Жидкостная хроматография при высоких давлениях - Энгельгардт Х.

Автор: Энгельгардт Х.

Теги: другие физико-химические методы анализа (кроме оптических) физика химия анализ аналитическая химия естественные науки хроматография

Год: 1980

Похожие

Практическая газовая и жидкостная хроматография

Спутник хроматографиста. Методы жидкостной хроматографии

Практическая высокоэффективная жидкостная хроматография

Растворитель как средство управления процессом в жидкостной хроматографии

Текст

Х.ЭНГЕЛЬГАРДТ
ЯНН!

HEINZ ENGELHARDT % ЭНГЕЛЬГАРДТ
hochdruck- WM А ^АГТН А О
FLUSSIGKEITS- /IVM ДЛЛ/V 1П A/I
CHROMATOGRAPHIE
Zweite, iiberarbeitete
und erweiterte Auflage
Mit 62 Abbildungen
und 18 Tabellen
ХРОМАТОГРАФИЯ
ПРИ ВЫСОКИХ
ДАВЛЕНИЯХ
Перевод с английского
доктора хим. наук О. Г. Ларионова
под редакцией
чл.-корр. АН СССР [К. В. Чмутова
SPRINGER-VERLAG ИЗДАТЕЛЬСТВО «МИР»
BERUN HEIDELBERG NEW YORK МОСШХ 1980

УДК 543.544
Книга посвящена одному из наиболее эффективных ме-
методов хроматографии, обеспечивающему анализ сложных био-
биологических объектов, которые не выдерживают высоких тем-
температур (например, при газохроматографических приемах раз-
разделения).
Предназначена для химиков-аналитиков и физико-хими-
ков - работников научно-исследовательских институтов, про-
промышленных предприятий, учебных заведений.
Редакция литературы по химии
2603040000
э 20503-100
041@1 )-80
100-80
© by Springer-Verlag Berlin Heidelberg 1975, 1977.
All Rights Reserved. Authorized translation from
German language edition published by Springer-
Verlag
Berlin - Heidelberg - New York
© Перевод на русский язык, «Мир», 1980
ПРЕДИСЛОВИЕ РЕДАКТОРА ПЕРЕВОДА
Со времени возникновения метода жидкостной хроматографии
при высоких давлениях прошло немногим более десяти лет. Для хро-
хроматографии с ее темпами развития это довольно большой срок. Тео-
Теоретическая база и основная экспериментальная методика были раз-
разработаны уже давно.
В физико-химической картине и химизме процесса мы не обнару-
обнаружим ничего нового. Закономерности обычной классической колоноч-
колоночной хроматографии соблюдаются во всех случаях и при высоких да-
давлениях, но подбор условий эксперимента (дисперсность сорбентов,
скорость потока, размеры колонок) специфичны для этого прогрес-
прогрессивного метода.
Для специалиста в области классической хроматографии наи-
наибольший интерес представят, конечно, первые главы, содержащие ос-
основные данные о приемах работы и аппаратуре. Осуществить разде-
разделение смесей растворов веществ, как мы уже говорили, можно
и обычными колоночными методами, и в последующих главах автор
рассматривает все виды колоночной хроматографии — адсорбцион-
адсорбционную, распределительную, ионообменную и гель-фильтрационную.
Однако он постоянно возвращается к специфике исследований при
высоких давлениях и дает весьма полезные указания об особенностях
применения в каждом случае хроматографии при высоких давлениях,
позволяющей ускорить процесс анализа. Предлагаемая вниманию
читателей книга насыщена экспериментальным материалом главным
образом из области органической и биологической химии, отличает-
отличается компактностью изложения и, несомненно, будет полезна для даль-
дальнейшего развития метода советскими исследователями.
К. Чмутов

ПРЕДИСЛОВИЕ К НЕМЕЦКОМУ ИЗДАНИЮ
Начиная примерно с 1969 г. жидкостная хроматография при вы-
высоких давлениях получила признание как стандартный метод разде-
разделения. На развитие этого метода наложило отпечаток то обстоятель-
обстоятельство, что его «пионеры» были специалистами в области газовой
хроматографии. Они полагали, что принципы и приемы прежнего
метода можно полностью использовать в области скоростной жид-
жидкостной хроматографии. Прошло некоторое времй, прежде чем стало
окончательно ясно, что это не так. Хотя в теоретическом аспекте без-
безразлично, является ли элюент газом или жидкостью, количественное
различие таких параметров, как вязкость и коэффициент диффузии,
существенно меняет картину.
Сегодня, по-видимому, все признают, что в аппаратурном отно-
отношении жидкостная хроматография при высоком давлении даже про-
проще, чем газовая хроматография. Хроматографисты пришли к едино-
единому мнению, что оптимальный размер частиц неподвижной фазы
должен составлять 5 или 10 мкм.
Поскольку для разработки коммерческих приборов требуется
примерно два года, то само собой разумеется, что имеющиеся в на-
настоящее время в продаже приборы не вполне отвечают последним
достижениям техники. Автор книги поставил перед собой очень важ-
важную задачу - познакомить читателя, не вдаваясь в детальное обсу-
обсуждение теории хроматографии, с теми вопросами, которые он дол-
должен решить, выбирая прибор для хроматографии при высоких
давлениях и систему неподвижная фаза - элюент для решения кон-
конкретной задачи разделения.
И. Халаш
ПРЕДИСЛОВИЕ АВТОРА
КО ВТОРОМУ ИЗДАНИЮ
Жидкостная хроматография при высоких давлениях развивается
чрезвычайно быстрыми темпами. За время, прошедшее после опуб-
опубликования первого издания этой книги, была усовершенствована ап-
аппаратура, разработаны новые разделительные системы, в известной
мере завершилась дискуссия о влиянии размера частиц на раздели-
разделительную способность. Поэтому при подготовке второго издания мы
значительно переработали весь старый материал и дополнили книгу
новыми разделами. Так, влияние размера частиц на разделительную
способность рассматривается в специальном разделе, которым до-
дополнена гл. II, а в гл. III после описания методов заполнения коло-
колонок обсуждаются способы их характеристики.
В настоящее время многие разделения проводят на обращенных
фазах, и в гл. VI «Адсорбционная хроматография» подробно рассма-
рассматриваются свойства этих фаз и области их применения.
Свойства химически связанных фаз с функциональными группами
пока мало изучены, тем не менее мы сочли необходимым остано-
остановиться и на этом вопросе. Вероятно, в дальнейшем такие фазы в со-
сочетании с водными элюентами будут широко применяться в ситовой
хроматографии.
Развитие жидкостной хроматографии при высоком давлении еще
продолжается.
В заключение мне хотелось бы поблагодарить всех коллег, друзей
и сотрудников за их ценные указания и предложения.
Саарбрюккен, март 1977
X. Энгельгардт

ПРЕДИСЛОВИЕ АВТОРА
К ПЕРВОМУ ИЗДАНИЮ
Эта книга знакомит хроматографиста, начинающего работать
в области скоростной жидкостной хроматографии, с аппаратурой,
приемами разделения и возможностями метода. Для того чтобы чи-
читатель мог выбрать нужные ему элементы прибора, мы подробно
обсуждаем основные вопросы работы аппаратуры.
Теория метода изложена нами очень кратко; в главе «Основные
положения» упоминаются только важнейшие параметры прагматиче-
прагматической хроматографии. В то же время факторы, влияющие на разделе-
разделение, рассматриваются очень подробно и сравнительно большое вни-
внимание уделяется параметрам, которые приводят к ошибкам и плохой
воспроизводительности. Я надеюсь, что ни у кого из читателей не
создастся впечатление, что надежность скоростной жидкостной хро-
хроматографии меньше, чем у других хроматографических методов. Та-
Такое мнение было бы ошибочным.
Жидкостная хроматография при высоких давлениях развивается
настолько быстро, что в тот момент, когда эта книга выйдет, ее уже
можно будет дополнить новыми материалами. Поэтому пусть меня
простит мой коллега, если он обнаружит отсутствие цитаты из его
последней важной работы.
В этой книге приведены результаты и идеи длительной плодо-
плодотворной дискуссии в области «прикладной физической химии», про-
проходившей в университете Саара. Я благодарю за терпение и помощь
моего уважаемого коллегу профессора, доктора И. Халаша и сотруд-
сотрудников рабочей группы, особенно докторов Й. Ассхауера, К. Хофмана
и И. Себестиана. Я благодарю моего уважаемого учителя профессо-
профессора, доктора Г. Хессе Эрлангена за содействие в работе.
Саарбрюккен, февраль 1975
X. Энгельгардт
Глава I
МЕТОД ХРОМАТОГРАФИИ
Хроматографическое разделение с жидкой подвижной фазой
впервые было проведено русским ботаником Цветом [1]. Этот ме-
метод предназначался для качественного и количественного анализа
смесей, а также для препаративных разделений. Диаметр первых ко-
колонок превышал 1 см [2 — 5]. Подвижная фаза перемещалась по ко-
колонке под действием силы тяжести, иногда, чтобы ускорить движе-
движение, создавали гидростатическое давление, однако скорость потока
не превышала 60 мл/ч на 1 см2 поперечного сечения колонки (т. е.
линейная скорость была меньше 0,02 см/с). Для того чтобы получить
при заданном давлении такую скорость потока, брали насадку со
средним диаметром частиц примерно 100 мкм (или больше). Разде-
Разделительная способность таких колонок была не особенно хорошей,
в частности из-за постоянной перегрузки колонки анализируемой
пробой.
Разработанные позднее методы хроматографии в тонких слоях,
а именно бумажная [6, 7] и тонкослойная хроматография [8, 9],
в значительной степени вытеснили колоночную хроматографию, так
как последние два метода позволяют быстрее и лучше разделить
анализируемые соединения, кроме того, используя напыляемые ре-
реагенты, значительно проще идентифицировать разделенные соедине-
соединения.
В последние годы интерес к колоночной хроматографии с под-
подвижной жидкой фазой вновь резко возрос, так как, во-первых, появи-
появились чувствительные детекторы, позволяющие обнаруживать в элюа-
те вещества пробы, во-вторых, в жидкостной хроматографии начали
применять методики и приемы, отработанные для газовой хромато-
хроматографии [10].
В жидкостной хроматографии при высоких давлениях [11 — 15]
разделение проводят в тонких колонках с внутренним диаметром
2—6 мм. Колонки заполняют частицами, средний диаметр которых
составляет менее 50 мкм. Обычная линейная скорость перемещения
жидкой фазы равна 0,1 —0,5 см/с и более; достигается это в результа-
результате использования высокого давления A0—400 атм) на входе
в колонку.

10
Глава I
Классификация хроматографических методов
Любое хроматографическое разделение возможно лишь при усло-
условии, что входящие в состав анализируемой пробы соединения пере-
перемещаются с разной скоростью благодаря различным величинам ве-
вероятности задерживания в неподвижной фазе. Подвижная фаза,
вместе с которой перемещается разделяемое вещество, может быть
газообразной или жидкой. В зависимости от типа неподвижной фазы
различают два основных хроматографических метода. Если непо-
неподвижная фаза — твердое вещество с большой активной поверх-
поверхностью, а подвижная фаза - газ, метод носит название газоадсорб-
газоадсорбционной хроматографии, если же подвижная фаза — жидкость, то это
жидкостная адсорбционная хроматография. Когда неподвижной фа-
фазой служит жидкость, насыщающая инертный носитель с большим
объемом пор, то в зависимости от характера подвижной фазы разли-
различают газораспределительную (газожидкостную) хроматографию
и жидкостную распределительную хроматографию. В адсорбционной
хроматографии в качестве неподвижной фазы используют активное
твердое вещество. Четко разграничить адсорбционную и распредели-
распределительную хроматографию практически невозможно. Так, в адсорб-
адсорбционной хроматографии, где часто используют предварительно про-
пропитанные адсорбенты, наблюдается непрерывный переход от чистой
адсорбции к более или менее явно выраженному распределению [16].
Точно так же рассматривая распределительный механизм, нельзя
пренебрегать влиянием носителя жидкой неподвижной фазы, особен-
особенно если поверхность носителя велика.
Четко классифицируются только ионообменная и ситовая (назы-
(называемая также гель-фильтрационной или гель-проникающей) хромато-
хроматография. В первом методе [17, 18] разделение проводится на ионооб-
менниках — нерастворимых пористых материалах (в настоящее вре-
время главным образом органических полимерах), на поверхности
которых содержатся катионные или анионные центры, способные об-
обмениваться на содержащиеся в подвижной фазе анионы и катионы.
В ситовой хроматографии [19, 20] используют пористые твердые ма-
материалы с определенным узким распределением пор по диаметрам.
Молекулы, эффективный диаметр которых больше, чем диаметр пор,
не могут диффундировать внутрь таких материалов и поэтому про-
проходят через колонку быстрее, чем молекулы меньших размеров, ко-
которые могут диффундировать внутрь пор. Это так называемая «хро-
«хроматография исключения». Поскольку в порах перенос вещества
в направлении оси колонки отсутствует, маленькие молекулы дви-
движутся через колонку медленнее.
Газохроматографическим методом целесообразно проводить раз-
разделение летучих соединений. Многие из нелетучих при нормальном
давлении веществ обычно несложно количественно перевести в лету-
летучие производные, которые можно разделить методом газовой хрома-
Метод хроматографии
11
Ситовая хроматография
Жидкостная хроматография
Газовая хроматография
_L
, ю юо 1000 10000 100000 1000000
Молекулярная масса
Рис. 1.1. Области применения хроматографических методов разделения.
тографии. Поэтому трудно указать точно верхнюю границу молеку-
молекулярной массы веществ, подлежащих разделению газохроматографи-
ческим методом.
Методом жидкостной хроматографии анализируют прежде всего
такие вещества, которые нельзя перевести в газовую фазу, не вызвав
их разложения. При сорбции небольших и неполярных молекул
большую роль играет конкуренция молекул растворителя, находя-
находящихся в большом избытке. Поэтому для разделения таких молекул
жидкостная хроматография непригодна. При разделении больших
молекул становятся заметными эффекты, связанные с «исключе-
«исключением». Жидкостная хроматография постепенно переходит в область
ситовой хроматографии, т. е. разделение проводится исключительно
в соответствии с формой молекул. На рис. 1.1 представлены при-
примерные области применения этих трех хроматографических методов.
При хроматографическом разделении применяют также различные
способы ввода пробы [21].
1. Непрерывный ввод пробы
Пробу или ее раствор можно непрерывно вводить в разделитель-
разделительную колонку. Такой метод разделения называют фронтальным ана-
анализом [22], или адсорбционной фильтрацией. Если пробу вводят
в виде раствора, то растворитель следует выбрать таким образом,
чтобы его взаимодействие с насадкой колонки было минимальным.
При таком разделении можно в чистом виде выделить только одно
наиболее слабо удерживающееся вещество. Все остальные выйдут из
колонки в виде смеси. Поскольку емкость колонки исчерпывается
при появлении из нее смеси исходного состава, такое разделение
можно проводить только как периодическое. Этот метод вряд ли

12
Глава I
пригоден для жидкостной хроматографии высокого давления, но его
часто используют для очистки применяемых в хроматографии рас-
растворителей [5].
2. Периодический ввод пробы
а. Элюентный анализ. В этом случае пробу вводят в непрерывный
поток элюента. Состав элюента до и непосредственно после ввода
пробы остается неизменным. Если состав не меняется в течение всего
разделения и взаимодействие элюента с неподвижной фазой незначи-
незначительно по сравнению с взаимодействием ее с пробой, то говорят об
элюентном анализе, или элюентной хроматографии [3]. На типичной
элюентной хроматограмме в идеальном случае зоны разделяемых
соединений отделены друг от друга зонами чистого элюента.
б. Градиентное элюирование. Если в процессе анализа непрерывно
меняют состав элюента, увеличивая его элюирующую способность
в результате усиления взаимодействия элюента с неподвижной фа-
фазой, то говорят о градиентном элюировании [24]. Этот метод позво-
позволяет сократить длительность анализа. Даже сильно удерживающиеся
составные части пробы выходят из колонки в виде зон более узких,
чем при использовании простого элюентного анализа.
в. Вытеснительный метод [25]. В этом методе после введения про-
пробы состав элюента меняют таким образом, что его взаимодействие
с неподвижной фазой становится более интенсивным, чем взаимодей-
взаимодействие с нею всех входящих в состав пробы соединений, и в результа-
результате все эти соединения полностью вытесняются из неподвижной фазы.
Вытеснитель двигает перед собой составные части пробы, которые
располагаются в порядке возрастания вероятности удерживания
в неподвижной фазе. В элюате, вытекающем из разделительной ко-
колонки, вещества пробы появляются непосредственно друг за другом.
Вид зон определяется вытеснителем.
В отличие от хроматограмм, получаемых элюентным методом,
на вытеснительных хроматограммах зоны не отделены друг от друга
зонами чистого элюента — из-за диффузии переходные зоны сме-
смешаны. Именно поэтому вытеснительная хроматография не нашла
дальнейшего развития. Однако при градиентном элюировании в кон-
конце опыта часто добавляют вытеснитель. С помощью такого приема
колонку можно регенерировать, удалив из иее в свою очередь вытес-
вытеснитель менее сильно удерживаемым элюентом.
Разделение анализируемой пробы на отдельные компоненты про-
проводят почти исключительно элюентным методом, поскольку зоны
выделяемых соединений отделены друг от друга зонами чистого
элюента. Площади пиков на хроматограммах пропорциональны ко-
количеству вещества в пробе, что позволяет применять элюентную
хроматографию для количественного анализа. Положение максиму-
максимумов симметричных пиков используют для качественой идентифика-
Метод хроматографии
13
ции составных частей пробы. Хроматография высокого давления от-
отличается от обычной, традиционной, жидкостной хроматографии
большей скоростью анализа, простотой идентификации и количест-
количественного определения разделенных веществ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Tswett M. S., Bei. dtsch. botan. Ges., 24, 316, 384 A906). Vgl. Hesse G.,
Weil H., in: Wielm-Mitteilungen Al 8, Eschwege, 1954.
2. Lederer E., Lederer M., Chromatography 2nd ed. Amsterdam, Elsevier, 1957.
3. Lederer E. (Hrsg.), Chromatographie en chimie organique et biologique.
Vol. I u. II. Paris, Masson, 1959, 1960.
4. Heftman E. (Hrsg.), Chromatography. New York, Reinhold, 1969.
5. Hesse G., Chromatographisches Praktikum. Frankfurt/Main, Akad. Ver-
lagsges., 1968.
6. Cramer F., Papierchromatographie. Weinheim, Verlag Chemie, 1958.
7. Hais J., Macek K., Handbuch der Papierchromatographie. Bd. I. Jena,
Gaustav — Fischer— Verlag, 1958.
8. Stahl E. (Hrsg.), Handbuch der Diinnschichtchromatographie. 2. Aufl.
Berlin-Heidelberg-New York, Springer, 1967. [См. перевод первого из-
издания: Шталь Э. и др. Хроматография в тонких слоях.— М.: Мир, 1965.]
9. Randerrath К., Diinnschichtchromatographie. Weinheim, Verlag Chemie, 1966.
10. Giddings J. C, Dynamics of Chromatography. New York, Marcel Dekker,
1965.
11. Современное состояние жидкостной хроматографии.-М.: Мир, 1974,
325 с.
12. Gouw Т. Н. (Ed.), Guide to Modern Methods of Instrumental Analysis,
New York, Wiley - Interscience, 1972.
13. Перри С. и др. Практическое руководство по жидкостной хроматогра-
хроматографии.-М.: Мир, 1974, 260 с.
14. Snyder L. R., Kirkland J. J., Modern Liquid Chromatography. American
Chemical Society Short Courses, 1971.
15. Основы жидкостной хроматографии,—М.: Мир, 1973, 264 с.
16. Engelhardt Я., Weigand N., Anal. Chem., 45, 1149 A973).
17. Гельферих Ф. Иониты. Основы ионного обмена.—М.: ИЛ, 1962, 490 с.
18. Dorfner К., Ionenaustauscher. Berlin, DeGruyter, 1964.
19. Determann H., Gelchromatographie. Berlin-Heidelberg-New York, 1967.
20. Altgelt К. Н., Segal L. (Eds.), Gel Permeation Chromatography. New York,
Marcel Dekker, 1971.
21. Halasz /., Vorlesungsniederschrift Universitat Nizza, 1971.
22. Tiselius A., Arkiv Kemi Min. Geol., 14b, 22 A941). Vgl. Endeavor, 11,
5 A952).
23. Reichstein Т., van Euw J., Helv. Chim. Acta, 21, 1197 A938).
24. Aim R. S., Williams R. J. P., Tiselius A., Acta Chem. Scand., 6, 826 A952).
25. Tiselius A., Arkiv Kemi Min. Geol., 16a, 18 A943).

Глава II
ОСНОВЫ ХРОМАТОГРАФИИ
А. Удерживание
Разделение двух веществ методом элюентной хроматографии
можно сравнить с гонками с препятствиями: если одно из соедине-
соединений удерживается неподвижной фазой — препятствиями — дольше,
чем другое, то сначала из колонки выйдет то соединение, которое
быстрее преодолело препятствия, и лишь затем другое соединение,
которое перемещается медленнее. Следовательно, в элюентной хро-
хроматографии вещества различаются только по времени удерживания
в (или на) неподвижной фазе, а точнее, по чистому времени удержи-
удерживания t'R. Общее время удерживания tR складывается из времени
удерживания неподвижной фазой t'R и из времени удерживания под-
подвижной фазой t0, называемого также «мертвым временем» (время
удерживания несорбирующегося вещества).
tR = to + tk, A)
Время удерживания несорбирующегося вещества для всех веществ
одинаково.
Приведенные в этой главе понятия, характеризующие раздели-
разделительную колонку, объясняются на рис. И. 1. Если хроматографию ис-
используют для качественной идентификации соединений, время удер-
удерживания не должно зависеть от количества пробы. Иными словами,
соотношение количеств вещества в неподвижной фазе и в элюенте не
должно зависеть от концентрации пробы в элюенте. Только при вы-
выполнении этого условия хроматографические пики имеют симме-
симметричную форму и их можно описать кривой Гаусса. Появление асим-
асимметричных пиков может указывать на нелинейность изотермы.
Время удерживания зависит от скорости потока элюента, поэтому
обычно предпочитают пользоваться такой характеристикой разделе-
разделения, как объем удерживания. Объем удерживания равен произведе-
произведению времени удерживания на объемную скорость F (см3/мин)
элюента.
VR = tRF. B)
Аналогично, зная время удерживания несорбирующегося вещества,
можно определить объем Vm подвижной фазы в разделительной
колонке.
VM = t0F.
C)
Основы хроматографии
15
Время
Рис. П.1. Важнейшие параметры, характеризующие разделение.
<о - мертвое время разделительной колонки, т. е. время элюирования пика неудерживаемого компонента;
'Я1' ''Я2 - чистое время удерживания; Гд], tR2 — время удерживания компонентов 1, 2...; в - ширина
пика в точках пересечения касательных с нулевой линией, w = 4а; а - дисперсия гауссовой кривой.
Исправленный объем удерживания Vff — это объем удерживания, из
которого вычтен объем подвижной фазы.
VN=VR- VM. D)
Исправленный объем удерживания пропорционален объему непо-
неподвижной фазы Vs. Коэффициент пропорциональности равен термо-
термодинамическому коэффициенту разделения, который в распредели-
распределительной хроматографии совпадает с коэффициентом распределении
Нернста, если носитель не влияет на удерживание (ср. гл. VII).
VN = KVS. E)
В адсорбционной хроматографии, как оказалось, целесообразно ис-
использовать нормированный исправленный объем удерживания, отне-
отнесенный к 1 г адсорбента (удельный объем удерживания).
V°N = VN/gA, Ea)
где дл — масса адсорбента в разделительной колонке.
Однако поскольку времена удерживания находят непосредственно
из хроматограммы, то обычно хроматографисты предпочитают
пользоваться именно этими характеристиками, а не объемами удер-
удерживания, хотя последние являются более правильными характери-
характеристиками. Следует фазу же сказать, что времена удерживания можно
сравнивать только при постоянной объемной скорости элюента,

16
Глава II
а объемы удерживания — при постоянном свободном сечении (для
подвижной фазы) колонки. Точно определить свободное сечение ко-
колонки практически невозможно, поэтому в хроматографии приводят
линейные скорости и. Отношение времен удерживания (вероятности
удерживания) в неподвижной и подвижной фазах называют
объемными, или массовым, отношением распределения к'.
к' = ~Г = * ° ¦ (Ф
Величина к' не зависит от длины колонки и при скоростях потока
меньше 5 см/с в жидкостной хроматографии не зависит также и от
скорости подвижной фазы. Между значением к' и коэффициентом
распределения в равновесных условиях существует следующая зави-
зависимость :
k' = K(Vs/VM). G)
Хроматографисты предпочитают пользоваться значением к', а не К,
поскольку точно определить величину Vm/Vs трудно. Получить хоро-
хорошее хроматографическое разделение можно, только работая в линей-
линейной области изотермы. Пока сохраняется это условие, к' не зависит
от величины пробы.
Отношение двух объемных отношений распределения при по-
постоянных внешних условиях и одинаковой неподвижной фазе назы-
называют относительным удерживанием и обозначают буквой а.
а = -
t'R2
_ к'2
К2
t0 ~ет ~ к\ к Г (8)
Относительное удерживание является мерой селективности, разде-
разделяющей системы. Чем селективнее неподвижная фаза удерживает
один из двух компонентов, тем больше относительное удерживание
обоих компонентов. Если а равно 1, то это означает, что в данной
системе отсутствует термодинамическое различие между обоими
компонентами и их нельзя разделить. Позднее мы подробно рассмо-
рассмотрим влияние величины относительного удерживания на разделение
зон двух веществ. В равновесных условиях, которые в хроматогра-
хроматографии почти всегда достигаются [1,2], относительное удерживание
а является термодинамической характеристикой, зависящей при по-
постоянной температуре только от природы соединений, входящих
в пробу, и свойств неподвижной и подвижной фаз. Поскольку в жид-
жидкостной хроматографии высокого давления влиянием носителя ни-
никогда нельзя полностью пренебречь, то значение а меняется в зави-
зависимости от величины покрытия носителя неподвижной жидкой
фазой. Определяя относительное удерживание различных соединений
на одинаковых разделительных колонках при их продолжительном
использовании, можно установить случайное изменение свойств раз-
разделительной колонки. Это испытание следует часто повторять.
Основы хроматографии
17
Б. Линейная скорость, пористость, проницаемость
Обычно вместо объемной скорости элюента F (см3/с) предпочи-
предпочитают пользоваться линейной скоростью.
Линейная скорость не зависит от поперечного сечения колонки
и пропорциональна перепаду давлений вдоль колонки. Линейную
скорость можно вычислить, если известно мертвое время, т. е. время
вымывания инертного неудерживаемого компонента
u = L,%, (9)
или объемная скорость F и свободное сечение q разделительной
колонки
u = F/q = F/r2neT. (Ю)
Свободное сечение q заполненной разделительной колонки всегда со-
составляет только часть полного сечения колонки и зависит от вида
насадки. Если разделительная колонка заполнена стеклянными ша-
шариками, то на долю свободного сечения приходится примерно 40%
поперечного сечения пустой колонки. Это справедливо лишь для рав-
равномерно заполненных колонок, для которых отношение внутреннего
диаметра к среднему размеру частиц превышает 10. Долю свободно-
свободного сечения не заполненной элюентом колонки, которая доступна для
элюента, называют пористостью разделительной колонки. При ис-
использовании непроницаемых стеклянных шариков пористость ет рав-
равна 0,4 [4, 5].
Пористость ет хроматографической колонки можно рассчитать,
исходя из отношения объемной скорости F и линейной скорости
и [5, б].
Ft0
Ftn
иг п
Lr2K Vo '
(И)
Vo — объем пустой разделительной колонки. Если колонка заполнена
пористым материалом (например, силикагелем, окисью алюминия,
кизельгуром, активным углем и т. д.), пористость всегда составляет
примерно 0,85. Это означает, что свободное сечение колонки, запол-
заполненной этими пористыми материалами, примерно вдвое больше, чем
пористость колонки, заполненной непроницаемыми частицами. По-
Поскольку объем между частицами пористых и непористых материалов
один и тот же, то, следовательно, объем пор пористых частиц прак-
практически равен объему между частицами. Поэтому различают под-
подвижную фазу, «стоящую» в порах, и «движущуюся» подвижную фазу.
Для полностью пористых частиц оба объема примерно одинаковы.
Вследствие этого линейная скорость в колонке, регулярно заполнен-
заполненной непроницаемыми частицами, примерно вдвое больше, чем в ко-
колонке, заполненной пористыми частицами (при постоянной объем-
объемной скорости и одинаковом перевале давлений.}.
2 Заказ 825

18
Глава II
Величина свободного сечения колонки может меняться от 0,42
R2n для колонки, заполненной непроницаемыми частицами, до 0,84
R2n для колонки, заполненной полностью проницаемыми частицами.
Величина пористости зависит от относительной величины размера
пор и молекул, что и используется в ситовой хроматографии
(ср. гл. IX).
Линейная скорость пропорциональна перепаду давления в колон-
колонке. Связь между проницаемостью и другими параметрами колонки
дается уравнением
A2)
F-r\L _
Apr^n ~ Ap Apt0 '
в котором F — объемная скорость, см3/с; и — линейная скорость
[уравнение (9)], см/с; L— длина колонки, см; г — радиус колонки, см;
ej— пористость; т) - вязкость элюента, П, и Ар — перепад давления,
дн/см2 («10 ~ 6 атм). Зависимость проницаемости от размера частиц
выражается с хорошим для хроматографической практики приближе-
приближением следующим эмпирическим соотношением:
KF = <*2/1000,
A3)
где dp — диаметр частиц, мкм (среднее арифметическое значение
фракции). Сравнение уравнений A2) и A3) показывает, что перепад
давлений, необходимый для создания постоянной линейной скорости
потока в двух колонках одинаковой длины, обратно пропорционален
квадрату размера частиц. Если диаметр частиц насадки меньше
10 мкм, то, чтобы получить даже относительно низкую линейную
скорость (~ 1 см/с), необходим перепад давлений в 300—400 атм, т. е.
необходимо максимальное давление, достигаемое в хроматогра-
хроматографах. Следует отметить, что мы привели определения пористости
и проницаемости, принятые в хроматографической практике. Эти
определения не идентичны принятым в гидро- и аэродинамике [5].
С помощью уравнения A3) при известном среднем размере час-
частиц можно вычислить проницаемость и сравнить ее с измеренной
и определенной по уравнению A2) величиной. Таким образом можно
оценить качество заполнения колонки. При использовании частиц
с диаметром < 10 мкм все же более важной является обратная зада-
задача. Определить точное распределение по размерам частиц диаме-
диаметром менее 10 мкм очень трудно, поэтому авторы работы [7] пред-
предложили рассчитывать средний «гидродинамический» диаметр частиц
для заполненных колонок по уравнению A3). Найденные таким обра-
образом диаметры частиц силикагеля хорошо совпали с обычными сред-
средними диаметрами, если колонки заполняли сырым способом. У ко-
колонок, заполненных сухим способом, измеренная проницаемость
была, как правило, несколько ниже расчетной [6, 8].
Основы хроматографии
19
В. Размывание хроматографической полосы
Перемещающаяся через разделительную колонку зона вещества
размывается в результате диффузионных процессов. В принципе со-
соответствующие положения, установленные для газовой хроматогра-
хроматографии [9, 10], можно без каких-либо изменений использовать в жид-
жидкостной хроматографии, если при этом учесть количественное
различие свойств газов и жидкостей [11] (табл. И.1). Так, коэффи-
Таблица II. 1
Порядок величин констант, определяющих размывание
хроматографической зоны
Коэффициент диффузии D, см2/с
Плотность р, г/см3
Вязкость г|, П
Число Рейнольдса
Жидкость
10-5
10-2
100
циенты взаимодиффузии в жидкостях примерно в 104 меньше, чем
в rajax. Вязкость подвижной жидкой фазы примерно в 100 раз боль-
больше, чем вязкость газа. Кроме того, в газовой хроматографии прене-
пренебрегают взаимодействием между подвижной и неподвижной фазами.
В то же время такие взаимодействия в жидкостной хроматографии
играют важную роль. Разумеется, теоретическая трактовка жидкост-
жидкостной хроматографии проще, чем газовой хроматографии, так как
жидкие подвижные фазы в используемой области давлений несжи-
несжимаемы.
Мерой размывания хроматографической полосы является высота,
эквивалентная теоретической тарелке (ВЭТТ). В хроматографии вы-
высота, эквивалентная теоретической тарелке, определяется для одного
компонента при заданной скорости элюента, постоянной температу-
температуре и постоянном соотношении фаз.
Уравнение A4) показывает, каким образом ВЭТТ можно опреде-
определить из записанной хроматограммы.
A4)
h = ml I ¦ _
Ширину пика у основания w получают как отрезок, отсекаемый на
основании двумя касательными, проведенными к пику. У кривой
Гаусса этот отрезок равен 4 ст. Как и в дистилляции, в хроматогра-
хроматографии используют понятие числа эквивалентных теоретических таре-
тарелок п.

20
Глава II
Число теоретических тарелок обратно пропорционально высоте, эк-
эквивалентной теоретической тарелке, и пропорционально длине ко-
колонки. Однако если два компонента имеют одинаковые значения к',
их нельзя разделить даже на колонке с 10000 тарелок. Поэтому для
описания разделительной колонки лучше использовать эффективную
высоту, эквивалентную теоретической тарелке, определяемую урав-
уравнением A6), или эффективное число теоретических тарелок N, опре-
определяемое уравнением A7) [12].
N = п
к'2
к'2
16 \Г
A7)
Эффективная высота, эквивалентная теоретической тарелке, или чис-
число тарелок являются для каждой пробы константами, если в колонке
поддерживаются постоянные условия. Поскольку эффективные вели-
величины разделения R (ср. гл. П. Г) двух компонентов пропорцио-
пропорциональны, то они служат мерой оценки разделительной способности
хроматографической колонки.
Г. Разделение
Разделение двух полос определяется расстоянием между макси-
максимумами пиков (выраженным как разность времен удерживания)
и средней арифметической шириной обоих пиков у основания w.
A8)
В хроматографии стремятся не к наибольшему, а только к оптималь-
оптимальному разделению, т. е. пики должна отстоять друг от друга только
на требуемое расстояние. Если пики имеют форму гауссовых кривых,
то для количественного анализа достаточно уже разделение с R = 1,5
(называемое также бст-разделением), так как для гауссовой кривой
w = 4 ст. В этом случае пики отделены друг от друга практически до
нулевой линии. Большего разделения добиваются, увеличивая дли-
длительность анализа. Если R равно 1, расстояние между обоими пика-
пиками w точно равно 4 ст (в этом случае говорят о 4ст-разделении). Для
количественного анализа такое разделение еще достаточно, так как
только примерно 2% площади пиков перекрывается. С помощью
уравнения A8) можно связать хроматографические параметры с раз-
разделением [13]. В результате получают важнейшее уравнение хрома-
хроматографии:
к'г
A9)
Основы хроматографии
21
в котором объединены факторы, определяющие разделение (относи-
(относительное удерживание а, массовое отношение распределения к'), с фак-
факторами, противодействующими разделению, т. е. с размыванием по-
полосы (число тарелок N). Преобразуя уравнение A9), получаем
выражение
4Яос ,
B0)
N =
ос-1
с помощью которого можно рассчитать необходимое для разделения
число тарелок, если заданы а и желательная степень разделения R.
В табл. П.2 приведены некоторые значения, рассчитанные с по-
Таблща II. 2
Число тарелок, необходимое для требуемого разделении,
при заданной величине а
Относительное
удерживание а
1,005
1,01
1,02
1,05
1,07
1,10
1,15
1,25
1,50
2,0
R= 1,0
650000
163000
42 000
7100
3 700
1900
940
400
140
65
R= 1,5
1450000
367000
94000
16000
8 400
4400
2 100
900
320
145
мощью уравнения B0). Для разделения, равного 1,5, требуется всегда
более чем вдвое большее число эффективных тарелок, чем для разде-
разделения, равного 1. Но из таблицы также видно, что число необхо-
необходимых для разделения тарелок быстро возрастает с уменьшением ос,
особенно когда а становится меньше 1,1, т. е. когда свойства разде-
разделяемых веществ становятся очень близкими. Если при заданном
а нельзя достичь требуемой степени разделения, то для разделения
такой пары веществ следует подыскать более селективную систему.
В жидкостной хроматографии при высоких давлениях в таком случае
можно сменить неподвижную фазу и (или) элюент.
Рис. П.2 должен пояснить взаимное влияние обоих факторов на
разделение двух пиков. Если Относительное удерживание двух ве-
веществ велико, то можно получить удовлетворительное разделение,
даже если пики очень широкие, т. е. разделяющая способность ко-
колонки низкая (А). Селективность колонки здесь является главной
причиной разделения.
Если относительное удерживание меньше, то при такой же разде-
разделяющей способности не получают желаемого разделения (Б). Одна-

Основы хроматографии
23
Рнс. 11.2. Влияние относительного удерживания и разделительной способ-
способности на разделение двух пиков (см. текст).
ко, улучшив разделительную способность колонки, можно отделить
друг от друга компоненты даже с таким маленьким относительным
удерживанием (Г). При большом относительном удерживании и хо-
хорошей разделительной способности (В) разделение становится на-
намного лучше оптимального (R = 1,5). Поскольку число тарелок про-
пропорционально длине колонки, то колонку можно укоротить с тем,
чтобы уменьшить число тарелок и уменьшить длительность анализа.
Разделение двух пиков целесообразнее улучшать, увеличивая относи-
относительное удерживание, а не число тарелок. Удвоение числа тарелок,
достигаемое в результате удвоения длины колонки, улучшает разде-
разделение только примерно в 1,4 раза. При этом удваивается время удер-
удерживания и вместе с ним продолжительность анализа. Все же на прак-
практике часто лучшего разделения проще добиться, увеличивая число
тарелок, а не меняя условия разделения. Поэтому в хроматографии
(прежде всего при теоретическом рассмотрении) обсуждают вопросы
оптимизации разделительной способности одной колонки.
Разделение двух пиков тем лучше, чем больше различие коэффи-
коэффициентов распределения, так как при этом относительное удерживание
становится большим. Поскольку необходимое для разделения число
тарелок пропорционально длительности анализа, то большим
величинам а соответствует также меньшая длительность анализа.
Разделительную систему всегда следует выбирать таким образом,
чтобы относительное удерживание было как можно большим, т. е.
чтобы разделительная система была очень селективной.
Д. Зависимость размывания полосы
от скорости потока
В газовой или жидкостной хроматографии экспериментальная за-
зависимость размывания полосы от скорости потока имеет вид кри-
кривой, приведенной на рис. П.З. Лучше всего ее можно описать с по-
помощью уравнения ван Деемтера [14]:
в
t = A+ — + Сти + Cju.
B1)
Подробно это уравнение разбирается в монографиях по газовой хро-
хроматографии, см., например, [9, 10].
Долю размывания полосы, которая не зависит от скорости пото-
потока (член А), приписывают так называемой вихревой диффузии. Веще-
Вещества, перемещающиеся через колонку, по-разному омывают зерна за-
заполняющего колонку материала, и поэтому длина пути этих веществ
может быть самой разной. Различия в направлении движения и ско-
скоростях потока ведут к размыванию полосы, которое должно зави-
зависеть только от вида и качества заполнения колонки. Член А пропор-
пропорционален диаметру частиц:
А = 2Xdp, B2)
где X - так называемый фактор упаковки.
Член В — в уравнении B1) описывает размывание полосы, вызы-
вызываемое продольной диффузией, он становится заметным тогько при
низких скоростях потока. Его вкладом в размывание полосы при
скоростях потока, превышающих 0,5 см/с, в жидкостной хроматогра-
хроматографии очень часто пренебрегают, что вполне оправдано, если диаметр
превышает 10 мкм. Размывание, обусловленное диффузией в элюен-
элюенте, описывают уравнением
B = 2yDm,; B3)
в этом выражении у учитывает ограничение пути диффузии в запол-
заполненной колонке.
Диффузия молекул пробы, включая инертные вещества, в движу-
движущемся элюенте отличается от диффузии в неподвижном элюенте.
Эффективная диффузия в направлении оси колонки в жидкостной
хроматографии при высоких скоростях больше, чем продольная диф-
диффузия (ср. уравнение Тейлора). Эту долю размывания полосы, вы-
вызванную диффузией в движущемся элюенте, связывают с членом Ст.

24
Глава II
Основы хроматографии
25
и, см/с
Рис. П.З. Кривые, характеризующие зависимость размывания полосы от
скорости потока.
Он зависит от диаметра частиц и обратно пропорционален коэффи-
коэффициенту диффузии в подвижной фазе
С» = Ф-^-; B4)
Ф является функцией только объемного отношения распределения к'
При движении через колонку молекулы пробы постоянно перехо-
переходят из подвижной фазы в неподвижную (сорбция) или обратно (де-
(десорбция). Если молекула сорбируется, то она отстает от центра зоны
которая продолжает двигаться вдоль колонки. Когда эта молекула'
возвращается из неподвижной фазы в подвижную, она движется бы-
быстрее, чем точка центра тяжести массы удерживаемой зоны так как
скорость элюента всегда больше, чем средняя скорость продвижения
зоны вещества. Этот процесс ведет к размыванию зоны вещества
1ак называемый член массопередачи в неподвижной фазе описывает-
описывается уравнением
Cs = const /(?')—¦
B5)
Дробь d2f/Ds служит мерой длительности задерживания в неподвиж-
неподвижной 4азе и измеряется в секундах. В литературе по газовой хромато-
хроматографии df называют средней толщиной пленки неподвижной фазы, а
Д, - коэффициентом диффузии пробы в неподвижной фазе. В жид-
жидкостной хроматографии скорости диффузии в подвижной и жидкой
неподвижной фазах одинаковы, поэтому диффузия в подвижной фа-
фазе, находящейся внутри пор, также приводит в размыванию полосы;
в газовой хроматографии этого не наблюдается. Молекулы, диффун-
диффундирующие в такую «стоящую» подвижную фазу, отстают от всех мо-
молекул, которые остаются в «движущейся» подвижной фазе. Эта доля
размывания полосы, не связанная с удерживанием вещества,
одинакова для инертного вещества и удерживаемых веществ. Если
скорость перемещения зон веществ незначительна (высокие значения
&'), то данный вклад в размывание полосы относительно мал. Его
можно снизить, уменьшая глубину пор и тем самым сокращая путь
диффузии. С этой целью либо заполняют колонку поверхностно-по-
поверхностно-пористыми частицами [15], т. е. частицами с непроницаемым ядром
(например, стеклянными шариками), на которые нанесен тонкий, в
~ 1 мкм, пористый слой, либо уменьшают диаметр частиц и, следо-
следовательно, глубину пор.
У поверхностно-пористых частиц объем пор и путь диффузии
в поры и из пор очень мал, в результате массообмен ускоряется и на-
наблюдаемое расширение полосы значительно меньше, чем на колон-
колонках, заполненных пористыми частицами такого же диаметра. Однако
поверхностно-пористые частицы отличаются незначительной ем-
емкостью, поэтому общее количество неподвижной фазы в колонке
мало. Тем не менее в скоростной жидкостной хроматографии такие
материалы успешно используют для проведения быстрых разделений
(ср. разд. V. А).
Значение поверхностно-пористых материалов (ППМ) уменьши-
уменьшилось после того, как удалось простым способом получать воспроиз-
воспроизводимые эффективные разделительные колонки, заполненные части-
частицами размером 10 мкм и меньше. В отличие от колонок с ППМ
величина предельной нагрузки здесь значительно больше и благода-
благодаря большему количеству эффективной неподвижной фазы значения к'
также выше.
Наиболее целесообразно ППМ использовать в тех случаях, когда
при разделении на полностью пористых частицах при заданном
элюенте получаются слишком большие времена удерживания. Из-за
небольшого количества неподвижной фазы на частицах ППМ време-
времена удерживания значительно меньше.
Все высказанные выше соображения носят более или менее каче-
качественный характер, так как процессы в заполненной колонке точно
описать нельзя. Такая трактовка возможна только в том случае, ког-
когда рассматривается открытая труба, на внутренней стенке которой
находится тонкий слой неподвижной фазы (уравнение Голея).
Наряду с уравнением ван Деемтера для описания зависимости
размывания полосы от скорости потока предложен также ряд упро-

26
Глава II
щенных уравнений. Для некоторой известной области скоростей за-
зависимость размывания полосы от скорости потока можно описать
с достаточным для опыта приближением уравнением
h = А* + С*и,
B6)
где А* - вклад в размывание, не зависящий от скорости потока; А*
в отличие от А не имеет конкретного физического смысла. Возраста-
Возрастание кривой (член С*) объясняется ограниченной скоростью массопе-
реноса.
Другое эмпирическое приближенное уравнение, описывающее за-
зависимость размывания полосы от скорости потока в ограниченной
области скоростей, ввел Снайдер [17]:
= Dux.
B7)
У')
Более поздние исследования [18] показали, что х не всегда, как пер-
первоначально считалось, равен 0,4, а может меняться в пределах от 0,3
до 0,6. Константа D равна высоте, эквивалентной теоретической та-
тарелке, при линейной скорости 1 см/с и при этом соответствует обоим
членам А и С из уравнения B6).
Используя предложенные Гиддингсом приведенные безразмерные
параметры [9], такие, как приведенная высота, эквивалентная теоре-
теоретической тарелке, Я = h/dp и приведенная скорость v = udJDu, Кнокс
ввел другое полуэмпирическое уравнение для описания зависимости
размывания от скорости потока [28, 29, 30]:
в
v
B8)
где В описывает продольную диффузию и обычно равен 1,5—2;
С описывает замедленный массообмен в неподвижной фазе, типич-
типичное его значение A— 2) • 10 ~ 2; А — член, характеризующий качество
заполнения колонки и замедленный массообмен в подвижной фазе
вне частиц. На вид кривой, полученной из уравнения B8), не должны
влиять размер частиц и свойства подвижной фазы. Обычно минимум
получают при значениях Я, равных 2—5, и при соответствующих
приведенных скоростях между 2 и 10. Авторы работ [31, 32] показа-
показали, что, оптимизируя диаметр частиц и поперечное сечение колонки
при заданном перепаде давления, всегда можно работать при опи-
описанных выше оптимальных условиях.
При оптимальных линейных скоростях ниже 1 мм/с при обыч-
обычном для гептана или хлористого метилена коэффициенте диффузии
(~ 310 см/с) в соответствии с приведенной здесь точкой зрения
даже при оптимальных условиях наименьшие из возможных величин
Я всегда более чем вдвое превышают диаметр частиц.
Основы хроматографии
27
Е. Размывание полосы и диаметр частиц
Справедливость уравнения B4), согласно которому высота, экви-
эквивалентная теоретической тарелке, пропорциональна квадрату диаме-
диаметра частицы, и других приближенных эмпирических уравнений, на-
например уравнения B8), подтверждена экспериментально. Правда,
такая зависимость вполне выполняется, только если размер частиц
превышает 80 мкм [8]. В жидкостной хроматографии при высоких
давлениях, когда колонки заполняются более мелкими частицами,
эта зависимость уменьшения высоты, эквивалентной теоретической
тарелке, нарушается. В работах [7, 16, 17, 27, 33, 34] указывается, что
h уменьшается пропорционально d*>3 - d\~%.
При определении этой зависимости встает вопрос о среднем раз-
размере частиц ситовой фракции. Размер частиц не является точно оп-
определяемой величиной, а зависит от метода определения (например,
светорассеяние, микроскопические измерения, седиментация, счетчик
Каутера и др.) и методов усреднения (числовое, объемное или массо-
массовое). При этом нельзя учесть, не изменился ли случайно средний диа-
диаметр частиц, например в процессе заполнения колонки. Халаш пред-
предложил [6] за средний диаметр частиц принимать эффективный
гидродинамический диаметр частиц в заполненной разделительной
колонке, определенный по проницаемости, т. е. по перепаду давле-
давления, необходимому для создания желаемой скорости потока. Пре-
Преобразуя уравнения A3), получаем
B9)
г пАр
В уравнении B9), как уже отмечалось выше, все величины имеют раз-
размерность системы СГС (например, Ар измеряется в дин/см2, или ~
~ 10 ~ 6 атм). Диаметр частиц, найденный по уравнению B9), совпа-
совпадает с диаметром частиц монодисперсной ситовой фракции, опреде-
определенным микроскопическим методом и усредненным по числу частиц.
Рассматривая зависимость отдельных членов уравнения ван
Деемтера [уравнения B1) — B5)] от размера частиц, можно заметить,
что как член В [уравнение B3)], так и член Cs, характеризующий мас-
соперенос в неподвижной фазе [уравнение B5)], не зависят от диаме-
диаметра частиц.
В жидкостной хроматографии последним членом можно прене-
пренебречь, если только не используют колонки с максимальной степенью
покрытия, тогда как член Ст [уравнение B4)], связанный с массопе-
реносом в элюенте, необходимо учитывать.
Экспериментально установлено, что А = 3dp (т. е. X = 1,5) и В =
= 2Dm (т. е. у = 1). Член С„ [уравнение B4)] включает переменную ср,
зависящую от к'. Если считать, как это делает Халаш [27], что мас-
массообмен в подвижной фазе описывается уравнением Голея [36], то
можно вычислить значение ср для к' от 1 до 0,047. (Для к' = 5 рассчи-

тайное значение <р = 0,09. Если диаметр частиц меньше 10 мкм,
h едва ли зависит от к', и вполне можно принять, что <р = const =
= 0,047.) С учетом всех этих предположений уравнение B1) можно
записать в несколько иной форме:
J 2Dm 0,047<*?
a = 4+-tl+-V^"- C0)
Рассчитывая величину h, следует учитывать все члены, так как часто
большой член А компенсируется малым членом С, и наоборот. Это
уравнение справедливо для той области скоростей, которая обычно
используется в настоящее время в жидкостной хроматографии при
высоких давлениях. Выбор этой области определяется в настоящее
время главным образом имеющейся аппаратурой.
Если рассматривать только величины отдельных членов и их за-
зависимость от размера частиц, то А меняется линейно с dp, а С про-
пропорционален d\. Если колонка заполнена очень мелкими частицами
(dp < 10 мкм), пропорциональность размывания полосы от размера
частиц всегда меньше, так как А > (В/и + Си). Для очень маленьких
диаметров частиц (dp<3 мкм) A«dp[27].
Вследствие этого при уменьшении размера частиц выигрыш
в разделяющей способности уменьшается по сравнению с увеличи-
увеличивающимися издержками, необходимыми в этом случае для создания
требуемого давления, так как проницаемость всегда остается про-
пропорциональной d\.
Чтобы разделение было хорошим и (или) скорость анализа высо-
высокой, следует всегда работать по крайней мере при скорости Mmin,
определяемой минимальным значением А. (Чтобы уменьшить дли-
длительность анализа, само собой разумеется, можно работать также
при и > umin. Конечно, при этом разделительная способность умень-
уменьшается.) Значение ц„ы также является функцией диаметра частиц,
и при уменьшающемся диаметре частиц umia перемещается в область
более высоких значений. Это означает, что провести разделение при
мт1п на колонке, заполненной частицами меньшего размера, можно,
только используя дополнительное давление.
Дифференцируя уравнение C0) по и, находят ц„,а по уравне-
уравнению
[В ]/Щ 6,52 Рт
Основы хроматографии
29
Соответствующее этой скорости рассчитанное из уравнений C0)
и C1) минимальное значение высоты, эквивалентной теоретической
тарелке, равно
hmin*3-4dp. C2)
При небольших диаметрах частиц получают оптимальное значе-
значение h, соответствующее примерно 3—4 диаметрам частицы [37].
С уменьшением диаметра частиц (dp < 5 мкм) вдвое h также умень-
уменьшается вдвое, в то время как необходимое давление возрастает в
8 раз. Это обусловлено тем, что наряду с проницаемостью (пропор-
(пропорциональна dp) примерно вдвое увеличивается минимальная скорость
и, следовательно, давление, необходимое для того, чтобы можно
было работать по крайней мере при Mmin, если остальные пара-
параметры (например, длина колонки, вязкость и т. д.) остаются посто-
постоянными. Поскольку выбор максимального давления зависит от воз-
возможностей используемой аппаратуры, то при прочих равных усло-
условиях этим же определяется наименьший возможный диаметр частиц
при обычной работе в жидкостной хроматографии при высоких
давлениях.
Применение частиц малого диаметра сопряжено, кроме того, и
с другими трудностями. Работать при Mmin и максимально допусти-
допустимом давлении можно лишь при следующем условии: разделительная
колонка должна быть тем короче, чем меньше диаметр частиц. Ис-
Использовать разделительные колонки длиной меньше 7—10 см не ре-
рекомендуется, так как в этом случае уже нельзя пренебрегать
мертвым объемом подвижной фазы вне разделительной колонки, по-
поскольку он сравним с объемом подвижной фазы в разделительной
колонке. Размывание полосы вне разделительной колонки (ср. разд.
Ж) становится сравнимым с размыванием в разделительной колонке
или даже превышает последнее. Кроме того, размывание зон, изме-
измеренное в единицах времени, становится таким малым, что к вре-
временным характеристикам срабатывания детекторов и самописцев
предъявляются значительно большие требования, чем обычно.
При использовании малых частиц принципиальные затруднения
возникают из-за выделения теплоты трения, обусловленной перепа-
перепадом давления. Авторы работы [27] показали, что в полностью изо-
изолированной разделительной колонке разность температур элюента
между входом и выходом составляет 5-7°С при перепаде давления
в 100 атм. Вдоль колонки возникает градиент температур. Поскольку
разделительная колонка никогда не является адиабатной системой,
то возникает дополнительный радиальный градиент температур.
Вязкость элюента, внутренние коэффициенты диффузии компонентов
пробы и удерживание компонентов (коэффициенты распределения)
меняются внутри колонки. Это не только не позволяет дать теорети-
теоретическое описание процессов массопереноса в разделительной колонке,
но и делает возможным дополнительное искажение зоны вещества
(повышает величину И). В связи с этим диаметр частиц в жидкостной
хроматографии можно уменьшить только до какого-то оптимально-
оптимального размера. В настоящее время минимальный диаметр частиц, види-
видимо, составляет 3 мкм, а оптимальное значение лежит между 3 — 5
мкм. При нынешнем состоянии техники хорошо и воспроизводимо
заполнить колонку частицами такого размера удается только доста-
достаточно опытным хроматографистам. Длина разделительной колонки

30
Глава II
при этих диаметрах частиц, как следует из сказанного выше, не дол-
должна быть меньше 7 см.
Заполнить колонку частицами размером 10 мкм намного проще.
Длина колонки в этом случае обычно составляет 20—30 см. Раздели-
Разделительная способность таких колонок, как правило, достаточна для ру-
рутинного анализа, ее можно увеличить, последовательно соединяя не-
несколько таких колонок, если проницаемость их достаточна.
Ж. Размывание полосы вне колонки
При известных условиях одним из следствий низких коэффициен-
коэффициентов диффузии молекул пробы в подвижной жидкой фазе является
значительный вклад в размывание полосы, вносимый мертвым объе-
объемом в блоке дозатора, в местах соединения колонки с детектором,
а также объемом самого детектора (внеколоночный объем). Размы-
Размывание полосы тем больше, чем больше внеколоночный объем по
сравнению с удерживаемым объемом пробы [19]. Из-за медленной
диффузии образующиеся профили потока не уравновешены. В ре-
результате пик чистого вещества иногда имеет два максимума, поэто-
поэтому может создаться впечатление о наличии в пробе примеси или вто-
второго компонента. Особенно заметно размывание мешает при анали-
анализе быстро проходящих через колонку веществ с небольшими значе-
значениями к'. Размывание полосы в соединительных трубках можно ча-
частично или даже полностью исключить [20], создавая искусственное
радиальное перемешивание. Если соединительные трубки никак нель-
нельзя сделать короткими или если перед детектором необходимо уста-
установить теплообменник [21], следует использовать скрученные в спи-
спираль деформированные капиллярные трубки, в которых ток жидкости
вынужден менять направление. Чтобы сократить общий мертвый
объем, пробу можно подавать непосредственно в разделительную
колонку. Объем ячейки детектора должен быть как можно меньше,
хотя здесь часто приходится идти на компромисс, так как для опти-
оптимальных показаний необходима также определенная толщина слоя.
Эта проблема подробно обсуждается в статье [25].
Долю размывания полосы вне колонки лучше всего установить,
получив кривую зависимости h =f(u) для нескольких веществ. Если
соединения со значениями к' < 5 дают кривые другой формы, чем со-
соединения с более высоким значением к', то это указывает на размы-
размывание полосы вне колонки. Об этом же говорят формы пиков, напри-
например образование хвоста у пиков соединений с небольшими
значениями к' и отсутствие хвоста у пиков тех соединений, которые
удерживаются сильнее. Если найденная высота, эквивалентная теоре-
теоретической тарелке, для инертного соединения больше, чем для удер-
удерживаемого на колонке, то это также свидетельствует о возможном
Основы хроматографии
31
размывании полосы вне колонки. Самостоятельно изготовленные,
как и купленные, приборы особенно после их перестройки всегда сле-
следует испытать подобным образом.
3. Оптимальные условия анализа,
время анализа
Оптимальными условиями разделения считаются такие условия,
когда при наименьшей затрате времени удается добиться максималь-
максимально возможного разделения [26]; при этом технические трудности
должны быть минимальными. Как уже отмечалось, разделение R >
> 1,5 нежелательно, так как оно достигается только за счет увеличе-
увеличения длительности анализа. Каждой пробе соответствуют своя опти-
оптимальная система неподвижной и подвижной фаз и своя определенная
температура разделения, отвечающие при заданном разделении наи-
наибольшей селективности и соответственно наибольшему относитель-
относительному удерживанию (ос). Всегда следует стремиться подбирать опти-
оптимальную систему фаз и оптимальную температуру, так как при этом
удается сократить до минимума число теоретических тарелок и со-
соответственно длину колонки.
Необходимое в этих условиях время анализа, соответствующее
времени удерживания последнего пика, рассчитывают [26] по урав-
уравнению
— П + к'Л C3)
Время анализа, необходимое для оптимального разделения, зависит
от свойств подвижной фазы и от того, с какой скоростью эта фаза
будет перемещаться при заданном перепаде давлений. Поэтому всег-
всегда следует стремиться выбрать среди нескольких элюентов со
сходными хроматографическими свойствами подвижную фазу с низ-
низкой вязкостью.
Свойства разделительной колонки и способ ее заполнения также
значительно влияют на длительность анализа. Как уже было сказа-
сказано, разделительная колонка всегда должна быть более короткой.
Минимальная длина колонки лимитируется необходимым числом
теоретических тарелок. Как известно, число тарелок обратно пропор-
пропорционально диаметру частиц в квадрате (или в меньшей степени), по-
поэтому всегда стремятся использовать частицы меньшего размера.
Однако с уменьшением размера частиц снижается также проницае-
проницаемость колонки, и для того, чтобы можно было поддерживать по-
постоянную скорость элюента, приходится повышать давление. Обы-
Обычные насосы высокого давления позволяют создавать давление
порядка 300-400 атм, поэтому уменьшать размер частиц и соответ-
соответственно длительность анализа можно только до определенных пре-
пределов. Кроме того, принципиальные ограничения [положение мини-

32
Глава II
мума на кривой h =/(м)], по-видимому, не позволяют работать
с частицами, диаметр которых меньше 3—4 мкм (ср. разд. Е).
Температура влияет на длительность анализа только косвенно.
Так, с увеличением температуры снижается вязкость подвижной
фазы. Благодаря этому при постоянном перепаде давлений увеличи-
увеличивается-скорость элюента. Как известно, коэффициенты диффузии
с увеличением температуры также возрастают, поэтому при более
высокой температуре получают более острые зоны. Само собой раз-
разумеется, что температура влияет также на кинетику и термодинами-
термодинамику удерживания вещества.
Необходимое для разделения число тарелок можно получить и на
длинной колонке, заполнив ее большими частицами (~ 30 мкм), и на
короткой колонке, заполнив ее более мелкими частицами E или 10
мкм). Естественно, при этом предполагается, что обе колонки можно
одинаково хорошо и воспроизводимо заполнить. В данной ситуации
выбор колонки зависит от технических возможностей аппаратуры,
например от того, можно ли получить нужную постоянную скорость
элюента при давлении, создаваемом насосом. Выбирая размер ча-
частиц насадки, следует помнить, что колонка должна быть заполнена
в соответствии с предъявляемыми требованиями и что материал на-
насадки должен выдерживать необходимое давление. Если разделение
проводят в коротких колонках, важную роль играет аппаратурный
мертвый объем, так как объем подвижной фазы в колонке становит-
становится сравним с мертвым объемом. В то же время если колонка запол-
заполнена мелкими частицами, элюируемые соединения перемещаются по
ней в виде очень острых зон и достигают детектора менее разба-
разбавленными, чем в более длинных колонках, заполненных частицами
большего размера (ср. разд. В), поэтому чувствительность детектиро-
детектирования в первом случае выше. Мерой скорости анализа служит ско-
скорость образования теоретических тарелок, т. е. число тарелок, обра-
образующихся в секунду. Поскольку разделение двух пиков пропорцио-
пропорционально числу эффективных тарелок, то целесообразно в качестве
меры скорости анализа использовать число эффективных тарелок,
образованных за секунду,
Чем больше число эффективных тарелок, образующихся за секунду,
тем меньше время анализа. В очень хороших разделительных колон-
колонках, заполненных частицами диаметром 5—10 мкм, можно без осо-
особого труда получить 100—300 тарелок в секунду. Это соответствует
в зависимости от значения к' примерно 10—40 эффективным тарел-
тарелкам. Функциональная зависимость от к' в уравнении C4) имеет мак-
максимум при к', равном 2. Для быстрых анализов систему следует вы-
выбрать таким образом, чтобы значения к' лежали в пределах от 1,5 до
4. Конечно, анализ многокомпонентных проб в этой узкой области
Основы хроматографии
33
0.7
0.5
аз
0.1
о
и
1
юо
60
20
о
15
и, мм/с
31
37
15
и, мм/с
Рис. И.4. Зависимость размывания полосы от скорости потока (верхняя
кривая) и определение оптимальной скорости.
насадка: энпакс, 1% оксидипропионитрил; элюент: «-гептан; колонна: 50 ем х 2 мм (внутр.).
значений к' проводить нельзя. В этом случае разделительную способ-
способность колонки следует повышать, увеличивая длительность анализа,
т. е. либо работать с меньшими скоростями, либо использовать бо-
более длинные колонки.
Для каждой разделительной колонки существует оптимальная
скорость, превышать которую не имеет смысла. В первом приближе-
приближении скорость элюента пропорциональна прилагаемому давлению. Из
обычной кривой h =f(u) получают, как показано на рис. И.4, кривую
h/u =f(u) (чтобы не усложнять картину, используют высоту, эквива-
3 Заказ 825

34
Глава II
лентную теоретической тарелке, которая пропорциональна эффек-
эффективной высоте, эквивалентной теоретической тарелке, Я).
В качестве оптимальной скорости принимают такую скорость,
при которой кривая зависимости h/u =/(и) становится горизонталь-
горизонтальной. При этом значительное увеличение давления, а следовательно,
и линейной скорости не приводит больше к значительному уменьше-
уменьшению соотношения h/u.
Если с помощью имеющейся аппаратуры можно создать требуе-
требуемое давление, то всегда следует работать при оптимальной скорости.
Для того чтобы число тарелок с увеличением скорости потока не
слишком сильно уменьшалось, всегда стремятся поддерживать как
можно меньший угол подъема кривой h =/(м) (член С). Если предпо-
предположить, что член А мал, то чем меньше член С для данной колонки,
тем меньше оптимальная скорость. Напротив, если член А большой,
то при малом члене С оптимальная скорость очень велика. Таким
образом, у хорошей разделительной колонки должно быть не только
по возможности в целом наименьшее размывание полосы, но также
должно быть уравновешено соотношение членов А и С. Это необхо-
необходимо для получения уже при малой скорости потока наиболее низко-
низкого соотношения h/u. Еще раз напомним, что каким будет разделе-
разделение — зависит не только от числа тарелок, одновременно должно
быть достаточно большим также различие в значениях к'.
И. Выбор разделительной колонки
Из приведенного выше обсуждения следует, что при выборе ко-
колонки учитывают требуемые 1) степень разделения, 2) скорость ана-
анализа и 3) нагрузку колонки. Если необходимо провести анализ до-
достаточно быстро и получить при этом хорошее разделение, то
целесообразно использовать колонку, заполненную ППМ. Однако
количество активной неподвижной фазы в такой колонке очень мало
и уже при относительно небольшой пробе система перегружается.
Высокую степень разделения получают, используя возможно мень-
меньшие пробы и большие времена анализа. Улучшить разделение мож-
можно, повысив давление в системе; это позволит в необходимой степени
удлинить разделительную колонку и соответственно увеличить дли-
длительность анализа. Чтобы число теоретических тарелок в колонке
было достаточным, размеры частиц неподвижной фазы или носите-
носителей должны быть минимальными. Если имеется несколько под-
подвижных фаз, то всегда выбирают ту, которая обладает самой низкой
вязкостью. Число тарелок и линейную скорость элюента (при задан-
заданном перепаде давлений) можно оптимизировать, уменьшая вязкость
подвижной фазы.
Если разделение желательно провести как можно быстрее, то вы-
выбирают самые короткие разделительные колонки, иногда даже от-
Основы хроматографии
35
казываясь от полного разделения. В тех случаях, когда анализ опти-
оптимизируют за счет снижения степени разделения, колонку заполняют
поверхностно-пористым веществом. Оптимальную скорость анализа
получают при значениях к' около 2. Методом жидкостной хромато-
хроматографии при высоких давлениях можно проводить разделение в тече-
течение нескольких секунд, но, разумеется, необходимо сначала выяс-
выяснить, насколько это целесообразно.
До сих пор в жидкостной хроматографии при высоких давлениях
нагрузка колонки не играла решающей роли и оптимизацию прово-
проводили главным образом в отношении скорости анализа и разделения.
Даже при минимальном размере пробы, необходимом для того,
чтобы ее компоненты еще можно было обнаружить с помощью де-
детектора, колонки, заполненные поверхностно-пористыми материала-
материалами, часто бывают перегружены. Потерю в разрешающей способно-
способности возмещают, удлиняя разделительную колонку.
Препаративная разделительная колонка должна иметь достаточ-
достаточно большую допустимую удельную нагрузку. С этой целью попереч-
поперечное сечение колонки следует увеличить и заполнить колонку подхо-
подходящей насадкой. Для того чтобы разделенные вещества можно было
легко выделить в чистом виде, подвижная фаза (а в случае распреде-
распределительных систем и растворенная в подвижной фазе неподвижная
фаза) должна быть летучей. Степень разделения в препаративной
хроматографии всегда меньше, чем в аналитической, и из-за неиз-
неизбежного использования длинных разделительных колонок длитель-
длительность анализа также всегда больше.
В «магическом треугольнике» хроматографии
разделение
скорость ¦
-преЬельиая допустимая
нагрузка
можно проводить оптимизацию только в одном направлении, причем
чем больше проводят оптимизацию в одном направлении, тем дальше
удаляются от двух других параметров. Еще не описана такая
система, в которой высокое разрешение сочеталось бы с большой
предельной допустимой нагрузкой и возможностью быстрого раз-
разделения.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Anderson J. R., J. Am. Chem. Soc, 78, 5692 A956).
2. Kelker #., Ber. Bunsenges., 77, 187 A973).
3. Carman P. C, Flow of Gases through Porous Media. London, Butter-
worth, 1956.

