влиять на эффективность передачи вируса тлями. Например,
затемнение растений N. rustica на двое или четверо суток перед заражением
увеличивало их восприимчивость к вирусу увядания дурмана при механи-
ческой инокуляции, по пе влияло на эффективность заражения с помощью
тлей Myzus persicae. Точно так же затемнение на двое суток перед заражением
не повышало восприимчивости растений лимской фасоли к вирусу огуречной
мозаики при передаче тлями Myzus persicae. В то же время инкубация зара-
жаемых растений после инокуляции при повышенной температуре (30 °C)
приводила к увеличению относительного числа зараженных растений [1682].
Специфичность передачи вирусов тлями
Тли разных видов в значительной степени отличаются друг от друга
по числу передаваемых ими вирусов. Крайний случай представляет тля
Myzus persicae, которая с помощью стилета способна передать около 70 виру-
сов. Известны виды тлей, передающие только один вирус. Конечно, сведения
на этот счет частично отражают ту степень интереса, с которой изучались
те или иные виды тлей, по пет никакого сомнения в том, что различия в числе
передаваемых вирусов действительно существуют. Данные, приведенные
в табл. 19, свидетельствуют о том, что наиболее эффективными переносчика-
ми обычно являются представители семейства Aphididae. Это подтверждается
и более детальными исследованиями. Так, Цеттлер [1985] показал, что все
7 испытанных им видов из семейства Aphididae передают вирус обыкновенной
мозаики фасоли. Наибольшая эффективность. (51%) отмечена для Myzus
persicae. Из 10 видов тлей, относящихся к другим семействам, только 4 пере-
давали вирус; максимальная эффективность передачи (14%) отмечалась у тли
Phyllaphis fagi (L.)
Очень близкие виды тлей могут сильно различаться по способности
передавать вирус. Например, тля М. persicae, питаясь на растениях семей-
ства крестоцветных, зараженных одновременно и вирусом мозаики цветной
капусты, и вирусом черной кольцевой пятнистости капусты, передает оба эти
вируса, тогда как тля М. ornatus способна в этом случае передавать только
вирус мозаики цветной капусты [1034].
Разные виды тлей часто очень сильно различаются по эффективности
передачи одного вируса. Следует отметить, что при изучении этого вопроса
не всегда уделялось достаточно внимания таким факторам, как возраст
и численность колонии, а также состояние растения-хозяина. Однако даже
в тех экспериментах, в которых эти факторы тщательно учитывались, можно
было обнаружить большие различия в эффективности передачи вируса. Так,
Брэдли и Райдаут [255] выявили значительную разницу в эффективности
передачи различными видами тлей У-вируса картофеля даже тогда, когда
условия и время питания были стандартизированы. На фиг. 75 демонстри-
руется эффективность передачи вируса тлями трех видов после питания
на больных растениях в течение различного времени.
В большинстве исследований в качестве переносчиков использовались
крылатые и бескрылые живородящие самки. Было установлено, что разные
формы одного вида тли, адаптированные к разным сезонам и растениям-хозяе-
вам, могут различаться по эффективности передачи вирусов; впрочем, на
этот счет изучены лишь немногие виды [1288, 1310]. Пока неясно, абсолютны
ли эти различия между разными формами тлей или же просто некоторые
формы являются более эффективными переносчиками, чем другие.
Взаимоотношения между вирусами растений и переносчиками 393
Фиг. 75. Сравнительная эффективность передачи У-вируса картофеля тремя видами
тлей при различной продолжительности питания иа больных растениях [255].
I — Л?, persicae; II — A. abbreviata; III — № solanifoli.
У тлей вид может состоять из нескольких клопов, имеющих очень неболь-
шие анатомические отличия. Такие клоны часто различаются до эффектив-
ности, с которой они передают циркулирующие вирусы; что касается разли-
чий между клонами в передаче вирусов с помощью стилета, то достоверных
примеров такого рода известно лишь очень немного. Симонс [1588] показал,
что клопы хлопковой тли (Aphis gossypii Glover) различаются по способности
передавать вирус южной мозаики огурца.
И наконец, существуют индивидуальные различия в эффективности
передачи вируса, зависящие от условий культивирования тлей. Учитывая
этот фактор, можно объяснить некоторые противоречивые данные, встречаю-
щиеся в литературе. Молодые, хорошо развитые колонии будут давать актив-
ных особей. В более старых, отживающих колониях тли характеризуются
меньшей эффективностью и большей вариабельностью передачи [249, 1714].
Получение вируса тлями
В классической работе Уотсом [1870] с вирусом 3] растений белены
и с М. persicae в качестве его переносчика выявлены две основные особенности
взаимоотношений между вирусом, передаваемым с помощью стилета, и тлей-
переносчиком. Во-первых, тли лучше инфицируются после короткого (2 мин),
чем после более длительного периода пребывания на зараженном вирусом
растении. И, во-вторых, если тлей сначала заставить голодать, а потом поме-
стить иа зараженное вирусом растение, то эффективность передачи вируса
возрастает. Уотсон, обсуждая этот феномен, предполагает, что во время пита-
ния тли продуцируют какое-то вещество, инактивирующее вирус. При отсут-
ствии контакта с растением образование этого вещества прекращается,
и после возвращения па растение тли в течение короткого периода могут
получать и передавать вирус до тех пор, пока инактивирующее вещество
не начнет выделяться вновь. Уотсон и многие другие исследователи считают,
что вещество, инактивирующее вирус, содержится в слюне, но убедительных
данных, которые подтверждали бы эту точку зрения, пет.
Рассматривая процесс в целом, следует учитывать, что при получении
насекомым вируса особенно важное значение имеет активность тлей при
394
Глава XVI
помещении их на лист. Поведение тлей на листе исследовали многие авторы.
Сильвестер [1716] обнаружил, что вирус мозаики свеклы может быть полу-
чен тлей в результате единичных, очень кратковременных проколов (15—60 с);
эти проколы могли регистрироваться, а также в определенное время преры-
ваться оператором. Этот метод позволил более точно оценить изменения вос-
приимчивости растения, чем при длительном питании тли и многократном
прокалывании листа в процессе питания [1715]. Длительность прокола можно
отмечать по контакту нижней губы с поверхностью листа, но это не всегда
означает, что стилеты на самом деле введены в лист [243]. Определить время
введения стилета трудно, поэтому продолжительность прокола измеряется
длительностью контакта нижней губы с листовой поверхностью. Заканчивая
прокол, тля втягивает стилеты резким движением вверх. Тля может получить
вирус даже в том случае, если длительность прокола составляет всего 5 с.
Вероятность инфицирования Myzus persicae У-вирусом картофеля наиболь-
шая при длительности прокола 11—60 с [240]. При длительности прокола
более 5 мин вероятность получения вируса тлей снижается. При прокалы-
вании ткани листа может произойти механическая очистка стилета от вируса
[242]. Многими авторами показано, что для прокола эпидермиса
требуется около 60 с. Следовательно, вирус должен попадать на стилет из
эпидермальных клеток.
Ван Хуф [818] воспользовался тем фактом, что слюнной чехол, образую-
щийся при прохождении стилета через клетки, толще гладких цилиндри-
ческих каналов, образующихся между клетками, и отличается от них по очер-
таниям. Он пришел к выводу, что М. persicae и A. fabae обычно вводят стилет
между поперечными стенками клеток эпидермиса. Некоторые виды тлей
инфицируются во время кратковременных проколов, и при этом, судя по ходу
слюнного чехла, их стилет вводится в лист (как в эпидермис, так и в паренхи-
му) в основном между клетками [1262, 1263]. Брэдли [249] (он наблюдал
300 особей М. persicae на листьях табака) показал, что, когда тля прокалы-
вает поверхность листа, нижняя губа проходит между двумя эпидермальными
клетками. Итак, вероятно, стилет вводится тлями в основном в простран-
ство между двумя клетками эпидермиса. Проведенные в последнее время
исследования с использованием серийных срезов и электронной микроско-
пии показали, что при введении стилетов повреждаются поперечные стенки
клеток эпидермиса (Лопец-Абелла и Брэдли, личное сообщение). Вопрос
о том, извлекается ли вирус при быстром проколе из межклетного про-
странства или из самой клетки, остается до сих пор открытым.
Как полагают Боудэн с соавторами [131], причиной того, что тли с боль-
шей легкостью получают вирусы, которые передаются стилетом, после быст-
рых проколов, является более высокая концентрация таких вирусов в эпи-
дермисе. Однако более поздние наблюдения [797, 1259, 1818] не подтвердили
представления о таком неравномерном распределении этих вирусов.
После работы Уотсон [1870] многие исследователи в своих опытах выдер-
живали тлей без пищи в течение часа или более перед тем, как поместить
их на растение, которое служило источником инфекции. Обычно эта проце-
дура в несколько раз увеличивала эффективность передачи. В более поздней
работе было показано, что эффективен и короткий период голодания (5 мин).
Брэдли [249] считает, что в какой-то степени это объясняется особенностями
поведения тлей сразу после того, как их удаляют с растения, на котором они
питались. Сначала примерно в течение 2 мин насекомые прокалывают лист
редко и неохотно, отводя стилеты в нижнюю губу, прежде чем снова пустить
их в ход; на это уходит 30—60 с или более.
Брэдли [249] указывает, что проколы, которые делает тля, различны
по длительности в зависимости от их цели. Быстрыми проколами насекомое
определяет пригодность растения для питания, а глубокие, более длительные
Взаимоотношения между вирусами растений и переносчиками 395
проколы, при которых обычно затрагиваются проводящие ткани, служат
непосредственно для питания. Возможно, то, будет ли питаться тля на расте-
нии или нет, определяется специфическими химическими стимуляторами
растения-хозяина. Так, было показано, что питание Brevicoryne brassicae
(L.) на крестоцветных стимулируется глюкозидом горчичного масла сини-
грином [1895].
Как предполагает Брэдли [249], при быстрых пробных проколах слюна
не выделяется (обычно она сосредоточивается вокруг кончика стилета) и
насекомое может получать соответствующий стимулятор, воспринимаемый
как сигнал пригодности растения. Однако позднее (Брэдли, личное сооб-
щение) оказалось, что слюна выделяется даже в том случае, когда тля полу-
чает вирус при очень быстрых проколах. Если растение оказалось для тли
подходящим, она делает глубокий прокол и выделяет студенистую слюну,
которая образует слюнной чехол с особым внешним слоем [1818]. На фото
86 показаны слюнные чехлы в губчатой паренхиме.
Слюнной чехол, возможно, инактивирует вирус или, как считает ван
дер Вант [1814], служит механическим барьером, препятствующим попада-
нию вируса в стилет или в ткани растения из стилета.
Последние данные, касающиеся особенностей прокалывания листа
тлей М. persicae, когда она получает вирус обыкновенной мозаики фасоли,
подтвердили ту точку зрения, что для передачи вируса с помощью стилета
важны быстрые пробные проколы, а не проколы, служащие для питания
[1986]. Передача вируса в тех случаях, когда тли делают много проколов на
листе растения, служащего источником инфекции, была так же эффективна,
как и передача тлями, сделавшими только один быстрый прокол. Этот факт
пе согласуется с представлением о том, что, когда тля прокалывает ткань
растения, она выделяет вещества, инактивирующие вирус.
Большинство первичных проколов тля производит в зоны между жил-
ками. Однако Брэдли [251] обнаружил, что для М. persicae, питающейся
па листьях табака, зараженного вирусом огуречной мозаики, наилучшим
источником инфекции при быстрых проколах являются жилки листа,
особенно жилки второго порядка.
Инфицирование тлей через искусственные мембраны
Оценивая, изложенные выше данные, можно сказать, что неизучен-
ными остаются еще многие стороны процесса передачи вирусов с помощью
стилета. Чтобы выравнять условия опыта, многие исследователи исполь-
зуют в своих работах метод инфицирования тлей при питании их па инфек-
ционном материале через искусственные мембраны.
Первые попытки в этом направлении были не очень успешными. Брэдли
[247] определял действие мембраны, подкармливая через нее М. persicae на
интактной ткани табака, зараженного У-вирусом картофеля. Тли при этом
инфицировались слабо, но способность заражать здоровые растения не
уменьшалась. Было показано, что тля М. persicae может инфицироваться
через тонкую мембрану вирусом мозаики люцерны [1338]; применяли кон-
центрированный забуференный раствор очищенного вируса в 5%-ной саха-
розе. Инфекционность препарата, которую оценивали механической иноку-
ляцией, была примерно в 100 раз выше инфекционности зараженных расте-
ний, но относительное число тлей, способных получать и передавать вирус,
было примерно тем же, что и при питании насекомых на больных расте-
ниях. При инфицировании длительность прокола мембраны составляла
40—80 с.
Сравнение способности трех видов тлей передавать вирус огуречной
мозаики после инфицирования на больных растениях и при питании через
396
Глава XVI
мембрану раствором очищенного вируса показало, что М. persicae в обоих
случаях переносит вирус с наибольшей эффективностью [1196].
В более детальных исследованиях [1341] было обнаружено, что для
Инфицирования М. persicae через мембрану очищенным вирусом мозаики
люцерны и вирусом огуречной мозаики требуется 20 с. При использовании
растворов вирусов, которые давали при механической инокуляции макси-
мальное число некрозов, инфицирование М. persicae и передача вируса также
были максимальными. Тли совсем или почти совсем не инфицировались
разбавленными растворами вируса (при использовании таких растворов
для механической инокуляции локальные некрозы появлялись). Добавле-
ние сока больных растений к препарату очищенного вируса огуречной моза-
ики обычно препятствовало передаче инфекции тлями, но почти не сказы-
валось на числе некрозов, вызываемых механической инокуляцией. Это
могло быть одной из причин неудач более ранних опытов, в которых тлей
подкармливали через мембраны неочищенным экстрактом листьев; при этом
добиться передачи вируса не удавалось. РНК вируса огуречной мозаики не
передавалась тлями, хотя они передавали интактный вирус сходного или
более низкого титра. Как предполагает ван Хуф [1818], эти результаты
вовсе не исключают того, что инфекционной формой при передаче вируса
от растения может быть вирусная РНК. Однако совпадение данных, касаю-
щихся длительности подкармливания на очищенном вирусе, времени пере-
дачи инфекции и скорости развития симптомов, с данными, полученными
при передаче вируса с интактного растения, подтверждает представление,
согласно которому вирус огуречной мозаики передается тлей от растения
к растению в интактной форме.
М. persicae при питании через мембрану не инфицируется вирусом!
мозаики цветной капусты и вирусом мозаики турнепса, хотя легко передает
их от растения к растению. Причина этого не установлена. Вероятно, дело-
здесь вовсе не в мембране, поскольку М. persicae успешно инфицируется
этими вирусами при питании через мембрану, помещенную поверх лепестков
больных растений.
Даффус и Голд [474] наблюдали за питанием отдельных особей М. per-
sicae через мембрану, используя растительные экстракты, меченные 32Р.
Они обнаружили большие различия в количестве поглощенного материала
между тлями разных возрастов и форм. Интенсивность питания нимф была
более однородной, чем у взрослых особей, и питались' они несколько более
активно. Компоненты растительных экстрактов, препятствующие приобре-
тению тлями вируса западной желтухи свеклы, как правило, подавляли
также пищевую активность тлей. При интенсивном питании тли за 24 ч
поглощают, по-видимому, около 2—5 мкл питательного раствора.
Сохранение инфекционности
При передаче вирусов с помощью стилета тли обычно способны зара-
жать растения сразу после питания на источнике инфекции и довольно
быстро утрачивают инфекционность. Таким образом, здесь не встает вопрос
о возможности репликации вируса в переносчике, как в случае циркулирую-
щих вирусов. То, насколько быстро теряется инфекционность, зависит от
многих факторов (в том числе от температуры и от того, культивируются
ли тли на растениях или в тех или иных искусственных условиях).
В случае многих вирусов, передаваемых с помощью стилета, тли очень
быстро теряют инфекционность, если их перенести на здоровые кормовые
растения (нередко это происходит в течение нескольких минут). Потеря
инфекционности происходит примерно с одинаковой скоростью при питании
тлей как на восприимчивых к вирусу, так и на устойчивых растениях [242].
Взаимоотношения между вирусами растений и переносчиками 397
Фиг. 78. Потеря способности инфекционных
тлей Myzus persicae передавать К-вирус кар-
тофеля после культивирования па листьях
здоровых растений табака (//) и выдержива-
ния в стеклянных сосудах без пищи (/).
В каждом случае всего исследовалось 50 осо-
бей. Время после инфицирования представлено
в логарифмическом масштабе [242].
Время, прошедшее после ишрицировамя.мия
Вероятно, происходит очистка стилета от вируса при проколе растения
[242]. Роль слюнного секрета не установлена. Некоторые проколы могут
не приводить к заражению — из-за того, что вирус либо почему-то остался
в стилете, либо попал в растение, но не достиг соответствующего участка в
клетке или инактивировался под влиянием каких-то компонентов клетки
растения-хозяина или слюны тлей. Вероятно, после каждого «успешного»
прокола количество вируса в стилете снижается, так что уменьшается воз-
можность заражения. При передаче некоторых вирусов, например вируса
мозаики цветной капусты растениям турнепса, инфицирующая способность
тли Brevicoryne brassicae сохраняется в течение более длительного времени —
до двух дней или более [440]. Причины, определяющие эти различия,
неизвестны.
Как правило, при передаче с помощью стилета тли сохраняют инфек-
ционность несколько дольше (до нескольких часов) в том случае, если их
сразу же после инфицирования удалять с растений, не давая питаться.
Отчасти, быть может, дело здесь в том, что тли в это время не пускают в ход
стилет, однако Брэдли [246] показал, что тли, снятые с растений, отнюдь
не теряют своей активности. Они стремятся проколоть любую поверхность,
и при этом отделяется слюна и работают стилеты. На фиг. 76 приведены
графики, характеризующие скорость утраты М. persicae способности пере-
носить У-вирус картофеля при культивировании на здоровых растениях
и выдерживания в стеклянных сосудах.
При пониженных температурах [756, 926] тли сохраняют инфекцион-
ность гораздо дольше, чем обычно (до 6 дней в случае вируса мозаики тур-
непса). Вероятно, в этих условиях потеря инфекционности объясняется
в основном просто нормальной инактивацией вируса с течением времени.
Главным основанием для проведения опытов, имеющих целью опреде-
ление длительности сохранения у тлей способности заражать растения,
послужила проблема распространения вирусов в поле. Условия, в которых
проводились опыты, в большинстве случаев не полностью совпадали с теми,
которые наблюдаются в поле. Однако Кокбейн и др. [387] попытались при-
близить условия опытов к полевым, давая возможность тлям в течение раз-
личного времени летать в токе воздуха. Инфекционность крылатых особей
М. persicae и Aphis fabae при передаче вирусов мозаики гороха и мозаики
сахарной свеклы уменьшалась примерно одинаково как в том случае, когда
они летали свободно, так и при выдерживании без пищи в стеклянной
камере. Когда тлей выдерживали в течение 30 мин при температуре выше
30 °C, эффективность передачи этих вирусов резко снижалась.
398
Глава XVI
Брэдли и Ганонг [252, 253] показали, что после кратковременного
облучения стилетов ультрафиолетом тли утрачивают способность к зара-
жению. Тлей с обнаженными стилетами получали следующим образом:
насекомых с погруженным в лист больного растения табака стилетом анес-
тезировали с помощью СОг через 15—30 с после начала прокола. На фото
87 представлены изображения стилетов, полученные при использовании
сканирующего электронного микроскопа.
Погружение стилетов М. persicae на 30 с в 0,03 %-ный (или более кон-
центрированный) раствор формалина или обработка кончиков стилетов
ультрафиолетом приводит к тому, что тли теряют способность передавать
У-вирус картофеля сразу же после его получения. Предварительная обра-
ботка 0,25%-ным формалином влияет на способность тлей получать и пере-
давать У-вирус картофеля не в большей степени, чем обработка водой (кото-
рая не оказывает никакого действия). Сильвестер и Ричардсон [1720] полу-
чили очень сходные результаты. Во всех этих экспериментах не исключена
возможность того, что формалин проникает в пищу или в проток слюнной
железы и инактивирует вирус не на (или в) кончике стилета, а где-нибудь
в другом месте. Это замечание не относится к опытам с использованием
ультрафиолета. Брэдли и Ганонг [252] показали, что если облучать стилеты
таким образом, чтобы не затронуть при этом их концы, то способность пере-
давать У-вирус картофеля почти не изменяется.
В этих опытах облучению подвергалась ббльшая часть тела насекомых,
что сказывалось на их последующем поведении. Брэдли [250] провел более
тонкие эксперименты. Он отделял две мандибулы (внешние стилеты) от сое-
диненных максилл (внутренняя пара стилетов) и отдельно облучал дисталь-
ные концы (25 мкм) тех и других. Облучение максилл у бескрылых особей
М. persicae приводило к тому, что почти все тли, получившие вирус огуреч-
ной мозаики, утратили способность заражать им растения, тогда как после
облучения мандибул этого не происходило. Как показано в опытах с исполь-
зованием трех различных вирусов, погружение дистальных концов максилл
в воду (5 раз в течение 15 с) вызывает утрату вирулентности почти у всех
насекомых. Контрольные опыты показали, что такая обработка не оказы-
вает неблагоприятного воздействия на способность тлей получать и переда-
вать вирус. По-видимому, эти опыты свидетельствуют о том, что вирус
мозаики люцерны, вирус огуречной мозаики и У-вирус картофеля перено-
сятся М. persicae на концах максилл. Вопрос о том, переносится ли вирус
также на мандибулах, остается открытым; данные, которые свидетельство-
вали бы в пользу такой возможности, отсутствуют.
Процесс инокуляции
Стадия инокуляции (заражение растения) при передаче вирусов стиле-
том очень сходна с процессом приобретения вируса. Как сообщают многие
авторы, инокуляция возможна в результате быстрых проколов растения
длительностью всего 5 с. Первые проколы, длящиеся более 15—30 с, не уве-
личивают вероятности заражения [238]. Возможно, что при этих первых
проколах вирус обычно вводится между поперечными стенками клеток эпи-
дермиса. Однако вовсе не исключено, что вирус вносится в клетки эпидер-
миса или в лежащие непосредственно под ними клетки мезофилла. Различия
в восприимчивости разных участков растения к вирусу незначительны [245,
1717]. Так, Брэдли показал, что восприимчивость различных частей
листа N. tabacum (средние жилки, жилки второго порядка, участки меж-
ду жилками) к У-вирусу картофеля при передаче тлей М. persicae оди-
накова.
Взаимоотношения между вирусами растений и переносчиками 399
чПолу персистентные» вирусы
Известно, что некоторые вирусы, распространяемые тлями, сохраня-
ются в насекомом дольше, чем это характерно для типичных вирусов, пере-
даваемых с помощью стилета. Сюда относятся вирус желтухи свеклы (пере-
носчик М. persicae), вирус мозаики цветной капусты (переносчики М. per-
sicae и В. brassicae) и вирусы крапчатости и окаймления жилок земляники
(переносчик Pentatrichopus jacobi Hille Ris Lambers). Имеются данные о том,
что эти вирусы теряются переносчиком после линьки [440, 557, 757]. Однако
доказать это весьма трудно, поскольку время до и во время линьки, в тече-
ние которого тля не питается, не удается точно измерить, а между тем оно
приближается по продолжительности к времени, в течение которого вирус
сохраняется в переносчике между линьками. Если вирус утрачивается после
линьки, то его, вероятно, следует относить не к группе циркулирующих
вирусов, а к группе вирусов, передаваемых с помощью стилета. Брэдли и
Сильвестер [256] обнаружили, что облучение концов стилетов М. persicae не
приводит к утрате инфекционности при передаче вируса желтухи сахарной
свеклы. В то же время У-вирус картофеля инактивируется после подобной
обработки. Если считать, что оба вируса инактивируются сходными дозами
ультрафиолета, то вирус желтухи сахарной свеклы должен отличаться от
У-вируса картофеля и других типичных вирусов, передаваемых стилетом,
по характеру взаимоотношений с насекомым. Что касается «полуперсистент-
ных» вирусов, то предварительное выдерживание насекомых без пищи
может и не приводить к усиленной передаче инфекции, а при удлинении
периода предварительного питания на больном растении эффективность
передачи увеличивается. Таким образом, хотя эти вирусы, по-видимому,
не-являются циркулирующими, они в некоторых отношениях отличаются
от типичных вирусов, передаваемых с помощью стилета.
Циркулирующие вирусы
При линьке тли ее хитиновый покров сбрасывается вместе со стиле-
тами, причем сбрасывается также выстилка переднего и заднего отделов
кишечника. Таким образом, вирусы, сохраняющиеся после линьки, должны
находиться в среднем отделе кишечника или в каком-либо другом участке
тела, насекомого. Если инфекционность сохраняется и после линьки, то
вирус относят к группе циркулирующих.
При передаче большинства циркулирующих вирусов тля приобретает
способность заражать здоровые растения только спустя определенное время
после получения вируса. Длительность латентного периода варьирует от не-
скольких часов до нескольких дней или даже недель.
При передаче вируса пожелтения жилок осота латентный период
в организме переносчика (Hyperomyzus lactucae L.) весьма длителен, причем
продолжительность его в значительной степени зависит от температуры
[472]. Наиболее короткий латентный период был зарегистрирован при 25 °C
(8 дней), самый длинный — при 5 °C (46 дней). В опытах, в которых насе-
комые заражали серию растений, у первых двух или трех зараженных расте-
ний отмечался более длительный инкубационный период (время от зараже-
ния до развития симптомов). На растениях той же серии, зараженных позже,
симптомы развивались быстрее; отсюда можно сделать вывод, что концен-
трация вируса, вводимого с помощью тли в растение, со временем увели-
чивается. Насекомые сохраняли способность передавать вирус через 52 дня
после удаления с больного растения.
Вирус пожелтения жилок осота имеет крупные бацилловидные частицы
(гл. V). Такие частицы были обнаружены в ядрах слюнных желез Н. lactucae
400
Глава XVI
(переносчика этого вируса) и в ядрах клеток зараженного растения [1426].
Этот вирус может быть последовательно передан путем инъекции гемолим-
фы от одной тли другой; с инфицированием, по-видимому, связано увели-
чение смертности тлей, наблюдавшееся в экспериментах [1722]. Этот вирус
передается тлей II. lactucae трансовариально; около 1% отродившихся
личинок способны заражать растения [1719]. Все приведенные выше данные
служат веским свидетельством в пользу того, что этот вирус размножается
в тле-переносчике.
Стаббс и Гроган [1691] показали, что вирус некротического пожелтения
салата-латука размножается в переносчике Hyperomyzus lactucae L. Недавно
с помощью методов электронной микроскопии было показано, что характер-
ные бацилловидиые частицы вируса (с внешней оболочкой или без нее) при-
сутствуют в мышцах, мозге, жировом теле, мицетомах, трахеях, эпидермисе,
слюнных железах и клетках кишечника насекомого-переносчика [1285].
Эти частицы не обнаружены в эмбрионах, развивающихся внутри инфици-
рованных насекомых. В некоторых клетках можно было наблюдать до 300
вирусных частиц. В то же время в окружающих клетках вирус часто не
обнаруживался. Такое распределение было бы невозможно, если бы вирус-
ные частицы приобретались механически с растительным соком.
Хотя тли, передающие циркулирующие вирусы, часто очень долго
сохраняют способность заражать растения, эффективность передачи может
с течением времени снижаться. Это хорошо прослеживается на примере
гороховой тли (Acyrthosiphon pisum Harris) и вируса деформирующей мозаики
гороха, который сохраняется в насекомом после линьки [1264].
Латентный период в случае вируса деформирующей мозаики гороха
различен для трех видов тлей-переносчиков; его длительность зависит от
вида, расы и стадии развития насекомого [356]. В случае наиболее эффектив-
ной (в смысле передачи вируса) расы М. persicae у тлей первых возрастов
минимальная длительность латентного периода составляет 7—8 ч, а время,
в течение которого у половины насекомых, находящихся в опыте, заканчи-
вается латентный период (LPSO), равно 14,4 ч. У взрослых насекомых той же
расы минимальный латентный период длится 26 ч, а ЬР50 составляет 60,3 ч.
Было показано, что у нимф каждого следующего возраста длина латентного
периода увеличивается. Чепмен и Бат [356] считают, что разница в латент-
ном периоде определяется тремя факторами: 1) более коротким расстоянием
у нимф первых возрастов между кишечником и слюнными железами; 2) более
высокой метаболической активностью у нимф первого возраста; 3) хотя
взрослые особи за единицу времени поглощают больше растительного мате-
риала, у нимф это количество за то же время будет относительно больше
(по отношению к массе тела) и, таким образом, они получают относительно
больше вируса.
Тли, у которых эффективность передачи снижается, могут, по крайней
мере частично, восстановить способность к передаче, если дать им возмож-
ность дополнительно питаться на больных растениях [1721]. Продолжи-
тельность периода, в течение которого тля может заражать растения, зависит
от той стадии развития, на которой тля находилась во время инфицирова-
ния, а не от длительности питания на больном растении. Это иллюстри-
руют графики, приведенные на фиг. 77.
Различные изоляты вируса деформирующей мозаики гороха могут
передаваться тлями в течение разных периодов времени [1718]. У изолятов,
дольше сохраняющихся в организме переносчика, снижение эффективности
передачи вируса связано с ослаблением интенсивности таких процессов,
как размножение и экскреция, что отражает, по-видимому, общее снижение
активности переносчиков с возрастом.
Взаимоотношения между вирусами растений и переносчиками 401
Фиг. 77. Влияние возраста гороховой тли в момент инфицирования на последующую
способность передавать вирус деформирующей мозаики гороха [1721].
Всех насекомых после питания па больных растениях ежедневно переносили на свежие тест-растения.
Сплошная линия обозначает процент передачи вируса нимфами в 12-часовом возрасте при инфици-
ровании в течение 3—8 ч. Пунктирная линия и точки обозначают процент передачи вируса взрослыми
8-дисвными насекомыми после питания на больном растениихвдтечение 24 ч.
Опыты, в которых тлей инфицировали путем введения сока растений,
пораженных вирусом деформирующей мозаики гороха, или гемолимфы насе-
комых, способных передавать этот вирус, дали весьма скудные результаты
11264]. Однако Ричардсон и Сильвестер [1425] обнаружили, что если инъе-
цировать неинфекционным особям выделения тлей (медвяная роса), питав-
шихся на больных растениях, то они становятся инфекционными и пере-
дают вирус с большой эффективностью. При питании тлей на больных расте-
ниях их выделения становились инфекционными примерно через 1,5 ч. При
питании па здоровых растениях инфекционность утрачивалась примерно
через трое суток. Частицы вируса деформирующей мозаики гороха были обна-
ружены па ультратонких срезах в цитоплазме и центральных вакуолях
листьев больных растений гороха. Сходные частицы были найдены в жиро-
вом теле тлей (фото 88), а также в полости кишечника [1570].
Поскольку ничего подобного не удается обнаружить в неинфекционных
тлях, можно предположить, что это и есть вирусные частицы. Все приве-
денные факты служат веским свидетельством в пользу того, что вирус дефор-
мирующей мозаики гороха действительно размножается в организме A. ptsum.
Вирус западной желтухи свеклы, который может сохраняться в пе-
реносчике {Муzus persicae) иа протяжении всей его жизни, образует харак-
терные включения в цитоплазме клеток кишечника [1458]. Однако одного
этого наблюдения недостаточно, чтобы сделать заключение о размножении
вируса в тлях. Питерс [1323] обнаружил два типа полиэдрических вирусо-
подобных частиц в тлях М. persicae, которые, как предполагалось, были
леинфекционны, и рму не удалось получить колонии тлей, не содержащих
этих частиц. Питание таких тлей на различных растениях-хозяевах не при-
водило к появлению на последних симптомов заболевания.
Определить истинный минимальный латентный период циркулирую-
щих вирусов в тлях очень трудно. Если вирусы циркулируют с той же ско-
ростью, что и неорганический фосфат, то этот период при 22—24 °C может
длиться около 5 ч (Клофт и Эрхард [1006] показали, что именно такое время
проходит между питанием тлей на материале, меченном: 32Р, и выделением
этого изотопа со слюной).
Многие циркулирующие вирусы не передаются от растения к растению
механически, поэтому отсутствует метод их определения с помощью расте-
ний-индикаторов. Однако Рохов [1433] обнаружил, что раствором вируса
желтой карликовости ячменя можно подкармливать тлей через мембраны:
26-0893
402
Глава XVI
это и послужило основой для создания подходящего метода. Мюллер и
Рохов [1242] описали более универсальный метод, при котором раствор,
содержащий вирус, вводится в насекомое путем инъекции. Macrosiphum
granarium (Kirby) и lihopalosiphum padi (L.) передают разные штаммы виру-
са желтой карликовости ячменя, если получают этот вирус, питаясь на
растениях. По данным Мюллера и Рохова, специфичность сохраняется
и тогда, когда эти штаммы вируса вводятся насекомым путем инъекций.
Имеется сообщение о двух видах тлей, у которых при питании па расте-
ниях, зараженных вирусом желтой карликовости ячменя, в течение 12 ч
или менее, способность передавать вирус достигала максимума примерно'
через 5 суток [1434].
Различные формы Rhopalosiphum fitchii (Sand) различаются по способ-
ности передавать вирус желтой карликовости ячменя [1294]. Например,
зимние формы передают вирус в отличие от осенних. Различные клопы одно-
го и того же вида тлей из разных географических зон могут отличаться друг
от друга по способности передавать тот или иной штамм циркулирующего
вируса. Так, один из клопов R. padi, обитающий в штате Канзас, легко
передает штамм вируса желтой карликовости ячменя, который с трудом
передается тлями Нью-Йоркского клона [1439]. Эта разница была наиболее
заметной в опытах, проводившихся при температуре 15—20 °C. При 30 °C
тли Нью-Йоркского клона, как выяснилось, способны передать вирус.
R. padi этих двух клонов имеют небольшие морфологические различия,
например в жилковании передних крыльев, однако это, вероятно, никак
не связано со способностью передавать вирус. Отдельные изоляты вируса
желтой карликовости ячменя, выделенные из зерновых культур и других
злаков в провинции Манитоба, передавались разными тлями с самой раз-
личной эффективностью [635]. Некоторые штаммы, выделенные в Англии,
передавались тлями Rhopalosiphum padi в отличие от других штаммов [1876].
По наблюдениям Рохова [1435], гораздо более сложная ситуация склады-
вается в том случае, когда тли питаются на растениях овса, зараженных
одновременно двумя штаммами вируса желтой мозаики ячменя; при этом
некоторые стороны специфической связи между штаммами вируса и пере-
носчиком изменяются. Еще не установлено, что в данном случае позволяет
тле получать и передавать штамм вируса, который она в обычных условиях
не переносит,— то ли присутствие в растении того штамма, переносчиком
которого она является, то ли возникновение в растениях при смешанном
заражении новых, пока не идентифицированных штаммов.
Используя метод подкармливания тлей через мембрану, Рохов и Бракке
[1438] выделили вирус желтой карликовости ячменя из растений овса. Им
также удалось выделить из тлей, питавшихся иа больных растениях, харак-
терные полиэдрические частицы (хотя и не совсем в чистом виде). Этот же
метод использовался для выделения вируса западной желтухи свеклы
[473].
Стегви и Понсеп [1675] установили, что тли могут становиться инфек-
ционными в результате инъецирования им гемолимфы из тлей, зараженных
вирусом скручивания листьев. Эти авторы имели возможность проводить
опыты по серийной передаче инфекции тлями, питающимися на растениях,
иммунных к этому вирусу. Эти опыты, в принципе сходные с опытами Блэка
на цикадках (стр. 405), свидетельствуют о том, что вирус скручивания
листьев действительно размножается в тле-переносчике. Однако эти резуль-
таты еще не подтверждены. Недавно Питерс и ван Лун [1325] смогли инфи-
цировать тлей путем подкормки через мембраны на растворах, приготов-
ленных из тлей или из растений, зараженных вирусом скручивания листьев.
Вирус скручивания листьев картофеля был выделен из инфекционных
особей М. persicae и частично охарактеризован. Частицы этого вируса диа-
Взаимоотношения между вирусами растений и переносчиками 403
метром около 23 им имеют форму, более или менее приближающуюся к гек-
сагональной [1324]. Сходные частицы были выделены из больных растений
[1016]. По-видимому, присутствие в тле частиц одного штамма вируса
скручивания листьев картофеля не исключает присутствия частиц другого
штамма. Харрисон [716] показал, что тли М. persicae, которые питались на
растениях, зараженных невирулентным штаммом и передавали его здоровым
растениям, были способны получать и передавать вирулентный штамм с той
же легкостью, что и тли, ие содержащие вируса.
Было обнаружено, что тли М. persicae различных клонов различаются
по способности передавать растениям Physalis floridiana и Datura stramonium
вирус скручивания листьев картофеля, введенный им путем инъекции [377].
Эти различия были приписаны неодинаковой способности тлей разных кло-
пов выживать после инъекций, а также нормально питаться на неподходя-
щих для них растениях.
Имеется несколько сообщений (к примеру [976]) о том, что иногда
вирус скручивания листьев картофеля может передаваться без латентного
периода (например, в течение часа после 30-минутпого питания иа больном
растении). Таким образом, возможно, что вирус скручивания листьев карто-
феля, а также, вероятно, некоторые другие циркулирующие вирусы пере-
даются двумя путями: прямым способом, подобно вирусам, передаваемым
с помощью стилета, и еще одним способом, когда передача вируса связана
с его размножением в переносчике.
Подводя итоги, можно сказать, что самые различные факты, такие, как
сохранение инфекционности после линьки, наличие латентного периода,
способность к заражению в течение длительного срока и присутствие вируса
в гемолимфе и клетках тела насекомого, свидетельствуют о том, что многие
циркулирующие вирусы размножаются в тлях-переиосчиках. В настоящее
время наиболее убедительные данные получены для вирусов некротического
пожелтения салата-латука, пожелтения жилок осота и скручивания листьев
картофеля. Остается, однако, точно установить факт размножения вируса
в переносчике. Для некоторых вирусов возможно получить биохимические
доказательства репликации вируса в организме тли; для этого можро было
бы инфицировать тлей, затем подкармливать их на здоровом растительном
материале, меченном 32Р, и попытаться выделить из них меченый вирус или
меченую двухцепочечпую вирусную РНК.
ЦИКАДКИ (JASSOIDEA)
Строение и жизненный цикл
Строение цикадки-переносчика Agallia constricta (van Duzee) изучено
довольно подробно [194, 631]. Здесь мы ограничимся несколькими заме-
чаниями о строении ее органов. На фиг. 78 дано схематичное изображение
главных органов головного и грудного отделов тела. Слюнные железы, играю-
щие важную ролг> в передаче вируса, состоят из главной четырехлопастной
железы и придаточной железы. Она содержит пять основных типов апипусов.
По обе стороны брюшка находится по мицетому; функпии этого обра-
зования неизвестны. Жировое тело, которое, возможно, выполняет запасаю-
щую функцию, окружает все органы головного и грудного отделов, а также
брюшка. Пищеварительный тракт состоит из трех основных отделов: перед-
него кишечника, среднего кишечника и заднего кишечника (фиг. 79).
В отличие от тлей цикадки имеют простой жизненный цикл: из яиц
выходят нимфы, которые после нескольких линек превращаются во взрос-
26*
Фиг. 78. Цикадка Agallia constrlcta (головной и грудной отделы в сагиттальном разрезе,
схема) [631].
7 _ головной мозг; 2 — глотка; з — слюнные железы; 4 — пищевод; 5 — аорта; в — клетки крови;
7 _ брюшной ганглий; з — заднегрудной ганглий; 9 — среднегрудной ганглий; ю — переднегрудной
ганглий; 11 — подглоточный ганглий; 72 — нижняя губа; 13 — верхняя губа; 14 — общий проток;
__слюнной насос; 1в — гипофаринкс; 17 — антеклипеус; 18 — эпифаринкс; 19 — слюнной проток;
20____всасывающий насос; 21 — расширяющие накачивающие мышцы; 22 — постклипеус.
Фиг. 79. Пищеварительная система A. constrida [631].
1 — пищевод; 2 — желудок; з — средняя кишка; 4 — трубка средней кишки; 5 — мальпигиевы со-
суды; 6 — средний отдел; 7 — прямая кишка; 8 — анальное отверстие; 9 — задний отдел; 10 — задняя
кишка; 11 — передний отдел; 12 — фильтрационная камера.
Взаимоотношения между вирусами растений и переносчиками 405
лых насекомых. В течение года может развиваться одно или несколько поко-
лений. Различные виды цикадок зимуют либо в стадии яйца, либо в стадии
взрослого насекомого, либо в стадии нимфы.
Взаимоотношения между вирусом и переносчиком
Первый вирус растений, о котором стало известно, что он размножается
в организме переносчика, передавался цикадкой. Несколько других деталь-
но изученных к настоящему времени вирусов также относятся к группе
пропагативных вирусов, т. е. размножаются в переносчике. Разумеется,
все они в то же время являются и циркулирующими вирусами. Однако извес-
тен один вирус, который, вероятно, передается цикадкой с помощью стилета,
а также вирус, который, по-видимому, только циркулирует, ио не размно-
жается в переносчике.
Вирус, предположительно передаваемый с помощью стилета
До недавнего времени считали, что все вирусы, передающиеся цикад-
ками или сходными насекомыми, относятся к группе циркулирующих или
к группе пропагативных вирусов (основные особенности этого типа переда-
чи изложены на стр. 388). Исключение составляет вирус тунгро (tungro),
поражающий рис. Этот вирус быстро теряется переносчиком — цикадкой
Nephotettix impicticeps Ishihara [1073]. Цикадки этого вида, пересаженные на
здоровые растения после кормления на больном растении, передавали вирус
без инкубационного периода в течение 1 ч. В течение пяти дней или менее
они полностью теряли инфекционность, которую вновь приобретали только
после подкормки на больных растениях. Способность передавать вирус утра-
чивалась также после линьки, но при подкармливании на источнике инфек-
ции она восстанавливалась вновь. Таким образом, описываемый вирус по
многим свойствам напоминает вирусы, переносимые тлями с помощью сти-
лета. Однако имеются и некоторые отличия. Например, цикадка не пере-
дает вирус после питания на больном растении в течение 1 мин, что, возмож-
но, просто отражает различия в особенностях питания между цикадками
и тлями.
Циркулирующий вирус
Вирус курчавости верхушки сахарной свеклы, по-видимому, цирку-
лирует в переносчике (Circulifer tenellus Baker), не размножаясь в нем [161,
163, 166].
Пропагативные вирусы
Данные о размножении в переносчике. В работе с цикадками-перенос-
чиками основное внимание уделялось вопросу о размножении вирусов в
насекомом. Хотя еще в 30-х годах были получены весьма убедительные дан-
ные, свидетельствующие о том, что такое размножение действительно про-
исходит, тем не менее идея о возможности заражения растительных и жи-
вотных тканей одним и тем же вирусом встретила сильное сопротивление.
К настоящему времени получены многочисленные данные, с несомненностью
свидетельствующие о том, что некоторые вирусы растений, передаваемые
цикадками, действительно размножаются в организме переносчиков.
Опыты по серийному заражению с помощью инъекций. Блэк и Вракке
[208] вводили экстракты цикадок Agallia constricta, инфицированных виру-
сом раневых опухолей клевера, здоровым цикадкам, которые культивиро-
406
Глава XVI
вались на иммунных к этому вирусу растениях люцерны; эти цикадки далее
питались на люцерне в течение двух недель, и их экстракт вновь вводился
здоровым насекомым. После 7 таких пассажей цикадки все еще были инфек-
ционными и, судя по способности заражать малиновый клевер, содержали
вирус примерно в той же концентрации, что и насекомые первой группы.
Поскольку величина разведения исходного вируса в этом опыте должна
была бы составить 10"18, ясно, что имело место размножение его в насеко-
мом. По-видимому, эта работа служит первым определенным доказательст-
вом того, что вирус может реплицироваться в насекомом, которое его пе-
редает.
Трансовариалъная передача и опыты по разведению. Фукуси [576] обна-
ружил, что вирус карликовости риса передается цикадкой Nephotetlix api-
calis var. cincticeps (Uhl) через яйца насекомого. Такого рода передача имеет
место, когда вирус содержит самка; если же инфекционен только самец,
передача невозможна. Фукуси [577] показал также, что этот вирус может
бзз дополнительного инфицирования передаваться через яйца на протяже-
нии 7 поколений, ведущих свое происхождение от одной-единственпой инфи-
цированной самки. Фукуси установил, что длительность инкубационного
периода в организме переносчика весьма значительна (в среднем 30—
45 дней).
Блэк [204] провел эксперимент по серийному заражению, длившийся
5 лет; его результаты с несомненностью доказывают, что агент, вызываю-
щий скручивание листьев клевера, размножается в переносчике Agalliopsis
novella (Say.). Вероятно, это заболевание вызывается микоплазмоподобпым
организмом. Вирусные частицы не описаны, и на некоторых растениях это
заболевание проявляется по типу желтухи астр (Блэк, личное сообщение).
G момента инфицирования самки на больном растении до откладки
инфекционных яиц должно пройти какое-то определенное время, иначе
вирус не сможет развиваться. Например, вирус раневых опухолей не раз-
вивается в яйцах, отложенных цикадкой A. constricta раньше чем через
14—21 день после инфицирования самки [1611]. Инкубационный период
продолжается некоторое время после отрождеиия нимф из инфекционных
яиц. У вируса раневых опухолей клевера этот период от отрождеиия нимф
до того времени, когда они становятся способными заражать растения,
длится 6—9 дней [1611].
Эффективность передачи вируса через яйцо широко варьирует у раз-
ных вирусов и разных переносчиков. Блэк [205] нашел, что эта величина
при передаче вируса желтой карликовости картофеля цикадкой А. constricta
составляет 0,8%. Возможно, эффективность трансовариальной передачи
вируса находится под генетическим контролем (стр. 410).
Определение вирусного антигена и вируса в насекомом. При заражении
вирусом раневых опухолей в больных растениях и в инфицированных цикад-
ках были выявлены два вирусоспецифичных антигена — сам вирус и раство-
римый антиген, который гораздо меньше вируса по размеру и который легко
отделить центрифугированием [209]. Виткомб и Блэк [1900] обнаружили
нарастание количества растворимого антигена в теле A. constricta при после-
довательных инъекциях большими дозами вируса раневых опухолей. Кривая
увеличения концентрации растворимого антигена резко шла вверх и выхо-
дила на плато через 8—10 сут (фиг. 80). В то же время относительное число
насекомых, переносящих вирус, возрастало гораздо медленнее и через неко-
торое время снова снижалось.
Рэдди и Блэк [1411] определяли увеличение инфекционности у A. const-
ricta при передаче вируса раневых опухолей после подкармливания на боль-
ном растении в течение одних суток. С 6-го по 27-й день концентрация вируса
быстро нарастала, а затем медленно снижалась.
Взаимоотношения между вирусами растений и переносчиками 407
Фиг. 80. Размножение вируса раневых опухолей в цикадке-переносчике Л. constricta
[1900].
Нарастание количества вирусного растворимого антигена (I) и число насекомых (в %), передающих
заболевание после инъекции вируса нимфам последнего возраста (II).
Подсчет частиц с помощью электронного микроскопа. Гамец и Блэк [603]
использовали метод подсчета частиц для прямой оценки количества вируса
раневых опухолей в переносчике A. constricta. Они установили, что мини-
мальная инфекционная доза при инъекциях составляет Ю2»° вирусных
частиц. Число вирусных частиц, экстрагируемых из одной цикадки через
различные промежутки времени после инокуляции, составило 10fi>0 через
6 дней, 10в>20 через 30 дней и 108>7 через 40 дней. Таким образом, кривая
нарастания титра вируса при этом способе оценки полностью совпадает
с кривой, полученной при измерении инфекционности (фиг. 80).
Локализация вируса внутри насекомого. Результаты опытов, описанных
в предыдущем разделе, не оставляют никаких сомнений в том, что эти виру-
сы размножаются в цикадках-переносчиках. Для размножения вируса
необходима тесная связь между вирусом, с одной стороны, и клетками и
органами насекомого — с другой. Для некоторых вирусов наличие такой
связи выявлено с помощью электронного микроскопа, методом флуоресци-
рующих антител и измерениями количества вируса в различных органах
ипфмцироваппых насекомых.
Электронно-микроскопические исследования. Вирус карликовости риса
имеет частицы приблизительно сферической формы диаметром около 70 нм;
диаметр внутренней полости составляет около 50 нм (стр. 101). Эти частицы
идентифицируются па ультратонких срезах очень легко. Фукуси и др. [580]
обнаружили такие частицы в инфекционных Nephotettix cincticeps Uhl.
(в клетках жирового тела, кишечного эпителия, слюнных желез и мальпи-
гиевых сосудов). Схбдные частицы обнаруживаются в хлоротичных участках
листьев больных растений риса.
В зараженных растениях и в насекомых-переносчиках часто можно
наблюдать вирусные частицы в виде скоплений кристаллов. Как и следовало
ожидать, частицы вирусов, передаваемых трапсовариальио, обнаруживаются
в яйцевой трубке инфицированных цикадок [579].
Электронно-микроскопические исследования цикадок A. constricta, инфи-
цированных вирусом раневых опухолей, показали, что этот вирус присут-
ствует во многих тканях насекомого, в том числе в мышечных клетках,
жировом теле, мальпигиевых сосудах, мицетоме, трахеях, эпидермисе
и слюнных железах [1564, 1565, 1567, 1569]. Наибольшие скопления, часто
в виде микрокристаллов, отмечаются в цитоплазме клеток жирового тела;
408
Глава XVI
поэтому Сиката и Мараморош считают, что размножение вируса происхо-
дит, вероятнее всего, в жировом теле насекомого. Однако опыты по выявле-
нию в насекомом вирусного антигена показали, что местом первичного раз-
множения вируса после инфицирования при питании является кишечник
(см. следующий раздел). Небольшое количество вируса, обычно в виде отдель-
ных частиц, обнаруживается в слюнной железе.
Сиката и Мараморош [1568] вводили вирус раневых опухолей в брюшко
нимф A. constricta и наблюдали за появлением вируса с помощью электрон-
ного микроскопа. Они обнаружили, что помимо жирового тела вирус через
некоторое время накапливается также в эпидермисе, мышцах и трахеях.
После таких инъекций в брюшко вирус в клетках кишечника не обнару-
живался.
Хируми и др. [794] провели детальное изучение нервной системы насе-
комых, инфицированных вирусом раневых опухолей; они установили, что
вирусные частицы широко распространяются в теле переносчика, наиболее
часто встречаясь в цитоплазме клеток ганглиев и реже в цитоплазме клеток,
нейроглии. Обнаруживались одиночные вирусные частицы, агрегаты и труб-
чатые скопления. Иногда вирусные частицы можно было видеть в клетках
периневрия, аксонах, трахеобластах и латеральных нервах.
Гранадос и др. [669] описали три морфологически хорошо различимых
типа кровяных клеток в гемолимфе A. constricta — плазматоциты, сфери-
ческие клетки и гранулярные гемоциты. У инфицированных цикадок агре-
гаты частиц вируса раневых опухолей были найдены в цитоплазме плазма-
тоцитов (фото 89) и сферических клеток, что свидетельствует о размноже-
нии вируса в этих клетках. В гранулярных гемоцитах вирусные частицы не
обнаружены.
Вирус раневых опухолей и вирус карликовости риса очень сходны по'
своему строению (гл. V); их распределение в переносчике, в котором они
размножаются, по-видимому, примерно одинаково, причем оба локализо-
ваны в цитоплазме зараженных клеток.
Герольд и Мунц [767, 769] обнаружили в клетках кишечника и слюнных
желез Peregrinus maidis (Ashm) вирусоподобные частицы диаметром 50—
60 нм. Эти образования, вероятно представляющие собой вирусные частицы,
могут быть переданы путем инъекции цикадкам, не содержащим вирус. После
контакта с цикадками Р. maidis на самых различных растениях, которые
были испытаны, внешние признаки заболевания не проявлялись. По-види-
мому, в этой цикадке вирус находится в латентной форме. Джерола и др. [612]
нашли сферические вирусоподобные частицы в растениях кукурузы, зара-
женных вирусом резкой карликовости, а также в клетках жирового тела
Laodephax striatellus Fallen. Данные, полученные Ли [1060], показывают,
что к идентификации вирусных частиц следует относиться с большой осто-
рожностью, если она основана только на результатах исследования
ультратонких срезов. Ли обнаружил вирусоподобные частицы в слюн-
ных железах цикадок, которые, по всей видимости, были свободны от
вируса.
Локализация с использованием специфических антител. При изучении
распределения вирусного антигена в организме насекомого-переносчика
очень удобно использовать метод флуоресцирующих антител [1607, 1610,
1612]. Синха [1603] использовал этот метод, для того чтобы обнаружить-
появление антигена вируса раневых опухолей в нимфах A. constricta после
суточного питания на растениях малинового клевера, зараженных этим виру-
сом. У некоторых особей антиген определялся на 4-й день в фильтрацион-
ной камере кишечника. Между 4-м и 12-м днями число особей, у которых
антиген обнаруживался в этом отделе, возрастало, и антиген появлялся
в соседних отделах кишечника. В других органах антиген не удавалось
Взаимоотношения между вирусами растений и переносчиками 400'
выявить ранее чем через 12 дней. На 12-е сутки антиген можно было обнару-
жить в гемолимфе, на 14-е — в жировом теле, мозге и мальпигиевых сосу-
дах и на 17-е — в слюнных железах. Таким образом, фильтрационная каме-
ра — первичный участок заражения этим вирусом. Отсюда вирус распро-
страняется но другим органам, вероятно с гемолимфой. О том, что вирус
активно размножается в этих органах, свидетельствует тот факт, что вирус-
ный антиген не только адсорбируется на поверхности клеток, но и обнару-
живается внутри них.
Пробы на инфекционность. Синха [1G04] проверял распределение виру-
са желтой карликовости картофеля в теле переносчика Л. constricta, вводя
экстракты различных органов инфекционных насекомых группам цикадок,
свободных от вируса; далее определялась способность этих последних зара-
жать растения. У насекомых, которые были инфицированы в течение 4 не-
дель, вирус обнаруживался в гемолимфе, кишечнике, мозге, жировом теле,
мальпигиевых сосудах, слюнных железах и мицетомах. В яичниках и семен-
никах содержалось очень небольшое количество вируса.
Факторы, влияющие па размножение и передачу. Вирус может размно-
жаться в цикадках, питающихся па иммунном растении-хозяине. Вирус
может сохраняться в перезимовавших яйцах, которые будут служить источ-
ником инфекции для яровых культур и в отсутствие больных растений.
Следовательно, сохранение вируса в насекомом и трапсовариальпая пере-
дача, а также факторы, влияющие на ее эффективность, имеют большое
экономическое значение.
Возраст насекомого-переносчика, в котором происходит инфицирование.
У некоторых цикадок более эффективными переносчиками являются ним-
фы, а не взрослые насекомые, а у этих последних эффективность передачи
падает с возрастом. Так, Синха [1602], используя для выявления вирусного
антигена метод флуоресцирующих антител, изучал способность отдельных
особей A. constricta в разном возрасте инфицироваться вирусом раневых
опухолей после двухнедельного питания иа больных растениях клевера.
Насекомые проверялись на инфекционность после питания в течение 4—
5 иед на здоровых растениях. Из 60 насекомых вирусный антиген содер-
жался у 21 нимфы, у 9 взрослых особей через 1—7 дней после окрыления,
у 6 взрослых особей через 2—3 иед после окрыления и у 3 взрослых особей
через 3—4 нед после окрыления. Синха обнаружил, что если перед питанием
на больных растениях брюшко взрослых насекомых проколоть тонкой иглой,
то число зараженных особей возрастает до уровня, характерного для нимф.
Таким образом, возможно, что с возрастом стенка кишечника становится
барьером для проникновения вируса и последующей передачи. Что проис-
ходит при проколах брюшка, неясно — либо вирус просто проникает в гемо-
лимфу через отверстие в кишечной стенке, либо здесь действует какой-то
более тонкий механизм. Например, при этом может возникать раневая реак-
ция, при которой в стенке кишечника иа месте прокола появляются клетки,
проницаемые для вируса.
Синха [1605] проследил за появлением антигена вируса раневых опу-
холей в нимфах и взрослых особях A. constricta после питания на больных
растениях в течение суток. Через 32 дня после инфицирования антиген
обнаруживался в гемолимфе и слюнных железах у 50% нимф и лишь у 5%
взрослых насекомых. У остальных насекомых распространение антигена
было ограничено первичным участком заражения, в фильтрационной камере
кишечника, причем локализация антигена в кишечпике взрослых особей
была более ограниченной, чем у иимф. По-видимому, с возрастом кишечник
у насекомого становится более устойчивым к инфекционному началу, и вирус,
присутствующий в фильтрационной камере кишечника у многих взрослых
насекомых, не способен проникать в полость тела.
410
Глава XVI
Изменения, происходящие после инфицирования. Слайхыоз [1616] нашел,
что цикадка Endria inimica (Say) через некоторое время утрачивает способ-
ность передавать вирус северо-американской полосатой мозаики пшеницы.
Некоторые особи передавали вирус прерывисто и теряли инфекциоппость
через 72 дня. Однако данные Синха и Чайковски [16091, полученные в серий-
ных опытах с применением инъекций, свидетельствуют о том, что этот вирус,
безусловно, размножается в насекомом-переносчике.
Температура. Используя метод флуоресцирующих антител для анализа
распределения вирусного антигена, Сипха [1605] изучал действие повышен-
ных температур на распространение вируса раневых опухолей в цикадке
A. constricta. Группы лимф питались на больном растении в течение суток
при 27 °C и затем в течение последующих трех суток выдерживались также
при 27 °C, для того чтобы дать возможность вирусной инфекции проник-
нуть в фильтрационную камеру. В это время вирусный антиген обнаружи-
вался в фильтрационной камере. Одну группу продолжали инкубировать
при 27 °C, а другую перевели в термостат с температурой 36 °C. Такая высо-
кая температура препятствовала проникновению вируса из фильтрацион-
ной камеры в другие отделы кишечника, гемолимфу и слюнные железы.
Через 6 дней антиген исчезал из фильтрационной камеры у 60% насекомых.
Генетические вариации у цикадок. Нагараи и Блэк [1257] проводили
отбор А. constricta в течение 6 поколений и выделили несколько разных рас,
из которых некоторые были способны к трансовариальиой передаче вируса
раневых опухолей, тогда как другие не обладали этой способностью. Синха
и Шелли [1611] обнаружили, что расы, передающие вирус трансовариальпо,
эффективно инфицируют растения в отличие от рас, неспособных к трансо-
вариалыюй передаче. Различные расы A. constricta, выведенные Нагараи и
Блэком, различались также по способности инфицироваться вирусом жел-
той карликовости картофеля и передавать его. Эта способность не коррели-
ровала со способностью передавать вирус трансовариальпо, как в случае
вируса раневых опухолей.
Изменение свойств вируса. Длительное культивирование вируса в расте-
нии без передачи цикадками может привести к тому, что он уже не переда-
ется насекомыми. Так, Блэк [206] обнаружил, что один изолят вируса жел-
той карликовости картофеля, который поддерживался в N. rustica в течение
16,5 лет, утратил способность передаваться цикадками.
Патогенность для насекомого. Точные данные о том, что инфицирование
вирусом растений вызывает настоящее заболевание у цикадок, в которых
этот вирус размножается, отсутствуют. (Микоплазмоподобные организмы,
которые, по-видимому, являются возбудителями желтухи астр, вызывают
заболевание у пасекомых-перепосчиков.) Сухов [1701] описал появление
многочисленных игольчатых кристаллов в кишечнике Deltocephalus stri-
ata s L., инфицированных вирусом мозаики озимой пшеницы, когда pH
ткани доводили до 4,0. Значение этого факта ие установлено.
Как упоминалось выше, частицы, характерные для вируса раневых
опухолей, широко распространяются по нервной системе у A. constricta.
Присутствие вируса ведет к дегенерации ганглиев. Однако в дальнейшем
у инфицированных цикадок нс наблюдается никаких макроскопических
признаков заболевания или нарушений в поведении [794].
Механизм репликации вируса в насекомом. Исследования, описанные
выше, позволили узнать, в каких органах насекомого предположительно
происходит репликация некоторых вирусов. Ткани насекомого, так же как
и растительная ткань, могут поддерживать размножение вируса. Гамец и
Блэк [602] путем подсчета числа вирусных частиц определили, что макси-
мальная концентрация вируса раневых опухолей в корневых опухолях расте-
ний донника примерно та же (14,2 -1011 частиц/г), что и в цикадках-пере-
Взаимоотношения между вирусами растений и переносчиками 411
носчиках (14,0 -1011 частиц/г). До сих пор почти ничего пе известно о том.
как на самом деле происходит репликация вирусов в клетках насекомого.
Исследования, проведенные с помощью электронного микроскопа, показали,
что вирусы раневых опухолей и карликовости риса накапливаются только
в цитоплазме, и, возможно, именно здесь происходит их синтез. Реовиру-
сы — сходные с ними по структуре вирусы, заражающие клетки млекопита-
ющих, — синтезируются в цитоплазме [1422]. Однако реовирусы и вирус
раневых опухолей, по-видимому, серологически пе родственны друг другу
[605]. Можно предполагать, что репликация вирусной РНК идет иа двух-
цепочечпой структуре и что вирусный белок синтезируется скорее всего с
помощью аппарата рибосом и транспортных РНК насекомого; однако экспе-
риментальные данные, касающиеся этой и связанных с пей проблем, отсут-
ствуют.
Чу и др. [374], используя метод флуоресцирующих антител, показали,
что в культуре клеток Agallia constricta антиген вируса желтой карлико-
вости картофеля накапливается в ядрах вскоре после заражения. Напротив,
антиген вируса раневых опухолей накапливается в цитоплазме (цветная
вклейка 2).
Заражение вирусом раневых опухолей эпителиальных клеток насеко-
мого в культуре [375] может явиться важным шагом па пути использования
методов молекулярной биологии при решении всех этих проблем. Однако
для проведения подобных опытов пока доступны лишь небольшие количества
клеток.
Клетки в культуре чрезвычайно восприимчивы к заражению. Гамец
и Блэк [602] определили, что при инъекции цикадкам минимальная инфек-
ционная доза вируса раневых опухолей составляет примерно 400 вирусных
частиц. Минимальная инфекционная доза на клетку при заражении моно-
слоя также составляет около 400 частиц. Минимальная концентрация вируса
в зараженной жидкой культуре клеток была около 10е частиц/мл [604].
К этой величине также близка минимальная эффективная концентрация
вируса в цикадках после инъекции. Чу и Блэк [371] разработали методику
оценки инфекционности с помощью флуоресцирующих антител в работе
с культурой клеток A. constricta, зараженных вирусом раневых опухолей.
Максимальная адсорбция вируса клетками наблюдалась через 2 ч при 30 °C.
Специфическая флуоресценция антител впервые была отмечена в некоторых
клетках после 12 ч. Культура клеток цикадки Aceratagallia sanguinolenta
(AS), пе являющейся переносчиком, также была восприимчива к зараже-
нию вирусом раневых опухолей, хотя и в меньшей степени. Эта работа откры-
вает возможности для разработки такого же быстрого, чувствительного
и точного метода определения инфекционности некоторых вирусов растений,
как и те, что уже существуют для вирусов животных.
С точки зрения эволюции вирусов было бы интересно выяснить, исполь-
зуют ли вирусы, способные размножаться и в животном и в растении, оди-
наковые наборы вирусоспецифичных белков в клетках таких типов. Воз-
можно, что генетический материал этих вирусов содержит информацию,
которая используется только одним из этих двух хозяев. Известно, что
большинство вирусов, способных реплицироваться в насекомых, имеют
более крупные частицы по сравнению с вирусами, передаваемыми стилетом,
или вирусами, для которых переносчики не известны (впрочем, известны
и исключения из этого правила, папример вирус полосатой мозаики пше-
ницы [1541]).
Известны случаи, когда вирусы теряют способность передаваться насе-
комыми. Это справедливо, папример, для вируса желтой карликовости кар-
тофеля, который в течение многих лет пассировался в растениях с помощью
прививок [206]. Мы можем лишь предполагать, что при длительном пребы-
412
Глава XVI
вании вируса только в растительной ткани возникает мутация в том участке
молекулы нуклеиновой кислоты, который определяет функции вируса в на-
секомом-переносчике, причем естественно, что в растении-хозяине эти мута-
ции не испытывают давления отбора. В результате могли бы возникать куль-
туры вируса, не размножающиеся в специфическом переносчике. Это пред-
положение можно проверить иа вирусах, передаваемых механическим путем,
используя мутанты, полученные действием азотистой кислоты. Можно,
было бы рассчитывать па появление некоторого числа мутантов, способных
размножаться либо только в растении-хозяине, либо только в насекомом.
ДРУГИЕ ГРУППЫ HOMOPTERA
Горбатки (Membracoidea)
Показано, что Micrutalis sp. передает псевдоскручивапие верхушки
томатов [1589, 1591]. Однако позднее было установлено, что возбудителем,
этого заболевания является не вирус, а микоплазмоподобпый организм.
Светоноски (Fulgoroidea),
Oliarus atkinsoni (Myers) является переносчиком пожелтения листьев
новозеландского льна (Phormiiirn. tenax) [231]. Этот вид эндемичен для Новой
Зеландии и питается только на новозеландском льне. О взаимоотношениях
между возбудителем заболевания и переносчиком мало что известно. Воз-
можно, это заболевание вызывается микоплазмоподобным организмом, а не
вирусом; недавно мы обнаружили эти организмы во флоэме больных расте-
ний и в насекомых-переносчиках [1802].
Псиллиды (Chermoidea)
Один из представителей этого семейства, грушевая медяница, Psylla
pyricola (Foerster), известна как переносчик вируса вырождения груши [869];
о взаимоотношениях между возбудителем и переносчиком никаких данных
не имеется, да и вопрос о вирусной природе этого заболевания остается
открытым.
Белокрылки (Aleyrodoidea)
Белокрылки известны как переносчики не менее 8 заболеваний, глав-
ным образом поражающих тропические растения. О вирусах, передаваемых
белокрылками, известно очень мало, поскольку большинство из них с трудом
передается механическим способом. Известно, что вирус мозаики абутилона
имеет сферические частицы, о морфологии же остальных возбудителей:
никаких сведений не имеется, и не исключено, что некоторые из них явля-
ются не вирусами, а микоплазмоподобными организмами. Из переносчиков
лучше других изучена Bemisia tabaci (Gennadius), которая передает многие
заболевания. Личинки первого возраста подвижны (в отличие от личинок
других возрастов), но передвигаются лишь на небольшие расстояния. Взрос-
лая форма крылатая. В течение года может развиваться большое число-
поколений. Нимфы В. tabaci питаются на сфлоэме [1345].
В Индии белокрылки являются чрезвычайно важной группой перенос-
чиков. В. tabaci передает вирус курчавости листьев табака, вирус желтой
сетчатости табака и некоторые другие. Варма [1839] показал, что особи этого-
вида могут содержать в себе и передавать одновременно два разных вируса.
Взаимоотношения между вирусами растений и переносчиками 413
Орландо и Зильбершмидт [1287] установили, что для инфицирования В. ta-
baci вирусом инфекционного хлороза мальвоцветпых насекомому достаточно
питаться на больном растении в течение 30 мин. Вирусом мозаики эуфорбии
В. tabaci инфицируется через 30 мин или более (а не за 5—10 мин) [410].
Инкубационный период у этого вируса длится 4—48 ч (после питания на
больных растениях). Часто насекомые сохраняют способность передавать
его на протяжении всей жизни. Самки заражают растения примерно вдвое
эффективнее, чем самцы. Инфицироваться вирусом и передавать его спо-
собны как нимфы, так и взрослые насекомые.
Данные о возможности трапсовариальной передачи вирусов у бело-
крылой или о размножении вирусов в этих насекомых отсутствуют. На осно-
вании имеющихся отрывочных сведений можно лишь предположить, что
в данном случае взаимоотношения вируса с переносчиком очень близки
к тому, что наблюдается для некоторых циркулирующих вирусов, передаю-
щихся тлями.
Коэн и Харпац [393] обнаружили, что после питания В. tabaci в тече-
ние 1—2 дней на растениях Datura stramonium L., зараженных вирусом
желтого скручивания листьев томатов, происходит постепенное снижение
(в течение последующих 10—12 дней) способности насекомых заражать
здоровые растения. Эту утрату способности к заражению пе удавалось
предотвратить повторной подкормкой насекомых па больных растениях.
Однако насекомые, полностью утратившие способность заражать растения,
могут вновь приобрести ее при повторном питании на больном растении.
Вирус желтого скручивания листьев томатов не передается механически.
Белокрылки не инфицируются ни при подкормке через мембрану экстрак-
тами больных растений или экстрактами инфекционных насекомых, ни
после инъекций этих экстрактов [392]. При питании экстрактами насекомых,
находившихся в течение двух дней на больных растениях, способность
В. tabaci получать вирус от больных растений и передавать его снижалась;
этот факт свидетельствует о том, что в инфицированных насекомых, воз-
можно, содержится какой-то фактор, ингибирующий передачу вируса.
Кокциды (червецы и щитовки, Coecoidea)
Эти насекомые гораздо менее подвижны на растении, чем тли и цикадки;
поэтому как переносчики вирусов они сравнительно малоэффективны. С од-
ного растения на другое червецы и щитовки переходят только в том случае,
если растения так или иначе соприкасаются. Ползающие нимфы передви-
гаются быстрее, чем взрослые насекомые. Кокциды могут переноситься
с одного растения на другое муравьями. Иногда они переносятся на довольно
большие расстояния ветром [1766].
Установлено, что кокциды являются переносчиками некоторых вирусов,
поражающих тропические растения. Наиболее важное экономическое значе-
ние имеет группа вирусов деформации побегов дерева какао. По крайней
мере один из этих вирусов передается механическим путем, хотя и с низкой
эффективностью [297]. Вирусы группы деформации побегов дерева какао
передаются несколькими переносчиками. Например, Pseudococcus njalensis
(Laing) и Ps. citri (Risso) способны передавать большинство вирусов этой
группы. Ps. longispimes (Т. Т.) передает только некоторые из них, a Ferrisia
virgata (Ck. 11) — остальные [1350].
Эффективность передачи инфекции Р. njalensis возрастает с увеличением
продолжительности питания на растениях примерно до 50 мин. В питаю-
щемся насекомом вирус быстро исчезает, однако в насекомых, голодавших
после получения вируса, он сохраняется до 36 ч [1352]. Голодание перед
инфицированием может увеличивать эффективность передачи, если насе-
414
Глава XVI
комые питаются на больном растении меньше 10 мин. Кокциды питаются
на флоэме. Стилеты проникают в клетки коры и минуют склеренхиму, про-
ходя через сердцевинные лучи [493].
Как явствует из сказанного, взаимоотношения между вирусами дефор-
мации побегов дерева какао и кокцидами имеют некоторое сходство с тем,
что наблюдается для вирусов, передаваемых с помощью стилета, и их пере-
носчиков-тлей. Возможно, кокциды также переносят вирус на стилетах.
У насекомых некоторых видов имеются различные расы, из которых одни
являются переносчиками вируса, другие же этой способностью не обла-
дают [1350].
Долгое время считалось, что увядание ананаса — заболевание, встре-
чающееся на Гавайских островах и в других местах, вызывается токсином
насекомого. Позже было обнаружено, что его возбудителем является вирус,
который передается Dysmicoccus sp. [328].
ЛИГЕИДЫ (HETEROPTERA)
Установлено, что два представителя рода Nysius передают мозаику
Centrosema', ее возбудитель — вирус, заражающий тропические бобовые
растения [1834]. После пребывания на больных растениях в течение 2 ч
эти насекомые способны передавать вирус в течение 24 ч. Вирус передается
механически, но очень нестабилен в растительных экстрактах. Детали взаи-
моотношений с переносчиком не исследованы. По-видимому, этот вирус
передается также двумя видами тлей (с помощью стилета), однако этот факт
требует проверки в опытах с использованием чистых изолятов вируса,
в которых следует свести к минимуму опасность случайных заражений.
ГРЫЗУЩИЕ НАСЕКОМЫЕ
Вирусы, передаваемые тлями с помощью стилета, переносятся в опре-
деленном смысле механически, но специфичность взаимосвязи между тлями,
вирусами и штаммами вирусов показывает, что передача с помощью стилета
представляет собой явление более сложное, чем пассивный перенос вирусов
при простой механической инокуляции. Относительно передачи вирусов
тлями имеется один неясный вопрос: совершенно непонятно, почему такие
вирусы, как ВТМ, Х-вирус картофеля и вирус желтой мозаики турнепса,
не передаются этими насекомыми, несмотря на то что они сравнительно
стабильны, накапливаются в растениях в высокой концентрации и легко
передаются путем механической инокуляции.
Такие вирусы могут передаваться чисто механическим способом насе-
комыми с грызущим ротовым аппаратом.
Насекомые, передающие вирусы механическим путем, известны в сле-
дующих отрядах: Orthoptera, Dermaptera, Coleoptera, Lepidoptera (личинки)
и Diptera (также личинки). Для некоторых из этих вирусов, например для
ВТМ, распространение благодаря механической передаче насекомыми имеет,
вероятно, небольшое значение, для других же, например для ВЖМТ,
передача жуками является основным способом распространения инфек-
ции.
Ранние сообщения о том, что ВТМ передается с небольшой эффективно-
стью тлями и кокцидами, были опровергнуты [1290]. Было обнаружено, что
при смачивании стилетов тлей препаратами ВТМ или РНК ВТМ вирус также
не передается. ВТМ может быть и поглощен тлями и другими сосущими насе-
комыми. Кикумото и Матсуи [969] с помощью электронного микроскопа обна-
Взаимоотношения между вирусами растений и переносчиками 415
ружили частицы ВТМ и среднем желудке тли Myzus persicae. Используя для
обнаружения вируса тот же метод, Матсуи и др. [1165] показали, что М. persicae
может получать ВТМ, питаясь на больных растениях табака, и переносит
этот вирус в каплю дистиллированной воды, если получает его при подкормке
через полипропиленовую мембрану. Однако вирус, перенесенный в дистил-
лированную воду, оказался неинфекциопным. В сходных экспериментах
Пайрол [1339, 1340] в течение 30—40 с подкармливал через мембрану 175 тлей
М. persicae раствором очищенного препарата ВТМ (12,5 мг/мл), а затем в то-
чение такого же времени позволял им поглощать дистиллированную воду.
После этого методом подсчета местных некрозов определялась иифекцион-
пость дистиллированной воды. Вирус был выявлен в небольших, по стати-
стически значимых количествах в 12 из 175 изученных случаев, использован-
ных в опыте. Неясно, имеют* ли эти результаты отношение к условиям есте-
ственного питания насекомых па растениях. Концентрация вируса в растворе
была в 5 раз выше концентрации вируса в сильно зараженном листе; кроме
того, возможно, что очищенный вирус в силу каких-то особенностей своего
физического состояния лучше удерживается стилетами тлей, чем вирус, погло-
щаемый из клеток. Тли, подкармливаемые через мембрану РНК ВТМ, неспо-
собны передавать вирус [1341]. Орлоб [1290] обнаружил, что инфекционный
вирус табачной мозаики, нанесенный на обнаженные стилеты М. persicae,
удается обнаружить до того, как образуется слюнной чехол, но не после
этого.
Высказывались предположения, что вещество, присутствующее в слюне
или образующееся при смешивании слюны и сока растения, инактивирует
ВТМ, что участки листа, прокалываемые тлями, невосприимчивы к ВТМ,
что потенциально восприимчивых участков достигает недостаточное количе-
ство вируса. Вопрос о правильности этих предположений остается откры-
тым. Тикл и Сильвестер [1755] обрызгивали листья N. glutinosa концентри-
рованным раствором очищенного ВТМ, давая ему высохнуть па поверхности
листа. Питаясь на таких листьях, М. persicae индуцировали типичные мест-
ные некрозы, характерные для ВТМ, хотя и с очень низкой частотой. Про-
ведя серию тщательно контролируемых экспериментов, Лойек и Орлоб
[1095] показали, что М. persicae может получать ВТМ из листьев, покрытых
препаратом вируса, и вводить его в здоровые листья с помощью стилетов.
Эти опыты свидетельствуют о том, что стилеты М. persicae вполне могут
переносить ВТМ и притом в восприимчивые к вирусу участки, однако этот
процесс очень неэффективен.
Чисто механическим путем ВТМ может передаваться па челюстях
Melanoplus existentialis [I860] и Epitrix cucumeris (Harr) [1290]. Смит [1629]
также обнаружил, что ВТМ может переноситься иа лапках прямокрылых.
На листьях N. glutinosa местные некрозы появляются па тех участках поверх-
ности листа, которых касаются лапки насекомого. ВТМ может передаваться
(в течение ограниченного промежутка времени) на частях ротового аппарата
(по не па конечностях) двумя видами жуков (Tettigonia viridissima и Т. can-
tans) и гусеницами Barathra brassicae [1846]. Как и ВТМ, вирус желтой мозаики
турнепса может поглощаться тлями, хотя и не передается ими. Хатчисон
и Мэтьюз [849] подкармливали Hyadaphis brassicae (L.) очищенным препара-
том ВЖМТ, меченного как по белку, так и по РНК, и показали, что вирус
попадает в кишечник насекомого. Значительное количество явно интактного
вируса, способного реагировать с антисывороткой к ВЖМТ, сохранялось
в кишечнике насекомого в течение нескольких дней. В экстрактах насекомых
обнаружены ингибиторы инфекционности вируса [1628]. Хатчисон [848]
обнаружил в экстрактах Н. brassicae какой-то агент (возможно, белок),
способный осаждать ВЖМТ из раствора. Однако весьма маловероятно, что
такие ингибиторы ответственны за неспособность насекомого передавать
416
Глава X VI
вирус. В естественных условиях вирус желтой мозаики турнепса передается
несколькими видами крестоцветных блошек (Phyllotreta sp.) [1157]. Кроме
того, его могут передавать самые разные жуки [1629]. У жуков грызущий
ротовой аппарат и нет слюнных желез. Питаясь на растении, они отрыгивают
часть содержимого переднего отдела кишечника. Смит установил, что именно
эта особенность их питания играет роль при передаче вируса. Отрыгивание
пищи приводит к тому, что ранее поглощенный насекомым инфекционный
материал попадает на лист. При разжевывании этот материал вводится в лист.
ВЖМТ может распространяться и другими грызущими насекомыми, напри-
мер прямокрылыми и уховертками — у этих насекомых ротовые части имеют
сходное строение. ВЖМТ не передается гусеницами, также пережевывающи-
ми, но не отрыгивающими пищу [1629]. Инфекционные жуки и их личинки
могут в течение нескольких дней сохранять способность к заражению расте-
ний. Возможно, это время соответствует периоду, в течение которого инфек-
ционный материал остается в переднем отделе кишечника.
Фрайтаг [559] обнаружил два вида огуречных жуков, способных переда-
вать вирус мозаики тыквы — еще один стабильный вирус, присутствующий
в растении в высокой концентрации. Выяснилось, что жидкая пища, отрыги-
ваемая жуками, питающимися на больных растениях, отличается высокой
инфекционностыо. Таким образом, вероятно, что этот вирус передается так же
как и ВЖМТ. Отдельные жуки сохраняют инфекционность до 17 сут.
ТРИПСЫ (THYSANOPTERA)
В качестве переносчиков вируса бронзовости томатов известны только
Thrips tabaci (Lindeman) и три вида Frankliniella. Имеется сообщение о том,
что некоторые виды трипсов передают вирус кольцевой пятнистости табака
[171]. Thrips tabaci — насекомое-космополит, питающееся на растениях
по меньшей мере 140 видов, относящихся к 40 различным семействам. Раз-
множаются они в основном партеногенетически. Личинки большей частью
неактивны; очень активны окрылившиеся взрослые особи. Питается Т. tabaci,
высасывая содержимое субэпидермальных клеток растения-хозяина. Взрослые
особи живут до 20 дней. В течение года может развиться несколько поколений.
Инфицируются вирусом бронзовости томатов только личинки [66]; минималь-
ное время инфицирования составляет 15—30 мин [1405, 1477]. Инкубацион-
ный период длится у Т. tabaci от 4 до 18 сут, а у Frankliniella fusca — при-
мерно 4—12 сут [1477]. Если инкубационный период заканчивается до окукли-
вания, личинка становится инфекционной. Отдельные особи могут сохранять
инфекционность на протяжении всей жизни, однако их способность заражать
растения бывает неустойчивой. Вирус не передается трансовариалыю. Ника-
ких определенных данных о размножении вируса в переносчике не имеется,
однако наличие достаточно длительного инкубационного периода свидетель-
ствует в пользу этого предположения. Из-за малых размеров трипсов по срав-
нению с цикадками и даже с тлями экспериментировать с ними довольно
сложно?
ПАУКООБРАЗНЫЕ» (ARACHNIDA)
Клещи-переносчики растительных вирусов относятся к двум семействам,
Eriophyidae и Tetranychidae. Представителей обоих этих семейств объеди-
няет между собой способ питания — они прокалывают растительные клетки
и высасывают их содержимое, однако в других отношениях они сильно раз-
личаются.
Взаимоотношения между вирусами растений и переносчиками 417
Галлообразующие, или четырехногие клещи (Eriophyidae)
Это крайне специализированные паразиты растений. Известно, что пред-
ставители этого семейства передают по крайней мере шесть вирусов расте-
ний. Они питаются, прокалывая стилетами растительные клетки и высасывая
их содержимое. Стилеты заключены внутри выемки хоботка, имеющего два
утолщения, которые действуют в качестве слюнных протоков (фото 90).
У этих клещей две пары ног; глаза, сердце, экскреторная и дыхательная сис-
темы у них отсутствуют.
Эриофииды — очень мелкие членистоногие (около 0,2 мм в длину);
их способность к самостоятельному передвижению весьма ограниченна.
Обычно они буквально кишат на почках и молодых листьях, ио вызываемые
ими повреждения часто очень невелики, и их легко не заметить. Они быстро
гибнут при подсушивании. Несмотря на это, они распространяются от расте-
ния к растению в основном с помощью ветра [1614].
Большинство видов строго специфично в отношении растений, на кото-
рых они питаются. Обычно данный вид питается только на растениях, отно-
сящихся к одному роду или самое большее к одному семейству. Клещи-эрио-
фииды не могут долго существовать без растения-хозяина, поэтому большин-
ство растений, на которых они питаются, многолетние. У этих клещей срав-
нительно простой цикл развития, который завершается обычно за 6—14 дней.
Имеется две стадии нимф, за которыми следует стадия покоящейся «псевдо-
куколки». Самцов часто не удается обнаружить. У некоторых видов имеется
две формы самок, одна из них — зимующая.
Один из наиболее хорошо изученных клещей-переносчиков — Aceria
tulipae Keifer., способный передавать одновременно два вируса — вирус
полосатой мозаики пшеницы и вирус пятнистой мозаики пшеницы [1615].
Иа фиг. 81 показано строение основных внутренних органов молодой взрос-
лой особи этого вида. Длина зрелых взрослых особей около 250 мкм.
Взаимоотношения этого переносчика с вирусом полосатой мозаики пше-
ницы изучены очень детально. Подобно вирусам, передаваемым тлями с помо-
щью стилета, этот вирус имеет палочкообразные частицы и легко передается
с соком. Aceria tulipae может получать вирус после питания на зараженном
листе в течение 15 мин. Минимальный период, необходимый для передачи
вируса, также составляет около 15 мин. После линек клещи не утрачивают
инфекционности и могут сохранять ее (по крайней мере в условиях теплицы)
в течение 6—9 дней после удаления их с больных растений. Если клещей
выдерживать при 3 °C на растениях, иммунных к вирусу, они остаются
2
।-----------1
50 мкм
Фиг. 81. Схема внутреннего строения молодого взрослого клеща A. tulipae [1311].
1 — задняя кишка; г ~ средняя кишка; з — передняя кишка; 4 — головогрудь; 5 — передние поги;
в — задние ноги; 7 — половое отверстие; 8 — яйцо; 9 — ооцит; 10 — сумка в задней кишке, аналогич-
ная прямой кишке; 11 — анальная присоска.
27—0893
418
Глава XVI
инфекционными на протяжении двух месяцев. При питании на больных расте-
ниях инфицируются только нимфы. Проверка инфекционности отдельных
особей показала, что после питания на больных растениях пшеницы вирус
передавали около 30% клещей [1291, 1617].
Изучение взаимоотношений вируса и переносчика затруднено из-за
малых размеров клещей, однако путем прямой инокуляции растений пшеницы
гомогенатами клещей, а также с помощью электронно-микроскопического
и серологического анализа гомогенатов удалось выявить вирус в переносчи-
ках [1311]. Исследование ультратоиких срезов показало, что распростра-
нение вируса ограничено кишечником; вирус присутствует в высоких концент-
рациях в задней кишке и в задней части средней кишки (фото 91).
О размножении вируса в клещах данных не имеется. Паливал и Слай-
хьюв считают, что поглощенный вирус должен накапливаться в средней
и задней кишке. Пищеварительный канал A. tulipae представляет собой
прямую трубку, мышцы имеются только в глоточном и анальном участках.
По мнению Па лива ла и Слайхыоза, переносчик может заражать растения
как при питании, когда вирус выходит обратно через ротовое отверстие, так
и при выделении через анальное отверстие, когда анальная присоска и щетин-
ки, используемые клещом для того, чтобы удерживаться на листе, могут
вызывать повреждения листовой поверхности. Недавно вирусные частицы
были обнаружены в паренхиматозных клетках клеща [1739]; это обстоятель-
ство позволяет предполагать, что вирус способен перемещаться из кишечника
в слюнные железы. Однако с помощью одного электронно-микроскопического
анализа невозможно определить, какие вирусные частицы играют роль при
передаче [1739].
Неизвестно, почему взрослые особи A. tulipae не инфицируются при
питании на больных растениях пшеницы. Это ограничение может быть свя-
зано либо с какими-то изменениями физических свойств кишечника у взрос-
лого клеща, либо с появлением в нем ферментов, способных разрушать вирус.
Тетраниховые клещи (Tetranychidae)
Эта группа объединяет клещей средних размеров (~ 0,8 мм), питающихся
на растениях и обычно имеющих широкий круг хозяев. Известен только один
представитель Tetranychidae, обыкновенный паутинный клещ Tetranychus
telarius L., который, как можно полагать, служит переносчиком вируса
(он передает У-вирус картофеля) [1510]. Оптимальный период для инфици-
рования насекомого и для заражения растений составляет около 5 мин,
однако следует отметить, что число растений, использованных в опыте, было
недостаточным для точного установления этих сроков. Передача клещом
У-вируса картофеля сходна с передачей вирусов (в том числе того же У-вируса
картофеля) тлями с помощью стилета. Орлоб [1293] испытал Tetranychus
urticae на способность к передаче 9 вирусов; оказалось, что ни один из них
он не может передавать; однако, судя по присутствию вируса в теле клеща,
некоторые вирусы, в том числе ВТМ, он поглощает (ВТМ этот клещ погло-
щает уже через 10 с). Выделения клещей были инфекционными, однако источ-
ником заражения они, по-видимому, служить не могут.
НЕКОТОРЫЕ ПОЛОЖИТЕЛЬНЫЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ ВИРУСОВ
НА ПЕРЕНОСЧИКОВ
Известно несколько случаев, когда заражение растения вирусом приво-
дило к тому, что оно становилось более пригодным для роста и репродукции
насекомого-переносчика.
Взаимоотношения между вирусами растений и переносчиками 419
Время перенесения тлей т растения,дна
Фиг. 82. Влияние заражения растения вирусом на скорость размножения тлей [965J.
Развитие популяций Aphis fabae на здоровых растениях сахарной свеклы (II) и па растениях, заражен-
ных вирусом мозаики (I) за 12 дней до того, как на них Помещали тлей. На оси ординат отложено общее
число тлей ла растениях (или только что переселившихся с них).
Вирус реверсии черной смородины (Jiibes nigrum L.) передается клещом
Phytoptus ribis (Nal.), и существует интересная взаимосвязь между зараже-
нием растений и их чувствительностью к клещу-переносчику. Треш [1767]
констатировал, что кусты черной смородины, зараженные вирусом реверсии,
заселяются клещами гораздо обильнее, чем здоровые кусты того же сорта.
Треш объясняет это тем, что листья растений, зараженных вирусом реверсии,
опушены в значительно меньшей степени, чем здоровые, и поэтому более
доступны для клещей, которые распространяются с помощью ветра.
При культивировании Aphis fabae на растениях свеклы, зараженных
вирусом мозаики сахарной свеклы, отрождение самок происходит раньше,
чем на здоровом растении [965]. Поскольку па зараженных вирусом расте-
ниях плотность популяции тлей растет быстрее, это приводит к ускорению
начала их миграции и к снижению числа насекомых на больном растении.
Таким образом, общий эффект заражения вирусом выражен гораздо силь-
нее, чем это показано на фиг. 82.
В опытах с использованием отдельных листьев эта разница проявлялась
на листьях всех возрастов. Сходный эффект обнаружен Бейкером [60],
который культивировал на свекле 4 вида тлей. Тли Myzus persicae предпочи-
тали питаться па растениях, зараженных вирусом желтухи свеклы, после
этого быстрее размножались и жили дольше, чем при питании па нормальных
зеленых растениях.
Этот феномен имеет отношение к распространению вируса в полевых
условиях и заслуживает тщательного исследования как с биохимической,
так и с экологической точки зрения.
27*
ГЛАВА XVII
ЭКОЛОГИЯ
Для того чтобы вирус мог продолжать свое существование, необходимо
подходящее растение, в котором он может размножаться, эффективные спо-
собы распространения и заражения, а также резерв соответствующих расте-
ний-хозяев, поражая которые, он может распространяться. Существующая
в действительности ситуация, определяющая развитие каждого данного вируса
в какой-то определенной местности или в мировом масштабе, является резуль-
татом сложного взаимодействия многих физических и биологических факто-
ров. В этой главе мы кратко рассмотрим наиболее важные из них и проил-
люстрируем те способы, благодаря которым они могут взаимодействовать
друг с другом и оказывать, таким образом, влияние на распространение виру-
сов растений. Понимание экологии вируса в применении к отдельной куль-
туре и ic определенной местности важно для разработки соответствующих
методов борьбы с вызываемым вирусом заболеванием. Как и в отношении
большинства других облигатных паразитов, основными экологическими фак-
торами, которые следует рассматривать, обычно считают пути передачи виру-
сов от растения к растению, а также способы, с помощью которых другие
факторы воздействуют на распространение вирусов.
БИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Свойства вируса и растения-хозяина
Стабильность вируса и концентрация в растении
При прочих равных условиях вирус, который стабилен, находясь как
внутри, так и вне растения, и достигает в тканях высокой концентрации,
имеет большую вероятность выжить и распространиться, чем тот, который
этими свойствами не обладает. По-вицимому, выживаемость и распростра-
нение некоторых вирусов в значительной мере зависят от высокой степени
стабильности, а также от количества вируса, продуцируемого в зараженной
ткани. Например, ВТМ может в течение длительного периода сохраняться
в мертвом растительном материале, находящемся в почве, которая в таком
случае становится источником инфекции для последующих культур [286,
889].
Скорость передвижения, и распространения вирусов по растению
Вирусы или штаммы вирусов, медленно передвигающиеся по растению
от того места, где произошло заражение, имеют меньшую вероятность выжить
и затем эффективнее распространиться, чем те из них, которые перемещаются
быстро. Скорость передвижения вирусов играет также определенную роль,
если ее рассматривать с точки зрения продолжительности жизни отдельных
растений-хозяев. Так, вирусы, заражающие долгоживущие деревья и кустар-
ники, могут передвигаться по своим растениям-хозяевам гораздо медленнее,
Экология
421
чем те, которые инфицируют однолетние растения. Некоторые стабильные
вирусы, как, например, ВТМ, накапливающиеся в высоких концентрациях
и при инфицировании своих обычных растений-хозяев поражающие почти
все ткани, хорошо приспособлены к распространению механическими спосо-
бами. Вирусы, которые могут проникать в семена и сохраняться там, имеют
существенное преимущество по сравнению с другими вирусами с точки зре-
ния их распространения, а также способности к выживанию. Распростране-
ние вируса некроза табака у большинства растений-хозяев ограничивается
их корневой системой, и существование этого вируса в природе зависит
от способности грибов-переносчиков передавать его через почву и заражать,
таким образом, другие растения.
Степени поражения
Вероятность выживания вируса, вызывающего быстро распространяю-
щееся системное заболевание и тем самым приводящего растение к гибели,
гораздо меньше, чем в том случае, когда вирус вызывает у растений лишь
слабые или средней тяжести заболевания, позволяющие им нормально вегети-
ровать и размножаться. Возможно, что в полевых условиях существует
естественный отбор, направленный против штаммов, вызывающих быструю
гибель растений-хозяев. Цикадки, отродившиеся иа западе США, инфици-
руются первоначально штаммами вируса курчавости верхушки сахарной
свеклы, которые вызывают слабые симптомы на растении-хозяине. Вирулент-
ные штаммы этого вируса вызывают гибель некоторых видов растений до того,
как на них закончит развитие очередное поколение цикадок. Таким образом,
в пустынных районах вирулентные штаммы имеют тенденцию к самоуничто-
жению [162].
Однако при выращивании свеклы интенсивность заболевания зависит
от самых различных причин. Небольшие растения сахарной свеклы, выращи-
ваемые при полном солнечном освещении, являются хорошим хозяином для
цикадок. Крупные же растения, создающие большую тень, менее пригодны
для питания переносчика. В связи с этим распространениеТнекоторых силь-
ных штаммов вируса курчавости верхушки сахарной свеклы облегчается
тем, что при заражении такими штаммами возникают маленькие, низкорослые
растения, а это в свою очередь способствует размножению переносчика [162].
Кроме того, распространению сильных штаммов способствует тот факт, что
заражение слабыми штаммами не предохраняет растения от последующего
заражения вирулентными штаммами [626]. Цикадки, зимующие около полей
сахарной свеклы, передают более вирулентные штаммы, чем цикадки, отлов-
ленные в степи.
Мутабилъностъ вирусов и отбор штаммов
Частота, с которой вирус мутирует и образует штаммы, способные при-
способиться it изменениям окружающей среды, может благоприятствовать
его выживанию и распространению. Провести хорошо аргументированное
сравнение частоты мутаций у различных вирусов трудно, но, вероятно, она
сильно варьирует. Например, вирус скручивания листьев картофеля, по-ви-
димому, относительно стабилен (хотя это может быть просто результатом
недостаточного количества опытов, проведенных при изучении этого вируса),
тогда как многие другие вирусы, например ВТМ и вирус броизовости тома-
тов, существуют в природе в виде многочисленных штаммов. Имеются совер-
шенно четкие данные, служащие доказательством того, что различные штаммы
одного и того же вируса могут различаться по частоте, с которой они проду-
цируют определенный тип мутанта. Слабые штаммы Х-вируса, выделенные
422
Глава XVII
из картофеля, часто дают начало штаммам, вызывающим кольцевую пятни-
стость в табаке, но никогда не удавалось наблюдать, чтобы этим свойством
обладал штамм, вызывающий симптомы кольцевой пятнистости, первоначально
выделенный из томата [1167]. Один из штаммов ВТМ (штамм аукуба) образует
лишь ограниченный набор мутантов, различающихся по симптомам, тогда
как обычный штамм ВМТ может давать широкий круг мутантов самого раз-
личного типа [99].
В гл. XIII уже говорилось, что известны различные примеры, когда
в определенных растениях-хозяевах происходит селективное размножение
отдельных штаммов вируса, присутствующих в смеси. Существуют также
данные о том, что иногда переносчики-беспозвоночные передают некоторые
штаммы вируса более эффективно, чем другие (гл. XVI). Результаты подоб-
ного рода иллюстрируют те способы, с помощью которых отбор штаммов может
происходить в естественных условиях.
В поле различные штаммы ВТМ могут заражать разные виды и сорта
табака. Возможно, что основным фактором, приводящим к тому, что тот
или иной штамм становится преобладающим, т. е. доминирует, в определен-
ном растении-хозяине, является скорость, с которой он может системно рас-
пространиться по растению и таким образом исключить заражение другими
штаммами (гл. XIII).
В тех районах, где однолетние культуры, такие, как табак, возделываются
в течение многих лет, могут доминировать и характерные штаммы вируса.
Так, Джонсон и Валло [883] показали, что в районах длительного выращива-
ния табака иа разных фермах преобладают разные штаммы ВТМ. В более
широком масштабе географическая изоляция может, по-видимому, привести
к дивергенции штаммов, особенно при различных климатических условиях.
Например, в странах с высокими летними температурами может происходить
инактивация вирусов in vivo в природных условиях. Так, в некоторых райо-
нах Индии клубни картофеля, которые хранятся в обычных складах, могут
освободиться от вируса скручивания листьев, тогда как клубни, содержа-
щиеся в охлажденных хранилищах, остаются полностью инфекционными
[933, 1758]. Аналогичным образом растения земляники, выращиваемые
в Империал-Валли (Калифорния), освобождались от вируса морщинистости
земляники [558].
Нередко наблюдается географическая изменчивость, обусловливающая
тип доминирующего штамма вируса. Так, Рохов и др. [1442] обнаружили
различия в доминирующем штамме вируса желтой карликовости ячменя,
который присутствовал в растениях овса, выращенных в штатах Иллинойс
и Нью-Йорк. Различия касались основных переносчиков — тлей и степени
проявления симптомов при заболевании. Кроме того, нет оснований полагать,
что эти ситуации остаются неизменными. Рохов [1436] представил неко-
торые данные, показывающие, что в штате Нью-Йорк свойства доминирую-
щего штамма вируса желтой карликовости ячменя менялись.
Сельскохозяйственная практика может различными путями оказывать
воздействие иа отбор штаммов вируса, которые становятся доминирующими
для какой-то культуры. Например, на плантациях в Шотландии, где выра-
щивался сорт картофеля Арран, условия культивирования и селекции этой
культуры непреднамеренно приводили к тому, что фактически все перспек-
тивные растения заражались Х-вирусом картофеля на ранней стадии своего
развития, что происходило из-за контакта со старыми широко распространен-
ными сортами, сильно пораженными этим вирусом. Поскольку картофель
размножается вегетативным путем, все растения с симптомами мозаики выб-
раковывались; это привело I? тому, что сорт оказался зараженным в основ-
ном слабым штаммом Х-вируса [1168]. Неожиданная вспышка летального
вирусного заболевания может непосредственно свидетельствовать о возник-
Экология
423
новении новых, неустойчивых взаимоотношений менаду вирусом и растением-
хозяином. При заражении растений картофеля, свободных от Х-вируса,
этим же вирусом, полученным от другого бессимптомно зараженного сорта,
не наблюдалось проявления симптомов непосредственно в тот год, когда про-
водили заражение. В следующем году болезнь имела самые различные про-
явления, даже на разных ростках, возникших из одного и того же клубня.
Некоторые ростки были поражены штаммами, вызывающими резкую некро-
тизацию и отмирание, тогда как на других появлялась слабая пятнистость
или же симптомов не было вовсе [1167]. При последующем культивировании
в результате естественного и искусственного отбора непременно была бы
получена линия картофеля снова лишь со слабым типом поражения.
В тех случаях, когда многолетние сорняки и дикорастущие растения-
хозяева служат источником вируса для какой-либо однолетней сельско-
хозяйственной культуры, сменяющая ее культура может оказаться заражен-
ной такими штаммами, у которых никогда не было возможности полностью
адаптироваться к культурному растению.
Когда сельскохозяйственные мероприятия или некоторые другие фак-
торы существенно не меняются, можно ожидать, что в отношении каких-то
определенных видов растений-хозяев и условий окружающей среды отбор
штаммов вируса будет идти до тех пор, пока не станут доминировать штаммы,
наилучшим образом приспособленные к условиям существования. Основные
факторы, влияющие па выживаемость штамма, таковы: 1) эффективная
передача насекомыми или иными способами; 2) более быстрое размножение
и распространение по растению, чем у конкурирующих штаммов; 3) разви-
тие слабой или не слишком сильной формы заболевания.
Спектр растений-хозяев вируса
Общее распределение вирусов в растительном царстве обсуждается
в гл. XIX. Здесь мы рассмотрим факторы, связывающие жизнеспособность
вируса и его распространение в полевых условиях со спектром растений-
хозяев.
Вирусы широко варьируют в отношении спектра тех видов растений-
хозяев, которые они поражают. Так, некоторые вирусы, поражающие земля-
нику, по-видимому, ограничены родом Fragaria. Другие вирусы могут зара-
жать широкий круг растений. Например, для вируса бронзовости томатов
характерен очень широкий, спектр растений-хозяев, куда входят как одно-
дольные, так и двудольные растения. Известно, что этот вирус поражает
растения 166 видов, относящихся к 34 семействам [190]; большое число вос-
приимчивых к нему видов принадлежит к семействам Solanaceae и Gompositae.
Вирусы с очень узким набором растений-хозяев, вероятно, выживают
либо потому, что эти растения являются многолетними, либо размножаются
вегетативным путем, или же вследствие того, что такие вирусы передаются
через семена. Вирус некротического пожелтения салата-латука в Австралии
поддерживается в природе только на растениях разных видов, относящихся
к роду Sonchus (осот). При выращивании салата-латука этот вирус стал
серьезной проблемой лишь в самые последние годы. Стаббс (личное сообще-
ние) считает, что резкое уменьшение популяции кроликов, вызванное миксо-
матозом, привело к более интенсивному распространению осота и, таким
образом, к увеличению резерватора вируса некротического пожелтения
салата-латука.
Широкий набор растений-хозяев дает вирусу гораздо больше возмож-
ностей для сохранения и широкого распространения. Вирусы, которые так же
успешно поражают многолетние декоративные растения, как и сельскохо-
зяйственные и плодовые культуры, широко распространены по земному
424
Глава XVII
шару. Основные примеры их: 1) вирус желтой мозаики фасоли и вирус огу-
речной мозаики, резерватором которых служат гладиолусы; 2) вирус брои-
зовости томатов, который поддерживается в георгинах. Эти растения, как
Правило, заражены и во многих странах являются основным резерватором
данного вируса. Георгины также поражаются и вирусом огуречной мозаики,
но при этом внешние симптомы заболевания часто отсутствуют; 3) вирус
огуречной мозаики, который резервируется и в лилиях, часто не изменяя
внешнего вида растений.
Для многих нематод и вирусов, которые они переносят, характерен
широкий спектр растений-хозяев, к числу которых относятся и многолетние
древесные растения. При отсутствии подходящих сельскохозяйственных куль-
тур такие вирусы и их переносчики часто могут сохраняться в древесных
растениях, образующих живые изгороди, а также в лесах. Вирус папоротни-
ковидности листьев винограда и его переносчик нематода Xiphinema index
необычны в том смысле, что распространение их обоих в значительной степени
ограничено плантациями винограда. Поскольку виноградная лоза — это
долгоживущая культура, заражение других растений-хозяев с целью под-
держания вируса не является необходимым. Кроме того, и переносчик
и вирус обладают способностью в течение нескольких лет сохраняться
в жизнеспособных корнях, которые могут оставаться в почве даже после
того, как побеги винограда удалены.
Распространение переносчиками
Мы уже рассматривали различные группы беспозвоночных-переносчи-
ков (гл. XVI), а также грибы (гл. VI), которые являются переносчиками
вирусов. С экологической точки зрения лучше говорить о двух группах
этих переносчиков — тех, которые распространяют вирусы через почву
(от одних корней к другим), и тех, которые переносят их через воздушную
среду. Следует рассмотреть и третью возможность — распространение виру-
сов на большие расстояния. Особая роль здесь принадлежит человеку, не
говоря уже о том, что он принимает участие и в механическом распростра-
нении вирусов.
Распространение через воздушную среду
Оценивая вирусы растений в целом, можно сказать, что бесспорно наи-
более важным агентом распространения, а следовательно, и выживания
вирусов являются летающие и питающиеся соком растений насекомые-пере-
носчики, в особенности тли. Способ распространения вируса в пределах
определенной культуры, а также скорость и расстояние, на которое он может
быть передан, зависят от многих факторов. Среди них следует отметить сле-
дующие: 1) источник инокулума; инокулум может попасть в культуру
извне, от больных растений в самой культуре, получивших вирус при пере-
даче через семена или при вегетативном размножении, а также от сорняков
и других растений, находящихся в этой культуре; 2) количество потенциально
пригодного инокулума; 3) природа и образ жизни переносчика (например,
что касается тлей, то важное значение имеет, колонии ли это или крылатые
формы); 4) передается ли вирус с помощью стилета, является ли он циркули-
рующим или размножается в переносчике; 5) время, когда переносчик ста
новится активным, по отношению к срокам вегетации растений данной куль-
туры; 6) погодные условия.
В одной из ранних работ, где оценивалась зависимость распространения
вируса от количества тлей, подсчитывалось их количество на растениях
в разные периоды в течение сезона вегетации. Часто связь между количест-
Экология
425
Фиг. 83. Различия в характере распро-
странения двух переносимых тлями виру-
сов на одном и том же картофельном поле
[167].
А. Распределение растений, зараженных У-виру-
сом картофеля. Б- Распределение растений, за-
раженных вирусом скручивания листьев карто-
феля. Источник У-вируса находился за предела-
ми поля. Вирус скручивания листьев (ВСЛ) рас-
пространялся от зараженного растения. Кружоч-
ками с буквой У обозначены растения, поражен-
ные У-вирусом картофеля; белыми кружочка-
ми — здоровые растения, а черными — поражен-
ные вирусом скручивания листьев картофеля.
А
Б
вом насекомых и распространением вируса не была выражена четко. Донка-
стер и Грегори [467] сделали очень важное заключение, указав на значение
мигрирующих крылатых тлей, в особенности тех, которые передвигаются
по растениям на участке, занятом определенной культурой, в начале сезона
вегетации. Размер довольно стабильных популяций тлей, которые образуются
на отдельных растениях, в значительной степени зависит от местных погод-
ных и других условий в пределах распространения данной культуры. Попу-
ляции тлей могут увеличиваться очень быстро (примерно в десять раз в тече-
ние семи дней), и даже на небольших участках внутри культуры плотность
популяции может варьировать очень широко. В последующей работе был
подтвержден тот факт, что основное значение имеет миграция тлей в начале
сезона вегетации. Так, Хискот и Бродбент [750] высаживали проросший
картофель в сосуды, помещали сосуды в поле и уже там через определенные
интервалы в течение вегетационного периода заражали эти растения виру-
сом скручивания листьев или У-вирусом, после чего регистрировали коли-
чество тлей и появление больных растений в поле. Эти вирусы распростра-
нялись от зараженных растений в начале сезона вегетации, когда тлей было
немного, а не в середине сезона, когда количество тлей было наибольшим.
