Текст
                    ОСНОВЫ БИОХИМИИ
ЛЕНИНДЖЕРА

LENINGER PRINCIPLES OF BIOCHEMISTRY Fifth Edition David L. Nelson Professor of Biochemistry University of Wisconsin-Madison Michael M. Cox Professor of Biochemistry University of Wisconsin-Madison W. H. FREEMAN AND COMPANY NewYork
ЖИЛ Ж15@М[И[К Д.Нельсон М.Кокс ОСНОВЫ БИОХИМИИ ЛЕНИНДЖЕРА В трех томах 1 ОСНОВЫ БИОХИМИИ СТРОЕНИЕ И КАТАЛИЗ Издание 4-е, исправленное, электронное Перевод с английского канд. хим. наук Т. П. Мосоловой канд. хим. наук Е. М. Молочкиной канд. биол. наук В. В. Белова под редакцией академика РАН А. А. Богданова и член-корр. РАН С. Н. Кочеткова Москва Лаборатория знаний 2020
УДК 578.1 ББК 28.072я73 Н49 Серия основана в 2006 г. Нельсон Д. Н49 Основы биохимии Ленинджера : в 3 т. Т. 1 : Осно- вы биохимии, строение и катализ / Д. Нельсон, М. Кокс ; пер. с англ.-4-е изд., электрон.— М. : Лаборатория знаний, 2020. — 749 с. — (Лучший зарубежный учебник). — Систем, тре- бования: Adobe Reader XI ; экран 10”. —Загл. с титул, экрана.— Текст : электронный. ISBN 978-5-00101-864-3 (Т. 1) ISBN 978-5-00101-863-6 В учебном издании, написанном американскими учеными, которые получили признание как талантливые преподаватели университетского уровня, рассмотрены современные концепции биохимии в соответствии с изменившейся идеологией этой науки. В томе 1 рассмотрены основы биохимии, связь строения биомолекул с их реакционной и каталитической активностью, строение и функции биомембран, механизмы биосигнализации. Для студентов биологических, химических и медицинских вузов, а также научных работников. УДК 578.1 ББК 28.072я73 Деривативное издание на основе печатного аналога: Основы био- химии Ленинджера : в 3 т. Т. 1 : Основы биохимии, строение и ка- тализ / Д. Нельсон, М. Кокс ; пер. с англ. — 4-е изд. — М. : Лабо- ратория знаний, 2020. — 704 с. : ил. — (Лучший зарубежный учебник). — ISBN 978-5-00101-246-7 (Т. 1); ISBN 978-5-00101-245-0. В соответствии со ст. 1299 и 1301 ГК РФ при устранении ограничений, установленных техническими средствами защиты авторских прав, правообладатель вправе требовать от нарушителя возмещения убытков или выплаты компенсации ISBN 978-5-00101-864-3 (Т. 1) ISBN 978-5-00101-863-6 First published in the United States by W. H. FREEMAN AND COMPANY, New York Copyright© 2008 by W. H. Freeman and Company All rights reserved. © Перевод на русский язык, Лаборатория знаний, 2015
Предисловие к русскому изданию Перед Вами, читатель, настольная книга всех биохимиков и молекулярных биологов. Почти 40 лет назад был опубликован блестя- щий учебник Альберта Ленинджера «Биохимия» (Biochemistry: The Molecular Basis of Cells Structure and Function by Albert L. Lehninger. New York: Worth Publishers, 1972). На русском языке эта книга из- давалась дважды (Ленинджер А. Биохимия, М.: Мир, 1974, 1976). Следуя за развитием науки, ав- тор переработал учебник, который появился под названием «Основы биохимии» (Lehninger A. L. Principles of Biochemistry. Worth Publishers, New York, 1982). Книга выдержала несколько переизданий на английском языке, а также переводов на ос- новные «научные» языки мира. У нас в стране этот учебник вышел в трех томах (Ленинджер А. Основы биохимии. В 3 т. — М.: Мир, 1985). Мож- но без преувеличения сказать, что на этой книге выросли по крайней мере два поколения исследо- вателей. За прошедшие годы были сделаны выдаю- щиеся открытия в науках о жизни, кардинальные изменения претерпели экспериментальные мето- ды, изменилась и сама идеология биохимии. Все это требовало существенного пересмотра и об- новления учебника. После кончины А. Ленинджера труд по подго- товке новых изданий взяли на себя Дэвид Нельсон и Майкл Кокс, которые по существу написали но- вую книху, сохранив общие принципы построения учебника Ленинджера, отразив преемственность в названии (Lehninger Principles of Biochemistry). С новым авторским коллективом книга вышла уже дважды (4-е и 5-е изд. — 2003,2005 гг.). Теперь этот учебник предлагается русскоя- зычному читателю. Как и ранее, в русском пере- воде «Основы биохимии» выходят в трех томах, что, безусловно, будет удобно читателю, в первую очередь студенту. Деление на тома соответству- ет тематическим частям, выделенным авторами (Часть I. Строение и катализ. Часть II. Биоэнер- гетика и метаболизм. Часть III. Пути передачи информации). В первый том «Основы биохимии. Строение и катализ» вошли предисловия, статьи об авторах и вступительная статья, глава 1 «Основы био- химии», где даны основные понятия биохимии, охарактеризованы компоненты клетки, а также часть I «Строение и катализ» (главы 2-12), где рассмотрены важнейшие биомолекулы и неко- торые ключевые процессы, такие как биологиче- ский транспорт и передача сигнала. Во втором томе «Биоэнергетика и метаболизм» (главы 13-23) рассмотрены главные принципы биоэнергетики, пути распада и синтеза клеточных компонентов, а также гормональная рехуляция и интеграция метаболизма у млекопитающих. Третий том «Пути передачи информации» (главы 24-28) посвящен принципам передачи генетической информации и рехуляции экспрес- сии генов. В конце третьего тома находятся глос- сарий, используемые сокращения и обозначения, ответы к задачам, предметный указатель ко всему комплекту из трех томов. При изучении биохимии читатель сможет легко убедиться в достоинствах этого учебника, который получил особое признание у специали- стов за систематичность изложения материала. Здесь приведены определения всех основных терминов и краткое описание наиболее важных экспериментальных методов. Особо следует от- метить великолепные иллюстрации, вниматель- ное изучение которых дает возможность полнее понять суть описываемых процессов.* Не сомневаемся, что эта книга будет весьма востребованной. Новое издание на русском язы- ке этого всемирно известного учебника окажет неоценимую помощь студентам и аспирантам, изучающим биохимию, а также преподавателям. Все научные сотрудники смохут с пользой и удо- вольствием читать и перечитывать интересный материал, каждый раз открывая что-то новое в любимой науке. Перевод книги выполнен Т. П. Мосоловой (предисловие, главы 1-7, 14-16, а также фраг- менты текста, появившиеся в 5-м издании), Н. Н. Багровой (главы 8,18, 20, 22), В. В. Беловым (главы 9,13,17), Е. М. Молочкиной (главы 10-12, 21), Н. Л. Арюткиной (глава 19), О. М. Алексеевой (глава 23), О. В. Ефременковой (главы 24-28). А. А. Богданов, академик РАН С. Н. Кочетков, член-корр. РАН * В тексте даны ссылки на электронные ресурсы ©. См. сайт http://bcs.whfreeman.com/lehninger5e/.
Краткое содержание трех томов ТОМ 1 1 Основы биохимии Часть I СТРОЕНИЕ И КАТАЛИЗ 2 Вода 3 Аминокислоты, пептиды и белки 4 Трехмерная структура белков 5 Функции белков 6 Ферменты 7 Углеводы и гликобиология 8 Нуклеотиды и нуклеиновые кислоты 9 Технологии на основе информации из ДНК 10 Липиды 11 Биологические мембраны и транспорт 12 Биосигнализация ТОМ 2 Часть II БИОЭНЕРГЕТИКА И МЕТАБОЛИЗМ 13 Принципы биоэнергетики 14 Гликолиз, глюконеогенез и пентозофосфатный путь 15 Принципы регуляции метаболизма на примере метаболизма глюкозы и гликогена 16 Цикл лимонной кислоты 17 Катаболизм жирных кислот 18 Окисление жирных кислот и образование мочевины 19 Окислительное фосфорилирование и фотофосфорилирование 20 Биосинтез углеводов у растений и бактерий 21 Биосинтез липидов 22 Биосинтез аминокислот, нуклеотидов и связанных с их метаболизмом молекул 23 Интеграция и гормональная регуляция метаболизма у млекопитающих ТОМ 3 Часть III ПУТИ ПЕРЕДАЧИ ИНФОРМАЦИИ 24 Гены и хромосомы 25 Метаболизм ДНК 26 Метаболизм РНК 27 Метаболизм белка 28 Регуляция генной экспрессии Приложение 1. Сокращения и обозначения, используемые в биохимии Приложение 2. Ответы к задачам Глоссарий Источники иллюстраций Предметный указатель
Об авторах книги Дэвид Л. Нельсон родился в Фэрмонте, штат Миннесота, США. Получил степень бакалавра по химии и биологии в колледже Св. Олафа в 1964 г. Выполнил диссертационную работу по биохимии в медицинской школе Стэнфорда под руководством Артура Корнберга. Получив стипендию Гарвардской медицинской школы, работал вместе с Юджином П. Кеннеди, ко- торый был одним из первых аспирантов Ле- нинджера. В 1971 г. Нельсон работает в уни- верситете Висконсин-Мэдисон, с 1982 г. — в должности профессора биохимии; в настоящее время — директор Центра биологического об- разования. Научные интересы Нельсона связаны с из- учением передачи сигналов, регулирующих дви- жение ресничек и эндоцитоз у простейших рода Paramecium (в основном его работы посвящены определению роли ферментов, в частности про- теинкиназ, в передаче сигнала). В научной груп- пе Нельсона используют современные методы исследования: различные методы очистки белка, иммунологические методы анализа, электрон- ная микроскопия, а также генетические, моле- кулярно-биологические и электрофизиологиче- ские методы. Нельсон известен как выдающийся лектор и преподаватель. Более 40 лет он курирует лек- ционные курсы по биохимии для студентов, специализирующихся в различных областях биологической науки. Он читает также лекции по курсу биохимии студентам, изучающим медсестринское дело, лекции для аспирантов по структуре и функциям мембран и по моле- кулярной нейрофизиологии. Инициатор орга- низации многих стипендий с целью поддержки активно работающих студентов и аспирантов. За свою выдающуюся преподавательскую деятельность Нельсон получал награды, в том числе премию Дрейфуса для педагогов- ученых. Имеет звание почетного профессора Университета Висконсина. В 1991-1992 гг. Нельсон был приглашенным профессором в Колледже Спелмана. Вторая страсть уче- ного — история науки, вот почему он читает студентам курс истории биохимии и собирает собственную коллекцию старинных научных инструментов. Дэвид Л. Нельсон и Майкл М. Кокс Майкл М. Кокс родился в Уилмингтоне, штат Делавэр, США. С самого начала изуче- ния биохимии книга Ленинджера оказала на М. Кокса столь сильное влияние, что переори- ентировала его научные интересы от биоло- гии к биохимии. По окончании университета шт. Делавэр в 1974 г. Кокс выполнил диссерта- ционную работу в университете Брандейса под руководством Уильяма П. Дженкса; с 1979 г. работал в Стэнфордском университете под ру- ководством Роберта Лемана. С 1983 г. М. Кокс работает в университете Висконсин-Мэдисон, а с 1992 г. — в должности профессора биохи- мии. Диссертация Кокса посвящена примене- нию модели общего кислотно-основного ката- лиза для изучения ферментативных реакций. В Стэнфордском университете он занимался изучением ферментов, участвующих в реком- бинации генов, уделив основное внимание изучению белка RecA и установлению меха- низма переноса нити ДНК; разработанные Коксом методы выделения и анализа белка RecA используются до сих пор. Главной темой в научной работе Кокса всегда было изучение ферментов, участвующих в генетической ре- комбинации. В университете Висконсина Кокс руко- водит большой и активной научной группой,
[8] Об авторах книги работающей в области энзимологии, топологии и энергетики рекомбинации генов. Основные темы научных работ его сотрудников посвяще- ны механизмам обмена нитей ДНК при участии белка RecA, роли АТР в системе RecA и регу- ляции рекомбинационной репарации. Частич- но группа занята изучением клеток Deinococcus radiodurans, обладающих удивительно мощной системой репарации, и применением этой си- стемы репарации в биотехнологии. На протяжении последней более четверти века Кокс совместно с Д. Нельсоном преподает курс биохимии студентам и читает лекции по структуре и топологии ДНК, ДНК-белковым взаимодействиям и биохимии рекомбинации аспирантам. Аспиранты первого года слушают его курс о профессиональной ответственности будущих ученых. За свои научные исследования и преподавательскую деятельность Кокс был на- гражден премией Дрейфуса для педагогов-уче- ных и премией компании Eli Lilli по биологиче- ской химии в 1989 г. Хобби Кокса - садоводство, коллекционирование вин и участие в планиро- вании зданий для научных исследований.
Несколько слов о науке В наступившем XXI в. при получении класси- ческого естественно-научного образования не уделяется должного внимания философии науки и философским обоснованиям научных теорий. Поскольку предполагается, что в бу- дущем вы будете заниматься научной деятель- ностью, здесь уместно еще раз остановиться на сути таких понятий, как наука, ученый и науч- ный метод. Наука подразумевает одновременно способ наблюдения за окружающим миром, а также сум- му данных и теорий, вытекающих из этого наблю- дения. Мощь науки и ее успех напрямую следуют из тех ее положений, которые можно проверить, исследуя природные явления, которые можно наблюдать, измерить и воспроизвести, или пред- лагая теории, имеющие предсказательную силу. Прогресс науки базируется на фундаментальном принципе, о котором редко говорят, но который чрезвычайно важен; этот принцип заключается в постоянстве законов, управляющих силами и явлениями во всей Вселенной. Лауреат Нобе- левской премии Жак Моно назвал этот принцип «постулатом объективности природы». Таким об- разом, мир вокруг нас можно понять, применив научный метод, как это делают при научных ис- следованиях. Если бы мир не подчинялся стро- гим законам, наука не могла бы успешно разви- ваться. Кроме постулата объективности наука не выдвигает никаких предположений об окружаю- щем мире, которые не подлежали бы изменению и уточнению. Приемлимы лишь те научные идеи или предположения, которые (1) воспроизводи- мо подтверждаются и (2) могут быть использова- ны для точного предсказания новых явлений. Научные идеи могут быть воплощены в раз- ные формы, причем смысл терминов, которые ученые при этом используют, в значительной степени отличается от того, что под этими тер- минами понимают люди, не занятые научной де- ятельностью. Так, гипотезой называют идею или предположение, которое обеспечивает разумное и проверяемое объяснение одного или нескольких наблюдений, но которое может не иметь боль- шого числа экспериментальных подтверждений. Научная теория — это уже нечто большее; это идея, которая в достаточной степени подтверж- дается экспериментальным путем и объясняет основную часть наблюдений определенного рода. Научная теория всегда основана на фактах и мо- жет быть проверена, поэтому теорию можно при- менить при дальнейших исследованиях. Если научная теория многократно проверена на фак- тах и подтверждена по многим параметрам, ее можно принять как научный факт. Можно сказать, что научные идеи составляют содержание научных статей, которые публикуются в научных журналах по рецензии других ученых. Ежегодно в мире в 16 000 научных журналов пу- бликуется около 1,4 миллиона статей, и этой ин- формацией может воспользоваться любой человек. Ученые — это люди, которые применяют на- учный метод к познанию окружающего мира. Уче- ным не становятся просто при получении научной степени или звания, а отсутствие таковых не меша- ет человеку внести весомый вклад в развитие на- уки. Настоящему ученому свойственно пытаться сформулировать какую-либо гипотезу в ответ на появление новых данных. Принимаемые научные гипотезы должны основываться на измеряемых и воспроизводимых наблюдениях, причем излагать эти наблюдения ученый должен абсолютно честно. Научный метод включает целый набор путей исследования, причем любой путь может приве- сти к научному открытию. Путь от гипотезы до эксперимента — ученый формулирует гипотезу и проверяет ее экспериментальным методом. Мно- гие биохимические процессы, с которыми биохи- мики сталкиваются в своей ежедневной работе, были открыты именно таким образом. Джеймс Уотсон и Френсис Крик установили структуру ДНК; благодаря этому открытию была сформу- лирована гипотеза о том, что спаривание основа- ний ДНК лежит в основе передачи генетической информации при синтезе полинуклеотидных последовательностей. Эта гипотеза помогла в от- крытии РНК- и ДНК-полимераз. Уотсон и Крик открыли структуру ДНК, ис- пользуя метод моделирования и расчетов. Они не проводили никаких самостоятельных экспе- риментов, а использовали экспериментальные данные, полученные ранее другими учеными. Некоторые смелые ученые в качестве научного метода избрали метод наблюдений. Открытия, сделанные известными путешественниками, в том числе Чарльзом Дарвином при путешествии на «Бигле» в 1831 г., позволили создать карту на- шей планеты, описать ее обитателей и изменили
[10] Несколько слов о науке наши представления об окружающем мире. Со- временные ученые, исследующие морские глу- бины или посылающие ракеты к другим плане- там, идут тем же путем познания. Еще один путь, напоминающий путь гипотезы-эксперимента, основан на методе гипотеза-дедукция. Крик считал, что должна существовать молекула-по- средник, отвечающая за перенос информации матричной РНК в белок. Эта гениальная гипо- теза привела к открытию Малоном Хогландом и Полом Замечником транспортных РНК. Не все научные открытия совершаются «по плану»; часто важную роль играет интуиция (прозорливость) ученого. Открытия пеницил- лина Александром Флемингом в 1928 г. и ката- литической активности РНК Томасом Чеком в начале 1980-х гг. до некоторой степени были счастливыми случайностями, однако эти ученые были готовы к восприятию и использованию своих открытий. Немаловажную роль может сыграть и вдохновение. Так, метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), который теперь зани- мает центральное место в биотехнологических исследованиях, был создан Кэри Маллисом в порыве вдохновения во время путешествия по Северной Калифорнии в 1983 г. Перечисленные нами пути к научному от- крытию могут показаться никак не связанными между собой, однако у них есть важные общие свойства. Все они направлены на изучение при- роды. Все они опираются на воспроизводимое на- блюдение и (или) эксперимент. Все идеи и экс- периментальные подтверждения, связанные с научным поиском, могут быть проверены и вос- произведены учеными в любой точке света. Все- ми научными гипотезами и открытиями могут воспользоваться другие ученые для создания новых гипотез и совершения новых открытий. Все они приносят информацию, которая соответ- ствующим образом пополняет информационное богатство научного знания. Изучение устройства мира - тяжелая работа. Но нет более захватываю- щего и достойного занятия, чем пытаться хотя бы частично понять устройство мира.
Предисловие Первое издание книги «Principles of Bio- chemistry», написанной Альбертом Ленин- джером 25 лет назад, послужило отправной точкой и моделью для последующих четырех изданий. За четверть века биохимические зна- ния неимоверно расширились. Двадцать пять лет назад не был расшифрован ни один геном, не был проведен рентгеноструктурный анализ ни одного мембранного белка и не существова- ло ни одной нокаутной мыши. Только-только были открыты рибозимы и внедрена техноло- гия ПЦР, а археи были признаны отдельным царством организмов. Сегодня новые генети- ческие последовательности публикуются еже- недельно, а новые белковые структуры появ- ляются и того чаще; ученые создали тысячи разных нокаутных животных, что способствует успешному развитию биохимии, физиологии и медицины. В этом пятом издании книги пред- ставлены фотографии 31 Нобелевского лауре- ата, которые получили свои премии в области химии, физиологии или медицины уже после выхода в свет первого издания. Одной из задач каждого последующего из- дания было в какой-то степени отразить поток поступающей новой информации, но при этом не перегрузить издание, ведь по этой книге сту- денты часто впервые знакомятся с биохимией. Тщательный отбор информации позволил нам изложить основные принципы биохимии и при этом поведать о захватывающих научных до- стижениях последних лет, об их значении для будущего человечества. Пример такого уди- вительного исследования иллюстрирует рент- геноструктурный анализ РНК-полимеразы, когда в атомном разрешении удалось иденти- фицировать информационную функцию ДНК, РНК и белка в ключевой момент передачи ин- формации. Мы стоим на пороге появления новой моле- кулярной физиологии, в рамках которой такие процессы, как активация мембранных процессов, секреция, действие гормонов, зрение, обоняние, вкусовые реакции, дыхание, мышечные сокраще- ния и движение клеток, будут объяснены на моле- кулярном уровне и станут доступны для генетиче- ского анализа и фармакологического воздействия. Знание молекулярного строения сложных мем- бранных комплексов, например ответственных за окислительное фосфорилирование или фото- фосфорилирование, безусловно, позволит глубже понять эти столь важные для жизни процессы. (Такие изменения вызывают у нас желание помо- лодеть и вернуться к началу нашей научной и пе- дагогической карьеры. Ведь наша книга — не един- ственная вещь, которая постарела за все эти годы.) В каждом новом издании мы старались со- хранить те достоинства книги Ленинджера, кото- рые сделали ее классическим учебником, а имен- но, четкое изложение, тщательное разъяснение трудных вопросов и описание тех методов, кото- рыми пользуются современные биохимики. Как авторы мы работаем вместе уже более 25 лет и как преподаватели — уже почти столько же. За все эти годы тысячи наших студентов в университете Висконсин-Мэдисон были неиссякаемым источ- ником идей о том, как сделать курс современной биохимии более понятным. Наши студенты об- учали и вдохновляли нас. Мы очень надеемся, что эта книга, посвященная двадцатипятилетней годовщине первого издания, поможет обучить и вдохновить новых студентов, изучающих биохи- мию, и, возможно, заставит некоторых из них по- любить биохимию так, как любим ее мы.
Благодарности Эта книга — плод коллективного труда, и ее выход в свет был бы невозможен без под- держки сотрудников издательства Freeman and Company, которые поддерживали нас на всем пути создания книги. Ренди Россиньоль (главный редактор) и Кейт Ар (ответственный редактор) организовывали рецензии, внесли множество ценных предложений, подбадрива- ли нас, вели к цели и героически (хотя и не всег- да успешно) заставляли нас укладываться в от- веденные временные рамки. Наш выдающийся редактор Лиз Геллер каким-то образом умудря- лась продвигать выпуск книги, несмотря на все пропущенные сроки и внезапные изменения, причем делала это с ее всегдашним обаянием и мастерством. Мы благодарны Вики Томаселли за дизайн книги и Марше Коэн за замечатель- ный макет. Нам вновь повезло встретиться в работе с выдающимся техническим редактором Линдой Стрендж, которая подготовила выпуск всех пяти изданий Principles of Biochemistry (а также два ранних издания Biochemistry само- го Ленинджера). Ее помощь бесценна, и любое ее прикосновение к тексту всегда его улучша- ет. Нам также вновь повезло работать вместе с Морганом Райаном, который помогал нам при выпуске двух предыдущих изданий книги. Мы благодарим Дену Дигильо Бетц за ее помощь в подборе и размещении фотографий и Ника Ти- мошко и Уитни Кленч за координацию работы всех участников проекта. Мы также выражаем благодарность директору по маркетингу Деб- би Клер за организацию продажи и маркетинга книги и за ее прекрасный юмор. В Мэдисоне нашим первым редактором и критиком при подготовке всех изданий кни- ги была и остается Брук Солтведт. Она первой просматривала главы рукописи, помогала в под- готовке текста и рисунков, следила за согласо- ванием отдельных фрагментов, за единством номенклатуры и ласково, но настойчиво нас под- гоняла. Мы благодарим Шелли Лузетти, теперь работающую в университете Нью-Мехико, кото- рая, как и при подготовке предыдущего издания книги, прочла каждое слово корректуры, нашла много ошибок и внесла ценные предложения, которые улучшили книгу. Новое оформление книги, включая изобра- жение новых молекулярных структур, выполнено здесь, в Мэдисоне, Адамом Стейнбергом, который внес много полезных предложений, позволивших сделать изображения более наглядными. В насто- ящем издании также есть изображения молекул, выполненные для третьего и четвертого изданий Жан-Ивом Сгро — нашим коллегой из Мэдисона. Нам очень повезло, что с нами в работе принима- ли участие такие талантливые люди, как Брук, Шелли, Адам и Жан-Ив. Мы также очень признательны Брайану Уайту из Массачусетского университета в Бо- стоне, который составил новые задачи по ана- лизу экспериментальных данных для каждой главы книги. Многие наши коллеги проявляли большой интерес к ходу выполнения проекта и оказали нам большую помощь, внося полезные ком- ментарии. Особую благодарность мы хотим выразить Лоренсу Андерсону из университе- та Висконсин-Мэдисон, Джеффри Д. Эско из Калифорнийского университета в Сан-Диего, Джеку Киршу и его студентам из Калифорний- ского университета в Беркли, а также Дане Эш- вод, Шиу-Чуан (Шерил) Тсай, Майклу Г. Кумски и их коллегам (перечисленным ниже) из Кали- форнийского университета в Ирвайне. Многие помогли нам подготовить и выпустить это пя- тое издание книги, внося полезные советы, ком- ментарии и замечания. Мы признательны всем, кого мы включили в этот список: Ричард М. Амазино, Университет Висконсин- Мэдисон Луиза Е. Андерсон, Университет Иллинойса, Чикаго Шерил Бейли, Университет Небраски, Линкольн Кеннет Балазович, Университет Мичигана Томас О. Болдуин, Университет Аризоны Вай Бандариан, Университет Аризоны Юджин Барбер, Университет Рочестера Себастьян И. Беднарек, Университет Висконсин- Мэдисон Рамачандра Бхат, Университет Линкольна Джеймс Бланкеншип, Корнелльский университет Сандра Дж. Бонетти, Университет Колорадо, Пуэбло Барбара Боуман, Калифорнийский университет, Беркли
Благодарности [13] Скотт Д. Бриггс, Университет Пердью Джефф Бродски, Университет Питтсбурга Бен Колдуэлл, Западный университет Миссури Дэвид Камерини, Калифорнийский университет, Ирвайн Джеффри Колберг, Калифорнийский университет, Лонг-Бич Гийом Шанфро, Калифорнийский университет, Лос-Анджелес Мелани Кокко, Калифорнийский университет, Ирвайн Ким Д. Коллинз, Университет Мэриленда Шарль Т. Дамерон, Университет Дюкена Ричард С. Эйзенштейн, Университет Висконсин -Мэдисон Джеральд В. Фейгенсон, Корнелльский университет Роберт Г. Филлингейм, Университет Висконсин -Мэдисон Брайан Фокс, Университет Висконсин-Мэдисон Джеральд Д. Френкель, Университет Рутгерса Перри Фрай, Университет Висконсин-Мэдисон Дэвид Е. Грэхем, Техасский университет, Остин Уильям Дж. Граймс, Университет Аризоны Мартин Ганн, Техасский AM университет Оливия Хэнсон, Университет Центральной Оклахомы Эми Харк, Муленберг колледж Шон В. Хернандес, Университет Висконсин- Мэдисон Питер Хинкл, Корнелльский университет П. Шинг Хо, Университет Орегона Чарльз Г. Хугстратен, Университет Мичигана Джервальд Йогл, Университет Броуна Сэр Ханс Корнберг, Университет Бостона Боб Лэндик, Университет Висконсин-Мэдисон Патрик Д. Ларкин, Техасский AM университет, Корпус-Кристи Райан П. Лиегель, Университет Висконсин -Мэдисон Мария Линдер, Калифорнийский университет, Фуллертон Энди С. ЛиВанг, Техасский AM университет Джон Мейкемсон, Международный университет Флориды Джон С. Мэттьюс, Фармакологический факультет университета Миссисипи Бенжамин Дж. МакФарланд, Тихоокеанский университет Сиэтла Анант Менон, Медицинский колледж Вейла Корнелла Сабеха Мершант, Калифорнийский университет, Лос-Анджелес Скотт С. Мор, Университет Бостона Кимберли Моури, Университет Броуна Лейша Муллинс, Техасский AM университет Севайт Негаш, Калифорнийский университет, Лонг-Бич Аллен В. Нихолсон, Университет Темпл Хироши Никайдо, Калифорнийский университет, Беркли Джеймс Нтамби, Университет Висконсин -Мэдисон Тимоти Ф. Осборн, Калифорнийский университет, Ирвайн Жозе Р. Перес-Кастинейра, Университет Севильи, Испания Терри Платт, Университет Рочестера Венди Погозельски, Университет Нью-Йорка, Генезео Джонатан Поппер, Университет Висконсин -Мэдисон Томас Паулос, Университет Висконсин-Мэдисон Джек Прейсс, Университет Мичигана Анна Родаминска-Пандия, Университет Арканзаса Рон Райнес, Университет Висконсин-Мэдисон Том А. Рапопорт, Медицинский факультет Гарварда Джейсон Дж. Реддик, Университет Северной Каролины, Гринсборо Мэри Робертс, Бостонский колледж Ингрид К. Руф, Калифорнийский университет, Ирвайн Абузар Сулеймани, Тегеранский университет, Иран Марк Спаллер, Университет Уэйна Стефен Спиро, Техасский университет, Даллас Нарасимха Шрирама, Университет Колорадо Ион Д. Стюарт, Университет Флориды Кони Стоун, Калифорнийский университет, Станислос Ион Р. Сталтсфус, Университет Мичигана Джереми Торнер, Калифорнийский университет, Беркли Дин Р. Толан, Бостонский университет Сандра Л. Турчи, Университет Миллерсвилля Мануэль Вареле, Восточный университет Нью-Мехико
[14] Благодарности Боб Уорбуртон, Университет Шеперда Трейси Уор, Сайлемский колледж Сьюзан Уэйнтрауб, Техасский университет, Центр наук о здоровье Майкл Яффе, Массачусетский технологический институт Нам просто не хватит места для того, чтобы поблагодарить всех наших людей, чью помощь мы чувствовали при подготовке этой книги к из- данию. Мы выражаем глубокую признательность всем, и настоящим выражением нашей благодар- ности может служить этот труд, доведенный до логического завершения. Безусловно, мы берем на себя всю ответственность за любые ошибки и не- точности, которые могут встретиться в книге. Мы еще раз хотим поблагодарить наших сту- дентов в Университете Висконсин-Мэдисон за их многочисленные предложения и комментарии. Если в книге что-то не так, они, без сомнения, нам об этом сообщат. Мы благодарим студентов и сотрудников наших научных групп, а также со- трудников Центра биологического образования, которые помогли нам правильно распорядиться нашим временем; мы благодарим наших коллег из биохимического факультета университета Ви- сконсин-Мэдисон за их советы и критические замечания; мы также благодарим всех студентов и преподавателей, которые прислали нам свои комментарии и предложения. Мы надеемся, что наши читатели и в дальнейшем будут продолжать вносить свой вклад в следующие издания книги. Наконец, мы выражаем глубочайшую при- знательность нашим женам, Брук и Бет, и нашим семьям, которые продемонстрировали удиви- тельное терпение и оказали нам большую под- держку при написании этой книги. Дэвид Л. Нельсон Майкл М. Кокс Мэдисон, Висконсин, Январь 2008 г.
Клетка — это атом в биологии...Чтобы понять, что такое жизнь, нужно изучить клетку и определить ее строение с тем, чтобы познать законо- мерности жизнедеятельности любой клетки, найти те различия, которые отвечают за ее специфические функции. Франсуа Жакоб, Логика жизни: история наследования, 1970 Основы биохимии 1.1 Принципы организации клетки 17 1.2 Химические основы биохимии 28 1.3 Физические основы биохимии 40 1.4 Генетические основы биохимии 50 1.5 Эволюционные основы биохимии 54 Примерно 15-20 миллиардов лет назад в ре- зультате взрыва, сопровождавшегося извер- жением раскаленных субатомных частиц с очень высокой энергией, возникла Вселенная. Простейшие элементы (водород и гелий) об- разовались за считанные секунды. По мере рас- ширения и остывания Вселенной материя под действием гравитации конденсировалась, и воз- никали звезды. Некоторые из них становились огромными и взрывались как сверхновые звезды, высвобождая энергию, необходимую для слия- ния атомных ядер и образования разнообразных химических элементов. Так несколько миллиар- дов лет назад возникла Земля с теми химически- ми элементами, которые сейчас на ней существу- ют. Жизнь возникла около четырех миллиардов лет назад: появились простые микроорганизмы, способные добывать энергию из химических со- единений, позже — из солнечного света и исполь- зовать ее для синтеза великого множества слож- ных биомолекул, используя простые элементы и соединения, находящиеся на поверхности Земли. Биохимия изучает, каким образом замеча- тельные свойства живых организмов возникают из тысяч различных неживых молекул. Выделен- ные в индивидуальном состоянии и исследован- ные, эти молекулы подчиняются всем физическим и химическим законам, описывающим поведение неживой материи; это справедливо для всех про- цессов, протекающих в живых организмах. Био- химические исследования позволяют понять, каким образом неживые молекулы в составе жи- вых организмов взаимодействуют между собой, способствуя сохранению и непрерывному под- держанию жизни, причем и взаимодействия про- исходят строго в соответствии с физическими и химическими законами, управляющими неживой материей. Тем не менее живые организмы обладают особыми признаками, отличающими их от других материальных объектов. Каковы же эти отличи- тельные признаки? Сложность химического состава и строения на микроуровне. Тысячи различных моле- кул участвуют в составлении замысловатой внутренней структуры клетки (рис. 1-1, а). Среди них встречаются очень длинные био- полимеры (каждая макромолекула содер- жит характерный набор субъединиц и имеет уникальную трехмерную структуру), а также способность к высокоспецифическому, т. е. избирательному, связыванию с другими моле- кулами внутри клетки. Благодаря получению, преобразованию и использованию энергии окружающей сре- ды (рис. 1-1, б) организм может создавать и поддерживать свои внутренние структуры и выполнять механическую, химическую,
[16] 1. Основы биохимии Рис. 1-1. Некоторые признаки живой материи, а) Электронная микрофотография окрашен- ного тонкого среза мышечной ткани позвоночного иллюстрирует сложность живой ткани на микроуровне; 6) степной сокол получает необходимые ему питательные вещества, по- едая более мелких птиц; в) биологическое воспроизведение характеризуется изумитель- ной точностью. осмотическую и электрическую работу Это противодействует стремлению всей неживой материи к распаду и переходу в неупорядо- ченное состояние. Эти противоположные процессы уравновешивают друг друга. Способность к точному самовоспроизведе- нию (рис. 1-1, в). Из единственной бактери- альной клетки, помещенной в стерильную питательную среду, за 24 ч может возникнуть миллиард идентичных «дочерних» клеток. Каждая клетка содержит тысячи различных молекул, некоторые из них имеют чрезвы- чайно сложную структуру, но тем не менее каждая бактерия является точной копией оригинала и ее строение полностью опреде- ляется информацией, содержащейся в гене- тическом материале исходной клетки. Механизмы восприятия изменений в окру- жающей среде непрерывно приводят ор- ганизм в соответствие с условиями среды путем адаптации внутренней химической структуры или изменения положения в окружающей среде. Специфические функции всех компонентов живого организма и регуляция их взаимоот- ношений. Это отличительная черта не толь- ко макроструктур, таких как стебель и лист или сердце и легкое, но также внутрикле- точных микроструктур и индивидуальных химических соединений. Взаимодействие химических веществ в живом организме ди- намично, изменения в одном соединении вы- зывают скоординированные или компенси- рующие изменения в других, причем вместе весь ансамбль приобретает черты, отличные от тех, что присущи его отдельным частям. Набор молекул выполняет некую программу, конечный результат которой состоит в вос- произведении этой программы и самого на- бора молекул, т. е. жизни. Способность изменяться со временем пу- тем последовательной эволюции. Организ- мы очень понемногу изменяют наследуемые стратегии выживания в соответствии с из- менениями внешних условий. Результатом бесконечной эволюции является огромное многообразие форм жизни, внешне весьма различных (рис. 1-2), но в основе своей свя- занных общим происхождением. Общность всех живых организмов на молекулярном уровне выражается в сходстве последова- тельностей генов и структуры белков. Несмотря на единство жизни, основополага- ющие обобщения для всех живых организмов сде- лать сложно. Разнообразие жизни на Земле огром- но. Диапазон условий существования организмов огромен — от горячих источников до арктической
1.1 Принципы организации клетки [17] Рис. 1-2. Различные живые организмы имеют одинако- вое химическое строение. Птицы, звери, растения, по- чвенные микроорганизмы и человек построены из оди- наковых структурных единиц (клеток) и макромолекул (ДНК, РНК, белки), построенных из мономерных единиц одинакового типа (нуклеотиды, аминокислоты). Живые организмы используют одни и те же метаболические пути для синтеза компонентов клетки, у них общий гене- тический код, и они происходят от одних и тех же эволю- ционных предков. Приведен фрагмент картины Яна ван Кесселя мл. (1626-1679) «Сады Эдема». тундры и от кишечника животных до студенче- ских общежитий — тем не менее специфическая биохимическая адаптация достигается в пределах общей химической структуры. Для большей ясно- сти в данной книге мы иногда используем обобще- ния, которые, возможно, несовершенны, но полез- ны. Кроме того, мы часто обращаем внимание на исключения, которые по возможности подкрепля- ем примерами. Биохимия на молекулярном уровне описыва- ет структуру, механизмы и химические процессы, свойственные всем организмам, и формулирует принципы организации, лежащие в основе любых форм жизни, которые можно назвать принципа- ми молекулярной логики жизни. Хотя биохимия вносит значительный вклад в фундаментальную и прикладную медицину, сельское хозяйство, си- стему питания и промышленность, ее основной задачей является изучение самой жизни. В данной вступительной главе мы кратко остановимся на описании клеточных, химиче- ских, физических (термодинамических) и гене- тических основ биохимии и общего принципа эволюции — изменения свойств живых клеток на протяжении поколений. При изучении книги полезно возвращаться к данной главе для восста- новления в памяти изложенного здесь фундамен- тального материала. 1.1. Принципы организации клетки Единство и различие организмов очевидны уже на клеточном уровне. Самые маленькие орга- низмы состоят из одной клетки и имеют микро- скопические размеры. Более крупные многокле- точные организмы содержат много разных типов клеток, отличающихся по размеру, форме и спец- ифическим функциям. Несмотря на эти очевид- ные различия, все клетки как простейших, так и наиболее сложных организмов имеют общие фундаментальные свойства, которые можно ис- следовать на биохимическом уровне. Клетки являются структурными и функциональными единицами всех живых организмов Клетки всех видов имеют общие особенности строения (рис. 1-3). Плазматическая мембрана ограничивает клетку, отделяя ее содержимое от окружающей среды. Мембрана состоит из молекул липидов и белков, образующих тонкий, плотный, пластичный, гидрофобный барьер вокруг клетки. Мембрана препятствует свободному проникнове- нию в клетку неорганических ионов и большинства других заряженных или полярных соединений. Прохождение определенных ионов и молекул обе- спечивают транспортные белки внутри плазмати- ческой мембраны; рецепторные белки передают в клетку сигналы; мембранные ферменты участвуют в некоторых метаболических реакциях. Поскольку отдельные липиды и белки в плазматической мем- бране не связаны между собой ковалентными свя- зями, вся структура отличается замечательной гиб- костью, позволяющей клетке изменять свою форму и размер. По мере роста клетки в плазматическую мембрану встраиваются вновь образующиеся мо- лекулы липидов и белков. При делении каждой клетки образуются две новые, каждая из которых окружена собственной мембраной. Рост и деление (дробление) клетки происходят без нарушения це- лостности мембраны.