36
Глава II
4. Bohemen J., Purnell J. H., J. Chem. Soc, London, 1961, 360.
5. Deininger G., Ber. Bunsenges., 77, 145 A973).
6. Halasz I., Ber. Bunsenges., 77, 140 A973).
7. Endele R., Halasz I., Unger K., J. Chromatogr., 99, 377 A974).
8. Halasz I., Naefe M., Anal. Chem., 44, 76 A972).
9. Giddings J. C, Dynamics of Chromatography. New York, Marcel Dekker,
1965.
10. Lialewood А. В., Gas Chromatography. 2nd ed. New York, Academic
Press, 1970.
11. Халаш И. в кн. Современное состояние жидкостной хроматографии,—
М.: Мир, 1974, 325 с.
12. Desly D. H., Goldup A., Swanton W. Т., in Brenner N., Callen J. E.,
Weiss M. D. (Eds.), Gas Chromatography. New York, Academic Press,
1962.
13. Purnell J. H., J. Chem. Soc, London, 1960, 1268.
14. van Deemter J. J., Zuiderweg F. J., Klinkenberg A., Chem. Engng. Sci.,
5, 271 A956).
15. Halasz I., Horvath C, Anal. Chem., 36, 1179 A969).
16. Endele R., Dissertation. Saarbrucken, 1974.
17. Snyder L. R., J. Chromatogr. Sci., 7, 352 A969).
18. Waters J. L., Little J. N., Horgan D. F., J. Chromatogr. Sci., 7, 293 A969).
19. Halasz I., Kroneisen A., Gerlach H. O., Walkling P., Z. Anal. Chem.,
234, 81 A968).
20. Halasz I., Kroneisen A., Gerlach H. 0., Walkling P., Z. Anal. Chem., 234,
97 A968).
21. Halasz I., Walkling P., Ber. Bunsenges., 74, 66 A970).
22. Halasz I., Walking P., Ber. Bunsenges., 74, 66 A970).
22. Deininger G., Halasz I., J. Chromatogr. Sci., 9, 83 A971).
23. Halasz I., Heine E., in Purnell J. H. (Ed.), Progress in Gas Chromatography.
New York, Interscience, 1968.
24. Halasz I., Afihauer J., Endele R., J. Chromatogr., 112, 37 A975).
25. Kennedy G J., Knox J. H., J. Chromatogr. Sci., 10, 549 A972).
26. Knox J. H., Vasvari G., J. Chromatogr., 83, 181 A973).
27. Knox J. H., Pryde A., J. Chromatogr., 112, 171 A975).
28. Knox J. H., Jurand J., Luird G. R., Proc. Soc. Anal. Chem., 1974, 310.
29. Knox J. H., Saleem M., J. Chromatogr. Sci., 7, 614 A969).
30. Majors R., J. Chromatogr. Sci., 11, 88 A973).
31. Kirkland J. J., J. Chromatogr. Sci., 10, 129 A972).
32. Halasz I., Z. Anal. Chem., 277, 257 A975).
33. Golay M. J. E., in Desty D. H. (Ed.), Gas Chromatography, 1958. S.
36 ff. London, Butterworth 1958.
34. Halasz I., Schmidt H, Vogtel P., J. Chromatogr., 126, 19 A976).
Глава III
АППАРАТУРА ДЛЯ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
ПРИ ВЫСОКИХ ДАВЛЕНИЯХ
Конструкция приборов для жидкостной хроматографии при высо-
высоких давлениях не зависит от того, какой применяется принцип разде-
разделения. На стандартных аналитических приборах можно также прово-
проводить микропрепаративное разделение. В настоящее время выпу-
выпускаются хроматографы, выполненные как одно целое, и отдельные
блоки хроматографов, позволяющие получить прибор с требуемыми
характеристиками. В этой главе мы рассмотрим отдельные блоки
прибора.
На рис. III.I приведена блок-схема хроматографа для жидкостной
хроматографии. Насос 2 обеспечивает постоянную подачу раствори-
растворителя из резервуара 1. В зависимости от типа насоса поток при необ-
необходимости можно сгладить с помощью демпфирующего устройства
4. В том месте, где давление может быть наибольшим (обычно не-
непосредственно за насосом), следует установить предохранительный
вентиль 3. Подвижная фаза после демпфирования подается в разде-
разделительную колонку 7 через устройство для ввода пробы F).
Давление на входе в разделительную колонку измеряют маноме-
манометром 5. Выходящие из разделительной колонки составные части про-
пробы определяют с помощью детектора 8; хроматограмма регистри-
регистрируется компенсационным самописцем 9. К детектору можно
присоединить и другие регистрирующие приборы, такие, как инте-
интегратор и т. д. Если составные части пробы следузт выделить, то
элюат собирают с помощью коллектора фракций 10; желательно,
Рис. III. 1. Схема хроматографа для жидкостной хроматографии при высоких
давлениях (пояснения см. в тексте).

38
Глава III
чтобы этот коллектор управлялся самописцем. Следует предусмо-
предусмотреть возможность термостатирования A1) узла для ввода пробы,
колонки и детектора, чтобы можно было работать при постоянной
температуре, отличающейся от комнатной. Подвижную фазу до вво-
ввода пробы следует термостатировать при температуре колонки.
А. Емкость для элюента.
Обезгаживание элюента
Чтобы при проведении аналитических работ можно было избе-
избежать дополнительного добавления растворителя, объем сосуда для
элюента должен составлять примерно 1000 мл. Во многих выпу-
выпускаемых приборах емкость для элюента в целях безопасности снаб-
снабжена легко управляемыми устройствами для обезгаживания [1, 2].
Емкость для элюента имеет нагреватель, регулятор температуры
и магнитную мешалку. Пары элюента конденсируются в холодиль-
холодильнике. Кроме того, ускорить обезгаживание можно, подключив ва-
вакуумную систему. Многие растворители в смеси с воздухом дают
взрывчатые смеси, поэтому систему следует промывать азотом. Для
этого Опять-таки необходимы устройства для регулирования и изме-
измерения расхода газа.
Необходимость обезгаживания обсуждалась во многих работах.
В настоящее время считают, что пузырьки воздуха, появляющиеся
при расширении растворенного в элюенте газа в детекторе, могут су-
существенно препятствовать обнаружению пробы. Незначительное из-
избыточное давление A-2 атм) в ячейке детектора препятствует обра-
образованию там пузырьков воздуха. Такое избыточное давление можно
создать, просто удлинив капилляр на выходе из детектора. Если тем-
температура в емкости для'элюента выше, чем в разделительной колон-
колонке и в детекторе, обезгаживания не требуется.
Пузырьки воздуха могут появляться в системе из-за плохого
уплотнения резьбовых соединений, через которые по принципу водо-
водоструйного насоса в систему засасывается воздух. Соответствующее
уплотнение резьбовых соединений тефлоновыми шайбами устраняет
возможность засасывания воздуха.
Разложение неподвижных фаз или проб, способных к окислению
под действием растворенного воздуха, наблюдается не часто, так как
рабочие температуры, как правило, низки, однако в принципе оно
возможно. Само собой разумеется, что возможно также и образова-
образование перекисей в элюенте.
Если используются тройные смеси, температура емкости для
элюента и разделительной колонки должна быть одной и той же, так
как иначе произойдет расслоение.
Разумеется, расположение и конструкция сосуда для элюента дол-
должны позволять легкую смену элюента.
Аппаратура для жидкостной хроматографии
39
Б. Насосы
Элюеит должен подаваться в колонку при высоких давлениях, не-
непрерывно и без пульсаций. Для аналитических работ (внутренний
диаметр колонок до 5 мм) насосы должны обеспечивать подачу
элюента со скоростью 10 мл/мин при давлении примерно 300—400
атм. Для препаративных работ необходимы большие расходы жид-
жидкости. Для подачи подвижной фазы можно использовать: 1) плун-
плунжерный насос с длинным ходом поршня и постоянной подачей
элюента; 2) плунжерные насосы с коротким ходом поршня и мем-
мембранные поршневые насосы с пульсирующей подачей элюента и по-
постоянной частотой хода поршня; 3) поршневые насосы с коротким
ходом поршня с меняющейся частотой хода поршня; 4) беспорш-
беспоршневые насосы, в которых используется газ.
Насосы типа 1, 3 и 4 обеспечивают почти свободный от пульсаций
поток элюента. При применении насосов типа 2 поток следует сгла-
сгладить с помощью демпфирующего устройства, установленного перед
устройством для ввода проб. Насосы могут обеспечивать постоянное
давление или постоянный поток. Если сопротивление разделитель-
разделительной колонки постоянно, то при постоянном давлении обеспечивается
постоянный поток, и наоборот.
1. Поршневые насосы с длинным ходом поршня
В таких насосах поршень движется с постоянной небольшой ско-
скоростью и постоянно подает подвижную фазу. Когда поршень дости-
достигает конечного положения, поток прерывается, и во время хода
всасывания заполняется цилиндр. Время подачи зависит от объема
цилиндра, который равен примерно 100-500 мл, и от расхода
элюента. Преимущество насосов этого типа состоит в том, что ис-
исключены вентили и обеспечивается беспульсационный поток раство-
растворителя с постоянной скоростью. Недостатком этих насосов является
то, что поток прерывается тем чаще, чем больше скорость элюента.
Диаметр поршня настолько велик, что сила, необходимая для движе-
движения поршня при высоких давлениях, достигает нескольких тонн. При
этом поршень должен двигаться с незначительной, но постоянной
скоростью. Кроме того, добиться хорошего уплотнения между по-
поршнем и стенками цилиндра достаточно сложно. По этим причинам
хорошие насосы такого типа сравнительно дороги.
2. Поршневые насосы с коротким ходом поршня
и поршневые мембранные насосы
Эти насосы обеспечивают непрерывный, но пульсирующий поток.
Диаметр поршня относительно невелик, поэтому решить проблему
уплотнения в данном случае несложно. В хроматографии рекомен-

40
Глава III
дуется использовать поршневые мембранные насосы, так как детали
этого насоса, непосредственно контактирующие с элюентом, можно
очень легко изготовить из инертного материала (например, стали
V4A). В таких насосах перемещение поршня передается мембране,
а вместе с ней подаваемому раствору с помощью гидравлической
жидкости. Уплотнение поршня соприкасается только с гидравличе-
гидравлической жидкостью (масло определенной и высокой вязкости), что упро-
упрощает проблему уплотнения и повышает надежность насосов такого
типа. Само собой разумеется, что распределительный механизм по-
потока элюента требует использования шариковых клапанов.
Недостаток насосов этого типа состоит в том, что характеристи-
характеристики подачи зависят от противодавления, что обусловлено конечным
временем срабатывания клапанного механизма. С увеличением да-
давления уменьшается подающая способность. Поэтому, оценивая ра-
работу насоса, следует обращать внимание на то, достаточна ли его
подающая способность при максимальном рабочем давлении. Порш-
Поршневые мембранные насосы надежны и сравнительно недороги. Если
в одной системе установлено несколько поршневых мембранных на-
насосов, смещенных по фазе, то демпфирование осуществить просто
[3]. При использовании трех головок насоса, обеспечивающих сме-
смещение по фазе на 120°, пульсации в результирующем потоке элюента
значительно сглажены. Пульсации поршневых насосов с высокой
скоростью хода поршня сгладить проще, чем пульсации насосов
с относительно низкой скоростью движения поршня.
3. Насосы с переменной частотой хода поршня
Описанные выше поршневые насосы работают с постоянной ча-
частотой хода поршня. Чтобы изменить подаваемый объем, меняют
рабочий объем цилиндра. При заданном объеме рабочей камеры на-
насоса уменьшение рабочего объема цилиндра всегда ухудшает коэф-
коэффициент полезного действия, так как сжимаемый объем больше обы-
обычно требуемого. Поэтому почти все насосы, разработанные спе-
специально для жидкостной хроматографии при высоких давлениях,
имеют постоянный объем цилиндров, а подачу в них регулируют,
меняя частоту перемещения поршня. Движение обоих поршней не си-
синусоидально и не находится точно в противофазе.
Управляемый с помощью эксцентрика второй поршень начинает
медленно двигаться еще до того, как первый поршень достигнет ко-
конечного положения. В момент достижения первым поршнем конеч-
конечного положения второй поршень достигает максимальной подачи,
а первый перемещается в обратное положение и вновь заполняется.
На рис. Ш.2 сравниваются характеристики подачи насосов этого ти-
типа и обычных поршневых насосов (два или три поршня, смещенные
по фазе на 180 или 120°).
При низких частотах пульсации также едва заметны. Более того,
Аппаратура для жидкостной хроматографии
41
Рис. Ш.2. Движение поршней в насосах.
а - насос с меняющейся частотой хода поршня; 6 - мембранный насос с двумя головками, смещенными
по фазе на 180°; в — мембранный насос с тремя головками, смещенными по фазе на 120°.
пульсации и неточности подачи можно легко выровнять с помощью
электронного управления. С этой целью на заданном сопротивлении
постоянно определяют падение давления, и если оно отклоняется от
заданного, в электронный блок управления скоростью мотора насоса
поступает сигнал и подача элюента меняется, пока не установится
заданное падение давления. В настоящее время еще трудно предска-
предсказать влияние подобных относительно недорогих мини-компьютеров
на дальнейшее развитие технологии насосов для жидкостной хрома-
хроматографии при высоких давлениях.
Насосы с электронно-регулируемой частотой хода поршня (при-
(привод с шаговым электродвигателем или электродвигателем постоян-
постоянного тока) отлично подходят для создания систем градиентного
элюирования.
4. Беспоршневые насосы с использованием газа
В насосах этого типа газ давит на деформируемый металлический
или пластиковый сильфон, содержащий элюент. В одном из простей-
простейших вариантов пластиковую емкость, заполненную элюентом, поме-

42
Глава III
щают в автоклав и, чтобы элюент вытекал из этой емкости, в авто-
автоклаве создают избыточное давление, напуская туда газ из баллона.
Можно также заполнить элюентом длинную трубку и затем подать
туда газ из баллона [5]. Максимальное давление, которое можно по-
получить таким образом, зависит от давления в газовом баллоне
A50-200 атм). К сожалению, при этом газ может диффундировать
через разделяющую мембрану и раствориться в элюенте. При вырав-
выравнивании давления до нормального растворенный газ образует пузы-
пузырьки, которые искажают показания детектора. Эта проблема не воз-
возникает в тех случаях, когда элюент подают поршневыми насосами,
работающими с использованием газа. В этих насосах газ при давле-
давлении меньше 10 атм давит на поршень с относительно большим попе-
поперечным сечением. Этот поршень приводит в движение поршень
с меньшим сечением, который и вытесняет жидкость. При этом да-
давление газа можно увеличить примерно в 50 раз. При одном ходе
поршня подается до 70 мл элюента. Насосы данного типа отличают-
отличаются от описанного поршневого насоса с длинным ходом поршня тем,
что заполнение цилиндра жидкостью при разряжении газового ци-
цилиндра происходит в течение нескольких секунд, при этом подача
элюента почти не нарушается (нарушение подачи в крайнем случае
наблюдается в виде короткого отклонения на самописце, которое не-
нельзя спутать с пиком). Преимущество насосов этого типа заклю-
заключается в том, что с помощью сравнительно простых средств можно
достичь высокого давления и получить почти свободный от пульса-
пульсаций поток. С помощью таких насосов очень просто регулировать
скорость потока, используя обычное в газовой хроматографии про-
программирование давления. Такие насосы обеспечивают постоянный
поток элюента, только если падение давления в системе не меняется.
Если элюент подается насосом с использованием газа, скорость по-
потока следует часто контролировать, так как перепад давления может
меняться, например, вследствие попадания частиц перегородки на на-
насадку при впрыскивании пробы с помощью шприца. Если необходи-
необходимо повысить давление, то газ заменяют на гидравлическую жид-
жидкость, которую подают с помощью простого насоса низкого давле-
давления.
В. Демпфирование пульсаций
Пульсации в потоке элюента, подаваемого поршневыми насосами
с коротким ходом поршня, необходимо демпфировать перед раздели-
разделительной колонкой. Пульсации могут нарушать показания детектора
и вызывать эрозию неподвижной фазы (в распределительной хрома-
хроматографии). Демпфирование пульсации проводят так же, как и выпря-
выпрямление переменного тока [6]. В простейшем случае цепь демпфиро-
демпфирования состоит из соединенных друг с другом емкости и сопротивле-
сопротивления. Гидравлическими сопротивлениями служат капилляры или
Аппаратура для жидкостной хроматографии
43
диафрагмы. В качестве пневматических емкостей используют запол-
заполненные газом пространства или объемные эластичные части, напри-
например трубки Бурдона. Очень важно, чтобы части демпфирующей це-
цепи, в которых находится жидкость, или полностью находились
в потоке элюента, или их можно было бы легко промывать перед
сменой элюента. При выравнивании переменного тока сглаживание
общей волны достигается легче в тех случаях, когда выравнивается
полуволна Точно так же проще сгладить пульсации насоса, в кото-
котором имеются по меньшей мере две головки, работающие смещенны-
смещенными по фазе на 180°. Демпфирование результирующего потока элюен-
элюента, подаваемого насосом с тремя головками, смещенными на 120° по
фазе, не составляет труда. Флуктуации скорости потока элюента во
всех областях должны составлять максимум 1, а лучше 0,5%. Сгла-
Сглаживание пульсаций по описанному выше способу достигается в ре-
результате снижения рабочего давления. В зависимости от длины
и свободного сечения ограничивающего капилляра снижение давле-
давления при демпфировании достигает примерно 40 атм.
В статье [7] кратко, но достаточно наглядно описано устройство
для демпфирования пульсаций в параллельной ветви. Это устрой-
устройство, кроме того, можно использовать в качестве предохранительно-
предохранительного вентиля и для контроля давления. Давление жидкости можно так-
также программировать, применяя устройство для программирования
давления в газовой хроматографии.
Г. Ввод пробы
Пробу вещества вводят в поток элюента (как это обычно принято
в газовой хроматографии) с помощью шприца через перегородку
в блок для ввода пробы (дозатор) или используют петлю для ввода
пробы, из которой пробу вымывают в систему элюентом. Проба
должна попадать в колонку без значительного смешивания с элюен-
элюентом, т. е. ее следует вводить шприцем непосредственно в начало раз-
разделительной колонки. Кроме того, давление или скорость потока
в разделительной колонке при введении пробы не должны нарушать-
нарушаться. Очень важно, чтобы объем пробьг можно было легко менять.
1. Петля для ввода пробы
В ситовой хроматографии пробу вводят чаще всего с помощью
петли, так как вязкие растворы полимеров вводить шприцем очень
трудно. Объемы подобных петель для ввода проб слишком велики
(от 0,02 до 2 мл), чтобы их можно было применять в жидкостной
хроматографии. Петли меньшего объема очень сильно увеличивают
размывание полосы в результате неизбежного образования профиля
потока и размывания пробы в элюенте. Недавно в продаже появи-
появились петли с меньшим объемом A—20 мкл). Однако, прежде чем их

44
Глава III
применять, необходимо решить проблему уплотнения, особенно при
частом употреблении петли. Новые типы петель пригодны также для
давлений, превышающих 100 атм. Следует заметить, что в тех уста-
установках, в которых используются петли таких малых объемов, не дол-
должно быть искажающего мертвого объема между выходом вентиля
и разделительной колонкой. Вводить пробы с помощью петли целе-
.сообразно не только в ситовой хроматографии, но и в препара-
препаративных работах. Эту операцию довольно просто автоматизировать,
особено если проводится рутинный анализ.
2. Устройство для ввода пробы шприцем (дозатор)
Ввод пробы инъекционным шприцем через перегородку в поток
элюента непосредственно перед разделительной колонкой или в на-
начало колонки используют наиболее часто. При правильной конструк-
конструкции дозатора мертвый объем практически не увеличивается. Блоки
для ввода пробы шприцем имеются в продаже, конструкция их
описывается во многих работах [6, 8].
С помощью обычных шприцев, используемых в газовой хромато-
хроматографии, если они имеют хорошо подогнанные поршни, можно еще
без труда работать при давлениях 50—100 атм. В продаже имеются
также шприцы, пригодные для ввода пробы при давлениях до 600
атм. Кроме хорошего уплотнения цилиндра, необходимого для во-
воспроизводимого ввода пробы и при низких давлениях, важна также
механическая защита, предотвращающая выбрасывание поршня при
протыкании мембраны.
При таком способе ввода пробы очень большие требования
предъявляются к перегородке: она должна не только выдерживать
высокие давления, но и быть устойчивой к действию растворителей.
Устойчивость прокладки к давлению можно значительно увеличить,
используя блок для ввода пробы соответствующей конструкции [6].
Гораздо труднее найти такие материалы, которые были бы пла-
пластичными, протыкаемыми, самоуплотняющимися, устойчивыми к ор-
органическим растворителям и не содержали бы пластификаторов, ан-
тиоксидантов и других веществ, способных растворяться в элюенте,
так как это приводит к периодическому появлению на хроматограм-
ме определенных полос или к дрейфу нулевой линии. Часто придать
прокладке определенные свойства можно, вываривая ее перед приме-
применением в растворителе.
Многие прокладки становятся под влиянием органических элюен-
тов хрупкими, и при каждом вводе пробы от прокладки отрывается
крошка, удерживаемая колонкой. Такие крошки меняют проницае-
проницаемость разделительной колонки, что можно заметить по увеличению
давления или уменьшению скорости потока. Увеличивается также
опасность того, что из скопившихся в колонке крошек будут вымы-
вымываться пластификаторы, олигомеры и другие вещества. Поэтому при
Аппаратура для жидкостной хроматографии
45
каждой замене прокладки из начала разделительной колонки следует
тщательно удалить все попавшие туда крошки прокладки. Целесо-
Целесообразно помещать в начало колонки небольшой тампон из стеклян-
стеклянной ваты: он будет играть роль фильтра и позволит легко удалить
остатки прокладки. Такой тампон из стеклянной ваты, кроме того,
не дает частицам насадки попасть в канюлю шприца, и шприц не за-
засоряется даже в тех случаях, когда пробу вводят непосредственно
в разделительную колонку.
Буна-iV и неопрен пригодны в качестве прокладок, если раствори-
растворителями служат вода, спирты и н-гексан. Если элюирование проводит-
проводится ароматическими соединениями, прокладки изготавливают из бо-
более устойчивого материала — витона-А. Однако при использовании
в качестве элюента хлороформа и хлористого метилена время жизни
прокладки из витона-А все же очень ограничено; в этом случае более
надежна прокладка из белой силиконовой резины.
Очень удобно вводить пробу шприцем с длинной канюлей с бо-
боковыми выходными отверстиями [9]. Канюлю вводят поперек пото-
потока элюента и закрепляют с помощью двух тефлоновых уплотнений
таким образом, что выходное отверстие при заполнении шприца на-
находится вне системы для ввода пробы. Если необходимо ввести про-
пробу, то шприц перемещают настолько, чтобы отверстие на канюле по-
попало в поток элюента непосредственно перед разделительной
колонкой. После того как проба введена, канюлю сразу же переме-
перемещают в исходное положение, чтобы уменьшить возмущение, возни-
возникающее в результате вымывания вещества пробы из канюли.
В другой системе пробу с помощью шприца при нормальном да-
давлении вводят в накопительную петлю непосредственно перед
разделительной колонкой. Далее, переключая мембранный вентиль,
направляют поток элюента через накопительную петлю и вымывают
пробу в разделительную колонку. Благодаря конструктивным осо-
особенностям дополнительное размывание полосы при этом методе
ввода пробы даже для разделительных колонок, заполненных части-
частицами диаметром около 10 мкм, пренебрежимо мало.
Если разделение проводится при очень высоких давлениях, пробу
можно вводить в разделительную колонку при остановленном пото-
потоке элюента, т. е. когда в колонке нет давления. При этом почти не
наблюдается размывания зоны. После ввода пробы поток элюента
восстанавливается, устанавливается рабочее давление и начинается
разделение. Конечно, проходит определенное время, прежде чем
в колонке опять установится желаемый профиль давления. Такой
способ введения пробы не отвечает условию, согласно которому при
вводе пробы давление и скорость потока в системе не должны нару-
нарушаться. Определение времени удерживания разделяемых веществ
при таком способе ввода пробы некорректно. Поэтому в таких слу-
случаях вместе с пробой вводят внутренний стандарт и определяют от-
относительное удерживание. При количественных определениях вну-

46
Глава HI
тренний стандарт даже необходим. Кроме того, при рассматривае-
рассматриваемом способе ввода пробы возможны толчки давления, и
в результате плотность насадки разделительной колонки может
измениться.
Объем вводимой пробы определяется растворимостью пробы
в подходящем элюенте. Однако он не должен быть слишком боль-
большим, так как в противном случае становится возможным дополни-
дополнительное размывание полосы. Опасность размывания существует пре-
прежде всего тогда, когда объем пробы и объем подвижной фазы
в разделительной колонке — величины одного порядка [19]. При ана-
аналитических работах следует брать как можно меньшие объемы проб,
т. е. пробы должны быть возможно более концентрированными. В то
же время применение сильно концентрированных растворов в препа-
препаративных работах может привести к перегрузке начальной части
колонки.
Д. Разделительная колонка
1. Материал колонки
В качестве колонок используют чаще всего трубки из нержавею-
нержавеющей стали, а также стеклянные и танталовые трубки. Основное пре-
преимущество стеклянных колонок - возможность визуального контро-
контроля за качеством заполнения. Однако в тех случаях, когда рабочее
давление превышает 70 атм, обычно такие колонки использовать не-
нельзя. Правда, если стеклянную колонку поместить в стальную ру-
рубашку и поднять давление в рубашке, то на такой колонке можно
работать при давлениях выше 70 атм. Стеклянные трубки имеют
гладкую внутреннюю поверхность.
У разделительных колонок из тантала внутренняя поверхность
также гладкая [9]. Тантал - очень твердый материал, и резьбовые
соединения на таких колонках следует приклеивать. У трубок из
нержавеющей стали внутренняя поверхность более или менее
шероховата и покрыта продольными канавками. Если эту ше-
шероховатость удалить путем расточки трубки или путем полировки ее
внутренней поверхности, то такие колонки можно воспроизводимо
заполнять насадкой. При этом воспроизводимость заполнения не зави-
зависит от способа изготовления исходной трубки (горячее или холодное
протягивание, прецизионное протягивание и т. д.). Разделительная
способность колонок из нержавеющей стали, обработанных таким
образом, может быть примерно в 10 раз выше, чем колонок из не-
необработанных трубок. Воспроизводимость заполнения колонки воз-
возрастает от 30 до почти 90% [12].
Итак, суммируем важнейшие характеристики колонок, изгото-
изготовленных из перечисленных выше материалов.
Стеклянные колонки: гладкая внутренняя поверхность, прозрач-
прозрачность, инертность, можно использовать при давлениях до 70 атм.
Аппаратура для жидкостной хроматографии
47
Колонки из нержавеющей стали: относительная коррозионная стой-
стойкость, способность к пассивации, можно применять при любых
давлениях.
Танталовые колонки: гладкая внутренная поверхность, значительная
инертность, твердость.
Медные колонки: легко обрабатываются, склонны к коррозии.
Следовательно, если анализируются водные растворы солей (на-
(например, ацетатные или цитратные буферы), стеклянные колонки пред-
предпочтительнее, чем колонки из нержавеющей стали.
Внутренний диаметр аналитических разделительных колонок со-
составляет обычно 2—4 мм. Колонки диаметром 2 мм заполняют, как
правило, частицами диаметром 30 мкм. Разделительная способность
и воспроизводимость колонок диаметром 3 — 4 мм, заполненных ча-
частицами диаметром менее 10 мкм, лучше, чем колонок с меньшим
внутренним диаметром [13].
2. Форма колонки
Форма разделительной колонки в значительной степени опреде-
определяется величиной и формой используемых термостатов. Прямые ко-
колонки проще заполнять, чем свернутые. Из-за незначительной ра-
радиальной диффузии в жидкой подвижной фазе в изогнутых трубках
в жидкостном хроматографе выравнивание профиля потока насту-
наступает значительно медленнее, чем в разделительной колонке газового
хроматографа. Сгибать уже заполненные колонки следует по воз-
возможности в спирали большого радиуса. При сгибании колонки может
происходить истирание частиц. Это уменьшает проницаемость раз-
разделительной колонки. Частицами диаметром менее 10 мкм за-
заполняют только прямые колонки. Обычная длина таких колонок
10-50 см.
3. Присоединение колонок
Для запирания разделительной колонки предпочитают вместо по-
пористой тефлоновой шайбы устанавливать в обоих концах колонки
металлокерамические или стеклянные пористые фильтры или
фильтры из металлического волокна. В некоторых случаях в конце
колонки можно поместить дополнительно фильтровальную бумагу
(«для фильтрации мелких осадков»). Сопротивление фильтра должно
быть как можно меньше, но неизбежно присутствующие в насадке
тонкие частицы повышают сопротивление, они могут вымываться из
разделительной колонки в детектор или даже закупорить подводя-
подводящие капилляры. При подсоединении разделительной колонки к бло-
блоку ввода пробы и детектору, а также при соединении отдельных раз-
разделительных колонок следует избегать, как уже многократно
отмечалось, любых излишних мертвых объемов [6]. Соединительные
и переходные узлы следует высверливать, чтобы получить бес-

48
Глава III
Рис. Ш.З. Схематическое изображе-
изображение резьбового соединения на кон-
конце колонки.
/-разделительная колонка, 4-6 мм; 2 — за-
заглушка колонки; 3 - высверленный штуцер; 4 -
подводящий капилляр, 1,6 мм.
шовные переходы между узлом ввода пробы и колонкой, между от-
отдельными частями разделительной колонки и между разделительной
колонкой и детектором.
На рис. Ш.З показано присоединение шестимиллиметровой разде-
разделительной колонки к соединительному капилляру детектора диаме-
диаметром 1,6 мм. Продажные переходные детали рассверливают таким
образом, чтобы подводящую трубку детектора можно было прибли-
приблизить непосредственно к концу колонки.
4. Заполнение колонки
Существуют два принципиально различных метода заполнения
разделительной колонки насадкой, и выбор того или иного метода
зависит от диаметра частиц насадки.
Частицами диаметром более 20 мкм разделительную колонку
можно заполнить сухим способом. Колонку устанавливают верти-
вертикально и небольшими порциями засыпают в нее насадку. При этом
по колонке постукивают или ее вибрируют. После добавления ка-
каждой новой порции частиц высота слоя должна увеличиться на не-
несколько миллиметров [10, 10а]. Чтобы слой насадки был достаточно
плотным, нижним торцом трубки постукивают еще и по твердой
подставке. Описанным способом можно получить хорошо и во-
воспроизводимо заполненную колонку. Таким методом можно также
Аппаратура для жидкостной хроматографии
49
заполнять колонки носителем, на который уже нанесена неподвиж-
неподвижная жидкая фаза. Если частицы легко слипаются, то имеет смысл до-
дополнительно уплотнить насадку точно подогнанной по внутреннему
диаметру колонки палочкой. При любом методе заполнения следует
обратить внимание на то, чтобы частицы не раздавливались и не
истирались.
Если разделительная колонка (диаметр частиц 30—40 мкм) хоро-
хорошо заполнена полностью пористой насадкой, при линейной скорости
элюента 2 см/с высота, эквивалентная теоретической тарелке, равна
примерно 1 мм. Для поверхностно-пористых материалов высота, эк-
эквивалентная теоретической тарелке, в аналогичных условиях соста-
составляет всего 0,2-0,5 мм.
Частицы диаметром 5-10 мкм лучше всего намывать в виде сус-
суспензии в колонку, заполненную элюентом, так как в этом случае ме-
метод заполнения сухой насадкой не пригоден. В процессе заполнения
суспензии должны оставаться стабильными и не должно происхо-
происходить осаждение или агломерация частиц. Стабильные суспензии по-
получают в том случае, когда а) между частицами и суспендирующей
жидкостью нет различия в плотностях — «метод сбалансированной
плотности» или б) вязкость суспендирующей среды настолько вели-
велика, что скорость оседания частиц минимальна - «метод высокой
вязкости».
Метод сбалансированной плотности детально описан в ряде ра-
работ [14—17, 22], там же приведены конструкции устройств для запол-
заполнения [14, 17]. Силикагель с истинной плотностью примерно 2,2
можно суспендировать только в бром- или иодсодержащих углево-
углеводородах. Как правило, для этой цели используют тетрабромэтан.
Для снижения плотности до требуемого значения добавляют четы-
реххлористый углерод. Для того чтобы избежать комкования частиц,
желательно добавить к суспендирующей жидкости примерно 10% по-
полярного соединения (диоксан, метанол). На рис. Ш.4 показана воз-
возможная конструкция сосуда для заполнения. Общий объем сосуда
должен быть равен примерно 100—150 мл, чтобы можно было за-
заполнять микропрепаративные колонки, объем которых довольно
велик.
Чтобы можно было заполнить колонку длиной 30 см с внутрен-
внутренним диаметром 4 мм, необходимо суспендировать ~ 2 г сили-
кагеля в 50 мл суспендирующей жидкости (например, смеси тетра-
бромэтана, диоксана и четыреххлористого углерода 20:15:15). Эту
суспензию осторожно переводят в сосуд для заполнения (см. рис.
Ш.4). Разделительную колонку с помощью переходника, диаметр ко-
которого равен диаметру колонки, а длина составляет примерно 2 см,
присоединяют к сосуду для заполнения и заполняют элюентом.
Переходник заполняют насадкой вместе с колонкой, но не исполь-
используют при разделении. Поверх суспензии заливают более легкий сме-
смешиваемый с тетрабромэтаном элюент, например н-гептан. После
4 Заказ 825

50
Глава III
OIL
Рис. III.4. Схема устройства для запол-
заполнения колонки.
Объем: ~ 100 мл для аналитических колонок 30 см х 4 мм
(внутр.) и ~ 200 мл для колонок 30 см х 10 мм (внутр.).
Диаметр выходного отверстия трубки сосуда для за-
заполнения должен быть равен диаметру заполняемой
колонки и внутреннему диаметру переходника.
присоединения источника давления включают насос; при этом в си-
системе ни в коем случае не должны образовываться пузырьки возду-
воздуха. С помощью насоса суспензию затем передавливают в колонку.
Давление, при котором происходит заполнение колонки, должно
быть больше наивысшего рабочего давления, при котором проводит-
проводится анализ. Об окончании заполнения в приведенном примере (вытес-
(вытеснение тетрабромэтана гептаном) свидетельствует падение давления
(меньшая вязкость гептана!). Чтобы полностью удалить суспенди-
суспендирующую жидкость и уплотнить насадку, колонку промывают еще не-
некоторое время при высоком давлении. В качестве вытесняющих жид-
жидкостей предпочтительны органические элюенты, так как в этом
случае на колонке можно работать сразу после заполнения и не нуж-
нужно проводить дальнейшее кондиционирование (например, сложное
удаление воды).
Тетрабромэтан очень легко отщепляет бром или бромистый во-
водород, которые при промывании колонки гептаном, водой, метано-
Аппаратура для жидкостной хроматографии
51
лом и т. д. удаляются не полностью. Химически модифицированные
фазы под действием тетрабромэтана могут разлагаться или изме-
изменяться. В таких случаях целесообразно заполнять колонки вяз-
вязкостным методом. В качестве суспендирующего материала исполь-
используют жидкости с высокой вязкостью (например, парафиновое масло,
циклогексанол и т. д.). Аппаратура и методика заполнения иден-
идентичны описанным выше.
Описаны также такие методы заполнения, в которых используются
оба принципа (сбалансированная плотность и высокая вязкость).
Если регулировать плотность и (или) вязкость суспендирующей среды
так, чтобы суспензия оставалась стабильной по крайней мере до тех пор,
пока не закончится заполнение колонки, то с помощью суспензион-
суспензионного метода заполнения можно заполнить колонку практически лю-
любой насадкой.
Для окиси алюминия пригодна смесь тетрабромэтан - диоксан
(90:10 по объему). Наполнение колонок для ситовой хроматографии
и ионного обмена неподвижными фазами на основе полистирола
и т. д. можно проводить с той средой, в которой эти фазы предвари-
предварительно набухали и в которой будет проводиться разделение. Следует
помнить, что при смене элюента степень набухания и соответственно
заполнения меняется. Этот метод заполнения колонки непригоден
для носителей, предварительно покрытых разделяющей жидкостью
(носители, применяемые в распределительной хроматографии), так
как она в процессе заполнения или кондиционирования может быть
вымыта. Таким способом можно заполнять колонки только чистыми
носителями, а разделяющую жидкость наносят уже в заполненной
колонке по методу нанесения разделяющей жидкости из элюента
(см. гл. VIIJ.
Приготовить хорошо упакованную колонку может только опыт-
опытный экспериментатор. Проще заполнять колонку частицами диаме-
диаметром примерно 10 мкм, поэтому новичку следует начинать работать
именно с такой насадкой. Предположим, что ему удастся получить
хорошо и воспроизводимо упакованные колонки длиной 30 см с 3000
теоретических тарелок и что такая разделительная способность для
решения поставленных перед ним задач еще недостаточна, тогда он
должен попытаться заполнить колонку частицами диаметром при-
примерно 5 мкм. Для рутинных анализов такие насадки используются
редко, так как применяемая при этом аппаратура должна отвечать
определенным требованиям.
5. Характеристика и испытание разделительных колонок
Как показано в разд. П.Е, минимальная достижимая высота, экви-
эквивалентная теоретической тарелке, является функцией размера частиц
неподвижной фазы. Чем меньше диаметр частиц, тем меньше высота
тарелки и тем больше при одинаковой длине разделительной колон-
4*

52
Глава III
ки число тарелок. Конечно, это справедливо при условии, что все ко-
колонки заполнены одинаково хорошо. Чем меньше диаметр частиц,
тем большие требования предъявляются к аппаратуре, особенно если
диаметр частиц меньше 10 мкм. При этом размывание полосы вне
колонки может стать настолько большим, что h перестанет зависеть
от диаметра частиц. Определение внеколоночного размывания (на-
(например, в узле ввода пробы, детекторе и подводящих коммуника-
коммуникациях) возможно только при больших затратах (например, требуются
безынерционные самописцы и т. д.). Подобные теоретические сообра-
соображения, например относительно реального размывания полосы в раз-
разделительной колонке, мало что дают практику. Ему необходимо
приготовить колонку с определенным числом тарелок, для того
чтобы можно было выполнить необходимое разделение, и важно
установить, можно ли считать оптимальным разделение, проведен-
проведенное на такой колонке с использованием имеющейся у эксперимента-
экспериментатора аппаратуры.
Качество упаковки колонки или минимальное достижимое раз-
размывание полосы можно установить из хроматографических данных
с помощью следующих опытов [23].
а) Асимметрия пика, особенно инертного и слабоудерживаемых
пиков (к' < 5), говорит о плохом заполнении разделительной колон-
колонки. Разумеется, предварительно следует устранить нарушения, вызы-
вызываемые аппаратурой. Если пик инертного вещества и пики со значе-
значениями к' < 1 асимметричны, то причиной, возможно, является
аппаратура. Это можно установить точно, только сняв кривую h =
=/(u). Если при линейных скоростях более 3 мм/с наблюдается от-
отклонение от прямой линии, то скорее всего асимметрия пика вызва-
вызвана несовершенством прибора. Асимметричность определяют как
частное от деления отрезков (w, см. рис. П.1), отсекаемых на нулевой
линии перпендикуляром, опущенным из максимума пика на нулевую
линию, причем берут отношение отрезка после перпендикуляра к от-
отрезку до перпендикуляра. Если фактор асимметрии больше чем 1,5
(квадрат фактора асимметрии может достигать 2,0 [22]), то колонку
следует заполнить заново, так как размывание, или образование хво-
хвостов, ухудшает разделение или вызывает загрязнение разделяемых
соединений из-за перекрывания их зон, если проводится ми-
микропрепаративное разделение.
б) Время удерживания инертного пика (tQ) и линейная скорость
элюента также относятся к числу основных характеристик раздели-
разделительной колонки.
В жидкостной хроматографии при высоких давлениях часто труд-
трудно решить, удерживается ли анализируемое вещество, особенно если
экспериментатор располагает только УФ-детектором. Если роль
элюента выполняет алифатический углеводород (например, н-гептан),
то можно в качестве инертного вещества рассматривать тетрахлор-
этилен или четыреххлористый углерод. Если в распоряжении имеется
Аппаратура для жидкостной хроматографии
53
дифференциальный рефрактометр, то мертвое время можно точно
определить, используя гомолог элюента с меньшей молекулярной
массой. Если элюентом служит хлористый метилен, бензол не удер-
удерживается. Само собой разумеется, что в этом случае н-гептан — так-
также инертное соединение.
Определить мертвое время для химически связанных непо-
неподвижных фаз и воды или смесей воды с органическими растворите-
растворителями значительно сложнее. Если элюирование проводится смесью
с водой, то в качестве инертжио соединения можно рас-
рассматривать или органический компонент, или воду (дифферен-
(дифференциальный рефрактометр!). Тяжелая вода также не удерживается на-
насадкой, если в качестве элюента используют воду. Проблемы
возникают также при анализе солей или диссоциированных веществ.
Последние могут при прочих равных условиях элюироваться даже
перед инертным пиком в результате эффекта исключения (например,
в результате наличия доннановского потенциала). В таких случаях
мертвое время f0 можно точно определить, только применяя непо-
неполярные элюенты и неудерживающиеся пробы.
Проверить результаты измерений можно с хорошим приближе-
приближением, рассчитав мертвое время по формуле A1):
f0 = Lr2K?j/F,
где L — длина колонки, см, г - радиус колонки, см, и F - скорость
потока, см3/с. Общая пористость ет для полностью пористых носите-
носителей (независимо от метода заполнения) равна 0,84 + 5%. Для химиче-
химически связанных фаз, а также для ионообменников ет всегда меньше.
В предельном случае ег равна 0,42 (например, для непроницаемых
стеклянных шариков). В системах с обращенной фазой с хорошим
приближением ет можно принять равной 0,75.
в) Диаметр частиц насадки, приведенный поставщиком, не обяза-
обязательно совпадает с «эффективным гидродинамическим диаметром»
частиц, который влияет на разделительную способность и проницае-
проницаемость колонки. Как показано в разд. П. Е, гидродинамический диа-
диаметр частиц можно определить по проницаемости разделительной
колонки или по перепаду давления, необходимому для создания оп-
определенного потока через разделительную колонку. Преобразуя
уравнение B9), согласно данным работы [25], получаем
dp = 41
где dp измеряется в мкм, если F определено в см3/мин, L— в см,
г) — в сП, г — в мм и Ар — в атм. (Константы, необходимые для пере-
перевода единиц в систему СГС, входят в коэффициент.)
г) Определив указанным выше способом размер частиц и рассчи-
рассчитав по мертвому времени линейную скорость и, предполагаемую вы-
высоту, эквивалентную теоретической тарелке, h в хорошо запол-

54
Глава III
ненных колонках можно установить с помощью следующего
эмпирического приближенного уравнения [23]:
где h измеряется в мкм, если dp дан в мкм, а и — в мм/с. Это уравне-
уравнение выполняется только для неполярных элюентов с низкой вяз-
вязкостью, например н-гептана, хлористого метилена, и низкомолеку-
низкомолекулярных проб, например бензола и его производных (нитробензола,
нитроанилина, нитрофенола и т. д.).
С помощью данного эмпирического уравнения можно рассчитать
только величину h; расчет отдельных членов (А, В, С) невозможен.
Разделительную колонку, из которой соединения элюируются
в виде симметричных пиков, можно считать хорошо заполненной
и пригодной к употреблению, если экспериментально найденная ве-
величина h в 1,5 раза больше значения h, рассчитанного по приведенно-
приведенному выше уравнению. При расчете используют гидродинамический
диаметр частиц, найденный из скорости потока и перепада давления.
(Сведения о размерах частиц, приведенные на упаковке, не всегда
можно использовать.) Для неполярных неподвижных фаз (обращен-
(обращенная фаза) и полярных элюентов (например, воды) экспериментальные
значения h вдвое больше рассчитанных по приведенному выше
уравнению.
Размывание полосы всегда усиливается с увеличением скорости
элюента, если линейные скорости превышают 1—2 мм/с. При мень-
меньших скоростях уже для частиц с очень малым диаметром E мкм)
становится заметным член В (см. разд. П.Е).
В табл. Ш.1 сравнивается разделительная способность колонок,
заполненных частицами различного диаметра; заполнение колонок
проводилось разными методами. Для того чтобы можно было оце-
оценить влияние размеров частиц, в таблице приведены рассчитанные
длины колонок с примерно 3000 тарелок C000 тарелок достаточно
для многих рутинных разделений). Там же указан также перепад да-
давления, необходимый для колонки данной длины. Время анализа (по-
(последний столбец) всегда тем меньше, чем меньше длина колонки.
Чтобы читатель сам мог решить вопрос, имеет ли смысл всегда про-
проводить измерения при более высокой скорости элюента, приведем
следующий пример. Если при диаметре частиц 5 мкм скорость
элюента составляет всего 2 мм/с, то при длине колонки 12 см доста-
достаточен перепад давления в 40 атм. В этих условиях разделение закан-
заканчивается через 4 мин. При почти вдвое большей длине колонки
и примерно в 8 раз большем перепаде давления анализ длится 1,4
мин.
д) Нагрузка колонки по пробе составляет чаще всего 10." * г про-
пробы на 1 г неподвижной фазы. При большем соотношении пробы
и неподвижной фазы величина пробы влияет на высоту тарелки
Аппаратура для жидкостной хроматографии
55
Таблица III. 1
Диаметр частиц и максимальная разделительная способность
s
II
и 5
I
ls
S I
40
40
30
10
Пористые
Поверхност-
но-порис-
но-пористые
То же
Пористые
То же
Сухой
То же
В виде сус-
суспензии
То же
20
20
20
10
5
10
5
2
1000-2000
400-700
300-500
100-150
60-100
50-70
30-50
20-40
500
200
150
45
30
20
15
12
250
100
130
180
60
320
120
40
17
7
5
3
4
1,4
2
4
а Для ~ 3000 тарелок при приведенной скорости элюента н-гептана.
и время удерживания, так как начинает меняться величина к'. Каче-
Качественный анализ и идентификация по времени удерживания при этом
больше невозможны. Экспериментальная кривая определения допу-
допустимой нагрузки приведена на рис. VI.2.
Е. Термостатирование
При очень многих анализах температуру разделительной колонки
необходимо контролировать и поддерживать постоянной. Для этой
цели обычно используют воздушные термостаты с сильным переме-
перемешиванием воздуха, конструкция которых достаточно проста. Перед
колонкой следует установить дополнительный хорошо 1ействующий
теплообменник, чтобы подвижная фаза до разделительной колонки
приняла температуру термостата. В отличие от жидкостных термо-
термостатов воздушные термостаты мало инерционны и очень быстро вы-
выходят на заданный режим, хотя проблема теплопередачи в послед-
последнем случае решается сложнее. При использовании воздушных
термостатов с открытыми нагревательными элементами может про-
произойти взрыв, поэтому такие термостаты должны быть снабжены
устройствами для промывания термостатируемого пространства
азотом.
Ж. Измерение скорости потока
Скорость протекающей жидкости следует проверять как можно
чаще. Проще всего собирать определенные объемы жидкости и фик-

56
Глава III
сировать необходимое для этого время. Можно также использовать
принцип сифона [11]. При этом элюент течет в сифон с опреде-
определенным объемом. При освобождении сифона с помощью фотоячейки
получают электрический импульс, дающий на ленте самописца мар-
маркирующую отметку. Зная объем сифона и время, соответствующее
расстоянию между отметками, можно рассчитать скорость потока.
Поскольку такой прибор может работать непрерывно в процессе все-
всего разделения, то маркирующие отметки наносятся на ленту само-
самописца и таким образом скорость потока непрерывно контролируется.
Ротаметры, обычно используемые в газовой хроматографии,
в жидкостной хроматографии из-за большого различия в вязкостях
подвижной фазы и из-за ее сильной температурной зависимости тре-
требуют для каждой температуры и каждого растворителя специальной
тщательной калибровки, поэтому в ЖХ их применяют очень редко.
3. Сборник фракций
Устройства для сбора отдельных фракций, необходимых только
для того, чтобы можно было определить растворенные составные
части пробы, в аналитической жидкостной хроматографии при высо-
высоком давлении больше почти не нужны, так как чувствительность де-
детекторов достаточна. Только в особых случаях (например, при изме-
измерении радиоактивности и др.) собирают отдельные фракции либо
имеющие постоянный объем, либо собранные за определенный про-
промежуток времени. Для препаративных работ, когда размер пробы
превышает 100 мг, конечно, подходит коллектор фракций. В этом
случае должна иметься возможность (так же как в препаративной га-
газовой хроматографии) управлять сборником фракций с помощью
самописца. Тогда число фракций, необходимых для проведения всей
работы, значительно уменьшается. Наряду с пробоотборниками, из-
известными из классической колоночной хроматографии, в продаже
имеются приборы меньших размеров (на 10 — 20 фракций), выпу-
выпускаемые специально для жидкостной хроматографии при высоких
давлениях.
И. Регистрирующее устройство
Записывают хроматограммы с помощью компенсационного
самописца, который должен быть связан с детектором. Время пробе-
пробега должно составлять 0,25 или 0,5 с для того, чтобы при наличии
очень быстро появляющихся пиков не наблюдалось нарушения хро-
матограмм. Времена элюирования могут различаться очень сильно,
поэтому скорость движения ленты самописца должна легко регули-
регулироваться. Как и газовые хроматографы, жидкостные хроматографы
могут быть подсоединены к интеграторам и небольшим вычисли-
вычислительным машинам.
Аппаратура для жидкостной хроматографии
57
К. Аппаратура для градиентного элюирования
Состав элюента в жидкостной хроматографии имеет решающее
значение. Проводя элюирование смесями различного состава, можно
за короткое время элюировать из колонки в виде острых хорошо
разделенных пиков не только легко элюируемые выбранным элюен-
том соединения, но и те компоненты пробы, которые таким элюен-
том постоянного состава элюировались бы с трудом. Градиентное
элюирование позволяет значительно сократить продолжительность
анализа и существенно улучшить его чувствительность. Разумеется,
разрешение в большинстве случаев становится хуже. Все эти вопросы
подробно обсуждаются в разд. VI.3.4, здесь же мы только рассмо-
рассмотрим, какая аппаратура применяется при градиентном элюировании.
Большинство используемых в настоящее время детекторов фикси-
фиксирует также изменение состава элюента. Далее мы на этом вопросе
остановимся, а пока только отметим, что даже при использовании
дифференциальных,устройств и фавнительной колонки, идентичной
соответствующей разделительной колонке, дрейф нулевой линии
полностью не исключается. Едва ли даже возможно заполнить две
разделительные колонки таким образом, чтобы гидродинамическое
сопротивление их было полностью идентичным.
При проведении градиентного элюирования встает вопрос о том,
как осуществить смешивание элюентов. Проще всего проводить сме-
смешивание элюентов в той части прибора, где давление низкое. Для
этого можно использовать устройства, известные из классической
жидкостной хроматографии [21, 24]. Подача раствора может осу-
осуществляться с помощью поршневого насоса с коротким ходом
поршня. Однако длинный путь между камерой смешения и раздели-
разделительной колонкой и возможное смешивание в насосе и демпфирую-
демпфирующем устройстве могут служить причиной плохой воспроизводимости
результатов разделения. В работе [20] описан автоматический аппа-
аппарат с 20 форсосудами для смешивания при низком давлении. Соста-
Составление смесей для градиентного элюирования при высоких давле-
давлениях требует больших затрат. Обычно используют для каждого
компонента собственную систему подачи. Решающее значение
имеют геометрия камеры смешения и то, как через нее протекает
раствор, так как в разделительную колонку должна поступать уже
готовая смесь. Объем каналов, соединяющих камеру смешения
и разделительную колонку, должен быть минимально возможным
и между ними не должно быть никаких ответвлений, промываемых
элюентом.
В большинстве выпускаемых приборов имеется устройство для гра-
градиентного элюирования. Самое простое устройство такого типа —
это система из двух поршневых насосов с длинным ходом поршня,
скорость подачи которых меняется противоположним образом. При
этом либо оба насоса вместе подают растворители в камеру для

58
Глава III
смешения, либо один насос подает растворители в цилиндр другого,
который при этом выполняет роль камеры смешения, в нем же осу-
осуществляется дополнительное перемешивание с помощью магнитной
мешалки.
Градиентное элюирование можно проводить и в установках с од-
одним насосом, если это насос постоянного давления. Второй более
сильно элюирующий компонент помещают в накопительную петлю.
С помощью подходящего распределительного вентиля с раздели-
разделительной колонкой или расположенной перед ней камерой смешения
соединяют либо непосредственно насос, либо накопительную петлю.
В результате чего и достигается градиент концентраций в элюирую-
щей смеси. Смешивание обоих «пробкоподобных» потоков элюентов
должно быть очень хорошим.
Довольно просто также менять концентрацию компонентов
в элюирующей смеси, используя поршневые мембранные насосы
с двумя головками. Каждая головка насоса подает свой элюент.
С помощью шагового мотора ход поршня в обеих головках насоса
меняется противоположным образом. Результирующий поток
элюента при этом должен оставаться постоянным, его контроли-
контролируют двумя расходомерами, соединенными обратной связью с ша-
шаговым мотором. Обеспечить синхронное изменение хода поршней,
а также воспроизводимость и точность градиентного состава можно
с помощью электронных устройств.
При градиентном элюировании целесообразно использовать на-
насосы с меняющейся частотой хода поршня, снабженные шаговыми
моторами или моторами постоянного тока. С помощью элек-
электронных устройств работой двух насосов можно управлять таким
образом, чтобы при постоянном общем количестве подаваемого на
колонку элюента количества отдельных его компонентов, по-
подаваемых каждым насосом, менялись противоположным заранее вы-
выбранным способом. Таким образом можно приготовить элюент из
двух компонентов, отвечающий любой выбранной программе.
В настоящее время решены еще не все задачи, связанные с прак-
практическим осуществлением градиентного элюирования. Например,
при смешении двух органических растворителей выделяется тепло,
которое следует отводить. Далее, если у смешиваемых компонентов
сильно различается вязкость, то в процессе разделения могут ме-
меняться скорость элюента (в системах с постоянным давлением) или
давление (в системах с постоянным подаваемым объемом). Наконец,
до сих пор не разработан детектор, предназначенный специально для
градиентного элюирования (В принципе для этой цели пригоден
транспортный детектор; см. разд. VIJT.)
Кроме программирования состава элюента, в жидкостной хрома-
хроматографии применяется программирование скорости элюента (путем
программирования давления на входе в колонку) и температуры раз-
разделения [18].
Аппаратура для жидкостной хроматографии
59
Для программирования потока или давления могут служить уже
названные регуляторы потока (см. стр. 26) [7]. Если позволяет систе-
система подачи элюента, то объемная скорость элюента увеличивается со-
соответственно увеличению давления на входе в колонку. Любое про-
программируемое увеличение линейной скорости элюента ведет
к сокращению длительности анализа. Большинство детекторов в из-
известных пределах объемных скоростей @,5-8 мл/мин) не откликает-
откликается на увеличение потока элюента через измерительную ячейку (ДР-
и УФ-детекторы). При работе с такими детекторами для сокращения
времени анализа можно использовать программирование скорости
потока.
Программирование температуры (постоянное увеличение темпе-
температуры) не относится к числу универсальных методов. Во-первых,
при изменении температуры только УФ-детектор работает достаточ-
достаточно стабильно, а дифференциальный рефрактометр вообще не приго-
пригоден. Во-вторых, при повышении температуры нарушается (см. разд.
VI. Ш.2) равновесие, например, между водой, адсорбированной на
поверхности адсорбента, и водой, растворенной в элюенте. Как и
в газовой хроматографии, линейному градиенту температур соответ-
соответствует экспоненциальный градиент давления или скорости потока.
Элюент необходимо нагреть до требуемой температуры перед
тем, как он поступит в разделительную колонку. В качестве теплооб-
теплообменника вполне пригоден капилляр длиной примерно 1 м (внутрен-
(внутренний диаметр 0,25 мм), который помещают в тот же самый термо-
термостат, в котором находится и разделительная колонка. (При работе
с циркуляционными термостатами достаточно рубашки типа холо-
холодильника Либиха.)
Л. Меры безопасности
Используемое в аппаратуре давление не представляет опасности,
так как в жидкостном хроматографе циркулируют несжимаемые
жидкости. Однако большинство элюентов легко воспламеняются
При плохом уплотнении соединений, особенно часто в месте устано-
установления прокладки в дозаторе, может появиться сильная струя под-
подвижной фазы. Воздушный термостат следует снабдить устройством
для промывки инертным газом. Особенно внимательно необходимо
-еледить за тем, чтобы термостат не перегревался, так как при слиш-
слишком высокой температуре и высоком давлении возможен переход
элюента в сверхкритическую область.
Для того чтобы при случайном засорении аппаратуры отдельные
части прибора не были испорчены в результате повышения давления,
в установке обязательно должен быть предусмотрен предохрани-
предохранительный вентиль. Целесообразно устанавливать предохранительный
вентиль непосредственно за насосом, т. е. там, где достигается самое
высокое давление.

60
Глава III
В заключение напомним, что практически все органические рас-
растворители вредны, так, например, хлороформ является канцероге-
канцерогеном.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Обзорная статья:
Генри Р. в кн. Современное состояние жидкостной хроматографии. — М.:
Мир, 1974, 325 с.
1. Schrenker H., CZ-Chemie-Technik, 1, 73 A972).
2. Нире К.-Р., Schrenker H., Chromatographia, 5, 44 A972).
3. Orlita F., Kaiser R., Chemiker-Ztg., 95, 84 A971).
4. Waters Assoc, Chromatography Notes, Vol. 2, No. 1 (Feb. 1972).
5. Karger B. L., Berry L. V., Anal. Chem., 44, 93 A972).
6. Halasz I., Kroneisen A., Gerlach H. O., Walkling P., Z. Anal. Chem., 234,
81 A968).
7. Deininger G., Halasz I., J. Chromatogr., 60, 65 A971).
8. Pearce В., Thomas W. L., Anal. Chem., 44, 1107 A972).
9. Ecker E., Chemiker-Ztg., 95, 511 A971).
10. Karger B. L., Сотое К., Engelhardt H., J. Chromatogr. Sci., 8, 242 A970).
10a. Halasz I., Naefe M., Anal. Chem., 44, 76 A972).
11. Schneider H., Rossler G., Halasz I., Chromatographia, 6, 237 A973).
12. Halasz /., Vortrag Toronto, 1973.
13. Boehme W., Diplom-Arbeit Saarbriicken, 1973.
14. Kirkland J. J., J. Chromatogr. Sci., 10, 593 A972).
15. Kirkland J. J., in Perry S. G. (Ed.), Gas Chromatography 1972. S. 39 ff.
Barking, Essex, England, Applied Science Publ. 1973. Barking, Essex,
England, Applied Science Publ., 1973.
16. Majors R. E., Anal. Chem., 44, 1722 A972).
17. Strubert W., Chromatographia, 6, 50 A973).
18. Wiedemann H., Dissertation Saarbriicken, 1973.
19. Berry L. V., Karger B. L., Anal. Chem., 45, 819 A A973).
20. Scott R. P. W., Kucera P., J. Chromatogr. Sci., 11, 83 A973).
21. Snyder L. R., Chromatographic Rev., 7, 1 A965).
22. Afihauer /., Halasz /., J. Chromatogr. Sci., 12, 139 A974).
23. Halasz I., Z. Anal. Chem., 277, 257 A975).
24. Engelhardt H., Elgass H., J. Chromatogr., 112, 415 A975).
25. Halasz I., Schmidt H., Vogtel P., J. Chromatogr., 126, 19 A976).
Глава IV
ДЕТЕКТОРЫ
Состав элюента, вытекающего из колонки, непрерывно контроли-
контролируют детектором. К сожалению, для жидкостной хроматографии по-
пока не разработано специального универсального детектора. Физико-
химические свойства подвижной фазы и анализируемой пробы
различаются лишь незначительно, поэтому в жидкостной хромато-
хроматографии используют или только специфические детекторы (например,
УФ-детекторы), или детекторы, измеряющие дифференциальным
способом очень незначительное разлилие в общих свойствах (диффе-
(дифференциальный рефрактометр). Для каждой системы проба — элюент
следует выбирать подходящий детектор. По этой причине в каждом
хроматографе должно быть по крайней мере два различных детекто-
детектора. Один из них должен принадлежать к той группе детекторов, с по-
помощью которых измеряют по дифференциальной схеме общее свой-
свойство элюента (например, показатель преломления, диэлектрическая
проницаемость, а второй должен специфично распознавать иссле-
исследуемые вещества (причем в этом случае имеются определенные огра-
ограничения относительно выбора подвижной фазы). К группе специфи-
специфических причисляют УФ-детекторы, полярографические детекторы
и детектор по измерению радиоактивности.
Ультрафиолетовый детектор и дифференциальный рефрактометр
в настоящее время используются в жидкостной хроматографии чаще
всего. УФ-детекторы наиболее чувствительны в тех случаях, когда
у входящих в состав пробы соединений достаточно велики коэффи-
коэффициенты поглощения при соответствующей длине волны. Разумеется,
при их использовании на выбор элюентов накладываются ограниче-
ограничения. Элюент должен быть при рабочей длине волны детектора пол-
полностью прозрачным для УФ-излучений. Дифференциальный рефрак-
рефрактометр очень чувствителен к изменениям температуры и давления.
Оба типа детекторов показывают концентрацию пробы в элюенте, т.
е. относятся к числу концентрационных. При описании детекторов
приводят следующие их характеристики.
Уровень шумов влияет на нижнюю границу чувствительности.
В хроматографии пик только тогда считается пиком, когда он по
меньшей мере вдвое больше, чем наибольший пик шума. Наряду
с чисто электрическими шумами причиной шума могут быть пузырь-
пузырьки воздуха или загрязнения в элюенте.