Крылатых тлей можно собрать, когда они садятся на растения какой-
либо культуры, идентифицировать и испытать на соответствующих видах
растений-хозяев, чтобы узнать, содержат ли они те или иные вирусы.
Скорость и характер распространения различных вирусов, даже тех,
которые передаются переносчиками, относящимися к одной, и той же группе,
на участках, запятых какой-либо культурой, могут значительно варьиро-
вать. На фиг. 83 представлены два различных типа распространения виру-
сов. Так, вирус, который вносится переносчиками в культуру извне, не обя-
зательно распространяется с первично зараженных растений на другие расте-
ния. Незначительное распространение вируса на участке, занятом этой куль-
турой, может наблюдаться в том случае, если заражение происходит в конце
вегетационного периода или если переносчики быстро мигрируют. Ситуация
такого рода показана на фиг. 83, Л. Здесь представлена часть картофельного
поля, которая первоначально была свободна от У-вируса картофеля. Источник
426
Глава XVII
заражения находился на расстоянии нескольких сотен метров. Данных
о вторичном распространении нет. Больные растения были распределены
по полю беспорядочно. В центр того же поля в начале сезона вегетации поме-
щали одно растение, зараженное вирусом скручивания листьев картофеля.
О том, что распространение этого вируса в пределах данного картофельного
поля идет от растения к растению, можно судить по тому, что заразившиеся
растения группируются вокруг источника инфекции (фиг. 83, Б).
Ван дер Планк [1808] разработал метод, с помощью которого можно
определить, распространяется ли вирус от больных растений в пределах
участка, занятого какой-либо культурой. Этот метод основан на допущении,
что поступающий извне вирус будет вызывать беспорядочное заражение
растений. Отсюда очевидно, что имеется некоторая вероятность частоты,
с которой будут встречаться рядом два больных растения, образуя пары.
Это можно выразить следующей формулой:
где р — число пар, п — количество просмотренных подряд растений и X —
число пар больных растений. При больших значениях п стандартная ошибка
р равна ]/р.
Если обнаруженное число пар больных растений (три растения вместе
считаются за две пары) окажется значительно большим, чем ожидалось,
то можно предположить, что вирус распространялся от больных растений,
находящихся в пределах данного поля. Распространение вируса по планта-
ции не обязательно приводит к поражению двух соседних растений, хотя
очевидно, что случайное распределение не может исключить этой возмож-
ности. Тип заражения, осуществляемый в поле переносчиком одного вида,
может не выявиться четко в том случае, если в одно и то же время активно
распространяют вирус два переносчика: с помощью первого из них заражают-
ся соседи, тогда как другой вызывает «скачкообразное» заражение расте-
ний, находящихся на каком-то расстоянии друг от друга.
Для вирусов, переносимых стилетом, особенно важное значение имеют
крылатые формы тлей, которые вообще не образуют на культуре колоний,
а двигаются от растения к растению. Хотя они могут составлять небольшую
часть общей популяции, эти формы тлей способны приносить вирус извне
или получать его от больных растений на участке, занятом данной культу-
рой, и быстро распространять его, так как они двигаются в поисках подхо-
дящих для питания растений. Колонии тлей также имеют значение, если
они передвигаются в пределах плантации.
Как это мы уже показали в отношении тлей, тип распространения забо-
левания иа участке, занятом какой-либо культурой, в большой степени зави-'
сит от образа жизни переносчика. Крестоцветные блошки значительно
отличаются от тлей по типу передвижения внутри культуры. Обычно они
гораздо активнее, чем тли, перемещаются от растения к растению на корот-
кие расстояния, но делают это гораздо чаще, чем бескрылые тли; с другой
стороны, они обычно не перемещаются так далеко, как крылатые формы.
На фиг. 84 представлен тип распространения крестоцветными блошками вируса
желтой мозаики турнепса на поле, где эта культура выращивалась рядом
с участком, на котором произрастали растения, зараженные вирусом механи-
ческим способом. Площадь, на которой вначале росли здоровые растения,
была разделена на участки, примыкающие под прямым углом к площади,
занятой зараженными растениями. Число зараженных растений в поле резко
падало с удалением от источника инфекции [1157]. При тех же условиях
сходное снижение числа больных растений наблюдалось и при распростра-
нении вируса тлями.
Экология
427
Фиг. 84. Снижение числа зараженных рас-
тений при естественном распространении
ВЖМТ па турнепсе крестоцветными блошка-
ми [1157].
Показана зависимость числа зараженных растений
(%), подсчитанных па каждом участке, от расстоя-
ния, отделяющего участок, который служил источ-
ником инфекции и примыкал к участку № 1.
Большая часть обсуждавшихся выше фактов касается различий в числе
растений, зараженных каким-либо вирусом с помощью тлей. Степень прояв-
ления заболевания у отдельных растений может существенно увеличиваться
с увеличением дозы вируса, которая вводится большим количеством тлей
[1622] (фото 69). Заболевание обычно проявляется также тем более резко,
чем моложе растение в момент заражения.
Распространение через почву
Существует три группы вирусов, передающихся через почву: 1) вирусы,
переносчик которых неизвестен; 2) вирусы, которые передаются грибами;
3) вирусы, которые передаются нематодами.
Вероятно, ВТМ является одним из немногих вирусов, в заметной степени
передаваемых через почву без помощи какого-либо известного переносчика.
Стабильность этого вируса позволяет ему от сезона к сезону сохраняться
в растительных остатках в том случае, если условия благоприятствуют этому.
Заражение происходит при выращивании восприимчивых культур в зара-
женной почве и осуществляется, по-видимому, через небольшие ранки,
возникающие па корнях во время посадки растений или обработки почвы.
Вирус крупных жилок салата-латука, передаваемый через почву грибом
Olpidium, имеет узкий круг растений-хозяев, но может легко пережить какие-
то неблагоприятные для него условия в почве, находясь в покоящихся спо-
рах этого гриба. Этот вирус способен в течение многих лет сохраняться
в сухой почве, не имея доступа к растениям-хозяевам. С другой стороны,
вирус некроза табака, который также передается грибом Olpidium, имеет
широкий круг растений-хозяев, но, чтобы сохраниться, нуждается, вероят-
но, в постоянном присутствии и смене в почве корней растений, так как пере-
носится, по-видимому, на поверхности зооспор.
Несомненно, наиболее важной группой вирусов, передающихся через
почву, являются вирусы, распространяемые с помощью нематод. Экология
этих вирусов значительно отличается от экологии вирусов, которые распро-
страняются летающими переносчиками. Нематоды живут долго, имеют
428
Глава XVII
Фиг. 85. Распространение нематод и вируса мозаики резухи в культуре земляники
по отношению к Prunus spinosa (2) в живой изгороди (I). Это растение рассматривается
как источник вируса и переносчика [730].
Полукруг (А) обозначает зону, в которой расположены больные растения земляники. Цифры внутри
кружков — количество нематод X. diversicaudaium на каждые 250 мл почвы, отобранной в трех точках.
широкий круг хозяев и в течение длительных периодов могут сохраняться
при неблагоприятных для них условиях и при отсутствии соответствующих
растений-хозяев. Так, Харрисон и Хупер [723] обнаружили, что при отсут-
ствии растений нематода Longidorus elongatus сохраняется во влажной почве
при комнатной температуре более двух лет; этот срок был в опыте наиболь-
шим. В теле переносчиков, которые не питаются, вирус способен сохраняться
на протяжении нескольких недель или месяцев.
У нематод нет устойчивых покоящихся форм, но они могут'мигрировать,
если условия пребывания в почве становятся неблагоприятными. Когда
верхний слой почвы летом высыхает, а зимой промерзает, они переходят
в нижние слои и возвращаются, если условия становятся благоприятными.
Распространение нематод в необрабатываемой почве происходит, веро-
ятно, довольно медленно. Харрисон и Винслоу [730] подсчитали, что попу-
ляция X. dtversicaudatum распространяется в необрабатываемой почве, заня-
той лесом, со скоростью, составляющей примерно 30 см в год. Скорость рас-
пространения переносчиков увеличивается при культивации и, возможно,
при дренажных работах. Тип заражения, наблюдаемый при поражении
какой-либо культуры, может в значительной степени зависеть от перенос-
чика и состояния вируса в почве перед тем, как данная культура была выса-
жена. На фиг. 85 схематически показано распространение нематод и вируса
мозаики резухи в культуре замляники по отношению к Prunus spinosa, кото-
рый, как считали, служил источником вируса и переносчика [730]. Участок,
занятый больными растениями земляники, приблизительно совпадает с зоной,
где была расположена корневая система этого растения (фиг. 85). При выра-
щивании двулетних или многолетних культур на полях, уже зараженных
нематодами, до появления первых видимых признаков заболевания может
пройти один или два года, так как симптомы на листьях могут отсутствовать
примерно в течение года после заражения. Последующее распространение
может привести к медленному увеличению площади участков, занятых
на плантации больными растениями (фото 92)
Распространение на большие расстояния
Распространение вирусов на относительно большие расстояния, вероят-
но, происходит время от времени естественным путем. Так, в Скандинавии
была отмечена вспышка желтухи свеклы, которая явилась, по-видимому,
следствием широкого внедрения в июле 1959 г. массы крылатых тлей, пере-
несенных с Европейского континента устойчивыми южными ветрами, ско-
Экология
429
рость которых колебалась от 5 до 10 м/сек [1297]. Эти тли принесли с собой
континентальные штаммы вируса и вызвали 100%-ное заражение этой куль-
туры в Швеции. Установить, как часто происходит распространение вирусов
таким способом, очень трудно. Зачастую сложно определить, откуда мигри-
ровал переносчик, и проследить за маршрутом миграции, а еще труднее дока-
зать, что насекомые принесли с собой какой-то определенный вирус. Под-
счеты показали, что циркулирующие и полуперсистептные вирусы могут
легко сохраняться в переносчике в течение времени, необходимого для того,
чтобы впоследствии осуществить заражение. Даже неперсистентиый (не
сохраняющийся долго в переносчике) вирус при безостановочном полете
насекомого может быть перенесен на расстояние 60 км и более [882]. До недав-
него времени распространение вируса некротического пожелтения салата-
латука было ограничено, по-видимому, только Австралией. Однако Р. Клоуз
(личное сообщение) обнаружил в Новой Зеландии иа культуре салата-латука
вирус, которыйфточти несомненно представлял собой какой-то штамм вируса
некротического пожелтения. Возможно, что этот вирус попал сюда совсем
недавно с вирофорными тлями, которые при помощи ветра были перенесены
из Австралии, расположенной примерно в 2400 км. Бродбент [283] показал,
что домовый воробей (Passer dotnesiicus L.) заражает примерно одну пятую
часть здоровых растений, будучи посажен в клетку с зараженными ВТМ
и здоровыми растениями томата. Вопрос же о том, является ли передача
на большие расстояния таких вирусов, как ВТМ, с помощью птиц важным
фактором распространения инфекции в поле, еще подлежит рассмотрению.
Передающиеся через семена вирусы, возможно, и могут переноситься
на значительные расстояния птицами, однако до сих пор не зафиксировано
ни одного примера такого рода. Проктор [1365] показал, что жизнеспособные
семена могут сохраняться в пищеварительном тракте морских птиц в тече-
ние 340 ч — время, вполне достаточное для перелета на несколько тысяч
километров. Птицы, питающиеся в областях, удаленных от моря, могут отры-
гивать семена вблизи морского побережья, где эти семена могут быть вто-
рично заглочены морскими птицами. Проктор пишет, что устойчивые семена
в таких случаях как бы делают пересадку с вида «пригородного сообщения»
на «трансконтинентальный» вид.
За последние несколько столетий многие вирусы, ограниченные до этого
одной или несколькими географическими зонами, широко распространились
по свету, и несомненно, что основную ответственность за это несет человек.
Вирусы переносились в растениях или частях растений, а иногда, возможно,
и в беспозвоночных-переносчиках. Многие вирусные болезни картофеля
были, безусловно, завезены в Европу из Америки вместе с этой культурой,
а затем попали с клубнями во многие другие страны. Вирус мозаики салата-
латука, поскольку он передается через семена, встречается, вероятно, по-
всюду, где выращивается эта культура. Тот факт, что ВТМ может сохранять
инфекционность в курительном табаке, по-видимому, в достаточной степени
объясняет его присутствие везде, где имеются крупные табачные плантации.
Распространение некоторых вирусов, вероятно, представляет собой
более сложную проблему, включающую в себя как активное распространение
подходящего насекомого-переносчика и вируса, так и соответствующего рас-
тения-хозяина. Раски и Хыоит [1399] считают, что за распространение по зем-
ному шару вируса папоротниковидности листьев винограда (и его пере-
носчика — нематоды) ответствен главным образом человек, так как вино-
градные лозы переносились им с места на место.
Бэннет [164] привел обзорные данные, касающиеся проблемы геогра-
фического происхождения вируса курчавости верхушки сахарной свеклы.
Этот вирус был зарегистрирован на западе США до 1900 г. Здесь он переда-
вался только цикадкой Circultfer tenellus. Известно, что в течение многих
430
Глава XVII
лет вирус встречался лишь в этой зоне, и было высказано предположение,
что вирус является эндемичным и передается местным переносчиком. С. tenel-
lus не имеет близких сородичей в Западном полушарии, но некоторые виды,
относящиеся к этому роду, встречаются в Средиземноморье. В 1958 г. было
обнаружено, что вирус курчавости верхушки сахарной свеклы широко рас-
пространен в Турции [165]. Это дало возможность предположить, что и вирус
и переносчик могли быть распространены первоначально в Средиземноморье,
а уже оттуда попасть на запад США. Основной вопрос при этом заключается
в том, каким же образом цикадка С. tenellus могла быть перенесена на такое
расстояние теми видами транспорта, которые использовались до 1895 г.
Бэннет указывает на то, что при наплыве людей в Калифорнию во время
золотой лихорадки многие иммигранты прибывали на судах из Южной Евро-
пы, заходивших в порты мыса Горн. Возможно, что эти суда перевозили коз,
для которых хорошей пищей служила кормовая свекла. Цикадка, приспо-
собленная к питанию на свекле, в течение долгого времени могла сохраняться
ла побегах этой культуры при ее хранении, и таким образом и переносчик и
вирус могли прибыть в Америку в одно и то же время. Этот пример иллюстри-
рует трудности, связанные с установлением происхождения вируса и его
дальнейшего распространения. Одной из главных проблем при этом является
отсутствие полной и падежной информации в отношении вирусов, которые
распространены во многих частях света. Например, вполне вероятно,
что вирус курчавости верхушки сахарной свеклы заражал растения
в Турции в течение столетий, однако он идентифицирован там лишь
в 1958 г.
Несмотря на карантинные меры, которые введены во многих странах,
распространение вирусов человеком продолжается до сих пор. Так, вирус
западной мозаики сельдерея, в течение многих лет известный на западе США,
в Новой Зеландии появился впервые в 1966 г. и был обнаружен там в четырех
примыкающих друг к другу огородных хозяйствах района Маигере южнее
Окленда. К 1968 г. вирус был зарегистрирован иа всех промышленных план-
тациях этой зоны и в результате перевозок растений, которые проводились
с коммерческими целями, распространился и на территории второго круп-
ного района южнее Окленда, где выращиваются овощи для продажи [572].
Насколько известно, этот вирус не передается через семена и имеет доста-
точно узкий круг растений-хозяев, относящихся к семейству зонтичных
(сельдерей, пастернак, кориандр, морковь и петрушка). Из 18 видов тлей-
переносчиков по крайней мере 10 обитали в Новой Зеландии в течение мно-
гих лет. Мы можем лишь строить предположения по поводу того, как вирус
попал в этот район земного шара. Он мог проникнуть при нелегальном ввозе
растений или с растительными отбросами, множество которых иногда сбра-
сывали корабли в гавани Окленда и которые часто прибивались к берегу,
сохраняясь в достаточно свежем виде. Тли-переносчики, существовавшие
в этой стране, могли питаться на таком материале.
Вирусы, попавшие в новую обстановку, могут иногда найти там усло-
вия, способствующие очеш, быстрому их распространению. Стаббс [1690]
указывает на то, что вирус пестрой карликовости моркови очень быстро
распространился в Австралии, где в большом количестве имеется тля Cavariella
aegopodii, служащая переносчиком. Напротив, в Калифорнии, где усло-
вия для этого переносчика неблагоприятны, вирус распространялся мед-
ленно.
С точки зрения распространения вирусов в мировом масштабе Новая
Зеландия является интересным примером, так как географически это, вероят-
но, самая изолированная область с весьма дифференцированным и высоко-
развитым сельским хозяйством. Полинезийцы, переселившиеся в Новую
Зеландию, ввели там в культуру несколько новых пищевых растений, напри-
Экология
431
Фиг. 80. Общее число вирусов, зарегистриро-
ванных в Новой Зеландии (с интервалами
в 5 лет).
Годы
мор таро (Colocasia esculenta Schott.) и батат (Ipomoea batatus Lam.). За по-
следние 150 лет европейские иммигранты ввезли сюда большое количество
полевых и садовых культур и одновременно и множество сорных растений.
Сейчас в Новой Зеландии зарегистрировано около 68 вирусов, причем все
они поражают вновь введенные в культуру виды растений [463]. Почти все
эти вирусы оказались идентичными тем из них, которые встречаются в дру-
гих районах земного шара, главным образом в Европе и. Северной Америке.
Легко представить себе, что большинство из них было распространено с клуб-
нями, клубнелуковицами, отводками, корневыми черенками, семенами и т. д.
Например, из 68 вирусов 18 поражают фруктовые деревья, размножающиеся
вегетативно.
Первые вирусные заболевания были зарегистрированы в Новой Зеландии
в 1929 г. па картофеле. На фиг. 86 показано увеличение числа выявленных
вирусов, наблюдавшееся с тех пор в течение каждых пяти лет. Вероятно,
изображенная па этой фигуре кривая имеет мало связи со временем, когда
эти вирусы «прибыли» па территорию Новой Зеландии. С некоторыми воз-
можными исключениями (касающимися, папример, вопроса о вирусе запад-
ной мозаики сельдерея, который обсуждался выше) можно принять, что эта
кривая отражает главным образом те усилия, которые были направлены
иа поиски и идентификацию вирусов, уже присутствовавших в течение неко-
торого времени в Новой Зеландии. Например, систематическая работа
по выявлению вирусов, поражающих фруктовые деревья, началась после
1945 г., ив период с 1945 по 1965 г. было обнаружено 16 таких вирусов;
однако несомненно, что большинство из них присутствовало здесь и ранее
в течение многих лет.
Основными переносчиками этих вирусов являются завезенные виды тлей.
Новая Зеландия очень бедна эндемичными видами тлей, и их место в фауне
занято Psyllidae [412]. Удивительным является тот факт, что в Новой Зелан-
дии до сих пор не обнаружены вирусы, переносчиками которых служили бы
цикадки, хотя представители некоторых родов, могущих быть потенциаль-
ными переносчиками, имеются [425, 504]. По-видимому, вероятность одновре-
менного попадания в одно и то же место и распространения там цикадки-
переносчика и зараженного вирусом растения очень невелика.
432
Глава XVII
Новая Зеландия имеет богатую местную флору (около 2000 видов) сосу-
дистых растений [691]. Для сельского хозяйства они не представляют какой
либо ценности, кроме Phormium tenax, полезного, культивируемого как
прядильное растение, и двух видов из рода Solanum, которые, как выясни-
лось недавно, оказались полезным источником сырья для получения корти-
зона. Никаких серьезных поисков вирусов, поражающих местные виды покры-
тосеменных растений, не проводилось, а это должно было бы, несомненно,
привести к выявлению новых вирусов, не причиняющих серьезного вреда
растениям-хозяевам.
Даже в странах с высокоразвитой уже в течение некоторого времени
технологией сельского хозяйства бывает трудно, а часто и невозможно зафик-
сировать поступление и распространение тех или иных вирусов. Эти трудности
хорошо иллюстрируются историей, которая произошла недавно в континен-
тальных США и Канаде с вирусами, поражающими кукурузу (Zea mays L.)
[1685]. До 1962 г. здесь не считали, что вирусные болезни имеют важное
значение и сказываются на производстве кукурузы. Примерно в течение
50 лет было известно, что возбудитель мозаики сахарного тростника пора-
жает кукурузу в США, однако это не рассматривали как какую-то существен-
ную проблему. Имелись также сведения о том, что заболевание, известное
под названием карликовости кукурузы (сейчас считается, что ее вызывают
микоплазмоподобные организмы), с 1946 г. появилось в штатах, граничащих
с Мексикой. В 1961 г. было сообщено о ненормальном положении с кукуру-
зой в штате Миссисипи. Эпифитотия вновь повторилась в 1962 г., захватив
гораздо большую площадь. Еще большая площадь была поражена в этом
штате в 1963 г., и тогда же заболевание было отмечено и в некоторых других
штатах. В этот период считалось, что причиной создавшейся ситуации являет-
ся агент, вызывающий карликовость кукурузы. Вследствие серьезных эко-
номических убытков начались интенсивные исследования, связанные с изуче-
нием вирусов, поражающих кукурузу. В 1964 г. стало очевидно, что имеется
по крайней мере три агента, поражающих эту культуру: 1) возбудитель,
вызывающий карликовость кукурузы (тогда считалось, что ее вызывает
вирус), 2) вирус мозаики сахарного тростника и 3) вновь описанный непер-
систентный переносимый тлями вирус, названный вирусом карликовой моза-
ичности кукурузы (штамм вируса мозаики сахарного тростника [1557]).
Четвертый обнаруженный вирус, возможно, является родственным вирусу
полосатой мозаики пшеницы.
В период между 1963 и 1965 гг. было отмечено широкое распространение
этих различных заболеваний в континентальных США. Это объясняется как
распространением вирусов, так и повышенным интересом к ним со стороны
части фитопатологов. Сейчас невозможно, бросая взгляд назад, отделить
друг от друга эти два фактора. Кроме того, только в 1964 г. стало ясно, что
симптомы заболевания, описанные на больных растениях кукурузы, недо-
статочны для того, чтобы разграничить вызывающих их возбудителей, так
что первоначальное распределение вирусов теперь не может быть установлено
точно.
Приемы возделывания сельскохозяйственных культур
На поражаемость какой-либо культуры вирусной болезнью значитель-
ное влияние могут оказывать методы ее выращивания и способы обработки,
применяемые в той или иной зоне в течение всех четырех сезонов. Конечно,
соответствующие приемы возделывания могут помешать распространению
инфекции. При этом возникает множество различных ситуаций. Влияние
различного рода факторов, которые имеют в данном случае значение, мы
проиллюстрируем ниже на нескольких примерах.
Экология
433
Фиг. 87. Влияние сроков сева озимой пшеницы на поражение вирусом полосатой мозаики
пшеницы в провинции Альберта в 1955 г. [1618].
Посевы пшеницы сорта Джон Файф (I) были расположены в 12 м, а посевы пшеницы сорта Харьков-
ская (II) — в (13 м восточнее посевов яровой пшеницы, которая была источником инфекции.
Срок сева
Зависимость между заражением растений вирусной болезнью и сроками
сева можно метко проследить на примере выращивания озимой пшеницы
в южной Альберте. Обычно процент поражения этой культуры вирусом поло-
сатой мозаики пшеницы заметно зависит от сроков ее посева [1618] .(фиг. 87).
Если проводить сев раньше сентября, то происходит частичное перекры-
вание периодов вегетации озимой культуры и яровой, являющейся источни-
ком инфекции.
Высокие температуры воздуха могут привести к резкому уменьшению
количества тлей, которые являются переносчиками инфекции. Если задер-
жать время сева до момента преобладания высоких температур, то озимая
культура может быть поражена в гораздо меньшей степени.
Севооборот
Тип севооборота оказывает определенное влияние на распространение'
вирусов, способных перезимовывать в сорняках или в проростках падалицы
предшествующей культуры. В некоторых культурах большое количество
спонтанно выросших растений, содержащих вирус, может вегетировать
в течение длительного времени. Донкастер и Грегори [467] показали, что
для того, чтобы избавиться от таких растений картофеля, засоряющих поля,
занятые этой культурой, требуется 5—6 лет. В случае многолетних культур
количество больных растений увеличивается с возрастом культуры, как это
было показано на примере вируса мозаики люцерны [615].
Обработка почвы
На распространение и сохранение вирусов в почве или в растительных
остатках могут оказывать влияние методы обработки почвы. Нематоды,
а также грибы, являющиеся переносчиками вирусов, могут распространяться
28—0893
434
Глава XVII
при перемещении почвы, происходящем во время обработки. На сохранение
ВТМ в растительных остатках оказывает влияние степень аэрации почвы,
а также ее влажность. Если предшествующей культурой был картофель,
то обработка полей во время холодной погоды может в значительной степени
спилить выживание певыкопанных клубней [467].
Размер поля
Влияние размера поля па распространение вируса сильно зависит от источ-
ника первоначальной инфекции. Если источник инфекции находится за пре-
делами поля, занятого какой-то культурой, тогда, как указывает ван дер
Планк [1809], концентрация растений на больших полях компактной формы
приводит к тому, что возможность заражения извне оказывается минималь-
ной. Это имело место при заражении люцерны вирусом мозаики люцер-
ны [615].
Густота насаждений и размер растений
Летающие насекомые, заносящие вирус извне на какую-либо культуру,
на каждой данной площади заражают большее количество растений, если
они расположены достаточно далеко друг от друга, чем при густых посадках.
Случаи поражения вирусом желтухи свеклы, вирусом мозаики свеклы и виру-
сом мозаики цветной капусты отмечались реже в тех случаях, когда рас-
стояние между растениями или между рядами растений было меньше [213,
280, 1680].
Как можно предполагать, высокие растения, растущие па участке, заня-
том какой-либо культурой, имеют больше шансов быть зараженными виру-
сами, которые передаются насекомыми, чем низкие растения, поскольку
вероятность посещения таких растений насекомыми более высока. Бродбент
[280] обнаружил эту закономерность на рассадочных грядах цветной капусты.
На протяжении одного сезона вирусом мозаики цветной капусты было пора-
жено 30% высоких растений, 15% растений среднего размера и 5% невысоких
растений.
ФИЗИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Сезонность и погодные условия
Фиг. 88 на примере вирусов желтухи свеклы и слабого пожелтения свек-
лы, поражающих сахарную свеклу, иллюстрирует значительные ежегодные
отклонения, которые могут наблюдаться при заражении однолетних куль-
тур [1875].
Уотсон и Хискот подчеркивали, что особое значение для последующего
распространения заболевания имеет равняя миграция М. persicae. Однако
следует учитывать и другие факторы. Например, в июне 1945 г. было зареги-
стрировано очень небольшое количество тлей М. persicae, однако в этом же
году наблюдалась резкая вспышка вирусной инфекции. В июне 1946 г. было
отмечено самое большое количество тлей этого вида за восемь лет, в течение
которых проводилось обследование, однако уровень поражения в этом году
был низким. Можно почти с полной уверенностью утверждать, что за 8-лет-
ний период основным фактором, определяющим уровень поражения, была
степень зараженности культуры иа соседних участках. На основании дан-
ных, полученных при работе со сходными источниками инфекции, можно
предполагать, что сезонные колебания частоты заражения такой культуры,
Экология
435
Фиг. 88. Ежегодные учеты количества тлей и распространения вирусов желтухи и сла-
бого пожелтения свеклы тлями на посевах сахарной свеклы в Англии.
Гистограммы показывают число тлей М. persicae, отловленных в неделю; линиями обозначен процент
пораженных растений.
как сахарная свекла, вероятно, являются следствием продолжительного
влияния погодных условий на популяцию тли-переносчика в течение большей
части сезона вегетации. Они влияют на сроки и численность тлей, мигрирую-
щих на культуру, на развитие популяции внутри культуры и на ее переме-
щение.
Необычные погодные условия могут привести к сильной вспышке забо-
левания, которое обычно наблюдается в какой-то определенной области
и на какой-то культуре каждый год, однако в довольно слабой степени. Све-
дения о сильной эпифитотии вируса полосатой мозаики пшеницы осеныо
1963 г. в южной Альберте могут служить иллюстрацией взаимодействия раз-
личных факторов. Посев озимой пшеницы проводится, как правило, в тече-
ние первых двух недель сентября. Это обычно приводит к тому, что данная
культура избегает заражения, источником которого являются посевы созре-
вающей яровой пшеницы (фиг. 87). В 1963 г. погодные условия были необыч-
ными [47]. Количество выпавших весной осадков было гораздо ниже нормы.
Посевы яровых зерновых культур оказались разреженными, многие семена
не проросли. Создавшееся положение неожиданно изменилось в конце июня,
когда выпали обильные дожди. В районе, который до этого страдал от засухи,
проросли (примерно на месяц позже) не дававшие ранее всходов семена яро-
вой пшеницы и ячменя, а растения, остановившиеся в росте, стали обильно
куститься. В июне и июле количество осадков было больше нормы (или близко
к норме), что обеспечило дополнительное интенсивное развитие этой культу-
28*
436
Глава XVII
ры, а снижение интенсивности летних пахотных работ привело к чрезмер-
ному развитию растений падалицы. В этом районе, где количество выпавших
весной осадков было ниже нормы, пшеница и ячмень, которые занимали боль-
шие площади, не созрели до конца сентября. Обе эти поздно созревшие куль-
туры и стали массовыми резерваторами вируса и его переносчика — клеща.
Озимая пшеница, посеянная в обычные сроки (первые две недели сентяб-
ря), сильно пострадала от вирусной инфекции. Осенью погода также была
не такой, как обычно, что способствовало интенсивному распространению
вируса клещами. Средняя температура в сентябре была 34,5 °C (на 5,5°
выше среднего уровня за 30 лет). Такие необычно высокие температуры про-
должали отмечаться и в октябре.
Сезон 1964 г. не благоприятствовал распространению вируса, но из-за
его широкого распространения на полях, засеянных озимой пшеницей перед
заморозками в 1963 г., посевы зерновых на значительных площадях погибли.
На фиг. 89 показано распространение и интенсивность поражения посевов
озимой пшеницы вирусом полосатой мозаики в южной Альберте в 1963—
1964 гг. Это распределение ясно показывает, как эпифитотия 1964 г. была
связана с недостатком весенних осадков, который наблюдался в 1963 г.
На скорость размножения и передвижения распространяющихся по воз-
духу переносчиков вирусных болезней могут оказывать значительное влия-
ние отдельные факторы, формирующие погоду в какой-то определенной мест-
ности, как, например, температура воздуха, влажность и ветер. Сокращению
некоторых популяций тлей, вероятно, способствуют высокие температуры
воздуха. Ветер, по-видимому, является важным фактором, который не только
содействует распространению вирусов передающимися через воздух пере-
носчиками или задерживает его, но также определяет основное направление
этого распространения. Порывы ветра могут приводить к локальному умень-
шению количества переносчиков и больных растений (см., например, [1065]).
Фиг. 89. Взаимосвязь между вспышкой вирусной инфекции, вызванной вирусом__поло-
сатой мозаики на озимой пшенице, которая наблюдалась в 1963—1964 гг. в южной Аль-
берте, и необычно низким уровнем осадков, выпавших весной 1963 г. [46].
В зоне внутри изогиеты с 1 апреля по 1 июня выпало меньше 50 мм осадков* Зона, рекомендованная
для выращивания озимой пшеницы, расположена юго-западнее заштрихованной линии. Черным цветом
обозначены посевы, перепаханные из-за заражения вирусом полосатой мозаики, точками — посевы,
пораженные вирусом полосатой мозаики, но не перепаханные, белым цветом — посевы, не пораженные
вирусом полосатой мозаики, крестиками — участки площадью менее 40 га.
Экология
437
Фиг. 90. Влияние направления, в ко-
тором дует вотр (обозначено стрелкой),
иа распределение вируса желтой мо-
заики фасоли па шести полях, засеян-
пых фасолью (источник инфекции —
расположенные рядом посевы красного
клевера) [701]. ...
Показана зависимость между числом пора-
женных растений (%) и расстоянием от кле-
верного поля. По оси абсцисс отложено рас-
стояние в футах, умноженное на 100 (1 фут =
= 30,48 см).
Червецы, которые передают вирус деформации побегов дерева какао, сравни-
тельно неактивны и передвигаются по растению только на короткие расстоя-
ния, хотя могут перемещаться с помощью муравьев. Однако на некоторое
расстояние они могут переноситься и с помощью ветра.
С другой стороны, крылатые тли обычно не летают, когда дует слишком
сильный ветер, но направление их полета может изменяться в зависимости
от направления ветра. Это проиллюстрировано на фиг. 90, где показано
распространение вируса желтой мозаики фасоли с помощью тлей М. persicae
в культуре фасоли (источником инфекции служили расположенные рядом
посевы красного клевера) 1701].
Однако сильные ветры могут иногда переносить тлей иа очень большие
расстояния (см. стр. 428). Направление движения цикадок также в значи-
тельной степени может определяться силой и направлением ветра. Цикадка
С. tenellusae может продвигаться против ветра, дующего со скоростью, превы-
шающей 3 км/ч.
Эффективность распространения вируса реверсии черной смородины
галловым клещом-переносчиком (Phytoptus ribis Nal.) иа расстоянии около
15 м от зараженных растений в значительной степени зависит от направления,
в котором дует ветер. Однако другие факторы, например турбулентность
воздушных потоков, вызываемых расположенными поблизости строениями
или деревьями, могут оказывать отрицательное действие на перемещение
этого переносчика и распространение вируса [1768].
Почва
Почвенные условия могут различным образом сказываться на степени
поражения вирусной болезнью. На высокоплодородных почвах возможность
438
Глава XVII
распространения вирусных болезней увеличивается. Так, внесение органи-
ческих, а также некоторых неорганических удобрений увеличивало на карто-
фельных полях число растений, пораженных вирусом скручивания листьев
и У-вирусом [288]. Некоторые виды тлей-переносчиков быстрее размножаются
на таких растениях. На степень поражения, несомненно, оказывает влияние
и питание растений, подавляя симптомы заболевания или делая их более
отчетливыми.
Почвенные условия могут играть заметную роль, оказывая влияние на сох-
ранение ВТМ в растительных остатках. Инактивация вируса происходит
быстрее во влажных, хорошо аэрируемых почвах, чем в сухих, плотных или
заболоченных почвах [889].
Температура почвы может оказывать значительное влияние на передачу
вирусов нематодами. Деброт [441] обнаружил, что в случае передачи нема-
тодой Longidorus macrosoma вируса кольцевой пятнистости малины при 20 °C
заражаются 16 из 20 проростков огурца, при 25 °C — 4 из 20 проростков,
а при 30 °C заражения не происходит. Снижение эффективности передачи
вируса при высоких температурах не было следствием гибели нематод; при
всех трех температурных режимах количество их к концу эксперимента было
примерно одинаковым. Высокие температуры могут отрицательно влиять
на процесс питания пематод.
СОХРАНЕНИЕ ВИРУСА НА ПРОТЯЖЕНИИ ГОДОВОГО ЦИКЛА
Сохранение вируса в течение зимнего периода может осуществляться
по-разному. Существуют вирусы, способные перезимовывать с помощью
нескольких различных способов.
1. Многие вирусы легко сохраняются от одного сезона до другого в одном
и том же растении-хозяине или в посадочном материале. Сюда относятся
вирусы, переживающие неблагоприятное время года в многолетних растениях,
в клубнях, отводках и т. д., а также вирусы, передающиеся через семена.
Подобно этому культуры, которые остаются в поле в течение зимы (напри-
мер, кормовая свекла), могут служить резерватором вируса и переносчика
[751].
2. Вирусы, для которых характерен широкий спектр растений-хозяев,
хорошо приспособлены к сохранению в природе, если в числе восприимчи-
вых к ним растений имеются многолетники, группа видов однолетних расте-
ний, у которых периоды вегетации не совпадают, а лишь накладываются
один на другой, или же виды, способные передавать вирус через семена.
3. Вирусы, передающиеся цикадками трансовариалыго, могут зимовать
в яйцах, отложенных насекомыми.
4. ВТМ и некоторые другие вирусы могут сохраняться в течение зимы
при благоприятных условиях в почве (в растительных остатках и, возможно,
в свободном виде); ВТМ может также переносить неблагоприятное время
года, находясь в растительной подстилке в сараях и т. п.
5. Вирус крупных жилок салата-латука может в течение длительного
времени сохраняться в покоящихся спорах Olpidium.
6. Сельскохозяйственные мероприятия мюгут приводить к тому., что
в определенных местностях вирус в течение всего года сохраняется на сме-
няющих друг друга посевах одного и того же растения. Это может происхо-
дить там, где климатические условия позволяют собирать урожай в течение
всего года, где дикие злаки вегетируют в течение зимнего периода одновре-
менно с культурами, имеющими промышленное значение, или, наконец,
когда в одной и той же местности выращивается и озимая и яровая пшеница.
Вирус полосатой мозаки пшеницы сохраняется при наличии живого расти-
Экология
439
Фиг. 91. Цикл вируса полосатой мозаики пшеницы.
Основная борт,5а с заболеванием, вызванным этим вирусом в южной Альберте,— предотвращение зара-
жения вирусом осенних всходов озимой пшеницы.
Темная зона — период, в течение которого могут быть приняты эффективные меры борьбы; прерывистыми
линиями отмочено время, в течение которого проблема заражения осложняется наличием растений
падалицы и либо рано посеянной озимой пшеницы, либо поздно созревающих сортов яровой пшеницы
и ячменя; стрелками обозначена передача вируса клещами, которые переносятся ветром.
тельного материала. Как обсуждалось выше, такие условия создаются в том
случае, если всходы озимых культур появляются раньше, чем убраны яровые.
На фиг. 91 показан такой цикл, а также зона (означающая период времени),
когда принимаемые меры борьбы имеют целью образовать разрыв между
двумя культурами.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
На основании данных, представленных в этом кратком обзоре, можно
сказать, что не все вирусы обладают теми свойствами, которые способствуют
их сохранению и распространению. Каждому вирусу свойственна какая-то
комбинация признаков, которые позволяют ему сохраняться более или менее
эффективно. С одной стороны, крайним случаем является ВТМ, который
не имеет определенного переносчика среди беспозвоночных, но сохраняется
благодаря своей большой устойчивости к инактивации, высокой концентра-
ции, которой он обычно достигает в растении-хозяине, легкости, с которой
происходит механическая передача, и широкому кругу восприимчивых расте-
ний. Вирусы, которые размножаются в насекомом-переносчике и передаются
через яйца, для своего сохранения не нуждаются в растении (другая край-
ность).
Вирус броизовости томатов представляет собой пример очень лабиль-
ного вируса, чрезвычайно интенсивно распространяющегося в поле. В обыч-
ных условиях вне растения ои может сохранять инфекционность только
в течение нескольких часов. Передается вирус переносчиком определенного
типа (виды трипсов, инфицируемые только на стадии, нимф), но, несмотря
440
Глава XVII
на это, широко распространен по земному шару и встречается повсеместно
на территории отдельных стран. Возможно, что широкое распространение
этого вируса зависит от нескольких факторов, к числу которых можно отне-
сти следующие [190]: 1) очень большой круг восприимчивых растений,
куда входят многие многолетние бессимптомные резерваторы инфекции,
которые в зоне умеренного климата и в субтропиках являются источником
вируса на протяжении всего года; 2) широкое распространение видов трип-
сов, способных передавать вирус; 3) образование большого набора штаммов,
возникающих при смешанном заражении, и возможность рекомбинаций,
что приводит к быстрой адаптации вируса в отношении новых растений-
хозяев со сравнительно слабыми симптомами заболевания.
Когда этот вирус был впервые описан в Австралии па плантациях тома-
тов, болезнь сильно угнетала растения и многие из них погибали. В течение
последних лет поля обычно поражаются штаммами, действующими па расте-
ния гораздо слабее [190].
Многие вирусы, распространяющиеся нематодами, передаются и через
семена ряда растений-хозяев, относящихся к числу как сорняков, так и куль-
турных растений [1080]. Зараженные проростки часто выглядят здоровыми.
Сочетание способности передаваться нематодами, а также через семена, воз-
можно, имеет значение для сохранения и распространения многих вирусов
[1251]. Прорастание инфицированных семян сорняков может привести к пов-
торному заражению популяции нематод, находящихся в почве, и зараженные
семена могут быть перемещены па большие расстояния, чем нематоды, обра-
зуя новые очаги инфекции. Мурант и Листер [1251] показали, что такие виру-
сы, как вирус черной кольцевой пятнистости томатов, который обычно обнару-
живается в почве в семенах сорных растений, не сохраняются в переносчике
Longidorus elongatus дольше чем примерно девять недель. В противополож-
ность этому два вируса (вирус мозаики резухи и вирус папоротниковидное™
листьев винограда), сохраняющиеся в переносчике Xiphinema ssp. в течение
восьми месяцев или более, очень редко обнаруживались в семенах расте-
ний, выращенных на зараженной почве, или не обнаруживались в них
вовсе.
Вирусы, у которых весь или почти весь цикл развития связан с природ-
ной флорой и фауной, изучены слабо, так же как и их экология. Большая
часть полученной информации — это побочный продукт исследования тех
болезней, которые имеют важное экономическое значение. Вероятно, при
длительном воздействии естественного отбора на вирус и на генотип растения-
хозяина и при отсутствии вмешательства человека вирусы могут хорошо,
адаптироваться к своим хозяевам, а также к беспозвоночным или иным пере-
носчикам. По-видимому, действие такой вирусной инфекции на растение
было бы минимальным. Лишь иногда можно было бы встретить отдельные
растения с тяжелыми формами заболевания, но эпифитотии были бы
редкими.
Возможно, что остатки подобной адаптации наблюдаются в случае взаи-
моотношений вируса мозаики резухи и его переносчика нематоды X. diver-
sicaudatum с видами, произрастающими в лесистой местности, которые
некогда сформировали естественную растительность на большей части тер-
ритории Англии [730]. Подобно этому в Австралии вирус некротического
пожелтения салата-латука сохраняется в естественных условиях на видах
рода Sonchus. Возможно, что Австралия является родиной этих растений.
Вирус не причиняет особого вреда этим растениям, которые играют роль
резерватора инфекции (Стаббс, личное сообщение).
Сельское хозяйство даже на самых ранних, примитивных его стадиях
должно было изменить условия окружающей среды, в которой существовали
вирусы, что происходило несколькими основными путями:
Экология
441
1. Селекция растений, а позднее выведение новых их сортов привели
к возникновению растений-хозяев с новыми генотипами, которые реагировали
па существующие вирусы уже иным образом.
2. Сельскохозяйственное производство привело к новым контактам
растений различных видов, в результате чего образовались новые расти-
тельные сообщества, включающие полезные виды и сорняки, связанные
с культурными растениями.
3. Такие сельскохозяйственные сообщества растений распространялись
по всему миру и оказывались, таким образом, по соседству с местными фло-
рами. Вирусы, характерные для этих флор, распространялись на сельскохо-
зяйственные культуры.
4. Вместе с растениями в новые зоны передвигались насекомые-перенос-
чики и виды, могущие служить потенциальными переносчиками; насекомые,
ранее обитавшие в этих зонах, могли также распространяться на сельско-
хозяйственные культуры.
5. Выращивание на больших площадях какого-то одного основного вида
растений могло привести к развитию громадной популяции насекомых-пере-
носчиков и последующей сильной вспышке заболевания. Вероятность этого
увеличивалась при выращивании определенной культуры на протяжении
нескольких лет на одном и том же участке (например, выращивание на семе-
на двулетних растений, таких, как сахарная свекла) или при интродукции
сорняков, которые являлись резерваторами вируса.
6. Такие методы обработки почвы, как культивация и дренаж, могли
изменять почвенные условия и оказывать, таким образом, сильное влияние
на обитающих в почве переносчиков вирусов.
7. Прививки, не считая их роли в распространении вирусов, могли при-
водить к появлению новых заболеваний в результате селекции вирусных
штаммов и инфицирования ранее не зараженных видов и сортов растений.
Некоторые сельскохозяйственные мероприятия могут невольно способ-
ствовать отбору слабых штаммов вируса или растений, устойчивых к вирусу,
но, вообще говоря, факторы, описанные выше, постоянно комбинируются
самым различным образом; это приводит к созданию новых, неустойчивых
экологических ситуаций, при которых как на полевых, так и на садовых
культурах могут наблюдаться вспышки заболеваний.
ГЛАВА XVIII
ЭКОНОМИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ВИРУСНЫХ
БОЛЕЗНЕЙ растений и ЗАЩИТНЫЕ МЕРОПРИЯТИЯ
Э КОНОМИ Ч ЕСКОЕ 3 J1АЧЕН И Е
Часто трудно получить точные данные о прямых потерях урожая
в результате поражения растений вирусами и о стоимости мероприятий, про-
водимых для того, чтобы свести к минимуму этот ущерб. Размеры прямых
потерь у различных культур сильно варьируют по годам в разных районах,
так что средние значения в сущности не показательны. Можно выделить три
основные ситуации, при которых наблюдаются потери урожая:
1. Поражение многолетних культур (в особенности древесных пород),
приводящее к отмиранию или ослаблению растений, часто имеет очень серь-
езные последствия, так как выращивание таких культур требует длительного
времени и площадь бывает занята под ними долго. В качестве примеров можно
привести вырождение цитрусовых в Северной и Южной Америке и деформа-
цию побегов дерева какао — болезнь, поражающую плантации этой куль-
туры в Западной Африке.
2. Поражение однолетних культур, выращиваемых из семян. Примером
могут служить многие овощные культуры, у которых потери, вызванные
определенным заболеванием, сильно варьируют по годам. В США, напри-
мер, ежегодные средние потери урожая пшеницы от вирусных болезней на
протяжении десято лет составляли около 2%; в Канзасе в 1959 г. эти
потери достигли 20% [1102].
3. Поражение растений, размножающихся вегетативным способом,
например картофеля и многих декоративных растений. Такие культуры
нередко бывают в сильной степени поражены вирусом, но обнаруживают
при этом лишь слабые симптомы поражения. Зачастую больными оказыва-
ются все растения и в то же время снижение урожая бывает небольшим
(около 10%). Надежность сведений относительно снижения продуктивности
растений в результате поражения вирусом зависит от типа культуры.
В отношении, например, плодовых деревьев средние показатели могут дать
достаточно точную информацию. На фиг. 92 показано, как на протяжении
семи лет снижался вес яблок у яблонь сорта Лорд Ламбурн, пораженных
болезнью плодов.
У большей части сортов вишни вирусная инфекция снижает урожай,
однако такого снижения не наблюдалось при заражении вишни сорта Мертон
Харт вирусом размочаливания листьев, так как в этом случае значительно
возрастала фертильность растений [1353].
Если снижение урожая однолетних культур, выращенных из семян,
обусловливается только вирусными болезнями, т. е. если картина не затем-
няется несбалансированным питанием или действием других паразитов, то
обычно в этом случае причиненные убытки можно оценить более или менее
точно. Точными данными по урожайности располагают, как правило, в отно-
шении таких культур, как пшеница или сахарная свекла, при их использо-
вании для силосования или технической переработки. Более или менее точно
оценить потери урожая можно и в том случае, если достаточно хорошо
известна степень поражения культуры [46]. Что же касается растений, раз-
множающихся вегетативно, то в этом случае оценить снижение урожая
удается не всегда, так как часто отсутствует здоровый материал, необходи-
Экономическое значение вирусных болезней и защитные меры 443
Фнг. 92. Ежегодное снижение веса яблок у яблонь сорта Лорд Ламбурп (подпой MVI),
пораженных болезнью плодов [1351].
I — здоровые деревья; II — деревья, зараженные через привой. 1 фунт = 453 г.
мый для сравнения. В течение многих лет считалось, что 7^-вирус картофеля
не оказывает влияния на урожай картофеля сорта Кинг Эдуард. Однако,
когда Кассанис [938] получил плои этого сорта, свободный от вируса, урожай-
ность его оказалась примерно на 10% выше урожайности лучших коммер-
ческих клонов того же сорта, а клубни были более выравненными по размеру.
Стандартным способом оценивать снижение урожая какой-либо отдель-
ной культуры при повреждении ее тем или иным вирусом нельзя. Величину
потерт, определяет и характер местности и особенности вегетационного пери-
ода. Эта величина зависит от сорта растения-хозяина и штамма вируса, от
количества и активности переносчиков, времени появления инфекции, состоя-
ния растений, погодных условий и присутствия других паразитов.
Особенный вред причиняет одновременное поражение культуры двумя
вирусами. При поражении сои различными штаммами вируса мозаики уро-
жай снижался обычно на 8—25%; если же посевы были заражены одновре-
менно и вирусом крапчатости бобов фасоли, то снижение урожая достигало
80% [1449].
Более раннее заражение растений влечет за собой большие потери. Зави-
симость снижения урожая от времени миграции тлей можно хорошо иллюст-
рировать иа примере поражения посевов моркови вирусом пестрой карли-
ковости, который передается тлей Cavariella aegopodii (Scop) (фиг. 93).
При подсчете мигрирующих тлей, пойманных в ловушки, которые
помещались в поле, оказалось, что с каждым десятикратным увеличением
количества переносчика урожай моркови с 1 га снижался примерно на 15 т.
Интерпретация этих данных усложняется тем обстоятельством, что засушли-
вые периоды, благоприятствовавшие весной перелетам тлей и их размноже-
нию, сами по себе могли оказывать влияние па развитие растений (например,
снижая количество прорастающих семян).
При позднем заражении меныпие потери урожая отмечаются еще и пото-
му, что по старым растениям вирус распространяется медленнее и в меньшей
степени их угнетает. Так, Бродбент и др. [289] обнаружили, что клубни
растений картофеля, зараженных в поздние сроки вирусом скручивания
листьев, часто не содержат вируса. Фиг. 94 дает представление^ о потерях
урожая сахарной свеклы в Великобритании в результате поражения виру-
сами желтухи за период с 1946 по 1962 г. В среднем урожай был снижен на
8,6%. Халл подсчитал, что в 1957 г., когда снижение урожая было наиболь-
444
Глава XVIII
Фиг. 93. Зависимость между временем миграции Cavariella aegopodii, переносчика вируса
пестрой карликовости моркови, и урожаем этой культуры в Англии [1875].
Представлены данные за период с 1959 по 1965 г. N — число насекомых, отловленных в конце мая..
1 аир = 0,4 га.
Фиг. 94. Действие вирусов желтухи сахарной свеклы на урожай этой культуры в Вели-
кобритании за период с 1946 по 1962 г. [838].
шим, общие потери, обусловленные инфекцией, составили несколько больше
1 млн. т корнеплодов (рассчитано исходя из содержания сахара 16%).
При оценке потерь важно определить не только снижение урожая на
одно растение или на га. Если сбор урожая производится на протяжении
вегетационного периода несколько раз и если цена продукта зависит от его'
качества, то важное значение приобретает время поражения, а также влия-
ние инфекции на качество урожая. Бродбент [282] отмечает, например, что-
качество томатов, пораженных ВТМ, сильно ухудшалось при заражении
в поздние сроки. Исходя из рыночных цен, он рассчитал денежные убытки
(в процентах) при разных сроках заражения. Ниже приводятся эти
данные.
Экономическое значение вирусных болезней и защитные меры 445
Сроки, заражения
растений. ВТМ
3 марта
14 апреля
31 мая
Убытки, рассчитан-
ные только на осно-
вании весовых потерь
19
18
12
Убытки, рассчитан-
ные с учетом качества
19
27
33
В условиях вольного рынка учет зависимости между весовыми и денеж-
ными потерями, которые несут отдельные хозяйства, осложняется еще и во-
просом о том, в какой мере эти потери затрагивают разные хозяйства. Если
потери у всех хозяйств более или менее одинаковы, то цены на продукт повы-
шаются и это в какой-то мере компенсирует потери. Если же страдают только
несколько хозяйств, то их денежные убытки при тех же потерях урожая
будут гораздо большими.
Дополнительные сложности возникают в тех случаях, когда интересую-
щие пас виды растений выступают в роли членов экологического сообщества.
•Это было четко показано па примере вирусного заболевания ежи. Катерал
и Грифите [340] ставили опыты в трех вариантах, выращивая растения:
1) в горшках под открытым небом, 2) в открытом грунте и 3) в смешанных
газонах. При выращивании растений в горшках вирусная инфекция сущест-
венно снижала их кущение (примерно на 40%); однако у больных растений
вес отдельных побегов был большим, так что потери в сухой массе оказались
незначительными. При выращивании в горшках как больные, так и здоро-
вые растения занимали все доступное пространство.
В открытом грунте, т. е. там, где рост растений в боковом направлении
не ограничивался, и сухая масса и число побегов увеличивались у здоровых
растений гораздо быстрее, чем у больных. В результате сухая масса у боль-
ных растений оказалась вдвое меньшей, чем у здоровых. Как правило,
больные растения цвели раньше и давали меньшее количество семян, к тому
же с пониженной жизнеспособностью. Этого ие наблюдалось при выращива-
нии растений на газонах, где между растениями существовала конкуренция
и где играли важную роль различные компенсаторные факторы. Изучая эту
проблему, Катерал и Грифите [341] использовали небольшие эксперимен-
тальные газоны, засеянные ежой; количество больных растений на этих
газонах составляло 0, 50 и 100%.
В течение двух лет из числа больных растений погибло 44%, а из числа
здоровых — 21%. Если же на газонах одновременно присутствовали и боль-
ные и здоровые растения, то снижение продуктивности больных растений
успешнее компенсировалось интенсивным ростом здоровых тогда, когда
тазопы подстригали ежемесячно, а не 1—2 раза в сезон. Катерал и Грифите
считают, что если не проводить стрижки газонов, то тенденция больных
растений давать большое число цветущих (вертикальных) побегов будет
приводить к затенению здоровых растений, находящихся в стадии кущения.
'С другой стороны, вертикальные побеги больных растений в большей степени
•страдают при подрезании, и если стрижку газонов проводить часто, то интен-
сивный рост боковых побегов у незатененных здоровых растений компенси-
рует недостаточный рост больных.
Такого рода компенсация не имела места в том случае, если иа неболь-
ших участках, где выращивался райграс (Lolium perenne L.), половина расте-
ний была поражена вирусом желтой карликовости ячменя [339]. Поражение
этим вирусом приводит не столько к уменьшению числа побегов, сколько
it приостановке роста растений. В результате больные растения задерживают
боковой рост здоровых растений. Если па газонах вместе с больными и здо-
ровыми растениями райграса произрастал белый клевер, то продуктивность
446
Глава XVIII
последнего на протяжении большей части вегетационного периода (кроме
весны) увеличивалась с увеличением зараженности райграса. Весной зара-
женные вирусом растения райграса отрастали раньше, чем здоровые.
ЗАЩИТНЫЕ МЕРОПРИЯТИЯ
Основной метод защиты растений от грибных заболеваний — это обра-
ботка фунгицидами. Применение фунгицидов либо полностью предохраняет
растения от заражения, либо сводит заражение к минимуму. В отношении
вирусных болезней растений такие прямые методы защиты пока отсутствуют.
Основные мероприятия, которые могут в этом случае принести пользу,
носят косвенный характер, их проводят с целью сократить источники инфек-
ции внутри и вне посевов или насаждений, снизить распространение вируса
переносчиками и уменьшить действие вируса на растения. Однако проведе-
ние таких мероприятий в какой-либо определенной местности, вообще говоря,
не решает проблемы. Борьба с вирусными болезнями — это непрекращаю-
щаяся борьба, и проводить ее следует объединенными усилиями из года
в год. Есть, правда, несколько исключений, когда определенный сорт культи-
вируемого растения обладает устойчивостью или иммунностью по отношению
к какому-нибудь вирусу. Но и в этом случае положение не всегда остается
благополучным; сорт, известный своей устойчивостью к данному заболева-
нию, может оказаться восприимчивым к нему с появлением каких-нибудь
новых штаммов того же вируса.
Мы рассмотрим здесь различные способы, которые используются для
защиты растений от вирусных болезней. Следует помнить и о том, что иногда
вирусная инфекция повышает восприимчивость растений к какому-либо
другому заболеванию. В этих случаях могут потребоваться иные защитные
мероприятия. Известно, например, что поражение вирусом желтухи увели-
чивает восприимчивость сахарной свеклы к заражению грибом Alternaria.
Это вторичное действие вирусной инфекции удавалось в некоторые годы
ослабить, опрыскивая растения соответствующими фунгицидами [1462, 1464].
Для того чтобы проводимые меры борьбы были эффективными, необхо-
димо прежде всего правильно идентифицировать тот вирус (или вирусы),
который поражает данную культуру. Идентификация вируса только по одним
симптомам заболевания очень ненадежна. Салат-латук, например, пора-
жается 14 различными вирусами, которые передаются тлями, цикадками,
трипсами, нематодами и грибами [386]. Многие из этих вирусов вызывают
симптомы бронзовости (на листьях растения образуются коричневые некро-
тические пятна), после чего растение желтеет и рост его прекращается. Дру-
гим примером может служить заражение свеклы желтухами в западных
районах США. До тех пор пока Даффус [471] не выделил и не описал вирус
западной желтухи свеклы, который вызывает практически те же симптомы,
что и обычный вирус желтухи, но имеет совершенно иную эпидемиологию,
и внешние симптомы поражения и потери урожая приписывались исключи-
тельно этому последнему вирусу (присутствие которого было доказано).
Устранение источников инфекции
Очевидно, что если посевной или посадочный материал свободен от виру-
са и в поле отсутствует источник инфекции или отсутствуют пути для ее
распространения, то самой проблемы защиты растений от вируса не возни-
кает. Проводить меры с целью уничтожения источника инфекции в поле
имеет смысл лишь тогда, когда нам точно известна природа этого источника
и то, каким путем вирус может распространиться из мест резервации на
посевы.
Экономическое значение вирусных болезней и защитные меры 447
Живые растения как источник вируса
Источником вируса могут служить: 1) многолетние сорняки, а также то
однолетние сорняки, у которых вирус передается через семена или у которых
на протяжении года имеется несколько поколений, накладывающихся друг
па друга; 2) многолетние декоративные растения, у которых заболевание
часто проявляется в слабой форме; 3) неродственные культуры; 4) растения
падалицы того же вида (вырастающие па местах посевов предшествующей
культуры); 5) семенники двулетников (например, сахарной свеклы и многих
овощных культур), вступающие в фазу созревания примерно в то же время,
когда всходят посевы этой культуры первого года вегетации.
Казалось бы, что от большей части таких источников инфекции можно
освободиться. Однако па практике это обычно сделать трудно, а часто и
невозможно, особенно па территориях, где имеются посевы разных культу;),
в том числе и в небольших частных хозяйствах. О том, как трудно добиться
полного уничтожения растений картофеля, выросших из неубранных клуб-
ней, мы уже говорили в гл. XVII. В хозяйствах, расположенных в умерен-
ной и субтропической зонах, часто выращивается целый набор различных
растений, многие из которых могут служить резерваторами весьма вредо-
носных вирусов. Проводить эффективные защитные мероприятия в таких
хозяйствах обычно трудно или вообще невозможно.
Эффективность мер по удалению восприимчивых к вирусу растений на
какой-либо территории в значительной степени зависит от круга растений-
хозяев данного вируса. Если круг восприимчивых к вирусу растений доста-
точно узок, то есть смысл пытаться уничтожить иа данной территории всех
прочих хозяев этого вируса; однако в отношении таких вирусов, как вирус
огуречной мозаики или вирус бронзовости томатов, проведение подобных
мер обычно бесполезно.
Растительные остатки
Растительные остатки в почве или в теплицах могут служить очагами
резервации вирусов, передающихся механическим путем, и быть источником
инфекции для последующей культуры. В отношении такого крайне стабиль-
ного вируса, как ВТМ, общие фито санитарные мероприятия весьма важны,
особенно в тех случаях, когда восприимчивые культуры из года в год выра-
щиваются па одном и том же месте. С помощью частичной стерилизации
почвы (эта мера может быть экономически оправданна) полностью освобо-
диться от ВТМ в теплицах очень трудно [291].
Прополка
Иногда удаление больных растений представляется целесообразным, но,
разумеется, эта мера пе будет иметь никакого смысла, если вирус может
быстро проникнуть в культуру из какого-нибудь внешнего источника. Про-
водить прополку следует в начале сезона и лишь в том: случае, если вирус
распространяется сравнительно медленно и в основном внутри посева. Даже
у многолетних растений при медленном распространении заболевания унич-
тожение больных растений и посадка здоровых дают возможность поддержи-
вать сравнительно устойчивую продуктивность (так, папример, обстоит дело
при поражении персиков вирусом мозаики). Уничтожение больных растений
может оказаться эффективным и в борьбе с реверсией черной смородины,
поскольку поражение вирусом значительно увеличивает восприимчивость рас-
тений к клещу-переносчику [1768]. С помощью формулы, предложенной ван
дер Планком: (гл. XVII), можно получить сведения о том, имеет ли место
распространение инфекции внутри посевов или насаждений.
448
Глава XVIII
Использование безвирусных семян
В тех случаях, когда вирус передается через семена, этот источник
инфекции может играть весьма важную роль, поскольку распространение
инфекции на другие растения начинается очень рано, когда растения эти
еще совсем молодые. Если зараженные семена являются главным или един-
ственным источником вируса и если растения при этом можно выращивать
в достаточной изоляции от внешних резерваторов инфекции, то использова-
ние семян, свободных от вируса или зараженных лишь в очень небольшой
степени, представляет собой весьма эффективный способ борьбы с болезнью.
Вероятно, наилучшим примером такого рода может служить вирус
мозаики салата-латука. Гроган и др. [682] показали в Калифорнии, что при
выращивании салата-латука из безвирусных семян процент больных расте-
ний к моменту созревания был намного ниже, чем иа соседних участках, где
для посева использовались стандартные семена, имевшиеся в продаже.
В течение некоторого времени эта мера не давала должного эффекта, пока
не стало ясно, что и при незначительной зараженности семян поражение
растений может быть очень тяжелым, если только тли-переносчики доста-
точно активны [1989]. Было показано, что в условиях Калифорнии не сле-
дует проводить посев семенами, зараженность которых превышает 0,1%.
Ниже приводятся средние результаты восьми опытов такого рода.
% зараженных
семян
0,0
0,1
0,4
1,6
% больных расте-
ний при сборе
урожая
3,4
7,6
20,1
29,5
Томлинсон [1779], исследуя этот вопрос в Англии, получил сходные
результаты. Чтобы обеспечить должный эффект при использовании свобод-
ных от вируса или слабозаражеиных семян, необходимо введение системы
сертификатов, удостоверяющих, что семенные растения выращивались в усло-
виях соответствующей изоляции. Недавними исследованиями было показано,
что даже если зараженность семян салата-латука составляет всего 0,1%,
посев такими семенами не предохраняет культуру от поражения мозаикой
(Гроган, личное сообщение). В Калифорнии, в долине Салинас, в настоящее
время пользуются только такими семенными фондами, в которых при испы-
тании на 30 000 семян ие обнаруживается ни одного зараженного данным
вирусом.
Использование безвирусного посадочного материала
Основной источник вируса для большей части растений, которые раз-
множаются вегетативно, — это хроническая инфекция в самом растении.
В отношении таких культур одним из наиболее успешных методов защиты
от вирусных болезней является выращивание безвирусных клонов (точнее
клонов, не содержащих какого-либо определенного вируса). При этом пред-
стоит решить две проблемы. Во-первых, требуется найти свободную от
вируса линию нужного сорта, а если сорт заражен целиком, то провести
определенную работу, с тем чтобы освободить от вируса какое-либо расте-
ние или часть растения. Во-вторых, получив безвирусный клон, необходимо
поддерживать какую-то часть материала в свободном от вируса состоянии,
а остальной материал размножать в таких условиях, в которых повторное
Экономическое значение вирусных болезней и защитные меры 449
заражение данным вирусом сводится к минимуму или вообще не имеет места.
Размноженный таким способом посадочный материал используют затем для
выращивания культуры на основных площадях.
Методы идентификации безвирусного материала
Визуальное выявление вирусного заболевания по симптомам не является
надежным методом при селекции исходных растений. Более падежные мето-
ды идентификации здоровых и зараженных растений необходимы, и они
существуют. Какой из них следует применить в каждом частном случае, это
зависит от вируса и от растения-хозяина. Идентификация многих вирусов
(в особенности тех, которые поражают древесные породы) — весьма тру-
доемкое дело. Основным методом является в этом случае прививка одному
или нескольким индикаторным растениям. Распределение вируса по дереву,
особенно па ранних стадиях инфекции, может быть неравномерным; поэтому,
для того чтобы убедиться в отсутствии вируса, необходимо повторять эти тесты
в течение нескольких лет. Так, Хамптон [700], прививавший по четыре почки
с исследуемого растения на каждое индикаторное дерево, обнаружил, что
в течение первого года вирус карликовости сливы на растениях вишни опре-
делялся не всегда (29—63%, в зависимости от сорта). Вероятность выявле-
ния инфекции в значительной степени возрастала в том случае, когда дерево
было заражено уже в течение трех лет. Неравномерное распределение вируса
может иметь место и у травянистых растений (гл. VII). Бимстер [138], в .част-
ности, обнаружил, что при заражении картофеля У-вирусом инфицируются
не все клубни и даже не обязательно все части одного и того же клубня.
Нижняя часть клубня бывает заражена реже, чем верхушка. Таким образом,
верхушка клубня является более надежным материалом для тестирования.
Для идентификации многих вирусов молото использовать метод меха-
нической инокуляции индикаторных растений. Используется и серологиче-
ский анализ, а также различные цитологические (см., например, [1429]),
электронно-микроскопические и химические тесты [1072]. Однако наиболее
падежным методом выявления здоровых растений остается все же постановка
тестов на инфекционность.
Методы получения безвирусных растений
Получение безвирусного материала в естест-
венных уело в иях. Иногда на каком-то определенном участке
можно обнаружить отдельные растения данного сорта, не зараженные виру-
сом. Если здоровых растений найти не удается, то иногда можно восполь-
зоваться тем обстоятельством, что вирус распределяется по растению нерав-
номерно. Особенно это относится к некоторым вирусам, поражающим пло-
довые деревья. В таких случаях с непораженных частей дерева берут почки.
Иногда вирус, который системно распространяется по всему растению, не
успевает проникнуть в кончики побегов быстрорастущих стеблей. Именно
благодаря этому Холмсу [821] удалось получить растения георгин, свобод-
ные от вируса бронзовости томатов. Соответствующая процедура успешно
используется при работе с некоторыми вирусами и определенными растения-
ми-хозяевами. Однако многие растения, размножающиеся вегетативным
путем, поражены тем или иным вирусом практически на 100%. В этих слу-
чаях, для того чтобы получить здоровый исходный материал, следует поль-
зоваться каким-либо из специальных методов, описанных ниже.
Тепловая терапия. По-видимому, прогревание — наиболее
распространенный метод из числа тех, которые применяются для освобож-
дения растительного материала от вирусов. Холдинге [811] перечисляет
'29—0893
450
Глава XVIII
Фиг. 95. Зависимость инактивации вируса скручивания листьев в клубнях картофеля
(7) и гибели самих клубней (77) от времени и температуры [514].
около 90 вирусов, от которых удалось освободить методом прогревания по-
крайней мере один какой-нибудь вид растения-хозяина.
Тепловой обработке можно подвергать два разных вида растительного-
материала. Покоящиеся части растений (клубни, древесные почки, черепки
сахарного тростника) обычно выдерживают более высокие температуры, чем
растущие ткани; эффект обработки в этом случае, по всей вероятности, свя-
зан с прямой инактивацией вируса. Температурные режимы и продолжи-
тельность обработки варьируют очень широко (от 35 до 54 °C, от несколь-
ких минут до нескольких часов). Часто для прогревания используют горя-
чую воду, так как при кратковременной обработке горячим воздухом расти-
тельный материал, как правило, равномерно не прогревается. Если ткани
не полностью гидратированы, то обработка сухим теплом значительно менее
эффективна, чем обработка горячей водой.
Гораздо чаще, однако, тепловой обработке подвергают растущие ткани.
При этом, как правило, применяют обработку горячим воздухом, а пе горя-
чей водой. Прогревание обычно проводится в течение нескольких недель,
при температуре 35—40 °C. Такая обработка обеспечивает наиболее высо-
кую выживаемость растительного материала. Условия проведения тепловой
обработки варьируют очень широко и подбираются эмпирически для каж-
дой комбинации вирус—растение. На фиг. 95 показана зависимость гибели
клубней картофеля, а также инактивации вируса скручивания листьев от
времени и температуры.
Очень часто сразу же после прогревания от обработанных побегов отде-
ляют самый кончик верхушки, так как этот кончик иногда уже не содержит
вируса, в то время как остальная часть побега еще остается инфекционной.
От некоторых стабильных вирусов, таких, как ВТМ, нельзя освобо-
диться прогреванием растительной ткани. В настоящее время мы не распо-
лагаем никакими критериями, чтобы сказать заранее, может ли растение
того или иного вида быть таким способом освобождено от какого-то опреде-
ленного вируса или же нет. Пока еще не ясно, какие механизмы лежат
в основе освобождения ткани от вируса: вероятно, они включают в себя
и инактивацию уже синтезированного интактного вируса и нарушение репро-
дукции вируса.
Экономическое значение вирусных болезней и защитные меры 451
В случае стабильных вирусов, таких, как Х-вирус картофеля, отдель-
ные части растения можно освободить от инфекции, выдерживая растение
в течение нескольких месяцев при сравнительно низких температурах (около
35 °C). Меллор и Стейс-Смит [1197] указали, что очень важно начинать такую
обработку осенью или зимой, чтобы успеть закончить ее до начала вегетации.
Им удавалось освободиться сразу от двух вирусов картофеля, а именно от
X- и S-вируса, выращивая растения картофеля в течение нескольких меся-
цев при 33—37 °C, после чего пазушные почки (длиной 0,3—1,0 мм) отде-
ляли от растения и выращивали иа питательной среде [1656].
Культивирование апикальной меристемы.
В гл. VII мы уже говорили о распределении вируса по апикальной меристе-
ме. Культивирование апикальной меристемы оказалось, весьма эффектив-
ным методом освобождения вегетативно размножающихся растений от неко-
торых вирусов. Холдинге [811] показал, что в культуре апикальной мери-
стемы стерильным остается конус нарастания и первая пара листовых зачат-
ков. У различных растений длина этого участка колеблется от 0,1 до 0,5 мм,
тогда как длина копчика верхушки, отделяемого после прогревания (см.
выше), обычно составляет 0,5—2 см. Минимальный размер апикального
участка, из которого можно вырастить целое растение, у разных видов раз-
личен. У ревеня, например, он составляет 0,3 мм (или больше) [1855].
На фото 93 показан участок апикальной меристемы картофеля, который
обычно используется для выращивания безвирусных растений.
Для регенерации целого растения во многих случаях необходимо (по
крайней мере при существующих методах культуры ткани), чтобы культи-
вируемый участок меристемы включал хотя бы один листовой зачаток.
Разные исследователи используют для культивирования апикальной
меристемы самые различные питательные среды. Основные ингредиенты
такой среды — соответствующие минеральные соли (макро- и микроэле-
менты), сахароза и один или несколько стимуляторов роста (например, индо-
лилуксусная или гибберелловая кислота); иногда культуру выращивают
па агаре.
Из части апикальной меристемы может вырасти растение, свободное от
вируса. С тех пор как Морел в 1948 г. [1232] предложил этот метод, он стал
широко использоваться (см., например, [931, 1067, 1234, 1235]). Холдинге
[811] перечисляет 22 вируса, от которых удалось таким способом освобо-
дить по крайней мере один вид растения-хозяина. Коммерческие сорта
ревеня удалось освободить от пяти вирусов, которыми они обычно бывают за-
ражены [1855]. Метод культивирования апикальной меристемы успешно при-
меняется в работе с теми растениями, которые не выдерживают тепловой обра-
ботки. Иногда этот метод дает хорошие результаты в сочетании с тепловой обра-
боткой; при этом используется апикальная меристема прогретых растений.
В борьбе с теми вирусами, от которых трудно освободиться, можно использо-
вать ингибиторы, подавляющие размножение вируса. Их вводят в питательную
среду. Квок [1373] для освобождения картофеля от X- и S-вирусов вводил в сре-
ду 2,4-Д в концентрации 0,1 ч. на млн. Кассанис и Тинсли [951] подобным
же образом использовали 2-тиоурацил для уничтожения У-вируса кар-
тофеля.
Только часть культур апикальной меристемы дает растения, свободные
от вируса. В настоящее время не ясно, от чего зависит успех или неуспех
при использовании-этого метода. Можно представить, себе несколько различ-
ных ситуаций: 1) хотя обычно вирус в меристематической ткани отсутствует,
отдельные образцы ткани могут быть загрязнены им; 2) некоторые части
меристемы могут содержать вирус, а другие — нет; 3) вирус, присутствую-
щий в меристеме, инактивируется в процессе культивирования на искусствен-
ной среде. Применяя метод культивирования апикальной меристемы, очень
29*
452
Глава XVIII
важно помнить, что растения, выращенные из меристемы и на вид кажущиеся
здоровыми, должны перед использованием в течение определенного времени
подвергаться проверке. На ранней стадии признаки заболевания обнаружи-
ваются не всегда; однако после длительной инкубации в некоторых случаях
наблюдается развитие инфекции.
При работе с орхидными используют протокорм, разрезая его на не-
сколько частей, выращивая их в культуре и затем снова разрезая. Таким
путем можно очень быстро получать безвируспые клоны.
Действие пониженных температур. Влияние
инкубации растений при пониженных температурах на выживаемость виру-
сов изучено еще недостаточно. Можно было ожидать, что низкие температуры
не оказывают сколько-нибудь значительного действия иа вирусы, которые
стабильны in vitro. В некоторых случаях выращивание при пониженных
температурах приводило к освобождению растительного материала от виру-
сов. Селеки и Блэк [1529] выращивали при 14 °C отводки растений донника,
зараженных вирусом раневых опухолей. В этих условиях даже после
нескольких вегетативных поколений развития опухолей не наблюдалось.
Отводки растений третьего поколения срезали и выращивали в теплице в
обычных условиях. 95% этих растений при выращивании в теплице дали
отводки второго (тепличного) поколения, которые, как показало отсутствие
опухолей, были на 90% свободны от вируса. Механизм действия пониженной
температуры неизвестен. Возможно, это действие обусловлено снижением
скорости репродукции вируса и (или) скорости его передвижения (в резуль-
тате чего часть растения оказывается свободной от вируса). Другое предпо-
ложение, высказанное Блэком и Селеки,основывается на том, что концентра-
ция вируса в опухолях примерно в 100 раз выше, чем в остальных частях
растения. Пониженные температуры могут подавлять развитие опухолей
и тем самым в значительной степени сокращать количество вируса, которое
могло бы синтезироваться и распространиться по растению.
Химиотерапия. Результаты многочисленных опытов, в которых
с целью освобождения растений от вируса использовались антивирусные
препараты, принесли разочарование. Имеется несколько сообщений об «изле-
чении» растений с помощью таких препаратов; однако часто при этом выводы
авторов основываются на экспериментах с очень небольшим числом расте-
ний или же сами результаты экспериментов могут быть интерпретированы
иначе (см., например, [825]). Ни один из способов химической обработки
растений сам по себе еще не нашел применения в практике. Пайн [1332] обна-
ружил, что инъекции диметилсульфоксида персиковым деревьям могут
в течение одного сезона задерживать появление симптомов вируса мозаики
персика и вируса некротической кольцевой пятнистости, однако в следую-
щем году эти симптомы появляются вновь. Как уже отмечалось выше, в неко-
торых случаях можно использовать химическую обработку в сочетании
с тепловой или с таким методом, как культивирование апикальной мери-
стемы.
Кассанис и Тинсли [951] сообщают об освобождении культуры каллюс-
пой ткани табака от У-вируса картофеля путем добавления к питательной
среде 2-тиоурацила (в концентрации 2 мкг/мл). Добиться регенерации расте-
ний картофеля из безвирусной каллюсиой ткани не удалось.
Защита безвирусного материала от повторной инфекции
После того как материал, свободный от вируса, тем или иным способом
получен, он должен быть размножен в условиях, которые исключают вто-
ричное заражение и позволяют оценить его производственную пригодность
и его типичность. Затем безвирусный материал размножают для коммерчес-
Экономическое значение вирусных болезней и защитные меры 453
ских целей. Во время размножения и распределения материала необходимо
вести непрерывный контроль над всеми операциями, связанными с его выра-
щиванием и продажей. Классическим примером такого контроля может
служить система сертификатов, принятая в Великобритании и обеспечившая
в последние три десятка лет увеличение урожая картофеля вдвое или втрое,
в значительной степени за счет снижения зараженности растений вирусами.
Проверенный исходный посадочный материал, практически свободный от
вируса, выращивается в условиях изоляции в определенных районах Шот-
ландии, неблагоприятных для миграции тлей и заселения ими картофеля
[1777]. Из материала, полученного таким способом, выращиваются высоко-
качественные клоны уже на территории Англии, в тех районах, где
тли встречаются в небольшом количестве. Здоровые клоны регулярно прове-
ряются. Использование инсектицидов системного действия позволило расши-
рить сеть участков, па которых можно выращивать посадочный материал.
В настоящее время в разных странах мира существует много таких
систем для разных полевых и садовых культур, в том числе для плодовых
деревьев (косточковых и семечковых), для винограда, ягодников и карто-
феля. В отношении некоторых групп растений, в особенности тех, которые
выращиваются ради цветков или клубней, эффективность программы иско-
ренения вирусов сильно ограничивается из-за обособленности отдельных
хозяйств.
Один из вопросов, который нередко возникает при разработке систем
выращивания кондиционного семенного или посадочного материала, это
вопрос о том, какое количество растений следует перед реализацией продук-
ции проверять на инфекционность. По мнению Маркхэма и его сотрудни-
ков [1158], объем работы по проверке инфекционности должен быть разумно
ограничен, для чего тесты следует ставить не с отдельными растениями,
а с группами растений. Составляя такие группы по принципу адекватной
выборки, зараженность растений в поле можно затем выражать через про-
цент зараженных групп. Надежность этого теста, разумеется, увеличивается
с увеличением числа растений, подвергаемых анализу.
При оценке любой такой системы следует учитывать: 1) вероятность того,
что материал с «высоким» уровнем зараженности будет забракован, и 2) веро-
ятность того, что материал с «низким» уровнем зараженности будет принят.
Можно составлять схемы, рассчитанные на ту или иную вероятность выбра-
ковки или принятия материала.
Марроу и др. [1162] разработали метод для проверки семян салата-ла-
тука па отсутствие вируса мозаики. Они получали экстракты из нескольких
сотен семян и использовали их как инокулум для заражения восприимчи-
вого индикаторного растения; результаты интерпретировались в соответ-
ствии с диаграммами или таблицами, основанными на биномиальном распре-
делении.
Агротехнические мероприятия
Нарушение инфекционного цикла
Если в определенной зоне выращивается какая-нибудь одна основная
восприимчивая к вирусу культура или группа близких культур, причем
именно они являются в этой зоне главными хозяевами данного вируса, то
число больных растений можно заметно уменьшить, организовав производ-
ство таким образом, чтобы в какой-то период времени ни одна из этих куль-
тур не вегетировала. Хороший пример такой организации производства —
контроль за сроками сева озимой пшеницы в Альберте, который проводится,
чтобы избежать одновременной вегетации яровой и озимой пшеницы (фиг. 87
454
Глава XVIII
и 91). Это мероприятие обычно дает хорошие результаты, особенно если оно
сочетается с уничтожением всходов падалицы пшеницы и ячменя (до того,
как появятся всходы озимых), а также с уничтожением диких злаков, вос-
приимчивых к вирусу полосатой мозаики пшеницы. Соблюдение интервалов,
на протяжении которых растения, восприимчивые к данному заболеванию,
не выращиваются, дает положительный эффект и с некоторыми другими
вирусами, имеющими ограниченный круг хозяев и распространяющимися
при помощи насекомых. Например, в двух районах Калифорнии, где выра-
щивается сельдерей, урожаи этой культуры на протяжении 1930—1934 гг.
постепенно снижались. В эти годы они составили соответственно 1026, 740,
661, 555 и 311 корзин с акра. После того как в 1935 г. сельдерей не выращи-
вался в течение 5 мес, урожай его составил 800 корзин с акра, а в 1936
и 1937 гг., когда такой интервал длился 3,5 мес, урожай увеличился до 926
и 847 соответственно [1542].
Другой пример такого же рода касается вируса желтой карликовости
лука. Эта культура выращивалась в 1939—1945 гг. в Новой Зеландии в одном
из районов поблизости от Крайстчерча. В результате сильных вспышек забо-
левания культура лука в этом районе была запрещена, а все несобранные
луковицы и лук-шалот было решено уничтожить. Эти мероприятия привели
к полному исчезновению названного заболевания в данном районе [348].
С тех пор сообщений о нем не поступало.
Изменение сроков сева
Вирусные болезни в гораздо большей степени снижают урожай в тех
случаях, когда инфицируются молодые растения. Кроме того, зрелые расте-
ния часто более устойчивы к заражению и вирус перемещается по ним мед-
леннее. Поэтому сроки сева могут влиять на время появления инфекции и па
зараженность посевов в тех случаях, когда речь идет о вирусах, распростра-
няемых насекомыми. Оптимальные сроки сева зависят от времени миграции
переносчика. Если переносчик мигрирует рано, можно рекомендовать про-
водить посев в более поздние сроки. Если миграция происходит поздно,
то благоприятный эффект дает посев в ранние сроки, поскольку ко времени
заражения растения будут уже достаточно большими. В Шотландии, напри-
мер, картофель, посаженный в третью неделю мая, поражался вирусом скру-
чивания листьев и У-вирусом в несколько большей степени, чем при посадке
в первую неделю апреля, так как в этом последнем случае в период наиболь-
шей активности тлей-переносчиков растения были более зрелыми.
Букер [221] проводил опыты по выращиванию в северной Нигерии ара-
хиса и нашел, что ранние посадки в меньшей степени поражаются розеточ-
ностыо и дают большой урожай. Правда, при этом увеличению урожая спо-
собствовали и некоторые другие факторы.
О какой бы культуре ни шла речь, эффект от изменения сроков посева
или уборки урожая, проявляющийся в снижении пораженности вирусом,
следует рассматривать в связи с другими экономическими факторами. Брод-
бент и др. [289] обнаружили, например, что картофель, высаженный в ран-
ние сроки и рано собранный, поражается вирусными болезнями в меньшей
степени, однако урожайность его при этом все же сильно снижается, так что
эффект в конечном счете оказывается отрицательным.
Густота стояния растений
В гл. XVII мы упоминали о том, что при загущенных посадках наблю-
дается тенденция к снижению зараженности. Влияние густоты стояния
растений на пораженность вирусом, распространение тлей-переносчиков
Экономическое значение вирусных болезней и защитные меры 455
<&иг. 96. Влияние плотности посева па
зараженность арахиса вирусом розеточ-
ностп [3].
"Число растений на акр: 1 — 9600; II—
= 19 05(1; III — 38 550; IV — 78 750;
V — 100 200. 1 акр = 0,4 га.
ш урожайность растений показано на примере поражения арахиса вирусом
розеточности [3, 4]. Обследование посевов с различной густотой стояния
растений проводилось в разные сезоны. Заселенность посевов тлями оказа-
лась выше там, где расстояние между растениями было большим. На фиг. 96
показано, что с увеличением густоты Стояния зараженность растений виру-
сом розеточности резко снижается (количество больных растений приведено
на этой фигуре с учетом повторных заражений).
Хотя иа загущенных посевах пораженность розеточпостыо меньше,
однако при очень высокой густоте стояния конкуренция между растениями
приводит к снижению урожая и стоимость семенного материала значительно
возрастает. Следует использовать такие нормы высева, чтобы почва как
можно раньше оказывалась полностью покрытой растениями, но чтобы густо-
та стояния растений не была при этом чрезмерной, так как конкуренция
между растениями может привести к потерям урожая.
По мнению Халла [839], большая заселенность тлями при низкой густоте
стояния растений, возможно, определяется тем фактом, что насекомых при-
влекает желтый цвет (растения, посаженные редко, растут свободно, и потому
их желтые молодые листья хорошо видны). Это объяснение, однако, непри-
годно для описанных опытов с арахисом [3], поскольку там скученность
растений была всегда значительной.
Удаление надземных частей растения
Чтобы ограничить распространение вируса в конце вегетационного
сезона, некоторые системы безвирусного семеноводства предписывают про-
водить уборку до определенного срока. Это относится к производству семен-
ного картофеля в Голландии, где каждый год в соответствии с данными
по отлову тлей определяются сроки уборки урожая клубней или уничтоже-
ния ботвы. Бимстер [139], однако, показал, что если ботву не уничтожить
полностью, то эта мера будет иметь противоположный эффект. Прищипка
растений картофеля вскоре после заражения в значительной степени увели-
чивает проникновение X- и У-вирусов в клубни. Причины этого неизвестны,
однако следует помнить, ч1о прищипка способствует отрастанию новых моло-
дых побегов.
456
Глава XVIII
Борьба с переносчиками
Прежде чем предпринимать какие-либо меры для борьбы с переносчи-
ком, распространяющим вирус, необходимо определить, какой организм
является переносчиком данного вируса. Иногда сведения такого рода полу-
чить трудно. Так, в течение многих лет велись поиски переносчика вируса
мозаики персика в Калифорнии. При этом было проверено около 150 видов
насекомых и клещей, пока, наконец, не удалось показать, что инфекцию1
распространяет клещ Eriophyes insidiosus (Keifer и Wilson) [1916]. Нередко
основным или даже единственным переносчиком вируса является не вид,
постоянно связанный с данной культурой, а насекомое, попавшее на нее слу-
чайно. В Австралии вирус некротического пожелтения салата-латука спе-
цифически передается тлей Hyperomyzus lactucae (L.). Эта тля размножается
на дикорастущих растениях, восприимчивых к вирусу (Sonchus spp.). Опа
переносит вирус на культивируемый и дикий салат-латук, по не может жить
па этих растениях дольше нескольких дней (Стаббс, личное сообщение).
Тем не менее эти виды салата-латука должны, очевидно, чем-то привлекать
тлей, поскольку некоторые другие виды растений в поле тли пе заражают,
несмотря на то что их восприимчивость к инфекции доказана эксперимен-
тально.
Насекомые-переносчики
Инсектициды. В борьбе с насекомыми, вредящими растениям, приме-
няется большое число различных инсектицидов. Чтобы уничтожить насеко-
мых, причиняющих какой-либо культуре прямой ущерб, необходимо просто1
понизить численность их популяции до такого уровня, при котором этот
ущерб уже не будет иметь существенного значения. Гораздо более трудной
проблемой является борьба с насекомыми — переносчиками вирусов, так
как для распространения вируса достаточно сравнительно небольшого числа
крылатых особей. Инсектициды контактного действия дают надлежащий
эффект лишь при многократной обработке растений. Более перспективными
в смысле защиты от вирусных болезней представляются персистентные
инсектициды, особенно в том случае, если они передвигаются по проводя-
щей системе растения. Различные вирусы часто заносятся в культуру крыла-
тыми тлями, которые, питаясь, могут заразить растение при первом же кон-
такте с ним, до того, как сами они погибнут от действия инсектицида. Если
вирус передается стилетом, то севшая на растение тля быстро утрачивает
инфекционность, и в таком случае уже не существенно, будет ли она после
этого уничтожена или нет (если иметь в виду заражение культуры извне).
Иначе обстоит дело с тлями, которые передают циркулирующий вирус.
Такие тли обычно способны заразить большое число растений, и потому их
уничтожение при питании на первом же растении будет ограничивать распро-
странение инфекции.
Что касается последующего распространения вируса внутри посева или
насаждения, то здесь действуют сходные факторы. Поскольку при распро-
странении циркулирующего вируса насекомое питается на зараженном рас-
тении достаточно долго, обработка инсектицидами сильнее снижает распро-
странение таких вирусов, чем вирусов, которые передаются стилетом.
Различия такого рода обнаружили Бурт и др. [307] при изучении дей-
ствия двух системных инсектицидов на распространение двух вирусов карто-
феля тлей М. persicae. Под влиянием этих инсектицидов распространение
персистентного вируса скручивания листьев в значительной степени ограни-
чивалось, в то время как на распространение неперсистентного У-вируса
такая обработка не оказала почти никакого влияния.
Экономическое значение вирусных болезней и защитные меры 457
Чтобы определить время, па протяжении которого происходит наиболее
интенсивное распространение вируса скручивания листьев на картофельных
полях в Англии, Бурт и др. [308] проводили опрыскивание растений систем-
ными инсектицидами в разные сроки. Полученные ими результаты показали,
что особенно большое значение имеет распространение инфекции крылатыми
тлями is начале вегетационного периода; поэтому обработку системными
ядами следует проводить возможно раныпе.
Точно так же, как с У-вирусом картофеля, обстоит дело и с другими
вирусами, которые передаются стилетом (например, с вирусом мозаики сала-
та-латука). Обработка инсектицидами не обеспечивает в этих случаях эффек-
тивной защиты от вируса.
Опрыскивание имеет ряд отрицательных сторон. Это дополнительная
операция, во время которой растения повреждаются трактором, а потому
не всегда целесообразно проводить опрыскивание именно тогда, когда оно
всего более необходимо. Кроме того, при опрыскивании инсектициды иногда
разносятся ветром по полю и могут при этом повреждать другие культуры..
Перечисленных неудобств можно в значительной степени избежать, если
вместо опрыскивания применять системные инсектициды в гранулированной
форме, вводя их в почву во время посева. При посадке картофеля определен-
ное количество гранул можно впоситт» в борозду с помощью специального
приспособления, прикрепленного к посадочной машине. Некоторые систем-
ные инсектициды применялись в таком виде, и это дало хорошие результаты
в борьбе с вирусом скручивания листьев картофеля [383, 1624].
Дисульфотон и форат — инсектициды, используемые в борьбе против
тлей, — пригодны для внесения в почву в гранулированном виде. Они плохо-
растворяются в воде и потому поступают в почву из гранул медленно, так что
растения поглощают их па протяжении длительного периода [382, 383]. Эти
инсектициды обеспечивают защиту картофеля от тлей в течение по крайней
мере 10 пед после посадки. В одном из опытов через 55—65 дней после посад-
ки картофеля па сто листьев приходилось па необработанных участках 1300—
3300 тлей, а на обработанных 10—25. Проведение таких мер борьбы с тлями
в значительной степени ограничивало распространение вируса скручивания
листьев от больных растений к здоровым внутри культуры. Однако гранули-
рованные системные инсектициды ие всегда дают надлежащий эффект.
Например, хотя душистый горошек при внесении таких инсектицидов стано-
вится токсичным для тлей, но это не снижает числа растений, зараженных
вирусом обыкновенной мозаики гороха (передается стилетом) и вирусом
деформирующей мозаики (циркулирующий вирус) [843].
Применение неподходящих инсектицидов может привести к повышению
зараженности культуры либо потому, что тли будут растревожены, либо
из-за того, что при этом погибнут хищники, поедающие тлей. Бродбент и др.
[290] обнаружили, например, что грядки нарциссов, опрыснутые ДДТ или
системным фосфорорганическим инсектицидом, были поражены, вирусом
желтой штриховатости в большей степени, чем необработанные грядки.
Активизировались после обработки почти всегда только крылатые тли; пере-
мещения бескрылых форм не отмечалось.
Распространение вируса желтухи свеклы также может усилиться
в результате применения таких инсектицидов, как ДДТ и трихлорофон [477,
841]. В то же время правильно применяемые фосфорорганические инсекти-
циды задерживают распространение вирусов желтухи тлями внутри посевов
[840]. Будет ли такое опрыскивание приносить экономический эффект, зави-
сит от времени и степени распространения вируса в данном вегетационном
сезоне. В Англии опрыскивание, проведенное в июне, дает ощутимую при-
бавку урожая в тех случаях, когда на необработанных участках желтухой
поражено более 20% растений. Разработана система профилактических
458
Глава XVIII
опрыскиваний для фермерских .хозяйств, основанная на ежедневном подсчете
тлей, питающихся на данной культуре [840]. Фермеры получают соответ-
ствующее предупреждение (относительно необходимости опрыскивания)
всякий раз, как в их районе число тлей достигает определенного уровня
(1 тля на 4 растения).
Очень большое значение имеет время опрыскивания. С 1962 по 1966 г
опрыскивание в сроки, определяемые путем подсчета тлей, снижало пора-
женность желтухой на 37%. Если же опрыскивание проводили па две педели
раньше или позже, то пораженность снижалась всего на 24—25% [842].
Вирус желтой карликовости ячменя — возбудитель главного заболе-
вания, поражающего пшеницу в Новой Зеландии. Обнаружено два периода
распространения вируса в посевах этой культуры. Первый период — это
осень (май), когда крылатые тли приносят инфекцию извне. Небольшая
популяция тлей зимует па посевах, и второй период распространения инфек-
ции (уже внутри посевов) начинается во время размножения тлей воспой
(сентябрь). (Напомним, что речь идет о Южном полушарии.) Система пре-
дохранительных опрыскиваний основывается на подсчете тлей во время
осепней миграции [384]. Такой четкий интервал между двумя периодами
распространения инфекции дает значительно большую свободу при выборе
времени опрыскивания (с июля по сентябрь), чем при выращивании сахарной
свеклы в Европе. В табл. 22 показано увеличение урожая пшеницы в резуль-
тате весеннего и осеннего опрыскивания эффективным фосфорорганическим
инсектицидом.
Таблица 32
Влияние опрыскивания системным инсектицидом на пораженность трех сортов
пшеницы вирусом желтой карликовости ячменя и на урожай [1623]
Сорт Аотеа Сорт Крозс 7-35 Сорт 705.01
Обработка поражен- ность, % урожай, бушели на акр поражен- ность, % урожай, бушели на акр поражен- ность, % урожай, бушели на акр
Опрыскивание 11 72 7 61 4 67 1)
весной и осенью Без опрыски- 33 59 32 48 32 61
вания
1) Слабое поражение стеблевой ржавчиной.
Цветная вклейка 1 иллюстрирует влияние опрыскивания иа внешний
вид посевов во время сбора урожая. Более светлый цвет обработанных
участков зависит от созревания растений. Опрыскивание посевов риса
системными инсектицидами снизило зараженность вирусом [1316].
Опрыскивание масляными эмульсиями. После
того как вирофорные тли прокалывали парафиновую пленку, их способ-
ность передавать У-вирус картофеля значительно снижалась [241]. Было
показано, что это зависит не от самого парафина, а от содержащегося в нем
масла. Другие масла обнаруживали сходное действие [248, 257]. Эти наблю-
дения послужили основой для разработки метода опрыскивания масляными
эмульсиями как одного из способов защиты растений от вирусов, распро-
страняемых тлями. Трудности были связаны с тем, что масла токсичны для
растений. Кроме того, нелегко было добиться, чтобы эмульсия покрывала
растение равномерно, включая и нижнюю поверхность листьев.
Экономическое значение вирусных болезней и защитные меры 459
Фиг. 97. Влияние опрыскивания масляной эмульсией на распространение вируса огуреч-
ной мозаики [1091].
I — контроль; II — опыт.
Проводя опыты в теплице, Лёбенштейн и др. [1090] обнаружили, что
опрыскивание огурцов 1%-иой водной эмульсией соответствующего масла
с добавлением детергента предохраняло растения от заражения вирусом
огуречной мозаики (который переносится тлей Aphis gossypii). Позже было
найдено, что опрыскивание масляной эмульсией снижает в полевых усло-
виях распространение У-вируса на картофеле [258] и вируса огуречной моза-
ики на огурцах [1091]. Фиг. 97 показывает влияние такой обработки па рас-
пространение вируса огуречной мозаики.
Лёбенштейн и его сотрудники отмечают, что опрыскивание посевов мас-
ляными эмульсиями положительно сказывалось на урожае лишь в том случае,
если заражение происходило в начале вегетационного периода, так что рост
контрольных (необработанных) растений резко угнетался. Такое опрыски-
вание не приносило растениям особого вреда; в тех же условиях орошение
дождеванием предотвращало скопление масла па листьях. Большая часть
работ, в которых исследовалась возможность использования масляных
эмульсий, проводилась с вирусами, которые передаются стилетом, но поло-
жительный результат был отмечен и. для вируса желтухи свеклы [1811, 1812].
Некоторые масла действуют специфично. Так, кукурузное масло предотвра-
щает передачу тлей М. persicae вируса мозаики свеклы, по ие вируса желтухи
[1810]. Механизм защитного действия масляных эмульсий пока неясен.
Масла, в молекуле которых содержится 16 или менее атомов углерода, неэф-
фективны; вероятно, это объясняется тем, что они способны испаряться
(Брэдли, личное сообщение). Кроме того, опрыскивание больных растений
затрудняет поглощение вируса тлями. В определенных условиях опрыски-
вание масляной эмульсией зараженных и «подозрительных» растений, нахо-
дившихся рядом с посевами, уменьшало заражение посевов извне. Сейчас
известно, что опрыскивание масляными эмульсиями тормозит распростране-
ние примерно 10 вирусов (из 100, которые передаются стилетом). Такую
обработку экономически выгодно проводить там, где вирусы вызывают еже-
годные потери урожая. Большое преимущество масляных эмульсий, по срав-
нению с инсектицидами, заключается в том, что для животных и человека
масла нетоксичны.
460
Глава XVIII
Н е х и м и ч е с к и е барьеры для переносчиков.
Испытывались различные средства, которые могут служить барьером, пре-
пятствующим проникновению насекомых в культуру или отпугивающим их.
Иногда высокие покровные культуры защищают растения второго яруса
от поражения вирусами, которые распространяются насекомыми. Так,
в частности, обстоит дело при совместном выращивании тыквы и кукурузы.
Показано, что в определенных условиях такие заградительные культуры
играют положительную роль. Так, Бродбент [280] обнаружил, что если во-
круг грядок с рассадой цветной капусты посеять узкую полоску ячменя (три
ряда на расстоянии 30 см один от другого), то это может снизить поражение
рассады вирусом примерно на 20%. Ячмень не поражается вирусами кресто-
цветных. Многие тли, прилетающие извне, оседают на заградительной куль-
туре, пробуют питаться, а затем или остаются иа ней, или улетают. Если
такие тли затем и переходят на капусту, то к этому времени они уже успе-
вают утратить любой пеперсистентный вирус, который они песли, начав
питаться па растениях ячменя.
В долине Иордапа (Израиль) соломенная мульча может служить барье-
ром для белой мушки, заражающей огурцы вирусом мозаики бутылочной
тыквы. На участках с соломенной мульчой развитие инфекции задержива-
лось и заметное увеличение урожая было в какой-то степени следствием сни-
жения числа больных растений [1275].
Имеются сведения о том, что при выращивании некоторых культур
в борьбе с тлями используется алюминиевая фольга, которой покрывают
почву. Тлей, приближающихся к этому участку, вероятно, отпугивают отра-
женные ультрафиолетовые лучи. Смит и др. [1620] сообщают, что когда
такую фольгу помещали на грядки с гладиолусами, количество тлей, отлов-
ленных на этих грядках, уменьшалось примерно на 95%, а число растений,
зараженных вирусом огуречной мозаики, снижалось на две трети. С другой
стороны, когда фольгу использовали для защиты посадок дыни от вируса
мозаики арбуза, это лишь задерживало появление симптомов [450]. Тот же
метод пытались применить и при выращивании высококачественных сортов
хризантем и также безрезультатно [692].
Защита растений с помощью хищников и па-
разитов насекомых. Несомненно, что паразиты и хищники
играют главную роль в ограничении роста популяции тлей. На фиг. 98 пока-
заны результаты опытов, проведенных Эвансом [502] в Танзании. На
отдельных растениях арахиса, находящихся в разных участках поля, он
выбирал небольшие колонии тлей Aphis craccivora (каждая такая колония
Фиг. 98. Рост небольших колоний тлей на растениях арахиса и последующее снижение-
числа тлей в результате их уничтожения хищниками [502].
I — тли; II — хищники.
Экономическое значение вирусных болезней и защитные меры 461
состояла из одной взрослой особи и пяти нимф), а затем следил за их ростом
и наблюдал, как отражается иа нем появление хищников.
В некоторых условиях хищники могут в какой-то степени ограничивать
распространение определенного вируса, но обычно значение их невелико,
«ели они появляются после ранней миграции тлей, так как для распростра-
нения вируса наиболее важен именно этот период. Стаббс [1690] считает, что
вирус пестрой карликовости моркови, вызывающий эпифитотии этой болезни
в Австралии, не причиняет такого ущерба в Калифорнии из-за того, что здесь
на тле Cavariella aegopodii, передающей вирус, активно паразитируют осы-
бракоииды, которых в Австралии, насколько известно, пот. Недавно в районе
Мельбурна искусственно ввели хищника тлей (Aphidius), после чего тли
практически исчезли и вирус пестрой карликовости моркови более уже не
причиняет ущерба в этой зоне (Стаббс, личное сообщение). В то же время
Треш [1766] в Западной Африке пытался использовать паразитов (грибы,
и перепончатокрылые) в борьбе с червецами, переносящими вирусы дерева
какао, и не добился успеха (несмотря па то что эти переносчики сравнитель-
но малоподвижны).
Нематоды
В принципе обработка почвы нематоцидами должна обеспечивать защи-
ту растений от вирусов, распространяемых нематодами. Передвижение
и распространение нематод происходит обычно медленно, а потому можно
рассчитывать, что действие одной такой обработки будет длиться дольше,
чем действие инсектицидов. С другой стороны, как указывает Сол [1637],
инфекционные нематоды могут встречаться и на значительной глубине.
С помощью почвенных проб, взятых на глубине до 80—100 см, удавалось
заражать растения вирусом погремковости табака. Следовательно, вполне
возможно, что обработанная почва будет вновь заселяться нематодами из
более глубоких слоев, т. е. из тех мест, где они избежали действия фуми-
гации.
Харрисон и др. [733] провели полевые опыты в некоторых районах
на юге Англии и показали, что в результате летней обработки почвы дихлор-
пропаном-дихлорпропеиом (Д-Д) или метилбромидом в количестве около
1000 кг/га погибло свыше 99% нематод Xiphinema diversicaudatum, находив-
шихся в почве. Обработка резко снизила заражение земляники вирусом мозаи-
ки резухи. Земляника была посажена после фумигации и обследована через
1—2 года. При использовании обоих ядохимикатов гибель нематод отмеча-
лась в почве па глубине до 70 см (наибольшая глубина, с которой брали про-
бы почвы). Зараженность растений на участках, обработанных фумиганта-
ми, зависела от количества выживших нематод (фиг. 99).
В условиях опыта, результаты которого представлены на фиг 99, при
уничтожении 99% нематод зараженность растений вирусом снизилась на
‘97%, а при уничтожении 90% нематод — всего па 56%. С другой стороны,
по подсчетам Харрисона и др. [733], в тех случаях, когда популяция
нематод X. diversicaudatum редуцируется до такой степени, что на 2 л почвы
приходится менее одной нематоды, обработку почвы следует проводить только
один раз в несколько лет, так как численность нематод возрастает медленно.
Мурант и Тейлор [1252] также показали, что однократная фумигация
почвы Д-Д или пентахлорнитробензолом (ПХНБ) полностью защищает
землянику от поражения вирусом черной кольцевой пятнистости томатов
и вирусом кольцевой пятнистости малины (оба вируса передаются немато-
дой Longidorus elongatus). Лучшим из двух фумигантов был ПХНБ, так как
он не оказывал никакого заметного действия на рост растений. Под влия-
нием Д-Д увеличивалась облиственпость растений, вследствие чего во влаж-
462
Глава XVIII
Фиг. 99. Фумигация почвы как мера борьбы
с нематодами, передающими вирус мозаики
резухи [733].
__ % больных растений в опыте 100'
% больных растений в контроле ’
N___ Число нематод в опыте х 100
Число нематод в контроле
иые годы растения сильно поражались Botrytis cinerea. Поскольку L. elon-
gatus имеет широкий круг растений-хозяев (культурные сорта и сорняки)
и может в течение долгого времени обходиться вообще без пищи, освободить
почву от этой нематоды только с помощью севооборота невозможно [1749].
Наилучшим способом защиты от вирусов, которые передаются L. elongatus,
является, по-видимому, уничтожение присутствующего в почве перенос-
чика с помощью химических средств. Однако высокая стоимость таких
препаратов ограничивает их применение, делая его экономически целе-
сообразным лишь на определенных культурах, например па ягодных
кустарниках.
Грибы
При выращивании салата-латука в теплице поражение растений виру-
сом крупных жилок снижалось, если почву перед посевом обрабатывали
некоторыми фумигантами, в том числе хлорпикрином и смесью дихлор-
пропена и дихлорпропапа (Д-Д) [683]. Довольно успешными были и полевые
опыты, проведенные с целью полностью или частично уничтожить в почве
Olpidium (этот гриб является переносчиком данного вируса). Марлат и Мак-
Китрик [1161] обнаружили, что если обрабатывать полевые участки ПХНБ
из расчета 80 кг/га, то пораженность растений вирусом крупных жилок сни-
жается примерно вдвое. Последействие одной такой обработки сказывалось
в течение двух лет. Созревание растений при этом несколько задерживалось.
Человек
Для некоторых вирусов, передающихся механическим путем, и в част-
ности для ВТМ, главным фактором распространения служит деятельность
человека при выращивании и обработке культуры. Если такие культуры,
как табак или томат, уже заражены ВТМ, то ограничить распространение
вируса очень трудно, особенно при пасынковании и подвязке растений.
Защитные мероприятия сводятся к дезинфекции инвентаря и мытью рук.
Бродбент [281] рекомендует использовать для этого 3%-ный раствор трех-
замещенного ортофосфата натрия. Мулхолланд [1244] сообщает, что если
пользоваться для обрезки растений ножом особой конструкции, то можно
довольно успешно избежать распространения ВТМ. Такой нож имеет полую
пластиковую ручку, которая заполняется 10%-ным раствором ортофосфа-
тата натрия с добавкой детергента; во время работы раствор медленно сте-
кает по лезвию ножа. Рабочая одежда обычно сильно загрязняется ВТМ,
и в этом случае вирус распространяется при контакте такой одежды с расте-
ниями. На одежде, оставленной в темном закрытом помещении, ВТМ может
Экономическое значение вирусных болезней и защитные меры 463;
сохраняться в течение трех лет [285], по при дневном: свете он инактиви-
руется через несколько педель. Почти полную дезинфекцию одежды обеспе-
чивает сухая чистка или стирка в горячей воде с детергентом.
