IV Болезни пчел. Современные средства и методы обеспечения ветеринарного благополучия по инфекционной и протозойной патологии животных, рыб и пчел - Гулюкин М.И., Субботин В.В., Соколова Н.Л., Ложкова Н.И., Трондина Г.А.

Автор: Гулюкин М.И. Субботин В.В. Соколова Н.Л. Ложкова Н.И. Трондина Г.А.
Теги: медицинские науки семиология симптоматология признаки и симптомы заболеваний исследование диагностика пропедевтика пчеловодство ветеринария
Год: 2011
Похожие
Паразитология и инвазионные болезни животных
Болезни пчел. Диагностика и лечение
Текст
                    РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК
ОТДЕЛЕНИЕ ВЕТЕРИНАРНОЙ МЕДИЦИНЫ
Государственное научное учреждение
Всероссийский научно-исследовательский институт
экспериментальной ветеринарии им. Я. Р. Коваленко
Современные средства и методы
обеспечения ветеринарного благополучия
по инфекционной и протозойной патологии
животных, рыб и пчел
УДК 619:616-07
Современные средства и методы обеспечения ветеринарного
благополучия по инфекционной и протозойной патологии
животных, рыб и пчел
Представлены нормативные документы на диагностические тест-системы, вакцины,
химиотерапевтические препараты, а также методические рекомендации и наставления,
разработанные ГНУ ВИЭВ Россельхозакадемии в 2006-2010 гг.
Составители:
Гулюкин М.И., академик РАСХН, профессор, доктор ветеринарных наук;
Субботин В.В., профессор, доктор ветеринарных наук;
Соколова Н.Л., доктор биологических наук;
Ложкова Н.И., кандидат биологических наук;
Трондина Г.А., кандидат биологических наук
Материалы рассмотрены и одобрены на Ученом Совете ВИЭВ,
протокол № 1 от 25 января 2011 г.
Подписано в печать 17.03.2011 г. Формат 1/8 84x62.
Бумага офсетная. Гарнитура Таймс. Печать офсетная.
Усл. печ. л. 22,25. Уч.-изд. л. 26,5. Тираж 150 экз. Зак. 98.
Издано ООО “Агентство творческих технологий”
Печатается в редакции заказчика.
Москва, 2011г.
IV
Болезни пчел
264
РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК
ОТДЕЛЕНИЕ ВЕТЕРИНАРНОЙ МЕДИЦИНЫ
ГНУ ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ВЕТЕРИНАРИИ ИМ. Я.Р .КОВАЛЕНКО
« Утверждаю»
Академик секретарь Отделения
ветеринарной медицины Россельхозакадемии,
Академик РАСХН
А.М. Смирнов
13.08.2009 г.
МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
ПО ИЗГОТОВЛЕНИЮ ДИАГНОСТИКУМОВ ОСТРОГО ПАРАЛИЧА,
МЕШОТЧАТОГО РАСПЛОДА, ФИЛАМЕНТОВИРОЗА И БОЛЕЗНИ
ДЕФОРМАЦИИ КРЫЛА ПЧЕЛ
Разработчик - ведущий научный сотрудник ВНИИ экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко, кандидат био-
логических наук Ю.М.Батуев.
Предназначены для сотрудников научно-исследовательских учреждений, специалистов по ветеринарии, пчеловодству.
Методические рекомендации рассмотрены и одобрены на Секции «Патология пчел, рыб, и охрана полезных гидробио-
нтов» Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (16 июня 2009 г, протокол № 2)
Рецензент: профессор В.И. Масленникова (МГАВМиБ им. К. И. Скрябина).
Ответственный за выпуск: заведующий сектором инфекционной и инвазионной патологии Отделения ветеринарной
медицины Россельхозакадемии, кандидат ветеринарных наук А. В. Суворов.
1. ВВЕДЕНИЕ
В настоящее время большую тревогу у пчеловодов всего мира вызывает так называемый «коллапс» пчели-
ных семей в США. Осенью 2006 г. и зимой 2007 г. примерно 25% пчеловодов потеряли более половины семей
пчел. На некоторых пасеках гибель достигала 80% . В подавляющем большинстве случаев в погибших от коллапса
семьях пчел был обнаружен новый вирус, родственный вирусу острого паралича. Этот вирус впервые выделен в
2004 г. в Израиле и назван Израильским вирусом острого паралича. Необычно высокая (более 30%) осенне-зимняя
гибель пчел происходит в США до сих пор, однако единого мнения о причинах «коллапса» нет, хотя этому вопро-
су посвящено множество исследований, в том числе вирусологических. Можно ли считать вирус основной причи-
ной или только индикатором коллапса.
В некотрых европейских странах, где в последние годы также наблюдалась необычно высокая гибель пчел,
проведены собственные исследования этого вопроса. Во Франции в сезоне 2007-08 гг при исследовании зимнего
подмора с пасек, где происходила необычно высокая гибель семей пчел, в 40% образцов обнаружен обычный ви-
рус острого паралича и только в 14% Израильский вирус острого паралича.
В публикациях, посвященных «коллапсу» многие авторы для своих вирусологичесих исследований исполь-
зовали современную высокочувствительную реакцию цепной полимеризации (ПЦР), с помощью которой можно
выявлять носительство вируса. Но носительство и болезнь не одно и то же. Не приводятся данные о количестве
вируса в погибших пчелах, позволяющие судить о том, что пчела погибла от вируса или являлась всего лишь его
носителем. Интересные данные о генетической структуре РНК вирусов острого паралича и Израильского острого
паралича, о возможности рекомбинации, рассуждения о возможности разной вирулентности вариантов этих виру-
сов, не отвечают однако на главный вопрос о конкретной роли вирусов в коллапсе пчелиных семей.
Первооткрывателем большинства вирусов пчел (в том числе и вируса острого паралича) L.Bailey было по-
казано, что пчелы, не проявляющие никаких признаков заболевания могут являться носителями многих вирусов.
Эти вирусы можно было выявить только с помощью биопробы (наиболее чувствительным для того времени мето-
дом). Однако если пчелы погибали от какого-либо вируса, то они содержали его в очень больших количествах (до
1% от веса тела) и легко могли быть определены относительно малочувствительной по современным понятиям
реакцией иммунодиффузии. Было показано, что если у пчелы можно установить вирус без его дополнительой
концентрации с помощью реакции иммунодиффузии, можно считать, что этот вирус явился причиной гибели дан-
ной пчелы.
В связи с вышесказанным актуально проведение широких вирусологических исследований пчел на терри-
265
тории России. Не умаляя достоинств современной и очень высокочувствтельной реакции ПЦР, доступной для ис-
пользования лишь в ограниченном числе крупных научно-исследовательских учреждений, основной упор следует
сделать на использовании простой и доступной реакции иммунодиффузии. Однако до сих пор нет единых норма-
тивных документов на изготовление диагностикумов вирусных болезней пчел для реакции иммунодиффузии.
Для составления методических рекомендаций по изготовлению диагностикумов острого паралича, мешот-
чатого расплода, филаментовироза и болезни деформации крыла пчел использован многолетний опыт изготовле-
ния диагностикумов этих вирусных болезней пчел в «Отделе охраны полезной энтомофауны» ВИЭВ, а также ли-
тературные данные. В связи со сходством характеристик вируса острого паралича, Израильского вируса острого
паралича, Кашмир-вируса пчел и некоторых других пикорнаподобных вирусов пчел данные методические реко-
мендации несомненно могут быть использованы для изготовления диагностикумов и этих вирозов.
1.	ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ.
1.1.	Диагностикумы (специфические сыворотки и антигены) предназначены для выявления в пчелах анти-
генов вируса острого паралича, вируса мешотчатого расплода, нитевидного вируса пчел и вируса деформации
крыла в реакции иммунодиффузии.
1.2.	Антигены вирусов представляют собой пористую массу, расфасованную в ампулы, от светлокоричне-
вого (мешотчатый расплод), до темнокоричневого или серого цвета (острый паралич, деформация крыла и фила-
ментовироз). Антигены готовят из экстрактов личинок или куколок (мешотчатый расплод), или из взрослых пчел,
погибших от соответствующих вирусов.
1.3.	Антигены нормальных тканей готовят аналогично из экстрактов здоровых личинок, куколок или пчел.
1.4.	Специфические сыворотки представляют собой розоватую пористую массу, расфасованную в ампулы.
Сыворотки готовят путем иммунизации кроликов очищенными антигенами соответствующих вирусов. Перед ис-
пользованием сыворотку разводят фосфатно-буферным раствором (pH 7,0) в объеме, указанном на этикетке, анти-
гены разводят дистиллированной водой.
2.	СХЕМА ТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО ПРОЦЕССА ИЗГОТОВЛЕНИЯ ПРЕПАРАТОВ
2.1.	Технологический процесс производства антигенов.
2.1.1.	Антиген вируса острого паралича готовят из пчел, погибших от этого вируса после лабораторного за-
ражения методом микроинъекции. Антиген вируса мешотчатого расплода готовят из погибших личинок из боль-
ных семей пчел с характерными клиническими признаками этого заболевания (неразлагающиеся личинки, погиб-
шие на стадии предкуколки после запечатывания их пчелами, имеющие вид мешочка в подвешенном состоянии)
либо из погибших куколок, погибших от этого вируса после лабораторного заражения методом микроинъекции.
Антиген вируса деформации крыла готовят из пчел с характерными клиническими признаками заболевания (де-
формированные крылья). Антиген нитевидного вируса получают из пчел, пораженных этим вирусом. Необходи-
мый патологический материал собирают на пасеке, неблагополучной по филаментовирозу в период обострения
заболевания (в средней полосе России в мае - начале июня). Собирают ползающих по земле, неспособных к поле-
ту пчел. Среди них отбирают пчел, имеющих молочно-белую гемолимфу. Наличие вируса в гемолимфе подтвер-
ждают с помощью электронной микроскопии методом негативного контрастирования. Если изменение цвета ге-
молимфы до молочно-белого связано с нитевидным вирусом, при электронной микроскопии непосредственно в
нативной гемолимфе обнаруживают массу частиц крупного вируса с характерной морфологией. Морфологически
этот вирус нельзя спутать ни с одним другим вирусом.
2.1.2.	Для экстрагирования вирусов из погибших личинок, куколок или пчел их гомогенизируют, гомогенат
экстрагируют дистиллированной водой (0,5 мл на одно насекомое) с добавлением эфира (!4 часть по объему). При
экстрагировании нитевидного вируса эфир не используют, так как он разрушает оболочку этого вируса.
2.1.3.	Вируссодержащую жидкость осветляют низкоскоростным центрифугированием при 2000 g 10 мин.
Водную фракцию надосадочной жидкости разливают по 1 мл в ампулы и лиофилизируют. На этикетке указывают
количество добавляемой дистиллированной воды для получения рабочего разведения.
2.1.4.	Технологический процесс производства антигенов нормальных тканей пчел отличается тем, что для
его производства используют здоровых насекомых.
2.2.	Технологический процесс производства специфических сывороток.
2.2.1.	Для иммунизации животных вирусные антигены подвергают очистке. Количество вирусного антиге-
на, достаточного для иммунизаци одного кролика, можно получить из 50 насекомых, погибших от вируса.
2.2.2.	Вирусы острого паралича, мешотчатого расплода и деформации крыла (после осветления низкоско-
ростным центрифугированием и сбора водной вируссодержащей фракции) осаждают с помощью ультрацентрифу-
ги при 70000 g (в средней части пробирки) 90 мин. Вируссодержащий осадок ресуспендируют в фосфатном буфе-
ре и вирус очищают центрифугированием в градиенте плотности сахарозы (от 10 до 60%) при ускорении не менее
70000 g в верхней части пробирки (около 100000 g в средней части) 80 мин.
2.2.3.	Значительно более крупный нитевидный вирус осаждают при 10000 g 20 мин. Вируссодержащий
осадок ресуспендируют в фосфатном буфере и вирус очищают центрифугированием в градиенте плотности саха-
розы (от 10 до 60%) при 15000 g в верхней части пробирки 30 мин.
2.2.4.	Процесс иммунизации одинаков для всех вышеупомянутых вирусов.Фракцию сахарозы, содержащую
вирус, собирают, разбавляют физиологическим раствором до объема 3 мл, разливают по 1 мл во флаконы, замора-
живают и в дальнейшем используют для иммунизации кролика.
266
2.2.5.	Перед первой инъекцией 1 мл антигена смешивают с полным адъювантом Фрейнда в соотношении
1:1 и вводят кролику в подушечки задних лапок по 0,2 мл, в бедренные мышцы по 0,5 мл и внутрикожно в три
точки спины по 0,2 мл. Вторую инъекцию делают через 21 день, при этом 1мл антигена разводят физиологиче-
ским раствором в два раза и вводят кролику внутривенно через 7 дней после первой. Третью инъекцию делают
также внутривенно через 7 дней после второй. Обескровливание производят на 7-10 день после последней инъек-
ции.
2.2.6.	Кровь собирают в стерильную колбу, выдерживают при 37°С до образования сгустка, отделяют от
стенок стерильной стеклянной палочкой и оставляют при 4°С на ночь. На следующий день сыворотку отсасывают,
разливают по 1 мл в ампулы и проводят лиофильную сушку.
2.2.6.	В полученной сыворотке титр специфических антител в реакции иммунодиффузии должен быть не
ниже 1 : 32, титр антител к нормальным тканям пчел не выше 1:4. Определяют наибольшее разведение сыворот-
ки, при котором специфическая полоса преципитации остается достаточно яркой, а реакция с нормальными тка-
нями пчел отсутствует полностью. Определенное таким образом рабочее разведение сыворотки должно быть не
менее, чем в 4 раза выше разведения, при котором наблюдается реакция с нормальными тканями пчел. На ампуле
с сывороткой указывают данное рабочее разведение.
3.	КОНТРОЛЬ ДИАГНОСТИКУМОВ.
3.1.	Контроль диагностикумов острого паралича, мешотчатого расплода, филаментовироза и болезни де-
формации крыла пчел осуществляется в отделе «Охраны полезной энтомофауны» ВИЭВ.
3.2.	Испытуемые антиген и сыворотка на данный вирус в перекрестной реакции иммунодиффузии в рабо-
чих разведениях должны давать четкую полосу преципитации, сливающуюся своим концом с полосой преципита-
ции, образуемой соответствующим музейным антигеном и сывороткой, хранящимися в ВИЭВ. Кроме того испы-
туемая сыворотка в указанном рабочем разведении не должна давать полосу преципитации с антигенами нор-
мальных тканей пчел.
РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК
ОТДЕЛЕНИЕ ВЕТЕРИНАРНОЙ МЕДИЦИНЫ
ГНУ ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ВЕТЕРИНАРИИ ИМ. Я.Р. КОВАЛЕНКО
« Утверждаю»
Академик секретарь Отделения
ветеринарной медицины Росселъхозакадемии,
Академик РАСХН
А.М. Смирнов
02.03.2009 г.
МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
ПО ДИАГНОСТИКЕ ВОЗБУДИТЕЛЯ ЕВРОПЕЙСКОГО ГНИЛЬЦА
ПЧЕЛ - MELISSOCOCCUS PLUTONIUS
Разработчик - сотрудник ВНИИ экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко доктор ветеринарных наук,
профессор М.А. Лучко.
Предназначены для специалистов по ветеринарии, пчеловодству, преподавателей и студентов сельскохозяйственных
ВУЗов, сотрудников научно-исследовательских учреждений.
Методические рекомендации рассмотрены и одобрены на Секции «Патология пчел, рыб и охрана полезных гидробион-
тов» Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (26 июня 2008 г., протокол № 2).
Рецензент: доктор биологических наук В.И. Масленникова (МГАВМиБ им. К. И Скрябина).
Ответственный за выпуск: заведующий сектором инфекционной и инвазионной патологии Отделения ветеринарной
медицины Россельхозакадемии, кандидат ветеринарных наук А.В. Суворов.
1.	ВВЕДЕНИЕ
Целью настоящих методических рекомендаций является: унифицировать технику постановки диагноза на
европейский гнилец (ЕЕВ)согласно современным требованиям Международного Эпизоотического Бюро, с учетом
267
последних достижений в создании и производстве испытанных нами тест- наборов фирмы Vita ( Великобритания),
а также обратить внимание исследователей на ряд приемов выделения и идентификации возбудителя гнильца,
отсутствующих в отечественных методических указаниях.
Возбудителем заболевания является неспорообразующая бактерия MELISSOCCUS
PLUTONIUS.TpyaHocTH выделения этого широко распространенного в мире агента связаны со сходством клини-
ческого проявления европейского гнильца в ряде случаев с американским гнильцом, парагнильцом, поражениями
вызванными другими микроорганизмами -Bacillus laterosporus, Paenibacillus alvei, Enteroccus fecalis и
др.(А.Вогскег1, 1966, Fritsch 1975) или осложненными формами течения мешотчатого расплода и варрооза пчел.
Выделение М. plutonius часто зависит от времени патологического процесса, состояния тела больной или погиб-
шей личинки, из которой будут готовиться мазки для микроскопии или производиться высев на питательную сре-
ду, обсемененности ее посторонней микрофлорой. Важное значение имеют условия и среды для культивирования
и последующей идентификации видовой принадлежности агента. Шестое издание Мануала МЭБ по диагностиче-
ским тестам и вакцинам наземных животных в разделе « Европейский гнилец» включает условия проведения ре-
акции цепной полимеризации (ПЦР) и даются праймеры для осуществления этой реакции. Мы посчитали необхо-
димым ввести этот текст для ускорения освоения методики ПЦР при европейском гнильце отечественными лабо-
раториями.
2.	ПРИЗНАКИ ЗАБОЛЕВАНИЯ.
Характерной особенностью заболевания является гибель личинок преимущественно открытого расплода, а
при хроническом течении и печатного расплода. Болезнь обычно возникает весной и в первой половине лета. По-
раженные личинки перед гибелью становятся мутно-белыми, сморщиваются и погибают. Пчелы-кормильцы рас-
познают мертвых личинок и удаляют их из ячеек, что делает расплод «пестрым».Не удаленные инфицированные
личинки позднее размягчаются, изменяют цвет на коричневый, превращаясь вначале в полужидкую массу а затем
в высохшие корочки, легко извлекаемые из ячеек.
3.	ВЗЯТИЕ И ПЕРЕСЫЛКА ПРОБ НА ИССЛЕДОВАНИЕ.
В лабораторию направляют образцы сота размером 10 х15 см с больными и погибшими не разложившими-
ся личинками. В образце не должно содержаться меда, или он должен находиться в минимальном количестве.
Образец помещают в деревянный ящик или твердую картонную коробку. Нельзя упаковывать образцы в
полиэтиленовые пакеты, поскольку в них усиленно развивается плесень.
Лабораторное исследование на европейский гнилец включает: микроскопию окрашенных мазков приготов-
ленных из патматериала, выделение культуры М. plutonius и при необходимости иммунологические методы и ПЦР.
4.	МИКРОСКОПИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ.
Пораженные или погибшие, не разложившиеся личинки наиболее пригодны для обнаружения возбудителя.
Личинку вскрывают при помощи двух пинцетов и извлекают содержимое средней кишки, которая полностью или
частично заполнена бактерией в виде матовых, белых сгустков. Содержимое средней кишки здоровых личинок
имеет золотисто-коричневый цвет.
На предметном стекле готовят каплю водной суспензии содержимого кишечника и добавляют к ней каплю
5 %-ного водного раствора нигрозина (негативный метод окраски). Делают мазок в несколько см2, осторожно вы-
сушивают на пламени и просматривают под иммерсией. Обнаружение в большом количестве продолговатых ко-
пьевидных (клиновидных) кокков расположенных отдельно, парами, в форме розеток или коротких цепочек сви-
детельствует о наличии M.plutonius. Мазки могут быть окрашены также по Граму и 2 %-ным фуксином. Кокки
Грам-позитивны, палочки Грам-негативны. Размер бактерии 0,5 - 1 мкм.
5.	КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ВОЗБУДИТЕЛЯ
Для культивирования используют среду содержащую (г/л) -дрожжевой экстракт Дифко (или бактопептон)
10,0; цистеин или цистин 1,0; глюкозу 10,0; растворимый крахмал 10,0; КН2РО4 - 13,6; агар 20,0 для плотной сре-
ды и 2,0 для полужидкого агара( ПЖА.), pH - 6,6 по КОН.
Посевным материалом служит водная суспензия (1:10 ) ткани личинки (в идеале содержимое средней киш-
ки). Культивирование проводят в атмосфере, содержащей 10 % СО2 при 34-35 °C.
На плотном агаре М. plutonius растет в виде небольших (1,0 -1,5 мм) белых или матовых колоний в течении
4-6 суток. Бактерия in vitro является полиморфной и может иметь форму палочек. Сохраняют культуру на косом
агаре, в пробирках под резиновыми пробками, в течении нескольких месяцев. Бактерия неподвижная, не образует
спор, микроаэрофил, ферментирует глюкозу, не сбраживает маннит и сорбит.
Кроме М. plutonius из патматериала может быть выделен Enterococcus faecalis, а также Bac.alvei.
Enter.faecalis (Str. liquifaciens)-CTpenTOKOKK в виде коротких цепочек является причиной кислого запаха, ис-
ходящего от сота. Хорошо растет на средах, используемых для культивирования M.plutonius, угнетает его рост.
Размножается быстро (24 часа) на обычных питательных средах (МПБ, МПА) в аэробных условиях. Делают дроб-
ный пересев на 2-3 чашки с глюкозо-кровяным агаром и среды Гисса. E.faecalis разлагает с образованием кислоты
без газа глюкозу, маннит, сорбит и не обладает гемолитической активностью.
Bac.alvei хорошо растет на среде, используемой для М. plutonius . На МПБ образует помутнение, слизистый
осадок, пленку, опадающую на дно пробирки при встряхивании. На плотном агаре образует крупные колонии (в
форме оленьих рогов) с блестящей поверхностью. Грамположительные спорообразующие палочки, в мазках рас-
полагаются в виде частокола. Дает положительную реакцию на каталазу, разлагает мальтозу и сахарозу с образо-
268
ванием кислоты, не разлагает арабинозу, не восстанавливает нитраты, вызывает бета-гемолиз.
Для корректности диагноза рекомендуется параллельно культивировать типовой штамм M.plutonius N.
CJMB 702443.
6.	СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ.
Для предварительного диагноза непосредственно на пасеке может быть использована зарубежная се-
рологическая тест-система «Vita Test”, которая с положительным результатом апробирована в наших условиях.
Антигеном служит M.plutonius, размножающийся в личинке, который вступает в специфическую реакцию с анти-
телом (индикатор) находящимся в наборе.
Диагноз на европейский гнилец считается установленным при обнаружении в исследуемом материале М.
plutonius.
7.	РЕАКЦИЯ ЦЕПНОЙ ПОЛИМЕРИЗАЦИИ (ПЦР)
Реакция цепной полимеризации (ПЦР), рекомендованная МЭБ, может быть применена в случае трудно
идентифицируемых бактерий, которых предварительно культивируют на жидкой питательной среде. Геномную
ДНК получают, используя стандартные методы. Пробу ДНК ресуспендируют в 50 мкл 1 х ТЕ буфере (10 тМ
Tris/HCl, pH 7,5; ImM EDTA [этилен диамин тетра-уксусная кислота]). Приблизительно 1-3 мкг геномной ДНК
амплифицируют в 50 мкл реакционной смеси. Для ПЦР реакции также можно использовать личинку. Каждую
личинку инкубируют индивидуально в жидкой среде в течение 10-12 часов при 30° С в анаэробных эксикаторах,
содержащих азот с 10 % СО2. Два мл каждого образца затем центрифугируют при 1000 g 2 мин., далее надосадоч-
ную жидкость центрифугируют при 10000 g в течение 5 мин. Конечный осадок ресуспендируют в 100 мкл сте-
рильной Н2О и прогревают при 95°С в течение 15 минут. Один микролитр амплифицируют в 50 мкл смеси ПЦР.
Кроме матричной ДНК смесь содержит 2 шМ MgCl2, 50 pmol в мкл прямого (EFB - F) и обратного праймеров
(EFB - R, последовательности праймеров приведены ниже), 25 тМ (каждого) дезоксинуклеозид - трифосфатов и 1
U Tag- полимеразы. Амплификация специфических ДНК фрагментов происходит в термоциклере при следующих
условиях ПЦР: 95°С -1 минута; 30 циклов: 93°С - 1 минута, 55°С -30 сек) и 72°С-1 мин.; и финальный цикл 72° С -
5 мин.
