Текст
                    ОСНОВЫ БИОХИМИИ
ЛЕНИНДЖЕРА

LEHNINGER PRINCIPLES OF BIOCHEMISTRY Fifth Edition David L. Nelson Professor of Biochemistry University of Wisconsin-Madison Michael M. Cox Professor of Biochemistry University of Wisconsin-Madison W. H. FREEMAN AND COMPANY New York
Д. Нельсон М.Кокс ОСНОВЫ БИОХИМИИ ЛЕНИНДЖЕРА В трех томах 2 БИОЭНЕРГЕТИКА И МЕТАБОЛИЗМ Издание 4-е, исправленное, электронное Перевод с английского канд. хим. наук Т. П. Мосоловой, канд. хим. наук Е. М. Молочкиной, канд. биол. наук В. В. Белова, канд. хим. наук Н. Л. Арюткиной и канд. биол. наук О. М. Алексеевой под редакцией академика РАН А. А. Богданова и член-корр. РАН С. Н. Кочеткова Москва Лаборатория знаний 2020
УДК 578.1 ББК 28.072я73 Н49 Серия основана в 2006 г. Нельсон Д. Н49 Основы биохимии Ленинджера : в 3 т. Т. 2 : Биоэнергетика и метаболизм / Д. Нельсон, М. Кокс ; пер. с англ.-4-е изд., электрон.— М. : Лаборатория знаний, 2020. — 691 с. — (Лучший зарубежный учебник). — Систем, требования: Adobe Reader XI ; экран 10”. —Загл. с титул, экрана. — Текст : электронный. ISBN 978-5-00101-865-0 (Т. 2) ISBN 978-5-00101-863-6 В учебном издании, написанном американскими учеными, которые получили признание как талантливые преподаватели университетского уровня, рассмотрены современные концепции биохимии в соответствии с изменившейся идеологией этой науки. В том 2 вошла часть II «Биоэнергетика и метаболизм». Даны общие термодинамические понятия применительно к биологическим системам, классификация химических реакций, происходящих в живых организ- мах, подробно рассмотрены основные метаболические пути — гликолиз, глюконеогенез, пентозофосфатный путь, цикл лимонной кислоты, ката- болизм жирных кислот и аминокислот, окислительное фосфорилирование и фотофосфорилирование, процессы биосинтеза и деградации основных биомолекул, в том числе жиров, а также принципы регуляции метаболизма. Для студентов биологических, химических и медицинских вузов, а также научных работников. УДК 578.1 ББК 28.072я73 Деривативное издание на основе печатного аналога: Основы биохи- мии Ленинджера : в 3 т. Т. 2 : Биоэнергетика и метаболизм / Д. Нельсон, М. Кокс ; пер. с англ.-4-е изд. — М. : Лаборатория знаний, 2020.— 636 с. : ил.— (Лучший зарубежный учебник). — ISBN 978-5-00101-247-4 (Т. 2); ISBN 978-5-00101-245-0. В соответствии со ст. 1299 и 1301 ГК РФ при устранении ограничений, установленных техническими средствами защиты авторских прав, правообладатель вправе требовать от нарушителя возмещения убытков или выплаты компенсации ISBN 978-5-00101-865-0 (Т. 2) ISBN 978-5-00101-863-6 First published in the United States by W. H. FREEMAN AND COMPANY, New York Copyright© 2008 by W. H. Freeman and Company All rights reserved. © Перевод на русский язык, Лаборатория знаний, 2015
ЧАСТЬ II Биоэнергетика и метаболизм 13 Основы биоэнергетики. Типы химических реакций 11 14 Гликолиз, глюконеогенез и пентозофосфатный путь 65 15 Принципы регуляции метаболизма 121 16 Цикл лимонной кислоты 181 17 Катаболизм жирных кислот 225 18 Окисление жирных кислот и образование мочевины 261 19 Окислительное фосфорилирование и фотофосфорилирование 305 20 Биосинтез углеводов у растений и бактерий 403 21 Биосинтез липидов 445 22 Биосинтез аминокислот, нуклеотидов и связанных с их метаболизмом молекул 505 23 Интеграция и гормональная регуляция метаболизма у млекопитающих 565 Метаболизм — это высококоординированная деятельность клетки, при которой проис- ходит кооперативное взаимодействие мно- гих мультиферментных систем (метаболические пути) для того, чтобы: (1) извлечь химическую энергию из окружающей среды (либо путем по- глощения энергии солнечного света, либо при деградации богатых энергией питательных ве- ществ); (2) превратить молекулы питательных веществ в собственные, характерные для клетки молекулы, включая предшественники макромо- лекул; (3) из предшественников-мономеров про- вести сборку макромолекул: белков, нуклеиновых кислот и полисахаридов; и (4) осуществить синтез и деградацию биомолекул, необходимых клетке для выполнения ее функций, — липидов мембран, внутриклеточных мессенджеров и пигментов. Метаболизм включает сотни различных ка- тализируемых ферментами реакций. В этой час- ти книги (часть II) мы рассмотрим центральные метаболические пути, которые совсем не столь многочисленны и удивительно сходны у всех жи- вых форм. Живые организмы можно разделить на две большие группы в зависимости от того, в виде каких молекул они получают углерод из окружа- ющей среды. Автотрофы (такие как фотосинте- зирующие бактерии и сосудистые растения) в ка- честве единственного источника углерода могут
[6] Часть II. Биоэнергетика и метаболизм Рис. 1. Круговорот углекислого газа и кислорода между автотрофным (фотосинтезирующим) и гетеротрофным доменами (экосистемами) биосферы. В этот круговорот вовлечены огромные массы веществ; биосферный оборот оценивается в ~4 • 1011 т углерода в год. использовать диоксид углерода атмосферы, из которого они строят все свои углеродсодержа- щие биомолекулы (см. рис. 1-5). Некоторые ав- тотрофные организмы, например цианобактерии, могут также использовать атмосферный азот для того, чтобы производить все свои молекулы, ко- торые содержат азот. Гетеротрофы не могут ис- пользовать углекислый газ атмосферы и должны получать углерод из окружающей среды в форме относительно сложных органических молекул, таких как глюкоза. Многоклеточные животные и большинство микроорганизмов — гетеротрофы. Автотрофные клетки и организмы относительно самодостаточны, в то время как гетеротрофные клетки и организмы для удовлетворения сво- их потребностей в углероде нуждаются в более сложных органических молекулах и поэтому должны питаться продуктами жизнедеятельно- сти других организмов. Многие автотрофные организмы используют фотосинтез, где в качестве источника энергии ра- ботает солнечный свет. Гетеротрофные организмы получают энергию при расщеплении органических питательных веществ, образуемых автотрофами. В биосфере автотрофы и гетеротрофы живут вместе в большом взаимозависимом цикле. Автотрофные организмы для построения своих органических биомолекул используют углекислый газ атмосфе- ры. В этом процессе некоторые автотрофы генери- руют кислород из воды. Гетеротрофы в качестве питательных веществ используют органические продукты, образуемые автотрофами, и выделяют в атмосферу углекислый газ. Для некоторых окисли- тельных реакций с образованием диоксида углеро- да необходим кислород, который в реакциях окис- ления превращается в воду. Таким образом, между гетеротрофным и автотрофным естественными экосистемами постоянно происходит круговорот углерода, кислорода и воды. Движет этим глобаль- ным процессом солнечная энергия (рис. 1). Все живые организмы нуждаются также в источнике азота, который необходим для синтеза аминокислот, нуклеотидов и других соединений. Растения в качестве источника азота используют главным образом аммиак или нитраты. Позво- ночные животные должны получать азот в форме аминокислот или других органических соедине- ний. Только некоторые организмы — цианобак- терии и многие виды почвенных бактерий, оби- тающих в качестве симбионтов на корнях расте- ний, — способны превращать атмосферный азот N2 в аммиак (этот процесс называется фиксацией азота). Далее нитрифицирующие бактерии окис- ляют аммиак до нитритов и нитратов. В природе есть бактерии, превращающие нитраты в свобод- ный азот. Таким образом, в дополнение к глобаль- ному круговороту углерода и кислорода в био- сфере происходит круговорот азота, в котором участвует огромное количество этого элемента (рис. 2). Круговороты кислорода, углерода и азо- Рис. 2. Круговорот азота в биосфере. Газообразный азот N2 составляет 80% земной атмосферы.
[7] та, в которые в конечном счете вовлекаются все виды, зависит от естественного баланса между активностью продуцентов (автотрофов) и консу- ментов (гетеротрофов) в нашей биосфере. Круговороты этих элементов приводятся в движение громадным потоком энергии, поступа- ющим в биосферу извне, а затем преобразуемым в биосфере; все начинается с поглощения солнеч- ной энергии фотосинтезирующими организмами с последующим использованием этой энергии для создания богатых энергией углеводов и дру- гих органических соединений. Эти питательные вещества выступают в качестве источника энер- гии для гетеротрофных организмов. В метабо- лических процессах и при любых превращениях энергии часть свободной энергии теряется путем выделения тепла в окружающую среду и увели- чения энтропии системы. Таким образом, в био- сфере материя участвует в непрекращающемся круговороте веществ, а энергия утилизируется — организмы не способны регенирировать энергию, которая рассеивается в виде теплоты и энтропии. Круговорот углерода, кислорода и азота осущест- вляется непрерывно, в то время как энергия по- стоянно превращается в форму, в которой она уже не может быть использована, — в тепловую энергию. Метаболизм — совокупность всех химиче- ских превращений, которые происходят в клетке или организме и осуществляются посредством серии последовательных катализируемых фер- ментами реакций, называемых метаболическими путями. Реакции (стадии) метаболического пути следуют друг за другом в определенном порядке и на каждой стадии в систему привносится неболь- шое специфическое изменение ее химического состава. Обычно при этом происходит удаление, перемещение или добавление одного атома или функциональной группы. Превращение предше- ственника в конечный продукт идет через серию промежуточных продуктов метаболизма, назы- ваемых метаболитами. Термин промежуточный метаболизм часто применяют к совокупности ферментативных реакций всех метаболических путей, в которых происходит взаимное превраще- ние предшественников, метаболитов и низкомоле- кулярных веществ (обычно с Мг< 1000). Катаболизм объединяет процессы деграда- ции, при которых органические молекулы пищи (углеводы, жиры и белки) превращаются в низ- комолекулярные и более простые конечные про- дукты (такие как молочная кислота, СО2, NH3). Катаболизм сопровождается высвобождением энергии, которая запасается в форме АТР и вос- становленных переносчиков водорода (NADH, NADPH, FADH2). Остаток энергии рассеивается в виде тепла. Анаболизм, называемый также био- синтезом, включает процессы, при которых из мелких простых предшественников синтезиру- ются более крупные и сложные молекулы, в том числе жиры, полисахариды, белки и нуклеиновые кислоты. Реакции анаболизма протекают с потре- блением энергии, обычно получаемой при раз- рыве фосфатных связей АТР и восстановлении NADH, NADPH, FADH2 (рис. 3). Макромолекулы клетки Белки Полисахариды Липиды Нуклеиновые кислоты Содержащие энергию пита- тельные вещества Углеводы Жиры Белки ADP+HPO^- NAD+ NADP+ FAD Анаболизм ATP NADH NADPH fadh2 Хими- ческая энергия Молекулы- предшественники Аминокислоты Сахара Жирные кислоты Азотистые основания Катаболизм Бедные энергией конечные продукты СО2 Н2О NH3 Рис. 3. Энергетическое сопряжение путей катаболизма и анаболизма. Катаболические пути поставляют химиче- скую энергию в форме АТР, NADH, NADPH и FADH2. Эти переносчики энергии «работают» в анаболических пу- тях, где происходят превращения низкомолекулярных веществ в макромолекулы.
[8] Часть II. Биоэнергетика и метаболизм Одни метаболические пути представлены линейной цепочкой последовательных пре- вращений. Другие метаболические пути имеют разветвления, т. е. из одного предшественника создается множество полезных конечных про- дуктов, или из нескольких исходных веществ образуется один продукт. Вообще, катаболиче- ские пути конвергентны, тогда как анаболиче- ские — дивергентны (рис. 4). Некоторые пути представляют собой реакционные циклы, когда молекула исходного вещества регенерируется в серии реакций, при этом несколько молекул, образованных из исходного реагента, вновь дают исходное вещество как продукт. В следу- ющих главах рассмотрены примеры различных метаболических путей. У большинства клеток есть ферменты для проведения как реакций распада, так и реак- ций синтеза важных групп биомолекул, напри- мер жирных кислот. Однако одновременное протекание синтеза и распада жирных кислот было бы расточительно, это предотвращается взаимной регуляцией анаболических и катабо- лических последовательностей реакций — ког- да одна реакционная цепочка активизируется, другая подавляется. Такая регуляция не могла бы осуществляться, если бы анаболические и катаболические пути катализировались одним Фосфолипиды Триацилглицерины Жирные кислоты Крахмал Аланин Фенил- аланин Гликоген » Глюкоза > Пируват Лейцин Изолейцин Конвергентный катаболизм Сахароза Серин Каучук карОТИНОИдНые Стероидные гормоны Изопентил- ^Желчные пирофосфат ^Холестерин кислоты Мевалонат Витамин К Эфиры холестерина Ацетоацетил-Со А Эйкозаноиды Жирные кислоты ►Триацилглицерины Цитрат С D Р - диацил гл ицерин Фосфолипиды Оксалоацетат *со2 со2 Циклический путь Дивергентный анаболизм б а в Рис. 4. Три типа нелинейных метаболических путей, а — конвергентный катаболический путь; б — дивергентный анаболический путь; в — циклический путь, в котором одно из ис- ходных веществ (в данном случае оксалоацетат) регенерируется, и цикл вновь начинается. Ацетат — ключевой промежуточный продукт метаболизма — возникает при распаде целого ряда богатых энергией молекул (а); он служит в качестве предшественника многих продук- тов (б) и поглощается в катаболическом пути — цикле лимонной кислоты (в).
[91 и тем же набором ферментов, действующих в одном направлении для анаболизма и в проти- воположном — для катаболизма. Ингибирова- ние фермента, вовлеченного в катаболизм, при- вело бы к ингибированию последовательности реакций анаболического направления. Катабо- лические и анаболические пути, которые имеют одинаковые концевые точки (например, глюко- за пируват и пируват глюкоза), могут использовать множество одинаковых фермен- тов. Но вот что обязательно — по крайней мере одна из стадий катаболического и анаболиче- ского путей катализируется разными фермен- тами и имеет различные механизмы регуляции; эти ферменты и являются местами отдельной регуляции. Более того, чтобы анаболический и катаболический пути были необратимыми, уникальные для каждого направления последо- вательности реакций должны включать хотя бы одну реакцию, которая термодинамически весь- ма благоприятна, другими словами, обратная ей реакция термодинамически невыгодна. Не- зависимость регуляции катаболических и ана- болических процессов усиливается и тем, что парные катаболический и анаболический пути обычно происходят в разных участках клетки. Например, катаболизм жирных кислот проис- ходит в митохондриях, а синтез — в цитоплазме. Концентрации промежуточных метаболитов, ферментов и регуляторов могут поддерживать- ся в различных участках клетки на разных уров- нях. Благодаря тому, что метаболические пути кинетически контролируются концентрацией субстрата, отдельные промежуточные продукты анаболизма и катаболизма тоже контролируют скорость метаболических процессов. Механиз- мам таких анаболических и катаболических процессов мы уделим особое внимание. Метаболические пути регулируются на нескольких уровнях как внутри клетки, так и внеклеточно. Наиболее быстро метаболические процессы реагируют на наличие субстрата. В общем случае внутриклеточная концентрация субстрата меньше Км; при этом скорость ре- акции определяется концентрацией субстрата (см. рис. 6-11). Второй способ внутриклеточно управлять скоростью метаболических процес- сов связан с аллостерической регуляцией (т. 1, с. 220) промежуточным продуктом метаболиз- ма или коферментом, например аминокислотой или АТР, которые сигнализируют о состоянии метаболизма внутри клетки. Когда клетка со- держит достаточное для своих насущных по- требностей количество, скажем, аспартата или когда уровень АТР в клетке такой, что дальней- шее потребление энергии в данный момент не нужно, эти сигналы аллостерически ингибиру- ют активность одного или более ферментов в соответствующей последовательности реакций. У многоклеточных организмов метаболическая активность различных тканей регулируется и интегрируется ростовыми факторами и гормо- нами, которые действуют снаружи клетки. В некоторых случаях эта регуляция происходит фактически мгновенно (иногда быстрее, чем за миллисекунду) через изменения содержания внутриклеточных мессенджеров, которые из- меняют активность ферментов путем аллосте- рической регуляции или их ковалентной моди- фикации, например при фосфорилировании. В других случаях внеклеточный сигнал приводит к изменению концентрации фермента в клетке, влияя на скорость его синтеза или распада. Та- кой эффект проявляется только через минуты или часы. Часть II мы начинаем с описания основных энергетических закономерностей метаболизма (гл. 13). Затем обсудим главные пути катаболиз- ма, по которым клетка получает энергию, окисляя разнообразные вещества (гл. 14-19). Подробно энергетические аспекты метаболизма рассмотре- ны в гл. 19. Она посвящена хемиосмотическому сопряжению энергии — универсальному меха- низму, по которому синтез АТР определяется трансмембранным электрохимическим потенци- алом, возникающим либо в процессе окисления субстрата, либо в процессе поглощения солнеч- ной энергии. В гл. 20-22 рассматриваются главные ана- болические пути, где за счет энергии АТР из более простых молекул-предшественников син- тезируются углеводы, липиды, аминокислоты и нуклеотиды. В гл. 23 мы перейдем к детальному обсуждению метаболических путей у различных организмов, начиная с Echerichia coli и заканчивая человеком, и гормональных механизмов их регу- ляции и интеграции у млекопитающих. И после этого мы, наконец, перейдем к изу- чению промежуточного метаболизма. Изучая клеточный метаболизм, надо помнить, что мио-
[10] Часть II. Биоэнергетика и метаболизм гочисленные реакции, описанные в этой книге, действительно происходят и играют решающую роль в живых организмах. Всегда старайтесь по- нять, какова роль того или иного химического процесса (реакции или всего метаболического пути) в организме. Каким образом изучаемые реакции связаны с другими реакциями, непре- рывно происходящими в той же самой клетке с целью получения энергии и веществ, необходи- мых для поддержания жизнеспособности клет- ки? Как многоуровневые механизмы регуляции приводят в равновесие поглощение и выделение веществ и энергии, т. е. обеспечивают достиже- ние стационарно-динамического состояния все- го организма? Изучая метаболизм с таких пози- ций, вы испытаете захватывающее и вполне по- учительное погружение в основы самой жизни, и полученные вами глубокие знания, безуслов- но, найдут множество применений в медицине, сельском хозяйстве и биотехнологиях.
Общая энергия вселенной остается постоянной; общая энтропия непре- рывно увеличивается. Рудольф Клаузиус, The Mechanical Theory of Heat with Its Applications to the Steam-Engine and to the Physical Properties of Bodies (Механическая теория тепла в приложении к паровому двигателю и физическим свойствам тел), 1865 Благодаря изоморфизму энтропии и информации можно установить вза- имосвязи между двумя формами энергии: энергией совершать действие и энергией направлять действие, которое совершается. Франсуа Жакоб, La logique du vivant: une hitoire de I'heredite (Логика жизни: история наследственности), 1970 Основы биоэнергетики. Типы химических реакций 13.1. Биоэнергетика и термодинамика 12 13.2. Химические основы биохимических реакций 20 13.3. Перенос фосфатных групп и АТР 28 13.4. Окислительно-восстановительные реакции в биологических системах 43 Живые клетки и организмы должны осу- ществлять процессы поддержания жиз- ни, роста и размножения. Способность извлекать и преобразовывать энергию, которая расходуется на биологические процессы, явля- ется фундаментальным свойством всех живых организмов. Эта свойство было приобретено на Антуан Лавуазье, 1743-1794 ранней стадии клеточной эволюции. В современ- ных организмах совершается множество разно- образных преобразований энергии, превращений одной формы энергии в другую. Живые организ- мы используют химическую энергию клеточных «топливных» молекул для синтеза сложных высо- коупорядоченных макромолекул из простых мо- лекул-предшественников. Они также превращают химическую энергию клеточного «топлива» в гра- диенты концентраций и градиенты электрических потенциалов, в движение и тепло. Немногие орга- низмы, такие как светляки и некоторые глубоко- водные морские рыбы, способны излучать свет. Фотосинтезирующие организмы преобразуют све- товую энергию в другие формы энергии. Химические механизмы, которые лежат в ос- нове биологических преобразований энергии, в течение столетий зачаровывали биологов и бро- сали им вызов. Французский химик Антуан Ла- вуазье заметил, что животные каким-то образом превращают химическое «топливо», т. е. вещества из пищи, в тепло, и сделал вывод, что дыхание — жизненно важный процесс. ...в общем, дыхание не что иное, как медлен- ное горение углерода и водорода, которое очень похоже на процесс, происходящий в керосиновой лампе или свече. С этой точки зрения животные, которые дышат, являются
[12] Часть II. 13. Основы биоэнергетики. Типы химических реакций настоящими топливными котлами, которые сжигают и пожирают сами себя. Можно ска- зать, что эта аналогия между горением и ды- ханием не избежала внимания поэтов — пра- вильнее, философов древности. Этот огонь, украденный с небес, этот факел Прометея не только идея, рожденная в головах инженеров и поэтов, он является верным описанием про- цессов, происходящих в природе, по крайней мере в организме животных, которые дышат. Поэтому, следуя античным творениям, мож- но и нам пофилософствовать, сказав, что фа- кел жизни зажигается в тот момент, как толь- ко младенец начинает дышать, и он не гаснет до тех пор, пока не наступает смерть.* В XX в. человечество достигло начального понимания большинства химических процессов «факела жизни». Превращения энергии в биоло- гических системах подчиняются тем же физиче- ским законам, которые управляют и всеми дру- гими природными процессами. Поэтому студен- там-биохимикам очень важно понять эти законы, а также то, как эти законы применимы к потоку энергии в биосфере. В этой главе мы сначала обсудим законы термодинамики и количественные соотношения между свободной энергией, энтальпией и энтро- пией. Далее рассмотрим типы происходящих в живых клетках основных биохимических реак- ций, которые необходимы для использования, хранения, передачи и высвобождения энергии, воспринимаемой организмом из окружающей среды. Затем мы подробнее остановимся на тех реакциях, которые играют особую роль в био- логических процессах энергетического обмена, в частности на реакциях с участием АТР. И на- конец, перейдем к рассмотрению важных окис- лительно-восстановительных реакций в живых клетках, энергетических закономерностей пере- носа электронов в биологических системах, а так- же тех переносчиков электронов, которые наи- более часто работают в этих процессах в качестве кофакторов. * Из мемуаров Армана Сегена и Антуана Лавуазье, да- тированных 1789 г.; цитировано по книге [Lavoiser А. (1862) Oeuvres de Lavoisier, Imprimerie Imperiale, Paris]. 13.1. Биоэнергетика и термодинамика Биоэнергетика изучает количественные сторо- ны преобразований энергии из одной формы в другую, которые происходят в живых клетках, а также химические процессы, лежащие в основе этих преобразований. Хотя законы термодинами- ки уже обсуждались в предыдущих главах, а воз- можно, хорошо были изучены вами ранее, здесь будет весьма полезно в общих чертах вспомнить некоторые количественные аспекты. Преобразования энергии в биологических системах подчиняются законам термодинамики Многочисленные количественные исследования по взаимопревращению различных форм энер- гии, выполненные физиками и химиками, позво- лили в XIX в. сформулировать два основных за- кона термодинамики. Первый закон — это закон сохранения энергии: при любом физическом или химическом изменении общее количество энер- гии во вселенной остается постоянным; энергия может переходить из одной формы в другую или может перераспределиться, но не может исчез- нуть. Второй закон термодинамики о том, что все процессы во вселенной стремятся к увеличению беспорядка (дезорганизации): в результате лю- бых естественных процессов энтропия вселенной возрастает. «Итак, по второму закону термодинамики...»
13.1 Биоэнергетика и термодинамика [13] Живые организмы — это некая совокуп- ность молекул, однако совокупность гораздо бо- лее высокоорганизованная, чем окружающие их вещества. Организмы способны создавать и под- держивать свойственную им упорядоченность, что, казалось бы, противоречит второму закону термодинамики. Однако на самом деле живые организмы тоже подчиняются этому закону и действуют строго в его рамках. Прежде чем на- чать обсуждение второго закона термодинамики в приложении к биологическим системам, следу- ет дать определение этим системам и ввести такое понятие, как окружающая среда. Под реакционной системой понимают сово- купность веществ, которые подвергаются дан- ному химическому или физическому процессу. Такой системой может быть организм, клетка или два реагирующих друг с другом соединения. Совокупность реакционной системы и окружа- ющей среды составляет вселенную. В лабора- тории некоторые химические или физические процессы могут протекать в изолированных или в закрытых системах, не способных к обмену веществ и энергии с окружающей средой. Од- нако живые клетки и организмы являются от- крытыми системами, которые обмениваются и веществами, и энергией с окружающей средой. Живые системы никогда не приходят к равно- весию с окружающей средой. Постоянные взаи- модействия между системой и окружающей сре- дой объясняют, каким образом организмы могут поддерживать внутреннюю упорядоченность и при этом действовать в рамках второго закона термодинамики. В гл. 1 (т. 1, с. 22) мы дали определение трем количественным термодинамическим функциям, с помощью которых можно выразить энергети- ческие изменения, происходящие в химической реакции. Вернемся к ним еще раз. Свободная энергия Гиббса G — это та часть энергии, которая способна производить ра- боту в реакции, протекающей при постоян- ной температуре и постоянном давлении. В тех случаях, когда реакция протекает с вы- свобождением свободной энергии (т. е. изме- нения в системе происходят с уменьшением свободной энергии), изменение свободной энергии AG < 0, и такая реакция называется экзергонической. В эндергонических реак- циях система приобретает (повышает) сво- бодную энергию и AG > 0. Энтальпия Н — это так называемое «тепло- содержание» реакционной системы. Она от- ражает количество и природу химических связей в веществах, вступающих в реакцию, и в веществах — продуктах реакции. Хими- ческая реакция, при которой происходит вы- деление тепла, называется экзотермической. Если энтальпия образования Яобр продуктов реакции меньше, чем для веществ, вступаю- щих в реакцию, АЯ < 0. Реакционные систе- мы, которые получают тепло от окружающей среды, называются эндотермическими; для них АЯ > 0. Энтропия 5 — мера хаотичности (или неупо- рядоченности) системы (см. доп. 1-3). Когда продукты реакции менее сложные и более неупорядоченные, чем исходные вещества, считается, что реакция протекает с увеличе- нием энтропии А5 > 0. Единицы измерения AG и АЯ — Дж/моль (джо- уль на моль) и кал/моль (калории на моль). На- помним, 1 кал = 4,184 Дж. Единицы энтропии S — Дж/(моль • К) (джоуль на моль и на кельвин) (табл. 13-1). В условиях, характерных для биологических систем (постоянная температура и давление), из- Таблица 13-1 Некоторые физические постоянные и размерности некоторых термодинамических параметров Константа Больцмана, к = 1,381 • 10 23 Дж/К Число Авогадро, N= 6,022 • 1023 моль 1 Константа Фарадея, J = 96 480 Дж/(В • моль) Газовая постоянная, R = 8,315 Дж/(моль • К) = = 1,987 кал/(моль • К) Размерность AG и АЯ — Дж/моль (или кал/моль) Размерность А5 — Дж/(моль • К) или кал/(моль • К) 1 кал = 4,184Дж Размерность абсолютной температуры Т — К (кельвины) 25 °C = 298 К При 25 °C RT = 2,479 кДж/моль = 0,592 ккал/моль
[14] Часть II. 13. Основы биоэнергетики. Типы химических реакций менения свободной энергии, энтальпии и энтро- пии связаны количественно друг с другом следу- ющим уравнением: ЛС = ЛЯ-ГЛ5 (13-1) где AG — изменение свободной энергии системы в результате реакции, А// — изменение энталь- пии, Т — температура (в кельвинах, К) и Л5 - изменение энтропии. Условимся, что А5 > 0, ког- да энтропия увеличивается, и, как отмечалось выше, ЛЯ < 0, когда система отдает тепло окру- жающей среде. Для самопроизвольно (спонтан- но) протекающих реакций и природных процес- сов всегда AG < 0. Согласно второму закону термодинамики, при химических реакциях или физических про- цессах энтропия вселенной увеличивается. Из этого закона, однако, не следует, что возраста- ние энтропии должно происходить обязательно в самой реакционной системе. Внутриклеточная упорядоченность, которая создается в процессе роста и деления клеток, более чем компенсирует- ся возникающей при этом неупорядоченностью в окружающей среде. Коротко говоря, живые орга- низмы сохраняют внутреннюю упорядоченность, получая из окружающей среды свободную энер- гию в виде питательных веществ или солнечно- го света и возвращая в нее такое же количество энергии в виде тепла и энтропии. Клеткам необходимы источники свободной энергии Клетки — изотермические системы, они функци- онируют при постоянной температуре (а также при постоянном давлении). Тепло (нагревание) не может служить источником энергии для клеток, поскольку тепло способно производить работу лишь в том случае, когда оно переходит от более нагретого тела к более холодному или из области с более высокой температурой в область с более низкой температурой. Клетки могут и должны ис- пользовать свободную энергию Гиббса G, которая определяет прочность химических связей между атомами, состояние равновесия и направление хи- мических реакций; это та теоретически возможная химическая энергия системы, которая может быть превращена в работу, т. е. выделена во вселенную в виде тепла и энтропии при протекании химиче- ской реакции при постоянной температуре и по- стоянном давлении. Гетеротрофные клетки извле- кают необходимую свободную энергию из моле- кул питательных веществ, а фотосинтезирующие клетки поглощают энергию солнечного света. И те, и другие переводят свободную энергию в АТР и другие «энергетические» соединения, которые способны запасать энергию для выполнения рабо- ты (биологических процессов) в условиях посто- янной температуры. Изменение стандартной свободной энергии непосредственно связано с константой равновесия Состав реакционной системы (смесь веществ, вступающих в реакции, и продуктов реакции) ме- няется до тех пор, пока не устанавливается равно- весие. По достижении равновесия концентрации реагирующих веществ и продуктов реакции не меняются, скорости прямой и обратной реакций становятся равными и дальнейшие изменения в системе прекращаются. Концентрации реагиру- ющих веществ и продуктов реакции в состоянии равновесия определяют константу равновесия Keq (т. 1, с. 24). Запишем для обобщенной реакции аЛ + ЬВ сС+б/D где a, Ь, с и d — число молекул А, В, С и D, кон- станту равновесия [C]c[D]rf где [А], [В], [С] и [D] — молярные концентрации веществ в состоянии равновесия. Неравновесная реакционная система всег- да самопроизвольно стремится к установлению равновесного состояния при заданных условиях (концентрация, температура, давление); при этом происходит изменение свободной энергии реак- ции AG. При стандартных условиях, т. е. при тем- пературе Т= 298 К = 25 °C, исходных концентра- циях всех компонентов реакции 1 моль/л (или М) или для газообразных веществ парциальном дав- лении 101,3 кПа (килопаскаль) = 1 атм, движущая сила системы к состоянию равновесия определя- ется изменением стандартной свободной энер- гии AG°. Стандартными условиями для реакций с участием ионов водорода является [Н+] = 1 М,
13.1 Биоэнергетика и термодинамика [15] или pH 0. Большинство биохимических реакций происходит в разбавленных буферных растворах при pH « 7. При этом и pH, и концентрацию воды (для чистой воды [Н2О] = 55,5 М) можно считать постоянными. Для удобства расчетов в качестве стандартных условий для биохимических про- цессов приняты следующие: концентрация водо- родных ионов 10-7 М (pH 7), концентрация воды 55,5 М и концентрация Mg2+ 1 мМ (для реакций, протекающих с участием ионов Mg2+, включая большинство реакций с участием АТР). КЛЮЧЕВЫЕ ДОГОВОРЕННОСТИ. Для удобства в каче- стве стандартного состояния (стандартных усло- вий) биохимических систем выбраны условия, отличные от тех, что приняты в химии и физике. А именно, в биохимии стандартное состояние со- ответствует [Н+] = 10-7 М (pH 7) и [Н2О] = 55,5 М. Для реакций с участием ионов Mg2+ (к которым относятся многие реакции с участием АТР) кон- центрация Mg2+ в растворе обычно считается по- стоянной и равной 1 мМ. Физические параметры, относящиеся к биохи- мическому стандартному состоянию, называются приведенными стандартными параметрами и пи- шутся со штрихом (например, AG'° и A'q) для того, чтобы отличать их от неприведенных параметров, используемых химиками и физиками. Заметим, что в других учебниках биохимии чаще используется обозначение AG°' (а не AG'°, как мы ввели выше). Параметр AG'° рекомендован Международным со- юзом химиков и биохимиков с целью подчеркнуть, что неприведенный параметр G' — это критерий равновесия. Для простоты здесь и далее будем на- зывать эти приведенные параметры стандартными изменениями свободной энергии. КЛЮЧЕВЫЕ ДОГОВОРЕННОСТИ. Согласно другой до- говоренности, если Н2О, Н+ и/или Mg2+ выступа- ют в качестве исходных веществ или продуктов реакции, их концентрации не включаются в урав- нения, такие как (13-2), а вместо этого входят в константы К' иАС'°. Итак, константа равновесия K'eq характеризу- ет реакцию, отсюда и А (7 — это характеристический параметр реакции. Как мы отмечали в гл. 6, K'eq и А (7° связаны простым соотношением: AG'° = -RT\nK'eq (13-3) Это просто один из возможных способов расче- та константы равновесия реакции через изме- нение стандартной свободной энергии химиче- ской реакции. В табл. 13-2 приведены значения А (7° и K'eq. Если K'eq = 1,0, то А (7° = 0,0 (так как In 1,0 = 0). Если K'eq> 1,0, то А (7° < 0. Если же K'eq < 1,0, то А (7° > 0. Поскольку зависимость А(7° от K'eq логарифмическая, относительно не- большие изменения А(7° приводят к сильным изменениям K'eq. Полезно также определить изменение сво- бодной энергии и другим путем. А(7° — это раз- ность между свободной энергией продуктов ре- акции и свободной энергией исходных веществ. Когда А(7° < 0, свободная энергия образования Go6p (продуктов реакции) < Go6p (реагентов); та- кая реакция при стандартных условиях происхо- дит самопроизвольно (спонтанно), поскольку все химические реакции стремятся идти в направле- нии, соответствующем уменьшению свободной энергии системы. Если А(7° > 0, то Go6p (продук- тов реакции) > Go6p (реагентов). При концентра- циях исходных компонентов 1,0 М (стандартные условия) такая реакция идет в обратном направ- лении. В табл. 13-3 обобщены эти положения. Таблица 13-2 Константы равновесия и изменения стандартной свободной энергии реакции kG'° кДж/моль ккал/моль* 103 -17,1 -4,1 102 -11,4 -2,7 101 -5,7 -1,4 1 0,0 0,0 10-> 5,7 1,4 10~2 11,4 2,7 10 3 17,1 4,1 10~4 22,8 5,5 10~5 28,5 6,8 10 6 34,2 8,2 * В СИ размерность энергии — джоуль (и килоджоуль); сокращенно Дж (и кДж). Однако биохимики чаще все- го приводят AG'° в ккал/моль (килокалория на моль). 1 кДж = 4,184 ккал.
[16] Часть II. 13. Основы биоэнергетики. Типы химических реакций Таблица 13-3 K'q, AG'° и направление химических реакций при стандартных условиях AG'° При начальной концентрации всех веществ 1 М >1,0 <0 Прямая реакция 1,0 0 Равновесное состояние <1,0 >0 Обратная реакция Пример 13-1 РАСЧЕТ А6'° Найдите изменение свободной энергии реакции, катализируемой ферментом фосфоглюкомутазой: Глюкозо-1-фосфат глюкозо-6-фосфат В начале реакции концентрация глюкозо-1- фосфата составляла 20 мМ, а глюкозо-6-фосфат в реакционной среде отсутствовал; в равновес- ной смеси при 25 °C и pH 7,0 содержится 1,0 мМ глюкозо-1-фосфата и 19 мМ глюкозо-6-фосфата. Потерей или увеличением свободной энергии со- провождается реакция, идущая в направлении образования глюкозо-6-фосфата? Решение. Следует рассчитать константу равно- весия: f глюкозо-6-фосфат] К'щ =------------------= 19 мМ/1,0 мМ = 19 [глюкозо-1 -фосфат] Теперь можно найти стандартное изменение сво- бодной энергии: AG'° = -7?TlnK'eq = - (8,315 ДжДмоль • К) (298 К) (In 19) = -7,3 кДж/моль AG'° < 0, т. е. превращение глюкозо-1-фосфата в глюкозо-6-фосфат сопровождается уменьшением (потерей, высвобождением) свободной энергии. В обратной реакции изменение свободной энер- гии равно по величине, но противоположно по знаку, т. е. для обратной реакции AG'° > 0. Таблица 13-4 Изменение стандартной свободной энергии в некоторых химических реакциях при pH 7,0 и 25 °C (298 К) AG'° Реакция кДж/моль ккал/моль Гидролиз Кислотный гидролиз Уксусный ангидрид + Н2О 2 ацетата -91,1 -21,8 АТР + Н2О ADP + -30,5 -7,3 АТР + Н2О АМР + PPi -45,6 -10,9 PPi + Н2О 2Pi -19,2 -4,6 UDP-глюкоза + Н2О UMP + глюкозо-1-фосфат -43,0 -10,3 Гидролиз эфиров Этилацетат + Н2О —> этанол + ацетат -19,6 -4,7 Глюкозо-6-фосфат + Н2О глюкоза + Pi -13,8 -3,3 Гидролиз амидов и пептидов Глутамин + Н2О глутамат + NHj -14,2 -3,4 Глицил глицин + Н2О —> 2 глицина -9,2 -2,2 Гидролиз гликозидов Мальтоза + Н2О —> 2 глюкозы -15,5 -3,7 Лактоза + Н2О глюкоза + галактоза -15,9 -3,8 Внутримолекулярные перегруппировки Глюкозо-1-фосфат глюкозо-6-фосфат -7,3 -1,7 Фруктозо-6-фосфат —> глюкозо-6-фосфат -1,7 -0,4 Отщепление воды Малат фумарат + Н2О 3,1 0,8 Окисление молекулярным кислородом Глюкоза + 6О2 6СО2 + 6Н2О -2,840 -686 Пальмитат + 23О2 16СО2 + 16Н2О -9,770 -2,338
13.1 Биоэнергетика и термодинамика [17] В табл. 13-4 приведены численные значения изменений стандартной свободной энергии не- которых важных химических реакций. Отметим, что гидролиз простых эфиров, амидов, пептидов и гликозидов, как и внутримолекулярные пере- группировки и элиминирование, сопровождают- ся небольшим изменением стандартной свобод- ной энергии, в то время как при гидролизе анги- дридов кислот происходит значительное умень- шение стандартной свободной энергии. Полное окисление органических веществ, таких как глю- коза или пальмитиновая кислота, до СО2 и Н2О, протекающее в клетках многоступенчато, при- водит к очень большому уменьшению стандарт- ной свободной энергии. Данные, приведенные в табл. 13-4, относятся к стандартным условиям. Параметры реакций, происходящих в клетке, можно получить, приведя величины в стандарт- ных условиях к реальным условиям (в клетке). Изменения свободной энергии в реальных системах зависят от концентраций исходных веществ и продуктов реакции Мы должны четко уяснить, что изменение сво- бодной энергии AG и изменение стандартной сво- бодной энергии AG'° численно различаются. Каж- дая химическая реакция характеризуется опре- деленным изменением стандартной свободной энергии, которое может быть положительным, отрицательным или равным нулю в зависимости от константы равновесия данной реакции. По из- менению стандартной свободной энергии можно судить о том, в каком направлении протекает дан- ная реакция и как далека она от равновесия при исходных концентрациях всех компонентов 1,0 М, pH 7,0, температуре 25 °C и давлении 101,3 кПа. Таким образом, AG'° — характеристический пара- метр (константа) данной реакции. Однако в ре- альных условиях изменение свободной энергии AG зависит от концентраций исходных веществ и продуктов реакции, а также от изменения тем- пературы по ходу реакции. Реальные условия могут не совпадать со стандартными. Более того, для любой реакции, спонтанно стремящейся к равновесию, всегда AG < 0, и по мере протекания реакции AG увеличивается, стремясь в пределе к нулю, AG -* 0. В момент установления равнове- сия AG = 0 — в данной реакции больше не может быть совершено никакой работы. Для любой реакции аА + ЬВ — сС + dD AG и AG'° связаны уравнением [С]с [D]d AG = AG'° +/?Г1п [A]a[B]b « (13-4) в котором параметры, выделенные красным, определяют состояние данной системы. Кон- центрации в уравнении 13-4 принято называть действующими массами, а отношение [С]с[D]d/ [А]а[В]ь выражает закон действующих масс Q. В качестве примера давайте предположим, что реакция Л + В — С + Г) протекает при стан- дартных условиях: температура (25 °C) и давле- ние (101,3 кПа), но что концентрации [А], [В], [С] и [D] не равны между собой и ни одна из них не равна стандартной концентрации 1,0 М. Чтобы найти изменение свободной энергии AG реакции, протекающей слева направо, при этих нестандартных условиях, подставим числен- ные значения концентраций компонентов А, В, С и D в уравнение 13-4. Параметры R, Т и AG'° определены стандартными условиями. AG < 0 и по мере протекания реакции этот параметр стремится к нулю из-за того, что вещества А и В расходуются ([А] и [В] уменьшаются), а веще- ства С и D нарабатываются ([С] и [D] увеличи- ваются). Отметим, что в состоянии равновесия AG = 0 и уравнение 13-4 упрощается: 0 = АС = АС'° + /?Г1п [C]eq[D]eq [A]eq[B]eq AG'° = RT In K' Итак, мы снова получили уравнение 13-3, связы- вающее изменение стандартной свободной энер- гии и константу равновесия. Критерий самопроизвольности протекания реакции связан с AG, а не с AG'°. При AG'° > 0 реакция идет только при условии, что AG < 0. Такое возможно, когда в уравнении 13-4 второе слагаемое 0 < RT In ([продукты реакции]/[ис- ходные вещества]) > AG'°. Например, при очень быстром удалении продуктов [продукты реакции]/[исходные вещества] 1 так что RT In [продукты реакции]/[исходные вещества] < 0 (большое отрицательное число). Величины AG и AG'° выражают максимальное количество свободной энергии, которое данная
[18] Часть II. 13. Основы биоэнергетики. Типы химических реакций реакция теоретически может предоставить, т. е. количество энергии, которое могло быть реали- зовано, если бы имелся высокоэффективный механизм ее использования. Поскольку тако- го механизма нет (во время любого процесса, какая-то часть свободной энергии всегда теря- ется в виде энтропии), количество работы, вы- полненное за счет данной реакции при постоян- ной температуре и постоянном давлении, всег- да меньше теоретически ожидаемого. Другой важный момент заключается в том, что некоторые благоприятные в термодинамическом отношении реакции (а именно, реакции, для кото- рых AG'° « 0) происходят с недостаточно большой скоростью. Например, горение (реакция окисле- ния) дров до СО2 и Н2О термодинамически очень выгодно. Однако дрова хранятся годами — горение начинается несамопроизвольно, поскольку энер- гия активации (см. рис. 6-2 и 6-3) реакции горения выше, чем доступная при комнатной температуре энергия. Если предоставить необходимую энер- гию активации (например, от зажженной спички), начнется процесс горения, превращающий дерево в более стабильные продукты СО2 и Н2О и высво- бождающий энергию в виде тепла и света. Теплота, выделенная при этой экзотермической реакции, обеспечивает энергию активации для горения сле- дующих порций дров, и таким образом процесс го- рения может продолжаться непрерывно. В живых клетках химические реакции про- текали бы чрезвычайно медленно, если бы там не было эффективных катализаторов — ферментов, которые вовсе не обеспечивают реакционную си- стему дополнительным теплом (энергией), а по- нижают энергию активации. Фермент «предлага- ет» альтернативный путь реакции с более низкой энергией активации, чем в случае некатализиру- емой реакции, для того чтобы энергия большин- ства молекул субстрата при комнатной темпе- ратуре оказалась достаточной для преодоления энергетического барьера — энергии активации. Благодаря ферментативному катализу скорость реакции увеличивается во много раз. Изменение свободной энергии реакции не зависит от пути, по которому реакция протекает, а зависит только от природы и концентрации исходных веществ и конечных продуктов реакции. При ферментатив- ном катализе не изменяется величина константы равновесия реакции', но под действием ферментов может увеличиваться и действительно увеличи- вается скорости прямой и обратной реакций и процесс идет в термодинамически разрешенном направлении (которое определено знаком изме- нения свободной энергии). Изменения стандартной свободной энергии аддитивны Рассмотрим последовательные реакции А В и В С. Каждая реакция имеет собственную константу равновесия и характеризуется опре- деленным изменением стандартной свободной энергии AGf и AG2°. Поскольку эти две реакции протекают последовательно, компонент В мож- но исключить из обсуждения. Тогда рассмотрим суммарную реакцию А С, которая характери- зуется константой равновесия и, следователь- но, изменением стандартной свободной энергии АС'°бщ. Для последовательных химических реакций AG'° аддитивны. Для суммарной реакции А С общее изменение стандартной свободной энер- гии АС'°бщ равно сумме изменений стандартных свободных энергий А(Д° и AG2° двух реакций: ag;o6i4 = ag;° + ag2° (1) а^в ag;° (2) В С AG2° Итого: А^С AG;° + AG2° Этот принцип биоэнергетики объясняет, как ре- акция (эндергоническая реакция), не выгодная термодинамически, может быть проведена в пря- мом направлении при сопряжении с высокоэк- зергонической реакцией через общий промежу- точный продукт. Например, у многих организмов синтез глюкозо-6-фосфата является первой ста- дией при усвоении глюкозы: Глюкоза + Pj глюкозо-6-фосфат + Н2О AG'° = 13,8 кДж/моль Для этой реакции AG'° > 0, и при стандартных условиях реакция самопроизвольно не происхо- дит в указанном направлении. Другой процесс в клетке — гидролиз АТР до ADP и Р, - наоборот высокоэкзергонический: АТР +Н2О ADP + AG'° = -30,5 кДж/моль
13.1 Биоэнергетика и термодинамика [19] Эти две реакции связаны общими промежуточ- ными продуктами Pj и Н2О и их можно предста- вить как последовательные реакции: (1) Глюкоза + Pj глюкозо-6-фосфат + Н2О (2) АТР +Н2О ADP + Pi Итого: АТР + глюкоза ADP + глюкозо-6-фосфат Общее изменение стандартной свободной энер- гии можно получить как сумму А<7° отдельных реакций: AG'° = 13,8 кДж/моль + (-30,5 кДж/моль) = = -16,7 кДж/моль Суммарная реакция экзергоническая, и энер- гия, запасенная в АТР, используется для синтеза глюкозо-6-фосфата, хотя образование этого со- единения из глюкозы и неорганического фосфа- та Pj — эндергонический процесс. Реальный путь образования глюкозо-6-фосфата в клетке путем переноса фосфатной группы от АТР отличается от приведенных выше реакций (1) и (2), но ко- нечный результат получается тот же самый, что и при суммировании этих двух реакций. В тер- модинамических расчетах состояния системы в начале и конце процесса представлены этими ве- ществами. А путь между начальным и конечным состояниями не важен. Мы уже говорили о том, что AG'° — способ выражения константы равновесия реакции. Для реакции (1) Г глюкозо-6-фосфат] К' = F-----------1ГП1 = 3,9- 10-3 М1 41 [глюкоза] [Pi] Заметим, что Н2О не входит в это выражение, по- скольку концентрация воды (55,5 М) не изменя- ется в ходе реакции. Константа равновесия реак- ции гидролиза АТР равна К' СЧ2 [ADP][Pj] [АТР] = 2,0 • 105 М а константа равновесия двух сопряженных реакций [глюкозо-6-фосфат][АИР][ Pi] Keq3= [глюкоза] [Pi][АТР] = (К^) = (3,9 • Ю-з м-1) (2)0 • 105 м) = 7,8 • 102 Здесь следует обратить внимание на важный мо- мент, касающийся константы равновесия. Хотя AG'° двух реакций, из которых слагается третья, аддитивны, K'eq суммарной реакции равна про- изведению K'eq этих отдельных реакций. Говорят, что константы равновесия реакций мультипли- кативны. Благодаря сопряжению гидролиза АТР с синтезом глюкозо-6-фосфата К'щ увели- чивается в 2,0 • 105 раза. Эта стратегия, где при синтезе вторичных метаболитов и клеточных компонентов присут- ствует общий промежуточный продукт, встре- чается во всех живых клетках. Очевидно, что она работает только при условии постоянного наличия таких соединений, как АТР. В следую- щих главах мы обсудим некоторые из наиболее важных путей синтеза АТР. Краткое содержание раздела 13.1 БИОЭНЕРГЕТИКА И ТЕРМОДИНАМИКА Живые клетки постоянно выполняют работу. Для поддержания своих высокоорганизован- ных структур, синтеза клеточных компонен- тов и многих других процессов клеткам не- обходима энергия. Биоэнергетика занимается количественным изучением превращений энергии в биологи- ческих системах. Биологические превраще- ния энергии подчиняются законам термоди- намики. На ход любой химической реакции влияют два фактора: стремление к состоянию с наи- большей устойчивостью (прочностью) связей (характеризуется энтальпией Н) и стремле- ние к наивысшей неупорядоченности систе- мы (характеризуется энтропией 5). Суммар- ной движущей силой реакции является изме- нение свободной энергии AG; этот термодина- мический параметр учитывает общий эффект этих двух факторов: AG = АЯ — ГА5. Изменение стандартной свободной энер- гии — характеристический физико-хими- ческий параметр данной реакции; его мож- но рассчитать из константы равновесия: AG'° = -RT In К' .