62
Глава IV
Дрейф нулевой линии нежелателен. Вызывается он чаще всего
медленным изменением температуры окружающей среды, скорости
потока или вымыванием неподвижной фазы из разделительной
колонки.
Различают два вида чувствительности: абсолютную чувствитель-
чувствительность детектора, зависящую от шума, конструкции прибора и ис-
используемого метода измерения, и относительную чувствительность,
которая показывает, какое количество определяемого вещества еще
различимо в данных условиях. Кроме того, при выборе детектора
следует принимать во внимание размывание полосы в детекторе, за-
зависимость показаний от внешних параметров и степень сложности
работы с прибором. Для количественного анализа важную роль
играет линейность показаний. К сожалению, не у всех детекторов по-
показания в области возможного применения полностью линейны.
Если одновременно используется несколько детекторов, то их це-
целесообразно присоединять один к другому последовательно, причем
их следует располагать друг за другом в соответствии с увели-
увеличивающимся мертвым объемом. Необходимо предусмотреть также
устойчивость измерительной ячейки к давлению, так как на неко-
некоторых детекторах (например, теплообменниках дифференциального
рефрактометра) особенно при высоких скоростях потока может воз-
возникнуть заметное падение давления.
А. УФ-детекторы
УФ-детекторы очень часто выбирают из-за их относительной не-
нечувствительности к изменению температуры и скорости потока. Ча-
Чаще всего Э1И приборы работают только на одной длине волны —
длине волны наиболее интенсивной линии ртутной лампы низкого
давления, т. е. при 253,7 нм. В некоторых приборах устанавливают
флуоресцентную приставку с тем, чтобы можно было возбудить еще
излучение с длиной волны 280 нм. Большинство приборов выполне-
выполнено таким образом, что проводить измерения можно только при
одной из этих длин волн, и только очень немногие УФ-детекторы
могут работать одновременно при различных длинах волн.
В принципе возможно также применение фотометров или спек-
спектрофотометров, с помощью которых можно проводить измерения
при любой выбранной длине волны. Особенно хорошего разрешения
при этом не требуется, ширина полосы 10—20 нм вполне достаточна.
Если в регистрирующем двухлучевом спектрофотометре [19] можно
ограничить луч диафрагмой с отверстием диаметром примерно 1 мм
и если при этом уровень шумов останется допустимым, то такие
спектрофотометры также могут служить детектором. При прохожде-
прохождении зоны вещества через измерительную ячейку поток элюента мож-
можно на короткое время остановить и снять его УФ-спектр. Подобное
прерывание потока почти не дает дополнительного размывания по-
Детекторы
63
Фатосопротивле-
чие
Измерительная
ячейка
Ячейка
сравнения
Лампа
Рис. IV.1. Кювета УФ-детектора для жидкостного хроматографа.
лосы, поскольку, как уже говорилось, диффузия в потоке жидкости
очень незначительна. Записывать хроматограмму при таком способе
детектирования целесообразно на двух самописцах. С помощью
одного регистрируют обычную хроматограмму (изменение поглоще-
поглощения во времени при постоянной длине волны), а с помощью другого
самописца при остановленном потоке элюента снимают спектр (за-
(зависимость поглощения от длины волны). В качестве детектора [50,
51] используют также быстрорегистрирующий спектрофотометр, по-
позволяющий в течение 20 с записать всю спектральную область.
Спектрометр и дополнительный самописец стоят дорого, поэто-
поэтому, разумеется, возникает вопрос, окупятся ли такие издержки [51],
так как возможности идентифицирования с помощью УФ-детектора
ограниченны.
При небольшом объеме кюветы длина оптического пути должна
составлять 5—10 мм, поэтому отверстие для прохождения луча дол-
должно быть также небольшим (~ 1 мм). Возможное устройство кю-
кюветы показано на рис. IV. 1. Проточная ячейка имеет Z-образную
форму. Важно, чтобы в измерительной ячейке не было областей, че-
через которые не протекает раствор, так как ячейка должна быстро
промываться. В то же время поток в ячейке не должен быть турбу-
турбулентным даже при больших скоростях перемещения элюента. Шумы
не должны зависеть от скорости элюента. При толщине слоя 10 мм
у большинства УФ-детекторов объем ячейки меньше 10 мкл (~8
мкл). В статье [1] описана ячейка, имеющая Н-форму. В УФ-детек-

64
Глава IV
торах можно использовать как однолучевые устройства, так
и устройства со сравнительной ячейкой. Сравнительная ячейка мо-
может быть заполнена элюентом или непрерывно промываться им. За-
Заполненные подвижной фазой, не содержащей пузырьков воздуха,
сравнительные ячейки облегчают коррекцию, особенно если при ис-
используемой длине волны элюент уже имеет незначительное собствен-
собственное поглощение. Скомпенсировать изменение состава потока элюен-
та с помощью потока такого же состава в сравнительной ячейке
очень сложно, так как получить два синхронных и одинаковых по со-
составу потока практически невозможно (то же самое относится
к сравнительной колонке).
Недостаток УФ-детекторов — специфичность их действия. С по-
помощью этих детекторов можно выявить только молекулы, погло-
поглощающие УФ-излучение с длиной волны, близкой к той, на которой
работает детектор. Из-за большой чувствительности детектора нет
необходимости проводить измерения в максимуме поглощения. Вда-
Вдали от максимума полосы поглощения еще получают достаточную
чувствительность. С помощью детектора, работающего на длине
волны 254 нм, можно определять любые ароматические соединения
и большинство кетонов и альдегидов, полоса поглощения которых
достигает этой области. Полосы поглощения многоядерных арома-
ароматических соединений сдвинуты в область больших длин волн, но при
254 нм поглощение еще достаточно сильное, и поэтому чувствитель-
чувствительность определения этих соединений вполне приемлема.
В каталогах спектров и учебниках по УФ-спектроскопии указы-
указывается, в каких областях соединения определенных групп дают мак-
максимум поглощения и как велик их молярный коэффициент по-
поглощения. Эти данные следует всегда использовать как справочные.
При выборе подвижной фазы также имеются ограничения. На
рис. IV.2 показаны границы пропускания важнейших фаз. Эти данные
получены для очищенных растворителей; обычные продажные про-
продукты содержат загрязняющие их примеси, границы пропускания
этих растворителей сдвинуты в область более коротких длин волн.
По этой причине в хроматографии рекомендуется пользоваться рас-
растворителями, выпускаемыми «для спектроскопии».
Чувствительность УФ-детектора сильно зависит от величины мо-
молярного коэффициента поглощения анализируемого соединения.
В области используемых длин волн B54 или 280 нм) этот коэффи-
коэффициент может меняться примерно от 20 для насыщенных карбо-
карбонильных соединений до 10000 для ароматических, гетероциклических
и т. п. соединений. Шум УФ-детекторов почти во всех приборах на-
находится на уровне 10" 4 единиц поглощения. В новых УФ-детекторах
шум составляет примерно 10 ~ 5 единиц поглощения. С помощью за-
закона Ламберта - Бера можно рассчитать наименьшие концентрации
соединений, которые еще можно определить УФ-детектором при ус-
условии, что пики этих соединений вдвое больше, чем порог шума.
Детекторы
65
Вода
Спирты
Алканы
Ацетонитрил
Циклоеепсан
Простой эфир
(свободный от переписей)
Тетрагидрофуран
Алкилеалоевниды
Хлористый метилен
Хлороформ
Упсусноэтиловый эфир
Четыреххлористыи
углерод г
Ароматические углеводо-
углеводороды
Ацетон
254 нм -280 нм
I I
_L
I I l i l I i l l I l I I
200 220 240 2Б0 280 300 320 340
им
Рис. IV.2. Границы пропускания важнейших элюентов, используемых при
хроматографировании с УФ-детектором.
В табл. IV.1 приведены взятые из работы [2] коэффициенты по-
поглощения. Последний столбец таблицы показывает, какие количества
веществ еще можно определить при 8-микролитровом объеме ячейки
детектора (толщина слоя 1 см). В хроматографической колонке веще-
вещество пробы в конце колонки распределено в объеме намного боль-
большем, чем объем пробы, так как в процессе хроматографического раз-
разделения проба разбавляется и объем, в котором содержится проба,
может достигать (в зависимости от значения к' и заполнения колон-
Таблица IV. 1
Теоретическая граница чувствительности УФ-детекторов
Вещество
Е B)
Граница чувствитель-
чувствительности, (при шуме
2 ¦ 10~* е. п.), г/мл
Абсолютное количество
в ячейке объемом
8 м*ла, г
Насыщенные карбониль-
карбонильные соединения с мо-
молекулярной марсой 100
Бензол
Бензальдегид
Антрацен
20
200
11000
220000
2- Ю-6
1,5-10-7
3,8-10-9
3,5-100
1,6-Ю-8
1,2
2,8
Ю-9
10-"
ю-12
а Плотность элюента произвольно принята равной 1 г/мл.
5 Заказ 825

66
Глава IV
ки) от 10 до 1000 мкл и даже больше. Поэтому чтобы можно было
получить ощутимый сигнал, содержание анализируемого компонента
в исходной пробе должно быть по меньшей мере в 10-100 раз боль-
больше количеств, приведенных в табл. IV. 1.
УФ-детектор — очень чувствительный и очень селективный при-
прибор. Если элюент не поглощает УФ-излучения в области рабочих
длин волн, можно использовать метод градиентного элюирования.
Однако даже при этом может наблюдаться дрейф нулевой линии,
так как при принятой обычной конструкции ячейки одновременно
определяется изменение показателя преломления. Используя измери-
измерительную ячейку подходящей конструкции, можно с помощью оптиче-
оптических методов подавить указанное изменение показаний за счет изме-
изменения показателя преломления. В ионообменной хроматографии
можно менять значения рН и ионную силу элюента, если ионы не
поглощают в УФ-области.
Б. Дифференциальный рефрактометр
С помощью дифференциального рефрактометра определяют об-
общий показатель преломления системы проба — элюент. Для того
чтобы получить чувствительный сигнал, показатель преломления
подвижной фазы следует скомпенсировать путем измерения по диф-
дифференциальному методу. Сигнал получают от всех соединений, пока-
показатель преломления которых достаточно отличается от показателя
преломления элюента. Поэтому дифференциальный рефрактометр
намного более универсален, чем УФ-детектор. Эта универсальность,
конечно, также является недостатком. Поскольку дифференциальный
рефрактометр реагирует на любое изменение состава элюента, он не-
непригоден для градиентного элюирования, если только показатели
преломления выбранных растворителей не совпадают. Кроме того,
показатель преломления очень сильно зависит от температуры: при
изменении температуры на ГС показания детектора меняются на
10 " 4 единиц показателя преломления. Поэтому чтобы получить до-
достаточно большую чувствительность A0 е. п. п.), температуру
элюента и обеих измерительных ячеек следует поддерживать по-
постоянной с точностью +0,00ГС [3]. Следовательно, требуются эф-
эффективный теплообменник и блок с большой теплоемкостью (напри-
(например, металлический блок, сглаживающий незначительные темпера-
температурные колебания). На показаниях дифференциального рефрактоме-
рефрактометра сказываются также колебания скорости потока. Поэтому если
элюент подается насосом с пульсирующим потоком, необходимо
очень хорошее демпфирование.
В выпускаемых приборах используют два принципиально раз-
различных метода измерения.
Детекторы
67
1. Рефрактометр Френеля
Принцип действия этого рефрактометра основан на законе отра-
отражения Френеля, который гласит, что часть светового потока, ко-
который отражается от фазовой границы раздела, зависит от угла па-
падения (90 — а) и от показателя преломления обеих сред, образующих
фазовую границу раздела.
Схема измерительного устройства показана на рис. IV.3. Измерительную
и сравнительную ячейки освещают одной и той же лампой A). На граничной
поверхности между жидкостью B) и поверхностью призмы часть светового
потока (б) отражается. Эту часть ие используют для измерения. Другая часть
светового потока проходит через слой жидкости и диффузно рассеивается от
задней стальной пластины D), граничащей с обеими ячейками и служащей
в качестве теплообменника. Эта часть светового потока попадает через опти-
оптическую систему на отдельные для каждой ячейки фотосопротивлеиия G). Ес-
Если меняется показатель преломления жидкости, протекающей через измери-
измерительную ячейку, по сравнению с жидкостью в ячейке сравнения, то возникает
разность освещенности между обеими отраженными частями светового пото-
потока от измерительной и сравнительной ячеек. В этом случае регистрируют
разность значений сопротивлений обоих фотосопротивлений. Объемы обеих
ячеек между призмой (9) и стальной пластинкой (ограниченные тефлоновой
маской 5) могут быть очень малы (~ 5 мкл).
Недостатком этого метода измерения является то, что с по-
помощью одной призмы невозможно охватить весь диапазон показате-
показателей преломления растворителей, используемых в жидкостной хрома-
хроматографии. Поэтому в таких приборах применяют призмы для
области 1,31-1,44 и 1,40-1,55. К сожалению, трудно также добиться
достаточного постоянства температур между элюентом и измери-
измерительным устройством, особенно при высоких скоростях потока (> 1
мл/мин). Термостатирования одной стальной пластины недоста-
недостаточно.
Рис. IV.3. Схема рефрактометра Френеля (пояснения см. в тексте).

68
Глава IV
Оптимальная граница чувствительности рефрактометра Френеля
лежит при + 4 • 10 ~ 7 е. п. п., т. е. при оптимальных условиях можно
еще определять, например, анилин в гексане, если концентрация
анилина равна 2•10" 4%.
2. Отклоняющий рефрактометр
Если луч света проходит через ячейку, заполненную двумя жидко-
жидкостями с различными показателями преломления, то отклонение луча
света пропорционально разности показателей преломления.
На рис. IV.4 показана принципиальная схема рефрактометра этого типа.
Луч света лампы /, ограниченный диафрагмой 2, фокусируют линзой 3 и на-
направляют в кювету, у которой одна ячейка заполнена жидкостью сравнения,
а другая — элюентом. Луч отклоняется, отражается зеркалом и проходит еще
раз через кювету, опять отклоняется и попадает на детектор — фотосопроти-
фотосопротивление.
Если показатели преломления жидкости сравнения и элюента одинаковы,
то луч точно падает на небольшую щель детектора. Если показатель прело-
преломления в измерительной ячейке меняется, то луч отклоняется и больше не
попадает точно на детектор. В результате сила фототока снижается. В начале
измерений луч фиксируют с помощью поворотной стеклянной пластинки 7,
служащей для выравнивания различных показателей преломления.
С помощью такого рефрактометра можно измерять все воз-
возможные показатели преломления. Замена кюветы становится излиш-
излишней. Кювету и все оптическое устройство просто термостатировать.
Можно установить весь прибор в металлический блок и в него же
поместить теплообменник [3]. Измерительная ячейка в этом приборе
вдвое больше, чем в рефрактометре Френеля A0 мкл), чувствитель-
чувствительность рефрактометра этого типа также выше [4]. При опти-
оптимальных условиях шумы меньше 3-10"8 е. п. п. [3]. Это означает,
что, например, в к-гексане анилин в принципе можно обнаружить
Рис. IV.4. Схема рефрактометра отклонения.
/-лампа; 2 -диафрагма; J-линза; 4 - измерительная ячейка; 5-зеркало; 5-ячейка сравнения;
7 — установление оптического нуля; 8 — детектор.
Детекторы
69
при концентрации его 1 • 10 5%. С помощью таких детекторов без
особого труда обнаруживают компоненты, концентрация которых
составляет примерно 10" *%. Однако следует помнить, что концен-
концентрация пробы на выходе из колонки всегда ниже, чем в верхней ча-
части колонки. Разбавление тем сильнее, чем прочнее проба удержи-
удерживается в колонке (т. е. чем больше к'), чем больше высота,
эквивалентная теоретической тарелке, и чем длиннее разделительная
колонка. При примерно одинаковой высоте, эквивалентной теорети-
теоретической тарелке, для алдрина и эндрина с помощью отклоняющего
рефрактометра еще можно определить 0,4 мкг алдрина (к' = 0,2) и 2,2
мкг эндрина (к'=9,2) [4].
Сравнение этих величин с приведенными в табл. IV. 1 показывает,
что если проводится разделение соединений с коэффициентами по-
поглощения больше 102, УФ-детекторы в большинстве случаев более
чувствительны, чем обычные дифференциальные рефрактометры. Все
же рефрактометр детектирует все компоненты, показатель преломле-
преломления которых отличается от показателя преломления элюента, в то
время как получить сигнал УФ-детектора можно только при усло-
условии, что в молекуле имеется хромофор.
В табл. IV.2 перечислены важнейшие элюенты и даны их показа-
показатели преломления. Хроматографически одинаковые растворители,
Таблица IV. 2
Показатели преломления важнейших элюеитов 20°С [5]
Элюеиты
Ацетон
Ацетонитрил
Этанол
Бромистый зтил
Бензол
Хлороформ
Циклогексан
Диэтиловый эфир
Диизопропиловый эфир
^1 ТЖ УЧ D>^4 rt WW
диоксан
Уксусноэтиловый эфир
Уксуснометиловый эфир
Гептан
Гексан
Метанол
Хлористый метилен
Пентан
Хлористый изопропил
н-Хлористый пропил
Четыреххлористый углерод
Тетрагидрофуран
Толуол
Вода
Показатель преломления
1,3588
1,3441
1,3611
1,4239
1,5011
1,4433 при 25°С
1,4266 при 19,5°С
1,3526
1,3679
1,4224
U701 при 25°С
1,3617
1,38764
1,37486
1,3288
1,3348 при 15°С
1,3579
1,3781
1,3886
1,4664
1,4076 при 21°С
1,4961
1,3330

70
Глава IV
например пентан, гексан или хлороформ и хлористый метилен, раз-
различаются по показателям преломления, так что чувствительность
определения в критических ситуациях можно улучшить путем за-
замены элюента.
Кроме описанных выше рефрактометров в жидкостной хромато-
хроматографии при высоких давлениях применяются и рефрактометры дру-
других типов. В одном из детекторов для определения изменения пока-
показателя преломления используют эффект Христиансена. В янейку
детектора помещают твердое вещество (например, стекло), показа-
показатель преломления у которого такой же, как и у подвижной фазы. До
тех пор пока показатели преломления твердого тела и элюента
имеют одинаковую величину, ячейка кажется полностью прозрачной.
Если, например, при элюировании пробы меняется показатель прело-
преломления элюента, то сразу же меняется и прозрачность ячейки. Это
изменение можно измерить с помощью фотоэлемента. Чувствитель-
Чувствительность такого устройства должна быть по порядку величины такой
же, как и у других типов рефрактометров. Однако подобрать для ка-
каждого растворителя или смеси растворителей твердое тело с со-
соответствующим показателем преломления чрезвычайно сложно.
Изменение показателя преломления в элюате можно также опре-
определить с помощью интерферометра, но эти приборы очень дороги.
В. Микроадсорбционный детектор
Этот детектор измеряет теплоту сорбции, выделяющуюся при
прохождении зоны вещества через неподвижную фазу [6]. Поскольку
после сорбции всегда следует десорбция пробы, сопровождающаяся
поглощением тепла из элюента, то в идеальном случае положи-
положительный и отрицательный эффекты должны чередоваться. Теоретиче-
Теоретически получают дифференциальную гауссову кривую. Такой детектор
в состоянии различать все вещества, но, к сожалению, он до сих пор
не лишен некоторых систематических ошибок. Значительным недо-
недостатком такого способа детектирования является несимметричность
сигнала; десорбционный сигнал менее острый, чем адсорбционный.
Часто также площадь десорбционного пика меньше, поэтому при
электронном интегрировании не удается получить гауссову кривую,
а S-образный сигнал делает невозможным идентифицирование
близлежащих пиков. Точное определение времени удерживания
(элюирование точек центра тяжести) едва ли возможно. Хотя высота
адсорбционного пика и является функцией величины пробы, все же
величина сигнала очень легко меняется в результате загрязнения или
дезактивирования незначительных количеств адсорбента в измери-
измерительной ячейке.
Кроме того, микроадсорбционный детектор чувствителен к коле-
колебаниям скорости потока и даже показывает пульсации плохо демп-
демпфированного поршневого насоса.
Детекторы
71
В то же время в этом детекторе очень простое измерительное
устройство. Термисторы можно поместить в конце колонки, в ре-
результате мертвый объем станет едва заметным. К сожалению, темпе-
температурные колебания при этом плохо компенсируются, поэтому не-
непосредственно за термистором, помещенным в адсорбент, в поток
элюента ставят второй термистор, окруженный только стеклянными
шариками, компенсирующий колебания температуры элюента
и окружающей температуры. Даже при наличии такого устройства
мертвый объем минимален. Qa.\.o собой разумеется, что прибор дол-
должен быть хорошо термостатирован, по меньшей мере до ± 0,003°С
Если это условие не выполняется, между колонкой и детектором
происходит теплообмен. С помощью такого устройства можно фик-
фиксировать изменение температуры в 10 ~ 4оС. В настоящее время при-
приборы данного типа больше не выпускаются.
Г. Транспортный детектор (пламенно-ионизационный
детектор)
При использовании детектора такого типа перед определением
пробы летучий элюент удаляется. Для этой цели пробу наносят на
транспортное устройство (цепочки, сетки, спирали или проволоки),
испаряют элюент, а нелетучую пробу переводят в пламенно-иониза-
пламенно-ионизационный детектор. Огромное преимущество данной системы заклю-
заключается в том, что в идеальном случае можно получить сигнал только
от собственно пробы и что поэтому этот сигнал не зависит от вида
хроматографического проявления. Химические свойства, температу-
температура, пульсации подвижной фазы не влияют на результаты. Разумеет-
Разумеется, элюент, а также проба должны отвечать следующему условию:
их летучести должны очень сильно различаться, только тогда после
испарения элюента на транспортной системе останется достаточный
остаток пробы.
Схема детектора этого типа [8] показана на рис. IV.5. Поверх-
Поверхность проволоки из нержавеющей стали тщательно очищают и окис-
окисляют, прокаливая проволоку при высокой температуре. После такой
обработки покрывают проволоку равномерно даже элюенты с высо-
высоким поверхностным натяжением. Обработанную таким образом про-
проволоку протягивают через поток элюента и покрывают пробой
и элюентом. В печи для испарения, в которой поддерживается тре-
требуемая температура, элюент испаряют и вымывают воздухом. После
этого пробу на проволоке транспортируют в окислительную печь
и при 600—800°С сжигают в токе воздуха. Продукты сгорания из пе-
печи отсасывают с помощью струйного насоса, приводимого в дей-
действие водородом, и после каталитического превращения в метан
определяют в пламенно-ионизационном детекторе (ПИД). Такие опе-
операции, как сжигание и превращение в метан, более предпочтительны,
чем пиролиз, так как воспроизводимость результатов в первом слу-

72
Глава IV
Рис. IV.5. Схема транспортного детектора (см. текст)
/ — разделительная колонка, 2 — нанесение элюата на проволоку, 3 — камера предварительного испа-
испарения, 4 — воздух, 5 — катализатор, 6 - пламенно-ионизационный детектор (ПИД), 7 - отсос, 8 - уст-
устройство для очистки проволоки, 9 — катушки для проволоки.
чае значительно выше. Транспортировать проволоку длиной 10 км
и толщиной 0,12 мм следует, конечно, с постоянной скоростью.
Чувствительность транспортного детектора по сравнению с ПИД
применяемым в газовой хроматографии, не очень велика, однако на-
находится в той же концентрационной области, что и чувствительность
почти всех детекторов в жидкостной хроматографии, т. е. составляет
1—3 мкг/мл. Если учесть, что на проволоке остается очень незначи-
незначительное количество пробы, то эта чувствительность отличная. Не
следует упускать из виду, что часть пробы при испарении раствори-
растворителя теряется. При этом различия в летучестях компонентов пробы
могут исказить количественный результат. Кроме того, не все сго-
сгорающие газы подходят для ПИД. Этот детектор был бы идеальным
для жидкостной хроматографии при высоких давлениях, так как
с его помощью можно определять свойства собственно пробы, не со-
содержащей элюента, и при этом были бы возможны без особых ос-
осложнений разделения с использованием градиентного элюирования.
Д. Детектор по флуоресценции
С помощью детектора по флуоресценции в элюенте можно обна-
обнаружить вещества, у которых при облучении главным образом
в ближней УФ-области возбуждается флуоресценция, и они излучают
Детекторы
73
в видимой области. Длина волны возбуждающего излучения либо
задается типом лампы (например, ртутной лампы среднего или вы-
высокого давления), либо регулируется монохроматором. В большин-
большинстве случаев измерение проводят перпендикулярно направлению
возбуждающего излучения. Рассеянный свет возбуждающей длины
волны можно замаскировать с помощью подходящего фильтра.
Детектор по флуоресценции очень специфичен, правила работы
с ним еще сложнее, чем правила работы с УФ-детектором. Так, на-
например, флуоресценцию можно погасить или подавить невидимыми
сопутствующими веществами. Некоторые растворители, в частности
кислородсодержащие, гасят флуоресценцию, и поэтому их, как
и элюенты, поглощающие в области возбужденного излучения, ис-
использовать нельзя.
Чувствительность детекторов по флуоресценции часто выше, чем
чувствительность УФ-детекторов. Так, наиболее часто применяемый
в качестве стандарта при флуоресцентных измерениях хининсульфат
удается определять даже в том случае, когда концентрация его соста-
составляет 10" 7%. Область линейности сигнала у детектора по флуорес-
флуоресценции больше, чем у УФ-детекторов.
Если подлежащие разделению соединения не обладают флуоресцен-
флуоресценцией, то их, как правило, можно перевести во флуоресцирующие про-
производные и тем самым значительно повысить возможность их обна-
обнаружения. Так, например, аминокислоты, алкалоиды, катехинамины
можно определить с помощью детектора по флуоресценции в обла-
области нанограммовых количеств в виде денсилпроизводных A-димети-
ламинонафталин-8-сульфоновая кислота) [27, 28, 29]. Разделить ден-
сил-производные относительно просто, хотя молекулярные свойства
в результате превращения в производные становятся очень близкими
(ср. рис. VII.9 и VII. 10).
Е. Другие детекторы
1. Электрохимические детекторы
В ряде работ [9, 10, 23, 30, 31, 52-58] описано детектирование
пробы в элюате с помощью электрохимического окисления или
восстановления (полярографический и амперометрический методы).
В этом случае обычно поддерживая постоянное напряжение, опреде-
определяют как функцию времени ток, протекающий между электродами
при окислении или восстановлении пробы. На практике осуществить
метод окисления проще, так как элюент при этом не нужно обра-
обрабатывать предварительно (удаление растворенного кислорода). Если
же используется метод восстановления, то из элюента следует уда-
удалить растворенный кислород. Окисление или восстановление и вме-
вместе с тем возможность определения веществ зависит от окислитель-
окислительного или восстановительного потенциала элюента. Само собой

74
Глава IV
Детекторы
75
разумеется, что элюент должен обладать известной проводимостью.
В водные элюенты для этого добавляют нитрат калия @,05 м), в ор-
органические элюенты рекомендуется добавлять перхлорат тетраэтил-
аммония. Если анализируются водные и водно-спиртовые растворы,
можно работать с потенциалом 1 В (относительно стандартного ка-
каломельного электрода). При этом напряжении можно, кроме того,
определять органические азотсодержащие соединения (например,
" амины, аминокислоты, гетероциклические азотсодержащие соединения
и т. д.), нитросоединения, фенолы, альдегиды и кетоны. Поскольку для
каждого класса соединений характерно свое напряжение разложения,
то можно, меняя напряжение, сделать детектор или очень селектив-
селективным для определенного класса соединений, или, если напряжение
выбрано высоким, пригодным для всех классов соединений.
Наряду с классическим капельным ртутным электродом [9] ис-
используют также специальные электроды, например электрод на осно-
основе углеродсодержащей силиконовой резины [10] или чистые угле-
углеродные электроды [30]. Твердые электроды следует очищать от
продуктов окисления. С этой целью, в частности, ведут работу в
пульсирующем режиме: положительное рабочее напряжение на ко-
короткое время меняют на отрицательное очищающее (восстанавли-
(восстанавливающее) напряжение. Впрыскивание элюента на электрод [30]
улучшает очистку.
Чувствительность детекторов данного типа сильно зависит от
окислительной или восстановительной способности веществ пробы.
На основе имеющихся в настоящее время данных можно считать де-
детекторы данного типа очень перспективными, так как такие важные
вещества, как, например, адреналин и его производные, можно опре-
определить в биологически важной области концентраций.
2. Детектор по электропроводности
Детектор по электропроводности является очень специфичным,
так как дает сигнал только от ионов, и применять его можно только
для водных и полярных элюентов. Выпускаемые приборы позволяют
определять как абсолютную, так и дифференциальную (относительно
элюента) проводимость. Точность при дифференциальном методе
больше, чем при определении абсолютной проводимости. Для того
чтобы можно было проводить с достаточной чувствительностью из-
измерения в элюентах с большой проводимостью, приборы оборудуют
устройством для компенсации нулевого значения. Само измерение
проводимости ставит некоторые проблемы.
Если применяют источник постоянного тока, то проводимость
при высоких концентрациях ионов маскируется поляризационным
эффектом. При использовании переменного тока поляризация подав-
подавляется, но в этом случае может меняться и диэлектрическая прони-
проницаемость. Благодаря этому проводимость маскируется прежде всего
при незначительных концентрациях ионов. Поэтому в тех приборах,
которые питаются переменным током, детектор должен работать
только при положительном сдвиге фазы. При этом подавляются ис-
искажения, обусловленные изменением диэлектрической проницаемо-
проницаемости при отрицательном сдвиге фазы.
В детекторе этого типа можно получить очень маленький объем
измерительной ячейки — примерно 2 мкл. Для автоматической ком-
компенсации температуры ячейку снабжают термистором. Поскольку
при изменении температуры на 1°С проводимость может измениться
примерно на 2%, необходимо хорошее термостатирование. Удобной
является калибровка по удельной электропроводности, так как
в этом случае определение постоянных ячейки излишне. Калибровку,
конечно, необходимо повторить при замене ячейки. С помощью та-
таких чувствительных приборов можно определить разность проводи-
мостей на уровне 5-10~4 мкОм^-см. Указанному изменению
проводимости соответствует изменение концентрации водного рас-
раствора поваренной соли от 5-10" 7 до 10" 6%. В буферных растворах
из-за собственной проводимости буфера чувствительность, выражен-
выраженная в единицах концентрации, конечно, ниже. Линейная зависимость
сигнала от концентрации наблюдается в области 0,01-100000
3. Детектор по диэлектрической проницаемости
(емкостный детектор)
Концентрацию пробы в элюенте можно также определить по из-
изменению емкости. Если диэлектрические проницаемости элюента
и вещества сильно различаются, даже небольшим концентрациям со-
соответствует значительное изменение диэлектрической проницаемо-
проницаемости, и детектор отличается высокой чувствительностью. Чтобы ком-
компенсировать влияние температуры, можно проводить измерения по
дифференциальной схеме, используя сравнительную ячейку. Спе-
Специального детектора для жидкостной хроматографии при высоких
давлениях в настоящее время в продаже нет, хотя были описаны раз-
различные измерительные устройства [И-13] и обсуждалась перспек-
перспективность детектора [14-15]. Ячейки конструируют таким образом,
чтобы расстояние между электродами было жестко фиксировано. Хо-
Хотя площадь поверхности обоих электродов должна быть относитель-
относительно большой, объем ячейки может быть очень незначительным. По-
Подобные детекторы при одинаковом уровне шумов должны быть
чувствительнее, чем дифференциальный рефрактометр. Чувствитель-
Чувствительность детекторов не зависит от скорости потока. Для примера чув-
чувствительность для хлороформа в изооктане (Де«3) [13] равна
9-10~5%, для ацетона в к-гексане (Де = 19,9) составляет примерно
4-10~5% и для октана в к-гексане (Де = 0,06) равна 2,6 ¦ 10~2%.

76
Глава IV
4. Радиоактивность
Измерение радиоактивности возможно, только если разделяемые
соединения имеют достаточный уровень радиоактивности. В этом
случае определение очень специфично и ему не мешает изменение со-
состава элюента. Имеются специальные сцинтилляционные счетчики
для жидкостной хроматографии при высоких давлениях с объемом
ячейки примерно 200 мкл. Можно использовать также имеющиеся
в продаже приборы с большим мертвым объемом (~ 1 мл), если раз-
размывание полосы, обусловленное мертвым объемом, допустимо [60].
В описанных в литературе методах работы сцинтилляторы находи-
находились в непосредственном контакте с элюентом [16—17]. В некоторых
случаях, чтобы улучшить условия счета при использовании очень
слабого излучения, поток элюента можно остановить в тот момент,
когда в измерительной ячейке находится основное количество ра-
радиоактивного вещества. Само собой разумеется, элюент должен
быть прозрачен для сцинтилляционного излучения. Загрязнения, да-
давление в ячейке, изменение скорости потока, а также факторы, пре-
препятствующие нормальному измерению при обычном стационарном
методе определения радиоактивности, искажают сигнал детектора.
5. Непосредственное соединение жидкостного хроматографа
высокого давления с масс-спектрометром
Непосредственное присоединение жидкостного хроматографа
к масс-спектрометру вызывает значительно больше проблем, чем со-
соединение газового хроматографа с масс-спектрометром. Во-первых,
количество элюента при разделении методом жидкостной хромато-
хроматографии так велико, что с ним не может справиться обычная вакуум-
вакуумная система масс-спектрометра. При скорости элюента 1 мл/мин
образуется (при нормальных условиях) 150—1200 мл/мин пара, в то
время как для современных масс-спектрометрических вакуумных си-
систем при химической ионизации допустимые количества (при нор-
нормальных условиях) максимально составляют 1—20 мл/мин. Кроме
того, наиболее важной областью применения жидкостной хромато-
хроматографии при высоких давлениях является разделение нелетучих или
труднолетучих проб. Во-вторых, испарение пробы в масс-спектроме-
масс-спектрометре не должно сопровождаться ее разложением. Однако, поскольку
анализируемая проба находится в зоне испарения недолго, эту зада-
задачу решить проще. Так, уже проверены на практике различные спо-
способы подготовки пробы.
1. Испарение элюента и пробы при атмосферном давлении и ио-
ионизация их в указанных условиях [21-22]. Через щель в вакуумной
системе втягивается только часть ионов. Масс-спектры получены
в нанограммовой области.
2. Поток элюента делят, часть элюента со скоростью 10 мкл/мин
подают непосредственно в источник ионов масс-спектрометра и там
Детекторы
11
испаряют [25, 32]. Если проводится химическая ионизация, скорость
потока растворителя может быть относительно велика. В этом слу-
случае элюент должен отвечать определенным требованиям. Необходи-
Необходимо отметить, что в процессе ионизации могут образовываться ионы
с большим массовым числом, чем это соответствует молекулярной
массе пробы, так как на молекулярном ионе (а также, например, на
ионе осколка молекулы) могут осаждаться молекулы элюента (или
их осколки). Интерпретация таких масс-спектров очень сложна.
3. Многообещающим представляется использование обогати-
обогатительных систем, с помощью которых достигается предварительное
отделение элюента от пробы. Прежде всего целесообразно, по-види-
по-видимому, подавать пробу в масс-спектрометр после удаления элюента
с помощью транспортного механизма, аналогичного примененному
в транспортном детекторе. Проба может поступать в масс-спектро-
масс-спектрометр на транспортирующей проволоке [24] или на ленте [33]. В по-
последнем случае в масс-спектрометр подается большое количество ве-
вещества. При использовании транспортного механизма в масс-спек-
масс-спектрометр поступает только ~ 10 ~7 г/с элюента, одновременно
с которым попадает 20—40% нелетучей пробы (например, метилстеа-
рата при величине пробы 10" 8 г) [33]. Чувствительность при опреде-
определении полного ионного тока составляет 10 ~6 г/мл, т. е. имеющегося
количества вещества (~ 1 нг) вполне достаточно, чтобы снять спектр.
В работе [34] описаны также мембранные системы обогащения,
устанавливаемые между выходом из колонки и входом в масс-спек-
масс-спектрометр. Дополнительные преимущества при присоединении жид-
жидкостного хроматографа к масс-спектрометру могло бы дать исполь-
использование масс-спектрометрии с десорбцией полем, при которой
наряду с молекулярными ионами образуется очень небольшое коли-
количество осколочных ионов [18].
6. Другие методы измерения
Кроме описанных выше методов определение концентрации ве-
веществ в элюенте проводилось также путем измерения изменения
плотности, вязкости, теплопроводности, давления пара и скорости
звука. Описан также детектор по определению массы, в котором по-
после испарения элюента непрерывно определяли и регистрировали
остающееся на микровесах количество вещества [20].
Работа над всеми этими детекторами, а также ионизационным
детектором [26] еще не закончена, поэтому сколько-нибудь полные
сведения об их применимости и чувствительности пока привести
нельзя.
Электронно-захватный детектор (ЭЗД), широко используемый
в газохроматографическом анализе пестицидов, применяется для
определения методом ЖХ галогенсодержащих веществ [35] и для
анализа остатков молока [36]. При этом весь элюент колонки испа-

78
Глава IV
Детекторы
79
ряют, с помощью промывающего газа (например, азота) вводят в де-
детектор и затем пар опять конденсируют. Само собой разумеется, что
элюент или его примесь не должны сами давать электронно-захват-
электронно-захватные реакции. Пока описано только разделение с использованием
в качестве элюента к-гексана, к которому добавлено до 5% алифати-
алифатического спирта или простого эфира.
Разделение неорганических соединений проводилось также на
жидкостном хроматографе, подсоединенном к атомно-абсорбционно-
му спектрофотометру [59].
Ж. Сравнение важнейших детекторов.
Детекторы с использованием химических реакций.
В табл. IV.3 перечислены важнейшие типы детекторов и приве-
приведены их основные характеристики. Из имеющихся в продаже детек-
детекторов только три позволяют определять практически все вещества.
К сожалению, эти детекторы не относятся к наиболее чувстви-
чувствительным, кроме того, их показания сильно зависят от температуры.
Таблица IV. 3
Основные типы детекторов н их характеристики
Детектор
УФ-детектор
Рефрактометр
Адсорбционный
Транспортный
По электропроводно-
электропроводности
Флуориметрический
Емкостный
Полярографический
Универ-
Универсальность
Нет
Да
»
»
Нет
»
Да
Нет
Измеряемая
величина
Поглощение
Показатель
преломле-
преломления
Температура
Сила тока
Удельное со-
сопротивление
Поглощение
Диэлектричес-
Диэлектрическая прони-
проницаемость
Сила тока
Максимальная
чувствительность
(наиболее благо-
благоприятный случай),
г/мл
10-10
ю-7
10"9 г/с
Ю-7
ю-8
ю-9
ю-7
ю-9
Температурная
зависимость
Пренебре-
Пренебрежимо ма-
мала
10 е. п./°С
5 ¦ 10-5/°С
Нет
2%/°С
Нет
10-3/°С
1,5%/°С
Приведенные в таблице данные о максимальной чувствительно-
чувствительности взяты из сообщений фирм и представляют главным образом ста-
статически измеренные величины, т. е. приведенные концентрации были
введены непосредственно в измерительную ячейку.
Объемы измерительных ячеек всех детекторов лежат в пределах
от. 2 до 10 мкл и. поэтому соответствуют требованиям практики.
В некоторых приборах уровень шума зависит от скорости потока из-
за конструкции проходного канала, а вследствие этого чувствитель-
чувствительность определения также зависит от скорости потока (см. выше).
Область линейности почти у всех детекторов составляет 1:1000 и,
по-видимому, достаточна для количественного анализа.
Область линейности сигнала УФ-детектора увеличивается с уве-
увеличением степени монохроматичности источника УФ-излучения.
Показания почти всех описанных здесь детекторов пропорцио-
пропорциональны концентрации, и величина сигнала не зависит от скорости по-
потока. Только показания микроадсорбционного детектора связаны
с величиной потока. В этом случае сигнал тем больше, чем выше
скорость потока. Показания пламенно-ионизационного детектора,
применяемого в газовой хроматографии, также зависят от скорости
потока. Однако так как в системе с жидкостным хроматографом
предусмотрена транспортная система, вводящая в пламенно-иониза-
пламенно-ионизационный детектор определенное, зависящее от его концентрации
в элюенте колонки количества вещества, то этот детектор также
можно считать концентрационным.
Чувствительность применяемых в настоящее время детекторов
недостаточна для прямого определения многих важных соединений,
например аминокислот, в натуральных смесях. Поэтому приходится
проводить химическое модифицирование и получать производные,
которые можно определять с помощью более чувствительного детек-
детектора. Так, алифатические аминокислоты определяют с помощью ре-
рефрактометра, однако результаты анализа будут намного точнее, если
те же самые аминокислоты определяют в виде их денсилпроиз-
водных, используя УФ-детектор или детектор по флуоресценции [27,
37]. Безусловно, для этой цели пригодны не только денсилпро-
изводные, описан, например, анализ фенолизоцианатов [38] или ани-
лидов [39] жирных кислот, нитробензоатов Сахаров или спиртов [40]
и т. д.
Чувствительность определения можно усилить, если проводить
химическую реакцию в тот момент, когда соединение вышло из раз-
разделительной колонки, но еще не попало в детектор. Однако при этом
достигнутое в колонке разделение зон веществ не должно ухудшать-
ухудшаться в результате реакции, реагирующее вещество и элюент должны
хорошо смешиваться. Реакцию проводят в потоке (во время реакции
элюент и реагент должны находиться в одном объеме), и смесь попа-
попадает в фотометрический детектор только после того, как реакция
закончится.
Делить поток элюента на сегменты с помощью пузырьков возду-
воздуха в жидкостной хроматографии при высоких давлениях можно,
только если разделительная способность достаточно высока, иначе
произойдет сильное размывание полосы. Подавляя шумы от пузырь-
пузырьков воздуха в детекторе с помощью электронного устройства, можно
все же получить и "в этом случае сглаженную хроматограмму [48].
Несмотря на отмеченные трудности, такие системы все же пригодны

80
Глава IV
для специфического определения ряда соединений. Так, органические
фосфаты определяют с высокой селективностью с помощью
холинэстеразного метода. Хотя стоимость такого рода реагентов до-
достаточно высока, быстро протекающие реакции получили широкое
распррстранение. Например, определение аминокислот или аминов
проводят с помощью флурама, который быстро дает очень коротко-
живущую флуоресценцию в видимой области.
Классическую реакцию с нингидрином можно проводить в трубках
подходящей формы, дополнительного размывания полосы при этом
не происходит [42]. Разрешающая способность при разделении кис-
кислот на колонках, заполненных частицами диаметром 10 мкм, соста-
составляет 0,1-1 нг. Используя общеприменимый принцип проведения
реакций в трубках специальной формы [43], можно проводить и дру-
другие реакции [42].
В работах [44, 45] описана реакция обмена элюента с ионом
Се (IV), в результате которой образуются флуоресцирующие ионы
Се (III).
В качестве реакторов для проведения реакций обмена после хро-
матографического разделения пригодны заполненные раздели-
разделительные колонки, но перепад давления в общей системе (раздели-
(разделительная и реакционная колонки) при этом больше, чем в том случае,
когда реакцию проводят не в колонке, а в специальной трубке.
Авторы работ [46, 49] исследовали реакции, сопровождающиеся
образованием флуоресцирующих или окрашенных соединений в ре-
реакционной колонке. Описаны также реакционные детекторы [47] для
определения Сахаров в элюате из ионообменных колонок (боратные
комплексы).
Практическое применение таких реакционных детекторов на-
настолько сложно, что для каждой отдельной реакции необходимо из-
изготовить и оптимизировать свой собственный детектор. По-видимо-
По-видимому, в ближайшее время выпуск их едва ли будет налажен. Скорее
всего можно ожидать появления комплектных систем для решения
специальных проблем разделения (например, определения Сахаров,
аминокислот).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Обзор:
Бирн С. в кн. Современное состояние жидкостной хроматографии.—М.:
Мир, 1974, 325 с.
1. Felton #., J. Chromatogr. Sri., 7, 13 A969).
2. Williams D. H., Fleming I., Spektroskopische Methoden in der organischen
Chemie. Stuttgart, Thieme-Verlag, 1968.
3. Deininger G., Halasz I., J. Chromatogr. Sci., 8, 499 A970).
4. Bombaugh К J., Levangie R. F., King R. N., Abrahams L., J. Chromatogr.
Sci., 8, 657 A970).
5. Handbook of Chemistry and Physics. 46th Edition. Chemical Rubber Co.
1965.
Детекторы
81
6. Hupe K.-P., Bayer E., J. Chromatogr. Sci., 5, 197 A967).
7. Lapidus В. M., Karmen A., J. Chromatogr. Sci., 10, 103 A972).
8. Scott R. P. W., Lawrence J. G., J. Chromatogr. Sci., 8, 65 A970).
9. Koen J. G., Huber J. F. K., Poppe H., Den Boef G., J. Chromatogr. Sci.,
8, 192 A970).
10. Joynes P. L., Maggs R. S., J. Chromatogr. Sci., 8, 427 A970).
11. Haderka S., J. Chromatogr., 52, 213 A970).
12. Vespalec R., Hana K, J. Chromatogr., 65, 53 A972).
13. Poppe H., Kuysten J., J. Chromatogr. Sci., 10, 16 A A972).
14. Haderka S., J. Chromatogr., 54, 357 A971).
15. Haderka S., J. Chromatogr., 57, 181 A971).
16. Schram E., in Bransome E. D., jr. (Hrsg.), Current Status of Liquid
Scintillation. New York, Grune and Stratton, 1970.
17. Нам J. A., Anal. Biochem., 23, 289 A968).
18. Schulten H. R., Beckey H. Я, J. Chromatogr., 83, 315 A973).
19. Carr D., Varian Instrument Applications, 7, 14 A973).
20. Schulz W. W., King W. H., jr., J. Chromatogr. Sci., 11, 343 A973).
21. Horning E. C, Horning M. G., Carrol D. J., Dzidic J., Stillwell R. N.,
Anal. Chem., 45, 936 A974).
22. Horning E. C, Carrol D. J., Dzidic J., Haegele К D., Horning M. G.,
Stillwell R. N., J. Chromatogr. Sci., 12, 725 A974).
23. Davenport R. J., Johnson D. C, Anal. Chem., 46, 1971 A974).
24. Scott R. P. W., Scott С G., Munroe M., Hess J., jr., J. Chromatogr.,
99, 395 A974).
25. Arpino P. J., Dawkin B. G., McLafferty F. M., J. Chromatogr. Sci., 12,
574 A974).
26. Mowery R. A., jr., Juvet R. S., jr., J. Chromatogr. Sci., 12, 687 A974).
27. Bayer E., Grom E., Kaltenegger В., Uhmann R., Anal. Chem., 48, 1106
A976).
28. Frei R. W., Santi W., Thomas M., J. Chromatogr., 116, 365 A976).
29. Schwedt G., Bussemas H. H., Chromatographia, 9, 17 A976).
30. Application sheet, Edt. Research, 65 Ivy Crescent, London W 4.
31. Blank С L., J. Chromatogr., 117, 35 A976).
32. Baldwin M. A., McLafferty F. W., Org. Mass Spectrom., 7, 1111 A973).
33. McFadden W. H., Schwartz H. L., Evans S., J. Chromatogr., 122, 389 A976).
34. Jones P. R., Yang S. K., Anal. Chem., 47, 1000 A975).
35. Willmott F. W., Dolphin R. J., J. Chromatogr. Sci., 12, 695 A974).
36. Dolphin R. J., Willmott F. W., Mills A. D., Hoogeveen L P. J., J. Chro-
Chromatogr., 122, 259 A976).
37. Lawrence J. F., Frei R. W., Chemical derivatization in liquid chromato-
graphy. Amsterdam, Elsevier, 1976.
38. Borch R. F., Anal. Chem., 47, 2437 A975).
39. Hoffmann N. E., Lino J. C, Anal. Chem., 48, 1104 A976).
40. Nachtmann F., Spitzy H., Frei R. W., J. Chromatogr., 122, 293 A976).
41. Ramsteiner К A., Hermann W. R., J. Chromatogr., 104, 438 A975).
42. Neue U., Dissertation Saarbriicken, 1976.
43. Halasz I., Walkling P., Ber. Bunsenges., 74, 66 A970).
44. Katz S., Pitt W. W., jr., Mrochetz J. E., Dinsmore S., J. Chromatogr.,
101, 193 A974).
45. Katz S., Pitt W. W., jr., Mrochetz J. E., J. Chromatogr., 104, 303 A975).
46. Muusze R. G., Huber J. F. K, J. Chromatogr. Sci., 12, 779 A974).
6 Заказ 825

82
Глава IV
47. Zech К, Voelter W., Chromatographia, 8, 7, 350 A975).
48. Snyder L. R., J. Chromatogr., 125, 287 A976).
49. Deelder R. S., Kroll M. G. F., van den Berg J. H. M., J. Chromatogr.,
125, 307 A976).
50. Demon M. S., De Angelis T. P., Yacynych A. M., Heinemann W. R.,
Gilbert T. W., Anal. Chem., 48, 20 A976).
51. Milano M. J., Lam S., Grushka E., J. Chromatogr., 125, 315 A976).
52. Kissinger P. Т., Refshange C, Dreiling R., Adams R. N.y Anal. Lett., 6,
465 A973).
53. Kissinger P. Т., Felice L. J., Riggin R. M., Pachla L. A., Wenke D. C,
Clin. Chem., 20, 992 A974).
54. Riggin R. M., Rau L., Alcorn R. L., Kissinger P. Т., Anal. Lett., 7, 791
A974).
55. Riggin R. M., Schmidt A. L., Kissinger P. Т., J. Pharm. Sci., 64, 680 A975).
56. Buchta R. C, Papa L J., J. Chromatogr. Sci., 14, 213 A976).
57. Tjaden U. R., Lankelma J., Poppe H., J. Chromatogr., 125, 275 A976).
58. Lankelma J., Poppe H., J. Chromatogr., 125, 375 A976).
59. Jones IV D. R., Tung H. C, Manahan S. E., Anal. Chem., 48, 7 A976).
60. Figge K, Piater Я, Kolbe W., G-I-T, Fachz. Lab., 19, 192 A975).
Глава V
НОСИТЕЛИ И НЕПОДВИЖНЫЕ ФАЗЫ
Материалы для заполнения колонок в жидкостной хромато-
хроматографии при высоком давлении должны быть устойчивы к давлению.
Проницаемость заполненной разделительной колонки ни в коем слу-
случае не должна зависеть от перепада давления на колонке. Большин-
Большинство неорганических материалов, используемых в качестве носителей,
стабильны примерно до 600 атм, однако каркас пор высокопористых
материалов (объем пор > 2 мл/г) уже при этом давлении может
разрушаться.
Если колонка заполнена набухающей насадкой, например ионооб-
менником с органической матрицей, проницаемость колонки с увели-
увеличением давления всегда ухудшается. Это может привести к тому, что
в конце концов скорость злюента уменьшится. Тем не менее в про-
продаже имеются относительно устойчивые к действию давления чисто
органические ионообменники (см. разд. В).
В жидкостной хроматографии при высоких давлениях в качестве
носителей используют два класса материалов.
1. Полностью пористые материалы (например, силикагель, окись
алюминия) с большой удельной поверхностью E0—500 м2/г) и боль-
большим удельным объемом пор @,2—2 мл/г), т. е. такие же, как исполь-
используемые в обычной классической колоночной хроматографии, но
с диаметром частиц в пределах 5—50 мкм. Преимущественно приме-
применяют ситовую фракцию от 10 до 5 мкм. С помощью таких материа-
материалов получают очень эффективные разделительные колонки (см. разд.
И. Е).
2. Поверхностно-пористые материалы (ППМ). В этом случае на
непроницаемое ядро (например, стекло) наносят тонкий пористый ак-
активный слой. Обычно толщина пористого слоя составляет 1 — 3 мкм
A/30-1/40 диаметра частицы). Наряду с силикагелем и окисью алю-
алюминия на стеклянные шарики наносят ионообменную смолу, полиа-
полиамиды и другие материалы.
Подобные материалы устойчивы к давлению, но количество ак-
активной неподвижной фазы в них незначительно.
Удельная поверхность силикагельных слоев в расчете на общую
массу составляет 0,2-15 м2/г. Фактическая же удельная поверхность
силикагеля в тонком слое значительно больше и соответствует по-
поверхности пористых частиц. Ионообменная емкость поверхностно-

Фирменное
название
Корасил
Пеллосил
Перисорб А
Вайдек
Зипакс
Пеллумина
Пеллидон
Химический
состав
SiO2
SiO2
SiO2
SiO2
SiO2
A12O3
Полиамид
Важнейшие коммерческие поверхностно-пористые материалы
Удельная
поверхность
м2/г
I 7
II 14
HS 4
НС 8
-10
12
~ 1
HS 4
НС 8
~ 1
Диаметр
пор, А
50-70
60
-60
400
Размер
частиц,
мкм
37-50
*
37-44
30-40
30-44
25-37
37-44
45
Форма частиц
Сферическая
То же
»
»
»
»
»
Предельная степень
покрытия непод-
неподвижной фазой, /п
I 0,9-1,2
II 1,9-2,5
<3
~2
1-1,5
1-1,5
Фирма-
поставщик
7
5
4
6
3
5
5
Таблица V.1
Примечание
Благодаря адсорбцион-
адсорбционным силам при жид-
жидкостной ~распредели-
тельной хроматографии
удерживается мини-
минимальное количество не-
неподвижной жидкой фа-
фазы
См. корасил
То же
См. корасил. Не пригоден
для метанола
Не пригоден для жидко-
жидкостной адсорбционной
хроматографии из-за
незначительной поверх-
поверхности
См. корасил
Слой полиамида на стек-
стеклянных шариках
Сил Х-Н
Актихром
Ликвахром
SiO2
SiO2
SiO2
12
25
10
35±15 »
40 Неправильная
44-53 То же
3-6
1-6
2
13
13
См. корасил
Стеклянный порошок. Не
истинный ППМ
То же
Список фирм-поставщиков неподвижных фаз (к табл. V.I — V.5)
1. BioRad Laboratories, 8000 Miinchen.
2. Bodenseewerk Perkin-Elmer, 7770 tjberlingen.
3. DuPont de Nemours, Deutsche Niederlassung, 6360 Friedberg (Hessen).
4. Merck AG, 6100 Darmstadt.
5. Whatman SA, Zone Industrielle, 45210 Ferrieres, Loiret, Frankreich in Deutschland zu beziehen bei:
5a. WGA, W. Guenther Analysentechnik, Sentagew, 4000 Diisseldorf.
5b. Vetter KG, Malscher StraBe, 6837 St. Leon - Rot.
6. Macherey-Nagel + Co., WerkstraBe 6-8, 5160 Diiren.
7. Waters GmbH, Herzog-Adolf-StraBe 4, 6240 Konigstein/Ts.
8. Woelm PHARMA GmbH & Co., Postfach, 3440 Eschwege.
9. Phase Separation Ltd., Deeside Industrial Estate, Queensferry, Flintshire, U. K.
In Deutschland zu beziehen bei:
9a. Latek, Labortechnik-Gerate GmbH, WielandstraBe 21, Heidelberg.
10. Durrum Chemical Corporation, 3950 Fabian Way, Palo Alto, CA 94303, U.S.A.
11. Beckman Instruments GmbH, Frankfurter Ring, 8000. Miinchen.
12. Hamilton Micromeasure AG, CH-7402 Bonaduz, Schweiz.
13. Applied Science Laboratories, State College, PA 16 801, U.S.A.
14. Varian GmbH, Alsfelder StraBe 6, 6100 Darmstadt.