[18] 1. Основы биохимии Ядро (у эукариот) или нуклеоид (у бактерий) Содержит генетический материал в форме ДНК и связанные с ней белки. Ядро окружено мембраной. Плазматическая мембрана Прочный и гибкий двойной липидный слой. Избирательно проницаем для полярных веществ. Содержит мембранные белки, участвующие в транспорте у веществ, передаче сигнала и ферментативных реакциях. Цитоплазма Водное содержимое клетки, в котором суспендированы частицы вещества и органеллы. центрифугирование при 150 000 g Супернатант: цитозоль Концентрированный раствор ферментов, РНК, мономеров макромолекул, метаболитов, неорганических ионов. Осадок: частицы и органеллы Рибосомы, запасные гранулы, митохондрии, хлоропласты, лизосомы, эндоплазматический ретикулум. Рис. 1-3. Универсальные элементы строения живой клетки. Все клетки имеют ядро или нуклеоид, плазма- тическую мембрану и цитоплазму. Цитозолем называют часть цитоплазмы, которая остается в супернатанте после центрифугирования клеточного экстракта при 150 000 д в течение 1 ч. Внутреннее пространство, ограниченное плазматической мембраной, заполнено цито- плазмой (рис. 1-3), представляющей собой во- дную среду (цитозоль) с множеством частиц, выполняющих разнообразные функции. Цито- золь — это концентрированный раствор, содержа- щий ферменты и кодирующие их молекулы РНК, строительные блоки для этих макромолекул (аминокислоты и нуклеотиды), сотни небольших органических молекул (метаболитов — проме- жуточных продуктов биосинтеза и распада), ко- ферменты для многих ферментативных реакций, неорганические ионы и такие надмолекулярные структуры, как рибосомы, где происходит синтез белков, и протеасомы, где разрушаются те белки, в которых клетка больше не нуждается. Все клетки, по крайней мере в определенный период своей жизни имеют ядро или нуклеоид, в котором хранится и реплицируется геном — полный набор генов, состоящих из ДНК. У бактерий и архей нуклеоид не отделяется от цитоплазмы мембраной. У большой группы эукариот (от греч. ей — истинный и karyon — ядро) ядро состоит из ядерного материа- ла, заключенного в двухслойную мембрану — ядер- ную оболочку. Клетки, имеющие ядерную оболочку, называют эукариотическими. Все микроорганизмы, не имеющие ядерной оболочки, раньше называли прокариотами (от греч. pro — до, karyon — ядро), однако теперь среди них выделяют отдельно домен архей и домен бактерий (см. ниже). Размеры клеток лимитированы диффузией кислорода Большинство клеток имеют микроскопические размеры и невидимы невооруженным глазом. Диаметр клеток животных и растений — от 5 до 100 мкм, а длина большинства клеток однокле- точных микроорганизмов обычно не превышает 1-2 мкм. Что ограничивает размеры клетки? Ниж- ний предел, по всей видимости, определяется ми- нимальным количеством необходимых клетке био- молекул разных видов. Самые маленькие клетки бактерий — микоплазмы — имеют диаметр 300 нм и объем около 10“14 мл. Бактериальная рибосома в наибольшем измерении имеет размер 20 нм, следо- вательно, несколько рибосом занимают значитель- ную часть объема клетки микоплазмы. Верхний предел размера клетки, вероятно, определяется скоростью диффузии растворен- ных веществ в водной среде. Например, бакте- риальные клетки получают энергию в реакциях, протекающих с потреблением молекулярного кислорода, который поступает из окружающего пространства через плазматическую мембрану путем диффузии. Клетка настолько мала, а отно- шение площади ее поверхности к объему настоль- ко велико, что диффундирующий кислород легко достигает любого участка цитоплазмы. Однако по мере увеличения размеров клетки снижается
1.1 Принципы организации клетки [19] отношение площади ее поверхности к объему, и потребление кислорода в реакциях метаболизма увеличивается быстрее, чем количество кисло- рода, поступающего в клетку в результате диф- фузии. Таким образом, начиная с определенного размера клеток метаболизм с использованием О2 становится невозможным, что и определяет тео- ретический верхний предел размера клетки. Существуют три царства живых организмов Каждый живой организм можно отнести к одной из трех больших групп (доменов) - трех ветвей эволюции, происходящих от общего предшествен- ника (рис. 1-4). По биохимическим свойствам различают две большие группы одноклеточных микроорганизмов — бактерии и археи. Бактерии населяют почву, поверхностные водоемы, а так- же ткани живых или разлагающихся организмов. Большинство хорошо изученных бактерий, в том числе Escherichia coli, относятся к эубактериям. Археи были выделены в отдельный домен Карлом Вёзе в 1980-х гг. Многие из этих организмов живут в экстремальных природных условиях, например в соленых озерах, горячих источниках, болотах с очень высокой кислотностью воды и в глубинах океана. Существующие данные позволяют пред- положить, что археи и бактерии выделились в отдельные ветви на ранних этапах эволюции. Все эукариотические организмы составляют третий домен — эукариоты, они происходят из той же ветви эволюции, которая дала начало археям. Та- ким образом, археи являются более близкими род- ственниками эукариотам, чем бактериям. Представителей доменов архей и бактерий разделяют на подгруппы в зависимости от ус- ловий их обитания. Аэробные организмы, на- селяющие места с достаточным содержанием кислорода, могут получать энергию от переноса электронов с топливных молекул на кислород. Микроорганизмы, адаптированные к анаэроб- ным условиям, где кислород практически отсут- Эукариоты г Животные Миксомицеты Энтамебы Археи Грибы Растения Инфузории Зеленые „ несерные Эубактерии бактерии Грамполо- жительные бактерии Пурпурные бактерии Цианобактерии Флавобактерии Галофилы Жгутиковые Трихомонады Термотоги Рис. 1-4. Филогения трех царств живых организмов. Филогенетическое родство часто ил- люстрируют с помощью подобного «фамильного древа». Основой для построения этого дре- ва является сходство нуклеотидных последовательностей рибосомной РНК внутри каждой группы; чем больше сходство последовательностей, тем ближе располагаются ветви, так что расстояние между двумя ветвями отражает степень расхождения двух последовательно- стей. Филогенетические деревья также могут быть основаны на сходстве последовательно- сти аминокислот в отдельном белке. Например, на основе сравнения последовательностей белка GroEL (бактериальный белок, который участвует в сборке белков) построено древо, показанное на рис. 3-32. На рис. 3-33 представлено «консенсусное» древо, при построении которого для получения более точных результатов эволюционного сродства групп орга- низмов использованы несколько параметров сравнения. Methanosarcina Methanobacterium Thermoproteus Methanococcus Pyrodictium Thermococcus celer Микроспоридии Дипломонады
[20] 1. Основы биохимии Все живые организмы Восстановленные соединения §8 И и я св I д о о ф sL Автотрофы (углерод из СО2) Фототрофы (энергия света) Гетеротрофы (энергия из органических соединений) Хемотрофы (энергия химических соединений) Литотрофы (энергия из неорганических соединений) Окисленные соединения 3 а. ф S s а. Б Цианобактерии Растения Пурпурные бактерии Зеленые бактерии Серные бактерии Водородные бактерии Органотрофы (энергия из органических соединений) Большинство прокариот Все нефототрофные эукариоты Рис. 1-5. Организмы можно классифицировать в соответствии с теми источниками энергии (солнечный свет либо окисление химических соединений) и углерода, которые они исполь- зуют для синтеза веществ в клетке. ствует, получают энергию путем переноса элек- тронов на нитрат (с образованием N2), сульфат (с образованием H2S) или СО2 (с образованием СН4). Многие организмы, эволюционировавшие в анаэробных условиях, являются облигатными (строгими) анаэробами: в присутствии кисло- рода они погибают. Другие — факультативные анаэробы, они могут жить и без кислорода, и в его присутствии. Организмы можно классифицировать в соот- ветствии с тем способом, с помощью которого они получают энергию и углерод, необходимые для синтеза клеточного вещества (рис. 1-5). В зависи- мости от источника энергии выделяют две большие группы организмов: фототрофы (от греч. trophe — питание) используют солнечный свет, а хемотро- фы добывают энергию путем окисления топлив- ных молекул. Группа хемотрофных организмов, называемых литотрофами, способна окислять не- органические вещества: HS- до элементарной серы S°, S0 до SO4-, NO2 до NO3, a Fe2+ до Fe3+. Органо- трофы окисляют различные органические веще- ства, находящиеся в окружающей их среде. Фото- трофы и хемотрофы также можно разделить на группы в соответствии с тем, мохут ли они исполь- зовать в качестве источника углерода СО2 (авто- трофы) или должны получать углерод из органи- ческих питательных веществ (гетеротрофы). Бактерия Escherichia coli — наиболее изученная бактерия В строении клеток бактерий много общего, но есть и групповые особенности (рис. 1-6). В норме Е. coli является безопасным обитателем кишечни- ка человека. Длина ее клетки около 2 мкм, диа- метр чуть менее 1 мкм. Клетка защищена внеш- ней мембраной, а внутренняя плазматическая мембрана ограничивает пространство, в котором заключены цитоплазма и нуклеоид. Простран- ство между внешней и внутренней мембранами занято тонким, но прочным слоем полимеров, называемых пептидогликанами, которые при- дают клетке жесткость и определенную форму. Плазматическая мембрана вместе с внешними по отношению к ней слоями образует клеточную оболочку. Прочность клеткам архей придают полимеры другого типа — псевдопептидоглика- ны. Плазматическая мембрана бактерий состоит из тонкого двойного слоя липидов с белковыми включениями. Мембраны архей имеют анало- гичное строение, однако их липиды поразитель- ным образом отличаются от липидов бактерий (см. рис. 10-12). В цитоплазме Е. coli содержится около 15 000 рибосом, от десяти до тысячи копий каждого из примерно 1000 различных ферментов, а также
1.1 Принципы организации клетки [21] >рана Нуклеоид. Содержит единственную длинную кольцевую молекулу ДНК. Клеточная оболочка. У разных видов бактерий имеет _ разную структуру. Пили. Обеспечивают адгезию на поверхности другой клетки. Рибосомы. Бактериальные рибосомы мельче эукариотических, но играют ту же роль - участвуют в синтезе белка на основе матрицы РНК. Жгутики. Необходимы для передвижения клетки. Грамотрицательные бактерии. Внешняя мембрана, слой пептидогликана Археи. Нет внешней мембраны; слой пептидогликана расположен снаружи от плазматической мембраны Слой пептидогликана Внешняя мембрана Слой пептидогликана| Внутренняя мембрана Грамположительные бактерии. Нет внешней мембраны, более толстый слой пептидогликана Цианобактерии. Грамотрицательные бактерии; плотный слой пептидогликана; развитая внутренняя мембрана, содержащая фотосинтетические пигменты Рис. 1-6. Общие структурные элементы бактериальных клеток. В связи с различным стро- ением клеточной оболочки некоторые эубактерии (грамположительные бактерии) удер- живают краситель при окрашивании по Граму, а некоторые — нет (грамотрицательные бактерии). Е. coli относится к грамотрицательным бактериям. Цианобактерии представля- ют собой эубактерии с особым строением внутренней мембраны, в которой локализованы фотосинтетические пигменты. Клеточные оболочки архей и грамположительных эубакте- рий под электронным микроскопом выглядят сходным образом, однако строение их мем- бранных липидов и полисахаридов заметно различается (см. рис. 10-12). около 1000 органических веществ с молекуляр- ной массой менее 1000 (метаболиты и кофак- торы). В нуклеоиде расположена единственная кольцевая молекула ДНК, а в цитоплазме, как и у многих других бактерий, встречается одна или не- сколько более мелких кольцевых молекул ДНК, называемых плазмидами. В природных условиях некоторые плазмиды обеспечивают устойчивость бактерий к различным находящимся в окружаю- щей среде токсинам и антибиотикам. В лабора- торных условиях эти молекулы ДНК необычайно удобны для осуществления экспериментальных
[22] 1. Основы биохимии Животная клетка Рибосомы - аппарат синтеза белка Пероксисомы разлагают пероксиды Цитоскелет поддерживает структуру клетки, способствует передвижению органелл Лизосомы уничтожают внутриклеточные остатки Транспортные пузырьки (везикулы) обеспечивают транспортировку белков и липидов между ЭР, аппаратом Гольджи и плазматической мембраной Аппарат Гольджи осуществляет процессинг, упаковку и доставку белков к другим органеллам или выводит их из клетки Ядерная оболочка у у отделяет хроматин у у (комплекс ДНК с у у белком) от цито- у у плазмы у у Плазматическая мембрана \ у отделяет клетку от окружающей среды, регулирует поступление и выделение веществ х Х^Митохондрии - место окисления х. топливных молекул с X. \ образованием АТФ \ х. X. х. Гладкий эндоплазматический ретикулум у 'X. \ (ГЭР) служит местом синтеза липидов I \ \ X. и метаболизма лекарств , у Ядрышки - место синтеза х^ j \ рибосомной РНК Шероховатый у эндоплазматический ретикулум' (ШЭР) - участок синтеза большинства белков \ Ядро содержит гены (хроматин) Ядерная / / оболочка / Рибосомы/ Цитоскелет Хлоропласты собирают солнечный свет, образуют АТФ и углеводы Гранулы крахмала служат __ местом хранения углеводов, образовавшихся в результате фотосинтеза Тилакоиды - участки светозависимого синтеза АТФ \ Клеточная стенка ЛГ \ '• обеспечивает жесткость и \ форму клетки, защищает ее . \ от осмотического шока / \ Вакуоли - место разложения / \ и переработки макромолекул, / \ а также место хранения / \ метаболитов Плазмодесма обеспечивает контакт ' между двумя растительными клетками Клеточная стенка соседней клетки Глиоксисома - место хранения ферментов глиоксилатного цикла Растительная клетка Рис. 1-7. Строение эукариотической клетки. Схематически изображены клетки двух основ- ных типов: вверху — животная клетка, внизу — растительная клетка. Клетки растений обыч- но имеют диаметр от 10 до 100 мкм, а животные клетки — от 5 до 30 мкм. Структуры, выделен- ные красным цветом, присутствуют только в животных или только в растительных клетках. В клетках эукариотических микроорганизмов (например, протистов и грибов) имеются такие же структуры, как в клетках растений и животных, а кроме того, во многих из них также есть специализированные органеллы, которые здесь не изображены.
1.1 Принципы организации клетки [23] to А 'д'.Ь к ф У Дифференциальное центрифугирование Г омогенизация ткани Супернатант центрифугируют с более высокой скоростью (20 000 g, 20 мин) Низкая скорость центрифугирования (1000 g, 10 мин) Супернатант центрифугируют с еще более высокой скоростью (80 000 g, 1 ч) а Гомогенат ткани Супер- натант содержит раствори- мые белки Осадок содержит целые клетки, ядра, цитоскелеты, плазматические мембраны Осадок содержит микросомы (фрагменты ЭР), мелкие везикулы Осадок содержит рибосомы, крупные макромолекулы Осадок содержит митохондрии лизосомы, пероксисомы Изопикническое центрифугирование (в градиенте сахарозы) Центрифугирование Супернатант центрифугируют с очень высокой скоростью (150 000 g, Зч) Градиент сахарозы Менее — плотный компонент Образец Более — ПЛОТНЫЙ компонент б 8 7 6 5 4 Oj 3 2 1 Рис. 1-8. Разделение субклеточных структур ткани. Для получения внутриклеточных ор- ганелл ткань, например, печени сначала подвергают механической гомогенизации для раз- рушения клеток и диспергирования их содержимого в буфере. Раствор сахарозы обеспе- чивает практически такое же осмотическое давление, какое существует внутри клеточных органелл, что препятствует проникновению в органеллы воды, их разбуханию и разрушению. а) Крупные и мелкие частицы в суспензии можно разделить центрифугированием с разными скоростями, б) Частицы различной плотности можно разделить изопикническим центрифу- гированием. Для этого центрифужные пробирки заполняют раствором, плотность которого возрастает сверху вниз. Для получения градиента плотности готовят, например, растворы с разной концентрацией сахарозы. Затем смесь органелл помещают в верхнюю часть пробирки и центрифугируют с высокой скоростью. При этом органеллы осаждаются в градиенте до того уровня, плотность которого точно соответствует их собственной. После центрифугирования каждый слой можно отобрать из пробирки отдельно.
[24] 1. Основы биохимии манипуляций и очень широко используются мо- лекулярными генетиками. Большинство бактерий (включая Е. coli) существуют в виде индивидуальных клеток, но некоторые виды бактерий (например, миксобак- терии) демонстрируют простейшее «социальное поведение», образуя многоклеточные агрегаты. Эукариотические клетки содержат разнообразные мембраносвязанные органеллы, которые можно выделить и исследовать Типичные эукариотические клетки (рис. 1-7) во много раз превышают по размеру бактериальные и обычно имеют диаметр от 5 до 100 мкм, а их объем в тысячи или миллионы раз больше объема бактериальных клеток. Отличительной особен- ностью эукариот является наличие ядра и мно- гочисленных связанных с мембраной органелл со специфическими функциями: митохондрий, эндоплазматического ретикулума, комплекса Гольджи, пероксисом и лизосом. В растительных клетках, кроме того, содержатся вакуоли и хло- ропласты (рис. 1-7). В цитоплазме многих клеток присутствуют гранулы или капельки, содержа- щие запасные питательные вещества, такие как крахмал и жиры. Значительный вклад в развитие биохимии внесли работы Альбера Клода, Кристиана де Дюва и Джорджа Паладе, посвященные методам разде- ления клеточных органелл — важного этапа в вы- делении и изучении функций биомолекул и более крупных клеточных структур. При обычной про- цедуре фракционирования (рис. 1-8) клетки или ткани, находящиеся в растворе, гомогенизируют в мягких условиях. При этом происходит разрыв плазматической мембраны, но большинство кле- точных органелл сохраняют свою целостность. Затем гомогенат центрифугируют. Ядра, митохон- дрии и лизосомы различаются по размеру и соот- ветственно по скорости седиментации. У них раз- ная удельная плотность и при центрифугировании в градиенте плотности они оказываются в разных фракциях. Дифференциальное центрифугирование приводит к грубому фракционированию содер- жимого цитоплазмы. Далее каждую фракцию можно разделить изопикническим* центрифу- * Изопикнический — имеющий ту же плотность. гированием. При этом органеллы с разной пла- вучей плотностью (результат различного соот- ношения в них белков и липидов) разделяются центрифугированием в слое растворителя с гра- диентом плотности. Осторожно отбирая каждую фракцию градиента в центрифужной пробирке, можно рассмотреть в микроскоп все органеллы и приступить к дальнейшему изучению очищен- ной фракции. Таким образом удалось установить, например, что лизосомы содержат гидролитиче- ские ферменты, митохондрии — окислительные ферменты, а хлоропласты — фотосинтетические пигменты. Выделение органеллы, содержащей определенный фермент, часто является первой стадией очистки данного фермента. Цитоплазма имеет цитоскелет и обладает динамическими свойствами С помощью флуоресцентной микроскопии мож- но различить несколько типов белковых фила- ментов, пересекающих крест-накрест эукариоти- ческую клетку и образующих трехмерную сеть, называемую цитоскелетом. Существуют три ос- новных типа цитоплазматических фибрилл (ни- тей) — актиновые филаменты, микротрубочки и промежуточные филаменты (рис. 1-9); они раз- личаются по толщине (от 6 до 22 нм), строению и специфическим функциям. Все филаменты слу- жат для организации и структурирования цито- плазмы и придают форму клетке. Актиновые фи- ламенты и микротрубочки также способствуют передвижению органелл и целых клеток. Все фибриллы цитоскелета, независимо от типа, построены из простых белковых молекул, которые, связываясь друг с другом нековалентно, образуют тяжи определенной толщины. Эти филаменты не яв- ляются постоянными структурами: они непрерывно диссоциируют на составляющие их единицы и соби- раются вновь. Их положение в клетке также не фик- сировано строго, а может значительно изменяться при митозе, цитокинезе, амебоидном движении или при изменениях формы клетки. Разборка, сборка и локализация всех типов филаментов регулируются другими белками, которые необходимы для связы- вания филаментов или перемещения вдоль них ци- топлазматических органелл. Описанная выше ситуация наблюдается в эукариотической клетке с сетчатой структурой нитей и сложной организацией мембраносвязан-
1.1 Принципы организации клетки [25] Рис. 1-9. Три типа волокон цитоскелета: актиновые волокна, микротрубочки и промежу- точные волокна. Клеточные структуры можно пометить с помощью антител (узнающих определенные белки) с флуоресцентной меткой, присоединенной ковалентной связью. С помощью флуоресцентного микроскопа в обработанных таким образом клетках можно увидеть соответствующие структуры, а) Клетки эндотелия легочной артерии быка. В крас- ный цвет окрашены пучки актиновых волокон, называемые стрессовыми волокнами; в зе- леный цвет — выходящие из центра клетки микротрубочки; в синий — хромосомы внутри ядра, б) Клетки легких тритона в митозе. Микротрубочки (зеленый цвет), прикрепленные к кинетохорам (желтый цвет) на конденсированных хромосомах (синий цвет), растягива- ют хромосомы к противоположным полюсам клетки (центросомы; малиновый цвет). Про- межуточные волокна, построенные из кератина (красный цвет), служат для поддержания структуры клетки. ных компартментов (рис. 1-7). Филаменты раз- бираются и вновь собираются в каком-то другом участке клетки. Окруженные мембраной частицы отпочковываются от одной органеллы и сливают- ся с другой. Органеллы перемещаются в цито- плазме вдоль белковых филаментов, а энергию для этих передвижений обеспечивают моторные белки. Внутренние мембраны разделяют отдель- ные метаболические процессы и служат поверх- ностями, на которых протекают некоторые фер- ментативные реакции. Транспортные механизмы эндо- и экзоцитоза, способствующие проникно- вению веществ соответственно в клетку и из нее, связаны со слиянием и раскрытием мембран. Эти процессы обеспечивают обмен между цитоплаз- мой и окружающей средой и позволяют осущест- влять секрецию произведенных в клетке продук- тов и захват внеклеточных веществ. Подобная организация цитоплазмы сложна, но далеко не хаотична. Движение и локализация органелл и элементов цитоскелета находятся под строгим контролем. На определенных этапах жиз- ни эукариотической клетки происходят серьез- ные, точно спланированные перестройки, такие как митоз. Взаимодействия между цитоскелетом и органеллами обратимы и имеют нековалентную природу; их рехуляцию осуществляют различные внутри- и внеклеточные сигналы. В клетках существуют надмолекулярные структуры Макромолекулы и их мономерные звенья сильно различаются по размерам (рис. 1-10). Молекула аланина имеет длину менее 0,5 нм. Переносящая кислород молекула гемоглобина в эритроцитах со-
[26] 1. Основы биохимии Некоторые аминокислоты а ООО- ООО ООО + H3N—С—Н + H3N— С—Н + 1 H3N—С—Н СН3 СН2ОН 1 сн2 Аланин Серин СОО- Аспартат ООО- СОО- + H3N— С—Н + H3N—С—Н СОО- + 1 1 СН2 СН2 H3N—С—Н 1 l_NH сн2 с ОН 11 )СН нсЧш Гистидин SH Цистеин Тирозин Рис. 1-10. Органические молекулы, из которых по- строена основная часть клеточного вещества: «био- химический алфавит», а) Шесть из 20 аминокислот, из которых состоят все белки (боковая цепь выделена розовым цветом); б) пять азотистых оснований, два пятиуглеродных сахара и остаток фосфорной кис- лоты, из которых построены все нуклеиновые кис- лоты; в) пять компонентов мембранных липидов; г) D-глюкоза — мономерное звено большинства угле- водов. Заметьте, что остаток фосфорной кислоты вхо- дит в состав как нуклеиновых кислот, так и мембран- ных липидов. Некоторые компоненты липидов Компоненты нуклеиновых кислот ООО' I сн2 сн2 сн2 сн2 сн2 сн2 сн2 сн сн I сн2 сн2 сн2 сн2 сн2 сн2 сн2 сн3 Олеат соо- СН2ОН сн2 СНОН сн2 СН2ОН сн2 Глицерин сн2 1 2 СН3 сн2 + | 1 СН3—N— СН2 СН2 ОН сн2 1 1 сн3 сн2 Холин СН2 1 2 сн2 1 2 сн2 Мономер большинства СН2 углеводов сн2 г сн2 СН2ОН сн2 Н/1 °\Н 1 сн3 \он Н/1 Пальмитат но\__/он н он a-D-Глюкоза
1.1 Принципы организации клетки [27] Уровень 4: Клетка и ее органеллы Уровень 3: Уровень 2: Уровень!: Надмолекулярные Макромолекулы Мономерные звенья комплексы Рис. 1-11. Структурная иерархия в молекулярной организации клетки. В растительной клетке ядро содержит несколько типов надмолекулярных комплексов, включая хромосо- мы. Хромосомы состоят из макромолекул ДНК и множества различных белков. Каждый тип макромолекул построен из простых мономерных звеньев, например ДНК состоит из нукле- отидов (дезоксирибонуклеотидов). стоит приблизительно из 600 аминокислотных зве- ньев, организованных в четыре длинные цепи, сло- женные в глобулы; нативный гемоглобин достигает в диаметре 5,5 нм. Белки, в свою очередь, гораздо мельче рибосом (диаметр последних около 20 нм), а те значительно уступают по размерам таким ор- ганеллам, как митохондрии (диаметр митохондрий около 1000 нм). Существует колоссальная разница между простыми биомолекулами и теми клеточны- ми структурами, которые можно наблюдать в све- товой микроскоп. Иерархия в структурной органи- зации клетки изображена на рис. 1-11. Мономерные звенья белков, нуклеиновых кислот и полисахаридов связаны ковалентными связями. В надмолекулярных комплексах молеку- лы удерживаются вместе гораздо более слабыми нековалентными взаимодействиями, среди кото- рых выделяют водородные связи (между поляр- ными группами), ионные (между заряженными группами), гидрофобные (между неполярными группами в водных средах) и ван-дер-ваальсовы взаимодействия, причем все нековалентные вза- имодействия характеризуются гораздо меньшей энергией, чем ковалентная связь. Природа этих не- ковалентных взаимодействий обсуждается в гл. 2. Макромолекулы в надмолекулярных структурах удерживаются большим числом слабых взаимо- действий, обеспечивающих уникальную структу- ру этих комплексов. В исследованиях in vitro можно не заметить важных взаимодействий между молекулами Одним из подходов к исследованию биологиче- ских процессов является изучение очищенных молекул in vitro («в пробирке») при отсутствии других «лишних» молекул, находящихся в интакт- ной клетке (т. е. in vivo — «в живом организме») . Такой подход весьма полезен, однако не следует забывать, что содержимое клетки очень сильно отличается от содержимого пробирки. «Лиш- ние» компоненты, удаленные при очистке, мохут играть важнейшую роль для биологического дей- ствия или для регуляции выделенной молекулы. Например, изучение чистых ферментов in vitro обычно проводят при очень низких концентра- циях ферментов в тщательно перемешиваемых водных растворах. В клетках ферменты раство-
[28] 1. Основы биохимии рены или суспендированы в желеобразном цито- золе вместе с тысячами других белков, некоторые из которых связывают данный фермент и влияют на его активность. Многие ферменты входят в по- лиферментные комплексы, в которых реагирую- щие вещества «передаются» от одних ферментов к другим, вовсе не выходя в окружающую среду В желеобразном цитозоле диффузия затруднена, поэтому его состав в разных участках клетки мо- жет быть различным. Короче говоря, исследуемая молекула может вести себя в пробирке совсем не так, как в клетке. Основной задачей биохимии яв- ляется изучение влияния клеточной организации и макромолекулярных комплексов на функциони- рование отдельных ферментов и других биологи- ческих молекул для понимания законов их функ- ционирования как in vivo, так и in vitro. Краткое содержание раздела 1.1. ПРИНЦИПЫ ОРГАНИЗАЦИИ КЛЕТКИ Все клетки ограничены плазматической мем- браной, имеют цитозоль, в котором растворе- ны метаболиты, коферменты, неорганические ионы и ферменты, а также содержат набор генов, заключенных в нуклеоид (бактерии и археи) или ядро (эукариоты). Фототрофы для своей жизнедеятельности ис- пользуют солнечный свет, хемотрофы окисля- ют топливные молекулы, передавая электро- ны на акцепторы электронов: неорганические вещества, органические вещества или молеку- лярный кислород. Бактериальные клетки и клетки архей имеют ци- тозоль, нуклеоид и плазмиды. Эукариотические клетки содержат ядро и разделены на множество компартментов, где в различных органеллах про- текают специфические процессы; органеллы можно выделить и изучать отдельно. Белки цитоскелета собраны в длинные нити (филаменты), придающие клетке прочность, определяющие ее форму и служащие в каче- стве направляющих путей для движения кле- точных органелл. Надмолекулярные комплексы удерживают- ся за счет нековалентных взаимодействий и имеют иерархическую структуру; некоторые комплексы видны в световой микроскоп. При выделении отдельных молекул из этих ком- плексов для исследований in vitro могут быть упущены некоторые важные закономерности жизнедеятельности клетки. 1.2. Химические основы биохимии Биохимия объясняет биологические принципы в химических терминах. В конце XVIII в. химики пришли к выводу, что составы живой и неживой материи принципиальным образом различаются. Антуан Лавуазье (1743-1794) отмечал относи- тельную химическую простоту «минерального мира» в отличие от сложности «мира растений и животных», который, как он знал, был построен из соединений, богатых такими элементами, как углерод, кислород, азот и фосфор. В первой половине XX в. были проведены исследования биохимического процесса разло- жения глюкозы в дрожжах и в мышечных клет- ках животных. Удивительно, но химизм процес- сов в этих двух, казалось бы, таких разных типах клеток оказался схожим: разложение глюкозы в обоих случаях проходило с образованием десяти одних и тех же промежуточных продуктов и при участии десяти тех же самых ферментов. После- дующее изучение многих других биохимических процессов во множестве различных организмов подтвердило общность этого наблюдения, что было метко сформулировано в 1954 г. Жаком Моно: «Что верно для Е. coli, то верно и для сло- на». Установившаяся сегодня точка зрения об общности происхождения всех организмов от од- ного эволюционного предшественника частично основана на этой повсеместно наблюдаемой уни- версальности химических превращений и про- межуточных продуктов, которую часто называют «биохимическим единством». Для живых организмов важными являются лишь менее 30 из более чем 90 существующих в природе химических элементов. Большинство элементов живой материи имеют небольшой атомный номер: лишь пять элементов имеют атомные номера выше 34 (селен) (рис. 1-12). В клетках преобладают четыре элемента: водо- род, кислород, азот и углерод; в большинстве клеток на их долю приходится более 99% мае-
1.2 Химические основы биохимии [29] Рис. 1-12. Элементы, необходимые для жизни и здоровья животных. Основные элементы (отмечены оранжевым цветом) входят в состав всех клеток и тканей; ежедневная потреб- ность в них исчисляется в граммах. Потребность в следовых элементах (отмечены желтым цветом) гораздо ниже: человеку требуется всего несколько миллиграммов Fe, Си и Zn в сут- ки, а остальных элементов еще меньше. Потребность в элементах у растений и микроорга- низмов похожа, однако способы получения этих элементов различаются. сы. Эти легкие элементы способны образовать соответственно одну, две, три и четыре прочные связи, причем в соответствии с общим прави- лом чем легче элемент, тем более прочные связи он образует. Микроэлементы (рис. 1-12) состав- ляют очень малую долю массы человеческого тела, однако они играют важную роль, посколь- ку обычно необходимы для функционирования специфических белков, в том числе и многих фер- ментов. Например, способность молекулы гемо- глобина переносить кислород зависит от четырех ионов железа, которые составляют лишь 0,3% массы этой молекулы. Биомолекулы представляют собой органические соединения, содержащие различные функциональные группы Химические свойства живых организмов в пер- вую очередь связаны с тем, что в их состав вхо- дит углерод, на долю которого приходится более половины сухой массы клеток. Углерод способен образовывать одинарные связи с атомами водо- рода, одинарные и кратные (двойные и тройные) между атомами в углеродной цепи, а также свя- зи с атомами кислорода (одинарные и двойные), азота (одинарные, двойные и тройные) и с дру- Рис. 1-13. Многообразие углеродных связей. Углерод может образовывать одинарные, двойные и тройные ковалентные связи (все показаны красным цветом), в том числе и с другими атомами углерода. Тройные связи в биомолекулах встречаются редко.
Рис. 1-14. Геометрия углерод-углеродных связей, а) Четыре одинарные связи, которые образует атом углерода, направлены в пространстве к вершинам правильного тетраэдра; б) вокруг одинарных связей углерод-углерод возможна полная свобода вращения, как это показано на примере молекулы этана (СН3-СН3); в) двойная углерод-углеродная связь ко- роче и не допускает свободного вращения. Оба атома углерода, образующие двойную связь, а также атомы А, В, X и Y лежат в одной плоскости. Метильная Этильная Фенильная Н I R—С—Н I н н н I I R—С—С—Н I I н н н н с=с R—\н Ч // С—С н н Сложноэфирная R1—О—R2 Эфирная R1—С—О—R2 О Имидазольная Карбонильная R—С—Н (альдегид) Д Карбонильная R1—С—R2 (кетон) Д Карбоксильная R—С—О О Гидроксильная R—О—Н о-н н Енольная Ацетильная R—О—С—С—Н О Н Ангидридная (образованная R двумя остатками карбоновых кислот) Н Аминогруппа R—N—Н Н Амидогруппа Н I N 1 11 2 Иминная R С R r3 N-замещенный имин N (основание Шиффа) R1—С—R2 Сульфгидрильная (меркаптогруппа) Гуанидиновая R---С=СН / \ R—S—Н Дисульфидная R1—S—S—R2 Тиоэфирная R1—С—S—R2 О О’ I Фосфорильная R—О—Р—ОН О Фосфоанги- дридная О’ О’ О—Р—О—Р—О—R2 II II О о Смешанная ангидридная q - (образована карбоксикислотой и фосфорной кислотой, R—С—О— Р—ОН другое название - ацил фосфат) II II Рис. 1-15. Некоторые характерные функциональные группы биомолекул. На данном ри- сунке и далее в книге R — любой заместитель (функциональная группа). Это может быть просто атом водорода, но чаще какой-либо углерод со держащий радикал. Если в молекуле несколько заместителей, их обозначают как R1, R2 и т. д.
1.2 Химические основы биохимии [31] гими элементами (рис. 1-13). Для биологии важ- ное значение имеет способность атомов углерода образовывать стабильную одинарную связь с че- тырьмя другими атомами углерода. Кроме того, два атома углерода могут «обобществить» две или три пары электронов, в результате чего воз- никает двойная или тройная связь. Четыре одинарные ковалентные связи, об- разуемые атомом углерода, направлены в про- странстве к вершинам правильного тетраэдра, причем угол между двумя любыми связями со- ставляет около 109,5° (рис. 1-14), а длина связей равна примерно 0,154 нм. Все атомы или груп- пы в таких тетраэдрических молекулах могут свободно вращаться вокруг одинарных связей, за исключением тех случаев, когда к двум со- седним атомам углерода присоединены очень большие или сильно заряженные группы ато- мов. Двойная углерод-углеродная связь короче одинарной (около 0,134 нм) и вокруг нее невоз- можно вращение. Связанные ковалентной связью атомы угле- рода в составе биомолекул могут образовывать линейные и разветвленные цепи и циклические структуры. Возможно, что в процессе возник- новения и эволюции живых организмов спо- собность углерода образовывать разные типы углерод-углеродных связей, а также связей с другими элементами стала решающим факто- ром, определившим выбор именно соединений углерода в качестве основного строительного материала клеток. Никакой другой химический элемент не способен создавать молекулы с та- ким разнообразием размеров, форм и функцио- нальных групп. Большинство биомолекул можно рассма- тривать в качестве производных углеводородов, в которых атомы водорода заменены функцио- нальными группами, которые придают молекуле различные химические свойства. При этом об- разуются органические соединения различных классов. Спирты содержат одну или несколько гидроксильных групп; амины — аминогруппы; альдегиды и кетоны — карбонильные группы; карбоновые кислоты — карбоксильные группы (рис. 1-15). Многие биомолекулы полифункцио- нал ьны, т. е. содержат две или несколько разных функциональных групп (рис. 1-16), каждая из Рис. 1-16. Некоторые характерные функциональные группы одной биомолекулы. Ацетилко- фермент А (ацетил-СоА) является переносчиком ацетильных групп в некоторых ферментатив- ных реакциях. На структурной формуле молекулы цветом показаны функциональные группы. Как мы увидим в гл. 2, некоторые из этих функциональных групп могут существовать в про- тонированной и непротонированной формах в зависимости от pH среды. В пространственной модели атомы N изображены синим цветом, атомы С черные, атомы Р оранжевые, атомы 0 крас- ные, а атомы Н белые. Слева желтым цветом обозначен атом серы в тиоэфирной связи между ацетильным остатком и коферментом А.
[32] 1. Основы биохимии которых имеет свои химические характеристики и участвует в специфических реакциях. Химиче- ская «индивидуальность» соединения определя- ется химией его функциональных групп и их рас- положением в трехмерном пространстве. Клетки содержат универсальный набор небольших молекул В водной фазе (цитозоле) каждой клетки рас- творено около тысячи различных небольших органических молекул с молекулярной массой от -100 до -500 (в дополнении 1-1 объясняются различные способы выражения молекулярных масс). Ключевые метаболиты основных метабо- лических путей, сохранившихся в ходе эволю- ции, обнаруживаются практически во всех клет- ках. Этот набор молекул включает основные аминокислоты, нуклеотиды, сахара и их фосфо- рилированные производные, а также ряд моно-, ди- и трикарбоновых кислот. Все эти молекулы полярны или заряжены, растворимы в воде и присутствуют в клетке в микромолярных или миллимолярных концентрациях. Они удержи- ваются внутри клетки, поскольку не могут само- стоятельно проникнуть сквозь плазматическую мембрану. У эукариот транспорт молекул в клетку и из нее, а также между разными компар- тментами клетки обеспечивают специфические мембранные транспортные структуры. Единый набор одних и тех же веществ в клетках живых организмов отражает универсальность метабо- лических механизмов и их эволюционный кон- серватизм от самых первых клеток. Однако некоторые небольшие биологи- ческие молекулы встречаются только в опре- деленных типах клеток или организмов. На- пример, сосудистые растения кроме обычного набора молекул содержат небольшие молеку- лы — вторичные метаболиты, которые играют специфическую роль в жизни растений. К этим метаболитам относятся соединения, придаю- щие растениям характерные запахи, и такие ве- щества, как морфин, хинин, никотин и кофеин, которые оказывают сильное физиологическое действие на организм человека, а растения ис- пользуют их совсем для других целей. Полный набор небольших молекул в конкретной клетке называют «пулом метаболитов», или «метабо- ломом» по аналогии с термином «геном» (более подробно см. в разд. 1.5). Основными компонентами клеток являются макромолекулы Многие биологические молекулы представляют собой макромолекулы, т. е. полимеры с молеку- лярной массой свыше 5000, построенные из про- стых предшественников. Короткие полимерные молекулы называют олигомерами (от греч. oligos — несколько). Белки, нуклеиновые кислоты и поли- сахариды — все это макромолекулы, состоящие из мономеров с молекулярной массой 500 и ниже. На синтез макромолекул клетка расходует основной Дополнение 1-1 Абсолютная и относительная молекулярная масса. Единицы измерения При указании молекулярной массы используют две эквивалентных размерности. Оба способа можно встретить в этой книге. Во-первых, относительная молекулярная масса М (или 7ИГ), которая определяется как отношение массы молекулы к одной двенадцатой массы атома углерода-12 (12С). Поскольку М опре- делена как отношение, это величина безразмерная. Во-вторых, абсолютная молекулярная масса, т. Это просто-напросто масса одной молекулы, т. е. массы од- ного моля вещества в граммах к числу Авогадро (чис- лу молекул в 1 моль). Абсолютная молекулярная масса измеряется в дальтонах (Да). 1 Да = У12 массы атома углерода-12.1кДа = 1000 Да, 1 МДа = 1 000 000 Да. Пусть дано, что молекулярная масса в 1000 раз больше молекулярной массы воды. Правильная за- пись: М = 18 000, т = 18 000 Да = 18 кДа; неправильно: М= 18 000 Да. Кроме того, массы атомов или молекул выра- жают в атомных единицах массы (а. е. м. или а. е.). 1 а. е. м. определена как У12 массы атома углеро- да-12. Поскольку экспериментально определенная масса атома 12С составляет 1,9926 • 10 23 г, 1 а. е. м. = = 1,6606 • 10 24 г. Атомные единицы массы принято использовать при отнесении пиков на масс-спектрах (см. доп. 3-2).