[20] Часть II. 13. Основы биоэнергетики. Типы химических реакций В реальной системе изменение свободной энергии AG не константа, а зависит от А(7° и от концентраций исходных веществ и про- дуктов реакции: AG = А(7° +/?Г1п [продукты реакции] [исходные вещества] Когда AG « 0, реакция протекает слева на- право (т. е. в прямом направлении); когда AG » 0, реакция идет в обратном направле- нии. При AG = 0, система находится в состо- янии равновесия. Изменение свободной энергии реакции не зависит от пути протекания реакции. Изме- нение свободной энергии нескольких после- довательных реакций (стадий) — аддитив- ный параметр; общее изменение свободной энергии суммарной химической реакции, ко- торая является результатом последователь- ных реакций с общим промежуточным про- дуктом, равно сумме AG отдельных реакций. 13.2. Химические основы биохимических реакций При биологических процессах с передачей энергии, о которых мы говорим здесь, протека- ют вполне определенные химические реакции. В клетке могут происходить не все типы реакций, которые обычно изучают в общем курсе органи- ческой химии. Какие же реакции могут проте- кать в биологических системах, а какие нет? Это зависит, во-первых, от системы и, во-вторых, от скорости реакции. Оба фактора имеют опреде- ляющее значение для механизма и направления метаболического пути. Об этом и пойдет речь да- лее. Реакция, в которой используется доступный субстрат, который превращается в нужный про- дукт, считается значимой для организма. Однако даже потенциально значимые реакции не всегда могут протекать в клетке. Некоторые химические превращения настолько замедленны (т. е. имеют настолько высокие энергии активации), что не могут происходить в живых системах даже в при- сутствии мощных катализаторов — ферментов. Те реакции, которые действительно протекают в живых клетках, представляют собой возникший в процессе эволюции набор химических «инстру- ментов», позволяющий обходить «невозможные» реакции. Для хорошего понимания биохимии клетки необходимо уметь распознавать те реак- ции, протекание которых возможно. Несмотря на все указанные ограничения, количество метаболических превращений в обычной клетке огромно. Большинство клеток обладают способностью осуществлять тысячи специфических ферментативных реакций, на- пример превращать простое вещество глюкозу в аминокислоты, нуклеотиды или липиды, извле- кать энергию из веществ, поступающих с пищей, путем их окисления или проводить полимериза- цию мономерных молекул с образованием макро- молекул. Чтобы изучить все эти реакции, необходим систематический подход. Химические реакции, происходящие в живых организмах, можно раз- делить на типы, и тогда не понадобится изучать каждую отдельную реакцию, чтобы понять «ло- гику», заложенную в биохимических процессах. Множество реакций в живых клетках можно классифицировать, выделив пять типов: 1) реак- ции, идущие с образованием или разрывом связи углерод-углерод; 2) внутримолекулярные пере- группировки, изомеризация и элиминирование; 3) реакции с участием свободных радикалов; 4) реакции с переносом функциональных групп; 5) окислительно-восстановительные реакции. Далее мы подробнее обсудим различные типы реакций на конкретных примерах биохимиче- ских превращений. Заметьте, что реакции раз- ного типа не исключают друг друга, например реакция изомеризации может идти по свободно- радикальному механизму. Однако прежде чем продолжить обсужде- ние типов реакций, нам следует вспомнить два главных химических принципа. Первый принцип заключается в том, что ковалентная химическая связь образуется в результате обобществления пары электронов, а разрыв этой связи может про- исходить двумя путями (рис. 13-1). При гомоли- тическом разрыве каждый атом, участвовавший в образовании связи, превращается в свободный радикал, несущий один неспаренный электрон. При гетеролитическом разрыве, который проис- ходит гораздо чаще, оба электрона остаются при одном атоме. На рис. 13-1 изображены частицы, которые наиболее часто образуются при расще- плении связей С—С и С—Н. Карбанионы, кар-
13.2 Химические основы биохимических реакций [21] бокатионы и гидрид-ионы очень нестабильны, и, как мы увидим далее, это свойство во многом и определяет химические свойства этих ионов. Второй принцип состоит в том, что многие биохимические реакции происходят при взаимо- действии нуклеофилов (функциональных групп, которые богаты электронами и способны отда- вать их другим атомам и группам атомов) и элек- трофилов (электронодефицитных групп, спо- собных принимать электроны от других групп). Нуклеофилы, взаимодействуя с электрофилами, отдают им электроны. Часто встречающиеся в биологических системах нуклеофилы и электро- филы представлены на рис. 13-2. Обратите вни- мание, что атом углерода может выступать как в роли нуклеофила, так и в роли электрофила в зависимости от того, какие химические связи и функциональные группы его окружают. Нуклеофилы —ОТ Отрицательно заряжен- ный кислород (как в не- протонированной гидрок- сильной группе или иони- зированной карбоновой кислоте) — Сульфид-анион Карбанион —N— I Незаряженная аминогруппа Имидазол Н—07 Электрофилы Атом углерода карбониль- ной группы (более электро- отрицательный атом кисло- рода карбонильной группы оттягивает электроны с углерода) Гомолити- ческий _^_н ___У + .Н разрыв Углеродный Атом Н радикал II II -С-С- —С * + * С— II II Углеродные радикалы Гетеролита- ческий _^_н __ —i:- + н+ разрыв Карбанион Протон Гидроксид-ион Карбокатион Гидрид- ион Карбанион Карбо- катион Рис. 13-1. Два механизма разрыва связей С—С и С—Н. При гомолитическом разрыве связи каждый атом сохра- няет за собой один электрон, что приводит к образова- нию углеродного радикала (углерод имеет неспаренный электрон) или незаряженного атомарного водорода. При гетеролитическом разрыве связи оба электрона остают- ся связанными с одним из атомов. При этом образуются карбанионы, карбокатионы, протоны или гидрид-ионы. Протонированная иминогруппа (имин, активированный прото- нированием для нуклеофильной атаки по атому углерода) O^:R О—Р=О 1U о Фосфор фосфатной группы Протон Рис. 13-2. Наиболее распространенные нуклеофилы и электрофилы в биохимических реакциях. В схемах ме- ханизмов химических реакций, при которых происходит образование или разрыв ковалентных связей, электро- ны изображают точками, а изогнутые стрелки показы- вают направление перемещения электрона или пары электронов. Ковалентная связь образуется в результа- те обобществления пары электронов. Не участвующие в образовании химической связи электроны, если они важны для понимания механизма реакции, изображают парой точек (:). Изогнутые стрелки (х-^) показывают направление смещения пары электронов. Перемещение одного электрона (как в свободнорадикальных реакциях) изображают стрелкой, похожей на рыболовный крючок (^>). Во многих процессах участвует неподеленная пара электронов. Реакции, протекающие с образованием или разрывом связи углерод-углерод. Гетеролити- ческий разрыв связи С—С приводит к образо- ванию карбаниона и карбокатиона (рис. 13-1). Образование же связи С—С происходит в резуль- тате соединения нуклеофильного карбаниона и электрофильного карбокатиона. Карбанионы и карбокатионы обычно настолько нестабильны, что их образование в качестве промежуточных продуктов химической реакции, даже при учас-
[22] Часть II. 13. Основы биоэнергетики. Типы химических реакций Рис. 13-3. Химические свойства карбонильной группы. а — атом углерода карбонильной группы обладает элек- трофильными свойствами, что связано со способностью электроноакцепторного атома кислорода оттягивать на себя электроны. В результате возникает гибридная ре- зонансная структура, в которой атом углерода несет частичный положительный заряд, б — делокализация электронов на карбонильной группе способствует ста- билизации карбаниона на соседнем атоме углерода и об- легчает его образование, в — имины выполняют ту же функцию, что и карбонильная группа, облегчая делока- лизацию электронов, г — карбонильная группа не всегда действует в одиночку; ее способность оттягивать на себя электроны часто увеличивается благодаря присутствию иона металла (Ме2+, например, Мд2+) или кислоты (НА). тии ферментов, энергетически очень невыгодно. В условиях клетки эти реакции просто не могут протекать, если только на «помощь» не приходит какая-либо функциональная группа, содержащая электроотрицательные атомы (О или N), способ- ные изменить электронное состояние соседних атомов углерода и стабилизировать его таким об- разом, чтобы облегчить образование карбанионов и карбокатионов. Карбонильные группы играют очень важную роль в химических реакциях, задействованных в различных метаболических путях. Атом углерода карбонильной группы несет частичный положи- тельный заряд, что связано с электроноакцептор- ными свойствами кислорода карбонильной груп- пы, поэтому такой атом углерода выступает в роли электрофила (рис. 13-3, а). Таким образом, кар- бонильная группа может облегчать образование карбаниона на соседнем атоме углерода путем де- локализации отрицательного заряда (рис. 13-3, б). Иминогруппа C=+NH2 может выполнять ана- логичную функцию (рис. 13-3, в). Способность карбонильных и иминогрупп делокализовать электроны может быть дополнительно усиле- на общим кислотным катализатором или ионом металла, таким как Mg2+ (рис. 13-3, г; см. также рис. 6-21 и 6-23). Карбонильные группы играют особенно важ- ную роль в реакциях трех основных типов, про- исходящих с образованием или разрывом связей С—С (рис. 13-4), а именно при альдольной кон- денсации, конденсации Кляйзена и в реакциях декарбоксилирования. В этих реакциях образую- щийся карбанион стабилизирован карбонильной группой, причем достаточно часто другой карбо- нил выступает в роли электрофила, с которым ре- агирует нуклеофил — карбанион. О R2 R3 тт+ О 1^2 ^3 и I । > ¥ и I I Ri—С—С :Gz»C==O -А—► R С-С-С-ОН II II н r4 н r4 Альдольная конденсация О Н Ri II I I CoA-S—С—С—С—ОН I I н R2 Сложноэфирная конденсация Кляйзена II lift // ¥ II I R — С—С-1С R—С—С—Н + СО, I । н ° н Декарбоксилирование 0-кетокислоты Рис. 13-4. Примеры реакций с разрывом или образо- ванием связи С—С в биологических системах. В аль- дольной конденсации и конденсации Кляйзена кар- банион выполняет функцию нуклеофила, а углерод карбонильной группы выступает в роли электрофила. В обоих случаях карбанион стабилизирован другой кар- бонильной группой при соседнем атоме углерода. В ре- акции декарбоксилирования в результате отщепления С02 (этот атом углерода выделен синим) образуется карб- анион. Эта реакция не могла бы происходить со сколь- ко-нибудь заметной скоростью без стабилизирующего эффекта карбонильной группы, расположенной рядом с карбанионом. Каждый раз, когда изображают карбанион, подразумеваются стабилизирующие резонансные струк- туры с участием соседней карбонильной группы, как по- казано на рис. 13-3, б. В стабилизации карбаниона вместо карбонильной группы может принимать участие имино- группа (рис. 13-3, в) или другая электроноакцепторная группа, включая некоторые кофакторы ферментов, на- пример пиридоксаль.
13.2 Химические основы биохимических реакций [23] Диметил аллилпирофосфат Изопентенил- пирофосфат О- О- Н О “О—Р—О—Р—о н с Н2 с2 , ?нз с сн3 н О Изопентенилпирофосфат Диметилаллильный карбокатион Геранилпирофосфат Рис. 13-5. Возникновение карбокатиона при образова- нии связи углерод-углерод. На одной из ранних стадий биосинтеза холестерина фермент пренилтрансфераза катализирует конденсацию изопентенилпирофосфата с диметилаллилпирофосфатом с образованием геранилпи- рофосфата (см. рис. 21-36). Реакция начинается с отще- пления пирофосфатной группы из диметилаллилпиро- фосфата, в результате чего возникает карбокатион, ста- билизируемый за счет резонанса с соседней связью С=С. Альдольная конденсация достаточно часто используется для образования связи С—С; при гликолизе альдолаза катализирует обратную реакцию превращения шестиуглеродного со- единения в два трехуглеродных соединения (см. рис. 14-5). При конденсации Кляйзена карб- анион стабилизируется карбонильной группой соседнего тиоэфира; пример — синтез цитрата в цикле лимонной кислоты (см. рис. 16-9). При декарбоксилировании также достаточно часто образуется карбанион, стабилизированный кар- бонильной группой; пример — катализируемая ацетоацетатдекарбоксилазой реакция образо- вания кетоновых тел при катаболизме жирных кислот (см. рис. 17-18). Целые метаболические пути основаны на том, что вступающие в реак- цию вещества имеют карбонил в подходящем окружении, что позволяет осуществлять реак- ции образования и разрыва углерод-углерод- ных связей. В некоторых случаях электроно- акцепторную функцию карбонильной группы выполняет иминогруппа или специализирован- ный кофактор, например пиридоксальфосфат. Карбокатион как промежуточное соедине- ние в некоторых реакциях образования или раз- рыва связи углерод-углерод возникает в резуль- тате удаления хорошей уходящей группы, такой как пирофосфат (см. ниже раздел, посвященный реакциям переноса групп). В качестве примера можно привести реакцию, катализируемую пре- нилтрансферазой (рис. 13-5), происходящую на начальных стадиях биосинтеза холестерина. Внутримолекулярные перегруппировки, изоме- ризация и элиминирование. Другой распростра- ненный тип клеточных реакций — внутримолеку- лярные перегруппировки, при которых перерас- пределение электронов приводит к структурным изменениям, не затрагивая общего окислитель- ного состояния. Например, различные функци- ональные группы могут претерпевать окисли- тельно-восстановительные превращения, но вся молекула в целом не меняет свое окислительное состояние. Группы, находящиеся при атомах углерода, соединенных двойной связью, могут претерпевать ^г/с-трш/с-переходы, что может со- провождаться переносом самой двойной связи. Пример изомеризации в результате окислитель- но-восстановительной реакции — образование фруктозо-6-фосфата из глюкозо-6-фосфата при гликолизе (рис. 13-6 ; эта реакция подробно об- суждается в гл. 14): С-1 восстанавливается (аль- дегид превращается в спирт), а С-2 окисляется (спирт превращается в кетон). На рис. 13-6, б по- казан перенос электронов при этой изомеризации. Цг/с-трш/с-превращения проиллюстрированы на примере реакции, катализируемой пролил-^г/с- трш/с-изомеразой, участвующей в фолдинге не- которых белков (см. рис. 4-7, б). Простой перенос связи С=С происходит при метаболизме олеино- вой кислоты, весьма распространенной жирной кислоты (см. рис. 17-9). Интересные примеры ре- акций с переносом двойной связи можно наблю- дать при биосинтезе холестерина (см. рис. 21-33).
[24] Часть II. 13. Основы биоэнергетики. Типы химических реакций н н^с^с— II I о он ОНН НН О- llll I -С-С-С-С-О-Р-О- llll II н ононн о Глюкозо-6-фосфат фосфогексозо- изомераза Н ОНН НН О- I _ I I I I I Н^С—^С-С-С-С-С-О-Р-СГ I II I I I I II он о н ононн о Фруктозо-6-фосфат (1) Bt отрывает протон. @ Это способствует образованию двойной связи С=С. (3) Электроны карбо- нильной группы образуют связь O-H с ионом водорода, предоставляемым В2. Электрон покидает связь ОС для образования связи С-Н с протоном, предоставляемым Bt. (4) В2 отрывает протон, способствуя образованию связи Промежуточный ендиол Вг с—с ОН о н I В2 Рис. 13-6. Реакции изомеризации и элиминирования, а — превращение глюкозо-б- фосфата в фруктозо-б-фосфат, катализируемое фосфогексозоизомеразой. б — реакция про- текает через образование ендиола. Изогнутыми синими стрелками показано перемещение связывающих электронных пар. Розовым цветом указан ход окисления слева направо. В2 и В2 — ионизируемые группы фермента, они в ходе реакции способны принимать и отдавать протоны (т. е. выступают в роли кислот или оснований). Розовым цветом выделены нукле- офильные группы, синим — электрофильные. Копропорфириноген III Радикал копропорфиногена III Рис. 13-7. Реакции декарбоксилирования, инициируемые свободными радикалами. Био- синтез гема (см. рис. 22-24) в клетках Escherichia coli включает стадию декарбоксилирова- ния, при которой пропионильная боковая группа копропорфириногена III превращаются в винильную группу протопорфириногена IX. При росте бактерии в анаэробных условиях фермент кислород-независимая копропорфириноген-Ш-оксидаза, называемая также бел- ком HemN, стимулирует декарбоксилирование по изображенному здесь свободнорадикаль- ному механизму. Акцептор высвобождающихся электронов неизвестен. Для простоты пока- заны только важные для описания механизма реакции участки молекул, а полностью струк- туры представлены на рис. 22-24. При росте Е. coli в присутствии кислорода эта реакция заменяется окислительным декарбоксилированием, катализируемым другим ферментом. Протопорфириноген IX
13.2 Химические основы биохимических реакций [25] Пример реакции элиминирования, происхо- дящей без изменения общего окислительного со- стояния молекулы, — отщепление воды от спирта с образованием двойной связи С=С. НН Н2О R н II I4 \ / R-C-C-Rt ч " /С=С\ Н ОН Н2° Н Ri Похожие реакции элиминирования происходят в аминах. Реакции с участием свободных радикалов. Ранее считалось, что гомолитический разрыв ковалентной связи с образованием свобод- ных радикалов происходит достаточно редко, однако это было обнаружено в очень разных биохимических процессах. Среди них — изо- меризация с участием аденозилкобаламина (витамина В12) или S-аденозилметионина, инициируемая 5'-дезоксиаденозильным ради- калом (см. реакцию, катализируемую метил- малонил-СоА-мутазой, в доп. 17-2), иниции- руемые радикалами реакции декарбоксилиро- вания (рис. 13-7), реакции редуктаз, например реакция, катализируемая рибонуклеотидре- дуктазой (см. рис. 22-41), а также перегруп- пировки, например реакция, катализируемая ДНК-фотолиазой (см. рис. 25-27). Реакции с переносом функциональных групп. В живых организмах часто происходят реак- ции с переносом ацильной, гликозильной или фосфорильной группы от одного нуклеофила к другому. Перенос ацильной группы обычно со- провождается присоединением нуклеофила к карбонильному углероду ацильной группы с об- разованием промежуточного тетраэдрического интермедиата: <3 R-C-X | О Тетраэдрическое промежуточное соединение Примером может служить реакция, ката- лизируемая химотрипсином (см. рис. 6-21). В принципе, замещение может происходить как по механизму SN1, так и по механизму SN2, как по- казано на рис. 6-25 для лизоцима. Особую роль в метаболизме играют реак- ции с переносом фосфорильной группы; эти реакции рассматриваются в разд. 13.3. Важ- ную роль при метаболизме играют реакции присоединения хороших уходящих групп к промежуточным продуктам метаболизма, что служит для их «активации» и дальнейших превращений. К хорошим уходящим группам в реакциях нуклеофильного замещения отно- сятся неорганический ортофосфат (анионы фосфорной кислоты Н3РО4 — смесь Н2РО4 и НРО4-, которую обычно сокращенно обозна- чают как Р^ и неорганический пирофосфат (Р2О74”, сокращенно PPi); эфиры и ангидриды фосфорной кислоты достаточно активны для дальнейшей реакции. Кроме того, нуклео- фильному замещению способствует присоеди- нение фосфорильной группы к такой плохой уходящей группе, как гидроксильная группа. Нуклеофильное замещение, при котором фос- форильная группа РОз” выступает в качестве уходящей группы, происходит в сотнях мета- болических реакций. Фосфор может образовывать пять кова- лентных связей. Неорганический ортофосфат Pi (рис. 13-8, а) обычно изображают с тремя простыми (одинарными) связями Р—О и одной двойной связью Р=О; это удобно, но далеко не точно. На самом деле в ортофосфате Pi все четыре связи фосфор-кислород эквивалентны и имеют в какой-то степени характер двойной связи, так что структура этого аниона тетра- эдрическая (рис. 13-8, б). Поскольку у кисло- рода более выражены электроноакцепторные свойства, чем у фосфора, электронная пара не в равной степени принадлежит обоим атомам: расположенный в центре структуры атом фос- фора несет частичный положительный заряд и поэтому может выступать в качестве электро- фила. Во множестве реакций метаболизма фос- форильная группа РОз” переносится от молеку- лы АТР на молекулу спирта, в результате чего образуется фосфат (эфир) (рис. 13-8, в), или на карбоновую кислоту с образованием сме- шанного ангидрида. При атаке нуклеофила на электрофильный атом фосфора молекула АТР превращается в достаточно стабильный про- межуточный продукт, в котором фосфор пяти- валентен (рис. 13-8, г). Перенос фосфорильной группы завершается отщеплением уходящей
[26] Часть II. 13. Основы биоэнергетики. Типы химических реакций II о—Р—сг I О" СГ I О=Р-СГ I ст в ООО ____________ ।-----1 ।--1 II II | Аденин |—|Рибоза|—О—Р—О—Р—О—Р—О НО—R п- п- п- Глюкоза АТР о I--------1 I-------1 11 | Аденин |—|Рибоза|— О—Р—* О~ О II о—р—0“ + I О" о—р—о—R ADP Глюкозо-6-фосфат, эфир фосфорной кислоты группы (ADP). Большое семейство ферментов, катализирующих перенос фосфорильной груп- пы от молекулы АТР, называют киназами (от греч. kinein — двигать). Например, гексокиназа «передвигает» фосфорильную группу от АТР на молекулу глюкозы. Однако не только фосфорильные группы ак- тивируют молекулы для последующей реакции. Тиоспирты (тиолы), в которых атом кислорода спиртовой группы заменен на серу, также явля- ются хорошими уходящими группами. Тиолы активируют карбоновые кислоты путем образо- вания тиоэфиров. В последующих главах мы рас- смотрим несколько реакций, включая реакции синтеза липидов, катализируемые синтетазами жирных кислот (см. рис. 21-2), при которых ну- клеофильное замещение по карбонильному угле- роду тиоэфира приводит к переносу ацильной группы на другой остаток. Окислительно-восстановительные реакции. В биомолекулах углерод может существовать в пяти окислительных состояниях в зависимости от тех элементов, с которыми он делит электро- ны (рис. 13-9), а переходы между этими состо- яниями играют важнейшую роль в метаболизме (окислительно-восстановительным реакциям посвящен разд. 13.4). Во многих окислительных процессах в биологии соединения теряют два электрона и два иона водорода (упрощая, будем говорить два водорода). Такие реакции обычно называют реакциями дегидрирования, а ката- g .° Z—P'--W I О Z = R—ОН W = ADP Рис. 13-8. Альтернативные варианты изображения структуры неорганического ортофосфата, а — три атома кислорода связаны с атомом фосфора одинарными свя- зями, а четвертый присоединен двойной связью; можно построить четыре различные резонансные структуры. б — более точные резонансные структуры, если все че- тыре связи кислород-фосфор имеют природу отчасти двойной связи; при этом гибридные орбитали образуют тетраэдр с атомом фосфора в центре, в, г-— при атаке ну- клеофила Z (здесь ОН-группа при С-б в глюкозе) на АТР происходит замещение с образованием ADP (здесь W). В этой 5и2-реакции образуется промежуточное соедине- ние с пятивалентным фосфором Р. -сн2-сн3 —сн2—СН2ОН -CH2-cf Н(Е) - сн2—с< он Алкан Спирт Альдегид (кетон) Карбоновая кислота 0=С=0 Углекислый газ Рис. 13-9. Окислительные состояния углерода в био- молекулах. Ряд органических соединений, каждое из которых можно получить путем окисления атома угле- рода (выделен красным цветом) в предшествующем со- единении. Диоксид углерода — наиболее окисленная форма углерода, встречающаяся в живых системах.
13.2 Химические основы биохимических реакций [27] ОН п 2Н+^2е о п । Z 2_ || Z СНз-СН-С/ s СНз-С-С/ О- \ О- 2Н+ + 2е- Лактат лактат- Пируват дегидрогеназа Рис. 13-10. Окислительно-восстановительная реакция. Представлена реакция окисления лактата до пирувата. Происходит дегидрирование — удаление двух электро- нов и двух ионов водорода (что эквивалентно удалению двух атомов водорода) от атома С-2 лактата с образовани- ем пирувата (кетона). В клетках эту реакцию катализиру- ет лактатдегидрогеназа, а электроны переносятся на ко- фактор никотинамидадениндинуклеотид (NAD). Реакция обратима; пируват может восстанавливаться электрона- ми от кофактора. лизирующие их ферменты — дегидрогеназами (рис. 13-10). В некоторых, хотя и не во всех, био- химических реакциях окисления атом углерода связывается с атомом кислорода ковалентной связью. Ферменты, катализирующие такие про- цессы, называют оксидазами, а если при этом атом кислорода берется непосредственно из мо- лекулярного кислорода (О2), то такие ферменты называют оксигеназами. Любой процесс окисления обязательно со- провождается восстановлением, при котором акцептор электронов принимает электроны, уда- ленные при окислении. Реакции окисления обыч- но происходят с выделением энергии (вспомните костер: вещества, из которых состоит древеси- на, окисляются молекулярным кислородом из воздуха). Большинство живых клеток получа- ют необходимую им энергию путем окисления «топливных» молекул, таких как углеводы или жиры (фотосинтезирующие организмы исполь- зуют солнечную энергию, поглощая свет). Опи- санные в гл. 14-19 катаболические процессы (т. е. процессы, сопровождаемые выделением энергии) представляют собой последовательности окисли- тельных реакций, где перенос электронов от то- пливных молекул к кислороду осуществляется с помощью переносчиков электронов. Высокое сродство молекулярного кислорода к электронам делает весь процесс переноса электронов экзерго- ническим и обеспечивает необходимую энергию для синтеза АТР, что является основной задачей реакций катаболизма. Многие реакции всех пяти рассмотренных здесь типов происходят в присутствии кофакто- ров в форме коферментов или ионов металлов (примеры — витамин В12, S-аденозилметионин, фолат, никотинамид, железо). Кофакторы свя- зываются с ферментами (обратимо или же прак- тически необратимо), благодаря чему и осущест- вляется катализ определенных химических пре- вращений (см. разд. 6.1, т. 1). Большинство ко- факторов участвуют в определенной достаточно узкой группе родственных реакций. В последую- щих главах мы обсудим наиболее важные кофак- торы. Если положить в основу кофакторы, изуче- ние биохимических процессов можно организо- вать совсем по-другому, поскольку все реакции с участием конкретного кофактора взаимосвязаны. Биохимические и химические уравнения вовсе не одно и то же Биохимики записывают реакции метаболизма с помощью упрощенных схем, что особенно замет- но, например, в случае реакций с участием АТР. Фосфорилированные соединения могут диссо- циировать по нескольким ступеням и, как мы об- суждали выше, связывать при этом ионы магния. Например, при pH 7,0 и концентрации Mg2+ 2 мМ АТР существует в виде АТР4-, НАТР3-, Н2АТР2-, MgHATP- и Mg2ATP. Однако рассуждая о био- логической роли АТР, мы далеко не всегда ин- тересуемся подобными деталями и при этом не рассматриваем АТР как некую сумму веществ. И поэтому реакцию гидролиза АТР биохимик запи- сывает в виде следующей схемы: АТР + Н2О ADP + Pi где на самом деле АТР, ADP и Pi — некоторая сумма (смесь) веществ. В то же время константа равновесия K'eq = [ADP] [PJ/f АТР] зависит от pH и от концентрации свободных ионов Mg2+. Обра- тите внимание, что в биохимическом уравнении (в приведенной схеме) не фигурируют ионы во- дорода и Mg2+, поскольку их концентрации посто- янны (не меняются при протекании биохимиче- ской реакции). Таким образом, в биохимическом уравнении нет необходимости уравнивать число атомов Н и Mg, а также заряды, а вот в химиче- ском уравнении обязатеььно надо уравнивать число всех элементов, участвующих в реакции (в данном примере С, N, О и Р).
[28] Часть II. 13. Основы биоэнергетики. Типы химических реакций Для сравнения мы может записать химиче- ское уравнение, в котором уравниваются все эле- менты и заряды. Например, в отсутствие магния гидролиз АТР при pH > 8,5 можно записать сле- дующим образом: АТР4 + Н2О ADP3 + НРОГ + Н+ Соответствующая константа равновесия (X'eq = [ADP3 ] [НРО4 ][Н+]/[АТР4 ]) зависит только от температуры, давления и ионной силы раствора. В биохимии используются оба способа за- писи уравнений реакций метаболизма. Хими- ческая форма записи необходима в тех случаях, когда мы хотим учесть все атомы и все заряды, что бывает нужно при описании механизма хи- мической реакции. Биохимическая форма запи- си используется для определения направления самопроизвольного протекания реакции при за- данных значениях pH и [Mg2+], а также для рас- чета константы равновесия. В данной книге мы в основном используем биохимическую форму записи реакций, за ис- ключением тех случаев, когда речь идет о меха- низме реакции; значения AG'° и K'eq соответству- ют pH 7 и концентрации ионов Mg2+ 1 мМ. Краткое содержание раздела 13.2 ХИМИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ БИОХИМИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ Множество химических реакций, которые происходят в живых организмах, можно раз- делить на пять основных типов. Карбонильная группа играет важную роль в реакциях образования и разрыва связи С С. Часто в качестве промежуточного соединения образуется карбанион, стаби- лизированный соседними карбонильными группами или (реже) иминогруппами или кофакторами. Перераспределение электронов может при- водить к внутримолекулярным перегруппи- ровкам, изомеризации и элиминированию (отщеплению) функциональных групп. К таким реакциям относятся внутримолеку- лярные окислительно-восстановительные реакции, цис-транс-перевруппировки при двойной связи и перенос двойной связи. Гомолитический разрыв ковалентной связи с образованием свободных радикалов про- исходит в некоторых реакциях метаболизма, таких как изомеризация, декарбоксилирова- ние и реакции, катализируемые редуктазами. Особенно важную роль в клетке играют ре- акции с переносом фосфорильной группы; это способ активации молекул, которые без подобной активации не могли бы претер- певать дальнейших химических превраще- ний. Окислительно-восстановительные реакции сопровождаются потерей и приобретением электронов: одно вещество получает элек- троны и восстанавливается, а другое веще- ство отдает электроны и при этом окисляет- ся. Реакции окисления обычно протекают с высвобождением энергии и играют важную роль в процессах катаболизма. 13.3. Перенос фосфатных групп и АТР Познакомившись с некоторыми фундаменталь- ными закономерностями изменений энергии в химических системах, мы теперь можем рас- смотреть энергетический цикл в клетках и осо- бую роль АТР как энергетического посредника, связывающего процессы катаболизма и анабо- лизма (см. рис. 1-28, т. 1). Гетеротрофные клет- ки получают свободную энергию в химической форме в процессе катаболизма молекул пита- тельных веществ и используют эту энергию для синтеза АТР из ADP и неорганического фос- фата Р[. Затем АТР отдает часть своей хими- ческой энергии в эндергонических процессах, таких как синтез промежуточных продуктов метаболизма и макромолекул из более мелких предшественников, перенос веществ через мем- браны против градиента концентраций и моле- кулярная динамика. Такая передача энергии от АТР в конце концов приводит к распаду АТР на ADP и Pj, а в некоторых случаях до АМР и 2 Рь Мы обсудим здесь химические основы больших
13.3 Перенос фосфатных групп и АТР [29] изменений свободной энергии, которыми со- провождается процесс гидролиза АТР и других высокоэнергетических фосфатных соединений, и покажем, что в большинстве реакций переда- чи энергии от АТР происходит перенос групп, а не простой гидролиз АТР Для иллюстрации энергетических превращений, в которых АТР поставляет энергию, рассмотрим синтез инфор- мационных макромолекул, транспорт раство- ров через мембраны и сокращение мышц. При гидролизе АТР изменение свободной энергии выражается отрицательным числом, большим по абсолютной величине Почему же при гидролизе АТР стандартная свободная энергия настолько отрицательна? Рассмотрим химические основы этого процес- са, воспользовавшись рис. 13.11. Гидролитиче- ское отщепление концевого фосфата с разры- вом фосфоангидридной связи в АТР приводит к незначительному уменьшению напряжения в структуре молекулы АТР, обусловленного электростатическими взаимодействиями. Вы- свободившийся Pi (НРО42 ) стабилизирует- ся путем образования резонансных структур, существование которых невозможно в АТР. ADP2- — другой прямой продукт гидролиза АТР немедленно диссоциирует, высвобождая в среду ионы водорода в очень низкой концен- трации, [Н+] « 10-7 М. Концентрации прямых продуктов гидролиза АТР в клетке значитель- но ниже их концентраций в равновесной си- стеме (табл. 13-5); таким образом, по закону действующих масс в клетке имеются благо- приятные условия для гидролиза АТР. Для гидролиза АТР в стандартных усло- виях изменение свободной энергии составляет -30,5 кДж/моль, однако в живых клетках этот параметр существенно отличается от этой ве- личины, поскольку клеточные концентрации АТР, ADP и Р| не равны между собой и гораз- при гидролизе отталкивание одноименных зарядов уменьшается О II “О—Р—ОН I Pi О резонансная стабилизация Рис. 13-11. Объяснение очень большой величины свободной энергии реакции гидролиза АТР. CD Раз- рыв концевой фосфатной связи при гидролизе сни- мает электростатическое напряжение молекулы АТР с четырьмя отрицательными зарядами. (2) Продукт ре- акции неорганический фосфат Pt стабилизируется пу- тем образования гибридной резонансной структуры, в которой каждая из четырех связей фосфор-кислород в некоторой степени имеет природу двойной связи, а водородный ион не связан постоянно ни с одним из атомов кислорода. (Резонансная стабилизация проис- ходит и в фосфатах с эфирной или ангидридной свя- зями. Но у них число резонансных форм меньше, чем у Рф (3) При pH 7 продукт ADP2- сразу же диссоциирует. Четвертый фактор (на рисунке не отражен), который благоприятствует гидролизу АТР, — это более высо- кая степень сольватации (в данном случае гидратации) продуктов Pi и ADP по сравнению с исходным АТР, из-за чего продукты реакции становятся устойчивее, чем ис- ходные вещества. “ 8~ “13- .0. 8-0—р—о«- н+ о _ 8~ J О о II II I-------1 I-----1 НО—Р—О—Р—О—| Рибоза |—| Аденин | О" 0“ ADP2 диссоциация по следующей ступени Н+ + О—Р—О—Р—О—| Рибоза]—| Аденин | 0“ 0“ ADP3- АТР4- + Н20----> ADP3" + Р?“ + Н+ AG'° = —30,5 кДж/моль
[30] Часть II. 13. Основы биоэнергетики. Типы химических реакций Таблица 13-5 Концентрации адениновых нуклеотидов, неорганических фосфатов и креатинфосфатов в некоторых клетках Клетки Концентрация (мМ)а АТР ADP6 АМР Pi РСг Гепатоциты крыс 3,38 1,32 0,29 4,8 0 Миоциты крыс 8,05 0,93 0,04 8,05 28 Нейроны крыс 2,59 0,73 0,06 2,72 4,7 Эритроциты человека 2,25 0,25 0,02 1,65 0 Клетки Е. coli 7,90 1,04 0,82 7,9 0 а Для эритроцитов приведены концентрации в цитозоле (у эритроцитов человека нет ни ядра, ни митохондрий). Во всех других случаях имеется в виду общее содержание в клетке, концен- трация ADP в цитозоле сильно отличается. РСг — креатинфосфат (обсуждается на с. 33). 6 Приведена суммарная концентрация всех форм ADP; содержание свободного ADP может быть гораздо ниже (см. с. 30-31). до ниже стандартных концентраций, равных 1,0 М (табл. 13-5). Более того, в цитозоле с АТР и ADP связываются ионы Mg2+ (рис. 13-12), и в большинстве ферментативных реакций, в которых АТР участвует в качестве доно- ра фосфорильной группы, активной формой АТР является именно его комплекс с магнием MgATP2-. Поэтому правильнее говорить о AG'° гидролиза MgATP2-. В доп. 13-1 приведен рас- чет AG гидролиза АТР в интактных эритроци- О О О “О—Р—О—Р— О—Р—о о; р- Mg2 + “О—Р—О—Р—о 0" /0“ Mg2+ ст о о Рис. 13-12. Мд2+ и АТР. При образовании комплексов с Мд2+ отрицательные заряды на кислородных атомах ча- стично нейтрализуются, что влияет на конформацию фосфатных групп в таких нуклеотидах, как АТР и ADP. тах с использованием данных, приведенных в табл. 13-5. В интактных клетках величина AG гидролиза АТР, обычно обозначается AGp и на- зывается потенциалом фосфорилирования. Поскольку в клетках разных типов концен- трации АТР, ADP и Р^ варьируют (см. табл. 13- 5), величины AGp гидролиза АТР в них также различны. Более того, в любой клетке AGp мо- жет изменяться во времени в зависимости от условий метаболизма, на которые влияют кон- центрации АТР , ADP, Pi и Н+ (pH). Мы можем рассчитать AGp любой реакции метаболизма в клетке, если известны концентрации всех ис- ходных веществ и продуктов реакции, а также другие параметры (pH, температура и концен- трация ионов Mg2+). Расчеты усложняются тем, что суммарные концентрации АТР, ADP, Pi и Н+ могут быть существенно выше, чем соответствующие сво- бодные концентрации, которые входят в термо- динамические расчеты, ведь часть АТР, ADP, и Pi связано с клеточными белками. Например, по различным данным, в расслабленной мыш- це концентрация свободных молекул ADP ва- рьирует от 1 до 37 мкМ. В примере 13-2, если использовать концентрацию 25 мкМ, получим AGp = -64 кДж/моль. Возможно, этот расчет AGp не столь уж поучителен; однако надо помнить наш вывод относительно изменений свободной
13.3 Перенос фосфатных групп и АТР [31] Пример 13-2. РАСЧЕТЛ6р Вычислите свободную энергию гидролиза АТР (AGp) в эритроцитах человека. Стандартная свободная энергия гидролиза АТР равна -30,5 кДж/моль, а кон- центрации АТР, ADP и Р^ в эритроцитах приведены в табл. 13-5; pH 7,0, темпе- ратура тела 37 °C. Что можно сказать о количестве энергии, необходимом для синтеза АТР в таких условиях? Решение. В эритроцитах человека концентрации АТР, ADP и Pi равны 2,25 мМ, 0,25 мМ и 1,65 мМ соответственно. Свободная энергия гидролиза АТР в эритроцитах при стандартных условиях (см. уравнение 13-4) [ADP] [PJ AGD = AG'° + RTln ---- [ATP] Подставляя численные значения, получаем г (0,25 • 10-3)(1,65 • 103)1 AGp = -30,5 кДж/моль + [(8,315 Дж/моль • К)(298 К) In--2 25 1Q_3-"] = = -30,5 кДж/моль + (2,48 кДж/моль) In 1,8 • 10-4 = = -30,5 кДж/моль — 21 кДж/моль = -52 кДж/моль (Обратите внимание, что ответ округлен (52,5 округлили до 52) по прави- лам округления цифры 5 до ближайшего меньшего (а не большего) целого числа, чтобы избежать завышения значений.) Таким образом, в интактных эритроцитах AGp гидролиза АТР (-52 кДж/моль) существенно выше, чем AG'° = -30,5 кДж/моль. Итак, для синтеза АТР из ADP и Pi в эритроцитах требуется 52 кДж/моль. энергии: in vivo энергия, высвобождаемая при гидролизе АТР, выше изменения стандартной свободной энергии AG'°. В дальнейшем для гидролиза АТР мы будем приводить величину AG'°, так как это позволит сравнивать энергетику разных реакций в клетке. Но не забывайте, что в живой клетке AG гидро- лиза АТР, а также многих других реакций может очень сильно отличаться от AG'°. Здесь следует сделать одно важное замеча- ние, касающееся содержания АТР в клетках. Мы показали (и еще обсудим далее), какие химиче- ские свойства АТР делают эту молекулу удоб- ным энергетическим ресурсом клетки. Однако АТР управляет реакциями метаболизма и дру- гими энергозатратными процессами не только благодаря своим химическим свойствам. Более важную роль сыграло то, что в ходе эволюции выработались такие регуляторные механизмы, которые поддерживают внутриклеточную кон- центрацию АТР на значительно более высоком уровне, чем равновесные концентрации в реак- циях гидролиза. При снижении концентрации АТР уменьшается не только количество топли- ва, но само топливо теряет свою мощность: снижается AG гидролиза этой молекулы (т. е. потенциал фосфорилирования, AGp). Как мы увидим при обсуждении метаболических про- цессов, протекающих с образованием и расхо- дованием АТР, живые клетки выработали тон- кие механизмы (которые, как может показать- ся на первый взгляд, снижают эффективность процессов и противоречат здравому смыслу) для поддержания высокой концентрации АТР.
[32] Часть II. 13. Основы биоэнергетики. Типы химических реакций Свободная энергия других фосфорилированных соединений и тиоэфиров тоже велика Фосфоенолпируват (ФЕП; рис. 13-13) содержит фосфоэфирную связь, которая подвергается ги- дролизу с образованием енольной формы пиру- вата, и этот прямой продукт реакции может сра- зу же в результате таутомеризации переходить в более устойчивую кетоформу Благодаря тому, что исходный ФЕП имеет только одну форму (енольную), а продукт (пируват) может суще- ствовать в двух формах (енольной и кетоформе), продукт реакции более стабилен по сравнению с исходным веществом. Это в основном и опре- деляет большую величину стандартной свобод- ной энергии гидролиза фосфоенолпирувата: AG'° = -61,9 кДж/моль. Другое трехуглеродное соединение 1,3-бис- фосфоглицерат (рис. 13-14) содержит ан- гидридную связь между карбоксильной S / \ О-c ХО сг с сн2 ФЕП н2о гидролиз^ Pi “°-С\ /ОН О—с\ /О С таутомеризация С II I СН2 СНз Пируват (енольная форма) Пируват (кетоформа) ФЕП3 + Н2О -----> пируват + Pf AG'° = -61,9 кДж/моль Рис. 13-13. Гидролиз фосфоенолпирувата (ФЕП). Реакция катализируется пируваткина- зой и сопровождается последующей таутомеризацией пирувата. Таутомеризация ФЕП не- возможна, и поэтому продукты гидролиза более стабильны, чем исходные вещества. Как показано на рис. 13-11, происходит также резонансная стабилизация неорганического фосфата Pi. I 2 СНОН н2о гидролиз оч он V I снон резонансная стабилизация СНОН I сн2 о I “О—Р=О I 0“ диссоциация сн2 о I О—Р=0 I 0“ 1,3-Бисфосфоглицерат 3-Фосфоглицериновая кислота 3-Фосфоглицерат 1,3-Бисфосфоглицерат4 + Н20 ----> 3-фосфоглицерат3 + Рf + Н+ AG'° = -49,3 кДж/моль Рис. 13-14. Гидролиз 1,3-бисфосфоглицерата. Прямым продуктом гидролиза является 3-фосфоглицериновая кислота, содержащая недиссоциированную карбоксильную группу, которая, однако, тут же диссоциирует. Благодаря резонансной стабилизации продукт реак- ции более стабилен по сравнению с исходным веществом.