Таблица \ .2
Основные характернстнкн важнейших коммерческнх норнстых адсорбентов
Фирменное названиеа
Удельная
поверх-
поверхность, м2/г
Диаметр
пор, А
Удельный
объем пор,
мл /г
Размер частиц,
мкм
Форма частиц
Фирма-
поставщик
Примечание
Лихросорб Si 60
Si 100
Лихросфер Si 100
Si 300
Si 500
Si 1000
Si 4000
Порасил А
В
С
D
E
F
Силикавольм 18
Зорбакс Сил
500
400
250
250
50
20
6
-400
200
75
30
-10
~ 2
500
250-350
60
100
100
250
500
1000
4000
<100
-150
-300
-600
-1000
>2000
60
75
-0,8
5, 7, 10, 30
5, 10, 20
10
<40
40-60
18-32
32-64
6-8
Неправильная
Сферическая
Сферическая,
у частиц
< 40 мкм
неправиль-
неправильная
Неправильная
Сферическая
Идентичен со сфе-
росилом
ХОА400
ХОА200
ХОВ075
ХОВ030
ХОВ015
ХОС005
Партисил
Сферисорб S 5 W
S 10 W
S 20 W
Силика А
Сил-Х1
Сил 60-5
ц-Порасил
Сферосил
Микропак
Нуклеосил 50
Нуклеосил 100
Нуклеосил 100
400
200
200
200
400
400
-500
400
600
400
500
300
430
55-60
80
80
80
- 100
-100
60
-100
60
60
50
100
100
0,75
1,0
0,8
0,8
0,8
1,0
1,5
5
10
20
5
10
20
13±5
13±5
5 ±2,5
Ю±2,5
20 ±2,5
8-12
5, 10, 20
5, 10
5; 7,5; 10
5; 7,5; 10
5; 7,5; 10
Неправильная
Сферическая
Неправильная
То же
»
Сферическая
Неправильная
Сферическая
То же
»
5
9
2
6
7
14
6
6
6
«Химически дезак-
тирован»
Ср. порасил
Только в запол-
заполненных колонках
Некоторые из приведенных здесь адсорбентов выпускаются в продажу только в заполненных разделительных колонках

I
I
t
I8
ma
о и
Ц
U О
и >s
X О О
й .. я
?¦* й
я S
ill
О а X
н&3
i s i
si
si
и
i 4 S
о
а
03
i
ft
U
So
я s
о
I
10 23 2
1Л"
го
о'
го
о"
I
S
о о
о о
8
о
|5
|z
||
S о
оэ
•е
и
|
а
s
ю
.is
Носители и неподвижные фазы
89
пористых ионообменников, рассчитанная на 1 г насадки, относитель-
относительно невелика (~10 мкэкв./r). ППМ с успехом используют в тех
случаях, когда разделение необходимо провести за короткое время
или когда разделяемые соединения слишком сильно удерживаются
на обычных пористых материалах. Диаметр частиц ППМ лежит
в пределах 25 — 50 мкм. Разделительная способность колонок, запол-
заполненных ППМ, чаще всего больше, чем у колонок, заполненных по-
пористыми частицами такого же размера (ср. табл. III. 1). Однако инте-
интерес к такого рода материалам ослабевает по мере того, как удается
хорошо и воспроизводимо заполнять колонки пористыми частицами
диаметром от 5 до 10 мкм.
Ситовые фракции, применяемые для заполнения, должны быть по
возможности более узкими. Частицы диаметром более 20 мкм легко
классифицировать с помощью сит, причем для частиц диаметром
меньше 40 мкм следует предпочесть мокрое просеивание. Частицы
диаметром менее 20 мкм можно классифицировать только с по-
помощью воздушного классификатора, причем чистые фракции прежде
всего для частиц диаметром менее 10 мкм получают только мето-
методом седиментации. Перед применением носители необходимо осво-
освободить от очень мелких частиц, образовавшихся при истирании, про-
проводя седиментацию в воде (метаноле или ацетоне для очень
маленьких частиц). Это улучшит проницаемость разделительной ко-
колонки и, кроме того, предотвратит засорение капилляров, ведущих
к детекторам. При использовании относительно широких ситовых
фракций обычно наблюдается самая неблагоприятная ситуация. На
проницаемость разделительной колонки больше всего влияют самые
мелкие частицы ситовой фракции, в то время как на разделительную
способность в основном влияют частчцы наибольшего диаметра.
А. Насадки, применяемые в адсорбционной
и распределительной хроматографии
В принципе в адсорбционной и распределительной хроматогра-
хроматографии в качестве носителей можно использовать все материалы, удель-
удельная поверхность которых больше 2 м2/г. У многих поверхностно-по-
поверхностно-пористых материалов, например у зипакса, удельная поверхность очень
невелика, поэтому, чтобы разделение было возможно, многие ППМ
приходится покрывать разделяющей жидкостью. Для адсорбцион-
адсорбционной хроматографии такие частицы не пригодны.
В табл. V.1 перечислены важнейшие из имеющихся в продаже
ППМ. На частицы ППМ можно нанести примерно 1-2% разделяю-
разделяющей жидкости; при большем содержании этой жидкости частицы
склеиваются.
В табл. V.2 приведены физические свойства важнейших из имею-
имеющихся в продаже пористых носителей. Эти насадки приемлемы для

90
Глава V
адсорбционной хроматографии (гл. Vl), а после покрытия разделяю-
разделяющей жидкостью и для распределительной хроматографии (см. гл.
VII). По-видимому, средней диаметр пор носителей не влияет на их
хроматографические свойства, если он находится в пределах
60 - 700А. При одинаковом качестве элюента значение к' данного ве-
вещества пробы тем меньше, чем меньше удельная поверхность носи-
носителя. Подробное обсуждение свойств неподвижных фаз содержится
в гл. VI и VII. Максимальная степень покрытия разделяющей жид-
жидкостью в распределительной хроматографии примерно соответствует
объему пор твердого тела. Например, на 1 г силикагеля с объемом
пор 1 мл/г можно нанести ~ 1 г разделяющей жидкости — так назы-
называемое 100%-ное покрытие.
Б. Химически модифицированные носители
Гидроксильные группы на поверхности силикагеля или окиси
алюминия определяют адсорбционные свойства и селективность не-
неподвижной фазы. Эти группы можно заменить на органические со-
соединения, хроматографические свойства носителя при этом также из-
изменятся в большей или меньшей степени. Хроматографические
свойства химически связанной неподвижной фазы зависят от струк-
структуры твердого носителя (его удельной поверхности, объема пор
и т. д.). Как правило, химической модификации подвергают только
силикагель. Для одного и того же элюента, если специфическое се-
селективное влияние органических групп модификатора отсутствует,
значение к' для модифицированной фазы всегда меньше, чем для ис-
исходного («голого») силикагеля.
Селективность можно изменить, заменив органический компо-
компонент, например вводя функциональные группы в органический оста-
остаток, преимущественно в ш-положение к связи с поверхностью силика-
силикагеля. Поскольку заместить все гидроксильные (силанольные) группы
на поверхности силикагеля практически невозможно, то на селектив-
селективность фазы дополнительно влияют оставшиеся гидрооксильные
группы. Поэтому добиться того, чтобы селективность фазы точно
соответствовала свойствам связанного органического остатка, очень
трудно.
Силанольные группы на поверхности силикагеля можно заме-
заместить на различные органические соединения, в частности кремнеор-
ганические. На рис. V.1 представлена схема получения химически мо-
модифицированного силикагеля.
«Мономерное» покрытие поверхности органическими молекула-
молекулами получают, например, только в результате этерификации сила-
нольных групп первичными спиртами [2]. Органический остаток
образует с поверхностью ковалентную связь. Подобные «щетки»
Si - О — С целесообразно использовать в газовой хроматографии [2,
3]. Однако они подвержены гидролизу и поэтому в жидкостной хро-
A
Л in"
Л
\
a
s s
h
ас-Л-о-
Ь
ас-Л-о-
f >
</> Я
/II /1\
а. п
X
? ?
Л W
/1\
.?
и
О
Г) I
F
f •'- ?>
о
¦ffi-x
A
о с
л л
-й- о'
-О-й-о'
i
о
i
*-(Л О —
I
х ° ? ?
О~Л"й О"
т i m
X-in-X
О , О
ir-in-o-
/
Л
п"
и
а.
i
Х- Z
о
i
in
\
О
I
i/i
/|\
s i
о
OH
х
о
I
i/i
||\
г
и
+
о
а. а.
ч /
Л
/ ч
о СЗ
х
о
I
Л
/1\
X
о
> 3
6 1
Я О

92
Глава V
матографии применяются редко. Более стабильны модифициро-
модифицированные силикагели, у которых органический остаток связан с крем-
кремнием через азот [4, 5]. Можно также получить подобные фазы со
связью Si - N - С, содержащие самые различные органические
группы, обрабатывая «хлорированный» силикагель аминами, содер-
содержащими вторую функциональную группу (реакция II). Эти фазы не
.подвергаются гидролизу в области рН 4 — 7,5.
Полностью устойчивые к гидролизу химически модифициро-
модифицированные носители получают, обрабатывая силикагель хлор- или ал-
коксисиланами. В результате этой реакции образуется новая связь
Si - О - Si. Исключительно мономерное покрытие получают только
при обработке силикагеля монохлор- или моноалкоксисиланами (ре-
(реакция IV,a). Эти реакции используют в газовой хроматографии для
подавления реакционной активности носителей, что необходимо
в некоторых случаях. Из-за стерической затрудненности реакции сте-
степень замещения обычно не очень высока. Поэтому к силикагелю
можно привить только очень немного углерода и соответственно не-
небольшое число функциональных групп. При использовании дихлор-
или трихлорсиланов или соответствующих алкоксисиланов реакцию
можно направить в двух различных направлениях. Образование по-
лисилоксанов (связанный полимер) можно подавить, хотя и не пол-
полностью исключить (реакция Ш,б), если работать в условиях, пол-
полностью исключающих присутствие влаги [6], т. е. силикагель
и растворитель должны быть хорошо высушены. В то же время, до-
добавляя определенное количество воды, например в виде пара или
в растворе, можно провести направленную полимеризацию силанов
в полисилоксаяы (связанное силиконовое масло) [7, 8] (реакция IV,a
и б). Такие реакции можно проводить и на частицах ППМ. В резуль-
результате полимеризации образуются относительно толстые пленки [9,
10]. В то время как химически модифицированные фазы с моно-
мономерным покрытием («щетки») по своим хроматографическим свой-
свойствам (например, скорости массопередачи) подобны чистым твердым
телам, фазы со связанными полисилоксанами больше напоминают
распределительные системы, в которых твердое тело покрыто нера-
нерастворимой в элюенте. разделяющей жидкостью. Поскольку в процес-
процессе полимеризации образуется некоторое количество сильносшитых
полисилоксанов, то массопередача низкая из-за медленной и затруд-
затрудненной диффузии. Поэтому значения h сильно возрастают с увеличе-
увеличением скорости элюента [10]. На практике нельзя провести такого
четкого разделения между «мономерной» и «полимерной» химически
связанными фазами. Какой тип фазы выгоднее, зависит от раздели-
разделительной системы [11]. По сравнению с обычными частицами, покры-
покрытыми жидкими фазами, химически связанные фазы имеют некоторые
преимущества.
1. Отпадает необходимость в насыщении элюента жидкой непо-
неподвижной фазой.
Носители и неподвижные фазы
93
2. Из распределительной системы исключается обычная форко-
лонка.
3. Пробы, выделяемые из элюента, не загрязнены неподвижной
фазой, а такое загрязнение обычно препятствует применению в пре-
препаративной хроматографии распределительных колонок.
4. Неподвижная фаза не вымывается из колонки, так как она
связана с твердым телом. Поэтому проблема механической эрозии
при высоких скоростях отсутствует.
5. При использовании подобных связанных фаз можно приме-
применять различные методы программирования, включая градиентное
элюирование, чего нельзя делать в случае обычных носителей, по-
покрытых неподвижной фазой.
6. Внешние параметры (температура, влажность растворителя
и т. д.) меньше влияют на равновесие в разделительной колонке.
Последние два пункта говорят о преимуществе химически свя-
связанных фаз по сравнению с чистыми полярными неподвижными фа-
фазами, такими, как силикагель и окись алюминия. Регенерирование
силикагеля и окиси алюминия после проведения градиентного элюи-
рования часто длится дольше, чем само элюирование, в результате
того, что установление равновесия со всегда присутствующей
в элюенте водой происходит очень медленно (см. гл. VI.III.4).
Если органический остаток не содержит функциональных групп,
т. е. если, например, используют алкилсилан, в алкильный радикал
которого обычно входит 4—18 атомов углерода, то получают обра-
обращенные неподвижные фазы. В системах с обращенной фазой (см. гл.
VI) неподвижная фаза неполярна (гидрофобна), а подвижная фаза по-
лярна (гидрофильна). С обращением свойств фазы обращается также
элюотропный ряд: неполярные соединения удерживаются сильнее,
чем полярные. Системы с обращенной фазой предпочтительны в тех
случаях, когда вещества пробы растворимы только в относительно
полярных растворителях, из которых они не удерживаются на по-
полярных адсорбентах. В системах с обращенной фазой можно также
отделять очень неполярные соединения, которые не удерживаются из
неполярных элюентов на полярных адсорбентах (например, твердые
жиры). Истинные системы с обращенной фазой гидрофобны, не сма-
смачиваются водой и не должны иметь силанольных групп, доступных
для молекул пробы. Качественное указание о наличии свободных не-
незамещенных и неэкраниро ванных силанольных групп дает адсорбция
метилового красного из раствора в бензоле [12]. Если силикагель
после встряхивания с раствором метилового красного и промывания
чистым бензолом еще окрашен в красно-фиолетовый цвет, то это оз-
означает, что имеются свободные силанольные группы. В «истинной»
обращенной фазе времена удерживания полярных соединений из не-
неполярных элюентов должны быть очень малыми [13].
Используя подходящие хлор- или алкилсиланы с функцио-
функциональными группами, можно получить также другие химически свя-

Таблица V. 4
Химическн модифицированные носители8
Фирменное
название
Дурапак-Кар-
бовакс-Кора-
сил
Бондапак Фе-
нил/Корасил
Бондапак С 18/
Корасил
Вайдек 201 RP
Вайдек 501 РР
Ко: Пелл ODS
Ко: Пелл Пак
Пермафаза
ЕТН
Пермафаза
ODS
Перисорб RP2
Перисорб RP8
Перисорб RP18
Перисорб РА6
ODS SIL-X-2
Дурапак OPN
Порасил
Дурапак-Кар-
бовакс 400-
Порасил С
Бондапак С18/
Порасил В
Бондапак Фе-
нил/Порасил
D
Функциональные
группы
Карбовакс 400
Дифенильные
Октадецило-
вые
То же
Пропионит-
р ильные
Октадецило-
вые
Нитрильные
Силоксановый
эфир
Октадецило-
вые
Обработан
диметилди-
хлорс планом
Октановые
Октадецило-
вые
Покрыт поли-
полиамидом 6
Октадецило-
вые
Оксид ипро-
пионитрил
Карбовакс 400
Октадецило-
вые
Фенильные
Носитель
ППМ
То же
»
»
»
»
»
»
»
»
»
»
»
»
Порис-
Пористый
То же
»
»
Размер
частиц, мкм
37-50
37-50
37-50
30-44
30-44
44-53
44-53
<30
<30
30-44
30-44
30-44
30-44
35±15
35-75
37-75
37-75
37-75
Фирма-
поставщик
7
7
7
6
6
5
5
3
3
4
4
4
4
2
7
7
7
7
Примечание
Связь Si-O-C
Обращенная
фаза
То же
»
Обращенная
фаза
Фаза средней
полярности
Обращенная
фаза
То же
»
»
Слой полиак-
риллактама
Обращенная
фаза
Связь Si-O-C
То же
Обращенная
фаза
Слабополяр-
Слабополярная обра-
обращенная фаза
Некоторые нз приведенных фаз поставляются только в готовых колонках.
Таблица V. 5
Коммерческие
химически модифицированные носители на основе
силикагеля (dp < 10 мкм, носитель порястый)
Фирменное
название
ODS SIL-X-1
Фенилсил-Х-1
Флюоретерсил-Х-1
Алкилфенилсил-
Х-1
Амнносил-Х-1
Цианосил-Х-1
Зорбакс ODS
ц-Бондапак С18
ц-Бондапак NH2
ц-Бондапак CN
ц-Бондапак Карбо-
гидрат
SIL-60-CN
SIL-60-NO2
SIL-60-NH2
Нуклеосил С 8
Нуклеосил С 18
Нуклеосил CN
Нуклеосил NO2
Нуклеосил NH2
Функциональные
группы
Октадециловые
Фенильные
Фторалкильные
Алкилфенильные
Алкиламиногруп-
пы
Нитрогруппы
Октадециловые
То же
Алкиламиногруп-
пы
Нитрильные
Нитрильные
Нитрогруппы
Аминогруппы
Октановые груп-
группы на нуклео-
силе 100
Октадециловые
Нитрильные
Нитрогруппы
Аминогруппы
Размер
частиц, мкм
13 + 5
13 + 5
13 + 5
13 + 5
13 + 5
13 + 5
6-8
< 10
< 10
< 10
<10
5,10
5,Ю
5,10
5, 7, 5, 1С
5, 7, 5, К
5, 10
5, 10
5, 10
Фнрма-
поставщнк
2
2
2
2
2
2
3
7
7
7
7
6
6
6
6
6
6
6
6
Примечание
Обращенная фаза
Слабополярная
обращенная фа-
фаза
Слабоосновной
ионообменник
Обращенная фаза
То же
Слабоосновной
ионообменник
Для разделения са-
харов
Для разделения
полярных соеди-
соединений
Для разделения
полярных и аро-
ароматических сое-
соединений
Для разделения
Сахаров и пепти-
пептидов
Обращенная фаза
То же
Для разделения
полярных соеди-
соединений
Для разделения
ароматических
соединений
Для разделения
Сахаров, пепти-
пептидов

96
Глава V
Продолжение табл. V.5
Фирменное
название
НукяеосилМ(СН3J
Лихросорб RP2
Лихросорб RP8
Лихросорб RP18
Лихросорб DIOL
Лихросорб NH2
Партисил ODS
Сферисорб ODS
Вайдек ТР (об-
(обращенная фаза)
Партисил РАС
Вайдек ТР поляр-
полярный
Микропак-CN
Функциональные
группы
Диметиламино-
группы
Диметилдихлор-
силан на лихро-
сорбе SI60
Октальные
Октадециловые
Вицинальные
ОН-группы
Аминогруппы
Октадециловые
То же
»
Алкилнитриль-
ные
То же
»
Размер
частиц, мкм
5, 10
5, 10, 30
5, 10
5, 10
10
10
10
10
10
10
10
Фирма-
поставщнк
6
4
4
4
4
4
5
9
6
9
6
14
Примечание
Для разделения
ароматических
соединений, фе-
фенолов (слабоос-
(слабоосновной анионо-
обменник)
Химически связан-
связанные диметиль-
ные группы
Обращенная фаза
Обращенная фаза,
как и микропак,
СН от 15
Как и микропак,
NH2 от 15
Обращенная фаза
То же
»
занные неподвижные фазы. Взяв за основу такие фазы, можно, про-
проводя реакцию в несколько ступеней, получить фазы другого состава
[6]. Таким способом получают, в частности, катионообменники (с
кислотными алкил- или арилсульфогруппами) и анионообменники (с
амино- и диалкиламиногруппами или с группами четвертичных ам-
аммониевых оснований). Определить селективность химически свя-
связанных неподвижных фаз, содержащих другие функциональные
группы, довольно сложно и делать это надо очень осторожно, так
как число незамещенных силанольных групп часто оказывает боль-
большее влияние на селективность, чем введенные с большим трудом
функциональные группы.
В последнее время опубликовано большое число статей и об-
обзорных работ [11, 13 — 21], посвященных химически связанным непо-
неподвижным фазам. В табл. V.4 перечислены важнейшие химически свя-
связанные неподвижные фазы, имеющиеся в продаже. Там же по
возможности указаны функциональные группы этих фаз. Некоторые
Носители и неподвижные фазы
97
из приведенных в таблице неподвижных фаз можно получить только
в заполненных колонках. Применение химически связанных непо-
неподвижных фаз описано в гл. VI, разд. IV.B.
В. Ионообменники
В табл. V.6 приведены важнейшие разработанные специально для
жидкостной хроматографии при высоком давлении имеющиеся
в продаже ионообменники на основе ППМ. Частицы почти всех ио-
нообменников имеют форму шариков; они покрыты тонким диффу-
диффузионным слоем и отличаются хорошими хроматографичесцими свой-
свойствами. Большой недостаток этих ионообменников - низкая ем-
емкость, составляющая всего 10-50 мкэкв./г. Поскольку при изменении
ионной силы или рН объем частиц не меняется, их очень удобно ис-
использовать в колонках. Проницаемость колонок, заполненных таким
материалом, в процессе разделения практически не меняется. Ио-
Ионообменники получают в результате химического замещения со-
соответствующих силанпроизводных до или после нанесения на ча-
частицы. Устойчивость к изменению рН достаточна, тем не менее
в щелочной среде (рН > 8) возможна реакция гидроксил-ионов с ма-
материалом силикагеля. Следует отметить, что сильноосновные анио-
ниты на основе силикагеля в гидроксильной форме катализируют
саморастворение в воде.
В опубликованных относительно недавно работах [22-26] опи-
описаны ионообменники, у которых с пористым силикагелем ковалентно
связаны (по типу «щеток») алкильные или арильные группы, в ко-
которые в свою очередь введены ионообменные группы. На основе си-
силикагеля с частицами размером 5-10 мкм получают ионообменники
с хорошими хроматографическими свойствами и достаточной ем-
емкостью B00-1000 мкэкв./г). Как известно, емкость зависит от вели-
величины удельной поверхности исходного силикагеля, поэтому емкость
ионообменников такого типа достаточна практически для любого
разделения. Поставляемые различными фирмами ионообменники
приведены в табл. V.6.
Первые разработанные специально для хроматографии при высо-
высоких давлениях ионообменники получали следующим образом: на не-
непроницаемые стеклянные шарики наносили путем полимеризации
полистирольную пленку и в нее вводили функциональные группы
[27]. Емкость таких ионообменников достаточно высока. При ис-
использовании неводных растворителей слой полимера может набу-
набухать или растворяться. То же самое относится к ионообменникам на
основе зипакса. Полиметакрилаты растворяются в органических
растворителях.
Классические пористые ионообменники сжимаются под дей-
действием давления и в жидкостной хроматографии при высоких давле-
давлениях применяются только в особых случаях. Специально для улуч-
7 Заказ 825

Таблица V.6
Важнейшие ионообмениики для жидкостной хроматографии при высоких давлениях на основе ППМ или силиквгеля
Фирменное название
ц-Бондапак NHa
Бондапак АХ-Корасила
А8-Пеллионекс-8АХа
АЕ-Пеллионекс-8АХа
АЬ-Пеллионекс-\УАХ°
Пермафаза ААХа
Перисорб ANa
Вайдек 301 SBa
Зипакс ААХа
Зипакс WAXa
Носитель
Пористый силикагель
ППМ, химически связанный
Стекло, покрытое полистиро-
полистиролом
Стекло, покрытое аромати-
ароматическим полиэфиром
Стекло с алифатической мат-
матрицей
ППМ, химически связанный
То же
»
) ППМ с полислоем
Емкость
(сухого),
мкэкв./г
30
10
10
10
30
100
12
12
Свойства
Слабоосновный
Сильноосновный
То же
»
Слабоосновный
Сильноосновный
То же
»
Сильноосновный
Слабоосновный
Размер
частиц,
мкм
-10
30-50
44-53
44-53
44-53
25-37
30-40
30-44
25-37
25-37
Фирма-
поставщик
7
7
5
5
' 5
3
4
6
Примечание
Можно использо-
использовать в спирте
рН 2-7
Стабилен при рН
1-9
Покрытый поли-
полимером зипакс не
пригоден для ра-
работы с органи-
органическими раство-
растворителями
Партисил 10 SAXa
Нуклеосил SBa
Лихросорб ANa
Вайдек ТР51
Бондапак СХ-Корасил
Н8-Пеллионекс-8СХ6 ]
НС-Пеллионекс-SCX6}
Перисорб КАТ6
Вайдек 401 SA6
Зипакс SCX6
Лихросорб КАТ6
Нуклеосил SA
Партисил 10 SCX6
Вайдек ТР Катион*
Пористый
ППМ, химически связанный
Полистирол на стеклянных
шариках
ППМ, химически связанный
То же
ППМ, полислой
Пористый
»
»
»
10
1000
30
10
60
50
100
5
850
1000
Сильноосновный
То же
Сильнокислотный
То же
I
10
5, 10
10
10
37-44
44-53
44-53
30-40
30-44
25-37
10
5, 10
10
10
5
6
4
6
7
5
5
4
6
3
4
6
5
6
Поставляется в
фосфатной фор-
форме
Четвертичный ам-
монийхлорид
Четвертичные ам-
аммониевые груп-
группы
Стабилен при рН
1-9
При использова-
использовании неводных
элюентов воз-
возможны ослож-
осложнения
Сульфогруппы
То же
Анионообменник.
К^тионообменник.

100
Глава V
Таблица V.7
Ионообменникн с органической матрицей для жидкостной хроматография
при высоком давлении8
Фирменное название
Степень
сшивки, % ДВБ
Емкость (су-
(сухого), мэкв/г
Размер
частиц, мкм
поставщик
Анионообменники
(сильноосновные, функциональная группа — N+R3)
Аминекс А 14
А 25
А 27
А 28
Дуррум DA х 8
х 8А
DA х4
Гамильтон 7800
4
4, 6, 8
3,4
3,2
3,2
3,2
4
4
2
17-23
17,5 ±2
12-15
7-11
20±2
8±2
2О±5
20±5
Катионообменники
(сильнокислотные, функциональная группа — SO3H)
Аминекс А 4
А5
А6
А7
Бекман А А 15
РА 28
РА 35
Дуррум DC-1 А
2А
4А
6А
Гамильтон HPAN90
В 80
Н70
8
8
8
7,5
7,5
7
7,75
5,0
5,0
5,0
5,0
5
5
5
5
5
5
5
5,2
5,2
5,2
16-24
13 + 2
17,5 + 2
7-11
22 + 6
16
13
18 + 3
12 + 3
8±2
11 + 1
22 + 6
15 + 5
24 + 6
10
12
12
10
12
' В таблице приведены имеющиеся в продаже ионообменные смолы с dp < 20 мкм.
шения аминокислотного анализа в настоящее время разработаны
довольно устойчивые к действию давления ионообменники с части-
частицами размером меньше 20 мкм. Используя такие частицы, можно
проводить разделение при высоких давлениях (до ~ 200 атм). Ио-
Ионообменная емкость таких ионообменников составляет 3-5 мкэкв./г,
т. е. примерно в 100 раз больше, чем у ионообменников на основе
ППМ. Обычные ионообменники меняют свой объем при изменении
рН, концентрации ионов и температуры элюента. Прежде чем запол-
Носители и неподвижные фазы
101
нять колонки такими ионообменниками, им надо дать набухнуть.
В табл. V.7 приведены ионообменники, чаще всего используемые
в скоростной жидкостной хроматографии.
Г. Неподвижные фазы для ситовой хроматографии
В ситовой хроматографии разделение основано на различной до-
доступности внутренней пористой структуры носителей (см. гл. IX).
Первоначально в этом виде хроматографии использовали набухшие
в элюентах полимеры (гели). Так, например, разделение водных си-
систем проводили на сшитых декстранах (сефадекс), полиакриламиде
(биогель Р) или агарозе (биогель А). С органическими элюентами
разделение проводили на гидрофобных полимерах — полистиролах
с большей или меньшей степенью сшивки (стирагель, порагель, био-
бидс S). Для этой же цели пригодны также гели поливинилацетата
(например, меркогель OR). Подобные гидрофобные гели только тог-
тогда показывают хорошую разделяющую способность, когда элюент
смачивает поверхность и полимер набухает.
Гели (набухшие полимеры) не очень устойчивы к давлению, и раз-
разделение возможно только при очень низких скоростях элюента
(малый перепад давления). Кроме того, набухание и сжатие насадки
в колонке ведут к ухудшению проницаемости и (или) разделяющей
способности. «Классические» гели едва ли пригодны для ситовой
хроматографии при высоких давлениях.
На мелких ситовых фракциях полистирола (dp < 15 мкм) разделе-
разделение методом ситовой хроматографии можно проводить и при боль-
больших скоростях элюирования. Такие полистиролы поступают в прода-
продажу под названием стирагель (Waters Assoc, Milford, Mass.). Другие
гели, например меркогель OR или гидрофильный меркогель PGM
(полиэтиленгликольметакрилат) [27], сохраняют устойчивость при
умеренных давлениях (~ 60 атм). Разделение водных растворов мож-
можно проводить на сфероне - полиэтиленгликольакрилате.
При использовании пористых стекол и силикагелей проблем, свя-
связанных с устойчивостью к давлению, не возникает. И тот, и другой
материал представляют собой почти чистый SiO2, но пористая струк-
структура их формируется разными способами. Силикагель получают ли-
либо из жидкого стекла, либо путем полимеризации тетраэтилового
эфира кремневой кислоты. Последующая гидротермальная обработ-
обработка увеличивает первоначально диаметр пор [28]. Пористые стекла
получают из расслоенных боросиликатных стекол, из которых с по-
помощью водяного пара удаляют выделившуюся борную кислоту. На
поверхности обоих носителей имеются кислотные группы (сила-
нольные или льюисовские кислотные центры), влиянием которых не-
нельзя пренебрегать (например, под влиянием этих групп может разру-
разрушиться третичная структура протеинов).

102
Глава V
У поставляемых различными фирмами силикагелей, например
лихросорба, лихросфера, порасила и сферосила, или пористых сте-
стекол, например CPG-10 или Биогласа, диаметр пор лежит в пределах
от 60 до 2500 А. Выпускается лихросорб с диаметром пор до
25000 А. Если колонки заполнены силикагелем или пористыми сте-
стеклами, разделение можно проводить как полярными, так и непо-
неполярными элюентами. При использовании неполярных элюентов не-
необходимо следить за тем, чтобы разделяемые вещества не адсорби-
адсорбировались на поверхности твердого тела. В ситовой хроматографии
водных растворов биологических веществ применяют химически мо-
модифицированный силикагель [18, 29—32] обычно с гликольэфирной
группировкой на конце. Подобные фазы смачиваются водой, но на-
наряду с ситовым эффектом проявляют и эффект обращенной фазы.
Распределение пор по диаметрам в таких фазах может быть раз-
различным, как, например, в выпускаемой на продажу гликофазе (Gly-
cophase) или ц-бондагеле Е (ц-Bondagel Е).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Обзор носителей для жидкостной хроматографии при высоких давлениях:
Majors R. E., American Laboratory, 1972, 27 — 39; International Laboratory
Nov./Dec., 1975.
Leitch R. E., DeStefano J. J., J. Chromatogr. Sci., 11, 105 A973).
Locke D. C, J. Chromatogr. Sci., 11, 120 A973).
Dark W. A., Limpert R. J., J. Chromatogr. Sci., 11, 114 A973).
1. Karger B. L,, Engelhardt #., Conroe K, Halasz I., in Stock R. (Ed.), Gas
Chromatography, 1970. London, Institute of Petroleum, 1971.
2. Halasz /., Sebestian /., Angew. Chemie, 81, 464 A969).
3. Halasz /.,* Sebestian /., J. Chromatogr. Sci., 12, 161 A974).
4. Brust O. E., Sebestian I., Halasz /., in Perry S. G., Gas Chromatography,
1972. Ec. Applied Science. Barking, Essex, 1973.
5. Brust O. E., Halasz /., J. Chromatogr., 83, 15 A973).
6. Sebestian I., Halasz /., Chromatographia, 7, 371 A974).
7. Aue W. A., Hastings С R., J. Chromatogr., 42, 319 A969).
8. Hastings C. R., Aue W. A., Augl J. M., J. Chromatogr., 42, 487 A970).
9. Kirkland J. J., DeStefano J. J., J. Chromatogr. Sci., 8, 309 A970).
10. Kirkland J. J., J. Chromatogr. Sci., 9, 206 A971).
11. Sebestian /., Halasz I., in Giddings J. С et al., Advances in Chroma-
Chromatography. Vol. 14. New York, Dekker, 1976.
12. Kolthoff I. M., Shapiro /., J. Am. Chem. Soc, 72, 776 A950).
13. Karch K, Sebestian I., Halasz I., J. Chromatogr., 122, 3 A976).
14. Grushka E. (Ed.), Bonded Stationary Phases in Chromatography. Ann Arbor,
Mich., Ann Arbor Science Publ., 1974.
15. Rehak V., Smolkova E., Chromatographia, 9, 219 A976).
16. Kirkland J. J., Chromatographia, 8, 661 A975),
17. Boksanyi L., Liardon O., Kovats E. sz., Adv. Coll. Interfac. Sci., 6, 95
A976).
18. Chang S. H, Gooding К M., Regnier F. E., J. Chromatogr., 120, 321 A976).
19. Unger K, Becker N., Roumeliotis P., J. Chromatogr., 125, 115 A976).
Носители и неподвижные фазы
103
20. Horvath С, Melander W., Molnar J., J. Chromatogr., 125, 129 A976).
21. Karger B. L., Gant J., Hartkopf A., Weiner P. H., J. Chromatogr., 128,
65 A976).
22. Unger K, Nyamah ?>., Chromatographia, 7, 63 A974).
23. Weigand N., Dissertation Saarbriicken, 1974.
24. Weigand N., Sebestian I., Halasz I., J. Chromatogr., 102, 325 A974).
25. Sounders D. H., Barford R. A., Magidman P., Olszewski L. Т.,
Rothbart H. L., Anal. Chem., 46, 834 A974).
26. Asmus P. A., Low C.-E., Novotny M., J. Chromatogr., 119, 25 A976).
27. Heitz H., Angew. Chemie, 82, 675 A970).
28. Her R. K, The Colloid Chemistry of Silica and Silicates. Ithaca, N. Y.,
Cornell Univ. Press, 1955.
29. Chang S. H., Gooding K. M., Regnier F. E., J. Chromatogr., 125, 103 A976).
30. Wu A. C. M., Bough W. A., Conrad E. C, Alden jr., К. Е., J. Chromatogr.,
128, 87 A976).
31. Regnier F. E., Noel R., J. Chromatogr. Sci., 14, 316 A976).
32. Persiani C, Cukor P., French K., J. Chromatogr. Sci., 14, 417 A976).

Глава VI
АДСОРБЦИОННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
I. ПОЛЯРНЫЕ НЕПОДВИЖНЫЕ ФАЗЫ
А. Общие положения
Большинство разделений в жидкостной хроматографии основано
на адсорбционных эффектах. При этом на разделение влияет взаимо-
взаимодействие адсорбента, пробы и элюента. В основе сорбции на окисных
сорбентах лежит специфическое взаимодействие между полярной по-
поверхностью адсорбента и полярными группами адсорбирующихся
молекул. К таким взаимодействиям относятся диполь-дипольное
взаимодействие между постоянным и индуцированным диполями,
а также образование водородной связи вплоть до образования п-
комплексов или комплексов с переносом заряда. В принципе возмож-
возможная в некоторых условиях хемосорбция в общем нежелательна, так
как она может значительно повысить время удерживания или приве-
привести к необратимой сорбции или разложению вещества.
Получить воспроизводимые хроматографические данные можно, ес-
если изотерма адсорбции линейна. Только в этом случае время удер-
удерживания не зависит от величины пробы. К сожалению, практически
всегда изотермы адсорбции более или менее искривлены. Чаще всего
приходится иметь дело с изотермами адсорбции ленгмюровского ти-
типа, когда адсорбированное количество с увеличением концентрации
уменьшается, т. е. уменьшает;я время удерживания (рис. VI.1). Кроме
того, область наивысшей концентрации вещества в зоне смещается
в начало полосы вещества (область концентрации насыщения) и на-
наблюдается известная асимметрия пика (образование хвоста). Такое
асимметричное распределение в адсорбционной хроматографии
объясняется почти исключительно нелинейностью изотерм.
Если разделение проводится в нелинейной области изотермы ад-
адсорбции, время удерживания зависит от величины пробы. В этом
случае возможна только приблизительная качественная идентифи-
идентификация по временам удерживания. Разделение двух соседних зон не-
неполное и выделить чистые вещества иногда невозможно.
Опыт показывает, что линейная область изотерм адсорбции оди-
одинакова для многих адсорбентов.
Поэтому если величины пробы ниже 10 ~4 г/г адсорбента, или
0,1 мг/г адсорбента, можно считать, что время удерживания не зави-
зависит от величины пробы и что работа проводится в линейной области
изотермы [1]. Эту область называют также «линейной емкостью»
адсорбента. Линейная емкость тем ниже, чем более неоднородна по-
Адсорбционная хроматография
105
Тип изотермы
Линейная Выпуклая
Bub зоны в злюенте
Вогнутая
Влияние величины пробы
в/г
г/г
г/г —>
Величина пробы
Реи. VI. 1. Влияние типа изотермы адсорбции на вид полосы и объем
удерживания.
верхность адсорбента. При нанесении на поверхность адсорбента по-
полярных соединений, например воды, линейная область изотермы уве-
увеличивается. Линейную область изотермы можно увеличить, модифи-
модифицируя поверхность химически. Преимущество этого способа заклю-
заключается в том, что химически связанные соединения не вымываются
при изменении элюента.

106
Глава VI
Адсорбционная хроматография
107
800
¦ 600
' 400
200
2.9
2.7
2.S
2.3
а, в/г
Рис. VI.2. Определение линейной емкости адсорбента.
Неподвижная фаза: силикагель меркогель Si 100; элгоент: н-гептан; проба: нитробензол.
В критических случаях линейную емкость адсорбента следует
определить экспериментально. Используя найденные значения к' или
h, строят их зависимость от логарифма величины пробы, приходя-
приходящейся на грамм адсорбента. На рис. VI.2 приведена подобная кривая
для силикагеля. После того как величина пробы достигнет некоторо-
некоторого определенного значения, размывание полосы и значения к' на-
начинает меняться. Согласно Снайдеру [1], 10%-ное изменение значе-
значения к' еще допустимо (определение линейной емкости). Однако такое
изменение к' допустимо только для классической колоночной хрома-
хроматографии, в жидкостной хроматографии при высоких давлениях оно,
по-видимому, должно быть меньше. Не следует превышать полу-
полученные наибольшие допустимые значения пробы. Увеличение ши-
ширины полосы связывают с образованием хвостов.
Для того чтобы ввод пробы не вызывал дополнительного размы-
размывания полосы, объем жидкости, в котором растворяют пробу при
аналитических работах, должен быть как можно меньше. Размыва-
Размывание может наблюдаться в тех случаях, когда объем подвижной фазы
в разделительной колонке небольшой, а величины к' составных ча-
частей пробы меньше двух. При более высоких значениях к' или при
градиентном элюировании объемы, в которых растворена проба, не
играют заметной роли.
Образование хвостов, связанное с нелинейностью изотермы ад-
адсорбции, можно очень просто отличить от образования хвостов,
обусловленного недостатками аппаратуры, например слишком боль-
большим мертвым объемом. Недостатки аппаратуры прежде всего при-
приводят к образованию хвоста у пика инертных соединений и соедине-
соединений с небольшими значениями к' (к' < 5). У пиков соединений
с большими значениями к' (в этом случае предполагается линейная
изотерма адсорбции) обычно не наблюдается таких хвостов, которые
можно было бы объяснить недостатками аппаратуры. Если причина
образования хвоста - нелинейность изотермы, то, само собой разу-
разумеется, пик инертного вещества не имеет хвоста. Асимметрия полос
при этом усиливается с увеличением значения к'. Для того чтобы при
данной чувствительности детектора еще можно было установить на-
наличие пика вещества, приходится вводить в колонку тем больше ве-
вещества, чем сильнее оно удерживается. Вогнутая изотерма сорбции,
также приведенная на рис. VI. 1, наблюдается очень редко. Такая фор-
форма изотермы возможна, например, при адсорбции на поверхности
жидкости; при этом образуется хроматографический пик с мед-
медленным нарастанием переднего и крутым обрывом заднегс фронта.
Подобные полосы получают также при плохой растворимости ве-
вещества в элюенте. В большой области концентраций полностью ли-
линейные изотермы встречаются очень редко. Поэтому, переходя
к новой системе, всегда следует убедиться, не зависит ли время удер-
удерживания от величины пробы, и с этой целью провести несколько раз-
разделений при различных величинах пробы. Идентификация компонен-
компонентов смеси по найденным временам удерживания возможна, только
если выполняется это условие.
Б. Полярные адсорбенты и их свойства
Из числа многих разработанных для классической колоночной
хроматографии адсорбентов в жидкостной хроматографии при высо-
высоких давлениях используют практически только силикагель и окись
алюминия; на их основе изготавливают либо пористые носители, ли-
либо поверхностно-пористые материалы (ППМ). Все эти носители
представляют собой типичные окисные полярные адсорбенты чаще
всего с одинаковым рядом элюирования. Однако селективность их
несколько различается. Так, окись алюминия более, чем силикагель,
пригодна для разделения многоядерных ароматических углеводоро-
углеводородов.
Наряду с полярными адсорбентами в настоящее время все боль-
большее и большее распространение получают химически модифициро-
модифицированные сорбенты, в частности для систем с обращенной фазой ис-
используют сорбенты, поверхность которых неполярна. Область их
применения примерно такая же, как область применения активного
угля в классической колоночной хроматографии. Активные угли из-

108
Глава VI
за их плохих механических свойств (а также из-за плохой воспро-
воспроизводимости этих свойств при получении) для жидкостной хромато-
хроматографии при высоких давлениях ие пригодны.
Следует напомнить, что свойства активных адсорбентов на осно-
основе аморфных гелей могут меняться не только от партии к партии, но
и в процессе хранения или транспортировки, очистки и т, д.
1. Силикагель
Силикагель — один из наиболее распространенных адсорбентов. Его часто
также используют в качестве носителя для жидких неподвижных фаз в рас-
распределительной хроматографии (см. разд. А данной главы и гл. VII). Силика-
гели, в том числе и некоторые пористые стекла, аморфны; их можно полу-
получить в очень чистом виде с различными физическими свойствами (удельная
поверхность, объем и диаметр пор) [2, 3]. В жидкостной хроматографии при
высоких давлениях применяют главным образом силикагели с относительно
большой удельной поверхностью (> 200 м /г), большим удельным объемом
пор (>0,7 мл/г) и средним диаметром пор (80—150 А).
Влияние структуры пор силикагеля на хроматографическое разделение по-
показано на рис. VI.3. Разделение олигофеииленов проводилось при иден-
идентичных условиях (н-гептан, 20%-ная относительная влажность) на силикаге-
лях с различной пористой структурой [16]. Удельная поверхность силикаге-
лей уменьшалась от 250 м2/г (Si 100) до 6 м2/г (Si 4000). Оптимальное
разделение достигнуто на силикагеле с удельной поверхностью 50 м2/г. Абсо-
Абсолютное удерживание зависит от величины удельной поверхности, и если
структура поверхности не меняется, то относительное удерживание не дол-
должно зависеть от удельной поверхности. При меньших диаметрах пор (< 60
А) уже даже для относительно небольших молекул может наблюдаться эф-
эффект исключения.
Гидроксильные группы на поверхности (силанольная группа) могут распо-
располагаться либо в виде отдельно стоящих групп, либо соседние группы могут
образовывать между собой водородную связь. Адсорбция воды сопрово-
сопровождается образованием водородных связей. При термической обработке при
температурах ниже 150°С удаляется только физически адсорбированная вода.
Когда температура превысит 200°С, происходит поверхностная реакция. При
температурах ЗОО-5ОО°С Происходит конденсация соседних гидроксильных
групп с выделением воды и образованием силоксановых групп. При еще более
высоких температурах отщепляются отдельно стоящие, так называемые сво-
свободные гидроксильные группы. Поступающие в продажу прогретые при вы-
высоких температурах силикагели не содержат гидроксильных групп и потому
для адсорбционной хроматографии не пригодны. Силикагель, дегидроксилнро-
ванный при высоких температурах, гидрофобен [4] и не обладает никакой се-
селективностью по отношению к адсорбции полярных молекул. Вода,
добавляемая к высушенному, частично дегидроксилировайному силикагелю,
адсорбируется только физически. При комнатной температуре регидратации
силанольных групп почти не происходит.
Результаты определения числа гидроксильных групп иа единицу поверх-
поверхности очень сильно зависят от свойств силикагеля и метода определения [2].
Оптимальным значением, вероятно, является 5 ОН-групп на 100 А2, что от-
отвечает примерно 8 мкмоль ОН/м2 поверхности. Адсорбция ненасыщеиных
и полярных молекул на силикагеле происходит почти исключительно на этих
поверхностных гидроксильных группах.
Путем химического модифицирования поверхностных силанольных групп
получают гидрофобную неподвижную фазу со свойствами обращенной фазы.
Получая производные путем введения функциональных групп, соответствую-
Адсорбционная хроматография
109
SI ЮО
8 t, мин
Si 500
Si 1000
UL
Si 4000
0 I
2 3 t, мин
I t, мин
О I t. мин
Рис. VI.3. Влияние пористой структуры силикагеля на разделение олиго-
фениленов (фирма Merck 75-36) [16].
Неподвижные фазы: лихросфер Si 100, Si 500, Si 1000, Si 4000, йрк 10 мим; полоша: 20 смхЗ мм
(внутр.); элюент: и-гептан B0%-ная относительная влажность; F = 5 мл/мин: Др = 125 атм. Проба:
/ — бензол; 2 — дифенил; 3 — л*-терфенил; 4 — .м-кватерфеиил; 5 — л<-квинквифенил; б — л*-сесквифенил.
щим образом меняют свойства и селективность силикагелей [5 - 7] (см. разд.
V. Б).
Поскольку поверхность силикагелей проявляет слабые кислотные свой-
свойства, то соединения с основными свойствами, особенно если элюент по-
полярный, удерживаются сильнее, чем кислые и нейтральные вещества. Про-
Продажные силикагели часто нейтрализуют, добавляя к ним основания.
В полярных средах, особенно в воде, кислотная реакция поверхности силика-
силикагеля может привести к нарушениям, однако изменение веществ при хромато-
графировании на силикагелях наблюдается редко [8].

по
Глава VI
2. Окись алюминия
Окись алюминия, пригодную для хроматографии, получают, удаляя воду
из байерита и активируя его затем при 200—500°С. Полученная кристалличе-
кристаллическая окись алюминия (у-А^Оз) в процессе нагревания (900— 1000°С) перехо-
переходит в высокотемпературные формы, которые при 1100°С все переходят в а-
- окись алюминия. Последняя не обладает уже никакой хроматографической
активностью («полностью сожженная» А12О3).
Удельная поверхность окиси алюминия составляет 100 — 200 м2/г при
удельном объеме пор 0,2-0,3 мл/г, а средний диаметр пор равен 100 — 200 А.
У окиси алюминия, полученной при более высокой температуре, удельная
поверхность меньше G0-90 м2/г).
Механизм адсорбции на окиси алюминия сложнее, чем на силикагеле.
Наряду с образованием водородных связей с поверхностными гидрок-
сильными группами или атомами кислорода возможно взаимодействие ос-
основных (обогащенных электронами) молекул с льюисовскими кислотными
центрами на атомах алюминия. Адсорбция на льюисовских кислотных цен-
центрах частично необратима. При адсорбции воды эта активность исчезает.
Высокоактивные кислотные льюисовские центры вызывают разложение
чувствительных веществ в процессе их разделения. Чтобы подавить актив-
активность этих центров, к окиси алюминия добавляют 1 — 3% воды [9]. Разложе-
Разложение пробы на окиси алюминия могут также вызывать кислотные или ос-
основные поверхностные реакции. В окиси алюминия, полученной из байерита,
сохраняется некоторое остаточное количество байерита в форме алюмината
натрия; рН водных суспензий такой окиси алюминия равен девяти, и поэто-
поэтому ее называют «основной». В полярных средах, особенно в воде, поверх-
поверхностные центры алюмината натрия могут действовать как катионообменные
центры, что может приводить к необратимой адсорбции катионных соедине-
соединений, например к разложению чувствительных к щелочам соединений. При
обработке основной окиси алюминия сильными кислотами, например соля-
соляной, протекает следующая реакция:
AlO"Na+ + 2НС1 -»¦ > А1 - Cl + NaCl + Н2О
Обработанная окись алюминия дает водную суспензию с рН 3, и поэтому
ее называют «кислой» окисью алюминия; она является анионным обменни-
ком. При осторожной нейтрализации получают «нейтральную» окись алю-
алюминия, не проявляющую ни катионо-, ни анионообменных свойств. На такой
окиси алюминия (водные суспензии рН 6,8) не наблюдается эффектов, свя-
связанных с кислотными или основными поверхностными реакциями. «Ней-
«Нейтральная» окись алюминия не адсорбирует из водных растворов ни метиле-
новый голубой (адсорбируется «основными» катионными центрами), ни
нафтоловый оранжевый (адсорбируется «кислотными» анионообменными
центрами). «Нейтральная» окись алюминия предпочтительна для разделения
чувствительных веществ в неполярных средах, так как иа поверхности окиси
алюминия почти всегда находится адсорбированная вода, в которой раство-
растворяются удерживающиеся вещества и при этом вступают в контакт с кис-
кислотными или основными поверхностными группами в полярной среде.
Окись алюминия относят к полярным адсорбентам. По хроматографиче-
ским свойствам она очень напоминает силикагель, но молекулы ненасы-
ненасыщенных веществ удерживаются на ней, как правило, сильнее. Миогоядерные
ароматические соединения на окиси алюминия разделить легче, чем на сили-
силикагеле. Осложнения, обусловленные необратимой адсорбцией (хемосорбцией)
или рассмотренными выше поверхностными реакциями, при разделении на
окиси алюминия наблюдаются чаще, чем на силикагеле.
Адсорбционная хроматография
111
3. Полиамиды
Полиамиды пригодны для разделения соединений, способных образовы-
образовывать водородные связи (фенолы, хиноны, сахара и т. д.). Величина сорбции
зависит от числа пептидных группировок в полимере (например, найлон-4,
найлон-6 и найлон-11). Иногда, чтобы уменьшить необратимую адсорбцию,
приходится ацетилировать свободные конечные аминогруппы полиамида.
Чистый полиамид для жидкостной хроматографии при высоких давле-
давлениях не пригоден. Однако его можно очень легко нанести на непористый или
пористый носитель. Такие фазы имеются в продаже.
Наиболее сильная адсорбция на полиамиде происходит из растворителей,
не способных к образованию водородных связей. Элюирование проводят
с помощью таких растворителей, как спирты, вода или диметилформамид.
Полное вытеснение сорбированного вещества возможно только при промы-
промывании колонки раствором едкого натра.
4. Адсорбенты, обладающие групповой селективностью
Силикагель, покрытый нитратом серебра, используют в жидкостной хро-
хроматографии для селективного отделения насыщенных органических соедине-
соединений от ненасыщенных. Подобные системы, известные из классической коло-
колоночной хроматографии, применимы и в жидкостной хроматографии при
высоком давлении. В работах [10, 11] описаны примеры такого разделения
(нитрат серебра [10], тринитрофлуоренон [11]).
Селективность модифицированных неподвижных фаз с подходящими
функциональными группами аналогична селективности фаз с физическим по-
покрытием [б], но химически связанные фазы имеют ряд преимуществ
(см. гл. V) [12].
В. Влияние воды на разделение
Как известно, адсорбированная вода довольно сильно влияет на
хроматографические свойства. Из неполярных органических раство-
растворителей воду удаляют с помощью окисных адсорбентов, например
окиси алюминия и силикагеля. В ряде работ описаны способы стан-
стандартизации содержания воды в адсорбентах [9, 13, 14] и способы
приведения адсорбентов в равновесие с водой, содержащейся
в элюенте при равновесии [9, 15]. Согласно одному из таких мето-
методов, к адсорбенту, имеющему определенную активность, добавляют
определенное количество воды. Для жидкостной хроматографии при
высоких давлениях этот метод малопригоден, так как расход элюен-
та в расчете на грамм адсорбента значительно больше, чем в класси-
классической жидкостной хроматографии, и активность адсорбента опреде-
определяется в основном содержанием воды в элюенте, а не количеством
предварительно добавленной воды. Равновесие между водой, раство-
растворенной в элюенте, и адсорбированной водой устанавливается бы-
быстро. Если колонки заполнены с помощью одного из описанных вы-
выше суспензионных методов, активность адсорбента может ь>чисеть
от элюента даже в еще большей степени.

112
Глава VI
254
им
2 мин
2 мин
254
ИМ
1
2 май
Рис. VI.4. Влияние содержания воды в элюенте на разделение олигофени-
олигофениленов [16].
Поверхностно-пористый адсорбент перисорб A, i?.« 30 мкм; элюент; а — н-гептан, высушенный над
молекулярным ситом, б - 100 мл насыщенного водой гептана 4- 200 мл гептана, высушенного над мо-
молекулярным ситом, « — насыщенный водой гептан; колонка: 50 см х 2 мм (внутр.); и = 6,2 см/с;
Др =» 56 атм.
Проба: 1 - бензол; 2 — 5 - олнгофенилены.
На рис. IV.4 на примере разделения олигофениленов [16] показа-
показано, насколько сильно содержание воды в адсорбенте влияет на разде-
разделение. В этом примере оптимальное разделение получают в том слу-
случае, когда элюирование проводят смесью, содержащей одну часть
Адсорбционная хроматография
113
254
ИМ
254
мм
Ю
15 тип
Рис. VI.5. Разделение стероидов на силикагеле [16].
Силикагель: меркогель Si 60; элюент: хлороформ с добавкой 0,5% спирта для стабилизации: а — высу-
высушен над молекулярным ситом, б - насыщен водой (~ 0,2% Н2О); колонка: 200 см х 2 мм (внутр.);
F - 0,75 мл/мни: Др - 185 атм.
Проба: / — дексаметазон; 2-флуоргидрокортизон; 3 — гидрокортизон.
насыщенного водой гептана (а) и две части сухого гептана (б). Если
содержание воды слишком велико (в), разделение становится невоз-
невозможным.
Возможна также и противоположная ситуация: разделение стано-
становится возможным, только если элюент содержит воду. На рис. VI.5,a
показано разделение стероидов на силикагеле; элюент (хлороформ)
был высушен над молекулярным ситом. Разделение в приведенном
примере неполное, у пиков большие хвосты. При работе с насы-
насыщенным водой хлороформом @,2% воды) снижается длительность
анализа, все три соединения дают острые неперекрывающиеся пики
(рис. VI.5,6). В этом случае образуется система, характерная для
распределительной хроматографии (см. гл. VII.B.3).
Из-за сильного влияния содержания воды в элюентах на хрома-
тографическое разделение иногда адсорбционную хроматографию
описывают как хроматографию с плохой воспроизводимостью. Та-
Такое же влияние, как и вода, оказывают все другие полярные примеси,
даже если они присутствуют в элюенте только в виде следов. Напри-
Например, к галогенуглеродам для стабилизации обычно добавляют не-
небольшие количества @,2-2%) этанола. В качестве элюентов следует
применять только очищенные и высушенные растворители. Предва-
Предварительная очистка элюентов с помощью фильтрации через активные
адсорбенты [9], позволяющая удалить все полярные загрязнения,
могла бы стать стандартным методом в каждой хроматографиче-
ской лаборатории.
Если следить за содержанием воды в чистых растворителях и ис-
8 Заказ 825

114
Глава VI
От детектора
й
Хлоркальциевая
трубка
= К термостату
Форколонка с окисью
алюминия
К насосу
Сосуд
для элюента
Рис. VI.6. Сисг ма контроля влажности (СКВ). Прясыения см. в тексте.
пользовать достаточно большой объем подвижной фазы (многократ-
(многократная циркуляция), то можно улучшить воспроизводимость экспери-
экспериментов. Между адсорбентом и элюентом сохраняется равновесие.
Точно определить очень небольшое содержание воды
в алифатических углеводородах титрованием по Карлу Фишеру
сложно, так как точность определения будет достаточной, если ти-
титруют относительно большое количество элюента (начиная от
200 мл). Трудно приготовить и сохранить две различные порции непо-
неполярного элюента, с помощью которых можно было бы получить
идентичные значения к'. Значения к' очень сильно зависят от таких
незначительных колебаний содержания воды, которые невозможно
установить титрованием по Карлу Фишеру [17]. Чем больше раство-
растворимость воды в элюенте, тем меньше влияние содержания воды на
величину к'. В хлористом метилене (максимальная растворимость во-
воды примерно 0,2%) изменение содержания воды на несколько мг/л
не вызывает значительного колебания к'.
Воспроизводимость результатов разделения значительно выше,
если в циркуляционную систему включают буферную систему, кото-
которая отбирает или добавляет в элюенты и вместе с тем в аналитиче-
аналитическую разделительную колонку определенное и постоянное равновес-
равновесное количество воды. При этом элюент циркулирует через заполнен-
заполненную окисью алюминия или силикагелем колонку, которую целесо-
Адсорбционная хроматография
115
образно установить между выходом из детектора и всасывающим
патрубком насоса [17].
На рис. VI.6 показан прибор для контроля за влажностью, со-
собранный из стандартных стеклянных деталей. В систему контроля
влажности (СКВ) входит сосуд для элюента объемом 500—1000 мл.
На нем укреплена термостатируемая капельная воронка (емкость
100-200 мл), нижний конец которой закрыт пористой пластинкой
и фильтровальной бумагой или стеклянным фильтром. В эту капель-
капельную воронку помещают примерно 100 г окиси алюминия или 50 г
силикагеля, которые либо высушены (активированы), либо покрыты
нужным количеством воды. В качестве исходного можно использо-
использовать то количество воды, которое необходимо для установления тре-
требуемой степени активности по Брокману. Чтобы оптимизировать
разделение, адсорбент в воронке предварительно покрывают тре-
требуемым количеством воды (ср. рис. VI.7).
Путем циркуляции элюента элюент и адсорбент, находящиеся
в разделительной колонке, приводят к равновесному состоянию, со-
соответствующему количеству воды в разделительной колонке. В рав-
равновесных условиях к' постоянна для всех соединений, входящих
в состав пробы. Содержание воды в воронке СКВ, температура во-
воронки и температура разделительной колонки определяют абсо-
абсолютные и относительные величины к'.
На рис. VI.7 показано разделение многоядерных ароматических
углеводородов при контролируемом с помощью СКВ содержании
воды в элюенте (к-гептане). Для сравнения приведены также концен-
концентрации воды, найденные титрованием по Карлу Фишеру.
Длительность установления равновесия зависит от объемной ско-
скорости элюента и от растворимости воды в элюенте. Затраты времени
на «высушивание» разделительной колонки (увеличение значения к')
всегда больше, чем на «увлажнение». В качестве ориентировочных
значений для к-гептана можно принять следующие: примерно 18 ч
для «увлажнения» и 48 ч для полного высушивания при скорости по-
потока примерно 4 мл/мин. Для хлористого метилена достаточно всего
6—14 ч. Элюированные вещества пробы также удаляются с по-
помощью СКВ из элюента и в дальнейшем не препятствуют разделе-
разделению. Без затруднения можно провести несколько сот разделений,
используя одно заполнение СКВ E00—1000 мл).
В табл. VI. 1 приведены порядки величин концентраций воды
в различных элюентах [15, 17, 18]. Степень покрытия окиси алюми-
алюминия в СКВ соответствует степени активности по Брокману [13]. Кро-
Кроме того, систему можно дополнительно характеризовать с помощью
значений к' некоторых стандартных веществ.
Если из-за особенностей применяемых систем адсорбент — элюент
или аппаратуры СКВ применить нельзя, разделительную систему
следует стандартизовать только по хроматографическим данным.
Для этого берут стандартную смесь с пробами веществ, у которых к'

116
Глава VI
мин 12 11 10 9
Рис. VI.7. Разделение ароматических соединений при различном содержании
воды в элюентах, установленном с помощью системы контроля влаж-
влажности (СКВ).
СКВ: нейтральная окись алюминия вольм для колоночной хроматографии с 4,5, 6 и 9% воды;
Г, °С: 25; объем сосуда для элюента: 500 мл.
Разделительная колота: нейтральная окись алюминия вольм, d, a 5 мкм; 7; °С: 25; элюент:
к-гептан с добавками 45-КГ4, 35-КГ4 и 14-КГ^ воды; F - 2,8 мл/мин; и-4,2 мм/с; Др-100 атм.
Проба: / - инертное вещество (тетрахлорэтилен); 2 - бензол; 3 - нафталин; 4 - дифенил; 5 - антрацен;
6 — пирен; 7 — флуорантен; *- 1,2-бенэантрацен.
лежат в интервале 1 -10. Для каждой новой порции элюента опреде-
определяют значение к! этой стандартной смеси после приведения колонки
в равновесие. Если полученное значение больше предыдущего, то это
означает, что новая порция элюента суше, чем предыдущая. Доба-
Добавляя насыщенный водой элюент, можно понизить значение к' до тре-
требуемого значения. Если же полученное значение к' меньше, чем преды-
предыдущее, то таким же образом, используя более сухой элюент,
следует понизить содержание воды. Особо осторожно и тщательно
следует проводить разделение в таких системах, в которые входит
адсорбент с большой удельной поверхностью и неполярные элюенты
с относительно небольшим содержанием воды.
Адсорбционная хроматография
117
Таблица VI.1
Концентрация воды в элюеитах A0~4%), находящихся в равновесии
с окисью алюминия, содержащей определенное количество воды
Элюент
н-Гептан
Четыреххлористый углерод
Бензол
Диизопропиловый эфир
Хлороформ
Хлористый метилен
Содержание воды в Al2Oi, %
0
<5
<5
<5
3
15
40
100
250
140
700
6
35
120
340
1050
700
1200
10
55
150
400
2400
900
1500
15
60
160
460
3200
1200
1800
Литература
17
18
18
18
18
17
Как следует из табл. VI.1, для каждого растворителя характерно
свое равновесное содержание воды для определенной степени актив-
активности. Особенно сложно выявить оптимальное соотношение воды
при градиентном элюировании. В этом случае количество адсорби-
адсорбированной воды постоянно меняется. В зависимости от содержания
воды и полярных растворителях вода или вымывается из адсорбента,
или адсорбируется на нем. При иозвращении к исходному раствори-
растворителю первоначальные условия равновесия устанавливаются только
по прошествии какого-то времени, тем не менее начинать новое раз-
разделение можно только после того, как эти условия будут достиг-
достигнуты. Химически модифицированная неподвижная фаза типа «ще-
«щеток», по-видимому, обладает некоторыми преимуществами по
сравнению с «голыми» адсорбентами. Поскольку поверхностные си-
ланольные группы в «щетках» замещены, содержание воды в элюен-
те меньше влияет на удерживание. Поэтому на таких неподвижных
фазах можно проводить также анализ с программированием темпе-
температуры (см. гл. VI, разд. Ш.2).
Между полярным соединением, растворимым в элюенте, и носи-
носителем быстро устанавливается адсорбционное равновесие, поэтому
такие вещества можно в больших или меньших количествах нано-
наносить на неподвижную фазу. В конечном итоге можно разделитель-
разделительную колонку с активным адсорбентом сделать «распределительной»
колонкой. Иногда это — единственный способ получить систему для
распределительной хроматографии. Практически таким образом
можно нанести на активную твердую фазу любую полярную разде-
разделяющую жидкость. Из тройных смесей при этом адсорбируются пре-
прежде всего полярные растворители, которые образуют неподвижную
жидкую фазу (см. гл. VII).
Добавляя незначительные количества воды или других полярных
соединений (например, спиртов) к адсорбенту или к элюенту, сни-
снижают объем удерживания. Полярные соединения на таких адсорбен-
адсорбентах перестают удерживаться. Если адсорбент «активируют» в колон-

118
Глава VI
ке (лучше всего пропуская сухие или очищенные элюенты), то
неудерживаемые в «мокрой» системе вещества удерживаются и раз-
разделяются; элюотропный ряд при этом чаще всего не меняется. Со-
Состав элюента остается постоянным, меняется только «активность»
адсорбента в колонке.
Г. Влияние растворителя на разделение
Правильный выбор растворителя при разделении часто имеет
более важное значение, чем выбор неподвижной фазы. На заданном
адсорбенте в зависимости от свойств элюента проба может удержи-
удерживаться очень сильно, вообще не удерживаться или удерживаться тре-
требуемое время. К применяемым в жидкостной хроматографии элюен-
там предъявляются следующие требования.
Элюент должен позволять опознать пробу. Так, например, при
УФ-детектировании пробы элюент не должен поглощать в заданном
диапазоне длин волн.
Элюент должен растворять пробу. В аналитических работах, где
анализируются очень небольшие пробы, это условие играет мень-
меньшую роль, чем в препаративных работах. Иногда вещества раство-
растворимы только в таких элюентах, из которых они адсорбируются
очень слабо - с малым временем удерживания (незначительная рас-
растворимость и большая элюирующая способность). В этом случае ме-
меняют неподвижную фазу и либо используют систему с обращенной
фазой, либо пытаются провести разделение методом распредели-
распределительной хроматографии.
Элюент должен быть таким, чтобы его можно было легко и ко-
количественно удалить; это условие особенно важно, если проводится
препаративное разделение.
При выборе элюента необходимо учитывать его вязкость. Чем
меньше вязкость элюента, тем меньше при данной скорости элюента
необходимое давление. Если в распоряжении имеются два элюента
или смеси элюентов примерно одинаковой «полярности», то следует
отдать предпочтение элюенту с более низкой вязкостью.
Недопустимы необратимые взаимодействия элюента ни с про-
пробой, ни с адсорбентом. Так, например, ацетон и другие алифатиче-
алифатические кетоны на таких активных адсорбентах, как окись алюминия,
могут претерпевать реакции конденсации. При этом изменится элюо-
тропное поведение элюента.
1. Элюотропные ряды
Элюотропным рядом называют экспериментально установленную
последовательность растворителей, расположенных в соответствии
с увеличивающейся элюирующей силой. Такие ряды получают для
одного и того же адсорбента и материала пробы, определяя зависи-
Адсорбционная хроматография
119
Таблица VI.2
Элюотропный ряд. Свойства важнейших растворителей
дли адсорбционной хроматографии
Элюент
к-Пентан
к-Гексан
к-Гептан
Изооктан
Циклогексан
Четыреххлористый углерод
Диизопропиловый эфир
Толуол
к-Пропилхлорид
Бензол
Бромистый этил
Этиловый эфир
Хлороформ
Хлористый метилен
Тетрагидрофуран
Хлористый этилен
Метилэтилкетон
Ацетон
Диоксан
Этилацетат
Метилацетат
Нитрометан
Ацетонитрил
Пиридин
н-Пропанол
Этанол
Метанол
Гликоль
Вода ]
Формамид >
Уксусная кислота J
Элюирую-
Элюирующая сила
ей Г11
0,00
0,01
0,01
0,01
0,04
0,18
0,28
0,29
0,30
0,32
0,37
0,38
0,40
0,42
0,45
0,49
0,51
0,56
0,56
0,58
0,60
0,64
0,65
0,71
0,82
0,88
0,95
1,11
Очень
большая
Диэлектри-
Диэлектрическая про-
проницаемость
[124]
1,84
1,88
1,92
1,94
2,02
2,24
3,8
2,38
7,7
2,28
9,34
4,33
4,8
8,93
7,58
10,7
18,5
21,4
2,21
6,11
6,68
35,9
37,5
12,4
21,8
25,8
33,6
37,7
80,4
ПО
6,1
Вязкость,
сП B0е)
Г1241
0,235
0,j3
0,42
0,50
0,98
0,97
0,37
0,59
0,35
0,65
0,39
0,23
0,57
0,44
0,46
0,79
0,4
0,32
1,54
0,45
0,37
0,65
0,37
0,94
2,3
1,2
0,6
19,9
1,00
3,76
1,26
Показатель
преломле-
преломления B0сС)
[124]
1,358
1,375
1,388
1,391
1,426
1,466
1,368
1,496
1,389
1,501
1,421
1,353
1,443
1,424
1,407
1,445
1,379
1,359
1,422
1,370
1,362
1,382
1,344
1,510
1,38
1,361
1,329
1,427
1,333
1,448
1,372
Длина
волны
УФ-детек-
тора. нм
200
200
200
200
210
265
220
290
225
290
230
220
250
250
220
230
330
330
220
260
260
380
210
310
200
200
200
200
180
Получены для окнеи алюминия.
мость времени удерживания от растворителя; чем меньше время
удерживания пробы, тем больше «полярность» растворителя. Для
всех окисных адсорбентов (например, окись алюминия, силикагель
и т. д.) установлены примерно одинаковые элюотропные ряды.
В табл. VI2 показан элюотропный ряд Снайдера [1], он лишь незна-
незначительно отличается от первого элюотропного ряда, полученного
Траппе [19]. Последовательность растворителей в ряду всегда та-
такова, что адсорбция из растворителей, стоящих в начале ряда, для
данной пробы является наибольшей (большее время удерживания,

120
Глава VI
более высокие величины к'). Чем ниже стоит элюент в ряду, тем
меньше время удерживания и тем больше его элюирующая сила
(«полярность»), которая в конце концов становится такой большой,
что проба больше вообще не удерживается. Более сильным является
тот элюент, который сам сильнее адсорбируется твердой фазой. По-
Поскольку элюент по сравнению с пробой всегда присутствует в боль-
большом избытке и сорбируется на активных центрах поверхности, то
уже с помощью относительно неполярных элюентов можно элюиро-
вать полярные вещества.
В табл. VI.2 собраны важнейшие органические растворители. По-
Порядок соответствует возрастающим значениям е0 (элюирующая сила
[1]). Численные значения для е0 (определены для окиси алюминия)
нужны только для того, чтобы показать различие между растворите-
растворителями. Если различия в е0 слишком велики, то можно рекомендовать
использовать смеси растворителей. Для силикагеля при неизменном
ряде значения е0 несколько меньше. Эта последовательность анало-
аналогична последовательности возрастания величины диэлектрической
проницаемости. Поэтому в таблице наряду со значениями е0 приве-
приведены также значения диэлектрической проницаемости. Наблюдаемые
иногда различия вызываются селективным или специфическим
взаимодействием некоторых элюентов с адсорбентами. Самые незна-
незначительные количества полярных примесей могут полностью изме-
изменить положение растворителя в элюотропном ряду. Как известно,
эти примеси являются также причиной различного положения и та-
таких важных элюентов, как хлористый метилен, хлороформ, этиловый
эфир, в элюотропных рядах.
2. Выбор элюента
Элюент для неизвестной смеси пока еще выбирают методом проб
и ошибок, хотя в последнее время сделаны попытки предсказывать
качество элюентов, используя параметр растворимости Гильдебран-
да [1, 20, 21]. Если речь идет о совершенно неизвестной смеси, с ко-
которой никаких предварительных опытов не проводили и разделить
которую методом тонкослойной хроматографии не пытались, то
лучше всего начать с элюента со средней полярностью, например
с хлористого метилена. Если полученная величина к' окажется слиш-
слишком маленькой или составные части пробы будут выходить из ко-
колонки вместе с пиком инертного вещества, то это означает, что по-
полярность элюента слишком велика. В этом случае переходят к тем
элюентам, которые в элюотропном ряду стоят выше, т. е. элюентам
с меньшей полярностью. Можно также снизить содержание воды
в элюенте и тем самым увеличить активность адсорбента. Значение
к' при этом также увеличится. Однако таким приемом следует поль-
пользоваться достаточно осторожно, поскольку при этом обычно усили-
Адсорбционная хроматография
121
вается нелинейность, следствием чего может быть образование
хвостов.
Если вещества удерживаются сильнее, чем это желательно, то
следует несколько увеличить элюирующую силу элюента, т. е. повы-
повысить его полярность. В этом случае используют элюенты, которые
в элюотропном ряду стоят ниже использованного элюента. Если вре-
время удерживания слишком велико, его можно также уменьшить, уве-
увеличивая содержание воды в элюенте (уменьшая активность адсорбен-
адсорбента). Такой способ подбора элюента очень трудоемок. Очень часто
для того, чтобы разделительная система после смены растворителя
пришла в состояние равновесия, требуется довольно много времени,
до 15-100 мин, поэтому, если отсутствуют какие-либо указания
о составе или хроматографическом поведении пробы, следует прове-
провести предварительное разделение пробы методом тонкослойной хро-
хроматографии (ТСХ) (см. гл. X).
Элюирующая сила элюентов должна быть такой, чтобы значения
к' были меньше 10. Только при этом условии разделение можно про-
провести достаточно быстро. Однако получить такое значение к' на
чистых элюентах удается очень редко и, как правило, приходится ис-
использовать смеси нескольких полярных растворителей.
3. Смеси растворителей
Полностью исчерпать возможности адсорбционной хроматогра-
хроматографии можно, только используя в качестве элюентов смеси растворите-
растворителей. Однако необходимо помнить, что мгогие физические свойства
растворов, такие, как вязкость, растворимость и элюирующая спо-
способность, не меняются линейно с составом. Снайдер [1] установил
для некоторых смесей зависимость экспериментально найденной
элюирующей силы от состава (рис. VI.8). Показанные на рисунке
кривые имеют характерную форму. Для того чтобы значительно уве-
увеличить элюирующую способность, достаточно уже незначительных
количеств полярных компонентов. Это особенно наглядно видно на
примере смесей компонентов, элюирующая способность которых
сильно различается (например, пентан — пиридин или пентан — аце-
ацетон). Элюирующая способность смеси возрастает уже при добавле-
добавлении нескольких процентов полярного компонента; дальнейшее уве-
увеличение концентрации незначительно повышает элюирующую силу.
Если различие элюирующей способности элюентов незначительно,
то зависимость элюирующей силы от состава примерно линейна
(пентан - четыреххлористый углерод и пентан — н-хлористый про-
пропил).
На рис. VI.9 показано влияние состава элюента на удерживание
стероидов и барбитуратов. Если анализируются стероиды, чтобы
значительно уменьшить к', достаточно добавить 1% уксусной кис-
кислоты к хлористому метилену. При разделении барбитуратов может

122
Глава VI
0.1
20 40 SO 80
Концентрация В в А, об. %
ЮО
Рис. -VI.8. Элюирующая сила смесей элюентов на окиси алюминия [1].
1 — пентан - четыреххлористый углерод; 2 — пентан - н-хлористый пропил,- 3 - пентан - хлористый ме-
метилен; 4 — пентан — ацетон; 5 — пентан — пиридин.
наблюдаться аналогичная картина или же могут превалировать дру-
другие эффекты, например плохая растворимость в хлористом метилене,
хорошая растворимость в уксусной кислоте и т. д. Объяснить по-
подобные «вторичные эффекты» растворителя [1] очень трудно. Даже
для элюентов с одинаковой элюируюшей силой может наблюдаться
изменение относительных удерживаний и обращение элюотропного
ряда за счет «вторичных эффектов» растворителей [1].
Одной из причин «вторичных эффектов» может быть расслоение
элюентов на поверхности адсорбента. Полярные компоненты всегда
адсорбируются на адсорбенте в первую очередь. В тонкослойной
хроматографии это ведет к образованию нескольких фронтов [22]
с различным составом элюента. В разделительной колонке соответ-
соответствующий эффект наблюдается только при первоначальном смачива-
смачивании. Однако поскольку в колонку постоянно подается новый элюент,
Адсорбционная хроматография
123
о 10 го зо
Концентрация зтилацетата в хлористом метилене, об. %
Рис. VI.9. Влияние состава элюента на удерживание.
«Щетки»: динитрофенил на меркогеле Si 100; элюент: хлористый метилен - этилацетат; колонка:
30 см.
Проба: 1 — прогестерон; 2 — тестостерон; 3 — проминал; 4 — люминал; 5 — барбитал.
то адсорбент непрерывно удаляет полярные компоненты до тех пор,
пока не установится состояние равновесия. Адсорбционная система
при этом до известной степени переходит в систему распределитель-
распределительной хроматографии (см. гл. VII).
В связи с этим адсорбционно-хроматографическое разделение
в некоторых случаях трудно воспроизвести. Это можно было бы по-
пояснить на примере разделения стероидов (рис. VI.9). В чистом хлори-
хлористом метилене для прогестерона к' равно 24, для тестостерона к'
больше 50, и его определить нельзя. Если теперь к хлористому мети-
метилену добавляют 1 об. % сухого этилацетата, то к' понижается до 1,2

124
Глава VI
или 4,4. При незначительном изменении концентрации уксусноэтило-
вого эфира в хлористом метилене, например вследствие разбавления,
к' значительно меняется. Если, кроме того, возможны «вторичные
эффекты удерживания», то меняется не только время удерживания,
но и относительное удерживание отдельных пиков (см. хроматограм-
му барбитуратов на рис. VI.9) и становится возможным даже обра-
обращение последовательности в ряду элюирования. Поэтому, чтобы не
' опасаться расслоения на адсорбенте и сильной зависимости к' от не-
незначительного изменения состава элюента, смеси следует составлять
из растворителей с близкой элюирующей силой. То же самое можно
сказать о выборе компонентов для градиентного элюирования.
Д. Влияние структуры веществ пробы
Молекулярная структура пробы определяет порядок в ряду элюи-
элюирования в большей степени, чем свойства твердой неподвижной фазы
и элюента. Знание состава пробы и структуры ее составных частей
упрощает выбор системы и позволяет прогнозировать последова-
последовательность элюирования.
Сила удерживания зависит почти исключительно от вида и числа
функциональных групп в молекуле. Поскольку концентрации пробы
обычно низки (<0,1%), растворимость практически не оказывает
влияния. В простейшем случае в специфическое взаимодействие с по-
поверхностью при адсорбции вносит вклад каждый отдельный атом
и каждая группа в молекуле пробы. Так, среди членов гомологиче-
гомологического ряда удерживание усиливается с увеличением молекулярной
массы. При этом взаимодействие функциональной группы с поверх-
поверхностью адсорбента должно быть беспрепятственным, в частности
оно не должно быть затруднено стерически.
Если функциональные группы в подобных молекулах вступают во
взаимодействие друг с другом, например образование водородной
связи и т. д., то в результате этого меняются сила и вид взаимодей-
взаимодействия с поверхностью адсорбента. В качестве стандартного примера
приводят орто- и лара-нитрофенолы: время удерживания орто-ни-
трофенола (внутримолекулярная водородная связь!) значительно
меньше, чем время удерживания пара-нитрофенола.
Кроме того, сила адсорбции зависит от величины молекулы (мо-
(молярного объема), особенно в неполярных системах. В классических
адсорбционных системах влияние дисперсионной силы уменьшается
с увеличением полярности элюента.
Для зависимости последовательности вымывания от вида функ-
функциональных групп можно построить следующий эмпирический ряд.
Удерживание некоторого соединения R - X, где R — органический
радикал, X — функциональная группа, увеличивается в ряду: алкил <
< галоген (F < С1 < Вг < I) < простой эфир < третичный амин<
< нитрил < нитросоединение < эфир карбоновой кислоты < кетон <
Адсорбционная хроматография
125
< альдегид < первичный амин < амид карбоновой кислоты <
< спирт < фенол < карбоновая кислота < сульфокислота.
В зависимости от того, связана ли функциональная группа с али-
алифатическим или ароматическим остатком, внутри этого ряда воз-
возможны определенные перестановки. Если, например, изомерия с бен-
бензольным кольцом вызывает увеличение плотности заряда в функцио-
функциональной группе, то взаимодействие более сильной «основной»
группы «с кислотой» поверхности адсорбента оказывается значитель-
значительно большим. Сверхсопряжение боковой алкильной цепи в толуоле
или этилбензоле с бензольным кольцом является, например, причи-
причиной более сильного по сравнению с бензолом удерживания этих со-
соединений, хотя сама алкильная группа не вносит никакого значитель-
значительного вклада в удерживание.
Удлинение алкильной цепи алифатических соединений почти не
влияет на удерживание. Методом адсорбционной хроматографии
удается провести групповое (по функциональным группам) разделе-
разделение соединений, причем члены гомологического ряда вымываются
почти сразу друг за другом, особенно когда число метиленовых
групп становится больше 4—6. С помощью адсорбционной хромато-
хроматографии удается получить хорошее разделение только для первых
членов гомологического ряда, а соединения с более чем 10 атомами
углерода в цепи вообще нельзя разделить. В этом случае рекомен-
рекомендуется провести разделение, используя хроматографию с «обращен-
«обращенной фазой» или распределительную хроматографию.
Сила удерживания зависит также от стерических факторов.
Чтобы взаимодействие с адсорбентом было максимальным, адсор-
адсорбирующаяся молекула должна иметь возможность расположиться
параллельно поверхности адсорбента. Блокирующие алкильные
группы, расположенные по соседству с функциональными группами,
ведут к уменьшению удерживания. i/uc-Изомеры всегда удерживают-
удерживаются сильнее, чем транс-изомеры (классический пример: разделение
цис- и транс-азобензолов). У производных циклогексана, а также
у стероидов функциональные группы, расположенные экваториально,
усиливают сорбцию в большей степени, чем такие же группы, распо-
расположенные аксиально.
Все проблемы, связанные с влиянием структуры пробы на удер-
удерживание, подробно обсуждаются в литературе, см., например, [1].
В заключение следует только повторить: сила удерживания опре-
определяется видом функциональных групп и возможностью приближения
этих групп к поверхности твердого тела.