1.2 Химические основы биохимии [33] запас своей энергии. Далее макромолекулы могут собираться в надмолекулярные комплексы, фор- мируя такие функциональные структуры, как ри- босомы. В табл. 1-1 представлены основные клас- сы биомолекул в клетках бактерии Е. coli. Белки, представляющие собой длинные по- лимеры, построенные из аминокислотных звеньев, составляют самую большую фракцию веществ клетки (после воды). Некоторые белки выполня- ют каталитическую функцию (ферменты), другие служат в качестве структурных элементов, рецеп- торов или переносчиков, участвующих в переме- щении веществ в клетку и из нее. Белки, вероятно, наиболее многочисленны по своему разнообразию и функциям среди всех типов биомолекул. Все белки, функционирующие в данной клетке, назы- вают протеомом клетки. Нуклеиновые кислоты (РНК и ДНК) представляют собой полимеры, по- строенные из нуклеотидов. С их помощью в клетке хранится и передается генетическая информация; кроме того, некоторые молекулы РНК выполняют структурные или каталитические функции в над- молекулярных комплексах. Полисахариды по- строены из остатков простых сахаров, таких как глюкоза; они выполняют три основные функции: запасают энергию в клетке, составляют жесткий каркас клеточной стенки (у растений и бактерий) и служат внеклеточными элементами узнавания со специфическими участками связывания опреде- ленных белков других клеток. Короткие полимер- ные сахара (олигосахариды), связанные с белками или липидами на клеточной поверхности, играют роль специфических сигнальных молекул. Липи- Молекулярный состав клетки Е. coli Процент Примерное от общей массы число типов клетки молекул Таблица 1-1 Вода 70 1 Белки 15 3 000 Нуклеиновые кислоты ДНК 1 1-4 РНК 6 >3 000 Полисахариды 3 10 Липиды 2 20 Мономерные молекулы и промежуточные соединения 2 500 Неорганические ионы 1 20 ды (в основном жиры, сложные эфиры жирных кислот) содержат остатки нерастворимых в воде органических кислот с длинным углеводородным «хвостом» являются структурными компонента- ми мембран, запасными топливными веществами, пигментами или внутриклеточными сигнальными молекулами. Число мономерных звеньев в моле- кулах белков, нуклеиновых кислот, полисахари- дов и липидов очень велико: молекулярные массы белков составляют от 5000 до миллиона, полисаха- ридов типа крахмала — до нескольких миллионов, нуклеиновых кислот — до нескольких миллиар- дов. Молекулы липидов имеют меньшие размеры (М от 750 до 1500), и их обычно не относят к ма- кромолекулам. Однако многие молекулы липидов способны к образованию крупных надмолекуляр- ных структур, связанных нековалентными связя- ми. Клеточные мембраны построены из гигант- ских агрегатов липидных и белковых молекул. Поскольку последовательность белков и нуклеиновых кислот несет в себе много инфор- мации, эти молекулы часто называют информа- ционными макромолекулами. Как упоминалось выше, некоторые олигосахариды также служат в качестве информационных молекул. Трехмерная структура характеризуется конфигурацией и конформацией Принципиальное значение для функционирова- ния биомолекул, безусловно, имеет ковалентная структура и наличие функциональных групп, однако не менее важно расположение атомов в пространстве, т. е. стереохимия молекулы. Угле- родсодержащие вещества обычно существуют в виде двух или более стереоизомеров, у которых при одинаковом химическом составе атомы рас- положены в пространстве по-разному. В таком случае говорят о разных конфигурациях. Вза- имодействия между биомолекулами неизбежно происходят стереоспецифически, т. е. требуют специфической конфигурации реагирующих молекул. На рис. 1-17 представлено три способа сте- реохимического изображения структур простых молекул. Перспективная модель однозначным образом отражает специфическую стереохимиче- скую структуру молекулы, однако углы взаимно- го расположения связей и длина связей доходчи- вее изображаются с помощью шаростержневых
[34] 1. Основы биохимии У H3N— С— Н Н—С—Н I н в а Рис. 1-17. Способы изображения молекул. Три модели показывают строение аминокисло- ты аланина, а) Перспективное изображение структурной формулы: темный клинышек (—) обозначает связь, в которой расположенный на широком конце атом выходит из плоскости рисунка по направлению к читателю; заштрихованный клинышек (.) обозначает связь, уходящую под плоскость рисунка; б) шаростержневая модель, на которой хорошо видны относительные длины связей и углы между ними; в) СРК-модель, в которой относитель- ные размеры всех атомов соответствуют их ван-дер-ваальсовым радиусам. СРК-модель — модель Кори-Полинга-Колтуна (см. прим, на с. 35). Н хн \=С ноос хсоон НООС ХН С=С\ нх соон Малеиновая кислота (цис) Фумаровая кислота (транс) 11 -ф/с-Ретиналь Рис. 1-18. Конфигурация геометрических изомеров. а) Такие изомеры, как малеиновая и фумаровая кислоты, не могут превратиться друг в друга без разрыва кова- лентных связей, что требует больших затрат энергии. б) На начальном этапе восприятия света в сетчатке по- звоночных происходит поглощение видимого света 11-цис-ретиналем. Энергия поглощенного света (око- ло 250 кДж/моль) способствует превращению 11-цис- ретиналя в полностью-тпрпнс-ретиналь, что запускает электрический импульс в клетках сетчатки. (В шаро- стержневых моделях ретиналя атомы водорода не изо- бражены.) б Полностью-??грбшс-ретиналь
1.2 Химические основы биохимии [35] Рис. 1-19. Хиральные и ахиральные молекулы, а) Если атом углерода связан с четырьмя разными группами или атомами (А, В, X, Y), то последние могут расположиться двумя спо- собами. При этом образуются две структуры, представляющие собой несовместимые зер- кальные отражения друг друга (энантиомеры). Такой асимметрический атом углерода на- зывают хиральным атомом или хиральным центром, б) Когда атом углерода связан только с тремя разными группами или атомами (т. е. один и тот же заместитель встречается дважды), возможна лишь одна пространственная конфигурация. Такую молекулу называют симме- трической или ахиральной. Эту молекулу можно совместить с ее зеркальным отражением: молекулу перед зеркалом (слева) нужно повернуть против часовой стрелки (ось вращения проходит сверху вниз по связи от А к С), и она совместится с изображением в зеркале. Зеркальное отражение исходной Ахиральная молекула: в результате вращения молекулы 0 Исходная молекула можно совместить молекулу с ее отражением моделей. В СРК-моделях* радиусы всех атомов пропорциональны их ван-дер-ваальсовым ради- усам, а контур молекулы описывает занимаемое ею пространство (т. е. часть пространства, из ко- торого исключены атомы, входящие в состав дру- гих молекул). Конфигурация молекулы определяется на- личием 1) двойной связи, вокруг которой невоз- можно свободное вращение, или 2) хирального центра, относительно которого заместители рас- положены определенным образом. Конфигура- ционные изомеры не могут превращаться друг в друга без разрыва одной или нескольких кова- лентных связей. На рис. 1-18 представлены моде- ли малеиновой кислоты и ее изомера — фумаро- вой кислоты. Эти соединения — геометрические изомеры, или цис-транс-изомеры; они различа- ются расположением заместителей относительно *По первым буквам имен Р. Кори (R. Cory), Л. Полин- га (L. Poling) и У. Л. Колтуна (W. L. Koltun); другое название — spacefilling модели. — Прим, перев. двойной связи (от лат. cis — на этой стороне, с од- ной стороны от двойной связи, trans — через, по разные стороны от двойной связи). Малеиновая кислота (в нейтральной среде цитоплазмы в виде малеата) — ^z/c-изомер, а фумаровая (фумарат) — транс-изомер. Оба вещества хорошо изучены, имеют характерные свойства и могут быть разде- лены. Участок связывания одной из этих молекул (например, на молекуле фермента) не подходит для связывания другой, что объясняет различ- ную биологическую роль этих соединений, хотя их структурная формула одинакова. В другом типе стереоизомерии четыре раз- личных заместителя при тетраэдрическом ато- ме углерода могут располагаться в пространстве двумя различными способами. В результате воз- никают две конфигурации (рис. 1-19) и два сте- реоизомера с похожими или даже идентичными химическими свойствами, но с индивидуальными физическими свойствами или биологической ак- тивностью. Атом углерода с четырьмя различны- ми заместителями называют асимметрическим.
[36] 1. Основы биохимии Энантиомеры (зеркальные отражения) Энантиомеры (зеркальные отражения) Диастереомеры (не являются зеркальными отражениями) Рис. 1-20. Два типа стереоизомеров. Приведены изображения четырех различных 2,3-дизамещенных бутанов (число асимметричных атомов углерода п = 2, следовательно, воз- можно существование 2Л = 4 стереоизомеров). Каждое вещество представлено в отдельной рамке с помощью перспективного изображения структурной формулы и шаростержневой модели, которая повернута различным образом, чтобы дать возможность увидеть все группы. Две пары стереоизомеров являются зеркальными отражениями друг друга, т. е. энантиомера- ми. Другие пары не зеркальные отражения, они диастереомеры. Такой атом является хиральным центром (от греч. chiros — рука; для некоторых хиральных молекул очень подходят модели левой и правой руки). Молекула с единственным хиральным центром может иметь два стереоизомера; при наличии двух или более (п) хиральных центров возможно существование 2п стереоизомеров. Структуры некоторых стереоизомеров явля- ются зеркальными отражениями друг друга; их называют энантиомерами (рис. 1-19). Пары стереоизомеров, которые не являются зеркаль- ными отражениями, называют диастереомерами (рис. 1-20). Луи Пастер в 1848 г. первым обнаружил, что энантиомеры имеют практически идентичные хи- мические свойства, но их можно различить при пропускании луча плоскополяризованного света (см. дополнение 1-2). Растворы индивидуальных (отделенных друг от друга) энантиомеров враща- ют плоскость поляризации плоскополяризованно- го света в противоположных направлениях, но их эквимолярные растворы (рацемические смеси) не обладают оптической активностью. Соедине- ния, не имеющие хиральных центров, не способны вращать плоскость поляризации плоскополяризо- ванного света. КЛЮЧЕВЫЕ ДОГОВОРЕННОСТИ. Учитывая важность стереохимической структуры в реакциях между биомолекулами (см. ниже), биохимик обязан на- зывать и изображать структуру каждой молеку- лы таким образом, чтобы ее стереохимия была очевидной. Для соединений, содержащих более одного хирального центра, наиболее подходящей номенклатурой является /?/5-система, где опре- делен приоритет каждого заместителя при хи- ральном атоме углерода: -осн2 > -он > -nh2 > -соон > -сно > -СН2ОН > -сн3 > -н В соответствии с /?/5-системой молекулу нуж- но изображать таким образом, чтобы хиральный атом оказывался перед функциональной груп- пой с наименьшим приоритетом (положение 4 на схеме молекулы; с. 37). Если приоритет осталь- ных трех групп (от 1 до 3) снижается по часовой стрелке, это /^-конфигурация (от лат. rectus — правый); если приоритет трех групп снижается против часовой стрелки, это 5-конфигурация (от лат. sinister — левый). Таким образом, любой хи- ральный атом можно обозначить или как R, или 5. При записи формулы соединения с хиральным центром необходимо указывать эти обозначения,
1.2 Химические основы биохимии [37] Дополнение 1-2 Луи Пастер и оптическая активность: In vino veritas Луи Пастер столкнулся с явлением оптической ак- тивности в 1843 г. в процессе исследования кристал- лических осадков, образующихся на дне бочек с ви- ном (осадок в вине оказался винной кислотой, иначе называемой рацемической, от лат. racemus — кисть винограда). С помощью тонкого пинцета он разде- лял два типа кристаллов, которые были идентичны по форме, но как зеркальные отражения друг друга. Оба типа кристаллов имели все химические свойства винной кислоты, однако раствор одних кристаллов вращал плоскополяризованный свет влево (лево- вращающая форма), а раствор других кристаллов — вправо (правовращающая форма). Позднее Пастер описывал свой эксперимент: В изомерных телах элементы и их пропорции одинаковы, различается лишь расположение ато- мов... Нам известно, что, с одной стороны, молеку- лярная организация двух винных кислот асимме- трична, а с другой стороны — что эта организация абсолютно идентична, за исключением направления этой асимметрии. Расположены атомы правовра- щающей формы кислоты в виде правозакрученной спирали или в вершинах неправильного тетраэдра, а может, они размещены каким-то другим асимме- тричным образом? Нам это неизвестно. * Теперь мы это знаем. Рентгенография кристал- лов, осуществленная в 1951 г., подтвердила, что структуры лево- и правовращающих форм винной кислоты являются зеркальными отражениями друг * Из лекции Пастера на заседании Химического общества в Париже в 1883 г; [DuBos, R. (1976) Louis Pasteur: Free Lance of Science, p. 95, Charles Scribner’s Sons, New York]. Луи Пастер, 1822-1895 друга; была также установлена абсолютная конфи- гурация каждой формы (рис. 1). С помощью того же подхода было продемонстрировано, что, хотя аминокислота аланин имеет две стереоизомера (Ей D), в белках всегда присутствует только один из них (L-изомер, гл. 3). НООС1 4СООН \2 3 / ..С-Ск LOH ноос1 4СООН \2 3 / НОт/ \н ы он (22?,37?)-Винная кислота (правовращающий изомер) (2S,3S) -Винная кислота (левовращающий изомер) Рис. 1. Пастер разделил кристаллы двух стереоизомеров винной кислоты и показал, что растворы индивидуаль- ных форм вращали плоскополяризованный свет в оди- наковой степени, но в противоположных направлени- ях. Эти правовращающая и левовращающая формы были позднее названы (R,R)~ и (5,5)-изомерами. Принцип R/5-номенклатуры изложен в тексте. и тогда становится понятна стереохимия любого хирального центра. Еще одна номенклатура стереоизомеров - D/L-система — рассматривается в гл. 3. Молеку- ла с одним хиральным центром (например, два изомера глицеральдегида) может быть однознач- но описана с помощью любой из этих систем. сно но-с—н СН2ОН L- Глицеральдегид сн2он(а) (S) - Глицеральдегид
[38] 1. Основы биохимии Угол поворота, град. Рис. 1-21. Конформации. Благодаря свободе вращения во- круг связи С-С в молекуле этана возможно существование многих конформаций. Как показано на шаростержневой модели, если поворачивать ближайший к читателю атом углерода с тремя прикрепленными к нему атомами водо- рода относительно дальнего атома углерода, то потенци- альная энергия молекулы достигает максимума в полно- стью заслоненной конформации (угол поворота 0°, 120° и т. д.) и минимума в полностью заторможенной конформа- ции (угол поворота 60°, 180° и т. д.). Поскольку энерге- тические различия сравнительно невелики, то происходят быстрые взаимопревращения двух форм (миллионы раз в секунду), так что их нельзя выделить по одной. Взаимодействия между биомолекулами являются стереоспецифическими Биологические взаимодействия между молеку- лами стереоспецифичны: они возможны лишь в случае «правильной» стереохимической структу- ры реагирующих веществ. Трехмерная структура мелких и крупных биологических молекул, т. е. структура с учетом конфигурации и конформа- ции молекулы, играет весьма важную роль в био- логических взаимодействиях, например между реагентом и его ферментом, гормоном и его ре- цептором на клеточной поверхности или анти- геном и специфическим антителом (рис. 1-22). Изучению стереохимии биомолекул прецезион- ными физическими методами посвящено много исследований. В живых организмах хиральные молекулы обычно присутствуют лишь в одной из возмож- ных форм. Например, все аминокислоты в соста- ве белков присутствуют исключительно в виде L-изомеров, а глюкоза встречается только в виде D-изомера. (Принципы номенклатуры стерео- изомеров аминокислот изложены в гл. 3, саха- ров — в гл. 7; для многих биомолекул наиболее Следует различать конфигурацию и конфор- мацию молекулы — положение в пространстве заместителей в результате свободного вращения вокруг одинарных связей без разрыва каких-ли- бо связей. Например, в молекуле простого угле- водорода этана возможно практически свободное вращение относительно связи углерод-углерод. В результате в зависимости от угла поворота возможно существование нескольких переходя- щих друг в друга конформаций молекулы этана (рис. 1-21). Две конформации представляют особый интерес: заторможенная, наиболее ста- бильная и, следовательно, преобладающая, и за- слоненная, наименее стабильная. Невозможно выделить вещество в одной из этих конформа- ций, поскольку переходы из одной конформации в другую происходят постоянно. Однако если один или более атомов водорода у каждого угле- рода заменить функциональной группой, которая имеет большой объем или несет заряд, то свобода вращения вокруг связи С-С ограничивается, что в свою очередь снижает число возможных устой- чивых конформаций производных этана. Рис. 1-22. Комплементарность макромолекулы и малой молекулы. Связывание белка с участком РНК из регуля- торной области TAR в геноме вируса иммунодефицита человека (показан серым цветом) представлено на при- мере связывания амида аргинина (окрашенная молеку- ла). Структура амида аргинина соответствует карману на поверхности РНК и удерживается в такой ориентации несколькими нековалентными связями с РНК. Данное изображение молекулы РНК получено с помощью ком- пьютерной программы GRASP, которая позволила смоде- лировать форму внешней поверхности макромолекулы, исходя из ван-дер-ваальсовых радиусов всех атомов в молекуле или из параметра «исключенного объема», т. е. объема, в который не может проникнуть молекула воды.
1.2 Химические основы биохимии [39] СН3 О С ^сн I I Н2С сн2 СН3—С Н II сн2 СН3 О С ^сн I I Н2С сн2 н-%-( I СН3 (R)-Карвон (мята) (5)-Карвон (тмин) "ООС N СН2 С ХЧСГ ОСН3 II си Н О уН2 НС ^СН II I НС ^сн н "ООС ZC^*HN С^ СН2 С ,ЧС ОСН3 II Н О ^Н2 с^ НС ""CH II I НС ^сн с^ Метиловый эфир L-аспартил- L-фенилаланина (аспартам), сладкий Метиловый эфир L-аспартил- D-фенил аланина, б горький Рис. 1-23. Стереоизомеры, различаемые человеком, а) Два стереоизомера карвона: (7?)-карвон, выделяемый из масла мяты, имеет специфический мятный аромат; (5)-карвон из семян тмина пахнет тмином. 6) Аспартам — это искусственный заменитель сахара, поступа- ющий в продажу под разными торговыми названиями. Вкусовые рецепторы легко отличают его от горького стереоизомера, несмотря на то что эти вещества различаются лишь конфи- гурацией у одного из двух хиральных атомов углерода, в) Антидепрессант циталопрам (Це- лекса™) — селективный ингибитор обратного захвата серотонина; препарат представляет собой рацемическую смесь двух стереоизомеров, из которых только (5)-циталопрам оказы- вает терапевтическое действие. Стереохимически чистый (5)-циталопрам (эсциталопрам оксалат) продается под торговым названием Лексапро. Как можно догадаться, эффективная доза Лексапро составляет половину эффективной дозы Целексы. удобна ^/5-номенклатура, изложенная выше.) Напротив, при лабораторном синтезе соедине- ний с асимметрическим атомом углерода обычно образуются все возможные хиральные формы, например смесь L- и D-изомеров. Живые клетки создают только одну хиральную форму биомоле- кул, поскольку синтезирующие их ферменты так- же являются хиральными. Стереоспецифичность, т. е. способность раз- личать стереоизомеры, свойственна ферментам и другим белкам и является характерным элементом молекулярной «логики» живых организмов. Если участок связывания в молекуле белка комплемен- тарен одному изомеру хирального соединения, он не может быть комплементарным другим изофор- мам по той же причине, по какой левая перчатка
[40] 1. Основы биохимии не годится для правой руки. На рис. 1-23 пред- ставлены замечательные парные примеры, иллю- стрирующие способность биологических систем различать стереоизомеры. Основные типы химических реакций, встре- чающихся в биохимии, рассмотрены в гл. 13 (пе- ред обсуждением путей метаболизма). Краткое содержание раздела 1.2. ХИМИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ БИОХИМИИ Благодаря многообразию связей углерода возможно существование широкого набора углеродных скелетов с различными функци- ональными группами, придающими биомо- лекулам биологическую и химическую спе- цифичность. В живых клетках встречается практически универсальный набор из нескольких сотен не- больших молекул. Основные пути взаимных метаболических превращений этих молекул мало изменились в процессе эволюции. Белки и нуклеиновые кислоты представля- ют собой линейные полимеры, состоящие из простых мономерных звеньев; их последова- тельность несет информацию, определяющую трехмерную структуру и биологические функ- ции каждой молекулы. Конфигурация молекулы изменяется только с разрывом ковалентной связи. Если атом угле- рода имеет четыре разных заместителя (хи- рал ьный атом), то эти заместители могут рас- полагаться в пространстве двумя различными способами, образуя различающиеся по свой- ствам стереоизомеры. Биологической актив- ностью обладает только один стереоизомер. Конформация молекулы определяет положе- ние составляющих ее атомов в пространстве, которое может изменяться путем вращения атомов вокруг одинарных связей без разрыва ковалентных связей. Взаимодействия между биомолекулами прак- тически всегда стереоспецифичны: они требу- ют точной комплементарности реагирующих молекул. 1.3. Физические основы биохимии Для обеспечения жизнедеятельности и самовоспро- изведения живые организмы должны выполнять определенную работу. Реакции синтеза, протекаю- щие в клетках, как и процессы синтеза на производ- стве, требуют энергетических затрат. Энергия рас- ходуется при движении бактерии и беге спринтера на Олимпийских играх, при полете светляков и при электрическом разряде угря. Хранение и передача информации также требуют затрат энергии, без ко- торой богатые информацией молекулы неизбежно утратили бы свою структуру и значение. В процессе эволюции клетки создали высо- коэффективные механизмы использования энер- гии солнечного света или топливных молекул для осуществления многочисленных процессов, протекающих с затратой энергии. Одной из задач биохимии является количественное описание процессов получения, передачи и расходования энергии живыми клетками в химических терми- нах. Превращения энергии в клетке, как и все другие процессы преобразования энергии, можно рассматривать с учетом законов термодинамики. Живые организмы находятся в динамическом стационарном состоянии, но не в равновесии с окружающей средой Молекулы и ионы в живых организмах по типу и концентрации отличаются от тех, что находятся в окружающей среде. Парамеция в пруду, акула в оке- ане, бактерия в почве, яблоня в саду — все они отли- чаются по составу от окружающего их мира. Кроме того, по достижении зрелости они поддерживают свой состав более или менее постоянным, несмотря на непрерывно меняющиеся внешние условия. Хотя характерный состав живого организма сла- бо изменяется со временем, но набор молекул внутри него вовсе не находится в статическом состоянии. Небольшие молекулы, макромолекулы и надмоле- кулярные структуры непрерывно синтезируются и распадаются в химических реакциях, сопровождаю- щихся постоянным оборотом вещества и энергии в системе. Молекулы гемоглобина, которые вот в этот самый момент переносят кислород от наших легких к мозгу, были синтезированы в прошлом месяце. К следующему месяцу они будут уничтожены и полно- стью заменены новыми. Глюкоза, которую ваш орга- низм получил при последнем приеме пищи, сейчас циркулирует у вас в кровотоке. До конца дня эти
1.3 Физические основы биохимии [41] молекулы глюкозы превратятся во что-то еще, воз- можно, в углекислый газ или жир, и будут заменены новой глюкозой, так что ее концентрация в крови остается более или менее постоянной на протяже- нии всего дня. Количество гемоглобина и глюкозы в крови относительно постоянно, поскольку скорость синтеза или захвата каждого из этих веществ со- впадает со скоростью их разложения, потребления или превращения в другие продукты. Постоянство концентрации является результатом динамического стационарного состояния, которое далеко от равно- весия. Поддержание этого стационарного состояния требует затрат энергии. Если клетка не может более производить энергию, она погибает и начинает раз- лагаться, приходя к равновесию с окружающей сре- дой. Ниже мы подробнее обсудим суть понятий «ста- ционарное состояние» и «равновесие». Организмы перерабатывают энергию и вещества из окружающей среды Химическую реакцию в растворе можно предста- вить как систему, включающую все реагирующие вещества, продукты реакции и растворитель, а так- же некоторый объем атмосферного воздуха вбли- зи, короче говоря, всего, что содержится в опреде- ленной области окружающего пространства. Эта система и окружающая среда вместе составляют вселенную. Если система не обменивается веще- ством и энергией с окружающей средой, ее назы- вают изолированной. Если система обменивается с окружающей средой энергией, но не обменивает- ся материей (веществом), ее называют закрытой. Если происходит обмен и энергией, и материей, это открытая система. Живой организм представляет собой откры- тую систему: он обменивается с окружающей сре- дой энергией и материей. Живые организмы мо- гут получать энергию двумя способами: 1) путем захвата из окружающей среды химического то- плива (например, глюкозы) и его окисления (см. дополнение 1-3, случай 2); 2) путем поглощения солнечного света. Первый закон термодинамики постулирует принцип сохранения энергии', при любых химиче- ских или физических процессах общее количество энергии в системе остается постоянным, хотя форма энергии может изменяться. Клетки способны вир- туозно трансформировать химическую, электро- магнитную, механическую и осмотическую энер- гию с очень высокой эффективностью (рис. 1-24). Потенциальная энергия Превращения энергии направлены на совершение работы • Питательные вещества из окружающей среды (сложные молекулы типа сахаров или жиров) • Солнечный свет а Химические превращения в клетке Энергетические затраты клетки: • химический синтез • механическая работа • осмотический и электрический градиенты • образование света • перенос генетической информации б Тепло в Снижение упорядоченности (рост энтропии) в окружающей среде В результате метаболизма образуются вещества с более простой структурой, чем у исходных топливных молекул: CO2,NH3,H2O, НРО1- г Повышение упорядоченности (энтропии) в системе Простые вещества образуют полимерные информационные макромолекулы: ДНК, РНК, белки Рис. 1-24. Некоторые пути превращения энергии в жи- вых организмах. Энергетические превращения в процес- се метаболизма сопровождаются увеличением беспоряд- ка системы и окружающего ее пространства, выраженной в терминах энтропии, по мере снижения потенциаль- ной энергии сложных молекул питательных веществ. а) Живые организмы получают энергию из окружающей среды; б) переводят некоторое количество энергии в необходимую клеткам форму; в) возвращают некоторое количество энергии в виде тепла в окружающую среду; г) выделяют конечные продукты, молекулы которых ме- нее организованы, чем исходные топливные молекулы, что повышает энтропию системы. Одним из результатов этих превращений является д) рост упорядоченности (уменьшение энтропии) в системе, что связано с синте- зом сложных макромолекул. В гл. 13 мы вернемся к раз- говору о количественном выражении энтропии.
[42] 1. Основы биохимии Дополнение 1-3 Энтропия: преимущество беспорядка Термин «энтропия», буквально означающий «изменение внутри», впервые был использован в 1851 г. Рудольфом Клаузиусом, автором одной из формулировок второго начала термодинамики. Для того чтобы определить эн- тропию количественно требуется привлечение матема- тической статистики и теории вероятности, однако суть этого понятия на качественном уровне можно объяснить с помощью трех простых примеров, каждый из которых иллюстрирует один из аспектов энтропии. Здесь такие основные определения энтропии, как «хаотичность» и «беспорядок», проявляются с разных сторон. Пример 1: Горячий чайник и рассеяние тепла Нам известно, что пар, образующийся при кипении воды, может совершать полезную работу. Однако предполо- жим, что мы выключаем конфорку под чайником с кипя- щей (температура 100 °C) водой (это наша «система») на кухне («окружающая среда») и даем чайнику остыть. По мере его остывания никакой видимой работы не совер- шается, но тепло от горячего чайника поступает в окру- жающую среду, повышая температуру на кухне на беско- нечно малую величину, пока не установится равновесие. В момент равновесия чайник (с водой), воздух и предме- ты на кухне имеют одинаковую температуру. Свободная энергия, сосредоточенная в чайнике с кипятком, потен- циально способна совершать работу. Эквивалентная этой энергии тепловая энергия все еще присутствует в кипят- ке (чайнике) и на кухне (т. е. во «вселенной»), однако в полностью рассеянном виде. Эту энергию больше нельзя использовать для совершения работы, поскольку на кух- не температура везде одинакова. Более того, повышение энтропии окружающей среде (на кухне) необратимо. Из собственного опыта мы знаем, что тепло никогда не вер- нется из окружающего воздуха в чайник и температура воды в чайнике не может самопроизвольно подняться до 100 °C (и даже на несколько градусов). Пример 2: Окисление глюкозы Энтропия характеризует состояние не только энергии, но и вещества. Аэробные (гетеротрофные) организ- мы используют свободную энергию полученной из внеш-ней среды глюкозы путем ее окисления кислоро- дом, также полученным из внешней среды. Конечные продукты этого окислительного метаболизма — СО2 и Н2О — возвращаются в окружающую среду. В ре- зультате данного процесса в окружающей среде про- исходит рост энтропии, в то время как внутри самого организма сохраняется стационарное состояние, и в его внутреннем порядке не происходит никаких из- менений. Некоторый рост энтропии связан не только с выделением тепла, но и с другим типом беспорядка, как следует из уравнения окисления глюкозы: С6Н12О6 + 6О2 6СО2 + 6Н2О Мы можем показать это на схеме: 7 молекул 12 молекул В результате реакции окисления атомы, составляв- шие 1 молекулу глюкозы и 6 молекул кислорода (всего 7 молекул), рассредоточились в менее упорядочен- ной системе, так как теперь число молекул равно 12 (6СО2 + 6Н2О). В любой химической реакции, приводящей к уве- личению числа молекул (или к превращению твердого вещества в жидкое или газообразное, молекулы кото- рого перемещаются более свободно), упорядоченность системы снижается, следовательно, повышается эн- тропия. Пример 3: Энтропия и информация Приведенный ниже короткий фрагмент монолога Бру- та при приближении армии Марка Антония («Юлий Цезарь», акт IV, сцена 3) представляет собой содержа- щий информацию осмысленный набор слов, составлен- ный из 25 букв английского алфавита: There is a tide in the affairs of men, Which, taken at the flood, leads on to fortune; Omitted, all the voyage of their life Is bound in shallows and in miseries? Кроме явного смысла слов здесь многое скрыто скры- того — имеется указание на сложное сплетение собы- тий, разыгрываемых в пьесе, а также отражены взгляды автора на сам конфликт, амбиции героев и их жажду к превосходству (первенству). Этот маленький фрагмент, *В делах людей прилив есть и отлив, С приливом достигаем мы успеха. Когда ж отлив наступит, лодка жизни По отмелям несчастий волочится. (Перевод М. Зенкевича)
1.3 Физические основы биохимии [43] пронизанный шекспировским пониманием человече- ской природы, очень насыщен информацией. Однако если использованные в этом фрагменте 125 букв расставить в случайном порядке, как пока- зано в рамке, они вообще не будут иметь никакого смысла. В данном случае 125 букв не несут никакой информации, но характеризуются очень высокой энтропией. Подоб- ные рассуждения помогают нам понять, что информация является формой энергии, ее называют «отрицательной энтропией». Раздел математики, называемый теорией информации лежит в основе логики компьютерного программирования и тесно связан с термодинамикой. Живые организмы являются высокоупорядоченными структурами, чрезвычайно насыщенными информацией, и потому характеризуются низкой энтропией. Поток электронов обеспечивает организм энергией Практически все живые организмы прямо или косвенно добывают энергию из солнечной ра- диации, являющейся результатом термоядер- ных реакций на Солнце. В процессе фотосин- теза происходящее под действием солнечного света расщепление воды приводит к высвобож- дению электронов для восстановления СО2 и к выделению в атмосферу молекулярного кисло- рода: свет 6СО2 + 6Н2О С6Н12О6 + 6О2 (восстановление СО2, энергия поглощается) Нефотосинтезирующие клетки и организмы получают необходимую им энергию путем окисления энергетически богатых продуктов фотосинтеза и передачи электронов от этих мо- лекул на атмосферный кислород с образовани- ем воды, СО2 и других конечных продуктов, что приводит к их рециркуляции в окружающей среде: С6Н12О6 + О2 6СО2 + 6Н2О + энергия (окисление глюкозы, энергия выделяется) Автотрофы и гетеротрофы участвуют в глобаль- ных циклах углерода и кислорода, управляемых солнечным светом, в результате эти две большие группы организмов зависят друг от друга. Прак- тически все преобразования энергии в клетке можно проследить по потоку электронов от од- ной молекулы к другой от более высокого к более низкому электромеханическому потенциалу. По формальным признакам этот процесс аналогичен потоку электронов в электрической цепи, рабо- тающей от батарейки. Все реакции с переносом электронов являются окислительно-восстанови- тельными: один реагент окисляется (отдает элек- троны), а другой восстанавливается (принимает электроны). Создание и поддержание порядка требуют совершения работы и затрат энергии Как уже было сказано, ДНК, РНК и белки пред- ставляют собой информационные макромоле- кулы; последовательность мономерных звеньев в них несет определенную информацию — как последовательность слов в предложении. Клет- ка затрачивает энергию не только на создание ковалентных связей между звеньями этих поли- меров, но и на сборку их в строго определенном порядке. Чрезвычайно важно, чтобы аминокис- лоты из смеси выстроились в специфической последовательности в определенную белковую молекулу. Это приведет к увеличению упорядо- ченности в популяции молекул. Однако в соот- ветствии со вторым началом термодинамики в природе существует тенденция к усилению бес- порядка: общая энтропия Вселенной постоянно растет. Таким образом, для осуществления синтеза макромолекул из мономерных единиц система (в данном случае клетка) должна полу- чить энергию.
[44] 1. Основы биохимии КЛЮЧЕВЫЕ ДОГОВОРЕННОСТИ. Для количественного выражения беспорядка или хаотичности среди компонентов химической системы используют специальный параметр — энтропию 5 (см. до- полнение 1-3). Любые изменения хаотичности системы выражаются как изменение энтропии А5, которое в соответствии с принятыми догово- ренностями считают положительными при росте энтропии. Дж. Уиллард Гиббс, развивший теорию Дж. Уиллард Гиббс, 1839-1903 энергетических изменений в процессе химической реакции, показал, что свободную энергию (энер- гию Гиббса, G) любой закрытой системы можно описать тремя параметрами: энтальпией (Н), отра- жающей число и тип связей, энтропией (5) и абсо- лютной температурой (Т), выраженной в кельви- нах. Уравнение для свободной энергии выглядит следующим образом: G = H—TS. Если химическая реакция протекает при постоянной температуре, то изменение свободной энергии (AG) определяет- ся изменением энтальпии (АЯ), отражающим тип и число образующихся и разрушающихся хими- ческих связей и нековалентных взаимодействий, а также изменением энтропии (А5), отражающим изменение хаотичности в системе: АС = АЯ-ГА5 где, по определению, для реакции, происходящих с выделением тепла, АЯ < 0, а А5 > 0 (беспорядок в системе увеличивается). nh2 он он енозин (аденозиш/грифосфат, АТР) О" I О—Р—ОН + (Р)—(Р)—Аденозин (аденозиндифосфат, ADP) О Неорганический фосфат (РД ОН О" । 1 О—Р—О—Р—ОН + (Р)—Аденозин (аденозишионофосфат, АМР) О О Неорганический пирофосфат (РРД Рис. 1-25. Молекула аденозинтрифосфата (АТР) как источник энергии. Здесь буквой © обозначены фосфорильные группы. Удаление от АТР концевой фосфорильной группы (вы- делена розовым цветом) в результате расщепления фосфоангидридной связи приводит к образованию аденозиндифосфата (ADP) и неорганического фосфат-иона (НРО^-). Этот эк- зергонический процесс сопряжен со многими эндергоническими процессами в клетке (как в примере на рис. 1-26, б). Кроме того, АТР является источником энергии для многих клеточ- ных процессов: в реакции расщепления АТР теряет две концевые фосфорильные группы, что приводит к образованию неорганического пирофосфата (H2P20f_), часто обозначаемого РР?
1.3 Физические основы биохимии [45] Реакция может протекать самопроизволь- но только если AG < 0 (энергия выделяется). Однако функционирование клетки в значи- тельной степени зависит от таких молекул, как белки и нуклеиновые кислоты, для которых свободная энергия образования AGf > 0: они менее стабильны и гораздо более упорядочены, чем смесь их мономерных звеньев. Для осу- ществления термодинамически невыгодных (эндергонических) реакций клетка сопрягает их с другими реакциями, которые протекают с высвобождением свободной энергии (экзерго- нические реакции), так что суммарный процесс становится энергетически выгодным: А// < 0. Обычным источником энергии в сопряженных биологических реакциях является гидролиз фосфоангидридных связей, например, в моле- кулах аденозинтрифосфата (АТР, рис. 1-25) и гуанозинтрифосфата (GTP). Как © обозначе- ны фосфорильные группы: Аминокислоты Белок АТР АМР + © -® или АТР ADP + © AGt>0 (эндергонический процесс) AG2<0 (экзергонический процесс) При сопряжении этих двух реакций суммарный процесс экзергонический (AGt + AG2 < 0). Ис- пользуя такую стратегию сопряжения, клетки синтезируют и поддерживают богатые информа- цией молекулы, необходимые для их жизни. Энергетическое сопряжение в биологических реакциях При изучении биоэнергетики (науки о превра- щениях энергии в живых системах) основное внимание уделяется сопряженным процессам, в которых энергия, получаемая при метабо- лизме топливных молекул или от солнечного света, расходуется на осуществление реакций, идущих в клетке с затратами энергии. В свя- зи с этим полезно рассмотреть простую задачу из курса механики (рис. 1-26, а). Предмет, на- ходящийся на вершине наклонной плоскости, обладает определенной потенциальной энер- гией, поскольку он поднят на некоторую высо- ту. Предмет скользит вниз по плоскости и при этом теряет свою потенциальную энергию. Если с помощью блока соединить этот скользящий предмет с меньшим по размеру предметом, то самопроизвольное скольжение большого пред- мета будет поднимать маленький, т. е. совер- Механический процесс Эндергонический а процесс Экзергонический процесс Рис. 1-26. Энергетическое сопряжение при механических и химических процессах, а) Дви- жение предмета вниз высвобождает потенциальную энергию, с помощью которой можно осуществить механическую работу. Потенциальная энергия, высвобождаемая в результате самопроизвольного движения вниз (экзергонический процесс, показан розовым цветом), может быть использована для подъема другого предмета (эндергонический процесс, по- казан голубым цветом), б) Образование глюкозо-б-фосфата из глюкозы и неорганическо- го фосфата (Pi) по реакции 1 приводит к образованию продукта, более богатого энергией, чем исходные вещества. В этой эндергонической реакции AG > 0. Экзергонический процесс гидролиза АТР (реакция 2) характеризуется большим отрицательным значением AG2. Сум- марная реакция, составленная из реакций 1 и 2, характеризуется изменением свободной энергии AG3 = AGt + AG2. Поскольку AG3 < 0, суммарная реакция является экзергонической и может протекать самопроизвольно. Химический процесс Реакция 2: Реакция 3: Глюкоза + АТР глюкозо-6-фосфат Д G%=ДСг1+ДСг2 Координата реакции
[46] 1. Основы биохимии шится определенная работа. Количество энер- гии, доступное для совершения работы, равно изменению свободной энергии Гиббса (AG). Величина высвобождаемой энергии всегда не- сколько меньше теоретического значения, по- скольку часть энергии рассеивается в виде тепла. Чем выше поднят большой предмет, тем больше энергии (AG) высвобождается по мере его сколь- жения вниз и тем большую работу можно выпол- нить за счет этой энергии. Более крупный объект может поднять более мелкий объект лишь за счет того, что вначале более крупный объект был далек от положения равновесия', в какой-то более ран- ний момент времени он был поднят над землей с затратой определенной энергии. Как все сказанное применить к химической реакции? В закрытых системах химические ре- акции протекают самопроизвольно до дости- жения состояния равновесия. При равновесии скорость образования продуктов реакции равна скорости обратной реакции их превращения в исходные вещества. Таким образом, концентра- ции реагирующих веществ и продуктов реакции не изменяются — достигается стационарное со- стояние. Изменение энергии системы от исход- ного состояния к равновесию (при постоянной температуре и давлении) определяется измене- нием свободной энергии (AG). Величина AG за- висит от конкретной химической реакции и от удаленности исходной системы от состояния равновесия. Каждое вещество, участвующее в реакции, обладает определенной потенциальной энергией, которая зависит от типа и числа имею- щихся в нем связей. В самопроизвольно протека- ющих реакциях энергия образующихся продук- тов меньше, чем у реагирующих веществ, так что в результате реакции энергия высвобождается, и ее можно использовать на совершение работы. Это экзергонические реакции, в которых раз- ность свободной энергии реагирующих веществ и продуктов — отрицательная величина. Для осуществления эндергонических реакций необ- ходимо затратить энергию, AG — положительная величина. Аналогично тому, как это происходит в механическом процессе, только часть энергии, высвобождаемой в экзергонической химической реакции, может быть использована для совер- шения работы. В живых системах часть энергии излучается в виде тепла или теряется при увели- чении энтропии. В живых организмах, как и в примере на рис. 1-26, а, для осуществления энергетически невыгодной эндергонической реакции она может быть сопряжена с экзергонической. На рис. 1-26, б в виде графиков, называемых энергетически- ми диаграммами, продемонстрировано превра- щение глюкозы в глюкозо-6-фосфат — первый этап метаболического пути окисления глюкозы. Простейшим способом получения глюкозо-6- фосфата является следующий: Реакция 1: Глюкоза + Р? глюкозо-6-фосфат (AG > 0, эндергоническая реакция). — неорганический фосфат НРО^”. Сейчас не будем останавливаться на структуре участвую- щих в реакции соединений, мы подробно пого- ворим об этом позже. Данная реакция не может протекать самопроизвольно, поскольку AG > 0. Напротив, вторая реакция экзергоническая и мо- жет протекать в любых клетках: Реакция?: ATP^ADP + P? (AG < 0, экзергоническая реакция). В реакциях 1 и 2 участвует неорганический фос- фат Р^: он потребляется в реакции 1 и выделяется в реакции 2. При суммировании реакций 1 и 2 не- органический фосфат сокращается. Реакция 3: Глюкоза + АТР глюкозо-6-фосфат + ADP В реакции 2 выделяется больше энергии, чем рас- ходуется в реакции 1, поэтому в реакции 3 AG3 < 0, следовательно, синтез глюкозо-6-фосфата может протекать по реакции 3. Сопряжение экзергонических и эндергони- ческих реакций, имеющих общие промежуточные продукты, — важнейший принцип энергетическо- го обмена в живых организмах. Как мы увидим, в результате реакций, протекающих с распадом АТР (как реакция 2 на рис. 1-26, б), высвобождается энергия, позволяющая протекать многим эндерго- ническим реакциям в клетке. Распад АТР в клетке является экзергоническим процессом по той при- чине, что во всех живых клетках концентрация АТР превышает его равновесную концентрацию. Имен- но это отклонение от равновесия делает АТР ос- новным источником химической энергии в клетке.