13.3 Перенос фосфатных групп и АТР [33] сосг I о сн2 II Н I “О—Р—N—С—N— СН3 । J 0“ +nh2 Креатинфосфат СОСГ СОО- Н20 СИ2 h2n сн2 ----H2N—С—N—СН3 <-------------> СН3 гидролиз V || резонансная д- 5+ Pi +NH2 стабилизация 2§+ Креатин Креатинфосфат2 + Н20 ----> креатин + Р2 AG'° = -43,0 кДж/моль Рис. 13-15. Гидролиз креатинфосфата. Разрыв связи Р-N в креатинфосфате приводит к образованию креатина, который стабилизируется образованием гибридной резонансной структуры. Другой продукт реакции также резонансно стабилизирован. группой при С-1 и фосфатным остатком. Гидролиз этого ацилфосфата сопровожда- ется значительным отрицательным изме- нением стандартной свободной энергии (AG'° = -49,3 кДж/моль), что можно объяс- нить, исходя из структурных особенностей ис- ходного вещества и продуктов реакции. Когда вода присоединяется по ангидридной связи 1,3-бисфосфоглицерата, один из продуктов реакции 3-фосфоглицериновая кислота бы- стро теряет протон, образуя 3-фосфоглицерат (карбоксилат-ион), имеющий две одинаково возможные резонансные формы (рис. 13-14). Протеканию реакции в прямом направлении благоприятствует удаление продукта реакции (3-фосфоглицериновой кислоты) и образова- ние резонансно стабилизированного иона. В креатинфосфате (рис. 13-15) связь Р—N может подвергаться гидролизу с образованием свободного креатина и Рь Выделение Pi и резо- нансная стабилизация креатина способствуют протеканию реакции в прямом направлении. Из- менение стандартной свободной энергии гидро- лиза креатинфосфата снова оказывается боль- шим (-43,0 кДж/моль). Во всех этих реакциях, где происходит выделение фосфата, образование нескольких резонансных форм Pj приводит к повышению устойчивости продукта реакции по сравне- нию с исходным веществом, что также явля- ется важной причиной большой отрицатель- ной величины изменения свободной энергии. В табл. 13-6 приведена стандартная свободная энергия гидролиза нескольких фосфорилиро- ванных соединений. Таблица 13-6 Стандартные свободные энергии гидролиза некоторых фосфорилированных соединений и ацетил-СоА (тиоэфир) Соединение \G° кДж/моль ккал/моль Фосфоенолпируват -61,9 -14,8 1,3-Бисфосфоглицерат (^ 3-фосфоглицерат + Pi) -49,3 -11,8 Креатинфосфат -43,0 -10,3 ADP (^ АМР + Pi) -32,8 -7,8 АТР ADP + ^) -30,5 -7,3 АТР (^ АМР + PPJ -45,6 -10,9 АМР (^ аденозин + Pj) -14,2 -3,4 PPi (^ 2 ^) -19,2 -4,0 Глюкозо-1 -фосфат -20,9 -5,0 Фруктозе-6-фосфат -15,9 -3,8 Глюкозо-6-фосфат -13,8 -3,3 Глицерин-1 -([юсфат -9,2 -2,2 Ацетил-СоА -31,4 -7,5 Источник. Данные взяты в основном из Jencks, W. Р. (1976) in Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, 3rd edn (Fasman, G. D., ed.), Physical and Chemical Data, Vol. 1, pp. 296-304, CRC Press, Boca Raton, FL. Для гидролиза пи- рофосфата — из Frey, Р & Arabshahi, А. (1995) Standard free- energy change for the hydrolysis of the a-[3-phosphoanhydride bridge in ATP. Biochemistry 34,11 307-11 310. Тиоэфиры, в молекулах которых в эфир- ной связи вместо кислорода содержится сера, также характеризуются большой отрицатель- ной стандартной свободной энергией гидро-
[34] Часть II. 13. Основы биоэнергетики. Типы химических реакций сн3—с S-CoA Ацетил-Со А Н2О гидролиз CoASH сн3-с он Уксусная кислота * диссоциация Кн+ СН3—С • Ацетат V" резонансная стабилизация Ацетил-Со А + Н2О---> ацетат + СоА + Н+ AG'° = —31,4 кДж/моль Рис. 13-16. Гидролиз ацетилкофермента А. Гидролиз тиоэфира ацетил-СоА характеризуется большой отрица- тельной стандартной свободной энергией. В тиоэфирах сера занимает место кислорода в сложноэфирной связи. Полная структурная формула кофермента А (СоА или CoASH) приведена на рис. 8-41, т. 1. лиза. Ацетилкофермент А, или ацетил-СоА (рис. 13-16), - один из тиоэфиров, играющих важную роль в метаболизме. Ацильная груп- па этих соединений активируется в реакциях переацилирования, конденсации или окисли- тельно-восстановительных реакциях. Тиоэфи- ры гораздо меньше подвержены резонансной стабилизации, чем кислородные эфиры. По- этому разность свободных энергий исходных веществ и продуктов гидролиза, которые резо- нансно стабилизируются, в случае тиоэфиров еще больше, чем в случае соответствующих кислородных эфиров (рис. 13-17). В обоих случаях гидролиз эфира приводит к образова- нию карбоновой кислоты, которая диссоции- рует и может давать несколько резонансных форм. Вместе оба этих фактора обусловлива- ют большую отрицательную величину AG'° (-31,4 кДж/моль) гидролиза ацетил-СоА. Подводя итоги, отметим, что в реакциях ги- дролиза, которые характеризуются большими отрицательными величинами изменений стан- дартной свободной энергии, продукты реакций стабильнее, чем исходные вещества. Это обсу- ловлено одной или несколькими следующими причинами: (1) в реагентах вследствие электро- статического отталкивания при разделении за- | Тиоэфир] ~’о Дополнительную стабилизацию s~ кислородного эфира обеспечивают резонансные структуры СН3—С R Сложный эфир О AG гидролиза тиоэфира сн3—С ХО—R резонансная стабилизация <---------> СН3-< з- о О—R g- де гидролиза сложного эфира СН3—С + R—SH \)Н СН3—С + R—ОН хон Рис. 13-17. Свободная энергия гидролиза сложных эфиров и тиоэфиров. Продукты гид- ролиза этих эфиров характеризуются приблизительно одинаковой свободной энергией (G), однако свободная энергия тиоэфира выше, чем у «кислородного» эфира. Частичное пере- крывание орбиталей атомов 0 и С обеспечивает резонансную стабилизацию кислородных эфиров; орбитали атомов S и С перекрываются плохо, что приводит к незначительной резо- нансной стабилизации тиоэфиров.
13.3 Перенос фосфатных групп и АТР [35] рядов напряжение связи ослабевает, как в случае с АТР; (2) продукты реакции стабилизируются при диссоциации, как АТР, ацилфосфаты и тио- эфиры; (3) продукты реакции стабилизируются при изомеризации (таутомеризации), как фосфо- енолпируват; и/или (4) продукты реакции стаби- лизируются благодаря существованию резонанс- ных структур, как в случае креатина, высвобож- даемого из фосфокреатина, карбоксилат-иона (из ацилфосфатов и тиоэфиров) и фосфата Р^ (из ангидридных и эфирных соединений). АТР поставляет энергию благодаря переносу групп, а не просто гидролиза На протяжении всей книги будут встречаться реакции или процессы, где используется энергия АТР, и участие АТР в этих реакциях обычно обо- значается, как на рис. 13-18, а, изогнутой стрел- кой, показывающей превращение АТР в ADP и Pi (или в некоторых случаях АТР в АМР и пи- рофосфат PPj). При таком обозначении реакции кажутся простым гидролизом, при котором вода вытесняет Pi (или PPL), и хочется сказать, что ATP-зависимые реакции «протекают за счет ги- дролиза АТР». На самом деле, это не так. Гидро- лиз АТР обычно не приводит ни к чему иному, кроме выделения тепла, что не может управлять химическим процессом в изотермической си- стеме. Одна-единственная изогнутая стрелка в схеме реакции на рис. 13-18, а и в других схемах почти всегда обозначает двухстадийный процесс (рис. 13-18, б), в котором часть молекулы АТР, а именно фосфорильная или пирофосфориль- ная группа или аденилатный фрагмент (АМР) из АТР, вначале переносится на молекулу суб- страта или на аминокислотный остаток в со- ставе фермента, ковалентно с ним связываясь и увеличивая его свободную энергию. Затем на второй стадии фосфатсодержащий фрагмент, образованный на первой стадии, замещается с образованием Pb PPj или АМР. Таким образом, АТР, участвуя в образовании ковалентной связи, привносит свою свободную энергию в фермен- тативную реакцию. Однако в некоторых процессах действитель- но происходит прямой гидролиз АТР (или GTP). Например, нековалентное связывание АТР (или GTP) с последующим гидролизом до ADP (или а Реакция, записанная как одностадийная Связанный с ферментом глутамилфосфат б Реакция протекает в две стадии Рис. 13-18. Две стадии гидролиза АТР. а — участие АТР в реакции часто изображается как одна стадия, однако этот процесс почти всегда двухстадийный, б — реакция, катализируемая ATP-зависимой глутаминсинтетазой. ф Фосфорильная группа от АТР присоединяется к глута- мату, затем (2) фосфорильная группа замещается на NH3 и высвобождается в виде Pi. GDP) и Pi может обеспечивать энергией цикл конформационных изменений некоторых белков, осуществляющих механическое движение. Это происходит при мышечном сокращении и при пе- ремещении ферментов вдоль ДНК или смещении матричной РНК относительно рибосомы. Гидро- лиз фосфоангидридных связей снабжает энерги- ей также реакции, которые катализируются хели- казами, RecA-белками и некоторыми топоизоме- разами (гл. 25). Действующие в сигнальных пу- тях GTP-связывающие белки гидролизуют GTP, что приводит к конформационным изменениям, блокируя сигналы гормонов или других внекле- точных агентов (гл. 12).
[36] Часть II. 13. Основы биоэнергетики. Типы химических реакций На основании величины стандартной свобод- ной энергии гидролиза фосфатсодержащие соеди- нения, обнаруженные в живых организмах, услов- но можно разделить на две группы (рис. 13-19). У «высокоэнергетических» соединений Л G'° гидро- лиза < -25 кДж/моль; у «низкоэнергетических» Л G'° > -25 кДж/моль. По этому критерию АТР (AG'° гидролиза -30,5 кДж/моль = -7,3 ккал/моль) — вы- сокоэнергетическое соединение; глюкозо-6-фосфат (AG'° -13,8 кДж/моль = -3,3 ккал/моль) — низко- энергетическое соединение. Выражение «высокоэнергетическая фос- фатная связь» давно используется биохимиками при описании связи Р—О, разрыв которой про- исходит в реакциях гидролиза; но это не совсем корректно — можно неправильно понять, что энергия заключена в самой связи. В действитель- ности, разрыв любой химической связи требует затраты энергии. Свободная энергия, высво- бождаемая при гидролизе фосфатсодержащих соединений, обязана своим происхождением не разрыву специфической связи, а тому, что про- дукты реакции обладают более низкой свободной энергией, чем реагенты. Для простоты мы иногда будем пользоваться выражением «высокоэнерге- тическое фосфатное соединение» применительно к АТР или другим фосфатсодержащим соедине- ниям с большой отрицательной стандартной сво- бодной энергией гидролиза. Из аддитивности изменений свободной энер- гии последовательных реакций следует, что лю- бое фосфорилированное соединение может быть образовано при сопряжении реакции синтеза с распадом другого фосфорилированного соеди- нения с более низкой отрицательной свободной энергией гидролиза. Например, благодаря тому, что при отщеплении Pi от фосфоенолпирувата (ФЕП) освобождается больше энергии, чем не- Рис. 13-19. Оценка биологических фосфатсодержащих соединений на основании величин стандартной свободной энергии гидролиза. Показан перенос фосфорильных групп, обозна- ченных ©л от высокоэнергетических фосфорильных доноров через АТР к молекулам акцеп- торов (например, глюкозе и глицерину) с образованием их низкоэнергетических фосфатных производных. Во внутриклеточных условиях такой перенос фосфорильных групп, катализи- руемый ферментами киназами, происходит с потерей свободной энергии на каждой стадии. При гидролизе низкоэнергетических фосфатных соединений высвобождается Р? который об- ладает еще более низким потенциалом передачи фосфорильной группы (см. текст).
13.3 Перенос фосфатных групп и АТР [37] обходимо для проведения конденсации Р^с ADP, термодинамически возможен прямой перенос фосфорильной группы от ФЕП на ADP: Л (7°, (кДж/моль) (1) ФЕП + Н2О пируват + Pj -61,9 (2) ADP + АТР + Н2О +30,5 Итого: ФЕП + ADP пируват + АТР -31,4 Обратите внимание, что хотя итоговая реакция и представлена в виде алгебраической суммы первых двух реакций, она по сути является тре- тьей отдельной реакцией, которая не включает Pi; ФЕП передает фосфорильную группу непо- средственно ADP На основании величин стан- дартной свободной энергии гидролиза мы мо- жем описать фосфорилированные соединения как соединения, имеющие высокий или низкий потенциал переноса фосфорильной группы (табл. 13-6). Потенциал переноса фосфориль- ной группы фосфоенолпирувата очень высокий, АТР — высокий, а глюкозо-6-фосфата — низкий (рис. 13-19). Многие процессы катаболизма направлены на синтез высокоэнергетических фосфатных со- единений, но их образование не является конеч- ной целью как таковой. Эти соединения — лишь средство активирования множества разнообраз- ных веществ с целью их дальнейших химических превращений. Перенос фосфорильной группы эффективно привносит свободную энергию, ко- торая используется в последующих метаболи- ческих превращениях. Выше мы описывали, как происходит синтез глюкозо-6-фосфата с пере- носом фосфорильной группы от АТР В следую- щей главе будет показано, как фосфорилирова- ние глюкозы активирует глюкозу, т. е. система «заправляется» таким образом «топливом» для катаболических реакций, которые происходят в любой живой клетке. Благодаря своему среднему положению на шкале потенциалов фосфорилиро- вания АТР может передавать энергию от высоко- энергетических фосфатсодержащих соединений, которые образуются в процессах катаболизма, к таким соединениям, как глюкоза, превращая их в более реакционноспособные формы. Таким обра- зом, АТР служит универсальным переносчиком энергии во всех живых клетках. У АТР есть еще одна особенность, которая очень важна для его роли в метаболизме: хотя в водных растворах молекула АТР термодинами- чески нестабильна и поэтому является хорошим донором фосфорильной группы, кинетически она стабильна. Из-за очень больших значений энергии активации (от 200 до 400 кДж/моль), необходимой для неферментативного расще- пления фосфоангидридных связей, АТР не мо- жет самопроизвольно отдавать фосфорильные группы воде или сотням других потенциальных акцепторов, находящихся в клетке. Перенос фосфорильных групп от АТР происходит толь- ко при наличии специфических ферментов, по- нижающих энергию активации. Поэтому клетка способна управлять распределением энергии, переносимой молекулами АТР, путем регуляции активности ферментов. АТР отдает фосфорильную, пирофосфорильную и аденильную группы Реакции, в которых принимает участие АТР, — это, как правило, реакции нуклеофильного заме- щения Sn2 (см. разд. 13-2), в которых в качестве нуклеофилов могут выступать, например, кисло- род спирта или карбоксилата либо азот креатина боковой цепи аргинина или гистидина. Каждый из трех атомов фосфора АТР подвержен нуклео- фильной атаке (рис. 13-20), в результате чего об- разуются разные продукты реакции. Нуклеофильная атака спиртом у-фосфата (рис. 13-20, а) вытесняет ADP и приводит к об- разованию нового фосфорного эфира. Опыты с реагентами, меченными 18О, продемонстрирова- ли, что в новом соединении кислород эфирной связи происходит от спирта, а не от АТР, и, сле- довательно, от АТР переносится фосфорильная группа (-РО3 ), а не фосфатная (-ОРО3 ). При переносе фосфорильной группы от АТР к глута- мату (рис. 13-18) или к глюкозе (т. 1, с. 308) про- исходит атака в у-положение молекулы АТР При атаке на р-фосфат в АТР образуется АМР и происходит перенос пирофосфорильной (не пирофосфатной) группы к атакующему ну- клеофилу (рис. 13-20, б). Например, образование 5'-фосфорибозил-1 -пирофосфата (с. 518), ключе- вого промежуточного продукта в синтезе нуклео- тидов, обусловлено атакой группы —ОН рибозы на р-фосфат. При нуклеофильной атаке в а-положение молекулы АТР происходит вытеснение PPi и
[38] Часть II. 13. Основы биоэнергетики. Типы химических реакций Три положения в молекуле АТР для атаки нуклеофилом R18O У /3 а ООО II II II I 1 I----1 О—Р—О—Р—О—Р—О—| Рибоза |—| Аденин | /О / О- О- \ R18O R18O R18O R18O—Р—О- R18O—Р—О—Р—О- I I I О- О- О- О- ADP AMP PPi Перенос фосфорильной группы а Перенос пирофосфорильной группы б Перенос аденилильной группы в Рис. 13-20. Реакции нуклеофильного замещения АТР. Любой из трех атомов фосфора (а, [3 или у) может служить электрофильной мишенью для нуклеофильной атаки — в дан- ном случае меченым нуклеофилом R-180:. В качестве нуклеофилов могут выступать спирт (R0H), карбоксильная группа (RCOO-) или фосфоангидрид (например, нуклеозидмонофос- фат или нуклеозиддифосфат), а — когда кислород нуклеофила атакует у-положение, тогда в эфирной связи продукта реакции оказывается меченый кислород. Это свидетельствует о том, что с АТР переносится именно фосфорильная (-РОз“), а не фосфатная группа (-ОРОз-). б — при атаке в (3-положение отщепляется АМР и на нуклеофил переносится пирофос- форильная (не пирофосфатная) группа, в — при атаке в a-положение замещается PPj и нуклеофилу передается аденилильная группа. перенос аденилата (5'-АМР) в виде аденилиль- ной группы (рис. 13-20, в). Такая реакция назы- вается реакцией аденилилирования (вероятно, самое неуклюжее слово в биохимическом язы- ке). Обратите внимание, что при гидролизе а-0- фосфоангидридной связи освобождается значи- тельно больше энергии (~46 кДж/моль), чем при гидролизе р-у-связи (~31 кДж/моль) (табл. 13- 6). Более того, побочный продукт аденилили- рования неорганический пирофосфат PPi затем гидролизуется при участии повсеместно рас- пространенного фермента неорганической пи- рофосфатазы с образованием двух молекул не- органического ортофосфата Pi. При этом выде- ляется 19 кДж/моль энергии, что обеспечивает дальнейший энергетический «толчок» для реак- ции аденилилирования. В результате суммарной реакции разрываются обе фосфоангидридные связи АТР. Поэтому реакции аденилилирования термодинамически очень выгодны. В том случае, когда энергия АТР используется для проведения особенно невыгодных метаболических реакций, аденилилирование часто используется в каче- стве механизма сопряжения энергии. Хорошим примером такого способа сопряжения энергии может служить активация жирных кислот. Первая стадия активации жирной кислоты, необходимой для окисления с выделением энер- гии или для синтеза более сложных липидов, - это образование тиолового эфира (см. рис. 17-5). Прямая конденсация жирной кислоты с кофер- ментом А — эндергоническая реакция, однако при постадийном удалении двух фосфорильных групп от АТР образование СоА-производного жирной кислоты — экзергонический процесс. Сначала аденилат (АМР) переносится от АТР к карбоксильной группе жирной кислоты с обра- зованием смешанного ангидрида (аденилатного
13.3 Перенос фосфатных групп и АТР [39] Дополнение 13-1 АТР поставляет энергию для светляков Для биолюминесценции требуются значительные коли- чества энергии. Светляки используют АТР в ряде реак- ций, преобразующих химическую энергию в световую. В 1950-х гг. Уильям МакЭлрой с коллегами из Универ- ситета Джона Хопкинса выделил из нескольких тысяч светляков, собранных детьми в Балтиморе и его окрест- ностях, главных участников этих энергетических процес- сов: карбоновую кислоту люциферин и фермент люцифе- разу. Для генерации вспышки света требуется активация люциферина, при которой происходит пирофосфатное расщепление АТР и образование люцифериладенилата (рис. 1). В присутствии молекулярного кислорода и лю- циферазы люциферин подвергается многостадийному окислительному декарбоксилированию до (гидр)ок- силюциферина, что сопровождается излучением света. Цвет световых вспышек различается в зависимости от вида светляков и, по-видимому обусловлен различиями в структуре люциферазы. Люциферин регенерируется из гидроксилюциферина в серии последующих реакций. В лаборатории очищенные люциферин и люци- фераза светляков используются для измерения очень малых количеств АТР по интенсивности генерируемой световой вспышки; можно измерить количества АТР по- рядка нескольких пикомолей (10 12 моль). В углублен- ных исследованиях люциферазы было проведено кло- нирование соответствующего гена в растениях табака. Когда такие растения поливали раствором, содержащим люциферин, они светились в темноте (см. рис. 9-29). ангидрида жирной кислоты) и высвобождением РР? Затем тиоловая группа кофермента А заме- щает аденилатную группу и образует тиоэфир жирной кислоты. Суммарная реакция энергети- чески эквивалентна экзергоническому гидроли- зу АТР до АМР и PPj (AG'° = -45,6 кДж/моль) и эндергоническому образованию ацил-Со А жир- ной кислоты (Л<7° = 31,4 кДж/моль). Образова- ние ацил-Со А жирной кислоты становится энер- гетически выгодным благодаря гидролизу РР| неорганической пирофосфатазой. Таким обра- зом, при активации жирной кислоты разрыва- ются обе фосфоангидридные связи АТР. В итоге, AG'° — это сумма AG'° разрыва этих связей, т. е. -45,6 кДж/моль + (-19,2) кДж/моль: АТР + 2Н2О AMP +2Pj AG'° = -64,8 кДж/моль Активация аминокислот перед их полимери- зацией в белки (см. рис. 27-19) осуществляется аналогичным набором реакций, в которых кофер- мент А заменяет молекула транспортной РНК. Интересное использование расщепления АТР до АМР и PPi происходит у светляков, которые ис- пользуют АТР в качестве источника энергии для генерации световых вспышек (доп. 13-1).
[40] Часть II. 13. Основы биоэнергетики. Типы химических реакций Для сборки информационных макромолекул необходима энергия При сборке макромолекул ДНК, РНК, белков (т. е. биополимеров) из простых молекул-предшест- венников, о чем подробно говорится в третьем томе, необходима энергия как для конденсации мономерных единиц, так и для создания упорядо- ченных последовательностей. Предшественника- ми ДНК и РНК в биосинтезе служат нуклеозид- трифосфаты; при этом реакция полимеризации сопровождается расщеплением фосфоангидрид- ной связи между а- и р-фосфатами и высвобож- дением PPj (рис. 13-21). В этих реакциях при син- тезе РНК остатками, переносимыми на растущий биополимер, являются аденилат (АМР), гуанилат (GMP), цитидилат (СМР) или уридилат (UMP), а при синтезе ДНК их дезоксианалоги (с ТМР вместо UMP). Как отмечалось выше, при актива- ции аминокислот, необходимой для синтеза белка, происходит перенос аденилатных групп от АТР; кроме того, как мы увидим в гл. 27, эти несколько стадий белкового синтеза сопровождаются еще и гидролизом GTP Во всех перечисленных случаях экзергонический распад нуклеозидтрифосфата со- пряжен с эндергоническим синтезом биополимера с определенной последовательностью. АТР обеспечивает энергию для активного транспорта и для сокращения мышц АТР может поставлять энергию для переноса иона (или молекулы) через мембрану в другой водный компартмент, где концентрация этого компонен- та выше (см. рис. 11-38). Процессы, связанные с транспортом веществ, являются главными потре- бителями энергии. Например, в почках и мозге человека две трети энергии, потребляемой в со- стоянии покоя, идет на перекачивание Na+ и К+ через плазматические мембраны с помощью Na+/ К+-АТРазы. Транспорт Na+ и К+ сопровождается циклическим фосфорилированием-дефосфори- лированием транспортного белка, а в качестве до- нора фосфорильной группы участвует АТР (см. рис. 11-37). Ха+-зависимое фосфорилирование На+/К+-АТРазы вызывает изменение конформа- ции белка, а К+-зависимое дефосфорилирование возвращает его в первоначальное состояние. Каж- дый цикл процесса транспорта сопровождается расщеплением АТР до ADP и Рь при этом измене- ние свободной энергии гидролиза АТР приводит к циклическим изменениям конформации белка, в результате чего происходит электрогенное перека- чивание ионов Na+ и К+. Заметим, что в этом слу- чае фосфорильная группа от АТР переносится на молекулу фермента, а не субстрата. В клетках сократительной системы скелет- ных мышц миозин и актин специализируются на преобразовании химической энергии АТР в меха- ническую (движение) (см. рис. 5-31). АТР прочно связывается (но нековалентными связями) с од- ной из конформаций миозина, удерживая белок в этом состоянии. Когда миозин катализирует ги- дролиз связанного с ним АТР, от белка отщепля- ются ADP и Рь и это вновь приводит к изменению конформации белковой молекулы, в которой она и находится до присоединения другой молекулы АТР. Связывание и последующий гидролиз АТР (посредством миозин-АТРазы) поставляет энер- гию, которая вызывает циклические изменения конформации головки миозина. Изменение кон- формации многих отдельных молекул миозина приводит к скольжению миозиновых фибрилл вдоль актиновых филаментов (см. рис. 5-30), что и обеспечивает макроскопическое сокращение мышечного волокна. Как мы уже отмечали ранее, мышечное сокра- щение — это один из немногих случаев, при кото- рых источником химической энергии в сопряжен- ном процессе скорее является сама реакция гидро- лиза АТР, а не перенос групп от АТР Во всех типах клеток происходит трансфосфорилирование нуклеотидов Хотя мы сосредоточили свое внимание на АТР как основном переносчике энергии в клетке и до- норе фосфатных групп, все другие нуклеозидтри- фосфаты (GTP, UTP, СТР) и все дезоксинуклео- зидтрифосфаты (dATP, dGTP, dUTP, dCTP) энер- гетически эквивалентны АТР. Изменение свобод- ной энергии при гидролизе фосфоангидридных связей этих соединений почти совпадает с вели- чинами для АТР, приведенными в табл. 13-6. Для выполнения различных биологических функций эти нуклеотиды создаются и сохраняются в виде нуклеозидтрифосфатов (NTP) путем переноса фосфорильной группы на соответствующие нук- леозиддифосфаты (NDP) и нуклеозидмонофос- фаты (NMP).
13.3 Перенос фосфатных групп и АТР [41] АТР — важное высокоэнергетическое фос- фатсодержащее соединение, которое образуется в процессах катаболизма, таких как гликолиз, окислительное фосфорилирование, а в фотосин- тетических клетках — фотофосфорилирование. Затем с помощью некоторых ферментов осущест- вляется перенос фосфорильных групп от АТР к другим нуклеотидам. Нуклеозиддифосфаткина- зы, обнаруженные во всех клетках, катализируют следующую реакцию: Mg2+ АТР + NDP (или dNDP) ADP + NTP (или dNTP) AG'°«0 Хотя эта реакция обратима, относительно высо- кое значение отношения [ATP]/[ADP] в клетках в норме способствует протеканию реакции слева направо с образованием NTP и dNTP. На самом деле фермент катализирует двухстадийный про- цесс передачи фосфорильной группы — клас- сическое замещение по механизму «пинг-понг» (рис. 13-21, см. также рис. 6-13, б). Сначала про- исходит перенос фосфорильной группы от АТР к активному участку гистидинового остатка фермента с образованием промежуточного фос- форилированного фермента; затем фосфориль- ная группа от этого соединения переносится на акцептор NDP. Поскольку фермент неспецифи- чен к основанию в NDP и одинаково хорошо ра- ботает и с dNDP, и с NDP, в присутствии АТР он способен синтезировать все NTP и dNTP из со- ответствующих NDP. Переносы фосфорильных групп от АТР при- водят к накоплению ADP Например, при энер- гичном мышечном сокращении происходит нако- пление ADP, что препятствует АТР-зависимому сокращению. В периоды острой потребности АТР в клетках понижается концентрация ADP и в то же время под действием аденилаткиназы нака- пливается АТР. Mg2+ 2 ADP АТР + AMP AG'° ~ О Эта реакция обратима, поэтому после того как острая необходимость в АТР пропадает, фермент может снова превращать АМР в ADP, а последний затем может фосфорилироваться в митохондри- ях до АТР Аналогичный фермент гуанилаткина- за превращает GMP в GDP за счет расходования АТР. Подобным образом энергия, запасенная в процессе катаболического образования АТР, ис- пользуется для обеспечения клетки необходи- мым количеством NTP и dNTP Готовым источником фосфорильных групп для быстрого синтеза АТР из ADP служит креатин- фосфат (рис. 13-15). Концентрация креатинфос- фата (РСг) в скелетных мышцах составляет при- близительно 30 мМ, что почти в 10 раз превышает концентрацию АТР. В других тканях, таких как гладкая мускулатура, мозг и почки, концентрация РСг составляет от 5 до 10 мМ. Обратимая реакция переноса фосфорильной группы от креатинфосфа- та к ADP катализируется креатинкиназой Mg2+ ADP + РСг TP + Cr AG'° = -12,5 кДж/моль Аденозин —(Р)—(?) (ADP) Аденозин —(Р)—(Р)—(Р) (АТР) Нуклеозид —(Р)—(Р)—(Р) (любой NTP или dNTP) Нуклеозид —(Р)—(?) (любой NDP или dNDP) Рис. 13-21. «Пинг-понг»-механизм работы нуклеозиддифосфаткиназы. Сначала фермент связывается с субстратом (АТР в нашем примере) и фосфорильная группа от АТР переносит- ся на боковую цепь остатка гистидина. Происходит высвобождение ADP и его место занима- ет другой нуклеозиддифосфат (или дезоксинуклеозиддифосфат), который превращается в соответствующий трифосфат в результате переноса фосфорильной группы от фосфогисти- динового остатка.
Часть II. 13. Основы биоэнергетики. Типы химических реакций [42] Креатинфосфат служит резервуаром фосфо- рильных групп в тех случаях, когда из-за не- ожиданной потребности в энергии истощают- ся запасы АТР; при этом восстановление АТР происходит значительно быстрее, чем при ка- таболическом синтезе. Когда же потребность в энергии ослабевает, образуемые в процессах катаболизма молекулы АТР используются для пополнения запасов РСг в обратной креатинки- назной реакции. У низших в филогенетическом отношении организмов в качестве резервуа- ров фосфорильных групп служат другие РСг- подобные молекулы, которые носят общее на- звание фосфагенов. Неорганические полифосфаты — потенциальные доноры фосфорильных групп Неорганические полифосфаты polyP (или (polyP)., где п — число ортофосфатных групп) представ- ляют собой линейные полимеры, состоящие из многих десятков или сотен остатков Pi? связан- ных друг с другом фосфоангидридными свя- зями. Эти вещества, присутствующие во всех организмах, в некоторых клетках могут нака- пливаться в больших количествах. Например, у дрожжей концентрация polyP, аккумулирую- щихся в вакуоли, при равномерном распределе- нии по всей клетке составила бы 20 мМ. (Ср. с концентрациями других доноров фосфориль- ных групп, см. табл. 13-5.) 0 0 0 0 0 II II II II II О—Р—О—Р—О—Р—О—Р—О—Р—О— I I I I I О- О- О- О- О- Неорганический полифосфат (polyP) Потенциальная роль polyP заключается в том, что он может служить в качестве фосфагена, т. е. резервуара фосфорильных групп для произ- водства молекул АТР, так же, как креатинфосфат используется в мышцах. PolyP обладает пример- но таким же потенциалом (энергией) переноса фосфорильной группы, как и РР? Самый корот- кий полифосфат PPi (п = 2) служит в качестве источника энергии для активного транспорта в вакуолях растений. У растений пирофосфат РР} служит донором фосфатной группы по крайней мере для одного фермента — фосфофруктокина- зы, т. е. он играет ту же роль, что АТР у животных и микроорганизмов (с. 73). Обнаружение высо- ких концентраций polyP в вулканических кон- денсатах и выбросах пара наводит на мысль, что он мог служить источником энергии в добиологи- ческой и ранней клеточной эволюции. У бактерий фермент полифосфаткиназа-1 (РРК-1) катализирует обратимую реакцию Mg2+ АТР + polyP. ADP + ро1уР.+1 А (7° = -20 кДж/моль по механизму, в котором в качестве промежу- точного продукта принимает участие связан- ный с ферментом фосфогистидин (вспомните механизм действия нуклеозиддифосфаткина- зы, описанный выше). Другой фермент поли- фосфаткиназа-2 (РРК-2) катализирует обра- тимый синтез GTP (или АТР) из полифосфата и GDP (или ADP) Mg2+ GTP + ро1уРи+1 ADP + ро1уРи Полагают, что РРК-2 действует главным образом в направлении синтеза GTP и АТР, а РРК-1 - в направлении синтеза полифосфатов. Киназы РРК-1 и РРК-2 присутствуют в клетках раз- личных бактерий, включая многие патогенные виды. Как было показано, у бактерий повышен- ный уровень polyP стимулирует экспрессию ряда генов, отвечающих за адаптацию организ- ма к условиям голодания и другим угрожающим жизни условиям. Например, у Escherichia coli polyP накапливаются, когда клеткам не хватает аминокислот или Рь и этот запас способствует их выживанию в этих неблагоприятных услови- ях. Делеции генов полифосфаткиназ снижают способность некоторых патогенных бактерий к поражению тканей животных. Поэтому этот фермент может оказаться уязвимой мишенью при разработке новых противомикробных ле- карственных препаратов. У дрожжей нет гена, кодирующего РРК- подобный белок, однако есть четыре гена (не имеющие отношения к генам РРК у бактерий), которые необходимы для синтеза полифосфа- тов. По-видимому, механизм полифосфатного синтеза у эукариот совершенно иной, чем у прокариот.
13.4 Окислительно-восстановительные реакции в биологических системах [43] Краткое содержание раздела 13.3 ПЕРЕНОС ФОСФОРИЛЬНЫХ ГРУПП И АТР Аденозинтрифосфат (АТР) связывает про- цессы катаболизма и анаболизма. Это хи- мическое соединение — энергетическая «ва- люта» живой клетки. Экзергоническое пре- вращение АТР в ADP и Р^ или в АМР и PPi сопряжено со многими эндергоническими реакциями. Гидролиз АТР служит источником энергии для конформационных изменений, приво- дящих к сокращению мышц. Однако обычно не гидролиз молекулы АТР, а перенос фос- форильной, пирофосфорильной или адени- лильной группы от АТР к молекуле субстра- та или фермента участвует в энергетическом сопряжении распада АТР и эндергонических превращений субстратов. Благодаря этим реакциям переноса групп АТР обеспечивает энергией анаболические реакции, включая синтез информационных молекул, а также транспорт молекул и ионов через мембраны против градиента концентра- ций и градиента электрического потенциала. Для поддержания способности к переносу фосфатных групп концентрация АТР долж- на быть намного выше равновесной концен- трации, что достигается в реакциях катабо- лизма, сопровождающихся производством энергии. В клетках содержатся и другие метаболиты, имеющие большие по абсолютной величине отрицательные свободные энергии гидро- лиза, в их числе фосфоенолпируват, 1,3-бис- фосфоглицерат и креатинфосфат. Эти высо- коэнергетические соединения с высоким по- тенциалом переноса фосфорильной группы, подобные АТР, — хорошие доноры фосфориль- ных групп. Тиоэфиры также характеризуются высокими свободными энергиями гидролиза. Неорганические полифосфаты, присутству- ющие во всех клетках и имеющие высокий потенциал переноса групп, могут служить в качестве резервуара фосфорильных групп. 13.4» Окислительно-восстановительные реакции в биологических системах Главное в метаболизме — перенос фосфорильных групп. Однако важное значение имеет и перенос электронов в окислительно-восстановительных реакциях. В этих реакциях происходит потеря электронов одной молекулой, которая при этом окисляется, и получение электронов другой мо- лекулой, которая восстанавливается. За работу, которая совершается живыми организмами, пря- мо или косвенно отвечают потоки электронов в окислительно-восстановительных реакциях. У нефотосинтезирующих организмов источниками электронов служат восстановленные соедине- ния (пища); у фотосинтезирующих организмов в роли первоначального донора электронов высту- пает молекула, способная переходить в возбуж- денное состояние при поглощении света. Пути переноса электронов при метаболизме сложные. В катализируемых ферментами реакциях элек- троны движутся от промежуточных продуктов метаболизма к специализированным перенос- чикам электронов. Переносчики в свою очередь отдают электроны акцепторам, имеющим более высокое сродство к электронам, и это приводит к выделению энергии. В клетках содержатся раз- нообразные молекулы-преобразователи энергии, которые превращают энергию электронного по- тока в полезную работу. Мы начинаем наше обсуждение с того, как электродвижущая сила (эдс) может совершать работу, затем коснемся теоретических основ и экспериментальных принципов измерений энергии в окислительных реакциях в терминах эдс и обсудим соотношение между этой силой, выражаемой в вольтах, и изменением свободной энергии — в джоулях. В заключение мы опишем химические основы процессов окисления-вос- становления, а также строение наиболее распро- страненных специализированных переносчиков электронов, которые неоднократно встретятся в следующих главах. Поток электронов может выполнять биологическую работу Всякий раз, когда мы используем электро- двигатель, включаем электрический свет или электронагреватель или же в двигателе нашего
[44] Часть II. 13. Основы биоэнергетики. Типы химических реакций автомобиля проскакивает искра, воспламеняю- щая бензин, на самом деле это совершает рабо- ту поток электронов. Источником электронов в электрической цепи может быть батарейка (аккумулятор, электрохимический элемент) с двумя электродами, которые изготовлены из разного материала. Электрические провода обеспечивают протекание потока электронов от одного электрода на одном полюсе батарей- ки через двигатель (внешнюю цепь) к другому электроду на другом полюсе батарейки. Благо- даря тому, что материал противоположно за- ряженных электродов имеет разное сродство к электронам, во внешней цепи самопроизвольно течет электрический ток (поток электронов) под действием силы, пропорциональной разно- сти сродства к электронам материалов электро- дов, т. е. под действием электродвижущей силы (эдс). Электродвижущая сила (как правило, в несколько вольтов) способна совершать работу, если в цепь включен преобразователь энергии, в данном случае электродвигатель. Для соверше- ния полезной работы двигатель можно соеди- нить с несколькими механизмами. В живых клетках также есть внутренняя био- логическая «электроцепь», в которой электроны поставляет такое соединение, как, например, глю- коза. При ферментативном окислении глюкозы освобожденные электроны спонтанно движутся через целый ряд промежуточных соединений- переносчиков электронов (интермедиатов) к другому химическому соединению, например О2. Такой транспорт электронов — экзергонический процесс, поскольку О2 обладает более высоким сродством к электрону по сравнению с интерме- диатами. Результирующая эдс снабжает энерги- ей множество молекулярных преобразователей энергии (ферменты и другие белки), которые совершают биологическую работу. Например, в митохондриях связанные с мембраной фермен- ты сопрягают поток электронов с образованием трансмембранной разности pH, выполняющей ос- мотическую и электрическую работу. Созданный таким образом протонный градиент обладает по- тенциальной энергией, которая иногда называет- ся протондвижущей силой по аналогии с электро- движущей силой. Другой фермент АТР-синтаза на внутренней мембране митохондрий использу- ет протондвижущую силу для совершения хими- ческой работы: синтеза АТР из ADP и (по мере самопроизвольного транспорта протонов через мембрану). Сходным образом у Е. coli локализо- ванные в мембране ферменты преобразуют эдс в протондвижущую силу, которая затем использу- ется для движения жгутиков. Электрохимиче- ские принципы, которые регулируют изменение энергии в макроскопической цепи с электродви- гателем и батарейкой (аккумулятором), с одина- ковым успехом применимы и к молекулярным процессам, сопровождающимся электронными потоками в живых клетках. Окислительно-восстановительные процессы можно представить в виде полуреакций Хотя окисление и восстановление не происхо- дят поодиночке (друг без друга), при описании переноса электронов удобно рассматривать окис- лительно-восстановительную реакцию как две полуреакции. Например, окисление иона железа Fe2+ ионом меди Си2+ Fe2+ + Cu2+ Fe3+ + Cu+ можно записать в виде двух полуреакций, где Fe2+ — восстановитель, а Си2+ — окислитель: Окисление'. Fe2+ « Fe3++e_ (1) Восстановление'. Cu2+ + е~ « Cu+ (2) В окислительно-восстановительной реакции ве- щество, отдающее электроны (донор электронов), называется восстановителем; а акцептор электро- нов (принимает электроны) называется окисли- телем. В данном случае двухзарядные катионы железа Fe2+ и трехзарядные катионы Fe3+ образу- ют сопряженную окислительно-восстановитель- ную пару (редокс-пару). Аналогично, кислота и соответствующее основание — тоже сопряженная пара, но это кислотно-основная пара. Напомним (см. гл. 2, т. 1), что в общем виде кислотно-основ- ные реакции записывают следующим образом: донор протонов « Н+ + акцептор протонов Для окислительно-восстановительных реакций можно написать похожее общее уравнение: донор электронов . е~ + акцептор электронов В полуреакции (1) Fe2+ — донор электронов, a Fe3+ — акцептором электронов. Ионы Fe2+ и Fe3+ — сопряженная редокс-пара.
13.4 Окислительно-восстановительные реакции в биологических системах [45] Перенос электронов в окислительно-вос- становительных реакциях между органическими и неорганическими соединениями принципиаль- но ничем не отличаются. В гл. 7 мы рассматрива- ли окисление восстанавливающего сахара (альде- гида или кетона) ионом меди Си2+ (см. рис. 7-10): R—С + 4ОН +2Cu2+R-C. + Си2О + 2Н2О Н ОН Эту реакцию можно представить в виде двух по- луреакций: R—Сх + 2ОН“ R—Сх + 2е“ + Н2О (1) Н ОН 2Cu2+ + 2е“ + 2ОН“ Си2О + Н2О (2) Поскольку от углерода альдегидной группы от- щепляются два электрона, вторую полуреакцию (одноэлектронное восстановление двухзарядного иона меди до однозарядного) надо умножить на коэффициент 2, чтобы привести к балансу заря- ды в суммарной окислительно-восстановитель- ной реакции. Биологические процессы окисления часто включают и дегидрирование В живых клетках углерод существует в несколь- ких состояниях окисления (рис. 13-22). Когда общая электронная пара находится между атомом углерода и другим, отличным от углерода атомом Метан Н Н:С:Н Н 8 Этан (алкан) Н Н Н:С:С:Н Н Н 7 Этилен (алкен) Н :с: Н* Н :С.’ Н 6 Этанол (спирт) Н Н Н:С:С:О:Н Н Н 5 Ацетилен (алкин) Н:С: ::С:Н 5 Формальдегид Н. ‘.С:: О.* Н* 4 Уксусный альдегид (альдегид) ? н Н:С:С J н *9: 3 Ацетон (кетон) н’2’н Н:С:С:С:Н Н Н 2 Рис. 13-22. Состояния окисления углерода в биосфере. Обратите внимание на атомы углерода, которые отмечены красным, и их электроны связи. Если атом углерода свя- зан с менее электроотрицательным атомом Н, оба элек- трона связи (красные) смещены к углероду. Если углерод связан с другим углеродом (этан), электронная пара на- ходится ровно посередине между ними, хотя только один из двух электронов в этой паре поступил от «красного» углерода. Если «красный» углерод связан с более элек- троотрицательным атомом 0 (этанол), электроны связи смещены к кислороду. Цифры в правой колонке указы- вают число электронов, смещенных к «красному» угле- роду, что можно использовать при грубой оценке степе- ни окисления углерода в соединении (функциональной группе): в данном ряду соединений степень окисления Муравьиная кислота (карбоновая кислота) .0: Н:С * . :о: * ' н 2 Угарный газ 2 Уксусная кислота (карбоновая кислота) Н Н:С:С Н .6: .0.* ’ ’ Н Углекислый углерода увеличивается сверху вниз. ;О::С о: газ
[46] Часть II. 13. Основы биоэнергетики. Типы химических реакций (обычно Н, С, S, N или О), эта электронная пара оказывается смещенной к более электроотрица- тельному атому. Электроотрицательность увели- чивается в ряду H<C<S<N<0. Например, в метане СН4 углерод более электроотрицательный, чем любой из четырех связанных с ним атомов во- дорода, и поэтому в четырех связях С 11 атом С «притягивает» поближе к себе все восемь электро- нов (рис. 13-22). В этане электроны, образующие связь С—С, находятся на одинаковом расстоянии от каждого углерода и принадлежат им поровну, т. е. можно считать, что у одного атома углерода находятся только семь, а не восемь электронов. В этаноле атом С-1 менее электроотрицательный, чем связанный с ним кислород, и поэтому атом О «перетягивает к себе» оба электрона, образующих связь С—О, а вокруг атома С-1 остается только пять электронов. При каждой формальной потере электрона атом углерода подвергается окислению; это происходит даже без участия кислорода, на- пример, когда алкан (—СН2—СН2—) превраща- ется в алкен (—СН=СН—), происходит окисле- ние — формальная потеря электронов, т. е. отри- цательных зарядов, на самом деле происходит по- теря атомов водорода. В биологических системах при окислении часто происходит дегидрирование, а многие ферменты, которые катализируют реак- ции окисления, называются дегидрогеназами. За- метим, что более восстановленные соединения на рис. 13-22 (вверху} богаче водородом, чем кисло- родом, в то время как в более окисленных соедине- ниях (внизу} число атомов кислорода увеличива- ется, а число атомов водорода уменьшается. Не во всех биологических окислительно- восстановительных реакциях участвует углерод. Например, при превращении молекулярного азота в аммиак происходит восстановление ато- мов азота. 6Н+ + бе- + N2 2NH3 Передача электронов от одной молекулы (донора электронов) к другой (акцептору элек- тронов) осуществляется четырьмя различными способами. 1. Прямой перенос электронов. Например, окис- лительно-восстановительная пара Fe2+/Fe3+ может передавать электроны паре Cu+/Cu2+: Fe2+ + Cu2+ Fe3+ + Cu+ 2. Перенос атомов водорода (Н+ + е), ведь фор- мально атом водорода состоит из протона Н+ и одного электрона е-. В этом случае можно записать общее уравнение АН2^^А + 2е+2Н+ где АН2 — донор водорода (или электро- нов). (Не путайте с реакцией диссоциации кислоты, в которой участвуют ионы Н+, но не электроны.) АН2 и А — это сопряжен- ная окислительно-восстановительная пара (А/АН2), которая может участвовать в реак- ции с другой редокс-парой В/ВН2): ан2 + в — а + вн2 3. Перенос электронов от донора к акцептору в форме гидрид-иона (:Н_), несущего два элек- трона, как в случае NAD-зависимых дегидро- геназ, о которых речь пойдет ниже. 4. Присоединение кислорода. Здесь кислород взаимодействует с органическим восстано- вителем и образует новые связи с други- ми атомами в молекуле продукта реакции. Примером такой реакции служит окисле- ние углеводорода до спирта: R—СН3 + !/2О2 R-CH2-OH В этой реакции углеводород — донор элек- тронов, а кислород — акцептор электронов. В клетках встречаются все четыре способа переноса электронов. В окислительно-восста- новительных реакциях для обозначения пере- носа заряда, эквивалентного 1 е-, используется термин восстановительный эквивалент; при этом не имеет значения, переносится ли сам электрон как таковой, атом водорода, гидрид- ион или же происходит реакция с кислородом, в результате которой образуется окисленный продукт. Поскольку молекулы питательных ве- ществ обычно ферментативно дегидрируются с одновременной потерей двух восстановитель- ных эквивалентов и поскольку каждый атом кислорода способен принять два восстанови- тельных эквивалента, биохимики условились считать единицей биологического окисления два восстановительных эквивалента, переходя- щих с субстрата на кислород.