126
Глава VI
П. НЕПОЛЯРНЫЕ НЕПОДВИЖНЫЕ ФАЗЫ
А. Общие положения
В настоящее время в жидкостной хроматографии в качестве непо-
неподвижных неполярных фаз используют химически связанные фазы, ко-
которые получают простым способом и с воспроизводимыми свой-
свойствами. Неподвижные неполярные фазы называют «обращенными
фазами» (ОФ), поскольку в отличие от обычной хроматографии
в этом виде хроматографии неподвижная фаза неполярная и наибо-
наиболее сильная адсорбция (наибольшее удерживание) происходит из по-
полярных элюентов, а именно из воды. Снижая полярность элюента,
например в результате добавления метанола, можно уменьшить
удерживание. Хроматография с «обращенными фазами» впервые бы-
была описана Говардом и Мартином [23], которые нанесли на силика-
гель парафиновое масло и н-октан и, используя водные элюенты,
разделили с помощью этой распределительной системы жирные кис-
кислоты. Чтобы на силикагель легче было нанести неполярную непо-
неподвижную фазу, Говард и Мартин провели силанизацию силикагеля
диметилдихлорсиланом. Такими же хроматографическими свойства-
свойствами, как эти обращенные фазы, обладают активные угли, особенно ес-
если они графитированы. Механическая прочность подобных фаз мала
однако ее можно улучшить, проведя термическую обработку
Стабильные «активные угли» можно получить путем термиче-
термического разложения бензола на силикагеле [26]. Промышленный вы-
выпуск обращенных фаз на основе углерода еще не налажен, поэтому
мы обсудим только свойства ОФ, получаемых обработкой силикаг&-
ля алкилсиланами.
Б. Свойства обращенных фаз
Обращенные фазы относительно просто получить, обрабатывая
силикагель моно-, ди- или трихлорсиланами. Для хроматографии
с обращенной фазой выпускаются различные адсорбенты, причем
число углеродных атомов в привитом углеводородном радикале мо-
может меняться от одного (метил) до восемнадцати (октадецил).
У настоящей ОФ все силанольные группы на поверхности силика-
силикагеля должны быть замещены или экранированы. Подобные фазы не
должны адсорбировать метиловый красный (см. гл. V, разд. В). Дру-
Другой более чувствительный метод определения незамещенных сила-
нольных групп - удерживание полярных проб из неполярных элюен-
элюентов (например, н-гептана) [27]. Как известно, при разделении на
силикагеле с неполярными элюентами удерживание зависит от взаи-
взаимодействия пробы с силанольными группами [1]. Чем меньше до-
доступных силанольных групп в разделительной колонке, т. е. чем
больше силанольных групп замещено или экранировано алкильными
Адсорбционная хроматография
127
группами, тем меньше удерживание полярных веществ из непо-
неполярных элюентов. На ОФ, у которой, если бы это было возможно,
все силанольные группы полностью замещены, при элюировании не-
неполярными элюентами все полярные пробы должны вымываться
вместе с инертным веществом. Поэтому на «хорошей ОФ», у кото-
которой адсорбция метиленового красного показывает отрицательный
результат, величина к' должна быть меньше 0,5 (на «голом» силика-
силикагеле с тем же элементом к' > 10). Пропил- или бутилсиланы хорошо
экранируют силанольные группы. При обработке силикагеля
алкилсиланами с более длинными алкильными группами степень за-
замещения из-за стерических препятствий ниже, однако и в этом случае
силанольные группы в достаточной степени экранированы. Дополни-
Дополнительной характеристикой обращенной фазы служит общее количе-
количество связанной органической фазы, определяемое, например, с по-
помощью С, Н-анализа. Однако эта характеристика ничего не говорит
о доступности или экранировании силанольных групп. Силикагель
с удельной поверхностью 300—400 м2/г (например, лихросорб Si 100)
может химически связывать 16 — 22% углерода (из С, Н-анализа;,
если обработка проведена октадецилсиланом. Если используют ал-
килсиланы с более короткими углеводородными цепями, то масса
связанной органической фазы уменьшается. При этом количество
связанного углерода зависит также от структуры пор (диаметр пор
и удельная поверхность). Так, с силикагелем, имеющим удельную по-
поверхность 50 м /г (диаметр пор ~ 300А), может быть связано только
4,5% углерода [28].
Чем больше углерода связано с силикагелем, т. е. чем ниже фазо-
фазовое соотношение VJVS, тем больше значение к' для пробы с по-
постоянным составом элюента. Если проба содержит соединения одно-
одного и того же гомологического рада, то зависимость к' от числа
углеродных атомов в этих соединениях имеет вид прямой. Наклон
этой прямой тем больше, чем длиннее связанные алкильные группы.
Это означает, что относительное удерживание двух соседних членов
гомологического ряда на фазе С18 всегда больше, чем на ОФ с более
короткими связанными алкильными группами [27, 29]. Однако, по-
видимому, данное утверждение справедливо, только если связанная
фаза смачивается элюентом, так как различие в абсолютном и отно-
относительном удерживании между фазами с группами С4 — С18 при ис-
использовании в качестве элюента воды слишком мало [27].
Экранировать силанольные группы можно даже группами с 3-4
атомами углерода, но получить более высокие значения к' и относи-
относительно большее удерживание удается, только вводя более длинные
алкильные группы (предпочтительно С18).
Предельная допустимая нагрузка фазы с группами С18 (~20%
связанного углерода) примерно вдвое больше, чем нагрузка фазы
с группами С4 (~ 7% связанного углерода). По сравнению с голым
силикагелем предельно допустимая нагрузка обращенной фазы

128
Глава VI
Адсорбционная хроматография
129
с группами С18 примерно на порядок выше и составляет около
2-Ю г пробы/г неподвижной фазы.
Разделительная способность колонок, заполненных обращенной
фазой, соответствует колонкам, заполненным силикагелем, при усло-
условии, что размер частиц и коэффициенты диффузии идентичны. Все же
часто значения h для удерживаемых веществ на ОФ больше, чем
ожидается, особенно если элюентом служит вода, не содержащая
"добавок.
В. Влияние растворителя на разделение
Если элюирование ведется водой, на обращенных фазах наиболь-
наибольшее удерживание показывают органические вещества. Элюирование
пробы можно ускорить, увеличивая концентрацию органического
растворителя в воде, следовательно, величина удерживания умень-
уменьшается с уменьшением полярности элюента. На рис. VI. 10 показана
зависимость значений к' фенола и бутанола от содержания метанола
@—100%) в воде, используемой в качестве элюента на двух раз-
различных ОФ (С4 и С18). Наклон кривых, по-видимому, не зависит от
числа алкильных групп. При концентрации воды свыше 20% полу-
получают линейную зависимость lgfc' от концентрации [30]. (При более
высоких концентрациях метанола используемые здесь пробы почти
инертны.) Линейная зависимость lgfe' от концентрации метанола
в воде наблюдается и для других систем [31]. Кроме того, из приве-
приведенных на рис. VI, 10 кривых можно видеть, что получить идентичные
времена удерживания на обращенных фазах С4 и С18, т. е. скомпен-
Ю
Ш
/и
50 100
Концентрация воды в мвтаиолв.%
Рис. VI. 10. Зависимость значений
к' от состава элюента.
Неподвижные иеполярные фазы: бутил (С«)
и октадецил (С,„); элюеит: вода - метанол.
Проба: 1 — феиол; 2 — н-бутанол.
Таблица VI.3
Элюотропнын ряд для обращенной фазы
Элюент
Метанол
Ацетонитрил
Этанол
Изопропанол
Диметилформамид
н-Пропанол
Диоксан
Относительное
удержива!
с,
1,0
3,2
3,2
8,4
9,4
10,8
12,5
те на ОФ
с18
1,0
3,1
3,1
8,3
7,6
10,1
11,7
сировать увеличение значений fe' на обращенной фазе С18, вызванное
удлинением алкильной цепи от С4 до С18, можно, повысив концен-
концентрацию метанола в элюенте.
Вязкость водно-метанольных смесей проходит через максимум
A,84 сП) при 20°С, когда концентрация метанола в воде составляет
40%; при этой же температуре вязкость метанола равна 0,6 сП,
а вязкость воды — 1,0 сП. Поскольку эта смесь относится к числу не-
неидеальных, высота, эквивалентная теоретической тарелке, h зависит
от состава элюента. Все другие смешивающиеся с водой органические
растворители отличаются большей, чем у метанола, элюирующей си-
силой. Чем сильнее растворитель удерживается из воды на обращен-
обращенной фазе, тем больше элюирующая сила этого растворителя или его
смеси с водой.
В табл. VI.3 приведены величины удерживания (относительно ме-
метанола) важнейших не поглощающих в УФ-области смешивающихся
с водой органических растворителей на обращенных фазах С8 и С18.
Этот порядок соответствует обращению элюотропного ряда для ад-
адсорбционной хроматографии (см. табл. VI.2). Наиболее сильным
элюентом для системы с ОФ, полностью вымывающим все компо-
компоненты пробы, следует считать тот органический растворитель, из ко-
которого адсорбция на силикагеле является наибольшей. Следователь-
Следовательно, наиболее сильные элюенты в системе с ОФ — алифатические
углеводороды. Если, например, элюирование ведется смесями эта-
этанол - вода и изопропанол - вода равной концентрации, то послед-
последняя смесь быстрее вымывает пробу из колонки. На смеси двух
элюентов распространяется то же эмпирическое правило, которое
было установлено для адсорбционной хроматографии на полярных
неподвижных фазах: лучше использовать более высокие концентра-
концентрации слабее элюирующего растворителя, чем небольшие концентра-
концентрации (несколько процентов) сильного элюента. Приготавливать такую
смесь следует очень тщательно, так как нежелательный эффект вы-
9 Заказ 825

130
Глава VI
теснения может вызвать элюирование нескольких веществ в одном
пике. Линейная зависимость lg к' от концентрации органического
компонента в воде уже в системе вода - ацетонитрил отсутствует
[31]. В системах с ОФ добавление уксусной кислоты к элюентам вы-
вызывает такое же уменьшение элюирования, как и добавление метаио-
ла. Поэтому, например, при разделении кислот элюирующую силу
.смеси растворителей можно менять, добавляя уксусную кислоту.
Химически связанные фазы имеют большое преимущество по
сравнению с голыми силикагелями: кондиционирование колонок
с ОФ при смене растворителя проводится очень быстро. Во многих
случаях для того, чтобы разделительная колонка опять пришла в со-
состояние равновесия, достаточно прокачать через нее в среднем 10 ко-
колоночных объемов нового элюента.
Однако в системах с ОФ довольно трудно точно определить мер-
мертвое время, особенно если элюентом служит вода. В качестве детек-
детектора при точном определении мертвого времени необходим диффе-
дифференциальный рефрактометр; в качестве неудерживающейся пробы
можно использовать окись дейтерия D2O. Если элюирование ведется
водно-метанольными смесями, инертным веществом может быть во-
вода или метанол. Если в распоряжении хроматографиста имеется
только УФ-детектор, подобрать инертное вещество, поглощающее
в УФ-области, сложно. Многие вещества либо удерживаются, либо,
если они диссоциируют, могут исключаться. Исключение, по-видимо-
по-видимому, вызывается теми же причинами, что и доннановский потенциал
в ионообменной хроматографии [32, 33]. Этот эффект можно пода-
подавить путем добавления нейтральных солей @,1 -0,3 моль/л)
к элюенту.
Приближенный расчет мертвого времени (см. гл. II, разд. В или
гл. III, разд. Д.5) для систем с ОФ имеет очень приближенный харак-
характер, так как при химической обработке силикагелей объем их пор ме-
меняется. Для точного расчета необходимо знать объем пор обращен-
обращенной фазы или общую пористость е^ разделительной колонки.
Экспериментально показано, что ек у обращенных фаз на силикагеле
с диаметром пор около 100А составляет 0,75. В критических случаях
бк разделительной колонки, заполненной обращенной фазой, можно
определить, используя в качестве пробы бензол, а в качестве элюента
хлористый метилен. Пористая структура силикагеля, или пористость
разделительной колонки, почти не меняется при смене элюента от
хлористого метилена через метанол к воде.
Повышение температуры оказывает на удерживание пробы такое
же влияние, как и увеличение содержания органического компонента
в воде, т. е. длительность элюирования сокращается. В первом при-
приближении повышение температуры на 30°С вдвое уменьшает время
удерживания при постоянном составе элюента [31]. Однако при
этом уменьшается селективность разделительной системы. Показано,
например, что и при 20 и при 60°С селективность и длительность
Адсорбционная хроматография
131
разделения могут быть одинаковыми, если в первом случае элюиро-
элюирование проводят смесью ацетонитрил — вода, взятых в соотношении
60:40, а во втором количество воды увеличивают E3:47). При более
высокой температуре разделительная способность колонки из-за луч-
лучшего массообмена повышается.
Г. Влияние структуры компонентов пробы
При использовании ОФ зависимость времени удерживания от
структуры вещества проще, чем в хроматографии на силикагеле.
В первом приближении удерживание компонентов пробы увеличи-
увеличивается с уменьшением растворимости их в воде, т. е. с уменьшением
их полярности. Внутри гомологического ряда удерживание увеличи-
увеличивается с ростом числа углеродных атомов. Удлинение алкильной це-
цепи, например, н -спиртов на одну СН2-группу увеличивает к' на 4 еди-
единицы, если элюентом служит вода [31]. Если же элюирование
ведется смесью воды и органического растворителя, то, естественно,
вклад СН2-группы меньше.
Пробы с разветвленными алкильными группами всегда элюи-
руются быстрее, чем пробы с неразветвленной цепью, причем первы-
первыми элюируются пробы с наиболее разветвленными группами. Поэто-
Поэтому для бутиловых спиртов получена такая последовательность
элюирования: mpem-бутиловый спирт B-метилпропанол-2), втор-бу-
тиловый спирт (бутанол-2), изобутанол B-метилпропанол-1), н-бута-
нол; причем при использовании в качестве элюента смеси вода — ме-
метанол (9:1) относительное удерживание перечисленных спиртов
различается более чем на 1,1 [30].
Порядок элюирования проб на обращенной фазе напоминает по-
последовательность элюирования, получаемую в газовой хроматогра-
хроматографии на графитированной саже для неразветвленных и разветвленных
углеводородов [34]. Как и в газовой хроматографии, порядок элюи-
элюирования компонентов пробы в системах с ОФ зависит от различий
в дисперсионных взаимодействиях этих соединений, а также от ги-
гидрофобного эффекта [31] или сольвофобного взаимодействия [35].
На рис. VI.11 демонстрируется влияние на удерживание числа ал-
кильных групп в таких относительно больших молекулах, как симме-
симметричные триазины, которые применяют в качестве гербицидов [36].
При элюировании водно-метанольной смесью G5:25) удается разде-
разделить с относительным удерживанием > 1,3 триазины, в которых за-
заместители в боковой цепи отличаются всего лишь на одну метилено-
вую группу.
Первоначально системы с ОФ использовали для разделения силь-
сильнополярных соединений, растворимых только в таких элюентах, из
которых сорбция на силикагеле незначительна, т. е. таких соедине-
соединений, которые можно растворить только в сильнополярных раствори-

132
Глава VI
^
4 3
t, мин
сГ*
¦5-
3 я
о о
i 1
Рис. VI.ll. Влияние алкильных групп, введенных в симметричные триазины,
на удерживание.
Неподвижная фаза: Si №0 - обращенная фаза С1В, i, * 10 мжм; колонка: 30 см х 4 мм (внутр.); злюеит:
вода - метанол B5 + 75); F = 1,6 мл/мни; и - 2,6 мм/с; Др - 130 атм; УФ-детектор, 254 им.
Пробы: 1 - норазии, R, = Н, R2 = С3Н7, R, - СН3, к' = 0,6; 2 - атразин, R, = Н, R2 = С3Н7, R, = С2Н,,
к' = 0,83; 3 - пропазин, R, = Н, R2 = С3Н„ R, - С3Н7, к' = 1,14; 4 - триэтазин, R, = С2Н5, R2 = С2Н,,
R, = С2Н„ *- = 1,77; 5 - ипазин, R, - С2Н5, R2 - С2Н5, R, = С3Н„ к' - 2,36.
телях, например воде, спирте и т. д. Однако, применяя в качестве
элюента метанол, в системах с ОФ можно разделять ароматические
углеводороды и даже насыщенные и ненасыщенные углеводороды.
Так, на обращенной фазе С18 при элюировании метанолом в ряду
бициклогексил, фенилциклогексан, дифенил относительное удержива-
удерживание соседних компонентов отличается более чем вдвое [27]. Если
проводится разделение ненасыщенных и насыщенных жирных кислот
с одинаковым числом атомов углерода, то насыщенные кислоты
элюируются всегда первыми (см. рис. VI. 19).
Влияние других заместителей на удерживание представлено на
рис. VI.12 на примере замещенных фенолов; элюентом в данном слу-
случае служила вода. При введении одной, двух или трех метильных
групп в молекулу фенола lg к' увеличивается на постоянное значение.
Одна дополнительная этильная группа оказывает приблизительно
такое же влияние, как две метальные группы, причем роль играет
также положение заместителей, например орто- или пара-положение
по отношению к гидроксильной группе. Триметилфенол элюируется
вместе с пропилфенолом. При введении атомов хлора в молекулу
фенола lg к' также увеличивается на постоянную величину. Одна ни-
« й
Р %
S 2
ю
i о

134
Глава VI
трогруппа дает такой же результат, тогда как при введении второй
или третьей нитрогруппы к' сильно понижается. Пикриновая кислота
и 2,4-динитрофенол хорошо растворимы в воде и элюируются перед
фенолом. При введении второй гидроксильной группы значение к'
уменьшается, причем гидрохинон элюируется значительно раньше,
чем пирокатехин и резорцин. Аналогично ведут себя и триоксибен-
золы.
Последовательность элюирования соединений других классов
также зависит от структурной формулы, числа и типа заместителей.
Так, например, стероиды элюируются перед теми их производными,
в которых оксигруппы замещены на карбонильные группы. Ацетил-
производные удерживаются сильнее, чем аналогичные оксипро-
изводные. Введение двойной связи также уменьшает значение к'.
Эти немногие примеры показывают, что удерживание веществ
пробы в системах с ОФ можно предсказать. В пределах одного го-
гомологического ряда получают всегда линейную зависимость lgfe' от
числа углеродных атомов. Если значения к' компонентов не под-
подчиняются этой зависимости, то это означает, что элюируемые соеди-
соединения принадлежат другому гомологическому ряду. Усиление гидро-
гидрофобного характера пробы путем введения заместителей всегда ведет
к увеличению к', причем каждый заместитель дает свой характерный
вклад. О гидрофобном, или «сольвофобном», вкладе подробно гово-
говорится в ряде работ, см., например, [31, 35, 123].
III. ПРОБЛЕМА ЭЛЮИРОВАНИЯ
При изократнь'х условиях, т. е. при постоянных условиях разделе-
разделения (температура, давление) и постоянном составе элюента, можно
разделить только смеси таких веществ, у которых значение к' мень-
меньше 10 @ < к' < 10). В тех случаях, когда концентрация сильнее удер-
удерживающихся соединений достаточно высока, удается элюировать
в виде определимых пиков вещества с большими значениями к'. Если
речь идет о сложных смесях, содержащих компоненты с самыми раз-
разными значениями к', то подобные смеси невозможно разделить
и элюировать при изократных условиях за практически приемлемое
время.
Чтобы оптимизировать разделение, т. е. элюировать в виде хоро-
хорошо определяемых пиков и компоненты с небольшими значениями к',
и сильнее удерживающиеся компоненты, следует использовать раз-
различные методы программирования.
При этом можно добиться, чтобы зона каждого вещества была
элюирована при оптимальных условиях. В жидкостной хроматогра-
хроматографии при высоком давлении можно программировать:
1) скорость элюента (программирование давления на входе);
2) температуру разделения (программирование температуры);
Адсорбционная хроматография
135
3) неподвижную фазу,
а) меняя активность адсорбента,
б) переключая колонки;
4) состав элюента (градиентное элюирование).
Все эти методы программирования, за исключением метода За,
применимы как для полярных, так и для неполярных неподвижных
фаз.
Теория всех этих методов рассматривается Снайдером [23], здесь
же мы обсудим только некоторые практические соображения. При
любом программируемом анализе разрешение зон веществ всегда
хуже, чем при непрограммируемом разделении. Однако в первом
случае сокращается и оптимизируется длительность анализа. По-
Поскольку разрешение зон веществ часто больше, чем это необходимо,
особенно при разделении проб с очень большими значениями к', со-
сокращение длительности разделения вполне допустимо. Кроме того,
при программировании пробы элюируются в виде острых и концен-
концентрированных зон. При этом увеличивается чувствительность опреде-
определения позднее выходящих пиков. С практической точки зрения целе-
целесообразно только такое программирование, которое позволяет
получать острые пики элюируемых соединений, т. е. имеет смысл
программировать увеличение скорости элюента, увеличение темпера-
температуры, уменьшение активности или удельной поверхности неподвиж-
неподвижной фазы и увеличение элюирующей силы элюента. Использовать
эти методы программирования в жидкостной хроматографии при
высоком давлении достаточно сложно, однако возможности разделе-
разделения и область применения метода при этом увеличиваются.
1. Программирование давления или скорости потока [38]
Время удерживания в хорошем приближении обратно пропорцио-
пропорционально падению давления на колонке при постоянных условиях раз-
разделения. Линейное увеличение давления на входе и вместе с ним ско-
скорости потока ведет поэтому к линейному уменьшению времени
удерживания. Поскольку время удерживания соединений одного го-
гомологического ряда увеличивается экспоненциально, то для того,
чтобы получить постоянное расстояние между пиками внутри гомо-
гомологического ряда, целесообразно задавать экспоненциальную про-
программу давления. Из газовой хроматографии известно, что экспонен-
экспоненциальная программа давления соответствует линейной программе
температуры [39]. Программировать увеличение скорости потока
в жидкостной хроматографии при высоком давлении можно сле-
следующим образом.
Подача насоса увеличивается в результате непрерывного измене-
изменения хода поршня. На форме программы в этом случае сказывается
зависимость подачи поршневого насоса от противодавления. Пере-

136
Глава VI
мешение поршня в насосах с длинным ходом поршня можно
легко регулировать с помощью электронных устройств, однако в этом
случае положение осложняется из-за того, что объем цилиндра огра-
ограничен. Большие скорости э.г'змента достигаются очень быстро и запасы
растворителя в объеме цилиндра через короткое время оказываются
исчерпанными. Программировать давление, используя насосы с пере-
переменной частотой хода поршня, гораздо проще.
С помощью регулирующих устройств (см. гл. III, разд. В) можно
без больших трудностей получить линейную и экспоненциальную
программы давления [38].
К неподвижной фазе и разделительной колонке не предъявляется
никаких специальных требований. Наклон (член Q кривой h=f(u)
должен быть возможно меньше. (Сами величины h для программиро-
программирования давления дают мало, так как они определяются только для по-
постоянной линейной скорости.) В распределительных системах при ра-
работе с большими конечными скоростями следует считаться
с механической эрозией неподвижной фазы (см. гл. VII). При анализе
с программированием скорости элюента можно без труда использо-
использовать дифференциальный рефрактометр и УФ-детектор. Все же при
скоростях программирования больших чем 6 атм/мин дифферен-
дифференциальный рефрактометр реагирует на изменение скорости потока
(дрейф нулевой линии). Как и следовало ожидать, на показания УФ-
детектора скорость потока не влияет.
Чтобы оценить преимущества программирования давления,
сравним разделение с программированием давления с изо-
изобарными разделениями при трех различных давлениях на входе
(рис. VI. 13).
Если разделение ведется с иаинизшим давлением на входе A0
атм), разрешение первых четырех пиков оптимальное, но пик 5 элюи-
руется только через 20 мин. После увеличения давления до 25 или 50
атм пик 5 элюируется уже в приемлемое время, однако при этом
ухудшается разделение пиков 1—4, у которых время удерживания
меньше. Оптимальное разделение с примерно одинаково хорошим
разделением всех пиков получают в этом примере только при про-
программированном экспоненциальном увеличении давления от 10 до
100 атм.
Итак, приведенный пример показывает, что анализ с программи-
программированием давления рационально проводить в тех случаях, когда раз-
различие времен удерживания на хроматограмме увеличивается экспо-
экспоненциально, т. е. разделение двух соседних пиков слишком большое.
В подобной ситуации целесообразно применить экспоненциальное
программирование давления. Если речь не идет о разделении членов
одного гомологического ряда, то в зависимости от поставленной за-
задачи можно использовать какой-нибудь другой вид программы, на-
например часто прерывают программу в нужном месте. Программиро-
Программирование давления имеет еще одно большое преимущество: по
Др-10атм
и -0,35 см /с
10
П Ар =25атм
S и=0,88 см/с
20 мин
10 мин
Ш Ар-50атм
и =/.75 см/с
1 2
1
10 атм
3 4
t, MUH
ж
Ч
100 атм
3
t, MUH
Рис. VI. 13. Программирование давления при разделении инсектицидов.
Неподвижная фаза: мержогель Si 200, d, а 30-40 мжм; элюент: н-гептан; колонка: 50 см х 2 мм
(внутр.). 1-111: изобарное разделение, IV: разделение при программируемом давлении.
Проба: /-альдрин; 2-гептахлор; i-ДДТ; 4-линдан.

138
Глава VI
окончании анализа при сбросе давления и возвращении к первона-
первоначальному входному давлению исходное состояние достигается в те-
течение нескольких секунд.
2. Программирование температуры
Сила удерживания веществ пробы в адсорбционной системе зави-
зависит главным образом от различия теплот адсорбции пробы и элюен-
та. Повышение температуры ведет к уменьшению теплоты адсорб-
адсорбции (- АН/ Т) и вместе с тем к уменьшению времени удерживания.
Поэтому программирование температуры в жидкостной хроматогра-
хроматографии дает такие же результаты, как и в газовой хроматографии: более
сильно удерживающиеся вещества при более высоких температурах
элюируются быстрее и в виде острых зон. К сожалению, использова-
использование температурного программирования в жидкостной хроматогра-
хроматографии связано с принципиальными трудностями. Увеличение темпера-
температуры влияет на равновесное распределение воды между твердым те-
телом и элюентом. При повышенной температуре адсорбированная во-
вода вымывается элюентом из разделительной колонки. После
охлаждения до исходной температуры адсорбент в разделительной
колонке имеет большую активность, чем до этого, времена удержи-
удерживания проб более высокие. С повышением температуры времена
удерживания должны уменьшаться, однако в действительности этот
эффект зависит от типа элюентов и от равновесного распределения
воды. Для некоторых элюентов времена удерживания с увеличением
температуры растут или не меняются. Эти эффекты используются
при программировании температуры с добавлением «замедлителя»
(модератора) [40, 41]. К элюенту добавляют небольшое @,1-1%)
количество замедлителя, например изопропанола. Из большой фор-
колонки, температуру которой меняют по той же программе, замед-
замедлитель извлекают элюентом, который ускоряет элюирование соеди-
соединений пробы с разделительной колонки. Возможно также «обрат-
ное»программирование температуры с добавлением замедлителя без
форколонки.
Авторы работы [42] показали, что, если колонка заполнена хими-
химически связанной фазой, влиянием адсорбированной воды (замедли-
(замедлитель) можно пренебречь. Применяя такие фазы, можно без осложне-
осложнений проводить анализы с программированием температуры. После
возвращения к исходной температуре разделительная система опять
находится в равновесии и объемы удерживания остаются такими же,
как перед изменением температуры.
Поскольку насадка имеет плохую теплопроводность, то недоста-
недостаточно термостатировать только колонку и программировать темпе-
температуру только в ней. Необходимо, чтобы элюент уже перед раздели-
разделительной колонкой имел необходимую температуру. Для этого
достаточно в жидкостной термостат, обогревающий разделительную
Адсорбционная хроматография
139
колонку, поместить капилляр длиной примерно 1 м (внутренний диа-
диаметр 0,5 — 1 мм). Хотя нагревать и охлаждать воздушными термоста-
термостатами значительно удобнее, чем жидкостными, но для программиро-
программирования температуры в жидкостной хроматографии термостаты
первого типа применяются редко. Теплопередача от воздуха
к элюенту недостаточно хорошая, теплоемкости жидкостей намного
выше.
Программирование с помощью предварительно нагретого элюен-
та, кроме того, уменьшает радиальный температурный градиент
в разделительной колонке, который может вызывать размывание по-
полосы. Теплоемкости элюента и насадки в колонке примерно одина-
одинаковы, поэтому очень скоро температура насадки становится такой
же, как и температура элюента.
В качестве детектора при анализе с программированием темпера-
температуры можно использовать только УФ-детектор или транспортный
детектор. Для заполнения колонок «голые» силикагель или окись
алюминия не пригодны. Разделение с программированием темпера-
температуры удобнее всего проводить на химически связанных неподвижных
фазах.
На рис. VI.14 показано влияние температуры на разделение смеси
ароматических соединений. Три приведенные хроматограммы (а-б)
получены в изотермическом режиме при различных температурах.
При комнатной температуре (а) разделение 8 веществ длится при-
примерно 30 мин, при 43°С (б) оно заканчивается уже примерно через
12 мин, однако разделение первых пиков ухудшено, при 70°С (в) раз-
разделение практически не достигается, а элюирование всех соединений
заканчивается уже через 5 мин. Разделение с программированием
температуры D°С/мин) заканчивается примерно через 12 мин, разде-
разделение всех пиков хорошее (г).
При этом следует обратить внимание на то, что h с увеличением
температуры становится меньше. Разумеется, величину h можно
определять только из хроматограммы, полученной при постоянной
температуре. Снижение величины h обусловлено уменьшением вязко-
вязкости элюента, которое с увеличением температуры на 50°С снижается
примерно на 50%. Вязкость при работе с постоянным входным да-
давлением меняется соответственно изменению температуры и одно-
одновременно влияет также на скорость элюента. Увеличение же скоро-
скорости ускоряет элюирование более сильно удерживающихся веществ.
Если работа ведется с постоянным расходом элюента, давление на
входе в колонку уменьшается по мере повышения температуры, но
линейная скорость остается постоянной.
Программирование скорости потока и программирование темпе-
температуры дают практически одинаковые результаты. Оба метода целе-
целесообразно применять в тех случаях, когда получить хорошее разде-
разделение последних пиков можно, лишь значительно увеличив длитель-
длительность анализа. Решить, какому программированию отдать предпоч-

140
Глава VI
О 3
24 27
10
t, мин
0 2 4 6
t. мин
Адсорбционная хроматография
141
тение, сложно. В принципе сначала следует попытаться оптимизиро-
оптимизировать разделение с помощью программирования скорости потока или
давления, так как этот метод экспериментально проще и никаких
особых требований к неподвижной фазе при этом не предъявляется.
При таком программировании не затрагиваются равновесные фак-
факторы, обусловливающие разделение (адсорбция, распределение
и т. д.)
Если при этом не достигают успеха и составные части пробы
элюируются только через очень большой отрезок времени или
с образованием сильных хвостов, то следует использовать програм-
программирование температуры. Однако в этом случае к стабильности непо-
неподвижной фазы предъявляются определенные требования.
Оба метода программирования ведут в общем к понижению зна-
значения к' примерно в 100 раз, т. е. у тех соединений, у которых при
комнатной температуре к' равно 100—200, при 50—70° С к' снижается
до < 10. Эти данные следует рассматривать все же только как при-
J
О 5 W
t, МОИ
Рис. VI.14. Разделение с программированием температуры.
Неподвижна» фаза: динитрофенил на меркогеле Si 200 («щетки»), <(, % 30—40 мкм; элюент: н-гептан;
колоша: 50 см х 2 мм (внутр.): Д/> - 10 атм. а - в: изотермическое разделение при 22°С (а), 43К (б)
и 70°С (в); г: разделение с программированным повышением температуры со скоростью 4°С/мин, исход-
исходная температура 23°С.
Проба: У - инертное вещество; 2 - бензол; 3 - нафталин; 4 - антрацен; 5 - 2-феннлнафталии; б - хри-
зен; 7-перилен; «-пнцен.

142
Глава VI
близительные, поскольку значительную роль могут играть такие
факторы, как скорость элюента, скорость программирования, длина
колонки и т. д.
3. Программирование неподвижной фазы
а. Изменение активности адсорбента. Как уже было показано
в разд. VIJ.B, между количеством воды, растворенным в элюенте
и адсорбированным на активном твердом теле, устанавливается рав-
равновесие [15]. Чем больше воды адсорбировано на адсорбенте, тем
ниже его «активность» и вместе с тем меньше адсорбция компонен-
компонентов пробы. Постепенно увеличивая содержание воды в элюенте,
можно снизить активность адсорбента и ускорить элюирование по-
полярных компонентов. При добавлении воды на адсорбенте происхо-
происходит «расслоение» элюента: в начале колонки воды адсорбируется
больше, чем в конце колонки. Активность неподвижной фазы и вме-
вместе с тем адсорбция составных частей пробы в начале колонки мень-
меньше, чем в конце ее. Такая «градиентная» колонка [43] использова-
использовалась уже в классической колоночной хроматографии. Поскольку
переход активный адсорбент — дезактивированный адсорбент проис-
происходит более или менее непрерывно и при постоянном вводе воды
граница между активным и дезактивированным адсорбентом посте-
постепенно спускается вниз, то составные части пробы собираются в бо-
более острые зоны (небольшая скорость перемещения передней части
зоны и более высокая скорость перемещения задней части зоны) и,
наконец, элюируются. В экстремальном случае зоны вытесняются
фронтом воды.
Если содержание воды в колонке с силикагелем увеличивается
в результате повышения ее содержания, например в хлористом ме-
метилене от 6 ¦ 10" 3 до 0,2%, то к' увеличивается в 5 • 102 - 1 • 103 раз.
Время элюирования и вместе с тем разделения можно увеличить, ес-
если увеличивать содержание воды не ступенчато, а непрерывно.
С целью сокращения элюирования проводится программирован-
программированное дезактивирование неподвижной фазы или вытеснение сильно ад-
адсорбирующихся соединений водой. Следует, однако, отметить, что
при разделении указанным способом возможно одновременное
элюирование нескольких соединений. Главным образом это вызы-
вызывается проскоком зоны воды. Кроме того, конец зоны вещества,
элюируемого с образованием хвоста, в некоторых случаях может так
сжаться, что его можно принять за следующий пик. С проблемой
«расщепления» зоны вещества хроматографисты столкнулись уже
в классической колоночной хроматографии [44].
б. Переключение колонок. Метод переключения колонок широко
распространен в газовой хроматографии [45], особенно в промыш-
промышленной газовой хроматографии [46], и используется также в жид-
жидкостной хроматографии [37, 47-50]. Разделение пробы проводится
50 мин
в 12 мин
1+й
10
го
30
Рис. VI.15. Разделение с переключением колонок [49].
Колонка /: 25 см х 2,7 мм (внутр.); силикагель, 2 м2/г; колонка 11: 25 см х 2,7 мм (внутр.), силихагель,
15 м2/г; элюент: вода - этанол - изооктан. а - разделение на колонках 1 и 11; б - разделение на колон-
колонке 1; «-разделение с переключением колонок: пики 7-72-колонка /, пнки y-d-колонки 1 н //.
Пробы: / - децилбензол; 2 — прогестерон; S - андростандион; 4 - метилтестостерон; 5 - тестостерон;
6 — андростерои; 7-16 а-оюнпрегиен-4-дион-3,20; S - 19-оюиандростен-4-днон-3,17; 9 - кортикостерои:
10 — 11-дегндрокортикостерон; 11 -кортизон; 77-кортизол.

144
Глава VI
при постоянном составе подвижной фазы последовательно или па-
параллельно на различных неподвижных фазах. Состав элюента не ме-
меняется, а меняются главным образом длина разделительной колонки
(число теоретических тарелок), сила сорбции (величина удельной по-
поверхности), соотношение фаз (различные степени покрытия одина-
одинаковыми неподвижными фазами) и селективность (различные химиче-
химически связанные неподвижные фазы).
Чаще всего предварительное разделение проводят на относитель-
относительно коротких колонках и фракции этих элюатов далее разделяют на
других разделительных колонках с теми же самыми или другими не-
неподвижными фазами. На рис. VI.15 показано оптимизирование раз-
разделения стероидов с помощью переключения колонок [49]. Отде-
Отделенные на колонке / элюируемые первыми стероиды поступают
в колонку // и находятся там до тех пор, пока из колонки / не будут
элюированы разделенными более сильно удерживающиеся стероиды
(пики 7—12). После этого поток элюента переключают на колонку II
и на ней разделяют и элюируют другие стероиды (пики 1—6). Состав
элюента остается прежним. Из-за низких коэффициентов диффузии
дополнительного размывания полосы при этом не наблюдается. Сле-
Следует позаботиться, чтобы в переключающем вентиле и в его подво-
подводящих коммуникациях не происходило размывания полосы.
4. Градиентное элюирование.
Программирование состава элюента
Градиентным элюированием называют программированное уве-
увеличение элюирующей силы элюента. Этот метод программирования
Таблица VI. 4
Ряд элюентов для градиентного элюирования по Скотту ]51]
Элгоент
1. н-Гептан
2. Четыреххлористый углерод
3. Четыреххлористый углерод/хлороформ
4. Четыреххлористый углерод/хлороформ/
1,2-дихлорэтан
5. Четыреххлористый углерод/хлороформ/
1,2-дихлорэтан/2-нитро пропан
6. Четыреххлористый углерод/хлороформ/
1,2-дихлорэтан/2-нитропропан/нитроме-
тан
7. Нитрометан/пропилацетат
8. Метилацетат
9. Ацетон
10. Этанол
11. Метанол
12. Вода
Концентрация, %
100
100
58/42 (по объему)
36/26/38 (по объему)
20/14/21/45 (по объему)
14/11/14/33/28 (по объему)
36/64 (по объему)
100
100
100
100
100
Адсорбционная хроматография
145
Таблица VI.5
Ряд элюентон для градиентного элюированнн по Снайдеру
[54] для силикагеля
Элюент
Концентрация
(по объему), %
Элюирующая
сила
1. Пентан
2. Пентан/2-хлорпропан
3. Пентан/2-хлорпропан
4. Пентан/2-хлорпропан
5. Пентан/этиловый эфир
6. Пентан/этнловый эоир
7. Пентан/этнловый э< >ир
8. Пентан/этиловый эфир
9. Этиловый эфир/метанол
10. Этиловый эфир/метанол
11. Этиловый эфир/метанол
12. Этиловый э< шр/метанол
13. Этиловый эфир/метанол
95,8/4,2
90/10
79/21
96/4
89/11
77/23
44/56
98/2
96/4
92/8
80/20
50/50
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
0,45
0,50
0,55
0,60
представляется наиболее перспективным, так как позволяет провести
оптимальное разделение очень сложных смесей. Благодаря много-
многообразию элюентов разделение смесей с самой разной полярностью
можно проводить как на полярных, так и на неполярных не по-,
движных фазах. На рис. VI. 16 приведена хроматограмма смеси, со-
содержащей 21 компонент самой различной полярности, начиная с не-
неполярного углеводорода сквалана и кончая растворимой в воде
полярной глюкозой; хроматограмма получена с помощью метода
ступенчатого градиентного элюирования. Элюирование смеси осу-
осуществлялось 12 элюентами различной элюирующей силы. Выбор
элюирующих смесей (табл. VI.4) проводился в соответствии с теоре-
теоретическими представлениями Скотта [51 — 53]. Элюенты подбирались
таким образом, чтобы результирующий градиент давал линейное
увеличение элюирующей силы, приведенный объем удерживания
пробы в предшествующем элюенте был в 2—3 раза больше, чем
в последующем, т. е. отношение обоих значений к' (к' в первом
элюенте/fc' во втором элюенте) составляло примерно 2,5 [51]. При
подборе элюентов, кроме того, учитывалось, что по мере снижения
эффективной молекулярной массы уменьшается и влияние диспер-
дисперсионных сил. Разумеется, такое разделение можно провести только
в приборе с транспортным детектором, так как некоторые раствори-
растворители поглощают в УФ-области (< 300 нм).
Снайдер [54] описал ряд элюентов (табл. VI.5), который перекры-
перекрывает тот же диапазон элюирующей силы и включает только раство-
растворители, полностью прозрачные в УФ-области. Следует отметить, что
чувствительные УФ-детекторы одновременно измеряют разницу по-
показателей преломления. Поэтому при использовании ряда Снайдера
10 Заказ 825

146
Глава VI
15 I
/2
Ю
МЛ
Рис. VI.16. Градиентное элюирование [31].
Неподвижная фаза: силшсагель: био-сил А; элюент: см. табл. VI.S; колонка 50 см х 2 мм (внутр.);
F — 0,5 мл/мин.
Проба: / - сквалан; 2 - антрацен; 3 - метнлстеарат; 4 — бензофенон; 5 - хлоранилин; 6 — нитроанилин;
7 - л-диннтробенэол; 8 — л-ннтрофенол; 9 - дегидрохолестерин; 10 — катехол; 11 — фенацетин; 12 — аде-
нин; 13 -фенолфталеин; 14 - EEDQ; 15 — хинин; 16 - ацетилсалициловая кислота; 17 -бензойная
кислота; 18 - ВОС-лейцин; 19 - ВОС-глицин; 20-алаиин; 21 - глюкоза.
следует учитывать дрейф нулевой линии. Кроме того, при использо-
использовании этого ряда может наступить расслоение фаз.
Члены ряда элюентов в табл. VI.6 выбраны таким образом, что
различие в элюирующей силе е0 (см. разд. 1.Г.1) между отдельными
смесями составляет точно 0,05 единицы. Согласно Снайдеру [54], к'
пробы уменьшается при этом в 2—4 раза. В этом ряд элюентов
Снайдера аналогичен ряду Скотта (см. табл. VI.4).
Проводить многоступенчатое градиентное элюирование можно
только на таких приборах, которые позволяют приготавливать
смеси различной элюирующей силы (градиенты) в той части насоса,
где давление низкое. При этом необходимы непрерывно работающие
насосы; объемы коммуникаций между местом, где готовятся гра-
градиенты, и началом колонки должны быть очень малыми.
На большинстве же приборов для градиентного элюирования
в жидкостной хроматографии при высоком давлении можно гото-
готовить градиенты только из двух элюентов. Градиентное элюирование
усложняется из-за различия в вязкости используемых растворителей,
различия в сжимаемости и неидеального поведения смесей. Выбран-
Выбранная система элюентов должна быть испытана на воспроизводимость
приготовления градиентов и постоянство подачи при заданной
программе.
Адсорбционная хроматография
147
Смешивание двух элюентов проводят по различным программам.
Увеличение концентрации второго компонента во времени может
описываться вогнутой, линейной или выпуклой кривой. Предпочти-
Предпочтительна, конечно, линейная градиентная кривая. Действительный, т. е.
эффективный, градиент зависит не только от программирования со-
состава смеси, он всегда является функцией различия полярностей или
элюирующих сил обоих компонентов. Если смесь приготавливают из
двух элюентов, значительно различающихся по элюирующей силе,
то уже незначительные количества второго компонента вызывают
резкое увеличение элюирующей силы, т. е. фактическая градиентная
кривая имеет выпуклую форму.
Такая форма кривой обычно нежелательна, так как с самого нача-
начала разделения компоненты элюируются почти неразделенными сразу
друг за другом. Кроме того, из-за расслоения смеси элюента по-
появляются также эффекты вытеснения, аналогичные описанным
в разд. 3 а. Примером таких смесей могут служить смеси н-гексана
и спирта, например изопропанола, взятого в количестве нескольких
процентов. При линейном программировании примерно линейное
увеличение элюирующей силы получают, только если полярности
смешиваемых компонентов различаются лить незначительно. К та-
такого типа смесям относятся смеси н-гексан - хлоралканы (хлористый
пропил, хлористый метилен и т. д.), применяемые в системах с по-
полярными неподвижными фазами, а также смеси вода — метанол (или,
что также иногда допускается, ацетонитрил), применяемые в систе-
системах с неполярными неподвижными фазами.
Между прочим, слишком большое различие в полярностях про-
проявляется в том, что при проскоке второго компонента на хромато-
грамме появляется очень большой пик: одновременно элюируются
(без разделения) несколько соединений. Рис. VI.17 показывает много-
многоступенчатое градиентное элюирование с переходом от гептана к ди-
хлорметану и далее к смесям дихлорметана с изопропанолом. Вско-
Вскоре после смены растворителей (замедление градиента, вызванное
разделительной колонкой) элюируется большой пик (прежде всего
в тех случаях, когда в смеси содержится изопропанол). Эта зона со-
содержит сразу несколько соединений, которые в дальнейшем можно
разделить с использованием подходящих систем.
Сведения о продолжительности отдельных ступеней градиентного
элюирования или о количестве элюента, необходимом для одного
шага программы, указать очень трудно, так как при этом необходи-
необходимо учитывать длину разделительной колонки, или объем пустот
в насадке, скорость потока и т. д. Авторы работы [53] показали, что
при ступенчатом градиентном элюировании нельзя, удвоив длину ко-
колонки (удвоение объема пустот), просто увеличивать вдвое продол-
продолжительность ступени элюирования. В каждом конкретном случае не-
необходимо определять свои подходящие параметры. При этом можно
исходить из эмпирической зависимости [53], согласно которой
10*

Глава VI
мин 30
Рис. VI. 17. Многоступенчатое градиентное элюирование масла перечной
мяты [56].
Колота: 30 см х 4,2 мм (внутр.); неподвижная фаза: силихагель Si 100, d, * 10 мкм; F — 2 мл/мин;
УФ-детежтор, 254 им; объем пробы: 0,5 мкл. Градиенты приготовлены при низком давлении.
Объем камеры смешения 10 см3. Программа элюирования: 1) 5 мин изократное элюирование и-гепта-
иом; 2) градиентное элюирование с переходом к хлористому метилену; 3) то же с переходом к смеси
хлористый метилен - изопропаиол A0%); 4) то же с переходом к смеси хлористый метилен — нзопро-
паиол 1:1. Регенерируют колонку, промывая ее перед вводом пробы а) 15 мин хлористым метиленом,
б) 15 мин н-гептаном (Uvasol, Merck).
объем каждой ступени градиентного элюирования должен соста-
составлять по меньшей мере 2,5 колоночных объема. Согласно другим
сведениям, эти значения должны быть намного больше. Для прове-
проведения полного градиентного элюирования с привлечением всего на-
набора компонентов - от неполярных до сильнополярных — требуется
примерно 250 колоночных объемов. При* этом без остатка элюи-
руются как неполярные, так и полярные соединения.
В приборе для жидкостной хроматографии при высоком давле-
давлении с аналитической колонкой 30 см х 4 мм (внутр.) элюирование
с градиентом от 0 до 100% компонента Б должно продолжаться не
менее 20 мин при скорости элюента 2 мл/мин. Чем короче период
градиентного элюирования, тем меньше компонентов удается отде-
отделить друг от друга в процессе элюирования. Если при постоянном
времени градиентного элюирования увеличивают скорость потока,
то объем удерживания, при котором вымывается пик, увеличивается.
Однако из-за более высокой скорости увеличивается также ширина
полос, так что улучшить разделение не удае.тся.
При градиентном элюировании особые требования предъявляют-
предъявляются к чистоте элюентов. Например, рекомендуется очистка элюентов
путем адсорбционной фильтрации через активную окись алюминия
Адсорбционная хроматография
149
20 15 . 10 т
О
¦ н-
Су.программа
Рис. VI.18. Многоступенчатое градиентное элюирование. Холостое градиент-
градиентное элюирование, проведенное при тех же условиях, что на рис. VI. 17, но без
введения пробы и изократиого начального промывания (примеси из
элюента!).
или силикагель (см. рис. XII.1). Скопившиеся в разделительной ко-
колонке загрязнения вымываются из нее при градиентном элюирова-
элюировании в виде острых пиков, которые можно принять за пики компонен-
компонентов смеси. Поэтому перед анализом целесообразно провести
градиентное промывание колонки с тем, чтобы определить наличие
пиков, обусловленных загрязнением. Пример такого «холостого»
элюирования показан на рис. VI.18. Эта хроматограмма получена
в тех же условиях, что и приведенная на рис. VI. 17, только проба
в первом случае не вводилась. Степень обогащения многими приме-
примесями может быть чрезвычайно высокой, поэтому длительность реге-
регенерирования или объемы, расходуемые на промывание при регенери-
регенерировании, должны быть постоянными. Кроме того, рекомендуется до
или после разделения проводить градиентное элюирование при иден-
идентичных условиях без добавления пробы. Такое обогащение примеся-
примесями наблюдается как для полярных, так и для неполярных непо-
неподвижных фаз. Концентрируются примеси не только исходного, т. е.
наиболее слабого элюента градиентной смеси, но и примеси наибо-
наиболее сильного элюента, для элюирования которых элюирующая сила
градиентной смеси еще недостаточна. Это означает, что для гра-
градиентного элюирования можно использовать только растворители
с высокой степенью очистки (ч. д. а. или «для анализа остатков»). Все
это удорожает анализ, так как после разделения элюенты получают
в виде смеси.

150
Глава VI
Регенерирование разделительной колонки, т. е. переход в исход-
исходное состояние путем удаления полярных компонентов элюента, зани-
занимает довольно много времени, особенно если это колонка с поляр-
полярной неподвижной фазой. При этом вымыть остатки полярных
растворителей намного проще, чем добиться установления равнове-
равновесия между поглощенной адсорбентом и растворенной в элюенте во-
водой [56]. Чтобы проверить, восстановлены ли в системе исходные
условия, повторно определяют величину к' для пробы. Для регенери-
регенерирования разделительной колонки и восстановления исходных усло-
условий требуется по меньшей мере 10—30 колоночных объемов элюен-
элюента. Таким образом, регенерация колонки занимает больше времени,
чем само разделение методом градиентного элюирования. Поэтому
часто имеет смысл не приводить колонку опять к исходным усло-
условиям (равновесие с неполярным элюентом), а стандартизовать также
время регенерирования, поскольку это все равно необходимо делать
из-за примесей в элюенте. Время регенерирования можно также зна-
значительно сократить путем обращения градиентов [56, 57].
Регенерирование колонок, заполненных неполярными или други-
другими химически связанными фазами, связано с меньшими трудностя-
трудностями. Равновесие вновь устанавливается после промывания уже пятью
колоночными объемами. Все же следует и здесь стандартизовать
время регенерации, так как на неполярных фазах могут концентриро-
концентрироваться примеси из воды и (или) метанола.
Для регенерирования разделительной колонки при ступенчатом
градиентном элюировании, т, е. для возвращения разделительной ко-
колонки от воды к к-гептану, необходимо использовать ряд из трех
или пяти растворителей для того, чтобы избежать эффекта расслое-
расслоения. Скотт [53] предлагает следующий ряд элюентов-. этанол, аце-
ацетон, этилацетат, 1Д-дихлорэтан, гептан. Объем каждого из этих
элюентов должен более чем в шесть раз превышать мертвый объем
колонки. Разумеется, регенерирование для экономии времени можно
проводить при более высоких скоростях, чем разделение.
Градиентное элюирование незаменимо при разделении смесей со-
соединений, полярности которых значительно различаются. Необходи-
Необходимость в градиентном элюировании возникает при разделении таких
смесей методом адсорбционной хроматографии на полярных и непо-
неполярных неподвижных фазах и методом ионообменной хроматогра-
хроматографии (см. гл. VIII, разд. Г.5). Используя градиентное элюирование
в адсорбционной хроматографии, можно в процессе одного анализа
разделить смеси компонентов, значения к' которых различаются
в 10* и более раз. Чтобы можно было реализовать это огромное
преимущество в рутинных анализах, надо решить ряд задач и,
в частности, уменьшить вероятность ошибочной интерпретации хро-
матограмм, полученных при градиентном элюировании. При соблю-
соблюдении определенных мер предосторожности, например проведении
холостого градиентного элюирования в идентичных условиях перед
Адсорбционная хроматография
151
97:3
CH3CN:H20 67:35
1
WO 200 300 400
Объем элюирования, мл
500
Рис. VI. 19. Градиентное элюирование фенациловых эфиров жирных кислот
[58].
Колоша: 90 см х 6,4 мм (внутр.); неподвижная фаза: ц-бондапак С-18 (Waters Associates). Элюент: смесь
ацетоннгрнл - вода; F= 2 мл/мин; и = 1 мм/с.
Проба: насыщенные и ненасыщенные жирные кислоты от лаурнновой (/) до лигноцернновой B4)
кислоты. Ненасыщенные кислоты всегда элюируются перед насыщенными кислотами, содержащими
такое же число углеродных атомов.
или после соответствующих анализов, осуществить градиентное
элюирование достаточно просто.
Устройства для градиентного элюирования в жидкостной хрома-
хроматографии при высоких давлениях (смешение при высоких давлениях)
стоят очень дорого, и многие хроматографисты ими не располагают.
В таких случаях градиентное смешение можно проводить перед насо-
насосом (в области низкого давления) [56]. Можно также менять состав
элюентов ступенчато, просто заменяя сосуд с элюентом. Если набор
таких сосудов достаточно велик и концентрации элюентов меняются
постепенно, то фактически будет проводиться элюирование с не-
непрерывным градиентом. На рис. VI.19 показана хроматограмма, по-
полученная при таком ступенчатом изменении элюирующей силы сме-
смеси растворителей [58]. Из-за низкой скорости элюирования @,1 см/с)
разделение фенациловых эфиров жирных кислот длится более 4 ч.
IV. ВОЗМОЖНОСТИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ
АДСОРБЦИОННОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
Интерес к жидкостной хроматографии при высоких давлениях
в последнее время все больше и больше растет. Уже появились
первые монографии и обзорные статьи о применении жидкостной
хроматографии при высоком давлении в клинической медицине [59],
в фармацевтической промышленности [60], при последовательном

152
Глава VI
анализе пептидов и протеинов [61] ив судебной медицине [62]. Если
бы мы стали обсуждать все опубликованные за это время примеры
разделений, то объем книги чрезмерно возрос бы, поэтому мы предт
почли ограничиться лишь примерами разделений, поэтому системы,
приведенные в данной главе, выбраны произвольно. Разделение
же отдельных классов соединений рассматривается в ряде статей
и монографий [63-65]. Определенный интерес представляют также
более старые монографии по колоночной хроматографии [66, 67],
так как от систем классической колоночной хроматографии относи-
относительно просто перейти к жидкостной хроматографии при высоких
давлениях. В этом разделе мы рассмотрим несколько примеров раз-
разделения, демонстрирующих возможности различных разделительных
систем.
А. Полярная неподвижная фаза
Для жидкостной хроматографии при высоком давлении на по-
полярных твердых фазах справедливы те же закономерности, которые
установлены для классической колоночной хроматографии («адсорб-
(«адсорбционная хроматография»). Применяется жидкостная хроматография
при высоком давлении главным образом для разделения неполярных
соединений и соединений со средней полярностью. Сильнополярные
и ионогенные соединения удерживаются на полярных адсорбентах
слишком сильно, и для их разделения применяют другие системы
(распределительная или ионообменная хроматография) предпочти-
предпочтительно с неполярными неподвижными фазами.
Разделение ароматических многоядерных углеводородов выпол-
выполняют на силикагеле, окиси алюминия, пористых телах и поверхност-
поверхностно-пористых материалах (см. рис. VI.4) [17, 68-72]. Чтобы повы-
повысить селективность, на адсорбент наносят комплексообразователи,
например нитрат серебра, тринитрофлуоренон [10, 11]. На силикаге-
силикагеле, покрытом нитратом серебра, можно иногда разделить цис-
и транс-изомеры олефинацетатов (от С10 до С18) [73], добавляя ком-
плексообразователь (нитрат серебра) к элюенту [74]. Разделительная
способность жидкостной хроматографии при высоких давлениях
в этой области продемонстрирована на примере разделения 13 аро-
ароматических углеводородов, проведенного за 60 с (рис. VI.20).
Это разделение также показало, что, заполняя частицами очень
малого диаметра (dp к 5 мкм) относительно короткую колонку F,5
см), можно получить достаточное число теоретических тарелок (п х
а* 3000) и, следовательно, проводить на таких колонках сложные раз-
разделения. Поскольку длина колонки невелика, необходимый перепад
давления, несмотря на малый размер частиц, составляет всего
72 атм.
Описано также разделение методом жидкостной хроматографии
при высоких давлениях пестицидов [50, 75], полихлорбифенилов [76,
Адсорбционная хроматография
153
60
40
t.c
20
Рис. VI.20. Разделение многоядерных ароматических соединений.
Колонка: 6,5 см х 4 мм (внутр.); неподвижная фаза: лихросфер (Merck); элюент: к-пеитан; Др = 72 атм;
и = 9,3 мм/с.
Проба: 1 - инертное вещество; 2 - растворитель; 3 - бензол; 4 — нафталин; 5 - дифеинл; 6 - антрацен;
7-пиреи; 8 - флуорантен; 9 - о-терфенил; /0 - 1,2-бензантрацен; // - 3,4-бензпирен; /.2-перилен;
13- 1,12-бензперилен; 14 - коронен; 15- 1, 2, 5, 6-дибензантрацен.
77], гербицидов [78] (см. ис. VI. 11). Разумеется, чувствительность
обнаружения при этом ниже, чем при разделении методом газовой
хроматографии с использованием селективных детекторов, но мето-
методом жидкостной хроматографии разделяют сами вещества, а не спе-
специально полученные их производные, что значительно упрощает
анализ.
Сначала главной областью применения жидкостной хроматогра-
хроматографии при высоком давлении был анализ фармацевтических и лекар-
лекарственных препаратов [79-81], стероидов [82, 83], сердечных ядов
[84, 85], алкалоидов [86], а также афлатоксинов [87]. Этим же мето-
методом проведено разделение диастереомеров. Чтобы повысить разде-
разделительную способность, Наканиши и сотр. [88] (они использовали
силикагель с размером частиц примерно 40 мкм) несколько раз про-
прокачивали смесь через одну и ту же разделительную колонку.
Уже на колонке длиной 30 см, если она заполнена силикагелем
с малым размером частиц D — 8 мкм), можно провести разделение

154
Глава VI
Инертное
вещество
2 4
t, мин
Рис. VI.21. Разделение диастерео-
меров а-фенилэтиламид о-ме-
тилоксифенилуксусной (мин-
(миндальной) кислоты.
Колонка: 30 см х 3 мм (внутр.); неподвиж-
неподвижная фаза: сферосил ХОА 400; элюент: нзо-
октан - хлороформ B :1, по объему); F —
= 1,4 мл/мин,- &р = 135 атм.
пары диастереомеров (рис. VL21) [89, 90]. На полярной неподвижной
фазе можно также разделить порфирин и производные хлорофилла
(метиловый эфир) [91, 92].
Однако следует заметить, что многие разделения можно осуще-
осуществить и на других неподвижных фазах («обращенная фаза») и с дру-
другими разделительными системами (распределительная хроматогра-
хроматография). Выбор системы зависит не только от того, какие вещества
анализируются, но и от того, работал ли уже хроматографист с дан-
данной разделительной системой.
Б. Неполярная неподвижная фаза
Я
е
х
В настоящее время в жидкостной хроматографии при высоком
давлении чаще всего применяются системы с обращенной фазой.
Примерно 60-80% всех аналитических разделений проводят этим
методом. В большинстве случаев неподвижной фазой служит силика-
гель, обработанный октадецилсиланом, а элюентом — смесь воды
и метанола или ацетонитрила. Эта хроматографическая система
очень проста, получить воду и метанол достаточной степени чистоты
несложно. Хроматографические свойства системы хорошо воспроиз-
воспроизводимы, и если в колонке поддерживается рН < 8, то разделительная
способность не меняется в течение длительного времени.
Области применения полярных и неполярных фаз перекрываются.
На рис. VI. 22 сравнивается разделение на^полярной неподвижной фа-
фазе (химически связанный эфир) с неполярным элюентом и разделение
методом «обращенной» хроматографии, т. е. на неполярной неподвиж-
8
л s
If
111
и m -^ ,
I
СО
m 5
§ *
u s
5 Й
U )S
vo
2 U о S г
О x | i ь Si
^ S q
о а
V
? - s | a »
;1

156
Глава VI
2
t, мин
Рис. VI.23. Разделение кортикостероидов [54].
Колонка: 30 см х 4 мм (внутр.); обращенная фаза: октадецнлсилан на меркосорбе Si 100, d, * 10 мкм;
элюент: вода - метанол B5 :75); и = 5,2 мм/с; Ар = 175 атм.
Проба: / — инертное вещество; 2 — кортизон; 3 — гидрокортизон; 4 — тетрагндрокортнзон; 5 — 11 -дезок-
снкортнкостерон; 6- 11-дезокснкортнкостеронацетат.
ной фазе с полярным элюентом [93]. В системе с обращенной фазой
порядок вымывания производных мочевины, как это и следовало
ожидать, меняется на обратный, причем сильнее всего удерживается
соединение с самой длинной алкильной группой (небурон).
В работах [94-96] описано разделение ароматических углеводо-
углеводородов и пестицидов в системах с обращенной фазой [94-96]. Ис-
Используя в качестве элюента смесь метанол - вода, можно отделить
бензол от дейтеробензола [97]. Поскольку неполярные вещества
очень сильно удерживаются на обращенных фазах, то такие фазы
пригодны для извлечения органических примесей из воды [98, 99]
или морских осадков [100].
Проводя элюирование водно-метанольными смесями различного
состава, можно без труда разделить или определить в биологических
материалах кортикостероид [104] (рис. VI.23), а также андроген
и прогестерон [30], фитостерин [101], сердечные яды [30, 102], жабий
яд [103].
Адсорбционная хроматография
157
Рис. VI.24. Разделение фенолкарбоновых кислот [54].
Колонка: 30 см х 4 мм (внутр.); обрашенная фаза: децнлснлан на меркосорбе Si 100, d, к 10 мкм;
элюент; вода - ледяная уксусная кислота B0%); и = 5,9 мм/с; &р = 160 атм.
Проба: 1 - хннная кнслота - метанол; 2 - хлорогеновая кнслота; 3 - кофейная кислота; 4 - л-кумаро-
вая кнслота; 5 - л-кумаровая кислота; 6 - о-кумаровая кнслота; 7-кумарин.
Карбоновые кислоты [30] (рис. VI.24) или их производные (рис.
VI. 19) [58, 105], аминокислоты или их фенилгидантоинпроизводные
[106, 107], пептиды [108], антибиотики [109, ПО], простагландин
[111] и другие полярные вещества, например эрготамин, ЛСД [112],
N-нитрозосоединения [ИЗ] и производные флуорескамина [114], бы-
были разделены на обращенных фазах или определены в лекарственных
препаратах и в биологических растворах.
В системах с обращенной фазой сорбция возрастает с увеличе-
увеличением числа неполярных групп. Этим методом можно разделять со-
соединения не только одного гомологического ряда, но и одного поли-
мергомологического ряда. Проводя элюирование смесью мета-
метанол — хлористый метилен, можно разделить или выделить, если
проводится препаративное разделение, отдельные члены ряда поли-

158
Глава VI
90
80
70
60
;50
40
30
го -
ю 1-
1
1 О
Рис. VI.25. Анализ эпоксидной смолы Ероп 1004 [116].
Колонка: 120 см х 2 мм (внутр.); неподвижная фаза: кораснл - бондапак С1В, i, к 40 мкм; элюент:
градиентное люнрованне с переходом от смесн вода - 30% ТГФ к смесн вода - 90% ТГФ;
F = 1 мл/мнн.
стирола до молекулярной массы примерно 3000 [115]. На рис. VI.25
показано разделение на обращенной фазе эпоксидной смолы [116];
чтобы сократить длительность анализа, в процессе элюирования
в данном случае в элюенте увеличивается содержание тетрагидрофу-
рана (ТГФ).
Сильнополярные хорошо растворимые в воде соединения типа
пентаэритрита [117] и олигосахаридов [116] также были разделены
на обращенной фазе, причем моно- и дисахариды были разделены на
химически модифицированной обращенной фазе - химически связан-
связанном 3-аминопропилсилане. На рис. VI.26 показано разделение моно-
и дисахаридов на такой химически модифицированной фазе [116].
Химическая прививка к поверхности силикагеля иных, чем алкил-
силаны, органических молекул всегда снижает адсорбционную актив-
активность твердого тела. Поэтому на таких неподвижных фазах, исполь-
используя смеси элюентов со средней элюирующей силой, можно разделять
полярные соединения. Кроме того, при замене алкилсиланов на дру-
другие органические соединения селективность неподвижной фазы ме-
меняется. Свойства подобных неподвижных фаз сильно зависят от
Адсорбционная хроматография
159
Рис. VI.26. Разделение Сахаров
[116].
Колонка: 30 см х 4 мм (внутр.); непод
внжная фаза: jj-бондапак-карбогндраг,
dp ±10 мкм; элюент: ацетоннтрнл - вода
G5:25).
а: / — фруктоза; 2 — глюкоза; 3 — са-
сахароза; 4 -мальтоза.
Дпх4
10 15
t, MUH
20
степени их покрытия. Фазы с различными органическими радикала-
радикалами и одинаковой степенью покрытия сравнивать очень трудно, со-
соответственно очень трудно определить точно влияние функцио-
функциональных групп. Наряду с амино- или углеводными фазами,
о которых уже говорилось выше, в продаже имеются еще фазы с ни-
трильными и гликольными группами. Последние, по-видимому,
предпочтительны в ситовой хроматографии пептидов при использо-
использовании в качестве элюента воды (см. гл. IX). Если элюирование ведет-
ведется полярными растворителями, например вода — метанол, основное
влияние на разделение оказывает обращенная фаза, тогда как в си-
системах неполярный элюент - носитель с неэкранированными сила-
нольными группами на селективность разделения влияют и по-
полярные функциональные группы (см. рис. VI22).
В. Полиамидные смолы
По полярности полиамидные фазы (см. гл V, разд. Б, гл. VI. разд.
Б. 4) стоят между силикагелем и системами с обращенной фазой. Од-
Однако из-за медленной диффузии в неподвижную фазу полимера мас-
сообмен на них все же хуже, чем на силикагеле или на неподвижных
фазах типа «щеток». Этот вид носителя занимает как бы промежу-
промежуточное положение между химически модифицированными твердыми
фазами и распределительными системами.
На полиамидных смолах можно проводить разделение хинонов,
фенолов, сульфонамидов, консервантов пищевых продуктов
[118-120], денсиламинокислот [121] и металлопорфиринов [122].