Полугнездовая ПЦР была вначале разработана Djordjevic и др. и затем усовершенствована для чуствитель-
ного выявления M.plutonius в мёде, разложившихся и целых личинках, и имаго (McKee В.А. и др.) Первая реакци-
онная смесь в объёме 50 ml содержит 5-30 нг геномной ДНК, 3 mM MgCl2, 200 тМ каждой трифосфат дезоксири-
бонуклеазы, 100 нг праймеров Мр-1, Мр-2, 5 мкл 10х ПЦР-буфера (100 mM Tris/HCl, pH 8,3; 15 тМ MgCl2; 500
тМ КС1) и 1 и Taq-полимеразы. Условия амплификации состоят из первоначального цикла денатурации при 95°С
2 минуты, последующих 40 циклов денатурации (95°С, 30 секунд), отжига праймеров (61 °C, 15 секунд) и элонга-
ции (72°С, 1 минута). Третий праймер Мр-3 используют в паре с праймером Мр-1 чтобы амплифицировать фраг-
мент ДНК из 1 мкл продукта ПЦР, полученного в предыдущей реакции. Условия реакции для полугнездовой ПЦР
соответствуют как описано выше, за исключением того, что концентрация MgCl2 , снижается до 1,5 - шМ и тем-
пература отжигания до 56°С.
Молекулярный вес продуктов ПЦР определяют электрофорезом в 1,0-1,5% агарозном геле, содер-
жащем бромистый этидий.
Наимено- вание	Последовательность	Величина ГТЦР- продукта.
EFB - F EFB-R	5’-GAA-GAG-GAG-TTA-AAA -GGC-GC-3’ 5’ - TTA - TCT - СТА - AGG - CGT - TCA-AAG-G-3’	812 пар
MP- 1	5’ - CTT - TGA - ACG - CCT - TAG - AGA - 3’	486 пар
MP-2 MP-3	5’ - АТС - АТС - TGT - CCC - ACC - TTA - 3’ 5’ - TTA - ACC - TCG - CGG - TCT - TGC - GTC - TCT - C - 3’	276 пар
8.	ЛИТЕРАТУРА
1.	Смирнов А.М. 1987. Бактериозы и микозы пчел. В книге: «Болезни и вредители медоносных пчел».
Москва «Агропромиздат».
2.	Методические указания по лабораторной диагностике европейского гнильца пчел 1986. Москва.
Г осагропром.
3.	OIE Terrestrial Manual,2008. Chapter 2.9.3. European Foulbrood of honey Bees.
4.	Bailey L. Ball B.V. 1991. Honey Bee Pathology. Academic Press. London, UK, and New York, USA.
5.	A. Borchert 1966. Die Krankheiten und schadlinge der Honigbienc. S. Hirrel Verlag. Leipzig, s. 108- 114.
6.	W. Fritzsch, R. Bremer 1975. Bienengesundheitsdienst. VEB Gustav Fischer Verlag Yena.
7.	Djordjevic S. P., Noone K., Smith L. end Homitzky M.A.Z.(1998). Development of a hemi-nested PCR assay
for the specific detection of Melissococcus piuton. J. Apic. Res., 37, 165-174.
8.	McKee B.A., Djordjevic S. P., Goodman R.D., end Homitzky M.A. (2003). The detection of Melissococcus
pluton in honey bees (Apis mellifera) and their products using a hemi-nested PCR. Apidologie, 34, 19-27.
269
РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК
«Утверждаю»
Академик секретарь Отделения
ветеринарной медицины Россельхозакадемии,
Академик РАСХН
А.М. Смирнов
08.06.2010 г.
МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИЗУЧЕНИЮ СРЕДСТВ И ПРИЁМОВ
БОРЬБЫ С КЛЕЩОМ ВАРРОА
Настоящие рекомендации разработаны академиком РАСХН А.М. Смирновым и профессором ВИЭВ О.Ф. Гробовым
совместно с сотрудниками специализированных лабораторий ВИЭВ (Сотников А.Н.) и ВНИИВСГЭ (Клочко Р. Т, Луганский
С.Н., Блинов А.В., Котова А.А.).
Рецензент - профессор, доктор сельскохозяйственных наук А. С. Кочетов (ТСХА).
Методические рекомендации предназначены для государственных научно-исследовательских ветеринарных учрежде-
ний, специалистов по ветеринарии и пчеловодству.
Материалы рассмотрены и одобрены учёным советом ГНУ ВНИИВСГЭ и секцией «Патологии пчёл, рыб и охраны по-
лезных гидробионтов» ВИЭВ (протокол № 2 от «5» апреляи2010 г.).
Ответственный за выпуск - заведующая сектором Отделения ветеринарной медицины РАСХН, кандидат биологиче-
ских наукЛ.В. Бабышова.
1. ВВЕДЕНИЕ
Проблема варроатоза пчёл остается актуальной. Она привела к изменению эпизоотической ситуации, появ-
лению массовых септических заболеваний пчёл бактериальной и вирусной природы, осложнила течение многих
болезней пчёл. Последние исследования по изучению массовой гибели пчёл в мире показали значительную роль
клеща в этих потерях.
В настоящий момент применение акарицидных средств стало жизненной необходимостью ведения пчело-
водства. Однако это, в свою очередь, выдвигает ряд новых проблем:
-	необходимость постоянного контроля за популяцией клеща в улье;
-	необходимость регулярного и многократного использования акарицидов;
-	загрязнение продуктов пчеловодства их остатками;
-	появление устойчивости паразита к акарицидам;
-	необходимость беспрерывного поиска новых средств химической природы для замены существующих средств.
Разработанные в своё время методические рекомендации по изучению мер борьбы с клещом были ориенти-
рованы в основном на поиски эффективных и безопасных для пчёл акарицидов, что позволило в 80 годы прошло-
го столетия успешно их использовать и достигнуть восстановления численности пчёл на территории бывшего
СССР. От применения этих препаратов вряд ли придётся отказаться и в будущем, учитывая сравнительно быстрое
их воздействие на популяцию клеща в гнёздах пчёл при правильном и своевременном применении. Вместе с тем,
уже в настоящем необходимо сделать акцент на разработку более безопасных способов борьбы, исключающих
или снижающих недостатки акарицидов химической природы. В связи с этим существующие ранее рекомендации
переработаны с ориентацией исследователей на совершенствование и создание новых подходов к борьбе с этим
паразитом на базе проводящихся новых исследований в настоящем.
Для разработки и внедрения какого-либо способа борьбы с клещом варроа необходимо определение многих
показателей по действию того или другого используемого агента или приёма на паразита, отдельных пчёл и их
семьи в целом.
В настоящее время для борьбы с варроатозом пчёл используются различные приёмы, включая лекарствен-
ную терапию, зоотехнические, физические, биологические и генетические способы борьбы или их сочетания. Ра-
ботая над тем или иным средством, исследователь должен стремиться получить максимально полные данные по
его влиянию на паразита, хозяина и продукцию последнего, учесть последствия длительного воздействия разраба-
тываемого средства не только на указанные объекты, но и на окружающую среду. В связи с этим в начале работы
исполнитель должен чётко представлять биологию паразита и хозяина, тщательно ознакомиться с имеющимися
данными о препарате или избранном способе борьбы.
Разработка мер борьбы с варроатозом - задача нелёгкая, так как исследователь имеет дело с двумя орга-
низмами, тесно взаимосвязанными в своих сложных биологических циклах развития.
Используемые для борьбы с варроатозом пчёл препараты должны обладать высоким избирательным дей-
ствием на клещей и быть безвредными для пчёл и теплокровных животных, не кумулироваться в продуктах пче-
ловодства и организме насекомых при длительном применении. Предпочтение следует отдавать веществам мало-
токсичным для пчёл и человека, удобным для применения. Ознакомление с препаратом начинают с изучения его
технических данных. Выясняют химическое, условное и коммерческое название, синонимы, химическую формулу
270
соединения. Если это сложное химическое вещество, то необходимо знать его составные части и источники полу-
чения. Для препаратов из лекарственных растений требуются сведения о качественном и, желательно, количе-
ственном содержании алкалоидов, гликозидов, дубильных веществ, эфирных масел, сапонинов и др.
Важное значение при определении возможностей использования того или иного соединения в качестве
противоварроатозного средства имеют данные о его физико-химических свойствах. К таковым относятся: внеш-
ний вид, цвет, запах, вкус, летучесть, агрегатное состояние (твёрдое, жидкое вещество, эмульгирующийся концен-
трат, смачивающийся порошок, настойка, экстракт), молекулярный вес, температура плавления (кипения), раство-
римость в воде и органических растворителях, возможность и условия стерилизации. Выясняют стойкость при
хранении, сроки и способы хранения.
При проведении лабораторных и пасечных испытаний акарицидности и токсичности препаратов для пчёл
необходимо руководствоваться общепринятыми нормативными документами:
•	Основные методические требования к постановке экспериментов в пчеловодстве. Современные
методы исследования патологии пчёл (утв. РАСХН, 2000);
•	Методические рекомендации по изучению и разработке способов профилактики и борьбы с вар-
роатозом пчёл (утв. ВАСХНИЛ, 1987);
•	Методические рекомендации по оценке действия и потенциальной опасности пестицидов для ме-
доносных пчёл (утв. РАСХН, 2000);
•	Методы испытаний дезинфекционных средств для оценки их безопасности и эффективности (М.,
1998 г.,ч. 2);
•	Методические указания о порядке испытания новых дезинфицирующих средств для ветеринар-
ной практики (утверждены ГУВ Госагропрома СССР, 1987);
•	Методика определения акарицидной эффективности препаратов (способов) в пчеловодстве. Утв.
ГУВ Госагропрома СССР, 1987 г.
2. ЦИКЛ РАЗВИТИЯ VARROA DESTRUCTOR
Клещ Varroa destructor (ранее V. jacobsoni), поражающий европейскую медоносную пчелу, представлен
двумя гаплотипами: патогенным, широко распространённым в мире, включая территорию России, корейским или
русским вариантом и сравнительно мало патогенным японо-тайландским вариантом, поражающим пчёл Японии,
Тайланда и Южной Америки.
Клещ паразитирует на взрослых насекомых и в расплоде. На взрослых особях хозяина находятся исключи-
тельно самки клеща, выполняющие функции расселения и сохранения внутри улья и распространения за его пре-
делами. Преимущественно клещей обнаруживают на молодых пчёлах. При пчелином воровстве из-за усиления
запаха ядовитой железы в улье до 40% паразитов способны к перемещению; в норме только 5% клещей покидают
взрослых пчёл. Осенью на пасеках обмен клещей между ульями может достигать до 80 особей в сутки.
Размножается клещ в печатном расплоде пчёл. Место расположения расплода варроа легко воспринимает
своими терморецепторами, способными различать колебания температуры в пределах 0,4°С. Подходящую ячейку
клещ выбирает по выделению эфиров жирных кислот, особенно пальмитиновой кислоты и её соединений, исхо-
дящих из личинок. Наиболее интенсивное выделение этих эфиров происходит у личинок рабочих пчёл при массе
161 мг за 20 - 27 ч, а у личинок трутней при массе 410 мг за 36 - 40 ч перед запечатыванием. Трутни выделяют в
5,6 раза больше эфиров и в 1,7 раза продолжительнее, чем рабочие пчёлы, у личинок матки выделение этих ве-
ществ в 3 раза меньше рабочих особей. Этим объясняется преимущественное поражение трутневого расплода.
Проникнув в ячейку, самка клеща опускается на дно ячейки и остается неподвижной около 5 ч в корме ли-
чинки. После запечатывания ячейки и потребления личинкой остатков корма клещ активизируется, питается ге-
молимфой хозяина, продвигаясь к верху ячейки. Приблизительно через 60 ч после сплетения кокона и перехода
личинки в стадию неподвижной предкуколки самка паразита начинает откладывать по одному беловатому яйцу, с
интервалом 30 часов, постепенно опускаясь ко дну ячейки.
Из первого неоплодотворенного яйца (имеет 7 хромосом) размером 672±17,0><522,0±21,0 мкм, расположенного у
вершины ячейки, развивается самец клеща. Из последующих более крупных яиц (733,2±29,7х 576,1 ±23,3 мкм) - самки.
Самка-основательница потомства откладывает яйца различной степени зрелости, из них жизнеспособными
являются лишь те, в которых к моменту откладки сформировалась восьминогая бесцветная протонимфа. Вышед-
шая из оболочки яйца протонимфа питается на теле хозяина, линяет и превращается в дейтонимфу, которая после
питания и линьки преобразуется во взрослых самца или самку. Питание и копуляция на теле хозяина происходят в
местах, помеченных калом самки-основательницы. Полный цикл развития самца длится 5,5-6,3 суток, самки 6,5-
6,9 суток. Яйца, отложенные самкой на 15-16 сутки развития пчелиного и на 18-19 сутки трутневого расплода, не
успевают развиться до взрослых форм. Самец оплодотворяет только молодых самок, которые отличаются от сам-
ки-основательницы более светлым покровом. После вскрытия ячейки и выхода хозяина самец и недоразвившиеся
стадии клеща погибают. В среднем в одной поражённой ячейке рабочей европейской пчелы рождается 1,3 дочер-
ние самки, в трутневой - 2,6. При заходе в ячейку двух и более самок-основательниц яйцепродукция их снижается.
Количество заходов самок в ячейки для яйцекладки, число отложенных жизне- и нежизнеспособных яиц, а
также смертность клещей в ячейках сотов зависят от сезона года, колебаний температуры и влажности в улье и
прочих условий. Оптимальные условия для развития клеща: температура 34-36°С и относительная влажность 60-80%.
3. ЛАБОРАТОРНЫЕ ИСПЫТАНИЯ АКАРИЦИДНОЙ АКТИВНОСТИ ПРЕПАРАТОВ
Выбирают необходимое направление работы (воздействие на имаго паразита или на его формы развития).
Проводят предварительный отбор препаратов по литературным данным с учётом степени их изученности, вклю-
271
чая акарицидность, действие на организм беспозвоночных (в том числе медоносной пчелы) и теплокровных жи-
вотных; возможности создания удобной формы или условий применения; длительности сохранения в различном
состоянии; разработанности методов определения в пищевых продуктах, включая продукты пчеловодства. Де-
тально изучают условия работы с этими препаратами.
Целью лабораторных исследований акарицидов для борьбы с варроатозом являются:
•	определение действия препарата на взрослых рабочих пчёл (трутней, матку, расплод) в зависимо-
сти от их возраста и сезона года при различных способах внесения испытываемого средства и кратности об-
работки;
•	определение действия препарата на взрослых самок клеща варроа или формы его развития;
•	выбор наиболее эффективного способа применения препарата;
•	предварительное определение лечебной дозы препарата, величины разрыва между лечебной и
токсической дозой.
3.1.	ОБЩИЕ ТРЕБОВАНИЯ
Лаборатория должна быть оборудована вытяжным шкафом, иметь термостаты, достаточное количество
садков для содержания пчёл, сейфы для хранения акарицидов и прочее необходимое оборудование. К работе с
ядовитыми и сильнодействующими веществами допускаются лица, прошедшие соответствующую подготовку,
знакомые с правилами техники безопасности и не имеющие противопоказаний к работе с пчёлами.
Для лабораторных опытов необходимо иметь поражённые клещами семьи пчёл, из которых берут насеко-
мых для исследования в опытные и контрольные группы. Следует избегать отбора пчёл ранней весной. Пчёл
определенного возраста, поражённых и непоражённых клещом в стадии куколки, выводят из расплода в изолято-
ре, размещённом в термостате.
При необходимости обездвиживание пчёл может быть обеспечено двуокисью углерода. При этом исполь-
зуют минимальное количество СО2 и минимальную экспозицию. Пчёл помещают в чистые хорошо вентилируе-
мые садки по 10 или 100 особей в зависимости от характера опыта и длительности наблюдения. Поодиночке пчё-
лы не должны содержаться более одного часа. Необходимо избегать повторного использования садков, без их
тщательной очистки, промывки и просушки. Лучше использовать одноразовые садки, например, картонные со
съёмной крышкой и двумя сторонами, затянутыми сеткой. Садки не должны быть причиной гибели насекомых.
Садки с пчёлами содержат в термостате при температуре 34-36° и относительной влажности 60-80%. Пчёл
кормят сахарным сиропом (1:1) по общепринятой методике.
Желательно использовать химически чистые препараты, т.к. токсичность действующего вещества (ДВ) мо-
жет отличаться от действия готовых форм, вследствие существенного влияния имеющихся в нем компонентов;
возможны также обработки готовым продуктом. Следует также предусмотреть контроли: обработки растворите-
лями, чистый контроль. Используют ряд концентраций (доз) испытываемого вещества для выведения линий ре-
грессии, определения токсикологических показателей. Температура испытываемого вещества должна быть не ни-
же температуры садка с пчёлами. Каждую концентрацию (дозу) препарата испытывают на рабочих пчёлах 5-7, 8-
15 и 16-20-дневного возраста, а при необходимости на трутнях, матках и разновозрастном расплоде. С каждой
группой пчёл ставят не менее трёх опытов при соответствующем числе и идентичности пчёл в контролях.
Следует иметь в виду, что даже одновозрастные пчёлы, взятые из различных семей, имеют определённые
отличия в продолжительности жизни.
Для получения сопоставимых результатов расчёты концентрации и дозировки препарата проводят по ДВ и
используют одинаковую схему разведения, например, так называемую ’’логарифмическую”: 0,1%—0,005%—
0,0025%-0,001%-0,0005% и т.д.
Количество препарата для получения исходной концентрации определяют по формуле:
______ахУ
х= р
где:
V - необходимый для опыта объём раствора, мл;
а - содержание ДВ в заданном растворе, %;
р - содержание ДВ в исходном препарате, %;
X - количество исходного препарата, которое необходимо взять для приготовления нужного объёма рас-
твора с заданной концентрацией.
При V400 мл а=1%, р=50%.
Приготавливают исходный концентрированный раствор, из которого последовательными разведениями по-
лучают растворы требуемых концентраций.
Изучение акарицидной активности препарата начинают с максимально переносимой для пчёл дозы (кон-
центрации). В последующем количество препарата увеличивают или уменьшают в зависимости от полученного
эффекта. Желательно изучение не менее пяти концентраций.
Время проявления токсического действия препаратов устанавливают в ходе ежедневного наблюдения за
поведением пчёл и клещей и учёта их гибели.
Многие вещества вызывают отпадение клещей от тела пчёл, поэтому важно установить жизнеспособность
паразитов после обработок. Для этого отпавших самок помещают на чистое предметное стекло и наблюдают под
микроскопом за сохранением подвижности конечностей при прикосновении холодной или нагретой препароваль-
272
ной иглы или при помещении клеща в каплю 3-5% молочной кислоты. Самок, не проявляющих признаков жизни,
считают погибшими. Вычисляют процент погибших самок клещей по отношению к общему числу отпавших пара-
зитов с учётом времени воздействия препарата.
В некоторых случаях важно знать сохранение прикрепительной способности отпавших клещей к хозяину. С
этой целью 10 живых отпавших после обработки самок варроа и такое же число интактных клещей подсаживают
на соответствующее число рабочих пчёл, которых содержат в отдельных садках в термостате. Учёт отпавших
клещей на дно садка проводят через 1, 2, 4, 6 и 8 ч. Вычисляют процент отпавших клещей по отношению к обще-
му их числу за время наблюдения в опытной и контрольной группах. Опыт ставится в трёхкратной повторности.
Результаты обрабатывают методами вариационной статистики.
Отравление может сопровождаться возбуждением, угнетением, расстройством деятельности пищевари-
тельного тракта, нарушением координации движений, параличом мышечного аппарата. У поражённых клещей
наблюдают возбуждение, нарушение координации движений, гибель. Кроме того, для определения влияния испы-
тываемых соединений на обрабатываемые объекты проводят гистологические, гистохимические исследования, а
также биохимические с целью выявления изменения активности моноаминооксидазы и эстераз (холинэстераза,
бутирилэстераза, трибутириназа) или других мишеней действия препарата.
Оценку токсичности препаратов проводят по максимально переносимой для пчёл дозе (МПД), абсолютной
смертельной дозе, вызывающей гибель всех обрабатываемых объектов (ЛДюо) и дозе, вызывающей гибель 50%
пчёл и клещей (ЛД5о), которую рассчитывают через 48 ч после обработки. ЛД50 препаратов, обладающих отдалён-
ным действием, определяют в более поздние сроки после гибели 50% обработанных объектов. Расчёт ЛД50 прово-
дят по методу Кербера (1932 г.), обладающему достаточной простотой и достоверностью.
Вычисления проводят по формуле:
S(zxd)
аМ=Дтп- -----------
где: аМ = ЛДз0;
Дт = ЛДюо;
z - половина суммы числа клещей или пчёл, павших от двух последующих доз;
d - разница в величине двух последующих доз;
ш - число пчёл в испытании каждой дозы.
Для повышения достоверности в опыте необходимо использовать возможно большее количество клещей и
пчёл.
Кроме того, определение величин СК50 и ЛД50, их достоверных пределов, выявление статистически допу-
стимой (существенной) разницы проводят графическим методом "пробит-анализа" (Беленький М.Б., 1958, 1963;
Попов П.В., 1965).
Для удобства вычислений весь цифровой материал заносят в таблицу. В неё записывают число подопытных
клещей, концентрацию препарата в процентах и логарифмах, найденных с помощью таблицы или компьютер?;
гибель клещей в процентах и пробитах (преобразованные проценты гибели клещей), полученных из таблицы; ги-
бель клещей, ожидаемую по линии регрессии; разницу между гибелью клещей в опыте и ожидаемую по линии
регрессии; критерий сходства опытных и ожидаемых процентов гибели.
На миллиметровой бумаге вычерчивают оси координат и на оси абсцисс откладывают логарифмы концен-
трации препарата, а на оси ординат - пробиты. На графике находят точки переселения логарифмов концентрации
и соответствующей ей смертности клещей (пробиты). С помощью прозрачной линейки на возможно более близ-
ком расстоянии от нанесённых точек проводят прямую - линию регрессии. По графику отыскивают концентра-
ции, при которых ожидается гибель 50% и 95% особей. Для этого от пробита 5,00 (соответствующего гибели 50%
особей) проводят прямую, параллельную абсциссе, из точки пересечения прямой с линией регрессии, на абсциссу
опускают перпендикуляр и определяют значение ЛД50. Таким же образом по пробитам находят и другие концен-
трации.
При использовании в опыте большого числа клещей (не менее 400 в среднем по каждой концентрации)
ошибку ЛД50 можно не вычислять.
Стандартная ошибка ЛД50 вычисляется по формуле:
пгг _ ЛД84 - ЛД16
где: ЛД84 - соответствует пробиту 6;
ЛД]6 - пробиту 4;
N - число особей в опыте для точек, расположенных между значениями пробитов 3,5 и 6,5.
О степени избирательности судят по коэффициенту избирательности (КИ), установленному отношением
ЛД5о для пчёл к ЛД50 для клещей (Ю.С. Коган, 1965).
Интервал доз от минимально действующих на клещей до минимально действующих на пчёл позволяет
определить терапевтическую широту и среднюю терапевтическую дозу (ТД50).
Отношением средней смертельной (ЛД50) для пчёл к средней терапевтической (ТД50) дозе определяется те-
рапевтический индекс препарата. Препараты, используемые для борьбы с варроатозом пчёл, должны обладать
273
высоким акарицидным и минимальным токсическим действием на пчёл. При этом лечебная доза не должна пре-
вышать максимально переносимую. Чем больше разница между терапевтической и максимальной переносимой
концентрацией, тем безопасней применение препарата.
3.2.	ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТРОЙ ОРАЛЬНОЙ И КОНТАКТНОЙ ТОКСИЧНОСТИ
Основным направлением опасного воздействия остро токсичных веществ является их контактное действие.
Контактная ЛД50 - наиболее важная величина при оценке инсектицидов, тогда как оральная ЛД50 является наибо-
лее важной величиной для оценки веществ, не являющихся остро токсичными.
В лаборатории оценивают оральную и контактную токсичность исследуемого вещества для взрослых рабо-
чих пчёл и находящихся на них клещей. Пчёл подвергают воздействию различных доз вещества путём скармлива-
ния, топикального нанесения или контакта с обработанной поверхностью при групповом воздействии. Величину
смертности используют для построения линии регрессии и определения ЛД50.