ВТМ — наиболее стабильный из всех вирусов, передающихся механи-
ческим путем. Однако и другие вирусы этой группы довольно легко пере-
даются, например, через ножи, которыми пользуются для обрезки растений,
и т. п. Таким способом распространяются вирус пестролепестпости тюльпана,
вирус мозаики цимбидиума, Х-вирус картофеля, вирус веретеновидпости
клубней картофеля и некоторые вирусы гладиолуса [279].
Иммунные, устойчивые и толерантные сорта
В гл. XII мы уже говорили о генетически детерминированной устойчи-
вости и иммунности. Введение генов устойчивости в растения определенных
сортов (пригодных для сельскохозяйственного производства) с последующим
размножением растений, устойчивых или иммунных к заражению, представ-
ляет собой одно из лучших решений проблемы вирусных болезней. Попытки
в этом направлении предпринимаются в отношении почти всех особенно-
вредоносных болезней растений. Гены, ответственные за устойчивость, гипер-
чувствительпость или иммунность, удается выявить довольно часто, но обыч-
но их очень трудно ввести в растения нужных сортов. Иногда полная иммун-
ность к вирусу обнаруживается даже у такого растения, у которого боль-
шинство известных сортов отличается высокой восприимчивостью. Например,
сеянец картофеля сорта USDA 41956 оказался иммунпым к Х-вирусу. Опре-
деленные сорта малины иммупны к вредоносным вирусам, передающимся
через почву [312].
Цветная вклейка 1 иллюстрирует поразительный эффект генетичес-
кой устойчивости, который можно наблюдать в поле в период сильной
эпифитотии.
В некоторых случаях работа по выведению устойчивых сортов увенча-
лась крупным успехом. Вирус мозаики сахарного тростника представлял
собой серьезную угрозу для этой культуры до тех пор, пока иа Яве не были
обнаружены устойчивые сорта P.O.J, на основе которых были затем созданы
новые устойчивые сорта [1703]. В то же время Рассел [1461] среди 100 000
растений не смог обнаружить ни одного, устойчивого к вирусу желтухи
сахарной свеклы. Позднее, правда, он сообщил, что среди линий, толерант-
ных к вирусу, ему удалось найти растения, в известной мере устойчивые
к вирусам желтух [1463].
Полевую устойчивость к вирусу может проявлять сорт с гиперчувстви-
тельной реакцией на заражение. В этом случае на растениях появляются
местные некрозы, а системного распространения вируса не происходит.
Выведены, например, некоторые линии N. tabacum, обладающие некроти-
ческой реакцией на ВТМ, которая характерна для N. glutinosa [1807]. Поле-
вая устойчивость той или иной культуры может зависеть и от того, что
отдельные зараженные растения быстро погибают, вследствие чего источник
инфекции устраняется.
Если среди растений-хозяев не удается обнаружить таких, которые обла-
дали бы генетической устойчивостью или иммунностью, то иногда ведутся
поиски толерантных сортов или рас. Толерантность к определенным виру-
сам описана примерно у 30 видов культурных растений. Однако выращива-
ние толерантных растений — значительно менее удовлетворительное реше-
ние проблемы, чем культивирование растений, обладающих генетической
устойчивостью или иммунностью. Причин для этого несколько.
1. Зараженные толерантные растения служат источником инфекции
для других растений; поэтому совместное выращиЬание толерантных и вое-
464
Глава XVIII
приимчивых сортов в условиях, где распространение вируса может проис-
ходить быстро, дает плохие результаты.
2. Во время вегетации происходит заражение большого числа растений.
Изменения в генетическом аппарате растения или вируса могут привести
к утрате реакции толерантности.
3. Вирусная инфекция иногда повышает восприимчивость растений
к грибным заболеваниям (гл. XII). Тем не менее толерантные сорта в сравне-
нии со стандартными дают гораздо лучшие урожаи, если условия таковы,
что вирусная инфекция может причинить серьезный ущерб и если вблизи
посевов имеется большой очаг инфекции, который не может быть уничтожен.
Особенно пригодны толерантные сорта в том случае, когда культура является
однолетней, а для посадок используется свободный от вируса материал.
В Калифорнии, например, производство сахарной свеклы практически цели-
ком базируется па сортах, толерантных к вирусу курчавости верхушки.
Довольно успешно используются сорта ячменя, толерантные к вирусу жел-
той карликовости [868], и сорта хлопка, толерантные к вирусу скручивания
листьев [1747].
Поведение некоторых сортов в полевых условиях определяется тем, что
эти сорта по той или иной причине непривлекательны для насекомых-пере-
носчиков. Разные сорта арахиса при выращивании в сходных условиях
в разной степени поражаются вирусом розеточиости, что можно объяснить
их неодинаковой привлекательностью для переносчика данного вируса
Aphis crassivora [502]. В полевых условиях не всегда возможно определить,
какой вклад в устойчивость сорта вносит невосприимчивость растений
к вирусу, а какой — их непривлекательность для переносчика. Сочетание
этих двух факторов дает иногда в полевых условиях поразительный
эффект; растения избегают и массового заселения тлями, и заражения
вирусом.
Основная трудность при создании устойчивых сортов связана с возмож-
ностью образования или появления иа данной территории новых штаммов
вируса или новых рас переносчика, по отношению к которым эти сорта ока-
зываются восприимчивыми.
Гиддингс [625] сообщает, что сорта сахарной свеклы, которые были
ранее устойчивы к вирусу курчавости верхушки, впоследствии утратили
это свойство.
Сорта, устойчивые или гиперчувствительные по отношению к штаммам
определенного вируса, распространенным в данной зоне, могут оказаться
восприимчивыми к штаммам того же вируса, встречающимся в других зонах.
Определенные сеянцы картофеля обладали гиперчувствительностыо по
отношению к штаммам Х-вируса, встречающимся в Австралии. Однако ког-
да затем потомство этих сеянцев пытались выращивать на территории
Англии, то гиперчувствительности у них пе обнаружили [850].
Считалось, что ген L, обнаруженный у растений перца, защищает эту
культуру от системного заражения всеми штаммами ВТМ. Однако Гринлиф
и др. [677] обнаружили штамм ВТМ, вызывающий системную инфекцию
также и у растений перца, обладающих этим геном.
Трудности при подборе исходного материала для селекции значительно
увеличиваются, если приходится иметь в виду различные штаммы не одного,
а нескольких вирусов (именно так обстоит дело в Африке с деревом какао)
[650].
Проблема вирусных штаммов в селекционной работе хорошо иллюстри-
руется опытами Раста [1400, 1401], который для заражения 30 клонов Lyco-
persicum peruvianum использовал 64 различных изолята ВТМ. Даже если
различные изоляты были выделены из одного и того же штамма ВТМ (судя
по симптомам на томатах и табаке), они отличались друг от друга по составу
Экономическое значение вирусных болезней и защитные меры 465
клонов L. peruvianum, которые были к ним восприимчивы. Каждый клон
был восприимчив по крайней мере к одному изолиту.
И в тех случаях, когда выведенный сорт представляется устойчивым,
при его выращивании имеет смысл принимать определенные меры для того,
чтобы уменьшить контакт растений с вирусом. Даусон [438] сообщает, на-
пример, что в томатах, устойчивых к ВТМ, вирус в течение нескольких педель
не распространялся по растениям системно и обнаруживался в низких кон-
центрациях. Однако экстракты из таких зараженных растений, устойчивых
к вирусу, оказались более инфекционными для здоровых устойчивых расте-
ний, чем экстракты из растений восприимчивых лилий. Устойчивые расте-
ния, зараженные таким вирусом, давали более четкие симптомы.
Защита при помощи слабых штаммов вируса
Заражение растения слабым штаммом вируса может иногда защитить
это растение от сильного штамма того же вируса. Некоторые исследователи
предлагают поэтому специально заражать растения слабыми штаммами
вируса в качестве защитного мероприятия. Такой прием, однако, может
быть использован только в очень тяжелой ситуации. Для обычной практики
его нельзя рекомендовать по ряду причин: 1) так называемые слабые штаммы
часто снижают урожай примерно на 5—10%; 2) искусственно зараженные
культуры могут служить источником вируса для растений других] видов
и сортов; 3) в некоторых растениях доминирующий штамм вируса может
изменить свои свойства и стать более агрессивным; 4) при смешанном зараже-
нии (если в культуру попадают неродственные вирусы) растения иногда
бывают поражены очень сильно.
Бродбент [282] считает, что, поскольку позднее заражение томатов
в теплице вирусом табачной мозаики часто вызывает резкое ухудшение
качества плодов (по сравнению с заражением в ранние сроки), в тех хозяй-
ствах, где это явление наблюдается регулярно, растения следует на ранних
стадиях специально заражать слабым штаммом вируса. Правда, найти сла-
бый штамм ВТМ, поражающий томаты и в то же время не вызывающий боль-
ших потерь урожая, довольно трудно [287]. Следует, однако, сделать одну
оговорку: важно, в каких условиях производится оценка таких потерь. Как
указывает Раст [1400], в субоптимальных условиях, от которых здоровые
растения страдают сильнее больных, поражение слабым штаммом вируса
выражается иногда в совершенно ничтожном снижении урожая. Тем не менее
при оптимальных условиях тот же самый штамм вируса может явиться
причиной довольно серьезных потерь.
Защита с помощью антивирусных препаратов
Значительные усилия были затрачены на поиски таких ингибиторов,
которые, блокируя заражение растений и процесс репродукции вирусов,
давали бы прямой эффект в смысле защиты культуры от вирусов, подобно
тому как фунгициды защищают растения от патогенных грибов. В гл. XIV
мы перечисляли типы испытанных соединений такого рода и обсуждали их
действие.
Главные трудности при поисках таких ингибиторов заключаются в сле-
дующем:
1. Эффективный антивирусный препарат должен блокировать процесс
заражения и репродукцию вируса, не повреждая при этом само растение.
Это первая и главная проблема. Размножение вируса настолько тесно свя-
зано с процессами, происходящими в клетке, что любое вещество, блоки-
рующее это размножение, будет скорее всего повреждать и растение. Едии-
30-0893
466
Глава XVIII
ственный известных! нам вирусоспецифичный процесс — это РНК-зависи-
мый синтез вирусной РНК. Ингибиторы, блокирующие один только этот
процесс и не затрагивающие никаких других внутриклеточных процессов,
могут быть эффективными в борьбе с вирусной инфекцией. По-видимому,
2-тиоурацил блокирует синтез вирусной РНК; однако, к сожалению, он
оказывает и побочное действие.
2. Чтобы предотвратить заражение, происходящее при участии пере-
носчиков-беспозвоночных, эффективный антивирусный препарат должен
передвигаться по проводящей системе растения. В гл. XVI мы уже говорили,
что определенные вещества, присутствующие только на листовой поверхно-
сти, могут оказывать некоторое защитное действие против вирусов, переда-
ющихся механическим путем (например, против ВТМ).
3. Препарат системного действия должен сохранять свою активность
в течение достаточно длительного времени, так как проводить частые обра-
ботки было бы экономически невыгодно. Многие соединения, обладающие-
антивирусной активностью, инактивируются в растении.
4. Необходимо, чтобы такой препарат можно было производить в боль-
ших количествах и чтобы стоимость его была не слишком высока. Это тре-
бование относится к большей части культур и вирусов, однако оно пе рас-
пространяется на такие высокоценные культуры, как, например, тепличные-
орхидеи.
5. Для того чтобы антивирусный препарат можно было использовать,
на многих культурах, он должен удовлетворять требованиям, предъявляе-
мым правилами по контролю за качеством пищевых продуктов и медикамен-
тов. Многие препараты, которые были опробованы в экспериментах, оказа-
лись с этой точки зрения неудовлетворительными.
Холмс [820], работавший с растениями табака, содержащими ген N
и реагирующими на заражение ВТМ системным некрозом, смачивал поч-
ву, в которой выращивались растения, 0,01%-ным раствором 2-тиоурацила.
Часть растений удалось таким способом защитить от системного заражения-
вирусом. Холмс отмечает, что такая обработка позволяет в условиях инфек-
ции получать семена при скрещивании растений. Однако вряд ли этот пре-
парат может найти практическое применение.
В строго контролируемых условиях теплиц опрыскивание растений
N. tabacum и N. glutinosa раствором 8-азагуанина защищало их от зараже-
ния вирусом мозаики люцерны при механической инокуляции; какого-либо
заметного вреда растениям такая обработка не приносила. Аналогичным
образом действовало и увлажнение почвы вокруг растений огурцов, также-
в строго определенных условиях; при этом снижалась пораженность огур-
цов вирусом огуречной мозаики, который передается тлями [1173]. Это при-
меры наиболее удачных находок в поисках системного антивирусного пре-
парата, который обладал бы защитным действием и при этом не повреждал
растения. Однако в практике сельского хозяйства такие препараты пока еще-
не применяются. Особое внимание нужно обращать на время обработки
(с учетом времени заражения). Обработку следует повторять часто, так как-
внутри растения 8-азагуанин очень быстро превращается в неактивный
8-азаксантин. Защита растений от вируса огуречной мозаики, который пере-
дается тлями, оказывается гораздо менее эффективной в тех случаях, когда
количество инфекционных тлей больше. Если на растении уже появились,
признаки системного поражения, то использование 8-азагуанииа пе предот-
вращает дальнейшего распространения инфекции. Результаты, получен-
ные при работе в теплице, не воспроизводятся полностью в полевых усло-
виях. В таком случае этот препарат повреждает некоторые растения. Это,
по-видимому, происходит из-за того, что растения во время обработки нахо-
дятся на разных стадиях роста. Кроме того, защита оказывается недоста—
Экономическое значение вирусных болезней и защитные меры 467
точно эффективной потому, что препарат неравномерно покрывает растения
и частично смывается дождями. Суммируя, можно сказать, что 8-азагуапип
не является надежным препаратом для работы в изменчивых полевых усло-
виях. Слишком мал интервал между той его концентрацией, которая блоки-
рует размножение вируса, и той, которая повреждает растение.
В настоящее время в отношении многих вирусов гораздо более перспек-
тивной считается борьба с насекомыми-переносчиками при помощи систем-
ных инсектицидов, а не прямое] химическое воздействие па репликацию
вируса в самом растении.
Защита от распространения вирусов на большие расстояния
В странах с высокоразвитым хозяйством установлен порядок, предот-
вращающий завоз новых заболеваний и распространение тех, которые здесь
уже существуют. Сейчас во многих странах введены строгие правила с целью
препятствовать проникновению отдельных вирусов и их переносчиков,
иногда из каких-то определенных государств или зон. Введение карантин-
ных ограничений и принятие эффективных мер для их выполнения — слож-
ная проблема. Экономические и политические факторы часто играют при этом
немаловажную роль. Карантинные меры могут быть очень цепными в борьбе
с теми вирусами, которые передаются семенами или сохраняются в покоя-
щихся .вегетативных органах (например, в почках древесных пород). При
совместных усилиях стран или областей, которые экспортируют и импорти-
руют растительный материал, выполнение карантинных мер может быть
очень действенным средством защиты от вирусных болезней растений.
Насколько эффективно карантинные меры ограничивают распростране-
ние вирусов на большие расстояния, сказать трудно. В Новой Зеландии
вирусы были впервые включены в число карантинных объектов в 1952 г.
При ознакомлении с фиг. 86 может показаться, что введение карантина
в отношении вирусов мало сказалось на проникновении новых вирусов
в страну. Однако несомненно, что многие вирусы, впервые описанные
в Новой Зеландии в 1952 г., существовали здесь и раньше. Быть может,
потребуется еще 10 или 20 лет, чтобы удостовериться в том, что проник-
новение новых вирусов иа территорию Новой Зеландии приостановилось.
30*
ГЛАВА XIX
РАСПРЕДЕЛЕНИЕ ПО ГРУППАМ РАСТЕНИЙ
В настоящее время наши знания, касающиеся вопросов о том, как пора-
жаются вирусами различные группы растений и как происходит распределе-
ние вирусов по этим группам, являются отрывочными и неполными. Возмож-
но, это обусловлено двумя причинами. Первая причина заключается в том,
что вирусологи, изучающие вирусы растений при исследовании болезней,
которые они обнаруживают в поле, интересуются, как правило, вирусами,
наносящими экономический ущерб при выращивании культурных растений.
На поражение растений других видов они обращают внимание лишь постоль-
ку, поскольку эти виды могут играть роль резерваторов вируса или резер-
ваторов переносчика вируса, который поражает виды культурных растений.
Поэтому еще совсем недавно круг хозяев всех известных нам вирусов расте-
ний был ограничен покрытосеменными. В этой группе большая часть расте-
ний-хозяев была представлена полевыми или садовыми культурами или это
были сорняки, сопровождающие культурные растения, которые произраста-
ли в районах, где было развито сельское хозяйство.
Большинство населения земного шара использует в пищу растения
12 видов: рис, пшеницу, кукурузу, сахарную свеклу, сахарный тростник,
картофель, батат, маниок, фасоль, сою, кокосовые орехи и бананы. Из 630
вирусов или вирусоподобных заболеваний, перечисленных в списке Миколо-
гического института в Англии [1164], 96 вирусов поражают эти 12 видов
растений. Как обычно считают, число видов покрытосеменных растений
составляет примерно 250 000 [1915]. Следовательно, около 15% всех описан-
ных вирусов или вирусоподобных организмов обнаружено примерно у 0,005%
известных видов растений. Табак и томаты представляют собой пример ино-
го рода. Обе эти однолетние культуры требуют при своем выращивании
больших затрат на единицу площади. Известно, что табак и томаты являются
основными растениями-хозяевами для тридцати различных вирусов. Из низ-
ших растений очень немногие используются в промышленных целях. Не уди-
вительно поэтому, что первый вирус из числа поражающих представителей
этой группы растений был обнаружен у культивируемых грибов.
Вторая причина ограниченности наших знаний является более спорной.
Как уже обсуждалось в гл. XVII, представляется вероятным, что наличие
широко распространенных и выраженных в сильной степени заболеваний
растений, причиной которых служит поражение вирусами, в значительной
мере является следствием сельскохозяйственных мероприятий, проводимых
человеком. Возможно, что в естественных условиях вирусы хорошо приспо-
соблены к своим растениям-хозяевам и повреждают их незначительно.
Поэтому эпизодическое обследование растений, произрастающих в их естест-
венных местообитаниях, дает очень небольшую информацию относительно
тех вирусов, которые могут присутствовать в той или иной зоне. Для полу-
чения соответствующих сведений следует, используя большое число таких
местных видов, провести серию длительных и трудоемких опытов по инфи-
цированию, применяя с этой целью и механическую инокуляцию и испыты-
вая возможных беспозвоночных-переносчиков. Однако пока таких систе-
матических опытов проведено очень мало. Например, в Новой Зеландии
Распределение по группам растений
469
имеется около 2000 видов, которые являются представителями местной фло-
ры сосудистых растений [691], и примерно три четверти из них — эндемики.
Из их числа на присутствие латентной или слабой вирусной инфекции очень
поверхностно проверено, вероятно, не более 10 видов растений. Даже в тех
районах, где в течение многих лет работает большое число вирусологов,
новые вирусы, вероятно, еще ждут своего открытия. Так, Халл [844] в кол-
лекции папоротников ботанического сада Кембриджского университета
обнаружил несколько видов с симптомами пятнистости и нашел в них виру-
соподобные частицы.
Распределение вирусов по разным группам растений, рассмотренное
в этой главе, показывает, что у наиболее старых в эволюционном отношении
групп растений встречается меньше вирусов. Последующие исследования,
вероятно, подтвердят, что это действительно так. Одна из причин того, что
«живые ископаемые» таких древних групп растений существуют в настоящее
время, возможно, заключается в том, что эти растения приобрели устойчи-
вость или иммунность к различным патогенным организмам и вредителям,
в том числе и к вирусам. Так, Ginkgo bilobaL.— дерево, относящееся к голо-
семенным,-- существует уже примерно 200 миллионов лет и обладает уди-
вительной устойчивостью к поражению грибами. Экстракт, выделенный из
этого растения, содержит вещества, которые ингибируют рост грибов
и инфекционность некоторых вирусов [1136].
РАСПРЕДЕЛЕНИЕ ВИРУСОВ СРЕДИ НИЗШИХ ГРУПП РАСТЕНИЙ
Водоросли
Помимо нескольких вирусов, которые заражают сине-зеленые водорос-
ли, до сих пор пока неизвестны вирусы, которые поражали бы представи-
телей, этой группы растений. Однако в настоящее время па основании био-
химических и ультраструктурных исследований сине-зеленых водорослей
стало очевидно, что они в этом отношении имеют большее сходство с бакте-
риями, чем с другими группами водорослей. В соответствии с этим вирусы
сине-зеленых водорослей, описанные Сафермаиом и Моррисом [1471], Шней-
дером и др. [1506], Смитом и др. [1630], а также Луфтигом и Хазелькорном
[1107], по своей структуре очень похожи па некоторые ставшие классически-
ми вирусы бактерий, имеющие гексагональную головку и отросток, или
хвост. Сюз и др. [1697] считают, что РНК ВТМ может заражать растущие
клетки Chlorella pyrenoidosa и реплицироваться в'них. Количество полученной
в их опытах инфекционной РНК было невелико и нарастало медленно, в свя-
зи с чем данный вопрос требует дальнейшего изучения.
Грибы
Вирусы в культивируемых грибах
Холлингс [810] выделил из шампиньонов Agaricus bisporus (J. Lange)
препараты, содержащие вирусоподобные частицы трех типов, и показал
с помощью инъекций в спорофор, что эти частицы могут вызывать заболева-
ние. Вирус 1 представлял собой многогранник диаметром 25 нм, частицы
вируса 2, похожего на вирус 1, имели диаметр 29 нм, а вирус 3 был пред-
ставлен бацилловидными частицами величиной 19x50 нм, довольно сход-
ными с длинными частицами вируса мозаики люцерны (фото 94), Холлингс,
используя в качестве инокулума экстракты больных грибов, натирал листья
ряда покрытосеменных растений, в том числе и растений-хозяев вируса
470
Глава XIX
мозаики люцерны, но не смог вызвать у них таким образом появления каких-
либо симптомов заболевания.
На характер поражения отдельных спорофоров могут оказывать значи-
тельное влияние условия выращивания [1044], причем на лотках, на которых
выращиваются грибы, образуются характерные зоны вокруг участков зара-
жения. Рядом с участком заражения имеется центральная зона, на которой
не растет ничего, кроме нескольких уродливых грибов. Зона, расположен-
ная вокруг центральной, содержит большое число прекративших рост пло-
довых тел, которые преждевременно буреют. Кнаружи от этой зоны боль-
шинство грибов выглядит здоровыми, и только у некоторых из них четко
выражены признаки заболевания, в частности их ножки становятся водя-
нистыми. Рост иа агаре замедляется (фото 94).
Взаимосвязь между этими тремя типами частиц и вызываемым ими забо-
леванием еще точно не установлена. Холдинге и др. [813] разработали метод
быстрого выделения вируса из небольших количеств грибной ткани, исполь-
зуя метод дезинтеграции ультразвуком. При этом вирусы 1 и 2 выделялись
из остального материала либо поодиночке, либо вместе, тогда как вирус 3
обнаруживался только в сочетании с частицами, имеющими форму много-
гранника.
Если образцы ткани, взятые из зараженных спорофоров, выращенных
на компосте, культивировали на агаризованной среде, особенности колоний
изолятов зависели от вирусов, присутствующих в зараженном спорофоре
[1043, 1044]. Когда образцы, взятые иа разных и все увеличивающихся рас-
стояниях от участка заражения, культивировали на агаре, содержание
вируса 1 во всех пробах было примерно одинаковым. Однако концентрация
вируса 2 была максимальной вблизи зоны инокуляции и постепенно снижа-
лась с удалением от нее. Пробы мицелия, содержащие немного частиц виру-
са 2, росли лучше и образовывали сильнее развитые мицелиальные тяжи,
чем те, в которых вирус присутствовал в большом количестве. Особенности
роста и содержание вируса 2 в изолятах мицелия остаются более или менее
постоянными при пересевах на агар и отражают особенности исходного спо-
рофора. Существует, по-видимому, какой-то механизм, контролирующий
взаимосвязь между количеством вируса 2 и ростом гиф, когда мицелий выра-
щивается на агаре, который неприменим для культуры грибов, растущих
на компосте. Впоследствии зоны, которые вначале были поражены лишь
слабо, постепенно инфицируются все сильнее.
Эти вирусы могут распространяться с помощью фрагментов мицелия
или спор [1492]. Болезнь может передаваться даже тогда, когда на лотках
для выращивания площадью 0,5 м2 присутствует всего 10 спор. Распростра-
нение этих вирусов в производственных условиях происходит, по-видимому,
при использовании лотков для выращивания, загрязненных спорами и мице-
лием, которые содержат вирус [1044]. Такого рода распространение можно
ограничить, проведя частичную стерилизацию паром или метилбромидом
(Ласт, личное сообщение).
Вирусы в Penicillium spp.
Клейншмидт и Пробст [1003] выделили какой-то материал из фильтра-
тов культуры Penicillium stoloniferum (штамм АТСС 14586), который инги-
бировал вирусную инфекцию при заражении животных и тканевых культур.
Они назвали этот материал статалоном и предположили, что он относится
к полианионным полисахаридам. Впоследствии было показано [1002, 1004],
что статалон обладает антивирусным действием, индуцируя образование
интерферона. Эллис и Клейншмидт [490] обнаружили присутствие вирусо-
подобных частиц в препаратах статалона и в мицелии Р. stoloniferum и выска-
Распределение по группам растении
471
вали мысль о том, что способность препарата статалона стимулировать обра-
зование интерферона обусловлена присутствием вируса. Банкс и др. [86],
которые выделили большое количество полиэдрических вирусных частиц
.диаметром 25—30 им из культур Р. stoloniferum (штамм АТСС 14586), полу-
чили убедительные данные, свидетельствующие в пользу того, что антиви-
русная активность препаратов статалона определяется действием вирусной
РНК, стимулирующей образование интерферона у мышей.
Присутствие вируса в мицелии и фильтратах культур определялось
с помощью электронной микроскопии, специфических вирусных антисыво-
роток и центрифугированием в градиенте плотности. На протяжении первых
двух дней инкубации в культуре, подвергавшейся встряхиванию, вирус
можно было обнаружить только в мицелии. После наступления лизиса вирус
освобождался в культуральную среду.
Соответствующая тепловая обработка спор штамма АТСС 14586 привела
к образованию субштамма, в котором данный вирус не обнаруживался
и который ие обладал способностью индуцировать образование интерферона.
Таким образом, этот субштамм был похож иа другие свободные от вируса
изоляты Р. stoloniferum. Зараженный вирусом штамм рос медленнее, чем
штаммы, свободные от вируса, или субштамм, освобожденный от вируса
путем тепловой обработки. Колонии зараженного штамма отличались от
незаряженного тем, что росли медленнее, края их были неровными и для них
были характерны различные оттенки зеленого цвета.
Препараты РНК, приготовленные из частично очищенных препаратов
вируса, были активными как стимуляторы образования интерферона. Такая
.активность исчезала при инкубации с панкреатической рибонуклеазой
в 0,03 М фосфатном буфере. Одновременно исчезала и кислотонераствори-
.мость РНК. Рибонуклеаза не оказывала какого-либо определенного дейст-
вия в 0,2 М растворе поваренной соли, что свидетельствует о том, что вирус-
ная РНК, вероятно, является двухцепочечной.
Шоуп [1574] выделил антивирусное вещество, названное хеленином, из
культур Penicillium funiculosum. После этого другими исследователями
было показано, что хелеиин оказывает антивирусное действие, стимулируя
•образование интерферона, и что действующим агентом является, по-види-
мому, двухцепочечная РНК. Банкс и др. [86] исследовали штамм Р. funicu-
losum тем же способом, с помощью которого изучался штамм Р. stoloniferum.
Они смогли выделить из мицелия вирусные частицы сходного морфологиче-
ского строения, и препараты этих частиц были активны в отношении стиму-
ляции образования интерферона. Вирусы, выделенные из двух видов Peni-
cillium, оказались серологически пе родственными. Несмотря па то что эти
вирусные частицы обладают физическими и химическими свойствами мел-
кого полиэдрического вируса, о заражении ими культур здоровых грибов
пока не сообщалось.
Другие обстоятельства, свидетельствующие в пользу вирусной инфекции
у грибов
В литературе имеются некоторые сведения о возможности передачи
инфекции у грибов, которая при дальнейших исследованиях, возможно,
будет идентифицирована как вирусная. Например, Линдберг [1068—1070]
•описал заболевание Helminthosporium victoriae, которое может быть искусст-
венно передано. Зараженные колонии, растущие на агаре, не погибали, но
на краях их рост, задерживался и существующий воздушный мицелий
разрушался или лизировался. Когда зараженные и здоровые изоляты вво-
дили в один и тот же слой агара на расстоянии около 1 см друг от друга, рост
здорового изолята нарушался после нескольких часов контакта с больной
Глава XIX
472
культурой. Субкультуры, полученные от той колонии, которая была раньте
здоровой, оставались больными; это свидетельствует о том, что полученный
эффект определяется не только действием токсина, выделяемого больным
изолятом. Заражение происходило лишь в том случае, если] гифы больных
и здоровых колоний были переплетены, и не происходило при погружении
мицелия в экстракты больных грибов.
Были описаны условия, в которых наступает так называемая «вегета-
тивная смерть» Aspergillus glaucus [875, 876]. Когда вегетативный рост куль-
туры этих грибов поддерживается пересадкой кончиков гиф, интенсивность
роста снижается и появляются участки отмерших гиф. В том случае, когда
здоровый штамм грибов формирует гетерокарионы со штаммом с симпто-
мами «вегетативной смерти», все продукты гетерокариоза заболевают, между
тем как по таким признакам, как окраска спор, наблюдается расщепление,
как это и ожидается в случае ядерной наследственности. Агент, вызываю-
щий «вегетативную смерть», проникает в здоровый гомокарион гораздо
дальше точки максимального проникновения ядер штаммов, пораженных
«вегетативной смертью». Возможно, в последующих работах будет показано,
что «вегетативная смерть» грибов вызывается каким-то вирусом.
Мохообразные
О вирусах, поражающих эту группу растений, не сообщалось.
Папоротникообразные
До тех пор пока Халл [844] в двух районах Англии не описал вирус,
который поражал папоротник Phyllitis scolopendrium, вирусы, поражаю-
щие папоротники и другие папоротникообразные, описаны не были.
На листьях больных растений папоротника, найденных Халлом, наблюда-
лась крапчатость, они были уже и для них была характерна морщинистость
(фиг. 100).
Фиг. 100. Вирусная болезнь папоротника Phylliiis scolopendrium [844].
А. Зараженные листья и лист здорового растения (справа). Б. Гистограмма, отражающая распреде-
ление по длине частиц, обнаруженных в больных растениях.
Распределение по группам растений
473
При электронно-микроскопических исследованиях неочищенных пре-
паратов, полученных из больных растений, в них были обнаружены палочко-
образные частицы, которые не встречались при анализе здоровых растений
(фиг. 100), Измерения показали, что в этих препаратах чаще всего встре-
чаются частицы длиной около 135 и 320 им; диаметр и тех и других составлял
22 нм. Здоровое растение Phyllitis scolopendrium можно было заразить меха-
ническим путем, экстрагируя больные листья в 1%-ном К2НРО4 с Mg-бенто-
нитом и используя полученный экстракт в качестве инокулума.
Молодые спорофиты Dryopteris jllix mas (L.) Schott также можно было
заразить механически. Попытки заразить некоторые виды двудольных расте-
ний, которые обычно используются в качестве индикаторных при исследо-
вании вирусов, оказались безуспешными. Некоторые другие виды папорот-
ников, на которых появлялись симптомы крапчатости, как оказалось, содер-
жали палочкообразные частицы.
Частицы, обнаруженные в Phyllitis scolopendrium, по форме напоминали
частицы вирусов группы погремковости табака, по отличались от вирусных
частиц этой группы по длине. Данные предварительных опытов позволяют
предполагать, что этот вирус передается через почву.
Голосеменные
Ряд вирусов, инфицирующих покрытосеменные растения, как оказа-
лось, заражает и некоторые голосеменные растения; в природе у представи-
телей этой группы обнаружено несколько вирусоподобных заболеваний,
которые, вероятно, действительно вызываются вирусами.
Ярвуд [1960] сообщил, что корни Pinus sy Ivestris L. инфицируются путем
механической инокуляции вирусом некроза табака, а нематоды могут зара-
жать два вида сосны вирусом мозаики резухи [1961]. Харрисон [720] обна-
ружил, что нематода Xiphinema diversicaudatum может передавать вирус
мозаики резухи корням Chamaecyparis lawsoniana Pari. По-видимому, этот
вирус заражает только корни и не может быть получен из стволов и ветвей.
В сходных экспериментах Picea stichensis Carr, заражали с помощью нема-
тоды Longidorus attenuates вирусом черной кольцевой пятнистости тома-
тов, однако осуществить заражение вирусами погремковости табака и
раннего побурения гороха, которые передаются видами Trichodorus, не
удалось.
Что касается распространения вирусов голосеменных в природе, то опи-
сано заболевание ели {Picea excelsa L.), при котором на ранних стадиях зара-
жения хвоя становится желтовато-зеленой или желтовато-белой [344]. Позже
симптомы хлороза могут исчезнуть, но рост растения нарушается, иглы ста-
новятся более короткими и растут асимметрично. Заболевание передается
тлей Sacchiphantes abietisL., а также путем прививки. По-видимому, проявле-
ние симптомов болезни связано с присутствием в растении палочкообразных
частиц, длина которых чаще всего составляет около 625 им, а диаметр около
50 им.
Пеной Попович [1321] описали заболевание Pinus nigra, которое характе-
ризуется деформацией игл и симптомами мозаики; авторы полагают, что это
заболевание вызывает вирус. Заболевание распространено там же, где
и предполагаемых! переносчик Chionapsis austriaca. Шмельцер и др. [1498] опи-
сали крапчатость сосны и ели, а Биддл и Тинсли [196] сообщили о том, что
они обнаружил!! неизвестный до сих пор палочкообразный вирус в Pinus
monticola Dougl.
474
Глава XIX
КРУГ ПОКРЫТОСЕМЕННЫХ РАСТЕНИЙ-ХОЗЯЕВ,
ПОРАЖАЕМЫХ ВИРУСАМИ
Почти все описанные до сих пор вирусы растений, как оказалось, зара-
жают виды, относящиеся к покрытосеменным. Экспериментальные данные
имеются лишь в отношении незначительной части возможных комбинаций
растение — вирус, однако, вероятно, можно считать, что болыпинство видов
иммунпо или устойчиво к большинству вирусов.
Что касается клеточных паразитов, то можно предположить, что у расте-
ний, живущих длительное время, таких, как деревья, и видов, доминирую-
щих в природных условиях па больших площадях, как, например, травы
в прериях, должна была развиться большая устойчивость по отношению
к паразитам, оказывающим летальное действие, чем у других видов. Сходные
соображения могут быть выдвинуты и в отношении вирусной инфекции,
однако находящихся в нашем распоряжении экспериментальных данных
такого рода немного.
Не считая того факта, что испытана относительно небольшая часть ком-
бинаций растение — вирус, наши знания относительно круга растений-
хозяев ограниченны, что обусловлено следующими причинами:
1. В большом числе сообщений, касающихся изучения круга растений-
хозяев, отмечались лишь полученные исследователями положительные
результаты.
2. Если па зараженном тест-растении симптомов не обнаруживали,
присутствие замаскированной инфекции не всегда проверяли обратным
заражением индикаторных растений. Например, Саундер и Шрамм [1490]
обнаружили, что растения табака сорта Ксанти, хотя на них и не проявля-
лось симптомов заболевания, инфицируются вирусом желтой мозаики тур-
непса, что было показано опытами по обратному заражению китайской
капусты. (Эти опыты были неточно изложены Мэтьюзом и Ралфом [1188].)
В тех случаях, когда проводятся такого рода опыты по обратному зара-
жению, приходится принимать произвольное решение о том, что считать кри-
терием размножения вируса, если не учитывать инфекционности инокулума,
оставшегося на листе. Так, Холмс [819] считал, что наличие 10 некрозов на
лист при обратном заражении N. glutinosa можно рассматривать как крите-
рий того, что ВТМ и вирус гравировки табака действительно размножаются
в этом индикаторном растении. Размножение вируса в одной или несколь-
ких клетках растения вблизи места заражения часто не удается определить
обычными методами. Инокуляция инфекционной РНК снимает или умень-
шает фон инфекционности, создаваемый остаточным ииокулумом.
3. Значительное влияние на результаты может оказывать способ иноку-
ляции. В случае широко проводимых исследований круга растений-хозяев
почти всегда используется механическая инокуляция, поскольку это наибо-
лее удобно, однако многие растения содержат ингибиторы инфекционности,
препятствующие механическому заражению определенных видов или исполь-
зованию их в качестве источника инфекции, а иногда и тому и другому вмес-
те (гл. XIV).
4. При изучении большого числа видов растений обычно проводят опы-
ты, используя лишь один комплекс условий, хотя известно, что каждый
данный вид широко варьирует по своей чувствительности к какому-либо
вирусу, что зависит от условий произрастания (гл. XII). Например, зара-
жение интактным ВТМ Rhoeo discolor определяется условиями освещения,
в которых вегетирует это растение [98, 664].
5. Очень близкие штаммы вируса могут отличаться друг от друга
в отношении тех растений, которые к ним восприимчивы. Данные, касаю-
Распределение по группам растений 475
зцисся круга растений-хозяев, могут относиться только к определенному
штамму вируса.
Тем не менее на основе накопленной информации можно сделать неко-
торые общие выводы. Так, разные вирусы широко варьируют в зависимости
от характерного для них круга растений-хозяев. Например, распростране-
ние некоторых вирусов, поражающих землянику, ограничено, по-видимому,
лини, родом Fragaria, тогда как другие, в частности ВТМ и вирус бронзо-
вости томатов, заражают растения многих видов и родов, относящихся к раз-
ным семействам.
Иногда круг растсиий-хозяев одного вируса частично совпадает с кру-
гом растений-хозяев другого, по-видимому, не родственного ему вируса.
Так, Холмс [819] обнаружил, что среди 310 исследованных им видов 83 были
чувствительны и к ВТМ и к вирусу гравировки табака, 116 были восприим-
чивы к ВТМ и устойчивы к вирусу гравировки, ни один из видов не был чув-
ствителен к вирусу гравировки и устойчив к ВТМ и 111 видов были невос-
приимчивы к обоим вирусам.
Болд и Тинсли [68—70] с помощью статистических методов пересмотре-
ли данные, полученные в ранних работах [819, 1361]. При этом было обна-
ружено, что в группах растений, находящихся на более высоких ступенях
филогенетического развития, большая часть видов оказалась чувствительной
к тем вирусам, которые изучались, чем это наблюдалось в низших филогене-
тических группах. Вообще говоря, вирусы могут заражать большую часть
видов в семействе, куда относятся обычные, встречающиеся в поле растения-
хозяева, а также в близкородственных семействах, ио не в семействах, нахо-
дящихся в отдаленном родстве. Статистические данные, подобные тем, кото-
рые были получены Болдом и Тинсли, ие могут заменить информацию,
касающуюся биохимии, молекулярной биологии и генетики вирусов, которая
необходима для того, чтобы понять, почему же тот или иной вирус способен
к заражению и к репликации только в клетках определенного типа.
Данные, имеющиеся в нашем распоряжении и касающиеся мелких виру-
сов, позволяют предполагать, что круг растений-хозяев определяется РНК
вируса, а не белком оболочки. Попытки расширить круг растений-хозяев,
используя для заражения инфекционную РНК, а не вирус в целом, обычно
были безуспешными (см., например, [739]). Хиберт и др. [775] показали, что
искусственно синтезированные гибридные вирусные частицы, состоящие из
РНК вируса хлоротической крапчатости коровьего гороха и структурного
белка вируса мозаики костра, могут инфицировать растения коровьего
гороха, иммунные к вирусу мозаики костра. Такой гибрид не заражает
ячмень, являющийся обычным растением-хозяином для вируса мозаики
костра. Эти и сходные с ними опыты свидетельствуют о том, что, во-пер-
вых, круг растений-хозяев, чувствительных к вирусной РНК, не может
быть расширен путем «одевания» РНК белком вируса, который поражает
данное растение, и, во-вторых, что структурный белок вируса, который
пе поражает какое-либо растение, не снижает инфекционности РНК,
входящей в состав дайной частицы. Эти опыты не исключают возможности,
которая обсуждалась в гл. IV, что имеется один небольшой белок или пептид,
прочно связанный с РНК, который играет роль в определении биологи-
ческой специфичности и инфекционности вируса.
ГЛАВА XX
НОМЕНКЛАТУРА, КЛАССИФИКАЦИЯ
И ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О ПРОИСХОЖДЕНИИ ВИРУСОВ
ИСТОРИЯ ВОПРОСА
При исследовании природных объектов люди стремятся дать им какое-то
название и классифицировать их. Смысл классификации заключается в объе-
динении объектов со сходными свойствами в группы; таким образом, всякая
классификация — это прежде всего система, облегчающая поиски инфор-
мации. Если классификация составлена на основании адекватных критериев,
то она отражает также эволюционные связи. Теоретически возможно рас-
сматривать проблемы именования и классификации вирусов раздельно. Иа
практике, однако, эти две задачи очень быстро начинают сливаться друг
с другом. В течение последних сорока лет присвоение наименований вирусам
растений и их классификация находились в более или менее хаотическом
состоянии. До сих пор не разработана международная согласованная систе-
ма. В 1930 году вопрос о необходимости такого соглашения был поднят
на заседании V Международного ботанического конгресса в Кембридже
(Англия) [887]. Однако до сих пор окончательного соглашения пе удалось
достигнуть ни одной международной комиссии, и хотя отдельные исследо-
ватели предлагали свои собственные системы, они не получили поддержки
какой-либо группы или комиссии и ни одна из этих систем не стала обще-
принятой.
Первые исследователи обычно давали вирусу название по растению-
хозяину, в котором он был обнаружен, и по наиболее выраженному^ симптому
болезни. Примером может служить вирус табачной мозаики. Вначале пола-
гали, что вирусы — это стабильные системы, и каждую совокупность симпто-
мов приписывали другому вирусу. Однако к началу 30-х годов выяснились
три важных обстоятельства: а) вирусы могут существовать в виде различ-
ных штаммов, способных вызывать разные симптомы у одного и того же
растения-хозяина; б) разные вирусы могут вызывать очень сходные симптомы
у одного и того же растения-хозяина; в) некоторые болезни могут быть выз-
ваны присутствием сразу двух неродственных вирусов. Джонсон в 1927 году
[885] ив своих последующих работах подчеркивал, что для идентификации
вирусов следует учитывать не только растения-хозяева и симптомы болезни,
но использовать также какие-то другие критерии. Он указывал, что более
надежными критериями были бы такие свойства вирусов, как термостабиль-
ность in vitro. Он предложил строить названия вирусов следующим образом:
к названию растения-хозяина, в котором он впервые был обнаружен, добав-
лять слово «вирус» и соответствующий номер. Например, для вируса табач-
ной мозаики это звучало бы так: табачный вирус 1. Джонсон и Хогген [888]
составили описательный ключ, взяв за основу 5 признаков: способ передачи,
природные или дифференцирующие хозяева, долговечность in vitro, точка
тепловой инактивации и отличительные или специфические симптомы. Эта
система охватывала около 50 вирусов.
Смит [1627] разработал схему, согласно которой известные вирусы
или вирусные болезни были подразделены на 51 группу. Вирусы были наз-
ваны и сгруппированы в соответствии с названием рода растения-хозяина,
в котором они впервые были обнаружены. Представители одной группы
имели порядковые номера. Например, вирус табачной мозаики носил паз-
Номенклатура, классификация и происхождение вирусов 477
вание Nicotiana-wpyc 1, в группу АшсЦшиа-вирусов входило 15 различных
вирусов. Таким образом, вирусы, не имеющие ничего общего друг с другом
но своим важнейшим свойствам, попадали в одну группу. И хотя список,
составленный Смитом, в течение некоторого времени служил полезным ката-
логом известных вирусов, его ни в коем случае нельзя было рассматривать
как классификацию.
Холмс [818] опубликовал классификацию, в основу которой были поло-
жены реакции хозяина и способы передачи инфекции. Он использовал бино-
минальную и триноминальную системы латинских названий. Например,
вирус табачной мозаики превратился в Marmor tabaci, Holmes. Основу его
классификации составляли болезни, а не вирусы, и поэтому 53 из 89 рассмот-
ренных Холмсом вирусов попали в род Marmor, объединявший вирусы,
о которых уже в то время было известно, что они резко различаются по сво-
им свойствам (например, вирус табачной мозаики и вирус кустистой карли-
ковости томатов). Тем не менее латинская биноминальная система привлекла
внимание ряда исследователей, которыми были предложены различные моди-
фицированные схемы [1066, 1122, 1123, 1806]. Система Холмса была одобрена
Номенклатурной комиссией Американского фитопатологического общества
[327]. Позднее Холмс опубликовал пересмотренную схему (эта схема вышла
в качестве приложения в 6-м издании определителя микробов Берджи [172],
включавшего, помимо вирусов растений, также вирусы животных и бакте-
рий). Этот вариант системы все еще грешил явными несообразностями в опре-
делении целого ряда групп. Многие вирусологи вообще считали использо-
вание биноминальной системы латинских названий применительно к виру-
сам невозможным или в лучшем случае преждевременным. Хаисен [704, 705]
предложил систему классификации, основанную на свойствах вирусных
частиц, симптомах заболеваний и способах передачи. В этой классификации
используются латинизированные кодовые названия, содержащие информа-
цию о вирусах, которые могут служить источником родовых наименований
для латинизированной биноминальной системы.
Тот факт, что некоторые вирусы растений способны размножаться в орга-
низме насекомых-переносчиков, а также сходство в строении многих вирусов
растений, животных и бактерий делают крайне желательной разработку
единой системы их классификации и номенклатуры. Например, вирус ране-
вых опухолей и реовирус очень сходны по строению, хотя и не родственны
в серологическом отношении [605]. Одна из таких попыток создать общую
классификацию принадлежит Львову и др. [1113]. Однако в течение послед-
них 20 лет все яснее становилось, что приемлемая во всех отношениях систе-
ма номенклатуры и классификации может быть разработана только при
условии международного сотрудничества и соглашения с учетом мнений
подавляющего большинства работающих в этой области исследователей.
Можно надеяться, что миновало то время, когда отдельные исследователи
или национальные научные общества будут публиковать схемы классифика-
ции совершенно независимо друг от друга.
Теперь предпринимаются новые попытки разработки системы, согласо-
ванной в международном масштабе. На Международном микробиологиче-
ском конгрессе в Москве в 1966 году состоялось заседание Международной
комиссии по номенклатуре вирусов, в которую входят 130 представителей
микробиологических обществ многих стран. Комиссия имеет Исполнительный
комитет, состоящий из 12 членов. Было учреждено 5 подкомиссий для рас-
смотрения вопросов, связанных с номенклатурой и идентификацией групп.
Есть все основания надеяться, что в течение последующих 10—15 лет
будет разработана достаточно хорошо обоснованная и для всех приемлемая
система номенклатуры и классификации. Для этого, однако, необходимо,
чтобы работу этих комиссий поддерживало большинство вирусологов, чтобы
478
Глава XX
ни одна из групп вирусологов не стремилась навязывать свои мнения осталь-
ным и чтобы работа комиссий протекала без излишней спешки. А до тех
пор большинство исследователей в области вирусологии растений будут,
вероятно, пользоваться списком, опубликованным Микологическим инсти-
тутом в Кью (Англия). Вслед за первым изданием, вышедшим в свет в 1946 г.,
были опубликованы второе (1957 г.) и третье (1968 г.) [1164], в котором при-
веден перечень, охватывающий около 630 вирусов (а также возбудителей,
предположительно являющихся вирусами) с наиболее распространенными
наименованиями и синонимами на английском и других языках. Следует
отметить, что третье издание этого великолепного списка уже в момент его
опубликования оказалось устаревшим, по крайней мере в одном важном
пункте. Дело в том, что, как свидетельствуют результаты недавно проведен-
ных исследований, около 20 (а может быть, и гораздо больше) болезней,
перечисленных как вирусные, в действительности, вероятно, вызываются
организмами типа микоплазм (гл. X).
Микологический институт планирует в качестве помощи вирусологам
периодическое издание (в виде брошюр) сводок по отдельным вирусам, в ко-
торые должны быть включены синонимы, библиография, описание вирусных
частиц и их свойств, главные вызываемые ими болезни, спектр хозяев,
симптоматология (с иллюстрациями, позволяющими судить о типичных симп-
томах), перечень штаммов вируса, способы их передачи, методы очистки
и данные о географическом распространении. Эти сводки будут составлены
вирусологами, внесшими наибольший вклад в изучение рассматриваемого-
вируса.
Еще один подход к проблеме выдвинут вирусологами, работающими
с вирусами бобовых культур [225]; они сделали ряд предложений относи-
тельно стандартизации при идентификации и наименовании этих вирусов.
Это привело к организации в 1962 году международной группы по изучению
вирусов бобовых. Сотрудничество в этой группе существенно помогло раз-
работке стандартизированной номенклатуры вирусов, поражающих бобо-
вые [223].
СУЩЕСТВУЮЩИЕ КРИТЕРИИ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ
ПРИ КЛАССИФИКАЦИИ ВИРУСОВ
При любой попытке классификации вирусов возникают две взаимосвя-
занные проблемы. Первая из них состоит в том, чтобы выявить родственные
вирусы, которые должны быть включены в более крупные группы. При этом
должны приниматься во внимание наиболее стабильные свойства вируса
(количество и тип нуклеиновой кислоты, морфология частиц, тип перенос-
чика). Вторая проблема — выявление различий между родственными виру-
сами и установление степени родства между вирусами внутри данной группы.
Для этой цели наиболее полезны такие особенности, которые отличаются
большей изменчивостью. К ним относятся симптомы, спектр хозяев и амино-
кислотный состав капсидного белка. Некоторые свойства, например сероло-
гическая специфичность, могут быть полезны как для определения более
крупных групп, так и для дифференциации вирусов в группах. Обсуждая
вопрос о критериях, используемых при классификации вирусов, мы сталки-
ваемся с двумя общими проблемами. Одна из них — проблема относитель-
ной важности различных признаков для классификации. Сравнительная
оценка такого рода неизбежна независимо от того, на какой основе прово-
дится распределение вирусов по группам. Некоторые примеры, иллюстри-
рующие важность этих вопросов, рассматриваются ниже (в частности, в раз-
деле о нуклеиновых кислотах). Вторая проблема касается взаимосвязи меж-
Номенклатура, классификация и происхождение вирусов
479
ду разными признаками. Например, замена одного основания в молекуле
нуклеиновой кислоты может привести к замене одной аминокислоты в кап-
сидном белке, что в свою очередь изменяет серологическую специфичность
и электрофоретическую подвижность вируса.
Нуклеиновые кислоты
Поскольку нуклеиновая кислота является генетическим материалом
вируса, ее свойства должны в первую очередь приниматься во внимание
как при распределении родственных вирусов в более крупные группы, так
и при выявлении небольших различий в пределах групп.
Иногда высказывается мнение, что, зная полную последовательность
оснований в молекулах нуклеиновых кислот всех вирусов, можно было бы
решить абсолютно все проблемы, связанные с их классификацией. Вероятно,
мы и в самом деле смогли бы в этом случае судить о степени родства между
близкими вирусами, исходя из известного числа мутационных событий: одна-
ко и после этого все еще осталось бы множество нерешенных вопросов, откры-
вающих дорогу весьма произвольным решениям.
Установление полных последовательностей оснований не помогло бы
решить вопрос, какие критерии наиболее важны при объединении в группы
вирусов, у которых сходство в нуклеотидных последовательностях незначи-
тельно. В этом случае возникло бы много дополнительных вопросов.
Например, какой признак следует считать более важным — наличие
двухцепочечной, а не одноцепочечной нуклеиновой кислоты или же число,
частиц, в которых содержится полный геном вируса?
Даже в группе вирусов, сходных по составу оснований, пришлось бы
принимать произвольные решения с учетом совсем иных критериев, нежели
последовательность оснований в нуклеиновых кислотах. Известно, что,
например, замена одного основания может иметь разные последствия в зави-
симости от того, где она происходит. Она может привести к сравнительно
несущественной замене аминокислоты в капсидном белке, которая будет'
выявлена только при помощи аминокислотного анализа. Такая же замена
в другом положении может привести к образованию дефектного капсидного
белка, неспособного взаимодействовать с РНК. Как решить вопрос, какой
из этих мутантов больше отличается от родительского штамма?
Предположим, что у нас имеются два мутантных штамма вируса. Один
из них отличается от родительского тем, что в молекуле его нуклеиновой
кислоты заменены два основания, в результате чего произошли две амино-
кислотные замены в капсидном белке. В другом имеется пять таких замен
оснований в РНК, из которых, однако, 4 «немые», т. е. в силу вырожденности
кода не вызывающие изменений в полипептидиой цепи. Какой из этих мутан-
тов следует считать более близким к родительскому штамму?
У мутантного штамма могло бы, скажем, иметься пять аминокислотных
замен в капсидном белке, что привело бы всего лишь к появлению заметных
серологических различий, не более того. В то же время у другого штамма
было бы всего три замены: одна, изменяющая серологическую специфич-
ность, — в капсидном белке, вторая, позволяющая вирусу размножаться
при высокой температуре, — в РНК-полимеразе и третья, контролирующая,
скажем, спектр хозяев, — еще в каком-то белке. Какой штамм следовало,
бы в этом случае считать наиболее близким к родительскому?
Целый ряд важнейших свойств нуклеиновой кислоты должен непремен-
но учитываться при любом распределении вирусов по группам, однако отно-
сительная важность всех этих свойств для целей классификации пока не уста-
новлена.
480
Глава XX
Тип нуклеиновой кислоты
Недавно впервые был описан вирус растений, содержащий ДНК [1561].
Несомненно, число таких вирусов будет расти. Таким образом, может быть
установлен один общий критерий, а именно тип генетического материала
(ДНК это или РНК).
Число цепей
Большинство вирусов растений имеет одноцепочечную РНК, но извест-
ны два вируса, содержащие двухцепочечную РНК. Единственный описан-
ный до настоящего времени ДНК-содержащий вирус растений содержит
двухцепочечную ДНК. Вполне вероятно, что и среди вирусов растений
будут обнаружены вирусы, содержащие одноцепочечную ДНК, как это отме-
чается для вирусов животных и бактерий.
Размеры
Молекулярные массы нуклеиновых кислот у вирусов растений колеб-
лются примерно от 0,4 до 10-10°, по у большинства из них молекулярная
масса нуклеиновой кислоты составляет около 1,0-2,0-10°; такая однород-
ность этого показателя снижает его значение для классификации. Кроме
того, пока не известно, происходит ли у вирусов удвоение генетиче-
ского материала. Если происходит, то использовать просто величину моле-
кулы нуклеиновой кислоты в качестве критерия нельзя. Отношение коли-
чества нуклеиновой кислоты к количеству белка в вирусной частице широко
варьирует у разных вирусов. Процентное содержание белка у палочкообраз-
ных вирусов выше, чем у икосаэдрических.
Нуклеотидный состав и нуклеотидная последовательность
Можно ожидать, что у совершенно не родственных вирусов должно быть
очень мало сходных нуклеотидных последовательностей; однако в настоя-
щее время это не более чем предположение. Степень гомологии нуклеиновых
кислот у родственных вирусов, вероятно, варьирует.
Отношения оснований лишь весьма приблизительно отражают истинные
последовательности оснований в молекуле нуклеиновой кислоты. Тем не ме-
нее эти отношения иногда могут служить для идентификации тех или иных
групп вирусов. Например, для ВЖМТ и вирусов, сходных с ВЖМТ по ряду
других признаков, характерно необычно высокое содержание цитидиловой
кислоты.
Специфические ферменты расщепляют РНК с образованием довольно
коротких олигонуклеотидов. Относительная частота различных олигонуклео-
тидов в разных РНК может быть определена при помощи соответствующих
методов фракционирования с последующим анализом фрагментов. Частота
этих коротких фрагментов может сказать нам о нуклеиновой кислоте гораз-
до больше, чем общий нуклеотидный состав. Этот подход иногда исполь-
зуется для идентификации вирусов и их штаммов (гл. XIII). Результаты
распределения вирусов по группам, проведенного на основании этого крите-
рия, очень хорошо коррелируют с тем, что получается при группировке
по аминокислотному составу капсидных белков. Однако определение часто-
ты олигонуклеотидов, вероятно, оправдывает затраченный труд только в том
случае, если из гидролизата удается выделить хотя бы одну (или более) уни-
кальную последовательность, содержащую не менее 20 нуклеотидов (гл. IV).
Номенклатура, классификация и происхождение вирусов
481
Ни для одной вирусной РНК пока не удалось определить полную нук-
леотидную последовательность. Однако степень гомологии между вирусами
можно было бы определять при помощи гибридизации с использованием
двухцепочечпых форм РНК вирусов растений; этот метод вполне может
оказаться пригодным как для распределения родственных вирусов по груп-
пам, так и для оценки степени родства в каждой группе. Другой способ уста-
новления степени родства состоит в определении частоты 16 возможных
динуклеотидов в различных нуклеиновых кислотах. Этот прием до сих пор
использовался только в работе с ДНК-co держащими вирусами [1694].
Число фрагментов нуклеиновой кислоты в геноме
В гл. VIII описаны многокомпонентные вирусные системы. Известно,
что у некоторых вирусов генетический материал состоит из нескольких дис-
кретных фрагментов нуклеиновой кислоты. Число и размеры этих фрагмен-
тов служат ценным критерием при идентификации определенных групп виру-
сов (например, вирусы группы погремковости табака). Не исключено, что,
так же как и среди вирусов животных, среди вирусов растений будут обна-
ружены такие, у которых в одной частице содержится несколько фрагментов
активной нуклеиновой кислоты.
Число и структура белков в вирусной частице
До сих пор не установлено, содержат ли какие-либо вирусы растений
структурные белки более чем одного типа. Будущие исследования, вероят-
но, позволят выявить такие вирусы (в частности, из числа крупных вирусов).
Число и свойства структурных белков послужат важным критерием при
создании системы вирусов.
Такие параметры, как молекулярные размеры и аминокислотный состав
капсидных белков, оказались не слишком полезными при выделении обшир-
ных групп вирусов, однако они имеют существенное значение для распозна-
вания штаммов в пределах группы. Не имея прямых сведений о нуклеотид-
ной последовательности, можно использовать данные об аминокислотной
последовательности капсидных белков ряда вирусов для определения числа
мутационных событий, затронувших данный белок, у одного штамма в отли-
чие от другого (гл. XIII).
Другие составные части вирусов
Кроме РНК и белка, частицы некоторых вирусов растений содержат
липиды или полиамины. Наличие этих соединений, их количество, химиче-
ский состав и роль в структуре вируса могут служить критериями для клас-
сификации.
Строение вирусов
В своей важной работе Брандес и Веттер [271] указали на значение мор-
фологий частиц при объединении вирусов, имеющих удлиненные частицы,
в группы. Они установили, что их можно сгруппировать по характерной сред-
ней (модальной) длине их частиц. Сходство в длине вирионов отражает сход-
ство в длине РНК и в структуре белковой субъединицы, так как этими фак-
торами контролируется спиральная структура частиц. Вирусы, отнесен-
ные на основании этого критерия к одной группе, имеют и другие общие
свойства, например стабильность и внешний вид под электронным микро-
скопом. Кроме того, оказалось, что в пределах таких групп многие вирусы
3 1-0893
482
Глава XX
родственны и в серологическом отношении; в то же время обнаружить серо-
логическое родство между разными группами не удается. В тех случаях,
когда известны переносчики, представители одной группы имеют общего
переносчика [270]. Метод Брандеса и Веттера оказался самым удачным,
и построенная на его основе система палочкообразных вирусов представляет
собой наиболее удачную из всех систем классификации, разработанных
до сих пор в области вирусологии. При измерениях длины с целью охаракте-
ризовать вновь открытый вирус анализ следует проводить, пользуясь в каче-
стве стандарта вирусом с известным распределением длины частиц. Тейлор
и Смит [1750] представили данные об изменении модальной длины частиц
вируса желтой мозаики фасоли в зависимости от вида растения-хозяина.
Если это широко распространенное явление, то значение модальной длины
частиц как критерия для различения штаммов вирусов тем самым сильно
снизилось бы.
Для целей классификации изометрических вирусов морфология частиц,
выявляемая при помощи электронного микроскопа, оказалась далеко не
столь полезной, как в случае палочкообразных вирусов. Это связано главным
образом с тем, что многие сферические вирусы имеют очень близкие размеры
(диаметр около 25—30 нм) и внешне очень сходны. Морфологические разли-
чия удается выявить лишь при использовании препаратов и фотографии
очень высокого качества. Однако в тех случаях, когда удается получить
подробные сведения о симметрии и расположении субъединиц с помощью
рептгеиоструктурного анализа или электронной микроскопии с высоким
разрешением, эти параметры служат важным критерием для распределения
изометрических вирусов по группам. Для крупных вирусов со сложной
морфологией структура частицы, выявляемая методом электронной микро-
скопии, служит цепным указанием па возможные таксономические взаимо-
отношения. Разработка методов электронно-микроскопического исследова-
ния вирусов в неочищенных экстрактах растений [269, 800, 801] позволила
значительно ускорить исследование строения вирусов, что в свою очередь
имеет большую ценность для диагностики, особенно применительно к болез-
ням, вызываемым палочкообразными вирусами.
Физико-химические свойства
В качестве критериев при составлении системы используют несколько
независимо определяемых свойств вирусных частиц, зависящих от их соста-
ва и строения. Чаще всего это величина плавучей плотности, коэффи-
циент седиментации и электрофоретическая подвижность.
Стабильность вирусов
Исторически так сложилось, что устойчивость вируса, определяемая
по изменению его инфекционности (часто в неочищенных экстрактах), издав-
на служит важным критерием при распределении вирусов по группам. Такие
свойства, как точка тепловой инактивации, длительность храпения при ком-
натной температуре, чувствительность к pH, различным химическим соеди-
нениям, ферментам и физическим воздействиям (например, инактивация при
облучении ультрафиолетом), до сих пор весьма полезны во многих случаях,
особенно для тех вирусов, которые еще не охарактеризованы другими спосо-
бами. Меньшее значение они имеют при работе с такими вирусами, как ВТМ,
которые достаточно хорошо изучены в других отношениях. Использование
для целей классификации одной только устойчивости безотносительно к дру-
гим свойствам вируса привело бы к большой путанице. Так, например,
большинство штаммов ВТМ отличается высокой стабильностью, однако
Номенклатура, классификация и происхождение вирусов
483
некоторые мутанты крайне неустойчивы, а другие существуют в растении
только в виде свободной нуклеиновой кислоты (гл. XIII).
Полезные сведения можно иногда получить, изучая инактивирующее
действие различных реактивов на вирус. Вирусы, структура которых под-
держивается главным образом за счет ионных связей между субъединицами,
разрушаются концентрированными растворами солей. Напротив, вирусы,
структура которых поддерживается в основном за счет гидрофобных взаи-
модействий, стабилизируются в концентрированных солевых растворах, и
вызвать их деградацию можно, например, мочевиной.
Серологические реакции
Возможности и ограничения серологических методов в определении
родства между вирусами обсуждались в гл. XV. В прошлом эти методы счи-
тались наиболее падежными при решении вопроса о включении тех или иных
вирусов в соответствующие группы. В пределах каждой группы палочко-
образных вирусов, установленной на основании различий в длине частиц,
многие представители серологически родственны, хотя между группами
серологического родства пе обнаружено. Весьма вероятно, что серологиче-
ские тесты останутся одним из наиболее важных критериев при подразделе-
нии вирусов на группы. Когда дело дойдет до определения степени родства
внутри каждой группы, будут, несомненно, выявлены пограничные ситуа-
ции. С помощью серологических тестов, вероятно, можно лишь определять,
являются ли выделенные изоляты близкородственными или же между ними
существует отдаленное родство. Не говоря уже о чисто технических трудно-
стях (например, вариабельности антисывороток; см. гл. XV), вряд ли вооб-
ще с помощью серологических тестов удастся определять степень родства
с необходимой точностью. У типичного мелкого вируса, имеющего РНК
с молекулярной массой 2>106 и капсидный белок с молекулярной массой
примерно 2 ПО4, всего около Чщ РНК участвует в кодировании белка обо-
лочки. Результаты работы с мутантами ВТМ свидетельствуют о том, что лишь
весьма небольшая часть молекулы структурного белка (вероятно, всего
около 1/5) участвует в определении серологической специфичности интакт-
ного вируса. Таким образом, при исследовании серологического родства меж-
ду вирусами мы учитываем лишь около 2% белкового материала, кодируе-
мого вирусной РНК. У крупных вирусов (таких, как вирус броизовости
томатов), возможно, существуют маскированные антигены, подобные тем,
которые обнаружены у миксовирусов животных.
Вирусоспецифичные некапсидные белки
Как отмечалось в гл. VII, нуклеиновые кислоты большинства вирусов
растений имеют достаточно большую молекулярную массу и способны коди-
ровать кроме капсидного белка несколько других белков. Известно, что
некоторые вирусы растений обладают РНК-полимеразной активностью, но
фермент этот еще не был охарактеризован сколько-нибудь определенно. Что
касается других белков, то неизвестно даже, какие функции они могли бы
выполнять. Поскольку некоторые мутанты ВТМ, полученные при воздей-
ствии азотистой кислотой, имеют тот же капсидный белок, что и родительский
штамм, ио отличаются от него по вызываемым ими симптомам (гл. XIII), ка-
жется вполне вероятным, что некапсидные белки могли бы контролировать
такие биологические свойства, как симптомы заболевания и спектр поражае-
мых хозяев. Для разработки обоснованной системы классификации вирусов
необходимы сведения о числе, функциях, активности и строении этих белков
31*
484
Глава XX
у ряда различных вирусов. Отсутствие сведений о таких белках является
в настоящее время одной из наиболее серьезных причин, задерживающих
разработку определенной системы классификации и номенклатуры.
Дефектные частицы и многокомпонентные вирусы
Исследования, проведенные сравнительно недавно (гл. VIII), позволяют
предположить, что типы частиц, образующихся при вирусной инфекции,
и их функциональная роль послужат важным критерием при установлении
различных групп вирусов. Например, вирусы группы ВЖМТ продуцируют
значительное количество пустых белковых оболочек, не содержащих РНК.
У других вирусов существование двух или более вирусных частиц может
быть следствием фрагментированного состояния генома. Например, у виру-
сов группы мозаики тыквы РНК распределена между двумя частицами.
У вирусов группы погремковости табака РНК распределена между двумя
палочкообразными частицами — длинной и короткой.
Активность вируса в организме растения-хозяина
До тех пор пока для целей классификации вирусов использовались такие
биологические характеристики, как совокупность симптомов и спектры рас-
тений-хозяев, существовала значительная неопределенность в идентифика-
ции и классификации вирусов. По мере накопления знаний о физических
и химических свойствах вирусов роль чисто биологических свойств в каче-
стве критериев при построении системы вирусов уменьшалась. В настоящее
время кажется совершенно очевидным, что проявление вирусной инфекции
на растении, вероятно, есть выражение активности особых белков, кодируе-
мых вирусной РНК. По этой причине симптомы и прочие проявления жизне-
деятельности вируса в растении должны приобрести определенное значение
для целей классификации вирусов. Мы пока не знаем, какую роль можно
приписать тому или иному симптому или различию в симптомах. Это одна
из причин, заставляющих сейчас отдать предпочтение обсуждаемому ниже
подходу к классификации вирусов, предложенному Адансоиом.
Макроскопические симптоматические различия часто позволяют обна-
ружить существование особого штамма вируса в тех случаях, когда это
не удается сделать па основании других доступных критериев. Это очень
ценно. Минимальное отличие такого вируса состоит, как можно полагать,
в замене одного основания в цистроне, кодирующем какой-то некапсидный
белок. Более детальные цитологические исследования показали, что опреде-
ленные группы вирусов вызывают характерные цитологические изменения
в поражаемых ими клетках (гл. IX). Имеющиеся данные наводят на мысль,
что ультраструктурные изменения в клетках могут служить более стабиль-
ными критериями для целей классификации вирусов, нежели макроскопиче-
ские симптомы.
Перекрестная защита — явление, при котором инфицирование одним
штаммом вируса предохраняет растение от заражения другим, родствен-
ным штаммом. Это явление использовалось ранее в качестве важной основы
для установления родства между вирусами. Оно и сейчас может сослужить
хорошую службу для целей классификации, однако при интерпретации
результатов должна соблюдаться сугубая осторожность, поскольку извест-
но, что для ряда родственных штаммов такая перекрестная защита не наблю-
дается, тогда как для некоторых неродственных вирусов, напротив, ее удает-
ся обнаружить (гл. XIII).
Номенклатура, классификация и происхождение вирусов
485
Способы передачи
В последние годы выяснилось, что все или почти все вирусы передаются
в природе только одним типом переносчика (гл. VI и XVI). Немногочислен-
ные сообщения о том, что вирусы переносились представителями двух раз-
личных групп членистоногих, нуждаются в проверке. Тип переносчика слу-
жит весьма устойчивым признаком, полезным при выделении основных групп
вирусов. Одпако в пределах данной группы вирусов или вирусных штаммов
могут существовать значительные различия в эффективности и возможности
передачи одним переносчиком данного вида. Способ передачи инфекции пере-
носчиком (с помощью стилета или циркулятивным путем у тлей, па наружных
покровах, в спорах грибов и т. д.) служит дополнительным критерием при
классификации вирусов.
Генетика
Недавно было показано, что у нескольких родственных групп вирусов
растений РНК содержится ие в одной частице, а существует в виде двух
или более фрагментов и заключена в составе нескольких частиц. Это откры-
вает большие возможности для использования генетических методов с целью
определения степени родства между вирусами в пределах таких групп, а
также изучения числа, последовательности и функций цистропов в геноме
этих вирусов. Среди вирусов группы погремковости табака комплементация
между длинными и короткими частицами возможна только для близкород-
ственных, по не для отдаленных штаммов [568, 1078]. Пока неясно, удастся
ли составить детальные генетические карты этих вирусов. Из всех известных
в настоящее время систем система вируса мозаики люцерны, состоящая
по меньшей мере из четырех частиц, вероятно, является паилучшей для этой
цели.
СОВРЕМЕННЫЕ СИСТЕМЫ КЛАССИФИКАЦИИ ВИРУСОВ
Известно два общих принципа классификации организмов. Один из них—
иерархический принцип — лежит в основе классической линнеевской клас-
сификации растений и животных. Это логическая система, в которой так
или иначе делаются заключения об относительной важности различных
признаков, которые затем используются для включения систематической
единицы в определенный класс, порядок, семейство, род и т. д. Система,
предложенная Адаисоном [6], исходит из противоположного принципа: она
основана на допущении равноценности всех признаков. Существуют различ-
ные мнения относительно этих двух подходов к классификации вирусов
[618, 1111].
Однако возможен еще один подход к решению интересующей пас пробле-
мы— подход практический, или прагматический; он состоит в том, чтобы
объединять вирусы в группы, исходя из общих соображений и здравого смы-
сла и полагаясь на то, что все противоречия разрешит будущее. Этот подход
описан ниже.
Монотетическая иерархическая классификация
Львов и др. [1113] предложили систему, в которой тип нуклеиновой
кислоты вируса (ДНК или РНК), строение и симметрия вирусных частиц,
наличие или отсутствие оболочки, число морфологических субъединиц
у икосаэдрических вирусов или диаметр палочкообразных вирусов признава-
лись наиболее важными признаками (здесь они перечислены в порядке
486
Глава XX
уменьшения важности) при установлении основных подразделений. Их
система получила поддержку в «Предложениях и рекомендациях» Временной
комиссии по номенклатуре вирусов [1366]. Были предложены наименования
для различных групп, вплоть до семейств. Вот как это выглядело для пер-
вых трех групп:
Царство
Vila
Подцарство (тип
генетического
материала)
Deoxyvira
Ribovira
Классы (симме-
трия частиц)
Deoxyhelica
Deoxycubica
Deoxybinala (2 типа
симметрии)
Ribohelica
Ribocubica
Эта схема критиковалась с различных точек зрения [1322]. Основная
трудность, связанная с применением этой или любой другой подобной ей
системы, состоит в отсутствии научной основы для установления относи-
тельной важности различных признаков. В самом деле, вполне возможно,
что самые важные свойства вирусов нам просто неизвестны. Например,
в 1965 году, когда была предложена упомянутая выше схема, не было извест-
но, что генетический материал вирусов может быть распределен среди нес-
кольких частиц. Сразу же возникает вопрос, что важнее — число фрагмен-
тов генома или тип симметрии белковой оболочки? По-видимому, введение
описанной схемы было бы преждевременным, она, несомненно, потребовала
бы серьезных периодических изменений, и тем самым нынешняя запутанная
ситуация нисколько не разрешилась бы.
Классификация Адансона
Адансон [6] считал, что систематические единицы следует выделять,
учитывая все известные признаки и считая их равнозначными. Он предло-
жил несколько не связанных между собой классификаций, основанных каж-
дая на каком-то одном признаке, а затем сравнил результаты, полученные
при идентификации видов, произведенной на основании разных признаков.
В конечном счете были получены группы, основанные на наибольшем числе
совпадающих признаков. Этот метод слишком трудоемок и до недавнего вре-
мени не получил широкого распространения, так как для получения удовлет-
ворительных результатов требовалось учесть не менее 60 равнозначных неза-
висимых качественных (т. е. + или —) признаков [1635]. Однако с появле-
нием вычислительной техники возродился интерес к классификациям такого
рода. Вычислительную машину можно по-разному использовать для экспе-
риментальной разработки классификации вирусов [145, 146, 616]. Анализ,
проводимый при помощи такой машины, объективен, причем могут учиты-
ваться числовые данные, такие, как отношение оснований в нуклеиновых
кислотах и аминокислотный состав белка. Классификацию, основанную
на расчетах, полученных с помощью вычислительной машины, иа данном
этапе следует рассматривать как экспериментальную. Этот подход, как
и любой другой метод классификации, также лимитирован недостатком дан-
ных о вирусах. На практике неизбежно некоторое взвешивание признаков,
даже когда оно сводится к решению вопроса о том, какие признаки отбро-
сить, а какие включить. Из всех возможностей этого подхода нас в настоя-
щее время в основном будет интересовать проверка систем классификаций,
полученных другими методами, и выявление новых, не известных ранее отно-
шений между вирусами, существование которых может быть затем прове-
рено экспериментальным путем.
Номенклатура, классификация и происхождение вирусов 487
Номенклатура
Одна из главных причин, по которой латинская биноминальная система
номенклатуры в настоящее время неприложима к вирусам, состоит в том,
что название вируса должно было бы одновременно служить его обозначе-
нием и содержать некоторые сведения о нем. Однако при современном состоя-
нии знаний (вернее, при отсутствии их для большинства вирусов) неизбежно
потребовалось бы периодически изменять эти названия. Пытаясь преодо-
леть эту трудность, Гиббс и др. [618, 621] разработали систему, в которой
названия вирусов состоят из двух частей — первая часть представляет собой
постоянное обозначение (общеупотребительное название), а вторая изменена
в зашифрованную информацию, которую можно легко пополнять или заме-
нять по мере накопления новых данных. Каждая криптограмма состоит
из четырех пар символов [616].
1-я пара. Тип нуклеиновой кислоты /Число цепей нуклеиновой кис-
лоты.
Символы для типа нуклеиновой кислоты: R — РНК, D —- ДНК.
Символы для числа цепей: 1 — одноцепочечиая, 2 — двухцепочечпая.
2-я пара. Молекулярная масса нуклеиновой кислоты /в млн.) /Про-
центное содержание нуклеиновой кислоты в инфекционных частицах.
3-я пара. Внешний вид частицы/Внешний вид «нуклеокапсида»
(нуклеиновая кислота вместе с белком, тесно связанным с ней).
Символы для обоих признаков: S — сферические, Е —• удлиненные
с параллельными сторонами и незакруглеиными концами, U — удлиненные
с параллельными сторонами и закругленным концом (концами), X — слож-
ные или отличные от всех перечисленных.
4-я пара. Типы заражаемых хозяев/Типы переносчиков.
Символы для обозначения типов хозяев: А — актиномицеты, В — бак-
терии, F — грибы, I — беспозвоночные, S — семенные растения, V — поз-
воночные.
Символы для типов переносчиков: Ас — клещи (Acarina, Arachnida),
Al — белокрылки (Aleirodidae, Hemiptera, Insecta), Ap — тли (Aphididae,
Hemiptera, Insecta), Au — цикадки (Auchenorrhyncha, Hemiptera), Cc —
кокциды (червецы и щитовки) (Coccidae, Hemiptera), Cl — жуки (Coleoptera,
Insecta), Di. — мухи и комары (Diptera, Insecta), Fu — грибы (Chytridiales
и Plasmodiophorales, Fungi), Gy — кружевницы и др. клопы (Gymnocerata,
Hemiptera), Ne — нематоды (Nematoda), Ps — листоблошки (Psyllidae,
Homoptera), Si — блохи (Siphonaptera, Insecta), Th — трипсы (Thysanop-
tera, Insecta), Ve — переносчики известны, но не относятся к перечисленным
выше группам. Символы для всех пар:* — о данном свойстве вируса ничего
не известно, ( ) — сведения, заключенные в скобках, сомнительны или
не подтверждены.
Пример. Вирус табачной мозаики по этой системе обозначается следую-
щим образом: (R/1; 2/5; E/E;S/*).
Если точно известно, что данный вирус связан с какой-то группой виру-
сов, которой присвоено определенное название, то это последнее ставится
после криптограммы.
Пользование криптограммами имеет ряд преимуществ, они:
а) облегчают идентификацию и повышают точность тривиального наз-
вания вируса;
б) позволяют сразу же оценить объем информации, имеющейся о разных
вирусах;
в) помогают преодолеть трудности, связанные с наличием синонимов
и омонимов и с переводом на другие языки;
488
Глава XX
г) содержат единообразную информацию, понятную в равной степени
специалистам по вирусам растений, животных и бактерий;
д) могут быть легко модернизированы в том случае, если результаты
будущих исследований потребуют включения в криптограмму каких-либо
более важных свойств вирусов.
Криптограммы используются в основном в письменных публикациях.
Невероятно, чтобы, обращаясь друг к другу в разговоре, вирусологи гово-
рили: «R/1; 0,4/20; S/S; S/Fu» вместо «вирус-сателлит». Тем, кто работает
с этим вирусом, хорошо известны его свойства. Информация, необходимая
для составления криптограмм, может быть почерпнута в опубликованном
списке названий вирусов [616]. В научной статье криптограмма, вероятно,
должна использоваться всего один раз, в разделе, касающемся описания
применявшегося в работе материала. Это способствует существенному
сокращению объема текста, хотя, возможно, было бы проще перечислить свой-
ства обычным образом.
Распространение таких криптограмм, несомненно, стимулировало бы
включение в статьи стандартной основной информации о вирусах, с которы-
ми работает автор. Однако при этом возникает опасность того, что в шифры
вирусов будут включаться свойства, выведенные на основании того, что уже
известно для изучаемого изолята. Допустим, например, что в какой-то лабо-
ратории экспериментально установлено, что некий вирус имеет следующие
свойства: R/1; 0,4/20; S/S; S*. Достаточно ли этого, чтобы прийти к заклю-
чению, что речь должна идти о вирусе-сателлите, т. е. можно ли написать
/Fu вместо /*? И если нет, то насколько полной должна быть проверка
с помощью тестов на передачу вируса грибами для того, чтобы можно было
написать /Fu? Криптограмма вовсе не освобождает от необходимости тща-
тельной экспериментальной работы, которая должна быть детально описана
в тексте независимо от того, использовалась криптограмма или нет.
Эта система может превратиться в очень громоздкую в тех случаях, ког-
да инфекционность вирусов реализуется при наличии более чем одной части-
цы. Так, Джаспарс (личное сообщение) отмечает, что криптограмма для
вируса мозаики люцерны в настоящее время должна выглядеть так: R/1;
(1,6) +*4-*+ (0,5) +*/184-184-18+18+18; U + U + U + U 4-S/U + U +
+ U + U + S; S/АР. Вероятно, для таких вирусов возможно ввести ка-
кую-то упрощенную криптограмму.
Что касается меня, то я полностью поддерживаю точку зрения Гиббса
и его сотрудников, согласно которой тривиальные названия следует и впредь
использовать. До каких пор — покажет время. Лучшей проверкой на целе-
сообразность применения криптограмм будет их широкое использование
как вирусологами, так и в журналах, публикующих статьи по вирусологии.
ГРУППЫ ВИРУСОВ РАСТЕНИЙ
В списке вирусов растений, опубликованном Микологическим институ-
том [1164], числится 630 болезней, вызываемых вирусами, а также заболева-
ний, вирусная этиология которых представляется вероятной. Для 457 из
этих заболеваний известно, что они передаются либо путем механической
инокуляции, либо с помощью одного из беспозвоночных-переносчиков (или
обоими способами), но сведения о свойствах частиц возбудителя отсутствуют.
Результаты исследований, обсуждавшиеся в гл. X, позволяют предполо-
жить, что около 60 из этих болезней, возможно, вызываются микоплазмо-
подобными организмами, а не вирусами. В данный момент мы можем счи-
тать доказанным с высокой степенью вероятности вирусное происхождение
173 болезней, для которых имеются некоторые сведения о размере и форме
вирусных частиц.
Номенклатура, классификация и происхождение вирусов
489
Подкомиссия вирусов растений Международной комиссии по номенкла-
туре вирусов (председатель Харрисон) имеет следующие задачи: 1) оценка
степени сходства и различия между вирусами растений, учитывая все извест-
ные свойства этих вирусов; 2) разделение всех известных вирусов на группы;
3) описание типичного представителя каждой из предлагаемых групп; 4) име-
нование групп, если это потребуется; 5) тщательное изучение мнений иссле-
дователей, работающих в области вирусологии растений; 6) представление
доклада следующему Международному микробиологическому конгрессу.
Комиссия подготовила список групп вирусов. Приводимый ниже пере-
чень аналогичен тому, который был разослан вирусологам всего мира для
обсуждения. Метод, использованный при объединении различных вирусов
в те или иные группы, отличается как от иерархического метода, так и от ме-
тода Адансона и составляет тот самый подход к проблеме, который мы наз-
вали подходом с точки зрения здравого смысла; вероятно, он получит под-
держку большинства исследователей вирусов растений.
Большим шагом вперед явилось бы достижение соглашения об основ-
ных группах вирусов. В настоящее время не делается никаких попыток выя-
вить степень родства в пределах каждой группы. Эту проблему еще долго
не удастся решить. В пределах многих групп (например, в группе ВТМ)
непрерывно обнаруживаются новые штаммы [366], которые часто пе уклады-
ваются в рамки группы, установленные исходя из ранее известных штаммов.
Ниже приводится список групп вирусов растений, предложенный Харри-
соном (апрель 1969 г.).
Примечание: отсутствие одного или нескольких свойств, общих со свой-
ствами типичного представителя данной группы, не исключает возможности
включения данного вируса в эту группу. Однако подавляющее большинство
свойств должно быть общим. Группы перечисляются в произвольном порядке.
1. Типичный представитель — вирус погремковости табака (изолят
PRN). Основные свойства: содержание РНК приблизительно 5%. Жесткие
палочкообразные частицы, спиральная симметрия (шаг спирали 2,5 нм),
мол. масса белковых субъединиц примерно 24 000. Два главных компонента:
1) палочки длиной 180—210 нм инфекциониы, коэффициент седиментации
приблизительно 300 S, мол.масса РНК около 2,5 -10е; 2) более короткие
функциональные частицы. Точка тепловой инактивации составляет прибли-
зительно 70—80 °C; хранится несколько месяцев. Концентрация в соке
часто достигает 20—100 мг/л. Симптомы — часто некрозы. Широкий спектр
хозяев. Переносчики — нематоды (Trichodorus spp.); в организме нематод
сохраняется неделями. Передается механическим путем. Между представи-
телями группы имеется отдаленное серологическое родство.
Другие представители: вирус раннего побурения гороха.
2. Типичный представитель — вирус табачной мозаики (обычный~vul-
gare ~ Ui-итамм). Основные свойства: содержание РНК (одноцепочечной)
приблизительно 5%, мол. масса РНК около 2-10s. Прямые трубчатые части-
цы, коэффициент седиментации около 190 S, спиральная симметрия (шаг
спирали 2,3 нм). Белковые субъединицы с мол. массой примерно 17 500.
Инфекционные частицы длиной около 300 нм. Точка тепловой инактивации
выше 90 °C, хранится много лет. Концентрация в соке часто выше 1 мг/мл.
Симптомы — в большинстве случаев мозаика и крапчатость. Распространяет-
ся механически, переносчики неизвестны. Между представителями имеется
серологическое родство.
Другие представители: вирус зеленой крапчатой мозаики огурцов,
вирус кольцевой пятнистости Odontoglossum, вирус мозаики подорожника,
вирус опунции Сэммонса, вирус мозаики конопли, вирус мозаики томатов.
3. Типичный представитель — Х-вирус картофеля. Основные свойства:
содержание РНК около 6%. Гибкие палочки, спиральная симметрия (шаг
490 Глава XX
спирали 3,4 нм). Инфекционные частицы с коэффициентом седиментации
около 118 S, длиной приблизительно 480—580 нм. Точка тепловой инактива-
ции 65—75 °C, хранится месяцами. Концентрация в соке часто достигает
500 мг/л. Симптомы — главным образом мозаика, крапчатость и кольцевая
пятнистость. Спектр хозяев несколько ограниченный. Распространяется
механическим путем. Между представителями группы имеется отдаленное
серологическое родство.
Другие представители: Х-вирус кактуса, вирус желтой мозаики клеве-
ра, вирус кольцевой пятнистости гортензии, вирус мозаики белого клевера.
Возможные представители: вирус курчавой карликовости артишоков,
вирус обыкновенной мозаики маниока, вирус мозаики орхидеи (род СутЫ-
dium), вирус мозаики нарциссов, вирус мозаики папайи, вирус аукуба-мозаи-
ки картофеля.
4. Типичный представитель — латентный вирус гвоздики. Основные
свойства: содержание РНК около 6%. Слегка гибкие палочки, спиральная
симметрия (шаг спирали 3,4 пм). Инфекционные частицы 620—690 нм дли-
ной. Точка тепловой инактивации 55—70 °C, хранится несколько дней. Кон-
центрация в соке часто 20—100 мг/л. Симптоматика слабо выражена или
вообще отсутствует. Узкий спектр хозяев. Многие представители этой груп-
пы имеют переносчиков — тлей, в организме которых не сохраняются дли-
тельно. Возбудитель передается механически. Между представителями
имеется отдаленное серологическое родство.
Другие представители: вирус 2 кактуса, /5-вирус хризантемы, латентный
вирус страстоцвета, вирус полосатости гороха, М-вирус картофеля, 5-вирус
картофеля, вирус жилковой мозаики красного клевера.
Возможные представители: вирус бородавчатости цикория, вирус моза-
ики фреезии, латентный вирус хмеля, вирус мозаики тополя.
5. Типичный представитель — Y-eupyc картофеля. Основные свой-
ства: гибкие палочки. Спиральная симметрия, шаг 3,4 нм. Инфекционные
частицы 720—780 пм длиной. Точка тепловой инактивации 50—60 °C. Кон-
центрация в соке часто 5—25 мг/л, хранится несколько дней. Обычные симп-
томы — мозаика. Довольно узкий спектр хозяев, переносчики — тли,
в организме переносчика не сохраняется. Передается механически. Между
представителями имеется отдаленное серологическое родство.
Другие представители: вирус обыкновенной мозаики фасоли, вирус
желтой мозаики фасоли, вирус мозаики свеклы, вирус желтой прижилковой
мозаики клевера, вирус мозаики коровьего гороха, передаваемый тлями,
вирус колумбийского дурмана, вирус мозаики белены, вирус мозаики горо-
ха, A-вирус картофеля, вирус мозаики сои, вирус гравировки табака, вирус
мозаики арбуза (Южная Африка).
Возможные представители: вирус мозаики сельдерея, вирус полосато-
сти ежи сборной, вирус мозаики ириса, вирус мозаики салата-латука, вирус
посветления жилок мальвы, вирус желтой штриховатости нарцисса, вирус
желтой карликовости лука, вирус кольцевой пятнистости папайи, вирус
«оспы» слив, вирус мозаики сахарного тростника, вирус мозаики тюльпа-
нов, вирус мозаики турнепса, вирус мозаики арбуза 1 (США).
6. Типичный представитель — вирус мозаики люцерны. Свойства: сос-
тоит не менее чем из четырех компонентов — трех бацилловидных (размеры
18x 58, 18x48 и 18x36 нм) и одного сферического; коэффициенты седи-
ментации этих компонентов соответственно равны 99, 89, 73 и 68 S. Функцио-
нально активны самый тяжелый и самый легкий компоненты, а возможно,
и остальные; все они содержат одноцепочечную РНК. Наиболее тяжелый
имеет мол. массу около£1,6-10е и следующий нуклеотидный состав: Г = 23,
А=27, Ц=20, У—30. Точка тепловой инактивации’ДО—70 °C, хранится несколь-
ко дней. Концентрация в соке 20—500 мг/л. Симптомы — крапчатость, моза-
Номенклатура, классификация и происхождение вирусов
491
ика и кольцевая пятнистость. Широкий спектр хозяев, переносчик — тля
(в организме тли, питающейся па растении, сохраняется менее 2 ч). Пере-
дается механически.
Другие представители неизвестны.
7. Типичный представитель — вирус деформирующей мозаики вороха.
Свойства: содержание РНК (одноцепочечной) около 20%, мол. масса РНК
приблизительно 1 -10°; нуклеотидный состав: Г = 26, А=24, Ц = 24, У =26.
Изометрические частицы с коэффициентом седиментации 115 S, примерно 28 нм
в диаметре, мол. масса белковых субъединиц приблизительно 21 000. Имеются
также частицы с коэффициентом седиментации около 90 S. Точка тепловой
инактивации 55—60 °C, хранится несколько дней. Концентрация в соке
часто 5—25 мг/л. Симптомы — крапчатость и деформация. Узкий спектр
хозяев, переносчик — тля (в организме переносчика сохраняется несколько
педель). Передается механически.
Другие представители неизвестны.
8. Типичный представитель — вирус огуречной мозаики (изолят S ван
Регенмортеля [7657]). Основные свойства: содержание РНК (одиоцепочечпой)
около 18%, мол. масса примерно 1 -10е; нуклеотидный состав: Г = 24, А =
= 23, Ц = 23, У =30. Изометрические частицы с коэффициентом седимента-
ции 98 S, приблизительно 30 нм в диаметре, содержат 180 белковых субъ-
единиц с мол.массой примерно 32 000; другие частицы отсутствуют. Точка
тепловой инактивации 60—70 °C, хранится несколько дней. Концентрация
в соке часто 20—200 мг/л. Симптомы — мозаика. Широкий спектр хозяев,
переносчик — тля (в организме питающейся тли сохраняется 2 ч), пере-
дается механическим путем. Между представителями группы имеется отда-
ленное серологическое родство.
Другие представители: вирус аспермии томатов, вирус желтой мозаики
огурцов (штамм 6).
9. Типичный представитель — вирус желтой мозаики турнепса (кемб-
риджский изолят). Основные свойства: содержание РНК (одноцепочечной)
приблизительно 35%, мол.масса около 2-10е; нуклеотидный состав: Г = 17,
А = 22, Ц = 40, У = 21 (подгруппа «а»), изометрические частицы
с коэффициентом седиментации около 110 S, диаметром 30 нм, 180 белковых
субъединиц собраны в четкие пента-гексамерные блоки, мол. масса
субъединиц около 20 000; имеются частицы с константой седимента-
ции 50 S, представляющие собой пустые белковые оболочки. Точка тепловой
инактивации обычно 70—90 °C, хранится несколько недель. Концентрация
в соке часто 50—500 мг/л. Симптомы — мозаика и крапчатость. Узкий спектр
хозяев; переносчики — грызущие насекомые (сохраняется в организме пере-
носчика несколько дней). Передается механическим путем. Между вирусами
в каждой из двух подгрупп имеется серологическое родство.
Другие представители: а) вирус желтой мозаики какао, вирус мозаики
дикого огурца; б) латентный вирус картофеля, вирус крапчатости белладон-
ны, вирус крапчатости паслена, вирус мозаики баклажанов, вирус жел-
той мозаики онониса.
10. Типичный представитель — вирус мозаики коровьего гороха (изо-
лят SB). Основные свойства: 3 компонента, все они имеют изометрические
частицы диаметром около 30 нм, с коэффициентами седиментации 115, 95
и 55 S; содержание РНК (одноцепочечной) соответственно 33, 22 и 0%.
РНК-содержащие компоненты являются функциональными, мол.масса РНК
в более тяжелом компоненте приблизительно 2 40е; нуклеотидный состав
Г = 23, А = 27, Ц = 17, У = 33. Точка тепловой инактивации 60—80 °C,
хранится от одной до нескольких недель. Концентрация в соке часто 50—
200 мг/л. Симптомы — мозаика и крапчатость. Довольно узкий спектр хозя-
ев, переносчики — жуки (сохраняется в организме переносчика несколько
492
Глава XX
дней). Передается механическим путем. Между различными представителями
имеется отдаленное серологическое родство.
Другие представители: вирус крапчатости бобов фасоли, вирус пятни-
стости конских бобов, вирус мозаики редиса, вирус крапчатости красного
клевера, вирус мозаики тыквы, собственно вирус мозаики конских бо-
бов.
И. Типичный представитель — вирус кольцевой пятнистости табака.
Основные свойства: 3 компонента, все они имеют изометрические частицы
диаметром около 30 нм, с коэффициентами седиментации приблизительно
125, 95 и 50 S. Два более тяжелых компонента содержат одноцепочечную
РНК, нуклеотидный состав: Г — 24, А=23, Ц = 22, У = 31; содержание РНК
в самом тяжелом компоненте около 40%, мол.масса примерно 2-10°. Точка
тепловой инактивации 55—70 °C, хранится несколько дней или недель.
Концентрация в соке часто 10—50 мг/л. Передается семенами. Симптомы —
кольцевая пятнистость и крапчатость. Широких! спектр хозяев; перенос-
чики — нематоды (в организме нематод сохраняется в течение нескольких
недель). Передается механическим путем. Серологическое родство между
отдельными представителями слабо выражено.
Другие представители: вирус мозаики резухи, вирус папоротниковид-
ности листьев винограда, вирус кольцевой пятнистости малины, вирус
латентной кольцевой пятнистости земляники, вирус черной кольцевой
пятнистости томатов и вирус кольцевой пятнистости томатов.
Возможный представитель: вирус скручивания листьев вишни.
12. Типичный представитель — вирус некроза табака (штамм А).
Основные свойства: содержание РНК около 20%, частицы изометрические,
диаметром примерно 28 нм, с коэффициентом седиментации 118 S, другие
частицы отсутствуют. Точка тепловой инактивации 65—95 °C, хранится
до нескольких месяцев. Концентрация в соке может составлять 10—100 мг/л.
Часто проявляются симптомы некроза. Широкий спектр хозяев, перенос-
чики — грибы (Olpidium) (вероятно, сохраняется в зооспорах в течение
нескольких часов). Передается механическим путем. Между представителями
имеется серологическое родство.
Другой представитель: вирус некроза табака, штамм D.
13. Типичный представитель — вирус мозаики костра. Основные свой-
ства: содержание РНК (одноцепочечной) около 22%, молекулярная масса
приблизительно 1,1-10е; нуклеотидный состав: Г = 28, А = 27, Ц = 21,
У = 24. Частицы изометрические диаметром около 25 нм, с коэффициентом
седиментации 90 S, состоящие из 180 белковых субъединиц с мол.массой
20 000, другие частицы отсутствуют. Точка тепловой инактивации 70—95 °C,
срок хранения in vitro сильно варьирует. Концентрация в соке часто 50—
200 мг/л. Симптомы — крапчатость; довольно узкий спектр хозяев. Пере-
дается механическим путем. Данных о существовании серологического род-
ства’ между отдельными представителями не имеется.
Другие представители: вирус крапчатости конских бобов, вирус хлоро-
тической крапчатости коровьего гороха.
14. Типичный представитель — вирус кустистой карликовости тома-
тов. Основные свойства: содержание РНК (одноцепочечиой) около 17%,
мол.масса примерно 1,5 -10е, нуклеотидный состав: Г = 28, А = 25, Ц = 22,
У = 25. Частицы изометрические диаметром-—30 нм, с коэффициентом седи-
ментации 140 S, белковые субъединицы собраны попарно, дополнительные
частицы отсутствуют. Точка тепловой инактивации 85—90 °C, хранится
несколько недель. Концентрация в соке часто 20—200 мг/л. Симптомы — часто
крапчатость и деформация; широкий спектр хозяев. Передается механиче-
ским путем. Между отдельными представителями имеется серологическое
родство.
Номенклатура, классификация и происхождение вирусов 493
Другие представители: вирус крапчатой морщинистости артишока,
итальянский вирус кольцевой пятнистости гвоздики, вирус скручивания
листьев пеларгонии, вирус звездчатой мозаики петунии.
15. Типичный представитель — вирус бронзовости томатов. Свойства:
вероятно, содержит РНК, белок и липиды. Частицы изометрические диамет-
ром 70—80 пм, с коэффициентом седиментации 560 S. Точка тепловой инакти-
вации 42 °C, хранится несколько часов. Концентрация в соке, вероятно,
менее 20 мг/л. Симптомы — кольцевая пятнистость и некрозы. Широкий
спектр хозяев; переносится трипсами (в организме переносчиков сохраняется
несколько недель). Передается механическим путем.
Другие представители неизвестны.
16. Типичный представитель — вирус мозаики цветной капусты (изо-
ляпг Cabbage В). Основные свойства: содержит ДНК, частицы изометрические
диаметром~50 нм, с коэффициентом седиментации примерно 220 S; допол-
нительные частицы отсутствуют. Точка тепловой инактивации 75—80 °C,
хранится несколько дней. Концентрация в соке, вероятно, 10—100 мг/л.
Симптомы — мозаика и крапчатость. Узкий спектр хозяев, переносчики —
тли (в организме питающейся тли сохраняется несколько часов). Передается
механическим путем. Между представителями имеется серологическое родство.
К этой группе относится также вирус мозаики Dahlia.
ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О ПРОИСХОЖДЕНИИ
И ЭВОЛЮЦИИ ВИРУСОВ
Хотя сейчас благодаря исследованиям структуры и репликации виру-
сов, а также молекулярной биологии нормальных клеток мы знаем об этой
проблеме несколько больше, происхождение и эволюция вирусов все еще
остаются в основном предметом умозрительных рассуждений. Тем не менее
эти вопросы неизменно вызывают большой интерес; кстати, они непосред-
ственно связаны с проблемой классификации. Как указывал Пири [1366],
большинство исследователей согласны между собой в том, что всякая класси-
фикация, если только она не преследует узкопрактические цели, должна
иметь филогенетический смысл.
Нет оснований предполагать, что все вирусы, заражающие различные
группы организмов, или хотя бы вирусы, заражающие одну группу организ-
мов, имеют общее происхождение. Более того, возможно, что вирусы, кото-
рые в настоящее время известны нам как агенты, инфицирующие какую-то
одну определенную группу организмов, на самом деле возникли совсем
в другой группе организмов. Сейчас очевидно, что в строении некоторых
групп вирусов растений и животных, а также в механизмах их репликации
в клетках существует значительное сходство. Большинство наблюдаемых
различий между вирусами растений и вирусами животных, вероятно,
отражает различие реакций организма-хозяина на инфекцию. Известно, что
некоторые вирусы растений размножаются в организме их переносчиков—насе-
комых. Среди Heteroptera имеются группы, например пентатомиды (клопы-
черепашки), представители которых питаются как на растениях, так и па
млекопитающих. Известны виды, питающиеся на растениях и на других насе-
комых. Таким образом, членистоногие переносчики издавна служили связую-
щим звеном между растениями и позвоночными, способствуя широкому
распространению вирусов, возникших в каждой из этих групп или в организме
членистоногих.
В последующих разделах мы кратко рассмотрим три возможных пути
происхождения вирусов: а) вирусы — примитивные доклеточные формы
494
Глава XX
жизни; б) вирусы возникли как составные части нормальных клеток, вышед-
шие из-под контроля клеточных механизмов и начавшие реплицироваться
независимо; в) вирусы — продукт деградации микроорганизмов.
Потомки примитивных доклеточных форм жизни
Высокоразвитый облигатный паразитизм вирусов, как мы представляем
его себе в настоящее время, не дает оснований считать, что вирусы являются
примитивными доклеточными формами жизни. Они используют тот же
генетический код, что и клеточные организмы, синтез их белков зависит
от рибосом, транспортных РНК и соответствующих ферментов, поставляе-
мых клеткой-хозяином (имеются сведения, что некоторые вирусы могут сами
вносить в клетку одну или более необходимых для них транспортных РНК).
В свое время при обсуждении вопроса о происхождении генетического кода
было высказано предположение, что примитивный код, возможно, был
дублетным и кодировал 16 аминокислот в ранних белках. Когда код превра-
тился в триплетный, в синтезе белка начали использоваться еще 4 амино-
кислоты [900]. Однако строение белка оболочек у вирусов растений не дает
оснований говорить об их примитивности. Четыре аминокислоты, которые,
как предполагалось, появились позднее в процессе эволюции (метионин, трип-
тофан, тирозин и серин или аргинин), обнаруживаются у этих вирусов при-
мерно с той же частотой, что и в белках других групп. Например, содержа-
ние триптофана — одной из тех аминокислот, которые встречаются в белках
с низкой частотой, составляет (в приближенных процентных концентрациях)
в бактериальном белке 0,8; в белке дрожжей 1,4; в белке водорослей 2,0;
в белке цитоплазмы листьев ячменя 2,3 [214]. Среднее содержание
триптофана в 6 капсидных белках вирусов растений составляет 1,2.
Нуклеотидный состав и другие химические свойства вирусных нуклеи-
новых кислот также не имеют каких-либо явных отличительных особенностей.
Таким образом, хотя вирусные частицы относительно просты по своей струк-
туре, то, что известно об их химическом составе и законах репликации,
не позволяет сделать вывод, что в эволюционном отношении они более при-
митивны, нежели клеточные организмы.
Возникновение из нормальных клеточных компонентов
Часто предполагали, что вирусы могут вести свое происхождение от како-
го-то клеточного компонента, вышедшего из-под влияния нормальных регу-
лирующих механизмов и превратившегося в самореплицирующуюся едини-
цу. Иногда считается, что это могло произойти в тех самых клетках, в кото-
рых данный компонент обнаруживается обычно. Чаще высказывается пред-
положение, что компонент нормальной клетки одного организма превра-
щается в вирус при введении в клетки другого. Например, некоторые вирусы
растений могли бы произойти из нормальных компонентов насекомых, питав-
шихся соком растений.
Поскольку вирусы несут генетическую информацию, было высказано
предположение, что они представляют собой гены хозяина, вышедшие из-под
влияния регуляторных механизмов клетки и способные реплицироваться
независимо от клеточного деления. Возможное существование близкого род-
ства между ДНК некоторых вирусов бактерий и геномом бактерии-хозяина
является наиболее веским свидетельством в пользу этой точки зрения. ДНК
умеренных фагов может оставаться тесно связанной с бактериальной ДНК
и реплицироваться вместе с ней без вреда для клетки. Индукция приводит
к неограниченному размножению вирусной ДНК; в результате образуются
вирусные частицы и клетка-хозяин гибнет. У бактерий известны различные
Номенклатура, классификация и происхождение вирусов
495
добавочные генетические элементы, способные реплицироваться в бактери-
альной клетке независимо от остального генома: бактериоциногенные факто-
ры, половые факторы и факторы устойчивости (обусловливающие устойчи-
вость к некоторым лекарственным препаратам). Некоторые из этих факторов
могут объединяться друг с другом или с бактериальной ДНК. При отсут-
ствии такой интеграции их можно иногда наблюдать в виде отдельных зон
ДНК в градиенте хлористого цезия. Лурия и Дарнелл [1109] предполагают,
что в клетках прокариотов возникло множество различных элементов гене-
тической информации и что вирусы бактерий, содержащие ДНК, вероятно,
составляют один из них.
Линдегреи [1071] описал возможные стадии образования бактериофага
из ДНК профага, предположив, что профаг возникает как фрагмент чуже-
родной бактериальной ДНК, случайно проникший в клетку, который па ран-
них стадиях делится синхронно с бактериальной ДНК. Следующим важным
этапом в развитии вируса явилось бы такое изменение профага, в резуль-
тате которого стало возможным его независимое от ДИК клетки-хозяина
размножение; в результате профаг использовал бы все доступные нуклеотиды,
нарушив тем'самым рост клетки-хозяина. Наконец, на какой-то более позд-
ней стадии могла бы образоваться защитная белковая оболочка и возникли
другие белки, что должно было обеспечить выживание ДНК вне организма
хозяина и эффективное заражение новых клеток. Отделившийся фрагмент
бактериальной ДНК вначале, очевидно, кодировал белки, приспособленные
к бактериальным функциям. Необходимы очень существенные изменения
в ДНК, чтобы могли возникнуть объекты настолько сложные и специализи-
рованные, как, скажем, фаг Т2 Е. coli, содержащие к тому же основания,
которые в бактериальной ДНК отсутствуют.
В клетках эукариотов имеются органеллы и частицы (например, хлоро-
пласты и митохондрии), которые содержат функциональную ДНК. Возможно,
что ДНК-содержащие вирусы в клетках эукариотов могли бы образоваться
именно из нормальной ДНК в этих органеллах, а не из ядерпой ДНК. Пред-
полагается, что ДНК некоторых вирусов, вызывающих опухоли в клетках
млекопитающих, включается в геном клетки-хозяина. Происхождение таких
вирусов, возможно, сходно с тем, что описано выше. Первый ДНК-содер-
жащий вирус, инфицирующий растения, описан совсем недавно (гл. IV),
и случаи интеграции вирусной нуклеиновой кислоты с геномом растительной
клетки пока не известны. Однако некоторые любопытные эффекты вирусной
инфекции, например сохранение в течение многих лет симптомов болезни
при видимом отсутствии вируса (гл. X), возможно, обусловлены именно такой
интеграцией. Леду и Хыоар [1057] представили данные, позволяющие пред-
положить, что ДНК Micrococcus lysodeikticus, проникшая через разрезы
на поверхности семян ячменя, включается в ядерную ДНК ячменя и репли-
цируется с ней. Имеются также указания на то, что ДНК Agrobacterium
tumifaciens может связываться с ДНК клеток томатов [27].