1.3 Физические основы биохимии [47] На возможность самопроизвольного протекания реакции указывают Кец и Д6° Способность реакции протекать до конца можно выразить с помощью константы равновесия. Для реакции, где а моль вещества А взаимодействует с b моль вещества В, с образованием с моль веще- ства С и d моль вещества D аА + ЬВ сС + dD константа равновесия Keq или просто К опреде- ляется равновесными концентрациями исходных веществ и продуктов реакции: к= [Ceq]c[Deq]rf/[Aeq]e[Beq]fe, где [ Aeq] — концентрация A, [Beq] — концентрация В и т. д. в состоянии равновесия. Высокое значе- ние К означает, что реакция протекает до тех пор, пока реагирующие вещества практически полно- стью не превратятся в продукты реакции. Гиббс показал, что AG (изменение свободной энергии) любой химической реакции является функцией изменения стандартной свободной энергии (AG°), характеристического параметра реакции, и концентраций исходных веществ и продуктов реакции: [СисхНВисх]^ (] п AG = AG° + 7?Tln-------------- (1-1) [Аисх]в[ВисхР где [Аисх] — исходная концентрация А и т. д., R — универсальная газовая постоянная, Т— абсо- лютная температура. AG — это мера отклонения системы от по- ложения равновесия. При достижении равно- весия осуществление работы невозможно: AG = 0. В данном случае [Аисх] = [Aeq] и т. д. для всех реагирующих веществ и продуктов реакции, так что [СисхИОисхГ [CeqHDeqH [АИСХ]Й[ВИСХ]" ' Подставляя в уравнение 1-1 AG = 0 и К = = [Сисх]с[Оисх]^[Аисх]й[Висх]^ получаем AG° = - RTlnKeG из которого видно, что AG° — это еще один способ (кроме Keq) выражения движущей силы реакции. Поскольку Keq можно измерить экспериментально, мы можем вычислить AG° — характеристический термодинамический параметр реакции. Единицей измерения AG и AG° является Дж/моль или кал/моль. При Keq » 1 AG° - большое отрицательное число, при Keq « 1 AG° — большое положительное число. Из таблиц экс- периментальных значений Keq или АС°можно легко определить, какие реакции идут до конца, а какие нет. Следует сделать одно замечание относи- тельно интерпретации AG°: термодинамические константы подобного рода указывают, где (при каких концентрациях веществ) устанавливается равновесие реакции, но они ничего не говорят о том, как быстро достигается равновесие. Скоро- сти реакций подчиняются законам кинетики] на этом мы остановимся в гл. 6. Ферменты способствуют ускорению химических реакций Все биологические макромолекулы термодинами- чески гораздо менее стабильны, чем их мономер- ные звенья, но с точки зрения кинетики они весьма устойчивы', без катализатора их распад протекает настолько медленно (длительность процесса из- меряется годами), что во временной шкале, в кото- рой существуют живые организмы, их можно счи- тать устойчивыми. Практически все химические реакции в клетке протекают со значительными скоростями только благодаря наличию фермен- тов — биологических катализаторов, которые, как и любые другие катализаторы, многократно повыша- ют скорость специфических химических реакций и при этом в данных реакциях не расходуются. Путь от реагирующего вещества (или ве- ществ) к продукту (продуктам) практически неизбежно проходит через энергетический ба- рьер, называемый активационным барьером (рис. 1-27). Для протекания реакции необходимо преодолеть этот барьер (сообщить системе энер- гию, равную энергии активации). При разрыве и создании связей обычно возникает переходное со- стояние с более высокой свободной энергией, чем у реагирующих веществ и продуктов реакции. На энергетической диаграмме переходное состояние находится в наивысшей точке, а разница энергий исходных веществ в основном и в переходном со- стояниях называется энергией активации AGA Фермент катализирует реакцию путем создания
[48] 1. Основы биохимии Активационный барьер (переходное состояние*) AG Координата реакции А—>В Рис. 1-27. Изменения энергии при химической реакции. Активационный барьер (характеризующий переходное со- стояние, см. гл. б) в реакции превращения исходного ве- щества А в продукт В должен быть преодолен, даже при условии, что продукты реакции более стабильны, чем ис- ходные вещества (большое отрицательное значение AG). Энергию, необходимую для преодоления активационного барьера, называют энергией активации (AG*). Ферменты катализируют реакцию, снижая активационный барьер. Они связываются с молекулами, находящимися в переход- ном состоянии, и эта энергия связывания снижает энер- гию активации со значения AG*HeKaT (синяя кривая) до AG^aT (красная кривая). (Заметьте, что энергия активации не связана с изменением свободной энергии AG.) подходящих условий для достижения переходно- го состояния, он комплементарен структуре пере- ходного состояния по стереохимии, полярности и заряду Связывание фермента с веществом в переходном состоянии является экзергониче- ским процессом; энергия, которая выделяется в результате этого связывания, снижает энергию активации данной реакции и значительно повы- шает скорость процесса. Еще одним достоинством ферментативного катализа является возможность связывания двух или большего числа реагирующих веществ на по- верхности фермента на близком расстоянии друг от друга и в стереоспецифической ориентации, благо- приятной для протекания реакции. Это на несколь- ко порядков повышает вероятность продуктивных столкновений между реагирующими веществами. В результате действия перечисленных и некото- рых других факторов, обсуждаемых в гл. 6, скоро- сти ферментативных реакций примерно в 1012 раз превышают скорости некатализируемых реакций. (Это в миллион миллионов раз быстрее!) Биологические катализаторы, за редкими исключениями, представляют собой белки (ино- гда каталитические функции может выполнять молекула РНК, см. гл. 26 и 27). Опять же за не- многими исключениями, каждый фермент ка- тализирует специфическую реакцию, и каждая реакция в клетке катализируется особым фер- ментом. Понятно, что каждой клетке необходи- мы тысячи различных ферментов. Многообразие ферментов, их специфичность (способность раз- личать реагирующие вещества) и возможность регуляции позволяют клетке селективно сни- жать активационные барьеры. Эта селективность чрезвычайно важна для эффективной регуляции клеточных процессов. Позволяя тем или иным реакциям протекать со значительными скоростя- ми в определенные периоды времени, ферменты регулируют перенос веществ и энергии в клеточ- ных процессах. Тысячи ферментативных химических реак- ций в клетке организованы в многочисленные последовательности, называемые метаболиче- скими путями, в которых продукт одной реакции является исходным веществом для другой. Неко- торые метаболические пути служат для разложе- ния органических веществ до простых конечных продуктов, а высвобождаемая химическая энергия направляется на необходимые клетке нужды. Вме- сте все реакции разложения, протекающие с вы- свобождением энергии, называют катаболизмом. Энергия, выделяющаяся в реакциях катаболизма, расходуется для синтеза АТР. Благодаря этому внутриклеточная концентрация АТР значительно превышает его равновесную концентрацию, так что для реакции распада АТР AG « 0. В реакциях метаболизма образуются переносчики электронов в восстановленной форме — NADH и NADPH, причем обе молекулы могут отдавать электроны в процессах, идущих с образованием АТР, или спо- собствовать протеканию восстановительных ста- дий в реакциях биосинтеза. Другие метаболические пути начинаются от небольших молекул-предшественников и пре- вращают их во все более крупные и сложные мо- лекулы, в том числе белки и нуклеиновые кисло- ты. Такие реакции синтеза, которые неизбежно протекают с затратой энергии, вместе называют анаболизмом. Общая сеть ферментативных ре- акций составляет метаболизм клетки. АТР, а также эквивалентные ему по энергетическому содержанию нуклеозидтрифосфаты цитидин- трифосфат (СТР), уридинтрифосфат (UTP) и гуанозинтрифосфат (GTP) являются связующим
1.3 Физические основы биохимии [49] звеном между катаболическими и анаболически- ми элементами этой сети (см. схему на рис. 1-28). Метаболические пути, затрагивающие основные вещества в клетке — белки, жиры, углеводы и ну- клеиновые кислоты, практически идентичны во всех живых организмах. Запасные питательные вещества Потребленная пища Фотоны солнечного света Другая клеточная активность Сложные биомолекулы Механическая работа Осмотическая работа Реакции катаболизма (экзерго- нические) Реакции анаболизма (эндерго- нические) NH3 ^°Дукты, предо56*''* Рис. 1-28. Роль АТР в метаболизме. АТР является интерме- диатом многих процессов, идущих с потреблением и с вы- делением энергии. Его значение для клетки сравнимо со значением денег для экономики: он «зарабатывается/про- изводится» в экзергонических реакциях и «тратится/потреб- ляется» в эндергонических реакциях. Никотинамидаденин- динуклеотид(фосфат) NAD(P)H — переносчик электронов, который принимает электроны, высвобождающиеся в окис- лительных реакциях, а затем отдает их в различных восстано- вительных реакциях биосинтеза. В клетке этот важный для анаболических процессов кофактор присутствует в сравни- тельно низкой концентрации, поэтому он должен постоянно генерироваться в процессах катаболизма. Сбалансированная и экономичная работа клетки достигается путем регуляции метаболизма Живые клетки не только постоянно синтезируют тысячи разных углеводов, белков, жиров, нукле- иновых кислот и их мономеров, но производят их ровно в том количестве, которое необходимо клет- ке в конкретных условиях. Например, в условиях быстрого роста необходимо большое количество предшественников белков и нуклеиновых кислот, а при отсутствии роста их нужно гораздо меньше. Ключевые ферменты всех метаболических путей регулируются таким образом, чтобы каждый тип молекул-предшественников синтезировался в не- обходимом в данный момент количестве. Рассмотрим метаболический путь синтеза аминокислоты изолейцина в клетках Е. coll. Этот метаболический путь имеет пять стадий, которые катализируют пять различных ферментов (интер- медиаты процесса обозначены буквами от А до F): Х-У | фермент 1 1 А--------> В----> С --> D ---> Е---> F Треонин Изо лейцин Если клетка начинает производить изолейцина больше, чем нужно для синтеза белка, то неис- пользованные молекулы изолейцина накаплива- ются и ингибируют каталитическую активность первого фермента данного метаболического пути, что немедленно приводит к снижению уровня синтеза изолейцина. Такая регуляция по принци- пу обратной связи поддерживает баланс между образованием и расходом метаболитов. (По всей книге символом ® обозначено ингибирование ферментативной реакции.) Концепция дискретных метаболических пу- тей важна для нашего понимания метаболизма, но она очень сильно упрощает реальную ситуа- цию. В клетке присутствуют тысячи метаболи- тов, многие из которых задействованы далеко не в одном метаболическом пути. Метаболизм пра- вильнее представлять как сеть взаимосвязанных и взаимозависимых путей. Изменение концен- трации лишь одного метаболита может сказаться на других метаболических путях и привести к пе- реходу на другие пути преобразования веществ. Кажется невозможным понять и количественно
[50] 1. Основы биохимии описать столь сложный комплекс взаимосвязей между метаболитами и метаболическими путями, однако существуют новые подходы к решению этой проблемы (гл. 15), которые уже вносят важ- ный вклад в понимание системы общей регуля- ции метаболизма. Кроме того, клетки регулируют синтез своих собственных катализаторов — фер- ментов — в ответ на возрастание или снижение потребности в том или ином продукте метаболиз- ма; этот вопрос рассматривается в гл. 28. Экспрес- сия генов (перевод информации, содержащейся в ДНК, в клеточные белки) и синтез ферментов являются дополнительными уровнями контроля клеточного метаболизма, которые также необхо- димо учитывать при описании полной системы регуляции метаболизма в клетке. Краткое содержание раздела 1.3 ФИЗИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ БИОХИМИИ Живые клетки — это открытые системы, ко- торые обмениваются с окружающей средой и веществом, и энергией и используют энер- гию для поддержания внутри себя динами- ческого стационарного состояния, далекого от равновесия с окружающей средой. Клетки добывают энергию из солнечного света или топливных молекул и превращают ее из пото- ка электронов в химические связи в молекуле АТР. Способность химической реакции приходить к равновесию можно выразить с помощью изменения свободной энергии Гиббса (AG), которая имеет две составляющие: изменение энтальпии (АЯ) и изменение энтропии (А5). Эти переменные связаны между собой урав- нением: AG = ЛЯ — 7А5. Если AG реакции < 0, такая реакция называ- ется экзергонической и протекает до образо- вания конечных продуктов; если AG > 0, реак- ция называется эндергонической и протекает в обратном направлении. AG суммарного про- цесса есть сумма величин AG всех реакций. Превращение АТР в Р, и ADP или в РР} и АМР — экзергонический процесс (AG « 0), многие эндергонические реакции могут про- текать благодаря сопряжению с этим высоко- экзергоническим процессом. Стандартное изменение свободной энергии реакции (AG°) — термодинамический пара- метр, связанный с константой равновесия: AG° = -7?TlnKeQ. Большинство экзергонических реакций в клетке протекают со значительными скоро- стями только благодаря катализу фермента- ми. Ферменты стабилизируют переходное состояние, снижают энергию активации AG# и тем самым повышают скорость реакции на по- рядки величин. Каталитическая активность ферментов в клетке регулируется. Метаболизм представляет собой совокуп- ность многочисленных взаимосвязанных ре- акций, в которых происходит последователь- ное превращение клеточных метаболитов. Каждая последовательность реакций регули- руется таким образом, чтобы обеспечивать клетку всем необходимым в данный момент времени с наименьшими затратами энергии. 1.4. Генетические основы биохимии Возможно, самым замечательным свойством живых клеток и организмов является их спо- собность воспроизводить себе подобных в бес- численных поколениях с почти идеальной точностью. Эта непрерывность передачи наслед- ственных черт на протяжении миллионов лет предполагает постоянство структуры молекул, несущих генетическую информацию. Лишь не- многие следы цивилизации, даже выгравирован- ные на меди или вырезанные в камне (рис. 1-29), пережили более тысячи лет. Однако существу- ют доказательства того, что генетические ин- струкции, заложенные в живых организмах, остаются практически неизменными на протя- жении несравнимо более длительного периода. Многие бактерии имеют ту же форму, размер и внутреннюю структуру и содержат те же виды простых молекул и ферментов, что и бактерии, жившие около четырех миллиардов лет назад. Эта общность структуры и состава — результат общности структуры генетического материала.
1.4 Генетические основы биохимии [51] Рис. 1-29. Два древних манускрипта, а) Призма Сеннахе- риба, датированная VII в. до н. э. На призме на ассирий- ском языке изложены некоторые исторические события, происходившие во времена правления царя Сеннахериба. Призма содержит около 20 000 знаков, имеет вес около 50 кг и сохранилась почти в неизменном виде 2700 лет. б) Единственная молекула ДНК бактерии Е. coli, вытек- шая из ее поврежденной клетки. Длина этой молекулы ДНК в сотни раз превосходит саму клетку и содержит всю необходимую информацию, определяющую особенности клеточной структуры и функций. Бактериальная ДНК со- держит около 4,6 млн знаков (нуклеотидов), весит менее Ю-10 г и почти не подверглась изменениям за несколько миллионов лет. (Желтые пятна и черные точки на данной окрашенной электронной микрофотографии являются артефактами приготовления образца.) К важнейшим открытиям биологии XX в. относится установление химической природы и трехмерной структуры генетического вещества — дезоксирибонуклеиновой кислоты, ДНК. По- следовательность мономерных звеньев (нукле- отидов или, точнее, дезоксирибонуклеотидов) в этом линейном полимере кодирует инструкции, необходимые для синтеза всех других компонен- тов клетки, и служит матрицей для создания та- ких же молекул ДНК, передаваемых потомству при делении клетки. Непрерывность существо- вания биологического вида требует сохранения его генетической информации в устойчивой фор- ме, точной экспрессии и воспроизведения с ми- нимальным количеством ошибок. Эффективное хранение, экспрессия и воспроизведение генети- ческой информации определяют индивидуаль- ность вида, его отличия от других и обеспечивают существование вида в последующих поколениях. Генетическая информация (наследственность) заключена в молекулах ДНК ДНК представляет собой длинную тонкую мо- лекулу органического полимера. Это одна из редких молекул, которая в одном измерении (в ширину) имеет атомные размеры, а в другом из- меряется по привычной человеку шкале (длина молекулы ДНК может достигать нескольких сантиметров). Человеческий сперматозоид или яйцеклетка, несущие наследственную информа- цию, накопленную за миллиарды лет эволюции, передают ее в виде молекул ДНК, в которых ге- нетическая информация закодирована в линей- ной последовательности ковалентно связанных нуклеотидных звеньев. Обычно когда мы описываем свойства химиче- ских веществ, мы имеем в виду усредненные харак- теристики огромного числа идентичных молекул. Трудно предсказать поведение одной-единствен- ной молекулы из набора молекул, составляюще- го, скажем, 1 пмоль вещества (~6 • 1011 молекул), зато усредненные характеристики вполне пред- сказуемы, поскольку при усреднении оперируют с большим числом молекул. Исключением явля- ется клеточная ДНК. Весь генетический материал Е. coli заключен в одной-единственной молекуле ДНК, содержащей 4,64 млн нуклеотидов. Клетка Е. coli должна дать идентичное потомство путем клеточного деления, и эта единственная молеку- ла ДНК обязана воспроизвести себя с точностью до мельчайших деталей — здесь нет возможности для усреднений! Все вышесказанное справедливо для всех типов клеток. Человеческий сперматозо- ид приносит в оплодотворяемую им яйцеклетку всего лишь по одной молекуле ДНК в каждой из 23 различных хромосом, которые комбинируются лишь с одной молекулой ДНК в каждой соответ- ствующей хромосоме яйцеклетки. Результат этого соединения абсолютно предсказуем — образуется зародыш со всеми его ~25 ООО генов, состоящих из 3 млрд нуклеотидов. Поразительный химический феномен! Пример 1-1 ТОЧНОСТЬ РЕПЛИКАЦИИ ДНК Какое количество раз на сегодняшний день ре- плицировалась ДНК бактерии Е. coli, если самая первая клетка этого вида появилась 3,5 млрд лет
[52] 1. Основы биохимии назад? Для простоты примите, что на протяже- нии этого времени деление клетки Е. coll проис- ходило один раз каждые 12 часов (это слишком большое время для современных бактерий, но, возможно, слишком малое для их древних пред- шественников). Решение. (1 деление/12 ч) (24 ч/сут.) (365 сут./год) (3,5 • 109 лет) = 2,6 • 1012 поколений. На одной странице данной книги содержит- ся почти 5000 знаков, следовательно, во всей книге их около 5 млн. Хромосома Е. coli также содержит около 5 млн знаков (пар оснований). Допустим, что вы переписываете эту книгу от руки, а затем вашу копию переписывает ваш одногруппник, затем его копию переписывает третий одногруппник и т. д. Насколько сильно каждая дальнейшая копия будет отличаться от оригинала? А теперь представьте себе учебник, который получился бы при переписывании книги 1012 раз! Структура ДНК позволяет осуществлять репликацию и репарацию с почти абсолютной точностью Способность живых клеток сохранять свой гене- тический материал и удваивать его для передачи следующему поколению является результатом комплементарности двух цепей, составляющих молекулу ДНК (рис. 1-30). ДНК представляет собой линейный полимер, построенный из че- тырех различных мономерных звеньев — дезок- сирибонуклеотидов, организованных в строго определенной линейной последовательности. Именно в этой линейной последовательности закодирована генетическая информация. Две полимерные цепи закручены вокруг друг друга, образуя двойную спираль ДНК, в которой каж- дый дезоксирибонуклеотид одной нити образует специфическую пару с комплементарным дезок- сирибонуклеотидом из другой нити. Перед тем как клетка начинает делиться, две нити ДНК рас- ходятся, и каждая служит матрицей для синтеза новой комплементарной нити, в результате чего образуются две идентичные двуспиральные мо- лекулы — по одной для каждой из двух дочерних Старая Новая Новая Старая цепь 1 цепь 2 цепь 1 цепь 2 Рис. 1-30. Комплементарность двух цепей ДНК. ДНК — линейный полимер из соединенных ковалентной связью дезоксирибонуклеотидов четырех типов: дезоксиадени- лата (А), дезоксигуанилата (G), дезоксицитидилата (С) и дезокситимидилата (Т). Каждый нуклеотид имеет специфи- ческую трехмерную структуру и способен специфически (нековалентно) связываться с одним нуклеотидом в ком- плементарной цепи: А всегда образует пару с Т, a G — пару с С. Таким образом, в двухцепочечной молекуле ДНК пол- ная последовательность нуклеотидов одной цепи компле- ментарна последовательности другой цепи. Две цепи (или нити) удерживаются вместе водородными связями (пока- заны вертикальными светло-синими черточками), между парами нуклеотидов. Кроме того, две цепи ДНК закручены вокруг друг друга, образуя двойную спираль. При реплика- ции (удвоении) ДНК две нити (синие) спиральной молеку- лы расходятся, и синтезируются две новые (красные), каж- дая из которых комплементарна одной из исходных нитей. В результате образуются две двуспиральные молекулы ДНК, идентичные исходной молекуле.
1.4 Генетические основы биохимии [53] клеток. Если одна нить повреждена, неизмен- ность генетической информации обеспечивается наличием второй нити, служащей матрицей для репарации (восстановления) повреждения. Линейная последовательность ДНК кодирует белки с трехмерной структурой Информация в ДНК закодирована в виде линей- ной (одномерной) последовательности дезокси- рибонуклеотидных звеньев, а вот экспрессия этой информации приводит к образованию трехмер- ных клеточных структур. Этот переход от одного к трем измерениям происходит в два этапа. Ли- нейная последовательность дезоксирибонукле- отидов в ДНК кодирует (через промежуточную стадию образования РНК) белок с соответству- ющей линейной последовательностью аминокис- лот (рис. 1-31). Белок принимает определенную трехмерную форму, которая определяется его аминокислотной последовательностью и стаби- лизируется в первую очередь нековалентными взаимодействиями. Хотя окончательная форма свернутого белка диктуется его аминокислот- ной последовательностью, для процесса сборки (фолдинга) необходима помощь «молекулярных шаперонов» (см. рис. 4-29). Точная трехмерная структура белка, т. е. нативная конформация, яв- ляется необходимым условием его нормального функционирования. Белок в нативной конформации может об- разовывать нековалентные комплексы с другими макромолекулами (другими белками, нуклеи- новыми кислотами или липидами), в результате чего возникают такие надмолекулярные струк- туры, как хромосомы, рибосомы и мембраны. Молекулы, входящие в состав этих комплексов, имеют специфические высокоаффинные участки для связывания других молекул этого комплекса, так что внутри клетки они могут спонтанно соби- раться в целые рабочие комплексы. Сама белковая последовательность несет не- обходимую информацию для правильного свер- тывания и принятия нативной конформации, тем не менее успешное выполнение этой процедуры зависит от внутриклеточных условий — pH, ион- ной силы, концентрации ионов металлов и т. д. Таким образом, самой по себе последовательно- сти ДНК недостаточно для образования клеточ- ных структур. Ген гексокиназы I Транскрипция ДНК W в комплементарную РНК Матричная РНК ' I Трансляция РНК в I полипептидную цепь на рибосоме Неупак >- ванная гексокиназа Каталитически активная гексокиназа Укладка полипептидной цепи в гексокиназу в нативной конформации Рис. 1-31. От ДНК к РНК, от РНК к белку и далее к фер- менту (на примере гексокиназы). Линейная последова- тельность дезоксирибонуклеотидов в ДНК, кодирующая фермент гексокиназу, сначала транскрибируется в ком- плементарную последовательность рибонуклеотидов (РНК). Далее последовательность РНК (матричная, или ин- формационная, РНК) транслируется в линейную белковую цепь, которая принимает строго определенную простран- ственную структуру, вероятно, при участии молекулярных шаперонов. Принявшая нативную конформацию молекула гексокиназы обладает каталитической активностью: она катализирует фосфорилирование глюкозы, используя АТР в качестве донора фосфорильной группы. Краткое содержание раздела 1.4 ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ БИОХИМИИ Генетическая информация закодирована в линейной последовательности четырех типов дезоксирибонуклеотидов в составе ДНК. Двойная спираль ДНК служит матрицей для собственной репликации и репарации. Линейная последовательность аминокислот в белке, закодированная в гене данного белка, определяет уникальную трехмерную структу-
[54] 1. Основы биохимии ру белка. Она также зависит от внутриклеточ- ных условий. Некоторые макромолекулы с высоким сродст-вом к другим макромолекулам способ- ны самостоятельно образовывать надмолеку- лярные комплексы. 1.5. Эволюционные основы биохимии Биологические явления обретают смысл, если их рассматривать через призму эволюции. Феодосий Добжанский, преподаватель биологии, март 1973 Огромный прогресс в биохимии и молекулярной биологии, произошедший в последние десятиле- тия, лишь подтвердил приведенное выше замеча- тельное обобщение Добжанского. Удивительное сходство метаболических процессов и последо- вательностей генов у самых разных организмов строго доказывает, что все существующие сегодня организмы имеют общего эволюционного пред- шественника и произошли от него в результате ряда небольших изменений (мутаций), каждое из которых обеспечивало определенному организму преимущество в конкретной экологической нише. Изменения наследственной информации создают возможность для эволюции Несмотря на практически безукоризненную точность репликации, иногда в этом процессе случаются ошибки, приводящие к изменениям нуклеотидной последовательности ДНК, т. е. ге- нетическим мутациям (рис. 1-32), изменяющим генетическую программу того или иного компо- нента клетки. Неверно исправленное повреждение одной из цепей ДНК приводит к такому же непра- вильному результату. Передаваемые по наследству мутации ДНК, т. е. мутации в репродуктивных клетках, могут оказаться для нового организма или клетки опасными или даже летальными. На- пример, такая мутация может привести к синтезу аномального фермента, который не способен ка- тализировать важную метаболическую реакцию. Однако иногда возникают мутации, помогающие организмам или клеткам выживать в определен- ных условиях. Мутантный фермент, например, может иметь несколько иную специфичность, по- зволяющую ему использовать субстрат, который клетка ранее не могла метаболизировать. Если популяция мутантных клеток окажется в услови- ях, когда этот субстрат является единственным или преобладающим, она получит преимущество перед остальными немутировавшими клетками (клетками дикого типа). Мутантная клетка и ее потомство выживут и будут процветать в таких новых условиях, а клетки дикого типа будут голо- дать и постепенно исчезнут. Этот феномен Дарвин назвал «выживанием наиболее приспособленного организма в условиях отбора», по сути это процесс природной селекции. В результате ошибки при репликации хро- мосомы в нее может встраиваться вторая полная копия гена. Вторая копия является избыточной, и такие мутации не очень опасны. Это один из спо- собов, позволяющий клеткам эволюционировать: возникает новый ген с новыми функциями при сохранении исходного гена с прежними (обычны- ми) функциями. С этой точки зрения молекулы ДНК современных организмов являются истори- ческими документами, запечатлевшими долгий путь от самых первых клеток к сегодняшним ви- дам. Однако исторический «отчет» ДНК непол- ный: в ходе эволюции многие мутации должны были исчезнуть. Но тем не менее молекулы ДНК являются лучшим документом истории биоло- гии, имеющимся в нашем распоряжении. Часто- та ошибок при репликации ДНК не может быть слишком высокой, поскольку это привело бы к нежизнеспособности следующего поколения клеток, но не может быть и слишком низкой, по- скольку тогда исключается возможность генети- ческой изменчивости, позволяющей выжившим мутантам приспосабливаться к новым условиям обитания. Несколько миллиардов лет адаптивного от- бора научили клетки извлекать максимум выго- ды из химических и физических свойств молекул потребляемых веществ. Удачные генетические изменения в отдельных организмах популяции в сочетании с естественным отбором (выживани- ем и воспроизведением организмов, наилучшим образом приспособившихся к изменившимся условиям обитания) привели к возникновению огромного разнообразия современных организ- мов, каждый из которых адаптирован к существо- ванию в определенной экологической нише.
1.5 Эволюционные основы биохимии [55] Ген гексокиназы Редкая ошибка, возникшая во вре- мя репликации ДНК, приводит к копированию гена гексокиназы Исходный ген Копия гена Вторая редкая ошибка приводит к мутации в копии гена гексокиназы Мутация Исходная гексокиназа (не метаболизирует галактозу) Мутантная гексокиназа с некоторой субстратной специфичностью к галактозе Рис. 1-32. Репликация ДНК и мутации: возможный путь появления новой ферментативной активности. В данном примере рассматривается возможность случайного события, когда ген гексокиназы в гипотетическом организме при репликации ДНК копируется дважды. В резуль- тате такой организм несет в себе две полные копии гена гексокиназы, одна из которых не нужна. В ходе множества клеточных делений ДНК двух генов гексокиназы продолжает ре- плицироваться, причем в этом процессе возможны редкие случайные ошибки, приводящие к изменениям последовательности одной копии и кодируемого ею белка. Очень редкое, но воз- можное событие: измененный белок получает способность связываться с новым субстратом (галактоза в нашем гипотетическом случае). Несущая такой мутантный ген клетка теперь обладает способностью метаболизировать галактозу, что позволит ей выжить в тех условиях, когда глюкозы в среде нет, но есть галактоза. Если бы репликация гена не предшествовала его мутации, была бы утеряна исходная функция данного белка (метаболизм глюкозы). Биомолекулы возникли в процессе химической эволюции Итак, мы познакомились с первой «главой» исто- рии эволюции — возникновением первых живых клеток. Органические вещества, в том числе ос- новные биомолекулы типа аминокислот и углево- дов, из которых состоят живые организмы, обна- руживаются в земной коре, океанах и в атмосфере лишь в следовых количествах. Каким же образом у первых живых организмов возникли столь харак- терные органические соединения, используемые в качестве строительных блоков в биополимерах? В соответствии с одной из гипотез эти соеди- нения возникли в результате мощных атмосфер- ных воздействий (ультрафиолетового излучения, вспышек молнии или вулканических изверже- ний) на газы в пребиотической атмосфере Земли и на неорганические вещества в горячих источни- ках в глубинах океана. Классический опыт, иллюстрирующий аби- отическое (небиологическое) происхождение органических биомолекул, был осуществлен в 1953 г. Стенли Миллером в лаборатории Га- рольда Юри. Миллер на протяжении недели или
[56] 1. Основы биохимии более пропускал электрические разряды, ими- тировавшие молнию, через смесь газов, подоб- ную существовавшей на Земле в ранний период перед зарождением жизни (метан, аммиак, во- дяные пары и водород) между двумя электро- дами (рис. 1-33). При анализе газовой фазы из реакционного сосуда были обнаружены оксид и диоксид углерода, а также исходные вещества. Водная фаза содержала разнообразные орга- нические соединения, в том числе некоторые аминокислоты, гидроксикислоты, альдегиды и циановодород HCN. Этот эксперимент доказал возможность абиотического пути образования биомолекул в относительно мягких условиях за сравнительно короткий срок. Электроды Рис. 1-33. Абиотический синтез биомолекул. Искро- разрядный аппарат, использовавшийся Миллером и Юри, в экспериментах по демонстрации абиотического образования органических веществ в условиях прими- тивной атмосферы. Через смесь газов в сосуде пропу- скали электрические разряды, после конденсации про- дукты реакции анализировали. Среди продуктов были обнаружены различные биомолекулы, в том числе и аминокислоты. В более сложных лабораторных эксперимен- тах были получены доказательства того, что в этих условиях могут также образовываться мно- гие химические составляющие живых клеток, в том числе полипептиды и РНК-подобные моле- кулы. Полимерные цепочки РНК могут прояв- лять каталитические свойства в важных биологи- ческих реакциях (см. гл. 26 и 27). РНК, вероятно, сыграла важнейшую роль в пребиотической эво- люции как в качестве катализатора, так и источ- ника информации. РНК и схожие с ней предшественники могли быть первыми генами и катализаторами В существующих сегодня организмах нуклеи- новые кислоты кодируют генетическую инфор- мацию, определяющую структуру ферментов, а ферменты катализируют репликацию и репара- цию нуклеиновых кислот. Взаимозависимость этих двух классов соединений ставит перед на- укой трудный вопрос: что было раньше — ДНК или белок? Однако, может быть, они появились одно- временно и им обоим предшествовала РНК. От- крытие того факта, что молекулы РНК способны катализировать собственный синтез, указывает на возможную роль РНК или подобных моле- кул в качестве первых генов и первых катализа- торов. По этому сценарию (рис. 1-34) на одной из ранних стадий биологической эволюции в «первичном бульоне» возникла молекула РНК, которая смогла катализировать синтез других молекул РНК с той же последовательностью, т. е. образовалась самореплицирующаяся моле- кула РНК. Концентрация молекул РНК должна была возрастать экспоненциально, поскольку из одной молекулы получается две, из двух — че- тыре и т. д. Точность саморепликации, вероятно, была неабсолютной, поэтому стали появляться варианты РНК и некоторые из них оказались еще лучше приспособлены к саморепликации. В конкурентной борьбе за нуклеотиды победили наиболее эффективные молекулы, а менее эф- фективные исчезли. Согласно гипотезе «мира РНК», разделение функций между ДНК (хранение генетической информации) и белком (катализ) произошло позднее. Возникали новые варианты саморепли- цирующихся РНК, которые были способны так-
1.5 Эволюционные основы биохимии [57] же катализировать конденсацию аминокислот- ных звеньев в полипептидные цепи. В какой-то момент образовавшиеся таким образом пептиды стали усиливать способность РНК к саморе- пликации. Такая пара РНК/пептид-помощник могла претерпевать дальнейшие изменения, соз- давая еще более эффективные системы реплика- ции. Замечательное открытие того факта, что в аппарате для синтеза белка современной клетки (рибосоме) не белок, а РНК катализирует об- разование пептидной связи, свидетельствует в пользу гипотезы «мира РНК». Через какое-то время после возникновения этих примитивных систем белкового синтеза произошло следующее изменение: функцию Возникновение из компонентов примитивной атмосферы Земли «первичного бульона», содержащего в том числе нуклеотиды Образование коротких молекул РНК со случайной последовательностью Селективная репликация способных к самоудвоению каталитических фрагментов РНК Катализируемый РНК синтез специфических пептидов Повышение роли пептидов в репликации РНК; параллельная эволюция РНК и белков Развитие примитивных систем трансляции с участием РНК-генома и белкового синтеза, катализируемого РНК Геномная РНК начинает образовывать копии ДНК ДНК-геном транслируется на РНК-белковых комплексах (рибосомах) под действием белковых катализаторов Рис. 1-34. Возможный сценарий развития «мира РНК». сохранения «генетической» информации взя- ла на себя молекула ДНК, последовательность которой комплементарна последовательности самореплицирующейся РНК. Молекулы РНК, в свою очередь, эволюционировали, совершен- ствуя катализ синтеза белка. (Далее в гл. 8 мы остановимся на том, почему молекула ДНК более стабильна по сравнению с РНК и лучше подходит для хранения наследственной инфор- мации.) Белки проявили себя в качестве универ- сальных катализаторов и позднее взяли на себя эту функцию. Липидоподобные компоненты из «первичного бульона» образовали относительно непроницаемые слои, окружавшие саморепли- цирующиеся ассоциации молекул. Высокая кон- центрация белков и нуклеиновых кислот внутри этих липидных оболочек способствовала моле- кулярным взаимодействиям, необходимым для репликации. Биологическая эволюция началась более трех с половиной миллиардов лет назад Земля возникла около 4,6 млрд лет назад, а первые живые организмы появились более 3,5 млрд лет назад. В 1996 г. ученые обнаружили в Гренландии не окаменевшие останки, а «хими- ческие» доказательства жизни («топливные мо- лекулы»), возраст которых свыше 3,85 млрд лет. Они нашли вросшие в камень углеродсодержа- щие вещества, вероятно, биологического про- исхождения. В первый миллиард лет существо- вания Земли кое-где стали появляться первые простые организмы, способные воспроизводить свою собственную структуру на основании ма- трицы (РНК?), служившей первым генетиче- ским материалом. Поскольку атмосфера Земли в те времена была практически лишена кисло- рода, и лишь немногие микроорганизмы исполь- зовали органическое вещество, образовавшее- ся в естественных процессах, существовавшие органические соединения были относительно устойчивыми. С учетом этой устойчивости орга- нических соединений и огромной длительности происходивших процессов, можно только пред- полагать, как невероятное стало неизбежным: органические вещества включались в развиваю- щиеся клетки, эффективность механизмов само- воспроизведения возрастала. Начался процесс биологической эволюции.
[58] 1. Основы биохимии Первые клетки, вероятно, были хемогетеротрофами Самые первые клетки возникали в восстанови- тельной атмосфере (где нет кислорода) и, вероят- но, получали энергию из неорганических веществ, таких как сульфид железа (II) и карбонат желе- за (II), которые тогда на Земле имелись в больших количествах. Например, в реакции FeS + H2S^FeS2+H2 выделяется достаточное количество энергии, чтобы обеспечить синтез молекулы АТР или аналогичного вещества. Необходимые клеткам органические вещества могли появиться из ком- понентов ранней атмосферы Земли (СО, СО2, N2, NH3, СН4 и др.) в результате небиологиче- ских воздействий, таких как вспышки молнии и вулканические извержения, или в гидротер- мальных процессах. Существует также гипотеза, что органические вещества были привнесены на Землю из космоса. В 2006 г. космический зонд Stardust вернулся на Землю с частицами кос- мической пыли из хвоста кометы, и в этой пыли были обнаружены различные органические ве- щества. Первые одноклеточные организмы, воз- никшие из смеси органических веществ в «пер- вичном бульоне», практически наверняка были хемогетеротрофами (рис. 1-5). Необходимые им органические вещества исходно возникли из компонентов первичной атмосферы (СО, СО2, N2, СН4 и др.) не биологическим путем, а под действием тепла от вулканической дея- тельности и разрядов молний. Первые гетеро- трофы постепенно приобретали способность добывать энергию из окружающих веществ, использовали ее для синтеза необходимых им молекул и становились менее зависимыми от внешних источников питания. Очень важным шагом в эволюции было появление пигментов, способных усваивать энергию Солнца, с помо- щью которой клетки могли восстанавливать («фиксировать») СО2, превращая его в более сложные органические вещества. Первым до- нором электронов для этого процесса фотосин- теза, по-видимому, был H2S, превращавшийся в элементную серу или сульфат-ионы (SO4“). Позднее клетки стали использовать в качестве донора электронов воду, в результате чего в ат- мосферу стал поступать кислород. Потомками тех первых фотосинтезирующих организмов, продуцирующих кислород, являются современ- ные цианобактерии. Поскольку в ранние периоды существования Земли атмосфера почти не содержала кислорода, первые клетки были анаэробами. В таких услови- ях хемотрофы могли окислять органические ве- щества до СО2, передавая электроны не на кисло- род, а на такие акцепторы, как SO4~, в результате чего в качестве побочного продукта образовывал- ся H2S. С появлением продуцирующих кислород фотосинтезирующих бактерий атмосфера все бо- лее обогащалась кислородом — мощным окисли- телем и смертельным ядом для анаэробов. В этих сложных условиях, которые Линн Маргёлис и Дорион Саган назвали «кислородным холоко- стом», некоторые линии микроорганизмов дали начало аэробам, получавшим энергию в процессе передачи электронов от топливных молекул кис- лороду. Поскольку такие реакции сопровождают- ся высвобождением значительного количества энергии, в аэробных условиях использующие кислород организмы получили энергетическое преимущество над анаэробными собратьями. В результате в кислородсодержащей атмосфере стали преобладать аэробные организмы. Современные бактерии населяют практи- чески все экологические ниши в биосфере; су- ществуют организмы, способные использовать в качестве источника углерода и энергии прак- тически любые органические вещества. Фото- синтезирующие микробы в пресной и в соленой воде поглощают солнечную энергию и исполь- зуют ее для образования углеводов и других клеточных компонентов, которые, в свою оче- редь, служат источником питания для других живых организмов. Процесс эволюции продол- жается. На примере быстро воспроизводящих- ся бактериальных клеток мы можем увидеть этот процесс в лабораторных условиях. Один из подходов к получению примитивной клет- ки («протоклетки») в лабораторных условиях состоит в том, чтобы определить минимальное количество необходимых для жизни генов, ана- лизируя геномы самых просто устроенных бак- терий. Минимальным геномом среди свобод- ноживущих бактерий обладает Mycobacterium genitalium: он состоит из 580 000 пар нуклеоти- дов и содержит 483 гена.