Для определения оральной токсичности используют формуляцию препарата и его действующее вещество,
каждое в смеси с 20-50% раствором сахара. Если возможно, смешивают с раствором сахара без использования
дополнительных химических растворителей.
При скармливании пчёл не кормят в течение 2-х часов перед опытом. При индивидуальном скармливании
10 или 20 мкл опытного раствора для каждой пчелы с клещом задают с помощью стеклянной трубки. При группо-
вом скармливании пчёлы берут опытный раствор сахара самостоятельно, обмениваются кормом друг с другом и,
таким образом, получают усреднённые дозы. После опытного кормления пчёл обеспечивают чистым раствором
сахара и меняют его ежедневно, если опыт продолжается 48 часов. Учитывают гибель клещей.
Для определения контактной токсичности, по возможности, вещество растворяют в ацетоне. В противном
случае используют другие растворители. Анестезированных пчёл обрабатывают путём топикального нанесения
испытуемого вещества. Точно отмеренное количество продукта наносят на грудь каждой пчелы. После нанесения
дают пчёлам свежий раствор сахара и меняют его ежедневно, если опыт продолжается 48 часов. Пчёлам кон-
трольной группы наносят на грудь такое же количество растворителя. Обработанных пчёл возвращают в садки.
Снятых со взрослых пчёл интактных самок варроа помещают по 10 особей в садки с обработанными пчё-
лами опытной и контрольной групп. Либо в чашку Петри со слегка увлажнённой фильтровальной бумагой на дне
помещают 10 самок варроа, на спинной щиток которых микрошприцом наносят испытуемое вещество (или рас-
творитель). Через 1-2 минуты клещей переносят в садки с интактными пчёлами. Контролем служит садок с пчё-
лами и подсаженными на них десятью самками без обработки.
Учитывая количество клещей, прикрепившихся к пчёлам в течение 1 часа, в дальнейшем подсчитывают
число погибших клещей из числа прикреплённых и потом отпавших через 48 часов и более (если смертность воз-
растает).
Если смертность в чистом контроле значительна (больше 15%), необходимо повторить опыт. После кор-
рекции на смертность в контролях подсчитывают смертность и, проанализировав соответствующими статистиче-
скими методами, вычисляют величину средней летальной дозы (ЛД50), выражая её в мкг действующего вещества
или препаративной формы на одну пчелу.
3.3.	ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТРОГО ФУМИГАНТНОГО ДЕЙСТВИЯ (ДЛЯ ВЕЩЕСТВ, ОБЛАДАЮЩИХ ВЫРАЖЕННОЙ
ЛЕТУЧЕСТЬЮ ПРИ 20°С)
Чистые чашки Петри заполняют наполовину раствором испытуемого препарата в рекомендуемой рабочей
концентрации; садки с пчёлами устанавливают сверху непосредственно на края чашек так, чтобы испарения ис-
пытываемого вещества проникали через перфорированное дно садка внутрь. Экспозиция - 8 часов.
Садок с контрольными пчёлами устанавливают над чашкой Петри с растворителем или водой.
Подсчитывают число погибших и поражённых пчёл (клещей) через 24 и 48 часов или позже (если смерт-
ность постепенно возрастает), в опытных и контрольных садках.
3.4.	ОПРЕДЕЛЕНИЕ ХРОНИЧЕСКОЙ ОРАЛЬНОЙ ТОКСИЧНОСТИ ПРИ ГРУППОВОМ СКАРМЛИВАНИИ
Проводят данное исследование, если ЛД50 действующего вещества и препаративной формы при остром
оральном и контактном действии менее 100 мкг/пчелу, а также для веществ, приводящих к увеличивающейся ги-
бели пчёл к 48 часам наблюдения в сравнении с 24 часами.
При этом используют смесь мёда с водой (1:1) или раствор сахара (2:1); в вертикальных кормушках, закры-
тых пластиковыми пробками с кормовыми отверстиями. Корм содержит 1/2, 1/4 и, при возможности, меньшие
части ранее определённой максимально переносимой концентрации/дозы (ЯД?) действующего вещества и/или
препаративной формы. Ежедневно проводят учёт гибели пчёл до тех пор, пока не погибнет половина или большая
часть насекомых. По результатам наблюдений определяют показатель средней продолжительности жизни пчёл
для каждой концентрации пестицида по формуле:
274
Пж =
(al + а2 + аЗ + ... ап)
N
где:
al, а2,... ап - число живых пчёл после 1, 2,. п дней скармливания опытного корма;
N - число первоначально взятых в опыт пчёл.
Контрольные пчёлы постоянно получают чистый раствор сахара, который ежедневно меняют на свежепри-
готовленный.
3.5.	ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНТАКТНОЙ ТОКСИЧНОСТИ ПРИ ГРУППОВОМ ВОЗДЕЙСТВИИ
Показатели острого контактного действия испытуемого вещества могут быть также определены на группе
пчёл, при этом одновременно можно установить продолжительность токсического действия препаративной фор-
мы при контакте с обработанной поверхностью.
3.5.1.	ОСТРАЯ КОНТАКТНАЯ ТОКСИЧНОСТЬ ПРИ ГРУППОВОМ ВОЗДЕЙСТВИИ
На матовое стекло, соответствующее размерам дна садка, наносят 1 мл раствора препарата в рекомендуе-
мой рабочей концентрации (или раствор адекватного количества действующего вещества), высушивают на откры-
том воздухе в естественных условиях. Затем его помещают на дно специального садка (экспозиметра) с пчёлами,
поражёнными клещами. Обеспечивают принудительное контактирование пчёл с поверхностью стекла в течение
30 минут. Затем пчёл переносят в чистый садок для дальнейших наблюдений.
3.5.2.	ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТИ ОСТАТОЧНОГО ДЕЙСТВИЯ ПРЕПАРАТА НА СТЕКЛЯННОЙ
ПОВЕРХНОСТИ (ДЛЯ ВЕЩЕСТВ, ЛД50 КОТОРЫХ МЕНЕЕ 10 МКГ/ПЧЕЛУ)
Использованное в опыте по п. 3.5.1. обработанное стекло хранят на открытом воздухе в вытяжном шкафу и
периодически используют для принудительного контактирования с ним новых групп пчёл. По результатам учёта
гибели пчёл и клещей в опыте и в последующие дни определяют д лительность остаточного действия препарата в
сутках. Контрольные пчёлы с клещами в обоих опытах контактируют со стеклом, обработанным использованным
в опыте растворителем или водой.
3.6.	ИСПОЛЬЗОВАНИЕ АЭРОЗОЛЬНЫХ ПРЕПАРАТОВ
Аэрозоли, содержащие крупные частицы акарицидов (туманы), могут быть получены в лабораторных усло-
виях с помощью различных бытовых распылителей или порошковдувателей, выводной конец которых вводят в
специальное отверстие герметично закрытой камеры.
Высокодисперсные, мало оседающие аэрозоли инсектоакарицидов образуются при использовании аэро-
зольных (дымовых) шашек (термические таблетки, акарицидные полоски), а также при сжигании препарата в ды-
маре. Действие аэрозольных шашек основано на использовании теплоты экзотермических реакций пиротехниче-
ской смеси для возгонки препарата, который при последующем смешивании с воздухом образует конденсацион-
ный аэрозоль.
Высокодисперсные (конденсационные) аэрозоли препаратов получают сжиганием определённой навески
препарата на пламени горелки в пробирке, соединённой системой трубок с герметичной камерой.
Используют также аэрозольные баллоны и аэрозольные упаковки, изготовленные в заводских условиях.
Садки с пчёлами (не менее трёх) ставят в специальные герметичные камеры из прозрачного материала, в
одну из которых вводят аэрозоль препарата. Другую (контрольную) группу пчёл в садках оставляют во второй
камере без обработки. Через 1,5, 10, 20, 30 мин., а иногда и более после введения аэрозоля садки вынимают из
камер и помещают в термостат.
Учёт гибели пчёл и клещей проводят каждый час в первые 8 часов после начала опыта, в последующем -
ежедневно в течение 10 дней. На основании полученных результатов рассчитывают ЛД50 и ЛДюо; кроме того, для
пчёл определяют МИД. Для сравнения степени токсичности изучаемых препаратов их дозы (концентрации) сле-
дует выражать в мкг вещества, находящегося в камере объёмом 1 м3, т.е. в мкг/м3.
3.7.	ЛЕГКОВОЗГОНЯЮЩИЕСЯ ПРЕПАРАТЫ И ГАЗЫ
Введение газов осуществляется через специальное устройство в герметичной камере. Количество подавае-
мого газа определяют по количеству вытесненного воздуха, с учётом плотности газа и газовых смесей по отноше-
нию к плотности воздуха. С целью более равномерного смешения иногда герметичную камеру оборудуют лопаст-
ным вентилятором, работающим от руки исследователя или электромотора.
При работе с легковозгоняющимися веществами садки с подопытными пчёлами ставят в герметичную ка-
меру, куда в бюксе или на часовом стекле вносят навеску легковозгоняющегося вещества. При проведении иссле-
дований необходимо учитывать площадь испаряющей поверхности. Камеру и садки с контрольной группой пчёл
помещают в термостаты с температурой 34-36°С. По истечении определённого отрезка времени (1, 2, 6, 12, 24, 48,
72 ч) садки вынимают и учитывают количество испарившегося вещества и число погибших членистоногих. По
результатам опыта определяют ЛД50, ЛДюо Для пчёл и клещей, кроме того, находят максимально переносимую
дозу, выраженную в мкг на 1 м3 объёма камеры. При оценке последнего параметра необходимо также проследить
за длительностью жизни пчёл и клещей. С этой целью проводят учёт числа погибших особей, содержавшихся в
термостате, после пребывания в парах легковозгоняющегося вещества; данные учёта сравнивают с контролем.
Срок наблюдения 20-25 дней.
275
4. ИС11Ы1АНИЕ 11РЕ11A1J/X 1 ОН В УСЛОВИЯХ НАСЕКИ
Наиболее перспективные препараты, отобранные после проведения лабораторных испытаний, изучают на
семьях пчёл. Следует всегда иметь в виду возможность несовпадения некоторых показателей в лабораторных и
пасечных условиях, что связано с отсутствием дефекации у пчёл при содержании в садках, плохой аэрацией сад-
ков и т. д.
В пасечных испытаниях определяют эффективность препарата, процент осыпи клещей, снижение экстен-
сивности и интенсивности поражения пчёл и печатного трутневого расплода; оптимальную дозу препарата на
улочку, пчелиную семью, курс лечения; число обработок; интервалы между ними; продолжительность лечения.
Устанавливают также оптимальные условия обработки: температуру воздуха, время суток, сезон года,
наличие остаточных количеств препарата в продуктах пчеловодства, побочные явления и осложнения, меры пре-
дупреждения и борьбы с ними, противопоказания к применению препарата.
Изучение акарицидности и влияния препаратов на пчёл проводят на семьях или нуклеусах, подобранных по
принципу аналогов.
При формировании опытных и контрольных групп учитывают породу и возраст маток, силу семей в улоч-
ках (расстояние между рамками улья, плотно покрытыми пчёлами), запас кормов, количество засева и расплода,
поражённость клещом. О степени инвазированности судят по экстенсивности (проценту поражённых пчёл в груп-
пе) и интенсивности (числу клещей, паразитирующих на одной пчеле) поражения 100 взрослых пчёл (насекомых
следует брать с рамок, имеющих расплод) и 100 ячеек печатного трутневого расплода, взятого с нижней части
центральной рамки; при отсутствии последнего используют печатный пчелиный расплод. Учёт количества кор-
мов, печатного расплода и засева проводят по числу квадратов рамки-сетки. Для определения дозы препарата
необходимо подбирать семьи различной силы: слабые (4-5 улочек пчёл весной или осенью), средние (6-7 улочек)
и сильные (более 8 улочек). Необходима также подборка групп семей пчёл с сильной (более 30%), средней (20-
30%) и слабой степенью поражения, с расплодом и без печатного расплода. Каждая группа должна быть представ-
лена не менее чем тремя семьями пчёл. Насекомых помещают в плотный, без щелей улей с плотно закрывающей-
ся крышкой. Иногда для герметизации улей накрывают полиэтиленовой плёнкой, которую по краям придавлива-
ют крышкой. Улей должен иметь съёмное дно, между дном и корпусом помещают сетчатый (величина ячейки 2x2
мм) подрамник. Под сетку закладывают лист промасленной белой бумаги. При испытании некоторых препаратов
возникает необходимость утепления улья, а также увеличения расстояния между рамками до 3 см; для этого уда-
ляют крайние рамки.
Обработку семей проводят рано утром до начала лёта пчёл или поздно вечером после возвращения их в
улей, в некоторых случаях целесообразна дневная обработка. Одни и те же семьи обрабатывают в различные се-
зоны года: весной, летом и осенью. В периоды обработок и наблюдения за подопытными семьями учитывают
температуру окружающего воздуха.
Каждый препарат испытывают в 3-5 дозах (концентрациях), меньших максимально переносимой дозы
(концентрации), полученной в садковых условиях, в нескольких повторностях, при наличии соответствующего
контроля. На одну дозу (концентрацию) и контроль используют не менее трёх семей.
Токсичность испытываемых соединений для обрабатываемых объектов определяют по изменению поведе-
ния и гибели пчёл, трутней и маток, засеву до и после обработки. О возможном влиянии препарата на пчелиные
семьи судят также по продолжительности жизни опытных и контрольных пчёл, их работоспособности. С этой це-
лью подсчитывают число пчёл, вылетающих в период медосбора за 5-10 минут из летка до и после обработки
(первый час и через 24-48 ч), в течение трёх дней. Через 1 и 5 суток после применения препарата проводят взве-
шивание улья. Рамкой-сеткой до и после обработки измеряют печатный мёд и напрыск, взвешивают медовый зо-
бик у 10 пчёл (2-3 раза в течение 24 дней); учитывают количество отводков (роёв), полученных от семей, а в пе-
риод откачки мёда - медосбор у обработанных и необработанных пчёл.
Токсическое действие акарицидов на трутней определяют по изменению формы и подвижности спермато-
зоидов, способности к оплодотворению. Для определения влияния препарата на пчёл и клещей могут быть ис-
пользованы гистологические, гистохимические и биохимические исследования.
Акарицидность препаратов устанавливают по числу осыпавшихся клещей в течение определённого отрезка
времени с учётом гибели клещей в контроле, изменения степени инвазированности пчёл и печатного трутневого
расплода.
Для определения необходимого числа обработок и интервалов между ними, которые зависят от продолжи-
тельности действия препаратов, проводят ежедневный учёт гибели клещей и пчёл. На основании полученных дан-
ных устанавливают продолжительность курса лечения.
Акарицидную активность изучаемых соединений рассчитывают по формуле Аббота, учитывающей гибель
клещей в опытной и контрольной группах:
гибель клещей в опыте,% - гибель клещей в контроле, %	. „„
. .	- _	х j 00
100% (гибель клещей в контроле)
Для более точного определения пасечной эффективности препаратов в остром опыте проводят учёт клещей,
оставшихся на пчёлах после обработки. С этой целью после подсчёта клещей, осыпавшихся под действием препа-
рата, бумагу, лежащую на дне улья, заменяют на новую. Семью закуривают и определяют число паразитов, от-
павших во время закуривания. Для подсчёта числа клещей, оставшихся на пчёлах, используют ПДИЭА-1. Прибор
276
состоит из стеклянной воронки диаметром 100 мм (№5) и сетки из проволоки диаметром 0,4 мм, изогнутой по
форме конуса воронки, но не касающейся её стенок.
Воронка с резиновой трубкой длиной 9-12 см с металлическим зажимом на ней соединяется со стеклянной
трубкой, имеющей длину 5-7 мм (внутренний диаметр 14 мм), на конце которой резиновым кольцом крепят двой-
ной слой марли. Прибор устанавливают на штативе.
Закуренных пчёл (по 100-200 и более) помещают в воронку, заливают 1% водным раствором стирального
порошка или пасты ОП-7 и помешивают стеклянной палочкой. Через 5-7 минут раствор сливают, этим же или
новым раствором промывают пчёл ещё 2-3 раза. Затем марлю снимают и подсчитывают имеющихся на ней кле-
щей. Таким образом, поступают со всеми закуренными пчёлами.
После этого, суммируя число клещей, осыпавшихся при обработке препаратом, при закуривании и остав-
шихся на пчёлах, определяют общее количество паразитов, бывших в семье до применения акарицида. Эффектив-
ность препарата в % определяют по формуле:
П1
Х= — п " Х100
где: П] - число клещей, осыпавшихся под действием препарата;
П - число клещей в семье до обработки.
Об эффективности и целесообразности дальнейшего применения препарата судят как по числу осыпавших-
ся клещей, снижению степени инвазированности пчёл и печатного трутневого расплода, так и по числу погибших
пчёл. Эффективными считаются препараты, вызвавшие отпадение не менее 80% паразитов и не оказавшие отри-
цательного действия на жизнедеятельность семьи пчёл. Полученные результаты необходимо рассматривать как
предварительные, так как следует учитывать не только острую токсичность соединения (сразу после обработки),
но и возможное отдалённое влияние его на воспроизводительную функцию маток и трутней, подвергающихся
многократным обработкам.
Окончательную оценку эффективности и безвредности препарата дают по состоянию опытных семей вес-
ной следующего года (сила семей в улочках, наличие матки, экстенсивность и интенсивность поражения 100 пчёл
и клиническое состояние насекомых).
Препараты, обладающие акарицидностью, безвредные для семей пчёл, в последующем испытывают в срав-
нении с утверждёнными противоварроатозными средствами.
4.1.	АЭРОЗОЛИ
Диспергационные аэрозоли, содержащие крупные частицы акарицидов (туманы), могут быть получены с
помощью гидравлических (гидропульт, автомакс, дезинфаль и др.) и пневматических (ЖР-6 для жидкостей и ПР-1
-для порошков) распылителей. Давление, необходимое для выбрасывания из резервуара жидкостей и порошков,
создается при помощи ручных поршневых насосов.
Обработку семей аэрозолями акарицидов, получаемыми с помощью распылителей, а также аэрозольных
баллонов и упаковок под давлением, проводят поверх рамок. Снимают крышку улья, убирают утеплительную по-
душку и покрывающий холстик. Для наиболее равномерного распределения препарата расширяют межрамочные
пространства, удаляя из ульев крайние рамки и раздвигая оставшиеся. Во избежание потерь препарата сразу же
после обработки быстро кладут на место холстик, утеплительную подушку и крышку. Струю аэрозоля направля-
ют в леток, который сразу же закрывают. Продолжительность воздействия аэрозолей акарицидов устанавливают
экспериментальным путём.
В контроле используют две группы семей, из которых одну обрабатывают аэрозолями, не содержащими
препарата, вторую оставляют необработанной.
Аэрозоли термических акарицидных полосок и таблеток получают непосредственно в улье. Приготовлен-
ные формы в тлеющем виде вводят в улей через леток с помощью специально изготовленной металлической пла-
стинки длиной 25-30 см и шириной, равной диаметру таблетки. На конце пластинки с трёх сторон делают ограни-
чительные бортики высотой, равной толщине таблетки, для поджигания термической таблетки паяльной лампой
снизу делают отверстия диаметром 10 мм, на расстоянии 12-13 мм от переднего бортика.
Акарицидные полоски можно помещать в межрамочные пространства улья. С этой целью из улья вынима-
ют одну соторамку. На проволоку пустой рамки подвешивают на крючке, либо согнутую пополам акарицидную
полоску, поджигают её и рамку ставят на свободное место. После этого закрывают леток и ставят на место крыш-
ку улья. Тлеющие акарицидные полоски можно вводить в межрамочное пространство улья через отверстие диа-
метром 2 см, сделанное в потолочной доске, и на проволоке подвешивать в свободном пространстве. Отверстие
затыкают корковой пробкой для фиксирования проволоки и предотвращения улетучивания препарата. Возможно
также, вводить в улей акарицидную полоску в тлеющем виде через леток - на металлической пластине с шипами.
Высокодисперсные аэрозоли препаратов получают и при сжигании их в дымаре. Для введения аэрозолей
препарата в улей на крышку обычного дымаря под углом 90° приваривают трубку длиной 25 см, свободный конец
которой должен быть щелевидным: шириной 2,5-3 см и высотой 8 мм. Указанные размеры обеспечат свободное
прохождение носика дымаря через леток в улей на глубину 3^4 см. Дымарь наполняют мелко наколотым древес-
ным углём твёрдых пород деревьев (дуб, береза, бук), разжигают и доводят до появления пламени.
Навеску препарата равномерно рассыпают по поверхности раскалённого угля, после чего быстро закрыва-
ют крышку дымаря. Носик дымаря вводят в леток и нагнетают дым в улей.
277
1 [родолжительность воздействия аэрозолей акарицида на семью, а, следовательно, и время, в течение кото-
рого необходимо держать закрытым леток, устанавливают экспериментальным путём. Таким же способом обраба-
тывают семьи аэрозолями акарицидов при возгонке в специально оборудованном дымаре.
Для контроля используют две группы семей, одну из которых обрабатывают аэрозолем, полученным при
сжигании угля в дымаре или таблеток, полосок, не содержащих акарицида; другую группу оставляют необрабо-
танной.
4.2.	ЛЕГКОВОЗГОНЯЮЩИЕСЯ ВЕЩЕСТВА, ГАЗЫ И ПОРОШКИ
Способ применения легковозгоняющихся веществ во многом определяется их агрегатным состоянием.
Порошкообразные препараты в дозе, рассчитанной на одну улочку, вносят непосредственно на верхние
бруски рамок, предварительно очищенные от прополиса, и распыляют в межрамочном пространстве. Перед вне-
сением порошков легко возгоняющихся веществ можно положить на брусья соторамок обтянутую плотной капро-
новой тканью рамку, на которой ровным слоем насыпан препарат. Для предупреждения улетучивания его накры-
вают полиэтиленовой плёнкой, которую прижимают крышкой к корпусу улья. Порошкообразные легковозгоняю-
щиеся вещества насыпают также в мешочки и помещают между боковыми стенками и рамками на дне улья. С
целью предотвращения прогрызания мешочков пчёлами их изолируют с помощью металлической сетки или дру-
гих приспособлений.
Некоторые препараты можно располагать на дне улья под сетчатым дном.
Жидкие легковозгоняющиеся вещества размещают на дне улья с помощью специальных приспособлений,
надёжно изолирующих акарицид с помощью металлической сетки от пчёл и свободно проходящих через леток.
Для этого используют лотки из жести или другие открытые ёмкости, имеющие достаточную площадь испарения,
сосуды с фитилями из фильтровальной бумаги или хлопчатобумажной ткани, а также фитили, пропитанные пре-
паратом. Кроме того, легковозгоняющиеся вещества могут быть помещены в улей в желатиновых капсулах, кото-
рые предварительно прокалывают в нескольких местах.
При изучении эффективности таких соединений необходимо учитывать, что с увеличением температуры
повышается степень естественной возгонки препаратов. Уменьшая или увеличивая размеры летка, можно в какой-
то степени влиять на степень возгонки препарата. Поэтому при формировании опытных групп следует подбирать
ульи с одинаковыми по величине летками.
Для снижения степени возгонки препарата к нему примешивают не реагирующие с активно действующим
веществом соединения (кремневый гель, крахмальный клейстер и др.).
После введения препарата леток оставляют открытым. Контролем служит группа необработанных семей.
При испытании порошков акарицидов предусматривают дополнительную группу семей, которую обрабатывают
входящим в состав препарата наполнителем. По мере испарения препарата пополняют его количество. Учёт гибе-
ли клещей и пчёл проводят ежедневно. Определяют длительность акарицидного действия, необходимую для уста-
новления количества обработок на один курс лечения. Применение аэрозолей, газов, порошков иногда бывает не-
возможно в ульях с расплодом пчёл из-за повышенной чувствительности расплода к препаратам или длительного
сохранения остаточных количеств применяемого средства в продуктах пчеловодства. С целью предотвращения
этих нежелательных явлений проводят обработки взрослых пчёл вне улья, в специальных камерах, пустых корпу-
сах ульев. Такого рода обработки в ёмкостях без сот обычно гораздо эффективнее, но значительно повышают за-
траты труда.
4.3.	ВНЕСЕНИЕ ПРЕПАРАТОВ С КОРМОМ
Сахарный сироп, содержащий определённое количество препарата, наливают в предварительно вымытые и
продезинфицированные кормушки и скармливают в течение одних или более суток каждой опытной семье. Кон-
трольной группе пчелосемей дают чистый сахарный сироп. За пчёлами устанавливается постоянное наблюдение.