Общий механизм, описанный выше, гораздо труднее согласовать с тем,
что нам известно о вирусах, содержащих РНК. Их репликация осуще-
ствляется за счет РНК-зависимого синтеза РНК. Существование такого про-
цесса в нормальных клетках пока не известно. Однако в препаратах ДНК-зави-
симой РНК-полимеразы из Micrococcus lysodeikticus [1258] и из Azotobacter
vinelandii [1021] выявлена активность РНК-зависимой РНК-полимеразы,
причем в этой системе актиномицин D не влиял на синтез РНК. Возможно,
РНК-содержащие вирусы образовались из фрагментов информационной
РНК клетки-хозяина, которые каким-то образом приобрели капсидный белок
и способность к специфической саморепликации.
Иногда обращают внимание на сходство между рибосомами и мелкими
РНК-содержащими вирусами. Рибосомы действительно имеют некоторое внеш-
496
Глава XX
нее сходство с мелкими икосаэдрическими вирусами. Они примерно такой же
величины и содержат РНК и белок, однако иа этом сходство кончается.
Для рибосомной РНК характерно необычно высокое содержание гуаниловой
кислоты и низкое содержание метилированных оснований [470]. Белковая
фракция цитоплазматических (80 S) рибосом может быть разделена путем
электрофореза в геле примерно на 20 различных компонентов, и у растений,
имеющих отдаленное родство, электрофореграммы белков несколько различ-
ны [115]. Характер распределения белков в случае 683-рибосом хлоропла-
стов отличается от того, что наблюдается для 833-рибосом. Таким образом,
рибосомы имеют сложную структуру, которая, вероятно, точно приспособ-
лена к их функции «рабочего инструмента» в белковом синтезе. И РНК,
и белки рибосом структурно более сложны, чем у вирусов примерно той же
величины. Не установлено, обладает ли рибосомная РНК или ее РНК-пред-
шественник функцией информационной РНК по отношению к структурным
белкам рибосом, хотя в системе белкового синтеза in vitro она и может функ-
ционировать в качестве информационной РНК [1296]. Еще одно принципи-
альное различие состоит в том, что рибосомная РНК синтезируется на опре-
деленных участках клеточной ДНК в отличие от РНК-зависимого синтеза
вирусной РНК. Сравнительно недавно из клеток Xenopus laevis была выде-
лена ДНК, ответственная за синтез рибосомной РНК.
Клеточная ДНК содержит несколько участков, кодирующих 288-
и 18S-PHK рибосом; эти участки чередуются с участками ДНК, не связан-
ными с синтезом рибосомной РНК. Данные генетических исследований на дро-
зофиле [1428] и экспериментов с ДНК Xenopus [597] позволяют предполо-
жить, что может происходить избыточное образование копий такой «рибо-
сомной» ДНК. Таким образом могли бы появляться внехромосомные копии
ядерной ДНК. Этот феномен, особенно если он возможен для других цистро-
нов помимо тех, которые связаны с синтезом рибосомной РНК, вероятно,
имеет отношение к возникновению некоторых вирусов.
Различные исследователи сообщали о том, что им удалось вызвать обра-
зование вирусов в здоровых растениях при помощи тех или иных физических
и химических воздействий. Однако возможность случайного загрязнения та-
кими вирусами, как ВТМ, и существование латентных вирусов крайне затруд-
няют интерпретацию результатов экспериментов по индукции вирусов.
В разное время на электронных микрофотографиях препаратов, полу-
ченных из растений, считавшихся свободными от вируса, наблюдали вирусо-
подобные частицы. Некоторые из них почти наверняка являются латентными
вирусами (например, палочковидные образования, которые наблюдали Дву-
ражна и Вайнтрауб [479] в растениях картофеля). В других случаях природа
частиц совершенно неизвестна. Антон-Лампрехт [30, 32] описал сферические
частицы с довольно постоянным диаметром (60 им) в цитоплазме нескольких
гибридов Epilobium с «неправильным» плазматипом. Насчитывалось от сотни
до нескольких сот таких частиц на клетку. Они имели двойную оболочку,
«зону мантии» и маленькое плотное центральное ядро — вероятно, РНК.
От вирусов приблизительно такого же диаметра они отличались небольшим
размером этого ядра. Клетки на всех стадиях дифференцировки содержали
примерно одинаковое число таких частиц, которые не передавались спосо-
бами, характерными для вирусов. Остается неясным, какое отношение имеют
эти частицы к вирусам или каким-либо клеточным органеллам.
До самого недавнего времени казалось, что проблема происхождения
вирусов останется, возможно, навсегда предметом домыслов. Однако иссле-
дования, проведенные на вирусах млекопитающих, наводят на мысль, что
ключ к выяснению их происхождения, возможно, удастся найти, изучая
частоты различных динуклеотидов в их генетическом материале. Сьюбек-
Шарп и др. [1695, 1696] предположили, что в результате естественного отбора
Номенклатура, классификация и происхождение вирусов 497
и клетках организма возник набор транспортных РНК, оптимально адапти-
рованных к потребностям трансляции клеточной РНК. Популяция участков
узнавания кодонов в транспортных РНК в настоящее время не поддается
прямому определению, но эта популяция должна быть связана с частотой
динуклеотидов в клеточной ДНК, которую можно определить.
Сыобек-Шарп и его сотрудники определили частоты динуклсотидов
у нескольких ДНК-содержащих вирусов млекопитающих и сравнили их
с частотами динуклеотидов в ДНК млекопитающих. Исследованные ДНК
млекопитающих характеризуются в целом значительным дефицитом дублета
ЦфГ и сходны по частотам динуклеотидов. По частотам динуклеотидов ДНК
мелких вирусов — полиомы, кроличьей папилломы, папилломы человека
и SV40 — сильно напоминают ДНК клеток-хозяев; в то же время для круп-
ных вирусов (осповакцины, псевдобешенства, герпеса, ринопиевмонии лоша-
дей) эта закономерность не наблюдается. Сыобек-Шарп и др. [1696] и Сыобек-
Шарп [1694] предполагают, что мелкие вирусы, которые по частоте динуклео-
тидов сходны с клеткой-хозяином, произошли из участков генома клеток
млекопитающих, а крупные вирусы, которые по частоте динуклеотидов отли-
чаются от клеток-хозяев, возникли вне организма млекопитающих. Сыобек-
Шарп [1694] указывает, что ДНК вируса псевдобешепства в общих чертах
очень схожа с ДНК Micrococcus lysodeilcticus, однако до сих пор такого рода
сходство ни в одном случае больше не обнаружено.
Как полагает Сыобек-Шарп [1694], такое близкое сходство частот дину-
клеотидов у мелких ДНК-содержащих вирусов и их клеток-хозяев могло
возникнуть двумя путями. Во-первых, вирусная ДНК могла произойти
из ДНК хозяина — либо недавно, либо в далеком прошлом, а частота дину-
клеотидов сохраняется такой же, как у хозяина, под давлением отбора,
поскольку вирус использует трансляционные механизмы хозяина. Во-вто-
рых, возможно, что какая-то чужеродная ДНК, отличная от ДНК клетки-
хозяина, со временем под давлением отбора со стороны механизма трансля-
ции измелилась, приобретя близкое сходство с ДНК хозяина. Сам Сыобек-
Шарп склоняется к первой точке зрения, поскольку второй механизм
предполагает значительное число аминокислотных замен в вирусном; белке.
Впрочем, это возражение не слишком убедительно: известны, к примеру,
многочисленные штаммы ВТМ, капсидные белки которых по своему аминокис-
лотному составу болёе Чём на 50 % отличаются от белков типичного штамма
ВТМ. Если исходить из предположения, что все вирусы возникли в результате
дегенерации микроорганизмов, то мелкие вирусы, изученные Сыобек-Шар-
пом, представляют собой организмы, выродившиеся в большей степени, чем
крупные, и, следовательно, у них было больше времени для тесной адапта-
ции к трансляционному аппарату хозяина.
Хэй и Сыобёк-Шарп [743] показали, что мелкий РНК-содержащий вирус
млекопитающих — вирус мышиного энцефаломиокардита (мол. масса РНК
3 -10е дальтон) — имеет такую же частоту динуклеотидов, что и ДНК хозяина.
Ни один из вирусов растений до сцх пор в этом плане не изучен. Кажется
невероятным, чтобы столь отдаленные группы организмов, как покрытосемен-
ные и насекомые, имели сходные частоты динуклеотидов; кроме того, неко-
торые вирусы растений, как известно, могут реплицироваться в обоих хозяе-
вах. Зная частоты динуклеотидов у этих групп организмов, мы могли бы соста-
вить себе некоторое представление о происхождении этих вирусов или хотя бы
о том, с каким хозяином (растительным или животным) они были дольше
связаны.
Итак, гипотеза, согласно которой вирусы, в частности мелкие, ведут
свое происхождение от нормальных клеточных компонентов, представляется
вполне правдоподобной, и в настоящее время ее придерживаются многие
вирусологи. ' '
32-0893
498
Глава XX
Дегенерировавшие микроорганизмы
Мысль о том, что вирусы — это паразитические формы, возникшие’
в результате крайней степени деградации клеточных организмов, выдвига-
лась уже неоднократно [305, 674]. В последние годы число ее сторонников
сильно приуменьшилось [513, 1237]. Этому в основном способствовало рас-
пространившееся убеждение в фундаментальном различии между клетками
и вирусами, а также открытие тесной интеграции между ДНК клетки-хозяина
и ДНК ряда вирусов бактерий и животных. Однако не исключено, что раз-
рыв между вирусами и клетками в большой степени кажущийся, а интегра-
ция ДНК клетки и ДНК вируса, возможно, возникла па более поздней ста-
дии развития паразитизма и не должна служить указанием на происхождение.
ДНК вируса осповакцины имеет мол. массу около 1,6 -10s дальтон и содер-
жит информацию, достаточную для кодирования нескольких сотен белков.
Это около х/в информации, содержащейся у возбудителей группы пситтакоза
(PLT) (9,5 -108 дальтон), которых сейчас не относят к вирусам [1236, 1237],
и около 1/2а информации, содержащейся в ДНК Е. coli (2,8-109 дальтон}
[316]. В то же время вирус осповакцины несет почти в 200 раз больше инфор-
мации, чем самый мелкий из известных вирусов (вирус-сателлит). Как явст-
вует из этих цифр, разрыв в количестве генетической информации между
вирусами и клетками не так уж велик. Возбудители PLT были выделены
в отдельную группу, отличную от вирусов, на основании различных крите-
риев, в частности чувствительности к антибактериальным препаратам.
В самое последнее время было показано, что некоторые представители этой
группы чувствительны к индуцируемым вирусами интерферонам [702].
Одну из простейших групп клеточных организмов, известных в настоя-
щее время, составляют микоплазмы (гл. X). При инфекциях, вызываемых
агентами типа микоплазм, в клетках обнаруживаются мелкие плотные тель-
ца, по размерам сходные с вирусами (80—100 нм в диаметре). Пока еще точно'
не установлено, способны ли эти мелкие формы служить источником возникно-
вения истинно клеточных форм. В нижеследующей схеме суммированы основ-
ные предполагаемые этапы процесса, в результате которого простые вирусы
могли бы возникнуть из некоторых микоплазмоподобных организмов.
Стадии предполагаемой эволюции вирусов из организмов типа микоплазм
Микоплазмоподобный организм — облигатный паразит
(имеет клеточную мембрану, ДНК, рибосомы, тРНК, систему гене-
рирования энергии; клеточная оболочка отсутствует)
I
Гипотетический организм, напоминающий микоплазмы и возбудителя псит-
такоза
(имеет клеточную мембрану, ДНК, рибосомы, тРНК; система генериро-
вания энергии и клеточная оболочка отсутствую т
Гипотетический крупный ДНК-содержащий «вирус»
(рибосомная и тРНК в инфекционной частице отсутствуют, но имеется
информация для них; в процессе репликации способен синтезировать
вирусоспецифичную мембрану в клетке-хозяине для образования вакуоли,
в которой синтезируются и содержатся во время синтеза и сборки виру-
соспецифичные рибосомы, тРНК, мРНК и ферменты, необходимые для
белкового синтеза)
ДНК-содержащий вирус несколько меньших размеров
(имеет вирусоспецифичную элементарную мембрану в вирусной части-
Номенклатура, классификация и происхождение вирусов
499
це, но в процессе репликации использует рибосомы, тРНК и соответ-
ствующие ферменты хозяина; приближением к этой форме может слу-
жить вирус осповакцины)
I
ДНК-содержащий вирус, лишенный способности синтезировать мембрану
(использует компоненты мембран хозяина для формирования оболочки
вирусной частицы)
Мелкие вирусы, содержащие двух-
цепочечную ДНК (оболочка отсут-
ствует)
Вирусы, содержащие двухцепочечную
РНК (РНК используется и как гене-
Вирусы, содержащие одноцепочеч-
ную ДНК (размеры их постепенно
уменьшаются; двухцепочечная ДНК
обнаруживается у таких вирусов
только во время репликации)
тический материал, и как матрица
для белкового синтеза; некоторые
представители имеют оболочку)
Вирусы, содержащие одноцепочечную
РНК (размеры их постепенно умень-
шаются; двухцепочечная РНК обна-
руживается только во время репли-
кации)
Вирус, размножение которого зависит
от другого вируса (вирус-сателлит,
содержащий информацию для мини-
мального числа функций капсидного
белка и для кодирования специфи-
ческой РНК-полимеразы)
Если какие-либо вирусы действительно произошли из клетки, то одним
из наиболее важных этапов в этом процессе должна была быть утрата плазма-
тической мембраны. Если бы такая мембрана отсутствовала на репликатив-
ной стадии жизненного цикла организма, то деление как механизм размно-
жения было бы упразднено. В таком случае существование системы вирусо-
специфичных (т. е. кодируемых вирусом) рибосом и тРНК не имело бы смысла,
поскольку они были бы свободны в цитоплазме клетки-хозяина. Таким
образом, вслед за исчезновением плазматической мембраны вскоре могла бы
исчезнуть и способность кодировать синтез рибосом и тРНК, так что в вирус-
ной частице со временем осталась бы только одна-единствеиная нуклеиновая
кислота (ДНК).
Мембраны, окружающие частицы некоторых крупных вирусов, возмож-
но, представляют собой мембраны клеточного организма, из которого эти ви-
русы произошли. Проведенные недавно исследования по структуре и биосин-
тезу мембраны вируса осповакциныпоказали, что: а) «элементарная» мембрана
вируса неотличима по внешнему виду и по толщине от мембраны L-клетки
или других клеток, в которых он присутствует; б) белок или белки, содержа-
щиеся в мембране вируса, кодируются им самим; в) набор жирных кислот
вируса отличается от набора жирных кислот хозяина [429]. Известно, что
некоторые вирусы, имеющие оболочку, используют для ее построения фраг-
менты мембраны клетки-хозяина.
Широко известно, что липиды и белки in vitro в соответствующих усло-
виях могут образовывать мембраны, очень сходные в структурном отношении
с естественными. Важная роль конфигурации затравки, наличие которой
необходимо для сборки макромолекул при образовании клеточных структур,
подчеркнута Зоннеборном [1646]. Однако необходимость таких «затравочных»
конфигураций для плазматических мембран не установлена. Исследования,
проведенные недавно на Mycoplasma spp., показали, что если после разруше-
ния и солюбилизации липидного и белкового компонентов плазматической
32*
500
Глава XX
мембраны удалить детергент, то возможно спонтанное восстановление мем-
браны при наличии в среде Mg2+ [1450]. Таким образом, структурные компо-
ненты мембраны, вероятно, сами содержат достаточно информации структур-
ного характера, что делает возможным их взаимодействие в соответствующих
условиях с образованием мембран в отсутствие предсуществующих мембран-
матриц. Поэтому вполне можно представить себе, что вирус образует специ-
фическую мембрану в зараженной клетке, даже если опа и отсутствует у него
в качестве структурного компонента.
Небезынтересно было бы выяснить, кодирует ли вирусный геном какие-
либо компоненты мембран, окружающих пузырьки, которые иногда видны
в зараженных вирусами клетках растений. Возможно, что в таких пузырь-
ках удастся обнаружить вирусоспецифичные рибосомы или тРНК. Если
данный вирус ведет свое происхождение от клеток прокариотов, то следо-
вало бы ожидать, что это будут 70S-, а не 803-рибосомы. Рибосомы, кото-
рые связаны с элементарными тельцами возбудителей трахомы и пситтакоза,
имеют коэффициент седиментации 70 S [1485]. Согласно грубому подсчету
(принимая, что в рибосоме содержится 20 белков со средней молекулярной
массой), одна матрица для рибосом соответствует двуспиральной ДНК
с мол. массой ~ 107 дальтон. Такая ДНК легко может уместиться в частице
вируса осповакцииы, но не в частицах мелких вирусов.
Второй узловой этап в приведенной выше схеме — переключение с ДНК
на РНК. Такое переключение можно рассматривать как упрощение, поскольку
генетический материал (обе цепи или одна) в данном случае может одновре-
менно действовать в качестве информационной РНК в белковом синтезе.
РНК-зависимый синтез РНК пока еще не обнаружен в нормальных интакт-
ных клетках. Показано, что он происходит в клетках, зараженных РНК-
содержащими вирусами, и имеются данные [395] о существовании вирусо-
специфической двухцепочечной РНК в клетках, зараженных вирусом оспо-
вакцины.
Благодаря наличию дезоксирибозы ДНК несколько более устойчива
к гидролизу под действием химических агентов, чем РНК. Гипотеза, согласно
которой вирусы — это дегенерировавшие клеточные микроорганизмы, пред-
полагает, что переход от ДНК к РНК, вероятно, стал возможным после того,
как вирусный геном значительно уменьшился и белковая оболочка обеспе-
чила ему достаточно надежную защиту и необходимость в дополнительной ста-
бильности, сообщаемой ему ДНК, отпала.
Что касается происхождения «паразитического» вируса, такого, напри-
мер, как вирус-сателлит вируса некроза табака (последний этап в приве-
денной выше схеме), то проведенные недавно эксперименты Спигелмана
и сотрудников дают материал для предположения об одном из возможных
механизмов. Миле и др. [1212], используя репликазу фага Qp и матричную
РНК, показали, что в соответствующих условиях in vitro синтезировались
преимущественно более короткие молекулы. При последующих переносах
эти молекулы уже преобладали. Скорость размножения в ходе эксперимента
возрастала, и к 74-му переносу она уже была в 15 раз выше исходной.
В РНК после репликации присутствовало только 550 из имевшихся вначале
3600 нуклеотидов.
Можно представить себе, что в одной и той же клетке могли реплици-
роваться два неродственных вируса — вирус некроза табака и предок вируса-
сателлита. Если бы РНК предка вируса-сателлита реплицировалась в виде
фрагментов различной величины и если бы этот вирус мог использовать неко-
торые функции генома вируса некроза табака, то под влиянием давления
отбора сохранился бы лишь минимум функций — кодирование капсидного
белка, репликазыиее участка узнавания. Кроме того, вирус-сателлит должен
был синтезировать капсидный белок, способный надлежащим образом ориен-
Номенклатура, классификация и происхождение вирусов 501
тироваться вокруг более мелкого фрагмента РНК с образованием обо-
лочки.
В приведенной выше схеме не рассматривается возможность эволюцион-
ных взаимоотношений между мелкими спиральными и икосаэдрическими
вирусами.
Часто считается, что различия между спиральными и икосаэдрическими
вирусами достаточно велики, однако, возможно, с точки зрения эволюции
это и не совсем так. Как показали исследования последних лет (гл. VII), РНК
одного из икосаэдрических вирусов может взаимодействовать с белком ВТМ с
образованием палочковидной частицы, а РНК ряда других вирусов, взаимо-
действуя с белком такого икосаэдрического вируса, как вирус хлоротической
крапчатости коровьего гороха, образует инфекционные гибридные икосаэд-
рические частицы [775]. Можно представить себе, что палочкообразный вирус
мутировал, так что РНК оказывалась лишенной своей белковой оболочки,
но сохраняла способность реплицироваться в клетке, как это отмечается,
например, для некоторых мутантов ВТМ. При соответствующих условиях
эта форма в течение какого-то времени могла существовать в природе.
В качестве примера можно привести вирусы, существующие в виде
«обнаженной» РНК (гл. V). Видимо, в каких-то условиях давление отбора
на цистрон, ответственный за синтез капсидного белка, отсутствовало.
В результате случайной мутации стал возможен синтез белка, который упа-
ковывался по законам икосаэдрической симметрии вокруг вирусной PPlK.
Такая снабженная оболочкой РНК имела явное селективное преимущество
перед «обнаженной» РНК в отношении стабильности и возможности передачи
новым хозяевам. Аналогичный процесс мог иметь место и при превращении
икосаэдрических частиц в палочковидные.
Мы рассмотрели гипотезу о происхождении вирусов путем дегенерации
(в результате перехода к паразитическому существованию) из более высоко-
организованных клеточных форм несколько подробнее главным образом пото-
му, что в ряде дискуссий по этому вопросу, проходивших в последнее время,
она явно недооценивалась.
Имеющиеся в нашем распоряжении данные не позволяют считать этот
путь менее правдоподобным, чем любой другой, во всяком случае для круп-
ных вирусов. Разнообразные предположения о происхождении вирусов сей-
час уже ие столь беспочвенны, как, скажем, 20 лет назад. Исследования,
проводимые в самых разных направлениях, вероятно, уже в ближайшие годы
позволят нам лучше разобраться в данной проблеме. Наиболее важные нап-
равления исследований таковы:
а) выяснение детальной структуры и расположения ДНК в хромосомах
и ее поведения на всех этапах клеточного цикла; б) выяснение частот дину-
клеотидов у разных групп организмов и у вирусов и разработка методов опре-
деления частот антикодонов в популяциях тРНК; в) выяснение вопроса
о том, синтезируют ли крупные вирусы свои собственные тРНК; г) изучение
биохимии и биологической активности мелких телец, обнаруживаемых
при инфекциях, вызываемых микоплазмами; д) выяснение происхождения
мембран, индуцируемых при вирусной инфекции во многих клетках,
и, наконец; е) более детальное изучение энзимологии нормального синтеза
ДНК и РНК.
ЛИТЕРАТУРА
1. Aach II. G., Serologische Untersuchungen zur Structur des Tabakmosaikvirus, Bio-
chim. Biophys. Acta, 32, 140—146 (1959).
2. Aach II. G., Funatsu. G., Nirenberg M. W., Fraenkel-Conrat H., Further attempts to
characterise products of TMV-RNA-directed protein synthesis, Biochemistry, 3, 1362—
1366 (1964).
3. A’Brook J., The effect of planting date and spacing on the incidence of groundnut roset-
te disease and of the vector Aphis craccivora Koch at Mokawa, Northern Nigeria, Ann.
Appl. Biol., 54, 199-208 (1964).
4. A'Brook J., The effect of plant spacing on the numbers of aphids trapped over the
groundnut crop, Ann. Appl. Biol., 61, 289—294 (1968).
5. Ackers G. K., Steere R. L., Restricted diffusion of macromolecules through agar-gel
membranes, Biochim. Biophys. Acta, 59, 137—149 (1962).
6. Aclanson M., Families des Plantes, Vol. 1, Vincent, Paris, 1763.
7. Agrawal II. 0., Identification of cowpea mosaic virus isolates, Mededel, Landbou-
whogeschool Wageningen, 64, 1—53 (1964).
8. Agrawal II. 0., The morphology of arabis mosaic virus, J. Ultrastruct. Res., 17, 84—
90 (1967).
9. Agrawal ff., Maat D. Z., Serological relationships among polyhedral plant viruses
and production of high-titred antisera, Nature, 202, 674—675 (1964).
10. Agrios G. N., Effect of extracts from healthy and virus-infected apple and pear tis-
sues on the growth of certain pathogenic fungi, Phytopathology, 56, 176—179 (1966).
11. Ahmed M. E., Black L. M., Perkins E. G-, Walker B. L., Kummerour F. A., Lipid in
potato yellow dwarf virus, Biochem. Biophys. Res. Commun., 17, 103—107 (1964).
12. Albertsson P. A., Partition of Cell Particles and Macromolecules, 231 pp., Almquist
and Wiksell, Stockholm, I960.
13. Albertsson P. A-, Partition of Cell Particles and Macromolecules, Wiley, New York,
1960.
14. Aldwinckle II. S., Selman I. W., Some effects of supplying benzyladenino to leaves
and plants inoculated with viruses, Ann. Appl. Biol., 60, 49—58 (1967).
15. Allen W. R., Tomato bushy stunt virus from Primus avium II Serological typing and
the characterisation of antibody types and activities, Can. J. Botany, 46 , 229 — 233
(1968).
16. Allen W. R-, Tremaine J. II., Characteristics of antigens and antibodies associated
with the Prunus necrotic ringspot virus immune system, Virology, 25, 122—132 (1965).
17. Allison R. M., Effect of leafroll virus infection on soluble nitrogen composition of
potato tubers, Nature, 171, 573 (1953).
18. Amelunxen F., Morgenroth K., Picksak T., Untersuchungen an der Epidermis mit dem
Stereoscan-Elektronenmikroskop, Z. Pflanzenphysiol., 57, 79—95 (1967).
19. Ames B. N., Dubin D. T., The role of polyamines in the neutralisation of bacteriophage
deoxyribonucleic acid, J. Biol. Chem., 235, 769—775 (1960).
20. Anderer F. A., Das Molekulargewicht der Peptideinheit im Protein des Tabakmosaik-
virus, Z. Naturforsch., 14b, 24—28 (1959).
21. Anderer F. 4., Reversible Denaturierung des Proteins aus Tabakmosaikvirus, Z. Na-
turforsch., 14b, 642—647 (1959).
22. Anderer F. A., Preparation and properties of an artificial antigen immunologically
related to tobacco mosaic virus, Biochim. Biophys. Acta, 71, 246—248 (1963).
23. Anderer F. A., Uhlig H., Weber E., Schramm G., Primary structure of the protein of
tobacco mosaic virus, Nature, 186, 922—925 (1960).
24. Anderer F. 4., Schlumberger H. D., Frank H., A serological screening method for the
detection of free C-terminal amino acids in virus coat proteins, Biochim. Biophys.
Acta, 140, 80-92 (1967).
25. Andreae W. A., Effect of scopoletin on indoleacetic acid metabolism, Nature, 170,
83-84 (1952).
26. Andreae W. 4., Andreae S. R., Studies on indoleacetic acid metabolism. I. The Effect
of methyl umbelliferone, maleic hydroxide and 2, 4-D on indoleacetic acid oxidation,
Can. J. Botany, 31, 426-,437 (1953).
Литература
503
27. Anker Р., Stroun М., Bacterial nature of radioactive DNA found in tomato plants
incubated in the presence of bacterial DNA3H, Nature, 219, 932—933 (1968).
28. Ansevin A. 1'., Lauffer M. A., Polymerisation-depolymerisation of tobacco mosaic
virus protein 1 Kinetics, Biophys. .1., 3, 239—251 (1963).
29. Anson M. L-, Stanley W. M., Some effects of iodine and other reagents on the structure
and activity of tobacco mosaic virus, J. Gen. Physiol., 24, 679—690 (1941).
,30. Anton-Lamprecht I., Electron microscopical evidence of unusual structures in the cyto-
plasm of some plasmotypes of Epilobium hybrids, J. Ultrastruct. Res., 12, 624—633
(1965).
31. Anton-Lamprecht I., Beitrage zum Problem der Plastidenabanderung. III. Ober das
Vorkommon von «Ruckmutationen» in einer spontan enstandenen Plastidenschecke
von Epllobium hirsutum, Z. Pflanzenphysiol., 54, 417—445 (1966).
32. Anton-Lamprecht I., Electronenmikroscopische Untersuchungen an Plasmonabiinderun-
gen von EpiloШт-Bastarden. II. Mitteilung. Ober das Vorkommen spharischer Par-
tikeln im Plasma der Epilobium-Artoa und der Plasmonabanderungen dor (E. hirsutum
Essen X E. parviflorum Tiibingen)-Bastarde, Z. Verorbungslchre, 98, 257—269 (1966).
33. Arber A., The colouring of sixteenth century herbals, Nature, 145, 803—804 (1940).
34. Arnott II. J., Smith К. M-, Electron microscopy of virus-infected sunflower leaves,
J. Ultrastruct. Res., 19, 173—195 (1967).
35. Arnott II. J., Smith. К. M., Electron microscopic observations on the apparent repli-
cation in vivo of a plant virus, Virology, 34, 25—35 (1968).
36. Arnott S., Hutchinson F., Spencer M., Wilkins M. H. F-, Crystalline virus RNA pat-
terns, Nature, 211, 227—232 (1966).
.37 . Aronson 4. Z., Bancroft J. В., Density heterogeneity in purified preparations of broad
'bean mottle virus, Virology, 18, 570—575 (1962).
38. Asomaning E. J. A., Lockhard R. G., Studios on the physiology of cocoa (Theobroma
cacao L.), I. Suppression of swollen-shoot symptoms by light, Ann. Appl. Biol., 54,
193-198 (1964).
39. Astier-Manifacier S-, Cornuet P., Isolement de lajreplicase de 1’acide ribonucloiquo
du virus de la mosaique jaune du navet. Synthese asymetrique de polynucleotides iden-
tiques a 1’acide nucleique viral, Ann. Epiphyties, 16, 13—26 (1965).
40. Astier-Manifacier S-, Cornuet P., Etudes sur le mechanisms de la synthese in vitro du
RNA du virus de la mosaique jaune du navet, Bull. Soc. Franc. Physiol. Vegetale,
12, 20—27 (1966).
41. Astier-Manifacier S., Cornuet P., Etude de la replicase du virus de la mosaique jaune
du Navet. Cinetique de la synthese in vitro de chains virale, Ann. Epiphyties, 17, 191 —
198 (1966).
42. Атабеков И. Г., Попова Г. 4., Киселев Н. 4., Кафтаиова 4. С., Петровский Г. В.,
In vitro polymeriration of winter wheat mosaic virus antigen, Virology, 35, 458—472
(1968).
43. Athow K. L., Bancroft J. B., Development and transmission of tobacco ringspot virus
in soybean, Phytopathology, 49, 697—701 (1959).
44. Athow K. L., Laviolette F. A., Relation of seed position and pod location to tobacco
ringspot virus seed transmission in soybean, Phytopathology, 52, 714—715 (1962).
45. Atkinson P. H., Matthews R. E. F., Distribution of tobacco mosaic virus in systemi-
cally infected tobacco leaves, Virology, 32, 171—173 (1967).
46. Atkinson T. G-, Grant M. N., An evaluation of streak mosaic losses in winter wheat,
Phytopathology, 57, 188—192 (1967).
•47. Atkinson T. G., Slykhuis J. T., Relation of spring drought, summer rains and high
fall temperatures to the wheat streak mosaic epiphytotic in southern Alberta, 1963,
Can. Plant Disease Surv., 43, 154—159 (1963).
48. Audus L. J., Plant Growth Substances, 2nd ed., 553 pp., Leonard Hill, London, 1959.
49. Ayala A., Transmission of the California tobacco rattle virus by three species of ne-
matode of the genus Trichodorus Cobb., 1913. Ph. D. Thesis, Univ, of California, Davis,
California, 1965.
50. Ayala A., Allen M- W-, Transmission of the California tobacco rattle virus by three
species of the nematode genus Trichodorus, Nematologica, 12, 87 (1966).
51. Babos P., RNA turnover in tobacco leaves infected with tobacco mosaic virus, Nature,
211, 972-974 (1966).
52. Babos P., The ribonucleic acid content of tobacco leaves infected with tobacco mosaic
virus, Virology, 28, 282—289 (1966).
53. Babos P., Kassanis B., Unstable variants of tobacco necrosis virus, Virology, 18, 206—
211 (1962).
54. Babos P., Kassanis B., Serological relationships and some properties of tobacco necro-
sis virus strains, J. Gen. Microbiol., 32, 135—144 (1963).
55. Babos P., Kassanis B-, Thermal inactivation of tobacco necrosis virus, Virology, 20,
490-497 (1963).
56. Babos P., Kassanis B., The behaviour of some tobacco necrosis virus strains in plants.
Virology, 20, 498—506 (1963).
504
Литература
57. Bachrach U., Rabina S., Loebenstetn G., Ellon G., Antiviral action of oxidised spermine —
inactivation of plant viruses, Nature, 208, 1095—1096 (1965).
58. Backus R. C., Williams R. C., Use of spraying methods and of volatile suspending media
in the preparation of specimens for electron microscopy, J. App. Phys., 21, 11—15
(1950).
59. Baker E. W., Wharton G. W-, An Introduction to Acarology, 465 pp., Macmillan, New
York, 1952.
60. Baker P. F., Aphid behaviour on healthy and on yellows-virus-infocted sugar boot,
Ann. Appl. Biol., 48, 384—391 (I960).
61. Баландин II. Г., Хорошутииа В. В., Тоиеур В. С., Изучение механизма синтеза
РНК в экстрактах из листьев Ntcotlana glutinosa, зараженных вирусом табачной
мозаики, ДАН СССР, 155, 201-203 (1959).
62. Bald J. G., The uso of numbers of infections for comparing the concentration of plant
virus suspensions, I. Dilution experiments with purified suspensions, Ann. Appl. Biol.,
24, 33 - 55 (1937).
63. Bald J. G., The use of numbers of infections for comparing the concentration of plant
virus suspensions, II. Distortion of the dilution series, Ann. Appl. Biol., 24, 56—76
(1937).
64. Bald J. G-, Cytological evidence for the production of plant virus ribonucleic acid in
the nucleus, Virology, 22, 377-387 (1964).
65. Bald J. G-, Symptoms and cytology of living cells infected with defective mutants of
tobacco mosaic virus, Virology, 22, 388—396 (1964).
66. Bald J. G., Samuel G., Investigations on «Spotted Wilt» of tomatoes, II. C.S.I.R.O.,
Australia Bull., 54, 23 pp. (1931).
67. Bald J. G., Solberg P. A., Apparent release of tobacco mosaic virus in living infected
cells, Nature. 190, 651—652 (1961).
68. Bald J. G., Tinsley T. W-, A Quasi-genetic model for plant virus host ranges, I. Group
reactions within taxonomic boundaries, Virology, 31, 616—624 (1967).
69. Bald J. G., Tinsley T. W., A Quasi-genetic model for plant virus host ranges, II. Dif-
ferentiation between host ranges, Virology, 32, 321—327 (1967).
70. Bald J. G., Tinsley T. W-, A Quasi-genetic model for plant virus host ranges, III. Con-
gruence and relatedness, Virology, 32, 328—336 (1967).
71. Ball E. M., Brakke M. K., Antibody reactions in density gradient centrifugation and
in electron microscopy, Phytopathology, 57, 802 (1967).
72. Bancroft I. B-, Temperature and temperature-light effects on the concentration of squash
mosaic virus in leaves of growing cucurbits, Phytopathology, 48, 98—102 (1958).
73. Bancroft J. B., Purification and properties of bean pod mottle virus and associated
centrifugal and electrophoretic components, Virology, 16, 419—427 (1962).
74- Bancroft J. B., Plant viruses. Defectiveness and dependence, Symp. Soc. Gen. Micro-
biol., 18, 229- 247 (1968).
75- Bancroft J. B., Tomato top necrosis virus, Phytopathology, 58, 1360—1363 (1968).
76. Bancroft J. B., Hiebert E., Formation of an infectious nucleoprotein from protein and!
nucleic acid isolated from a email spherical virus, Virology, 32, 354—356 (1967).
77. Bancroft J. B., Kaesberg P., Size and shape of alfalfa mosaic virus, Nature, 181, 7 20—
721 (1958).
78. Bancroft I. B., Key I. L., Effect of actinomycin D and ethylene diamine tetracetic
acid on the multiplication of a plant virus in etiolated soybean hypocotyls, Nature,
202, 729—730 (1964).
79. Bancroft J. B., Pound G. S., Effect of air temperature on the multiplication of tobacco
mosaic virus in tobacco, Phytopathology, 44, 481—482 (1954).
80. Bancroft J. B., Pound G. S-, Cumulative concentrations of tobacco mosaic virus in
tobacco and tomato at different temperatures, Virology, 2, 29—43 (1956).
81. Bancroft J. B., Hills G. J., Markham R., A study of the self-assembly process in a small
spherical virus. Formation of organized structures from protein subunits in vitro, Vi-
rology, 31, 354-379 (1967).
82. Bancroft J. B., Hiebert E., Rees M. W., Markham R., Properties of cowpea chlorotic
mottle virus, its protein and nucleic acid, Virology, 34, 224—239 (1968).
83. Bancroft J. B., Wagner G- W., Bracker С. E., The self-assembly of a nucleic-acid free
pseudo-top component for a small spherical virus, Virology, 36, 146—149 (1968).
84. Bancroft J. B., Bracker C. D-, Wagner G. W., Structures derived from cowpea chlorotic
mottle and brome mosaic virus protein, Virology, 38, 324—335 (1969).
85- Banerjee K., Lauffer M. A., Polymerisation-depolymerisation of tobacco mosaic virus
protein, VI. Osmotic pressure studies of early stages of polymerisation, Biochemistry,
5, 1957—1964 (1966).
86. Banks G. T., Buck K. W-, Chain E. B-, Htmmelweit F-, Marks J. E., Tyler J. M., Hol-
lings M., Last F. T-, Stone О. M-, Viruses in fungi and interferon stimulation, Nature,
218, 542-545 (1968).
87. Bartels R., Serologische Untersuchungen iiber das Verhalten des Kartoffel-A-virus in
Tabakpflanzen, Phytopathol. Z., 21, 395—406 (1954).
Литература 505-
88. Basset J., Gratia A., Macheboeuf M., Manti P., Action of high pressures on viruses,
Proc. Soc. Exptl. Biol. Med., 38, 248—251 (1938).
89. Baur E-, Zur Aetiologie der infoctioson Panachierung, Ber. Dcut. Botan. Ges., 22,
453-460 (1904).
90. Baur J. R., Ilalliwell R. S., Langston R., Effect of tobacco mosaic virus infection on
glucose metabolism in Nicotiana tabacum var. Samsun. I. Investigations with X4C la-
belled sugars, Virology, 32, 406—412 (1967).
91. Baur J. R., Ilalliwell R. S-, Langston R., Effect of tobacco mosaic virus infection on
glucose metabolism in Nicotiana tabacum L. var. Samsun. II. Investigation of malonic
acid inhibition on respiration, Virology, 32, 413—415 (1967).
92. Baur J. R., Richardson B., Ilalliwell R. S., Langston R., Effect of tobacco mosaic virus
infection on glucose metabolism in Nicotiana tabacum var. Samsun. III. Investiga-
tion of hexosemonophosphate shunt enzymes and steroid concentration and biosynthe-
sis, Virology, 32, 580-588 (1967).
93. Bawden F. C., A study on the histological changes resulting from certain virus infec-
tions of the potato, Proc. Roy. Soc. (London), Bill, 74—85 (1932).
94. Bawden F. C., Plant Viruses and Virus Diseases, 3rd ed., 335 pp., Chronica Botan.,
Waltham, Massachusetts, 1950.
95. Bawden F. C., The multiplication of plant viruses, Ciba Found. Symp. Nature Viru-
ses, pp. 170—190 (1957).
96. Bawden F. C., Reversible chmges in strains of tobacco mosaic virus from leguminous,
plants, J. Gen. Microbiol., 18, 751—766 (1958).
97. Bawden F. C., Effect of nitrous acid on tobacco mosaic virus. Mutation or selection?
Nature, 184, B.A., 27—29 (1959).
98. Bawden F. C., The susceptibility of Rhoco discolor to infection with tobacco mosaic
virus, J. Biol. Chem., 236, 2760-2761 (1961).
99. Bawden F. C-, Plant Viruses and Virus Diseases, 4th ed., 361 pp., Ronald Press, New
York, 1964 (имеется перевод 1-го издания, Боуден, «Вирусы и вирусные болезни»,
ИЛ, М., 1952).
100. Bawden F. С., Crook Е. М-, Some properties of potato virus X in leaf extracts made
in different ways, Brit. J. Exptl. Pathol., 28, 403—415 (1947).
101. Bawden F. C., Freeman G. G., The nature and behaviour of inhibitors of plant viruses
produced by Trichothecium roseum Link, J. Gen. Microbiol., 7, 154—168 (1952).
102. Bawden F. C-, Kassanis B., The suppression of one plant virus by another, Ann. Appl.
Biol., 32, 52—57 (1945).
103. Bawden F. C., Kassanis B., The behaviour of some naturally occurring strains о potato
virus Y, Ann. Appl. Biol., 34, 503—516 (1947).
104. Bawden F. C-, Kassanis B-, Some effects of host nutrition on the susceptibility of plants
to infection by certain viruses, Ann. Appl. Biol., 37, 46—57 (1950).
105. Bawden F. C-, Kassanis B., Some effects of thiouracil on virus infected plants, J. Gen.
Microbiol., 10, 160-173 (1954).
106. Bawden F. C., Kassanis B., The serological relationship between tobacco mosaic virus
and cucumber mosaic viruses 3 and 4, Virology, 34, 174—175 (1968).
107. Bawden F. C., Kleczkowskt A., Protein precipitation and virus inactivation by extracts
of strawberry plants, J. Pomol. Hort. Sci., 21, 2—7 (1945).
108. Bawden F. C-, Kleczkowskt A., The behaviour of some plant viruses after exposure
to ultraviolet radiation, J. Gen. Microbiol., 8, 145—156 (1953).
109. Bawden F. C., Kleczkowskt A., Studies on the ability of light to counteract the inacti-
vating action of ultraviolet irradiation on plant viruses, J. Gen. Microbiol., 13, 370—
382 (1955).
110. Bawden F. C., Kleczkowskt A., An electrophoretic study of sap from uninfected and
virus-infected tobacco plants, Virology, 4, 26—40 (1957).
111. Bawden F. C-, Kleczkowskt A., Some properties of decomposition products of potato
virus X, Virology, 7, 375—384 (1959).
112. Bawden F. C., Kleczkowskt A., Photoreactivation of nucleic acid from tobacco mosaic
virus, Nature, 183, 503—504 (1959).
113. Bawden F. C., Kleczkowskt A., Some effects of ultraviolet radiation on the infection
of Nicotiana glutinosa leaves by tobacco mosaic virus, Virology, 10, 163—181 (1960).
114. Bawden F. C., Pirie N. W-, Experiments on the chemical behaviour of potato virus X,
Brit. J. Exptl. Pathol., 17, 64—74 (1936).
115. Bawden F. C., Pirie N- W-, The isolation and some properties of liquid crystalline
substances from solanaceous plants infected with three strains of tobacco mosaic virus,
Proc. Roy. Soc. (London), B123 , 274-320 (1937).
116. Bawden F. C., Pirie N. W-, Crystalline preparations of tomato bushy stunt virus,
Brit. J. Exptl. Pathol., 19, 251—263 (1938).
117. Bawden F. C-, Pirie N. W-, The inactivation of some plant viruses by urea, Biochem.
J., 34, 1258-1277 (1940).
118. Bawden F. C., Pirie N. W., The effects of alkali and some simple organic substances
on three plant viruses, Biochem. J., 34, 1278—1292 (1940).
506
Литература
119. Bawden F. C., Pirie N. W-, The inactivation of tomato bushy stunt virus by heating
and freezing, Biochem. J., 37, 70—80 (1943).
120. Bawden F. C., Pirie N. ИЛ, Further studies on the purification and properties of a
virus causing tobacco necrosis, Brit. J. Exptl. Pathol., 26, 277—285 (1945).
121. Bawden F. C., Pirie N. Ж, The virus content of plants suffering from tobacco mosaic,
Brit. J. Exptl. Pathol., 27, 81-90 (1946).
122. Bawden F. C., Pirie N. W., Some effects of freezing in the leaf and of citrate in vitro
on the infectivity of a tobacco necrosis virus, J. Gen. Microbiol., 4, 482—492
(1950).
123. Bawden F. C-, Pirie N. W., Observations on the anomalous proteins occurring in ex-
tracts of plants infected with strains of tobacco mosaic virus, J. Gen. Microbiol., 14,
460-477 (1956).
124. Bawden F. C., Pirie N. W-, A virus inactivating system from tobacco leaves, J. Gen.
Microbiol., 16, 696—710 (1957).
125. Bawden F. C., Pirie N. VP., The activity of fragmented and reassembled tobacco mo-
saic virus, J. Gen. Microbiol., 17, 80—95 (1957).
126. Bawden F. C-, Pirie N- W., The infectivity and inactivation of nucleic acid preparations
from tobacco mosaic virus, J. Gen. Microbiol., 21, 438—456 (1959).
127. Bawden F. C., Roberts F. M., The influence of light intensity on the susceptibility of
plants to certain viruses, Ann. Appl. Biol., 34, 286—296 (1947).
128. Bawden F. C-, Roberts F. M., Photosynthesis and predisposition of plants to infec-
tion with certain viruses, Ann. Appl. Biol., 35, 418—428 (1948).
129. Bawden F. C., Sheffield F. M. L., The intracellular inclusions of some plant virus
diseases, Ann. Appl. Biol., 26, 102—115 (1939).
130. Bawden F. C., Pirie N. W-, Bernal J. D., Fankuchen. I., Liquid crystalline substances
from virus-infected plants, Nature, 138, 1051 — 1052 (1936).
131. Bawden F. C-, Hamlyn В. M. G., Watson M. A., The distribution of viruses in diffe-
rent leaf tissues and its influence on virus transmission by aphids, Ann. Appl. Biol.,
41, 229-239 (1954).
132. Beakbane A. B., Thompson E. C-, Abnormal lignification in the wood of some apple
trees, Nature, 156, 145—146 (1945).
133. Beale H. P., Immunologic reactions with tobacco mosaic virus, Proc. Soc. Exptl.
Biol. Med., 25, 602 (1928).
134. Beale H. P., Jones C. R-, Virus diseases of tobacco mosaic and potato yellow dwarf
not controlled by certain purified antibiotics, Contrib. Boyce Thompson Inst., 16,
395-407 (1951).
135. Bear F. E., Coleman R. (eds.), Hunger Sings in Crops, 390 pp., Am. Soc. Agron. Natl.
Fertlizer Assoc., Washington, D.C., 1949.
136. Becarevic A., Djordjevic B., Sutil! D., Effect of ultraviolet light on tobacco mosaic
virus containing 5-fluorouracil, Nature, 198, 612—613 (1963).
137. Beemster A. B. R., The rate of infection of potato tubers with potato virus YN in re-
lation to position of the inoculated leaf. In «Viruses of Plants» (A- B. R. Beemster
and J. Dijkstra, eds.), pp. 44—47, North-Holland Publ-, Amsterdam, 1966.
138. Beemster A. B. R., Partial infection with potato virus YjV of tubers from primarily
infected potato plants, Neth. J. Plant Pathol., 73, 161—164 (1967).
139. Beemster A. B. R., Effects of removal of leaves and tops on translocation of potato
virus X and potato virus Yw in potato plants, Neth. J. Plant Pathol., 73, 139—146
(1967).
140. Beer S. V., Kosuge T., Spermidine, the major polyamine component of turnip yellow
mosaic virus, Phytopathology, 58, 1042 (1968).
141. Beijerinck M. W-, Over een contagium vivum fluidum als oorzaak van de vlekziekte
der tabaksbladen, Verhandel. Koninkl. Akad. Wetenschap., Afdel. Wis-Natuurk,
7, 229-235 (1898).
142. Bell A. A., Respiratory metabolism of Phareolus vulgaris infected with alfalfa mosaic
and southern bean mosaic viruses, Phytopathology, 54, 914—922 (1964).
143. Bellamy A. R., Joklik W- K., Studies on the А-rich RNA of reovirus, Proc. Natl. Acad.
Sci. U.S., 58, 1389-1395 (1967).
144. Bellamy A. R., Shapiro L-, August J. T., Joklik W- K., Studies on reovirus RNA. I.
Characterisation of reovirus genome RNA, J. Mol. Biol., 29, 1—17 (1967).
145. Bellett A. J. D., Preliminary classification of viruses based on quantitative compari-
sons of viral nucleic acids, J. Virol., 1, 245—259 (1967).
146. Bellett A. J. D., The use of computer-based quantitative comparisons of viral nucleic
acids in the taxonomy of viruses. A preliminary classification of some animal viruses,
J. Gen. Virol., 1, 583—585 (1967).
147. Benda G. T. A., Some effects of ultraviolet irradiation on leaves of French bean (Pha-
seolus vulgaris L.), Ann. Appl. Biol., 43, 71—85 (1955).
148. Benda G. T. A., Infection of Nicotiana glutinosa L, following injection of two strains
of tobacco mosaic virus into a single cell, Virology, 2, 820—827 (1956).
Литература
507
149. Benda G- T. A., Bennett C. W-, Effect of curly top virus on tobacco seedlings; infection
without obvious symptoms, Virology, 24, 97—101 (1964).
150. Benjamini E., Young J. D., Shimizu M-, Leung C-, Immunochemical studies on the
tobacco mosaic virus protein. I. The immunological relationship of the tryptic pepti-
des of tobacco mosaic virus protein to the whole protein, Biochemistry, 3, 1115—1120
(1964).
151. Benjamini E., Young J. D., Peterson W. J', Leung С. Y., Shimizu M., Immunoche-
mical studies on the tobacco mosaic virus protein. II. The specific binding of a tryptic
peptide of the protein with antibodies to tho whole protein, Biochemistry, 4, 2081—
2085 (1965).
152. Benjamini E., Shimizu M., Young J. D., Leung C. Y., Immunochemical studios on
the tobacco mosaic virus protein. VI. Characterisation of antibody populations follow-
ing immunisation with tobacco mosaic virus protein, Biochemistry, 7, 1253—1260
(1968).
.153 . Benjamini E., Shimizu M., Young J. D., Leung C. Y-, Immunochemical studies on
the tobacco mosaic virus protein. VII. Tho binding of octanoylated peptides of tho
tobacco mosaic virus protein with antibodies to the whole protein, Biochemistry,
7, 1261—1264 (1968).
154. Bennett C. W., Plant tissue relations of sugar boot curly top virus, J. Agr. Ros., 48,
665-701 (1934).
155. Bennett C. W., Relation of food translocation to movement of virus of tobacco mosaic,
J. Agr. Res., 60, 361-390 (1940).
156. Bennett C. W-, Acquisition and transmission of viruses by dodder (Cuscuta subtnclusa),
Phytopathology, 30, 2 (Abstr.) (1940).
157. Bennett C. W-, The relation of viruses to plant tissues, Botan. Rev., 6, 427—473 (1940).
158. Bennett C. W., Latent virus of dodder and its effect on sugar beet plants, Phytopatho-
logy, 34, 77-91 (1944).
159. Bennett C. W-, Recovery of water pimpernel from curly top and tho reaction of reco-
vered plants to reinoculation with different virus strains, Phytopathology, 45, 531—
536 (1955).
160. Bennett C. W., Sugar beet yellows disease in the United States, U.S. Dept. Agr. Tech.
Bull., 1218, 1-63 (1960).
161. Bennett C. W., Curly top virus content of the beet leaf hopper influenced by virus con-
centration in diseases plants, Phytopathology, 52, 538—540 (1962).
162. Bennett C. W., Highly virulent strains of curly top virus in sugar beet in Western
United States, J. Am. Soc. Sugar Beet Technologists, 12, 515—520 (1963).
163. Bennett C. W., Apparent absence of cross-protection between strains of the curly top
virus in the beet leaf hopper, Circulifer tenellus, Phytopathology, 57, 207—209 (1967).
164. Bennett C- W., Epidemiology of leafhopper transmitted viruses, Ann. Rev- Phytopa-
thol., 5, 87-108 (1967).
165. Bennett C- W-, Tanrisever A., Curly top disease in Turkey and its relationship to curly
top in North America, J. Am. Soc. Sugar Beet Technologists, 10, 189—211 (1958).
166. Bennett C. W-, Wallace H. E-, Relation of the curly top virus to the vector Eutettix
tenellus, J. Agr. Res., 56, 31—51 (1938).
167. Benson A. P-, Hooker W. J., Carbohydrate distribution in grafted potato plants repre-
senting two types of resistance to virus X, Phytopathology, 58, 571—574 (1968).
168, Bercks R-, Untersuchungen uber individuolle Unterschiede von Antiseren genen Kar-
toffel-X-Virus bei Reaktionen mit verwandten Viren, Phytopathol. Z-, 47, 301—313
(1963).
169. Bercks R-, Methodische Untersuchungen fiber den serologischen Nachwois pflanzenpa-
thogener Viren mit dem Bentonit-Flockungstest, dem Latextest und dem Bariumsulfat-
test, Phytopathol. Z., 58, 1—17 (1966).
170. Bercks R., Brandes J., Vergleichende serologischen und electronenmikroskopische
Untersuchung des Weisskleemosaik-Virus, des Hydrangearingspot-Virus und des
Kartoffel-X-Vurus, Phytopathol. Z., 42, 45—56 (1961).
171. Bergeson G. B., Athow K. L., Laviolette F. A., Thomasine M-, Transmission, movement
and vector relationships of tobacco ringspot virus in soybean, Phytopathology, 54,
723-726 (1964).
172. Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 6th ed., Suppl. No. 2, pp. 1127—
1286, Williams and Wilkins, Baltimore, Maryland, 1948.
173. Bergman E. L., Boyle J. S., Effect of tobacco mosaic virus on the mineral content of
tomato leaves, Phytopathology, 52, 956—957 (1962).
174. Bergquist P. L., Burns D. J. W-, Plinston C. A., Participation of redundant transfer
ribonucleic acids from yeast in protein synthesis, Biochemistry, 7, 1751—1761
(1968).
175. Bernal J. D., Carlisle С. H-, Unit cell measurements of wet and dry crystals of turnip
yellow mosaic virus, Nature, 162, 139—140 (1948).
176. Bernal J. D., Fankuchen I., Structure types of protein «crystals» from virus-infected
plants, Nature, 139, 923—924 (1937).
508
Литература
177. Bernal J. D., Fankuchen I., X-ray and crystallographic studies of plant virus pre-
parations, I. Introduction and preparation of specimens, II. Modes of aggregation of
the virus particles, J. Gen. Physiol., 25, 111—146 (1941).
178. Bernal J. D., Fankuchen I., X-ray and crystallographic studies of plant virus prepa-
rations, III. Structure of the particle, Biological implications, J. Gen. Physiol., 25,
147-165 (1941).
179. Bernal J. D., Fankuchen I., Utley D. P., Structure of the crystal of tomato bushy stunt
virus preparations, Nature, 142, 1075 (1938).
180. Best R. J., Precipitation of the tobacco mosaic virus complex at its isoelectric point,
Australian J. Exptl. Biol. Med. Sci., 14, 1—13 (1936).
181. Best R. J., Studies on a fluorescent substance present in plants, 1. Production of the
substance as a result of virus infection and some applications of the phenomenon, Aust-
ralian J. Exptl. Biol. Mod. Sci., 14, 199—213 (1936).
182. Best R. J., The quantitative estimation of relative concentrations of the viruses of
ordinary and yellow tobacco mosaics and of tomato spotted wilt by the primary lesion
method, Australian J. Exptl. Biol. Med. Sci., 15, 65—79 (1937).
183. Best R. J., On the presence of an «oxidase» in the juice expressed from tomato plants
infected with the virus of tomato spotted wilt, Australian J. Exptl. Biol. Med. Sci.,
15, 191-199 (1937).
184. Best R. J., Studies on a fluorescent substance present in plants, 2. Isolation of the sub-
stance in a pure state and its identification as 6-methoxy-7-hydroxy 1 : 2 benzopyrone,
Australian J. Exptl. Biol. Med. Sci., 22, 251—255 (1944).
185. Best R. J., The development and multiplication of viruses, J. Australian Inst. Agr.
Sci., 20, 36-40 (1954).
186. Best R. J., Cross protection by strains of tomato spotted wilt virus and a now theory
to explain it, Australian J. Biol. Sci., 7, 415—424 (1954).
187. Best R. J., Exchange of character determinants between strains of plant viruses, Aust-
ralian J. Sci., 20, 76 (1957).
188. Best R. J., Recombination experiments with strain A and strain E of tomato spotted’
wilt virus, Virology, 15, 327—339 (1961).
189. Best R. J., Preparation and properties of tomato spotted wilt virus (strain E), Enzy-
mologia, 31, 333-354 (1966).
190. Best R. J., Tomato spotted wilt virus, Advan. Virus Res., 13, 65—146 (1968).
191. Best R. J., Gallus II. P. C., Further evidence for the transfer of character determinants
(recombination) between strains of tomato spotted wilt virus, Enzymologia, 17, 207
(1955).
192. Best R. J., Katekar G. F., Lipid in a purified preparation of tomato spotted wilt virus,.
Nature, 203, 671-672 (1964).
193. Best R. I., Palk B- A., Electron microscopy of strain E of tomato spotted Wilt virus-
and comments on its probable biosynthesis, Virology, 23, 445—460 (1964).
194. Bharadwaj R. K., Reddy D. V. R., Sinha R. C-, A reinvestigation of the alimentary
canal in the leafhopper Agallia constricta (Homoptera, Cicadellidae), Ann. Entomol.
Soc. Am., 59, 616-617 (1966).
195. Bhargava K. S-, Some properties of four strains of cucumber mosaic virus, Ann. Appl.
Biol., 38, 377-388 (1951).
196. Biddle P. G., Tinsleij T. W., Virus diseases of conifers in Great Britain, Nature, 219,
1387—1388 (1968).
197. Bieleski R. L., Levels of phosphate esters in Spirodela, Plant Physiol., 43, 1297—1308
(1968).
198. Bieleski R. L-, Effect of phosphorous deficiency on levels of phosphorus compounds in
Spirodela, Plant Physiol., 43, 1309—1316 (1968).
199. Bils R. F.., Hall С. E., Electron microscopy of wound tumor virus, Virology, 17,
123-130 (1962).
200. Birnsteil M., Spiers J., Purdom I., Jones K., Loaning U. E-, Properties and composition
of the isolated ribosomal DNA satellite of Xenopus laevis, Nature, 219, 454—463 (1968).
201. Black L. M-, Mechanical transmission of aster-yellows virus to leafhoppers, Phytopatho-
logy, 30, 2 (1940).
202. Black L- M., Specific transmission of varieties of potato yellow-dwarf virus by related,
insects, Am. Potato J., 18, 231—233 (1941).
203. Black L. M., Some properties of aster-yellows virus, Phytopathology, 33, 2 (1943).
204. Black L- M., A plant virus that multiplies in its insect vector, Nature, 166, 852—853
(1950).
205. Black L- M., Occasional transmission of some plant viruses through eggs of their insect
vectors, Phytopathology, 43, 9—10 (1953).
206. Black L. M., Loss of vector transmissibility by viruses normally insect transmitted.
Phytopathology, 43, 466 (1953).
207. Black L. M., Biological cycles of plant viruses in insect vectors. In «The Viruses»
(F. M. Burnet and W. M. Stanley, eds.), Vol. 2, pp. 157—185, Academic Press, New
York, 1959.
Литература
509
208. Black L. M-, Brakke M. K., Multiplication o£ wound tumor virus in an insect vector,
Phytopathology, 42, 269—273 (1952).
209. Black L- M., Brakke M. K., Serological reactions of a plant virus transmitted by leaf-
hoppers, Phytopathology, 44, 482 (1954).
210. Black В- M., Markham R., Base-pairing in the ribonucleic acid of woundtumor virus,
Neth. J. Plant Pathol., 69, 215 (1963).
211. Blade L- M., Smith К. AL, Hills G. J., Markham R., Ultrastructure of potato yellow-
dwarf virus, Virology, 27, 446—449 (1965).
212. Black L. M., Reddy D. V. R., Relchmann M- E., Virus inactivation by moderate forces
during quasi-equil'ibrium zonal density gradient centrifugation, Virology, 31, 713—
715 (1907).
213. Blencowe J, IV., Tinsley T- W-, The influence of density of plant population on the
incidence of yellows in sugar beot crops, Ann. Appl. Biol., 38, 395—401 (1951).
214. Block R. J., Weiss K. W., Amino Acid Handbook, 386 pp., Thomas, Springfield, Illi-
nois, 1956.
215. Bockstahler L. E., Biophysical studies on double-stranded RNA from turnip yellow
mosaic virus-infected plants, Molec. Gon. Genetics, 100, 337—348 (1967).
216. Bockstahler L. E., Kaesberg P., Infectivity studios of bromo grass mosaic virus RNA,
Virology, 27, 418-424 (1965).
217. Boedtker H., Some physical properties of infective ribose nucleic acid isolated from
tobacco mosaic virus, Biochim. Biophys. Acta, 32, 519—531 (1959).
218. Boedtker H., Configurational properties of tobacco mosaic virus ribonucleic acid, J.
Mol. Biol., 2, 171-188 (1960).
219. Boedtker H-, Dependence of the sedimentation coefficient on molecular weight of RNA
after reaction with formaldehyde, J. Mol. Biol., 35, 61—70 (1968).
220. Boedtker H., Stumpp S-, The stimulation of amino-acid incorporation in the coll-
free Escherichia coli system by thermally degraded tobacco mosaic virus ribonucleic
acid, Biochim. Biophys. Acta, 87, 247—252 (1964).
221. Booker R. H., The effect of sowing date and spacing on rosette disease of groundnut in
Northern Nigeria, with observations on the vector, Aphis craccivora, Ann. Appl. Biol.,
52, 125—131 (1963).
222. Bos L-, Symptoms of Virus Diseases in Plants with Indexes of Names in English, Dutch,
German, French and Italian, 132 pp. Mededel, 307, Centre for Agricultural Publica-
tions and Documentation, Wageningen, Netherlands, 1963.
223. Bos L-, Tentative list of viruses reported from naturally infected leguminous plants,
Neth. J. Plant Pathol., 70, 161—174 (1964).
224. Bos L., Grancini P., Peculiar histoid enations in white clover and their relationships
to virus diseases and toxic effects of leafhopper feeding, Phytopathol. Z., 61, 253 —
272 (1968).
225, Bos L., Hagedorn. D. J., Quantz L-, Suggested procedures for international identifica-
tion of legume viruses, Tijdse.hr Plantenziekton, 66, 328—343 (1960).
226. Bosch L-, Polypeptide synthesis in cell free systems of Escherischla coli directed by
plant viral RNA. In «Regulation of Nucleic Acid and Protein Biosynthesis» (V. V. Ko-
ningsberger and L. Bosch, eds.), pp. 259—271, Elsevier, Amsterdam, 1967.
227. Bosch L-, van Kninpenberg P. IT., Voorma H. O., van Ravenswaay Claasen / C., Protein
synthesis by cell-free extracts of E. coli programmed with plant viral RNA. In «Viru-
ses of Plants» (A. B. R. Beemster and J. Dijkstra, eds.), pp. 275—294, North-Holland
Pubbl., Amsterdam, 1966.
228. Bosch L-, Bonnet-Smits E- M-, van Duin J., In situ breakage of turnip yellow mosaic
virus RNA and in situ aggregation of the fragments, Virology, 31, 453—460 (1967).
229. Baser H-, Einfluss pflanzlicher Viroson auf Stoffwechselfunktionon d s Wirtes. Akti-
vitaten einiger Fermente des Glykolysesystems.und dos Gitronensaurs-.yclus in gesun-
den und virosen Kartoffelblattern und -knollen, II. Mitt. Phytopathol. Z., 33, 197—
202 (1958).
230. Bove J. M-, Virus de la mosaique jaune de navot. Synthese assymotrique in vitro d’un
segment de ARN virale, 193 pp. These de doctorat d’etat es sciences naturelie,
C.N.R.S., Paris, 1967.
231. Boyce S- W-, Boyce W. R., Chamberlain E- E., Cumber R. Л., Fry P. R., Matth-
ews R. E- F., Newhook F. J., Stzemienski K., Preliminary note on yellow leaf disease
of phormium, New Zealand J. Sei. Technol., A33'(3), 76—77 (1951).
232. Boyle J. S-, Bergman E. L-, Factors affecting incidence and severity of internal brow-
ning of tomato induced by tobacco mosaic virus, Phytopathology, 57, 354—362 (1967).
233. Boyle L- W-, McKinney H. H., Local virus infections in relation to leaf epidermal
cells, Phytopathology, 28, 114—122 (1938). .
234. Bozarth R. F., Diener T- O., Changes in concentration of free amino acids and amides
induced in tobacco plants by potato virus X and potato virus Y, Virology, 21, 188—
193 (1963).
235. Bozarth R. F., Ross A. F., Systemic resistance induced by localized virus infections.
Extent of changes in uninfected plant parts, Virology, 24, 446—455 (1964).
510
Литература
236. Bozicevich J., Scott ЕЕ. A., Vincent M. M., The bentonite floculation test for detection
of plant viruses and titration of antibody, Proc. Soc. Exptl. Biol. Med., 114, 794—
798 (1963).
237. Bradish C. S., Crawford L. 7., Biophysical studies of the interactions between the
viruses of tobacco mosaic and tomato bushy stunt and their rabbit antisera, Virology,
11, 48-78 (1960).
238. Bradley R. EE. E., Studies on the aphid transmission of a strain of henbane mosaic
virus, Ann. Appl. Biol., 39, 78—97 (1952).
239. Bradley R. EE. E., Ultraviolet irradiation of tobacco infected with potato virus Y and
the availability of virus to aphids, Nature, 173, 350 (1954).
240. Bradley В. EE. E., Studies on the mechanism of transmission of potato virus Y by the
green peach aphid, Myzus persicae (Sulz) (Homoptera, Aphidae), Can. J. Zool., 32,
64-74 (1954).
241. Bradley В. EE. E., Effects of depth of stylet penetration on aphid transmission of potato
virus Y, Can. J. Microbiol., 2, 539—547 (1956).
242. Bradley В. EE. E., Loss of virus from the stylets of aphids, Virology, 8, 308—318 (1959).
243. Bradley В. EE. E., Our concepts. On rock or sand? Recent Advan. Botany, 1, 528—
535 (1961).
244. Bradley R. EE. E., Different areas of tobacco leaves as sources of potato virus Y for
aphids, Virology, 16, 366—370 (1962).
245. Bradley В. EE. E., Topical susceptibility of tobacco leaves to potato virus Y inoculated
by aphids, Virology, 17, 357—358 (1962).
246. Bradley B. El. E-, Effect of keeping viruliferous aphids on plants or glass on their
transmission of sugar beet yellows virus, Virology, 17, 571—573 (1962).
247. Bradley В. EE. E., Are aphids apt to acquire potato virus Y, or transmit it when pro-
bing plants through a membrane? Virology, 21, 152—155 (1963).
248. Bradley R. El. E-, Some ways in which a paraffin oil impedes aphid transmission of'
potato virus Y, Can. J. Microbiol., 9, 369—380 (1963).
249. Bradley В. EE. E., Aphid transmission of stylet-borne viruses. In «Plant Virology»-
(M. K. Corbett and II. D. Sisler, eds.), pp. 148—174, Univ, of Florida Press, Gaines-
ville, Florida, 1964.
250. Bradley В. ЕЕ. E-, Which of an aphids stylets carry transmissible virus? Virology,
29, 396-401 (1966).
251. Bradley R. EE. E., Tobacco leaf veins as sources of a cucumber mosaic for aphids, Vi-
rology, 34, 172-173 (1968).
252. Bradley В. EE. E., Ganong R. Y., Evidence that potato virus Y is carried near the tip
of the stylets of the aphid vector Myzus persicae (Silz.), Can. J. Microbiol., 1, 775—
783 (1955).
253. Bradley В. ЕЕ. E., Ganong R. Y., Some effects of formaldehyde on potato virus Y in
vitro, and ability of aphids to transmit the virus when their stylets are treated, with
formaldehyde, Can. J. Microbiol., 1, 783—793 (1955).
254. Bradley R. EE. E., Ganong R. Y., Potato virus Y inactivated in tobacco inoculated by
aphids, Virology, 4, 172—181 (1957).
255. Bradley R. EE. E., Rideout D. W-, Comparative transmission of potato virus Y by four
aphid species that infest potato, Can. J. Zool., 31, 333—341 (1953).
256. Bradley R. EE. E., Sylvester E. S., Do aphids carry transmissible sugar beet yellows
virus via their stylets? — Evidence from ultraviolet radiation, Virology, 17, 599—
601 (1962).
257. Bradley R. EE. E., Wade С. 7., Wood F. 4., Aphid transmission of potato virus Y in-
hibited by oils, Virology, 18, 327—328 (1962).
258. Bradley R. EE. E., Moore C. A., Pond В. D., Spread of potato virus Y curtailed by oil,
Nature, 209, 1370-1371 (1966).
259. Brakke M. K., Density gradient centrifugation a new separation technique, J. Am.
Chem. Soc., 73, 1847-1848 (1951).
260. Brakke M. K., Zonal separations by density gradient centrifugation, Arch. Biochem.
Biophys., 45, 275-290 (1953).
261. Brakke M. K-, Zone electrophoresis of dyes, proteins and viruses in density gradient
columns of sucrose solutions, Arch. Biochem. Biophys., 55, 175—190 (1955).
262. Brakke M. K., Density gradient centrifugation and its application to plant viruses,
Advan. Virus. Res., 7, 193—224 (I960).
263. Brakke M. K., Stability of purified Barley stripe mosaic virus, Virology, 17, 131 —
142 (1962).
264. Brakke M. K., Stabilization of brome grass mosaic virus by magnesium and calcium,
Virology, 19, 367-374 (1963).
265. Brakke M. K., Nonideal sedimentation and the capacity of sucrose gradient columns for
virus density-gradient centrifugation, Arch. Biochem. Biophys., 107, 388—403
(1964).
266. Brakke M. K., Daly J. M., Density-gradient centrifugation. Non-ideal sedimentation
and the interaction of major and minor components, Science, 148, 387—389 (1965).
Литература
511
267. Brakke М. К., Estes А. Р., Some factors affecting vector transmission of soil-borne
wheat mosaic virus from root washings and soil debris, Phytopathology, 57, 905—910'
(1967).
268. Brakke M. K., Vatter A. E., Black L. M., Size and shape of woundtumor virus, Brook-
haven Symp. Biol., 6, 137-156 (1954).
269. Brandes J., Identifizicrung von gestreckten pflanzenpathogenen Viren auf morphologi-
sche Grundlage, Mitt. Biol. Bundesanstalt Land-Forstwirtsch. Berlin — Dahlem,
110, 130 (1964).
270. Brandes J., Bercks R., Gross morphology and serology as a basis for the classification
of elongated plant viruses, Advan. Virus Res., 11, 1—22 (1965).
271. Brandes J., Wetter C-, Classification of elongated plant viruses on the basis of their
particle morphology, Virology, 8, 99—115 (1959).
272. Brants D. II., The influence of meristematic tissue and injuries on the transport of
tobacco mosaic virus in Nicotiana tabacum L. cultivar Samsun, Acta Botan. Neerl.,
10, 113—163 (1961).
273. Brants D. II., Transport of C14 labelled tobacco mosaic virus material in tobacco lea-
ves, Virology, 20, 388-390 (1963).
274. Brants D. II., The susceptibility of tobacco and bean leaves to tobacco mosaic virus-
infection in relation to the condition of ectodesmata, Virology, 23, 588—594 (1964).
275. Brants D. II., Relation between ectodesmata and infection of leaves by tobacco mo-
saic virus, Virology, 26, 554—557 (1965).
276. Brants D. II., Relation between ectodesmata and infection of tomato roots by UC la-
belled tobacco mosaic virus, Virology, 29, 622—627 (1966).
277. Braun W., Nakano M., Antibody formation: — Stimulation by polyadenylic and
polycytidylic acids, Science, 157, 819—821 (1967).
278. Breece J. R., Hart W. J-, A possible association of nematodes with the spread of peach
yellow bud mosaic virus, Plant Disease Reptr., 43, 989—990 (1959).
279. , Brierley P., Transmission of some gladiolus viruses on tools in harvesting flowers and
corms, Plant Disease Reptr., 46, 505 (1962).
280. Broadbent L., Investigation of Virus Diseases of Brassica Crops, 94 pp. A.R.C. Rept.
Ser. No. 14, Cambridge Univ. Press, London and New York, 1957.
281. Broadbent L., The epidemiology of tomato mosaic. III. Cleaning virus from hands and)
tools, Ann. App. Biol., 52, 225—232 (1963).
282. Broadbent L-, The epidemiology of tomato mosaic. VII. The effect of TMV on tomato-
fruit yield and quality under glass, Ann. Appl. Biol., 54, 209—224 (1964).
283. Broadbent L-, The epidemiology of tomato mosaic. IX. Transmission of TMV by birds,.
Ann. Appl. Biol., 55, 67—69 (1965).
284. Broadbent L. II., The epidemiology of tomato mosaic. XI. Seed-transmission of TMV,
Ann. Appl. Biol,, 56, 177—205 (1965).
285. Broadbent L., Pletcher J. T., The epidemiology of tomato mosaic. IV. Persistence of
virus on clothing and glasshouse structures, Ann. Appl. Biol., 52, 233—241 (1963).
286. Broadbent L., Fletcher J. T-, The epidemiology of tomato mosaic virus. XII. Sources-
of TMV in commercial tomato crops under glass, Ann. Appl. Biol., 57, 113—120
(1966).
287. Broadbent L-, Winsor G. W., The epidemiology of tomato mosaic. V. The effect on
TMV-infected plants of nutrient foliar sprays and of steaming the soil, Ann. Appl. Biol.,
54, 23-30 (1964).
288. Broadbent L., Gregory P. H-, Tinsley T. W., The influence of planting date and manu-
ring on the incidence of virus diseases in potato crops, Ann. Appl. Biol., 39, 509—
524 (1952).
289. Broadbent L-, Heathcote G. D-, McDermott N., Taylor С- E., The effect of date of plan-
ting and of harvesting potatoes on virus infection and on yield, Ann. Appl. Biol., 45,
603-622 (1957).
290. Broadbent L-, Green D. E., Walker P., Narcissus virus diseases, Daffodil Tulip Year-
book, 28, 154-160 (1963). _ •
291. Broadbent L., Read W. II., Last F. T,, The epidemiology of tomato mosaic. X. Persis-
tence of TMV infected debris in soil and the effects of soil partial sterilisation, Ann.
Appl. Biol., 55, 471-483 (1965).
292. Brownhill T. J., Jones A. S-, Stacey M-, The inactivation of ribonuclease during the
isolation of ribonucleic acids and ribonucleoproteins from yeast, Biochem. J., 73,
434-438 (1959).
293. Brownlee G. G., Sanger F., Barrell B. G., The sequence of 5 S ribosomal ribonucleic acid,
J. Mol. Biol., 34, 379-412 (1968).
294. Bruening G., The inheritance of top component formation in cowpea mosaic virus.
Virology, 37, 577-584 (1969).
295. Bruening G., Agrawal II. O-, Infectivity.of a mixture of cowpea mosaic virus ribonuc-
leoprotein components, Virology, 32, 306—320 (1967).
296. В rues С. T., Melander A. L., Carpenter F. M., Classification of insects, Bull. Museum
Comp. Zool. Ifarvard Cpll., 108, 917 pp. (1954).
•512 Литература
УЛ. Brunt Л. A., Kenten R. IL, Mechanical transmission of cocoa swollen-shoot virus,
Virology, 12, 328-330 (1960).
298. Brunt A. A., Kenten R. IL, The use of protein in the extraction of cocoa swollen-shoot
virus from cocoa leaves, Virology, 19, 388—392 (1963).
299. Brunt A. 4., Kenten R. IL, Nixon IL L., Some properties of cocoa swollonshoot virus,
J. Gen. Microbiol., 36, 303-309 (1964).
300. Bryan J. K., Shearer G. B., Commoner B., Rapid biosynthetic incorporation of C1"1
labelled amino acids into tobacco mosaic virus, Virology, 22, 67—78 (1964).
301. Burdett, A. N., Warelng P. I'., The effects of kinetin and contaminating bacteria on
the incorporation of 32P-orthophosphate into various fractions of nucleic acids extracted
from radish leaves, Planta, 81, 88—96 (1968).
302. Burdon R. IL, Billeler 1YL A., Weissmann C-, Warner R. C., Ochoa S-, Knight C. 4.,
Replication of viral RNA. V. Presence of a virus specific double-stranded RNA in
leaves infected with tobacco mosaic virus, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S., 52, 768—775
(1964).
303. Burger W. C., Stahmann M. A., The combination of lysine polypeptides with tobacco
mosaic virus, J. Biol. Chem., 193, 13—22 (1951).
304. Burk L. G., Stewart R. N., Demen H., Histogenesis and genetics of a plastidcontrolled
chlorophyll variegation in tobacco, Am. J. Botany, 57, 713—724 (1964).
305. Burnet IL M., Virus as Organism, 134 pp. Harvard Univ. Press, Cambridge, Massachu-
setts, 1945.
306. Burroughs R., Goss J. A., Sill W. IL, Jr., Alterations in respiration of barley plants
infected with brome grass mosaic virus, Virology, 29, 580—585 (1966).
307. Burt P. E., Broadbent L., Heathcote G. D., The use soil insecticides to control potato
aphids and virus diseases, Ann. Appl. Biol., 48, 580—590 (1960).
•308, Burt P. E., Heathcote G. D., Broadbent L., The use of insecticides to find when leaf
roll and virus Y spread within potato crops, Ann. Appl. Biol., 54, 13—22 (1964).
309. Buzzell A., Action of urea on tobacco mosaic virus, J. Am. Chem. Soc., 82, 1636—
1641 (1960).
310. Buzzell 4., Action of urea on tobacco mosaic virus. II. The bonds between protein su-
bunits, Biophys. J., 2, 223—233 (1962).
311. Buzzell A., Trkula D., Lauffer M. A., X-ray studies on tobacco mosaic virus, Arch.
Biochem. Biophys., 63, 470—476 (1956).
312. Cadman C. IL, Raspberry viruses and virus diseases in Britain, Hort. Res., 1, 47—61
(1961).
313. Cadman C. IL, Evidence for association of tobacco rattle virus nucleic acid with a
cell component, Nature, 193, 49—52 (1962).
314. Cadman С. II., Harrison B. D., Studies on tho properties of soil-borne viruses of the
tobacco rattle type occuring in Scotland, Ann. Appl. Biol., 47, 542—556 (1959).
315. Cadman С. II., Harrison B. D., Studies on the behaviour in soils of tomato black ring
raspberry ringspot and arabis mosaic viruses, Virology, 10, 1—20 (1960).
316. Cairns J., The chromosome of Escherichia coli, Cold Spring Harbor Symp. Quant.
Biol., 28, 43 -46 (1963).
• 317. Caldwell J., The physiology of virus diseases in plants. II. Further studies on the move-
ment of mosaic in the tomato plant, Ann. Appl. Biol., 18, 279—298 (1931).
• 318. Caldwell J., The physiology of virus diseases in plants. V. The movement of the virus
agent in tobacco and tomato, Ann. Appl. Biol., 21, 191—205 (1934).
• 319. Caldwell J., Some effects of a plant virus on nuclear division, Ann. Appl. Biol., 39,
98-102 (1952).
320. Caldwell J., Seed transmission of viruses, Nature, 193, 457—459 (1962).
321. Campbell R. N., Fry P. R., The nature of the associations between Olpidium brassicae
and lettuce big vein and tobacco necrosis viruses,'Virology, 29, 222—233' (1966).
322. Campbell R. N-, Grogan R. G., Big-vein of lettuce and its transmission by Olpidium
brassicae, Phytopathology, 53, 252—259 (1963).
-323. Campbell R. N., Grogan R. G., Asquisition and transmission of lettuce big-vein virus
by Olpidium brassicae, Phytopathology, 54, 681—690 (1964).
324. Capecchi M. .R., Polypeptide chain termination in vitro isolation of a release factor,
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S., 58, 1144-1151 (1967).
325. Capoor S. P-, The movement of tobacco mosaic viruses and potato virus X through
tomato plants, Ann. Appl. Biol., 36, 307—319 (1949).
326. Carsner E., Attenuation of the virus of sugar beet curly-top, Phytopathology, 15,
745-757 (1925).
327. Carsner E., Holmes F. O., Johnson J., McKinney H. H., Thornberry H. IL, PFeiss F-,
Bennett С- IV., Report of the committee on nomenclature and classification of plant
viruses, Phytopathology, 33, 424 (1943).
328. Carter W., Mealybug wilt of pineapple. A reappraisal, Ann. N.Y. Acad. Sci., 105,
741-764 (1963).
329. Cartwright T. E., Ritchie 4. E., Laufjer M, 4., The. reaction of tobacco mosaic virus
with formaldehyde, III. Kinetics of the loss of infectivity, Virology, 2, 689—702 (1956).
Литература
513
330. Caspar В. L. D., Radial density distribution in the tobacco mosaic virus particle,
Nature, 177, 928 (1956).
331. Caspar D. L. I)., Assembly and stability of the tobacco mosaic virus particle, Advan.
Protein Ghom., 18, 37—121 (1963).
332. Caspar D. L. D., Klug A., Physical principles in the construction of regular viruses,
Cold Spring liarbar Symp. Quant. Biol., 27, 1—24 (1962).
333. Caspar D. L. D., Klug A., Structure and assembly of regular virus particles. Viruses,
Nucleic Acids and Cancer, Univ, of Texas M.D. Anderson Hosp, arid Tumor Inst.,
pp. 27—39, Williams and Wilkins, Baltimore, Maryland, 1963.
334. Caspar D. L. D., Dulbecco R., Klug A., Lwoff A., Stoker M. P. G., Tournier P., Wil-
dy P-, Proposals. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 27, 49 (1962).
335. Casper R., Blue light promotes symptom formation and virus multiplication in plants,
Virology, 34, 179—181 (1968).
336. Casterman C., Teener R., Sur le mechanisme de 1’inhibition par la ribonuclease do la
multiplication du virus de la mosaique du tabac, Biochim. Biophys. Acta, 16, 433
(1955).
337. Casterman C., Teener R,, An initial ribonuclease sensitive phase in the multiplication
of tobacco mosaic virus, Virology, 3, 197—206 (1957).
338. Castillo M. B., Orlob G. B., Transmission of two strains of cucumber mosaic and alfalfa
mosaic viruses by single aphids of Myzus persicae, Phytopathology, 56, 1028—1030
(1966).
339. Catherall P. L., Effects of barley yellow dwarf virus on the growth and yield of single
plants and simulated swards of perennial rye-grass, Ann. Appl. Biol., 57, 155—162
(1966).
340. Catherall P. L., Griffiths E., Influence of cocksfoot streak virus on the growth of single
cocksfoot plants, Ann. Appl. Biol., 57, 141—148 (1966).
341. Catherall P. L., Griffiths E., Influence of cocksfoot streak virus on the growth of cock-
sfoot swards, Ann. Appl. Biol., 57, 149—154 (1966).
342. Cech M., Some notes on the use of agar gel filtration in the study of plant viruses,
Virology, 18, 487-489 (1962).
343. Cech M., On the role of chloroplasts in the tobacco mosaic virus reproduction, Phyto-
pathol. Z., 59, 72-82 (1967).
344. Cech M., Kralik ()., Blattnfj C., Rod-shaped particles associated with virosis of spruce,
Phytopathology, 51, 183—185 (1961).
345. Chalcraft J. P-, Matthews R. E. F., Cytological changes induced by turnip yellow
mosaic virus infections, Virology, 28, 555—562 (1966).
346. Chaicroft /• P-, Matthews R, E. F-, Virus strains and leaf ontogeny as factors in the
production of leaf mosaic patterns by turnip yellow mosaic virus, Virology, 33,
167—171 (1967).
347. Chaicroft J. P-, Matthews R. E. F-, Role of virus strains and leaf ontogeny in the
production of mosaic patterns by turnip yellow mosaic virus, Virology, 33, 659—673
(1967).
348. Chamberlain E. E., Baylis G. T. S., Onion yellow dwarf. Successful eradication, New
Zealand J. Sci. Technol., A29, 300—301 (1948).
349. Chamberlain E. E., Atkinson J. D., Hunter J. A., Plum mosaic, a virus disease of
plums, peaches and apricots in New Zealand, New Zealand J- Sci. Technol., 33 (2),
1-16 (1951).
350. Chambers T. C-, Francki R. I. B., Localisation and recovery of lettuce necrotic yellows
virus from xylem tissues of Nicotians. glutinosa, Virology, 29, 673—676 (1966).
351. Chambers T- C., Francki R. I. B., Randles J. W., The fine structure of gladiolus virus,
Virology, 25, 15-21 (1965).
352. Chambers T. C., Crowley N. C-, Francki R. I. B., Localization of lettuce necrotic
yellows virus in host leaf tissue, Virology, 27, 320—328 (1965).
353. Chandra N., Hildebrandt A. L., Tobacco mosaic virus inclusion bodies in tobacco
tissue cultures, Nature, 206, 325—326 (1965).
354. Chandra N., Hildebrandt A. L., Differentiation of plants from tobacco mosaic virus
inclusion-bearing and inclusion-free single tobacco cells, Virology, 31, 414—421
(1967).
355. Chany C., Brailovsky C., Stimulating interaction between viruses (stimulons), Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S., 57, 87-94 (1967).
356. Chapman R. K., Bath J. E., The latent period of pea enation mosaic virus in three
of its aphid vectors with emphasis on adult versus nymph comparisons, Phytopatholo-
gy, 58, 494—499 (1968).
357. Cheo P. C-, Effect of seed maturation on inhibition of southern bean mosaic virus
in bean, Phytopathology, 45, 17—21 (1955).
358. Cheo P. C-, Linder R. C-, In vitro and in vivo effects of commercial tannic acid and
geranium tannin on tobacco mosaic virus, Virology, 24, 414—425 (1964).
359. Cheo P. C., Pound G. S-, Weathers L. G-, The relation of host nutrition to the con-
centration of cucumber virus I in spinach, Phytopathology, 42, 377—381 (1952).
33—0893
514
Литература
360. Cheo Р. С., Friesen В- S., Sinsheimer R. L., Biophysical studies of infectious ribo-
nucleic acid from tobacco mosaic virus, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S., 45, 305—313
(1959).
361. Cheo P. C., Linder R. C-, McRitchie J- J., Effect of foreign RNA on tobacco mosaic
virus local lesion formation, Virology, 35, 82—86 (1968).
362. Chessin M., Growth substances and stunting in virus infected plants, Proc. 3rd Conf.
Potato Virus Diseases, Lisse-Wageningen, Netherlands, pp. 80—84, 1957.
363. Chessin M., Light quality and photoreactivation of plants and viruses, Ann. Appl.
Biol., 46, 388-392 (1958).
364. Chesstn M-, Photodynamic inactivation of infectious nucleic acid, Science, 132, 1840—
1841 (1960).
365. Chessin M., Solberg R. A., Jakobson M., Differential sensitivity of tobacco mosaic
virus and its infectious nucleic acid to fast electrons, Nature, 202, 830—831 (1964).
366. Chessin M-, Zaillin M., Solberg R. A., A new strain of tobacco mosaic virus from
Lychnis alba, Phytopathology, 57, 452—453 (1967).
367. Chester K. S., A serological estimate of the absolute concentration of tobacco mosaic
virus, Science, 82, 17 (1935).
368. Chester K. S-, Serological tests with Stanley’s crystalline tobacco mosaic protein,.
Phytopathology, 26, 715—734 (1936).
369. Chester K. S-, Separation and analysis of virus strains by means of precipition tests,.
Phytopathology, 26, 778—785 (1963).
370. Chester K. S-, Serological studies of plant viruses, Phytopathology, 27, 903—912'
(1937).
371. Chiu R.-J., Black L. M., Assay of wound tumor virus by the fluorescent cell counting
technique, Virology, 37, 667—677 (1969).
372. Chiu R.-J., Sill W. £1., Jr., Chemotherapeutic effects of some substituted purines,
and pyrimidines and other compounds against three cereal viruses and tobacco mosaic;
virus, Phytopathology, 52, 432—438 (1962).
373. Chiu R.-J., Sill W. H., Jr., Purification and properties of brome grass mosaic virus,
Phytopathology, 53, 1285—1291 (1963).
374. Chiu R.-J., Liu R., MacLeod R., Black L. M-, Potato yellow dwarf virus in leafhopper
cell culture, Virology, 40 (1970) (in press).
375. Chiu R.-J., Reddy D. V. R., Black L. M., Inoculation and infection of leafhopper
tissue cultures with a plant virus, Virology, 30, 562—566 (1966).
376. Clark J. M., Jr., Chang A. Y., Spiegelman S., Reichmann M. E-, The in vitro transla-
tion of a monocistronic message, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S., 54,1193—1197(1965).
377. Clark M. F., Ross A. F., Variation among clones of Myzus persicae in ability to trans-
mit potato leaf roll virus acquired by injection, Phytopathology, 54, 199—204 (1964).
378. Clark M. F., Matthews R. E. F-, Ralph R. K., Ribosomes and polyribosomes in Brassica
pekinensis, Biochim. Biophys. Acta, 91, 289—304 (1964).
379. Clinch P., Loughnane J. B., Murphy P. A., A study of the infiltration of viruses into
seed potato stocks in the field, Sci. Proc. Roy. Dublin. Soc., 22, 18—31 (1938).
380. Close R. C., PhD. Thesis, 144 pp., Univ, of London, 1962.
381. Close R. C-, Some effects of other viruses and of temperature on the multiplication
of potato virus X, Ann. Appl. Biol., 53, 151—164 (1964).
382. Close R. C., Control of leaf roll virus in potatoes, Proc. New Zealand Weed Pest Control
Conf., 18, 222-226 (1965).
383. Close R. C., Granular insecticides for aphid control, Proc. New Zealand Weed Pest.
Control Conf., 20, 222—226 (1967).
384. Close R. C., Smith II. C., Lowe A. D., Cereal virus warning system, Commonwealth.
Phytopathol. News, 10, 7—9 (1964).
385. Cochran G. W-, Effect of shading techniques on transmission of tobacco mosaic virus,
through dodder, Phytopathology, 36, 396 (1946).
386. Cock L- J., Virus diseases of lettuce, N.A.A.S. Quart. Rev., 79, 126—138 (1968).
387. Cockbain A. J., Gibbs A. J., Ueathcoate G. D., Some factors affecting the transmission
of sugar-beet mosaic and pea mosaic viruses by Aphis fabae and Myzus persicae, Ann.
Appl. Biol., 52, 133-143 (1963).
388. Cocking E. C., An electron microscope study of the initial stages of infection of isolated
tomato fruit protoplasts by tobacco mosaic virus, Planta, 68, 206—214 (1966).
389. Cocking E. C., Pojnar E., Appearance of tobacco mosaic virus in thin sections using-
different staining procedures, J. Gen. Virol., 2, 317—318 (1968).
390. Cocking E. C., Pojnar E., An electron microscopic study of the infection of isolated
tomato fruit protoplasts by tobacco mosaic virus, J. Gen. Virol., 4, 305—315 (1969)..
391. Cohen M., Siegel A., Zaillin M., Hudson W. R., Wildman S. G., A study of tobacco
mosaic virus strain predominance and an hypothesis for the origin of systemic virus-
infection, Phytopathology, 47, 694—702 (1957).
392. Cohen S-, The occurence in the body of Betnisia tabaci of a factor apparently related
to the phenomenon of «Periodic Acquisition» of tomato yellow loaf curl virus, Virologyъ
31, 180-183 (1967).
Литература
515
393. Cohen S-, Harpaz I., Periodic rather than continual acquisition of a new tomato virus
by its vector the tobacco whitefly (Bemisia tabaci Gonnadius), Entomol. Exptl. Appl.,
7, 155-166 (1964).
394. Cohen S- S., Schachman H. K-, Physical studies on the ribonucleic acid of turnip
yellow mosaic virus, Virology, 3, 575—586 (1957).
395. Colby C., Duesberg P. H., Double-stranded RNA in Vaccinia virus infected cells,
Nature, 222, 940-944 (1969).
396. Commoner B-, Linear biosynthesis of tobacco mosaic virus. Development and test
of a model, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S., 48, 2076-2083 (1962).
397. Commoner B., Nercer F. L., Inhibition of the biosynthesis of tobacco mosaic virus by
thiouracil, Nature, 168, 113—114 (1951).
398. Commoner B., Mercer F- L., The effect of thiouracil on the rate of tobacco mosaic virus
biosynthesis, Arch. Biochem. Biophys., 35, 278—288 (1952).
399. Commoner B-, SlmingtonJ., Linear biosynthesis of tobacco mosaic virus: incorporation
of Cu into rods of different lengths, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S., 48, 1984—1991 (1962).
400. Commoner B., Newmark P., Rodenberg S- D-, An electrophoretic analysis of tobacco
mosaic virus biosynthesis, Arch. Biochem. Biophys., 37, 15—36 (1952).
401. Commoner B., Shearer G. B., Yamada M., Linear biosynthesis of tobacco mosaic virus.
Changes in rod length during the course of infection, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.,
48, 1788-1795 (1962).
402. Cook A. A., Genetics of response in pepper to three strains of potato virus Y, Phyto-
pathology, 53, 720-722 (1963).
403. Cook A. A., Isolation and maintenance of potato virus Y strains virulent on selected
papper varieties, Phytopathology, 57, 385—388 (1967).
404. Corbett M. K., Purification of potato virus X without aggregation, Virology, 15,
8-15 (1961).
405. Corbett M. K-, Electron microscopy of partially degraded tobacco mosaic virus, Viro-
logy, 22, 539—543 (1964).
406. Corbett M. K., Some distinguishing characteristics of the orchid strain of tobacco
mosaic virus, Phytopathology, 57, 164—172 (1967).
407. Corbett M. K., Grant T. J., Purification of citrus variegation virus, Phytopathology,
57, 137-143 (1967).
408. Corbett M. K., Roberts D. A., A rapid method for purifying tobacco ringspot virus, and
its morphology as determined by electron microscopy and negative staining, Phyto-
pathology, 52, 902—905 (1962).
409. Cornuet P., Martin P., Limasset P., Extraction du virus de la Mosaique du Dahlia
(Marmot Dahliae, Holmes) 5 partir de Dahlias infectes et obtention de son antiserum,
Compt. Rend., 231, 913-914 (1950).
410. Costa A. 5., Bennett C- W-, White fly transmitted mosaic of Euphorbia prunifolia,
Phytopathology, 40, 266—283 (1950).
411. Costa A. S., Bennett C. W., Studies on the mechanical transmission of the yellows
virus of sugar beet, Phytopathology, 45 , 233 — 238 (1955).
412. Cottier W-, Aphids of New Zealand, New Zealand Dept. Sci. Ind. Res. Bull., 106,
382 pp. (1953).
413. Couch H. B., Studies on the seed transmission of lettuce mosaic virus, Phytopathology,
45, 63-70 (1955).
414. Cremer M. C-, Kooistra G., Investigations on notched leaf («Kartelblad») of Gladiolus
and its relation to rattle virus, Nematologica, 10, 69—70 (1964). (Abstr.)
415. Crespin Medina A., Grogan R- G., Seed transmission of bean mosaic viruses, Phyto-
pathology, 51, 452—456 (1961).
416. Crick F. H- C-, The genetic code — yesterday, today and tomorrow, Cold Spring
Harbor. Symp. Quant. Biol., 31, 3—9 (1966).
417. Crick F- H. C., Watson J. D-, Structure of small viruses, Nature, 177, 473—475 (1956).
418. Cronshaw J-, Hoefert L., Esau K., Ultrastructural features of Beta leaves infected
with beet yellows virus, J. Cell. Biol., 31, 429—443 (1966).
419. Crowley N. C., Studies on the time of embryo infection by seed-transmitted viruses,
Virology, 8, 116—123 (1959).
420. Crowley N. C., Factors affecting the local lesion response of Nico liana glutinosa to
lettuce necrotic yellows, Virology, 31, 107—113 (1967).
421. Crowley N. C-, Francki R. I. B., Purification and some properties of centrosema mosaic
virus, Australian J. Biol. Sci., 16, 468—472 (1963).
422. Crowley N. C-, Hanson J- B., The infection of apical meristems of tomato roots with
tobacco mosaic virus after treatment with ethylenediamine-tetracetic acid, Virology,
12, 603-606 (1960).
423. Crowley N. C-, Harrison B-D-, Francki R. I. B., Partial purification of lettuce necrotic
yellows virus, Virology, 26, 290—296 (1965).
424. Cruickshank I. A. M., Perrin D. R., The isolation and partial characterisation of
Monilicolin A, a polypeptide with phaseollin-inducing activity from Monilinia
fructicola, Life Sci., 7, 449—458 (1968).
33*
516
Литература
425. Cumber Ft. A., Insects associated with wheat barley and oat crops in the Rangitiki
Manawatu, Southern Hawkes Bay and Wairarapa districts during the 1960—1961
season, New Zealand J. Agr. Res., 5, 163—178 (1962).
426. Daft M- J., Some interactions of kinetin and temperature on tobacco leaves infected
with tomato aucuba mosaic virus, Ann. Appl. Biol., 55, 51—56 (1965).
427. Dahl D., Knight C. A., Some nitrous acid-induced mutants of tomato atypical mosaic
virus, Virology, 21, 580—'586 (1963).
428. Dahlberg J. Ё-. Haselkorn R., The ribosome-binding sites in turnip yellow mosaic
virus RNA, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S., 55, 1269—1276 (1966).
429. Dales S., Mosbach, E. II., Vaccinia as a model for membrane biogenesis, Virology, 35,
564-583 (1968).
430. Damirdagh I. S-, Ross A. F., A marked synergistic interaction of potato viruses X
and Y in inoculated leaves of tobacco, Yirology, 31, 296—307 (1967).
431. Darnell J. E-, Levintow L., Thoren M. M., Hooper J. L., The time course of synthesis
of polio virus RNA, Virology, 13, 271—279 (1961).
432. Das S., Raski D. J., Vector-efficiency of Xiphinema index in the transmission of gra-
pevine fanleaf virus, Nematologica, 14, 55—62 (1968).
433. Davies P., Barry R. D., Nucleic acid of influenza virus, Nature, 211, 384—387 (1966).
434. Davis R. E., Whitcomb R. F., Sucrose-onhanced local infection of plants by viruses,
Phytopathology, 57, 808 (1967).
435. Davis R. E., Whitcomb R. F., Stem R. L-, Remission of aster yellows disease by anti-
biotics, Science, 161, 793—795 (1968).
436. Davison E. M-, Cell to cell movement of tobacco ringspot virus, Virology, 37, 694—
696 (1969).
437. Dawson J. R. O., Contrasting effects of resistant and susceptible tomato plants on
tomato mosaic virus multiplication, Ann. Appl. Biol., 56, 485—491 (1965).
438. Dawson J- R. O., The adaption of tomato mosaic virus to resistant tomato plants,
Ann. Appl. Biol., 60, 209—214 (1967).
439. Day M. F-, The mechanism of the transmission of potato leafroll virus by aphids,
Australian J. Biol. Sci., 8, 498—513 (1955).
440. Day M. F., Venables D. G., The transmission oi cauliflower mosaic virus by aphids,
Australian J. Biol. Sci., 14, 187—197 (1961).
441. Debrot E. A., Studies on a strain of raspberry ringspot virus occurring in England,
Ann. Appl. Biol., 54, 183-191 (1964).
442. De Freniery D., Knight C. A., A chemical comparison of three strains of tomato bushy
stunt virus, J. Biol. Chem., 214, 559—566 (1955).
443. De Rosier D., Haselkorn R., Minor components associated with turnip yellow mosaic
virus, Virology, 30, 705—715 (1966).
444. Desjardins P. R., Diener T. O., Subtle effects of freezing on the sensitivity of tobacco
mosaic virus to alkaline degradation, Phytopathology, 57, 809 (1967).
445. De Zoeten G. A., California tobacco rattle virus, its intracellular appearance and the
cytology of the infected cell, Phytopathology, 56, 744—754 (1966).
446. De Zoeten G. A., Application of scanning microscopy in the study of virus transmission
of aphids, J. Virol., 2, 745—751 (1968).
447. De Zoeten G. A., Gaard G., Possibilities for inter- and intracellular translocation of
some icosahedral plant viruses, J. Cell. Biol., 40, 814—823 (1969).
448. De Zoeten G. .4., Schlegel D. E., Broad bean mottle virus in leaf tissue, Virology, 31,
173-176 (1967).
449. De Zoeten G. A., Schlegel D. E-, Nucleolar and cytoplasmic uridine H3 incorporation
in virus-infected plants, Virology, 32, 416—427 (1967).
450. Dickson R. C., Laird E. F., Aluminium foil to protect melons from watermelon mosaic
virus, Plant Disease Reptr., 50, 305 (1966).
451. Diener T. O., Virus infection and other factors affecting ribonuclease activity of plant
leaves, Virology, 14, 177—189 (1961).
452. Diener T. O., Isolation of an infectious, ribonuclease sensitive fraction from tobacco
leaves recently inoculated with tobacco mosaic virus, Virology, 16, 140—146 (1962).
453. Diener T. O., Isolation of infectious ribonucleic acid from southern bean mosaic virus,
Virology, 27, 425-429 (1965).
454. Diener T. O-, Desjardins P. R., Factors affecting the stability of tobacco mosaic virus 1.
Ribonuclease induced protection of a virus from alkaline degradation, Virology, 29,
15-25 (1966).
455. Diener T. O., Jenifer F. G., A dependable local lesion assay for turnip yellow mosaic
virus, Phytopathology, 54, 1258—1260 (1964).
456. Diener T. O-, Raymer W. B., Potato spindle tuber virus; a plant virus with properties
of a free nucleic acid, Science, 158, 378—381 (1967).
457. Diener T. O., Raymer W. B-, Potato spindle tuber virus. A plant virus with properties
of a free nucleic acid, II. Characterization partial purification, Virology, 37, 351—366
(1969).
Литература
517
458, Diener Т. О., Schneider I. R., The two components of tobacco ringspot virus nucleic
acid. Origin and properties, Virology, 29, 100—105 (1966).
459. Diener T. O., Schneider I. R., Virus degradation and nucleic acid release in single
phase phenol systems, Arch. Biochim. Biophys., 124, 401—412 (1968).
460. Diener T. O., Scott II. 4., Кар er J- M., Highly infectious nucleic acid from crude and
purified preparations of cucumber mosaic virus (Y strain), Virology, 22, 131—141
(1964).
461. Dijkstra J., On the early stages of infection by tobacco mosaic virus in Nicotiana
glutinosa L., Virology, 18, 142—143 (1962).
462. Dijkstra J., Multiplication of TMV in isolated epidermal tissue of tobacco and Nico-
tiana glutinosa leaves. In «Virus of Plants» (A. B. R. Beemster and J. Dijkstra, ods.),
pp. 19—21, North-Holland Publ., Amsterdam, 1966.
463. Dingley J. M., Records of plant diseases in Now Zealand, New Zealand Dept. Sci.
Ind. Ros. Bull., 192, 298 pp. 1969.
464. Ditchfield J., Almeida J. D., The fine structure of cocal virus, Virology, 24, 232—235
(1964).
465. Djordjevic B., Effect of 5-fluorodeoxyuridine on the replication of tobacco mosaic
virus in meristematic tissue, Nature, 207, 327 (1965).
466. Doi У., Teranaka M., Yora K-, Asuyatna H., Mycoplasma or PLT grouplike micro-
organisms found in the phloem elements of plants infected with mulberry dwarf,
potato witches broom, aster yellows, or Paulownia witches broom, Nippon Shokubutsu
Byori Gakkaiho, 33, 259—266 (1967).
467. Doncaster J. P., Gregory P. II., The spread of virus diseases in the potato crop, Brit.
Agr. Ros. Council Rept. Ser. 7, 189 pp. (1948).
468. Domer R. W-, Knight C. A., The preparation and properties of some plant virus
nucleic acids, J. Biol. Chem., 205, 959—967 (1953).
469. Doty P., Boedtker H., Fresco J. R., Haselkorn R., Litt M., Secondary structure in
ribonucleic acids, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S., 45, 482—499 (1959).
470. Dubin D. T., Gunalp A., Minor nucleotide composition of ribosomal precursor and
ribosomal nucleic acid in Escherichia coli, Biochim. Biophys. Acta, 134, 106—123
(1967).
471. Duffus J. E., Radish yellows, a disease of radish, sugar beet, and other crops. Phyto-
pathology, 50, 389-394 (1960).
472. Duffus J. E., Possible multiplication in the aphid vector of sow thistle yellow vein
virus, a virus with an extremely long insect latent period, Virology, 21, 194—202
(1963).
473. Duffus J. E., Gold A. II., Transmission of beet western yellows virus by aphids feeding
through a membrane, Virology, 27, 388—390 (1965).
474. Duffus J. E., Gold A. H., Relationship of tracer-measured aphid feeding to acquisition
of beet western yellows virus and to feeding inhibitors in plant extracts, Phytopatho-
logy, 57, 1237-1241 (1968).
475. Dunn D. B., Hitchborn J. II., The use of bentonite in the purification of plant viruses,
Virology, 25, 171—192 (1965).
476. Dunn D. B., Hitchborn J. H., The extraction of infectious high molecular weight
RNA from turnip yellow mosaic virus with ethanol, Virology, 30, 598—607 (1966).
477. Dunning R. A., Winder G. H., The effect of insecticide applications to the sugar beet
crop early in the season on aphid and yellows incidence, Plant Pathol., 14, 30—36
(1965).
478. Dwurazna M. M., The development of fungal diseases in potato breeding in the region
of Cracow, Roczniki Nauk Rolniczycb, D78, 145—158 (1957).
479. Dwurazna M. M-, Weintraub M., A virus-like particle in Avon and Fundy potatoes,
Phytopathology, 53, 839—842 (1963).
480. Edwardson J. R., Electron microscopy of cytoplasmic inclusions in cells infected
with rod-shaped viruses, Am. J. Botany, 53, 359—363 (1966).
481. Edwardson J. R., Cylindrical inclusions in the cytoplasm of leaf cells infected with
tobacco etch virus, Science, 153, 883—884 (1966).
482. Edwardson J. R., Corbett M. K., A virus-like syndrome in tomato caused by a muta-
tion, Am. J. Botany, 49, 571—574 (1962).
483. Edwardson J. R., Purcifull D. E-, Christie R. G., Electron microscopy of two small
spherical plant viruses in thin sections, Can. J. Botany, 44, 821—826 (1966).
484. Edwardson J. R., Purcifull D. E., Christie R. G., Structure of cytoplasmic inclusions
in plants infected with rod-shaped viruses, Virology, 34, 250—263 (1968).