1.5 Эволюционные основы биохимии [59] Эукариотические клетки возникли в несколько стадий из более простых предшественников Судя по ископаемым остаткам, около 1,5 млрд лет назад начали возникать более крупные и слож- ные организмы, возможно, это были первые эука- риотические клетки (рис. 1-35). Детали эволю- ционного пути от доядерных к ядерным клеткам невозможно восстановить только на основании ископаемых остатков, однако морфологическое и биохимическое изучение современных орга- низмов позволило приблизительно представить последовательность событий, согласующихся с результатами анализа ископаемых остатков. Обязательно должны были произойти три принципиальных изменения. Во-первых, по- 500 Диверсификация многоклеточных эукариот (растения, грибы, животные) ООО Появление красных и зеленых водорослей Появление эндосимбионтов (митохондрии, пластиды) 1 500 — Появление простейших - первых эукариот к 2 000 - S ч и о и g 2 500 — Появление аэробных бактерий, *5 возникновение кислородной атмосферы S 3 000 - Появление фотосинтезирующих, производящих кислород цианобактерий о глл _ Появление фотосинтезирующих серных ° бактерий и метаногенов 4 000 — Формирование континентов и океанов 4 500 — Образование Земли Рис. 1-35. Этапы эволюции жизни на Земле. скольку клетка обзаводилась все большим ко- личеством ДНК, нужны были более сложные механизмы для осуществления компактной упаковки ДНК в комплексах со специфически- ми белками, а также для точного разделения между дочерними клетками в процессе деления. Для этого понадобились специализированные белки, стабилизирующие свернутую ДНК и разрушающие комплексы ДНК с белком (хро- мосомы) при делении клетки. Во-вторых, при увеличении размера клетки стала развиваться система внутренних мембран, в том числе по- явилась двойная мембрана, окружающая ДНК. Эта мембрана отделяла синтез РНК на основе ДНК-матрицы, протекающий в ядре, от синте- за белка на рибосомах в цитоплазме. Наконец, в-третьих, ранние эукариотические клетки, ко- торые не могли осуществлять фотосинтез или аэробный метаболизм, включали в себя аэроб- ные или фотосинтезирующие бактерии — по- явились эндосимбиотические ассоциации, со временем ставшие постоянными (рис. 1-36). Некоторые аэробные бактерии превратились в митохондрии современных эукариот, а некото- рые фотосинтезирующие цианобактерии стали пластидами, как, например, хлоропласты в зе- леных водорослях — вероятных предшествен- никах клеток современных растений. На более поздних этапах эволюции одно- клеточные организмы стали образовывать кла- стеры, что позволило им увеличить подвиж- ность, повысить эффективность метаболизма или репродукции по сравнению со свободно- живущими одиночными клетками. Дальнейшая эволюция таких кластеров привела к возникно- вению устойчивых ассоциаций отдельных кле- ток и постепенному развитию специализации внутри колоний — произошла дифференциров- ка клеток. Использование преимуществ клеточной специализации привело к возникновению еще более крупных и высокодифференцированных организмов, в которых одни клетки осущест- вляли сенсорные функции, другие — пищевари- тельные, фотосинтетические, репродуктивные и т. д. Современные многоклеточные организ- мы содержат сотни типов клеток, специализи- рующихся на определенной функции, обслужи- вающих весь организм. Основные механизмы, возникшие еще на заре эволюции, далее раз-
[60] 1. Основы биохимии Симбиотическая система теперь способна осуществлять аэробный катаболизм. Некоторые бактериальные гены проникают в ядро, а бывшие бактерии превращаются в митохондрии. Анаэробная эукариотическая клетка-предшест- венник Митохондрия Бактериальный геном Аэробная бактерия Аэробный метаболизм эффективен, поскольку топливные молекулы окисляются до СО2. Ядро Бактерия «заглатывается» эукариотом и размножается внутри него. Анаэробный метаболизм неэффективен, поскольку топливо не окисляется полностью. Геном Хлоропласт Фотосинтезирующая эукариотическая клетка Нефотосинтезирующая эукариотическая клетка Фотосинтезирующая цианобактерия Аэробная эукариотическая клетка Световая энергия используется для синтеза биомолекул из СО2. Втянутая внутрь клетки цианобактерия становится эндосимбионтом и размножается; новые клетки могут синтезировать АТР, используя энергию солнечного света. Со временем некоторые гены цианобактерий перемещаются в ядро, а бывшие цианобактерии становятся пластидами (хлоропластами). Рис. 1-36. Роль эндосимбиоза в эволюции эукариот. Самые первые эукариоты были ана- эробами. Они включили внутрь себя пурпурные бактерии (показаны желтым цветом), ко- торые придали им способность осуществлять аэробный катаболизм и со временем превра- тились в митохондрии. Фотосинтезирующие цианобактерии (показаны зеленым цветом) впоследствии стали эндосимбионтами некоторых аэробных эукариот, превратив эти клетки в фотосинтезирующих предшественников современных зеленых водорослей и растений. вивались и оттачивались. В основе пульсирую- щих движений ресничек парамеции и жгутиков хламидомонады лежат те же самые ключевые структуры и механизмы, что используются, на- пример, высокоспециализированными клетка- ми сперматозоидов позвоночных. Молекулярное строение раскрывает эволюционные связи Сегодня в распоряжении биохимиков огромная и все время пополняющаяся кладовая знаний о молекулярном строении клеток. Накопленные знания можно использовать для анализа эволю- ционных связей и усовершенствования эволюци- онной теории. Последовательность генома (всего гене- тического «багажа» организма) полностью определена уже для сотен бактерий, более 40 архей, постоянно увеличивающегося числа эу- кариотических микроорганизмов (например, Saccharomyces cerevisiae и Plasmodium sp.), расте- ний, включая Arabidopsis thaliana и рис, много- клеточных животных, включая Caenorhabditis elegans (круглый червь), Drosophila melanogaster (фруктовая мушка), мышь, крысу, собаку, шим- панзе и Homo sapiens (табл. 1-2). Этот список постоянно пополняется. Зная последователь- ности геномов, можно проводить детальное сравнение различных видов и глубже понять эволюционный процесс. До настоящего време- ни молекулярная систематика, основанная на
1.5 Эволюционные основы биохимии [61] Некоторые организмы, для которых определены полные нуклеотидные последовательности Организм Размер генома (млн пар нуклеотидов) Число генов Биологические особенности Mycoplasma genitalium 5,8 105 4,8 102 Вызывает пневмонию Treponema pallidum 1,1 • 106 1,0 • 103 Вызывает сифилис Borrelia burgdorferi 9,1 105 8,5 102 Вызывает болезнь Лайма Helicobacter pylori 1,7 • 106 1,6 • 103 Вызывает язву желудка Methanococcusjannaschii 1,7 • 106 1,7 • 103 Растет при 85 °C! Haemophilus influenzae 1,8 106 1,6 103 Вызывает грипп Archaeoglobus fulgidus 2,2 • 106 2,4 • 103 Относится к царству архей, метаноген Synechocystis sp. 3,6 106 3,2 103 Цианобактерия Bacillus subtilis 4,2 • 106 4,1 • 103 Распространенная почвенная бактерия Escherichia coli 4,6 • 106 4,4 • 103 Некоторые штаммы вызывают токсический шок Saccharomyces cerevisiae 1,2 107 5,9 103 Одноклеточный эукариотический организм Plasmodium falciparum 2,3 • 107 5,3 • 103 Вызывает малярию у человека Caenorhabditis elegans 1,0 108 2,3 104 Многоклеточный круглый червь Anopheles gambiae 2,3 108 1,3 104 Переносчик малярии Arabidopsis thaliana 1,2 • 108 3,2 • 104 Сорное растение Oryza satica 3,9 108 3,8 104 Посевной рис Drosophila melanogaster 1,2 • 108 2,0 • 104 Фруктовая мушка Mus musculus domesticus 2,6 • 109 2,7 • 104 Лабораторная мышь Pan troglodytes 3,1 109 4,9 104 Шимпанзе Homo sapiens 3,1 • 109 2,9 • 104 Человек Источник: страница RefSeq для каждого организма на www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes последовательностях генов, согласовывалась с классической систематикой, основанной на изу- чении макроскопических структур, но во многом была более точной. Хотя на уровне анатомии по- стоянно происходило расхождение организмов, основополагающее единство живого становится очевидным при проведении исследований на мо- лекулярном уровне. В самых простых и самых сложных организмах молекулярные структуры и механизмы обладают замечательным сход- ством. Эти сходства легче всего проследить на уровне последовательностей либо ДНК, кодиру- ющих белки, либо самих белков. Если последовательности двух генов (ну- клеотидные последовательности ДНК или по- следовательности кодируемых ими белков) имеют очевидное сходство, их называют гомо- логичными, а кодируемые ими белки — гомоло- гами. Если два гомологичных гена обнаружены у одного и того же вида, их называют парало- гичными, а кодируемые ими белковые продук- ты — паралогами. Считается, что паралогич- ные гены образовались путем удвоения гена и постепенных изменений последовательностей обеих копий. Обычно паралогичные белки име- ют не только схожие аминокислотные после- довательности, но и аналогичную трехмерную структуру, хотя в ходе эволюции стали выпол- нять различные функции. Два гомологичных гена (или белка) из орга- низмов разных видов называют ортологичными, а их белковые продукты — ортологами. Ортоло- ги в обоих организмах обычно выполняют одну и ту же функцию. Поэтому, когда выясняется, что вновь секвенированный ген в организме одного вида ортологичен гену из организма другого вида, можно предположить, что они кодируют белки с одинаковыми функциями. Так, без проведения биохимических исследований на основании ге- номных последовательностей можно определить функции белковых продуктов. Аннотированный геном кроме самой последовательности ДНК
[62] 1. Основы биохимии содержит описание предполагаемой функции продукта каждого гена, выведенной на основании сравнения данной геномной последовательности с последовательностями из других организмов, в которых функции белков известны. В принципе, определяя метаболические пути (наборы фер- ментов), кодируемые данным геномом, можно вывести метаболические характеристики орга- низма на основании одной только геномной по- следовательности. Различия в последовательностях гомоло- гичных генов можно рассматривать как грубый способ оценки степени расхождения двух видов в процессе эволюции, т. е. эти различия позволяют оценить, как давно общий предшественник дал начало двум эволюционным линиям. Чем больше различий, тем раньше произошло расхождение. Можно построить филогенетическое (фамиль- ное) древо, на котором эволюционная дистанция между двумя любыми видами определяется бли- зостью их расположения (например, рис. 1-4). В ходе эволюции появляются новые струк- туры, процессы и регуляторные механизмы, что отражает изменения в геномах эволюциониру- ющих организмов. В геноме такого простого эу- кариотического организма, как дрожжи, должны были появиться отсутствующие у бактерий и архей гены, отвечающие за образование ядерной мембраны. Геном насекомых должен содержать отсутствующие у дрожжей гены белков, опре- деляющие специфическую сегментированную структуру тела насекомых. Геномы всех позво- ночных должны содержать гены, несущие инфор- мацию о развитии позвоночника, а геномы мле- копитающих — уникальные гены, отвечающие за образование плаценты, существующей только у млекопитающих, и т. д. Сравнение целых геномов организмов каждого типа приводит к выявлению генов, имеющих принципиальное значение для фундаментальных эволюционных изменений в структуре и развитии организма. Функциональная геномика указывает назначение генов в специфических клеточных процессах После определения полной нуклеотидной после- довательности генома и аннотирования каждого гена (т. е. приписывания каждому гену опреде- ленной функции) молекулярный генетик может сгруппировать гены в соответствии с теми про- цессами, в которых они участвуют (синтез ДНК или белка, образование АТР и др.). Таким образом удается определить, какая часть генома отвечает за ту или иную активность клетки. Функции мно- гих генов (более 40%) в клетках Е. coli, A. thaliana и Н. sapiens до сих пор неизвестны. У всех трех ви- дов значительную часть генома составляют гены транспортных белков, отвечающих за перемеще- ние ионов и небольших молекул через плазмати- ческую мембрану (их все же больше у бактерий и растений, чем у млекопитающих: 10% из ~4 400 генов у Е. coli, ~8% из ~32 ООО генов у A. thaliana и ~4% из ~29 ООО генов у Н. sapiens). Гены, коди- рующие белки и РНК для их синтеза, составляют 3-4% генома Е. coli. В более сложно устроенных клетках A. thaliana больше генов требуется для до- ставки белков к местам их основной локализации, чем для синтеза самих этих белков (соответствен- но 6 и 2% генома). В общем, чем сложнее организм, тем большую часть его генома составляют гены, регулирующие клеточные процессы, и меньшая часть отвечает за реализацию основных процессов типа образования АТР и синтеза белка. Сравнительный анализ геномов играет все большую роль в биологии человека и медицине Геномы человека и шимпанзе совпадают на 99,9%, но разница между двумя видами огромна. Эти небольшие различия в геномах должны объяснить человеческую способность говорить, чрезвычайную развитость мышц шим- панзе и массу других вещей. Сравнение геномов позволит исследователям идентифицировать гены, которые могут быть связаны с расхожде- нием в программах развития человека и других приматов и с появлением у человека более слож- ных функций, в том числе языка общения. Кар- тина станет проясняться только по мере того, как будет проведено сравнение генома челове- ка с геномными последовательностями многих приматов. В то же время генетические различия между людьми чрезвычайно ничтожны по сравнению с различиями между человеком и шимпанзе, тем не менее все мы очень разные, в том числе это касается здоровья и предрасположенности к хроническим заболеваниям. Еще очень многое
Дополнительная литература для дальнейшего изучения [63] предстоит узнать о различиях в геномных после- довательностях людей, но со всей определенно- стью можно предсказать, что в ближайшие деся- тилетия доступность генетической информации принципиально изменит систему медицинской диагностики и лечения. Можно ожидать, что паллиативное лечение некоторых генетических заболеваний сменится реальной помощью, а бо- лезни, предрасположенность к которым связана с наличием определенных генетических марке- ров, можно будет предупреждать усиленными превентивными мерами. Сегодняшняя «история болезни», возможно, сменится медицинским «прогнозом». Краткое содержание раздела 1.5 ЭВОЛЮЦИОННЫЕ ОСНОВЫ БИОХИМИИ Наследуемые случайные мутации приводили к появлению организмов, лучше приспосо- бленных к выживанию в определенных эко- логических нишах; такое потомство выдержа- ло естественный отбор. Этот процесс мутаций и отбора лежит в основе дарвиновской теории эволюции, указавшей на происхождение всех живущих ныне организмов от первой клетки и объяснившей фундаментальное сходство всех живых организмов. Жизнь возникла около 3,5 млрд лет назад, наиболее вероятно, с появлением заключен- ной в мембрану самореплицирующейся мо- лекулы РНК. Составляющие первой клетки могли возникнуть вблизи горячих источни- ков в глубинах океана, в результате действия молнии или высокой температуры на такие простые молекулы, как СО2 и NH3. Каталитическая и генетическая функции РНК первых геномов со временем были пере- даны белкам и ДНК. В результате эндосимбиоза с бактериями эукариотические клетки приобрели способ- ность к фотосинтезу и окислительному фос- форилированию. Возникли многоклеточные организмы с дифференцировкой клеток, в результате которой различные типы клеток специализируются на выполнении одной или нескольких функций, важных для жизне- деятельности всего организма. Знание полных нуклеотидных последователь- ностей организмов, находящихся на разных ветвях филогенетического древа, способст- вует пониманию эволюционного процесса и открывает широчайшие возможности для раз- вития медицины. Ключевые термины Все термины объясняются в глоссарии. Анаболизм 27 Археи 19 Бактерии 19 Геном 18 Изменение свободной энергии Гиббса (AG) 46 Изменение стандартной свободной энергии (AG0) 47 Катаболизм 27 Конфигурация 33 Конформация 38 Метаболит 18 Мутация 54 Прокариоты 18 Равновесие 46 Стереоизомеры 33 Хиральный центр 36 Цитоскелет 24 Экзергоническая реакция 45 Эндергоническая реакция 45 Энергия активации (AG*) 48 Энтальпия (Я) 44 Энтропия (5) 44 Эукариоты 18 Ядро 18 Дополнительная литература для дальнейшего изучения Общие сведения Friedman, Н.С. (2004) From ‘Butyribacterium” to “F. coli”\ an essay on unity in biochemistry. Perspect. Biol. Med. 47,47-66. Fruton, J.S. (1999) Proteins, Enzymes, Genes: The Interplay of Chemistry and Biochemistry, Yale University Press, New Haven. Выдающийся историк биохимии прослеживает разви- тие этой науки и обсуждает ее вклад в медицину, фарма- цевтику и сельское хозяйство. Harold, ЕМ. (2001) The way of the Cell: Molecules, Organisms, and the Order of Life, Oxford University Press, Oxford. Judson, H.E (1996) The Eighth Day of Creation: The Makers of the Revolution in Biology, expanded edn. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. Хорошее и авторитетное изложение истории развития биохимии и молекулярной биологии в XX в.
[64] 1. Основы биохимии Kornberg, А. (1987) The two cultures: chemistry and biology. Biochemistry 26,6888-6891. О важной роли химических методов анализа в ре- шении биологических задач в изложении знаменитого практика. Monod, J. (1971) Chance and Necessity, Alfred A. Knopf, Inc., New York. Впервые вышла в 1970 г. под названием Le hasard et la necessite, Editions du Seuil, Paris. О философских послед- ствиях развития биологии. Morowitz, H.J. (2002) The Emergence of Everything (How the World Became Complex), Oxford University Press, Oxford. Краткое, прекрасно написанное рассуждение о появле- нии сложных организмов из более простых. Расе, N.R. (2001) The universal nature of biochemistry. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98,805-808. Как дать минимальное определение жизни на Земле и в других местах. Принципы организации клетки Becker, W.M., Kleinsmith, L.J., & Hardin, J. (2000) The World of the Cell, 5th edn, The Benjamin Cummings Publishing Company, Redwood City, CA. Прекрасный вводный курс клеточной биологии. Lodish, Н., Berk, A., Matsudaira, Р., Kaiser, С. A., Krieger, М., Scott, M.R., Zipursky, S.L., & Darnell, J. (2003) Molecular Cell Biology, 5th edn, W.H. Freeman and Company, New York. Подобно книге Альбертса с соавторами, данная книга также может служить прекрасным подспорьем в изуче- нии этой и последующих глав настоящей книги. Purves, W.K., Sadava, D., Orians, G.H., & Heller, H.C. (2001) Life: The Science of Biology, 6th edn, W.H. Freeman and Company, New York. Химические основы биохимии Barta, N.S. & Stille, J.R. (1994) Grasping the concepts of stereochemistry. J. Chem. Educ. 71,20-23. Понятное описание R/S-номенклатуры стереоизоме- ров; приведены практические советы по определению и запоминанию типа изомера. Vollhardt, К.Р.С. & Shore, N.E. (2002) Organic Chemistry: Structure and Function, W.H. Freeman and Company, New York. Современное изложение стереохимии, функциональ- ных групп, реакционной способности и химии основных классов биомолекул. Физические основы биохимии Atkins, P.W. & de Paula, J. (2001) Physical Chemistry, 7th edn, W.H. Freeman and Company, New York. Atkins, P.W. & Jones, L. (1999) Chemical Principles: The Quest for Insight, W.H. Freeman and Company, New York. Blum, H.E (1968) Time’s Arrow and Evolution, 3rd edn, Princeton University Press, Princeton. Замечательное обсуждение влияния второго начала термодинамики на биологическую эволюцию. Генетические основы биохмии Griffiths, A.J.E, Gelbart, W.M., Lewinton, R.C., & Miller, J.H. (2002) Modem Genetic Analysis: Integrating Genes and Genomes, W.H. Freeman and Company, New York. Hartwell, L., Hood, L., Goldberg, M.L., Silver, L.M., Veres, R.C., & Reynolds, A. (2003) Genetics: From Genes to Genomes, McGraw-Hill, New York. International Human Genome Sequencing Consortium. (2001) Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature 409,860-921. Jacob, E (1973) The Logic of Life: A History of Heredity, Pantheon Books, Inc., New York. Впервые вышла в 1970 г. под названием La logique du vivant: une histoire de I’heredite, Editions Gallimard, Paris. Увлекательный исторический и философский анализ того пути, по которому мы шли к теперешнему понима- нию молекулярных основ жизни. Klug, W.S. & Cummings, M.R. (2002) Concepts of Genetics, 7th edn, Prentice Hall, Upper Saddle River, NJ. Pierce, B. (2002) Genetics: A Conceptual Approach, W.H. Freeman and Company, New York. Эволюционные основы биохимии Brow, J.R. & Doolittle, W.E (1997) Archea and the prokaryote-eukaryote transition. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 61,456-502. Очень подробное обсуждение аргументов в пользу рас- положения архей на филогенетической ветви, ведущей к многоклеточным организмам. Carroll, S.B. (2006) The Making of the Fittest: DNA and the Ultimate Forensic Record of Evolution, WW Norton & Company, Inc., New York. Carroll, S.B. (2005) Endless Forms Most Beautiful: The New Science of Evo Devo and the Making of the Animal Kingdom, W.W. Norton & Company, Inc., New York de Duve, C. (1995) The beginnings of the life on earth. Am. Sci. 83,428-437. Возможный сценарий последовательности химических реакций, приведших к возникновению первого живого организма. de Duve, С. (1996) The birth of complex cells. Am. Sci. 274 (April), 50-57. Evolution of Catalytic Function. (1987) Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 52. Сборник почти 100 статей по всем аспектам пребио- тической и ранней биологической эволюции; возмож-
Вопросы и задачи [65] но, лучший источник информации по молекулярной эволюции. Gesteland, R.E, Atkins, J.E, & Cech, T.R. (eds). (2006) The RNA World, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. Сборник обзорных статей по широкому кругу вопро- сов, касающихся гипотезы мира РНК. Lazcano, А. & Miller, S.L. (1996) The origin and early evolution of life: prebiotic chemistry, the pre-RNA world, and time. Cell 85,793-798. Краткий обзор развития исследований в области про- исхождения жизни: примитивные атмосферы, кратеры подводных вулканов, автотрофные/гетеротрофные орга- низмы, мир РНК и пре-РНК, а также продолжительность возникновения жизни. Margulis, L. (1996) Archaeal-eubacterial mergers in the origin of Eukarya: phylogenetic classification of life. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93,1071-1076. Аргументы в пользу разделения всех живых организ- мов на пять царств: монеры, протисты, грибы, животные и растения (сравните со статьей Woese et al.). Margulis, L., Gould, S.J., Schwartz, K.V., & Margulis, A.R. (1998) Five Kingdoms: An Illustrated Guide to the Phyla of Life on Earth, 3rd edn, W.H. Freeman and Company, New York. Описание основных групп живых организмов с пре- красными иллюстрациями и электронными микрофото- графиями. Mayr, Е. (1997) This Is Biology: The Science of the Living World, Belknap Press, Cambridge, MA. История развития науки, в частности дарвиновской те- ории эволюции, в изложении знаменитого последователя Дарвина. Miller, S.L. (1987) Which organic compounds could have occurred on the prebiotic earth? Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 52,17-27. Свод лабораторных экспериментов по воспроизведе- нию химической эволюции в изложении человека, поста- вившего знаменитый эксперимент Миллера-Юри. Woese, C.R. (2002) On the evolution of cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99,8742-8747. Краткий ясный обзор. Woese, C.R. (2004) A new biology for a new century. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 68,173-186. Развитие современной мысли о клеточной эволюции пера одного из апологетов данной области. Woese, C.R., Kandler, О., & Wheelis, M.L. (1990) Towards a natural system of organisms: proposal for the domains Archaea, Bacteria, and Eucarya. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 4576-4579. Аргументы в пользу разделения всех живых организ- мов на три царства (сравните со статьей Margulis, 1996). Вопросы и задачи__________________________ Ниже представлены некоторые вопросы и за- дачи, относящиеся к содержанию данной главы. При решении можно пользоваться таблицами, помещенными на заднем форзаце. Каждое зада- ние имеет заголовок, так чтобы читателю легче было определить, к какой теме оно относится. Каждый раз при решении численных задач пом- ните, что в ответе должно стоять корректное чис- ло значащих цифр. Краткие решения приведены в Приложении Б; расширенные варианты отве- тов опубликованы в отдельном издании (David L. Nelson and Michael M. Cox, Lehninger Principles of Biochemistry Absolute Ultimate Guide (Study Guide & Solutions Manual, W. H. Freeman). 1. Размеры клеток и их компонентов а) Если увеличить клетку в 10 000 раз (та- кое увеличение обычно достигается в электрон- ном микроскопе), то какого размера она стала бы? Предположите, что вы рассматриваете «ти- пичную» эукариотическую клетку с диаметром 50 мкм. б) Если вы рассматриваете мышечную клетку (миоцит), сколько в ней содержится молекул ак- тина? (Считайте, что клетка имеет сферическую форму и не содержит никаких других компонен- тов; молекулы актина имеют сферическую форму и диаметр 3,6 нм. Объем шара равен (4/3)лг2.) в) Если вы рассматриваете клетку печени (гепатоцит) таких же размеров, сколько в ней мо- жет содержаться митохондрий? (Считайте, что клетка имеет сферическую форму и не содержит никаких других компонентов; митохондрии име- ют сферическую форму и диаметр 1,5 мкм.) г) Глюкоза служит основным источником энергии для большинства клеток. Пусть внутри- клеточная концентрация глюкозы равна 1 мМ (т. е. 1 миллимоль/л). Рассчитайте число моле- кул глюкозы, содержащихся в нашей гипотети- ческой эукариотической клетке (сферической формы). (Число Авогадро, равное числу молекул в 1 моле неионизированного вещества, составля- ет 6,02 • 1023.) д) Гексокиназа является важным ферментом в метаболизме глюкозы. Если концентрация гек- сокиназы в нашей эукариотической клетке равна 20 мкМ, то сколько молекул глюкозы приходится на одну молекулу гексокиназы?
[66] 1. Основы биохимии 2. Компоненты клетки Е, coli. Клетки Е. coli име- ют форму цилиндра высотой 2 мкм и диаметром 0,8 мкм. Объем цилиндра вычисляется по форму- ле nr2h, где h — высота цилиндра. а) Сколько весит одна клетка Е. coli, если ее плотность (в основном за счет воды) равна в сред- нем 1,1 • 103 г/л? б) Толщина защитной клеточной оболочки Е. coli равна 10 нм. Какую долю (в процентах) обще- го объема бактерии составляет клеточная оболочка? в) Е. coli быстро растет и размножается бла- годаря тому, что в ее клетке присутствует около 15 000 сферических рибосом (диаметр рибосомы 18 нм), осуществляющих синтез белков. Какая часть общего объема клетки приходится на долю рибосом? 3. Генетическая информация в ДНК Е. coli. Со- держащаяся в ДНК генетическая информация определяется линейной последовательностью ко- дирующих единиц, называемых кодонами. Каж- дый кодон представляет собой специфическую последовательность из трех нуклеотидов (трех пар нуклеотидов в двухцепочечной ДНК) и соот- ветствует одному аминокислотному остатку в бел- ке. ДНК Е. coli имеет очень большую молярную массу — около 3,1 • 104 * * * * 9 г/моль. Средняя молярная масса пары нуклеотидов равна 660 г/моль, а вклад каждой пары нуклеотидов в длину молекулы ДНК составляет 0,34 нм. а) Используя эти данные, рассчитайте длину молекулы ДНК Е. coli. Сравните длину молекулы ДНК с размерами клетки (задача 2). Каким обра- зом ДНК помещается в клетке? б) Подсчитайте, чему равно максимальное число белков, которое может быть закодировано в молекуле ДНК Е. coli, если предположить, что белковая молекула состоит в среднем из 400 ами- нокислот. 4. Высокая скорость метаболизма у бактерий. Бактерии характеризуются значительно более высокой скоростью метаболизма, чем клетки жи- вотных. В идеальных условиях бактериальная клетка обычно увеличивается в размерах вдвое и делится каждые 20 мин, тогда как большинству животных клеток для этого требуется 24 ч. Из-за высокой скорости метаболизма бактериям необ- ходимо иметь большую площадь поверхности по отношению к объему клетки. а) Почему максимальная скорость метабо- лизма должна зависеть от соотношения между площадью поверхности клетки и ее объемом? б) Рассчитайте отношение площади поверх- ности клетки к ее объему у сферической бакте- рии Neisseria gonorrhea, вызывающей гонорею (диаметр клетки 0,5 мкм). Сравните полученное значение с отношением площади поверхности клетки к ее объему у шаровидной амебы — круп- ной эукариотической клетки диаметром 150 мкм. Площадь поверхности сферы рассчитыва- ется по формуле лг2. 5. Быстрый транспорт в аксонах. Нейроны име- ют длинные тонкие отростки, называемые аксо- нами. Аксоны обеспечивают передачу сигнала в нервной системе организма. Некоторые аксоны могут достигать длины до 2 м, например аксоны, отходящие от спинного мозга и заканчивающиеся в мышцах пальцев ног. Маленькие заключенные в мембрану частицы, переносящие важные для ра- боты аксонов вещества, движутся вдоль микро- трубочек цитоскелета от центра клетки до окон- чаний аксонов. Если средняя скорость движения этих частиц 1 мкм/с, сколько времени понадо- бится такой частице (везикуле), чтобы пройти от центра клетки в спинном мозге до окончания аксона в пальцах ног? 6. Витамин С: отличается ли искусственный витамин С от натурального? Некоторые по- ставщики обогащенных витаминами пищевых продуктов заявляют, что витамины, получен- ные из природных источников, полезнее для здоровья, чем синтезированные. Например, считается, что чистая L-аскорбиновая кислота (витамин С) из плодов шиповника полезнее чи- стой L-аскорбиновой кислоты, синтезирован- ной на химическом производстве. Различаются ли витамины из этих двух источников? Может ли организм различить витамины из разных ис- точников? 7. Идентификация функциональных групп. На рис. 1-15 и 1-16 показаны некоторые функцио- нальные группы, часто встречающиеся в биомо- лекулах. Поскольку свойства и биологическая активность биомолекул в значительной степе- ни зависят от их функциональных групп, важно уметь их идентифицировать. Укажите функцио-
Вопросы и задачи [67] нальные группы в каждом из приведенных ниже соединений и назовите их. н I н—с—он I н—с—он I н—с—он I н Глицерин б <*Ж2 сн2 NH 1_ С-0 н—с—он I Н3С—с—сн3 СН20Н Пантотенат, витамин II НО—Р—О" I о н н + I I H3N—С—С—ОН Н Н Этаноламин а ;с=с—соо- Фосфоенолпируват, промежуточный продукт в метаболизме глюкозы в СОО- + I H3N—С—Н Н—С—ОН I сн3 Треонин, аминокислота г д \//° с Н—NH3 НО—С—н н—с—он н—с—он I СН2ОН D-Глюкозамин е 08. Активность лекарственных веществ и сте- реохимия. В некоторых случаях количест- венные различия в биологической активности двух энантиомеров одного и того же вещества вы- ражены достаточно сильно. Например, D-изомер изопротеренола (применяется при легких присту- пах астмы) действует в качестве бронхорасширяю- щего средства в 50-80 раз сильнее, чем L-изомер. Укажите хиральный центр в молекуле изопротере- нола. Почему два энантиомера так сильно разли- чаются по биологической активности? ОН НН I I I C-CH2-N—с—сн3 н сн3 Изопротеренол 9. Разделение биомолекул. Для изучения био- молекул определенного вида (белка, нуклеино- вой кислоты, углевода или липида) в лаборатор- ных условиях исследователь в первую очередь должен отделить эти молекулы от других, при- сутствующих в образце, т. е. провести очистку. Специфические методы очистки описаны далее в тексте. Однако, глядя на формулы мономер- ных звеньев биомолекул, вы уже сейчас можете указать несколько характерных особенностей, позволяющих выделить их из смесей с други- ми молекулами. Например, как бы вы отделили а) аминокислоты от жирных кислот и б) нуклео- тиды от глюкозы? 10. Возможна ли кремниевая жизнь? Кремний расположен в той же группе Периодической си- стемы, что и углерод, и может образовывать до четырех одинарных связей. Многие научно-фан- тастические произведения были основаны на предположении существования кремниевой жиз- ни. Возможно ли это? Какие свойства кремния де- лают его менее подходящим на роль главного эле- мента жизни по сравнению с углеродом? Чтобы ответить на этот вопрос, вспомните, что вы прочли относительно способности углерода образовы- вать разнообразные связи, а также воспользуйтесь учебником неорганической химии, чтобы осве- жить в памяти свои знания о способности кремния образовывать связи. 11. Действие лекарственных препаратов и форма молекул. Несколько лет назад две фирмы выпустили в продажу препарат под торго- выми названиями декседрин и бензедрин. Струк- турная формула этого вещества приведена на ри- сунке. По физическим свойствам (содержанию С, Н и N, температуре плавления, растворимости и др.) оба препарата идентичны. Тем не менее реко- мендованная доза декседрина (он до сих пор вы- пускается) составляла 5 мг/сут., а рекомендован- ная доза бензедрина (снят с производства) была вдвое выше. Таким образом, для достижения од- ного и того же физиологического эффекта бензе- дрина требуется гораздо больше, чем декседрина. Объясните это кажущееся противоречие. 12. Строительные блоки сложных биомолекул. На рис. 1-10 показана структура наиболее важных компонентов сложных биомолекул. Укажите стро- ительные блоки, из которых состоят три изобра- женные ниже важные биологические биомолеку- лы (показаны в ионной форме, соответствующей физиологическому значению pH).
[68] 1. Основы биохимии а) Гуанозинтрифосфат (GTP) — энергетиче- ски богатая молекула, нуклеотид, входящий в со- став РНК: он он б) Фосфатидилхолин — компонент многих мембран: 0“ н н СН3 СН3- N—СН2—СН2—О—Р—О—СН2 СН3 о НС-0-С-(СН2)7-С=С-(СН2)7-СН3 О СН2—О—С—(СН2)14—СН3 о в) Метэнкефалин (энкефалин, содержащий в пятом положении метионин) — природный опиат мозга: 13. Определение структуры биомолекулы. Из мышц кролика выделили неизвестное ве- щество X. Его структура была установлена на основании следующих наблюдений и экспе- риментов. Результаты качественного анализа показали, что вещество содержит только угле- род, водород и кислород. Навеска вещества X была подвергнута полному окислению, после чего определены количества образовавших- ся Н20 и С02. Из данных этого анализа было сделано заключение, что массовые доли С, И и О в веществе X составляют 40,0, 6,71 и 53,29% соответственно. Молекулярная масса веще- ства X по данным масс-спектрометрии рав- на 90,0 а. е. м. (см. дополнение 1-1). Методом инфракрасной спектроскопии показано, что в молекуле X есть одна двойная связь. Вещество X легко растворяется в воде, образуя кислый раствор. При исследовании этого раствора с помощью поляриметра было установлено, что X обладает оптической активностью. а) Определите эмпирическую и молекуляр- ную формулы X. б) Нарисуйте возможные структуры ве- щества X, которые удовлетворяли бы молеку- лярной формуле и имели одну двойную связь. Рассмотрите только линейные или разветвлен- ные структуры, не принимая во внимание ци- клические структуры. Учтите, что атомы кисло- рода с трудом образуют связи между собой. в) Какое значение структуры при определе- нии имеет оптическая активность вещества? Ка- кие структуры, предложенные вами в пункте (б), соответствуют этому наблюдению? г) Какое значение для структуры молекулы имеет тот факт, что при растворении вещества X образуется кислый раствор? Какие структуры, предложенные вами в пункте (б), соответствуют этому наблюдению? д) Каково строение вещества X? Совместимо ли со всеми имеющимися данными существова- ние нескольких структур? Анализ экспериментальных данных_________ 14. Сладкий вкус вещества. Человек многие вещества воспринимает как сладкие. Сладкий вкус возникает, когда молекула вещества свя- зывается с рецептором сладкого — одним ти- пом рецепторов на поверхности определенных клеток языка. Чем прочнее связывание, тем меньшей концентрации вещества достаточно для насыщения рецепторов и тем более слад- кий вкус обеспечивает данная концентрация вещества. Изменение свободной энергии AG° в реакции связывания сладкого вещества с ре- цептором можно измерить в килоджоулях или в килокалориях на моль. Количественно сладкий вкус можно опре- делять в относительных единицах, принимая за точку отсчета (за 1 ед.) сладость сахарозы. На- пример, сладость сахарина составляет 161 ед., что означает, что он в 161 раз слаще сахарозы. На практике эту величину определяют, сравни- вая по вкусу сладость растворов, содержащих различную концентрацию каждого сладкого ве- щества. Растворы сахарозы и сахарина имеют
Анализ экспериментальных данных [69] одинаковую сладость, когда сахароза взята в концентрации в 161 раз выше, чем концентрация сахарина. а) Какова связь относительной сладости ве- щества и АС° реакции связывания? В частности, более отрицательное значение AG° соответствует большей или меньшей относительной сладости? Объясните свой ответ. Ниже представлены структуры 10 веществ, каждое из которых кажется человеку сладким на вкус. Для каждого вещества представлены значе- ния относительной сладости и AG° реакции свя- зывания с рецептором сладости. б-Хлор-Б-триптофан отн. сладость 906 AG° = -10,7 ккал/моль Дезоксисахароза отн. сладость 0,95 AG° = -6,67 ккал/моль Алитам отн. сладость 1 937 AG° = -11,1 ккал/моль Неотам отн. сладость 11 057 AG° = -12,1 ккал/моль Сахароза отн.сладость 1 AG° = -6,71 ккал/моль о Тетрабромсахароза отн. сладость 13 012 AG° = -12,2 ккал/моль D-Триптофан отн. сладость 21 AG° = -8,5 ккал/моль Сахарин отн. сладость 161 AG° = -9,7 ккал/моль но Сукроновая кислота отн. сладость 200 000 AG0 = -13,8 ккал/моль СН3 Аспартам отн. сладость 172 AG° = -9,7 ккал/моль Морини, Бассоли и Темусси (2005) исполь- зовали компьютерные методы (методы «in silico») для моделирования связывания молекул сладких веществ с рецепторами.
[70] 1. Основы биохимии б) В чем преимущество компьютерного мето- да определения сладости веществ по сравнению с органолептическим методом определения сладо- сти человеком или животными? В своих ранних работах Шалленбергер и Акре (1967) предположили, что все сладкие ве- щества имеют структурную группу АН-В, где А и В — электроотрицательные атомы, разделенные расстоянием не менее 2,5 А (0,25 нм), но не более 4 А (0,4 нм); Н — атом водорода, связанный с од- ним из электроотрицательных атомов ковалент- ной связью (с. 481). в) Учитывая, что длина «типичной» одинар- ной связи составляет 0,15 нм, идентифицируйте группы АН-В в каждой приведенной выше моле- куле. г) На основании своего ответа на вопрос (в) выскажите два возражения против утверждения, что «молекулы, имеющие структурную группу АН-В, сладкие». д) Для двух приведенных выше молекул мо- дель АН-В позволяет объяснить различия в от- носительной сладости и величине AG°. Какие это молекулы и как с их помощью подтвердить спра- ведливость данной модели? Многие приведенные выше молекулы, име- ющие очень похожую структуру, весьма сильно различаются по сладости и величине AG°. Приве- дите два примера и с их помощью покажите, по- чему модель АН-В не может объяснить различия в сладости и значении AG°. В своем методе компьютерного моделиро- вания для предсказания величины AG° в реак- ции связывания сладкого вещества и рецептора сладости Морини с соавторами использовали трехмерную структуру рецептора сладости и специальную программу для моделирования динамики молекул (GRAMM). Сначала они «тренировали» свою модель, т. е. изменяли па- раметры модели таким образом, чтобы пред- сказанные моделью значения AG° совпадали с известными значениями AG° для определен- ного ряда веществ. А затем они «тестировали» модель, пытаясь предсказать значения AG° для нового набора молекул. е) Почему Морини с соавторами тестирова- ли модель на другом ряде веществ, а не на том же, на котором проводилась «тренировка» модели? ж) Оказалось, что предсказываемые зна- чения AG° для тестируемого набора веществ отличаются от реальных значений в среднем на 1,3 ккал/моль. Используя значения, при- веденные для перечисленных выше молекул, оцените ошибку в определении относительной сладости. Литература Morini, G., Bassoli, А., & Temussi, Р.А. (2005) From small sweeteners to sweet proteins: anatomy of the binding sites of the human T1R2-T1R3 receptor./. Med. Chem. 48,5520-5529. Schallenberger, R.S. & Acree, T.E. (1967) Molecular theory of sweet taste. Nature 216,480-482.
ЧАСТЬ I Строение и катализ 2 Вода 3 Аминокислоты, пептиды и белки 113 4 Трехмерная структура белков 171 5 Функции белков 225 б Ферменты 269 7 Углеводы и гликобиология 339 8 Нуклеотиды и нуклеиновые кислоты 391 9 Технологии на основе информации ДНК 433 10 Липиды 487 11 Биологические мембраны и транспорт 525 12 Биосигнализация 591 Биохимия, можно сказать без преувеличе- ния, это химия жизни, и живые организмы (именно живые) могут быть, таким образом, исследованы, проанализированы, а также поняты их функции. Приступая к изучению биохимии, каждый студент должен узнать ее язык и основ- ные принципы: это-то мы и будем обсуждать в части I. Главы части I посвящены структуре и функ- циям основных веществ в составе клетки: воды (гл. 2), аминокислот и белков (гл. 3-6), сахаров и полисахаридов (гл. 7), нуклеотидов и нуклеи- новых кислот (гл. 8), жирных кислот и липидов (гл. 10) и, наконец, мембран и мембранных сиг- нальных белков (гл. 11 и 12). Рассказ о каждом типе молекул сопровождается обсуждением под- ходов, применяющихся для их изучения. Опи- сание некоторых методов включено в основное содержание главы, а одна глава (гл. 9) целиком посвящена биотехнологии, связанной с клониро- ванием, геномикой и протеомикой. Знакомство с биохимией начинается с воды (гл. 2), поскольку ее свойства важны для структуры и функций всех других компонен- тов клетки. При изучении каждого класса орга- нических молекул мы в первую очередь будем рассматривать ковалентные взаимодействия между мономерными звеньями (аминокислота- ми, моносахаридами, нуклеотидами и жирными кислотами), а затем описывать структуру ма- кромолекул и построенных из них надмолеку- лярных комплексов. Основная идея такого из- ложения состоит в том, что полимерные макро- молекулы в живых системах, несмотря на свои большие размеры, — высокоупорядоченные химические соединения, имеющие строго опре- деленную последовательность мономерных зве- ньев, определяющую их структуру и функции.