Устанавливают предварительно вымытые и продезинфицированные кормушки и скармливают лечебный
сироп в течение одних или более суток каждой опытной семье. Контрольной группе пчелосемей дают чистый са-
харный сироп. За пчёлами устанавливается постоянное наблюдение.
Ежедневно учитывают гибель клещей и пчёл. Оценку эффективности препарата проводят по числу осы-
павшихся клещей и изменению заклещёванности пчёл и печатного трутневого расплода, до и после обработки, с
учётом соответствующих показателей в контроле.
4.4.	ВНЕСЕНИЕ ПРЕПАРАТОВ НА ПЛАСТИНАХ
Одним из способов сокращения возможных остатков ДВ в продуктах пчеловодства является внесение пре-
паратов на пластинах, которые помещают между сотовыми рамками, заполненными пчёлами. Используется есте-
ственное стремление пчёл удалять посторонние, мешающие их работе предметы, когда пчёлы находятся в посто-
янном контакте с пластиной, пытаются захватить её края жвалами. За счёт этого акарицид, который находится на
поверхности пластин, попадает в их организм. В качестве носителей ДВ используют полихлорвиниловые и дере-
вянные пластины, а также хлопчатобумажную ткань и некоторые сорта картона. При этом следует учитывать без-
вредность носителя для пчёл (опасными могут быть вещества, используемые для пропитки дерева, ткани и карто-
на) и степень выделения ДВ на поверхности пластины при температуре гнезда. Недостатком такого рода внесения
ДВ является изменение площади гнезда, обсиживаемого пчёлами при внешних колебаниях температуры; картон-
ные и тканевые пластины недолговечны и сравнительно быстро удаляются пчёлами; полихлорвиниловые и дере-
вянные пластины при длительном использовании покрываются воском и прополисом.
278
5.	ОПРЕДЕЛЕНИЕ УСТОЙЧИВОСТИ КЛЕЩА ВАРРОА К АКАРИЦИДАМ
Развитие резистентности к пестицидам у многих видов членистоногих является одной из отрицательных
сторон химического метода борьбы. Многократное применение химических препаратов в течение одного сезона,
быстрая смена поколений клещей могут привести к появлению резистентных популяций варроа, которые обычно
меньше, чем чувствительные особи. При этом становится неизбежным увеличение доз препаратов, кратности хи-
мических обработок, повышается опасность токсического воздействия на пчёл, загрязнения мёда и других про-
дуктов пчеловодства.
Исследователь, занимающийся изучением химических средств борьбы с вредными членистоногими, дол-
жен владеть методом определения их резистентности.
По имеющимся данным, резистентность популяции паразитов развивается ступенчато. Так, у клещей-
вредителей растений различают три этапа образования устойчивости:
1.ни	зкая и относительно стабильная устойчивость - толерантность (превышает естественную чувствитель-
ность клеща в 2 раза);
2.бы	строе возрастание устойчивости (в 8-10 раз за 10-12 поколений) - является сигналом замены препарата;
3.ст	абильная устойчивость (любые дозы препарата неэффективны, ЛД^о и ЛД95 сходны).
Определение резистентности клещей к препаратам заключается в выявлении устойчивых особей популяций
с помощью диагностической дозы и установления уровня устойчивости популяции. Применение диагностической
дозы препарата, которая подбирается для клещей нормальной чувствительности, позволяет обнаружить единич-
ных резистентных особей. Обнаружение выживших клещей в трёх последовательных проверках считается опас-
ным сигналом, диагностическая доза во всех проверках должна быть одинаковой, так как она предназначена не
для определения уровня устойчивости, а для получения информации о доле устойчивых особей в популяции.
Определение уровня устойчивости проводят на особях резистентной популяции в сравнении с особями,
имеющими нормальную чувствительность.
О характере изменения чувствительности самок варроа к акарициду судят по соотношению параметров
токсичности препарата для исследуемой популяции клещей варроа к заведомо чувствительной популяции парази-
та. При невозможности определения ЛД50 на чувствительной популяции клещей варроа сравнение значений про-
водят по токсикологической характеристике препарата, полученной при испытаниях, проведенных перед внедре-
нием его в практику на особях, ранее не подвергавшихся обработкам этим препаратом. Увеличение ЛД50 препара-
та, на клещах варроа, длительное время подвергавшихся воздействию этого акарицида, свидетельствует о появле-
нии у паразитов устойчивости к нему. Достоверность различий в полученных показателях токсичности препарата
в трех опытах, проведенных в течение одного сезона года, по группам резистентных и чувствительных клещей
может быть подтверждена статистической обработкой данных (Г.Ф. Лакин, 1973 и др.). Фактор изменения чув-
ствительности клещей к препарату определяют по формуле:
_________________ЬР5	0 - устойчивой популяции варроа_______
LD50 - чувствительной популяции варроа
5.1.	НЕПОСРЕДСТВЕННОЕ ВОЗДЕЙСТВИЕ АКАРИЦИДА НА КЛЕЩЕЙ ВАРРОА
Контакт с поверхностью, содержащей акарицид. Внутреннюю поверхность стеклянных капсул (цилиндров)
диаметром 6 мм и высотой 3-5 мм, помещённых в чашке Петри, покрывают парафином, содержащим определён-
ные количества акарицида.
От специально подготовленного расплода или взрослых пчёл из семьи берут самок варроа и помещают по
одной в цилиндры. На каждую концентрацию препарата берут не менее 10 чувствительных и испытываемых са-
мок варроа. Контролем служат самки варроа, взятые из исследуемой, и заведомо чувствительных семей пчёл, по-
саженные в цилиндры, обработанные чистым парафином. Сверху цилиндры накрывают стеклом, покрытым пара-
фином, с концентрацией препарата как в цилиндре, а в контроле - стеклом, покрытым чистым парафином. Количество
погибших клещей учитывают через каждый час. ЛД50 препарата рассчитывают через 2-6 часов после начала опыта.
Упрощённый вариант. Испытывают действие известной концентрации ДВ в препарате на чувствительных и
испытываемых клещей. Для этого указанную концентрацию наносят на лист фильтровальной бумаги или кладут
полоску препарата в чашку Петри. На подготовленную поверхность помещают не менее 30 самок варроа из ука-
занных групп. Контролями служат аналогичные клещи этих групп, содержащиеся на увлажнённой чистой водой
фильтровальной бумаге или сухой поверхности чашки Петри.
Гибель клещей в чашках учитывают через каждый час, до гибели всех паразитов. Определяется процент ги-
бели. Надёжность метода определения устойчивости клещей к «Апистану» достигает 99,4%, не выявление устой-
чивых особей не превышает 5%. Данный метод широко используют в странах Европы (J. Trouller, 1996).
Топикальное нанесение акарицида. На дорзальный щиток клещей с помощью микрошприца наносят раз-
личные концентрации препарата. Массу препарата с учётом концентрации определяют по делению шприца.
Для определения токсичности препарата для клещей из семей пчёл с признаками резистентности паразита к
акарициду отбирают самок варроа по 10 (15) шт. на каждую группу. Клещей обрабатывают различными (3-5)
концентрациями акарицида. Аналогичным образом отбирают и обрабатывают самок варроа, заведомо чувстви-
тельных к препарату. Чистым контролем будут служить самки варроа с признаками устойчивости к препарату и
чувствительные к нему после нанесения на них чистой воды в том же объёме.
Учёт гибели самок варроа проводят ежечасно в течение 8 часов после топикального нанесения на них ака-
рицида и затем определяют ЛД50 в мкг.
279
5.2.	ВОЗДЕЙСТВИЕ АКАРИЦИДОВ НА КЛЕЩЕЙ, НАХОДЯЩИХСЯ НА ПЧЕЛЕ
Скармливание пчёлам сахарного сиропа с акарицидом. Из пчелиных семей, имеющих признаки устойчиво-
сти клещей к акарициду, и чувствительных, набирают в энтомологические садки по 25 (50) пчёл с клещами. Каж-
дой группе дают 3-5 испытываемых концентраций акарицида в сахарном сиропе.
Для приготовления необходимой концентрации сахарного сиропа в него вносят соответствующее количе-
ство акарицида. Нерастворимые в воде препараты предварительно растворяют в спирте, объём которого в сахар-
ном сиропе не должен превышать 5% объёма. Сахарный сироп с препаратом скармливают в течение 24 часов, по-
сле чего пчёлам дают чистый сахарный сироп. В качестве контроля используют таких же пчёл с клещами, пчёлам
дают чистый сахарный сироп.
Учёт гибели клещей проводят ежедневно в течение трёх дней. По результатам опыта определяют ЛД50 пре-
парата для клещей с признаками устойчивости к акарициду и чувствительных к нему. Расчёт проводят через 48 и
72 часа после начала скармливания препарата.
Топикальное нанесение акарицида на пчёл. Из семьи пчёл с подозрением на появление устойчивости у са-
мок варроа к препарату и из семей пчёл с нормальной чувствительностью паразитов к нему в энтомологические
садки подбирают по 25-30 пчёл с находящимися на них клещами. На отобранных пчёл калиброванной петлей или
микрошприцем наносят различные дозы акарицида.
Калиброванную петлю изготавливают из металлической проволоки с сечением 0,4-0,6 мм. Для калибровки
петли в предварительно взвешенный бикс вносят 60-80 капель раствора препарата и определяют его массу. Затем
делением ее на число капель раствора препарата определяют массу одной капли для каждой концентрации.
Проверяют действие 3-5 концентраций акарицида. В контрольных садках пчёлы с клещами, подозревае-
мыми в устойчивости к акарициду, и чувствительные к нему, остаются необработанными. Учёт гибели погибших
самок варроа проводится ежедневно. Расчёт ЛД50- через 48 и 72 часа после обработки.
5.3.	ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВРЕМЕНИ ОТПАДЕНИЯ КЛЕЩЕЙ С ТЕЛА ОБРАБОТАННЫХ АКАРИЦИДОМ ПЧЁЛ.
В 10 чашек Петри или энтомологические садки кладут фильтровальную бумагу, увлажнённую лечебной
концентрацией акарицида. В 10 других чашках (садках) бумагу увлажняют чистой водой (контрольная группа). Во
все чашки (садки) сажают по 5 молодых взрослых пчёл без клещей. Насекомых выдерживают в течение 2 часов в
тёмном месте, после чего переводят в чистые чашки (садки). В 5 чашек (садков) опытной и контрольной групп
помещают по пять самок варроа из испытываемой популяции, а в остальные вносят такое же количество парази-
тов, чувствительных к акарициду. Отмечают время прикрепления и отпадения клещей от пчёл в каждой чашке
(садке).
Чувствительные к флувалинату («Апистану») варроа отпадали от обработанных пчёл в среднем через 8 (3-
11) минут, устойчивые сохранялись до 20 (8-46) минут, в контрольных группах клещи оставались на насекомых.
(J.P. Faucon, Р. Drajnudel, 1996).
5.4.	ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ КЛЕЩЕЙ ПОСЛЕ ОБРАБОТКИ АКАРИЦИДОМ.
Работы в этом направлении могут преследовать различные цели: выявление ранних признаков возникнове-
ния устойчивости у паразита; сохранение жизнеспособности резистентных самок варроа, перенёсших очередное
воздействие препарата; сравнительное изучение воспроизводства и смертности в резистентных и чувствительных
популяциях клеща и т.д.
Способность к движению отпавших при обработке самок варроа устанавливают прикосновением к ним хо-
лодной или нагретой препаровальной иглы. Возможность прикрепления - наблюдением за фиксацией клещей на
предложенных им молодых пчёлах. В ряде случаев клещей подсаживают на выделенных из сотов личинок пчёл
(трутней) перед их запечатыванием. В лабораторных условиях следят за питанием таких клещей, откладкой яиц
самками (N. Milani, 1995). Оценку действия акарицидных препаратов на воспроизводительную функцию самок
варроа и жизнеспособность потомства можно найти в работах А.А. Замазия (1987, 1988, 1989); А.А. Замазий,
О.Ф.Гробов(1990).
5.5.	ПАСЕЧНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
На пасеке отбирают группу из 3-5 семей равной силы. Семьи пчёл размещают в ульях с клещеуловителями
(или на предварительно очищенное дно ульев помещают смазанные маслом листы бумаги). Через три дня подсчи-
тывают количество отпавших самок клещей. Рассчитывают среднее отпадение паразитов на семью в сутки до
проведения лечения (МЦ.
Затем в каждую семью вновь помещают чистые листы промасленной бумаги и проводят рекомендуемый
курс обработки используемым средством согласно инструкции (средство №1). В течение процесса лечения листы
промасленной бумаги удаляют и заменяют новыми каждые 3 дня. Проводят подсчёт отпавших клещей на бумаге и
в сотах, устанавливают общее число паразитов, отпавших за курс обработки в каждой семье, определяют среднюю
величину отпадения на семью в сутки (М2).
Обработанные семьи пересаживают на чистые соты. На дно ульев вновь кладут чистые листы промаслен-
ной бумаги и проводят обработку препаратом, действующее вещество которого принадлежит к другому химиче-
скому классу (средство №2). При обработке пиретроидными препаратами (ДВ «Апистана» -флувалинат, «Байва-
рола» - флуметрин, «Габона» - акринатрин) или органическими кислотами (муравьиная, щавелевая, молочная) и
тимолом (тимол-содержащими препаратами) проверку проводят «Бипином» (ДВ - амитраз), «Фольбексом ВА»
(ДВ - бромпропилат) или «Перицином» (ДВ - кумафос) двукратно через 24 часа; последние средства проверяют
280
взаимно. Через 24 часа после последней обработки удаляют лист бумаги и подсчитывают количество отпавших
клещей после обработки вторым средством. Определяют эффективность обработки каждой семьи по формуле:
Эффективность	Число отпавших клещей при использовании средства №1
средства № 1 =	--------------------------------------------------------------- х ] 00%
Число отпавших клещей от средства №1 + средства №2
Высчитывают среднюю величину эффективности по опытной группе семей пчёл (М3).
Проводят сравнение средних Мь М2 и М3:
При М2 < Мь - препарат неэффективен.
При М2 > Мь - препарат обладает акарицидным эффектом.
м,	м2	
при 	 *100 или		- х Ю0=95% - высокий акарицидный эффект, использование средства
М2	м3	целесообразно;
Mi	м2	
при ——	 *100 или	х л	— х Ю0=50% - акарицидный эффект низкий, использование средства
м2	М3	нецелесообразно;
Величины эффективности
---- х 100 между 50-95% указывают на необходимость повтор-
М2--ных обработок ульев в течение сезона на пасеке.
Снижение эффективности пока- М2
зателя	------ х 100=95% ниже 95% при правильном использовании
Мз	средства указывает на образование устойчиво-
сти клеща.
Для более точного определения пасечной эффективности средства №1 количество клещей, оставшихся на
пчёлах после обработки вторым акарицидом, устанавливают в остром опыте. Для этого семью пчёл пересаживают
на чистые соты, на дно улья кладут промасленную бумагу. Семью пчёл закуривают и определяют число самок
варроа, оставшихся на пчёлах после обработки препаратом. Подсчитывают число отпавших клещей от закурива-
ния и самок варроа, оставшихся на пчёлах.
Клещей, оставшихся на закуренных пчёлах, можно подсчитывать с помощью ПДИЭА-1 и определить эф-
фективность действия препарата.
В практических условиях при обработке семей пчёл жидким амитразом («Бипином») после использования
«Апистана» можно установить чувствительность паразита к последнему препарату по числу отпадающих особей:
отпадение после повторной обработки 0-10 особей варроа - популяция чувствительна к «Апистану», обработка этим
препаратом эффективна; 11-50 варроа - популяция приобрела устойчивость, действие препарата ослаблено; при ги-
бели более 51 клеща - популяция устойчива, обработка «Апистаном» неэффективна (J.P. Faucon et aL, 1995).
При проведении пасечных опытов, в особенности осенью, следует учитывать значительный ежедневный
обмен клещами между семьями пчёл как внутри пасеки, так и с соседними.
6.	ХЕМОСТЕРИЛЯНТЫ, ЮВЕНИЛЬНЫЕ ГОРМОНЫ И ИХ АНАЛОГИ
Хемостерилянты, ювенильные гормоны и их аналоги должны обладать высокой избирательностью, быть
безвредными для людей и пчёл и иметь короткий период полураспада.
6.1.	ЛАБОРАТОРНЫЕ ИСПЫТАНИЯ ДЕЙСТВИЯ ХЕМОСТЕРИЛЯНТОВ И ЮВЕНИЛЬНЫХ ГОРМОНОВ
НА САМОК КЛЕЩА-
Хемостерилянты испытывают на молодых (не более суток после выхода из расплода) самках клеща мето-
дами топикального нанесения, контакта с обработанным тест-объектом и воздействия через гемолимфу обрабо-
танных пчёл.
Топикальное нанесение растворов хемостерилянтов на дорзальный щиток самок варроа проводят с помо-
щью калибровочной иглы или микрошприца.
Контакт самок с тест-объектом, обработанным раствором (этаноловым, метаноловым, ацетоновым и т.п.)
хемостерилянта, проводят в чашках Петри, куда перед опытом помещают обработанный и выпаренный при ком-
натной температуре тест-объект (полиэтиленовая плёнка, фильтровальная бумага, дерево, вощина). Затем в чашку
вносят 15 самок клеща. Испытывают 3^1 экспозиции и 2-3 концентрации изучаемого препарата. В первом кон-
троле используют столько же паразитов, которых на такое же время помещают на тест-объекты, обработанные
растворителем. Вторую контрольную группу размещают на чистых тест-объектах. Затем клещей переносят в от-
дельные садки с пчёлами и открытым трутневым расплодом или расплодом рабочих пчёл (5x5 см или 4><6 см с 5-
6-дневными личинками) и ведут наблюдения в течение 15-20 дней, как указано ниже. Обработанных хемостери-
281
лянтом самок можно культивировать на личинках пчёл последнего возраста в пробирках. Смену личинок в про-
бирках проводят по достижении ими стадии предку колки (появление кокона).
Метод воздействия препарата на паразита (самку клеща) через гемолимфу хозяина (пчелы) заключается в
том, что 75 подопытным пчёлам вместе с сахарным сиропом скармливают нетоксичную для них концентрацию
препарата в 2-3 дозах, после чего в каждый садок помещают 15-20 самок варроа.
Садки с пчёлами содержатся в термостате при температуре 34-36°С и относительной влажности 60-80%.
Через сутки в садки помещают соты с трутневым расплодом размером 5><5 (4x6) см, содержащим 5-6-дневных
личинок или расплод рабочих пчёл перед его запечатыванием. После запечатывания расплода (на 3-4 сутки) соты
убирают из садков и помещают туда новые такие же пробы расплода. Запечатанные соты с личинками помещают
в термостат при той же температуре и через 2-3 суток вскрывают, подсчитывают число самок варроа и их потом-
ство (яйца и нимфальные стадии) в каждой ячейке. Самок клеща отбирают и помещают в другой садок с тем же
числом заведомо здоровых пчёл и пробами сота с трутневыми личинками такого же размера. В течение опыта,
который длится 20-22 дня, проводят четыре смены проб сотов с трутневым расплодом. При наблюдении учиты-
вают число вышедших из яиц преимагинальных стадий клеща, гибель и среднюю продолжительность жизни
опытных самок варроа в каждой генерации.
Контрольных самок паразита содержат в тех же условиях на пчёлах, получающих чистый сахарный сироп и
сахарный сироп с растворителем хемо-стерилянта (вода, этанол, метанол, ацетон, эфир и т.п.). Смену проб сотов с
расплодом и учёт проводят в те же сроки, что и в опыте.
Ювенильные гормоны и их аналоги испытывают на самках клеща методом дозированного нанесения мик-
рошприцом на часть сота размером 5x5 см с 5-6-дневным трутневым расплодом, а также методом скармливания
пчёлам-кормилицам в течение суток с сахарным сиропом.
При дозированном нанесении препаратов в садок помещают часть сота, обработанную раствором препара-
та, а также 75 пчёл, инвазированных 15-20 особями самок варроа.
При групповом скармливании в садок помещают пробу сота размером 5x5 см с 5-6-суточным трутневым
расплодом и 75 молодых инвазированных 15-20 самками варроа пчёл, которым дают в течение суток испытывае-
мый препарат.
Садки с опытным материалом ставят в термостат при оптимальных условиях (см. выше). После запечаты-
вания расплода пробы сотов помещают в отдельные садки до выхода из него молодых трутней. Так поступают и с
контролем, которым служит аналогичная группа, не получавшая испытываемого препарата. Каждым методом
изучают 3-5 доз препарата с целью определения ЛД50 для клещей. Повторность опыта для каждой исследуемой
дозы препарата трёхкратная. Особое внимание обращают на длительность и полноту метаморфоза трутней и ра-
бочих пчёл.
6.2.	ИСПЫТАНИЕ ТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ПРЕПАРАТОВ НА ПЧЁЛ, ТРУТНЕЙ, МАТОК
И ИХ ПРЕИМАГИНАЛЬНЫЕ СТАДИИ.
Токсичность препаратов для взрослых пчёл, трутней и маток испытывают методами топикального нанесе-
ния, аэрозольной обработки, контакта с тест-объектом и дозированного скармливания.
Все опыты проводятся в трёх повторностях. Влияние препаратов на яй-цепродукцию изучают на молодых
оплодотворённых матках в нуклеусах. При этом после ранее проведённых исследований на клещах и рабочих
пчёлах отбирается оптимальная доза и испытывается как минимум на трёх матках. Яйцепродукцию учитывают,
замеряя ежедневно засев и печатный расплод рамкой-сеткой и следя за состоянием личинок и куколок.
Влияние препарата на половую активность трутней определяется гистологически по структурным измене-
ниям, происходящим в половых органах после обработки хемостерилянтом, а также по подвижности спермиев,
изменению их формы.
6.3.	ИСПЫТАНИЕ ХЕМОСТЕРИЛЯНТОВ, ЮВЕНИЛЬНЫХ ГОРМОНОВ И ИХ АНАЛОГОВ НА СЕМЬЯХ ПЧЁЛ
Хемостерилянты, ювенильные гормоны и их аналоги на семьях пчёл испытываются после проведения опы-
тов в лаборатории и на нуклеусах. Отбирают препараты, нетоксичные для пчёл и человека и обладающие избира-
тельным действием на клещей.
Каждый препарат испытывают на трёх семьях пчёл, опрыскивая соты его раствором или скармливая его как
минимум в трёх дозах.
Эффективность обработки определяют по интенсивности и экстенсивности поражения печатного расплода
до постановки и через 7, 14, 30 и 60 дней после окончания опыта. Устанавливают яйцепродукцию маток, характер
и состояние засева, при этом обращают внимание на метаморфоз всех стаз медоносной пчёлы.
Контролями служат аналогичная группа пчёл, обработанная той же дозой растворителя, и необработанные семьи.
7.	АТТРАКТАНТЫ И РЕПЕЛЛЕНТЫ.
Данные препараты должны обладать избирательностью в отношении самок варроа, быть безвредными для
пчёл и людей, не оказывать угнетающего действия на половую активность трутней и маток, не нарушать взаимо-
связи различных стаз в гнезде медоносных пчёл.
Существуют две группы аттрактантов: вещества, выделяемые хозяином (медоносной пчелой), и половые
аттрактанты паразита. Наибольший интерес на данной стадии изученности представляют первые, так как если
самки варроа действительно ориентируются при выборе ячеек по этим веществам, то возможно создание биологи-
ческих ловушек.
В практике пчеловодства для борьбы с клещом используют рамки-ловушки, удаление клеща с трутневым
расплодом, который более привлекателен для паразита. Самки варроа также предпочитают откладывать яйца в
282
старых сотах, которые ранее использовались клещом. Использование эфиров жирных кислот, особенно пальмити-
новой, выделяемых личинками трутней и рабочих пчёл, также возможно, но их применение требует особой осто-
рожности, т.к. этим сигналом пользуются также пчёлы для определения времени запечатывания расплода в семье.
В этой связи также могут быть опасны и репелленты. Репеллентным действием обладают эфирные масла ряда
растений, здесь нельзя исключить при внесении в улей дезориентацию самок варроа при выборе мест размноже-
ния. Однократная копуляция самок в молодом возрасте внутри ячейки и гибель самца после ее вскрытия вряд ли
позволит использовать в практике борьбы с варроа половые феромоны паразита.