13.4 Окислительно-восстановительные реакции в биологических системах [47] Восстановительный потенциал — мера сродства к электронам Если в растворе присутствуют две сопряженные редокс-пары, перенос электрона от донора элек- трона одной пары к акцептору электрона другой может произойти спонтанно. Направление такой реакции зависит от сродства к электрону акцеп- торов электронов в каждой редокс-паре. Мерой этого сродства служит стандартный восстано- вительный потенциал Е° (измеряется в вольтах), его можно измерить экспериментально (рис. 13- 23). Электрохимики выбрали в качестве стандар- та, по отношению к которому проводится измере- ние, полуреакцию Н+ + е/2Н2 Этому водородному электроду (он называется полуячейкой), на котором данная полуреакция происходит, произвольно присвоен нулевой вос- становительный потенциал Е'° = 0,00 В. Когда водородный электрод (электрод сравнения) со- единен через внешнюю цепь с рабочим электро- дом (другой полуячейкой), находящимся в рас- творе со стандартными концентрациями окис- ленной и восстановленной форм (при стандарт- ных условиях: 25 °C, концентрации растворов 1 М, давление газов 101,3 кПа), поток электро- нов во внешней цепи направлен от полуячейки с меньшим стандартным восстановительным потенциалом к полуячейке с большим потен- циалом. По договоренности, у электрода (полу- ячейки) с наибольшим «стремлением» получить электроны Е° — положительное число (со зна- ком «плюс»), а у той, что передает электроны во- дородной ячейке, Е° — отрицательное число (со знаком «минус»). Когда два электрода соедине- ны через внешнюю цепь, электрод, который име- ет более высокое (более положительное) значе- ние Е° (восстановительный потенциал выше), будет восстанавливаться. Восстановительный потенциал полуячейки зависит не только от природы материала элек- трода, но и от его активности, которая связана с концентрацией в растворе. Более 100 лет назад Вальтер Нернст вывел уравнение, связывающее стандартный восстановительный потенциал Е° с восстановительным потенциалом Е для произ- вольной концентрации окисленной и восстанов- ленной форм этого элемента в ячейке. Прибор для измерения эдс Электрод сравнения — водородный электрод, в котором газ Н2 Ячейка для проб; концентрации окисленных под давлением 101,3 кПа уравновешен с раствором 1 М Н+ и восстановленных форм изучаемой редокс-пары равны 1М Рис. 13-23. Измерение стандартного восстановитель- ного потенциала F° редокс-пары. Направление потока электронов — от рабочего электрода к электроду сравне- ния. Самый известный электрод сравнения — водородный электрод (pH 0). Электродвижущая сила (эдс) водородного электрода принята равной 0,00 В. При pH 7 рабочего элек- трода Е'° водородного электрода составляет -0,414 В. На- правление потока электронов зависит от относительного потенциала обоих электродов (так называемое «давление» электронов). Солевой мостик, содержащий насыщенный раствор КС1, обеспечивает канал для движения противо- ионов между рабочим электродом и электродом сравне- ния. Из наблюдаемого значения эдс и эдс ячейки срав- нения экспериментатор может найти восстановительный потенциал рабочей ячейки, содержащей редокс-пару. По договоренности, у электрода, который «приобретает» электроны, более высокий потенциал. (13-5) Уравнение Нернста Е RT J [акцептор электронов] nF [донор электронов] где R — универсальная газовая постоянная, Т — абсолютная температура (в кельвинах), п — чис- ло перенесенных электронов на одну молекулу, F — постоянная Фарадея (табл. 13-1). При 298 К (25 °C) и после подстановки численных значений постоянных получим £ £о + 0,026 ВI [акцептор электронов] п [донор электронов] ' '
[48] Часть II. 13. Основы биоэнергетики. Типы химических реакций КЛЮЧЕВЫЕ ДОГОВОРЕННОСТИ. В случае окислитель- но-восстановительных реакций стандартные ус- ловия определяют, как для А (7°: pH 7 и 25 °C; стандартный восстановительный потенциал обо- значен 77°. По договоренности, для любой окис- лительно-восстановительной реакции разность потенциалов Е'° равна разности восстановитель- ных потенциалов Е'° акцептора и донора электро- нов. В табл. 13-7 приведены стандартные вос- становительные потенциалы Е'°, которыми мы и будем пользоваться — они применимы только для систем при нейтральном pH (pH 7). Любое значение Е'° в табл. 13-7 получено как разность потенциалов между стандартным водородным электродом (pH 0) и сопряженной редокс-пары с концентрацией 1 М и pH 7. Обратите внимание, что, согласно приведенным в табл. 13-7 данным, в цепи из сопряженной пары 2Н+/Н2 при pH 7 и стандартного водородного электрода (pH 0) элек- троны переходят из ячейки с pH 7 в стандартную ячейку (pH 0); таким образом, для пары 2Н+/Н2 измеряемое значение Е'° = -0,414 В. Стандартные восстановительные потенциалы можно использовать для расчета изменений свободной энергии Зачем биохимикам нужны восстановительные потенциалы? Их удобно использовать, ведь если для любых двух ячеек известны Е, измеренные относительно стандартного водородного электро- да, можно найти их восстановительные потенци- алы относительно друг друга. После этого можно предсказать направление потока электронов при соединении двух полуячеек внешней цепью или в том случае, если компоненты обеих ячеек ока- жутся в одном растворе. Электроны стремятся в полуячейку с более положительным значением Е, и сила тока пропорциональна разности вос- становительных потенциалов А£. Энергия само- произвольной окислительно-восстановительной реакции характеризуется изменением свободной энергии и пропорциональна А£: AG = -пЕАЕ или А (7° = -пЕЕ'° где п означает число электронов, перенесенных в реакции. Зная Е'° (можно взять из таблицы вос- становительных потенциалов (табл. 13-7)) и кон- Таблица 13-7 Стандартные восстановительные потенциалы некоторых биологически важных полуреакций при pH 7,0 и 25 °C (298 К) Полуреакция Е'°,В !/2О2 + 2Н+ + 2е -^Н2О 0,816 Fe31 + е Fe2+ 0,771 NO3 + 2Н+ + 2е NO2 + Н2О 0,421 Цитохром/(Ре3+) + е цитохром/(Fe2+) 0,365 Fe(CN)63 (феррицианид) + е Fe(CN)64 0,36 Цитохром а3 (Fe3+) + е цитохром а3 (Fe2+) 0,35 О2 + 2Н+ + 2е Н2О2 0,295 Цитохром a (Fe3+) + е цитохром a (Fe2+) 0,29 Цитохром с (Fe3+) + е -* цитохром с (Fe2+) 0,254 Цитохром Ci (Fe3+) + е -* цитохром q (Fe2+) 0,22 Цитохром b (Fe3+) + е цитохром b (Fe2+) 0,077 Убихинон + 2Н+ + 2е убихинол + Н2 0,045 Фумарат2 + 2Н++ 2е -^сукцинат2 0,031 2Н+ + 2е -^Н2 (стандартные условия, pH 0) 0,000 Кротонил-СоА + 2Н+ + 2е бутирил-СоА -0,015 Оксалоацетат2 + 2Н+ + 2е -> малат2 -0,166 Пируват + 2Н+ + 2е -* лактат -0,185 Ацетальдегид + 2Н+ + 2е этанол -0,197 FAD + 2Н+ + 2е FADH2 -0,219а Глутатион + 2Н+ + 2е 2 восстановленных глутатиона -0,23 S + 2Н++ 2е = H2S -0,243 Липоевая кислота + 2Н+ + 2е -* дигидролипоевая кислота -0,29 NAD+ + Н+ + 2е -^NADH -0,320 NAdP+ + Н1 + 2е NADPH -0,324 Ацетоацетат + 2Н+ + 2е |3-гидроксибутират -0,346 а-Кетоглутарат + СО2 + 2Н+ + 2е изоцитрат -0,38 2Н+ + 2е -^Н2 (при pH 7) -0,414 Ферредоксин (Fe3+) + е ферредоксин (Fe21) -0,432 Источник: Данные взяты из Loach, R.A. (1976) In Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, 3rd edn (Fasman, G.D., ed.), Physical and Chemical Data, vol. 1, pp. 122-130, CRC Press, Boca Raton, FL. a Для свободного FAD; FAD, связанный co специфическим флавопротеином (например, сукцинатдегидрогеназой), имеет другое значение Е'°, которое зависит от белкового окружения. центрации реагирующих веществ, с помощью этого уравнения можно рассчитать изменение сво- бодной энергии окислительно-восстановительной реакции.
13.4 Окислительно-восстановительные реакции в биологических системах [49] Пример 13-3 РАСЧЕТА6'° И AG ОКИСЛИТЕЛЬНО- ВОССТАНОВИТЕЛЬНОЙ РЕАКЦИИ Найти изменение стандартной свободной энер- гии AG'0 для реакции, в которой ацетальдегид восстанавливается биологическим переносчиком электронов NADH: Ацетальдегид + NADH + Н+ —» этанол + NAD+ Далее рассчитать реальное изменение свободной энергии AG, если концентрации ацетальдегида и NADH 1,00 М, а концентрации этанола и NAD+ 0,100 М. (1) Ацетальдегид + 2Н+ + 2е_ этанол £'° = -0,197В (2) NAD+ + 2Н+ + 2е- NADH + Н+ Е'° = -0,320 В Вспомните, что по договоренности кЕ'° — это разность между кЕ'° акцептора электронов и А£'° донора электронов. Решение. В данном примере ацетальдегид — акцеп- тор электронов (п = 2), которые он отдает NADH. А£'° = -0,197 В - (-0,320 В) = 0,123 В. А (7° = -пЕкЕ'° = -2 • 96,5 кДж/(В • моль) • 0,123 В = = -23,7 кДж/моль Это изменение свободной энергии окислительно- восстановительной реакции при pH 7, когда аце- тальдегид, этанол, NAD+ и NADH присутствуют в концентрациях 1,00 М. Чтобы вычислить AG, когда концентрации ацетальдегида и NADH 1,00 М, а этанола и NAD+ 0,100 М, сначала определим Е обоих восстанови- телей (уравнение 13-5): RT [ацетальдегид] г = г ~г--- П-------------= ^ацетальдегид 111 пг [этанол] 0,026 В , 1,00 = -0,197 В +--------In —— = 2 0,100 = -0,197 В + 0,013 В (2,303) = -0,167 В „ ™ КТ , [NAD+] Tnadh — Е +---In--------- nF [NADH] о ооо 0,026 В , 0,100 = -0,320 В +---------In -----= 2 1,0 = 0,320 В + 0,013 В ( 2,303) = 0,350 В Отсюда мы можем найти А£, а затем по урав- нению 13-6 рассчитать AG: АЕ = -0,167 В - (-0,350) В = 0,183 В AG = -пЕкЕ = = -2 • 96,5 кДж/(В • моль) • 0,183 В = = -35,3 кДж/моль Таким образом можно рассчитать изменение сво- бодной энергии любой окислительно-восстано- вительной реакции при любых концентрациях редокс-пар. Для окисления глюкозы до углекислого газа в клетках необходимы специальные переносчики электронов Основы энергетики окислительно-восстанови- тельных реакций, о которых речь шла выше, при- менимы ко многим метаболическим реакциям с участием переносчиков электронов. Например, у многих организмов окисление глюкозы обеспе- чивает энергией синтез АТР. Для реакции полно- го окисления глюкозы С6Н12О6 + 6О2 6СО2 + 6Н2О kG'° = -2840 кДж/моль. Эта энергия намного боль- ше той, что необходима для синтеза АТР (от 50 до 60 кДж/моль; см. доп. 13-1). В клетках глюкоза пре- вращается в СО2 не по одной реакции с большим выделением энергии, а в серии контролируемых ре- акций, часть из которых окислительные. Свободная энергия, выделяемая при реакциях окисления, того же порядка по величине, что и энергия, необходи- мая для синтеза АТР из ADP, поэтому часть ее за- пасается. Электроны, высвобождаемые в реакциях окисления, переносятся на коферменты, такие как NAD+ и FAD (речь о них пойдет ниже), специали- зирующиеся на переносе электронов. Некоторые коферменты и белки служат универсальными переносчиками электронов Множество ферментов, катализирующих реак- ции окисления в клетке, направляют электроны с сотен своих различных субстратов на универсаль- ные электронные переносчики, которых лишь несколько. Восстановление этих переносчиков в процессах катаболизма приводит к сохранению свободной энергии, которая выделяется при окис- лении субстрата. NAD+, NADP+, FMN и FAD -
[50] Часть II. 13. Основы биоэнергетики. Типы химических реакций водорастворимые коферменты, которые подвер- гаются обратимому окислению и восстановле- нию во многих метаболических реакциях с пере- носом электронов. Нуклеотиды NAD+ и NADP+ без затруднений переходят от одного фермента к другому; флавиннуклеотиды FMN и FAD обыч- но очень прочно связаны с ферментами флаво- протеинами, для которых они служат простети- ческими группами. Жирорастворимые хиноны, например убихинон и пластохинон, действуют в качестве переносчиков электронов и доноров протонов в безводной среде — в мембранах. Же- лезосерные белки и цитохромы с прочно свя- занными простетическими группами, которые подвержены обратимому окислению и восста- новлению, также служат переносчиками электро- нов во многих окислительно-восстановительных реакциях. Некоторые из этих белков раствори- мы в воде, остальные являются периферически- ми или интегральными мембранными белками (см. рис. 11-6). В завершение этой главы рассмотрим хи- мические свойства нуклеотидных коферментов, а также некоторых ферментов (дегидрогеназ и флавопротеинов), использующих эти кофермен- ты. Окислительно-восстановительные свойства хинонов, железосерных белков и цитохромов обсуждаются в гл. 19. NADH и NADPH действуют совместно с дегидрогеназами — растворимыми переносчиками электронов Никотинамидадениндинуклеотид (NAD+ в окис- ленной форме) и его фосфорилированный ана- лог никотинамидадениндинуклеотидфосфат (NADP+) состоят из двух нуклеотидов, соединен- ных фосфоангидридной связью (рис. 13-24, а). Длина волны (нм) б Рис. 13-24. NAD и NADP. а — никотинамидадениндинуклеотид NAD+ и его фосфорилирован- ный аналог NADP+ подвергаются восстановлению до NADH и NAD PH, присоединяя гидрид-ион (т. е. два электрона и один протон) от окисляемого субстрата. Гидрид-ион присоединяется либо спереди (сторона А), либо сзади (сторона Б) плоского никотинамидного кольца (см. табл. 13-8). б — УФ-спектр поглощения NAD+ и NADH. Восстановление никотинамидного кольца приводит к появлению новой широкой полосы поглощения с максимумом при 340 нм. Образование NADH в ферментативной реакции можно легко проследить, наблюдая за появле- нием поглощения при 340 нм (коэффициент молярной экстинкции е340 = 6200 М-1см-1).
13.4 Окислительно-восстановительные реакции в биологических системах [51] Поскольку никотинамидное кольцо напоминает пиридин, эти соединения иногда называют пири- диннуклеотидами. Источником никотинамидной функциональной группы в никотинамиднуклео- тидах служит витамин ниацин. Оба кофермента подвержены обратимо- му восстановлению никотинамидного кольца (рис. 13-24). Как только молекула субстрата окисляется (дегидрируется) с образованием двух атомов водорода, окисленная форма нуклеотида (NAD+ или NADP+) присоединяет гидрид-ион (:Н~, эквивалент протона и двух электронов) и восстанавливается (до NADH или NADPH). Вто- рой выделившийся протон попадает в водную среду. Для каждого кофактора-нуклеотида можно написать полуреакцию: NAD+ + 2е- + 2Н+ NADH + Н+ NADP+ + 2е- + 2Н+ NADPH + Н+ Восстановление NAD+ или NADP+ превращает бензоидное кольцо никотинамидной функцио- нальной группы (с положительным зарядом на азоте кольца) в хиноидную форму (отсутствует заряд на азоте). Обратите внимание, что вос- становленные нуклеотиды поглощают свет при 340 нм, а окисленные формы нет (рис. 13-24, б). Знак плюс в аббревиатурах NAD+ и NADP+ не означает суммарный заряд на этих молекулах (обе они отрицательно заряжены); он указывает на то, что никотинамидное кольцо находится в окисленной форме с положительным зарядом на атоме азота. В аббревиатурах NADH и NADPH символ Н означает добавленный гидрид-ион. Для этих нуклеотидов без уточнения их окисли- тельного состояния используются обозначения NADhNADP. В большинстве тканей общая концентрация [NAD+ + NADH] « IO-5 М, [NADP+ + NADPH] « « IO-6 M. Во многих клетках и тканях отношение NAD1 (okhc4.)/NADI 1(восст.) — большая вели- чина, что благоприятствует переносу гидрид-ио- на с субстрата на NAD+ с образованием NADH. Напротив, NADPH(bocct.) обычно присутству- ет в больших количествах, чем окисленная фор- ма NADP+, что благоприятствует переносу во- дорода с NADPH на субстрат. Все это отражает специфическую роль в метаболизме этих двух коферментов: NAD+, как правило, действует при окислении, обычно в катаболических реак- циях; a NADPH — чаще при восстановлении, практически всегда в анаболических реакци- ях. Некоторые ферменты могут использовать любой кофермент, однако для большинства на- блюдается значительное предпочтение одно- го кофермента перед остальными. Кроме того, процессы, в которых эти два кофактора прини- мают участие, изолированы друг от друга в раз- ных органеллах эукариотических клеток: окис- ление энергоемких веществ, таких как пируват, жирные кислоты и а-кетокислоты, которые образуются из аминокислот, происходят в ма- триксе митохондрий, тогда как процессы вос- становительного биосинтеза, например синтез жирных кислот, — в цитоплазме. Эта функцио- нальная и пространственная специализация по- зволяет клетке содержать два индивидуальных хранилища переносчиков электронов с своими особыми функциями. Известно более 200 ферментов, катализиру- ющих реакции, в которых NAD+ (или NADP+) получает гидрид-ион от восстановленного суб- страта или же NADPH (или NADH) отдает водо- род окисленному субстрату. Напишем эти реак- ции в общем виде: АН2 + NAD+ А + NADH + Н+ А + NADPH + Н+ АН2 + NADP+ где АН2 восстановленный субстрат, а А — окис- ленный. Общее название этого класса фермен- тов — оксидоредуктазы, обычно же их называют дегидрогеназами. Например, алкогольдегидроге- наза катализирует первичный катаболизм этано- ла — окисление до уксусного альдегида: СН3СН2ОН + NAD+ СН3СНО + NADH + Н+ Этанол Ацетальдегид Обратите внимание, что один из атомов углерода в этаноле потерял водород; спирт при этом окис- лился до альдегида (чтобы оценить состояния окисления углерода, вернитесь к рис. 13-22). В восстановленном NAD+ или NADP+ ги- дрид-ион, вообще говоря, может быть присоеди- нен на любую сторону никотинамидного коль- ца: спереди (А) или сзади (Б), как показано на рис. 13-24, а. Исследования субстратов с изотоп- ными метками показали, что данный фермент катализирует либо перенос типа А, либо типа Б, но не оба одновременно. Например, алкоголь-
[52] Часть II. 13. Основы биоэнергетики. Типы химических реакций Стереоспецифичность дегидрогеназ, использующих NAD* или NADP* в качестве коферментов Стереохимическая специфичность Таблица 13-8 Фермент Кофермент к никотинамидному кольцу (А или Б) См. страницу Изо цитрат деги; фогеназа NAD+ А 193 а - Кетоглутарат деги дрогеназа NAD+ Б 194 Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа NADP+ Б 109 Малатдегидрогеназа NAD+ А 199 Глутаматдегидрогеназа NAD+ или NADP+ Б 269 Глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназа NAD+ Б 76 Л актатд егид рогеназа NAD+ А 91 Алкогольдегидрогеназа NAD+ А 93 Рис. 13-25. Укладка Россмана. Этот структурный мотив обнаружен в связывающем NAD участке многих деги- дрогеназ. а — два близких по структуре мотива, у каж- дого по три параллельные [3-складки и по две а-спирали (Р-а-[3-а-[3). 6 — нуклеотидсвязывающий домен фер- мента лактатдегидрогеназы (PDB ID 3LDH) с NAD в раз- вернутой конформации (шаростержневая модель) и с Р-а-[3-а-[3-мотивом укладки Россмана (зеленый цвет разных оттенков); NAD связан посредством водородных связей и солевых мостиков. дегидрогеназа дрожжей и лактатдегидрогеназа сердца позвоночных переносит гидрид-ион на сторону А никотинамидного кольца или удаляет гидрид-ион с этой стороны кольца; это дегидро- геназы типа А. Другие — дегидрогеназы Б — пе- реносят гидрид-ион или удаляют его со стороны Б никотинамидного кольца (табл. 13-8). Специ- фичность фермента по той или другой стороне может быть очень значительной; например у лактатдегидрогеназы предпочтение стороны А над стороной Б больше, чем в 5 • 107 раз! Причи- на такого предпочтения заключается в специфи- ческом расположении функциональных групп в молекуле фермента, участвующих в образова- нии водородной связи, относительно группы - CONH2 никотинамида. Большинство дегидрогеназ, которые ис- пользуют NAD или NADP, связывают кофактор в консервативной области белка, которая на- зывается укладкой Россмана (Майкл Россман впервые установил структуру лактатдегидро- геназы и описал этот структурный фрагмент). Укладка Россмана, как правило, это шесть па- раллельных р-складок, объединенных с четырь- мя сх-спиралями (рис. 13-25). Связь между дегидрогеназой и NAD или NADP относительно непрочная; кофермент спокойно диффундирует между ферментами, действуя в качестве водорастворимого перенос- чика электронов от одного метаболита к друго- му. Например, при образовании спирта в про-
13.4 Окислительно-восстановительные реакции в биологических системах [53] цессе брожения глюкозы в клетках дрожжей гидрид-ион отщепляется от глицеральдегид-3- фосфата одним ферментом (глицеральдегид-3- фосфатдегидрогеназой типа Б) и переносится на NAD+. Затем образованный NADH покидает по- верхность фермента и диффундирует к другому ферменту (алкогольдегидрогеназе типа А), кото- рый переносит гидрид-ион на ацетальдегид с об- разованием этанола: (1) Глицеральдегид-З-фосфат + NAD+ 3-фосфоглицерат + NADH + Н+ (2) Ацетальдегид + NADH + 11^ этанол + NAD+ Итого: глицеральдегид-3-фосфат + ацетальдегид 3-фосфоглицерат + этанол Обратите внимание, что в суммарной реакции не происходит образования или расходования NAD+ или NADH; коферменты действуют как катализа- торы — они повторно высвобождаются и итого- вая концентрация NAD+ + NADH не изменяется. Дефицит в пище ниацина, витаминной формы NAD и NADP, вызывает пеллагру СЯ Как мы уже отмечали в гл. 6 и увидим в пос- кЛ ледующих главах, большинство кофермен- тов — это производные витаминов. Пиридинопо- добные кольца NAD и NADP образуются из вита- мина ниацина (никотиновой кислоты; рис. 13-26), который образуется из триптофана. У человека ни- ацин в необходимых количествах обычно не син- тезируется; это главным образом относится к тем людям, кто потребляет пищу, содержащую мало триптофана (например, кукурузу — очень низкое содержание триптофана). Нехватка у человека Ниацин (никотиновая кислота) Никотин Никотинамид Триптофан Рис. 13-26. Структуры ниацина (никотиновой кислоты) и его производного никотинамида. В природных био- системах предшественником этих соединений является триптофан. В лаборатории никотиновая кислота впервые была получена окислением природного никотина — от- сюда и название. Как никотиновая кислота, так и нико- тинамид лечат пеллагру, однако никотин (из сигарет) не обладает исцеляющей силой. ниацина сказывается на всех NAD(P)-3aBncnMbix дегидрогеназах и приводит к серьезной болезни пеллагре (итал. — «грубая кожа»; у собак болезнь называется «черным языком»). Болезнь харак- теризуется тремя симптомами: дерматит, диарея и деменция, причем во многих случаях приво- дит к летальному исходу. Столетие назад пелла- гра была распространенной болезнью; в южных штатах США, где кукуруза служила основным продуктом питания населения, в период с 1912 по 1916 гг. было порядка 100 000 больных пелла- грой и умерло около 10 000. Джозеф Голдбергер в 1920 г. показал, что пеллагра вызывается недостат- ками рациона питания, а в 1937 г. Фрэнк Стронг, Д. Уэйн Вули и Конрад Эльвейем обнаружили, что Фрэнк Стронг, 1908-1993 Д. Уэйн Вули, 1914-1966 Конрад Эльвейем, 1901-1962
[54] Часть II. 13. Основы биоэнергетики различных биохимических реакций эффективным средством от «черного языка» слу- жит ниацин. Добавление в пищу этого недорогого соединения позволило справиться с пеллагрой в развитых странах. Однако важно отметить, что эта победа оказалась неабсолютной — пеллагра все еще встречается среди алкоголиков, у кото- рых всасывание ниацина в кишечнике сильно ос- лаблено и чьи потребности в калориях зачастую удовлетворяются спиртными напитками, лишен- ными в сущности витаминов, включая и ниацин. В некоторых местностях, например на Деканском плоскогорье в Индии, пеллагра все еще встреча- ется, особенно среди бедных. Флавиннуклеотиды прочно связываются с флавопротеинами Флавопротеины (табл. 13-9) — это ферменты, которые катализируют окислительно-восста- новительные реакции, используя в качестве кофермента флавинмононуклеотид (FMN) или флавинадениндинуклеотид (FAD) (рис. 13-27). Таблица 13-9 Некоторые ферменты (флавопротеины), использующие флавиннуклеотидные коферменты Фермент Флавин- нуклеотид Cm. страницу Ацил - Со А-; (егидрогеназа FAD рис. 17-8 Дигидролипоилдегидрогеназа FAD 186 Сукцинатдегидрогеназа FAD 198 Глицерол-3- фос фат дегид । югеназа FAD рис. 19-30 и текст Тиоредоксинредуктаза FAD рис. 22-39 и текст NADH - дегидрогеназа (комплекс I) FAD рис. 19-1 и текст Гликолатоксидаза FAD рис. 20-21 Коферменты флавиннуклеотиды образуются из витамина рибофлавина. Конденсированная многоядерная структура флавиннуклеотидов (изоаллоксазиновое кольцо) подвергается об- ратимому восстановлению, получая от вос- FMN изоаллоксазиновое кольцо FADH* (FMNH*) (семихинон) FADH2(FMNH2) (полностью восстановленный) FAD I неон I неон I сн2 Флавинадениндинуклеотид (FAD) и флавинмононуклеотид (FMN) Рис. 13-27. Окисленные и восстановленные формы FAD и FMN. FMN включает ту часть структуры FAD (в окис- ленной форме), которая изображена выше пунктирной линии. Флавиннуклеотиды получают два атома водорода (два электрона и два протона), которые появляются во флавиновой кольцевой системе. Если FAD или FMN полу- чают всего один атом водорода, образуется семихинон, стабильный радикал.
13.4 Окислительно-восстановительные реакции в биологических системах [55] становленного субстрата либо один, либо два электрона в виде одного или двух атомов водо- рода (у атома водорода один электрон и один протон). Полностью восстановленные формы обозначаются FADH2 и FMNH2. Когда полно- стью окисленный флавиннуклеотид получает всего один электрон (один атом водорода), об- разуется семихинонная форма изоаллоксази- нового кольца, обозначаемая FADH* и FMNH*. Поскольку функция флавиновых нуклеотидов несколько отличается от функции никотина- мидных коферментов (участие в переносе од- ного или двух электронов), флавопротеины за- действованы в более широком наборе реакций, чем КАВ(Р)-связанные дегидрогеназы. Как и у никотинамидных коферментов (рис. 13-24), у флавиннуклеотидов при восста- новлении наблюдается сдвиг основной полосы поглощения. У полностью восстановленных фла- вопротеинов (получивших два электрона) макси- мум поглощения, как правило, лежит при 360 нм. У частично восстановленных флавопротеинов (получивших один электрон) появляется еще один максимум поглощения при 450 нм; полно- стью окисленная флавиновая система дает макси- мумы при 370 и 440 нм. Максимумы поглощения промежуточной семихинонной (радикальной) формы, восстановленной одним электроном, ле- жат при 380,480, 580 и 625 нм. Эти спектральные особенности можно использовать при изучении реакций с участием флавопротеинов. В большинстве флавопротеинов флавинну- клеотид довольно прочно связан с белком, а в не- которых ферментах, например в сукцинатдегидро- геназе, он связан ковалентно. Такие прочно свя- занные коферменты называются простетическими группами. Они не переносят электроны, диффун- дируя от одного фермента к другому; напротив, они предоставляют средство, с помощью кото- рого флавопротеин может временно удерживать электроны, пока он катализирует электронный перенос с восстановленного субстрата на акцептор электронов. Характерная особенность флавопро- теинов состоит в том, что стандартный восстано- вительный потенциал (£'°) связанного флавин- нуклеотида может изменяться, что имеет очень важное значение. Из-за сильного взаимодействия между ферментом и простетической группой фла- виновое кольцо приобретает восстановительный потенциал, величина которого характерна для данного флавопротеина и иногда значительно от- личается от восстановительного потенциала сво- бодного флавиннуклеотида. Например, у FAD, связанного с сукцинатдегидрогеназой, Е'° 0,0 В, а для свободного FAD Е'° = -0,219 В; для других флавопротеинов Е'° лежит в диапазоне от -0,40 до +0,06 В. Флавопротеины — соединения очень сложного строения; некоторые из них наряду с флавиннуклеотидом несут еще прочно связанные неорганические ионы (например, содержат ионы железа или молибдена), способные участвовать в переносе электронов. Некоторые флавопротеины выполняют со- вершенно неожиданные функции, действуя в качестве рецепторов света. Криптохромы пред- ставляют собой семейство флавопротеинов, широко распространенных в эукариотических организмах, которые опосредуют действие си- него света на развитие растений и влияние света на циркадные ритмы млекопитающих (физиологические и биохимические колебания с 24-часовым периодом). Криптохромы явля- ются гомологами другого семейства флавопро- теинов — фотолиаз. Фотолиазы, обнаруженные как у прокариот, так и у эукариот, используют энергию поглощенного света для исправления химических дефектов в ДНК. Действие флавопротеинов в качестве элек- тронных переносчиков обсуждается в гл. 19 при рассмотрении их роли в окислительном фосфо- рилировании (в митохондриях) и в фотофосфо- рилировании (в хлоропластах), а в гл. 25 речь пойдет о фотолиазных реакциях. Краткое содержание 134 ОКИСЛИТЕЛЬНО-ВОССТАНОВИТЕЛЬНЫЕ РЕАКЦИИ В БИОЛОГИЧЕСКИХ СИСТЕМАХ У многих организмов главный запасающий энергию процесс состоит в многостадийном окислении глюкозы до СО2, при котором часть энергии окисления сохраняется в виде АТР, по мере того как электроны переносятся на О2. Биологические окислительно-восстанови- тельные реакции можно представить в виде двух полуреакций, каждая из которых харак- теризуется стандартным восстановительным потенциалом Е'°.
[56] Часть II. 13. Основы биоэнергетики. Типы химических реакций При соединении двух электрохимических полуячеек, каждая из которых содержит ком- поненты полуреакции, электроны стремятся перейти в полуячейку с большим восстано- вительным потенциалом, что зависит от раз- ности между двумя восстановительными по- тенциалами (А£) и является функцией кон- центраций окисленных и восстановленных форм. Изменение стандартной свободной энергии окислительно-восстановительной реакции прямо пропорционально разности стандарт- ных восстановительных потенциалов двух полуячеек: AG'° = -nFE'°. Многие биологические реакции окисле- ния — это реакции дегидрирования, в кото- рых один или два атома водорода (Н+ + е~) переносятся с субстрата на акцептор водо- рода. Окислительно-восстановительные ре- акции в живых клетках происходят при уча- стии специальных переносчиков электронов. NAD и NADP — свободно диффундирую- щие коферменты многих дегидрогеназ. Как NAD+, так и NADP+ получают два электрона и один протон. Флавиннуклеотиды FAD и FMN выступают в роли прочно связанных простетических групп флавопротеинов. Они способны полу- чать либо один, либо два электрона и один или два протона. Флавопротеины служат также в качестве рецепторов света в крипто- хромах и фотолиазах. Ключевые термины Термины, выделенные жирным шрифтом, объясня- ются в глоссарии. автотрофы 5 аденилаткиназа 41 аденилилирование 38 альдольная конденса- ция 22 анаболизм 7 восстановительный эк- вивалент 46 гетеролитический раз- рыв связи 20 гетеротрофы 6 гомолитический разрыв связи 20 дегидрирование 46 дегидрогеназы 46 карбанион 21 карбокатион 21 катаболизм 7 киназа 26 конденсация Кляйзена 23 креатинкиназа 41 криптохром 55 метаболизм 7 метаболит 7 метаболические пути 7 неорганическая пиро- фосфатаза 38 нуклеозиддифосфат- киназа 41 нуклеофил 21 оксиредуктаза 51 пиридиннуклеотид 51 полифосфат- киназа-1 42 полифосфат- киназа-2 42 потенциал фосфо-ри- лирования (AGp) 30 приведенные стандарт- ные константы 15 промежуточный мета- болизм 7 радикал 20 сопряженная редокс- пара 44 стандартный восстано- вительный потен- циал (F) 47 тиоэфир 33 флавиннуклеотиды 54 флавопротеин 54 фосфагены 42 фотолиаза 55 электродвижущая сила (эдс) 43 электрофил 21 Дополнительная литература для дальнейшего изучения Биоэнергетика и термодинамика Atkins, P.W. (1984) The Second Law, Scientific American Books, Inc., New York Прекрасно иллюстрированное обсуждение второго закона термодинамики и его приложений начального уровня. Atkinson, D.E. (1977) Cellular Energy Metabolism and Its Regulation, Academic Press, Inc., New York. Классическое освещение роли ATP, ADP и AMP в кон- троле скорости катаболизма. Bergethon, P.R. (1998) The Physical Basis of Biochemistry, Springer Verlag, New York. Главы c 11 no 13 этой книги, а также книги Tinoco и др. и van Holde и др. (см. ниже) содержат превосходный справочный материал по физико-химической биохимии с основами термодинамики. Edsall, J.T. & Gutfreund, Н. (1983) Biothermodynamics: The Study of Biochemical Processes at Equilibrium, John Wiley & Sons, Inc., New York. Hammes, G. (2000) Thermodynamics and Kinetics for the Biological Sciences, John Wiley & Sons, Inc., New York. Понятное изложение, хорошие иллюстрации, прекрас- ные примеры и задания. Harold, ЕМ. (1986) The Vital Force: A Study of Bioenergetics, W. H. Freeman and Company, New York. Неперегруженное обсуждение термодинамики биоло- гических процессов.
Дополнительная литература для дальнейшего изучения [57] Harris, D.A. (1995) Bioenergetics at a Glance, Blackwell Science, Oxford. Краткое и понятное изложение закономерностей энергетики клетки, некоторые вводные главы по термо- динамике. Haynie, D.T. (2001) Biological Thermodynamics, Cambridge University Press, Cambridge. Очень доступное объяснение термодинамики и кине- тики биологических систем. Loewenstein, W.R. (1999) The Touchstone of Life: Molecular Information, Cell Communication, and the Foundations of Life, Oxford University Press, New York. Превосходно изложены взаимосвязи между энтропией и информацией. Nicholls, D.G. & Ferguson, S.J. (2002) Bioenergetics 3, Academic Press, Inc., New York. Понятное обсуждение теоретических основ биоэнер- гетики и механизмов передачи энергии в сопровождении хороших иллюстраций. Tinoco, L, Jr., Sauer, К., Wang, J.С., & Puglisi, J.D. (2002) Physical Chemistry: Principles and Applications in Biological Sciences, 4th edn, Prentice-Hall, Inc., Upper Saddle River, NJ. Главы 2-5 посвящены термодинамике. van Holde, K.E., Johnson, C., & Ho, P.S. (2006) Principles of Physical Biochemistry, 2nd edn, Prentice-Hall, Inc., Upper Saddle River, NJ. Особенно полезны гл. 2 и 3. Химические основы биохимических реакций Frey, Р.А. (2001) Radical mechanisms of enzymatic catalysis. Annu. Rev. Biochem. 70,121-148. Очень полезный обзор свободнорадикальных реакций. Frey, Р.А. & Hegeman, A.D. (2006) Enzymatic Reaction Mechanisms, Oxford University Press, New York. Написанный известными учеными современный спра- вочник по реакциям, происходящим в живых системах. Gutteridge, А. & Thornton, J.M. (2005) Understanding nature’s catalytic toolkit. Trends Biochem. Sci. 11, 622-629. Kraut, D.A., Carroll, K.S., & Herschlag, D. (2003) Challenges in enzyme mechanism and energetics. Annu. Rev. Biochem. 72,517-571. Хороший обзор по основам ферментативного катали- за в современном ихложении; особо выделены проблемы, пока далекие от понимания. Перенос фосфорильной группы и АТР Alberty, R.A. (1994) Biochemical thermodynamics. Biochim. Biophys. Acta 1207,1-11. Объясняются различия между биохимическими и хи- мическими уравнениями, даны примеры расчетов приве- денных термодинамических параметров для АТР и дру- гих фосфорилированных соединений. Bridger, W.A. & Henderson, J.F. (1983) Cell АТР, John Wiley & Sons, Inc., New York. Химия ATP, его роль в метаболической регуляции, а также в катаболизме и анаболизме. Brown, M.R.W. & Kornberg, А. (2004) Inorganic polyphosphate in the origin and survival of species. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101,16085-16087. Fraley, C.D., Rashid, M.H., Lee, S.S.K., Gottschalk, R., Harrison, J., Wood, P.J., Brown, M.R.W., & Kornberg, A. (2007) A polyphosphate kinase 1 (ppkl) mutant of Pseudomonas aeruginosa exhibits multiple ultrastructural and functional defects. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104,3526-3531. Frey, P.A. & Arabshahi, A. (1995) Standard free-energy change for the hydrolysis of the a-p-phosphoanhydride bridge in ATP. Biochemistry 34,11307-11310. Hanson, R. W. (1989) The role of ATP in metabolism. Biochem. Educ. 17,86-92. Превосходное краткое изложение химии и биологии АТР. Kalckar, Н.М. (1991) Fifty years of biological research: from oxidative phosphorylation to energy requiring transport regulation. Annu. Rev. Biochem. 60,1-37. Изложена история изучения ATP. Kornberg, A. (1999) Inorganic polyphosphate: a molecule of many functions. Annu. Rev. Biochem. 68,89-125. Lipmann, E (1941) Metabolic generation and utilization of phosphate bond energy. Adv. Enzymol. 11,99-162. Классическая интерпретация роли высокоэнергетиче- ских фосфатных соединений в биологии. Pullman, В. & Pullman, А. (1960) Electronic structure of energy-rich phosphates. Radiat. Res., Suppl. 2,160-181. Обсуждение химии ATP и других «богатых энергией» соединений; для углубленного уровня изучения. Rees, D.C. & Howard, J.B. (1999) Structural bioenergetics and energy transduction mechanisms. J. Mol. Biol. 293,343-350. Обсуждение структурных основ эффективного сопря- жения двух энергетических процессов с помощью изме- нения конформации. Veech, R.L., Lawson, J.W.R., Cornell, N.W, & Krebs, H. A. (1979) Cytosolic phosphorylation potential. J. Biol. Chem. 254,6538-6547. Экспериментальное определение концентраций ATP, ADP и Pi в мозге, мышцах и печени, а также обсуждение методов определения изменения свободной энергии при синтезе АТР в клетках. Westheimer, ЕН. (1987) Why nature chose phosphates. Science 235,1173-1178. Химические аспекты уникальной «адаптации» фос- фатных эфиров и ангидридов в метаболических превра- щениях.
[58] Часть II. 13. Основы биоэнергетики. Типы химических реакций Окислительно-восстановительные реакции в биологических системах Cashmore, A.R., Jarillo, J.A., Wu, Y.J., & Liu, D. (1999) Cryptochromes: blue light receptors for plants and animals. Science 284,760-765. Dolphin, D., Avramovic, O., & Poulson, R. (eds). (1987) Pyridine Nucleotide Coenzymes: Chemical, Biochemical, and Medical Aspects, John Wiley & Sons, Inc., New York. Двухтомник с превосходным собранием обзоров. Наи- более полезны главы, написанные Kaplan, Westheimer, Veech, а также Ohno и Ushio. Fraaije, M.W. & Mattevi, A. (2000) Flavoenzymes: diverse catalysts with recurrent features. Trends Biochem. Sci. 25, 126-132. Hosier, J.P., Ferguson-Miller, S., & Mills, D.S. (2006) Energy transduction: proton transfer through the respiratory complexes. Annu. Rev. Biochem. 75,165-187. Massey, V. (1994) Activation of molecular oxygen by flavins and flavoproteins. J. Biol. Chem. 269,22459-22462. Краткий обзор химии флавин-кислородных взаимо- действий в флавопротеинах. Rees, D.C. (2002) Great metalloclusters in enzymology. Annu. Rev. Biochem. 71,221-246. Обзор, посвященный металлокластерам в ферментах и механизмам их действия; для углубленного уровня из- учения. Roehm, К.-Н. (2001) Electron carriers: proteins and cofactors in oxidative phosphorylation. In Encyclopedia of Life Sciences, John Wiley & Sons, Inc./Wiley Inter Science, www.els.net. Хороший обзор различных классов переносчиков элек- тронов, участвующих в дыхании. Williams, R.E. & Bruce, N.C. (2002) New uses for an old enzyme — the old yellow enzyme family of flavoenzymes. Microbiology 148,1607-1614. 2. Вычисление NG'° из константы равновесия. Найдите изменения стандартной свободной энергии в следующих катализируемых фермен- тами метаболически важных реакциях при 25 °C и pH 7,0, используя данные по константам рав- новесия. аспартатамино- трансфераза а) Глутамат + оксалоацетат < > < > аспартат + а-кетоглутарат К' = 6,8 триозофосфат- изомераза б) Дигидроксиацетонфосфат < > < > глицеральдегид-3-фосфат К' = 0,0475 фосфофрукто- киназа в) Фруктозо-6-фосфат + АТР < > < > фруктозо-1,6-бисфосфат + ADP К' = 254 eq 3. Расчет константы равновесия из AG'°. Рас- считайте константы равновесия K'eq реакций при pH 7,0 и 25 °C, используя значения NG'° из табл. 13-4. глюкозо-6-фосфатаза а) Глюкозо-6-фосфат + Н2О < * < > глюкоза + Pi [З-галактозидаза б) Лактоза + Н2О < > < > глюкоза + галактоза фумараза в) Малат < > фумарат + Н2О Вопросы и задачи______________________ 1. Изменения энтропии при развитии яйца. Рассмотрим систему, состоящую из яйца в ин- кубаторе. В яичном белке и желтке содержатся белки, углеводы и липиды. При оплодотворении яйца из одной клетки развивается сложный ор- ганизм. Обсудите этот необратимый процесс и дайте качественную оценку изменений энтропии в системе, ее окружении и во всем пространстве. Прежде всего следует правильно определить си- стему и ее окружение. 4. Экспериментальное определение и AG'°. Если 0,1 М раствор глюкозо-1-фосфата инкуби- ровать с фосфоглюкомутазой в каталитическом количестве, глюкозо-1-фосфат превращается в глюкозо-6-фосфат. Концентрации компонентов указаны для равновесной реакции Глюкозо-1-фосфат < > глюкозо-6-фосфат 4,5 • 10 3М 9,6 • 10 2М Рассчитайте K'eq и NG'° для этой реакции при 25 °C. 5. Экспериментальное определение AG'° ги- дролиза АТР. Требуется осуществить прямое
Вопросы и задачи [59] измерение изменения стандартной свободной энергии при гидролизе АТР, поскольку в равно- весной реакции трудно определить количество АТР, гидролизуемое за 1 мин. Однако AG'° мож- но рассчитать из констант равновесия двух фер- ментативных реакций: Глюкозо-6-фосфат + Н2О глюкоза + Pi К' = 270 АТР + глюкоза -» ADP + глюкозо-6-фосфат К' = 890 Найдите стандартную свободную энергию гидро- лиза АТР при 25 °C. 6. Различие между AG'° и AG. Рассмотрим следу- ющее превращение, происходящее при гликолизе (гл. 14): Фруктозо-6-фосфат < > глюкозо-6-фосфат К' = 1,97 eq ’ а) Найдите AG'° реакции (при 25 °C). б) Если концентрацию фруктозо-6-фосфата довести до 1,5 М, а глюкозо-6-фосфата до 0,50 М, чему равно AG? в) Почему AG'° и AG не совпадают по вели- чине? 7. Свободная энергия гидролиза СТР. Сравните структуру нуклеозидтрифосфата СТР со струк- турой АТР Цитидинтрифосфат (СТР) ОН ОН Предскажите значения K'eq и AG'° для следу- ющей реакции: АТР + CDP ADP + СТР 8. Зависимость AG от pH. Свободная энергия, вы- деляющаяся при гидролизе АТР в стандартных условиях (при pH 7,0), равна -30,5 кДж/моль. Больше или меньше выделится свободной энер- гии, если гидролиз АТР происходит в стандартных условиях, но при pH 5,0? Объясните. Используйте физиологический график для объяснения этой за- висимости. Э 9. AG'° сопряженных реакций. Глюкозо-1-фосфат превращается во фруктозо-6-фосфат в двух по- следовательных реакциях: Глюкозо-1-фосфат глюкозо-6-фосфат Глюкозо-6-фосфат фруктозо-6-фосфат Основываясь на величинах AG'° из табл. 13- 4, рассчитайте константу равновесия K'eq суммар- ной реакции при 25 °C: Глюкозо-1-фосфат фруктозо-6-фосфат 10. Влияние отношения [ATP]/[ADP] на величи- ну свободной энергии гидролиза АТР. Используя уравнение 13-4, постройте график AG от In Q (от- ношение действующих масс) при 25 °C для указан- ных в таблице концентраций АТР, ADP и Pi. Для данной реакции AG'° = -30,5 кДж/моль. Исполь- зуя этот график, объясните, почему регуляция ме- таболизма направлена на поддержание высокого значения отношения [ATP]/[ADP]. Концентрация (мМ) АТР 5 3 1 0,2 5 ADP 0,2 2,2 4,2 5,0 25 Pi 10 12,1 14,1 14,9 10 Аденозинтрифосфат (АТР) ОН ОН 11. Способ преодоления невыгодности реакций: ATP-зависимое химическое сопряжение. Фос- форилирование глюкозы до глюкозо-6-фосфата является начальным шагом в катаболизме глюко- зы. Непосредственное фосфорилирование глю- козы Pj описывается уравнением Глюкоза + глюкозо-6-фосфат + Н2О \G'° = 13,8 кДж/моль
[60] Часть II. 13. Основы биоэнергетики. Типы химических реакций а) Рассчитайте константу равновесия при- веденной реакции. В гепатоцитах крысы физио- логическая концентрация глюкозы и Pj состав- ляет ~4,8 мМ. Какова равновесная концентрация глюкозо-6-фосфата, полученного непосредствен- ным фосфорилированием глюкозы неорганиче- ским фосфатом? Приемлема ли эта реакция как стадия метаболизма при катаболизме глюкозы? Объясните. б) В принципе по крайней мере один из способов увеличения концентрации глюкозо-6- фосфата заключается в смещении равновесия реакции вправо увеличением внутриклеточных концентраций глюкозы и Рь Предполагая, что концентрация Pj не меняется и равна 4,8 мМ, най- дите, какой должна быть внутриклеточная кон- центрация глюкозы, чтобы равновесная концен- трация глюкозо-6-фосфата составила 250 мкМ (это обычная физиологическая концентрация)? Будет ли такой способ физиологически приемле- мым, если известно, что максимальная раствори- мость глюкозы меньше 1 М? в) Фосфорилирование глюкозы в клетке со- пряжено с гидролизом АТР; т. е. часть свободной энергии гидролиза АТР идет на фосфорилирова- ние глюкозы: (1) Глюкоза + Pj глюкозо-6-фосфат + Н2О AG'° = 13,8 кДж/моль (2) АТР + Н2О ADP + AG'° = -30,5 кДж/моль Итого: глюкоза + АТР глюкозо-6-фосфат + ADP Рассчитайте К'щ суммарной реакции. При АТР- зависимом фосфорилировании глюкозы ка- кая ее концентрация необходима для получе- ния 250 мкМ внутриклеточной концентрации глюкозо-6-фосфата, если концентрации АТР и ADP равны 3,38 и 1,32 мМ соответственно? Дает ли такое сопряжение в принципе осуществимый способ фосфорилирования глюкозы в клетке? Объясните. г) Хотя сопряжение гидролиза АТР с фос- форилированием глюкозы термодинамически разумно, пока остается невыясненным, каким образом это должно происходить. Раз установ- лено, что для сопряжения необходим общий по- средник, можно использовать гидролиз АТР для повышения внутриклеточной концентрации Pi и стимулировать тем самым невыгодное фосфо- рилирование глюкозы. Разумен ли такой путь? (Подумайте о растворимости метаболических посредников.) д) ATP-сопряженное фосфорилирование глюкозы в гепатоцитах катализируется фермен- том глюкокиназой. Этот фермент связывается с АТР и глюкозой с образованием комплекса глю- коза-АТР-фермент, а фосфорильная группа переносится непосредственно с АТР на глюкозу. Объясните преимущества такого пути. 12. Расчет AG'° ATP-сопряженных реакций. Из данных табл. 13-6 найдите AG'° реакций а) Креатинфосфат + ADP креатин + АТР б) АТР + фруктоза ADP + фруктозо-6-фосфат 13. Сопряжение гидролиза АТР с энергетически невыгодными реакциями. Для исследования ре- зультатов сопряжения гидролиза АТР в физио- логических условиях с термодинамически невы- годной биохимической реакцией рассмотрим ги- потетическое превращение X Y, для которого AG'° = 20 кДж/моль. а) Чему равно отношение [Y]/[X] в состоя- нии равновесия? б) Пусть X и Y участвуют в последователь- ности реакций, в ходе которых происходит гидро- лиз АТР до ADP и Pj. Суммарная реакция X + АТР + Н2О Y + ADP + Вычислите [Y]/[X] для этой реакции в состоянии равновесия. Примите, что равновесные концен- трации АТР, ADP и равны 1 М. в) Известно, что в физиологических услови- ях [АТР], [ADP] и [^] не равны 1 М. Вычислите [Y]/[X] для ATP-сопряженной реакции со значе- ниями [АТР], [ADP] и [PJ, взятыми для миоци- тов крыс. 14. Расчеты AG при физиологических концен- трациях. Найдите физиологическое AG (а не AG'°) реакции Креатинфосфат + ADP креатин + АТР при 25 °C для цитозоля нейронов с концентра- цией креатинфосфата 4,7 мМ, креатина 1,0 мМ, ADP 0,73 мМ и АТР 2,6 мМ.