[72] Часть I. Структура и катализ Это утверждение строится на трех взаимосвя- занных принципах: 1) уникальная структура каждой макромолекулы определяет ее функ- ции; 2) нековалентные взаимодействия имеют ключевое значение для структуры, а следова- тельно, для функционирования макромолекул; 3) мономерные звенья в полимерных макромо- лекулах соединены в специфические последова- тельности, которые содержат в себе информацию, определяющую организацию живых систем. Структурно-функциональные взаимосвя- зи молекул особенно наглядно проявляются в белках, характеризующихся невероятным раз- нообразием функций. Одна специфическая по- следовательность аминокислот образует проч- ную структуру нитей, из которых состоят волосы и шерсть, другая образует белок, переносящий кислород в крови, третья связывает другие бел- ки и катализирует расщепление их внутримоле- кулярных связей. Аналогичным образом, особые функции полисахаридов, нуклеиновых кислот и липидов являются прямым проявлением их химической структуры, т. е. определяются свой- ствами мономерных звеньев и точным поряд- ком их соединения в полимерную цепь. Цепочки сахарных остатков могут служить источником энергии, структурными волокнами и специфи- ческими участками узнавания; соединенные в ДНК или РНК нуклеотиды содержат в себе план устройства всего организма; комплексы липидов образуют мембраны. Глава 12 обобщает материал, касающийся функционирования биомолекул. В ней описывается, как специфические сигнальные системы регулируют активность биомолекул и поддерживают гомеостаз на уровне клетки, орга- на или всего организма в целом. При переходе мономерных звеньев к все бо- лее крупным полимерным молекулам основную роль начинают играть не ковалентные, а другие типы взаимодействий. Несомненно, ковалентные связи и внутри мономерных звеньев, и между ними в полимерной молекуле накладывают огра- ничения на возможную форму макромолекулы. Однако именно многочисленные нековалентные взаимодействия определяют устойчивую натив- ную конформацию биомолекулы и в то же время делают ее достаточно гибкой, что существенно для биологических функций. Как мы увидим, нековалентные связи играют важнейшую роль в проявлении каталитической активности фермен- тов, во взаимодействии комплементарных осно- ваний в составе нуклеиновых кислот, а также в расположении и свойствах липидов в мембранах. Тот принцип, что последовательность моно- мерных звеньев заключает в себе определенную информацию, с наибольшей полнотой раскрыва- ется в обсуждении свойств нуклеиновых кислот (гл. 8). Однако белки и некоторые низкомоле- кулярные сахара (олигосахариды) также вы- полняют функции информационных молекул. Аминокислотная последовательность белков со- держит в себе информацию, определяющую сво- рачивание белка в специфическую трехмерную структуру, и в итоге отвечает за его функциони- рование. Некоторые олигосахариды также имеют уникальную первичную последовательность и трехмерную структуру, распознаваемую другими макромолекулами. Во всех классах биомолекул легко обнару- живается сходная структурная иерархия: макро- молекулы образуются из мономерных звеньев определенного строения с помощью довольно прочных связей. Трехмерная структура биомо- лекул поддерживается нековалентными взаи- модействиями. Далее эти макромолекулы могут образовывать надмолекулярные комплексы и ор- ганеллы, которые осуществляют метаболические функции в клетках. Все молекулы, описанные в части I, являются строительным материалом жизни.
Я верю, что использование методов структурной химии для решения проб- лем физиологии позволит показать, что роль водородных связей в физиоло- гии больше, чем любых других структур. Лайнус Полинг, Природа химической связи, 1939 Вода 2.1. Слабые взаимодействия в водных средах 73 2.2. Ионизация воды, слабые кислоты и слабые основания 89 2.3. Роль буферных систем в поддержании pH в биологических системах 96 2.4. Участие воды в реакциях 104 2.5. Живые организмы приспособлены к водной среде 105 Вода — самое распространенное вещество в живой природе; массовая доля воды в боль- шинстве живых организмов составляет 70% и более. Первые живые организмы на Земле, не- сомненно, появились в водной среде, и ход эво- люции определялся свойствами того водного окружения, в котором возникла жизнь. Данная глава начинается с рассмотрения фи- зических и химических свойств воды, к которым адаптированы все структурные элементы и функ- ции живой клетки. Для структуры и функций био- молекул необычайно важное значение имеют силы притяжения между молекулами воды и ее слабая ионизованность. При рассмотрении вопроса об ионизации поговорим о константах равновесия реакции диссоциации воды, pH и кривых титрова- ния, а также покажем, как водные растворы слабых кислот и оснований и их соли действуют в каче- стве буферов, препятствуя изменениям pH в био- логических системах. Молекула воды и продукты ее диссоциации (Н+ и ОН-) оказывают глубокое влияние на структуру, процесс сборки и свойства всех клеточных компонентов, прежде всего белков, нуклеиновых кислот и липидов. Свойства воды как растворителя, включая способность образо- вывать водородные связи между собственными молекулами и молекулами растворенных веществ, решающим образом влияют на нековалентные вза- имодействия, ответственные за силу связывания и специфичность «узнавания» биомолекул. 2.1. Слабые взаимодействия в водных средах Наличие водородных связей приводит к прочно- му сцеплению молекул воды и делает ее жидкой при комнатной температуре, а также способствует образованию высокоупорядоченной кристалли- ческой структуры льда (твердое состояние). По- лярные биомолекулы легко растворяются в воде, поскольку разрушают ассоциаты из молекул воды из связи вода-вода с образованием энергетически более выгодной связи вода-растворенное веще- ство. Напротив, неполярные вещества не способ- ны связываться с молекулами воды, другими сло- вами, неполярные вещества плохо растворяются в воде. В водных растворах неполярные вещества часто образуют кластеры. Водородные связи, ионные, гидрофобные (от греч. боящийся воды) и ван-дер-ваальсовы взаимо- действия по отдельности довольно слабые, однако вместе они оказывают весьма значительное влия- ние на трехмерную структуру белков, нуклеиновых кислот, полисахаридов и мембранных липидов.
[74] Часть!. 2. Вода Температура плавления, температура кипения и теплота испарения некоторых растворителей Температура плавления (°C) Температура кипения (°C) Теплота испарения (Дж/г)* Вода 0 100 2 260 Метанол (СН3ОН) -98 65 1 100 Этанол (СН3СН2ОН) -117 78 854 Пропанол (СН3СН2СН2ОН) -127 97 687 Бутанол (СН3(СН2)2СН2ОН) -90 117 590 Ацетон (СН3СОСН3) -95 56 523 Гексан (СН3(СН2)4СН3) -98 69 423 Бензол (С6Н6) 6 80 394 Бутан (СН3(СН2)2СН3) -135 -0,5 381 Хлороформ (СНС13) -63 61 247 * Количество теплоты, необходимое для превращения 1,0 г жидкости при температуре ее кипения и атмосферном давлении в газообразное состояние. Эта величина является мерой той энергии, которую нужно затратить на преодоление сил притяжения между молекулами в жидкой фазе. Необычные свойства воды обусловлены наличием водородных связей По сравнению с большинством других жидко- стей вода имеет высокие температуры плавления и кипения и теплоту испарения (табл. 2-1). Эти особенности воды хорошо объясняются сильным притяжением между соседними молекулами, вследствие чего жидкая вода характеризуется большим внутренним сцеплением. Причину по- добных межмолекулярных взаимодействий мож- но понять, если рассмотреть электронную струк- туру молекулы Н2О. Каждый атом водорода в молекуле воды имеет общую пару электронов с атомом кисло- рода. Геометрия молекулы определяется формой внешних электронных орбиталей кислорода; здесь можно увидеть аналогию со связывающи- ми sp3 орбиталями углерода (рис. 1-14). Орбита- ли кислорода вытянуты к углам неправильного тетраэдра, имеющего по одному атому водорода в каждом из двух углов и неподеленные элек- тронные пары кислорода в двух других углах (рис. 2-1, а). Угол, образуемый связью Н-О-Н, составляет 104,5° — чуть меньше, чем в правиль- ном тетраэдре (109,5°), что связано с взаимным отталкиванием неподеленных электронных пар кислорода. Рис. 2-1. Строение молекулы воды, а) Биполярная природа молекулы воды показана с помощью шаро- стержневой модели. Пунктирными линиями обозна- чены несвязывающие орбитали. Электронные пары, расположенные на внешних электронных орбита- лях, образуют вокруг атома кислорода неправильный тетраэдр. Каждый атом водорода несет частичный по- ложительный (5+), а атом кислорода — частичный от- рицательный заряд (25_). б) Две молекулы Н20 связаны водородной связью (здесь и далее водородная связь обозначается тремя голубыми черточками), соединя- ющей атом кислорода верхней молекулы и атом водо- рода нижней молекулы. Водородные связи длиннее и слабее, чем ковалентные связи 0-Н.
2.1 Слабые взаимодействия в водных средах [75] Ядро атома кислорода притягивает электро- ны сильнее, чем ядро водорода (протон), т. е. кис- лород является более электроотрицательным. В результате положение поделенных пар электро- нов между кислородом и водородом несиммет- ричное — электроны расположены ближе к атому кислорода, чем к атому водорода. Такая асимме- трия приводит к образованию в молекуле воды двух электрических диполей — по одному вдоль каждой связи Н-О. В результате на водородах локализуется частичный положительный заряд (6+), а на кислороде — частичный отрицательный, равный по модулю сумме двух частичных поло- жительных зарядов (26). Этим и объясняется электростатическое притяжение между атомом кислорода одной молекулы воды и атомом водо- рода другой молекулы (рис. 2-1, 6), называемое водородной связью. В данной книге мы будем изображать водородную связь в виде трех голубых параллельных черточек, как на рис. 2-1,6. Водородные связи сравнительно слабые. Энергия диссоциации (энергия, необходимая для разрыва связи) водородной связи в жидкой воде составляет 23 кДж/моль, тогда как энер- гия диссоциации ковалентной связи О-Н воды равна 470 кДж/моль, а ковалентной С-С-связи 348 кДж/моль. В образование водородной свя- зи 10% вносят ковалентные взаимодействия (за счет перекрывания электронных орбиталей), а 90% — электростатические взаимодействия. При комнатной температуре тепловая энергия водно- го раствора (кинетическая энергия движения от- дельных атомов и молекул) имеет тот же порядок величины, что и энергия диссоциации водородной связи. При нагревании воды скорость отдельных молекул увеличивается. В каждый момент време- ни большинство молекул жидкой воды участвует в образовании водородных связей, однако время жизни каждой водородной связи составляет лишь от 1 до 20 пикосекунд (1 пс = 10“12 с). При разры- ве одной водородной связи через 0,1 пс образуется другая — с тем же или новым партнером. Корот- коживущие группы молекул воды, связанные во- дородными связями, были удачно названы «мер- цающими кластерами». Множество водородных связей между молекулами воды создают сильное внутреннее сцепление в жидкой воде. Протяжен- ная сетчатая структура связанных водородными связями молекул воды может включать в себя и молекулы растворенных веществ (белков, ну- клеиновых кислот и др.), что позволяет большим молекулам взаимодействовать друг с другом на расстояниях в несколько нанометров без прямого физического контакта. Поскольку расположение электронных ор- биталей вокруг атома кислорода близко к тетра- эдрическому (рис. 2-1, а), каждая молекула воды способна образовать водородные связи максимум с четырьмя соседними молекулами воды. Так как в жидком состоянии при атмосферном давлении молекулы воды находятся в непрерывном дви- жении, то считают, что каждая молекула в любой момент времени образует водородные связи в среднем с 3,4 других молекул. Напротив, во льду молекулы зафиксированы в пространстве и ока- зываются связанными с максимально возможным количеством соседей; при этом образуется регу- лярная пространственная решетка (рис. 2-2). Для того чтобы разорвать достаточное число водород- ных связей и нарушить кристаллическую решетку Рис. 2-2. Водородные связи между молекулами воды во льду. Каждая молекула воды во льду связана с четырь- мя другими молекулами воды (максимально возможное число для воды), так что при этом образуется регулярная кристаллическая решетка. В жидкой воде при комнатной температуре и при атмосферном давлении каждая моле- кула воды связана водородными связями приблизитель- но с 3,4 молекул. Кристаллическая решетка льда более рыхлая (лед имеет меньшую плотность, чем вода), и по- этому лед плавает на поверхности воды.
[76] Часть!. 2. Вода льда, требуется много тепловой энергии, что выра- жается в сравнительно высокой температуре плав- ления воды (табл. 2-1). При плавлении льда или испарении воды затрачивается тепловая энергия: Н2О (твердая) Н2О (жидкая) АЯ= +5,9 кДж/моль Н2О (жидкая) Н2О (газ) АЯ = +44,0 кДж/моль В процессе плавления или испарения энтро- пия системы повышается, поскольку высокоорга- низованная структура молекул (лед) переходит в менее организованное (вода) или в полностью дезорганизованное состояние (пар). При ком- натной температуре плавление льда и испарение воды происходят самопроизвольно: стремление молекул воды ассоциировать посредством обра- зования водородных связей оказывается слабее энергетической выгоды от перехода к хаотиче- скому состоянию. Вспомним, что для самопро- извольного протекания процесса изменение сво- бодной энергии (AG) должно быть отрицательной величиной: AG = АЯ — 7А5, где AG представляет собой движущую силу процесса, АЯ — изменение энтальпии, связанное с образованием и разрывом связей, а А5 отражает изменение упорядочен- ности системы. Поскольку в процессах плавле- ния и испарения АЯ > 0 (теплота поглощается), именно повышение энтропии (А5) делает значе- ние AG отрицательным и способствует данным превращениям. Вода образует водородные связи с полярными растворенными веществами Водородные связи существуют не только в воде. Они легко образуются между электроотрицатель- ным атомом (акцептором водорода, в качестве которого обычно выступает кислород или азот) и атомом водорода, ковалентно связанным с дру- гим электроотрицательным атомом (донором водорода) в той же самой или в другой молекуле (рис. 2-3). Атомы водорода, связанные ковалент- ной связью с углеродом, не участвуют в образо- вании водородных связей, поскольку электро- отрицательность атома углерода лишь немного выше, чем водорода, и следовательно, связь С-Н практически неполярна. Именно этим различием объясняется сравнительно высокая температура I q Акцептор / / \ z водорода О N О Донор Н Н Н водорода I I I ООО I I I \ / / О О N Н Н Н I I I N N N z \ / \ / \ Рис. 2-3. Типы водородных связей, наиболее часто встре- чающиеся в биологических системах. Акцептором водо- рода обычно служит атом кислорода или азота; донором водорода является другой электроотрицательный атом. кипения бутилового спирта СН3(СН2)2СН2ОН (117 °C) и низкая — у бутана СН3(СН2)2СН3 (-0,5 °C). В молекуле бутилового спирта есть полярная гидроксильная группа, которая может участвовать в образовании межмолекулярных водородных связей. Незаряженные, но полярные Между гидроксильной группой спирта и водой R хо I Н б нх н Между карбонильной группой кетона и водой R2 I н I о нх Между пептидными группами в полипептидах Между комплементарными основаниями в ДНК Тимин Аденин Рис. 2-4. Некоторые водородные связи, имеющие важ- ное значение для биологических систем.
2.1 Слабые взаимодействия в водных средах [77] биомолекулы (такие как сахара) легко растворя- ются в воде благодаря стабилизационному эф- фекту от образования водородных связей между гидроксильными группами или карбонильным кислородом сахара и полярными молекулами воды. Спирты, альдегиды, кетоны и соединения, содержащие связи N-Н, образуют водородные связи с молекулами воды (рис. 2-4) и обычно хо- рошо растворяются в воде. Водородные связи обладают наибольшей прочностью в тех случаях, когда взаимная ориен- тация связанных между собой молекул обеспечи- вает максимальную энергию электростатическо- го взаимодействия. Такая ситуация наблюдается, если атом водорода и два «делящих» его атома расположены на одной прямой, т. е. если акцеп- тор находится на одной линии с ковалентной связью между атомом донора и атомом водорода (рис. 2-5) и если положительно заряженный ион водорода находится ровно между частичными отрицательными зарядами на атомах кислорода. Другими словами, водородная связь характери- зуется определенной направленностью и вследст- вие этого способна удерживать обе связанные с ее помощью молекулы или группы в определен- ной ориентации. Ниже мы увидим, что именно это свойство водородных связей способствует стабилизации строго определенных трехмерных структур, характерных для молекул белков и нук- леиновых кислот, имеющих большое число вну- тримолекулярных водородных связей. R 1 Прочная водородная связь Более слабая водородная связь Рис. 2-5. Направленность водородной связи. Максималь- ное притяжение между частичными электрическими заря- дами (рис. 2-1) реализуется в том случае, когда три атома (в данном случае О, Н и 0), участвующие в образовании водородной связи, лежат на одной прямой. Если группы, участвующие в образовании водородной связи, строго за- фиксированы (например, являются частями одной и той же молекулы белка) и такое идеальное расположение не- возможно, то образуется более слабая связь. Между водой и заряженными веществами существуют электростатические взаимодействия Вода является полярным растворителем. В ней легко растворяется большинство биомолекул, ко- торые обычно представляют собой заряженные или полярные вещества (табл. 2-2). Легко раство- ряющиеся в воде вещества называют гидрофиль- ными (от греч. любящий воду}. Напротив, непо- лярные растворители (хлороформ, бензол и др.) плохо растворяют полярные биомолекулы, но хорошо растворяют те вещества, которые облада- ют гидрофобными свойствами, т. е. неполярные молекулы типа липидов и смол. Вода растворяет такие соли, как NaCl, гид- ратируя и стабилизируя ионы Na+ и С1“ путем ослабления электростатических взаимодействий между ними, тем самым препятствуя их ассоциа- ции с образованием кристаллической структуры (рис. 2-6). Те же принципы применимы и к рас- творению заряженных биомолекул, содержащих такие функциональные группы, как ионизован- ная карбоксильная группа (СО О), протони- рованная аминогруппа (-NH3), а также эфиры или ангидриды фосфорной кислоты. Вода легко растворяет подобные вещества, при этом водо- родные связи в молекулах растворенных веществ заменяются водородными связями между рас- творенным веществом и водой, кроме того, экра- нируются электростатические взаимодействия между молекулами растворенного вещества. Воду очень удобно использовать для оценки электростатических взаимодействий между рас- творенными ионами, поскольку она имеет высо- кую диэлектрическую проницаемость (этот фи- зический параметр отражает количество диполей в растворителе). Сила ионных взаимодействий в растворе (F) зависит от величины заряда (Q), расстояния между заряженными группами (г) и диэлектрической проницаемости растворителя (е, безразмерная величина), в котором происхо- дит взаимодействие: г Q1Q2 F =—Г" ег Диэлектрическая проницаемость воды при 25 °C равна 78,5, а для такого неполярного рас- творителя, как бензол, е = 4,6. Таким образом, ионные взаимодействия между растворенными ионами сильнее проявляются в неполярных, чем
[78] Часть!. 2. Вода Таблица 2-2 Примеры полярных, неполярных и амфифильных биомолекул (в ионной форме при pH 7) Полярные Глюкоза Н ОН Неполярные Типичная смола СН3(СН2)^СН=СН— (СН2)6—СН2—С О I СН3(СН2)^СН=СН— (СН2)^СН2 Глицин +NH3 —СН2—COO Аспартат +NH3 ООС—СН2—СН—COO СН3— СН— соо Лактат ОН ОН I Глицерин НОСН2—СН—СН2ОН Амфифильные Фенилаланин Фосфатидилхолин О СН3(СН2)15СН2—С—О—СН2 СН3(СН2)15СН2—С—О—СН О +N(CH3)3 О СН2—О—Р —о—сн2—сн2 о Полярная группа ] Неполярная группа в полярных средах. Зависимость силы ионных взаимодействий от расстояния (от 1 /г2) приводит к тому, что в воде притяжение или отталкивание ионов действует лишь на очень коротком рассто- янии — в диапазоне от 10 до 40 нм в зависимости от концентрации электролита. на ориентацию молекул воды Рис. 2-6. Вода как растворитель. Хорошая растворимость в воде многих кристаллических солей обусловлена гидратацией ионов, образующих эти соли. Кристаллическая решетка NaCl разрушается, по мере того как молекулы воды окружают ионы Na+ и С1_. Заряды ионов частично нейтрализуются, и электростатическое притяжение, которое обусловливает об- разование решетки, ослабевает.
2.1 Слабые взаимодействия в водных средах [79] При растворении кристаллических веществ энтропия возрастает При растворении соли NaCl ионы Na+ и С1~ по- кидают кристаллическую решетку и получают большую свободу передвижения (рис. 2-6). Лег- кость растворения в воде таких солей, как NaCl, во многом объясняется ростом энтропии системы (усилением беспорядка). В терминах термоди- намики, образованию раствора способствует из- менение свободной энергии: АС = АЯ — 7А5, где АЯ имеет небольшое положительное значение, а 7А5 — большое положительное значение, отсюда АС<0. Неполярные газы плохо растворяются в воде Важные для биологических систем молекулы СО2, О2 и N2 неполярны. В молекулах кислорода и азота электроны поделены поровну между обо- ими атомами. В молекуле СО2 каждая связь С=О полярная, однако два диполя имеют противопо- ложное направление и нейтрализуют друг друга (табл. 2-3). Переход молекул из неупорядочен- ного состояния в газовой фазе в водный раствор нарушает свободу их перемещения и движение молекул воды, т. е. сопровождается снижением энтропии. Неполярная природа молекул и сни- жение энтропии при переходе из газовой фазы в жидкость определяют очень плохую раствори- мость этих соединений в воде (табл. 2-3). У не- которых организмов имеются растворимые в воде белки-переносчики (например, гемоглобин и миоглобин), облегчающие транспорт кислоро- да. Диоксид углерода образует в воде угольную кислоту (Н2СО3) и переносится в виде бикарбо- нат-иона (НСО3) либо в свободном состоянии (бикарбонат очень хорошо растворим в воде: -100 г/л при 25 °C), либо в комплексе с гемогло- бином. Такие газы, как NH3, NO и H2S, также важ- ны для жизнедеятельности некоторых организ- мов; эти полярные молекулы хорошо растворя- ются в воде и ионизированы в водных растворах. Неполярные вещества при растворении вызывают энергетически невыгодные изменения в структуре воды При смешивании воды с бензолом или гексаном образуются две фазы. Неполярные соединения (бензол и гексан) гидрофобны, т. е. они не спо- собны вступать в энергетически выгодные вза- имодействия с молекулами воды и нарушают водородные связи, существующие между моле- кулами воды. Любые молекулы или ионы, по- падая в водный раствор, нарушают там водрод- ные связи, однако полярные или заряженные вещества, такие как NaCl, компенсируют нару- шение связей вода-вода образованием новых связей вода-растворенное вещество. Суммар- Растворимость некоторых газов в воде Газ Структура* Полярность Растворимость в воде, г/л (tp_pa)** Азот N-N Неполярный 0,018 (40 °C) Кислород 0=0 Неполярный 0,035 (50 °C) Углекислый газ 8 8 о=с=о Неполярный 0,97 (45 °C) Аммиак НХН| N 18 Полярный 900(10 °C) Сероводород н н s U Полярный 1,860 (40 °C) * Стрелками показаны диполи: направление от области с частичным положительным заря- дом (У, здесь не показан) к области с частичным отрицательным зарядом (б ). ** Заметьте, что полярные молекулы растворяются в воде даже при низкой температуре луч- ше, чем неполярные молекулы при повышенной температуре.
[80] Часть!. 2. Вода Высокоупорядоченные молекулы воды образуют оболочку вокруг гидрофобной алкильной цепи Распределение липидов в воде. Вокруг каждой молекулы липида образуется слой упорядоченных молекул воды. <©. ъХ а Образование липидных кластеров. Упорядоченные структуры воды возникают толь- ко вокруг непо- лярных частей липидных моле- кул; энтропия возрастает, поско- льку упорядочено меньшее число молекул воды. Мицеллы. Все гидрофобные группы спрятаны внутрь мицеллы; число упорядо- ченных молекул воды минимизи- ровано; энтропия еще больше возрастает. Рис. 2-7. Поведение амфифильных соединений в водном растворе, о) Длинноцепочечные жирные кислоты имеют гидрофобные алкильные цепи, которые окружены слоем упорядо- ченных молекул воды, б) Образование мицелл приводит к минимизации контакта гидро- фобной поверхности жирных кислот с водой, кроме того, в такой структуре минимальное число упорядоченных молекул воды задействовано в образовании оболочки вокруг непо- лярных молекул. Стабилизация мицеллы происходит за счет выигрыша в энергии в резуль- тате высвобождения иммобилизованных молекул воды.
2.1 Слабые взаимодействия в водных средах [81] ное изменение энтальпии (АЯ) при растворении таких молекул обычно невелико. Напротив, ги- дрофобные вещества никак не компенсируют нарушение структуры водородных связей между молекулами воды, поэтому их растворение со- провождается небольшим увеличением энталь- пии; разрыв водородных связей между молекула- ми воды требует определенной энергии, которую необходимо получить из окружающей среды. Кроме этого, растворение в воде гидрофобных веществ приводит к значительному снижению энтропии. Молекулы воды, находящиеся в непо- средственной близости от неполярной молеку- лы, фиксируются в определенной ориентации и формируют высокоупорядоченную оболочку во- круг каждой молекулы растворенного вещества. Молекулы воды, организованные таким обра- зом, имеют не такую упорядоченную структуру, как клатраты (кристаллы неполярных веществ и воды), но эффект в обоих случаях достигает- ся один и тот же — упорядочение молекул воды снижает энтропию. Число упорядоченных моле- кул воды, а следовательно, и уменьшение энтро- пии, пропорциональны площади поверхности гидрофобного вещества, заключенного в оболоч- ку из молекул воды. Таким образом, изменение свободной энергии, сопровождающее растворе- ние неполярного вещества в воде, не благопри- ятствует этому процессу: AG = АЯ — 7А5, где АЯ — положительное число, А5 — отрицательное число, отсюда AG > 0. Амфифильные соединения имеют как по- лярные (заряженные), так и неполярные группы (табл. 2-2). При смешивании амфифильного сое- динения с водой его полярные гидрофильные об- ласти стремятся раствориться, однако неполяр- ные гидрофобные области пытаются избежать контакта с растворителем (рис. 2-7, а). Неполяр- ные группы собираются вместе и образуют кла- стеры с минимальной поверхностью, а полярные группы располагаются так, чтобы максимально увеличить свои контакты с водой (рис. 2-7, б). В результате в воде образуются устойчивые структуры амфифильных веществ, называемые мицеллами, которые могут состоять из сотен или тысяч молекул. Силы, удерживающие вместе не- полярные группы молекул растворенного веще- ства, называют гидрофобными взаимодействия- ми. Они не связаны с внутренним притяжением между неполярными остатками. Скорее, здесь Комплекс фермента с субстратом стабилизируется за счет водородных связей, а также ионных и гидрофобных взаимодействий Рис. 2-8. Высвобождение упорядоченных молекул воды способствует образованию фермент-субстратного ком- плекса. Как вокруг молекулы фермента, так и вокруг мо- лекулы субстрата существует слой упорядоченных моле- кул воды. Связывание фермента с субстратом приводит к высвобождению некоторого количества упорядоченных молекул. Повышение энтропии является термодинамиче- ским стимулом образования фермент-субстратного ком- плекса (см. с. 282). реализуется стремление системы достичь макси- мальной термодинамической стабильности пу- тем минимизации числа упорядоченных молекул воды, которые окружают гидрофобные участки молекул растворенного вещества.
[82] Часть!. 2. Вода Многие биомолекулы являются амфифиль- ными: белки, пигменты, некоторые витамины, а также стеролы и фосфолипиды в мембранах име- ют как полярные, так и неполярные участки. Об- разованные такими молекулами структуры удер- живаются за счет гидрофобных взаимодействий между неполярными группами. Гидрофобные взаимодействия между липидами, а также меж- ду липидами и белками являются важнейшим принципом построения биологических мембран. Гидрофобные взаимодействия между неполяр- ными аминокислотами играют роль в стабилиза- ции трехмерной структуры белков. Образование водородных связей между во- дой и полярными соединениями также приводит к упорядочиванию молекул воды, однако в случае растворения неполярных веществ энергетический эффект меньше. Часть движущей силы, направлен- ной на связывание полярного субстрата (реагирую- щего вещества) с комплементарной полярной по- верхностью фермента, расходуется на повышение энтропии, поскольку фермент выталкивает упоря- доченные молекулы воды с поверхности субстрата, а субстрат выталкивает упорядоченные молекулы воды с поверхности фермента (рис. 2-8). Ван-дер-ваальсовы взаимодействия обусловлены слабыми силами межатомного притяжения При слишком близком контакте двух незаряжен- ных атомов происходит взаимодействие окружаю- щих их электронных облаков. Случайные вариа- ции положения электронов вокруг одного ядра могут создавать электрический диполь, который способен индуцировать противоположный элек- трический диполь в соседнем атоме. Два диполя слабо притягиваются друг к другу в результате чего ядра сближаются. Такие слабые силы притяжения называют ван-дер-ваальсовым притяжением (или силами Лондона). По мере сближения двух ядер возникает противоположно направленная сила от- талкивания их электронных облаков. В точке, где общее притяжение максимально, говорят, что ядра находятся в ван-дер-ваальсовом контакте. Каж- дый атом характеризуется ван-дер-ваальсовым радиусом, определяющим, насколько близко этот атом позволяет подойти другому атому (табл. 2-4). В приведенных в данной книге СРК-моделях молекул размеры всех атомов соотносятся, как их ван-дер-ваальсовы радиусы. Таблица 2-4 Ван-дер-ваальсовы радиусы и ковалентные радиусы (при образовании одинарной связи) некоторых элементов Элемент Ван-дер-ваальсов радиус (нм) (в Ковалентный радиус одинарной связи) (нм) Н 0,11 0,030 О 0,15 0,066 N 0,15 0,070 С 0,17 0,077 S 0,18 0,104 р 0,19 0,110 I 0,21 0,133 Источники: значения ван-дер-ваальсовых радиусов при- водятся по Chauvin, R. (1992) Explicit periodic trend of van der Waals radii. J. Phys. Chem. 96, 9194-9197. Значения ковалентных радиусов приводятся по Pauling, L. (1960) Nature of the chemical bond, 3rd ed., Cornell University Press, Ithaca, NY. Замечание: ван-дер-ваальсовы радиусы описывают про- странственные размеры атома. Если два атома связаны ковалентной связью, то атомные радиусы в участке свя- зывания меньше ван-дер-ваальсовых радиусов, посколь- ку связанные атомы объединены общей электронной па- рой. Расстояния между ядрами при ван-дер-ваальсовых взаимодействиях или при образовании ковалентной связи приблизительно равны соответственно сумме ван- дер-ваальсовых или ковалентных радиусов двух атомов. Таким образом, длина одинарной связи С-С примерно равна 0,077 нм + 0,077 нм = 0,154 нм. Слабые взаимодействия играют очень важную роль в структуре и функциях макромолекул Описанные нами выше нековалентные взаимо- действия (водородные связи, а также ионные, ги- дрофобные и ван-дер-ваальсовы взаимодействия) (табл. 2-5) гораздо слабее ковалентных. Энергия разрыва одинарной связи С-С 350 кДж/моль, свя- зи С-Н 410 кДж/моль, а для ван-дер-ваальсовых сил она составляет всего лишь 4 кДж/моль. Ги- дрофобные взаимодействия также гораздо сла- бее ковалентных связей, однако они значительно усиливаются в растворе полярного растворителя (например, в концентрированном солевом рас- творе). Прочность ионных взаимодействий и во- дородных связей зависит от полярности раство- рителя и расположения связанных с водородом атомов, но она всегда меньше прочности ковалент-
2.1 Слабые взаимодействия в водных средах [83] Таблица 2-5 Четыре типа нековалентных («слабых») взаимодействий между биомолекулами з водном растворе Водородные связи Между нейтральными группафми Между пептидами Ионные взаимодействия С II Притяжение —+NH3 —>«— О—С— Отталкивание Гидрофобные взаимодействия Ван-дер-ваальсовы взаимодействия — +NH3 <—=’H3N+— вода Любые два соседних атома ных связей. Тепловая энергия молекул в водном растворе при 25 °C обычно имеет тот же порядок величины, что и энергия слабых взаимодействий, поэтому вероятность взаимодействия между рас- творенным веществом и растворителем (водой) практически такая же, как и взаимодействия меж- ду молекулами растворенного вещества. В связи с этим как водородные связи, так и ионные, гидро- фобные и ван-дер-ваальсовы взаимодействия по- стоянно возникают и распадаются. Хотя эти четыре типа взаимодействий по от- дельности слабее ковалентной связи, суммарный эффект от действия множества взаимодействий такого рода может быть весьма значительным. На- пример, в нековалентном связывании фермента с субстратом могут быть задействованы как во- дородные связи, так и ионные, гидрофобные или ван-дер-ваальсовы взаимодействия. Образование каждой из этих слабых связей вносит свой вклад в общее понижение свободной энергии системы. Можно рассчитать устойчивость нековалентно- го взаимодействия, например водородной связи между небольшой молекулой и макромолекулой, исходя из энергии связи. Устойчивость, описывае- мая константой равновесия связи (см. ниже), экс- поненциально зависит от энергии связи. Для дис- социации комплекса двух биомолекул (например, фермента и субстрата), связанных множеством слабых сил, необходимо, чтобы все эти взаимодей- ствия были разрушены одновременно. Поскольку данные взаимодействия постоянно появляются и исчезают, одновременный разрыв всех связей мало- вероятен. Таким образом, молекулярная структура, удерживаемая с помощью 5-20 слабых взаимодей- ствий, оказывается гораздо более устойчивой, чем могло бы показаться при формальном сложении небольших значений энергии связывания. В таких макромолекулах, как белки, ДНК и РНК, имеется множество участков для образова- ния водородных связей, гидрофобных, ионных и ван-дер-ваальсовых взаимодействий, так что сум- марный эффект от действия этих слабых сил может быть огромным. Наиболее стабильная (т. е. натив- ная) структура макромолекул обычно характеризу- ется максимальным числом реализованных слабых взаимодействий. В соответствии с этим принципом происходит укладка полипептидной или полинук- леотидной цепи в присущую ей пространственную форму. Связывание антигенов и специфичных к ним антител также зависит от кумулятивного эф- фекта множества слабых взаимодействий. Как уже говорилось выше, именно энергия, высвобожденная Рис. 2-9. Связывание воды с молекулой гемоглобина (PDB ID 1A3N). Кристаллическая структура молекулы ге- моглобина а) со связанными молекулами воды (красные шарики) и б) без молекул воды. Молекулы воды настолько сильно связаны с белком, что при рентгеноструктурном анализе ведут себя так, как будто являются частью кри- сталлической структуры. Две а-субъединицы гемогло- бина изображены серым, а две р-субъединицы — синим цветом. Каждая субъединица связана с гемом (структура из красных палочек; в данном ракурсе гем виден только в р-субъединицах). Структура и функции гемоглобина об- суждаются в гл. 5.
[84] Часть!. 2. Вода Рис. 2-10. Цепочка молекул воды в цитохроме/. Молеку- лы воды связываются в протонном канале мембранного белка цитохрома f, являющегося частью фотосинтети- ческого аппарата в хлоропластах (рис. 19-64). Пять мо- лекул воды связаны между собой и с функциональными группами белка водородными связями; в этом взаимодей- ствии участвуют атомы основных цепей остатков валина, пролина, аргинина и аланина, а также атомы боковых це- пей трех остатков аспарагина и двух остатков глутамина. Молекула белка связана с гемом (рис. 5-1), ион железа в котором облегчает перенос электронов в процессе фото- синтеза. Поток электронов сопряжен с процессом пере- носа протонов через мембрану, возможно, в соответствии с «прыжковым» механизмом переноса протонов по це- почке связанных молекул воды (рис. 2-13). при нековалентном связывании фермента с суб- стратом, является движущей силой каталитиче- ской реакции. Связывание гормона или медиато- ра с клеточным рецептором — это тоже результат слабых взаимодействий. Из-за больших размеров молекул ферментов и рецепторов (по сравнению с их субстратами или лигандами) на их поверхности есть множество участков для реализации слабых взаимодействий. Комплементарность реагирую- щих макромолекул на молекулярном уровне озна- чает возможность слабых взаимодействий между полярными, заряженными и гидрофобными груп- пами на их поверхности. При изучении структуры белков, например та- ких, как гемоглобин (рис. 2-9), методом рентгено- структурного анализа (см. доп. 4-5, с. 196) часто вы- ясняется, что молекулы воды связаны с белком на- столько сильно, что ведут себя как часть кристалли- ческой структуры. Аналогичное явление наблюда- ется и в кристаллах РНК или ДНК. Эти связанные молекулы воды, которые в водном растворе можно обнаружить методом ядерного магнитного резонан- са, имеют совсем другие свойства, чем молекулы в толще воды. Например, они не обладают осмотиче- ской активностью (см. ниже). Связанные молеку- лы воды играют важную роль в функционировании многих белков. Так, в одной из основных реакций фотосинтеза под действием света протоны прони- кают сквозь биологическую мембрану по мере того, как электроны передаются в ряду специальных белков-переносчиков (рис. 19-60). Один из этих белков — цитохром/ — имеет цепочку из пяти свя- занных молекул воды (рис. 2-10), которые могут обеспечивать перенос протонов через мембрану в соответствии с механизмом, названным «протон- ными прыжками» (см. ниже). Еще один подобный световой протонный насос — бактериородопсин, по-видимому использует для трансмембранного переноса протонов цепочку связанных молекул воды, ориентированных определенным образом (рис. 19-67). Растворенные вещества изменяют свойства воды Любое растворенное вещество изменяет некото- рые физические свойства растворителя (воды), в частности давление пара, температуру кипения, температуру плавления (замерзания) и осмоти- ческое давление. Эти свойства называют колли- гативными свойствами, поскольку в основе изме- нения всех свойств лежит одна и та же причина: концентрация воды в растворе ниже, чем в чистой воде. Изменение коллигативных свойств не зави- сит от химической природы растворенного веще- ства, а зависит только от числа частиц (молекул, ионов) в единице объема растворителя. Напри- мер, диссоциирующий в водном растворе NaCl изменяет осмотическое давление в два раза силь- нее, чем такое же количество недиссоциирующей в воде глюкозы. Молекулы воды стремятся переместиться из области с более высокой концентрацией воды в об- ласть с более низкой концентрацией — в соответст- вии со стремлением любой природной системы к разупорядочению. При разделении двух водных
2.1 Слабые взаимодействия в водных средах [85] Осмотическое Полупроницаемая мембрана Рис. 2-11. Осмос и определение осмотического давления, а) Исходное состояние. В пробир- ке содержится водный раствор, а в стакане — чистая вода. Полупроницаемая мембрана про- пускает воду, но не пропускает растворенное вещество. Вода течет из стакана в пробирку, стремясь сравнять концентрации воды по обе стороны мембраны, б) Конечное состояние. Вода проникла в раствор вещества, молекулы которого не могут проходить сквозь мембрану, в результате чего произошло разбавление раствора. В состоянии равновесия давление стол- ба раствора, имеющего высоту h, уравновешивает осмотическое давление, характеризующее стремление воды проникнуть в зону с более низкой концентрацией, в) Осмотическое давле- ние (П) определяется как сила, которую нужно приложить к поршню, чтобы снизить уровень раствора в пробирке до уровня воды в стакане. Эта сила пропорциональна высоте столба жид- кости (h) в пробирке в состоянии (б). растворов с разной концентрацией растворенных веществ с помощью полупроницаемой мембраны (позволяющей проходить молекулам воды, но не пропускающей растворенные вещества) молеку- лы воды диффундируют из области с большей кон- центрацией воды в область с меньшей концентра- цией, оказывая осмотическое давление (рис. 2-11). Осмотическое давление (П) определяется как сила, которую нужно приложить для оказания сопротив- ления движению воды (рис. 2-11, в), и рассчитыва- ется по уравнению Вант-Гоффа: П = icRT где R — универсальная газовая постоянная, Т— аб- солютная температура. Множитель zc, являющийся произведением молярной концентрации раствора (с) и фактора Вант-Гоффа (г), называется осмоляр- ностью раствора и отражает степень диссоциации растворенного вещества на ионы. В разбавленном растворе NaCl происходит полная диссоциация соли на ионы Na+ и С1~, что удваивает число частиц растворенного вещества, т. е. г = 2. Для всех недиссо- циирующих веществ г = 1. Осмотическое давление в растворе нескольких (п) веществ представляет собой сумму осмотических давлений, оказываемых каждым растворенным веществом: П = RT(iici + i2c2 + ... + incn) Явление осмоса, проявляющееся в движении воды через полупроницаемую мембрану под дейст- вием разности осмотических давлений, играет важнейшую роль в жизни большинства клеток. Плазматические мембраны клеток гораздо луч- ше проницаемы для воды, чем для большинства других небольших молекул, ионов и макромо- лекул. Проникновение воды в клетку частично происходит путем обычной диффузии молекул воды сквозь двойной липидный слой, а частично связано с наличием в мембране белковых кана- лов (так называемых аквапоринов, см. рис. 11-46), обеспечивающих селективный транспорт воды. Растворы с осмолярностью, равной осмолярно- сти цитоплазмы клетки, называют изотониче- скими по отношению к клетке. Количество воды в клетке, помещенной в изотонический раствор, не уменьшается и не увеличивается (рис. 2-12).