160
Глава VI
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Snyder L. R., Principles of Adsorption Chromatography. New York, Dekker,
1968.
2. Unger K., Angew. Chemie, 84, 331 A972).
3. Her K., The Colloid Chemistry of Silica and Silicates. Ithaca, University
Press, 1965.
4. Uihlein M., Dissertation Saarbrucken, 1971.
5. Sebestian I., Brust E. O., Halasz I., in Perry S. G. (Ed.), Gas Chromato-
Chromatography 1972. Ec. Applied Science, Barking, Essex, 1973.
6. Brust E. O., Sebestian I., Halasz I., J. Chromatogr., 83, 15 A973).
7. Sebestian I., Halasz I., Chromatographia, 7, 371 A974).
8. Hesse G., Z. Anal. Chem., 211, 5 A965).
9. Hesse G., Chromatographisches Praktikum. Frankfurt/Main, Akadem. Ver-
lagsgesellschaft, 1968.
10. VMlecchia R., Thiebaud M., Frei R. W., J. Chromatogr. Sci., 10, 411 A972).
11. Karger B. L., Guiochon G., Martin M., Loheac J., Anal. Chem., 45, 496
A973).
12. Locke D. C, J. Chromatogr. Sci., 11, 120 A973).
13. Brockmann H., Schodder H., Ber. dtsch. chem. Ges., 74, 73 A941).
14. Lederer E. (Ed.), Chromatographie en chimie organique et biologique.
Paris, Masson, 1959.
15. Hesse G., Roscher G., Z. Anal. Chem., 200, 3 A965).
16. Dr. EisenbeiB in Fa. Merck AG, Darmstadt, Privatmitteilung.
17. Engelhardt H., Bohme W., J. Chromatogr., 133, 67 A977).
18. Wiedemann H., Diplomarbeit Erlangen 1971, vgl., Engelhardt H., Wiede-
mann H., Anal. Chem., 45, 1649 A973).
19. Trappe W., Biochem. Z., 305, 150 A940).
20. Keller R. A., Karger B. L., Snyder L. R., in Stock N. (Ed.), Gas
Chromatography 1970. London, Institute of Petroleum, 1971.
21. Keller R. A., Snyder L. R., J. Chromatogr. Sci., 9, 346 A971).
22. Geiss F., Die Parameter der Dunnschicht-Chromatographie. Braunschweig;
Vieweg, 1972.
23. Howard G. A., Martin A. J. P., Biochem. J., 46, 215 A951).
24. Collin H., Eon C, Guiochon G., J. Chromatogr., 119, 41 A976).
25. Collin H., Eon C, Guiochon G., J. Chromatogr., 122, 223 A976).
26. Collin H, Guiochon G., J. Chromatogr., 126, 43 A976).
27. Karch K, Sebestian /., Halasz /., J. Chromatogr., 122, 3 A976).
28. Kirkland J. J., Chromatographia, 8, 661 A975).
29. Hemetsberger Я., Maasfeld W., Ricken H., Chromatographia, 9, 303 A976).
30. Karch. K, Sebestian I., Halasz I., Engelhardt H., J. Chromatogr., 122, 171
A976).
31. Karger B. L., Gant J. R., Hartkopf A., Weiner P. H., J. Chromatogr., 128,
65 A976).
32. Гельферих Ф. Иониты. Основы ионного обмена,—М.: ИЛ, 1962, 490 с.
33. Werner W., Dissertation Saarbrucken, 1976.
34. Schneider W., Bruderreck H., Halasz I., Anal. Chem., 36, 1533 A964).
35. Horvath C, Melander W., Molnar I., J. Chromatogr., 125, 129 A976).
36. Roth В., Dissertation Saarbrucken, 1977.
37. Snyder L. R., J. Chromatogr. Sci., 8, 692 A970).
38. Wiedemann H., Engelhardt H., Halasz I., J. Chromatogr., 91, 141 A974).
Адсорбционная хроматография
161
39. Halasz /., Holdinghausen F., J. Gas Chromatogr., 5, 385 A967).
40. Scott R. P. W., Lawrence J. G., J. Chromatogr. Sci., 7, 65 A969).
41. Maggs R. J., J. Chromatogr. Sci., 7, 145 A969).
42. Wiedemann H., Dissertation Saarbrucken, 1973.
43. Hesse G., Roscher G., Chromatographia, 2, 512 A969).
44. Snyder L. R., J. Chromatogr., 13, 415 A964).
45. Simmons M. C, Snyder L. Л.,\Аш11. Chem., 30, 32 A958).
46. Szonntagh E. L., in Ettre L. Sr, Zlatkis A. (Eds.), The Practice of Gas
Chromatography. New York, Interscience, 1967.
47. Spackman D. H., Stein W. H., Moore S., Anal. Chem., 30, 1190 A958).
48. Scott С D., Chilcote D. D., Lee N. A., Anal. Chem., 45, 85 A972).
49. Huber J. F. K, van der Linden R., Ecker E., Oreans M., J. Chromatogr.,
93, 267 A973).
50. Dolphin R. J., Willmot F. W., Mills A. D., Hoogeveen L. P. J., Chroma-
Chromatogr., 122, 259 A976).
51. Scott R. P. W., Kucera P., Anal. Chem., 45, 749 A973).
52. Scott R. P. W., Kucera P., J. Chromatogr. Sci., 11, 83 A973).
53. Scott R. P. W., Kucera P., J. Chromatogr., 83, 257 A973).
54. Снайдер Л. В кн. Современное состояние жидкостной хроматографии.—
М.: Мир, 1974.
55. Snyder L. R., Sounders D. L., J. Chromatogr. Sci., 7, 195 A969).
56. Engelhardt H., Elgass Я., J. Chromatogr., 112, 415 A975).
57. Majors R. E., Anal. Chem., 45, 755 A973).
58. Borch R. F., Anal. Chem., 47, 2438 A975).
59. Dixon P. F., Gray С H., Lim С. К, Stoll M. S., High Pressure Liquid
Chromatography in Clinical Chemistry. London — New York — San Francisco,
Academic Press, 1976.
60. Bailey F., J. Chromatogr., 122, 74 A976).
61. Deyl Z., J. Chromatogr., 127, У1 A976).
62. Wheals В. В., J. Chromatogr., 122, 85 A976).
63. Parris N. A., Instrumental Liquid Chromatography. Amsterdam, Elsevier,
1976.
64. Жидкостная колоночатая хроматография. - M.: Мир, 1978.
65. Deyl Z., Kopecky J., Bibliography of Liquid Column Chromatography,
J. Chromatogr., Suppl. Vol. 6, 1976.
66. Heftmann E., Chromatography. 3rd ed. New York, Van Nostrand — Rein-
hold, 1975.
67. Lederer E., Chromatographie en chimie organique et biologique. Vols.
I et II. Paris: Masson 1959/1960.
68. Strubert W., Chromatographia, 6, 205 A973).
69. Martin M., Loheac J., Guiochon G., Chromatographia, 5, 33 A972).
70. Popl M., Stejskal M., Mostecky J., Anal. Chem., 46, 1581 A974).
71. Boden H., J. Chromatogr. Sci., 14, 391 A976).
72. Bohme W., Engelhardt H., Compedium 74/75, Erganzungsband zu «Erdol
und Kohle», 1975.
73. Heath R. R., Tumlinson J. H., Doolittle R. E., Proveaux А. Т., J.
Chromatogr. Sci., 13, 380 A975).
74. Schomurg G., Zegarski K., J. Chromatogr., 114, 174 A975).
75. Little J. N., Horgan D. F., et al J. Chromatogr. Sci., 8, 625 A970).
76. Brinkman К A. Th., Seetz J. W. F. L., Reymer H. G. M., J. Chrorflatogr
116, 353 A976).
11 Заказ 825

162
Глава VI
77. Brinkman К. А. Тк, De Кок A., De Vries G., Reymer H. G. Л1, J.
Chromatogr., 128, 101 A976).
78. Elsenbeis F., Sieper H., J. Chromatogr., 83, 439 A973).
79. Htnsvark O. N., Zazulak W., Cohen A. I., J. Chromatogr. Sci., 10, 379
A972).
80. Krol G. J., Mannan С A., Gemmill jr., F. Q., Hicks G. E., Uko В. Т.,
J. Chromatogr., 74, 43 A972).
. 81. Stutz M. H., Sass S., Anal. Chem., 45, 2134 A973).
82. Fitzpatrick F. A., Siggia S., Dingman J., Anal. Chem., 44, 2211 A972).
83. Touchstone J. C, Wortmann W., J. Chromatogr., 76, 244 A973).
84. Castle M. C, J. Chromatogr., 115, 437 A975).
85. Nachtmann F., Spitzy R. W., Frei R. W., J. Chromatogr., 122, 293
A976).
86. Erni F., Frei R. W., Lindner W., J. Chromatogr., 125, 265 A976).
87. Seitz L M., J. Chromatogr., 104, 81 A975).
88. Koreeda M., Weiss G., Nakanishi K., J. Am. Chem. Soc., 95, 239
A973).
89. Siemens Karlsruhe, Anwendungsbeispiel 12/03.
90. Scott С G., Petrin M. J., McCorkle Г., J. Chromatogr., 125, 157 A976).
91 Evans N., Games D. E., Jackson A. H., Matlin S. A., J. Chromatogr.,
115, 325 A975).
92 Evans N., Jackson A. H., Matlin S. A., Towill R., J. Chromatogr., 125,
345 A976).
93. Kirkland J. J., Anal. Chem., 43, A2) 43 a A971).
94 Vaughan С. С, Wheals В. В., Whitehouse M. J., J. Chromatogr., 78, 203
A973).
95. Seiber J. N., J. Chromatogr., 94, 151 A974).
96. Klimisch H. J., Ambrosius D., J. Chromatogr., 120, 299 A976).
97. Cartoni G. P., Ferretti J., J. Chromatogr., 122, 287 A976).
98. Aufsatz M., Diplomarbeit. Saarbrucken, 1976.
99. Leoni V., Puccetti G., Grella A., J. Chromatogr., 106, 119 A975).
100. May W. E., Chester S. N., Cram S. P., Gump B. H., Hertz H. S.,
Enagonio O. P., Dyszel S. M., J. Chromatogr. Sci., 13, 535 A975).
101. Rees H. H., Donnahey D. ?.., Goodwin T. W., J. Chromatogr., 116, 281
A976).
102. Erni F., Frei R. W., J. Chromatogr., 130, 169 A977).
103. Shimada K., Hasegawa M,, Hasebe K., Fujii Y., Nambara Г., J. Chroma-
Chromatogr., 124, 79 A976).
104. O'Hare M. J., Nice E. C, Magee-Brown Я., Bullman Я., J. Chromatogr.,
125, 357 A976).
105. Hoffmann N. E., Liao J. C, Anal. Chem., 48, 1104 A976).
106. Graffeo A..P., Haag A., Karger B. ?.., Analyt. Lett., 6, 505 A973).
107. Haag. A., Longer K., Chromatographia, 7, 659 A974).
108. Krummen K., Frei R. W., J. Chromatogr., 132, 27 A977).
109. Chevalier G., Bollet C, Rohrbach P., Risse C, Chaude M., Rosset R.,
J. Chromatogr., 124, 343 A976).
110. Hartmann V., Rodiger M., Chromatographia, 9, 266 A976).
111. Fitzpatrick F. A., Anal. Chem., 48, 499 A976).
112. Jane /., Wheals В. В., J. Chromatogr., 84, 181 A973).
113. Heyns K., Roper H., J. Chromatogr., 93, 429 A974).
114. Samejima K., J. Chromatogr., 96, 250 A974).
115. Werner W., Dissertation Saarbrucken, 1976.
116. Anwendungsbeispiel der Fa. Waters MeBtechnik GmbH, Konigstein.
Адсорбционная хроматография
163
117. Callmer К., J. Chromatogr., 115, 397 A975).
118. Rabel F. M., Anal. Chem., 45, 957 A973).
119. Olson L., Samuelson O., J. Chromatogr., 106, 139 A975).
120. Collet G., Rocca J. L., Sage D., Berticat P., J. Chromatogr., 121, 213
121. Deyl Z., Rosmus J., J. Chromatogr., 69, 129 A972).
122. Svrivstava T. S., Yonetani Т., Chromatographia, 8, 124 A975).
123. Horvath C, Melander W., Molnar /., Anal. Chem., 49, 142 A977).
11*

Глава VII
РАСПРЕДЕЛИТЕЛЬНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
А. Введение
Этот хроматографический метод, как и широко используемая
в лабораторной практике экстракция, основан на различном распре-
распределении вещества между жидкими фазами. Многократная ступенча-
ступенчатая экстракция применяется для разделения соединений уже давно
[1], а первое сообщение о новом хроматографическом методе — рас-
распределительной хроматографии — авторы ее Мартин и Синг [2] опу-
опубликовали в 1941 г.
На пористый мелко раздробленный порошок (носитель) наносят
жидкую фазу. Такой кажущийся внешне сухим порошок (неподвиж-
(неподвижную фазу) помещают в разделительную колонку и пропускают через
нее вторую жидкость (подвижную фазу).
Вещества, входящие в состав пробы, по-разному распределяются
между неподвижной (разделяющая жидкость, пропитывающая носи-
носитель — пористое, мелко раздробленное твердое тело) и подвижной
фазой (протекающей через слой неподвижной фазы жидкостью), бла-
благодаря чему и становится возможным разделение. Носитель не дол-
должен влиять на равновесное распределение, он должен быть
инертным, но должен обеспечивать равномерное распределение не-
неподвижной жидкой фазы по всей поверхности, чтобы равновесное
распределение компонентов пробы между обеими фазами устанавли-
устанавливалось достаточно быстро.
Если носитель инертен, коэффициенты распределения, найденные
классическим методом, совпадают с полученными из хромато-
граммы (см. гл. II, разд. А).
Методы распределения нашли широкое распространение в газо-
газовой хроматографии, в которой почти все разделения основаны на
распределении компонентов между жидкой неподвижной и подвиж-
подвижной газовой фазами. Теорию процесса распределения можно пред-
представить в достаточно простой форме. Свойства разделяющих жидко-
жидкостей воспроизводимы, поэтому неоднократно предпринимались
попытки провести теоретическое обсуждение процессов распределе-
распределения с тем, чтобы методом газовой [3, 4] и жидкостной [5] хромато-
хроматографии можно было исследовать физико-химические свойства раз-
различных систем.
Использование процессов распределения в жидкостной хромато-
хроматографии несколько осложняется в связи с тем, что жидкие фазы — по-
Распределительная хроматография
165
движная и неподвижная — не должны смешиваться друг с другом.
Подобрать такие фазы очень сложно, поэтому обе жидкости перед
приготовлением неподвижной фазы (носитель и разделяющая
жидкость) приводят в равновесие друг с другом. Даже при хорошем
насыщении подвижной фазы разделяющей жидкостью в хроматогра-
фической установке должна быть предусмотрена форколонка, запол-
заполненная носителем, содержащим избыточное количество разделяющей
жидкости. Это необходимо для того, чтобы элюент и в условиях
хр-оматографирования был полностью ьасыщен. Температура в фор-
колонке и разделительной колонке должна всегда быть одинаковой.
Поскольку жидкие фазы не должны смешиваться, растворимость
компонентов пробы в неподвижной и подвижной фазах сильно раз-
различается. Поэтому если растворимость пробы в неподвижной фазе
выше, время удерживания очень возрастает, а это ведет к снижению
чувствительности детектирования (широкие полосы), если же раство-
растворимость пробы в подвижной фазе выше, время удерживания лишь
незначительно отличается от мертвого времени колонки.
Для того чтобы преодолеть это затруднение, часто используют
тройные смеси из неполярного, например гексан, и сильнополярного,
например вода, растворителей, к которым добавляют третий компо-
компонент, например какой-нибудь низший спирт, усредняющий раствори-
растворимость. Применяя такие смеси, можно уменьшить различие в поляр-
полярности неподвижной и подвижной жидкостей и, меняя состав
неподвижной фазы, подобрать подходящие условия разделения. По-
Поскольку часто работают вблизи критической температуры смешения
системы, то следует следить за постоянством температуры сосуда
для элюента, форколонки, разделительной колонки и детектора.
Полностью инертный носитель для неподвижной фазы не-
неизвестен. Влияние материала носителя и вклад в удерживание пробы,
обусловленный адсорбцией на поверхности носителя, подробно обсу-
обсуждаются в работах по газовой хроматографии [6, 7]. Вкладом ад-
адсорбции на поверхности твердого тела нельзя пренебрегать и
в жидкостной хроматографии [8, 9], особенно если у носителя боль-
большая удельная поверхность. Следует также учитывать проблемы, свя-
связанные с влиянием примесей, которые подробно обсуждались
при рассмотрении границы раздела вода - активное твердое тело
(см. гл. VI, разд. I.B).
Носитель (адсорбент) находится в равновесии с элюентом, насы-
насыщенным разделяющей жидкостью, и адсорбирует разделяющую
жидкость, если она более полярна, чем элюент, до тех пор, пока не
установится равновесие. Поэтому если разделяющая жидкость вы-
вымывается из разделительной колонки в результате механической эро-
эрозии, то эта жидкость вновь адсорбируется на носителе из насыщен-
насыщенного ею элюента, пока не установится равновесие [8]. Кроме того,
такой прием позволяет колонки, предназначенные для адсорбцион-
адсорбционной хроматографии, сделать пригодными для распределительной

166
Глава VII
хроматографии. Поглощаемое носителем равновесное количество
разделяющей жидкости зависит от температуры.
Уровень шумов детекторов в распределительном методе в не-
несколько раз больше, чем при разделении адсорбционным методом,
так как из колонки постоянно могут вымываться следы разделяю-
разделяющей жидкости. Особенно заметно это становится, когда неполярная
разделяющая жидкость нанесена на полярный носитель, а элюент
более полярен, чем разделяющая жидкость. Гидрофобизация носите-
носителей, например силанизация их, уменьшает шумы детектора.
Если распределительная хроматография используется в препара-
препаративных целях, выделенные вещества элюента загрязнены веществом
неподвижной фазы. Поэтому систему следует выбирать таким обра-
образом, чтобы неподвижную фазу можно было легко отделить от веще-
вещества пробы.
Несмотря на перечисленные трудности, распределительная хрома-
хроматография вполне приемлема как метод жидкостной хроматографии
высокого давления, и многочисленные успешные разделения, выпол-
выполненные таким способом, подтверждают это. Распределительную хро-
хроматографию всегда следует рекомендовать в тех случаях, когда раз-
разделяемые вещества на поверхности активных адсорбентов могут
легко претерпевать каталитические изменения. Разделяющая
жидкость, нанесенная на адсорбент, подавляет активность носителя.
Для разделения проб сильно- и среднеполярных веществ распредели-
распределительная хроматография также более пригодна, чем адсорбционная.
Опасность механической эрозии колонки можно частично устранить,
если применять химически связанные неподвижные фазы.
Б. Носители и разделяющие жидкости
1. Материалы, используемые как носители
В гл. V были представлены материалы, используемые как носите-
носители разделяющих жидкостей. В принципе носителями могут быть
любые пористые материалы, которые поддаются пропитыванию не-
независимо от величины их удельной поверхности, природы и тол-
шины пористого слоя.
Первоначально из-за лучшей разделяющей способности в каче-
качестве носителей выбирали главным образом поверхностно-пористые
материалы (ППМ). Толщина пористого слоя у ППМ невелика, и на
них можно нанести только незначительное количество неподвижной
фазы. Максимальная величина покрытия составляет 1-2%. Раздели-
Разделительные колонки, заполненные ППМ с нанесенной неподвижной фа-
фазой, обладают всеми преимуществами, присущими таким частицам:
хорошая разделительная способность, высокая скорость анализа и т. д.
Поскольку степень покрытия относительно мала, величины к' так-
также малы и соответственно линейная емкость подобных раздели-
РаспредеМтельнан хроматография
167
тельных колонок незначительна. Колонки недостаточно стабильны.
Даже небольшая потеря неподвижной фазы значительно меняет
объем удерживания.
Если же на полностью пористый носитель, объем пор у которого
значительно больше, чем у ППМ (~ 1 мл/г), нанести такое количе-
количество разделяющей жидкости, которого было бы достаточно для за-
заполнения почти всего объема пор, то мы получим так называемую
тяжело нагруженную колонку [10]. Колонки этого типа отличаются
высокой разделительной способностью (выше, чем у колонок
с малой нагрузкой) [8], высокой линейной емкостью, высокой ем-
емкостью по пикам, так как значения к' могут лежать в очень широкой
области; пробы с высокими значениями к' вымываются еще в виде
симметричных зон; потеря неподвижной фазы из-за эрозии почти не
сказывается на объеме удерживания; объем разделительной колонки,
занимаемый подвижной фазой, меньше, чем у колонок, заполненных
«голым» носителем или носителем, покрытым малым количеством
разделяющей жидкости. Благодаря этому при заданной линейной
скорости требуемая объемная скорость значительно ниже (см. гл. II,
разд. Б).
Как ППМ [11], так и пористые носители с большой поверх-
поверхностью [9, 8] могут адсорбировать наряду с неподвижной фазой
и вещества пробы. У пористых носителей на основе кизельгура, на-
например хромосорб Р, влияние адсорбции на удерживание пробы не-
незначительное. У подобных носителей при относительно небольшой
удельной поверхности объем пор большой, и на них можно нанести
большое количество неподвижной фазы C0—50%).
Оптимальный носитель для распределительной хроматографии
должен характеризоваться следующими свойствами [8].
Объем пор. Чем больше объем пор, тем больше количество непо-
неподвижной фазы, которое можно нанести на носитель, прежде чем его
частицы начнут склеиваться друг с другом. При удельном объеме
пор 1-1,3 мл/г нагрузку можно легко довести до 1 г разделяющей
жидкости на 1 г носителя, т. е. покрытие может быть 100%-ным.
Чем больше неподвижной фазы на носителе и вместе с тем в хрома-
тографической колонке, тем менее заметны потери неподвижной
фазы в результате эрозии и тем слабее их влияние на объем удержи-
удерживания пробы.
Диаметр пор. Средний диаметр пор носителя влияет на размыва-
размывание полосы удерживаемой пробы. Для носителя с диаметром пор 40 А
член С в уравнении B1) значительно больше, чем для носителя
с диаметром пор 100 А и более. Кроме того, большие молекулы
и прежде всего молекулы с большой сольватной оболочкой при
меньших диаметрах пор могут уже исключаться. (В таких случаях
малые времена удерживания совпадают с мертвым временем, полу-
полученным для малых инертных молекул, см. гл. IX.)
Более того, диаметр пор определяет стабильность колонки и ее

168
Глава VII
устойчивость к эрозии. Недостаточная устойчивость разделительной
колонки при использовании фаз, находящихся в равновесии, объяс-
объясняется исключительно эрозией. В узких порах, где капиллярные силы
больше, неподвижная фаза удерживается более прочно, чем в широ-
широких. Поэтому разделительные колонки с узкопористыми носителями
значительно стабильнее при высоких скоростях потока, чем колонки
с широкопористыми носителями. Если диаметр пор носителя больше
1000 А, то уже при линейной скорости потока ниже 5 см/с разделяю-
разделяющая жидкость вымывается за несколько минут. Разделительные ко-
колонки с носителем, Диаметр пор которого составляет 500 А или мень-
меньше, стабильны до линейных скоростей 10-15 см/с [9]. Поэтому диа-
диаметр пор носителей для распределительной хроматографии должен
находиться в пределах 100-500 А.
Удельная поверхность. Влияние удельной поверхности носителя
можно выяснить, сравнивая коэффипиенты распределения, опреде-
определенные а) из хроматографических данных и б) классическим методом
при исследовании распределения между двумя фазами. Если носи-
носитель влияет на удерживание, то коэффициент распределения, опреде-
определенный хроматографически, всегда больше, чем найденный в класси-
классическом опыте. Иногда определенные хроматографически коэффи-
коэффициенты распределения в 5-10 раз больше обычных [8]. Установле-
Установлено, что влиянием силикагеля на удерживание можно пренебречь
только в том случае, если его удельная поверхность меньше 20 м2/г.
В качестве неподвижной жидкой фазы в этих опытах использовался
3,3'-оксидипропионитрил (ОДПН). Хроматографически устано-
установленный коэффициент распределения такого силикагеля одинаков
с найденным для силанизованного хромосорба Р, который обычно
рассматривают как инертный адсорбент. Влияние носителя на удержи-
удерживание разделяемых веществ, конечно, зависит также от их структуры.
Так, установлено, что в идентичных условиях в системах 8Ю2/ОДПН
разделение спиртов в очень большой степени зависит от величины
удельной поверхности, в то время как при разделении нитрилов
удерживание обусловлено только механизмом распределения [9].
Если влияние адсорбции на удерживание изучается на носителях
с большими удельными поверхностями при большой нагрузке разде-
разделяющей жидкости, то необходимо следить за количеством неподвиж-
неподвижной фазы в разделительной колонке. В таких системах при измене-
изменении нагрузки меняется не только абсолютное, но и относительное
удерживание веществ; качественная индентификация хроматографи-
хроматографически разделенных веществ очень сложна.
На рис. VII. 1 приведена зависимость значений к' различных проб
от величины нагрузки силикагеля неподвижной фазой. Показанные
на рисунке кривые типичны для смешанного адсорбционно-распреде-
лительного механизма [11, 12]. Значения к' сначала очень сильно
уменьшаются с увеличением загрузки носителя неподвижной фазой,
проходят через минимум и после этого начинают увеличиваться.
Распределительная хроматография
169
к
НО
120
ЮО
80
60
40
20
Фенол
Бензилоеый
спирт
имвтилфталат
»- Ацетофенон
0.2
0А
0.6
а, г/г
0.8
W
Рис. VII.1. Зависимость величины к' от степени покрытия носителя [8].
Носитель: меркогель Si 100; разделяющая жидкость: 3,3-оксидипропионитрил; элюент: и-гексан;
и = 4 см/с.
Уменьшение к' связано с исключением сильных активных адсорб-
адсорбционных центров, а увеличение к' соответствует увеличению количе-
количества неподвижной фазы. Однако и в этой области имеет место ад-
адсорбция на поверхности твердого тела; это легко показать
с помощью обычных методов изучения смешанного механизма, ис-
используемых в газовой хроматографии [6, 7].
На рис. VII.2 показана зависимость рассчитанных по данным,
приведенным на рис. VII. 1, «коэффициентов распределения» от
обратного объема (l/Vj) разделяющей жидкости в колонке. В случае
«чисто распределительного» механизма коэффициенты распределе-
распределения не должны зависеть от 1/F^.
Если носитель - силикагель с большой удельной поверхностью
E00 м2/г), пренебрегать вкладом адсорбции на твердом теле нельзя
и при полном покрытии разделяющей жидкостью A/Fl<2). Только
для наименее удерживаемого вещества (АФ) «хроматографический»
коэффициент распределения при большой нагрузке не зависит от коли-
количества неподвижной фазы.
Длительность работы и возможность использования разделитель-
разделительной колонки для распределительной хроматографии зависят от
устойчивости набивки колонки к механической эрозии. При этом
предполагается, что элюент насыщен разделяющей жидкостью. Ме-
Механическая эрозия при низких скоростях элюента (< 1 см/с) обычно
незначительна. Если работа ведется при более высоких скоростях, не-
необходимо проверять постоянство разделяющей способности колонки

170
Глава VII
Распределительная хроматография
171
Бензиловый
спирт
Диметилфталат
Рис. VII.2. Зависимость хроматографически определенного коэффициента
распределения от объема разделяющей жидкости [8]. Условия разделения
см. в подписи к рис. VII. 1.
и значений к'. С этой целью периодически проводят хроматографи-
рование пробной смеси соединений с известными значениями к', так
же как это делается при проверке равновесия в системе адсорбент —
вода (см. гл. VI, разд. 1.1). Если у носителя большая удельная по-
поверхность (например, ППМ), тонкий слой, образованный силикаге-
лем, тоже имеет большую поверхность, и между разделяющей
жидкостью, адсорбированной на носителе и растворенной в элюенте,
устанавливается равновесие. Это используется для нанесения (см
дальше) неподвижной фазы на носитель. Разделительные колонки
для распределительной хроматографии пригодны для рутинных ана-
анализов только при условии, что покрытие носителя по меньшей мере
соответствует равновесному. Только в этом случае покрытие, время
удерживания и относительное удерживание не зависят от продолжи-
продолжительности работы разделительной колонки. Само собой разумеется,
можно работать при покрытиях, превышающих «равновесное», если
избегать высоких скоростей элюирования. При покрытиях, меньших
равновесного, время удерживания и относительное удерживание по-
постоянно меняются.
2. Разделяющие жидкости
Некоторые из неподвижных жидких фаз, обычно используемых
в газовой хроматографии, применимы и в жидкостной хроматогра-
хроматографии. Так, первоначально разделение методом жидкостной хромато-
хроматографии при высоких давлениях проводилось, например, с 3,3'-оксиди-
пропионитрилом (ОДПН), 1,2,3-тр«с-B-цианэтокси)пропаном, три-
метиленгликолем, полиэтиленгликолями различной степени поли-
полимеризации, карбоваксом и др. Однако подвижной фазой при этом
могут быть только неполярные алифатические углеводороды, лишь
в крайнем случае содержащие небольшое количество (до 10%) хлоро-
хлороформа или тетрагидрофурана и других простых эфиров, все другие
элюенты хорошо растворяют эти неподвижные фазы. Поскольку рас-
растворимость веществ пробы в подходящих элюентах слишком мала,
такие системы находят лишь ограниченное применение. Более того,
различия в селективности неподвижных фаз (носитель +
+ разделяющая жидкость) данного типа незначительны. Это, в част-
частности, демонстрирует рис. VII.3, на котором приведены хромато-
граммы пяти ароматических спиртов, полученные в системах с раз-
различными неподвижными фазами. Более всего для такого разделения
пригоден полиэтиленгликоль 400. Однако и^-за хорошей раствори-
растворимости перечисленных выше фаз во многих элюентах продолжитель-
продолжительность работы разделительных колонок незначительна, даже если
элюенты насыщены разделяющей жидкостью [13]. Разделительные
жидкости с высокой вязкостью характеризуются низкими коэффи-
коэффициентами диффузии, поэтому разделительная способность систем
с неподвижной фазой этого типа хуже, чем у систем с разделитель-
разделительной жидкостью малой вязкости [14]. При работе с УФ-детектором
нельзя использовать разделительные жидкости, поглощающие в УФ-
области, так как обычно даже при незначительной растворимости их
в элюенте он перестает быть прозрачным для УФ-излучения.
Выбирая системы для разделения методом распределительной
хроматографии, можно ориентироваться на уже известные системы
распределения, применяемые при экстракционном разделении [1].
Более полярный компонент системы обычно наносят на носитель,
а менее полярный служит элюентом. Кроме того, в жидкостной хро-
хроматографии при высоких давлениях можно использовать системы,
разработанные для хроматографии на бумаге. Так, например, извест-
известно, что на бумаге, пропитанной формамидом, очень легко разделить
стероиды. Если нанести формамид на силикагель, то разделить сте-
стероиды можно и методом жидкостной хроматографии при высоких
давлениях [8], так как сам формамид в элюентах средней полярно-
полярности — бензоле, хлористом метилене и хлороформе — почти нераство-
нерастворим.
До сих пор мы говорили только о бинарных смесях, хотя область
применения тройных смесей должна быть намного более широкой

Kapdoeaitc
4000
Карбовапс
1500
Распределительная хроматография
173
ТМГ
10
Рис VII.3. Селективность разделительных колонок [13].
7
мл/мин,
тиленгликоль, карбовак различной молекулярной массы; элюент: «-г«саи,
Пооба- 1 - ад'-диметилбеизиловый спирт; 2 - а-метилбеизиловый спнрт, 3 - 2-феиилэтиловый спирт;
^ ' 4-коричный спирт; 5- бензиловый спирт.
[15]. Как уже отмечалось, чтобы жидкости, составляющие простую
бинарную смесь, не смешивались, полярность их должна значитель-
значительно различаться. Если к такой бинарной смеси теперь добавить тре-
третий компонент, полностью смешивающийся с первыми двумя, то он
будет действовать как агент растворения, и различие в полярности
двух фаз уменьшится.
Количество добавляемого третьего компонента, разумеется, надо
дозировать таким образом, чтобы система оставалась двуфазной. Ес-
Если, меняя состав, приближаются к точке, в которой наступает полная
смешиваемость, то разделительная система теряет селективность.
Более того, когда обе фазы становятся похожими друг на друга, ста-
стабильность разделительной колонки уменьшается, так как подвижная
фаза вымывает неподвижную.
Состав фаз следует всегда выбирать таким образом, чтобы на не-
него не влияли незначительные изменения температуры. С использова-
использованием тройных смесей углеводород (изооктан) — этанол — вода,
взятых в различном соотношении, проведено разделение стероидов
[16], пестицидов [17] и хелатов металлов [18]. Это свидетельствует
о широких возможностях применения тройных смесей. Само собой
разумеется, что углеводород можно заменить, например, на хло-
хлористый метилен [19]. Процесс разделения проб, которые в водной
среде способны диссоциировать, можно оптимизировать, меняя зна-
значения рН водной неподвижной или подвижной фаз. При этом диссо-
диссоциация разделяемых кислот или оснований подавляется, и они элюи-
руются в виде более острых зон. В хроматографии на бумаге или
в тонком слое, для того чтобы получить более четкие пятна разде-
разделяемых кислот, к элюенту добавляют уксусную или разбавленную
соляную кислоту.
Если же анализируются основания, то к растворителю добавляют
аммиак или слабые органические основания. Кроме того, к разде-
разделяемым кислотам или основаниям в неподвижной или подвижной
фазе можно добавить подходящие противоионы и вызвать образова-
образование соли между кислотой или основанием и соответствующим про-
тивоионом. Образующиеся «ионные пары» значительно меняют
удерживающую способность ионогенных веществ, в то время как
удерживание неионогенных веществ остается прежним. Таким обра-
образом, в этом случае возможна дополнительная оптимизация разделе-
разделения.
Первые систематические работы в области «хроматографии
ионных пар» принадлежат Шиллу [33, 34]. Из1за отсутствия подходя-
подходящих ионообменников для жидкостной хроматографии при высоких
давлениях метод «хроматографии ионных пар» стал развиваться как
метод разделения ионогенных соединений. В зависимости от кон-
конкретной системы фаз для различных типов разделений используют
разные наименования, хотя основной принцип один и тот же.
В хроматографии ионных пар носителем водной неподвижной

174
Глава VII
фазы, содержащей противоион (например, перхлорат), а иногда
и подходящий буфер, служит силикагель. Элюент с водой не смеши-
смешивается [35—38]. В хроматографии спаренных ионов [47] в качестве
неподвижной фазы используют обращенную фазу. К элюентам, на-
например смеси воды с метанолом, если проводится разделение кис-
кислот, добавляют органическое основание (тетрабутиламмонийфосфат),
а если проводится разделение оснований, то органическую кислоту
A-гептансульфокислоту) [39, 43]. В так называемой хроматографии
мыл [44] применяют органические противоионы с длинными углево-
углеводородными цепями (> С10).
Меняя рН в неподвижной или подвижной фазе при разделении
ионных пар, можно влиять на диссоциацию пробы и противоиона
или соответствующего соединения. Таким способом можно добиться
того, что разделительная система станет очень селективной к образо-
образованию ионных пар, а это позволит провести оптимальное отделение
интересующих веществ пробы. Возможности этого метода можно
пояснить на примере разделения карбоновых кислот. В основе диссо-
диссоциации карбоновых кислот лежит следующее равновесие:
R - СООН <=* R - СОСГ + Н+
При добавлении кислоты или кислотного буфера равновесие сдви-
сдвигается влево, диссоциация подавляется. Зоны элюирования при этом
становятся острее и в крайнем случае имеют только небольшие
хвосты. Подавить с помощью кислоты диссоциацию более кислых
проб, которые и при рН 2 еще полностью диссоциированы, нельзя,
в частности, и потому, что необходима специальная коррозионно-
стойкая аппаратура. Подобные пробы почти не удерживаются, ча-
частично исключаются или вымываются в виде очень несимметричных
пиков. Если добавить к элюенту подходящий противоион, например
четвертичную аммониевую соль, то образуется соль органического
основания карбоновой кислоты. Само собой разумеется, что коэффи-
коэффициент распределения у этой ионной пары иной, чем у свободной кис-
кислоты. Кроме стадии диссоциации карбоновой кислоты реакция обра-
образования ионной пары включает диссоциацию добавленного проти-
противоиона
Распределителъная хроматография
175
и образование ионной пары
R4N + + R - СОО - т± RCOO : NR4
Образование ионной пары зависит от рН неподвижной или подвиж-
подвижной фаз. Величина рН должна быть такой, чтобы проба и соедине-
соединение, в которое входит противоион, были полностью диссоциированы.
В качестве противоиона выбирают также соединения, которые пол-
полностью диссоциируют в широкой области рН; при этом можно подо-
подобрать оптимальное для разделения значение рН (диссоциация про-
бы). Обычно роль таких соединений играют сильные кислоты,
например хлорная кислота, алкилсульфокислоты, и соли сильных ос-
оснований, например четвертичные аммониевые соли. Постоянное зна-
значение рН в области 2—8 поддерживают с помощью буферных рас-
растворов. При более низких и более высоких значениях рН следует
опасаться коррозии аппаратуры, в частности коррозии фильтров,
растворения силикагеля и т. д. Состояние равновесия и скорость
образования ионной пары зависят от типа пробы, вида и концентра-
концентрации противоиона и значения рН. При этом оптимизировать разделе-
разделение можно, меняя не только неподвижную фазу или полярность
элюента, но и селективность (путем изменения температуры). Разде-
Разделение оснований в принципе подчиняется тем же закономерностям.
На практике, по-видимому, осуществить разделение по методу
ионных пар с использованием обратимых фаз проще, так как в этом
случае противоион можно добавлять в элюент. Вводить необхо-
необходимые противоионы в колонки, заполненные силикагелем с водой
в качестве неподвижной фазы, труднее.
Биогенные амины и продукты обмена веществ [36, 45], фармацев-
фармацевтические препараты [37, 46], карбоновые кислоты [42], аскорбиновая
кислота [43] и промежуточные продукты и красители [44] были раз-
разделены с помощью хроматографии ионных пар. В работе [47] даны
подробные указания по практическому применению метода и пере-
перечислены реактивы, применяемые в хроматографии ионных пар на
обращенных фазах.
3. Нанесение неподвижной фазы на носитель
В классическом варианте нанесения неподвижной фазы на носи-
носитель предполагается, что колонку заполняют сухим способом. Как
правило, диаметр частиц насадки превышает 25 мкм. Разделяющую
жидкость обычно наносят из раствора, после чего растворитель мед-
медленно удаляют испарением. Если хроматографическую колонку за-
заполняют суспензией, то чаще всего разделительные жидкости уда-
удаляют из колонки или тем же растворителем, который использовался
для приготовления суспензии, или подвижной фазой при кондицио-
кондиционировании колонки. Поэтому после заполнения таких колонок носи-
носителем на него необходимо нанести разделяющую жидкость.
Проще всего добавить небольшое количество неподвижной фазы
в колонку, отмытую от элюента. Поскольку маленькие капельки не-
неподвижной фазы проходят через колонку и осаждаются частично
в детекторе, чтобы установилось стабильное соотношение, нужно
очень много времени. Однако при этом распределение разделяющей
жидкости на носителе может быть неоднородным. Более удобен
опробованный уже в газовой хроматографии метод: раствор необхо-
необходимой разделительной жидкости продавливают через колонку, после
чего растворитель удаляют либо газом, например азотом [20], либо

176
Глава VII
элюентом [21]. Конечно, и в этом случае нельзя предсказать, сколь-
сколько разделяющей жидкости удержится носителем.
Если носитель - активный твердый материал с большой у дель-
дельной,поверхностью, а подвижная фаза - полярная жидкость, то нано-
наносить жидкую фазу на носитель излишне. В этих случаях между разде-
разделяющей жидкостью, растворенной в элюенте и адсорбированной на
активном носителе, устанавливается равновесие. Чем больше разли-
различие в полярностях неподвижной и подвижной фаз и чем больше
удельная поверхность носителя, тем большее количество разделяю-
разделяющей жидкости удерживает твердый носитель. Время, необходимое
для установления равновесия, зависит главным образом от концен-
концентрации разделяющей жидкости в элюенте и от объемной скорости
элюента. Целесообразно в сосуд для элюента добавить избыток не-
неподвижной фазы и в процессе нанесения жидкой фазы заставлять
элюент циркулировать. В качестве сосуда для предварительного кон-
кондиционирования элюента можно также использовать форколонку, за-
заполненную хромосорбом с нанесенной на него выбранной разделяю-
разделяющей жидкостью. Форколонка должна содержать достаточный избы-
избыток разделяющей жидкости. Время, необходимое для нанесения
неподвижной фазы, можно значительно сократить, повысив темпера-
температуру в форколонке на 1 - 2°С по сравнению с разделительной
колонкой.
Приготовленные таким образом [15, 22, 23] колонки с равномер-
равномерно распределенной разделяющей жидкостью отличаются большой
продолжительностью жизни, поскольку потери в результате вымыва-
вымывания разделяющей жидкости непрерывно компенсируются, пока тем-
температура и концентрация разделяющей жидкости в элюенте по-
постоянны. Путем изменения количества разделяющей жидкости,
растворенной в элюенте, можно изменить равновесное распределение
на носителе. В результате не только увеличится или уменьшится вре-
время удерживания, но и изменится также и относительное удержива-
удерживание. Это дает возможность приготовить в каждом конкретном слу-
случае оптимальную систему. Если предварительно вымыть находив-
находившуюся в колонке неподвижную фазу подходящим растворителем, то
можно в той же колонке нанести на носитель другую разделяющую
жидкость. Перед нанесением новой неподвижной фазы колонку сле-
следует регенерировать и активировать, т. е. следует удалить сухим
элюентом меньшей полярности остатки полярной промывной жид-
жидкости, например остатки занесенной воды. Обычно для полной реге-
регенерации разделительной колонки достаточно примерно 20 коло-
колоночных объемов промывной жидкости, например метанола, при этом
вымываются также вещества, удерживающиеся очень сильно. Для ре-
регенерации разделительной колонки (активирования) необходимо
40- 100 колоночных объемов неполярного элюента, например хлори-
хлористого метилена или гептана.
Распределительная хроматография
177
4. Определение количества неподвижной фазы
При обычном способе нанесения неподвижной фазы на носитель
из раствора количество разделяющей жидкости можно определить
взвешиванием. Разумеется, при этом предполагается, что разделяю-
разделяющая жидкость не улетучивается с парами растворителя. Сложнее
определить количество неподвижной фазы в разделительной колон-
колонке, удерживаемое носителем в равновесном состоянии. Точно это ко-
количество можно установить, только удалив набивку из разделитель-
разделительной колонки. Очень точно степень покрытия носителя неподвижной
фазой можно также узнать по результатам классического С, Н-ана-
лиза набивки (носитель и разделяющая жидкость).
Если набивка находится в колонке, то степень покрытия можно
приблизительно установить исходя из пористости (см. гл. II, разд. Б).
Пористость разделительной колонки, заполненной силикагелем, в от-
отсутствие неподвижной фазы всегда находится между 0,82—0,85 (см.
гл. II, разд. Б). Если все поры заполнены неподвижной фазой, то
в отношении инертного вещества колонка ведет себя так, как будто
она заполнена непроницаемыми стеклянными шариками. Пористость
колонки в этом случае равна 0,42—0,45. Если известны объем пор
и плотность упаковки носителя в колонке, то количество неподвиж-
неподвижной фазы в насадке можно рассчитать. В табл. VII. 1 сравниваются
экспериментально найденные величины пористости и вычисленные
из них количества неподвижной фазы. Экспериментальные данные
пвлучены для колонки, заполненной силикагелем (меркогель Si 100)
с большим объемом пор A мл/г); в качестве неподвижной фазы ис-
использовалась вода. В соответствии с уменьшением пористости увели-
увеличивается линейная скорость, если объемная скорость поддерживается
постоянной. Постоянный перепад давления и постоянную объемную
скорость получают в тех случаях, когда носитель при нанесении не-
неподвижной фазы ни набухает, ни сжимается. В присутствии таких по-
полярных неподвижных фаз, как вода или низшие спирты, силикагель,
Таблица VII.1
Пористость и степень покрытия колонки с силикагелем*
Пористость
0,88
0,84
0,80
0,76
0,70
0,44
Степень покрытия (расчетная), г/г
_
0,08
0,15
0,22
0,33
0,80
Линейная скорость, см/с
0,76
0,86
0,9
0,92
0,95
1,35
а Колонка: 30 см х 4 мм (внутр.); носитель: 2,08 г SiO,. меркогель Si 100; </. = 10 мкм;
:нт СН,С1,; F= 5 мл/мин; Ар = 100 атм. " у
12 Заказ 825

178
Глава VII
используемый как носитель, может набухать. Если при этом поддер-
поддерживается постоянное давление на входе в колонку, объемная ско-
скорость убывает в процессе нанесения неподвижной жидкой фазы (при
постоянной объемной скорости возрастает соответствующее давле-
давление на входе). Набухание силикагеля почти всегда обратимо и не
влияет на разделительную способность колонки.
В. Свойства разделительной колонки
1. Стабильность и продолжительность работы колонки
Стабильность и продолжительность работы колонки зависят от
следующих факторов.
а) Насыщение элюента неподвижной фазой, достигаемое с по-
помощью форколонки, в которой степень покрытия неподвижной фа-
фазой больше, чем в разделительной колонке. Форколонку можно за-
заполнить другим носителем, например силикагелем, имеющим другой
размер частиц. При этом компенсируется случайное изменение
растворимости разделяющей жидкости в элюенте при повыше-
повышении давления (хотя подобных эффектов при давлениях менее 400 атм
еще не следует ожидать).
б) Равенство и постоянство температур форколонки, разделитель-
разделительной колонки и сборника. Состав смеси часто зависит от темпера-
температуры, и изменение температуры может повлиять на количество раз-
разделяющей жидкости в насадке. Если колонка заполнена частицами
малого диаметра, внутри нее может возникнуть градиент темпера-
температур, обусловленный нагреванием элюента за счет работы сжатия [24,
25]. В этом случае в низу колонки, где температура выше, на носите-
носителе меньше разделительной жидкости, чем в начале колонки.
в) Разделяющая жидкость может выноситься из колонок в ре-
результате механической эрозии.
г) Вещества пробы всегда следует растворять в элюенте, пропу-
пропущенном через разделительную колонку, а не в чистом ненасыщенном
растворе, так как иначе вымывается неподвижная фаза.
Если все перечисленные факторы не учитываются, продолжитель-
продолжительность работы разделительной колонки снижается. Уменьшение коли-
количества разделяющей жидкости в разделительной колонке всегда за-
заметно сказывается на уменьшении времен удерживания в тех
случаях, когда колонка заполнена инертными носителями. Если но-
носитель активный, время удерживания может как уменьшаться, так
и увеличиваться (рис. VII. 1). У разделительных колонок с большой
степенью покрытия (больше 0,3 г разделяющей жидкости на 1 г но-
носителя) небольшие изменения количества разделяющей жидкости ве-
ведут к менее заметным изменениям времени удерживания.
Распределительная хроматография
179
2. Предельная допускаемая нагрузка
(линейная емкость)
Предельная допускаемая нагрузка разделительных колонок (ли-
(линейная емкость) в распределительной хроматографии примерно на
порядок выше, чем в чисто адсорбционных системах (см. гл. VI, разд.
I.A). Без заметного увеличения размывания полос можно ввести в ко-
колонку 10" 3 — 10" 2 г пробы на 1 г разделяющей жидкости. Размыва-
Размывание полосы возрастает значительно быстрее, чем уменьшаются зна-
,чения к' при перегрузке колонки. На рис. VII. 4 приведены кривые,
полученные для носителей с различным максимальным количеством
нанесенной неподвижной фазы. Если мерой допускаемой нагрузки
служит увеличение размывания полосы, то предельная допускаемая
нагрузка не зависит от значения к'. Перегрузка колонки (возрастание
размывания полосы) не всегда ведет к образованию хвостов. Если
в качестве границы допускаемой нагрузки используют изменение
значений к', то получают несколько более высокие значения. Несмо-
Несмотря на такие высокие допускаемые нагрузки, системы в жидкостной
хроматографии высокого давления часто перегружены, прежде всего
в тех случаях, когда общее количество разделяющей жидкости мало,
например когда колонка заполнена ППМ.
в
7
6
5 5
< 4
3
2
1
1 i-i i i I I I I I I I 1 LJ_l_l
2 4 6 8 Ю~3
10
-2
«Г
Рис. VII.4. Допускаемая нагрузка в системах распределительной хроматогра-
хроматографии (колонка с максимальной степенью покрытия) [9].
Колонка: 50 см х 2 мм (внутр.); неподвижная фаза: 1) 0,91 г ОДПН/1 г порасила А; 2) 0,79 г/1 г по-
расила С; 3) 0,34 г/1г порасила Е; элюент: я-гептан; и= 1,97 см/с; Т= 34°С.
Проба: беяэонитрил.
12*

180
Глава VII
3. Препаративное применение
Распределительная хроматография допускает большие нагрузки,
и поэтому она пригодна для препаративных разделений. В раздели-
разделительную колонку с внутренним диаметром 2 мм длиной 50 см, за-
заполненную силикагелем с максимальной степенью покрытия, можно
без опасения вводить до 10 мг вещества в расчете на компонент.
Этого достаточно для многих аналитических исследований и реак-
реакций. Если разделение хорошее, в колонку можно ввести еще боль-
большую пробу. Однако выделенные составные части пробы после удале-
удаления элюента загрязнены разделяющей жидкостью, поэтому для
препаративных работ разделяющую жидкость следует выбирать та-
таким образом, чтобы ее можно было легко отделить.
4. Разделяющая способность
Разделяющая способность колонок для распределительной хро-
хроматографии зависит от размера частиц носителя. Кроме того, на
размывание полосы влияет вязкость разделяющей жидкости [11].
Для колонок с максимальной степенью покрытия наблюдается пред-
предсказанная теорией зависимость числа теоретических тарелок п (член
Q от к' [26]. Максимальное значение h достигается при к' « 1. Если
к' выше 30, значения h сравнимы с соответствующими пику инертно-
инертного вещества [8, 9]. Удивительно, что при использовании частиц
малого диаметра (dp < 10 мкм) эта зависимость больше не наблю-
наблюдается. В этом случае h — постоянная величина, на которую почти не
влияет к' пробы [22]. В подобных разделительных колонках с увели-
увеличением скорости потока h возрастает незначительно.
5. Техника программирования
Из используемых в адсорбционной хроматографии методов про-
программирования, позволяющих сократить длительность анализа, для
распределительной хроматографии приемлемы только программиро-
программирование давления и скорости потока. На рис. VII. 5 показана хромато-
грамма, полученная при программировании давления. Разделение,
выполненное при низкой начальной скорости 0,9 см/с, заняло бы бо-
более 60 мин.
Программирование температуры и градиентное элюирование
в распределительной хроматографии применять нельзя, так как при
этом меняется состав системы носитель — разделяющая жидкость
(ср. программирование с «замедлителем» в гл. VI, разд. III.2) и даже
разделяющая жидкость может быть полностью вымыта из колонки.
Для любой разделяющей жидкости, используемой в качестве непо-
Распределителъная хроматография
181
Рис. VII.5. Распределительная хроматография с программированием давле-
давления [9].
Колонка: 50 см х 2 мм (внутр.); неподвижная фаза: 0,72 г ОДПН/1 г порасила С с привитым оксипро-
пионитрилом, dr as 40 мкм; элюент: н-гептаи; Др: от 7,5 до 135 атм; Г= 34°С.
Проба: 1 - нонан (к' - 0); 2 — тионафтен @,3); 3 - ^№-днметиланилнн @,8); 4 - ос-нафтохинолнн A,6);
5 — хинальдин B,4); 6 - л-бензодиазин C,95); 7 — нзохниолнн F,5); 8 — фенилпропанол A6,8); 9 —
бензиловый спирт C2); 10 - анисовый спирт F3).
движной фазы, в известном смысле справедливо все то, что говори-
говорилось об адсорбции воды в главе, посвященной адсорбционной
хроматографии.
Г. Применение
Методом распределительной хроматографии целесообраслее все-
всего проводить разделение соединений, полярность которых слишком
велика, чтобы их можно было разделить с помощью адсорбционной
хроматографии. Тем не менее методом распределительной хромато-
хроматографии можно разделить и неполярные вещества, например много-
многоядерные ароматические углеводороды. Пример такого разделения
приведен на рис. VII.6. Длительность анализа в данном случае боль-
больше, чем при разделении, показанном на рис. VI.20, что во многом
объясняется большим размером частиц носителя.
Высокую скорость анализа при таком же размере частиц полу-
получают, используя ППМ, покрытые разделительной жидкостью. На

182
Глава VII
45
I I I I
го
40 60
t, MUH
80
Рис. VII.6. Разделение много-
многоядерных ароматических сое-
соединений (колонка с максималь-
максимальной степенью покрытия) (Merck
72/1).
Колонка: 250 см х 2 мм (внутр.); непод-
неподвижная фаза: меркосорб SI 60, покрытый
фрактоннтрнлом III E0%); элюент: н-гептан;
F = 15 мл/ч.
Проба: /-бензол; 2 -нафталин; 3-
антрацен; 4-пнрен; 5 - флуорантен; 6-
тетрацен; 7-хризен; 8 - бензапнрен; 9-
коронен.
10
20
30
Рис. VII.7. Разделение пласти-
пластификаторов на поверхностно-по-
поверхностно-пористых материалах (Merck 73/1).
Колонка: 50 см х 2 мм (внутр.); неподвиж-
неподвижная /фаза: пернсорб, покрытый ОДПН
A,3%); элюеит: и-гептан; Др = 75 атм;
F = 6,7 мл/мин.
Проба: / - дибутилфталат; 2-диэтил-
фталат; 3 — диметилфталат.
Распределительная хроматография
183
Рис. VII.8. Разделение стерои-
стероидов (колонка с максимальным
покрытием).
Колонка: 30 см х 4,2 мм; носитель: мер-
меркосорб Si 100, dp к 10 мкм; разделяющая
жидкость: формамид (~ 50%) нанесен из под-
подвижной фазы; элюент: хлористый метилен;
Др = 105 атм; и = 0,45 см/с.
Проба: 1 — инертное вещество; 2 — хорти-
костерон (f - 1,3); 3 - кортизон C,0); 4 -
альдостерон C,6); 5 - гидрокортизон G,3).
12
10 8 6 4
t, MUH
рис. VII.7 показан очень быстрый анализ пластификаторов. Это раз-
разделение можно провести и методом адсорбционной хроматографии.
Однако полярные соединения типа стероидов целесообразнее разде-
разделять с помощью распределительной хроматографии. На рис. VII.8
показано разделение некоторых кортикостеронов в системе силика-
гель - формамид - хлористый метилен [8, 22]. Успешное разделение
и определение стероидов проводят и на других системах [19, 27—29,
32] (см. рис. VI.5). Фенолы [8, 14, 22], фенолкарбоновые кислоты [30],
ней оно генные поверхностно-активные вещества [31] и хетты ме-
металлов [18] были разделены с помощью распределительной жид-
жидкостной хроматографии при высоких давлениях.
В работах [22, 23] описано разделение производных аминокислот,
в частности образующихся при эдмановском расщеплении пептидов
фенилтиогидантоина [23] и денсиламинокислот [22]. На рис. VII.9
и VII. 10 показано разделение денсилпроизводных важнейших амино-
аминокислот. Разделяющая жидкость была адорбирована носителем (сили-
кагель) из подвижной фазы. В качестве элюента для разделения про-
производных монофункциональных аминокислот более всего пригодна
смесь насыщенного водой хлористого метилена с 1% ледяной уксус-
уксусной кислоты и 1% 2-хлорэтанола. Производные полярных аминокис-
аминокислот в этой системе удерживаются слишком долго. Если увеличить
содержание 2-хлорэтанола в элюенте до 10%, то после того, как на
колонке установится равновесие, на ней можно разделять также ден-

22 20 IB 16 14
12 ~ 10
t, мин
Рис. VII.9. Разделение денсиламинокислот I [22].
Колонка: 50 см х 4,2 мм; насадам: лнхросфер Si 100, dr я 10 мим; разделяющая жидкость: полярный
компонент, нанесенный в количестве -0,4 г/г из подвижной фазы; элюент: насыщенный водой хло-
хлористый метилен — ледяная уксусная кислота A%) — 2-хлорэтанол A%); Д/> = 255 атм; и = 0,6 см/с.
Проба: / — инертное вещество; 2 — иеидентифицированное вещество; 3 - денснлизолейцин (*'= 2,9);
4 - деисилвалнн C,25); 5 - денсиллейцин C,9); 6 - деиснлтирозни D,7); 7 - деиснлаланин F,5); 8-
денснлтриптофан (8,0); 9 — денсилглицин (8,8); 10 — дененлгнстиднн A0,1); JJ - денсиллизин A4,4).
I I I I I I I I I I I I I I I
II I I I I
20
15
t. UUH
10
Рис. VII. 10. Разделение денсиламинокислот II [22]. Неподвижную фазу и ус-
условия разделения см. в подписи к рис. VII.9, элюент содержит 2-хлорэтанол
A0%).
Проба: /-инертное соединение; 2-смесь, см. рнс. VII.9; 3 - иеидентнфнцированиое соединение;
4 - деиснлтреоннн (к' - 5,9); 5 - денснлсернн (8,0); 6 - деисилглутамниовая кислота (8,5); 7 - денсил-
аспарагиномя кислота A1,0); 8 - денсилцистин A5,5).
Распределительная хроматография
185
силпроизводные полярных аминокислот (рис. VII. 10). Неполярные
производные аминокислот элюируются при этом вблизи пика инерт-
инертного вещества.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Hecker Е., Verteilungsverfahren irn chemischen Laboratorium. Weinheim,
Verlag Chernie.
2. Martin A. J. P., Synge R. L. M., Biochem. J., 35, 1358 A941).
3. Littlewood А. В., Gas Chromatography, 2nd ed. New York, Academic
Press, 1970.
4. Leibnitz E., Struppe H. G. (Hrsg.), Handbuch der Gas-Chromatographie.
Weinheim, Verlag Chemie, 1970. [Имеется перевод первого издания:
Руководство по газовой хроматографии.— М.: Мир, 1969.]
5. Locke D. С, in Ciddings J. С, Keller R. A. (Eds.), Advanc. Chromato-
Chromatography. Vol. 8, New York, Dekker, 1969.
6. Conder J. R., Locke D. C, Purnell J. #., J. Phys. Chem., 73, 700 A969).
7. Cadogan D. F., Conder J. R., Locke- D. C, Purnell J. #., J. Phys. Chem.,
73, 708 A969).
8. Engelhardt H., Weigand N., Anal. Chem., 45, 1149 A973).
9. Rossler G., Halasz /., J. Chromatogr., 92, 33 A974)
10. Halasz I., Engelhardt H., Asshauer J., Karger B. L., Anal, Chem., 42,
1460 A970).
11. Karger B. L., Engelhardt H., Conroe K., Halasz I., in Stock N. (Ed.), Gas
Chromatography, 1970. London, Institute of Petroleum, 97.
12. Halasz I., Wegner E. ?., Nature, 189, 570 A961).
13. Шмит Дж. В кн. Современное состояние жидкостной хроматогра-
хроматографии.- М.: Мир, 1974.
14. Karger В. L, Conroe К., Engelhardt H., J. Chromatogr. Sci., 8, 242 A970).
15. Huber J. F. К, J. Chromatogr. Sci., 9, 72 A971).
16. Huber J. F. K, Meijers С A. M., Hulsman J. A. R. J., Anal. Chem., 44,
111 A972).
17. Koen J. G., Huber J. F. K, Poppe H., Den Boef G., J. Chromatogr. Sci.,
8, 192 A970).
18. Huber J. F. K, Kraak J. C, Veening #., Anal. Chem., 44, 1554 A972).
19. Hesse Chr., Hovermann W., Chromatographia, 6, 345 A973).
20. Majors R. E., Anal. Chem., 45, 755 A973).
21. Kirkland J. J., Dilks jr., С. Н., Anal. Chem., 45, 1778 A973).
22. Engelhardt H., Asshauer J., Neue U., Weigand N., Anal. Chem., 46, 336
A974).
23. Frank G., Strubert W., Chromatographia, 6, 522 A973).
24. Киркленд Дж. В кн. Современное состояние жидкостной хроматогра-
хроматографии.- М.: Мир, 1974.
25. Endele R., Dissertation Saarbrucken, 1974.
26. Dal Noggare S., Juvet R. S., Gas-Liquid Chromatography, New York,
Interscience, 1962.
27. Siggia S., Dishman R. A., Anal. Chem., 42, 1223 A970).
28. Karger B. L., Berry L. V., Clin. Chem., 17, 757 A971).
29. Meijers С A. M., Hulsman J. A. R. J., Huber J. F. K, Z. Anal. Chem.,
261, 347 A972).