Вопросы и задачи [61] 15. Свободная энергия, необходимая для синте- за АТР в физиологических условиях. В цитозо- ле гепатоцитов крыс коэффициент действующих масс Q равен [АТР] [ADP][Pi] = 5,33 • 102 М1 Найдите свободную энергию, необходимую для синтеза АТР в гепатоцитах крыс. 16. Химическая логика. В ходе гликолиза шестиуглеродный сахар фруктозо-1,6-бисфосфат расщепляется с образованием двух трехуглерод- ных сахаров, которые подвергаются дальнейшим метаболическим превращениям (см. рис. 14-5). При этом за две стадии до реакции расщепления происходит изомеризация глюкозо-6-фосфата во фруктозо-6-фосфат (см. ниже) (промежуточная стадия представляет собой фосфорилирование фруктозо-6-фосфата с образованием фруктозо- 1,6-бисфосфата) (с. 73)). н—С—ОН Подсказка. Механизм этой реакции аналогичен механизму любой другой реакции, катализируе- мой NADH-зависимой дегидрогеназой, например алкогольдегидрогеназой. 18. Механизм ферментативной реакции. II. Биохимические реакции часто кажутся более сложными, чем они есть на самом деле. В пен- тозофосфатном пути (гл. 14) седогептулозо- 7-фосфат реагирует с глицеральдегид-3-фос- фатом с образованием эритрозо-4-фосфата и фруктозо-6-фосфата при участии фермента трансальдолазы. с=о I но—с—н I н-с-он п „ I °% /н н—с—он с I + I . Н—С—ОН Н—С—ОН трансальдолаза СН2ОРО|- СН2ОРО|“ Седогептулозе- Глицеральдегид- 7-фосфат 3-фосфат н—С—ОН но—с—н н—с—он глюкозофосфат- изомераза но—с—н н—с—он СН2ОРО* СН2ОРОз Глюкозо-6-фосфат Фруктозо-6-фосфат В чем смысл стадии изомеризации в ходе данно- го процесса? Подсказка. Подумайте, что могло бы произойти при расщеплении связи С—С без предварительной изомеризации. ° / с I н—с—он I н—с—он СН2ОРО|“ Эритрозо- 4-фосфат С=О I но—с—н I н—с—он I н—с—он СН2ОРО|- Фруктозо- 6-фосфат 17. Механизм ферментативной реакции. I. Лак- татдегидрогеназа — один из ферментов, исполь- зующих в качестве кофермента NADH. Фермент катализирует превращение пирувата в лактат Изобразите механизм данной реакции (стрел- ками покажите направление передачи электро- нов). Подсказка. Взгляните на реакцию альдоль- ной конденсации и учтите название данного фермента. °%/0- с I с=о I СН3 NADH+H+ NAD+ лактатдегидро- геназа Ч/0- с I )—с—н I сн3 Пируват L-лактат Изобразите механизм данной реакции (стрелка- ми покажите направление передачи электронов). 19. Организм взрослого человека постоянно ис- пользует АТР. а) Для синтеза АТР из ADP и Pj при ус- ловии, что реагенты взяты в концентрациях 1 М (стандартное состояние), требуется всего 30,5 кДж/моль свободной энергии. Поскольку истинные физиологические концентрации АТР, ADP и Pi не равны 1 М, свободная энергия, не- обходимая для синтеза АТР в физиологических условиях, отличается от А(7°. Найдите свобод-
[62] Часть II. 13. Основы биоэнергетики. Типы химических реакций ную энергию, необходимую для синтеза АТР в гепатоцитах человека, если физиологические концентрации АТР, ADP и Pi составляют 3,5, 1,50 и 5,0 мМ соответственно. б) Взрослому человеку с массой тела 68 кг (150 фунтов) требуется 2000 ккал (8,360 кДж); эту энергию человек получает с пищей за сут- ки (24 ч). Пища усваивается, а свободная энер- гия используется для синтеза АТР Затем АТР предоставляет организму энергию для выпол- нения ежедневной химической и механической работы. Предположив, что эффективность пре- вращения энергии пищи в АТР составляет 50%, найдите массу АТР, который используется орга- низмом взрослого человека за 24 ч. Какой про- цент от массы тела составляет АТР? в) Несмотря на то что в организме человека каждый день синтезируются огромные количе- ства АТР, при синтезе АТР масса человека не пре- терпевает значительных изменений. Объясните это кажущееся противоречие. 20. Скорости обновления у- и р-фосфатов в АТР. Если небольшое количество АТР с радиоактив- ной меткой на месте последнего атома фосфора [у-32Р]АТР добавить в экстракт дрожжей, то че- рез несколько минут примерно половина 32Р ока- жется в Pi; при этом концентрация АТР остается неизменной. Объясните это. Если выполнить та- кой же эксперимент, используя [р-32Р]АТР с 32Р в центральном положении, через столь же корот- кий промежуток времени в Pi не появляется 32 Р. Почему? 21. Распад АТР до АМР и PPj в ходе метабо- лизма. Синтез активированной формы ацетата (аце-тил-СоА) является ATP-зависимым про- цессом: Ацетат + СоА + АТР ацетил-СоА + АМР + PPi a) AG'° гидролиза ацетил-СоА до ацетата и СоА составляет -32,2 кДж/моль, а гидроли- за АТР до АМР и PPi -30,5 кДж/моль. Найдите А (7° ATP-зависимого синтеза ацетил-СоА. б) Почти в каждой клетке есть фермент не- органическая пирофосфатаза, катализирующая гидролиз PPj до Pi. Какой эффект оказывает при- сутствие данного фермента на синтез ацетил- СоА? Объясните. 22. Энергия переноса Н+. Париетальные клет- ки желудка содержат мембранные «насосы», которые обеспечивают транспорт ионов водо- рода из цитозоля этих клеток (pH 7,0) в же- лудок, обеспечивая кислотность желудочному соку (pH 1,0). Найдите свободную энергию, необходимую для транспорта 1 моль ионов во- дорода с помощью этого насоса. Подсказка. См. гл. И. Температура 25 °C. 23. Стандартные восстановительные потенциа- лы. Стандартный восстановительный потенци- ал Е'° любой редокс-пары характеризует следу- ющую полуреакцию: Окислитель + п электронов восстановитель Для двух сопряженных редокс-пар NAD+/NADH и пируват/лактат Е'° = -0,32 В и -0,19 В соответ- ственно. а) Какая сопряженная пара обладает боль- шей склонностью к потере электронов? Пояс- ните. б) Какой окислитель более сильный? Пояс- ните. в) Если начальная концентрация каждого реагента и продукта при pH 7 составляет 1 М, в каком направлении пойдет реакция? Пируват + NADH + Н+ . . лактат + NAD+ г) Каково изменение стандартной свободной энергии А (7° превращения пирувата в лактат при 25 °C? д) Какова константа равновесия К'щ этой ре- акции? 24. Энергетика дыхательной цепи. Перенос электронов в дыхательной цепи митохондрий можно представить суммарным уравнением NADH + Н+ + l/2 О2 Н2О + NAD+ а) Найдите АЕ'° суммарной реакции перено- са электронов в митохондриях. Используйте зна- чения Е'° из табл. 13-7. б) Найдите А (7° этой реакции. в) Сколько молекул АТР может теоре- тически образоваться в этой реакции, если в клетке свободная энергия синтеза АТР 52 кДж/моль?
Анализ экспериментальных данных [63] 25. Зависимость электродного потенциала от концентрации. Найдите электродный потенциал (в вольтах), регистрируемый электродом, кото- рый погружен в раствор, содержащий следующие смеси NAD+ и NADH при pH 7,0 и 25 °C относи- тельно полуячейки с Е'° 0,00 В: а) 1,0 мМ NAD+ и 10 мМ NADH; б) 1,0 мМ NAD+ и 1,0 мМ NADH; в) 10 мМ NAD+ и 1,0 мМ NADH. 26. Сродство к электронам. Расположите сле- дующие вещества в порядке увеличения их стрем- ления присоединять электроны: а) а-кетоглута- рат + СО2 (с образованием изоцитрата); б) оксало- ацетат; в) О2; г) NADP+. 27. Направление окислительно-восстановитель- ных реакций. Какая из следующих реакций (по вашему мнению) должна идти в прямом направ- лении в стандартных условиях, если предполо- жить, что имеются соответствующие ферменты, катализирующие их? а) Малат + NAD+ оксалоацетат + NADH + Н+ б) Ацетоацетат + NADH +11^ Р-гидроксибутират + NAD+ в) Пируват + NADH +11^ лактат + NAD+ г) Пируват + р-гидроксибутират лактат + ацетоацетат д) Малат + пируват оксалоацетат + лактат е) Ацетальдегид + сукцинат этанол + фумарат Анализ экспериментальных данных_________ 28. «Хитрая» термодинамика. Термодинамика — один из самых интересных разделов науки, одна- ко интерпретация ее законов не всегда правильна. В качестве забавного примера рассмотрим фраг- мент работы, выполненной Робинсоном, Хэмпсо- ном, Манро и Вани и опубликованной в журна- ле Science в 1993 г. В работе изучалась миграция небольших молекул между соседними клетками нервной системы через синаптическую щель. Вы- яснилось, что красители люцифер желтый (не- большая отрицательно заряженная молекула) и биоцитин (небольшой цвиттер-ион) перемеща- лись между клетками глии двух типов (между вспомогательными клетками нервной системы) только в одном направлении. После инъекции красителей в астроциты они быстро проникали в соседние астроциты, олигодендроциты или клет- ки Мюллера, однако после инъекции красителей в олигодендроциты или клетки Мюллера они лишь слабо и медленно проникали в астроциты. Все эти типы клеток разделены между собой си- наптическими щелями. Хотя это и не было основной целью работы, авторы все же предложили молекулярную модель такого однонаправленного транспорта (см. рис.). Подпись к этому рисунку гласит: «Модель одно- направленной диффузии красителей между со- седними олигодендроцитами и астроцитами, осно- ванная на различии диаметров пор. Подобно рыбе в ловушке, молекулы красителя (черные кружки) могут проходить из астроцитов в олигодендроци- ты (А), но не в обратном направлении (Б)». Несмотря на то, что статья прошла рецензи- рование перед публикацией в этом авторитетном журнале, в 1994 г. редакция журнала получила несколько писем, в которых указывалось, что мо- дель Робинсона с соавторами нарушает второе начало термодинамики. а) Объясните, почему предложенная модель нарушает второе начало термодинамики. Под- сказка. Рассмотрите, что было бы с энтропией системы, если бы в астроцитах и олигодендро- цитах, разделенных синаптической щелью типа рыболовного экрана («телевизора»), в начальный момент времени была бы одинаковая концентра- ция красителя. б) Объясните, почему данная модель непри- годна для описания поведения малых молекул, хотя хорошо описывает рыбную ловлю.
[64] Часть II. 13. Основы биоэнергетики. Типы химических реакций в) Объясните, почему рыба, попадая в ло- вушку, не может из нее выбраться. г) Предложите два возможных механизма для объяснения однонаправленного транспорта молекул красителя между клетками, которые бы не нарушали второго начала термодинамики. Литература Letters to the editor. (1994) Science 265,1017-1019. Robinson, S.R., Hampson, E.C.G.M., Munro, M.N., & Vaney, D.I. (1993) Unidirectional coupling of gap junctions between neuroglia. Science 262,1072-1074.
Спиртовое брожение, которое лежит в основе чудесного и, по-видимому, самопроизвольного процесса превращения простого виноградного сока в возбуждающее вино, с древних времен привлекало внимание естество- испытателей. Артур Гарден, Alcoholic Fermentation (Спиртовое брожение), 1923 14 Гликолиз, глюконеогенез и пентозофосфатный путь 14.1. Гликолиз 66 14.2. Метаболические пути, питающие гликолиз 86 14.3. Превращение пирувата в анаэробных ус- ловиях: брожение 90 14.4. Глюконеогенез 97 14.5. Пентозофосфатный путь окисления глюкозы 107 В метаболизме растений, животных и многих микроорганизмов глюкоза занимает централь- ное место. Молекула глюкозы богата энергией и поэтому используется клетками в качестве «то- плива». Полное окисление глюкозы до углекислого газа и воды сопровождается изменением свободной энергии, равным -2840 кДж/моль. В клетках глю- коза запасается в виде высокомолекулярных соеди- нений — крахмала или гликогена, что позволяет на- капливать большое количество гексозных звеньев и при этом сохранять сравнительно низкую осмоляр- ность цитозоля. При увеличении энергетических затрат клетки глюкоза высвобождается из внутри- клеточных запасов и используется для продуциро- вания АТР аэробным или анаэробным путем. Глюкоза — не только прекрасный источник энергии, но и универсальный предшественник, из которого в реакциях биосинтеза образуется множество интермедиатов. Например, бактерия Escherichia coli производит из глюкозы углеродные скелеты всех аминокислот, нуклеотидов, кофер- ментов, жирных кислот и других продуктов, не- обходимых ей для роста. Для полного понимания метаболических процессов с участием глюкозы необходимо было бы рассмотреть сотни или даже тысячи различных реакций. В клетках животных и в клетках сосудистых растений глюкоза претерпе- вает превращения трех основных типов: 1) запаса- ется в виде полисахаридов или сахарозы; 2) путем гликолиза окисляется до трикарбоновых соедине- ний (пирувата) с образованием АТР и различных интермедиатов метаболизма; 3) по пентозофосфат- ному (фосфоглюконатному) пути окисляется до рибозо-5-фосфата, необходимого для синтеза ну- клеиновых кислот и NADPH, участвующего в вос- становительных реакциях биосинтеза (рис. 14-1). Внеклеточный мат- рикс и полисахариды клеточной стенки синтез X структуре-Л образующих молекул Гликоген, крахмал, Глюкоза окисление по пентозофосфат - ному пути У Пируват Рибозо-5- фосфат Рис. 14-1. Основные пути использования глюкозы в клетке. Глюкоза претерпевает и другие превращения, однако в большинстве клеток наиболее существенные количества глюкозы расходуются именно по этим трем самым важным направлениям.
[66] Часть II. 14. Гликолиз, глюконеогенез и пентозофосфатный путь Те организмы, которые не могут получить глюкозу из других источников, должны синте- зировать ее самостоятельно. Фотосинтезиру- ющие организмы образуют глюкозу из атмос- ферного СО2, превращая его триозу и далее в глюкозу. Нефотосинтезирующие клетки про- изводят глюкозу из более простых трех- и че- тырехуглеродных предшественников в глюко- неогенезе (процессе, обратном гликолизу), где эффективно используются многие гликолити- ческие ферменты. В данной главе мы остановимся на от- дельных реакциях гликолиза, глюконеогенеза и пентозофосфатного пути и обсудим функ- циональное значение каждого из этих путей. Кроме того, мы рассмотрим различные пре- вращения пирувата, образующегося в резуль- тате гликолиза; к ним относятся процессы бро- жения, используемые многими организмами в анаэробных условиях для получения АТР, а человеком — для промышленного производ- ства этилового спирта, молочной кислоты и других важных продуктов. Мы также разберем метаболические пути, поставляющие для гли- колиза различные сахара из моно-, ди- и поли- сахаридов. Обсуждение метаболизма глюкозы продолжается в гл. 15, где рассматриваются процессы анаболизма и катаболизма, связы- вающие глюкозу с гликогеном. Механизмы регуляции метаболизма мы проиллюстриру- ем на примере реакций синтеза и деградации углеводов. Пути биосинтеза полисахаридов внеклеточного матрикса и клеточных стенок из глюкозы обсуждаются в гл. 20. 14-1- Гликолиз В процессе гликолиза (от греч. glykys — сладкий или сахар и lysis — разрушение) происходит по- следовательное ферментативное расщепление молекулы глюкозы с образованием двух моле- кул трехуглеродного соединения пирувата. Часть высвобождающейся в этом процессе свободной энергии запасается в виде АТР и NADH. Из всех метаболических путей последовательность реак- ций гликолиза была установлена первой, и он, по- видимому, изучен лучше всего. Начиная с откры- тия Эдуардом Бухнером в 1897 г. ферментации в дрожжевом экстракте и вплоть до установления полного метаболического пути в дрожжах (рабо- ты Отто Варбурга и Ганса Эйлера-Челпина) и в мышцах (работы Густава Эмбдена и Отто Мейер- гофа) в 1930-х гг. основное направление биохи- мических исследований было сконцентрировано на реакциях гликолиза в дрожжевом экстракте и мышцах. Изменение научных взглядов под вли- янием данного открытия было сформулировано Жаком Лебом в 1906 г.: «Благодаря открытию Бухнера биология освободилась еще от одного мифа. Разло- жение сахара на СО2 и спирт нельзя считать проявлением «принципа витализма», как и расщепление тростникового сахара инверта- зой. История данного вопроса поучительна, поскольку не позволяет считать, что те или иные проблемы находятся вне нашего по- нимания лишь по той причине, что они пока еще не нашли своего объяснения.»
14.1 Гликолиз [67] Исследование процесса гликолиза стиму- лировало развитие методов очистки ферментов, помогло осознать роль коферментов, например NAD, а также выявить ключевую метаболиче- скую функцию АТР и других фосфорилирован- ных соединений. Были очищены и детально из- учены гликолитические ферменты из многих видов организмов. Гликолиз — практически универсальный центральный путь катаболизма глюкозы; в боль- шинстве клеток в этом процессе происходит пре- вращение основных количеств углеродсодержа- щих соединений. В некоторых клетках и тканях млекопитающих (например, эритроцитах, моз- говом веществе почки, головном мозге, сперме) гликолитическое расщепление глюкозы — это единственный источник метаболической энер- гии. Некоторые ткани растений, служащие для накопления крахмала (картофельные клубни), а также ряд водных растений (например, водяной кресс) получают большую часть необходимой им энергии в процессе гликолиза; многие анаэроб- ные организмы полностью зависят от гликолиза. Брожение — это общий термин, обозна- чающий анаэробное разложение глюкозы или других органических питательных веществ с целью высвобождения энергии, запасаемой в виде АТР. Поскольку живые организмы воз- никли в бескислородной атмосфере, анаэробное разложение глюкозы, возможно, самый древ- ний биологический механизм, позволяющий получить энергию из органических молекул. В процессе эволюции данная последовательность химических превращений полностью сохрани- лась. Гликолитические ферменты позвоночных очень похожи на своих гомологов у дрожжей и шпината как по аминокислотной последова- тельности, так и по третичной структуре. У ор- ганизмов разных видов гликолиз различается лишь деталями регуляции и судьбой образую- щегося пирувата. При этом термодинамические принципы и типы регуляторных механизмов, управляющих гликолизом, такие же, как и для всех метаболических путей в клетке. Итак, гли- колиз играет важную роль в химии жизни и как модельный процесс он удобен для изучения об- щих принципов метаболизма. Прежде чем начать изучение отдельных стадий гликолиза, взглянем на этот процесс в целом. Гликолиз протекает в две стадии Расщепление шестиуглеродной глюкозы на две молекулы трехуглеродного пирувата представ- ляет собой последовательность из 10 реакций, из которых первые пять называют подготовительной стадией (рис. 14-2, а). Сначала глюкоза фосфо- рилируется по гидроксильной группе у атома С-6 (реакция Ф). Образующийся при этом D-глюкозо- 6-фосфат превращается в D-фруктозо-б-фосфат (реакция ®), который в свою очередь тоже фос- форилируется — теперь по атому С-1 — с образо- ванием D-фруктозо-!,6-бисфосфата (реакция ®). В обеих реакциях фосфорилирования донором фосфорильной группы служит АТР. Поскольку все производные сахаров, образующиеся в про- цессе гликолиза, — D-изомеры, мы посчитали воз- можным здесь опустить в названиях соединений букву D, за исключением тех случаев, когда важно подчеркнуть их стереохимические свойства. Фруктозо-1,6-бисфосфат распадается с образо- ванием двух трехуглеродных молекул — дигидрок- сиацетонфосфата и глицеральдегид-3-фосфата (реакция Ф; именно эта стадия «лизиса» дает назва- ние всему процессу). Затем в результате изомериза- ции дигидроксиацетонфосфата образуется вторая молекула глицеральдегид-3-фосфата (реакция ®); на этом заканчивается первая стадия гликолиза. Далее мы с химической точки зрения обсудим под- робнее, насколько важную роль играет стадия изо- меризации (реакция ®) для фосфорилирования и разрушения связи С—С в реакциях ® и Ф. Обрати- те внимание, что до стадии расщепления глюкозы на трехуглеродные соединения расходуются две молекулы АТР; несколько позже эти затраты АТР будут не только компенсированы, но и перекрыты. Итак, на подготовительной стадии гликолиза энер- гия, заключенная в АТР, увеличивает потенциаль- ную энергию интермедиатов; углеродные цепи всех расщепляемых гексоз превращаются в один и тот же продукт — глицеральдегид-3-фосфат. Вторая (возвратная) стадия гликолиза (стадия «выплаты процентов») сопровождается высвобож- дением энергии (рис. 14-2, б). Каждая молекула глицеральдегид-3-фосфата окисляется и фосфори- лируется под действием неорганического фосфата (не АТР!) с образованием 1,3-бисфосфоглицера- та (реакция ®). При превращении двух молекул 1,3-бисфоглицерата в две молекулы пирувата (ре- акции ®-®) происходит высвобождение энергии.
[68] Часть II. 14. Гликолиз, глюконеогенез и пентозофосфатный путь а Фруктозо-6-фосфат вторая «пуско- вая» реакция \Н НО? н\1 [/он ©-О—СН^О СН2—ОН Подготовительная стадия Фосфорилирование глюкозы и ее превращение в глицеральдегид-3-фосфат (Т) Гексокиназа @ Глюкозофосфат- изомераза Фосфофрукто- киназа-1 ADP Фруктозо-1,6-бисфосфат Расщепление шестиугле- родного са- хара на два трехуглерод- ных сахара (£но-сщ,о. сн2—о—(р) \н но> ОН н Альдолаза Триозофосфат- изомераза Глицеральдегид-З-фосфат 5 б Глицеральдегид-З-фосфат (2) Дигидроксиацетонфосфат ©-О—сн2—сн—с' он н ©—о—сн2—с—сн2он о (Р)-О-СН2-СН-СЧ он н окисление и фосфорили- (б) рование 1,3-Бисфосфоглицерат (2) первая реакция с образованием АТР (фосфори- (7) . лированиена 2 АТР уровне суб- страта) 3-фосфоглицерат (2) 8 2-Фосфоглицерат (2) 9 ^2Н2О Фосфоенолпируват (2) вторая реакция с образованием АТР (фосфори- лирование на уровне суб- C1Q) 2ADP страта) Пируват (2) Возвратная стадия („выплаты процентов") Окислительное превращение глицеральдегид-3-фосфата в пируват, сопряженное с образованием АТР и NADH ©-о—сн2—сн—с ОН °-® (б) Глицеральдегид-3- фосфатдегидрогеназа ©-о—сн2—сн—с он °- @ Фосфоглицерат- киназа (8) Фосфоглицерат- мутаза СН2-СН-С он о °“ (р) СН2=С—С\ (9) Енолаза (П)) Пируваткиназа сн3—с—с 11 V о °
14.1 Гликолиз [69] В результате сопряженного фосфорилирования четырех молекул ADP большая часть этой энергии накапливается в виде АТР. Общий выход АТР в процессе гликолиза, однако, составляет не четыре, а лишь две молекулы на одну молекулу глюкозы, поскольку две молекулы АТР расходуются на под- готовительной стадии. Кроме того, энергия, высво- бождающаяся на второй стадии гликолиза, запаса- ется в виде двух молекул NAD PH в расчете на одну молекулу глюкозы. В процессе гликолиза происходят превраще- ния трех разных типов: 1) расщепление углерод- ного скелета глюкозы с образованием пирувата; 2) фосфорилирование ADP до АТР под действием высокоэнергетических фосфорилированных со- единений, образующихся при гликолизе; 3) пере- нос гидрид-иона на NAD+ с образованием NADH. Превращения молекулы пирувата. За исклю- чением нескольких интересных случаев среди бактерий у всех остальных организмов образую- щийся в результате гликолиза пируват претерпе- вает дальнейшие превращения по одному из трех основных путей катаболизма. У аэробных орга- низмов и в тканях при аэробных условиях глико- лиз — это всего лишь первая стадия полного рас- щепления глюкозы (рис. 14-3). При окислении пирувата образуется ацетогруппа ацетилкофер- мента А, а карбоксильная группа пирувата пре- вращается в СО2. Далее ацетогруппа полностью окисляется до СО2 в цикле лимонной кислоты (гл. 16). Эти процессы сопровождаются перено- сом электронов на молекулу О2 с образованием Н2О в митохондриях. Энергия, высвобождаемая ◄-------------------------------------------- Рис. 14-2. Две стадии гликолиза. На подготовительной стадии (а) из каждой молекулы глюкозы образуются две молекулы глицеральдегид-3-фосфата; обе эти молекулы претерпевают дальнейшие превращения на возвратной стадии, б — конечным продуктом второй стадии глико- лиза является пируват. На первой стадии гликолиза на одну молекулу глюкозы расходуются две молекулы АТР, а на второй стадии образуются четыре молекулы АТР, что в сумме приводит к образованию двух молекул АТР на каждую молекулу глюкозы, превращенную в пируват. Нумерация реакций на схеме соответствует нумерации в тексте; ферменты, катализирующие соответствующие реакции, перечислены справа. Помните, что каждая фос- форильная группа, обозначенная здесь как ®, несет два отрицательных заряда (—Р0|_). Глюкоза низкое содержание кислорода или анаэробные условия гликолиз (10 последовательных реакций) 2 Пируват анаэробные условия аэробные 2 Лактат условия V 2СО2 2 Этанол + 2СО2 Спиртовое брожение в дрожжах 2 Ацетил-СоА Молочнокислое брожение в работающих мышцах, в эритроцитах цикл лимонной кислоты и в других клетках некоторых микроорганизмов 4СО2 + 4Н2О Животные, растительные и многие микробные клетки в аэробных условиях Рис. 14-3. Возможные пути катаболизма пирувата, обра- зующегося в результате гликолиза. Пируват, кроме того, служит предшественником во многих реакциях анабо- лизма, которые здесь не изображены. при переносе электронов, является движущей си- лой образования АТР в митохондриях (гл. 19). Второй возможный путь превращения пиру- вата — его восстановление до лактата в процессе молочнокислого брожения. При интенсивной работе мышц в условиях недостатка кислорода (гипоксия) NADH не может вновь превращаться в NAD+, однако NAD+ как акцептор электронов необходим для дальнейшего окисления пирува- та. В таких условиях пируват восстанавливает- ся до лактата, принимая электроны от NADH, в результате чего образуется NAD+, необходимый для продолжения гликолиза. Некоторые типы клеток и тканей (например, клетки сетчатки и эритроциты) превращают глюкозу в лактат даже в аэробных условиях; кроме того, некоторые ми- кроорганизмы также образуют лактат в процессе гликолиза в анаэробных условиях (рис. 14-3). На третьем основном пути катаболизма пируват превращается в этиловый спирт. Пре- вращение пирувата в этанол и СО2 в некоторых тканях растений, у определенных видов беспоз- воночных, простейших и микроорганизмов (на- пример, у пекарских дрожжей) при недостатке кислорода или в анаэробных условиях называют спиртовым брожением (рис. 14-3).
[70] Часть II. 14. Гликолиз, глюконеогенез и пентозофосфатный путь Окисление пирувата — важный процесс катабо- лизма, однако пируват участвует и в реакциях ана- болизма. Например, на его основе строится углерод- ный скелет аминокислоты аланина. Мы рассмотрим эти реакции пирувата в последующих главах. Образование АТР и NADH в процессе гликоли- за. Часть энергии, запасенной в молекуле глю- козы, в результате гликолиза переходит в АТР, а часть сохраняется в пирувате. Полное уравнение гликолиза можно записать следующим образом: Глюкоза + 2NAD+ + 2ADP + 2^ 2 пируват + 2NADH + 2Н++ 2АТР + 2Н2О (14-1) При разложении каждой молекулы глюкозы до пирувата происходит образование двух молекул АТР из ADP и Pi и двух молекул NADH при вос- становлении NAD+. Акцептором водорода в дан- ной реакции выступает NAD+ (см. рис. 13-24), связанный с мотивом укладки Россмана (см. рис. 13-25). Восстановлению NAD+ предшествует ферментативный перенос гидрид-иона (:Н) от альдегидной группы глицеральдегид-3-фосфата на никотинамидное кольцо NAD+, что приводит к образованию восстановленной формы кофермен- та NADH. Другой атом водорода из молекулы суб- страта высвобождается в раствор как Н+. Мы можем записать гликолиз в виде двух отдельных реакций — экзергонической реакции (превращение глюкозы в пируват) Глюкоза + 2NAD+ 2 пируват + 2NADH + 2Н+ (14-2) AG'° = -146 кДж/моль и эндергонической (образование АТР из ADP и Pi) 2ADP + 2Pi 2АТР + 2Н2О (14-3) AG2° = 2 • 30,5 кДж/моль = 61,0 кДж/моль Суммируя уравнения 14-2 и 14-3, получим изменение свободной энергии в процессе глико- лиза (АС'0°бщ): А<70°бщ = ag;° + AG2'° = = -146 кДж/моль + 61,0 кДж/моль = = -85 кДж/моль В стандартных условиях в клетке гликолиз необ- ратим и проходит полностью (до конца) — боль- шая отрицательная величина изменения свобод- ной энергии. Энергия, заключенная в пирувате. В результа- те гликолиза высвобождается лишь небольшая часть энергии, запасенной в молекуле глюко- зы. Образующиеся две молекулы пирувата по- прежнему содержат значительную долю энергии молекулы глюкозы, и эту энергию можно извлечь в ходе окислительных реакций в цикле лимонной кислоты (гл. 16) и окислительного фосфорили- рования (гл. 19). Роль фосфорилированных интермедиатов. Каждый из девяти интермедиатов на пути пре- вращения глюкозы в пируват фосфорилирован (рис. 14-2). Фосфорильные группы, по-видимому, выполняют три функции. 1. Поскольку в плазматической мембране обычно нет переносчиков фосфорилирован- ных сахаров, фосфорилированные интер- медиаты не могут покинуть клетку. После первой же стадии фосфорилирования отпа- дает необходимость затрачивать энергию на удерживание интермедиатов внутри клетки, несмотря на большую разницу в их внутри- и внеклеточной концентрациях. 2. Фосфорильные группы играют важную роль в сохранении метаболической энергии. Энер- гия, высвобождающаяся при разрыве фос- фоангидридной связи (например, в АТР), частично сохраняется благодаря образова- нию эфиров фосфорной кислоты (напри- мер, глюкозо-6-фосфата). Богатые энергией фосфорилированные соединения, образую- щиеся в процессе гликолиза (1,3-бисфосфо- глицерат и фосфоенолпируват), отдают свою фосфорильную группу молекулам ADP, в ре- зультате чего образуется АТР. 3. Энергия связывания фосфатных групп в ак- тивных центрах ферментов снижает энергию активации и повышает специфичность фер- ментативных реакций (гл. 6). Фосфатные группы ADP, АТР и интермедиатов гликоли- за образуют комплексы с ионами Mg2+, а цен- тры связывания субстратов многих глико- литических ферментов специфичны к этим комплексам. Большинству гликолитических ферментов для проявления активности тре- буются ионы Mg2+.
14.1 Гликолиз [71] На подготовительной стадии гликолиза расходуется АТР На подготовительной стадии гликолиза расходу- ются две молекулы АТР, а фосфорилированный шестиуглеродный сахар расщепляется на два фосфорилированных трехуглеродных сахара. Понимание того, что интермедиатами гликолиза являются именно фосфорилированные гексозы, было достигнуто не сразу и в некотором смысле случайно. В 1906 г. Артур Гарден и Уильям Янг проверяли свою гипотезу, в соответствии с кото- рой ингибиторы протеолитических ферментов должны стабилизировать ферменты в дрожже- вом экстракте при сбраживании глюкозы. Они добавляли к дрожжевому экстракту сыворотку крови (в которой, как было известно, содержат- ся ингибиторы протеолитических ферментов) и действительно наблюдали усиление метаболиз- ма глюкозы. Однако контрольный эксперимент, целью которого было продемонстрировать от- сутствие стимулирующей активности сыворотки после кипячения, показал, что сыворотка и после кипячения оказывала такое же стимулирующий эффект на гликолиз. Тщательный анализ содер- жимого прокипяченной сыворотки показал, что стимулирующий эффект связан с наличием неор- ганического фосфата. Вскоре Гарден и Янг об- наружили, что глюкоза, добавленная к дрожже- вому экстракту, превращалась в гексозобисфос- фат (эфир Гардена-Янга, идентифицированный впоследствии как фруктозо-1,6-бисфосфат). Это открытие дало начало длительной серии исследо- ваний, посвященных изучению функций органи- ческих эфиров фосфорной кислоты в биохимии, в результате которых сложились наши современ- ные представления о центральной роли переноса фосфорильных групп. Артур Гарден, 1865-1940 Уильям Янг, 1878-1942 ® Фосфорилирование глюкозы. В первой реак- ции гликолиза происходит активация глюкозы путем ее фосфорилирования по атому С-6, в ре- зультате чего образуется глюкозо-6-фосфат; до- нором фосфорильной группы является АТР: н ОН н он Глюкоза Глюкозо-6-фосфат AG'° = -16,7 кДж/моль Эта необратимая во внутриклеточных условиях реакция катализируется гексокиназой. Вспомните, что киназами называют ферменты, катализирую- щие перенос концевой фосфорильной группы от АТР на нуклеофильную акцепторную молекулу (см. рис. 13-20). Киназы относятся к классу фермен- тов трансфераз (см. табл. 6-3). В случае гексокиназы акцептором выступает гексоза (обычно D-глюкоза, хотя в некоторых тканях гексокиназы катализиру- ют также фосфорилирование других распростра- ненных гексоз, таких как D-фруктоза и D-манноза). Как и многим другим ферментам, гексокина- зе для проявления активности необходимы ионы Mg2+, поскольку на самом деле субстратом дан- ного фермента выступает не АТР4-, а комплекс MgATP2- (см. рис. 13-2). Ионы Mg2+ экранируют отрицательные заряды фосфорильных групп АТР, в результате чего концевой атом фосфора стано- вится более доступным для нуклеофильной атаки -ОН-группой глюкозы. При связывании глюкозы молекула гексокиназы претерпевает значительные изменения (индуцированное соответствие), а при связывании АТР два домена белка сближаются на ~8 А (см. рис. 6-22, т. 1). В результате такого сме- щения связанная молекула АТР приближается к связанной молекуле глюкозы, что предотвращает проникновение окружающей воды. В противном случае вода могла бы попадать в активный центр и атаковать (гидролизовать) фосфоангидридные связи АТР. Подобно девяти другим ферментам гликолиза, гексокиназа представляет собой рас- творимый белок, находящийся в цитозоле. Гексокиназа есть почти у всех организмов. В геноме человека закодированы четыре гексоки- назы (I—IV), и все они катализируют одну и ту же реакцию. Ферменты, катализирующие одну и
[72] Часть II. 14. Гликолиз, глюконеогенез и пентозофосфатный путь ту же реакцию, но кодируемые разными генами, называют изоферментами (см. доп. 15-2). Одна из форм, присутствующая в гепатоцитах, гексо- киназа IV (она же глюкокиназа) отличается от всех других форм гексокиназы своими кинети- ческими и регуляторными свойствами, что имеет важное физиологическое значение (см. разд. 15.3). ® Превращение глюкозо-6-фосфата во фрук- тозо-6-фосфат. Фермент фосфоглюкоизомераза (глюкозофосфатизомераза) катализирует об- ратимую изомеризацию альдозы глюкозо-6- фосфата и кетозы фруктозо-6-фосфата: Глюкозо-6-фосфат Mg2+ фосфогексозо- изомераза Фруктозо-6-фосфат AG'° = 1,7 кДж/моль Механизм этой реакции включа- ет образование промежуточного ендиола (рис. 14-4). Реакция легко протекает в обоих направлениях, что связано с небольшим измене- нием свободной энергии. Изомеризация играет принципиальную роль для всего процесса глико- лиза, поскольку перегруппировки карбонильной и гидроксильной групп у атомов С-1 и С-2 необходимы для протекания двух следующих ре- акций. Для реакции фосфорилирования (реак- ция @) требуется, чтобы у атома С-1 появилась спиртовая группа, а для расщепления связи между атомами С-3 и С-4 (реакция @) важно, чтобы у атома С-2 находилась карбонильная группа (с. 22). ® Фосфорилирование фруктозо-6-фосфата до фруктозо-1,6-бисфосфата. Во второй из двух «пусковых» реакций гликолиза фосфоф- руктокиназа-1 (PFK-1) катализирует перенос фосфорильной группы АТР на фруктозо-6- замыкание и раскрытие кольца Фруктозо-6- фосфат Н НО 6СН2ОРО|~ , „ ХСН2ОН 2 ОН он н НО3СН I Н4СОН I Н5СОН I носн I неон I неон I СН2ОРО^ г^с-Ендиол Фосфо- глюко- изомераза н+ А. Перенос протона приводит к образованию ^wc-ендиола Благодаря кислотному гидролизу той же молекулы Glu ускоряется образование фруктозо-6-фосфата 6СН2ОРО^“ раскрытие и замыкание кольца В: Н—С—ОН I 0=0 I носн I неон I неон СН2ОРО|“ 5 Рис. 14-4. МЕХАНИЗМ РЕАКЦИИ. Реакция, катализируемая фосфоглюкоизомеразой. В раскрытии и замыкании кольца (стадии Фи®) принимает участие остаток His активного центра (для простоты здесь не показан). Протон (выделен розовым цветом), исходно на- ходящийся у атома С-2, становится более подвижным благодаря смещению электронов к карбонильному кислороду и кислороду соседней гидроксильной группы. После переноса протона от атома С-2 на остаток Glu (слабая кислота) в активном центре он свободно обме- нивается на протоны из раствора, так что вовсе не обязательно, что на стадии ® к атому С-1 присоединяется тот же самый протон. S Механизм действия фосфоглюкоизомеразы
14.1 Гликолиз [73] СН2ОРО|“ Л фосфат, в результате чего образуется фруктозо- 1,6-бисфосфат: СН2—ОН АТР АРР ^2 _____УМ?У______> ОН фосфофруктокиназа-1 (PFK-1) Фруктозо-6-фосфат opQ2_ х 2 0 3 СН2-ОРОГ ---------------* 5\б НО/2 он н Фруктозо-1,6-бисфосфат 5 н но Н\1_ у он н AG'° = -14,2 кДж/моль КЛЮЧЕВЫЕ ДОГОВОРЕННОСТИ. Соединения, имеющие в своем составе две фосфатные или фосфорильные группы, присоединенные к разным участкам моле- кулы, называют бисфосфатами (или бисфосфо-со- единениями); например, фруктозо-1,6-бисфосфат и 1,3-бисфосфоглицерат. Соединения с двумя соеди- ненными между собой фосфатными группами, как в пирофосфорильной группе, называют дифосфата- ми] например, аденозиндифосфат ADP. Те же пра- вила используются и в номенклатуре соединений с тремя фосфатными группами: различают трисфос- фоты (например, инозит-1,4,5-трисфосфат) и три- фосфаты (например, аденозинтрифосфат АТР). Фермент, который превращает фруктозу во фруктозо-1,6-бисфосфат, называется PFK-1, чтобы отличить его от PFK-2 — фермента, ко- торый катализирует в другом метаболическом пути образование фруктозо-2,6-бисфосфата из фруктозо-6-фосфата. Во внутриклеточных усло- виях реакция, катализируемая PFK-1, необратима; это первый «контрольный пункт» гликолиза. Глю- козо-6-фосфат и фруктозо-6-фосфат могут претер- певать и другие превращения, однако фруктозо-1,6- бисфосфат задействован лишь в гликолизе. Фосфофруктокиназы некоторых бактерий, простейших, а также, по-видимому, всех рас- тений в качестве донора фосфатной группы для синтеза фруктозо-1,6-бисфосфата используют пирофосфат РРЬ а не АТР: Mg2+ Фруктозо-6-фосфат + PPi фруктозо-1,6-бисфосфат + Pj AG'° = -14 кДж/моль Фосфофруктокиназа-1 — один из фермен- тов со сложной аллостерической регуляцией. Его активность возрастает всякий раз, когда в клетке уменьшаются запасы АТР или начина- ют накапливаться продукты его распада — ADP и особенно АМР. Напротив, фермент ингиби- руется, когда в клетке оказывается достаточное количество АТР, а также других топливных мо- лекул, например жирных кислот. У некоторых организмов фруктозо-2,6-бисфосфат (не путайте с фруктозо-1,6-бисфосфатом, образующимся при действии PFK-1) является мощным аллостери- ческим активатором PFK-1. Рибулозо-5-фосфат, промежуточное соединение пентозофосфатного пути, который обсуждается ниже в данной главе, также косвенным путем активирует фосфофрук- токиназу. Более подробно разные уровни регуля- ции этой стадии гликолиза обсуждаются в гл. 15. @ Расщепление фруктозо-1,6-бисфосфата. Фермент фруктозодифосфатальдолаза, кото- рый часто называют просто альдолазой, катали- зирует обратимую реакцию альдольной конден- сации (см. рис. 13-4). Фруктозо-1,6-бисфосфат расщепляется с образованием двух триозофос- фатов — альдозы глицеральдегид-3-фосфата и кетозы дигидроксиацетонфосфата: 6 1 СН2ОРО|“ СН2ОРО|“ он н Фруктозо-1,6-бисфосфат (1)СН2ОРО (2)С=О I (3)СН2ОН °ч/н (4)С I (6) снон (6)СН2ОРОГ Дигидроксиацетон- Глицеральдегид- фосфат 3-фосфат AG'° = 23,8 кДж/моль Существует два класса альдолаз. Альдола- зы I, обнаруженные в клетках растений и жи- вотных, действуют в соответствии с механиз- мом, изображенным на рис. 14-5. Ферменты класса II, присутствующие в грибах и бактери- ях, не образуют основания Шиффа в качестве промежуточного соединения. Ион цинка в ак- тивном центре этих ферментов координирован
[74] Часть II. 14. Гликолиз, глюконеогенез и пентозофосфатный путь с карбонильным кислородом у атома С-2; Zn2+ поляризует карбонильную группу и стабилизи- рует енольное производное, образующееся при расщеплении связи С-С. Хотя реакция расщепления фруктозо-1,6- бисфосфата характеризуется положительным изменением стандартной свободной энергии, при низких внутриклеточных концентрациях реагирующих веществ реальное изменение сво- бодной энергии невелико, поэтому альдолазная реакция может протекать в обоих направле- ниях. Далее мы увидим, что в глюконеогенезе альдолаза катализирует обратную реакцию (см. рис. 14-16). ® Взаимопревращения триозофосфатов. В по- следующих стадиях гликолиза непосредственное участие может принимать лишь один из двух три- озофосфатов, образованных альдолазой, а имен- но, глицеральдегид-3-фосфат. Другой продукт - СН2ОРОГ 0 СН2ОРО| но н н но он Фруктозо-1,6- оисфосфат Замыкание и раскрытие кольца Протонированное основание Шиффа н ЧЖгОРОГ Lys—А— “ I НО3СН .1 „ Н4С—о—н -в: J НБСОН 6СН2ОРОз“ :В— н+ Lys в активном центре атакует карбонильную группу субстрата, что приводит к образованию сн2оро?~ Н | —N+-^C—О—Н :А— I—I н носн :в_ \ НС—о—н ~В:' | неон СН2ОРО|“ Н2О СН2ОРОГ Lys-N+=C :А- Альдолаза промежуточного соединения После перегруппировки на ферменте образуется протонированное основание Шиффа, а делокализация электронов ускоряет последующие стадии НС^О^-Н —вн неон СН2ОРОз Дигидроксиацетонфосфат Глицеральдегид-3- фосфат Фермент возвращается в исходное состояние, получая протон из СН2ОРО|“ с=о I СН2ОН выделение второго продукта Гидролиз основания Шиффа — процесс, обратный его образованию Протонированное основание Шиффа I неон Разрыв связи С-С (реакция, обратная альдольной конденсации) приводит к первому продукту СН2ОРОз“ Фермент образует ковалентную связь с енамином Рис. 14-5. МЕХАНИЗМ РЕАКЦИИ. Реакция, катализируемая альдолазой I. Здесь изображе- на реакция, обратная альдольной конденсации. Обратите внимание, что расщепление связи между С-3 и С-4 зависит от наличия карбонильной группы у атома С-2. А и В — аминокислот- ные остатки, действующие как кислота (А) и основание (В).