485. Egarni F-, Takahashi K., Uchida T., Ribonucleases in Taka-diastase: Properties,
chemical nature and applications, Progr. Nucleic Acid Res. Mol. Biol., 3, 59—101
(1964).
486. Eglinton G., Hamilton R. /., Leaf epicuticular waxes, Science, 156, 1322—1335 (1967).
487. Eikhom T. S-, Stockley D. J., Spiegelman S-, Direct participation of a host protein
in the replication of viral RNA in vitro, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S., 59, 506—512
(1968).
518
Литература
488. Elbertzhagen И., EinBeitrag zumStickstoff-undPhosphatstoffwechselmosaikviruskran-
ker Tabakpflanzen, Phytopathol. Z., 34, 66—82 (1958).
489. Elliott C. G-, Hendrie M- E., Knights B. A., Parker W., A steroid growth factor requi-
rement in a fungus, Nature, 203, 427—428 (1964).
490. Ellis L. F., Kleinschmidt W- J-, Virus-like particles of a fraction of statalon, a mould
product, Nature, 215, 649—650 (1967).
491. Ellis S- T-, Gowans J. L-, Howard J. C., Cellular events during antibody formation,
Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 32, 395—406 (1967).
492. Engler R., Schramm G., Infectious ribonucleic acid as a precursor of tobacco mosaic
virus, Nature, 183, 1277-1278 (1959).
493. Entwistle P. F-, Longworth J. F-, The relationships between cacao viruses and their
vectors the feeding behaviour of three mealybug (Homoptera: Pseudococcidae) species,
Ann. Appl. Biol., 52, 387-391 (1963).
494. Esau. K., An anotomists view of virus diseases, Am. J. Botany, 43, 739—748 (1956).
495. Esau K., Phloem degeneration in Graminae effected by the barley yellow dwarf virus,
Am. J. Botany, 44, 245-251 (1957).
496. Esau K., Cronshaw J., Relation of tobacco mosaic virus with host cells, J. Cell Biol.,
33, 665—678 (1967).
497. Esau K., Cronshaw J., Tubular components in cells of healthy and tobacco mosaic
virus-infected Nicotiana, Virology, 33, 26—35 (1967).
498. Esau K., Gill R. II., Tobacco mosaic virus in dividing mesophyll cells of Nicotiana,
Virology, 38, 464-472 (1969).
499. Esau K., Cronshaw J., Hoefert L. L-, Organisation of beet-yellows inclusions in leaf
cells of Beta, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S., 55, 486—493 (1966).
500. Esau K., Cronshaw J., Hoefert L. L., Relation of beet yellows virus to the phloem and
to movement in the sieve tube, J. Cell. Biol., 32, 71—87 (1967).
501. Eslick R. F-, Afanasiev M. M., Influence of time of infection with barley stripe mosaic
on symptoms, plant yield and seed infection of barley, Plant Disease Rept., 39, 722—
724 (1955).
502. Evans A. C., Groundnut rosette disease in Tanganyika, 1. Field studies, Ann. Appl.
Biol., 41, 189-206 (1954).
503. Evans N. A., McLaren A. D., Quantum yields for the inactivation of tobacco mosaic
virus nucleic acid by ultraviolet irradiation (254 mu), J. Gen. Virol., 4, 55—63 (1969).
504. Eyles A. C., Insects associated with the major fodder crops in the North Isband, II.
Hemiptera, New Zealand J. Agr. Res., 3, 994—1008 (1960).
505. Fantes К. H., O'Neill С. F., Some similarities between a viral inhibitor of plant origin
and chick interferon, Nature, 203, 1048—1050 (1964).
506. Farkas G. L., Solymosy F., Simultaneous activation of pentose phosphate shunt enzy-
mes in a virus-infected local lesion host plant, Nature, 195, 835—836 (1962).
507. Farkas G. L., Stahmann M., On the nature of changes in peroxidase isoenzymes in bean
leaves infected by southern bean mosaic virus, Phytopathology, 56, 669—677
(1966).
508. Farkas G. L-, Kiraly Z., Solymosy F., Role of oxidative metabolism in the localisa-
tion of plant viruses, Virology, 12, 408—421 (I960).
509. Farley J. D., Lockwood J. L., Increased susceptibility to root rots in virusinfectod
peas, Phytopathology, 54, 1279—1280 (1964).
510. Favre R., Boy de la Tour E-, Segre N., Kellenberger E., Studies on the morphogenesis
of the head of phage T-even, 1. Morphological, immunological and genetic characte-
risation of polyheads, J. Ultrastruct. Res., 13, 318—342 (1965).
511. Feix G., Pallet R., Weismann C., Replication of viral RNA, XVI. Enzymatic synthe-
sis of infectious viral RNA with noninfectious QB minus strands as template, Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S., 59, 145-152 (1968).
512. Feldman J. M., Boninsegna J. A., Antiserum for tomato spotted wilt virus, Nature,
219, 183-184 (1968).
513. Fenner F-, Biology of Animal Viruses, Vol. 1. Molecular and Cellular Biology, 501 pp.,
Academic Press, New York, 1968.
514. Fernow К. H., Peterson L. C-, Plaisted R. L-, Thermotherapy of potato leafroll, Am.
Potato 'J., 39, 445-451 (1962).
515. Flers W., Sinshelmer R. L., The structure of the DNA of bacteriophage ФХ174, III.
Ultracentrifugal evidence for a ring structure, J. Mol. Biol., 5, 424—434 (1962).
516. Finch J. T., Preliminary X-ray diffraction studies on tobacco rattle and barley stripe
mosaic viruses, J. Mol. Biol., 12, 612—619 (1965).
517. Finch J. T., Bancroft J. B., Structure of the reaggregated protein shells of two spherical
viruses, Nature, 220, 815-816 (1968).
518. Finch J. T., Klug A., X-ray «powder» diagrams of crystals of an artificial top compo-
nent from turnip yellow mosaic virus, J. Mol. Biol., 2, 434—435 (1960).
519. Finch J. T., Klug A., Arrangement of protein subunits and the distribution of nucleic
acid in turnip yellow mosaic virus, II. Electron microscopic studies, J. Mol. Biol.,
15, 344—364 (1966).
Литература
519
520. Finch J- T., Klug A., Structure of broad bean mottle virus, 1. Analysis of electron
micrographs and comparison with turnip yellow mosaic virus and its top component,
J. Mol. Biol., 24, 289-302 (1967).
521. Einch J. T., Leberman R., Yu-Shang C-, Klug A., Rotational symmetry of the two
turn disk aggregate of tobacco mosaic virus protein, Nature, 212, 349—350 (1966).
522. Finch J. T., Klug A., Regenmortel M. H. V., The structure of cucumber mosaic virus,
J. Mol. Biol., 24, 303-305 (1967).
523. Finch J. T., Leberman R., Berger J. E., Structure of broad bean mottle virus, II.
X-ray diffraction studies, J. Mol. Biol., 27, 17—24 (1967).
524. Finlay K. W-, Inheritance of spotted wilt resistance in the tomato, II. Five genes
controlling spotted wilt resistance in four tomato types, Australian J. Biol. Sci., 6,
153-163 (1953).
525. Ford R. E., Bateman D. F., Boron nutrition of Nicotiana tabacum and its influence on
the multiplication and translocation of potato virus X, Phytopathology, 54, 1405—
1408 (1964).
526. Ford R. E., Ross A. F-, Effect of temperature on the interaction of potato viruses X
and Y in inoculated tobacco leaves, Phytopathology, 52, 71—77 (1962).
527. Ford 11. E., Ross A. F., The interaction of potato viruses X and Y in tobacco leaf tissue
differing in age, Phytopathology, 52, 226—232 (1962).
528. Foster R. E., Chenopodium amaranticolor nutrition affects cucumber mosaic virus
infection, Phytopathology, 57, 838—840 (1967).
529. Foster R. E., Webb R. E-, Temperature effects on symptom expression and concentra-
tion of six muskmelon viruses, Phytopathology, 55, 981—985 (1965).
530. Fraenkel-Conrat H., Reaction of nucleic acid with formaldehyde, Biochim. Biophys.
Acta, 15, 307-309 (1954).
•531. Fraenkel-Conrat II., The role of nucleic acid in the reconstitution of active tobacco
mosaic virus, J. Am. Chem. Soc., 78, 882—883 (1956).
532. Fraenkel-Conrat II., Degradation of tobacco mosaic virus with acetic acid, Virology,
4, 1—4 (1957).
533. Fraenkel-Conrat II., The chemical basis of the infectivity of tobacco mosaic virus and
other plant viruses. In «The Viruses» (F. M. Burnet and W. M. Stanley, eds.), vol. 1,
pp. 429—457, Academic Press, New York, 1959.
534. Fraenkel-Conrat H., Chemical modification of viral ribonucleic acid, I. Alkylating
agents, Biochim. Biophys. Acta, 49, 169—180 (1961).
535. Fraenkel-Conrat II., Structure and function of virus proteins and viral nucleic acid.
In «The Proteins» (IT. Neurath, ed.), Vol. 3, pp. 99—151, Academic Press, New York,
1965.
536. Fraenkel-Conrat II., Colloms M-, Reactivity of tobacco mosaic virus and its protein
towards acetic anhydride, Biochemistry, 6 , 2740 — 2745 (1967).
537. Fraenkel-Conrat II., Singer B., Virus reconstitution, II. Combination of protein and
nucleic acid from different strains, Biochim. Biophys. Acta, 24, 540—548 (1957).
538. Fraenkel-Conrat II., Singer B., Reconstitution of tobacco mosaic virus, IV. Inhibition
by enzymesand other proteins and use of polynucleotides, Virology, 23,354—362 (1964).
.5 39. Fraenkel-Conrat II., Williams R. C-, Reconstitution of active tobacco mosaic virus
from its inactive protein and nucleic acid components, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.,
41, 690-698 (1955).
540. Fraenkel-Conrat II., Singer B., Williams R. C., Infectivity of virus nucleic acid,
Biochim. Biophys. Acta, 25, 87—96 (1957).
541. Fraenkel-Conrat II., Singer B., Veldee S., The mechanism of plant virus infection,
Biochim. Biophys. Acta, 29, 639—640 (1958).
542. Fraenkel-Conrat II., Singer B., Tsugita A., Purification of viral RNA by means of
bentonite, Virology, 14, 54—58 (1961).
543. Fraenkel-Conrat II., Veldee S-, Woo J., The infectivity of tobacco mosaic virus, Viro-
logy, 22, 432-433 (1964).
544. Francke B-, Hojschneider P. H., Ober infektiose Substrukturen aus Escherichia coli
bakteriophagen, VII. Formation of a biologically intact replicative form in ribonucleic
acid bacteriophage (M12)-infected cells, J. Mol. Biol., 16, 544—552 (1966).
545. Francki R. I. B., Infectivity of tobacco mosaic virus from leaves treated with 2-thiou-
racil, Virology, 17, 9—21 (1962).
546. Francki R. I. B-, Inhibition of cucumber mosaic virus infectivity by leaf extracts,
Virology, 24, 193-199 (1964).
547. Francki R. I. B-, Some factors affecting particle length distribution in tobacco mosaic
virus preparations, Virology, 30, 388—396 (1966).
548. Francki R. I. B-, Effect of high light intensities on spontaneous and virus-induced
local lesions in Gomphrena globosa, Phytopathology, 57, 329 (1967).
549. Francki R. I. B., Inactivation of cucumber mosaic virus (Q strain) nucleoprotein by
pancreatic ribonuclease, Virology, 34, 694—700 (1968).
550. Francki R. I. B-, Matthews R. E. F., Relation between incorporation of 2-thiouracil
into tobacco mosaic nucleic acid and virus inhibition, Virology, 17, 22—29 (1962).
520
Литература,
551. Francki R. I. В., Matthews R. E. F-, Some effects of 2-thiouracil on the multiplica-
tion of turnip yellow mosaic virus, Virology, 17, 367—380 (1962).
552. Franklin R. E-, Location of the ribonucleic acid in the tobacco mosaic virus particle,
Nature, 177, 928—930 (1956).
553. Franklin R. E-, Klug A., Holmes К. C., Ciba Found. Symp. Nature Viruses, p. 39,
1957.
554. Franklin R. M-, Purification and properties of the replicative intermediate of the
RNA bacteriophage R17, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S., 55, 1504—1511 (1966).
555. Fraser D., Cosentino V-, The amino acid composition of turnip yellow mosaic virus
and the associated abnormal protein, Virology, 4, 126—129 (.1957).
556. Fraser R. D. B., Infrared dichroism of tobacco mosaic virus protein, Nature, 170,
491 (1952).
557. Frazier N. W-, Nonretention of two seinipersistent strawberry viruses through ecdysis
by their aphid vector, Phytopathology, 56, 1318—1319 (1966).
558. Frazier N. IP., Voth F., Bringhurst R. S., Inactivation of two strawberry viruses
in plants grown in a natural high temperature environment, Phytopathology, 55,
1203-1205 (1965).
559. Freitag J. Ek., Beetle transmission host range and properties of squash mosaic virus,
Phytopathology, 46, 73—81 (1956).
560. Fridborg K., Hjerten S., Haglund S-, Liljas A., Lundberg В. K. S., Oxelfelt P-, Philip-
son L-, Strandberg B., Purification, electron microscopy and .X-ray diffraction studies
of the satellite tobacco necrosis virus, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S., 54, 513—521
(1965).
561. Fridlimd P. R., Effect of time and temperature on the rate of graft transmission of the
Primus ringspot virus, Phytopathology, 57 , 230— 231 (1967).
562. Fridlimd P. R., The relationship of inoculum-receptor contact period to the rate of
graft transmission of twelve Prunus viruses, Phytopathology, 57, 1296—1299 (1967).
563. Friesen B. S-, Sinsheimer R. L-, Partition cell analysis of infective tobacco mosaic
virus nucleic acid, J. Mol. Biol., 1, 321—328 (1959).
564. Frist R. II., Bendel I. J-, Smith К. M-, Lauffer M. A., The protein subunit of cucum-
ber virus 4; degradation of viruses by succinylation, Virology, 26, 558—566 (1965).
565. Fritzsche R., Kegler II., Die Obertragung des Blattrollvirus der Kirsche (cherry leaf
roll virus) durch Nematoden, Naturwissenschaften, 51, 299 (1964).
566. Fritzsche R., Schmidt II. B., Xiphinema poraelongatum Atherr und Xiphenema n. sp.,
Zwei Vectoren des Arabis-Mosaikvirus, Naturwissenschaften, 50, 163 (1963).
567. Frost R. R., Harrison B. D., Comparative effects of temperature on the multiplication
in tobacco leaves of two tobacco rattle viruses, J. Gen. Virol., 1, 455—464 (1967).
568. Frost R. R., Harrison B. D., Woods R. D., Apparent symbiotic interaction between
particles of tobacco rattle virus, J. Gen. Virol., 1, 57—70 (1967).
569. Fry P. R., Lettuce mosaic, New Zealand J., Sci. Technol., 33A, 52—63 (1952).
570. Fry P. R., Campbell R. H., Transmission of a tobacco necrosis virus by Olpidium bras-
sicae, Virology, 30, 517—527 (1966).
571. Fry P. R., Matthews R. E. F-, Timing of some early events following inoculation with
tobacco mosaic virus, Virology, 19, 461—469 (1963).
572. Fry P. R., Proctor С. II.. A serious virus disease of celery, New Zealand Commercial
Gro'wer, 24 (1), 23-24 (1968).
573. Fry P. R., Taylor W. B., Analysis of virus local lesion experiments, Ann. Appl. Biol.,
41, 664—674 (1954).
574. Fujisawa I., Hayashi T., Matsui C., Electron microscopy of mixed infections with two
plant viruses, I. Intracellular interactions between tobacco mosaic virus and tobacco,
etch virus, Virology, 33, 70—76 (1967).
575. Fujisawa I., Rubio-Hu.ertos M., Matsui C-, Yamaguchi A., Intracellular appearance
of cauliflower mosaic virus particles, Phytopathology, 57, 1130—1132 (1967).
576. Fukushi T-, Transmission of the virus through the eggs of an insect vector, Proc. Imp.
Acad. (Tokyo), 8, 457—460 (1933).
577. Fukushi T., Further studies on the dwarf disease of rice plant, J. Fac. Agr. Hokkaido.
Univ., 45, 83—154 (1940).
578. Fukushi T., Shikata E., Fine structure of rice dwarf virus, Virology, 21, 500-503-
(1963).
579. Fukushi T., Shikata E., Localisation of rice dwarf virus in its insect vector, Virology,
21, 503—505 (1963).
580. Fukushi T., Shikata E., Kimura I., Some morphological characters of rice dwarf virus,
Virology, 18, 192-205 (1962).
581. Fulton J. P., Transmission of tobacco ringspot virus by Xiphinema americanum,
Phytopathology, 52, 375 (1962).
582. Fulton J. P-, Dual transmission of tobacco ringspot virus and tomato ringspot virus,
by Xiphinema americanum, Phytopathology, 57, 535—537 (1967).
583. Fulton R. W., Superinfection by strains of tobacco mosaic virus, Phytopathology,
41, 579—592 (1951).
Литература
521
584. Fulton R. W., Mutation in a tobacco mosaic virus strain, Phytopathology, 42, 156—
158 (1952).
585. Fulton R. W., Mechanical transmission and properties of rose mosaic virus, Phyto-
pathology, 42, 413—416 (1952).
586. Fulton R. ИА, Resistance in tobacco to cucumber mosaic virus infection, Phytopatho-
logy, 43, 472 (1953).
587. Fulton R. PF., The effect of dilution on necrotic ringspot virus infectivity and tho
enhancement of infectivity by noninfective virus, Virology, 18, 477—485 (1962).
588. Fulton R. W., Transmission of plant viruses by grafting, dodder, seed and mechanical
inoculation. In «Plant Virology» (M. K. Corbett and H. D. Sisler, eds.), 527 pp., Univ,
of Florida Press, Gainsville, Florida, 1964.
589. Fulton R. W., Mechanical transmission of viruses of woody plants, Ann. Rev. Phyto-
pathol., 4, 79—102 (1966).
590. Fulton R. W., Purification and some properties of tobacco streak and Tulare apple
mosaic viruses, Virology, 32, 153—162 (1967).
591. Funatsu G., Fraenkel-Conrat H-, Location of amino acid exchanges in chemically
evoked mutants of tobacco mosaic virus, Biochemistry, 3, 1356—1362 (1964).
592. Furumoto W- A., Miskey R., A mathematical model for the infectivity dilution curve
of tobacco mosaic virus; theoretical considerations, Virology, 32, 216—223 (1967).
593. Furumoto W. A., Mickey R., A mathematical model for the infectivity dilution curve
of tobacco mosaic virus; experimental tests, Virology, 32, 224—233 (1967).
594. Furumoto W. A., Wildman R. G., Studios on the mode of attachment of tobacco mosaic
virus, Virology, 20, 45—52 (1963).
595. Furumoto W- 4., Wildman S. G-, The specific infectivity of tobacco mosaic virus,
Virology, 20, 53—61 (1963).
596. Gairdner A. E-, Tho inheritance of factors in Cheiranthus cheiri, J. Genet., 32, 479—
486 (1936).
597. Gall J. G-, Differential synthesis of the genes for ribosomal RNA during amphibian
oogenesis, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S., 60, 553—560 (1968). w-
598. Gdlvez G. E., Loss of virus by filtration through charcoal, Virology, 23, 307—312
(1964).
599. G&lvez G. E., Specific adsorption of plant viruses by antibodies coupled to a solid
matrix, Virology, 28, 171-187 (1966).
600. Galvez G. E., Purification of virus-like particles from rice tungo virus-infected plants,
Virology, 33, 357-359 (1967).
601. G&lvez G. E., Purification and characterisation of rice tungro virus by analytical
density-gradient centrifugation, Virology, 35, 418—426 (1968).
602. Gamez R., Black L. M., Application of particle-counting to a leafhopperborne virus,
Nature, 215, 173—174 (1967).
603. Gamez R., Black L. M., Particle counts of wound tumor virus during its peak concentra-
tion in leaf hoppers, Virology, 34, 444—451 (1968).
604. Gamez R., Chiu R., The minimum concentration of a plant virus needed for infection
of monolayers of vector cells, Virology, 34, 356—357 (1968).
605. Gamez R., Black L. M., MacLeod R., Reexamination of the serological relationship
between wound tumor virus and reovirus, Virology, 32, 163—165 (1967).
606. Gardner W- S-, Electron microscopy of barley stripe mosaic virus Comparative cyto-
logy of tissues infected during different stages of maturity, Phytopathology, 57,
1315-1326 (1967).
607. Garnsey S. M., Jones W. J-, Relationship of symptoms to the presence of tatter leaf
virus in several citrus hosts. In «Proc. 4th Conf. Intern. Organization Citrus Virol.»
(J.F.L. Childs, ed.), pp. 207—212, Univ. Florida Press, Gainesville, 1968.
608. Gay J. D., Kuhn C. W-, Effect of source host on tho specific infectivity of cowpea chlo-
rotic mottle virus, Phytopathology, 57, 459 (1967).
609. Geismann T. A., The flavonoid constituents of normal and virus-infected peach and
cherry leaves, Arch. Biochem. Biophys., 60, 21—26 (1956).
610. Gendron Y., Kassanis B., The importance of the host species in determining the action
of virus inhibitors, Ann. Appl. Biol., 41, 183—188 (1954).
611. Gerola F. M-, Bassi M., Giussani G-, Some observations on the shape and localisation
of different viruses in experimentally infected plants and on the fine structure of the
host cells, Ш. Turnip yellow mosaic virus in Brassica chinensis L, Caryologia, 19,
457-479 (1966).
612. Gerola F. M., Bassi M., Lovisolo O., Vidano C-, Virus like particles in both maize
plants infected with maize rough dwarf virus and the vector Laodephaz striatellus
Fallen, Phytopathol. Z., 56, 97—99 (1966).
613. Gerola F. M., Bassi M., Favali M. 4.., Betto E., An electron microscopy study of the
penetration of tobacco mosaic virus into leaves following experimental inoculation,
Virology, 38, 380-386 (1969).
614. Ghabrtal S. A., Pirone T. P., Physiology of tobacco etch virus-induced wilt of peppers,
Virology, 31, 154-162 (1967).
i22 Лите pamy pa
615. Gibbs A. J., Lucerne mosaic virus in British lucerne crops, Plant Pathol., 11, 167 —
171 (1962).
616. Gibbs A. J., In «Cryptograms in Plant Virus Names» (E. B. Martyn, ed.), pp. 135—149,
Commonwealth Mycol. Inst., Surrey, England, 1968.
617. Gibbs A. J., Harrison B. D., A form of pea early-browning virus found in Britain, Ann.
Appl. Biol., 54, 1-11 (1964).
618. Gibbs A. J., Harrison B. D., Realistic approach to virus classification and nomencla-
ture, Nature, 218, 927—929 (1968).
619. Gibbs A. G., Nixon H. L., Woods R. D-, Properties of purified preparations of lucerne
mosaic virus, Virology, 19, 441—449 (1963).
620. Gibbs A. J., Harrison B. D., Woods R. D., Purification of pea enation mosaic virus,
Virology, 29, 348—350 (1966).
621. Gibbs A. /., Harrison B. D., Watson D. H., Wildy P., What’s in a virus name? Nature,
209, 450-454 (1966).
622. Gibbs A. J., Hecht-Polriar E., Woods R. D., Some properties of three related viruses.
Andean potato latent, Dulcamara mottle and ononis yellow mosaic, J. Gen. Microbiol.,
44, 177-193 (1966).
623. Gibor A., Phenotypic variations among chloroplasts of a single cell, Science, 155,
327-328 (1967).
624. Gicherman G., Loebenstein G., Competitive inhibition by foreign nucleic acids and
induced interference by yeast-RNA with the infection of tobacco mosaic virus, Phy-
topathology, 58, 405—408 (1968).
625. Giddings N. J., Sugar beet varieties in relation to curly-top virus strains, Sugar, 42,
52 (1947).
626. Giddings N. J., Combination and separation of curly top virus strains, Proc. Am. Soc.
Sugar Beet Technologists, 6, 502—507 (1950).
627. Gierer A., Structure and biological function of ribonucleic acid from tobacco mosaic
virus, Nature, 179, 1297-1299 (1957).
628. Gierer A., Die Gross der biologisch aktiven Einheit der Ribosenucleinsaure des Tabak-
mosaikvirus, Z. Naturforsch., 13b, 485—488 (1958).
629. Gierer A., Mundry K. W., Production of mutants of tobacco mosaic virus by chemical
alteration of its ribonucleic acid in vitro, Nature, 182, 1457—1458 (1958).
630. Gierer A., Schramm G-, Infectivity of ribonucleic acid from tobacco mosaic virus,
Nature, 177, 702-703 (1956).
631. Gil-Fernandez C-, Black L. M., Some aspects of the internal anatomy of the leafhopper
Agallia constricta (Homoptera: Cicadellidae), Ann. Entomol. Soc. Am., 58, 275 —284
(1965).
632. Gill С. C., Increased multiplication of viruses in rusted bean and sunflower tissue,
Phytopathology, 55, 141—147 (1965).
633. Gill С. C., Suppression of virus lesions by rust infection, Virology, 26, 590—595
634. Gill С. C., Fluorescent metabolites in virus- or rust-infected bean leaves, Can. J. Bota-
ny, 43, 201-215 (1965).
635. Gill С. C., Transmission of barley yellow dwarf virus isolates from Manitoba by five
species of aphids, Phytopathology, 57, 713—718 (1967).
636. Gill С. C., Rate of movement of barley yellow dwarf virus out of inoculated cereal
leaves, Phytopathology, 58, 870—871 (1968).
637. Gillaspie A. G-, Bancroft J. B., Properties of ribonucleic acid from alfalfa mosaic
virus and related components, Virology, 27, 391—397 (1965).
638. Gillaspie A. G-, Bancroft J. B-, The rate of accumulation, specific infectivity and
electrophoretic characteristics of bean pod mottle virus in bean and soybean, Phyto-
pathology, 55, 906—908.
•639. Gilliland J. M., Symons R. H., Partial purification and properties of ribonucleotide
kinases in virus-infected and healthy plants, Virology, 33, 221—226 (1967).
•640. Gilliland J. M-, Symons R. H., Properties of a plant virus-induced RNA polymerase
in cucumbers infected with cucumber mosaic virus, Virology, 36, 232 —240 (1968).
641. Gilliland J. M., Langman R. E., Symons R. H., Properties of the ribonucleotide kina-
ses after infection of cucumber with tobacco ringspot viruses, Virology, 30, 716—723
(1966).
642. Gilmer R. M., Additional evidence of tree-to-tree transmission of sour cherry yellows
virus by pollen, Phytopathology, 55, 482—483 (1965).
643. Gilmer R. M-, Brass K. D-, Nonuniform distribution of prune dwarf virus in sweet
sour cherry trees, Phytopathology, 53, 819—821 (1963).
644. Gilmer R. M., Kelts L- J., Transmission of tobacco mosaic virus in grape seeds, Phyto-
pathology, 58, 277—278 (1968).
645. Gilmer R. M., Wilks J. M., Seed transmission of tobacco mosaic virus in apple and
pear, Phytopathology, 57, 214—217 (1967).
646. Ginoza W., Kinetics of heat inactivation of ribonucleic acid of tobacco mosaic virus,
Nature, 181, 958-961 (1958).
Литература
523
'647. Ginoza И7-, Radiosensitive molecular weight of single-stranded virus nucleic acids,
Nature, 199, 453-456 (1963).
<548. Ginoza W-, Atkinson D. E., Comparison of some physical and chemical properties
of eight strains of tobacco mosaic virus, Virology, 1, 253—260 (1955).
649. Ginoza W-, Norman Л., Radiosensitive molecular weight of tobacco mosaic virus
ribonucleic acid, Nature, 179, 520—521 (1957).
650. Gleindinning D. R., Legg J. T., Lavi N. K., Martinson V., A field experiment in
Ghana on the tolerance of cocoa seedlings to cocoa swollen-shoot and cocoa mottle-
leaf viruses, Ann. Appl. Biol., 57, 389-396 (1966).
651. Glitz D. G., Bradley Л., Fraenkel-Conrat II., Nucleotide sequences at the 5'-linked
ends of viral ribonucleic acids, Biochim. Biophys. Acta, 161, 1—12 (1968).
-652. Goffeau A., Bove J. M., Virus infection and photosynthesis. I. Increased photopho-
sphorylation by chloroplasts from Chinese cabbage infected with turnip yellow mosaic
virus, Virology, 27, 243—252 (1965).
653. Gold A. II., Duffus I. E., Infectivity neutralization — a serological method as applied
to persistent viruses of beets, Virology, 31, 308—313 (1967).
-654. Gold А. H., Suneson C. A., Houston В. 11., Oswald J. W., Electron microscopy and
seed and pollen transmission of rod-shaped particles associated with the falso-stripe
virus disease of barley, Phytopathology, 44, 115—117 (1954).
655. Goldin M. I., Fedotina F. L., Virus inclusions in the plant cells and the nature of
viruses, Plant Virol. Proc. 5th Conf. Czech. Plant Virologists, Prague, 1962, pp. 11 —
119, Czechoslovak Academy of Sciences, 1964.
656. Gomatos P. J., Tamm I., Animal and plant viruses with double-helical RNA, Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S., 50, 878—885 (1963).
657. Gondo M., Further studies on the transpiration of mosaic diseased tobacco plant,
Kagoshima Daigaku Nogakubu Gakujutsu Hokoku, 2, 71—74, 1953 (Abstr. in Rev.
Appl. Mycol., 35, 128 (1956)).
-658. Gonzalez L. C., Pound G. S-, The response to temperature of cabbage virus A infection
in Nicotiana glutinosa, Phytopathology, 53, 1041—1045 (1963).
659. Goodchild D. J., Cohen M., Wildman S- G., The specific activity of tobacco mosaic
virus as a function of age of infection, Virology, 5, 561—566 (1958).
660. Goodey T., Soil and Freshwater Nematodes (revised by J. B. Goodey), 2nd ed.,
544 pp., Methuen, London, 1963.
-661. Gooding G. V., Jr., Purification and serology of a virus associated with the grape
yellow vein disease, Phytopathology, 53, 475—480 (1963).
(662. Goodman P. J., Watson M. A., Hill A. R. C., Sugar and fructosan accumulation in
virus-infected plants rapid testing by circular-paper chromatography, Ann. Appl.
Biol., 56, 65-72 (1965).
i663. Gordon M. P., Huff J. W., Heat inactivation of tobacco mosaic virus ribonucleic
acid as studied by end group analysis, Biochemistry, 1, 481—484 (1962).
'664. Gordon M. P-, Smith C., The infection of Rhoeo discolor by tobacco mosaic virus ribo-
nucleic acid, J. Biol. Chem., 236, 2762—2763 (1961).
- 665. Gordon M. P., Staehelin M., Studies on the incorporation of 5-fluorouracil into a virus
nucleic acid, Biochim. Biophys. Acta, 36, 351—361 (1959).
666. Gordon M. P., Huff J. W., Holland J. J., Heat inactivation of the infectious ribo-
nucleic acids of polio and tobacco mosaic viruses, Virology, 19, 416—418 (1963).
- 667. Govier D. A., The reaction of the dische diphenylamine reagent with sap from potato
plants infected with potato leaf roll virus, Virology, 19, 561—564 (1963).
• 668. Gowen J. IV., Mutation in drosophila bacteria and viruses, Cold Spring Harbor Symp.
Quant. Biol., 9, 187-193 (1941).
' 669. Granados R. R., Ward L. S-, Maramorosch K., Insect viremia caused by a plant-
pathogenic virus, Electron microscopy of vector hemocytes, Virology, 34, 790—796
(1968).
' 670. Granados R. R., Maramorosch K., Shikata E., Mycoplasma. Suspected etiologic agent
of corn stunt, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S., 60, 841—844 (1968).
671. Gratia A., Pluralite antigenique et identification serologique des virus de plantes,
Compt. Rend. Soc. Biol., 114, 923 (1933).
• 672. Gratia A., Quality antigenique des virus plants et des bacteriophages, Compt. Rend.
Soc. Biol., 114, 1382 (1933).
< 673. Gray R. A., Inhibition of local lesion and systemic plant virus infection with a new
antiviral agent cytovirin, Phytopathology, 47, 522 (1957).
674. Green R. G., On the nature of filterable virus, Science, 82, 443—445 (1935).
• 675. Greenleaf W. H., Effects of tobacco etch virus on peppers (Capsicum sp.), Phytopathology,
43, 564-570 (1953).
< 676. Greenleaf W. H., Breeding tobacco-etch virus-resistant tabasco-type peppers, Phyto-
pathology, 49, 317 (Abstr.) (1959).
< 677. Greenleaf W. H-, Cook A. A., Heyn A. N. J., Resistance to tobacco mosaic virus in
Capsicum with reference to the Samsun latent strain, Phytopathology, 54, 1367—1371
<(1964).
524
Литература
678. Gregory J., Holmes К. C., Methods of preparing oriented tobacco mosaic virus sols
for X-ray diffraction, J. Mol. Biol., 13, 796—801 (1965).
679. Grieve B. J., Studies in the physiology of host parasite relations. 4. Some effects of
tomato spotted wilt virus on growth, Australian J. Exptl. Biol. Med. Sci., 21, 89—
101 (1943).
680. Grogan R. G., Bardin. R., Some aspects concerning tho seed transmission of lettuce
mosaic virus, Phytopathology, 40, 965 (1950).
681. Grogan R. G-, Uyemoto J. K.\ A D serotype of satellite virus specifically associated'
with a D serotype of tobacco necrosis virus, Nature, 213, 705—707 (1967).
682. Grogan R. G., Welch J E., Bardin R., Common lettuce mosaic and its control by the
use of disease free seed, Phytopathology, 42, 573—578 (1952).
683. Grogan R. G., Zink F. W., Hewitt W. B-, Kimble K. A., The association of Olpidium.
with the big-vein disease of lettuce, Phytopathology, 48, 292—297 (1958).
684. Griinberger D., O'Neal C., Nirenberg M., Stimulation of amino acid incorporation
into protein by polyuridylic-8-azaguanylic acid, Biochim. Biophys. Acta, 119, 581 —
585 (1966).
685. Griinberger D.; Holy A., Borm F., Synthesis and coding properties of 8-azaguanosine-
containing triribonuclooside diphosphates, Biochim. Biophys. Acta, 161, 147—155
(1968).
686. Gampf D. J., Hamilton R. I., Isolation and characterization of barley stripe mosaic
virus protein, Virology, 35, 87—93 (1968).
687. Gupta В- M-, Price W. C., Production of plant virus inhibitors by fungi, Phytopatho-
logy, 40, 642-652 (1950).
688. Gupta В. M., Price W- C., Mechanism of inhibition of plant virus infection by fungal
growth products, Phytopathology, 42, 45—51 (1952).
(589 . Gussin G. N., Three complementation groups in bacteriophage R17, J. Mol. Biol.,
21, 435-453 (1966).
690. Haggis G. H-, Rearrangement of tobacco mosaic virus subunits during drying, Viro-
logy, 25, 154—156 (1965).
691. Hair J. B-, Biosysteinatics of the New Zealand flora 1945—1964, New Zealand J.
Botany, 4, 559-595 (1966).
692. Hakkaart F- A., Effect of aluminium strips on the spread of two aphid-borne chry-
santhemum viruses, Noth. J. Plant. Pathol., 73, 181—185 (1967).
693. Hall С. E., Lengths of tobacco mosaic virus from electron microscopy, J. Am. Chem.
Soc., 80, 2556-2557 (1958).
694. Hall D. M., Wax microchannels in the epidermis of white clover, Science, 158, 505—
506 (1967).
695. Halliwell R. S-, Langston R., Effects of gamma irradiation on symptom expression
of barley stripe mosaic virus disease and on two viruses in vivo, Phytopathology, 55,
1039—1040 (1965).
696. Halperin J., Kaper J. M., In situ alkaline degradation of turnip yellow mosaic virus
RNA; A comparative analysis, Virology, 33, 760—763 (1967).
697. Hamilton R. I., Ball E- M., Antigenic analysis of extracts from barley infected with,
barley stripe mosaic virus, Virology, 30, 661—672 (1966).
698. Hampton R. E., Fulton. R. W-, The relation of polyphenoloxidase to instability in
vitro of prune dwarf and sour cherry necrotic ringspot viruses, Virology, 13, 44—52
(1961).
699. Hampton R. E-, Suseno R., Brumagen D. M., Accumulation of fluorescent compounds
in tobacco associated with tobacco mosaic virus hypersensitivity, Phytopathology,
54, 1062—1064 (1964).
700. Hampton R. O., Probabilities of failing to detect prune dwarf virus in cherry trees
by bud indexing, Phytopathology, 56, 650—652 (1966).
701. Hampton R. O., Natural spread of viruses infectious to beans, Phytopathology, 57,
476-481 (1967).
702. Hanna L., Merigan T. C., Jawety E., Inhibition of TRIG agents by virus induced1
interferon, Proc. Soc. Exptl. Biol. Med., 122, 417—421 (1966).
703. Hansen A. J., Hildebrandt A. C., The distribution of tobacco mosaic virus in plant
callus cultures, Virology, 28, 15—21 (1966).
704. Hansen. H- P-, Correlations and interrelationships in viruses and in organisms. I.
Classification and nomenclature of plant viruses, Kgl. Vet. Land-Bohoejskole, Arsskr.,
pp. 108—137, 1956.
705. Hansen H. P., On the general nomenclature of viruses, Kgl. Vet. Land-Bohoejskole,
Arsskr., pp. 191—206, 1966.
706. Hariharasubramanian 7., The effect of 8-azaguanine, 2-thiouracil, and 2,4-dichlo-
rophenoxyacetic acid on the multiplication and infectivity of Dolichos enation mosaic-
virus, Phytopathol. Z-, 62, 92—99 (1968).
707. Hariharasubramanian 7., Siegel A., Characterisation of a new defective strain of TMV,.
Virology, 37. 203-208 (1969).
Литература
525
'708 . Harrington W. F-, Schachman II. К., Studies on the alkaline degradation of tobacco
mosaic virus. I. Ultracentrifugal analysis, Arch. Biochom. Biophys., 65, 278—295
(1956).
709. Harris J. I., Hindley J., The protein subunit of turnip yellow mosaic virus, J. Mol.
Biol., 3, 117-120 (1961).
710. Harris J. I., Hindley J., The protein subunit of turnip yellow mosaic virus, J. Mol.
Biol., 13, 894—913 (1965).
711. Harris J- I., Knight С. A., Action of carboxypeptidaso on tobacco mosaic virus,
Nature, 170, 613-614 (1952).
712. Harris J. I., Knight C. A., Studies on the action of carboxy peptidase on tobacco
mosaic virus, J. Biol. Ghem., 214, 215—230 (1955).
713. Harrison A. L., Physiology of bean mosaic, N.Y. State Agr. Expt. Sta. (Geneva, N.Y.)
Bull., 235, 48 pp. (1935).
714. Harrison B. D., The infectivity of extracts made from leaves at intervals after inocu-
lation with viruses, J. Gen. Microbiol., 15, 210—220 (1956).
715. Harrison B. D., Studies on the effect of temperature on virus multiplication in inocu-
lated loaves. Ann. Appl. Biol., 44, 215—226 (1956).
716. Harrison В. I)., Ability of single aphids to transmit both avirulent and virulent
strains of potato leaf roll virus, Virology, 6, 278—286 (1958).
717. Harrison B. D-, Plant Pathol. Dep. Rept. Rothamsted Expt. Sta., 1960, p. 118 (1961).
718. Harrison В D., Plant Pathol. Dep. Rept. Rothamsted Expt. Sta., 1961, p. 105 (1962).
719. Harrison B. D-, Specific nematode vectors for serologically distinctive forms of rasp-
berry ringspot and tobacco black ring viruses, Virology, 22, 544—550 (1964).
720. Harrison B. D., Infection of gymnosperms with nematode-transmitted viruses of flo-
wering plants, Virology, 24,' 228—229 (1964).
721. Harrison B. D., Cadman С. H., Role of a dagger nematode (Xiphinema sp.) in outbreaks
of plant diseases caused by arabis mosaic virus, Nature, 184, 1624—1626 (1959).
722. Harrison B. I)., Crowley N. C., Properties and structure of lettuce necrotic yellows
virus, Virology, 26, 297-310 (1965).
723. Harrison B. D., Hooper D. J., Longevity of Longidorus elongatus (de Man) and other
nematodes in soil kept in polythene bags, Nematologica, 9, 158—160 (1963).
724. Harrison B. D., Klug A., Relation between length and sedimentation coefficient for
particles of tobacco rattle viruses, Virology, 30, 738—740 (1966).
725. Harrison B. D., Nixon H. L., Separation and properties of particles of tobacco rattle
virus with different lengths, J. Gen. Microbiol., 21, 569—581 (1959).
726. Harrison B. D., Nixon H. L., Some properties of infective preparations made by dis-
rupting tobacco rattle virus with, phenol, J. Gon. Microbiol., 21, 591—599 (1959).
727. Harrison B. D., Nixon II L-, Purification and electron microscopy of three soil borne
plant viruses, Virology, 12, 104—117 (1960).
728. Harrison B. D., Pierpont W. S., The relation of polyphenoloxidase in leaf extracts
to the instability of cucumber mosaic and other viruses, J. Gen. Microbiol., 32, 417—
427 (1963).
729. Harrison B. D., Roberts I. M., Association of tobacco rattle virus with mitochondria,
J. Gen. Virol., 3, 121-124 (1968).
730. Harrison B. D., Winslow R. D., Laboratory and field studios on the relation of arabis
mosaic virus to its nematode vector Xiphinema diversicaudatum Micolotzky, Ann. Appl.
Biol., 49, 621—633 (1961).
731. Harrison B. D., Woods R. D., Serotypes and particle dimensions of tobacco rattle
viruses from Europe and America, Virology, 28, 610—620 (1966).
732. Harrison B. D., Mouiat W- P-, Taylor С- E., Transmission of a strain of tomato black
ring virus by Longidorus elongatus (Nematoda), Virology, 14, 480—485 (1961).
733. Harrison B. D., Peachey J. E-, Winslow R. D., The use of nematicides, to control the
spread of arabis mosaic virus by Xiphinema diversicaudatum (Micol.), Ann. Appl.
Biol., 52, 243—255 (1963).
734. Harrison B. D., Nixon II. L-, Woods R. D., Lengths and structure of particles of bar-
ley stripe mosaic virus, Virology, 26, 284—289 (1965).
'735. Hart R. G., Electron-microscopic evidence for the location of ribonucleic acid in
particles of tobacco mosaic virus, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S., 41, 261—264 (1955).
'736. Hart R. G., Morphological changes accompanying thermal denaturation of tobacco
mosaic virus, Biochim. Biophys. Acta, 20, 388—389 (1956).
737. Haruna I., Spiegelman S-, Specific template requirements of RNA replicases, Proc.
Natl. Acad. Sci. U. S., 54, 579-587 (1965).
'738. Haselkorn R., Studies on infectious RNA from turnip yellow mosaic virus, J. Mol.
Biol., 4, 357—367 (1962).
739. Haselkorn R., Discussion comment. In «Acids Ribonuclek(ues et Polyphosphates.
Structure, Synthese et Fonctions», Colloq. Intern. Centre Nat. Rech. Sci. (Paris),
106, 489 (1962).
"740. Haselkorn R., Fried F. A., Cell-free protein synthesis: The nature of the active complex,
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S., 51, 308—315 (1964).
526
Литература
741. Haselkorn R., Fried V- 4., Dahlberg J. E., Cell-free protein synthesis; the association
of viral RNA and E. coli ribosomes, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S., 49, 511—517 (1963).
742. Ilavranek P., Zavada J., An apparently two-factor dose-response dependence in lucerne
mosaic virus assay, Acta Virol. (Prague), 11, 544—550 (1967).
743. Hay J., Subak-Sharpe H., Analysis of nearest neighbour base frequencies in the RNA
of a mammalian viruv: Encephalomyocarditis virus, J. Gen. Virol., 2, 469—472
(1968).
744. Hayashi T-, Matsui C-, Fine structure in the lesion periphery produced by tobacco'
mosaic virus, Phytopathology, 55, 387—392 (1965).
745. Hayashi T., Matsui €, Electron microscopy of dark green spots on leaves of Nicotiana
glutinosa induced by tobacco mosaic virus, Phytopathology, 56, 192—196
(1966).
746. Hayashi T-, Matsui C-, Electron microscopy of host cells infected with tobacco etch
virus. IV. Tritiated uridine and leucine uptake of intracellular virus and intranuclear
crystalline inclusions, Virology, 33, 47—54 (1967).
747. Hayshi Y., Amino acid activation in tobacco leaves infected with tobacco mosaic
virus, Virology, 18, 140—141 (1962).
748. Hayashi Y., Incorporation of C14 amino acids in various cell fractions of tobacco leaves-
infected with tobacco mosaic virus, Virology, 21, 226—231 (1963).
749. Heagy J., Rochow W. F., Thermal inactivation of barley yellow dwarf virus, Phyto-
pathology, 55, 809—810 (1965).
750. Heathcote G- D-, Broadbent L-, Local spread of potato leaf roll and Y viruses, European
Potato J., 4, 138-143 (1961).
751. Heathcote G. D-, Cockbain A- J., Aphids from mangold clamps and their importance-
as vectors of beet viruses, Ann. Appl. Biol., 57, 321—336 (1966).
752. Hebert T. T., Precipitation of plant viruses by polyethylene glycol, Phytopathology,
53, 362 (1963).
753. Hecht E. I., Bateman D. F-, Non-specific acquired resistance to pathogens resulting
from localised infections by Thielaviopsis basicola or viruses in tobacco leaves, Phyto-
pathology, 54, 523—530 (1964).
754. Hecht-Poinar E. I., Yarwood С- E-, Magnesium trisilicate increases virus transmission,
Virology, 29, 351-352 (1966).
755. Heimbeclc L. S-, On the Etiology of Brown Roots Yellowing and Wilt due to «В» Type
(Dienes) L. (Klieneberger) Forms of Bacteria with Special Reference to Pea Wilt,
39 pp., Dreyers Forlag, Oslo, 1954.
756. Heinze K., Uber das Verhalten uhbestandiger phytopathogener Viren bei der Ubert-
ragung durch Blattlause, Phytopathol. Z., 36, 131—145 (1959).
757. Heinze K., Uber Virusubertragungen mit Blattlausen auf landwirtschaftliche Kul-
turpflanzen unter Beriicksichtigung verschiedener Stadie des Entwicklungszyklus,
Nachrbl. Deut. Pflanzenschutzdienstes (Brunswick), 15, 5—9 (1963).
758. Helms K., Role of temperature and light in lesion development of tobacco mosaic
virus, Nature, 205, 421-422 (1965).
759. Helms K., Interference between two strains of tobacco mosaic virus in leaves of Pinto
bean, Virology, 27, 346-350 (1965).
760. Helms K-, McIntyre G. A., Heat-induced variations in number and size of lesions of'
tobacco mosaic virus on Pinto bean, Virology, 23, 565—572 (1964).
761. Helms K., McIntyre G- A-, Light-induced susceptibility of Phaseolus vulgaris L. to-
tobacco mosaic virus infection. I. Effects of light intensity, temperature and length,
of the preinoculation dark period, Virology, 31, 191—196 (1967).
762. Helms K., McIntyre G- A., Light-induced susceptibility of Phaseolus vulgaris L. to-
tobacco mosaic virus infection. II. Daily variation in susceptibility, Virology, 32,
482-488 (1967).
763. Helms K., Pound G. S-, Zinc nutrition of Nicotiana tabacum L- in relation to multipli-
cation of tobacco mosaic virus, Virology, 1, 408—423 (1955).
764. Hendrix J. W-, Sterol induction of reproduction and stimulation of growth of Pythium
and Phytophthora, Science, 144, 1028—1029 (1964).
765. Henke O., Untersuchungen des Stoffwechsels vergilbungskranker Zuckerriiben, Zentr.
Bakteriol. Parasitenk., Abt. II, 108, 134—147 (1954).
766. Henke O-, Untersuchungen iiber den stoffwechsel blattrollkranker Kartoffelpflanzen,.
Zentr. Bakteriol. Parasitenk., Abt. II, 110, 361—377 (1957).
767. Herold F-, Munz K-, Electron microscopic demonstration of virus-like particles in
Peregrinus maidis following asquisition of maize mosaic virus, Virology, 25, 412—417
(1965).
768. Herold F., Munz K-, An unusual kind of crystalline inclusion of tobacco mosaic virus,
J. Gen. Virol., 1, 375—378 (1967).
769. Herold F-, Munz K., Virus particles in apparently healthy Peregrinus maidis, J. Virol.,.
1, 1028-1036 (1967).
770. Herold F., Munz K., Morphological studies of maize mosaic virus I, J. Gen. Virol.,.
1, 227-234 (1967).
Литература
527
771. Herold F., Bergold G. H., Weibel J., Isolation and electron microscopic demonstration
of a virus infecting corn. (Zea mas L.), Virology, 12, 335—347 (1960).
772. Herridge E. A., Schlegel D. E., Autoradiographic studies of tobacco mosaic virus
inoculations on host and non-host species, Virology, 18, 517—523 (1962).
773. Hershey A. D-, Chase M., Independent functions of viral protein and nucleic acid in
growth of bacteriophage, J. Gen. Physiol., 36, 39—56 (1952).
774. Hewitt W. B., Raski D. J., Goheen A. C-, Nematode vector of soil borne fan-leaf virus
of grapevines, Phytopathology, 48, 586—595 (1958).
775. Hiebert E-, Bancroft J. B., Bracker С. E-, The assembly in vitro of some small spheri-
cal viruses, hybrid viruses and other nucleoproteins, Virology, 34, 492—508 (1968).
776. Highton P. J., Beer M-, An electron microscopic study of extended single polynucleo-
tide chains, J. Mol. Biol., 7, 70-77 (1963).
777. Hilborn M. T., Hyland F., McCrum R. C., Pathological anatomy of apple trees affected
by the stem-pitting virus, Phytopathology, 55, 34—39 (1965).
778. Hill R. L-, Hydrolysis of proteins, Advan. Protein Chem., 20, 37—107 (1965).
779. Hillman W. S-, The Lemnaceae or duckweeds, Botan. Rev., 27, 221—287 (1961).
780. Hills G. J., Plaskitt A., A protein stain for the electron microscopy of small isometric
plant virus particles, J. Ultrastructure Res., 25 , 323 —329 (1968).
781. Hirai A., Wildman S- G., Similarity in symptoms produced in tobacco plants by
actinomysin D and TMV, Virology, 31, 721—722 (1967).
782. Hirai A., Wildman S- G., Effect of TMV multiplication on RNA and protein synthesis
in tobacco chloroplasts, Virology, 38, 73—82 (1969).
783. Hirai A., Wildman S- G., Hirai T-, Specific inhibition of TMV-RNA synthesis by
Blasticidin S, Virology, 36, 646—651 (1968).
784. Hirai T-, Hirai A., Tobacco mosaic virus: Cytological evidence of the synthesis in the
nucleus, Science, 145, 589—591 (1964).
785. Hirai T., Hakagaki Y., Microspectrophotometric studies on leaf epidermis of TMV
infected tobacco plants. In «Viruses of Plants» (A. B. R. Beemster and J. Dijkstra,
eds.), pp. 90—93, North-Holland Publ., Amsterdam, 1966.
786. Hirai T., Shimomura T., Blasticidin S, an effective antibiotic against plant virus
multiplication, Phytopathology, 55, 291—295 (1965).
787. Hirai T., Wildman S- G., Cytological and cytochemical observations on the early
stage of infection of tomato hair cells by tobacco mosaic virus, Plant Cell Physiol.
(Tokyo), 4, 265-275 (1963).
788. Hirai T., Suzuki N., Kimura I., Nakazawa M., Kashiwagi Y., Large inclusion bodies
associated with virus diseases of rice, Phytopathology, 54, 367—368 (1964).
789. Hirai T., Hiroshima A., Itoh T-, Takahashi T-, Shimomura T., Hayashi Y., Inhibitory
effect of blasticidin S on tobacco mosaic virus multiplication, Phytopathology, 56,
1236-1240 (1966).
790. Hirai T., Saiio T-, Onda H-, Kitani K., Kiso A., Inhibition by blasticidin S of the
ability of leaf hoppers to transmit rice stripe virus, Phytopathology, 58, 602—604
(1968).
791. Hiruki C., Transmission of tobacco stunt virus by Olpidium brassicae, Virology, 25,
541-549 (1965).
792. Hiruki C-, Host specificity in transmission of tobacco stunt virus by Olpidium bras-
sicae, Virology, 33, 131—136 (1967).
793. Hiruki C-, Kaesberg P., Double-stranded replicative form of viral RNA from barley
plants infected with brome grass mosaic virus, Phytopathology, 55, 1061 (1965).
794. Hirumi H., Granados R- R., Maramorosch K., Electron microscopy of a plant pathogenic
virus in the nervous system of its insect vector, J. Virol., 1, 430—444 (1967).
795. Hitchborn J- II., Ph. D. Thesis, Cambridge Univ., 1955.
796. Hitchborn J. H., The effect of high temperature on the multiplication of two strains
of tobacco ringspot virus, Virology, 3, 243—244 (1957).
797. Hitchborn J. H., The distribution of viruses in leaves and their inactivation by ultra-
violet irradiation, Ann. Appl. Biol., 46, 563—570 (1958).
798. Hitchborn J- II., Evidence for the release of 28 S RNA from turnip yellow mosaic virus
heated in vitro, J. Gen. Virol., 3, 137—140 (1968).
799. Hitchborn J. II., Dunn D. B., Differential adsorption of the two components of wild
cucumber mosaic virus by bentonite, Virology, 26, 441—449 (1965).
800. Hiichborn J- II., Hills G- J., Electron microscopic examination of wild cucumber mosaic
virus in negatively stained crude preparations, Virology, 26, 756—758 (1965).
801. Hitchborn J. II., Hills G. J., The use of negative staining in the electron microscopic
examination of plant viruses in crude extracts, Virology, 27, 528—540 (1965).
802. Hitchborn J. H-, Hills G. J-, Tubular structures associated with turnip yellow mosaic
virus in vivo, Science, 157, 705—706 (1967).
803. Hitchborn J. II., Hills G. J., A. study of tubes produced in plants infected with a strain
of turnip yellow mosaic virus, Virology, 35, 50—70 (1968).
804. Hitchborn J. II., Hills G. J., Hull R., Electron microscopy of virus-like particles found
in diseased Plantago lanceolata in Britain, Virology, 28, 786—772 (1966).
28 Литература
805. Hodgson И7. Л., Munro J-, An inhibitor of potato virus X in potato plants infected
with Phytophthora infestans, Phytopathology, 56, 560—561 (I960).
806. Haglund S', Electron microscopic studies on some virus and immunoglobulin com-
ponents, Arkiv Kerni, 28, 505—538 (1968).
807. Hdglund S-, Some electron microscopic studies on the sattelite tobacco necrosis virus
ami its IgG-antibody, .1. Gen. Virol., 2, 427—436 (1968).
808. Holden M-, Tracey M- I’., The effect of infection with tobacco mosaic virus on the
levels of nitrogen, phosphorus protease and poctase in tobacco leaves and on their
response to fertilizers, Biochim. J., 43, 151—156 (1948).
809. Hollings M., Physiological ring pattern in some Gesneraceae, Plant Pathol., 4, 123—
128 (1955).
810. Pollings M., Viruses associated with a dieback disease of cultivated mushroom, Nature,
196, 962—965 (1962).
811. Hollings M., Disease control through virus-free stock, Ann. Rev. Phytopathol., 3,
367—396 (1965).
812. Hollings M., Lellioi R. A., Preservation of some plant viruses by freezedrying, Plant
Pathol., 9, 63- 66 (1960).
813. Pollings M., Stone О. M., Last F. T., Detection and identification of viruses in mush-
room sporophores and mycelium discrupted with ultrasound. Ropt. Glasshouse Crops
Res Inst., 1964, pp. 151—154, 1965.
814. Holmes F- ()., Local lesions in tobacco mosaic, Botan. Gaz., 87, 39—55 (1929).
815. Holmes F. O-, Local lesions of mosaic in Nlcotiana tabacum L-, Contrib. Boyce Thomp-
son Inst., 2, 163 — 172 (1931).
816. Holmes F. О., A masked strain of tobacco mosaic virus, Phytopathology, 24, 845—
873 (1934).
817. Holmes F- O-, Inheritance of resistance to tobacco mosaic disease in tobacco, Phyto-
pathology, 28, 553—561 (1938).
818. Holmes E. O-, Handbook of Phytopathogonic Viruses, 221 pp., Burgess, Minneapolis,
Minnesota, 1939.
819. Holmes F- O-, A comparison of the experimental host ranges of tobacco-etch and tobacco
mosaic viruses, Phytopathology, 36, 643—659 (1946).
820. Holmes F- (J-, Preventative and curative effects of thio uracil treatments in mosaic-
hypersenstitive tobacco, Virology, 1, 1—9 (1955).
821. Holmes F- O-, Elimination of spotted wilt virus from dahlias by propagation of tip
cuttings, Phytopathology, 45, 224—226 (1955).
822. Holmes F. O., Inheritance in tobacco of an improved resistance to infection by tobacco
mosaic virus, Virology, 12, 59—67 (1960).
823. Holmes F- O., Concomitan t inheritance of resistance to several viral diseases in tobacco,
Virology, 13, 409-413 (1961).
824. Holmes F. O-, Symptomology of viral diseases in plants. In «Plant Virology»
(M. K. Corbett and H. D. Sislor, eds.), pp. 17—38, Univ, of Florida Press, Gainsville,
Florida, 1964.
825. Holmes F- O-, Elimination of turnip-mosaic virus from a stock of horseradish, Phyto-
pathology, 55, 530—532 (1965).
826. Holoubek p., Mixed reconstitution between protein from common tobacco mosaic
virus and ribonucleic acid from other strains, Virology, 18, 401—404 (1962).
827. Holoubek V., The composition of tobacco mosaic virus protein after the incorporation
of 5-fluorouracil into the virus, J. Mol. Biol., 6, 164—166 (1963).
828. Holoubek V., Effect of tobacco mosaic virus protein on tobacco mosaic virus infecti-
vity, Nature, 203, 499-501 (1964).
829. Honeycutt R. P., Millikan D. F-, Changes in nucleic acid content of Primus mahaleb
leaves as a result of virus infection, Phytopathology, 54, 1109—1111 (1964).
830. Hoogendam В. И7., van Ravenswaay-Claasen J. C-, Bosselaar A., Voorma FI. O-,
Bosch L-, Chain initiation during polypeptide synthesis in cell-free bacterial systems
programmed with plant viral messengers. II. The role of N-formylmethionine, Biochim.
Biophys. Acta, 157, 579—588 (1968).
831. Hooker W. J., Kim W. S-, Inhibitors of potato virus X in potato leaves with diffe-
rent types of virus resistance, Phytopathology, 52, 688—693 (1962).
832. Horne R. W-, Russell G- E., Trim A- R-, Fligh resolution electron microscopy of beet
yellows virus filments, J. Mol. Biol., 1, 234—236 (1959).
833. Howatson A- F-, Whitmore G- F-, The development and structure of vescicular stoma-
titis virus, Virology, 16, 466—478 (1962).
834. Hrsel I., Break J., Ultrastructural changes in chloroplasts and cytoplasm caused by
local infection of tobacco with tobacco mosaic virus and cucumber virus 4, Virology,
23, 252-258 (1964).
835. Huff J. ИЛ, Sastry K. S., Gordon M. P., Wacker W. E. C., The action of metal
ions on tobacco mosaic virus ribonucleic acid, Biochemistry, 3, 501—506 (1964).
• 836. Huguelet J. E-, Hooker W. J-, Latent infection of Gomphrena globosa by potato virus X,
Phytopathology, 56, 431—437 (1966).
Литература
529
• 837. Hulett II. R., Loring H. S-, Effect of particle length distribution on infectivity of
tobacco mosaic virus, Virology, 25, 418—430 (1965).
. 838. Hull R., The influence of disease on yield of sugar beet, Ann. Appl. Biol., 51, 516—
518 (1964).
• 839. Hull R., Spread of Groundnut rosette virus by Aphis cracclvora (Koch.), Nature,
202, 213-214 (1964).
840. Hull R., Control of sugar beet yellows, Ann. Appl. Biol., 56, 345—347 (1965).
• 841. Hull R., Gates L. F-, Experiments on the control of beet yellows virus in sugar beet
seed-crops by insecticidad sprays, Ann. Appl. Biol., 40, 69—78 (1953).
842. Hull R., Heathcote G- D-, Experiments on the time of application of insecticide to
decrease the spread of yellowing viruses of sugar beet 1954—1966, Ann. Appl. Biol.,
60, 469-478 (1967).
843. Hull R., Selman I. W-, The incidence and spread of viruses in sweet peas (^Lathyrus
odoratus L-) in relation to variety and the use of systemic insecticides, Ann. Appl.
Biol., 55, 39-50 (1965).
844. Hull R. E-, A virus disease of Hart’s-Tongue fern, Virology, 35, 333—335 (1968).
845. Hull R. E., Johnson M. W-, The precipitation of alfalfa mosaic virus by magnesium,
Virology, 34, 388—390 (1968).
846. Hull R. E-, Rees M., Short M. N., Studies on alfalfa mosaic virus. I. The protein and
nucleic acid, Virology, 37, 404—415 (1969).
847. Hull R. E., Hills G. J., Markham R., Studies on alfalfa mosaic virus. II. The structure
of the virus components, Virology, 37, 416—428 (1969).
848. Hutchinson P- B-, The precipitation of plant viruses by extracts of insects, Virology,
20, 583-595 (1963).
849. Hutchinson P. B-, Matthews R. E. F., The fate of turnip yellow mosaic virus in the
nonvector aphid Hydaphis brassicae (L.), Virology, 20, 169—175 (1963).
850. Hutton E. M-, Some factors affecting localised and systemic necrotic reactions to virus Y
in the potato, Australian J. Sci. Res., Bl, 416—438 (1948).
851. Huxley H. E., Some observations on the structure of tobacco mosaic virus. Stockholm
Conf. Electron Microscopy Sept. 1956, Proc., pp. 260—261, Academic Press, New
York, 1957.
852. Huxley H. E-, Zubay G-, The structure of the protein shell of turnip yellow mosaic
virus, J. Mol. Biol., 2, 189—196 (I960).
853. le T. S., An electron microscope study of tomato spotted wilt virus in the plant cell,
Nath. J. Plant Pathol., 70, 114—115 (1964).
854. Ishiie T-, Doi У., Yora K-, Asuyama H-, Suppressive effects of antibiotics of Tetra-
cycline group on symptom development of mulberry dwarf disease, Nippon Shoku-
butsu Byori Gakkaiho, 33, 267—275 (1967).
855. Israel II. W., Ross A. F-, The fine structure of local lesions induced by tobacco mosaic
virus in tobacco, Virology, 33, 272—286 (1967).
856. Ito T-, Shiroya T., Kubo S-, Tomaru K-, Amagasa J., Photoinactivation of acridine-
sensitised tobacco mosaic virus ribonucleic acid with monochromatic light, Currents
Mod. Biol., 1, 192-195 (1967).
857. Ивановский Д., Uber die Mosaikkrankheit der Tabakspflanze, Bull. Acad. Imp. Sci.
St. Petersburg, N.S. Ill 35, 65 (1892).
858. Izadpanah K., Shepherd R. J., Purification and properties of the pea anation mosaic
virus, Virology, 28, 463—476 (1966).
859. Jaros H., The growth rhythms in healthy and virus X, Y and X + Y infected pota-
toes of the var. Epoka and Dar. Plant Virol. Proc. 5th Conf. Czech. Plant Virologists,
Prague, 1962, Czech. Acad. Sci., Prague, 1964.
860. Jaspars E- M. J-, Moed J. R., The complexity of alfalfa mosaic virus. In «Viruses
of Plants» (A. B. R. Beemster and J. Dijkstra, eds.), pp. 188—195, North—Holland
Publ., Amsterdam, 1966.
861. Jedlinski H., Plant virus infection in relation to the interval between wounding and
inoculation, Phytopathology, 46, 673—676 (1956).
862. Jedlinski H., Initial infection processes by certain mechanically transmitted plant
viruses, Virology, 22, 331—341 (1964).
863. Jedlinski H., Brown С. H., Cross protection and mutual exclusion by three strains
of barley yellow dwarf virus in Avena sativa L., Virology, 26, 613—621 (1965).
864. Jeener R., A preliminary study of the incorporation in growing turnip yellow mosaic
virus and its related noninfective antigen, of labelled amino acids, Biochim. Biophys.
Acta, 13, 307-308 (1954).
865. Jeener R., Effects on the antigenic determinants of tobacco mosaic virus of a small
number of base replacements in the ribonucleic acid, Virology, 26, 10—15
(1965).
866. Jeener R., Lemoine P., Occurrence in plants infected with tobacco mosaic virus of
a crystallisable antigen devoid of ribonucleic acid, Nature, 171, 935—936 (1953).
867. Jeener R., Rosseels J-, Incorporation of 2-thiouracil 36S in the ribosenucleic acid of
tomato mosaic virus, Biochim. Biophys. Acta, 11, 438 (1953).
3 4—0893
530
Литература
868. Jenkins G., Comparison of tolerance to barley yellow dwarf virus in barley and oats,.
Ann. Appl. Biol., 57, 163—168 (1966).
869. Jensen D- D., Griggs W- TI., Gonzales C- Q-, Schneider H., Pear decline virus transmis-
sion by pear psylla, Phytopathology, 54, 1346—1351 (1964).
870. Jensen II. J., Allen Г. C., Jr., Transmission of tobacco rattle virus by tho stubby-
root nematode, Trichodorus alllus, Plant Disease Reptr., 48, 333 (1964).
871. Jensen S. G., Photosynthesis respiration and other physiological relationships in
barley infected with barley yellow dwarf virus, Phytopathology, 58, 204—208 (1968).
872. Jensen S. G-, Factors affecting respiration in barley yellow dwarf virus-infected barley,
Phytopathology, 58, 438—443 (1968).
873. Jha A., Posnette A. F-, Transmission of a virus to strawberry plants by a nematode
(Xiphinema sp.), Nature, 184, 962—963 (1959).
874. Jha A., Posnette A. F-, Transmission of Arabis mosaic virus by the nematode Xiphi-
nema diversicaudatum (Micol), Virology, 13, 119—123 (1961).
875. Jinks J. L-, Lethal suppressive cytoplasms in aged clones of Aspergillus glaucus,
J. Gem. Microbiol., 21, 397-409 (1959).
876. Jinks J. L., Extrachromosomal Inheritance, 177 pp., Prentice-Hall, Englewood Cliffs,
New Jersey, 1964.
877. Jockusch IT., In vivo- und in vitro-Verhalten temperature/sensitivcr Mutanton dos
Tabakmosaikvirus, Z. Vererbungslehre, 95, 379—382 (1964).
878. Jockusch H-, Two mutants of tobacco mosaic virus temperature sensitive in two diffe-
rent functions, Virology, 35, 94—101 (1968).
879. John V. T-, A micro-immuno-osmophoretic technique for assay of tobacco mosaic
virus, Virology, 27, 121—123 (1965).
880. John V- T-, Weintraub M., Symptoms resembling virus infection induced by high
temperature in Nicotiana glutinosa, Phytopathology, 56, 502—506 (1966).
881. John V. T-, Weintraub M., Phenolase activity in Nicotiana glutinosa infected with,
tobacco mosaic virus, Phytopathology, 57, 154—158 (1967).
882. Johnson C- G-, International dispersal of insects and insectborno viruses, Noth.
J. Plant Pathol., 73, Suppl. 1, 21—43 (1967).
883. Johnson E. M-, Valleau W. D., Field strains of tobacco mosaic virus, Phytopathology,
36, 112—116 (1946).
884. Johnson F. H., Baylor M. B-, Fraser D., The thermal denaturation of tobacco mosaic
virus in relation to hydrostatic pressure, J. Biol. Chems, 19, 237—245 (1948).
885. Johnson J., The classification of plant viruses, Wisconsin, Univ. Agr. Exptl. Sta.
Res. Bull., 76, 1-16 (1927).
886. Johnson J., Virus attenuation and mutation, Phytopathology, 37, 12 (1947).
887. Johnson J-, Hoggan I. A., The challenge of plant virus differentiation and classifica-
tion, Proc. 5th Intern. Botan. Congr., Cambridge, Engl., p. 225, 1930 (Abstr.).
888. Johnson J., Hoggan I. A-, A descriptive key for plant viruses, Phytopathology, 25,.
328-343 (1935).
889. Johnson J-, Ogden W. B-, The overwintering of tobacco mosaic virus, Wisconsin,
Univ. Agr. Exptl. Sta. Bull., 95, 25pp (1929).
890. Johnson J. H., Fields Z. E-, Darlington W. A., Removing viruses from water by poly-
electrolytes, Nature, 213, 665—667 (1967).
891. Johnson M- S-, Young R. J., Fractionation on benzoylated DEAE-cellulose of tRNA
from tobacco mosaic virus infected tobacco leaves, Virology, 38, 607—613 (1969).
892. Johnson M. W-, The binding of metal ions by turnip yellow mosaic virus, Virology,
24, 26—35 (1964).
893. JohnsonM. W-, Hills G. J., Electron microscopy of turnip yellow mosaic virus (TYMV)
ribonucleic acid (RNA), Virology, 21, 517—520 (1963).
894. Johnson M. W., Markham R., Nature of the polyamine in plant viruses, Virology,
17, 276—281 (1962).
895. Jonard G-, Ralijaona D., Htrth L., Action de 1'uree sur le virus de la mosaique jaune’
du navet. Proprietes du RNA obtenu lors de la formation de capsides artificielles,
Compt. Rend., 264, 2694—2697 (1967).
896. Joshi II. U., Carr A. J. H., Effect of clover Phyllody virus on modulation of white
clover (Trifolium repens) by Rhizobium trtfolii in the soil, J. Gen. Microbiol., 49,
385-392 (1967).
897, Joshi L-, Holmes F. O., Induced tolerance of tobacco mosaic virus to heat, Phyto-
pathology, 58, 60—61 (1968).
898. Joshi L., Thornberry H. H., Effect of magnesium trisilicate on the infectivity of tobac-
co mosaic virus, Virology, 35, 169—171 (1968).
899. Joshi P. C-, Noggle G. R., Growth of isolated mesophyll cells of Arachis hypogaea in
simple defined medium in vitro, Science, 158, 1575—1577 (1967).
900. Jukes T. H., Molecules and Evolution, 285 pp., Columbia Univ. Press, New York,
1966.
901. Kabat E. A., Mayer M. M., Experimental Immunochemistry, 2nd ed., 905 pp.,.
Thomas, Springfield, Illinois, 1961.
Литература
531
902. Kado С. I., Increase in plant virus infection by magnesium in the presence of phospha-
te, Nature, 197, 925-926 (1963).
903. Kado C. J., Chenopodium, a sensitive host for TMV-RNA, Virology, 24, 660—665
(1964).
904. Kado С. I., Biological and Biochemical characterisation of Sowbane mosaic virus,
Virology, 31, 217-229 (1967).
905. Kado С. I., The isolation and quantitative assay of strains of tobacco mosaic virus
on leaf disks, Virology, 33, 171—173 (1967).
906. Kado С. I., Knight C. A., Location of a local gene in tobacco mosaic virus RNA, Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S., 55, 1276—1283 (1966).
907. Kado С. I., Knight C. A., The coat protein genes of tobacco mosaic virus. 1. Location
of the gene by mixed infection, J. Mol. Biol., 36, 15—23 (1968).
908. Kado С. I., Regenmortel M. II. V., Knight C. A., Studies one som strains of tobacco
mosaic virus in orchids. I. Biological, chemical and serological studies, Virology, 34,
17—24 (1968).
909. Kahn R. P-, Scott II. A., Bozicevich J., Vincent M. M., Detection of potato viruses X,
M, and S in dormant potato tubers by the bentonite flocculation test, Phytopathology,
57, 61—65 (1967).
910. Kalmakoff J., Tremaine J. II., Some physical and chemiycal properties of carnation
rinsgpot virus, Virology, 33, 10—16 (1967).
911. Kalmus II., Kassanis B., Reduction by carbon dioxide of susceptibility of beans to
tobacco necrosis viruses, Nature, 154', 641 (1944).
912. Kaper J. M., Preparation and characterisation of artificial top component from turnip
yellow mosaic virus, J. Mol. Biol., 2, 425—433 (1960).
913. Kaper J. M., Protein components from turnip yellow mosaic virus, Nature, 186, 219—
220 (1960).
914. Kaper J. M., Some aspects of the structure of ribonucleic acid inside turnip yellow
mosaic virus. In «Viruses of Plants» (A. B. R. Beemster and J. Dijkstra, eds.),
pp. 324—329, North-Holland Publ., Amsterdam, 1966.
915. Kaper J. M., Halperin J- E-, Alkaline degradation of turnip yellow mosaic virus.
II. In situ breakage of the ribonucleic acid, Biochemistry, 4, 2434—2441 (1965).
916. Kaper J. M., Jenifer P. G-, Studies on the interaction of p-mercuribenzoate with tur-
nip yellow mosaic virus. IV. Conformational change, exposure of buried prototropic
groups, and pH induced degradation, Biochemistry, 6, 440—446 (1967).
917. Kaper J. M., Jenifer P. G., Studies on the interaction of p-mcrcuribenzoato with
turnip yellow mosaic virus. V. Induced ribonuclease sensitivity and degradation of the
virion, Virology, 35, 71—81 (1968).
918. Kaper J. M., Siberg R. A., Degradation of turnip yellow mosaic virus by freezing and
thawing in ivtro; a new method for studies on the internal organisation of the viral
components and for isolating native RNA, Virology, 38, 407—413 (1969).
919. Kaper J. M., Sieere R. L., Infectivity of tobacco ringspot virus nucleic acid prepara-
tions, Virology, 7, 127-139 (1959).
920. Kaper J. M-, Steere R. L., Isolation and preliminary studies of soluble protein and
infectious nucleic acid from turnip yellow mosaic virus, Virology, 8, 527—530 (1959).
921. Kaper J. M., Diener T. O., Scott II. A., Some physical and chemical properties of
cucumber mosaic virus (strain Y) and of its isolated ribonucleic acid, Virology, 27,
54-72 (1965).
922. Karas J. G-, Hamner C. L-, De. Zeeuw D. J., Sell II. M., Inhibition of localized virus
lesions by N-dimethylamino-succinamic acid, Nature, 203, 1197 (1964).
923. Karaseh M., Changes in free and acetylated amino acids during tobacco virus multi-
plication, Biochim. Biophys. Acta, 78, 644—648 (1963).
924. Karie II. P., Shalla T. A., Inability of poach bud mosaic virus and C14 to move into
opposite noninoculated primary leaves of compea, Phytopathology, 56, 562—563
(1966).
925. Kassanis B., Intranuclear inclusions in virus-infected plants, Ann. Appl. Biol., 26,
705—709 (1939).
926. Kassanis B., Transmission of tobacco etch viruses by aphides, Ann. Appl. Biol., 28,
238-243 (1941).
927. Kassanis B., Neutralization of some plant viruses by rabbit sera, Brit. J. Exptl.
Pathol., 24, 152-159 (1943).
928. Kassanis B., Some effects of high temperature on the susceptibility of plants to infec-
tion with viruses, Ann. Appl. Biol., 39, 358—369 (1952).
929. Kassanis B., Some effects of sucrose and phosphorus in increasing the multiplication
of tobacco mosaic virus in detached tobacco leaves, J. Gen. Microbiol., 9, 467—474
(1953).
930. Kassanis B., Heat therapy of virus-infected plants, Ann. Appl. Biol., 41, 470—474
(1954).
931. Kassanis B., The use of tissue cultures to produce virus-free clones from infected potato'
varieties, Ann. Appl. Biol., 45, 422—427 (1957).
34*
532
Литература
932. Kassanis В., Some effects of varying temperature on the quality and quantity of tobac-
co mosaic virus in infected plants, Virology, 4, 187—199 (1957).
933. Kassanis B-, Effects of changing temperature on plant virus diseases, Advan. Virus
Res., 4, 221-241 (1957).
934. Kassanis B., Comparison of the early stages of infection by intact and phenoldisrupted
tobacco necrosis virus, Virology, 10, 353—369 (1960).
935. Kassanis B-, The transmission of potato aucuba mosaic virus by aphids from plants
also infected by potato viruses A or Y, Virology, 13, 93—97 (1961).
936. Kassanis B., Potato paracrinkle virus, European Potato .1., 4, 14—25 (1961).
937. Kassanis B-, Properties and behaviour of a virus depending for its multiplication on
another, J. Gen. Microbiol., 27, 477-488 (1962).
938. Kassanis B., Therapy of virus-infected plants, J. Roy. Agr. Soc. Engl., 216, 105—114
(1965).
939. Kassanis B., Properties and behaviour of satellite virus. In «Viruses of Plants»
(A. B. R. Beemster and J. Dijkstra, eds.), pp. 177—187, North-Holland Publ.,
Amsterdam, 1966.
940. Kassanis B., Kleczkowski A., The isolation and some properties of a virusinhibiting
protein from Phytolacca esculenta, J. Gen. Microbiol., 2, 143—153 (1948).
941. Kassanis B-, Kleczkowski A., Inactivation of a strain of tobacco necrosis virus and of
the RNA isolated from it by ultraviolet radiation of different wavelengths, Photochem.
Photobiol., 4, 209-214 (1965).
942. Kassanis B-, Kleczkowski A., Mutual precipitation of two viruses, Nature, 205, 310
(1965).
943. Kassanis B., McCarthy D., The quality of virus as affected by the ambient tempera-
ture, J. Gen. Virol., 1, 425 -440 (1967).
944. Kassanis B-, Macfarlane I., Transmission of tobacco necrosis virus by zoospores of
Olpidium brassicas, J. Gen. Microbiol., 36, 79—93 (1964).
945. Kassanis B-, Macfarlane I., Transmission of tobacco necrosis virus to tobacco Callus
tissues by zoospores of Olpidium brassicae, Nature, 201, 218—219 (1964).
946. Kassanis B-, Macfarlane I., Interaction of virus strain fungal isolate and host species
in the transmission of tobacco necrosis virus, Virology, 26, 603—612 (1965).
947. Kassanis B., Macfarlane I., The transmission of satellite viruses of tobacco necrosis
virus by Olpidium brassicae, J. Gen. Virol., 3, 227—232 (1968).
948. Kassanis B-, Hixon H. L., Activation of one plant virus by another, Nature, 187,
713-714 (1960).
949. Kassanis B-, Nixon H. L., Activiation of one tobacco necrosis virus by another, J. Gen.
Microbiol., 25, 459-471 (1961).
950. Kassanis B., Sheffield F- M. L-, Variations in the cytoplasmic inclusions induced by
three strains of tobacco mosaic virus, Ann. Appl. Biol., 28, 360—367 (1941).
951. Kassanis B., Tinsley T. W., The freeing of tobacco tissue cultures from potato virus Y
by 2-thiouracil, Proc. 3rd Conf. Potato Virus Diseases, Lisse-Waganingen, 1957,
pp. 153—155, 1958.
952. Kassanis B-, Varma A., The production of virus-free clones of some British potato
varieties, Ann. Appl. Biol., 59, 447—450 (1967).
953. Kassanis B-, Welkie G. W., The nature and behaviour of unstable variants of tobacco
necrosis virus, Virology, 21, 540—550 (1963).
954. Kassanis B-, Woods R. D-, Aggregated forms of the satellite tobacco necrosis virus,
J. Gen. Virol., 2, 395-398 (1968).
955. Kassanis B-, Tinsley T- W-, Quale F., The inoculation of tobacco callus cells with
tobacco mosaic virus, Ann. Appl. Biol., 46, 11—19 (1958).
956. Kausche G. A., Stubbe IT., Ober die Entstehung einer mit Rontgenstrahlen induzierten
«Mutation» des Tabakmosaikvirus, Naturwissenschaften, 29, 501—502 (1939).
957. Kausche G. A., Stubbe H., Zur Frage der Entstehung rontgenstrahleninduzierter
Mutationen beim Tabakmosaikvirusprotein, Naturwissenschaften, 28, 824 (1940).
958. Kausche G. A., Pfankuch E-, Ruska 4., Die Sicht ormachung von pflanzlichem Virus
im Obermikroskop, Naturwissenschaften, 27, 292—299 (1939).
959. Kausche G- A., Pfankuch E-, Ruska E-, Beobachtungen uber Schall- und Ultraschall-
einwirkungen am Protein des Tabakmosaikvirus, Naturwissenschaften, 29, 573 (1941).
960. Kauzmann W-, Some factors in the interpretation of protein denaturation, Advan.
Protein Chem., 14, 1—63 (1959).
961. Kavanau J. L-, On correlation of the phenomena associated with chromosomes, foreign
proteins and viruses. III. Virus associated phenomena, characteristics and reproduc-
tion, Am. Naturalist, 83, 113—138 (1949).
962. Kellenberger E., Boy de la Tour E-, Studies on the morphopoiesis of the head of phage
T-even. II. Observations on the fine structure of polyheads, J. Ultrastruct. Res., 13,
343 -358 (1965).
963. Kelley J. J., Kaesberg P., Biophysical and biochemical properties of top component
a and bottom component of alfalfa mosaic virus, Biochim. Biophys. Acta, 61, 865—871
(1962).
Литература
533
964. Kennedy В- W-, Cooper В. L-, Association of virus infection with mottling of soybean
seed coats, Phytopathology, 57, 35—37 (1967).
965. Kennedy J- S-, Benefits to aphids from feeding on Galled and virus-infected leaves,
Nature, 168, 825—826 (1951).
966. Kennedy J. S-, Day M. F-, Easiop V- F-, A Conspectus of Aphids as Vectors of Plant
Viruses, 114 p., Commonwealth Inst Entomol., London, 1962.
967. Ketellapper H. J., Temperature induced chemical defects in higher plants, Plant
Physiol., 38, 175-179 (1963).
968. Kikumoto T-, Matsui C-, Electron microscopy of intracellular potato virus X, Viro-
logy, 13, 294-299 (1961).
969. Kikumoto T-, Matsui C-, Electron microscopy of plant viruses in aphid midguts,
Virology, 16, 509—510 (1962).
970. Kim Y- T-, Wildman S- G-, Synthesis of infectious tobacco mosaic virus RNA by
cell-free extracts obtained from TMV infected tobacco leaves, Biochem. Biophys.
Res. Commun., 8, 394—401 (1962).
971. Kimmins W- C-, The effect of darkening on the susceptibility of french bean to tobacco
necrosis virus, Can. J. Botany, 45, 543—553 (1967).
972. Kimmins W. C-, Litz R. E-, Tho effect of leaf water balance in the susceptibility
of french bean to tobacco necrosis virus, Can. J. Botany, 45, 2115—2118 (1967).
973. Kimura I., Further studies on rice dwarf virus, Nippon Shokubutsu Byori Gakkaiho,
27, 197-203 (1962).
974. King M. E-, Harris R. V., Studies in strawberry virus diseases. IV. Symptom expres-
sion of yellow edge in the variety Royal Sovereign, J. Pomol. Hort. Sci., 19, 212—242
(1942).
975. Kirdly Z-, Szirmai J., The influence of kinetin on tobacco mosaic virus production
in Nicotiana glutinosa leaf diska, Virology, 23, 286—288 (1964).
976. Kirkpatrick H. C-, Ross A. F-, Aphid transmission of potato leafroll virus to solana-
ceous species, Phytopathology, 42, 540—546 (1952). •
977. Kisimoto R., Genetic variation in the ability of a planthopper vector; Laodelphax
striatellus (Fallen) to acquire the rice stripe virus, Virology, 32, 144—152 (1967).
978. Киселев H- 4., Гаврилова JI- П-, Спирин, A. C-, On configurations of highpolymer
ribonucleic acid macromolecules as revealed by electron microscopy, J. Mol. Biol., 3,
778—783 (1961).
979. Kitajima E- W-, Electron microscopy of vira-cabe^a virus (Brazilian tomato spotted
wilt virus) within the host cell, Virology, 26, 89—99 (1965).
980. Kitajima E- W-, Costa A. S-, Electron microscope studies on Gomphrena virus, Viro-
logy, 29, 523 —539 (1966).
981. Kitajima E- W-, Lauritis J- A., Plant virions in plasmodesmata, Virology, 37, 681—
685 (1969).
982. Kleczkowski A., Combination of potato virus X and tobacco mosaic virus with pepsin
and trypsin, Biochem. J., 38, 160—167 (1944).
983. Kleczkowski A., Combination between different proteins and between proteins and
yeast nucleic acid, Biochem. J., 40, 677—687 (1946).
984. Kleczkowski A-, The transformation of local lesion counts for statistical analysis, Ann.
Appl. Biol., 36, 139-152 (1949).
985. Kleczkowski A-, Interpreting relationships between concentration of plant viruses
and numbers of local lesions, J. Gen. Microbiol., 4, 53—69 (1950).
986. Kleczkowski A., A method for testing results of infectivity tests with plant viruses for
compatibility with hypotheses, J. Gen. Microbiol., 8, 295—301 (1953).
987. Kleczkowski 4., Stability of chymotrypsin and tobacco mosaic virus decreased by
ultraviolet radiation, Biochem. J., 56, 345—349 (1954).
988. Kleczkowski 4., The statistical analysis of plant virus assays: A transformation to
include lesion numbers with small means, J. Gen. Microbiol., 13, 91—98 (1955).
989. Kleczkowski 4., Effects of non-ionising radiations on viruses, Advan. Virus Res., 4,
191—220 (1957).
990. Kleczkowski 4., An electrophoretic study of the mechanism of precipitin reactions,
Immunology, 1, 36—45 (1958).
991. Kleczkowski A-, Effects of non-ionising radiation on plant viruses, Ann. N.Y. Acad.
Sci., 83, 661-669 (1960).
992. Kleczkowski A., Serological behaviour of tobacco mosaic virus and of its protein frag-
ments, Immunology, 4, 130—141 (1961).
993. Kleczkowski A., Destruction of antigenicity in vitro of human serum albumin and
of tobacco mosaic virus by ultraviolet radiation, Photochom. Photobiol., 1, 291—297
(1962).
994. Kleczkowski A., A study of the effects of salt and of pH on precipitation of antigenanti-
body compounds, Immunology, 8, 170—181 (1965).
995. Kleczkowski A., Serological properties of viruses and their fragments. In «Viruses of
Plants» (A- B. R. Beemster and J. Dijkstra, eds.), pp. 196—204, North-Holland
Publ., Amsterdam, 1966.
534 Литература
996. Kleczkowskt A., Mathematical Models for infectivity dilution curves of plant viruses,
Virology, 34, 186-187 (1968).
997. Kleczkowskt A-, Experimental desing and statistical methods of assay. In «Methods
in Virology» (K. Maramorosch and H. Koprowski, eds.), Vol. 4, pp. 615—730, Acade-
mic Press, New York, 1968.
998. Kleczkowskt 4., Dark Reactivation of ultraviolet-irradiated tobacco necrosis virus,
J. Gen. Virol., 3, 19-24 (1968).
999. Kleczkowskt A., McLaren A. D., Inactivation of infectivity of RNA of tobacco mosaic
virus during ultraviolet irradiation of the whole virus at two wavelengths, J. Gon.
Virol., 1, 441—448 (1967).
1000. Kleczkowskt A., Kainmen A., Protection from proteolysis by aggregating the protein
isolated from tobacco mosaic virus, Biochim. Biophys. Acta, 53, 181—185
(1961).
1001. Kleinschmidt A. K., Dunnebacke T. II., Spendlove R. S-, Shaffer F. L-, Whitcomb R. F.,
Electron microscopy of RNA from reo virus and wound tumor virus, J- Mol. Biol.,
10, 282-288 (1964).
1002. Kleinschmidt W. J., Murphy E. B-, Investigations on interferon induced by statalon,
Virology, 27, 484-489 (1965).
1003. Kleinschmidt W. J., Probst G. W-, The nature of statalon, an antiviral agent, Antibiot.
Chemotherapy, 12, 298—309 (1962).
1004. Kleinschmidt W. J-, Cline J. C-, Murphy E. B-, Interferon production induced by
statalon, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S., 52, 741—744 (1964).
1005. Klistewicz J. M., Inheritance of reactions in safflower to lettuce mosaic virus, Phyto-
pathology, 57, 789-790 (1967).
1006. Kloft W-, Ehrhardt P-, Studies on the assimilation and secretion of labelled phosphate
in aphids, Radioisotopes Radiation entomol., Proc. Symp. Bombay, India, 1960,
pp. 181-189, 1962.
1007. Klug A., Berger J. E., An optical method for the analysis of perioicities in electron
micrographs, and some observations on the mechanism of negative staining, J. Mol.
Biol., 10, 565—569 (1964).
1008. Klug A., Caspar D. L- D., The structure of small viruses, Advan. Virus Res., 7, 225—
325 (1960).
1009. Klug A., Longley W-, Leberman R., Arrangement of protein subunits and the distribu-
tion of nucleic acid in turnip yellow mosaic virus. I. X-ray diffraction studies, J. Mol.
Biol., 15, 315-343 (1966).
1010. Kluge M., Viruspartikel im Siebrohrensaft von Cucumis sativus L. nach Infektion
durch das Cucumisivrus 2A, Planta, 73, 50—61 (1967).
1011. KnightC- A., The nucleic acids of some strains of tobacco mosaic virus, .1. Biol. Chem.,
197, 241-249 (1952).
1012. Knight C. A., Variation and its chemical correlates. In «The Viruses» (F. M. Burnet
and W. M. Stanley, eds.), Vol. 2, pp. 127—156, Academic Press, New York,
1959.
1013. Kodama T-, Bancroft J. B-, Some properties of infectious ribohucleic acid from broad
bean mottle virus, Virology, 22, 23—32 (1964).
1014. Koenig R., Bercks 7?., Anderungen in heterologen Reaktionsvermogen von Antisoron
gegen Vertreter der Potato Virus X-Gruppe im Laufe des Immunisierungsprozesses,
Phytopathol. Z., 61, 382-398 (1968).
1015. Koenig R., Mueller W. C-, The diphenylamine reaction and transmission experiments
with phenol extracts of plants infected with potato leaf roll virus, Phytopathology,
54, 1223-1227 (1964).
1016. Kojima M., Shikata E., Sugawara M., Murayama D; Isolation and electron micro-
scopy of potato leaf roll virus from plants, Virology, 35, 612—615 (1968).
1017. Kolehmatnen L., Zech II., von Wettstein D., The structure of colls during tobacco
mosaic virus reproduction. Mesophyll cells containing virus crystals, J. Cell Biol.,
25, 77-97 (1965).
1018. Komuro Y., Iwaki M., Multiplication of tobacco mosaic virus in the duckweed (Sptro-
dela polyrhiza), Nippon Shokubutsu Byori Gakkaiho, 29, 48—51 (1964).
1019. Komuro У., Iwaki M., Inoculation experiments of several plant viruses to duck-weed
(Spirodela polyrhiza), Nippon Shokubutsu Byori Gakkaiho, 30, 8—12 (1965).
1020. Kontaals D. G., Schlegel D. E-, Basal septa oi broken trichomes in Nicotiana as pos-
sible infection sites for tobacco mosaic virus, Virology, 16, 244—247 (1962).
1021. Krakow J. S-, Ochoa S-, Ribonucleic acid polymerase of Azotobacter vinelandii 1.
Priming by polyribonucleotides, Proc. Natl. Acad. Sci. U-S., 49, 88—94 (1963).
1022. Kramer G., Wittmann H. G., Schuster II., Die Erzeugung von Mutanten des Tabak-
mosaikvirus durch den Einbau von Fluoruracil in die Virusnucleinsaure, Z. Natur-
forsch., 19b, 46-51 (1964).
1023. Kubitschek H. E., Mutagenesis by near-visible light. Science, 155, 1545—1546 (1967).
1024. Kubo S-, Chromatographic studies of RNA synthesis in tobacco leaf tissues infected
with tobacco mosaic virus, Virology, 28, 229—235 (1966).
Литература,
535
1025. Kubo S-, Tomaru К., Nitta Т-, Shiroya Т-, Hidaka Z., Chromatography of tobacco
.mosaic virus, its constitutonts and nucleic acids extracted from infected tobacco leaf
tissues, Virology, 26, 406—412 (1965).
1026. Kuhn С- Ж, Decline in specific infectivity of cowpea chlorotic mottle virus in vivo,
Virology, 25, 9—14 (1905). '
1027. Kuhn C. W., Bancroft J. B-, Concentration and specific infectivity changes of alfalfa
mosaic virus during systemic infection, Virology, 15, 281—288 (1961).
1028. Kunkel L- O., Heat treatments for the cure of yellows and other virus diseases of peach,
Phytopathology, 26, 809—830 (1936).
1029. Kunkel L- O-, Effect of heat on ability of Cicadula sexnotata (Fall.) to transmit aster
yellows, Am. J. Botany, 24, 316—327 (1937).
1030. Kunkel L- O-, Heat cure of aster yellows in periwinkles, Am. J. Botany, 28, 761—769
(1941).
1031. Kunkel L- 0., Variation in phytopathogenic viruses, Ann. Rev. Microbiol., 1, 85—100
(1947).
1032. Kutsky R. J., Effects of indolebutyric acid and other compounds on virus concentration
in plant tissue cultures, Science, 115, 19—20 (1952).
1033. Kutsky R. J., Rawlins T- E-, Inhibition of virus multiplication by napthalene acetic
acid in tobacco tissue cultures, as revealed by a spectrophotometric method, J. Bacte-
rid.,, 60, 763-766 (1950).
1034. Kvicala B-, Selective powe'r in virus transmission exhibited by an aphis, Nature, 155,
174—175 (1945).
1035. Lackey C- F-, Restoration of virulence of attenuated curlytop virus by passage through
Stellaria media, J. Agr. Res., 44, 755—765 (1932).
1036. Lafleche D-, Bove J. M-, Sites d’incorporation de 1’uridine tritide dans les cellules
du parenchyme foliaire de Brassica chinesis saines ou infectdes par le virus de la mosai-
que jaune du navet, C.R. Acad. Sci., Paris, 266, 1839—1841 (1968).
1037. Lamey H- A., Everett T- R-, Increased susceptibility of hoja blanca virusinfected rice
leaves to Cochliobolus mtjabeanus, Phytopathology, 57, 227 (1967).
1038. Langenberg W. G-, Schlegel D. E-, Immunoradio-autographic evidence for the synthe-
sis of TMV antigen in the nucleus, Phytopathology, 57, 818 (1967).
1039. Langenberg W- G-, Schlegel D- E-, Autoradiography with 126I-labelle<l antibodies as
a means of localising TMV antigens in plant cells, Virology, 32, 167—170 (1967).
1040. Langenberg Ж G., Schlegel D. E-, Localisation of tobacco mosaic virus protein in
tobacco leaf cells during the early stages of infection, Virology, 37, 86—93 (1969).
1041. Lapierre II., Replication du virus de la mosaique jaune du Navet. DeveniT de L’arn
parental, Ann. Epiphyties, 17, 179—183 (1966).
1042. Larson R. II., Stahmann M. A., Walker J. C-, The induction of mutants in potato
virus X by nitrogen mustard, Proc. 2nd Intern. Congr. Potato Virus Diseases, Lisse-
Wageningen, pp. 95—99, 1954.
1043. Last F. ?., Physiology of parasitism, llndian Botan. Soc., 45, 185—198 (1966).
1044. Last F- T-, Hollings M-, Stone О- M., Some effects of cultural treatments on virus
diseases of cultivated mushroom Agaricus bisporus, Ann. Appl. Biol., 59, 451—462
(1967).
1045. Lauffer M- A., Polymerization-depolymerization of tobacco mosaic virus protein.
In «The Molecular Basis of Neoplasia», M. D. Anderson Hosp. Tumor Inst. University
of Texas Press, Austin, Texas, pp. 180—206, 1962.
1046. Lauffer M. A., Polymerisation-depolymerisation of tobacco mosaic virus protein. VI.
Osmotic pressure studies of early stages of polymerisation, Biochemistry, 5, 1957—
1964 (1966).
1047. Lauffer M. 4., Bendel I. J., The hydration of viruses, Advan. Virus Res., 2, 241—
287 (1954).
1048. Lauffer M. A., Dow R. B-, The denaturation of tobacco mosaic virus at high pressures,
J. Biol. Chem., 140, 509-518 (1940).
1049. Lauffer M. A., Price W- C-, Thermal denaturation of tobacco mosaic virus, J. Biol.
Chem., 133, 1—15 (1940).
1050. Lauffer M. A-, Price W. C-, Infection by viruses, Arch. Biochem., 8, 449—468 (1945).
1051. Lauffer M- A-, Trkula D., Buzzell 4., Mechanism of inactivation of tobacco mosaic
virus by X-rays, Nature, 177, 890 (1956).
1052. Lauffer M. A., Ansevin A. T., Cartwright T. E., Polymerisation-depolymerisation of
tobacco mosaic virus protein, Nature, 181, 1338—1339 (1958).
1053. Lawson R- H., Taconts P. J., Transfer of dahlia mosaic virus with liquid nitrogen and
relation of transfer to symptoms and inclusions, Phytopathology, 55, 715—718 (13 65).
1054. Lea D. E., Actions of Radiations on Living Cells, 402 pp., Cambridge Univ. Press,
London and New York, 1946.
1055. Leberman R., The isolation of plant viruses by means of «simple» coacervates, Viro-
logy, 30, 341-347 (1966).
1056. Lebeurier G., Hirth L-, Effect of elevated temperatures on the development of two
strains of tobacco mosaic virus, Virology, 29, 385—395 (1966).
536
Литература
1057. Ledoux L-, Huort R., Integration and replication of DNA of M. lysodeikticus in DNA
of germinating barley, Nature, 218, 1256—1259 (1968).
1058. Lee C- L-, Black L- M-, Anatomical studies of Trifolium incarnartum infected by
wound tumor virus, Am. J. Botany, 42, 160—168 (1955).
1059. Lee P. E-, Electron microscopy of inclusions in plants infected with wheat striate-
mosaic virus, Virology, 23, 145—151 (1964).
1060. Lee P. E., Virus-like particles in the salivary glands of apparently virus-free leaf-
hoppers, Virology, 25, 471—472 (1965).
1061. Lee P. E-, Morphology of wheat striate mosaic virus and its localisation in infected
cells, Virology, 33, 84-94 (1967).
1062. Lee P. E., Partial purification of wheat striate mosaic virus and fine structural studies-
of the virus, Virology, 34, 583—589 (1968).
1063. Letham D- S-, Chemistry and physiology of kinetin-like compounds, Ann. Rev. Plant
Physiol., 18, 349-364 (1967).
1064. Levin D. IL, Litt M., Studies on the secondary structure of soluble ribonucleic acid,
containing 8-azaguanine, J. Mol. Biol., 14, 506—514 (1965).
1065. Lewis T., Artificial windbreaks and the distribution of turnip mild yellow virus and.
Scaptomyza apicalis (Diptera) in a turnip crop, Ann. Appl. Biol., 58, 371—376 (1966).
1066. Limasset P-, Nomenclature des virus phytopathogenes, Ann. Epiphyties, 12, 317—
323 (1946).
1067. Limasset P-, Cornuet P-, Recherche du virus de la mosaique du tabac (Manner tabaci,.
Holmes) dans les meristems des plantes infectees, Compt. Rend., 228, 1971—1972
(1949).
1068. Lindberg G. D., A transmissible disease of Helminthosporium. victoriae, Phytopathology,
.49, 29-32 (1959).
1069. Lindberg G. D., Reduction in pathogenicity and toxin production in diseased Hel-
minthosporium victoriae, Phytopathology, 59, 457—460 (1960).
1070. Lindberg G. D., Transmission of a disease of Helminthosporium victoriae, Phytopatho-
logy, 50,- 644 (1960).
1071. Lindegren С. C-, A hypothesis of viral pathogenesis, Nature, 194, 130—133 (1962)..
1072. Linder R. C-, Chemical tests in the diagnosis of plant virus diseases, Botan. Rev., 27,
501-521 (1961).
1073. Ling К. C-, Nonpersistence of the Tungro virus of rice in its leafhopper vector Nepho-
tettix impicticeps, Phytopathology, 56, 1252—1256 (1966).
1074. Ling К. C-, Pound G- S., Sulfur nutrition of Nicotiana tabacum in relation to multi-
plication of tobacco mosaic virus, Phytopathology, 52, 155—158 (1962).
1075. Lister R. M., Transmission of soil borne virus through seed, Virology, 10, 547—549-
(1960).
1076. Lister R. M., Strawberry latent ringspot. A new nematode-borne virus, Ann. Appl.
Biol., 54, 167-176 (1964).
1077. Lister R. M., Possible relationships of virus specific products of tobacco rattle virus,
infections, Virology, 28, 350—353 (1966).
1078. Lister R. M., Functional relationships between virus-specific products of infection
by viruses of the tobacco rattle type, J. Gen. Virol., 2, 43—58 (1968).
1079. Lister R. M., Bracker С- E-, Defectiveness and dependence in three related strains-
of tobacco rattle virus, Virology, 37, 262—275 (1968).
1080. Lister R. M., Murant A. F., Seed-transmission of nematode-borne viruses, Ann. Appl.
Biol., 59, 49-62 (1967).
1081. Littlefield J. W., Dunn D- B-, The occurrence and distribution of thymine and three-
methylated adenine bases in ribonucleic acids from several sources, Biochem. J., 70,
642-651 (1958).
1082. Lockhart В- E- L., Semancik ! S-, Inhibition of the multiplication of a plant virus,
by actinomysin D, Virology, 36, 504—506 (1968).
1083. Lodish IL F-, Bacteriophage f2 RNA- Control of translation and gene order, Nature,
220, 345-350 (1968).
1084. Loebenstein G., Effect of a virus infection in sweet potatoes upon the host plant respira-
tion, Virology, 9, 62—71 (1959).
1085. Loebenstein G-, Inducing partial protection in the host plant with native virus protein,.
Virology, 17, 574-581 (1962).
1086. Loebenstein G-, Further evidence on systemic resistance induced by localized necrotic
virus infections in plants, Phytopathology, 53, 306—308 (1963).
1087. Loebenstein G-, Linsey N., Peroxidase activity in virus infected sweet potatoes, Phyto-
pathology, 51, 533—537 (1961).
1088. Loebenstein G., Lovrekovtch J., Interference with tobacco mosaic virus local lesion for-
mation in tobacco by injected heat-killed cells of Pseudomonas syringae, Virology, 30,
587-591 (1966).
1089. Loebenstein G., Ross A. F-, An extractable agent induced in uninfected tissues by
localised virus infections, that interferes with infection by tobacco mosaic virus.
Virology, 20, 507—517 (1963).
Л итература
537
1090. Loebenstein G-, Alper М-, Deutsch M., Preventing aphid-spread cucumber mosaic
virus with oils, Phytopathology, 54, 960—962 (1964).
1091. Loebenstein G-, Deutsch M., Frankel H., Sabar Z-, Field tests with oil sprays for the-
prevention of cucumber mosaic virus in cucumbers, Phytopathology, 56, 512—516
(1966).
1092. Loebenstein G., Rabina S., van Praagh T-, Induced interference phenomena in virus,
infections. In «Viruses of Plants» (A. B. R. Beemster and J. Dijkstra, eds.), pp. 151 —
157, North Holland Publ., Amsterdam, 1966.
1093. Loebenstein G-, Rabina S-, Praagh T., Sensitivity of induced localised acquired,
resistance to actinomycin D, Virology, 34, 264— 268 (1968).
1094. Loening U. E-, Ingle J., Diversity of RNA components in green plant tissues, Nature,.
215, 363-367 (1967).
1095. Lojek J. 8., Orlob G. B., Aphid transmission of tobacco mosaic virus, Science, 164,.
1407-1408 (1969).
1096. Longley W., Leberman R., Structural similarity of artificial and natural top com-
ponents of turnip yellow mosaic virus, J. Mol. Biol., 19, 223—225 (1966).
1097. Loomis W- D., Battaile J., Plant phenolic compounds and the isolation of plant enzy-
mes, Phytochemistry, 5, 423—438 (1966).
1098. Loor F., Comparative immunogenicities of tobacco mosaic virus protein subunits,,
and reaggregated protein subunits, Virology, 33, 215—220 (1967).
1099. Loring H. S-, The reversible inactivation of tobacco mosaic virus by crystalline
ribonuclease, J. Gen. Physiol., 25, 497—505 (1942).
1100. Loring H. S-, Al-Rawi 8. 4., Fujimoto У., The iron content of tobacco mosaic virus,
and some properties of its infectious nucleic acid, J. Biol. Chem., 233, 1415—1420-
(1958).
1101. Loring H. S-, Fujimoto У., Tu A. T-, Tobacco mosaic virus — a calciummagnesium
coordination complex, Virology, 16, 30—40 (1962).
1102. Losses in Agriculture, U.S. Dept. Agr. Handbook, 291, 120 pp. (1965).
1103. Loughnane J. B-, Murphy P. 4., Dissemination of potato viruses X and F by leaf
contact, Sci. Proc. Roy. Dublin Soc., 22, 1—15 (1938).
1104. Louie R., Lorbeer J. W-, Mechanical transmission of onion yellow dwarf virus, Phyto-
pathology, 56, 1020-1023 (1966).
1105. Lowe 4. D., The ecology of the cereal aphid in Canterbury, Proc. New Zealand Weed.
Pest Control Conf., 17, 175—186 (1964).
1106. Lozeron II. 4., Gordon M. P-, Ultraviolet sensitisation and photoreactivation of.'
tobacco mosaic virus ribonucleic acid containing 5-fluorouracil, Biochemistry, 3,
507-510 (1964).
1107. Luftig R., Haselkorn R., Studies on the structure of blue-green algae virus LPP-1,
Virology, 34, 664-674 (1968).
1108. Luria 8. E., General Virology, 427 pp., Wiley, New York, 1953.
1109. Luria 8- E., Darnell J. E., General Virology, 2nd ed., 512 pp., Wiley, New York,
1967. (С. Лурия, Дж. Дариелл, Общая вирусология, изд-во «Мир», М.,
1970.)
1110. Luria 8. Е., Williams R. С., Backus R. С-, Electron micrographic counts of bacterio-
phage particles, J. Bacteriol., 61, 179—188 (1951).
1111. Lwoff 4., Principles of classification and nomenclature of viruses, Nature, 215, 13—14
(1967).
1112. Lwoff 4., Tournier P., The classification of viruses, Ann. Rev. Microbiol., 20, 45—74
(1966).
1113. Lwoff 4., Horne R. W-, Tournier P., A system of viruses, Cold Spring Harbor Symp.
Quant., Biol., 27, 51-55 (1962).