7.1.	ЛАБОРАТОРНЫЕ ИСПЫТАНИЯ ДЕЙСТВИЯ ПРЕПАРАТОВ НА КЛЕЩЕЙ
Аттрактанты и репелленты испытывают на самках клеща следующими методами: ингаляция в ольфакто-
метре, внесение в ячейки сота без расплода, внесение в ячейки сота с трутневым и пчелиным расплодом 5-6-
суточного возраста.
Опыты проводят в трёх повторностях с соответствующими контролями. В каждом опыте используют 15
самок варроа.
При изучении аттрактантов и репеллентов в ольфактометре учитывают расстояние и скорость перемещения
особей в сторону испытываемого препарата. Большое значение при ориентации самок паразита имеет температура
струи воздуха.
При внесении препарата в соты необходимо помнить, что при вертикальной миграции самки клеща отдают
предпочтение нижней части сота с трутневым расплодом. Эффективность препарата определяют по числу особей
клеща, находящихся в опытных ячейках сота, содержащего аттрактант, по сравнению с контролем, которым в
этих опытах служат ячейки сота, не подвергавшиеся обработке препаратом.
7.2.	ИСПЫТАНИЕ ДЕЙСТВИЯ АТТРАКТАНТОВ И РЕПЕЛЛЕНТОВ НА ПЧЁЛАХ
Влияние препаратов на пчёл определяют методом топикального нанесения, дозированного скармливания,
контакта с обработанным тест-объектом (часть сота).
В каждом опыте используют по 75 пчёл, помещённых в садки и содержащихся в термостате при оптималь-
ных условиях. Контролем служит аналогичная группа пчёл, содержащаяся в отдельном термостате и не подвер-
гавшаяся обработкам. Все опыты по изучению аттрактанта проводят в 3-5 дозах для определения ЛДюо, ЛДзо-
Исследование репеллентных свойств препаративной формы (для веществ, ЛД50 которых менее 10
мкг/пчелу) проводят путём одновременного группового скармливания опытных растворов сахара с различными
концентрациями препарата в садках с 5-6 пробирочно-вакуумными кормушками. Это позволяет испытывать од-
новременно до 5 концентраций препарата в сравнении с чистым контролем (раствор сахара без препарата). О ре-
пеллентных свойствах препарата судят по расходу корма в отдельных кормушках за 48 часов и рассчитывают Ко-
эффициент Защитного Действия (КЗД) по формуле:
КЗД=ЮО-(Ох 100/К) %,
где:
О - количество сахарного сиропа, потреблённого пчёлами из опытной кормушки;
К - количество сахарного сиропа, потреблённого пчёлами из контрольной кормушки;
Расчёт КЗД делается для каждой испытанной концентрации.
7.3.	ИСПЫТАНИЕ АТТРАКТАНТОВ И РЕПЕЛЛЕНТОВ НА СЕМЬЯХ ПЧЁЛ
После определения ЛДюо и ЛД50 препарата для пчёл в садковых опытах проводят его испытания на семьях
пчёл путём обработки экрана с ловушкой для клещей. Изучают влияние препарата на жизнедеятельность и рабо-
тоспособность семей пчёл. Особое внимание при этом следует обратить на сохранение единства семьи как биоло-
гической единицы, взаимосвязи между маткой и рабочими пчёлами, рабочими пчёлами и трутнями, отношение
рабочих пчёл к воспитанию расплода различного возраста и т.д.
8.	БАКТЕРИАЛЬНЫЕ ИНСЕКТОАКАРИЦИДЫ
Микробные препараты должны быть высокотоксичными для клещей и безвредными для пчёл и людей. Они
могут быть приготовлены из микроорганизмов, выделенных от больных самок клеща, а также на основе устойчи-
вых и неспособных образовывать мутации при применении в условиях пчелиной семьи штаммов или вариантов
различных патогенов. Применяют также препараты из продуктов метаболизма (экзо- и эндотоксины) микроорга-
низмов.
К настоящему времени в ряде стран получены положительные результаты при распылении спор некоторых ви-
дов грибов и бактерий в лабораторных условиях и в ульях, например, штамма Enterobacter cloaceae (J. Hrabak, 2003).
8.1.	ЛАБОРАТОРНЫЕ ИСПЫТАНИЯ ДЕЙСТВИЯ ПРЕПАРАТОВ НА КЛЕЩАХ
Микробные препараты испытывают на самках клеща методами топикального нанесения их растворов,
эмульсий, суспензий, взвесей и контакта с обработанным тест-объектом.
После нанесения препарата 25 опытных самок помещают на 75 молодых пчёл в садок и содержат в термо-
стате при температуре 34-36°С и относительной влажности 60-80%.
Гибель клещей учитывают четырёхкратно с интервалом 15 минут в течение первых 5 часов и ежесуточно в
течение последующих 20-22 дней опыта. При этом определяют также среднюю продолжительность жизни кле-
щей, признаки их поражения: нарушение естественного положения тела, координации движения, возбуждение,
283
угнетение, паралич и т.д. При работе с микроорганизмами и их токсинами важно проследить их влияние на про-
дуктивность самок варроа и отдалённые последствия для потомства паразита.
При наличии признаков поражения у данной популяции клещей производится высев микроорганизмов из
их тела на питательные среды и изучается патогенез заболевания с использованием гистологических методов.
Опыты проводятся с дозированным количеством микробных тел в 1 мг препарата или 1 мл суспензии (по
существующим стандартам мутности) микроорганизмов. Препараты испытывают в 3-5 дозах и определяют ЛД50 и
ЛДюо-
9.	ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ХИМИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ (АКАРИЦИДЫ, ХЕМОСТЕРИЛЯНТЫ, АНАЛОГИ
ЮВЕНИЛЬНЫХ ГОРМОНОВ, АТТРАКТАНТЫ, РЕПЕЛЛЕНТЫ) И БИОПРЕПАРАТОВ В ПРОДУКТАХ ПЧЕЛОВОДСТВА.
В продуктах пчеловодства недопустимо содержание даже следов пестицидов. Поэтому для акарицидов, ре-
комендуемых в качестве противоварроатозных средств, предусматривается проведение исследования по выявле-
нию возможных остаточных количеств препаратов в мёде и других продуктах. С этой целью могут быть исполь-
зованы методы определения содержания акарицидов в других биологических субстратах.
Для обнаружения остатков пестицидов в продуктах пчеловодства могут быть использованы физико-
химические, биохимические и биологические методы. Чувствительность аналитических методов, используемых в
настоящее время для обнаружения препаратов в биологических субстратах, достигает 0,0001 мг на 1 кг исследуе-
мого продукта.
Биологические методы, основанные на высокой чувствительности различных членистоногих (комнатные
мухи, плодовые мухи-дрозофилы, личинки комаров и дафний) к некоторым группам пестицидов, ввиду их неспе-
цифичности, не позволяющей установить вид пестицида, не нашли широкого применения.
Биохимические методы основаны на угнетении активности ферментов, обладающих групповой специфич-
ностью к ФОС и карбаматам (агар-диффузный метод Санди, предложенный А.А. Непоклоновым и В.К. Метели-
цей, метод А.А. Покровского в модификации Д.Д. Полоза и В.А. Полоцкого). Они имеют чувствительность 0,001
мг/кг, просты и удобны, но не специфичны: при их использовании требуется тщательная очистка экстрактов.
Химические методы основаны на титрометрии, реакции осаждения и фотометрии. Они имеют высокую
специфичность, но требуют длительного времени, тщательной очистки экстрактов и обладают сравнительно сла-
бой чувствительностью (5-10 мг/кг).
Физико-химические методы - хроматография, полярография, нейтронно-активационный анализ, ультрафи-
олетовая и инфракрасная спектрометрия, атомно-адсорбционная спектрометрия. Наибольшее значение в практи-
ческих условиях получили тонкослойная и газовая хроматографии, позволяющие работать с различными пестици-
дами.
Сущность анализа заключается в экстрагировании (извлечении) препарата из биологического субстрата,
очистке экстрактов от сопутствующих веществ, определении их концентрации и количества.
Экстрагирование пестицидов. Большое значение для максимального извлечения препарата из пробы имеет
правильный подбор экстрагента и способа смешивания его с субстратом. Необходимо, чтобы используемый рас-
творитель (экстрагент) обладал большей способностью к извлечению пестицида, чем побочных веществ, мешаю-
щих идентификации акарицида. Наиболее часто для извлечения хлорорганических препаратов из биологических
субстратов используют ацетонитрил, ацетон, Н-гексан, петролейный эфир, бензол, смесь гексана с ацетоном или
хлороформом; фосфорорганических соединений - этилацетат, спирты, хлороформ. Экстрагирование пестицидов
из пробы мёда (10-25 г) и других продуктов пчеловодства предпочтительно проводить ацетонитрилом, гексаном,
бензолом, хлороформом. Для этого пробу заливают выбранным растворителем и при постоянном встряхивании
или перемешивании производят экстрагирование. Иногда используют несколько растворителей.
Для освобождения экстрактов от побочных веществ (жиров, воска, пигментов, белка и др.) можно исполь-
зовать сернокислую очистку, омыление, осаждение, вымораживание, распределение в двух несмешивающихся
жидкостях, колоночную адсорбционную очистку в тонком слое адсорбента, дистилляцию и т.д. Способ и степень
очистки экстракта подбирают в зависимости от вида пестицида и субстрата и метода его анализа.
Способы концентрирования экстрактов основаны на дистилляции, выпаривании, кристаллизации, высали-
вании и т.д. Наиболее часто используют концентрирование экстрактов в токе воздуха.
Применяемый исследователем метод должен обладать достаточными специфичностью и чувствительно-
стью. Остаточные количества препарата определяют в открытом (напрыск) и печатном мёде через различные сро-
ки после обработки ульев (1, 7, 14, 28, 60 дней), устанавливают время детоксикации продукта при различных
условиях хранения. Для выяснения сроков детоксикации акарицида в продуктах пчеловодства пробу с определён-
ным количеством вещества хранят при различных температурных условиях (в холодильнике, при комнатной тем-
пературе, в термостате). Периодически проводят определение содержания пестицида до полной его детоксикации.
Применение хемостерилянтов требует особой осторожности и контроля. Для выявления остатков этих ве-
ществ могут быть использованы методы газовой и колоночной хроматографии при соответствующем контроле -
чистом препарате; необходимы также тщательные наблюдения за лабораторными животными (белые мыши, кры-
сы, кролики, морские свинки), долго получавшими с кормом продукты пчеловодства из семей, обработанных хе-
мостерилянтом. Исследуются репродуктивная способность животных, картина крови, при убое проводят гистоло-
гическое исследование печени, почек, семенников или яичников. Важным является выявление возможных изме-
нений в хромосомах соматических и половых клеток.
Аналогичными методами исследуют влияние ювенильных гормонов и аттрактантов и репелленов.
Остатки бактериальных инсектоакарицидов в продуктах пчеловодства могут быть выявлены путём высева
284
микроорганизмов на специальные среды; экзо- и эндотоксины выделяют путем газовой или колоночной хромато-
графий при наличии в контроле чистых аналогичных токсинов, а также путём скармливания продуктов пчеловод-
ства теплокровным лабораторным животным, за которыми проводят длительное наблюдение. При их гибели де-
лают высевы на специальные среды из органов или проводят гистологическое изучение органов (печень, почки,
сердце, лёгкие, кишечный тракт).
К производственному испытанию не допускаются препараты, накапливающиеся в мёде и других продуктах
пчеловодства, остающиеся в них свыше 6 месяцев при отсутствии способа их детоксикации, позволяющего сохра-
нить натуральные свойства продукта.
Препараты, сохраняющиеся меньше 6 месяцев в остаточных количествах, безвредных для теплокровных,
могут быть допущены к дальнейшему испытанию. Необходимо исключение их попадания в откачанный мёд (ко
времени главного взятка).
Синтетические пиретроиды (препаратов «Апистан», «Байварол», «Габон») жирорастворимы и накаплива-
ются в воске, что требует их более частой смены. Их применение недопустимо при заготовке сотового мёда.
Из применяемых в настоящее время акарицидов наиболее длительно сохраняется в меде кумафос («Пери-
цин»), амитраз («Бипин») при поливании на пчёл в улочках присутствует в мёде до трёх дней, его дериваты не
обнаруживаются через 17-20 дней. Накопление некоторых жирорастворимых пиретроидов в воске сотов может
приводить в последующем к появлению их в мёде.
10.	ФИЗИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
Для борьбы с вредными членистоногими широко применяют физические методы - ионизирующее излуче-
ние, термические воздействия, радиоактивные изотопы, ультрафиолетовые и инфракрасные ловушки, ультразвук,
поляризационное поле и др.
Применение физических методов должно основываться на глубоком знании биологии паразита (клещ) и хо-
зяина (пчёлы). Кроме того, метод должен обладать избирательным действием на клеща, а параметры воздействия
применяемого метода на паразита должны быть намного ниже, чем МПД для пчёл.
Из испытанных физических методов (вакуум, действие электрического поля, ультравысоких частот, элек-
тромагнитного поля, гамма-излучения и др.), которые подкупают отсутствием остатков акарицидов в продуктах
пчеловодства, только механическое удаление (встряхивание взрослых пчёл с порошко- или пылевидными инерт-
ными средствами) позволяет снизить поражённость насекомых на 66,5%. В практике нашло некоторое ограничен-
ное признание нагревание взрослых пчёл до 47°С в течение 15 минут или до 45°С - 30 минут в сетчатой кассете
при её встряхивании. Обработка возможна только один раз в сезон из-за сильного стресса насекомых. При обра-
ботке иногда происходит регургитация содержимого медового зобика пчёл. Метод трудоёмок.
10.1.	ЛАБОРАТОРНЫЕ ИСПЫТАНИЯ
Каждый опыт по выявлению акарицидного эффекта физического агента необходимо проводить на группах
пчёл (75 особей), ин Базированных клещами (не менее 50 особей) и содержащихся в садках. После воздействия
физическим агентом садки с подопытными особями помещают в термостат при температуре 34-36°С и относи-
тельной влажности 60-80%. Все опыты проводят в трёх дозах, каждая доза изучается в 3-5 экспозициях и в трёх
повторностях.
Перспективные агенты, отобранные в опытах на клещах и лётных пчёлах, испытывают затем на трутнях,
матках и расплоде разного возраста. При этом определяют влияние изучаемого агента на половую активность
трутней и яйцепродукцию маток. С помощью гистологических и гистохимических методик определяют наруше-
ния морфоструктуры половых органов маток и трутней, а также гистоизменения в организме взрослых и преима-
гинальных стадий пчёл, маток и трутней после воздействия изучаемого физического агента.
Контролем во всех сериях опытов служит аналогичная группа инвазированных клещами пчёл, не подвер-
гавшихся воздействию физического агента и содержащихся в термостате при указанных выше условиях.
10.2.	ИСПЫТАНИЯ НА СЕМЬЯХ ПЧЁЛ
После лабораторных испытаний, в результате которых были отработаны режимы (доза, экспозиция и т.д.)
воздействия физического агента на пчёл, маток и трутней, проводят испытания его на семьях пчёл. В каждом опы-
те используют группу, состоящую из трёх семей пчёл, контролем служит аналогичная группа, не подвергавшаяся
воздействию физического агента. Учёт эффективности проводят по интенсивности и экстенсивности поражения
100 пчёл и 100 ячеек печатного трутневого расплода, по осыпи клещей на липкую бумагу, а также по количеству
засева, открытого и печатного расплода ежедневно в течение первых четырёх дней, а в дальнейшем один раз в три
дня. Опыт длится 22-24 дня. Учитывают жизнеспособность и работоспособность обработанных и интактных се-
мей пчёл.
11.	ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВОСПРОИЗВОДИТЕЛЬНОЙ ФУНКЦИИ САМОК ВАРРОА
По имеющимся данным, химические препараты, используемые для борьбы с варроатозом пчёл, могут угне-
тать репродуктивную способность самок клеща. Поэтому одним из важных показателей при оценке противовар-
роатозной эффективности применяемых средств является определение их влияния на воспроизводительную спо-
собность самок варроа. Для проведения такой работы необходимо знать биологические особенности развития V.
destructor и способы культивирования пчелиного расплода и паразита в лабораторных условиях.
11.1.	ПОДГОТОВКА БИОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА
О влиянии химических препаратов или физических факторов на воспроизводительную функцию варроа су-
285
дят по изменению репродуктивной способности самок клеща, осыпавшихся с пчёл после обработки, способных
вновь прикрепляться к ним и оставшихся на пчёлах. В качестве контроля используют самок клещей, не подвер-
гавшихся никакому воздействию.
Обработку пчелиных семей химическими препаратами или другими средствами проводят в соответствии с
разработанными ранее параметрами их применения (доза, кратность, интервалы между аппликациями), при этом
последняя обработка должна быть проведена за трое суток до запечатывания расплода. Каждый исследуемый
препарат или способ испытывают не менее чем на трёх семьях пчёл, подобранных по принципу аналогов.
При формировании опытных и контрольных групп учитывают породу и возраст маток, силу семей в улоч-
ках, запас кормов, количество засева и расплода, экстенсивность и интенсивность поражения пчёл и расплода.
Во время проведения исследований пчелиные семьи должны находиться в одинаковых условиях содержа-
ния, кормления и ухода. Особое внимание следует уделять организации и проведению противороевых мероприя-
тий (увеличение ёмкости гнезда, затемнение ульев, улучшение вентиляции гнёзд, уменьшение утепления, посто-
янная загрузка пчёл работой по интенсивному строительству сотов). Принимают меры по предупреждению слё-
тов, налётов, нападения и блуждания пчёл на пасеке. Во время опыта не рекомендуется проводить смену маток,
отбирать молодых пчёл и расплод.
В качестве биологического материала используют трутневых (а при их отсутствии - пчелиных) личинок
определённого возраста и самок клещей варроа. Для получения одновозрастного расплода подбирают хорошего
качества пчелиные и трутневые соты, отстроенные на трутневой вощине, и ставят их на одни сутки в семьи для
очистки и полировки. После подготовки сотов отыскивают матку и помещают её для засева на 24 ч под колпачок
из разделительной решётки размером 20х20 см. Более длительное пребывание яиц под колпачком отрицательно
сказывается на уходе за ними пчёл. Для получения расплода, имеющего различающийся в пределах одних суток
возраст, матку перемещают под колпачок с противоположной стороны сота. На верхнем бруске рамки напротив
места нахождения матки под колпачком отмечают дату и продолжительность её пребывания.
На 5-6 сутки после откладки яиц расплод осматривают для определения его состояния, на трутневый (пче-
линый) расплод составляют календарь развития. Для получения одновозрастных трутневых личинок, достаточно
иметь на пасеке 4-5 подвергшихся обработке и контрольных пчелиных семей-доноров силой не менее 5-7 улочек
и 8-10 сотов.
После обработки пчелиных семей химическими препаратами или другими способами отпавших с пчёл жи-
вых самок варроа собирают с поддона (или с листа бумаги, положенного на дно улья перед обработкой) и исполь-
зуют для дальнейших исследований.
Для изучения воспроизводительной функции клешей, оставшихся на пчёлах после обработки, отбирают
100-200 живых пчёл и помещают в садок.
В зависимости от последующих целей используют открытый расплод перед запечатыванием или печатный
поражённый расплод, предварительно освободив рамку от пчёл с помощью гусиного пера. Рамки нельзя встряхи-
вать. Максимальное время пребывания расплода вне пчелиной семьи или вне термостата не должно превышать 2
часов. В случае использования печатного расплода обработку химическими препаратами или другими средствами
проводят в соответствии с разработанными ранее параметрами их применения (доза, кратность, интервалы между
аппликациями), при этом последняя обработка должна быть проведена за трое суток до запечатывания расплода.
11.2.	ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВОСПРОИЗВОДИТЕЛЬНОЙ ФУНКЦИИ САМОК ВАРРОА И ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ
ПОТОМСТВА.
Влияние воздействия различных факторов на последующее воспроизводство потомства самками клеща,
подвергавшихся их действию, проводят по учёту самок-основательниц, отложенных ими яиц с учётом их разме-
ров, погибших и живых протонимф, дейтонимф, самцов и дочерних самок в печатном расплоде, находящемся
непосредственно в обработанных и контрольных ульях пасеки, а также в лабораторных условиях.
Плодовитость самок клеща оценивают на стадии куколки 18-19-дневного возраста у трутня и 16-17-
дневного возраста у рабочих пчёл. Рамки с печатным расплодом указанного возраста вынимают из обработанных
и контрольного ульев, вносят в помещение, где на столе, используя глазной пинцет и препаровальную иглу, при
хорошем освещении аккуратно проводят удаление крышечек над печатным расплодом. Следят за возможным вы-
ходом клещей при вскрытии ячейки. Удалённую крышечку внутренней стороной вверх помещают в чашку Петри
с затемнённым дном (заклеенным чёрной бумагой) и тщательно осматривают, иногда пользуясь лупой (х2-х3), её
поверхность. Такому же осмотру подвергают выделенную куколку и внутреннюю поверхность ячейки. Ведут за-
пись отдельно по трутневому расплоду и расплоду рабочих пчёл, при этом учитывают число живых и погибших
самок-основательниц, не давших потомство в ячейке, число яиц, прото- и дейтонимф, взрослых самцов и самок
(дочерние самки имеют более светлый хитиновый покров в отличие от материнской самки). При выделении яиц
следует определять их жизнеспособность, учитывая в кладках самок в зависимости от условий могут быть до 20%
яиц нежизнеспособных. Жизнеспособными являются яйца, в которых к моменту откладки содержится сформиро-
ванная протонимфа. Такие яйца имеют больший размер: 672,0±17,0х522,0±21,0 мкм у яиц, дающих самца, и
733,2±29,7x576,1 ±23,3 мкм - для самок, яйца меньшего размера обычно не жизнеспособны (И. А. Акимов и др.,
1993). Желательно провести учёт клещей в 100 ячейках печатного расплода каждой стазы пчёл, результаты обра-
батываются методом вариационной статистики, проводится сравнение материалов в обработанной и контрольной
группах.
286
Учитывая влияние внешних факторов на семьи пчёл, аналогичные исследования целесообразно провести с
печатным расплодом, взятым из опытных и контрольных семей пасеки после закрытия отверстий ячеек сотов в
лаборатории. Соты содержат в термостате при температуре 34-36°С и относительной влажности 60-80% до до-
стижения куколками указанного выше возраста.
Чтобы определить особенности размножения отпавших после обработки клещей, сохранивших способ-
ность прикрепления к пчёлам, и паразитов, сохранившихся на некоторых обработанных насекомых, проводят
опыты по привлекательности расплода и последующего размножения в нем этих групп паразитов.
После обработки пчелиных семей препаратами с рамок отбирают 100 пчёл, на которых должно быть не ме-
нее 30 самок варроа и помещают в энтомологический садок. Живых самок клеща, упавших в подрамник и способ-
ных прикрепляться к пчёлам, собирают (не менее 30 шт.) и подсаживают на последних (100 экз.), которых поме-
щают в другой садок. Аналогично подсаживают в контрольной, не подвергавшейся обработке группе. Садки с
пчёлами, поражёнными клещом, ставят в термостат при температуре 30°С и дают сахарный сироп (1:1), на другой
день температуру в термостате доводят до 34-36°С и в садки помещают кусочки сота 5Х5 см с 6-7-дневным пче-
линым (трутневым) расплодом. Выдерживают в течение 2 суток. После запечатывания расплода его оставляют
для последующей инкубации и учёта воспроизводства клеща как указано выше. Взрослых пчёл удаляют, подсчи-
тывают количество клещей, зашедших в расплод, оставшихся на пчёлах и отпавших на дно садка.
В расплоде, находящемся в ульях или в лабораторных условиях, от каждой опытной и контрольной семьи
(п=3) подсчитывают число самок-основательниц и число жизнеспособного потомства. Определяют плодовитость
(М), выраженную отношением суммы числа особей потомства (Vj + V2 + V3... Vn) к числу самок-основательниц
(N) по формуле:
V1 +V2 + Уз + Уп
N
Рассчитывают плодовитость самок в опытной и контрольной группах отдельно для трутневого и пчелиного
расплода, культивируемых в естественных и лабораторных условиях.
Характер изменения репродуктивной способности самок-основательниц, подвергшихся различным воздей-
ствиям, определяют сравнением средней плодовитости самок в группах, используя коэффициент отклонения от
контроля (К.О.К.):
М -Мк
к.о.к. = —— х 1 оо%,
мк
где Мо- средняя плодовитость самок в опытной группе;
Мк - средняя плодовитость самок в контрольной группе.