14.1 Гликолиз [75] Фруктозо-1,6-бисфосфат Номера атомов углерода в глюкозе 1 2 3 хсн2-о—© 2С=О но—с—н н—с—он н—с—он 6сн2—о—(р) Номера а атомов альдолаза углерода 1 в глюкозе СН2—о—(р/н— С=О 4 С=О н—с—ОН 5 СН2ОН СН2— О—(Р) 6 Дигидрокси- ацетонфосфат триозофосфатизомераза Глицеральдегид- 3-фосфат Номера атомов углерода в глюкозе 4 или 3 н С=О D-Глицеральдегид- 5 или 2 Н—С—ОН 3-ФосФат 6 или 1 3СН2—О—(Р) Последующие реакции гликолиза б Рис. 14-6. Судьба атомов углерода при превращении глюкозы в глицеральдегид-3-фосфат. а — происхождение атомов углерода у двух трехуглеродных продуктов в реакциях, катали- зируемых альдолазой и триозофосфатизомеразой. Конечный продукт этих двух реакций — глицеральдегид-3-фосфат (2 молекулы), б — в молекуле глицеральдегид-3-фосфата атомы углерода происходят из одного из двух определенных атомов углерода молекулы глюкозы. Заметьте, что нумерация атомов глицеральдегид-3-фосфата отличается от нумерации угле- родной цепочки в глюкозе, из которой он образован. В молекуле глицеральдегид-3-фосфата углерод наиболее сложной функциональной группы (карбонильной группы) имеет первый номер, С-1. Подобное изменение нумерации важно учитывать при интерпретации резуль- татов экспериментов с глюкозой, несущей один меченный изотопной меткой углерод (см. в конце главы задачи 3 и 5). дигидроксиацетонфосфат — быстро и обратимо превращается в глицеральдегид-3-фосфат под действием пятого фермента гликолиза триозо- фосфатизомеразы: сн2он с=о '' । триозофосфат- СН2ОРОд“ изомераза Дигидрокси- ацетонфосфат Оч Н V I неон СН2ОРО|- Глицеральдегид- 3-фосфат AG'° = 7,5 кДж/моль Механизм этой реакции аналогичен механизму катализируемой фосфоглюкоизомеразой реак- ции @ (рис. 14-4). После действия триозофосфат - изомеразы в исходной молекуле глюкозы атомы С-1, С-2 и С-3 химически неразличимы от атомов С-4, С-5 и С-6 соответственно (рис. 14-6) — обе «половинки» молекулы глюкозы превращаются в глицеральдегид-3-фосфат. Этой реакцией завершается подготови- тельная стадия гликолиза: фосфорилирова- ние молекулы гексозы по положениям 1 и 6 и ее расщепление с образованием двух молекул глицеральдегид-3-фосфата. На второй стадии гликолиза образуются АТР и NADH Вторая (возвратная) стадия гликолиза (стадия «выплаты процентов»; рис. 14-2, б) включает ре- акции фосфорилирования, в ходе которых часть свободной энергии из исходной молекулы глю- козы запасается в форме АТР. Выше мы показали,
[76] Часть II. 14. Гликолиз, глюконеогенез и пентозофосфатный путь что из одной молекулы глюкозы получаются две молекулы глицеральдегид-3-фосфата, которые претерпевают дальнейшие превращения на вто- рой стадии гликолиза. Превращение двух молекул глицеральдегид-3-фосфата в две молекулы пиру- вата сопровождается образованием четырех моле- кул АТР из ADP. Однако в расчете на одну моле- кулу глюкозы суммарный выход АТР составляет лишь две молекулы, поскольку две молекулы АТР были израсходованы на подготовительной стадии гликолиза для фосфорилирования двух концевых углеродов молекулы гексозы. ® Окисление глицеральдегид-3-фосфата до 1,3-бисфосфоглицерата. Первая реакция на второй стадии гликолиза — окисление глицеральдегид-3-фосфата до 1,3-бисфосфогли- церата, катализируемое глицеральдегидфосфат- дегидрогеназой: НСОН + НО—Р—0“ СН2О₽оГ О" NAD+ NADH + Н+ глицеральдегид- фосфатдегидрогеназа Глицеральдегид- Неорганический 3-фосфат фосфат НСОН СН2ОРОз В ходе реакции глицеральдегид-3-фосфат остается ковалентно связанным с ферментом (рис. 14-7). Альдегидная группа глицеральдегид- 3-фосфата реагирует с -SH-группой остатка Cys в активном центре фермента; эта реакция напо- минает образование полуацеталя (см. рис. 7-5), но в данном случае образуется тио полуацеталь. Взаимодействие остатка Cys, играющего важную роль в катализе, с ионами тяжелых металлов, та- кими как Hg+, приводит к необратимому ингиби- рованию фермента. Количество NAD+ в клетке (< 10-5 М) зна- чительно меньше количества глюкозы, метабо- лизируемой за несколько минут. Если бы об- разующийся на этой стадии гликолиза NADH постоянно не окислялся и не использовался вновь, гликолиз очень скоро остановился бы. О рецикле NAD+ мы поговорим чуть позже. ® Перенос фосфатной группы с 1,3-бисфосфо- глицерата на ADP. Фермент фосфоглицератки- наза катализирует перенос высокоэнергетической фосфатной группы от карбоксильной группы 1,3-бисфосфоглицерата на ADP, в результате чего образуются АТР и 3-фосфоглицерат. НСОН СН2ОРОз | Рибоза |—| Аденин] 1,3-Бисфосфоглицерат ADP 1,3-Бисфосфоглицерат ДО'° = 6,3 кДж/моль Это первая из двух реакций гликолиза, кото- рые ведут к запасанию энергии в виде АТР В результате данной реакции альдегидная груп- па глицеральдегид-3-фосфата окисляется, но образуется не свободная карбоксильная группа, а смешанный ангидрид фосфорной и карбоно- вой кислот. Ангидрид такого типа, называемый ацилфосфатом, характеризуется очень высо- кой стандартной свободной энергией гидролиза (AG'° = -49,3 кДж/моль; см. рис. 13-4, табл. 13-6). В ацилфосфатной группе у атома С-1 в 1,3-бис- фосфоглицерате сохраняется большая часть энергии от окисления альдегидной группы глицеральдегид-3-фосфата. Mg2" I НСОН СН2ОРОз фосфо- глицераткиназа 3- Фосфоглицерат | Рибоза |—| Аденин | AG'° = -18,5 кДж/моль
14.1 Гликолиз [77] NAD+ Глицеральдегид- $ 3-фосфатдегидро- । геназа Cys Глицеральдегид - 3-фосфат Образование фермент- субстратного комплекса. При связывании NAD+ в активном центре рХа Cys понижается с 8 до 5,5 — образуется более активная тиолатная форма СН2ОРО|“ NAD+ НСОН Cys Между субстратом и S -группой остатка Cys образуется ковалентная тиополуацетальная связь СН2ОРО|- нсон i=o ipoj- Ковалентная тиоэфирная связь между ферментом и субстратом подвергается фосфоролизу (ее атакует Рр, высвобождается второй продукт — 1,3-бисфосфоглицерат NADK СН2ОРО|- \нсон I Cys 1,3-Бисфосфоглицерат Образовавшийся NADH покидает Cys активный центр и заменяется Cys новой молекулой NAD+ Рис. 14-7. МЕХАНИЗМ РЕАКЦИИ. Реакция, катализируемая глицеральдегид-3-фосфатде- гидрогеназой. Фермент-субстратный комплекс окисляется по активному центру молекулой NAD+ Обратите внимание, что название фермента фос- фоглицераткиназы соответствует обратной ре- акции, когда фосфорильная группа переносится с АТР на 3-фосфоглицерат. Как и все ферменты, фосфоглицераткиназа катализирует реакцию в обоих направлениях. В соответствии со своим названием данный фермент действует в реакци- ях глюконеогенеза (см. рис. 14-16) и фотосинте- тической ассимиляции СО2 (см. рис. 20-4). При гликолизе катализируемая этим ферментом ре- акция протекает в направлении синтеза АТР, как указано выше. Реакции гликолиза ® и ® сопряжены друг с другом, поскольку имеют общий промежуточ- ный продукт 1,3-бисфосфоглицерат, образую- щийся в первой (эндергонической) реакции и отдающий свою ацилфосфатную группу АТР во второй (экзергонической) реакции. Суммарное уравнение этих двух реакций выглядит следую- щим образом: Глицеральдегид-З-фосфат + ADP + Pj + NAD+ 3-фосфоглицерат + АТР + NADH + Н+ А (7° = -12,5 кДж/моль Таким образом, суммарная реакция характери- зуется отрицательным изменением стандартной свободной энергии. Как обсуждалось в гл. 13, реальное измене- ние свободной энергии AG зависит от изменения стандартной свободной энергии Л<7° и отноше- ния действующих масс Q — отношение произве- дения концентраций продуктов к произведению
[78] Часть II. 14. Гликолиз, глюконеогенез и пентозофосфатный путь концентраций реагирующих веществ (см. уравне- ние 13-4). Для реакции ® можно записать: AG = AG'° + /?rlnQ = А(7° RTI ,3-бисфосфоглицерат] [NADH] [глицеральдегид-3-фосфат] [PJ [NAD+] Обратите внимание, что [Н+] не входит в пара- метр Q, поскольку при биохимических расчетах Фосфоглицератмутаза Происходит перенос фосфатной группы с His в активном центре наС-2(ОН) субстрата. Второй His активного центра участвует в основном катализе. “ООС Н—С—о—ро|- Н2С—отроГ 2,3-Бисфосфогли- \ церат (2,3-БФГ) HN :N. I H [Н+] считают постоянной величиной (10-7 М) и включают в AG'° (с. 15). Если Q < 1, то In Q < 0. Потребление про- дукта реакции ® (1,3-бисфосфоглицерата) в ре- акции ® приводит к тому, что в стационарном состоянии концентрация 1,3-бисфосоглицерата довольно низкая, следовательно, для всего про- цесса с сопряжением энергии Q — малая вели- чина. Тогда множитель InQ имеет знак минус, а изменение свободной энергии (AG) — большая отрицательная величина. Таким образом, мы еще одним способом показали, как происходит сопряжение реакций @ и ®, имеющих общее промежуточное соединение. Конечным результатом этих двух сопря- женных реакций, обратимых в условиях клетки, является то, что энергия, высвобождаемая при окислении альдегидной группы до карбоксиль- ной, запасается в ходе сопряженного образования АТР из ADP и Р? Синтез АТР в результате пере- носа фосфорильной группы от субстрата 1,3-бис- фосфоглицерата называют фосфорилировани- ем на уровне субстрата в отличие от механизма окислительного фосфорилирования. В фосфо- рилировании на уровне субстрата принимают участие растворимые ферменты и химические интермедиаты (в нашем случае 1,3-бисфосфогли- церат), тогда как окислительное фосфорилиро- вание связано с переносом протонов через мем- брану с участием мембраносвязанных ферментов (гл. 19). ООС Н—с—о—РО|" Фосфатная группа переносится с С-3 субстрата на первый His активного центра. Вторая молекула His участвует в кислотном катализе. His 2’0sP-nCn н Н2С—О—Н 2 - Фосфоглицерат HN His ® Превращение 3-фосфоглицерата в 2-фосфо- глицерат. Фермент фосфоглицератмутаза ка- тализирует обратимый перенос фосфорильной группы между атомами С-2 и С-3 в молекуле гли- церата; важную роль в данной реакции играют ионы Mg2+: °ч/0- с I НС—он СН2—О—POj З-Фосфоглицерат очА Mg2* С фосфо- НС—О—РО-з“ цератмутаза | сн2—ОН 2-Фосфоглицерат AG'°= 4,4 кДж/моль 2 Рис. 14-8. Реакция, катализируемая фосфоглицерат- мутазой. Реакция протекает в две стадии (рис. 14-8). Сначала фосфорильная группа, связанная с остатком His в молекуле фермента, перено-
14.1 Гликолиз [79] сится на гидроксильную группу у атома С-2 3-фосфоглицерата, в результате чего образу- ется 2,3-бисфосфоглицерат (2,3-БФГ). За- тем фосфатная группа у атома С-3 2,3-БФГ переносится на тот же остаток His, образуется 2-фосфоглицерат и высвобождается фосфо- рилированный фермент. Фосфоглицератмута- за фосфорилирована — фосфатная группа от 2,3-БФГ; для начала каталитического цикла не- обходимо небольшое количество последнего, поэтому 2,3-БФГ постоянно возобновляется в ходе реакции. ® Дегидратация 2-фосфоглицерата с образо- ванием фосфоенолпирувата. Это вторая реак- ция гликолиза, в которой образуется соедине- ние, способное активно участвовать в переносе фосфорильной группы (первая — реакция ©). Фермент енолаза катализирует обратимое уда- ление молекулы воды от 2-фосоглицерата, что приводит к образованию фосфоенолпирувата (ФЕП): пируваткиназы, для активности которой необхо- димо присутствие К+, а также Mg2+ или Мп2+: С—О—Р—О- сн2 0“ Фосфоенолпируват Mg2-", к °%/0’ с с=о СНз Пируват Y’ Н—С—ОРО|- но—сн2 V С—ОРО|- II сн2 2 - Фосфоглицерат Фосфоенолпируват ADP пируваткиназа СГ О—Р=0 АТР ДСг'° = -31,4 кДж/моль В данной реакции фосфорилирования на уровне субстрата продукт реакции (пируват) сначала по- является в енольной форме, а затем подвергается быстрой неферментативной таутомеризации, пре- вращаясь в кетоформу преобладающую при pH 7: с О Д(7,О=7,5 кДж/моль Механизм реакции, катализируемой енолазой, включает образование енольного интермеди- ата, который стабилизируется ионами Mg2+ (рис. 6-23). Несмотря на сравнительно неболь- шое изменение стандартной свободной энергии в данной реакции, AG гидролиза фосфорильных групп исходного вещества и гидролиза продук- та существенно различаются: -17,6 кДж/моль для 2-фосфоглицерата (низкоэнергетический эфир фосфорной кислоты) и -61,9 кДж/моль для фосфоенолпирувата (высокоэнергетическое фосфорилированное соединение) (см. рис. 13-3, табл. 13-6). ® Перенос фосфорильной группы от фосфо- енолпирувата на ADP. Последняя стадия гли- колиза состоит в переносе фосфорильной груп- пы с фосфоенолпирувата на ADP под действием I с—он —. тауто- сн2 меризация Пируват (енольная форма) I с=о I СНз Пируват (кетоформа) Суммарная реакция характеризуется боль- шим отрицательным значением изменения стан- дартной свободной энергии, что в значительной степени связано с самопроизвольным превраще- нием енольной формы пирувата в кетоформу (см. рис. 13-3). Для реакции гидролиза фосфоенолпи- рувата AG'° = -61,9 кДж/моль. Почти половина этой энергии запасается в фосфоангидридной связи молекулы АТР (-30,5 кДж/моль), а другая часть (-31,4 кДж/моль) выступает движущей си- лой, смещающей равновесие реакции в сторону образования АТР. Во внутриклеточных условиях реакция, катализируемая пируваткиназой, прак- тически необратима и выполняет важную роль в регуляции (см. гл. 15).
[80] Часть II. 14. Гликолиз, глюконеогенез и пентозофосфатный путь Выигрыш в АТР заметен при составлении полного баланса гликолиза Составим полный материальный баланс гликолиза. При этом надо учесть следующее: 1) превращения углеродного скелета глюкозы; 2) расход Pf и ADP и выход АТР; 3) пути переноса электронов в окисли- тельно-восстановительных реакциях. В левой ча- сти уравнения запишем все вещества, расходуемые в процессе гликолиза, а именно АТР, NAD+, ADP и Pi (см. рис. 14-2), а в правой части — все продукты гликолиза (помните, что из каждой молекулы глю- козы образуется две молекулы пирувата). Глюкоза + 2 АТР + 2 NAD+ + 4 ADP + 2 2пируват + 2 ADP + 2NADH + 2H+ + 4ATP + 2H2O Вычитая из левой и правой части уравнения оди- наковые слагаемые, получаем общее уравнение гликолиза в аэробных условиях: Глюкоза + 2 NAD+ + 2 ADP + 2 2 пируват + 2 NADH + 2 Н+ + 2 АТР + 2 Н2О Две молекулы NADH, образующиеся в цито- золе в процессе гликолиза, в аэробных условиях вновь окисляются до NAD+ путем переноса своих электронов по электронтранспортной цепи, что в эукариотических клетках происходит в митохон- дриях. По электронтранспортной цепи электроны направляются к месту назначения — молекуле О2: 2 NADH + 2 Н+ + О2 2 NAD+ + 2 Н2О Перенос электронов от NADH на О2 в митохон- дриях обеспечивает энергию, необходимую для синтеза АТР путем окислительного фосфорили- рования (гл. 19). Итак, при гликолизе из одной молекулы глю- козы образуются две молекулы пирувата (путь превращения углерода). Две молекулы ADP и две молекулы Pi превращаются в две молекулы АТР (путь превращения фосфорильных групп). Четы- ре электрона в виде двух гидрид-ионов переносят- ся от двух молекул глицеральдегид-3-фосфата на две молекулы NAD+ (путь переноса электронов). Гликолиз находится под строгим контролем При изучении сбраживания глюкозы дрожжами Луи Пастер обнаружил, что скорость потребления глюкозы и общее количество потребляемой глюко- зы в анаэробных условиях во много раз выше, чем в аэробных. Позже исследования на мышечной ткани выявили столь же значительное различие в скоро- стях анаэробного и аэробного гликолиза. Сегодня биохимические причины «эффекта Пастера» по- нятны. Выход АТР при гликолизе в анаэробных ус- ловиях (2 молекулы на молекулу глюкозы) гораздо ниже, чем при полном окислении глюкозы до СО2 в аэробных условиях (30 или 32 молекулы АТР на мо- лекулу глюкозы; см. табл. 19-5). Таким образом, для образования одного и того же количества АТР в ана- эробном процессе должно расщепляться примерно в 15 раз больше глюкозы, чем в аэробном. Количество глюкозы, распадающейся в про- цессе гликолиза, регулируется так, чтобы под- держивать примерно постоянный уровень (кон- центрацию) АТР (и интермедиатов гликолиза, участвующих в биосинтезе). Необходимый кон- троль скорости гликолиза достигается благодаря сложной взаимосвязи между расходованием АТР, регенерацией NADH, аллостерической регуляци- ей некоторых гликолитических ферментов (в том числе гексокиназы PFK-1 и пируваткиназы); кон- центрации ключевых метаболитов испытывают ежесекундные колебания при поддержании вну- триклеточного баланса потребления и образова- ния АТР. В несколько более длительном времен- ном диапазоне гликолиз регулируется с помощью гормонов (глюкагона, адреналина и инсулина), а также путем изменения экспрессии генов некото- рых гликолитических ферментов. Особый интерес представляет аномальная регуляция гликолиза при злокачественных новообразованиях. Немецкий биохимик Отто Варбург в 1928 г. обратил внимание на то, что почти во всех опухолевых тканях гли- колиз происходит с более высокими скоростями, чем в нормальных тканях, даже при достаточном количестве кислорода. Это наблюдение положено в основу некоторых методов диагностирования и лечения онкологических заболеваниях (доп. 14-1).
14.1 Гликолиз [81] Дополнение 14-1 : МЕДИЦИНА Высокая скорость гликолиза в опухолевых тканях лежит в основе методов химиотерапии при некоторых онкологических заболеваниях и облегчает постановку диагноза Во многих типах опухолей у человека и животных по- требление глюкозы и гликолиз происходят прибли- зительно в 10 раз быстрее, чем в нормальных тканях. Большинство опухолевых клеток существует в усло- виях гипоксии (т. е. при недостаточном содержании кислорода), поскольку в начале развития опухоли капиллярная сеть недостаточно развита и не может доставлять необходимое количество кислорода. В опу- холевых клетках, расположенных на расстоянии более 100-200 мкм от ближайшего капилляра, образование АТР полностью зависит от гликолиза (без последу- ющего окисления пирувата). Энергетический выход (две молекулы АТР на молекулу глюкозы) значитель- но ниже того, что можно получить при полном окис- лении пирувата до СО2 в митохондриях (~30 молекул АТР на молекулу глюкозы; см. гл. 19). Чтобы получить такое же количество АТР, опухолевые клетки вынуж- дены потреблять больше глюкозы, чем нормальные клетки, превращая ее в пируват, а затем в лактат с ре- циклом NADH. Возможно, в начале трансформации нормальных клеток в опухолевые, во-первых, произ- водство АТР переходит на зависимость от гликолиза и, во-вторых, во внеклеточной жидкости развивается толерантность к низким pH (что обусловлено образо- ванием молочной кислоты — конечного продукта гли- колиза). Обычно чем агрессивнее опухоль, тем выше в ней скорость гликолиза. Эта активизация гликолиза в какой-то степени достигается благодаря увеличению продукции глико- литических ферментов и мембранных переносчиков Рис. 1. При анаэробном метаболизме глюкозы в опухоле- вых клетках образуется значительно меньше АТР (две мо- лекулы АТР на молекулу глюкозы), чем при полном окис- лении до С02, которое происходит в здоровых клетках в аэробных условиях (~30 молекул АТР на молекулу глю- козы). В результате опухолевые клетки вынуждены по- треблять существенно больше глюкозы, чтобы получить то же количество АТР. В опухолевых тканях наблюдается значительная активация синтеза переносчиков глюкозы и гликолитических ферментов. Вещества, ингибирую- щие гексокиназу, глюкозо-б-фосфат-дегидрогеназу или транскетолазу, блокируют производство АТР в ходе гли- колиза и в результате убивают раковые клетки, лишая их необходимой энергии. GLUT 1 и GLUT3 (см. табл. 11 -3), переносящих глюкозу внутрь клетки. (Вспомните, что GLUT 1 и GLUT3 не за- висят от инсулина.) Индуцируемый гипоксией транс- крипционный фактор-1 (hypoxia-inducible transcription factor, HIF-1) представляет собой белок, который дей- ствует на уровне синтеза мРНК, стимулируя произ- водство не менее восьми ферментов гликолиза и пере- носчиков глюкозы при недостатке кислорода (рис. 1). При повышении скорости гликолиза опухолевые клет- ки способны выживать в анаэробных условиях до no- ^GLUTl поступление глюкозы Глюкоза <— 2-Дезоксиглюкоза <— Лонидамин ч— З-Бромпируват 6-аминоникотиновая кислота
[82] Часть II. 14. Гликолиз, глюконеогенез и пентозофосфатный путь Дополнение 14-1 !' МЕДИЦИНА Высокая скорость гликолиза в опухолевых тканях лежит в основе методов химиотерапии при некоторых онкологических заболеваниях и облегчает постановку диагноза (продолжение) явления новых кровеносных сосудов. Еще один белок, индуцируемый HIF-1, это пептидный гормон — фактор роста сосудистого эндотелия VEGF (vascular endothelial growth factor), который стимулирует ускоренный рост кровеносных сосудов (ангиогенез) в опухоли. Кроме того, существуют доказательства того, что опухолевый супрессор р53, который при многих онкологических заболеваниях мутирует (т. 1, с. 670), контролирует синтез и сборку митохондриальных бел- ков, необходимых для передачи электронов молекуле кислорода. В клетках с мутантной формой р53 мито- хондриальный транспорт электронов нарушен, в связи с чем для образования АТР в этих клетках преобладает гликолиз (рис. 1). Высокая зависимость опухолевых клеток от гликолиза по сравнению с нормальными клетками предоставляет возможность для разработки страте- гии противоопухолевой химиотерапии: ингибиторы гликолиза могут находить и уничтожать опухолевые клетки путем ограничения в этих клетках запасов АТР. В настоящий момент известны три эффективных ин- гибитора гексокиназы, которые можно использовать в качестве химиотерапевтических агентов: 2-дезокси- глюкоза, лонидамин и 3-бромпируват. Предотвращая синтез глюкозо-6-фосфата, эти три вещества не толь- ко лишают опухолевые клетки образующегося при гликолизе АТР, но также препятствуют образованию пентозофосфатов в пентозофосфатном пути, который также начинается с глюкозо-6-фосфата. Без пентозо- фосфатов клетки не могут синтезировать важные для синтеза ДНК и РНК нуклеотиды и поэтому не могут расти и делиться. Еще одним противоопухолевым препаратом, уже допущенным к клиническому при- менению, является иматиниб (гливек; см. доп. 12-5). Он ингибирует специфическую тирозинкиназу, пре- дотвращая активацию синтеза гексокиназы, которую обычно стимулирует эта тирозинкиназа. В настоящее время проходит фазу доклинических испытаний в ка- честве противоопухолевого препарата аналог тиамина окситиамин, блокирующий действие фермента транс- кетолазы, которая превращает ксилулозо-5-фосфат в глицеральдегид-3-фосфат (рис. 1). [18Е]2-Фтор-2-дезоксиглюкоза (FdG) [18Е]6-Фосфо-2-фтор-2- дезоксиглюкоза (б-фосфо-FdG) Рис. 2. Гексокиназа фосфорилирует 18Г-меченую 2-фтор-2-дезоксиглюкозу (ФДГ или FdG), образующаяся меченая 6-фосфо-ФДГ проникает в клетки, где ее можно обнаружить по эмиссии позитронов изотопами 18F. Варбурга многие считают самым выдающим- ся биохимиком первой половины XX в. Он внес существенный вклад в развитие многих направ- лений, в том числе известны его исследования в области дыхания, фотосинтеза, энзимологии и промежуточного метаболизма. Начиная с 1930 г. Варбург с коллегами выделили и получили в крис- таллическом виде семь ферментов, участвующих в гликолизе. Этими же учеными создан прибор, который совершил переворот в традиционных методах изучения окислительного метаболизма. С помощью манометра Варбурга можно опреде- лить потребление кислорода в тканях, измеряя изменения объема газа во времени, и по этим дан-
14.1 Гликолиз [83] Высокая скорость гликолиза в опухолевых клет- ках имеет также диагностическое значение. Сравне- ние скоростей захвата глюкозы в различных участках ткани может помочь в локализации опухоли. При по- зитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ) пациен- там вводят неопасный для здоровья меченый аналог глюкозы, который захватывается, но не метаболизи- руется тканями. В качестве такого меченого соедине- ния может использоваться 2-фтор-2-дезоксиглюкоза (ФДГ), в которой гидроксильная группа в положении С-2 глюкозы заменена на 18F (рис. 2). Это соединение захватывается переносчиком GLUT и является хоро- шим субстратом для гексокиназы, но не может пре- Рис. 3. Обнаружение опухолевой ткани методом позитрон- но-эмиссионной томографии (ПЭТ). Взрослому мужчине хирургическим путем удалили первичную опухоль кожи (злокачественную меланому). Слева — изображение, полученное с помощью компьютерной томографии (КТ- сканирование всего тела), видно расположение мягких тканей и костей. В центре — результаты ПЭТ после вве- дения пациенту 18Р-меченой 2-фтор-2-дезоксиглюкозы (ФДГ). Темные пятна соответствуют областям с активным поглощением глюкозы. Как и ожидалось, высокое содер- жание метки наблюдается в области головного мозга и мочевого пузыря. Это связано с тем, что головной мозг является основным потребителем глюкозы в организме, а выведение 18Р-меченой б-фосфо-ФДГ осуществляется с мочой. Если интенсивность свечения метки при ПЭТ- сканировании представить в цветовом изображении (с увеличением интенсивности от зеленого цвета через желтый — к красному) и наложить эту картину на изо- бражение, полученное методом КТ-сканирования, можно обнаружить наличие раковых клеток в верхних отделах позвоночника, в печени и некоторых мышцах (справа) из-за метастазирования первичной злокачественной опухоли. вращаться в ендиольное промежуточное соединение в реакции, катализируемой фосфогексозоизомеразой (см. рис. 14-4) и, следовательно, накапливается в виде 6-фосфо-ФДГ. Степень накопления этого вещества зависит от скорости его захвата и фосфорилирова- ния, которая, как отмечалось ранее, обычно в 10 и более раз выше в опухолевых тканях, чем в здоровых тканях. При радиоактивном распаде 18F образуются позитроны (два на атом 18F), которые можно обнару- жить с помощью серии чувствительных детекторов, расположенных вокруг тела человека, что позволя- ет достаточно точно локализовать зоны накопления 6-фосфо-ФДГ (рис. 3). ным рассчитать концентрацию ферментов с окис- лительной активностью. В лаборатории Эмиля Фишера (Нобелев- ская премия по химии в 1902 г.) Варбург изучал химию углеводов, а сам стал лауреатом Нобелев- ской премии по физиологии и медицине в 1931 г. Ряд учеников и сподвижников Варбурга также были награждены Нобелевской премией, среди них Отто Мейергоф (1922), Ханс Кребс и Фриц Липманн (1953), Хуго Теорелль (1955). В лабо- ратории Мейергофа обучался Липманн и неко- торые другие лауреаты Нобелевской премии: Се- вере Очоа (1959), Андре Львов (1965) и Джордж Уолд (1967).
[84] Часть II. 14. Гликолиз, глюконеогенез и пентозофосфатный путь GLUT4 Глюкоза Пузырьки с 3J GLUT4 сливаются с плазматической мембраной (4) о о о Поступление глюкозы через „ ° GLUT4 Плазматическая мембрана Первичное нарушение Поджелудочная при диабете С1/ железа выделяет ' инсулин IRS Активируется | инсулиновый PI-3K рецептор I -РКВ Гексокиназа фосфорилирует глюкозу Глюкозо-6-фосфат фосфатный путь Рибулозо-5-фосфат 2 АТР Ацетоацетат, /3-гидроксибутират Пируват ~30 АТР t Пируват окисляется в цикле лимонной кислоты Окислительное k фосфорилирование Д в митохондрии г— Жировые капли Жирная Триацил- кислота глицерин Мобилизация триацилглицерина позволяет организму использовать жирные кислоты как z - альтернативное \\ топливо Г) тт СО2 Поток электронов в z Q8J митохондрии обеспечивает синтез АТР Рис. 14-9. Метаболизм углеводов и жиров в адипоцитах при диабете I типа. В норме инсулин инициирует проникновение переносчиков глюкозы GLUT4 в плазматическую мембрану путем слияния содержащих GLUT4 везикул с мембраной, что позволяет осу- ществлять потребление глюкозы из кровотока. При снижении уровня инсулина в крови GLUT4 вновь включается в везикулы путем эндоцитоза. При инсулинозависимом диа- бете (диабете I типа) этот нормальный ход событий нарушается. Отсутствие инсули- на предотвращает потребление глюкозы при помощи GLUT4; в результате клеткам не хватает глюкозы, а в крови ее содержание избыточно. Недостаток глюкозы для произ- водства энергии приводит к тому, что адипоциты начинают расщеплять запасенные в виде жировых капелек триацилглицерины и поставлять образующиеся жирные кислоты другим тканям для выработки АТР в митохондриях. В печени образуются два побоч- ных продукта этого процесса (ацетоацетат и [3-гидроксибутират, см. с. 252), которые накапливаются и выделяются в кровь. Они служат источником энергии для головного мозга, но при этом происходит снижение pH крови, что вызывает кетоацидоз. Та же по- следовательность событий наблюдается и в мышечной ткани, за исключением того, что миоциты не запасают триацилглицерины, а вместо этого используют жирные кислоты, высвобождаемые в кровь адипоцитами.
14.1 Гликолиз [85] Нарушение потребления глюкозы клетками при сахарном диабете I типа О Метаболизм глюкозы у млекопитающих огра- ничен скоростью потребления глюкозы клет- ками и ее фосфорилированием гексокиназой. Транс- порт глюкозы из кровотока осуществляется при участии семейства переносчиков глюкозы GLUT (см. табл. 11-3). Переносчики глюкозы в гепатоци- тах (GLUT1, GLUT2) и нейронах головного мозга (GLUT3) всегда присутствуют в плазматической мембране клеток. Напротив, основной переносчик глюкозы в клетках скелетных мышц, сердечной мышцы и жировой ткани (GLUT4) хранится в не- больших внутриклеточных везикулах и перемеща- ется к плазматической мембране только в ответ на сигнал инсулина (рис. 14-9). Механизм передачи сигнала с помощью инсулина мы обсуждали в гл. 12 (см. рис. 12-16). Таким образом, в скелетных мыш- цах, сердце и жировой ткани захват и метаболизм глюкозы зависят от нормальной выработки инсули- на р-клетками пожелудочной железы в ответ на по- вышение уровня глюкозы крови (см. рис. 23-27). При сахарном диабете I типа (который также называют инсулинозависимым диабетом) слиш- ком мало р-клеток, и поэтому в организме выра- батывается недостаточное количество инсулина для стимуляции потребления глюкозы клетками скелетных и сердечной мышц и клетками жировой ткани. После приема пищи, содержащей углеводы, уровень глюкозы крови повышается до аномально высоких показателей; такое состояние называют гипергликемией. Неспособные усваивать глюкозу мышечные и жировые ткани начинают использо- вать жирные кислоты из запасных триацилглице- ринов. В печени образующийся из этих жирных кислот ацетил-СоА превращается в кетоновые тела (ацетоацетат и р-гидроксибутират), которые пере- носятся в другие ткани и служат в качестве источ- ника энергии (гл. 17). Эти вещества играют осо- бенно важную роль в головном мозге, который при недостатке глюкозы использует кетоновые тела как альтернативное топливо. (Жирные кислоты не мо- гут проникать через гематоэнцефалический барьер и поэтому не могут быть источником энергии для нейронов головного мозга.) Если больного диабетом I типа не ле- чить, избыточное образование ацетоацетата и Р-гидроксибутирата приводит к их накоплению в крови, что сопровождается снижением pH кро- ви и кетоацидозом, несущим угрозу для жизни больного. Инъекции инсулина обращают ход со- бытий: GLUT4 перемещается в плазматическую мембрану гепатоцитов и адипоцитов, глюкоза потребляется клетками и фосфорилируется, уро- вень глюкозы крови снижается, что приводит к уменьшению выработки кетоновых тел. При диабете значительно изменяется ме- таболизм как углеводов, так и жиров. Мы вновь обратимся к этой теме в гл. 23 после обсуждения метаболизма липидов (гл. 17 и 21). Краткое содержание раздела 14.1 ГЛИКОЛИЗ Гликолиз — это практически универсаль- ный процесс, в результате которого молеку- ла глюкозы окисляется с образованием двух молекул пирувата, а энергия накапливается в виде АТР и NADH. Все 10 ферментов гликолиза находятся в ци- тозоле, а все 9 интермедиатов представляют собой фосфорилированные соединения, со- стоящие из шести или трех атомов углерода. На подготовительной стадии гликолиза для превращения глюкозы во фруктозо-1,6- бисфосфат расходуются две молекулы АТР. При разрыве связи между атомами С-3 и С-4 образуются две молекулы триозофосфата. На второй стадии гликолиза каждая молекула глицеральдегид-3-фосфата, образовавшаяся из глюкозы, окисляется по атому С-1. Энергия, высвобождаемая в этой реакции, запасается в форме одной молекулы NADH и двух молекул АТР в пересчете на один окисленный триозо- фосфат. Суммарное уравнение гликолиза: Глюкоза + 2 NAD+ + 2 ADP + 2 2 пируват + 2 NADH + 2 Н+ + 2 АТР + 2 Н2О Гликолиз строго регулируется в соответ- ствии с другими процессами, идущими с вы- игрышем в энергии, что обеспечивает посто- янный уровень АТР. При диабете I типа нарушение потребле- ния глюкозы мышечной и жировой тканью оказывает большое влияние на метаболизм углеводов и жиров.
[86] Часть II. 14. Гликолиз, глюконеогенез и пентозофосфатный путь 14.2. Метаболические пути, питающие гликолиз В гликолизе принимает участие не только глю- коза, но и многие другие углеводы после их превращения в один из интермедиатов глико- лиза. Наиболее важную роль играют запасные полисахариды крахмал и гликоген, дисахариды мальтоза, лактоза, трегалоза и сахароза, а также моносахариды фруктоза, манноза и галактоза (рис. 14-10). Полисахариды и дисахариды пищи разлагаются до моносахаридов Почти у всех людей основным источником угле- водов служит крахмал. Расщепление крахмала начинается уже во рту под действием фермента слюны а-амилазы (рис. 14-10), катализирующей гидролиз внутренних гликозидных связей в мо- лекуле крахмала с образованием более коротких полисахаридных фрагментов или олигосахари- дов. (Обратите внимание, что в данной реакции гидролиза атаку осуществляет не неорганический Трегалоза Лактоза трегалаза сахараза лактаза Сахароза Н ОН D-глюкоза H2q Гликоген, ? поступающий с «---— пищей; крахмал «-амилаза Эндогенный гликоген Н ОН D-галактоза НОСН2 0 н НО ОН н D-фруктоза он АТР | фруктокиназа Фруктозо-1 -фосфат фруктозофосфат- альдолаза СН2ОН гексо- киназа Глюкозо-1- фосфат гексо- киназа UDP-галактоза фосфорилаза ✓ UDP-глюкоза фосфоглюко- мутаза Глюкозо-6- фосфат Фруктозо-6- фосфат 4 Глицеральдегид + Дигидроксиацетон- фосфат триозокиназа i триозофосфат- АТР\ \ изомераза Фруктозо-1,6- бисфосфат Н Н D-манноза АТР / гексокиназа Маннозо-6-фосфат фосфоманнозо- изомераза Глицеральдегид-3 - фосфат Рис. 14-Ю. Включение гликогена, крахмала, дисахаридов и гексоз пищи в подготови- тельную стадию гликолиза.
14.2 Метаболические пути, питающие гликолиз [87] фосфат, а молекула воды.) В желудке из-за низко- го значения pH а-амилаза слюны инактивирует- ся, но далее начинает работать другая а-амилаза, секретируемая поджелудочной железой в тонкий кишечник. В результате действия панкреатиче- ской а-амилазы образуются в основном мальто- за и мальтотриоза (ди- и трисахариды глюкозы с al—>4-связями), а также так называемые лимит - декстрины, представляющие собой фрагменты амилопектина со связями al ^6 в точках ветвле- ния. Мальтоза и декстрины далее разлагаются на щеточной кайме кишечника (на микроскопиче- ских выростах кишечного эпителия, благодаря которым площадь поверхности кишечника зна- чительно увеличивается). Структура пищевого гликогена во многом похожа на крахмал, и его расщепление идет по тому же пути. Эндогенные гликоген и крахмал разлагаются в результате фосфоролиза Гликоген, запасаемый в тканях животных (в основном в печени и скелетных мышцах) и в клетках микроорганизмов, а также крахмал в рас- тениях могут использоваться самими клетками после осуществления реакции фосфоролиза, ка- тализируемой гликогенфосфорилазой (у расте- ний — фосфорилазой крахмала). Эти ферменты катализируют атаку неорганическим фосфатом гликозидной связи (al—>4), соединяющей два концевых остатка глюкозы на невосстанавливаю- щем конце, в результате чего образуется глюкозо- 1-фосфат и укороченный на одну глюкозную единицу полимер (рис. 14-11). Часть энергии, вы- свобождающейся при фосфоролизе гликозидной связи, запасается в форме эфира фосфорной кис- лоты глюкозо-1-фосфата. Гликогенфосфорилаза (или фосфорилаза крахмала) действует много- кратно до тех пор, пока не достигнет участка вет- вления с конфигурацией (al ^6) (см. рис. 7-15), где ее действие прекращается. Для удаления раз- ветвления необходим специальный фермент. Ме- ханизм и контроль расщепления гликогена под- робнее обсуждаются в гл. 15. Глюкозо-1-фосфат, образующийся под дей- ствием гликогенфосфорилазы, превращается в глюкозо-6-фосфат по обратимой реакции, ката- лизируемой фосфоглюкомутазой: Глюкозо-1-фосфат глюкозо-6-фосфат Невосстанавливающий конец Гликоген (крахмал), п глюкозных звеньев гликогенфосфорилаза \ (фосфорилаза крахмала) 0“ I 0=Р—0“ I он Глюкозо-1 -фосфат Гликоген (крахмал), (гг-1) глюкозных звеньев Рис. 14-11. Расщепление внутриклеточного гликогена гликогенфосфорилазой. Этот фермент катализирует взаимодействие неорганического фосфата (выделен ро- зовым цветом) с концевым остатком глюкозы (голубой) на невосстанавливающем конце гликогена, в результате чего образуется глюкозо-1-фосфат и укороченный на одно звено гликоген. Здесь происходит не гидролиз, а фосфоролиз. Фосфоглюкомутаза действует практически по тому же механизму, что и фосфоглицератмута- за (с. 78). Общее название мутаза применяют к ферментам, катализирующим перенос функци- ональных групп из одного положения в другое внутри одной молекулы. Мутазы относятся к более широкому классу изомераз, осуществля- ющих взаимопревращения стереоизомеров, а также структурных или позиционных изомеров (см. табл. 6-3). Образующийся под действием фосфоглюкомутазы глюкозо-6-фосфат может использоваться в гликолизе или другом метабо- лическом пути, например в пентозофосфатном пути (разд. 14.5).