186
Глава VII
30. Hovermann W., Rapp A., Ziegler A., Chromatographia, 6, 317 A973).
31. Huber J. F. K, Kolder F. F. M., Miller J. M., Anal. Chem., 44, 105 A972).
32. Trefz F. K, Byrd D. J., Kochen W., J. Chromatogr., 107, 181 A975).
33. Schill G., Acta Pharm. Sue, 2, 13 A965).
34. Schill G., Modin R., Persson B. A., Acta Pharm. Sue., 2, 119 A965).
35. Eksborg S., Schill G., Anal. Chem., 45, 2092 A973).
36.
37.
Karger B. L., Persson B. A., J. Chromatogr. Sci., 12, 521 A974).
Karger B. L., Su S. C, Marchese S., Persson B. A., J. Chromatogr. Sci.,
12, 678 A974).
Kraak J. C, Huber J. F. K, J. Chromatogr., 102, 333 A974).
Wittmer D. P., Nuessle N. O., Haney W. G., Anal. Chem., 47, 1422 A975).
Wahlund K.-G., J. Chromatogr., 115, 411 A975).
Wahlund K.-G., Lund U., J. Chromatogr., 122, 269 A976).
Fransson В., Wahlund K.-G., Johansson J. M., Schill G., J. Chromatogr., 125,
327 A976).
Sood S. P., Sartori L. E., Wittmer D. P., Haney W. G., Anal. Chem., 48,
796 A976).
Knox J. H., Laird G. R., J. Chromatogr., 122, 17 A976).
Persson B. A., Lagerstrom P.-O., J. Chromatogr., 122, 305 A976).
Knox J. H., Jurand J., J. Chromatogr., 110, 103 A975).
Глава VIII
ИОНООБМЕННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
А. Основные положения
По нерастворимому остову (матрице) ионообменника опреде-
определенным образом распределены ко валентно связанные функцио-
функциональные группы, способные к диссоциации. Чаще всего это сульфо-
группы, реже карбоксильные группы (катионообменники) либо
третичные аминогруппы или четвертичные аммониевые группы
(анионообменники). Методом ионообменной хроматографии можно
разделить такие соединения, которые в сильнополярных элюентах
хотя бы частично диссоциируют. Разделение основано на различии
сродства ионов к противоионам матрицы ионообменника и ионам,
содержащимся в растворителе.
При разделении органических ионов возможно дополнительное
удерживание, обусловленное сорбцией на матрице ионообменника.
Так, часть матрицы может действовать как обращенная фаза
и влиять на элюирование ионов.
Ионообменную хроматографию в ее классическом варианте мож-
можно считать достаточно известным методом [1—5], и поэтому мы
здесь ограничимся лишь кратким обзором. Упрощенно ионный об-
обмен можно описать обменным равновесием.
Катионный обмен:
<=* Y+ (элюент) + Х+ (матрица)"
Х+ (элюент) + У+ (матрица)"
Анионный обмен:
X" (элюент) + У" (матрица)" *± Y~ (элюент) + X" (матрица)".
Разделение смесей катионов или анионов основано на различии в се-
селективности при сорбции подлежащих разделению ионов по отноше-
отношению к ионам того же знака, удерживаемым обменником в результате
образования ионной пары.
Меняя рН злюента, можно влиять на диссоциацию связанных или
растворенных ионных пар. Этим способом, например, удается разде-
разделить смеси кислот или оснований с различными значениями рК. Од-
Однако для таких разделений следует использовать только сильно-
сильнокислые или си ль но основные обменники. У слабокислых или слабоос-
слабоосновных обменников диссоциация обменника очень быстро по-
подавляется, и ионный обмен прекращается (см. положение элюентов
Н+ или ОН", разд. Г. 3). Изменив ионную силу раствора буфера,

188
Глава VIII
можно сдвинуть равновесие обмена. Изменение ионной силы влияет
на объемы удерживания намного больше, чем изменение значений
рН. Дополнительно на ионообменное равновесие можно повлиять,
заменив"тип буфера или используя подходящие реакции комплексо-
образования.
Приведем простой пример [6]. Многозарядные ионы, как правило, удер-
удерживаются на обменнике сильнее, чем однозарядные. По прочности связи ка-
катионы в разбавленном растворе располагаются в следующий ряд:
м4+ >м3+ >м2+ >м1 +
Если на катионообменнике адсорбированы Fe3 + и Си2 +, то под дей-
действием разбавленной соляной кислоты вымывается сначала медь, затем же-
железо. Разделение катионов при вытеснении с помощью большого избытка
протонов плохое. В то же время если элюентом служит разбавленная фос-
фосфорная кислота, то концентрация протонов недостаточна для вытеснения ка-
катионов из обменника. Однако поскольку железо образует с фосфорной кис-
кислотой отрицательно заряженный комплекс, то оно больше не удерживается
катионообменником и появляется в элюенте. Медь же можно вымыть разба-
разбавленной соляной кислотой.
Ионы тяжелых металлов очень часто образуют анионные ком-
комплексы в концентрированных галогеноводородных кислотах, и адсорб-
адсорбцию комплексов на анионообменниках часто используют для разде-
разделения таких катионов. Для вымывания ионов концентрацию кислоты
непрерывно или периодически уменьшают. Поскольку комплексы раз-
разрушаются с образованием катионов, которые, само собой разумеет-
разумеется, не могут удерживаться на анионообменнике, то эти катионы
вымываются.
С помощью ионного обмена можно разделить также ионогенные
комплексы нейтральных молекул, например борнокислотный ком-
комплекс сахара или бисульфитные продукты присоединения карбо-
карбонильных соединений. Для разделения используют также реакции об-
обмена лигандов на обменниках, заряженных ионами тяжелых метал-
металлов. Поскольку в такой системе должны образовываться комплексы
ионов металлов, связанных с ионообменником (например, комплексы
аминокислот и ионов меди, связанных ионообменником), то здесь,
как при разделении на ионообменниках полярных органических мо-
молекул, например Сахаров, с помощью водно-спиртовых элюентов, не-
нельзя говорить о чистой ионообменной хроматографии. В последнем
случае образуется распределительная система из водной фазы в зер-
зерне обменника и протекающей водно-спиртовой фазы [7].
При разделении органических соединений наряду с обменным ме-
механизмом вклад в удерживание вносят также сорбционные эффекты
на матрице сорбента. Поэтому предсказать селективность -азделе-
-азделения органических соединений на ионообменниках очень трудно.
Ионообменная хроматография
189
Б. Ионообменные материалы
В гл. V уже были названы важнейшие коммерческие ионооб-
ионообменные материалы. Чтобы их можно было использовать в жидкост-
жидкостной хроматографии при высоких давлениях, они должны отвечать
всем тем требованиям, которые предъявляются к ионообменникам
в классической жидкостной хроматографии (нерастворимость, хими-
химическая стабильность и др.), но самое главное - эти материалы дол-
должны быть устойчивы к действию давления.
Хороших хроматографических свойств (низкие значения h, бы-
быстрый массообмен) можно достичь (см. гл. И) только уменьшением
пути диффузии. С этой целью либо уменьшают диаметр частиц на-
насадки, либо заполняют колонку поверхностно-пористыми материала-
материалами. Далее мы рассмотрим типы ионообменников, опробованных
в жидкостной хроматографии при высоких давлениях.
1. Ионообменник с органической полимерной матрицей
Колонки для жидкостной хроматографии при высоком давлении
можно заполнять частицами мелких фракций смол E —20 мкм), ис-
используемых в обычной ионообменной хроматографии. Предпочтение
отдают сильносшитым ионообменникам, например полистирольным
смолам с 6-8% дивинилбензола, так как они слабо набухают
л устойчивы к действию давления. Кроме того, специально для жид-
жидкостной хроматографии при высоких давлениях изготавливают ио-
нообменники в виде шариков диаметром 5 — 10 мкм. Некоторые из
наиболее часто используемых ионообменников приведены в табл. V.7
(см. гл. V).
Если разделение на таких ионообменниках проводится методом
жидкостной хроматографии при высоких давлениях, то прежде всего
следует обратить внимание на следующую зависимость: когда да-
давление превысит некоторое определенное значение, линейная ско-
скорость элюента перестает расти с увеличением перепада давления на
колонке. В таких случаях давление превышает прочность матрицы.
При этом часто ухудшается также разделительная способность ко-
колонки. Уменьшение давления не обязательно приведет к восстано-
восстановлению первоначальных свойств разделительной колонки (раздели-
(разделительная способность, проницаемость и др.).
Прежде чем заполнять колонку, смоле дают предварительно на-
набухнуть. При изменении ионной силы или рН объем набухших ио-
ионообменников, как известно, меняется. Это может повлиять как на
проницаемость, так и на разделительную способность колонки (на-
(например, в результате образования пустот). Емкость таких обменни-
ков достаточно велика, достигает нескольких миллиэквивалентов на
грамм.

190
Глава yill
Ионообменная хроматография
191
2. Полимерные ионообменники на ППМ
В английском языке для определения двух групп таких ионооб-
менников применяют два термина - pellicular от pellicula - кожица
и superficial — поверхностный. Мы назовем их пелликулярными и по-
поверхностно-пористыми ионообменниками.
а. Пелликулярные ионообменники получают следующим обра-
образом: на непроницаемые стеклянные шарики (~ 30 мкм) наносят
пленку из органического полимерного ионообменника [33]. Толщина
слоя составляет примерно 1 мкм. Степень сшивки полимера может
быть небольшой, поскольку он не должен быть устойчивым к дей-
действию давления. Малая степень сшивки и очень тонкий слой полиме-
полимера обусловливают хорошие хроматографические свойства колонок,
заполненных такими насадками, что позволяет уменьшить время
анализа. Другим достоинством этих носителей является независи-
независимость объема насадки от ионной силы элюента. Благодаря этому ко-
колонки можно заполнять 'сухим способом.
б. Поверхностно-пористые ионообменники незначительно отли-
отличаются от описанных выше. Полимерный органический ионообмен-
ник наносят на стеклянный шарик, на котором имеется тонкий слой
пористого силикагеля [37]. Материалы этого типа, как и пеллику-
пелликулярные ионообменники, отличаются малой обменной емкостью
(~ 10 мкэкв./г), так как содержание собственно ионообменника в них
незначительно. На колонках, заполненных поверхностно-пор истыми
ионообменниками, можно разделять только небольшие количества
веществ, поэтому детекторы должны быть очень чувствительными.
Из-за растворимости полимерного ионообменного слоя в органиче-
органических растворителях в качестве элюента можно использовать только
водные растворы. Важнейшие коммерческие материалы этого типа
приведены в табл. V.6.
3. Ионообменники типа «щеток»
На частицы ППМ можно не только нанести полимеры, к ним
можно также «привить» алкильные или арильные группы, образую-
образующие ковалентные связи с атомами поверхности носителя. В эти
группы затем можно ввести ионообменные группы и таким образом
получить ионообменники типа щеток. Имеющиеся в продаже мате-
материалы такого типа приведены в табл. V.6.
Из-за низкой удельной поверхности поверхностно-пористых носи-
носителей ионообменная емкость незначительна C0-60 мкэкв./г). Такие
ионообменники можно использовать в системах с органическими
элюентами. Если исходным материалом служат полностью пористые
силикагели с большой удельной поверхностью, то после проведения
соответствующих реакций (силанизация и последующее введение ио-
ионообменных групп) получают ионообменники с большой емкостью
B00-700 мкэкв./г) [8, 9, 41]. Ионообменная емкость пропорциональ-
пропорциональна удельной поверхности силикагеля-носителя. Если размер частиц
достаточно мал E, 10 мкм), то разделительная способность колонок
отличная и скорость анализа высокая. Эти обменники несжимаемы
и не меняют объем при изменении состава элюента (например, при
изменении ионной силы). Однако при рН > 8,5 силикагель раство-
растворяется, поэтому они не пригодны для сильноосновной среды.
4. Жидкие ионообменники
На силикагель так же, как это делается в распределительной хро-
хроматографии, можно нанести «жидкие ионообменники». Жидкие ио-
ионообменники делятся на а) жидкие ионообменники, например нера-
нерастворимые в воде длинноцепочечные третичные амины или соедине-
соединения с четвертичными аммониевыми основаниями, и б) жидкие
катионообменники, например диалкиловые эфиры фосфорной кис-
кислоты. Стабильность такой системы небольшая, так как прочность
сцепления «жидких ионообменников», имеющих неполярные органи-
органические остатки, с поверхностью силикагеля относительно небольшая.
Многие жидкие ионообменники принадлежат к поверхностно-ак-
поверхностно-активным веществам, которые предрасположены к образованию
эмульсий в воде. Путем гидрофобизации (силанизации) поверхности
силикагеля можно улучшить прочность сцепления ионообменника
с силикагелем. Подобные системы обладают теми же преимущества-
преимуществами и недостатками, что и распределительная система, рассмотренная
в гл. VII.
В качестве примера можно привести разделение катионов на си-
ликагеле, покрытом диалкилсульфокислотой в додекане. Элюирова-
ние проводилось азотной кислотой [44].
В хроматографии ионных пар (см. гл. VII, разд. Б.2) [10, 11, 4&]-_
к элюенту или неподвижной фазе добавляют четвертичные аммо-
аммониевые соли или алкилсульфокислоты, образующие с разделяемыми
кислотами или основаниями соли. Поэтому процессы, на которых
основана хроматография ионных пар, весьма напоминают процессы
разделения на жидких ионообменниках.
В. Характеристика ионообменников
Свойства ионообменника определяются типом входящих в него
функциональных групп. Различают сильно- и слабокислотные ио-
ионообменники, первые содержат сульфогруппы, вторые - карбок-
карбоксильные группы. В сильноосновных ионообменниках имеются
группы третичных аминов или четвертичных аммониевых оснований
в слабоосновных — первичные аминогруппы.
Поскольку матрица заметно влияет на селективность и хромато-
хроматографические свойства ионообменника, необходимо точно знать ха-

192
Глава VIII
/ 2 3
Объем 0,1 н. NaOH, ami
Рис. VIII. 1. Кривые титрования «голого» силикагеля B) и меркогеля Si 100
A) с привитой н-бутилсульфокислотой.
рактеристики носителя функциональных групп. Для ионообменников
с чисто органической матрицей наряду с составом матрицы, напри-
например полистирол, полиметилакрилат и т. д., всегда указывают степень
сшивки матрицы, например процент добавки дивинилбензола в по-
листирольные смолы, поскольку от этой характеристики зависит
устойчивость к давлению и доступность функциональных групп. Чи-
Чисто органические смолы делят на микропористые и макропористые,
в которых подход к микропорам облегчен из-за того, что зерна про-
пронизаны макропорами. Методика получения макропористых смол
разработана относительно недавно. Свойства ионообменников на ос-
основе ППМ зависят от того, каким образом нанесен слой, адсорбиро-
адсорбированы ли органические функциональные группы физически или свя-
связаны химически, а также от типа этой группы.
Важна также обменная емкость. Чем больше обменная емкость,
тем больше максимально допускаемая нагрузка. Кроме того, при бо-
более высокой обменной емкости концентрация солей в элюенте может
превышать 0,01 м, так как к' также растет с увеличением обменной
емкости. Если обменная емкость мала, приходится работать с низки-
Ионообменшя хроматография
193
ми концентрациями ионов, воспроизводимость результатов при этом
ухудшается.
Если в пробе содержатся соли, то возможно полное вытеснение.
Обменную емкость ионообменников определяют обычными ме-
методами (см. [2, 5]). Очень быстрый способ — прямое титрование ос-
основанием или кислотой соответственно кислотных или основных
форм ионообменников. Степень кислотности или основности функ-
функциональных групп ионообменника устанавливают по конечной точке
титрования. Только у сильнокислотных и сильно основных обменни-
ков конечная точка титрования лежит при рН 7. Титрование следует
повторять после нескольких циклов заряжения и регенерирования,
емкость при этом не должна меняться.
На рис. VIII. 1 показана кривая титрования сильнокислотного ка-
тионообменника типа «щетки» (кривая 1) (привитая к силикагелю бу-
тилсульфокислота). Для сравнения приведена кривая титрования сла-
слабокислотного катионообменника силикагеля (кривая 2).
Г. Оптимизация разделения
Как известно, ионообменное равновесие можно описать законом
действующих масс. Если на разделение не оказывается дополнитель-
дополнительное воздействие со стороны матрицы, то можно предсказать селек-
селективность и последовательность элюирования исходя из равновесных
данных
В ионообменной хроматографии успех или неуспех разделения за-
зависит также от свойств элюента. Поскольку в качестве элюента поч-
почти исключительно используют воду, то на разделение можно воздей-
воздействовать, меняя величину рН, род буфера (вид противоионов)
и ионную силу. Кроме того, селективность можно изменить, доба-
добавляя комплексообразующие соединения и органические компоненты.
1. Влияние рН на удерживание
Удерживание слабых кислот или оснований зависит от рН элюен-
элюента, так как в зависимости от величины рН они могут либо находить-
находиться в диссоциированном состоянии и разделяться в результате ионно-
ионного обмена, либо проходить через колонку в виде недиссоцииро-
ванных молекул. Наблюдаемое иногда незначительное удерживание
обусловлено другими причинами.
Зависимость удерживания (величина W) от рН показана на
рис. VIII. 2 на примере некоторых пуриновых и пиримидиновых ос-
оснований. В качестве ионообменника использовали привитую к сили-
силикагелю н-бутилсульфокислоту [12], в качестве элюента - 0,1 м бу-
буферный раствор фосфата натрия с рН 2,5 — 7,5. В области рН > 6 зна-
13 Заказ 825

194
Глава VIII
Ионообменная хроматография
195
Рис. VIII. 2. Влияние рН на значения /с' (пуриновые и пиримидиновые
основания) [12].
Иоиообмениик: м-бутилсульфокислота иа мерогосорбе Si 100, 250 мкэта./г; подвижная фаза: 0,1 м
буферный раствор фосфата натрия.
Проба: 1 - урацил; 2 — гуаиии; 3 - цитозии; 4 — аденин.
чения к' для всех оснований лежат между 1 — 1,8. При указанных
величинах рН обменник уже полностью находится в Na+ -форме,
свободные основания не могут конкурировать с ионами натрия. При
снижении рН значения к' оснований увеличиваются. При низких рН
к' опять почти не зависит от рН. В этой области рН основания уже
полностью протонированы и не могут вступать во взаимодействие
с ионообменником. Точка перегиба кривых с хорошим приближе-
приближением соотиетствует значениям рКа оснований, при которых основа-
основания находятся в равновесии с их солью в соотношении 1:1.
Аналогичная зависимость к' от рН найдена для морфиновых ос-
оснований на частицах ППМ, покрытых катионообменником (Zipax
SCX) для рН 9,1—9,8. Для этой относительно узкой области наблю-
наблюдается лицейная зависимость lgfe'=/(pH) [13]. Удерживание в той
области величин рН, где к' не зависит от рН, можно объяснить влия-
влиянием матрицы. Урацил, который при указанных значениях рН не на-
находится в ионогенном состоянии, удерживается только благодаря
влиянию матрицы.
2. Влияние ионной силы элюента на удерживание
Ионная сила элюента влияет на удерживание намного сильнее,
чем изменение рН. Это известно еще из классической ионообменной
хроматографии (см., например, рис. VIII.3). Если емкость ионообмен-
ника относительно невелика, сильнее всего к' уменьшается с увеличе-
увеличением концентрации фосфата от 0,01 до 0,05 м. У обменников с более
высокой емкостью эта область сдвинута к более высоким концентра-
концентрациям ионов. Влияние концентрации ионов в элюенте на к' объясняет-
объясняется смещением ионообменного равновесия. Значения к! компонентов
пробы обратно пропорциональны концентрациям ионов. Если, ис-
используя значения к', приведенные на рис. VIII.3, построить зависи-
зависимость к' от обратной концентрации, то получим прямую, которая не
проходит через нуль, а пересекает ось при к', равном 0,1 —0,8. Таким
образом можно определить влияние матрицы на удерживание, по-
поскольку в системе с обращенной фазой на сорбцию на поверхности
матрицы почти не влияет концентрация неорганических ионов.
3. Изменение буферного раствора
На селективность разделения можно воздействовать, меняя, ионы
в элюенте. Иногда разделение удается осуществить только с совер-
совершенно специфическими буферными растворами. Примером тому слу-
служит разделение Сахаров в присутствии буферных растворов борной
0,01
0,05 0,1 0,2 0.3
Концентрация NaH2PO4, моль/л
Рис. VIII.3. Влияние ионной силы на значения к' (пуриновые и пиримиди-
пиримидиновые основания).
Иоиообмениик: н-бутилсульфокислота на меркосорбе Si 500, 45 мкэкв./г; элюеит: буферный раствор
фосфата натрия.
Проба: 1 — адеиии; 2 —цитозии; 3 — гуанин; 4 — урацил и тимин.
13*

196
Глава VIII
Ионообменная хроматография
197
кислоты [14]: только с борной кислотой сахар образует комплекс,
способный к ионному обмену. Со всеми остальными буферными рас-
растворами сахара показывают очень низкие значения к', так как они
удерживаются только в результате неионообменной адсорбции.
Элюирующая способность анионов и катионов зависит от того,
насколько сильно они сами удерживаются соответствующим обмен-
ником. Общее правило, определяющее сорбцию неорганических ио-
ионов, уже приводилось. Сила адсорбции анионов на классическом
сильноосновном анионообменнике убывает в следующем ряду:
цитрат > оксалат > I" > HSOJ > NOJ > Вг " > С1" >
формиат > ацетат > ОН " > F "
На различных коммерческих анионообменниках эта последователь-
последовательность варьируется. Для слабоосновных ионообменников порядок ио-
ионов также несколько меняется, например гидроксильные ионы в этом
случае являются сильными элюентами, так как диссоциация слабоос-
слабоосновных анионообменников в щелочной среде уменьшается.
Для сильнокислотного катионообменника также установлена по-
последовательность адсорбции катионов:
Fe3+ >Ba2+ >Pb2+ >Ca2+ >Ni2+ >Cd2+ >Cu2+ >Co2+ > .
>Zn2+ >Mg2+ >Mn2+ >UOf+>Tl2+ >Ag+ >Cs+ >
>Rb+ >K+ >NH+ >Na + >H+ >Li +
У слабокислотных обменников, например у обменников с карбок-
карбоксильными группами, Н-ионы действуют как наиболее сильные
элюенты, поскольку при рН 4,5 эти обменники больше не диссоции-
диссоциируют.
При автоматическом аминокислотном анализе переход от буфера
с лимоннокислым натрием к буферу с лимоннокислым литием ведет
к общему увеличению к'. Благодаря этому удается разделить важней-
важнейшие аминокислоты — аспарагиновую и глутаминовую [15]. Стимули-
Стимулируя образование комплексов компонентов пробы с ионами, которые
находятся в элюенте или связаны с обменником, можно направленно
влиять на селективность разделения и увеличивать или уменьшать
значение к'.
4. Другие методы воздействия
Хотя изменение температуры мало влияет на ионообменное рав-
равновесие [5], оно все же может вызвать уменьшение времени удержи-
удерживания из-за уменьшения, например, неионообменной сорбции. При
повышении температуры разделительной колонки обычно получают-
получаются более острые и симметричные пики (увеличение коэффициентов
диффузии). Эмпирически установлено, что с увеличением темпера-
температуры от 25 до 50°С коэффициент диффузии удваивается. Селектив-
Селективность ионообменного разделения меняется при добавлении к элюен-
ту органических растворителей, полностью смешивающихся с водой,
например низших спиртов, ацетонитрила, тетрагидрофурана. Умень-
Уменьшение гидратации ионов, изменение диссоциации и комплексообра-
зование могут вести к изменению значений к' и относительных удер-
удерживаний. Кроме того, разделительная способность увеличивается
с уменьшением вязкости элюента.
При добавлении к элюентам полярных органических компонен-
компонентов, например спиртов, ионный обмен более или менее подавляется
и разделение проходит по механизму распределительной хромато-
хроматографии. Неподвижная фаза в обменнике при этом состоит из воды,
которая адсорбируется в результате гидратации носителей заряда.
В то же время элюент состоит из смеси вода — спирт. Такие системы
с успехом использовались для разделения Сахаров и углеводов
(см. [7]).
5. Градиентное элюирование
В ионообменной хроматографии элюирование часто проводят
градиентным методом, меняя рН или концентрацию элюента. Ио-
нообменники с органической матрицей меняют объем с изменением
рН и особенно с изменением концентрации ионов, что заметно ухуд-
ухудшает проницаемость колонки или ее разделительную способность
из-за образования пустот. Такое же влияние оказывает и органиче-
органический растворитель, добавляемый в процессе градиентного элюиро-
вания.
При использовании ионообменников на основе ППМ или силика-
гелей с модифицированной поверхностью такие проблемы не возни-
возникают. Хотя сам фосфатный буфер не должен поглощать в УФ-обла-
сти, при градиентном элюировании может наблюдаться смещение
нулевой линии УФ-детектора B54 нм) из-за присутствия в фос-
фосфатных буферах полифосфатов.
Д. Применение
В принципе в данном разделе следовало бы привести только при-
примеры разделения, проведенного на специально полученных, устой-
устойчивых к давлению, ненабухающих ионообменниках. Однако, приме-
применяя жидкостную хроматографию при высоких давлениях, удается
значительно сократить длительность классических ионообменных
разделений, например анализа аминокислот [16, 17], проводя разде-
разделение на более мелких ситовых фракциях обменных смол при незна-
незначительном увеличении давления. Еще больше сократить длитель-
длительность анализа можно, заменив «медленную» реакцию с нингидри-
ном, например, на реакцию с флурамом (Гофман - Ля Рош),
который с первичными аминогруппами дает сильную флуоресцен-

198
Глава VIII
Ионообменная хроматография
199
цию в видимой области [18, 19]. Поэтому мы рассмотрим, как про-
проходит разделение на ионообменниках различных типов, тем более
что ионному обмену в жидкостной хроматографии при высоком да-
давлении посвящены многие монографии [20-24].
Ь Классические ионообменники в жидкостной хроматографии
при высоком давлении
На рис. VIII.4 показано разделение аминокислот на ионообмен-
ионообменной смоле, приемлемой для хроматографии при высоком давлении.
Величина частиц ненабухшей смолы составляет 8—9 мкм. На
сравнительно короткой колонке C5 см) за 2 ч удается разделить 16
аминокислот. Для обнаружения используется флурам. При перепаде
давления примерно 30 атм скорость элюента составляет 0,5 мл/мии.
Подобные смолы со степенью сшивки примерно 8% и небольших
размерах частиц в некоторых случаях можно подвергать даже более
высоким давлениям. Скотт [20а] выполнил многочисленные разделе-
в*Ю'ейп
ВвоЬ
20
40
60
16
30
60
t, MUH
90
120
Рис. VIII.4. Анализ аминокислот (Durrum Datenblatt).
Колонка: 35 см х 3,2 мм (внутр.); неподвижная фаза: ионообменннк дуррум DC-4 А; элюент: буферная
система V по Дурруму; F = 12 мл/ч; Др = 32 атм; реакции определения: флуорескамин — амннко —
флуорнметр.
Проба: / - аспарагиновая кислота; 2 -треонин; 3- серия; 4 - глутамнновая кислота; 5 -глицин;
6 — аланин; 7-цистин; S-валнн; 9-метионин; 10 - изолейцин; // - лейцнн; 12 -тирозин; 13 -
фенилаланин; 14 — лизин; /5 —гистидин; 16 — аргинин.
t, MUH
Рис. VIII.5. Разделение Сахаров методом распределительной хроматографии
на ионообменниках (Siemens Datenblatt 05/05).
Колонка; 50 см х 3 мм (внутр.); неподвижная фаза: ионообменник амннекс А-7 в литиевой форме;
элюент: 0,001 м раствор LiCl в водио-этанольной смеси A5:85); F = 0,45 мл/мин; Др = 270 атм;
Г=70°С.
Проба: / —рамноза; 2 —глюкоза; 3 —сахароза; 4 — трегалоза; 5~мелнбноза; б — рафииоза.
ния для определения органических компонентов в биологических
жидкостях, растворах, например моче, сыворотке и т. д., на классиче-
классических органических ионообменниках. В некоторых отдельных пробах
мочи удалось определить от 100 до 120 веществ, поглощающих
в УФ-области; при использовании специфических реакций с углево-
углеводами идентифицировано 48 компонентов [26, 26а]. Полный анализ
мочи длится от 20 до 30 ч [27]. Разработаны автоматические при-
приборы для клинических лабораторий [27а]. В работе [28] описано
разделение Сахаров в виде боратных комплексов, проведенное мето-
методом жидкостной хроматографии при высоком давлении, а в работе
[29] разделение их методом распределительной хроматографии [29].
Пример разделения показан на рис. VIII.5 [30]. Методом хромато-
хроматографии при высоком давлении на органических ионообменниках раз-
разделены также кето- и оксикарбоновые кислоты [31]. С помощью
аминокислотного анализатора на ионообменнике были идентифици-
идентифицированы ароматические соединения [32].

200
Глава VIII
Ионообменная хроматография
201
2. Поверхностно-пористые материалы
После опубликования основополагающей работы Хорвата и Лип-
ски [33] иа поверхностно-пористых материалах с нанесенным катио-
но- и анионообменным слоем начали проводить разделение нуклеи-
нуклеиновых кисло- и оснований [21—24, 34, 35]. Продолжительность
анализа составляет примерно 30 мин. На силикагеле, покрытом
пленкой полимера, например зипаксе, разделены нуклеиновые кис-
кислоты, компоненты фармацевтических препаратов ит.д [21, 36 — 39].
Оказалось, что ионообменники пригодны для определения и разделе-
разделения составных частей лекарственного растительного сырья (морфин,
героин, метадон) [13]. Изготовлены также ионообменники, у ко-
которых органические радикалы, содержащие ионообменные функцио-
функциональные группы, «привиты» к поверхностному слою силикагеля ча-
частиц ППМ (образуют с ним ковалетные связи). Разделение
нуклеиновых кислот на привитом ионообменнике пермафазе Дюпон
показано на рис. VIII.6. Такие ионообменники с успехом используют
в анализе нуклеотидов [40].
3. Ионообменники на основе химически
модифицированного силикагеля
Ионообменники типа «щеток» сочетают хорошие хроматографи-
ческие свойства с высокой обменной емкостью [8, 9, 12, 41]. На по-
подобных ионообменниках проведены анализы аминокислот [8] и ну-
ю
Рис. VIII.6. Разделение моно-, ди- и
трифосфатов методом градиентного
элюирования (бюллетень методов ЖХ
фирмы Дюпон 820 М 11).
Колонка: 100 см х 2 мм (внутр.); ионообмеииик:
пермофаза А АХ; элюент: экспоненциальный гради-
градиент от 0,002 м КН2РО4 (рН 3,3) до 0,5 м КН2РО4;
скорость подъема 3%/мин; F = 1 мл/мии; Ар = 70 атм.
~TZ Г Г ' ' "- Проба: 1-СМР; 2 -AMP; 3-UMP; 4-GUP;
10 15 20 25 30 35 J-CDP; «-UDP; 7- ADP; S-GDP; 9-CTP;
t, MUH 10 - UTP; 11 - ATP; 12 - GTP.
12
\
г
t, MUH
10 8
6 4
f, MUH
Рис. VIII.7. Разделение витаминов на ионообменниках [12].
Колонка: 50 см х 2,3 мм (внутр.); ионообменник: бутнлсульфокнслота на меркогеле Si 100,
dpsl0 мкм, 230 мкэкв./г; элюеит: 0,02 м буфер фосфата натрия. Слева: рН 5,5; и = 2,2 см/с;
Д, = 90 атм; проба: 1 - тиамнн 2НС1; 2 - амид никотиновой кислоты; 3 - пнридоксол НО. Справа:
рН 3,9; и = 3,6 см/с; Д, = 150 атм; проба: 1 - аскорбиновая кислота; 2 - никотиновая кнлота; 3-
амид никотиновой кислоты; 4 — пиридоксол НС1.
клеи новых кислот и разделение водорастворимых витаминов.
Рис. VIII. 7 показывает разделение на катионообменнике водораство-
водорастворимых витаминов при различных значениях рН [12].
При рН 3,9 амид никотиновой кислоты элюируется в виде
сдвоенного пика. С повышением рН до 5,5 амид никотиновой кис-
кислоты элюируется одним пиком. Одновременно значительно сокра-
сокращается время анализа.
Разумеется, у подобных ионообменников может также наблю-
наблюдаться неионообменная сорбция на матрице [12]. Обзор новейших
применений ионообменной хроматографии можно найти
в статье [43].
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Самуэльсон О. Ионообменные разделения в аналитической химии.—
М. Л.: Химия, 1966, 416 с.
2. Гельферих Ф. Иониты. Основы ионного обмена.—М.: ИЛ, 1962, 490 с.
3. Dorfner К., Ionenaustrauscher. 2. Aufl. Berlin, De Gruyter, 1964.
4. Inczedy J., Analytische Anwendungen von Ionenaustauschern. Budapest,
Verlag der Ungar. Akademie der Wissenschaften, 1964.
5. Rieman III W., Walton H. F., Ion-exchange in Analytical Chemistry,
Oxford, Pergamon Press.

202
Глава VIII
6. Hesse G., Chromatographisches Praktikum. Frankfurt, Akadem. Verlagsges.,
1968.
7. Martinsson E., Samuelson 0., J. Chromatogr., 50, 429 A970).
8. Unger K., Nyamah D., Chromatographia, 7, 63 A974).
9. Weigand N., Sebestian I., Halasz I., J. Chromatogr., 102, 333 A975).
10. Eksborg S., Schill G., Anal. Chem., 45, 2092 A973).
11. Kraak J. C, Huber J. F. K., J. Chromatogr., 102, 333 A975).
12. Weigand N., Dissertation Saarbrucken, 1974.
13. Knox J. H., Jurand J., J. Chromatogr., 87, 95 A973).
14. Khym J. X., Zill L. P., J. Am. Chem. Soc, 74, 2090 A952).
15. Benson J. V., Gordon M. J., Patterson J. A., Anal. Biochem, 18. 228
A967).
16. Ertinghausen G., Adler H. J., Reichler A. S., J. Chromatogr., 42, 355 A969).
17. Firmenschrift, Hamilton Chromatographie-Harze.
18. Udenfried S., Stein S., Bohlen P., Leimgruber W., Weigele M., Science, 178,
871 A972).
19. Benson J. R., Durrum Resin Report No. 6. December, 1973.
20. Скотт Ч. В кн. Современное состояние жидкостной хроматографии.—
М.: Мир, 1974, 325 с.
20а. Scott С. D., Science, 186, 226 A974).
21. Гере Д. В кн. Современное состояние жидкостной хроматографии.—
М.: Мир, 325 с.
22. Brown P. R., High Pressure Liquid Chromatography, Biochemical and
Biomedical Application. Academic Press, 1973.
23. Horvath C. S., in Glick F. (Ed.), Methods of Biochemical Analysis. New
York, Wiley, 1973.
24. Horvath C. S., in Marinsky J. A., Marcus Y. (Eds.), Ion Exchange and
Solvent Extraction. Vol. 5, New York, Dekker, 1973.
25. Scott С D., Chilcote D. D., Lu N. ?., Anal. Chem., 44, 85 A972).
26. Scott С D., Jolley R. L., Pitt W. W., Johnson W. F., Am. J. Clin.
Pathol., 53, 701 A970).
26a. Scott С D., Lee N. ?., J. Chromatogr., 83, 383 A973).
27. Burtis С A., J. Chromatogr., 52, 97 A970).
27a. Scott C. D., in Bodansky O., Lamer A. L. (Hrsg.). Advances in Clinical
Chemistry, Vol. 15, New York, Academic Press, 1972.
28. Liljamaa J. J., Hallen A. A., J. Chromatogr., 57, 153 A971).
29. Hobbs J. S., Lawrence J. G., J. Chromatogr., 72, 311 A972).
30. Anwendungsbeispiel 05/05 der Fa. Siemens, Karlsruhe.
31. Kaiser U. J., Chromatographia, 6, 387 A973).
32. Lange H. W., Hempel K., J. Chromatogr., 59, 53 A971).
33. Horvath C, Preiss В., Lipsky S. R., Anal. Chem., 39, 1422 A967).
34. Brown P. R., J. Chromatogr., 57, 383 A971).
35. Shmukler H. W., J. Chromatogr. Sci., 10, 137 A972).
36. Шмит Дж. В кн. Современное состояние жидкостной хроматогра-
хроматографии.-М.: Мир, 1974, 325 с.
37. Kirkland J. J., J. Chromatogr. Sci., 8, 72 A970).
38. Anders M. W., Latorre J. P., J. Anal. Chem., 42, 1430 A970).
39. Anders M. W., Latorre J. P., J. Chromatogr., 55, 409 A971).
40. Henry R. A., Schmit J. A., Williams R. C, J. Chromatogr. Sci., 11,
358 A973).
Ионообменная хроматография
203
41. Sauders D. H., Barford R. A., Magidman P., Olszewski L. Т., Roth-
bart H. L., Anal. Chem., 46, 834 A974).
42. Eksborg S., Lagerstrom P. O., Modin R., Schill G., J. Chromatogr 83,
99 A973).
43. Walton H. F., Anal. Chem., 46, 398 R A974).
44. Horwitz E. P., Delphin W. H., Bloomquist С A. A. Vandegrift G F
J. Chromatogr., 125, 203 A976).

Глава IX
СИТОВАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
Ситовая хроматография
205
А. Введение
В отличие от описанных выше методов разделения для ситовой
хроматографии характерен один-единственный механизм разделения.
Если взаимодействия между пробой и поверхностью в определенной
степени исключены, то порядок элюирования или объем элюирова-
ния определяется только величиной молекулы (см. гл. IX, разд. Б).
Метод известен под многими названиями. Поскольку первона-
первоначально для этой цели применяли только гели - набухшие в злюенте
полимеры с различной степенью сшивки, то использовали такие на-
названия, как гель-фильтрация [1], гель-проникающая хроматография
или гель-хроматография. Однако поскольку механизм разделения ос-
основан на том, что определенные молекулы из-за своего размера не
могут проникнуть в поры, т. е. исключаются, а гели из-за их незначи-
незначительной устойчивости к давлению не могут быть использованы в ус-
условиях хроматографии при высоких давлениях, то здесь отдано
предпочтение понятию «хроматография исключения» («Ausschelufi-
Chromatographie») *. В качестве неподвижных фаз используют как ги-
гидрофильные (например, сшитые декстраны) [1], так и гидрофобные
материалы (например, сшитый полистирол) [2]. Методам работы
в обычной классической колоночной хроматографии посвящено не-
несколько монографий [3-6], поэтому здесь мы опишем только при-
примеры возможного использования ситовой хроматографии высокого
давления.
Б. Основы ситовой хроматографии
Пористые тела характеризуются удельной поверхностью, объе-
объемом пор и диаметром пор или распределением пор по размерам.
Объем пор твердых тел доступен только для таких молекул, наи-
наибольший диаметр которых меньше, чем диаметр устья пор. Моле-
Молекулы, диффундирующие в поры, попадают в пространство, в кото-
котором не происходит никакого движения, в «стоячую» подвижную
фазу, поэтому они передвигаются по колонке медленнее тех молекул,
* В дальнейшем мы будем пользоваться принятым в отечественной лите-
литературе термином «ситовая хроматография».- Прим. перев.
которые слишком велики, чтобы диффундировать в поры. Распреде-
Распределение пор по размерам никогда не бывает строго монодисперсным,
поэтому резкую границу между исключенными и проникшими моле-
молекулами получают только в том случае, когда проба является индиви-
индивидуальным веществом, т. е. имеет единственную степень полимериза-
полимеризации. Если зто условие не выполняется, то все молекулы, которые
велики, чтобы диффундировать внутрь пор, элюируются с объемом
удерживания, равным объему элюента между частицами (межча-
(межчастичный объем). Разделительная колонка ведет себя таким образом,
как будто она заполнена непористыми инертными стеклянными ша-
шариками (см. гл. II, разд. Б). Молекулы, диаметр которых меньше, чем
диаметр устья пор, могут в большей или меньшей степени диффун-
диффундировать внутрь них. При этом скорость движения молекул вдоль
колонки замедляется по сравнению со скоростью исключенных мо-
молекул, т. е. находящихся вне пор. Снижение скорости движения вдоль
колонки и увеличение объема злюирования тем больше, чем дальше
молекула может диффундировать в поры, т. е. чем больше доступная
часть объема пор. Поскольку в ситовой хроматографии взаимодей-
взаимодействие молекул пробы с поверхностью неподвижной фазы обычно
мало, то злюирование всех молекул, разделяемых в соответствии
с их размерами, заканчивается в тот момент, когда наименьшая мо-
молекула, для которой доступны все поры, появляется на выходе из ко-
колонки. Этому объему Vo разделительной колонки соответствует
мертвое время t0. Все компоненты пробы, злюируемые по истечении
мертвого времени, соответствующего элюированию инертного веще-
вещества, удерживаются в колонке, т. е. вступают в какой-либо форме во
взаимодействия с неподвижной фазой. Мертвый объем Vo состоит из
объема между частицами Vz и объема пор Vp внутри частиц. Раз-
Разность между объемами удерживания наименьшей молекулы и пол-
полностью исключенных молекул соответствует объему пор твердого
тела в разделительной колонке.
Это соотношение схематически показано на рис. IX. 1. В верхней
части рисунка приведены кривые элюирования отдельных стандар-
стандартов полимера, в нижней части — зависимость объема злюирования
от молекулярной массы полимера. С помощью подобной калибро-
калибровочной кривой можно, исходя из объемов элюирования пробы, уста-
установить распределение молекулярных масс полимеров (см. гл. IX,
разд. Г.1). Разумеется, молекулярная масса служит только мерой ве-
величины клубка молекулы полимера в растворителе. В ситовой хро-
хроматографии нецелесообразно пользоваться обычными хроматографи-
ческими величинами: время удерживания, величина к', относительное
удерживание и т. д. Наименьшая молекула всегда имеет наибольшее
время удерживания. Для того чтобы избежать ошибок, обычно гово-
говорят об объеме элюирования Ve. Объем элюирования зависит от диа-
диаметра молекулы пробы и равен сумме межчастичного объема Vz
и доступного для пробы объема пор Vp. Полностью исключенные

206
Глава IX
Ситовая хроматография
207
Рис. IX. 1. Разделение полистиролов различной молекулярной массы [14].
Вверху: хроматограмма, полученная лрн разделении полистролов с мол. массой от 2100 до
2,6 ¦ 106 (бензол использован в качестве наименьшей молекулы). Внизу: калибровочная кривая, полученная
по приведенным результатам.
Колонка: 30 см х 4 мм (внутр.); неподвижная фаза: силикагель (проф. Унгер), ip к 10 мкм;
Vp = 2,05 мл/г; Vz - межчастичиый объем; Гр - объем неподвижной фазы; элюент: хлористый метилен;
и = 0,12 см/с; Др = 22 атм
молекулы элюируются с объемом элюирования Ve = Vz, а самые
мелкие молекулы, например молекулы растворителя,— с объемом
элюирования Ve=Vz+Vp=V0 (рис. IX.1).
Вместо объема Ve обычно используют пористость — величину, от-
отнесенную к объему пустой колонки Vk (см. гл. II, разд. Б) [7]. Ее лег-
легко найти из хроматограммы, и она не зависит от характеристик раз-
разделительной колонки (плотности насадки и т. д.)- Мертвому объему
Vo соответствует полная пористость гт= VJVk — часть объема
колонки доступна для «стоящего» и движущегося элюента. Объем
колонки можно определить с достаточной точностью. В ситовой
хроматографии применяют только пористость ер, пропорциональ-
пропорциональную объему пор (Vp) твердого тела (ер = VP/VK). С увеличением разме-
размера молекулы доступная часть пористости ер уменьшается и соответ-
соответственно сокращается время элюирования.
Для хорошего разделения, помимо определенного числа ступеней
разделения, необходим возможно больший объем пор и при этом
важна не столько величина удельного объема пор насадки (см3/г),
сколько величина доступного объема пор в разделительной колонке
(см3/см3). Из-за того что с изменением удельного объема пор ме-
меняется и кажущаяся плотность материала, даже большое различие
в удельных объемах пор не сказывается на разделении, проводимом
методом ситовой хроматографии, хотя на первый взгляд это пред-
представляется неожиданным. При увеличении удельного объема пор от
0,5 до 1 см3/г, т. е. удвоении его, участвующий в разделении объем
пор увеличивается в колонке только примерно на 30% [18].
Наряду с объемом пор важную роль играет разделительная спо-
способность колонки. Из-за более низких коэффициентов диффузии мо-
молекул полимеров в ситовой хроматографии значение h всегда боль-
больше, чем при разделении проб с меньшей молекулярной массой на
таких же колонках. Поскольку даже узкая полимерная фракция пред-
представляет собой дисперсию, в результате разделения этой фракции на
разделительной колонке пик оказывается размытым и кажущееся
значение h увеличивается. Величина h достигает наибольшего значе-
значения в тех случаях, когда максимум распределения пор по размерам
приблизительно совпадает с диаметром клубка фракции полимера
[19]. Для характеристики разделительной способности колонки в си-
ситовой хроматографии следует использовать только значения h, полу-
полученные для полностью исключенной пробы или для наименьшей мо-
молекулы, лучше всего для индивидуального вещества с определенной
молекулярной массой.
Рабочий объем пор и разделительную способность системы мож-
можно увеличить, последовательно соединяя несколько колонок или про-
пропуская пробу вновь через ту же самую разделительную колонку, т. е.
осуществляя циркуляцию. Циркуляция целесообразна, только если
размывание полосы в коммуникациях и насосе незначительно. Внеко-
лоночное размывание (см. гл. II, разд. Ж) в ситовой хроматографии
может значительно ухудшить разделительную способность, гак как
при этом h увеличивается для всех веществ. Особенно это заметно,
когда разделение проводят на коротких разделительных колонках
(L< 15 см) с малым Vk. Так, если длина колонки составляет пример-
примерно 10 см, то с увеличением диаметра от 3,2 до примерно 8 мм объем

208
Глава IX
Ситовая хроматография
209
ее увеличивается приблизительно в 6 раз, а число теоретических та-
тарелок, если колонка заполнена частицами размером ~ 6 мкм, возра-
возрастает только чуть больше чем в 3 раза (от 1500 до 5000) [18]. Это го-
говорит о размывании полосы вне колонки.
В. Неподвижные фазы для ситовой хроматографии
Неподвижные фазы для ситовой хроматографии были рассмо-
рассмотрены в гл. V.F. Большинство неподвижных фаз, используемых
в классической гель-хроматографии, не пригодны из-за их сжимаемо-
сжимаемости. Некоторые сильносшитые полимеры, например ц-стирагель 500
или гель полиакрилэтиленгликоля, еще пригодны для работы при да-
давлениях до примерно 50 атм.
Колонки для ситовой хроматографии при высоких давлениях за-
заполняют устойчивыми к давлению твердыми фазами с жесткой ма-
матрицей, например силикагелем. Эти материалы по сравнению с «мяг-
«мягкими» гелями имеют некоторые преимущества: ими легче заполнять
колонку, их не нужно выдерживать в элюентах для набухания, про-
проницаемость колонок, заполненных такой насадкой, не зависит от да-
давления. Разделение можно проводить с различными элюентами, так
как за набуханием геля следить не надо. При смене элюента состоя-
состояние насадки не меняется, поэтому смена растворителя осуществляет-
осуществляется относительно быстро и просто. Это увеличивает возможности ме-
метода. Твердые фазы и их пористая структура устойчивы при высоких
температурах почти ко всем органическим растворителям, что осо-
особенно важно, например, при характеристике полиолефинов.
Можно изготовить силикагели с диаметрами пор от 20 до 25000
А. Выпускаются силикагели, частицы которых имеют форму шари-
шариков диаметром 10 мкм и менее; средний диаметр пор их составляет
от 60 до 4000 А. Их можно использовать для разделения полимеров
с обычными в химии полимеров молекулярными массами. На сили-
кагеле с диаметром пор 60 А еще можно разделить молекулы с мо-
молекулярной массой менее 1000, а силикагель с диаметром пор около
4000 А еще не полностью исключает полимеры с молекулярной мас-
массой 7-Ю6 [18]. На силикагеле со средним диаметром пор примерно
250 А можно разделить полистиролы с молекулярными массами от
2000 до примерно 100000 (см. рис. IX. 1).
Недостатком этих полярных неподвижных фаз является их ад-
адсорбционная активность. Однако во многих случаях ее можно по-
подавить, выбрав подходящий элюент (см. элюотропный ряд в табл.
VI.2). Например, полистиролы адсорбируются на силикагеле из четы-
реххлористого углерода (Ve > Vo), а из хлористого метилена, тетраги-
дрофурана или диметилформамида они исключаются, т. е. элюи-
руются разделенными по молекулярным массам (Ve < Vo). Иногда не-
нежелательную остаточную активность можно подавить, проведя сила-
низации поверхности, например, с помощью триметилхлорсилана.
Если к поверхности прививается много углеродсодержащих групп,
как, например, при получении материалов для хроматографии
с обращенной фазой, то объем пор уменьшается пропорционально
числу атомов углерода.
Однако такие фазы всегда имеют заметную каталитическую ак-
активность, что приводит к превращениям или необратимой адсорбции
природных полимеров (белков, ферментов и т. д.) [13]. При исполь-
использовании в качестве элюентов водных растворов компоненты пробы
адсорбируются на таких материалах по принципу обращенных фаз
(см. гл. VI, разд. Г) и разделение только по молекулярной массе ста-
становится невозможным. Применяя органические радикалы с полярны-
полярными функциональными группами, можно получить химически свя-
связанные фазы, которые так же, как, например, силикагель, смачивают-
смачиваются водой. Часто используют [20, 21] фазу с такой функциональной
группой:
Si - СН2 - СН2 - СН2 - О - СН2 -СН - СН2 - ОН
он
Фазы такого типа, например гликофаза или диол, выпускаются на
продажу. Эпоксидную группу можно с помощью воды перевести
в гликольную или обработать другими нуклеофильными соединения-
соединениями, например аминами, спиртами и т. д. [21]. Однако даже подобные
фазы еще могут адсорбировать необратимо некоторые белки и фер-
ферменты [20].
Неподвижные фазы характеризуют по границам исключения и по
калибровочной кривой. Калибровочная кривая представляет собой
зависимость логарифма среднемассового значения молекулярной
массы Mw от объема элюирования Ve (см. рис. IX.1). На калибровоч-
калибровочной кривой имеется линейный участок, соответствующий оптималь-
оптимальной области применения данной фазы. Однако вид подобных харак-
характеристических кривых зависит от типа используемого полимера,
поэтому хроматографисты пытаются получить универсальную кали-
калибровочную кривую. Была установлена зависимость диаметра враще-
вращения клубка полимера от средней молекулярной массы. Определенные
таким образом радиусы были использованы для характеристики ма-
материала носителей [6, 8 -10].
Распределение пор по размерам у органических полимеров отли-
отличается от такового для силикагеля. Для органических гелей харак-
характерны сравнительно широкое распределение пор по размерам, на-
начиная с малых диаметров, и очень острая верхняя граница
исключения. У силикагелей распределение пор по размерам более
или менее узкое и симметричное относительно среднего диаметра
пор. Последовательно соединяя несколько колонок, заполненных си-
ликагелями с различным диаметром пор, можно получить систему,
перекрывающую всю область применения ситовой хроматографии.
14 Заказ 825

210
Глава IX
Ситовая хроматография
211
Г. Применение ситовой хроматографии
Для ситовой хроматографии справедливы все закономерности ко-
колоночной хроматографии. Удвоение длины колонки приводит
к удвоению объема элюирования. Для того чтобы объем пор и раз-
разделительная способность были достаточными, колонка должна быть
длинной. Поэтому необходимо по возможности устранить все при-
причины, вызывающие размывание полос. Разделение на неподвижных
фазах с малым размером частиц дает значительно лучшие резуль-
результаты. Вязкость элюента должна быть как можно меньше (большие
коэффициенты диффузии). По этой причине, а также потому, что
с увеличением температуры растворимость полимеров повышается,
в ситовой хроматографии разделение проводят при более высоких
температурах, иногда лишь немного меньших, чем точка кипения
элюента. Появление пузырьков газа в детекторе можно предотвра-
предотвратить, создавая небольшое избыточное давление A —2 атм) в ячейке.
Специфика применения ситовой хроматографии рассматривается
в ряде монографий [3—6]. Мы же лишь продемонстрируем на от-
отдельных примерах возможности скоростной ситовой хроматографии.
Во многих случаях при анализе очень сложных смесей ситовая хро-
матографил может служить хорошим методом предварительного
разделения и отделения высокомолекулярных примесей. Как сооб-
сообщают авторы работы [18], при использовании жестких гелей при вы-
высоких линейных скоростях (> 1 мм/с) очень большие молекулы (на-
(например, с Mw = 7-106) могут разрушаться под действием срезываю-
срезывающей силы.
1. Определение молекулярно-массового распределения
полимеров
Главной областью применения ситовой хроматографии остается
определение молекулярно-массового распределения полимеров. При
этом предполагается, что молекулы пробы не адсорбируются на по-
поверхности носителя и что между «стоящим» и движущимся элюен-
том моментально устанавливается равновесное распределение моле-
молекул пробы [11].
С помощью соответствующих стандартных полимеров, например
полистирола, с узким молекулярно-массовым распределением полу-
получают калибровочную кривую. Если при проведении расчетов при-
принимают, что гидродинамический радиус молекулы пропорционален
логарифму молекулярной массы и граничной вязкости (индекс Штау-
дингера, истинная вязкость) [т\], то результаты молекулярно-массо-
молекулярно-массового распределения линейных полимеров, отличающихся по химиче-
химическому составу, вполне совпадают [8]. При молекулярной массе
примерно 50000 [12] точность определения молекулярных масс со-
составляет примерно 5%. Иногда результаты менее удовлетвори-
удовлетвориРис. IX.2. Ситовая хроматография
дисперсий полиметилметакрилатов
[10].
Неподвижная фаза: меркогель Si 3500; элюеит:
вода; колонка 160 см х 9 мм (внутр.); F =
— 8 мл/ч. В пике 1070 А содержатся также
частицы большего размера.
1070
640
350 А
Va. мл
тельны, так как не всегда полимеры ведут себя таким образом, как
это описывает изложенная здесь простая модель, тем не менее каче-
качественную картину состава или молекулярно-массового распределе-
распределения пробы полимера получают всегда. Калибровочную кривую для
определяемого полимера следует проверить, с этой целью проводят
независимое определение молекулярной массы. При замене распре-
распределительной колонки и особенно при замене носителя всегда следует
вновь проверить калибровочную кривую по стандартам, так как по-
получить, например, два образца силикагеля с полностью идентичным
распределением пор практически невозможно.
Поскольку пористая структура жестких силикагелей при смене
элюентов не меняется, то не наблюдаются и изменения селективно-
селективности разделительной системы, если только геометрия растворенных
полимерных молекул не зависит от вида растворителя.
Наряду с определением молекулярно-массового распределения
полимеров с помощью ситовой хроматографии были также опреде-
определены радиусы частиц дисперсий полимеров [10]. На силикагеле со
средним диаметром пор 12000 А удалось разделить дисперсии поли-
метилакрилата с диаметрами частиц от 350 до 2390 А. Элюентом
служила вода, в которую в данном случае был добавлен эмульгатор.
Из-за низких «скоростей диффузии» частиц разделение можно вести
только при низких скоростях элюента (~0,1 мл/мин при внутреннем
диаметре колонки 9 мм!). Кривые элюирования для различных дис-
дисперсий C50—2390 А) показаны на рис. IX.2. Калибровочные кривые
дисперсий полистирола и метилметакрилата идентичны. Для частиц
диаметром примерно 1 мкм наблюдается только эффект фильтра-
фильтрации, обусловленный особенностями аппаратуры. Эти частицы были
вновь получены при промывании колонки.
Используя описанный метод определения молекулярной массы
полимеров с помощью ситовой хроматографии, можно решить
обратную задачу - быстро определить распределение пор по разме-
размерам для насадки [7]. Случайные диаметры пор твердого тела сопо-
сопоставляют с полистирольными стандартами и добиваются, чтобы
кривые распределения пор, полученные с помощью ситовой хрома-
хроматографии, совпадали с кривыми распределения, определенными клас-
14*

212
Глава IX
Ситовая хроматография
213
сическим методом (капиллярная конденсация азота, ртутная пороме-
трия). С помощью этих измерений найдено, какому диаметру пор
D соответствует полистирольный стандарт, который исключается.
Зависимость D от молекулярной массы дается следующим соотно-
соотношением:
<P=O,62(MJ0-59.
Среднемассовой молекулярной массе 10000 пробы полистирола, рас-
растворенной в хлористом метилене, или диаметру ее клубка по этой
формуле соответствует диаметр пор 140 А, а молекулярной массе
3,7 • 106 - диаметр пор 4530 А. Удивительно, что соответствующий
полимеру диаметр пор постоянно в 2,5 раза больше [14], чем диа-
диаметр клубка, найденный другим способом [15], т. е. для того, чтобы
моментально устанавливалось равновесное распределение, диаметр
пор должен быть в 2,5 раза больше, чем диаметр клубка полимера.
Этот метод определения кривой распределения пор одинаково
пригоден и для мелких (dp > 1 мкм) и для крупных (dp < 150 мкм) ча-
частиц. Верхняя граница диаметров пор, которую можно определить,
в настоящее время зависит от того, какими фракциями полимеров
располагает экспериментатор. Описанный метод, по-видимому, бу-
будет совершенствоваться.
2. Использование скоростной ситовой хроматографии
в биологии
Использование устойчивых к давлению силикагелей для ситовой
хроматографии белков и т. д. ограничено из-за мешающей необрати-
необратимой сорбции [13]. Путем химической прививки «углеводов» к по-
поверхности пористого стекла можно уменьшить этот мешающий эф-
500000
25
15 5
t, мин
Рис. IX.3. Ситовая хроматография сы-
сыворотки крови человека (Pierce Previews,
июнь 1974).
Неподвижная фаза: глшсофаза G «а пористом стекле с контро-
контролируемым диаметром пор 170 А; колонка: 100 см х 4,2 мм
(внутр.); элюеит: 0,05 м фосфатный буфер, рН 7,0. Главный пик:
альбумин, мол. масса * 70000.
600
Декстраны
ПЭГ
BOO
0 1 2 3 4 5 6
t, мин
Рис. IX.4. Элмирование декстранов и полиэтиленгликоля в системе с гли-
кофазой.
Неподвижная фаза: и Si - СН2 - СН2 - О - СН2 - СНОН - СН2ОН иа Si 100, &, х 10 мкм; колонка:
30 см х 4,3 мм (внутр.); элюеит: вода, F = 2,1 см3/мии; и = 2,6 мм/с; Др — 67 атм, детектор: дифферен-
дифференциальный рефрактометр.
Проба: декстраиы (М„ * 500000 и 10000; рафииоза (М„ = 595); полиэтилеигликоль (М„ = 600); ииерт-
иое вещество D2O.
фект, а в некоторых случаях даже полностью исключить. На рис. IX.3
показано разделение сыворотки крови человека на химически -мо-
-модифицированном пористом стекле. На голом пористом стекле прове-
провести это разделение невозможно, так как в этом случае альбумин ад-
адсорбируется необратимо. К сожалению, даже подобные модифициро-
модифицированные неподвижные фазы всегда необратимо удерживают часть та-
таких белков, как, например, гемоглобин, каталаза и т. д. Объясняется

214
Глава IX
Ситовая хроматография
215
это, по-видимому, тем, что поверхность носителя сохраняет остаточ-
остаточную активность и что поверхность химически связанной фазы
гидрофобна.
Рис. ГХ.4 показывает диаграмму элюирования декстранов и по-
полиэтил енгликоля 600 на подобной гликофазе. В то время как дек-
страны элюируются перед инертным веществом D2O и при этом раз-
разделяются в соответствии с величиной молекул, полиэтиленгликоль
адсорбируется из воды, используемой в качестве элюента, и частично
разделяется на полимергомологические члены. Полиэтиленгликоли
с большими молекулярными массами при этих условиях еще сильно
удерживаются. Меняя состав элюента или полярные связанные функ-
функциональные группы, можно подавить сорбцию полиэтиленгликолей
и разделить их также с помощью ситовой хроматографии.
На гликофазах разделены такие водорастворимые полимеры, как
полимерные клеящие вещества и поливиниловые спирты [22], а так-
также декстраны и цитозан (деацетилированный цитин) [23], и другие
водорастворимые природные вещества, например биологические эк-
экстракты [20, 21, 24]. При разделении последних особенно заметно,
что адсорбция или каталитическая активность неподвижной фазы ис-
исключены не полностью. Некоторые гидрофильные органические по-
полимеры, например сополимеры этиленгликольдиметилакрилата и по-
лиэтиленгликольдиметилакрилата [16], относительно устойчивы
к действию давления. Подобные продукты, например меркогель
PGM 2000, можно использовать до давлений, составляющих при-
примерно 100 атм. К сожалению, эти гели еще не производятся с раз-
различными границами исключения, но для ситовой хроматографии не-
нестойких соединений они пригодны.
13. Kennedy J. F., J. Chromatogr., 69, 325 A972).
14. Martin К., Dissertation Saarbrucken, 1975.
15. Vollmert В., Polymer Chemistry. Berlin - Heidelberg - New York, Springer,
1974.
16. Heitz W., Winan #., Makromolekulare Chem., 131, 75 A970).
17. Peters R., Kontakte, 3, 22 A973).
18. Kirkland J. J., J. Chromatogr., 125, 231 A976).
19. Werner W., Dissertation Saarbrucken, 1976.
20. Regnier F. ?., Noel R., J. Chromatogr. Sci., 14, 316 A976).
21. Chang S. #., Gooding К. M., Regnier Г. Е., J. Chromatogr., 120, 321 A976).
22. Persiani C, Cuker P., French K., J. Chromatogr. Sci., 14, 417 A976).
23. Wu A. C. M., Bough W. A., Conrad E. C, Alden jr. К. Е., J. Chromatogr
128, 87 A976).
24. Chang S. M., Gooding K. M., Regnier F. ?., J. Chromatogr., 125, 103 A976).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Porath J., Flodin P., Nature, 183, 1657 A959).
2. Vaughan M. F, Nature, 188, 55 A960).
3. Детерман Г. Гель-хроматография. Гель-фильтрация. Гель-проникающая
хроматография. Молекулярные сита.—М.: Мир, 1970, 252 с.
4. Altgelt К. #., Advanc. Chromatography, 7, 3 A968).
5. Бомба К. В кн. Современное состояние жидкостной хроматографии.—
М.: Мир, 1974, 325 с.
6. Altgelt К. #., Segal L. (Eds.), Gel Permeation Chromatography, New York,
Dekker, 1971.
7. Halasz /., Martin K., Ber. Bunsenges., 79, 731 A975).
8. Benoit #., Gallot Z., in Kovats E. (Hrsg.), Saulenchromatographie, 1969.
Supplementum zu Chimia., Aarau, 1970.
9. Kreveld M. E., v. Denhoed N., J. Chromatogr., 83, 111 A973).
10. Krebs K.-F., Eisenbeifi F., Vortrag GDCh-Hauptversammlung, 1971. Vgl.
auch EisenbeiB F., Kontakte, 3, 35 A973).
11. Casassa E. F., Tagami Y., Macromolecules, 2, 19 A969).
12. Cooper A. R., Johnson J. F., Porter R. S., Int. Lab. May., June 1973, S. 38.