Отрицательное значение коэффициента отклонения от контроля свидетельствует о том, что испытуемый
фактор угнетает воспроизводительную функцию самок варроа. Положительное значение коэффициента указывает
на увеличение в сравнении с контролем плодовитости самок, подвергшихся обработкам. При значении коэффици-
ента, не превышающем 5-10%, следует считать, что факторы не действуют на воспроизводство самок.
Опыт применения различных акарицидов для борьбы с варроатозом пчёл показал их действие на клещей,
паразитирующих на взрослых пчёлах, и практическую недоступность варроа в печатном расплоде, хотя имеется
сообщение Н.М. Столбова об увеличении их размножения в гнездах пчёл после использования фольбекса (хлор-
бензилата).
11.3.	ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВЛИЯНИЯ РАЗЛИЧНЫХ ФАКТОРОВ НА ВОСПРОИЗВОДИТЕЛЬНУЮ ФУНКЦИЮ
И ЖИЗНЕСПОСОБНОСТЬ ПОТОМСТВА ПО А.А. ЗАМАЗИЮ
Влияние средств борьбы на воспроизводство варроа может быть изучено при индивидуальном культивиро-
вании самок клеща на куколках в лаборатории в условиях стерильности.
Садки заселяют поражёнными клещом пчёлами из исследуемых групп семей, в них помещают открытый
расплод перед запечатыванием.
На второй день после запечатывания расплода сот вынимают из садка и приступают к распечатыванию яче-
ек и пересадке личинок пчёл (трутней) с клещом в пробирки Флоринского. Работа по извлечению личинок должна
проводиться на хорошо освещённом месте, для этого сот кладут или ставят отвесно (в зависимости от удобства)
на лист белой бумаги и препаровальной иглой осторожно снимают восковые крышечки ячеек, после чего раздви-
гают их бортики и пинцетом вытаскивают личинок вместе с клещом, переносят их в пробирку Флоринского. Если
клещ остался на стенке или на дне ячейки, его осторожно снимают препаровальной иглой, смоченной в воде. По-
сле этого пробирку Флоринского плотно закрывают кусочком вощины, проделывая в ней препаровальной иглой
отверстие (для лучшего обмена воздуха), и ставят на штатив в горизонтальном положении.
Закончив пересадку самок с расплода, приступают к снятию их с пчёл в садке (в том случае, если все самки
не зашли в расплод самостоятельно). Для этого поочередно осматривают каждую пчелу, снимают клеща и поме-
щают его на расплод в пробирку Флоринского. Личинок пчёл (трутней) в данном случае берут из ячеек сота, где
не было клеща. После этого в пробирки Флоринского отбирают из сота ещё 10-15 личинок (запасных) на случай
гибели последних в опытных или контрольных группах.
287
На следующий день осматривают все пробирки и при обнаружении погибших личинок пробирки выбрако-
вывают. За опытными и контрольными клещами, находящимися в пробирках Флоринского, наблюдают в течение
8 дней, ежедневно отмечая состояние личинок (куколок) и самок варроа. Самки, сохранившие способность откла-
дывать яйца, обычно увеличены в объёме. При откладывании яиц самками на стенке пробирки делают отметку
цветным восковым карандашом и регистрируют время их откладки, определяя тип и размеры. Для измерения ис-
пользуют микроскоп МБС-2, МБС-9. После этого для удобства проведения обработки результатов размеры яиц,
выраженные в миллиметрах, умножают (длину на ширину), получая индекс-форм.
За отложенными яйцами проводят постоянное (с интервалом 4 часа) наблюдение для определения периода
инкубации личинок в яйце до появления протонимфы. В течение данного опыта учитывают, сколько самок при-
ступило к яйцекладке и на какой день, продолжительность яйцекладки, время откладки первого яйца в период
подготовки самки для откладки последующего, количество откладываемых яиц (плодовитость), их типы, размеры
и жизнеспособность по дням яйцекладки и в целом; период инкубации личинок в яйце до появления протонимфы.
Проведение этих исследований дает возможность установить, нарушается или нет воспроизводительная функция
у самок, оставшихся на пчёлах, зашедших после обработки в расплод или не зашедших, а также у самок, осыпав-
шихся в подрамник, но способных к паразитированию.
Для определения способности самок-основательниц к повторному циклу откладки яиц после окончания
первой яйцекладки их убирают из пробирок и подсаживают на свободных от клеща пчёл в садке. Через сутки в
садок ставят кусочек сота размером 5><5 см с открытым 6-7-дневным расплодом. После запечатывания расплода
на второй день последний вскрывают, личинок с клещом переносят в пробирки Флоринского, а оставшихся самок
на пчёлах переносят на расплод и проводят исследования, как описано выше. Всего проводят 3 пассажа самок-
основательниц для определения количества циклов яйцекладки.
После этого отбирают дочерних самок (отличаются от самок-основательниц более светлой окраской) и под-
саживают на свободных от клеща пчёл в садок. Через сутки в садок помещают кусочек сота размером 5><5 см с
открытым 6-7-дневного возраста пчелиным (трутневым) расплодом. На второй день после запечатывания послед-
него приступают к вскрытию ячеек и пересадке личинок с клещом в пробирки Флоринского для исследования, как
описано выше. Отсутствие яйцекладки или её изменения будут свидетельствовать о нарушении воспроизводи-
тельной функции дочерних самок клеща варроа.
Расчёты проводят отдельно для каждой из последующих групп пчелиных семей, обработанных препаратом,
и контрольных.
Пример. После применения химического препарата из 60 самок в расплод зашли 35, а в контрольной группе
- 48. Из числа зашедших в расплод к яйцекладке приступили в опытной 21, в контроле - 30. Средняя плодови-
тость: в опытной 2,0±0,11, в контрольной 2,3±0,08 яйца на самку. Продолжительность яйцекладки (дней): 2,5 - в
опытной и 3,0 - в контрольной. Отложено всего яиц: 42 - в опытной и 71 - в контрольной, в т.ч. жизнеспособных
12 и 36 соответственно. Средний индекс-форм яиц всех типов 0,198 - опытная группа и 0,246 - контрольная. Про-
должительность периода инкубации личинки в яйце: 40±1,8 часов опытная и 30±1,2 - контрольная. Количество
жизнеспособных яиц с нормальным периодом инкубации.
Определение увеличения продолжительности периода инкубации личинки в яйцах опытной группы (в про-
центах):
По
Уп= ц— Х100
где: Уп - увеличение периода инкубации яиц опытной группы (%);
По - продолжительность периода инкубации личинки в яйцах опытной группы (часов);
Пк - продолжительность периода инкубации личинки в яйцах контрольной группы (часов).
Определение количества жизнеспособных яиц с нормальным периодом инкубации в опытной группе (%):
Кн-ПНП0-Пк) = 100-( 133-100) = 100 - 33 = 67 (%),
где: Кн - количество жизнеспособных яиц с нормальным периодом;
Пк - продолжительность периода инкубации личинки в яйце контрольной группы (%);
По - продолжительность периода инкубации личинки в яйце опытной группы (%). Учитывают также количество
самок с нормальным циклом яйцекладки: опытная - 7, контрольная - 25.
Для расчёта берут данные о количестве самок, приступивших к яйцекладке только на первый день репродуктив-
ного периода в опытной и контрольной группах (от общего количества яйцекладущих). Самки, приступившие к
откладке яиц на второй день периода, считаются с нарушенным циклом. Определяют численность жизнеспособ-
ного потомства (т.е. дочерних самок) из расчета на одну самку-основательницу: в опытной - 0,33, в контрольной -
1,0. Результаты сводят в таблицу.
288
Показатели	Опытная группа		Контрольная группа	
	количество	%	количество	%
1	2	3	4	5
Всего самок в опыте	60	100	60	100
Из них: зашли в расплод	35	58,3	48	80,0
Приступили к яйцекладке из числа зашедших	21	60,0	30	62,5
Плодовитость самок	2,0±0,11	86,9	2,3±0,09	100
Количество жизнеспособных яиц	12	28,5	36	50,7
Продолжительность яйцекладки (дней)	2,5	83,3	3,0	100
Количество самок с нормальным циклом яйцекладки	7	33,3	25	83,3
Индекс-форм яиц всех типов	0,198	91,6	0,216	100
Количество жизнеспособного потомства	0,33	33,0	1,0	100
Продолжительность периода инкубации (часов) и количество жизнеспособных яиц с нормальным периодом инкубации	40±1,8	67	30,1±1,2	100
Итого: в среднем процентов		60,2		86,3
Характер влияния химических препаратов на воспроизводительную функцию самок варроа определяют пу-
тем сравнения показателей исследований в опытной и контрольной группах. Он выражается через коэффициент
отклонения, определяемый по формуле:
П0-Пк	60,2-86,2
К.о.к. -  х100%=  *100% = 30,1%,
Пк	86,2
где: К.о.к. - коэффициент отклонения от контроля;
По - средний показатель в опытной группе;
Пк - средний показатель в контрольной группе.
Отрицательное значение коэффициента отклонения от контроля свидетельствует о том, что препараты
угнетают воспроизводительную функцию самок варроа, а положительное - указывает на стимуляцию. При значе-
нии коэффициента, не превышающем ±5%, следует считать, что химические препараты на воспроизводительную
функцию самок варроа не оказывают существенного влияния.
12.	ИЗУЧЕНИЕ ДЕЙСТВИЯ СРЕДСТВ НА МЕДОНОСНЫХ ПЧЁЛ
Семья медоносных пчёл состоит из нескольких десятков тысяч рабочих пчёл, сотен трутней и матки и
представляет собой единое биологически взаимосвязанное сообщество, представляющее хозяйственную единицу.
Применяемые для борьбы с варроатозом средства и способы не должны нарушать эти взаимосвязи, влиять на мат-
ку, функции рабочих особей и трутней.
Борьба с варроа, помимо снижения численности паразита включает также комплекс мер по поддержанию
жизнедеятельности семей пчёл, ослабленных клещом. Особого внимания требует восстановление продолжитель-
ности жизни, отдельных биохимических показателей организма пчёл семьи.
Для опытов и контроля, руководствуясь «Методическими рекомендациями по постановке экспериментов в
пчеловодстве» (М., 2000) подбирают семьи-аналоги с одновозрастными матками-сёстрами, равные по силе, коли-
честву расплода и кормов.
До и после обработки пчёл проводят тщательный осмотр семей. Погибших маток можно найти на дне улья,
предлетковой доске и площадке перед ульем. Живые матки обычно передвигаются по соту со свитой взрослых
особей. Обращают внимание на засев яиц маткой, присутствие однодневных яиц - раположены вертикально,
двухдневные яйца - наклонны, а трёхдневные - лежат на дне ячейки, указывают на присутствие матки в момент
осмотра. Важным является положение яиц в ячейке: в норме они располагаются на дне ячеек. Расположение на
стенках, наличие двух яиц в ячейке указывают на отрутневение матки. Учитывают площадь засева на соте: сокра-
щение, особенно в первые дни после обработки, может указывать на влияние используемого способа на плодови-
тость маток. Нередко такие семьи в последующем отрутневевают. Проводят учёт площади открытого и печатного
расплода (см. ниже), обращают внимание на состояние личинок, особенности печатки расплода, наличие и коли-
чество пустых ячеек на площади расплода и прочие изменения.
При осмотре до и после опытов учитывают силу семей. В улье со стандартными рамками (435х300 мм)
пчёлы, в зависимости от заполнения кормом их медового зобика, занимающие пространство между рамками
(улочка) весят 250 - 300 г (при среднем весе одной особи 100 мг количество насекомых 2500 - 3000). Сильная семья
при сборке гнезда на зиму имеет 10 (2,5 кг) и более улочек, а весной не менее 9 (2,3 кг), при наличии 6 улочек семьи
относят к слабым. Учёт силы семей проводят рано утром или поздно вечером, когда все пчёлы находятся в улье.
Следят за вылетом и прилётом пчёл из улья, учитывают количество вылетающих и возвращающихся в улей
насекомых за определённую единицу времени.
Наблюдают за степенью очистки дна улья, наличием погибших и погибающих (признаки) пчёл на летковой
289
доске и площадке перед ульем. Учитывают величину подмора, особенно при зимовке.
Работы с группой (не менее 3) опытных и контрольных (п=3) семей проводят в течение одного дня, одно-
временно.
12.1.	ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧИСЛА ЯЧЕЕК С РАСПЛОДОМ НА СОТОВОЙ РАМКЕ И В ПЧЕЛИНОЙ СЕМЬЕ.
Предлагаемый метод позволяет достаточно точно определить количество расплода в пчелиной семье, что
помогает составить общее представление о жизнедеятельности пчёл в улье. Как правило, учёт расплода проводит-
ся через каждые 12 дней после начала эксперимента не менее трёх раз.
Наблюдения показали, что расплод на сотовых рамках располагается в виде геометрических фигур: круга,
эллипса, более или менее выраженного прямоугольника, квадрата. Исходя из этого, можно определять количество
расплода пчёл с помощью математических формул.
Вариант 1. Поверхность расплода имеет более или менее выраженную форму круга. Определяют площадь
круга по формуле:
л х d2
S =	-------------
4
где:	S - площадь круга, см2;
л - математическая постоянная, равная 3,1415;
d - диаметр круга, см.
Установлено, что на 1 см2 сотов размещается четыре ячейки. Поэтому число, выражающее площадь круга,
надо умножить на 4, после чего получится число ячеек на данной площади. Поскольку расплод располагается на
обеих сторонах сота, полученную величину следует умножить на 2. Окончательно формула приобретает следую-
щий вид:
R] = 2x7rxd2 (1)
где: R] -число ячеек в соте, занятых расплодом.
Вариант 2. Поверхность расплода имеет форму эллипса. В таком случае следует измерить длинную и ко-
роткую оси эллипса и рассчитать число ячеек по формуле:
R2 = 2хАхВхл (2)
где:	R2 - число ячеек в соте;
А - малая ось эллипса, см;
В - большая ось эллипса, см.
Вариант 3. Для определения количества расплода, имеющего форму прямоугольника или квадрата, исполь-
зуют формулу площади прямоугольника и данные о числе ячеек на 1 см2. Окончательная формула выглядит сле-
дующим образом:
R3 = 2xDxhx4 (3)
где:	R3 - число ячеек с расплодом в соте;
h - высота прямоугольника, см;
D - длина прямоугольника, см.
Полученные данные по каждой сотовой рамке суммируют и определяют общее количество расплода в улье.
Следует заранее заготовить рабочую таблицу, в которую заносят промеры, а затем рассчитывают количество рас-
плода.
ОБРАЗЕЦ РАБОЧЕЙ ТАБЛИЦЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА РАСПЛОДА
№ п/п	№ пчелосе- мьи	№ соторамки		Вариант 1		Вариант 2			Вариант 3			Сумма
				d	R.	А	В	r2	D	h	Из	
												
*Итого												
* Итоговое количество расплода определяется в каждой семье отдельно.
12.2.	ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЕМОЛИМФОФОРМУЛЫ У ПЧЁЛ.
Определение гемолимфоформулы позволяет установить общий показатель жизнеспособности пчёл, может
служить дополнительным тестом при определении срока жизни пчёл, подвергнутых тем или иным воздействиям.
12.2.1.	ОТБОР ОПЫТНОГО МАТЕРИАЛА.
При отборе пчёл для исследования необходимо учитывать силу семьи, сезон года и благополучие в отно-
шеиии заразных болезней. Для получения более достоверных данных лучше брать пчёл одного возраста. С этой
целью соты с расплодом на выходе помещают в термостат при температуре 34-35°С и относительной влажности
70-80%. По мере выхода пчёл из ячеек их отбирают в садки в количестве, необходимом для постановки опыта, и
выращивают до определённого возраста. В качестве корма используют мёд, пыльцу, медовое тесто, сахарный си-
роп. Вышедших из ячеек пчёл можно метить специальными метками и возвращать в свои семьи до начала опытов.
Для получения достоверных данных контрольные и опытные группы пчёл лучше брать из одной семьи. В каждой
290
группе должно быть не менее 50 пчёл с учётом того, что часть пчёл гибнет от механических повреждений; воз-
можны также различные погрешности в приготовлении мазков. Для статистической обработки данных необходи-
мо изучить не менее 10 мазков гемолимфы пчёл каждой группы.
12.2.2.	ТЕХНИКА ВЗЯТИЯ ГЕМОЛИМФЫ
Гемолимфу получают после удаления головы и конечностей пчелы, путём прокалывания кутикулы с помо-
щью тонкой пипетки или микрошприца в область сердечного сосуда. Наиболее удобным способом получения ге-
молимфы является взятие её из синуса в области четвёртого тергита брюшка. Гемолимфу берут от живых пчёл,
либо от насекомых, убитых парами эфира или хлороформа и выдержанных в течение 10 минут в горячей воде при
60°С. В последнем случае окраска мазков гемолимфы бывает более интенсивной, гемоциты, освобождающиеся
при надавливании, фиксируются.
12.2.3.	ФИКСАЦИЯ И ОКРАСКА МАЗКОВ
Взятую гемолимфу наносят на предметное стекло. С помощью тонкой пластинки, пипетки или шлифован-
ного стекла делается мазок размером с 1-2-копеечную монету. Для приготовления одного мазка используют гемо-
лимфу одной пчелы. Мазки высушивают в течение 24 ч, после чего фиксируют в метаноле или спирт-эфире 15-30
минут. Окраску мазков производят по методам Паппенгейма, Райта, Романовского-Гимза.
12.2.4.	ПРОСМОТР МАЗКОВ И ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ
Окрашенные мазки просматривают под микроскопом, используя иммерсионный объектив. Гемоцитарную
формулу определяют по общепринятой методике выведения лейкоформулы у животных. Существуют различные
классификации гемоцитов. Наиболее совершенной из них является классификация клеточных элементов гемо-
лимфы, предложенная Б.А. Шишкиным (1956).
При просмотре мазков гемолимфы можно обнаружить следующие клетки.
1.	Платоциты 2 стадии: круглые или слегка овальные клетки, содержащие компактное ядро, хорошо окра-
шивающееся по Романовскому-Гимза в ярко-малиновый цвет с фиолетовым оттенком; ядро окружено узким
ободком цитоплазмы. Средний размер клетки 5,68^3,90 мкм.
2.	Платоциты 3 стадии: округлые или овальные клетки, ядро менее компактно, чаще расположено эксцен-
трично, после окраски по Романовскому-Гимза приобретает красно-фиолетовый цвет. Средний размер клеток
7,96x6,24 мкм. Цитоплазма выражена хорошо.
3.	Платоциты 4 стадии: круглые, чаще овальные клетки с выступами или выемками. Цитоплазма содержит
вакуоли, иногда имеет зернистое строение. Размеры клетки колеблются от 12,94 мкм до 8,68 мкм в длину и от 8,46
мкм до 6,98 мкм в ширину. Ядро менее компактно, может быть представлено отдельными глыбками хроматина.
4.	Платоциты 5 стадии: уплощённые овальные клетки, ядро в виде фиолетовых глыбок располагается более
или менее эксцентрично. Цитоплазма выражена значительно, окрашивается в бледно-сиреневый цвет. Размеры
клеток колеблются в пределах 12,34-8,68x10,24-7,47 мкм.
5.	Платоциты 6 стадии: клетки овальной или круглой формы, ядро разрыхлённое, глыбки хроматина мель-
че, свободно лежат в цитоплазме. Цитоплазма слабо или почти не окрашивается азур-эозиновыми красками, ваку-
оли почти незаметны. Клетки по размерам несколько крупнее предыдущих, ядро разрыхлённое, глыбки хроматина
мельче, свободно лежат в цитоплазме. Цитоплазма слабо или почти не окрашивается азур-эозиновыми красками,
вакуоли почти незаметны.
6.	Платоциты 7 стадии: клетки овальной или округлой формы, крупнее предыдущих. Ядро состоит из от-
дельных, слабо заметных глыбок.
7.	Сферулоциты: крупные клетки, имеющие чёткую границу между ядром и цитоплазмой, ядро окрашива-
ется в фиолетовый цвет. Цитоплазма клеток содержит включения - сферулы. Средний размер клеток 12,9-
11x17,8-14,8 мкм.
8.	Эноцитоиды: клетки, имеющие размер от 7x7 до 14,9х5,4 мкм, цитоплазма всегда содержит базофильные
зёрна, ядро не имеет чётких границ с цитоплазмой и состоит из свободно лежащих глыбок хроматина.
Для удобства сравнения гемолимфоформул молодых и старых, здоровых и больных пчёл предложен воз-
растной коэффициент гемолимфы (ВКГ), представляющий собой отношение числа старых клеток к числу зрелых
и молодых (О.Ф. Гробов, 1967).
вкг = платоциты 5+6+7 стадии + клетки с лизисом ядра_________________
платоциты 2+3+4 стадии + клетки с делением ядра
Для получения средних данных ВКГ по группе пчёл используют обычные методы вариационной статистики.
12.3.	ОПРЕДЕЛЕНИЕ СТЕПЕНИ РАЗВИТИЯ ЖИРОВОГО ТЕЛА ПО МАУРИЦИО
Метод позволяет выявить жизнеспособность пчёл, особенно способность к продолжительной зимовке после
воздействия определённых факторов.
12.3.1.	ОТБОР ОПЫТНОГО МАТЕРИАЛА.
Пчёл убивают парами эфира, при помощи пинцета удаляют жало и кишечник, пчёл закрепляют в препара-
ционной ванночке брюшком вверх, хитиновый панцирь брюшка разрезают по средней линии, брюшко отделяют
от груди и обе половинки брюшного панциря отводят в стороны так, чтобы была хорошо видна спинная часть жи-
рового тела с сердечными камерами посередине. Для постановки опыта необходимо не менее 20 пчёл.
291
12.3.2.	ПРОСМОТР ОПЫТНОГО МАТЕРИАЛА.
Жировое тело пчёл исследуют под микроскопом (при 30-кратном и большем увеличении). Степень разви-
тия жирового тела оценивается по шкале Маурицио, которая предусматривает 5 степеней развития:
1	- жировое тело не развито, оно настолько прозрачно, что через него ясно просвечивает хитин спинного
панциря;
2	- жировая ткань однослойная, плоская. Клетки голубовато-белые, полупрозрачные, без отчётливо види-
мых включений;
3	- жировая ткань однослойная, с несколькими складками, клетки белые, округлые, без хорошо заметных
включений;
4	- жировая ткань многослойная, складчатая, клетки округлые, с хорошо выраженными включениями;
5	- жировая ткань многослойная, с многочисленными складками, клетки большие, округлые, жёлтого цвета,
заполнены включениями.
12.4.	ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОБЩЕГО БЕЛКА В ГЕМОЛИМФЕ ПЧЁЛ ПО ЛОУРИ
Метод Лоури основан на определении оптической плотности окрашенного раствора при одновременном проте-
кании биуретовой реакции и реакции Фолина. Чувствительность метода - 0,2 мкг в 0,05 мл. Этот метод позволяет уста-
новить влияние изучаемого фактора на белковый обмен и продолжительность жизнедеятельности пчёл.
12.4.1.	Реактивы
Реактив А - 2%-ный раствор Na2CO3 (безводный) в 0,1Н растворе NaOH.
Реактив В - 0,5%-ный раствор CuSO4 х 5Н2О в растворе виннокислого натрия или калия (Na2C4H4O6).
Реактив С - смесь 50 мл реактива А и 1 мл реактива В, готовят перед употреблением (годен в течение суток).
Реактив Е - фенольный реактив Фолина - титрованный по фенолфталеину. При титровании реактив Фоли-
на разбавляют, чтобы сделать его однонормальным. Для приготовления реактива в 1,5-литровую колбу помещают
100 г вольфрамовокислого натрия (Na2WO4 х 2Н2О), 25 г молибденовокислого натрия (Na2MoO4 х 2Н2О), 750 мл
дистиллированной воды, 50 мл 85%-ной фосфорной кислоты и 100 мл концентрированной соляной кислоты. По-
сле этого смесь нагревают в течение 10 ч при умеренном кипячении с обратным холодильником. По окончании
кипячения прибавляют 150 г сернокислого лития (Li2SO4), 50 мл воды и несколько капель брома. Избыток брома
удаляют кипячением без холодильника в течение 15 минут, после чего жидкость охлаждают, фильтруют, разводят
водой до 1 л и хранят в тёмной склянке. Приготовленный таким образом реактив не должен иметь зеленоватого
оттенка, возникновение которого указывает на появление продуктов восстановления.