[88] Часть II. 14. Гликолиз, глюконеогенез и пентозофосфатный путь Пример 14-1 ЗАПАСАНИЕ ЭНЕРГИИ ПРИ РАСЩЕПЛЕНИИ ГЛИКОГЕНА В ПРОЦЕССЕ ФОСФОРОЛИЗА Рассчитайте выигрыш энергии (в молекулах АТР на мономерное звено глюкозы) при расще- плении гликогена не путем гидролиза, а путем фосфоролиза. Решение. В результате фосфоролиза образуется фосфорилированная глюкоза (глюкозо-1-фосфат), которая затем превращается в глюкозо-6-фосфат — без затрат энергии клетки (1 АТР) на образование глюкозо-6-фосфата из свободной глюкозы. Таким образом, на подготовительной стадии расходуется в пересчете на одну мономерную единицу глюкозы лишь одна молекула АТР по сравнению с двумя мо- лекулами в том случае, когда гликолиз начинается со свободной глюкозы. Другими словами, клетка экономит три молекулы АТР в расчете на моно- мерное звено глюкозы (четыре молекулы АТР об- разуются на стадии запасания энергии и одна, а не две молекулы АТР расходуется на подготовитель- ной стадии), тем самым сохраняется одна молекула АТР на каждый мономер глюкозы. Расщепление в желудочно-кишечном тракте полисахаридов пищи, таких как гликоген и крах- мал, путем фосфоролиза вместо гидролиза не дало бы выигрыша энергии, поскольку фосфорилиро- ванные сахара не проникают в клетки слизистой кишечника, а должны быть сначала дефосфорили- рованы с образованием свободных сахаров. Чтобы проникнуть в клетку, дисахариды должны сначала подвергнуться гидролизу до моно- сахаридов. В кишечнике дисахариды и декстрины гидролизуются под действием ферментов, связан- ных с поверхностью кишечного эпителия: Декстрин + иН2О----------* п D-глюкоза декстриназа Мальтоза + Н2О * 2 D-глюкоза мальтаза Лактоза + Н2О > D-галактоза + D-глюкоза JIdKi dod Сахароза + Н2О сахараза * D-фруктоза + D-глюкоза Трегалоза + Н2О 2 D-глюкоза Образовавшиеся таким путем моносахариды ак- тивно транспортируются в эпителиальные клет- ки (см. рис. 11-44), а затем попадают в кровь и переносятся к различным тканям, где фосфори- лируются и вовлекаются в последовательность гликолитических реакций. 0 Непереносимость лактозы часто встреча- ется среди взрослого населения Земли, за исключением жителей Северной Европы и неко- торых регионов Африки. Это состояние связано с полным или частичным отсутствием лактазной активности в клетках кишечника у взрослых. Из- за этого лактоза не полностью расщепляется и не всасывается в тонком кишечнике, а попадает в толстую кишку, где бактерии превращают ее в ток- сичный продукт, вызывающий спазмы кишечника и диарею. Проблема еще более усугубляется тем обстоятельством, что нерасщепленная лактоза и ее метаболиты повышают осмолярность содержи- мого кишечника, что способствует удерживанию воды. В тех странах, где распространена непере- носимость лактозы, взрослое население исполь- зует в пищу не молоко, а молочные продукты, прошедшие обработку лактазой. При некоторых заболеваниях человека в кишечнике могут вооб- ще отсутствовать все или почти все дисахаридазы. Поэтому при проблемах с пищеварением, вызван- ных потреблением дисахаридов с пищей, рекомен- дуется соблюдение определенной диеты. Другие моносахариды включаются в гликолиз на разных участках пути У большинства организмов не только глюкоза, но и другие гексозы могут подвергаться глико- лизу после превращения в фосфорилированные производные. D-Фруктоза, встречающаяся в сво- бодном виде во многих фруктах, а также образу- ющаяся в тонком кишечнике позвоночных при гидролизе сахарозы, подвергается фосфорилиро- ванию гексокиназой: Mg2+ Фруктоза + АТР —> фруктозо-6-фосфат + ADP Таким же путем основные количества фруктозы включаются в гликолиз в клетках мышц и почек. В печени реализуется другой путь. Фермент пе- чени фруктокиназа катализирует фосфорилиро- вание фруктозы не по С-6, а по С-1: Mg2+ Фруктоза + АТР —> фруктозо-1-фосфат + ADP
14.2 Метаболические пути, питающие гликолиз [89] Далее фруктозе-1-фосфат расщепляется на гли- церальдегид и дигидроксиацетонфосфат под дей- ствием фермента фруктозофосфатальдолазы: !Н2ОРОГ С=О 1СН2ОРОз“ 2С=О з1 НОСН СН2ОН Дигидроксиацетон- фосфат + Галактозо-1-фосфат затем переходит в С-4- эпимер — глюкозо-1-фосфат — в результате се- рии реакций, в которых переносчиком гексоз- ных групп выступает уридиндифосфат (UDP; рис. 14-12). Эпимеризация включает стадию окисления -ОН-группы у атома С-4 до кетогруп- пы с последующим восстановлением кетогруппы до -ОН-группы с обращением конфигурации. Кофактором в реакциях окисления и восстанов- ления служит NAD+. неон неон 6СН2ОН Фруктозо-1 -фосфат фруктозо- фосфатальд ол аза q q неон I Галактоза СН2ОН Глицеральдегид Дигидроксиацетонфосфат превращается в глицер- альдегид-3-фосфат под действием гликолитичес- кого фермента триозофосфатизомеразы. Глице- ральдегид фосфорилируется за счет АТР при уча- стии триозокиназы до глицеральдегид-3-фосфата: Глицеральдегид + АТР —> —> глицеральдегид-3-фосфат + ADP В результате оба продукта гидролиза фруктозо- 1-фосфата включаются в гликолиз в виде глицеральдегид-3-фосфата. галакто- киназа 0 D-галактоза, образующаяся в результате ги- дролиза дисахарида лактозы (молочного саха- ра), поступает по кровотоку из кишечника в печень, где сначала фосфорилируется за счет АТР по атому С-1 под действием фермента галактокиназы: Mg2+ Галактоза + АТР —> галактозо-1-фосфат + ADP Рис. 14-12. Превращение галактозы в глюкозо-1-фосфат. Процесс протекает с образованием производного сахара и нуклеотида UDP-галактозы при замещении глюкозо- 1-фосфата в UDP-глюкозе галактозо-1-фосфатом. Далее UDP-галактоза под действием ийР-глюкозо-4-эпимеразы превращается в UDP-глюкозу; при этом сначала происхо- дит окисление -ОН-группы у атома С-4 (выделена розо- вым цветом) при участии NAD+, а затем восстановление при участии NADH. Результатом данной реакции являет- ся обращение конфигурации у атома С-4. UDP-глюкоза используется в другом цикле той же реакции. Суммарный итог данного цикла — превращение галактозо-1-фосфата в глюкозо-1-фосфат; при подведении материального ба- ланса получается, что ни UDP-галактоза, ни UDP-глюкоза не образуются и не расходуются. Галактозо-1- фосфат
[90] Часть II. 14. Гликолиз, глюконеогенез и пентозофосфатный путь Нарушение функций любого из трех фермен- тов, действующих в этой серии реакций, вызыва- ет у человека галактоземию. При недостаточно- сти галактокиназы в крови и моче обнаруживают высокую концентрацию галактозы. У младенцев может развиться катаракта, что связано с отло- жением в хрусталиках глаз метаболита галактозы галактитола. СН2ОН н—с—он I но—с—н I но—с—н I н—с—он СН2ОН D-Галактитол Симптомы этого заболевания носят умеренно тяжелый характер; значительно облегчает состо- яние полное исключение галактозы из рациона питания. Галактоземия, вызванная недостаточностью трансферазы, — более тяжелое заболевание и ха- рактеризуется отставанием в росте, нарушения- ми речи и умственной недоразвитостью, а также поражением печени, которое может оказаться смертельным даже при исключении галактозы из рациона питания. Недостаточность эпимеразы сопровождается аналогичными симптомами, но при тщательном соблюдении диеты имеет менее тяжелые последствия. D-Манноза, образующаяся при расщеплении различных полисахаридов и гликопротеинов, фос- форилируется гексокиназой по положению С-6: Mg24 Манноза + АТР маннозо-6-фосфат + ADP Маннозо-6-фосфат изомеризуется под действием фермента фосфоманноизомеразы с образованием фруктозо-6-фосфата — интермедиата гликолиза. Краткое содержание раздела 14.2 МЕТАБОЛИЧЕСКИЕ ПУТИ, ПИТАЮЩИЕ ГЛИКОЛИЗ Запасные формы глюкозы— полисахариды гликоген и крахмал — вовлекаются в глико- лиз в результате двустадийного процесса. Фосфоролитическое отщепление остатка глюкозы от конца молекулы полисахарида, приводящее к высвобождению глюкозо-1- фосфата, катализируется гликогенфосфори- лазой или фосфорилазой крахмала. Далее фосфоглюкомутаза превращает глюкозо-1- фосфат в глюкозо-6-фосфат, который посту- пает в путь гликолиза. Потребляемые с пищей полисахариды и ди- сахариды расщепляются до моносахаридов гидролитическими ферментами кишечника; затем моносахариды проникают в клетки кишечника, а из них транспортируются в пе- чень и другие ткани. Различные D-гексозы, в том числе фруктоза, галактоза и манноза, также могут подвер- гаться гликолизу, предварительно превра- тившись в глюкозо-6-фосфат, фруктозо-6- фосфат или фруктозо-1-фосфат. В превращении галактозо-1-фосфата в глюкозо-1-фосфат задействованы два ну- клеотидных производных: U D Р-галактоза и UDP-глюкоза. Генетические дефекты лю- бого из трех ферментов, катализирующих превращение галактозы в глюкозо-1-фосфат, вызывают галактоземию разной степени тя- жести. 14.3. Превращение пирувата в анаэробных условиях: брожение В аэробных условиях пируват, образующийся на финальной стадии гликолиза, окисляется до ацетата (ацетил-Со А), который поступает в цикл лимонной кислоты и окисляется до СО2 и Н2О, a NADH, образующийся при дегидрировании глицеральдегид-3-фосфата, в итоге вновь окисля- ется до NAD+ в результате передачи электронов на О2 в митохондриях. Однако при недостатке кислорода (при гипоксии), например в активно работающих мышцах, в подводных частях расте- ний или у молочнокислых бактерий, образовав- шийся в результате гликолиза NADH не может возвращаться в окисленную форму с помощью О2. Невозможность регенерации NAD+ оставляла бы клетки без акцептора электронов, необходи-
14.3 Превращение пирувата в анаэробных услоувиях: брожение [91] мых для окисления глицеральдегид-3-фосфата, что привело бы к остановке энергетически выгод- ных реакций гликолиза. Следовательно, должен существовать какой-то другой путь регенерации NAD+. Первые клетки, появившиеся в практически лишенной кислорода земной атмосфере, умели добывать энергию из топливных молекул в анаэ- робных условиях. Большинство современных ор- ганизмов сохранили способность регенерировать NAD+ в анаэробном процессе гликолиза путем переноса электронов от NADH с образованием таких восстановленных конечных продуктов, как лактат или этанол. Пируват является последним акцептором электронов при молочнокислом брожении Если ткани животных не получают достаточ- ного количества кислорода, чтобы поддержи- вать аэробное окисление пирувата и NADH, образовавшихся в результате гликолиза, то регенерация NAD+ из NADH происходит пу- тем восстановления пирувата до лактата. Как уже отмечалось выше, некоторые типы клеток и тканей (например, эритроциты, не имеющие митохондрий и не способные окислять пиру- ват до СО2) образуют лактат из глюкозы даже в аэробных условиях. Восстановление пирува- та катализирует фермент лактатдегидрогеназа, под действием которой при pH 7 образуется L-изомер лактата: I С=О I СН3 NADH + Н+ лактат- дегидрогеназа I но—с—н I СНз L-Лактат Пируват AG'° = —25,1 кДж/моль Равновесие этой реакции сильно сдвинуто в сто- рону образования лактата, на что указывает боль- шое по величине отрицательное изменение стан- дартной свободной энергии. При гликолизе дегидрирование двух мо- лекул глицеральдегид-3-фосфата, образую- щихся из каждой молекулы глюкозы, сопро- вождается превращением двух молекул NAD+ в две молекулы NADH. Поскольку восстанов- ление двух молекул пирувата до двух молекул лактата приводит к образованию двух моле- кул NAD+, то суммарное содержание NAD+ и NADH не меняется. Лактат, образующийся при активной работе мышц (или в эритроцитах), может быть по- вторно использован. При восстановлении сил после активной мышечной деятельности он переносится кровотоком к печени, где превра- щается в глюкозу. Во время активной физиче- ской нагрузки (например, при спринтерском беге) образуется большое количество лактата; снижение pH в крови и мышцах, связанное с диссоциацией молочной кислоты, ограничива- ет период наиболее напряженной физической активности. Даже тренированные легкоатлеты в самой лучшей спортивной форме способны бежать с максимальной скоростью не более од- ной минуты (доп. 14-2). Хотя превращение глюкозы в лактат про- текает через две окислительно-восстано- вительные стадии, углерод не меняет своей степени окисления: в глюкозе (С6Н12О6) и мо- лочной кислоте (С3Н6О3) соотношение Н:С одно и то же. Тем не менее некоторое количе- ство энергии, заключенной в молекуле глюко- зы, при превращении в лактат высвобождается, и этой энергии достаточно для образования двух молекул АТР на одну молекулу расще- пленной глюкозы. Подобные процессы, иду- щие с выделением энергии (в форме АТР), но не сопровождающиеся потреблением кисло- рода или изменением концентрации NAD+ и NADH, обычно называют брожением. Бро- жение осуществляют очень многие организ- мы, часто обитающие в анаэробных условиях; конечные продукты брожения довольно разно- образны и нередко находят практическое при- менение.
[92] Часть II. 14. Гликолиз, глюконеогенез и пентозофосфатный путь Дополнение 14-2 Спортсмены, аллигаторы и целаканты: гликолиз при пониженном содержании кислорода Большинство позвоночных являются аэробными орга- низмами; они превращают глюкозу в пируват в процессе гликолиза, а затем с помощью молекулярного кислорода полностью окисляют пируват до СО2 и Н2О. Анаэроб- ный катаболизм глюкозы до лактата происходит в крат- кие моменты чрезвычайно высокого мышечного напря- жения, например при беге на стометровку, когда кислород не успевает поступать в мышцы с достаточной скоростью, чтобы окислять пируват. В это время мышцы в качестве источника энергии для выработки АТР используют вну- тренние запасы глюкозы (гликоген), сбраживая ее до лактата. При спринтерском беге концентрация лактата в крови достигает очень высоких значений. В процессе глюконеогенеза в печени лактат медленно превращается обратно в глюкозу (это происходит после снятия нагруз- ки при восстановлении дыхания, когда интенсивность потребления кислорода снижается), постепенно достигая нормы. Избыток кислорода, потребленного при восста- новлении дыхания, покрывает его предыдущие затраты. При восстановлении дыхания кислород необходим для синтеза АТР в процессе глюконеогенеза, цель которого — регенерировать гликоген, «заимствованный» из печени и мышц в период максимальной нагрузки. Цикл реакций, включая превращение глюкозы в лактат в мышцах и пре- вращения лактата в глюкозу в печени, называют циклом Кори в честь Карла и Герти Кори, работы которых (1930- 1940 гг.) позволили объяснить суть и роль данного мета- болического пути (см. доп. 15-1). Кровеносная система большинства мелких позво- ночных достаточно быстро переносит кислород к мыш- цам, так что не возникает необходимости использовать анаэробный путь разложения мышечного гликогена. Например, перелетные птицы часто без отдыха покры- вают большие расстояния с высокой скоростью, не пре- вышая обычных затрат кислорода. В мышцах многих «бегающих» животных среднего раз- мера также поддерживается почти ис- ключительно аэробный метаболизм. А вот кровеносная система более круп- ных животных, к которым относится и человек, не может полностью обеспечи- вать аэробный метаболизм в мышцах в длительные периоды интенсивной мы- шечной активности. Такие животные в обычных условиях передвигаются довольно медленно, а интенсивная мы- шечная деятельность развивается лишь в случае край- ней необходимости, поскольку подобные вспышки ак- тивности требуют периода длительного восстановления для погашения перерасхода кислорода. Аллигаторы и крокодилы, например, в обычных условиях довольно пассивны. Лишь при возбуждении они способны на молниеносную атаку и стремительные удары своим мощным хвостом. Время такой взрывной активности очень короткое, а после этого наступает длительный период восстановления. Движения, осу- ществляемые в случае крайней необходимости, сопро- вождаются сбраживанием молочной кислоты в мышцах с образованием АТР. При этом запасы мышечного гли- когена быстро расходуются, а концентрация лактата в мышцах и внеклеточных жидкостях резко возрастает. После бега на стометровку спортсмен восстанавливает дыхание примерно за полчаса или даже быстрее, а вот аллигатору после вспышки активности может потребо- ваться много часов покоя и повышенного потребления кислорода для удаления избытка лактата из крови и вос- становления уровня мышечного гликогена. Другие крупные животные, например слоны и но- сороги, а также ныряющие млекопитающие, такие как киты и тюлени, имеют похожие особенности метаболиз- ма. Возможно, динозавры и другие вымершие крупные животные для своей мышечной активности использо- вали молочнокислое брожение, требующее длитель- ных периодов восстановления, и в это время они были уязвимы для более мелких хищников, способных луч- ше использовать кислород и более приспособленных к продолжительной мышечной активности. Глубоководные исследования позволили обнару- жить огромное разнообразие жизни на больших морских глубинах, где концентрация кислорода практически рав- на нулю. Например, оказалось, что у первобытного цела- канта — огромной рыбы, живущей у побережья Южной Африки на глуби- нах около 4000 м, практически во всех тканях осуществляется анаэробный метаболизм. В организме этого живот- ного углеводы превращаются в лактат и другие продукты, большинство из которых должны удаляться. Некото- рые морские позвоночные получают АТР путем сбраживания глюкозы до этанола и СО2.
14.3 Превращение пирувата в анаэробных услоувиях: брожение [93] Этанол — восстановленный продукт спиртового брожения Дрожжи и другие микроорганизмы сбражива- ют глюкозу не до лактата, а до СО2 и этилового спирта. Сначала в процессе гликолиза глюкоза превращается в пируват, а затем пируват в дву- стадийном процессе разлагается на этанол и СО2: со2 ТРР, Т Mg2+y Жват- . ксилаза °ч/н с I СНз NADH + Н+ I NAD+ ОН алкоголь- дегидрогеназа сн2 СНз Пируват Ацетальдегид Этанол На первой стадии пируват необратимо декар- боксилируется под действием пируватдекар- боксилазы. Эта простая реакция декарбокси- лирования не приводит к окислению пирувата. Пируватдекарбоксилаза требует присутствия ионов Mg2+ и кофермента тиаминпирофосфата (ТРР). На второй стадии ацетальдегид восста- навливается до этанола под действием алкоголь- дегидрогеназы; при этом роль восстановителя играет NADH, образовавшийся при дегидриро- вании глицеральдегид-3-фосфата. Данная реак- ция хорошо изучена и является примером пере- носа водорода с участием NADH (рис. 14-13). Таким образом, продукты спиртового броже- Ацетальдегид с =05 -zn2+ гз О NH2 Алкоголь- дегидрогеназа NADH । R н Ион Zn2+ в активном центре фермента поляризует карбонильный кислород в молекуле ацетальдегида, облегчая переход гидрид-иона (розовый) от NADH. Восстановленный интермедиат принимает протон из раствора (синий), и в результате получается этанол. NAD+ Н I сн3—с-он н Этанол Рис. 14-13. МЕХАНИЗМ РЕАКЦИИ. Действие алкогольдегидро- геназы. 0 Механизм действия алкогольдегидрогеназы ния — этанол и СО2, что можно записать в виде суммарного уравнения реакции: Глюкоза + 2 ADP + 2 Pi -* 2 этанол + 2 СО2 + 2 АТР + 2 Н2О Как и в случае молочнокислого брожения, при спир- товом брожении не меняется соотношение числа атомов водорода и углерода при превращении глю- козы (Н: С = 12 : 6 = 2) в две молекулы этанола и две молекулы СО2 (в сумме Н: С = 12 : 6 = 2). При любом процессе брожения в исходных веществах и продуктах реакции отношение Н: С одинаково. Пируватдекарбоксилаза обнаружена у пив- ных и пекарских дрожжей (Saccaromyces cerevi- siae), а также у всех других организмов, сбра- живающих глюкозу до этилового спирта, в том числе и у некоторых растений. Характерные пу- зырьки в шампанском возникают при декарбок- силировании пирувата и образовании СО2 под действием пивных дрожжей. Древнее искусство пивоварения кроме реакций спиртового броже- ния включает в себя целый ряд других фермента- тивных процессов (доп. 14-3). При изготовлении хлеба именно СО2, выделяющийся при смешива- нии дрожжей с сахаром, заставляет поднимать- ся тесто. Этот фермент отсутствует в тех тканях позвоночных, а также у тех организмов, которые осуществляют молочнокислое брожение. Алкогольдегидрогеназа обнаружена у мно- гих организмов, способных метаболизировать этанол, в том числе у человека. В печени этот фермент катализирует окисление этанола как по- требленного человеком, так и образованного ки- шечной микрофлорой; этот процесс сопровожда- ется восстановлением NAD+ до NADH. В данном случае реакция протекает в направлении, обрат- ном образованию этанола при брожении. Тиаминпирофосфат переносит «активные» ацетальдегидные группы При рассмотрении реакции, катализируемой пируватдекарбоксилазой, мы впервые стал- киваемся с коферментом тиаминпирофосфатом (ТРР; рис. 14-14) — производным витамина Bt. Недостаток витамина Bt в рационе питания че- ловека может привести к развитию болезни бе- ри-бери, характеризующейся накоплением жид- кости в организме (отеками), болями, параличом; болезнь может иметь летальный исход.
[94] Часть II. 14. Гликолиз, глюконеогенез и пентозофосфатный путь Дополнение 14-3 Спиртовое брожение: пивоварение и производство биотоплива Пивоварением люди начали заниматься давно, а на определенном этапе перенесли этот процесс в крупно- масштабное производство. Пиво является продуктом спиртового брожения углеводов, содержащихся в се- менах зерновых культур (например, ячменя), под дей- ствием гликолитических ферментов дрожжей. Углево- ды, в основном полисахариды, прежде всего должны расщепиться до ди- и моносахаридов. Поэтому снача- ла готовят солод, для чего семена ячменя проращива- ют до тех пор, пока они не синтезируют необходимые гидролитические ферменты, а затем дальнейшее про- ращивание прекращают нагреванием. Полученный солод содержит ферменты, катализирующие гидролиз [3-связей в целлюлозе и в других полисахаридах из клеточных стенок семенных оболочек ячменя, а также другие ферменты, например ot-амилазу и мальтазу. Следующий производственный процесс пивова- рения — приготовление сусла, т. е. питательной среды для роста клеток дрожжей. Солод смешивают с водой, а затем дробят или растирают. При этом ферменты со- лода воздействуют на полисахариды и расщепляют их до мальтозы, глюкозы и других простых сахаров, рас- творимых в водной среде. Затем клеточный остаток отделяют, а жидкое сусло варят, добавляя для арома- тизации хмель, охлаждают и аэрируют. На следующем этапе в сусло добавляют клетки дрожжей. В аэробном сусле дрожжи растут и размно- жаются очень быстро, получая энергию из присут- ствующих в сусле сахаров, причем этиловый спирт не образуется, поскольку при достаточном содержании кислорода дрожжи окисляют возникающий в резуль- тате гликолиза пируват до СО2 и Н2О через цикл ли- монной кислоты. После того как весь растворенный в сусле кислород исчерпан, клетки дрожжей переключа- ются на анаэробный метаболизм и начинают сбражи- вать сахара до этилового спирта и СО2. Процесс бро- жения контролируется концентрацией образующегося этанола, значением pH и количеством оставшихся са- харов. После остановки брожения дрожжевые клетки удаляют, а молодое пиво готово для финальной стадии дображивания. На этой заключительной стадии пивоварения контролируют количество пены, возникающей из-за наличия в пиве растворенных белков. Обычно обра- зование пены регулируется протеолитическими фер- ментами, выделяющимися в процессе приготовления солода. Если эти ферменты воздействуют на белки слишком долго, то пены и пузырьков возникает мало, а если недостаточно долго, то охлажденное пиво не бу- дет прозрачным. Иногда для пенообразования к пиву добавляют протеолитические ферменты из других ис- точников. Технология крупномасштабного производства ал- когольных напитков в настоящее время используется и для решения совершенно иной задачи — для производ- ства этанола в качестве альтернативного топлива. Из-за понимания того факта, что ископаемые ресурсы могут закончиться, а также из-за роста цен на топливо для двигателей внутреннего сгорания, проявляется инте- рес к этанолу как альтернативе традиционному топли- ву или добавки к топливу. Основным преимуществом этилового спирта в качестве топлива является возмож- ность его получения из сравнительно недорогих и возоб- новляемых источников, богатых сахарозой, крахмалом или целлюлозой (крахмал — из кукурузы или пшеницы, сахароза — из сахарной свеклы или сахарного тростни- ка, а целлюлоза — из соломы, отходов деревообраба- тывающей промышленности или твердых городских отходов). Обычно сначала исходный материал хими- ческим путем превращают в моносахариды, а затем эту смесь используют в качестве питательного субстрата для определенных штаммов дрожжей в промышленных ферментерах (рис. 1). В результате ферментации обра- зуется не только этанол, но и побочные продукты, такие как белки, которые можно использовать в качестве кор- мовых добавок в животноводстве. Рис. 1. Промышленное брожение для получения биото- плива и других продуктов обычно проводят в ферменте- рах объемом на тысячи литров среды.
14.3 Превращение пирувата в анаэробных услоувиях: брожение [95] Тиаминпирофосфат (ТРР) играет важную роль при расщеплении связей, прилегающих к карбонильной группе, например при декарбокси- лировании а-кетокислот, а также в тех химиче- ских реакциях, при которых происходит перенос активированной ацетальдегидной группы между двумя атомами углерода (табл. 14-1). Функцио- нальная часть молекулы ТРР (тиазольное кольцо) имеет довольно кислый протон при атоме С-2. Дис- социация этого протона приводит к образованию активный тиазольное кольцо Н Тиаминпирофосфат (ТРР) СН3 С ОН ацетальдегид +As - CH2-nwL ° ° г сн2—СН2—О—Р—О—Р—О“ СН3 I I О“ О“ Гидроксиэтилтиамин- пирофосфат в Н ТРР СН3 С-2 в тиазольном кольце ТТР быстро отщепляет протон. Н К—N СН3 Пируват о // с— ' ^о- СНз—Сх Н Ацеталь- дегид н н ® Отщепление тиазольного кольца приводит к образованию ацетальдегида. R—N сн3 ТРР-карбанион г В' сн 3 Гидроксиэтил- - Трр При протониро- вании образует- ся гидрокси- этил-ТРР. А СНз-С-ОН ТРР-карбанион атакует карбонильную группу пирувата. ° Z СНз-с-с С О R—N^> ? СН3 R' Декарбоксилиро- вание ускоряется делокализацией электронов в тиа- зольном кольце. СО* резонансная стабилизация Рис. 14-14. МЕХАНИЗМ РЕАКЦИИ. Тиаминпиро- фосфат (ТРР) и его роль при декарбоксилиро- вании пирувата, а — в форме ТРР витамин Bj (ти- амин) выступает в роли кофермента. Красным цветом выделен реакционноспособный атом углерода в тиазольном кольце молекулы ТРР. В реакции, катализируемой пируватдекарбок- силазой, два из трех атомов углерода пирувата временно переносятся на ТРР в форме гидрокси- этильной («активной» ацетальдегидной) груп- пы (б), которая впоследствии высвобождается в виде ацетальдегида, в — тиазольное кольцо в ТРР стабилизирует карбанион, поскольку явля- ется электронодефицитной структурой, позво- ляющей делокализовать электроны карбаниона за счет резонансной стабилизации. Обладающие таким свойством структуры иногда называют «электронными ловушками»; они играют важ- ную роль во многих биохимических реакциях (здесь помогают разорвать связь С-С). в Меха- низм действия тиаминпирофосфата
[96] Часть II. 14. Гликолиз, глюконеогенез и пентозофосфатный путь Некоторые ТРР-зависимые реакции Таблица 14-1 Фермент Путь(и) Расщепляемая связь Образующаяся связь Пируватдекарбоксилаза Спиртовое брожение ° п , 11 R1—С- С о- г я о Пируватдегидрогеназа а-Кетоглутаратдегидрогеназа Синтез ацетил-СоА Цикл лимонной кислоты ° о II Z R2—С—С о- 3 о О. cZ V 1 Транскетолаза Реакции ассимиляции углерода Пентозофосфатный путь О ОН II 1 R3—С—С—R4 1 Н о он II 1 R3—С—С—R5 1 н карбаниона, который как раз и является активным началом в ТРР-зависимых реакциях (рис. 14-14). Карбанион легко взаимодействует с карбониль- ными группами, а тиазольное кольцо выступает в качестве «электронной ловушки», сильно облег- чающей такие реакции, как декарбоксилирование под действием пируватдекарбоксилазы. С помощью брожения получают многие продукты питания и химические реагенты Уже несколько тысяч лет назад наши предки ис- пользовали процесс брожения для получения и переработки продуктов питания. Некоторые ми- кроорганизмы, присутствующие в сырых пище- вых продуктах, сбраживают углеводы и превра- щают их в продукты метаболизма, придающие пище ее характерный внешний вид, текстуру и вкус. Йогурт, известный с библейских времен, образуется в результате жизнедеятельности бак- терии Lactobacillus bulgaricus, сбраживающей углеводы молока до молочной кислоты; проис- ходящее при этом уменьшение pH среды приво- дит к осаждению молочных белков, что и создает густую консистенцию и кисловатый привкус на- турального йогурта. Бактерия Propionibacterium freudenreichii сбраживает углеводы молока с об- разованием пропионовой кислоты и СО2; про- пионовая кислота осаждает молочные белки, а пузырьки газа создают сырные дырки, так ха- рактерные для сортов швейцарского сыра. Мно- гие другие продукты питания также получают в результате брожения; это пикули, квашеная ка- пуста, сосиски и колбасы, соевый соус, а также множество излюбленных продуктов националь- ной кухни, таких как кимчи (Корея), темпояк (Индонезия), кефир (Россия), дахи (Индия) и позол (Мексика). Уменьшение pH среды, сопро- вождающее брожение, позволяет консервиро- вать продукты питания, поскольку большинство микроорганизмов, вызывающих порчу продук- тов, не способны расти при низких pH. В сель- ском хозяйстве отходы растениеводства, такие как стебли кукурузы, используют на корм ско- ту в виде силоса; для приготовления силосной массы отходы собирают в больших контейнерах (силосных ямах), где при ограниченном доступе воздуха происходит микробное брожение, что снижает pH силосной массы. Силос может хра- ниться долгое время и не портиться. В 1910 г. Хаим Вейцман (позже он стал первым президентом Израиля) обнаружил, что бактерия Clostridium acetobutyricum превраща- ет крахмал в смесь бутилового спирта и ацето- на. Это открытие послужило началом развития промышленной ферментации, при которой не- которые доступные богатые сахарами вещества (например, кукурузный крахмал или мелассу), смешивают с чистой культурой специфических микроорганизмов, способных превратить их в более ценные продукты. Так, используемый для получения газохола (смесь спирта с бензином) метанол, а также муравьиная, уксусная, пропи- оновая, масляная, янтарная кислоты, глицерин, этанол, изопропанол, бутанол и бутандиол по- лучают в промышленности с помощью фермен- тации. Промышленную ферментацию обычно проводят в больших закрытых цистернах, в ко-
14.4 Глюконеогенез [97] торых температура и подача воздуха регулиру- ются таким образом, чтобы создать наиболее благоприятные условия для развития полезных микроорганизмов и неблагоприятные — для не- желательных микроорганизмов. Прелесть про- мышленной ферментации заключается в том, что сложные, многостадийные химические пре- вращения осуществляются с высоким выходом и небольшим количеством побочных продуктов под действием самовоспроизводящихся живых «химических заводов» — микробных клеток. В некоторых технологиях применяются иммоби- лизованные на инертном носителе клетки, что позволяет осуществлять непрерывный процесс, пропуская исходный субстрат через слой клеток и собирать на выходе конечный продукт. Это ли не мечта инженеров! Краткое содержание раздела 14.3 ПРЕВРАЩЕНИЕ ПИРУВАТА В АНАЭРОБНЫХ УСЛОВИЯХ: БРОЖЕНИЕ Образующийся в процессе гликолиза NADH должен быть вновь переведен в окисленную форму — в NAD+, который необходим в ка- честве акцептора электронов в начале второй стадии гликолиза. В аэробных условиях это осуществляется в митохондриях путем пере- дачи электронов от NADH на О2. В анаэробных условиях или при понижен- ном содержании кислорода многие организ- мы регенерируют NAD+, перенося электроны от NADH на молекулу пирувата, в результате чего образуется лактат. Другие организмы, такие как дрожжи, получают NAD+ при вос- становлении пирувата до этилового спирта и СО2. При таком анаэробном процессе (бро- жении) не происходит окисления или вос- становления углерода в молекулах глюкозы. Многие микроорганизмы способны сбра- живать сахар, содержащийся в сырой пище, что изменяет кислотность (pH), вкус и тек- стуру продуктов и, кроме того, защищает их от гниения. Процесс брожения используют в промышленных масштабах для получения различных ценных продуктов из недорогого исходного органического сырья. 14.4. Глюконеогенез Центральная роль глюкозы в метаболизме прояви- лась еще в начале эволюционного пути нашей био- сферы, а для современных организмов — от микро- ба до человека — этот сахар остается практически универсальным источником энергии и строитель- ным блоком. Некоторые ткани млекопитающих получают всю необходимую энергию только из глюкозы. Для головного мозга и нервной системы человека, а также эритроцитов, яичек, мозгового вещества почек и эмбриональных тканей глюкоза служит единственным или же главным источни- ком энергии. Только для работы головного мозга ежедневно требуется 120 г глюкозы — это больше половины глюкозы, запасенной в форме гликогена в мышцах и печени. Однако этих запасов глюко- зы не всегда хватает; гликоген расходуется между приемами пищи, при длительном голодании и по- сле интенсивной физической нагрузки. В такие периоды организм должен синтезировать глюко- зу из предшественников неуглеводной природы. Этот синтез осуществляется с помощью метабо- лического пути, называемого глюконеогенезом («новое» образование сахаров), в котором пируват и другие соединения, состоящие из трех или четы- рех атомов углерода, превращаются в глюкозу. Глюконеогенез происходит в клетках жи- вотных, растений и микроорганизмов. Механизм этого процесса примерно одинаков во всех клет- ках и во всех организмах. У животных важными предшественниками глюкозы являются такие трехуглеродные соединения, как лактат, пируват и глицерин, а также некоторые аминокислоты (рис. 14-15). У млекопитающих глюконеогенез протекает преимущественно в печени и в меньшей степени в корковом веществе почек. Синтезиро- ванная глюкоза поступает в кровь для снабжения других тканей. Лактат, образующийся в мышцах в результате анаэробного гликолиза при тяжелой физической нагрузке, снова поступает в печень и превращается в глюкозу, которую кровь переносит обратно в мышцы, где из нее образуется гликоген; данный цикл называют циклом Кори (доп. 14-2; см. также рис. 23-20). В семенах растений запас- ные жиры и белки посредством нескольких мета- болических путей, в том числе и глюконеогенеза, превращаются в дисахарид сахарозу, распределя- ющуюся по всему растению при его росте. Глюко- за и ее производные служат строительным мате-
[98] Часть II. 14. Гликолиз, глюконеогенез и пентозофосфатный путь Глюкоза Другие в крови Гликопротеины моносахариды Сахароза Глюкозо-6-фосфат Животные Глюкогенные Глицерин 3-Фосфо- аминокислоты А глицерат Рис. 14-15. Синтез углеводов из простых предше- ственников. Путь превращения фосфоенолпирувата в глюкозо-б-фосфат является общим при биосинтетиче- ских превращениях многих предшественников угле- водов в клетках животных и растений. Однако только растения и фотосинтезирующие бактерии способны использовать С02 для синтеза углеводов. В процессе превращения пирувата в фосфоенолпируват образует- ся оксалоацетат — промежуточное соединение цикла лимонной кислоты, который обсуждается в гл. 16. Таким образом, любое соединение, которое можно превратить в пируват или оксалоацетат, может служить исходным материалом для глюконеогенеза. К таким веществам относятся аланин и аспартат, превращаемые в пируват и оксалоацетат соответственно, а также другие амино- кислоты, из которых образуются трех- или четырех- углеродные фрагменты (так называемые глюкогенные аминокислоты; см. табл. 14-4 и рис. 18-5). Растения и фотосинтезирующие бактерии обладают уникальной способностью преобразовывать С02 в углеводы, исполь- зуя глиоксилатный цикл (с. 212). Пируват 1 Лактат Триацил- Связывание глицерины СО2 Таблица 14-2 Изменение свободной энергии в реакциях гликолиза в эритроцитах Реакция гликолиза AG'° (кДж/моль) AG (кДж/моль) ® Глюкоза +- АТР > глюкозо-6-фосфат + ADP -16,7 -33,4 (2) Глюкозо- 6-фосфат - фруктозо-6-фосфат 1,7 от 0 до 25 (з) Фруктозо-6-фосфат + АТР > фруктозе-1,6-бис фосфат + ADP 14,2 -22,2 @ Фруктозе-1,6-бисфосфат < . дигидроксиацетонфосфат + глицеральдегид-3-фосфат 23,8 от 0 до -6 © Дигидроксиацетонфосфат глицеральдегид-3-фосфат 7,5 от 0 до 4 © Глицеральдегид-З-фосфат + Pj + NAD+ - . 1,3-бисфосфоглицерат + NADH + Н+ 6,3 от -2 до 2 © 1,3-Бисфосфоглицерат + ADP - 3-фосфоглицерат + АТР -18,8 от 0 до 2 ® З-Фосфоглицерат 2-фосфоглицерат 4,4 от 0 до 0,8 © 2-Фосфоглицерат . фосфоенолпируват + Н2О 7,5 от 0 до 3,3 ® Фосфоенолпируват + ADP > пируват + АТР -31,4 16,7 Примечание. Как определено в гл. 13 (с. 14-15), AG'° представляет собой изменение стандартной свободной энергии; АС — это изменение свободной энергии, рассчитанное на основании реаль- ных концентраций интермедиатов гликолиза, находящихся в эритроцитах при физиологических условиях и pH 7,0. Оранжевым цветом выделены обходные реакции глюконеогенеза. Приведен- ные схемы не уравнены по числу атомов водорода и заряду (с. 28).
14.4 Глюконеогенез [99] Гликолиз Глюконеогенез риалом для создания клеточной стенки растений, нуклеотидов и коферментов, а также множества других важнейших метаболитов. У многих микро- организмов глюконеогенез начинается с простых органических молекул, состоящих из двух или трех атомов углерода, таких как ацетат, лактат и пропионат, содержащихся в питательной среде. Хотя реакции глюконеогенеза одинаковы во всех организмах, метаболическое окружение и принципы регуляции этого процесса различаются в разных видах организмов и в разных тканях. В данном разделе мы обсудим, как протекает процесс глюконеогенеза в печени млекопитающих. В гл. 20 мы увидим, как фотосинтезирующие организмы используют этот метаболический путь для превра- щения первичных продуктов фотосинтеза в глюко- зу для запасания ее в виде сахарозы или крахмала. Метаболические пути гликолиза и глюконео- генеза не идентичны — они протекают в противо- положных направлениях, хотя на самом деле они имеют несколько общих стадий (рис. 14-16); семь из 10 ферментативных реакций глюконеогенеза — это обратные реакции гликолиза. Три реакции гликолиза in vivo необратимы и не могут использо- ваться в глюконеогенезе: 1) превращение глюкозы в глюкозо-6-фосфат под действием гексокиназы, 2) фосфорилирование фруктозо-6-фосфата с обра- зованием фруктозо-1,6-бисфосфата под действием фосфофруктокиназы-1 и 3) превращение фосфо- енолпирувата в пируват при участии пируватки- назы (рис. 14-16). В клетках эти реакции характе- ризуются большим отрицательным изменением стандартной свободной энергии, в то время как другие реакции гликолиза имеют AG, близкое к нулю (табл. 14-2). В глюконеогенезе три необра- тимые стадии осуществляются другим набором ферментов, которые катализируют экзергониче- ские реакции (AG 0), протекающие необратимо в сторону образования глюкозы. Таким образом, в клетках как гликолиз, так и глюконеогенез проте- кают необратимо. У животных оба пути осущест- вляются в основном в цитозоле, что требует их координированной регуляции. Независимая регу- ляция двух метаболических путей осуществляется через те ферментативные стадии, которые не явля- ются для них общими. Мы начнем изучение глюконеогенеза с рас- смотрения трех обходных реакций (вспомните, что под «обходными» подразумевают реакции, обходящие необратимые стадии гликолиза). АТР фосфо- фрукто- киназа-1 ADP Фруктозо-6-фосфат Pi фруктозо-1,6- бисфосфатаза Н2О Фруктозо-1,6-бисфосфат Дигидрокси- ацетонфосфат - ----Дигидрокси- ат II ацетонфосфат Л л (2) Глицеральдегид-З-фосфат (2) NADH + (2) Н+ (2) NADH + Н+ (2) 1,3-Бисфосфоглицерат (2) ADP (2) АТР (2) ADP (2) АТР (2) 3-Фосфоглицерат (2) 2-Фосфоглицерат > (2) GDP (2) ADP х (2) Фосфоенол- / ФЕП-карбокси- пируват (ФЕП) ^Акиназа пируват-у (2) GTP киназа^Д ^2) Оксалоацетат (2) АТР (2)ADP (2) Пируват «^ХГпируват- I карбоксилаза (2) АТР Рис. 14-16. Противоположно направленные пути гли- колиза и глюконеогенеза в печени крысы. Реакции гликолиза — слева, красным цветом; реакции глюко- неогенеза — справа, синим цветом. Главные участки регуляции глюконеогенеза, изображенные на схеме, обсуждаются далее в данной главе и подробнее — в гл. 15. На рис. 14-19 представлен альтернативный путь превращений оксалоацетата, реализующийся в митохон- дриях.
[100] Часть II. 14. Гликолиз, глюконеогенез и пентозофосфатный путь Превращение пирувата в фосфоенолпируват протекает в две экзергонические стадии Первая обходная реакция глюконеогенеза — это превращение пирувата в фосфоенолпируват (ФЕП). Данный процесс не может осуществляться простым обращением пируваткиназной реакции гликолиза (с. 79), которая характеризуется боль- шим отрицательным значением изменения стан- дартной свободной энергии и поэтому в интактной клетке необратима (табл. 14-2, реакция ®). Вместо этого фосфорилирование пирувата реализуется по обходному пути, состоящему из последовательно- сти реакций, которые в эукариотических клетках требуют участия как цитозольных, так и митохон- дриальных ферментов. Как мы увидим далее, изо- браженный на рис. 14-16 и описанный здесь во всех подробностях путь метаболизма представляет со- бой один из двух возможных путей превращения пирувата в ФЕП. Этот путь является основным, если предшественником для образования глюкозы Я Гидрокарбонат Пируват Р I НО—+СН3—С—Сх О" О" пируват- карбоксилаза Оксалоацетат б' Оксалоацетат Оч /О с-^сн^с-с^ -О о- + I о о \ о I-------, II II \|| | Гуанозин |—О—Р—О—Р—О—Р—О 0“ 0“ 0“ GTP ФЕП- карбоксикиназа О—РОз- СН2=С—ООО- Фосфоенолпируват служит пируват или аланин. Второй путь, описан- ный ниже, преобладает в том случае, когда предше- ственником глюкозы служит лактат. Прежде всего пируват транспортируется из цитозоля в митохондрии или образуется в ми- тохондриях из аланина в процессе трансамини- рования, при котором а-аминогруппа аланина удаляется (в результате чего образуется пируват) и переносится на а-кетокислоту (реакции транс- аминирования обсуждаются в гл. 18). Затем ми- тохондриальный фермент пируваткарбоксилаза в присутствии кофермента биотина превращает пируват в оксалоацетат (рис. 14-17): Пируват + НСО3_ + АТР оксалоацетат + ADP + Pi (14-4) Биотин в реакции карбоксилирования играет роль переносчика активированного гидрокарбоната (рис. 14-18). Механизм реакции представлен на рис. 16-16. (Отметим, что НСО3 возникает при диссоциации угольной кислоты, образующейся из СО2 + Н2О.) В результате фосфорилирования НСО^ под действием АТР получается смешанный ангидрид (карбоксифосфат); затем биотин вытес- няет фосфат, и образуется карбоксибиотин. Пируваткарбоксилаза — это первый регу- ляторный фермент глюконеогенеза, требующий присутствия ацетил-СоА в качестве активатора (ацетил-СоА образуется при окислении жирных кислот (гл. 17), и его накопление свидетельствует о возможности использования жирных кислот в качестве источника энергии). Как мы увидим в гл. 16 (см. рис. 16-15), катализируемая пируват- карбоксилазой реакция способна поставлять ин- термедиаты для другого важного метаболическо- го пути — цикла лимонной кислоты. Митохондриальная мембрана не содержит переносчиков оксалоацетата, поэтому до перено- са в цитозоль образовавшийся из пирувата окса- лоацетат переходит в восстановленную форму - Рис. 14-17. Синтез фосфоенолпирувата из пирувата. а — в митохондриях пируват превращается в оксало- ацетат в биотинзависимой реакции, катализируемой пи- руваткарбоксилазой. б — в цитозоле оксалоацетат под действием ФЕП-карбоксикиназы превращается в фосфо- енолпируват, а включившийся в состав оксалоацетата С02 вновь выделяется. Декарбоксилирование приводит к перераспределению электронов, что облегчает атаку карбонильного кислорода на у-фосфатную группу GTP.
14.4 Глюконеогенез [101] малат (соль яблочной кислоты) под действием митохондриального фермента малатдегидро- геназы, используя NADH: Оксалоацетат + NADH + Н+ . . L-малат + NAD+ (14-5) В этой реакции изменение стандартной свобод- ной энергии довольно значительное, но в физио- логических условиях (в том числе при очень низкой концентрации оксалоацетата) AG « 0, и реакция легко протекает в обратном направле- нии. Митохондриальная малатдегидрогеназа участвует и в глюконеогенезе, и в цикле лимон- ной кислоты, однако общие потоки метаболитов в этих двух процессах противоположные по на- правлению. Рис. 14-18. Роль биотина в пируваткарбоксилазной ре- акции. Кофактор биотин ковалентно связан с ферментом амидной связью, соединяющей его с с-аминогруппой остатка лизина, в результате чего образуется биотини- лированный фермент. Пируваткарбоксилазная реакция протекает в две стадии, которые происходят в двух раз- ных каталитических центрах на молекуле фермента. В каталитическом центре 1 гидрокарбонат превращается в С02 с затратой одной молекулы АТР. Затем С02 реагирует с биотином, образуя комплекс карбоксибиотина с фермен- том. Длинное «плечо», состоящее из биотина и боковой цепи того лизина, к которому он присоединен, переносит С02 от комплекса карбоксибиотин-фермент на каталити- ческий центр 2 на поверхности фермента, где С02 высво- бождается и взаимодействует с пируватом, в результате чего образуется оксалоацетат и регенерируется биотини- лированный фермент. Центральная роль подобных «гиб- ких плеч» в переносе интермедиатов между активными центрами фермента проиллюстрирована на рис. 16-17, а детали механизма пируваткарбоксилазной реакции пред- ставлены на рис. 16-16. Подобный механизм реализуется и в других реакциях биотинзависимого карбоксилирова- ния, катализируемых, например, пропионил-СоА-карбок- силазой (см. рис. 17-11) и ацетил-СоА-карбоксилазой (см. рис. 21-1). Малат покидает митохондрии с помощью специальной транспортной системы, находящей- ся во внутренней митохондриальной мембране (см. рис. 19-30). В цитозоле малат вновь окисля- ется до оксалоацетата с образованием NADH: Малат + NAD+ оксалоацетат + NADH + Н+ (14-6) Оксалоацетат затем превращается в ФЕП под действием фосфоенолпируваткарбоксикиназы (рис. 14-17). Эта Mg2+-зависимая реакция тре- бует присутствия GTP в качестве донора фосфо- рильной группы: Оксалоацетат + GTP . ФЕП + СО2 + GDP (14-7) Во внутриклеточных условиях реакция обрати- ма: образование одного богатого энергией фосфа- та (ФЕП) находится в равновесии с гидролизом другого фосфата (GTP). Уравнение этого обходного метаболического пути получаем при суммировании уравнений от (14-4) до (14-7): Пируват + АТР + GTP + НСО3 ФЕП + ADP + GDP + Pi + СО2 (14-8) А<7° = 0,9 кДж/моль
[102] Часть II. 14. Гликолиз, глюконеогенез и пентозофосфатный путь Итак, для превращения одной молекулы пирува- та в ФЕП должны израсходоваться две высоко- энергетические фосфатные группы (одна от АТР и одна от GTP), каждая из них при внутриклеточ- ных условиях обладает энергией ~50 кДж/моль. Напротив, при превращении ФЕП в пируват в процессе гликолиза лишь одна молекула АТР синтезируется из ADP. Хотя изменение стан- дартной свободной энергии AG'° двустадийно- го превращения пирувата в ФЕП составляет 0,9 кДж/моль, истинное изменение свободной энергии с учетом внутриклеточных концентра- ций интермедиатов имеет довольно большое отрицательное значение (-25 кДж/моль). Это связано с тем, что образующийся ФЕП быстро расходуется в других реакциях, так что его кон- центрация постоянно находится на достаточно низком уровне. Таким образом, внутри клетки данная реакция практически необратима. Обратите внимание, что в реакции, ка- тализируемой ФЕП-карбоксикиназой, вы- свобождается та же самая молекула СО2, что присоединяется к пирувату на стадии, катали- зируемой пируваткарбоксилазой (рис. 14-17, б). Эта последовательность реакций карбоксили- рования-декарбоксилирования служит для «активации» пирувата, поскольку декарбокси- лирование оксалоацетата облегчает образова- ние ФЕП. В гл. 21 мы обсудим, как подобная последовательность реакций карбоксилирова- ния-декарбоксилирования используется для активации ацетил-Со А в биосинтезе жирных кислот (см. рис. 21-1). Поясним, почему эти реакции происходят именно в митохондриях. В цитозоле [NADH]/ [NAD+] = 8 • IO-4, что примерно в 105 раз ниже, чем в митохондриях. Поскольку NADH из ци- тозоля расходуется в процессе глюконеогене- за для превращения 1,3-бисфосфоглицерата в глицеральдегид-3-фосфат (рис. 14-16), без достаточного количества NADH биосинтез глюкозы происходить не может. Транспор- тировка малата из митохондрий в цитозоль и его превращение в оксалоацетат способствует переносу восстановительных эквивалентов в цитозоль, где наблюдается их дефицит. Таким образом, превращение пирувата в ФЕП обеспе- чивает важный баланс в процессе глюконеоге- неза между произведенным и израсходованным в цитозоле NADH. Второй вариант обходной реакции от пиру- вата к ФЕП преобладает в тех случаях, когда ис- ходным веществом для синтеза глюкозы служит лактат (рис. 14-19). Такой метаболический путь использует лактат, образовавшийся при гликолизе, например, в эритроцитах или в анаэробных усло- виях в мышцах, и он играет особенно важную роль у крупных позвоночных в период после интенсив- ной физической нагрузки (доп. 14-2). Превращение лактата в пируват в цитозоле гепатоцитов сопрово- ждается образованием NADH, поэтому в данном случае нет нужды в переносе восстановительных эквивалентов (в форме малата) из митохондрий. Оксалоацетат Оксалоацетат со2 карбоксилаза со2 Пируват Митохондрия Цитозоль пируват- карбокси- лаза Пируват Пируват NADH + Н+ NAD+ Лактат Рис. 14-19. Альтернативные пути образования фосфоенол- пирувата (ФЕП) из пирувата. Вклад каждого из двух про- цессов определяется доступностью лактата или пирувата и потребностью в NADH в цитозоле для глюконеогенеза. Спра- ва — путь, преобладающий в том случае, когда исходным со- единением является лактат, поскольку в результате лактатде- гидрогеназной реакции NADH находится в цитозоле и его не нужно выкачивать из митохондрий (см. текст).