Глава X
ВЫБОР РАЗДЕЛИТЕЛЬНОЙ СИСТЕМЫ
Выбор разделительной системы
217
Перед начинающим хроматографистом часто стоит вопрос, какая
разделительная система позволит быстро провести оптимальное раз-
разделение. Особенно проблематична такая постановка вопроса прежде
всего в тех случаях, когда о свойствах или составе пробы ничего не
известно.
Предварительные решения можно принять, выяснив раствори-
растворимость пробы. В хроматографии при высоких давлениях к раствори-
растворителям предъявляются особые требования, поэтому следует ограни-
ограничиться только некоторыми стандартными растворителями. Испы-
Испытанными «неполярными» растворителями являются к-гептан (или
углеводороды от пентана до изооктана), 1-хлорпропан, хлористый,
метилен (или хлороформ) иногда с добавкой 5-10% уксусной кис-
кислоты. Само собой разумеется, пригодны также смеси. К стан-
стандартным «полярным» элюентам относятся вода, метанол и другие
низшие спирты, например изопропанол, этанол. Если, например, про-
проба растворяется только в «полярном» элюенте, то заранее известно,
что из-за большой полярности составных частей пробы разделение
методом адсорбционной хроматографии на силикагеле или окиси
алюминия скорее всего не удастся. В этом случае элюирование, ве-
вероятно, возможно только с использованием очень полярных элюен-
тов, например спиртов, ацетонитрила и т. д., но тем не менее разде-
разделение, как это установлено на практике, будет плохим.
Подобные пробы, растворимые только в полярных элюентах,
лучше разделять в системах с обращенной фазой (см. гл. VI, разд. II),
в которых неподвижная фаза неполярна, а элюент полярен, или
в распределительных системах, например тройных смесях. Если речь
идет о соединениях типа солей, то можно попытаться провести раз-
разделение методом ионообменной хроматографии.
Разумеется, некоторые пробы удается более или менее одинаково
хорошо разделить, используя самые разные системы. Так, стероиды
можно разделить методом адсорбционной (см. рис. VI.5), и распреде-
распределительной (см. рис. VII.8) хроматографии, а также методом хромато-
хроматографии с обращенной фазой (см. рис. VI.23). В отобранных системах
путем незначительной модификации элюента можно менять удержи-
удерживание. При выборе системы решающее значение имеют знания
и опыт работы с данной специальной разделительной системой. На-
Например, если хроматографист много работает в области адсорбцион-
адсорбционной хроматографии, то сначала следует попытаться разделить пробу
именно этим методом.
В табл. Х.1 приведены некоторые эмпирические данные, которы-
которыми можно руководствоваться при выборе системы. Разделение отно-
относительно неполярных веществ, различающихся по виду, положению
заместителей или по функциональным группам, по-видимому, имеет
смысл проводить в адсорбционной, системе. Изомеры положения
двойной связи (например, цис- и транс-изомеры) также отлично де-
делятся с помощью подобных систем. В качестве элюентов предпочти-
предпочтительны алифатические углеводороды, хлорпропан, хлористый мети-
метилен или хлороформ и их смеси. Чтобы увеличить полярность
элюентов, можно добавить несколько процентов уксусной кислоты,
так как она относительно слабо поглощает в УФ-области. Уменьшая
удельную поверхность неподвижной фазы, например путем замены
Таблица Х.1
Молекулярное строение анализируемого соединения
н хроматографнческне системы разделения
Структурный параметр
Размер молекулы
Изомеры
Цепь — кольцо
Разветвление с одинаковым числом С
Стерические (цис — транс)
Оптические
Число двойных связей
Положение двойной связи
Гомологический ряд
Заместители (число и положение)
Неполярные (алкил, галоген)
Средней полярности (нитрокарбонильная,
эфирная группа)
Полярные (фенолы, спирты, амины, амиды)
Сильнополярные (кислотные или основ-
основные группы)
Хроматографическая система разделения
I "i
I
"8.
а Только для чисто водных систем.

218
Глава X
неподвижной фазы на силикагель с небольшой удельной поверх-
поверхностью или ППМ, можно получить полное элюирование и для менее
полярных элюентов.
Если полярные смеси растворителей элюируют не все компо-
компоненты пробы, то адсорбционную систему можно постепенно переве-
перевести в распределительную систему, вводя полярные добавки, напри-
например воду, до насыщения неполярных элюентов или получая тройные
смеси, например хлористый метилен, спирт, вода. Как об этом под-
подробно говорилось в гл. VII, в этом случае в порах твердого тела бла-
благодаря преимущественной адсорбции полярных компонентов элюен-
та образуется неподвижная жидкая фаза. Скорость образования
жидкой разделительной фазы зависит от свойств твердой фазы и со-
состава элюента. Чтобы убедиться в постоянстве состава фазы, вводят
пробу повторно и определяют значения к' или относительное
удерживание.
Распределительная хроматография занимает промежуточное по-
положение между адсорбционной хроматографией и хроматографией
на обращенных фазах. Распределительные системы предпочтительны
при разделении членов гомологического ряда. Такое разделение
можно провести и в системах с обращенной фазой. Методом адсорб-
адсорбционной хроматографии можно разделить только низшие члены го-
гомологического ряда. Оптические изомеры удается разделить только
в форме пар диастереомеров (см. рис. VI.21), что в общем не предста-
представляет трудностей. Для расщепления рацематов в принципе пригодны
оптически активные подвижные фазы. Подобные фазы для классиче-
классической колоночной хроматографии известны только в форме про-
производных целлюлозы [2, 3], для жидкостной хроматографии при вы-
высоком давлении они не пригодны. Область применения ионообмен-
ионообменной хроматографии ограничена, так как использовать можно лишь
чисто водные системы. В таких системах можно разделять те ионы
или соединения, которые легко и обратимо образуют комплексы (об-
(обмен лнгандов) с ионами, связанными с ионообменником. Кроме то-
того, на органической матрице ионообменника может также происхо-
происходить неионообменная сорбция. Если в системах с ионообменниками
к водным элюентам добавляют органические растворители, то
элюенты разделяются и образуется распределительная система. Если
бы дополнительно учитывали обе эти возможности разделения на
ионообменниках, то возможности использования этого метода
были бы более многообразны, чем это следует из табл. Х.1.
Основное назначение ситовой хроматографии — разделение моле-
молекул по размерам, хотя во всех рассмотренных до этого системах воз-
возможен эффект исключения. Например, исключение может происхо-
происходить в полярных элюентах, когда у относительно небольших
молекул образуется настолько большая сольватная оболочка, что
они не могут войти в поры, хотя этого нельзя ожидать, если исхо-
исходить только из величины их молекул.
Выбор разделительной системы
219
Если о составе пробы известно мало, то может оказаться по-
полезным исследовать пробу методом ситовой хроматографии с целью
определения молекулярно-массового распределения компонентов
пробы. Полярные полимеры, например белки, проявляют тенденцию
к необратимой сорбции, поэтому опознать их не удается или же они
меняют разделительные свойства колонки. Имея представление
о молекулярной массе пробы, легче выбрать разделительную
систему.
При проведении разделений всегда встает вопрос: все ли компо-
компоненты пробы вымыты или некоторые из них удерживаются настоль-
настолько сильно, что их пик маскируется шумами нулевой линии? Решить
этот вопрос очень сложно. Можно попытаться многократно разде-
разделить одну и ту же пробу в различных системах, однако проще всего
сначала увеличить элюирующую силу элюента и проследить за изме-
изменением положения и числа элюированных пиков. Окончательно ре-
решить вопрос о том, элюированы ли и очень сильно удерживаемые
составные части пробы, можно только после разделения в системе
с обращенными фазами. Если первоначальное разделение проводи-
проводилось в системе с полярной неподвижной фазой (например, с силика-
гелем), то в таких условиях прочнее всего удерживаться должны вы-
высокополярные компоненты. В системе с обращенной фазой, где
неподвижная фаза неполярная, эти компоненты почти не удержи-
удерживаются или удерживаются очень слабо, поэтому можно установить
их наличие. Все сказанное справедливо и в том случае, когда разде-
разделение сначала проводят в системе с обращенной фазой. При этом ре-
рекомендуется перейти от системы с обращенной фазой к адсорбцион-
адсорбционной системе.
Следует взять за правило проводить разделение проб, о составе
которых известно очень мало, по меньшей мере в двух различных
системах. Только при этом условии можно достаточно надежно
идентифицировать составные части пробы.
Быстрому выбору подходящей разделительной системы может
помочь градиентное элюирование. Таким способом можно быстро
установить число компонентов пробы. Зная время элюирования и со-
соответствующий состав элюента, можно сделать заключение о поляр-
полярности составных частей пробы. Все это облегчает выбор элюента для
элюирования при изократных условиях. Поскольку всегда суще-
существует возможность образования ложных пиков, которые возникают
вследствие концентрирования примесей элюента на неподвижной фа-
фазе, то при интерпретации пиков следует быть осторожным. Всегда
желательны дополнительные изократные разделения. При использо-
использовании полярных неподвижных фаз градиентное элюирование на-
начинают с относительно неполярных элюентов, например гептана,
переходят к более полярному элюенту, например хлористому мети-
метилену, и затем к элюенту, к которому в качестве вытеснителя доба-
добавлен компонент с большой элюирующей силой, например 10-50%

220
Глава X
изопропанола. Само собой разумеется, этот путь можно сократить.
Если неподвижная фаза неполярна, то начинают градиентное элюи-
рование водой и постепенно переходят к чистому метанолу. Однако
и в этом случае следует считаться с возможностью появления
ложных пиков.
Перенесение методов разделения, известных из классической ко-
колоночной хроматографии, в хроматографию при высоком давлении
не представляет никаких трудностей. Конечно, это касается только
разделительной системы, но не данных по удерживанию. В распреде-
распределительных системах свойства материала носителя всегда играют не-
некоторую роль, поэтому могут проявиться различия, обусловленные
предварительной обработкой носителя.
При перенесении разделительных систем, используемых в тонко-
тонкослойной хроматографии (ТСХ), в хроматографию на колонке возни-
возникают трудности. Прямой перевод значений ТСХ в соответствующие
параметры удерживания (к', объем удерживания) жидкостной хрома-
хроматографии при высоком давлении очень сложен, хотя формально ве-
величины Rf и к' связаны следующим соотношением:
^ = 1/1+fc'.
Разумеется, это соотношение справедливо только для идентичных
равновесных условий. В разделительной колонке фазовое соотноше-
соотношение постоянное, в то время как в ТСХ объем подвижной фазы в на-
направлении фронта убывает. Состав фаз в колонке постоянный, а
в ТСХ на разделение веществ пробы накладывается разделение
(фронтальный анализ) растворителя (элюента). Состав подвижной
фазы меняется между линией старта и фронтом [4, 5]. Многократно
можно было наблюдать образование нескольких фронтов. Скорость
перемещения фронта (скорость перемещения подвижной фазы)
уменьшается с удалением фронта от уровня проявителя в камере.
Поэтому изократность условий при разделении ТСХ невозможна,
а это основная предпосылка справедливости вышеуказанного соот-
соотношения. По этим же причинам нельзя сравнивать высоту тарелки
или число разделительных ступеней в ТСХ и колоночной хромато-
хроматографии, так как значение h определяют только для постоянной ско-
скорости потока, постоянного фазового соотношения, изократных усло-
условий и т. д. Само собой разумеется, что число тарелок или высоту
тарелки в ТСХ можно получить из величины пятна, однако эти зна-
значения нельзя сравнивать с соответствующими значениями, полу-
полученными методом колоночной хроматографии.
Допуская справедливость приведенного выше уравнения, хотя из
сказанного следует, что это недопустимо, находят, что Rf, равным
0,9, 0,5 или 0,1, соответствуют к', равные 0,1, 1,0 и 9,0. Эти условия
разделения ТСХ @,1 <Ry <0,9) можно реализовать в разделитель-
разделительной колонке @,1 < fc' < 10). Достижимое разделение 5-10 пятен
в верхней половине пластины ТСХ @,5 < R f < 0,9) можно просто
и

222
Глава X
Выбор разделительной системы
223
сравнить с примерно 1000 — 2000 тарелок в колонке. В нижней поло-
половине пластины для ТСХ @,5 < Rf <0,l) можно разделить примерно
такое же количество пятен. Здесь разделительная колонка из-за более
широкой области значений к! A < к! < 10), вероятно, превосходит
ТСХ.
Изложенное свидетельствует о том, что трудности, возникающие
при перенесении разделительной системы ТСХ на разделение в ко-
колонке, не являются неожиданными. Качественное перенесение в коло-
колоночную хроматографию результатов, полученных в ТСХ при исполь-
использовании неполярного однокомпонентного растворителя, относитель-
относительно несложно. Если при этом учитывают содержание воды в слое,
обусловленное влажностью воздуха, и в разделительной колонке
поддерживают те же условия (например, с помощью системы кон-
контроля влажности), то можно воспользоваться результатами разделе-
разделения ТСХ; однако при этом не надо добиваться, чтобы значения к' со-
соответствовали вычисленным из значений Rf. Оптимизировать
разделение в хроматографической колонке можно, незначительно ме-
меняя полярность элгоента.
Целесообразность разделительных систем ТСХ с многокомпо-
многокомпонентными проявителями, полярность которых сильно различается,
намного более проблематична хотя бы только из-за фронтального,
разделения проявляющей жидкости. В этом случае состав проявляю-
проявляющей жидкости и состав фаз, необходимый для элюирования пятен,
можно определить только очень приближенно. Чем больше компо-
компонентов содержит проявляющая жидкость в ТСХ, тем меньше имеет
смысл переносить результаты разделения, проведенного этим мето-
методом, на колоночную хроматографию. Данные колоночной хромато-
хроматографии следует дополнять данными ТСХ. Так, основываясь на ре-
результатах разделения ТСХ, очень просто установить, можно ли
элюировать все компоненты с помощью выбранного элюента (в
стартовом пятне не остается никакой пробы!). Благодаря разнообра-
разнообразию реагентов для обнаружения такое решение можно принять отно-
относительно просто. При использовании селективных реагентов по
меньшей мере полутают дополнительную информацию о составе
пробы.
Эти соображения справедливы исключительно для хроматогра-
хроматографии на полярных неподвижных фазах (SiO2, A12O3). К сожалению,
в настоящее время еще не существует пригодных для практических
целей систем, которые позволяли бы проводить разделение на обра-
обращенных фазах методом ТСХ.
В табл. Х.2 еще раз приведены характеристики рассмотренных си-
систем и указаны важнейшие правила выбора систем и способа влия-
влияния на удерживание проб [1].
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Hesse G., Chromatographisches Praktikum. Frankfurt/Main, Akad. Verlagsge-
' sellschaft, 1968.
2. Luttringhaus A., Hess U., Rosenbau H. J., Z. Naturforsch., 22b, 1296 A967).
3. Hesse G., Hagel R., Chromatographia, 6, 277 A973).
4. Geiss F., Parameter der Dunnschicht-Chromatographie. Braunschweig, Vieweg,
1972.
5. Engelhardt H, Engel В., Chromatographia, 1, 490 A968).

Глава XI
СПЕЦИАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ РАЗДЕЛЕНИЯ
А. ПРЕПАРАТИВНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
Препаративным разделением обычно называют анализы, в ко-
которых величина пробы составляет от 10 мг до нескольких граммов. Та-
Такие разделения можно проводить на обычных приспособленных для
аналитических разделений приборах. Для многих современных мето-
методов исследований достаточно 10—100 мг вещества.
Препаративное разделение можно проводить, только если получе-
получено хорошее аналитическое разделение при такой величине пробы, ко-
которая соответствует линейной области, т. е. при максимальной на-
нагрузке 10"*—10~3 г пробы на грамм неподвижной фазы. Как
известно, максимальная предельная нагрузка (см. гл. VI, разд. I.A,
и рис. VI .2) равна тому максимальному количеству пробы, при кото-
котором разделение на определенной колонке происходит без ухудшения
ее разделительной способности. На обычных аналитических колон-
колонках (внутренний диаметр 3-4 мм и длина 30 см) можно легко разде-
разделить пробу примерно в 1 мг. Для многих дорогостоящих природных
веществ это уже «препаративное» количество. При аналитическом
разделении (когда величина пробы соответствует линейной области),
меняя условия разделения, можно оптимизировать разделение таким
образом, что расстояние между пиками станет очень большим. Само
собой разумеется, что при этом длительность анализа увеличивается.
Если пики удалены друг от друга достаточно далеко, то пробу мож-
можно увеличить. Хотя пики при этом станут шире, перекрывания зон
веществ тем не менее не произойдет из-за лучшего разрешения. Та-
Таким образом можно на аналитических хроматографических колонках
разделять «препаративные» количества веществ от 5 до 100 мг. Сле-
Следует только учесть, что с увеличением пробы время удерживания
становится меньше. При очень больших пробах элютивная хромато-
хроматография может перейти в вытеснительную хроматографию (ср. гл. I):
пик одного компонента при определенных условиях вытесняется из
колонки пиком следующего за ним второго компонента. В этом слу-
случае зоны злюируемых соединений больше не разделены зонами чи-
чистого элюента.
Увеличивая диаметр колонки, можно увеличить пробу разделяе-
разделяемого вещества; однако, чтобы получить ту же самую линейную ско-
скорость элюента на колонке с вдвое большим диаметром, скорость
подачи элюента необходимо увеличить вчетверо. Максимальная про-
производительность насосов, используемых в жидкостной хроматогра-
Специальные методы разделения
225
фии при высоком давлении, составляет обычно 10—15 мл/мин, по-
поэтому увеличивать диаметр колонки можно в определенных преде-
пределах — до 8 — 10 мм. Разделительная способность подобных колонок
полностью соответствует разделительной способности аналитиче-
аналитических колонок. Незначительное модифицирование аналитических при-
приборов позволяет проводить разделение на более широких раздели-
разделительных колонках (до 25 мм) [1, 11 — 14]. Колонки большего
диаметра невыгодны, так как узкие фракции мелких частиц адсор-
адсорбентов относительно дороги. Путем автоматизации и непрерывного
повторения анализа на тонких колонках можно разделить такие же
количества веществ, как и на широких колонках. В продаже имеются
приборы для автоматических препаративных разделений, снаб-
снабженные коллектором фракций и приспособлением для автоматиче-
автоматического ввода пробы, которое управляется программным устройством.
С помощью этих приборов можно не только собирать отдельные
фракции, но и в заданный момент вновь автоматически вводить про-
пробу. Однако автоматизировать анализ можно лишь при условии, что
параметры разделения длительное время остаются постоянными.
Мы не будем больше касаться технической стороны проблемы.
Многократное препаративное разделение небольших проб на анали-
аналитических колонках или колонках с несколько увеличенным внутрен-
внутренним диаметром (до 10 мм) в настоящее время, по-видимому, следует
считать наилучшим решением, так как для такого разделения при-
пригодно большинство выпускаемых аналитических хроматографов.
Для уменьшения расхода элюентов и разделяющих материалов
можно воспользоваться методом рециркуляции, часто применяемым
в ситовой хроматографии для увеличения числа разделительных та-
тарелок. В этом случае колонку можно нагрузить значительно сильнее,
так как протекающая проба разбавляется. Рециркуляцию можно
проводить до тех пор, пока наиболее быстрый пик не догонит наибо-
наиболее медленный. При подаче элюента с выхода колонки на вход в на-
насосе не должно происходить значительного смешивания, приводяще-
приводящего к размыванию полос.
Совершенно другой принцип положен в основу коммерческих
препаративных жидкостных хроматографов. Эти приборы рассчи-
рассчитаны на достижение максимальной производительности при мини-
минимальных затратах. Этого добиваются за счет снижения качества раз-
разделения. Разделительные колонки выпускаются в виде полиэтиле-
полиэтиленовых гильз с внутренним диаметром 5 см, заполненных дешевым
силикат ел ем с большим размером частиц E0—100 мкм). Гильзы до-
достаточно просто вставляются и извлекаются из кассеты для такой
колонки. Оптимальная плотность упаковки достигается благодаря
радиальному сжатию колонки в кассете, что дополнительно улуч-
улучшает разделительную способность системы. Поскольку необходимый
перепад давления сравнительно мал, даже простые насосы позво-
позволяют подавать элюент в колонку со скоростью 50—500 мл/мин. На
15 Заказ 82S

226
Глава XI
такой колонке можно довольно легко разделить пробу в несколько
граммов. При этом, безусловно, не нужны ни предварительная
очистка, ни предварительное удаление неэлюируемых компонентов
пробы, например белковых веществ в биологических материалах и т. д.
По сравнению с высококачественным аналитическим разделением
такой подход предпочтителен прежде всего в тех случаях, когда не-
необходимо отделить друг от друга относительно немного компонен-
компонентов, как, например, при препаративном выделении соединений орга-
органического синтеза и т. п.
При препаративных работах пробу можно вводить с помощью
шприца или петли для ввода пробы. Более разбавленные растворы
вводят преимущественно последним способом. Дополнительным
размыванием полосы при препаративных работах можно пренебречь.
Иногда при препаративных работах возникают трудности, связанные
с вводом пробы и равномерным распределением пробы по всему се-
сечению колонки. Прежде всего в этом случае уже несправедливо эм-
эмпирическое правило, согласно которому раствор пробы при вводе
должен быть как можно более концентрированным. Авторы работы
[2] показали, что при одинаковом количестве пробы разбавленные
растворы дают меньшее размывание полосы, чем концентриро-
концентрированные растворы. Это можно объяснить местными перегрузками
разделительной системы.
По этой причине, а также из-за ограниченной растворимости со-
составных частей пробы в элюенте при определенных условиях прихо-
приходится вводить относительно большой объем пробы. Объем пробы
влияет на форму пика, только если он становится больше стандарт-
стандартного отклонения колонки (в единицах объема), вызванного процес-
процессом смешения внутри колонки [16]. Стандартное отклонение колон-
колонки можно легко определить из ширины пика у основания (w = 4ст) на
хроматограмме на ленте самописца (а, измеряется в секундах) и из
объемной скорости. У обычных разделительных колонок, запол-
заполненных силикагелем с диаметром частиц примерно 10 мкм, это
объемное стандартное отклонение составляет 50—150 мкл. При
больших объемах проб гауссова кривая переходит в прямоугольный
пик. Из-за увеличения площади пика, обусловленного увеличением
объема пробы, разделение двух соседних пиков ухудшается, даже ес-
если это не вызвано большой нагрузкой колонки.
Как правило, обычные детекторы для препаративного разделения
слишком чувствительны. У фотометрических детекторов необходи-
необходимую чувствительность подобрать очень просто: нужно уменьшить
толщину слоя раствора в ячейке. Конечно, у некоторых детекторов
увеличение расхода элюента приводит к колебаниям нулевой линии
и увеличению шумов. Отводная трубка детектора должна быть как
можно короче и шире для того, чтобы при большой скорости элюен-
элюента окошки ячейки не находились под слишком большим давлением
и чтобы это не привело к разрушению ячейки.
Специальные методы разделения
227
Итак, препаративные работы можно проводить на дорого-
дорогостоящих дающих хорошее разделение аналитических приборах,
используя колонки, заполненные носителем с малым диаметром
частиц, и на сравнительно дешевых колонках с посредственной
разделительной способностью. Какое из этих направлений победит,
пока еще сказать нельзя. Заметим только, что производитель-
производительность, которой нельзя пренебрегать при препаративных разде-
разделениях, не зависит от размеров частиц, если условия работы
идентичны.
Б. Количественный анализ
Жидкостная хроматография при высоком давлении, как и все
хроматографические методы, позволяет провести не только каче-
качественный, но и количественный анализ. Как и во всех хроматографи-
ческих методах, в данном случае площадь пика также пропорцио-
пропорциональна величине введенной пробы. Выбор способа определения
площади пика зависит от имеющегося опыта. Как и в газовой хро-
хроматографии [3, 4], можно рассчитать площадь пика, умножив высоту
пика на ширину его на половине высоты, можно также определить
площадь с помощью дискового интегратора или электронного инте-
интегратора или с помощью компьютера [5]. Ошибки в результатах из-
измерения площади составляют от 1 до 5% и при графическом опреде-
определении зависят от навыка экспериментатора.
Причины ошибок частично уже известны из газовой хроматогра-
хроматографии. Так, если пробу вводят в колонку шприцем, то из-за высокого
противодавления трудно добиться того, чтобы введенные количества
раствора были строго одинаковыми. Если шприц применяется дли-
длительное время, то большая часть вещества может выдавиться проти-
противодавлением по поршню. При точных количественных исследованиях
и прежде всего при серийных анализах используют петлю для ввода
пробы, так как воспроизводимость результатов при этом выше. При
введении пробы с помощью шприца всегда следует использовать
«внутренний стандарт», чтобы исключить ошибку, связанную с вво-
вводом пробы. В качестве внутреннего стандарта к пробе добавляют
точно известное количество вещества, не содержащегося в исходной
смеси. Это контрольное вещество по возможности следует выбирать
таким образом, чтобы оно элюировалось на «пустом» месте хрома-
тограммы, полученной до его введения. Путем отнесения результа-
результатов к площади этого стандарта компенсируют ошибку, обусловлен-
обусловленную введением пробы с помощью шприца. Причиной ошибки,
связанной с процессом хроматографического разделения, часто
является неполное элюирование пробы; по этой причине сумма пло-
площадей определенных пиков, принимаемая за 100%, может быть оши-
15*

228
Глава XI
бочной. Этот источник ошибок можно исключить, если проводить
измерения в двух независимых друг от друга системах.
Показания детекторов в жидкостной хроматографии при высоком
давлении пропорциональны# концентрациям [6]. С помощью само-
самописца регистрируют изменение концентрации как функцию времени.
При количественном анализе, измеряя площади, интегрируют кон-
конс I Для того чтобы получить интере-
интерецентрацию по времени
сующую величину массы (г), площадь пика следует умножить на ско-
скорость потока (см3/с). Поэтому количественный анализ, основанный
на измерении площадей, не может быть точным, если нет гарантии,
что скорость потока остается постоянной не только в течение всего
анализа, но и во время элюирования одного пика. У всех коммерче-
коммерческих приборов постоянство скорости потока гарантируется с точ-
точностью ± 1%. Если концентрации компонентов пробы рассчиты-
рассчитываются по высоте пиков, то необходимо обращать внимание на
постоянство значений к' или на постоянство объема удерживания.
Показания детекторов в жидкостной хроматографии зависят от
типа вещества, поэтому для каждого конкретного соединения сле-
следует получить специальную калибровочную кривую. Работая с УФ-
детекторами, необходимо помнить, что литературные значения коэф-
коэффициентов поглощения нельзя использовать даже в тех случаях,
когда детектор работает на той же самой длине волны. Ширина
спектральной полосы обычных УФ-детекторов для жидкостной хро-
хроматографии при высоком давлении равна 5—15 нм, тогда как в ра-
работах обычно приводятся молярные коэффициенты поглощения для
полосы 0,5—1 нм. Поэтому коэффициенты поглощения, которыми
пользуются при количественной обработке хроматограммы, зависят
от типа детекторов или ширины их спектральной полосы. Обычно
эти коэффициенты ниже и зависят от формы УФ-полосы поглоще-
поглощения. Для бензола етах = 215 при 255 нм [7]; в то же время при 254 нм
при ширине спектральной полосы 10 нм коэффициент поглощения
равен ~ 100.
Относительно большая ширина спектральной полосы является
причиной ограниченной линейности показаний детекторов для
жидкостной хроматографии. Отклонения от закона Ламберта — Бера
становятся тем больше, чем круче полоса поглощения [8]. Только
у веществ с очень плоским максимумом поглощения отклонением от
закона Ламберта — Бера можно пренебречь. Благодаря этим откло-
отклонениям линейная область УФ-детекторов ограничена ~5-102 едини-
единицами концентрации. Если необходимо увеличить область концентра-
концентрации до 103 единиц концентрации, то в области высоких концентра-
концентраций следует допустить отклонения от линейности до 10% и более.
При количественном анализе из-за зависимости интенсивности
поглощения от температуры (прежде всего когда измерения прово-
Специалъные методы разделения
229
дят на плече лолосы поглощения) необходимо термостатировать ко-
колонку и измерительную ячейку. Кроме того, следует соблюдать все
меры предосторожности, известные из фотометрии [8].
В. Анализ микропримесей
Поскольку чувствительность детекторов, используемых в жидко-
жидкостной хроматографии, ограниченна, часто задача, стоящая перед хро-
хроматографистом, состоит в том, чтобы определить микропримеси
определенного компонента в смеси. Если даже концентрация веще-
вещества в анализируемой пробе' еще достаточно велика для прямого
определения, то после разделения из-за разбавления в процессе хро-
матографического элюирования она становится намного меньше.
Поэтому, чтобы все же можно было проводить определение, следует
увеличить вводимую пробу. Это не вызывает осложнений, особенно
если работа ведется с очень разбавленными растворами, так как ко-
колонку при этом не перегружают. Существует правило, что в колонку
можно вводить, не вызывая заметного дополнительного размывания
полосы, пробу, объем которой не превышает примерно 5% объема
колонки. Объем пробы можно увеличить еще больше, если значение
к' определяемого вещества приблизительно больше 2 и не нужно
определять вещества, элюируемые перед ним. В неподвижной фазе
скорость перемещения компонентов вдоль колонки меньше скорости
элюента, поэтому при к! > 2 проба концентрируется и перемещается
по колонке в виде более узкой, чем это отвечает объему введенной
пробы, зоны.
Следовательно, разделительную колонку можно использовать
для накопления и концентрирования микропримесей. Если в выбран-
выбранной системе все нужные компоненты пробы удерживаются очень
сильно, то они сконцентрируются в начале колонки. Это может про-
произойти и при неоднократном введении разбавленного раствора про-
пробы, и при прокачивании раствора пробы через колонку. Повышая за-
затем элюирующую силу элюента, можно начать элюировать сконцен-
сконцентрированные таким образом компоненты пробы. Необходимость
такого накопления компонентов пробы методом адсорбционной
фильтрации (см. гл. I) возникает в тех случаях, когда надо опреде-
определять очень незначительные количества веществ в большом объеме.
Работая с водными растворами, для накопления и концентрирования
компонентов можно использовать системы с обращенной фазой. Ес-
Если растворитель неполярный, применяют обычную адсорбционную
систему с сильно полярной неподвижной фазой.
Если сконцентрировать нужные компоненты пробы не предста-
представляется возможным или если даже после сконцентрирования чув-
чувствительность недостаточна, то ее можно повысить, уменьшая сте-
степень разбавления пробы в процессе разделения. Мы не будем
обсуждать вопросы повышения чувствительности детекторов за счет

230
Глава XI
уменьшения шумов, подбора рабочей длины волны, толщины слоя
и т. д.
Чтобы провести разделение, необходимо определенное число тео-
теоретических тарелок. Поскольку разбавление зависит от длины колон-
колонки или времени пребывания компонентов пробы в разделительной
колонке, то для анализа микропримесей следует использовать как
можно более короткие колонки с необходимым числом тарелок Вы-
Высота тарелки уменьшается с уменьшением радиуса частиц, поэтому
анализ микропримесей целесообразно вести на колонках, запол-
заполненных частицами как можно меньшего размера. При этом необхо-
необходимое число тарелок получают в значительно более коротких колон-
колонках, в которых из-за меньших t0 наблюдается меньшее разбавление.
Высота тарелки зависит от линейной скорости элюента, поэтому при
анализе следует выбирать скорость потока, соответствующую ми-
минимальной высоте тарелки, т. е. проводить разделение при hMm, имш,
"макс- Разделительную способность в этом случае оптимизируют за
счет времени анализа.
Времена удерживания следует подбирать таким образом, чтобы
значения к' были небольшими, так как иначе будут получаться широ-
широкие пики.
Разделительная способность не зависит от внутреннего диаметра
колонки, если и узкие, и широкие колонки заполнены одинаково хо-
хорошо, а размывание при этом тем меньше, чем меньше внутренний
диаметр колонки, т. е. площадь поперечного сечения г2п, по которой
распределяется проба!
В литературе подробно обсуждается влияние этих параметров на
пределы чувствительности [9, 10].
Таким образом, для" определения микрокомпонентов следует ис-
использовать как можно более короткие разделительные колонки, за-
заполненные частицами наименьшего размера. Внутренний диаметр
колонок должен быть наименьшим из возможных, а скорость элюен-
элюента должна соответствовать имин. Систему следует подбирать таким
образом, чтобы значения к' были оптимальными, т. е. лежали в преде-
пределах 1,5 — 4. Если работа ведется с сильно разбавленными раствора-
растворами и не нужно опасаться, что колонка окажется перегруженной, то
можно увеличивать объем пробы до тех пор, пока пик исследуемого
вещества не станет заметно размываться.
Если проба, в которой следует определить микрокомпоненты,
имеется в неограниченном количестве, то диаметр колонки не играет
никакой роли [17]. Величину пробы можно увеличивать до границы
предельной допустимой нагрузки, а в тех случаях, когда селектив-
селективность разделительной системы для отделения микрокомпонентов до-
достаточно велика, нагрузку можно увеличивать и больше, жертвуя
разделением.
Специальные методы разделения
231
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Wolf III J. P., Anal. Chera., 45, 1248 A973).
2. De Stefano J. J., Beachell H. C, J. Chromatogr. Sci., 10, 654 A972).
3. Kaiser R., Gas-Chromatographie, Bd. IV, Quantitative Bestimmung. Mann-
Mannheim, Bibliograph. Inst.
4. Ettre L. S., Zlatkis A. (Eds.), Practice of Gas Chromatography. New York,
Interscience, 1967.
5. Karger B. L, Barth H., Dallmeier ?., Couttois G., Keller H. ?., J.
Chromatogr., 83, 289 A973).
6. Halasz I., Anal. Chem., 36, 1428 A964).
7. Сильверстейн P. Спектрофотометрическая идентификация органических
соединений. - M.: Мир, 1977, 590 с.
8. Kortim С, Kolorimetrie-Photometrie und Spektrometrie. 4. Aufl. Berlin —
Gottingen - Heidelberg, Springer, 1962.
9. Meijers С A. M., Hulsman J. A. R. J., Huber J. F. K., Z. Anal. Chem.,
261, 347 A972).
10. Karger B. L., Martin M., Guiochon G., Anal. Chem., 46, 1640 A974).
11. Wehrli A., Z. Anal. Chem., 277, 289 A975).
12. Larmann J. P., Williams R. C, Baker D. R, Chromatographia, 8, 92 A975).
13. Attebery J. A., Chromatographia, 8, 121 A975).
14. Godbille ?., Devaux P., J. Chromatogr., 122, 317 A976).
15. Gonroe K., Chromatographia, 8, 119 A975).
16. Wehrli A., Hermann U., Huber J. F. K, J. Chromatogr., 125, 59 A976).
17. Halasz I., Endele R., Asshauer J., J. Chromatogr., 112, 37 A975).

Глава XII
ОЧИСТКА РАСТВОРИТЕЛЕЙ
Очистка растворителей
233
При разделении с помощью жидкостной хроматографии плохая
воспроизводимость результатов чаще всего обусловлена недостаток
ной чистотой растворителей, используемых в качестве элюентов. За-
Загрязнения накапливаются в разделительной колонке, что может при-
привести к искажению результатов определения. Этот вопрос подробно
обсуждается в гл. VI. Незначительные следы полярных примесей, та-
таких, как вода, спирт и т. д., меняют свойства разделительной си-
системы, особенно если разделение проводится методом адсорбцион-
адсорбционной хроматографии.
Желательно, чтобы все элюенты перед применением были пере-
перегнаны, особенно если после разделения проба должна быть вновь
выделена. В противном случае нелетучие компоненты элюента могут
загрязнить пробу. При градиентном элюировании примеси, содер-
содержащиеся в неполярном элюенте, могут концентрироваться на колон-
колонке. При переходе к более сильным элюентам эти примеси элюируют-
ся в виде острых зон, которые ошибочно можно принять за
компоненты пробы. На рис. ХИЛ показан пример такого разделения
(нижняя хроматограмма).
Верхняя хроматограмма, на которой при градиентном элюирова-
элюировании почти не видно примесей, получена при использовании гептана,
который помимо перегонки был дополнительно очищен адсорбцион-
адсорбционной фильтрацией через окись алюминия.
При помощи этого метода очистки [1 — 5] не только удаляют по-
полярные примеси, в том числе и воду, но одновременно получают
элюенты со значительно лучшим пропусканием в УФ-области. Хло-
Хлористый метилен и хлороформ, граница пропускания которых лежит
вблизи наиболее часто используемой длины волны УФ-детектора
B54 нм), следует почти всегда предварительно очищать этим спосо-
способом; при этом значительно увеличивается область линейности
сигнала.
Очищают растворители методом классической колоночной хро-
хроматографии. Колонку с внутренним диаметром 2—5 см, длиной
40—150 см заполняют высокоактивными адсорбентами, например
окисью алюминия и силикагелем, и сразу же наливают сверху
элюент. Первую часть капающего из колонки растворителя соби-
собирают отдельно, так как чаще всего он недостаточно чист, но его
5 4 з 2 1 о
t, MUH
Рис. XII. 1. Очистка растворителей. Градиентное элюирование без введения
пробы.
Элюент: н-гептан -> хлористый метилен, а — разделительную колонку промывают IS мнн перегнанным
н-гептаном н проводят градиентное промывание до хлористого метилена; 6 — разделительную колонку
промывают 15 мин н-гептаном, дополнительно очищенным с помощью адсорбционной фильтрации
через окись алюминия. Колонка: 30 см х 4 мм (внутр.); неподвижная фаза: силнкагель меркогель
Si 100; F - 4,6 мл/мин; Др = 70 атм.
можно опять налить в верхнюю часть колонки. Средняя и главная
фракции вполне пригодны для работы.
Если колонка отработана, то на выходе из нее появляется ис-
исходный, содержащий примеси растворитель. Количество очищенного
растворителя зависит от активности, т. е. от удельной поверхности
адсорбента, полярности растворителя, количества примесей в раство-
растворителе и их полярности. Ниже приведены величины, дающие лишь
ориентировочные соотношения адсорбента и растворителя. Опыт-
Опытным путем следует стандартизовать то количество примесей в дан-
данном элюенте, которое выбранный адсорбент может поглотить. На
100 г окиси алюминия можно очистить примерно 150-600 мл али-
алифатических углеводородов (пентан, гексан, гептан и т. д.). Силика-

234
Глава XII
гель, обладающий большей удельной поверхностью, имеет большую
емкость. Наилучшие результаты очистки достигнуты на смешанных
колонках, заполненных окисью алюминия и силикагелем [4]. Для ре-
регулирования скорости потока на конце колонки следует установить
кран, который, однако, должен работать без смазки!
Объем полярных элюентов, например хлористого метилена, хло-
хлороформа и т. д., который можно очистить тем же количеством ад-
адсорбента, конечно, меньше B00—400 мл/100 г окиси алюминия). Если
проводится очистка уже высушенных элюентов, количество очищен-
очищенного растворителя можно увеличить.
Элюенты, стоящие в элюотропном ряду ниже эфиров уксусной
кислоты, таким способом очистить нельзя. Эти элюенты можно вы-
высушить с помощью цеолита 3 А, но не очистить. Такие растворители
целесообразно хранить над цеолитом, так как из-за большого разме-
размера частиц (> 1 мм) молекулярное сито мало пригодно для проведе-
проведения процесса очистки в колонках. В высушенных таким способом
элюентах могут содержаться мелкие твердые частицы, которые иног-
иногда нарушают работу клапанов насоса. Хорошо высушенные элюенты
гигроскопичны. Работать с такими растворителями следует в усло-
условиях, исключающих возможность попадания в них влаги, и хранить
их над свежерегенерированным и высушенным молекулярным ситом.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Wohlleben G., Angew. Chem., 67, 741 A955).
2. Wohlleben G., Angew. Chem., 68, 752 A956).
3. Hesse G., Schildknecht H., Angew. Chem., 67, 737 A955).
4. Hesse G., Engelbrecht B. P., Engelhardt H, Nitsch S., Z. Anal. Chem., 241,
91 A968).
5. Engelhardt H., in Zief M., Spieghts R. M. (Eds.), Ultrapurity. New York,
Dekker, 1972.
ПРИЛОЖЕНИЕ
Поставщики (состояние на 1977 г.)
Комплектное оборудование поставляют следующие фирмы:
1. Abimed, Analysentechnik
Ludwigshafener Str. 26, 4000 Dusseldorf
2. Altex Scientific Corp., Berkeley, Calif., USA
Kontron Technik GmbH
Industriegebiet 1, 8051 Eching b. Munchen
3. Applied Research Laboratories GmbH
Hans-Bokler-Str. 7, 6078 Neu-Isenburg
4. Bodenseewerk Perkin-Elmer
Postfach 1120, 7770 Uberlingen
5. C. Desaga GmbH
Postfach 101969, 6900 Heidelberg 1
6. DuPont de Nemours (Deutschland) GmbH
Instrument Products Division
Dieselstr. 18, 6350 Bad Nauheim
7. Hewlett-Packard GmbH
Ohmstr. 6, 7500 Karlsruhe
8. ISCO (Instrumentation Specialities Company, Lincoln,
Neb., USA)
Colora MeBtechnik GmbH
Postfach 1240, 7073 Lorch/Wurtt. 1
9. P. J. Kipp + Zonen Vertriebs-GmbH
Wiesenau 5, 6242 Kronberg/Taunus
10. Laboratory Data Control, Riviera Beach, Fla., USA
Latek, Labortechnik-Gerate GmbH
Wielandtstr. 21, 6900 Heidelberg
11. Micrometritics Instr. Corp., Norcross, Ga., USA
Coulter Electronics GmbH
Hulser Str. 295, 4150 Krefeld
12. Packard GmbH
Hanauer Landstr. 120, 6000 Frankfurt/Main 1
13. Pye Unicam Ltd., Cambridge, England
Philips GmbH
Unternehmensbereich Elektronik Industrie
Miriamstr. 87, 3500 Kassel
14. Siemens AG
Bereich Мей- und ProzeStechnik
7500 Karlsruhe 21

236
Приложение
15. Spectra-Physics GmbH
Alsfelder Str. 12, 6100 Darmstadt
16. Tracor Instruments, Austin, Tex., USA
Infochroma
Chiemgaustr. 38, 8000 Munchen 90
17. Varian GmbH
Hilpertstr. 8, 6100 Darmstadt
18. Waters GmbH
Herzog-Adolf-Str. 4, 6240 Konigstein/Taunus
19. Wissenschaftliche Geratebau KG
Dr. H. Knauer + Co GmbH
StraSe 635 Nr. 38, 1000 Berlin 37 - Zehlendorf
ПРЕДМЕТНЫЙ УКАЗАТЕЛЬ
Адсорбент. См. также Фаза неподвижная
189, 104, 107
групповая'селективность 111
определение активности 115
полярные 107
Анализ
количественный 227
— точность 227
оптимальные условия 31
примесей 229
скорость 13, 31, 34
фронтальный 11
злюентный 12
Аппаратура 37
Бондапак 94
Вайдек 94
Высота, эквивалентная теоретической та-
тарелке 19, 53
в тонкослойной хроматографии 220
зависимость от размера частиц S3, 54
минимальная 54
приведенная 26
эффективная 20
Гель-фильтрация см. Хроматография
ситовая
Гликофаза 102, 209
Градиентное элюирование 12, 13, 57, 146,
197
аппаратура для 57
в ионообменной хроматографии 197
использование УФ-детектора 66
осложнения 148
продолжительность 147
регенирование колонки 150
ряд злюентов 145
— по Скотту 144
- - Сиайдеру 145
форма градиента 147
чистота злюентов 149, 232
Детекторы 61
дифференциальный рефрактометр 61,
66
— отклоняющий 68
Френеля 67
для препаративных разделений 226
емкостной 75
линейность при количественном анализе
228
масс-спектрометр 76
микроадсорбционный 70
пламенно-ионизационный 71
по радиоактивности 76
по флуоресценции 72
по электропроводности 74
с использованием химических реакций
78
сравнение различных 78
транспортный 71
УФ 62
- выбор элюентов 61
— чувствительность 61, 64
фотометрический 62
- чувствительность 61
шумы 63
электрохимический 76
Диаметр частиц 9, 18
и время анализа 54, 55
и максимальное разделение 54, 55
и проницаемость 18
и размывание полосы 28, 54
определение в колонке 53
средний 9, 27
Диффузия
коэффициент 19
продольная 23
Дурапак 94
Зипакс 84
Зорбакс 86

238
Предметный указатель
Изократные условия разделения 134
Ионный обмен 10, 187
влияние буфера 195
- ионной силы 195
-рН 193
- температуры 196
градиентное элюирование 197
неподвижные фазы 93
-обменная емкость 189, 190, 191, 192
- органическая матрица 189
- пелликулярные 190
- поверхиостно-пористые 190
- с жидкими ионообменниками 191
- характеристики 191
- химически связанные 190
оптимизация разделения 193
применение 197
распределительная хроматография при
197
Мертвый объем 14
влияние на размывание 29
Микропак 87
Нагрузка 54
при адсорбционной хроматографии 104
- препаративных разделениях 224
- распределительной хроматографии
179, 180
Насосы 39
поршневые 39
- мембранные 39
- с длинным ходом поршня 39
коротким ходом поршня 39
переменной частотой хода поршня
40
с использованием газа 41
Нуклеосил 87
Коллектор фракций 56, 225
Колонка 34
выбор 34
длительность работы в распределитель-
распределительной хроматографии 169
для препаративного разделения 224
заполнение 48
— методы 48
высокой вязкости 49
сбалансированной плотности 49
сухим способом 48, 49
- устройство для 50
испытание 32, 51
критерии выбора 34
материалы для 46
нагрузка 35
присоединение 47
проницаемость 17, 18
регенерация после градиентного
злюирования 150
свободное сечение 17
форма 47
характеристика и испытание 51
Корасил 84
Коэффициент распределения 15
Линейная емкость
Лихросорб 86
Лихросфер 86
104
Массопередача 24
Мертвое время 14, 17
измерение 52, 53
- в случае обращенной фазы 130
Обращенная фаза. См. также Фаза
неподвижная обращенная 126
влияние злюентов на разделение 128,
129
нагрузка 127, 128
определение мертвого времени 130
применение 151, 154
структура компонентов пробы и удер-
удерживание на 131
температура разделения 138
злюотропный ряд 129
Объемная скорость 14-17
Окись алюминия 107, ПО, 115
реакции на поверхности ПО
Оптимизация
условий разделения 31, 193
Отношение распределения 16
и значения Я,
массовое 16, 21
объемное 16
Партисил 87
Пеллосил 84
Пеллумина 84
Перисорб 84
Пермафаза 94
Пика асимметрия 52, 107
Поверхностно-пористые материалы,
ППМ 25, 83, 166, 200
Поверхность удельная, влияние на
разделение 83, 108
Полиамид 84, 111
Порасил 86, 87
Пористость 17, 206
зависимость от количества разделяющей
жидкости 177
Предметный указатель
239
ППМ см. Поверхностно-пористые
материалы
Проба
ввод 11, 43, 44
— непрерывный 11
— периодический 12
— петля для 43
— при препаративном разделении 226
— с установкой потока 45
— с помощью шприца 44
— устройство для 44—45
перевод в производные для лучшего
обнаружения 79
растворитель для 216
Программирование 134
давления 58, 135
— в распределительной хроматографии
180
методы 134, 135
неподвижной фазы 142
состава злюента см. Градиентное
элюирование 144
температуры 58, 138
Проницаемость 17, 31
и перепад давления 31
и размер частиц 31
Пульсации 42
демпфирование 42
Разделение 20, 21
аминокислот 198
влияние воды при адсорбционной хро-
хроматографии 111
— растворителя 115—117
время 22—31
выбор системы для 216
денсиламинокислот 184
диастереомеров 154
жирных кислот 151
кортикостеринов 156
нуклеиновых кислот 200
олигофениленов 109
оптимальное 20
пластификаторов 182
многоядерных ароматических соедине-
соединений 115, 116, 152, 153, 182
препаративное 224
— ввод пробы 225, 226
— детектор для 226
— методом распределительной хромато-
хроматографии 180
— нагрузка при 224
— приборы для 225
— сборник фракций 56
продуктов мочи 155
растворимых в воде витаминов 201
Сахаров 159, 199
скорость, связь с размером частиц
28, 54
степень 32, 35
стероидов 143, 144, 183
температура 134, 135
условия, оптимизация 31
фенолкарбоновых кислот 157
Разделительная система 216
выбор 216
Разделительная способность 13. См. число
теоретических тарелок
максимальная, связь с размером частиц
28, 54
Размывание 19
внеколоночиое 30
зависимость от скорости потока 23
размера частиц 27, 30
Разрешение 20, 32, 35
в ситовой хроматографии 207
Сборник фракций 56
Селективность 16, 21
Силанольные группы 90, 108
Силикагель 90, 106, 108
поверхностные силанольные группы
90, 108
пористая структура, влияние на раз-
разделение 108
— — - — в распределительной хрома-
хроматографии 167
силанизирование 92, 126
Система контроля влажности 114, 115
Ситовая фракция 89
Скорость 14, 17, 53, 55
линейная 14, 17, 53
— в минимуме 28
— измерение 55
объемная 14, 17
— определение 55
оптимальная 33
потока 9
Старатель 101
Сферисорб 87
Сферосил 87
Тарелка теоретическая 19
число 19, 21
- необходимое для разделения 21
- - — эффективных 20, 32
- - - в секунду 32
Теплота трения жидкой фазы 29
Термостатирование 55
Удерживание 14
время 14

240
Предметный указатель
— исправленное 14
- мертвое 14
объем 14
— исправленный 15
- - нормированный 15
относительное 16, 21, 22
Фаза
неподвижная 104, 126, 152, 154
— — для адсорбционной хроматогра-
хроматографии 89
- для ионного обмена 97
— — распределительной хроматогра-
хроматографии 89, 101
- - ситовой хроматографии 101, 208
— неполярные 92
— программирование 142
- фирмы-поставщики 85
- химически модифицированные 90
— - - с функциональными группами
90, 96
обращенная 126
- преимущества 93
подвижная см. Элюент 16
— движущаяся 17
- стоящая 17
Фронтальный анализ 11
Хроматограмма 12
в элютивной хроматографии 12
регистрация 12
Хроматография 56
адсорбционная 10, 104, 216
- влияние на разделение
- — пористой структуры 108,
- — содержания воды 111
- выбор элюента 118, 120
- градиентное элюирование 146
- нагрузка 104, 128
- на неполярных фазах 128
- — применение 151
- иа полярных неподвижных фазах 107
- - применение 152
- неподвижные фазы 105, 107, 126
- переход к распределительной хро-
хроматографии 117
- проблемы элюирования 134
- программирование
- - неподвижной фазы 142
- - скорости элюента 135, 141
- - температуры 138
- стандартизация по значениям к' 115
- установление равновесия с водой 114,
115
бумажная 9
вытеснительная 12
газовая, сравнение с ЖХ при высоких
давлениях 10
гель-проникающая см. Хроматография
ситовая
жидкостная при высоких давлениях 9
ионных пар 173, 175
исключения см. Ситовая
колоночная 9
распределительная 10, 165, 216
— адсорбция в 168
— нагрузка 179
- применение 180, 181
ситовая 10, 204, 218
- механизм 204
- определение основных величин 205,
206
- синтетических полимеров 209
— неподвижные фазы для 101, 208
— применение 210
- - определение молекулярно-массо-
вого распределения 210
— — определение радиуса частиц дис-
дисперсий полимеров 211
— — определение распределения пор по
размерам 211, 212
тонкослойная 9
- перенесение условий разделения в
колоночную
фронтальная 11
элютивная 12
Циркуляция 207
в препаративном разделении 225
при разделении диастереомеров 153
Число эквивалентных теоретических таре-
тарелок 19
«Щетки» 90, 107
Элюент 118, 120, 126, 128
влияние на разделение в адсорбцион-
адсорбционной хроматографии 118, 120, 128
— при использовании обращеиной фазы
128
выбор в адсорбционной хроматогра-
хроматографии 118, 120
емкость для 38
обезгаживание 38
очистка 232
полярность 118
Предметный указатель
241
программирование
— скорости 58, 135
— состава см. Градиентное
вание
элюиро-
элюирование
прозрачность для УФ-детекторов 64
скорость 14, 17
— измерение 55
— линейная 17
смешанный, в адсорбционной хрома-
хроматографии 120
чистота при градиентном элюировании
148
элюирующая сила 118, 120
- смесей 121
элюотропный ряд 118, 119, 129
Элюирование 134
Элюотропный ряд 118
для полярных неподвижных фаз 118,
119
- обращенных фаз 129
16 Заказ 825

СОДЕРЖАНИЕ
Предисловие редактора перевода 5
Предисловие к немецкому изданию 6
"Предисловие автора ко второму изданию 7
Предисловие автора к первому изданию 8
Глава I. МЕТОД ХРОМАТОГРАФИИ 9
Классификация хроматографических методов Ю
1. Непрерывный ввод пробы Ч
2. Периодический ввод пробы 12
Список литературы 13
Глава П. ОСНОВЫ ХРОМАТОГРАФИИ 14
A. Удерживание 14
Б. Линейная скорость, пористость, проницаемость 17
B. Размывание хроматографической полосы 19
Г. Разделение 20
Д. Зависимость размывания полосы от скорости потока 23
Е. Размывание полосы и диаметр частиц 27
Ж. Размывание полосы вне колонки '. 30
3. Оптимальные условия анализа, время анализа 31
И. Выбор разделительной колонки 34
Список литературы 35
Глава III. АППАРАТУРА ДЛЯ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРА-
ХРОМАТОГРАФИИ ПРИ ВЫСОКИХ ДАВЛЕНИЯХ 37
A. Емкость для элюента. Обезгаживание злюента 38
Б. Насосы 39
1. Поршневые'насосы с длинным ходом поршня 39
2. Поршневые насосы с коротким ходом поршня и поршневые
мембранные насосы 39
3. Насосы с переменной частотой хода поршня 40
4. Беспоршневые насосы с использованием газа 41
B. Демпфирование пульсаций 42
Г. Ввод пробы 43
1. Петля для ввода пробы 43
2. Устройство для ввода пробы шприцем (дозатор) 44
Д. Разделительная колонка 46
1. Материал колонки 46
2. Форма колонки 47
3. Присоединение колонок 47
4. Заполнение колонки . 48
5. Характеристика и испытание разделительных колонок .... 51
Е. Термостатирование 55
Ж. Измерение скорости потока 55
3. Сборник фракций 56
Содержание
243
И. Регистрирующее устройство 56
К. Аппаратура для градиентного элюирования 57
Л. Меры безопасности 59
Список литературы $0
Глава IV. ДЕТЕКТОРЫ 61
A. УФ-детекторы 62
Б. Дифференциальный рефрактометр 66
1. Рефрактометр Френеля 67
2. Отклоняющий рефрактометр 68
B. Микроадсорбционный детектор 70
Г. Транспортный детектор (пламенно-ионизационный детектор)... 71
Д. Детектор по флуоресценции 72
Е. Другие детекторы 73
1. Электрохимические детекторы 73
2. Детектор по электропроводности 74
3. Детектор по диэлектрической проницаемости (емкостный де-
детектор) 75
4. Радиоактивность 76
5. Непосредственное соединение жидкостного хроматографа высо-
высокого давления с масс-спектрометром 76
6. Другие методы измерения 77
Ж. Сравнение важнейших детекторов. Детекторы с использованием
химических реакций 78
Список литературы 80
Глава V. НОСИТЕЛИ И НЕПОДВИЖНЫЕ ФАЗЫ 83
A. Насадки, применяемые в адсорбционной и распределительной
хроматографии 89
Б. Химически модифицированные носители 90
B. Ионообменники 97
Г. Неподвижные фазы для ситовой хроматографии 101
Список литературы 102
Глава VI. АДСОРБЦИОННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ 104
I. Полярные неподвижные фазы 104
A. Общие положения 104
Б. Полярные адсорбенты и их свойства 107
1. Силикагель 108
2. Окись алюминия 110
3. Полиамиды Ш
4. Адсорбенты, обладающие групповой селективностью .... 111
B. Влияние воды на разделение 111
Г. Влияние растворителя на разделение 118
1. Элюотропные ряды • 118
2. Выбор элюента 120
3. Смеси растворителей 121
Д. Влияние структуры веществ пробы 124
16*

244
Содержание
II. Неполярные неподвижные фазы 126
A. Общие положения 126
Б. Свойства обращенных фаз 126
B. Влияние растворителя на разделение 128
Г. Влияние структуры компонентов пробы 131
III. Проблема элюнроаанни 134
1. Программирование давления или скорости потока 135
2. Программирование температуры 138
3. Программирование неподвижной фазы 142
4. Градиентное элюирование. Программирование состава элюента 144
IV. Возможности использования адсорбционной хроматографии .... 151
A. Полярная неподвижная фаза 152
Б. Неполярная неподвижная фаза 154
B. Полиамидные смолы 159
Список литературы 160
Глава VII. РАСПРЕДЕЛИТЕЛЬНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ .... 164
A. Введение 164
Б. Носители и разделяющие жидкости 166
1. Материалы, используемые как носители 166
2. Разделяющие жидкости 171
3. Нанесение неподвижной фазы на носитель 175
4. Определение количества неподвижной фазы 177
B. Свойства разделительной колонки 178
1. Стабильность и продолжительность работы колонки .... 178
2. Предельная допускаемая нагрузка (линейная емкость) 179
3. Препаративное применение 180
4. Разделяющая способность 180
5. Техника программирования 180
Г. Применение 181
Список литературы 183
Глава VIII. ИОНООБМЕННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ 187
A. Основные положения 187
Б. Ионообменные материалы 189
1. Ионообменник с органической полимерной матрицей .... 189
2. Полимерные ионообменники на ППМ 190
3. Ионообменники типа «щеток» 190
4. Жидкие ионообменники 191
B. Характеристика ионнообменников 191
Г. Оптимизация разделения 193
1. Влияние рН на удерживание 193
2. Влияние ионной силы элюента на удерживание 195
3. Изменение буферного раствора 195
4. Другие методы воздействия . 196
5. Градиентное элюирование 197
Д. Применение 197
1. Классические ионообменники в жидкостной хроматографии при
высоком давлении 198
Содержание
245
2. Поверхностно-пористые материалы 200
3. Ионообменники на основе химически модифицированного си-
ликагеля 200
Список литературы 201
Глава IX. СИТОВАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ 204
A. Введение 204
Б. Основы ситовой хроматографии 204
B. Неподвижные фазы для ситовой хроматографии 208
Г. Применение ситовой хроматографии 210
1. Определение молекулярно-массового распределения полимеров 210
2. Использование скоростной ситовой хроматографии в биологии 212
Список литературы 214
Глава X. ВЫБОР РАЗДЕЛИТЕЛЬНОЙ СИСТЕМЫ 216
Список литературы 223
Глава XI. СПЕЦИАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ РАЗДЕЛЕНИЯ 224
A. Препаративная хроматография 224
Б. Количественный анализ 227
B. Анализ микропримесей 229
Список литературы 231
Глава XII. ОЧИСТКА РАСТВОРИТЕЛЕЙ 232
Список литературы 234
Прнложепне 235
Предметный указатель 237

Уважаемый читатель!
Ваши замечания о содержании книги, ее оформлении, ка-
качестве перевода и другие просим присылать по адресу: 129820,
Москва, И-110, ГСП, 1-й Рижский пер., д. 2.
ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ ПРИ ВЫСОКИХ
ДАВЛЕНИЯХ
Редактор Р. Краснова
Художник Ю. Фомин
Художественный редактор Г. Шотнна
Технический редактор Г. Алюлина
Корректор Т. Пашковская
ИБ № 1764
Сдано в набор 10.07.79.
Подписано к печати 07.03.80.
Формат 60 х 90'/|б-
Бумага офсетная J* 1
Гарнитура тайме. Печать офсетная.
Объем 7,75 бум. л. Усл. печ. л. 15,5.
Уч.-иэд. л. 15,11. Иэ*_№ 3/0168
Тираж 3800 экз. Зал. тип. 3178Цена 2 р. 30 к.
ИЗДАТЕЛЬСТВО «МИР»
129820, Москва, И-110, ГСП, 1-й Рижский пер., 2.
Ордена Октябрьской Революции, ордена Трудового Красного Знамени
Ленинградское производственно-техническое объединение «Печатный
Двор» имени А. М. Горького «Союзполиграфпрома» при Государ-
Государственном комнтете СССР по делам издательств, полиграфии и книж-
книжной торговли. 197136, Ленинград, П-136, Чкаловский пр., 15.

ИЗДАТЕЛЬСТВО «МИР»
выпускает в свет в 1980 г. книгу по химии
Тонкослойная хроматография в фармации и клинической
биохимии. Пер. со словаря./III аршунова М., Шварц В.,
Михалек Ч. и др., 43 л., 6 р. 20 к.
Авторы книги — высококвалифицированные специалисты ЧССР,
разработавшие ряд оригинальных методов в тонкослойной хромато-
хроматографии лекарственных веществ. В книге наряду с изложением
теоретических основ перспективных аналитических методов приведены
также практически ценные прописи методик анализа ряда важней-
важнейших соединений, представляющих интерес для клинической биохимии.
Книга предназначена для работников фармацевтической промыш-
промышленности, биохимических лабораторий, научных лабораторий, научных
сотрудников фармацевтических и медицинских институтов, аспирантов
и студентов соответствующих вузов.
Заблаговременно оформляйте заказы на интересующие вас книги.
Заказы принимают магазины, распространяющие научно-техническую
литературу. Своевременно сданный заказ гаргнтирует приобретение
нужных вам книг.