12.4.2.	ХОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ
Гемолимфу пчёл разбавляют 0,85%-ным раствором хлористого натрия в 1000 раз. В три пробирки отбирают
по 0,4 мл разбавленной гемолимфы (проба должна содержать не менее 10 мкг и не более 60 мкг белка). Добавляют
по 4,4 мл щёлочно-медного реактива С, энергично встряхивают и оставляют стоять при комнатной температуре 10
мин. Затем в пробирки добавляют по 0,2 мл реактива Е, встряхивают и оставляют стоять 30 мин. для проявления
окраски. Оптическую плотность раствора определяют при 750 ммк на спектрофотометре СФ-4А или на фотоэлек-
троколориметре с красным светофильтром. Опытные пробы измеряют против контрольных (0,4 мл дистиллиро-
ванной воды, 4,4 мл реактива С, 0,2 мл реактива Е).
12.4.3.	ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ.
Содержание белка в испытываемой пробе устанавливают по калибровочной кривой, построенной заранее
по раствору какого-либо белка или смеси белков точно известной концентрации.
Готовят серию растворов белка или смеси белков, определение которых предполагается осуществить. Кон-
центрацию белков в сложных белковых смесях, используемых для приготовления стандартных растворов, опреде-
ляют каким-либо иным методом, например, рефрактометрически в случае сыворотки крови или гемолимфы бес-
позвоночных. Белки растворяют в 0,1Н растворе гидроксида натрия. Серию растворов готовят путём разведения
исходного концентрированного раствора белка до необходимых значений. Определение белка в каждом из ука-
занных растворов проделывают не меньше 5 раз по указанной выше схеме. Оптические плотности растворов из-
меряют, как указано выше и строят график - калибровочную кривую: на оси абсцисс указывают концентрацию
растворов в мг или мкг, на оси ординат - значения оптической плотности. Количество белков в гемолимфе пчёл
определяют, учитывая разведение, по формуле:
х = ах 1000
0,4
где а - количество белка в пробе, найденное по калибровочной кривой, г;
0,4 - объём исследуемой гемолимфы, мл;
X - количество белка в пробе, г%.
12.5.	ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОБЩЕГО КОЛИЧЕСТВА ЛИПИДОВ В ГЕМОЛИМФЕ ПЧЁЛ ПО МЕТОДУ СВАНА
Метод позволяет установить влияние агента на липидный обмен, выявить степень подготовленности обра-
ботанных пчёл к зимовке. Общее количество липидов - ценный дополнительный (контрольный) показатель при
определении величины жирового тела у пчёл.
292
12.5.1.	ПОДГОТОВКА ОПЫТНОГО МАТЕРИАЛА
Для исследований используют гемолимфу, взятую от живых пчёл с помощью тонкого капилляра из синуса
в области четвёртого тергита брюшка насекомого. Для проведения анализа необходимо 0,02-0,04 мл гемолимфы,
взятой от 20-30 насекомых.
12.5.2.	ХОД АНАЛИЗА
Сухие полоски фильтровальной бумаги, употребляемой для электрофореза, натягивают горизонтально и
наносят на них по 0,04 мл гемолимфы. Если ожидается высокое содержание липидов, то наносят 0,02 мл (при 1000
мг% и выше). Бумагу высушивают на воздухе при помощи вентилятора. Глазной пипеткой наносят раствор краси-
теля, избыток которого через 15-20 минут отмывают водопроводной водой. После сушки на воздухе на бумаге
остаются серо-голубые пятна, которые вырезают и помещают в пробирки для элюации.
Элюацию производят в 4 мл смеси этанола с уксусной кислотой в течение 1 ч при периодическом встряхи-
вании. Количество красителя, связанного с липидами, определяют спектрофотометрированием при 595 нм и на
фотоэлектроколориметре при той же длине волны. По стандартной калибровочной кривой вычисляют количество
липидов, соответствующее полученной величине экстинкции.
12.5.3.	ОКРАСКА ЛИПОПРОТЕИДОВ
Для окраски применяют насыщенный раствор Судана черного Б в этаноле.
12.5.4.	ПОСТРОЕНИЕ СТАНДАРТНОЙ КАЛИБРОВОЧНОЙ КРИВОЙ
Для построения стандартной калибровочной кривой берут смесь жиров или один из доступных жиров в
концентрации, близкой к естественной. Можно использовать раствор триолеина (1 г в 100 мл абсолютного этано-
ла) или смесь из 200 г триолеина, 150 г трибутирина и 150 мг холестерина в 100 мл абсолютного этанола. Различ-
ные количества раствора наносят на бумагу, высушивают, окрашивают, вырезают и элюируют таким же спосо-
бом, как при определении общего количества липидов в гемолимфе.
Измерения производят на спектрофотометре СФ-4 или на фотоэлектроколориметре ФЭК-М. Совпадение
параллельных проб на обоих приборах хорошее. На основании полученных данных строят калибровочную кри-
вую, пользуясь которой, рассчитывают концентрацию общих липидов в гемолимфе.
12.6.	ОПРЕДЕЛЕНИЕ СУММАРНОГО КОЛИЧЕСТВА НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ В ГЕМОЛИМФЕ ПЧЁЛ.
Метод позволяет выявить агенты, влияющие на нуклеиновый обмен.
12.6.1	. РЕАКТИВЫ
0,6Н раствор хлорной кислоты . Раствор гепарина, приготовленный из расчёта: 1 г гепарина на 100 мл фи-
зиологического раствора. Для исследований используют двукратно разведённый раствор.
12.6.2	. ХОД АНАЛИЗА
В большие пробирки объёмом 30 мл наливают 1,4 мл дистиллированной воды и добавляют 0,1 мл гемо-
лимфы пчёл, взятой у живых насекомых с помощью капилляра из синуса в области четвертого тергита брюшка
(приготовленная таким образом проба может храниться в холодильнике до двух недель). В пробирки добавляют
13,5 мл хлорной кислоты, ставят в кипящую водяную баню на 20 мин, после инкубации охлаждают в холодной
воде и фильтруют содержимое через обычный фильтр. Пробирки не следует закупоривать. Фильтрат спектрофо-
тометрируют при длинах волн 270 нм и 290 нм.
При взятии гемолимфы микропипетку промывают раствором гепарина.
12.6.3	. ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ
Из значения экстинкции пробы при 270 нм вычитают значение, полученное при 290 нм. Разницу умножают
на коэффициент 813, рассчитывая концентрацию нуклеиновых кислот в мг%.
12.7.	ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВЛИЯНИЯ АКАРИЦИДОВ НА МОНОАМИНООКСИДАЗЫ (МАО)
И ЭСТЕРАЗЫ ПЧЁЛ И КЛЕЩЕЙ
Мишенью действия акарицидов в организме членистоногих обычно являются защитные ферменты моно-
аминооксидазы и эстеразы, определение которых используют в опытах.
12.7.1.	ХОД АНАЛИЗА И ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ
Влияние на пчёл и клещей изучают по изменению моноаминооксидаз (МАО) в гомогенатах из интактных
пчёл и клещей, используя модифицированный метод определения активности МАО (трансаминазы) в тканях жи-
вотных (М.Ф. Пономарёва, 1976). Для приготовления гомогенатов берут головы интактных пчёл и самок клещей
варроа. Гомогенаты готовят, растирая навески (9 мг) на холоде в фарфоровых ступках в 5 мл 1/15М фосфатного
буфера (pH 7,5). Через 30 минут гомогенаты переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют 10 минут
при 2000 g.
Для исследования каждой пробы берут 4 пробирки. В первую пробирку (опыт) вносят 2 мл надосадочной
жидкости и 0,5 мл тирамина. Тирамин готовят в день исследования, растворив в 10 мл дистиллированной воды 1
мг тирамина.
Во вторую пробирку (контроль 1)вносят 2 мл надосадочной жидкости, в третью пробирку - 3,0 мл фосфат-
ного буфера (контроль на реактивы). В четвёртую пробирку - 2,5 мл фосфатного буфера и 0,5 мл тирамина (кон-
троль стандартной пробы). Содержимое пробирок перемешивают и инкубируют в термостате 1 час при темпера-
293
туре +36°С. После инкубации во все пробирки вносят по 1 мл 10% раствора трихлоруксусной кислоты, во вторую
пробирку добавляют 0,5 мл тирамина, тщательно перемешивают и центрифугируют 15 минут при 1500 g. Затем из
каждой пробирки отливают в центрифужные пробирки по 1 мл надосадочной жидкости и добавляют по 0,2 мл
концентрированной соляной кислоты, вносят по 1 капле 1 % спиртового раствора а-нитрозо-р-нафтола и по 3 кап-
ли концентрированной азотной кислоты, перемешивают и помещают в водяную баню с температурой +95°С на 60
секунд. Содержимое пробирок при этом приобретает красный цвет. После охлаждения в них добавляют по 1 мл
дистиллированной воды и центрифугируют 10 минут при 1000 g. Одновременно параллельно готовят гомогенаты,
в которые за 30 минут до внесения субстрата (тирамин) вносят препарат по 3,5 мкг ДВ и отдельно готовят кон-
троль стандартной пробы, в котором используют препараты в тех же количествах. После центрифугирования со-
держимое пробирок колориметрируют на ФЭК-Н в кювете на 5 мл с зелёным фильтром (540 нм) против контроля
на реактивы.
Величину убыли тирамина рассчитывают в мкг/г/час по формуле:
А = аХ50
в
где: А - величина убыли мкг тирамина,
а - разница показаний между второй (контроль 1) и первой опытными пробами;
в - оптическая плотность стандартной пробы;
50 - количество мкг тирамина в стандартной пробе. Сравнение показателей, полученных на пчёлах и кле-
щах, позволяют судить о степени воздействия изучаемого средства на объекты исследования, а также объяснить
механизм действия акарицида.
12.8.	ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЭСТЕРАЗ
В основе механизма токсического действия фосфорорганических соединений лежит инактивация жизнен-
но-важного фермента ацетилхолинэстеразы, приводящая в конечном счёте к прекращению проведения нервных
импульсов и гибели животного организма. Степень угнетения ацетилхолинэстеразы определяют в головном мозге
живых опытных и контрольных пчёл, взятых из одной семьи. Реакцию проводят в индикаторно-буферном раство-
ре. Индикатор - бромтимоловый синий - имеет в щелочной среде синюю окраску, а в кислой - зелёную, перехо-
дящую затем в жёлтую. Субстратом является ацетилхолинхлорид, при расщеплении которого ацетилхолинэстера-
зой образуется уксусная кислота. Об угнетении фермента судят по длительной задержке изменения цвета индика-
тора от синего к зелёному, поскольку при глубоком угнетении ацетихолинэстеразы гидролиз ацетилхолина соот-
ветственно снижен и уксусная кислота выделяется в очень малых количествах.
Реактивы, приборы и посуда. Двузамещенный фосфат натрия, 0,1Н раствор едкого натрия, 0,1Н раствор со-
ляной кислоты, бромтимоловый синий, ацетилхолин хлористый, ступка, пробирки химические, пипетки на 10 и 2
мл, мерная колба или цилиндр на 500 мл, штатив для пробирок, часы.
Приготовление растворов.
Раствор №1 - ПО мг бромтимолового синего и 200 мл двузамещённого фосфата натрия (Na2HP04xl2H20)
растворяют, растирая в ступке с 5 мл 0,1Н раствора едкого натрия. Полученный раствор переносят в мерную кол-
бу на 500 мл, ступку тщательно ополаскивают сначала 15 мл 0,1 Н раствора едкого натрия, а затем дистиллирован-
ной водой, всё сливают в мерную колбу и доводят прокипячённой дистиллированной водой до метки. Раствор
насыщенного синего цвета. Стоек при хранении в склянке с притёртой пробкой.
Раствор №2 - к 10 мл раствора №1 прибавляют несколько капель 0,1Н раствора соляной кислоты до полу-
чения интенсивного зелёного цвета. Раствор стоек при длительном хранении в склянке с притёртой пробкой.
Раствор №3 - 1% водный раствор ацетилхолина. Содержимое одной ампулы (0,2 г) растворяют в 20 мл ди-
стиллированной воды.
Раствор №4 - 9 мл раствора №1 смешивают с 1 мл раствора №3. Готовят перед употреблением.
Ход определения и расчёт угнетения активности эстеразы.
Берут 13 здоровых и такое же количество подвергнутых действию препарата пчёл, отрезают головы и очень
тщательно в течение 5 минут растирают их в маленьких ступках с порошком стекла и 0,5 мл 1% раствора хлорида
натрия, после чего в гомогенаты добавляют 3,5 мл этого же раствора.
Гомогенаты, перелитые в узкие пробирки, тщательно встряхивают и отстаивают в течение 10 минут. Наби-
рают 2 мл надосадочной жидкости гомогената голов здоровых пчёл и вносят по 1 мл в две химически чистые про-
бирки. Так же поступают и с гомогенатами голов отравленных пчёл.
Первые две пробирки являются контрольными, вторые две - опытными. В каждую первую пробирку в кон-
троле и в опыте приливают по 2 мл раствора № 2. Цвет содержимого пробирок зелёный или салатный. Эти про-
бирки служат колориметрическими (цветными) стандартами. В каждую вторую пробирку в контроле и в опыте
приливают по 2 мл раствора №4. Цвет раствора синий. Содержимое пробирок перемешивают встряхиванием и
замечают время. В дальнейшем отмечают время уравнивания цвета в контрольной и опытной пробах с их колори-
метрическими стандартами.
Степень угнетения активности фермента в процентах может быть вычислена по формуле:
294
где:
X - угнетение ацетилхолинэстеразы в процентах;
Во - время уравнивания цвета в опытной пробе со стандартом, в минутах;
Вк - время уравнивания цвета в контрольной пробе со стандартом, в минутах.
13.	ПЧЕЛОВОДНЫЕ (ЗООТЕХНИЧЕСКИЕ) МЕТОДЫ
Практика борьбы с варроатозом показала, что применение пчеловодных приёмов позволяет ограничивать
численность паразитов в гнёздах пчёл. При постановке экспериментов в этом направлении целесообразно прово-
дить длительные (2-3 сезона) опыты на больших группах семей-аналогов (по 10-15 семей в опытной и контроль-
ной группах).
Важное значение в борьбе с клещом имеют расположение сотов на тёплый и холодный занос в улье, фор-
мировании отводков в семьях и использование рамок-ловушек с трутневым расплодом, время и частота удаления
которых определяется погодными условиями в данной местности.
14.	ГЕНЕТИЧЕСКИЙ СПОСОБ БОРЬБЫ
Как показывает многолетний опыт работы с паразитом, развитие клеща, скорость его накопления в гнёздах
зависит от подвидовых и индивидуальных особенностей семей пчёл. Это позволяет проводить отбор таких семей,
вести работы по разведению, созданию устойчивых линий пчёл на основе маток.
Изучение клеща варроа в семьях восковой пчелы показало, что насекомые способны распознавать пора-
жённых клещом куколок в расплоде, своевременно вскрывают такие ячейки и удаляют их содержимое. Рабочие
особи способны как к самоочистке тела от паразита, так и удалению его с других пчёл. Они стремятся уничтожить
клеща своими жвалами и удалить его из улья. Аналогичное поведение, но в менее выраженной мере, отмечают в
некоторых семьях европейских медоносных пчёл.
Способ отбора «гигиенических пчёл» практически отработан: вырезают кусок сота размером 5><6 см, со-
держащий приблизительно около 100 ячеек с расплодом (следует учитывать время его закладки), который поме-
щают на 24 часа при минус 24°С. Затем вырезанный участок вставляют вновь в рамку того улья, из которого взят
расплод. Удаление такого расплода пчёлами в течение 48 часов позволяет рассматривать такие семьи «гигиениче-
скими». Следует иметь в виду, что свежезапечатанный расплод удаляется пчёлами лучше (S. Taber, 1982; S. Taber, М.
Gilliam, 1987). Такие «гигиенические» семьи чаще сохраняют и другие признаки борьбы с болезнями и паразитами.
Вторым направлением является использование времени развития расплода пчёл. Исследования показали,
что в некоторых семьях выход рабочих пчёл из ячеек европейских пород наступает на 9-19 часов раньше поло-
женного срока (21 день). Ускорение выхода пчёл на 1 час, по данным Р. Бухлера и В. Дрешера (1990), позволяет
снизить поражённость гнезда на 8,7%. Э.А. Линакс (Вестник Агропрома, 1989, №15 (119) удалось показать отсут-
ствие необходимости обработок против клеща в отобранных им семьях, у которых матки проходили развитие в
течение 14 дней вместо 16, а рабочие особи выходили на 19 день. Аналогичные результаты получены исследова-
телями в Германии при скрещивании гибридов карника и капской пчелы и шведскими специалистами при исполь-
зовании гибридов итальянских пчёл и хорошо переносящей условия зимовки чёрной горной пчелы Кении.
Степень удаления самок клещей из расплода, самоочищения пчёл и очистки тела окружающих пчёл от па-
разитов может быть определена путем учёта паразитов с повреждениями тела к общему числу их на листе про-
масленной бумаги на дне улья за период 10-15 дней. Однако при этом семьи пчёл должны быть свободны от ли-
чинок восковой моли, муравьев и других паразитов улья, могущих вызвать подобные изменения.
Исследования в этом направлении в настоящее время развернуты с 1984 года во многих странах мира,
включая Россию (НИИ пчеловодства).
15.	КОМБИНИРОВАННЫЕ МЕТОДЫ
В ряде случаев возникает необходимость сочетания различных приёмов борьбы с варроатозом. В настоящее
время широкое распространение получил метод комбинированного применения пчеловодных (зоотехнических)
приёмов и акарицидных препаратов. Применяют также физический (тепловой) метод с одновременной обработ-
кой акарицидами или используют несколько акарицидных препаратов. При изучении действия нескольких агентов
на пчёл и клещей в опытах соответственно должно быть увеличено число контролей. Разработка комбинирован-
ных методов требует от исследователя постановки разносторонних опытов в лаборатории и на семьях пчёл с учё-
том возможности увеличения ошибок при изучении многокомпонентных систем.
Наиболее эффективный результат сокращения числа обработок семей акарицидами получен при раннем со-
здании отводков пчёл, куда из основной семьи собирают весь печатный расплод и рамку со свежим засевом яиц,
на которых пчёлы закладывают маточник для свищевой матки. После выхода всех пчёл из печатного расплода и
оплодотворения матки отводок обрабатывается акарицидом. Основная семья и вторично развившийся отводок
обрабатываются акарицидом при формировании гнёзд к зимовке. Характер экспериментов определяется особен-
ностями используемых методов.
16.	ПРОИЗВОДСТВЕННЫЕ ИСПЫТАНИЯ
Препарат проверяют на возможно большем числе пчелиных семей и пасек, расположенных в различных
природно-климатических зонах страны, на разных породах пчёл. Работу проводят по методике, подготовленной
исследователем с учётом существующей методики, утверждённой ГУ В Госагропрома СССР от 10.12.87. Научно-
производственная апробация происходит в присутствии представителя фармсовета, учреждения, предлагающего
препарат и проводящего его испытание, а также специалистов хозяйств.
В ходе испытания проверяют эффективность препарата в различных природно-климатических зонах, уточ-
няют режимы обработок, выявляют нежелательные последствия применения препарата и пути их устранения.
По окончании производственного испытания составляют акт (приложение 1).
295
17.	МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ ПРИ ПРОВЕДЕНИИ ИССЛЕДОВАНИЙ
К работе с пчёлами допускаются лица, не обладающие повышенной чувствительностью к пчелиному яду и
аллергическими реакциями на продукты пчеловодства. Работу проводят в специальной лицевой сетке и халате.
К работе с акарицидами, хемостериляцтами, ювенильными гормонами, их аналогами и аттрактантами до-
пускаются лица, прошедшие специальную подготовку. Необходимо предотвращать попадание препаратов на ко-
жу, слизистые оболочки и в органы дыхания, использовать средства индивидуальной защиты - противогазные
респираторы (РПГ-67), противопылевые респираторы (Ф-62 Ш, ПРВ-5, У-2К, ’’Лепесток”, "Астра-2”), респирато-
ры с герметичными очками ПО-1. Индивидуальная защита от попадания ядохимикатов на кожу и слизистые обо-
лочки осуществляется с помощью спецодежды, спецобуви, рукавиц или перчаток и защитных очков. После обра-
ботки необходимо тщательно вымыть руки, прополоскать рот. Категорически запрещено курить и принимать пи-
щу при работе с препаратом. Посуду, употребляемую для приготовления рабочих концентраций акарицидов, по-
сле использования следует хорошо промыть горячей водой с мылом и содой. Запрещается хранение, транспорти-
ровка тары из-под препарата вместе с продуктами питания и фуражом, а также использование её для перевозки
пищевых продуктов и воды.
Акарициды и хемостерилянты хранят в тёмной посуде в опечатанном сейфе.
Эксперименты с такими агентами, как ионизирующее излучение, радиоактивные изотопы, ультразвук, уль-
трафиолетовые лучи и т.д., необходимо проводить в специально оборудованных лабораториях, строго соблюдая
личную гигиену и технику безопасности. К работе с ними могут быть допущены лишь специально подготовлен-
ные лица.
Все работники, проводящие исследования с пестицидами, хемостерилянтами, радиоактивными изотопами и
проникающим излучением, должны находиться на учёте в районной поликлинике и периодически проходить ме-
дицинские осмотры.
18.	ПРИЛОЖЕНИЯ.
Приложение 1.
Республика область
район, населенный пункт_______________________________
хозяйство_____________________________________________
АКТ
Производственного испытания акарицидности
__________________________при варроатозе пчёл
от числа месяца 20________года
составлен комиссией: представитель
Фармсовета;
сотрудники учреждений, рекомендующие
препарат;
ответственный за проведение производ-
ственного испытания;
вет. врач хозяйства;
пчеловод хозяйства.
Название и форма (метод) применения препаратов:
Испытываемого____________________________________________
Характеристика пасеки: число семей, в опытной группе,
пчёлы содержатся в ульях лежаках двенадцатирамочных
двухкорпусных многокорпусных
Характеристика семей: сила в улочках_____________________
Количество (от-до):	мёда,перги,расплода.
Поражённость (инвазированность) 100 пчёл и 100 ячеек печатного расплода
(трутневого, пчелиного)__________________________________
Погодные условия в период обработки: температура воздуха
относительная влажность__________________________________
Погибло пчёл (маток)
Погибло клещей___________
Погибло печатного расплода
Поражённость после обработки составила: на 100 пчёл %
на 100 ячеек (трутневого, пчелиного) расплода %.
Примечание
Заключение___________________________________________________________________________________
Подписи____________________________________________________________
296
Приложение 2.
Затраты времени на отдельные виды работ при двухкорпусном содержании пчелиных семей.
Вид работ	Число работающих	Средние затраты времени (мин)	Можно сделать за 4 ч чистой работы
Чистка доньев	3	1,4	170
Замена доньев	2	1,06	226
Замена доньев с одновременной чисткой их	2-3	2,0	120
Чистка и дезинфекция семей	1	8	30
Подкормка пчелиных семей сахарным сиропом	3	1,4	171
Подготовка ульев для отводков	1-2	2,1	111
Формирование отводков	2-3	6	40
Подсадка маток	2-3	2,2	109
Проверка отводов, расширение и подсиливание их расплодом	2	4,4	55
Расширение гнезда вощиной	2	1,04	230
Постановка вторых корпусов с переносом рас- плода в верхний корпус	2-3	1,67	144
Подготовка пчёл к зиме	3	5,6	43
Приложение 3.
Перевод процентов смертности в пробиты (по Блиссу).