[86] Часть!. 2. Вода Внеклеточные растворенные Клетка в гипертоническом растворе; вода выходит наружу, и клетка сжимается. Клетка в гипотоническом растворе; вода проникает в клетку, создавая внутреннее давление; клетка разбухает и может лопнуть. Рис. 2-12. Влияние осмолярности внешней среды на движение воды через плазматиче- скую мембрану. Если клетку, находящуюся в осмотическом равновесии с окружающей сре- дой (т. е. находящуюся в изотоническом растворе) (а), перенести в гипертонический (б) или гипотонический раствор (в), то вода начнет проходить сквозь плазматическую мембра- ну, стремясь уравновесить осмолярность внутри клетки и в окружающей среде. В гипертоническом растворе, осмолярность кото- рого превышает осмолярность цитозоля, клетки сжимаются, поскольку вода из них выходит. На- против, в гипотоническом растворе, осмолярность которого ниже осмолярности цитозоля, клетки разбухают, поскольку в них усиленно проникает вода. В естественных условиях концентрация био- молекул и ионов в клетках обычно выше, чем в окружающей среде, так что под действием осмоти- ческого давления вода должна была бы проникать в клетки. Если не противостоять этому давлению, прибывающая вода будет растягивать плазматиче- скую мембрану и в конечном итоге разорвет клет- ку (осмотический лизис). У клеток есть несколько механизмов для предотвращения подобной катастрофы. Плазма- тическая мембрана клеток бактерий и растений окружена нерастяжимой клеточной стенкой, име- ющей достаточную жесткость и прочность, чтобы противостоять осмотическому давлению и не до- пустить осмотического лизиса. Некоторые пре- сноводные простейшие, обитающие в условиях гипотонической среды, имеют специальные ор- ганеллы — сократительные вакуоли, которые вы- качивают из клетки воду. У многоклеточных жи- вотных плазма крови и интерстициальная жид- кость (межклеточная жидкость тканей) имеют осмолярность, близкую к осмолярности цитозо- ля. Значительный вклад в осмолярность плазмы крови вносит высокая концентрация альбумина и других белков. Кроме того, для поддержания осмотического равновесия с окружающей средой клетки активно выкачивают в интерстициальную жидкость Na+ и некоторые другие ионы. Поскольку влияние растворенных веществ на осмолярность зависит от числа частиц в рас-
2.1 Слабые взаимодействия в водных средах [87] творе, а не от их массы, макромолекулы (белки, нуклеиновые кислоты, полисахариды) оказыва- ют гораздо меньшее действие, чем составляющие их мономерные молекулы в эквивалентном по массе количестве. Например, один грамм поли- сахарида, состоящего из 1000 остатков глюкозы, оказывает такое же влияние на осмолярность, как один миллиграмм глюкозы. Энергетические запа- сы клетки хранятся в виде полисахаридов (крах- мала или гликогена), а не глюкозы или других простых сахаров, что позволяет избежать опасно- го повышения осмотического давления в запаса- ющей клетке. В растениях осмотическое давление служит для поддержания механической прочности. Вода поступает в клетки растений благодаря очень вы- сокой концентрации растворенных веществ в кле- точной вакуоли (рис. 2-12). Возникающее в ре- зультате этого осмотическое давление на клеточ- ную стенку (тургорное давление), возрастая, при- дает жесткость клеткам, тканям и всему растению в целом. Зелень в приготовленном салате вянет, поскольку потеря воды приводит к снижению тургора. Явление осмоса важно учитывать и в ла- бораторной практике. Например, митохондрии, хлоропласты и лизосомы ограничены полупро- ницаемыми мембранами. Выделение органелл из разрушенных клеток должно осуществляться в изотоническом растворе (см. рис. 1-8), что позво- лит избежать проникновения в органеллы избы- точного количества воды, сопровождающегося их набуханием и разрушением. В буферах, исполь- зуемых при фракционировании клеток, обычно содержится достаточная концентрация сахарозы или других инертных веществ, предохраняющих органеллы от осмотического лизиса. Пример 2-1 ОСМОТИЧЕСКОЕ ДАВЛЕНИЕ В ОРГАНЕЛЛЕ. I Предположим, что основными растворенными веществами в интактных лизо- сомах являются КС1 (—0,1 М) и NaCl (-0,03 М). Какой должна быть концентра- ция сахарозы в растворе для экстракции лизосом при комнатной температуре (25 °C), чтобы предотвратить их набухание и лизис? Решение. Нужно найти концентрацию сахарозы, обеспечивающую такое же осмотическое давление, какое создают КС1 и NaCl, присутствующие в ли- зосомах. Для расчета осмотического давления воспользуемся уравнением Вант-Гоффа: п = RT (itct + z2c2 + i3c3 + ... + г„с„) где R — универсальная газовая постоянная (8,315 Дж/моль-К), Т— абсолютная температура (в кельвинах), q, с2 и с3 — молярные концентрации растворенных веществ, a i2 и i3 — число частиц, которое образуется в растворе каждого ве- щества (г = 2 для КС1 и NaCl). Рассчитаем осмотическое давление в лизосоме: ПЛИзосома RT 0кС1СКС1 + ZNaClCNaCl) = RT[(2) (0,03 моль/л) + (2) (0,1 моль/л)] = /?Г(0,26 моль/л) Поскольку концентрации растворенных веществ известны лишь с точностью до одного знака после запятой, получаем Плизосома = RT (0,3 моль/л). Осмотическое давление раствора сахарозы определяется по формуле: Псахапоза = ^Осахароза Сахароза) Cd.AdpUod. \ CdAapUod. Cd.A<ipUod.z В данном случае Сахароза = 1> поскольку сахароза в воде не диссоциирует. Таким образом, П-сахароза RT Сахароза
[88] Часть!. 2. Вода Приравниваем осмотическое давление содержимого лизосом осмотическому давлению раствора сахарозы: ^сахароза ^лизосома RT (^сахароза) — RT (0,3 МОЛЬ/л) ^сахароза МОЛЬ/л Таким образом, требуемая концентрация сахарозы (Мсахароза 342) составляет (0,3 моль/л)(342 г/моль) = 102,6 г/л, или ссахароза = 0,1 кг/л. Пример 2-2 ОСМОТИЧЕСКОЕ ДАВЛЕНИЕ В ОРГАНЕЛЛЕ. II Предположим, что для уравновешивания осмотического давления внутри лизосом (см. пример 2-1) мы решили использовать раствор полисахарида, например гликогена. Считая, что этот линейный полимер состоит из 100 глю- козных звеньев, рассчитайте количество гликогена, необходимое для дости- жения того же осмотического давления, что и в примере 2-1. Мг гликогена, состоящего из остатков глюкозы, -18 000, и, как и сахароза, в воде он не дис- социирует. Решение. Мы получили в примере 2-1: ^сахароза RT(0,3 МОЛЬ/л) Аналогичным образом, ^гликоген 7?7^ 0'гликоген ^гликоген) 7^7^ (Сгликоген) Для раствора гликогена с тем же осмотическим давлением, что и в растворе сахарозы, можно записать: Пгликоген Псахароза RT (сгликоген) = RT (0,3 моль/л) Сгликоген = 0,3 моль/л = (0,3 моль/л) (18 000 г/моль) = 5,4 кг/л Сгликоген = 5 кг/л. Это невероятно высокая концентрация! Как мы увидим позднее (с. 353), клетки печени и мышц запасают углеводы не в виде низкомолекулярных сахаров, таких как глюкоза или сахароза, но в виде высокомолекулярного гликогена, что позволяет минимизировать влия- ние на осмолярность цитозоля. Краткое содержание раздела 2.1. СЛАБЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ В ВОДНЫХ СРЕДАХ Большое различие электроотрицательности атомов Н и О является причиной сильной по- лярности молекулы воды, благодаря чему она образует водородные связи с другими молеку- лами воды, а также с молекулами растворенных веществ. Водородные связи постоянно рвутся и вновь образуются, имеют в основном электро- статическую природу и по прочности слабее ковалентных связей. Вода — хороший раствори- тель для полярных (гидрофильных) веществ, с которыми она образует водородные связи, и для заряженных веществ, с которыми она вступает в электростатические взаимодействия.
2.2 Ионизация воды, слабые кислоты и слабые основания [89] Неполярные (гидрофобные) вещества плохо растворяются в воде и не способны образо- вывать водородные связи с растворителем. При наличии в водном растворе гидрофоб- ных веществ происходит энергетически не- выгодное упорядочение молекул воды на их поверхности. Для минимизации обращенной к воде поверхности неполярные вещества, такие как липиды, образуют агрегаты (ми- целлы) таким образом, что гидрофобные остатки молекул обращены внутрь мицелл, а полярные группы реагируют с водой. Силы, заставляющие гидрофобные частицы удер- живаться вместе в растворе полярного рас- творителя, называют гидрофобными взаимо- действиями. Многочисленные слабые нековалентные вза- имодействия играют важную роль в образо- вании нативной конформации таких макро- молекул, как белки и нуклеиновые кислоты. Наиболее устойчивая конформация биомо- лекулы характеризуется реализацией макси- мального числа водородных связей внутри самой молекулы, а также между молекулой и растворителем. При этом гидрофобные остат- ки образуют кластеры внутри биомолекулы, в результате чего их контакт с водой оказывает- ся минимальным. Физические свойства водных растворов силь- но зависят от концентрации растворенных веществ. Если два водных раствора разделе- ны полупроницаемой мембраной (такой как плазматическая мембрана, отделяющая клет- ку от окружающей среды), вода стремится пройти сквозь мембрану и сравнять осмоляр- ность двух растворов. Давление, оказываемое при этом водой, называют осмотическим дав- лением. 2.2. Диссоциация воды. Слабые кислоты и слабые основания Многие свойства воды в качестве растворителя можно объяснить, рассматривая Н2О как неза- ряженную молекулу. Однако иногда необходи- мо учитывать диссоциацию молекул воды и на- личие в воде ионов водорода Н+ и гидроксиль- ных ионов ОН-. Диссоциация воды как любая обратимая реакция характеризуется констан- той равновесия. При растворении в воде слабых кислот они диссоциируют — в воде появляются дополнительные ионы Н+; слабые основания присоединяют Н+ и переходят в протонирован- ную форму. Каждый из этих процессов харак- теризуется константой равновесия. Общая кон- центрация ионов водорода определяется экс- периментально и выражается как pH раствора. Чтобы предсказать, что будет происходить в растворе, необходимо знать константы равно- весия соответствующих реакций диссоциации. Поэтому далее мы рассмотрим равновесия при диссоциации воды, а также слабых кислот и ос- нований в водном растворе. В чистой воде мало ионов Молекулы воды имеют небольшую склонность к диссоциации, т. е. к образованию ионов водорода (протона) и гидроксила в соответствии со следу- ющим уравнением: Н2О^Н+ + ОН (2-1) Обычно мы представляем продукт диссоциации воды как Н+, однако следует иметь в виду, что свободных протонов в воде не существует. Ионы водорода в воде немедленно гидратируются, т. е. превращаются в ион гидроксония (гидрония) Н3О+. Благодаря наличию водородных связей между молекулами воды гидратация протонов происходит практически мгновенно: Н—011: Н—О ?----Н— О—Н + ОН’ хн хн i Степень диссоциации воды можно опреде- лить по ее электрической проводимости. Чистая вода проводит электричество, поскольку Н3О+ движется к катоду, а ОН- — к аноду. Движение этих ионов в электрическом поле отличается исключительной быстротой по сравнению с та- кими ионами, как Na+, К+ или С1~. Такую высо- кую подвижность можно объяснить, учитывая механизм передачи протона, изображенный на рис. 2-13. Дело в том, что не один конкретный протон передвигается в толще воды на дальние расстояния, а целая «армия» протонов перено- сит заряд между соседними, связанными водо- родными связями молекулами воды; суммар-
[90] Часть!. 2. Вода Ион гидроксония отдает протон Н Вода принимает протон и становится ионом гидроксония Рис. 2-13. Механизм «протонных прыжков». Свое- образные «прыжки» протонов между соседними связан- ными водородной связью молекулами воды очень силь- но увеличивают общую скорость переноса протона на достаточно большие расстояния. Как только ион гидрок- сония (наверху слева) отдает свой протон, практически сразу молекула воды, находящаяся от него на некотором расстоянии (внизу справа), принимает протон и сама становится ионом гидроксония. Скорость передачи про- тона в соответствии с таким механизмом оказывается намного выше скорости диффузии и объясняет удиви- тельно высокую подвижность протона по сравнению с подвижностью других одновалентных катионов, таких как Na+ или К+. ный эффект этого состоит в переносе протона на дальнее расстояние за удивительно короткое время. Благодаря столь высокой подвижности Н+ (а также ОН , который перемещается так же быстро, только в противоположном направле- нии) кислотно-основные реакции в водных рас- творах обычно протекают с очень высокими ско- ростями. Как отмечалось выше, такой механизм переноса протона играет, по всей видимости, очень важную роль в биологических процессах (рис. 2-10; см. также рис. 19-67). Поскольку обратимая реакция диссоциации воды имеет очень важное значение для понима- ния роли воды в функционировании клеток, не- обходимо знать способы количественного выра- жения степени ионизации. Рассмотрим кратко некоторые общие свойства обратимых химиче- ских реакций. Равновесие любой химической реакции ха- рактеризуется константой равновесия Keq, часто обозначаемой просто К. Константу равновесия химической реакции A + B^^C + D (2-2) можно выразить через концентрации реагирую- щих веществ (А и В) и продуктов реакции (Си D) в соответствии с уравнением: [C]eq[D]eq Xeq “ [A]eq[B]eq Строго говоря, в уравнении должны стоять ак- тивности (эффективные концентрации в не- идеальных растворах) каждого вещества. Однако, за исключением отдельных, очень точных экспе- риментов, константу равновесия можно оценить, измеряя равновесные концентрации веществ. Константа равновесия — безразмерная величи- на, но следует помнить, что для ее определения в уравнение подставляют значения концентраций веществ, выраженные в молях. Константа равновесия служит количествен- ной характеристикой химической реакции при данной температуре. Она позволяет вычис- лить состав равновесной смеси независимо от количеств исходных веществ и образующихся продуктов. И наоборот, если известны концен- трации всех исходных веществ и конечных про- дуктов в состоянии равновесия, то для реакции, протекающей при данной температуре, можно легко вычислить константу равновесия. Как мы показали в гл. 1, логарифм константы равно- весия связан с изменением свободной энергии Гиббса AG°. Диссоциацию воды можно охарактеризовать величиной константы равновесия Диссоциация воды в соответствии с уравнени- ем 2-1 протекает лишь в незначительной степени; в любой конкретный момент при 25 °C лишь две из 109 молекул воды распадаются на ионы. Кон- станту равновесия обратимой реакции (2-1) мож- но записать как
2.2 Ионизация воды, слабые кислоты и слабые основания [91] [Н+][ОН] еч ~ [Н2О] (2-3) В чистой воде при 25 °C концентрация воды со- ставляет 55,5 М (эту величину получают, раз- делив массу 1 л воды (в граммах) на молярную массу воды: (1000 г/л)/(18,015 г/моль) = 55,5 М). Эту величину можно считать практически по- стоянной по сравнению с гораздо более низки- ми концентрациями Н+ и ОН-, составляющими 1 • 10-7 М. Таким образом, значение 55,5 М мож- но подставить в уравнение 2-3, в результате чего получаем: [Н+][ОН ] Xeq ~ 55,5 М ИЛИ (55,5 М) Keq = [Н+][ОН ] = Kw (2-4) где Kw представляет собой произведение 55,5 • Keq и называется ионным произведением воды при 25 °C. По электропроводности чистой воды при 25 °C было найдено Keq = 1,8 • 10-16. Подстановкой этой величины в уравнение 2-4 получаем числен- ное значение ионного произведения воды: Kw = [Н+] [ОН ] = (55,5 М) (1,8 • 10-16 М) = = 1,0 • 1014 М2 Это означает, что в водном растворе при 25 °C произведение [Н+][ОН] всегда равно 1 • 10-14 М2. В чистой воде концентрации ионов равны [Н+] = [ОН]. Этот раствор называется нейтраль- ным (нейтральное значение pH). Можно рас- считать концентрации Н+ и ОН- в нейтральном растворе, пользуясь значением ионного произве- дения воды: KW=[H+][OH] = [H+]2 = [OH-]2 [Н+] = у/к^= VI • 10-14 м2 [Н+] = [ОН] = 10-7 м Так как ионное произведение воды является постоянной величиной, очевидно, что если кон- центрация ионов Н+ превышает 1 • 10-7 М, то концентрация ионов ОН- должна быть меньше этой величины, и наоборот. Когда концентра- ция Н+ очень высокая, как, например, в соля- ной кислоте, концентрация ОН- должна быть очень низкой, поскольку их произведение — по- стоянная величина. Таким образом, используя ионное произведение воды, можно вычислить концентрацию Н+, если известна концентрация ОН-, и наоборот. Пример 2-3 РАСЧЕТ [Н+] Какова концентрация ионов Н+ в 0,1 М растворе NaOH? Решение. Запишем ионное произведение воды: KW=[H+][OH] Решая это уравнение относительно [Н+], получа- ем для [ОН ] = 0,1 М Kw 1 • 10-14 М2 10-14 М2 [Н+] =------=------------= —;— L J [ОН] 0,1 М 10-1М = ю-13 м Пример 2-4 РАСЧЕТ [0Н-] Какова концентрация ОН- в растворе, содержа- щем 1,3 • 10-4 М Н+? Решение. Запишем ионное произведение воды: KW=[H+][OH] Решая это уравнение относительно [ОН ], получаем для [Н+] = 1,3 • 10-4 Kw 1 • ю-14 м2 ю-14 м2 L J [Н+] 0,00013 М 1,3-10-4М = 7,7 • 10-11 М При решении этих или любых других уравнений округляйте результат до необходимого числа зна- чащих цифр, как показано здесь. Шкала pH: обозначения концентраций ионов Н+ и 0Н~ Шкала pH составлена на основе ионного произ- ведения воды Kw (табл. 2-6). Она представляет собой удобный способ обозначения концентра- ций Н+, а следовательно, и ионов ОН-, в любом
[92] Часть!. 2. Вода Таблица 2-6 Шкала pH [Н+] (М) pH [ОН ] (М) рОН* 10°(1) 0 10 14 14 10 1 1 10 13 13 10 2 2 10 12 12 10 3 3 10 11 И 10 4 4 10 10 10 10 5 5 10 9 9 10 6 6 10 8 8 10 7 7 10 7 7 10 8 8 10 6 6 10~9 9 10 5 5 10 10 10 10 4 4 10 11 И 10 3 3 10 12 12 10 2 2 10 13 13 10 1 1 10 14 14 10°(1) 0 * Иногда по аналогии с pH используют рОН. По определе- нию, рОН = — lg[OH ]. Заметьте, что всегда pH + рОН = 14. pH этих растворов. На рис. 2-14 приведены pH некоторых жидкостей. Заметьте, что концентра- ция ионов Н+ в кока-коле (pH 3,0) или красном вине (pH 3,7) примерно в 10 000 раз выше, чем в крови (pH 7,4). Для приблизительной оценки pH водного раствора используют различные красители (ин- дикаторы), например лакмус, фенолфталеин или феноловый красный, которые изменяют цвет при изменении pH. Измерение pH в химической или клинической лаборатории осуществляют стеклянными электродами, которые селективны к ионам Н+, но не реагируют на присутствие в растворе ионов Na+, К+ и других катионов. Зна- чения pH растворов измеряют на pH-метре. При измерениях необходимы два электрода — сте- клянный электрод и электрод сравнения. ЕЯ Измерение pH является одной из наиболее кЯ важных и часто используемых в биохимии процедур, поскольку от pH зависит структура и водном растворе в интервале между 1,0 М Н+ и 1,0 М ОН-. Что же такое pH? pH = lg—— = lg[H+] lH J где символ «р» означает отрицательный лога- рифм. Можно рассчитать pH нейтрального рас- твора при 25 °C, в котором [Н+] = 1 • 10-7: 1 pH = lg-------=7,0 р 6i,o-io-7 Обратите внимание на то, что концентрация про- тонов должна быть выражена в молях (М). В случае нейтрального раствора pH = 7, и это не произвольно выбранное значение, а результат, полученный из ионного произведения воды при 25 °C, причем целое число получено расчетным путем. Растворы с pH > 7 — щелочные, поскольку в них концентрация ОН- больше концентрации Н+, растворы с pH < 7 — кислые. Важно понимать, что шкала pH логарифми- ческая. Если величины pH двух растворов разли- чаются на 1, это означает, что концентрация Н+ в одном растворе в 10 раз выше, чем в другом, при этом мы можем и не знать численных значений Рис. 2-14. pH (шкала pH слева) некоторых жидкостей.
2.2 функции многих биологических макромолекул, в частности каталитическая активность ферментов (рис. 2-21). Измерения pH крови и мочи — это рутинные процедуры, постоянно используемые в медицинской диагностике. Например, у людей, страдающих тяжелой формой диабета, значение pH крови часто снижено по сравнению с нор- мальным значением 7,4. Такое состояние носит название ацидоза (ниже оно описано более де- тально). При некоторых других заболеваниях pH крови может быть выше нормы; такое состояние называется алкалозом. Случаи сильного ацидоза или алкалоза опасны для жизни. Ионизация воды, слабые кислоты и слабые основания [93] Слабые кислоты и основания характеризуют константами диссоциации Соляная, серная и азотная кислоты, называемые обычно сильными кислотами, полностью дис- социируют в разбавленных водных растворах. Сильные основания NaOH и КОН в водных рас- творах также полностью диссоциируют. Одна- ко для биохимии более важное значение имеют слабые кислоты и основания — те, которые в водных растворах не диссоциируют полностью. Они встречаются почти во всех биологических системах и принимают активное участие в ме- Одноосновные кислоты Уксусная кислота (Ка = 1,74 • 10-5М) Ион аммония (Хй = 5,62 • 10-ю М) Двухосновные кислоты Угольная кислота (Хй=1,70* 10-4 М); Бикарбонат-ион (Хй=6,31 • Ю н М) Глицин, карбоксигруппа (Хй = 4,57 • Ю-з М); Глицин, аминогруппа (Хй = 2,51 • 10-ю М) Трехосновные кислоты Фосфорная кислота (Хй = 7,25 • Ю-з М); Дигидрофосфат-ион (Ка = 1,38 • 10-7М); Моногидрофосфат-ион (Ка = 3,98 • 10-13 М) NHJ сн2< о о СН3С СН3С; \)Н V РК = 4,76 Н2СО3^^ НСОз+Н рК = 3,77* ,0 он О сн2с О- рКа= 2,34 Н3РО4^^ Н2РО4 Гн Р*Са=2,14 NHJ NH3 + H рКа= 9,25 НСО3 NHJ 0 I S сн2с О- Н2РО4^^ НРО1 +н рКа= 6,86 =Ф± СО3 +Н рка= 10,2 nh2 о 1 # СН2СХ О- рКа+= 9,60 НРО1 РО43 +н рка= 12,4 Р + н 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 И 12 13 pH Рис. 2-15. Акцептор и донор протона составляют сопряженную кислотно-основную пару. Некоторые соединения, такие как уксусная кислота или ион аммония, являются одно- основными, т. е. при диссоциации могут отщепить лишь один протон. Существуют также двухосновные (угольная кислота (Н2СО3) или глицин) и трехосновные кислоты (например, фосфорная кислота (Н3Р04)). Реакции диссоциации для нескольких сопряженных кислотно- основных пар, показанных на рисунке, расположены в соответствии с градиентом pH. Для каждой реакции приведены константы диссоциации (£а) и показатели их отрицательных логарифмов (p-йу. Значениях р£а угольной кислоты Н2СО3 при двухступенчатой диссоциа- ции объяснены на с. 99.
[94] Часть!. 2. Вода таболизме и его регуляции. Поведение водных растворов слабых кислот и оснований легче по- нять, если сначала познакомиться с некоторыми определениями. Кислоты можно определить как доноры про- тонов, а основания — как акцепторы протонов. Донор протона и соответствующий акцептор об- разуют сопряженную кислотно-основную пару (рис. 2-15). Примером сопряженной кислот- но-основной пары являются уксусная кислота (СН3СООН — донор протона) и ацетат-анион (СН3СОО~ — акцептор протона). Они связаны следующей обратимой реакцией: СН3СООН Н+ + СН3СОО- Характерная особенность каждой кислоты состоит в том, что в воде она теряет свой протон. Чем сильнее кислота, тем сильнее выражена эта тенденция. Способность любой кислоты НА от- щеплять протон и образовывать сопряженное основание А" характеризуется константой равно- весия (К) обратимой реакции НА Н+ + А- где = [Н+][А] = 7<W1 [НА] Кя Константу равновесия этой реакций обычно на- зывают константой ионизации или константами диссоциации кислоты. Численные значения кон- стант диссоциации некоторых кислот представ- лены на рис. 2-15. Более сильные кислоты, такие как фосфорная или угольная кислоты, имеют бо- лее высокие константы диссоциации, тогда как более слабые кислоты, такие как анион НРО42-, характеризуются более низкими значениями констант. На рис. 2-15 приводятся также значения р/Га, которые по аналогии с pH определяются в соот- ветствии с уравнением: pAa = lg(l/Aa) = -lgKa Чем сильнее способность соединения отдавать протон, тем более сильной кислотой оно явля- ется и тем более низкое значение рАа ему со- ответствует. Как мы увидим далее, численное значение рАа слабых кислот довольно легко определить. Значения рКа слабых кислот можно определить из кривых титрования Для определения количества кислоты в данном растворе проводят титрование. Для этого к точно отмеренному объему раствора кислоты добавля- ют раствор сильного основания (обычно едкого натра NaOH) с известной концентрацией. Рас- твор основания добавляют маленькими порци- ями до тех пор, пока не произойдет нейтрализа- ция кислоты, что устанавливают по показаниям pH-метра или по изменению окраски индикатора. Концентрацию кислоты в анализируемом раство- ре можно определить исходя из объема и концен- трации добавленного раствора NaOH. График, отражающий зависимость pH титру- емого раствора от концентрации добавленного основания, называется кривой титрования. Из этого графика можно определить величину рАа слабой кислоты. Проследим за ходом титрования 0,1 М раствора уксусной кислоты (для простоты обозначим ее здесь как НАс) с помощью 0,1 М раствора NaOH при 25 °C (рис. 2-16). Процесс включает в себя две обратимые реакции: Н2О Н+ + ОН- (2-5) НАс Н+ + Ас- (2-6) Эти реакции характеризуются соответствующи- ми константами равновесия: Aw = [Н+][ОН ] = 1 • 1014 М2 (2-7) [НД[Ас] [НАс] = 1,74-105М (2-8) В начале титрования, до добавления NaOH, ук- сусная кислота уже слегка диссоциирует, причем степень ее диссоциации можно определить, зная константу диссоциации (уравнение 2-8). По мере добавления NaOH ионы ОН- сое- диняются со свободными ионами Н+ и образуют молекулы воды. При этом концентрации обоих ионов в растворе должны постоянно соответ- ствовать значению ионного произведения воды (уравнение 2-7). Как только свободные ионы Н+ оказываются связанными, уксусная кислота НАс диссоциирует в соответствии с собственной константой диссоциации (уравнение 2-8). В ре- зультате по мере добавления щелочи концентра-
2.2 Ионизация воды, слабые кислоты и слабые основания [95] Число эквивалентов ОН О 50 100% Доля оттитрованной кислоты Рис. 2-16. Кривая титрования уксусной кислоты. После добавления каждой порции NaOH к раствору уксусной кислоты измеряют значение pH. Эту величину отклады- вают по оси ординат, тогда как по оси абсцисс отклады- вают долю общего количества NaOH, требуемого для пре- вращения всей уксусной кислоты в депротонированную форму, т. е. в ацетат. По полученным точкам проводят кривую титрования. В рамках указаны преобладающие ионные формы уксусной кислоты при соответствующих значениях pH. В средней точке кривой титрования кон- центрации донора и акцептора протонов равны, а значе- ние pH в этой точке численно равно значению р£а. Зона, выделенная голубым цветом, соответствует буферной зоне системы (когда ионизовано от 10 до 90% титруемой уксусной кислоты). ция НАс постоянно уменьшается, а концентра- ция аниона Ас- увеличивается. В средней точке титрования, точно соответствующей добавле- нию 0,5 моль эквивалентов NaOH, половина ис- ходной кислоты находится в диссоциированной форме, а это значит, что концентрация донора протона НАс становится равной концентрации акцептора Ас-. В этой точке соблюдается очень важное соотношение: значение pH раствора, со- держащего равные молярные концентрации ук- сусной кислоты и иона ацетата, а именно 4,76, точно равно значению рАа уксусной кислоты (сравните значения на рис. 2-15 и 2-16). Скоро нам станет ясен смысл этого соотношения, кото- рое соблюдается для всех слабых кислот. По мере того как мы продолжаем титрова- ние, добавляя новые порции NaOH, оставшаяся недиссоциированная кислота постепенно пре- вращается в ацетат. Конечная точка титрования наблюдается около pH 7,0: вся уксусная кислота передала свои протоны анионам ОН-, в результа- те чего образовались вода и ацетат. На протяже- нии всего процесса титрования существуют два взаимосвязанных равновесия (уравнения 2-5 и 2-6), каждое из которых характеризуется своей константой равновесия. На рис. 2-17 сравниваются кривые титрова- ния трех слабых кислот с сильно различающими- ся константами диссоциации: уксусной кислоты 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 Число эквивалентов ОН- 0 50 100% Доля оттитрованной кислоты Рис. 2-17. Сравнение кривых титрования трех слабых кис- лот: СН3СООН, Н2РО4 и NH£. В рамках указаны преобладаю- щие ионные формы этих соединений при соответствующих значениях pH. Справа указаны соответствующие буферные зоны. Сопряженные кислотно-основные пары являются эф- фективными буферными системами при тех значениях pH, при которых доноры протонов ионизованы на 10-90%.
[96] Часть!. 2. Вода (рКа = 4,76), дигидрофосфат-иона (рКа = 6,86) и иона аммония (рКа = 9,25). Кривые титрования этих кислот имеют одинаковую форму, но со- ответствуют разным значениям pH, поскольку кислоты различаются по силе. Уксусная кислота имеет наиболее высокое значение Ка (самое ма- ленькое рКа) и является самой сильной из этих трех слабых кислот (легче других отдает свой протон); при pH 4,76 она уже наполовину диссо- циирована. Дигидрофосфат отдает протон труд- нее; он диссоциирован наполовину при pH 6,86. Самой слабой из трех кислот является ион аммо- ния, он диссоциирует на 50% лишь при pH 9,25. Самый важный вывод, который можно сде- лать на основании кривых титрования слабых кислот, состоит в том, что характер этих кривых указывает на возможность использования слабых кислот и их анионов в качестве буферов, которые будут описаны далее. Краткое содержание раздела 2.2. ДИССОЦИАЦИЯ ВОДЫ. СЛАБЫЕ КИСЛОТЫ И СЛАБЫЕ ОСНОВАНИЯ Чистая вода — слабый электролит; в ней со- держатся равные количества ионов водорода (ионов гидроксония Н3О+) и гидроксид-ионов. Диссоциация воды характеризуется константой равновесия К = [Н+][ОН-] [Н2О] . Из этого выражения можно вывести значение ион- ного произведения воды (Kw). При 25 °C Kw = [Н+][ОН ] = 55,5К = 1014 М2. Значение pH водного раствора отражает кон- центрацию ионов водорода в логарифмиче- ских единицах: pH = lg(l/[H+]) = — lg[H+], Чем выше кислотность раствора, тем ниже его pH. Слабые кислоты частично диссоциируют с высвобождением иона водорода, снижая тем самым pH водного раствора. Слабые основания принимают протон, повышая pH. Тенденция принимать или отдавать протон для каждого конкретного основания или кислоты характери- зуется константой диссоциации (Ка): _ [Н+][А-] К<х> [НА] Значение рКа отражает относительную силу слабого основания или кислоты в логарифми- ческих единицах: рКа = lg( 1 /Ка) = — lgKa. Чем сильнее кислота, тем ниже рКа этой кис- лоты; чем сильнее основание, тем выше рКа этого основания. Значение рКа можно опреде- лить экспериментально: оно равно значению pH в средней точке кривой титрования дан- ной кислоты или основания. 2.3. Роль буферных систем в поддержании pH в биологических системах Почти каждый биологический процесс зависит от pH; даже незначительные изменения pH мо- гут вызвать сильные изменения скоростей про- цессов. Это справедливо не только для тех ре- акций, в которых напрямую участвует ион Н+, но и для тех, в которых он, как может показать- ся, не принимает никакого участия. Ферменты, катализирующие многие реакции в клетке, и различные молекулы, на которые они так или иначе воздействуют, содержат ионизируемые группы и характеризуются определенным зна- чением рКа. Например, протонированные ами- ногруппы и карбоксильные группы в амино- кислотах, а также фосфатные группы в нукле- отидах выступают в качестве слабых кислот; их состояние ионизации зависит от pH среды. (Если ионизируемая группа спрятана вглубь белка, а не экспонирована на его поверхности, окруженной водным раствором, соответствую- щее значение рКа, т. е. кажущееся значение рКа, может сильно отличаться от рКа в воде.) Ранее мы уже отмечали, что ионные взаимодействия важны для стабилизации белковых молекул и позволяют ферментам узнавать и связывать свои субстраты. В клетках живых организмов поддерживает- ся постоянное значение pH, соответствующее оп- тимальному состоянию ионизации биомолекул (обычно около 7). Значение pH во внеклеточной жидкости у многоклеточных организмов также строго регулируется. Постоянство pH достигает- ся в первую очередь с помощью биологических буферов — смесей слабых кислот и сопряженных оснований.
2.3 Роль буферных систем в поддержании pH в биологических системах [97] Буферы — это смеси слабых кислот и сопряженных оснований Буферы представляют собой водные системы, способные препятствовать изменению pH при добавлении небольших количеств кислоты (Н+) или основания (ОН ). Буферная система состоит из слабой кислоты (донора протона) и сопряжен- ного с ней основания (акцептора протона). При- мером буферной системы может служить смесь равных количеств уксусной кислоты и ацетата, что соответствует средней точке кривой титрова- ния, показанной на рис. 2-16. Обратите внимание, что кривая титрования уксусной кислоты имеет относительно горизонтальный участок, распро- страняющийся приблизительно на одну единицу pH в каждую сторону от средней точки, соответ- ствующей pH 4,76. При увеличении концентра- ции ионов Н+ или ОН- в этой области происхо- дит лишь слабое изменение pH, которое намного меньше, чем изменения, возникающие при добав- лении такого же количества этих ионов за преде- лами данного участка. Этот относительно плоский участок кривой соответствует буферной зоне со- пряженной кислотно-основной пары уксусная кислота/ацетат. В средней точке буферной зоны, где концентрация донора протона (уксусной кис- лоты) точно равна концентрации сопряженного основания (ацетата), буферная емкость системы максимальна. Это означает, что увеличение кон- центрации ионов Н+ или ОН- в этой области вы- зывает минимальные изменения pH. Значение pH в средней точке кривой титрования точно равно значению рКа титруемой кислоты. При добавле- нии небольших количеств ионов Н+ или ОН- в ацетатный буфер его pH несколько изменяется, но эти изменения несоизмеримо слабее тех, которые наблюдаются при добавлении тех же количеств ионов в чистую воду или в раствор соли сильного основания и сильной кислоты (например, NaCl), не обладающей буферной емкостью. Буферная емкость является результатом рав- новесия двух обратимых реакций, протекающих в растворе, содержащем приблизительно равные концентрации донора протонов и сопряженного с ним акцептора. На рис. 2-18 продемонстриро- ван механизм действия буферной системы. Если мы добавляем к буферному раствору ионы Н+ или ОН-, возникает небольшое изменение в со- отношении относительных концентраций слабой xw=[H+][OH-] (СН3СООН) Рис. 2-18. Буферная система уксусная кислота/ацетат. Благодаря обратимости реакции диссоциации уксусной кислоты система может принимать как ионы Н+, так и ОН-. Донор протонов (уксусная кислота, НАс) имеет резерв связанных протонов, которые при необходимости могут выделяться и нейтрализовывать добавляемые в систему ионы ОН- с образованием Н20. Это происходит, как толь- ко равновесие в системе нарушается и значение [Н+] [ОН-] превышает 10-14 М2 (при 25 °C). Равновесие быстро вос- станавливается, так что ионное произведение воды вновь становится равным 10-14 М2, однако теперь временно кон- центрация Н+ оказывается снижена. В результате выраже- ние [Н+] [Ас-]/[НАс] ниже значения Ка, так что НАс вновь диссоциирует, пока система не достигнет равновесия. Аналогичным образом, сопряженное основание (Ас-) мо- жет реагировать с добавляемыми в систему ионами Н+. И вновь две реакции диссоциации стремятся к равновесию. В соответствии с данным механизмом сопряженная кис- лотно-основная пара, такая как уксусная кислота/ацетат, препятствует изменениям pH, вызванным добавлением небольших количеств кислоты или основания. Буферное действие — это всего лишь следствие взаимосвязи двух обратимых реакций, стремящихся к состоянию равновесия в соответствии с константами Kw и Ка. кислоты и ее аниона и, следовательно, небольшое изменение pH. Уменьшение концентрации одно- го из компонентов буферной системы точно урав- новешивается повышением концентрации друго- го компонента. Сумма компонентов при этом не меняется, меняется лишь их соотношение. Для каждой сопряженной кислотно-основ- ной пары характерна своя область pH, где она яв- ляется эффективным буфером (рис. 2-17). Пара Н2РО4“/НРО42“ имеет рКа = 6,86 и поэтому про- являет свойства буфера в диапазоне pH от 5,9 до 7,9; пара NH4+/NH3 с рКа = 9,25 может служить буфером в области pH от 8,3 до 10,3.
[98] Часть I. 2. Вода Уравнение Хендерсона-Хассельбаха. pH, рКа и концентрации компонентов в буферной системе связаны простым соотношением Кривые титрования уксусной кислоты, Н2РО4- и NH4+ (рис. 2-17) мало различаются по форме. Это позволяет предположить, что все они отражают некую общую закономерность. И действительно так: форма кривой титрования любой кислоты описывается уравнением Хендерсона-Хассель- баха, анализ которого помогает понять буферные свойства и кислотно-основной баланс в крови и тканях позвоночных животных. Данное уравне- ние — по существу еще одна форма выражения константы диссоциации кислоты. Уравнение Хендерсона-Хассельбаха для диссоциации сла- бой кислоты НА с образованием ионов Н+ и ОН- выглядит следующим образом: _[НД[А] [НА] Сначала решим это уравнение относительно [Н+]: [НА] Возьмем отрицательный логарифм обеих частей уравнения: [НА] -lg[H+] =-lg/Ca — Ig-j-^rj- Заменяя lg[ 111 ] на pH и IgA, на р/<;„ получаем: , [НА] pH = рха -lg-[A=j Теперь поменяем числитель и знаменатель в вы- ражении -lg[HA][A], для чего потребуется из- менить знак, и получим уравнение Хендерсона- Хассельбаха: 1 [А] pH - рАа + 1g— (2 9) Данное уравнение описывает кривые титрования всех слабых кислот и позволяет вывести ряд важ- ных количественных соотношений. Например, из него следует, почему рХа слабой кислоты числен- но равно значению pH в средней точке на кривой титрования. В данной точке [НА] = [А ], следо- вательно, pH = рАа + Igl = рАа + 0 = рАа Уравнение Хендерсона-Хассельбаха позволяет нам также: 1) рассчитать рХа при заданном зна- чении pH и молярном соотношении донора и ак- цептора протонов; 2) рассчитать pH, зная рХа и молярное соотношение донора и акцептора прото- нов; 3) рассчитать молярное соотношение донора и акцептора протонов, если известны pH и рХа. Слабые кислоты и основания служат буферами в клетках и тканях Внеклеточные и внутриклеточные жидкости многоклеточных организмов имеют характерные и практически постоянные значения pH. Первая линия защиты организма от изменений pH обе- спечивается буферными системами. Цитоплазма большинства клеток содержит высокую концен- трацию белков, состоящих из аминокислот, чьи функциональные группы действуют как слабые кислоты или основания. Например, рХа ими- дазольного кольца в боковой цепи гистидина (рис. 2-19) составляет 6,0; таким образом, белки, содержащие остатки гистидина, являются эффек- тивными буферами в области нейтральных значе- ний pH, а боковая цепь гистидина в этой области значений pH может существовать как в протони- рованной, так и в непротонированной форме. Пример 2-5 ДИССОЦИАЦИЯ ГИСТИДИНА Рассчитайте, какова доля молекул гистидина, име- ющих протонированное имидазольное кольцо при pH 7,3. Значения рХа для гистидина: pXt = 1,82, рХ2 (имидазол) = 6,00 и рХ3 = 9,17 (см. рис. 3-12, б). Решение. Три ионизируемые группы гистидина имеют достаточно сильно различающиеся значе- С----N4 II НС----Nz Н Рис. 2-19. Ионизация гистидина. Аминокислота гисти- дин, входящая в состав белков, представляет собой сла- бую кислоту. Значение р£а протонированного азота в боковой цепи равно 6,0.