14.4 Глюконеогенез [103] Пируват, образовавшийся в лактатдегидрогеназной реакции, переносится в митохондрии и превращает- ся в оксалоацетат под действием пируваткарбокси- лазы, как описано выше. Однако этот оксалоацетат под действием митохондриального изофермента ФЕП-карбоксикиназы превращается сразу в ФЕП, а ФЕП уходит из митохондрий для продолжения глюконеогенеза. Митохондриальный и цитозоль- ный изоферменты ФЕП-карбоксикиназы коди- руются разными хромосомными генами, что слу- жит еще одним примером того, как два различных фермента, катализирующих одну и ту же реакцию, локализованы в разных частях клетки или имеют разные метаболические функции (вспомните изо- ферменты гексокиназы). Второй обходной путь — превращение фруктозо-1,б-бисфосфата в фруктозо-6-фосфат Еще одной реакцией гликолиза, которая не мо- жет использоваться для глюконеогенеза, являет- ся фосфорилирование фруктозо-6-фосфата под действием фосфофруктокиназы-1 (PFK-1; табл. 14-2, реакция ®). Эта реакция характеризуется большим отрицательным значением изменения стандартной свободной энергии и, следователь- но, необратима в условиях клетки, поэтому об- разование фруктозо-6-фосфата из фруктозо-1,6- бисфосфата (рис. 14-16) осуществляется под действием другого фермента — М§2+-зависимой фруктозе- 1,6-бисфосфатазы (ФБФаза-1). При этом происходит практически необратимый ги- дролиз фосфатной группы у атома С-1 (а не пере- нос фосфорильной группы на ADP): Фруктозо-1,6-бисфосфат + Н2О фруктозо-6-фосфат + Pj А (7° = -16,3 кДж/моль Следует отличать ФБФазу-1 от сходного фермента Ф Б Фазы-2, выполняющего регулятор- ную функцию (см. гл. 15). Третий обходной путь — образование глюкозы из глюкозо-6-фосфата Этот обходной путь реализуется на заключитель- ной стадии глюконеогенеза и представляет со- бой дефосфорилирование глюкозо-6-фосфата с образованием глюкозы (рис. 14-16). Обращение гексокиназной реакции (с. 71) требовало бы пе- реноса фосфатной группы от глюкозо-6-фосфата на ADP с образованием АТР, что энергетически невыгодно (табл. 14-2, реакция Ф). Реакция, ка- тализируемая глюкозо-6-фосфатазой, не сопро- вождается синтезом АТР, это просто гидролиз эфира фосфорной кислоты: Глюкозо-6-фосфат + Н2О глюкоза + Pj А (7° = -13,8 кДж/моль Этот М§2+-зависимый фермент обнаружи- вается на люменальной поверхности эндоплаз- матического ретикулума гепатоцитов, клеток почек и эпителиальных клеток тонкой кишки (см. рис. 15-28), но не других тканей, которые, следовательно, не могут поставлять глюкозу в кровь. Если бы другие ткани содержали глюкозо- 6-фосфат, данная ферментативная активность позволяла бы гидролизовать глюкозо-6-фосфат, необходимый этим тканям для гликолиза. Глю- коза, образующаяся в результате глюконеогене- за в печени или почках, а также потребляемая с пищей, доставляется в мозг и в мышечные ткани кровотоком. Глюконеогенез необходим, но сопряжен с большими энергетическими затратами Реакции биосинтеза, ведущие от пирувата к глю- козе (табл. 14-3), можно выразить суммарным уравнением: 2 Пируват + 4 АТР + 2 GTP + + 2 NADH + 2 Н+ + 4 Н2О глюкоза + 4 ADP + + 2 GDP + 6 +2 NAD+ (14-9) Итак, для образования из пирувата од- ной молекулы глюкозы требуется израсходо- вать шесть высокоэнергетических фосфатных групп — четыре из АТР и две из GTP. Кроме того, для восстановления двух молекул 1,3-бис- фосфоглицерата необходимы две молекулы NADH. Поэтому понятно, что с помощью урав- нения 14-9 записана не просто обратная реакция превращения глюкозы в пируват в процессе гли- колиза, таким образом показано, что затрачива- ются только две молекулы АТР: Глюкоза + 2 ADP + 2^ + 2 NAD+ 2 пируват + 2 АТР + 2 NADH + 2 Н+ + 2 Н2О Синтез глюкозы из пирувата — это энерго- затратный процесс. Большая часть энерге-
[104] Часть II. 14. Гликолиз, глюконеогенез и пентозофосфатный путь Таблица 14-3 Последовательность реакций глюконеогенеза с пируватом в начальной точке пути Пируват + НСО3 + АТР-------> оксалоацетат + ADP + Р^ х2 Оксалоацетат + GTP фосфоенолпируват + СО2 + GDP х2 Фосфоенолпируват + Н2О 2-фосфоглицерат х2 2-Фосфоглицерат 3-фосфоглицерат х2 З-Фосфоглицерат + АТР 1,3-бисфосфоглицерат + ADP х2 1,3-Бисфосфоглицерат + NADH + Н+ ------ глицеральдегид-3-фосфат + NAD+ + Р, х2 Глицеральдегид-З-фосфат дигидроксиацетонфосфат Глицеральдегид-З-фосфат + дигидроксиацетонфосфат фруктозе-1,6-бисфосфат Фруктозе-1,6-бисфосфат----> фруктозо-6-фосфат + Р^ Фруктозе-6-фосфат глюкозе-6-фосфат Глюкозо-6-фосфат + Н2О----» глюкоза + Р( Итого: 2 Пируват + 4 АТР + 2 GTP + 2 NADH + 2 Н+ + 4 Н2О--> глюкоза + 4 ADP + 2 GDP + 6 Ц + 2 NAD+ Примечание. Обходные реакции выделены оранжевым цветом; все другие реакции — обрат- ные стадии гликолиза. Цифры справа указывают на то, что данная реакция должна быть уч- тена дважды, поскольку для образования молекулы глюкозы требуется два трехуглеродных предшественника. Здесь не рассматривались реакции, необходимые для восполнения в цито- золе NADH, затраченного в глицеральдегидфосфатдегидрогеназной реакции (превращение лактата в пируват в цитозоле или перенос восстановительных эквивалентов из митохондрий в цитозоль в форме малата). Приведенные реакционные схемы не уравнивались по числу атомов водорода и заряду (с. 28). тических затрат связана с необходимостью обеспечить необратимость процесса глюконео- генеза. Во внутриклеточных условиях общее изменение свободной энергии при гликолизе составляет примерно -63 кДж/моль, а изме- нение свободной энергии при глюконеогенезе -16 кДж/моль (в тех же условиях). Таким об- разом, в клетке гликолиз и глюконеогенез про- текают необратимо. Интермедиаты цикла лимонной кислоты и некоторые аминокислоты являются глюкогенными Изложенный выше путь биосинтеза глюкозы ре- ализуется при ее образовании не только из пиру- вата, но также из других четырех-, пяти- и шести- углеродных соединений, возникающих в цикле лимонной кислоты (гл. 16). Цитрат, изоцитрат, а-кетоглутарат, сукцинил-СоА, сукцинат, фу- марат и малат — интермедиаты цикла лимонной кислоты; они могут окисляться, превращаясь в оксалоацетат (см. рис. 16-7). Некоторые или даже все атомы углерода большинства аминокислот, Таблица 14-4 Глюкогенные аминокислоты (сгруппированы по месту вхождения в цикл лимонной кислоты) Превращаются Превращаются в пируват в сукцинил-СоА Аланин Изолейцин* Цистеин Метионин Глицин Треонин Серин Валин Треонин Превращаются Триптофан* в фумарат Превращаются Фенилаланин* в а-кетоглутарат Тирозин* Аргинин Превращаются Глутамат в оксалоацетат Глутамин Аспарагин Гистидин Аспартат Пролин Примечание. Эти аминокислоты служат предшествен- никами глюкозы в крови или гликогена в печени, по- скольку могут превращаться в пируват или интермеди- аты цикла лимонной кислоты. Из 20 аминокислот лишь лейцин и лизин не способны поставлять углерод для синтеза глюкозы. * Эти аминокислоты являются еще и кетогенными (см. рис. 18-21).
14.4 Глюконеогенез [105] образующихся при катаболизме белков, в итоге включаются в состав пирувата или интермедиа- тов цикла лимонной кислоты. Иными словами, такие аминокислоты в конце концов превраща- ются в глюкозу, и поэтому их называют глюко- генными (табл. 14-4). У млекопитающих наиболее важные глю- когенные аминокислоты — аланин и глутамин, переносящие аминогруппы в печень из других тканей (см. рис. 18-9). После удаления ами- ногрупп в митохондриях клеток печени угле- родные скелеты этих аминокислот (пируват и а-кетоглутарат) легко включаются в глюко- неогенез. тонфосфата — промежуточного продукта глюко- неогенеза. Как мы увидим в гл. 21, глицерофосфат явля- ется важным промежуточным продуктом в синтезе триацилглицеринов в адипоцитах, однако эти клет- ки не имеют глицераткиназы и поэтому не могут фосфорилировать глицерин. Вместо этого адипо- циты осуществляют укороченную версию глюко- неогенеза, известную под названием глицеронео- генеза; этот процесс заключается в превращении пирувата в дигидроксиацетонфосфат в соответ- ствии с начальными стадиями глюконеогенеза с по- следующим восстановлением дигидроксиацетон- фосфата до глицерофосфата (см. рис. 21-21). Млекопитающие не могут превращать жирные кислоты в глюкозу Полное превращение жирных кислот в глюкозу в организме млекопитающих невозможно. Как мы увидим в гл. 17, катаболизм большинства жирных кислот приводит к образованию лишь ацетил-Со А. Млекопитающие не могут пре- вращать ацетил-Со А в глюкозу, поскольку ка- тализируемая пируватдегидрогеназой реакция необратима, а в клетках нет другого пути для превращения ацетил-Со А в пируват. Растения, дрожжи и многие бактерии имеют возможность превращать ацетил-Со А в оксало- ацетат (глиоксилатный цикл; см. рис. 16-20), по- этому эти организмы могут использовать жир- ные кислоты в качестве исходного материала для глюконеогенеза. Этот процесс имеет боль- шое значение, например, при прорастании се- мян, пока листья не разовьются в достаточной степени, чтобы с помощью фотосинтеза произ- водить необходимое количество энергии и угле- водов; при прорастании семян запасные жиры используются для производства энергии и син- теза клеточной стенки. Млекопитающие не могут превращать жир- ные кислоты в углеводы, но они могут использо- вать небольшое количество глицерина, образую- щегося при распаде жиров (триацилгж^ерг/нов), для глюконеогенеза. Фосфорилирование гли- церина под действием глицераткиназы с после- дующим окислением среднего атома углерода приводит к образованию в печени дигидроаце- Гликолиз и глюконеогенез взаимно регулируются Если процессы гликолиза (превращение глюкозы в пируват) и глюконеогенеза (превращение пиру- вата в глюкозу) идут одновременно с высокими скоростями, результатом являются потребление АТР и выделение тепла. Например, фосфофрук- токиназа-1 и фруктозобисфосфатаза-1 катализи- руют реакции, идущие в противоположных на- правлениях: АТР + фруктозо-6-фосфат----------> фосфофрукто- киназа-1 ---------> ADP + фруктозо-1,6-бисфосфат Фруктозо-1,6-бисфосфат + Н2О----------> фруктозобис- фосфатаза-1 ---------> фруктозо-6-фосфат + Pi Суммарное уравнение этих двух реакций: АТР + Н2О ADP + Pj + тепло Эти две ферментативные реакции, как и ряд дру- гих реакций гликолиза и глюконеогенеза, регу- лируются аллостерически и путем ковалентной модификации (фосфорилирования). В гл. 15 мы рассмотрим механизмы регуля- ции подробнее. Сейчас достаточно сказать, что регуляция происходит таким образом, что при интенсификации превращения глюкозы в пиру- ват превращение пирувата в глюкозу ослабевает, и наоборот.
[106] Часть II. 14. Гликолиз, глюконеогенез и пентозофосфатный путь Дополнение 14-4 МЕДИЦИНА Почему пифагорейцы не ели фалафель: дефицит глюкозо-б-фосфатдегидрогеназы Бобы фава, или садовые бобы, — основной компонент арабского блюда фалафель, с античных времен использо- вались в пищу жителями Средиземноморья и Ближнего Востока. Греческий философ и математик Пифагор за- претил своим ученикам употреблять в пищу эти бобы из- за того, что они, возможно, были причиной фавизма — за- болевания, приводящего в некоторых случаях к смерти, поскольку при фавизме в течение 24-48 ч после употре- бления в пищу бобов эритроциты начинают лизировать, высвобождая в кровь свободный гемоглобин, развивает- ся анемия, желтуха, увеличивается печень и селезенка. Похожие симптомы наблюдаются при лечении противо- малярийным препаратом примахином, сульфамидными антибиотиками, а также от некоторых гербицидов. Сим- птомы имеют генетическую природу, а именно дефицит фермента глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ), который встречается примерно у 400 млн человек по всему миру. В большинстве случаев дефицит фермента никак не проявляется, а клинические симптомы наблю- даются лишь при сочетании генетического дефекта с воз- действием определенных факторов внешней среды. Первую реакцию пентозофосфатного пути, в ре- зультате которого образуется NADPH, катализирует глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа (см. рис. 14-21). Этот важный для многих процессов биосинтеза восстанови- тель, кроме того, защищает клетки от окислительного повреждения под действием пероксида водорода Н2О2 и свободных супероксидных радикалов — высокоак- тивных окислителей, возникающих в качестве побоч- ных продуктов метаболизма при приеме некоторых лекарств (примахина), а также дивицина — токсичного компонента бобов фава. В норме Н2О2 превращается в воду под действием восстановленного глутатиона и глутатионпероксидазы, а окисленный глутатион об- ратно переходит в восстановленную форму под дей- ствием глутатионредуктазы и NADPH (рис. 1). Кро- ме того, Н2О2 расщепляется на кислород и воду под действием фермента каталазы, для активности кото- рого также необходим NADPH. При недостаточности Г6ФДГ понижена продукция NADPH, поэтому разло- жение Н2О2 ингибируется. В результате в клетке мо- жет происходить пероксидирование липидов, приво- дящее к разрушению мембран эритроцитов, окисление белков, а также возникать дефекты ДНК. Обращает на себя внимание то, как распределяет- ся дефект Г6ФДГ. Этот дефект встречается у 25% на- селения в тропической Африке, в некоторых районах Ближнего Востока и Юго-Восточной Азии, т. е. в об- ластях с высоким уровнем распространения малярии. Кроме эпидемиологических наблюдений, результаты Краткое содержание раздела 14*4 ГЛЮКОНЕОГЕНЕЗ Глюконеогенез происходит везде; это много- стадийный процесс, в результате которого пируват или родственные трехуглеродные соединения (лактат, аланин) превращаются в глюкозу. Семь (обратимых) стадий глюко- неогенеза катализируются теми же фермен- тами, что участвуют в гликолизе. Три необратимые стадии глюконеогенеза осуществляются по обходным путям при участии специфических ферментов глюко- неогенеза: 1) пируваткарбоксилаза и ФЕП- карбоксикиназа катализируют превраще- ние пирувата в ФЕП через оксалоацетат; 2) фруктозобисфосфатаза-1 катализирует де- фосфорилирование фруктозо-1,6-бисфосфа- та; 3) глюкозо-6-фосфатаза катализирует дефосфорилирование глюкозо-6-фосфата. Образование глюкозы из пирувата — энерго- затратный процесс: для образования одной молекулы глюкозы требуется 4 АТР, 2 GTP и 2 NADH. У млекопитающих глюконеогенез протекает в печени и почках, снабжая глюкозой голов- ной мозг, мышцы и эритроциты. Пируваткарбоксилаза активируется в при- сутствии ацетил-СоА, что повышает ско- рость глюконеогенеза, если клетка уже имеет достаточное количество других субстратов (жирных кислот) для получения энергии. Животные не могут превращать в глюкозу ацетил-СоА, образованный при катаболизме жирных кислот; растения и микроорганизмы обладают такой способностью. Гликолиз и глюконеогенез взаимно регули- руются, что позволяет избежать неэкономно- го ведения обоих процессов одновременно.
14.5 Пентозофосфатный путь окисления глюкозы [107] исследований in vitro показали, что в дефицитных по Г6ФДГ эритроцитах замедляется рост возбудителя малярии Plasmodium falciparum. Этот паразит очень чувствителен к окислительному повреждению и унич- тожается при таком уровне окислительного стресса, который не оказывает пагубного влияния на организм хозяина. Баланс между устойчивостью против маля- рии и пониженным сопротивлением к окислительным повреждениям поддерживает существование Г6ФДГ- дефицитного генотипа в популяции людей, живущих в областях распространения малярии. Дефицит Г6ДФГ вызывает серьезные клинические последствия только при чрезмерном окислительном стрессе, вызванном лекарствами, гербицидами или дивицином. Считается, что действие противомалярийного препарата примахина связано с созданием окислитель- ного стресса для возбудителя. Определенная ирония заключается в том, что противомалярийный препарат по тому же самому биохимическому механизму может вызвать болезнь. Дивицин тоже действует в качестве противомалярийного препарата, а употребление бо- бов фава может уберечь от малярии. Отказываясь от фалафеля, пифагорейцы с нормальной активностью Г6ФДГ могли подвергать себя повышенному риску за- болеть малярией! Супер- оксид- радикал 2Н О2 Митохондриальное дыхание, ионизирующая радиация, сульфамидные и противомалярийные препараты, ▼ гербициды, дивицин о2- Пероксид н 0 водорода Н2о<> Гидрок- ' сильный ’ОН радикал 2GSH глутатионпероксидаза > 2Н2О глутатион- редуктаза NADP+ GSSG Окислительное повреждение липидов, белков, ДНК Глюкозо-6- ™ntn‘ фосфат глюкозо-6-фосфат- глюконо дегидрогеназа (Г6ФДГ) о-лактон NADPH + Н Рис. 1. Роль NADPH и глутатиона в защите клеток от ак- тивных форм кислорода. Восстановленный глутатион (GSH) защищает клетку, разрушая пероксид водорода и гидроксильный радикал. Для возвращения окисленной формы глутатиона (GSSG) в восстановленную форму тре- буется NADPH, образующийся под действием глюкозо-б- фосфатдегидрогеназы. е 14.5. Пентозофосфатный путь окисления глюкозы 0В большинстве тканей животных преоб- ладающий путь катаболизма глюкозо-6- фосфата — это гликолитическое разложение до пирувата, основная часть которого затем окисля- ется в цикле лимонной кислоты, приводя в итоге к образованию АТР. Однако глюкозо-6-фосфат подвергается и другим превращениям до специ- альных продуктов, в которых нуждается клетка. В некоторых тканях наиболее важный процесс — окисление глюкозо-6-фосфата до пентозофос- фата через пентозофосфатный путь (цикл или шунт), иначе называемый фосфоглюконатным или гексозомонофосфатным путем (рис. 14-20). На этом окислительном пути в качестве акцеп- тора электронов выступает NADP+, превраща- ющийся в NADPH. Быстроделящиеся клетки, такие как клетки костного мозга, кожи и слизи- стой кишечника, используют пентозы для син- теза РНК, ДНК и таких коферментов, как АТР, NADH, FADH2 и кофермент А. В других тканях важным продуктом пен- тозофосфатного пути являются не пентозы, а донор электронов NADPH, необходимый для восстановительного биосинтеза и защиты от по- вреждающего действия радикалов кислорода. Наибольшую потребность в NADPH испыты- вают те ткани, в которых происходит активный синтез жирных кислот (печень, жировая ткань, молочные железы) или холестерина и стероид- ных гормонов (печень, надпочечники, половые железы). Эритроциты, клетки хрусталика и ро- говицы подвержены непосредственному воз- действию кислорода и, следовательно, вредному воздействию свободных радикалов, образуемых кислородом. Поддержание в этих клетках вое-
[108] Часть II. 14. Гликолиз, глюконеогенез и пентозофосфатный путь Неокисли- тельный Окислительный этап этап I------1 I------------1 НСОН НСОН Глюкозо-6-фосфат носн о СО2 транскетолаза, трансальдолаза NADPH- NADP+< NADPH 6-Фосфоглюконат X------NADP+ 2GSH НСОН Глюкозо-6- фосфат Рибулозо-5-фосфат Рибозо-5-фосфат Нуклеотиды, коферменты, ДНК, РНК глутатион- редуктаза -GSSG Жирные кислоты, стерины и др. восстанови- тельный биосинтез Предшественники Рис. 14-20. Общая схема пентозофосфатного пути. Обра- зующийся на окислительном этапе NADPH используется для восстановления глутатиона (GSSG) (см. доп. 14-4) и поддержания восстановительного биосинтеза. На этом этапе также образуется рибозо-5-фосфат, необходимый для синтеза нуклеотидов, коферментов и нуклеиновых кислот. В тех клетках, которые не используют рибозо-5- фосфат для биосинтеза, на неокислительном этапе про- исходит превращение шести молекул пентозы в пять молекул гексозы (глюкозо-б-фосфата), что позволяет продолжать выработку NADPH и превращать глюкозо-б- фосфат в С02 (за шесть циклов). становительных условий (большие значения и глутатионОх/глутатионКЕ1), и NADPH/NADP+) позволяет предотвратить или ликвидировать окислительное повреждение белков, липидов и других чувствительных молекул. Образующийся в пентозофосфатном цикле NADPH настолько важен для предотвращения окислительных по- вреждений в эритроцитах, что генетический де- фект первого фермента данного метаболическо- го пути глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы может вызывать серьезные клинические последствия (доп. 14-4). Рис. 14-21. Окислительные реакции пентозофосфатного пути. Конечными продуктами данного метаболического пути являются рибозо-5-фосфат, С02 и NADPH. НС СН2ОРО|“ глюкозо-6- фосфатдегидро- геназа NADP+ NADPH + Н С=О НСОН носн НСОН о НС СН2ОРО|- лактоназа /-Н2о Mg2+ оч ZO“ V с НСОН НОСН НСОН НСОН СН2ОРО|“ NADP 6-фосфоглюконат- дегидрогеназа NADPH +Н СО2 СН2ОН С=О I НСОН фосфопентозо- II изомераза Ц НСОН сн2оро!“ сно I НСОН I НСОН I сн2ороГ 6- Фосфоглюконо- S-лактон 6- Фосфоглюконат О-Рибулозо-5- фосфат D-Ph6o3o-5- фосфат
14.5 Пентозофосфатный путь окисления глюкозы [109] На окислительном этапе образуются пентозофосфаты и NADPH Первой реакцией пентозофосфатного пути (рис. 14-21) является окисление глюкозо-6-фос- фата до внутримолекулярного эфира 6-фосфо- глюконо-6-лактона под действием фермента глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ). Акцептором электронов выступает NADP+; равновесие реакции сильно смещено в сторо- ну образования NADPH. Лактон гидролизует- ся под действием специфической лактоназы до 6-фосфоглюконата, который затем окисля- ется и декарбоксилируется 6-фосфоглюконат- дегидрогеназой с образованием кетопентозы рибулозо-5-фосфата. В этой реакции образуется вторая молекула NADPH. (Рибулозо-5-фосфат необходим для регуляции гликолиза и глюко- неогенеза, что будет показано в гл. 15.) Далее фосфопентозоизомераза превращает рибулозо- 5-фосфат в его изомер — рибозо-5-фосфат. В не- которых тканях пентозофосфатный путь на этом завершается; общее уравнение процесса выгля- дит следующим образом: Глюкозо-6-фосфат + NADP+ + Н2О рибозо-5-фосфат + СО2 + 2 NADPH + 2 Н+ В результате образуется NADPH — восстанови- тель в реакциях биосинтеза, а также рибозо-5-фос- фат — предшественник для синтеза нуклеотидов. На неокислительном этапе пентозофосфаты превращаются в глюкозо-6-фосфат В тканях, где особенно требуется NADPH, об- разующиеся на окислительном этапе пенто- зофосфатного пути пентозофосфаты вновь превращаются в глюкозо-6-фосфат. В этом не- окислительном процессе рибулозо-5-фосфат окислительные реакции пентозофосфатного пути Рибозо-5- Седогептулозо-7- Фруктозо-6- фосфат фосфат фосфат изомераза эпимераза а транс- кетолаза Ксилулозо-5- фосфат Глицеральдегид- 3-фосфат транс- альдолаза Эритрозо-4- фосфат 5С ЗС Глюкозо-6- фосфат глюкозофосфат - изомераза Фруктозо-6- фосфат транс- кетолаза Ксилулозо-5- фосфат Глицеральдегид-3- фосфат фруктозе-1,6- оисфосфатаза альдолаза триозофосфат - изомераза 5С ЗС Рис. 14-22. Неокислительные реакции пентозофосфатного пути, а — в этих реакциях происходит превращение пентозофосфатов в гексозофосфаты, что позволяет непрерывно осуществлять реакции окислительного этапа пентозофосфатного пути (рис. 14-21). Здесь действуют как специфические ферменты (транскетолаза и трансальдолаза), так и фермен- ты, задействованные в реакциях гликолиза и глюконеогенеза, б — схема превращений ше- сти пентоз (5С) в пять гексоз (6С). Обратите внимание, что реакции состоят из серии двух взаимопревращений (а). Каждая приведенная здесь реакция обратима; однонаправленные стрелки указывают направление реакций при непрерывном окислении глюкозо-6-фосфата. В темновых реакциях фотосинтеза эти реакции протекают в противоположном направле- нии (см. рис. 20-10).
[110] Часть II. 14. Гликолиз, глюконеогенез и пентозофосфатный путь СН2ОН СН2ОН С=О оч н ТРР о н . с=о снон с транскетолаза Q СНОН L l9 L 19 R1 R2 R1 R2 Кетоза Альдоза (донор) (акцептор) СН2ОН СН2ОН VH С=О 1 но—с—н 1 с=о 1 но—с—н н—с—он 1 н—с—он + 1 н—с—он °ч/н трр С 1 1 н—с—он 1 н—с—он 1 н—с—он 1 1 транскетолаза Н С ОН н—с—он 1 CH2OPOj“ СН2ОРО|“ CH2OPOj“ сн2оро!“ Ксилулозо-5- фосфат Рибозо-5- фосфат Глицеральдегид-З- фосфат Седогептулозо- 7-фосфат Рис. 14-23. Первая реакция пентозофосфатного пути, катализируемая транскетолазой. а — реакция, катализируемая транскетолазой, состоит в переносе двухуглеродного остатка от кетозы (донор) на альдозу (акцептор) с помощью ТРР-связанного фермента, б — превра- щение двух пентозофосфатов в триозофосфат и семиуглеродное соединение седогептулозо- 7-фосфат. СН2ОН 1 с=о 1 СН2ОН но—с—н 1 Ч/н с=о 1 н—с—он 1 °ч/н с 1 но—с—н 1 н—с—он 1 с + 1 . н—с—он 1 н—с—он + 1 н—с—он Н С ОН трансальдолаза н—с—он н—с—он СН2ОРО|“ СН2ОРО|“ СН2ОРО|" СН2ОРО|“ Седогептулозо-7- Глицеральдегид-3 - Эритрозо-4- Фруктозо-6- фосфат фосфат фосфат фосфат Рис. 14-24. Реакция, катализируемая трансальдолазой. СН2ОН С=О I но—с—н I н—с—он СН2ОРО|- V I н—с—он I н—с—он СН2ОРО|“ ТРР транскетолаза СН2ОН с=о I „ „ но-с-н °ч /н I с н—с—он I + I н—с—он н—с—он СН2ОРО|“ СН2ОРО|“ Ксилулозо-5- фосфат Эритрозо-4 - фосфат Глицеральдегид-3- Фруктозо-6- фосфат фосфат Рис. 14-25. Вторая реакция, катализируемая транскетолазой
14.5 Пентозофосфатный путь окисления глюкозы [111] сначала превращается в свой эпимер ксилулозо- 5-фосфат: СН2ОН СН2ОН с=о с=о I I Н— С—ОН ч но—с—н | рибозо-5- | н—С —ОН фосфатэпимераза Н—С —ОН сн2ороГ сн2ороГ Рибулозо-5-фосфат Ксилулозо-5-фосфат Затем в результате перегруппировки углеродного скелета (рис. 14-22) шесть пятиуглеродных фос- фатов превращаются в пять шестиуглеродных фосфатов, завершая тем самым цикл и способ- ствуя окислению глюкозо-6-фосфата и образова- нию NADPH. Реализация данного цикла приво- дит в итоге к превращению глюкозо-6-фосфата в шесть молекул СО2. В этом процессе участвуют два фермента, задействованные исключительно в пентозофосфатном пути, а именно, транскетола- за и трансальдолаза. Транскетолаза катализиру- ет перенос двухуглеродного фрагмента от кетозы (донор) на альдозу (акцептор) (рис. 14-23, а). Первой реакцией пентозофосфатного пути с уча- стием транскетолазы является перенос атомов С-1 и С-2 от ксилулозо-5-фосфата на рибозо-5- фосфат, в результате образуется семиуглеродный продукт седогептулозо-7-фосфат (рис. 14-23, б). Оставшийся от ксилулозы трехуглеродный фраг- мент превращается в глицеральдегид-3-фосфат. Далее фермент трансальдолаза катализиру- ет реакцию, напоминающую альдолазную реак- цию гликолиза: происходит перенос трехуглерод- ного фрагмента от седогептулозо-7-фосфата на глицеральдегид-3-фосфат, в результате образуются фруктозо-6-фосфат и тетроза эритрозо-4-фосфат (рис. 14-24). Теперь опять начинает действовать транскетолаза, которая из эритрозо-4-фосфата и ксилулозо-5-фосфата образует фруктозо-6-фосфат и глицеральдегид-3-фосфат (рис. 14-25). Две мо- лекулы глицеральдегид-3-фосфата, образовавшие- ся при повторении этих реакций, превращаются в молекулу фруктозо-1,6-бисфосфата, как в процес- се глюконеогенеза (рис. 14-16). И, наконец, фрук- тозобисфосфатаза-1 и глюкозофосфатизомераза превращают фруктозо-1,6-бисфосфат в глюкозо-6- фосфат. Цикл завершен: шесть пентозофосфатов превращены в пять гексозофосфатов (рис. 14-22, б). Для действия транскетолазы необходим ко- фактор тиаминпирофосфат (ТРР), который ста- а Транскетолаза ОН I нон2с—С II резонансная стабилизация ТРР ОН I НОН2С-С“ Трансальдолаза СН2ОН Г ОН LysX N ЧС Н Н резонансная стабилизация СН2ОН Протонированное основание Шиффа Рис. 14-26. Стабилизация карбанионов путем ковалент- ных взаимодействий с транскетолазой и трансальдо- лазой. а — кольцо ТРР стабилизирует двухуглеродный карбанион, переносимый транскетолазой (механизм дей- ствия ТРР см. на рис. 14-14). б — в реакции, катализи- руемой трансальдолазой, стабилизация трехуглеродного карбаниона, возникшего в результате альдольного рас- щепления, происходит путем образования протониро- ванного основания Шиффа между е-аминогруппой боко- вой цепи лизина и субстратом. билизирует образующийся в реакции двухугле- родный карбанион (рис. 14-26, а) точно так же, как это было описано для пируватдекарбоксила- зы (рис. 14-14). Трансальдолаза (рис. 14-26, б) стабилизирует карбанион, возникающий при об- разовании основания Шиффа между боковой цепью остатка лизина и карбонильной группой субстрата (кетозы). Изображенный на рис. 14-21 процесс назы- вают окислительным пентозофосфатным путем. Первые две реакции окисления характеризуются большим отрицательным изменением стандарт- ной свободной энергии и необратимы во внутри- клеточных условиях. Реакции неокислительного этапа пентозофосфатного пути (рис. 14-22) лег- ко обратимы и, следовательно, предоставляют возможность для превращения гексозофосфатов в пентозофосфаты. Как мы увидим в гл. 20, пре- вращение гексозофосфатов в пентозофосфаты
[112] Часть II. 14. Гликолиз, глюконеогенез и пентозофосфатный путь занимает центральное место в фотосинтетиче- ской ассимиляции СО2 у растений. Данный путь метаболизма, называемый восстановительным пентозофосфатным путем, фактически пред- ставляет собой обращение процесса, изображен- ного на рис. 14-22, и использует многие из ука- занных ферментов. Все ферменты, принимающие участие в пентозофосфатном пути, локализованы в ци- тозоле, подобно ферментам гликолиза и боль- шинству ферментов глюконеогенеза. Действи- тельно, все три процесса связаны наличием нескольких общих интермедиатов и ферментов. Глицеральдегид-З-фосфат, образующийся при действии транскетолазы, легко превращается в дигидроксиацетонфосфат под действием глико- литического фермента триозофосфатизомеразы, а две названные триозы под действием альдола- зы образуют фруктозо-1,6-бисфосфат, как в про- цессе глюконеогенеза. Триозофосфаты же могут окисляться до пирувата в реакциях гликолиза. Путь превращения триоз определяется потребно- стью клетки в пентозофосфатах, NADPH и АТР. Глюкозо-б-фосфат распределяется между гликолизом и пентозофосфатным путем Участие глюкозо-6-фосфата в гликолизе или пентозофосфатном пути зависит от текущих нужд клетки и концентрации NADP+ в цито- золе. Без этого акцептора электронов первая реакция пентозофосфатного пути (катализи- руемая Г6ФДГ) протекать не может. Если в клетке в результате восстановительных реак- ций биосинтеза NADPH быстро превращается в NADP+, уровень NADP+ повышается, проис- ходит аллостерическая регуляция Г6ФДГ, и в итоге увеличивается количество глюкозо-6- фосфата, включающегося в пентозофосфатный путь (рис. 14-27). При снижении потребностей в NADPH уменьшается уровень NADP+, пен- тозофосфатный путь замедляется и глюкозо- б-фосфат в большей степени направляется на гликолиз. Глюкоза Синдром Вернике-Корсакова усугубляется дефектом транскетолазы Глюкозо-6- гликолиз + АТР в Синдром Вернике-Корсакова связан с не- достаточностью тиамина, который входит в состав тиаминпирофосфата (ТРР). Этот син- дром чаще встречается при хроническом зло- употреблении алкоголем, который затрудняет всасывание тиамина в кишечнике. Симптомы заболевания могут усиливаться при мутации гена транскетолазы, что приводит к образова- нию фермента, сродство которого к ТРР может быть в 10 раз ниже, чем у нормального фермен- та. Этот дефект делает человека гораздо более чувствительным к недостаточности тиамина: даже умеренная недостаточность этого вещества (неощутимая для людей с нормальной формой транскетолазы) может привести к уменьшению содержания ТРР ниже того уровня, который не- обходим для насыщения фермента. В результа- те замедляются все реакции пентозофосфатного пути. У страдающих синдромом Вернике-Корса- кова это приводит к усилению симптомов заболе- ваания, что выражается в потере памяти, спутан- ности сознания и частичном параличе. фосфат пентозо- <—’с--------------. фосфатный 4---ЫАВРН путь 6-Фосфоглюконо- лактон > NADPH----- Пентозо - фосфаты Рис. 14-27. Роль NADPH в регуляции распределения глюкозо-6-фосфата между гликолизом и пентозофос- фатным путем. Если NADPH образуется быстрее, чем ис- пользуется в реакциях биосинтеза и для восстановления глутатиона (см. рис. 14-20), концентрация NADPH увели- чивается и происходит ингибирование первого фермента пентозофосфатного пути. В результате больше глюкозо- б-фосфата оказывается доступным для гликолиза.
Дополнительная литература для дальнейшего изучения [113] Краткое содержание раздела 14.5 ПЕНТОЗОФОСФАТНЫЙ ПУТЬ ОКИСЛЕНИЯ ГЛЮКОЗЫ Окислительный пентозофосфатный путь (ина- че называемый фосфоглюконатным или гексо- зомонофосфатным путем) состоит в окислении и декарбоксилировании глюкозо-6-фосфата у атома С-1 с восстановлением NADP+ до NADPH и образованием пентозофосфатов. NADPH служит восстановителем в реакци- ях биосинтеза, а рибозо-5-фосфат — предше- ственник нуклеотидов и нуклеиновых кислот. Быстрорастущие ткани, а также те клетки, что осуществляют активный биосинтез жирных кислот, холестерина или стероидных гормонов, направляют на пентозофосфатный путь больше глюкозо-6-фосфата, чем ткани, менее нуждаю- щиеся в пентозофосфатах или восстановителе. Окислительный этап пентозофосфатного пути представляет собой двухступенчатое пре- вращение глюкозо-6-фосфата до рибулозо-5- фосфата, сопровождающееся восстановлением NADP+ до NADPH. Неокислительный этап состоит в превращении пентозофосфатов в глюкозо-6-фосфат, что запускает цикл заново. На втором (неокислительном) этапе пентозо- фосфатного пути транскетолаза (с ТРР в ка- честве кофактора) и трансальдолаза катали- зируют взаимопревращения трех-, четырех-, пяти-, шести- и семиуглеродных сахаров, что приводит к обратимому образованию пяти гексозофосфатов из шести пентозофосфатов. В темновых реакциях фотосинтеза эти же ферменты катализируют обратный процесс, называемый восстановительным пентозофос- фатным путем, а именно, превращение пяти гексозофосфатов в шесть пентозофосфатов. Генетический дефект транскетолазы, снижа- ющий сродство фермента к ТРР, усугубляет синдром Вернике-Корсакова. Участие глюкозо-6-фосфата в гликолизе или пентозофосфатном пути в большой степени определяется соотношением концентраций NADP+hNADPH. Ключевые термины Термины, выделенные жирным шрифтом, объясни ются в глоссарии. ацилфосфат 76 биотин 100 брожение 67 галактоземия 90 гексозомонофосфатный путь 107 гипоксия 69 гликолиз 66 глюконеогенез 97 изомеразы 87 изоферменты 72 молочнокислое бро- жение 69 мутазы 87 непереносимость лак- тозы 88 окислительное фосфо- рилирование в дыхательной цепи 78 пентозофосфатный путь 107 спиртовое брожение 69 тиаминпирофосфат (ТРР) 93 фосфоглюконатный путь 107 фосфоенолпируват (ФЕП) 79 фосфорилирование на уровне субст- рата 78 Дополнительная литература для дальнейшего изучения Общие сведения Fruton, J.S. (1999) Proteins, Genes, and Enzymes: The Interplay of Chemistry and Biology, Yale University Press, New Haven. Подробно изложена история изучения гликолиза. Гликолиз Boiteux, А. & Hess, В. (1981) Design of glycolysis. Philos. Trans. R. Soc. Lond. Ser. В Biol. Sci. 293,5-22. Обзор средней сложности, посвященный гликолизу и классическим представлениям о его контроле. Dandekar, Т., Schuster, S., Snel, В., Huynen, М., & Bork, Р. (1999) Pathway alignment: application to the comparative analysis of glycolytic enzymes. Biochem.J. 343,115-124. Обзор среднего уровня сложности на базе данных по биоинформатике, посвященный эволюции гликолиза. Dang, C.V. & Semenza, G.L. (1999) Oncogenic alterations of metabolism. Trends Biochem. Sci. 24,68-72. Краткий обзор молекулярных основ усиления глико- лиза в опухолях. Erlandsen, Н., Abola, Е.Е., & Stevens, R.C. (2000) Com- bining structural genomics and enzymology: completing the picture in metabolic pathways and enzyme active sites. Curr. Opin. Struct. Biol. 10,719-730. Обзор среднего уровня сложности, посвященный структуре гликолитических ферментов. Gatenby, R.A. & Gillies, R.J. (2004) Why do cancers have high aerobic glycolysis? Nat. Rev. Cancer 891-899. Hardie, D.G. (2000) Metabolic control: a new solution to an old problem. Curr. Biol. 10, R757-R759.
[114] Часть II. 14. Гликолиз, глюконеогенез и пентозофосфатный путь Harris, A.L. (2002) Hypoxia — a key regulatory factor in tu- mor growth. Nat. Rev. Cancer 2,38-47. Heinrich, R., Melendez-Hevia, E., Montero, E, Nuno, J.C., Stephani, A., & Waddell, T.D. (1999) The structural design of glycolysis: an evolutionary approach. Biochem. Soc. Trans. 27, 294-298. Keith, B. & Simon, M.C. (2007) Hypoxia-inducible factors, stem cells, and cancer. Cell 129,465-472. Обзор среднего уровня сложности. Knowles, J. & Albery, W.J. (1977) Perfection in enzyme cata- lysis: the energetics of triose phosphate isomerase. Acc. Chem. Res. 10,105-111. Kresge, N., Simoni, R.D., & Hill, R.L. (2005) Otto Fritz Meyerhof and the elucidation of the glycolytic pathway. J. Biol. Chem. 280,3. Краткий обзор классических работ; доступен в интернете. Kritikou, Е. (2006) р53 turns on the energy switch. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7,552-553. Pelicano, H., Martin, D.S., Zu, R-H., & Huang, P. (2006) Glycolysis inhibition for anticancer treatment. Oncogene 25, 4633-4646. Обзор среднего уровня сложности. Phillips, D., Blake, C.C.E, & Watson, H.C. (eds.) (1981) The Enzymes of Glycolysis: Structure, Activity and Evolution. Philos. Trans. R. Soc. Bond. Ser. В Biol. Sci. 293, 1-214. Сборник превосходных обзорных статей по гликоли- тическим ферментам; доступен для начинающих изучать биохимию. Plaxton, W.C. (1996) The organization and regulation of plant glycolysis. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 47, 185-214. Очень полезный обзор на тему внутриклеточной лока- лизации гликолитических ферментов и регуляции глико- лиза у растений. Rose, I. (1981) Chemistry of proton abstraction by glycolytic enzymes (aldolase, isomerases, and pyruvate kinase). Philos. Trans. R. Soc. Lond. Ser. В Biol. Sci. 293,131-144. Обзор среднего уровня сложности, посвященный меха- низму действия данных ферментов. Shirmer, Т. & Evans, P.R. (1990) Structural basis for the allosteric behavior of phosphofructokinase. Nature 343, 140-145. Smith, T.A. (2000) Mammalian hexokinases and their abnormal expression in cancer. Br. J. Biomed. Sci. 57, 170-178. Обзор посвящен четырем изоферментам гексокиназы у млекопитающих — их свойствам, тканевому распределе- нию и экспрессии при развитии опухолей. Метаболические пути, питающие гликолиз Elsas, L.J. & Lai, К. (1998) The molecular biology of galacto- semia. Genet. Med. 1,40-48. Novelli, G. & Reichardt, J.K. (2000) Molecular basis of disor- ders of human galactose metabolism: past, present and future. Mol. Genet. Metab. 71,62-65. Petry, K.G. & Reichardt, J.K. (1998) The fundamental im- portance of human galactose metabolism: lessons from genetics and biochemistry. Trends Genet. 14,98-102. Van Beers, E.H., Buller, H.A., Grand, R.J., Einerhand, A.W.C., & Dekker, J. (1995) Intestinal brush border glyco- hydrolases: structure, function, and development. Grit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 30,197-262. Брожение Demain, A.L., Davies, J.E., Atlas, R.M., Cohen, G., Hers- hberger, C.L., Hu, W.-S., Sherman, D.H., Willson, R.C., & Wu, J.H.D. (eds). (1999) Manual of Industrial Microbio- logy and Biotechnology, American Society for Microbiology, Washington, D.C. Классическое введение в промышленные методы фер- ментации. Liese, A., Seelbach, К., & Wandrey, С. (eds). (2006) Indus- trial Biotransformations, John Wiley & Sons, New York. Использование микроорганизмов в промышленных синтезах продуктов из дешевых исходных материалов. Глюконеогенез Gerich, J.E., Meyer, С., Woerle, H.J., & Stumvoll, М. (2001) Renal gluconeogenesis: its importance in human glu- cose homeostasis. Diabetes Care 24,382-391. Обзор средней сложности, посвященный роли почек в глюконеогенезе. Gleeson, Т. (1996) Post-exercise lactate metabolism: a com- parative review of sites, pathways, and regulation. Annu. Rev. Physiol. 58,565-581. Hers, H.G. & Hue, L. (1983) Gluconeogenesis and related aspects of glycolysis. Annu. Rev. Biochem. 52,617-653. Matte, A., Tari, L.W, Goldie, H., & Delbaere, L.T.J. (1997) Structure and mechanism of phosphoenolpyruvate carboxyki- nase. J. Biol. Chem. 272,8105-8108. Пентозофосфатный путь окисления глюкозы Chayen, J., Howat, D.W., & Bitensky, L. (1986) Cellu- lar biochemistry of glucose 6-phosphate and 6-phospho-