%	0	1	2	3	4	5	6	7	8	9
0	—	2,67	2,95	3,12	3,25	3,35	3,46	3,52	3,60	3,66
10	3,72	3,77	3,83	3,87	3,92	3,96	4,01	4,05	4,09	4,12
20	4,16	4,20	4,23	4,26	4,30	4,33	4,36	4,39	4,42	4,45
30	4,50	4,51	4,53	4,56	4,59	4,62	4,64	4,67	4,70	4,72
40	4,75	4,77	4,80	4,82	4,85	4,87	4,90	4,93	4,95	4,98
50	5,00	5,03	5,05	5,08	5,10	5,13	5,15	5,18	5,20	5,23
60	5,25	5,28	5,31	5,33	5,36	5,39	5,41	5,44	5,47	5,50
70	5,52	5,55	5,58	5,61	5,64	5,67	5,71	5,74	5,77	5,81
80	5,84	5,88	5,91	5,95	5,99	6,04	6,08	6,13	6,18	6,23
%	0,0	0,1	0,2	0,3	0,4	0,5	0,6	0,7	0,8	0,9
90	6,28	6,29	6,29	6,30	6,31	6,31	6,32	6,32	.6,33	6,34
91	6,34	6,35	6,35	6,36	6,37	6,37	6,38	6,39	6,39	6,40
92	6,41	6,41	6,42	6,43	6,43	6,44	6,45	6,45	6,46	6,47
93	6,48	6,50	6,50	6,50	6,51	6,51	6,52	6,53	6,54	6,55
94	6,55	6,56	6,57	6,58	6,59	6,60	6,61	6,62	6,63	6,64
95	6,65	6,65	6,67	6,68	6,69	6,70	6,71	6,72	6,73	6,74
96	6,75	6,76	6,77	6,79	6,80	6,81	6,83	6,84	6,85	6,87
97	6,88	6,90	6,91	6,93	6,94	6,96	6,98	7,00	7,01	7,03
98	7,05	7,08	7,10	7,12	7,14	7,17	7,20	7,23	7,26	7,29
99	7,33	7,37	7,41	7,46	7,51	7,58	7,65	7,75	7,88	8,09
19.	ЛИТЕРАТУРА.
1.	Акимов И.А. и др. Пчелиный клещ Varroa jacobsoni. Киев. Паукова думка. 1993.
2.	Гробов О.Ф., Иванов Ю.А., Микитюк В.В., Сотников АН., Шаблий М.Я., Мигалатюк Е.М., Обухов М.Л. Мето-
дические рекомендации по изучению препаратов и способов борьбы с варроозом пчёл, утв. Отд. ветеринарии
ВАСХНИЛ 27 апр. 1981 г. М. ВАСХНИЛ. Отд. ветеринарии 1981, 52 стр.
3.	Гробов О.Ф., Иванов Ю.А., Мигалатюк Е.М., Микитюк ВВ., Домацкая Т.Ф., Столбов Н.М., Авдеева О.И., Му-
равская А.И., Кардаков В.П., Шарандак Н.И., Тищенко А.И., Думнич Е.И., Бунич А.С., Садов А.В., Уваров А.В.
Методические указания по исследованию влияния акарицидных препаратов на пчёл и клещей варроа. Утв. Отд.
ветеринарии 10 мая 1982. М. ВАСХНИЛ. Отд. ветеринарии, 1982, 37 стр.
4.	Гробов ОФ., Иванов Ю.А., Космачев В.Н., Замазий А.А. Методические рекомендации по определению рези-
стентности клеща варроа якобсони к акарицидным препаратам. Утв. Отд, ветеринаринарной медицины РАСХН 24
июня 2003 г. М. РАСХН 2003,16 стр.
5.	Замазий А.А., Гробов О.Ф. Оценка действия акарицидных препаратов на воспроизводительную функцию самок
297
варроа и жизнеспособность потомства (методические указания). ВАСХНИЛ Южное отделение. Кишинев, Мол-
дагроинформреклама, 1990, 13 стр.
6.	Иванов Ю.А., Сотников А.Н. Методика определения акарицидной эффективности препаратов (способов) в пче-
ловодстве. Утв. Зам. начальника ГУВ Госагропрома СССР, 10.12.1987. 4 стр.
7.	Методические рекомендации по изучению и разработке с способов профилактики и борьбы с аспергиллёзом
пчёл. Утв. ВАСХНИЛ, 1987 г.
8.	Методические рекомендации по оценке действия и потенциальной опасности пестицидов для медоносных пчёл.
Утв. РАСХН, 2000.
9.	Методические рекомендации к постановке экспериментов в пчеловодстве. Утв. РАСХН, 2000.
10.	Методические указания о порядке испытаний новых дезинфекционных средств для ветеринарной практики.
Утв. ГУВ Госагропрома СССР, 1987.
И.	Методы испытаний дезинфекционных средств для оценки безопасности и эффективности, часть 2. М. 1998.
РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК
ОТДЕЛЕНИЕ ВЕТЕРИНАРНОЙ МЕДИЦИНЫ
ГНУ ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ВЕТЕРИНАРИИ ИМ. Я.Р.КОВАЛЕНКО
« Утверждаю»
Академик секретарь Отделения
ветеринарной медицины Россельхозакадемии,
Академик РАСХН
А.М. Смирнов
13.08.2010 г.
МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
ПО ЛАБОРАТОРНОМУ СОДЕРЖАНИЮ И РАЗВЕДЕНИЮ БОЛЬШОЙ ВОСКОВОЙ
ОГНЕВКИ GALLERIA MELLONELLA L.
Разработчик - сотрудник ВНИИ экспериментальной ветеринарии
им. Я.Р.Коваленко кандидат биологических наук Т.В.Коновалова.
Предназначены для специалистов по ветеринарии, пчеловодству, преподавателей и студентов сельскохозяй-
ственных ВУЗов, сотрудников научно-исследовательских учреждений.
Методические рекомендации рассмотрены и одобрены на Секции
«Патология пчел, рыб и охрана полезных гидробионтов» Отделения ветеринарной медицины Россельхозакаде-
мии (16 июня 2009 г., протокол №2).
Рецензент: кандидат биологических наук Р. Т.Клочко (ВНИИВСГЭ)
Ответственный за выпуск: заведующий сектором инфекционной и инвазионной патологии Отделения ветери-
нарной медицины Россельхозакадемии, кандидат ветеринарных наук А. В. Суворов
ВВЕДЕНИЕ
Большая восковая огневка находит широкое применение в научно-производственных целях. На севере
США и севере Европы занимаются коммерческим выращиваем личинок этого вида для использования в каче-
стве приманки в рыболовстве. Она служит сырьем для приготовления косметических средств, медицинских пре-
паратов. Ее используют в лабораторных опытах по изучению биологии развития, физиологии, токсикологии и т.п.
насекомых. С другой стороны, большая восковая огневка представляет интерес как хозяин для массового раз-
ведения различных паразитов-энтомофагов, используемых в биологической борьбе: хальцид, ихневмонид, брако-
нид, тахин. Большая восковая огневка - один из распространенных тест-объектов при оценке активности ин-
сектицидов, энтомопатогенов и биологически активных веществ. В частности, она используется в микробиологи-
ческой промышленности при стандартизации бактериального инсектицида энтобактерина.
Культивирование большой восковой огневки в силу ряда особенностей ее биологии (сравнительно ко-
роткого цикла развития, отсутствия диапаузы, афагии бабочек, способности развиваться без света) не представля-
ет значительных трудностей). Известно несколько методов лабораторного разведения этого вида, большинство из
298
которых все же не подходит для его круглогодичного культивирования как тест-объекта, поскольку не позволяет
получать достаточно стандартный и недорогой материал.
Цель настоящих методических рекомендаций - оптимизировать метод культивирования большой воско-
вой огневки (G. mellonella) как тест-объекта для оценки активности инсектицидов и биопрепаратов, в том числе, и
тех, которые могут быть использованы для борьбы с этим серьезным вредителем медоносных пчел.
2.	МОРФОЛОГИЯ И БИОЛОГИЯ G. MELLONELLA
Большая восковая огневка распространена везде, где есть пчелы, за исключением районов с суровым
климатом и расположенных на высоте свыше 1500-2000 м над уровнем моря.
Самки имеют размах крыльев 15-35 мм, длина их тела в среднем 13 мм (рис. 1). Крылья и тело покрыты
чешуйками, содержащими пигмент. Цвет передних крыльев фиолетово-серый со светло-серыми и темными пят-
нами, задних - серый с темными штрихами по заднему краю. Задний край передних крыльев ровный, а задних -
закругленный. В спокойном состоянии самка держит крылья, сложенными крышеобразно. Голова удлинена и
суживается вследствие направленных вперед шипиков, имеет опушение и короткий хоботок, большие фасеточные
глаза, подвижные тонкие усики, состоящие из 60 члеников. Брюшко состоит из 10 члеников, при надавливании на
него выступает длинный яйцеклад.
Самцы меньше самок: размах крыльев 14-33 мм, длина тела в среднем 11,3 мм. Передние крылья бурые, с
глубокой полулунной выемкой на заднем крае. В спокойном состоянии самец держит крылья не столь собранны-
ми, чем самка. Голова опушена, круглая, шипики менее развиты, чем у самки, и направлены кверху. При надавли-
вании на брюшко выступает копулятивный аппарат.
Размер и цвет бабочек обоих полов варьирует в зависимости от диеты личинки. Имаго, которые выра-
щиваются на среде из воска, имеют серебристо-белую окраску, а те, которые выращиваются на диете из сотов с
расплодом пчел, имеют окраску преимущественно от коричневой до темно-серой и почти черной.
Яйца большой восковой огневки круглые или слегка овальные, величиной 0,5 х 0,35 мм, белого цвета.
Личинка первого возраста имеет длину 1 мм, передняя часть тела значительно шире задней, голова свет-
ло- желтого цвета, несколько уплощена; имеет восемь ног и на заднем конце две щетинки. Взрослая личинка до-
стигает длины 18-28 мм, беловато-серого цвета, тело состоит из 13 сегментов, широкое в средней части и слегка
суживается к головному и заднему концу. Г олова бурая. Личинок этого вида легко отличить от близкородствен-
ных видов огневок по следующим признакам: наличие глазков по четыре с каждой стороны; наружный вентраль-
ный край мандибул равномерно закруглен, без выемки в вершинной трети; стигмы овальные, их перитрема
светло-коричневая, одинаковой ширины по всей окружности (рис. 2).
Коконы имеют длину 14-20 мм, диаметр 5-7 мм, гладкие, белые, покрытые в большинстве случаев тем-
ными комочками фекалий и остатками корма. Куколка имеет длину у самки 16 мм, у самца - 14 мм, в начале
развития соломенно-желтого, а в конце темно-бурого цвета. Для имаго большой восковой огневки характерна
афагия, т.е. они не питаются и живут за счет веществ, накопленных в стадии личинки. Однако у них наблюдается
выделение жидких буровато-желтых экскрементов. Отмечены некоторые биологические различия у огневок этого
вида из разных мест.
Бабочки огневки выплаживаются из куколок вечером после 17 ч, реже - утром, с 6 до 11 ч. Бабочки, вы-
шедшие из куколок утром, остаются в улье, расправляют крылья, спариваются. Пчелы на них не реагируют. Сам-
ки приступают к откладке яиц через 24 ч после спаривания.
Бабочки, вышедшие вечером, выбегают из легкового отверстия и прикрепляются к горизонтальным по-
верхностям спинкой книзу, расправляют крылья. Через 20-30 мин бабочка складывает крылья и остается на месте
еще 10-20 мин. С наступлением темноты они летят на деревья и рассредоточиваются в листве на высоте свыше 12
м. Оплодотворенные самки слетают с деревьев и пытаются внедриться в улей.
Для откладки яиц самки выбирают преимущественно сильные семьи пчел. В одну семью могут входить
для откладки яиц каждую ночь 7-12 самок огневки. Бабочки перемещаются по соту и, когда находят подходящее
место для откладки яиц, их усики начинают усиленно вибрировать.
Яйца откладывают отдельными партиями на стенки ячеек со свежей пыльцой, под крышечки частично
запечатанных ячеек с медом, реже - в узких (0,2 мм) щелях рамок, стенок и дна улья или на его наружной по-
верхности под крышкой. Продолжительность откладки партии яиц (54 шт.) 2 мин, самка остается на соте до 1 ч. За
час до рассвета огневки покидают улей и летят на деревья, где ведут малоподвижный образ жизни. Откладка яиц
при температуре окружающего воздуха свыше 21° С продолжается в течение четырех ночей. За свою жизнь сам-
ка откладывает от 400 до 800 яиц, но отдельные особи могут отложить до 1800 яиц.
Скорость откладки яиц наивысшая в первые 2 дня после выхода из куколки, после чего количество от-
кладываемых яиц в день резко сокращается, а в последние (7-10-й дни) практически прекращается. По мере уве-
личения возраста самки удлиняются сроки развития преимагинальных стадий в ее потомстве. Наивысшая доля
жизнеспособности яиц (96%) отме-чается в 1-й день жизни самки, а затем постепенно снижается до 61,1% на 6-й
день, после чего вновь наблюдается повышение числа жизнеспособных яиц. Смертность яиц и гусениц в потом-
стве быстро возрастает по мере старения самки. В первые 3 дня откладки яиц соотношение полов сдвинуто в
сторону самцов, а в последние дни - в сторону самок.
Развитие яйца продолжается при температуре 27.5° С и 70%-ной относительной влажности воздуха 5
дней; при температуре 29-30° С - 3-5 дней; при понижении температуры до 18° С срок выплода личинок удлиня-
ется до 30 дней.
299
Яйцекладки содержат от десяти до нескольких сотен экземпляров и представляют собой кучки, где яйца
крепко склеены друг с другом.
Выплаживающаяся личинка с помощью мандибул разрезает хорион и освобождает голову. Вышедшие
на поверхность субстрата молодые личинки очень подвижны, быстро двигаются на нем или на стенках сосуда, в
котором он находится. Этот период блуждающей жизни молодых личинок при массовом разведении может
продолжаться до 24 ч и позволяет им разъединиться до контакта с пищей.
Существует два типа личинок: одни проходят семь стадий развития, другие - восемь; в сответствии с
этим размеры их головных капсул также отличаются. Масса личинок при выходе из яиц составляет в сред-
нем 0,02 мг; в момент первой и последующих линек она соответственно возрастает в среднем до 0,07; 0,22; 0,83;
1,82; 6,45; 20,68; 56,78 мг, а к концу развития личинок - до 151,10 мг (масса личинок самцов составляет 86 -155
мг, масса личинок самок - 112-222 мг). Длительность отдельной стадии развития ( в днях): личинок, имеющих
семь стадий развития, - 6,02; 3,16; 3,22; 3,12; 3,35; 3,78; 8,53; личинок, имеющих восемь стадий развития - 5,25;
2,89; 2,90; 3,15; 3,59; 3,14; 3,59; 3,14; 3,76; 8,71.
Длительность развития личинок большой восковой огневки при 30° С составляет 25-28 дней; при 27,5 °C
- 32,25 дня. Температура 45° С является предельной, которую гусеницы могут вынести. При понижении темпера-
туры до 15 °C и ниже развитие личинок огневки сильно замедляется.
В течение последующей стадии развития личинки по мере увеличения и достижения максимальной мае-.
сы ее тела различают несколько позиций:
блуждающая личинка в течение 6-30 ч перемещается очень быстро по краю сосуда, перестает питаться, почти
опорожняет кишечник и ткет более или менее значительное количество шелковых нитей;
личинка выделяет несколько нитей, которые служат закреплению коконов;
личинка с тонким коконом, положение ее в коконе хорошо видно (4-6 ч);
личинка с прозрачным коконом, который уплотняется, но движения ее еще видимы (4-6 ч);
личинка с непрозрачным коконом, но еще не законченным (4-8 ч);
личинка с законченным коконом, но подвижна; и если кокон надрезан, она из него свободно выходит (6-12 ч);
личинка полуподвижная, не покидает надрезанный кокон, но если на нее слегка надавить, может энергично дви-
гаться (6-8 ч);
личинка неподвижная, не реагирует на раздражение и только может слегка повернуться, сильно уменьшается в
длину, голова ее направлена кпереди. Эта стадия предкуколки (8-12 ч). Закончив рост, гусеницы огневки
подыскивают место в какой-нибудь щели, трещине улья, в складках холстиков и т.п. и прядут кокон в течение
двух дней. Куколки часто располагаются группами, коконы лежат в рядах плотно друг к другу.
Масса куколок самок 188-212 мг, самцов -125-138 мг.
Средняя продолжительность развития куколки при температуре 35° С равна 7,2 , при 27,5° С - 8,05 дня.
Температура, оптимальная для развития большой восковой огневки, составляет 35° С, при этом весь цикл
развития от яйца до имаго продолжается 36 дней. При 30° С длительность цикла развития составляет около 40
дней; при понижении температуры до 20° С она удлиняется в среднем до 120 дней; при 10° С и ниже развитие
огневки прекращается. Зимуют в улье только личинки и иногда куколки в состоянии оцепенения.
Продолжительность жизни бабочек большой восковой огневки от 3 до 30 дней и более. Большая часть
оплодотворенных самок погибает через 7 дней, если их содержать при температуре 30-32° С. В течение года
большая восковая огневка дает три поколения.
Наибольшему разрушению личинками большой восковой огневки подвергаются соты в слабых семьях и
при неправильном хранении их вне гнезда. Одна личинка может повреждать 500 и более ячеек. Проходя в средо-
стение сота и по донышкам ячеек, они слегка приподнимают личинок и куколок пчелы. Такой приподнятый
расплод пчелы запечатывают не полностью, а запечатанных куколок распечатывают, оставляя середину ячейки
открытой, при этом край незапечатанной крышечки вокруг отверстия они утолщают и надстраивают в виде от-
тянутого кверху ободка или воротничка. Возникает так называемый «неприкрытый» или «горбатый» расплод. При
сильном поражении сотов огневкой ощущается резкий специфический запах. Нередко она вызывает гибель се-
мей или их ослабление.
При постановке диагноза на поражение расплода пчел огневкой на пасеках при осмотре гнезда обраща-
ют внимание на наличие ее личинок и куколок в углах крышки и стенок улья, под утеплительным материалом на
рамках и дне улья, на ходы гусениц огневки в сотах и изменение в расплоде («горбатый « расплод, перфорация
крышечек над печатным расплодом по ходу движения гусениц), наличие специфического запаха; над листом бу-
маги (холстиком) держат поврежденную сотовую рамку, освобожденную от пчел, и ударяют несколько раз по
верхней планке. Потревоженные личинки огневки выпадают из своих ходов на лист бумаги. Для постановки диа-
гноза на видовую принадлежность в ветеринарную лабораторию направляют 15-20 личинок в 10%-ном растворе
формалина или 70%-ном этиловом спирте в пенициллиновых флаконах в течение 1-3 суток после их сбора. Лабо-
ратор-ные исследования заключаются в осмотре личинок огневки под микроскопом МБС-1, МБС-2, МБС-9 при
увеличении х 8-16. Личинок большой восковой огневки необходимо дифференцировать от личинок других бабо-
чек (малой восковой огневки, южной амбарной огневки, платяной моли и др.) ПО приведенным выше отличи-
тельным признакам. Гибель расплода пчел от большой восковой огневки необходимо дифференцировать от за-
стуженного, замершего, мешотчатого расплода, американского, европейского гнильцов, парагнильца, варрооза.
3.	ЛАБОРАТОРНОЕ СОДЕРЖАНИЕ И РАЗВЕДЕНИЕ G. MELLONELLA.
300
Культивирование большой восковой огневки проводят в термостате при температуре 28° С и относитель-
ной влажности воздуха 70-80% и содержании гусениц на искусственной питательной среде.
3.1.	Состав и приготовление питательной среды.
Поскольку для получения тест-культуры большой восковой огневки нельзя использовать ее естественный
нестандартный корм (пчелиная сушь, старые соты), нами была создана стандартная искусственная питательная
среда, максимально соответствующая пищевым потребностям вида по биохимическому составу и соотношению
компонентов. За основу взяли искусственную питательную среду, регламентируемую ГОСТом на энтобактерин
(ГОСТ 21108-75), состоящую из восьми компонентов (в %): меда -13, пчелиного воска -13, глицерина -13, пив-
ных дрожжей -13, сухого цельного молока -13, кукурузной муки -23, пшеничных отрубей или пшеничной муки -
10, воды -2. Для удешевления среды было исключено сухое цельное молоко, пивные дрожжи заменены на кормо-
вые, а также снижено содержание меда, воска, глицерина, кукурузной муки.
Оптимизированная искусственная питательная среда имеет следующий состав по массе (в %): мед -10,4;
пчелиный воск - 10,4; глицерин -10,4; кормовые дрожжи -10,4; пшеничные отруби - 20,8; кукурузная мука -18,8;
пшеничная мука -8,4;
вода -10,4.
В ряду непрерывных генераций большой восковой огневки основные биологические показатели остава-
лись устойчивыми в течение многих лет.
Воск, мед, глицерин, взвешенные с точностью до 0,01 г, и воду помещают в эмалированную посуду и ста-
вят в сушильный шкаф при температуре 80° С до расплавления воска и образования однородной жидкости. Затем
эту жидкость вливают в сухую, предварительно перемешанную смесь из кормовых дрожжей, пшеничных отру-
бей, кукурузной и пшеничной муки. Все тщательно перемешивают и готовую среду раскатывают в виде колбасок,
которые помещают в стеклянные банки, плотно закрытые полиэтиленовыми крышками. Готовый корм возможно
хранить в холодильнике при температуре 5° С до трех месяцев. Застывший корм измельчают на терке и расклады-
вают гусеницам по садкам
(банкам).
3.2.	Культивирование G. mellonella для получения маточной культуры.
Для воспроизводства большой восковой огневки используют имаго маточной культуры в возрасте 1 -2 сут.
с одинаковым физиологическим состоянием, когда бабочки дают наиболее однородное, жизнеспособное и быст-
рорастущее потомство, что повышает стандартность получаемого биоматериала.
Садки для выращивания гусениц представляют собой банки емкостью 0,8-1,0 л, которые закрывают вна-
чале салфетками из бязи, а к 4-5-му возрасту гусениц салфетки заменяют полиэтиленовыми крышками, в которые
запаивают металлическую сетку диаметром 4 см с отверстиями 0,1 мм2. В садки помещают двухчасовые яйце-
кладки огневки (200 яиц) на 50-100 г среды. По мере роста гусениц подкладывают корм небольшими порциями
так, чтобы слой свежего корма не превышая 2-3 см для предотвращения его порчи. Всего требуется 200 г корма.
При повышенной влажности корм делается чрезмерно жидким, поэтому необходимо проветривать тер-
мостат время от времени. При появлении плесени, садки необходимо уничтожать, своевременно заменять салфет-
ки на крышки, систематически стерилизовать термостат путем обжига спиртом.
Для получения яиц большой восковой огневки отбирают гусениц 7-го возраста массой 85 +10 мг и пере-
носят их по 150-200 шт. в почвенные сита с отверстиями (0,2-0,3 см), на дно которых предварительно кладут не-
большое количество корма (50-100 г). Здесь гусеницы окукливаются, а вышедшие из куколок бабочки через от-
верстия сита откладывают яйца на фильтровальную бумагу, помещенную снаружи и закрепленную сверху с по-
мощью другого сита с крупными отверстиями. Яйцекладки вместе с бумагой вырезают, дезинфицируют в слабо-
розовом растворе марганцево-кислого калия (путем погружения на 1-2 сек.), подсушивают на воздухе при ком-
натной температуре в течение 3-5 мин. и раскладывают в садки.
Развитие яиц огневки длится 5-7 дней. Отродившиеся личинки 1 -го возраста свободно передвигаются по
стенкам садка в поисках корма, а затем вбуриваются в него. Наступление 7-го возраста гусениц происходит через
21-28 дней с момента отрождения. Цикл развития огневки от яйца до яйца длится 56-60 дней.
3.3.	Культивирование G. mellonella для получения стандартных гусениц 7-го возраста
Культивирование большой восковой огневки для получения стандарных гусениц 7-го возраста проводят анало-
гично описанному выше. Ежедневно заселяют садки (на 1 л -200 г корма) яйцами двухчасовой кладки из расчета
500 шт. на садок.
Для биологической оценки отбираются гусеницы 7-го возраста массой 85+10 мг, шириной головной кап-
сулы от 1,9 до 2,3 мм.
На оценку передаются гусеницы после предварительного голодания в течение 3-4-х часов, для чего они
отбираются в банку без корма.
4.	ЛИТЕРАТУРА
1.	Загуляев А.К., 1965. Моли и огневки - вредители зерна и продовольственных запасов. М.-Л.: Наука.
2. ГОСТ 21108-75, 1981. Энтобактерин сухой (переиздание с изменением №1). М.
3.	Гробов О.Ф. и др., 1992. Опасные болезни и вредители пчел. М.: Нива России.
301
5.	ПРИЛОЖЕНИЕ
Рис. 1. Общий вид отдельных стадий развития G. mellonella:
1 -личинка; 2 - куколка; 3 -кокон; 4 -имаго, самка; 5 -имаго, самец
2
Рис. 2. Гусеница G. mellonella:
1. левая глазная область и окружающие ее щетинки;
2. переднегрудной щит и престигмальный щиток, левая
сторона переднегрудного сегмента (Варшапоып,
1978).
302