2.3 Роль буферных систем в поддержании pH в биологических системах [99] ния рХа, так что первая кислота (группа —СООН) полностью ионизуется до того, как вторая группа (протонированный имидазол) начинает отдавать свой протон, а вторая группа в свою очередь полно- стью ионизируется до того, как начинает диссоции- ровать третья группа (—NH3). (С помощью уравне- ния Хендерсона-Хассельбаха можно показать, что слабая кислота, ионизованная лишь на 1% при pH на две единицы ниже своего значения рХа, ионизо- вана на 99% при pH на две единицы выше значения рХа; см. также рис. 3-12, б.) При pH 7,3 карбоксиль- ная группа гистидина полностью депротонирована (—СОО ), а а-аминогруппа полностью протониро- вана (—NH3). Следовательно, можно утверждать, что при pH 7,3 частично диссоциирована лишь имидазольная группа, которая может находиться как в протонированной (обозначим ее через HisH+), так и в депротонированной форме (His). Используем уравнение Хендерсона- Хас- сельбаха: 1 [А] pH-pXa + lg— Подставляем значения рХ2 = 6,0 и pH = 7,3 и по- лучаем: [His] 7,3= 6,0 + 1g [HisH+] [His] 1,3 = lg[HisH+] [His] IO13 = r„- „+1 = 2,0 • 101 [HisH+] Таким образом, доля молекул гистидина, нахо- дящихся при pH 7,3 в протонированной форме HisH, составляет 1/21 (1 часть HisH+ и 21 часть молекул гистидина, находящихся в любой фор- ме), или около 4,8%. Нуклеотиды, такие как АТР, как и многие другие низкомолекулярные метаболиты, содержат функ- циональные группы, способные к ионизации. Именно они обеспечивают буферные свойства цитоплазмы. Некоторые высокоспециализиро- ванные органеллы и внеклеточные компартменты содержат в больших концентрациях соединения, которые обеспечивают их буферную емкость: ор- ганические кислоты в вакуолях растений, аммо- нийный буфер в моче. Фосфатная и бикарбонатная буферные системы играют наиболее важную роль с био- логической точки зрения. В фосфатной буфер- ной системе, действующей в цитоплазме любой клетки, в качестве донора протонов выступа- ет Н2РО4, а в качестве акцептора протонов - нроЬ Н2РО4 Н+ + НРО4” Фосфатный буфер наиболее эффективно дейст- вует в области pH, близкой к значению рХа = 6,86 (рис. 2-15, 2-17), т. е. в диапазоне pH от 5,9 до 7,9. Таким образом, он эффективен как раз в биоло- гических жидкостях. Например, в большинстве цитоплазматических компартментов клеток мле- копитающих pH находится в интервале от 6,9 до 7,4 (см. пример 2-6). Функции буфера в плазме крови частично выполняет бикарбонатная система, состоящая из угольной кислоты Н2СО3 в качестве донора про- тона и бикарбоната НС О/ в качестве акцептора протона (Xt — константа диссоциации по первой ступени): н2со3^^ н++нсо3 [Н+][НСО3] К1 [Н2СО3] Данная буферная система сложнее других кис- лотно-основных пар, поскольку один из ее ком- понентов — угольная кислота — образуется при растворении (р) в воде диоксида углерода в соот- ветствии с обратимой реакцией: СО2(р) + Н2О Н2СО3 _ [СО2(р)][Н2О] К2~ [Н2СО3] В нормальных условиях диоксид углерода — газ, и концентрация растворенного СО2 определяется равновесием с газообразным СО2 (г): СО2(г) СО2(р) _[СО2(р)] 3 [СО2(г)] Итак, pH бикарбонатного буфера определяется концентрацией Н2СО3 и НСО3“, а концентрация Н2СО3, в свою очередь, определяется концен- трацией растворенного СО2, которая зависит
[100] Часть!. 2. Вода Пример 2-6 ФОСФАТНЫЕ БУФЕРЫ а) Рассчитайте pH смеси растворов 0,042 М NaH2PO4 и 0,058 М Na2HPO4. Решение. Применим уравнение Хендерсона-Хассельбаха [сопряженное основание] pH = рКа + к---------------------- [кислота] В нашем случае кислота (вещество, которое отдает протон) — Н2РО4, а сопря- женное основание (вещество, которое присоединяет протон) — НРО4“. Под- ставив данные нам значения концентрации кислоты и сопряженного основа- ния и р/% (6,86), получим: рН= 6,86+ lg(^|^)= 6,86+ 1g 1,38 = 6,86 + 0,14= 7,0 Для грубой оценки правильности решения можно применить следующий принцип: если в растворе больше сопряженного основания, чем кислоты, то от- титровано более 50% кислоты, и, таким образом, pH больше р/% (6,86; значе- ние, при котором оттитровано точно 50% кислоты). б) Насколько изменится pH 1 л буфера, приготовленного в примере (а), если к нему добавить 1,0 мл 10,0 н. NaOH? Решение. 1 л буфера содержит 0,042 моль NaH2PO4. При добавлении 1,0 мл 10,0 и. NaOH (0,010 моль) эквивалентное количество (0,010 моль) NaH2PO4 переходит в Na2HPO4, получается 0,032 моль NaH2PO4 и 0,068 моль Na2HPO4. pH такого раствора равен: Рн^рК. + 18ШМ] = 6,86+ 1g?® = 6,86 + 0,33= 7,2 v, vOZ в) Насколько изменится pH 1 л чистой воды (pH = 7), если к нему добавить 1,0 мл 10,0 и. NaOH? Сравните результат с полученным в предыдущем при- мере. Решение. NaOH полностью диссоциирует на ионы Na+ и ОН-: [ОН ] = 0,010 моль/л, или 1,0 • 10-2 М. рОН = - log [ОН ], рОН = 2,0. Зная, что рОН + pH = 14 для всех растворов, получаем, что в нашем растворе pH = равен 12. Как видим, одно и то же количество NaOH меняет pH 1 л воды с 7 до 12, а буфера из примера (б) всего лишь с 7 до 7,2, что показывает эффективность буферных растворов! от концентрации СО2 в газовой фазе или пар- циального давления СО2 (обозначается j>CO2). В итоге pH бикарбонатного буфера, находяще- гося в контакте с газовой фазой, определяется концентрацией НСО3- в водной фазе и j>CO2 в газовой фазе. Бикарбонатный буфер играет важную физио- логическую роль, поскольку поддерживает pH плазмы крови около значения 7,4. В такой буферной системе, как было сказано выше, дейст- вуют три взаимосвязанных обратимых равнове- сия, в данном случае между газообразным СО2
2.3 Роль буферных систем в поддержании pH в биологических системах [101] Н+ + НСОз / реакция 1 Жидкая фаза (кровь в капиллярах) Газообразная фаза (воздушное пространство легких) Н£О3 / реакция 2 СО2(р) реакция 3 СО2(г) Рис. 2-20. Бикарбонатная буферная система. Между С02, находящимся в воздушном пространстве легких, и бикар- бонатным буфером в плазме крови, протекающей через капилляры легких, существует равновесие. Поскольку концентрация растворенного С02 быстро регулирует- ся интенсивностью дыхания, бикарбонатная буферная система крови находится практически в равновесии с об- ширным потенциальным резервуаром С02. в воздушном пространстве легких и бикарбона- том (НСО3“) в плазме крови (рис. 2-20). Когда ионы Н+ (например, из молочной кис- лоты, образующейся в мышечной ткани при боль- шой физической нагрузке) попадают в кровь при ее прохождении через ткани, в реакции 1 на рис. 2-20 наступает новое равновесие, соответствующее бо- лее высокой концентрации Н2СО3. При этом в со- ответствии с реакцией 2 возрастает концентрация СО2(р) в крови, что по реакции 3 приводит к росту парциального давления СО2(г) в воздушном про- странстве легких, а лишний СО2 выдыхается. Уве- личение pH плазмы крови (например, в результате образования NH3 при катаболизме белков) вызы- вает противоположный ход событий: снижение концентрации Н+ в крови способствует усилению диссоциации Н2СО3 на Н+ и НСО3, что заставляет дополнительное количество газообразного СО2 из легких растворяться в крови. Таким образом, ин- тенсивность дыхания, т. е. скорость вдыхания воз- духа и выдыхания СО2, может обеспечить быст- рые сдвиги равновесия, что способствует поддер- жанию в крови постоянного значения pH. Частота дыхания контролируется стволом головного моз- га: при повышении содержания СО2 в крови или снижении pH крови дыхание учащается и стано- вится более глубоким. При pH 7,4, соответствующем pH плаз- мы крови, в растворе присутствует в основном НСО3_ и совсем мало Н2СО3, а при добавлении небольшого количества основания (NH3 или ОН ) происходит титрование Н2СО3, приводя- щее к снижению буферной емкости. Кажется, что важная роль угольной кислоты (рКа = 3,57 при 37 °C) в создании буферной системы плазмы крови (pH 7,4) противоречит выдвинутому нами ранее утверждению, что наиболее эффективный буфер создается в диапазоне рКа ± 1 единица pH. Данный парадокс объясняется тем, что в крови содержится много растворенного углекислого газа СО2(р), а его равновесие с Н2СО3 устанавли- вается достаточно быстро: СО2(р) + Н2О Н2СО3 Мы можем теперь определить константу - константу равновесия реакции гидратации угле- кислого газа. = [Н2СО3] Kh [СО2(р)] Теперь, учитывая источник СО2(р), можно за- писать [Н2СО3] как Kh [СО2(р)] и подставить это выражение в уравнение кислотной диссоциации Н2СО3: _[Н+][НСО3] _[Н+][НСО3] а [Н2СО2] Kh [СО2(р)] Теперь можно иначе записать равновесие в реак- ции диссоциации Н2СО3: _ [Н+][НСО3] КьКа Хкомбин. [С02(р)] Можно рассчитать значение новой констан- ты Ккомбин и кажущееся значение рКкомбин, зная экспериментально определенные значения Kh (3,0 - IO 3 М) и Ка (2,7 • IO 4 М) при 37 °C: хкомбин. = (3,о-10-3 М) (2,7.10-4 м) = = 8,1 -10 7 М2 Р^Чсомбин. — 6, 1 В клинической практике часто значение кажу- щейся, или комбинированной, константы рКкомбин принимают равным 6,1, что упрощает расчеты. В этом случае получаем: . [НСО3] pH = 6,1 +1g 1 (0,23 -/9СО2) где парциальное давление углекислого газа, рСО2, выражено в килопаскалях (кПа; обычно
[102] Часть I. 2. Вода j>CO2 находится в диапазоне от 4,6 до 6,7 кПа), а 0,23 — это соответствующий коэффици- ент растворимости СО2 в воде; в результате 0,23 • рСО2 «1,2 кПа. Концентрация НСО3“ в плазме обычно составляет около 24 мМ. При отсутствии лечения диабет приводит к угрожающему состоянию — ацидозу КЯ Значение pH плазмы крови человека в нор- ме колеблется от 7,35 до 7,45, так что многие ферменты плазмы крови проявляют максималь- ную активность именно в этом диапазоне pH. Нарушение механизма регуляции pH, например, при тяжелых формах диабета обусловлено «пере- производством» метаболических кислот, что вы- зывает падение pH крови до 6,8 и ниже (ацидоз) и может приводить к необратимым повреждениям клеток и к смерти. При некоторых других забо- леваниях значение pH возрастает настолько, что тоже может стать причиной смерти. Многие особенности структуры и функцио- нирования клеток связаны со значением pH, а каталитическая активность ферментов особенно Рис. 2-21. Оптимальный уровень pH для некоторых фер- ментов. Пепсин — пищеварительный фермент, находящий- ся в желудочном соке, pH которого составляет около 1,5. Именно такие условия оптимальны для действия пепсина. Пищеварительный фермент трипсин действует в тонком ки- шечнике, поэтому его оптимум pH совпадает с нейтральным значением pH в просвете тонкой кишки. Щелочная фосфа- таза костной ткани — гидролитический фермент, участву- ющий в минерализации костного вещества. чувствительна к этому параметру. Обычно фер- менты проявляют максимальную каталитическую активность при определенном значении pH - оптимуме pH (рис. 2-21). Отклонение величины pH в любую сторону от оптимального значения часто сопровождается резким падением фермента- тивной активности. Таким образом, незначитель- ные изменения pH могут приводить к большим изменениям скоростей некоторых важнейших ферментативных реакций. В связи с этим биоло- гический контроль pH в клетке и в жидкостях ор- ганизма играет необычайно важную роль во всех процессах метаболизма и клеточной активности, а изменение pH крови вызывает серьезные физио- логические последствия (см. доп. 2-1). Если больного диабетом не лечить, то не- достаток инсулина или нечувствительность к инсулину (в зависимости от типа заболевания) приводит к нарушению процесса поступления глюкозы из крови в ткани и заставляет ткани ис- пользовать в качестве источника энергии запасен- ные жирные кислоты. По причинам, которые мы рассмотрим позднее (см. разд. 23.2), эта зависи- мость от жирных кислот вызывает накопление в высокой концентрации двух карбоновых кислот — Р-гидроксимасляной и ацетоуксусной кислоты (концентрация в плазме 90 мг в 100 мл по срав- нению с < 3 мг в 100 мл у здорового человека; с мочой выводится около 5 г за 24 ч по сравнению с < 125 мг за 24 ч в норме). Диссоциация этих кис- лот снижает pH крови до значения ниже 7,35, что приводит к ацидозу. Тяжелый ацидоз сопровожда- ется головными болями, сонливостью, тошнотой, рвотой и диареей, далее могут возникнуть ступор, кома и конвульсии; по-видимому, основной при- чиной таких последствий является неоптимальная работа некоторых ферментов. Если у пациента об- наружена высокая концентрация глюкозы в кро- ви, низкое значение pH плазмы и высокий уровень содержания p-гидроксимасляной и ацетоуксусной кислот в крови и моче, наиболее вероятный диаг- ноз в таком случае — сахарный диабет. К ацидозу могут также приводить и другие со- стояния. Употребление постной пищи и голодание приводят к использованию в качестве источника энергии запасных жирных кислот и в результате — к тем же последствиям, что и диабет. Очень высо- кая физическая нагрузка, какую испытывают, на- пример, спринтеры или велосипедисты, приводит к временному накоплению в крови молочной кис-
2.3 Роль буферных систем в поддержании pH в биологических системах [103] Дополнение 2-1 ‘Г МЕДИЦИНА Побыть немного кроликом (Не пытайтесь повторить этот опыт!) Ниже представлен фрагмент записей Дж. Б. С. Хол- дейна, относящихся к эксперименту по контролиро- ванию уровня pH крови и опубликованных им в кни- ге «Возможные миры» (Possible Worlds, Harper and Brothers, 1928). «Я хотел понять, что произойдет с человеком, если его сделать более кислым или более щелочным... Кто-то скажет, что сначала следовало бы поставить экс- перимент на кролике, и некоторые исследователи как раз и действуют в этом направлении, однако трудно понять, что на самом деле чувствует кролик в опреде- ленной ситуации. И действительно, некоторые кроли- ки совершенно не готовы к сотрудничеству. ...Поэтому я и мой коллега начали ставить экспе- рименты друг на друге. Мой коллега доктор X. В. Дэвис и я принялись подщелачивать свой организм, усиленно дыша и употребляя в пищу около трех унций бикарбона- та натрия. Подкисляли мы себя путем сидения в душной комнате с содержанием углекислого газа от шести до семи процентов. В результате мы дышали так, как будто только что закончили состязание по гребле, к тому же у нас была довольно сильная головная боль. Каждый из нас провел в комнате не более двух часов, хотя в нашей газовой камере не оставалось неискоренимого запаха горчичного газа от экспериментов военного времени, который заставлял всхлипывать каждого, кто входил в комнату. Наиболее очевидная вещь, которую следовало проделать, — выпить соляную кислоту. Если ее пить не- разбавленной, она растворяет зубы и сжигает гортань, но я хотел позволить ей продиффундировать во все отделы организма. Самый крепкий раствор, который я пил, со- стоял из одной части концентрированной кислоты и ста частей воды. Но уже пинты для меня было достаточно, так как я получил раздражение пищевода и желудка, хотя расчеты показывали, что для достижения нужного мне эффекта мне следовало выпить полтора галлона... Я утверждал, что если глотать хлорид аммония, то в орга- низме он частично разлагается, высвобождая соляную кислоту. Теперь это доказано... Печень превращает аммо- ний в безопасное вещество мочевину, и лишь затем оно попадет в сердце и головной мозг. Соляная кислота со- единяется с бикарбонатом натрия, который присутству- ет во всех тканях, в результате чего образуется хлорид натрия и углекислый газ. Таким образом, этот газ обра- зовывался во мне со скоростью шесть кварт в час (хотя все же менее часа)... Я был удовлетворен тем, что мне удалось воспро- извести в себе тот тип учащенного дыхания, который наблюдается на терминальной стадии болезней почек и диабета. Было давно известно, что это симптомы от- равления кислотой, однако каждый случай отравления кислотой усложняется дополнительными химически- ми аномалиями, так что было непонятно, какие же симптомы вызваны действием кислоты как таковой». «Теперь перенесемся в Гейдельберг, где Фройденберг и Гиорги изучали тетанию у детей... Им пришло в голову, что было бы неплохо проверить, что будет, если организм больного станет более кислым. Тетания была случайно обнаружена у нескольких пациентов, которых лечили от других недугов большими дозами бикарбоната натрия или которые потеряли большое количество соляной кислоты в результате частой рвоты. Если щелочность тканей приво- дит к тетании, то, возможно, кислота могла бы излечить от нее. К сожалению, мало кто возьмется лечить умирающе- го ребенка, помещая его в комнату, наполненную углекис- лым газом, или давая ему выпить соляной кислоты. Так что из этой идеи ничего не вышло; врачи давали больным известь, которую трудно проглотить и которая нарушает пищеварение, но которая, безусловно, помогла во многих случаях заболевания тетанией. Но когда они прочли мою статью о воздействии хлорида аммония, они стали давать его детям и были обрадованы тем, что тетания отступала уже через не- сколько часов. Потом этот способ использовался еще и в Англии, и в Америке, как для детей, так и для взрос- лых. Это лечение не устраняет причину заболевания, но приводит больного в такое состояние, в котором он имеет большой шанс выздороветь». лоты. При почечной недостаточности нарушается способность организма регулировать уровень би- карбоната в крови. При заболеваниях легких (та- ких как эмфизема, пневмония и астма) снижается способность распределять СО2, образующийся при окислении энергетических веществ в тканях, что приводит к накоплению Н2СО3. При ацидозе следует идентифицировать и лечить вызвавшее его заболевание: диабетикам назначают инсулин, пациентам с больными легкими — стероиды или антибиотики. В особо тяжелых случаях пациентам внутривенно вводят раствор бикарбоната.
[104] Часть!. 2. Вода Пример 2-7 ЛЕЧЕНИЕ АЦИДОЗА БИКАРБОНАТОМ Почему внутривенное введение раствора бикар- боната повышает pH плазмы крови? Решение. Отношение [НСО3]/[СО2(р)] опреде- ляет pH бикарбонатного буфера в соответствии с уравнением: и [НСО3] pH = 6,1 + 1g—L (0,23 ^СО2) Если [НСО3] возрастает, aj>CO2 не меняется, то pH увеличивается. II II _ Il II R—О—Р— ОН + НО—Р—О R—О—РОРО + Н20 I I II 0“ 0“ 0“ 0“ (ADP) (АТР) Фосфоангидрид Рис. 2-22. Участие воды в биологических реакциях. АТР представляет собой фосфоангидрид, образующийся в ре- акции конденсации (потери молекулы воды) между ADP и фосфатом. Под R на данном рисунке подразумевается аденозинмонофосфат. Эта реакция конденсации идет с затратой энергии. Обратная реакция — гидролиз (присо- единение молекулы воды) АТР до ADP и фосфата — идет с выделением эквивалентного количества теплоты. Эти ре- акции конденсации и гидролиза АТР — только один при- мер роли воды как реагента в биологических процессах. Краткое содержание раздела 2.3 РОЛЬ БУФЕРНЫХ СИСТЕМ В ПОДДЕРЖАНИИ pH В БИОЛОГИЧЕСКИХ СИСТЕМАХ Смесь слабой кислоты (или основания) и ее соли препятствует изменениям pH, вызван- ным добавлением ионов Н+ или ОН-, т. е. дей- ствует в качестве буфера. Значение pH раствора слабой кислоты (или основания) и ее соли можно вычислить по уравнению Хендерсона-Хассельбаха: 1 [А] pH = pKa + lgy-— [НА] Значение pH внутриклеточных и внеклеточных жидкостей организма поддерживается на опти- мальном (физиологическом) уровне (обычно pH около 7,0) с помощью фосфатного и бикарбо- натного буферов. Для большинства ферментов такие значения pH являются оптимальными. Состояния, при которых pH увеличивается, приводя к ацидозу, или снижается, приводя к алкалозу, могут угрожать жизни человека. 2.4. Участие воды в реакциях Вода является не просто средой, в которой проис- ходят химические реакции в живых клетках; она принимает непосредственное участие во многих химических реакциях. Образование АТР из ADP и неорганического фосфата — это пример реак- ции конденсации, идущей с образованием воды (рис. 2-22). Обратная реакция (гидролиз) идет с присоединением молекулы воды. Реакции ги- дролиза происходят при ферментативном разло- жении белков, углеводов и нуклеиновых кислот. Реакции гидролиза, протекающие под действием ферментов гидролаз, практически всегда явля- ются экзергоническими — при образовании двух молекул из одной возрастает энтропия системы. А обратные реакции, т. е. образование клеточных полимеров из мономерных звеньев (конденса- ция), являются эндергоническими и не могут протекать самопроизвольно. Как увидим далее, клетка умеет обходить эти термодинамические запреты, сопрягая эндергонические реакции кон- денсации с такими экзергоническими процесса- ми, как, например, разрыв ангидридной связи в молекуле АТР. Когда вы читаете эту книгу, вы поглощаете кислород (по крайней мере, мы на это надеемся!). В результате окисления топливных молекул (на- пример, глюкозы) образуются вода и углекислый газ. Суммарная реакция выглядит следующим образом: С6Н12О6 + 6О2----> 6СО2 + 6Н2О Глюкоза Некоторым животным, обитающим в условиях очень сухого климата (песчанкам, кенгуровым крысам, верблюдам), этой «метаболической» воды, образующейся при окислении пищи и за-
2.5 Приспособленность живых организмов к водной среде [105] пасных жиров, хватает для того, чтобы длитель- ное время обходиться без питьевой воды. В эритроцитах углекислый газ, образующий- ся при окислении глюкозы по реакции, катализи- руемой ферментом карбоангидразой, превраща- ется в растворимый НСО3: СО2 + Н2О НСО3 + Н+ В данной реакции вода не только выступает в ка- честве субстрата, но также участвует в переносе протона, образуя цепочки связанных водородны- ми связями молекул, через которые осуществля- ются «прыжки» протонов (рис. 2-13). Зеленые растения и водоросли для расщеп- ления воды в процессе фотосинтеза используют энергию солнечного света: свет 2Н2О + 2А----> О2 + 2АН2 Здесь под А подразумеваются электроноакцеп- торные молекулы, которые могут быть разными у разных типов фотосинтезирующих организ- мов. Вода в этой реакции служит донором элект- ронов в окислительно-восстановительной цепи (рис. 19-57), играющей ключевую роль в любом живом организме. Краткое содержание раздела 2.4 УЧАСТИЕ ВОДЫ В РЕАКЦИЯХ Вода в биологических системах выполняет двоякую функцию: является средой, в кото- рой происходят реакции метаболизма, и сама участвует во многих биологических процес- сах, таких как гидролиз, конденсация и окис- лительно-восстановительные реакции. 2.5. Живые организмы приспособлены к водной среде Живые организмы успешно приспособились к во- дной среде и используют ее необычные свойства. Благодаря своей высокой удельной теплоемко- сти (количество тепловой энергии, необходимое для повышения температуры 1 г вещества на ГС) вода действует в клетках как «тепловой буфер», позволяющий поддерживать в организме относи- тельно постоянную температуру вне зависимости от изменений температуры окружающей среды и от количества тепла, выделяющегося в процессе метаболизма. Кроме того, высокая теплота испа- рения воды (табл. 2-1) используется некоторыми позвоночными для защиты организма от пере- грева путем испарения пота. Сильно выраженное сцепление молекул в жидкой воде, обусловленное действием межмолекулярных водородных связей, способствует эффективному транспорту раство- ренных питательных веществ от корней к листь- ям растений в процессе транспирации. Даже то, что лед имеет более низкую плотность, чем вода, важно для жизненного цикла водных организмов. Замерзание водоемов начинается с поверхности, и образующийся слой льда защищает нижний слой воды и его обитателей от холодного атмосферного воздуха и от замерзания. Однако наиболее суще- ственным для всех живых организмов является тот факт, что многие физические и биологические свойства макромолекул, в частности белков и ну- клеиновых кислот, обусловлены их взаимодей- ствием с молекулами воды. Вода оказала глубокое и решающее влияние на ход биологической эво- люции. Если где-то еще во Вселенной существует жизнь, она вряд ли напоминает земную, разве что это место так же богато жидкой водой, как Земля. В воде обитают многочисленные виды живых организмов. Мягкие кораллы, губки, мшанки и водоросли конкурируют за пространство на этом рифе у Филиппинских островов.
[106] Часть I. 2. Вода Ключевые термины Термины, выделенные жирным шрифтом, объясня- ются в глоссарии. pH 92 рХа94 Алкалоз 93 Амфифильный 81 Ацидоз 93 Буфер 97 Буферная зона 97 Ван-дер-ваальсовы взаимодействия 82 Водородная связь 75 Гидролиз 104 Гидрофильный 77 Гидрофобный 77 Гидрофобные взаимодей- ствия 81 Гипертонический 86 Гипотонический 86 Изотонический 85 Ионное произведение воды (/€w) 91 Конденсация 104 Константа диссоциации кислоты (Ха) 94 Константа равновесия (/Q90 Кривая титрования 94 Мицелла 81 Осмолярность 85 Осмос 85 Силы Лондона 82 Сопряженная кислотно- основная пара 94 Уравнение Хендерсона- Хассельбаха 98 Энергия диссоциации 75 Дополнительная литература для дальнейшего изучения Общая информация Belton, P.S. (2000) Nuclear magnetic resonance studies of the hydration of proteins and DNA. Cell. Mol. Life Sci. 57, 993-998. Denny, M.W. (1993) Air and Water: The Biology and Physics of Life’s Media, Princeton University Press, Princeton, NJ. Замечательный обзор, посвященный свойствам воды с биологической точки зрения. Eisenberg, D. & Kauzmann, W. (1969) The Structure and Properties of Water, Oxford University Press, New York. Классическая работа, посвященная физической химии воды и гидрофобным взаимодействиям. Franks, Е & Mathias, S.E (eds) (1982) Biophysics of Water, John Wiley & Sons, Inc., New York. Большой набор статей по структуре чистой воды и ци- топлазмы. Gerstein, М. & Levitt, М. (1998) Simulating water and the molecules of life. Sci. Am. 279 (November), 100-105. Хорошо иллюстрированное описание метода компью- терного моделирования для изучения важных комплек- сов воды с белками и нуклеиновыми кислотами. Kandori, Н. (2000) Role of internal water molecules in bacteriorhodopsin. Biochim. Biophys. Acta 1460,177-191. Обзор средней степени сложности о роли внутрен- них цепочек воды для переноса протона в бактериоро- допсине. Kornblatt, J. & Kornblatt, J. (1997) The role of water in recognition and catalysis of enzymes. The Biochemist 19 (3), 14-17. Краткий полезный обзор о влиянии связанной воды на структуру и функции белков. Kuntz, LD. & Zipp, А. (1977) Water in biological systems. N. Engl. J. Med. 297,262-266. Краткий обзор физических состояний воды в цитозоле и ее взаимодействий с растворенными биомолекулами. Luecke, Н. (2000) Atomic resolution structures of bacteriorhodopsin photocycle intermediates: the role of discrete water molecules in the function of this light-driven ion pump. Biochim. Biophys. Acta 1460,133-156. Углубленный обзор, посвященный протонным насо- сам, использующим внутренние цепи молекул воды. Nicolls, Р. (2000) Introduction: the biology of the water molecule. Cell. Mol. Life Sci. 57,987-992. Краткий обзор свойств воды, предваряющий серию прекрасных обзорных статей, опубликованных в том же номере (особенно Pocker, а также Rand et. al., см. ниже). Symons, М.С. (2000) Spectroscopy of aqueous solutions: protein and DNA interactions with water. Cell. Mol. Life Sci. 57,999-1007. Westhof, E. (ed.) (1993) Water and Biological Macromolecules, CRC Press, Inc., Boca Ration, FL. Книга из 14 глав, каждая из которых написана отдель- ным автором, на углубленном уровне отражает исследо- вания структуры воды и ее взаимодействий с белками, нуклеиновыми кислотами, полисахаридами и липидами. Wiggins, Р.М. (1990) Role of water in some biological processes. Microbiol. Rev. 54,432-449. О роли воды в биологии с обсуждением физической структуры жидкой воды, ее взаимодействий с биомолеку- лами, а также состояния воды в живых клетках. Осмос Cayley, D.S., Guttman, H.J., & Record, М.Т., Jr. (2000) Biophysical characterization of changes in amounts and activity of Escherichia coli cell and compartment water and turgor pressure in response to osmotic stress. Biophys. J. 78, 1748-1764. Углубленное физическое исследование водной фрак- ции цитоплазмы бактерии Escherichia coli, выращенной на средах с разной осмолярностью (см. также Record et al., 1998, представлена ниже). Rand, R.P., Parsegian, V.A., & Rau, D.C. (2000) Intracellular osmotic action. Cell. Mol. Life Sci. 57,1018-1032. Обзор роли воды в ферментативном катализе; результа- ты получены при изучении концентрированых растворов.
Вопросы и задачи [107] Record, М.Т., Jr., Courtenay, E.S., Cayley, D.S., & Guttman, H.J. (1998) Responses of E. coli to osmotic stress: large changes in amounts of cytoplasmic solutes and water. Trends Biochem. Sci. 23,143-148. Обзор среднего уровня сложности о способах, которы- ми бактериальные клетки регистрируют изменения ос- молярности окружающей среды (см. также Cayley et al., 2000, представлена выше). Zonia, L., & Munnik, T. (2007) Life under pressure: hydrostatic pressure in cell growth and function. Trends Plant Sci. 12,90-97. Слабые взаимодействия в водных средах Chaplin, М. (2006) Do we underestimate the importance of water in cell biology? Nat. Rev. Molec. Cell Biol. 7,861-866. Fersht, A.R. (1987) The hydrogen bond in molecular recognition. Trends Biochem. Sci. 12,301-304. Четкое и краткое количественное описание роли водо- родных связей в узнавании на молекулярном уровне и ферментативном катализе. Frieden, Е. (1975) Non-covalent interactions: key to biological flexibility and specificity. J. Chem. Educ. 52,754-761. Обзор и примеры четырех типов слабых взаимодей- ствий, стабилизирующих макромолекулы и определяю- щих их биологическую специфичность. Jeffrey, G.A. (1997) An Introduction to Hydrogen Bonding, Oxford University Press, New York. Детальное обсуждение структуры и свойств водород- ных связей, в том числе в воде и биомолекулах. Ladbury, J. (1996) Just add water! The effect of water on the specificity of protein-ligand binding sites and its potential application to drug design. Chem. Biol. 3,973-980. Levy, Y. & Onuchic, J.N. (2006) Water mediation in protein folding and molecular recognition. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35,389-415. Углубленное обсуждение роли воды в структуре белка. Martin, T.W. & Derewenda, Z.S. (1999) The name is bond — H-bond. Nat. Struct. Biol. 6,403-406. Обзор доказательств, подтверждающих, что водород- ные связи частично носят ковалентный характер. Pocker, Y. (2000) Water in enzyme reactions: biophysical aspects of hydration-dehydration processes. Cell. Mol. Life Sci. 57,1008-1017. Обзор роли воды в ферментативном катализе на при- мере карбоангидразы. Schwabe, J.W.R. (1997) The role of water in protein-DNA interactions. Curr. Opin. Struct. Biol. 7,126-134. Обсуждение значения воды для специфичности и сродства во взаимодействиях между белками и ДНК. Stillinger, ЕН. (1980) Water revisited. Science 209,451-457. Короткий обзор физической структуры воды, вклю- чающий обсуждение важной роли водородных связей и природы гидрофобных взаимодействий. Tanford, С. (1978) The hydrophobic effect and the organization of living matter. Science 200,1012-1018. Обзор химических и энергетических основ гидрофоб- ных взаимодействий между биомолекулами в водных растворах. Слабые кислоты, слабые основания и буферы: практические задачи Segel, LH. (1976) Biochemical Calculations, 2nd edn, John Wiley & Sons, Inc., New York. Вопросы и задачи____________________________ 1. Растворимость этанола в воде. Объясните, по- чему этанол СН3СН2ОН лучше растворяется в воде, чем этан СН3СН3. 2. Расчет значения pH по концентрации ионов водорода. Каков pH раствора с концен- трацией протонов а) 1,75 • 10-5 моль/л; б) 6,50 • 10-10 моль/л; в) 1,0 • 10-4 моль/л; г) 1,50 • IO’5 моль/л? 3. Расчет концентрации ионов водорода по зна- чению pH. Какова концентрация протонов в рас- творе с pH а) 3,82; б) 6,52; в) 11,11? 4. Кислотность соляной кислоты в желуд- ке. В клинической лаборатории проводили титрование 10 мл желудочного сока, взятого у пациента через несколько часов после еды, с по- мощью 0,1 М раствора NaOH до нейтральной ре- акции. Для этого понадобилось 7,2 мл NaOH. В желудке пациента к этому времени уже не содер- жалось непереваренной пищи или напитков, так что считаем, что никаких буферов в желудочном соке нет. Какова была кислотность желудочного сока? 5. Расчет pH раствора сильной кислоты или сильного основания, а) Напишите реакцию дис- социации соляной кислоты, б) Рассчитайте pH раствора 5,0 • 10-4 М НС1. в) Напишите реакцию диссоциации гидроксида натрия, г) Рассчитайте pH раствора 7,0 • 10-5 М NaOH. 6. Расчет значения pH на основании концен- трации сильной кислоты. Найдите pH раствора, приготовленного разведением 3,0 мл 2,5 М НС1 водой до конечного объема 100 мл.
[108] Часть I. 2. Вода 7. Определение содержания ацетилхолина по изменению pH. Концентрацию медиатора аце- тилхолина можно определить по изменению pH в процессе гидролиза этого вещества. При инку- бации ацетилхолина с ферментом ацетилхолин- эстеразой он количественно превращается в хо- лин и уксусную кислоту, которая диссоциирует с образованием ацетат-иона и иона водорода: О СН3 II + I 1^0 СН3-С—о—СН2-СН2—N-СНз сн3 Ацетилхолин СН3 но—сн2—ch2^n—сн3+ сн3—с—О” + н+ сн3 о Холин Ацетат По данным анализа, водный раствор, содержа- щий неизвестное количество ацетилхолина, имел объем 15 мл и pH 7,65. После инкубации с ацетил - холинэстеразой pH раствора снизился до 6,87. Сколько молей ацетилхолина содержалось в 15 мл образца? Считайте, что анализируемая смесь не содержала буферов. 8. Физический смысл константы р/Са. Какой из перечисленных ниже водных растворов имеет са- мое низкое значение pH: 0,1 М НС1; 0,1 М уксус- ная кислота (рКа = 4,86); 0,1 М муравьиная кис- лота (рКа = 3,75)? 9. Приготовление уксуса. Один из способов при- готовления уксуса (далеко не самый лучший) со- стоит в разведении уксусной кислоты, единствен- ного кислого компонента уксуса, до подходящего значения pH (см. рис. 2-14) и добавлении необ- ходимых вкусовых добавок. При 25 °C уксусная кислота (Мг = 60) представляет собой жидкость с плотностью 1,049 г/мл. Рассчитайте объем ук- сусной кислоты, который нужно добавить к дис- тиллированной воде, чтобы получить 1 л уксуса (см. рис. 2-15). 10. Идентификация сопряженного основания. Какое вещество в приведенных парах сопряжен- ное основание? a) RCOOH, RCOO- в) Н2РО4- Н3РО4 б) RNH2, RNH3+ г) н2со3, нсо3- 11. Расчет pH раствора слабой кислоты и сопря- женного основания. Найдите pH разбавленно- го раствора, содержащего следующие молярные отношения ацетата калия и уксусной кислоты (рКа = 4,76): а) 2:1; б) 1:3; в) 5:1; г) 1:1; д) 1:10. 12. Зависимость растворимости от pH. Силь- но выраженная полярность воды и способность легко образовывать водородные связи делают ее прекрасным растворителем для находящихся в ионной форме (заряженных) веществ. Напротив, неионизированные и неполярные органические вещества, такие как бензол, очень плохо раство- ряются в воде. В принципе растворимость в воде любой органической кислоты или основания можно увеличить, переведя молекулу в заряжен- ную форму. Например, бензойная кислота плохо растворяется в воде, однако добавление к раство- ру бикарбоната натрия приводит к повышению pH и депротонированию молекул бензойной кис- лоты с образованием бензоат-ионов, которые хо- рошо растворимы. Бензойная кислота рКа=5 Рассмотрите приведенные ниже формулы ве- ществ: в каком растворе они лучше растворятся — в 0,1 М NaOH или в 0,1 М НС1? Красным цветом от- мечены протоны, способные диссоциировать. Ион пиридиния ptfa=5 а Метиловый эфир N-ацетилтирозина Р^а=Ю
Вопросы и задачи [109] 13. Лечение сыпи, вызванной контактом с ядовитым плющом. Производные катехола с длинными цепями алкильных групп, содержа- щиеся в ядовитом плюще и ядовитом дубе, вызы- вают характерную зудящую сыпь. ОН ОН (СН2)„—СН3 рХа~8 Если вы случайно дотронулись до ядовитого плюща, то какой из предложенных ниже спосо- бов обработки пораженного участка кожи следу- ет применить и почему? а) Промывание поверхности кожи холодной водой. б) Промывание поверхности кожи разбав- ленным уксусом или лимонным соком. в) Промывание поверхности кожи водой с мылом. г) Промывание поверхности кожи водой с мылом и с бикарбонатом натрия (питьевой со- дой). 14. Значение pH и всасывание лекарствен- ных веществ. Аспирин представляет собой слабую кислоту с рКа 3,5. Он всасывается в кровь через клетки слизистой желудка и тонкой кишки. Для всасывания веще- ства необходимо, чтобы оно проникало сквозь плазматическую мембрану. Скорость этого про- цесса определяется полярностью молекулы: заря- женные и сильнополярные вещества проникают медленно, а нейтральные гидрофобные молекулы проходят сквозь мембрану легко. Значение pH в содержимом желудка примерно равно 1,5, а в тон- кой кишке — около 6. Откуда (из желудка или из кишечника) большее количество аспирина про- никает в кровь и почему? 15. Расчет pH по молярной концентрации ком- понентов раствора. Каково значение pH раство- ра, содержащего 0,12 моль/л NH4C1 и 0,03 моль/л NaOH (для пары NH4/NH3 рКа = 9,25)? 16. Расчет pH раствора после титрования сла- бой кислоты. Вещество имеет рКа 7,4. К 100 мл 1,0 М раствора этого вещества с pH 8,0 добавили 30 мл 1,0 М соляной кислоты. Каков pH получен- ного раствора? 17. Свойства буфера. Аминокислота глицин ча- сто используется в биохимической практике в качестве основного компонента буфера. Амино- группа глицина, имеющая рКа 9,6, может суще- ствовать либо в протонированной форме (NH3), либо в виде свободного основания (-NH2) в соот- ветствии с равновесием: R-NH3 R-NH2 + Н+ а) В каком интервале pH глицин может быть использован в качестве эффективного буфера? б) Какова доля молекул глицина с протони- рованной аминогруппой (-NH3+) в 0,1 М раство- ре при pH 9,0? в) Какой объем 5 М раствора КОН нужно добавить к 1 л 0,1 М раствора глицина с pH 9,0, чтобы значение pH стало равно 10,0? г) Каким должно быть численное соотноше- ние между pH раствора и рКа аминогруппы гли- цина, чтобы 99% молекул глицина находились в протонированной форме? 18. Приготовление фосфатного буфера. Како- во отношение молярных концентраций НРО4~ и Н2РО4 в растворе с pH 7,0? Фосфорная кислота (Н3РО4) имеет три значения рКа: 2,14, 6,86 и 12,4. Подсказка. Достаточно знать лишь одну констан- ту Р^а- 19. Приготовление стандартного буфера для калибровки pH-метра. Стеклянный электрод pH-метра дает электрический сигнал, величина которого пропорциональна концентрации ионов водорода. Для того чтобы по величине сигнала можно было определить значение pH, необходи- мо калибровать стеклянный электрод с помощью стандартных растворов с известной концентра- цией ионов Н+. Определите, какие количества в граммах однозамещенного фосфата натрия (NaH2PO4 • Н2О, Мг 138) и двузамещенного фосфата натрия (Na2HPO4, Мг 141) необходи-
[110] Часть!. 2. Вода мо взять для приготовления 1 л стандартного буфера с pH 7,00, в котором суммарная концен- трация фосфатов равна 0,100 М (см. рис. 2-15). Значения рКа фосфорной кислоты возьмите из задачи 18. 20. Расчет отношения молярных концентраций сопряженного основания и слабой кислоты на основании значения pH. Каково отношение мо- лярных концентраций сопряженного основания и слабой кислоты (рХа = 6,0) при pH 5,0? 21. Приготовление буферного раствора с задан- ными значениями pH и ионной силы. Из 0,10 М растворов уксусной кислоты (рХа = 4,76) и аце- тата натрия приготовьте 1,0 л 0,10 М ацетатного буфера с pH 4,0. Объясните свои действия. 22. Выбор слабой кислоты для приготовления буфера. Раствор какого из перечисленных со- единений имеет лучшие буферные свойства при pH 5,0: муравьиная кислота (рХа = 3,8), уксусная кислота (рХа = 4,76) или этиламин (рХа = 9,0)? Кратко поясните свой ответ. 23. Работасбуфернымирастворами. Буферный раствор содержит 0,010 моль/л молочной кис- лоты (рХа = 3,86) и 0,050 моль/л лактата натрия, а) Определите pH буфера, б) Определите изме- нение pH, вызванное добавлением 5 мл 0,