1114. Lyttleton J- W-, Isolation of ribosomes from spinach chloroplasts, Exptl. Cell. Res.,.
26, 312-317 (1962).
1115. Lyttleton J- W-. Protein constituents in plant ribosomes, Biochim. Biophys. Acta,
154, 145-149 (1968).
1116. Lyttleton J- W-, Hole F- A., The deoxyribonucleic acid content of tobacco leaves,.
New Zealand, J. Sci., 10, 1061-1068 (1967).
1117. Lyttleton J. W., Matthews R. E. F-, Release of nucleic acid from turnip yellow mosaic-
virus mild conditions, Virology, 6, 460—471 (1958).
1118. McCarthy D., Separation of stable aggregates of tobacco mosaic virus protein by
electrophoresis on polyacrylamide gels, J. Gen. Virol., 3, 417—425 (1968).
1119. McGee Z. 4., Rogul M., Wittier R. G-, Molecular genetic studies of relationships among
mycoplasma, L-forms and bacteria, Ann. N.Y- Acad. Sci., 143, 21—30 (1967).
1120. McKenzie D- W-, The problem of «gnarling» or «flatlimb» in Gravenstein apples,.
Orchardist of New Zealand, 26, (10), 2—3 (1953).
1121. McKinney II. II., Mosaic diseases in the Canary Islands, West Africa and Gibraltar,
J. Agr. Res., 39, 557-578 (1929).
1122. McKinney ff. H., Genera of the plant viruses, J. Wash. Acad. Sci., 34, 139—154
(1944).
538
Литература
1123. McKinney Н. Н., Descriptions and revisions of several species of viruses in the genera
Marmor Fractilinea and Galla, J. Wash. Acad. Sci., 34, 322—328 (1944).
1124. McKinney H. Silber G-, Greeley L- W., Longevity of some plant viruses stored
in chemically dehydrated tissues, Phytopathology, 65, 1043—1044 (1965).
1125. McLaren A. D., Kleczkoivski A., Some gross changes in particles of tobacco mosaic
virus caused by large doses of ultraviolet radiation, J. Gen. Virol., 1, 391—394 (1967).
1126. McLaren G- D-, Infectivity changes in preparations from plants infected with tobacco
mosaic virus, J. Gen. Virol., 1, 243—245 (1967).
1127. McLean G. D-, Francki R. I. B-, Purification of lettuce necrotic yellows virus by
column chromatography on calcium phosphate gel, Virology, 31, 585—591 (1967).
1128. MacLeod R., An interpretation of the observed polymorphism of potato yellow dwarf
virus, Virology, 34, 771-777 (1968).
1129. MacLeod R., Hills G. J., Markham R., Formation of true three-dimensional crystals
of the tobacco mosaic virus protein, Nature, 200, 932—934 (1963).
1130. MacLeod R., Black L. M-, Moyer F. H., The fine structure and intracellular localisa-
tion of potato yellow dwarf virus, Virology, 29, 540—552 (1966).
1131. Macquaire G-, Nouvelle method d’isolement de la replicase du virus de la mosaique
jaune du navet, Ann. Epiphyties, 16, 27—31 (1965).
1132. McRitchie J- J-, Alexander L- J-, Host-specific Lycopersicon strains of tobacco mosaic
virus, Phytopathology, 53, 394—398 (1963).
1133. McWhorter F- P-, Price W. C-, Evidence that two different plant viruses can multiply
simultaneously in the same cell, Science, 109, 116—117 (1949).
1134. Madueivesi J. N. C-, Hagedorn D. J., Ribonuclease sensitive infectious units from
Wisconsin pea streak virus, Phytopathology, 56, 46 (1966).
1135. Magdoff-Fairchild B. S-, Electrophoretic and buoyant density variants of southern
bean mosaic virus, Virology, 31, 142—153 (1967).
1136. Major R. T-, Ginkgo, the most ancient living tree, Science, 157, 1270—1273 (1967).
1137. Majorana G-, Paul H. L-, The production of new types of symptoms by mixtures of
different components of two strains of alfalfa mosaic virus, Virology, 38, 145—151
(1969).
1138. Malkiel S-, Immunochemical studies on tobacco mosaic virus. IV. The serological
behaviour of sonic treated tobacco mosaic virus, J. Immunol., 57, 55—65 (1947).
1139. Mandel H. G-, Matthews R. E- F., Matus A-1., Ralph R- K-, Replicative form of plant
viral RNA, Biochem. Biophys. Res. Gommun., 16, 604—609 (1964).
1140. Mandeles S-, Location of unique in tobacco mosaic virus ribonucleic acid, J. Biol.
Chem., 243, 3671—3674 (1968).
1141. Mandryk M-, Acquired systemic resistance to tobacco mosaic virus in Nicotiana taba-
cum evoked by stem injection with Perenospora tabacina Adam, Australian J. Agr.
Res., 14, 315-318 (1963).
1142. Maramorosch K., Reversal of virus-caused stunting in plants by giberellic acid, Science,
126, 651-652 (1957).
1143. Maramorosch K., An ephemeral disease of maize transmitted by Dalbulus elinatus,
Entomol. Exptl. Appl., 2, 169—170 (1959).
1144. Maramorosch K., Shikata E-, Granados R. R-, Structures resembling mycoplasma
in diseased plantsand in insect vectors, Trans N.Y. Acad. Sci., 30, 841—855
(1968).
1145. Marbrook J-, Matthews R. E. F-, The differential immunogenicity of plant virus
proteins and nucleoproteins, Virology, 28, 219—228 (1966).
1146. Marinos N. G-, Multifunctional plastids in the meristematic region of potato tuber
buds, J. Ultrastruct. Res., 17, 91—113 (1967).
1147. Markham R-, Physicochemical studies on the turnip yellow mosaic virus, Discussions
Faraday Soc., 11, 221—227 (1951).
1148. Markham R-, Chemistry of some functional components of viruses, Cold Spring Harbor
Symp. Quant. Biol., 18, 141—148 (1953).
1149. Markham R., The biochemistry of plant viruses. In «The Viruses» (F. M. Burnet and
W. M. Stanley, eds.), Vol. 2, pp. 33—125, Academic Press, New York, 1959.
1150. Markham R., A. graphical method for the rapid determination of sedimentation coef-
ficients, Biochem. J., 77, 516—519 (1960).
1151. Markham R-, The analytical centrifuge as a tool for the investigation of plant viruses,
Advan. Virus Res., 9, 241—270 (1962).
1152. Markham R., Deviations in nitrogen metabolism associated with viruses. In «Recent
Aspects of Nitrogen Metabolism in Plants» (E. J. Hewitt and С. V. Cutting, eds.),
pp. 203—216, Academic Press, New York, 1968.
1153. Markham R-, Smith J. D-, Chromatographic studies on nucleic acids. 4. The Nucleic
acid of the turnip yellow mosaic virus, including a note on the nucleic acid of tomato
bushy stunt virus, Biochem. J., 49, 401—406 (1951).
1154. Markham R-, Smith J. D., The structure of ribonucleic acids. 1. Cyclic nucleotides
produced by ribonuclease and by alkaline hydrolysis, Biochem. J., 52, 552—557
(1952).
Литература
539
'1 155. Markham R-, Smith J. D., The structure of ribonucleic acids. 2. The smaller products
of ribonuclease digestion, Biochem. J., 52, 558—565 (1952).
1156. Markham R., Smith J. D., The structure of ribonucleic facids. 3. The end groups,
the general structure and the nature of the «core», Biochem. J., 52, 565—571
(1952).
1157. Markham 7?., Smith К. M., Studies on the virus of turnip yellow mosaic, Parasito-
logy, 39, 330-342 (1949).
1158. Markham R-, Matthews R. E. F-, Smith К. M-, Testing potato stocks for virus X,
Farming Feb, 40—46 (1948).
1159. Markham R., Frey S., Hills G- J., Methods for enhancement of image detail and accen-
tuation of structure in electron microscopy, Virology, 20, 88—102 (1963).
1160. Markham R-, Hitchborn J. H-, Hills G. J., Frey S-, The anatomy of tobacco mosaic
virus, Virology, 22, 342—359 (1964).
1161. Marlatt R. B., McKittrick R. T-, Fungicidal control of big vein in the irrigated lettuce
crop, Phytopathology, 53, 597—599 (1963).
1162. M arrow J-, Messiaen C-М., Migliori A., Methodo de controls de 1’etat sanitaire des
graines de lattice, Ann. Epiphyties, 18, 227—248 (1967).
1163. Martin M- M., Purification and electron microscope studies of tomato spotted wilt
virus (TSWV) from tomato roots, Virology, 22, 645—649 (1964).
1164. Martyn E- B., Plant Virus Namaz. An Annotated List of Names and Synonyms of
Plant Viruses and Diseases, 204 pp., Commonwealt Mycol. Inst., Surrey, England,
1968.
1165. Matsui C-, Sasaki T-, Kikumoto T-, Electron microscopy of tobacco mosaic virus
particles from aphid stylets, Virology, 19, 411—412 (1963).
1166. Matsui C-, Hibino FI., Hayashi T., Electron microscopy of host cells infected with
tobacco etch virus. III. Intranuclear inclusions of leaves at an early stage of infec-
tion, Virology, 28, 214—218 (1966).
1167. Matthews R. E- F., Studies on potato virus X. I. Types of change in potato virus X
infections, Ann. Appl. Biol., 36, 448—459 (1949).
.1168 . Matthews R. E- F-, Studies on iiotato virus X. II. Criteria of relationships between
strains, Ann. Appl. Biol., 36, 460—474 (1949).
1169. Matthews R. E. F-, Reactions of Cyphomandra betacea to strains of potato virus X,
Parisitology, 39, 241—244 (1949).
4170. Matthews R. E. F-, Effect or some substituted purines on the development of plant
virus infections, Nature, 167, 892—893 (1951).
1171. Matthews R. E. F-, Factors affecting the production of local lesions by plant viruses.
I. Effect of time of day of inoculation, Ann. Appl. Biol., 40, 377—383 (1953).
1172. Matthews R. E. F-, Factors affecting the production of local lesions by plant viruses.
II. Some effects of light, darkness and temperature, Ann. Appl. Biol., 40, 556—565
•1173. Matthews R. E. F-, Chemotherapy and plant viruses, J. Gen. Microbiol., 8, 277—288
(1953).
1174. Matthews R. E. F-, Incseaseoration of 8-azaguanine into nucleic acid of tobacco mosaic
virus, Nature, 171, 1065—1066 (1953).
1175. Matthews R. E. F-, Effects of some substituted purines on plant viruses and virus
diseases, Atti del VI Congresso Intrenazionale di Microbiologia, Roma, 3, 363—372
(1953).
1176. Matthews R. E. F-, Effects of some purine analogues on tobacco mosaic virus, J. Gen.
Microbiol., 10, 521-532 (1954).
1177. Matthews R. E- F-, Infectivity of turnip yellow mosaic virus containing 8-azaguanine,
Virology, I, 165-175 (1955).
1178. Matthews R. E- F., Thiouracil in tobacco mosaic virus, Biochim. Biophys. Acta, 19,
559 (1956).
1179. Matthews R. E. F., Plant Virus Serology, 127 pp., Cambridge Univ. Press, London
and New York, 1957.
1180. Matthews R. E. F-, Studies on the relation between protein and nucleoprotein particles
in turnip yellow mosaic virus infections, Virology, 5, 192—205 (1958).
1181. Matthews R. E. F-, Turnip yellow mosaic virus nucleoprotein particles with differing
biological and physical properties, Nature, 184, 530—531 (1959).
1182. Matthews R. E- F-, Properties of nucleoprotein fractions isolated from turnip yellow
mosaic virus preparations, Virology, 12, 521—539 (1960).
1183. Matthews R. E- F., Virus inactivation in vitro and in vivo. In «Plant Pathology.
An Advanced Treatise» (J. G. Horsfall and A. E. Dimond, eds.), Vol. 2, pp. 461—506,
Academic Press, New York, 1960.
1184. Matthews R. E- F-, Reconstitution of turhip yellow mosaic virus RNA with TMV
protein subunits, Virology, 30, 82—96 (1966).
1185. Matthews R. E. F-, Serological techniques for plant viruses. In «Methods in Virology»
(K. Maramorosch and I-L Koprowski, eds.), Vol. 3, pp. 199 — 241, Academic Press,
New York, 1967.
540
Литература
1186. Matthews R. E- F-, Lyttleton J. W-, Heat inactivation of turnip yellow mosaic virus-
in vivo, Virology, 9, 332—342 (1959).
1187. Matthews R. E- F-, Proctor С- II., Influence of aliphatic organic acids and metal-
ions on numbers of local lesions produced by a tobacco necrosis virus, J. Gen. Micro-
biol., 14, 366-370 (1956).
1188. Matthews R. E- F., Ralph R. K., Turnip yellow mosaic virus, Advan. Virus Res., 12,
273-328 (1966).
1189. Matthews R. E- F-, Smith J. If., The chemotherapy of viruses, Advan. Virus Res.,
3, 49-148 (1953).
1190. Matthews R. E. F., Bolton E. T-, Thompson H. R., Kinetics of labelling of turnip-
yellow mosaic virus with P32 and S3a, Virology, 19, 179—189 (1963).
1191. Matus A. I., Ralph R. K., Mandel II. G., Complexes of viral and ribosomal ribonucleic-
acids, J. Mol. Biol., 10, 295—302 (1964).
1192. May D. S., Knight C. A., Polar stripping of protein subunits from tobacco mosaic
virus, Virology, 25, 502—507 (1965).
1193. Mayer A., Heber die Mosaikkrankheit des Tabaks, Landwirtsch. Versuchs-Stationen,
32, 451-467 (1886).
1194. Mayo M. A., Cocking E. C., Labeling of tobacco mosaic virus with 12aI, J. Gen. Virol.,
2, 89—97 (1968).
1195. Mazzone H. M., Incardona N. L., Kaesberg P., Biochemical and biophysical properties-
of squash mosaic virus and related macromolecules, Biochim. Biophys. Acta, 55,
164-175 (1962).
1196. Megahed E.-S-, Pirone T- P-, Comparative transmission of cucumber mosaic virus
acquired by aphids from plants or through a membrane, Phytopathology, 56, 1420—
1421 (1966).
1197. Mellor F- C-, Stace-Smith R., Eradication of potato virus X by thermotherapy, Phyto-
pathology, 57, 674-678 (1967).
1198. Mercer F- L., Lindhorst T- E., Commoner B., Inhibition of tobacco mosaic virus bio-
synthesis by 2-thiopyrimidines, Science, 117, 558—559 (1953).
1199. Merrett M. J., The respiration rate of tomato stem tissue infected by tomato aucuba.
mosaic virus, Ann. Botany (London), 24, 223— 231 (1960).
1200. Merrett M. J., Sunderland D. W., The metabolism of carbon-14 specifically labelled,
glucose in leaves showing tobacco mosaic virus induced local necrotic lesions, Physiol.
Plantarum, 20, 593-599 (1967).
1201. Merriam V-, Gordon M. P-, Photoreactivation of tobacco mosaic virus ribonucleic
acid following near ultraviolet irradiation, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S., 54, 1261 —
1268 (1965).
1202. Messieha M., Aphid transmission of maize dwarf mosaic virus, Phytopathology,
57, 956-959 (1967).
1203. Miczynski K- A., Studies on the free amino acid composition of tobacco plants infected-
with potato virus X, Acta Biol. Cracov, 2 , 23 —33 (1959). [In Rev. Appl. Mycol.,
40, 127 (1961).]
1204. Miczynski K. A., Detection of free viral nucleic acid in the potato virus X infected
tobacco by gel electrophoresis, Phytopathol. Z., 61, 309—330 (1968).
1205. Miki T., Knight С. A-, Preparation of broad bean mottle virus protein, Virology,
25, 478-481 (1965).
1206. Miki T-, Knight C. A., Some chemical studies on a strain of white clover mosaic-
virus, Virology, 31, 55—63 (1967).
1207. Miki T., Knight C. A., The protein subunit of potato virus X, Virology, 36, 168—
173 (1968).
1208. Milicic D., Stefanac Z-, Plastidenveranderungen unter dem Einfluss des Wasserriiben-
gelbmosaikvirus (turnip yellow mosaic virus), Phytopathol. Z., 59, 285—296
(1967).
1209. Milicic D., Stefanac Z., Juretic N., Wrischer M-, Cell inclusions of Holmes ribgrass-
virus, Virology, 35, 356—362 (1968).
1210. Miller С- O-, Witham F. H., A kinetin-like factor from maize and other sources,
Colloq. Intern. Centre Natl. Rech. Sci. (Paris), 123, 1—6 (1964).
1211. Miller G. L-, Stanley W. M., Derivatives of tobacco mosaic virus. I. Acetyl ana.
phenylureido virus, J. Biol. Chem., 141, 905—920 (1941).
1212. Mills D. R., Peterson R. L-, Spiegelman S-, An extra cellular Darwinian experiment
with a self-duplicating nucleic acid molecule, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S., 58, 217—224
(1967).
1213. Milne R. G-, Multiplication of tobacco mosaic virus in tobacco leaf palisade cells,
Virology, 28, 79-89 (1966).
1214. Milne R. G-, Electron microscopy of tobacco mosaic virus on leaves of Chenopodium
amaranticolor, Virology, 28, 520—526 (1966).
1215. Milne R. G-, Electron microscopy of tobacco mosaic virus in leaves of Nicotiana glu-
tinosa, Virology, 28, 527—532 (1966).
1216. Milne R. G-, Plant viruses inside cells, Sci. Progr. (Oxford), 55, 203—222 (1967)..
Литература
541
1217. Milne R. G-, In vitro crystallization of tobacco mosaic virus in the presence of basic
proteins, J. Gen. Virol., 1, 403—404 (1967).
1218. Milne R. G-, Electron microscopy of leaves infected with sowbane mosaic virus and
other polyhedral viruses, Virology, 32, 589—600 (1967).
1219. Milo G. E-, Jr., Santilli V-, Changes in the ascorbate concentration of pinto bean
leaves accompanying the formation of TMV-induced local lesions, Virology, 31, 197—
206 (1967).
1220. Mink G. I., Inactivation of tulare apple mosaic virus by O-quiniones, Virology, 26,
700—707 (1965).
1221. Mink G. I., Kinetics of quinone inactivation of tulare apple mosaic virus, Virology,
33, 609-612 (1968).
1222. Mink G. I., Bancroft J. B., Purification and serology of tulare apple mosaic virus,
Nature, 194, 214 (1962).
1223. Mink G.1., Saksena K. N., Silbernagel M. J., Purification of the bean red node strain
of tobacco streak virus, Phytopathology, 56, 645—649 (1966).
1224. Misawa T., Kato S-, Suzuki T-, Studies on infection and the multiplication of plant
viruses. (Ill) Relationship between the cell nucleus and cucumber mosaic virus replica-
tion, Tonoku J. Agr. Res., 16, 265—274 (1966).
1225. Misawa T., Kato S-, Suzuki T., Changes of ribonuclease activity in tobacco-loaf infec-
ted with CMV. Reprinted from Jubilee Pub in Commemoration of 60th Birthday of M.
Sakamoto, pp. 183—189 (1968).
1226. Mitra S-, Kaesberg P., Biophysical properties of RNA from turnip yellow mosaic virus,
J. Mol. Biol., 14, 558-571 (1965).
.1227 . Miura K.-I., Muto A., Lack of messenger RNA activity of a double-stranded RNA,
Biochim. Biophys. Acta, 108, 707—709 (1965).
1228. Miura K.-I., Kimura I., Suzuki N., Double-stranded ribonucleic acid from rice dwarf
virus, Virology, 28, 571—579 (1966).
1229. Moed J. R., Veldstra II., Alfalfa mosaic virus; Comparative investigations of top a and
bottom components by moans of fingerprinting and immunological techniques, Viro-
logy, 36, 459-466 (1968).
1230. Moore J. D-, Boyle J. S-, Keitt G. IK., Mechanical transmission of a virus disease to
cucumber from sour cherry, Science, 108, 623—624 (1948).
1231. Moorhead E. L-, Serological studies of viruses infecting the cereal crops. II. The anti-
genic characteristics of wheat streak mosaic virus as determined by the complement
fixation technique, Phytopathology, 49, 151—157 (1959).
1232. Morel G., Researches sur la culture associce de parasites obligatoires et des tissues
vegetaux, Ann. Epiphyties, 14, 123 —234 (1948).
1233. Morel G-, Martin C., Guerison de dahlias atteints d'une maladie a virus, Compt.
Rend., 235, 1324-1325 (1952).
1234. Morel G., Martin C-, Guerison de pommes de terre atteintes de maladies a virus,
Comp. Rend. Acad. Agr. France, 41, 472—475 (1955).
1235. Morel G., Martin C-, Guerison de plantes atteintes de maladies a virus par cultures
de nwristem.es apicaux, Intern. Hort. Congr. 14th, The Hague-Scheveningen, Rept.,
1, 303 (1955).
1236. Moulder J. W., The Psittacosis Group as Bacteria, IB A Lectures Microbiol Biochem.,
95 pp., Wiley, New York, 1964.
1237. Moulder J. W-, The relation of the psittacosis group (Chlamydiae) to bacteria and
viruses, Ann. Rev. Microbiol., 20, 107—130 (1966).
1238. Mowat W- P-, Olpidium brassicae. Electrophoretic mobility of zoospores associated
with their ability to transmit tobacco necrosis virus, Virology, 34, 565—568 (1968).
1239. Muller II. O., Die Ausmessung der Tiefe iibermikroskopischer Objekte, Kolloid Z-,
99 (1), 6-28 (1942) (Chem. Abstr., 37, p. 3991, 1943).
1240. MUller К. O-, Munro J., The reaction of virus infected potato plants to Phytophthora
infestans, Ann. Appl. Biol., 38, 765—773 (1951).
1241. Mueller W. C., Koenig R-, Nuclear inclusions produced by bean yellow mosaic virus as
indicators of cross protection, Phytopathology, 65, 242— 243 (1965).
1242. Mueller W. C-, Rochow W. F-, An aphid-injection method for the transmission of
barley yellow dwarf virus, Virology, 14, 253—258 (1961).
1243. Mueller W. C-, Rochow W- F-, Ross A. F-, Transmission of barley yellow dwarf virus
to oats by aphids made viruliferous by needle injection, Phytopathology, 50, 647
(1960).
1244. Mulholland R. I., Control of the spread of mechanically transmitted plant viruses,
Commonwealth Phytopathol. News., 8, 60—61 (1962).
1245. Mundry K. W., Zur Frage des Einflusses von Rontgen- und uv-Strahlen auf die Muta-
tionsrate des Tabakmosaikvirus nach Bestrahlung reiner Praparate, Z. Induktive
Abstammungs-Vererbungslehre, 88, 115—127 (1957).
1246. Mundry К. W., Die Abhangigkeit des Auftretens neuer Virusstiime von der Kulture-
temperatur der Wirtspflanzen, Z. Induktive Abstammungs-Vererbungslehre, 88,
407-426 (1957).
542
Литература
1247. Mundry К- W., A model of the coat protein cistron of tobacco mosaic virus and its-
biochemical investigation. The model, the experimental approach, and the isolation-
of a long oligonucleotide from TMV-RNA, Z. Vererbungslehro, 97, 281—296 (1965).
1248. Mundry K. W-, Gierer A., Die Erzeugung von Mutationen des Tabakmosaikvirus-
durch chemische Behandlung seiner Nucleinsaure in vitro, Z. Vererbungslehre, 89,
614—630 (1958).
1249. Murakishi II. II., Transfer of virus by a direct leaf-to-leaf method, Nature, 198, 312—-
313 (1963).
1250. Murakishi H. II., Survival of dissociated tomato callus cells inoculated with tobacco-
mosaic virus, Virology, 27, 236—239 (1965).
1251. MurantA. F-, Lister R. M-, Seed transmission in the ecology of nematodeborne viruses,
Ann. Appl. Biol., 59, 63—76 (1967).
1252. Murant A- F., Taylor С- E-, Treatment of soil with chemicals to prevent transmission
of tomato black ring and raspberry ringspot viruses by Longidorus elongatus (de Man),
Ann. Appl. Biol., 55, 227-237 (1956).
1253. Murphy P. A., On the cause of rolling in potato foliage, and on some further insect
carriers of the disease, Sci. Proc. Roy. Dublin Soc., 17, 163—184 (1923).
1254. Nagaraj A. N-, Fluorescent antibody staining of viral antigen in dissociated plant
cells, Virology, 18, 329-331 (1962).
1255. Nagaraj A. N-, Immunofluorescence studios on synthesis and distribution of tobacco
mosaic virus antigen in tobacco, Virology, 25, 133—142 (1965).
1256. Nagaraj A. N., Black L- M., Localisation of wound-tumor virus antigen in plant
tumors by the use of fluorescent antibodies, Virology, 15, 289—294 (1961).
1257. Nagaraj A. N-, Black L- M-, Hereditary variation in'the ability of a leafhopper to
transmit two unrelated plant viruses, Virology, 16, 152—162 (1962).
1258. Nakamoto T., Weiss 8- B-, The biosynthesis of RNA: Priming by polyribonucleotides,
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S., 48, 880-887 (1962).
1259. Namba R., Aphid transmission of plant viruses from the epidermis and subepidermal
tissue: Myzus persicae (Sulzer) — cucumber mosaic virus, Virology, 16, 267—271
(1962).
1260. Narayanaswamy P-, Ramakrtshnan K., Sterility mosaic of pigeon pea. III. Nitrogen
metabolism of infected plants, Proc. Indian Acad. Sci., B63 (6), 288—296 (1966).
1261. Narita K., Isolation of acetylpeptide from enzyme digests of TMV-protein, Biochim.
Biophys. Acta, 28, 184—191 (1958).
1262. Nault L- R-, Inoculation of pea enation mosaic virus by tho green peach, potato and
foxglove aphids, J. Econ. Entomol., 60, 1586—1587 (1967).
1263. Nault L. R-, Gyrisco G- G., Relation of the feeding process of the pea aphid to the
inoculation of pea enation mosaic virus, Ann. Entomol. Soc. Am., 59, 1185—1197
(1966).
1264. Nault L- R., Gyrisco G. G-, Rochow W- F., Biological relationship between pea enation-
mosaic virus and its vector, the pea aphid, Phytopathology, 54, 1269—1272 (1964).
1265. Nelson D. S-, Day M. F-, Detection of cauliflower mosaic virus by immune adherence,
Phytopathology, 54, 395—398 (1964).
1266. Nelson R-, Down E. E-, Influence of pollen and ovule infection in seed transmission-
of bean mosaic, Phytopathology, 23, 25 (1933).
1267. Newcomb E. H., Fine structure of protein storing plastids in bean root tips, J. Cell.
Biol., 33, 143-163 (1967).
1268. Nickell L. G-, Effect of certain dyes on growth in vitro of virus tumor tissue from
Rumex acetosa, Botan. Gaz., 112, 290—293 (1951).
1269. Nielsen L. IV., Elimination of the internal cork virus by culturing the apical meristems-
of infected sweet potatoes, Phytopathology, 50, 840—841 (1960).
1270. Nienhaus F-, Stille B-, Ubertragung des Kartoffel-X-Virus dutch Zoosporen von
Synchytrium endobioticum, Phytopathol. Z., 54, 335—337 (1965).
1271. Nienhaus F-, Yarwood С- E-, Translocated wound stimuli affecting plant virus infec-
tions, Virology, 20, 477—483 (1963).
1272. Nitzany F- E-, Synergism between Pythium ultimum and cucumber mosaic virus,
Phytopathology, 56, 1386—1389 (1967).
1273. Nitzany F. E., Friedman S-, Application of the half-life concept to some plant viruses,
Phytopathology, 53, 548—551 (1963).
1274. Nitzany F- E., Sela I., Interference between cucumber mosaic virus and tobacco-
mosaic virus on different hosts, Virology, 17, 549—553 (1962).
1275. Nitzany F- E-, Geisenberg II., Koch B., Tests for the protection of cucumbers from-
a white fly-borne virus, Phytopathology, 54, 1059—1061 (1964).
1276. Niu С-1., Shore V., Knight C. A., The peptide chains of some plant viruses, Virology,.
6, 226-233 (1958).
1277. Nixon H. L-, An estimate of the number of tobacco mosaic virus particles in a single-
hair cell, Virology, 2, 126—128 (1956).
1278. Nixon H. L., Fisher H. L-, An improved spray droplet technique for quantitative-
electron microscopy, Brit. J. Appl. Phys., 9, 68—70 (1958).
Литература
543
1279. Nixon II. L-, Gibbe Л. J., Electron microscope observations on the structure of turnip
yellow mosaic virus, J. Mol. Biol., 2, 197—200 (I960).
1280. Novacky A., Hampton R. E., Peroxidase isozymes in virus-infocted plants, Phyto-
pathology, 58, 301-305 (1968).
1281. Nuorteva P-, Studies on the causes of the phytopathogenicity of Calligypona pelluctda
(F.) (Hom Araeopidae), Ann. Zool. Soc. Zool. Botan. Fennicae Vanamo, 23 (4), 1—58
(1962).
1282. Nyland G-, Possible virus-induced genetic abnormalities in tree fruits, Science, 137,
598-599 (1962).
1283. Offord R. E-, Electron microscopic observations on the substructure of tobacco rattle
virus, J. Mol. Biol., 17, 370-375 (1966).
1284. Offord R. E., Harris J. I., The protein subunit of tobacco rattle virus. Federation
Europian Biochem. Soc., 2nd Symp., Vienna, p. 216 (Abstr.), Verlag der Wiener
Medizinischen Akadomie, 1965.
1285. O’Louglilin G. T-, Chambers T. C-, The systemic infection of an aphid by a plant
virus, Virology, 33, 262-271 (1967).
1286. Opel II., Wirkungen von Kinetin auf virus- und mehltaninfizierte Pflanzou, Monatsber.-
Deut. Akad. Wiss. Berlin, 6 , 276 — 278 (1964).
1287. Orlando A., SUberschmidt K-, Studies on the natural dissemination of the virus on
«infectious chlorosis» of the malvaceae (A bullion virus 1. Baur) and its relation with
the insect vector Bemlsia tabaci (Genn.) (Homoptera-Aleyrodidae), Arquiv. Inst. Biol..
(Sao Paulo), 17, 1-36 (1946).
1288. Orlob G- B., Further studies on the transmission of plant viruses by different forms
of aphids, Virology, 16, 301—304 (1962).
1289. Orlob G- B., Some effects of photosensitising dyes on three plant viruses, Virology,
21, 291—299 (1963).
1290. Orlob G. B., Reappraisal of transmission of tobacco mosaic virus by insects, Phyto-
pathology, 53, 822-830 (1963).
1291. Orlob G- B-, Feeding and transmission characteristics of Aceria tulipae Keifer as vector
of wheat streak mosaic virus, Phytopathol. Z., 55, 218—238 (1966).
1292. Orlob G. B., Inactivation of purified plant viruses and their nucleic acids by photo-
sensitising dyes, Virology, 31, 402—413 (1967).
1293. Orlob G- B., Relationships between Tetranychus urticae Koch and some plant viruses,
Virology, 35, 121-133 (1968).
1294. Orlob G. B., Amy D. C-, Transmission of barley yellow dwarf virus by different forms
of the apple grain aphid Rhopalostphum fttchii (Sand.), Virology, 10, 273—274 (1960).
1295. Orlob G. B-, Amy D. C-, Some metabolic changes accompanying infection by barley
yellow dwarf virus, Phytopathology, 51, 768—775 (1961).
1296. Osawa S-, Ribosome formation and structure, Ann. Rev. Biochem., 37, 109—130
(1968).
1297. bssiannilsson F-, Insects in the epidemology of plant viruses, Ann. Rev. Entoniol., 11,
213-232 (1966).
1298. Oster G., Studies on the sonic treatment of tobacco mosaic virus, J. Gon. Physiol.,
31, 89-102 (1947).
1299. Otsukt У., Takebe I., Fluorescent antibody staining of tobacco mosaic virus antigen
in tobacco mesophyll protoplasts, Virology, 38, 497—499 (1969).
1300. Ouehterlony O., Diffusion-in-gol methods for immunological analysis II, Progr. Allergy,
6, 30-154 (1962).
1301. Owen P. C-, The respiration of tobacco leaves in the 20-hour period following inocula-
tion with tobacco mosaic virus, Ann. Appl. Biol., 43, 114—121 (1955).
1302. Owen P. C., The respiration of tobacco leaves after systemic infection with tobacco
mosaic virus, Ann. Appl. Biol., 43, 265—272 (1955).
1303. Owen P. C-, The effect of infection with tobacco etch virus on rates of respiration and
photosynthesis of tobacco leaves, Ann. Appl. Biol., 45, 327—331 (1957).
1304. Owen P- C., The effects of infection with tobacco mosaic virus on the photosynthesis of
tobacco leaves, Ann. Appl. Biol., 45, 456—461 (1957).
1305. Owen P. C., Photosynthesis and respiration rates of leaves of Nicotiana glutinosa
infected with tobacco mosaic virus and of N- tabacum infected with potato virus X,
Ann. Appl. Biol., 46, 198-204 (1958).
1306. Owen P- C-, Some effects of virus infection on the water contents of Nicotiana species,
Ann. Appl. Biol., 46, 205—209 (1958).
1307. Owusu G- K-, Crowley N. C., Francki R. I. B-, Studies of the seed-transmission of
tobacco ringspot virus, Ann. Appl. Biol., 61, 195—202 (1968).
1308. Oxelfelt P-, The use of a sintered-glass filter for concentrating tobacco mosaic virus
suspensions, Virology, 30, 740—741 (1966).
1309. Pace N. R., Bishop D. II. L-, Spiegelman 8., The immediate precursor of viral RNA
in the Q|3 replicase reaction, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S., 59, 139—144 (1968).
1310. Paine J., Legg J. T-, Transmission of hop mosaic by Phorodon humuli (Schrank),
Nature, 171, 263—264 (1953).
.544 Литература
,3,1. Р«К».< У. с., Slykku,. Г. Т: Loo.toUoi.oI -gj» «Щ»—
13,2. 5&SЙ oto KranU.ru to №,
,3,3. fMf&S^gS^ '-Ц
13». КЙГЛЖЙ. SoSuto oS oTiuoftol tolou to,to.,„ by b.b.oo.
mosaic virus, Virology, 26, 413—418 (196o). „nr<lon <>£ all sorts <»£ nloasant
1315. Parkinson J., Paradisiin sole paradisus 11’гге«^13^°ь0гЬмДи., London, 1(H>6.
flowers... with a kitchen garden of all manner ol . nl.evout virus infoelion
1316. Pathak M. D., Vea E., John V. T-, Control of insect vectors to prevent Virus mleclion
of rice plants, J. Econ. EntomoL, 60, 218-zzo liauy. Kartoffolviren
1317. Paul H. L., Bode 0-, Elektronemickroskopische Unterauchungon or i i rwiimviiu,
II. Vermessung der Teilchen von drei Stammen des Rattle-Virus, nywpamoi. Zi,
1318. /^Researches sur la croissance des plantes viruses; virus et auxinos, Conipt.
1319. ?Siar?A, В JXw5?.', La constitution auxinique> de tabacs sains onattends
de maladies a virus; Pr&once et role de la scopoldtine, Compt. Rens., 244, 1.40-1.43
1320. pSck A. C-, Dingman C. W., Resolution of multiple ribonucleic acid species by
polyacrylamide gel electrophoresis, Biochemistry, 6, 1М1а-1»2/
1321. Репо M., Popovic J., A virosis of Pinus nigra andP- sylvestris, Suinarstvi, 18, 399 404
1322. ^Pereira H- G., Virus nomenclature, Nature, 210, 149 150 (1966).
1323. Peters D. D., The purification of virus-like particles from the aphid Myzus persicae,
1324. Peters P.’ D.^The purification of potato leaf roll virus from its vector Myzus persicae,
1325. Peters^.’ D-V Loon L- C-, Transmission of potato leaf roll by apjiids after feeding on
virus preparations from aphids and plants, Virology» » . v )•
1326. Petersen P. D-, McKinney H. H., The influence of four “«smc diseases on tha plastid
pigments and chlorophyllase in tobacco leaves, Phytopathology, 28, 32J 3 (1938).
1327. Petkau A., Chelack W. S., Permeability of a thin phospholipid membrane to ions and
tobacco mosaic virus, Biochim. Biophys. Acta, 135, 812 824 (1JI57).
1328. Phillips J. H-, Brown D. M., The mutagenic action of hydroxylamine, I rogr. Nucleic
Acid Res. Mol. Biol., 7, 349—368 (1967). _
1329. Pierpont W. S-, The enzymic oxidation of chlorogemc acid and some reactions of the
quinone produced, Biochem. J., 98, 567—580 (19G0). .
1330. Pierpont W. S-, Cytochrome oxidase and mitochondrial protein in extracts of leaves
of Nicotiana glutinosa L., infected with tobacco mosaic virus, J. Exptl. Botany, 19,
1331. Pierpont W- S^ Harrison B- D-, Copper-dependent and iron-dependent inactivations
of cucumber mosaic virus by polyphenols, J. Gen. Microbiol., 32, 129 hO (1963).
1332. Pine T. S-, Reactions of peach trees and peach tree viruses to treatment with dimethyl
sulphoxide and other chemicals, Phytopathology, 57, 071 073 (1J(>7).
1333. Pinteric L-, Taylor J., The lowered drop method for the preparation of specimens of
partially purified virus lysates for quantitative electron microgiapliic analysis, Viro-
logy, 18, 359-371 (1962). . , , , . . . .
1334. Pirie N. W., Physical and chemical properties of tomato bushy stunt virus and the
strains of tobacco mosaic virus, Advan. EnzymoL, 5, 1 29 (lJ4o).
1335. Pirie N. W., The fission of tobacco mosaic and some other viruses with strontium
nitrate, Biochem. J., 56, 83—86 (1954).
1336. Pirie N. W-. Prerequisites for virus classification, Symp. Soc. Gen. Microbiol., 12,
374—393 1962). , „7 n n -с i
1337. Pirie N. W., Smith К. M., Spooner E. T., McClementW. D., Purified preparations
of tobacco necrosis virus (Nicotiana virus 11), Parasitology, 30, 543—551 (1938).
1338. Pirone T. p., Aphid transmission of a purified stylet-borne virus acquired through
a membrane, Virology, 23, 107—108 (1964). .
1339. Pirone T. P., Acquisition release of infectious tobacco mosaic virus by aphids, Phyto-
pathology, 57, 463 (1967).
1340. Pirone T. P., Acquisition and release of infectious tobacco mosaic virus by aphids,
Virology, 31, 569-571 (1967). , ... , .
1341. Pirone T- P-, Megahed E.-S., Aphid transmissibility of some puniied viruses and viral
RNAs, Virology, 30, 631—637 (1966). _ . ♦ >, - ,
1342. Pirone T. P., Pound G. S-, Molybdenum nutrition of Nicotiana tabacum in relation to
multiplication of tobacco mosaic virus, Phytopathology, 52, 822 826 (1962).
1343. Pirone T. P., Pound G. S-, Shepherd R. J-, Properties and serology of purified cauli-
flower mosaic virus, Phytopathology, 51, 541 54b (1У01).
Литература
545
1344. Pley С. ИЛ И., Talens L-, Boseh L-, Mandel М-, In situ breakage of turnip yellow
mosaic virus RNA and in situ aggregation of the fragments, Analysis of successive
stages, Virology, 38, 371—379 (1969).
1345. Pollard D. G., Feeding habits of the cotton whitefly, Bemisia tabaci Genn. Ann. Biol.,
43, 064—671 (1955).
1346. Porter С. A., Weinstein L- H., Biochemical changes induced by thiouracil in cucumber
mosaic virus-infected and noninfected tobacco plants, Contrib. Boyce Thompson Inst.,
19, 87-106 (1957).
1347. Porter C- A-, Weinstein L. IIAltered biochemical patterns induced in tobacco by
cucumbsr virus infection, by thiouracil and by their interaction, Contrib. Boyce
Thompson Inst., 20, 307—316 (1960).
1348. Porter R. R., Chemical structure of у-globulin and antibodies, Brit. Med. Bull., 19,
197-201 (1963).
1349. Posnette A- F-, Virus diseases of cacao in West Africa. I. Cacao viruses 1A, IB, 1C
and. ID, Ann. Appl. Biol., 34, 388—402 (1947).
1350. Posnett A. F., Virus diseases of cacao in West Africa. VII. Virus transmission by
different vector species, Ann. Appl. Biol., 37, 378—384 (1960).
1351. Posnett A. F-, Cropley R., Field experiments with chat-fruit virus disease of apple,
Ann. Appl. Biol., 55, 439—445 (1965).
1352. Posnette A. F-, Robertson N. F., Virus diseases of cacao in West Africa. VI. Vector
investigations, Ann. Appl. Biol., 37, 363—377 (1950).
1353. Posnette A. F-, Cropley R., Swait A- A. J., The incidence of virus diseases in English
sweet-cherry orchards and their effect on yield, Ann. Appl. Biol., 61, 351—360 (1968).
1354. Pound G. S-, Bancroft J. B-, Cumulative concentrations of tobacco mosaic virus in
tobacco at different photoperiods and light intensities, Virology, 2, 44—56 (1956).
1355. Pound G- S', Garces-Orejuela C., Effect of photoperiod on the multiplication of turnip
mosaic virus in rape, Phytopathology, 49, 16—17 (1959).
1356. Pound G. S-, Helms K., Effects of temperature on multiplication of potato virus X
in Nicotiana species, Phytopathology, 45, 493—499 (1955).
1357. Pound G. S-, Weathers L- G-, The relation of host nutrition to multiplication of turnip
virus I in Nicotiana glutinosa and N. multivalvis, Phytopathology, 43, 669—674 (1953).
1358. Pound G. S', Welkie G. W-, Iron nutrition of Nicotiana tabacum L. in relation to multi-
plication of tobacco mosaic virus, Virology, 5, 371—381 (1958).
1359. Preece D. A., Nested balanced incomplete block designs, Biometrika, 54, 479—486
(1967).
1360. Price J. L-, Thompson W. W., Occurrence of a crystalline inclusion in the chloroplasts
of Macadamia leaves, Nature, 214, 1148—1149 (1967).
1361. Price W- C-, Comparative host range of six plant viruses, Am. J. Botany, 27, 530—541
(1940).
1362. Price W. C-, Genetic composition in relation to isoelectric point and serological reac-
tion of strains in tobacco mosaic virus, Trans. N.Y. Acad. Sci., 16, 196—201
(1954).
1363. Price W- C-, Inactivation of southern bean mosaic virus by ultraviolet light, Virology,
25, 1—8 (1965).
1364. Price W- C., Flexuous rods in phloem cells of lime plants infected with citrus tristeza
virus, Virology, 29, 285—294 (1966).
1365. Proctor V. W-, Long-distance dispersal of seeds by retention in digestive tract of
birds, Science, 160, 321—322 (1968).
1366. Proposals and Recommendations of the Provisional Committee for Nomenclature of
Viruses (P.C.N.V.), Ann. Inst. Pasteur, 109, 625—637 (1965).
1367. Pryor D. E-, Exploratory experiments with the big-vein disease of lettuce, Phyto-
pathology, 36, 264—272 (1946).
1368. Purcifull D. E-, Some properties of tobacco etch virus and its alkaline degradation
products, Virology, 29, 8—14 (1966).
1369. Purcifull D. E-, Edwardson J'. R., Watermelon mosaic virus: Tubular inclusions in
pumpkin leaves and aggregates in leaf extracts, Virology, 32, 393—401 (1967).
1370. Purcifull D. E-, Sphepherd R. J., Preparation of protein fragments of several rod-
shaped plant viruses and their use in agar gel diffusion tests, Phytopathology, 54,
1102-1108 (1964).
1371. Purcifull D. E-, Edwardson J- R-, Christie R. G., Electron microscopy of intracellular
aggregates in pea (Pisum sativum) infected with clover yellow mosaic virus, Virology,
29, 276—284 (1966).
1372. Purcifull D- E-, Edwardson J. R., Christie S- R., Aggregated filaments in extracts from
Lupinus infected with watermelon mosaic virus, Virology, 35, 478—482 (1968).
1373. Quak F., Heat treatment and substances inhibiting virus multiplication in meristem
culture to obtain virus-free plants, Proc. 15th Intern. Hort. Congr., Nice, 1958, 1,
144—148 (1961).
1374. Rader W- E-, Fitzpatrick II. F-, Hildebrand E. M-, A seed-borne virus of musk-melon,
Phytopathology, 37, 809—816 (1947).
35-089.3
546 Литература
1375. Ragetli Н. W., Weintraub M-, Purification and characteristics of a virus inhibitor from
Dianthus caryophyllus L. I. Purification and activity, Virology, 18, 232—240 (1962).
1376. Ragetli H. W. J-, Weintraub M., Purification and characteristics of a virus inhibitor
from Dianthus caryaphyllus L- II. Characterisation and mode of action, Virology, 18,
241—248 (1962).
1377. Ragetit H. W- Л, Weintraub M., Immuno-osmophoresis; a rapid and sensitive method
for evaluating viruses, Science, 144, 1023—1024 (1964).
1378. Ralph R. K., Bergquist P. L-, Separation of viruses into components. In «Methods
in Virology» K. Maramorosch and H. Koprowski, eds.), Vol. 2, pp. 463—545, Acade-
mic Press, New York, 1967.
1379. Ralph R. K-, Clark M. F-, Intracellular location of double-stranded plant viral ribo-
nucleic acid, Biochim. Biophys. Acta, 199, 29—36 (1966).
1380. Ralph R. K., Matthews R. E- F-, Nature of infectious material in deoxyribonucleo-
protein preparations from leaves infected with tobacco mosaic virus, Biochem. Biophys.
Res. Commun., 12, 287—292 (1963).
1381. Ralph R. K., Wojcik S- J-, Synthesis of double-stranded viral RNA by cell-free extracts
from turnip yellow mosaic virus-infected leaves, Biochim. Biophys. Acta, 119, 347—
361 (1966).
1382. Ralph R. K., Wojcik S- J., Effects of 2-thiouracil on synthesis of doublestranded
turnip yellow mosaic virus RNA in cell-free extracts, Biochim. Biophys. Acta, 129,
625—627 (1966).
1383. Ralph R. K., W ojcik S- J., Double-stranded tobacco mosaic virus RNA, Virology, 37,
276-282 (1969)'
1384. Ralph R. K., Matthews R. E. F., Matus A. I., Mandel H. G., Isolation and properties
of double-stranded RNA from virus infected plants, J. Mol. Biol., 11, 202—212 (1965).
1385. Ralph R. K., Matthews R. E- F., Matus A. I., Effects of 2-thiouracil on the formation
of double-stranded plant viral ribonucleic acid, Biochim. Biophys. Acta, 108, 53—66
(1965).
1386. Randles /. W-, Ribonuclease isozymes in Chinese cabbage systemically infected with
turnip yellow mosaic virus, Virology, 36, 556—563 (1968).
1387. Randles J. W-, Francki R. I. B-, Some properties of a tobacco ringspot virus isolate
from Fouth Australia, Australian J. Biol. Sci., 18, 979—986 (1965).
1388. Rappaport I., Acid dissociation of aggregates of antibody and tobacco mosaic virus,
with recovery of infectious virus, Biochim. Biophys. Acta, 47 , 206— 208 (1961).
1389. Rappaport I., Analysis of the cross-reaction between two strains of tobacco mosaic
virus, Nature, 189, 986—990 (1961).
1390. Rappaport I., The antigenic structure of tobacco mosaic virus, Advan. Virus Res.,
11, 223-271 (1965).
1391. Rappaport I., Siegel A., Inactivation of tobacco mosaic virus by rabbit antiserum,
J. Immunol., 74, 106—116 (1955).
1392. Rappaport I., Wildman S. G-, A kinetic study of local lesion growth on Nicotiana
glutinosa resulting from tobacco mosaic virus infection, Virology, 4, 265—274
(1957).
1393. Rappaport I., Wu J.-H-, Release of inhibited virus infection following irradiation
with ultraviolet light, Virology, 17, 411—419 (1962).
1394. Rappaport I., Wu J.-H., Activation of latent virus infection by heat, Virology, 20,
472-476 (1963).
1395. Rappaport I., Zaitlin M-, Antigenic study of the protein from a defective strain of
tobacco mosaic virus, Science, 157, 207—208 (1967).
1396. Rappaport I., Siegel A-, Owen R. D-, Wildman S. G-, A comparative study of antibody
inactivation of tobaccoj. mosaic virus, J. Immunol., 78, 259—261 (1957).
1397. Rappaport I., Wildman S- G., Furumoto W-, Inactivation of duponoltreated tobacco
mosaic virus with rabbit antiserum, Virology, 23, 389—393 (1964).
1398. Rappaport I., Siegel A., Haselkorn R-, Influence of the state of sub-unit aggregation
on the antigenic specificity of TMV and TYMV, Virology, 25, 325—328 (1965).
1399. Raski D. J., Hewitt W. B-, Plant-parasitic nematodes as vectors of plant viruses,
Phytopathology, 53, 39—47 (1963).
1400. Rast A. Th. B., Yield of glasshouse tomatoes as affected by strains of tobacco mosaic
virus, Neth. J. Plant Pathol., 73, 147—156 (1967).
1401. Rast A. Th. B-, Differences in aggressiveness between TMV-isolates from tomato on
clones of Lycopersicum peruvianum, Neth. J. Plant Pathol., 73, 186—189 (1967).
1402. Rauws A. G-, Jaspars E. M. J., Veldstra H-, The base compositions of ribonucleic acids
from alfalfa mosaic virus components, Virology, 23, 283—286 (1964).
1403. Raychandhuri S- P., Mishra M- D-, Inhibition of chilli mosaic virus infection by
growth regulators, Indian J. Exptl. Biol., 2, 190—192 (1964).
1404. Razin S-, The cell membrane of mycoplasma, Ann. N.Y. Acad. Sci., 143, 115—129
(1967).
1405. Развязкина Г. M-, Значение табачного трипса в развитии эпифитотий верхушечного
хлороза махорки, Докл. ВАСХНИЛ, 18, 27—31 (1953).
Литература
547
1406. Reddi К- К., Studies on tobacco leaf ribonuclease.'III. Its role in the synthesis of
tobacco mosaic virus nucleic acid, Biochim. Biophys. Acta, 33, 164—169 (1959).
1407. Reddi К. K., Studies on the formation of tobacco mosaic Virus ribonucleic acid.
II. Degradation of host ribonucleic acid following infection, Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S., 50, 75-81 (1963).
1408. Reddi К. K., Studies on the formation of tobacco mosaic virus ribonucleic acid.
III. Utilization of ribonucleosides of host ribonucleic acid, Proc. Natl. Acad.. Sci.
U.S., 50, 419-420 (1963).
1409. Reddi К. K., Studies on the formation of tobacco mosaic virus ribonucleic acid.
III. Fate of tobacco mosaic virus after entering tho host coll, Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S., 55, 593-598 (1966).
1410. Reddi К. K., Anjaneyalu Y. F-, Studies on the formation of tobacco mosaic virus
ribonucleic acid. I. Nonparticipation of deoxyribonucleic acid, Biochim. Biophys.
Acta, 72, 33—39 (1963).
1411. Reddy D. V- R., Black L. M., Production of wound-tumour virus and woundtumor
soluble antigen in the insect vector, Virology, 30 551—561 (1966).
1412. Rees M. W-, Short M. N-, Variations in the composition of two strains of tobacco
mosaic virus in relation to their host, Virology, 26, 596—602 (1965).
1413. Reichmann M- E-, The satellite tobacco necrosis virus; a single protein and its genetic
code, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S., 52, 1009-1017 (1964).
1414. Reichmann M. E-, Stace.-Smith R., Preparation of infectious ribonucleic acid from
potato virus X by means of guanidine denaturation, Virology, 9, 710—712 (1959).
1415. Reichmann M- E-,ReesM. W., Symons R. H., Markham R., Experimental evidence for
the degeneracy of the nucleotide triplet code, Nature, 195, 999—1000 (1962).
1416. Reichmann M. E-, Chang A. Y., Faiwan L., Clark J. M-, Jr., The satellite tobacco
necrosis virus in studies of genetic coding, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol.,
31, 139-144 (1966).
1417. Reid M. S., Matthews R. E- F-, On tho origin of the mosaic induced by turnip yellow
mosaic virus, Virology, 28, 536—570 (1966).
1418. Reinecke C- J-, Reisen R., Voorma И- O-, Bosch L-, Chain initiation during polypeptide
synthesis in a cell-free bacterial system programmed with plant viral messengers.
1. Dependence on formylation and ribosomal factors, Biochim. Biophys. Acta, 157,
566—578 (1968).
1419. Reinert R. A., Kasperbauer M. J., Influence of red and for red light on virus content
of callus tissues cultured from Nicotiana tabacum, Phytopathology, 56, 1108—1109
(1966).
1420. Rentschler L-, Aminosauresequenzen und physikochemisch.es Verhalten des Hiillpro-
teins eines Wildstammes des Tabakmosaikvirus. II. Aggregationsverhalten und
Ladungsurteilung im Vergleich zu den Stammen Vulgare und Dahlemense, Molec.
Gen. Genetics, 100, 96—108 (1967).
1421. Resconich E. C., Movement of tobacco necrosis virus in systemically infected soybeans,
Phytopathology, 53, 913—916 (1963).
1422. Rhim J- S-, Jordan L- E-, Mayor FI. D-, Cytochemical fluorescent antibody and elec-
tron microscopic studies on the growth of reo virus (Echo 10) in tissue culture, Virology,
17, 342-355 (1962).
1423. Rice R. V., Kaesberg P-, Stahmann M. A., The breaking of tobacco mosaic virus using
a new freeze drying method, Biochim. Biophys. Acta, 11, 337—343 (1953).
1424. Rice R. V-, Lindberg G- D., Kaesberg P-, Walker J. C-, Stahmann M. A., The three
components of squasch mosaic virus, Phytopathology, 45, 145—148 (1955).
1425. Richardson J-, Cylvester E. S-, Aphid honeydew as inoculum for the injection of pea
aphids with pea enation mosaic virus, Virology, 25, 472—475 (1965). Г <
1426. Richardson J-, Sylvester E- S-, Further evidence of multiplication of sowthistle yellow
vein virus in its aphid vector Hyperomyzus lactuceae, Virology, 35, 347—355
(1968).
1427. Рыжков В. Л., Влияние аминокислот и близких к ним соединений на репродукцию
вируса табачной мозаики, ДАН СССР, 80, 677—679 (1951).
1428. Ritossa F. М., Unstable redundancy of genes for ribosomal RNA, Proc. Natl. Acad.
Sci. U.S., 60, 509-516 (1968).
1429. Robb S- M-, A method for the detection of dahlia mosaic virus in Dahlia, Ann. Appl.
Biol., 52, 145-148 (1963).
1430. Roberts D. A., Corbett M. K., Reduced photosynthesis in tobacco plants infected with
tobacco ringspot virus, Phytopathology, 55, 370-371 (1965).
1431. Roberts F- M., Underground spread of potato virus X, Nature, 158, 663 (1946).
1432. Roberts F- M., The infection of plants by viruses through roots, Ann. Appl. Biol.,
37, 385-396 (1950).
1433. Rochow W. F-, Transmission of barley yellow dwarf virus acquired from liquid extracts
by aphids feeding through membranes, Virology, 12, 223—232 (1960).
1434. Rochow И7- F-, Latent periods in the aphid transmission of barley yellow dwarf virus,
Phytopathology, 53, 355—356 (1963).
35*
548 Литература
1435. Rochow W- F-, Apparent loss of vector specificity following double infection by two
strains of barley yellow dwarf virus, Phytopathology, 55, 62—68 (1965).
1436. Rochow W. F-, Possible shift in predominating strains of barley yellow dwarf virus
in New York, Plant Disease Reptr., 49, 687—691 (1965).
1437. Rochow Ж. F-, Ball E. M-, Serological blocking of aphid transmission of barley yellow
dwarf virus, Virology, 33, 359—362 (1967).
1438. Rochow W- F-, Brakke M. K-, Purification of barley yellow dwarf virus, Virology,
24, 310-322 (1964).
1439. Rochow W. F-, Eastop V. F-, Variation within Rhopalosiphum p_adi and transmission
of barley yellow dwarf virus by clones of four aphid species, Virology, 30, 286—296
(1966).
1440. Rochow W. F., Ross A. F-, Virus multiplication in plants doubly infected by potato
viruses X and Y, Virology, 1, 10—27 (1955).
1441. Rochow W. F-, Ross A. F-, Siegel В- M., Comparison of local lesion and electron micro-
scope particle-count methods for assay of potato virus X from plants doubly infected
by potato viruses X and Y, Virology, 1, 28—39 (1955).
1442. Rochow W. F., Jedlinski H., Coon B- F-, Murphy II. C., Variation in barley yellow
dwarf of oats in nature, Plant Disease Reptr., 49, 692—695 (1965).
1443. Rottger B., Ribonucleic acids of healthy and tobacco mosaic virus infected tobacco
leaves, Biochim. Biophys. Acta, 95, 525—531 (1965).
1444. Ross A. A., The concentration of alfalfa-mosaic virus in tobacco plants at different
periods of time after inoculation, Phytopathology, 31, 410—420 (1941).
1445. Ross A. F-, Localised acquired resistance to plant virus infection in hypersensitive
hosts, Virology, 14, 329—339 (1961).
1446. Ross A. F-, Systemic acquired resistance induced by localised virus infections in
plants, Virology, 14, 340—358 (1961).
1447. Ross 4. F-, Systemic effects of local lesion formation. In «Viruses of Plants»
(A- B. R. Beemster and J. Djikstra, eds.), pp. 127—150, North Holland Publ., Amster-
dam, 1966.
1448. Ross A. F-, Williamson С. E-, Physiologically active emanations form virus infected
plants, Phytopathology, 41, 431—438 (1951).
1449. Ross J. P., Effect of single and double infections of soybean mosaic and bean pod
mottle viruses on soybean yield and seed characters, Plant Disease Reptr., 52, 344—348
(1968).
1450. Rotten S-, Stein O., Razin S-, Reassembly of Mycoplasma membranes disaggregated
by detergents, Arch. Biochem. Biophys., 125, 46—56 (1968).
1451. Рувимов II. Г-, Некоторые данные по физиологии скручивания листьев картофеля,
Болезни растений, 19, 148—159 (1930).
1452. Roy D., Fraenkel-Co nr at H., Lesnaw J., Reichmann M. E-, The protein subunit of the
satellite tobacco necrosis virus, Virology, 38, 368—369 (1969).
1453. Rubio-Huertas M., Origin and composition of cell inclusions associated with certain
tobacco and crucifer viruses, Phytopathology, 46, 553—556 (1956).
1454. Rubto-Huertos M-, Hidalgo F. G-, Ultrathin sections of intranuclear and intracyto-
plasmic inclusions induced by severe etch virus, Virology, 24, 84—90 (1964).
1455. Rubio-Huertos M., Vela-Cornejo A., Light and electron microscopy of virus inclusions
in Amaranthus livldus cells, Protoplasma, 62, 184—193 (1966).
1456. Rubio-Huertos M., Vela A., Lopez-Abella D-, Crystalline arrays of spherical particles
in turnip yellow mosaic virus-infected cells, Virology, 32, 438—444 (1967).
1457. Rubio-Huertos M-, Matsui C-, Yamaguchi A., Kamel T., Electron microscopy of
X body formation in cells of cabbage infected with Brassica virus 3, Phytopathology,
58, 548-549 (1968).
1458. Ruppel E. G-, Possible particles of beet western yellows virus in the intestines of
viruliferous aphids, Phytopathology, 58, 256—257 (1968).
1459. Rushizky G. W., Knight C. A., Ribonuclease-sensitive infectious units from tomato
bushy stunt virus, Virology, 8, 448—455 (1959).
1460. Rushizky G. W., Knight C. A., McLaren A. D., A comparison of the ultraviolet light
inactivation of infectious ribonucleic acid preparations from tobacco mosaic virus,
with those of native and reconstituted virus, Virology, 12, 32—47 (1960).
1461. Russell G- E-, Breeding for resistance to sugar beet yellows, Brit. Sugar Beet Rev.,
28, 163-170 (1960).
1462. Russell G. E-, The control of Alternarla species on leaves of sugar beet infected with
yellowing viruses. I. Some effects of four fungicides on two beet varieties, Ann. Appl.
Biol., 56, 111—118 (1965).
1463. Russell G. E., Breeding for resistance to infection with yellowing viruses in sugar
beet. I. Resistance in virus-tolerant breeding material, Ann. Appl. Biol., 57, 311—320
(1966).
1464. Russell G. E., The control of Altemaria species on leaves of sugar beet infected with
yellowing. II. Experiments with two yellowing viruses and virustolerant sugar beet,
Ann. Appl. Biol., 57, 425-434 (1966).
Литература
549
1465. Ryder Е. J., Transmission of common lettuce mosaic virus through the gametes of the
lettuce plant, Plant Disease Reptr., 48, 522—523 (1964).
1466. Sadasivan T. S-, A quantitative study of the interaction of viruses in plants, Ann.
Appl. Biol., 27, 359—367 (1940).
1467. Sanger H. L., Untersuchungen uber schwer iibertragbare Formen des Rattle-Virus,
Proc. 4th Conf. Potato Virus Diseases, Brunswick, 1960, pp. 22—29, 1961.
1468. Sanger II. L-, Characteristics of tobacco rattle virus. I. Evidence that its two particles
are functionally defective and mutually complementing, Molec. Gen. Genetics, 101,
346-367 (1968).
1469. Slinger H. L-, Brandenberg E-, Ober die Gewinnung von infektiosem Press-Saft aus
«Wintertyp» Pflanzen des Tabak-Rattle-Virus durch Phenolextraktion, Naturwissen-
schaften, 48, 391 (1961).
1470. Sanger H. L-, Knight C. A., Action of actinomycin D on RNA synthesis in healthy
and virus infected tobacco leaves, Biochem. Biophys. Res. Commun., 13, 455—461
(1963).
1471. Safferman R. S-, Morris M. E., Algal virus: Isolation, Science, 140, 679—680
(1963).
1472. Saito Y., Iwata Y., Haemagglutination test for titration of plant virus, Virology,
22, 426-428 (1964).
1473. Sakar Relative infectivity of tobacco mosaic virus and its nucleic acid, Virology,
20, 185-193 (1963).
1474. Sakar S-, Is potato leaf roll virus transmissible by use of a phenol extract, Virology,
21, 510-513 (1963).
1475. Sakar S-, The amount and nature of ribonuclease sensitive infectious material during
biogenesis of tobacco mosaic virus, Z. Vererbungslehre, 97, 166—185 (1965).
1476. Sakar S-, Jockusch II., Wild type and defective coat proteins of tobacco mosaic virus,
Electrophoretic analysis of plant extracts in polyacrylamide gels, Biochim. Biophys.
Acta, 160, 259-261 (1968).
1477. Sakimura K., The present status of thrips-borne viruses. In «Biological Transmission
of Disease Agents» (K. Maramorosch, ed.), pp. 33 —40, Academic Press, New York,
1962.
1478. Salaman R. N., Protective inoculation againts a plant virus, Nature, 131, 468 (1933).
1479. Salaman R. N., The potato virus «X», its strains and reactions, Phil. Trans. Roy.
Soc., London, B229, 137—217 (1938).
1480. Sampson P. J., Taylor R. II., A comparison of the electron microscope. Microprecipi-
tin tests and indicator plants for the detection of potato viruses S, X, and Y, Phyto-
pathology, 58, 489—493 (1968).
1481. Samuel G., Some experiments on inoculating methods with plant viruses and on local
lesions, Ann. Appl. Biol., 18, 494—506 (1931).
1482. Samuel G-, The movement of tobacco mosaic virus within the plant, Ann. Appl. Biol.,
21, 90-111 (1934).
1483. Samuel G., Bald J. G-, On the use of primary lesions in quantitative work with two
plant viruses, Ann. Appl. Biol., 20, 70—99 (1933).
1484. Santilli V., Nepokroeff С. M., Gagliardi N. C., Susceptibility of pinto bean leaves
to tobacco mosaic virus and its relationship to leaf ribonuclease content, Nature, 193,
656-658 (1962).
1485. Sarov I., Becker У., RNA in the elementary bodies of trachoma agent, Nature, 217,
849—852 (1968).
1486. Sastry K. S-, Gordon M. P-, The photodynamic inactivation of tobacco mosaic virus
and its ribonucleic acid by acridine orange, Biochem. Biophys. Acta, 129, 32—41
(1966).
1487. Sastry K. S., Gordon M. P-, The photosensitised degradation of guanosine by acridine
orange, Biochim. Biophys. Acta, 129, 42—48 (1966).
1488. Sastry K. S. M., Effect of trace elements on multiplication and concentration of sunn-
hemp mosaic virus, Indian J. Exptl. Biol., 2, 185—189 (1964).
1489. Sato T-, Kyogoku Y., Higuchi S-, Mitsui Y-, Litaka Y-, Tsubot M., Miura K., A pre-
liminary investigation on the molecular structure of rice dwarf virus ribonucleic acid,
J. Mol. Biol., 16, 180-190 (1966).
1490. Saunder E., Schramm G., Die Bedeutung der Proteinhiille fiir die Wirtsspezifitat
von Pflanzenviren, Z. Naturforsch., 18b, 199—202 (1963).
1491. Schein R. D., Age-correlated changes in susceptibility of bean leaves to Uromyces
phaseoli and tobacco mosaic virus, Phytopathology, 55, 454—457 (1965).
1492. Schisler L- C., Sinden J. W-, Sigel E- M., Etiology, symptomology and epidemiology
of a virus disease of cultivated mushrooms, Phytopathology, 57, 519—526
(1967).
1493. Schlegel D. E-, The organic acid composition of healthy and tobacco mosaic virus
infected tobacco plants, Virology, 6, 1—7 (1958).
1494. Schlegel D. E-, Rawlins T. E-, A screening test of the effect of organic sompounds on
production of tobacco mosaic virus, J. Bacteriol., 67, 103—109 (1954).
550 Литература
1495. Schlegel D. E., Smith S- H., Sites of virus synthesis in plant cells. In «Viruses of
Plants» (A- B. R. Beemester and J. Dijkstra eds.), pp. 54—65, North-Holland Publ.,
Amsterdam, 1966.
1496. Schlegel D. E., Gold A. A., Rawlins T. E-, Suppressing effect of radioactive phosphorus
on symptoms and virus content of mosaic tobacco plants, Phytopathology, 43, 206—
209 (1953).
1497. Schlosser E. R., Ober den Einfluss des Gelbsuchtvirus auf eine nachfolgende Cerco-
spora-Infektion bei Zuckerriiben, Zucker, 9, 589—592 (1956).
1498. Schmelzer K., Schmidt H. E-, Schmidt H. B., Viruskrankheiten und virusverdachtige
Erscheinungen an Forstgeholzen, Arch. Forstw-, 15, 107—120 (1966).
1499. Schmid G. H-, Gaffron H., Light metabolism and chloroplast structure in chlorophyll-
deficient tobacco mutants, J. Gen. Physiol., 50, 563—582 (1967).
1500. Schmidt H. B-, Fritzsche R., Lehmann W., Die Obertragung des Weidelgrasmosaik-
Virus durch Nematoden, Naturwissenschaften, 50, 386 (1963).
1501. Schneider I. R., Difference in the translocatability of tobacco ringspot and southern
bean mosaic viruses in bean, Phytopathology, 54, 701—705 (1964).
1502. Schneider I. R., Diener T. O-, The correlation between the proportions of virus-related
products and the infectious component during the synthesis of tobacco ringspot virus,
Virology, 29, 92—99 (1966).
1503. Schneider I. R., Diener T- O., In vivo and in vitro decline of specific infectivity of
tobacco ringspot virus correlated with nucleic acid degradation, Virology, 35, 150—
157 (1968).
1504. Schneider I. R., Worley J. F-, Upward and downward transport of infectious particles
of southern bean mosaic virus through steamed portions of bean stems, Virology, 8,
230-242 (1959).
1505. Schneider I. R., Worley J. F., Rapid entry of infectious particles of southern bean
mosaic virus into living cells following transport of the particles in the water stream,
Virology, 8, 243—249 (1959).
1506. Schneider I. R., Diener T. O-, Safferman R. S', Blue-green algal virus LPP-1. Purifi-
cation and partial characterisation, Science, 144, 1127—1130 (1964).
1507. Schramm G-, Ober die Spaltung des Tabakmosaik-Virus und die Wiedervereinigung
der Spaltstiicke zu hohermolekularen Proteinen. 1. Die Spaltungsreaktion, Z. Natur-
forsch., 2b, 112-121 (1947).
1508. Schramm G-, Schumacher G-, Zillig W., An infectious nucleoprotein from tobacco
mosaic virus, Nature, 175, 549—550 (1955).
1509. Schroth M. N., Teakle D. S., Influence of virus and fungus lesions on plant exudation
and chlamydospore germination of Fusarium solani f. phaesoli, Phytopathology, 53,
610-612 (1963).
1510. Schulz J. T', Tetranijchus telarius (L.) new vector of virus Y, Plant Disease Reptr.,
47, 594-596 (1963).
1511. Schuster II., The ribonucleic acids of viruses. In «The Nucleic Acids» (E. Chargaff and
J. N. Davidson, eds.), Vol. 3, pp. 245 —301, Academic Press, New York, 1960.
(Нуклеиновые кислоты, стр. 205, ИЛ, М., 1962.)
1512. Schuster Н., Schram G-, Bestimmung der biologisch wirksamen Einheit in der Ribo-
senucleinsaur' des Tabakmosaikvirus auf chemischem Wege, Z. Naturforsch., 13b,
697-704 (1958).
1513. Schuster II., Wilhelm R. C., Reaction differences between tobacco mosaic virus and its
free ribonucleic acid with nitrous acid, Biochim. Biophys. Acta, 68, 554—560 (1963).
1514. Schuster H., Wittmann H. G-, The inactivating and mutagenic action of hydroxylamine
on tobacco mosaic virus, Virology, 19, 421—430 (1963).
1515. Schwartz J. II., Initiation of protein synthesis under the direction of tobacco mosaic
virus RNA in cell-free extracts of Escherichia coli, J. Mol. Biol., 30, 309—322 (1967).
1516. Schwartz J. H., Eisenstadt J. M., Brawerman G-, Zinder N. D., Biosynthesis of the
coat protein of coliphage f2 by extracts of Euglena gracilis, Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S., 53, 195-200 (1965).
1517. Scott II. A., Purification of cucumber mosaic virus, Virology, 20, 103—106 (1963).
1518. Scott II. A., Serological behaviour of cucumber mosaic virus (strain Y) and the virus
protein, Virology, 34, 79—90 (1968).
1519. Scott II. A., Kahn R. P-, Bozicevich J., Vincent M. M-, Detection of potato virus X
in tubers by the bentonite flocculation test, Phytopathology, 54, 1292—1293 (1964).
1520. Sehgal О. P-, Siegel A., Attempted enzymatic deamination of tobacco mosaic virus
ribonucleic acid, Nature, 202, 472—474 (1964).
1521. Sela I., Applebaum S- W-, Occurrence of antiviral factor in virus-infected plants,
Virology, 17, 543-548 (1962).
1522. Sela I., Harpaz I., Birk Y., Separation of a highly active antiviral factor from virus-
infected plants, Virology, 22, 446—451 (1964).
1523. Sela. I., Harpaz I., Birk Y., Suppression of virus infectivity in diseased plant tissue
following treatment with an antiviral factor from virus infected plants, Virology, 25,
80-82 (1965).
Литература
551
1524. Sela I., Harpaz I., Birk Y-, Identification of the active component of an antiviral fac-
tor isolated from virus-infected plants, Virology, 28, 71—78 (1966).
1525. Selman I. W-, The growth of the plant in relation to the incidence of virus infection,
J. Pomol. Hort. Sci., 23, 50—62 (1947).
1526. Selman I. И7., The effect of kinetin on infection of Petunia leaves and tomato leaves
with tomato spotted wilt virus, Ann. Appl. Biol., 53, 67—76 (1964).
1527. Selman I. W-, Brierley M. R., Pegg G- F-, Hill T- A., Changes in the free amino acids
and amides in tomato plants inoculated with tomato spotted wilt virus, Ann. Appl.
Biol., 49, 601—615 (1961).
1528. Selsky M. I., Black L- M-, Effect of high and low temperatures on the survival of
wound-tumor virus in sweet clover, Virology, 16, 190—198 (1962).
1529. Semal J., Action of hydrochloric acid on the infection of Nicotiana glutinosa leaves
by tobacco mosaic virus and by its nucleic acid, Virology, 16, 230—235 (1962).
1530. Semal J., Effects of actinomycin D in plant virology, Phytopathol. Z., 59, 55—71
(1967).
1531. Semal J., Hamilton R. I., RNA synthesis in cell-free extracts of barley leaves infected
with bromegrass mosaic virus, Virology, 36, 293—302 (1968).
1532. Semal J., Kummert J., Incorporation d’uridine MC dans des fragments de feuilles
d’orge infectees par le virus de la mosaique du brome, Ann. Epiphyties, 18, 11—19
(1967).
1533. Semancik J. S-, Purification and properties of two isolates of tobacco rattle virus
from pepper in California, Phytopathology, 56, 1190—1193 (1966).
1534. Semancik J. S., Studios on electrophoretic heterogeneity in isometric plant viruses,
Virology, 30, 698-704 (1966).
1535. Semancik J. S-, Bancroft J. B-, Further characterisation of tho nucleoprotein compo-
nents of bean pod mottle virus, Virology, 22, 33—39 (1964).
1536. Semancik J. S-, Bancroft J. B-, Stability differences between the nucleoprotein com-
ponents of bean pod mottle virus, Virology, 27, 476—483 (1965).
1537. Semancik J. S-, Kajiyama M. R-, In vitro degradation products of tobacco rattle virus,
J. Gen. Virol., 1, 211-218 (1967).
1538. Semancik J. S-, Kajiyama M. R., Enhancement of tobacco rattle virus stable form
infection by heterologous short particles, Virology, 34, 170—172 (1968).
1539. Semancik J- S-, Reynolds D- A., Assembly of protein and nucleoprotein particles
from extracted tobacco rattle virus protein and RNA, Science, 164, 559—560
(1969).
1540. Semancik J. S-, Weathers L- G-, Exocortis virus of citrus: Association of infectivity
with nucleic acid preparations, Virology, 36, 326—328 (1968).
1541. Serjeant E- P-, The transmission of European wheat striate mosaic virus by J'avcsella
pellucida (Fabr.) injected with extracts of plants and plant-hoppers, Ann. Appl. Biol.,
59, 39-48 (1967).
1542. Sevrertn H. P-, Ereitag H- J-, Western celery mosaic, Hilgardia, 11, 495—558 (1938).
1543. Shalaby R. A-, Banerjee K., Lauffer M- A., Ion binding by tobacco mosaic virus and
its protein, Biochemistry, 7, 955—959 (1968).
1544. Shallo, T- A., Relations of tobacco mosaic virus and barley stripe mosaic virus totheir
host cells as revealed by ultrathin tissue-sectioning for the electron microscope, Viro-
logy, 7, 193—219 (1959).
1545. Shalla T. A., Assembly and aggregation of tobacco mosaic virus in tomato leaflets,
J. Cell. Biol., 21, 253-264 (1964).
1546. Shalla T. A., Virus particles in chloroplasts of plants infected with the U5 strain
of tobacco mosaic virus, Virology, 35, 194—203 (1968).
1547. Shalla T. A., Amici A., The distribution of viral antigen in cells infected with tobacco
mosaic virus as revealed by electron microscopy, Virology, 31, 78—91 (1967).
1548. Shanks С- H., Jr., Chapman R. K., The use of antiviral chemicals to protect plants
against some viruses transmitted by aphids, Virology, 25, 83—87 (1965).
1549. Shatkin A. J-, Sipe J. D., Single-stranded adenine-rich RNA from purified reoviruses,
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S., 59, 246-253 (1968).
1550. Shaw J. G-, In vivo removal of protein from tobacco mosaic virus after inoculation of
tobacco leaves, Virology, 31, 665—675 (1967).
1551. Shaw J. G-, In vivo removal of protein from tobacco mosaic virus after inoculation
of tobacco leaves. II. Some characteristics of the reaction, Virology, 37, 109—116
(1969).
1552. Sheffield F- M. L-, The formation of intracellular inclusions in solanaceous hosts
infected with aucuba mosaic of tomato, Ann. Appl. Biol., 18, 471—493 (1931).
1553. Sheffield F- M. L-, Micrurgical studies on virus-infected plants, Proc. Roy. Soc.
(London), B126, 529-538 (1939).
1554. Sheffield F- M. L-, VII. Preliminary studies in the electron microscope of some plant
virus inclusion bodies, J. Roy. Microscop. Soc., 66, 69—76 (1946).
1555. Sheffield F- M. L-, Studies of the clove tree. IV. Natural grafting and its bearing on
sudden death disease, Ann. Appl. Biol., 39, 103—110 (1952).
552 Литература
1556. Shepherd J. F., Shalla T. A., Tobacco etch virus cylindrical inclusions; antigenically
unrelated to the causal virus, Virology, 38, 185—188 (1969).
1557. Shepherd R. J., Properties of a mosaic virus of corn and Johnson grass and its relation
to the sugar cane mosaic virus, Phytopathology, 55, 1250—1256 (1965).
1558. Shepherd R. J., Fulton R. W-, Identity of a seedborne virus of cowpea, Phytopatho-
logy, 52, 489—493 (1962).
1559. Shepherd R. J., Pound G. S-, Influence of boron nutrition of Nicotiana tabacum on the
multiplication of tobacco mosaic virus, Phytopathology, 50, 26—30 (1960).
1560. Shepherd R. J., Wakeman R- J-, Ghabrial S- A., Preparation and properties of the
protein and nucleic acid components of pea enation mosaic virus, Virology, 35, 255—
267 (1968).
1561. Shepherd R. J., Wakeman R. J-, Romanko R. R., DNA in cauliflower mosaic virus,
Virology, 36, 150-152 (1968).
1562. Shigematsu A., Mizusawa Y., Hirai T., Incorporation of two radioactive amino acids
into the nucleic acid fractions in tobacco leaves infected with tobacco mosaic virus,
Virology, 28, 331—338 (1966).
1563. Shikata E., Lu Y--T-, Electron microscopy of northern cereal mosaic virus in Japan,
Proc. Japan. Acad., 43, 918—923 (1967).
1564. Shikata E-, Maramorosch K., Electron microscope evidence for the systemic invasion
of an insect host by a plant pathogenic virus, Virology, 27, 461—475 (1965).
1565. Shikata E-, Maramorosch K., Plant tumor virus in arthropod host: Microcrystal for-
mation, Nature, 208, 507—508 (1965).
1566. Shikata E., Maramorosch K., Electron microscopy of pea enation mosaic virus in plant
cell nuclei, Virology, 30, 439—454 (1966).
1567. Shikata E-, Maramorosch IC, Electron microscopy of wound tumor virus assembly
sites in insect vectors and plants, Virology, 32, 363—377 (1967).
1568. Shikata E-, Maramorosch K., Electron microscopy of the formation of wound tumor
virus in abdominally inoculated insect vectors, J. Virol., 1, 1052—1073 (1967).
1569. Shikata E., Orenski S- W., Hirumi II., Mttsuhashi J., Maramorosch K., Electron
micrographs of wound-tumor virus in an animal host and in a plant tumor, Virology,
23, 441-444 (1964).
1570. Shikata E-, Maramorosch K., Granados R. R., Electron microscopy of pea enation
mosaic virus in plants and aphid vectors, Virology, 29, 426—436 (1966).
1571. Shikata E-, Maramorosch K-, Ling К. C-, Matsumoto T., On the mycoplasma-like
structures encountered in the phloem cells of American aster yellows, corn stunt,
Phillipine rice yellow dwarf and Taiwan sugar cane white leaf diseased plants, Nippon
Shokubutsu Byori Gakkaiho, 34, 208—209 (1968).
1572. Shimomura T., Hirai T-, The amount of lipids in tobacco leaves and the turnover
in the course of tobacco mosaic virus infection, Phytopathol. Z., 48, 421—433
(1963).
1573. Shipp W., Haselkorn R., Double-stranded RNA from tobacco leaves infected with
TMV, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S., 52, 401-408 (1964).
1574. Shope R. E., An antiviral substance from Penicillium funiculosum. I. Effect on infec-
tion in mice with swine influenza virus and Columbia S.K. encephalomyelitis virus
J. Exptl. Med., 97, 609-650 (1953).
1575. Siegel A., Mutual exclusion of strains of tobacco mosaic virus, Virology, 8, 470—477
(1959).
1576. Siegel A., Studies on the induction of tobacco mosaic virus mutants with nitrous
acid, Virology, 11, 156-167 (1960).
1577. Siegel A., Norman A., Action spectra for two strains of tobacco mosaic virus, Virology,
6, 725-731 (1958).
1578. Siegel A., Wildman S- G., Some natural relationships among strains of tobacco mosaic
virus, Phytopathology, 44, 277—282 (1954).
1579. Siegel 4., Wildman S- G-, The inactivation of the infectious centres of tobacco mosaic
virus by ultraviolet light, Virology, 2, 69—82 (1956).
1580. Siegel A., Wildman S- G., Ginoza W-, Sensitivity to ultraviolet light of infectious tobac-
co mosaic virus nucleic acid, Nature, 178, 1117—1118 (1956).
1581. Siegel A., Ginoza W-, Wildman S- G-, The early events of infection with tobacco
mosaic virus nucleic acid, Virology, 3, 554—559 (1957).
1582. Siegel A., Zaitlin M-, Sehgal От P-, The isolation of defective tobacco mosaic virus
strains, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S., 48, 1845—1851 (1962).
1583. Siegel A., Hills G- J., Markham R., In vitro and in vivo aggregation of the defective
PM2 tobacco mosaic virus protein, J. Mol. Biol., 19, 140—144 (1966).
1584. Silber G-, Burk L- G-, Infectivity of tobacco mosaic virus stored for fifty years in
extracted «unpreserved» plant juice, Nature, 206, 740—741 (1965).
1585. Simmonds N. Ж, Harrison E-, The genetics of reaction to pepper veinbanding virus,
Genetics, 44, 1281—1289 (1959).
1586. Simmons N. S., Blaut E. R., The structure of tobacco mosaic virus and its components,
Biophys. J., 1, 55-62 (1961).
Литература
553
1587. Simons J. N., Three strains of cucumber mosaic virus affecting bell pepper in the
everglades area of South Florida, Phytopathology, 47, 145—150 (1957).
1588. Simons J. A., Variation in the efficiency of aphid transmission of southern cucumber
mosaic virus and potato virus Y in pepper, Virology, 9, 612—623 (1959).
1589. Simons J. N., The pseudo-curly top disease in South Florida, J. Econ. Entomol., 55,
358-363 (1962).
1590. Simons J. N., Resistance of Capsicum annuum «Italian El» to infection with potato
virus Y, Phytopathology, 56, 1370—1375 (1966).
1591. Simons j. N., Coe D, M., Transmission of pseudo-curly top virus in Florida by a tree
hopper, Virology, 6, 43—48 (1958).
1592. Simons J. IV., Moss L- M., The mechanism of resistance to potato virus Y infection
in Capsicum annuum var. «Italian Е1», Phytopathology, 53, 684—691 (1963).
1593. Simons J. N., Swidler R., Moss L- M., Succulent-type plants as sources of plant virus
inhibitors, Phytopathology, 53, 677—683 (1963).
1594. Singer B-, Fraenkel-Conrat II., Effects of bentonite on infectivity and stability of
TMV-RNA, Virology, 14, 59—65 (1961).
1595. Singer B., Fraenkel-Conrat H-, Enzyme resistance of complexes with ribonucleic acid
with metals, Biochemistry, 1, 852—858 (1962).
1596. Singer B-, Fraenkel-Conrat IL, Effects of light in the presence of iron salts on ribo-
nucleic acid and model compounds, Biochemistry, 4, 226—233 (1965).
1597. Singer B-, Fraenkel-Conrat H., Dye-catalysed photoinactivation of tobacco mosaic
virus RNA, Biochemistry, 5 , 2446 — 2450 (1966).
1598. Singer B-, Fraenkel-Conrat H-, Chemical modification of viral RNA. VI. The action
of M-Methyl N' nitro-N-nitrosoguanidine, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S., 58, 234—239
(1967).
1599. Singer B., Fraenkel-Conrat IL, Greenberg J., Michelson A. Af., Reaction of nitroso-
guanidine (N-mothyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidino) with tobacco mosaic virus and
its RNA, Science, 160, 1235—1237 (1968).
1600. Singh M-, Hildebrandt A. C-, Movements of tobacco mosaic virus inclusion bodies
within tobacco callus cells, Virology, 30, 134—142 (1966).
1601. Singh R. P., Bagnall R. IL, Infectious nucleic acid from host tissues infected with
the potato spindle tuber virus, Phytopathology, 58, 696—699 (1968).
1602. Sinha R. C-, Effect of age of vector and of abdomen punctures on virus transmission,
Phytopathology, 53, 1170-1173 (1963).
1603. Sinha В. C., Sequential infection and distribution of wound-tumor virus in the internal
organs of a vector after ingestion of virus, Virology, 26, 673—686 (1965).
1604. Sinha R. C-, Recovery of potato yellow dwarf virus from hemolymph and internal
organs of an insect vector, Virology, 27, 118—119 (1965).
1605. Sinha R. C., Response of wound tumor virus infection in insects to vector age and
temperature, Virology, 31, 746—748 (1967).
1606. Sinha R. C., Serological detection of wheat striate mosaic virus in extracts of wheat
plants and vector leafhoppers, Phytopathology, 58, 452—455 (1968).
1607. Sinha R. C-, Black L. M., Studies on the smear technique for detecting virus antigens
in an insect vector by use of fluorescent antibodies, Virology, 17, 582—587 (1962).
1608. Sinha R. C., Chiykowski L- N., Multiplication of aster yellows virus in a nonvector
loafhopper, Virology, 31, 461—466 (1967).
1609. Sinha R. C-, Chiykowski L- N., Multiplication of wheat striate mosaic virus in its
leafhopper vector, Endria inimica, Virology, 32, 402—405 (1967).
1610. Sinha R. C., Reddy D. V- R-, Improved fluorescent smear technique and its applica-
tion in detecting virus antigens in an Insect vector, Virology, 24, 626—634 (1964).
1611. Sinha R. C-, Shelley S., The transovarial transmission of wound-tumor virus, Phyto-
pathology, 55, 324—327 (1965).
1612. Sinha R. C-, Reddy D. V- R., Black L. M., Survival of insect vectors after examination
of the haemolymph to detect virus antigens with fluorescent antibody, Virology, 24,
666-667 (1964).
1613. Slack C- R., Intracellular distribution of certain photosynthetic enzymes in leaves
of tropical grasses, Australian Soc. Plant Physiologists, Abstr. 9th Gen. Meeting,
1968.
1614. Slykhuis J- T-, Aceria tulipae Keifer (Acarina: Eriophyidae) in relation to the spread
of wheat streak mosaic, Phytopathology, 45, 116—128 (1955).
1615. Slykhuis J. T., Mite transmission of plant viruses. In «Biological Transmission of
Disease Agents» (K. Maramorosch, ed.), pp. 41—61, Academic Press, New York, 1962.
1616. Slykhuis J- 1'-, Vector and host relations of North American wheat striate mosaic
virus, Can. J. Botany, 41, 1171—1185 (1963).
1617. Slykhuis J- T., Mite transmission of plant viruses, Advan. Virus Res., 11, 97—137
(1965).
1618. Slykhuis J- T-, Andrews J. E., Pittmann U. J., Relation of date of seeding winter wheat
in southern Alberta to losses from wheat streak mosaic, root rot and rust, Can. J. Plant
Sci., 37, 113—127 (1957).
554
Литература
1619. Small G. D-, Tao M-, Gordon M. P-, Pyrimidine hydrates and dimers in ultraviolet
irradiated tobacco mosaic virus ribonucleic acid, J. Mol. Biol., 38, 75—87 (1968).
1620. Smith F- F., Johnson G. V., Kahn R. P-, Bing A., Repellancy of reflective aluminium
to transient aphid virus-vectors, Phytopathology, 54, 748 (1964).
1621. Smith F- H., McWhorter F. P., Anatomical effects of tomato ringspot virus in Vicia
faba, Am. J. Botany, 44, 470—477 (1957).
1622. Smith H. C-, The effect of aphid numbers and stage of plant growth in determining
tolerance to barley yellow dwarf virus in cereals, New Zealand J. Agr. Res., 10, 445—
466 (1967).
1623. Smith H- C., Wright G. M-, Barley yellow dwarf virus on wheat in New Zealand,
New Zealand Wheat Rev., 9, 60—79 (1964).
1624. Smith H. C-, Close R. C-, Rough B. F- A-, The efficiency of granular insecticides in
controlling virus diseases of crops, Proc. New Zealand Weed Pest Control Conf., 17,
168-174 (1964).
1625. Smith J. D-, Dunn D- B., The occurence of methylated guanines in ribonucleic acids
from several sources, Biochem. J., 72, 294—301 (1959).
1626. Smith К. M-, On the composite nature of certain potato virus diseases of the mosaic
group as revealed by the use of plant indicators and selective methods of transmission,
Proc. Roy. Soc. (London), B109, 251-266 (1931).
1627. Smith К. M-, A Text Book of Plant Virus Diseases, 615 pp., Churchill, London, 1937.
1628. Smith К. M-, Some notes on the relationship of plant viruses with vector and nonvector
insects, Parasitology, 33, 110—116 (1941).
1629. Smith К. M-, Plant virus vector relationships, Advan. Virus Res., 11, 61—93 (1965).
1630. Smith К. M., Brown R. M., Walne P. L-, Goldstein D. A., Electron microscopy of the
infection process of the blue green alga virus, Virology, 30, 182—192 (1966).
1631. Smith R. E-, Boncquet P- A., New light on curly top of sugar beet, Phytopathology,
5, 103-107 (1915).
1632. Smith S- H., Schlegel D. E., The Distribution of clover yellow mosaic virus in Vicia
faba root tips, Phytopathology, 54, 1273—1274 (1964).
1633. Smith 5. H., Schlegel D. E-, The incorporation of ribonucleic acid precursors in healthy
and virus infected plant cells, Virology, 26, 180—189 (1965).
1634. Smith S- H., McCall S- R., Harris J. H., Alterations in the auxin levels of resistant
and susceptible hosts induced by the curly top virus, Phytopathology, 58, 575—577
(1968).
1635. Sneath P. H. A., The construction of taxonomic groups, Symp. Soc. Gen. Microbiol.,
12, 289 -332 (1962).
1636. Sobey W. R., The inheritance of antibody response to tobacco mosaic virus in rabbits,
Australian J. Biol. Sci., 7, 111—117 (1954).
1637. Sol H. H., Some data on the occurrence of rallte virus at various depths in the soil
and its transmission, Tijdschr. Plantenziekten, 69, 208—214 (1963).
1638. SolH. H., Seinhorst J- W., The transmission of tobacco rattle virus by Trichodorus
pachydennus, Tijdschr. Plantenziekten, 67, 307—311 (1961).
1639. Solberg R. A., Bald J. G-, Virus invasion and multiplication during leaf histogenesis,
Virology, 17, 359—361 (1962).
1640. Solberg R. A., Bald J- G-, Cytoplasmic structure of healthy and TMV infected living
cells, Am. J. Botany, 49, 149—157 (1962).
1641. Solberg R. A., Bald J. G., Distribution of a nature and an alien form of tobacco mosaic
virus in the shoot apex of Nicotiana glauca Groh., Virology, 21, 300—308
(1963).
1642. Solymosy F-, Farkas (?. L-, Metabolic characteristics at the enzymatic level of tobacco
tissues exhibiting localised acquired resistance to viral infection, Virology, 21, 210—
221 (1963).
1643. Solymosy F-, Tener G- M., Reichmann M- E-, Partial nucleotide sequences in turnip
yellow mosaic virus RNA, Virology, 27, 409—417 (1965).
1644. Solymosy F-, Szinnai J., Beczner L-, Farkas G- L-, Changes in peroxidaseisozyme pat-
terns induced by virus infection, Virology, 32, 117—121 (1967).
1645. Sommer E-, Untersuchungen des Stoffwechsels vergilbungskranker Ruben unter
mitteldeutschen Verhaltnissen, Z. Zuckerind., 7, 387—393 (1957).
1646. Sonneborn T. M., The evolutionary integration of the genetic material into genetic
systems. In «Heritage from Mendel» (R. A. Brink, ed.), pp. 375—401, Univ, of Wiscon-
sin Press, Madison, Wisconsin, 1967.
1647. Spiegelman S', Haruna I., Holland I. B-, Beaudreau G-, Mills D-, The synthesis of
a self-propagating and infectious nucleic acid with a purified enzyme, Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S., 54, 919 -927 (1965).
1648. Spiegelman S-, Pace N. R., Mills D. R., Levlsohn R., Eikhom T. S-, Taylor M. M.,
Peterson R. L-, Bishop D. H. L-, The mechanism of RNA replication, Cold Spring
Harbor Symp. Quant. Biol., 33, 101—124 (1968).
1649. Spikes J. D., Stout M., Photochemical activity of chloroplasts isolated from sugar
beet infected with yellows virus, Science, 122, 375—376 (1955).
Литература
555
1650. Spire D., Contribution a L’etude serologique des virus vegetaux par la technique de
microelectrophoresis en milieu gdlose, Ann. Epiphytes, 18, 47—63 (1967).
1651. Спирин A. C-, On the macromolecular structure of native high-polymer ribonucleic
acid in solution, J. Mol. Biol., 2, 436—446 (1960).
1652. Спирин 4. C-, Температурный эффект и макромолекулярные структуры высоко-
полимерных рибонуклеиновых кислот различного происхождения, Биохимия, 26,
511-522, 1961.
4653. Sprague G. F., McKinney Н. Н-, Greeley L-, Virus as a mutagenic agent in maize,
Science, 141, 1052—1053 (1963).
1654. Sreenivasaya M-, Pirie N. W-, CCXXII. the disintegration of tobacco mosaic virus
preparations with sodium dodecyl sylphate Biochem. J., 32, 1707—1710 (1938).
1655. Stace-Smith R., Purification and properties of tomato ringspot virus and an RNA
deficient component, Virology, 29, 240—247 (1966).
1656. Stace-Smith R., Mellor F. C-, Eradication of potato viruses X and S by thermotherapy
and axillary bud culture, Phytopathology, 58, 199—203 (1968).
1657. Stace-Smith R., Reichmann M- E-, Wright N. S-, Purification and properties of tobacco
ringspot virus and two RNA-deficient components, Virology, 25, 487—494
(1965).
1658. Staehelin M., Inactivation of TMV-RNA with formaldehyde, Federation Proc., 16,
254 (1957).
1659. Staehelin M., Reaction of tobacco mosaic virus nucleic acid with formaldehyde,
Biochim. Biophys. Acta, 29, 410—417 (1958).
1660. Stahniann M. A., Gothoskar S- S-, The inhibition of the infectivity of tobacco mosaic
virus by some synthetic and natural polyelectrolytes, Phytopathology, 48, 362—365
(1958).
1661. Stahmann M. A-, Graf L. H., Patterson E- L-, Walker J C., WatsonD. W-, the inhibi-
tion of tobacco mosaic virus by synthetic lysine polypeptides, ,T. Biol. Chem., 189,
45-52 (1951).
1662. Stanley W- M., Chemical studies on the virus of tobacco mosaic. I. Some effects of
trypsin, Phytopathology, 24, 1055—1085 (1934).
1663. Stanley W- M., Isolation of a crystalline protein possessing the properties of tobacco-
mosaic virus, Science, 81, 644—645 (1935).
1664. Stanley W- M-, Chemical studies on the virus of tobacco mosaic virus. VI. The isolation
from diseased turkish tobacco plants of a crystalline protein possessing the properties
of tobacco mosaic virus, Phytopathology, 26, 305—320 (1936).
1665. Stanley W- M., Lauffer M. 4., Disintegration of tobacco mosaic virus in urea solu-
tions, Science, 89, 345—347 (1939).
1666. Stanley W- M-, Jr., Salas M-, Wahba A- J., Ochoa S., Translation of the genetic
message; factors involved in the initiation of protein synthesis, Proc. Natl. Acad.
Sci. U.S., 56, 290-295 (1966).
1667. Stapp C-, Bercks R-, Ober weitere Antrocknungsversuche mit Seren gegen Kartoffel-
viron, Phytopathol. Z., 15, 47—53 (1949).
1668. Stauffer R. F., Ross A. F., Effect of infection by potato virus Y on the concentration
of potato., virus X in tobacco plants, Phytopathology, 51, 740—744 (1961).
1669. Steere R. Electron microscopy of structural detail in frozen biological specimens,
J. Biophys. Biochem. Cytol., 3, 45—60 (1957).
1670. Steere R. L-, Tobacco mosaic virus; purifying and sorting associated particles accord-
ing to length, Science, 140, 1089—1090 (1963).
1671. Steere R. L., Purification. In «Plant Virology» (M. K. Corbett and H. D. Sisler, eds.),
pp. 211—234, Univ, of Florida Press, Gainsville, Florida, 1964.
1672. Steere R. L-, Ackers G- K., Purification and separation of tobacco mosaic virus and
southern bean mosaic virus by agar-gel filtration, Nature, 194, 114—116 (1962).
1673. Steere R. L-, Davis R. E-, Liquid gradient zone electrophoresis in removable capsules
for accurate sampling, Anal. Biochem., 22, 511—517 (1968).
1674. Steere R. L-, Williams R. C-, Identification of crystalline inclusion bodies extracted
intact from plant cells infected with tobacco mosaic virus, Am. J. Botany, 40, 81—84
(1953).
1675. Stegwee D., Ponsen M- B-, Multiplication of potato leaf roll virus in the aphid Myzus
persicae (Sulz.), Entomol. Exptl. Appl., 1, 291—300 (1958).
1676. Stein D. B., The developmental morphology of Nicotiana tabacum «White Burley»
as influenced by virus infection and gibberellic acid, Am. J. Botany, 49, 437—443
(1962).
1677. Steinschneider A., Fraenkel-Conrat H., Studies of nucleotide sequences in tobacco
mosaic virus ribonucleic acid. IV. Use of aniline in stepwise degradation, Biochemi-
stry, 5, 2735—2743 (1966).
1678. Steitz'lJ. A., Identification of the A protein as a structural component of bacterio-
phage R17, J. Mol. Biol., 33 , 923 -936 (1968).
1679. Steitz J- A., Isolation of the A protein from bacteriophage R17, J. Mol. Biol., 33,
937-945 (1968).
556
Литература
1680. Steudel W., Helling A., Die Vergilbungskrankheit der Rube, Mitt. Biol. Reichsanstalt
Lond-Forstwirtsch. Berlin-Dahlem, 79, 1—132 (1954).
1681. Stewart J. M., Young J- D., Benjamini E., Shimizu M., Leung C. Y., Immunochemi-
cal studies on tobacco mosaic virus protein. IV. The automated solidphase synthesis of
a decapeptido of tobacco mosaic virus protein and its reaction with antibodies to
the whole protein, Biochemistry, 5, 3396—3400 (1966).
1682. Stimmann M- W., Swenson K. G-, Effect of temperature and light on plant susceptibi-
lity to cucumber mosaic virus by aphid transmission, Phytopathology, 57, 1072—
1073 (1967).
1683. Stimmann M- Ж, Swenson K. G-, Aphid transmission of cucumber mosaic virus affec-
ted by temperature and age of infection in diseased plants, Phytopathology, 57, 1074—
1076 (1967).
1684. Stole A. L- H-, Veldstra H., Interactions of turnip yellow mosaic virus with quaternary
ammonium salts, Virology, 25, 508—515 (1965).
1685. Stoner W- N-, Corn (maize) viruses in the continental United States and Canada,
U.S. Dept. Agr., ARS 33-118, 95 pp., 1968.
1686. Strazielle C-, Benoit H., Hirth L-, Particularites structurales de 1’acide ribonucleique
extrait du virus de la mosaique jaune du navet II, J. Mol. Biol., 13, 735—748
(1965).
1687. Streeter D. (?., Gordon M. P-, Separation of Uj and U2 strains of tobacco mosaic virus
by continuous free-flow electrophoresis, Phytopathology, 56, 419—421 (1966).
1688. Strohmaler K-, A new procedure for quantitative measurements of virus particles in
crude preparations, J. Virol., 1, 1074—1081 (1967).
1689. Stubbs J- D-, Kaesberg P-, A protein subunit of bromegrass mosaic virus, J. Mol.
Biol., 8, 314-323 (1964).
1690. Stubbs L. L-, Motley dwarf virus disease of carrot in California, Plant Disease Reptr.,
40, 763-764 (1956).
1691. Stubbs L- L., Grogan R. G., Necrotic yellows; a newly recognised virus disease of
lettuce, Australian J. Agr. Res., 14, 439—459 (1963).
1692. Stubbs L- L-, Meagher J. W-, A virosis-like proliferation (witches’-broom) of lucerne
(Medicago saliva L.) caused by an eriophyid mite (A ceria medicaginis Keifer), Austra-
lian J. Agr. Res., 16, 125—129 (1965).
1693. Stussi C-, Lebeurter G-, Hirth L., Partial reconstitution of tobacco mosaic virus,
Virology, 38, 16-25 (1969).
1694. Subak-Sharpe H., Base doublet frequency patterns in tbe nucleic acid and evolution
of viruses, Brit. Med. Bull., 23, 116—168 (1967).
1695. Subak-Sharpe H-, Shepherd W- M-, Hay J., Studies on S-RNA coded by herpes virus,
Cold Spring tlarbor Symp. Quant. Biol., 31, 583—594 (1966).
1696. Subak-Sharpe H., Biirk R. R., Crawford L- V., Morrison J. M., Hay J., Ketr II- M.,
An approach to evolutionary relationships of mammalian DNA viruses through analy-
sis of the pattern of nearest neighbour base sequences, Cold Spring Harbor Symp.
Quant. Biol., 31, 737—748 (1966).
1697. Siiss R., Saunder E-, Rottger B., Senger H-, Versuche zur vermehrung infektioser
Ribonukleinsaure aus Tabakmosaikvirus in Chlorella, Biochem. Biophys. Acta, 95,
388-397 (1965).
1698. Sugiyama T-, Tobacco mosaic virus-like rods formed by «Mixed Reconstitution»
between MS2 ribonucleic acid and tobacco mosaic virus protein, Virology, 28, 488—
492 (1966).
1699. Sugiyama T-, Fraenkel-Conrat FI., Identification of 5' linked adenosine as end group
of TMV RNA, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S., 47, 1393-1397 (1961).
1700. Sugiyama T-, Fraenkel-Conrat H., The end groups of tobacco mosaic virus RNA-
II. Nature of the З'-linked chain end in TMV and of both ends in four strains, Bioche-
mistry, 2, 332—334 (1963).
1701. Сухов К- C-, К проблеме вирусных белков у злаков, ДАН СССР, 29, 137—138
(1940).
1702. Summers D. F-, Maziel J. V., Darnell J. E-, Evidence for virus specific noncapsid
proteins in polio virus-infected HeLa cells, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S., 54, 505—513
(1965).
1703. Summers E- M., Brandes E. W-, Rands R. D-, Mosaic of sugar cane in the United
States with species reference to strains of the virus, U.S. Dept. Agr. Tech. Bull., 955,
124 pp. (1948).
1704. Sumner J. B-, The isolation and crystallisation of the enzyme urease, J. Biol. Chem.,
69, 435-441 (1926).
1705. Sumner J. B., Crystalline urease, Ergeb. Enzymforsch., 1, 295—301 (1932).
1706. Sun C. N., Structural alterations of chloroplasts induced by virus in Abuiilon stria-
tum V. Thompson, Photoplasma, 60, 426—434 (1965).
1707. Sunderland D. W., Merrett M. J., Nicotinamide-adenine dinucleotides, adenosine
diphosphate and adenosine triphosphate content of tissues infected by tobacco mosaic
virus, Nature, 199, 1116—1117 (1963).
Литература
557
1708. Sunderland D. J7., Merrett M. J-, Nicotinamide-adonine dinucleotide and nicotin-
amide adenine dinucleotide phosphate concentrations in leaves of Nicotiana glutinosa
infected by tobacco mosaic virus, Nature, 200, 921 (1963).
1709. Sunderland D- W-, Merrett M. J-, Adenosine diphosphate and adenosine triphosphate
concentrations in leaves showing necrotic local virus lesions, Virology, 23, 274—276
(1964).
1710. Sunderland D- W-, Merrett M. /, The respiration of leaves showing necrotic local
lesions following infection by tobacco mosaic virus, Ann. Appl. Biol., 56, 477—484
(1965).
1711. Suseno H-, Hampton R. E-, The effect of strains of tobacco mosaic virus on peroxidase
and polyphenol oxidase activity in Nicotiana tabacum, Phytochemistry, 5, 819—822
(1966).
1712. Sutic D., Djordjevic B-, Effect of 5-fluorouracil on antigenic properties of tobacco
mosaic virus, Nature, 203, 434—435 (1964).
1713. Suzuki J-, Ilaselkorn R., Studies on the 5' terminus of turnip yellow mosaic virus
RNA, J. Mol. Biol., 36, 47-56 (1968).
1714. Swenson K. G., Bean yellow mosaic virus transmission by Myzus persicae, Australian
J. Biol. Sci., 15, 468-482 (1962).
1715. Swenson K. G., Welton R- E., Evaluation of plant susceptibility to infection with
bean yellow mosaic virus by aphid transmission, Phytopathology, 56, 269—271
(1966).
1716. Sylvester E. S-, Beet-mosaic virus-green peach aphid relationships, Phytopathology,
39, 417-424 (1949).
1717. Sylvester E- S-, Brassica nigra virus transmission. Some vector-virus-host plant rela-
tionships, Phytopathology, 43, 209—214 (1953).
1718. Sylvester E. S-, Retention of inoculativity in the transmission of pea enation mosaic
virus by pea aphids as associated with virus isolates, aphid reproduction and excretion,
Virology, 32, 524-531 (1967).
1719. Sylvester E-, Evidence or transovarial passage of sowthistle yellow vein virus in the
aphid Hyperomyzus lactucae, Virology, 38, 440—446 (1969).
1720. Sylvester E. S-, Richardson J-, Transmission of cabbage mosaic virus by green peach
aphids — stylet transmission studies, Virology, 22, 520—538 (1964).
1721. Sylvester E- S-, Richardson J-, Recharging pea aphids with pea anation mosaic virus,
Virology, 30, 592-597 (1966).
1722. Sylvester E- S-, Richardson J-, Additional evidence of multiplication of tho sowthistle
yellow vein virus in an aphid vector-serial passage, Virology, 37, 26—31 (1969).
1723. Sylvester E- S-, Simons J. N., Relation of plant species inoculated to efficiency of
aphids in the transmission of Brassica nigra virus, Phytopathology, 41, 908—910
(1951).
1724. Symington J-, Linear variation in stability of tobacco mosaic virus to stripping of
protein by detergent, Virology, 38, 309—316 (1969).
1725. Symington J-, Commoner B., Rod length in protein-stripped tobacco mosaic virus,
Virology, 32, 1-10 (1967).
1726. Symons R. H., Rees M- W-, Short M. N., Markham R., Relationships between tho
ribonucleic acid and protein of some plant viruses, J. Mol. Biol., 6, 1—15 (1963).
1727. Takahashi T-, Hirai T-, A cytochemical study of tobacco leaf cells infected with tobacco
mosaic virus, Virology, 19, 431—440 (1963).
1728. Takahashi T-, Hirai T., Respiratory increase in tobacco leaf epidermis in tho early
stage of tobacco mosaic virus infection, Physiol. Plantarum, 17, 63—70 (1964).
1729. Takahashi T., Hirai T-, Oxidative and phosphorylation activities of mitochondria
from tobacco leaf epidermis infected with' tobacco mosaic virus, Physiol. Plantarum,
18, 219-228 (1965).
1730. Takahashi T-, Hirai T-, Effect of tobacco mosaic virus infection on amino acid incor-
poration into isolated mitochondria from tobacco leaves, Physiol. Plantarum, 19,
888-899 (1966).
1731. Takahashi T-, Hayashi T-, Kiko Y., Evidence for multiplicity reactivation of ultra-
violet light irradiated ribonucleic acid isolated from tobacco mosaic virus, Japan.
J. Microbiol., 12, 187-193 (1968).
1732. Takahashi W- N., Changes in nitrogen and virus content of detached tobacco leaves
in darkness, Phytopathology, 31, 1117—1122 (1941).
1733. Takahashi W- N., Respiration of virus-infected plant tissue and effect of light on virus
multiplication, Am. J. Botany, 34, 496—500 (1947).
1734. Takahashi W- N., The inhibition of virus increase by malachite green, Science, 107,
226 (1948).
1735. Takahashi W- N., Christensen R. J., The virucidal action of high frequency sound
irradiation, Science, 79, 415—416 (1934).
1736. Takahashi W. N., Gold A. H., Serological studies with X protein, tobacco mosaic
virus, polymerised X protein and virus reconstituted from nucleic acid and X protein,
Virology, 10, 449-458 (1960).
558 Литература
1737. Takahashi W- N-, Ishii M., An abnormal, protein associated with tobacco mosaic
virus infection, Nature, 169, 419—420 (1953).
1738. Takahashi W. N., Rawlins T. E., Method for determining shape of colloidal particles.
Application in study of tobacco mosaic virus, Proc. Soc. Exptl. Biol., 30, 155—157
(1932).
1739. Takahashi Y., Orlob G. B-, Distribution of wheat streak mosaic virus-like particles
in Aceria tulipae, Virology, 38, 230— 240 (1969).
1740. Takebe I., Otsuki Y., Aoki S., Isolation of tobacco mesophyll cells in intact and active
state, Plant Goll Physiol. (Tokyo), 9, 115—124 (1968).
1741. Taniguchi T-, A rapid method for microanalytical determination of the amount of
tobacco mosaic virus in plant tissues, Nature, 194, 708 (1962).
1742. Taniguchi T-, The accumulation in plants of chromatographically separated components
of tobacco mosaic virus, Virology, 22, 245—252 (1964).
1743. Taniguchi T-, Effect of salts on the adsorption of tobacco mosaic virus to tobacco
leaf cell debris, Virology, 28, 131—134 (1966).
1744. Taniguchi T-, Chromatography of a mixture of tobacco mosaic virus and ribonuclease,
Virology, 30, 317-318 (1966).
1745. Taniguchi T-, Yamaguchi A., Hirai T-, Ribonuclease-induced stabilisation of an
alkali-labile TMV strain and lack of stabilisation of reaggregated TMV protein, Viro-
logy, 33, 757-759 (1967).
1746. Tao M., Gordon M. P-, Nester E. W., Kinetic isotope studies on the inactivation of
transforming deoxyribonucleic acid, tobacco mosaic virus and its nucleic acid by
ultraviolet light, Biochemistry, 5, 4146—4152 (1966).
1747. Tarr S. A. J., Leaf curl disease of cotton, Commonwealth Mycol. Inst. Kew, Surrey,
55 p., 1951.
1748. Taylor С. E., Transmission of raspberry ringspot virus by Longidorus elongatus (de
Man) (Nematoda: Dorylaimidae), Virology, 17, 493—494 (1962).
1749. Taylor С. E-, The multiplication of Longidorus elongatus (de Man) on different host
plants with reference to virus transmission, Ann. Appl. Biol., 59, 275—281 (1967).
1750. Taylor R. H., Smith P. R., The relationship between bean yellow mosaic virus and
pea mosaic virus, Australian J. Biol. Sci., 21, 429—437 (1968).
1751. Taylor R. H-, Grogan R. G., Kimble К. A., Transmission of tobacco mosaic virus
in tomato seed, Phytopathology, 51, 837—842 (1961).
1752. Teakle D. S-, Transmission of tobacco necrosis virus by a fungus, Olpidium brassicae,
Virology, 18, 224—231 (1962).
1753. Teakle D- S-, Gold А. Я-, Further studies of Olpidium as a vector of tobacco necrosis
virus, Virology, 19, 310—315 (1963).
1754. Teakle D. S-, Hiruki C-, Vector specificity in Olpidium, Virology, 24, 539 — 544 (1964).
1755. Teakle D. S-, Sylvester E- S-, Infection of plants by the feeding of aphids on leaves
sprayed with tobacco mosaic virus, Virology, 16, 363—365 (1962).
1756. TelizD., Transmission of tomato ringspot grape yellow vein, peach yellow bud mosaic,
and tobacco ringspot viruses by the nematode Xiphinema americanum Cobb. 1913.
Ph. D. Thesis, Univ, of California, Davis, California, 1966.
1757. Temmink J. H. M-, Campbell R. N., The ultrastructure of Olpidium brassicae.
III. Infection of host roots, Can. J. Bot., 47, 421—424 (1969).
1758. Thirumalachar M. J-, Inactivation of potato leaf roll by high temperature storage of
seed potatoes in Indian plains, Phytopathol. Z-, 22, 429—436 (1954).
1759. Thomas P. E., Fulton R. W-, Correlation of ectodesmata number with nonspecific
resistance to initial virus infection, Virology, 34, 459—469 (1968).
1760. Thomas P. E-, Fulton R. W., Resistance to spread of virus from cell to cell in T.I.
245 tobacco, Virology, 35, 108—111 (1968).
1761. Thompson W. W-, Weier T. E-, Drever H., Electronmicroscopic studies on chloroplast
from phosphorus deficient plants, Am. J. Botany, 51, 933—938 (1964).
1762. Thompson A- D-, Possible occurrence of interfering systems in virus-infected plants,
Nature, 187, 761—762 (1960).
1763. Thomson A. D., Effect of tobacco mosaic virus and potato virus Y on infection by
potato virus X, Virology, 13, 262—264 (1961).
1764. Thomson A- D., Interactions between plant viruses. 1. Appearance of new strains
after mixed infection with potato virus X strains, Virology, 13, 507—514 (1961).
1765. Thresh J. M-, Some effects of tannic acid and of leaf extracts which contain tannins
on the infectivity of tobacco mosaic and tobacco necrosis viruses, Ann. Appl. Biol.,
44, 608-618 (1956).
1766. Thresh J. M-, The spread of virus diseases in Cacao. W. African Cacao Res. Inst. Tech..
Bull., 5, 36 pp. (1958).
1767. Thresh J. M., Increased susceptibility to the mite vector (Phytoptus ribts Nal.) caused,
by infection with blackcurrant reversion virus, Nature, 202, 1028 (1964).
1768. Thresh J. M., Field experiments on the spread of blackcurrant reversion virus and
its gall mite vector (Phi/toptus ribts Nal.), Ann. Appl. Biol., 58, 219—230
(1966).
Литература
559
1769. Thrower L. В., A radioautographic study of the formation of local lesions by tobacco
mosaic virus, Phytopathology, 55, 558—562 (1965).
1770. Thung T. H., Physiologisch onderzoek met betrekking tot het virus der bladrolziekte van
de Aardappelplant, Solanurn. tuberosum L., Tijdschr. Plantenziekten, 34, 1—48 (1928).
1771. Thung T- H., Smetstof en plantencel bij enkele virusziekten van de Tabaksplant,
Handel. 6 Ned.-Ind- Natuurtvetensch. Congr. pp. 450—643 (1931) [Rev. Appl. Mycol.
11, 750-751 (1932)].
1772. Thung T. II., van der Want J. P. H-, Viruses and tannins, Tijdschr. Plantenziekten,
57, 173-174 (1951).
1773. Tilney-Bassett R- Л. E-, The structure of periclinal chimeras, Heredity, 18, 265—285
(1963).
1774. Timian R. G., Barley stripe mosaic virus seed transmission and barley yield as influen-
ced by time of infection, Phytopathology, 57, 1375—1377 (1967).
1775. Tinsley T. W-, The effects of varying the water supply of plants on their susceptibility
to infection with Viruses, Ann. Appl. Biol., 40, 750—760 (1953).
1776. Todd J- M., Spread of potato virus X over a distance, Proc. 3rd Conf. Potato Diseases,
Lisse-Wageningen, 1957 (1958).
1777. Todd J. M., The incidence and.control of aphid-borne potato virus diseases in Scotland,
European Potato J., 4, 316—329 (1961).
1778. Tomita K., Rich A., X-ray diffraction investigations of complementaty RNA, Nature,
201, 1160-1164 (1964).
1779. Tomlinson J. A., Control of lettuce mosaic by the use of healthy seed, Plant Pathol.,
11, 61-64 (1962).
1780. Tomlinson J. A-, Effect of phosphate and borate on the infectivity of some viruses
during purification, Nature, 200, 93—94 (1963).
1781. Tomlinson J. A-, GarrettR. G-, Role of Olpidium in the transmission of big vein disease
of lettuce, Nature, 194, 249—250 (1962).
1782. Tomlinson J. A., Garrett R. G., Studies on lettuce big-vein virus and its vector Olpi-
dium brassicae (Wor.) Dang, Ann. Appl. Biol., 54, 45—61 (1964).
1783. Tomlinson J. A-, Smith S. H., The use of density gradient centrifugation in a zonal
centrifuge rotor during purification of a pear virus, J. Gen. Virol., 3, 153—156 (1968).
1784. Tomlinson J. A., Walkey D- G. A., Effects of ultrasonic treatment on turnip mosaic
virus and potato virus X, Virology, 32, 267—278 (1967).
1785. Tomlinson J. A., Walkey D- G- A., Hughes D. E., Multiple transverse breakage of the
filamentous particles of turnip mosaic: virus by ultrasonic vibration, Nature, 207,
495-497 (1965).
1786. Townsley P. M-, Ribonucleoproteins in leaves infected with tobacco mosaic virus,
Nature, 197, 1274-1276 (1963).
1787. Tremaine J. H., The amino acid and nucleotide composition of the bean and cowpea
strains of southern bean mosaic virus, Virology, 30, 348—354 (1966).
1788. Tremaine J. H., Goldscack D. E-, The structure of regular viruses in relation to their
subunit amino acid composition, Virology, 35, 227—237 (1968).
1789. Tremaine J. H., Stace-Smith R., Chemical composition and biophysical properties
of tomato ringspot virus, Virology, 35, 102—107 (1968).
1790. Tremaine J, H., Willison R. S-, Estimation of the size of a stone fruit virus antigen by
the gel-precipitin technique, Can. J. Botany, 39, 1843—1845 (1961).
1791. Tremaine J. H., Wright N- S-, Cross-reactive antibodies in antisera to two strains
of southern bean mosaic virus, Virology, 31, 481—488 (1967).
1792. Treshow M., Dean G-, Horner F. M., Stimulation of tobacco mosaic virusinduced lesions
on bean by fluoride, Phytopathology, 57, 756—758 (1967).
1793. Tsao P. W., Intranuclear inclusion in the leaves of cotton plants infected with leaf
crumple virus, Phytopathology, 53, 243—244 (1963).
1794. Tsugita A., The proteins of mutants of TMV; classification of spontaneous and chemi-
cally evoked strains, J. Mol. Biol., 5, 293—300 (1962).
1795. Tsugita A., Fraenkel-Conrat H., The amino acid composition and C-terminal sequence
of a chemically evoked mutant of tobacco mosaic virus, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.,
46, 636-642 (1960).
1796. Tsugita A., Fraenkel-Conrat H., The composition of the proteins of chemically evoked
mutants of TMV-RNA, J. Mol. Biol., 4, 73—82 (1962).
1797. Tsugita A., Gish D- T-, Young J., Fraenkel-Conrat H., Knight C. A., Stanley W. M.,
The complete amino acid sequence of the protein of tobacco mosaic virus, Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S., 46, 1463-1469 (1960).
1798. Tsung С- M., Fraenkel-Conrat H-, The preparation and tryptic hydrolysis of S-amino-
ethylated tobacco mosaic virus protein, Biochemistry, 5 , 2061—2067 (1966).
1799. Tu J. C-, Ford R. E-, Effect of maize dwarf mosaic virus infection on respiration and
photosynthesis of corn, Phytopathology, 58, 282—284 (1968).
1800. Tu J. C-, Ford R. E-, Krass C- J-, Comparisons of chloroplasts and photosynthetic
rates of plants infected and not infected by maize dwarf mosaic virus, Phytopathology,
58, 285—288 (1968).
560
Литература
1801. Uppal В- NThe movement of tobacco mosaic virus in leaves of Nicotiana sylvestris,
Indian J. Agr. Sci., 4, 865—873 (1934).
1802. Ushiyama R., Bullivant S-, Matthews R. E- F., A mycoplasma-like organism associa-
ted with Phormium yellow leaf disease, New Zealand J. Botany, 7, 363—371 (1969).
1803. Uyemoto J. K., Grogan R. G-, Wakeman J. R., Selective activation of satellite virus
strains by strains of tobacco necrosis virus, Virology, 34, 410—418 (1968).
1804. Valenta V., Marcinka K., Enhanced infectivity of combined bottom and middle com-
ponents of red clover mottle virus, Acta Virology, 12, 288 (1968).
1805. Valleau W- D., Symptoms of yellow ringspot and longevity of the virus in tobacco
seed, Phytopathology, 29, 549—551 (1939).
1806. Valleau W. D., Classification and nomenclature of tobacco viruses, Phytopathology,
30, 820-830 (1940).
1807- Valleau W. D., Breeding tobacco varieties resistant to mosaic Phytopathology, 36,
412 (1946).
1808. Van der Plank J. E., A method for estimating the number of random groups of adjacent
diseased plants in a homogeneous field, Trans. Roy. Soc. S. Africa, 31, 269—278
(1946).
1809. Van der Plank J- E-, The relation between the size of fields and the spread of plant
disease into them, Part I. Crowd diseases, Empire J. Exptl. Agr., 16, 134—142 (1948).
1810. Vanderueken J., Effects of mineral oils and lipids on aphid transmission of beet mosaic
and beet yellow viruses, Virology, 34, 807—809 (1968).
1811. Vandeneken J-, Semal J., Aphid transmission of beet yellows virus inhibited by mine-
ral oil, Phytopathology, 56, 1210—1211 (1966).
1812. Vandeneken J., Vilalii N-, Inhibition de la transmission aphidienne de quelquos
phytovirus au moyen de pulverisations d’huile, Ann. Epithyties, 18, 125—132 (1967).
1813. Vandeneken J. A-, van Slogteren D. H. M., van der Want J. P. II., Immunological
methods. In «Modern Methods of Plant Analysis» (H. F. Liskens and M. V. Tracey,
eds.), Vol. 5, pp. 422—463, Springer, Berlin, 1962.
1814. Van der Want J. P. H., Onderzoekingen over virusziekten van de boon IPhaseolus
vulgaris L.), Diss. Wageningen, 84 pp. Meded. Inst, plzicktenk, Onderz. 85, Veenman
and Zonen, Wageningen, The Netherlands, 1954.
1815. Van Duin J-, Pley C. W-, Bonnet-Smits E. M-, Bosch L-, Interactions between plant
viral RNA and Escherichia coli ribosomes, Biochim. Biophys. Acta, 155, 444—455
(1968).
1816. Van Fleet D. 5., Histochemistry and function of the endodermis, Botan. Rev., 27,
165-220 (1961).
1817. Van Grlensven L. J. L. D., van Kammen A., The isolation of ribonuclease-resistant
RNA induced by cowpea mosaic virus: Evidence for two double-stranded RNA compo-
nents, J. Gen. Virol., 4, 423—428 (1969).
1818. Van Hoof FI. A., An investigation of the biological transmission of a nonpersistent
virus. Ph. D. Thesis, Wageningen Agr. Univ. Meded. Inst, plziektenk, Onderz. 161,
van Putten and Ortmeijer, Aklmar, The Netherlands, 1958.
1819. Van Hoof H- A., Trichodorus pachydermus and T. teres, vectors of the early browning
virus of peas, Tijdschr. Plantenziekten, 68, 391—396 (1962).
1820. Van Hoof II. A., Trichodorus teres a vector of rattle virus, Netl. J. Plant Pathol., 70,
187 (1964).
1821. Van Kammen A., The occurrence of infectious virus ribonucleic acid in the ribosomal
fraction from tobacco mosaic virus infected tobacco leaves, Mededel. Landbouwhoge-
school Wageningen, 63, 1—65 (1963).
1822. Van Kammen A., Purification and properties of the components of cowpea mosaic
virus, Virology, 31, 633—642 (1967).
1823. Van Kammen A., The relationship between the components of cowpea mosaic virus.
I. Two ribonucleoprotein particles necessary for the infectivity of GPMV, Virology,
34, 312-318 (1968).
1824. Van Kammen A., Brouwer D., Increase in polyphenol oxidase activity by a local virus
infection in uninoculated parts of leaves, Virology, 22, 9—14 (1964).
1825. Van Kammen A-, Henstra S., le T. S-, Morphology of tomato spotted wilt virus,
Virology, 30, 574-577 (1966).
1826. Van Ravenswaay-Claasen J- C., Synthesis of a plant viral specific protein in the cell
free system of Escherichia coli, Ph. D. Thesis, Univ, of Leiden, 1967.
1827. Van Ravenswaay-Claasen J. C-, van Leeuwen A. B. J-, Duifts G- A. H., Bosch L.,
In vitro translation of alfalfa mosaic virus RNA, J. Mol. Biol., 23, 535—544 (1967).
1828. Van Regenmortel M. II. 7., Purification of plant viruses by zone electrophoresis,
Virology, 23, 495—503 (1964).
1829. Van Regenmortel M. H. V., Plant virus serology, Advan. Virus. Res., 12, 207—271
(1966).
1830. Van Regenmortel M- II. I7., Serological studies on naturally occurring strains and
chemically induced mutants of tobacco mosaic virus, Virology, 31, 467—480
(1967).
Литерату pa
561
1831. Kara Regenmortel M. 11. V., Biochemical and biophysical properties of cucumber
mosaic virus, Virology, 31, 391—396 (1967).
1832. Kara Slogteren I). II. M-, VIII. Serological micro-reactions with plant viruses under
paraffin oil, Proc. 2nd Conf. Potato Virus Diseases, Lisse-Wageningen, pp. 51—54,
1955.
1833. Van Steveninck R. F. M., Influence of pea mosaic virus on the reproductive, capacity
of yellow lupins, Botan. Gaz., 119, 63—70 (1957).
1834. Van Velsen R. J., Crowley N. C-, Centrosema mosaic: Л plant virus transmitted by
both aphids and plant bugs, Nature, 189, 858 (1961).
1835. Van Vloten-Doting L., Verdeling van de genetische informatie aver do Natuurlijke
componenten van een plantvirus, Ph. D. Thesis, 87 pp., Univ, of Leiden, 1968.
1836. Van Vloten-Doting L., Jaspars E. M. J'., Enhancement of infectivity by combination
of two ribonucleic acid components from alfalfa mosaic virus, Virology, 33, 684—693
(1967).
1837. Van Vloten-Doting L-, Kruseman J., Jaspars E. M. J., The biological function and
mutual dependence of bottom component and top component a of alfalfa mosaic virus,
Virology, 34, 728—737 (1968).
1838. Varina A., Gibbs A. J., Woods It. D., Finch J. T., Some observations on the structure
of the filamentous particles of several plant viruses, J. Gon. Virol., 2, 107—114
(1968).
1839. Varma P. M., Ability of the white-fly to carry more than one virus simultaneously,
Current Sci. (India), 24, 317—318 (1955).
1840. Vasguez C-, Kleinschmidt A. K., Electron microscopy of RNA strands released from
individual reovirus particles, J. Mol. Biol._, 34, 137—147 (1968).
1841. Veldee 8., Fraenkel-Conrat IP., The characterisation of tobacco mosaic virus strains
by their productivity, Virology, 18, 56—63 (1962).
1842. Veriekamp J. II., Mosch W. II. M., Chromatographic studios on plant viruses.
III. The purification of potato virus X, potato virus Y, tobacco mosaic virus and
potato stem mottle virus by chromatography on cellulose columns with polyethylene
glycol-containing solutions as solvents, Virology, 23, 394—402 (1964).
1843. Verdun B. J. M., Bancroft J. B., The infectivity of tobacco mosaic virus RNA in coat
proteins from spherical viruses, Virology, 37, 501—506 (1969).
1844. Verhoyen M., Quelques researches sur deux variants particuliers du virus do la mosaique
du concombre, Agricultura (Louvain), 10, 359—375 (1962).
1845. Vinograd J., Bruner R., Band centrifugation of macromolecules in self generating den-
sity gradients. III. Conditions for convection-free band sedimentation, Bipolymers,
4, 157—170 (1966).
1846. Von Schmutterer II., Zur Kenntnis der Beissinsekten als Ubertrager pflanzlicher Viren,
Z. Angew. Entomol., 47, 277—301 (1961).
1847. Fora Sengbusch P., Aminosaureaustauscho und Tertiarstruktur eines Proteins. Vergleich
von Mutanten des Tabakmosaikvirus mit serologischen und physiko-chemischen Metho-
den, Z. Verorbungslehre, 96, 364—386 (1965).
1848. Von Sengbusch P., Influence of protein structure on selection of nitrous acid induced
mutants of TMV, Molec. Gen. Genetics, 99, 171—180 (1967).
1849. Von Sengbusch P-, Wittmann II. G-, Serological and physicochemical properties of the
wild strain and two mutants of tobacco mosaic virus with the same amino acid exchange
in different positions of the protein chain, Biochem. Biophys. Res. Commun., 18,
780-787 (1965).
1850. Von Wechmar M. B., van Regenmortel M. II. V., Serological studies on bromegrass
mosaic virus and its protein fragments, Virology, 34, 36—45 (1968).
1851. Von Wettstein D., Zech H., The structure of the nucleus and cytoplasm in hair cells
during tobacco mosaic virus reproduction, Z. Naturforsch., 17b, 376—379 (1962).
1852. Voorma II. O., Gout P. W., Duin J., Hoogendam B. W-, Bosch L-, The readout of turnip
yellow mosaic virus ribonucleic acid as a polycistronic messenger in cell-free systems
of Escherichia coll, Biochim. Biophys. Acta, 95, 446—460 (1965).
1853. Wacker W. E. C-, Gordon M. P., Huff J. W-, Metal content of tobacco mosaic virus
and tobacco mosaic virus RNA, Biochemistry, 2, 716—719 (1963).
1854. Wagner G. W-, Bancroft J. B., The self-assembly of spherical viruses with mixed coat
proteins, Virology, 34, 748—756 (1968).
1855. Walkey D. G. A., The production of virus-free rhubarb by apical tip-culture, J. Hort.
Sci., 43, 283-287 (1968).
1856. Walkey D. G. A., Webb M- J. TV., Virus in plant apical meristems, J. Gen. Virol., 3,
311-313 (1968).
1857. Walkinshaw С. II., Griffin G. D., Larson R. II., Trichodorus christiei as a vector of
potato corky ringspot (tobacco rattle) virus, Phytopathology, 51, 806—808 (1961).
1858. Wallace J. M., The use of leaf tissue in graft-transmission of psorosis virus, Phyto-
pathology, 37, 149-152 (1947).
1859. Wallace T., The Diagnosis of Mineral Deficiencies in Plants by Visual Symptoms, 2nd
cd., 107 pp., H.M. Stationery Office, London, 1951.
36-0893
562 Литература
1860. Walters II. J-, Some relationships of the three plant viruses in the differential grass-
hopper, Melanopus differentialis (Thos.), Phytopathology, 42, 355 (1952).
1861. Wang A. L-, Knight C. A., Analysis of protein components of tomato strains of tobacco
mosaic virus, Virology, 31, 101—106 (1967).
1862. Warmke H. E., Aucuba strain of tobacco mosaic virus: An unusual aggregate, Science,
156, 262-263 (1967).
1863. Warmke II. E., Fine structure of inclusions formed by the aucuba strain of tobacco
mosaic virus, Virology, 34, 149—159 (1968).
1864. Warmke II. E., Christie R. G-, Use of dilute osmium tetroxide for preservation of three-
dimensional crystals of tobacco mosaic virus, Virology, 32, 534—537 (1967).
1865. Warmke II. E., Edwardson J. R., Electron microscopy of crystalline inclusions of
tobacco mosaic in leaf tissue, Virology, 30, 45—57 (1966).
1866. Waskell L. A., Sastry K- S-, Gordon M. P., Studies on the photosensitised breakdown
guanosine by methylene blue, Biochim. Biophys. Acta, 129, 49—53 (I960).
1867. Watanabe Y., Millward S., Graham A. F., Regulation of transcription of the reovirus
genome, J. Mol. Biol., 36, 107—123 (1968).
1868. Watson D. II., Le Bouvier G. L., Tomlinson J. A., Walkey D. G. A., Electron micro-
scopy of antigen precipitates extracted from gel diffusion plates, Immunology, 10,
305-308 (1966).
1869. Watson D. J., Wilson J. H., An analysis of the effects of infection with leaf roll virus
on the growth and yield of potato plants and its interactions with nutrient supply and
shading, Ann. Appl. Biol., 44, 390—409 (1956).
1870. Watson M. A., Further studies on the relationship between hyoscyamus virus 3 and
the aphis Myzus persicae (Sulz.) with special reference to the effects of fasting, Proc.
Roy. Soc. (London), B125, 144—170 (1938).
1871. Watson M. A., The effect of sucrose spraying on symptoms caused by beet yellows
virus in sugar beet, Ann. Appl. Biol. 43, 672—685 (1955).
1872. Watson M.A., The effect of different host plants of potato virus C in determining its
transmission by aphids, Ann. Appl. Biol., 44, 599—607 (1956).
1873. Watson M. A., The ways in which plant viruses are transmitted by vectors, Rept.
7th Commonwealth Entomol. Conf.,, pp. 157—161, 1960.
1874. Watson M. A., Evidence for interaction or genetic recombination between potato viru-
ses Y and C in infected plants, Virology, 10, 211—232 (1960).
1875. Watson M. A., Heathcote G. D., The use of sticky traps and the relation of their catches
of aphids to the spread of viruses in crops, Rept. Rothamsted Exptl. Sta, pp. 292—300,
1965.
1876. Watson M. A., Mulligan T., The manner of transmission of some barley yellow-dwarf
viruses by different aphid species, Ann. Appl. Biol., 48, 711—720 (1960).
1877. Watson M. A., Roberts F. M., A comparative study of the transmission of hyoscyamus
virus 3, potato Y, and cucumber virus 1, by the vectors Myzus persicae (Sulz.), M.
circumflexus (Buckton) and Macrosiphum gei (Koch), Proc. Roy. Soc. (London), B217,
543—576 (1939).
1878. Watson M. 4., Roberts F- M-, Evidence against the hypothesis that certain plant
viruses are transmitted mechanically by aphids, Ann. Appl. Biol., 27, 227 — 233 (1940).
1879. Watson M. A., Watson D. J., The effect of infection with beet yellows and beet mosaic
virus on the carbohydrate content of sugar beet leaves and on translocation, Ann.
Appl. Biol., 38, 276—288 (1951).
1880. Way R. D., Gilmer R. M-, Reductions in fruit sets on cherry trees pollinated with
pollen from trees with sour cherry yellow, Phytopathology, 53, 399—401 (1963).
1881. Weathers L. G., Pound G. S-, Host nutrition in relation to multiplication of tobacco
mosaic virus in tobacco, Phytopathology, 44, 74—80 (1954).
1882. Weber P. V. V-, Inheritance of a necrotic-lesion reaction to a mild strain of tobacco
mosaic virus, Phytopathology, 41, 593—609 (1951).
1883. Weintraub M-, John V. T., Cytological abnormalities induced by high temperature
in Nicotiana glutinosa, Phytopathology, 56, 705—709 (1966).
1884. Weintraub M., Ragetli H. W. J., Coll wall composition of leaves with a localised virus
infection, Phytopathology, 51, 215—219 (1961).
1885. Weintraub M., Ragetli H. W- J-, Fine structure of inclusions and organelles in Vida
faba infected with bean yellow mosaic virus, Virology, 28, 290—302 (1966).
1886. Weintraub M-, Kemp W- G-, Ragetli II. W. J-, Studies on the metabolism of leaves
with localised virus infections. 1. Oxygen uptake, Can. J. Microbiol., 6, 407—415
(1960).
1887. Weintraub M., Ragetli H. W- J., Dwurazna M. M., Studies on the metabolism of
leaves with localised virus infections. Mitochondrial activity in TMV-infected Nico-
tiana glutinosa L., Can. J. Botany, 42, 541—545 (1964).
1888. Weissmann C., Billeter M. A., Schneider M. C., Knight C. A., Ochoa S., Replication
of viral RNA. VI. Nucleotide composition of the replicative form of tobacco mosaic
virus RNA and of its component strands, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S., 53, 653—656
(1965).
Литература
563
1889. Weissmann С., Billeter M. A., Vinuela E., Libonati M., Doublestranded RNA and the
replication of viral RNA. In «Viruses of Plants» (A. B. R. Beemstor and J. Dijkstra,
eds.), pp. 249—274, North-Holland Publ. Amsterdam, 1966.
1890. Weissmann C., Feix G., Slor H., In vitro synthesis of phage RNA: The nature of the
intermediates, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 33, 83—100 (1968).
1891. Welkie G. W-, Pound G. S-, Manganese nutrition of Nicotiana tabacum L., in relation
to multiplication of tobacco mosaic virus, Virology, 5, 92—109 (1958).
1892. Welkie G- W-, Pound G. $., Temperature influence on the rate of passage of cucumber
mosaic virus through tho epidermis of cowpea loaves, Virology, 5, 362—371 (1958).
1893. Welkie G. W-, Young S. F-, Miller G- W., Metabolite changes induced by cucumber
mosaic virus in resistant and susceptible strains of cowpea, Phytopathology, 57,
472-475 (1967).
1894. Welsh R. S-, Brakensick A., Cornell N., Habener J., Detergent degradation of the
methylene blue complex of tobacco mosaic virus, Virology, 16, 213—219 (1962).
1895. Wensler R. J. D-, Mode of host selection by an aphid, Nature, 195, 830—831 (1962).
1896. Werbin II., Hidalgo-Salvatierra O., Seear J., McLaren A. D., Comparative photoreac-
tivation of ultraviolet light-inactivated tobacco mosaic virus ribonucleic acid on
Chenopodium, pinto bean and tobacco plants, Virology, 28, 202—207 (1966).
1897. Wetter C., Serology in virus-disease diagnosis, Ann. Rev. Phytopathol., 3, 19—42
(1965).
1898. Wetter C., Immuno-diffusion of tobacco mosaic virus and its interaction with agar,
Virology, 31, 498—507 (1967).
1899. Whitcomb R. F-, A comparison of serological scoring with test plant scoring of leaf-
hoppers infected by wound tumor virus, Virology, 24, 488—492 (1964).
1900. Whitcomb R. F., Black L- M., Synthesis and assay of wound-tumor soluble antigen
in an insect vector, Virology, 15, 136—145 (1961).
1901. Whitcomb R. F-, Sinha R. C., Effect of host components and sucrose on infection by
potato yellow dwarf virus, Phytopathology, 54, 142—146 (1964).
1902. Whitcomb R. F-, Spendlove R. S., Density gradient centrifugation of virus antibody
complexes; a sensitive serological method, Virology, 30, 752—754 (1966).
1903. Whitcomb R. F-, Jensen D. D-, Richardson J., The infection of leafhoppers by western X
disease virus. IV. Pathology in the alimentary tract, Virology, 34, 69—78 (1968).
1904. White J. C., Horn N. L., The histology of tabasco peppers infected with tobacco etch
virus, Phytopathology, 55, 267—269 (1965).
1905. Whitehead T-, Respiration of healthy and leaf roll potatoes, Nature, 128, 967 (1931).
1906. Whitfeld P. R., A method for the determination of nucleotide sequence in polyribo-
nucleotides, Biochem. J., 58, 390—396 (1954).
1907. Whitfeld P. R., Application of the periodate method for the analysis of nucleotide
sequence to tobacco mosaic virus RNA, Biochim. Biophys. Acta, 108, 202—210
(1965).
1908. Whitfeld P. R-, Williams S-, On the ribonuclease activity associated with tobacco
mosaic virus preparations, Virology, 21, 156—161 (1963).
1909. Wildman S. G., Cheo С. C-, Bonner J., The proteins of green leaves. III. Evidence of
the formation of tobacco mosaic virus protein at the expense of a main protein compo-
nent in tobacco loaf cytoplasm, J. Biol. Chem., 180, 985—1001 (1949).
1910. Williams R. C-, Smith К. M., The polyhedral form of the Tipula irridescent virus,
Biochim. Biophys. Acta, 28, 464—469 (1958).
1911. Williams R. C-, Steere R. L., Electron microscopic observations on the unit length
of tho particles of tobacco mosaic virus, J. Am. Chem. Soc., 73, 2057—2060 (1951).
1912. Williams R. C., Wycoff R. G. W., The thickness of electron microscopic objects,
J. Appl. Phys., 15, 712—716 (1944).
1913. Williams S., Whitfeld P. R., Fractionation of partially degraded tobacco mosaic
virus ribonucleic acid, Nature, 211, 102—104 (1966).
1914. Williamson К. I., Taylor W. B., The analysis of particle counts by the spraydrop
method, Brit. J. Appl. Phys., 9, 264—267 (1958).
1915. Wilson C. L., Loomis W. E., Botany, 3rd ed. 573 pp., Holt Rinehart and Winston,
New York, 1962.
1916. Wilson N. S., Jones L. S-, Cochran L. C., An eriophyid mite vector of the peach mosaic
virus, Plant Disease Reptr., 39, 889—892 (1955).
1917. Wiltshire G. H., Changes in the organic acids of leaves associated with infection by
plant viruses, Congr. Intern. Biochim. 3е, Brussels, p. 102, 1955.
1918. Wiltshire G. II., The effect of darkening on the susceptibility of plants to infection
with viruses. I. Relation to changes in some organic acids in the French bean, Ann.
Appl. Biol., 44, 233-248 (1956).
1919. Wiltshire G. II., The effect of darkening on the susceptibility of plants to infection
with viruses. II. Relation to changes in ascorbic acid content of French bean and tobac-
co, Ann. Appl. Biol., 44, 249—255 (1956).
1920. Wimmer E., Reichmann M. E-, Pyrophosphate in the 5' terminal position of a vira
ribonucleic acid, Science, 160, 1452—1454 (1968).
36*
564
Литература
1921, Wimmer Е., Chang А. У., Clark J. M-, Jr., Reichmann M. E., Sequence studies of
satellite tobacco necrosis virus RNA. Isolation and characterisation of a 5' terminal
trinucleotide, J. Mol. Biol., 38, 59-73 (1968).
1922. Wittmann H. G., Comparison of the tryptic peptides of chemically induced and spon-
taneous mutants of tobacco mosaic virus, Virology, 12, 609—612 (I960).
1923. Wittman II. G., Proteinuntersuchungen an Mutanten des Tabakmosaikvirus als Boitrag
zur Problem des genetischen Codes, Vererbungslehre, 93, 491—530 (1962).
1924. Wittmann II. G., Proteinanalysen von chemisch indizierten Mutanten dos Tabak-
mosaikvirus, Vererbungslehre, 95, 333—334 (1964).
1925. Wittmann II. G., Die primare Protoinstruktur von Stammen des Tabakmosaikvirus.
Teil 4. Aminosauresequenzen (1 bis 61 und 135 bis 158) des Proteins dos Tabakmosaik-
virus-Stammos U2, Naturforsch., 20b, 1213—1223 (1965).
1926. Wittmann II. G., Ein Stamm des Tabakmosaikvirus mit freier N-terminaler Amino-
saure in der Hullproteinkette, Vererbungslehre, 97, 204—208 (1965).
1927. Wittmann H. G., Die Proteinstruktur der Defektmutante PM2 des Tabakmosaikvirus,
Vererbungslehre, 97, 297—304 (1965).
1928. Wittmann II. G., Wlttmann-Liebold B., Protein chemical studies of two RNA viruses
and their mutants, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 31, 163—172 (1966).
1929. Wlttmann-Liebold B., Wittmann II. G., Coat proteins of strains of two RNA viruses:
Comparison of their amino acid sequences,Molec. Gen. Genetics, 100, 358—363 (1967).
1930. Wolanskl B. S., Francki R. I. B-, Chambers T. C., Structure of lettuce necrotic yellow
virus. 1. Electron microscopy of negatively stained preparations, Virology, 33, 287 —
296 (1967).
1931. Wolffgang II., Keck A., Untersuchungen fiber den Stoffwechsel viruskrankor Pflanzen.
1. Die Phosphatase-Activitat in Nicotiana tabacum L. var. Samsun nach Infektion
mit TMV, Phytopathol. Z., 34, 57-65 (1958).
1932. Wolstenholme D. R., Bochstahler L- E., Electron microscopy of doublestrandod RNA
induced by turnip yellow mosaic virus and tobacco mosaic virus, Molec. Gen. Genetics,
100, 349-357 (1967).
1933. Wood II. A., Bancroft J. B., Activation of a plant virus by related incomplete nucleo-
protein particles, Virology, 27, 94—102 (1965).
1934. Woods D- D-, The relation of p-aminobenzoic acid to the mechanism of action of sulpha-
nilamide, Brit. .1. Exptl. Path., 21, 74—90 (1940).
1935. Worley J. F., Translocation of southern bean mosaic virus in phloem, fibres, Phyto-
pathology, 55, 1299—1302 (1965).
1936. Worley J. F., Schneider I. R., Progressive distribution of southern bean mosaic virus
antigen in bean leaves determined with a fluorescent antibody stain, Phytopathology,
53, 1255-1257 (1963).
1937. Worley J. F., Schneider I. R., Long-term storage of purified southern bean mosaic
virus freeze-dried in the presence of lactose, Phytopathology, 56, 1327 (1966).
T938. Wright N. S., Detection of strain-specific serological activity in antisera of tobacco
mosaic virus, clover yellow mosaic virus, and potato virus X, by complement fixation,
Virology, 20, 131-136 (1963).
1939. Wright N. S., Hardy M-, Fixation of complement by strains of potato virus X, Viro-
logy, 13, 414—419 (1961).
1940. Wright N. S-, Stace-Smith R., A comparison of the sensitivity of three serological
tests for plant viruses and other antigens, Phytopathology, 56, 944—948 (1966).
1941. Wu J.-H., Release of inhibited tobacco mosaic virus infection by ultraviolet irradia-
tion as a function of time and temperature after inoculation, Virology, 24, 441—445
(1964).
1942. Wu J.-H., Hudson W., Absence of interference between tobacco mosaic virus and
tobacco necrosis virus in the initiation of infection, Virology, 20, 158—161 (1963).
1943. JTu J.-II., Wildman S. G., Interference experiments relating to whether tobacco
mosaic virus and cucumber viruses 3 and 4 are strains of the same virus, Nature, 199,
1015—1016 (1963).
1944. Wu J.-H., lakely L. M-, Dimitman J. E., Inactivation of a host resistance mechanism
us an explanation for heat activation of TMV-infected bean leaves, Virology, 37,
658-666 (1969).
1945. Wu J.-H., Hudson W., Wildman S. G., Quantitative analysis of interference produced
by related strains of TMV compared with non-infectious TMV components, Phyto-
pathology, 52, 1264—1265 (1962).
1946. Wycoff R- W. G., An ultracentrifugal study of the pH stability of tobacco mosaic
virus protein, J. Biol. Chem., 122, 239—247 (1937).
1947. Yamaguchi A-, Hirai T., The effect of local infection with tobacco mosaic virus on
respiration in leaves of N. glutinosa, Phytopathology, 49, 447—449 (1959).
1948. Yamaguchi A-, Hirai T-, Symptom expression and virus multiplication in tulip
petals, Phytopathology, 57, 91—92 (1967).
1919. Yamazaki H., Kaesberg P-, Unusual base composition of the ribonucleic acid of wild
cucumber mosaic virus, Nature, 191, 96—97 (1961).
1951.
1952.
1953.
1954.
1955.
1956.
1957.
1958.
1959.
1960.
1961.
1962.
1963.
1964.
1965.
1960.
1967.
1968.
1969.
С. Е., Mechanical transmission of an apple mosaic virus, Hilgardia, 23,
(1955).
С. E., Mechanical transmission of plant viruses, Advan. Virus. Res., 4,
(1957).
Virus increase in seedling roots, Phytopathology, 49, 220—223 (1959).
1970.
1971.
1972.
1973.
1974.
1975.
1976.
1977.
1978.
1979.
1980.
1981.
Литература 565
1950. Yamazakill., Kaesberg P., Biophysical and biochemical properties of wild cucumber
9—TsC(19t’l) аП<* tW° relatod virus-like particles, Biochim. Biophys. Acta, 51,
. Yamazaki II., Kaesberg P., Isolation and characterisation of a protein subunit of
broad bean mottle virus, J. Mol. Biol., 6, 465—473 (1963).
• Yamazaki II., Kaesberg P., Degradation of bromegrass mosaic, virus with calcium
nneox ° an( t*le isolation of its protein and nucleic acid, J. Mol. Biol., 7, 760—762
(1963).
’ Yarwood C. E., Associations of rust and virus infections, Science, 114, 127—128 (1951).
42 ™137 (1952) pbosPbate iu plant virus inoculations, Phytopathology,
43Ги/°9() ^(19^3)^СС1и*ГОС' rosistalice to tobacco mosaic virus in bean, Phytopathology,
675™681 C(lM3)^°at resPiration °* Injured and diseased leaves, Phytopathology, 43,
Deleterious effects of water in plant virus inoculations, Virology, 1,
268—285 (1955). , >
Yarwood ...................
613—628
Yarwood
243 — 278
Yarwood
Yarwood с. E., Infection of gymnosperms with nematode-transmitted viruses of
lowering plants, Virology, 24, 228-229 (1959).
50 rtZ74°l^ ^7/5."’ (j'gpo)*86^ ac9u’refl resistance to tobacco mosaic virus, Phytopathology,
The quick-drying effect in plant virus inoculations, Virology, 20,
ozi — b2o (1963).
Yarwood С. E., Bentonite aids virus transmission, Virology, 28, 459—462 (1966).
rariaood t’. Я., Sequence of supplements in virus inoculations, Phytopathology, 58,
luZ—lot) (19bo).
Уагшоой C. E., Holm E. W., Heat adaptation in a rust and a virus, Phytopathology,
oz, /up—711 (1962).
Yasuda Y., Hirai T., Incorporation of H’-uracil into tobacco leaf epidermis infected
with tobacco mosaic virus, Exptl. Cell Bos., 34, 210—212 (1964).
Youden W- J., Beale II. P., Guthrie J. C., Relation of virus concentration to the num-
ber lesions produced, Contrib. Boyce Thompson Inst., 7, 37—53 (1935).
r Bemjamini E., Shimizu M-, Leung C. Y., Feingold B. F., Antigenic
norox ° tryPtlc peptides of tobacco mosaic virus protein, Nature, 199, 831—832
(1963). 1
, 'W '°'’ Benjamini E., Stewart J. M., Leung C. Y., Immunochemical studies
on tobacco mosaic virus protein. V. The solid-phase synthesis of peptides of an anti-
genically active decapeptide of tobacco mosaic virus protein and the reaction of these
poptides with antibodies to the whole protein, Biochemistry, 6, 1455-1460 (1967).
jacnos L)., Relation entre 1 activite de certaines systemes oxyclasiques et la multiplica-
tion, chez la tomato du virus X de la pomrne de terra et dii virus de la mosaique du
tabac, Compt. Rend., 240, 2084-2086 (1955).
Zaitltn M., Isolation of tobacco leaf cells capable of supporting virus multiplication,
Nature, 184, 1002—1003 (1959).
Zaillin M., Graft transmissibility of a systemic virus infection to a hypersensitive
host — a interpretation, Phytopathology, 52, 1222—1223 (1962).
Zaitltn M., Ferris W. R., Unusual aggregation of a nonfunctional tobacco mosaic
virus protein, Science, 143, 1451—1452 (1964).
Zaillin M., Hariha'rasubramanian V., The purification of insoluble coat proteins from
detective mutants of tobacco mosaic virus, Phytopathology, 58, 1074 (1968).
jaitim M., Ilesketh J. D., The short-term effects of infection by tobacco mosaic virus
/7cir4?parent Photosynthesis of tobacco leaves, Ann. Appl.' Biol., 55, 239-243
Lagendorf .4. T., Photosynthetic phosphorylation and Hill reaction acti-
vities of chloroplasts isolated from plants infected with tobacco mosaic virus, Viro-
u/gy, 12, /177—486 (1960).
Zaitlin M., Keswani C. L., Relative infectivities of tissues containing a defective
tobacco mosaic virus strain, Virology, 24, 495—498 (1964).
Zantlin M., McCaughey W. F-, Amino acid composition of a nonfunctional tobacco
mosaic virus protein, Virology, 26, 500—503 (1965).
(1963)re M’’ Siee<!l Л’’ A VirUS inllibitor from tobacco, Phytopathology, 53, 224-227
Zech II., Untersuchung iiber den Infectionsvorgang und die Wanderung des Tabak-
mosaikvirus im Pflanzonkorper, Planta, 40, 461—514 (1952).
566 Литература
1982. Zech ff., Morphologische und cytochemische Beobachtungen an Tabakmosaikvirus-
infizierten Protoplasten von Nicotiana tabacum, Exptl. Cell Res., 6, 560—562 (1954).
1983. Zech II., Cytochemische Untersuchungen zur Reproduktion des Tabakmosaikvirus,
II. U.V.-spektrophotometriche Messungen an infizierten Blattbaargellen von Nicotiana
tabacum, Z. Naturforsch. (1963).
1984. Zech II., Vogt-Kohne L., Ultraviolettmikrospektrographische Untersuchungen an
Tabakmosaikvirus in situ, Naturwissenschafteen, 42, 337—339 (1955).
1985. Zettler F. IP., A comparison of species of Aphididae with species of three other aphid
families regarding virus transmission and probe behaviour, Phytopathology, 57,
398-400 (1967).
1986. Zettler F. W-, Wilkinson R. E., Effect of probing behaviour and starvation of Myzus
persicae on transmission of bean common mosaic virus, Phytopathology, 56, 1079—
1082 (1966).
1987. Zimmerman E. F-, Azaguanine inhibition of protein synthesis. III. Site of action
in HeLa cells, Biochim. Biophys. Acta, 157, 378—391 (1968).
1988. Zimmermann. M. ff., Transport in the phloem, Ann. Rev. Plant Physiol., 11, 167—190
(1960).
1989. Zink F. W., Grogan R. G-, Welch J. E-, The effect of percentage of seed transmission
upon subsequent spread of lettuce mosaic virus, Phytopathology, 46, 622—624 (1956).
1990. Zummo N-, Effect of treatment of seed cane on susceptibility of sugar cane to sugar
cane mosaic virus, Phytopathology, 57, 83—85 (1967).
ПРЕДМЕТНЫЙ УКАЗАТЕЛЬ
Абразивные материалы как добавки к иио-
кулуму 120
Абсцизовая кислота 250
Абутплоп, инфекционный хлороз 9, 176,
205
Адепозинаминогидролаза, действие па ВТМ
284
Адоиозиитрифосфатаза, влияние вирусной
инфекции 242
8-Азагуапии, антивирусная активность
343—346
— включение в РНК вирусов 12
— защита растений 466
Азид 357
— при хранении вирусов 47
Азот, влияние на восприимчивость к инфек-
ции 266
— содержание в вирусах 53
Азотистая кислота 155
— — инактивация вирусов 335, 336
— — мутагенное действие 201, 285, 286
Азотистый иприт, мутагенное действие 286
Аконитаза, влияние вирусной инфекции
242
Акридин, производные, инактивация виру-
сов 342
Акридиновый оранжевый как инактиви-
рующий агент 328
Актиномицин D 495
— влияние на вирус крапчатости кон-
ских бобов 153
_. __ репликацию вирусов 147
— возникновение симптомов па листьях
при введении 233
— ингибирование синтеза РИК 150
— как ингибитор вируса 350
— подавление развития приобретенной
устойчивости 280
— при радиоавтографии 153
Алании в структурном белке вируса-сател-
лита 156
Алкилирующие агенты, инактивация виру-
сов 339
— — мутагенное действие 286
Алюминиевая фольга при борьбе с тлями
460
Алюминий, процентное содержание при
вирусной инфекции 249
л-Амипобеизилцеллюлоза 368
Американская желтуха астр 229
Аминокислоты в вирусных штаммах 293
— в структурном белке ВТМ 287
— — — — замещения 302, 373
— — штаммах ВЖМТ 293
Аминокислоты, изменение концентрации
при вирусной инфекции 245, 246
— концевые в капсидном белке 79
4(5)-Амиио-1Н-1,2,3-триазол-5(4)-карбок-
сиамид 345
Аморфные включения 213, 214
АМФ-кипаза, влияние вирусной инфекции
242
Аналитическое ультрацентрифугированио
24-26
Ананас, увядание 230
Анизотропия в потоке 34
Антибиотики, антивирусная активность 349
Антивирусные препараты 465—467
Антигон(ы) вируса южной мозаики фасоли
в листьях бобов 172
— ВТМ 301, 158
— — накопление и распределение 166
— идентификация 368
— маскированные 483
— молекулярная масса 359
— поливалентность 362
— природа 359, 360
— структура 370—375
— функция 359
— центры связывания, химическая струк-
тура 371-373
Аптиметаболиты 343
Антисыворотка(и) 363, 364
— в вирусологии 29
— изменчивость 378
— перекрестное тестирование 376
— получение 361, 362
Антитела как цитохимические реагенты
379, 380
— моченные (связанные с) ферритином
166, 215, 380
---166
— образование, специфичность 361
— природа 359—361
— связывание ВТМ 351
— структура 360
Антоцианиновые пигменты, влияние вирус-
ной инфекции 249
Апикальная меристема, вирусы 176, 178,
220
— — культивирование 451, 452
Арахис 455, 461, 464
Ароматические соединения, влияние вирус-
ной инфекции 247, 248
Аскорбиновая кислота, влияние вирусной
инфекции 247, 256
Аспарагин 76, 245
Ахромицин 227
568
Предметны й указатель
Ауксины 250
Ауроомицин 227
N-Ацетилами иокислота в белках вирусни
156
А цетил фосфат 24(5
Бактериальные фильтры при выделении
вируса 4(5
Бактерии и происхождение вирусов 495
- - L-формы 228
Вактериофаг(и), образование 495
— синтез белков 144
Бактериоципогеииые факторы 495
Батат 178, 229, 430
Вацилловидиые частицы 102
Бсзвирусиый материал 448—453
Белковая(ые) оболочка(и) 85, 86, 106; см.
также Белок вирусов, Белок оболочки,
Белок структурный, Белковая субъеди-
ница, Капсидный белок
— — высвобождение вирусной РНК 144 —
147
— — икосаздрическая 200
— — при реконструкции вирусов 142—
144
— — стабильность 94
— — строение 95, 96
Болковая(ые) субъедипица(ы) 73—81, 85
— — агрегация (05
— — влияние на серологическую специ-
фичность 374, 375
— — ВТМ, отщепление 94
— — выделение 73—76
— продукты, типы 73
Белковый компонент вирусов 12
Белок в препаратах вирусной РНК 63
Белок(ки) в препаратах вирусной РНК 63
— вирусный(ые) (вирусов) 257; см. также
Белок оболочки, Белок структурный,
Белковая оболочка, Белковая субъедини-
ца, Капсидный белок
— — аминокислоты 76—78
— — связывание с антителами 371—373
— — синтез, независимость от синтеза
РНК 159, 160
— — структура, вторичная и третичная
80, 81
— — тепловая дегенерация 314, 315
— некапсидиый(е) 14
— — классификация вирусов 483
— — состав 141
— оболочки(ек); см. также Белок вирус-
ный, Белок структурный, Белковая обо-
лочка, Капсидный белок
— — в клетках 219
— — выделение 73—76
— — строение 494
— — цистрон, локализация 304
— растворимые, влияние вирусной инфек-
ции 240
— синтез иа ранних стадиях вирусной
инфекции 150
— структурный(е); см. также Белок
вирусный
— — аминокислоты, последовательность
79-80, 300, 301
---ВТМ 287, 291, 300, 301
Белок(ки) структурный дефектный 301, 302
— — классификация вирусов 481
— — перекрестная защита 309
— — различия между вирусными штам-
мами 293
— — роль в приобретенной устойчивости
280
— — синтез 155—158
— — субъединицы 53
— — функция 301
— удаление при выделении вируса 40
— фракции 1, иммуногенность 375
- А 105
— — агрегация, влияние па серологиче-
скую специфичность 374
— — выделение из ВТМ 75
— — преципитация 364, 374
- X 105, 374
---ВТМ 301
Белокрылки, передача вирусов 382, 412,
413
№-Бепзиладолии, инактивация вирусов 348
Бентонит 62
— адсорбция вирусоспецифичпых анти-
тел 31
— в реакции агглютинации 366
— влияние па механическую инокуля-
цию 121
— при выделении вирусов 40, 41
-------РНК 56, 68
Бесклеточные системы, использование для
репликации вирусов 137
Боспозвопочиые-переносчики 132, 381—419
Бластицидин S как ингибитор вируса 349
Болезни мозаичного типа, распределение
вируса 176
— сходные с вирусными заболеваниями 10
Бор, процентное содержание при вирусной
инфекции 249
Боратный буфер, использование при выде-
лении вирусов 39
Бородавчатость персиков 208
Бронзовость 446
Бутаиол-хлороформ, использование при
выделении вирусов 41, 42
Вегетативное размножение растений, пере-
дача вирусов ИЗ
Ведьмины метлы 226—230
Венерическая лимфограпулома, возбуди-
тель 228
Вереей, обработка ВТМ 70
Верхний компонент 23, 185
Верхушечные некрозы картофеля 209
Ветер, распространение вирусов 436, 437
ВЖМТ; см. Вирус желтой мозаики тур-
непса
Вириоп(ы) 85, 205, 481
Вироплазмы 168
Вирус аспермии томатов 491
— — — влияние иа мейоз 112
— аукуба-мозаики картофеля 490
— — — передача тлями 390
— бородавчатости цикория 490
— броизовости томатов 250
— — — включение Н8-уридииа 153
— — — влияние генетических факторов
на реакцию растения 261
— — — в цитоплазме 220
Предметный указатель
569
Вирус бронзовости томатов, защита расте-
ний 447
— -. — инактивация кинетином 348
— липиды 81, 243
— — — место сборки 167
— — — очистка, выход 50
— — — передача трипсами 416
— — — перекрестная защита 308
— — — размножение, влияние темпера-
туры 269, 270
— — — растения-хозяева 423, 424, 475
— — — рекомбинация между тйтаммами
306
— — — свойства 493
~ — — скополетип 247, 248
— _ _ строение 102
— — — чувствительность к свойствам
среды 335, 336
— — — экология 421, 439
Вирус веротоповпдпости клубней картофеля
89, .180, 463
_____ передача 463
— внутреннего опробковения батата 178
— вызывающий заболевание коры цитру-
совых 89, 180
— — мозаичное заболевание подсолнеч-
ника 215
— вырождения груши 412
— герпеса 497
— гомфроиы 220
— — строение 103
— гравировки табака 168, 215, 490
— — — влияние иа растение 250, 251,
253
- -------pH 334
— — — заражения перца 255, 260
_ — — очистка, выход 50
— _ _ растения-хозяева 475
__ — — смешанная инфекция 215
— гриппа 102, 200
— деформации побегов дерева какао 209,
268
_ _ — —. — — нал очки 101
-------передача 437
_____ переносчики 413
— деформироваштости листьев клевера 15
— деформирующей мозаики гороха, клас-
сы частиц 191
_ — — — компоненты 23
_ _ _ _ передача тлями 400, 401, 457
-----------РНК 59
— — — — свойства 491
_____ ядро как место сборки 168
_____ дикого огурца 77, 220
— желтого скручивания листьев томатов,
передача 413
— желтой жилки винограда, очистка,
выход 50
— — карликовости картофеля, выделе-
ние 27
_ _ — _ липиды 82
— — — — локализация 167, 220
„ _ _ _ передача насекомыми 411
_ — — — строение 103
— — — лука 454, 490
— — — ячменя влияние инсектицидов
458
— _ — — географическая изменчивость
122
Вирус желтой карликовости ячменя, дви-
жение во флоэме 172
— _ _ _ интерференция между штам-
мами 298
_ _ _ _ очистка, выход 50
— — — — передача тлями 401, 402
_ __ _ _ устойчивость к нагреванию
313
— — мозаики какао 491
— — — клевера 490
— _ _ _ включения 216
— _____ в копчиках корней Vicia
faba 479
— — — — влияние актиномицина D 153
— — — коровьего гороха (ВЖМКГ),
белок 73
————— влияние актиномицина D
147
_ — — огурцов 491
— — — опописа 491
— — — почек персика 174
— — — турнепса (ВЖМТ), антитела 360
— 362
_ _ _ — белковая оболочка 96
_ _ _ — белковые оболочки пустые
187
_ _ _ — белковый компонент 185—
188
_ __ _ — белок, аминокислотный со-
став 78, 79, 293
— — — — — выделение 74
— — — — — оболочки в растениях 219
— — — — — синтез 14
— — — — влияние на изоферменты ри-
бонуклеазы 243
______ рибосомы 240
______ РНК клетки-хозяина
240
— — — — — — содержание фосфора
в листьях 246
— фотосинтез 252
— — — — — — хлоропласты 217—219
______ хлорофилл 248
_____ четвертичных солей аммо-
ния 7 6
— _ _ _ вторичная структура 66
— — — — выделение 12
— — — — гидратация 84
— _ _ _ деградация в щелочной среде
335
-------- _ дефектные частицы 484
— _ _ _ замораживание и оттаивание
320
— — — — заражение китайской капу-
сты 19, 176, 221, 222
_ _ _ _ иммуногенность компонентов
370
_ _ _ —инактивация 316, 319, 347, 348
_ _ _ _ кембриджский изолят, свой-
ства 491
_ _ _ _ классы частиц 186
— — — — место сборки 167
_ _ _ _ металлы 83
_ _ _ _ минорные фракции 186, 187
— — — — мозаичное заболевание 222,
223
— — — — мозаичные симптомы 218, 237
_ _ _ _ некротический штамм, влия-
ние иа клетку 219
570
Предметный указатель
Вирус желтой карликовости турнепса, ну-
клеопротеиды 202
— — — — олигонуклеотиды 292
— — — — определение в градиенте
плотности сахарозы 27
_____ с помощью 32Р 33
_ _ _ _ оптические свойства 97, 98
_ _ _ _ основания, состав 480
_ _ _ _ очистка, выход 50
_____ передача насекомыми 414—
416
-------_ перекрестная защита 307
_ _ _ _ перенос по ксилеме 173
— — — — — тлями 390
----------поглощение РЫК в ультра-
фиолете 65
— полиамин(ы) 37, 81
— — — — преципитация кроличьей ан-
тисыворотки, диаграмма 363
— — — — распределение в тканях 176
_ _ _ _ распространение крестоцвет-
ными блошками 426, 427
— — — — реконструкция 142
_ _ _ _ репликация, скорость 163
----------РНК; см. РНК
— — — — РНК-синтетаза 150
— — — — седиментация 25
_ _ _ _ серологические пробы 374
— — — — симптомы заражения 205
— — — — строение 85, 96—98
_ _ _ _ субъединицы 97
— — — — число частиц на клетку 163
— — — — центрифугирование 48
— — — — цитологические эффекты 217
- 219
— — — — штаммы 292, 293
— — — — щелочная обработка 98, 335
— фасоли 490
— — — — включения 168, 215, 216\
— — — — длина частиц 482
— — — — заражение душистого горош-
ка 249
— _ _ _ распространение, влияние
ветра 437
— — — — растение-хозяин 424
— — сетчатости табака, передача 412
— — штриховатости нарцисса 490
— желтухи вишни 111, 204
— — сахарной свеклы, влияние времени
года 271
---------- — на органические кислоты
247
— — — — — — урожай 444
— --------включения 216, 217
_ _ _ _ восприимчивость растения,
влияние света 262
_ _ _ _ локализация в растениях
169-171, 174, 176
----------местные поражения 204
_ _ _ _ накопление углеводов при
заражении 244
— — — — передача тлями 399
— — — — симптомы заболевания 206
— устойчивость растений 463
— свеклы, взаимодействие с грибами
— — — влияние инсектицидов 457
----------масляных эмульсий 459
-------передача тлями 388, 399, 434
Вирус желтухи свеклы, строение 93
— жилковой мозаики красного клевера
490
— западной желтухи свеклы 396, 401, 446
— — мозаики сельдерея, экология 430
— звездчатой мозаики петунии 492
— зеленой крапчатой мозаики огурцов,
номенклатура 489
— инфекционного хлороза в растениях
абутилона 176
— влияние на хлоропласты 219
— — — мальв оцветиых, передача 413
— карликовой мозаичности кукурузы 390
391, 432
— карликовости риса, группы частиц 220
— диаметр частиц' 407
— — — локализация в цикадках, 407
— — — передача 15, 406, 408
— — — распределение и растений 176
— — — репликация в цикадках 411
-------РНК 13, 88, 155
_ _ _ _ выделение 54
_ _ _ — свойства 59, 67, 68
— — — строение 101, 102
— — сахарного тростинка, влияние тем-
пературы 265
— — сливы 129, 449
— — табака, передача грибами 118
— колумбийского дурмана 490
— кольцевой пятнистости гвоздики, кап-
сидный белок 77
РНК 59
— — — гортензии 490
— — — малины 492
_ _ _ _ защита земляники при фуми-
гации 461
--— — передача 385, 386, 438
_ _ _ папайи 490
—------сливы, передача 109, 265
_ _ — табака 61, 100
-----------влияние фитохромной систе-
мы 268
-------------pH 332
-------— в растении фасоли 169, 174
— — — — выделение 42
— — — — инактивация 357
-------— капсидный белок 78
— — — — компоненты 192
_ _ _ _ очистка, выход 50
— — — — передача беспозвоночными
383
_ _ _ — _ нематодами 385, 386
— — — — — трипсами 416
-------— — через семена 109, 110
_ _ _ _ потеря инфекционности 332
-----------РНК 56, 59
— — — — свойства 492
— — — — серологический тест 31
-------томатов 492
— — — — в апикальной меристеме 178
— — — — включение 3Н-уридина 153
— капсидный белок 78
— — — — номенклатура 492
— — — — типы частиц 192
— — — Odontoglossum 489
— крапчатой морщинистости артишока
— крапчатости белладонны 491
— — бобов фасоли 492
Предметный указатель
571
Вирус крапчатости бобов фасоли, болок
73, 77
— — — — инокуляция сои 221
— — — — компоненты 189
— — гвоздики, белок 77
— — конских бобов 492
— — — — белок, выделение 74»*
— — — — — аминокислоты Т1,
— — — — влияние муравьиной кисло-
ты 74
— —~— — — па урожай сои 443
_____ гибридизация 143
_ --------инактивация хлористым
кальцием 337
— —-----инфекционность потеря 332
— — — — инфицирование Vicia faba 153
— — — — компоненты 192
_ _ _ _ номенклатура 492
_ _ _ _ РНК, инфекционность 61
_ _ — _ спермидин 81
— — — — строение 98, 99
— — красного клевера 191, 492
— — паслена 491
— кроличьей папилломы 497
— крупных жилок салата-латука, защита
растений 462
_____ передача 118, 131
— —-----распространение через поч-
ву 427
— ' — — — сохранение в спорах Olpi-
dium 438
— ксантозиса земляники, влияние време-
ни года 271
— курчавой карликовости артишоков 490
— курчавости верхушки сахарной свек-
лы, влияние на ростовые вещества 250
_ ------------ географическое распро-
странение 429, 430
_ _ — _ _ движение по флоэме 172
— — — — — заражение табака 208
— _ — — — — Samolus parviflorus 297
— — —------избирательная репродук-
ция 310
— — — — _ изменения во флоэме 209
— —-------— передача 421
_ _ — _ _ устойчивость растений
464
----— — — циркуляция в перенос-
чике 405
_ -----------экология 421
— — листьев табака, передача 412
_ хлопчатника 168
— кустистой карликовости томатов, агре-
гация частиц 25
— — — — антисыворотки 378
_ — — — влияние возраста листьев
на инфекцию 258
— —-------— мочевины 338
-------------температуры 269
-------------pH 332
_ _ — _ инактивация поверхностно-
активными веществами 341
— — — — — тепловая 316
— —-----капсидный белок 78, 79
— —-------местные поражения 203
_ ----------- _ число 20
_ -------металлы 82
— _ _ — мутанты 290
_ _ _ _ очистка, выход 50
Вирус кустистой карликовости томатов,
РНК 55, 59
----------свойства 492
— латентной кольцевой пятнистости зем-
ляники 385, 492
— лейкоза птиц, РНК 69
— локальной пигментации тюльпанов 206
— мозаики абутилона 412
— — арбуза 215, 490
— утрата инфекционности 312
— — баклажанов 491
---- белены 490
-------- валовой выход очищенного ви-
руса 50
---- белого клевера 490
-------- _ капсидный белок 48, 79
_ _ бутылочной тыквы 460
— — гороха 490
— _ _ влияние на цветение 251
— — — передача тлями 397
— — дикого огурца 59, 167, 491
— _ _ _ влияние уксусной кислоты 7 4
-------------- _ выделение белка 75
----------- капсидный белок 78
_____ компоненты 193
— — дыпи-канталупки, передача 111
----ильма, передача 109
— — ириса 490
---- конопли 489
— — конских бобов 492
_ _ _ _ седиментация 25
— — коровьего гороха 490
_ --------геном 199
— — — — изолят SB, свойства 491
_ _ _ _ инокуляция, число необхо-
димых частиц 130, 201
_ --------компоненты 189
_ _ _ _ очистка, выход 50
----------РНК 59
_ _ _ _ число частиц, необходимых
для инфекции 201
----костра, влияние 8-азагуанина 345
_ — _ _ актиномицина D 147
------ _ гибридизация 475
— — — инактивация хлористым каль-
цием 56, 337
-------капсидный: белок 77
— — — очистка, выход 50
-------реконституция 142
-------РНК 150
----------- инфекционность 182
— — — свойства 492
_ _ _ центры связывания с анти-
телами 375
— — кукурузы, строение 104
— — люцерны 485
_ _ _ белок, аминокислоты 77, 79
----------синтез 155
_ _ —влияние 8-азагуапина 344,345,466
----------размера поля иа распростра-
нение 434
---------- света 268
------- геном 199
_ _ _ инактивация 318, 328
— — — инфекционность 164, 221
-------классы частиц 100, 193—195
----; — количество в листьях 164, 221
— — — кривая разведения иифекцион-
ности 129
572
Предметный указатель
Вирус мозаики люцерны, криптограмма
488
_ _ — очистка, выход 50
_ _ _ передача тлями 201, 390, 395,
396, 398
_ _ _ преципитация 39
_ _ _ разрушение ФВК 87
_______РНК 59, 69
— — — свойства 490
-- _ — структура 100, 101
— — — ф°Рма 88
— _ _ число частиц, необходимых для
заражения 201
_ _ _ штаммы 295
---— экология 433
- _ нарциссов 490
_ _ озимой пшеницы 180
— — орхидеи (род С i/rubidium,)-, см. также
вирус мозаики цимбидиума 490
— — папайи 490
— — персика 452, 456
__ _ подорожника 489
— — пшеницы, передача грибами 119
_ _ райграса многоукосиого, передача
нематодами 385
— — редиса 492
— — резухи 492
— — — заражение сосны: 473
— — — передача нематодами 384—386
_ _ __ сохранение 440
— — — строение 100
_ _ _ экология 428, 440
— — салата-латука 215, 490
_ _ _ выделение 39
— — — заражение сафлора 260
— — — защита растений 448
— — — передача 109—111
_ _ _ распространение на большие
расстояния 429
— — сахарного тростника 490
— — _ _ включения 215
_ _ _ _ поражение кукурузы в США
432
---— — устойчивые сорта растений
463
— — сахарной свеклы, влияние на попу-
ляцию тлей 419
— — — — передача тлями 397
— — свеклы 490
— — — влияние густоты насаждений 434
_ _ _ передача тлями 394
— — сельдерея 490
— — сливы, передача 114
— — сои 490
— — томатов 489
— — тополя 490
— — турнепса 219
— — — инактивация ультразвуком 329
— — — передача тлями 396
— — — распределение в растениях 176
— — тыквы 492
— — — капсидный белок 78
— — — компоненты 188, 189
— — — очистка 50
— передача жуками 416
— — тюльпанов 490
— — фасоли, передача семенами 109
— — — — через пыльцу 111
— — фреезии 490
Вирус мозаики цветной капусты 219, 220, 493
— — — влияние густоты насаждо-
МИЙ 434
—. — — — ДНК 13, 53, 72, 73
399 — .—. передача тлями 388, 392, 396,
— — цимбидиума, передача 463; см, так-
же Вирус мозаики орхидеи (род СутЫ-
di ипг)
— — эуфорбии, передача 413
— — яблони 192
— — — инактивация фенолами 356
---Dahlia 121, 178, 220, 493
— — Centrosema, валовой выход 50
— — — передача 383, 414
— — Chenopodium rubrum, капсидный
белок 77, 79
----------РНК 59
— морщинистой курчавости листьев кар-
тофеля 178
— морщинистости земляники 422
— — турнепса, капсидный белок 78
— — — влияние па хлоропласты 219
— — — — уксусной кислоты 74
-------РНК 59
— — — спермидин 81
— мышиного энцефаломиокардита 497
— некроза верхушки томатов, компонен-
ты 193
_ _ огурца, капсидный белок 77
— — табака, асимметричность инфекции
174
— — — влияние на органические кисло-
ты 247
— — — — света 262
_ _ _ _. температуры 269
— — — в цитоплазме 219
— — — выделение 42
— — — действие мочевины 338
— — — заражение фасоли 22, 262, 267
— — — — Pinus sylvestrls 473
— — — инактивация 145, 316, 324, 337,
340
— — — инокуляция, развитие пораже-
ния 197, 198
— — — кривая разведения инфекцион-
ное™ 129
— — — мутанты 290
— — — нестабильные варианты 302
— — — передача Olpidium 145—147
-------РНК 59
— — — специфичность взаимосвязи с ви-
русом-сателлитом 197
— — — строение 99
— — — устойчивость растений 278
— —- — число частиц па клетку 163
— — — штамм А, свойства 492
— — — штаммы 196
— — — эк лип с 160
— — — экология 421, 427
— некротического пожелтения салата-ла-
тука 258
_ _ _ _ в Австралии 440
----------- внешняя оболочка (мемб-
рана) 103, 167
— — — — мембраны 167
---_ передача тлями 400, 403,
456
Предметный указатель
573
Вирус некротического пожелтения салата
-латука, присутствие в ксилеме 172
___________ цитоплазме 220
— — — — распространение 429
— — — — строение 103
— — — — экология 423
— некротической кольцевой пятнистости
вишни, кривая разведения иифокцион-
ности 129
________ передача семенами 110
_____ персика, влияние диметил-
сульфоксида 452
— — — — сливы, антигенная специфич-
ность 375
— обыкновенной мозаики гороха 457
— — — маниока 490
_ — — фасоли 215, 490
— огуречной мозаики 219
— — — в растении табака 176
_ _ _ влияние 8-азагуапииа 344, 345,
466
_____ высушивания листьев 122
_ _ _ _ масляных эмульсий 459
_ _ _ _ иа органические кислоты 247
————— рибонуклеазу 243
_ _ _ _ условий питания растения
иа число местных поражений 266
— — — восприимчивость фасоли, сезон-
ность 267
— — — заражение картофеля 245
— — — — коровьего гороха 162, 245
— — — — табака 238
— — — изолят ван Регопмортеля 491
_ _ _ инактивация светом 328
— — — капсидный белок 77
_ _ — отделение от ВТМ 115
— — — очистка, выход 50
_ _ _ передача тлями 388—390, 395,
396, 398
— — — растение-хозяин 424
-------РНК 59, 61, 67
— — — РНК-полимераза в пораженных
листьях 150
— — — скорость распространения 268
— — — смешанное заражение 272
— — — строение 99
— — — штаммы 295
— опунции Сэммонса 489
— осповакцины 497—500
— «оспы» слив 490
— папилломы человека, ДНК 497
— папоротниковидности листьев виногра-
да 424, 429, 492
— — — — передача нематодами 384, 385
— — — — экология 424
— постролепестиости тюльпанов 463
— построй карликовости моркови, влияние
па урожай 443, 444
— — — — защита растений 461
— — — — распространение географиче-
ское 430
— погремковости табака 15
— — — вирусоспецифичный продукт 183
_ _ — геном 199
— — — группы 291
— — — дефектность синтеза 154
— — — длина частиц 182—185
_ _ _ заражение голосеменных 473
— — — калифорнийский штамм 214
Вирус погремковости табака, капсидный
белок 78
— — — комплементация между части-
цами 485
— — — очистка, выход 50
— — — передача нематодами 201, 385,
386
— — — размножение, влияние темпера-
туры 269
— — — реконструкция 142
— — — репликация, избирательность
200
— — — РНК, инфекционность 61
_ _ _ _ локализация в клетке 154,
155
_ _ _ свойства 489
_ _ — связь с митохондриями 214
_ _ _ строение 89, 91, 92
— — — фоторсактпвация 325
— — — функции коротких и длинных
частиц 184, 185
— — — штаммы 184
— пожелтения жилок осота 105, 220, 399
— полиомиелита 140, 162
— полиомы, ДИК 497
— полосатой мозаики пшеницы 432
_ _ _ _ включения 220
— — — — влияние срока сева 433
— _ _ _ защита растений 454
— — — — клещ-переносчик 417
_ _ _ _ сохранение 438
_ _ _ _ строение 104
_ _ — _ эпитофитотия 435
— полосатости висконсинского гороха,
РНК 61
--- гороха 490
— — ежи сборной 490
— — табака 191
— поникания ветвей 245
— посвотлсния жилок мальвы 490
— прижилковой мозаики клевера 490
— пролиферирующей мозаики лобип 270
— псевдобыпепства, ДНК 497
— пятнистой мозаики пшеницы, клещ-
переносчик 417
— пятнистости конских бобов 492
— размочаливания листьев в растениях
цитраижа 175
— — — заражение вишни 442
— раневых опухолей 86
— — — антигены 406, 409
— — — влияние иа рост растений 250
— —----низких температур 319, 452
_ _ _ в цикадках 407, 408
— — — выделение 28
— — — инфицирование пунцового кле-
вера 209
— — — клевера, индуцированные опу-
холи 208
— — — — передача цикадками 405, 406
— — — локализация 38, 176
— — — размножение в переносчике 406
_ _ _ репликация в цикадках 411
-------РНК 13, 67, 68, 88
_ _ _ _ выделение 54
— — — строение 101
_ _ _ сходство с роовирусом 477
_ _ _ электронноплотные агрегаты 168
— раннего побурения гороха 473, 489
574
Предметный указатель
Вирус раннего побурения гороха, передача
нематодами 385
— реверсии черной смородины 419, 437
— ринопневмонии лошадей 497
— розеточности арахиса, влияние густо-
ты посевов 454, 455
Вирус-сателлит вируса некроза табака 15
— взаимодействие с ВНТ 196—198,
201
— капсидный белок 77, 79
— криптограмма 488
— очистка 50
— происхождение 500
- РНК 155, 156
_ _ количество генетической инфор-
мации 140
— — молекулярная масса и состав
оснований 59
— — последовательность оснований 13,
69
— строение 99
— структурный белок 156
— штаммы 197
— североамериканской полосатой мозаи-
ки пшеницы, передача 410
— скручивания листьев вишни 492
— — — — в клетках 220
— передача нематодами 385
_ — — — заражение картофеля 132,
244, 245
— _ _ картофеля, влияние времени
года 271
_ _ _ _ влияние инсектицидов 456,
457
— — — — передача тлями 402, 425, 426
— — _ пеларгонии 493
— слабого пожелтения свеклы, взаимо-
действие с грибами 275
— — — — передача тлями 434
— стерильной мозаики 245
— суровой гравировки при смешанном
заражении 273
' — табачной мозаики (ВТМ); см. также
А-белок
— — — агрегация белковых субъединиц
105, 212
------- адсорбция 52
— — — аминокислоты 79, 80
— аморфные включения в клетках
213
— — — анизотропия в потоке 11
— — — антигенность пептидных фраг-
ментов 372, 373
— — — антитела, меченные ферритином
_ _ _ _ центры связывания 371 —
373
— — — белковые субъединицы, отщепле-
ние 94
— — — белок, влияние фенола 75
— — — — выделение 74
----------капсидный, аминокислоты
14, 78, 79, 300, 301
_ --------кристаллы 105
— _ _ _ спиральные участки 81
— — в корневой меристеме томатов
— _ _ _ растениях N- glauca 178
— — — включения 211—214
Вирус табачной мозаики, включения радио-
активных предшественников 136
— — — влияние грибов 276
— — — — на дыхание 253, 254
-— ---липиды табака 243
— — — — — минеральный обмен 249
— — — — — митохондрии 240
— --------органические кислоты 247
_ _ _ _ _ ростовые вещества 250
_ _ — _ _ стерины 251
— — — — — урожай томатов 444
— — — — — фосфорсодержащие соеди-
нения 246
_------------- фотосинтез 252
------------цветение 249
—----------- температуры 264, 265, 311
— — — — (фтора 267
----------pH 332, 333, 334
— — — внутрпгелевая адсорбция 377
— — — восприимчивость N- glutinosa
266
--------- вторичная структура белка 81
— — — выделение 11, 38, 42, 48
---------гены, локализация 303, 304
---------гидратация 84
— — — движение в растении томата 170
----------- от клетки к клетке 168
—--------— через эпидермис 162
— — _ деградация, продукты 332, 333
— — — денатурация тепловая 326
— — — депротеинизация после зараже-
ния табака 146, 147
— — — длина частиц 90, 291
— — — — — влияние различных фак-
торов 181
— — — — — распределение 182
--------------— ДНК клетки-хозяина 154
— — — заражение смешанными штам-
мами 129
—--------— томатов, влияние влажности
270
— — — — фасоли 263
— — — — Spirodela polyrhiza 135
_ _ _ инактивация 8-азагуанином 345
----------- бластицидином S 349
— — — — влияние света 327
— — — — высокими давлениями 331
— — — — иодом 336
----------- кинетином 348
----------красителями 328
----------- кроличьей сывороткой 350,
351
---------— у-лучами 322
_ _ _ _ органическими соединениями
338-343
----------радиоактивными изотопами
323
----------рентгеновскими лучами 321,
322
— — — — рибонуклеазой 352
_ _ _ _ тепловая 314, 315
— — — — — адаптивный эффект 319
---------— ультразвуком 329—331
— — ультрафиолетом 144, 323—
327
— — — — 5-фторурацилом 348
— инфекционность 90, 128, 181,
182, 300, 313
Предметный указатель
575
Вирус табачной мозаики, инфицирование
тканевых культур 137
— — — карбоксипептидаза 37
— _ _ короткие палочкообразные ча-
стицы 181
_ _ _ концентрация и степень тяжести
заболевания 221
_ _ _ концентрирование очищенных
препаратов 46
— — — кривая разведения иифекцион-
ности 126
— — — кристаллические включения
211-213
_ — _ кристаллическое состояние 11
— — — локализация в клетке 166
— — _ местные некрозы при выделении
мутантов 282
_ _ _ местные поражения, ярко-жел-
тые 299
— _ _ место сборки внутри клетки
165
— — — металлы 82
_ _ _ механическая инокуляция 18
_ _ _ _ — влияние карборунда и
фосфата 121, 231
_ — — _ _ — промывки листьев 122
— — — мутагенное действие азотистой
кислоты 285
— — — мутанты 282, 290, 301, 422
— _ _ _ азотистые 289
_ _ _ _ дефектные 301, 302
— — — — изменения структурных ком-
понентов 286, 287
_ — _ _ искусственно индуцирован-
ные, выделение 282
_ _ _ _ замещения 287—288
_____ серологическое различие 373
_ _ — _ температурочувствительные
302
_ _ _ мутантный штамм РМ2 213
— — — негативное контрастирование 90
--------облучение 283
_ _ — — рентгеновскими лучами 63,
_ _ _ _ ультрафиолетом 309
обработка карбоксипептидазой
— — — — ледяной уксусной кислотой
334
_ _ _ _ перекисью водорода 335
— — — определение с помощью радио-
активных изотопов 33
______ преципитации в геле
367
_ _ _ орхидные изоляты 303
_ _ _ очистка, выход 50
_ _ _ палочки 94
_ _ _ _ короткие 180—182
— — — — распределение по длине 94
— — — передача 462, 463
— — — — насекомыми 414, 415
_ _ _ _ повиликой 143
_ _ _ _ птицами 429
_ _ _ — семенами 109
_ _ _ перекрестная защита 307—309
_ _ _ перемещение в стебле табака 172
— — — поглощение клещом 418
_ — — подавление 2-тиоурацилом 346,
347, 466
Вирус табачной мозаики, подорожниковый
штамм Холмса 213
— — — прогревание растительной ткани
450
— — — размножение, влияние темпера-
туры 269
_____ питания растений 270
— — — распределение в мозаичных ли-
стьях 176, 177
— — — распространение по флоэме 171,
172
_ _ — растворимый антиген 182
_ _ _ растения-хозяева 295, 474, 475
— —- —- реконструкция 141, 142
— — — рентгеноструктурный анализ 91
— — _ репродукция избирательная 310,
311
— рибонуклеазная активность 70
-------- РНК; см. РНК
— — — свойства 489
— — — связывание антител 365
— — — симптомы заражения 205
— _ _ синтез вирусных белков 157
— — — системная инфекция 174
— — — скополетип, накопление 247, 248
— смешанное заражение 215, 272,
273
— — — специфичность 303
_ — — сохранение в растительных остат-
ках и в почве 420, 438, 439
_ _ _ спермидин 81
_ _ _ специфический антиген 11
— — — стабильнее™ 332, 482
— — — строение 85, 89—91
— — — темно-зеленые участки мозаич-
ных листьев 224—225
— — — тли-переносчики 390
--------томатный штамм аукуба 213
--------устойчивость к высушиванию
330 331
— — — — растений 260, 277, 463, 464
-------- фракции 182
— — — число поражений, зависимость
от разведения инокулума 20
_ — _ _ субъединиц 90
—---------частиц, необходимых для
инфекции 127, 128
— — —--------на клетку 163
--------цистрон структурного белка 304
_ _ _ цитологические влияния 124,
151, 152, 166, 210-214
—-------штамм(ы) 295, 497
----------аукуба 129, 213
— — — — бобовый 311
----------Далемский 372
— — _ _ интерференция 296, 297
----------- продуктивность 299
— — — — системный, ингибирующее
действие 307
— слабые 465
— — — — чувствительность к облуче-
нию 300
----------РМ1 301, 302
----------РМ2 289, 301, 302
----------РМ4 302
----------Ut 178
----------U2 128
----------U5 166, 178
— — — экология 421, 422, 427
576
Предметный указатель
Вирус табачной мозаики, электронная ми-
кроскопия 90, 91
— тристецы цитрусовых, передача и рас-
пределение 176
— тунгро, передача 405
— увядания Дурмана, передача 392
- хлоротической крапчатости коровьего
гороха 492
_____________белок 74, 77, 475
_ — — — — влияние pH 55
— — — — — иифекциоиность 164
— очистка, выход 50
_____ реконструкция 142, 143
-------------РНК 59,' 61
_____ _ _ строение 99
_ _ _ _ — субъединицы 375
______ тепловая инактивация 319
_ черной кольцевой пятнистости капу-
сты, передача 392
_ _ _ _ томатов 492
_____ заражение голосеменных
473
- — — — — защита земляники 461
_ _ _ _ — передача нематодами 384—
386
— семенами 109, 121, 384
_ _ _ _ _ сохранение в переносчике
440
— штриховатой мозаики ячменя 112, 199
_ _ адсорбция на эритроцитах 31
_ — — — в клетках 21.7
_ _ _ _ передача семемами 109, 110
_____ _ строение 92
— южной мозаики фасоли, антисыворотки
378
_____ в цитоплазме 219
----- выход при очистке 50
— — — — движение во флоэме 172
_ _ _ _ капсидный белок 78
_ _ _ — передача семенами 110
— — — — перемещение в растении фасо-
ли 174
— — — — РНК, молекулярная масса
и состав оснований 59
_ _ _ _ _ иифекциоиность 61
_ _ _ — серологический тест 31
_ _ _ _ устойчивость растений 278
— 2 в мицелии 470
— — кактуса 490
— 3 растений белены 393
— — - — при смешанном заражении
273
— А картофеля 490
— — — распределение 175, 178
— В хризантемы 490
— С, передача тлями 390
— М картофеля 490
— S картофеля 490
— - — капсидный белок 78
— — — распределение 178
— — — строение 93
- SV40, ДНК 497
— X кактуса 490
— — картофеля, белок 75
— — — в листьях табака 160
— — — — Cyphomandra betacea ЗЮ
— — — влияние грибов 276
— — — — света 267, 268
— — — — температуры 269
Вирус X картофеля, влияние pH 334
— — — включения в инфицированных
клетках 216
— — — гинорчувствительность картофе-
ля 464
— — - - задержка роста растений 204
_ _ _ заражение табака 245
— — — — смешанное 272, 273, 274
— — — иммунитет 463
— — — инактивация 341
_ _ _ — мочевиной 338
— — — ...- тепловая 314
— — — — трипсином 353
_ _ _ ультразвуком 329
_ _ _ _ ультрафиолетом 145
— — — иифекциоиность, утрата 312
— — — капсидный белок 78, 79
— — — местные некрозы 263
_ _ — мутанты 290
— — — некротизация 207
— — — определение количественное 34
_ _ _ очистка, выход 50
— — — передача в полевых условиях
130
— — — — насекомыми 414
— — — — при прививке 113
— _ _ _ человеком 463
— Synchytrium 119
— — — распределение 178
-------рИК 56, 59
— — — свойства 489, 490
— — — скорость перемещения по стеб-
лям табака 172
— — — смешанное заражение табака 174
_ _ — устойчивость растений 278
— — — штаммы 295—297
— — — — отбор 422
— — — — умеренные 205
— У картофеля, влияние инсектицидов
456
— — — — масляных эмульсий 459
— — — — температуры 269
-------------------- pH 332
_ _ _ включения в инфицированных
клетках 214—216
-------действие 2-тиоурацила 451, 452
— — — заражение перца 260, 296
— — — — табака 245
— ~ _ инактивация 341
- - — -- очистка, выход 50
— — — передача клещом 418
---------тлями 391, 392, 397—399,
425
_ _ _ распределение в растениях 449
_ _ _ рекомбинация 306
_ _ _ свойства 490
— — — симптомы заражения 251
— _ _ строение 93
Вирус(ы), аминокислотный состав 77, 78;
см. также Аминокислоты
— агрегация 25
— антигены 359—380
— бактерий 138, 139, 142
— бацилловидные частицы 102—105
— биологическая активность, связь со
структурой 300—304
— в Penicillium sp. 470, 471
— взаимодействие с антителами 367
— — — грибами 275, 276
Предметный указатель
577
Впрус(ы), влияние па метаболизм растений
2.34-257
— выделение; см. Выделение вирусов
— генетическая информация 14
— геном 199, 481, 500
— гидратация 84
— группы 88, 488—493
— дефектные 180
— длина частиц, влияние температуры
270
— защитные мероприятия 446, 447
— животных, нагревание 317
---репликация 138, 140
— идентификация 446
— изменчивость 281—312
— — географическая 422
— изометрические 14, 96
— изопикническое разделение 26
— икосаэдрические 14, 94—96, 191
— инактивация 313—358
— инфекционность 15
— инфекционные частицы 89
— концентрация в растении 50
-------- _ влияние возраста листа 175
---— — экологическое значение 420
— косточковых плодовых 37
— млекопитающих, происхождение 496
— многокомпонентные 15, 89, 180—202
--- значение 199, 200
—------в классификации 484
— — смешивание компонентов 194—196
— нагревание 318—320
— неперсистептные(й) 388, 429
— неродственные, взаимодействия 271—
274
— нитевидные 93
— объем частиц 13
— основания, состав 12
— определение количественное 18—35
— — понятия 9, 16, 17
— очистка, выход 49, 50
— палочкообразные; см. Палочкообраз-
ные вирусы
— передаваемый с помощью стилета 388,
389
— передача; см. Передача вирусов
— переносимые стилетом, распростране-
ние 426
— персистентные 16, 388
— полуперсистентные 399, 429
— при высушивании растений 330, 331
— пропагативные в цикадках 405—412
_ _ определение термина 388
— размеры 88
— размножение в клетках растений 15
— распределение по группам растений
468-475
— реактивация 326
— резервация 447
— репродукция в растениях-хозяевах
ЗЮ_____312
— РНК; см. РНК вирусная
— синтез капсидного белка 15
— — ошибки 202
— смешанные искусственно 15
— содержащие «голую» РНК 53
— созревание, этапы 202
— состоящие из 42 структурных субъеди-
ниц 100
1/2 37-0893
Вирус(ы) сохранение в растениях 108
— специфичность 303
— спиральная симметрия 89
— стабилизация структуры 105
— стабильность; см. Стабильность виру-
сов
— строение, значение для классификации
481, 482
— — методы исследования 11, 85
— — субъединицы 96
— — схема 88
— структура и биологическая активность
300-304
— структурные компоненты 53
— сферические И, 87, 219, 220
— — миогокомпопептиость 185
— — реконструкция 142—144
— форма 86, 88
пули 102-105
— химический состав 53
— храпение очищенных препаратов 46,
47
— чистота, критерии 47—49
— центрифугирование в градиенте плот-
ности 15
— циркулирующие® в тлях 399—403
— — — цикадках 405
-- определение 388
-----передача тлями 456
_ _ перенос 429
— эволюция 200
— экология 420—441
Вирусные болезни, борьба 15, 16
— — симптомы 203—302
-----экономическое значение 442—467
— препараты, гомогенность 36
— — очистка 44
-----чистота, метод определения 25
— частицы гибридные 475
— — длина 481
— — инактивация 13
Вирусоподобные частицы дефектные 88
Вишня, урожай, влияние вирусной инфек-
ции 442
Включения внутриклеточные 210—220
— внутриядерные 215, 216
— при смешанном заражении 273
Вода, содержание в вирусах 84
— влияние на вирусную инфекцию 255,
256
Водный режим растении, влияние на вос-
приимчивость 265
-------------размножение вируса 270
Водород, содержание в очищенных вирус-
ных препаратах 53
Водородные ионы, концентрация и ста-
бильность вирусов 332—335; см. также
pH
— — при взаимодействии субъединиц 106
Водоросли, заражение вирусами 469
Возбудители PLT 228, 498
Воздух, загрязнение, влияние па чувстви-
тельность растений к вирусной инфек-
ции 267
Воздушная среда, распространение виру-
сов 424-427
Воробей домовый, перенос вируса 429
Восприимчивость растений к заражению
262-267
578
Предметный указатель
Восстанавливающие агенты, очистка виру-
са 39
Восстановительные свойства среды, чувст-
вительность вирусов 335
Выделение вирусов 15, 36—52
— — выбор растения-хозяина 37
— — высокоскоростное центрифугирова-
ние 42
— — диализ 43
— — критерии чистоты 47—49
— — экстракция, методы 41
— _ _ среда 39
— штаммов 281—283
Выздоровление 208
Высаливание и кристаллизация вирусов 43
Выход вируса, определение понятия 50
— очищенного вируса, методы измере-
ния 49
Гаптены, связывание с антителами 369
Ген(ы) вирусные, число и локализация
303, 304'
— L у перца 464
Генетическая рекомбинация 305, 306
— устойчивость 463
Генетические методы при изучении виру-
сов 201, 485
— отклонения 231
Генетический код и мутанты ВТМ 287—
290
_ _ происхождение 494
Геном вируса(ов) 199, 481
— вирусный 500
Генотип растения-хозяина, влияние иа ви-
русную инфекцию 259—261
Гексозомонофосфатный шунт, влияние ви-
русной инфекции 255
Гексокиназа, влияние вирусной инфекции
242
Гель-фильтрация при очистке вирусов 43,
46
Гиббереллины 250
Гибберелловая кислота 250, 251
— — инактивация вирусов 348
Гибридные вирусы 143
— частицы 475, 501
Гидратация вирусов 84
Гидроксаматы 157
Гидроксиламии, инактивация РНК ВТМ
338
— мутагенные эффекты 285
Гидроксилапатит 71
Гиперплазия 208
Гипоплазия 208
Гистидин в вирусном белке 76
Гладиолусы как хозяева вирусов 424
— защита от тлей 460
Глицин, включение в структурный белок
фага R17 156
Глицерин при хранении вирусов 47
Глутамин 76
— влияние вирусной инфекции 245
Глюкоза, влияние на образование местных
поражений 268
— при вирусной инфекции 244, 255
ГмФ-кииаза, влияние вирусной инфекции
на активность 242
Годовой цикл, сохранение вирусов 438
Голосеменные, инфицирование вирусами
473
Голубиный горох, заражение вирусом сте-
рильной мозаики 245
Горбатки 382, 412
Гормональный баланс, влияние вирусной
инфекции 251
Гормоны, симптомы, вызываемые у расте-
ний 232
Горох, заражение вирусом желтой мозапкп
клевера 216
Граны хлоропластов, влияние ВЖМТ 219,
249
— — дегенерация 217
— _ отсутствие у мутантов 253
Грибы, взаимодействие с вирусами 275, 276
— переносчики вирусов 16, 116—119,
469-472
— при борьбе с червецами 461
Грушевая медяница передача вируса 412
Гуанидингидрохлорид, выделение вирус-
ного белка 75
-РНК 56
Гусеницы, передача вирусов 415, 416
Густота насаждений, влияние на вирусы
434
2,4-Д, влияние на вирусы 348
Движение вирусов по растению 168—173
Двудольные растения, мозаика 205
Двукрылые, характеристика 382
Двуокись углерода, влияние на чувстви-
тельность растений к вирусу 340
Дегидроаскорбиновая кислота, влияние
вирусной инфекции 247
ДДТ 457
Дезоксирибоза в вирусах 53
Декстрансульфат, выделение вирусов 44
Дельтоэдр, определение 95
Детергенты, выделение вирусного белка 75
— — вирусной РНК 55
— отщепление, белковых субъединиц 94
Дефектная оболочка 89
Дефектные вирусные частицы 180—202, 484
— штаммы 301, 305
Деформация побегов дерева какао 207
N-Диметиламинояитариая кислота, инакти-
вация вирусов 349
Диметилсульфат, мутагенное действие 286
— инактивация РНК ВТМ 339, 340
Диметилсульфоксид, химиотерапия вирус-
ных болезней 452
Дисульфотоц 457
Диффузия в агаровом геле 35
Дихлорпропан-дихлорпропен (Д-Д), борьба
с нематодами 461
— регуляция роста грибов 462
2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота 232
ДНК бактериальная 495
— бактериофага срХ174 67
— в листьях 235
— вируса мозаики цветной капусты 53
72, 73
— — осповакцииы 498
— вирусная 72, 73
— — происхождение 497
— внехромосомиые копии 496
— гибридизация 228
Предметный указатель
579
ДНК клетки-хозяина, происхождение виру-
сов 494, 495
— растения при заражении вирусом 238
— — роль в репликации вируса 147
— рибосомная 496
— структурное сходство с двухцепочеч-
ной РНК 67, 68
ДНК-зависимая РНК-полимер аз а 495
ДНК-содержащие бактериофаги, генетиче-
ская рекомбинация 305
— вирусы млекопитающих 497
— — происхождение 495
Додецилсульфат натрия, выделение вирус-
ного белка 75
— — выделение РНК ВТМ 55
— — инактивация вирусов 341
Древесные растения как хозяева вирусов
131, 424
Дубильная кислота, инактивация вирусов
356
Дурман, введение смеси вирусов 10
— заражение вирусом гравировки табака
215
Душистый горошек, заражение вирусом 249
Дыня, защита от вируса 460
Дыхание, влияние вирусной инфекции
253-255
Дюпонол С 60
ДЭАЭ-целлюлоза 150
Европейская желтуха астр 229
— карликовость клевера 229
Ежа, влияние вирусов 44
Ель, вирусные заболевания 473
Железо как инактивирующий агент 329,
337
— недостаток 231
Желтая карликовость риса 229
Желтуха астр 10, 226, 228
— вишни 231
— персиков 226
— сахарной свеклы, влияние света иа про-
явление симптомов 268
— свеклы, распространение 428
Желтухи, возбудители 226—230
Желтый пигмент пластид 249
Жесткокрылые, характеристика 382
Жилки, выросты 230
— пожелтение 205, 206
— посветление 205, 206
— при изучении метаболизма растений
237
— формирование 222
Жировое тело тлей, присутствие вируса 401
— — цикадок 403, 407, 408
Жуки, передача вирусов 415, 416
Завядапие растений, влияние на вирусную
инфекцию 265
Заградительные культуры 460
Замораживание и оттаивание при выделе-
нии вирусов 320
— растительной ткани 38
Замыкающие клетки устьиц 123, 124
Западный X-•вирус мелкоплодиости вишни
229
Зародыш, выживание вируса ИЗ
Защита растений 446—467
Земляника 423
— влияние вирусной инфекции 259
— защита от вирусов 461
— освобождение от вируса морщинисто-
сти земляники 422
— пожелтение листьев 206
— распространение вируса мозаики резу-
хи в культуре 428
— таннипы 356
Зопа(ы) устойчивости 277
— эквивалентности 364
Зонтичные, растения-хозяева западной мо-
заики сельдерея 430
Зооспоры, заражение вирусом 116, 117
Излучение, инактивация вирусов 321—329
Изолимоиная кислота 247
Изоферменты 241
Изохроны 364
Изоцитратдегидрогеназа, влияние вирус-
ной инфекции 242
Изоэлектрическая точка, осаждение виру-
сов 43, 332, 333
Иммунность 259—260, 306
Иммунные сорта 463
Иммуноглобулины, изменения в процессе
иммунизации 378
— классы 360
Иммунодиффузия 374
— в агаре 376
Иммуиоосмофорез 29, 367
Иммуносорбенты твердые 368
Иммупоэлектрофорез 367
Инактивация вирусов 313—358
-----азотистой кислотой 285, 286
— — механизмы 332
— — нагреванием 319
— — происходящие при этом процессы
357, 358
Ингибиторы вирусов в растениях 37, 38,
131, 353, 354
— — связь с генетической резистентно-
стью 261
Индий, влияние на вирусную РНК 337
Индолилмасляпая кислота, инактивация
вирусов 348
Индукция вирусов 496
Инокуляция (механическая) 10, 13, 22, 266
— вирусной РНК 62, 145, 146
— воздействие различных факторов 120—
122
— восприимчивые к инфекции участки
124
— грызущими насекомыми 414
— двумя штаммами 309
— количество чувствительных участков
125
— листьев 134
— продолжительность существования за-
раженных участков 128
— способы 119, 120
— число зараженных клеток 151
---требующихся вирусных частиц 127—
130
37*
580
Предметный указатель
Инокуляция, эффективность 258, 259, 261,
262, 263, 265, 267, 268
Инокулум замороженный 121
— концентрация РНК 161
— смешанный 129
Инсектициды 456—459
— в борьбе с нематодами 461
Интерференционный микроскоп при иссле-
довании вирусов 24
Интерференция между штаммами 296—299,
307; см. также Перекрестная защита
Интерферон 276, 277, 470, 471
— птичий 357
Инфекционная единица, размер 64
Инфекционность вирусов 10, 125, 128, 313
— оценка 22—24
— проверка 453
— утрата 312, 332
— удельная вирусных штаммов 300
Инфекционные центры, чувствительность
к ультрафиолету 144
Инфекционный хлороз абутилона 9, 205
— цикл, нарушение 453
Инфекция, факторы, влияющие на течение
и характер 258—280
Инфицирование растений, методы 108—132
Иод, инактивация вирусов 336
Иодацетат, инактивация вирусов 339
Иод-крахмальная проба 18, 170
Иприт, инактивация РНК ВТМ 339
Итальянский вирус кольцевой пятнистости
гвоздики 493
Калии, влияние на восприимчивость к ин-
фекции 266
— содержание при вирусной инфекции
249
Калпюс, культура 136, 268
Кальции, влияние иа вирусную РНК 337
— при вирусной инфекции 249
— содержание в вирусах 82
Кампестерин в растениях табака 251
Капсид 85
— вируса мозаики коровьего гороха 73
Капсидный(е) белок(ки) 14, 15, 63, 101
— — аминокислотный состав 76—78
--- влияние аналогов 347
— — классификация вирусов 479, 480
--- кодирование 72
— — облучение ультрафиолетом 326
— — оксиаминокислоты 76
---стабильность вируса 332
Капсомер 85
Каптан 119
Капуста китайская, антигены 375
— — заражение ВЖМТ 221, 222, 237,
240, 243, 246
— _ _ аномалии хлоропластов 217
- 219
— — — — перекрестная защита 307
— — — — симптомы 205
----------синтез РНК 147, 149, 150
--- мозаичное заболевание 222
— — недостаток азота 19
— — пластидные мутанты 223
— — распределение вирусов 176
— — репликация вируса 137, 163
---рибосомы 236
Капуста китайская, РНК ВЖМТ 159
Карантинные моры 467
Карборунд, влияние на инокуляцию 121,
131
Карбоксипептидаза, влияние на ВТМ 37, 79
- А 371, 372
Карликовость 226
— кукурузы 228, 229, 432
— сливы 204
— тутовых деревьев 227
— шелковицы 227, 229
— травянистого покрова 229
Картофель, сорт Арран 422
— апикальная меристема, культивиро-
вание 451
— ведьмины метлы 229
— вирус(ы), распределение 178
---X и Г 10
— заражение вирусом скручивания ли-
стьев 244, 245, 422
— — — X, влияние возраста растения
259
-------Y 209
— защита от вирусных болезней 453—457
— мозаичные болезни 10
— недостаток питательных веществ 231
— некротизация 207
— прививка 113
— тепловая терапия 451
Квазиэквивалептность 95
Кинетин 113, 178
— как ингибитор вируса 348
Классификация вирусов Адансона 486
— — генетические методы 485
— — история 476—478
— — критерии 478—488
— — монотетическая иерархическая 485
— — серологическая 11
---серологические тесты 375—380
---современные системы 485—488
Клевер белый, урожай 445
— мозаичная крапчатость 230
— пунцовый, вирус раневых опухолей 209
Клеверный штамм желтухи астр 229
Клеточная оболочка, влияние вирусов 245
Клещ(и), передача вирусов 416—418, 437,
456
Климат и репликация вируса 271
Климатические условия, влияние на чув-
ствительность к вирусу 267
Клопы-черепашки 493
Коацервация при выделении вируса 43, 44
Кокциды, передача вирусов 413
Кольцевая пятнистость 18, 203, 207; см.
также Вирус кольцевой пятнистости
Компонент верхний (Т) 185
— нижний (В) 193
— средний (М) 190
Конские бобы 178
Концентрирование вируса 46
Коровий горох 131, 162, 245
Кофеии 356
Крапчатость плодов 206
— сосны и ели 473
— у папоротникообразных 473
Красители, влияние на инактивацию виру-
сов 342
Предметный указатель
581
Крахмал при вирусной инфекции 18, 209,
Крахмальные поражения 204
Креатинфосфат 246
Крестоцветные блошки, распространение
вирусов 416, 426, 427
Кривые разведения вируса 21
---инфокционпости 125, 126, 129, 191
Криптограммы 487, 488
Кристаллизация вирусов при высаливании
43
Кристаллические включения, образуемые
ВТМ 211-213
— структуры в клетках 167
Кристаллы вируса 152
Крымская желтуха 229
Ксилема, локализация и перемещение виру-
сов 172, 173, 176
— при поражении вирусом деформации
побегов дерева какао 209
Кукуруза, вирусные болезни 432
— карликовость 228, 229, 432
Кукурузное масло, специфичность в защите
растений 459
Культивирование апикальной меристемы
451
Культуры(а) каллюсные, концентрация
вируса 179
— клеток насекомых 411
— тканевые, репликация вируса 136—137
Курчавость верхушек картофеля 119
— — сахарной свеклы 9, 209
Кутикула листа 123, 125
Кутин 123
Лайм 176
[{5-Лактоглобулин, стабилизация вируса 334
Латекс при количественном определении
вирусов 31
Латентный вирус гвоздики, свойства 490
— — картофеля 491
— — мозаики повилики 109, 115
— — страстоцвета 490
— — хмеля 490
— период 160—162
— — при передаче вируса тлями 401
Лен новозеландский 229, 412
Лпгеиды, передача вирусов 414
Лигнин 245
Лилии как резервуар вируса 424
Лимонная кислота в инфицированных
листьях 247
Лиофилизация 320
Липид(ы) 166
— в вирусах 53, 81, 481
— влияние вирусной инфекции 243
Липидная мембрана 167
Лпст(ъя), возраст, влияние на вирусную
инфекцию 175, 258, 259
— гистогенез 222, 223
— инокуляция 134
— мозаика 205, 207, 237
— отделенные, репликация вирусов 134,
135
— пигменты 248, 249
— поверхность, структура 123, 124
— пожелтение 206, 226
— поражение ВНТ п ВС 197
Лист(ья), развитие 236
— рибосомы 157
— системно инфицированные 135, 164
— фосфорсодержащие соединения 138
— число клеток 134
Листовой волосок, введение вируса 124
Листовые диски, репликация вируса 135
у-Лучи, инактивация вирусов 332
Люпин 215
Магний (Mg21) в ВЗКМТ 83
— влияние на вирусную РНК 337
------ВТМ 271
— недостаток у растений 231
— при вирусной инфекции 249
Малатдегидрогопаза, влияние вирусной
инфекции па активность 242
Малоновая кислота 255
Маннит в препаратах актиномицина D 147
— влпяппо на число местных поражений
280
Марганец, влияние вирусной инфекции
на содержание в растении 249
Масляные эмульсии как способ борьбы
с тлями 458, 459
Медвяная роса 401
Медь, влияние вирусной инфекции на содер-
жание в растении 249
Межклетники 123
Мезофилл, проникновение и распростране-
ние вирусов 162, 169, 170, 176
— рост клеток в культуре 137
Мейоз, влияние вирусной инфекции 112
Мелколнстпость бобовых 229
Мелкоплодность вишни 204
Момбрана(ы) 220
— вируса осповакцппы 499
— исследования передачи вирусов тлями
396
— плазматическая, эволюция вирусов 499
полипропиленовая 415
Мембранные фильтры 46
Меристемная зона 179
Моркаптоэтанол 360
п-Меркурибепзоат, инактивация вирусов
342
Местные поражения, влияние различных
факторов на возникновение 258, 266, 268
— — подсчет 18, 35
— — при смешанном заражении 271; см.
также Некрозы
Металлы в вирусах 53, 82
— связь с вирусной РНК 337
Метаболизм растений, влияние вирусов
234-257
Метаболиты как ингибиторы вирусов 343—
Метилбромид как средство борьбы с нема-
тодами 461
Метиленовый синий, инактивация вирусов
342
— — количественное определение виру-
сов 31
Метилированные пурины 58
N-метил-N' -нитро-N-нитр оз огу анид ин, му-
тагенное действие 286
Метионин в структурных белках вирусов 76
------ВТМ 303
582
Предметный указатель
Метод двойного оттенения 86
— латинских квадратов 19
— «отпечатков пальцев» 48
— оттенения тяжелыми металлами 12
— уменьшающейся капли 32
— флуоресцирующих антител 158
— экстракции дисков зараженной ткани
34
Микоплазмы 10, 15
— во флоэме 227, 228
— поражающие млекопитающих 227, 228
— предполагаемое возникновение виру-
сов 498
Микоплазмоподобпые организмы 412
— — возбудители желтухи 228
— — морфология 227
— — передача 383
— — патогенность для насекомых-пере-
носчиков 410
Микромаиипуляционные методы для иноку-
ляции листьев 134
Микроэлементы, влияние на вирусы 271
Миксовирусы животных 483
Минеральные вещества, влияние вирусной
инфекции 249
Минорные основания 58
Минус-цепь 139, 140, 149, 151, 155, 170
Митоз в апикальной меристеме, влияние
вируса 176
Митохондрии, влияние вирусной инфекции
151, 157, 219, 220, 240
— связь с вирусом погремковости табака
214
— участие в сборке вирусов 168
Мицелий шампиньонов, вирусы 470, 471
Мицетом 403
Мозаика и аналогичные симптомы 205
— на листьях 237
— электронно-микроскопическое исследо-
вание клеток 218, 219
Мозаичная болезнь табака 9; см. также
ВТМ
Мозаичное заболевание, выраженность 221,
222
— — природа 222—225
Морковь, урожай, влияние вируса 443, 444
Морфологическая субъединица 85
Мохообразные 472
Мочевина, выделение вирусного белка 75
— выделение РНК 56
— инактивация вирусов 338
Муравьи 413
Муравьиная кислота, влияние иа вирус 74
Мурамовая кислота 228
Мутабильность вирусов как экологический
фактор 421—423
Мутагенные агенты 283—286
Мутантные штаммы, дефектные 170
Мутанты вирусов 53
- ВТМ 221, 287
— искусственно индуцированные, выде-
ление 282, 283
— серологические различия 373
— структурные, изменения 286, 287
— температурочувствительиые 230, 302
Мутации «молчащие» 290
— пластид 231; см. также Пластидные
мутанты
— частота 290, 291
Нагревание 300
— инактивация вирусов 314—317
— выделение вирусного белка 75
РНК 55
Надмуравьиная кислота 74
НАД-Н-хинонредуктаза, влияние вирус-
ной инфекции на активность 242
НАДФ-Н-хинонредуктаза, влияние вирус-
ной инфекции иа активность 242
Нарциссы, поражение вирусом, влиянии
ДДТ 457
Насекомые грызущие как переносчики
вирусов 414—416
Насекомые-переносчики 296, 382
— борьба 456
— влияние вирусов 418
— использование для оценки относи-
тельного количества вирусов 24
— перекрестная защита 298
— размножение вирусов 493
— распространение вирусов 424,. 42S>
— токсины 230
Натрий, содержание в вирусах 82
Нафтилуксуспая кислота 348
Негативное контрастирование 12, 86, 87
— — вируса карликовости риса 102
ВТМ 90
— — модель Гиббса и др. 100
Некрозы (местные), аскорбиновая кислота
247
— взаимодействия между неродственными
штаммами 272
— влияние внешних факторов 263—265,
267, 268, 270
— приобретенная устойчивость 277—2791
— при поражении ВНТ и ВС 197
— — системном заражении 272
— скорость распространения 169
— стимуляция дыхания при возникнове-
нии 255
Некротизация 207—209
Некротическая ржавая крапчатость на Рги-
nus avium и В. cerasus 231
Некротические местные поражения 203
Нематоды 380
— борьба 461, 462
— переносчики вирусов 16, 380, 384—
386, 427, 428
_ _ _ специфичность 386
— передача вирусов 440
---— влияние температуры почвы 438:
--- _ сосне 473
Никель, влияние на ВТМ 83
Нимфы 396, 400
Нитрат стронция, выделение РНК 56
Ногохвостки 382
Номенклатура вирусов 487—493
Нуклеазы, выделение РНК 54
— инактивирование вирусной РНК 62
— чувствительность РНК 69
Нуклеиновые кислоты вирусов 53; см. так-
же ДНК, РНК
— — в классификации вирусов 479—481
— — растения, изменения при вирусной-
инфекции 238—240
Нуклеопротеид Bj 186
Нуклеопротеидная минорная фракция В2-
186
------ Во 186
Предметны й указатель
5fe3
Нуклеопротеидная минорная фракция Воо
186
Нуклеотидная последовательность, класси-
фикация вирусов 480
Обезвоживание, инактивация вирусов 330,
331.
Огуречные жуки, передача вируса 416
Огуречный(е) вирус(ы) 3, очистка 50
_ _ 3 и 4, капсидный белок 79
спектр хозяев 295
— — 4, включения 214
Огурец(цы) 38, 131
— защита 459, 460
— поражение вирусом огуречной мозаики
206
— — — — — РГГК-полимераза 150
Однодольные растения, мозаика 205
— — развитие листа 225
Окисление как инактивирующий агент 335
Околоустьичные клетки 123
‘Оксиаминокислоты в вирусном белке, коли-
чество 76
Оксидаза аскорбиновой кислоты, влияние
вирусной инфекции 242
Олигонуклеотиды в ВЖМТ 292
— фракционирование 70
Определение количественное вирусов, чув-
ствительность методов 34, 35
«-Оптимум 363
— определение 30
-Оптимум 364
Опухолевый рост у растений 208
Опухоли, влияние света 268
Органические кислоты, влияние вирусной
инфекции 247
— — инактивация вирусов 341
— растворители, выделение РНК 56
— — инактивация вирусов 341
— соединения как инактивирующие аген-
ты 338—343
•Ортофосфат натрия, защита от вирусной
инфекции 462
Орхидные, получение безвирусных клопов
452
Осот как хозяин вируса 423
Оттенение тяжелыми металлами 86
Павловния, ведьмины метлы 229
Палисадная ткань 223
Палочкообразные вирусы 14, 81, 89—94,
482
_ _ агрегация 25
— — выделение 44
— — длина 89
— — реконструкция 141
— — строение 89, 93, 94
— — типы 89
— — число частиц, подсчет 32
•Папаин 353
Папоротникообразные, вирусы 472, 473
Паракристаллические агрегаты 212
Паракристаллы 81
Парастолбур 229
Паренхима губчатая 222
— палисадная 222
Паукообразные переносчики 381, 383, 416
Певчие цикады 382
.Пектин 123
Пектиназа 136
Пектиновая кислота 245
Пенициллин 228
Пентатомиды 493
Пентахлорнитробеизол, борьба с немато-
дами 461
Пентозофосфатизомераза, влияние вирус-
ной инфекции на активность 242
Пентозофосфатный цикл, влияние вирус-
ной инфекции па активность ферментов
255
Пепсин, влияние на вирусы 353
Пептидные фрагменты как антигены 372
Передача вирусов 296
— — грибами 116—119
— — насекомыми 9, 296, 382, 414—416,
418, 424, 429, 456, 493
— — в полевых условиях 130
------ „ результате прививки 114, 115,
265
— — при вегетативном размножении 113
— — прямая 108—115
— — с помощью повилики 115
— — семенами 108—113, 438, 440
— — специфичность переносчиков 118
— — способы 108—132
------значение для классификации 485
— — через пыльцу 111
— — штаммы 296
Перекрестная защита 296, 297
------значение Для классификации 484
— — механизм 306
Перемещение вирусов в растении, типы 168,
173; см. также Движение вирусов
Перенос растворенных веществ, влияние
вирусной инфекции 255
Переносчики вирусов беспозвоночные 381
- 419
— — борьба 456—463
— — почвенные
Перепончатокрылые при борьбе с черве-
цами 461
— характеристика 382
Перец, заражение вирусами 253, 260
— геи L 464
— механическая инокуляция 124
— резистентность 296
— увядание 255, 256
Пероксидаза(ы) 355
— влияние вирусной инфекции 241—243,
256
— изоферменты 242
Персиковые деревья, инъекция димстил-
сульфоксида 452
Пестролепестность 206, 231
— тюльпанов 9
Петуния 227, 229
Пигменты в листьях и цветках, влияние
вирусной инфекции 248, 249
Пииоцитоз 125
Пипеколиповая кислота, накопление при
вирусной инфекции 245
Пиримидиновые основания при облучении
327
Пиримидины, аналоги, инактивация виру-
сов 346-348
Пиропип 220
Питание растений, влияние па размноже-
ние вируса 270, 271
584
Предметны й указатель
Питание растении, влияние па чувстви-
тельность к вирусу 265, 266
Питательные вещества, недостаток 231
Плазмалемма, присоединение вируса 125
Плазматоциты как место репликации виру-
са 408
Плазмодесмы 123, 169
Пластидные мутанты 223, 225, 231
Пластиды в мутантах табака 222
— наследуемые по материнской линии
дефекты 231
— полифункциональиые 211
Плодоношение, влияние вируса 251
Плоды у растений с мозаичными симпто-
мами 206
Плюс-цепь(и) 139, 149
— как матрица при синтезе белков 155
Побочные клетки 123
Поверхностноактивные вещества, инакти-
вация вирусов 341, 342
Повилика 115, 226
Погодные условия, влияние па вирусы
434-438
Подорожник, вирусоподобные частицы 104
Подсолнечник, мозаичная болезнь 176
Позитивное контрастирование 86
Покрытосеменные, круг растений-хозяев
474, 475
Полиакриламидный гель, фракционирова-
ние вирусных белков 73
Полиамины, инактивация вирусов 342
— в вирусах 53, 81, 106, 107
Полилизин как ингибитор вируса 342
Полирибонуклеотиды, ступенчатая дегра-
дация 70
Полифеиолоксидаза, влияние вирусной
инфекции 24'1, 242
Полифенолы, влияние вирусной инфекции
256
Полиэлектролиты синтетические, инакти-
вация вирусов 342
Полиэтиленгликоль, осаждение вирусов 44
Половые факторы бактерий 495
Полосатость, природа 225
— на листьях томатов 270
_ у однодольных 206
Полужесткокрылые, характеристика 382
Почва, распространение вирусов 427, 433,
437
_ сохранение вирусов 438
--ВТМ 420
Преципитат(ы) специфический(е) 364, 365
Преципитация в геле 366—368
— — пробирках 29, 363
_ — — предельное разбавление 35
— двойная двумерная диффузия на пла-
стинках геля 366
— диаграмма 363
— диффузия в геле 29
— иеспецифическая 375, 376
— требуемое время 30
— чувствительность реакции 31
Прививка(и) как тест на вирусы 131
— передача вирусов 114, 115
_ __ _ влияние температуры 265
— самопроизвольная 115
Прищипка 455
Пробковый камбий при поражении карто-
феля У-вирусом 209
Проводящие ткани, движение вирусов 170
Проволочный мутант томатов 231
Происхождение вирусов 493—501
Прокариоты 495
Пролин при вирусной инфекции 246
Проназа, стабилизация вируса 334
Проницаемость, изменения при вирусной
инфекции 256
Пропилен окись, инактивация РНК 339
Прополка 447
Проростки, заражение вирусом 109
Протеолитические ферменты как ингиби-
торы вирусов 353
Профаг, возникновение 495
Профлавин, инактивация вируса 328
Прямокрылые, перенос вирусов 382, 415,
416
Псевдоскручивание верхушки томатов 412
Псевдоурацил 58
Псиллиды 382, 412
Пситтакоз, возбудитель 228
Птицы, передача вируса 429
Пурины, аналоги, инактивация вирусов
343-346
Путь Эмбдена — Мейергофа — Парнаса 255
Пшеница, защита от вирусного заболева-
ния 453
— передача вирусов клещами 417, 418
— поражение вирусом желтой карлико-
вости ячменя 458
— сроки сева и заражение вирусом 433
— урожай, влияние вирусов 442
— эпитофитотия 435, 436
Пыльца, передача вируса 111
pH, влияние на спектр поглощения в уль-
трафиолете 65
— выделение инфекционной РНК 54, 55
— инактивация вирусов 332—335
Равнокрылые хоботные, характеристика
382
Радиоактивные изотопы при инокуляции
134
— — инактивация вирусов 323
— — исследования репликации вируса
137, 138
— — количественное определение виру-
сов 33
— — определение чистоты вирусного пре-
парата 49
Размножение вирусов в тлях 401—403
— — _ цикадках 405—407
— — влияние температуры 268
— — — различных факторов 267—275
— — смешанное заражение 271—274
Райграс, поражение вирусом желтой кар-
ликовости ячменя 445
Распределение вирусов в растениях 173—
179
Распространение вируса из первично инфи-
цированных клеток 162
— — на большие расстояния 424, 428—
432
----_ _ _ карантинные меры 467
— — скорость и характер 425
----через воздушную среду 424—427
— — через почву 427, 428
Растение(я), влияние густоты посевов
на заражение вирусами 454, 455
Предметный указатель
585
Растение(я) какао, влияние света на ви-
русную инфекцию 268
— — защита от вирусов 461
— концентрация вирусов в клетках 14
— нарушения роста 207
— размер, влияние на заражение виру-
сами 434
— распределение вируса 38
— сроки заражения 110
— чувствительность к вирусной РНК 62
— — — инфекции 19
— хозяин(ева) 109
— — выделение вируса 37, 38
_ — избирательная репликация вирус-
ных штаммов 200
— — реакции с вирусными штаммами 295
_ _ спектр 423, 424
— — специфичность вирусов 303
— —- среди покрытосеменных 475
Реактивация вируса, переходные состоя-
ния 144
Реакция агглютинации 366
— анафилаксии 368
— гемагглютинации 369
— нейтрализации инфекционности 369
— преципитации 362—368
— связывания комплемента 368
Регуляторы роста растений, антивирусное
действие 348
Реконструкция вирусов, гибридные части-
цы 142—145
— — палочкообразные вирусы 141, 142
Рентгеновские лучи, инактивация вирусов
321, 322
— — мутагенные эффекты 283, 284
— — облучение ВТМ 63, 64
Рентгеноструктурный анализ И, 12, 85
Реовирус(ы) 17, 200, 477
- РНК 68
— синтез 411
Репликаза фага Qp 500
Репликация вирусов в насекомых 403,
410-412
— — динамика 159—165
— — вирусоспецифичпые белки 150
— — влияние актиномицина 147
— — концентрация вируса в растениях
176
— — локализация 165—168
— — первые фазы 144—158
— — связь с симптомами болезни 221 —
225
— — скорость 162—165, 179
_ _ структурные белки, синтез 155—
158
— — центры 308, 309
— — цитологические изменения 151—153
---экспериментальные системы для
изучения 135—138
— — этапы 138—144
Репродукция вирусов, влияние темпера-
туры 311
Рецепторы клеточные 63
Ржавчина 275
Рибоза в вирусах 53
Рибосомы 25
— в листьях китайской капусты 236
— — — классы 157
— отличия от вирусов 495, 496
38—0893
Рибосомы при вирусной инфекции
152, 239, 240
— — выделении вируса 40
— синтез белка вируса 158
— суточные изменения 236
— Ё. coli, связывание РНК ВЖМТ
Рис, распределение вируса 176
151,
157
220,
— заражение вирусом карликовости
221
Рибонуклеаза (РНКаза) 83
— в листьях Phaseolus vulgaris 62
— влияние вирусной инфекции 242, 243
— деградация РНК ВЖМТ 70
— действие 358
— инактивация вирусов 351
---РНК 60
— при выделении вирусной РНК 54
— стабилизация вирусов 334
— устойчивость РНК ВЖМТ 151
— фракционирование олигонуклеотидов
70, 71
- Ti 70, 71
РНК вируса(ов) 199
— — бактерий 139
— — карликовости риса 67, 68, 88
— — мозаики коровьего гороха 190
--------костра 182
_ _ _ люцерны 155
— — огуречной мозаики, формы 67
— — полиомиелита 140
— — раневых опухолей 68
— вирусная 85
— — аналоги оснований 345—347
— — белок в препаратах 63
— — в классификации вирусов 479—481
— — высвобождение из белковой оболоч-
ки 144—147
— — генетическая информация, количе-
ство 140, 141
_ _ _ рекомбинация 305
— — тепы, локализация 303, 304
-----двухцепочочные(ая) 101, 147—150,
190
_ _ _ время появления в клетке 159
_ _ — вторичная структура 67—69
_ _ _ кривая плавления 68
— — — синтез белка 155
— — деградация 56, 335
—. — инактивация, агенты 357
--------рибонуклеазой 60, 62
_ _ _ тепловая 315, 316
_ _ _ ультрафиолетом 322—327
— — инфекционность 60—64, 170, 313
— — _ влияние солей 337
---кодирование вирусоспбцифичиых
белков 198
— — кольцевая 67
— — комплексы с рибосомной РНК 57
— — компоненты 58
— — конфигурация 67
— — концевые группы 69, 70
---молекулярная масса 322
---одноцепочечная, вторичная струк-
тура 64—67
— — олигонуклеотиды 70
РНК вируса(ов), основания 58
---очистка 57, 58
— — последовательность оснований 69—
72
586
Предметный указатель
— — перокрестная защита 308, 309
— — поглощение в ультрафиолете 64, 65
— — размеры 12, 58
---различия между вирусными штам-
мами 291—293
— — репликация 411
_ — родительская 151
— — свободная, накопление 159, 160
— — связь с белком 106, 107
___ — — — металлами 82, 83, 337
___ _ — — рибосомами 157
___ _ синтез 15, 153
_ _ _ in vitro 150
— — температура плавления 66
_ — фракционирование 57
- ВЖМТ 81, 96, 147-150
__ __ в листьях китайской капусты, вре-
мя появления 159
— — — хлоропластах 154
— — вторичная структура 156
— — выделение 56, 320
_ _ деградация 67
— — комплексы с рибосомной РНК 57
— — концевые группы 70
_ _ молекулярная масса 64
— _ обработка щелочью 98
_ _ основания, отношения у разных
штаммов 292
— — — состав 59
-----реконструкция 142
— — связывание с рибосомами 157
— — температура плавления 66
— — устойчивость к рибонуклеазе 151
— — фракционирование 64
- ВТМ 83, 90, 141, 142, 149, 158
влияние облучения 322
— — вторичная структура 66, 156
— — выделение 55
— — высвобождение из белковой обо-
лочки 144
— — гидролиз 71, 72
_ — двухцепочечиая в митохондриаль-
ной фракции 153
— — заражение листьев N. glutinosa 161
— — — Chlorella 469
— — и синтез структурного белка 155
— — инактивация 327
— — инфекционность 61—63
— — конфигурация 67
— — концевые группы 70
— — молекулярная масса 59, 64
------ олигонуклеотиды 70, 71
_ _ основания, последовательность 69—
72
_ _ _ состав 59
— — расположение 91
— — свободная 159, 160
— — специфичность 198
— — температура плавления 66
— дрожжевая, влияние на вирус мозапкп
костра 182
— — как ингибитор вируса 350
— и происхождение вирусов 495
— растения при вирусной инфекции 152—
154, 239, 240
— реовируса, строение 69
— рибосомная, комплексы с вирусной
РНК 57
- — кр ивая плавления 68
— синтез вирусного белка 289
— транспортная, изменения, вызванные
вирусом 239
— — необычные основания 58
— — специфичность 156
— фага f2 155
---QP 144
--- R17 182
— Escherichia coli 13
— MS2, реконструкция 142
РНК-геном инфекционный 63
РНК-зависимый синтез вирусной РНК 466
РНК-полимераза 140, 199, 301, 314, 479
РНК-синтетаза(ы) 138—141, 200
— вирусоспецифичная 14
— из листьев, инфицированных ВЖМТ
150
— специфичность для вирусов 139, 150
РНК-содержащие вирусы, происхождение
495
— — репликация 140
Рост, стимуляторы 250
Ростовые вещества, влияние вирусной
инфекции 250, 251
Ртуть, влияние па вирусную РНК 337
Салат-латук, вирус(ы) 446
— — некротического пожелтения 456
— заражение ВНТ 117
— защита от вирусной инфекции 462
— семена безвирусные 448
— — проверка на отсутствие вируса
453
Сателлитные системы 202
Сафлор, заражение вирусом мозаики сала-
та-латука 260
Сахарный тростник, побеление листьев 229
Сахароза, влияние на вирусную инфекцию
268
-------------- механическую инокуляцию 121
— при вирусной инфекции 244
— центрифугирование в градиенте плот-
ности 26
Свекла сахарная, заражение вирусом жел-
тухи 244, 246; см. также Вирус желтухи
сахарной свеклы
_ _ _ — курчавости верхушки сахар-
ной свеклы 421
— — — грибом Alternaria 446
— — курчавость верхушки 9
— — недостаток магния 231
— — урожай, влияние вируса желтухи
443, 444
Сверхчувствительность 259—261
Свет видимый, влияние па восприимчивость
к заражению 262—264, 267
— — инактивация вирусов 327—329
— красный 268
— размножение вируса в растении 267,
268
— рассеяние 30
— реактивация вирусов 325, 326
— сплин 268
Светоноскп 382, 412
Сев, сроки, влияние на вирусную инфек-
цию 454
Севооборот, влияние на вирусы 433
Седиментационный анализ, оценка чистоты
вирусных препаратов 48
Предметный указатель
587
Седиментация при выделении вирусов,
недостатки 51
Сезонность, влияние на вирусы 434—438
Сезонные колебания восприимчивости расте-
нии 267
Семена безвпрусные 448
— передача вирусов 108—ИЗ, 429, 438,
440
— салата-латука 453
— сохранение вирусов 421
Сера, содержание в вирусах 53
Серин в вирусном белке 76
Серологические методы в исследованиях
вирусов 27—31, 35
— реакции 359—380
— — в классификации вирусов 375—380,
483
— — специфичность, роль четвертичной
структуры 373—375
Серотип 379
Сефадекс, выделение вируса 43, 48
Симптомы болезной вирусных или вызы-
ваемых другими агентами 203—233
— — включения 211—213
_ — влияние различных факторов 258—
280
— — — температуры 269
— — генетические отклонения 231
— — гистологические изменения 208, 209
----классификация вирусов 484
— — макроскопические 203—208
----местные 203—204
— — поражение цветка 249
— — различия между штаммами 294, 295
— — связанные с действием актиноми-
цина D 233
_ _ _ _ _ высоких температур 232
— — _ _ _ гормонов 232
— — — — — недостатком питательных
веществ 231
------сходные с симптомами вирусных
Заболеваний 226—233
— — цитологические изменения 209—221
Сииигрин 388, 395
Системная инфекция 174
Системное заражение, дыхательные пути
255
----симптомы 204—206
— распространение вируса 258, 259
Системно инфицированные листья 135
----растения, выделение штаммов 281
Ситовидные элементы 172, 209
Ситостерин р в растениях табака 251
Скополетин, накопление при вирусной
инфекции 247, 248, 250
Скручивание листьев картофеля, гистоло-
гические изменения 209
— — клевера 406
Слива, карликовость 204
Слюнной чехол 415
Слюнные железы цикадок 403
Смешанное заражение 271—274
Солевой(ыо) раствор(ы), выделение белков
74
-------РНК 55
Соли, выделение РНК 56
— инактивация вирусов 336, 337
Сосна, заражение вирусами 473
Сохранение вирусов в природе 438, 440
Соя, инокуляция вирусом крапчатости
бобов фасоли 221
_ — — некроза табака 174
— недостаток магния и железа 231
— урожай, влияние вирусов 443
Спермидин в вирусах 81
Стабильность вирусов 331, 332
— — значение для классификации 482
— — — экологическое 420
Статалоп 470, 471
Стеблевая поровость яблонь 209
Стерин(ы) в растениях табака 251
— потребность микоплазм в культуре 227
Стигмастерпн в растениях табака 251
Столбур 229
Стронций в ВЖМТ 83
Стронция нитрат, выделение РНК 56
Структурная субъединица 85
Сульфат аммония, выделение РНК 55
— — инактивация вирусов 337
— бария 31
Сульфит, влияние на белок ВЖМТ 74
Суспензии клеток, репликация вируса 136
Суточные колебания восприимчивости расте-
ний 266
Суточный ритм у растений 236
Сыворотка кроличья как ингибитор вируса
350, 351
SlT-группы в белковой оболочке 143
Табак, дыхание, влияние ВТМ 253
— заражение вирусом курчавости вер-
хушки сахарной свеклы 208
--------огуречной мозаики 238, 243, 245
— — смесью X- и У-вирусоп картофеля
174
—-------X- или У-вируса картофеля
и ВТМ 272
------ВТМ 136, 163, 165, 166, 176, 177,
211-214, 269, 422
— — — влияние генотипа 260, 261
—-------природа темно-зеленых участков
224, 225
---ранние стадии 239
_ — Л-вирусом картофеля 175
— — X-вирусом картофеля 169
— листья, инактивирующая система 356,
— мозаичная болезнь 9
— перемещение вирусов, скорость 172
— пластиды, аномалии 222, 223
— приобретенная устойчивость 277
— репликация вирусов 151—156
— сорт Ксанти, выделение мутантов ВТМ
282
— стерины 251
Табак,устойчивость к ВТМ 260, 261
— число клеток в листьях 134
— чувствительность к ВТМ 124
Таннин(ы) 37, 355
Таро 431
Темно-зеленые ткани 223 —225
Температура, влияние на восприимчивость
растений к вирусной инфекции 264—265
— влияние на скорость движения вируса
в растениях 268, 269
-----передачу вирусов семенами 111
—-----размножение вируса 268—270,
274, 311
------— симптомы заболеваний 269
38 *
588
Предметный указатель
Температура, инактивация вирусов 314—321
— низкие, инактивация вирусов 319, 452
— почвы, влияние на передачу вируса
нематодами 438
— при тепловой обработке 450, 451
— чувствительность штаммов 309
Температурочувствительные мутанты 302,
312
Тепловая инактивация, роль ионов метал-
лов 337
— терапия 226, 449—451
Тетрациклин, чувствительность микоплазм
227
Тиленхиды 381
Тимол при хранении вирусов 47
Тиопиронин как инактивирующий агенс
328
2-Тиоурацил 202
— влияние на синтез белка ВЖМТ 158
---— У-вирус картофеля 451, 452
— ингибирование вирусов 346—348
---ВТМ 466
Тканевые гомогенаты, репликация вируса
136
Тли, взаимодействия с вирусами, типы 388
— влияние вирусов на популяцию 419 •
।--густоты посевов 455
— инсектицидов 456—458
— — масляных эмульсий 458
— — нехимических барьеров 460, 461
— — хищников и паразитов иа популя-
цию 460, 461
— группы переносчиков 387
— жизненный цикл 386
— инфицирование через мембраны 395,
396
— миграция, роль в экологии вирусов
425, 426
---влияние на урожай 443
— передача вирусов 10, 389—403
— питание 386 .
— ротовые органы 398
— слюнной чехол 394, 395
— стадия нимфы. 386
— численность, годовые вариации 435
Тля гороховая, передача вируса 400, 401
— хлопковая, передача вирусов 393
— Hyperomyzus lactucae, передача вируса
456
— Myzus persicae, передача вируса 204
Токсины членистоногих 230
Толерантность 259, 261
Толерантные сорта 463—465
Толуидиновый синий как инактивирующий
агент 327, 328
Томаты, дыхание, .влияние ВТМ 253
— коричневая пигментация плодов 270
— повреждение 2,4-Д 232
— волосатость 270
— поражение вирусом бронзовости 245
— — — кустистой карликовости 257
ВТМ 158, 170, 178, 207, 303, 310,
444
---X- и У-вирусами картофеля 245
— проволочный мутант 231
— протопласты 125
— устойчивость к вирусу бронзовости 261
Травянистые растения, мозаика 205
Травянистый покров, карликовость 229
Транспирация, влияние вирусной инфек-
ции 255, 256
Треонин 371
— в вирусном белке, количество 76
— удаление из ВТМ 12
Триангуляционное число 97
Трипсин, инактивация вирусов 353
— расщепление белка ВЖМТ 80
— стабилизация вируса 334
Трипсы как переносчики вирусов 382, 383,
416
Триптофан в вирусных белках 76, 494
Трисиликат магния, влияние на инокуля-
цию 121
Трихлорофон 457
Тростник 265
Тюльпаны 9, 206, 258
Увядание ананаса 414
— гороха 228
— перца, влияние генотипа 260
Углеводы в вирусах 53
— влияние вирусной инфекции 243—
245
Углерод, содержание в вирусах 53
Уксусная кислота, выделение вирусных
белков 74
-------РНК 56
Ультразвук, инактивация вирусов 329, 330
Ультрафиолет, влияние после инокуляции
144
— инактивация вирусов 144, 145, 321—
327
— облучение стилетов тлей 398
— поглощение РНК 64
Ультрафиолетовая оптика при исследова-
ниях вирусов 24, 26
Ультрафиолетовые лучи, мутагенные эффек-
ты 283
Уридин-3Н 153
Уридинмонофосфаткиназа, влияние вирус-
ной инфекции 242
Урожай, влияние вирусов 442—446
Устойчивость бактерий к инфекции 259—
261, 276-280, 463-465
утрата 310
УФ-облучение ВТМ 306, 307
— чувствительность штаммов 300; см.
также Ультрафиолет
Уховертки, передача вирусов 382, 416
Фаг R17, структурный белок, включение
глицина 156
Факторы устойчивости у бактерий 495
Фасолевый вирус 1, локализация в расте-
нии ИЗ
— — 2, локализация в растении 113
Фасоль, влияние света на поражение виру-
сами 262, 263
— восприимчивость к вирусной инфек-
ции, суточные колебания 267
— --- вирусу некроза табака 262
— — — — огуречной мозаики, сезонные
изменения 267
-------ВТМ 258
— заражение вирусом кольцевой пятни-
стости табака 169
— --- некроза табака 22
Предметный указатель
589
Фасоль, влияние ВНТ и ВС 197
-----ВТМ 128
— приобретенная устойчивость 277
— размножение ВНТ, число частиц на
клетку 163
— хлоропласты, включения 211
ФВК, действие на вирусы 87
Фенол, выделение вирусного белка 75
-----РНК 55, 57
— использование при инокуляции 131
— устойчивая форма ВПТ 183
Фенолоксидазы 355
Фенольные соединения, инактивация виру-
са 354
— — при выделении вируса 39, 40
Ферменты, влияние вирусной инфекции
на активность 241—243
— мутагенные эффекты 284
Ферритин, метка антител 166, 215, 380
Физиологически активные газы 251
Фитоалексины 141
Фитохромная система, влияние на размно-
жение вируса 268
Флоккуляционная проба с бентонитом 35
Флоэма, вирусы 171, 172, 176
— микоплазмы 227, 228
— некротизация 244
— патологические изменения 208, 209
Флуоресцирующие антитела 379
— — в тканях насекомых 408—410
Форат 457
Формальдегид, инактивация вирусов 340
— обработка РНК 60
N-Формилметиоиин, включение 157
Фосфатаза кислая, влияние вирусной ин-
фекции 242
Фосфогексоизомераза, влияние вирусной
инфекции 242
Фосфоглюкомутаза, влияние вирусной
инфекции 242
6-Фосфоглюконатдегидрогеназа, влияние
вирусной инфекции 242
Фосфолипидные мембраны, проникновение
ВТМ 125
Фосфор в вирусах 53
— — растениях 138
Фосфор, влияние вирусной инфекции на со-
держание 246
— — на восприимчивость к инфекции 266
— недостаток 232
Фосфорнокислый калий, добавка к иноку-
луму 120
Фосфорорганические инсектициды 457
Фосфорсодержащие соединения, влияние
вирусной инфекции 246, 247
Фотореактивация 145, 325, 326
Фотосинтез, влияние вирусной инфекции
Фтор, влияние на ВТМ 267
5-Фтордезоксиуридин, влияние на ВТМ
179
Фторуглерод (фреон-113), выделение виру-
сов 42
5-Фторурацил 314
— ингибирование вирусов 347, 348
— мутагенные эффекты 284
— при инактивации ультрафиолетом 326
Фунгициды 119, 446
Фумиганты 461
6-Фурфуриламинопурин, см. Кинетин
Хелатные агенты, выделение вирусов 40
Хилла реакция 252
Химотрипсин 353
Хиноны 355, 356
Химиотерапия вирусных болезней 452
Хлорамфеникол 243
Хлористый кальций 74, 337
— цезий 48, 73
Хлорогеновая кислота 355, 356
Хлороз 206, 249
Хлоропласты в пластидных мутантах 223
— влияние вирусов 157, 158, 166, 217—
219, 249
— — высокой температуры 232
— включения 211
— локализация вирусной РНК 154
— отсутствие гран 253
— сборка вируса 165, 167, 168
— типы 238
Хлоротические поражения 18
Хлорофилл, влияние вирусной инфекции
248, 249
Хлорофиллаза 242
Хлороформ, выделение вирусов 42
Хлорпикрин как фумигант 462
Холестерин в растениях табака 251
Хранение вирусов 46—47, 300
Хроматография как метод очистки 46
— на колонках МАК 57
Цветение, связь со сроками инокуляции 110
Цветки, влияние вируса 206, 249
Целит 120
Целлюлаза 136
Центрифугирование, анализ вирусных пре-
паратов 47, 48
— аналитическое 24—26, 35
— в градиенте плотности 15, 26, 35, 43,
45, 47, 48, 57, 367
— дифференциальное 44
Центрифугирование зональное 26
— специфических агрегатов 367
Церкопиды 382
Цианин 249
Цикадки, влияние ветра 437
— жизненный цикл 403
— передача болезней 226, 228
— — вирусов 296, 405—410, 429, 438
---вируса карликовости риса 15
-------курчавости верхушки сахарной
свеклы 421
— пищеварительная система 404
— строение 403
— токсины 230
— характеристика 382
Цинк, влияние вирусной инфекции на со-
держание 249
Цистеин в вирусном белке 76
Цистин 76
Цитокинины ИЗ, 250
Цитохромоксидаза, влияние вирусной
инфекции на активность 242
Цитрат, инактивация вирусов 341
ЦМФ-киназа, влияние вирусной инфекции
на активность 242
590
Предметный указатель
Цитоплазма, агрегаты частиц 219
— как место сборки вируса 165, 167, 168
--- — формирования кристаллических
включений 213
— присутствие вирусов 219, 220
— репликация вируса 411
Частицы аморфные (Х-тела) 210
Человек как переносчик вирусов 429, 462—
463
Червецы как переносчики вирусов 382, 413,
437, 461
— токсины 230
Четвертичная структура 373—375
Четвертичные соли аммония, деградация
ВЖМТ 46
Чешуекрылые, характеристика 382
Число поражений 20, 21, 125, 126
Членистоногие, токсины 230
— переносчики, группы 381, 382
— — как связующее звено между расте-
ниями и позвоночными 493
Шелковица, карликовость 227, 229
Шлирен-оптика 24, 26
Штаммы, биологические критерии 294
— близкородственные, серологические
различия 378
- ВТМ 213
— выделение, методы 281—283
— генетическая рекомбинация 305—306
— и генотип растения-хозяина 261
— идентификация, критерии 291—300
— избирательная репликация в расте-
ниях-хозяевах 200
— инфекционность удельная 300
— классификация вирусов 479
— отбор, экологическое значение 421—
423
— отдаленные, серологические различия
378
Штаммы, передача 296
— — тлями 390, 402
— продуктивность 299
— происхождение в природе 290—291
— роль в защите растений 464, 465
— — — определении характера мозаич-
ного заболевания 22
— серологическое родство 376
— смешивание 200
— чувствительность к различным агентам
300
Щитовки 382, 413
Эволюция вирусов 493
— — предполагаемая из организмов типа
микоплазм, стадии 498
ЭДТА, деградация РНК ВЖМТ 67
Эклипс 160—162
Экология вирусов 420—441
— — влияние биологических факторов
420-434
— — — физических факторов 434—438
— — и сельскохозяйственная практика
432-434
— — сохранение на протяжении годо-
вого цикла 438, 439
Эктодесмы, роль в проникновении вируса
124, 125
Электронная микроскопия, антитела, мечен-
ные ферритином 380
— — в исследованиях вирусов 11, 12,
85, 86, 89, 180
— — вирусной РНК 67
— — включений 214
Электронный микроскоп, определение кон-
центрации вируса 50
------фотографический метод Маркхэма
87, 97
Электронно-микроскопические исследова-
ния вируса в цикадках 407, 408
Электроны быстрые, инактивация вирусов
322
Электрофорез, выделение вирусов 45
Электрофоретическая подвижность, разли-
чия между штаммами 294
Энации 207
Эндоплазматическая сеть при вирусной
инфекции 151, 152, 239
Эндосперм, локализация вируса 109
Эпидермис, вирусы 172, 176, 220
— — движение 162
— гистогенез 222, 223
— листа 124, 125
------табака, РНК 152—154
-------- число клеток 134
— при заражении ВТМ 152
— репликация вируса 134, 136
Эпикутикулярный воск 123
Эриофииды как переносчики вирусов 417
Эритроциты в серологических тестах 31
Этанол, инактивация вирусов 341
— выделение вирусов 41
— количественное определение вирусов 18
Этилен, влияние вирусной инфекции 251
— окись, инактивация вирусов 339
Этилендиаминтетраацетат (ЭДТА) 178
Яблоня(и), заражение вирусом поникания
ветвей 245
— стеблевая поровость 209
— уплощение ветвей 207
— филлодии 229
Яблочная кислота, влияние вирусной
инфекции 247
Ядерная мембрана инфицированных клеток
151
Ядро, антиген ВТМ 158
— включение ВТМ 213
— изменения после инфекции 152
— как место нахождения вирусов 220
— — — сборки вируса 168
Ядро при заражении ВТМ 210, 213
— репликация вируса 411
— синтез РНК при вирусной инфекции
154, 155
Ядрышко(и), роль в репликации вируса 153
— при заражении вирусом гравировки
табака 215
Яичный альбумин 63
Яйца цикадок, передача вируса 406
Янтарный ангидрид 76
Ячмень, заражение вирусом желтой карли-
ковости 259
— — — мозаики костра 150
УКАЗАТЕЛЬ ЛАТИНСКИХ НАЗВАНИЙ
Abutilon striatum 219
Acarina 383
A ceratagallia sanguinolenta 411
Aceria tulipae 417, 418
Acyrthosiphon pisum 400
Adelgidae 387
Agallia constricta 403- 411
Agalliopsis novella 406
Agaricus bisporus 469
Agrobacterium tumifaciens 495
Aleyrodoidea 382, 412
Alternaria 275, 446
Amaranthus lividus 176
AphididaeS 387
Aphidlus 461
Aplndoidea 382, 383, 386
Aphis craccivora 460, 464
- fabae 394, 397, 419
— gossypii 459, 388, 393
Aspergillus glaucus 472
Arachis hypogaea 137
Araclinida 381, 383, 416
Arthropoda 381
Azotobacter vinelandii 495
Barathra brassicae 415
Bemisia tabaci 412
Beta vulgaris 169, 171, 244
Botrytis cinerea 462
Brassica chlnensis 391
— juncea 391
— nigra 391
— pekinensts 224
— rap a 224
Brevicoryne brassicae 388, 395, 397
Callaphididae 387
Callistephus chlnensis 229
Calligypona pellucida 230
Canavalia ensiformis 338
Capsicum annum 213
— frutescens 260
Cavariella aegopod.il 430, 443, 461
Cercopoidea 382, 383
Cercospora 275
Chaitophoridae 387
Chamaecyparis lawsoniana 473
Chenopodium 167
— amaranticolor 38, 131, 212, 266, 312,
326
— capitatum 170, 174, 176, 204
Chermoidea 382, 412
Chieranthus cheiri 249
Chionapsis austriaca 473
Chlorella pyrenoidosa 469
Cicadoidea 382
Circulijer tenellus 405, 429, 430
Citrus sinensis 175
Coccoidea 382, 413
Coleopters 382, 414
Coleorrhyncha 382, 383
Collembola 382
Colleotrichum 276
Colocasia esculenta 431
Compositae 423
Cryptotaenia faponica 229
Cucumis sativus 38
Cucurbitaceae 295, 312
Cuscuta 115
— campestris 109
Cymbidium 176, 490
Cyphomandra betacea 310
Dalbulus elimatus 228—230
Datura 297
— stramonium 10, 216, 252, 278, 279,
403, 413
Dcrmaptera 382, 414
Dianthus caryophyllus 357
Diptera 382, 414
Dolichos biflorus 129, 191
Dorylaimida 381, 384
Driopteris jilix mas
Dysmicoccus 414
Endria inimica 410
Epilobium 496
— hirsutum 231
Epitrix cucumeris 415
Eragrostis trichodes 391
Eriophyes insidiosus 456
Eryngium aquaticum 310
Eriophyidae 383, 417
Erysiphe 27 6
— poligoni 275
Escherichia coli 12, 138, 139, 156, 157
Euglena gracilis 155
Euscelis plebejus 229
Eutettix tenella 9
Eerrisia virgata 413
Fragaria 423, 475
Frankliniella fuse a 416
Fulgoroidea 382, 412
Fusarium solani 275
Gomphrena globosa 263, 267, 278
Greenideidae 387
Helianthus annuus 276
Helmilhosporium vlctoriae 471
I-Ieteroptera 382, 383, 414, 493
Homoptera 230, 382, 412
Hordeum vulgare 217
Hymenoptera 382
Hyperomyzus lactucae 105, 456
Insecta 381, 382
Ipomoea batatus 430
Jassoidea 382, 383
Laohnidae 387
Lantana horrida 168
Laodelphax striatellus 104, 408
Lathyrus odoratus 249
Lemnaceae 135
Lepidoptera 382, 414
Lobium perenne 445
Longidorus 384, 386
— attenuatus 385, 473
— elongatus 385, 428, 440, 461, 462
— macrosoma 438
Lupinus luteus 251
592
Указатель латинских названий
Lysopersicon esulentum 296
— peruvianum 269, 464
Macadamia 211
Macrosiphum avenae 298
Macrosteles fascifrons 229
Melanoplus existentialis 415
Melilotus officinalis 319
Membracoidea 382, 412
Micrococcus lysodeikticus 495
Monilinia fructicola 141
Myzus ornatus 392
Myzus persicae 10, 204, 261, 298,299,388—
403, 414, 415, 434, 435, 456, 459
Nematoda 381, 384
Nephotettix iinpicticeps 405, 406
— cincticeps 229
Nicotiana 176
— clevelandii 200, 214
— digluta 260
— glauca 179, 310
— glutinosa 18, 21, 81, 114, 128, 158,
161, 162, 168, 210, 212, 214, 232, 241,
245, 246, 254, 255, 260, 266, 270, 272,
282, 297, 390, 415, 466, 474
— langsdorfii 129
— repanda 272
— rustica 82, 220, 229, 392, 410
— sylvestris 162, 304
— tabacum 166, 214, 246, 255, 260, 282,
295, 299, 304, 319, 326, 357, 390, 398,
463, 466
Nite Ila 238
Nothojagus 383
Nysius 383, 414
Odontoglossum 489
Oliarus atkinsonii 229, 412
Olpidium. 197, 427, 438, 462
— brassicae 116—119
Orthoptera 382, 414
Passer domesticus 429
Pemphigidae 387
Penicillium funiculosun 471
— stoloniferum 470, 471
Pentatrichopus jacobi 399
Peregrinus maidis 104, 408
Peronospora tabacina 276
Petunia hybrida 38, 200
Phaseolus vulgaris 19, 22, 37, 62, 110, 237,
241, 252, 255, 267, 278, 326
Phormium tenax 229, 412, 432
Phyllitis scolopendrium 472, 473
Phyllotreta 416
Phylloxeridae 387
Physalis floridiana 251, 403
Phytolacca esculenta 354
Phytophtora infestans 275
Phytoptus ribis 419, 437
Picea exelsa 473
— stichensis 473
Pinus monticola 473
— nigra 473
— sylvestris 473
Plantago lanceolata 104
Polymyxa 119
Poncirus trifoliata 175
Prunus 114
— avium., 231
— cerasus 231
— mahaleb 238
— pensylvanica 110
— spinosa 428
Pseudococcus citri 413
— longispimes 413
— njalensis 413
Pseudomonas syringae 350
Psylla pyricola 412
Puccinia 276
Rhoeo discolor 474
Rhopalosip.hum fitchii 402
— padi 298, 402
— pseudobradslcae 391
Rosaceae 37
Sacchiphantes abtetis 473
Samolus parviflorus 297
Serratia marcescens 226
Solanaceae, 212, 295, 310, 423
Solanum 432
Sonchus 423, 440, 456
Spirodela 138
— polyrhiza 135
Spongospora subterranea 119
Synchytrium endobioticum 119
Tetranychidae 383, 418
Tetranychus telarius 418
Tettigonia cantans 415
— viridissima 415
Thelaxidae 387
Thielaviopsis basicola 276
Thrips tabaci 416
Thysanoptera 382, 416
Trichodorus 473
— allius 385
— christei 385
— pachydermus 385, 386
— porosus 385
— primitivus 385
— similis 385
— teres 385
— viruliferus 385
Trichothecium roseum 349
Trifolium incarnatum 209
— repens 229
Trombidiformes 383
Tylenchidae 381
Tylencholaiminae 384
Uromyces 276
— phaseoli 275
Verbesina encelioides 121
Vieta faba 153, 176, 216, 388
Vigna cylindrica 191
Vigna sinensis 38, 125, 268, 278, 319, 349
Vinca rosea 229
Xiphinema 384, 386
— americanum 383—386
— coxi 385
— diversicaudatum 385, 386, 428, 440, 461
473
— index 384, 385
Zea mays 229, 432
Zinnia elegans 272
ОГЛАВЛЕНИЕ
Предисловие к русскому изданию.................. 5
Предисловие автора ............................... 7
ГЛАВА 1
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА И
КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИРУСОВ
Инфекционность.................................................... . .
Подстет числа местных поражений.......................................
Оценка инфекционности, основанная на определении числа инфицирован-
ных растений . .......................................................
Аналитическое ультрацентрифугирование.....................................
Центрифугирование в градиенте плотности...................................
Серологические методы.....................................................
Методы предельного разбавления при постановке тестов на преципитацию
Определение а-оптимума................................................
Время, требуемое для преципитации.....................................
Количество специфического преципитата.................................
Рассеяние света.......................................................
Добавление частиц или клеток для повышения чувствительности серологиче-
ской реакции .........................................................
Подсчет числа вирусных частиц с помощью электронного микроскопа. . . .
Химические методы, применяемые при работе с очищенными вирусами. . .
Применение радиоактивных изотопов для количественного определения вирусов
Эксперименты in vivo .................................................
Эксперименты in vitro.................................................
Смешанные методы..........................................................
Относительная чувствительность различных методов..........................
18
18
22
24
26
28
29
30
30
30
30
31
31
32
33
33
33
34
34
s глава ш
ВЫДЕЛЕНИЕ ВИРУСОВ
Выбор растительного материала ...........................................
Испытание на инфекционность
Исходный материал. ..................................................
Среда для экстракции.....................................................
pH и буферная система................................................
Ионы металлов и ионная сила..........................................
Восстанавливающие агенты и вещества, защищающие от фенольных соеди-
нений ...............................................................
Вещества, используемые для удаления растительных белков и рибосом . .
Методы экстракции . . . . . .............................................
Первичная очистка вируса . . . ..........................................
Осветление экстракта . . . ..........................................
Концентрирование вируса и удаление низкомолекулярных примесей. . . .
Дальнейшая очистка препаратов вируса ....................................
Центрифугирование в градиенте плотности.............................
Электрофорез в градиенте плотности . ........................ . .
Другие виды электрофореза ................................... . .
37
37
37
39
39
39
39
40
41
41
41
42
44
45
45
45
594
Оглавление
Гель-фильтрация в агаре..............................................
Хроматография........................................................
Концентрирование вируса и удаление низкомолекулярных веществ.........
Хранение очищенных вирусов..............................................
Идентификация инфекционных частиц и критерий чистоты....................
Идентификация вирусных частиц........................................
Критерий чистоты.....................................................
Концентрация вируса в растениях и валовой выход очищенного вируса . . . .
Определение выхода...................................................
Данные о валовом выходе вирусов......................................
Факторы, ограничивающие применение существующих методов выделения вирусов
Г ЛА В А IV
СТРУКТУРНЫЕ КОМПОНЕНТЫ
Нуклеиновые кислоты......................................................
Выделение РНК вируса...................................................
Компоненты, входящие в состав вирусной РНК...........................
Размеры молекул РНК..................................................
Инфекционность РНК................................................
Размер молекул РНК, необходимый для обеспечения инфекционности . .
Поглощение в ультрафиолете...........................................
Вторичная структура одноцепочечных вирусных РНК.....................
Кольцевая РНК.......................................................
Вторичная структура двухцепочечных вирусных РНК......................
Последовательность оснований.........................................
Вирус растений, содержащий ДНК.......................................
Белковая субъединица.....................................................
Выделение белка из вирусных препаратов...............................
Аминокислотный состав................................................
Концевые аминокислоты................................................
Последовательность аминокислот в структурных белках..................
Вторичная и третичная структура белковой субъединицы.................
Другие компоненты вируса.................................................
Полиамины..............................................................
Липиды ..............................................................
Металлы..............................................................
Вода.................................................................
46
46
46
46
47
47
47
49
49
50
51
53
53
58
58
60
63
64
64
67
67
69
72
73
73
76
79
79
80
81
81
82
81
84
ГЛАВА V
СТРОЕНИЕ ВИРУСОВ
Палочкообразные вирусы....................................................... 89
Жесткие палочкообразные частицы.......................................... 90
Гибкие палочкообразные частицы........................................... 93
Однородность строения палочек по длине................................... 93
Икосаэдрические вирусы...................................................... 94
ВЖМТ.................................................................... 96
Вирус крапчатости консцих бобов......................................... 98
Вирус огуречной мозаики............................................... 99
Вирус хлоротической крапчатости коровьего гороха. ........ 99
Вирус некроза табака.................................................... 99
Вирус-сателлит.......................................................... 99
Вирусы, состоящие, возможно, из 42 структурных субъединиц...............100
Вирус мозаики люцерны........................................................100
Вирусы, содержащие двухцепочечную РНК........................................101
Вирус раневых опухолей...................................................101
Вирус карликовости риса..................................................101
Крупные вирусы, имеющие внешнюю оболочку....................................102
Сферические частицы......................................................102
Бацилловидные частицы, или частицы, имеющие форму пули................... 102
Связи, стабилизирующие структуру вируса.................................... 105
Взаимодействия белок — белок............................................. 105
Взаимодействия белок — РНК............................................... 106
Оглавление
595
ГЛАВА VI
СПОСОБЫ ПЕРЕДАЧИ ВИРУСОВ
И МЕТОДЫ ИНФИЦИРОВАНИЯ РАСТЕНИЙ
Прямая передача вируса....................................................
Передача вирусов с помощью семян......................................
Передача вируса в процессе вегетативного размножения растений . . .
Передача вирусов в результате прививки................................
Передача вирусов с помощью повилики...................................
Передача вирусов с помощью организмов, не принадлежащих к высшим растениям
Беспозвоночные............................................................
Грибы.................................................................
Механическая передача вирусов.............................................
Инокуляция ..........................................................
Характер и число восприимчивых к инфекции участков...................
Число вирусных частиц, необходимое для инициирования инфекции . .
Механическая передача вирусов в полевых условиях......................
Эксперименты по передаче вирусов, проводимые с целью установления вирусной
природы заболевания.......................................................
ГЛАВА VII
РЕПЛИКАЦИЯ И РАСПРОСТРАНЕНИЕ ВИРУСОВ
ПО РАСТЕНИЮ
Экспериментальные системы................................................
Интактные растения...................................................
Переживающие ткани...................................................
Суспензии клеток и тканевые гомогенаты...............................
Тканевые культуры....................................................
Бесклеточные системы.................................................
Использование радиоактивных изотопов.................................
Вероятные этапы репликации вирусов растений..............................
Сведения, полученные в опытах с вирусами бактерий и животных . . . .
Количество генетической информации в вирусах растений................
Сведения, полученные в экспериментах по реконструкции вирусов растений
Первые фазы инфекции ....................................................
Высвобождение родительской вирусной РНК из белковой оболочки . . .
Возможная роль ДНК растения-хозяина..................................
Двухцепочечные вирусные РНК..........................................
Другие вирусоспецифичные белки.......................................
Природа и локализация синтеза РНК и белка на ранних стадиях вирусной
инфекции ............................................................
Синтез структурного белка вируса.....................................
Динамика появления и накопления вируса и вирусных компонентов ....
Независимость процессов синтеза РНК и белка вируса ..................
Двухцепочечиая вирусная РНК.....................................' . .
Накопление свободной вирусной РНК....................................
Эклипс, или латентный период.........................................
Распространение вируса из первично инфицированных клеток.............
Зрелый вирус.........................................................
•Локализация сборки вируса внутри клетки............................. .
Движение вирусов по растению.............................................
Движение от клетки к клетке..........................................
Перемещение на большие расстояния....................................
Окончательное распределение вируса в растении............................
Ограниченное распространение инфекции................................
Увеличение и снижение концентрации вируса с возрастом листа . . . .
Колебания концентрации вируса в различных органах и тканях . . . .
Вирусы, избирательно поражающие определенные ткани..................
Неравномерное распределение в мозаичных листьях.....................
Распределение вируса вблизи апикальной меристемы.....................
108
108
ИЗ
114
115
116
116
116
119
119
123
127
130
130
133
133
135
136
136
137
137
138
138
140
141
144
144
147
147
150
150
155
158
158
159
159
160
162
162
165
168
168
170
173
173
175
176
176
176
176
596
Оглавление
ГЛАВА VIII
ДЕФЕКТНЫЕ ВИРУСНЫЕ ЧАСТИЦЫ, МНОГОКОМПОНЕНТНЫЕ ВИРУСЫ
И ВИРУСЫ-САТЕЛЛИТЫ
Вирусы со спиральной структурой...........................................181
Вирус табачной мозаики................................................ 181
Вирус погремковости табака.............................................182
Сферические вирусы....................................................... 185
Вирус желтой мозаики турнепса......................................... 185
Вирусы группы мозаики тыквы........................................... 188
Другие икосаэдрические вирусы..................................... . 191
Вирус мозаики люцерны.................................................... 198
Вирус некроза табака (ВНТ) и вирус-сателлит (ВС)......................... 19G
Зависимость ВС от ВНТ..................................................196
Специфичность взаимосвязи между ВС и ВНТ...............................197
Последовательность событий в инокулированном листе.....................197
Природа взаимодействия между ВС и ВНТ................................. 198
Обсуждение............................................................... 199
Многокомпонентные вирусы.............................................. 199
Вирусы-сателлиты.......................................................201
Дефектные вирусные частицы............................................ 201
ГЛАВА IX
СИМПТОМЫ ВИРУСНЫХ БОЛЕЗНЕЙ
Макроскопические симптомы................................................ 203
Местные симптомы...................................................... 203
Симптомы системного поражения......................................... 204
Гистологические изменения.................................................208
Цитологические изменения в инфицированных растениях.......................209
Вирус табачной мозаики................................................ 211
Вирус погремковости табака.............................................214
Группа Y-вируса картофеля............................................. 214
Группа Х-вируса картофеля..............................................216
Группа вирусов желтухи сахарной свеклы.................................216
Вирус штриховатой мозаики ячменя.......................................217
Вирус желтой мозаики турнепса..........................................217
Другие мелкие сферические вирусы.......................................219
Крупные вирусы.........................................................220
Взаимосвязь между репликацией вируса, ростом растения и симптомами заболе-
вания .................................................................. 221
Концентрация вируса и степень тяжести заболевания......................221
Роль штаммов вируса в определении характера мозаичного заболевания . . 222
ГЛАВА X
АГЕНТЫ, ВЫЗЫВАЮЩИЕ СИМПТОМЫ, СХОДНЫЕ С СИМПТОМАМИ
ВИРУСНЫХ БОЛЕЗНЕЙ
Организмы типа микоплазм.................................................226
Токсины, вырабатываемые членистоногими.................................. 230
Генетические отклонения................................................. 231
Недостаток питательных веществ.......................................... 231
Высокие температуры......................................................232
Повреждения, вызываемые гормонами...................................... 232
Появление аномальной окраски под влиянием физиологических факторов . . . 232
Актиномицин D........................................................... 233
ГЛАВА XI
ВЛИЯНИЕ НА МЕТАБОЛИЗМ РАСТЕНИЙ
Переменные, которые следует учитывать в эксперименте.............. 234
Измеряемые параметры........................................... 235
Факторы, меняющиеся во времени.................................. 236
Неоднородность в момент взятия образца...........................237
Оглавление
597
Нуклеиновые кислоты и белки...........................................
ДНК ..............................................................
РНК и рибосомы....................................................
Растворимые белки.................................................
Активность ферментов..................................................
Липиды ...............................................................
Углеводы..............................................................
Компоненты клеточной оболочки.........................................
Концентрация некоторых низкомолекулярных соединений...................
Аминокислоты и родственные соединения.............................
Фосфорсодержащие соединения.......................................
Аскорбиновая кислота .............................................
Органические кислоты..............................................
Ароматические соединения..........................................
Пигменты................,.........................................
Минеральные вещества..............................................
Ростовые вещества.....................................................
Физиологически активные газы..........................................
Фотосинтез............................................................
Дыхание...............................................................
Транспирация, содержание воды и перенос растворенных веществ..........
Обсуждение............................................................
ГЛАВА XII
ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА ТЕЧЕНИЕ И ХАРАКТЕР ИНФЕКЦИИ
Факторы, связанные с растением-хозяином..................................
Возраст..............................................................
Генотип .............................................................
Факторы окружающей среды.................................................
Факторы, влияющие иа восприимчивость растений к заражению . . . .
Факторы, влияющие на размножение вируса и степень проявления заболевания
Смешанное заражение......................................................
Взаимодействия между неродственными вирусами.........................
Взаимодействие между вирусами и грибами..............................
Приобретенная устойчивость к инфекции....................................
238
238
239
240
9/, 4
245
245
245
246
247
247
247
248
249
250
251
252
253
255
256
258
258
259
262
262
267
271
271
275
276
ГЛАВА XIII
ИЗМЕНЧИВОСТЬ
Выделение штаммов...................................................... 281
Штаммы, возникающие естественным путем в некоторых растениях-хозяевах 281
Выделение штаммов из системно инфицированных растений................. 281
Отбор новых штаммов путем заражения особых растений-хозяев или изменения
условий выращивания растений........................................... 282
Выделение искусственно индуцированных мутантов........................ 282
Мутагенные агенты........................................................ 283
Действие рентгеновских и ультрафиолетовых лучей....................... 283
Действие высоких температур I . ...................................... 284
Ферменты.............................................................. 284
5-фторурацил.............'........................................... 284
Гидроксиламин ........................................................ 285
Азотистая кислота..................................................... 285
Различные химические мутагены......................................... 286
Изменения структурных компонентов в мутантах ВТМ.......................... 286
Мутанты ВТМ и генетический код............................................ 287
Частота мутаций и происхождение вирусных штаммов в природе................ 290
Критерии идентификации вирусных штаммов................................... 291
Структурные критерии.................................................. 291
Биологические критерии................................................ 294
Взаимосвязь между структурой и биологической активностью вирусов .... 300
Дефектные штаммы...................................................... 301
Структура вирусных частиц и специфичность в отношении хозяина . . . 303
Число и локализация вирусных генов.................................... 303
598
Оглавление
Вирусные штаммы в растении................................................... 305
Генетическая рекомбинация............................................... 305
Механизм перекрестной защиты.............................................306
Избирательная репродукция вирусов в специфических растениях-хозяевах 310
Избирательная репродукция вирусов при различных условиях окружающей
среды................................................................... 311
Утрата вирусом инфекционности для определенного растения-хозяина в резуль-
тате пассажа через другое растение...................................... 312
ГЛАВА XIV
ИНАКТИВАЦИЯ ВИРУСОВ
Температура ...............................................................
Нагревание in vitro....................................................
Нагревание in vivo.....................................................
Замораживание и оттаивание............................................
Действие излучений.........................................................
Рентгеновские лучи ...................................................
Быстрые электроны......................................................
у-Лучи................................................................
Включение радиоактивных изотопов в вирус..............................
Ультрафиолет...........................................................
Видимый свет..........................................................
Обработка ультразвуком ...................................................
Обезвоживание.............................................................
Высокое давление..........................................................
Старение вирусов...........................................................
In vitro.................................................. , . . . ,
In vivo ..............................................................
Концентрация водородных ионов.............................................
Окисление и восстановление.................................................
Неорганические вещества....................................................
Азотистая кислота .....................................................
314
314
318
320
321
321
322
322
323
323
327
329
330
331
331
331
332
332
335
335
335
Иод.................................................................... 336
Соли................................................................... 336
Органические соединения................................................... 338
Мочевина............................................................. 338
Гидроксиламин........................................................ 338
Алкилирующие агенты . . ....................... 339
Формальдегид........................................................... 340
Двуокись углерода...................................................... 340
Органические кислоты................................................... 341
Органические растворители.............................................. 341
Поверхностноактивпые вещества...........................................341
Синтетические полиэлектролиты......................................... 342
Красители и производные акридина....................................... 342
Полиамины.............................................................. 342
н-Меркурибензоат....................................................... 342
Метаболиты и антиметаболиты............................................... 343
Аналоги природных пуринов и пиримидинов...................343
Аминокислоты............................................................348
Регуляторы роста растений и родственные пм соединения...................348
Вещества биологического происхождения..................................... 349
Антибиотики и другие вещества, образуемые микроорганизмами .... 349
Кроличья сыворотка..................................................... 350
Ферменты, атакующие РНК................................................ 351
Протеолитические ферменты............................................. 35’3
Вещества из высших растений.............................................353
Краткие замечания относительно процессов, происходящих при инактивации
вирусов ................................................................ 357
Агенты, непосредственно инактивирующие РНК..............................357
Агенты, которые связываются с интактным вирусом, но не действуют непосред-
ственно на РНК......................................................... 358
Агенты, вызывающие абортивную инфекцию in vivo.............358
Прочие вещества....................................................... 358
Оглавление
599
ГЛАВА XV
СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ
Природа антигенов и антител.................................................359
Антигены............................................................... 359
Антитела.......................................................... . 360
Получение антисыворотки................................................... 361
Виды серологических реакций................................................362
Реакция преципитации ................................................ 302
Реакция связывания комплемента........................................308
Реакция анафилаксии ................................................. 368
Реакция гемагглютинации...............................................369
Реакция нейтрализации ипфекционности..................................369
Связывание гаптенов с антителами.......................................369
Структура антигенов вирусов растений.........................................370
Роль различных компонентов вируса в серологических реакциях .... 370
Химическая структура центров связывания..................................371
Роль четвертичной структуры в серологической специфичности .... 373
Серологическое родство между вирусами растений...............................375
Наличие или отсутствие серологического родства...........................375
Степень серологического родства между штаммами вирусов, принадлежащих
к одной группе ......................................................... 376
Меченые антитела как цитохимические реагенты.................................379
При световой микроскопии...............................................379
При электронной микроскопии............................................380
(ГЛАВА XVI
ВЗАИМООТНОШЕНИЯ МЕЖДУ ВИРУСАМИ РАСТЕНИЙ
И БЕСПОЗВОНОЧНЫМИ
Группы беспозвоночных-переносчиков............................................381
Нематоды (Nematoda).......................................................381
Членистоногие (Arthropodа)................................................381
Резюме....................................................................383
Нематоды (Nematoda)..........................................................384
Тли (Aphidoidea)..............................................................386
Особенности питания и жизненный цикл......................................386
Группы тлей-переносчиков..................................................387
Типы взаимоотношений между вирусами и тлями...............................388
Вирусы, передаваемые с помощью стилета....................................389
Циркулирующие вирусы......................................................399
Цикадки (Jassoidea)...........................................................403
Строение и жизненный цикл ................................................403
Взаимоотношения между вирусом и переносчиком..............................405
Другие группы Hoinoptera......................................................412
Горбатки (Membracoidea)...................................................412
Светоиоски (Fulgoroidea)..................................................412
Псиллиды (Chermoidea).....................................................412
Белокрылки (Aleyrodoidea).................................................412
Кокциды (червецы и щитовки, Coccoidea)....................................413
Лпгеиды (Heteroptera)........................................................ 414
Грызущие насекомые............................................................414
Трипсы (Thysanoptera).........................................................416
Паукообразные (Arachnida).....................................................416
Галлообразующие, или четырехногио клещи (Eriophyidae).....................417
Тетрапиховые клещи (Tetranychidae)........................................418
Некоторые положительные воздействия вирусов на переносчиков...................418
ГЛАВА XVII
ЭКОЛОГИЯ
Биологические факторы........................................................420
Свойства вируса и растения-хозяина.......................................420
Распространение переносчиками............... . . , ....... 424
600
Оглавление
Приемы возделывания сельскохозяйственных культур.......................432
Физические факторы.........................................................434
Сезонность и погодные условия..........................................434
Почва..................................................................437
Сохранение вируса на протяжении годового цикла.............................438
Заключение .............................................................. 439
ГЛАВА XVIII
ЭКОНОМИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ВИРУСНЫХ БОЛЕЗНЕЙ РАСТЕНИЙ
И ЗАЩИТНЫЕ МЕРОПРИЯТИЯ
Экономическое значение......................................................442
Защитные мероприятия....................................................... 446
Устранение источников инфекции..........................................446
Использование безвирусных семян....................................... 448
Использование безвирусного посадочного материала........................448
Агротехнические мероприятия............................................ 453
Борьба с переносчиками..................................................456
Иммунные, устойчивые и толерантные сорта................................463
Защита при помощи слабых штаммов вируса.................................465
Защита с помощью антивирусных препаратов............................... 465
Защита от распространения вирусов на большие расстояния.................467
ГЛАВА XIX
РАСПРЕДЕЛЕНИЕ ПО ГРУППАМ РАСТЕНИЙ
Распределение вирусов среди низших групп растений........................ 469
Водоросли............................................................. 469
Грибы................................................................. 469
Мохообразные..........................................................472
Папоротникообразные...................................................472
Голосеменные............................................................473
Круг покрытосеменных растений-хозяев, поражаемых вирусами.............. 47 i
ГЛАВА XX
НОМЕНКЛАТУРА, КЛАССИФИКАЦИЯ И ПРЕДСТАВЛЕНИЯ
О ПРОИСХОЖДЕНИИ ВИРУСОВ
История вопроса............................................................476
Существующие критерии, используемые при классификации вирусов .... 478
Нуклеиновые кислоты....................................................479
Число и структура белков в вирусной частице............................481
Другие составные части вирусов.........................................481
Строение вирусов.......................................................481
Физико-химические свойства.............................................482
Стабильность вирусов...................................................482
Серологические реакции.................................................483
Вирусоспецифичные некапсидные белки....................................483
Дефектные частицы и многокомпонентные вирусы...........................484
Активность вируса в организме растения-хозяина.........................484
Способы передачи.......................................................485
Генетика...............................................................485
Современные системы классификации вирусов..................................485
Монотетическая иерархическая классификация.............................485
Классификация Адансона.................................................486
Номенклатура . ........................................................487
Группы вирусов растений....................................................488
Представления о происхождении и эволюции вирусов...........................493
Потомки примитивных доклеточных форм жизни ............................494
Возникновение из нормальных клеточных компонентов......................494
Дегенерировавшие микроорганизмы .......................................497
Литература................................................................ 502
Предметный указатель..................................................... 567
Указатель латинских названий.............................................. 591
А. Из истории. Рисунки тюльпанов из «травника» Паркинсона, изданного в Лондоне
в 1656 г. Каждому цветку дано сортовое название, хотя пестролепестность некоторых
цветков явно вызвана вирусной инфекцией. Не исключено, что тональность цветов,
характерная для рисунков в таких «травниках», со временем изменилась (33].
В. Пример мозаичного заболевания. Листья китайской капусты, инфицированные тремя
различными изолятами вируса желтой мозаики турнепса. Вверху слева — здоровый лист.
В- Определение инфекционности. На листе Nicotiana glutinosa видны местные некроти-
ческие поражения, вызванные вирусом табачной мозаики. Каждая половинка листа
ииокулировапа вирусом, однако концентрация его в том и в другом случае различна.
Г- Цитологические симптомы. Микрофотография клеток в месте соединения между
темио-зелеиым островком ткани и желтым островком в листе китайской капусты, инфи-
цированным вирусом желтой мозаики турнепса. Темно-зеленые клетки по существу
нормальные. Соседние желто-зеленые клетки содержат аномальные хлоропласты и вирус
в высокой концентрации.
Д. Беспозвоночное-переносчик. Тля Dactynotus sonchii (L.) — переносчик вируса мозаики
цветной капусты, питающаяся на осоте.
Е. Борьба с инфекцией посредством борьбы с переносчиками. Фотография поля пшеницы,
зараженного вирусом желтой карликовости ячменя, переносимого тлей Rhopalosiphum
padi (L.), полученная методом аэрофотосъемки. Фотография сделана перед уборкой
урожая. Более темный квадрат в центре был оставлен неопыленным, тогда как остальное
поле было обработано инсектицидом системного действия для борьбы с переносчиком
вируса.
Ж- Борьба с инфекцией путем использования генетически устойчивых сортов. Поле чув-
ствительной к поражению брюквы с резко выраженными симптомами заболевания
в результате инфекции вирусом мозаики цветной капусты. В центральном ряду находятся
растения сорта Сенсейшн, устойчивого к вирусной инфекции.
3. Физические исследования. Ориентированный препарат вируса табачной мозаики, исполь-
зуемый для рентгеиоструктурного анализа. Раствор очищенного вируса табачной мозаики
в капилляре диаметром 0,5 мм, помещенном между скрещенными поляроидами под
углом 45° к плоскости поляризации. Однородное двойное лучепреломление в верхнем
образце (кроме левого участка) указывает на то, что расположение палочкообразных частиц
в высшей степени упорядочено, причем пх длинные оси параллельны оси капилляра.
Окраска клеток цикадок Agallia conslricla (в мопослое), илфпциронаиных вирусом желтой
карликовости картофеля (вверху) и вирусом раневых опухолей (внизу), после обработки
специфической флуоресцирующей антисывороткой ((фотография сделана с помощью флуо-
ресцентного микроскопа) [374].
Вверху: клетки АС-20, зараженные вирусом желтой карликовости картофеля, штамм
Нью-Джерси (X 400). Окрашенные пятна, по-вндпмому, локализованы в некоторых
ядрах; сплошное окрашивание наблюдается при скоплении пятен или в том случае, когда
ядра ие попадают точно в фокус. Слева внизу — скопление незаряженных клеток в виде
теней с черными кругами (это ядра, окруженные цитоплазмой, которая обладает некото-
рой собственной флуоресценцией).
Внизу: клетки Л С-20, зараженные вирусом раневых опухолей (X 400). Черные круги —
нсокрасившиеся ядра, окруженные окрашенной цитоплазмой. Иногда окрашенные участки
цитоплазмы над или под ядром расположены таким образом, что создается впечатление,
будто окрашены ядра. Заражены все клетки.
Фото 1. Сравнение ультрафиолетовой оптики и шлирен-оптики.
Смесь нуклеопротеида ВЖМТ («50 мкг на 1 мл) и пустых белковых оболочек («100 мкг
па 1 мл) центрифугировали при 35 000 об/мин в течение 20 мин в 0,1 М NaCl при pH 7,3.
Седиментация слева направо. Пики при использовании шлирен-оптики имеют приб-
лизительно одинаковый размер для обоих компонентов. Ультрафиолетовая оптика
гораздо чувствительнее для быстро седиментирующего нуклеопротеида, содержащего
35% РНК. А. Шлиреп-диаг рамма. В- Фотография, получеппая в проходящих ультра-
фиолетовых лучах. Б. Денситограмма фотографии, приведенной па фото Z7.
т/г 1-0893
Фото 2. Электронная микрофотография мпкрокапли, содержащей смесь частиц noiii
стирольного латекса (0,234 мкм в диаметре) и частиц ВТМ.
Мнкрокапля высушена на пленке-подложке. Оттенение платиной.
Фото 3. Октаэдрические кристаллы очищенного ВЖТМ, образованные при высаливанни
сульфитом аммония в концентрации, составляющей х/;1 насыщающей.
Фото 4. Скоростное центрифугирование и равновесное центрифугирование в градиенте
плотности как критерии гомогенности.
А. Скоростное центрифугирование. Внизу изображена ссдимонтограмма компонента В()
ВЖМТ в концентрации около 4,1 мг на 1 мл в 0,1 М NaCl при pH 7,4: центрифуги-
рование при 35 000 об/мин и течение 12 мин. Виден только один компонент. Вверху —
ссдимонтограмма компонента В(|() ВЖМТ в тех же условиях. Л. Равновесное центри-
фугирование. Компонент В(1 ВЖМТ (около 200 мкг) мосле центрифугирования в течение
42 ч при 35 600 об/мин в хлористом цезии с плотностью I) == 1,35 г/мл (нижняя содн-
ментограмма) и 1,39 г/мл (верхняя соднментограмма). В этом случае удастся наблюдать
более чем один компонент.
Фото 5. Электронные микрофотографии РНК ВТМ, показывающие зависимость ее кон-
фигурации от иоипой силы и температуры [978].
Л. Состояние клубка в растворе с ионной силой 0,1 М при комнатной температуре.
1нпой силой 0,0003 М при комнатной температуре,
в растворе с иоппой силой 0,00075 М, нагретом
ь. состояние палочки в растворе с и
В. Одиночная вытянутая нить РНК
до 70° С.
Фото 6. Электронная микрофотография ВТМ, подвергнутого частичной фенольной дегра-
дации; увеличение — 250 000.'
Видны оголенные отрезки ВПК, оттененные платиной.
Фото 7. Электронная микрофотография ВТМ, где в качестве контрастирующего вещества
использовалась ФВК; X 260 000.
Можно наблюдать центральный полый канал, заполненный контрастирующим веществом.
Фото 8. Модель ВТМ [1008].
А. Схема, иллюстрирующая взаимоотношения между ВПК и белковыми субъединицами.
В отсутствие белковых субъединиц РНК не может сохранять конфигурацию, представлен-
ную на этой схеме. На каждую белковую субъединицу приходится 3 нуклеотида, или
49 на виток большой спирали; межиуклеотидное расстояние составляет около 0,5 нм.
В. Фотография модели ВТМ с указанием основных размеров. Период идентичности
вдоль оси спирали равен 6,9 им, и на каждые 3 витка спирали приходится 49 субъединиц.
N = 25
N = I6
Фото 9. Структура вируса погремковости табака [1283].
А . Электронная микрофотография вируса с использованием в качестве контрастирующего
вещества уранилформиата. Л. Схематическое изображение в плане и сбоку коротких
вирусных частиц (слова); справа — схематическое изображение ВТМ в том же масштабе
(для сравнения). N — округленное число субъединиц на виток спирали.
Фото III. Олектроппыс микрофотографии некоторых палочкообразных вирусов.
А. Х-вирус картофеля (контрастирующее вещество — урапилформиат). В. Вирус
прижил новой мозаики красного клевера (представитель группы У-внруса картофеля);
обработка ФВК. В. Латентный вирус гвоздики, родственный S-вирусу картофеля
(контрастирующее вещество — урапилформиат). Г- Вирус желтухи свеклы (контрасти-
рующее вещество — ФВК).
Фото 11. Дельтоэдры, характеризующиеся пкоеаэдричоской симметрией (икосадсль-
тоэдры) [332].
Каждый из пих имеет 20 Т граней, представляющих собой равносторонние треугольники.
А и Б — класс Р=1, триангуляционное число равно 1 и 4 соответственно; В и Г — класс
Р=3, триангуляционное число равно 3 и 12 соответственно.
Ъ&О
€^5ъ 4?Х<>
_ ^8H>W
Фото 12. Расположение морфологических субъединиц, представляющих собой гекса-
меры и пентамеры, в структуре икосаэдрических вирусов, относящихся к двум простей-
шим классам (Р =1 — слева и Р = 3 — справа) (см. табл. 8) [332].
Субъединицы должны быть плотно упакованы на поверхности. Число морфологических
субъединиц в представленных на фото структурах равно 12, 42, 92, ... (Р = 1) и 32,
122, ... (Р = 3). На некоторых моделях морфологические единицы, представляющие
собой пентамеры и гексамеры, изображены разным цветом.
Фото 13. А. Двумерный кристалл ВЖМТ, содержащий небольшое количество пустых
белковых оболочек над отверстием в углеродной пленке-подложке. Частицы образуют
квадратный узор с осями симметрии 2-го порядка в направлении рядов решетки и пер-
пендикулярно плоскости отверстия. Соседние частицы в ряду ориентированы перпен-
дикулярно друг к другу (X 150 000). Б. Квадратный мотив идеализированного схема-
тического изображения частиц ВЖМТ, на котором видна относительная ориентация
частиц, приведенных на фото А [519].
1/2 2-0893
Фото 14. Фотография частицы ВЖМТ, полученная методом Маркхэма [1152].
Фото 15. Различные пробковые модели, построенные каждая из 180 субъединиц, лежащих
иа поверхности сферы и соответствующих ио расположению, направлению и размеру
и радиальном направлении структурным субъединицам белковой оболочки ВККБ (Л)
и ВЖМТ (Б) [519].
7 — двукратное, 2 — трехкратное и ,? — пятикратное увеличение (масштаб: 1 см = 13,5 пм).
Структурные субъединицы ВККБ выступают примерно иа 1,5 нм над поверхностью
частицы, и их длинные осп почти параллельны ближайшей локальной оси симметрии
6-го или 5-го порядка; эти субъединицы образуют 32 цилиндрические пли призматические
морфологические субъединицы. Структурные субъединицы ВЖМТ выступают дальше над
поверхностью частицы, чем у ВККБ, и по направлению расположены еще ближе к ло-
кальной оси симметрии 6-го или 5-го порядка; они образуют морфологические субъеди-
ницы, напоминающие по форме усеченные конусы [520].
Фото 16. Вирус-сателлит. Электронные микрофотографии двух вирусных частиц,
полученные в направлении, примерно совпадающем с осью 2-го порядка, и модель, иллю-
стрирующая такое расположение 12 морфологических субъединиц, при котором по-
лучается картина, близкая к наблюдаемой.
Фото 17. Модель структуры частиц вируса мозаики люцерны, предложенная Халлом
и др. [847]. Представлены геодезические модели частиц пяти размеров.
А — верхний (То) компонент. Б — верхний (Тп) компонент. В — верхний (Тр) ком-
понент. Г — средний (И) компонент. Д — нижний (В) компонент.
Фото 18. Электронные микрофотографии вируса карликовости риса, полученные методом
негативного контрастирования.
А. На поверхности частиц видны морфологические субъединицы. Б. На периферии
частиц видны выступы.
Фото 19. А. Вирус бропзовости томатов на ультратонком срезе листа томата. 13. Срез
частиц вируса гриппа, прикреплениях к эритроциту (для сравнения). В- Частицы
вируса бронзовости томатов в препарате из экстракта листа коровьего гороха; контрасти-
рование ураиилацетатом.
Фото 20. Вирусы, имеющие форму пули.
А, а. Поперечные срезы частиц вируса желтой карликовости картофеля, на которых
видно, что вирусная оболочка имеет ламеллярную структуру. Частицы несколько сжаты
сбоку. Негативное изображение фотографии, представленной па фото А. 13. Микро-
денсптометрпческая кривая для частицы, расположенной па фото А вверху |1130]. Г. Срез
клетки j¥. ruslica, па котором видна группа частиц вируса желтой карликовости карто-
феля, заключенных в окруженный мембраной пузырек. Д. Частица вируса пожелтении
жилок осота в негативно контрастированном препарате из экстракта листа |142(>|.
Фото 21. Х-белок ВТМ в виде стопки двойных дисков; увеличение примерно 120 000
[1159].
Фото 22. Электронная микрофотография истинного трехмерного кристалла белковых
агрегатов ВТМ (метод негативного контрастирования). Такие кристаллы образуются
но время диализа А-белка ВТМ в щелочном растворе. Видимый па поверхности рисунок —
сеть из квадратов — возникает в результате наложения белковых дисков, расположен-
ных в виде центрированной тетрагональной решетки; увеличение примерно 700 000
[1129].
Фито 23. Прививка нрасщеп.
Черенок (картофель), инфицированный У-вирусом картофеля (привой обозначен стрел-
кой), привит врасщоп на растение картофеля сорта Дакота.
Обратите внимание на гибель верхушек боковых побегов подвоя.
Фото 24. Заражение клетки корня грибом Olpidium. Электронная микрофотография,
показывающая содержимое ипцистированной зооспоры, проникающей в клетку-хозяина.
1 — цитоплазма цисты; 2 — цитоплазма клетки-хозяина; 3 — оболочка клетки-хозяина;
4 — оболочка цисты; 5 — тонопласт цисты; 6 — эктопласт цисты; 7 — вакуоль.
Фото 25. Л. Поверхность листа l/ellebnriis nlger с эпндормальпыми клетками и замы-
кающими клетками устьиц. В. Эпнкутнкулярпын воск па поверхности листа Brassica
oleracea var. capilaiae. Фотографии получены с помощью сканирующего электронного
микроскопа [18]. В- Волоски па поверхности листа табака. Па фотографии представлен
участок на границе между темно-зелеными тканями (справа) и желтыми тканями (слова)
мозаичного листа, инфицированного ВТМ. Клетки в левой части фотографии содержат
кристаллические вирусные включения.
Фото 2(>. Включение 8Н-уридипа и здоровые и инфицированные вирусом желтой мозаики
клевера копчики корней Vicia faba [1495].
Л. Здоровые корни; значительное включение в ядрышки. Б. Кории, инфицированные
вирусом; значительное включение в ядрышки. В- Здоровые копчики корпя, обработанные
актиномицином D; включение в ядсрпую РНК подавлено. Г. Кории, инфицированные
вирусом и обработанные актиномицином D; значительное включение в ядрышки.
Фото 27. Темноокрашонныо нити в цитоплазме клетки, находящейся на границе некроза,
вызванного ВТМ в листе Chenopodium aniaranilcolor [1214].
Видны целые нити и нити в поперечном сечении. Внизу слова видон агрегат палочкооб-
разных частиц ВТМ.
Фото 28. Срез, иа котором видна часть периферической зоны ядра клетки ЛС ruslica,
зараженной вирусом желтой карликовости картофеля [ИЗО].
1 - - ядро; i - митохондрия; 3 — наружная мембрана ядсриой оболочки; -I - - внутрен-
няя мембрана ядерпой оболочки; 5 — вирус; 6 — рибосомы, прикрепленные к наружной
мембране.
Фото 29. Продольный срез через дна ситовидных злемонта мелкой жилки листа llt'hi
I’ulgaris, зараженного вирусом желтухи свеклы (500].
('оеднпнтолыгыс канальцы ситовидного поля выстланы каллозой и содержат вирусные
частицы. В обеих клетках, особенно в нижней, содержится масса вирусных частиц.
Фото 30. Неравномерное распределение вируса размочаливания листьев в листе системно
зараженного растения цитранжа [607].
В участках, отмеченных кружками, наличие вируса определялось методом инокуляции
индикаторных растений, у которых развиваются местные некрозы. Цифры показывают
число вызванных некрозов.
Фото 31. Распределение вируса желтой прижилковой мозаики клевера в кончике корня
Vida faba [1632]. Указано число местных некрозов (в расчете на один лист), возникающих
после инокуляции индикаторных растений экстрактом из срезов толщиной 200 мкм.
Зак. 089.3
Фото 32, Седиментограммы вируса мозаики коровьего гороха, полученные при ультра-
цептрифугпровании с использованием шлпрея-оптики [1822].
Вверху — сок больных растений, осветленный прогреванием: в центре — препарат,
очищенный с использованием бутанола и хлороформа; внизу — препарат, очищенный
с использованием полиэтиленгликоля. Всюду видны три пика, соответствующие трем
компонентам вируса. Седиментация слева направо.
Фото 33. Двухцепочечная вирусоспецифичная РНК, выделенная из Vigna unguiculata
после заражения вирусом мозаики коровьего гороха.
Длина цепей 1,45 и 2,5 мкм.
Фото 34. Влияние ВС на размер и число местных некрозов, вызываемых ВИТ на фасоли
[949].
Правая сторона листа заражена ВИТ, левая — смесыо ВИТ и ВС.
Фото 35. Типы местных поражений.
Л. Хлоротические поражения, вызываемые вирусом мозаики сахарной свеклы на листе
Chenopodium amaraniicolor. II. Кольцевая пятнистость, вызываемая вирусом мозаики
люцерны па листьях табака. Д. Некротические поражения, вызываемые вирусом брон-
зовости томатов па листьях табака.
Фото 36. Карликовость растения сельдерея (сорт Юта Паскаль), возникшая в резуль-
тате естественного инфицирования вирусом западной мозаики сельдерея. Слева — здоро-
вое растение.
Фото 37. Мозаичное заболевание китайской капусты, вызнанное ВЖМТ. На фото-
графии изображен лист растения, инфицированного Кембриджским изолятом вируса.
При инокуляции растений экстрактами различно окрашенных участков ткани больных
листьев развиваются заболевания с различными симптомами (цветная вклейка 1).
Фото 38. А. Посвотлеиие жилок салата-латука, вызванное вирусом крупных жилок
салата-латука. Справа — лист здорового растения. 13. Симптомы, вызванные вирусом
мозаики цветной капусты па листе цветной капусты.
Фото 39. Листья Narcissus psetirlonarcissiis, зараженные вирусом мозаики нарцисса. Спра-
ва — здоровый лист.
Фото 40. Вирусный болезни цветков.
А- Левкой, зараженный вирусом мозаики турнепса. Б. Гладиолус, зараженный вирусом
огуречной мозаики. В. Фиалка, зараженная вирусом огуречной мозаики. Слепа —’здо-
ровый цветок.
Фото 41. Поражения плодов.
А. Плод огурца, инфицированный вирусом огуречной мозаики. Слепа — здоровый огурец.
!> Плоды груши. Поражения вызнаны вирусом жесткой деформации плодов груши.
Слева — здоровый плод. В. Плод яблони, cojit Гранин Смит, с концентрическими кру-
гами и красновато-коричневым рисунком. Заболевание возникло в результате заражения
вирусом кольцевой пятнистости яблонь.
Фото 42. Поражения листьев земляники в результате заражения вирусом пожелтения
краев листьев земляники.
Фото~43. Характерные кольцевые и линейные поражения, вызванные Орегонским штам-
мом вируса ногремковостн табака на листе табака (слева) и томата (справа).
Фото 44. Системная некротизация листа табака, развившаяся в результате заражения
вирусом бронзовости томатов 1181].
Л. Фотография листа в видимом спето. 13. (Фотографии в ультрафиолете. Флуорес-
ценция возникает благодаря накоплению в пораженных тканях флуоресцирующего
соединения сконолетнна.
Фото 45. Нарушения нормального роста растений в результате вирусной инфекции.
Л. Поражение листьев Phaseolus multiflorus в результате заражения вирусом мозаики
фасоли. Б. Уплощение ствола и ветвей у яблони сорта Гравоппгтснп [1120]. В. Растение
томата, зараженное смесью ВТМ и вируса огуречной мозаики.
Фото 4(). Галлы на стеблях белого донника, вызванные вирусом раневых опухолей
клевера.
<1><>то 47. Гистологические и цитологические нарушения, вызванные ВТМ в листе табака.
Л. Срез через палисадные клетки, расположенные в темпо-зеленом участке мозаичного
листа. Клетки выглядят в основном нормально. />. Срез соседнего желто-зеленого уча-
стка. В этом случае клетки большие и не дифференцированы по своей форме. Ядра не рас-
положены в центре, как это имеет место в клетках темно-зеленых участков.
Фото Срои клубня картофеля, инфицированного Х-впрусом картофеля, на котором
пн,юн слой про'iKiiiioi'o камбия, образовавшегося вблизи группы отмерших клеток (внизу
Фото 49. А. Ультратонкпй срез кристаллического включения, образовавшегося в клетке листа табака, инфициро-
ванного ВТМ. Видны регулярно расположенные слои вирусных частиц, что внешне напоминает кладку кирпича «в
елочку» [1864] Б. Микрофотография очищенного препарата ВТМ, полученного осаждением цитохромом с и от-
тененного металлом: частицы сложены в пачки п образуют слои, причем расположение их довольно сходно с тем.
что представлено на фото А [1217].
Фото 50. Аморфное включение в паренхимной клетке первичной коры табака, инфи-
цированного ВТМ, под световым микроскопом; X1501) [49(1].
1 — ядро; 2 — Х-тело.
<|)ото 51. Аморфное включение в паренхимной клетке табака, нпфициронапиого НТМ,
в катером видны эндоплазматическая сеть (/), рибосомы (2), вирусные частицы (.7) и широ-
кие нити (/); •' 53 000 | 496].
Фото 52. Электронная микрофотография части палисадной клетки листа Nicollana de-
velandii, на которой можно наблюдать длинные палочкообразные частицы вируса погрем-
ковости табака (штамм САМ), связанные с митохондриями; X 64 000.
Фото 53. Включения, образуемые вирусом гравировки табака в клетках листа табака.
А. Включения типа мельчайших колесиков (.Z), наблюдаемые на тонких, срезах при кон-
трастировании урапилацетатом — цитратом свинца (2 — округлое тельце) [481]. Б. Трех-
мерная модель включения, представленного на срезе па фото А [481]. В. Попереч-
ный разрез цилиндрического включения, образовавшегося в клетке листа табака,
инфицированного вирусом гравировки табака (484]. Препарат приготовлен с помощью
вакуум-инфпльтрацнн. Видна регулярная исчерченпое.ть со сродней периодичностью 5 нм.
Фито 54. Препарат, приготовленный из экстракта листьев растений, инфицированных
У-вирусом картофеля [11521.
Виден пучок вирусных частиц, заключенных в мембрану.
Фото 55. Включения в паренхимных клетках мелких жилок Beta vulgaris, инфициро-
ванной вирусом желтухи свеклы [499].
А. Структура включения, которую можно наблюдать с помощью светового микроскопа.
В. Структура включения при электронно-микроскопическом исследовании. Полосы
составлены из гибких вирусных частиц, расположенных более или менее регулярным
образом.
.•w
Фото Г>(>. Различные аномальности хлоронластов в клетках различных типов тканей
листа китайской капусты с симптомами мозаичного заболевания, вызванного ВЖМТ
1347].
А. Здоровый лист. 1>. Бледно-зеленый. В- Желто-зеленый. Г- Желто-зеленая ткань
с фрагментирующимися хлороиластамп. /(. Желто-зеленая ткань с большим количеством
пузырьков в хлороиластах. Е. Обесцвеченная (белая) ткань, в каждой клетке которой
обнаруживается одиночная масса вакуолизированного материала разрушенных хлоро-
пластов с большим количеством пузырьков.
Фото 57. Микроскопическая картипа мозаики па листе китайской капусты, ппфпциро-
аапном ВЖМТ [347].
Л- Верхние и нижние слон мезофилла темно-зеленые, центральная зона обеецнечепа.
!>. Обратная картипа.
Фото 58. Включения, состоящие из агрогиронаппых .хлоропластов, в клетке мезофилла
листа китайской капусты, системно инфицированной ВЖМТ.
Фото 59. Электронная микрофотография трубочек, построенных, возможно, из вирус-
ного белка, которые можно наблюдать в препаратах из экстрактов листьев китайской
капусты, инфицированных некротическим штаммом ВЖМТ. Негативное контрастиро-
вание; X 80 000.
Фото 60. Крупные вирусы, заключенные в окруженный мембраной пузырек (внутри ядра пли внутри впячиванпя ядерноп оболочки).
А. Вирус желтой карликовости картофеля в клетках Xicotiana rustica. Б- Вирус пожелтения жилок осота в клетках Sonchus oleraceus [1426].
Фото 61. Электронные микрофотографии мнконлазмоподобных организмов по флоэме
больных растений.
А. Флоэма Сгцplolaenia japonlca, пораженной возбудителем ведьминых метел. IJ. Phar-
bilis nil, пораженный возбудителем ведьминых метел батата. J3. Phorniium lenu.r, пора-
женный возбудителем пожелтении листьев.
Фото 62. Влияние обработки тетрациклином на развитие симптомов карликовости
у сеянцев шелковицы.
Слева — больное растение с симптомами карликовости у молодых листьев. Спра-
ва — то же растение через 30 дней после 12-кратной обрбаотки тетрациклином.
Фото 63. Микоилазмоподобные тельца в слюнной железе цикадки Macrostel.es face If го ns
Sial, инфицированной желтухой астр, через 4 иод после кормления ее на зараженном
растении Calllslephus chlnensis.
Микоплазмоподобные тельца различной величины, в которых видны гладкие эле-
ментарные мембраны, рибосомы и цепи ДИК. Рибосомы телец мельче, чем рибосомы
клетки-хозяина.
Фото 64. Растение люцерны с симптомами, напоминающими симптомы вирусного аабо
леваппя.
Фотография сделана через 3 под. после кормления на растении клеща.
фото (>5. Моза 14 ка, вызванная мутацией х,поропластов у растений табака.
Справа — лист мутанта, описанного Варком и др. [304]. Слева (ущп сранненця) —
мозаика, вызванная типичным штаммом ВТМ.
Фото (>0. «Проволочный» мутант томата сорта Марглоб. Внешне этот мутант сходен
с растениями, пораженными некоторыми вирусами (для сравнения см. фото 45 [48^1).
Фото (57. Растение JV. glutinosa, выращенное при высокой температуре (37,8 °C) |8Я1)|.
Внешне напоминает растение, пораженное вирусным заболеванием.
Фото (58. Действие гормона (2,4-Д) на растения томатов.
Слева — нормальный лист.
Фото (511. Влияние возраста растений в момент заражения и численности тлей - пере-
носчиков вируса—на подавление роста растений ячменя при заражении вирусом желтой
карлиновости ячменя ] 16221.
Л. Низкая численность тлей. 13- Высокая численность тлей. Стадии развития, па которых
произошло заражение (слеиа направо): контроль, цветение, выход в трубку, кущение,
три листа, один лист.
Фото 70. Реакция двух сортов табака на заражение томатным штаммом ВТМ.
А. Сорт Уайт Барлей; типичная картина системной мозаики. Б- Сорт Уорне; местная
некротическая реакция без системного распространения вируса. В. Гибриды F, (Уорне.
Q X Уайт Барлей о’); местные некрозы, сильная системная некротизация и прекраще-
ние роста.
Фото 71. Влияние соотношения X- и У-вирусов в инокулуме па степень некротизации
ипокулированных листьев турецкого табака [430].
А. Инокулум содержал экстракты листьев, зараженных смесью X- и У-вирусов в отно-
шении 1:1. Б- Концентрация У-вируса в инокулуме оставалась прежней, а экстракт,
содержавший Х-вирус, разводили в 103 раз.
Фото 72. Приобретенная устойчивость к инфекции.
А] и Аг- Местная приобретенная устойчивость [1445]. — диск, вырезанный из листа табака сорта Самсун NN; лист инокулпровали сначала
ВТМ (крупный некроз в центре), а спустя 7 дней вновь пнокулировалп концентрированным препаратом ВТМ. В зоне вокруг первого некро-
за совершенно нет некрозов, вызванных вторичной инокуляцией. А2—аналогичный эксперимент, в котором, однако, для второй инокуляции взят
Х-внрус картофеля. Свободная от некрозов зона не обнаружена. Б± и Б2- Устойчивость к инфекции, приобретенная на некотором расстоянии от
участка первичной инокуляции [1446]. Б2 — лист табака сорта Самсун NN сначала пнокулировалп ВТМ в верхушечной части, а затем через 7
дней инокулпровали ВТМ всю поверхность листа. 7>i — контрольный лист: вся поверхность пнокулпрована ВТМ.
Фото 73. Лист табака, инокулированпьтй мутантным штаммом ВТМ, образующим круп-
ные медленно развивающиеся желтые местные поражения.
Изолят этого штамма не полностью свободен от типичного штамма (вызывающего неви-
димые местные поражения). Четкие границы светло-желтых тканей в нижней левой
четверти листа отделяют эти участки от участков, в которых репродуцировался типичный
штамм ВТМ, что привело к ограничению распространения желтого штамма.
Фото 74. Перекрестная защита, наблюдаемая при инокуляции растений Datura tatula
различными штаммами Х-внруса картофеля [11(58].
Л. Здоровый лист пиокулировали штаммом, индуцирующим некротические местные пора-
жения. Г>. Лист предварительно системно инфицировали слабым штаммом вируса: наблю-
дается полная защита от некротического штамма. В- Лист предварительно системно
инфицировали штаммом, вызывающим крапчатость; наблюдается частичная защита.
Фото 75. Белок мутантного штамма РМ2 формирует при pH 5,3 длинные гибкие открытые
спиральные структуры; X 200 000.
Фото 76. Действие 2-тиоурацила на содержание ВЖМТ в листьях китайской капус-
ты [551].
Седнментограммы (шлиреи-оитика), полученные при анализе неосветлониого экстрак-
та. В нижней части фото — шлирен-диаграмма, полученная при использовании
необработанных растений, а в верхней части фото — тоже шлиреп-днаграмма, по растения
опрыскивались ежедневно 2-тноурацилом в течение 10 дней. Пик 1 соответствует раститель-
ному белку; ник 2 — пустым белковым оболочкам; пик 3 — 838-рибосомам, а пик 4 —
вирусному нуклеопротеиду.
Фото 77. Седимонтограмма нормальной (/) кроличьей сыворотки и иммунной сыворот-
ки (7/), полученной поело введения животному больших доз ВЖМТ.
Сыворотку разводили (1:5) н центрифугировали (130 мин, 52 640 об/мин). Основной
ник — это сывороточный альбумин. Содержание фракции 7S (IgG) в иммунной сыво-
ротке увеличено.
Фото 78. Комплекс вирус — антитело.
Па электронной микрофотографии видны отдельные частицы вируса-сателлита, связан-
ные с молекулами влрусоспоцифичпых антител класса IgG.
Фото 79. Типы расположения полос преципитации в опытах по иммунодиффузии.
Использованы некоторые штаммы ВТМ. I. Реакция идентичности — слияние полос
преципитации; антигены: В — типичный штамм ВТМ; Ж — желтый мутант, получен-
ный из типичного штамма; антисыворотка (Лс-В) к ВТМ; слияние зон свидетельствует
о том, что данные антигены серологически очень сходны или идентичны. II. Антисыво-
ротка ire реагирует с гетерологичным антигеном; антигены: О — вирус кольцевой пятни-
стости Odonloglossum', С — вирус опунции Сэммонса; антисыворотка (Лс-О) к О (оба
вируса реагируют с антисывороткой к ВТМ). ПТ. Реакция частичной идентичности:
полосы частично пересекаются, образуя фигуру в виде шпоры; антигены: В—ВТМ;
С — вирус опунции Сэммонса; антисыворотка (Лс-В) к ВТМ; такой тип свидетельствует
о том, что по вес антитела, имеющиеся в антисыворотке к ВТМ, связаны с полосой преци-
питации, которая образуется при реакции с антигеном С; несвязанные антитела диф-
фундируют через эту полосу и образуют шпору, реагируя с 5-антигеном. IV. Реакция
подпой псидеитичности: образование двойной шпоры. ВФВ — бобовая форма ВТМ;
U2 — штамм ВТМ; антисыворотка (Лс-В) к обычному штамму ВТМ. Полученная
реакция свидетельствует о том, что оба штамма реагируют с некоторым количеством
одних и тех же антител, содержащихся в аптисывороткерс обычному штамму ВТМ. Кроме
того, каждый из этих штаммов образует преципитат с теми антителами, которые не реаги-
руют со вторым штаммом.
Фото 80. Использование специфической антисыворотки для идентификации компонентов
в седиментирующей смеси.
Седиментограмма экстракта листьев китайской капусты, зараженной вирусом желтой
мозаики турнепса, после обработки 2-тиоурацплом. Препарат^смсшпвали с нормальной
сывороткой (f) и с кроличьей антисывороткой (77) к В5КМТ- Фотография сделана поело
19-минутного центрифугирования при 35 600 об/мнп. Реакция с антисывороткой при-
вела к преципитации двух вирусных компонентов (пустых белковых оболочек и нуклеопро-
теида), не затронув рибосомных фракций (68S- и 838-рибосомы цитоплазмы).
Фото 81. Перекрестная адсорбция.
I. Реакция антисыворотки к ВТМ (Ас) с ВТМ и А-белком; лупка с антигеном (Аг) запол-
нена препаратом ВТМ, содержащим неагрсгироваппый белок. Одиночная полоса, при-
мыкающая к лунке с антигеном, образована целым вирусом; двойная полоса образована
А-белком. I/. Сравнение между А-белком и Х-белком вируса кольцевой пятнистости
Odontoglossum. Слияние полос показывает, что белок, полученный методом щелочной
деградации, и неполимеризовапный белок, выделенный из клеток, идентичны.
Фото-82. Иллюстрация-того, что с помощью метода внутригелевой адсорбции можно
обнаружить различия между штаммами, которые не выявляются в прямых опытах по диф-
фузии в геле.
Г. ВТМ и ипдуцировапный азотистой кислотой мутант 1688 дают реакцию идентичности
с антисывороткой к ВТМ. II. Опыт с применением внутригелевой адсорбции; антисы-
воротка к ВТМ вначале адсорбировалась ВТМ в геле, после этого мутант 1688 продол-
жал реагировать с этой антисывороткой.
Фото 83. Антитела, мочеппыо ферритином ['1547].
Через 3 дня после заражения ВТМ клетки листа обрабатывали сывороткой, мочеппоп
ферритином. На основной фотографии представлена область цитоплазмы между клеточной
оболочкой (7) и хлоропластом (2). Большая часть частиц ферритина соединена с вирусными
частицами, которые также окрашены смесью ураиилацотата с цитратом свинца.Некоторые
вирусные частицы видны в поперечном разрезе (стрелки). На вставке даны вирусные
частицы при большем увеличении.
Фото 84. Нематоды Trlchodorus christei, питающиеся па корнях Vaccinium corymbosuin.
Фото 85. Группа бескрылых взрослых самок тлп Rhopalosiphum padi L. вместе с нимфами различных возрастов на листе пшеницы [1105].
Фото 86. Слюнные чехлы в ткани, образующиеся после питания тлей.
Внутренняя поверхность эпидермиса, снятого с листа конских бобов, на котором питались
многочисленные тли Aphis fabae. Слюнные чехлы расположены в межклетных прост-
ранствах губчатой паренхимы. Следует обратить внимание на то, что они выступают
из поперечных, стенок эпидермальных клеток.
Фото 87. Изображение ротовых частей тли М- persicae, полученное при использовании
сканирующего электронного микроскопа [446].
А- Нижняя губа со сросшимся концом и щетинками; мандибулярные стилеты выступают
из нижней губы (тлей замораживали в жидком азоте сразу же после того, как стилеты
были извлечены из листа). Б- Конец нижней губы и мандибулярные стилеты при большом
увеличении. В. Концы мандибулярных стилетов; видны гребенчатые края обоих стилетов
(вершина одного из стилетов заходит за вершину другого).
Фото 88. Срез через клетку жирового тела гороховой тли, содержащей инфекционный
вирус деформирующей мозаики гороха [1570].
Фото 89. Частицы вируса раневых опухолей в цитоплазме плазмацита из гемолимфы
цикадки-переносчика.
A
Фото 90. Голова взрослого клетца A ceria. tulipae [12911.
А. Электронная микрофотография стилетов. Волосок лежит вдоль верхней стороны
стилетов. 7>. Электронная микрофотография перышка па лапке. Длина стилетов около
5 мкм, во время питания опи погружаются в ткань примерно па1/3 своей длины- в- Строе-
ние головы (схема); 7 — щиток; 2 — кокса; 3 — хоботок; 4 — стилеты.
Фото 91. Скопление палочкообразных частиц вируса полосатой мозаики пшеницы на
эпителии заднего отдела средней кишки A. tulipae [1311].
Фото 92. Поражение земляники сорта Талисман вирусом кольцевой пятнистости малины.
Отстающие в росте растения расположены пятнами, что отражает характер размещения
переносчика Longidorus elongaius.
Фото 93. Культура апикальной меристемы [952].
А. Стебель картофеля через неделю после отрастания из покоящейся меристемы. Б. Про-
росток картофеля па стадии, пригодной для пересадки в почву. В. Гистологический срез
по оси апикальной меристемы проростка картофеля; видны два листовых зачатка. Над
черной линией расположен участок с одним листовым зачатком, который отрезают для
культивирования.
Фото 04. Белый штамм культивируемого гриба, который выращивался па солодовом
агаре около 2 иед при 25 °C.
Л. Здоровая колония. J3. Колония, зараженная вирусом. В. Грибном вирус 2.